[RU]

Данное изобретение направлено на модификаторы биологического ответа (BRM), которые могут содержать одно или более чем одно соединение, и на способы усиления иммунной системы с использованием BRM по изобретению, включающие увеличение специфичного иммунного ответа либо профилактически, либо для лечения в качестве адъюванта или вакцины при связывании с патогенным антигеном и для общей активации иммунной системы. Данное изобретение также направлено на уменьшение неограниченного или неправильного воспалительного ответа и/или иммунного ответа таким образом, чтобы лечить или предупреждать аутоиммунные заболевания и расстройства и ассоциированные симптомы. Кроме того, данное изобретение направлено на изготовление BRM соединений, содержащих выделенную сыворотку от млекопитающего, и подвергание данной сыворотки хроматографии с тангенциальным потоком и диализу с отсечением по молекулярной массе для получения одного или более чем одного очищенного BRM соединения, подходящего для введения нуждающемуся пациенту.

(57) Реферат / Формула:

Данное изобретение направлено на модификаторы биологического ответа (BRM), которые могут содержать одно или более чем одно соединение, и на способы усиления иммунной системы с использованием BRM по изобретению, включающие увеличение специфичного иммунного ответа либо профилактически, либо для лечения в качестве адъюванта или вакцины при связывании с патогенным антигеном и для общей активации иммунной системы. Данное изобретение также направлено на уменьшение неограниченного или неправильного воспалительного ответа и/или иммунного ответа таким образом, чтобы лечить или предупреждать аутоиммунные заболевания и расстройства и ассоциированные симптомы. Кроме того, данное изобретение направлено на изготовление BRM соединений, содержащих выделенную сыворотку от млекопитающего, и подвергание данной сыворотки хроматографии с тангенциальным потоком и диализу с отсечением по молекулярной массе для получения одного или более чем одного очищенного BRM соединения, подходящего для введения нуждающемуся пациенту.

---

Евразийское (21) 201892266 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.04.04
(51) Int. Cl.
A61K 38/00 (2006.01) A61K 38/48 (2006.01) A61P 37/00 (2006.01) C07K 7/00 (2006.01)
(54) ИММУНОМОДУЛЯЦИЯ В ЦЕЛЯХ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАССТРОЙСТВ
(31) 62/318,016; 62/453,586; 62/455,166
(32) 2016.04.04; 2017.02.02; 2017.02.06
(33) US
(86) PCT/US2017/025947
(87) WO 2017/176757 2017.10.12
(71) Заявитель:
МАРП ХОЛДИНГЗ, ЛЛК (US)
(72) Изобретатель:
Уиллфорд Кеннет О., Макклейн Дуглас А. (US)
(74) Представитель:
Осипов К.В., Ильмер Е.Г., Пантелеев А.С., Хмара М.В., Дощечкина В.В., Новоселова С.В., Липатова И.И. (RU)
(57) Данное изобретение направлено на модификаторы биологического ответа (BRM), которые могут содержать одно или более чем одно соединение, и на способы усиления иммунной системы с использованием BRM по изобретению, включающие увеличение специфичного иммунного ответа либо профилактически, либо для лечения в качестве адъюванта или вакцины при связывании с патогенным антигеном и для общей активации иммунной системы. Данное изобретение также направлено на уменьшение неограниченного или неправильного воспалительного ответа и/или иммунного ответа таким образом, чтобы лечить или предупреждать аутоиммунные заболевания и расстройства и ассоциированные симптомы. Кроме того, данное изобретение направлено на изготовление BRM соединений, содержащих выделенную сыворотку от млекопитающего, и подвергание данной сыворотки хроматографии с тангенциальным потоком и диализу с отсечением по молекулярной массе для получения одного или более чем одного очищенного BRM соединения, подходящего для введения нуждающемуся пациенту.
ИММУНОМОДУЛЯЦИЯ В ЦЕЛЯХ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ И
РАССТРОЙСТВ
Ссылка на родственные заявки
5 В данной заявке испрашивается приоритет по отношению к
предварительной заявке США № 62/455166, поданной 6 февраля 2017 г., предварительной заявке США № 62/453586, поданной 2 февраля 2017 г., и предварительной заявке США № 62/318016, поданной 4 апреля 2016 г. Полный объем каждой заявки является конкретно включенным посредством ссылки.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в формате ASCII через EFS-Web и является тем самым включенным посредством ссылки во всей его полноте. Указанная копия ASCII, созданная 4 15 апреля 2017 г., называется 3090.002.PCT_SL.txt и имеет размер 4078 байт.
Предшествующий уровень техники 1. Область изобретения
Согласно настоящему изобретению предложены композиции и способы для 20 усиления иммунной системы, включая усиление специфичного иммунного ответа либо профилактически, либо для лечения, в качестве адъюванта или вакцины, и для укрепления иммунной системы в общем и, в частности, для уменьшения неограниченного или неправильного воспалительного ответа и/или иммунного ответа, как, например, для лечения или предупреждения аутоиммунных 25 заболеваний и расстройств. Данное изобретение также направлено на способы изготовления модификаторов биологического ответа и, в частности, изготовления посредством хроматографии с тангенциальным потоком и диализа с отсечением по молекулярной массе.
30 2. Описание предшествующего уровня техники
Открытие агентов, которые потенцируют иммунный ответ, является движущей силой в исследовании современных лекарственных средств. Биоактивные пептиды, такие как цитокины, хемокины и катионные пептиды, представляют собой классы "относительно" низкомолекулярных соединений,
35 которые оказались многообещающими в данной области исследования. По
меньшей мере девять иммунозащитных пептидных продуктов имеются в продаже с годовыми продажами свыше 4 миллиардов долларов США (Latham, 1999).
Идея иммуностимуляции возникла в 1907 г. при идентификации спонтанной регрессии опухоли у некоторых пациентов после эпизода сепсиса (Rush and 5 Flaminio, 2000). В человеческой и ветеринарной медицине иммуностимулирующие препараты прежде всего используются для лечения хронических вирусных или бактериальных инфекций. В некоторых случаях иммуностимуляторы продемонстрировали эффективность в качестве первичного или вспомогательного лечения неопластических состояний (Rush, 2001). Предложенным механизмом
10 действия неспецифичных иммуностимулирующих препаратов является активация макрофагов и последующее высвобождение цитокинов, которые усиливают иммунный ответ (Rush and Flaminio, 2000). Профилактическое введение иммуностимулирующих препаратов до воздействия патогенов может снижать заболеваемость и смертность, ассоциированные сострой инфекцией (Rush, 2001).
15 Идея лечения и/или предупреждения заболеваний и расстройств с
использованием иммуностимуляции и, в более общем случае, иммунорегуляции получила значительное развитие. В человеческой медицине иммунорегулирующие препараты прогрессировали от неочищенных микробных, вирусных, растительных и тимусных экстрактов до синтетических вирусных комплексов и химически
20 определенных лекарственных средств (например, рекомбинантные цитокины). Препараты неочищенных экстрактов индуцируют неспецифичную иммунорегулирующую активность через генерализованную активацию макрофагов. Новое поколение иммунорегуляторов, таких как рекомбинантные цитокины, имеет селективные эффекты на конкретные компоненты иммунной системы.
25 Поскольку клетки иммунной системы циркулируют через кровь и
лимфатическую систему, сыворотка является логичным местом для поиска иммунорегуляторов. Только примерно половина из более чем 100 сывороточных белков была выделена и охарактеризована (de Gruyter, 1997), оставляя целый ряд белков и пептидов в качестве потенциальных иммунорегуляторов. Например,
30 иммуномодулятор фракции козьей сыворотки (CSFI) представляет собой неадъювантный иммуностимулятор, полученный из сыворотки козы (Ansley, Daniel R. Composition and Method for Immunostimulation in Mammals, патент США № 5219578; 15 июня 1993 г.). CSFI плохо определен Ansley, но говорится, что он состоит из смеси сывороточных белков и пептидов, 67% которых являются
35 иммуноглобулином. В данном патенте Ansley описывает способ отбора фракции сыворотки козы, содержащей иммуноглобулин, из неиммуногенно зараженных коз.
Данный способ состоял из осаждения сульфатом натрия, с последующим диализом ресуспендированного осадка на диализной мембране с порогом отсечения по MW (молекулярная масса) 30000 Дальтон для удаления солей и других низкомолекулярных веществ. Затем было показано, что диализированная 5 фракция является эффективной в лечении широкого спектра заболеваний животных, включающих лошадиное заболевание нижних дыхательных путей, копытную гниль овец, транспортную лихорадку жвачных, респираторное заболевание жвачных, лошадиную лимфому, лимфому жвачных и лошадиное заболевание, вызванное парвовирусом.
10 Hamm установил, что данная фракция сыворотки козы, содержащая
иммуноглобулин, могла быть использована в качестве вспомогательного средства для традиционных антибиотиков в лечении лошадиного заболевания нижних дыхательных путей. В данном исследовании более чем в два раза больше лошадей (86%) смогло поправиться за трехнедельный период при усилении
15 лечения фракцией козьей сыворотки по сравнению с контрольной группой (35%), которая получала только лечение антибиотиками (Hamm, 2002). Данная фракция теперь распространаяется в США под торговой маркой PulmoClear(tm) для лечения лошадиного заболевания нижних дыхательных путей.
Некоторые иммунорегуляторы, происходящие из одного вида, по-видимому,
20 обеспечивают кратковременный иммунитет от патогенной инфекции при введении другим видам-хозяевам. В недавнем исследовании Willeford смог установить, что фракция козьей сыворотки, по существу не содержащая иммуноглобулинов, могла давать значительную защиту курицам, зараженным терминальной дозой Pasteurella multocida, при введении данной фракции козьей сыворотки за 24 часа
25 до бактериального заражения (Willeford, 2000). Аналогичные результаты были отмечены Parker у мышей, зараженных Salmonella typhimurium (Parker, 2002).
Иммунорегуляторы также были получены из источников, отличных от животной сыворотки. Например, целый ряд иммуностимуляторов был получен из микобактериальных продуктов (Ford, 1986; Werner and Zerial, 1984; Diasio and
30 LoBuglio, 1995). Регрессин-V - эмульсия фрагментов микобактериальной клеточной стенки - лицензирована для лечения целого ряда новообразований у животных. Умерщвленная суспензия Propiobacterium acnes - иммунорегулин - лицензирована для ветеринарного применения при новообразованиях поздней стадии в качестве дополнения к другим терапиям. Хотя данные продукты и способны неспецифично
35 стимулировать иммунную систему у животных и являются терапевтически эффективными, также наблюдали, что они инициируют неблагоприятные эффекты,
такие как лихорадка и аллергические реакции, которые возникают из-за широкого спектра иммуностимулирующего действия (Kruth, 1998).
Иммунорегуляторы могут быть разделены на три главные группы: (а) иммунодепрессанты; (б) иммуностимуляторы (например, вакцина на основе 5 бациллы Кальметта-Герена) и (в) остальные иммунорегуляторы, которые включают модификаторы биологического ответа (например, колониестимулирующие факторы, интерлейкины, интерфероны и факторы некроза опухолей) (Takx-Kohlen, 1992; Molloy et al., 1993). Цитокины представляют собой растворимые низкомолекулярные полипептиды и гликопептиды, продуцируемые
10 широким спектром типов клеток, которые имеют подавляющие или усиливающие эффекты на пролиферацию, дифференциацию, активацию и подвижность клеток. В общем, цитокины не секретируются конститутивно, но продуцируются в ответ на стимуляцию инфекционными агентами или их производными продуктами (например, эндотоксин), медиаторами воспаления, механическими повреждениями
15 и самими цитокинами (Kogut, 2000).
Интерлейкин-1 (IL-1), фактор некроза опухолей-альфа (TNF-альфа) и интерферон (IFN) представляют собой три цитокина, которые участвуют в иммунном ответе. IL-1 участвует в ответе хозяина на антигенную стимуляцию и повреждение ткани, и было показано то, что он увеличивает устойчивость мышей к
20 патогенным организмам, таким как листерия, Escherichia coli и Candida albicans (Czuprynski and Brown, 1987; Cross et al., 1989; Pecyk et al., 1989). TNF-альфа и дельта-IFN повышали устойчивость мышей к Salmonella typhimurium (Morrissey and Charrier, 1994). Человеческие дельта-IFN имеют мощные противовирусные и антипролиферативные активности и используются в качестве противораковых и
25 противовирусных терапевтических агентов (Chang et al., 1999).
Тремя семействами низкомолекулярных пептидов, которые имеют иммунорегулирующие свойства, являются тахикинины, гормоны тимуса и катионные пептиды. Тахикинины представляют собой семейство близкородственных коротких нейропептидов, которые были исходно
30 идентифицированы по их активностям в качестве нейромедиаторов. Теперь известно то, что тахикинины опосредуют такие разнообразные активности как пролиферация Т-клеток, высвобождение IFN-гамма, TNF-альфа, IL-1 и IL-6, и усиленная секреция иммуноглобулинов (Maggio, 1990; Eglezos et al., 1991).
Тимические гормоны представляют собой семейство белков и пептидов,
35 точная биологическая роль которых не известна. Известно, что они участвуют в регуляции и дифференциации происходящих из тимуса лимфоцитов, и было
показано, что они действуют подобно цитокинам. Было показано, что некоторые тимические гормоны восстанавливают дефектный клеточно-опосредованный иммунитет у пациентов с разными неопластическими заболеваниями и вторичными иммунонедостаточностями в результате химио- и/или лучевой терапии (тимический 5 гуморальный фактор), а также усиливают продукцию IL-1, IL-2, TNF-гамма и TNF-альфа (фракция 5 тимозина) (Cohen et al., 1979; Dardenne and Savino, 1990).
Наблюдали, что некоторые катионные пептиды инициируют иммуностимулирующий ответ. Было показано, что декамерный пептид препятствует росту и распространению развившихся опухолей (Folkman, 1999).
10 Другие пептиды стимулируют антибактериальные, противогрибковые, антивирусные свойства и даже свойства заживления ран (Sanglier et al., 1993; Mizuno et al., 1995; Hancock, 1999). Считается, что данные "защитные" пептиды являются более общими по их действию, чем антитела, и, как таковые, имеют более широкий спектр активности (Hancock, 1999). В патенте США № 7358044
15 идентифицирован фактор, именуемый фактор пролиферации иммунных клеток или ICPF. ICPF был определен как 1-пептидил-(2,3)-диацил-0-глицероллипопептид. Утверждали то, что общая структура содержит нонапептид с аргинином на аминоконце, фенилаланин на карбоксиконце, сложный эфир серин-О-жирная кислота на второй аминокислоте нонапептида и вплоть до всего трех
20 длинноцепочечных жирных кислот, одна из которых представляет собой ненасыщенную жирную кислоту. Жирные кислоты, содержащиеся в молекуле ICPF, включали стеариновую кислоту, арахидиновую кислоту и арахидоновую кислоту. Позднее было определено то, что данная структура имеет иммуностимулирующую активность (К.О. Willeford, неопубликованное исследование).
25 Соответственно, имеется потребность в дополнительных и хорошо
определенных иммунорегуляторах для лечения и/или предупреждения заболеваний и расстройств.
Краткое изложение сущности изобретения
30 В настоящем изобретении преодолеваются проблемы и недостатки,
ассоциированные с современными стратегиями и проектами, и предлагаются новые средства, новые композиции и новые способы иммунорегуляции.
Одно воплощение данного изобретения направлено на композиции, которые содержат одно или более чем одно соединение, которое обеспечивает 35 иммунорегуляцию иммунной системы млекопитающего. Предпочтительно одно или более чем одно соединение выделяют из козьей сыворотки или синтезируют
генетически (рекомбинантно) или de novo. Также предпочтительно одно или более чем одно соединение является химически и/или структурно модифицированным. Предпочтительно композиции представляют собой фармацевтические композиции, содержащие один или более чем один фармацевтически приемлемый агент. 5 Заболевания и расстройства включают бактериальную, вирусную, грибковую и/или паразитарную инфекцию, неопластический рост, такой как рак, или аутоиммунные заболевания. Предпочтительно данная композиция содержит фармацевтическую композицию, содержащую пептидную последовательность SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4, и не содержащую других пептидных последовательностей фибрина.
