(57) Реферат / Формула:
Изобретение относится к выделенному рекомбинантному парвовирусному вектору, который содержит синтетический энхансер, содержащий множество энхансерных последовательностей, функционально связанный с промотором, и к способам применения этого вектора.
Евразийское (21) 201892006 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C12N15/86 (2006.01)
2019.04.30 A61K 48/00 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2017.03.07
(54) AAV-ОПОСРЕДОВАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПРОМОТОРА И ЭНХАНСЕРА
(31) 62/304,656
(32) 2016.03.07
(33) US
(86) PCT/US2017/021124
(87) WO 2017/155973 2017.09.14
(71) Заявитель: ЮНИВЕРСИТИ ОФ АЙОВА РИСЕРЧ ФАУНДЕЙШН (US)
(72) Изобретатель:
Энгельхард Джон Ф., Янь Цзыин (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Изобретение относится к выделенному реком-бинантному парвовирусному вектору, который содержит синтетический энхансер, содержащий множество энхансерных последовательностей, функционально связанный с промотором, и к способам применения этого вектора.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-552877ЕА/061
AAV-ОПОСРЕДОВАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
СИНТЕТИЧЕСКОГО ПРОМОТОРА И ЭНХАНСЕРА
Перекрестная ссылка на родственные заявки
По этой заявке испрашивается приоритет по дате подачи заявки США с серийным № 62/304,656, поданной 7 марта 2016 года, раскрытие которой включено в настоящее описание посредством ссылки
Положение о правах правительства
Изобретение осуществлено с правительственной поддержкой по гранту HL108902, выделенному в National Institutes of Health. Правительство имеет определенные права на изобретение.
Предпосылки
Кистозный фиброз (CF) представляет собой летальное аутосомно-рецессивное нарушение, которое поражает по меньшей мере 30000 человек только в США (O'Sullivan et al. , 2009) . Генетической основной CF является мутация одного гена, который кодирует регулятор трансмембранной проводимости при кистозном фиброзе (CFTR) (Riordan et al. , 1989; Rommens et al. , 1989). Она ведет к дефектному белку CFTR и вытекающим аномалиям в транспорт электролитов и текучих веществ во многих органах (Welsh, 1990; Rowe et al., 2005). Наиболее опасным для жизни исходом является CF заболевание легких, которое отличается вязким слизистым секретом и хроническими бактериальными инфекциями (Welsh, 1990) . Вместе с усовершенствованием ухода за пациентом и успехами в фармакологической терапии для CF, продолжительность жизни пациентов с CF постоянно увеличивается в течение последних десятилетий; однако качество жизни пациентов с CF остается низким, а лекарственные средства, которые облегчают легочные осложнения, являются дорогостоящими и эффективны только у отдельных пациентов. Поскольку заболевание легких является основной причиной смертности у пациентов с CF, а генетической основой является моногенный дефект, генная терапия для CF заболевания легких имеет потенциал к излечению всех пациентов с
CF, независимо от их мутации в CFTR. Таким образом, клинические исследования по CF легочной генной терапии начаты в середине 1990-х. Однако все исследования до настоящего времени были безуспешными (Sumner-Jones et al. , 2010) . Причина, лежащая в основе этого, состоит в том, что векторы, доступные для переноса генов в эпителий дыхательных путей человека (НАЕ), не эффективны (Mueller & Flute, 2008; Griesenbach & Alton, 2009; Griesenbach et al., 2010).
Аденоассоциированный вирус (AAV), член семейства парвовирусов человека, является непатогенным вирусом, репликация которого зависит от вирусов-помощников. По этой причине, rAAV векторы относятся к наиболее часто используемым в доклинических исследованиях и клинических исследованиях генной терапии
(Carter, 2005; Wu et al., 2006; Daya & Berns, 2008). В действительности, клинические исследования CF заболевания легких с использованием rAAV2 продемонстрировали хороший профиль безопасности и длительную персистенцию вирусного генома в ткани дыхательных путей (как оценивали с помощью биопсии) относительно других средств переноса генов (таких как рекомбинантный аденовирус). Тем не менее, перенос генов не позволял усовершенствовать функцию легких у пациентов с CF, поскольку не обнаруживали транскрипцию мРНК CFTR, извлекаемой из rAAV вектора
(Flotte, 2001; Aitken et al., 2001; Wagner et al., 2002; Moss et al. , 2007; Duan et al. , 2000) . Эти наблюдения соответствуют последним исследованиям rAAV трансдукции с использованием модели поляризованного НАЕ in vitro, в которой клетки выращивают на границе раздела воздух-жидкость (ALI) (Flotte, 2001; Duan et al. , 1998) . Низкая эффективность rAAV2 в качестве вектора для экспрессии CFTR в НАЕ главным образом обусловлена двумя основными препятствиями: 1) неэффективный процессинг вируса после проникновения и 2) ограниченная упаковывающая способность rAAV.
Начальные доклинические исследования с использованием rAAV2-CFTR, которые подкрепляли первые клинические исследования у пациентов с CF, осуществляли у макаков-резусов. Эти исследования демонстрировали, что вирусная ДНК и происходящая из
трансгена мРНК CFTR персистировали в легких в течение длительных периодов после гААУ2-опосредованного переноса генов CFTR (Conrad et al., 1996) . Однако более поздние исследования по сравнению эффективности rAAV2 трансдукции между ALI-культурами эпителия дыхательных путей человека и макака-резуса показывали, что тропизм rAAV2 к апикальной трансдукции значительно выше в культурах макаков-резусов, чем в их человеческих аналогах (Liu et al., 2007), вероятно, из-за видоспецифических различий в рецепторах и корецепторах AAV2, которые существуют на апикальной поверхности. В исследованиях поляризованного НАЕ, большинство вирионов AAV2 проходили интернализацию после апикальной инфекции, но накапливались в цитоплазме вместо того, чтобы проходить в ядро (Duan et al. , 2000; Ding et al. , 2005) . Одной помехой для внутриклеточной направленной миграции, необходимой для плодотворной вирусной трансдукции, является убиквитин-протеасомный путь (Duan et al., 2000; Yan et al. , 2002); временное ингибирование активности протеасом значительно усиливает трансдукцию (в 7 00 раз) гААУ2-люциферазных векторов с апикальной поверхности за счет содействия транслокации вектора в ядро (Yan et al., 2006). Однако применение ингибиторов протеасом для увеличения эффективности трансдукции rAAV-CFTR векторов только немного усовершенствует экспрессию CFTR, наиболее вероятно из-за низкой активности короткого промотора, используемого в rAAV-CFTR векторах (Zhang et al. , 2004) . Открытая рамка считывания (ORF) гена CFTR составляет 4,443 т. о., и таким образом приближается к размеру генома AAV в 4,67 9 т. о. Несмотря на то, что капсид AAV может вмещать содержимое, превышающее его нативный ДНК геном, его максимальная упаковывающая способность составляет приблизительно 5,0 т. о.
(Dong et al., 1996), и экспрессия трансгена из векторов, превышающих этот предел, ведет к значительно сниженной функции
(Wu et al., 1993) . С учетом необходимости цис-элементов в 300 п. о. из генома AAV (две последовательности ITR на концах) и кодирующей последовательности CFTR в 4443 п. о., в векторном геноме остается немного места (257 п. о.) для сильного промотора и сигнала полиаденилирования. Таким образом, rAAV-CFTR вектор
первого поколения (AV2.tgCF), который тестировали в клинических исследованиях, основан на активности криптического промотора из AAV2 ITR для управления транскрипцией кДНК полноразмерного CFTR с синтетическим сигналом полиаденилирования (Flotte et al., 1993; Aitken et al. , 2003).
He так давно разработан rAAV вектор AV2.tg83-CFTR, в
котором используется синтетический промотор в 83 п. о. (tg83)
(Zhang et al. , 2004) для усовершенствования экспрессии кДНК
полноразмерного CFTR человека. Размер генома этого вектора
составляет 4,95 т. о. Несмотря на то, что этого вектор давал 3-
кратное увеличение цАМФ-опосредованных С1" токов в CF НАЕ ALI-
культурах относительно AV2.tgCF, этот уровень экспрессии
оставался субоптимальным для применения в генной терапии CF.
Другие группы пытались использовать миниген CFTR для того, чтобы
создавать пространство для встраивания более хорошего промотора
в rAAV векторы; это выглядело обоснованным, исходя из более
ранних исследований функции и структуры гена CFTR, которые
показывают, что делеция коротких несущественных
последовательностей с С-конца и регуляторного домена (R-домена) оказывала только минимальные эффекты на функцию хлорных каналов в CFTR (Zhang et al. , 1998) . Один широко используемый миниген CFTR представляет собой CFTRAR, который утратил 156 п. о., кодирующих 52 аминокислотных остатка (708-759) на N-конце R-домена. Перенос генов с использованием рекомбинантного аденовирусного вектора, кодирующего CFTRAR, В CF НАЕ ALI-культуры показывал, что этот трансген сохраняет по меньшей мере 80% трансэпителиального транспорта С1~, обеспечиваемого полноразмерным CFTR (Ostedgaard et al., 2002) . Кроме того, экспрессия CFTRAR у мышей с нокаутом CFTR-/-, спасала летальный кишечный фенотип (Ostedgaard et al., 2011) . Эта делеция 156 п. о. позволяла упаковывать rAAV CFTR экспрессирующий вектор длиной 4,94 т. о., с экспрессией, управляемой минимальным промотором CMV (173 п. о.), в капсид AAV5 (Ostedgaard et al. , 2005). Дополнительные усилия были направлены на разработку вариантов AAV векторов с более высоким апикальным тропизмом через
направленную эволюцию капсида AAV в поляризованных НАЕ ALI-культурах (Li et al., 2009). Однако эти rAAV векторы не обеспечивали эффективной экспрессии CFTR, поскольку минимальный промотор CMV не функционировал хорошо в полностью дифференцированном эпителии дыхательных путей. Сущность изобретения
Чтобы обойти ограничение размера промотора в рекомбинантном аденоассоциированном вирусном (rAAV) векторе, который можно использовать для того, чтобы экспрессировать определенные трансгены, осуществляли скрининг набора из 10 0-членных синтетических энхансерных элементов, состоящих из десяти повторов по 10 п. о., на способность увеличивать экспрессию трансгена CFTR с короткого синтетического промотора в 83 п. о. в контексте rAAV вектора для применения в генной терапии кистозного фиброза (CF) . Скрининг эффективности синтетических энхансеров для усиления экспрессии трансгена проводили ступенчато в плазмидах без AAV последовательностей, провирусных векторах в форме плазмид с последовательностями AAV и rAAV векторах. Оценивали плазмидную трансфекцию и трансдукцию вирусным вектором в культивируемых клеточных линиях и у целых животных in vivo. Начальные исследования по оценке транскрипционной активности в монослойных (не поляризованных) культурах клеточных линий дыхательных путей человека и первичных клетках дыхательных путей хорька обнаруживали, что три из этих синтетических энхансеров (Fl, F5 и F10) значительно содействовали транскрипции трансгена люциферазы в контексте плазмидной трансфекции. Дополнительный анализ в поляризованных культурах эпителия дыхательных путей человека и хорька на границе раздела воздух-жидкость (ALI), а также в дыхательных путях хорька in vivo, демонстрировал, что энхансер F5 давал наивысший уровень экспрессии трансгена в контексте AAV вектора. Кроме того, демонстрировали, что увеличение размера вирусного генома от 4,94 до 5,04 т. о. не оказывает значительного влияния на выход частиц векторов, но значительно снижает функциональность rAAV-CFTR векторов из-за небольших концевых делеций, которые простирались в экспрессирующую CFTR кассету
слишком большого генома в 5,04 т. о. Поскольку rAAV-CFTR векторы размером больше 5 т. о. имеют значительно ослабленный векторный эффект, укороченный миниген CFTR хорька с делецией 159 п. о. в R-домене использовали для конструирования rAAV вектора
(AV2/2.F5tg83-fCFTRAR). Этот вектор давал приблизительно 17-
кратное увеличение экспрессии CFTR и значительно
усовершенствовал С1" токи в CF ALI-культурах. Эта комбинация
небольшого энхансера/промотора может иметь обширную полезность
для rAAV-опосредованной генной терапии, например, генной терапии
CF, в дыхательных путях.
Раскрытие относится к рекомбинантному вектору, такому как
парвовирусный вектор, например, рекомбинантный
аденоассоциированный вирусный (rAAV) вектор или бокавирусный
(BoV) вектор, такой как BoV человека, который содержит синтетический энхансер, имеющий множество синтетических энхансерных последовательностей, функционально связанных с промотором, например, синтетическим промотором. В одном из вариантов осуществления каждый из множества энхансеров имеет одну и ту же последовательность. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 2 из множества энхансеров имеют отличающуюся последовательность. В одном из вариантов осуществления синтетический энхансер формируют из различных энхансерных последовательностей, где каждая уникальная последовательность может быть представлена один раз или больше чем один раз, и если больше чем один раз, может быть в тандеме или чередоваться с другими (отличающимися) энхансерными последовательностями. Например, синтетический энхансер может иметь пять различных энхансерных последовательностей, каждая представлена два раза в синтетическом энхансере, и повторные последовательности могут быть в тандеме (или нет) . В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна из энхансерных последовательностей имеет сайт связывания ТР53. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна из энхансерных последовательностей имеет сайт связывания CREB. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна из энхансерных
последовательностей имеет сайт связывания NRF-1 (CATGCGCAG). В
одном из вариантов осуществления множество имеет комбинацию из
одного или нескольких сайтов связывания ТР53, одного или
нескольких сайтов связывания NRF-1 и/или одного или нескольких
сайтов связывания CREB, например, CREB7. В одном из вариантов
осуществления энхансерная последовательность имеет сайт
связывания, представленный на одной из фиг. 8А-8С. В одном из
вариантов осуществления множество имеет от 2 вплоть до 2 0
различных синтетических энхансерных последовательностей В одном
из вариантов осуществления по меньшей мере одна из энхансерных
последовательностей имеет не больше чем 15 п. о. В одном из
вариантов осуществления множество составляет приблизительно до
150 нуклеотидов в длину, например, приблизительно 20, 30, 40,
50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 или 140 нуклеотидов в
длину. В одном из вариантов осуществления синтетический энхансер
содержит Fl, F5 или F10. В одном из вариантов осуществления
энхансер имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% или
99% идентичности нуклеотидных последовательностей с Fl, F5 или
F10. В одном из вариантов осуществления связанный промотор
представляет собой синтетический промотор. В одном из вариантов
осуществления промотор представляет собой tg83. В одном из
вариантов осуществления промотор представляет собой промотор
AAV. В одном из вариантов осуществления промотор представляет
собой гетерологичный промотор, например, из генома другого
вируса или млекопитающего. В одном из вариантов осуществления
промотор функционально связан с открытой рамкой считывания,
например, гетерологичной открытой рамкой считывания. В одном из
вариантов осуществления открытая рамка считывания кодирует
продукт профилактического или терапевтического гена, например,
регулятор трансмембранной проводимости при кистозном фиброзе, ос-
антитрипсин, [3-глобин, у-глобин, тирозингидроксилазу,
глюкоцереброзидазу, арилсульфатазу А, фактор VIII, дистрофии или эритропоэтин. В одном из вариантов осуществления комбинация множества энхансерных последовательностей и промотора составляет не больше чем 300 нуклеотидов в длину, например, не больше чем
125, 150, 175, 200, 250 или 275 нуклеотидов в длину. В одном из вариантов осуществления комбинация множества энхансерных последовательностей и промотора составляет меньше чем 500 нуклеотидов в длину. В одном из вариантов осуществления вектор представляет собой парвовирусный вектор, такой как rAAV вектор, например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 или AAV9 вектор, или бокавирусный вектор человека, например, HBoVl, HBoV2, HBoV3 или HBoV4, или эволюционировавший вектор AAV или HBoV, который адаптирует уникальный тропизм, например, необязательно с использованием слегка измененных капсидных последовательностей от известных серотипов
Настоящее описание также относится к подходу к ступенчатому скринингу комбинаций тканеспецифических, а также повсеместных синтетических промоторов/энхансеров, в плазмидах, провирусных векторах и rAAV векторах, которые можно использовать при применении rAAV генной терапии к доставке кассеты большого трансгена. Примеры использования включают, но не ограничиваясь этим, экспрессию фактора VIII 4,3 т. о. с удаленным В-доменом в мышцах и/или печени при гемофилии А или доставку инструмента редактирования генов 4,2 т. о. из Streptococcus pyogenes (SpCas9) и химерной sgRNA вместе в любую желаемую ткань и орган in vivo.
Кроме того, изобретение относится к способам применения рекомбинантного парвовирусного вектора для того, чтобы инфицировать клетки, например, клетки млекопитающих, такие как клетки хорька, собаки, кошки, коровы, лошади, козы или свиньи или клетки примата, например, клетки человека, например, вводя композицию, содержащую рекомбинантный парвовирусный вектор, млекопитающему. Например, геном рекомбинантного парвовируса может содержать экспрессирующую кассету, кодирующую гетерологичный продукт гена, например, который представляет собой терапевтический белок, такой как регулятор трансмембранной проводимости при кистозном фиброзе, а-антитрипсин, [3-глобин, у-глобин, тирозингидроксилаза, глюкоцереброзидаза, арилсульфатаза А, фактор VIII, дистрофии, эритропоэтин, al-антитрипсин,
поверхностно-активный белок SP-D, SP-A или SP-C, эритропоэтин или цитокин, например, IFN-a, IFNy, TNF, IL-1, IL-17 или IL-б, или профилактический белок, который является антигеном, таким как вирусный, бактериальный, опухолевый или грибковый антиген, или нейтрализующее антитело или его фрагмент, которые направлены на эпитоп антигена, такой как тот, что из респираторного вируса человека, например, вируса гриппа или RSV, включая в качестве неограничивающих примеров белок HBoV, белок вируса гриппа, белок RSV или белок SARS.
Краткое описание фигур
Фиг. 1A-1D. Эффективность синтетических олигонуклеотидных энхансеров в увеличении активности tg8 3-yпpавляeмыx люциферазных репортерных плазмид в монослойных культурах. А) Схематическая структура репортерных векторов, используемых для скрининга библиотеки энхансеров. Показаны транскрипционные мотивы синтетического промотора tg83. (B-D) Репортерная активность в монослойных культурах клеточных линий дыхательных путей человека: (В) А549 и (С) IB3 и (D) первичные клетки дыхательных путей хорька после трансфекции указанными плазмидами. Люциферазный анализ проводили через 2 4 часа после трансфекции. Данные представляют среднюю (+/- SEM, N=3) относительную люциферазную активность для каждой трансфекции, нормализованную по таковой у безэнхансерного вектора pGL3-tg831uc, значение для которого в клетках каждого тестируемого типа принимали равным 1.
Фиг. 2A-2F. Эффективность энхансеров Fl, F5 и F10 в увеличении активности промотора tg8 3 в контексте провирусных плазмид и rAAV. А) Эффект AAV2 ITR, оказываемый на транскрипцию с промотора tg83, как оценивали после трансфекции А549 и первичных клеток дыхательных путей хорька с использованием pGL3-tg83 или pAV2-tg831uc. Данные представляют среднюю (+/- SEM, N=3) относительную люциферазную активность (RLU) через 24 часа после трансфекции. В) Эффективность энхансеров при транскрипции после трансфекции А54 9 и первичных клеток дыхательных путей хорька указанными AAV2 провирусными плазмидами. Данные представляют среднюю (+/- SEM, N=3) относительную люциферазную
активность для каждой трансфекции, нормализованную по безэнхансерному вектору pAV2-tg831uc (взятому за 1 для каждого типа клеток), через 24 часа после трансфекции. С) Эффективность энхансеров при транскрипции после инфекции клеток А54 9 указанными rAAV2 векторами через 2 4 часа после инфекции. Данные представляют среднюю (+/- SEM, N=3) относительную люциферазную активность для каждой инфекции, нормализованную по безэнхансерному вектору pAV2-tg831uc (взятому за 1). (D и Е) Эффективность энхансеров при транскрипции после базолатеральной инфекции поляризованного эпителия дыхательных путей (D) человека и (Е) хорька, который инфицировали с использованием 2x1010 DRP указанных rAAV2 векторов. Данные представляют среднюю (+/- SEM, N=4) относительную люциферазную активность (RLU) для каждого условия через 2 суток после инфекции. (F) Эффективность энхансеров при транскрипции в ткани легких и трахеи после инфекции детенышей хорька в возрасте 5 суток с использованием 2Х1011 DRP AV2/1.F5tg831uc или AV2/1.F10tg831uc, в присутствии ингибиторов протеасом. Люциферазную активность измеряли на 8 сутки после инфекции. Данные представляют среднюю (+/- SEM, N=4) относительную люциферазную активность (RLU/мкг белка).
