EA201891989A1 20190430 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2019\PDF/201891989 Полный текст описания [**] EA201891989 20170303 Регистрационный номер и дата заявки US62/304,045 20160304 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2017/020719 Номер международной заявки (PCT) WO2017/152088 20170908 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21904 Номер бюллетеня [**] АНТИТЕЛА К TIGIT Название документа [8] A61K 39/00, [8] A61K 39/395, [8] A61P 37/02, [8] C07K 16/28 Индексы МПК [US] Тсо Дж. Юнь, [US] Цурусита Наоя, [US] Дурамад Омар Сведения об авторах [US] ДжН БАЙОСАЙЕНСИЗ, ЛЛК, [US] АБМУНО ТЕРАПЬЮТИКС ЛЛК Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201891989a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Изобретение обеспечивает моноклональные антитела, которые специфически связываются с TIGIT. Моноклональные антитела обладают способностью к усиленной активации T-клеток и природных киллерных клеток путем ингибирования связывания TIGIT с CD155. Моноклональные антитела можно использовать для лечения злокачественного новообразования и инфекционного заболевания среди прочих применений.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Изобретение обеспечивает моноклональные антитела, которые специфически связываются с TIGIT. Моноклональные антитела обладают способностью к усиленной активации T-клеток и природных киллерных клеток путем ингибирования связывания TIGIT с CD155. Моноклональные антитела можно использовать для лечения злокачественного новообразования и инфекционного заболевания среди прочих применений.


Евразийское (21) 201891989 d3) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.03.03
(51) Int. Cl.
A61K 39/00 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) A61P 37/02 (2006.01) C07K16/28 (2006.01)
(54) АНТИТЕЛА К TIGIT
(31) 62/304,045; 62/413,025
(32) 2016.03.04; 2016.10.26
(33) US
(86) PCT/US2017/020719
(87) WO 2017/152088 2017.09.08
(71) Заявитель:
ДжН БАЙОСАЙЕНСИЗ, ЛЛК; АБМУНО ТЕРАПЬЮТИКС ЛЛК (US)
(72) Изобретатель:
Тсо Дж. Юнь, Цурусита Наоя, Дурамад Омар (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Изобретение обеспечивает моноклональные антитела, которые специфически связываются с TIGIT. Моноклональные антитела обладают способностью к усиленной активации T-клеток и природных киллерных клеток путем ингибирования связывания TIGIT с CD155. Моноклональные антитела можно использовать для лечения злокачественного новообразования и инфекционного заболевания среди прочих применений.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-551992ЕА/032
АНТИТЕЛА К TIGIT
Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет временной патентной заявки США № 62/304045, поданной 4 марта 2016 года, и временной патентной заявки США № 62/413025, поданной 26 октября 2016 года, описание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей их полноте.
Область техники, к которой относится изобретение [0002] В настоящей заявке представлены, inter alia, моноклональные антитела, которые специфически связываются с молекулами иммунных контрольных точек, таким образом, приводя к существенной активации иммунных клеток, а также применение таких антител для лечения злокачественного новообразования и инфекционного заболевания, среди прочего.
Уровень техники
[0003] Антиген-специфический иммунный ответ представляет
собой сложный биологический процесс, который контролируется
несколькими уровнями положительных и отрицательных регуляторов.
Т-клетки изначально стимулируются через Т-клеточный рецептор
(TCR) путем распознавания их когнатного пептидного антигена,
презентированного молекулами главного комплекса
гистосовместимости (МНС) на антиген-презентирующих клетках. Для оптимальной Т-клеточной активации требуется "второй сигнал", обеспечиваемый костимуляторными молекулами, такими как CD28. Иммунный ответ затем положительно регулируется костимуляторными молекулами, такими как ОХ40, GITR и 4-1ВВ, которые относятся к суперсемейству рецепторов TNF, и отрицательно регулируется молекулами контрольных точек, такими как PD-1 и CTLA-4. Функция молекул контрольных точек заключается в предотвращении нежелательной чрезмерной реакции иммунной системы в организме; однако, они также ограничивают способность иммунной системы эффективно бороться со злокачественными новообразованиями и инфекционным заболеванием. Сообщалось о том, что блокирование
функции PD-1 или CTLA-4 антагонистическим моноклональным IgG антителом эффективно для иммунотерапии злокачественных новоообразований у людей (см. обзор Pardoll, Nat. Rev. Cancer, 12:252-264, 2012; Mahoney et al., Nat. Rev. Drug Discov. 14:561584, 2015; Shin et al. , Curr. Opin. Immunol. 33:23-35, 2015; Marquez-Rodas et al. Алл. Transl. Med. 3:261, 2015).
[0004] Сообщалось о других молекулах контрольных точек, таких как TIM-3, LAG-3, TIGIT, BTLA и VISTA (Mercier et al. , Front. Immunol. 6:418, 2015). TIGIT (Т-клеточный иммунорецептор с Ig и I TIM доменами), член суперсемейства иммуноглобулинов с иммунорецепторным ингибиторным мотивом на основе тирозина (ITIM) в цитоплазматическом концевом сегменте, экспрессируется на подгруппах активированных Т-клеток и природных киллерных (NK) клеток (Yu et al. , Nat. Immunol. 10:48-57, 2009) . Известно, что TIGIT взаимодействует с CD155 (также называемым PVR и necl-5), CD112 (также называемым PVRL2 и нектин-2) и возможно CD113 (также называемым PVRL3 и нектин-3) (Mercier et al., supra; Martinet et al. , Nat. Rev. Immunol. 15:243-254, 2015). Сообщалсь, что связывание TIGIT с высокоаффинными лигандами CD155, которые экспрессируются на антиген-презентирующих клетках, подавляет функцию Т-клеток и NK клеток (Mercier et al. , supra; Joller et al. r J. Immunol. 186: 1338-1342, 2011; Stanietsky et al. , Eur. J. Immunol. 43:2138-2150, 2013; Li et al., J. Biol. Chem. 289:17647-17657, 2014; Zhang et al. Cancer Immunol. Immunother. Epub on Feb. 3, 2016). Также сообщалось, что TIGIT ингибирует Т-клетки опосредованно путем модуляции продукции цитокинов дендритными клетками (Yu et al., supra) .
[0005] Опухоли создают высокосупрессивное микроокружение, где инфильтрирующие Т-клетки истощаются и NK клетки подавляются молекулами контрольных точек, такими как PD-1 и TIGIT, для уклонения от иммунных ответов (Johnston et al., Cancer Cell. 26:926-937, 2014; Chauvin et al., J. Clin. Invest. 125:20462058, 2015; Inozume et al., J. Invest. Dermatol. Epub on Oct 12, 2015) . Как сообщалось, высокий уровень экспрессии TIGIT на CD8 + Т-клетках коррелирует с плохим клиническим результатом у пациентов с AML (Kong et al., Clin. Cancer Res. Epub on Jan. 13,
2016) . Функциональные дефекты истощенных TIGIT+ CD8+ Т-клеток у пациентов с AML, как сообщалось, обратимы при миРНК-опосредованном нокдауне экспрессии TIGIT (Kong et al., supra) . Также сообщалось, что эффекторные CD8+ Т-клетки при инфекции ВИЧ в крови и инфекции ВСГ (вирус свиного гриппа) в лимфоидной ткани демонстрируют более высокие уровни TIGIT (Chew et al. r PLOS Pathogens, 12:el005349, 2016). Кроме того, сообщалось, что ex vivo блокирование TIGIT антителом восстанавливает вирус-специфические CD8+ Т-клеточные эффекторные ответы. Раскрытие сущности изобретения
[0006] Изобретение относится к, inter alia, антителу, которое конкурирует с любым из TIG1, TIG2 или TIG3 за связывание с TIGIT человека. Антитело TIG1 характеризуется зрелой вариабельной областью легкой цепи SEQ ID N0:14 и зрелой вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID N0:10, антитело TIG2 характеризуется зрелой вариабельной областью легкой цепи SEQ ID N0:22 и зрелой вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID N0:18, и антитело TIG3 характеризуется зрелой вариабельной областью легкой цепи SEQ ID N0:30 и зрелой вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID N0:2 6, для специфического связывания с TIGIT. Некоторые антитела связываются с тем же самым эпитопом на TIGIT человека, что и TIG1, TIG2 или TIG3. Некоторые антитела ингибируют связывание TIGIT человека с CD155. Некоторые антитела включают три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, по существу из соответствующих трех CDR легкой цепи и трех CDR тяжелой цепи из TIG1. Некоторые антитела включают три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи TIG1, TIG2 или TIG3. Некоторые антитела включают три CDR тяжелой цепи, определенные по номенклатуре Кэбота, и три CDR легкой цепи, определенные по номенклатуре Кэбота, любого из TIG1 (SEQ ID N0:15-17 легкой цепи и 11-13 тяжелой цепи), TIG2 (SEQ ID N0:23-25 легкой цепи, 19-21 тяжелой цепи) или TIG3 (SEQ ID N0:31-33 легкой цепи и 27-29 тяжелой цепи) .
[0007] Некоторые моноклональные антитела связываются с эпитопом TIGIT человека, содержащим остатки 35 и 37 SEQ N0:1 и/или остатки 49 и 51 SEQ ID N0:1. Некоторые моноклональные
антитела связываются с эпитопом TIGIT человека, содержащим остатки 35, 37, 49 и 51 SEQ ID N0:1. Некоторые моноклональные антитела связываются с пептидом, состоящим из остатков 35-51 SEQ ID N0:1 и не более чем пяти фланкирующих аминокислот из SEQ ID N0:1 с обеих сторон. Некоторые моноклональные антитела связываются с пептидом, состоящим из остатков 35-51 SEQ ID N0:1. Некоторые такие моноклональные антитела связываются с эпитопом, состоящим из 3-20 смежных остатков SEQ ID N0:1.
[0008] Некоторые антитела являются химерными,
гуманизированными, венированными или человеческими. Некоторые антитела имеют IgGl каппа изотип человека. Некоторые антитела имеют IgG4 каппа изотип человека. Антитело может представлять собой интактное антитело или одноцепочечное антитело, Fab или
F(ab')2 фрагмент.
[0009] Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей любое из указанных выше антител и фармацевтически приемлемый носитель.
[0010] Изобретение также относится к способам лечения или
осуществления профилактики злокачественного новообразования у
пациента, включающим введение пациенту, страдающему
злокачественным новообразованием или имеющим повышенный риск развития злокачественного новообразования, любого из указанных выше антител в эффективном режиме. В некоторых способах пациент страдает острым миелоидным лейкозом или Т-клеточным лейкозом взрослых.
[ООН] В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению антител, описанных в настоящей заявке, в комбинации с ингибиторами иммунных контрольных точек. Было показано, что блокада иммунных контрольных точек, которая приводит к амплификации антиген-специфических Т-клеточных ответов, является перспективным подходом в лечении злокачественного новообразования у человека. Примеры иммунных контрольных точек (лигандов и рецепторов), некоторые из которых селективно активируются при регуляции в различных типах опухолевых клеток, которые являются кандидатами
для блокады, включают PD-1 (белок запрограммированной клеточной гибели 1); PD-L1 (лиганд запрограммированной клеточной гибели-1); BTLA (В и Т лимфоцитарный аттенюатор); CTLA-4 (антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов); TIM-3 (Т-клеточный мембранный белок 3); LAG-3 (ген активации лимфоцитов 3); V-доменный иммуноглобулиновый супрессор Т-клеточной активации (VISTA); CD9 6; A2aR (аденозиновый А2а рецептор); A2bR (аденозиновый А2Ь рецептор); CD73 (экто-5'-нуклеотидаза) ; CD39 (ENTPD1, NTPDasel); Аргиназу; индоламин-пиррол 2,3-диоксигеназу (IDO); триптофан 2,3-диоксигеназу (TDO); и ингибирующие рецепторы киллеров. Ингибиторы иммунных контрольных точек и комбинированная терапия с использованием таких ингибиторов обсуждаются подробно в настоящей заявке.
[0012] Изобретение также обеспечивает способы лечения индивида, инфицированного патогеном, включающие введение индивиду любого из указанных выше антител в эффективном режиме. В некоторых способах патоген представляет собой ВИЧ или ВСГ. В других способах патоген представляет собой вирусный, бактериальный, грибковый или простейший патоген.
[0013] В дополнительных аспектах в настоящей заявке представлено анти-TIGIT антитело, которое связывается с Полипептидом TIGIT на одном или нескольких аминокислотных остатках, включающих D51, где полипептид TIGIT имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID N0:1. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело является химерным, гуманизированным или венированным. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело не связывается с одним или несколькими аминокислотными остатками, включающими L4 4, 147 или Н55. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело включает зрелую вариабельную область
легкой цепи SEQ ID N0:14 и зрелую вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID N0:10. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело связывается с тем же с эпитопом, что и TIG1, в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID N0:1. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело включает три CDR легкой цепи, включающие SEQ ID N0:15-17, и три CDR тяжелой цепи, включающие SEQ ID N0:11-13. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело содержит зрелую вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID N0:35, и зрелую вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID N0:37. В некоторых вариантах осуществления зрелая вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID N0:35, и зрелая вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность SEQ ID N0:37. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, включающей SEQ ID N0:40, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или не присутствовать, и зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, включающей SEQ ID N0:41.
[0014] В следующих аспектах в настоящей заявке представлено моноклональное антитело, которое конкурирует с любым из TIG1, TIG2 или TIG3 за связывание с человеческим TIGIT, где антитело TIG1 характеризуется зрелой вариабельной областью легкой цепи SEQ ID N0:14 и зрелой вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID N0:10, антитело TIG2 характеризуется зрелой вариабельной областью легкой цепи SEQ ID N0:22 и зрелой вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID N0:18, и антитело TIG3 характеризуется зрелой вариабельной областью легкой цепи SEQ ID N0:30 и зрелой вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID N0:2 6, для специфического связывания с CD155. В некоторых вариантах
осуществления антитело связывается с тем же самым с эпитопом на человеческом TIGIT, что и любое из TIG1, TIG2 или TIG3. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело ингибирует связывание CD155 с человеческим TIGIT. В некоторых вариантах осуществления антитело включает три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, соответствующие трем CDR легкой цепи и трем CDR тяжелой цепи любого из TIG1, TIG2 или TIG3. В некоторых вариантах осуществления антитело включает три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи любого из TIG1, TIG2 или TIG3. В некоторых вариантах осуществления антитело включает три CDR тяжелой цепи, определенные по номенклатуре Кэбота, и три CDR легкой цепи, определенные по номенклатуре Кэбота, любого из TIG1 (SEQ ID N0:15-17 легкой цепи и 11-13 тяжелой цепи), TIG2 (SEQ ID NOs. 23-25 легкой цепи, 19-21 тяжелой цепи) или TIG3 (SEQ ID N0:31-33 легкой цепи и 27-29 тяжелой цепи). В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело является химерным, гуманизированным или венированным. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело имеет человеческий IgGl каппа изотип. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело представляет собой интактное антитело. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело представляет собой одноцепочечное антитело, Fab или F(ab')2 фрагмент. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело содержит зрелую вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID N0:35, и зрелую вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID N0:37. В некоторых вариантах осуществления зрелая вариабельная область тяжелой цепи по
меньшей мере на 95 или 99% идентична последовательности SEQ ID N0:35, и зрелая вариабельная область легкой цепи по меньшей мере 95 или 99% идентична последовательности SEQ ID N0:37. В некоторых вариантах осуществления зрелая вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:35, и зрелая вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:37. В некоторых вариантах осуществления зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, включающей SEQ ID N0:40, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или не присутствовать, и зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, включающей SEQ ID N0:41. В некоторых вариантах осуществления, зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, включающей SEQ ID N0:60, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или не присутствовать, и зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, включающей SEQ ID N0:64. В некоторых вариантах осуществления зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, включающей SEQ ID N0:61, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или не присутствовать, и зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, включающей SEQ ID N0:64. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело содержит зрелую вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID N0:43, и зрелую вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID N0:45. В некоторых вариантах осуществления зрелая вариабельная область тяжелой цепи по меньшей мере на 95 или 99% идентична последовательности SEQ ID N0:43, и зрелая вариабельная область легкой цепи по меньшей мере на 95 или 99% идентична последовательности SEQ ID N0:45. В некоторых вариантах осуществления зрелая вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:43, и зрелая вариабельная область легкой цепи имеет
аминокислотную последовательность SEQ ID N0:45. В некоторых вариантах осуществления зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, включающей SEQ ID N0:48, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или не присутствовать, и зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, включающей SEQ ID N0:49. В некоторых вариантах осуществления зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, включающей SEQ ID N0:62, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или не присутствовать, и зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, включающей SEQ ID N0:65. В некоторых вариантах осуществления зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, включающей SEQ ID N0:63, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или не присутствовать, и зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, включающей SEQ ID N0:65. В некоторых других аспектах в настоящей заявке представлено моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом, включающим остатки 35 и 37 SEQ N0:1 и/или остатки 49 и 51 SEQ ID N0:1. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с эпитопом, включающим остатки 35, 37, 49 и 51 SEQ ID N0:1. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с пептидом, состоящим из остатков 35-51 SEQ ID N0:1 и не более чем пяти фланкирующих аминокислот из SEQ ID N0:1 с обеих сторон. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с пептидом, состоящим из остатков 35-51 SEQ ID N0:1. В некоторых вариантах осуществления, эпитоп состоит из 3-2 0 смежных остатков SEQ ID N0:1. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело обладает одним или несколькими из следующих свойств: (а) ингибирует связывание TIGIT с CD155, необязательно с IC50 15-100 нг/мл, (Ь) повышает естественную Т-клеточную активацию в присутствии антиген-презентирующих клеток, экспрессирующих CD155, как измерено по продукции IL-2, необязательно 1,5-3-кратно, (с) повышает антиген-специфическую
Т-клеточную активацию, как измерено по продукции IL-12, необязательно 1,5-3-кратно, (d) повышает активацию природных киллерных клеток, как измерено по продукции любого из IL-2, IL-б, TNFa или IFNy, необязательно 1,5-3-кратно, (е) повышает продукцию Т-клетками по меньшей мере одного провоспалительного цитокина, необязательно 1,5-3-кратно, и (f) уменьшает продукцию Т-клетками по меньшей мере одного противовоспалительного цитокина, необязательно 1,5-3-кратно.
[0015] В другом аспекте в настоящей заявке представлены фармацевтические композиции, включающие любое из антител, описанных в настоящей заявке, и фармацевтически приемлемый носитель.
[0016] В других аспектах в настоящей заявке представлены
способы для лечения или осуществления профилактики
злокачественного новообразования, включающие введение индивиду,
имеющему рак или повышенный риск развития злокачественного
новообразования эффективного режима или терапевтически
эффективного количества любого из антител, раскрытых в настоящей
заявке. В некоторых вариантах осуществления рак представляет
собой острый миелоидный лейкоз или Т-клеточный лейкоз взрослых.
В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов
осуществления, раскрытых в настоящей заявке, индивиду вводят
опухоль-инфильтрирующие Т-клетки, которые активируются
антителом. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, индивиду вводят вакцину, индуцирующую иммунный ответ против злокачественного новообразования, который усиливается антителом. В некоторых вариантах осуществления вакцина включает антиген или его фрагмент, экспрессируемый на поверхности раковых клеток. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, индивиду вводят природные киллерные клетки, цитотоксичность которых против злокачественного новообразования усиливается антителом. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, индивиду также
вводят второе антитело против антигена, экспрессированного на поверхности клеток злокачественного новообразования, при этом эффектор-опосредованная цитотоксичность второго антитела против злокачественного новообразования усиливается антителом. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, индивиду также вводят второе антитело против антигена, экспрессированного на поверхности иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления, иммунная клетка представляет собой Т-клетку или природную киллерную клетку. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антиген представляет собой CTLA-4, PD-1 или PD-L1. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, индивиду также вводят одно или несколько лечений, выбранных из группы, состоящей из химиотерапии, облучения, клеточной терапии и хирургической операции. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, индивиду также вводят ингибитор одного или нескольких рецепторов или лигандов иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления ингибитор выбран из группы, состоящей из ипилимумаба, ниволумаба, пембролизумаба (ламбролизумаб) и атезолизумаба.
[0017] В дополнительных аспектах в настоящей заявке
представлены способы для лечения индивида, инфицированного
патогеном, включающие введение индивиду эффективного режима или
терапевтически эффективного количества любого из антител,
раскрытых в настоящей заявке. В некоторых вариантах
осуществления патоген представляет собой вирусный,
бактериальный, грибковый или простейший патоген. В некоторых вариантах осуществления, патоген представляет собой ВИЧ, ВСГ, гепатит, вирус герпеса, аденовирус, вирус гриппа, флавивирус, эховирус, риновирус, вирус Коксаки, короновирус, респираторный синцитиальный вирус, вирус эпидемического паротита, ротавирус, вирус кори, вирус краснухи, парвовирус, вирус коровьей оспы, HTLV вирус (Т лимфотропный вирус человека), вирус денге,
папилломавирус, вирус моллюска, полиовирус, вирус бешенства, JC
вирус, вирус абровирусного энцефалита, хламидии, риккетсии,
микобактерии, стафилококки, стрептококки, пневмококки,
менингококки, гоноококки, клебсиеллу, протеус, серрацию,
псевдомонас, легионеллу, дифтерию, сальмонеллу, бациллы, холеру,
столбняк, ботулизм, сибирскую язву, чуму, лептоспироз и
вызывающие болезнь Лайма бактерии. В некоторых вариантах
осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в
настоящей заявке, индивида лечат вакциной, индуцирующей иммунный
ответ против патогена, который усиливается антителом. В
некоторых вариантах осуществления вакцина включает белок
патогена или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления
любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке,
индивиду также вводят второе антитело против патогена, где
эффектор-опосредованная цитотоксичность второго антитела против
патогена усиливается антителом. В некоторых вариантах
осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в
настоящей заявке, индивиду также вводят одно или несколько из
противовирусного средства, антипаразитарного средства,
антибактериального средства или противогрибкового средства.
[0018] В другом аспекте в настоящей заявке представлены
способы, способствующие лечению злокачественного
новообразования, включающие введение индивиду, имеющему рак, терапевтически эффективного количества любого из антител, раскрытых в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления, рак представляет собой острый миелоидный лейкоз или Т-клеточный лейкоз взрослых. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, индивиду вводят опухоль-инфильтрирующие Т-клетки, которые активируются антителом. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, индивиду вводят вакцину, индуцирующую иммунный ответ против злокачественного новообразования, который усиливается антителом. В некоторых вариантах осуществления вакцина включает антиген, экспрессированный на поверхности раковых клеток, или его фрагмент. В некоторых вариантах
осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в
настоящей заявке, индивиду вводят природные киллерные клетки,
цитотоксичность которых против злокачественного новообразования
усиливается антителом. В некоторых вариантах осуществления
любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке,
индивиду вводят второе антитело против антигена,
экспрессированного на поверхности клеток злокачественного
новообразования, при этом эффектор-опосредованная
цитотоксичность второго антитела против злокачественного новообразования усиливается антителом. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, индивиду также вводят второе антитело против антигена, экспрессированного на поверхности иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления, иммунная клетка представляет собой Т-клетку или природную киллерную клетку. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антиген представляет собой CTLA-4, PD-1 или PD-L1. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, индивиду также вводят одно или несколько лечений, выбранных из группы, состоящей из химиотерапии, облучения, клеточной терапии и хирургической операции. В некоторых вариантах осуществления любого из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, индивиду также вводят ингибитор одного или нескольких рецепторов или лигандов иммунных контрольных точек. В некоторых вариантах осуществления один или несколько рецепторов или лигандов иммунных контрольных точек выбраны из группы, состоящей из CTLA-4, PD-1 и PD-L1. В некоторых вариантах осуществления ингибитор выбран из группы, состоящей из ипилимумаба, ниволумаба, пембролизумаба (ламбролизумаб) и атезолизумаба.
[0019] Каждый из аспектов и вариантов осуществления, описанных в настоящей заявке, можно использовать вместе, если только он явно или определенно не исключен из контекста варианта осуществления или аспекта.
Краткое описание чертежей
[0020] Фиг.1 схематически представляет структуру векторов
экспрессии для рекомбинантных TIGIT и CD155 белков.
[0021] Фиг.2 представляет ингибирование взаимодействия TIGIT-CD155 анти-TIGIT антителами.
[0022] Фиг.3 представляет аминокислотную последовательность TIG1 VH.
[0023] Фиг.4 представляет аминокислотную последовательность TIG1 VL.
[0024] Фиг.5 представляет аминокислотную последовательность TIG2 VH.
[0025] Фиг.б представляет аминокислотную последовательность TIG2 VL.
[0026] Фиг.7 представляет аминокислотную последовательность TIG3 VH.
[0027] Фиг.8 представляет аминокислотную последовательность TIG3 VL.
[0028] Фиг.9А представляет нуклеотидную последовательность HuTIGl VH гена и кодируемую аминокислотную последовательность, тогда как Фиг.9В представляет нуклеотидную последовательность HuTIGl VL гена и кодируемую аминокислотную последовательность.
[0029] Фиг.10 схематически представляет структуру вектора экспрессии pHuTIGl.AA.
[0030] Фиг.11 показывает результаты ELISA анализа связывания HuTIGl-IgGl.АА с человеческим TIGIT.
[0031] Фиг.12: FACS анализ связывания HuTIGl-IgGl.АА и HuTIG3-IgGl.АА с человеческим TIGIT.
[0032] Фиг.13 представляет график, показывающий блокирование взаимодействия между человеческим TIGIT и человеческим CD155 при помощи HuTIGl-IgGl.АА и HuTIG3-IgGl.АА.
[0033] Фиг.14А представляет нуклеотидную последовательность HuTIG3 VH гена и кодируемую аминокислотную последовательность, тогда как Фиг.14В представляет нуклеотидную последовательность HuTIG3 VL гена и кодируемую аминокислотную последовательность.
[0034] Фиг.15 представляет ELISA анализ связывания HuTIG3-IgGl.AA с человеческим TIGIT.
[0035] Фиг.16 показывает повышенную продукцию IL-2, вызываемую TIG1, при стимуляции антиген-специфического иммунного
ответа.
[0036] Фиг.17 представляет повышенную CD4+ и CD8+ Т-клеточную пролиферацию, вызываемую TIG1, при стимуляции антиген-специфического иммунного ответа.
[0037] Фиг.18 представляет экспрессию CD155 на К562 клетках (вверху) и TIGIT на NK клетках (внизу).
[0038] Фиг.19 представляет повышенную NK-клеточно-опосредованную цитотоксичность, вызываемую TIG1 на К562 клетках-мишенях .
[0039] Фиг.20 показывает, что HuTIGl-IgGl.АА потенцирует эффекторные ответы цитокинов.
[0040] Фиг.21 представляет экспрессию человеческого TIGIT клеточной линией Jurkat-TIGIT на поверхности клеток.
[0041] Фиг.22 показывает, что HuTIGl-IgGl.АА и HuTIG3-IgGl.AA не вызывают активность CDC.
[0042] Фиг.23 показывает, что HuTIGl-IgGl.АА и HuTIG3-IgGl.AA повышали естественную Т-клеточную активацию в in vitro анализе Т-клеточной антагонистической активности для античеловеческого антитела к TIGIT.
[0043] Фиг.24 представляет CD112, CD155 и PD-L1, экспрессированные GM-CSF/IL-4 дифференцированными дендритными клетками моноцитарного происхождения (moDCs).
[0044] Фиг.25 представляет повышенную секрецию IFNy при добавлении HuTIGl-IgGl.АА, анти-PD-Ll антитела и HuTIGl-IgGl.АА в комбинации с анти-PD-Ll антителом.
[0045] Фиг.2бА представляет экспрессию TIGIT и CD96 на человеческих лимфоидных и миелоидных клетках. Фиг.2бВ представляет репрезентативные гистограммы анти-TIGIT окрашивания при различных уровнях экспрессии.
[0046] Фиг.27 представляет картирование эпитопов HuTIGl-IgGl.AA методом проточной цитометрии.
[0047] Фиг.28 представляет ленточное представление внеклеточного IgV домена человеческого TIGIT с пронумерованными боковыми цепями аминокислотных остатков эпитопа в виде трехмерной фигуры.
[0048] Фиг.29А и Фиг.29В показывают результаты анализа CD4+ Т-клеточной субпопуляции для определения экспрессии TIGIT.
[0049] Фиг.ЗОА и Фиг.ЗОВ показывают результаты анализа CD8+ Т-клеточной субпопуляции для определения экспрессии TIGIT.
[0050] Фиг.31 представляет повышенную NK клеточно-опосредованную цитотоксичность, вызываемую HuTIGl-IgGl.АА и HuTIG3-IgGl.АА, на К562 клетках-мишенях.
[0051] Фиг.32А представляет экспрессию TIGIT на опухоль-инфильтрирующих лимфоцитах из диссоциированных образцов опухолей. Фиг.32В представляет репрезентативные гистограммы анти-TIGIT окрашивания при различных уровнях экспрессии.
Подробное описание
[0052] Изобретение обеспечивает, inter alia, моноклональные антитела, которые специфически связываются с внеклеточным доменом TIGIT, который является членом суперсемейства иммуноглобулинов с иммунорецепторный тирозиовым ингибиторным мотивом (ITIM) в цитоплазматическом концевом сегменте. Моноклональные антитела ингибируют связывание TIGIT с CD155 и, таким образом, могут активировать Т-клетки и/или NK клетки. Моноклональные антитела можно использовать для лечения злокачественного новообразования и инфекционного заболевания, среди прочих применений.