10 Предпочтительно одна или более чем одна пептидная последовательность является модифицированной, и предпочтительно данной модификацией является сульфатирование и/или фосфорилирование первого и/или второго тирозина SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4. Предпочтительно последовательность композиции является синтетической и немодифицированной либо липидами, либо сахаридами.
15 Предпочтительно данная композиция находится в терапевтически эффективном количестве, которое предпочтительно составляет примерно 0,1-100 мкг/мл. Предпочтительно фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду, масло, съедобное масло, жирные кислоты, липиды, полисахариды, целлюлозу, глицерин, гликоль и их комбинации, и является водным и
20 изготовленным для внутривенного введения. Предпочтительно данная композиция является нетоксичной и не вызывает побочных эффектов после введения пациенту.
Другое воплощение изобретения направлено на композиции, содержащие одно или более чем одно соединение по изобретению в комбинации с
25 существующими композициями и стратегиями для лечения и/или предупреждения заболеваний и расстройств. Предпочтительно данные способы включают выделение одного или более чем одного соединения из козьей сыворотки или сыворотки другого млекопитающего, и предпочтительно дополнительная очистка предпочтительно осуществляется посредством хроматографии с тангенциальным
30 потоком и диализа с отсечением по молекулярной массе. Предпочтительный способ изготовления фармацевтической композиции по изобретению включает следующее: обеспечение сыворотки млекопитающего, которая является стерильной; смешивание равных частей стерильной сыворотки со стерильным 0,5%-ным физиологическим раствором с образованием смеси; пропускание данной
35 смеси через систему хроматографии с тангенциальным потоком, с последующим диализом с отсечением по молекулярной массе и фильтрованием через 0,2 мкм
фильтр с образованием фильтрованного раствора; распределение данного фильтрованного раствора в однодозовые сосуды; и замораживание фильтрованного раствора при минус 10°С или менее. Предпочтительно диализ с отсечением по молекулярной массе представляет собой диализ с отсечением по 5 молекулярной массе 10 кДа. Также предпочтительно однодозовые сосуды содержат примерно 0,5-5 мл каждый, и однодозовые сосуды содержат от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 100 мкг/мл пептида последовательности SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4. Предпочтительно фильтрованный раствор тестируют на присутствие эндотоксина, и данный способ проводится согласно стандартам GMP
10 (надлежащая производственная практика) для фармацевтических композиций.
Другое воплощение изобретения направлено на способы лечения и/или предупреждения заболеваний и расстройств. Композиции по изобретению содержат терапевтически эффективное количество одного или более чем одного соединения и вводятся пациентам, нуждающимся в этом. Пациенты могут
15 представлять собой любое млекопитающее, как, например, человека. Введение может осуществляться парентеральным или непарентеральными способами, но предпочтительно является внутривенным, подкожным, внутрибрюшинным или пероральным. Лечение может осуществляться в течение коротких периодов времени (например, импульсно) или непрерывно в течение длительных периодов
20 или на протяжении всей жизни пациента. Предпочтительно способ по изобретению, включающий лечение заболевания или расстройства пациента, включал повторное введение водной фармацевтической композиции, содержащей пептидную последовательность SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4, и не содержащей другие пептидные последовательности фибрина. Предпочтительно
25 данное заболевание или расстройство включает вирусную, бактериальную, грибковую или паразитарную инфекцию, или воспалительное расстройство, а пациент представляет собой человека или другое млекопитающее. Предпочтительно терапевтически эффективная доза составляет примерно 0,5-5 мл, содержащих от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 100 мкг/мл пептидной
30 последовательности. Предпочтительно пептидная последовательность является модифицированной, и данная модификация представляет собой сульфатирование и/или фосфорилирование первого и/или второго тирозина SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4. Предпочтительно последовательность является синтетической или иным образом неприродной, и данная последовательность не является
35 модифицированной либо липидами, либо сахаридами. Предпочтительно повторное введение включает еженедельное введение в течение 2-20 недель или
дольше. Предпочтительно введение инициирует каскад иммунной системы, и предпочтительно данный каскад включает: повышающую регуляцию TNF-a в пределах примерно 0,5-12 часов после введения; повышающую регуляцию IL-6 после повышающей регуляции TNF-a; и повышающую регуляцию IL-10 после 5 повышающей регуляции IL-6, что приводит к понижающей регуляции IL-6. Предпочтительно IL-6 подвергается повышающей регуляции через 6 часов после введения, и IL-10 подвергается повышающей регуляции через 24 часа после введения. Предпочтительно данный способ дополнительно включает повышающую регуляцию макрофагов, NK-клеток (клетки - природные киллеры),
10 IFN-гамма, МСР-1 (моноцитарный хемоаттрактантный белок-1), Т-клеток, В-клеток и/или GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) после повышающей регуляции IL-6. Предпочтительно заболевание или расстройство представляет собой неправильное функционирование иммунной системы, которое нормализуется для пациента после повторных введений, и
15 неправильное функционирование иммунной системы представляет собой неконтролируемый воспалительный ответ. Предпочтительно уровни CD4 и CD8 у пациента повышаются, и введение водной фармацевтической композиции возвращает уровни CD4 и CD8 до гомеостазного уровня для данного пациента.
Другое воплощение данного изобретения направлено на композиции по
20 изобретению в качестве вакцин и/или адъювантов вакцин для лечения и предупреждения заболеваний и расстройств. Композиции по изобретению, содержащие BRM, являются полезными непосредственно в качестве адъювантов вакцин и, при связывании с конкретным антигеном, предпочтительно с антигенной частью патогена, которая вызывает иммунный ответ, в качестве самых вакцин.
25 Другое воплощение изобретения направлено на способы осуществления
регуляции иммунной системы посредством введения одного или более чем одного соединения по изобретению. Предпочтительно регуляция увеличивает иммунный ответ на инфекционный агент, такой как бактериальная или вирусная инфекция, или уменьшает неправильно повышенный иммунный ответ, как, например, при
30 аутоиммунных расстройствах.
Другие воплощения и преимущества изобретения отчасти изложены в описании, которое следует далее, и отчасти могут быть очевидными из данного описания, или их можно узнать из воплощения данного изобретения на практике.
35 Описание графических материалов
Фиг. 1А. Образец 2, показывающий полный спектр МС (масс-спектрометрия) двух первичных компонентов с m/z 1103 и 1131, с пиком при 1109, вероятно представляющим нейтральную потерю молекулы воды.
Фиг. 1Б. Кривая СВЭЖХ-МС (сверхвысокоэффективная жидкостная 5 хроматография-масс-спектрометрия) образца 2, где соединение 1103 элюируется в 7,48 мин, и соединение 1131 элюируется в 7,74 мин. Относительные интенсивности рассчитываются из площадей под кривой пиков.
Фиг. 1В. Спектр фрагментации (МС/МС) соединения 1103 образца 2.
Фиг. 1Г. Спектр МС/МС соединения 1130 образца 2, показывающий 10 частичное перекрывание масс между двумя графиками вплоть до m/z 997, которое показывает перекрывание либо N-концевых, либо С-концевых концов.
Фиг. 1Д. Соединения 1103 и 1131 в том виде, в котором они наблюдаются в образце 3.
Фиг. 1Е. Соединения 1103 и 1131 в том виде, в котором они наблюдаются в 15 образце 4.
Фиг. 1Ж. Соединения 1103 и 1131 в том виде, в котором они наблюдаются в образце 5.
Фиг. 13. Соединения 1103 и 1131 в том виде, в котором они наблюдаются в образце 6.
20 Фиг. 1И. Соединения 1103 и 1131 в том виде, в котором они наблюдаются в
образце 1, хотя спектр фрагментации и указывает иное.
Фиг. 1Й. Соединения 1103 и 1131 в том виде, в котором они наблюдаются в других образцах.
Фиг. 1К. Спектры фрагментации соединения 1130 из образца 7, 25 показывающие перекрытие, но и отличия от образца 1, вероятно обусловленные совпадающим аминокислотным составом, но отличным порядком последовательности в одном или более чем одном положении.
Фиг. 1Л. M/z соединения 1103 образца 7.
Фиг. 1М. Спектры фрагментации соединения 1103 образца 7.
30 Фиг. 2А. Профиль крови абсолютного числа нейтрофилов пациента.
Фиг. 2Б. Профиль крови числа лейкоцитов пациента.
Фиг. 2В. Профиль крови числа клеток CD4 пациента.
Фиг. 2Г. Профиль крови числа клеток CD8 пациента.
Фиг. 2Д. Профиль крови уровней иммуноглобулинов пациента.
35 Фиг. 2Е. Профиль крови уровней иммуноглобулинов пациента.
Фиг. 2Ж. Профиль крови уровней иммуноглобулинов пациента.
Фиг. 23. Профиль крови уровней подфракции IgG пациента.
Фиг. 2И. Профиль крови уровней подфракции IgG пациента.
Фиг. 2Й. Профиль крови уровней прокальцитонина пациента.
Фиг. 2К. Профиль крови уровней С-реактивного белка пациента.
5 Фиг. ЗА. Сравнение уровней CD4 и CD8 первого пациента.
Фиг. ЗБ. Сравнение уровней CD4 и CD8 второго пациента. Фиг. 4. Уровни цитокинов в разное время после введения NPIS40. Фиг. 5А. Краткий обзор химии крови пациента (часть А). Фиг. 5Б. Краткий обзор химии крови пациента (часть Б).
Описание изобретения
Иммунотерапевтические агенты обеспечивают стимуляцию иммунной системы в ответ на заболевание или расстройство. Хотя цитокинины, такие как интерфероны и TNF, часто обеспечивают кардинальные терапевтические
15 результаты, цитокины также требуют терапевтических дозировок при концентрациях, которые дают токсические побочные эффекты, которые иногда являются смертельными и/или хорошо не переносятся. Данные агенты, как таковые, не являются хорошими кандидатами для общего применения. Кроме того, часто именно взаимодействие многих цитокинов требуется для вызова полезного
20 эффекта, который часто не проявляется при введении одного цитокина.
Иммунная система млекопитающего представляет собой координированную и высокоорганизованную систему взаимодействий, которая обеспечивает организму способность адаптивно реагировать на почти все условия. Существенными компонентами данных взаимодействий являются цитокины,
25 которые отвечают за управление разнообразным набором функциональных событий в клетке. Некоторый успех в блокировке мишеней цитокинов оказался терапевтически полезным, но обработки, в которых цитокины непосредственно вводятся пациенту, показали только умеренный успех и, следовательно, типично рассматриваются только после того, как традиционные терапии оказались
30 неэффективными. Тем не менее, способность обуздать такие сигнальные медиаторы была бы привлекательной стратегией как в терапевтических, так и в профилактических целях.
Неожиданно было открыто то, что модификаторы биологического ответа (BRM), при введении пациенту, инициируют системное изменение профиля
35 цитокинов. Данным системным изменением может быть увеличение, снижение или стабилизация относительного уровня одного или более чем одного цитокина
иммунной системы пациента. Все термины увеличивать, повышать или активировать, уменьшать, снимать повышение, снимать активацию, стабилизировать и тому подобное используются в данном документе, в общем, для обозначения увеличения или уменьшения, в зависимости от того, что подходит, 5 или стабилизации на статистически значимое количество по сравнению с эталонным или контрольным уровнем.
Неожиданно открыли, что цитокиновый каскад, инициированный воздействием BRM по изобретению, модулирует врожденную и/или адаптивную иммунные системы, и, посредством этого, терапевтически или профилактически
10 уменьшает заболеваемость и смертность в животных моделях. При хроническом воспалении (например, гипер- и гипохронические условия) и также при некоторых болезненных состояниях иммунная система притормаживает или блокируется. При воздействии BRM по изобретению нормальное функционирование иммунных систем восстанавливается через селективный цитокиновый каскад, в иных
15 условиях не обнаруживаемый в природе. Каскад, стимулированный посредством данного изобретения, инициируется через системы клеточных и гормональных сигналов, которые обеспечивают модулирование и регуляторные действия цитокинов, факторов роста, Т-клеток, В-клеток, МНС-1 и II (главный комплекс гистосовместимости-1 и II) эндогенным способом, по сравнению с экзогенным
20 способом, посредством этого эффективно восстанавливая клеточную работу в направлении нормальной или того, что составляет норму для конкретного пациента. После конкретной части иммунного каскада по изобретению, где происходит повышающая регуляция IL-6, следует повышающая регуляция IL-10, которая сдерживается или блокируется у пораженных пациентов, что может быть
25 обусловлено неконтролируемыми воспалительными цитокинами, которые ингибируют или останавливают нормальные иммунные защитные реакции, и они могут развиваться до аутоиммунных ответов, потери иммунных защитных противовирусных и антибактериальных функций организма, а также нераспознавания мутаций или неправильной экспрессии цитокинов, что может
30 приводить к разным формам рака (например, онкогенез, метастазы и т.д.). После этого следует неспособность организма разрушать данные клетки и появляется состояние диагностируемого рака. При эндогенной повышающей регуляции IL-10 посредством BRM по изобретению действие неконтролируемых провоспалительных цитокинов, которые лежат в основе возникновения
35 заболевания, обращается.
Предпочтительный каскад, инициируемый введением соединений по изобретению, включает повышающую регуляцию TNF-a, после которой, в пределах 24-48 часов следует повышающая регуляция IL-6 (провоспалительный цитокин), после которой, в пределах 48-96 часов следует повышающая регуляция IL-10 5 (противовоспалительный цитокин), который, помимо его положительных эффектов, подавляет IL-6. Данная последовательность событий контролирует и модулирует иммунную систему и предотвращает возможность неконтролируемого цитокинового шторма. После экспрессии IL-10 имеет место повышающая регуляция TNF-гамма, который стимулирует противовирусный и/или
10 антибактериальный клеточный иммунный ответ, ангиогенез и также клеточное заживление. Повышающая регуляция IL-6 (провоспалительный цитокин) контролируется отложенным высвобождением IL-10 (противовоспалительный цитокин). Такое назначенное на определенное время высвобождение обеспечивает запуск защитных каскадов врожденной иммунной системы
15 (усиленная защита против бактериального нападения), также устраняя возможность цитокинового шторма, что видно посредством введения экзогенных цитокинов. Отложенное высвобождение IL-10 также минимизирует хроническое воспаление.
Одним преимуществом композиций и способов по изобретению является
20 возвращение к истинной цитокиновой и/или клеточной модуляции, а не просто к подавлению или стимуляции одного агента или клеток. Нормальным успешным ответом на стимул в отношении врожденной иммунной системы является повышающая регуляция TNFa, с последующей повышающей регуляцией IL-6. В таком ответе, при введении агента, который стимулирует IL-6, ответ IL-6 не
25 регулируется, просто усиливается. Результатом является сверхэкспрессия, которая приводит к воспалительному состоянию. В данных ситуациях, когда IL-6 не подвергается правильной повышающей регуляции, введение BRM по изобретению не будет осуществлять повышающую регуляцию или препятствовать данному процессу. Однако у стимулированного пациента, врожденная иммунная система
30 котрого не отвечает, введение BRM по изобретению будет инициировать правильный ответ TNFa, с последующим IL-6, с последующим IL-10 через 48-96 часов. Это восстанавливает правильную модуляцию врожденной системы. Эндогенная модуляция посредством введения BRM в конечном счете помогает восстанавливать нормальный гомеостаз при устранении отрицательных побочных
35 эффектов, ассоциированных с цитотоксическими фармацевтическими средствами.
Фармацевтические средства, разработанные для подавления иммунных каскадов (даже таргетным способом), оставляют организм подверженным риску.