Фиг. ЗА-ЗС. Влияние размера конструкции rAAV-CFTR на восстановление хлорных токов CFTR в поляризованном CF эпителии дыхательных путей. А) Схематическая иллюстрация структур rAAV2 векторов различных размеров, которые кодируют открытую рамку считывания (ORF) полноразмерного CFTR хорька и варианты с удаленным R-доменом, под управлением одних и тех же транскрипционных элементов: синтетический промотор 8 3 п. о.
(tg83), синтетический сигнал полиаденилирования 62 п. о. (рА) , 5'-нетранслируемая область 17 п. о. (UTR) и 3' UTR 9 п. о. ORF полноразмерного CFTR хорька (fCFTR) составляет 4455 п. о. Метку ЗхНА 99 п. о. вставляли между аминокислотными остатками S900 и 1901, доводя fCFTR(НА) до 4554 п. о. fCFTRAR имеет укороченную ORF (4296 п. о.); из R-домена удаляли 53 аминокислотных остатка
(1708-1760, 159 п. о.), fCFTRAR(НА) имеет длину 4395 п. о., при наличии инсерции НА-метки 99 п. о. и делеции 159 п. о. в R
домене. Функциональности этих векторов в отношении восстановления CFTR-специфичного транспорта С1" (отражаемого в трансэпителиальных токах короткого замыкания (Isc)) сравнивали в дифференцированных CF НАЕ ALI-культурах, после инфекции с использованием 1011 DRP на вставку Millicell (MOI приблизительно 105 DRP/клетка) в присутствии ингибиторов протеасом LLnL (10 мкМ) и доксорубицина (2 мкМ). CF НАЕ ALI-культуры создавали из условно трансформированной клеточной линии дыхательных путей человека с CF (CuFi8; генотип AF50 8/AF50 8). В) Типичные кривые изменений Isc в CF ALI-культурах, инфицированных указанными AAV-CFTR векторами, после последовательного добавления различных ингибиторов и агонистов. Амилорид и DIDS использовали для блокирования ENaC-опосредованных натриевых токов и не CFTR хлорных каналов перед добавлением агониста цАМФ (форсколин и IBMX) , a GlyHlOl использовали для блокирования CFTR-специфичных токов. Alsc (IBMX & Forsk) отражает активацию CFTR-опосредованных хлорных токов после введения агониста цАМФ, а Alsc (GlyHlOl) отражает ингибирование CFTR-опосредованных хлорных токов после добавления GlyHlOl. С) Эффекты размера вектора, оказываемые на восстановление хлорных Isc токов. rAAV-CFTR векторы увеличивали с приращением приблизительно 100 п. о. Представлены ответы Alsc (IBMX & Forsk) и Alsc (GlyHlOl), показывающие величину CFTR-опосредованного хлорного транспорта после базолатеральной инфекции CF НАЕ ALI, как описано в (В) . CFTR токи, которые возникали в первичных не CF НАЕ (N=14), приведены для сравнения. Данные представляют среднее (+/-SEM) для N=3 независимых вставок Millicell.
Фиг. 4А-4В. Анализ целостности вирусного генома посредством денатурирующего электрофореза в геле и анализа слот-блоттинга. А) Вирусную ДНК экстрагировали из 109 DRP указанных AAV-CFTR векторов, разрешенных на 0,9% щелочном агарозном геле, и переносили на нейлоновую мембрану. Саузерн-блоттинг осуществляли с использованием 32Р-меченного CFTR зонда для визуализации вирусной ДНК. В) Для того чтобы оценивать возможную делецию, которая может возникать на концах плюс- и минус-цепях вирусных
геномов, 3,33х108 DRP каждого вируса (титр определяли посредством
ПЦР TaqMan с использованием зонда/праймера для кДНК fCFTR)
загружали в трех повторениях в Slot-Dot(r) SF Module (Bio-Rad,
Hercules, CA) , оснащенный нейлоновой мембраной. 3-кратное
серийное разведение провирусной плазмиды (от ЗхЮ9 до 3,7х107
копий) также загружали для создания калибровочных крив для
количественного определения. Блоттинг зондировали с
использованием 32Р-меченных олигонуклеотидов к промотору tg83, кДНК CFTR или полиА. (-) и ( + ) представляют зонды, образующие гибриды с минус- и плюс-цепью одноцепочечного генома rAAV. Сначала гибридизацию проводили с использованием набора зондов, которые образуют гибриды с минус-цепью, и затем повторно зондировали с использованием набора олигонуклеотидов, которые образуют гибриды с плюс-цепью. Число копий вирусных геномов, которые обнаруживали с помощью каждого зонда, определяли (среднее +/- SEM, N=3) на основе измерения плотности сигнала с использованием NIH ImageJ и сравнения с калибровочными кривыми.
Фиг. 5. Эффекты энхансера F5, оказываемые CFTR токи, возникающие в CF НАЕ после инфекции rAAV векторами. CF НАЕ ALI инфицировали с использованием AV2/2.tg83-fCFTRAR ИЛИ AV2/2.F5tg83-fCFTRAR, при указанных MOI, с апикальной или базолатеральной поверхности. Ингибиторы протеасом вводили совместно во время 16-часового периода инфекции. Измерения Isc в инфицированных ALI-культурах проводили через 2 недели после инфекции. Средние (+/- SEM) Alsc (IBMX & Forsk) и Alsc (GlyHlOl) представлены вместе с N для указанного независимого анализа Transwell. CF и не CF НАЕ культуры с имитацией инфицирования представлены для сравнения.
Фиг. 6А-6В. Эффекты энхансера F5, оказываемые на CFTR токи и tg8 3-yпpaвляeмyю транскрипцию CFTR после инфекции rAAV векторами. CF НАЕ ALI инфицировали с использованием AV2/2.tg83-fCFTRAR ИЛИ AV2/2.F5tg83-fCFTRAR при MOI 2xl04 DRP/клетка с базолатеральной поверхности, в присутствии ингибиторов протеасом. A) Isc измеряли в инфицированных ALI-культурах на 3 и 10 сутки после инфекции. Представлены значения Alsc (IBMX &
Forsk) и Alsc (GlyHlOl). В) Относительное содержание мРНК CFTR векторного происхождения в культурах, которые оценивали на диаграмме а, как определяли с использованием RS-PCR и нормализовали по транскриптам GAPDH в каждом образце. Данные представляют среднее (+/- SEM) для N=3 независимых Transwell на каждой диаграмме.
Фиг. 7А-7В. Хорьков в возрасте 5 суток системно инфицировали с использованием 2Х1011 DRP AAV2/9F5tg8 31uc или AAV2/9F10tg831uc через инъекцию в яремную вену. Животных умерщвляли на 8 сутки после инфекции, моментальные ткани из различных органов собирали и гомогенизировали в репортерном лизирующем буфере (Promega) для люциферазного анализа. А) Данные сравнения экспрессии люциферазы после инфекций AAV2/9F5tg831uc или AAV2/9F10tg831uc, где экспрессию люциферазы с промотора F5tg8 3 произвольно принимали за 100 в каждой ткани. В) Значения представляют (среднюю+/-ЗЕМ, п=3) относительную люциферазную активность (RLU/мкг белка).
Фиг. 8A-8W. А-Е) Сайты связывания в F5, которые можно использовать для того, чтобы получать синтетические энхансеры, как раскрыто в настоящем описании. F-P) Сайты связывания в F10, которые можно использовать для того, чтобы получать синтетические энхансеры, как раскрыто в настоящем описании. Q-W) Сайты связывания в F5tg83, которые можно использовать для того, чтобы получать синтетические энхансеры или промотор, как раскрыто в настоящем описании. SEQ ID №№ 31-68.
Фиг. 9A-D. Эффективность переноса генов AV.F5Tg83-hCFTRAR в трахею и легкие хорька. Хорьков в возрасте 3 суток инфицировали объемом 100 мкл с бхЮ11 DRP AV. F5Tg83-hCFTRAR в 500 мкМ доксорубицина. Не инфицированные животные получали равный объем носителя с доксорубицином. На 10 сутки после инфекции легкие и трахею собирали целиком и моментально замораживали в жидком азоте. Ткань превращали в порошок и получали мРНК и кДНК для количественной ПЦР CFTR человека и хорька. (А и В) Копии мРНК hCFTR и fCFTR в (А) трахеи и (В) легких. Число копий определяли с использованием калибровочной кривой, созданной по серийным
разведениям плазмидной кДНК CFTR для каждого вида. (С и D) Соотношение мРНК hCFTR трансгенного происхождения и эндогенного fCFTR. С1-СЗ представляют животных в группе с имитацией инфицирования и А1-АЗ представляют животных в AAV-инфицированной группе. Также приведено усредненное для трех AAV-инфицированных животных. Штриховая линия представляет эндогенные уровни CFTR (соотношение=1). Данные описывают среднее +/-SEM для N=3 животных в каждой группе.
Фиг. 10A-D. AV.F5Tg8 3-hCFTRAR эффективно трансдуцирует дыхательные пути взрослых хорьков. Легкие хорьков в возрасте 1 месяца (N=3) трансдуцировали с использованием 7,5х1012 DRP AV.F5Tg8З-hCFTRAR, несущих кДНК hCFTRAR, в 500 мкл объеме PBS в присутствии 250 мкМ доксорубицина. Контрольное животное с имитацией инфицирования (N=1) получало 500 мкл PBS без вектора в присутствии 250 мкМ доксорубицина. Вектор доставляли в легкие с использованием микрораспылителя PennCentury через интубацию трахеи. Тем же животным также осуществляли назальную доставку с использованием 100 мкл, содержащих 1,5х1012 DRP, с 250 мкМ доксорубицина посредством инстилляции текучего вещества. При назальной доставке с имитацией инфицирования давали PBS с 250 мкМ доксорубицина. На 12 сутки после инфекции отдельно собирали доли легких, наряду с трахеей, килем и носовыми раковинами с прилежащей адвентицией. Ткани моментально замораживали, и порошкообразные образцы обрабатывали отдельно для мРНК и ДНК. А) РНК-специфичная ПЦР (RS-PCR) TaqMan с мРНК CFTR человека и эндогенной мРНК GAPDH хорька для животных, которых лечили вектором и имитацией. В результатах представлено соотношение мРНК hCFTR/fGAPDH. В) RS-PCR TaqMan с эндогенной мРНК CFTR хорька и эндогенной мРНК GAPDH хорька для животных, которых лечили вектором и имитацией. В результатах представлено соотношение мРНК fCFTR/fGAPDH. С) Количественная ПЦР TaqMan для числа векторных геномов в каждом образце на 100 нг ДНК. D) Соотношение копий мРНК для hCFTR/fCFTR в каждом образце. За 1 принимали эндогенные уровни CFTR (красная штриховая линия). Образцы легких содержали усредненно 3,0+/-0,5 копий мРНК hCFTR
трансгенного происхождения на копию мРНК fCFTR. Трансдукция тканей трахеи и носа была более вариабельной, но усредненно одна копия мРНК hCFTR трансгенного происхождения/fCFTR. В результатах представлено среднее +/-SEM для животных, которых лечили вектором.
Подробное описание
Генную терапию широко используют в клинических исследованиях с 1990-х годов, сообщалось о многих успешных случаях использования вирусных или не вирусных векторов для того, чтобы доставлять терапевтические гены. rAAV является наиболее широко используемым, для него доказан профиль высокой безопасности, широкий тропизм к тканям/органам и персистирующая экспрессия трансгена. AAV представляет собой небольшой одноцепочечный ДНК вирус с по существу небольшим геномом в 4,67 9 т. о., таким образом, применение rAAV для генной терапии ограничено доставкой относительно небольших трансгенов. Несмотря на то, что капсид AAV может вмещать геном rAAV слегка больший, чем его исходный размер, 4,95 т. о. по-видимому составляет максимальный размер для эффективной экспрессии трансгена. Поскольку последовательность обязательного цис-элемента AAV в 300 п. о. (концевые повторы на обоих концах) включают в rAAV вектор, фактическая вставка с кассетой экзогенной экспрессии гена не может превышать 4,6 т. о. Это является проблемой для доставки эффективной экспрессии большого гена, размер которого приближается к этому пределу.
Один типичный пример состоит в том, чтобы доставлять ген CFTR (регулятор трансмембранной проводимости при кистозном фиброзе) для генной терапии кистозного фиброза (CF) с использованием rAAV вектора. Кодирующая последовательность гена CFTR составляет целых 4,443 т. о. Чтобы конструировать CFTR-экспрессирующий AAV вектор с необходимыми минимальными 5' и 3' UTR и сайтами клонирования, есть пространство меньше 200 п. о. для встраивания промотора и сигнала полиаденилирования для управления транскрипцией кДНК полноразмерного CFTR.
В последнее время создана модель с нокаутом CFTR у хорьков,
которая спонтанно развивает фенотип легких, который отражает ключевые признаки заболевания CF человека, в том числе самопроизвольную бактериальную инфекцию легких, дефектную секрецию из подслизистых желез, диабет и желудочно-кишечное заболевание (Sun et al. , 2008; Sun et al. , 2010; Oliver et al. , 2012; Sun et al., 2014; Yan et al., 2013. Показано, что дыхательные пути новорожденных хорьков можно эффективно трансдуцировать с помощью rAAVl в присутствии ингибиторов протеасом (Yan et al., 2013) . Таким образом, доклинические исследования в модели CF на хорьках можно начинать сразу, как только создадут rAAV вектор, который эффективно экспрессирует CFTR в эпителии дыхательных путей. По существу небольшой геном 4,679 т. о. rAAV требует использования короткого, но надежного транскрипционного регуляторного элемента для эффективной экспрессии большого трансгена, размер которого приближается к пределу упаковки. Создавали кассету, которая эффективно экспрессирует ген CFTR хорька (fCFTR).
rAAV-CFTR вектор первого поколения (AV2.tgCF), зависящий от активности криптического промотора AAV2 ITR, неэффективно экспрессировал CFTR в клинических исследованиях. Чтобы преодолеть эту проблему, использовали другой rAAV вектор, AV2.tg83-CFTR, в котором используют синтетический промотор в 83 п. о. (tg83), чтобы усовершенствовать экспрессию. Несмотря на то, что этот вектор вызывал в 3 раза более высокие цАМФ-опосредованные С1" токи в CF НАЕ ALI-культурах, чем AV2.tgCF, этот уровень экспрессии остается субоптимальным для применения в генной терапии CF. Поэтому существует срочная потребность в сильном коротком промоторе для управления экспрессией CFTR в AAV векторе для генной терапии CF. Аналогичным образом, чтобы экспрессировать фактор VIII в 4,3 т. о. с удаленным В-доменом в мышцах и/или печени для генной терапии гемофилии с использованием rAAV, также необходим короткий промотор, эффективный в мышцах и печени.
Другой пример состоит в том, чтобы доставлять систему CRISPR/Cas9 для редактирования генов. Современное развитие способа редактирования генов CRISPR/Cas9 содействует новой
стратегии генной терапии у человека посредством коррекции дефектного гена в предварительно выбранных сайтах, не изменяя эндогенную регуляцию гена, представляющего интерес. Эта система состоит из двух ключевых компонентов: белок Cas9 и sgRNA, а также коррекционная матрица, когда необходимо. rAAV можно использовать для того, чтобы доставлять эти элементы in vivo в различные целевые органы, но необходима совместная доставка белка Cas9 и химерной sgRNA в одну и ту же клетку, поскольку двойная AAV векторная система доставки мало эффективна. Поскольку размер экспрессирующей кассеты для Streptococcus pyogenes (SpCas9) и sgRNA транскрипционной кассеты вместе превышает 4,2 т. о., то для использования одного rAAV вектора для доставки эффективно экспрессируемого белка SpCas9 необходимо использовать небольшую, но надежную промоторную/энхансерную последовательность, чтобы управлять экспрессией SpCas9, и, таким образом, желательны повсеместные и/или тканеспецифические энхансеры. Несмотря на то, что Cas9 Staphylococcus aureus (SaCas9), который составляет приблизительно 1,0 т. о., меньше по размеру, помещается вместе со своей sgRNA и релевантными экспрессирующими кассетами в один AAV вектор, использование короткого синтетического промотора допускает дополнительное встраивание матрицы коррекции генов для rAAV вектора "все-в-одном" в применении к генной терапии на основе редактирования генов.
Как описано ниже, короткие (меньше чем 0,2 т. о.)
синтетические энхансер/промоторы предоставляют решение для
разрешения текущей проблемы rAAV вектора при доставке кассеты
большого трансгена. Это раскрытие, в одном из вариантов
осуществления, относится к использованию синтетического
энхансера/промотора F5tg83 в 183 п. о. в rAAV векторах для того,
чтобы доставлять эффективную экспрессию CFTR в ткань дыхательных
путей легких для генной терапии CF. Это раскрытие, в одном из
вариантов осуществления, также предусматривает эффективный
подход для скрининга и идентификации комбинаций
тканеспецифических или повсеместных синтетических
промоторов/энхансеров.
Поскольку энхансерная активность различается в зависимости от клеточных линий и состояния дифференцировки клеток, а также находится под влиянием AAV ITR и последовательности гена, представляющего интерес, скрининг проводили ступенчато, например, в плазмидах, провирусных векторах и rAAV векторах.
В одном из вариантов осуществления система скрининга
включает определенный 8 3-членный синтетический коровый промотор
(tg8 3p) и набор случайных 10 0-членных синтетических
последовательностей с высокой энхансерной активностью.
Скрининговый подход можно использовать для скрининга 100-членных
синтетических последовательностей по их энхансерной активности
для усиления транскрипции промотора, например, транскрипции
промотора tg83p в 83 п. о., в другом органе/ткани для других
генов, представляющих интерес, схожим ступенчатым образом:
например, для управления экспрессией фактора VIII в мышцах или
печени, а также для управления экспрессией белка Cas9 в любых
конкретных тканях или стволовых клетках. Помимо
тканеспецифической экспрессии, подход также можно использовать для того, чтобы идентифицировать энхансер с повсеместным эффектом, чтобы усовершенствовать активность промотора tg83p в широком диапазоне тканей/органов, через тестирование экспрессии репортерных генов, происходящих из rAAV, на уровне нескольких органов.