I. Определения
[0053] Моноклональные антитела или другие биологические
соединения, такие как фрагмент TIGIT, типично обеспечиваются в
выделенной форме. Это значит, что антитело или другое
биологическое соединение типично является по меньшей мере на 50%
масс/масс очищенным от мешающих белков и других примесей,
возникающих при его получении или очистке, но не исключена
возможность того, что моноклональное антитело объединено с
избыточным количеством фармацевтически приемлемого
носителя(носителей) или другого наполнителя, предназначенного для облегчения его использования. Иногда моноклональные антитела по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95 или 99% масс/масс очищены от мешающих белков и примесей от процесса получения или очистки. Часто выделенное моноклональное антитело или другое
биологическое соединение является преобладающей
макромолекулярной частицей, оставшейся после очистки.
[0054] Специфическое связывание моноклонального антитела с его целевым антигеном означает аффинность (константу ассоциации или Ка) по меньшей мере 106, 107, 108, 109 или 1010 М-1, определенную, например, в анализе Примера 15. Специфическое связывание заметно выше по величине и отлично от неспецифического связывания, происходящего с по меньшей мере одной неродственной мишенью. Специфическое связывание может быть результатом образования связей между конкретными функциональными группами или конкретной пространственной соответствующей структурой (например, по типу замка и ключа), тогда как неспецифическое связывание обычно является результатом ван-дер-ваальсовых сил. Специфическое связывание, однако, необязательно предполагает, что моноклональное антитело связывается с одной и только с одной мишенью.
[0055] Основной структурной единицей антитела является тетрамер субъединиц. Каждый тетрамер включает две идентичные пары полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну
"легкую" (около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (около 50-70 кДа) . Амино-концевая часть каждой цепи включает вариабельную область из около 100-110 или больше аминокислот, преимущественно ответственную за распознавание антигена. Эта вариабельная область изначально экспрессируется связанной с отщепляемым сигнальным пептидом. Вариабельную область без сигнального пептида иногда называют зрелой вариабельной областью. Таким образом, например, зрелая вариабельная область легкой цепи означает вариабельную область легкой цепи без сигнального пептида легкой цепи. Карбокси-концевая часть каждой цепи определяет константную область, преимущественно ответственную за эффекторную функцию.
[0056] Легкие цепи классифицируются как каппа- или лямбда-цепи. Тяжелые цепи классифицируются как гамма-, мю-, альфа-, дельта- или эпсилон-цепи, и определяют изотип антитела, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. В пределах легких
и тяжелых цепей вариабельные и константные области связаны "J"-областью, состоящей из около 12 или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также включает "D''-область, состоящую из около 10 или более аминокислот. (Смотри, общее описание в Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7, полное содержание которого включено посредством ссылки во всей полноте для всех целей).
[0057] Зрелые вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепи образуют связывающий сайт антитела. Таким образом, интактное антитело имеет два связывающих сайта. За исключением бифункциональных или биспецифических антител, эти два сайта связывания являются одинаковыми. Все цепи демонстрируют одинаковую общую структуру из относительно консервативных каркасных областей (FR), соединенных тремя гипервариабельными областями, также называемыми определяющими комплементарность областями, или CDR. CDR из двух цепей каждой пары соединяются посредством каркасных областей, обеспечивая связывание со специфическим эпитопом. От N-конца до С-конца легкая и тяжелая цепи включают домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Присвоение аминокислот каждому домену осуществляется в соответствии с определением по Кэботу, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991) или Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. , Nature 342:878-883 (1989). Кроме того, Кэбат обеспечивает широко используемую систему нумерации (нумерация по Кэботу), в которой соответствующим остаткам между различными тяжелыми цепями или между различными легкими цепями присвоены одинаковые номера.
[0058] Термин "антитело" включает интактные антитела и их связывающие фрагменты. Таким образом, любую ссылку на антитело следует понимать как ссылку на антитело в интактной форме или связывающийся фрагмент, если только из контекста не следует иное. Как правило, фрагменты конкурируют с интактным антителом, из которого они происходят, за специфическое связывание с мишенью, включая отдельные тяжелые цепи, легкие цепи Fab, Fab',
F(ab')2, F(ab)c, Dabs, нанотела и scFv, диатела, scFv-Fc, минитела, IgNARs, V-NAR, hcIgG, bis-scFv, триатела и тетратела. Фрагменты могут быть получены методами рекомбинантных ДНК или путем ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов. Термин "антитело" также относится к биспецифическому антителу. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, обладающее двумя различными парами тяжелой/легкой цепи и двумя разными сайтами связывания (см., например, Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp.Immunol. , 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-53 (1992)).
[0059] Термин "эпитоп" относится к участку антигена, с которым связывается антитело. Эпитоп может быть сформирован из смежных или несмежными аминокислот, которые накладываются друг на друга при укладке в третичную структуру одного или нескольких белков. Эпитопы, образованные из смежных аминокислот (также известные как линейные эпитопы), обычно сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, в то время как эпитопы, образованные при формировании третичной структуры (также известные как конформационные эпитопы), обычно теряются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп типично включает по меньшей мере 3 или более, обычно по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Методы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и двумерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Протоколы картирования эпитопов в Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).
[00 60] Антитела, которые распознают одинаковые или перекрывающиеся эпитопы, могут быть идентифицированы с помощью обычного иммунного анализа, выявляющего способность одного антитела конкурировать за связывание с антигеном-мишенью с другим антителом. Эпитоп антитела может быть также определен при помощи рентгеновской кристаллографии антитела, связанного с его антигеном, для идентификации контактных остатков. Альтернативно, два антитела имеют один и тот же эпитоп, если все аминокислотные
мутации в антигене, которые уменьшают или элиминируют связывание одного антитела, уменьшают или элиминируют связывание другого антитела. Два антитела имеют перекрывающиеся эпитопы, если некоторые аминокислотные мутации, которые уменьшают или элиминируют связывание одного антитела, уменьшают или элиминируют связывание другого антитела.
[00 61] Конкуренцию между антителами определяют при помощи анализа, в котором антитело в условиях испытания ингибирует специфическое связывание контрольного антитела с общим антигеном (см., например, Junghans et al. , Cancer Res. 50:1495, 1990) . Испытываемое антитело конкурирует с контрольным антителом, если избыток испытываемого антитела (например, по меньшей мере 2х, Зх, 4х, 5х, бх, 7х, 8х, 9х, 10х, 15х, 20х, 25х, ЗОх, 35х, 40х, 45х, 50х, бОх, 70х, 80х, 90х, 100х или больше, включая значения между указанными значениями) ингибирует связывание контрольного антитела по меньшей мере на 50%, но предпочтительно на 75%, 90% или 99%. В других вариантах осуществления испытываемое антитело конкурирует с контрольным антителом, если избыток испытываемого антитела ингибирует связывание контрольного антитела на любую
величину из по
меньшей мере около
5 5 ts,
60%,
65%,
70%
или
предпочтительно
по меньшей мере около
75%,
76%,
77%,
78%,
79%,
80%, 81%, 82%, 8
3%, 84%, 85%, 86%, 87%
, 8 8%,
89%,
90%,
91%,
92%,
93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, как измерено в анализе конкурентного связывания. Антитела, идентифицированные с помощью методов конкурентного связывания (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и контрольное антитело, и антитела, связывающиеся со смежным эпитопом, расположенным проксимально по отношению к эпитопу, с которым связывается контрольное антитело, для образования пространственного затруднения. Предпочтительно конкуренцию оценивают, как описано в Примере 14.
[00 62] Термин "индивид" включает человека и других индивидов-млекопитающих. В некоторых случаях способы по изобретению можно использовать для экспериментальных животных, в ветеринарии и в разработке животных моделей для заболевания,
включая, но не ограничиваясь этим, грызунов, включая мышей, крыс, хомяков, а также приматов, таких как обезьяны. В некоторых вариантах осуществления индивиды принимают, или являются кандидатами для приема, либо профилактическое, либо терапевтическое лечение.
[0063] В контексте настоящей заявки, аминокислотный остаток из представляющей интерес аминокислотной последовательности, который "соответствует" или является "соответствующим" или в "соответствии с" аминокислотным остатком эталонной аминокислотной последовательности, показывает, что аминокислотный остаток из представляющей интерес последовательности находится в положении, гомологичном или эквивалентном указанному остатку в эталонной аминокислотной последовательности. Специалист в данной области сможет определить, соответствует ли положение конкретного аминокислотного остатка в полипептиде, таком как полипептид TIGIT, положению такого остатка в гомологичной эталонной последовательности. Например, последовательность полипептида TIGIT может быть выровнена с эталонной последовательностью с использованием известных методов (например, средства поиска основного локального выравнивания (BLAST), ClustalW2, программы выравнивания последовательностей на основе структуры (STRAP) и т.п.). Кроме того, координаты кристаллической структуры эталонной последовательности могут быть использованы в качестве помощи при определении трехмерной структуры гомологичного полипептидного остатка (Stengel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 109: 5399-5404, 2012. В другом аспекте, эквивалентные остатки могут быть идентифицированы путем определения гомологии на уровне третичной структуры. Используя такие способы, аминокислотные остатки полипептидного варианта TIGIT могут быть пронумерованы в соответствии с нумерацией положений аминокислотных остатков эталонной последовательности. Например, аминокислотную последовательность SEQ ID N0:1 можно использовать для определения нумерации положений аминокислотных остатков для каждого аминокислотного остатка TIGIT варианта, представляющего интерес, или эпитопа. В некоторых вариантах осуществления одна
аминокислотная последовательность соответствует другой
аминокислотной последовательности, если они имеют идентичность последовательностей по меньшей мере около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.
[00 64] Для целей классификации аминокислотных замен как консервативных или неконсервативных, аминокислоты сгруппированы следующим образом: Группа I (гидрофобные боковые цепи): Met, Ala, Val, Leu, Не; Группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи) : Cys, Ser, Thr; Группа III (кислотные боковые цепи) : Asp, Glu; Группа IV (основные боковые цепи) : Asn, Gin, His, Lys, Arg; Группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепей): Gly, Pro; и Группа VI (ароматические боковые цепи): Тгр, Туг, Phe. Консервативные замены включают замены между аминокислотами того же класса. Неконсервативные замены включают обмен члена одного из этих классов на член другого класса.
[0065] Процент идентичности последовательностей определяют путем максимального выравнивания последовательностей антител с использованием системы нумерации Кэбота. После выравнивания, если представляющую интерес область антитела (например, весь зрелый вариабельный участок тяжелой или легкой цепи) сравнивают с такой же областью эталонного антитела, то процент идентичности последовательностей между областями сравниваемого и эталонного антитела представляет собой количество положений, занятых той же аминокислотой как в области сравниваемого, так и эталонного антитела, деленное на общее количество выровненных положений двух областей, причем пропуски не учитываются, умноженное на 100 для преобразования в проценты.
[00 66] Композиции или способы "включающие" один или несколько перечисляемых элементов, могут включать другие элементы, конкретно не указанные. Например, композиция, которая включает антитело, может содержать только антитело или антитело в комбинации с другими ингредиентами.
[0067] Если явно не следует из контекста, ссылка на диапазон включает все целые числа в рамках этого диапазона и все
поддиапазоны, определяемые такими целыми числами.
II. Молекулы-мишени
[0068] Если не указано иное, TIGIT означает человеческий
TIGIT. Иллюстративной человеческой последовательности присвоен
Swiss-Prot номер доступа Q495A1. Полная последовательность
человеческого TIGIT содержит 244 аминокислот, из которых
аминокислоты 1-21 представляют собой сигнальный пептид, а
аминокислоты 22-244 образуют зрелый белок (SEQ ID N0:1).
Приблизительно остатки 22-141 образуют внеклеточный домен (SEQ
ID N0:3). Приблизительно остатки 142-162 образуют
трансмембранный домен, и приблизительно остатки 163-2 4 4 образуют цитоплазматический домен.
[0069] Если не указано иное, CD155 относится к человеческой
форме этого белка. Иллюстративная человеческая
последовательность для человеческого CD155 обозначена как Swiss-Prot Р15151, которая представляет собой белок из 417 аминокислот, из которых приблизительно остатки 1-20 представляют собой сигнальный пептид, 21-343 представляют собой внеклеточный домен (SEQ ID N0:6), 344-367 представляют собой трансмембранный домен и 368-417 представляют собой цитоплазматический домен.
[0070] Если явно не следует из контекста, ссылка на один из указанных выше белков означает по меньшей мере внеклеточный домен белка, и обычно полный белок за исключением отщепляемого сигнального пептида.
III. Антитела по изобретению
А. Специфичность связывания и функциональные свойства [0071] Изобретение обеспечивает моноклональные антитела, связывающиеся с эпитопами во внеклеточном домене TIGIT белка. Антитела, обозначенные как TIG1, TIG2 и TIG3, являются тремя такими иллюстративными мышиными антителами. Последовательности зрелых вариабельных областей тяжелых и легких цепей этих антител обозначены как SEQ ID N0:10 и 14, 18 и 22, и 26 и 30, соответственно. TIG1, TIG2 и TIG3 специфически связываются с внеклеточным доменом человеческого TIGIT.
[0072] Некоторые антитела по изобретению связываются с тем же или перекрывающемся эпитопом, что и антитело, обозначенное
как TIG1, TIG2 или TIG3. Другие антитела, обладающие такой специфичностью связывания, можно получить иммунизацией мышей при помощи TIGIT или его части, включая целевой эпитоп, и скрининга полученных антител на связывание с внеклеточным доменом TIGIT, необязательно в конкуренции с TIG1, TIG2 или TIG3. Антитела также можно скринировать против мутагенезированных форм TIGIT антигена для идентификации антитела, показывающего такой же или подобный профиль связывания с коллекцией мутационных изменений, как TIG1, TIG2 или TIG3. Мутации могут представлять собой системную замену аланином (или серином, если аланин уже присутствует) одного остатка за раз, или с более широкими промежутками, по всему внеклеточному домену TIGIT антитела или его части, в которой, как известно, находится эпитоп.
[0073] в Примере 16 картированы остатки 35, 37, 49 и 51 SEQ ID N0:1 как представляющие собой остатки, образующие эпитоп TIG1 антитела. Замена аланином на любом из этих остатков по существу устраняет связывание антитела. Изобретение, таким образом, включает другие антитела, связывающиеся с эпитопом человеческого TIGIT, включающим остатки 35 и 37 SEQ N0:1 и/или остатки 49 и 51 SEQ ID N0:1, и предпочтительно эпитопом, включающим все из этих остатков. Эпитоп может быть линейным (например, 3-20, 3-17 или 5-10 смежных остатков) или конформационным. Некоторые такие антитела связываются с пептидом, состоящим из остатков 35-51 SEQ ID N0:1 и не более чем 1, 2, 3, 4 или 5 фланкирующих аминокислот из SEQ ID N0:1 с обеих сторон. Некоторые такие антитела связываются с пептидом, состоящим из остатков 35-51 SEQ ID N0:1. Некоторые такие антитела могут быть генерированы путем иммунизации такими пептидами. Пример 19 также показывает, что остаток 90 SEQ ID N0:1 является критическим для связывания гуманизированного (Ни)TIG1 антитела с TIGIT, в дополнение к остаткам 35, 37, 49 и 51 SEQ ID N0:1. В других вариантах осуществления антитело (такое как HuTIGl антитело) связывается с эпитопом, включающим один или несколько из остатков, соответствующих аминокислотным положениям 35, 37, 49, 51 и/или 90 SEQ ID N0:1. В других вариантах осуществления антитело (такое как HuTIGl антитело) не связывается с одним или несколькими
остатками, соответствующими аминокислотным положениям 34, 39, 44, 47, 52, 55, 86, 88, 92 и/или 96 SEQ ID N0:1.
[0074] Антитела, обладающие специфичностью связывания выбранного мышиного антитела (например, TIG1, TIG2 или TIG3), также можно получить с использованием варианта метода фагового дисплея. См. Winter, WO 92/20791. Этот метод является особенно подходящим для получения человеческих антител. В этом методе вариабельную область либо тяжелой, либо легкой цепи выбранного мышиного антитела используют в качестве исходного материала. Если, например, вариабельная область легкой цепи выбрана в качестве исходного материала, конструируют библиотеку фагов, в которой члены демонстрируют одинаковую вариабельную область легкой цепи (т.е. мышиного исходного материала) и разные вариабельные области тяжелой цепи. Вариабельные области тяжелой цепи, например, можно получить из библиотеки перегруппированных человеческих вариабельных областей тяжелой цепи. Выбирают фаг, показывающий сильное специфическое связывание для TIGIT
(например, по меньшей мере 108, и предпочтительно по меньшей мере 109 М-1) . Вариабельная область тяжелой цепи из этого фага затем служит в качестве исходного материала для конструирования дополнительной библиотеки фагов. В этой библиотеке каждый из фагов демонстрирует одинаковую вариабельную область тяжелой цепи
(т.е. область, идентифицированную из первой библиотеки фагового дисплея) и разные вариабельные области легкой цепи. Вариабельные области легкой цепи можно получить, например, из библиотеки перегруппированных человеческих вариабельных областей легкой цепи. Снова, выбирают фаг, показывающий сильное специфическое связывание для TIGIT. Полученные антитела обычно имеют такую же или подобную специфичность в отношении эпитопа, как у исходного материала из мыши.
[0075] Некоторые антитела имеют зрелую вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR HI, Н2 и НЗ, и зрелую область легкой цепи, включающую CDR LI, L2 и L3, полностью или по существу из TIG1. Некоторые антитела имеют зрелую вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR HI, Н2 и НЗ, и зрелую вариабельную область легкой цепи, включающую CDR LI, L2 и L3,
полностью или по существу из TIG2. Некоторые антитела имеют зрелую вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR HI, Н2 и НЗ, и зрелую вариабельную область легкой цепи, включающую CDR LI, L2 и L3, полностью или по существу из TIG3. CDR могут быть определены в соответствии с любым принятым определением, включая определение по Кэботу, по Чотиа, по Кэботу и Чотиа, по АЬМ или определение по контакту, как показано в таблице ниже:
петля
Кэбот
АЬМ
Чотиа
Контакт
L-24--L34
L24--34
L24--L34
L30-L36
L50-L56
L50--156
L50 L56
L46-L55
L89--L97
L89--97
L89--L97
L89-L96
Н31-Н35В (Нумерация по Кэботу)
Н26-Н35Ь
Н26-Н32..34
НЗО-Н35В
Н31-Н35 (Нумерация по Чотиа)
Н26-Н35
Н26-Н32
НЗО-Н35
Н50-Н65
Н50-Н58
Н52-Н56
Н47-Н58
Н95-Н102
Н95-Н102
Н95-Н102
Н93-НЮ
[0076] Другие антитела можно получить путем мутагенеза кДНК, кодирующей тяжелую и легкую цепи иллюстративного антитела, такого как TIG1, TIG2 или TIG3. Моноклональные антитела, которые по меньшей мере на около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны TIG1, TIG2 или TIG3 в аминокислотной последовательности зрелых вариабельных областей тяжелой и/или легкой цепи и сохраняют их функциональные свойства, и/или которые отличаются от соответствующего антитела небольшим количеством функционально несущественных аминокислотных замен (например, консервативных замен), делеций или инсерций, также включены в изобретение. Аминокислоты в каркасах вариабельных областей, возможно являющиеся важными для связывания, можно идентифицировать, как описано в разделах, относящихся к гуманизации, ниже. Моноклональные антитела, содержащие по меньшей мере одну, и предпочтительно все шесть CDR(s),
определенных по номенклатуре Кэбота, которые на любое из следующих значений около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны соответствующим CDR TIG1, TIG2 или TIG3, также включены.
[0077] Антитела предпочтительно имеют одну или несколько из
следующих характеристик (i) ингибирование связывания
человеческого TIGIT с человеческим CD155, (ii) ингибирование связывания TIGIT с другими лигандами, такими как CD112 и CD113, (iii) усиление антиген-специфических Т-клеточных ответов, (iv) активация природных киллерных клеток, (v) стимуляция естественных Т-клеточных активаций, и (vi) стимуляция продукции одного или нескольких иммуностимуляторных цитокинов и/или снижение продукции одного или нескольких иммуносупрессорных цитокинов Т-клетками и другими клетками иммунной системы. Иллюстративные анализы для измерения этих свойств представлены в примерах.
[0078] Предпочтительные антитела полностью или частично ингибируют связывание TIGIT с CD155. Некоторые антитела могут ингибировать такое взаимодействие с любым из следующих значений 1С50 около 25-300 нг/мл, 25-75 нг/мл, 25-50 нг/мл, 40-75 нг/мл, 50-75 нг/мл, 50-90 нг/мл, 50-100 нг/мл, 75-100 нг/мл, 50-150, 75-175 нг/мл, 100-200 нг/мл, 125-225 нг/мл, 100-250 нг/мл, 150300 нг/мл, 175-250 нг/мл, 200-300 нг/мл, 25-275 нг/мл, 250-300 нг/мл, 49 +/-10% нг/мл, 65 +/-10% нг/мл или 76 +/-10% нг/мл, измеренных, как описано в примерах. В других вариантах осуществления, антитела могут полностью или частично ингибировать связывание TIGIT с CD155 с любым из следующих значений IC50 около 25 нг/мл, 50 нг/мл, 75 нг/мл, 100 нг/мл, 125 нг/мл, 150 нг/мл, 175 нг/мл, 200 нг/мл, 225 нг/мл, 250 нг/мл, 275 нг/мл или 300 нг/мл или больше, включая концентрации, находящиеся между этими значениями. Некоторые антитела могут усиливать антиген-специфические Т-клеточные ответы 1,5-3-кратно, например, с любым из следующих значений усиления ответа примерно 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3-кратно или больше, как измерено в примерах.
Некоторые антитела могут повышать продукцию 1, 2, 3 или всех из IL-2, IL-б, TNFcx и IFNy NK-клетками 1,5-3-кратно, например, с любым из следующих значений повышения продукции примерно 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3 -кратно или больше, как измерено в примерах. Некоторые антитела могут повышать естественную Т-клеточную активацию 1,5-3-кратно, например, с любым из следующих значений повышения активации примерно 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3 -кратно или больше, как измерено в примерах. Некоторые антитела могут ингибировать рак или инфекционное заболевание, как показано в животной модели или клинических испытаниях. Животные модели злокачественного новообразования, в которых раковые клетки человека инъецируют иммунодефицитному лабораторному животному, такому как мышь или крыса, являются широко доступными.
[0079] Гуманизация или химеризация антител повышает период полужизни in vivo по сравнению с исходными мышиными антителами. Получаемый в результате период полужизни может составлять 10-50 дней, например, у человека. Период полужизни можно измерить путем фармакокинетических исследований, таких, которые описаны Kim et al, Eur J of Immunol 24:542 (1994).
В. Нечеловеческие антитела
[008 0] Получение других нечеловеческих моноклональных антител, например, мышиных, морских свинок, приматов, кроличьих, куриных или крысиных, против TIGIT можно осуществить, например, путем иммунизации животного при помощи TIGIT или его фрагмента или клеток, несущих TIGIT. См. Harlow & Lane, Antobodies, А laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (включенный посредством ссылки для всех целей). Такой иммуноген можно получить из природного источника, путем пептидного синтеза или рекомбинантной экспрессии. Необязательно, иммуноген можно вводить слитым или иным образом, образующим комплекс с белком-носителем. Необязательно, иммуноген можно вводить с адъювантом. Можно использовать несколько типов адъювантов, как описано ниже. Для иммунизации лабораторных животных предпочтительным является
полный адъювант Фрейнда, затем неполный адъювант. Кроликов или морских свинок обычно используют для получения поликлональных антител. Мышей обычно используют для получения моноклональных антител. Антитела скринируют на специфическое связывание с TIGIT. Необязательно, антитела дополнительно скринируют на связывание с определенной областью TIGIT. Такой скрининг можно осуществить путем определения связывания антитела с коллекцией делеционных мутантов TIGIT и определения того, какие делеционные мутанты связываются с антителом. Связывание можно оценить, например, методом вестерн-блоттинга, FACS или ELISA. С. Гуманизированные антитела
[0081] Уменьшение или устранение ответа НАМА (человеческого анти-мышиного (также применимо к человеческому анти-крысиному или человеческому анти-кроличьему или человеческому антихомячьему, и т.д.) антителу) является важным аспектом клинической разработки подходящих терапевтических средств. См., например, Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al. , Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al. , J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al. , J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al. , Nature (1988), 332:323; Junghans et al. , Cancer Res. (1990), 50:1495. Как описанно в настоящей заявке, изобретение обеспечивает антитела, которые являются гуманизированными, чтобы ответ НАМА уменьшался или устранялся. Варианты этих антител можно затем получить с использованием рутинных способов, известных из уровня техники, некоторые из которых описаны ниже.
[0082] Гуманизированное антитело представляет собой
генетически сконструированное антитело, в котором CDR из
нечеловеческого "донорного" антитела пересажены в
последовательности человеческого "акцепторного" антитела {см., например, Queen, US 5530101 и 5585089; Winter, US 5225539, Carter, US 6407213, Adair, US 5859205, 6881557, Foote, US 6881557). Последовательности акцепторного антитела могут представлять собой, например, зрелую последовательность
человеческого антитела, смесь таких последовательностей,
консенсусную последовательность из последовательностей
человеческого антитела или последовательность области зародышевой линии. Таким образом, гуманизированное антитело представляет собой антитело, содержащее некоторые или все CDR полностью или по существу из донорного антитела и каркасные последовательности вариабельных областей и константные области, если присутствуют, полностью или по существу из последовательностей человеческого антитела. Подобным образом гуманизированная тяжелая цепь содержит по меньшей мере одну, две и обычно все три CDR полностью или по существу из тяжелой цепи донорного антитела, и каркасную последовательность вариабельной области тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи, если присутствуют, по существу из человеческих последовательностей каркасного участка вариабельной области тяжелой цепи и константной области. Подобным образом, гуманизированная легкая цепь содержит по меньшей мере одну, две и обычно все три CDR полностью или по существу из легкой цепи донорного антитела и каркасную последовательность вариабельной области легкой цепи и константную область легкой цепи, если присутствуют, по существу из человеческих последовательностей каркасного участка вариабельной области легкой цепи и константной области. В отличие от нанотел и dAbs, гуманизированное антитело включает гуманизированную тяжелую цепь и гуманизированную легкую цепь. Здесь и далее в настоящей заявке, CDR в рассматриваемом антителе по существу из соответствующей CDR в эталонном антителе, когда по меньшей мере около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% соответствующих остатков (определенных по Кэботу) идентичны между соответствующими CDR; однако, CDR Н2, как определено по номенклатуре Кэбота, в рассматриваемом антителе происходит по существу из соответствующей CDR в эталонном антителе, когда по
идентичны между соответствующими CDR. Каркасные
последовательности вариабельной области цепи антитела или константная область цепи антитела происходят по существу из человеческой каркасной последовательности вариабельной области или человеческой константой области, соответственно, когда по меньшей мере около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% соответствующих остатков, определенных по Кэботу, являются идентичными.
[0083] Хотя гуманизированные антитела часто включают все шесть CDR (предпочтительно, определенных по номенклатуре Кэбота) из нечеловеческого (например, мышиного) антитела, они также могут быть получены с меньшим числом CDR (например, по меньшей мере 3, 4 или 5) CDR из нечеловеческого антитела (например, Pascalis et al. , J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al. , Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000).
[0084] В некоторых антителах только часть CDR, а именно, ряд CDR остатков, необходимых для связывания, называемых SDR, требуются для сохранения связывания в гуманизированном антителе. CDR остатки, не контактирующие с антигеном и не находящиеся в SDR, могут быть идентифицированы на основании предыдущего исследования (например, остатки Н60-Н65 в CDR Н2 часто не требуются) из областей CDR по системе Кэбота, расположенных вне гипервариабельных петель Чотиа (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), методом молекулярного моделирования и/или эмпирически или как описанно в Gonzales et al. , Mol. Immunol. 41: 863, 2004. В таких гуманизированных антителах в положениях, в которых один или несколько из донорных CDR остатков отсутствует или в которых отсутствует вся донорная CDR, аминокислота, занимающая такое положение, может представлять собой аминокислоту, занимающую соответствующее положение (в соответствии с нумерацией Кэбота) в последовательности акцепторного антитела. Количество таких замен для включения акцепторных аминокислот вместо донорных в CDR отражает баланс соображений, касающихся конкуренции. Такие
замены потенциально выгодны для уменьшения количества мышиных аминокислот в гуманизированном антителе и, как следствие, уменьшения потенциальной иммуногенности. Однако замены также могут вызывать изменения аффинности, и предпочтительно избегать значительного снижения аффинности. Положения для замещения внутри CDR и аминокислоты для замены также могут быть выбраны эмпирически.
[0085] Хотя акцептор может быть идентичным по
последовательности выбранной человеческой каркасной
последовательности, независимо от того, происходит ли она из
человеческого иммуноглобулина или человеческой консенсусной
каркасной последовательности, настоящее изобретение
предполагает, что акцепторная последовательность может включать
ранее существовавшие аминокислотные замены относительно
последовательности человеческого иммуноглобулина или
человеческой консенсусной каркасной последовательности. Эти ранее существовавшие замены предпочтительно минимальны; обычно разница только в четырех, трех, двух или одной аминокислоте по отношению к человеческой последовательности иммуноглобулина или консенсусной каркасной последовательности.
[0086] Последовательности человеческого акцепторного антитела необязательно могут быть выбраны из множества известных последовательностей человеческих антител для обеспечения высокой степени идентичности последовательностей (например, 65-85% идентичности) между каркасами вариабельной области человеческой акцепторной последовательности и соответствующими каркасами вариабельной области цепи донорного антитела.
