|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Настоящее изобретение относится к антигенным эрреям и способам обнаружения в биологическом образце иммуноглобулинов, специфичных для любого из антигенов эррея. В частности, настоящее изобретение относится к антигенным эрреям, содержащим группы гранул с антигенным покрытием, закрепленных на твердой подложке. Кроме того, в данном документе охватываются картриджи, наборы и устройство, содержащие антигенный эррей и способы их применения.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к антигенным эрреям и способам обнаружения в биологическом образце иммуноглобулинов, специфичных для любого из антигенов эррея. В частности, настоящее изобретение относится к антигенным эрреям, содержащим группы гранул с антигенным покрытием, закрепленных на твердой подложке. Кроме того, в данном документе охватываются картриджи, наборы и устройство, содержащие антигенный эррей и способы их применения.
Евразийское (21) 201892164 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. G01N33/543 (2006.01)
2019.03.29 G01N 33/68 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2017.03.30
(54) АНТИГЕННЫЙ ЭРРЕЙ
(31) 16162859.9
(32) 2016.03.30
(33) EP
(86) PCT/EP2017/057481
(87) WO 2017/167843 2017.10.05
(71) Заявитель:
МЭКРОЭРРЭЙ ДИАГНОСТИКС ГМБХ (AT)
(72) Изобретатель:
Харванегг Кристиан, Миттерер Георг
(AT)
(74) Представитель:
Фелицына С.Б. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к антигенным эрреям и способам обнаружения в биологическом образце иммуноглобулинов, специфичных для любого из антигенов эррея. В частности, настоящее изобретение относится к антигенным эрре-ям, содержащим группы гранул с антигенным покрытием, закрепленных на твердой подложке. Кроме того, в данном документе охватываются картриджи, наборы и устройство, содержащие антигенный эррей и способы их применения.
1811202
АНТИГЕННЫЙ ЭРРЕЙ Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антигенным эрреям и способам обнаружения в биологическом образце иммуноглобулинов, специфичных для любого из антигенов эррея. В частности, настоящее изобретение относится к антигенным эрреям, содержащим группы покрытых антигеном гранул, закрепленных на твердой подложке. Кроме того, данным документом охватываются картриджи, наборы и устройство, содержащие антигенный эррей и способы их применения.
Предшествующий уровень техники
Аллергические заболевания и тесно связанные с ними заболевания, такие как бронхиальная астма, затрагивают четверть населения в промышленно развитых странах. ВОЗ назвала аллергические заболевания серьезной проблемой здравоохранения 2ГГ0 века. В настоящее время аллергия 1 типа затрагивает почти треть населения в промышленно развитых странах. Несмотря на частую безвредность, заболеваемость и тяжесть аллергии возрастают, равно как и прямые и косвенные издержки для общества. Теоретически диагностирование аллергии - простая задача, которая все еще представляет собой проблемы для диагностической отрасли и поставщиков медицинских услуг. Значительный процент пациентов не получает соответствующего диагноза и лечения. Последствиями являются снижение качества жизни, смерти, которые можно было бы предотвратить и, как правило, более высокие затраты на лечение. Чтобы оптимизировать лечение для каждого отдельного пациента, диагноз не может остановиться на идентификации источника аллергена (например, пыльца, животное, пища), но должен углубиться в профиль молекулярной сенсибилизации. Отдельные молекулы аллергенов, вызывающие болезнь, должны быть правильно идентифицированы, поскольку они отвечают за: перекрестную реактивность между источниками аллергенов, классификацию рисков (тяжелые реакции или более мягкие формы), тип симптомов (чихание, астма и т.д.), выбор терапии; и прогноз развития болезни. Эта потребность в увеличении диагностического разрешения создает множитель для ряда параметров, которые будут проверяться регулярно, то есть не соответствуют системам реимбурсации или текущими технологическими возможностями рутинной диагностической диагностики аллергии.
Таким образом, обнаружение специфических иммунных реакций в виде производства специфических антител против определенных биологических или небиологических антигенных мишеней является ключом к диагнозу аллергии типа I, но также и для других иммунологических состояний, таких как аутоиммунные заболевания и
инфекционные заболевания.
Во всех этих областях лежащее в основе состояние может быть вызвано различными антигенами, вызывающими заболевание, которые могут действовать как маркеры заболевания или антигенами, которые служат суррогатными маркерами для состояния или прогнозирования исходов, как в случае аутоиммунных заболеваний.
Термин "антиген" в общем случае относится к веществу, которое может заставить иммунную систему продуцировать против нее антительный ответ и, возможно, может вызвать биологическую реакцию, когда антитело связывается с ним в соответствующих условиях in vivo.
Теоретически, тщательный анамнез на первом стадии позволил бы сузить число тестовых параметров для второй стадии тестирования in vitro до достаточно низкого числа. Однако для ряда практических ограничений это не всегда легко достижимо, что делает применение многопараметрического диагностического тестирования для нескольких заболеваний привлекательным. Это справедливо, в частности, когда идентичный класс антител отвечает за иммунный ответ против множества антигенов (например, IgE, IgG, IgA), так что мультиантигенный мониторинг антительных ответов может способствовать улучшению медицинского обслуживания для каждого отдельного пациента. Использование биоинформатики для идентификации антигенных профилей или шаблонов или алгоритмов прогнозирования может значительно облегчить выбор диагноза и лечения и позволить врачу обеспечить более индивидуальный подход к лечению и мониторингу лечения у пациента.
Тесты in vitro для определения антигенспецифического иммуноглобулина в основном основаны на принципе ELISA, где антиген иммобилизуют на твердую фазу, которую затем инкубируют с образцом и после отмывания несвязанного образца и неспецифических антител, специфически связанные антитела обнаруживаются с помощью вторичного антитела или аффинного связующего видов, генерирующих детектируемый сигнал, известный специалистам в данной области (цвет, фотоны и т.д.).
Иммобилизация в этом контексте относится к связыванию антигена либо путем химической связи, либо с помощью других нековалентных способов прикрепления к твердой фазе, например к пластиковой поверхности или к любому другому твердому носителю с подходящими физическими и химическими свойствами для удержания антигена.
Распространенным осложнением при разработке многопараметрического иммунологического теста in vitro является гетерогенность антигенов, исходя из того, что в формате тестирования обычно можно применять только идентичные или, по меньшей
мере, сходные условия для каждого антигена во время иммобилизации и процедуры анализа. Следовательно, это приводит к компромиссу между количеством антигенов для включения в тест относительно технических характеристик теста в соответствии с измерениями, известными квалифицированному специалисту.
Подавляющее большинство соответствующих антигенов - это белки, будь то из биологических источников, таких как продукты питания, растения, бактерии или вирусы, или, как в случае аутоиммунитета, белки, произведенные самим организмом человека. Белки - по сравнению, например, с ДНК в генетическом тестировании - чрезвычайно универсальны, но также чрезвычайно неоднородны (заряд, структура, стабильность, свойства поверхности и т.д.), и необходимо учитывать не только физико-химические свойства каждого белка во время обработки и производства теста. Более важно сохранить биологическую активность, например, путем сохранения неизменной вторичной и третичной структуры биомолекул, которые создают фактические эпитопы и сайты связывания антител. В противном случае не может быть проведен функциональный анализ с клинически значимой чувствительностью и специфичностью.
Несколько релевантных антигенов при аллергических, инфекционных или аутоиммунных заболеваниях не являются свободными или растворимыми белками и нуждаются в относительно жестких химических растворителях, чтобы оставаться в растворе, что делает обычное связывание белка или обработку в процессе изготовления тестов in vitro трудоемкими. Примерами этого являются: запасные белки из орехов или семян или клеточные антигены, которые находятся в клеточных мембранах или в тканях, где они производятся локально.
В области диагностики аллергии in vitro еще одно осложнение заключается в том, что биологические источники, которые содержат антигены, вызывающие заболевание, очень гетерогенны между, но также и внутри источников. Как правило, так называемые экстракты аллергенов используются для диагностики in vivo и in vitro. Экстракт аллергена представляет собой водный сбор белкового содержимого из соответствующего источника, например, пищевых продуктов, животных, растений, пыльцы растений и т.д. В экстрактах аллергенов сложная и трудно стандартизованная смесь аллергенных и неаллергенных составляющих презентируется коже пациента или тестируется против образца крови пациентов, который может содержать специфические IgE-антитела.
Об этой сложной смеси белков, липидов, углеводов и других химических соединений известно, что только относительно небольшое количество белков или семейств белков в каждом источнике аллергена действительно является аллергенным, так что они могут вызвать в иммунной системе продуцирование антительного ответа.
Эта доля фактически релевантного антигена в подавляющем большинстве нерелевантного материала предъявляет высокие требования к способности связывания твердого материала носителя и, как правило, невозможно сделать чувствительный и специфический IgE-анализ для диагностики аллергии на простой гладкой поверхности, такой как планшет для ELISA, без дополнительного обогащения аллергенной фракции и удаления неаллергенных материалов.
В течение последних трех десятилетий многие из так называемых молекулярных антигенов, имеющих отношение к диагнозу аллергии, были идентифицированы и либо очищены из природного источника, либо получены технологией рекомбинантных ДНК. Использование молекулярных антигенов имеет много преимуществ: от стандартизации для лучшего понимания и прогнозирования молекулярной перекрестной реактивности, до классификации рисков пациентов и адаптивного лечения. Тем не менее, большой недостаток для любого рутинного тестирования заключается в том, что, во-первых, требуется гораздо большего опыта от врача в выборе параметра для тестирования. Во-вторых, создается значительно более высокая стоимость на одного пациента, если его тестируют обычными средствами однопараметрического тестирования, которые по-прежнему составляют более 99% коммерческого рынка. Более того, количество крови, которое должно быть взято у пациента, будет линейно расти с каждым обычным однопараметрическим тестом, обычно в диапазоне от 50 до 100 мкл на параметр.
Как следствие, многопараметрические (также называемые
мультиплексированными) системы анализа были разработаны и обнародованы несколькими группами, в которых используются различные базовые технологии, начиная от обычных миниатюрных систем для ELISA на основе микротитровальных планшетов (МТР) до эрреев или микроэрреев с суспензиями гранул в различных исполнениях.
Например, WO2004/104586A1 описывает способ и устройство для обнаружения аллергенспецифических антител на основе связывания таких антител с захватывающим реагентом (например, протеином А, протеином G или антителом, которое специфически связывается с иммуноглобулинами), который прикрепляется к биочипу с реактивной поверхностью. Затем связанное аллерген-специфическое антитело контактирует со своим соответствующим аллергеном, который детектируется меченым аллерген-специфическим антителом.
В US2005/079592A1 описано устройство для изготовления мультиплексного теста на гранулах, где гранулы с биологическим веществом, таким как белок, закрепленный на их поверхности, выбрасываются в определенные положения на твердофазную основу.
Кроме того, тест для анализа множества аналитов в образце описан в
US6268222B1. Тест основывается на коровых частицах или носителях, имеющих на своей поверхности множество мелких флуоресцентно меченных полимерных частиц или наночастиц.
В US2002/0015666A1 представлена система и способ хранения и дозирования множества отобранных реагентов из устройства хранения большого объема и Tai et al. ((Analytical Biochemistry, vol. 391, no. 2, August 2009, p. 98-105) описывает микрожидкостный картридж и систему для мультиплексированных иммуноанализов.
Хотя чипы на основе суспензии гранул теоретически могут иметь высокую степень мультиплексирования в небольших объемах, практические приложения ограничены типично менее чем 20 параметрами. Внутренняя изменчивость биологической матрицы, такой как сыворотка или плазма, затрудняет ее применение во всех обычных лабораториях, куда часто приходят гемолитические, липемические или иктеричные образцы. Более того, связывающая способность позволяет работать только с чистыми антигенами, а не, например, с сырыми экстрактами аллергенов в чувствительных приложениях, таких как обнаружение IgE. Кроме того, приборы основаны на FACS (сортировка флуоресцентных активированных клеток) или на других дорогих технологиях, требующих нескольких лазерных каналов и точности конфокального лазерного сканирования.
Обычные микроэрреи на стеклянных слайдах или внутри микротитровальных пластин могут преодолевать некоторые ограничения суспензионных гранул, жертвуя гибкостью смешивания реагентов по требованию, когда это необходимо для каждого образца пациента, и возможностью принципиальной оптимизации каждого параметра. Фактически, применение плоской и гомогенно активной поверхности для связывания белковых антигенов является значительным ингибирующим фактором для достижения высокой производительности. Кроме того, производство является не только дорогостоящим, но и очень сложным из-за пиколитровых количеств, которое необходимо дозировать или депонировать воспроизводимым образом. У существующих в настоящее время на рынке поставщиков технологий, нет реального высокопроизводительного инструментария для производства миллионов высококачественных диагностических микроэрреев в год. Размеры партии обычно небольшие (несколько сотен или меньше), а коэффициенты вариабельности (CV) высокие по сравнению с современными автоматизированными иммунологическими анализаторами. Подобно технологии гранул в суспензии, микроэрреи в основном работают с индикацией флуоресценции или люминесценции и требуют в этом отношении дорогостоящего инструментария. Из-за формата миниатюрного анализа автоматизация не является простой и требует сложного
оборудования и/или микрожидкостных конструкций, что опять-таки может быть проблематичным для обычных лабораторных образцов.
Другие многопараметрические тесты, такие как иммунохроматографический анализ на тест-полосках, имеют преимущество относительно низкой стоимости одного параметра, но страдают от недостатка чувствительности, воспроизводимости, редко автоматизированы и не могут иметь более 5-20 параметров на тест-полоску.
Таким образом, в этом сегменте рынка клинической химии в настоящее время нет доступных технологий, которые могут удовлетворить все потребности, в частности: низкую стоимость за тест, высокую степень мультиплексирования (> 200), воспроизводимость и отличные технические характеристики (CV, чувствительность, специфичность, диапазон измерения, количественная оценка и т.д.).
Таким образом, целью изобретения является предоставление антигенных эрреев с существенным улучшением воспроизводимости и отличными техническими характеристиками, но с сохранением возможности включения множества параметров и эффективного проведения теста.
Сущность изобретения
Задача главным образом решается заявленным объектом изобретения.
Достижения в области молекулярных исследований и мультиплексной технологии иммунотестов объединяются в данном документе для формирования продукта системы "одного окна" для тестирования in vitro, а именно антигенного эррея, включающего группы покрытых антигеном гранул, иммобилизованных на твердой подложке. Этот новый формат эрреев и способы их получения и применения были разработаны на основе преимуществ современных способов из однопараметрических анализов, в основном технических характеристик анализа с возможностью значительного мультиплексирования при оптимизации связывания для каждого отдельного антигена, но без введения существенных компромиссов по сравнению с альтернативными способами, в частности в отношении затрат на тест, масштабируемости производства или требований к сыворотке на параметр. Миниатюрный формат, например, при тестировании микроэрреями, непригоден для недорогого, но высокопроизводительного тестового формата, поэтому антигенный эррей, подробно описанный ниже, может рассматриваться как in vitro тест на макроэррее, состоящий из иммобилизованных нано- или микрочастиц, которые образуют дискретные сущности для каждой популяции антигенсвязанных гранул, но имеют значительно большие размеры, чем обычные микроэрреи.
Эта новая технология позволяет индивидуально оптимизировать связывание любого антигена (например, детектирующего антигена), такого как аллерген, с твердой
фазой, тем самым обеспечивая чувствительный, но надежный дизайн теста, и устраняя компромисс между экономической эффективностью и характеристиками параметров индивидуального теста. Приведенный в данном документе антигенный эррей и способы улучшают общую чувствительность, но, в частности, чувствительность при работе с гетерогенным исходным материалом в том, что касается двухфазного подхода связывания - первой с частицами, а второй - с твердофазной или пористой и трехмерно структурированной твердой фазой - создает множественную амплификацию поверхности, презентирующей антиген, с которой антитела могут связываться во время стадий инкубации анализа. Современные средства автоматизации и программные решения дополняют реагенты.
С помощью грамотно разработанных панелей антигенов в сочетании с устойчивостью, чувствительностью и специфичностью анализа, а также его легким применением, обеспечивается лучшая клиническая интерпретация результатов и прогнозирование перекрестной реактивности и, следовательно, выбор эффективных способов лечения.
Таким образом, описанный в данном документе эррей и способы впервые обеспечивают тест, который может изменить рутину диагностики аллергии, а также другие иммунологические состояния, основанные на специфическом и надежном обнаружении антител, например, инфекционное или аутоиммунное заболевание. В частности, в отношении диагностики аллергии, в настоящее время тесты in vitro проводятся как вторая или третья стадия диагностического процесса, но всесторонние, с высоким разрешением, но чувствительные скрининг-тесты, описанные в данном документе, могут стать инструментом первого уровня, только для сопровождения подтверждающего анамнеза, кожных проб или провокации. Преимущества будут применяться ко всей цепочке создания стоимости, но, самое главное, к пациентам, страдающим иммунологическими заболеваниями.
Приведенное в данном документе в одном аспекте представляет собой антигенный эррей, содержащий группы покрытых антигеном гранул, закрепленных на твердом носителе, причем каждая группа включает
(i) гранулы, покрытые одним детектирующим антигеном, или
(ii) гранулы, покрытые набором детектирующих антигенов, предпочтительно, в которых твердый носитель представляет собой лист или пластину, а детектирующий антиген представляет собой аллерген, маркер инфекции или аутоантиген.
В некоторых воплощениях детектирующий антиген представляет собой биомолекулу, состоящую из нуклеиновых кислот и/или аминокислот, предпочтительно
белка, пептида, антитела или молекулы ДНК или органического или неорганического химического соединения.
В некоторых воплощениях детектирующий антиген является аллергеном.
В некоторых воплощениях детектирующий антиген является маркером инфекции.
В некоторых воплощениях детектирующий антиген является аутоантигеном.
В некоторых воплощениях детектирующий антиген представляет собой антиген, полученный по технологии рекомбинантной ДНК, или антиген, выделенный и очищенный из биологического материала.
В некоторых воплощениях, где гранулы покрыты набором детектирующих антигенов, указанный набор детектирующих антигенов получают из экстракта или лизата биологического исходного материала, содержащего более одного антигена, или получают из очищенной фракции таких экстрактов или лизатов или очищенной фракции материалов, полученных из культуры клеток.
В некоторых воплощениях детектирующий антиген содержит один эпитоп, одну макромолекулу с несколькими связываемыми антителом эпитопами или смесь различных белков с различными антигенами, содержащими множество эпитопов.
В некоторых воплощениях гранулы представляют собой микро- или наночастицы. В частности, гранулы имеют размер от 5 до 500 нм в диаметре, предпочтительно от 200 до 500 нм в диаметре.
В некоторых воплощениях гранулы представляют собой гранулы из латекса, полимерные пластиковые гранулы, предпочтительно гранулы из полистирола, гранулы из биосовместимых полимеров или стеклянные гранулы, предпочтительно гранулы из двуокиси кремния. В частности, поверхность гранул является пористой или непористой.
В некоторых воплощениях детектирующий антиген связывается ковалентно или нековалентно с гранулами. В частности, детектирующий антиген связывается с гранулами нековалентно пассивной адсорбцией, предпочтительно гидрофобным и/или электростатическим присоединением.
В некоторых воплощениях детектирующий антиген связывается через антигенные спейсеры. В частности, детектирующий антиген связывается таким образом, при котором создается предпочтительная ориентация для презентации эпитопов, представленных на связанном антигене.
В некоторых воплощениях твердый носитель представляет собой лист или пластину пористого или непористого материала, предпочтительно нитроцеллюлозный лист, более предпочтительно ламинированный нитроцеллюлозный лист.
В некоторых воплощениях эррей содержит, по меньшей мере, 25 различных групп.
В частности, гранулы в пределах эррея или в пределах одной группы имеют одинаковый или разный тип. В некоторых воплощениях группы гранул с антигенным покрытием фиксируются на твердом носителе с использованием контактных способов или бесконтактных способов, предпочтительно с использованием соленоидной системы дозирования. В частности, каждая группа фиксируется как имеющий адрес элемент в прямоугольном эррее или в плотноупакованном эррее (orange-packed array), предпочтительно при плотностях 1 адресуемый элемент на мм2.
