EA201891926A1 20190430 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2019\PDF/201891926 Полный текст описания [**] EA201891926 20170318 Регистрационный номер и дата заявки US62/310,705 20160319 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2017/023110 Номер международной заявки (PCT) WO2017/165244 20170928 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21904 Номер бюллетеня [**] МИКРООРГАНИЗМЫ И ИСКУССТВЕННЫЕ ЭКОСИСТЕМЫ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БЕЛКА, ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ И ПОЛЕЗНЫХ ПОБОЧНЫХ ПРОДУКТОВ ИЗ СУБСТРАТОВ C1 Название документа [8] C12P 1/04, [8] C12P 5/00, [8] C12P 7/64, [8] C25B 1/04, [8] C12M 1/04, [8] C12N 1/20 Индексы МПК [US] Рид Джон С., [US] Геллер Джил, [US] Хенде Сонали Сведения об авторах [US] КИВЕРДИ, ИНК. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201891926a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Предложены микроорганизмы и биопроцессы, которые обеспечивают конверсию газообразных C1-содержащих субстратов, таких как синтез-газ, генераторный газ и возобновляемый H 2 в сочетании с CO 2 , в питательные и другие полезные биопродукты.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Предложены микроорганизмы и биопроцессы, которые обеспечивают конверсию газообразных C1-содержащих субстратов, таких как синтез-газ, генераторный газ и возобновляемый H 2 в сочетании с CO 2 , в питательные и другие полезные биопродукты.


Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201891926 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.03.18
(51) Int. Cl.
C12P1/04 (2006.01) C12P 5/00 (2006.01) C12P 7/64 (2006.01) C25B 1/04 (2006.01) C12M1/04 (2006.01) C12N1/20 (2006.01)
(54) МИКРООРГАНИЗМЫ И ИСКУССТВЕННЫЕ ЭКОСИСТЕМЫ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БЕЛКА, ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ И ПОЛЕЗНЫХ ПОБОЧНЫХ ПРОДУКТОВ ИЗ СУБСТРАТОВ C1
(31) 62/310,705; 62/454,347
(32) 2016.03.19; 2017.02.03
(33) US
(86) PCT/US2017/023110
(87) WO 2017/165244 2017.09.28
(71) Заявитель: КИВЕРДИ, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Рид Джон С., Геллер Джил, Хенде Сонали (US)
(74) Представитель:
Харин А.В., Котов И.О., Буре Н.Н., Стойко Г.В. (RU) (57) Предложены микроорганизмы и биопроцессы, которые обеспечивают конверсию газообразных d-содержащих субстратов, таких как синтез-газ, генераторный газ и возобновляемый H2 в сочетании с CO2, в питательные и другие полезные биопродукты.
1-H I
МИКРООРГАНИЗМЫ И ИСКУССТВЕННЫЕ ЭКОСИСТЕМЫ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БЕЛКА, ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ И ПОЛЕЗНЫХ ПОБОЧНЫХ ПРОДУКТОВ ИЗ СУБСТРАТОВ С1
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ [01] Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/310705, поданной 19 марта 2016 года и № 62/454347, поданной 3 февраля 2017 года, обе включены в данное описание в полном объеме посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ [02] Предмет изобретения относится к биологическому производству аминокислот и белков, и других компонентов биомассы в системе микроорганизмов с использованием газообразного субстрата, такого как синтез-газ или генераторный газ или пиролизный газ, или смеси газов Нг и СОг в качестве источника углерода и энергии. Изобретение также относится к использованию аминокислот микроорганизмов, белков и других компонентов биомассы для питания или обеспечения питательных веществ других гетеротрофных организмов, животных или людей. Аминокислоты, белки и другие компоненты биомассы, полученные в соответствии с данным изобретением, могут потребляться и использоваться в качестве питательных веществ другими организмами для производства продуктов питания и других биопродуктов.
[03] Это раскрытие относится к композициям, способным продуцировать и способам продуцирования аминокислот, белков и других компонентов биомассы путем культивирования бактерий или других микроорганизмов, которые растут в присутствии углеродосодержащих газов, таких как синтез-газ, генераторный газ, СО2, угарный газ и смеси вышеуказанного, содержащие газообразный водород. Это раскрытие дополнительно относится к способам фиксации углерода из газообразного субстрата в полезные органические молекулы, такие как аминокислоты, белки и другие питательные вещества. Бактерии и/или микроорганизмы согласно изобретению могут быть созданы способами генетической инженерии для использования в способах или других аспектах изобретения, описанных в данном документе. В некоторых других аспектах изобретения, описанных в данном документе, микроорганизмы не являются полученными способами генетической инженерии.
[04] Это раскрытие дополнительно относится к способам фиксации углерода из газа в полезные органические молекулы, такие как аминокислоты, белки и другие питательные вещества. Данное изобретение дополнительно описывает механизмы предоставления организму способности продуцировать и/или увеличивать продукцию организмом продуктов на основе углерода путем конверсии углекислого газа или других неорганических источников углерода и неорганической энергии, включая химическую энергию из неорганического химического соединения или непосредственно из электрического источника, в продукты на основе углерода и, в частности, аминокислоты, белки и другие питательные вещества, имеющие коммерческую ценность.
[05] Данное описание дополнительно относится к искусственным экологическим системам, разработанным трофическим системам, закрытым экологическим системам, микрокосмам, системам непрерывного культивирования, биорегенеративным и замкнутым системам жизнеобеспечения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ [06] Устойчивые и возобновляемые источники аминокислот, белков и других питательных веществ необходимы для удовлетворения растущих потребностей в продуктах питания. Необходимо также уменьшить количество выбросов углекислого газа и других парниковых газов (ПГ) в атмосферу, а также сократить глобальное потребление энергии на основе угля, нефти и природного газа в системах производства продуктов питания. Рост спроса в мировой экономике усиливает давление на земельные и водные ресурсы. Повышенное давление также оказывается на традиционные источники ископаемых углеводородов для производства продуктов питания и других сельскохозяйственных продуктов. Многие отрасли промышленности, включая современное сельское хозяйство, в значительной степени зависят от наличия источников ископаемых углеводородов в качестве материала для производства и переработки сельскохозяйственных культур. Экономически эффективные альтернативы нынешним действующим практикам могут помочь снизить растущее давление на землепользование, естественные среды обитания, воду, потребность в ископаемых ресурсах, затраты на сырье и выбросы парниковых газов.
[07] Известны биологические системы, которые связывают газообразный углерод посредством естественных биохимических метаболических процессов. Одним из примеров является нынешняя сельскохозяйственная система, основанная
на фотосинтезе в культурах высших сельскохозяйственных растений. Системы водорослей также были разработаны для создания продуктов питания и других продуктов, полученных при ведении сельского хозяйства, из СО2 посредством фотосинтетических реакций. Существуют также гетеротрофные реакции и производные с использованием источников связанного углерода, такого как сахар, который косвенно зависит от фотосинтеза. Животноводство и аквакультура, как правило, в настоящее время используют в качестве основного сырья продукты фотосинтеза, в виде различных кормов. Обычно используются искусственные или комплексные корма, которые представляют собой смеси кормовых продуктов, и витаминные и минеральные премиксы, которые приготовлены так, чтобы содержать требуемые уровни необходимых питательных веществ и энергии. Эти корма часто являются продуктами сельскохозяйственных культур. Или, в некоторых случаях, они получены при сборе или добыче диких организмов в природе. В основе этой продукции, как правило, лежит фотосинтетический трофический слой первичных продуцентов, которые либо потребляются прямо, либо косвенно. Примером производства продуктов питания, который служит для иллюстрации непосредственного потребления диких первичных фотосинтетических продуцентов, является выпас скота на необрабатываемых землях. Примером, который служит для иллюстрации производства продуктов питания путем косвенного потребления диких первичных фотосинтетических продуцентов является использование рыбной муки в аквакультуре, полученной из запасов дикой рыбы, такой как сардины и анчоусы, которые, в свою очередь, питаются фотосинтезирующими водорослями. Тем не менее, существующие практики сельского хозяйства, животноводства и аквакультуры и корма на основе фотосинтеза, которые используются в настоящее время имеют ряд проблем и ограничений.
[08] Увеличение мирового населения в сочетании с увеличением потребления морепродуктов на душу населения привело к постоянно растущему спросу на морепродукты. В то время как спрос растет, запасы многих морских рыб уже подвергаются чрезмерному вылову. Аквакультура помогла удовлетворить этот растущий спрос и улучшить питание и продовольственную безопасность во многих частях мира. Эксперты говорят, что при отсутствии роста мирового улова дикой рыбы практически все эти новые морепродукты должны выращиваться искусственно. По данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций (FAO), к 2030 году во всем мире потребуется еще 40 млн. тонн морепродуктов в год, чтобы соответствовать текущим потребностям, и "с
застоем производства промыслового рыболовства прогнозируется значительное увеличение производства рыбного продовольствия с использованием аквакультуры ... для поддержания нынешнего уровня потребления на душу населения в 2030 году потребуется еще 27 миллионов тонн продукции с использованием аквакультуры". Быстрый рост аквакультуры сопровождает рост в отрасли производства корма для аквакультуры.
[09] Рыбы являются одними из самых энергоэффективных животных для выращивания, а аквакультура является одним из наиболее ресурсосберегающих способов получения животного белка. В частности, рыбы конвертируют в массу тела большую часть пищи, которую они едят, в сравнении с наземными животными. "Коэффициенты конверсии кормов" (FCR) показывают, сколько фунтов корма требуется для производства фунта животного продукта. Было обнаружено, что лосось - самая культивируемая рыба на исскуственном кормлении, более эффективен, чем другие формы производства белка, например через курятину, свинину или говядину. Сообщается, что FCR для лосося составляет 1,2, в то время как для курицы: 1,9; свиньи: 5,9; и коровы: 8.7. Более того, углеродный след аквакультуры часто является частью углеродного следа животноводства на суше. Основные Вопросы о Аквакультуре Национального Управления Океанических и Атмосферных Исследований (National Oceanic and Atmospheric Administration) (NOAA) http://www.nmfs.noaa.gov/aquaculture/faqs/faq_aq_101.html включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
[10] Культивируемые рыбы питаются кормами, специально разработанными для удовлетворения их потребностей в питании. Этот корм может содержать все необходимые питательные вещества, необходимые для поддержания их здоровья и роста, и часто находится в виде высушенных гранул. Потребности в питании рыб зависят от вида. Травоядные рыбы потребляют кормовую смесь, которая может содержать растительные белки (например, сою, кукурузу), растительные масла, минералы и витамины. В дикой природе хищные рыбы, такие как лосось, потребляют другую рыбу. Однако даже в случае хищных рыб большая часть рациона может содержать растительные белки, масла, минералы и витамины. [11] На практике значительная часть корма для аквакультуры содержит источники животного белка и, в частности, рыбную муку. Компонент рыбной муки корма для аквакультуры, как правило, получен из взятой из природы рыбы. Однако широко распространенная практика сбора дикой рыбы для кормления других культивируемых рыб считается нерациональной. Основная проблема, стоящая перед
индустрией аквакультуры, заключается в уменьшении сильной зависимости от диких видов в основе пищевой цепи. В глобальном масштабе аквакультура использует примерно половину метрической тонны дикой цельной рыбы для производства одной метрической тонны культивируемых морепродуктов. Количество рыбы, которую вы получаете "на выходе" (в виде морепродуктов) по отношению к количеству рыбы, которую вы положили "на входе" (в корме), называется коэффициентом конверсии "рыба-на входе/рыба-на выходе" (FIFO) и сильно варьирует среди видов. Новый корм, изготовленный из соевых бобов и побочных продуктов рыболовства, помог снизить зависимость от истощенных запасов, но эксперты предупреждают, что требуется гораздо больше работы для обеспечения уверенности в том, что культивирование рыбы может быть расширено без нарушения окружающей среды или уменьшение количества других видов в океанах. Около % рыбной муки и масла получают при отлове небольших, встречающихся в открытом океане (пелагических) рыб, называемых кормовыми рыбами, таких как анчоусы, сельдь, менхаден, мойва, сардинопс, сардины и скумбрия. Несмотря на то, что они являются основными компонентами кормов для свиней и птиц в течение многих десятилетий, растущий процент ресурса кормовых рыб используется для производства водных кормов из-за мирового роста аквакультуры за последние два десятилетия. Доля аквакультуры в уловах кормовой рыбы почти удвоилась с 2000 года и теперь потребляет почти 70 процентов мирового производства рыбной муки и почти 90 процентов мирового производства рыбьего жира. Улов для этих различных применений привел к снижению численности сардин, анчоусов и других естественных кормовых рыб. Многие страны отправляют корабли в Антарктику для сбора более 200 000 тонн в год крошечного криля - основного источника пищи для пингвинов, тюленей и китов. Критиками нынешней практики аквакультуры это называется "высасыванием основы пищевой цепи чтобы производить массу относительно дешевого белка" и было описано как "экологическое безумие".
[12] Задача, с которой сталкивается аквакультура, заключается в повышении эффективности и устойчивости. С ростом затрат на рыбную муку производители аквакультуры пытаются разработать экономически эффективные, но здоровые альтернативы для использования в кормах для аквакультуры. Потенциальные альтернативы, которые исследуются, включают продукты питания и масла из растений (наибольший источник протеинов и пищевого масла в целом), отходы
переработки рыбы, дрожжи, водоросли, насекомые, жуки и другие особые продукты питания и морские водоросли.