[0087] Некоторые аминокислоты из каркасных остатков человеческой вариабельной области могут быть выбраны для замены на основании их возможного влияния на CDR конформацию и/или связывание с антигеном. Для исследования таких возможных влияний используют моделирование, исследование характеристик аминокислот в конкретных положениях или эмпирическое наблюдение эффектов замен или мутагенеза конкретных аминокислот.
[008 8] Например, в случае отличий аминокислоты между каркасным остатком нечеловеческой вариабельной области и
выбранным каркасным остатком человеческой вариабельной области,
человеческая аминокислота каркасного участка может быть заменена
эквивалентной аминокислотой каркасного участка из
нечеловеческого антитела, когда есть основания ожидать, что аминокислота:
(1) нековалентно связывается с антигеном непосредственно,
(2) является смежной с CDR областью,
(3) как-либо иначе взаимодействует с CDR областью
(например, находится в пределах около б А от CDR области).
[008 9] Другими кандидатами для замены являются аминокислоты акцепторной человеческой каркасной области, которые являются необычными для иммуноглобулина человека в этом положении. Эти аминокислоты могут быть заменены аминокислотами из эквивалентного положения нечеловеческого донорного антитела или из эквивалентных положений более типичных человеческих иммуноглобулинов. Другими кандидатами для замены являются аминокислоты акцепторной человеческой каркасной области, которые являются необычными для иммуноглобулина человека в этом положении.
[0090] Предпочтительное гуманизированное антитело содержит
зрелую вариабельную область тяжелой цепи по меньшей мере на
около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или меньше чем 100%
идентичную SEQ ID N0:35 и зрелую вариабельную область легкой
цепи по меньшей мере на около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,
87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
или меньше чем 100% идентичную SEQ ID N0:37. Предпочтительно,
любое изменение может иметь место по каркасным остаткам
вариабельной области, за исключением тех, которые определены как
возможно важные для связывания (см. абзац [0073]) .
Предпочтительно, любое изменение представляет собой
консервативную аминокислотную замену. Предпочтительное антитело включает зрелую вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID N0:35 и зрелую вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID N0:37. Для экспрессии полноразмерного антитела зрелую вариабельную область тяжелой
цепи предпочтительно связывают с константной областью тяжелой цепи, состоящей из, или включающей, SEQ ID N0:40, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или не присутствовать, и зрелую вариабельную область легкой цепи предпочтительно связывают с константной областью легкой цепи, состоящей из или, включающей, SEQ ID N0:41.
[0091] Другое предпочтительное гуманизированное антитело содержит зрелую вариабельную область тяжелой цепи по меньшей мере на около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или меньше чем 100% идентичную SEQ ID N0:43 и зрелую вариабельную область легкой цепи по меньшей мере на около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или меньше чем 100% идентичную SEQ ID N0:45. Предпочтительно, любое изменение имеет место по каркасным остаткам вариабельной области, за исключением тех, которые определены как возможно важные для связывания (см. абзац [0073] и примеры). Предпочтительно, любое изменение представляет собой консервативную аминокислотную замену. Предпочтительное антитело включает зрелую вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность SEQ ID N0:43, и зрелую вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность SEQ ID N0:45. Для экспрессии полноразмерного антитела зрелую вариабельную область тяжелой цепи предпочтительно связывают с константной областью тяжелой цепи, состоящей из, или включающей, SEQ ID N0:48, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или не присутствовать, и зрелую вариабельную область легкой цепи предпочтительно связывают с константной областью легкой цепи, состоящей из, или включающей, SEQ ID N0:49. D. Химерные и венированные антитела
[0092] Изобретение также обеспечивает химерные и венированные формы нечеловеческих антител, в частности, TIG1, TIG2, и TIG3 антител примеров.
[0093] Химерное антитело представляет собой антитело, в котором зрелые вариабельные области легкой и тяжелой цепей нечеловеческого антитела (например, мышиного) присутствуют в
комбинации с человеческими константными областями легкой и тяжелой цепей. Такие антитела по существу или полностью сохраняют специфичность связывания нечеловеческого антитела и являются примерно на две трети человеческой последовательностью.
[0094] Венированное антитело представляет собой тип гуманизированного антитела, которое сохраняет некоторые и обычно все из CDR и некоторые из каркасных остатков нечеловеческой вариабельной области нечеловеческого антитела, но с заменой других каркасных остатков вариабельной области, которые могут способствовать взаимодействию с В- или Т-клеточными эпитопами, например, экспонированных остатков (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) остатками из соответствующих положений последовательности человеческого антитела. Результатом является антитело, в котором CDR полностью или по существу из нечеловеческого антитела, а каркасы вариабельных областей нечеловеческого антитела стали более подобны человеческим путем замен. Венированные формы TIG1, TIG2 или TIG3 антитела включены в изобретение.
Е. Человеческие антитела
[0095] Человеческие антитела против TIGIT обеспечиваются с использованием различных способов, описанных ниже. Некоторые человеческие антитела выбирают путем осуществления экспериментов конкурентного связывания, методом фагового дисплея Winter, описанного выше, либо как имеющие такую же эпитоп-специфичность, как у конкретного мышиного антитела, такого как одно из мышиных моноклональных антител, описанных в примерах. Человеческие антитела также можно скринировать на специфичность в отношении конкретного эпитопа с использованием только фрагмента TIGIT в качестве антигена-мишени и/или путем скрининга антитела против коллекции делеционных мутантов TIGIT.
[0096] Способы получения человеческих антител включают триомный метод Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, Патент США № 4 634 664; и Engleman et al. , Патент США № 4 634 666, использование трансгенных мышей, включающих гены человеческого иммуноглобулина (см., например, Lonberg et al., W093/12227 (1993); US 5877397, US 5874299, US 5814318, US
5789650, US 5770429, US 5661016, US 5633425, US 5625126, US 5569825, US 5545806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) и методы фагового дисплея (см., например, Dower et al., WO 91/17271 и McCafferty et al., WO 92/01047, US 5877218, US 5871907, US 5858657, US 5837242, US 5733743 и US 5565332) . F. Выбор константной области
[0097] Вариабельные области тяжелой и легкой цепей химерных, гуманизированных (включая венированные) или человеческих антител могут быть связаны с по меньшей мере частью человеческой константной области. Выбор константной области зависит, частью, от того, желательны ли антитело-зависимый комплемент и/или клеточно-опосредованная цитотоксичность. Например, человеческие изотипы IgGl и IgG3 обладают комплемент-опосредованной цитотоксичностью, а человеческие изотипы IgG2 и IgG4 ей не обладают. Константные области легкой цепи могут быть лямбда или каппа. Для иммунотерапии против злокачественного новообразования или патогена, не экспрессирующего TIGIT, часто предпочтительны человеческие IgG2 или IgG4 или аттенуированная форма человеческого IgGl со сниженной эффекторной функцией. Для человеческого IgG4 часто предпочтительно включение S228P (Ей нумерация) генно-инженерной мутации на тяжелой цепи для предотвращения обмена Fab-фрагментами. Однако для элиминации раковых клеток, экспрессирующих TIGIT (например, из Т-клеточных или NK-клеточных опухолей) или для иммуносупрессии часто предпочтительны человеческие IgGl или IgG3.
[0098] Человеческие константные области демонстрируют аллотипические вариации и изоаллотипические вариации у разных индивидуумов, то есть константные области могут отличаться у разных индивидуумов по одному или нескольким полиморфным положениям. Изоаллотипы отличаются от аллотипов тем, что белки сыворотки, распознающие изоаллотип, связываются с не-полиморфной областью одного или нескольких других изотипов. Ссылка на человеческую константную область включает константную область с любым природным аллотипом или любой пермутацией остатков, занимающих полиморфные положения в природных аллотипах.
[0099] Одна или несколько аминокислот на амино или карбокси конце легкой и/или тяжелой цепи, такие как С-концевой лизин тяжелой цепи, может отсутствовать или может быть преобразована в части или во всех из этих молекул. Замены могут быть в константных областях для снижения или повышения эффекторной функции, такой как комплемент-опосредованная цитотоксичность или ADCC (см., например, Winter et al., Патент США № 5624821; Tso et al., Патент США № 5834597; и Lazar et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:4005, 2006) или для продления периода полужизни в организме человека {см., например, Hinton et al. , J. Biol. Chem. 279:6213, 2004) . Иллюстративные замены включают Gin в положении 2 50 и/или Leu в положении 42 8 (Ей нумерация) для увеличения периода полужизни антитела.
[00100] Некоторые антитела по изобретению конструируют путем введения мутации(мутаций) в константной области для получения пониженных эффекторных функций, таких как CDC и ADCC или ADCP, по сравнению с таким же антителом без мутации(мутаций). Предпочтительно, каждая или все из этих эффекторных функций снижаются по меньшей мере на 50%, 75%, 90% или 95% по сравнению с антителами без мутации. Представленные примеры показывают, как можно измерить CDC. Другие анализы описаны в Shields et al, 2001 J. Biol. Chem., Vol. 276, p 65916604; Chappel et al, 1993 J. Biol. Chem., Vol 268, p 2512425131; Lazar et al, 2006 PNAS, 103; 4005-4010.
[00101] Замена любого или всех положений 234, 235, 236 и/или 237 снижает аффинность к Fey рецепторам, в частности, к FcyRI рецептору {см., например, US 6624821). Алании является предпочтительным остатком для замены, и L234A/L235A является предпочтительной двойной мутацией для снижения эффекторной функции. Другие комбинации мутаций с пониженными эффекторными функциями включают L234A/L235A/ G237A, E233P/L234V/L235A/G236, A327G/A330S/P331S, К322А, L234A и L235A, L234F/L235E/P331S. Необязательно, положения 234, 236 и/или 237 в человеческом IgG2 заменены аланином, а положение 235 глутамином {см., например, US 5 624821). Две аминокислотные замены в сайте связывания
комплемента Clq в положениях 330 и 331 (EU-индекс) уменьшают фиксацию комплемента (см. Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993) и Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991)). Замена в человеческом IgGl или IgG2 остатков в положениях 233236 и в IgG4 остатков в положениях 327, 330 и 331 сильно снижает ADCC и CDC (см., например, Armour KL. et al. , 1999 Eur J Immunol. 29 (8) :2613-24; и Shields RL. et al. , 2001. J Biol Chem. 276 (9) :6591-604) . N297A, N297Q или N297G (Eu нумерация) мутации снижают гликозилирование и, соответственно, эффекторные функции. G. Экспрессия рекомбинантных антител
[00102] Химерные, гуманизированные (включая венированные) и человеческие антитела, как правило, получают путем рекомбинантной экспрессии. Рекомбинантные полинуклеотидные конструкции типично включают контролирующую экспрессию последовательность, функционально связанную с кодирующими последовательностями цепей антитела, включая природно-ассоциированные или гетерологичные промоторные области. Предпочтительно, контролирующие экспрессию последовательности представляют собой эукариотические промоторные системы в векторах, способных трансформировать или трансфицировать эукариотические клетки-хозяева. После введения вектора подходящему хозяину этого хозяина поддерживают в условиях, подходящих для высокого уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей, и осуществляют сбор и очистку рекомбинантных антител.
[00103] Клетки млекопитающего являются предпочтительным хозяином для экспрессии нуклеотидных сегментов, кодирующих иммуноглобулины или их фрагменты. См. Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Различные подходящие клеточные линии-хозяева, способные секретировать интактные гетерологичные белки, были разработаны в данной области, и они включают СНО клеточные линии, различные COS клеточные линии, HeLa клетки, НЕК2 93 клетки, L клетки и не продуцирующие антитела миеломы, включая Sp2/0 и NS0. Предпочтительно, клетки являются нечеловеческими. Векторы экспрессии для этих клеток могут включать контролирующие экспрессию последовательности, такие как
точка начала репликации, промотор, энхансер (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), и необходимые сайты обработки информации, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминаторов транскрипции. Предпочтительными контролирующими экспрессию последовательностями являются промоторы, происходящие из эндогенных генов, цитомегаловируса, SV40, аденовируса, бычьего папилломавируса и т.п. См. Со et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).
[00104] После того, как антитела экспрессированы, они могут быть очищены в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области техники, включая ВЭЖХ очистку, колоночную хроматографию, гель-электрофорез и т.п. (см. в общем Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).
IV. Терапевтические применения
[00105] Антитела могут использоваться для усиления иммунных реакций при лечении злокачественного новообразования и инфекционных заболеваний. Расстройства, поддающиеся лечению антителами по изобретению, включают, без ограничения, рак, включая гематологические злокачественные опухоли и солидные опухоли. Такие раковые опухоли могут экспрессировать или не экспрессировать TIGIT или CD155. Антитела к TIGIT эффективны против злокачественного новообразования, не экспрессирующего TIGIT, поскольку ингибирование взаимодействия TIGIT с CD155 стимулирует иммунный ответ против таких видов злокачественного новообразования. Примеры гематологических злокачественных новообразований включают лейкозы, лимфомы и миеломы, включая острый миелоидный лейкоз, Т-клеточный лейкоз взрослых, Т-клеточный крупногранулярный лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелолейкоз, острый моноцитарный лейкоз, лимфому Ходжкина и не-ходжкинскую лимфому и множественную миелому. Примеры солидных опухолей включают, без ограничения, рак яичников, рак эндометрия, рак молочной железы, рак легких (мелкоклеточный или немелкоклеточный), рак толстой кишки, рак предстательной железы, рак шейки матки, рак поджелудочной
железы, рак желудка, рак пищевода, гепатоцеллюлярную карциному (рак печени), почечноклеточную карциному (рак почки), опухоли головы и шеи, мезотелиому, меланому, саркомы и опухоли головного мозга (например, глиомы, такие как глиобластомы)
[00106] Способы по изобретению можно осуществить на практике в условиях адъювантной терапии. "Условия адъювантной терапии" относится к клинической ситуации, когда индивид имеет историю пролиферативного заболевания, особенно злокачественного новообразования, и обычно (но не обязательно) отвечал на лечение, которое включает, но не ограничивается этим, хирургию, лучевую терапию и/или химиотерапию. Однако из-за истории пролиферативного заболевания эти индивиды считаются подверженными риску развития этого заболевания. Лечение или введение в "условиях адъювантной терапии" относится к последующему способу лечения. В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке представлен способ для лечения или осуществления профилактики злокачественного новообразования, включающий введение индивиду, имеющему рак или повышенный риск развития злокачественного новообразования, терапевтически эффективного количества любого из антител, раскрытых в настоящей заявке в условиях адъювантной терапии.
[00107] Способы, представленные в настоящей заявке, также можно осуществлять в "не-адъювантных условиях", то есть способ можно осуществить до первичной/радикальной терапии. В некоторых аспектах индивид ранее проходил лечение. В других аспектах индивид ранее не проходил лечение. В некоторых аспектах лечение представляет собой терапию первой линии. В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке представлен способ для лечения или осуществления профилактики злокачественного новообразования, включающий введение индивиду, имеющему рак или повышенный риск развития злокачественного новообразования, терапевтически эффективного количества любого из антител, раскрытых в настоящей заявке, в не-адъювантных условиях.
[00108] Другие расстройства, которые можно лечить антителами по изобретению, включают инфекционные заболевания,
вызванные вирусами, бактериями, грибами, простейшими и другими патогенами (например, гепатит (А, В или С), вирус герпеса (например, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, и CMV, вирус Эпштейна-Барра), аденовирус, вирус гриппа, флавивирусы, эховирус, риновирус, вирус Коксаки, короновирус, респираторный синцитиальный вирус, вирус эпидемического паротита, ротавирус, вирус кори, вирус краснухи, парвовирус, вирус коровьей оспы, HTLV вирус, вирус денге, папилломавирус, вирус моллюска, полиовирус, вирус бешенства, JC вирус, ВИЧ, ВСГ и вирус абровирусного энцефалита, хламидии, риккетсии, микобактерии, стафилококки, стрептококки, пневмококки, менингококки и гоноококки, клебсиеллу, протеус, серрацию, псевдомонас, легионеллу, дифтерию, сальмонеллу, бациллу, холеру, столбняк, ботулизм, сибирскую язву, чуму, лептоспироз и бактерии, вызывающие болезнь Лайма. А. Введение антител
[00109] Антитела, описанные в настоящей заявке, вводят в
эффективном режиме, что означает дозировку, способ введения и
частоту введения, которые задерживают начало развития, уменьшают
тяжесть, ингибируют дальнейшее ухудшение и/или улучшают по
меньшей мере один признак или симптом расстройства. Если индивид
уже страдает от расстройства, режим можно назвать терапевтически
эффективным режимом. Если у индивида повышенный риск заболевания
по сравнению с общей популяцией, но он еще не испытывает
симптомов, режим можно назвать профилактически эффективным
режимом. В некоторых случаях терапевтическая или
профилактическая эффективность может наблюдаться у отдельного индивида относительно исторических контролей или опыта прошлого у того же индивида. В других случаях терапевтическая или профилактическая эффективность может быть продемонстрирована в доклинических или клинических испытаниях в популяции получающих лечение индивидов по сравнению с контрольной популяцией не получающих лечение индивидов.
[00110] В некоторых аспектах, любой из описанных в настоящей заявке способов включает введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких антител, описанных
в настоящей заявке, индивидам, нуждающимся в этом. Используемый
в настоящей заявке термин "терапевтически эффективное
количество" или "терапевтически эффективная доза" противораковой
терапии (такой как любое из антител против TIGIT, описанных в
настоящей заявке) представляет собой количество, достаточное для
получения полезных или желаемых результатов. Для
терапевтического применения, полезные или желаемые результаты
включают клинические результаты, такие как уменьшение одного или
нескольких симптомов, вызванных злокачественным
новообразованием, повышение качества жизни индивидов, страдающих от злокачественного новообразования, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения злокачественного новообразования, повышение эффекта другого лекарственного средства, например, путем нацеливания, задержки прогрессирования заболевания и/или продления выживания. Эффективную дозу можно вводить в виде одного или нескольких введений. Для целей настоящего изобретения эффективная дозировка противораковой терапии представляет собой количество, достаточное для осуществления терапевтического или профилактического лечения непосредственно или опосредованно. Как понимается в клиническом контексте, терапевтически эффективная доза противораковой терапии может достигаться или не достигаться в сочетании с другой противораковой терапией.
[00111] Иллюстративные дозы для любого из антител, описанных в настоящей заявке, составляют около 0,1-20 мг/кг или 0,5-5 мг/кг массы тела (например, около 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, б мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг, 15 мг/кг, 16 мг/кг, 17 мг/кг, 18 мг/кг, 19 мг/кг или 2 0 мг/кг) или 10-1500 мг (например, любая доза из меньше чем 10 мг, 20 мг, 30 мг, 4 0 мг, 50 мг, 60 мг, 7 0 мг, 8 0 мг, 90 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 450 мг, 500 мг, 550 мг, 600 мг, 650 мг, 700 мг, 750 мг, 800 мг, 850 мг, 900 мг, 950 мг, 1000 мг, 1100 мг, 1200 мг, 1300 мг, 1400 мг или 1500 мг или больше, включая значения между этими цифровыми значениями), в виде фиксированной дозы. Доза зависит от состояния индивида и
ответа на предшествующее лечение, если оно имело место, независимо от того, является лечение профилактическим или терапевтическим, и от того, является расстройство острым или хроническим, помимо прочего.
[00112] Введение может быть парентеральным, внутривенным, пероральным, подкожным, интраартериальным, интракраниальным, интратекальным, интраперитонеальным, интратуморальным, местным, интраназальным или внутримышечным. Предпочтительным является введение в системный кровоток путем внутривенного или подкожного введения. Внутривенное введение можно осуществить, например, путем инфузии в течение периода, такого как 30-90 мин.
[00113] Частота введения зависит от периода полужизни антитела в кровотоке, состояния индивида и способа введения, среди прочего. Частота может быть ежедневной, еженедельной, ежемесячной, ежеквартальной или с нерегулярными интервалами в ответ на изменения состояния индивида или прогрессирование расстройства, подвергаемого лечению. В качестве примера, частота для внутривенного введения представляет собой введение от одного раза в неделю до одного раза в квартал в ходе непрерывного периода лечения, хотя также возможно более или менее частое введение. Для подкожного введения в качестве примера можно указать частоту введения от одного раза в день до одного раза в месяц, хотя возможно более или менее частое введение.
[00114] Количество вводимых доз зависит от того, является ли заболевание острым или хроническим, а также от ответа расстройства на лечение. Для острых расстройств или острых обострений хронических расстройств часто бывает достаточно от 1 до 10 доз. Иногда одна болюсная доза, необязательно в виде дробных доз, достаточна при остром расстройстве или остром обострении хронического расстройства. Лечение может повторяться при рецидиве острого расстройства или острого обострения. При хронических заболеваниях антитело можно вводить через регулярные промежутки времени, например, еженедельно, раз в две недели, раз в месяц, раз в квартал, раз в шесть месяцев в течение по меньшей мере 1, 5 или 10 лет или в течение жизни индивида.
[00115] Лечение, включающее антитело против TIGIT, может
облегчить заболевание, увеличивая среднюю выживаемость без прогрессирования или общее время выживания пациентов со злокачественным новообразованием по меньшей мере на около 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, но предпочтительно по меньшей мере на около 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 100%, по сравнению с контрольными индивидами, или увеличить любое время из указанных на 2 недели, 1, 2 или 3 месяца, или предпочтительно на 4 или б месяцев, или даже на 9 месяцев или на год. Кроме того или альтернативно, лечение, включающее анти-TIGIT антитело, может повысить процент пациентов с полным ответом, частичным ответом или объективным ответом (полный + частичный) по меньшей мере на около 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, но предпочтительно по меньшей мере на около 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 10 0%, по сравнению с контрольными индивидами. Контрольные индивиды принимают то же лечение, что и индивиды, принимающие анти-TIGIT антитело, за исключением анти-TIGIT антитела. Таким образом, контрольные индивиды могут принимать только плацебо или комбинацию плацебо и некоторого химиотерапевтического средства отличного от анти-TIGIT антитела, если такое средство также принимают индивиды, принимающие анти-TIGIT антитело.
[00116] Анти-TIGIT антитела, раскрытые в настоящей заявке, могут усиливать NK-клеточно-опосредованную цитотоксичность СБ155-экспрессирующих клеток (таких как, но не ограничиваясь этим, К5 62 клетки) , на любую величину из около 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25% 26% 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35% или больше по сравнению с уровнем NK-клеточно-опосредованной цитотоксичности
С0155-экспрессирующих клеток в отсутствие одного из анти-TIGIT антител, раскрытых в настоящей заявке.
[00117] Как правило, в клинических испытаниях (например, в фазе II, в фазе II/III или в фазе III) увеличение средней выживаемости без прогрессирования и/или частоты ответа индивидов, получавших антитело против TIGIT, по сравнению с контрольной группой индивидов статистически значимо, например, на уровне р=0,05 или 0,01 или даже 0,001. Проценты пациентов с полным и частичным ответом определяются объективными критериями, обычно используемыми в клинических испытаниях для лечения злокачественного новообразования, например, перечисленными или принятыми Национальным институтом рака и/или Управлением по контролю за продуктами и лекарствами, и могут включать, например, определение объема опухоли, количества опухолей, метастазов, время выживания и качества жизни, среди прочего.
[00118] Фармацевтические композиции для парентерального введения предпочтительно являются стерильными и, по существу, изотоническими и изготавливаются в условиях GMP (правила правильного производства). Фармацевтические композиции могут быть представлены в стандартной дозированной форме (то есть доза для одного введения). Фармацевтические композиции могут быть сформулированы с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, разбавителей, эксципиентов или вспомогательных веществ. Лекарственная форма зависит от выбранного пути введения. Для инъекций антитела могут быть сформулированы в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический раствор или ацетатный буфер (чтобы уменьшить дискомфорт в месте инъекции). Раствор может содержать агенты для формулирования, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, антитела могут быть в лиофилизированной форме для восстановления подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой, перед использованием. Концентрация антитела в жидких композициях может варьироваться примерно в пределах 10-150 мг/мл. В некоторых композициях концентрация составляет около 25-50 мг/мл.
В. Комбинированные терапии
[00119] Настоящее изобретение предусматривает применение
антител против TIGIT в комбинации с одним или несколькими
активными терапевтическими средствами (например,
химиотерапевтическими средствами) или другими профилактическими или терапевтическими модальностями (например, облучением). В такой комбинированной терапии различные активные средства часто имеют разные взаимодополняющие механизмы действия. Такая комбинированная терапия может быть особенно предпочтительной, позволяя снизить дозу одного или нескольких средств, уменьшая или устраняя, таким образом, побочные эффекты, связанные с одним или несколькими средствами. Кроме того, такая комбинированная терапия может иметь синергический терапевтический или профилактический эффект на основное заболевание, расстройство или состояние.
[0012 0] Используемый в настоящей заявке термин "комбинация" означает терапевтические средства, которые можно вводить отдельно, например, сформулированными отдельно для отдельного введения (например, как может быть предусмотрено в наборе), и терапевтические средства, которые можно вводить вместе в одной композиции (т.е. "совместная композиция").
[00121] В некоторых вариантах осуществления любое из антител против TIGIT, раскрытых в настоящей заявке, вводят или применяют последовательно, например, когда одно средство вводят перед одним или несколькими другими средствами. В других вариантах осуществления антитела вводят одновременно, например, когда два или более средств вводят примерно в одно и то же время; два или более средств могут присутствовать в двух или более отдельных композициях или объединены в одну композицию (то есть совместную композицию). Независимо от того, вводят ли два или более средств последовательно или одновременно, они считаются вводимыми в комбинации для целей настоящего изобретения.
[00122] Антитела по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с по меньшей мере одним другим (активным) средством любым образом в соответствии с данными
обстоятельствами. В одном варианте осуществления лечение по меньшей мере одним активным средством и по меньшей мере одним антителом против TIGIT по настоящему изобретению поддерживают в течение определенного периода времени. В другом варианте осуществления лечение по меньшей мере одним активным средством уменьшают или прекращают (например, когда индивид стабилен), в то время как лечение антителом против TIGIT по настоящему изобретению поддерживают при постоянном режиме введения. В еще одном варианте осуществления лечение по меньшей мере одним активным средством уменьшают или прекращают (например, когда индивид стабилен), тогда как лечение антителом против TIGIT по настоящему изобретению уменьшают (например, более низкая доза, менее частое введение или более короткий режим лечения). В еще одном варианте осуществления лечение по меньшей мере одним активным средством уменьшают или прекращают (например, когда индивид стабилен), и лечение антителом против TIGIT по настоящему изобретению увеличивают (например, более высокая доза, более частое введение или более длительный режим лечения). В еще одном варианте осуществления лечение по меньшей мере одним активным средством поддерживают, а лечение антителом против TIGIT по настоящему изобретению уменьшают или прекращают
(например, более низкая доза, менее частое введение или более короткий режим лечения). В еще одном варианте осуществления лечение по меньшей мере одним активным средством и лечение антителами против TIGIT по настоящему изобретению уменьшают или прекращают (например, более низкая доза, менее частое введение или более короткий режим лечения).
[00123] Лечение антителами по изобретению можно сочетать с другими лечениями, эффективными против рассматриваемого расстройства. При использовании в лечении пролиферативного состояния, злокачественного новообразования, опухоли или предраковых заболеваний, расстройств или состояний антитела по изобретению можно сочетать с химиотерапией, облучением
(например, локализованной лучевой терапией или общей лучевой терапией тела), лечением стволовыми клетками, хирургией или лечением другими биологическими препаратами.
[00124] В некоторых вариантах осуществления настоящее
изобретение относится к способам подавления опухоли или роста
опухоли, включающим введение антител против TIGIT, описанных в
настоящей заявке, в сочетании с ингибитором сигнальной
трансдукции (STI) для достижения аддитивного или
синергетического подавления роста опухоли. Используемый в настоящей заявке термин "ингибитор сигнальной трансдукции" относится к средству, которое селективно ингибирует одну или несколько стадий в сигнальном пути. Ингибиторы сигнальной трансдукции (STIs) по настоящему изобретению включают: (i) ингибиторы BCR-Abl-киназы (например, иматиниб мезилат (GLEEVEC)); (ii) ингибиторы рецепторов эпидермального фактора роста (EGF), в том числе ингибиторы киназы и антитела; (iii) ингибиторы HER-2/пеи-рецепторов (например, HERCEPTIN); (iv) ингибиторы киназ семейства Akt или пути Akt (например, рапамицин); (v) ингибиторы киназы клеточного цикла (например, флавопиридол); и (vi) ингибиторы фосфатидилинозиткиназы. Средства, участвующие в иммуномодуляции, также можно использовать в комбинации с антителами против TIGIT, описанными в настоящей заявке, для подавления роста опухоли у раковых пациентов.
[00125] Примеры химиотерапевтических средств включают, но
не ограничиваются этим, алкилирующие средства, такие как тиотепа
и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, имсульфан
и пироссульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон,
метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая
алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид,
триэтилентиофосфаорамид и триметилоломелаламид; азотистые
иприты, такие как хиорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид,
эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид мехлоретамин
оксид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин,
трофосфамид, урацилиприт; нитрозомочевины, такие как кармустин,
хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин;
антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин,
азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карбабицин,
каминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин,
даунорубицин, деторубицин, б-диазо-5-оксо-Ъ-норлейцин,
доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил
(5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин,
метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие
как флударабин, б-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин;
пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, б-
азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин,
эноцитабин, флуксуридин, 5-FU; андрогены, такие как каластоун,
дромоностанол пропионат, эпитиотонол, мепитиостан, тестолактон;
средства, угнетающие функции надпочечников, такие как
аминоглутетимид, митотан, трилостан; заменитель фолиевой
кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон;
альдофосфамидгликозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин;
бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин;
диазиквон; элформитин; эллиптиний ацетат; этоглуцид; нитрат
галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон;
митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет;
пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид;
прокарбазин; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая
кислота; триазиквон; 2,2',2 ' '-трихлортриэтиламин; уретан;
виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол;
пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ара-С); циклофосфамид;
тиотепа; токсоиды (например, таксаны) , например паклитаксел,
таксол и доксетаксел; хлорамбуцил; гемцитабин; б-тиогуанин;
меркаптопурин; метотрексат; платина и платиновые координационные
комплексы, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин;
этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон;
винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид;
дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ11; ингибиторы
топоизомеразы; камптотецины, дифторметилорнитин (DMFO);
ретиноевая кислота; эсперамицины; капецитабин; антиметаболиты
(например, азатиоприн); антрациклины; растительные алкалоиды
(включая, например, алкалоиды барвинка); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных.