В некоторых воплощениях гранулы антигенного эррея, описанные в данном документе, принадлежат к одному или разным типам. В частности, гранулы из разных групп гранул могут быть одного типа (например, вся группа гранул антигенного эррея содержит гранулы из полистирола диаметром 200-500 нм), или гранулы из разных групп гранул могут быть разных типов (например, группа 1 содержит гранулы из полистирола, а группа 2 содержит стеклянные гранулы). Также гранулы в пределах одной группы могут быть одного или разных типов.
В одном аспекте, представленное в данном документе является аллергеным эрреем, включающим группы покрытых аллергеном гранул, закрепленных на твердом носителе, причем каждая группа включает
(i) гранулы, покрытые одним аллергеном, или
(ii) гранулы, покрытые набором аллергенов, предпочтительно аллергенным
экстрактом, предпочтительно, где твердый носитель представляет собой лист или
пластину.
В следующем аспекте, представленное в данном документе является способами детектирования иммуноглобулина, специфичного для детектирующего антигена, или для набора детектирующих антигенов, предпочтительно, где детектирующий антиген или набор детектирующих антигенов является аллергеном, маркером инфекции или аутоантигеном, причем способы, включают
(i) обеспечение антигенного эррея в соответствии с любым из описанных в данном документе антигенных эрреев,
(ii) инкубацию эррея с образцом,
(ш) инкубацию эррея с детектирующим реагентом,
(iv) необязательно инкубацию эррея с реагентом образования сигнала, и
(v) изменение детектируемого сигнала.
В некоторых воплощениях иммуноглобулин представляет собой IgE-антитело, ассоциированное с аллергией.
В некоторых воплощениях иммуноглобулин представляет собой IgG-антитело,
ассоциированное с инфекцией или аутоиммунным заболеванием.
Далее в данном документе описаны способы детектирования IgE-антитела, ассоциированного с аллергией, которые включают
(i) предоставление аллергенного чипа, описанного в данном документе,
(ii) инкубацию эррея с образцом,
(ш) инкубацию эррея с детектирующим реагентом, предпочтительно IgE-специфическим антителом или IgE-специфическим аптамером,
(iv) необязательно инкубацию эррея с реагентом образования сигнала и
(v) измерение детектируемого сигнала.
В некоторых воплощениях образец представляет собой биологическую жидкость, предпочтительно сыворотку, цельную или обработанную кровь, носовую жидкость или мочу, клеточный лизат или гомогенат ткани из объекта или пула объектов.
В некоторых воплощениях детектирующий реагент представляет собой аффинное связующее вещество, специфичное к иммуноглобулину, предпочтительно антитело (например, анти-IgE или анти-IgG антитело), аптамер (например, IgE-специфичный аптамер или IgG-специфичный аптамер) или аффитело. В частности, детектирующий реагент (i) непосредственно метится, предпочтительно цветным или флуоресцентным соединением или наночастицами золота или окрашенными наночастицами латекса; или (ii) конъюгируется с ферментом (например, анти-IgE или анти-IgG антителом непосредственно с детектируемой меткой или конъюгированное с ферментом).
В некоторых воплощениях способы дополнительно включают инкубацию эррея с реагентом образования сигнала в соответствии со стадией (iv) способа, описанного в данном документе, в котором детектирующий реагент конъюгирован с ферментом, и реагент образования сигнала содержит субстрат для указанного фермента.
В некоторых воплощениях способ дополнительно включает инкубацию описанного в данном документе антигенного эррея со стоп-раствором после стадии (iv) способов, описанных в данном документе, то есть добавления стоп-раствора после инкубации антигенного эррея с реагентом образования сигнала для прекращения образования сигнала.
Другим аспектом, представленным в данном документе, является картридж, содержащий тестовую камеру для любого из описанных в данном документе антигенных эрреев, резервуар для жидких отходов и, необязательно, штрих-код. Картридж может дополнительно включать резервуары или интегрированные флаконы для любого одного или более детектирующих реагентов, реагента образования сигнала, стоп-раствора, одного или нескольких буферов и одного или нескольких контрольных образцов.
Кроме того, представленный в данном документе представляет собой набор, содержащий любой из эрреев антигенов, описанных в данном документе, детектирующий реагент, один или несколько буферов, один или несколько контрольных образцов, инструкции для применения набора в любом из способов, описанных в данном документе, и, необязательно, реагент образования сигнала. Набор может дополнительно включать стоп-раствор.
В другом аспекте, представленном в данном документе, предлагается устройство, включающее камеру для одного или нескольких картриджей, описанных в данном документе, пипетку и устройство для обнаружения сигнала.
Чертежи
Фигура 1А и В: B/W представление 245 аллергенов, специфические измерения IgE и 5 стандартов IgE (верхний правый угол) в возрастающих концентрациях после проведения стандартного анализа с пулом человеческой сыворотки от аллергических индивидуумов (1А) или с отрицательным контролем (1В) и сканирования изображения с помощью планшетного сканера. Исходные изображения были в 16-битном формате TIFF в оттенках серого.
Фигура 1С: схематическое расположение позиций аллергенов, соответствующих фигурам 1А и В. Каждый аллергенный элемент составляет ок. 600 мкм в диаметре, расстояние между элементами составляло 1 мм в каждом направлении.
Фигура 2: Оценка теста путем сравнения с эталонным способом.
Фигура 3: Сравнение эррея с молекулярными аллергенами, непосредственно иммобилизованными на твердой подложке, и эррея с наночастицами в сочетании с теми же молекулярными аллергенами и иммобилизованными на твердом носителе того же типа. Графическое представление результатов из таблицы 4.
Фигура 4: Специфические измерения IgE с 8 различными положительными образцами и одним отрицательным по Pru р 3, основному аллергену персика.
Фигура 5: Технические характеристики и сравнение доступных многопараметрических анализов для IgE-специфических измерений. (*) IgE-специфические измерения по определению являются полуколичественными, поскольку нет международного эталона для подготовки индивидуальных аллергенов. (**) Средняя линейная корреляция тестирования> 100 образцов и сравнение компонентов аллергенов и экстрактов аллергенов с помощью ImmunoCAP и ImmunoCAP ISAC.
Фигура 6: Сравнение измерений IgE в образце, испытанном в день 0 и день 330, с использованием того же препарата гранул, покрытых аллергеном.
Подробное описание изобретения
Конкретные термины, используемые в описании, имеют следующее значение.
Используемый в данном документе термин "антиген" относится к веществу, которое может привести к тому, что иммунная система даст антительный ответ против него и, возможно, может вызвать биологическую реакцию, когда антитело связывается с ним в соответствующих условиях in vivo. Термин антиген, используемый в данном документе, относится к целой молекуле-мишени или фрагменту такой молекулы, распознаваемых антигенсвязывающим сайтом. В частности, субструктуры антигена, например полипептидной или углеводной структуры, обычно называемые "эпитопами", которые являются иммунологически релевантными, могут быть распознаны таким антигенсвязывающим сайтом.
Термин "антиген детекции", "антиген, который детектируется" или "детектирующий антиген" относится к антигену, определяющему антигенспецифическую реакцию, такую как реакция антитело-антиген. Термин "антиген", "антиген детекции", "антиген, который детектируется" и "детектирующий антиген" используются в данном документе взаимозаменяемо.
Термин "набор детектирующих антигенов" относится к одному или нескольким антигенам, определяющим реакцию, специфичную для состояния. Состоянием может быть заболевание или расстройство или предрасположенность к ним, такое как аллергия или аутоиммунное заболевание; этот термин включает состояния, которые не показывают каких-либо физических и/или клинических симптомов. Реакцией, специфичной для этого состояния, может быть реакция антитело-антиген, по меньшей мере, с одним антителом, которое характерно для/ассоциировано с указанным состоянием, и это состояние может быть определено такой реакцией; например, антитело IgE, специфичное к аллергену, если состояние является аллергией. Используемый в данном документе термин "набор антигенов" относится к одному или нескольким антигенам, полученным из того же биологического исходного материала, например, полученному из клеточного лизата, клеточного или тканевого гомогената или его очищенной фракции.
Термин "эпитоп" относится к той части антигена, которая определяет ее иммунологическую специфичность. Используемый в данном документе термин "эпитоп", в частности, относится к молекулярной структуре, которая может полностью образовывать специфический партнер связывания или быть частью специфического партнера связывания с участком связывания антитела. Эпитоп может либо состоять из углевода, пептидной структуры, жирной кислоты, органического, биохимического или неорганического вещества или его производных и любых их комбинаций.
Эпитопы могут быть либо линейными, либо конформационными эпитопами. Линейный эпитоп состоит из одного сегмента первичной последовательности полипептидной или углеводной цепи. Линейные эпитопы могут быть смежными или перекрывающимися. Конформационные эпитопы состоят из аминокислот или углеводов, объединенных путем сворачивания полипептида с образованием третичной структуры, и аминокислоты не обязательно смежны друг с другом в линейной последовательности. В частности, в отношении полипептидных антигенов конформационный или прерывистый эпитоп характеризуется наличием двух или более дискретных аминокислотных остатков, разделенных в первичной последовательности, но собирающихся в устойчивую структуру на поверхности молекулы, когда полипептид складывается в нативный белок/антиген.
Обычно эпитопом является полипептид или полисахарид в природном антигене. Как правило, В-клеточный эпитоп будет включать, по меньшей мере, около 5 аминокислот, но может иметь как минимум 3-4 аминокислоты. Эпитопы представляют собой формы, распознаваемые иммунными В- и Т-клетками, а также могут быть представлены неантигенными пептидами, и другими молекулами, которые обладают той же формой эпитопа, которая присутствует в нативном антигене. Примером элемента с формой эпитопа является аптамер. Аптамер - это молекула, которая обеспечивает форму, которая может имитировать иммунологический эпитоп. Для представления отдельных эпитопов могут использоваться порции молекул, таких как пептиды или молекулы, представляющие посттрансляционные модификации, углеводы, липиды и другие молекулы.
Термин "эррей" относится к набору групп гранул с антигенным покрытием, где каждая группа представляет собой пространственно разделенный адресуемый элемент. Такие элементы или молекулярные объекты могут быть пространственно адресуемыми, например, эррей на основе микротитрационных планшетов, или иммобилизованные на плоских поверхностях, где каждый элемент присутствует в разных координатах X и Y. Для такой пространственной адресации, также известной как кодирование, положение молекулы фиксировано, и это положение коррелирует с идентификацией, что позволяет идентифицировать специфичность антител, содержащихся в образце, для тестирования в эррее. Этот тип пространственного эррея обычно синтезируется или наносится пятнами на плоской подложке, создавая большое количество различных элементов, плотно расположенных в небольшой области.
Если не указано иное, термины "частицы", "наночастицы", "сферы", "микросферы" и "гранулы", используемые в данном документе, взаимозаменяемы и относятся к небольшим инертным носителям круглой, овальной или сферической формы,
которые могут быть покрыты антигеном (детектирующим антигеном) или набором антигенов (набором детектирующих антигенов).
Используемый в данном документе термин "группа гранул" относится к популяции гранул, связанных или покрытых (используемых в данном документе взаимозаменяемо) специфическим детектирующим антигеном, который может быть идентифицирован с антителом, специфичным для указанного антигена, в реакции антитело-антиген или популяции гранул, покрытых набором детектирующих антигенов, которые могут быть идентифицированы, по меньшей мере, одним антителом, специфичным для одного из детектирующих антигенов набора.
Термин "тип гранулы" относится к характеристике гранул, определяемых их размером, материалом, молекулярными свойствами поверхностного покрытия, гидрофобностью, электрическим зарядом, поверхностными свойствами (пористыми или непористыми поверхностями), химией связывания или химическим линкером/химией спейсера. Гранулы одного типа имеют одинаковый размер, материал, свойство поверхности, и для соединения антигена используется одна и та же химия. Гранулы другого типа представляют собой гранулы, которые отличаются, по меньшей мере, одной из этих характеристик.
Используемый в данном документе термин "подложка", "твердая подложка", "носитель", "твердый носитель" или "твердая фаза" относится к любой твердой поверхности, на которую могут быть осаждены и иммобилизованы адресуемые элементы/молекулярные объекты (гранулы с антигенным покрытием) для проведения анализов и реакций.
Термин "иммобилизованный" или "фиксированный" используется в данном документе взаимозаменяемо и означает, что материал или частица, в частности гранулят с антигенным покрытием, либо ковалентно, либо нековалентно связывают с твердой подложкой. Термин относится к материалу или частице, относительно стационарному и не высвобождаемому во время стадий инкубации и или промывки, осуществленных с твердой подложкой.
Термин "иммуноглобулин (Ig)" относится к придающей иммунитет части глобулиновых белков сыворотки, и к другим гликопротеинам, которые имеют одинаковые функциональные характеристики. Они обычно содержат четыре полипептидные цепи -две идентичные легкие цепи и две идентичные тяжелые цепи, которые связаны между собой дисульфидными связями.
Термин "IgG" относится к одному из изотипов Ig, обнаруженному в сыворотке, который является основным антителом, возникшим в ответ на антиген и имеющим четыре
основных подтипа: IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4.
Термин "IgE" относится к одному из изотипов Ig, обнаруженному в сыворотке, которая плотно связывается с тучной клеткой и базофилами, а также, когда дополнительно связана с антигеном, вызывает высвобождение гистамина и других медиаторов немедленной гиперчувствительности. Этот изотип Ig играет главную роль в преобладающих аллергических реакциях типа I, таких как сенная лихорадка, астма и анафилаксия.
Используемый в данном документе термин "антитело" относится к полипептидам или белкам, которые состоят из или содержат домены антител, которые понимаются как константные и/или вариабельные домены тяжелых и/или легких цепей иммуноглобулинов с или без линкерной последовательности. Полипептиды понимаются как домены антител, если они содержат структуру бета-бочки, состоящую, по меньшей мере, из двух бета-тяжей структуры домена антитела, связанных петлевой последовательностью. Домены антител могут иметь нативную структуру или модифицированы путем мутагенеза или дериватизации, например, для модификации антигенсвязывающих свойств или любого другого свойства, такого как стабильность или функциональные свойства, такие как связывание с Fc-рецепторами FcRn и/или рецептором Fcgamma. Термин "антитело" относится к антителам животного происхождения, включая такие виды млекопитающих, как, например, человек, мышь, кролик, крыса, коза, лама, корова и лошадь, или виды птиц, такие как курица, причем этот термин, в частности, включает рекомбинантные антитела, которые основаны на последовательностях животного происхождения.
Антитела могут существовать как интактные иммуноглобулины или как модификации в различных формах, включая, например, фрагмент Fv, содержащий только вариабельные области легкой и тяжелой цепи, фрагмент Fab или (Fab)2, содержащий вариабельные области и части константной области, одноцепочечное антитело и тому подобное. Антитело может быть животного (особенно из мыши, козы, кролика или крысы) или человеческого происхождения или может быть химерным. Используемый в данном документе термин "антитело" включает эти различные формы, которые могут быть получены путем модификации целых антител и/или синтезированные de novo с использованием методик рекомбинантных ДНК. "Моноклональные" антитела относятся к отдельным антителам или популяциям отдельных антител, в которых антитела идентичны по специфичности и аффинности, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах.
Используемый в данном документе термин "метка" относится к детектируемому соединению или композиции, которое прямо или косвенно конъюгировано с антителом
или фрагментом антитела, так, что образуется "меченое" антител о/фрагмент антитела или "детектирующее антитело". Метка может быть детектирована сама по себе, например, радиоизотопные метки, цветные или флуоресцентные метки, наночастицы золота или наночастицы цветного латекса или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции, которые могут быть обнаружены.
Используемый в данном документе термин "экстракт" относится к одному или нескольким веществам, обычно в концентрированной форме, полученным путем обработки материала, такого как биологический материал, из которого выделяется экстракт, с помощью растворителя, после чего растворитель удаляется. Термин "экстракт" также будет охватывать одно или несколько веществ, полученных путем воздействия на первичный экстракт последующих процессов очистки, известных специалистам в данной области техники. Как правило, экстракт содержит смесь белков и других молекул.
Экстракт аллергена обычно получают экстракцией аллергена(ов) из биологического исходного материала. Биологический исходный материал обычно представляет собой многоклеточный или неклеточный материал из многоклеточного организма из царств грибов, растений или животных или в некоторых случаях бактериального происхождения. Такой экстракт аллергена может быть получен водной экстракцией водорастворимого материала с использованием механических процедур гомогенизации (например, энергичного смешивания и перемешивания) с последующими стадиями очистки, такими как фильтрация или фракционирование, для получения раствора, т.е. экстракта. Экстракт затем может быть подвергнут дальнейшей очистке и/или обработке, такой как, например, сушка вымораживанием, удаляя по существу всю воду. Как правило, экстракт аллергена содержит смесь белков и других молекул.
В настоящем контексте термин "аллерген" относится к любому природному белку, его изоформам, модифицированному белку, рекомбинантному белку, рекомбинантному мутантному белку или любому его фрагменту белка или смесям белков, которые способны индуцировать аллергию, т.е. IgE-опосредованные реакции при их повторном воздействии на человека. Используемый в данном документе термин "набор аллергенов" относится к одному или нескольким аллергенам, полученным из одного и того же биологического исходного материала для аллергенов, например, полученным из аллергенного экстракта биологического исходного материала для аллергена.
Термин "биологический исходный материал" или "биологический материал" относится к любому материалу, происходящему из любого живого организма. В
частности, речь идет об отделенных клетках, кусочках ткани, бактериях, вирусах, дрожжах и субфракциях (таких как отделенные ядра или цитоплазма) многих из предыдущих источников (содержащих один или несколько антигенов).
Выражение "биологический исходный материал для аллергенов", используемый в данном документе, относится к любому биологическому материалу, содержащему один или несколько аллергенов. Примерами таких материалов являются РМВ (очищенное тело клеща) или WMC (цельная клеточная культура) акарид, обезжиренная или необезжиренная пыльца, например, трав, злаков, сорняков и деревьев, животная шерсть и перхоть, шкуры, грибные мицелий и споры, тела, яд или слюна насекомых и продукты питания.
Термин "аутоиммунное заболевание" включает любые заболевания, связанные с патогенными аутоантителами, заболевания, которые, скорее всего, опосредуются Т-клетками и заболевания, для которых доказательства патогенного процесса являются только прямыми. Указанные расстройства могут быть, без ограничения указанным, острой идиопатической тромбоцитопенией, аутоиммунными гемолитическими анаэмиями, аутоиммунной нейтропенией, аутоиммунной эритробластопенией, миастенией, синдромом Гийена-Барре, хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатией, рассеянным склерозом, моноклональными гаммапатиями с антимагневой активностью, адренолеукодистрофией, болезнью Грейвса, системной красной волчанкой, анти-кардиолипиновыми антителами и привычным выкидышем, рефрактерным полимиозитом, ювенильным ревматоидным артритом, ревматоидным артритом, синдромом Фелити, язвенным колитом, болезнью Крона, некоторыми гломерулонефритами, ANCA-позитивным системным васкулитом, болезнью Кавасаки, анти-фактор VII аутоиммунным заболеванием и воспалительной ретинопатией.
Термин "ковалентная связь" или "ковалентное взаимодействие" относится к связям или взаимодействиям, созданным совместным использованием пары электронов между атомами. Ковалентные связи/взаимодействия включают, без ограничения указанным, атомные связи, гомополярные связи, о-о-взаимодействия, о-л> взаимодействия, двухэлектронные связи, одиночные связи, двойные связи, тройные связи, а также комбинации этих взаимодействий/связей. Указанные взаимодействия/связи могут быть полярными или поляризованными или могут быть неполярными или неполяризованными.
"Нековалентная" относится к ассоциациям между атомами и молекулами, такими как ионные взаимодействия (например, диполь-дипольные взаимодействия, ионное спаривание и образование соли), водородная связь, неполярные взаимодействия, комплексы включения, клатрирование, ван-дер-ваальсовы взаимодействия (например, пи
пи стэкинг) и их комбинации.
Термин "пассивная адсорбция", "адсорбция" или "абсорбция" относится к адгезии атомов, ионов или молекул из газа, жидкости или растворенного твердого вещества с поверхностью. Механизм адсорбции основан главным образом на гидрофобных (типа Ван-дер-Ваальса, Лондона) сцеплениях между гидрофобными частями адсорбированной молекулы и поверхностью. Большинство гидрофобных молекул прилипают к поверхности пассивной адсорбцией. В случае менее гидрофобных молекул (или более гидрофильных поверхностей, таких как СООН- или №Г2-модифицированные поверхности) может происходить связывание как с ионными взаимодействиями, так и с гидрофобными взаимодействиями.