Хроническое воспаление служит помехой или останавливает правильную клеточную сигнализацию. Экзогенное введение IL-10 часто останавливает данный 5 процесс, но неспособность введения правильной дозы IL-10 и варьирование от пациента к пациенту удерживало от того, чтобы это стало приемлемым выбором. Существуют различия между индивидуальными пациентами, которые не могут быть оценены в пределах периода времени по ходу лечения. Поскольку в данном изобретении осуществляется повышающая регуляция IL-10 эндогенным способом,
10 отсутствует отрицательный побочный эффект, и хроническое воспаление обращается с возвращением правильной клеточной сигнализации. Каскад, инициированный по изобретению, восстанавливает иммунную систему до гомеостаза, предотвращая возможность отрицательных побочных эффектов, продуцируемых фармацевтическими средствами с одним действием, которые
15 блокируют или подавляют иммунный каскад, препятствуя одному цитокину, оставляя организм беззащитным против вмешательства или неправильно стимулируя иммунный каскад, приводя к аутоиммунным реакциям.
При введении BRM по изобретению в пределах 30 минут - одного часа происходит повышающая регуляция TNFa, инициирующая высвобождение IL-6,
20 начинающего эндогенный иммунный каскад. После этого предпочтительно следует повышающая регуляция макрофагов и затем NK-клеток. В 12-30 часов после введения многократная повышающая регуляция IL-10 уменьшает провоспалительное цитокиновое действие IL-6 и других стимулированных клеток. При высвобождении IL-10 имеет место многократное увеличение набора
25 цитокинов, включая IFN-гамма, антивирусные и другие характеристики которых сигнализируют для увеличения GM-CSF, а также CSF и моноцитарного хемоаттрактантого белка (МСР-1). В 30 часов после введения происходит повышающая регуляция МСР-1, который стимулирует рекрутирование Т-клеток, В-клеток, макрофагов и других иммунных клеток к местам поранения и повреждения
30 для инициации удаления поврежденной ткани и начала реального клеточного заживления. Поскольку эффект повышающей регуляции МСР-1 заключается в том, что данные клетки могут проходить через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), это также обеспечивает терапевтическую помощь при многих неврологических состояниях. Весь каскад, инициированный по изобретению, останавливается
35 примерно через 120 часов, и иммунная система правильно переустанавливается,
не оставляя следа воздействия по изобретению и позволяя организму получать другое введение для начала каскада еще раз, при необходимости.
BRM по изобретению являются нетоксичными при терапевтических и профилактических концентрациях, не демонстрируя цитотоксичности или 5 выявляемых коротковременных (сутки) или долговременных (недели и месяцы) побочных эффектов при введении пациентам. BRM безопасным способом подсказывают существующей иммунной системе модулировать ее собственную цитокиновую цепь, приводя к положительному терапевтическому или профилактическому результату.
10 Композиции BRM по изобретению могут лечить и/или предупреждать целый
ряд заболеваний и расстройств, и также обеспечивать систематическое или паллиативное лечение (например, симптоматическое лечение) пациента, подвергающегося традиционной терапии. Заболевания и расстройства, которые можно лечить и/или предупреждать, включают следующие: бактериальная
15 инфекция (например, Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Listeria, Mycobacteria, Salmonella, Escherichia coli, Yersinia pestis, Klebsiella, Shigella, Clostridium), вирусная инфекция (например, вирус гепатита В и С, вирус краснухи, вирус простого герпеса, ретровирус, вирус ветряной оспы, вирус человеческой папилломы, парвовирус, ВИЧ (вирус иммунодефицита человека)) или
20 паразитарная инфекция (например, плазмодий, лейшмания, гардия), воспаление, воспалительное заболевание кишечника, уменьшение интенсивности воспалительного состояния или симптома, хроническое воспалительное заболевание, рассеянный склероз, хроническая боль, болезнь Альцгеймера, ALS (боковой амиотрофический склероз), болезнь Лайма, рак, диабет типа 1 и типа 2,
25 аутоиммунные расстройства, синдром хронической усталости, ревматоидный артрит, тяжелая миастения, целиакия - злокачественные афты, системная красная волчанка, псориаз и их комбинации, но не ограничиваются ими. Кроме того, BRM по изобретению также можно использовать для лечения разных новообразований, включающих рак простаты, рак молочной железы, лимфому, рак поджелудочной
30 железы, рак почки, рак желудка, рак легкого, рак шейки матки, рак толстой кишки, меланому, лейкоз, опухоли и метастатическое заболевание, но не ограничивающихся ими.
Одно воплощение данного изобретения направлено на BRM, которые вызывают системные изменения цитокинового профиля млекопитающего.
35 Изменения, вызванные конкретным BRM, коррелируют с конкретными
заболеваниями и расстройствами, включающими аутоиммунные заболевания и заживление ран. Изменения редко являются статичными, но представляют собой каскад многочисленных взаимодействий, которые приводят к полезному иммунному ответу. Кроме того, данные изменения сохраняются лишь так долго, как 5 необходимо при рассмотрении конкретного состояния, и, предпочтительно, после чего иммунная система пациента и уровни цитокинов возвращаются к их уровням до воздействия. Считается, что сами BRM не являются ни бактериостатическими, ни бактерицидными, но полезным образом изменяют каскад взаимодействий цитокинов. Предпочтительно BRM выделяют из сыворотки млекопитающего и
10 также предпочтительно из козьей сыворотки. Один BRM по изобретению называется NPIS40.
NPIS40 непосредственно модулирует и воспалительные, и противовоспалительные цитокины, и не является антибиотиком, бактерицидным или вируцидным. Уровни цитокинов определяли до и на протяжении периода
15 времени после введения, включая интерферон-гамма - противовирусный цитокин, IL-6 - воспалительный цитокин и IL-10. Обнаружили, что интерферон-гамма подвергается повышающей регуляции, и обнаружили, что IL-6 сначала подвергается повышающей регуляции, а позднее подавляется посредством высвобождения IL-10. Известно то, что IL-6 помогает хозяину сопротивляться
20 бактериальным заражениям, но само непосредственное экзогенное введение слишком большого количества IL-6 может быть очень вредным, даже смертельным. NPIS40 позволяет организму контролировать уровни цитокинов для защиты против заболевания и/или для восстановления уровней после того, как проходит конкретное заболевание. BRM по изобретению не создают
25 неконтролируемый шторм цитокинов, но сохраняют механизмы, которые существуют, и обеспечивают самоконтроль иммунной системы.
Эта последовательность событий имеет полезный эффект у раковых пациентов и пациентов с аутоиммунным заболеванием. В анализах с мышами, которым был введен NPIS40, большая процентная доля могла сопротивляться
30 летальному бактериальному заражению по сравнению с контрольной группой.
Другое воплощение данного изобретения направлено на соединение BRM и подходящие фармацевтические композиции, которые в терапевтически эффективной дозе осуществляют повышающую регуляцию IgA пациента, нуждающегося в этом. Причина или этиологический фактор селективной
35 недостаточности IgA в настоящее время не известны или не понятны. В отличие от недостаточностей других lg, заместительная терапия lg не жизнеспосбна для
расстройств, связанных с селективной недостаточностью IgA. Введение BRM по изобретению осуществляет повышающую регуляцию IgA. Другое воплощение изобретения направлено на один или более чем один компонент выделенного и предпочтительно очищенного NPIS40 - NPIS40, синтезированный de novo, и 5 химически модифицированный NPIS40. Предпочтительно одним или более чем одним компонентом являются пептиды, ряд пептидов или пептидные комплексы. Неожиданно открыли, что компоненты NPIS40 с массами 1103 и 1131 включают фибринопептидные фрагменты. Синтезировали целый ряд данных фрагментов и обнаружили, что они имеют следующие аминокислотные последовательности:
10 YLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 1) с сульфонированием и/или фосфорилированием тирозина на первом и/или втором тирозине и происходит из фибринопептида В; GYLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 4) с сульфонированием и/или фосфорилированием тирозина на первом и/или втором тирозине и происходит из фибринопептида В; GYLDYDEVDDNRAKLPLDAR (SEQ ID
15 NO: 5) с сульфонированием и/или фосфорилированием тирозина на первом и/или втором тирозине и происходит из фибринопептида В; фрагмент, происходящий из фибринопепида А последовательности FLAEGGGV (SEQ ID NO: 6), фрагмент СЗ фибриногена бета последовательности SEETKENERFTV (SEQ ID NO: 7); фрагмент СЗ фибриногена бета последовательности SAKFSAEEELEIR (SEQ ID NO: 8);
20 фрагмент фибриногена альфа последовательности IQTADDSDPVGGEFLAEGGGV (SEQ ID NO: 11), которые могут быть немодифицированными; и фрагмент фибриногена альфа последовательности DEAESIEDLGIKGAHATKTGHA (SEQ ID NO: 9), который может быть немодифицированным.
Другое воплощение изобретения включает способы выделения и,
25 предпочтительно, очистки NPIS40. Способы изготовления BRM по изобретению из сыворотки включают получение сыворотки, которая может сохраняться замороженной, предпочтительно при минус 20°С или при более низкой температуре. Оттаивание сыворотки до примерно комнатной или более низкой температуры, предфильтрование сыворотки для удаления частиц и твердых
30 веществ, которые могут присутствовать, фильтрование с тангенциальным потоком против солевого раствора, такого как хлорид натрия, фильтрование через 0,2 мкм фильтры и хранение фильтрованной жидкости при температуре от примерно минус 10°С до примерно минус 25°С.
Другое воплощение изобретения включает способы лечения или
35 предупреждения заболевания или расстройства млекопитающего, или лечения симптомологии у пациента, включающие введение указанному пациенту
эффективного количества NPIS40 по изобретению. Предпочтительно заболевание или расстройство млекопитающего представляет собой бактериальную, вирусную или паразитарную инфекцию, рак или другое новообразование, хроническое состояние, такое как хроническая боль или дискомфорт, или их комбинацию. В 5 таких способах пациент предпочтительно представляет собой млекопитающее, такое как человека. Эффективным количеством выделенных пептидов является достаточное количество для получения эффективной сывороточной концентрации для лечения или предупреждения конкретного заболевания или расстройства и, после устранения расстройства, возвращения иммунной системы к ее состоянию
10 до воздействия.
Другое воплощение изобретения включает композиции BRM, содержащие фармацевтически приемлемые носители и/или соли. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают воду, солевые растворы, спирт, растительные масла, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат
15 магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, парфюмерное масло, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, сложные эфиры жирной кислоты и петроэтрала, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпиролидон и т.д., но не ограничиваются ими. Фармацевтические композиции по изобретению также могут быть стерилизованы и, если желательно, смешаны со вспомогательными
20 агентами, например, смазками, консервантами, стабилизаторами, увлажнителями, эмульгаторами, солями для влияния на осмотическое давление, буферами, красителями, корригентами и/или ароматическими веществами и тому подобным, которые не реагируют вредным образом с активными соединениями по изобретению. Фармацевтически приемлемая соль включает основную или
25 кислотную группу соединения по изобретению. Иллюстративные соли включают сульфат, цитрат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, йодид, нитрат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, лактат, салицилат, кислый цитрат, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат,
30 метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, пара-толуолсульфонат и памоат, но не ограничиваются ими.
Фармацевтически приемлемые соли также включают соли, полученные из соединения по изобретению, имеющие кислотную функциональную группу, такую как карбоксильная функциональная группа, и фармацевтически приемлемое
35 неорганическое или органическое основание. Подходящие основания включают гидроксиды щелочных металлов, таких как натрий, калий и литий; гидроксиды
щелочноземельных металлов, таких как кальций и магний; гидроксиды других металлов, таких как алюминий и цинк; аммиак и органические амины, такие как незамещенные или гидроксинезамещенные моно-, ди- или триалкиламины; дициклогексиламин; трибутиламин; пиридин; N-метил, N-этиламин; диэтиламин; 5 триэтиламин; моно-, бис- или трис-(2-гидрокси-низшие алкиламины), такие как моно-, бис- или трис-(2-гидроксиэтил)амин, 2-гидрокси-трет-бутиламин или трис-(гидроксиметил)метиламин, Ы,Ы-ди-низший алкил-Ы-(гидрокси-низший алкил)-амины, такие как Ы,Ы-диметил-Ы-(2-гидроксиэтил)амин или три-(2-гидроксиэтил)амин; N-метил-О-глюкамин, но не ограничиваются ими; и 10 аминокислоты, такие как аргинин, лизин и тому подобные. Другие фармацевтически приемлемые соли описываются в the Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (P. Heinrich Stahl and C. Wermuth, Eds., Verlag Helvetica Chica Acta, Zurich, Switzerland (2002), которая конкретно включена посредством ссылки).
15 BRM по изобретению включает соединения, которые могут быть
превращены посредством химического или физиологического процесса (например, ферментативных процессов и метаболического гидролиза). Такие соединения часто дают преимущества повышенной растворимости или замедленного высвобождения в организме. Также подразумевается то, что превращенные BRM
20 включают любые ковалентно связанные носители, которые высвобождают активное соединение in vivo, когда такое соединение вводится субъекту. Превращенные соединения активного соединения могут быть получены посредством модификации функциональных групп, присутствующих в активном соединении, таким образом, что модификации расщепляются либо в рутинной
25 манипуляции, либо in vivo по отношению к активному соединению. Механизмы превращения соединений по изобретению включают соединения, в которых гидрокси-, амино- или меркаптогруппа связывается с любой группой, которая при введении субъекту превращенного соединения активного соединения отщепляется с образованием свободной гидрокси-, свободной амино- или свободной
30 меркаптогруппы соответственно. Примеры превращенных соединений включают ацетатные, формиатные и бензоатные производные спирта или ацетамида, формамидные и бензамидные производные функциональной аминогруппы в активном соединении и тому подобное, но не ограничиваются ими.
Термин "субъекты, которых можно лечить BRM соединениями по
35 изобретению", используется в данном документе взаимозаменяемо с термином пациент и относится к млекопитающему, более предпочтительно к примату, еще
более предпочтительно к человеку. Млекопитающие включают, без ограничения, человека, приматов, диких животных, грызунов, одичавших животных, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, одомашненных и охотничье-промысловых животных, и домашних любимцев. Одомашненные и 5 охотничье-промысловые животные включают коров, лошадей, свиней, оленей, бизонов, буйволов, видов кошачьих, например, домашнюю кошку, видов псовых, например, собаку, лису, волка. Пациенты и/или субъекты включают любой поднабор из вышеуказанных и могут быть самцами и самками.
Введение одного или более чем одного соединения BRM по изобретению
10 предпочтительно содержит терапевтически или профилактически эффективное количество соединения BRM. Терапевтически эффективное количество представляет собой такое количество, которое имеет полезное влияние на субъекта посредством облегчения одного или более чем одного симптома расстройства или просто посредством уменьшения преждевременной смертности.
15 Например, полезным эффектом может быть уменьшение боли у животного на суточной основе, уменьшение продолжительности, частоты или интенсивности кризов боли, уменьшение слабости или повышенная выносливость или стойкость, или способность к хождению пешком на некоторое расстояние без одышки, или увеличенная сила. Предпочтительно терапевтическим количеством является то
20 количество соединения BRM, которое стимулирует или положительно усиливает иммунную систему против конкретного заболевания или расстройства.
Профилактические лечения предпочтительно включают введение композиции по изобретению субъекту, имеющему подтвержденное или подозреваемое расстройство, без наличия каких-либо явных симптомов.
25 Например, здоровым в иных отношениях пациентам, которые были подвергнуты генетическому скринингу и определены как подверженные высокому риску будущего развития расстройства, могут профилактически вводиться композиции BRM по изобретению. Введение может начинаться в момент рождения и продолжаться, при необходимости, пожизненно. И профилактические, и
30 терапевтические применения являются совершенно приемлемыми, так как данные соединения обычно являются безопасными и нетоксичными. Термин "профилактически эффективное количество" относится к достаточному количеству для того, чтобы оказывать влияние на полезный или желательный клинический результат при лечении, или к достаточному количеству соединения по данному
35 изобретению для придания профилактического эффекта субъекту, которого лечат.
Терапевтически или профилактически эффективные количества будут варьировать, как известно специалистам в данной области, в зависимости от конкретного заболевания, которое лечат, выбранного пути введения, носителя, эксципиента или солевой формы и возможности комбинированной терапии. В 5 общем, терапевтически или профилактически эффективное количество может варьировать, в зависимости от истории субъекта, возраста, состояния, пола, а также тяжести и типа медицинского состояния у субъекта, и введения других фармацевтически активных агентов. Эффективное количество может быть эмпирически определено обычными специалистами в данной области, и 10 ожидается, что оно составляет от примерно 0,001 мкг одного или более чем одного соединения BRM/мл общего объема крови до 100 мкг/мл, предпочтительно от примерно 0,1 мкг/мл до 50 мкг/мл и более предпочтительно от примерно 1 мкг/мл до 10 мкг/мл.