[13] Рыбоводы также все чаще обращаются к разведению всеядных рыб, таких как тилапия, которые могут легко потреблять корма, содержащие соевые бобы и другие зерна. Тилапия - всеядный потребитель малоподвижной пищи, который питается фитопланктоном, перифитоном, водными растениями, небольшими беспозвоночными, бентосной фауной, детритом, бактериями и бактериальными пленками, связанными с детритом. Тилапия Нила может фильтровать корм путем захвата взвешенных частиц, в том числе фитопланктона и бактерий, на слизистую оболочку в буккальной полости, хотя, как сообщается, его основной источник питания потребляется путем поверхностного соскребания на перифитоновых матах. Мальки Тилапии и молодые рыбы всеядны, питаются главным образом зоопланктоном и зообентосом, а также детритом, поверхностной биомассой (aufwuchs) и фитопланктоном. рН желудка Тилапии варьирует в зависимости от степени наполнения, и когда желудок полный может быть настолько низким, что составляет 1,4, что облегчается лизис сине-зеленых и зеленых водорослей, а также диатомовых водорослей. Требования Тилапии к белкам, липидам, витаминам, минералам и углеводам варьируют в зависимости от степени зрелости. [14] Пищевые потребности рыб на ранних стадиях развития часто отличаются от пищевых потребностей взрослых рыб. Почти все мальки, в том числе травоядных видов, обычно являются хищными и питаются зоопланктоном и небольшими беспозвоночными, такими как ракообразные на стадии личинки, молодняка и на других ранних стадиях развития. Производство большинства видов морских рыб в настоящее время зависит от живых кормов для поддержания личинок рыбных объектов в первые недели жизни. Этот живой корм часто содержит зоопланктон, который представляет собой микроорганизмы или маленькие организмы, обитающие в пресной, солоноватой или морской воде или других соленых водах. Организмы зоопланктона включают коловратки [тип Rotifera], отряд Cladoceran (например, Daphnia sp., Moina sp.), подкласс Copepoda (например, Cyclops) и морскую креветку (Anemia sp.). Сообщается, что экономическое производство зоопланктона препятствует успешной аквакультуре некоторых морских рыб. [15] Нереализованный потенциал аквакультуры побудил некоторых ученых, экономистов и политиков одобрить ее как один из наших лучших вариантов для обеспечения пищевыми продуктами растущего населения мира, которой к 2050 году, как ожидается, увеличится с 7 миллиардов до 9 миллиардов человек. Чтобы
полностью реализовать этот потенциал, необходимы новые источники белка и других питательных веществ для корма аквакультуры.
[16] Бактериальные клетки и другие микроорганизмы были применены для переработки сахаросодержащего сырья в полезные органические соединения, такие как белки и аминокислоты, в гетеротрофных ферментативных системах. Однако для этих систем существуют существенные препятствия. Гетеротрофное ферментатирование уязвимо к контаминации, потому что другие гетеротрофные микроорганизмы, которые могут расти на питательных веществах со связанным углеродом и конкурировать с производственным штаммом, встречаются повсеместно в непосредственной окружающей среде. Гетеротрофные технологии также, как правило, страдают от ограничений в свете конкуренции с нынешними способами производства продуктов питания, потому что вы, по сути, используете источник пищи для создания другого источника пищи. Это может привести к многочисленным негативным воздействиям на окружающую среду. [17] В дополнение к необходимости использования новых источников белка и других питательных веществ для кормления животных, которые, в свою очередь, либо потребляются, либо содержатся в качестве домашних животных, либо иным образом используются человечеством, существует потребность в альтернативных источниках белка и других питательных веществах для непосредственного потребления людьми. Одна из областей, где эта потребность особенно актуальна, находится в области космического полета человека, где требуется системы жизнеобеспечения, которая обеспечивает потребности экипажа - О2. Н2О и пищевые продукты, а также устраняет их отходы - СО2, сточные воды и тепло. Продовольственные товары представляют собой основной источник массы и объема при более длительных миссиях. Существует потребность в системах жизнеобеспечения, которые будут работать в течение более длительного периода времени без пополнения запасов. Неотъемлемым требованием для таких систем является способность превращать человеческие и корабельные отходы в полезные продукты, такие как кислород, питьевая вода, продукты питания и расходные материалы. Существует потребность в продукции продуктов питания, которые является съедобными после выращивания, и которая поддается расширенному надежному автоматическому росту и сбору. Падение мощности биологических систем является важным фактором. Существует потребность в биологических системах, которые эффективно используют надежные ядерные и/или солнечные энергетические системы.
[18] Хемоавтотрофные микроорганизмы представляют собой слабо изученную альтернативу фотосинтезирующим организмам для использования в процессах фиксации углерода, которая может удовлетворить многие неудовлетворенные потребности, описанные выше, избегая при этом ограничений фотосинтеза, описанных в данном документе, в то же время эффективно используя миллиарды лет ферментативной эволюции для реакций каталитической фиксации углерода и синтеза из исходного сырья С1. Реакции хемосинтеза, проводимые хемоавтотрофами для фиксации СОг и других форм неорганического углерода в органические соединения обеспечиваются за счет потенциальной энергии, хранящейся в неорганических химических соединениях, а не лучистой энергии света [Shively et al. (1998) Аппи. Rev. Microbiol. 52:191-230; Smith et al. (1967; JBacteriol 94(4): 972-983; Hugler et al. (2005) J Bacteriol 187(9): 3020-27; Scott and Cavanaugh (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(4): 1174-79]. Биохимические пути фиксации углерода, которые характерны для хемоавтотрофов, включают цикл трикарбоновой кислоты, цикл Кальвина-Бенсона-Бассама [Shively et al. supra, van Kaulen, et al. (1998) Annu. Rev. Microbiol, 191-230], и путь Вуда-Льюнгдаля [Ljungdahl (1986) 40: 415-50; Lee, et al. (2008) Biotechnology andBioengineering 101(2): 209-228; Fischer, et al. (2008) Metabolic Engineering 10:295-304]. Хемоавтотрофные микроорганизмы обычно представляют собой микроорганизмы, которые могут выполнять фиксацию СО2, как в фотосинтетической темновой реакции, но которые могут поглощать восстановители, необходимые для фиксации СО2, из неорганического внешнего источника, вместо того, чтобы генерировать их внутри во время фотосинтетической реакции на свету. Стадия сбора энергии, соответствующая фотосинтетической реакции на свету, должна все же происходить, но она может задействовать абиотический процесс, такой как, например, сбор световой энергии с использованием фотоэлектрического или солнечного теплового процесса. [19] Хемоавтотрофные организмы особенно хорошо подходят для гибридных химических/биологических процессов для конверсии СО2 в органические вещества, где биологическая стадия ограничена только фиксацией СО2. Эти стадии фиксации СО2 примерно соответствуют темновой реакции, которая происходит при фотосинтезе. Этому гибридному химическому/биологическому подходу было уделено гораздо меньше внимания, чем более традиционным гетеротрофным или фотосинтетическим биопроцессам для производства биопродуктов. Однако, существует ряд потенциальных преимуществ такого гибридного подхода, включая способность эффективно сочетать ферментативные способности, приобретенные за
миллиарды лет эволюции при фиксации СО2, с широким спектром технологий преобразования абиотической энергии, такой как солнечная фотоэлектрическая энергия, солнечная тепловая энергия, ветровая, геотермальная, гидроэлектрическая или ядерная, чтобы эффективно и без загрязнений приводить в действие общий процесс биохимического производства из источника углерода СО2. Кроме того, микроорганизмы, выполняющие фиксацию углерода без прямых требований к параметрам света, при таком гибридном процессе могут содержаться в более контролируемых и защищенных средах, менее подверженных воздействию потерь воды и питательных веществ, контаминации или ущербу, причинённому неблагоприятными погодными условиями в сравнении с теми, которые могут быть практически использованы для культивирования фотосинтетических микроорганизмов. Увеличение мощности биореактора может быть легче достигнуто при вертикальной, нежели при горизонтальной конструкции, что делает его потенциально более эффективным на суше. Гибридная химическая/биологическая система предлагает возможность прохождения молекулярных процессов превращения СО2 в органику, которые не имеют недостатков фотосинтеза, сохраняя при этом биологические возможности для комплексного и разнообразного органического синтеза из СО2 и других простых неорганических исходных веществ. [20] Ранее были описаны применения хемоавтотрофных микроорганизмов при улавливании и конверсии газа СО2 в связанный углерод. Однако многие из этих подходов имеют недостатки, которые ограничивают их эффективность, экономическую осуществимость, практичность и коммерческое внедрение. [21] Необходимо преодолеть узкое место, связанное со значительным увеличением объема сельскохозяйственной продукции для получения устойчивого результата в большом масштабе. Существует потребность биологического производства в компактном вертикальном масштабировании, а не в традиционных сельскохозяйственных подходах, которые масштабируются горизонтально и имеют высокую интенсивность использования земельных и водных ресурсов. Необходимо смягчить конфликт между получением продовольствия и природой, а также конфликты, связанные с использованием земельных ресурсов, и разрушением естественных мест обитания.
[22] Технологии газохимии (GTC) обеспечивают преимущество использования источников углеродных отходов в производстве органических молекул. К таким потенциальным источникам отходов относятся: отходы с высоким содержанием лигноцеллюлозы - путем превращения в синтез-газ (сингаз) посредством
газификации; и отходы СО2, полученные из промышленных дымовых газов, например, путем подачи водорода. Синтез-газ представляет собой смесь газов, которые обычно содержат Н2, СО и СО2 в качестве основных компонентов, которые могут быть получены путем парового реформинга метана и/или жидкого нефтяного газа или биогаза или путем газификации любого органического, легковоспламеняющегося материала на основе углерода, включая, но не ограничиваясь ими, биомассу, отходы органического материала, различные полимеры, торф и уголь. Для производства синтез-газа доступны многие процессы газификации. Ряд процессов газификации подвергает углеродсодержащее сырье частичному окислению при высоких температурах (500-1500 °С), при этом подача кислорода ограничена для предотвращения полного сгорания, обеспечивая получение синтез-газа с различным составом, зависящим от исходного сырья и условий реакции, так что соотношение FL-iCO может варьировать от 0,5:1 до 3:1. Можно повысить содержание водородного компонента синтез-газа и/или понизить содержание компонента СО с помощью реакции СО с паром в реакции конверсии водяного газа с одновременным увеличением содержания СО2 в смеси синтез-газа. [23] Некоторые основные технологии конверсии синтез-газа в химические соединения включают химические каталитические процессы, такие как процесс Фишера-Тропша (FT), а также процессы синтеза метанола или других смешанных спиртов, процесс Хабера-Боша для производства аммиака и мочевины и биологические процессы ферментации синтез-газа.
[24] Использование синтез-газа и/или СО2 и/или возобновляемого Н2 в биопроцессе газа обеспечивает возможность использования более дешевых, более гибких и более масштабируемых источников энергии и/или углерода для биологического синтеза устойчивых химических соединений и топлива, чем это возможно при помощи гетеротрофного или фототрофного биосинтеза. В биопроцессе синтез-газа синтез-газ действует как углерод и источник энергии для культуры микроорганизмов.
[25] Биопроцесс, основанный на использовании газообразного сырья, такого как синтез-газ, может оказывать значительно меньшее отрицательное воздействие на окружающую среду и производство продуктов питания при биологическом синтезе органических соединений, нежели оказывают высокоинтенсивные гетеротрофные или фототрофные технологии на земельные и водные ресурсы. Однако в настоящее время биологические технологии GTL и GTC обычно обеспечивают производство спиртов с относительно короткой цепью или другие органические соединения с
короткой цепью в качестве основных продуктов. Ни одна из этих использующихся в настоящее время биологических конверсий не обеспечивает производство коммерчески конкурентоспособных аминокислот, белков и других биологических питательных веществ. Микроорганизмы, потребляющие синтез-газ, используемые в современных биологических технологиях GTC, как правило, плохо подходят для синтеза молекул, имеющих среднюю и длинную углеродную цепь, таких как большинство аминокислот, белки и других биологические питательных веществ. [26] Хотя абиотический синтез аминокислот и пептидов из простых С1 и неорганических предшественников, таких как Н2, СО2, СО, Н2О, NH3, СН4, СН3ОН, НСОН, известен, такие подходы в настоящее время не являются конкурентоспособными по сравнению с биологическими способами для получения белков или производных белков для питания человека, животных и других гетеротрофов. Проблемы, препятствующие физикохимическому, абиотическому подходу, включают низкий выход и побочные реакции, приводящие к получению потенциально токсичных побочных продуктов.
[27] Необходимо идентифицировать набор микроорганизмов, которые могут расти в обычных и масштабируемых емкостях реактора, и которые производят коммерчески жизнеспособные наборы органических углеродных цепей, в частности, более четырех атомов углерода в длину при использовании коммерчески приемлемого способа. Необходимо идентифицировать микроорганизмы, которые метаболически не ограничены типичными источниками связанного углерода, такими как сахар, и микроорганизмы, которые могут дополнительно использовать синтез-газ, генераторный газ, а также широкий спектр абиотических источников углерода и энергии, направляемых через промежуточную смесь газов Н2/СО2, для синтеза молекул добавок. Это приведет к универсальности исходного сырья, которая намного превышает сравнимые гетеротрофные системы. Необходимо выявить и использовать микроорганизмы, которые могут использовать доноров электронов, таких как водород, присутствующий в синтез-газе, генераторном газе, а также легко вырабатываемый с помощью широкого спектра абиотических возобновляемых и/или имеющих низкий уровень выбросов СО2 технологий для роста и фиксации углерода. [28] Существует потребность в биологических средствах производства аминокислот, белков и других биологических питательных веществ из недорогого или возобновляемого сырья. Существует потребность в биопроцессе, который превращает недорогой синтез-газ и/или СО2 в более дорогостоящие органические
химические соединения, включая, но не ограничиваясь этим, аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ [29] В ответ на необходимость в области техники, которую изобретатели приняли во внимание при создании изобретения, в данном документе представлена система для производства органических химических соединений, включая, но не ограничиваясь этим, аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества из недорогих и возобновляемых исходных материалов. В некоторых вариантах реализации изобретение может сочетать эффективное производство этих высокоценных органических соединений с удалением источников отходов углерода и/или с улавливанием СО2, что может обеспечить дополнительный доход и/или социальную ценность.