Используемый в данном документе термин "электростатическое взаимодействие" или "электростатическое присоединение" относится к любому взаимодействию между заряженными компонентами, молекулами или ионами из-за сил притяжения, когда компоненты противоположного электрического заряда притягиваются друг к другу. Примеры включают, без ограничения указанным: ионные взаимодействия, ковалентные взаимодействия, взаимодействия между ионом и диполем (ионная и полярная молекула), взаимодействия между двумя диполями (частичные заряды полярных молекул), водородные связи и лондонные дисперсионные связи (индуцированные диполи поляризуемых молекул).
"Детектируемый сигнал" относится к физическому или химическому сигналу, который может быть измерен визуальными или инструментальными способами и включает колориметрические, флуоресцентные, электрические и хемилюминесцентные сигналы.
"Контрольное значение" или "контрольный сигнал" относится к эталонному значению, с которым можно сравнить сигнал, полученный с образцом объекта или пула объектов. Отрицательный контрольный сигнал может быть получен, например, (i) с образцом, который не содержит иммуноглобулина(ов), (ii) с гранулами, которые не покрыты каким-либо антигеном, то есть непокрытые гранулы, которые иммобилизованы на твердой подложке (ш) с материалом твердой подложки самим по себе без каких-либо гранул, закрепленных на нем, или (iv) с образцом здорового индивидуума или пула или группы здоровых индивидуумов. "Сигнал положительного контроля" можно получить, например, с помощью коммерческого эталонного образца с указанным количеством анализируемого вещества (то есть полного иммуноглобулина или определенного иммуноглобулина со специфичностью к конкретному антигену/аллергену), образец, который был подтвержден или испытан положительным в стандартном анализе или с
гранулами в сочетании с определенным количеством иммуноглобулина, которое должно быть обнаружено и зафиксировано на твердой подложке.
Термин "образец" относится к практически любому жидкому образцу. Образец может быть получен из любого желаемого источника, такого как физиологическая жидкость, например, кровь, слюна, глазная жидкость, мозговая спинномозговая жидкость, пот, моча, молоко, асцитная жидкость, слизистая, синовиальная жидкость, перитонеальная жидкость, амниотическая жидкость или т.п. Жидкий контрольный образец может быть предварительно обработан до применения, например, приготовлением сыворотки или плазмы из крови, разбавлением вязких жидкостей или тому подобное; способы обработки также могут включать разделение, фильтрацию, дистилляцию, концентрацию, инактивацию интерферирующих компонентов и добавление реагентов. Кроме того, твердое вещество можно использовать после его модификации с образованием жидкой среды. Этот термин применяется к любой жидкости организма, которая может быть использована в анализе in vitro.
Используемый в данном документе термин "объект" или "пациент" относится к теплокровному млекопитающему, в частности человеку или животному, не относящемуся к человеку.
нермин "биомолекула" относится к любой органической молекуле, которая является частью живого организма. Биомолекула включает нуклеотид, полинуклеотид, олигонуклеотид, пептид, белок, углевод, гликозилированную молекулу, липид и другие. Используемый в данном документе термин также относится к органическим молекулам, имитирующим структуру и специфичность связывания биомолекулы, например, аптамеру, который таким образом распознается тем же антителом, что и в случае биомолекулы.
"Технология рекомбинантных ДНК" относится к процедурам молекулярной биологии для получения последовательности рекомбинантной нуклеиновой кислоты, как описано, например, в Laboratory Manuals, edited by Weigel and Glazebrook, 2002 Cold Spring Harbor Lab Press; и Sambrook et al, 1989 Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Термин "антигенные спейсеры" относится к химическим линкерам, которые могут быть использованы для введения промежуточного слоя, создающего определенное расстояние между твердой поверхностью и связанным антигеном, а также к определению химических свойств указанного промежуточного слоя, например, в Bioconjugate Techniques, Greg Т. Hermanson, Academic Press, 25.07.2013
Целью изобретения является создание антигенного эррея, содержащей группы
гранул с антигенным покрытием, закрепленных на твердом носителе. В некоторых воплощениях гранулы, покрытые антигеном, представляют собой гранулы, покрытые одним детектирующим антигеном (например, антигеном, полученным по технологии рекомбинантной ДНК или выделенным и очищенным антигеном из биологического источника). В некоторых воплощениях гранулы, покрытые антигеном, являются гранулами, покрытыми набором детектирующих антигенов (например, антигенов, полученных из экстракта, такого как экстракт аллергена, антигенов, полученных из лизата, такого как лизат бактериальных клеток, антигенов, полученных из клеточного или тканевого гомогената или их очищенной фракцией).
Например, первая группа гранул связана с определенным (первым) детектирующим антигеном, полученным с помощью технологии рекомбинантной ДНК, вторая группа гранул связана с другим (вторым) детектирующим антигеном, очищенным из биологического материала, третья группа соединена с набором детектирующих антигенов, которые опять отличаются от первого и второго детектирующего антигена, набор детектирующих антигенов получают из клеточного лизата, четвертая группа гранул - с еще одним набором детектирующих антигенов, который получают из экстракта, и так далее. Таким образом, различные группы гранул с антигенным покрытием (популяция гранул) антигенного эррея различаются по антигену (например, детектируемому антигену или набору детектирующих антигенов), соединенному с ними.
Такие группы гранул с различными детектирующими антигенами или набором детектирующих антигенов могут быть получены с использованием различных источников (например, лизата, экстракта, рекомбинантного продуцирования) детектирующего антигена, различных типов гранул (гранулы разного размера и/или материала) и/или разных химий связывания (нековалентные или ковалентно связанные антигены).
Антигенный эррей, описанный в данном документе, включает, по меньшей мере, 25 различных групп гранул. В некоторых воплощениях описанный в данном документе антигенный эррей содержит, по меньшей мере, любую из 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 или 250 групп гранул. В некоторых воплощениях антигенный эррей содержит вплоть до любого числа из 300, 400, 500 или 1000 групп гранул. В некоторых воплощениях антигенный эррей содержит от 200 до 500 групп гранул, предпочтительно от 250 до 350 групп гранул.
В некоторых воплощениях группы гранул в антигенной эррее включают гранулы только одного типа (например, только гранулы из полистирола, только гранулы диаметром 200-500 нм и т.д.). В некоторых воплощениях группы гранул в антигенной эррее включают группы с различными типами гранул (например, гранулы из полистирола
диаметром 350 нм, латексные гранулы диаметром 300-500 нм и стеклянные гранулы диаметром 5-500 нм). В некоторых воплощениях группы гранул в антигенной эррее получают с использованием одной и той же химии связывания (например, различные детектируемые антигены/набор детектирующих антигенов связаны с различными группами гранул посредством пассивной адсорбции). В некоторых воплощениях химия связывания отличается между различными группами гранул (например, первый детектирующий антиген/набор детектирующих антигенов соединен с первой группой гранул с использованием пассивной адсорбции, а второй детектирующий антиген/набор детектирующих антигенов связан со второй группой гранул с использованием ковалентного линкера). В частности, антигенный эррей может содержать первую группу гранул, содержащих микрогранулы из полистирола диаметром около 200 нм, где первый детектирующий антиген соединяется с поверхностью посредством пассивной адсорбции, вторая группа гранул, содержащих микрогранулы из полистирола с диаметром около 500 нм и поверхностное покрытие NH2, где второй детектирующий антиген соединен с поверхностью через сшивающий агент EGS (этиленгликоль бис (сукцинимидилсукцинат)), который вводит спейсер с 12 атомами, третья группа гранул, содержащих микрогранулы из полистирола с диаметром около 200 нм и поверхностным покрытием СООН, где третий детектирующий антиген связан с поверхностью с помощью химии связывания посредством карбодиимида с EDC нулевой длины.
В некоторых воплощениях гранулы в пределах одной группы гранул (т.е. популяция гранул, покрытых одним и тем же детектирующим антигеном или популяция гранул, покрытых одним и тем же набором детектирующих антигенов) содержат гранулы одного и того же типа. В некоторых воплощениях гранулы в пределах одной группы гранул (то есть популяции гранул, покрытых одним и тем же детектирующим антигеном или популяции гранул, покрытых одним и тем же набором детектирующих антигенов) содержат различные типы гранул. Например, в одной группе гранул некоторые гранулы (первая подгруппа/тип гранул) представляют собой гранулы диаметром около 200 нм, в то время как некоторые другие гранулы (вторая подгруппа/тип гранул) имеют диаметр около 350 нм. В некоторых воплощениях гранулы диаметром около 200 нм предпочтительно связывают с первым детектирующим антигеном путем смешивания экстракта или лизата (т.е. смеси белков и других молекул) с указанными 200 нм гранулами и гранулами диаметром 350 нм предпочтительно связывают со вторым детектирующим антигеном, смешивая их с одним и тем же экстрактом, а затем объединяют два типа гранул в сочетании с двумя различными детектирующими антигенами, полученными из того же экстракта или лизата, тем самым создавая группу гранул разных типов с покрытием с
набором детектирующих антигенов.
В некоторых воплощениях описанная в данном документе антигенный эррей представляет собой аллергенный эррей, включающий, по меньшей мере, одну из 25, 50, 75 100, 125, 150, 175, 200 или 250 групп гранул, связанных с детектирующим аллергеном (например, аллергеном, продуцируемым технологией рекомбинантных ДНК или очищенным природным аллергеном) или набором детектирующих аллергенов (например, гранул в сочетании с экстрактом аллергена). В некоторых воплощениях аллергенный эррей включает группы гранул в количестве вплоть до любого числа из 300, 400, 500 или 1000. В некоторых воплощениях аллергенный эррей включает от 200 до 500 групп гранул, предпочтительнее от 250 до 350 групп гранул.
В некоторых воплощениях аллергенный эррей включает одну или несколько групп гранул, покрытых молекулярным/рекомбинантно продуцируемым аллергеном, одну или несколько групп гранул, покрытых экстрактом аллергена, и/или одну или несколько групп гранул, покрытых одним или несколькими аллергенами изолированными и очищенными из биологического источника.
В некоторых воплощениях описанная в данном документе эррей антигена или аллергена включает, по меньшей мере, 200 групп гранул (например, от 200 до 300 групп гранул), закрепленных на твердой пластине или листе (например, нитроцеллюлозной мембране), где эррей содержит (i) группы гранул (гранулы группы А) каждая группа (из гранул группы А) покрыта другим детектирующим антигеном/алл ер геном (например, группа 1, покрытая рекомбинантным первым антигеном/аллергеном, группа 2, покрытая вторым антигеном/алл ер геном, очищенным из экстракта или лизата, группа 3, покрытая рекомбинантным продуцируемым третьим антигеном/аллергеном и т.д.) и (ii) группы гранул (гранулы группы В), каждая группа (из гранул группы В), покрытая другим набором детектирующих антигенов/набором аллергенов (например, группа I покрыта первым экстрактом антигена/аллергена, полученного из первого биологического материала, группа II покрыта вторым экстрактом антигена/аллергена, полученного из второго биологического материала) и где группы гранул (гранулы обеих групп А и В) являются гранулами, изготовленными (например, гранулы из полистирола) с диаметром от 200 до 500 нм (например, диаметром около 350 нм), а также детектирующие антигены/аллергены или набор детектирующих антигенов/набор аллергенов соединены с гранулами ковалентно или нековалентно через одни и те же или разные химические связи. В некоторых воплощениях различные детектируемые антигены/аллергены или их наборы соединены с гранулами посредством пассивной адсорбции. В некоторых воплощениях часть детектирующих антигенов/аллергенов или их наборов присоединена посредством
пассивной адсорбции, в то время как другие детектирующие антигены/аллергены связаны ковалентно, например, посредством EGS-линкеров или EDC-химии.
В некоторых воплощениях группы гранул расположены на антигенном или аллергенном эррее, описанном в данном документе, в прямоугольной структуре рядов и столбцов или в плотно упакованном паттерне. В некоторых воплощениях описанный в данном документе антигенный или аллергенный эррей дополнительно включает положительные и/или отрицательные контрольные пятна в определенных положениях в эррее (например, пятна маркера), которые могут использоваться для обнаружения и идентификации гранул с антигенным покрытием в эррее.
Антигены
Антигены - это вещества, которые могут вызывать в иммунной системе ответ против себя. Антигены обычно представляют собой макромолекулы или молекулы, такие как белки, пептиды, полисахариды, антитела, полинуклеотиды, РНК, ДНК, липиды, гликозилированные молекулы, углеводы, органические или неорганические химические соединения, природные модификации таких молекул, аптамеры), которые являются чуждыми для хозяина. Антигены содержат один или несколько иммунологических эпитопов.
Антигены, описанные в данном документе, являются детектирующими антигенами, то есть антигенами, определяющими антигенспецифическую реакцию. В некоторых воплощениях детектирующими антигенами являются аллергены, маркеры инфекции и/или аутоантигены.
Аллергены - это антигены, способные стимулировать реакцию гиперчувствительности типа I у атопических индивидуумов через ответы иммуноглобулина Е (IgE). Аллергены могут содержаться внутри или могут быть получены из пищевого продукта, такого как, например, молочные продукты (например, коровье молоко), яйцо, сельдерей, кунжут, пшеница, соя, рыба, моллюски, сахара (например, сахара, присутствующие в мясе, такие как альфа-галактоза), арахис, другие бобовые (например, фасоль, горох, соя и т.д.) и орехи. В ином случае, аллерген может содержаться внутри или может быть получен из непродовольственного продукта, такого как продукты животного происхождения, например, экскреция пылевых клещей, мех и перхоть, шерсть; пыльца, например, пыльца деревьев (таких как пыльца березы, пыльца кедра, пыльца дуба, пыльца ольхи, пыльца граба, пыльца конского каштана, пыльца ивы, пыльца тополя, пыльца платана, пыльца липы, пыльца оливкового дерева, пыльца можжевельника мексиканского и пыльца Alstonia scholaris) сорняки (амброзия, подорожник, крапива, полынь обыкновенная, марь белая, щавель) трава (райграс,
тимофеевка); яд насекомых (например, яд пчелы, осы, москита, огненного муравья и т.д.), плесень, латекс, металлы (например, никель), бытовые чистящие средства, детергенты, лекарства, косметика (например, парфюмерия и т.д.), лекарственные средства (например пенициллин, сульфонамиды, салицилат и т.д.), терапевтические моноклональные антитела (например, цетуксимаб).
В некоторых воплощениях аллерген представляет собой перекрестно-реактивный аллерген. Перекрестно-реактивные аллергены являются аллергенами одного источника (например, березы), которые имеют структурное сходство с аллергенами другого источника (например, яблоко). Если у пациента имеет аллергия на первый источник, у него, вероятно, также разовьется аллергия на второй источник. В некоторых воплощениях аллерген является маркерным аллергеном. Маркерные аллергены преимущественно обнаруживаются в одном конкретном источнике. В некоторых воплощениях аллерген представляет собой пан-аллерген. Пан-аллергены (например, профилин) присутствуют в разных источниках. В некоторых воплощениях аллерген является основным аллергеном, который индуцирует преобладающий Ig-ответ в аллергической популяции, тогда как в другом воплощении аллерген может быть незначительным аллергеном, с которым реагирует только меньшинство аллергических пациентов. В некоторых воплощениях аллерген представляет собой аллерген, который перекрестно не реагирует с любым другим аллергеном.