Введение также может быть пероральным, парентеральным, подъязычным,
15 ректальным, как, например, в виде суппозитория, или энтеральным введением или посредством легочного поглощения или местного нанесения. Парентеральное введение может осуществляться внутривенной (в.в.) инъекцией, подкожной (п.к.) инъекцией, внутримышечной (в.м.) инъекцией, внутриартериальной инъекцией, внутриоболочечной (в.о.) инъекцией, внутрибрюшинной (в.б.) инъекцией,
20 внутрижелудочковой, внутрикапсульной, внутриглазничной, внутрисердечной, внутрикожной, транстрахеальной, суб кути куля рн ой, внутрисуставной, подкапсульной, подпаутинной, интраспинальной, интрацереброспинальной и надчревной инъекцией, инфузией и другими методиками инъекции или инфузии, или прямой инъекцией, или другим введением субъекту. Парентеральное введение
25 предпочтительно осуществляется посредством внутривенной инъекции или подкожной инъекции. В некоторых воплощениях композиция может вводиться посредством чрескожной трансфузии, как, например, с использованием кожного или накожного пластыря, посредством прямого контакта, например, с костным мозгом через надрез или некоторое другое искусственное открытие в организме.
30 Композиции также могут вводиться в носовые ходы в виде спрея. Артерии носовой области обеспечивают быстрый и эффективный доступ к кровотоку и немедленный доступ в дыхательную систему. Доступ к желудочно-кишечному тракту, который также может быстро вводить вещества в кровоток, может быть получен с использованием пероральных, в виде клизмы или инъецируемых форм введения.
35 Композиции могут вводиться в виде болюсной инъекции, спрея, средства для ингаляции, или могут вводиться последовательно с течение времени
(эпизодически), как, например, каждые два, четыре, шесть или восемь часов, каждые сутки (QD) или через сутки (QOD), или на протяжении более длительных периодов времени, таких как недели - месяцы. Композиции также могут вводиться с замедленным высвобождением, как, например, с использованием смол для 5 медленного высвобождения или других веществ и устройств для регулируемого во времени или отложенного высвобождения.
Перорально активные композиции BRM являются более предпочтительными, так как пероральное введение часто является самым безопасным, самым удобным и экономичным способом доставки лекарственного
10 средства. Но пероральное введение имеет недостатки, так как композиции часто плохо поглощаются через желудочно-кишечную выстилку. Соединения, которые плохо поглощаются, имеют тенденцию к тому, чтобы быть высокополярными. Следовательно, соединения, которые являются эффективными, как описано в данном документе, могут быть сделаны перорально биодоступными посредством
15 уменьшения или устранения их полярности. Это часто может осуществляться посредством изготовления композиции с использованием вспомогательного реактива, который нейтрализует ее полярность, или посредством модифиации соединения с использованием нейтрализующей химической группы. Пероральная биодоступность также является проблемой, так как лекарственные средства
20 подвергаются воздействию крайних условий желудочного рН и желудочных ферментов. Данные проблемы могут преодолеваться аналогичным образом посредством модифицирования молекулярной структуры для противостояния условиям очень низкой рН и сопротивления ферментам слизистой желудка, как, например, посредством нейтрализации ионной группы, посредством ковалентного
25 связывания, ионого взаимодействия или посредством стабилизации или удаления дисульфидной связи или другой относительно лабильной связи.
Фармацевтические композиции, содержащие один или более чем один BRM, подходящий для перорального введения, могут находиться в виде капсул, таблеток, пилюль, пастилок, пакетиков, драже, порошков, гранул; или в виде
30 раствора, или суспензии в водной или неводной жидкости; или в виде эмульсии типа "масло в воде" или "вода в масле"; или в виде эликсира или сиропа; и тому подобного; причем каждый из них содержит заданное количество соединения по настоящему изобретению в виде активного ингредиента. При назначении для перорального введения в твердой лекарственной форме (т.е. в виде капсул,
35 таблеток, пилюль и тому подобного) фармацевтическая композиция по изобретению типично будет содержать соединение по настоящему изобретению в
качестве активного ингредиента и один или более чем один фармацевтически приемлемый носитель, такой как цитрат натрия или дикальция фосфат. Возможно или альтернативно, такие твердые лекарственные формы также могут содержать: наполнители или расширители, такие как крахмалы, микрокристаллическая 5 целлюлоза, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремниевая кислота; связующие вещества, такие как карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или аравийская камедь; увлажнители, такие как глицерин; разрыхлители, такие как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или маниоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые силикаты и/или карбонат
10 натрия; агенты, задерживающие растворение, такие как парафин; ускорители поглощения, такие как соединения четвертичного аммония; увлажнители, такие как цетиловый спирт и/или глицерина моностеарат; абсорбенты, такие как каолин и/или бентонитовая глина; смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, натрия лаурилсульфат
15 и/или их смеси; красители и буферизующие агенты.
Также можно использовать твердые композиции аналогичного типа в качестве наполнителей в желатиновых капсулах; предпочительные вещества в связи с этим также включают лактозу или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли. Когда водные суспензии и/или эликсиры
20 являются желательными для перорального введения, активный ингредиент можно объединять с одним или более чем одним подсластителем или корригентом, красящим веществом или красителями и, если это желательно, эмульгаторами и/или суспендирующими агентами, наряду с такими разбавителями, как вода, этанол, пропиленгликоль, глицерин и разные подобные их комбинации.
25 В фармацевтических композициях по изобретению также могут
присутствовать агенты для высвобождения, увлажнители, агенты для покрытия, подсластители, корригенты и отдушки, консерванты и антиоксиданты. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеина гидрохлорид, бисульфат
30 натрия, метабисульфат натрия, сульфит натрия и тому подобное; растворимые в масле антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и тому подобное; и агенты, хелатирующие металлы, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота
35 (EDTA), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и тому подобное. Агенты для покрытия таблеток, капсул, пилюль и тому подобного включают агенты,
используемые для энтеросолюбильных покрытий, такие как ацетат целлюлозы фталат (САР), поливинилацетатфталат (PVAP), гидроксипропилметилцеллюлозы фталат, метакриловая кислота, сложноэфирные сополимеры метакриловой кислоты, ацетат целлюлозы тримеллитат (CAT), карбоксиметилэтилцеллюлоза 5 (СМЕС), гидроксипропилметилцеллюлозы ацетат сукцинат (HPMCAS) и тому подобное.
Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению возможно могут содержать замутняющие агенты и могут быть изготовлены таким образом, что они высвобождают только активный ингредиент или,
10 предпочтительно, в некоторой части желудочно-кишечного тракта, возможно, замедленным образом. Примеры заливочных композиций, которые можно использовать, включают полимерные вещества и воска. Активный ингредиент также может находиться в микроинкапсулированной форме, если это целесообразно, с одним или более чем одним из вышеупомянутых эксципиентов.
15 Если это желательно, фармацевтические композиции по настоящему
изобретению также могут быть изготовлены для обеспечения медленного или контролируемого высвобождения активных ингредиентов с использованием, в качестве примера, гидроксипропилметилцеллюлозы в разных пропорциях; или других полимерных матриц, липосом и/или микросфер. Могут быть изготовлены
20 композиции с замедленным высвобождением, включающие композиции, в которых активный компонент дериватизирован разными деградируемыми покрытиями, например, посредством микроинкапсулирования, множественных покрытий и т.д.
Предпочтительно фармацевтически приемлемая композиция BRM по изобретению не содержит достаточного количества эндотоксина для стимуляции
25 пирогенного ответа.
Индивидуальные импульсы композиций BRM, как раскрыто в данном документе, можно вводить пациенту непрерывно в течение периода нескольких часов, как, например, примерно 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16 часов, или нескольких суток, как, например, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток, предпочтительно от примерно 1 часа
30 до примерно 24 часов и более предпочтительно от примерно 3 часов до примерно 9 часов. В качестве альтернативы, периодические дозы могут вводиться в одном болюсе или небольшим числом инъекций композиции на протяжении короткого периода времени, типично меньше, чем 1 или 2 часа. В некоторых случаях имеются положительные последствия, которые повышают стандарты жизни
35 пациента, такие как, например, повышенная активность или подвижность, меньшее
число побочных эффектов, меньшее число пребываний в больнице или визитов к врачу.
Интервал между импульсами или интервал с отсутствием доставки может быть больше, чем 24 часа или может быть больше, чем 48 часов, и может быть 5 даже дольше, как, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 суток, две, три или четыре недели, или даже дольше. Интервал между импульсами может быть определен обычным специалистом в данной области. В качестве альтернативы, в некоторых воплощениях интервал между импульсами может быть рассчитан посредством введения другой дозы композиции BRM, когда активный компонент композции 10 больше не выявляется у пациента до доставки следующего импульса. В качестве альтернативы, интервалы также могут быть рассчитаны из периода полувыведения копозиции in vivo. Число импульсов в одной терапевтической схеме может составлять всего-лишь два, но может составлять от примерно 5 до 10, от 10 до 20, от 15 до 30 или более.
15 В некоторых воплощениях субъект может получать одну или более чем одну
композицию, содержащую композицию BRM, пожизненно согласно способам по данному изобретению, например, когда субъект имеет постоянное или неизлечимое заболевание или расстройство. Композиции могут вводиться посредством большинства из любых способов и могут доставляться субъекту в
20 виде перорального препарата или инъекции (например, внутривенной, подкожной и внутриартериальной), инфузии или инстилляции.
В некоторых воплощениях композицию, содержащую композицию BRM, можно вводить субъекту до того, как субъекту вводится химиотерапевтическое лечение или лучевая терапия. В альтернативных воплощениях композиция BRM
25 может вводиться субъекту совместно с другой фармацевтической композицией, содержащей один или более чем один дополнительный агент.
Другое воплощение изобретения включает выделенное антитело или фрагмент антитела, которое специфично реагирует против компонентов BRM по изобретению.
30 Другое воплощение изобретения включает выделенную нуклеиновую
кислоту, которая кодирует последовательности пептидов NPIS40 по изобретению. В качестве альтернативы, нуклеиновые кислоты могут целиком или частично гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, которая кодирует такие пептиды.
Другое воплощение изобретения включает композиции, содержащие один
35 или более чем один BRM по изобретению в качестве адъювантов для вакцин. Данные соединения могут вводиться до, одновременно или после введения
пациенту конкретной вакцины. Адъюванты усиливают ответ иммунной системы на вакцину и предочтительно вводятся пациенту таким же способом, что и вакцина, таким как, например, внутривенная, внутрибрюшинная или внутримышечная инъекция.
5 Другое воплощение данного изобретения включает композиции,
содержащие одно или более чем одно соединение по изобретению, с которым связана одна или более чем одна антигенная часть антигена. Предпочтительно данный антиген происходит от патогена, который подвергает пациента риску инфекции. Связывание BRM или химически модифицированного BRM с антигеном
10 может осуществляться посредством нековалентного связывания, связывания водородными связями или ковалентного связывания. Связывание предпочтительно осуществляется ковалентным связыванием, осуществляемым посредством связывающего агента. Подходящие связывающие агенты включают, например, цианоактивирующее соединение, такое как, например, 1-циано-4-
15 (диметиламино)-пиридиния тетрафторборат (CDAP) или аминоокси агент, создающий конъюгат одного или более чем одного соединения BRM, или химически, или структурно модифицированные соединения BRM, связанные с антигеном или антигенной частью антигена, предпочтительно патогена. Антигенная часть может представлять собой, например, белок, пептид, олигопептид,
20 полисахарид, углевод, органическую молекулу, липид, жирную кислоту, мембранную фракцию, специфическую химическую структуру или их комбинацию (например, липопептид, липопротеин, органо-жирная кислота, гаптенилированный белок и т.д.). Образование конъюгатов посредством аминокси химии с использованием аминоокси реакционноспособного агента раскрыто и описано в
25 публикации заявки на патент США № 2005-0169941, поданной 27 января 2005 г., и в публикации заявки на патент США № 2013-0302877, поданной 12 июня 2013 г. (конкретно включены посредством ссылки). Химия конъюгирования с использованием активирующего агента CDAP раскрыта и описана в патенте США № 5849301 и патенте США № 6299881 (конкретно включены посредством ссылки).
30 Вакцины, которые можно готовить согласно изобретению, включают
бактериальные, вирусные и паразитарные вакцины, такие как, например, дифтерийная вакцина; коклюшная (субъединичная) вакцина; столбнячная вакцина; Н. influenzae типа b (полирибозофосфат); S. pneumoniae, все серотипы; Е. coli, эндотоксин или антиген J5 (LPS (липополисахарид), липид А и гентабиоза); Е. coli,
35 О полисахариды (специфичные в отношении серотипа); Klebsiella, полисахариды (специфичные в отношении серотипа); S. aureus, типа 5 и 8 (специфичные в
отношении серотипа и обычные защитные антигены); S. epidermidis, полисахариды серотипа I, II и III (и обычные защитные антигены); N. meningitidis, специфичные в отношении серотипа или белковые антигены; вакцина против полиовируса; вакцина против паротита, кори и краснухи; против респираторно-синцитиального 5 вируса; бешенства; вакцина против лихорадки денге, вацина против желтой лихорадки, вакцина против вируса Зика, гепатита А, В, С и других; вируса иммунодефицита человека I и II (GP120, GP41, GP160, р24, другие); вирусов простого герпеса типов 1 и 2; CMV (цитомегаловирус); EBV (вирус Эпштейна-Барр); вируса ветряной оспы; малярии; туберкулеза; Candida albicans, других кандид;
10 Pneumocystis carinii; микоплазм; вирусов гриппа А и В; аденовируса; стрептококка группы А, стрептококка группы В, серотипов la, lb, II и III; Pseudomonas aeroginosa (специфичный в отношении серотипа); риновируса; парагриппа (типов 1, 2 и 3); коронавирусов; сальмонеллы; шигеллы; ротавируса; энтеровирусов; Chlamydia trachomatis и пневмонии (TWAR); и Cryptococcus neoformans. Предпочтительно
15 вакцины по изобретению предупреждают бактериальные, вирусные и паразитарные инфекции, такие как инфекции, вызванные Mycobacterium tuberculosis, Plasmodium falciparum.
Следующие примеры иллюстрируют воплощения изобретения, но их не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.
Примеры
Пример 1. Отбор сыворотки и очистка BRM
Стерильную сыворотку отбирали у овец, которые были сертифицированы как не имеющие какого-либо известного заболевания, и она была подвергнута
25 стерилизующему фильтрованию. Каждая отправленная партия сыворотки была сертифицирована как стерильная и не содержащая видов миколазм. Все производство сыворотки проводили согласно руководствам cGMP (текущая надлежащая производственная практика) с дополнительной переработкой.
Стерильную козью сыворотку (South Pacific Sera; Christchurch, Новая
30 Зеландия) перерабатывали согласно системе контроля качества ISO9000 согласно правилам GMP (надлежащая производственная практика). Сыворотку плюс физиологический раствор пропускали через 10 кДа мембрану, с последующим противовирусным фильтрованием в гибкий контейнер для биопроцессов с использованием 0,2 мкм фильтра до замораживания или распределения в 2 мл
35 инъекционные бутыли, которые содержали 1,5 мл жидкости каждая. Анализ белка с ВСА (бицинхониновая кислота) (спектрофотометрический скан) охватывал
интервал от 190 нм до 340 нм с определением белка посредством способа Waddell. Замороженную козью сыворотку помещали при температуре окружающей среды для частичного оттаивания. Объединенную, частично оттаявшую сыворотку анализировали на бионагрузку. Оттаявшую сыворотку фильтровали и промывали 5 500 мл 0,5-процентного раствора NaCI. Образец анализировали для обеспечения того, что эндотоксины отсутствовали. Устанавливали систему с тангенциальным потоком с использованием двух регенерируемых целлюлозных миникассет Pellicon 3. Кассеты предварительно обрабатывали перед диафильтрацией посредством повторной циркуляции 0,5% NaCI. Сыворотку фильтровали с током ретентата
10 приблизительно 0,92 л/мин и давлением подачи приблизительно 190 кПа. Образцы пермеата для спектрофотометрического сканирования получали каждые 5-10 минут. Когда последовательные сканы оказывались аналогичными, начинали процесс диафильтрации. Сыворотку перемешивали и одновременно закачивали с 0,5-процентным NaCI в контейнеры. Процесс фильтрования продолжали, пока
15 объем фильтрата не становился в два раза больше исходного объема (необработанной) козьей сыворотки до фильтрования. Получали 10 мл образцы, маркировали и хранили при температуре от минус 10°С до минус 25°С.