В частности, набор векторов, содержащих синтетический промотор tg83, связанный с различными синтетическими последовательностями (приблизительно 100 п. о.) с высокой энхансерной активностью, конструировали для начального скрининга в монослойных (не поляризованных) культурах клеточных линий дыхательных путей человека и первичных клеток дыхательных путей хорька, что, как рассмотрено далее, выявляло, что три из этих синтетических энхансеров (Fl, F5 и F10) значительно способствовали транскрипции трансгена люциферазы с tg83p в контексте плазмидной трансфекции. Следующим было конструирование rAAV репортерных векторов с предварительно отобранными кандидатами (Fl, F5 или комбинация энхансера/промотора tg8 3p и F5) . Эти векторы также включали частичную последовательность
гена, представляющего интерес (здесь CFTR), которая может
поместиться в геноме rAAV по максимуму; этот подход допускает
скрининг последовательностей кДНК, которые в конечном итоге
будут находиться в рекомбинантном вирусе, а также влияет на
активность энхансера/промотора через неизвестные процессы
(вероятно, вторичная структура ДНК) . Анализ в поляризованных
культурах эпителия дыхательных путей человека и хорька на
границе раздела воздух-жидкость (ALI) в контексте инфекции AAV
вектором обнаружил, что комбинация F5tg8 3 (183 п. о. в длину)
являлся наиболее эффективным промотором в обеих ALI-культурах,
приводя к 19,6-кратному и 57,5-кратному увеличению репортерной
экспрессии (люцифераза светляка) , соответственно, относительно
безэнхансерного аналога. Промотор F5tg8 3 также вызывал наивысший
уровень экспрессии трансгена в дыхательных путях хорька in vivo.
Наконец, промотор F5tg83 использовали в rAAV-CFTR векторе для
управления экспрессией CFTR, вектор (AV. F5tg83CFTRAR) давал
приблизительно 17-кратное увеличение относительно
безэнхансерного вектора (AV.tg83CFTRR) в управляемой вектором транскрипции мРНК CFTR и значительно усовершенствовал С1" токи в CF ALI-культурах человека.
Таким образом, увеличивали экспрессию с rAAV векторов,
имеющий большой трансген, используя комбинации небольших
синтетических энхансеров/промоторов, имеющие из определенного
8 3-членного синтетического корового промотора и набор случайных
синтетических 100-членных синтетических энхансеров. В частности,
несколько комбинаций коротких синтетических
промоторов/энхансеров 183 п. о. (F5tg83, Fltg83 и F10tg83) способны определять сильную экспрессиею трансгена в клетках дыхательных путей человека, а также не относящегося к человеку млекопитающего (такого как хорек). В одном из вариантов осуществления надежный промотор F5tg8 3 можно использовать в rAAV векторе для того, чтобы доставлять регулятор трансмембранной проводимости при кистозном фиброзе (CFTR) в 4,4 т. о. для генной терапии кистозного фиброза.
Изобретение дополнительно описано с помощью следующих
неограничивающих примеров. Пример 1
Материалы и методы
Получение rAAV векторов. Все стоки rAAV векторов создавали
в клетках НЕК2 93 посредством тройной совместной плазмидной
трансфекции с использованием системы без аденовирусов и очищали
в двух раундах ультрацентрифугирования с CsCl, как приведено в
Yan et al. (2 004) . Для всех вирусных векторов и провирусных
плазмид использовали rAAV2 геномы, которые упаковывали в капсид
AAV2 или AAV1 для того, чтобы создавать rAAV2/2 и rAAV2/l
вирусы, соответственно. ПЦР в реальном времени TaqMan
использовали для того, чтобы количественно определять физический
титр (устойчивые к ДНКазам частицы, DRP) очищенных вирусных
стоков, как описано в Yan et al. (2006) и Ding et al. (2006) .
Набор праймеры/зонд для ПЦР, который использовали для титрования
люциферазных векторов, представляет собой: 5'-
TTTTTGAAGCGAAGGTTGTGG-3' (прямой праймер) (SEQ ID № 1), 5'-CACACACAGTTCGCCTCTTTG-3' (обратный праймер) (SEQ ID № 2) и 5'-FAM-ATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAAT-TAMRA-3' зонд) (SEQ ID № 3); набор праймеры/зонд, использованный для векторов с CFTR хорька, представляет собой 5' -GACGAT GТ Т GAAAGСATАССАС-3' (прямой праймер)
(SEQ ID № 4), 5' - С АС ААС С AAAGAAAT AG С С АС С - 3' (обратный праймер) (SEQ ID № 5) и 5' - FAM - AG Т GAC ААС AT G GAAC AC AT АС С Т С С G - Т AMRA- 3' (зонд) (SEQ ID № 6) . Все праймеры и зонды синтезировали с помощью IDT
(Coralville, IA) . Реакцию ПЦР осуществляли и анализировали с использованием системы обнаружения ПЦР реальном времени и программного обеспечения Bio-Rad My IQTM В.
Анализ целостности вирусных геномов. Вирусную ДНК экстрагировали из 109 DRP AAV-CFTR векторов и разрешали в 0,9% щелочном денатурирующем агарозном геле при 2 0 вольтах в течение ночи в буфере 50 мМ NaOH/1 мМ EDTA. После переноса на нейлоновую мембрану, осуществляли саузерн-блоттинг с 32Р-меченным CFTR зондом для визуализации вирусной ДНК. Для проверки 5'-концевых геномных делеций в слишком больших rAAV векторах, 3,33х108 DRP
каждого вируса (количественно определяли с помощью ПЦР TaqMan с набором зонд/праймеры для кДНК fCFTR) загружали на нейлоновую мембрану для слот-блоттинга. Сначала блоты гибридизовали с набором из трех 32Р-меченных олигонуклеотидных зондов для минус-цепи генома rAAV: в 5'-последовательности промотора tg83: taccctcgagaacggtgacgtg (SEQ ID № 7); центре кДНК CFTR хорька: ggagatgcgcctgtctcctggaatg (SEQ ID № 8); и З'-последовательности синтетического полиА: gcatcgatcagagtgtgttggttttttgtgtg (SEQ ID № 9). После экспозиции с X-film, мембраны очищали от зонда и снова гибридизовали с другим набором из трех 32Р-меченных олигонуклеотидных зондов, комплементарных плюс-цепи. Программное обеспечение NIH ImageJ использовали для того, чтобы количественно определять интенсивность сигнала гибридизации для того, чтобы определять соответствующее число геномов, обнаруживаемых с помощью каждого зонда с использованием серийных разведений провирусной плазмиды в качестве стандартов.
Клеточная культура и условия трансфекции и инфекции. Клеточные линии дыхательных путей человека А54 9 и IB3, а также клетки НЕК2 93 культивировали в виде монослоев в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и пенициллина-стрептомицина и поддерживали в 37°С инкубаторе при 5% СОг. Первичные клетки дыхательных путей хорька выделяли и культивировали в качестве не поляризованного монослоя или на ALI для того, чтобы создавать поляризованный эпителий, как описано в Liu et al. (2007) . Поляризованный первичный НАЕ создавали из ткани дыхательных путей трансплантата легкого, как описано в Karp et al. (2002) с помощью Cells and Tissue Core of The Center for Gene Therapy в University of Iowa. Поляризацию клеток линии CuFi8, условно трансформированной клеточной линии, которую создавали из AF508/AF508 CF клеток дыхательных путей (Zabner et al. , 2003), поляризовали на ALI с использованием условий, схожих с таковыми, использованными для первичного НАЕ (Yan et al. , 2013) . Эпителий дыхательных путей хорька и человека выращивали на 12 мм мембранных вставках Millicell (Millipore) и дифференцировали с использованием среды
USG с добавкой 2% Ultroser G (Pall BioSepra, SA, France) на ALI перед использованием. Клеточные линии и первичные монослойные культуры клеток дыхательных путей трансфицировали плазмидами с использованием липофектамина и 1,0 мкг плазмиды. Для rAAV инфекций клеток А54 9, поляризованных эпителиальных клеток дыхательных путей человека или хорька, векторы обычно оставляли в среде для культивирования в течение 24 часов (клетки А549) или 16 часов (поляризованные клетки). Для апикальной инфекции поляризованных НАЕ ALI-культур, векторы разводили в среде USG до конечного объема 50 мкл и вносили в верхнюю камеру вставки Millicell. Для базолатеральной инфекции векторы добавляли непосредственно в среду для культивирования в нижнюю камеру. Ингибиторы протеасом добавляли в среду для культивирования на всем протяжении периода инфекции поляризованных клеток, по 4 0 мкМ LLnL (Ы-ацетил-Ь-лейцин-Ь-лейцин-Ь-норлейцин) и 5 мкМ доксорубицина в случае поляризованных человека и 10 мкМ LLnL и 2 мкМ доксорубицина в случае CuFI ALI-культур и ALI-культур хорька. Эпителии экспонировали для вирусов и химических соединений в течение 16 часов и затем удаляли. В этот момент вставки Millicell быстро промывали небольшим количеством среды USG и только в нижнюю камеру добавляли свежую среду USG. Доксорубицин получали из Sigma (St, Louis, МО) и LLnL получали из Boston Biochem (Cambridge, MA).
rAAV инфекция легких хорька. Все эксперименты с животными осуществляли в соответствии с протоколами, одобренными в Institutional Animal Care and Use Committee из University of Iowa. Инфекцию легких хорька in vivo осуществляли посредством интратрахеальной инъекции 300 мкл инокулята, содержащего 2Х1011 DRP rAAV2/l и 2 50 мкМ доксорубицина. Перед инфицированием в возрасте 5 суток, детенышей хорьков анестезировали посредством ингаляции смеси изофлурана и кислорода. На 8 сутки после инфекции животных умерщвляли интраперитонеальной инъекции чрезмерной дозы пентобарбитала натрия. Для анализа экспрессии люциферазы контейнер с трахеей и легкими хорька незамедлительно замораживали в жидком азоте и затем измельчали в порошок с
использованием криогенного тканевого измельчителя. 1 мл Passive Lysis Buffer (Promega, Madison, WI) добавляли в порошкообразную ткань, чтобы экстрагировать белок. После четырех циклов заморозки-оттаивания, тканевой экстракт центрифугировали на 15000 об./мин в течение 5 минут, и осветленный тканевой экстракт использовали для люциферазного анализа с использованием набора для люциферазного анализа из Promega.
Измерение экспрессии репортерной люциферазы светляка. В указанное время после инфекции или трансфекции, клетки лизировали с использованием люциферазного клеточного лизирующего буфера и определяли ферментативную активность люциферазы в клеточных лизатах с использованием Luciferase Assay System (Promega) в 20/20 люминометре, оборудованном автоматическим инжектором (Turner Biosystems, Sunnyvale, СА).
Измерение токов короткого замыкания. Трансэпителиальные токи короткого замыкания (Isc) измеряли с использованием фиксации напряжения в эпителии (Model ЕС-825) и автономной камерной системы Ussing (обе приобретали в Warner Instruments, Inc., Hamden, CT) , как описано в Liu et al. (2007). На всем протяжении эксперимента камеру содержали при 37°С и аэрировали раствор в камере. Базолатеральную сторону камеры заполняли буферным раствором Рингера, содержащим 135 мМ NaCl, 1,2 мМ СаС12, 1,2 мМ МдС12, 2,4 мМ КН2Р04, 0,2 мМ К2НР04 и 5 мМ Hepes, рН 7,4. Апикальную сторону камеры заполняли раствором Рингера с низким содержанием хлоридов, в котором NaCl заменяли на 135 мМ глюконат натрия. Трансэпителиальное напряжение фиксировали на нуле, токовые импульсы подавали каждые 5 с и регистрировали ток короткого замыкания с использованием многоканальной фиксации напряжения/тока VCC МС8 (Physiologic Instruments) и программного обеспечения Quick DataAcq. Следующие химические соединения последовательно добавляли в апикальную камеру: (1) амилорид (100 мкМ) , чтобы ингибировать эпителиальную натриевую проводимость с помощью ENaC; (2) 4, 4'-диизотиоцианато-стильбен-2, 2'-дисульфоновая кислота (DIDS) (100 мкМ), чтобы ингибировать не CFTR хлорные каналы; (3) агонисты цАМФ форсколин (10 мкМ) и З-изобутил-1
метилксантин (IBMX) (100 мкМ) для того, чтобы активировать CFTR хлорные каналы; и (4) ингибитор CFTR GlyH-101 (N-(2-лигроинленил)- [ (3, 5-дибром-2,4-
дигидроксифенил)метилен]глицингидразид) (10 мкМ), чтобы
блокировать секрецию С1" через CFTR. Alsc вычисляли по различиям в С1" измерении плато, усредненным за 45 с до и после каждого изменения условий (химический стимул).
Количественный анализ мРНК CFTR векторного происхождения после трансдукции с использованием rAAV. Общую РНК из rAAV-инфицированных клеток получали с использованием RNeasy Mini plus Kit (Qiagen). Поскольку остаточный оцДНК геном rAAV в образце РНК может представлять собой нежелательную матрицу для традиционной ПЦР в реальном времени, использовали модифицированный РНК-специфичный способ ПЦР для rAAV вектора46 для того, чтобы обнаруживать мРНК CFTR хорька векторного происхождения. Вкратце, синтез 1-й цепи кДНК инициировали с использованием связанного с адаптером (нижний регистр) вектор-специфичного праймера, который направлен на синтетическую сигнальную последовательность полиаденилирования (верхний регистр). Последовательность этого праймера представляет собой 5'-gcacgagggcgacugucaUGAUCGAUGCAUCUGAGCUCUUUAUUA-3' (SEQ ID № 10), где все dT заменены на dU. После того, как осуществляли расщепление РНКазой Н для устранения РНК-матриц, специфичный к CFTR хорька праймер (5'-TGCAGATGAGGTTGGACTCA-3'; SEQ ID № 11) использовали для синтеза 2-й цепи. Во избежание ложно амплификации с кДНК, полученной из одноцепочечной вирусной ДНК, все dU-компоненты в кДНК продуктах 1-й и 2-й цепи, а также избыточные адаптерные праймеры, расщепляли с применением урацил-N-гликозилазы (UNG). Таким образом, получали кДНК продукт 2-й цепи, связанный с комплементарной последовательностью адаптера, который происходил исключительно из rAAV транскриптов. Набор праймеров для ПЦР TaqMan содержал последовательность CFTR хорька 5'-CAAGTCTCGCTCTCAAATTGC-3' (SEQ ID № 12) и адаптерную последовательность 5'-GCACGAGGGCGACTGTCA-3' (SEQ ID № 13) . Используемый зонд TaqMan представлял собой 5'-FAM-
ACCTCTTCTTCCGTCTCCTCCTTCA-TAMRA-3' (SEQ ID № 14) . Результаты
Синтетические олигонуклеотидные энхансеры, которые увеличивают управляемую промотором tg8 3 транскрипцию в клетках дыхательных путей.
Предшествующий объективный скрининг, оценивающий короткие синтетические энхансеры из библиотеки, содержащей 52429 уникальных последовательностей, идентифицировал энхансерные элементы, способные активировать транскрипцию с минимального цитомегаловирусного (CMV) IE промотора в 128 п. о. (от -53 до + 75) в клетках HeLa (Schlabach et al., 2010) . Эта библиотека содержала все возможные 10-членные ДНК последовательности, напечатанные на микрочипах в виде 10 тандемных повторов (общей длины в 100 оснований каждая). Наиболее эффективные 10 0-членные олигонуклеотиды усиливали транскрипцию этого минимального CMV IE промотора в 128 п. о. до 75%-137% от того, что индуцировал CMV IE промотор дикого типа в 600 п. о. (Schlabach et al. , 2010) . В предыдущих исследованиях последовательность синтетического промотора в 83 п. о. (tg83) использовали для экспрессии полноразмерного гена CFTR из rAAV вектора (AV2.tg83-CFTR), и обнаруживали, что он вызывает более высокую экспрессию трансгена в CF НАЕ культурах чем криптический промотор из AAV2 ITR (Zhang et al., 2009). Промотор tg83 состоит из сайта ATF-1/CREB и сайта связывания Spl из промотора al субъединицы Ыа,К-АТФазы и ТАТА-бокса и сайта инициации транскрипции из CMV IE промотора. Предложена гипотеза о том, что объединение промотора tg83 с синтетическим энхансером, идентифицированным посредством скрининга библиотеки, позволит получить транскрипционные единицы с более высокой эффективностью в поляризованном эпителии дыхательных путей человека и/или хорька in vitro и in vivo. Для того чтобы тестировать эту возможность, лучшие восемь энхансерных последовательностей, идентифицированных Schlabach et al. (Fl, F4, F5, F10, C9, D3, CREB б и CREB 8; Schlabach et al. , 2 010) оценивали по их способности усиливать tg83 транскрипцию в эпителии дыхательных путей человека и хорька.
AGTCAGGG С AAG T СAG T G G С AAG TCAGGGCAGTCAGGGCAGTCAGGG С AAG TCAGGGCA AGTCAGGGСAAGTСAGGGСAAGTСAGGGСAAGTCAGGGCA (SEQ ID № 15) F10
gaattgacgcatatattgacgcatattgacgcaaattgacgcaaatgacagcaagattg acgcaaattgagcgcaaattgacgcaaattaattgacgcat (SEQ ID № 16) F4
СTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGAGCAAT С T GAT G СAAT С T GAT G СAATAT GAT GAAT G T GAT G СAAT (SEQ ID № 17) F5
TGGTGAGCGTCTGGGCATGTCTGGGCATGTCTGGGCATGTCTGGGCATGTCGGGCATTC TGGGCGTCTGGGCATGTCTGGGCATGTCTGGGCA (SEQ ID № 18) C3
GCTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGAGCAA T С T GAT G СAAT С T GAT G СAATAT GAT GAAT G T GAT G СAAT T (SEQ ID № 19) D9
GCTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGAGCAA T С T GAT G СAAT С T GAT G СAATAT GAT GAAT G T GAT G СAAT T (SEQ ID № 20) CREB 6
ATTGACGCGGATTGACGCGGATTGACGCGGATTGACGCGGATTGACGCGGATTGACGCG G (SEQ ID № 21) CREB8
ATTGACGCGGATTGACGCGGATTGACGCGGATTGACGCGGATTGACGCGGATTGACGCG GATTGACGCGGATTGACGCG (SEQ ID № 22)
Комбинации энхансеров/промоторов: tg83
ctcgagaacggtgacgtgcacgcgtgggcggagccatcacgcaggttgctatataagca gagctcgtttagtgaaccgtcaga (SEQ ID № 23) Fltg83
AGTCAGGG СAAG T СAG T G G СAAG TCAGGGCAGTCAGGGCAGTCAGGG СAAG TCAGGGCA AGTCAGGGCAAGTCAGGGCAAGTCAGGGCAAGTCAGGGCActcgagaacggtgacgtgcacgcg tgggcggagccatcacgcaggttgctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcaga (SEQ ID № 24)
F10tg83
GAAT T GAC G СATATATT GACGСATATT GACGCAAAT T GACGCAAAT GACAGСAAGATT G ACGCAAAT T GAGCGCAAAT T GACGCAAAT TAAT T GAC
ctcgagaacggtgacgtgcacgcgtgggcggagccatcacgcaggttgctatataagcagagct cgtttagtgaaccgtcaga (SEQ ID № 25) F4tg83
С T GAT GCAAT С T GAT GCAAT С T GAT GCAAT С T GATGCAAT С T GAT GCAAT С T GAGCAAT С T GAT GCAAT С T GAT GCAATAT GAT GAAT G T GAT GCAAT
ctcgagaacggtgacgtgcacgcgtgggcggagccatcacgcaggttgctatataagcagagct cgtttagtgaaccgtcaga (SEQ ID № 26) F5tg83
GTGGTGAGCGTCTGGGCATGTCTGGGCATGTCTGGGCATGTCTGGGCATGTCGGGCATT CTGGGCGTCTGGGCATGTCTGGGCATGTCTGGGCATctcgagaacggtgacgtgcacgcgtggg cggagccatcacgcaggttgctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcaga (SEQ ID №27)
C3tg83
GCTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGAGCAA TCTGATGCAATCTGATGCAATATGATGAATGTGATGCAATTctcgagaacggtgacgtgcacgc gtgggcggagccatcacgcaggttgetatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcaga (SEQ ID № 28)
D9tg83
GCTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGATGCAATСTGAGCAA TCTGATGCAATCTGATGCAATATGATGAATGTGATGCAATTctcgagaacggtgacgtgcacgc gtgggcggagccatcacgcaggttgetatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcaga (SEQ ID № 29)
CREB6tg83
ATTGACGCGGATTGACGCGGATTGACGCGGATTGACGCGGATTGACGCGGATTGACGCG Gctcgagaacggtgacgtgcacgcgtgggcggagccatcacgcaggttgctatataagcagagc tcgtttagtgaaccgtcaga (SEQ ID № 30)
Промотор tg8 3 клонировали в беспромоторный люциферазный репортерный плазмидный pGL3-Basic Vector (Promega) для того, чтобы создавать pGL3-tg83. Затем конструировали серию люциферазных репортерных экспрессирующих плазмид, в которую помещали один из восьми 10 0-членных энхансеров перед промотором tg83 в pGL3-tg83 (фиг. 1А) . Сравнение репортерной экспрессии с pGL3-tg8 3 и его энхансер-содержащих производных проводили в монослойных (не поляризованных) культурах двух клеточных линий дыхательных путей человека (А54 9 и IB3) и первичных клетках дыхательных путей хорька (фиг. 1B-1D). Две дополнительные
люциферазные экспрессирующие плазмиды, pAV2-CMV-luc (содержит CMV IE энхансер-промотор дикого типа, 600 п. о.) и pAV2-CBA-luc (содержит энхансер CMV IE-промотор [3-актина курицы, т. е., промотор СВА) включали в качестве контролей для промоторной активности высокого уровня. Оценка экспрессии люциферазы после плазмидной трансфекции показывала, что все тестируемые энхансеры увеличивали управляемую tg8 3 экспрессию люциферазы и что их эффективности варьировали в зависимости от клеточной линии: в культурах клеток А4 59 человека и первичных клеток дыхательных путей хорька Fltg83 и F5tg83 превышали активность промоторов СВА и CMV; и в культурах клеток IB3 человека F10tg83 был наиболее эффективным, но вызывал значительно меньшую экспрессию, чем промотор CMV (фиг. 1B-1D).