[30] Данное изобретение позволяет использовать природные или модифицированные микроорганизмы для превращения газа СО2 и/или синтез-газа и/или генераторного газа и/или метана в аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества с длиной углеродной цепи от средней до большой. Данная технология позволяет разрабатывать новые природные или классически выращиваемые и/или генетически улучшенные штаммы микроорганизмов, которые могут быть использованы для биопроцессинга синтез-газа в биологических процессах газохимии (GTC) для получения и/или секреции различных органических соединений с относительно длинной цепью, которые представляют собой добавки, и в настоящее время производятся только в больших количествах из культур сельскохозяйственных высших растений или животных источников.
[31] Данное изобретение относится к селекции и/или размножению и/или разработке микроорганизмов, включая, но не ограничиваясь этим, окисляющие водород, окисляющие угарный газ и оксигидрогеновые микроорганизмы с естественной способностью расти и синтезировать биомассу на газообразных источниках углерода, таких как синтез-газ и/или СО2, таким образом, что производственные микроорганизмы синтезируют целевые химические продукты при культивировании с газом. Микроорганизмы и способы согласно данному изобретению могут обеспечить возможность проведения недорогого синтеза биохимических веществ, которые могут конкурировать по цене с нефтехимическими продуктами и аминокислотами, белками и другими биологическими питательными
веществами, полученными из высших растений. В некоторых вариантах реализации изобретения эти аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества, как прогнозируется, имеют значительно более низкую цену, чем аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества, полученные при гетеротрофном или фототрофном синтезе с помощью микроорганизмов. [32] Изобретение относится к композиции, содержащей микроорганизм, который конвертирует синтез-газ и/или газ СО2 и/или смесь газа СО2 и Н2 вместе с источником азота, включая, но не ограничиваясь этим, аммиак, аммоний и/или мочевину, в одну или более аминокислот, белков и других биологических питательных веществ. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция содержит микроорганизм, причем микроорганизм представляет собой одно или более из следующего: гидрогенокислительный хемоавтотрофный микроорганизм; микроорганизм, окисляющий угарный газ; водородный микроорганизм. Водородные микроорганизмы, гидрогенотрофы, карбоксидотрофы и хемоавтотрофы в большей степени способны улавливать СО2 или СО в качестве единственного источника углерода для поддержания биологического роста. В некоторых вариантах реализации изобретения этот рост включает биосинтез аминокислот и белков. Водородные микроорганизмы и другие гидрогенотрофы могут использовать Н2 в качестве источника восстановительных электронов для дыхания и биохимического синтеза. В некоторых вариантах реализации данного изобретения водородные организмы и/или гидрогенотрофы и/или карбоксидотрофы и/или другие хемоавтотрофные микроорганизмы выращивают в потоке газов, включая, но не ограничиваясь одно или более из следующего: СО2; СО; Н2; наряду с неорганическими минералами, растворенными в водном растворе. В некоторых вариантах реализации изобретения водородные организмы и/или гидрогенотрофы и/или карбоксидотрофы и/или другие хемоавтотрофные и/или метанотрофные микроорганизмы конвертируют парниковые газы (Ш ) в биомолекулы, включая аминокислоты и белки.
[33] В некоторых вариантах реализации данного изобретения были преодолены общеизвестные недостатки фотосинтетических систем для улавливания и конверсии СО2, таких как те, которые основаны на водорослях или высших растениях, в то время как продолжает эффективно использоваться эволюционировавшая за миллиарды лет уникальная биологическая способность комплексного органического синтеза из СО2 для получения ценных биохимических веществ, таких как, но не ограничиваясь этим, аминокислоты и белки.
[34] В некоторых вариантах реализации изобретения композиция содержит микроорганизм, причем микроорганизм выбран из родов Rhodococcus или Gordonia. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция содержит микроорганизм, причем микроорганизм представляет собой Rhodococcus opacus. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция содержит микроорганизм, причем микроорганизм представляет собой Rhodococcus opacus (DSM 43205) или Rhodococcus sp. (DSM 3346). В некоторых вариантах реализации изобретения композиция содержит микроорганизм, причем микроорганизм выбран из родов Ralstonia или Cupriavidus. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция содержит микроорганизм, причем микроорганизм представляет собой Cupriavidus necator. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения штамм Cupriavidus necator представляет собой DSM 531 или DSM 541. [35] В одном аспекте предусмотрен природный или модифицированный микроорганизм, который способен превращать газообразный субстрат, такой как генераторный газ или синтез-газ или другую газовую смесь, которая содержит Н2 и СО2, и/или СО, и/или СН4 в аминокислоты, белки, и другие биологические питательные вещества. Газообразный субстрат используется микроорганизмом в качестве источника углерода и/или энергии. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы, способные расти на газообразном субстрате, трансформируются полинуклеотидом, который кодирует ген, который необходим для биосинтеза аминокислоты, белка или другого биологического питательного вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота, белок, другое биологическое питательное вещество или цельный клеточный продукт выделяется из клеток микроорганизмов или из среды для роста микроорганизмов. Генераторный газ, который может быть использован в описанных в данном документе процессах роста микроорганизмов, может быть получен из источников, которые включают газификацию отходов в качестве сырья и/или биомассы, или газообразные отходы промышленных процессов или паровой реформинг природного газа или биогаза.
[36] В одном аспекте предусмотрен не встречающийся в природе микроорганизм, который способен расти на газообразном субстрате в качестве источника углерода и/или энергии, причем микроорганизм содержит по меньшей мере одну экзогенную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой бактериальную клетку. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения бактериальная клетка представляет
собой Cupriavidus sp. или Ralstonia sp., например, но не ограничиваясь этим, Cupriavidus necator. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой Cupriavidus necator DSM 531 или DSM 541. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой Ralstonia eutropha N-l, DSM 13513. [37] В некоторых вариантах реализации изобретения газообразный субстрат содержит СОг в качестве источника углерода. В некоторых вариантах реализации изобретения газообразный субстрат содержит Н2 и/или 02 в качестве источника энергии. В некоторых вариантах реализации изобретения газообразный субстрат включает генераторный газ, синтез-газ или пиролизный газ. В некоторых вариантах реализации изобретения газообразный субстрат содержит смесь газов, содержащих Н2 и/или СО2 и/или СО.
[38] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм продуцирует аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества при культивировании в присутствии газового субстрата в условиях, подходящих для роста микроорганизма и производства биопродуктов.
[39] В некоторых вариантах реализации изобретения экзогенный ген кодируется кодирующей последовательностью в не встречающемся в природе микроорганизме, который переносится на плазмиду широкого спектра хозяев. В некоторых вариантах реализации изобретения экзогенная кодирующая последовательность гена находится под контролем неродного индуцируемого промотора. В некоторых вариантах реализации изобретения индуцируемый промотор получен из оперона ara Е. coli. [40] В некоторых вариантах реализации изобретения кодирующая последовательность (CDS) экзогенного гена является кодон-оптимизорованной для экспрессии в микроорганизме, как описано в данном документе, например, но не ограничиваясь этим, видах Ralstonia или Cupriavidus, например Cupriavidus necator. [41] В другом аспекте предлагаются способы получения аминокислот, белков и других биологических питательных веществ с использованием модифицированного микроорганизма, описанного в данном документе, который способен расти на газообразном субстрате в качестве источника углерода и/или энергии и который содержит по меньшей мере одну экзогенную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах реализации изобретения не встречающийся в природе микроорганизм, описанный в данном документе, культивируют в биореакторе, который содержит газообразный субстрат и культуральную среду (например, жидкую среду для выращивания), которая содержит другие питательные вещества для роста и
производства биопродуктов в условиях, которые являются подходящими для роста микроорганизма, причем микроорганизм продуцирует аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества.
[42] В некоторых вариантах реализации изобретения газообразный субстрат в биореакторе содержит Н2 и/или СО2. В некоторых вариантах реализации изобретения газообразный субстрат представляет собой генераторный газ, синтез-газ или пиролизный газ. В некоторых вариантах реализации изобретения газообразный субстрат представляет собой природный газ биогаз. В некоторых вариантах реализации изобретения газообразный субстрат получают из твердых бытовых отходов, черного щелока, сельскохозяйственных отходов, древесных отходов, труднодоступного природного газа, биогаза, сернистого газа, гидратов метана, шин, нефтяного кокса, сточных вод, навоза, соломы, лигноцеллюлозных энергетических культур, лигнина, растительных остатков, жмыха, опилок, остатков лесного хозяйства, пищевых отходов, отходов дорожного покрытия, отходов пластмассы, свалочного газа и/или лигноцеллюлозной биомассы.
[43] В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества извлекаются из культуральной среды. В некоторых вариантах реализации изобретения культуральная среда представляет собой двухфазную жидкую среду, которая содержит водную фазу и органическую фазу, а аминокислоты, белки и/или другие биологические питательные вещества выделяют с помощью экстракции или реакционной экструзии из органической фазы.
[44] В другом аспекте представлены микроорганизмы и способы получения аминокислот, белков и других биологических питательных веществ. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается природный или не встречающийся в природе микроорганизм, который способен расти на газообразном субстрате в качестве источника углерода и/или энергии, причем микроорганизм не содержит или содержит по меньшей мере одну экзогенную нуклеиновую кислоту, причем указанный микроорганизм биосинтезирует аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается способ получения аминокислот, белков и других биологических питательных веществ в природном или не встречающимся в природе микроорганизме, описанном в данном документе, который способен расти на газообразном субстрате в качестве источника углерода и/или энергии, причем микроорганизм не содержит или содержит одну или более экзогенных нуклеиновых
кислот и биосинтезирует аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества, включающий культивирование природного или не встречающегося в природе микроорганизма в биореакторе, который содержит газообразный субстрат и культуральную среду (например, жидкую среду для выращивания), которая содержит другие питательные вещества для роста и производства биопродуктов в условиях, которые подходят для выращивания микроорганизма и производства аминокислот, белков и других биологических питательных веществ, причем микроорганизм продуцирует аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества.
[45] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы согласно данному изобретению используются для улавливания СО2 из промышленных дымовых газов и получения богатой белками биомассы. В некоторых вариантах реализации изобретения эта богатая белками биомасса представляет собой реализуемый товар. В некоторых вариантах реализации изобретения богатая белками биомасса используется как белок одноклеточных организмов (SCP). В некоторых вариантах реализации изобретения богатая белками биомасса используется в качестве корма для аквакультуры или в качестве составляющей части корма для аквакультуры или в удобрении. В некоторых вариантах реализации изобретения богатая белками биомасса используется в качестве заменителя рыбной муки с высоким содержанием белка, используемой в аквакультуре и/или кормах для других животных и/или растительных удобрениях. В некоторых неограничивающих вариантах реализации данное изобретение используется как для снижения ПГ, так и для получения богатых белком продуктов для применения, включая, но не ограничиваясь этим, в качестве корма для животных или заменители рыбной муки, казеина, сыворотки или соевой муки.
[46] В одном аспекте предлагается биологический и химический способ улавливания и конверсии неорганических и/или органических молекул, содержащих только один атом углерода, в органические молекулы, содержащие два или более атомов углерода, продуцируемые посредством анаболического биосинтеза, включающий: введение неорганических и/или органических молекул, содержащие только один атом углерода в среду, пригодную для поддержания хемоавтотрофных микроорганизмов; введение газообразного субстрата в среду, пригодную для поддержания хемоавтотрофных микроорганизмов; причем неорганические и/или органические молекулы, содержащие только один атом углерода, используются микроорганизмом в качестве источника углерода для роста и/или биосинтеза;
конверсию в окружающей среде неорганических и/или органических молекул, содержащих только один атом углерода, в органические молекулы, содержащие два или более атомов углерода, по меньшей мере, посредством одной реакции хемосинтеза с фиксацией углерода и по меньшей мере одного пути анаболического биосинтеза, имеющегося у хемоавтотрофных микроорганизмов; причем реакция хемосинтеза с фиксацией и анаболический путь биосинтеза, по меньшей мере, частично питаются химической и/или электрохимической энергией, обеспечиваемой донорами электронов и акцепторами электронов, которые были получены химически и/или электрохимически и/или термохимически и/или введены в окружающую среду из, по меньшей мере, одного источника, внешнего по отношению к окружающей среде.
[47] В некоторых вариантах реализации изобретения указанный микроорганизм представляет собой бактериальную клетку. В некоторых вариантах реализации изобретения указанные микроорганизмы представляют собой водородные микроорганизмы. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный микроорганизм представляет собой Cupriavidus sp. или Ralstonia sp. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный микроорганизм представляет собой Cupriavidus necator. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы включают микроорганизмы, выбранные из одного или более из следующих родов: Cupriavidus sp., Rhodococcus sp., Hydrogenovibrio sp., Rhodopseudomonas sp., Hydrogenobacter sp., Gordonia sp., Arthrobacter sp., Streptomycetes sp. Rhodobacter sp., and/or Xanthobacter sp.
[48] В некоторых вариантах реализации изобретения указанный газообразный субстрат содержит СОг в качестве источника углерода. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный газообразный субстрат содержит Н2 и/или О2 в качестве источника энергии. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный газообразный субстрат содержит пиролизный газ или генераторный газ, или синтез-газ. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный газообразный субстрат содержит смесь газов, содержащих Н2 и/или СОг и/или СО. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный газообразный субстрат содержит Н2 и/или СО2.