Amb a 1
Ambrosia artemisiifolia
вид, родственный полыни/аброзии
Пыльца
растения
694
Ana с 2
Ananas comosus
ананас
фрукты
растения
1714
Ana о [Семя]
Anacardium occidentale
кэшью
семя
растения
1077
Ana о 3
Anacardium occidentale
кэшью
семя
Животные
1033
Ana p [яичный белок]
Anas
platyrhynchos
фисташка
Яйцо
растения
10853
Ana p [яичный желток]
Anas
platyrhynchos
персик
Яйцо
растения
2918
Ani ре
Anisakis pegreffii
анисакис
личинка
животные
1716
Ani s
Anisakis simplex
анисакис
личинка
животные
Ani s 1
Anisakis simplex
анисакис
личинка
животные
Ani s 3
Anisakis simplex
анисакис
личинка
животные
8793
Api [стебель]
Apium graveolens
сельдерей
стебель
растения
Apig 1.0101
Apium graveolens
сельдерей
корень
растения
1722
Api m [яд]
Apis mellifera
пчела
животные
Api m 1
Apis mellifera
пчела
животные
Api m 4
Apis mellifera
пчела
животные
11401
Arah
Arachis hypogaea
арахис
семя
растения
11402
Arah 1-NT
Arachis hypogaea
арахис
семя
растения
Arah 2
Arachis hypogaea
арахис
семя
растения
Arah 3
Arachis hypogaea
арахис
семя
растения
Arah 6
Arachis hypogaea
арахис
семя
растения
3100
Arah 8.0101
Arachis hypogaea
арахис
семя
растения
1050
ApaX Аглутинин
Arachis hypogaea
арахис
семя
растения
862
Arm r HRP
Armoracia rusticana
Хрен
лист
растения
1728
Art v
Artemisia vulgaris
полынь
пыльца
растения
753
Art v 1
Artemisia vulgaris
полынь
пыльца
растения
1730
Asp f
Aspergillus fumigatus
Aspergillus
споры
грибы
1732
Asp n
Aspergilus niger
Aspergillus
споры
грибы
3050
Asp r 1
Aspergillus restrictus
Aspergillus
споры
грибы
1734
Aspa о
Asparagus officinalis
Спаржа
стебель
растения
1738
Ber e
Bertholletia excelsa
Бразильский орех
семя
растения
1741
Betv [Пыльца]
Betula verrucosa
береза
пыльца
растения
Betv 1.0101
Betula verrucosa
береза
пыльца
растения
3136
Ставка v 2.0101
Betula verrucosa
береза
пыльца
растения
2200
Beta v [Лист]
Beta vulgaris
обычная свекла
лист
растения
1742
Blag
Blattella germanica
прусак
тело
животные
136
Blag 1
Blattella germanica
прусак
тело
животные
141
Blag 2
Blattella germanica
прусак
тело
животные
143
Blag 4
Blattella germanica
прусак
тело
животные
144
Blag 5
Blattella germanica
прусак
тело
животные
1744
Blot
Blomia tropicalis
клещ домашней пыли
тело
животные
2019
Bos d [Мясо]
Bos domesticus
корова
мышца
животные
10999
Bos d [Молоко]
Bos domesticus
корова
молоко
животные
163
Bos d4
Bos domesticus
корова
молоко
животные
164
Bos d5
Bos domesticus
корова
молоко
животные
165
Bos d6
Bos domesticus
корова
молоко
животные
167
Bosd8
Bos domesticus
корова
молоко
животные
10878
Bos d CA
Bos domesticus
корова
мышца
животные
7669
Bos d Желатин
Bos domesticus
корова
кожа
животные
1065
Bos d LF
Bos domesticus
корова
молоко
животные
1755
Bubb [Молоко]
Bubalus bubalis
одомашненный азиатский буйвол
молоко
животные
4043
Cam d [Молоко]
Camelus dromedarius
одногорбый верблюд
молоко
животные
1756
Can f [эпителий]
Canis familiaris
собака
эпителий
животные
174
Can f 1
Canis familiaris
собака
эпителий
животные
175
Can f 2
Canis familiaris
собака
эпителий
животные
176
Can f 3
Canis familiaris
собака
сыворотка
животные
5762
Can f 5
Canis familiaris
клещи
эпителий
животные
1757
Cand a
Candida albicans
кандида
споры
грибы
1760
Cap h [Молоко]
Capra hircus
козел
молоко
животные
709
Car p 1
Carica papaya
папайя
фрукты
растения
1540
Car p
Химопапаин
Carica papaya
папайя
фрукты
растения
2025
Cas s [Семя]
Castanea sativa
виды, родственные березе/лесному ореху/дубу
семя
растения
1765
Cav p
[Эпителий]
Cavia porcellus
морская свинка
эпителий
животные
10907
Cer si [Семя]
Ceratonia siliqua
рожковое дерево
семя
растения
2223
Che qu
Chenopodium quinoa
лебеда
семя
растения
1771
Cic a
Cicer arietinum
нут
семя
растения
2229
Cit г [Фрукты]
Citrus reticulata
мандарин
фрукты
растения
1775
Clah
Cladosporium herbarum
грибы
спор
грибы
1778
Cor а [пыльца]
Corylus avellana
лесной орех
пыльца
растения
2028
Cor а [Семя]
Corylus avellana
лесной орех
семя
растения
235
Cora 1.0103
Corylus avellana
лесной орех
пыльца
растения
5886
Cor a 14
Corylus avellana
клещи
семя
животные
245
Cor 8
Corylus avellana
лесной орех
семя
растения
246
Cor a 9
Corylus avellana
лесной орех
семя
растения
2429
Cot с [Яйцо белый]
Coturnix
золотой киви
яйцо
растения
2430
Cot с [Яичный желток]
Coturnix
золотой киви
яйцо
растения
1782
Cri с
Cricetus
хомяк
эпителий
животные
1784
Cryj
Cryptomeria japonica
кедр
пыльца
растения
1786
Cue m [мякоть]
Cucumis melo
мускусная дыня
фрукты
растения
1789
Cue s
Cucumis sativus
огурец
фрукты
растения
256
Cup a 1
Cupressus arizonica
кипарис аризонский
пыльца
растения
1799
Dau с
Daucus carota
морковь
корень
растения
295
Derf 1
Dermatophagoides farinae
кипарис аризонский
тело
растения
302
Deri 2
Dermatophagoides farinae
кипарис аризонский
тело
растения
310
Derp 1
Dermatophagoides pteronyssinus
клещи
тело
животные
311
Derp 10
Dermatophagoides pteronyssinus
клещи
тело
животные
316
Der p 2
Dermatophagoides pteronyssinus
клещи
тело
животные
5748
Derp 23.0101
Dermatophagoides pteronyssinus
клещи
тело
животные
321
Der p 7
Dermatophagoides pteronyssinus
клещи
тело
животные
323
Derp 9
Dermatophagoides pteronyssinus
клещи
тело
животные
3995
Equ as [Молоко]
Equus asinus
осел
молоко
животные
1813
Equ с
[Эпителий]
Equus caballus
лошадь
эпителий
животные
2032
Equ с [Молоко]
Equus caballus
лошадь
молоко
животные
335
Equ с 3
Equus caballus
лошадь
сыворотка
животные
10877
Equ с
Миоглобин
Equus caballus
лошадь
мышца
животные
340
Eur m 2
Euroglyphus maynei
лошадь
тело
животные
1816
Fag e
Fagopyrum esculentum
лошадь
семя
животные
1819
Feld
Felis domesticus
кошка
эпителий
животные
345
Feld 1
Felis domesticus
кошка
эпителий
животные
346
Feld 2
Felis domesticus
кошка
сыворотка
животные
2034
Foe v
[луковица]
Foeniculum vulgare
укроп
луковица
растения
1826
Fra а [фрукты]
Fragaria ananassa
клубника
фрукты
растения
1831
Gad m [мясо]
Gadus morhua
атлантическая треска
мышца
животные
1832
Gal d [яичный белок]
Gallus domesticus
курица
яйцо
животные
2036
Gal d [яичный желток]
Gallus domesticus
курица
яйцо
животные
2037
Gal d [Мясо]
Gallus domesticus
курица
мышца
животные
359
Gald 1
Gallus domesticus
курица
яйцо
животные
360
Gald2
Gallus domesticus
курица
яйцо
животные
361
Gald3
Gallus domesticus
курица
яйцо
животные
362
Gald 4
Gallus domesticus
курица
яйцо
животные
363
Gald 5
Gallus domesticus
курица
яйцо
животные
1834
Gly m
Glycine max
соя
семя
растения
368
Gly m 1
Glycine max
соя
семя
растения
1429
Gly m
Агглютинин
Glycine max
соя
семя
растения
1144
Gly m TI
Glycine max
соя
семя
растения
1840
Hel as
Helix aspersa
коричневая садовая улитка
мышца
животные
378
Hel as 1
Helix aspersa
коричневая садовая улитка
мышца
животные
1841
Hevb
Hevea brasiliensis
латекс
латекс
растения
379
Hevb 1
Hevea brasiliensis
латекс
латекс
растения
380
Hevb 10
Hevea brasiliensis
латекс
латекс
растения
384
Hev b 11
Hevea brasiliensis
латекс
латекс
растения
3314
Hevb 3.0101
Hevea brasiliensis
латекс
латекс
растения
3316
Hevb 5.0101
Hevea brasiliensis
латекс
латекс
растения
392
Hev b 6.02
Hevea brasiliensis
латекс
латекс
растения
396
Hev b 7.02
Hevea brasiliensis
латекс
латекс
растения
397
Hevb 8
Hevea brasiliensis
латекс
латекс
растения
404
Hevb 9
Hevea brasiliensis
латекс
латекс
растения
763
Horn's HSA
Homo sapiens
люди
сыворотка
животные
1384
Horn s LF
Homo sapiens
люди
молоко
животные
2040
Hor v [Семя]
Hordeum vulgare
ячмень
семя
растения
1850
Jug г [Семя]
Juglans regia
грецкий орех
семя
растения
425
Jug r 2
Juglans regia
латекс
семя
растения
426
Jug r 3
Juglans regia
грецкий орех
семя
растения
1856
Lac s
Lactuca sativa
вид, родственный полыни/амброзии
лист
растения
1857
Len с
Lens culinaris
чечевица
семя
растения
905
Lin us
Linum
usitatissimum
Linum usitatissimum
семя
растения
1868
Lol p [Пыльца]
Lolium perenne
травы
пыльца
растения
450
Lolp 1
Lolium perenne
пыльца
растения
940
Lup а [Семя]
Lupinus albus
Lupinus albus
семя
растения
1871
Maid [Фрукты]
Malus domestica
Malus domestica
фрукты
растения
1454
Maid 1.0108
Malus domestica
Malus domestica
фрукты
растения
1035
Mel g [яичный белок]
Meleagris gallopavo
индейка
яйцо
животные
10909
Mel g [яичный желток]
Meleagris gallopavo
индейка
яйцо
животные
2049
Мел [Мясо]
Meleagris gallopavo
индейка
мышца
животные
476
Мег а 1
Mercurialis annua
Mercurialis annua
мышца
растения
7643
Мег mr 1
Merluccius
европейский хек
мышца
животные
2051
Mus m [Эпителий]
Mus musculus
мышь
эпителий
животные
478
Mus m 1
Mus musculus
мышь
эпителий
животные
755
Mus m 4
Mus musculus
полынь
сыворотка
растения
1413
Myte
Mytilus edulis
голубая мидия
мышца
животные
2132
Octv
Octopus vulgaris
осьминог
мышца
животные
1888
Olee [Пыльца]
Olea europaea
оливковое дерево
пыльца
растения
482
Olee 1
Olea europaea
оливковое дерево
пыльца
растения
490
Olee 2
Olea europaea
оливковое дерево
пыльца
растения
2054
Ory с
[Эпителий]
Oryctolagus cuniculus
мышь
эпителий
животные
2057
Ory с [Мясо]
Oryctolagus cuniculus
кролик
мышца
животные
759
Ory с 6
Oryctolagus cuniculus
кролик
сыворотка
животные
11394
Ory s [Семя]
Oryza sativa
Oryza sativa
семя
растения
2061
Ovi а [Мясо]
Ovis aries
овца
мышца
животные
1892
Ovi a [Молоко]
Ovis aries
овца
молоко
животные
758
Ovi a 6
Ovis aries
овца
сыворотка
животные
1893
Пан b
Pandalus borealis
ракообразные
мышца
животные
1904
Parj
Parietaria judaica
постенница
пыльца
растения
507
Parj 2
Parietaria judaica
постенница
пыльца
растения
1912
Pen ch
Penicillium chrysogenum
пеницилл
споры
грибы
972
Pen m 1
Penaeus monodon
черная тигровая креветка
мышца
животные
1917
Per a
Periplaneta americana
американский таракан
тело
животные
542
Per a 7
Periplaneta americana
американский таракан
мышца
животные
1920
Pers a
Persea americana
Persea americana
фрукты
растения
1923
Pha v [Семя]
Phaseolus vulgaris
бобовые
семя
растения
1924
РЫр
Phleum pratense
злаки
пыльца
растения
551
РЫр 1.0102
Phleum pratense
злаки
пыльца
растения
3419
РЫр 2.0101
Phleum pratense
злаки
пыльца
растения
559
РЫр 5.0101
Phleum pratense
злаки
пыльца
растения
3420
РЫр 6.0101
Phleum pratense
злаки
пыльца
растения
3422
РЫр 7.0101
Phleum pratense
злаки
пыльца
растения
714
Pin р [Семя]
Pinus pinea
сосна
семя
растения
1008
Pis v [Семя]
Pistacia vera
фисташка
семя
растения
1932
Plaa
Platanus acerifolia
платан клёнолистный
пыльца
растения
572
Plaa 1
Platanus acerifolia
платан клёнолистный
пыльца
растения
10875
Pie о
[спорокарпий]
Pleurotus ostreatus
грибы
спорокарпий
грибы
2322
Pol spp
Polistes spp
перепончатокрылые
животные
1945
Рш ar [Фрукты]
Prunus armeniaca
вишня
фрукты
растения
1948
Рш du [Семя]
Prunus dulcis
миндальное дерево
семя
растения
2070
Рш р [Peel]
Prunus persica
персик
фрукты
растения
2069
Рш р
[Целлюлоза]
Prunus persica
персик
фрукты
растения
603
Рш р 3
Prunus persica
персик
фрукты
растения
9147
Рш р 7
Prunus persica
персик
фрукты
растения
1195
Pun g
Punica granatum
гранат
фрукты
растения
2834
Pun g 1
Punica granatum
гранат
фрукты
растения
11786
Pun g 14
Punica granatum
гранат
фрукты
растения
11787
Pun g 5
Punica granatum
гранат
фрукты
растения
11614
Pun g 7
Punica granatum
гранат
фрукты
растения
1955
Que a [Пыльца]
Quercus alba
растения
пыльца
растения
которые свидетельствуют о наличии инфекционного агента, такого как вирусы, паразиты,
бактерии, прионы и грибы.
Маркеры инфекции включают, без ограничения указанным, белки, гликопротеины (например, поверхностные или оболочечные белки бактерий или вирусов), смеси белков (например, лизат бактериальных клеток), другие детектируемые соединения, связанные с инфекционным агентом или частицами (например, вирусоподобные частицы или вирусные оболочки, бактериальные поверхностные антигены и т.д.).
Аутоантигены - это молекулы, созданные организмом, таким как человек, на которые у этого организма есть иммунный ответ, такой как образование антител к аутоантигену, то есть образование аутоантител. Выработка аутоантител обычно связано с аутоиммунным заболеванием. Примеры аутоантигенов включают как органоспецифические антигены, такие как тиреоглобулин, так и убиквитарные клеточные антигены, такие как ДНК, гистоны и частицы рибонуклеопротеина. Типичные аутоантигены, которые могут быть включены в антигенный эррей, описанный в данном документе, приведены в Таблице 2.
SLE = системная красная волчанка
SS = синдром Шегрена
SScl = склеродермия (системный склероз)
РМ = полимиозит
Der = дерматомиозит
Рэй = болезнь Рейно,
RA = ревматоидный артрит
MCTD = смешанное поражение соединительной ткани
Антигены, т.е. детектирующие антигены, описанного в данном документе антигенного эррея, могут быть антигенами, продуцируемыми с помощью технологии рекомбинантных ДНК, или антигенами, очищенными и выделенными из биологического исходного материала (например, антигенами из биологического материала, по существу свободного от любых других антигенов, которые могут быть выделены из одного и того же биологического материала способами, известными в данной области (сравните Ian R. Mackay & Noel R. Rose, The Autimmune Diseases, Fifth Edition, Academic Press 2014). В некоторых воплощениях гранулы соединены с рекомбинантно продуцируемым антигеном. В некоторых воплощениях гранулы соединены с выделенным и очищенным детектирующим антигеном из биологического источника.
В некоторых воплощениях антигенный эррей содержит группы гранул с набором детектирующих антигенов (например, по меньшей мере, один, два или более детектирующего антигена). Например, набор детектирующих антигенов может быть получен из экстракта (например, экстракта аллергена) или лизата (например, бактериального лизата или другого клеточного лизата) биологического источника. В некоторых воплощениях гранулы соединяются с экстрактом или лизатом биологического источника, тем самым получая гранулы с антигенным покрытием с набором детектирующих антигенов.
В некоторых воплощениях гранулы покрывают молекулярным аллергеном, полученным с помощью технологии рекомбинантной ДНК. В некоторых воплощениях гранулы покрывают аллергеном, выделенным или очищенным из биологического источника. В некоторых воплощениях гранулы покрывают экстрактом аллергена (например, набором аллергенов, таких как, по меньшей мере, один, два или более
аллергенов из биологического материала). Экстракт аллергена может содержать сырой экстракт аллергена; концентрированный экстракт аллергена; или несколько аллергенов, очищенных из экстракта аллергена. Аллергены являются естественными аллергенами. Аллергенный экстракт может, естественно, содержать одну или несколько изоформ одного и того же аллергена. Экстракт аллергена может также состоять из смеси, по меньшей мере, двух экстрактов аллергенов различных биологических источников, например двух разных, но тесно связанных видов аналогичного основного происхождения, обычно называемых spp.
Связывание антигена с использованием микро- или наночастиц
Антигенный эррей, описанный в данном документе, использует принцип индивидуальной оптимизированной стратегии сочетания гетерогенных и сложных биологических антигенов (т.е. детектирующих антигенов). В мультиплексном анализе обнаружения иммунологических антител это является предварительным условием для достижения оптимальной тестовой эффективности для каждого отдельного параметра.
Связывание антигена происходит в две разных стадии. На первом стадии каждый антиген соединен с взвешенными частицами микрометрового или нанометрового размера, например, микрогранулой или наногранулой.
В конкретном воплощении эти частицы являются сферическими частицами, которые могут содержаться в растворе в водных буферах, таких как те, которые обычно используются для хранения белка или, в более общем случае, биомолекулы. Частицами могут быть частицы латекса или полистирола, пластиковые полимерные частицы или частицы, изготовленные из стекла (кремнезем), пористые или непористые поверхностные частицы или даже частицы, сделанные из других биосовместимых полимеров. Размер частиц может составлять от нескольких нанометров до микрон, причем предпочтительный размер частиц составляет от 5 до 500 нм в диаметре, более предпочтительно от 200 до 500 нм, еще более предпочтительно от 200 до 350 нм (например, около 350 нм) в диаметре. В некоторых воплощениях гранулы представляют собой наночастицы полистирола.
Присоединение антигенов (белков, пептидов, антител, ДНК и других биомолекул, полученных из нуклеиновых кислот, аминокислот или органических или неорганических химических соединений, которые могут служить антигенами) может протекать через различные стратегии присоединения.
В простейшем воплощении антигенная молекула или макромолекула будет прикрепляться к частице (грануле) пассивной адсорбцией, например гидрофобным и/или электростатическим присоединением. Присоединение может быть облегчено путем выбора соответствующей буферной системы, которая создает среду для максимального
прикрепления, например, путем выбора буферной системы, которая имеет значение рН, близкое к изоэлектрической точке антигена, тем самым нейтрализуя поверхностный заряд в среднем.
В более сложных условиях, антиген, подлежащий связыванию, состоит либо из отдельных молекул, несущих один антиген, либо из одной макромолекулы с несколькими связывающими антитела эпитопами или даже с комплексной смесью различных белков с индивидуально различными антигенами, содержащими множество эпитопов (например, экстракт или лизат биологического исходного материала, включающий набор детектирующих антигенов), что может потребовать различных условий адсорбции для достижения оптимальных возможностей биологического связывания (авидность). В этом случае антигена или смесь антигенов может быть разделена на несколько аликвот и каждая аликвота, связанная в разных условиях, например, при различных значениях рН или в буферах с различной ионной силой или с различными буферными добавками, такими как соль, детергенты, буферные вещества и т.д. При каждом условии, каждый антиген соединяется в определенной конфигурации, которая может быть предпочтительной для биологической активности, или часть определенных антигенов может соединяться легче, чем другая субпопуляция, или вообще не в выбранных условиях. На следующем стадии различные аликвоты могут быть воссоединены для создания популяции микро- или наночастиц, которые несут разные антигены из исходной комплексной смеси или одного антигена в различных структурных конфигурациях. При достижении этого, первоначальный эпитопный репертуар биологического образца может быть связан с частицами без создания смещения таким образом, чтобы сохранялись только выбранные эпитопы или чтобы фактически были связаны только выбранные носители антигенов из сложной смеси.
Выбирая достаточное количество различных условий связывания и оптимизируя смесь дифференциально связанных комбинаций частиц и антигенов, конечный раствор частиц, загруженных антигенами, будет точно формировать эпитопный репертуар исходной смеси, или можно обогатить предпочтительные носители антигена в растворе частиц таким образом, чтобы сохранить при этом полную комплексность эпитопа в целом.
В еще более сложных условиях антигены могут быть соединены путем применения множества способов комбинаторной органической химии связывания, известных специалистам в данной области техники. В соответствии с этой стратегией антигены могут быть ковалентно связаны с частицами и могут выборочно связываться с определенной химической группой, присутствующей на поверхности антигенов, например амино- или карбоксильной группой, сульфгидрильной группой, ароматическим
остатком и т.д.
Кроме того, можно использовать подходящие антигенные спейсеры для оптимизации презентации антигена при работе с малыми антигенами, такими как пептиды или химические соединения.
Посредством химической поверхностной инженерии поверхности частиц также возможно оптимизировать сцепление гранул с твердой поверхностью носителя, подавить неспецифическое связывание или усилить связывание антитела.
В некоторых воплощениях детектирующий антиген или набор детектирующего антигена ковалентно связаны с гранулами (например, через линкер EGS с №12-покрытой поверхностью гранул, через линкер EDC с СООН-покрытой поверхностью гранул). В некоторых воплощениях детектирующий антиген или набор детектирующих антигенов нековалентно связаны с гранулами. Например, гранулы могут быть покрыты антигеном или набором детектирующих антигенов пассивной адсорбцией.
Кроме того, можно оптимизировать размер частиц в соответствии с требованиями производственного процесса. Частицы должны быть просты в обращении и оставаться в растворе, и в то же время они должны прикрепляться специфически или неспецифически после осаждения на окончательную твердую подложку. После наполнения частиц антигенами, наполненные частицы могут быть отделены от остаточного антигенного раствора, например, среди прочего, путем центрифугирования, магнитного разделения, электрического заряда или эксклюзионного эффекта. Благодаря этому разделению можно сохранять только фракцию предпочтительно связанных антигенов и избавиться от оставшейся, возможно не антигенной фракции исходной смеси антигенов.
Функциональное тестирование антигенсвязанных частиц может быть выполнено и результаты могут быть сравнены с доступными эталонными тестами, выполненными с помощью эталонного диагностического метода in vitro, относительно клинических справочных данных или относительно доступных стандартных препаратов. Поскольку не существует международно признанного лабораторного стандарта для многих антигенспецифических IgE-антител, одной из доступных эталонных систем являются образцы контроля качества Biorad Lyphocheck(r), которые были протестированы на IgE против основных аллергенов на трех наиболее широко используемых автоматических инструментах для иммуноанализа (www.bio-rad.com).
Степень связывания антигена может быть проверена различными способами, известными в данной области. Например, надосадочную жидкость из реакции связывания можно использовать для анализа ELISA, с помощью которого можно измерить содержание белка, или можно протестировать на 1D или 2D белковых гелях, в результате
чего можно оценить не только общее содержание несвязанных антигенов, но также можно задокументировать природу как несвязанных, так и связанных носителей антигенов (тех, которые больше не присутствуют в геле), глядя на размер/положение белковых пиков или точек. При необходимости надосадочная жидкость может быть дополнительно проанализирована с помощью масс-спектрометрии.
Аналогичный подход может быть применен для проверки стабильности связывания. Например, путем связывания частиц и затем тестирования надосадочной жидкости (раствора, не содержащего частицы) после определенных временных интервалов, можно определить, остаются ли антигенные белки неизменно прикрепленными к частицам или диффундируют ли они обратно в раствор через определенный период времени или при определенных условиях хранения, с определенными буферами хранения или детергентами.