[00126] Химиотерапевтические средства также включают антигормональные средства, которые действуют как регулирующие или ингибирующие гормональное воздействие на опухоли, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен и торемифен; и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалютамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных. В некоторых вариантах осуществления комбинированная терапия включает введение гормона или соответствующего гормонального средства.
[00127] Дополнительные способы лечения, которые можно использовать в сочетании с антителами против TIGIT, описанными в настоящей заявке, включают лучевую терапию, моноклональное антитело против опухолевого антигена, комплекс моноклонального антитела и токсина, Т-клеточный адъювант, трансплантацию костного мозга или использование антиген-презентирующих клеток (например, терапия дендритными клетками) или клеточных терапий. Используемый в настоящей заявке термин "клеточная терапия" относится к любой терапии, которая включает введение клеток в целях достижения желаемого терапевтического эффекта, например, для восстановления поврежденных или пересыщенных клеточных популяций или тканей взрослых или для усиления иммунного ответа против патогена или пролиферативной клетки (такой как раковая клетка). В других вариантах осуществления клеточная терапия включает введение недифференцированной клетки (такой как стволовая клетка или другая мульти- или тотипотентная клетка), способной дифференцироваться в конкретный тип клеток, необходимый для достижения желаемого терапевтического эффекта, например, восстановления поврежденных или пересыщенных клеточных популяций или тканей взрослых или усиления иммунного ответа против патогена или пролиферативной клетки (такой как раковая клетка). В некоторых вариантах осуществления антитела по
изобретению можно также вводить с инфильтрирующими опухоль Т-клетками или природными киллерами, которые необязательно были размножены или выбраны для хоуминга к опухоли ex vivo. Антитело по изобретению способствует активации этих клеток.
[00128] Предпочтительная комбинация представляет собой антитело по изобретению с вторым антителом, направленным на поверхностный антиген, предпочтительно экспрессируемый на раковых клетках по сравнению с контрольной нормальной тканью. Некоторые примеры антител, которые можно вводить в комбинированной терапии при помощи антител по изобретению для лечения злокачественного новообразования, включают Герцептин(r) (трастузумаб) против антигена HER2, Авастин(r) (бевацизумаб) против VEGF или антитела к рецептору EGF, такие как (Erbitux(r),
цетуксимаб) и Vectibix(r) (панитумумаб). Другие средства, которые можно вводить, включают антитела или другие ингибиторы любых из PD-1, PD-L1, CTLA-4, 4-1ВВ, BTLA, VISTA, TIM-3 и LAG-3; или другие ингибиторы пути передачи сигнала, например, ингибиторы mTOR и GSK3|3; и цитокины, например, интерферон-у, IL-2 и IL-15. Некоторые конкретные примеры дополнительных средств включают: ипилимумаб, пазопаниб, сунитиниб, дазатиниб, пембролизумаб, INCR024360, дабрафениб, траметиниб, атезолизумаб (MPDL3280A), рарцева, кобиметиниб и ниволумаб. Выбор второго антитела или другого средства для комбинированной терапии зависит от лечения злокачественного новообразования. Необязательно, рак тестируют на экспрессию или преимущественную экспрессию антигена для направления выбора подходящего антитела. Изотипом второго антитела предпочтительно является человеческий IgGl для промотирования эффекторных функций, таких как ADCC, CDC и фагоцитоз.
[00129] Антитела по изобретению также можно вводить с вакцинами, вызывающими иммунный ответ против злокачественного новообразования. Такой иммунный ответ усиливается антителом по изобретению. Вакцина может включать антиген, экспрессируемый на поверхности злокачественного новообразования, или его фрагмент, эффективный для индукции иммунного ответа, необязательно
связанный с молекулой-носителем.
[00130] В настоящем изобретении рассматривается применение антител против TIGIT, описанных в настоящей заявке, в сочетании с ингибиторами иммунных контрольных точек.
[00131] Огромное количество генетических и эпигенетических изменений, характерных для всех видов злокачественного новообразования, обеспечивает разнообразный набор антигенов, которые иммунная система может использовать для различения опухолевых клеток от их нормальных аналогов. В случае Т-клеток, максимальная амплитуда (например, уровни продукции или пролиферации цитокинов) и качество (например, тип генерируемого иммунного ответа, такой как картина продукции цитокинов) ответа, который инициируется с помощью распознавания антигена Т-клеточным рецептором (TCR), регулируется балансом между костимуляторными и ингибиторными сигналами (иммунными контрольными точками). В нормальных физиологических условиях иммунные контрольные точки имеют решающее значение для профилактики аутоиммунитета (то есть поддержания самоустойчивости), а также для защиты тканей от повреждений, когда иммунная система реагирует на патогенную инфекцию. Экспрессия белков иммунных контрольных точек может быть дисрегулирована опухолями как важный механизм иммуннорезистентности.
[00132] Примеры иммунных контрольных точек (лигандов и рецепторов), некоторые из которых селективно повышающе регулируются в различных типах опухолевых клеток, которые являются кандидатами для блокады, включают PD-1 (белок запрограммированной клеточной гибели 1); PD-L1 (лиганд запрограммированной клеточной гибели-1); BTLA (В и Т лимфоцитарный аттенюатор); CTLA-4 (цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный антиген 4); TIM-3 (Т-клеточный мембранный белок 3); LAG-3 (ген активации лимфоцитов 3); V-доменный иммуноглобулиновый супрессор Т-клеточной активации (VISTA); CD9 6; A2aR (аденозиновый А2а рецептор); A2bR (аденозиновый А2Ь рецептор); CD73 (экто-5'-нуклеотидаза) ; CD39 (ENTPD1, NTPDasel); Аргиназу; индоламин-пиррол 2,3-диоксигеназу (IDO); триптофан
2,3-диоксигеназу (TDO); и ингибирующие рецепторы киллеров, которые можно подразделить на два класса на основании их структурных особенностей: i) киллерные иммуноглобулин-подобные рецепторы (KIRs), и ii) лектиновые рецепторы С-типа (члены семейства трансмембранных рецепторов II типа). Другие иммунные контрольные точки, которые не были так хорошо определены, были описаны в литературе, включая как рецепторы (например, 2В4
(также известный как CD244) рецептор), так и лиганды (например, некоторые ингибиторные лиганды В7 семейства, такие В7-НЗ (также известный как CD276) и В7-Н4 (также известный как B7-S1, В7х и VCTN1)). См. Pardoll, (April 2012) Nature Rev. Cancer 12:252-64.
[00133] Настоящее изобретение предусматривает использование любого из антител против TIGIT, описанных в настоящей заявке, в сочетании с ингибиторами вышеуказанных рецепторов и лигандов иммунных контрольных точек, а также еще не описанных рецепторов и лигандов иммунных контрольных точек. В настоящее время доступны некоторые модуляторы иммунных контрольных точек, в то время как другие находятся в последней стадии разработки. Для иллюстрации, когда оно было одобрено для лечения меланомы в 2 011 году, полностью гуманизированное моноклональное антитело CTLA-4 ипилимумаб (YERVOY, Bristol-Myers Squibb) стало первым ингибитором иммунной контрольной точки, получившим официальное одобрение в США. Слитые белки, содержащие CTLA-4 и антитело
(CTLA-4-Ig, абатацепт (ORENCIA, Bristol-Myers Squibb)), использовали для лечения ревматоидного артрита, и было показано, что другие слитые белки эффективны у пациентов с трансплантацией почек, которые сенсибилизованы к вирусу Эпштейна Барра. Антитела против PD-1 находятся в стадии разработки (например, ниволумаб
(Bristol-Myers Squibb) и пембролизумаб (ламбролизумаб) (Merck)), а также антитела против PD-L1 (например, MPDL32 8 0A (Roche)). Ниволумаб и пембролизумаб показали потенциал у пациентов с меланомой, раком легких и почек.
[00134] Подобную комбинированную терапию можно использовать для лечения или профилактики инфекционных заболеваний, таких как вирусные, бактериальные, грибковые и паразитарные заболевания, расстройства и состояния, а также связанных с ними расстройств.
Например, антитело по изобретению можно комбинировать с антителом, направленным против патогена, или с вакциной против патогена, например, с паливизумабом против вируса саркомы Рауса. Вакцина может представлять собой белок патогена или его фрагмент, эффективный для индукции иммунного ответа. Антитело по изобретению усиливает иммунный ответ антитела или вакцины, направленной против патогена. Антитело по изобретению также можно вводить с Т-клетками или природными киллерными клетками, размноженными ex vivo.
[00135] Такая комбинированная терапия включает антивирусные средства, нацеленные на различные стадии жизненного цикла вируса и имеющие различные механизмы действия, включая, но не ограничиваясь этим, следующие: ингибиторы декапсидации вируса
(например, амантадин и римантидин); ингибиторы обратной транскриптазы (например, ацикловир, зидовудин и ламивудин); средства, нацеленные на интегразу; средства, которые блокируют присоединение факторов транскрипции к вирусной ДНК; средства
(например, антисмысловые молекулы), которые влияют на трансляцию
(например, фомивирсен); средства, которые модулируют функцию трансляции/рибозимов; ингибиторы протеазы; модуляторы сборки вируса (например, рифампицин); антиретровирусные средства, такие как, например, нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы
(например, азидотимидин (AZT), ddl, ddC, ЗТС, d4T); ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (например, эфавиренц, невирапин); нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы; и средства, которые предотвращают высвобождение вирусных частиц (например, занамивир и озелтамивир). Для лечения и/или профилактики некоторых вирусных инфекций (например, ВИЧ) часто необходима группа ("коктейль") противовирусных средств.
[00136] Другие противовирусные средства, предназначенные для использования в сочетании с любым из антител против TIGIT, описанных в настоящей заявке, включают, но не ограничиваются этим, следующие: абакавир, адефовир, амантадин, ампренавир, амплиген, арбидол, атазанавир, атрипла, боцепревирертет, цидофовир, комбривир, дарунавир, делавирдин, диданозин, докозанол, эдоксидин, эмтрицитабин, энфувиртид, энтекавир,
фамцикловир, фосампренавир, фоскарнет, фосфонет, ганцикловир, ибацитабин, иминовир, идоксуридин, имиквимод, индинавир, инозин, различные интерфероны (например, пегинтерферон альфа-2а), лопинавир, лоризид, маравирок, мороксидин, метизазон, нелфинавир, нексавир, пенцикловир, перимивир, плеконарил, подофиллотоксин, ралтегравир, рибавирин, ритонавир, пирамидин, саквинавир, ставудин, телоправир, тенофовир, типранавир, трифлуридин, тризивир, тромантадин, трувада, валацикловир, валганцикловир, викривирок, видарабин, вирамидин и залцитабин.
[00137] Настоящее изобретение рассматривает использование
любого из антител против TIGIT, раскрытых в настоящей заявке, в
сочетании с противопаразитарными средствами. Такие средства
включают, но не ограничиваются этим, тиабендазол, пирантел
памоат, мебендазол, празиквантел, никлозамид, битионол,
оксамникин, метриконат, ивермектин, албендазол, эфлорнитин,
меларсопрол, пентамидин, беннидазол, нифуртимокс и
нитроимидазол. Специалистам в данной области известны другие средства, которые могут оказаться полезными для лечения паразитарных расстройств.
[00138] Варианты осуществления настоящего изобретения предполагают использование любого из антител против TIGIT, раскрытых в настоящей заявке, в сочетании со средствами, полезными для лечения или профилактики бактериальных расстройств. Антибактериальные средства можно классифицировать различным образом, в том числе на основе механизма действия, на основе химической структуры и на основе спектра активности. Примеры антибактериальных средств включают средства, которые нацелены на клеточную стенку бактерий (например, цефалоспорины и пенициллины) или клеточную мембрану (например, полимиксины), или вмешиваются в действие основных бактериальных ферментов (например, сульфонамиды, рифамицины и хинолины). Большинство антибактериальных средств, которые направленно действуют на синтез белка (например, тетрациклины и макролиды), являются бактериостатическими, тогда как средства, такие как аминогликозид, являются бактерицидными. Другой способ классификации антибактериальных средств основан на их целевой
специфичности; средства "узкого спектра" нацелены на конкретные типы бактерий (например, грамположительные бактерии, такие как стрептококк), тогда как средства "широкого спектра" обладают активностью в отношении более широкого круга бактерий. Специалистам в данной области известны типы антибактериальных средств, подходящих для применения при конкретных бактериальных инфекциях.
[00139] Варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают использование любого из антител против TIGIT, описанных в настоящей заявке, в сочетании со средствами, полезными для лечения или профилактики грибковых расстройств. Противогрибковые средства включают полиены (например, амфотерицин, нистатин и пимарицин); азолы (например, флуконазол, итраконазол и кетоконазол); аллиламины (например, нафтифин и тербинафин) и морфолины (например, аморолфин); и антиметаболиты (например, 5-фторцитозин).
[00140] Настоящее изобретение охватывает фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные средств (и представителей классов средств), перечисленных выше.
[00141] Антитела против TIGIT можно использовать в сочетании с любым из вторых антител или средств, описанных для использования в совместном лечении в качестве компонентов фармацевтической композиции. В фармацевтической композиции средства могут быть объединены с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, как описано. V. Другие варианты применения
[00142] Антитела против TIGIT можно использовать для детекции TIGIT в контексте клинической диагностики или лечения или в исследованиях. Например, антитела можно использовать для детекции присутствия TIGIT на Т-клетках, природных киллерных клетках и раковых клетках в качестве признака того, что индивид страдает от злокачественного новообразования или инфекционного заболевания, поддающегося лечению. Экспрессия TIGIT на Т-клетках, природных киллерных клетках и/или раковых клетках индивида, страдающего злокачественным новообразованием или инфекционным заболеванием, также свидетельствует о том, что рак
или инфекционное заболевание поддаются лечению антителами по настоящему изобретению. Антитела также могут продаваться в качестве исследовательских реагентов для лабораторных исследований для детекции Т-клеток, природных киллерных клеток и злокачественных клеток и их реакции на различные стимулы. В таких применениях моноклональные антитела могут быть мечены флуоресцентными молекулами, спин-мечеными молекулами, ферментами или радиоизотопами и могут быть представлены в виде набора со всеми необходимыми реагентами для осуществления анализа на TIGIT. Антитела также можно использовать для очистки TIGIT, например, при помощи аффинной хроматографии. VI. Наборы
[00143] Антитела против TIGIT можно объединить с любым из
вторых антител или средств, описанных для использования в
совместном лечении в качестве компонентов набора. Изобретение,
раскрытое в настоящей заявке, предусматривает один или несколько
наборов, содержащих одно или несколько из описанных в настоящей
заявке антител, а также один или несколько фармацевтически
приемлемых эксципиентов или носителей (таких как, без
ограничения, фосфатно-солевые буферные растворы, вода,
стерильная вода, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон,
лецитин, арахисовое масло, кунжутное масло, эмульсии, такие как
эмульсии масло/вода или эмульсии вода/масло, микроэмульсии,
наноносители и различные типы смачивающих веществ). Добавки,
такие как спирты, масла, гликоли, консерванты, ароматизаторы,
красители, суспендирующие агенты и т.п., также могут быть
включены в наборы по настоящему изобретению вместе с носителем,
разбавителем или эксципиентом. В одном варианте осуществления
фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для
использования в композициях антител, описанных в настоящей заявке, является стерильным, свободным от патогенов и/или иным образом безопасным для введения индивиду без риска соответствующей инфекции и других нежелательных побочных эффектов. В наборе соответствующие вещества могут быть представлены в отдельных флаконах с инструкциями для комбинирования и последующего введения или с инструкциями для
отдельного введения. Набор может также включать письменные инструкции для правильной манипуляции и хранения любых антител против TIGIT, описанных в настоящей заявке.
[00144] Предполагается, что каждое максимальное числовое ограничение, приведенное в настоящем описании, включает каждое более низкое числовое ограничение, как если бы такие более низкие числовые ограничения были явно указаны в настоящей заявке. Каждое минимальное числовое ограничение, приведенное в настоящем описании, будет включать все более высокие числовые ограничения, как если бы такие более высокие числовые ограничения были явно указаны в настоящей заявке. Каждый численный диапазон, указанный в настоящем описании, будет включать в себя все более узкие числовые диапазоны, которые попадают в такой более широкий численный диапазон, как если бы такие более узкие числовые диапазоны были явно указаны в настоящей заявке.
[00145] Все патентные заявки, веб-сайты, другие публикации, номера доступа и т.п., на которые ссылаются выше или ниже, включены в качестве ссылки во всей их полноте для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была специально и индивидуально указана для ее включения посредством ссылки. Если разные версии последовательности связывают с номером доступа в разное время, имеется в виду версия, связанная с номером доступа на действующую дату подачи настоящей заявки. Действующая дата подачи означает более раннюю, чем фактическая дата подачи, или дату подачи приоритетной заявки, ссылающейся на номер доступа, если это применимо. Подобным образом, если разные версии публикации, веб-сайта или т.п. опубликованы в разное время, имеется в виду версия, которая была недавно опубликована на действующую дату подачи заявки, если не указано иное. Любой признак, стадия, элемент, вариант осуществления или аспект изобретения можно использовать в сочетании с любым другим, если специально не указано иное.
[00146] Хотя настоящее изобретение было описано достаточно подробно при помощи иллюстрации и примера для ясности и понимания, будет очевидно, что определенные изменения и
модификации могут быть реализованы в рамках прилагаемой формулы изобретения.
ПРИМЕРЫ
[00147] В следующих примерах обсуждается получение, описание и гуманизирование моноклональных антител против человеческого TIGIT, а также представлены иллюстративные способы, при помощи которых можно определить характеристики связывания антител, описанных в настоящей заявке.
Пример 1: Экспрессия рекомбинантных человеческих белков
TIGIT
[0014 8] Клонирование генов, мутагенез и конструирование плазмиды в этой работе осуществляли с использованием стандартных методов молекулярной биологии, таких, которые описаны в Sambrook and Russel {Molecular Cloning,. A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), Kostelny et al. (Int. J. Cancer 93:556-565, 2001) и Cole et al. (J. Immunol. 159:3613-3621, 1997).
[00149] Вектор экспрессии млекопитающего pFCm404 (Фиг.1) для продукции внеклеточной области человеческого TIGIT, слитой с Fc областью yl цепи человеческого иммуноглобулина (hTIGIT-Fc; SEQ ID N0:59), содержит следующие генетические компоненты. По направлению часовой стрелки от Sail сайта pFCm404 на Фиг.1, плазмида содержит транскрипционную единицу для hTIGIT-Fc, начиная с главного предраннего промотора и энхансера (CMV-P на Фиг.1) из цитомегаловируса человека (CMV). После CMV промотора следуют кодирующие области сигнального пептида (sp; SEQ ID N0:2), внеклеточная область человеческого TIGIT (hTIGIT; SEQ ID N0:3), полипептидный линкер (SEQ ID N0:4) и человеческая yl Fc область (SEQ ID N0:5), а затем следует сайт полиаденилирования гена yl тяжелой цепи человека. После hTIGIT-Fc гена следуют SV40 ранний промотор (SV4 0-P), ген пуромицин N-ацетил-трансферазы (puro) для резистентности к пуромицину и сегмент, содержащий SV4 0 сайт полиаденилирования (SV4 0-A). И наконец, pFCm4 04 содержит часть плазмиды pUC19, включающую бактериальную точку начала репликации (pUC ori) и ген |3 лактамазы (|3 лактамаза) .
Стрелки на Фиг.показывают ориентацию транскрипции.
Соответствующие сайты для рестрикционных ферментов показаны на чертежах.
[00150] Кодирующую область внеклеточной области человеческого TIGIT в pFCm404 заменяли ДНК фрагментом, кодирующим внеклеточную область человеческого CD155 (hCD155; SEQ ID N0:6), что приводило к образованию нового вектора экспрессии pFCm406 (Фиг.1). Внеклеточную область человеческого CD155, слитую с человеческой yl Fc областью (hCD155-Fc; SEQ ID N0:7), экспрессировали из pFCm406.
[00151] Кодирующую область yl Fc области между Agel и EagI сайтами в pFCm4 04 заменяли ДНК фрагментом, кодирующим FLAG пептид (FLAG; SEQ ID:8), с последующим сигналом связывания гликозилфосфатидилинозита человеческого CD55 (GPI; SEQ ID:9), что приводило к образованию нового вектора экспрессии pFCm4 07 (Фиг.1). Внеклеточную область человеческого TIGIT, слитую с FLAG и GPI (hTIGIT-GPI)-кодируемым pFCm406, экспрессировали на клеточной поверхности.
[00152] Для получения клеточных линий, стабильно продуцирующих hTIGIT-Fc и hCD155-Fc в культуральных супернатантах, векторы экспрессии pFCm404 и pFCm406, соответственно, вводили в хромосому мышиной миеломной клеточной линии NS0 (European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK) . NS0 клетки выращивали в DME среде, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), при 37°С в 7,5% С02 инкубаторе. Стабильную трансфекцию в NS0 осуществляли путем электропорации, как описано в Bebbington et al. {Bio/Technology 10: 169-175, 1992). Перед трансфекцией векторы экспрессии линеализировали с использованием Fspl. Примерно 107 клеток трансфицировали при помощи 10 мкг линеализированной плазмиды, суспендировали в DME среде, содержащей 10% FBS, и высевали в несколько 9б-луночных планшетов. Через 24 часа наносили селективную среду (DME среда, содержащая 10% FBS и 3 мкг/мл пуромицина). Примерно через 10 дней после начала селекции культуральные супернатанты анализировали на продукцию Fc слитых
белков методом ELISA с использованием козлиного антитела против человеческой гамма цепи для покрытия и HRP-конъюгированного козлиного антитела против человеческой гамма цепи для детекци Fc слитых белков.
[00153] NS0 стабильные трансфектанты, продуцирующие высокие уровни Fc слитых белков, адаптировали к Гибридома-SFM среде и размножали в ней (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) и выращивали до истощения в роллерных флаконах. После центрифугирования и фильтрации культуральный супернатант загружали на колонку с белком-А-сефарозой (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Колонку промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), затем Fc слитые белки элюировали с использованием 0,1 М глицина-HCl (рН 3,0) . После нейтрализации при помощи 1 М Tris-HCl (рН 8) буфер элюируемых Fc слитых белков обменивали на PBS путем диализа.
[00154] Для получения клеточных линий, экспрессирующих hTIGIT-GPI на поверхности, вектор экспрессии pFCm407 стабильно трансфицировали в NS0 клетки. Экспрессию hTIGIT-GPI на клеточной поверхности контролировали методом проточной цитометрии с использованием крысиного анти-FLAG моноклонального антитела и РЕ-меченного козлиного анти-крысиного IgG, Fc-специфического антитела. NS0 клеточные линии, экспрессирующие высокие уровни hTIGIT-GPI на клеточной поверхности (NSO-hTIGIT), использовали для скрининга анти-TIGIT антител.
Пример 2: Генерирование и характеризация анти-TIGIT моноклональных антител
[00155] Мышиные гибридомы, продуцирующие анти-человеческие TIGIT моноклональные антитела, получали на JN Biosciences (Mountain View, СА) с использованием стандартной гибридомной технологии, такой как GenomONE CF EX Cell Fusion Reagent (Cosmo Bio, Carlsbad, СА) . В качестве иммуногенов использовали человеческие TIGIT-Fc слитые белки и NSO-hTIGIT клетки.
[00156] Мышиные антитела, секретированные в культуральных супернатантах гибридомных клеток, подвергали серии скринингов для идентификации антител со следующими свойствами: (1) связывание с очищенным hTIGIT-Fc слитым белком, (2) связывание с
NSO-hTIGIT клетками, (3) не связывание с NS0 клетками, (4) связывание с CD3+ Т-клетками, происходящими из фитогемаглютинин-обработанных мононуклеарных клеток периферической крови человека, и (5) блокирование связывания hCD155-Fc слитого белка с NSO-hTIGIT клетками. Первое свойство связывания с hTIGIT-Fc испытывали методом ELISA с использованием HRP-конъюгированных козлиных антител против мышиных каппа и лямбда легких цепей
(SouthernBiotech, Birmingham, AL) для идентификации мышиных анти-TIGIT антител. Второе, третье и четвертое свойства исследовали методом проточной цитометрии с использованием РЕ-меченного козлиного анти-мышиная гамма цепь антитела
(SouthernBiotech) для детекции связанных с клетками мышиных антител. Пятое свойство анализировали методом проточной цитометрии, как описано ниже. Было обнаружено, что три мышиных моноклональных антитела (TIG1, TIG2 и TIG3) обладают всеми из этих пяти свойств. TIG1, TIG2 и TIG3 моноклональные антитела очищали из культурального супернатанта гибридомных клеток колоночной хроматографией с белком А, как описано выше. Изотипы TIG1, TIG2 и TIG3 представляют собой мышиные IgG2b/Kanna, IgG2a/Kanna и IgG2a/Kanna, соответственно.
[00157] Активность TIG1, TIG2 и TIG3 для блокирования взаимодействия между TIGIT и CD155 анализировали методом проточной цитометрии. NSO-hTIGIT клетки инкубировали с суб-насыщающей концентрацией hCD155-Fc в присутствии (или в отсутствие) различных концентраций анти-TIGIT моноклонального антитела в качестве конкурента. Детекцию hCD155-Fc, связанных с NSO-hTIGIT клетками, осуществляли с использованием DyLight488-меченного козлиного анти-человекого IgG, Fc-специфического антитела (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) . Как показано на Фиг.2, TIG1, TIG2 и TIG3 ингибировали связывание hCD155-Fc с NSO-hTIGIT клетками дозо-зависимым образом. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC50) для блокирования взаимодействия между hCD155-Fc и NSO-hTIGIT клетками составляла 49 нг/мл для TIG1, 197 нг/мл для TIG2 и 460 нг/мл для TIG3. Концентрация антител, необходимая для блокирования более чем 95% связывания CD155 с TIGIT, составляла 0,63 мкг/мл для TIG1, 1,25 мкг/мл для
TIG2 и 2,5 мкг/мл для TIG3.
Пример 3: V генное секвенирование анти-TIGIT моноклональных антител
[00158] Определение последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей (VH и VL, соответственно) мышиных анти-TIGIT антител осуществляли, следуя процедурам, описанным в Tsurushita et al (Methods 36:69-83, 2005). Тотальную РНК экстрагировали из примерно 107 клеток с использованием TRIzol реагента (Invitrogen, Carlsbad, СА) в соответствии с протоколом поставщика. Олиго dT-примированную кДНК для 5'-RACE синтезировали с использованием набора для кДНК амплификации SMARTer RACE
(Clontech, Mountain View, СА) , следуя протоколу поставщика. кДНК VH и VL амплифицировали при помощи полимеразной цепной реакции
(ПЦР), используя Phusion ДНК полимеразу (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) , с использованием 3' праймеров, которые специфически гибридизуются с мышиными константными областями тяжелой или легкой цепи (Tsurushita et al., supra), соответственно, и 5' праймера, обеспечиваемого в наболе SMARTer RACE для кДНК амплификации. Амплифицированные VH и VL гены клонировали с использованием набора для клонирования CloneJet PCR (Thermo Fisher Scientific) и подвергали секвенированию с праймерами, представленными в наборе для клонирования CloneJet PCR. Несколько VH и VL клонов секвенировали и идентифицировали уникальные последовательности, гомологичные типичным мышиным вариабельным областям тяжелой и легкой цепи.
[00159] Аминокислотная последовательность зрелой VH TIG1
(SEQ ID N0:10) показана на Фиг.3. Аминокислотные последовательности CDR1, 2 и 3 областей TIG1 VH представляют собой NFGMH (SEQ ID N0:11), FISSGSSSIYYADTVKG (SEQ ID N0:12) и MRLDYYAMDY (SEQ ID N0:13), соответственно.
[00160] Аминокислотная последовательность зрелой VL TIG1
(SEQ ID N0:14) показана на Фиг.4. Аминокислотные последовательности CDR1, 2 и 3 областей TIG1 VL представляют собой RASKSISKYLA (SEQ ID N0:15), SGSTLQS (SEQ ID N0:16) и QQHNEYPWT (SEQ ID N0:17), соответственно.
[00161] Аминокислотная последовательность зрелой VH TIG2 (SEQ ID N0:18) показана на Фиг.5. Аминокислотные последовательности CDR1, 2 и 3 областей TIG2 VH представляют собой EYTMH (SEQ ID N0:19), GINPNNGGTSYNQKFKG (SEQ ID N0:20) и PGWYNYAMDY (SEQ ID N0:21), соответственно.
[00162] Аминокислотная последовательность зрелой VL TIG2 (SEQ ID N0:22) показана на Фиг.6. Аминокислотные последовательности CDR1, 2 и 3 областей TIG2 VL представляют собой KASQGVSTAVA (SEQ ID N0:23), SASYRYT (SEQ ID N0:24) и QQHYITPWT (SEQ ID N0:25), соответственно.