Вирусное фильтрование: с использованием откалиброванного датчика давления, встроенного в линию с перистальтическим насосом, и вирусного
20 фильтра Millipore предварительно промыть то же самое приблизительно 75 л 0,5% NaCI. Переработанный остающийся диффузат фильтровали. Осуществляли запись жидкости, которая проходила фильтрование с тангенциальным потоком в 40 л сосуд при давлении, не превышающем 550 кПа, включая подробности в MBR (протокол на производство серии), время начала и завершения, и исходное и
25 конечное давление, наряду со средней скоростью тока. Сосуд взвешивали, и определяли объем фильтрата, предполагая, что 1 кг равен 1 литру, записывая то же самое в MBR. Образец 4x10 мл маркировали и хранили при температуре от 2°С до 8°С, вновь анализируя на бионагрузку и эндотоксины. Проводили анализ целостности вирусного фильтра.
30 Фильтрование и заполнение: откалиброванный датчик давления был
соединен в линию с перистальтическим насосом и фильтром Fluorodyne II Pall Kleenpak. Данное устройство было соединено с гибким 5 л мешком Hyclone, и приблизительно 5 литров было отфильтровано. Давление не должно превышать 300 кПа, или вещество испортится и может потребовать замены. Количество
35 фильтрата записывали в каждом мешке с маркированием четырех 10 мл образцов,
сохраняли в результате процесса и записывали в MBR. Один образец сохраняли для проведения анализа на эндотоксины и бионагрузку. Остальной продукт хранили при температуре от минус 10°С до минус 25°С. Ретентат конечного продукта хранили при температуре минус 4°С в течение 24 часов до заполнения 5 сосуда. Продукт, произведенный согласно Опции 2, называли NPIS40.
Пример 2. Олигосахаридный и олигонуклеотидный анализ NPIS40 NPIS40, отобранный согласно Примеру 1, сначала характеризовали посредством обогащения на основе лектинов, с последующей ЖХ-МС (жидкостная
10 хроматография-масс-спектрометрия) HILIC (жидкостная хроматография, основанная на гидрофильном взаимодействии) на присутствие олигосахарида и нанораспылительной инфузией в отрицательном режиме на олигонуклеотиды. Ни один из анализов не дал ответа, превышающего фон. Если и присутствует какой-либо вид олигосоединения, оно находилось или в количестве ниже порогов
15 выявления, или не могло наблюдаться с использованием данных способов. Кроме того, не наблюдали доказательства присутствия гликанов.
Пример 3. Масс-спектрометрический анализ
Семь образцов сыворотки, отобранных согласно Примеру 1, получали
20 посредством фильтрования выделенной сывороки через фильтр с MWCO (порог отсечения по молекулярной массе) 30 кДа, с последующей твердофазной экстракцией и вакуумным концентрированием, и их называли как (1) образец продукта, синтезированный de novo, (2) GT150909-Sec, (3) GT150930-1, (4) GT150904, (5) SF70507-6, (6) козий ICPF и (7) человеческий ICPF (см. Фиг. 1А-1М).
25 СВЭЖХ-МС/МС (сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография -
тандемная масс-спектрометрия) проводили с использованием Easy-LC 1000, связанного с масс-спектрометром Q-Exactive. Колонка представляла собой 25 см на 200 мкм колонку PepSwift monolith. Получали интактные (полная МС) спектры и спектры фрагментации (МС/МС).
30 Образцы 1-6, главным образом, состояли из двух соединений - соединения
с m/z 1102,9895 и соединения с m/z 1131,5001, соответствующих массам 2203,9632 и 2260,9844. Разница массы между данными соединениями составляет 57,0212. Наблюдаемая разница массы может быть приписана йодацетамидному производному или нескольким аминокислотным заменам. Спектры фрагментации
35 показывают, что имеется значительное перекрывание между образцами, и ни один из них не был обнаружен в козьих библиотеках. Образец 1 имеет такое же
соединение с m/z 1102,9, что и определенное по спектрам фрагментации, соединение с m/z 1131,5, несмотря на то, что оно имеет точно такую же родительскую массу, имеет слегка отличный спектр фрагментации. Объяснением данного наблюдения является то, что аминокислотный состав является таким же, 5 но порядок последовательности отличается в одном или более чем одном положении. Эти два соединения не наблюдаются в образце 7. Компоненты, идентифицированные в каждом образце, изложены в Таблице 1.
Таблица 1
10 Образец 1. Образец синтезированного de novo продукта, поставленный в
виде пилюли
Фрагмент фибринопептида В, модифицированный
GYLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 4) с сульфатированием на 1-ом
тирозине фрагмента фибринопептида В
15 GYLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 4)
Фрагмент фибринопептида А FLAEGGGV (SEQ ID NO: 6) Фрагмент цепи альфа фибриногена
LCLVLSLVGAIQTADDSDPVGGEFLAEGGGV (SEQ ID NO: 12)
20 Плюс минорные компоненты:
д1|162424563|дЬ|АВХ89978.1|константная область тяжелой цепи мю иммуноглобулина, частичная [Capra hircus]
gi|803080809|ref|XP_012034584.11 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х1
комплемента СЗ, частичная [Ovis aries]
25 gi|426230302|ref|XP_004009215.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х1
натриевого/йодного котранспортера [Ovis aries]
gi|803322707|ref|XP_012019563.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х2 рода IRRE-подобного белка 1 [Ovis aries musimon]
gi|426254655|ref|XP_004020992.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: белок, подобный 30 ядерному регулятору транскрипции 1 [Ovis aries]
Образец 2. GT150909-Sec
Фрагмент фибринопептида В, модифицированный
GYLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 4) с сульфатированием на 1-ом 35 тирозине фрагмента фибринопептида В
YLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 1)
Плюс минорные компоненты:
gi|803058249|ref|XP_012031490.1 |ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х1 миозина-9 [Ovis aries]
gi19267076901ref|XP_013824344.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: 2В-подобный белок, 5 ассоциированный с карциномой короткого неба, легкого и эпителия носа [Сарга hircus]
Образец 3. GT150930-1.
Фрагмент фибринопептида В, модифицированный
10 GYLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 4) с сульфатированием на 1-ом
тирозине фрагмента фибринопептида В, модифицированного
YLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 1) с сульфатированием на 1-ом тирозине фрагмента фибринопептида В
GYLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 4)
Образец 4. GT150904.
Фрагмент фибринопептида В, модифицированный
GYLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 4) с сульфатированием на 1-ом
тирозине фрагмента фибринопептида В, модифицированного
20 GYLDYDEVDDNRAKLPLD (SEQ ID NO: 3) с сульфатированием на 1-ом
тирозине фрагмента фибринопептида В, модифицированного
YLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 1) с сульфатированием на 1-ом тирозине
Плюс минорные компоненты:
25 gi|548486143|ref|XP_005686787.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: тимозин бета-10
[Сарга hircus]
д1|926730042|гет|ХР_005701550.2|ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: комплемент СЗ [Сарга hircus]
gi|926730881 |гет|ХР_005702023.2|ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: подобная 30 комплементу С4 [Сарга hircus]
gi18030336331ref|XP_012019984.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х1 rho-ассоциированной протеинкиназы 2 [Ovis aries]
g i 19266956221 ref |XP_013820690.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: комплемент СЗ,
частичная [Сарга hircus]
35 gi|803262238|ref|XP_011990819.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х5
субъединицы гамма-2 5'-АМФ-активированной протеинкиназы [Ovis aries musimon]
gi|803230738|ref |ХР_011975608.11П РОГНОЗИ РУЕМАЯ: изоформа ХЗ кальдесмона [Ovis aries musimon]
gi|803058071 |гет|ХР_004007547.2|ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: подобная
обонятельному рецептору 10С1 [Ovis aries]
5 gi|803317538|ref|XP_012016989.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х2 зиксина
[Ovis aries musimon]
Образец 5. SF70507-6
Фрагмент фибринопептида В, модифицированный
10 GYLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 4) с сульфатированием на 1-ом
тирозине фрагмента фибринопептида В
GYLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 4)
Фрагмент цепи альфа фибриногена
DEAESIEDLGIKGAHATKTGHAKA (SEQ ID NO: 10)
15 Плюс минорные компоненты:
д1|803170940|геГ|ХР_004017232.2|ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х1 цепи альфа фибриногена [Ovis aries]
gi|803080809|ref|XP_012034584.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х1 комплемента СЗ, частичная [Ovis aries]
Образец 6. Козий ICPF
Фрагмент фибринопептида В, модифицированный
GYLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 4) с сульфатированием на 1-ом
тирозине фрагмента В фибринопептида
25 YLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 1)
Плюс другие минорные компоненты:
д1|803170940|геГ|ХР_004017232.2|ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х1 цепи альфа фибриногена [Ovis aries]
дi19267076901ref|XP_013824344.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: подобная белку 2В, 30 ассоциированному с карциномой короткого неба, легкого и эпителия носа [Сарга hircus]
gi|685425595|pdb|4LUF|AL[enb А, кристаллическая структура овечьего сывороточного альбумина
gi|685425596|pdb|4LUH|AL[enb А, комплекс овечьего сывороточного 35 альбумина с 3,5-дийодсалициловой кислотой
д1|926712046|геГ|ХР_005691214.2|ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: цепь альфа фибриногена [Сарга hircus]
gi|926710444|ref|XP_013825345.1 |ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: БЕЛОК НИЗКОГО
КАЧЕСТВА: протромбин [Сарга hircus]
5 gi|803293300|ref|XP_012006313.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х2 цепи
альфа фибриногена [Ovis aries musimon]
gi|209447321|pdb|2RI4|BL[enb В, определение кристаллической структуры метемоглобина козы при 2,7 Ангстемах
g i |4262509451 ref |ХР_004019193.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: цепь А фактора 10 свертывания XIII [Ovis aries]
gi19267046541ref|XP_013823271.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: белок, родственный галектину [Сарга hircus]
gi|803247887|ref|XP_011983922.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: цепь А фактора
свертывания XIII [Ovis aries musimon]
15 gi|193085052|gb|ACF10391.^предшественник альбумина, частичная [Сарга
hircus]
gi|803189673|ref|XP_011956845.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: подобная комплементу С4-А [Ovis aries]
gi|926730803|ref|XP_013832694.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: подобная 20 комплементу С4-А [Сарга hircus]
gi|266618518|pdb|3EU1 |ВЦепь В, определение кристаллической структуры козьего гемоглобина (Сарга hircus) при разрешении 3 Ангстрема
gi|926715543|ref|XP_013827208.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: альфа-1В-
гликопротеин [Сарга hircus]
25 gi|803242149|ref|XP_011981169.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х2 белка,
родственного галектину [Ovis aries musimon]
gi|426224376|ref|XP_004006347.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: пролинбогатый белок 13 [Ovis aries]
gi|237640463|pdb|3D1A|DL[enb D, определение кристаллической структуры 30 козьего гемоглобина при разрешении 2,61 Ангстрема
gi|803189675|ref|XP_011956846.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х1 комплемента С4-А [Ovis aries]
g i 19266953721 ref |XP_013820599.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа X2
комплемента СЗ [Сарга hircus]
35 gi|548517042|ref|XP_005696356.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: белок trem-подобного
транскрипта 1 [Сарга hircus]
gi|926730881 |ге^ХР_005702023.2|ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: подобная комплементу С4 [Сарга hircus]
gi|209447327|pdb|2RI4|LL[enb L, определение кристаллической структуры
козьего метемоглобина при 2,7 Ангстремах
5 gi|926729006|ref|XP_013831983.1 |ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х2 ЕЗ
убиквитин-белоклигазы HUWE1 [Сарга hircus]
gi| 186886474|gb|ACC93613.1 |SLC25A38 [Ovis aries]
gi|926721902|ref|XP_013829453.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: комплемент C4 [Сарга hircus]
10 gi|926712071 |ref|XP_013825932.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: подобная
трансмембранному белку 131 [Сарга hircus]
gi|426239135|ref|XP_004013482.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: БЕЛОК НИЗКОГО КАЧЕСТВА: изоформа Х1 субъединицы альфа белка натриевого канала типа 4 [Ovis aries]
15 gi|803217947|ref|XP_011969334.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х2 белка
318 с цинковыми пальцами [Ovis aries musimon]
g i 18033203721 ref |XP_012018397.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа X2 ЕЗ убиквитин-белоклигазы DTX3L [Ovis aries musimon]
gi|802980807|ref|XP_012013620.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа ХЗ белка, 20 содержащего домен FGGY углеводкиназы [Ovis aries]
g i 18032447041 ref |XP_011982374.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа X2 стерилсульфатазы [Ovis aries musimon]
gi|548506471|ref|XP_005693115.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: БЕЛОК НИЗКОГО
КАЧЕСТВА: белок 4, содержащий цинковые пальцы и домен SCAN [Сарга hircus]
25 gi|803284013|ref|XP_012001677.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х8 белка
AHNAK, ассоциированного с дифференциацией нейробластов [Ovis aries musimon]
gi|803212895|ref|XP_011966845.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа Х2 фактора свертывания V [Ovis aries musimon]
gi18032455861ref|XP_011982785.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа X5 эпсина-30 2 [Ovis aries musimon]
gi|803321346|ref|XP_012018889.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа X2 комплемент С4-подобного [Ovis aries musimon]
gi|803240767|ref|XP_011980480.1 ПРОГНОЗИРУЕМАЯ: изоформа X2 нидогена-1 [Ovis aries musimon]
Образец 7. Человеческий ICPF
В данном образце не были идентифицированы фибринопептиды и фрагменты белка фибриногена человека или козы.
Образцы 2, 3 и 5 были более чистыми с наименьшим числом минорных идентифицируемых компонентов.
Пример 4. Анализ пептидов NPIS40
Часть NPIS40, отобранного согласно Примеру 1, анализировали на содержание пептидов. Главными компонентами являются модифицированные формы GYLDYDEVDDNRAKLPLDA (SEQ ID NO: 4) и YLDYDEVDDNRAKLPLDA
10 (SEQ ID NO: 1). Модификация осуществляется либо на первом, либо на втором тирозине. Данной модификацией может быть сульфатирование или фосфорилирование. Разница массы между сульфатированием и фосфорилированием является маленькой - 0,01 Да. Данной модификацией, вероятно, является фосфорилирование (НР03), а не сульфатирование (S03). И
15 она, более вероятно, осуществляется на втором Туг, а не на первом. Также возможно то, что существует смесь в одном из двух положении одной из двух модификаций, хотя и не наблюдали, что оба положения модифицируются в то же самое время. Также имеются два фрагмента СЗ, присутствующих примерно на 0,1% компонентов фибриногена бета - SEETKENERFTV (SEQ ID NO: 7) и
20 SAKFSAEEELEIR (SEQ ID NO: 8), и два фрагмента из фибриногена альфа в примерно 0,01% - IQTADDSDPVGGEFLAEGGGV (SEQ ID NO: 11) и DEAESIEDLGIKGAHATKTGHA (SEQ ID NO: 9). Все идентифицированные последовательности не были модифицированы.
25 Пример 5. Мышиная модель
NPIS40, отобранный согласно Примеру 1, или PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) в.б. инъецировали трем из шести мышей Swiss Webster через двое суток после заражения терминальной дозой сальмонеллы (5000 КОЕ), наряду с плазмидной конструкцией со вставкой гена lux (светится в темных бактериях).