Элемент F5 наиболее эффективно усиливает управляемую tg8 3 транскрипцию в поляризованном эпителии дыхательных путей человека и хорька in vitro, а также в дыхательных путях хорька in vivo.
Поскольку энхансеры Fl, F5 и F10 наиболее эффективны при активации управляемой tg8 3 транскрипции в монослойных культурах клеток дыхательных путей, оценивали способность этих элементов содействовать транскрипции в контексте rAAV векторных геномов. Конструировали четыре rAAV провирусных вектора, несущих люциферазную экспрессирующую кассету, с экспрессией под управлением tg83 (безэнхансерный), Fltg83, F5tg83 или F10tg83. Провирусную плазмиду pAV2-tg83-fCFTR использовали в качестве шаблонного вектора для клонирования, его промотор и 5' часть fCFTR кодирующей области заменяли на люциферазную экспрессирующую кассету в 2,1 или 2,2 т. о. Размер генома составлял 4,75 т. о. в случае rAV2.tg831uc и 4,85 т. о. для энхансер-содержащих векторов. Эту конструкцию использовали по двум причинам. Во-первых, сохранение как можно большей последовательности fCFTR обеспечивало то, что размер векторного генома будет схож с таковым у rAAV-CFTR экспрессирующих векторов, которые в конечном итоге будут созданы. Во-вторых, сохранение областей кДНК fCFTR максимизировало потенциальное
влияние последовательности CFTR хорька на функцию энхансера.
В качестве первой стадии исследования влияния AAV ITR и части последовательности трансгена fCFTR, подлежащей тестированию (т. е. З'-половины от кДНК fCFTR), на транскрипцию с промотора tg83, репортерную экспрессию с плазмид pGL3-tg83 и pAV2-tg831uc сравнивали после трансфекции в монослойные культуры А54 9 и первичных клеток дыхательных путей хорька. Обнаруживали, что плазмида pAV2-tg831uc в 2,5 раза (в А549) и 2 раза (в первичных клетках дыхательных путей хорька) транскрипционно более активна, чем плазмиды на основе pGL3 (фиг. 2А), что подсказывает, что включение AAV ITR и/или "лишних" последовательностей fCFTR оказывало в целом положительные эффекты на активность промотора tg83. Затем сравнивали экспрессию репортерного гена для плазмид pAV2-Fltg831uc, pAV2-F5tg831uc, pAV2-F10tg831uc, и pAV-tg831uc. Как и ожидали, энхансеры Fl, F5 и F10 значительно усовершенствовали транскрипцию с промотора tg83 (приблизительно в 10-19 раз) в клетках обоих типов (фиг. 2В) . Однако эффективность почти всех энхансеров был значительно снижена (приблизительно в 3-18 раз) в rAAV провирусных плазмидах по сравнению с плазмидами pGL3-tg8 3, которые не содержат ITR и последовательность CFTR (фиг. 2В, залитые столбцы в сравнении с фиг. 1В; фиг. 2В, незакрашенные столбцы в сравнении с фиг. 1D) . Это подсказывает, что последовательности из AAV ITR и/или части кДНК CFTR хорька оказывают общее негативное влияние на функцию энхансера. Однако этот эффект, оказываемый на синтетические энхансеры, различался между монослоями А54 9 и первичных клеток дыхательных путей хорька. В клетках А54 9 энхансер F1 испытывал наиболее значительное влияние, при снижении его активности в rAAV провирусной плазмиде в 18,1 раза, тогда как таковая у энхансеров F5 и F10 снижалась только в 8,2 раза и 3,8 раза, соответственно. В первичных клетках дыхательных путей хорька энхансеры F1 и F5 имели 4,4-кратное и 2,8-кратное снижение активности, соответственно, в контексте провирусной плазмиды, тогда как функция F10 была слегка усилена (приблизительно 4 0%).
Затем оценивали экспрессию с различных энхансерных элементов в контексте rAAV2/2 векторов. В клетках А549, схожие увеличения экспрессии с комбинации энхансера/промотора tg8 3 наблюдали после трансфекции провирусной плазмидой и инфекции соответствующим rAAV вектором (фиг. 2В, залитые столбцы в сравнении с фиг. 2С) . Затем первичные ALI-культуры эпителия дыхательных путей человека и хорька инфицировали равными титрами каждого rAAV вектора, и экспрессию трансгена оценивали в 2 сутки после инфекции. Эти эксперименты демонстрировали, что F5tg8 3 является наиболее эффективным промотором в обеих ALI-культурах человека и хорька (фиг. 2D и 2Е) , приводя к 19,6-кратному и 57,5-кратному увеличению, соответственно, управляемой tg83 транскрипции относительно таковой, управляемой с помощью безэнхансерного контроля (фиг. 2D и 2Е). Следует отметить, что дифференцированное состояние эпителиальных клеток дыхательных путей хорька, похоже, оказывает значительное влияние на экспрессию с различных комбинаций энхансера/промотора tg8 3 в контексте rAAV трансдукции; энхансер F5 более эффективно усиливал tg8 3 экспрессию в поляризованном эпителии (фиг. 2Е;
57.5- кратно), чем в недифференцированных монослоях (фиг. 2В;
16.5- кратно); энхансер F1 только немного увеличивал активность промотора tg83 в поляризованных клетках, но увеличивал экспрессию трансгена в 13,8 раза в клетках монослоя.
Наконец, активности in vivo у промоторов F5tg83 и F10tg83
сравнивали в дыхательных путях новорожденных хорьков, используя
интратрахеальную инъекцию двух rAAVl векторов с
псевдотипированным капсидом (AV2/1.F5tg831uc и AV2/1.F10tg831uc; инъецировали равные титры частиц). Ранее показано, что этот серотип капсида эффективен при трансдукции дыхательных путей хорька в присутствии ингибитора протеасом (Yan et al. , 2013) . Люциферазную активность измеряли в экстрактах, полученных из ткани трахеи и легких на 8 сутки после инфекции, и обнаруживали, что F5tg83 более эффективен, чем F10tg3, при трансдукции и легких и трахеи хорька (фиг. 2F) . Эти находки соответствовали таковым для поляризованных ALI-культур эпителия дыхательных путей хорька (фиг. 2Е).
Узкие пределы для размера генома rAAV оказывают значительное влияние на функциональность rAAV-CFTR векторов, при этом не меняя эффективность упаковки.
Размер ожидаемого генома AV.tg83fCFTR, если полностью упакован, составляет 4, 937 т. о. (фиг. ЗА) . Встраивание энхансера F5 увеличивает его до 5, 040 т. о. Несмотря на то, что общепризнанна способность AAV заключать в капсид геном rAAV слегка более длинный, чем его естественный размер (4,679 т. о.), постепенное увеличение размера rAAV вектора с 4,675 т. о. до 4, 883 т. о. и 5, 083 т. о. ведет к 25% и 75%, соответственно, снижению трансдукции (Dong et al., 1996) . Кроме того, одномолекулярное секвенирование (SMS) двух концов rAAV после упаковки провирусного генома в 5,8 т. о. показало, что 5' ITR нестабилен и имеет издержки в виде делеций (Kapranov et al., 2 012). Учитывая, что пределы для упаковки функционального генома в контексте rAAV-CFTR векторов еще не определены, было не ясно, будет ли геном AV.F5tg83fCFTR в 5,04 т. о. скомпрометирован в отношении стабильности и функции генома.
Этот вопрос изучали путем конструирования вектора AV2.tg83-fCFTR(HA) в 5,036 т. о., в котором экспрессирующую CFTR кассету продлевали посредством добавления эпитопной метки ЗхНА (99 нуклеотидов) в области, кодирующей четвертую внеклеточную петлю
(ECL4) в CFTR хорька (предыдущие исследования показывали, что эта инсерция не оказывает влияния на функцию хлорных каналов
(Glozman et al., 2009; Fisher et al., 2012)). Этот вектор позволял авторам изобретения проверять, как размер генома влияет на функциональность CFTR в отсутствие изменений транскрипции трансгена. Получали два rAAV2 вектора (AV2/2.tg83-fCFTR и AV2/2.tg83-fCFTR-HA; фиг. ЗА), и оценивали их способность создавать CFTR-опосредованные хлорные токи в поляризованных CF НАЕ. Выход векторов для двух вирус был почти одинаковым
(AV2/2.tg83-fCFTR приблизительно 5х109 DRP/мкл и AV2/2.tg83-fCFTR(НА) приблизительно ЗхЮ9 DRP/мкл). Поляризованные CF НАЕ культивировали на ALI и инфицировали с относительно высокой множественностью заражения (MOI) приблизительно 105 DRP/клетка
(1011 DRP каждого rAAV2 вектора на вставку) . На 10 сутки после инфекции, определяли уровень экспрессии CFTR посредством измерения тока короткого замыкания (Isc), как описано в Zhang et al. (2004) и Fisher et al. (2011) . На фиг. ЗВ представлена типичная кривая Isc после инфекции CF НАЕ с использованием AV2/2.tg83-fCFTR или AV2/2.tg83-fCFTR-HA. Амилорид и DIDS сначала применяли для блокирования не CFTR хлорных каналов и ENaC-опосредованных натриевых токов, а затем агонисты цАМФ (IBMX и форсколин) использовали для того, чтобы индуцировать активность CFTR. Изменения в Isc после добавления IBMX и форсколина (AlscIMBX & Forsk) и последующего добавления ингибитора CFTR GlyHlOl (AlscglyH) использовали для того, чтобы оценивать функцию CFTR. Эти результаты четко показывали, что функциональное дополнение активности CFTR в CF НАЕ выше после инфекции с использованием AV2/2.tg83-fCFTR, чем с использованием
AV2/2.tg83-fCFTR-HA (фиг. ЗВ) . Средние значения AlscIBMX & Forsk и AlscglyH из этих экспериментов сведены на фиг. ЗС. CFTR-опосредованные цАМФ-индуцибельные С1" токи, которые получали с помощью AV2/2.tg83-fCFTR(НА), составляли только 3,6% от таковых в не CF НАЕ ALI-культурах, но все же выше фоновых уровней (р <0,01). В отличие от этого, инфекция с использованием AV2/2.tg83-fCFTR создавала в 10 раз более высокие цАМФ-индуцибельные С1" токи, чем AV2/2.tg83-fCFTR(НА) и достигала приблизительно 30% активности CFTR в не CF НАЕ ALI-культурах. Эти результаты демонстрируют, что пределы для сохранения функции CFTR очень узки, когда получают слишком большие геномы rAAV, и что функциональность вектора не зависит только от эффективности упаковки DRP. Кроме того, эти исследования показывают, что встраивание 100-нуклеотидного энхансера F5 в AV2/2.tg83-fCFTR, при общем размере генома в 5,04 т. о., может иметь значимое негативное влияние на функцию генома.
Эффективная упаковка функционального минигена CFTR хорька в
rAAV
Далее исследовали возможность использования укороченного минигена CFTR хорька, чтобы дополнительно уменьшать размер
генома rAAV-CFTR вектора и сделать возможным встраивание энхансера F5. Сообщалось, что миниген CFTR человека (CFTRAR) С частичной делецией R-домена в 156 п. о. (кодирующей аминокислоты 708-759) сохраняет большую часть активности хлорного канала полноразмерного белка (Ostedgaard et al., 2002; Ostedgaard et al. , 2011) . Миниген fCFTRAR создавали посредством делеции гомологичной последовательности в 159 п. о., кодирующей аминокислоты 708-760 в соответствующем положении белка человека, и получали два дополнительных вектора: AV2/2.tg83-fCFTRAR (4,778 т. о.) и AV2/2.tg83-fCFTRAR(НА) (4,877 т. о.). Эта пара векторов позволяла исследовать не только функцию минигена fCFTR в CF НАЕ ALI-культурах, но также влияние инсерции НА-метки в ген fCFTR. Анализ ответов AlscIBMX & Forsk и AlscglyH на эти два вируса показывал, что и AV2/2.tg83-fCFTR и AV2/2.tg83-fCFTR(НА) создавали существенные CFTR-опосредованные С1" токи после инфекции CF НАЕ ALI-культур (фиг. ЗС) . Однако НА-меченная форма создавала приблизительно на 20% меньший С1" ток, чем AV2/2.tg83-fCFTRAR. Эта находка согласуется с rAAV векторами в 4,8 8 т. о., которые имеют только приблизительно 2 5% функциональной активности векторов в 4,68 т. о. (Dong et al. , 1996) . Альтернативно, сама НА-метка может влиять на функцию CFTR в контексте делеции R-домена, несмотря на то, что в контексте полноразмерного CFTR эта ECL4 НА-метка не оказывает влияния на функцию С1" канала (Glozman et al. , 2009; Fisher et al. , 2011) . Несмотря на больший размер генома у AV2/2.tg83-fCFTR (4,9437 т. о.), этот вектор создавал приблизительно на 30% больший CFTR-опосредованный ток, чем его более короткий аналог AV2/2.tg83-fCFTRAR (4, 778 т. о.) (фиг. ЗС) . Это снижение активности С1~
канала fCFTRAR схоже с таковым у hCFTRAR (Ostedgaard et al., 2 0 02). Однако, учитывая потенциал к сниженной функциональности у более крупных векторных геномов, влияние делеции R-домена на функцию белка CFTR хорька вероятно больше такового на CFTR человека.
Чтобы устанавливать влияние длины генома на упаковку тестируемых rAAV векторов, целостность вирусного генома
исследовали с использованием щелочного денатурирующего агарозного электрофореза в геле после, чего следовал саузерн-блоттинг (фиг. 4А) . Этот анализ показывал, что наименьший векторный геном (т. е. из AV2. tg8 3- fCFTRAR, 4, 77 8 т. о.) можно отличать от других трех вирусов на основе его более быстрой миграции через гель (AV2.tg83-fCFTRAR на 99 нуклеотидов короче, чем вектор AV2.tg83-fCFTRAR(НА)). Однако AV2.tg83-fCFTR(НА) (5, 036 т. о.), AV2.tg8 3-fCFTR (4, 937 т. о.) и AV2.tg83-fCFTRAR(HA) (4,887 т. о.) нельзя отличить друг от друга на основе этого анализа. Учитывая что, может быть возможно визуализировать отличия и 149 нуклеотидов (AV2.tg83-fCFTR(НА) в сравнении с AV2.tg83-fCFTRAR(НА)) и 99 нуклеотидов (AV2.tg83-fCFTR(НА) в сравнении с AV2.tg8 3-fCFTRAR(НА) и AV2.tg83-fCFTR(НА) в сравнении с AV2.tg83-fCFTR), эти находки интерпретировали как подтверждение мнения о том, что вирусные геномы, которые больше таковых у AV2.tg8 3-fCFTRAR(НА) (4,8 87 т. о.), склонны подвергаться делециям, которые компрометируют экспрессию трансгена CFTR.
Мнение о том, что делеция возникает в контексте более длинных геномов, дополнительно подтверждала гибридизация вирусных геномов с двумя наборами олигонуклеотидных зондов плюс-и минус-цепей в центре кДНК CFTR, промоторе tg83 и синтетических последовательностях полиА (фиг. 4В) . Результаты этого анализа показывали, что вирусная ДНК из наибольшего вектора AV2.tg83-fCFTR(HA) подвержена делециям на 5'-концах геномов плюс- и минус-цепей. В отличие от этого, З'-концы геномов плюс- и минус-цепей AV2.tg83-fCFTR(НА) оставались интактным, что согласуется с упаковкой одноцепочечных геномов AAV в направлении от 3' к 5'. Тот факт, что прочность гибридизации на промоторе tg83 (для плюс-цепи) и последовательности полиА (для минус-цепи) ниже, чем таковая при гибридизации кДНК fCFTR, подсказывал, что эти делеции не ограничены областью ITR (т. е. что повреждение распространялось в экспрессирующую CFTR кассету). Такие делеции не наблюдали во втором самым длинном векторе, AV2.tg83-fCFTR,
следовательно, экспрессирующая CFTR кассета в этом векторе наиболее вероятно все же остается интактной, несмотря на то, что частичные делеции в области ITR вероятно возникают, как предполагали по миграции вирусной ДНК в денатурирующем агарозном геле. Хотя делеции в областях ITR могут не оказывать непосредственного влияния на экспрессию трансгена CFTR, они могут влиять на стабильность вирусных геномов и, таким образом, опосредованно влиять на экспрессию CFTR. Эти результаты, вместе с функциональным анализом, приводят к заключению о том, что кДНК fCFTRAR без НА-метки лучше всего подойдет для тестирования влияния энхансера F5, оказываемого на rAAV-опосредованное дополнение CFTR.
Синтетический промотор F5tg8 3 усовершенствует rAAV-опосредованное дополнение CFTR.
Далее создавали провирусную плазмиду pAV2.F5tg83-fCFTRAR и получали вирус AV2/2.F5tg83-fCFTRAR С размером генома 4,87 т. о. Эффективность этого вируса для дополнения функции CFTR канала после инфекции поляризованных CF НАЕ сравнивали с таковой у аналогичного безэнхансерного вектора (AV2.tg83-fCFTRAR). Результаты этого анализа показывали, что встраивание энхансера F5 значительно усовершенствовало CFTR-опосредованные С1" токи (фиг. 5) . Через две недели после базолатеральной инфекции при
MOI 5x104 DRP/клетка, цАМФ-индуцированные CFTR-опосредованные С1~ токи для AV2/2.F5tg83-fCFTRAR в 3,5 раза превышали AV2/2.tg83-fCFTRAR, и первый составлял 89% от того, что наблюдали в не CF первичных НАЕ. Схоже усовершенствование функции CFTR (4,8-кратное) наблюдали с использованием AV2/2.F5tg83-fCFTRAR после апикальной инфекции, но в этом случае эффективность трансдукции была значительно ниже, как предварительно сообщалось для этого серотипа. При сниженной MOI 1х104 DRP/клетка базолатерально, AV2 /2.F5tg8 3-fCFTRAR вызывал 69% CFTR тока, создаваемого с помощью этого вектора при 5-кратно увеличенной MOI, что подсказывает, что в последнем случае дополнение функции CFTR достигало насыщения. Таким образом, когда сравнивают
эффективность векторов AV2/2.F5tg83-fCFTRAR (lxlO4 DRP/клетка) и AV2/2.tg83-fCFTRAR (5X104 DRP/клетка) в контексте оптимальной инфекции (т. е. базолатеральной) и ненасыщающих условий, встраивание энхансера F5 усовершенствовало эффект вектора в 13,5 раза. Этот уровень увеличения тока согласуется с увеличением экспрессии, наблюдаемой при использовании аналогичных люциферазных экспрессирующих векторов (фиг. 2D, в 19,6 раза).