[00163] Аминокислотная последовательность зрелой VH TIG3 (SEQ ID N0:2 6) показана на Фиг.7. Аминокислотные последовательности CDR1, 2 и 3 областей TIG3 VH представляют собой DYDMS (SEQ ID N0:27), YISDGGYNTYYPDTVKG (SEQ ID N0:28) и QILLRYYFDY (SEQ ID N0:29), соответственно.
[00164] Аминокислотная последовательность зрелой VL TIG3 (SEQ ID N0:30) показана на Фиг.8. Аминокислотные последовательности CDR1, 2 и 3 областей TIG3 VL представляют собой KSSQSLLYSSNQKNYLA (SEQ ID N0:31), WASTRES (SEQ ID N0:32) и QQYHSYPWT (SEQ ID N0:33), соответственно.
[00165] Присвоение CDR последовательностей и нумерация положений аминокислот на Фиг.3-8 представлены в соответствии с Кэбат et al. (1991). Последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 подчеркнуты на чертежах.
Пример 4: Конструирование и экспрессия гуманизированного TIG1 антитела
[00166] Гуманизацию VH и VL TIG1 осуществляли, как описанно в Queen et al. {Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:10029-10033, 1989), следуя процедурам Tsurushita et al. (Methods 36:69-83, 2 0 05). Вкратце, трехмерную молекулярную модель вариабельных областей TIG1 сначала конструировали с использованием алгоритма, разработанного JN Biosciences. Затем идентифицировали каркасные аминокислотные остатки, важные для образования структуры определяющих комплементарность областей (CDR) TIG1 с использованием молекулярной модели. Параллельно этому, выбирали кДНК-происходящие аминокислотные последовательности человеческих
VH и VL с высокой гомологией с TIG1 VH и VL, соответственно. И наконец, осуществляли прививку последовательностей CDR вместе с каркасными аминокислотными остатками, важными для поддержания CDR структуры, из TIG1 VH и VL в соответствующие выбранные человеческие каркасные последовательности.
[00167] Аминокислотная последовательность сконструированной гуманизированной TIG1 VH (HuTIGl VH) представляет собой MDSRLNLVFLVLILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGL EWVAFISSGSSSIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYW GQGTMVTVSS (SEQ ID N0:34). Аминокислотная последовательность зрелой HuTIGl VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIY YADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVSS
(SEQ ID N0:35) начинается в положении 20 в SEQ ID N0:34.
[00168] Аминокислотная последовательность сконструированной гуманизированной TIG1 VL (HuTIGl VL) представляет собой MRFQVQVLGLLLLWISGAQCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAP KLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIK
(SEQ ID N0:36). Аминокислотная последовательность зрелой HuTIGl VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID N0:37), начинается в положении 21 в SEQ ID N0:36.
[00169] Ген, кодирующий HuTIGl VH, синтезировали в виде экзона, включающего сигнал донора сплайсинга на 3' конце кодирующей области, Spel сайт на 5' конце фрагмента и HindiII сайт на 3' конце фрагмента. Нуклеотидная последовательность синтетического HuTIGl VH гена, фланкированная Spel и Hindlll сайтами (SEQ ID N0:38), показана вместе с предсказанной аминокислотной последовательностью (SEQ ID N0:34) на Фиг.9А.
[00170] Ген, кодирующий HuTIGl VL, синтезировали в виде экзона, включающего сигнал донора сплайсинга на 3' конце кодирующей области, Nhel сайт на 5' конце фрагмента и EcoRI сайт на 3' конце фрагмента. Нуклеотидная последовательность синтетического HuTIGl VL гена, фланкированная Nhel и EcoRI
сайтами (SEQ ID N0:39), показана вместе с предсказанной аминокислотной последовательностью (SEQ ID N0:36) на Фиг.9В.
[00171] Вектор экспрессии млекопитающего pH.uTIGl.AA
(Фиг.10) для продукции гуманизированной IgGl/каппа формы мышиного моноклонального античеловеческого антитела к TIGIT, TIG1 (HuTIGl-IgGl.АА) , был сконструирован как содержащий следующие генетические компоненты. По направлению часовой стрелки от Sail сайта на Фиг.10, вектор содержит транскрипционную единицу тяжелой цепи, начиная с главного предраннего промотора и энхансера из цитомегаловируса человека
(CMV) (CMV-P на Фиг.) для инициации транскрипции гена тяжелой цепи антитела. После CMV промотора следует экзон, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи гуманизированной формы TIG1, фланкированный Spel и HindiII сайтами (HuTIGl VH), геномная последовательность, содержащая человеческие константные области yl тяжелой цепи, включая экзоны СН1, шарнирной области, СН2 и СНЗ с промежуточными интронами, и сайт полиаденилирования человеческого гена тяжелой yl цепи. СН2 область, кодируемая в pHuTIGl.AA, содержит замены аминокислот на аланиновые остатки в положениях 234 и 235 (Ей нумерация) (L234A/L235A) для элиминации эффекторных функций (Hezareh et al. , J. Virol. 75:12161-12168, 2001). После последовательности гена тяжелой цепи транскрипционная единица легкой цепи начинается с CMV промотора и энхансера (CMV-P), с последующим экзоном, кодирующим вариабельную область легкой цепи гуманизированной формы TIG1, фланкированным Nhel и EcoRI сайтами (HuTIGl VL), геномной последовательностью, содержащей человеческий экзон константной области каппа цепи (Ск) с предшествующей ему частью интрона, и сайтом полиаденилирования человеческого гена каппа цепи после Ск экзона. Затем после гена легкой цепи следует ранний промотор SV40 (SV40-P), ген пуромицин N-ацетил-трансферазы (puro) для резистентности к пуромицину, и сегмент, содержащий сайт полиаденилирования SV40 (SV40-A). И наконец, pHuTIGl.AA содержит часть плазмиды pUC19, включающую бактериальную точку начала репликации (pUC ori) и ген |3 лактамазы (|3 лактамаза) . Стрелки на
Фиг.показывают ориентацию транскрипции.
[00172] Аминокислотная последовательность зрелой тяжелой гамма цепи HuTIGl-IgGl.АА, кодируемой в pHuTIGl.AA, представляет собой
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIYYADTV KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К (SEQ ID N0:40).
[00173] С-концевой лизин может присутствовать или не присутствовать.
[00174] Аминокислотная последовательность зрелой легкой каппа цепи HuTIGl-IgGl.АА, кодируемой в pHuTIGl.AA, представляет собой
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:41).
[00175] Вектор экспрессии pHuTIGl.AA вводили в хромосомы в
клеточной линии СН0-К1 яичников китайского хомячка (АТСС,
Manassas, VA) для получения клеточных линий, стабильно
продуцирующих HuTIGl-IgGl.АА. СНО-К1 клетки выращивали в SFM4CHO
среде (GE Healthcare Life Sciences, Logan, UT) при 37°C в 7,5%
C02 инкубаторе. Стабильную трансфекцию в СНО-К1 осуществляли
путем электропорации. Перед трансфекцией pHuTIGl.AA
линеализировали с использованием Fspl. В типичном эксперименте примерно 107 клеток трансфицировали при помощи 2 0 мкг линеализированной плазмиды, суспендировали в SFM4CHO среде и высевали при 100 мкл/лунка в несколько 9б-луночных планшетов после соответствующих разведений клеток. Через 4 8 часов добавляли SFM4CHO среду, содержащую 2 0 мкг/мл пуромицина, при 100 мкл/лунка для выделения стабильных трансфектантов. Примерно
через десять дней после начала селекции культуральные супернатанты трансфектантов анализировали на продукцию антител.
[00176] Экспрессию HuTIGl-IgGl.АА измеряли сэндвич-методом ELISA. В типичном эксперименте ELISA планшет покрывали козлиным анти-человеким IgG Fc-специфическим поликлональным антителом, промывали промывочным буфером (PBS, содержащий 0,05% Tween 20) и блокировали ELISA Буфером (PBS, содержащий 2% снятого молока и 0,05% Tween 20). После промывки промывочным буфером испытываемые образцы, соответствующим образом разведенные в ELISA Буфере, наносили на ELISA планшет. Соответствующее гуманизированное IgGl/к антитело использовали в качестве стандарта. После инкубации ELISA планшета в течение 1 часа при комнатной температуре и промывки промывочным буфером, связанные антитела определяли с использованием HRP-конъюгированного козлиного поликлонального антитела к каппа цепи человека. После инкубации планшета в течение 0,5 часа при комнатной температуре и промывки промывочным буфером инициировали проявление цвета путем добавления 100 мкл/лунка ABTS субстрата (Sigma-Aldrich) и останавливали при помощи 100 мкл/лунка 2% щавелевой кислоты. Поглощение считывали при 4 05 нм.
[00177] СНО-К1 стабильные трансфектанты, продуцирующие высокие уровни HuTIGl-IgGl.АА, увеличивали в объеме в SFM4CHO до тех пор, пока клеточная жизнеспособность не становилась меньше чем 50%. После центрифугирования и фильтрации культуральные супернатанты загружали на колонку с Белком A (HiTrap MABSelect SuRe, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Колонку промывали при помощи PBS, затем антитело элюировали с использованием 0,1 М глицин-НС1 (рН 3,0) . Буфер элюируемых антител нейтрализовали при помощи 1 М Tris-HCl (рН 8) и затем обменивали с PBS путем диализа. Концентрацию антител определяли путем измерения поглощения при 280 нм (1 мг/мл=1,4 OD).
Пример 5: Характеристика HuTIGl-IgGl.АА
[00178] Связывание HuTIGl-IgGl.АА с человеческим TIGIT исследовали методом ELISA. ELISA планшет покрывали 5 мкг/мл hTIGIT-Fc в PBS (100 мкл/лунка) при 4°С в течение ночи, промывали
промывочным буфером (PBS, содержащий 0,05% Tween 20) и блокировали при помощи 2 00 мкл/лунка SuperBlock блокирующего буфера (Thermo Fisher Scientific). После промывки лунок промывочным буфером добавляли HuTIGl-IgGl.АА, начиная с 2,5 мкг/мл и серийных 2-кратных разведений в SuperBlock блокирующем буфере, для связывания со связанным на планшете человеческим TIGIT. После инкубации ELISA планшета в течение 1 часа при комнатной температуре и промывки промывочным буфером связанные антитела определяли с использованием 100 мкл/лунка HRP-конъюгированного козлиного поликлонального антитела против человекой каппа цепи (Southern Biotech), 1/2000-разбавленного в ELISA Буфере. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре и промывки промывочным буфером инициировали проявление цвета с использованием 100 мкл/лунка ABTS субстрата и останавливали при помощи 100 мкл/лунка 2% щавелевой кислоты. Поглощение считывали при 4 05 нм. Как показано на Фиг.11, HuTIGl-IgGl.AA связывались с человеческий TIGIT дозо-зависимым образом. Полумаксимальная эффективная концентрация (ЕС50) HuTIGl-IgGl.АА для связывания с TIGIT составила 65 нг/мл. Это показывает, что HuTIGl-IgGl.АА представляет собой хорошее связующее для человеческого TIGIT.
[00179] Связывание HuTIGl-IgGl.АА с человеческим TIGIT также исследовали методом проточной цитометрии. NSO-hTIGIT клетки (8x105 клеток) инкубировали в 160 мкл FACS Буфера (PBS, содержащий 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% азида натрия) в присутствии (или в отсутствие) различных концентраций HuTIGl-IgGl.АА, начиная с 10 мкг/мл и серийных 2-кратных разведений, в течение 2 0 минут при 4°С. После промывки FACS Буфером связывание HuTIGl-IgGl.АА на NSO-hTIGIT клетках определяли с использованием РЕ-меченного козлиного античеловеческого IgG антитела в FACS буфере. После инкубации в течение 2 0 минут и промывки FACS Буфером клетки подвергали проточной цитометрии с использованием FACScan проточного цитометра (BD Biosciences, San Jose, СА) для получения среднеканальной флуоресценции (MCF) при каждой концентрации
антител. Фиг.12 показывает график MCF (вертикальная ось) при каждой концентрации антител (горизонтальная ось) . ЕС50 значение составляло 60 нг/мл. Это показывает, что HuTIGl-IgGl.АА представляет собой хорошее связующее для человеческого TIGIT, экспрессируемого на клеточной поверхности.
[00180] Активность HuTIGl-IgGl.АА для блокирования
взаимодействия между человеческим TIGIT и человеческим CD155
анализировали методом проточной цитометрии с использованием NSO-
hTIGIT клеток. NSO-hTIGIT клетки (106 клеток) инкубировали с суб-
насыщающей концентрацией (125 нг/мл) FITC-меченных hCD155-Fc
слитых белкой (hCD155-Fc-FITC) в 200 мкл FACS Буфера в
присутствии (или в отсутствие) различных концентраций HuTIGl-
IgGl.AA, начиная с 10 мкг/мл и серийных 2-кратных разведений, в
течение 20 минут при 4°С. После промывки FACS Буфером NSO-hTIGIT
клетки подвергали проточной цитометрии с использованием FACScan
проточного цитометра (BD Biosciences, San Jose, СА) . Для
исследования связывания hCD155-Fc-FITC на клетках получали MCF
при каждой концентрации антител. Как показано на Фиг.13, HuTIGl-
IgGl.AA блокировали взаимодействи между hCD155-Fc-FITC и TIGIT
на клеточной поверхности дозозависимым образом. Полумаксимальная
ингибирующая концентрация (IC50) HuTIGl-IgGl.АА для блокирования
TIGIT-CD155 взаимодействи составляла 67 нг/мл. Это показывает,
что HuTIGl-IgGl.АА является эффективным блокатором
взаимодействия между CD155 и TIGIT.
Пример 6: Конструирование и экспрессия гуманизированного TIG3 антитела
[00181] Гуманизацию VH и VL TIG3 осуществляли, следуя общей
процедуре, описанной в Примере 4. Аминокислотная
последовательность сконструированной гуманизированной VH TIG3
(HuTIG3 VH) представляет собой
MNFGLRLIFLVLTLKGVNCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGL
EWVAYISDGGYNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYW
GQGTTVTVSS (SEQ ID N0:42). Аминокислотная последовательность
зрелой VH HuTIG3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTYYPDTV
KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID N0:43) начинается в положении 20 в SEQ ID N0:42.
[00182] Аминокислотная последовательность сконструированной
гуманизированной VL TIG3 (HuTIG3 VL) представляет собой
MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQ
KPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGT
KVEIK (SEQ ID N0:44). Аминокислотная последовательность зрелой
VL HuTIG3
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID
N0:45), начинается в положении 21 в SEQ ID N0:44.
[00183] Ген, кодирующий HuTIG3 VH, синтезировали в виде экзона, включающего сигнал донора сплайсинга на 3' конце кодирующей области, Spel сайт на 5' конце фрагмента и HindiII сайт на 3' конце фрагмента. Нуклеотидная последовательность синтетического гена HuTIG3 VH (SEQ ID N0:46) показана вместе с предсказанной аминокислотной последовательностью (SEQ ID N0:42) на Фиг.14А.
[00184] Ген, кодирующий гуманизированную VL TIG3 (HuTIG3
VL) , синтезировали в виде экзона, включающего сигнал донора
сплайсинга на 3' конце кодирующей области, Nhel сайт на 5' конце
фрагмента и EcoRI сайт на 3' конце фрагмента. Нуклеотидная
последовательность синтетического HuTIG3 VL гена (SEQ ID N0:47)
показана вместе с предсказанной аминокислотной
последовательностью (SEQ ID N0:44) на Фиг.14В.
[00185] Вектор экспрессии млекопитающего pHuTIG3.AA для продукции гуманизированной IgGl/каппа формы моноклонального антитела TIG3 против человеческого TIGIT (HuTIG3-IgGl.АА) конструировали путем модификации pHuTIGl.AA следующим образом:
(1) HuTIGl VH ген заменяли HuTIG3 VH геном между Spel и HindiII сайтами, и (2) HuTIGl VL ген заменяли HuTIG3 VL геном между Nhel и EcoRI сайтами. СН2 область, кодируемая в pHuTIG3.AA, содержит замены аминокислот на аланиновые остатки в положениях 2 34 и 2 35
(Ей нумерация) (L234A/L235A) для элиминирования эффекторных функций.
Аминокислотная последовательность зрелой тяжелой гамма цепи HuTIG3-IgGl.АА, кодируемой в pH.uTIG3.AA, представляет собой EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTYYPDTV KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К (SEQ ID N0:48)
[00187] С-концевой лизин может присутствовать или не присутствовать.
[00188] Аминокислотная последовательность зрелой легкой каппа цепи HuTIG3-IgGl.АА, кодируемой в pHuTIG3.AA, представляет собой
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:49).
[00189] Транзиентную трансфекцию pHuTIG3.AA в 100 мл экспоненциально растущих Expi2 93 клеток (Thermo Fisher Scientific) осуществляли в соответствии с протоколом поставщика. СН0-К1 стабильные трансфектанты, продуцирующие высокие уровни HuTIG3-IgGl.АА, также получали путем электропорации pHuTIG3.AA, как описано выше, и увеличивали в объеме в SFM4CH0 до тех пор, пока клеточная жизнеспособность не становилась меньше чем 50%. HuTIG3-IgGl.АА очищали из культуральных супернатантов каждых транзиентно трансфицированных Expi2 93 клеток и стабильно трансфицированных СН0-К1 клеток на аффинной колонке с белком А, как описано выше.
Пример 7: Характеристика HuTIG3-IgGl.АА
[00190] Связывание HuTIG3-IgGl.АА с человеческим TIGIT исследовали методом ELISA, как описано в Примере 5. Как показано на Фиг.15, HuTIG3-IgGl.АА связывается с человеческим TIGIT дозо-зависимым образом. Полумаксимальная эффективная концентрация (ЕС50) HuTIG3-IgGl.АА для связывания с TIGIT составила 85 нг/мл.
Это показывает, что HuTIG3-IgGl.АА представляет собой хорошее связующее для человеческого TIGIT.
[00191] Связывание HuTIG3-IgGl.АА с человеческим TIGIT также исследовали методом проточной цитометрии, как описано в Примере 5. Как показано на Фиг.12, HuTIG3-IgGl.АА связывается с человеческим TIGIT дозозависимым образом. Полумаксимальная эффективная концентрация (ЕС50) HuTIG3-IgGl.АА для связывания с TIGIT составила 370 нг/мл. Это показывает, что HuTIG3-IgGl.АА представляет собой хорошее связующее для человеческого TIGIT.
[00192] Активность HuTIG3-IgGl.АА для блокирования
взаимодействия TIGIT с CD155 анализировали методом проточной
цитометрии с использованием NSO-hTIGIT клеток и FITC-меченного
hCD155-Fc, как описано в Примере 5. Как показано на Фиг.13,
HuTIG3-IgGl.АА блокирует взаимодействие между TIGIT и CD155
дозозависимым образом. Полумаксимальная ингибирующая
концентрация (IC50) HuTIG3-IgGl.АА для блокирования TIGIT-CD155 взаимодействия составляла 279 нг/мл. Это показывает, что HuTIG3-IgGl.AA является эффективным блокатором взаимодействия между CD155 и TIGIT.
Пример 8: Ответ IL-2 цитокинов на столбнячный анатоксин в человеческих Т-клетках усиливается посредством блокады TIGIT
[00193] Способность мышиных анти-TIGIT антител усиливать
антиген-специфические Т-клеточные ответы исследовали с
использованием in vitro анализа антиген-специфического ответа на
столбнячный анатоксин (см., например, Piersma et al., Vaccine.
2006 Apr 12;24 (16) :3076-83; Zaunders et al. , J Immunol. 2009 Aug
15;183(4):2827-36). Достаточная вакцинная защита для
столбнячного анатоксина достигается при помощи бустер-инъекций, которые позволяют иммунной системе индуцировать ответы CD4+ и CD8+ Т-клеток памяти. В качестве суррогатного показателя эффективности (см., например, Plotkin et al., Clin Vaccine Immunol. 2010 Jul; 17(7): 1055-1065; Goulon et al. Nov. 1972 Presse Med. 1:3049-3050.), уровни в сыворотке 0,1 МЕ/мл анатоксина против столбняка указывают на поддержание иммунного ответа.
[00194] Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs)
от людей-добровольцев, вакцинированных столбнячным анатоксином, получали (iQ Biosciences) с подтверждением титра столбняка в крови добровольцев выше чем 1,0 МЕ/мл методом ELISA (Genway). 800000 PBMCs культивировали в RPMI 1640 среде (Invitrogen), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), в 9б-луночных круглодонных планшетах (Nunc). 2 мкг/мл столбнячного анатоксина (List Biological Laboratories) добавляли в лунки, содержащие PBMCs, в присутствии мышиного анти-PD-l антитела (Biolegend, клон ЕН12.2Н7) или анти-TIGIT антитела (TIG1) при 3,3 мкг/мл или 10 мкг/мл в течение 4 дней при 37°С в 5% С02 инкубаторе. В качестве контроля, 2 мкг/мл столбнячного анатоксина добавляли к РВМС без каких-либо антител. Супернатанты из культивированных лунок собирали и измеряли содержание цитокинов, указывающих на Т-клеточную активацию, IL-2, путем мультиплексного анализа на микросферах (BD Pharmingen, СВА Thl/Th2 Cytokine Kit) методом проточной цитометрии (BD FACSCalibur). Как показано на Фиг.16, продукция IL-2 при стимуляции только столбнячным анатоксином составила 31 пг/мл. Продукция IL-2 еще больше повышалась до 70 пг/мл и 8 6 пг/мл в присутствии мышиного анти-TIGIT антитела TIG1 при 3,3 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно. Продукция IL-2 при стимуляции столбнячным анатоксином также повышалась до 3 9 пг/мл и 57 пг/мл в присутствии мышиного анти-PD-l антитела ЕН12.2Н7 при 3,3 мкг/мл и 10 мкг/мл, соответственно. Эти данные показывают, что TIG1 обладает функциональной способностью усиливать антиген-специфические ответы Т-клеточных цитокинов.
Пример 9: Пролиферативный ответ Т-клеток человека на столбнячный анатоксин усиливается посредством блокады TIGIT
[00195] Способность мышиных анти-TIGIT антител усиливать антиген-специфические Т-клеточные ответы исследовали с использованием in vitro анализа антиген-специфического ответа на столбнячный анатоксин (см., например, Piersma et al., Vaccine. 2006 Apr 12;24 (16) :3076-83; Zaunders et al., J Immunol. 2009 Aug 15;183(4):2827-36). РВМС от людей-добровольцев, вакцинированных столбнячным анатоксином, получали (iQ Biosciences) как описано в Примере 8. РВМС метили карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловым
эфиром (CFSE) (ThermoFisher) , представляющим собой реагент, используемый для in vitro и in vivo мечения клеток для отслеживания нескольких поколений с использованием разведения красителя методом проточной цитометрии. 250000 CFSE-меченные PBMCs культивировали в AIM-V среде (Invitrogen) в 9б-луночных круглодонных планшетах (Nunc). 2 мкг/мл столбнячного анатоксина (Astarte Biologies, LLC) добавляли в каждую лунку в присутствии мышиного анти-PD-l антитела (Biolegend клон ЕН12.2Н7) или TIG1 при 2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл или 10 мкг/мл в каждой лунке. Клетки инкубировали в течение 4 дней при 37°С в 5% С02 инкубаторе. В День 4 IL-2 [50 единиц/мл] (Peprotech) добавляли к культурам, а в День б PBMCs собирали для измерений пролиферации методом проточной цитометрии (BD FACSCalibur) для определения разбавления CFSE на CD4+ Т-клетках или CD8+ Т-клетках.
[00196] Как показано на Фиг.17 (верхние панели), столбнячный анатоксин индуцировал пролиферацию 4,5% и 6,5% человеческих CD4+ Т-клеток, полученных от доноров 1 и 2, соответственно. Добавление TIG1 еще больше повышало CD4+ Т-клеточную пролиферацию при всех испытываемых концентрациях антител (2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл и 10 мкг/мл), при этом подобные пролиферативные эффекты наблюдали с анти-PD-l антителом при этих диапазонах доз.
[00197] Как показано на Фиг.17 (нижние панели), столбнячный анатоксин индуцировал пролиферацию 15% и 15,5% человеческих CD8+ Т-клеток, полученных от доноров 1 и 2 соответственно. Добавление TIG1 еще больше повышало CD8+ Т-клеточную пролиферацию при всех испытываемых концентрациях антител (2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл и 10 мкг/мл), при этом подобные пролиферативные эффекты наблюдали с анти-PD-l антителом ЕН12.2Н7 при этих диапазонах доз. Эти результаты показывают, что TIG1 обладает способностью усиливать антиген-специфические Т-клеточные пролиферативные ответы.
Пример 10: Повышение NK-клеточно-опосредованной
цитотоксичности с использованием человеческих первичных эффекторных клеток и К562 клеток-мишеней посредством блокады TIGIT
[00198] Человеческие NK-клетки способны индуцировать природную цитотоксичность для клеток-мишеней, которые не содержат МНС I, таких как К5 62, клеточная линия хронического миелогенного лейкоза (CML) (см., например, Nagel et al., Cancer Res 1981; 41:2284-2288; Andersson et al. , Int J Cancer. 1979 Feb;23(2) :143-7. ; Lozzio et al. , Leuk Res. 1979; 3 ( 6) :363-70) . Экспрессию CD155 (PVR) на K562 клетках (АТСС) подтверждали с использованием коммерческого антитела (Biolegend анти-СБ155 клон SKII.4) . Как показано на Фиг.18 (верхняя панель), 98% К562 клеток, как было обнаружено, экспрессируют высокие уровни CD155 (черная гистограмма). Экспрессию TIGIT на человеческих CD56-положительных NK-клетках в РВМС (iQ Biosciences) с использованием коммерческого антитела (eBiosciences анти-TIGIT клон MBSA43 и Biolegend анти-СБ5б клон HCD56) также подтверждали на 3 репрезентативных человеческих донорах (Фиг.18, нижние панели).
[00199] Лизис К562 клеток, опосредованный NK-клетками, измеряли с и без TIG1. РВМС культивировали в течение ночи в AIM-V среде (Invitrogen) в присутствии интерлейкина-2 (IL-2) [200 единиц/мл] (Peprotech) при 37°С в 5% С02 инкубаторе. На следующий день К562 клетки метили CFSE и совместно культивировали 1:100 с PBMCs (Мишень:PBMCs; одна К562 клетка на сто РВМС, которые содержали примерно 5% NK-клеток) в течение 4 часов при 37°С в 5% С02 инкубаторе в присутствии 10 мкг/мл TIG1. После инкубации клетки собирали и окрашивали при помощи 5 нМ Sytox Red (ThermoFisher) для различения мертвых клеток-мишеней при помощи (CFSE+ Sytox Red+). Проценты К5 62 клеток-мишеней, лизированных NK-клетками, определяли методом проточной цитометрии (FACSCalibur; FlowJo Анализ). Как показано на Фиг.19, 2% К562 клеток было лизировано без TIG1. Когда добавляли TIG1, было лизировано 4,4% К562 клеток. Добавление TIG1 повышало NK-клеточно-опосредованную природную цитотоксичность К562 клеток двукратно, демонстрируя, что TIG1 обладает способностью повышать уровень киллинга клеток-мишеней субпопуляцией человеческих эффекторных клеток.
Пример 11: SEB-индуцированная продукция цитокинов человеческими Т-клетками усиливается посредством блокады TIGIT
[00200] Суперантигены, такие как SEB (Staphylococcus Entегоtoxin В), активируют Т-клетки путем связывания молекул МНС класса II на антиген-презентирующих клетках с v(3 элементом TCR, приводя к продукции цитокинов, включая интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-б (IL-б), фактор некроза опухоли альфа (TNFa) и
интерферон гамма (IFNy) (см., например, Krakauer et al., Toxins (Basel) . 2010 Aug; 2(8) : 1963-1983) . По сравнению с типичным антиген-индуцированным Т-клеточным ответом, где 0,1-0,001% Т-клеток могут активироваться, SEB способен активировать до 10-20% Т-клеток в человеческой крови в зависимости от фракции Т-клеток, содержащих v(33, v(3l2, vJ3l4 и v(3l7, обнаруженной в крови каждого конкретного донора. Поэтому SEB можно использовать для Т-клеточного анализа секреции цитокинов для определения уровня модуляции мишени посредством блокады TIGIT с использованием клеток цельной крови человека (WBC).
[00201] Свежевыделенные образцы WBC (Stanford Blood Center)
получали с использованием натрий гепарина не позднее чем через 4
часа после взятия крови с отсутствием визуальных признаков
гемолизиса. 250 мкл распределяли аликвотами по лункам в 96-
луночные круглодонные планшеты (Nunc) и стимулировали при помощи
SEB (Toxin Technology) при 1 мкг/мл конечной концентрации в
присутствии 10 мкг/мл гуманизированного анти-PD-l
моноклонального антитела или 10 мкг/мл HuTIGl-IgGl.АА в течение 24 часов при 37°С в 5% С02 инкубаторе. Через 24 часа 9б-луночные планшеты быстро центрифугировали для отделения слоя плазмы для сбора. После сбора образцов плазмы уровни экспрессии IL-2, IL-6, TNFa и IFNy измеряли путем мультиплексного анализа на микросферах для определения содержания цитокинов (Biolegend, LEGENDplex(tm) Панель человеческих CD8/NK) методом проточной цитометрии (BD FACSCalibur) и анализировали с использованием Biolegend программы для количественного определения.