30 Через 48 часов после введения NPIS40 все три мыши, получающие PBS, демонстрировали массовую инфекцию. Только одна из трех мышей, получающих NPIS40, продемонстрировала признаки инфекции, и они были существенно ослабленными по сравнению с PBS контролями.
35 Пример 6. Введение NPIS40
NPIS40 имеет выраженный и огромный потенциал не только в качестве терапевтического агента, но также в качестве профилактического агента против бактериальных патогенов и агентов вирусных заболеваний, а также против клеточных метастазов при неопластических заболеваниях. Другие области влияния 5 из данной работы включают следующее: NPIS40 может заменять применение антибиотиков в качестве терапевтических средств выбора в отношении инфекционных заболеваний, таким образом, уменьшая применение антибиотиков и снижая давление, которое движет развитием бактериальных штаммов, устойчивых к антибиотикам. NPIS40 может представлять собой новую и допустимую терапию в
10 отношении серьезных инфекционных заболеваний, таких как холера, дизентерия и туберкулез, которые губят в мире население развивающихся стран. NPIS40 можно использовать в качестве профилактики для кратковременной защиты на арене биотерроризма или в других инфекционных окружениях. NPIS40 может вводиться в качестве профилактического средства пациентам, подвергающимся большим
15 хирургическим вмешательствам, для предупреждения послеоперационной инфекции. NPIS40 может обеспечивать долговременную защиту в качестве адъюванта вакцины. NPIS40 можно использовать в качестве безопасного и эффективного терапевтического средства для предупреждения и лечения сезонных вспышек гриппа. NPIS40 можно использовать вспомогательно с другими
20 терапевтическими агентами для лечения инфекций с лекарственной устойчивостью. NPIS40 можно использовать для "утилизации" метастатических клеток у пациентов, подвергающихся химиотерапии или хирургическому вмешательству для лечения неопластических заболеваний.
NPIS40, очищенный согласно Примеру 1, вводили посредством в.в.
25 инъекции целому ряду пациентов. Каждый пациент получал исходную инъецию в сутки 0, с последующими повторными инъекциями примерно с недельными интервалами - всего для четырех инъекций.
Пример 7. Анализ профилей в крови после лечения
30 Пациенту 201 вводили NPIS40 согласно Примеру 5. Уровни разных
компонентов в крови измеряли, как показано на Фиг. 2А-2К. Вкратце, пациент 201 находился на NPIS40 с сентября, но имеется подозрение о том, что около 20 сентября пациент 201 возможно "растянул" частоту дозирования, другими словами, доза была пропущена.
35 Кривые CD4 и CD8 (см. Фиг. 2В и 2Г) показывают, что 5 сентября уровни и
CD4, и CD8 были низкими. Обработка NPIS40 начиналась 5 сентября, и затем оба
параметра быстро росли, лишь до падения вновь после 20 сентября. NPIS40 повторно вводили по более регулярной программе, и наблюдали быстрый ответ.
Пациент 201 поступил поступил в больницу около 25 ноября с вирусной инфекцией, но затем у него развился сепсис. При проведении анализа РСТ 5 (процентный объем тромбоцитов в крови) быстро возрастал до 33,9, что является явным указанием на сепсис. Число нейтрофилов и лейкоцитов (WBC) возрастало и затем стабилизировалось на в.в.и. (внутривенно инъецируемые) антибиотиках (см. Фиг. 2А и 2Б). Оба уровня увеличивались, при этом CRP (С-реактивный белок) и белок острой фазы оставались агрессивно высокими. Антибиотики заменяли на
10 более мощные в.в.и. антибиотики, с полученным в результате уменьшением обоих параметров на 1 декабря.
Неожиданным результатом был ответ пациента в показателях иммуноглобулинов (lg). Параметры lg были низкими, за исключением времени после обработки внутривенным lg до конца февраля (см. Фиг. 2Д, при этом кривая
15 lg имела значение 7,63 на 8 декабря. Затем у пациента 201 развился редкий неврологический побочный эффект, и в.в.и. lg было прекращено. Общий уровень IgG падал до 3,33 и возрастал только после оптимизации NPIS40 (9 декабря) (см. Фиг. 2Ж). Обе подфракции IgG (lgG1:5,28 и lgG2:0,64) возрастали выше минимума аналогичным образом (см. Фиг. 23). IgM (0,82) и IgA (0,91) вели себя аналогичным
20 образом. Данный результат показывает то, что хелперные клетки CD4 поддерживают продукцию подклассов IgG, IgA и IgM.
Пример 8. Сравнение уровней CD4 и CD8
На Фиг. ЗА и ЗБ показаны результаты анализа крови, касающиеся 25 количества CD4 и CD8, и ответа на NPIS40 для двух пациентов.
Как показано на Фиг. ЗА, пациент демонстрировал резкий ответ между 15 июня, после которого было начато введение NPIS40, и 13 июля. Подобным образом, 2 августа NPIS40 не давали. У данного пациента затем развился сепсис, и только после управления антибиотиками и восстановления введения NPIS40 к 4 30 августу клетки CD4 и CD8 действительно отвечали положительно.
Как показано на Фиг. ЗБ, инъекции NPIS40 были начаты 12 декабря, и химиотерапия была возобновлена 20 декабря. Исходный положительный ответ можно наблюдать к 19 декабря и последующее падение из-за возобновления химиотерапии, после чего, наконец, следовало медленное увеличение до мая.
Пример 9. Анализ уровней цитокинов
Разные препараты NPIS40, полученного из сыворотки, отобранного, как изложено в Примере 1, анализировали в качестве терапевтических агентов. Продукт получали из сыворотки посредством способа фильтрования с тангенциальным потоком. Конечный продукт, названный NPIS40, анализировали 5 масс-спектрометрическим анализом, который показывает то, что главным компонентом являются первичные пептиды, как изложено в Примере 4.
Добровольцам вводили дозы NPIS40, эквивалентные 1х, 2х и Зх обеспечению анализируемого агента. С течением времени отслеживали анализируемый набор цитокинов: исходный уровень (0 часов) и в 3, 24 и 48 часов 10 после введения. Проанализированные данные, полученные по отношению к цитокинам, показаны на Фиг. 4 и в Таблице 2, в которой перечислены уровни IL-8 после введения NPIS40.
15 Значения IL-1-бета, интерферона-гамма и IL-2 находились на уровне ноль
или около ноля во все измеренные моменты времени после введения, так как не было очевидной модуляции профиля. Однако все: IL-4, IL-6, IL-8, VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), TNF-a, МСР-1 и EGF (эпидермальный фактор роста) демонстрировали увеличение сывороточной концентрации в 3 часа, с
20 последующим возвращением к исходному уровню. TNF-альфа демонстрировал почти удвоение концентрации и высвобождения и имел тенденцию к тому, чтобы быть инициатором сигнала для последующих эффектов. Его экспрессия типично является очень короткой. Данные по IL-10 не были согласующимися, но, в общем, показывали запаздывание в пиковых сывороточных концентрациях по отношению к
25 моменту времени 3 часа. Известно то, что IL-10 помогает подавлению экспрессии воспалительных цитокинов (например, IL-6). CD4 и CD8 подвергаются повышающей регуляции/поддерживаются у раковых пациентов, которых лечат высокими дозами химиотерапевтических лекарственных средств.
30 Пример 10. Профиль химии пациентов, подвергавшихся лечению
На Фиг. 5А и 5Б показан профиль химии одного пациента, которого лечили NPIS40. Запасы железа нормализовались после начала лечения NPIS40. Из-за плохого соблюдения схемы и режима лечения запасы железа уменьшались 2 5 августа. Демонстрируется роль гепсидина, высвобождаемого кишечными макрофагами.
Пример 11. Клинические наблюдения пациентов, подвергавшихся лечению В пределах 3 часов с момента инъекции NPIS40 происходит многократная
10 повышающая регуляция IL-6, который является биомаркером инициации врожденного иммунного ответа. Приблизительно через 24 часа происходит многократная повышающая регуляция IL-10, который является и биомаркером адаптивного иммунного ответа, и "переключателем", который вызывает понижающую регуляцию IL-6 - сдерживая воспалительный каскад. Каскад многих
15 цитокинов, таких как IFN-гамма, TNF-a, GM-CSF и многих других наиболее важней в отношении аутизма, МСР-1. Данные каскады показывают то, что а) NPIS40 модулирует и адаптивную, и врожденную иммунную систему. Никакая другая молекула или лекарственное средство не модулирует обе системы, б) Каскады других цитокинов указывают на модуляцию правильной клетчной сигнализации и
20 клеточной коммуникаци, которая нарушается при хроническом воспалении, в) Облегчение хронического воспаления, которое является предвестником большинства болезненных состояний, не может быть недооцененным, г) Повышающая регуляция МСР-1, которая теперь объяснила наблюдаемые и улучшающиеся неврологические состояния рассеянного склероза (MS), ALS,
25 болезни Паркинсона, PLS (первичный латеральный склероз), аутизма и других. Данные улучшенные состояния были построены на отдельных примерах, так как они были получены при информированном согласии или заявлении об освобождении от требований в связи с состраданием для других состояний, где данные симптомы также облегчались. Немедленные и продолжительные
30 улучшения наблюдали у семи из семи детей с аутизмом. Посредством идентификации повышающей регуляции МСР-1 после введения NPIS40 можно понять положительные эффекты моноцитарного хемоаттрактантного белка 1. Кратким определением МСР-1 является: лиганд 2 хемокина (с мотивом С-С) (CCL2), также именуемый моноцитарным хемоаттрактантным белком 1 (МСР1) и
35 маленьким индуцибельным цитокином А2. CCL2 представляет собой маленький цитокин, который принадлежит к семейству хемокинов СС. CCL2 действует,
рекрутируя моноциты, Т-клетки памяти и дендритные клетки к местам воспаления, вызванного либо повреждением ткани, либо инфекцией. Наиболее важной характеристикой этого рекрутирования является то, что моноциты, Т-клетки памяти и дендритные клетки могут и действительно проходят через 5 гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Это является важным прорывом, так как стандартом лечения при многих неврологических воспалительных состояниях является применение стероидов, которые, как было доказано, не способны проходить через гематоэнцефалический барьер.
Полагают то, что иммунная система играет важную роль в аутизме:
10 исследователи обнаружили то, что дети с аутизмом имеют воспаление и периферической, и центральной иммунной системы, на что указывают повышенные уровни провоспалительных цитокинов и значительная активация микроглии. Биомаркеры ненормальной иммунной функции также были ассоциированы с усиленными ухудшениями поведенческих реакций, которые
15 характерны для центральных свойств аутизма, таких как недостатки социальных взаимодействий и коммуникации. Взаимодействия между иммунной системой и нервной системой начинаются рано во время эмбриональной стадии жизни, и успешное развитие нервной системы зависит от сбалансированного иммунного ответа. Полагают то, что активация иммунной системы беременной матери, как,
20 например, от токсичных веществ окружающей среды или от инфекции, может способствовать тому, что вызывается аутизм через нарушение развития мозга. Это поддерживается недавними исследованиями, в которых было обнаружено то, что инфекция во время беременности ассоциирована с повышенным риском аутизма. Вторичным фактором, но таким же важным как рекрутирование данных
25 иммунных клеток к месту воспаления и повреждения в мозге, является их функция в важной работе глимфатической системы. Глимфатическая система (или глимфатический путь клиренса) представляет собой функциональный путь клиренса отходов для центральной нервной системы позвоночных (ЦНС). Данный путь состоит из параартериального пути притока цереброспинальной жидкости
30 (ЦСЖ) для постуления в мозговую паренхиму, в сочетании с механизмом клиренса для удаления интерстициальной жидкости (ИСЖ) и внеклеточных растворов из интерстициальных компартментов мозга и спинного мозга.
Название "глимфатическая система" было введено в употребление датским нейробиологом Майкеном Недергаардом (Maiken Nedergaard) в связи с
35 признанием его зависимости от глиальных клеток и со сходством его функций с функциями периферической лимфатической системы. В двух статьях: Louveau et
al. из Университета Вирджинии, Школа медицины и Aspelund et al. из Университета Хельсинки независимо описали открытие того, что синусы твердой мозговой оболочки и менингеальные артерии на самом деле выстланы традиционными лимфатическими сосудами, и что эта неуловимая в течение длительного времени 5 форма сосудистой системы образует соединительный путь для поступления и выхода лимфатической жидкости и иммунных клеток из менингеального компартмента в глимфатическую систему.
NPIS40 запускает цитокиновый каскад, включающий МСР-1, который потенцирует восстановление здорового гомеостазного состояния - прекращение 10 хронического клеточного воспаления, обеспечение рекрутинга заживляющих иммунных клеток через ГЭБ и клиренс поврежденной ткани из мозга. В совокупности данные действия приносят терапевтическую пользу детям с аутизмом.
15 Пример 12. Аминокислотные последовательности BRM по изобретению
Аминокислотные последовательности, которые функционируют как BRM по
изобретению, включают одну или более чем одну из следующих:
SEQ ID NO: 1 YLDYDEVDDNRAKLPLDA (фрагмент фибриногена В)
SEQ ID NO: 2 LDYDEVDDNRAKLPLDA (фрагмент фибриногена В)
20 SEQ ID NO: 3 GYLDYDEVDDNRAKLPLD (фрагмент фибриногена В)
SEQ ID NO: 4 GYLDYDEVDDNRAKLPLDA (фрагмент фибриногена В)
SEQ ID NO: 5 GYLDYDEVDDNRAKLPLDAR (фрагмент фибриногена В)
SEQ ID N0: 6 FLAEGGGV (фрагмент фибриногена А)
SEQ ID NO: 7 SEETKENERFTV (концевой фрагмент фибриногена С)
25 SEQ ID NO: 8 SAKFSAEEELEIR (концевой фрагмент фибриногена С)
SEQ ID N0: 9 DEAESIEDLGIKGAHATKTGHA (фрагмент фибриногена А)
SEQ ID N0: 10 DEAESIEDLGIKGAHATKTGHAKA (фрагмент фибриногена А) SEQ ID N0: 11 IQTADDSDPVGGEFLAEGGGV (фрагмент фибриногена А) SEQ ID N0: 12 LCLVLSLVGAIQTADDSDPVGGEFLAEGGGV
30 (фрагмент фибриногена А)
Данные последовательности могут быть очищены из источников от млекопитающих, таких как сыворотка, или синтезированы искусственно. Данные последовательности могут быть модифицированы, как, например, первый и/или второй тирозин (Y) может быть фосфорилирован (НР03), сульфонирован (S03)
35 и/или модифицирован 3-нитротирозином, 3-аминотирозином, 3,4-дигидроксифенилаланином, 3,3'-дитирозином и другими поперечными связями, 3
хлортирозином, 3,5-дихлортирозином (DiClY) и/или хинонимином. Последовательности могут быть модифицированы бромированием и/или йодированием. Последовательности предпочтительно могут содержать замены, например, D на Е, V на I или L, N на Q и/или G на А.
Пример 13. Разнородный опыт с пациентами
NPIS40 вводили еженедельно подкожно трем пациентам. Пациент один отвечал трехкратным увеличением и CD4, и CD8. У пациента два нормализовались и CD4, и CD8 в пределах трех недель, которые оставались стабильными в течение
10 по меньшей мере четырех месяцев. Пациент два к возрасту 6 лет имел 52 предшествующие госпитализации из-за сепсиса. Пациент три имел многочисленные предшествующие рецидивирующие инфекции и недостаточности IgA, IgG, CD4 и CD8. Значения CD4 и CD8 оставались низкими после введения NPIS40. Пациента три госпитализировали с сепсисом во время испытания, что
15 обеспечило ежесуточный анализ значений CD4 и CD8 и дальнейшее лечение. После дополнительного введения NPIS40 значения CD4 и CD8 начали снижаться в сутки 4.