Учитывая очевидное насыщение CFTR токов при наивысшей MOI
(5х104 DRP/клетка) после базолатеральной инфекции с использованием AV2/2.F5tg83fCFTRAR, кинетику экспрессии CFTR оценивали при промежуточной MOI (2х104 DRP/клетка). Измерения осуществляли на 3 и 10 сутки после инфекции CF НАЕ с использованием AV2/2.F5tg83-fCFTRAR И AV2/2.tg8 3-fCFTRAR. Результаты этого анализа показывали, что, в контексте энхансера F5, начало CFTR-опосредованных С1" токов было более быстрым, чем в его отсутствие (фиг. 6А) . Фактически, CFTR токи были максимальными на 3 сутки после инфекции с использованием AV2/2. F5tg83-fCFTRAR, при этом токи возрастали в 3,6 раза между 3 и 10 сутками после инфекции с использованием AV2/2.tg83-fCFTRAR. Для более непосредственного сравнения транскрипционной активности между этими векторами, мРНК CFTR хорька исследовали с помощью РНК-специфичной ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени (RS-PCR), этот способ предотвращает амплификацию ДНК продуктов векторного происхождения и его ранее применяли при обнаружении мРНК CFTR из rAAV-инфицированных клеток и тканей
(Zhang et al. , 2004; Gerard et al. , 2003) . Анализы результатов RS-PCR, после нормализации по транскриптам GAPDH хорька, показывал в 6,4 раза и 17,1 раза повышенные уровни мРНК fCFTR после инфекции с использованием AV2. F5tg83-fCFTRAR В сравнении с AV2/2.tg83-fCFTRAR, В моменты времени на 3 и 10 сутки, соответственно (фиг. 6В). 10-кратное увеличение мРНК CFTR, которое наблюдали между 3 и 10 сутками после инфекции, подтверждает, что CFTR токи были насыщены к 3 суткам после инфекции. Таким образом, на транскрипционном уровне, встраивание
энхансера F5 увеличивало экспрессию CFTR в 17,1 раза, близко отражая результаты, наблюдаемые с использованием люциферазных экспрессирующих векторов (фиг. 2D, в 19,6 раза). Обсуждение
rAAV векторы привлекают существенное внимание в отношении генной терапии человека, но их по существу небольшой геном (4,67 9 т. о.) является значимой проблемой для доставки больших генов, таких как CFTR. Несмотря на то, что несколько лабораторий пытались проводить рациональное конструирование коротких энхансеров и промоторов для использования в rAAV векторах, этот подход еще должен дать надежную экспрессию CFTR в дыхательных путях. В данном исследовании предпринят полностью эмпирический подход посредством скрининга синтетических энхансеров по их эффективности при доставке экспрессии репортерного гена ступенчато - в плазмидах, провирусных векторах и вирусных векторах. Хотя основная цель состояла в разработке rAAV векторов для доставки CFTR в дыхательные пути, схожий подход может оказаться эффективным при попытках генной терапии, направленных на доставку других больших генов (например, фактора VIII и дистрофина), которые делают необходимым использование коротких промоторов.
Известно, что получение слишком большого генома rAAV ведет к случайным делециям на 5'-концах одноцепочечных геномов, заключаемых в капсиды (Kapranov et al., 2012), но функциональная целостность векторных геномов rAAV, которые приближаются к общепринятой максимальной емкости rAAV (приблизительно 5,0 т. о.), тщательно не исследована. Данное исследование дает, в контексте CFTR-экспрессирующих rAAV векторов, доказательство того, что функциональность генома rAAV начинает снижаться значительно ниже этого порога в 5,0 т. о. Доказательство, подтверждающее это, включает снижение функции CFTR для генома в 4, 877 т. о. в сравнении с геномом в 4, 77 8 т. о. (фиг. ЗС) и отсутствие различий в миграции одноцепочечных геномов в 4,8775,036 т. о. при визуализации на щелочных гелях (фиг. 4А). Дополнительно, самый большой CFTR вектор (5,036 т. о.) подвержен
делеции в приблизительно 30% геномов, которая выходит за пределы 5' ITR и в промотор (в случае плюс-цепи) или область полиА (в случае минус-цепи). Это подсказывает, что повреждение экспрессирующей CFTR кассеты может отвечать за значительное ослабление функции CFTR, доставляемого с помощью этого вектора. Хотя используемые олигозонды обнаруживали только делеции в 30% геномов для этой самой большой конструкции, 90% снижение CFTR хлорного тока между векторами в 4,937 и 5,036 т. о. подсказывает, что значительно большая процентная доля геномов подвержена функциональным делециям и что делеции ITR также могут ослаблять эффективность вектора.
Данные находки выглядят несоответствующими предыдущему наблюдаемому только 4-кратному изменению экспрессии трансгена между rAAV векторами, размер которых составляет 4,7 т. о. и 5,2 т. о. (Wu et al., 2010) . Однако в этом более раннем исследовании "лишнюю" последовательность, использованную для продления вектора, располагали между экспрессирующей кассетой и ITR, и делеции "лишней" последовательности вероятно будут оказывать меньшее влияние на транскрипционную активность трансгена. В данном исследовании AAV-CFTR вектора вместо этого использовали короткий синтетический промотор и сигнал полиА, и следовало ожидать значительного влияния небольших делеций в этих коротких транскрипционных регуляторных элементах, оказываемого на экспрессию гена. Поскольку титр устойчивых к ДНКазам частиц обычно используют для того, чтобы подтверждать эффективную упаковку геномов rAAV, небольшие 5'-концевые делеции будут оказывать значительное влияние на функциональность слишком больших rAAV векторов.
Эмпирический подход, который использовали для скрининга синтетических 100 п. о. энхансеров по способности усовершенствовать rAAV-опосредованную экспрессию трансгена в дыхательных путях, давал несколько важных наблюдений: 1) Энхансерная активность различалась в зависимости от клеточных линий, а также состояния дифференцировки клеток. 2) На энхансерную активность влияли ITR AAV и также возможно влияла
последовательность гена, представляющего интерес (в этом исследовании, З'-половина кодирующей области кДНК CFTR хорька). 3) Энхансерная активность в случае rAAV инфекции в целом схожа с таковой в контексте провирусного вектора, хотя с небольшими различиями. 4) Инфекция дыхательных путей человека и хорька с использованием вирусных векторов обнаруживала некоторые различия в функции энхансера (наиболее заметно для AV2/2.Fltg831uc, фиг. 2D и 2Е) . Эти результаты показывают, что, несмотря на то, что трансфекция провирусной плазмидой подходит для начального скрининга синтетических энхансеров, выполнение такого скрининга в неполяризованных первичных культурах дыхательных путей может не создавать те же паттерны экспрессии гена, которые наблюдают после AAV инфекции поляризованных культур дыхательных путей.
С помощью этого скрининга идентифицировали синтетический энхансер в 100 п. о. (F5), который значительно усовершенствует транскрипционную активность синтетического промотора в 8 3 п. о.
(tg83), в поляризованных культурах и первичных эпителиальных клеток человека и дыхательных путей хорька, а также в легких и трахее хорька in vivo. Миниген CFTR хорька, не содержащий часть R-домена из 53 аминокислот (fCFTRAR), сохранял приблизительно 7 0% функции fCFTR дикого типа, подобно сохранению 8 0% функции у аналогичной конструкции hCFTRAR, о которой сообщали ранее
(Ostedgaard et al., 2002). Тем не менее, это значительно скомпенсировано увеличенной экспрессией трансгена с AV2.F5tg83-
fCFTRAR, поскольку использование укороченного минигена позволяет сэкономить пространство в 150 п. о., чтобы сделать возможным встраивание энхансера F5. В контексте rAAV вектора, энхансер F5 значительно усовершенствовал управляемую tg8 3 экспрессию мРНК CFTR (17,1-кратно) на 10 сутки после инфекции CF НАЕ относительно вектора AV2/2.tg83-fCFTRAR, который не содержит этот энхансер. Это увеличение экспрессии мРНК CFTR с AV2/2.F5tg83-fCFTRAR хорошо коррелировало с 19,6-кратным усовершенствованием CFTR-опосредованных токов, которое делал возможным этот вектор, и вело к возникновению приблизительно 8 9% цАМФ-опосредованных С1" токов, которые наблюдали в не CF НАЕ.
Стоит отметить, что найден потолок на уровне функциональной коррекции, которого можно достичь в отношении изменений в Isc. В динамических исследованиях максимальной коррекции Isc в CF НАЕ достигали на 3 сутки после инфекции, приблизительно с 10-кратным увеличением мРНК CFTR на 10 сутки после инфекции, которое не приносило усовершенствования С1" токов (фиг. б). Эти находки дают важное понимание для оценки функциональности rAAV-CFTR векторов: дозозависимые эффекты вектора необходимы для точного сравнения конструкций векторов. Потолок CFTR токов может быть отражением самоограничивающей биологии клетки (например, контроль над общим количеством CFTR на плазматической мембране) , или аберрантной направленной миграции CFTR к базолатеральной мембране при более высоких уровнях экспрессии (Farmen et al., 2005).
Вкратце, создавали rAAV-CFTR вектор, который обеспечивает экспрессию на высоком уровне, пригодную для использования в исследованиях генной терапии легких в модели CF на хорьках. Кроме того, данные находки подсказывают, что небольшие синтетические энхансеры и промоторы могут быть эффективными инструментами для оптимизации конструкции rAAV векторов для доставки больших трансгенов.
Краткое изложение
Как рассмотрено в настоящем описании, комбинацию небольшого синтетического энхансера/промотора размером приблизительно 200 п. о. или меньше, можно использовать в rAAV векторе для того, чтобы доставлять эффективную экспрессию трансгена для экспрессии большого трансгена; в этом исследовании геном является CFTR. В настоящем описании также рассмотрен эмпирический подход для скрининга набора 10 0-членных синтетических энхансерных элементов по их способности увеличивать репортерную экспрессию с короткого синтетического промотора в 8 3 п. о. (tg83p) в ткани дыхательных путей легких. Частичную последовательность гена, представляющего интерес (в данном исследовании это CFTR), включают в репортерный вектор для того, чтобы максимизировать эффект для скрининга наилучшей энхансерной последовательности. Скрининг проводили ступенчато - в плазмидах, провирусных векторах и rAAV векторах, а также на различных клеточных/тканевых уровнях - в монослойных
(не поляризованных) культурах клеточных линии дыхательных путей человека и первичных клеток дыхательных путей хорька, в поляризованных культурах эпителия дыхательных путей человека и хорька на границе раздела воздух-жидкость (ALI) и дыхательных путях хорька in vivo. Энхансерная активность различается в зависимости от клеточных линий и состояния дифференцировки клеток, а также находится под влиянием AAV ITR и последовательности гена, представляющего интерес. Таким образом, эффекты энхансера в контексте плазмидной трансфекции могут отличаться от таковых в контексте rAAV трансдукции. Эффекты конкретного энхансера in vivo могут не быть предсказуемыми на основе его поведения, демонстрируемого в культуральных клеточных линиях. Таким образом, скрининг нужно проводить на различных клеточных/тканевых уровнях и ступенчато - в плазмидах, провирусных векторах и rAAV векторах, чтобы обеспечивать успех.
Обнаружено, что три синтетических энхансера (Fl, F5 и F10) значительно увеличивают транскрипцию tg8 3p для трансгена люциферазы в контексте плазмидной трансфекции. Промотор F5tg83, комбинация энхансера F5 и tg8 3p в 183 п. о., был наиболее эффективным промотором в ALI-культурах человека и хорька, приводя к 19,6-кратному и 57,5-кратному увеличению репортерной экспрессии, соответственно, относительно безэнхансерного аналога. Промотор F5tg8 3 также давал наивысший уровень экспрессии трансгена в дыхательных путях хорька in vivo. Когда промотор F5tg83 использовали для того, чтобы транскрибировать миниген CFTR в 4,2 т. о. (CFTRAR) В rAAV векторе, он давал приблизительно 17-кратное увеличение транскрипции мРНК CFTR векторного происхождения и значительно усовершенствовал С1" токи в CF ALI-культурах человека, по сравнению с вектором, в котором используют только tg83p.
Комбинации энхансера/промотора для эпителия легких
(например, F5tg83) не обязательно могут быть также эффективными для других органов/тканей. Например, когда AAV векторы, несущие репортерный ген люциферазы под управлением F5tg8 3 или F10tg8 3, использовали для того, чтобы инфицировать различные ткани/органы
пищеварительной системы, F5tg8 3 демонстрировал самую сильную промоторную активность в поджелудочной железе, желчном пузыре и печени, тогда как F10tg83 превосходил по эффективности F5tg83 в тонкой кишке (фиг. 7А-7В).
Несмотря на то, что исследования сосредотачивали на идентификации последовательности сильного синтетического энхансера/промотора, используемой для эффективной экспрессии CFTR в ткани легких/дыхательных путей, скрининговый подход можно использовать для любых желаемых типов клеток, тканей и органов in vitro и in vivo.
Таким образом, обнаруживали, что использование коротких энхансерных элементов (приблизительно 100-членных синтетических олигонуклеотидных последовательностей, состоящих из 10-членных повторов) усиливает экспрессию гена с минимального промотора в rAAV векторах. Эти 100 п. о. энхансерные элементы предварительно идентифицировали по их способности активировать транскрипцию под управлением предраннего (IE) минимального промотора CMV в клеточных линиях (Schlabach et al., 2010). Предложена гипотеза о том, что энхансеры, которые наиболее сильны в активации транскрипции, можно использовать для усиления активности синтетического промотора tg8 3 в клетках дыхательных путей в контексте rAAV векторов. Тестировали восемь комбинаций промотора tg83 и синтетических энхансеров в 100 п. о. и обнаруживали, что тот, который обозначали как F5, эффективно усиливал транскрипцию с промотора tg8 3 в поляризованных клетках дыхательных путей (in vitro), полученных как от человека, так и от хорька, а также в дыхательных путях хорька (in vivo). При использовании промотора F5tg83 и минигена CFTR хорька с частичной делецией в R-домене (fCFTRAR) находили rAAV вектор (AV2/2.F5tg83-fCFTRAR), у которого тестировали способность корректировать CFTR-опосредованный С1" транспорт в CF ALI-культурах.
Пример 2
AV.F5Tg8З-hCFTRAR тестировали на экспрессию hCFTR в дыхательных путях новорожденных и взрослых хорьков. Конечной точкой этих анализов было соотношение мРНК CFTR человека
трансгенного происхождения (hCFTR) и эндогенного CFTR хорька (fCFTR). У новорожденных хорьков в возрасте 3 суток (фиг. 9) AV. F5Tg83-CFTRAR вел к 240% более высокой экспрессии CFTR человека по сравнению с эндогенным CFTR (хорька) после доставки гена в легкие.
Принимая во внимание, что фенотип эпителия дыхательных путей хорька и секреция в дыхательных путях меняются по мере развития легких, оценивали, трансдуцирует ли AV.F5Tg83-CFTRAR дыхательные пути взрослого хорька и остается ли промотор активным. С этой целью оценивали способность AV.F5Tg83-CFTRAR трансдуцировать легкие хорьков в возрасте 1 месяца. У взрослых хорьков в возрасте 1 месяца (фиг. 10) AV.F5Tg83-CFTRAR вел к 300% более высокой экспрессии CFTR человека по сравнению с эндогенным CFTR (хорька) после доставки гена в легкие. Кроме того, соотношение CFTR человека и хорька составляло приблизительно один в носовом ходу. Эти находки у новорожденных и взрослых хорьков подсказывают, что промотор F5tg8 3 надежно экспрессирует трансген CFTR в легких in vivo.
Литература
Aitken et al., Chest, 123:792 (2003). Aitken et al., Hum Gene Ther., 12:1907 (2001). Carter, Hum Gene Ther., 16:541 (2005). Conrad et al., Gene Ther., 3:658 (1996). Daya & Berns, Clin. Microb. Rev., 21:583 (2008). Ding et al., Gene Ther., 12:873 (2005). Ding et al., Mol. Ther., 13:671 (2006). Dong et al., Hum. Gene Ther., 7:2101 (1996). Duan et al., Hum. Gene Ther., 9:2761 (1998). Duan et al., J. Clin. Invest., 105:1573 (2000). Farmen et al. , Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 289:1123 (2005).
Fisher et al., J. Biol. Chem., 287:21673 (2012). Flotte et al., J. Biol. Chem., 268:3781 (1993). Flotte, Curr. Opin. Mol. Ther., 3: 497 (2001). Flotte, et al., J. Biol. Chem., 268:3781 (1993).
Gerard et al., Gene Ther., 10:1744 (2003). Glozman et al., J. Cell Biol., 184:847 (2009). Griesenbach et al., Virus Adapt. Treat., 2:159, (2010). Griesenback & Alton, Adv. Drug Deliv. Rev., 61:128 (2009). Kapranov et al., Hum. Gene Ther., 23:46 (2012) . Karp et al., Methods Mol. Biol., 188:115 (2002). Li et al., Mol. Ther., 17:2067 (2009).
Liu et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 36:313 (2007). Liu et al., Gene Ther., 14:1543 (2007). Liu et al., Mol. Ther., 15:2114 (2007). Moss et al., Hum. Gene Ther., 18:726 (2007).
Mueller & Flotte, Clin. Rev. Allergy Immunol., 35:164 (2008) .
Olivier et al., J. Clin. Invest., 122:3755 (2012). Ostedgaard et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:2952 (2005).
Ostedgaard et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:2921 (2011).
Ostedgaard et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:3093 (2002).
O'Sullivan & Freedman, Lancet, 373:1891 (2009). Riordan et al., Science, 245:1066 (1989). Rommens et al., Science, 245:1059 (1989). Rowe et al., N. Engl. J. Med., 352:1992 (2005). Schlabach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107:2538 (2010) .
Summer-Jones et al., Gene Therapy for Cystic Fibrosis Lung Disease, Birkhauser Basel, Basel (2010).
Sun et al., Am. J. Pathol., 184:1309 (2014).
Sun et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 50:502 (2014).
Sun et al., J. Clin. Invest., 118:1578 (2008).
Sun et al., J. Clin. Invest., 120:3149 (2010).
Wagner et al., Hum. Gene Ther., 13:1349 (2002).
Welsch, FASEB. J., 4:2718 (1990).
Welsh et al., In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, eds. McGraw-Hill, New York, p. 3799 (1995).
Wu et al., Mol. Ther., 14:316 (2006).
Wu et al., Mol. Ther., 18:80 (2010).
Yan et al., Hum. Gene Ther., 24:786 (2013).
Yan et al., Hum. Gene Ther., 26:334 (2015).
Yan et al., J. Virol., 76:2043 (2002).
Yan et al., J. Virol., 78:2863 (2004).
Yan et al., Mol. Ther., 21:2181 (2013).
Zabner et al. , Am J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 284 : 844 (2003) .
Zhang et al., Mol. Ther., 10:990 (2004).
Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:10158 (1998).