[00202] Для определения изменения уровня экспрессии каждого из IL-2, IL-б, TNFa и IFNy, уровень цитокинов в присутствии
испытываемого антитела (плюс SEB) делили на уровень цитокинов в отсутствие антитела для каждого донора. 2-кратное изменение (например, определенное в присутствии анти-TIGIT), таким образом, означает, что абсолютная концентрация цитокинов, измеренная в эксперименте, в два раза больше обнаруженной в SEB-стимулированных контрольных условиях. Как показано на Фиг.20, SEB-стимулированная продукция IL-2, IL-6, TNFa или IFNy клетками крови здорового донора повышалась в присутствии 10 мкг/мл гуманизированного анти-PD-l или 10 мкг/мл HuTIGl-IgGl.АА. В этих условиях, SEB-индуцированная продукция цитокинов клетками WBC и ее модуляция при помощи HuTIGl-IgGl.АА является регистрируемым показателем потенцирования эффекторных ответов цитокинов. HuTIGl-IgGl.АА способен потенцировать иммунные ответы, как продемонстрировано стимуляцией продукции IL-2, IL-б, TNFa и IFNy в показанном анализе.
Пример 12: Характеристика HuTIGl-IgGl.АА и HuTIG3-IgGl.АА-опосредованной комплемент-зависимой цитотоксичности
[00203] Комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC)
относится к лизису клетки, которая экспрессирует молекулы-мишени в присутствии комплемента (см., например, Gazzano-Santoro et al. , J. Immunol. Methods, 2 02:163) . Активация классического пути комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (Clq) с антителами (подходящего подкласса), которые связаны с их распознанным антигеном на клеточной поверхности. Для оценки активации комплемента, человеческую Т-клеточную двойную репортерную родительскую клеточную линию Jurkat (Dual Jurkat; Invivogen) сконструировали для стабильной экспрессии человеческого TIGIT (Jurkat-TIGIT) на поверхности. Как показано на Фиг.21, экспрессию TIGIT на поверхности Jurkat-TIGIT клеток подтверждали методом проточной цитометрии с использованием коммерческого РЕ-меченного анти-TIGIT антитела (eBiosciences клон MSBA43). Jurkat-TIGIT поэтому использовали в качестве клеток-мишеней, которые конститутивно экспрессируют мембрана-связанный TIGIT и, таким образом, могут подвергаться активности антитело-связанного CDC в присутствии комплемента.
[00204] Анализ CDC осуществляли с использованием Jurkat-
TIGIT клеток и человеческого комплемента в присутствии HuTIGl-
IgGl.AA, HuTIG3-IgGl.АА или кроличьего анти-тимоцитарного
глобулина (ATG) (Fresenius Biotech GmbH) с увеличивающимися
концентрациями до 50 мкг/мл. ATG использовали в качестве
положительного контроля из-за его реактивности с Jurkat клетками
и документально подтвержденной комплемент-зависимой
цитотоксической активности с Jurkat клетками (см., например, Eiermann et al., J Hematother Stem Cell Res. 2001 Jun;10(3):385-90.; Ayuk et al. , Anticancer Research 29: 1355-1360 (2009). 50000 Jurkat-TIGIT клеток в RPMI 1640 среде (Invitrogen), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), высевали в 96-луночные круглодонные планшеты (Nunc). Используемые для обработки антитела добавляли, начиная с наивысшей концентрации 50 мкг/мл, с последующим трехкратным серийным разведением, и оставляли для инкубации с клетками в течение 1 часа при 37°С в 5% С02 инкубаторе. После этой 1-часовой инкубации добавляли человеческий комплемент и оставляли для инкубации еще в течение 3 часов при 37°С в 5% С02 инкубаторе. После завершения этой 3-часовой инкубации добавляли 5 мкг/мл пропидий иодида (ThermoFisher) и образцы анализировали методом проточной цитометрии (BD FACSCalibur) для определения процентов пропидий иодид-положительных в качестве показателя клеточной гибели.
[00205] Для определения нормализованных изменений проценты жизнеспособных клеток измеряли методом проточной цитометрии и процент пропидий иодид-положительных клеток оценивали как мертвые клетки. Значения для необработанных образцов нормализовали к 100%. Проценты жизнеспособности образцов в присутствии антитела делили на нормализованные необработанные с получением кратного изменения жизнеспособности. Как показано на Фиг.22, ни HuTIGl-IgGl.АА ни HuTIG3-IgGl.АА вплоть до 50 мкг/мл не индуцировали CDC активность. Эти данные показывают, что связывание как HuTIGl-IgGl.АА, так и HuTIG3-IgGl.АА с TIGIT не приводит к комплемент-опосредованной клеточной гибели Т-клеток.
Пример 13: Характеристика HuTIGl-IgGl.АА и HuTIG3-IgGl.АА с
использованием Jurkat двойной репортерной клеточной линии
[00206] Функциональное следствие блокирования человеческого TIGIT рецептора анализировали с использованием Jurkat-TIGIT репортерной клеточной линии, которая несет в хромосоме секретированный люциферазный репортерный ген, который управляется IFN|3 минимальным промотором, слитым с пятью копиями NF-кВ консенсусного элемента транскрипционного ответа и тремя копиями c-Rel сайта связывания. Jurkat-TIGIT клетки также экспрессируют секретированный эмбриональный репортерный ген щелочной фосфатазы (SEAP) под контролем ISG54 минимального промотора вместе с пятью элементами IFN-стимулируемого ответа.
[00207] Анализы включают две клеточные линии, представляющие Т-эффекторные клетки (Jurkat-TIGIT) и антиген-презентирующие клетки. Т-эффекторные клетки стабильно экспрессируют люциферазный репортер, который активируется ниже от Т-клеточного рецептора (TCR). Антиген-презентирующие клетки (искусственные антиген-презентирующие клетки или "аАРС") стабильно экспрессируют активаторный белок Т-клеток, который связывается и активирует Т-эффекторную клетку, такую как Jurkat-TIGIT, антиген-независимым образом (Promega). аАРС клетки также сконструированы для экспрессии CD155. Когда Т-эффекторную клетку совместно культивируют с ее соответствующей аАРС клеткой, взаимодействие TIGIT с CD155 ингибирует активацию Т-эффекторных клеток и уменьшает экспрессию люциферазы. Добавление анти-TIGIT блокирующего антитела высвобождает ингибиторный сигнал, делающий возможной экспрессию люциферазной активности.
[00208] В этом анализе 16000 аАРС, которые экспрессируют человеческий CD155 и активаторный белок Т-клеток (TCR Активатор CD155 СНО-К1) (Promega) высевали на 9б-луночный планшет с половинным объемом лунок и инкубировали при 37°С в 5% С02 инкубаторе в течение 24 часов. На следующий день 50000 человеческих Jurkat-TIGIT клеток совместно культивировали с TCR Активатор CD155 СНО-К1 в отсутствие или в присутствии HuTIGl-IgGl.AA или HuTIG3-IgGl.АА, начиная при 10 мкг/мл с двукратным серийным разведением, еще в течение 2 4 часов. Супернатанты
собирали и секретированную люциферазу измеряли с использованием QUANTI-Luc (Invivogen) и многорежимного планшет-ридера (Perkin Elmer EnSpire) в виде относительных световых единиц. Для определения кратного изменения относительных световых единиц относительные световые единицы Jurkat-TIGIT, совместно культивированных с TCR Активатор CD155 СН0-К1 в присутствии различных концентраций анти-TIGIT антител, делили на относительные световые единицы в отсутствие антител. Поэтому в качестве примера, 2-кратное увеличение {например, определенное в присутствии анти-TIGIT) , таким образом, означает, что относительные световые единицы, измеренные в эксперименте, в два раза больше, чем количество, определенное в контрольных условиях, стимулированных только TCR-активатором.
[00209] Как показано на Фиг.23, и HuTIGl-IgGl.АА и HuTIG3-IgGl.AA могли повышать естественную Т-клеточную активирующую сигнализацию, как определено по увеличению относительных световых единиц, индуцированных в присутствии каждого блокирующего TIGIT антитела, от 0,б мкг/мл до 10 мкг/мл, примерно с 1,5-2,5-кратным увеличением. Эти данные показывают, что анти-TIGIT антитела обладают антагонистической активностью, блокируя функцию TIGIT, и повышают естественную Т-клеточную активность.
Пример 14: Конкурентное связывание с TIGIT
[00210] Проточную цитометрию используют для идентификации антитела, которое конкурирует с TIG1 за связывание с человеческим TIGIT. TIG1 метят флуоресцентным красителем FITC с использованием набора для FITC-мечения антител Pierce (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом изготовителя. Связывание полученного FITC-меченного TIG1 с человеческим TIGIT исследуют методом проточной цитометрии с использованием NSO-hTIGIT клеток. Сто тысяч NSO-hTIGIT клеток инкубируют с различными концентрациями FITC-меченного TIG1, начиная с 10 мкг/мл и двукратных серийных разведений, в 2 00 мкл FACS Буфера (PBS, содержащий 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% азида натрия) при 4°С в течение 3 0 минут. После промывки при
помощи 2 мл FACS Буфера NSO-hTIGIT клетки суспендируют 0,2 мл FACS Буфера и подвергают анализу методом проточной цитометрии с использованием проточного цитометра FACScan (BD Biosciences, San Jose, СА) и получают среднеканальную флуоресценцию (MCF) при каждой концентрации антител. Суб-насыщающую концентрацию, где достигается 90% от максимального уровня флуоресценции, определяют для FITC-меченного TIG1.
[00211] Суб-насыщающую концентрацию FITC-меченного TIG1 инкубируют со ста тысячами NSO-hTIGIT клеток в присутствии (или в отсутствие) 200-кратно более высокой концентрации испытываемого антитела в 2 00 мкл FACS Буфера при 4°С в течение 3 0 минут. Например, когда 0,1 мкг/мл FITC-меченного TIG1 используют для связывания с NSO-hTIGIT клетками, 20 мкг/мл испытываемого антитела добавляют к клеточной суспензии. В качестве фонового контроля сто тысяч NSO-hTIGIT клеток инкубируют без каких-либо антител. После промывки при помощи 2 мл FACS Буфера NSO-hTIGIT клетки суспендируют в 0,2 мл FACS Буфера и подвергают анализу методом проточной цитометрии.
[00212] MCF значение для клеток NSO-hTIGIT, инкубированных с FITC-меченным TIG1 [MCF А], нормализуют к 100%, и MCF значение для клеток NSO-hTIGIT, инкубированных без каких-либо антител [MCF В], нормализуют к 0%. MCF значение для клеток NSO-hTIGIT, инкубированных с FITC-меченным TIG1 и испытываемым антителом [MCF С] , нормализуют с использованием следующей формулы: 100 х ( [MCF С] - [MCF B])/([MCF А] - [MCF В]). Когда нормализованное значение MCF для NSO-hTIGIT, инкубированных с FITC-меченным TIG1 и испытываемым антителом, меньше чем 2 0%, испытываемое антитело определяется как конкурирующее с TIG1 за связывание с человеческим TIGIT.
[00213] Такой же анализ можно использовать для идентификации антител, которые конкурируют с TIG2 или TIG3. Пример 15: Измерение аффинности
[00214] Антиген-связывающую аффинность моноклональных антител можно измерить при помощи безмаркерных оптических биосенсоров на эффекте поверхностного плазмонного резонанса
(SPR), таких как Biacore Т100 (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA) , ProteOn XPR36 (BioRad, Hercules, CA) , Octet RED384 (ForteBio, Menlo Park, СА) и IBIS MX96 (Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, UT) (Yang et al. , Anal. Biochem. 508:78-96, 2016). Аффинность связывания антигена для каждого из TIG1, TIG2 и TIG3 измеряли с использованием Biacore Т100, как описано Yang et al. {supra) . Белок A/G (Thermo Fisher Scientific) иммобилизовали на проточных ячейках в СМ5 сенсорном чипе (GE Healthcare Life Sciences) с использованием стандартного протокола связывания. Испытываемое антитело (TIG1, TIG2 или TIG3) захватывалось белком A/G на СМ5 сенсорном чипе. Различные концентрации рекомбинантных человеческих TIGIT белков, таких как Рекомбинантный Человеческий TIGIT, His-меченный (Creative BioMart, Shirley, NY) , использовали в потоке для связывания с испытываемым антителом на сенсорном чипе. Значения скорости ассоциации (ка) и скорости диссоциации (kd) взаимодействия между испытываемым антителом и человеческим TIGIT получали с использованием программы BIAevaluation (GE Healthcare Life Sciences). Константу ассоциации (Ка) рассчитывали путем деления скорости ассоциации (ка) на скорость диссоциации (kd) для каждого из TIG1, TIG2 и TIG3. Константу диссоциации (Kd) рассчитывали путем деления скорости диссоциации (kd) на скорость ассоциации (ка).
[00215] Исследования с использованием биосенсоров для HuTIGl-IgGl.АА осуществляли на BioRad ProteOn XPR36 системе в 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7,4, 0,005% Tween-20 и 0,2 мг/мл BSA при 25°С. HuTIGl-IgGl .АА разбавляли до 3,7, 1,2 и 0,4 нМ и захватывали в течение 5 минут на GLM сенсорном чипе, покрытом ~10000 RU анти-человеческого IgG антитела от GE. His-меченный растворимый рекомбинантный человеческий TIGIT (Cat # TIT-H52H3; Aero Biosysterns, Newark, DE) испытывали при 100 нМ в виде наивысшей концентрации в 3-кратных серийных разведениях до 1,2 нМ. Данные от трех разных поверхностных плотностей антител глобально подгоняли к 1:1 модели взаимодействия с использованием локально установленного Rmax. Полученные скорость ассоциации
(ка) и скорость диссоциации (kd) представляли собой (4,42 ± 0,02) х 105 М_1сек-1 и (4,09 ± 0,02) х 10~4 сек-1, соответственно. Рассчитанная константа диссоциации (Kd) имела значение 925 ± 7 пМ.
Пример 16: Картирование эпитопов
[00216] Для локализации эпитопа, распознаваемого каждым из TIG1, TIG2 и TIG3 в TIGIT молекуле, мутанты с одной аминокислотной заменой были образованы во внеклеточной области TIGIT (SEQ ID N0:3) методом сайт-направленного мутагенеза с использованием ПЦР с перекрывающимися расширениями (Higuchi, R.,
1989, в " PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", Erlich, H. A., ed., Stockton Press, New York, NY, pp 61-7 0). Для анализа использовали следующие шесть мутантов во внеклеточной области TIGIT: Q35A (SEQ ID N0:50), N37A (SEQ ID N0:51), Q39A (SEQ ID N0:52), N49A (SEQ ID N0:53), D51A (SEQ ID N0:54) и F86A (SEQ ID N0:55). Буква слева, цифра в середине и буква справа в названии каждого мутанта означают аминокислотный остаток в TIGIT дикого типа, расположение считая от N-концевого метионинового остатка во внеклеточной области TIGIT (SEQ ID N0:3), и аминокислоту в мутанте, соответственно. Аминокислотные остатки обозначены однобуквенным кодом. Каждый из этих шести мутантов содержит аминокислотную замену вблизи области контакта TIGIT-CD155 комплекса (Stengel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109:5399-5404, 2012) .
[00217] Вектор экспрессии млекопитающего pFCml7 9 имел такую
же структуру, как pFCm404 (Фиг.1), за исключением того, что (i)
ген пуромицин N-ацетил-трансферазы заменен геном
ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы Е. coli, и (ii)
внеклеточная область человеческого TIGIT заменена человеческим IL-15. ДНК фрагменты, кодирующие шесть включающих замену аланином мутантов внеклеточной области человеческого TIGIT, индивидуально встраивали в pFCml7 9 для замены IL-15-кодирующей области. Полученные векторы экспрессии, pFCml79-Q35A, pFCml79-N37A, pFCml79-Q39A, pFCml79-N49А, pFCml79-D51A и pFCml79-F86A, содержали Q35A, N37A, Q39A, N49A, D51A и F86A мутанты в TIGIT
кодирующей области, соответственно, и экспрессировали такую же последовательность TIGIT-Fc слитых белков, как кодируемая в pFCm4 04, за исключением одной аминокислотной замены, специфической для каждого мутанта.
[00218] Дикого типа и мутантные TIGIT-Fc слитые белки транзиентно экспрессировали в клеточной линии эмбриональных почек человека НЕК293. НЕК293 клетки выращивали в DMEM, содержащей 10% FCS, при 37°С в 7,5% С02 инкубаторе. Векторы экспрессии дикого типа и мутантных TIGIT-Fc слитых белков
(pFCm404, pFCml79-Q35A, pFCml79-N37A, pFCml79-Q39А, pFCml79-N49A, pFCml79-D51A и pFCml79-F86A) индивидуально трансфицировали в НЕК2 93 клетки способом с использованием полиэтиленимина
(Durocher et al. Nucl. Acids Res. 30: e9, 2002) . Уровни продукции TIGIT-Fc слитых белков в культуральных супернатантах измеряли методом ELISA. Вкратце, ELISA планшет покрывали 100 мкл/лунка козлиным анти-человеким IgG Fc-специфическим поликлональным антителом (Sigma-Aldrich) , 1/2000-разведенным в PBS, при 4°С в течение ночи, промывали промывочным буфером и блокировали ELISA Буфером 200 мкл/лунка в течение 20 минут при комнатной температуре. После промывки промывочным буфером культуральные супернатанты транзиентно трансфицированных НЕК2 93 клеток, соответствующим образом разведенные в ELISA Буфере (100 мкл/лунка), наносили на ELISA планшет. Очищенный hTIGIT-Fc использовали в качестве стандарта. После инкубации ELISA планшета в течение 3 0 минут при комнатной температуре и промывки промывочным буфером определяли связанные Fc слитые белки с использованием 100 мкл/лунка HRP-конъюгированного козлиного анти-человекого IgG поликлонального антитела (SouthernBiotech), 12000-разведенного в ELISA Буфере. После инкубации планшета в течение 3 0 минут при комнатной температуре и промывки промывочным буфером инициировали проявление цвета путем добавления 100 мкл/лунка ABTS субстрата (Sigma-Aldrich) и останавливали при помощи 100 мкл/лунка 2% щавелевой кислоты. Поглощение считывали при 4 05 нм.
[00219] Связывание каждого из мышиных TIG1, TIG2 и TIG3
антител с TIGIT мутантами исследовали методом ELISA. ELISA планшет покрывали при помощи 100 мкл/лунка козлиным античеловеческим IgG Fc-специфическим поликлональным антителом
(Sigma-Aldrich), 1/2000 разведенным в PBS, при 4°С в течение ночи, промывали промывочным буфером и блокировали 2 00 мкл/лунка ELISA Буфером в течение 2 0 минут при комнатной температуре. После промывки промывочным буфером 0,5 мкг/мл транзиентно экспрессируемых TIGIT-Fc слитых белков, содержащих либо TIGIT дикого типа, либо один из шести TIGIT мутантов, в ELISA Буфере
(100 мкл/лунка) наносили на ELISA планшет в двух параллельных экспериментах для инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут. В качестве отрицательного контроля использовали культуральные супернатанты нетрансфицированных НЕК2 93 клеток. После промывки промывочным буфером наносили 100 мкл/лунка 2 00 нг/мл испытываемого антитела (TIG1, TIG2 или TIG3) в ELISA Буфере (100 мкл/лунка). После инкубации ELISA планшета в течение 3 0 минут при комнатной температуре и промывки промывочным буфером определяли связанные антитела с использованием 100 мкл/лунка HRP-конъюгированного козлиного поликлонального антитела к мышиной каппа цепи (Bethyl Laboratories, Montgomery, ТХ) , 1/2000 разбавленного в ELISA Буфере. После инкубации планшета в течение 0,5 часа при комнатной температуре и промывки промывочным буфером инициировали проявление цвета путем добавления 100 мкл/лунка ABTS субстрата (Sigma-Aldrich) и останавливали при помощи 100 мкл/лунка 2% щавелевой кислоты. Поглощение считывали при 4 05 нм.
Таблица 1
Связывание TIG1, TIG2 и TIG3 с TIGIT мутантами
Относительное связывание с TIGIT (%)
TIGIT мутант
TIG1
TIG2
TIG3
Q35A (SEQ ID NO: 50)
-0.1
29.1
57.8
N37A (SEQ ID N0:51)
0.8
75.1
83.5
E39A (SEQ ID N0:52)
71.1
69.1
94.2
N49A (SEQ ID N0:53)
0.5
42.6
37.2
D51A (SEQ ID N0:54)
1.8
61.0
41.1
F86A (SEQ ID N0:55)
49.5
40.5
43.2
[00220] Для каждого из TIG1, TIG2 и TIG3 относительное связывание с каждым TIGIT мутантом рассчитывали по следующей формуле. Среднее поглощение с дикого типа TIGIT-Fc слитыми белками [Abs А] нормализовали к 100%, и среднее поглощение с культуральными супернатантами нетрансфицированных НЕК2 93 клеток
[Abs В] нормализовали к 0%. Среднее поглощение с мутантным TIGIT-Fc слитым белком [Abs С] нормализовали с использованием следующей формулы: 100 х ([Abs С] - [Abs В])/([Abs А] - [Abs В]). Результат представлен в Таблице 1. Относительное связывание TIG1 было меньше чем 5%, когда аминокислотный остаток был заменен аланином в положении 35, 37, 4 9 или 51, указывая на то, что аминокислотные остатки в этих четырех положениях являются критичными для связывания TIG1 с TIGIT. Ни один из TIGIT мутантов, используемых в этом анализе, не устранял связывание TIG2 и TIG3 с TIGIT.
Пример 17: Повышенная секреция IFNy при добавлении HuTIGl-IgGl.AA, анти-PD-Ll антитела и HuTIGl-IgGl.АА в комбинации с анти-PD-Ll антителом
[00221] Человеческие PBMCs сначала выделяли из лейкоцитарной пленки путем наслаивания крови на градиентную среду (Lymphoprep; STEMCELL; 07801) и сбора PBMCs после центрифугирования из интерфазы. На следующей стадии человеческие моноциты выделяли из PBMCs путем CD14 положительной селекции
(набор EasySep для положительной селекции человеческих CD14; STEMCELL; Cat# 18058) в соответствии с протоколом изготовителя и
культивировали в течение шести дней в RPMI среде, дополненной 5% FBS и 0,1 мкг/мл GM-CSF (R &D; Cat# 215-GM-050/CF) и 0,1 мкг/мл IL-4 (R &D; Cat# 204-IL-050/CF). Дифференцированные моноцитарные дендритные клетки (moDCs) собирали и проверяли на экспрессию CD155, CD112 и PD-L1 методом проточной цитометрии (Фиг.24).
[00222] Человеческие CD4+ клетки от 4 разных доноров выделяли из лейкоцитарных пленок путем отрицательного истощения (RosetteSep коктейль, обогащенный человеческими CD4 Т-клетками; STEMCELL; #15062) и определяли чистоту методом проточной цитометрии.
[00223] moDCs и CD4+ клетки объединяли в соотношени 1:4 (25000 moDCs; 100000 CD4+ клеток) и культивировали в течение четырех дней в бессывороточной среде (X-Vivo-2 0; LONZA; Cat# 04-448Q) в присутствии HuTIGl-IgGl.АА (5 мкг/мл или 15 мкг/мл) или анти-PD-Ll антитела (10 мкг/мл; клон 243,55.S1; SEQ ID N0:56 & 57) или обоих HuTIGl-IgGl.АА (15 мкг/мл) и анти-PD-Ll антитела (10 мкг/мл) в течение 4 дней перед количественным анализом IFNy с использованием Цитометрического Анализа на Микросферах (СВА; Human IFNy Flex Set; BD; Cat# 560111) . Человеческий IgGl Fc (25 мкг/мл; BioXcell; Cat# BE0096) использовали в качестве контроля.
[00224] Как показано на Фиг.25, блокада HuTIGl-IgGl.АА и анти-PD-Ll антителом независимо повышала продукцию IFNy по сравнению с соответствующим изотипическим контрольным антителом. Комбинация HuTIGl-IgGl.АА с анти-PD-Ll антителом существенно и синергически повышала продукцию IFNy по сравнению с любой монотерапией, используемой отдельно.
Пример 18: HuTIGl-IgGl.АА и HuTIG3-IgGl.АА распознают TIGIT, экспрессируемый на человеческих лимфоидных и миелоидных клетках
[00225] Суммарные человеческие PBMCs, выделенные у десяти доноров, совместно окрашивали непосредственно конъюгированными антителами, разграничивая Т-клетки, В-клетки, NK-клетки и субпопуляции миелоидной линии. Мертвые клетки исключали с использованием набора для окрашивания Live/dead Fixable Aqua Dead Cell Stain kit. Экспрессию TIGIT определяли с
использованием HuTIGl-IgGl.АА и HuTIG3-IgGl.АА антител, конъюгированных с А1ехаб47 красителем. Экспрессию CD96 определяли с использованием коммерчески доступного анти-СБ9б антитела (клон NK92,39). На Фиг.2бА, знак плюс (+) означает экспрессию выше фоновой, а (+++) означает наивысшую наблюдаемую экспрессию. Знак плюс/минус (+/-)показывает, что только субпопуляция клеток в обозначенной популяции экспрессирует TIGIT или CD96 выше фонового значения, а знак минус (-) указывает на отсутствие экспрессии выше фоновой. Во всех случаях фоновое значение определяли с использованием модифицированного способа Fluorescence Minus One (FMO), в котором были добавлены все флуорохромы, используемые в окрашивающей панели, за исключением целевого антитела (т.е. HuTIGl-IgGl.АА, HuTIG3-IgGl.АА, анти-CD96 антитело). Наоборот, целевое антитело заменяли IgG специфическим изотипическим контрольным антителом такой же конфигурации. Фиг.2бВ показывает репрезентативные гистограммы окрашивания анти-TIGIT антителами в PBMCs при разных уровнях экспрессии, которые использовали для определения уровней экспрессии CD96 на Фиг.2бА. Светлые гистограммы представляют модифицированный FMO. Темные гистограммы представляют HuTIGl-IgGl.AA или HuTIG3-IgGl.АА окрашивание.
[00226] Диссоциированные опухолевые клетки из меланомы,
колоректального злокачественного новообразования,
немелкоклеточной карциномы легкого и светлоклеточной почечно-клеточной карциномы получали из коммерческого источника и окрашивали непосредственно конъюгированными антителами, разграничивая Т-клетки и антиген-презентирующие клеточные субпопуляции. Лейкоциты идентифицировали с использованием пан-изоформы анти-СБ4 5 антитела (клон HI30). Мертвые клетки исключали с использованием набора для окрашивания Live/dead Fixable Aqua Dead Cell Stain kit. Экспрессию TIGIT определяли с использованием HuTIGl-IgGl.АА антитела, конъюгированного с А1ехаб47 красителем. Во всех случаях фоновое значение определяли с использованием модифицированного способа Fluorescence Minus One (FMO), в котором были добавлены все флуорохромы, используемые в окрашивающей панели, за исключением целевого
антитела (т.е. HuTIGl-IgGl.АА). Наоборот, целевое антитело заменяли IgG специфическим изотипическим контрольным антителом такой же конфигурации. Фиг.32В показывает репрезентативные гистограммы анти-TIGIT окрашивания на опухоль-инфильтрирующих лимфоцитах (TILs) при разных уровнях экспрессии, показанных на Фиг.32А. Светлые гистограммы представляют модифицированный FMO. Темные гистограммы представляют HuTIGl-IgGl.АА окрашивание.
Пример 19: Картирование эпитопов анти-человеческого TIGIT антитела HuTIGl-IgGl.АА методом проточной цитометрии
[00227] Человеческую кДНК TIGIT клонировали в pcDNA 3.1 (+)
с включающей 9 остатков гемагглютининовой (НА) пептидной меткой,
с последующим состоящим из 10 остатков пептидным линкером,
встроенным после состоящего из 21 остатка природного сигнального
пептида и перед N-концом зрелого TIGIT белка (SEQ ID N0:58).
Аминокислотные остатки, представляющие интерес (Т34, Q35, N37,
Е39, L44, 147, N49, D51, L52, Н55, F86, 188, Н90, Y92 и Т96), во
внеклеточной области человеческого TIGIT были мутированы в
аланин, по одной аминокислоте за один раз. Плазмиды очищали и
транзиентно трансфицировали в СНО-К1 клетки с использованием
реагента Fugene б (Promega) для трансфекции в соответствии с
рекомендациями изготовителя. Экспрессию НА-меченного
человеческого TIGIT мутанта подтверждали путем детекции при помощи анти-НА антитела.
[00228] Для анализа проточной цитометрии связывания анти-hTIGIT антитела с эпитопом, НА-меченные человеческие TIGIT белки с или без одиночной аминокислотной мутации транзиентно трансфицировали в СНО-К1 клетки. Через 2 4 часа трансфицированные клетки суспендировали в HBSS буфере (Thermo Fisher Scientific, Cat# 14175095) и инкубировали с HuTIGl-IgGl.АА антителом при меняющихся концентрациях в объеме 50 мкл. После инкубации в течение 1 часа при 4°С клетки промывали и осуществляли вторую инкубацию с 50 мкл А1еха488-конъюгированного анти-человеческого IgG(H+L) вторичного антитела (Thermo Fisher Scientific, Cat#A-11013) для детекции клеток, связанных антителом. Клетки инкубировали с анти-НА антителом (Sigma, Cat# Н7411) в качестве
положительного контроля, а нетрансфицированные СН0-К1 клетки использовали в качестве отрицательного контроля. Клетки анализировали на Attune NxT цитометре (Thermo Fisher Scientific) и данные обрабатывали с использованием программы FlowJo. Для каждого мутанта MFI (средняя интенсивность флуоресценции) при связывании насыщающего антитела нормализовали к 10 0% РОС (процент от контроля), и MFI для контроля с отсутствием связывания первичного антитела нормализовали к 0% РОС. Данные затем использовали для получения нелинейной сигмоидальной кривой с 4 параметрами при помощи программы для подборки кривой GraphPad Prism 7 с использованием следующей формулы: У=Нижняя точка+(Верхняя точка-Нижняя точка)/(1 + 10 < (LogESo~x) *угловой к°эФФичиент
Хилла) j
[00229] В этом анализе HuTIGl-IgGl.АА связывался с человеческим TIGIT дикого типа с ЕС50=1,28 нМ. Пять из пятнадцати одноточечных аланиновых TIGIT мутантов связывались с HuTIGl-IgGl.AA с более чем 10-кратным снижением аффинности связывания. Человеческий TIGIT (SEQ ID N0:3) с мутациями N49A, D51A, Н90А, N37A или Q35A связывался с HuTIGl-IgGl.АА с активностью, уменьшающейся в следующем диапазоне ЕС50=17,7 до 176 нМ, соответственно (Фиг.27). Все из этих остатков ко-локализуются к одной дискретной области на передней [3-листовой структуре IgV внеклеточного домена TIGIT (Фиг.28).