[49] В некоторых вариантах реализации изобретения указанный микроорганизм продуцирует аминокислоты и/или белок и/или витамины и/или биомассу при культивировании в присутствии газового субстрата в условиях, подходящих для роста микроорганизма и производства биопродуктов. В некоторых вариантах
реализации изобретения аминокислоты и/или белок и/или витамины и/или биомасса извлекаются из культуральной среды.
[50] В некоторых вариантах реализации изобретения указанные микроорганизмы и/или питательные вещества, полученные с помощью указанных микроорганизмов, используются в качестве корма или для обеспечения питания одного или более других организмов.
[51] В некоторых вариантах реализации изобретения указанный газообразный субстрат представляет собой пиролизный газ или генераторный газ, или синтез-газ. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный газообразный субстрат получают из твердых бытовых отходов, черного щелока, сельскохозяйственных отходов, древесных отходов, труднодоступного природного газа, биогаза, сернистого газа, гидратов метана, шин, нефтяного кокса, сточных вод, навоза, соломы, лигноцеллюлозных энергетических культур, лигнина, растительных остатков, жмыха, опилок, остатков лесного хозяйства, пищевых отходов, отходов дорожного покрытия, отходов пластмассы, свалочного газа, келпа, водорослей и/или лигноцеллюлозной биомассы.
[52] В некоторых вариантах реализации изобретения указанные доноры электронов и/или молекулы, содержащие только один атом углерода, образуются посредством термохимического процесса, действующего на органическое вещество, включающего по меньшей мере одно из: газификацию; пиролиз; паровой реформинг; автореформинг. В некоторых вариантах реализации изобретения указанные доноры электронов и/или органические молекулы, содержащие только один атом углерода, образуются посредством парового реформинга метана. В некоторых вариантах реализации изобретения соотношение водорода и угарного газа в получаемом на выходе газе при газификации и/или пиролизе и/или автореформинге и/или паровом реформинге регулируется с использованием реакции конверсии водяного газа до подачи газа микроорганизмам. [53] В некоторых вариантах реализации изобретения указанные доноры электронов и/или акцепторы электронов производятся или повторно используются с использованием возобновляемых, альтернативных или традиционных источников энергии, которые обеспечивают низкий уровень выбросов парниковых газов, причем упомянутые источники энергии выбраны, по меньшей мере, из одной из фотоэлектрической, солнечной тепловой, ветровой, гидроэлектрической, ядерной, геотермальной, геотермальной с повышенным КПД преобразования, с использованием энергии тепла океана, энергии океанских волн и приливов.
[54] В некоторых вариантах реализации изобретения упомянутые доноры электронов и/или акцепторы электронов производятся с использованием электросети в периоды, когда производство электроэнергии в электросети превышает потребность в электроэнергии, причем резервуары хранения буферизуют генерацию указанных доноров электронов и/или акцепторов электронов и их потребление в хемосинтетической реакции.
[55] В некоторых вариантах реализации изобретения молекулярный водород действует как донор электронов и производится способом, использующим по меньшей мере одно из следующего: электролиз воды; термохимическое расщепление воды; электролиз солевого раствора; электролиз и/или термохимическое расщепление сероводорода. В некоторых вариантах реализации изобретения электролиз воды для получения водорода осуществляется с использованием одного или более из следующего: протонообменные мембраны (РЕМ), жидкие электролиты, такие как КОН, щелочной электролиз, электролиз с использованием электролита на основе твёрдых полимеров, электролиз при высоком давлении, электролиз водяных паров при высокой температуре (HTES). В некоторых вариантах реализации изобретения термохимическое расщепление воды для получения водорода осуществляется с использованием одного или более из следующего: цикл оксида железа, цикл оксид церия (ГУ)-оксид церия (III), цикл цинк-оксид цинка, цикл йод-сера, цикл медь-хлор, цикл кальций-бром-железо, гибридный цикл серы.
[56] В некоторых вариантах реализации изобретения молекулярный водород действует в качестве донора электронов и производится посредством электрохимических или термохимических процессов, которые, как известно, обеспечивают получение водорода с низкими или отсутствующими выбросами углекислого газа, включая одно или более из следующего: реформинг паров метана с возможностью улавливания и секвестрования углерода (CCS); газификация угля с возможностью CSS; Кварнер-процесс и другие процессы, обеспечивающие получение чистого углерода в качестве продукта; газификация или пиролиз биомассы с возможностью CSS; пиролиз биомассы, обеспечивающий получение биоугольного побочного продукта.
[57] В некоторых вариантах реализации изобретения указанные доноры электронов включают, но не ограничиваются этим, один или более из следующих восстановителей: аммиак; аммоний; монооксид углерода; дитионит; элементарная сера; углеводороды; водород; метабисульфиты; оксид азота; нитриты; сульфаты,
такие как тиосульфаты, включая, но не ограничиваясь этим, тиосульфат натрия (ТЧагЗгОз) или тиосульфат кальция (СаБгОз); сульфиды, такие как сероводород; сульфиты; тионаты; тиониты; переходные металлы или их сульфиды, оксиды, халькогениды, галогениды, гидроксиды, оксигидроксиды, фосфаты, сульфаты или карбонаты в растворенных или твердых фазах; и электроны проводимости или валентной зоны в материалах твердотельных электродов. В некоторых вариантах реализации изобретения указанные акцепторы электронов включают одно или более из следующего: диоксид углерода; кислород; нитриты; нитраты; ионы трехвалентного железа или других переходных металлов; сульфаты; или дыры зоны проводимости или валентной зоны в материалах твердотельных электродов. [58] В некоторых вариантах реализации изобретения стадии биологической конверсии предшествует один или более этапов химической предварительной обработки, в которых указанные доноры электронов и/или акцепторы электронов и/или источники углерода и/или минеральные питательные вещества, требуемые микроорганизмом, производятся и/или очищаются при использовании по меньшей мере, одного химического вещества на входе и/или повторно используют из химических веществ, появляющихся на стадии фиксации углерода, и/или полученных из или содержащихся в потоке отходов других промышленных, горнодобывающих, сельскохозяйственных, сточных или отходообразующих процессов.
[59] В некоторых вариантах реализации изобретения органический химический продукт включает соединения с углеродными скелетами, которые содержат пять атомов углерода или более.
[60] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается способ получения аминокислот и/или белка и/или витаминов и/или биомассы, включающий культивирование микроорганизма, как описано в данном документе, в биореакторе, который содержит газообразный субстрат и культуральную среду, которая содержит другие питательные вещества для роста и производства биопродукта в условиях, которые пригодны для выращивания микроорганизма и производства аминокислот и/или белка и/или витаминов и/или биомассы, причем указанный микроорганизм продуцирует аминокислоты и/или белок и/или витамины и/или биомассу. [61] В некоторых вариантах реализации изобретения, по меньшей мере, одна реакция хемосинтеза и, по меньшей мере, один анаболический путь биосинтеза приводят к образованию биохимических веществ, включающих по меньшей мере одно из: аминокислоты; пептиды; белки; липиды; полисахариды; и/или витамины.
[62] В некоторых вариантах реализации изобретения биомасса и/или биохимические продукты получают во время указанной, по меньшей мере, одной реакции хемосинтеза, причем биомасса и/или биохимические вещества имеют применение в качестве по меньшей мере одного из следующего: источника органического углерода и/или азота для ферментации; источника питательных веществ для роста других микроорганизмов или организмов; источника питательных веществ или пищевого ингредиента для людей; корма для животных; сырья или химического промежуточного продукта для производства или химических процессов; источников фармацевтических, лекарственных или пищевых веществ; удобрения; почвенной добавки; и/или стабилизаторов грунта. [63] В некоторых вариантах реализации изобретения источник углерода и/или азота из указанной реакции хемосинтеза используется в ферментации для получения биохимических веществ, включая, по меньшей мере, одно из: коммерческие ферменты, антибиотики, аминокислоты, белки, пищевые продукты, пищевые ингредиенты; витамины, липиды, биопластики, полисахариды, биологически активные добавки, фармацевтические препараты. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный корм для животных используется для кормления одного или более из: крупного рогатого скота, овец, цыплят, свиней, рыб, моллюсков, насекомых, беспозвоночных, кораллов. В некоторых вариантах реализации изобретения указанные моллюски или кораллы при выращивании с использованием питательных веществ, биосинтезированных из С1 источников, производят карбонатные материалы, которые фиксируют СОг в твердой минерализованной форме с высоким альбедо.
[64] Различные объекты, признаки, аспекты и преимущества данного изобретения станут более понятными из последующего подробного описания предпочтительных вариантов реализации изобретения вместе с сопровождающими графическими материалами, на которых одинаковые цифры представляют собой одни и те же компоненты
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ [65] Неограничивающие варианты реализации данного изобретения будут описаны в качестве примера со ссылкой на прилагаемые фигуры, некоторые из которых являются схематическими и не предназначены для изображения в масштабе. Для ясности не каждый компонент отмечен в каждой фигуре, и не каждый компонент каждого варианта реализации изобретения изображен в случаях,
когда иллюстрация не является необходимой для того, чтобы специалист в данной области техники мог понять изобретение.
[66] На Фигуре 1 изображены метаболические пути водородных микроорганизмов.
[67] На Фигуре 2 изображена корреляция между оптической плотностью (OD) и плотностью биомассы.
[68] На Фигуре 3 изображена кривая роста Cupriavidus necator при выращивании в бутыли в присутствии газа.
[69] На Фигуре 4 изображено изменение давления в свободном пространстве с течением времени при выращивании Cupriavidus necator в бутыли в присутствии газа.
[70] На Фигуре 5 изображена сухая биомасса, полученная, в расчете на моль Нг, потребляемого Cupriavidus necator в бутылях.
[71] На Фигуре 6 изображена кривая роста водородного микроорганизма Cupriavidus necator, выращенного в присутствии Н2/СО2/О2 в биореакторе. [72] На Фигуре 7 изображены результаты роста хемотрофных и масличных микроорганизмов на разных источниках углерода. Бактериальный рост измеряли с помощью определения оптической плотности (OD) при 650 нм после указанных дней (в скобках). Условия среды и роста описаны в Примерах ниже. ND, не сделано. [73] На Фигуре 8 изображен профиль жирных кислот Rhodococcus opacus DSM 43205.
[74] На Фигуре 9 изображен профиль жирных кислот Rhodococcus sp. DSM 3346.
[75] На Фигуре 10 изображена схема биореакторов и вспомогательных систем,
используемых для выращивания С. necator в присутствии газа.
[76] На Фигуре 11 изображены два биореактора объемом 20 л, в которых
проходит выращивание С. necator на газе в вытяжном шкафу.
[77] На Фигуре 12 изображены контроллеры Applikon и консоли, которые
использовались для контроля работы реакторов на Фигуре 11 вместе с системой
обнаружения взрывоопасных газов, массовыми расходомерами, регуляторами
уровня, базовыми контрольными резервуарами, резервуаром для добавления среды и
резервуаром для контроля пенообразования.
[78] На Фигуре 13 изображена пробирка, содержащая сырой гексановый экстракт из С. necator, который содержит масло и полимеры.
[79] На Фигуре 14 изображены образцы масла, извлеченные из С. necator, выращенного в присутствии углекислого газа (СОг) в качестве единственного источника углерода и Н2 как единственного источника водорода и электронов. [80] На Фигуре 15 изображена суспензия биомассы С. necator до обработки ультразвуком (изображено слева) коричневого цвета и после обработки ультразвуком (изображено справа). Перед обработкой ультразвуком суспензия имела коричневый цвет, а после обработки ультразвуком, с полным разрушением клеток, цвет биомассы изменялся из коричневого в кремовый.
[81] На Фигуре 16 изображен профиль длин углеродных цепей жирных кислот, которые присутствовали в маслах, экстрагированных из Cupriavidus necator. [82] На Фигуре 17 изображен штамм Hydrogenovibrio marinus DSM 11271, растущий в биореакторе в присутствии смеси газов Н2, СО2 и О2. [83] На Фигуре 18 изображена система подачи газа и культуральные бутыли, используемые для выращивания штамма Rhodopseudomonas capsulata DSM 1710, изображено схематически.
[84] На Фигуре 19 изображена микрофотография R. capsulata.
[85] На Фигуре 20 изображен осадок биомассы R. capsulata, выделенной после
центрифугирования.
[86] На Фигуре 21 схематически изображена двухлитровая стеклянная система ферментера, используемая для выращивания штамма Xanthobacter autotrophicus DSM 432 в присутствии смеси газов Н2, СО2 и О2 в качестве единственного источника энергии и углерода для роста.
[87] На Фигуре 22 изображена верхняя пластина биореактора, изображенного на Фиг. 21, изображено схематически.
[88] На Фигуре 23 изображена схема системы реактора, используемой для выращивания Xanthobacter autotrophicus, содержащая манометры; газовые расходомеры; предохранительная и контрольная запорная арматура; 0,2 микронные фильтры; сосуд биореактора, датчики, исполнительные механизмы и контроллеры; конденсатор и пеноуловитель; и выпускной газоотвод.
[89] На Фигуре 24 изображена схема системы подачи газа, используемой для выращивания X. autotrophicus.
[90] На Фигуре 25 изображена корреляция между OD600 и сухой массой клеток (CDW)X autotrophicus.
[91] На Фигуре 26 изображена кривая роста водородного микроорганизма X. autotrophicus, выращенного в присутствии Н2/СО2/О2.
[92] На Фигуре 27 изображено использование СОг + возобновляемый Н2 для производства корма для аквакультуры.
[93] На Фигуре 28 изображена составная многоступенчатая система жизнеобеспечения или экологическая система с хемоавтотрофным первичным продуцентом.
[94] На Фигуре 29 изображен частичный баланс массы системы С. necator. [95] На Фигуре 30 изображена схема циркуляции замкнутой системы жизнеобеспечения С. necator.