Хранение гранул, связанных антигеном, и их обработка при производстве
Хранение покрытых гранул может протекать в условиях, которые стабилизируют белок, связанный с частицами, в течение, по меньшей мере, нескольких месяцев, предпочтительно нескольких лет после первоначальной связывания, с двумя основными целями, во-первых, с целью сохранения белков, присоединенных к частицам, а во-вторых, и что более важно, с целью сохранения биологически активных белков и защиту их от деградации, например, протеолитическим расщеплением. Кроме того, гранулы должны храниться в растворе и необходимо избегать любых осадков, поскольку это может привести к образованию агрегатов, которые впоследствии не могут быть растворены, что приводит к блокированию и разрушению части эпитопного репертуара, присутствующего в исходном антигенном растворе, без применения более жестких и потенциально антиген-разрушающих способов (нагревание, сдвиговая деформация, обработка ультразвуком, интенсивное перемешивание и т.д.).
Вышеупомянутый подход представляет собой значительное улучшение для любого процесса производства иммунного анализа, поскольку реагенты могут быть стабилизированы в достаточной степени в течение более длительного периода или даже бесконечно при хранении, например, при -80°С. Преимущество наличия стабильных наборов первичных реагентов для последующего производственного процесса в основном заключается в том, что после получения хорошего реагента, исходя из того, что он стабилен в течение длительного времени, необходимо прилагать относительно небольшие усилия в процедурах контроля качества. Принимая во внимание, что если соединение должно быть быстро осуществлено сразу перед применением, каждый раз, когда соединение будет завершено, должен быть проведен полный набор мер контроля качества
и документирования. Все еще оставалась бы неопределенность в отношении того, возникает ли варьирование процесса связывания или предшествующего ухудшения антигенного раствора, который может быть труднее хранить в течение более длительного времени, чем фактически адсорбированные антигены на поверхности частиц. Специалистам в данной области известно, что белки не могут храниться неограниченно в простом растворе даже при низких температурах, главным образом потому, что повторное замораживание и оттаивание могут ухудшить качество, а белки имеют тенденцию к осаждению или прикреплению друг к другу. Однако стабильность белков, присоединенных к поверхности, может быть значительно более продолжительной даже при менее благоприятных условиях хранения.
Условия, при которых возможно хранение в течение более длительного периода, также включают выбор наилучшего температурного диапазона, обычно либо -20°С, либо диапазон между 2-8°С, предпочтительно 2-4°С.
Буферы, используемые для хранения гранул с антигенным покрытием, описанных в данном документе, включают, без ограничения указанным: простой раствор NaCl, фосфатные буферы, буфер Tris, буфер MES, цитратный буфер, буфер HEPES и т.д.
Условия рН для хранения предпочтительны в физиологическом диапазоне, между рН 7-8, но также могут находиться в диапазоне рН 6-9 или даже рН 2-14.
Добавки для обеспечения более длительного хранения включают, без ограничения указанным: неионные детергенты, такие как Tween-20, SDS, Triton и другие.
Для того чтобы избежать бактериального или грибкового роста в препаратах во время хранения можно использовать азид натрия, катон или другие консерванты.
Многоатомные спирты, такие как глицерин, поливиниловый спирт и т.д., могут быть использованы для стабилизации как частиц в растворе, так и белков на частицах.
Полисахариды, такие как трегалоза, сахароза и т.д., могут дополнительно стабилизировать белки, в частности, от структурной деградации.
Сахара могут также использоваться для стабилизации белка даже после того, как частицы соединяются с твердой фазой окончательного анализа.
Поверхностное депонирование антигенных заряженных гранул в формате эррея
Перенос гранул из раствора в твердую фазу может быть проведен несколькими способами, известными специалистам в данной области техники. Цель состоит в том, чтобы перенести ряд растворов индивидуальных антигенсодержащих частиц (групп гранул) в упорядоченный эррей адресуемых элементов (отдельные молекулярные объекты с определенным положением на эррее), так чтобы после инкубации с антигенсодержащим биологическим образцом, например сывороткой пациента и соответствующим
определением события связывания, обнаруженный сигнал мог быть связан с соответствующим антигенным исходным материалом.
Принципиальные способы осаждения жидкостей из раствора на твердый носитель являются контактными или бесконтактными. Для контактных способов, как правило, штамп или штырь какого-либо рода несколько раз опускаются в исходную жидкость, а между погружением в исходную жидкость собранный материал, который поглощается штампом или штырем, осаждается на твердой подложке. Однако этот способ, являющийся более простой альтернативой, имеет существенные недостатки, когда речь идет о масштабируемости и воспроизводимости, поскольку большая часть производительности процесса будет зависеть от природы штампа и исходной жидкости, а также от смачиваемости твердой фазы, вязкости, состав жидкости и т.д.
Поэтому в большинстве современных приложений предпочтительными являются бесконтактные способы. Для описанных в данном документе эрреев может использоваться соленоидная система дозирования, при которой шприц создает давление в канале для жидкости, содержащем антигенный исходный раствор, и точно рассчитанное время открытия электромагнитного клапана позволяет образовывать точно однородные капли из керамического наконечника. Капля затем выбрасывается из керамического наконечника и после короткой фазы полета приземляется и присоединяется к твердой фазе. Движение твердой фазы под керамическим наконечником (или наоборот перемещение наконечника с помощью моторизованной оси) позволяет производить отдельные эррей, когда одна за другой упорядоченным образом наносятся разные исходные жидкости. В ином случае, осаждение капель может протекать через пьезо-управляемое каплеобразование, в результате чего основное отличие от ранее описанного способа заключается в том, что давление не создается шприцем, а электрическим импульсом к пьезокристаллу, а выдаваемый объем обычно намного меньше, в диапазоне пиколитра, тогда как дозирование соленоидом лучше всего работает в диапазоне нанолитровых капель.
Предпочтительный размер сформированных капель составляет 1 мм в диаметре, что дает круглые элементы (отдельные молекулярные объекты в качестве адресуемых элементов) диаметром около 1 мм на твердой фазе. Используя такие размеры, можно создавать эррей размером примерно 10x10 (100 в целом) различных антигенсвязанных областей на квадратный сантиметр. Количество жидкости, дозированной таким образом на твердой фазе, составляет около 30 нл на каплю, но может составлять от 1 нанолитра до 200 нанолитров или даже выше. Круглые элементы или блоки, содержащие определенную группу гранул с антигенным покрытием, могут быть идентифицированы по их
место положению/положению (пространственно адресуемому) и могут быть расположены в обычном прямоугольном эррее или в плотноупакованном эррее. Описанные в данном документе эррей содержат от 1 до 9 адресуемых элементов на мм2, например, любое количество из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 адресуемых элементов на мм2.
Важными переменными для качества депонированных пятен (однородность, форма, допуск расположения и т.д.) и количественная воспроизводимость с точки зрения коэффициента вариации конечного измерения являются: расстояние от мишени, давление в канале; время открытия канавки; объем капли; скорость движения оси; время между дозированием; керамический наконечник в процессе и между процессами очистки и кондиционирования; предварительная подгонка до фактического процесса нанесения пятна; объем аспирации и скорость аспирации; и геометрия микротитровального планшета. Во время процесса осаждения необходимо поддерживать антигенсвязанные частицы в растворе внутри устройства для работы с жидкостью, и избегать любого перекрестного загрязнения между осаждением разных гранул с антигенным покрытием путем достаточной очистки жидких каналов между циклами аспирации и дозирования.
Чтобы добиться процесса осаждения с нулевым дефектом, важно обнаружить каждое событие одиночного дефекта дозирования, например, путем добавления непостоянного красителя к раствору частиц, который позволяет обнаружить успешное осаждение жидкости на твердую фазу, но будет смываться во время фактической процедуры тестирования. Таким образом, отсутствующая капля может быть обнаружена и ретроспективно добавлена после первого раунда дозирования, что приведет к 100% полным партиям в 100% случаев.
Твердая подложка
Процесс осаждения обычно проводят на больших листах или пластинах твердого материала носителя, причем каждая партия обычно состоит от нескольких сотен до нескольких тысяч идентичных эрреев. Непрерывный процесс может быть реализован путем выравнивания необходимого количества каналов дозирования и перемещения подложки на пластинах или даже катушечной системы под наконечниками для дозирования и определения времени позиционирования и дозирования так, чтобы на твердой подложке были созданы упорядоченные массивы пятен частиц.
После стадии дозирования твердую подложку разрезают на куски соответствующего размера для дальнейшей сборки или хранения. В ином случае, твердую подложку можно разрезать до подходящих размеров еще до осаждения гранул с антигенным покрытием, где размер кусков соответствует количеству депонированных групп частиц и плотности отдельных групп. В предпочтительном воплощении отдельные
куски твердой подложки являются прямоугольными и от 5x5 мм до 200x200 мм или более, еще более предпочтительно от 10x10 до 20x30 мм.
Твердая подложка может состоять из нитроцеллюлозы, ламинированной нитроцеллюлозы или диазо-бумаги или органических полимеров, таких как полистирол, полиэтилен, полипропилен, полифторэтилен, полиэтиленокси, поливинилидендифторид (PVDF), полиакриламид, поликарбонат, полиаломер, поливинил, нейлон, полимеры и их трансплантаты или другие функционализированные пластмассы. Твердая подложка также может быть неорганической, такой как стекло, диоксид кремния, стекло с контролируемым размером пор (CPG) или диоксид кремния с обращенной фазой. Конфигурация твердого носителя может быть в форме мембраны или поверхности и может быть плоской, по существу плоской или неплоской. Твердые опоры могут быть пористыми или непористыми и могут иметь характеристики разбухания или неразбухания.
По своей природе твердая подложка может быть пористым или непористым материалом, обладающим способностью удерживать частицы, загруженные белковыми антигенами. Например, нитроцеллюлозные листы или слоистые нитроцеллюлозные листы могут быть использованы в качестве твердой фазы, при этом размер пор и точный состав нитроцеллюлозы могут оказать значительное влияние на результаты теста. Так же химическая активация нитроцеллюлозы с целью ковалентного связывания биомолекул может оказать благотворное влияние на результаты испытаний. В качестве твердой подложки доступны различные типы нитроцеллюлозных мембран, такие нитроцеллюлозные мембраны различаются по размеру пор, скорости потока или исходному материалу. Предпочтительно размер пор должен находиться в диапазоне размеров частиц, так чтобы частицы удерживались порами на поверхности, но в то же время не проваливались в структуру твердой подложки, что затруднило бы связывание антитела с поверхностью частиц.
Твердая фаза должна быть долговечной и совместимой с обычной процедурой ELISA, которая требует нескольких часов инкубации и промывки в водных растворах. Неспецифическое связывание с поверхностью должно быть либо по существу низким, либо должна быть возможность блокирования любого неспецифического связывания с твердой фазой, чтобы достичь требуемого отношения сигнал/шум (сигнал делится на стандартное отклонение шума).
Хранение тестов и сборка в картридж
Чтобы стабилизировать частицы после осаждения на твердую подложку, твердую подложку можно хранить при соответствующей температуре, предпочтительно 2-8°С.
Кроме того, сахар или другие стабилизирующие вещества могут быть добавлены распылением после нанесения частиц. Требование к стабильности составляет не менее одного года после изготовления, предпочтительно, по меньшей мере, 30 месяцев после изготовления, что может оставить 6 месяцев для доставки конечным пользователям после изготовления и оставшегося срока хранения 24 месяца у конечного пользователя.
Для практической обработки, хранения и транспортировки, а также для упаковки в комплекте, разрезанные полосы твердой подложки будут собраны в картридж, который более подробно описан ниже. Картридж не только обеспечивает физическую защиту твердых подложек макроэрреев, но также обеспечивает очень сложный и функциональный контейнер, который значительно облегчает автоматическую обработку тестов, обработку жидкости и удаление потенциально загрязненных материалов.
Процедура анализа
Далее в данном документе описаны способы in vitro детекции специфического иммуноглобулина для детектирующего антигена или для набора детектирующих антигенов с использованием описанного в данном документе антигенного эррея. В частности, способ включает
(i) обеспечение антигенного эррея, описанного в данном документе,
(ii) инкубацию эррея с образцом,
(ш) инкубацию эррея с детектирующим реагентом,
(iv) необязательно, инкубацию эррея с реагентом образования сигнала, и
(v) измерение детектируемого сигнала.
Повышенный детектируемый сигнал по сравнению с сигналом отрицательного контроля указывает на присутствие иммуноглобулина в образце, в то время как отсутствие увеличения сигнала указывает на отсутствие иммуноглобулина в образце.
В некоторых воплощениях детектируемый сигнал является колориметрическим, флуоресцентным, электрическим или хемилюминесцентным сигналом.
Биологический анализ, как описано в данном документе, имеет целью детектировать специфические иммуноглобулины против множества антигенов в одной аналитической процедуре, которая основана на принципе ELISA и обычно состоит из следующих основных стадий:
1) Предварительная промывка
2) Блокирование
3) Инкубация с образцом
4) Промывка
5) Инкубация с детектирующим реагентом
6) Промывка
7) Дополнительно: инкубация с образованием сигнала
8) Необязательно: остановка образования сигнала
9) Детекция и измерение результата
В некоторых воплощениях способы детекции иммуноглобулина, специфичного для детектирующего антигена или набора детектирующих антигенов (например, аллергена или набора аллергенов) с использованием описанного в данном документе антигенного эррея, включают
(i) обеспечение антигенного эррея (например, аллергенного эррея), описанного в данном документе,
(ii) инкубацию эррея с образцом (например, с сывороткой или цельной или обработанной кровью),
(ш) инкубацию эррея с детектирующим реагентом (например, анти-IgE антителом или анти-IgG антителом или IgE-специфическим или IgG-специфическим аптамером, непосредственно меченным детектируемым сигналом, анти-IgE антителом или анти-IgG антителом или IgE-специфическим или IgG-специфическим аптамером, конъюгированным с ферментом)
(iv) необязательно, инкубацию эррея с реагентом для образования сигнала
(например, субстратом для ферментативной реакции),
(v) необязательно, добавление стоп-раствора для завершения образования сигнала
(vi) измерение регистрируемого сигнала.
Образец в этом смысле может быть сывороткой пациента, цельной или обработанной кровью, жидкостью из носа, мочой, другими физиологическими жидкостями или клеточными лизатами или гомогенатами из тканей и т.д. Образец может быть от одного объекта или из пула объектов (например, пула сыворотки 10, 20, 30 объектов при скрининге большого количества испытуемых). В некоторых воплощениях образец представляет собой образец крови (например, образец сыворотки). В некоторых воплощениях размер выборки составляет любое из 1 мкл - 2000 мкл, например, любое из 1 мкл - 10 мкл, от 10 мкл до 50 мкл, от 50 мкл до 100 мкл, от 100 мкл до 500 мкл, от 500 мкл до 2000 мкл. В некоторых воплощениях размер выборки составляет любое из 1 мкл, 2 мкл, 3 мкл, 4 мкл, 5 мкл, 10 мкл, 20 мкл, 50 мкл, 100 мкл, 250 мкл, 500 мкл или 1000 мкл или 2000 мкл. В некоторых воплощениях образец не разбавлен. В некоторых воплощениях образец разбавлен. В некоторых воплощениях разбавление образца составляет от 1:1 до 1:10, от 1:10 до 1:100, от 1:100 до 1:1000 или от 1:1000 до 1:10000. В некоторых
воплощениях разбавление образца представляет собой любое значение из 1:10, 1:100, 1:1000 или 1:10000. Фактическое количество необходимого образца может зависеть от разбавления образца, используемого для реакции инкубации.
Исполнение теста не должно существенно влиять на биологический образец, даже если образец не находится в идеальном состоянии, что часто происходит во время обычного взятия крови. Типичными проблемами могут быть липемические, гемолитические или иктеричные жидкости для образцов, образцы с высоким содержанием белка или даже с высоким содержанием антител (IgG, IgE, другие).
Детектирующий реагент представляет собой аффинное связующее вещество биологического происхождения, предпочтительно антитело (например, детектирующее антитело) полученное либо иммунизацией, либо искусственным отбором с помощью случайной библиотеки. Другие аффинные связующие агенты могут быть искусственно подобранными связующими агентами на основе белков или нуклеиновых кислот, таких как аптамеры или аффитела.
Начальная стадия промывки предназначена для удаления любых твердых частиц, не связанных с твердой фазой, которые в противном случае конкурировали бы за связывание связывающегося с твердой фазой антигена и свободного растворимого антигена на стадии инкубации образца.
В общих чертах, стадия промывки не является одной стадией, но обычно выполняется многократно, чтобы добиться окончательного удаления любого нежелательного реагента ниже предела обнаружения. В частности, применение стадий промывки можно повторить 3-5 раз, в результате чего разбавление объема предполагается путем наклона картриджа и добавления свежего промывочного раствора, по меньшей мере, в 30 раз, так что после 3 раундов промывки разбавление составляет ок. 1 к 27 000, любая дополнительная стадия промывки еще больше увеличит разбавление в 30 раз.
Стадия блокирования предназначена для блокирования любой возможности неспецифического связывания любых составляющих образца, таких как детектируемое антитело, которое не специфично по отношению к иммобилизованному антигену, а также неспецифического связывания детектирующего реагента.
Блокирование может быть выполнено один раз до инкубации с образцом или может быть проведено несколько раз перед каждой стадией анализа или может быть добавлен блокирующий реагент для разбавления измеряемого образца, или даже детектирующий реагент (например, детектирующее антитело, аптамер или аффитело) могут содержаться в блокирующем реагенте.
Блокирующий реагент в этом отношении относится к любому веществу
биологического или другого происхождения, которое может смягчать непреднамеренные или неспецифические реакции связывания, которые обычно происходят между сложными биологическими образцами, такими как кровь или сыворотка, и множеством антигенов на твердой фазе. Блокирование предпочтительно не включает потенциально антигенного белка, который в противном случае мог бы вызвать еще большее неспецифическое связывание и снижение образования сигнала относительно шума.
Например, бычий сывороточный альбумин (BSA), который часто используется для простых процедур ELISA в качестве стабилизирующего или блокирующего агента, обычно непригоден, когда участвует человеческое IgE или IgG, так как BSA является потенциальным пищевым аллергеном и частым индуктором нерелевантного IgG у людей, которые часто потребляют молочные или мясные продукты из говядины. Таким образом, любые сайты связывания, заблокированные BSA, могут дать еще больше проблем с неспецифическим фоном, чем в противном случае, если образцы содержат соответствующие анти-В8А-антитела детектируемого подкласса. Подобные обстоятельства делают невозможным применение многих дешевых и легкодоступных блокирующих реагентов, которые часто используются в других областях.
Соответственно, если применяются блокаторы белка, они не должны быть иммуногенными для человека, такие как человеческий сывороточный альбумин, который обычно не связывает какие-либо человеческие антитела.
Альтернативные способы блокирования включают детергенты, сахара, полиспирты или другие соединения, которые могут дестабилизировать слабое связывание между партнерами взаимодействия, которые не так сильны и специфичны, как комплекс связывания антиген-антитело (как правило, с константами аффинности 10"9 М или менее).
Стадии инкубации с образцом или детектирующим реагентом (например, детектирующим антителом) обычно принимают пропорционально самому длинному периоду времени общей процедуры, с временем инкубации в диапазоне от минут до нескольких часов. Предпочтительно инкубация образца занимает менее двух часов, а инкубация с детектирующим реагентом занимает менее 30 минут. В случае, когда детектирующий реагент уже имеет детектируемую метку, стадию инкубации для образования сигнала можно опустить. В противном случае, в частности, при использовании генерации ферментативного сигнала, типичное время инкубации с реагентом для образования сигнала предпочтительно составляет менее 5 минут.
Во время инкубации настоящая конструкция картриджа позволяет перемешивать жидкость, тем самым смешивая образец и увеличивая массовый перенос аффинных связующих веществ к соответствующим антигенам. Предпочтительно перемешивание
следует за движением вдоль длинной стороны картриджа, который является достаточно мягким, чтобы жидкость не переполняла сосуды, но является достаточно жестким, чтобы увеличить кинетику реакции достаточно по сравнению с инкубацией без смешивания.
В ином случае, кинетику анализа можно увеличить или контролировать с помощью температуры или электромагнитных волн, предназначенных для более эффективного смешивания жидкости.