Все публикации, патенты и патентные заявки включены в настоящее описание посредством ссылки. Несмотря на то, что в приведенном выше описании это изобретение описано по отношению к определенным предпочтительным вариантам его осуществления и многие детали приведены в иллюстративных целях, специалистам в данной области будет очевидно, что изобретение допускает дополнительные варианты осуществления и определенные подробности в настоящем описании можно значительно изменять, не отступая от основных принципов изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Engelhardt, John F. Yan, Ziying
University of Iowa Research Foundation
<120> AAV-ОПОСРЕДОВАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПРОМОТОРА И ЭНХАНСЕРА
<130> 875.167WO1
<150> US 62/304,656
<151> 2016-03-07 <160> 68
<170> FastSEQ для Windows версии 4.0
<210> 1 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер
<400> 1
tttttgaagc gaaggttgtg g 21
<210> 2 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер
<400> 2
cacacacagt tcgcctcttt g 21
<210> 3 <211> 32 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический зонд
<400> 3
atctggatac cgggaaaacg ctgggcgtta at 32
<210> 4 <211> 22 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер
<400> 4
gacgatgttg aaagcatacc ac 22
<211> 22 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер
<400> 5
cacaaccaaa gaaatagcca cc
<210> 6 <211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический зонд
<400> 6
agtgacaaca tggaacacat acctccg 27
<210> 7 <211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический зонд
<400> 7
taccctcgag aacggtgacg tg 22
<210> 8 <211> 25 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический зонд
<400> 8
ggagatgcgc ctgtctcctg gaatg
<210> 9
<211> 32 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический зонд
<400> 9
gcatcgatca gagtgtgttg gttttttgtg tg 32
<210> 10 <211> 45 <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер
<400> 10
gcacgagggc gacugucaug aucgaugcau cugagcucuu uauua
<210> 11 <211> 20 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер
<400> 11
tgcagatgag gttggactca 20
<210> 12 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер
<400> 12
caagtctcgc tctcaaattg c 21
<210> 13 <211> 18 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер
<400> 13
gcacgagggc gactgtca 18
<210> 14 <211> 25 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер
<400> 14
acctcttctt ccgtctcctc cttca 25
<210> 15 <211> 99 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 15
agtcagggca agtcagtggc aagtcagggc agtcagggca gtcagggcaa gtcagggcaa 60 gtcagggcaa gtcagggcaa gtcagggcaa gtcagggca 99
<210> 16 <211> 100 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
60 100
<400> 16
gaattgacgc atatattgac gcatattgac gcaaattgac gcaaatgaca gcaagattga cgcaaattga gcgcaaattg acgcaaatta attgacgcat
<210> 17 <211> 98 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
60 98
<400> 17
ctgatgcaat ctgatgcaat ctgatgcaat ctgatgcaat ctgatgcaat ctgagcaatc tgatgcaatc tgatgcaata tgatgaatgt gatgcaat
<210> 18 <211> 93 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
60 93
<400> 18
tggtgagcgt ctgggcatgt ctgggcatgt ctgggcatgt ctgggcatgt cgggcattct gggcgtctgg gcatgtctgg gcatgtctgg gca
<210> 19 <211> 100 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
60 100
<400> 19
gctgatgcaa tctgatgcaa tctgatgcaa tctgatgcaa tctgatgcaa tctgagcaat ctgatgcaat ctgatgcaat atgatgaatg tgatgcaatt
<210> 20 <211> 100 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
60 100
<400> 20
gctgatgcaa tctgatgcaa tctgatgcaa tctgatgcaa tctgatgcaa tctgagcaat ctgatgcaat ctgatgcaat atgatgaatg tgatgcaatt
<210> 21 <211> 60 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 21
attgacgcgg attgacgcgg attgacgcgg attgacgcgg attgacgcgg attgacgcgg 60
<210> 22 <211> 79 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 22
attgacgcgg attgacgcgg attgacgcgg attgacgcgg attgacgcgg attgacgcgg 60 attgacgcgg attgacgcg 79
<210> 23 <211> 83 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 23
ctcgagaacg gtgacgtgca cgcgtgggcg gagccatcac gcaggttgct atataagcag 60 agctcgttta gtgaaccgtc aga 83
<210> 24 <211> 182 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 24
agtcagggca agtcagtggc aagtcagggc agtcagggca gtcagggcaa gtcagggcaa 60
gtcagggcaa gtcagggcaa gtcagggcaa gtcagggcac tcgagaacgg tgacgtgcac 120
gcgtgggcgg agccatcacg caggttgcta tataagcaga gctcgtttag tgaaccgtca 180
ga 182
<210> 25 <211> 179 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 25
gaattgacgc atatattgac gcatattgac gcaaattgac gcaaatgaca gcaagattga 60
cgcaaattga gcgcaaattg acgcaaatta attgacctcg agaacggtga cgtgcacgcg 120
tgggcggagc catcacgcag gttgctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcaga 179
<210> 26 <211> 181 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 26
ctgatgcaat ctgatgcaat ctgatgcaat ctgatgcaat ctgatgcaat ctgagcaatc 60
tgatgcaatc tgatgcaata tgatgaatgt gatgcaatct cgagaacggt gacgtgcacg 120
cgtgggcgga gccatcacgc aggttgctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag 180
a 181
<210> 27 <211> 178 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 27
gtggtgagcg tctgggcatg tctgggcatg tctgggcatg tctgggcatg tcgggcattc 60
tgggcgtctg ggcatgtctg ggcatgtctg ggcatctcga gaacggtgac gtgcacgcgt 120
gggcggagcc atcacgcagg ttgctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcaga 178
<210> 28 <211> 183 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 28
gctgatgcaa tctgatgcaa tctgatgcaa tctgatgcaa tctgatgcaa tctgagcaat 60
ctgatgcaat ctgatgcaat atgatgaatg tgatgcaatt ctcgagaacg gtgacgtgca 120
cgcgtgggcg gagccatcac gcaggttgct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 180
aga 183
<210> 29 <211> 183 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 29
gctgatgcaa tctgatgcaa tctgatgcaa tctgatgcaa tctgatgcaa tctgagcaat 60
ctgatgcaat ctgatgcaat atgatgaatg tgatgcaatt ctcgagaacg gtgacgtgca 120
cgcgtgggcg gagccatcac gcaggttgct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 180
aga 183
<210> 30 <211> 143 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 30
attgacgcgg attgacgcgg attgacgcgg attgacgcgg attgacgcgg attgacgcgg 60
ctcgagaacg gtgacgtgca cgcgtgggcg gagccatcac gcaggttgct atataagcag 120
agctcgttta gtgaaccgtc aga 143
<210> 31 <211> 12 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
cattcccaga cg
<210> 32 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 32
ggacatgtct 10
<210> 33 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 33
ggacatgtct 10
<210> 34 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 34
ggacatgtct 10
<210> 35 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 35
cgacaagccc 10
<210> 36 <211> 11 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 36
cgggcatcct g 11
<210> 37 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 37 tgggcgtgtg
<210> 38
<211> 12
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 38
cattcccaga cg 12
<210> 39 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 39
ggacatgtct 10
<210> 40 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 40
ggacatgtct 10
<210> 41 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 41
tgcgtcatta 10
<210> 42 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 42
tgcgtcatta 10
<210> 43 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 43
acgtaaattg 10
<210> 44 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 44
aaatgacggc 10
<210> 45
<211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 45
atgaccgcaa 10
<210> 46
<211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 46
acgtaaattg 10
<210> 47 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 47
caattaattg 10
<210> 48 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 48
caattaattg 10 <210> 49
<211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 49
tcaatcaatt
<210> 50 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 50
tcaattaaat 10
<210> 51 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 51
tcaattaaat
<210> 52 <211> 10
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 52
tcaattaaat 10
<210> 53 <211> 10
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 53
tcaattaaat 10
<210> 54 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 54
tcaattaaat
<210> 55
<211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 55
ctcaattaat
<210> 56 <211> 12
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 56
cattcccaga cg 12
<210> 57 <211> 10
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 57
ggacatgtct 10
<210> 58 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 58
ggacatgtct
<210> 59 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 59
ggacatgtct 10
<210> 60 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 60
cgacaagccc
<210> 61 <211> 11 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 61
cgggcatcct g 11
<210> 62 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 62
tgggcgtgtg 10
<210> 63 <211> 12 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 63
cattcccaga cg 12
<210> 64 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 64
ggacatgtct 10
<210> 65 <211> 10 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 65
ggacatgtct 10
<210> 66 <211> 12 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 66
ggtgacgtgt ac
<210> 67 <211> 12 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 67
ggtgacgtgt ac 12
<210> 68 <211> 12 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 68
ggtgacgtgt ac
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенный рекомбинантный парвовирусный вектор,
содержащий синтетический энхансер, содержащий множество
энхансерных последовательностей, функционально связанный с
промотором.
2. Рекомбинантный парвовирусный вектор по п.1, в котором каждая из множества энхансерных последовательностей имеет одну и ту же последовательность.
3. Рекомбинантный парвовирусный вектор по п.1, в котором по меньшей мере две из множества энхансерных последовательностей имеют отличающуюся последовательность.
4. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 13, в котором множество энхансерных последовательностей имеет от 2 до 20, от 2 до 15 или от 2 до 10 энхансерных последовательностей в тандеме.
5. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 14, в котором по меньшей мере одна из энхансерных последовательностей имеет не более чем 15 оснований.
6. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 15, в котором множество энхансерных последовательностей имеет один или более сайтов связывания Р53, один или более сайтов связывания NRF-1 или один или более сайтов связывания CREB или их комбинацию.
7. Рекомбинантный парвовирусный вектор по п.1, в котором синтетический энхансер содержит Fl, F5 или F10.
8. Рекомбинантный парвовирусный вектор по п.1, в котором синтетический энхансер имеет по меньшей мере одну энхансерную последовательность с по меньшей мере 8 0% идентичностью нуклеотидных последовательностей с Fl, F5 или F10.
9. Рекомбинантный парвовирусный вектор по п.1, в котором синтетический энхансер имеет по меньшей мере одну энхансерную последовательность с по меньшей мере 90% идентичностью нуклеотидных последовательностей с Fl, F5 или F10.
10. Рекомбинантный парвовирусный вектор по п.1, в котором
синтетический энхансер имеет по меньшей мере одну энхансерную
последовательность с по меньшей мере 95% идентичностью
нуклеотидных последовательностей с Fl, F5 или F10.
11. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 110, в котором множество энхансеров составляет приблизительно до 12 0 нуклеотидов в длину.
12. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 110, в котором множество энхансеров составляет приблизительно до 150 нуклеотидов в длину.
13. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 110, в котором множество энхансеров составляет приблизительно до 100 нуклеотидов в длину.
14. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 113, в котором промотор представляет собой синтетический промотор.
15. Рекомбинантный парвовирусный вектор по п.14, в котором промотор представляет собой tg83.
16. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 113, в котором промотор представляет собой гетерологичный промотор.
17. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 1-
16, который представляет собой бокавирусный или
аденоассоциированный вирусный вектор.
18. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 117, в котором промотор функционально связан с открытой рамкой считывания.
19. Рекомбинантный парвовирусный вектор по п.18, в котором открытая рамка считывания кодирует профилактический или терапевтический продукт гена.
20. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 1-
19, в котором комбинация множества энхансерных
последовательностей и промотор составляют не более чем 200
нуклеотидов в длину.
21. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 1-
19, в котором комбинация множества энхансерных
последовательностей и промотора составляет не более чем 150
нуклеотидов в длину.
22. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 1-
19, в котором комбинация множества энхансерных
последовательностей и промотора составляет не более чем 250 нуклеотидов в длину.
23. Рекомбинантный парвовирусный вектор по любому из пп. 122, в котором синтетический энхансер и промотор имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 99% или большую идентичность последовательностей нуклеиновых кислот с одной из SEQ ID №№ 2430 .
24. Способ экспрессии трансгена в клетке, включающий: введение композиции, содержащей рекомбинантный парвовирусный вектор, содержащий синтетический энхансер, содержащий множество энхансерных последовательностей, функционально связанный с промотором, функционально связанным с трансгеном, в эукариотическую клетку с тем, чтобы экспрессировать трансген в клетке.
25. Способ экспрессии трансгена у млекопитающего,
включающий введение млекопитающему композиции, содержащей
рекомбинантный парвовирусный вектор, содержащий синтетический
энхансер, содержащий множество энхансерных последовательностей
функционально, связанный с промотором, функционально связанным с
трансгеном, с тем, чтобы экспрессировать трансген в клетках
млекопитающего.
26. Способ по п. 24 или 25, в котором экспрессию трансгена усиливают по меньшей мере в 2, 5, 10 или 15 или более раз относительно соответствующего парвовирусного вектора, который не содержит синтетический энхансер.
27. Способ по любому из пп. 24-2 6, в котором множество энхансерных последовательностей имеет два или более сайтов связывания Р53, два или более сайтов связывания NRF-1 или два или более сайтов связывания CREB.
28. Способ по любому из пп. 2 5- 27, в котором композицию вводят инъекцией.
29. Способ по любому из пп. 2 5-2 7, в котором композицию вводят интраназально.
30. Способ по любому из пп. 24-29, в котором каждая из множества энхансерных последовательностей имеет одну и ту же
26.
последовательность.
31. Способ по любому из пп. 24-30, в котором по меньшей мере две из множества энхансерных последовательностей имеют отличающуюся последовательность.
32. Способ по любому из пп. 24-31, в котором множество энхансерных последовательностей имеет от 2 до 20, от 2 до 15 или от 2 до 10 энхансерных последовательностей в тандеме.
33. Способ по любому из пп. 24-32, в котором по меньшей мере одна из энхансерных последовательностей имеет не более чем 15 оснований.
34. Способ по любому из пп. 24-33, в котором синтетический энхансер содержит Fl, F5 или F10.
35. Способ по любому из пп. 24-33, в котором синтетический энхансер имеет по меньшей мере одну энхансерную последовательность с по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% идентичностью нуклеотидных последовательностей с Fl, F5 или F10 или по меньшей мере 95% идентичностью нуклеотидных последовательностей с Fl, F5 или F10.
36. Способ по любому из пп. 24-35, в котором множество энхансеров составляет приблизительно до 100, приблизительно до 12 0 или приблизительно до 150 нуклеотидов в длину.
37. Способ по любому из пп. 24-36, в котором промотор представляет собой синтетический промотор.
38. Способ по п.37, в котором промотор представляет собой
tg83 .
39. Способ по любому из пп. 24-36, в котором промотор представляет собой гетерологичный промотор.
40. Способ по любому из пп. 24-39, в котором вектор представляет собой бокавирусный или аденоассоциированный вирусный вектор.
41. Способ по любому из пп. 24-40, в котором трансген кодирует профилактический или терапевтический продукт гена.
42. Способ по любому из пп. 2 4-41, в котором комбинация множества энхансерных последовательностей и промотора составляет не более чем 150, не более чем 200 или не более чем 250 нуклеотидов в длину.
39.
43. Способ по любому из пп. 24-42, в котором синтетический энхансер и промотор имеют по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или большую идентичность последовательностей нуклеиновых кислот с одной из SEQ ID №№ 24-30.
44. Выделенный вектор, содержащий синтетический энхансер,
содержащий множество энхансерных последовательностей,
функционально связанный с промотором.
45. Вектор по п.44, в котором каждая из множества энхансерных последовательностей имеет одну и ту же последовательность.
46. Вектор по п.44, в котором по меньшей мере две из множества энхансерных последовательностей имеют отличающуюся последовательность.
47. Вектор по любому из пп. 44-4 6, в котором множество энхансерных последовательностей имеет от 2 до 20, от 2 до 15 или от 2 до 10 энхансерных последовательностей в тандеме.
48. Вектор по любому из пп. 44-47, в котором по меньшей мере одна из энхансерных последовательностей имеет не более чем 15 оснований.
49. Вектор по любому из пп. 44-48, в котором множество энхансерных последовательностей имеет один или более сайтов связывания Р53, один или более сайтов связывания NRF-1 или один или более сайтов связывания CREB или их комбинацию.
50. Вектор по п.44, в котором синтетический энхансер имеет по меньшей мере одну энхансерную последовательность с по меньшей мере 8 0%, 90% или 95% идентичностью нуклеотидных последовательностей с Fl, F5 или F10.
51. Вектор по любому из пп. 44-50, в котором множество энхансеров составляет приблизительно до 100, 120 или 150 нуклеотидов в длину.
52. Вектор по любому из пп. 44-51, в котором промотор представляет собой синтетический промотор.
53. Вектор по п.52, в котором промотор представляет собой
tg83 .
54. Вектор по любому из пп. 44-53, в котором промотор функционально связан с открытой рамкой считывания.
54.
55. Вектор по п.54, в котором открытая рамка считывания кодирует профилактический или терапевтический продукт гена.
56. Вектор по любому из пп. 44-55, в котором комбинация множества энхансерных последовательностей и промотора составляет не более чем 150, 2 00 или 2 50 нуклеотидов в длину.
57. Вектор по любому из пп. 44-56, в котором синтетический энхансер и промотор имеют по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 99% или большую идентичность последовательностей нуклеиновых кислот с одной из SEQ ID №№ 24-30.
58. Вектор по любому из пп. 44-57, который представляет собой плазмиду.
По доверенности
pGL3-tg83
pGL3-xxtg83
Энхансер (100-членный)
ATF-1
IHIii
/CREB SP1 TATA inr
tgsa pro 83-членный
А549 Первичные клетки
дыхательных путей хорька
AV.tg83-fCFTR, 4937 Nt
tg83 (83 п.о.) РА (62 п.о.)
ITR 11 К
AV.tg83 fCFTR(HA); 5036 Nt
3xHAtag (+99 п.о.)