[96] На Фигуре 31 изображена схема цепи производственного процесса для варианта реализации изобретения с улавливанием СО2, осуществляемого микроорганизмом, способным проводить реакцию с оксигидрогеном для получения богатой белками биомассы для корма животным или других питательных веществ или биологически активных добавок.
[97] На Фигуре 32 изображена схема интегрированной системы, преобразующей отходы СО2 и внепиковую, периодическую энергию из возобновляемых источников в высокобелковые корма, удобрения и питательные вещества. В дополнение к улавливанию СО2 и производству ценных питательных веществ, система снимает нагрузку с электросети за счет избыточной возобновляемой генерации в периоды низкого потребления. Это также позволяет более полно использовать возобновляемые мощности, позволяя возобновляемым источникам энергии продолжать генерировать энергию даже в периоды низкого потребления.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ [98] В данном документе предложены способы и системы биосинтетического производства аминокислот, белков и других биологических питательных веществ. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены природные или модифицированные микроорганизмы, которые продуцируют аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества на газообразном субстрате, включая, но не ограничиваясь этим, генераторный газ, синтез-газ, остаточный газ, пиролизный газ, гремучий газ, и газовые смеси, содержащие Н2 и СО2, и/или СО и/или СН4. Газообразный субстрат может служить источником углерода и/или энергии и/или источником доноров электронов и/или акцепторов электронов для роста микроорганизмов и биосинтеза биопродуктов.
[99] Предмет изобретения включает в определенных вариантах реализации изобретения микроорганизм дикого типа или модифицированный микроорганизм, способный расти в присутствии синтез-газа или генераторного газа, и/или Н2, и/или СО2, и/или СО, и/или СН4, и/или других газобразных отходов, которые способны продуцировать аминокислоты, включая, но не ограничиваясь этим, лизин и/или метионин.
[100] В некоторых вариантах реализации данного изобретения аминокислоты и/или пептиды и/или белки и/или витамины синтезируются из простых С1 и неорганических предшественников, включая, но не ограничиваясь одно или более из следующего: Н2, С02, СО, Н20, NH3, СН4, СН3ОН, НСОН, мочевина. [101] В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к способу получения одной или нескольких аминокислот или белков или витаминов, включающему контакт бактериальной клетки с синтез-газом и/или генераторным газом и/или газообразным СО2 и/или Н2 и/или СО и/или СН4; причем бактериальная клетка способна фиксировать газообразный СО2 и/или другие С1 молекулы в одной или нескольких аминокислотах или белках или витаминах, причем микроорганизм не содержит или содержит по меньшей мере первую экзогенную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка использует указанные газообразные субстраты в качестве источника восстанавливающих эквивалентов и/или метаболической энергии для синтеза одной или нескольких аминокислот или белков или витаминов. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм, используя свои природные механизмы, производит аминокислоты и/или белки и/или витамины.
[102] В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к способу получения аминокислот и/или белков и/или белковой биомассы и/или витаминов, причем способ включает культивирование естественного штамма или модифицированного микроорганизма в биореакторе или растворе с исходным сырьем, содержащим синтез-газ и/или генераторный газ и/или СО2 и/или газ Н2 и/или СО и/или СН4. [268] В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к биореактору, содержащему композицию или бактериальные клетки или клетки микроорганизма, описанные в данном докумене. В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к системе для получения одной или нескольких аминокислот, белков или питательных веществ, содержащей биореактор, который содержит: (а) популяцию микроорганизмов, содержащую описанные в данном документе клетки; и (Ь) впуск,
соединенный с источником исходного сырья, обеспечивающий доставку исходного материала, содержащего синтез-газ или генераторный газ, и/или газообразный СО2 и/или Н2 и/или СО и/или СН4.
[103] В другом аспекте изобретения изобретение относится к способу получения молекулы или смеси молекул в популяции микроорганизмов, содержащей клетку или композицию, описанную в данном документе, причем способ включает: культивирование популяции микроорганизмов, содержащих клетку или композицию описанную в данном документе, в исходном сырье, содержащем синтез-газ или генераторный газ, и/или газообразный С02 и/или Н2 и/или СО и/или СН4. [270] В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к способу получения аминокислот или белков, или других питательных веществ в популяции микроорганизмов, содержащей клетку композиции, описанной в данном документе, причем способ включает: культивирование популяции микроорганизмов, содержащих клетку или композицию описанную в данном документе, в исходном сырье, содержащем синтез-газ или генераторный газ, и/или газообразный СО2 и/или Н2 и/или СО и/или СН4. [104] В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к способу получения одной или более аминокислот или белков, или других питательных веществ, включающему (а) культивирование клетки, описанной в данном документе, в реакционной емкости или биореакторе в присутствии синтез-газа или генераторного газа и/или газообразного СОг и/или Н2 и/или СО и/или СН4, причем клетка продуцирует и/или выделяет одну или более аминокислот, или белков, или других питательных веществ в количестве, равном или превышающем по меньшей мере 10% полной сухой клеточной массы клеток; и (Ь) выделение одной или более аминокислот или белков, или других питательных веществ или цельноклеточного продукта из реакционной емкости. В некоторых вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает очистку одной или нескольких аминокислот или белков, или других питательных веществ, или цельноклеточных продуктов после выделения из реакционной емкости или биореактора. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более аминокислот или белков, или других питательные вещества, или цельноклеточных продуктов являются компонентами или предшественниками, или входят в состав корма или питательного вещества или удобрения, предоставляемого другому организму. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения другой организм представляет собой гетеротроф, а в некоторых таких вариантах реализации изобретения животное включает, но не ограничивается этим, одно или
более из: зоопланктон, моллюски или других беспозвоночные, рыбы, птицы или млекопитающие.
[105] В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к способу получения одной или нескольких аминокислот, включающему воздействие бактериальной клетки и/или клетки архей и/или другой клетки микроорганизма на синтез-газ и/или газообразный СО2 и/или Н2 и/или СО и/или СН4; причем клетка способна фиксировать газообразный СО2 и/или другие источники углерода С1 в одну или более аминокислот и/или белков и/или витаминов; причем соединения извлекают из биореактора и подают во второй или более дополнительных реакторов и/или технологических этапов, в которых соединения подвергаются последующей обработке для получения продуктов, включающих, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: удобрение, корм для аквакультуры, корм для животных, продукты питания для человека или витамины.
[106] В некоторых вариантах реализации изобретения данное изобретение предлагает композиции и способы для улавливания углекислого газа из потоков газа, содержащих углекислый газ, и/или углекислого газа, содержащегося в атмосфере или углекислого газа в растворенной, сжиженной или химически связанной форме с помощью химического и биологического процесса, который использует облигатные или факультативные хемоавтотрофные микроорганизмы и особенно хемолитоавтотрофные организмы и/или клеточные экстракты, содержащие ферменты из хемоавтотрофных микроорганизмов в одной или нескольких стадиях процесса фиксации углерода. Данное изобретение также предлагает композиции и способы для извлечения, обработки и использования химических продуктов реакций хемосинтеза, проводимых хемоавтотрофами, для фиксации неорганического углерода в органических соединениях, которые являются промежуточными соединениями или готовыми химическими веществами, включая, но не ограничиваясь этим, аминокислоты и/или белок и/или витамины и/или биомассу. Данное изобретение также предлагает композиции и способы получения, обработки и доставки химических питательных веществ, необходимых для хемосинтеза и поддержания хемоавтотрофных культур, включая, но не ограничиваясь этим, предоставление доноров электронов и акцепторов электронов, необходимых для хемосинтеза. Данное изобретение также предлагает композиции и способы поддержания среды, способствующей хемосинтезу и хемоавтотрофному росту, а также восстановления и повторного использования неиспользованных химических питательных веществ и технологической воды.
[107] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы, описанные в данном документе, рекомбинантно модифицированы для экспрессии одного или нескольких ферментов для биосинтетического производства аминокислот, белков и других биологических питательных веществ. В некоторых вариантах реализации изобретения субстраты или промежуточные соединения направляются на синтез аминокислот, белков и/или других биологических питательных веществ в клетках микроорганизмов, например, ацетил-СоА, пируват или малонил-СоА. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения некоторая часть потока углерода с использованием различных путей биосинтеза направлена на биосинтез целевых аминокислот, белков и других биологических питательных веществ.
[108] Одна особенность некоторых вариантов реализации данного изобретения заключается во включении одного или нескольких этапов процесса, в которых используются хемотрофные микроорганизмы и/или ферменты из хемотрофных микроорганизмов в качестве биокатализатора для конверсии химических соединений С1 в органические молекулы с более длинными углеродными цепями (то есть С2 или более, а в некоторых вариантах реализации изобретения С5 или молекулы с более длинной углеродной цепью) в рамках общего процесса конверсии источников углерода С1, включая, но не ограничиваясь этим, угарный газ, метан, метанол, формиат или муравьиную кислоту и/или смеси, содержащие химические соединения С1 включая, но не ограничиваясь этим, различные композиции синтез-газа, полученные из различных газообразных, пиролизных или парориформированных источников связанного углерода и/или метанового сырья. В некоторых таких вариантах реализации изобретения синтез-газ, содержащий С1 или технологический газ, или химические вещества С1 в жидкой форме или растворенные в растворе, закачиваются или иным образом добавляются в емкость или замкнутое пространство, содержащие питательные среды и хемотрофные микроорганизмы. В некоторых таких случаях хемотрофные микроорганизмы проводят биохимический синтез для удлинения химических веществ С1 в органические химические соединения с более длинными углеродными цепями с использованием углерода и электронов, имеющихся в химическом соединении С1, и/или электронов и водорода из молекулярного водорода и/или валентных электронов или электронов проводимости в твердотельных материалах электрода и/или одного или более из следующего списка доноров электронов, вливаемых или иным образом подаваемых в питательную среду, которые включают, но не
ограничиваются этим, однно или более из следующего: аммиак; аммоний; монооксид углерода; дитионит; элементарная сера; углеводороды; метабисульфиты; оксид азота; нитриты; сульфаты, такие как тиосульфаты, включая, но не ограничиваясь этим, тиосульфат натрия (МагБгОз) или тиосульфат кальция (СаБгОз); сульфиды, такие как сероводород; сульфиты; тионаты; тиониты; переходные металлы или их сульфиды, оксиды, халькогениды, галогениды, гидроксиды, оксигидроксиды, сульфаты или карбонаты в растворимой или твердой фазах. Доноры электронов могут окисляться акцепторами электронов в реакции хемосинтетического дыхания. В некоторых вариантах реализации изобретения акцепторы электронов, которые используются для дыхания микроорганизмами согласно данному изобретению, включают, но не ограничиваются этим, одно или более из следующего: кислород, диоксид углерода, трехвалентное железо или другие ионы переходных металлов, нитраты, нитриты, кислород, или дырочные носители зарядов в материалах твердотельных электродов. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения указанный хемотрофный микроорганизм представляет собой водородный или оксигидрогенный микроорганизм. [109] В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к хемотрофным бактериальным штаммам, которые содержат ноль или более последовательностей экзогенной нуклеиновой кислоты. Данное изобретение обуславливается в частности тем, что хемотрофные бактерии и специфические связанные с ними микроорганизмы обеспечивают непредвиденные преимущества в экономическом и крупномасштабном производстве химических веществ, белков, кормов, удобрений, мономеров, масел, топлива и других биологических веществ из газообразного и отработанного углерода, а также в результате обнаружения генетических способов и систем для модификации этих микроорганизмов для повышения производительности в этих применениях. Белки, липиды и другие биохимические вещества, синтезированные микроорганизмами согласно данному изобретению, могут быть применены для использования, включая, но не ограничиваясь этим, в качестве заместителей, мономеров, сырья для производства полимеров, смазочных материалов, в качестве ингредиентов для удобрений, кормов для животных, пищевых продуктов, средств личной гигиены и косметических продуктов. В некоторых вариантах реализации данного изобретения ферментативные и химические процессы могут быть использованы для получения витаминов, аминокислот и/или белков. Некоторые варианты реализации изобретения позволяют получать корма для животных и/или удобрения. Кроме того, данное
изобретение относится к способам культивирования и/или модификации хемотрофных бактерий для улучшения выхода аминокислот и/или белка и/или для снижения производственных затрат. В некоторых вариантах реализации изобретения генетически модифицированная бактерия производит больше определенного типа или типов молекул витамина или аминокислоты по сравнению с теми же бактериями, которые не являются генетически модифицированными. [110] Данное изобретение относится к способам и механизмам получения продукции и/или секреции представляющих интерес продуктов на основе углерода, включая, но не ограничиваясь этим, химические вещества, мономеры, полимеры, аминокислоты, белки, полисахариды, витамины, биологически активные добавки или фармацевтические продукты или их промежуточные продукты облигатными или факультативными хемотрофными организмами, таким образом, что эти организмы конвертируют углекислый газ и/или другие формы неорганического углерода и/или синтез-газа и/или другие соединения С1, такие как метанол и/или жидкие, газообразные и твердые продукты пиролитических реакций, таких как пиролизный газ и/или масла, в целевые продукты на основе углерода и, в частности, использованию таких организмов для коммерческого производства химических веществ, мономеров, полимеров, аминокислот, белков, полисахаридов, витаминов, кормов для животных, удобрений, биологически активных добавок или фармацевтических продуктов или их промежуточных продуктов. [111] В некоторых вариантах реализации изобретения данное изобретение также предлагает композиции и способы для этапов химического процесса, которые происходят последовательно и/или параллельно с этапами реакции хемосинтеза, которые: обеспечивают конверсию неочищенных исходных химических материалов в более очищенные химические материалы, которые подходят для поддержки этапа хемосинтетической фиксации углерода; которые преобразуют потребляемую энергию в химическую форму, которая может быть использована для совершения хемосинтеза и, в частности, в химическую энергию в виде доноров электронов и акцепторов электронов; которые направляют неорганический углерод, захваченный из промышленных или атмосферных или водных источников, на этап фиксации углерода или этапы процесса в условиях, подходящих для поддержки хемосинтетической фиксации углерода; которые дополнительно подвергают обработке продукты этапов хемосинтетической фиксации углерода в форме, пригодной для хранения, транспортировки и продажи, причем указанные продукты включают, но не ограничиваясь этим, аминокислоты и/или белки и/или витамины
и/или биомассу. Полностью химические, абиотические этапы процесса в сочетании с этапами биологической хемосинтетической фиксации углерода составляют общий процесс улавливания и конверсии углерода согласно данному изобретению. В данном изобретении используется уникальная легкость интеграции хемоавтотрофных микроорганизмов в поток химического процесса в качестве биокатализатора по сравнению с другими формами жизни. Без намерения ограничиваться теорией, эта уникальная способность и легкость, по-видимому, возникают из-за того, что хемоавтотрофы естественным образом действуют на границе биологии и абиотической химии посредством своего хемосинтетического способа существования.