Детекция и измерение
Для создания детектируемого сигнала существует несколько возможностей, известных специалистам в данной области техники. В простейшей форме детектирующий реагент, который связывается с сайтами антигена, загружается специфическим иммунным глобулином, непосредственно маркируется либо красителем, либо возбуждаемым соединением, таким как флуоресцентный краситель или наночастицы золота или наночастицы цветного латекса или аналогичные. В этом случае детекция не требует дополнительных стадий образования сигнала, и сигнал может считываться непосредственно после вымывания несвязанного детектирующего реагента.
В предпочтительном воплощении генерация ферментативного сигнала применяется при использовании детектирующих реагентов, которые конъюгированы с ферментом, который преобразует субстрат, содержащийся в реактиве для образования сигнала, в детектируемый сигнал.
Ферменты, конъюгированные с детектирующим реагентом, включают, без ограничения указанным, щелочную фосфатазу (АР), пероксидазу хрена (HRP) или бета-галактозидазу (GAL). Эти ферменты могут создавать цветной осадок из субстрата (например, NCIB/NBT) или могут создавать фотоны из преобразования люминофора (например, Lumingen APS-5) или могут преобразовывать субстрат для изменения коэффициента экстинкции на определенной длине волны, например, о-нитрофенил-бета-D-галактопиранозидазу, соответственно.
Если необходимо, ферментативную реакцию можно немедленно остановить, добавив вещество, которое сильно мешает конверсии субстрата ферментом, так называемый стоп-раствор (например, дистиллированная вода, EDTA, NaOH, НС1 и т.д.).
В некоторых воплощениях детектирующий реагент представляет собой антитело против человеческого IgE, непосредственно меченное цветным соединением, наночастицами золота или цветными латексными наночастицами или с возбуждаемым соединением. В некоторых воплощениях детектирующим реагентом является антитело против человеческого IgG, непосредственно помеченное красителем, наночастицами золота, цветными латексными наночастицами или возбуждаемым соединением. В
некоторых воплощениях детектирующий реагент представляет собой аптамер или аффитело, специфически распознающие антитела IgE или IgG человека, где аптамер или аффитело непосредственно помечены красителем, наночастицами золота, цветными латексными наночастицами или возбудимым соединением. В некоторых воплощениях детектирующий реагент представляет собой антитело против человеческого IgE или IgG, конъюгированное с ферментом (например, АР, HRP или GAL), и способ включает инкубацию эррея с реагентом образования сигнала (например, субстратом для ферментативной реакции) в соответствии со стадией (iv) описанного в данном документе способа и необязательно дополнительно добавление стоп-раствора (например, ddH20, EDTA, NaOH, соляной кислоты, серной кислоты или любого реагента, который может влиять на ферментативную реакцию, либо делая реакцию невозможной из-за требований к значению рН для каталитической реакции, путем уничтожения или изменения субстрата химически, путем блокирования активного центра фермента или замедления реакции до незначительного уровня и т.д.), согласно стадии (iv).
В некоторых воплощениях детектирующий реагент содержит два компонента: (i) первый компонент, содержащий анти-IgE или анти-IgG антитело; и (ii) второй компонент, содержащий реагент, распознающий анти-IgE или анти-IgG антитело, причем второй реагент либо непосредственно помечен красителем или возбуждаемым соединением, либо конъюгирован с ферментом и где антигенный эррей инкубируется с (i) и затем (ii) в соответствии со стадией (ш), описанных в данном документе способов (со стадией промывки между ними). Например, первый компонент может представлять собой анти-IgE или aHTH-IgG-антитело определенного типа, такое как антитело, полученное из организма, такого как крыса, мышь, кролик и т.д., а второй компонент может быть антителом, связывающим указанный тип антител, например антитело против крысиного антитела, против мышиного антитела, против кроличьего антитела и т.д.
В частности, в данном документе представлен способ in vitro для обнаружения IgE-антител, связанных с аллергией, включающий,
(i) предоставление аллергенного эррея, описанного в данном документе,
(ii) инкубацию эррея с образцом (например, сывороткой или цельной или
обработанной кровью),
(ш) инкубацию эррея с aHTH-IgE-антителом или aHTH-IgE-аптамером, непосредственно помеченным детектируемым сигналом или анти-IgE или анти-^Е-аптамером, конъюгированным с ферментом (например, конъюгированным с АР, HRP или GAL)
(iv) необязательно, инкубацию эррея с реагентом образования сигнала (например,
субстратом для ферментативной реакции),
(v) необязательно добавление стоп-раствора для завершения образования сигнала (например, ddH20, EDTA, NaOH, соляной кислоты, серной кислоты или любого реагента, которые могут влиять на ферментативную реакцию, и
(VI) измерение регистрируемого сигнала. Обнаружение цветного сигнала может осуществляться через простую CCD-камеру, CMOS-камеру, лазерный сканер, такой как обычный планшетный сканер, или любое другое устройство, способное измерять разность интенсивностей между обычно белым или прозрачным фоном твердой подложки и окрашенными участками реакции, где была обнаружена реакция связывания. В случае фотонного измерения для измерения сигналов индивидуально необходимо использовать камеру с достаточной чувствительностью или фотоумножитель.
Для количественной оценки требуется сначала определить области, в которых отдельные антигены были иммобилизованы. Этому может способствовать паттерн пятен положительного контроля, которые всегда дают обнаруживаемый и сильный сигнал, так называемые маркерные пятна. Например, пятном положительного контроля может быть группа гранул, соединенных с очищенным человеческим IgE-антителом. Из положения и ориентации пятен маркера известно относительное положение всех других сайтов, а также их размер, и они могут быть обнаружены внутри полученного изображения или массива точек данных.
Для каждой типично круглой области иммобилизованных заряженных частиц антигена интеграция сигнала может быть рассчитана путем добавления каждого пикселя, который находится в ожидаемом сигнале к общему сигналу, и каждый пиксель, который находится снаружи, может быть добавлен к фону. Кроме того, среднее, медиана и стандартное отклонение можно рассчитать как для сигналов, так и для фона. Все вычисления будут обрабатываться программным инструментом анализа изображения, например, известным специалисту, например ImageJ от NIH.
В описанных в данном документе способах предпочтительным является расчет локального фона, который получают путем суммирования всех пикселей, которые находятся в трехкратном диаметре площади пятна, но не внутри любого из сайтов антигенов в совокупности.
Кроме того, статистические меры контроля могут использоваться для оценки качества или надежности сигнала, такого как среднее значение для медианного варьирования, изменения сигнала, изменения шума и обнаружения выскакивающих наблюдений.
Порог либо с точки зрения суммарного измеряемого сигнала - фона, либо с точки
зрения отношения сигнал/шум применяется для фильтрации необработанных данных измерений. Предпочтительно только сигналы, которые, по меньшей мере, в 2 раза выше, чем изменение фонового шума, рассматриваются как положительные сигналы (например, детектируемый сигнал).
Нормализация и калибровка результатов
После получения необработанных данных измерений необходимо выполнить две стадии, которые требуются для того, чтобы получить из необработанных аналитических данных до клинически значимых единиц ответа.
В описанных в данном документе способах используются два разных способа достижения первой нормализации и второй калибровки результатов.
Нормализацией в этом отношении является способ нормализации вариаций общих уровней сигнала между измерениями, днями, партиями или операторами, до идентичного уровня в среднем. Таким образом, вариации в точном времени инкубации, различия из-за изменений температуры окружающей среды, изменения, вызванные матрицей образцов и т.д., могут быть в некоторой степени компенсированы.
В случае настоящей заявки для достижения этой нормализации используется стандартная кривая подкласса конкретного антитела, который должен быть измерен в анализе. Очищенное антитело, например IgE человека, иммобилизуют в возрастающих концентрациях в отдельных сайтах формата макроэррея. Согласно этому подходу, наивысшая концентрация на стандартной кривой будет считаться 100% -ным сигналом, тогда как каждому известному разбавлению стандартной кривой присваивается соответствующее уменьшение концентрации. Из всех точек кривой вычисляется соответствие кривой и используется для преобразования произвольных единиц интенсивности в относительные единицы сигнала путем применения уравнения кривой к каждому исходному измеренному значению.
Этот способ позволяет нормализовать средние интенсивности сигналов между измерениями, однако не может компенсировать индивидуальные колебания для каждого отдельного параметра в соответствующей партии. Как правило, в каждом производимом лоте существует определенная степень вариации производства, и часто эти вариации являются систематическими в том смысле, что, например, параметр 1 может быть на 10% выше долговременного среднего, а параметр 2 может быть на 5% ниже долговременного среднего, а параметр 3 может быть в пределах спецификаций. Для того чтобы устранить такие различия до необходимого минимума, можно обнаружить любые систематические вариации долговременного среднего с помощью хорошо определенных контрольных образцов уже на участке контроля качества производителя. Как только это
систематическое изменение идентифицируется, появляется возможность передавать эти различия конечному пользователю в виде листа данных или предпочтительно в формате автоматического кодирования, таком как 2В-штрих-код, напечатанный на каждой партии. Читая и интерпретируя этот штрих-код, конечный пользователь может - с помощью программных средств - автоматически корректировать значения измерений в соответствии с идентифицированными вариациями во время процедуры контроля качества на сайте производителя, а в приведенном выше Примере затем корректировать измерения параметра 1, уменьшая их на 10%, регулируя параметр 2, увеличивая их на 5% и оставляя параметр 3 неизменным. Следовательно, должна быть возможность уменьшения общей вариации иммунологического анализа до более низкого уровня, чем без этой настраиваемой и статистически обоснованной корректировки данных.
На последней стадии должна быть достигнута фактическая калибровка результатов. Калибровка в этом отношении представляет собой процесс преобразования скорректированных единиц относительного ответа в определенной форме абсолютных единиц. Абсолютные единицы должны служить значением, которое позволяет сравнивать результаты с системами других производителей, между лабораториями или между временными точками, даже когда были сделаны значительные изменения в системе.
Калибровка может быть осуществлена относительно международно признанного эталонного препарата, если таковой имеется. Для многих областей заболеваний для калибровки могут быть приобретены и использованы количественные эталонные стандарты. Обычный процесс калибровки, однако, нецелесообразен для применения в форматах многопараметрического анализа, просто потому, что для калибровки системы потребуется значительно больше усилий и затрат, чем для фактических измерений.
Стандартный подход для калибровки в однопараметрических анализах - это гомологичная калибровка, в результате чего измеряется результат измерения для конкретного взаимодействия антиген - антитело, которое должно быть измерено в образце с неизвестной концентрацией последнего, и сравнивается с результатами измерений определенных образцов с определенных концентраций иммуноглобулинов против соответствующего антигена и с использованием этой контрольной кривой для преобразования необработанного измерения в абсолютные количественные результаты измерений.
Это легко достигается при измерении относительно небольшого количества стандартных препаратов для калибровки по сравнению с относительно большим количеством неизвестных образцов.
Однако в приложении с несколькими сотнями индивидуальных параметров,
измеренных в каждой реакции, и каждым параметром, представляющим связывание идентичного подкласса антител, но с другим антигеном, гомологичная калибровочная кривая для каждого индивидуального параметра не представляется целесообразной, и, скорее всего, приведет к значительной дополнительной вариации. Поэтому используется так называемый метод гетерологичной калибровки. Калибровочная кривая создается не для одного измерения антиген-антитело с различными концентрациями соответствующего антитела, измеренного в отдельных образцах, а с одним образцом, который представляет диапазон конкретных концентраций антител против ряда различных иммобилизованных антигенов. Способ основан на том факте, что, когда один и тот же иммуноглобулин детектируется при связывании различных антигенов, абсолютным требованием является не калибровка антительного ответа для каждого антигена-мишени индивидуально а сохранение одной и той же калибровочной кривой только для каждого обнаруженного класса иммуноглобулинов.
Интерпретация результатов, поддерживаемых программными инструментами Описанное применение многопараметрических иммунологических измерений приведет к значительно большему количеству результатов теста, чем обычная однопараметрическая клиническая работа по профилю сенсибилизации пациента.
Следовательно, применение инструментов биоинформатики должно облегчать интерпретацию и визуализацию результатов в формате, который позволит врачу легче просмотреть данные и получить по возможности лучший диагностический вывод. Следующие факторы должны считаться актуальными для облегченного представления программного обеспечения или руководства:
1) Общая классификация состояния здоровья, например, на основании профиля о том, что есть вероятность, что пациент страдает от предполагаемого заболевания, для которого был заказан тест.
2) Детальная классификация заболевания, например, соответствующие параметры или паттерны параметров, которые указывают на состояние заболевания или причину заболевания.
3) Классификация риска пациента, например, путем различения пациентов по уровню антительного ответа против определенных мишеней или паттернов антительных ответов против комбинации мишеней или отсутствия защитных антител против определенных мишеней или отношения различных подклассов антител против различных антигенных мишеней.
4) Последствия лечения пациента, например, путем выбора соответствующих лекарств, предоставления правильных рекомендаций для предотвращения или даже
1)
предотвращения применения наиболее вероятных неэффективных лекарств. Полные панели для клинической интерпретации
Основным преимуществом мультиплексированного иммуноанализа является возможность включения всех соответствующих клинических параметров в один тест, что уменьшает нагрузку на врача для предварительного выбора тестов для каждого отдельного пациента и всегда позволяет получить полное клиническое обследование на одной аналитической стадии.
Конструкция картриджей и преимущества в отношении автоматизации Кроме того, в данном документе представлены картриджи, содержащие тестовую камеру для любого из описанных в данном документе антигенных эрреев, резервуар для жидких отходов и, необязательно, штрих-код для идентификации и калибровки. Картридж может дополнительно содержать резервуары или интегрированные флаконы для любого одного или нескольких детектирующих реагентов (например, меченого антитела, меченого аптамера или меченого аффитела), реагента для образования сигнала (например, ферментного субстрата) и стоп-раствора (например, дистиллированная вода, EDTA, NaOH, НС1 и т.д.). В некоторых воплощениях картридж дополнительно содержит резервуар или интегрированный флакон для одного или более контрольных образцов (например, положительных и/или отрицательных контролей) и/или одного или нескольких буферов, используемых во время процедуры анализа (например, буферов для промывки, блокирующих буферов, буферов для разбавления). В некоторых воплощениях положительный контрольный образец представляет собой коммерчески доступный стандартизованный образец с определенным количеством иммуноглобулина (например, общий IgG или IgE и/или определенный IgG или IgE, специфичный для конкретного антигена/аллергена). В некоторых воплощениях положительный контрольный образец представляет собой образец, который был проверен или испытан положительным в стандартном анализе соответствующего иммуноглобулина. В некоторых воплощениях отрицательный контрольный образец представляет собой коммерчески доступный образец, который не содержит никаких иммуноглобулинов или образец, который был проверен или испытан отрицательным в стандартном анализе для соответствующего иммуноглобулина. Картридж может дополнительно обеспечивать средство для мягкого перемещения антигенного эррея в тестовой камере или тестовой камеры в целом с размещенной в ней антигенным эрреем, чтобы обеспечить равномерное распределение образца и буферов на эррее во время периодов инкубации, а также тщательную промывку эррея. Размер картриджа будет зависеть от размера эррея и типа и количества используемых реагентов. Предпочтительно размер будет находиться в диапазоне от 1 см х
1 см х 5 см до 2 см х 5 см х 15 см.
Фиксация антигенных эрреев в картридже может осуществляться одним из нескольких способов, включая механическую фиксацию путем резки до точного размера окружающего пространства, с использованием механических фиксаций на краях полос или с использованием биосовместимых адгезивов, которые также выдерживают стадии промывки и инкубации во время процедуры ELISA. Важным аспектом фиксации является отсутствие создания зазоров, областей или отверстий в картридже или между картриджем и твердофазной тест-полоской, где может происходить неспецифическое связывание во время стадий инкубации, что может не поддаваться эффективной промывке, поскольку значительно увеличится образование общего неспецифического сигнала на стадии детекции, что, следовательно, приведет к уменьшению пикового сигнала до уровня шума анализа и общей эффективности анализа.
Схожее значение имеет фактор отсутствия позиционных эффектов инкубации и обнаружения сигнала, хорошо известных специалистам в данной области техники. Типичной систематической ошибкой является так называемый краевой эффект, при котором результаты участков реакции (пятен), находящихся близко к границе эррея, и прилегающим стенкам или флаконам картриджа, либо значительно, либо воспроизводимо выше или ниже, чем в середине эрреев. Различие может быть вызвано поведением жидкости при встряхивании или перемешивании, накоплением связующих в выбранных местах или поверхностным натяжением или кинетическими различиями в реакционных участках, окруженных более фиксированными границами и, следовательно, более ограниченной свободной диффузией, чем те, которые являются более центральными и менее ингибированными краями или стенками. Даже различия в пространственной температуре могут играть роль в наблюдаемых различиях, а также систематической ошибке в событии детекции, вызванном геометрией сосуда. Например, в случае микроэрреев, депонированных в круглых микролуночных планшетах, пятна в центре обычно значительно отличаются по поведению, чем пятна, расположенные ближе к границе планшетов. Хотя некоторые производители преодолевают это ограничение, печатая "круглые эррей" или паттерны, это конечно значительно уменьшает полезную площадь и количество признаков в каждой области, что не подходит для реального многопараметрического анализа с несколькими сотнями различных анализов в реакции.
Конструкция картриджа в представленном изобретении предлагает дополнительное преимущество. Картридж можно считать самим комплектом, он может содержать все жидкости и реагенты, необходимые для проведения испытаний в специально разработанных сосудах. Картридж может содержать штрих-код для
идентификации партии и даже корректирующие факторы для калибровки и т.д., которые могут храниться в таком штрих-коде.
Аналогично, набор одноразовых пластиковых наконечников может находиться на борту в картридже, откуда пипетка может захватывать их для процесса и повторно вводить в картридж после применения. Таким образом, окружающие части системы не подвергаются (например, при обработке жидкостью) контакту с жидкостями, которые потенциально биологически опасны или инфекционны, поскольку все жидкости собираются в самом картридже с помощью разработанной емкости для отходов. Поэтому нет необходимости в каких-либо специальных процедурах очистки или дезинфекции инструмента.
Поскольку картридж может захватывать или даже содержать все необходимые жидкости для процедуры теста, на основе такой конструкции можно спроектировать автоматизацию анализа таким образом, чтобы единственной частью обработки жидкостью могла быть поршневая пипетка, которую из-за одноразовых наконечников не требуется обслуживать или заменять клапаны или трубки в течение нормального ожидаемого срока службы прибора. Общая стоимость разработки, а также стоимость владения таким инструментом практически без технического обслуживания намного ниже, чем стоимость типичного автоматического анализатора иммунитета, который содержит много подвижных частей, клапанов и трубок, которые необходимо систематически заменять.
Во время стадий промывки картридж просто наклоняется в одну сторону, так что содержащаяся жидкость проходит в резервуар внутри картриджа, где она захватывается и, наконец, удаляется.
Кроме того, в данном документе представлены комплекты, содержащие антигенную эррей или картридж, описанные в данном документе, детектирующий реагент, контрольные образцы (например, положительный или отрицательный контроль), буферы, используемые во время анализа и инструкции для применения. Набор может дополнительно включать реагент образования сигнала (например, субстрат для фермента) и, возможно, стоп-раствор (например, дистиллированную воду, EDTA, NaOH, НС1 и т.д.). В некоторых воплощениях набор содержит антигенную эррей (например, аллергенный эррей), детектирующий реагент, специфичный для IgE или IgG (например, анти-IgE или анти-IgG антитело, аптамер или аффитело, специфичные для IgE или IgG, либо напрямую помеченные или конъюгированные с ферментом), буферные растворы (например, буферы для промывки, блокирующие буферы, буферы для разбавления) и, необязательно, реагент образования сигнала (например, ферментный субстрат). В некоторых воплощениях комплект дополнительно включает стоп-раствор (например, дистиллированную воду,
EDTA, NaOH, HC1 и т.д.).
Кроме того, в данном документе предусмотрено устройство, содержащее камеру для одного или нескольких картриджей, как описано в данном документе, пипетку и устройство для обнаружения сигнала (например, ПЗС-камера, CMOS-камера, лазерный сканер).
Кроме того, изобретение включает следующие разделы:
1. Антигенный эррей, содержащий группы покрытых антигеном гранул,
закрепленных на твердом носителе, где каждая группа включает
(i) гранулы, покрытые одним детектирующим антигеном, или
(ii) гранулы, покрытые набором детектирующих антигенов, предпочтительно, где твердый носитель представляет собой лист или пластину и где детектирующий антиген представляет собой аллерген, маркер инфекции или аутоантиген.