Пример 20: Ex vivo Иммунофенотипирование Т-клеточных субпопуляций из цельной крови отличных от человека приматов, которым вводили HuTIGl-IgGl.АА
[00230] Фармакокинетическое исследование осуществляли в Charles River Laboratories (Reno, NV) . Целью этого исследования было исследование ex vivo образцов цельной крови от обезьян cynomolgus, которым вводили одну дозу 10 мг/кг анти-TIGIT (HuTIGl-IgGl.АА) антитела для опосредованной оценки занятости рецепторов для TIGIT.
[00231] Трем ранее не подверженным экспериментам самкам обезьян cynomolgus (#67, #68 & #69) вводили разовую внутривенную дозу 10 мг/кг HuTIGl-IgGl.АА антитела. Образцы цельной крови в
натрий гепарине получали в течение 24 часов после последнего сбора образцов в точках времени, которые соответствовали следующим: пред-дозовая, Дни 1, 2, 7, 14, 21 и 28 после введения дозы. Для исследования цельной крови методом проточной цитометрии флуоресцентно меченное анти-человеческое TIGIT от BioLegend (клон MBSA43) использовали для определения уровней экспрессии TIGIT на клеточных субпопуляциях лимфоцитов крови обезьян cynomolgus, поскольку, как было показано, они перекрестно реагируют с нечеловеческими приматами (PLoS Pathog. 2016 Jan; 12(1); BioLegend). Живые клетки получали при помощи FACSCalibur и анализировали с использованием программы FlowJo.
[00232] Анти-TIGIT (MBSA43) было способно связываться как с CD4+, так и с CD8+ Т-клеточными субпопуляциями при окрашивании пред-дозовых образцов цельной крови. После введения дозы анти-TIGIT (MBSA43) было неспособно обнаруживать экспрессию TIGIT на этих Т-клеточных субпопуляциях вплоть до Дня 14 или 21, в зависимости от разных исследуемых обезьян, при этом уровни возвращались к пред-дозовым уровням обнаружения к Дню 21 или 28, в зависимости от разных исследуемых животных (Фиг.2 9В & ЗОВ). Причиной этой неспособности обнаруживать экспрессию TIGIT не были существенные изменения частоты CD4+ или CD8+ Т-клеток (Фиг.29А & ЗОА, соответственно), из чего можно заключить, что это было из-за занятости поверхности TIGIT обрабатываемым антителом (HuTIGl-IgGl.АА), а не из-за истощения Т-клеточной субпопуляции.
[00233] Эти данные подтверждают, что анти-TIGIT антитело HuTIGl-IgGl.АА является перекрестно-реактивным у обезьян cynomolgus, и использование анти-человеческого TIGIT от BioLegend (клон MBSA43) обеспечивает оценку занятости TIGIT рецептора.
Пример 21: Повышенная NK-клеточно-опосредованная
цитотоксичность, вызванная HuTIGl-IgGl.АА и HuTIG3-IgGl.АА на К562 клетках-мишенях
[00234] Анализ NK-клеточно-опосредованной цитотоксичности, описанный в Примере 10, повторяли с использованием очищенных NK клеток вместо PBMCs. Для получения достаточных и подходящих
очищенных NK клеток для этих экспериментов важно осуществить скрининг на донорные PBMCs с высокой NK-клеточной частотой, достаточной экспрессией TIGIT на поверхности и достаточной экспрессией CD22 6. Получали LeukoPak периферической крови (состоящие из 10 миллиардов клеток или больше) и осуществляли выделение NK клеток с использованием Miltenyi autoMACS Pro Separator в соответствии с инструкциями изготовителя (Miltenyi Biotec, catalog#130-092-657) . Очищенные NK клетки ре-суспендировали в среде, содержащей интерлейкин-2 (IL-2) [2 00 единиц/мл], в б-луночных планшетах, б-луночные планшеты помещали в 5% С02 инкубатор при 37°С на 24 часа перед осуществлением исследований естественной цитотоксичности с клетками, собранными из лунок.
[00235] Лизис К562 клеток, опосредованный очищенными NK клетками, измеряли с и без анти-TIGIT антитела (TIG1). NK клетки культивировали в RPMI 164 0 среде (Invitrogen) в присутствии интерлейкина-2 (IL-2) [200 единиц/мл] (Peprotech) в течение ночи при 37°С в 5% С02 инкубаторе. На следующий день К562 клетки метили CFSE и совместно культивировали 1:20 с NK клетками (Мишень:NK; одна К562 клетка на двадцать NK клеток) в течение 4 часов при 37°С в 5% С02 инкубаторе в присутствии 10 мкг/мл Ритуксана или гуманизированных анти-TIGIT антител (HuTIGl-IgGl.AA или HuTIG3-IgGl.АА). Ритуксан использовали в качестве отрицательного контроля, поскольку К562 клетки не экспрессируют CD2 0. После инкубации клетки собирали и окрашивали при помощи 5 нМ Sytox Красного (ThermoFisher) для различения мертвых клеток-мишеней при помощи (CFSE+ Sytox Красный+). Проценты К562 клеток-мишеней, лизированных NK-клетками, определяли методом проточной цитометрии (FACSCalibur; Анализ FlowJo).
[00236] Как показано на Фиг.31, при использовании очищенных NK клеток добавление анти-TIGIT антител повышало NK-клеточно-опосредованную природную цитотоксичность К562 клеток, демонстрируя, что анти-TIGIT антитела (HuTIGl-IgGl.АА или HuTIG3-IgGl.АА) обладают способностью повышать уровень киллинга клеток-мишеней (на 28% или 19%, соответственно, по сравнению с
нормализованными процентами 'Без Антитела' или с Ритуксаном) субпопуляцией человеческих эффекторных клеток. ПОСЛЕ ДОВАТЕ ЛЬНОСТИ
SEQ ID N0:1: Аминокислотная последовательность зрелого человеческого TIGIT:
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPS FKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLG AMAATLWICTAVIWVALTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPA GLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG
SEQ ID N0:2: Аминокислотная последовательность сигнального пептида выше внеклеточной области человеческого TIGIT: MGWSWIFFFLLSGTASVLS
SEQ ID N0:3: Аминокислотная последовательность внеклеточной
области человеческого TIGIT (hTIGIT):
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRV APGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID N0:4: Аминокислотная последовательность
полипептидного линкера непосредственно ниже от hTIGIT: TGGG
SEQ ID N0:5: Аминокислотная последовательность человеческой yl Fc области:
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N0:6: Аминокислотная последовательность внеклеточной области человеческого CD155:
DWVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSY SESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAE VQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQV DGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYN WSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGMSR NA
SEQ ID N0:7: Аминокислотная последовательность внеклеточной области человеческого CD155, слитой с Fc областью человеческой yl цепи (hCD155-Fc):
DWVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSY SESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAE VQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQV DGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYN WSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGMSR NATGGGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N0:8: Аминокислотная последовательность FLAG пептида (FLAG): DYKDDDDK
SEQ ID N0:9: Аминокислотная последовательность сигнала связывания гликозилфосфатидилинозита человеческого CD55 (GPI): PNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT
SEQ ID N0:10: Аминокислотная последовательность TIG1 VH: DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPEKGLEWVAFISSGSSSIYYADTV KGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARMRLDYYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID N0:11: Аминокислотная последовательность TIG1 VH CDR1: NFGMH
SEQ ID N0:12: Аминокислотная последовательность TIG1 VH CDR2: FISSGSSSIYYADTVKG
SEQ ID N0:13: Аминокислотная последовательность TIG1 VH CDR3: MRLDYYAMDY
SEQ ID N0:14: Аминокислотная последовательность TIG1 VL: DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSG SGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID N0:15: Аминокислотная последовательность TIG1 VL CDR1: RASKSISKYLA
SEQ ID N0:16: Аминокислотная последовательность TIG1 VL CDR2: SGSTLQS
SEQ ID N0:17: Аминокислотная последовательность TIG1 VL CDR3: QQHNEYPWT
SEQ ID N0:18: Аминокислотная последовательность TIG2 VH: EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVKQSHGKNLEWIGGINPNNGGTSYNQKF KGRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSDDSAVYYCARPGWYNYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID N0:19: Аминокислотная последовательность TIG2 VH
CDR1: EYTMH
SEQ ID N0:20: Аминокислотная последовательность TIG2 VH CDR2: GINPNNGGTSYNQKFKG
SEQ ID N0:21: Аминокислотная последовательность TIG2 VH CDR3: PGWYNYAMDY
SEQ ID N0:22: Аминокислотная последовательность TIG2 VL: DIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQGVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTG SGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYHCQQHYITPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID N0:23: Аминокислотная последовательность TIG2 VL CDR1: KASQGVSTAVA
SEQ ID N0:24: Аминокислотная последовательность TIG2 VL CDR2: SASYRYT
SEQ ID N0:25: Аминокислотная последовательность TIG2 VL CDR3: QQHYITPWT
SEQ ID NO:26: Аминокислотная последовательность TIG3 VH: EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSDYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISDGGYNTYYPDTV KGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCARQILLRYYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID N0:27: Аминокислотная последовательность TIG3 VH CDR1: DYDMS
SEQ ID N0:28: Аминокислотная последовательность TIG3 VH CDR2: YISDGGYNTYYPDTVKG
SEQ ID N0:29: Аминокислотная последовательность TIG3 VH CDR3: QILLRYYFDY
SEQ ID N0:30: Аминокислотная последовательность TIG3 VL: DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMTCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGV PDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID N0:31: Аминокислотная последовательность TIG3 VL CDR1: KSSQSLLYSSNQKNYLA
SEQ ID N0:32: Аминокислотная последовательность TIG3 VL CDR2: WASTRES
SEQ ID N0:33: Аминокислотная последовательность TIG3 VL CDR3: QQYHSYPWT
SEQ ID N0:34: Аминокислотная последовательность сконструированной гуманизированной TIG1 VH (HuTIGl VH): MDSRLNLVFLVLILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGL EWVAFISSGSSSIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYW
GQGTMVTVSS
SEQ ID N0:35: Аминокислотная последовательность зрелой HuTIGl VH:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIY YADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVSS
SEQ ID N0:36: Аминокислотная последовательность сконструированной гуманизированной TIG1 VL (HuTIGl VL): MRFQVQVLGLLLLWISGAQCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAP KLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID N0:37: Аминокислотная последовательность зрелой HuTIGl VL:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID N0:38: Нуклеотидная последовательность
синтетического HuTIGl VH гена в pHuTIGl.AA:
ACTAGTACCACCATGGACTCCAGGCTCAATCTGGTTTTCCTTGTCCTTATTCTGAAAGG CGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTG AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTTTGGAATGCACTGGGTTCGACAGG CTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATTCATTAGTAGTGGCAGTAGTTCCATCTACTATGC AGACACAG T GAAG G G С С GAT T СAC CAT С T С СAGAGACAAT G С СAAGAACAG С С T G TAC С T G СAA AT GAACAG T С T GAG G G С T GAG GACAC TGCCGTGTAT TAC T G T G СAAGAAT GAGAC T G GAT TAC T ATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCATGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGTATGGCCTCTA AGCTT
SEQ ID N0:39: Нуклеотидная последовательность
синтетического HuTIGl VL гена в pHuTIGl.AA:
GCTAGCACCACCATGAGGTTCCAGGTTCAGGTTCTGGGGCTCCTTCTGCTCTGGATCTC AGGAGCCCAGTGTGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTCTTTCTGCATCTGTTGGAGAT AGAG T СAC TAT TAC T T G СAG G G СAAG TAAGAG CAT TAG СAAATAT CTGGCCTGGTAT СAACAGA AACCTGGGAAAGCTCCTAAGCTGCTTATCTACTCTGGGTCCACTTTGCAATCTGGAGTTCCATC AAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAA GATTTTGCAACCTATTACTGTCAACAGCATAATGAATACCCCTGGACCTTCGGCGGAGGCACCA AAG T С GAAAT CAAACGTAAGTAGAATССAAAGAAT T С
SEQ ID N0:40: Аминокислотная последовательность зрелой гамма тяжелой цепи HuTIGl-IgGl.АА, кодируемой в pHuTIGl.AA: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIYYADTV KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVF
PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К
SEQ ID N0:41: Аминокислотная последовательность зрелой каппа легкой цепи HuTIGl-IgGl.АА, кодируемой в pHuTIGl.AA: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID N0:42: Аминокислотная последовательность сконструированной гуманизированной TIG3 VH (HuTIG3 VH): MNFGLRLIFLVLTLKGVNCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGL EWVAYISDGGYNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYW GQGTTVTVSS
SEQ ID N0:43: Аминокислотная последовательность зрелой HuTIG3 VH:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTY YPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID N0:44: Аминокислотная последовательность сконструированной гуманизированной TIG3 VL (HuTIG3 VL): MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQ KPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGT KVEIK
SEQ ID N0:45: Аминокислотная последовательность зрелой HuTIG3 VL:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAST RESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID N0:46: Нуклеотидная последовательность
синтетического HuTIG3 VH гена в pHuTIG3.AA:
ACTAGTACCACCATGAACTTTGGGCTCAGATTGATTTTCCTTGTCCTTACTCTGAAAGG CGTGAACTGTGAAGTCCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTTGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTG AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTGACTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGG CTCCTGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTGATGGCGGTTATAACACCTACTATCC
AGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAA ATGAACAGTCTGAGGGCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTGCAAGACAAATTCTGCTGCGGT ACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTGTCACAGTCTCCTCAGGTGAGTCCTTAAAACA AGCTT
SEQ ID N0:47: Нуклеотидная последовательность
синтетического HuTIG3 VL гена в pHuTIG3.AA:
GCTAGCACCACCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGCTGCTGCTGCTCTGGGTTTC TGGAACCTGTGGGGACATTCAGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCCTCAGTTGGAGAC AGGGTTACTAT СAC С T G СAAG T С СAG T СAGAG TCTTCTGTATAGTAG CAATСAAAAGAACTAC T TGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAGGCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAG GGAATCTGGGGTCCCTAGTCGCTTCTCAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC AGCAGTCTGCAGCCTGAAGACTTCGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATCATAGCTATCCCTGGA CCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAACGTAAGTAGAATCCAAAGAATTC
SEQ ID N0:48: Аминокислотная последовательность зрелой гамма тяжелой цепи HuTIG3-IgGl.АА, кодируемод в pHuTIG3.AA: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTYYPDTV KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG К
SEQ ID N0:49: Аминокислотная последовательность зрелой каппа легкой цепи HuTIG3-IgGl.АА, кодируемод в pHuTIG3.AA: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID N0:50: Аминокислотные последовательности внеклеточной области человеческого TIGIT с Q35A мутацией:
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTAVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPS FKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID N0:51: Аминокислотные последовательности внеклеточной области человеческого TIGIT с N37A мутацией:
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVAWEQQDQLLAICNADLGWHISPS
FKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID N0:52: Аминокислотные последовательности внеклеточной области человеческого TIGIT с Q39A мутацией:
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWAQQDQLLAICNADLGWHISPS FKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID N0:53: Аминокислотные последовательности внеклеточной области человеческого TIGIT с N49A мутацией:
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICAADLGWHISPS FKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID N0:54: Аминокислотные последовательности внеклеточной области человеческого TIGIT с D51A мутацией:
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNAALGWHISPS FKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID N0:55: Аминокислотные последовательности внеклеточной области человеческого TIGIT с F8 6A мутацией:
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPS FKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYACIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID N0:56: Аминокислотная последовательность зрелой тяжелой цепи анти-человеческого PD-L1 антитела
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTY YADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPG
SEQ ID N0:57: Аминокислотная последовательность зрелой легкой цепи анти-человеческого PD-L1 антитела
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLFTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID N0:58: Аминокислотная последовательность сигнального, НА tag и линкерного пептидов, слитых со зрелым человеческим TIGIT:
MRWCLLLIWAQGLRQAPLASGYPYDVPDYAGGGGSGGGGSMMTGTIETTGNISAEKGGS IILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTG EYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRKKK ALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYR SLGNCSFFTETG
SEQ ID N0:59: Аминокислотная последовательность внеклеточной области человеческого TIGIT, слитой с Fc областью yl цепи человеческого иммуноглобулина (hTIGIT-Fc):
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPS FKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTGT GGGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N0:60: Аминокислотная последовательность зрелой гамма тяжелой цепи HuTIGl-IgGl.Q:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIY YADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK
SEQ ID N0:61: Аминокислотная последовательность зрелой гамма тяжелой цепи HuTIGl-IgG4.Р:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIY YADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSLGK
SEQ ID N0:62: Аминокислотная последовательность зрелой
гамма тяжелой цепи HuTIG3-IgGl.Q:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTY YPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK
SEQ ID N0:63: Аминокислотная последовательность зрелой гамма тяжелой цепи HuTIG3-IgG4.Р:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTY YPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS LGK
SEQ ID N0:64: Аминокислотная последовательность зрелой каппа легкой цепи HuTIGl-IgGl.Q и HuTIGl-IgG4.Р:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID N0:65: Аминокислотная последовательность зрелой каппа легкой цепи HuTIG3-IgGl.Q и HuTIG3-IgG4.Р: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ДжН БАЙОСАЙЕНСИЗ, ЛЛК АБМУНО ТЕРАПЬЮТИКС ЛЛК ТСО Дж. Юнь ЦУРУСИТА Наоя ДУРАМАД Омар
<120> АНТИТЕЛА К TIGIT
<130> 50658-504001WO
<140> Не назначено <141> 2017-03-03
<150> 62/304,045
<151> 2016-03-04
<150> 62/413,025
<151> 2016-10-26 <160> 65
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 223
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly Ala Met Ala Ala Thr
115 120 125
Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val Val Ala Leu Thr Arg
130
135
140
Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu Gly Asp Leu Arg Arg
145 150 155 160
Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala Gly Leu Cys Gly Glu
180 185 190
Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp Tyr Phe Asn Val Leu
195 200 205
Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe Thr Glu Thr Gly
210 215 220
<210> 2
<211> 19
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Phe Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Ser
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 3
<211> 122
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly 115 120
<210> 4
<211> 4
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 4
Thr Gly Gly Gly 1
<210> 5
<211> 232
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 5
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 6
<211> 317
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 6
Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr
20 25 30
His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met
35 40 45
Ala Val Phe His Gln Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg
50 55 60
Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser
65 70 75 80
Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys
85 90 95
Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu
100 105 110
Arg Val Leu Ala Lys Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln
115 120 125
Leu Thr Gly Glu Pro Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly
130 135 140
Arg Pro Pro Ala Gln Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro
145 150 155 160
Asn Thr Ser Gln Val Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr
165 170 175
Ser Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val
180 185 190
Thr Cys Lys Val Glu His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr
195 200 205
Val Asn Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr
210 215 220
Asp Asn Asn Trp Tyr Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp
225 230 235 240
Ala Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met
245 250 255
Gly Pro Leu Pro Pro Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile
260 265 270
Arg Pro Val Asp Lys Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr
275 280 285
Asn Ala Leu Gly Ala Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu
290 295 300
Gly Pro Pro Ser Glu His Ser Gly Met Ser Arg Asn Ala
305 310 315
<210> 7
<211> 553
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 7
Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr
20 25 30
His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met
35 40 45
Ala Val Phe His Gln Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg
50 55 60
Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser
65 70 75 80
Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys
85 90 95
Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu
100 105 110
Arg Val Leu Ala Lys Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln
115 120 125
Leu Thr Gly Glu Pro Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly
130 135 140
Arg Pro Pro Ala Gln Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro
145 150 155 160
Asn Thr Ser Gln Val Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr
165 170 175
Ser Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val
180 185 190
Thr Cys Lys Val Glu His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr
195 200 205
Val Asn Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr
210 215 220
Asp Asn Asn Trp Tyr Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp
225 230 235 240
Ala Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met
245 250 255
Gly Pro Leu Pro Pro Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile
260 265 270
Arg Pro Val Asp Lys Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr
275 280 285
Asn Ala Leu Gly Ala Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu
290 295 300
Gly Pro Pro Ser Glu His Ser Gly Met Ser Arg Asn Ala Thr Gly Gly
305 310 315 320
Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
325 330 335
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
340 345 350
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
355 360 365
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
370 375 380
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
385 390 395 400
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
405 410 415
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
420 425 430
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
435 440 445
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
450 455 460
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
465 470 475 480
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
485 490 495
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
500 505 510
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
515 520 525
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
530 535 540
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550
<210> 8
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 8
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210> 9
<211> 37
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 9
Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser
1 5 10 15
Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr
20 25 30
Met Gly Leu Leu Thr 35
<210> 10
<211> 119
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 10
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Arg Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 11
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 11
Asn Phe Gly Met His 1 5
<210> 12
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 12
Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
Белок
<211> 10
<212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 13
Met Arg Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 14
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 15
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 15
Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 16
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 16
Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser
<210> 17
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 17
Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr 1 5
<210> 18
<211> 119
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 18
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Trp Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 19
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 19
Glu Tyr Thr Met His 1 5
<210> 20
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 20
Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 21
Pro Gly Trp Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 22
Белок
<211> 107
<212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr His Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 23
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 23
Lys Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Ala Val Ala
<210> 24
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 24
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5
<210> 25
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 25
Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp Thr 1 5
<210> 26
<211> 119
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ile Leu Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115
<210> 27
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 27
Asp Tyr Asp Met Ser
<210> 28
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 28
Tyr Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 29
Gln Ile Leu Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 30
<211> 113
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 30
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr His Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 31
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 31
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 32
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 32
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
<210> 33
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 33
Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5
<210> 34
<211> 138
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 34
Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr 85
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 100
Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Arg Leu 115 120
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 130 135
35 119
Белок
Искусственная последовательность
<210> <211> <212> <213>
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Arg Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36 <211> 127
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 36
Met Arg Phe Gln Val Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn
100 105 110
Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 37
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 38 <211> 448
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 38
actagtacca ccatggactc caggctcaat ctggttttcc ttgtccttat tctgaaaggc 60
gtccagtgtg aagtgcagct ggtggagtct gggggaggcc tggtgcagcc tggagggtcc 120
ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc actttcagta actttggaat gcactgggtt 180
cgacaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtcgcattca ttagtagtgg cagtagttcc 240
atctactatg cagacacagt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac 300
agcctgtacc tgcaaatgaa cagtctgagg gctgaggaca ctgccgtgta ttactgtgca 360
agaatgagac tggattacta tgctatggac tactggggtc aaggaaccat ggtcaccgtc 420
tcctcaggta agtatggcct ctaagctt 448
<210> 39
<211> 416
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 39
gctagcacca ccatgaggtt ccaggttcag gttctggggc tccttctgct ctggatctca 60
ggagcccagt gtgatatcca gatgacccag tctccatctt ctctttctgc atctgttgga 120
gatagagtca ctattacttg cagggcaagt aagagcatta gcaaatatct ggcctggtat 180
caacagaaac ctgggaaagc tcctaagctg cttatctact ctgggtccac tttgcaatct 240
ggagttccat caagattcag tggcagtgga tctggtacag atttcactct caccatcagt 300
agcctgcagc ctgaagattt tgcaacctat tactgtcaac agcataatga atacccctgg 360
accttcggcg gaggcaccaa agtcgaaatc aaacgtaagt agaatccaaa gaattc 416
<210> 40 <211> 449
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Arg Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225
230
235
240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 41 <211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> <211> <212> 42 138
Белок
<213> Homo sapiens
<400> 42
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile 1 5
Val Asn Cys Glu Val Gln Leu Val 20
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
35 40
Ser Asp Tyr Asp Met Ser Trp Val 50 55
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Asp 65 70
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr 85
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 100
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Ile Leu 115 120
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 130 135
43 119
<210> <211> <212> <213>
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 43
Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly 10 15
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 25 30
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe 45
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 60
Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro 75 80
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 90 95
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 105 110
Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
125
Ser Ser
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ile Leu Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 133
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 44
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Val Glu Ile Lys
130
<210> <211> <212> 45 113
Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr His Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 46
<211> 448
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 46
actagtacca ccatgaactt tgggctcaga ttgattttcc ttgtccttac tctgaaaggc 60
gtgaactgtg aagtccagct cgtggagtct gggggaggcc ttgtgcagcc tggagggtcc 120
ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc gctttcagtg actatgacat gtcttgggtt 180
cgccaggctc ctggcaaggg gctggagtgg gtcgcataca ttagtgatgg cggttataac 240
acctactatc cagacactgt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac 300
tccctgtacc tgcaaatgaa cagtctgagg gctgaggaca cagccgtcta ttactgtgca 360
agacaaattc tgctgcggta ctactttgac tactggggcc aaggcaccac tgtcacagtc 420
tcctcaggtg agtccttaaa acaagctt 448
<210> 47
<211> 434
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 47
gctagcacca ccatggattc acaggcccag gttcttatgc tgctgctgct ctgggtttct 60
ggaacctgtg gggacattca gatgacacag tctccatcct ccctgtctgc ctcagttgga 120
gacagggtta ctatcacctg caagtccagt cagagtcttc tgtatagtag caatcaaaag 180
aactacttgg cctggtacca gcagaaacca gggaaggctc ctaaactgct gatttactgg 240
gcatccacta gggaatctgg ggtccctagt cgcttctcag gcagtggatc tgggacagat 300
ttcactctca ccatcagcag tctgcagcct gaagacttcg cagtttatta ctgtcagcaa 360
tatcatagct atccctggac cttcggcgga ggcaccaagg tggaaatcaa acgtaagtag 420
aatccaaaga attc 434
<210> 48
<211> 449
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ile Leu Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 49
<211> 220
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr His Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115
120
125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 50
<211> 122
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 50
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Ala Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly 115 120
<210> 51
<211> 122
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 51
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Ala Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly 115 120
<210> 52
<211> 122
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 52
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Ala Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly 115 120
<210> 53
<211> 122
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 53
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Ala Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly 115 120
<210> 54
<211> 122
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 54
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Ala Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly 115 120
<210> 55
<211> 122
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 55
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Ala Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly 115 120
<210> 56
<211> 447
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 57 <211> 214
<212> Белок
<213> Homo sapiens
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Phe Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 58 <211> 263
<212> Белок
<213> Homo sapiens
Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala
1 5 10 15
Pro Leu Ala Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr
35 40 45
Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys
50 55 60
His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln
65 70 75 80
Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile
85 90 95
Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu
100 105 110
Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile
115 120 125
Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu
130 135 140
Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro
145 150 155 160
Leu Leu Gly Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val
165 170 175
Ile Val Val Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His
180 185 190
Ser Val Glu Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp
195 200 205
Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala
210 215 220
Ala Pro Ala Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu
225 230 235 240
Leu His Asp Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys
245 250 255
Ser Phe Phe Thr Glu Thr Gly 260
<210> 59
<211> 358
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 59
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly Thr Gly Gly Gly Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 60
<211> 449
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Arg Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305
310
315
320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 61
<211> 446
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Arg Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 62
<211> 449
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Arg Gln Ile Leu Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340
345
350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 63
<211> 446
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Ile Leu Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 64
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115
120
125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 65
<211> 220
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr His Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Анти-TIGIT антитело, которое связывается с полипептидом TIGIT на одном или нескольких аминокислотных остатках, содержащих D51,
где полипептид TIGIT имеет аминокислотную
последовательность, соответствующую SEQ ID N0:1.
2. Анти-TIGIT антитело по п.1, которое представляет собой моноклональное антитело.
3. Анти-TIGIT антитело по п.1 или п. 2, которое является химерным, гуманизированным или венированным.
4. Анти-TIGIT антитело по п.1, которое представляет собой человеческое антитело.
5. Анти-TIGIT антитело по любому из пп.1-4, которое не связывается с одним или несколькими аминокислотными остатками, содержащими L4 4, 147 или Н55.
6. Анти-TIGIT антитело по любому из пп.1-5, которое содержит
зрелую вариабельную область легкой цепи SEQ ID N0:14 и зрелую вариабельная область тяжелой цепи SEQ ID N0:10.
7. Рекомбинантное анти-TIGIT антитело по любому из пп.1-6, которое связывается с тем же с эпитопом, что и TIG1, в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID N0:1.
8. Анти-TIGIT антитело по любому из пп.1-7, содержащее три CDR легкой цепи, содержащие SEQ ID N0:15-17, и три CDR тяжелой цепи, содержащие SEQ ID N0:11-13.
9. Анти-TIGIT антитело по любому из пп.1-7, содержащее зрелую вариабельную область тяжелой цепи, которая по
меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID N0:35, и
зрелую вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID N0:37.
10. Анти-TIGIT антитело по п.9, в котором
зрелая вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:35 и
зрелая вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:37.
11. Антитело по п.9 или п.10, в котором
11.
зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, содержащей SEQ ID N0:40, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или отсутствовать, и
зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, содержащей SEQ ID N0:41.