[112] Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которому относится данное изобретение. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, второе изд., John Wiley and Sons, New York (1994), и Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) предоставляют специалисту в области техники основной словарь многих терминов, используемых в данном изобретении. Любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, могут быть использованы в практике или тестировании данного изобретения.
[113] Практика данного изобретения будет использовать, если не указано иное, обычные способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии и биохимии, которые находятся в компетенции специалистов в данной области техники. Такие способы полностью объясняются в литературе, например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, второе издание (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1994); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); и Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (Kriegler, 1990).
[114] Числовые диапазоны, указанные в данном документе, включают числа, определяющие диапазон.
[115] Если не указано иное, нуклеиновые кислоты записаны слева направо в ориентации 5'- 3'; аминокислотные последовательности записаны слева направо в ориентации от аминогруппы к карбоксильной группе соответственно.
Определения
[116] Существительные в одиночном числе включают указанные существительные во множественном числе, если в контексте явно не указано иное, таким образом, существительные в одиночном числе, используемые в данном документе в описании и в формуле изобретения, если явно указано на иное, следует понимать как "по крайней мере одно".
[117] Фраза "и/или", как она используется в данном документе в описании и в формуле изобретения, следует понимать как "одно или оба" из элементов, объединенных таким образом, то есть элементы, которые конъюнктивно присутствуют в некоторых случаях и дизъюнктивно присутствуют в других случаев. Кроме элементов, конкретно определенных в конструкции "и/или", другие элементы могут необязательно присутствовать независимо от того, связаны они или нет с теми элементами, которые конкретно указаны, если явно не указано иное. Таким образом, в качестве неограничивающего примера обозначение "А и/или В" при использовании в сочетании с неограничивающим выражением, например "содержащий", может относиться в одном варианте реализации изобретения к А без В (необязательно включая элементы, отличающиеся от В); в другом варианте реализации изобретения к В без А (необязательно включая элементы, отличающиеся от А); в еще одном варианте реализации изобретения как к А, так и к В (необязательно включая другие элементы); и т.п.
[118] Термин "около", используемый в данном документе при упоминании измеряемой величины, такой как количество, длительность времени и т.п., предназначен для охвата изменений ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1% или ± 0,1% от указанного значения, так как такие изменения подходят для выполнения раскрытых способов.
[119] Термины "аминокислота" относятся к молекуле, содержащей как аминогруппу, так и карбоксильную группу, которые связаны с углеродом, который обозначен как альфа-углерод. Подходящие аминокислоты включают, но не ограничиваются этим, как D-, так и L-изомеры природных аминокислот, а также не встречающиеся в природе аминокислоты, полученные с помощью органического синтеза или с помощью других метаболических путей. В некоторых вариантах реализации изобретения одна "аминокислота" может иметь несколько фрагментов боковой цепи, если это возможно на расширенном алифатическом или ароматическом скелете. Если в контексте конкретно не указано иначе, термин
аминокислота, используемый в данном документе, предназначен для включения аналогов аминокислот.
[120] Термин "Aufwuchs" (с немецкого для "рост на поверхности" или "разрастание") представляет собой набор мелких животных и растений, которые прилипают к открытым поверхностям в водных средах, таких как части укорененных растений. Как в морской, так и в пресноводной среде водоросли, особенно зеленые водоросли и диатомовые водоросли, составляют доминирующий компонент сообщества Aufwuchs. Мелкие ракообразные, коловратки и простейшие также обычно встречаются в пресной воде и в море, но личинки насекомых, олигохеты и тихоходки свойственны пресноводным фаунам.
[121] Термин "биомасса" относится к материалу, полученному путем роста и/или распространения клеток. Биомасса может содержать клетки и/или внутриклеточное содержимое, а также внеклеточный материал, включая, но не ограничиваясь этим, соединения, секретируемые клеткой.
[122] Термин "биореактор" или "ферментер" относится к закрытой или частично закрытой емкости, в которой клетки выращиваются и содержатся. Клетки могут, но не обязательно, находится в жидкой суспензии. В некоторых вариантах реализации изобретения вместо того, чтобы содержаться в жидкой суспензии, клетки могут альтернативно расти и/или содержаться в контакте с другим нежидким субстратом либо внутри него, включая, но не ограничиваясь этим, твердый материал для роста. [123] Термин "катализатор" относится к химическому агенту, такому как молекула или макромолекулярная структура, которая ускоряет скорость, с которой происходит химическая реакция, когда реагент или реагенты превращаются в продукт или продукты, в то время как собственно катализатор не превращается продукт или иным образом изменяется или потребляется при завершении химической реакции. После того, как катализатор участвует в одной химической реакции, поскольку он не изменяется, он может участвовать в дальнейших химических реакциях, воздействуя на дополнительные реагенты для создания дополнительных продуктов. Чтобы ускорить химическую реакцию, катализатор уменьшает энергетический барьер активации в пути реакции, позволяя ей происходить при более низкой температуре или быстрее при данной температуре. Таким образом может быть достигнут более быстрый переход системы в состояние химического равновесия. Катализаторы включают ферменты, которые являются белковыми катализаторами.
[124] Термин "целлюлозный материал" относится к любому материалу с большим количеством целлюлозы, которая представляет собой полисахарид, имеющий формулу (СбНю05)п, который обычно состоит из линейной цепи от сотен до тысячи П(1-> 4) связанных мономеров D-глюкозы. Источники целлюлозного материала включают, но не ограничиваются ими, картон, хлопок, кукурузу, бумагу, древесную стружку, опилки, жом сахарной свеклы, жмых сахарного тростника и прутьевидное просо.
[125] Термин "КоА" или "коэнзим А" относится к органическому кофактору конденсирующих ферментов, участвующих в синтезе и окислении жирных кислот, окислении пирувата, переносу ацетильной или другой группы и в других видах ацетилирования.
[126] Термин "кофактор" включает все молекулы, необходимые ферменту для осуществления его каталитической активности. В некоторых вариантах реализации изобретения кофактор представляет собой любую молекулу, отличающуюся от субстрата.
[127] В формуле изобретения, как и в описании, все переходные фразы, такие как "содержащий", "включающий", "несущий", "имеющий", "содержащий в себе", "использующий", "вмещающий" и т. п. должны пониматься как неограничивающие, то есть означают включение, но не ограничиваются этим. Только переходные фразы "состоящий из" и "состоящий в основном из" должны рассматриваться ограничивающими или полуограничивающими переходными фразами соответственно.
[128] Термин "экзогенный ген" означает нуклеиновую кислоту, которая была рекомбинантно введена в клетку, и которая кодирует синтез РНК и/или белка. В некоторых вариантах реализации изобретения экзогенный ген вводят путем трансформации. В некоторых вариантах реализации изобретения экзогенный ген вводят в клетку путем электропорации. Трансформированную клетку можно назвать рекомбинантной клеткой, в которую может быть введен дополнительный экзогенный ген(ы). Экзогенный ген, введенный в организм хозяина, может быть взят из другого вида (это называется гетерологичным), или он может встречаться естественным образом у одного и того же вида (это является гомологичным, как определено ниже). Таким образом экзогенные гены включают гомологичные гены, которые интегрированы или внедрены в области генома, эписомы или плазмиды, которые отличаются от расположения, где этот ген встречается в природных условиях. В клетку могут быть введены несколько копий экзогенного гена.
Экзогенный ген может присутствовать в виде более чем одной копии внутри клетки-хозяина или трансформированной клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм содержит от 1 до 10000 копий нуклеиновой кислоты, которая кодирует экзогенный белок. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм содержит от 1 до 1 ООО копий нуклеиновой кислоты, которая кодирует экзогенный белок. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм содержит от 1 до 10000 копий нуклеиновой кислоты, которая кодирует экзогенный белок. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм содержит от 1 до 1000 копий нуклеиновой кислоты, которая кодирует экзогенный белок. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм содержит от 1 до 500 копий нуклеиновой кислоты, которая кодирует экзогенный белок. В некоторых вариантах реализации изобретения экзогенный ген содержится в клетке в качестве вставки в геноме или в виде эписомной молекулы. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм содержит не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или 1000 копии одной или нескольких нуклеиновых кислот, которые кодируют один или более экзогенных белков.
[129] Используемый в данном документе термин "экспрессируемая форма" относится к конструкциям генов, которые содержат необходимые регуляторные элементы, функционально связанные с кодирующей последовательностью, которая кодирует фермент или его фрагмент, способный придавать ферментативную активность клетке, таким образом, что когда она присутствует в клетке, кодирующая последовательность будет экспрессироваться. В некоторых вариантах реализации изобретения композиция, содержащая микроорганизмы или бактериальные клетки согласно данному изобретению, содержит не более десяти экспрессируемых форм экзогенных последовательностей нуклеиновой кислоты. [130] Термин "лигноцеллюлозный материал" представляет собой любой материал, состоящий из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина, в котором углеводные полимеры (целлюлоза и гемицеллюлоза) тесно связаны с лигнином. Лигноцеллюлозные материалы включают в себя сельскохозяйственные отходы (включая кукурузную солому и жом сахарного тростника), большинство сельскохозяйственных культур, выращиваемых в качестве биомассы для получения энергии, древесные остатки (включая отходы лесопильных и бумажных фабрик) и значительную часть бытовых отходов.
[131] Термин "липиды" относится к категории молекул, которые могут растворяться в неполярных растворителях (таких как, но не ограничиваясь этим, хлороформ и/или эфир) и которые также имеют низкую или отсутствующую растворимость в воде. Гидрофобный характер липидных молекул обычно обусловлен наличием длинноцепочечных углеводородных участков внутри молекулы. Липиды включают следующие типы молекул: углеводороды, жирные кислоты (насыщенные и ненасыщенные), жирные спирты, жирные альдегиды, гидроксикислоты, дикислоты, моноглицериды, диглицериды, триглицериды, фосфолипиды, сфинголипиды, стерины, такие как холестерин и стероидные гормоны, жирорастворимые витамины (таких как витамины A, D, Е и К), поликетиды, терпеноиды и воски.
[132] Термин "лизат" относится к жидкости, содержащей смесь и/или раствор содержимого клеток, которая являются результатом лизиса клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения способы согласно данному изобретения включают очистку химических веществ или смеси химических веществ в клеточном лизате. В некоторых вариантах реализации изобретения способы согласно данному изобретению включают очистку аминокислот и/или белка в клеточном лизате. [133] Термин "лизис" относится к разрыву плазматической мембраны и, при ее наличии, клеточной стенки клетки, таким образом, что значительное количество внутриклеточного материала выходит во внеклеточное пространство. Лизис может быть осуществлен с использованием электрохимических, механических, осмотических, термических или вирусных средств. В некоторых вариантах реализации изобретения способы согласно данному изобретению включают проведение лизиса клеток или микроорганизмов, описанных в данном документе, для отделения химического вещества или смеси химических веществ от содержимого биореактора. В некоторых вариантах реализации изобретения способы согласно данному изобретению включают проведение лизиса клеток или микроорганизмов, описанных в данном документе, для отделения аминокислот или смеси аминокислот и/или белков от содержимого биореактора. [134] Используемый в контексте данного документа в описании и в формуле изобретения, термин "или" следует понимать как имеющий такое же значение, как "и/или", как определено выше. Например, при разделении элементов в списке "или" или "и/или" должны интерпретироваться как инклюзивные, т. е. включая хотя бы одно, но также включая более одного из количества или списка элементов, и, необязательно, дополнительные, не перечисленные элементы. Только термины,
явно обозначенные противоположным образом, такие как "только один" или "точно один из", или при использовании в формуле изобретения, термин "состоящий из", будут означать включение только одного элемента из числа или списка элементов. Как правило, используемый в данном документе термин "или" должен рассматриваться как указание на исключающие альтернативы (то есть "одно или другое, но не оба"), когда им предшествуют исключающие условия, такие как "либо", "один из", "только один из" или "лишь один из". Термин "состоящий в основном из", когда он используется в формуле изобретения, имеет свое обычное значение, которое используется в области патентного права. [135] Термин "перифитон" обозначает сложный комплекс водорослей, цианобактерий, гетеротрофных микроорганизмов и детрита, который прикрепляется к погруженным в воду поверхностям в большинстве водных экосистем. Он служит важным источником пищи для беспозвоночных, головастиков и некоторых рыб. [136] Термин "титр" относится к количеству вещества, продуцируемого микроорганизмом на единицу объема в процессе ферментации микроорганизмом. Например, титр биомассы может быть выражен в виде граммов биомассы, вырабатываемой на литр раствора.