AV.tg83-fCFTR._\R: 4778 Nt
AR (-159 п.о.) AV.iувЗ-fСFTR.\R (HA); 4877 Nt
^ 19 s
~ 18
о 4
~~ 3
AV2/2.tg83-fCFTR AV2/2 .tg83-fCFTR(HA) Амилорид
DIDo
IBMX & Forsk
Время (с)
CO CO
0 4 0
He CF HAE
12 л
9 б 3 О
-з --6
со сл
-12 J
Не инфици- Не инфици-
ВируС AV2/2.tg83-fCFTRAR AV2/2.F5tg83-fCFTRAR рОВЭННЫе реванше
МО! Апикальн. Базальн. Апикальн. Базальн. Апикальн. Базальн. (1 о3 DRP/клетка) so so so so ю ю
N 3 11 4 11 4 4 9 14
CuFi ALI
He CF HAE
ИВ IBMX & Forsk 1=3 GlyH101
1080 -
- 390 -
AV2/2> btg83 -fCFTRAR
После инфекции 3 сутки 10 сутки Вирус
3 сутки 10 сутки
AV2/2.tg83
-fCFTRAR
Не инфицированные
После инфекции 3 сутки 10 сутки 3 сутки 10 сутки
AV2/2.F5tgS3 AV2/2.tg83
Вирус -fCFTRAR -fCFTRAR
ФИГ.7А
Ш F5tg83
? F10tg83
ФИГ.7В
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паперн)
[ШШЖ 02
GTGGTTAGC
1 MOUSE$IAP 01
GTGGT
! MOUSESIAP 03
EBP-80
GTGGT
| EBV$TR4 04
CACCAC
|ЁВУ$Ш 05
CACCAC
| HSSPR264 01
c-Mvb
GGTGAG
|HS$APOA2_06
TCACC
| TDNA$NOS_01
| 1
ASF-1, OBF3.1, TGAla, TGAlb
TGAGC
[ DR0ME$UBX 08
Zeste
TGAGCG
I DROME$E74 07
Zeste
TGAGCG
| DROME$E74 08
Zeste
TGAGCG
! DROMES WHI.0 0 4
Zeste
TGAGCG
! DROME$ZESTE 0
1 2
Zeste
TGAGCG
| DR0ME$UBX 06
Zeste
CGCTCA
| DROME$EVE_04
Фактор GAGA
CGCTC
| DROME$EVE 08
1 ~
Фактор GAGA
CGCTC
| DROME$EVE_10
Фактор GAGA
CGCTC
ГА1$РАХ4 29
Pax-4a
CATTCCCAGACG
! CHTCKSBAG 04
TCTGGGCA
I CHICKSBAG 09
CTF
TCTGGGCA
| SV$SV40_37
CT'GGG
| RAT$TAT_06
NRF-1
CATGCGCAG
! SVSSV40 63
T-Ag
TGGGC
| CH1CK$BAG_03
GGGCA
I RATSNFl 01
LF-A1
GGGCA
1 HSSCATHD 01
ER-Spl
GGGCA
j RAT$VEGF.01
ER-ER-B
GGGCA
I MOUSE$PTOD 01
p53
GGACATGTCT
I CH1CKSBAG 03
TGCCC
| RAT$VEGF_02
ER-ER-B
TGCCC
RAT$SPT23_02
C/EBPa
CCCAGAAAT
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
ASSTGIF 09
TGIF
TGTCT
CHICKSBAG 04
TCTGGGCA
CHICKSBAG 09
CTF
TCTGGGCA
SVSSV40 37
CTGGG
RATSTAT 06
NRF-1
CATGCGCAG
SVSSV40 63
T-Ag
TGGGC
CHICKSBAG 03
GGGCA
RAT$NF1 01
LF-A1
GGGCA
HSSCATHDOl
ER-
Spl
GGGCA
RAT$VEGF_01
ER-ER-B
GGGCA
MOUSESPIDD 01
p53
GGACATGTCT
CHICKSBAG 03
TGCCC
RAT$VEGF.02
ER-
ER-B
TGCCC
RAT$SPI23_02
C/EBPa
CCCAGAAAT
ASSTGIF 09
TGIF
TGTCT
CHICKSBAG 04
TCTGGGCA
CHICK$BAG_09
CTF
TCTGGGCA
SVSSV40 37
CTGGG
RATSTAT 06
NRF-1
CATGCGCAG
SVSSV40 63
T-Ag
TGGGC
CHICK$BAG_03
GGGCA
RAT$NF1_01
LF-A1
GGGCA
HSSCATHD 01
ERa,
Spl
GGGCA
RAT$VF,GF_01
PR-a,
ER-B
GGGCA
MOUSESPIDD 01
p53
GGACATGTCT
CHICKSBAG.03
TGCCC
RAT$VEGF_02
ER-ER-B
TGCCC
RAT$SP123_02
C/EBPa
CCCAGAAAT
ASSTGIF 09
TGIF
TGTCT
CHICKSBAG 04
TCTGGGCA
CHICKSBAG 09
CTF
TCTGGGCA
SVSSV40 37
CTGGG
R.Y. S I -VI 06
NRF-1
CATGCGCAG
SVSSV40 63
T-Ag
TGGGC
ФИГ.8В
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
| CHICKSBAG, 03
GGGCA
RAT$NF1 01
LF-AI
GGGCA
| HS$CATHD_01
ER-Spl
GGGCA
j RAT$VEGF_01
ER-ER-B
GGGCA
| CHICKSBAG 03
TGCCC
! RAT$VEGF_02
ER-
ER-B
TGCCC
| HSSAPAFi 01
p53
CGACAAGCCC
| ASfflQXAl 13
HOXA3
CATGTTGGG
I ASSFTZ 56
Ftz
CCGACA
| HSV1SGD 01
ICP4
CCGAC
| AT$COR15A_01
ANT,
CBFI,
CBF2,
CBF3
CCGAC
| AT$RD29B 01
CBFI
CCGAC
| AT$RD29A_01
j | j
CBFI, DREBl
DREB2 A
CCGAC
| AT$COR78 01
ANT, CBFI, CBF2, CBF3
CCGAC
j AT$CORI5B_01
CBFI, CBF2, CBF3
CCGAC
| HSSCGB 03
С GGGC ATCCTG
! HS$CETP_02
LXR-
LXR-P.
RXR-
СGGGCA
j HSSCYCD1J5
i ....
Spl, Sp2, Sp3, Sp4
GCCCG
I CHICKSBAG 03
GGGCA
RAT$NF1 01
LF-AI
GGGCA
HS$CATHD_01
ER-
GGGCA
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паперн)
Spl
RAT$VEGF_OJ
ER-
ER-B
GGGCA
| CHICKSBAG 03
TGCCC
j RAT$VEGF_02
ER-
ER-B
TGCCC
| ASPNSABAA 03
abaA
CATTCT
| ASPN$ABAA_04
abaA
CATTCT
| ASPNSABAA 05
abaA
CATTCT
| ASPN$BRLA 03
abaA
CATTCT
I ASPN$RODA 05
abaA
CATTCT
| ABAASCONS Oi
abaA
CATTCY
! ASPNSBRLA 05
abaA
CATTCT
I ASPNSYA 02
abaA
AGAATG
| iSHSF OS
HSF
AGAAN
FSIISF 01
HSF
AGAAN
| SVSSV40J7
CTGGG
| RAT$IGFBP2 03
Spl
TGGGCGTGTG
; SVSSV40 63
T-Ag
TGGGC
TGGGCGGCT
1 RATSBMHC 04
NFc
TGACGCCCA
I MOUSESGLUT4 0 ! 3
Spl
GGGCGT
1 HSSU2SN 04
Spl
ACGCCC
| HSSCDUB 01
Spl
CGCCC
| ASSPAX4 29
Pax-4a
CATTCCCAGACG
I CHICKSBAG 04
TCTGGGCA
1 CHICKSBAG 09
CTF
TCTGGGCA
SVSSV40 37
CTGGG
I RATSTAT 06
NRF-1
CATGCGCAG
| SVSSV40 63
T-Ag
TGGGC
! CHICKSBAG 03
GGGCA
! RAT$NF1 01
LF-AI
GGGCA
| HS$CATHD_01
ER-
Spl
GGGCA
! RAT$VEGF_01
ER-
ER-B
GGGCA
1 MOUSESPIDD 01
p53
GGACATGTCT
| CHICKSBAG ('¦¦
TGCCC
\ RAT$VEGF_02
ER-ER-'P
TGCCC
RAT$SP123_02
C/EBPa
CCCAGAAAT
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
| ASSTGIF j)9
TGIF
TGTCT
! CHICKSBAG 04
TCTGGGCA
| CHICKSBAG 09
CTF
TCTGGGCA
j SVSSV40 37
CTGGG
I RATSTAT 06
NRF-1
CATGCGCAG
| SVSSV40 63
T-Ag
TGGGC
| CHICKSBAG 03
GGGCA
| RAT$NF1 01
LF-AI
GGGCA
! HSSCATHD 01 !
ER-
Spl
GGGCA
| RAT$VEGF_01
| l
ER-ER-B
GGGCA
j MOUSESPIDD 01
p53
GGACATGTCT
I CHICKSBAG 03
TGCCC
| RAT$VEGF.02
ER-
ER-B
TGCCC
ГКАТ$5Й23__02 j
C/EBPa
CCCAGAAAT
! ASSTGIF 09
TGIF
TGTCT
| CHICKSBAG 04
TCTGGGCA
1 CHICKSBAG 09
CTF
TCTGGGCA
| SVSSV40 37
CTGGG
! SVSSV40 63
T-Ag
TGGGC
I CHICKSBAG 03
GGGCA
! RATSNFl 01
LF-AI
GGGCA
| HSSCATHD 01
ERa,
Spl
GGGCA
| RAT$VEGF_01
ERa,
ER-B
GGGCA
I CHICKSBAG 03
TGCCC
RAT$VEGF_02
ER-
ER-P
TGCCC
ФИГ.8Е
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
YSMALol 04
MIGI
AATTG
RAT$TH 03
ARIX
AATTGA
PSAMSU7SN 04
ATTGA
HSSEGFR 15
TCAAT
ASSTWRKYJU
WRKY3. VVRKY4
TTGAC
ASSWRKY 01
WRKYI. WRKY2
TTGAC
AS$WRKY_02
WRKYI, WRKY2
TTGAC
ASSWRKY 03
WRKYI, WRKY2
TTGAC
ASSWRKY 04
WRKYI. WRKY2
TTGAC
AT$RLK4 01
WRKYI 8
TTGAC
ATSRLK4 02
WRKYI 8
TTGAC
CAMVS35SR_01
ASF-1, OBF4,
OBF5. SARP.
TGAl,
TGAla,
TGAlb,
TGA2,
TGA2.1,
TGA2.2.
TGA3. TGA6,
ZAPl
TGACG
PIGSUPA 02
CREB
TGACG
PIG$UPA_03
CREB, CREBB
TGACG
HSSINS 04
CREB
TGACG
HSSPL 12
TGACG
HSSCFOS H
AP-L ATF
TGCGTCA
HHS$PK 02
TGCGTCA
HSSPK 03
AP-1, ATF3, c-Fos, с-Jim, CRE-BPl, CREB. CREBp
TGCGTCA
HSSVIP 01
c-Fos, c-Jua
CRE-BPl.
CREB
CGTCA
BOVIN$PPTA_0]
C/EBP6, CRE-BP2
TGCGTCA
RATSPDYN 01
CREB
TGCGTCA
AS$PAX2_67
Рах-2.1,Рах-
AATAAATG
2.2
ФИГ.8Р
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паперн)
RAT$GLU 04
TATAT
HS$HH4_08
HiNF-D, HiNF-M, HiNF-P, TFIID, I'MF
TATAT
MOUSE$SRF 03
SRF (504 AA)
TATAT
RAT$GLU 04
TATAT
HSSHH408
HiNF-D, HiNF-M, HiNF-P, TFIID, TTvlF
TATAT
^ЩизЁ$знт 03
SRF (504 AA) '
TATAT
RATSDBH 01
ARIX, c-Fos, c-Jun, CREB, CREMtau
TGCGTCAT ТА
PSAMSU7SN 04
ATTGA
HSSEGFR 15
TCAAT
AS$TWRKY_01
WRKY3, WRKY4
TTGAC
ASSWRKY, 01
WRKYI, WRKY2
TTGAC
AS$WRKY_02
WRKYI, WRKY2
TTGAC
AS$WRKY_03
WRKYI, WRKY2
TTGAC
ASSWRKY 04
WRKYI, WRKY2
TTGAC
ATSRLK4 01
WRKY18
TTGAC
ATSRLK402 C-YmVoSR iij
WRKY18 ASK-!. OBI i.
OBF5, SARP,
TGAl,
TGAla,
TGAlb,
TGA2,
TGA2.1,
TGA2.2,
TGA3,
TGA6,ZAP1
TTGAC TGACG
PTG$UPA_02
CREB
TGACG
PIG$UPA_03
CREB, CREEP
TGACG
HS$FNS_04
CREB
TGACG
HSSPL 12
TGACG
HSSCFOS 11
AP-1, ATF
TGCGTCA
HSSPK 02
TGCGTCA
HSSPK 03
AP-L ATF3,
TGCGTCA
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
c-Fos, c-Jun, CRE-BPl, CREB, CREEP
HSSVTP_OI
c-Fos, c-Jun,
CRE-BPl.
CREB
CGTCA
BOVIN$PPTA_01
C/EBP5, CRE-BP2
TGCGTCA
RAT$PDYN 01
CREB
TGCGTCA
RAT$DBH_01
ARIX, c-Fos, c-Jun, CREB, CREMtau
TGCGTCAT ТА
PSAMSU7SN 04
ATTGA
HSSEGFR IS
TCAAT
ASrrWRKYJU
WRKY3. WRKY4
TTGAC
AS$WRKY_01
WRKYI, WRKY2
TTGAC
AS$WRKY_02
WRKYI, WRKY2
TTGAC
AS$WRKY_03
WRKYI, WRKY2
TTGAC
AS$WRKY_04
WRKYI, WRKY2
TTGAC
ATSRLK4 01
WRKY18 '
TTGAC
AT$RLK4 02
WRKYI 8
TTGAC
CAMV$35SR_01
ASF-1, OBF4,
OBF5, SARP,
TGAL
TGAla,
TGAlb,
TGA2,
TGA2.1,
TGA2.2,
TGA3, TGA6,
ZAPl
TGACG
PIGSUPA 02
CREB
TGACG
PIG$UPA_03
CREB, CREBP
TGACG
HSSINS 04
CREB
TGACG
HS$PL 12
TGACG
HBV$HBVE_27
CRE-BPl, CREB, pX
TGACGCAA
HSSCFOS 11
AP-L ATF
TGCGTCA
HSSPK_02
TGCGTCA
HSSPK 03
AP-1, ATF3,
TGCGTCA
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
| I
c-Fos, c-Jun,
CRE-BPl,
CREB,
P R FRR
SiiSViP 0!
L-JEvCDp
c-Fos, c-Jun
CRE-BPl,
CREB,
"CGTCA
I BOVTNSPPTA 01 1
C/EBP6, CRE-BP2
TGCGTCA
j RATSPDYN 01
CREB
TGCGTCA
| AS$NCX_33
Ncx
ACGTAAAT TG
[HSSEGFR 14
CAAAT
| MALZE$PMSS__01
CAAAT
| HSS1GH 04
ATTTG
| YSMAL61 04
MIGl
AATTG
ГГ <АТ$Ш 03
ARIX
AATTGA
! PSAM$U7SN_04
ATTGA
| HSSEGFR 15
TCAAT
! AS$TWRKY_01
WRKY3, WRKY4
TTGAC
| AS$WRKY_01
WRKYI, WRKY2
TTGAC
! AS$WRKY_02
WRKYI, WRKY2
TTGAC
| ASSWRKY"03
WRKYI, WRKY2
TTGAC
rAS$WRKY_04
WRKYI, WRKY2
TTGAC
| ATSRLK4 01
WRKY18
TTGAC
| AT$RLK4_02
WRKViS
TTGAC
| CAMV$35SR_01
j | j
ASF-1, OBF4,
OBF5, SARP,
TGAl,
TGAla,
TGAlb,
TGA2,
TGA2.1,
TGA2.2,
TGA3, TGA6,
ZAPl
TGACG
| PIG$UPA_02
CREB
TGACG
PIG$UPA_03
CREB, CREBB
TGACG
I HSSINS 04
CREB
TGACG
HSSPL 1.2
TGACG
| HBV$HBVE 27
CRE-BPl,
TGACGCAA
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
CREB, pX
! HSSCFOS 11
AP-I, ATF
TGCGTCA
1 HSSPK 02
TGCGTCA
1 HS$PK_03
AP-1, ATF3, o-Fos, c-Jua CRE-BPl, CREB, CREBP
TGCGTCA
I HSSVIP oi
1 1
c-Fos, c-Jun,
CRE-BPl,
CREB
CGTCA
1 BQVTN$PPTA_01
C/EBP5, CRE-BP2
TGCGTCA
1 RAT$PDYN_01
CREB
TGCGTCA
| HSSEGFR 14
CAAAT
| MAIZESPMS1 01
CAAAT
|[ЖЩМ 12
Twi
CAAATG
! HSSKffl 04
ATTTG
| XENLASAC 05
EMIT, MyoD
CATTTG
| MOUSESACRG 01
MyoD
CATTTG
| HS$JRF1_02
IPCS-BF
AAATGAC GGC
| HSSGMCSF 03
YY1
CATTT
| MOUSE$IL4_01
NF-CLEOa,
NF-CLEOb
TCATTT
HSSUPA__05
UEF-I
CATGACAG С
| HS$FN_ 05
PEBP2
ATGACCGC AA
| HS$UPA_06
| j i
Pbx-la,Pbx-lb, Pbx-2,
PKNOXL PKNOX2, UEF-3
TGACAG
1 ASSMEISl 01
Meis-la, Meis-lb
TGACAG
1 AS$MEIS1_03
Meis-la, Meis-lb
TGACAG
! AS$MEIS1._04
Meis-la, Meis-lb
TGACAG
! AS$MEIS1_05
Meis-la, Meis-lb
TGACAG
! ASSMEISl_06
ASSMH.SIJI"
Meis-la, Meis-lb Meis-la, Meis-lb
TGACAG
TGACAG
! ASSMEISl 08
Meis-la,
TGACAG
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
Meis-lb
AS$MEIS1_14
Meis-la,
Meis-lb
TGACAG
| AS$METS1_19
Meis-la, Meis-lb
TGACAG
| ASSMEISlАНОХА
! 9 01
HOXA9, Meis-la
TGACAG
| ASSMEISlAHOXA
! 9 02
HOXA9, Meis-la
TGACAG
| ASSMEIS1AHOXA ! 9 03
HOXA9, Meis-la
TGACAG
| ASSMEISl AHOXA ! 9 04
HOXA9, Meis-la
TGACAG
ASSMEISl AHOXA
I 9 05
HOXA9, Meis-la
TGACAG
! ASSMEISl AHOXA ! 9 06
HOXA9, Meis-la
TGACAG
! ASSMEIS1AHOXA ! 9 09
HOXA9, Meis-la
TGACAG
! ASSMEISl AHOXA j 9 10
HOXA9, Meis-la
TGACAG
I ASSMEISl AHOXA 9_13
HOXA9, Meis-la
TGACAG
ASSMEISIBHOXA
! 9 01
HOXA9, Meis-lb
TGACAG
| ASSMEISIBHOXA 9 02
HOXA9, Meis-lb
TGACAG
! ASSMEISIBHOXA 9 03
HOXA9, Meis-lb
TGACAG
! ASSMEISIBHOXA
1 9 04
HOXA9, Meis-lb
TGACAG
| ASSMEISIBHOXA
9 05
HOXA9, Meis-lb
TGACAG
! ASSMEISIBHOXA | 9 06
HOXA9, Meis-lb
TGACAG
j АБЖШЁзЖнОХА
1 9 07
HOXA9, Meis-lb
TGACAG
POTSPRlOa 01
PBF-1, PBF-2 (P24)
TGACA
! ASSTGIF 01
TGIF
TGTCA
! ASSTGIF 02
TGIF
TGTCA
| ASSTGIF_03" 1
[ TGIF
TGTCA
| ASSTGIF 04
TGIF
TGTCA
Г ASSTGIF 05
TGIF
TGTCA
j ASSTGIF 06
TGIF
TGTCA
I ASSTGIF 07
TGIF
TGTCA
AS$TGIF_08
TGIF
TGTCA
ФИГ
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
ASSTGIF 10
TGIF
TGTCA
ASSTGIF 11
TGIF
TGTCA
ASSTGIF 12
TGIF
TGTCA
ASSTGIF 13
TGIF
TGTCA
ASSTGIF 14
TGIF
TGTCA
ASSTGIF 15
TGIF
TGTCA
HSSD1A01
Meis-2a,
Meis-2b, Meis-2c, Meis-2d, TGIF
CTGTCA
ASSMEISl 11
Meis-la, Meis-lb
CTGTCA
ASSMEISl J 2
Meis-la,
Meis-lb
CTGTCA
POT$PR10a_01
PBF-l.PBF-2 (p24)
TGTCA
HSSGGJ2
NF-E
CTGTC
DROMESEVE 10
Фактор GAGA
CTGTC
MOUSESM2EAK 0
NF-Y
CAGCA
MOUSESTHYl 06
CAGCAA
RAV0SRAV0 01
C/EBPa
GCAAG
AMVSAMV 02
C/EBPa
CTTGC
XENLASACY 01
SRF
AAGAT
XENLA$ACY_01
SRF
ATCTT
HSSGG 26
GATA-I
AGATTG
MOUSESBMG 04
GATA-1
AATCT
PSAMSU7SN 04
ATTGA
HSSEGFR 15
TCAAT
AS$TWRKY_01
WRKY3, WRKY4
TTGAC
ASSWRKY J) I
WRKYI, WRKY2
TTGAC
AS$WRKY_02
WRKYI, WRKY2
TTGAC
AS$WRKY_03
WRKYI. WRKY2
TTGAC
AS$WRKY_04
WRKYI, WRKY2
TTGAC
ATSRLK4 01 AT$RLK4 02
WRKY18 WRKY18
TTGAC TTGAC
CAMVS3SSR 01
ASF-1, OBF4, OBF5, SARP, TGAl,
TGAla.TGAl b, TGA2,
TGACG
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
| I
TGA2.1TGA
2.2, TGA3, TGA6, ZAPl
| PIGSUPA 02
CREB
TGACG
| PIG$UPA_03
CREB, CREBbeta
TGACG
| HSSINS 04
' CREB
TGACG
[HSSPL !2
CRE-BPL CREB, pX
TGACG
TGACGCAA"
I HSSCFOS 11
AP-1, ATF
TGCGTCA
I HS$PK 02
TGCGTCA
| HS$PK_03
AP-1, ATF3, e-Fos, c-Jun, CRE-BPl,
CREB, CREBP
TGCGTCA
I HS$VIP_0I
I j
c-Fos, c-Jun,
CRE-BPl,
CREB
CGTCA
I BOVTN$PPTA_01
C/EBP5, CRE-BP2
TGCGTCA
| RATSPDYN 01
CREB
TGCGTCA
AS$NCX_33
Ncx
ACGTAAAT TG
| HSSEGFR_14
CAAAT
| MAIZE$PMS1 01
CAAAT
| HSSIGH 04
ATTTG
| Y$MAL61_04
MIGl
AATTG
| RATSTH 03
ARIX
AATTGA
| PS^$U7SN_04
ATTGA
| HSSEGFR 15
TCAAT
TDNA$NOS_01
| j
ASF-1, OBF3.1,
TGAla, TGAlb
TGAGC
! DROME$UBX_08
Zeste
TGAGCG
I DROMESE74 07
Zeste
TGAGCG
1 DROMESE74 08
Zeste
TGAGCG
| DROMESWHLO 0 ! 4
Zeste
TGAGCG
! DROMESZESTE 0 2
Zeste
TGAGCG
I DROME$UBX 06
Zeste
CGCTCA
| DROME$EVE 04
Фактор GAGA
CGCTC
! ШСМВД\/Ё_08
Фактор GAGA
CGCTC
| DROME$EVE_10
Фактор GAGA
CGCTC
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
I M0USE$MT1 06
MTF-1
TGCGCTC
| HSSEGFR 14
CAAAT
| MALZESPMSl 01
CAAAT
I HSSIGH 04
ATTTG
| YSMAL61 04
MIGl
AATTG
| RAT$TH_03
ARIX
AATTGA
| PSAM$U7SN_04
ATTGA
| HS$EGFR_15
TCAAT
| ASSTWRKY 01 |
WRKY3, WRKY4
TTGAC
j AS$WRKY_01
WRKYI, WRKY2
TTGAC
| ASSWRKY, 02
WRKYI, WRKY2
TTGAC
| AS$WRKY_03
WRKYI, WRKV2
TTGAC
| ASSWRKYJ)4
WRKYI, WRKY2
TTGAC
ГАТЩК4_О1"
WRKY18
h TTGAC
| AT$RLK4_02
WRKYI 8
TTGAC
j CAMV$35SR_01
ASF-1, OBF4,
OBF5, SARP,
TGAl,
TGAla,
TGAlb,
TGA2,
TGA2.1,
TGA2.2,
TGA3, TGA6,
ZAPl
TGACG
pPIGSUPA 02
CREB
TGACG
| PTG$UPA_03
CREB. CREBP
TGACG
| HSSINS 04
' CREB
TGACG
HSSPL 12
TGACG
| HBV$HBVE_27
CRE-BPl, CREB, Px
TGACGCAA
| HSSCFOS 11
AP-1, ATF
TGCGTCA
I HSSPK 02
TGCGTCA
j HSSPK 03
| j
AP-1, ATF3, c-Fos, c-Jun, CRE-BPl,
CREB,
PDFRR
TGCGTCA
i"HSSWJ)l
Ulvcup
c-Fos, c-Jun,
CRE-BPl,
CREB
CGTCA
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
BOV1N$PPTA_01
j_"" ."".".. ""."""."" "".""