BRM вводится еженедельно посредством в. в. инъекции взрослому пациенту-мужчине. В пределах 30 минут - часа после введения TNF-a
20 подвергается повышающей регуляции, инициируя высвобождение IL-6. После этого следует повышающая регуляция макрофагов и NK-клеток. Примерно в 12-30 часов после введения многократная повышающая регуляция IL-10 снижает действия провоспалительного цитокина IL-6 и провоспалительных клеток ТН1. IFN-гамма обладает противовирусными свойствами и другими важными
25 иммунорегулирующими функциями, наряду с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) (при оценке для лечения неврологических заболеваний), а также моноцитарным хемоаттрактантным белком (МСР-1). МСР-1 стимулирует рекрутирование Т-клеток, В-клеток, макрофагов и других иммунных клеток к местам раны и повреждения для инициации удаления
30 поврежденной ткани. Ассоциированным с эффектом повышающей регуляции МСР-1 является то, что данные клетки могут проходить через ГЭБ, что помогает излечению многих неврологических состояний. IL-8, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и эпидермальный фактор роста (EGF) подвергаются повышающей регуляции после исходного провоспалительного пика. IL-8 и VEGF являются
35 мощными стимуляторами ангиогенеза, и EGF является мощным стимулятором
роста клеток, пролиферации и дифференциации. В совокупности они обеспечивают мощный стимул для эффектов заживления ран.
Данный каскад завершается примерно через 120 часов. Если дополнительные положения изобретения считаются необходимыми (например, для 5 продолжения помощи в восстановлении нормализованного гомеостаза), могут быть продолжены административные практики.
Пример 14. Анализ BRM
BRM был проанализирован, и были обнаружены модифицированные формы 10 SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 4 с модификациями на первом или втором тирозине,
которыми могут быть сульфатирования или фосфорилирования. Разница массы
составляет меньше, чем 0,01 Да, и, следовательно, масс-спектрометрический
анализ является почти невозможным. Два фрагмента СЗ были представлены
примерно на 0,1% компонентов фибриногена бета - SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, a 15 два фрагмента из фибриногена альфа - примерно на 0,01% - SEQ ID NO: 11 и SEQ
ID NO: 9. Образцы анализировали на гликаны и олигонуклеотиды, не выявляемые
масс-спектрометрическим анализом.
Проводили обогащение на основе лектина, с последующей ЖХ-МС HILIC, и
проводили вторую нанораспылительную инфузию в отрицательном режиме. Ни 20 один анализ не вызывал ответ, превышающий фон, и, соответственно, либо
олигонуклеотид отсутствовал, либо любой присутствующий находился ниже
уровней выявления.
Биоактивность анализировали посредством модели мышиного
сальмонеллеза. И модифицированный, и немодифицированный пептиды не могли 25 продуцировать заметного ответа в анализе заражения сальмонеллезом.
Пример 15. Профили дозировки
Фармацевтические композиции, которые содержат BRM, не всегда соответствуют таким стандартам схем дозировки, как для других
30 фармацевтических средств, таких как цитотоксические лекарственные средства. Продукт по изобретению хранится при минус 20°С до применения. Перед применением продукту дают оттаять при комнатных температурах или при примерно 20°С. Не включают автоклавирование или внешние источники тепла. Дозы типично упаковывают в 1,5 мл аликвоты, и каждый флакон представляет
35 собой полную дозу. То, что изменяется согласно хроническому состоянию, протоколу лечения и продолжительности - это частота введения дозы. При самых
хронических диагностированных состояниях частота составляет: 1 дозу каждые 3 суток в течение по меньшей мере первого месяца, возможно в течение 3 месяцев, с частотой, растянутой до одного раза каждые 5 суток, затем один раз в неделю, затем дважды в месяц, до поддерживающей дозы один раз в месяц, или пока не 5 пройдут симптомы. Для пациентов, страдающих от хронических или изнуряющих состояний, предпочтительными являются подкожные инъекции продукта. Активность цитокинов пациента отслеживается во время лечения для определения возвращения к гомеостазу или иному нормальному функционированию их врожденной и/или адаптивной иммунных систем. Время от времени, как, например,
10 при длительных изнуряющих хронических состояниях, пациент может оставаться на лечении в течение значительно более длительных периодов, даже лет.
Новые пациенты, получающие их первую инъецируемую дозу, используют следующий протокол: 0,5 мл дозы, инъецированной подкожно. Если не наблюдается аллергической реакции или анафилаксии через примерно 20-30
15 минут, остальная доза вводится подкожно. Предпочтительными местами инъекции являются брюшная полость, рука, верхняя часть бедра, наружная поверхность бедра. Дозировки обычно являются следующими:
Частота в зависимости от состояния
20 Длительность лечения может варьировать, в зависимости от тяжести
состояния.
Концентрации:
A. Хроническая (X) - от 900 до 1100 мкг на 1,5 мл Б. Интенсивная (И) - 750-850 мкг на 1,5 мл
25 В. Терапевтическая (Т) - 450-600 мкг на 1,5 мл
Г. Поддерживающая (П) - 300-380 мкг на 1,5 мл
Частота для трудно поддающихся лечению диабетических ран и/или ран от
давления из-за неподвижности
30 А. Каждые 3 суток в течение первого месяца, хроническая (X)
Б. Каждые 5 суток для следующих шести доз, интенсивная (И)
B. Одна доза в неделю до закрытия раны, терапевтическая (Т)
Г. Одна доза в неделю в течение 4 недель, поддерживающая (П)
35 Частота для хронической болезни Лайма
А. Каждые 3 суток для первых восьми доз, X
Б. Каждые 5 суток для следующих двенадцати доз, И В. Одна доза в неделю для следующих 8 доз, Т Г. Одна доза каждые 10 суток для 6 доз, П
5 Частота для первичного прогрессирующего рассеянного склероза
А. Одна доза каждые 3 суток в течение 3 месяцев, X Б. Один раз в неделю в течение 6 месяцев, Т
В 9 месяцев следует вводить дополнительный протокол на основе данных анализов: нового набора анализов крови и неврологических анализов. Данный
10 протокол обычно является аналогичным для воспалительных и демиелинизирующих состояний, а также СЮР (хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия), синдрома Гийена-Барре, прогрессирующей воспалительной нейропатии, диабетической нейропатии и ALS (боковой амиотрофический склероз), включая СМТ (болезнь Шарко-Мари-Тута). Строго
15 рекомендуется консультирование по вопросу питания, направленное на противовоспалительную диету.
Частота для злокачественных новообразований
A. Одна доза каждые 3 суток в течение 2 месяцев - X 20 Б. Каждые 5 суток для следующих 8 инъекций - Т
B. Один раз в неделю в течение 3 месяцев - П
Г. Подходящие клинические анализы крови в соответствии с состоянием каждые 90 суток с пересмотром протокола.
25 Частота для рефлекторной симпатической дистрофии (RSD) и
гипераналгезии
A. Одна доза каждые 3 суток в течение одного месяца - X Б. Каждые 5 суток для следующих 8 инъекций - И
B. Один раз в неделю в течение 3 месяцев - Т
30 Г. Как необходимо для поддержания облегчения боли - П
Частота для хронических воспалительных условий, как при ревматоидном артрите, артериосклерозе, ишемии, хроническом псориазе, синдроме раздраженного кишечника (IBS), включающем воспалительные заболевания, 35 подобные болезни Крона и язвенному колиту
А. Одна доза каждые 3 суток в течение двух месяцев
Б. Каждые 5 суток в течение двух месяцев В. Один раз в неделю в течение 3 месяцев
Частота для аутоиммунного заболевания, которое включает любое число из более чем ста упомянутых состояний. Острое:
A. Одна доза каждые 3 суток в течение 5 недель - X Б. Каждые 5 суток в течение 8 недель - И
B. Один раз в неделю в течение 3 месяцев - Т/П Хроническое:
A. Одна доза каждые 3 суток в течение 9 недель - X Б. Каждые 5 суток в течение 9 недель - И
B. Один раз в неделю в течение 9 недель - Т
Кортикостероиды и любая другая терапия стероидами может нейтрализовать положительные эффекты продукта по изобретению, и все терапии стероидами должны быть прерваны по меньшей мере за 30 суток до начала любого протокола.
Другие воплощения и применения изобретения будут очевидными для специалистов в данной области из рассмотрения описания изобретения и воплощения изобретения на практике, раскрытых в данном документе. Все процитированные в данном документе ссылки, включая все публикации и все патенты США и иностранных государств, и патентные заявки, являются конкретно и целиком включенными посредством ссылки. Подразумевается то, что термин "содержащий", всякий раз, когда он используется, включает термины "состоящий" и "по существу состоящий из". Кроме того, подразумевается то, что термины содержащий, вмещающий и включающий не являются ограничивающими. Подразумевается то, что описание изобретения и примеры считаются лишь типичными, причем истинный объем и сущность изобретения указываются следующей формулой изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> MARPE HOLDINGS, LLC
<120> ИММУНОМОДУЛЯЦИЯ В ЦЕЛЯХ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАССТРОЙСТВ
<130> 3090.002.US
<140> <141>
<150> 62/455,166 <151> 2017-02-06
<150> 62/453,586
<151> 2017-02-02
<150> 62/318,016 <151> 2016-04-04
<160> 12
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1 <211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 1
Tyr Leu Asp Tyr Asp Glu Val Asp Asp Asn Arg Ala Lys Leu Pro Leu
1 5 10 15
Asp Ala
<210> 2 <211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 2
Leu Asp Tyr Asp Glu Val Asp Asp Asn Arg Ala Lys Leu Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala
<210> 3 <211> 18
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 3
Gly Tyr Leu Asp Tyr Asp Glu Val Asp Asp Asn Arg Ala Lys Leu Pro
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 4 <211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Sсинтетический пептид
<400> 4
Gly Tyr Leu Asp Tyr Asp Glu Val Asp Asp Asn Arg Ala Lys Leu Pro
1 5 10 15
Leu Asp Ala
<210> 5 <211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 5
Gly Tyr Leu Asp Tyr Asp Glu Val Asp Asp Asn Arg Ala Lys Leu Pro
1 5 10 15
Leu Asp Ala Arg
<210> 6 <211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 6
Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val
1 5
<210> 7 <211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> Описание искусственной последовательности: Sсинтетический пептид
<400> 7
Ser Glu Glu Thr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Thr Val
1 5 10
<210> 8 <211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 8
Ser Ala Lys Phe Ser Ala Glu Glu Glu Leu Glu Ile Arg
1 5 10
<210> 9 <211> 22
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 9
Asp Glu Ala Glu Ser Ile Glu Asp Leu Gly Ile Lys Gly Ala His Ala
1 5 10 15
Thr Lys Thr Gly His Ala 20
<210> 10 <211> 24
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Sсинтетический пептид
<400> 10
Asp Glu Ala Glu Ser Ile Glu Asp Leu Gly Ile Lys Gly Ala His Ala
1 5 10 15
Thr Lys Thr Gly His Ala Lys Ala 20
<210> 11 <211> 21
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 11
Ile Gln Thr Ala Asp Asp Ser Asp Pro Val Gly Gly Glu Phe Leu Ala
Glu Gly Gly Gly Val 20
<210> 12 <211> 31
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 12
Leu Cys Leu Val Leu Ser Leu Val Gly Ala Ile Gln Thr Ala Asp Asp
1 5 10 15
Ser Asp Pro Val Gly Gly Glu Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val
20 25 30
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Фармацевтическая композиция, содержащая последовательность SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4 и не содержащая других пептидных
5 последовательностей фибрина.
2. Композиция по п. 1, в которой данная последовательность является модифицированной.
3. Композиция по п. 2, в которой модификация представляет собой сульфатирование и/или фосфорилирование первого и/или второго тирозина SEQ
10 ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4.
4. Композиция по п. 1, в которой данная последовательность является синтетической.
5. Композиция по п. 1, в которой данная последовательность не является модифицированной либо липидами, либо сахаридами.
15 6. Композиция по п. 1, которая содержит терапевтически эффективное
количество.
7. Композиция по п. 6, в которой терапевтически эффективное количество
составляет примерно от 0,1 до 100 мкг/мл.
8. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая фармацевтически
20 приемлемый носитель.
9. Композиция по п. 8, в которой фармацевтически приемлемый носитель
выбран из группы, состоящей из воды, масла, съедобного масла, жирных кислот,
липидов, полисахаридов, целлюлозы, глицерина, гликоля и их комбинаций.
10. Композиция по п. 1, которая является водной и изготовленной для
25 внутривенного введения.
11. Композиция по п. 1, которая является нетоксичной и не вызывает
побочных эффектов после введения пациенту.
12. Способ изготовления фармацевтической композиции, включающий:
обеспечение сыворотки млекопитающего, которая является стерильной;
30 смешивание равных частей стерильной сыворотки со стерильным 0,5%-ным
физиологическим раствором с образованием смеси;
пропускание данной смеси посредством хроматографии с тангенциальным
потоком, с последующим диализом с порогом отсечения по молекулярной массе и
фильтрованием через 0,2 мкм фильтр, образуя фильтрованный раствор;
35 распределение фильтрованного раствора в однодозовые сосуды; и
замораживание фильтрованного раствора при минус 10°С или меньше.
13. Способ по п. 12, в котором диализ с порогом отсечения по молекулярной
массе представляет собой диализ с порогом отсечения по молекулярной массе 10
кДа.
14. Способ по п. 12, в котором каждый из однодозовых сосудов содержит
5 примерно от 0,5 до 5 мл.
15. Способ по п. 14, в котором однодозовые сосуды содержат от примерно
0,1 мкг/мл до примерно 100 мкг/мл пептида последовательности SEQ ID NO: 1
и/или SEQ ID NO: 4.
16. Способ по п. 12, в котором фильтрованный раствор анализируют на
10 присутствие эндотоксина.
17. Способ по п. 12, который осуществляют согласно стандартам GMP (надлежащая производственная практика) для фармацевтических композиций.
18. Способ лечения заболевания или расстройства пациента, включающий повторное введение водной фармацевтической композиции, содержащей
15 пептидную последовательность SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4, или модификацию SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4, где данный пациент не получает терапии стероидами на протяжении повторного введения.
19. Способ по п. 18, в котором заболевание или расстройство включает вирусную, бактериальную, грибковую или паразитарную инфекцию.
20 20. Способ по п. 18, в котором заболевание или расстройство включает
воспаление.
21. Способ по п. 18, в котором пациент представляет собой человека или
другое млекопитающее.
22. Способ по п. 18, в котором терапевтически эффективная доза содержит
25 примерно 0,5-5 мл, содержащих от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 100 мкг/мл
пептидной последовательности.
23. Способ по п. 18, в котором последовательность является
модифицированной.
24. Способ по п. 18, в котором модификация представляет собой 30 сульфатирование и/или фосфорилирование первого и/или второго тирозина SEQ
ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 4.
25. Способ по п. 18, в котором последовательность является синтетической.
26. Способ по п. 18, в котором последовательность не является
модифицированной либо липидами, либо сахаридами.
35 27. Способ по п. 18, в котором повторное введение включает еженедельное
введение в течение 2-20 недель.
28. Способ по п. 18, в котором введение инициирует каскад иммунной
системы.
29. Способ по п. 28, в котором каскад иммунной системы включает:
повышающую регуляцию TNF-a (фактор некроза опухолей-альфа) в
5 пределах примерно 0,5-12 часов после введения:
повышающую регуляцию IL-6 (интерлейкин-6) после повышающей регуляции TNF-a; и
повышающую регуляцию IL-10 после повышающей регуляции IL-6, которая
осуществляет понижающую регуляцию IL-6.
10 30. Способ по п. 29, в котором IL-6 подвергается повышающей регуляции
через 6 часов после введения.
31. Способ по п. 29, в котором IL-10 подвергается повышающей регуляции
через 24 часа после введения.
32. Способ по п. 29, дополнительно включающий повышающую регуляцию 15 макрофагов, натуральных клеток-киллеров (NK-клеток), интерферона-гамма (IFN-
гамма), моноцитарного хемоаттрактантного белка (МСР-1), Т-клеток, В-клеток и/или гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CFS) после повышающей регуляции IL-6.
33. Способ по п. 18, в котором заболевание или расстройство представляет 20 собой неправильное функционирование иммунной системы, которое
нормализуется для пациента после повторных введений.
34. Способ по п. 33, в котором неправильное функционирование иммунной
системы представляет собой неконтролируемый воспалительный ответ.
35. Способ по п. 18, в котором уровни CD4 и CD8 у пациента увеличиваются,
25 и введение водной фармацевтической композиции возвращает уровни CD4 и CD8
до гомеостазного уровня для данного пациента.