[137] Термин "выход" относится к количеству продукта, полученного из исходного материала (например, сахара), по отношению к общему количеству вещества, которое будет производиться, если все исходное вещество превращается в продукт. Например, выход аминокислот может быть выражен в виде % аминокислоты, полученной относительно теоретического выхода, если 100% исходного вещества превращается в аминокислоту. [138] Термин "продуктивность" относится к количеству вещества, продуцируемого микроорганизмом на единицу объема на единицу времени в процессе ферментации микроорганизмом. Например, продуктивность биомассы может быть выражен в виде граммов биомассы, вырабатываемой на литр раствора за час.
[139] Используемый в контексте данного документа термин "полинуклеотид" относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, любой трехмерной структуры, одно- или многоцепочечной (например, одноцепочечной, двухцепочечной, в форме тройной спирали и т. д.), которые содержат дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и/или аналоги или модифицированные формы дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, включая модифицированные нуклеотиды или основания или их аналоги. Поскольку генетический код является
вырожденным, для кодирования определенной аминокислоты может быть использовано более одного кодона, и в объем данного изобретения входят полинуклеотиды, которые кодируют определенную аминокислотную последовательность. Можно использовать любой тип модифицированного нуклеотидного или нуклеотидного аналога, при условии, что полинуклеотид сохраняет желаемую функциональность в условиях использования, включая модификации, повышающие устойчивость к нуклеазам (например, дезокси, 2'-0-Ме, фосфоротиоаты и т. д.). Также могут быть включены метки для целей обнаружения или захвата, например радиоактивные или нерадиоактивные метки или якоря, например биотин. Термин полинуклеотид также включает пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК). Полинуклеотиды могут представлять собой встречающиеся в природе или не встречающиеся в природе. Термины "полинуклеотид", "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" используются в данном документе взаимозаменяемо. Полинуклеотиды могут содержать РНК, ДНК или оба и/или модифицированные формы и/или их аналоги. Последовательность нуклеотидов может прерываться ненуклеотидными компонентами. Одна или более фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связующими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают, но не ограничиваются этим, варианты, в которых фосфат замещен P(0)S ("тиоат"), P(S)S ("дитиоат"), (0)NR2 ("амидат") P(0)R, P(0)OR', СО или СН2 ("формацеталь"), где каждый R или R' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (1-20 С), необязательно содержащий эфирную связь (-0-), арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или арадил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть одинаковыми. Полинуклеотиды могут быть линейными или замкнутыми, или содержать комбинацию линейных и замкнутых частей.
[140] Используемый в контексте данного документа термин "полипептид" относится к композиции, состоящей из аминокислот и рассматривающейся специалистом в данной области техники как белок. В данном документе используется обычный однобуквенный или трехбуквенный код для обозначения аминокислотных остатков. Термины "полипептид" и "белок" в данном документе используются взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и может прерываться компонентами, не являющимися аминокислотами. Термины также охватывают аминокислотный полимер, который был модифицирован естественным путем или путем
вмешательства; например, образование дисульфидных связей, гликозилирование, липидацию, ацетилирование, фосфорилирование или любые другие манипуляции или модификации, такие как конъюгация с меченым компонентом. К термину также относятся, например, полипептиды, содержащие один или более аминокислотных аналогов (включая, например, не встречающиеся в природе аминокислоты и т. д.), а также другие модификации, известные в данной области техники. [141] Используемый в контексте данного документа термин "вектор" относится к полинуклеотидной последовательности, предназначенной для введения нуклеиновых кислот в один или более типов клеток. Векторы включают векторы клонирования, векторы экспрессии, челночные векторы, плазмиды, фаговые частицы, кассеты и тому подобное.
[142] Используемый в контексте данного документа термин "экспрессия" относится к способу получения полипептида на основе последовательности нуклеиновой кислоты гена. Этот процесс включает как транскрипцию, так и трансляцию.
[143] Используемый в контексте данного документа термин "вектор экспрессии" относится к конструкции ДНК, содержащей кодирующую последовательность ДНК (например, последовательность гена), которая функционально связана с одной или более подходящей контролирующей последовательностью (последовательностями), способной осуществлять экспрессию кодирующей последовательности в хозяине. Такие контролирующие последовательности включают промотор для осуществления транскрипции, необязательно операторную последовательность для контроля такой транскрипции, последовательность, кодирующую подходящие сайты связывания с рибосомой мРНК, и последовательности, которые контролируют терминацию транскрипции и трансляции. Вектор может быть плазмидой, фаговой частицей или просто потенциальной геномной вставкой. После трансформации в подходящий хозяин вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина или может в некоторых случаях интегрироваться непосредственно в геном. Плазмида является наиболее часто используемой формой вектора экспрессии. Однако изобретение предназначено для включения таких других форм векторов экспрессии, которые реализуют эквивалентные функции и которые известны или становятся известными в данной области техники.
[144] Термин "ген" относится к сегменту ДНК, который участвует в получении полипептида и содержит области, предшествующие и следующие после
кодирующим областей, а также промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами). [145] Используемый в контексте данного документа термин "клетка-хозяин" относится к клетке или клеточной линии, в которую рекомбинантный вектор экспрессии для получения полипептида может быть трансфецирован для экспрессии полипептида. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и потомство может быть не обязательно полностью идентичным (морфологически или в отношении общей геномной кодирующей ДНК) исходной родительской клетке из-за естественной, случайной или преднамеренной мутации. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные или трансформированные in vivo с помощью вектора экспрессии.
[146] Термин "рекомбинантный" относится к генетическому материалу (т. е. к нуклеиновым кислотам, к полипептидам, которые они кодируют, и к векторам и клеткам, содержащим такие полинуклеотиды), который был модифицирован для изменения его последовательности или характеристик экспрессии, например, с помощью мутации кодирующей последовательности для получения измененного полипептида, слияния кодирующей последовательности с кодирующей последовательностью другого гена, помещение гена под контроль другого промотора, экспрессии гена в гетерологичном организме, экспрессии гена на пониженном или повышенном уровне, экспрессии гена в определенных условиях или конститутивно в способом, при котором его профиль экспрессии отличается от природного, и тому подобное. Обычно рекомбинантные нуклеиновые кислоты, полипептиды и клетки на их основе обрабатываются человеком таким образом, что они не являются идентичными родственным нуклеиновым кислотам, полипептидам и клеткам, встречающимся в природе.
[147] Термин "полученный из" охватывает термины "возникший из", "полученные из", "получаемые из", "изолированные из" и "созданные из", и обычно указывает, что один указанный материал имеет происхождение из другого указанного материале или имеет признаки, которые могут быть описаны посредством ссылки на другой указанный материал.
[148] Термин "культивирование" относится к выращиванию популяции клеток, например, клеток микроорганизма в подходящих условиях для роста в жидкой или твердой среде.
[149] Термин "введенный" в контексте введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку включает "трансфекцию", "трансформацию" или
"трансдукцию" и относится к внедрению последовательности нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, где нуклеотидная последовательность может быть внедрена в геном клетки (например, хромосому, плазмиду, пластиду или митохондриальную ДНК), превращена в автономный репликон или временно экспрессируется.
[150] Используемые в контексте данного изобретения термины "трансформированный", "стабильно трансформированный" и "трансгенный" относятся к клетке, которая имеет не встречающуюся в природе (например, гетерологичную или экзогенную) последовательность нуклеиновой кислоты, интегрированную в ее геном или присутствующую в виде эписомальной плазмиды, которая сохраняется спустя множество поколений.
[151] Термины "извлеченный", "выделенный", "очищенный" и "отделенный", используемые в контексте данного документа, относятся к материалу (например, к белку, нуклеиновой кислоте или клетке), который извлекается из по меньшей мере одного компонента, с которым он обычно связан. Например, эти термины могут относиться к материалу, который по существу или практически не содержит компонентов, которые обычно сопровождают его, как обнаруживается в его природном состоянии, например, в виде интактной биологической системы. [152] Используемый в контексте данного документа термины "дикого типа", "естественные" и "встречающиеся в природе" в отношении белков относятся к тем белкам, которые встречаются в природе. Термин "последовательность дикого типа" относится к аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая встречается в природе или имеет природное происхождение. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность дикого типа является исходной точкой проекта белковой инженерии, например, для получения вариантов белков. Термин "дикий тип" применительно к микроорганизму относится к микроорганизму, который встречается в дикой природе.
[153] Термин "хемоавтотрофный" относится к организмам, которые получают энергию путем окисления химических доноров электронов химическими акцепторами электронов и синтезируют все органические соединения, необходимые организму для жизни и роста из углекислого газа. [154] Термин "литоавторофный" относится к определенному типу хемоавтотрофии, при котором организм использует окисление неорганических химических доноров электронов неорганическими химическими акцепторами электронов в качестве источника энергии.
[155] Термин "гримучий газ" относится к газообразной смеси молекулярного водорода и кислорода. Термин "водородный микроорганизм" относится к микроорганизму, который может использовать водород в качестве донора электронов и кислород в качестве акцептора электронов при дыхании для получения внутриклеточных носителей энергии, таких как аденозин-5'-трифосфат (АТФ). Термины "оксигидроген" и "оксигидрогеновый микроорганизм" можно использовать в качестве синонимов с терминами "гримучий газ" и "водородный микроорганизм" соответственно. Водородные микроорганизмы обычно используют молекулярный водород с помощью гидрогеназ, причем некоторые из электронов, полученных от Н2, используются для восстановления NAD+ (и/или других внутриклеточных восстанавливающих эквивалентов), а некоторые из электронов, полученных от Н2, используются для аэробного дыхания. Водородные микроорганизмы обычно фиксируют СО2 автотрофно, посредством путей, включая, но не ограничиваясь этим, цикл Кальвина или обратный цикл лимонной кислоты ["Thermophilic bacteria", Jakob Kristjansson, Chapter 5, Section III, CRC Press, (1992)]. [156] Термин "гетеротрофный" относится к организмам, которые не могут синтезировать все органические соединения, необходимые организму для жизни и роста из углекислого газа, и которые должны использовать органические соединения для роста.
[157] Термин "окислитель водорода" относится к микроорганизмам, которые используют восстановленный Н2 в качестве донора электронов для получения внутриклеточных восстановительных эквивалентов и/или при дыхании. [158] Термин "ацетоген" относится к микроорганизмам, которые продуцируют ацетат и/или другие короткоцепочечные органические кислоты вплоть до длины цепи С4 в качестве продукта анаэробного дыхания.
[159] Термин "метаноген" относится к микроорганизму, который продуцирует метан в качестве продукта анаэробного дыхания.
[160] Термин "метилотроф" относится к микроорганизмам, которые могут использовать восстановленные одноуглеродные соединения, такие как, но не ограничиваясь этим, метанол или метан, в качестве источника углерода и/или в качестве донора электронов для их роста.
[161] Термин "экстремофил" относится к микроорганизмам, которые успешно существуют в физически или геохимически экстремальных условиях (например, высокая или низкая температура, рН или высокая соленость) по сравнению с
условиями на поверхности Земли или океана, которые обычно позволяют выживать большинству форм жизни.
[162] Термин "термофил" относится к типу экстремофилов, который успешно существует при относительно высоких температурных условиях жизни от 45 до 122 °С.
[163] Термин "гипертермофил" относится к типу экстремофилов, который успешно существует в чрезвычайно высокотемпературных условиях жизни, от 60 °С (140 °F) и выше.
[164] Термин "ацидофил" относится к типу экстремофилов, который успешно существует в очень кислых условиях (обычно при рН 2,0 или ниже). [165] Термин "галофит" относится к типу экстремофилов, который успешно существует в средах с очень высокой концентрацией соли.
[166] Термин "психрофил" относится к типу экстремофилов, способного к росту и размножению при низких температурах, от 10 °С и ниже. [167] Термин "генераторный газ" относится к газовой смеси, содержащей различные пропорции FL-, СО и СОг, и имеет величину теплоты сгорания, обычно находящуюся в пределах от половины до одной десятой в сравнении с природным газом на единицу объема в стандартных условиях. Генераторный газ может быть получен различными способами из различных исходных материалов, включая газификацию, паровой реформинг или автореформинг исходного материала на основе углерода. В дополнение к Н2, СО и СОг, генераторные газы могут содержать другие компоненты, включая, но не ограничиваясь этим, метан, сероводород, конденсируемые газы, смолы и золу в зависимости от процесса генерации и исходного сырья. Доля N2 в смеси может быть высокой или низкой в зависимости от того, используется ли воздух в качестве окислителя в реакторе или нет, и обеспечивается ли теплота реакции прямым сгоранием или косвенным теплообменом.
[168] Термины "Сингаз" или "Синтез-газ" относятся к типу газовой смеси, которая, как и генераторный газ, содержит Н2 и СО, но с более конкретными требованиями относительно содержания и соотношения Н2 и СО, а также количества примесей для синтеза конкретного типа химического продукта, такого как, но не ограничиваясь этим, метанол или дизельное топливо Фишера-Тропша. [169] Термин "источник углерода" относится к типам молекул, из которых микроорганизм получает углерод, необходимый для органического биосинтеза.
[170] Термин "источник энергии" относится либо к донору электронов, который окисляется кислородом в аэробном дыхании, либо к комбинации донора электронов, который окисляется, и акцептора электронов, который восстанавливается при анаэробном дыхании.
[171] Термин "двухфазная среда роста" относится к среде роста, содержащей две несмешивающиеся жидкие фазы.
[172] Термин "газификация" относится к обычно высокотемпературному процессу, при котором происходит конверсия материалов на основе углерода в смесь газов, включая водород, монооксид углерода и диоксид углерода, называемую синтез-газ, сингаз или генераторный газ. Этот процесс обычно включает частичное сжигание и/или применение тепла, генерируемого извне, наряду с контролируемым добавлением кислорода и/или пара, таким образом, что кислорода недостаточно для полного сгорания материала на основе углерода.