2. Антигенный эррей по разделу 1, в котором детектирующий антиген представляет собой биомолекулу, состоящую из нуклеиновых кислот и/или аминокислот, предпочтительно белка, пептида, антитела или молекулы ДНК или органического или неорганического химического соединения.
3. Антигенный эррей по любому из разделов 1 или 2, где детектирующий антиген является аллергеном.
4. Антигенный эррей по любому из разделов 1-3, где детектирующий антиген является маркером инфекции.
5. Антигенный эррей по любому из разделов 1-4, где детектирующий антиген является аутоантигеном.
6. Антигенный эррей по любому из разделов 1-5, где детектирующий антиген представляет собой антиген, полученный с помощью технологии рекомбинантной ДНК, или антиген, выделенный и очищенный из биологического материала.
7. Антигенный эррей по любому из разделов 1-6, где набор детектирующих антигенов получают из экстракта или лизата биологического исходного материала, содержащего более одного антигена.
8. Антигенный эррей по любому из разделов 1-7, где детектирующий антиген содержит единственный эпитоп, одну макромолекулу с несколькими антителосвязывающими эпитопами или смесь различных белков с различными антигенами, содержащими множество эпитопов.
9. Антигенный эррей по любому из разделов 1-8, где гранулы представляют собой микро- или наночастицы.
10. Антигенный эррей по любому из разделов 1-9, где гранулы имеют размер от 5
до 500 нм в диаметре, предпочтительно от 200 до 500 нм в диаметре.
11. Антигенный эррей по любому из разделов 1-10, в которой гранулы представляют собой латексные гранулы, полимерные пластиковые гранулы, предпочтительно гранулы полистирола, гранулы, изготовленные из биосовместимых полимеров, или стеклянные гранулы, предпочтительно кремниевые гранулы.
12. Антигенный эррей по любому из разделов 1-11, где поверхность гранул является пористой или непористой.
13. Антигенный эррей по любому из разделов 1-12, где детектирующий антиген связывается ковалентно или нековалентно.
14. Антигенный эррей по любому из разделов 1 или 13, где детектирующий антиген связан с гранулами нековалентно пассивной адсорбцией, предпочтительно гидрофобным и/или электростатическим присоединением.
15. Антигенный эррей по любому из разделов 1-14, где детектирующий антиген связывается через антигенные спейсеры.
16. Антигенный эррей по любому из разделов 1-15, где детектирующий антиген связан таким образом, при котором создается предпочтительная ориентация для презентации эпитопов, представленных на связанном антигене.
17. Антигенный эррей по любому из разделов 1-16, где твердый носитель представляет собой лист или пластину из пористого или непористого материала, предпочтительно нитроцеллюлозного листа, более предпочтительно ламинированного нитроцеллюлозного листа.
18. Антигенный эррей по любому из разделов 1-17, включающий гранулы того же или другого типа.
19. Антигенный эррей по любому из разделов 1-18, где эррей включает, по меньшей мере, 25 различных групп.
20. Антигенный эррей по любому из разделов 1-19, где группы гранул с антигенным покрытием закреплены на твердом носителе с использованием контактных способов или бесконтактных способов, предпочтительно с использованием соленоидной системы дозирования.
21. Антигенный эррей по любому из разделов 1 -20, где каждая группа фиксируется как адресуемый элемент в прямоугольном эррее или в плотноупакованном эррее, предпочтительно при плотности 1 адресуемый элемент на мм2.
22. Антигенный эррей по любому из разделов 1-3 и 6-21, в котором гранулы, покрытые антигеном, представляют собой покрытые аллергеном гранулы, закрепленные на твердом носителе, предпочтительно твердый носитель представляет собой лист или
11.
пластину, причем каждая группа включает
(i) гранулы, покрытых одним аллергеном, или
(ii) гранулы, покрытые набором аллергенов, предпочтительно экстрактом
аллергена.
23. Способ детекции иммуноглобулина, специфичного к детектирующему
антигену, или к набору детектирующих антигенов, включающий
(i) обеспечение антигенного эррея по любому из разделов 1-22,
(ii) инкубацию эррея с образцом,
(ш) инкубацию эррея с детектирующим реагентом,
(iv) необязательно инкубацию эррея с реагентом образования сигнала и
(v) измерение детектируемого сигнала.
24. Способ раздела 23, где иммуноглобулин представляет собой IgE-антитело, ассоциированное с аллергией.
25. Способ раздела 23, где иммуноглобулин представляет собой IgG-антитело, связанное с инфекцией или аутоиммунной реакцией.
26. Способ по любому из разделов 23-25, где образец представляет собой биологическую жидкость, предпочтительно сыворотку, целую или обработанную кровь, носовую жидкость или мочу, клеточный лизат или гомогенат ткани из объекта или пула объектов.
27. Способ по любому из разделов 23-26, где детектирующий реагент представляет собой аффинное связующее вещество, специфичное к иммуноглобулину, предпочтительно антитело, аптамер или аффитело.
28. Способ по любому из разделов 23-27, где детектирующий реагент представляет собой анти-IgE антитело, IgE-специфичный аптамер, IgE-специфичное аффитело, анти-IgG антитело, IgG-специфичный аптамер или IgG-специфичное аффитело. Способ по любому из разделов 23-27, в котором детектирующий реагент (i) помечен напрямую, предпочтительно цветным или флуоресцентным соединением или наночастицами золота или цветными латексными наночастицами; или (ii) конъюгирован с ферментом.
29. Способ по любому из разделов 23-28, дополнительно включающий инкубацию эррея с реагентом образования сигнала в соответствии со стадией (iv) пункта 23, где детектирующий реагент конъюгирован с ферментом, а реагент образования сигнала включает субстрат для упомянутого фермента.
30. Способ по разделу 30, дополнительно включающий эррей со стоп-раствором после стадии (iv).
31. Способ по любому из разделов 23-30 для обнаружения IgE-антитела, связанного
24.
с аллергией, включающий,
(i) обеспечение матрицы антигенов согласно разделу 22
(ii) инкубацию эррея с образцом,
(ш) инкубацию эррея с помощью детектирующего реагента (например, анти-IgE антитела или IgE-специфического аптамера или IgE-специфического аффитела)
(iv) необязательно инкубацию эррея с реагентом образования сигнала и
(v) измерение детектируемого сигнала.
32. Картридж, включающий тестовую камеру для антигенного эррея по любому из
разделов 1-22, резервуар для жидких отходов и, необязательно, штрих-код.
33. Набор, включающий антигенный эррей по любому из разделов 1-22, детектирующий реагент, один или несколько буферов, один или несколько контрольных образцов и инструкции для применения набора в способе согласно любому из элементов 23-31 и необязательно реагент образования сигнала.
34. Устройство, включающее камеру для одного или нескольких картриджей по элементу 32, пипетку и устройство для обнаружения сигнала.
Примеры
Примеры, описанные в данном документе, являются иллюстрацией настоящего изобретения и не предназначены для его ограничения. Различные воплощения настоящего изобретения описаны в соответствии с настоящим изобретением. Многочисленные модификации и вариации методов, описанных и проиллюстрированных в данном документе, могут быть внесены без отхода от сущности и объема изобретения.
Пример 1
Материалы и методы Аллергенный исходный материал
Аллергены были приобретены у различных внешних поставщиков или произведены самостоятельно. Аллергены были либо аллергенными экстрактами, либо очищенными природными аллергенами, либо рекомбинантными аллергенами. Аллергены обрабатывались в соответствии с рекомендациями поставщиков или в соответствии с нашим собственным опытом в отношении буферов и условий хранения. Повторное замораживание/оттаивание избегалось. Для аллергенов, которые были доставлены в лиофилизированной форме, восстановление проводилось в соответствии с инструкциями производителя.
Связывание аллергенов с наночастицами
Полистирольные наночастицы были приобретены у Polysciences Europe GmbH. Связывание материалов с аллергенами с частицами проводилось в соответствии с
рекомендациями производителя, но в конечном итоге их необходимо было оптимизировать для каждого препарата аллергенов. Для получения оптимальной эффективности связывания и биологической активности были применены различные подходы. Некоторые аллергены могут быть связаны пассивной адсорбцией с удовлетворительными результатами, в то время как многие аллергены требуют особых условий связывания или стратегий образования ковалентных связей. Для этой цели использовались частицы полистирола с модификациями поверхности NH2 или СООН, а также гомо- или гетеробифункциональные сшивающие агенты. Несколько препаратов аллергенов были обработаны таким образом, что сначала их разделили на несколько аликвот, затем соединили в разных условиях и, наконец, снова объединили для представления полного репертуара эпитопов аллергенов во время функционального тестирования.
Связывание пассивной адсорбцией (стандартный протокол)
Наночастицы были приготовлены в соответствии с инструкциями производителей. Аллергены или экстракты аллергенов разбавляли до соответствующей концентрации соединения, обычно менее 0,5 мг/мл, в буферах, соответствующих изоэлектрической точке аллергенов. Частицы (1% твердых веществ) и аллергены инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Инкубацию продолжали без смешивания в течение ночи при 2-8°С. Наконец, частицы осаждали путем центрифугирования при 10000 об/мин, 4°С в течение 15 минут, собирали надосадочную жидкость и суспендировали гранулы в соответствующих буферах и консервантах для длительного хранения.
Связывание пассивной адсорбцией (расширенный протокол)
Подобно вышеуказанному стандартному протоколу, за исключением того, что, по меньшей мере, использовали отдельно 3 разных диапазона рН, как правило, в нейтральном, кислотном и основном диапазоне. После выполнения протокола связывания частицы объединяли вместе при нейтральном рН.
Химическое связывание с частицами, поверхность которых покрыта СООН Наночастицы разбавляли до соответствующих концентраций, обычно 1% твердых веществ, затем промывали 3 раза в активирующем буфере (например, MES-буфер с рН от 5 до 7,5), гранулировали и суспендировали между стадиями промывки. Для активации частицы, содержащие поверхностные СООН-группы, активировали водорастворимым карбодиимидом, например 1-этил-З- (3-диметиламинопропил) карбодиимидом в течение 15-30 минут. После активации частицы два раза промывали в активирующем буфере. Белок разбавляли в буфере для связывания, не содержащем свободных NH2-rpynn, до
концентрации, которую обычно оптимизировали с помощью экспериментов по титрованию. Активированные частицы и белковый раствор инкубировали в течение не менее 3 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 2-8°С. Наконец, частицы осаждали путем центрифугирования, как описано выше, и суспендировали в буферах хранения, содержащих консерванты, до дальнейшего применения.
Химическое связывание с частицами, поверхность которых покрыта NH2 Использовали протокол, очень похожий на описанный выше, с тем отличием, что для активации NH2-rpynn на наночастицах использовали реактивный реагент, например, глутаральдегидную или сукцинимидную химию, такую как EGS-сшивающие агенты. Соответственно, буферы и значения рН должны были быть скорректированы для оптимизации эффективности связывания в случае каждой применяемой химии. Не во всех случаях теоретически оптимальное значение рН давало желаемую оптимальную эффективность связи, а скорее значение рН, которое не было бы выбрано путем изучения теоретических свойств белка.
Оценка эффективности связывания
Эффективность связывания измерялась с использованием как прямых, так и косвенных способов. До и после связывания измеряли концентрацию белка в растворе. Степень истощения белка из раствора после связывания была хорошим показателем связывания белка, но не биологической активности. Кроме того, связанные гранулы удаляли из белка с использованием способов, описанных поставщиком для получения белка из гранул. Эти обезжиренные белковые препараты также характеризовали с помощью измерения концентрации, а также денатурирующим электрофорезом в SDS-геле и окрашиванием кумасси синим.
Для окончательной оценки биологической активности связанных аллергенов проводили функциональное измерение с использованием стандартной процедуры проверки и анализа (см. ниже), для тестирования конкретных положительных сывороток для каждого препарата аллергенов. Параметрами, используемыми для тестирования, были: 15-минутное блокирование, 2-часовая инкубация сыворотки с разведенными 1:5 образцами сыворотки, инкубация с детектирующими антителами в течение 30 минут.
Дозированная подача частиц аллергена на твердую фазу
Нитроцеллюлозные мембраны приобретали у GE Healthcare и Pall Europe. Проверяли различные типы мембран с различными свойствами по размеру пор, скорости потока или материалу основы.
Дозированное нанесение осуществлялось с помощью прибора Biodot AD 1520 с использованием оптимизированных настроек для циклов движения, аспирации,
дозированного нанесения и промывки. Каждый препарат аллергена осаждали на твердой фазе в объеме, составляющем, по меньшей мере, 20 нанолитронов, с шагом между центрами 1 мм. Окончательные эррей имели геометрию, как правило, 10 столбцов и 25 строк.
После выдачи NC-листы герметизировали и хранили при 2-8°С до дальнейшей обработки. Перед анализом листы NC разрезали до соответствующих размеров, и небольшие виньетки, содержащие контрольную матрицу, помещали в кассеты для анализа.
Стандартная процедура анализа
Был создан тестовый эррей, содержащий 250 различных элементов, которые первоначально были заблокированы от неспецифического связывания в буфере, содержащем высокие концентрации неаллергенного белка, при осторожном покачивании контейнерной кассеты с эрреем.
Промывку между стадиями процесса проводили с использованием трис-буферного солевого раствора с рН 7,4 и 0,2% Tween-20 в качестве детергента (TBS-T).
После блокировки эррей инкубировали с сывороткой или плазмой пациента при постоянном осторожном покачивании в течение как минимум 15 минут. Сыворотку отбрасывали и эррей промывали несколько раз TBS-T при осторожном перемешивании.
После циклов промывки эррей инкубировали с разведенным анти-IgE человека антителом, которое было помечено щелочной фосфатазой (АР). Затем антитело отбрасывали и оставшиеся несвязанные антитела несколько раз промывали TBS-T.
Наконец, эррей инкубировали с субстратом формирования цвета BCIP/NBT (5-бром-4-хлор-З-индолилфосфат/нитросиний тетразолий) в течение нескольких минут до достижения достаточной чувствительности, затем реакцию останавливали и оставшийся субстрат смывали.
Эррей высушивали перед сканированием или визуализацией. Изображения получали как 24-битные цветные изображения и преобразовывали в 16-битные данные в оттенках серого.
Анализ
Каждый круглый элемент был количественно оценен путем вычисления средней интенсивности и вычитания локального фона из значения элемента. Отношение сигнал-шум > 2 рассматривалось как положительный сигнал.
Эррей были нормализованы по стандартной кривой иммобилизованного очищенного IgE человека, который был нанесен в виде пятен вместе с аллергенными препаратами. Кроме того, нормированные значения были откалиброваны с
использованием гетерологичной калибровки по сравнению с эталонным образцом с несколькими положительными результатами теста. Пример 2
Антигенный эррей, содержащий 245 групп гранул с антигенным покрытием, получали с использованием материалов и способов, описанных в Примере 1. Для данных, показанных в данном документе, наносили пятна только пассивно адсорбируемых аллергенов. IgE-специфические измерения для 245 аллергенов и 5 стандартов IgE с использованием пула человеческих образцов из нескольких аллергических объектов показаны на фигуре 1А. Соответствующий отрицательный образец без значительного уровня специфического IgE показан на фигуре 1В. Схема групп антигенов показана на фигуре 1С. Расстояние между группами антигенов составляло 1 мм в направлении х и у. Пример За. Тестовая оценка по сравнению с эталонным способом В общей сложности до 137 образцов пациентов (количество пациентов, перечисленных как п в таблице 3) испытывали с помощью представленного способа, описанного в Примере 1. Образцы пациентов разводили 1:5 для тестирования и применяли стандартную процедуру анализа. Для сравнения данных, полученные результаты сравнивались с имеющимися справочными данными, которые были получены с использованием другой версии теста ImmunoCAP ISAC (Thermo Fisher, Уппсала, Швеция). Образцы пациентов, выявленные положительными или отрицательными в контрольном анализе, показаны в таблице 3 как "пол" или "отр", соответственно. Для сравнения для создания статистики ROC (Curve Operator Curve) использовали данные Medcal Version 16.1. С этой целью любые антигенспецифические результаты выше, чем порог производителей в тесте ImmunoCAP ISAC, считались истинно положительными (= 1), в противном случае - как отрицательные (= 0). Результатом статистической оценки было: Площадь под кривой AUC (идеальная корреляция = 1, отсутствие корреляции = 0), аналитическая чувствительность, аналитическая специфика. Всего было учтено 3619 результатов измерений, из которых 692 положительных результата и 2927 отрицательных результатов. Результаты приведены в таблице 3 ниже. Также показана средняя чувствительность и специфичность, которые составляли соответственно 99% и 95%, в результате чего сниженная специфичность объяснялась более высокой чувствительностью нового способа, который будет генерировать более положительные результаты измерения, чем эталон.
220 образцов пациентов испытывали с помощью раскрытого способа, как описано в Примере 1. Аллергены были либо пассивно адсорбированы, либо химически связаны, например, с использованием различных химических линкеров. Образцы пациентов разводили 1:5 для тестирования и применяли стандартную процедуру анализа. Для сравнения данных полученные результаты сравнивались с имеющимися справочными данными, которые были получены с использованием другой версии теста ImmunoCAP ISAC (Thermo Fisher, Уппсала, Швеция). Чувствительность, специфичность и корреляция г2 для выбранных аллергенов показаны на фигуре 2. Чувствительность и специфичность оценивали с использованием MedCalc по сравнению с эталонными данными с использованием протоколов производителей для тестирования и порога 0,3 ISU.
Линейный регрессионный анализ результатов измерений был выполнен с помощью Microsoft Excel. Всего было учтено 779 положительных результатов и 2772 отрицательных результата.
Пример 4. Усиление сигнала
12 экстрактов аллергена или молекулярных аллергенов из молока и яйца иммобилизовали в двух разных условиях на твердофазном материале-носителе (нитроцеллюлоза Protran, 0,2 мкм, GE Healthcare). Первое условие непосредственно связывало аллергенные белки с твердой фазой, как описано изготовителем для процедур вестерн-блоттинга. Во-вторых, 12 аллергенов сначала связывали с полистирольными наночастицами размером 350 нм с помощью пассивной адсорбции в нейтральных условиях рН без дополнительной оптимизации условий взаимодействия, как описано в материалах и методах Примера 1.
Затем 20 сывороток крови с аллергией на молоко и яйца тестировали на специфический IgE против 12 белков. Полученные аллерген-специфические сигналы от каждого непосредственно иммобилизованного белкового препарата или каждого иммобилизованного связанного с частицами антигена (исходные данные для всех 20 сывороток, показанных в таблице 5) были усреднены по всем 20 сывороткам, два суммарных значения на каждый аллерген были сопоставлены и фактор был рассчитан между этими значениями. Результаты представлены в таблице 4 и на фигуре 3.
функциональном анализе
Были проведены специфические измерения IgE с 8 различными образцами, положительными против Рш р 3, основного аллергена персика (фигура 4). Один отрицательный образец был протестирован как контроль. Рш р 3 связывали с использованием нескольких различных способов, включая три разных способа ковалентного связывания (условие 1-3). Пассивная адсорбция белка вообще не работала, и белок почти не мог быть связаться с наночастицами только пассивной адсорбцией (результаты не показаны). Согласно анализу эффективности связывания между различными подходами образования ковалентной связи большой разницы не наблюдалось. Однако функциональный анализ выявил существенное различие в биологической активности связанных аллергенов при тестировании ряда сывороток и сравнении результатов с эталонным способом ImmunoCAP 100 от Thermo fisher, Уппсала,
Швеция).
В зависимости от тестируемой сыворотки наблюдаются значительные различия между результатами различных способов и подходами связывания. Основополагающим объяснением является то, что в зависимости от того, против каких эпитопов сыворотка имеет специфический IgE, определенный способ связывания или способ анализа представляют более или менее соответствующий эпитоп в активной конформации.
Значения непосредственно не сопоставимы, поскольку каждый способ дает результаты в разных единицах, которые, однако, откалиброваны по внутреннему стандарту, чтобы быть похожими.
Пример 6. Клиническое наблюдение пациента, выявившее дополнительную сенсибилизацию
Пациент посетил местную аллергологическую клинику после двух приступов астмы в ночное время, когда он оставался ночевать в доме друга с котом. Аллергия на траву и березу была известна раньше, но ранее не возникало проблем с дыханием. Результаты, полученные в клинике аллергии с использованием метода Immuno САР, показаны в Таблице 6 ниже (Reference 1С) и сравниваются с описанным в данном документе способом (упоминаемый как "FABER" в таблице 6). В Таблице 6 далее указаны результаты тестов на кожные заболевания (SPT) и наблюдаемые симптомы у пациента для выбранных аллергенов.