10095908580757065605550454035302520151050
1132.00
1103.49
1132.50
1103.99
1133.00
1104.49
1133.50
1102.02
1129.94
1104.99 1105.49
Ш5.99 111M7 111347 Щ6.98 1122.44 1124.49 Mifiii
1100 1105 1110 1115 1120 1125 1130 1135
m/z
10095: 90:
858075:
706560:
555045:
40:
3530-
25^
20: 15:
105:
415.22
1063.51
136.08
392.18
326.17
439.26 528.31
249.16
775.62
997.58
1019.47 867.92 \
670.28
200 400 600 800 1000
1200 m/z
1710.76
1923.61
2022.86
mil.
ini| |Цпн|
1597.69
|imf tm|mi|im|!m^ IIH|iilnltii|HH[iiii|i"ii|inniiii[Hti|iMi|iiT44njnTi;ti
1400 1600 1800 2000 2200
100-95^ 90^ 85^ 80^ 75^ 70^ 65^ 60^ 55^ 50^ 45^ 40^ 35^ 30-! 25^ 20^ 15^ Щ
1072.99
1092.02
1080.54 1088.74
ТТ1ТТ"чт"ят
1129.95 1125.13 \
fTfTf"ffflTfrff
1133.00
1134.00
(1135.00 114444 114955 1154.28
1080
1090
1100
1110
1120
1130
1140
1150
10095: 90: 85:
80^
75:
70^ 65^ 60^
55: 50:
45^ 40^ 35^ 30^ 25^ 20^ 15^ Щ
1133.00
1134,00
1129.45
1135,01 1141.98 114799
гт-т-гтт|1№^^тт-Г1
1120 1125 1130 1135 1140 1145
100:
95^
90:
85^ 80^ 75^ 70^
65^ 60^
55^ 50^
45:
40^ 35^ 30^ 25^ 20^ 15^ 10i 5^ О1
1081.48 1085.51
TJT-TTJTTTTTTTJ-,
1080
1103.98
1104.98
1105.98
1102.99
1096.48
1102.02
1106.99
Trrrt+fTfTTTfrri
1100
1117.00
1120
1131.99
1132.99
1133.99
1150
\(? 1139.00 1144.94 1150.49
rTtTffTWTTfTp
1140
100-q
95^ 90|
85^
80-:
75^
70| 65^ 80| 55^ 50^ 45^ 40^ 35^ 30| 25^ 20| 15^ Щ 5^ (K
1103.49
1102.48
1092,02 Ю96.48 4+?
Ттттуттхр,
1100
1118.57
1120
m/z 1130.50
1130
1133,00
1134.00
1139,00
1140
1145.50
1147.00 115145
1150
1158,46
100-q
95^
mi mi mi m щ mi
60| 55^
50-:
40^ 35^ 30^
25-;
20^ 15^
1103.49
1103.99
1104.99
1102.01
ттт~гт-гп 1095 1100 1105
1 г
1110
1117.49
1115
1120.68
I I 1 г
1120
1126.13
г~Т-Т-т-
1125
1132.00
1133.01
1134.01
1135
г-т-4 1130
1138,51
1140
1063.51
415.22
426.82
1018.47 855.91 V
841.90
528.30
924.93
670.28 \
400
1000
ini| 1111|1и|1чч111|||||Щ
600 800
1227.62
1200 m/z
1400
1710.79
1597.70 1505.64
1600
2000
2200
100:
9590858075: 70: 85:
805550:
4540: 35: 30:
2520:
15:
1050
1103.54
1104,04
1105.04
Tfmf^mffmrfmffmiymfft
1100 1105'
1144.00
1130.00 1130.50
1137.82
ilii|iiii|iHipnifllii|lill|Hil|lili|llli|iiii|iiiV|li4|4il|iill|llil|4ll|ilii]IHI|Hfl|ll
1130 1135 1140 1145
100:
95^ 90^ 85^ 80^ 75^ 70^ 65^ 60^ 55^ 50^ 45^ 40^ 35:
30: 25:
15:
169.13
339.24 268.16
367.23
200
805.40
676.35
1333.61
1481,68
916.40
1838.82
'1032.51 1145.51 Ч
1800
2200
1400
1600
2000
1292.56
800
1000
'ii'liNipnfim^ifiifiTtTTpW^^ н 11 |и и i и и |ii ii |и н (И
1200
m/z
• АБСОЛЮТНОЕ ЧИСЛО НЕЙТРОФИЛОВ
НАЗВАНИЕ АНАЛИЗА
23 НОЯ
2015 0:00
22 ЯНВ
2016 0:00
19ФЕВ
2018 13:25
22 АИР
2)18 15:35
31 МАЯ
2016 20:30
15ИЮН
2018 0:00
13ИЮЛ
2016
10:38
1 АВГ
2016 15:25
4 АВГ
2016 20:40
9 АВГ
2018 7:25
КОНТРОЛЬ
ГЕМАТОЛОГИЯ
ЧИСЛО КЛЕТОК CD4-DSP
738 L
541L
779 L
737 L
686 L
1000-1800
ЧИСЛО КЛЕТОК CD4-DSP
953
1250 Н
372 L
908
700-1100
ЧИСЛО КЛЕТОК CD8-DSP
768
964 Н
165 L
689
600-900
ЧИСЛО КЛЕТОК CD8-DSP
818 L
255 L
549 L
428 L
383 L
800-1500
ОТНОШЕНИЕ CD4:CD8 - DSP
1.19
2.12Н
1.42
1,72 Н
1,79 Н
1,0-1,6
ОТНОШЕНИЕ CD4:CD8 - DSP
1,24
1,30
2.25 Н
1,32
1.1-1.4
ЧИСЛО КЛЕТОК CD4 -TYG БЕЗ КОММЕНТАРИЕВ
538 L
1000-1800
ПРОЦЕНТ CD4 НЕДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ
30-40
ЧИСЛО КЛЕТОК CD8^ TYG ЗАРЯД
454 L
800-1500
CD8 ПРОЦЕНТ НЕДОВЕРПТЕЛЬНЫЙ
25-32
ОТНОШЕНИЕ CD4;CD8 НЕДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ
1,18
10-1,6
ФИГ. ЗА
НАЗВАНИЕ АНАЛИЗА
15 СЕН
2015
11:57
20 СЕН
2015 0:00
29 СЕН
2015 14:16
2 0КТ
2015 14:23
11 НОЯ
2015 9:05
19 ДЕК
2015 12:50
26 ДЕК
2015 0:00
9 ЯНВ
2018 0:00
8ФЕВ
2016 0:00
11 АПР
2016 12:50
21 АПР
2016 12:50
8 МАЯ
2016 0:00
КОНТРОЛЬ
ГЕМАТОЛОГИЯ
ЧИСЛО КЛЕТОК CD4 - DSP
51L
40 L
104 L
101L
113 L
190 L
53 L
97 L
198 L
155 L
150 L
175 L
700-1100
ЧИСЛО КЛЕТОК CD8 - DSP
115 L
85 L
256 L
236 L
193 L
571L
113 L
202 L
483 L
348 L
519 L
800-900
ОТНОШЕНИЕ CD4:CD8 - DSP
0,44 L
0.47 L
0,41 L
0,43 L
0,59 L
0,33 L
0,47 L
0,48 L
0.41 L
0,45 L
0,34 L
1,1-1,4
ФИГ. 4
НАЗВАНИЕ АНАЛИЗА
22 ЯНВ
2018 0:00
25 ЯНВ
2016 6:00
18ФЕВ
2016 0:00
19ФЕВ
2016 13:25
19ФЕВ
2016 0:00
22 АПР
2016
15:35
23 АПР
2016 15:40
25 АПР 2016
8:40
25 АПР
2016 11:30
26 АПР
2016 0:00
15ИЮН
2016 0:00
17ИЮН
2016 11:53
18ИЮН
2016 0:00
4 АВГ
2016 20:40
6 АВГ
2016 8:00
7 АВГ
2016 0:00
9 АВГ
2016 7:25
КОНТРОЛЬ
ХИМИЯ
('-РЕАКТИВНЫЙ 1.1 .И'ж
145.2 Н
42,7 Н
51Н
102,6 Н
712 Н
119 Н
184.0 Н
73,9 Н
35,2 Н
208,5 Н
213,9 Н
85,0 Н
81.5 Н
5.0
ИММУНОГЛОБУЛИН (i (IgG)
4.911
8.12
10,00
1,40
9,31
8,88
6,00-16,00
ИММУ1 К)! ЛОЬУЛИ! 1 Л (1"А)
0.89
1.05
1,05
122
135
118
010-3,00
ИММУПОГЛОЬУЛИП М (IgM)
0.73
1.25
1.19
121
1,24
0,95
0,50-2,60
ЖЕЛЕЗО-S*
<2.01
2,11
15,4
7.9 L
9,0-215
TPAi 1СФЕРРИ1 1-СЫ1ЮРОТКА*
2.2
2.34
2,10
1.61 L
2,03-3,60
НАСЫЩЕНИЕ
ТРАНСФЕРРИНА (LOG BIRON)
19 L
20-55
ФЕРРИТЫ 1 |ЕЛ]
165
217
819 Н
2079 Н
20-300
ПОДФРАКЦИЯ 1 lud
3,23 L
4,86
5,93
4,28
3,77-1131
! ЮДФРАКЦИЯ 2 !g(i
1,00
189
2,66
168
0,68-3,88
ПОДФРАКЦИЯ 3 IgG
0.21
0,25
0,31
0,24
0,16-0,89
ПОДФРАКЦИЯ 4 IgG
0.16
0,22
0,37
0,30
0,01-170
ФЕКЛДЫ !ЫИ КАЛЫ 1РОТЕКТИ11
154Н
МО
ЭНДОКРИНОЛОГИЯ
ФЕРРИТИН*
165
21?
819 Н
2079 Н
20-300
ИММУНОГЛОБУЛИН Е*
30.3
10-56.0
ФАДИАТОП*
0.10
0.14
0,00-0.35
RAS I (радноаллергосорбентный анализ) ЯИЧНЫЙ БЕЛОК F1
0.07
0,00-0,35
RAST ЯИЧНЫЙ ЖЕЛТОК F75
0.03
0.00-0,35
RAST ПШЕНИЦА F4
0.03
0,00-0,35
RAST ОВЕС F7
0.03
0,00-0,35
RAST БАНАН F92
0,09
0,00-0,35
RAST ЯБЛОКО F49
0.02
0,00-0,35
CAST (реакция конкурентного связывания иммобилизованного антигена) ТАРТРАЗИН СТ
100
CAST НАТРИЯ БЕНЗОАТ СТ
CAST НАТРИЯ САЛИЦИЛАТ СТ
120
CAST MSG (ГЛУТАМАТ) СТ
CAST НИТРИТ НАТРИЯ СТ
CAST МЕТАБИСУЛЬФИТ КАЛИЯ СТ
CAST СОРБИНОВАЯ КИСЛОТА СТ
ФИГ. 5А
НАЗВАНИЕ АНАЛИЗА
22 ЯНВ
2016
0:00
25 ЯНВ
2016 6:00
18ФЕВ
2016 0:00
19ФЕВ
2016 13:25
19ФЕВ
2016 0:00
22 АПР 2016
15:35
23 АПР
2016 15:40
25 АПР
2016
8:40
25 АПР
2016
11:30
26 АПР
2016 0:00
15ИЮН
2016 0:00
17ИЮН
2016 11:53
18ИЮН
2016 0:00
4 АВГ
2016 20:40
6 АВГ
2016 8:00
7 АВГ
2018 0:00
9 АВГ
2016 7:25
КОНТРОЛЬ
ГЕМАТОЛОГИЯ
ЧИСЛО ЭРИТРОЦИТОВ
4.28
4,76
418
412
4,58
417
4,58
4,95
4,0-5,2
ГЕМОГЛОБИН*
11.8
12,8
12,8
13.0
12,7
12,9
12,6
13,8
115-15.5
ГЕМАТОКРИТ
0.35
0,39
0.39
0,38
0,38
0.38
0,38
0,41
0,35-0,45
MCV (средний объем эритроцитов)
77-95
МСН (среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците в абсолютных единицах
25-33
МСНС (средняя концентрация
гемоглобина в эритроцитах)
32-38
RDW (покажель распределения
эритроцитов по объему)
15,8 Н
18,0 Н
16,4 Н
15,4 Н
15,7 Н
15.7 Н
15,9 Н
16,6 Н
10-15
ЧИСЛО ЛЕЙКОЦИТОВ
20.0 Н
7,1
14,8 Н
14,0 Н
25,0 Н
11,2
9,4
22.3 Н
4,5-13,5
НЕЙТРОФИЛЫ АБС.
17.28 *Н
3,73
11.20 Н
11,03 Н
20,93 *Н
7.12
4.98
19.89 *Н
150-8,50
ЛИМФОЦИТЫ АБС.
1.54
2,47
2,71
2,09
2,15
3.12
3.58
1,07
100-6,50
МОНОЦИТЫ АБС.
0,88 Н
0,79
0.51
0.55
1.35 *Н
0,63
0.49
1,05 Н
0,00-0,80
ЭОЗИНОФИЛЫ АБС.
0.22
0,08
0,21
0,22
0.33
0,21
0.21
0,2?
0,00-0,40
БАЗОФИЛЫ АБС.
0.10
0,08
0,09
0,11 н
0,25 Н
0,11 н
0,12 Н
0,22 Н
0,00-0,10
ЧИСЛО ТРОМБОЦИТОВ
291
389
408
325
354
463 Н
507 Н
381
140-420
ЧИСЛО КЛЕТОК CD4 - DSP
541L
779 L
73? L
i8 L
1000-1800
ЧИСЛО КЛЕТОК CD4 - DSP
372 L
906
700-1100
ЧИСЛО КЛЕТОК CD8 - DSP
185 L
889
600-900
ЧИСЛО КЛЕТОК CD8 - DSP
255 L
549 L
428 L
383 L
800-1500
ОТНОШЕНИЕ CD4:CD8 - DSP
2,12 Н
1,42
1,72 Н
1.79 Н
ОТНОШЕНИЕ CD4:CD8 - DSP
2,25 Н
132
11-14
СЕРОЛОГИЯ
ПРОКАЛЬЦИТОНИН
- КОЛИЧЕСТВЕННОЕ
0.505 Н
0,183
0,044
0.080
0,432
0,164
0,122
8,098 Н
13.160 Н
4,454 Н
1125 Н
0,000-0,500
ELISA (твердофазный иммунофер-ментый анализ) IgG к КОКЛЮШУ В
1,58
IgG к HAEMOPHILUS INFLUENZA В
1,73
1,50
IgG к STREP PNEUMONIAE
51,38
ФИГ. 5Б
(19)
(19)
(19)
<220>
<220>
<220>
<220>
ФИГ. 1A
ФИГ. 1A
ФИГ. IB
ФИГ. IB
ФИГ. IB
1132.00
1132.00
m/z
ФИГ. 1Д
m/z
ФИГ. 1Д
1132.00
1132.00
m/z
ФИГ. 1Д
m/z
ФИГ. 1Д
1132.00
1132.00
m/z
ФИГ, IE
m/z
ФИГ, IE
m/z
ФИГ. 1Ж
m/z
ФИГ. 1Ж
1132.00
1132.00
m/z
ФИГ. Ш
m/z
ФИГ. Ш
ФИГ. 1Й
ФИГ. 1Й
фиг. т
фиг. т
ФИГ. 1Л
ФИГ. 1Л
ФИГ. 1M
ФИГ. 1M
ФИГ. 2А
ФИГ. 2А
ФИГ 2Б
ФИГ 2Б
ФИГ. 2Г
ФИГ. 2Г
ФИГ. 2Д
ФИГ. 2Д
ФИГ. 2Е
ФИГ. 2Е
ФИГ. 2Ж
ФИГ. 2Ж
ФИГ. 23
ФИГ. 23
ФИГ. т
ФИГ. т
ФИГ. 2Й
ФИГ. 2Й
ФИГ. 2К
ФИГ. 2К
ФИГ. ЗБ
ФИГ. ЗБ