12. Моноклональное антитело, которое конкурирует с любым TIG1, TIG2 или TIG3 за связывание с TIGIT человека, причем
антитело TIG1 характеризуется зрелой вариабельной областью легкой цепи SEQ ID N0:14 и зрелой вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID N0:10,
антитело TIG2 характеризуется зрелой вариабельной областью легкой цепи SEQ ID N0:22 и зрелой вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID N0:18, и
антитело TIG3 характеризуется зрелой вариабельной областью легкой цепи SEQ ID N0:30 и зрелой вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID N0:2 6, для специфического связывания с CD155.
13. Моноклональное антитело по п.12, которое связывается с тем же самым с эпитопом на TIGIT человека, что и любое TIG1, TIG2 или TIG3.
14. Антитело по любому из пп.1-13, которое ингибирует связывание CD155 с TIGIT человека.
15. Моноклональное антитело по п.12, содержащее три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, соответствующие трем CDR легкой цепи и трем тяжелой цепи любого TIG1, TIG2 или TIG3.
16. Моноклональное антитело по п.12, содержащее три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи любого TIG1, TIG2 или TIG3.
17. Моноклональное антитело по п.12, содержащее три CDR тяжелой цепи, определенные по номенклатуре Кэбота, и три CDR легкой цепи, определенные по номенклатуре Кэбота, любого TIG1 (SEQ ID N0:15-17 легкой цепи и 11-13 тяжелой цепи), TIG2 (SEQ ID N0:23-25 легкой цепи, 19-21 тяжелой цепи) или TIG3 (SEQ ID N0:31-33 легкой цепи и 27-29 тяжелой цепи).
18. Моноклональное антитело по любому из пп.12-17, которое является химерным, гуманизированным или венированным.
19. Моноклональное антитело по п.12, которое представляет
13.
собой человеческое антитело.
20. Моноклональное антитело по любому из пп.12-19, которое имеет человеческий IgGl каппа изотип.
21. Моноклональное антитело по любому из пп.12-20, которое представляет собой интактное антитело.
22. Моноклональное антитело по любому из пп.12-20, которое представляет собой одноцепочечное антитело, Fab или F(ab')2~ фрагмент.
23. Моноклональное антитело по любому из пп.12-21,
содержащее
зрелую вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID N0:35, и
зрелую вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID N0:37.
24. Моноклональное антитело по п.23, в котором
зрелая вариабельная область тяжелой цепи по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID N0:35 и
зрелая вариабельная область легкой цепи по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID N0:37.
25. Моноклональное антитело по п.24, в котором
зрелая вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:35 и
зрелая вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:37.
26. Моноклональное антитело по п.25, в котором
зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, содержащей SEQ ID N0:40, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или отсутствовать, и
зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, содержащей SEQ ID N0:41.
27. Моноклональное антитело по п.25, в котором
зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, содержащей SEQ ID N0:60, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или
отсутствовать, и
зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, содержащей SEQ ID N0:64.
28. Моноклональное антитело по п.25, в котором
зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, содержащей SEQ ID N0:61, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или отсутствовать, и
зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, содержащей SEQ ID N0:64.
29. Моноклональное антитело по любому из пп.12-21,
содержащее
зрелую вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID N0:43 и
зрелую вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID N0:45.
30. Моноклональное антитело по п.29, в котором
зрелая вариабельная область тяжелой цепи по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID N0:43 и
зрелая вариабельная область легкой цепи по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID N0:45.
31. Моноклональное антитело по п.30, в котором
зрелая вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:43 и
зрелая вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:45.
32. Моноклональное антитело по п.31, в котором
зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, содержащей SEQ ID N0:48, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или отсутствовать, и
зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, содержащей SEQ ID N0:49.
33. Моноклональное антитело по п.31, в котором
зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, содержащей SEQ ID N0:62, при
условии, что С-концевой лизин может присутствовать или отсутствовать, и
зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, содержащей SEQ ID N0:65.
34. Моноклональное антитело по п.31, в котором
зрелая вариабельная область тяжелой цепи связана с константной областью тяжелой цепи, содержащей SEQ ID N0:63, при условии, что С-концевой лизин может присутствовать или отсутствовать, и
зрелая вариабельная область легкой цепи связана с константной областью легкой цепи, содержащей SEQ ID N0:65.
35. Моноклональное антитело, которое связывается с
эпитопом, содержащим остатки 35 и 37 SEQ ID N0:1 и/или остатки
49 и 51 SEQ ID N0:1.
36. Моноклональное антитело по п.35, которое связывается с эпитопом, содержащим остатки 35, 37, 49 и 51 SEQ ID N0:1.
37. Моноклональное антитело по п.35, которое связывается с пептидом, состоящим из остатков 35-51 SEQ ID N0:1 и не более чем пяти фланкирующих аминокислот из SEQ ID N0:1 с обеих сторон.
38. Моноклональное антитело по п.37, которое связывается с пептидом, состоящим из остатков 35-51 SEQ ID N0:1.
39. Моноклональное антитело по п.35, в котором эпитоп состоит из 3-20 смежных остатков SEQ ID N0:1.
40. Моноклональное антитело по любому из предшествующих пунктов, которое обладает одним или несколькими из следующих свойств:
(a) ингибирует связывание TIGIT с CD155, необязательно с
IC50 15-100 нг/мл,
(b) повышает естественную Т-клеточную активацию в
присутствии антиген-презентирующих клеток, экспрессирующих
CD155, как измерено по продукции IL-2, необязательно 1,5-3-
кратно,
(c) повышает антиген-специфическую Т-клеточную активацию,
как измерено по продукции IL-12, необязательно 1,5-3-кратно,
(с!) повышает активацию природных киллерных клеток, как
измерено по продукции любого из IL-2, IL-б, TNFa или IFNy, необязательно 1,5-3-кратно,
(e) повышает продукцию Т-клетками по меньшей мере одного провоспалительного цитокина, необязательно 1,5-3-кратно, и
(f) уменьшает продукцию Т-клетками по меньшей мере одного анти-воспалительного цитокина, необязательно 1,5-3-кратно.
41. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по
любому из предшествующих пунктов и фармацевтически приемлемый
носитель.
42. Способ лечения или осуществления профилактики
злокачественного новообразования, включающий введение индивиду,
страдающему злокачественным новообразованием или у которого
повышен риск развития злокачественного новообразования, антитела
по любому из предшествующих пунктов в эффективном режиме или в
терапевтически эффективном количестве.
43. Способ по п.42, где злокачественное новообразование представляет собой острый миелоидный лейкоз или Т-клеточный лейкоз взрослых.
44. Способ по п.42 или п.43, при котором индивиду вводят
опухоль-инфильтрирующие Т-клетки, которые активируются
антителом.
45. Способ по любому из пп.42-4 4, при котором индивиду вводят вакцину, индуцирующую иммунный ответ против злокачественного новообразования, который усиливается антителом.
46. Способ по п.45, при котором вакцина содержит антиген или его фрагмент, экспрессируемый на поверхности злокачественных клеток.
47. Способ по любому из пп.42-4 6, при котором индивиду вводят природные киллерные клетки, цитотоксичность которых против злокачественного новообразования усиливается антителом.
48. Способ по любому из пп.42-4 7, при котором индивиду также вводят второе антитело против антигена, экспрессированного на поверхности клеток злокачественного новообразования, при этом эффектор-опосредованная цитотоксичность второго антитела против злокачественного новообразования усиливается антителом.
43.
49. Способ по любому из пп.42-4 7, при котором индивиду также вводят второе антитело против антигена, экспрессированного на поверхности иммунной клетки.
50. Способ по п.49, при котором иммунная клетка представляет собой Т-клетку или природную киллерную клетку.
51. Способ по п. 49 или п. 50, при котором антиген представляет собой CTLA-4, PD-1 или PD-L1.
52. Способ по любому из пп.42-51, при котором индивиду также проводят один или несколько видов терапии, выбранных из группы, состоящей из химиотерапи, облучения, клеточной терапии и хирургической операции.
53. Способ по любому из пп.42-52, при котором индивиду также вводят ингибитор одного или нескольких рецепторов или лигандов иммунных контрольных точек.
54. Способ по п.53, при котором ингибитор выбран из группы, состоящей из ипилимумаба, ниволумаба, пембролизумаба (ламбролизумаб) и атезолизумаба.
55. Способ лечения индивида, инфицированного патогеном, включающий введение индивиду антитела по любому из предшествующих пунктов в эффективном режиме или в терапевтически эффективном количестве.
56. Способ по п.55, при котором патоген представляет собой вирус, бактерии, грибы или простейшие.
57. Способ по п.56, при котором патоген представляет собой
ВИЧ, ВСГ, гепатит, вирус герпеса, аденовирус, вирус гриппа,
флавивирус, эховирус, риновирус, вирус Коксаки, короновирус,
респираторный синцитиальный вирус, вирус эпидемического
паротита, ротавирус, вирус кори, вирус краснухи, парвовирус,
вирус коровьей оспы, HTLV вирус, вирус денге, папилломавирус,
вирус моллюска, полиовирус, вирус бешенства, JC вирус, вирус
абровирусного энцефалита, хламидии, риккетсии, микобактерии,
стафилококки, стрептококки, пневмококки, менингококки,
гоноококки, клебсиеллу, протеус, серрацию, псевдомонас,
легионеллу, дифтерию, сальмонеллу, бациллу, холеру, столбняк,
ботулизм, сибирскую язву, чуму, лептоспироз, и вызывающие
болезнь Лайма бактерии.
43.
58. Способ по любому из пп.55-57, при котором индивид получает лечение вакциной, индуцирующей иммунный ответ против патогена, который усиливается антителом.
59. Способ по п.58, при котором вакцина содержит белок патогена или его фрагмент.
60. Способ по любому из пп.55-59, при котором индивиду также вводят второе антитело против патогена, где эффектор-опосредованная цитотоксичность второго антитела против патогена усиливается антителом.
61. Способ по любому из пп.55-60, при котором индивиду также вводят одно или несколько противовирусных средств, антипаразитарных средств, антибактериальных средств или противогрибковых средств.
62. Способ, способствующий лечению злокачественного новообразования, включающий введение индивиду, страдающего злокачественным новообразованием, терапевтически эффективного количества антитела по любому из предшествующих пунктов.
63. Способ по п.62, при котором злокачественное новообразование представляет собой острый миелоидный лейкоз или Т-клеточный лейкоз взрослых.
64. Способ по п.62 или п.63, при котором индивиду вводят
опухоль-инфильтрирующие Т-клетки, которые активируются
антителом.
65. Способ по любому из пп.62-64, при котором индивиду вводят вакцину, индуцирующую иммунный ответ против злокачественного новообразования, который усиливается антителом.
66. Способ по п.65, при котором вакцина включает антиген, экспрессированный на поверхности злокачественных клеток, или его фрагмент.
67. Способ по любому из пп.62-66, при котором индивиду вводят природные киллерные клетки, цитотоксичность которых против злокачественного новообразования усиливается антителом.
68. Способ по любому из пп.62-67, при котором индивиду вводят второе антитело против антигена, экспрессированного на поверхности злокачественных клеток, при этом эффектор-опосредованная цитотоксичность второго антитела против
64.
злокачественного новообразования усиливается антителом.
69. Способ по любому из пп.62-67, при котором индивиду также вводят второе антитело против антигена, экспрессированного на поверхности иммунной клетки.
70. Способ по п.69, при котором иммунная клетка представляет собой Т-клетку или природную киллерную клетку.
71. Способ по п. 69 или п. 70, при котором антиген представляет собой CTLA-4, PD-1 или PD-L1.
72. Способ по любому из пп.62-71, при котором индивиду также проводят один или несколько видов лечений, выбранных из группы, состоящей из химиотерапии, облучения, клеточной терапии и хирургической операции.
73. Способ по любому из пп.62-72, при котором индивиду также вводят ингибитор одного или нескольких рецепторов или лигандов иммунных контрольных точек.
74. Способ по п.73, при котором один или несколько рецепторов или лигандов иммунных контрольных точек выбраны из группы, состоящей из CTLA-4, PD-1, PD-L1, TIM-3, LAG-3, BTLA, VISTA, CD96, A2aR, A2bR, Аргиназы, CD39, CD73, IDO и TDO.
75. Способ по п.74, при котором ингибитор выбран из группы, состоящей из ипилимумаба, ниволумаба, пембролизумаба (ламбролизумаб) и атезолизумаба.
По доверенности
ФИГ. 1
551992
Связывание hCD155-Fc с NSO/hTIGIT клетками в присутствии анти-TIGIT антитела
300 п
0.01 0.1 1 10
Концентрация конкурента (мкг/мл)
ФИГ. 2
TiGI VH
1 2 3
123456789 0123456789 0123456789 0123456789 DVQLVESGG GLVQPGGSRK LSCAASGFTF SNFGMHWVRQ
GDR1
4 5 6 7
0123456789 01223456789 0123456789 0123456739 a
APEKGLEVWA FISSGSSSIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF CDR2
1 1
S 9 0 1
0122223456789 0123456789 000123456789 0123
abc ab LQMTSLRSEDTAM YYCARM RLDY YAMDYWGQGTSV TVSS
CDR3
ФИГ. 3
T!G1 VL
1 2 3
123456789 0123456789 0123456789 0123456789 DVQITQSPS YLAAS PGETI TINCRASKSi SKYLAWYQEK
CDR1
4 5 6 7
0123456789 0123456789 0123456789 0123456789 PGKTNKLL1Y SGSTLQSGIP SRFSGSGSGT DFTLTiSSLE CDR2
8 9 0
0123456789 0123456789 01234567 PEDFAMYYCQ QHNEYPWTFG GGTKLEIK
ФИГ. 4
TIG2 VH
123456789 0123456789 EVQLQQSGP ELVKPGASVK 2 3
0123456789 0123456789 iSCKTSGYTF TEYTMHWVKQ CDR1
4 5 6 7
0123456789 01223456789 0123456789 0123456789 a
SHGKNLEWiG GINPNNGGTSY NQKFKGRATL TVDKSSSTAY
CDR2
1 1
8 9 0 1
0122223456789 01 23456789 000 1 23456789 0123
abc ab
MELRSLTSDDSAV YYCARPGWYN YAMDYWGQGTSV TVSS
CDR3
ФИГ. 5
TIG2VL
123456789 0123456789 DIVMTQSHK FMSTSVGDRV 2 3 0123456789 0123456789 NITCKASQGV STAVAWYQQK CDR1
4 5 0123456789 0123456789 PGQSPKLLIY SASYRYTGVP
CDR2 6 7 0123456789 0123456789 DRFTGSGSGT DFTFTISSVQ
8 9 0
0123455789 0123456789 01234567 AEDLAVYHCQ QHYITPMTFG GGTKLEiK CDR3
ФИГ. 6
ТЮЗ VH
123456789 0123456789 EVQLVESGG GLVKPGGSLK 2 3 0123456789 0123456789 LSCAASGFAF SDYDMSVWRQ CDR1
4 5
0123456789 0123456789 a
TPEKRLEWVA YISDGGYNTYY CDR2
6 7
0123456789 0123456789
PDTVKGRFTI SRDNAKNTLY
1 1
8 9 0 1
0122223456789 0123456789 000123456789 0123
abc ab
LQMSSLKSEDTA! YYCARQiLLR YYFDYWGQGTTL TVSS
CDR3
ФИГ. 7
ТЮЗ VL
1 2 3
123456789 0123456789 0123456777777789 0123456789
abcdef
DIVMSQSPS SLAVSVGEKV TMTCKSSQSLLYSSNQ KNYLAWYQQK
CDR1
4 5 6 7
0123456789 0123456789 0123456789 0123456789 PGQSPKLUY WASTRESGVP DRFTGSGSGT DFTLTISSVK CDR2
8 9 0
0123456789 0123456789 01234567 AEDLAVYYCQ QYHSYPWTFG GGTK LEI К CDR3
ФИГ. 8
HuTIGl VH gene
ACTAGTACCACCATGGACTCCAGGCTCAATCTGGTTTTCCTTGTCCTTATTCTGAAAGGC MDSRLNLVFLV LI L KG
GTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGGTCC
VQCEVQLVESGGGLVQ PGGS CTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTTTGGAATGCACTGGGTT
L RLSCAASGFTFSNFGMHWV CGACAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATTCATTAGTAGTGGCAGTAGTTCC
RQA PGKGL EWVA F I SSGSSS ATCTACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAC
iYYADTVKGRFTISRD N А К N AGCCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCA
SLYLQMNSLRAEDTAVYYC A AGAATGAGACTGGATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCATGGTCACCGTG
RMRLDYYAMDYWGQGTMVTV TCCTCAGGTAAGTATGGCCTCTAAGCTT ( SEQ ID N0:38)
S S (SEQ IDN0:34)
ФИГ. 9A
HuTIGl VL gene
GCTAGCACCACCATGAGGTTCCAGGTTCAGGTTCTGGGGCTCCTTCTGCTCTGGATCTCA
M RFQVQVLGL L L L W I S GGAGCCCAGTGTGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTCTTTCTGCATCTGTTGGA GAQCDIQMTQSPSSLSASVG
GATAGAGTCACTATTACTTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATCTGGCCTGGTAT DRVTITCRASKSiSKYLAW Y
CAACAGAAACCTGGGAAAGCTCCTAAGCTGCTTATCTACTCTGGGTCCACTTTGCAATCT QQKPGKAPKLLIYSG STLQS
GGAGTTCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGT G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S
AGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACCTATTACTGTCAACAGCATAATGAATACCCCTGG
SLQPEDFATYYCQQHNEY P W
ACCTTCGGCGGAGGCACCAAAGTCGAAATCAAACGTAAGTAGAATCCAAAGAATTC (SEQ ID N0:39)
TFGGGTKVEIK (SEQ ID N0:35)
ФИГ. 9B
CMV-P
р-лактамаза
SV4Q-A
pUCori
pure
Еаа!
СН2
СНЗ
CMV-P
pHuTIGl.AA SV40-P
HuTIGl VL
ФИГ. 10
tcoRi Nhel
Связывание HuTIGl-IgGl ,АА с человеческим TIGIT
0.001 0,01 0.1 1 10
Концентрация антитела (мкг/мл)
ФИГ. 11
FACS анализ связывания с NSO-hTIGIT клетками
HuTIGl-igGLAA HuT!G3-!gG1.AA
0.001 0.01 0.1 1 10
Концентрация антитела (мкг/мл)
ФИГ. 12
Связывание FITC-меченного CD155-FC с NSO-hTIGIT клетками
0,01 0.1 1 10
Концентрация конкурирующего антитела (мкг/мл)
ФИГ. 13
HuTIG3 VH ген
ACTAGTACCACCATGAACTTTGGGCTCAGATTGATTTTCCTTGTCCTTACTCTGAAAGGC
M N F G L R L I F L V L T L KG GTGAACTGTGAAGTCCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTTGTGCAGCCTGGAGGGTCC
V N С E V Q L V E S G G G L V Q P G G S CTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTGACTATGACATGTCTTGGGTT
LRLSCAASGFAFSDYDMSWV CGCCAGGCTCCTGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTGATGGCGGTTATAAC
RQA PGKGLEWVAY! SDGGYN ACCTACTATCCAGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAAC
T Y Y P D T V К G P. F T i S R D N А К N TCCCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTGCA
SLYLQMNSLRAEDTAVY Y С A AGACAAATTCTGCTGCGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTGTCACAGTC
RQILLRYYFDYWGQGTTVT V
TCCTCAGGTGAGTCCTTAAAACAAGCTT (SEQ ID N0:46) S S (SEQ ID N0:42)
ФИГ. 14A
HuTIG3 VL ген
GCTAGCACCACCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGCTGCTGCTGCTCTGGGTTTCT MDSQAQVLMLLLL W V S GGAACCTGTGGGGACATTCAGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCCTCAGTTGGA GTCGDIQMTQSPSSLS AS V G
GACAGGGTTACTATCACCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTTCTGTATAGTAGC.AATCAAAAG
DRVTITCKSSQSLLYSSNQ К AACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAGGCTCCTAAACTGCTGATTTACTGG
N YLAWYQQKPGKAPKLL ! Y W GCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTAGTCGCTTCTCAGGCAGTGGATCTGGGACAGAT
AST RES G У PS RFSGSGSGTD TTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGCCTGAAGACTTCGCAGTTTATTACTGTCAGCAA
FTLTISSLQPEDFAVYY CQQ TATCATAGCTATCCCTGGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAACGTAAGTAG
YHSYPWTFGGGT К V E i К (SEQ ID N0:44) AATCCAAAGAATTC (SEQ ID N0:47)
ФИГ. 14B
Связывание HuTIG3-lgG1 .АА с человеческим TIGIT
0.001 0.01 0.1 1
Концентрация антитела (мкг/мл)
ФИГ. 15
' Г
Я5>
ФИГ. 16
ПовышеннаяС04+ &С08+Т-клеточная пролиферация в присутствии TIG1 в результате стимуляции антиген-специфического ответа
I- аз
TIG1 усиливает пролиферативный TIG1 усиливает пролиферативный
ответ человеческих С04+Т-клеток Щ ответ человеческих С04+Т-клеток
на сенсибилизирующий антиген 1 на сенсибилизирующий антиген
Донор 1 ^г12 Донор 2
TIG1 усиливает пролиферативный TIG1 усиливает пролиферативный
ответ человеческих С08+Т-клеток ответ человеческих С08+Т-клеток
на сенсибилизирующий антиген | на сенсибилизирующий антиген
Донор 1 Щ Донор 2
ФИГ. 18
Повышенная NK-клеточная цитотоксичность, вызванная TIG1, на К562 клетках-мишенях
Повышенная NK-клеточная естественная цитотоксичность в присутствии TIG1 к К562 клеткам
C4I CD LO
о-5.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0-
ФИГ. 19
HuTIGl-lgG1 .АА потенцирует эффекторный ответ цитокинов
5 3.0'
Ответ человеческих IL-2 на SEB суперантиген
24 часа
5 3.0'
Ответ человеческих IL-6 на SEB суперантиген
24 часа
CD о.
CD 2.5' о
С\1
CD О.
CD О
2.5-
2.0'
Z.0-
со оо о оо 1.5
оз со о оо 1.5'
1.0'
1.0'
о о.
0.5
N °1 Ъ V <о
0.5
\ °V °d V $р <^N <^N <^N <^
<^N <^N <^
eh SEB [мкг/мл] Ei+Anti-PD-1 [Юмкг/мл] +HuTIG1-lgG1 .АА [10мкг/мл]
Ответ человеческих TNFa на SEB Ответ человеческих IFNg на SEB
суперантиген 24 часа
CD О.
CD С_Э
оз оо о
о. о 2.5
2,0-
1.5'
1.0'
0.5
суперантиген 24 часа
ч \ S
\ % Ъ V <о
& ж
ФИГ. 20
Jurcat-TIGIT клеточная линия экспрессирует TIGIT на поверхности клеток
Экспрессия человеческого TIGIT на Jurcat-TIGIT репортерной клеточной линии
^ 500-1
0=001 0,01 0,1
мкг/мл Антитела
Anti-TiGIT (MSBA43) РЕ eBioscienoes (12-9500-42)
ФИГ. 21
HuTIGl-IgGl .АА & Hu TIG3-lgG1 .АА не вызывает активность CDC
120-
ичност
отанны
100-
гокс
\о са о.
с_э
60-
с_э
с_э
QUI
1-19 по
МПЛ1
ванн
20-
CDC анализ с HuTIGl-IgGl .АА & Ни TIG3-lgG1 .АА
-е- кроличье ATG
0.1
-В- HuTIGl-lgG1 АА A HuTIG3-lgG1.AA
гтц
100
мкг/мл Антитела
ФИГ. 22
Анализ Т-клеточной антагонистической активности in vitro для анти-человеческих антител к TIGIT
3.0-1
ztz
2,5-
тноси
.ИНИЦ1
2.0-
\ к
ztz
ztz
LO-
QQ C_3
OS-
0,0-
HuTIGl-lgG1 .АА усиливает естественную Т-клеточную активацию с использованием Jurcat-TIGIT репортерной клеточной линии
CD _Q
ztz _о
О CD
СО СО
со о
HuTIG3-lgG1.AA усиливает естественную Т-клеточную активацию с использованием Jurcat-TIGIT репортерной клеточной линии
LO LO
О О
о. о I- со со
^ ^ ^
^ ^ ^
CD СО LO CD т-- С\]
533
CD CD
О) О)
CD CD CD I- -
О О
о I- со
^ ^ ^
^ ^ ^
CD CO LO
О 1- c\i
CD i
CD T-
O) CD
- _оз
CD T-1-
iZZ CD
S S §
CD CD
CD CD CD I- _
<С ОС
о ФИГ. 23
Анализ Т-клеточной антагонистической активности in vitro для анти-человеческих антител к TIGIT
- изотипический контроль =• окрашивающее антитело
Comp-BL2-A" CD155-PE 574.26-А Comp-RL1-A:: CD112-APC 670J4-A Comp-VLIA:: PDL1-Paciiic Blue
ФИГ. 24
2750
2500
2250
2000
i / ^/U
1500
'21 LJL.
1250
1000
7"dQ 500
250
HuTIGl HuTIGl Q-PD-L1 HuTIGl ИЗОТИПИЧеСКИЙ
5 мкг/мл 15 мкг/мл 10 мкг/мл a-PD-и контроль
ФИГ. 25
Лимфо-идные
В клетки
NK клетки
Субпопуляции Клеточно-поверхностные маркеры
Наивные
CD19- !gD+CD27+
CD19*lgD- CD27-
CD19+laD*CD2/
CD56+CD16-
Плазматические, клетки памяти
pD56+CD164
CD56hi
убТ клетки
CD56lo
Наивные
rCRy6+
CD4+CD45RA+CCR7+
+/- ;
Уровень экспрессии
Миело-идные
CD4 Т
клетки
CD8'
клетки
Дендритные клетки
Моноци-тарные
эффекторные
CD25+ ! reg
Наивные
эффекторные
Плазма-цитоидные
BDCA3+
Миелоидные
Классические
Воспалительные
CD16W CD14IO
CD4+CD45RA+CCR7-
i4+CD45RA-CCR7-
CD4+CD45RA-CCR7+
CD8+CD45RA+CCR7+
CD56-CD14tCLEC9a; CD14- CD123*HLA-DR
CD56' CLEC9a+CD141 HLA-DR+
CD56-CD141-aEC9a
CD14*CD33-HLA-Cf:-
CD56-CD141-CLEC9s
CD14^CD18'HLAOR
CD56- CD141 CLEC9a-CD14*CD33-HLA-D^
CD4*CD25RA*CD127
-4:
+/-
"4/-
W''iWli'v"""Ti'iii4 !¦¦ ¦ '
¦ I (tm)
ФИГ. 26A
ФИГ. 26В
ФИГ. 27
ФИГ. 28
100-1
80-
60-
40-
CJ>
20-
¦B--H-
****** *e
l-i-i-i-i-i 1-i-i-i-i-i-i 1-i-i-i-i-i-i-
Cyno# 67
Cyno#68
Cyno #69
ФИГ. 29A
Cyno #67
Cyno #68
Cyno #69
ФИГ. 29В
^ вон
о н-
60-
§ 401
Cyno #67
Cyno #68
Cyno #69
-i-i-i-i-i-i 1-i-i-i-i-i-i 1-i-i-i-i-i-г
ФИГ. зов
50-
ФИГ. 31
Клеточно-поверхностные маокеоы
HuTIGl
Меланома
Т-клетки
TCRP-CD4-CD25-
TCRp+ CD4+ CD25+
!; -t-ч-Ч- f
TCRjr CD8-
;! -( + H-1- ;'
Антигенпре-зентирующие клетки
CD11b+CD14+HLADR+
llllll
CD1 lb CD14- HLA-DR+
iiiiiif
Колорек-тальный рак
Т-клетки
TCRB+CD4+CD25-
TCRp+CD4+CD25+
TCRp+CD8+
Антигенпре-зентирующие клетки
CD11b+CD14+HLA-DR+
CD11b- CD14-HLA-DR-
Немелко-клеточная карцинома легкого
Т-клетки
TCR|3+CD4+CD25-
TCRp+CD4+CD25+
:! +1-Н- ¦.
TCRjJ-* CD8+
¦¦ i I ;
Антигенпре-зентирующие клетки
DC11b+CD14+HLA-DR+
DC11b- CD14-HLA-DR+
1111111
Светлокле-точная почечно-клеточная карцинома
Т-клетки
TCRp+CD4-CD25-
: : +'~: :
TCRj3+CD4+CD25+
;: V |
TCRp+ CD8+
I' .. +
Антигенпре-зентирующие клетки
CD11b+CD14+HLA-DR+
GDI 1b-CD14- HLA-DR+
Уровень экспрессии
+/-
++++
ФИГ. 32А
ФИГ. 32В
(19)
(19)
(19)
<400> 57
<400> 57
103
103
Ill
Ill
1/34
1/34
2/34
2/34
3/34
3/34
9/34
9/34
11/34
11/34
11/34
11/34
12/34
12/34
13/34
13/34
13/34
13/34
15/34
15/34
17/34
17/34
18/34
18/34
18/34
18/34
18/34
18/34
18/34
18/34
19/34
19/34
20/34
20/34
21/34
21/34
21/34
21/34
21/34
21/34
22/34
22/34
22/34
22/34
22/34
22/34
22/34
22/34
22/34
22/34
22/34
22/34
23/34
23/34
25/34
25/34
25/34
25/34
25/34
25/34
25/34
25/34
27/34
27/34
28/34
28/34
28/34
28/34
29/34
29/34
30/34
30/34
100-
32/34
31/34
100-
32/34
31/34
100-
32/34
31/34
100-
32/34
31/34
100-
32/34
33/34
34/34
34/34
34/34
34/34