Качественная корреляция (положительная или отрицательная) результатов in vitro между описанным в данном документе способом и эталонным способом ImmunoCAP обычно высока. Можно предположить, что некоторые из коммерчески полученных аллергенных экстрактов (например, Bet v, Amb а) не содержат достаточного количества аллергенов, так как полученные значения были первоначально ниже эталонного способа. Однако при обобщении результатов молекулярного тестирования можно получить очень похожий результат между нашим способом (Bet v 1.0101 + Bet v 2.0101) и ImmunoCAP.
Скарификационная проба (Skin prick test, SPT) у пациента была отрицательной на кошку. Кожный тест, а также тест IVD на системе ImmunoCAP проводили с экстрактами кожных аллергенов. Оба теста сработали плохо, дав отрицательный тест в SPT и умеренный положительный результат в тесте ImmunoCAP. Общая проблема с аллергенными экстрактами заключается в том, что точная природа аллергенов, присутствующих в смеси, неясна, а также в деградации аллергенов, которая может происходить при экстракции или хранении. Наш тестовый формат показал сравнительно низкий результат на коммерческом кошачьем экстракте, но очень высокий положительный результат на рекомбинантном чистом кошачьем аллергене Fel d 1. Очень
маловероятно, что такой высокий положительный результат in vitro был бы так же легко проигнорирован клиническим врачом на основании отрицательного результата теста SPT.
Были обнаружены дополнительные сенсибилизации, некоторые из которых не могут быть объяснены перекрестной реактивностью аллергена и поэтому могут считаться потенциально релевантными, например, против креветок и тараканов. Например, высокий уровень аллергенов типа PR10 (гомология Bet v 1) оказался положительным: Bet v 1.0101, Mai d 1.0108, Cor a 1.0103; Профилины, которые также высоко консервированы между видами, найденными положительными, представляли собой: Ara h 8.0101, Bet v 2.0101, Hev b 8, Мег a 1; Также эпителий множества животных или белки молока и мяса животных можно объяснить перекрестной реактивностью между видами животных.
С другой стороны, аллергены, такие как Bla g 1 тараканов или Pen m 1 креветок, не были найдены никакими эталонными тестами и могут рассматриваться как настоящие сенсибилизации, которые не могут быть объяснены перекрестной реактивностью с другими положительными результатами теста. Таким образом, эти белки могли быть исследованы далее по клинической значимости.
83 образца тестировали с использованием описанного в данном документе антигенного эррея (см. Примеры 1 и 2), а также использовали тест ImmunoCAP ISAC (Thermo Fisher Уппсала, Швеция) в качестве эталонного способа. Технические характеристики двух тестов сравниваются на фигуре 5.
Всего было протестировано 245 аллергенов в антигенном эррее, описанном в Примерах 1 и 2, и 112 аллергенов в эталонном способе, при этом 70 аллергенов перекрывались между двумя тестами. Результаты этих аллергенов, которые были непосредственно сопоставимы (идентичны) между двумя тестами, хорошо коррелировали, демонстрируя корреляцию Пирсона 76%. Для этих перекрывающихся аллергенов в эталонном способе были получены 1057 положительных результатов, а с помощью способа, описанного в данном документе, были получены 1159 положительных результатов, что соответствует увеличению примерно на 10% (9,65%) и указывает на повышенную чувствительность настоящего способа.
Кроме того, с помощью эталонного способа были получены в общей сложности 2508 положительных результатов теста, тогда как с текущим способом в то же время было получено 4740 положительных результатов. Таким образом, описанный в данном документе антигенный эррей идентифицировал гораздо больше сенсибилизаций, то есть увеличение на 89%, что дополнительно указывает на более высокую чувствительность эррея/способа антигена по сравнению с эталонным эрреем/способом. Результаты обобщены в Таблице 7.
Гранулы, связанные с аллергеном, готовили, как описано в Примере 1, и аллергенный эррей, получали в день 0. Несколько дополнительных антигенных эрреев (около 40) получали в течение 330 дней с использованием тех же препаратов гранул, связанных с аллергенами. Антиген-связанные гранулы хранились в течение этого периода времени при 2-8°С, за исключением случаев, когда они использовались для получения антигенных эрреев, для которой они выдерживались при комнатной температуре в течение примерно 30 мин.
Тот же образец был испытан в день 0 в антигенном эррее, изготовленном в день 0, а затем снова в день 330 в антигенном эррее, изготовленном в день 330. Результаты двух тестов и вариационного коэффициента (CV) приведены в таблице 8. На фигуре 5 показан график результатов в день 0 и день 330.
Эти данные показывают чрезвычайно высокую стабильность покрытых аллергеном гранул и воспроизводимость способа.
аллергенами
Березовая пыльца была приобретена у коммерческого поставщика, а экстракт аллергена был приготовлен способами, известными специалистам в данной области, в основном перемешиванием в определенных условиях и в течение определенных периодов времени в физиологическом буфере. Экстракт берёзовой пыльцы соединяли с наночастицей пассивным связыванием с использованием 4 различных условий рН и солей. Как показывают данные (таблица 9), на основе молекулярного профиля пациента (например, какие молекулярные аллергены у пациента имеют специфические антитела в сыворотке), разные значения рН дают различную количественную оценку slgE. Это указывает на то, что объединение разных условий рН сохраняет репертуар молекулярного эпитопа экстракта и приводит к более точному и более чувствительному измерению.
Кроме того, экстракт березы дополнительно обрабатывали методом эксклюзионной
хроматографии (SEC). Отдельные фракции, представляющие определенный диапазон молекулярной массы исходного экстракта, собирали и связывали с наночастицами с использованием одного условия. Как и ожидалось, в зависимости от модели молекулярного распознавания получается еще более выдающийся результат измерения в соответствии с паттерном молекулярной сенсибилизации пациентов. Например, образец 1 показал сопоставимые уровни специфического IgE во всех фракциях, тогда как образец 2 показал низкие уровни slgE против фракции 1, но высокий против фракции 3, тогда как образец 3 имел самые высокие уровни slgE против фракции 1. Объединение отдельных фракций и дальнейшая оптимизация условий связывания рН для каждой фракции приведут к более высокой аналитической чувствительности, чем у эталонного способа.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антигенный эррей, включающий группы покрытых антигеном гранул, закрепленных на твердом носителе, где каждая группа включает
(i) гранулы, покрытые одним детектирующим антигеном, или
(ii) гранулы, покрытые набором детектирующих антигенов, и где твердый носитель представляет собой лист или пластину, а детектирующий антиген представляет собой аллерген, маркер инфекции или аутоантиген.
2. Антигенный эррей по п. 1, отличающийся тем, что детектирующий антиген представляет собой биомолекулу, состоящую из нуклеиновых кислот и/или аминокислот, предпочтительно белка, пептида, антитела или молекулы ДНК или органического или неорганического химического соединения.
3. Антигенный эррей по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что детектирующий антиген представляет собой антиген, полученный по технологии рекомбинантных ДНК, или антиген, выделенный и очищенный из биологического материала.
4. Антигенный эррей по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что набор детектирующих антигенов получают из экстракта или лизата биологического исходного материала, содержащего более одного антигена.
5. Антигенный эррей по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что гранулы представляют собой микро- или наночастицы, предпочтительно, когда гранулы имеют размер от 5 до 500 нм в диаметре, предпочтительно от 200 до 500 нм в диаметре.
6. Антигенный эррей по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что гранулы представляют собой латексные гранулы, полимерные пластиковые гранулы, предпочтительно гранулы из полистирола, гранулы, изготовленные из биосовместимых полимеров, или стеклянные гранулы, предпочтительно гранулы из двуокиси кремния.
7. Антигенный эррей по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что детектирующий антиген связывается ковалентно или нековалентно, предпочтительно пассивной адсорбцией.
8. Антигенный эррей по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что твердый носитель представляет собой лист или пластину из пористого или непористого материала, предпочтительно нитроцеллюлозного листа, более предпочтительно ламинированного нитроцеллюлозного листа.
9. Антигенный эррей по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что эррей содержит, по меньшей мере, 25 различных групп, предпочтительно, где каждая группа фиксируется как адресуемый элемент в прямоугольном эррее или в плотноупакованном
2.
эррее, необязательно при плотности 1 адресуемый элемент на мм2.
10. Антигенный эррей по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что гранулы относятся к одинаковому или различным типам.
11. Антигенный эррей по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что гранулы, покрытые антигеном, являются гранулами, покрытыми аллергеном, и каждая группа гранул, покрытых аллергеном, включает
(i) гранулы, покрытые одним аллергеном, или
(ii) гранулы, покрытые набором аллергенов, предпочтительно экстрактом
аллергена.
12. Способ детектирования иммуноглобулина, специфичного для детектирующего антигена, или для набора детектирующих антигенов, включающий
(i) обеспечение антигенного эррея по любому из пп. 1-11,
(ii) инкубацию эррея с образцом,
(ш) инкубацию эррея с детектирующим реагентом,
(iv) необязательно инкубацию эррея с реагентом образования сигнала и
(v) измерение детектируемого сигнала.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что иммуноглобулин представляет собой IgE-антитело, ассоциированное с аллергией или IgE-антитело, ассоциированное с инфекцией или аутоиммунным заболеванием.
14. Способ по любому из пп. 12 или 13, отличающийся тем, что образец представляет собой биологическую жидкость, предпочтительно сыворотку, целую или обработанную кровь, носовую жидкость или мочу, клеточный лизат или гомогенат ткани от объекта или пула объектов.
15. Способ по любому из пп. 12-14, отличающийся тем, что реагент для детекции представляет собой аффинный связывающий агент, специфичный для иммуноглобулина, предпочтительно антитело, аптамер или аффитело, необязательно, где детектирующий реагент (i) непосредственно помечен, предпочтительно окрашенным или флуоресцентным соединением, или наночастицами золота или цветными латексными наночастицами; или (ii) конъюгирован с ферментом.
16. Способ по любому из пп. 12-15, дополнительно включающий инкубацию антигенного эррея с реагентом образования сигнала в соответствии со стадией (iv) по п. 12, где детектирующий реагент конъюгирован с ферментом, и реагент образования сигнала содержит субстрат для указанного фермента.
17. Способ по любому из пп. 12-16, дополнительно включающий инкубацию антигенного эррея с стоп-раствором после стадии (iv) по п. 12.
13.
18. Способ по любому из пп. 12-17, отличающийся тем, что иммуноглобулин представляет собой IgE-антитело, ассоциированное с аллергией, причем способ включает
(i) обеспечение антигенного эррея по п. 11,
(ii) инкубацию эррея с образцом,
(ш) инкубацию эррея с детектирующим реагентом, предпочтительно IgE-специфическим антителом или IgE-специфическим аптамером,
(iv) необязательно инкубацию эррея с реагентом образования сигнала и
(v) измерение детектируемого сигнала.
19. Картридж, содержащий тестовую камеру для антигенного эррея по любому из пп. 1-11, резервуар для жидких отходов и, необязательно, штрих-код.
20. Набор, содержащий антигенный эррей по любому из пп. 1-11, детектирующий реагент, один или несколько буферов, один или несколько контрольных образцов и инструкции для применения набора в способе по любому из пп. 10-13 и необязательно реагент образования сигнала.
21. Устройство, содержащее камеру для одного или нескольких картриджей по п. 19, пипетку и устройство для обнаружения сигнала.
19.
Фиг. 1А
Фиг. IB
Ven ga 1
Ves spp
Vit v [фрукт]
Zea m [семя]
Zea m 14
IgE Std. 1
IgE Std. 2
IgE Std. 3
IgE Std. 4
IgE Std. 5
Tri a [семя J
Tri a 18
Tri a
Tri a 7k-
буфер
Tri me
Tri tp
Uro du
Uro du 1
Ven sa
Sola 1
[фрукт]
Sola 1 [ семя]
Sola 1 6
Sola m
Sola t
Sola t 1
Spi о
Sus s [мясо]
Sus s 1
Thu a [мясо]
Rat n 1
Rat n 4
Sac с
Sal k 1
Sal 5 [мясо]
Sar m
Sec с [семя]
Ses i [ семя]
Sin a [семя ]
Sol so
Рш p
3 A
Pru p
Pun g
Pun g 1
Pun g 14
Pun g 5
Pun g 7
Oue a
[пылыр]
Oue i
[гыльца]
Rat n [эпит.]
Pin p [ семя ]
Pis v [ семя]
Pla a
[пыльца]
Pla a 1
Pie о [спора;
Pol
spp
Pru ar
[Фрукт;
Pru du
Pru p
[пульпа]
Pru p
3 В
Per a
Per a 7
Pers a
Pha v [семя]
Phi p
Phi p 1.010
Phi p 2.010
Phi p 5.010
Phi p 6.010
Phi p 7.010
Ory s [семя]
Ovi a [мясо]
Ovi a
[молоко]
Ovi a 6
Pan b
Parj
Parj 2
Pas n
Pen ch
Pen m 1
Mus m
Mus m 1
Myt e
Nep n
Oct v
Olee
[пыльца]
Ole e 1
Olee 2
Ory с [мясо]
Ory с 6
Lol p 1
Lup a [семя]
Mai d [фрукт]
Maid 1.010
Mala P
Mel g [яйцо]
Mel g [яйцо]
Mel g [мясо]
Мег a 1
Mer mr 1
Horn s HSA
Horn s LF
Ног v [семя]
Jug r [ семя]
Jug r
Lac s
Len с
Lep d
Lin us
Lol p
[пыльца]
Hevb
Hev b 1
Hev b 10
Hevb 11
Hevb 3.010
Hevb 5.010
Hevb 6.02
Hevb 7.02
Hevb 8
Hevb 9
Gal d
Gal d
Gal d 4
Gal d 5
Gly m
Gly m 1
Gly m
[агглютинин!
Gly m Tl
Hel as
Hel as 1
Feld
Feld 1
Feld 2
Foe v
пушвица
Fra a
Fra a [ache
Gad m
Gal d [яйцо]
Gald [яйцо]
Gal d 1
Der p 10
Der p 2
Der p 23.01
Der p 7
Der p 9
Equ as
[малою]
Equ с [эпит.]
Equ с
[молоко]
Equ с 3
Equ с
миото-бин
Cri с [элит.]
Cry j
Cue m
[пульпа]
Cue s
Cup a 1
Суп d
[пыльца]
Dau с
Derf
Der p
Der p 1
Cer si [семя]
Che qu
Cic a
Cit r [фрукт]
Cla h
Сое n [ семя ]
Cor a
[пыльца]
Cor a [семя]
Cor a 1.010
Cor a 9
Can f 1
Can f 2
Can f 3
Cor a 8
Cand a
Cap h
[молода]
Car p 1
Car p
здаюла-паин
Cas s [ семя]
Cav p [эпит.]
Bos d 6
Bos d 8
Bos d CA
Bos d
жегетин
Bos d LF
Bos d TG
Bot fu
Bub b
[молода]
Cam d
[молото]
Can f [эпит.]
Blag 1
Bla g
Bla g 4
Blag 5
Bio t
Bos d
[эпит.]
Bos d [мясо]
Bos d
[молоко]
Bos d 4
Bos d 5
Asp n
Asp r 1
As pa о
Ave s [семя ]
Ber e [семя]
Bet v
[пыльца]
Bet v 1.010
Bet v 2.010
Beta v лист
Bla g
Ara h 1-NT
Ara h 2
Ara h
Ara h 6
Ara h 8.010
Ara h
[armO-WIHHHl
Arm r HRP
Art v
Art v 1
Asp f
Ani pe
Ani s
Ani s 1
Ani s 3
Apig
[стебель^
Api g 1.010
Api m [ЯД]
Api m 1
Api m 4
Ara h
All p
Alls
Alt a 1
Alt a 6.010
Ama cr
Amb a
Amb a 1
Ana с
Ana с 2
Ana о [семя]
Act с [фрукт]
Act с 11
Act с
[хгаин]
Actd
[фрукт]
Actd 1
Actd 10
Actd 2
Act d 5
Aed с
All с
Фиг. 1С
(*) Чувствительность и специфичность оценивали с итользаванием MedCalc по сравнению с иосоднь!м*1 данными ImmunoCAP ISAC с использованием пртгоколоз пооизвесителгй для тестирования и порог 0,3 T5U
(**) Линейный регрессионный анализ результатов измерений выполнялся с помощью Microsoft Excel
Фиг. 2
Амплификация сигнала
800000 У00000 6QG000 500Ш0 400000 300000 200000 100000
Bos d Bos d 4 Bos d 5 Bos d 6 Bos d 8 Bos d Gal d Gai d Gal d 1 Gal d 2 Ga! d 3 Gal d 4
[Молоко] LF [Яичный [Яичный
белок] желток]
". Непосредственно Связанный с частицами
(мобилизованный)
Фиг. 3
Влияние оптимизированных условий связывания (белок переноса липидов,
персик)
Сыворотка
Сыворотка
Сыворотка 3
Сыворотка 4
Сыворотка 5
Сыворотка
Сыворотка 7
Сыворотка Отрицательная g сыворотка
¦ Условие 1
7,75
16,28
12,08
10,23
13,51
15,05
11,87
7,14
0,00
¦ Условие 2
2,07
12,12
4,88
0,15
6,86
6,38
1,61
1,12
0,00
as Условие 3
0,32
5,53
0,68
0,04
1,65
0,82
0,09
0,11
0,00
Эталонный способ
2,34
9,26
7,8
10,18
1,73
1,212
1,938
1,12
Фиг. 4
Технические характеристики и сравнение доступных много пар метрических анализов для измерений специфического IgE
: Производитель
^Апперттше намгонетты {#)
; Экстракты аллергенов (полные аллергены) {#)
Объем сыворотки
Объем сыворотки за отчетный результат 'длительность теста !шрав01ан"е сигнала ' Пре$еп обнаружения
^^^^^^^^
Л шейный диапазон
1 Счмтьвадае данных 'Стоимость сканера
' Лродажитеяьнжть екажраеаиия/егерация .Результаты,анализ и длительность
'Минимум образч" за один проход
[Макимум'ойя'зчовй"один прогон tl оператор,. IjsetfcJ
Калибровка
^Коррекция по аллергену или партии I
< Автоматизация
¦Женей* ойра &ганйст теста перед
I Результаты теста j Точность (CV, общая) ', Стабильность/хранение "Тип образна
^Гемолитическая интерференция образца j Ллерф^эеици общего IgE
FABER
j MaercArray aagnosBes "j
': i
;i ш -;j
\ 100 мкл (
' 0,4 мкл 1
j 4 часа j
j колориметрическое, ферментативное усиление.'
- > = 0,1 кШ/л для аплфлеиных компонентов j
j > - 0,5 kUA/л для экстрактов аллергене* ' j
I ОД - 50 единиц (2,5 log) измерен ""j
' конечной точки
j 0,1 100 единиц 0 too) кинетическое ']
! _ измерение _ _ _ ,
j Сканер или камера CCD/CMOS j
i <200 евро *
^ j <30 секунд да 40 тестов, ручная процедура i
! Полностью автоматический, <5 с на образец I
<100
Дополнительный "те 5раэец 8,
гетерологичмнй
нет
Ручная Дни (с защитой от света)
[ |~~~~~
j <100 ,
Омайн {стандартная кривя JgE) ¦]
: 1 И оснбвЁ 'шфйЯ'к'бда ttataMatrix, Артйя и ';
,] аллерген _ _ {
1 Ручная или папуавтс"мат1"еская 1
j бееконеч" j
25 % > 1 ISU, " 25 % < 1 1SU
Нет данных Сыворотка, плазма
Нет данных Данные 'недоступны
]?1рдо:"олыше единицы; гетутпичестветые{*|1Трс"щвшьмееди"14ы; гюлуколичжтвеиные С*1
} <15% 1
' j > 1 год, нет досгугжьс <данньк а реальном 1 j
Сьворотка, плазма <
j нет j
I Невозможно измерить <5000 kUAl tkjE
Фиг. 5
кг-л пт л;.","
Полученные сигнальные единицы, день О
Фиг. 6
(19)
(19)
(19)
1/8
2/8
3/8
4/8
|