С/ЕВРб, CRE-BP2
TGCGTCA
| RAT$PDYN_01
CREB
TGCGTCA
| HSSEGFR 14
CAAAT
! MAIZESPMSl 01
CAAAT
I HSSIGH 04
ATTTG
| ASSАТЫВ1 26
АТНВ-1
CAATTAAT TG
| ASSNKX61 02
Nkx6-1
TTAATTT
j AS$ATHB1_26
АТНВ-1
CAATTAAT TG
I Y$SUC2 02
MIGl
AATTA
RA':SL)BU ¦:•]
ARIX, c-Fos, c-Jun, CREB, CREMtau
AATTA
| DROME$EN_01.
En, Eve, Ftz, Prd, Zen-1, Zen-2
TCAATCAA TT
| DROME$EN_01
En, Eve, Ftz, Prd, Zen-1, Zen-2
TCAATTAA AT
DROME$EN_04
jA^TZ'i?
En, POU2F2
(Oct-2.1)
Ftz, Prd, Zen-1, Zen-2
TCAATTAA AT
TCAATTAA" AT
AS$EN_01
TCAATTAA AT
ENSCONS
| |
Abd-A, Abd-B, BarHl, Cfla, Cut, Ems. Ea Lab, PDM-1, Zfh-1, Zfh-2
TCAATTAA AT
! Y$MEL1_02
Mici
ATTAA
| CHICKSMGF 01
Gbx2
ATT.AA
I T5R13ME$ENJ)5
TCAATTAA A
DR OME$ ADH_2 9
CTCAATTA AT
! CHICKSMGF 02
Gbx2
TTAAT
! UBXSCONS 02
Ubx
TTAATKG
I MOUSESHOXC8 0 ! 4
TTAATTG
! CHICKSMGF 02
Gbx2
Ntxo-l
TTAAT Г1 AAi'i G
| ASSNKX61 02
Nkx6-1
TTAATTG
! ASSNKX61 03
Nkx6-1
TTAATTG
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паперн)
I AS$NKX61 05
1PF1, Nkx6-1
TTAATTG
| AS$NKX6l 06
Nkx6-1
TTAATTG
| ASSNKX61 08
Nkx6-1
TTAATTG
I ASSNKX61 09
Nkx6-1
TTAATTG
| ASSNKX61 10
Nkx6-1
TTAATTG
| Y$MEL1_02
MIGl
ATTAA
| BOVIN$RHO_02
Crx
CAATTAA
l ат1гжмет_01
'Gbx2
ATTAA
| Y$SUC2 02
MIGl
AATTA
! RAT$DBH_01
ARIX, e-Fos. c-Jun, CREB, CREMtau
AATTA
| Y5MAL61 04
MIGl
AATTG
I Жт$тн_оз 1
* ARIX
AATTGA
| PSAMSU7SN 04
ATTGA
Гнжсж is
TCAAT
I AS$TWRKY_01
WRKY3, WRKY4
TTGAC
! ASSWRKY 01 j
WRKYI, WRKY2
TTGAC
! AS$WRKY_02
WRKYI, WRKY2
TTGAC
| AS$WRKY_03
WRKYI, WRKY2
TTGAC
| AS$WRKY_04
WRKYI, WRKY2
TTGAC
| AT$RLK4 01
WRKY18
TTGAC
| ATSRLK4 02
WRKY18
TTGAC
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
HSSA11COL 02
GTGGTTAGC
MOUSESIAP 01
GTGGT
MOUSE$IAP 03
EBP-80
GTGGT
EBVSIR4 04
CACCAC
HH\ SIR i 05
CACCAC
HSSPR264 01
c-Myb
GG1 GAG
HS$APOA2_06
TCACC
TDNASNOS 0!
ASF-1, OBF3.1, TGAla, TGAlb
TGAGC
DROME$UBX_08
Zeste
TGAGCG
DROMES! ""- 07"""
Zeste
IGAGtG
DROMESE74 08
Zeste
TGAGCG
DROMESWHLO
Zeste
TGAGCG
DROMESZESTE
Zeste
TGAGCG
DROMESUBX 06
Zeste
CGCTCA
DROME$EVE_04
Фактор GAGA
CGCTC
DROME$EVE_08
Фактор GAGA
CGCTC
DROME$EVE_10
Фактор GAGA
CGCTC
AS$PAX4_29
Pax-4a
CATTCCCAGA
CH1CK$BAG_04
TCTGGGCA
CHICKSBAG 09
CTF
TCTGGGCA
SVSSV40 37
CTGGG
RATSTAT 06
NRF-1
CATGCGCAG
SVSSV40 63
T-Ag
TGGGC
CHICK$BAG_03
GGGCA
RATSNF'i 01
LF-AI
GGGCA
HSSCATHD01
ER-a,
Spl
GGGCA
RATSVEGF.01
ER-a, ER-P
GGGCA
MOUSESPIDD 01
p53
GGACATGTCT
CHICKSBAG 03
TGCCC
RAT$VEGF_02
ER-a, ER-P
TGCCC
RAT$SPI23_02
C/EBPa
CCCAGAAAT
ASSTGIF 09
TGIF
TGTCT
ФИГ.
v
Идентификатор
Последовательность (поисковый паттерн)
CHICK$BAG_04 !
TCTGGGCA
CHICKSBAG 09 ! CTF
TCTGGGCA
SVSSV40 37 |
CTGGG
RATSTAT 06 | NRF-1
CATGCGCAG
SVSSV40 63 j T-Ag
TGGGC
CHICK$BAG_03 j
GGGCA
RATSNF1 01 ! LF-AI
GGGCA
ITSSCATHD 01 ! ER-a, Spl
GGGCA
RATSVEGF 01 j ER-a, I ER-P
GGGCA
MOUSESPIDD 01 j p53
GGACATGTCT
CHICKSBAG 03 1
TGCCC
RATSVEGF 02 lll-a, ! ER-p
TGCCC
RATSSPI23..02 | C/EBPa
CCCAGAAAT
ASSTGIF 09 | TGIF
TGTCT
CHICKSBAG 04 j
TCTGGGCA
CH1CK$BAG_09 j CTF
TCTGGGCA
SV$SV40_37 !
CTGGG
RATSTAT 06 j NRF-i
CATGCGCAG
SV$SV40_63 | T-Ag
TGGGC
CHICKSBAG 03 !
GGGCA
RATSNF1_01 | LF-AI
GGGCA
HSSCATHD 01 ! ER-a,
i Sp*
GGGCA
RATSVEGF 01 i ER-a, ER-p
GGGCA
MOUSESPIDD 01 | p53
GGACATGTCT
CH1CK$BAG_03 j
TGCCC
RATSVEGF 02 ! ER-a, ! ER-P"
TGCCC
RAT$SPI23_02 ! C/EBPa
CCCAGAAAT
ASSTGIF 09 I TGIF
TGTCT
CHICKSBAG 04 !
TCTGGGCA
CHICKSBAG 09 i CTF
TCTGGGCA
SVSSV40 37 |
CTGGG
RATSTAT J)6 j NRF-1
CATGCGCAG
SVSSV40 63 | T-Ag
TGGGC
CHICKSBAG 03 j
GGGCA
RATSNFl 01 ! LF-AI
GGGCA
HSSCATHD 01 ! ER-a,
GGGCA
RATSVEGF 01 I ER-a, 1 ER-P
GGGCA
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
CHICKSBAG 03
TGCCC
RATSVEGF_02
ER-a,
ER-P
TGCCC
HSSAPAF1 01
p53
CGACAAGCCC
ASSHQXA3 13
HOXA3
CATGTTGGG
ASM 17. 56
Ftz
CCGACA
HSV1SGD 01
ICP4
CCGAC
AT$COR15A_01
ANT, CBFI, CBF2, CBF3
CCGAC
AT$RD29B 01
CBFI
CCGAC
AT$RD29A_01
CBFI, DREBl A,
DREB2A
CCGAC
AT$COR78_01
ANT, CBFI, CBF2, CBF3
CCGAC
ATSCOR15B_01
CBFI,
CBF2, CBF3
CCGAC
HS$CGB_03
CGGGCATCCT G
HS$CETP_02
LXR-a,
LXR-P, RXR-a,
CGGGCA
HS$CYCD1_15
Spl, Sp2, Sp3, Sp4
GCCCG
CHICKSBAG 03
GGGCA
RATSNF1 01
LF-AI
GGGCA
HS$CATHD__01
ER-a, Spl
GGGCA
RATSVEGF 01
ER-a, ER-p
GGGCA
CHICKSBAG 03
TGCCC
RATSVEGF_02
ER-a, ER-p
TGCCC
ASPNSABAA 03
abaA
CATTCT
ASPNSABAA 04
abaA
CATTCT
ASPNSABAA 05
abaA
CATTCT
ASPNSBRLA 03 TSPMRODA"O5"~
abaA abaA
CATTCT
"CATYCT
ABAASCONS 01
abaA
CATTCY
ASPNSBRLA 05
abaA
CATTCT
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
ASPN$YA 02
abaA
AGAATG
I$HSF 01
HSF
AGAAN
FSHSF 01
HSF
AGAAN
SVSSV40 37
CTGGG
RATSIGFBP2 03
Spl
TGGGCGTGTG
SVSSV40 63
T-Ag
TGGGC
Y$H0P1 01
TGGGCGGCT
RAT$BMHC 04
NFe
TGACGCCCA
MOUSE$GLUT4
Spl
GGGCGT
HSSU2SN 04
Spl
ACGCCC
HS$CDI1B 01
Spl
CGCCC
AS$PAX4_29
Pax-4a
CATTCCCAGA CG
CHICKSBAG 04
TCTGGGCA
CHICKSBAG 09
CTF
TCTGGGCA
SVSSV40 37
CTGGG
RATSTAT 06
NRF-1
CATGCGCAG
SVSSV40 63
T-A.g
TGGGC
CHICKSBAG 03
GGGCA
RATSNF101
LF-AI
GGGCA
HS$CATHD_01
ER-a, Spl
GGGCA
RATSVEGF01
ER-a, ER-p
GGGCA
MOUSESPIDD 01
p53
GGACATGTCT
CHICKSBAG 03 "КШУЕСТ02
"ER-a
ER-P
TGCCC
TGCCC
RAT$SPI23_02
C/EBPa
CCCAGAAAT
ASSTGIF 09
TGIF
TGTCT
CHICKSBAG 04
TCTGGGCA
CHICKSBAG 09
CTF
TCTGGGCA
SVSSV40 37
CTGGG
RATSTAT 06
NRF-1
CATGCGCAG
SV$SV40_63
T-Ag
TGGGC
CHICKSBAG 03 'RATSWI'OT
LF-AT
GGGCA 'GGGCA
HSSCATHD, 01
ER-alpha,
Spl
GGGCA
RAT$VEGF_01
ER-a,
ER-P
GGGCA
MOUSESPIDD 01
p53
GGACATGTCT
CHICKSBAG 03
TGCCC
RAT$VEGF_02
ER-a, ER-P
TGCCC
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
RAT$SPI23_02
C/EBPa
CCCAGAAAT
ASSTGIF 09
TGIF
TGTCT
CHICKSBAG 04
TCTGGGCA
CHICKSBAG 09
CTF
TCTGGGCA
SVSSV40 37
CTGGG
SVSSV40 63
T-Ag
TGGGC
CHICKSBAG 03
GGGCA
RATSNFi 01
LF-AI
GGGCA
HSSCATHD _01
ER-a, Spl
GGGCA
RAT$VEGF_01
ER-a, ER-p
GGGCA
CHICKSBAG 03
TGCCC
RAT$VEGF_02
ER-a, ER-p
TGCCC
ASSSTAT5A 44
STAT5A
TTCTCGACA
ISHSF 01
HSF
AGAAN
FSHSF 01
HSF
AGAAN
HS$TERT_01
с-Мус
CACCGT
WHEAT$H4_01
ssDBP-1, ssDBP-2
CCACGTCACC G
CREB$CONS_02
CREB, CREEP,
5CRE
GNTGACGY
AS$BZIP9Ii_27
bZIP91i
GGTGACGTGT AC
AS$BZIP9U_28
bZIP9Il
GGTGACGTGT AC
AS$BZ1P9U_30
bZIP91!
GGTGACGTGT AC
HSSAPOA2 06
TCACC
ADSMLS' SO
USF
CACGTGACC
ADSE4 02
E4F1
GTGACGT
ADSE4_03
CRE-BPL E4F1
GTGACGT
ADSE4 05
E4F1
GTGACGT
AD5$E1A_14
ATF
GTGACGT
AD5$E1A_16
"AD5$ETA"21
ATF "AT?
GTGACGT "GTGACGT
HSSM1B7 03
GTGACG
HS$P53_03
Рах-2, Рах-5, Рах-8
GTGAC
HSSMMP1 06
GTCAC
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
CAMV$35SR_01
ASF-1,
OBF4,
OBF5,
SARP,
TGAl,
TGAla,
TGAlb,
TGA2,
TGA2.1,
TGA2.2,
TGA3,
TGA6,
ZAPl.
17R7GR-~"
a, GRP
TGACG 1GACGi
HG$UPA_02
CREB
TGACG
PIG$UPA_03 USSYIP 04
CREB, CREBP ATF
TGACG
"TGTCGT
CAMV$35SR_03
HBP-1,
HBP-la,
HBP-
la(l),
HBP-
la(cl4),
HBP-lb,
HBP-
lb(cl)
TGACGT
HSSINS 04
CREB
TGACG
RAT$TH2A_01
TGACGT
ATSDBP 01
GBFl,
HBP-la,
HBP-lb,
OBF3.1,
OBF3.2,
OBF4,
OBF5,
TGAl,
TGA3,
TGA6
TGACGT
PEA$LEGA_01
HBP-la, HBP-lb
TGACGT
HS$PL_12
TGACG
HT1$HTLVT_20
TAF-I, i Al -11.
Tax
TGACGT
ФИГ.
Идентификатор
Связывающий фактор
Последовательность (поисковый паттерн)
BZIP910$CONS О 1
bZ!P9I0
TGACGTG
BZrP910$CONS_0
bZIP910
TGACGT
AD$E4_16
ATF, atfl, ATF3, e-Juo, CRE-BPl, CREB,
5CRE B, EivF, TREB-1
ACGTCA
RAT$TH_02
ATF
ACGTCA
HS$VTP_01
c-Fos, c-Jun, CRE-BPl, CREB
CGTCA
TDNASNOS02
HBP-1,
HBP-la,
HBP-lb
ACGTCA
RAT$TH2B 04
ACGTCA
RICE$NR1_01
HBP-la,
HBP-lb
ACGTCA
YSLPDl 02
ATF
ACGTCA
HSSENOl 01
HIF-1
GACGTG
ATSGST6 02
OBF4
GACGTG
RICESEMJ)!
OSBZ8,
TRABI
ACGTG
RICESEM 02
OSBZ8
ACGTG
HS$ET1 03
HIF-1
GCACGT
AS$mEMBP 15
EmBP-la
CACGT
MOUSE$MTl 01
Spl
TGCAC
MOUSESMTl 01
Spl
TGCAC
RATSCYTOP 04
AhR, Arrit
CACGC
DAUCE$DC3_04
DPBF-1, DPBF-2
CACGCG
ASSAHRARNT 5
AhR, Arnt
GCGTG
AS$DSC1 01
DSC1
ACGCGT
Y$CDC9 02
DSC1
ACGCGT
YSPOLl 01
MCBF
ACGCGT
ФИГ.
ФИГ.9В
ФИГ. 10В
о Имитация ш AV,F5Tg83-hCFTR
мРНК трансгена hCFTR Эндогенная мРНК fCFTR
ФИГ. юс
ФИГ.КШ
(19)
<210> 5
<210> 5
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 31
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 31
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
ФИГ. 1
ФИГ. 1
ФИГ.З
ФИГ.З
ФИГ.З
ФИГ.З
ФИГ.З
ФИГ.З
ФИГ.З
ФИГ.З
4/35
4/35
ФИГ. 5
ФИГ. 5
ФИГ. 5
ФИГ. 5
ФИГ. 5
ФИГ. 5
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
9/35
9/35