[173] Термин "гидрофобный" относится к веществу с низкой растворимостью в воде и большей растворимостью в гидрофобной фазе, нежели в водной фазе. [174] Термины "микроорганизм" и "микроб" означают микроскопические одноклеточные формы жизни, включая, но не ограничиваясь этим, микроорганизмы бактерий, грибов и водорослей.
[175] Термин "молекула" означает любую отдельную или различимую структурную единицу вещества, содержащую один или более атомов, и включает, например, углеводороды, липиды, полипептиды и полинуклеотиды. [176] Термин "масличный" относится к тому, что богато маслами или вырабатывает масла в больших количествах.
[177] Термин "органическое соединение" относится к любым газообразным, жидким или твердым химическим соединениям, которые содержат атомы углерода со следующими исключениями, которые считаются неорганическими: карбиды, карбонаты, простые оксиды углерода, цианиды и аллотропы чистого углерода, такие как алмаз и графит.
[178] Термины "является предшественником" или "предшественник" обозначают промежуточный продукт для получения одного или более компонентов готового продукта.
[179] Термин "продуцирование" включает производство соединений как внутри клетки, так и вне клетки, что должно включать секрецию соединений из клетки. [180] Если не указано иное, научные и технические термины, используемые в контексте данного раскрытия, должны иметь значения, которые обычно понимаются
специалистами в данной области техники. Кроме того, если иное не указано в контексте, одиночные термины включают значения во множественном числе, а множественные термины включают значения в единственном числе. Способы и методики данного раскрытия обычно выполняются в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области техники. Как правило, обозначения, используемые в контексте биохимии, энзимологии, молекулярной и клеточной биологии, микробиологии, генетики, белков, химии и гибридизации нуклеиновых кислот, описанными в данном документе, являются хорошо известными и широко используемыми в данной области техники. Способы и методики данного раскрытия обычно выполняются в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в данной области техники и описаны в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в данном описании, если не указано иное.
Получение аминокислот, белков и других биологических питательных веществ из
газовой энергии и углеродных субстратов
[181] В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются природные или модифицированные микроорганизмы, которые способны превращать генераторный газ или газовую смесь, содержащую FL; и/или СО, и/или СО2 и/или СН4 в аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются природные или модифицированные микроорганизмы, которые способны превращать генераторный газ или газовую смесь, содержащую Н2 и/или СО, и/или СО2 и/или СН4 в витамины. В некоторых вариантах реализации изобретения витамин представляет собой витамин В, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: витамин Bl, В2 и/или В12.
[182] Предмет изобретения включает в некоторых вариантах реализации изобретения природный микроорганизм, способный расти на синтез-газе и/или Н2 и СО2, и/или СО, и/или СН4 и/или другие газообразные отходы и который способен продуцировать аминокислоты, белки и другие биологические питательные вещества, используя указанные газы в качестве субстрата для роста. Предмет изобретения включает в других вариантах реализации изобретения природный микроорганизм, способный расти на синтез-газе и/или Н2 и СО2, и/или СО, и/или СН4 и/или другие газообразные отходы и который способен продуцировать витамин В1, витамин В2, и/или витамин В12 и/или другие витамины
[183] В некоторых вариантах реализации изобретения данное изобретение относится к способу получения аминокислот, белков и других биологических питательных веществ, включая, но не ограничиваясь этим, витамины путем объединения в биореакторе или растворе углеродсодержащего газа и природного или модифицированного штамма микроорганизма, который проводит конверсию углеродсодержащего газа, такой как синтез-газ, генераторный газ, СО2, угарный газ и/или смеси вышеуказанного и газообразного водорода; и/или соединений С1, газообразных или жидких, включая, но не ограничиваясь этим, метанол или метан, в аминокислоты, белки и/или другие биологические питательные вещества, включая, но не ограничиваясь этим, витамины.
[184] Генераторный газ, используемый в некоторых вариантах реализации процесса, может поступать из источников, которые включают газификацию исходного сырья в виде отходов и/или биомассы, или газообразных отходов промышленных процессов, или реформинга метаносодержащих газов, включая, но не ограничиваясь этим, природный газ, биогаз, свалочный газ, труднодоступный природный газ и/или факельный сжигаемый газ. В некоторых вариантах реализации изобретения метан может быть подвергнут конверсии в аминокислоты, белки и/или другие биологические питательные вещества, включая, но не ограничиваясь этим, витамины с использованием модифицированных или природных микроорганизмов и способов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации данного изобретения изобретение используется для получения аминокислот и/или белков и/или витаминов в регионах, в которых цены на природный газ являются самыми низкими, и в которых известно наличие труднодоступного и, в частности, "трудноизвлекаемого" и факельного сжигаемого природного газа, таких как США, Ближний Восток, Западная Африка и Россия.
[185] В некоторых вариантах реализации изобретения предмет изобретения включает модифицированный микроорганизм с одним или несколькими экзогенными генами.
[186] Хемоавтотрофы способны выполнять реакции хемосинтеза, которые фиксируют СО2 и/или другие формы неорганического углерода, в органические соединения, используя потенциальную энергию, хранящуюся в неорганических химических веществах для прохождения реакции, а не лучистую энергию света, как в микроорганизмах, выполняющих фотосинтез [Shively et al. (1998) supra; Smith et al. (1967) supra, Scott и Cavanaugh (2007) supra]. Биохимические пути фиксации углерода, которые характерны для хемоавтотрофов, включают цикл трикарбоновой
кислоты, цикл Кальвина-Бенсона-Бассама [Shively, et al. (1998) supra], и путь Вуда-Льюнгдаля [Ljungdahl (1986) supra; Lee, et al. (2008) supra; Fischer, et al. (2008) supra].
[187] Некоторые неограничивающие варианты реализации изобретения относятся к микроорганизму дикого типа или генетически модифицированному микроорганизму и композициям, содержащим такой микроорганизм, причем микроорганизм содержит ноль или один или более экзогенных генов, причем микроорганизм растет в присутствии углеродсодержащего газа или использует газообразный сырье, выбранное из синтез-газа, СО2, Н2, СО, СН4 или смеси газов, содержащих один или более газов, выбранных из синтез-газа, СО2, Н2, СО или СН4. [188] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм согласно данному изобретению выбран из микроорганизмов Ralstonia. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой Ralstonia eutropha. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм выбран из микроорганизмов Cupriavidus. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой Cupriavidus necator. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой Cupriavidus necator DSM531 или DSM541. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм выбран из рода Hydrogenobacter. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой Hydrogenobacter thermophilus. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм имеет обратный цикл трикарбоновый кислот (гТСА), также известный как обратный цикл лимонной кислоты или обратный цикл Кребса. [см., например, Miura, A., Kameya, М., Arai, Н., Ishii, М. & Igarashi, Y. A soluble NADH- dependent fumarate reductase in the reductive tricarboxylic acid cycle of Hydrogenobacter thermophilus TK-6. J Bacteriol 190: 71707177, doi:JB.00747-08 [pii] 10.1128/JB.00747-08 (2008).; Shively, et al. (1998)supra, которые включены в полном объеме в данный документ посредством ссылки.] [189] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой Rhodococcus opacus или Rhodococcus jostii или Rhodococcus sp.. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой Rhodococcus opacus DSM 43205 и/или Rhodococcus sp. DSM 3346. В некоторых вариантах реализации изобретения природный или модифицированный штамм включает, но не ограничивается этим, микроорганизмы, потребляющие водород, включая, но не ограничиваясь этим, роды Rhodococcus или Gordonia, Ralstonia или Cupriavidus. В некоторых вариантах реализации
изобретения композиция содержит микроорганизм, причем микроорганизм может естественным образом расти на Н2/СО2 и/или синтез-газе, причем микроорганизм может естественным образом накапливать липид до 50% массы или более от клеточной биомассы. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы обладают природной способностью направлять интенсивный поток углерода по пути биосинтеза жирных кислот. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм, проявляющий эти признаки, представляет собой Rhodococcus opacus (DSM 43205 или DSM 43206 или DSM 44193). [190] Изобретение относится к клетке и композициям, содержащим клетку класса Actinobacteria, содержащую ноль или один или более экзогенных генов. Изобретение также относится к клеткам и композициям, содержащим клетки семейства Nocardiaceae, содержащим ноль или один, или более экзогенных генов. Изобретение также относится к клеткам и композициям, содержащим клетки Corynebacterium, Gordonia, Rhodococcus, Mycobacterium и Tsukamurella, содержащим ноль или один, или более экзогенных генов. В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к клеткам семейства Nocardiaceae, содержащим ноль или один, или более экзогенных генов, причем клетка не является клеткой рода Mycobacterium. В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение предлагает клетку и композиции, содержащие клетку рода Rhodococcus, содержащую ноль или один, или более экзогенных генов, и в некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой штамм видов Rhodococcus sp., Rhodococcus opacus, Rhodococcus aetherivorans; Rhodococcus aurantiacus; Rhodococcus baikonurensis; Rhodococcus boritolerans; Rhodococcus equi; Rhodococcus coprophilus; Rhodococcus corynebacterioides; Nocardia corynebacterioides (синоним: Nocardia corynebacterioides); Rhodococcus erythropolis; Rhodococcus фашисты; Rhodococcus globerulus; Rhodococcus gordoniae; Rhodococcus jostii; Rhodococcus koreensis; Rhodococcus kroppenstedtii; Rhodococcus maanshanensis; Rhodococcus marinonascens; Rhodococcus opacus; Rhodococcus percolatus; Rhodococcus phenolicus; Rhodococcus polyvorum; Rhodococcus pyridinivorans; Rhodococcus rhodochrous; Rhodococcus rhodnii; (синоним: Nocardia rhodnii); Rhodococcus ruber (синоним: Streptothrix rubra); Rhodococcus sp. RHA1; Rhodococcus triatomae; Rhodococcus tukisamuensis; Rhodococcus wratislaviensis (синоним: Tsukamurella wratislaviensis); Rhodococcus yunnanensis; или Rhodococcus zopfii. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка, содержащая ноль или один, или более экзогенных генов, представляет собой одно или более из следующего: штамм Rhodococcus
opacus DSM номер 43205 или 43206; Rhodococcus sp. DSM номер 3346. В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к клетке Rhodococcus или композиции, содержащей клетку Rhodococcus, причем клетка не принадлежит виду, выбранному из Rhodococcus equi или Rhodococcus fascians. [191] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой микроорганизм из подотряда corynebacterineae или семейства burkholderiaceae. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка либо композиции, содержащие одну из других клеток, не относятся к Е. coli. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка согласно данному изобретению не является патогенной для животных или растений. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка согласно данному изобретению не является патогенной для человека. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка либо композиции, содержащие одну из других клеток, относятся к роду Ralstonia. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка либо композиции, содержащие одну из других клеток, относятся к видам Ralstonia eutropha или Cupriavidus necator или Cupriavidus metallidurans. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка, содержащая ноль или один, или более экзогенных генов, представляет собой штамм Cupriavidus necator DSM номер 531 или 541.
[192] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм согласно данному изобретению может накапливать белок до более 60% и/или более 70% и/или более 80% от общей клеточной массы. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой Cupriavidus necator DSM номер 531 или 541.
[193] В некоторых вариантах реализации изобретения композиция содержит микроорганизм, который может естественным образом расти на Н2/СО2 и/или синтез-газе, причем микроорганизм может естественным образом накапливать полигидроксибутират (РНВ) или полигидроксиалканоат (РНА) до 50% массы или более от клеточной биомассы. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы обладают природной способностью направлять интенсивный поток углерода через метаболический промежуточный продукт ацетил-СоА, который может приводить к биосинтезу жирных кислот наряду с рядом других путей синтеза, включая синтез РНА и РНВ, а также аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм, проявляющий такие способности, представляет собой Cupriavidus necator (DSM 531 или DSM 541).
[194] В некоторых вариантах реализации изобретения встречающийся в природе или модифицированный штамм включает, но не ограничивается этим, Corynebacterium autotrophicum. В некоторых вариантах реализации изобретения встречающийся в природе или модифицированный штамм включает, но не ограничивается этим, Corynebacterium glutamicum. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой Hydrogenovibrio marinus. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas palustris, или Rhodobacter sphaeroides.
[195] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой оксигидрогеновый или водородный штамм. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы представляют собой один или более из следующих водородных микроорганизмов: Aquifexpyrophilus, Aquifex aeolicus, или другие Aquifex sp.; Cupriavidus necator, Cupriavidus metallidurans, или другие Cupriavidus sp.; Corynebacterium autotrophicum или другие Corynebacterium sp.; Gordonia desulfuricons, Gordonia polyisoprenivorans, Gordonia rubripertincta, Gordonia hydrophobica, Gordonia westfalica, и другие Gordonia sp.; Nocardia autotrophica, Nocardia opaca, или другие Nocardia sp. ; пурпурные несерные фотосинтетические бактерии, включая, но не ограничиваясь этим, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas sulfoviridis, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas spheroides, Rhodopseudomonas acidophila и другие Rhodopseudomonas sp. и Rhodobacter sp.; Rhodospirillum rubrum, и другие Rhodospirillum sp.; Rhodococcus opacus и другие Rhodococcus sp.; Rhizobium japonicum и другие Rhizobium sp.; Thiocapsa roseopersicina и другие Thiocapsa sp.; Pseudomonas facilis, Pseudomonas flava, Pseudomonas putida, Pseudomonas hydrogenovora, Pseudomonas hydrogenothermophila, Pseudomonas palleronii, Pseudomonas pseudoflava, Pseudomonas saccharophila, Pseudomonas thermophile, и другие Pseudomonas sp.; Hydrogenomonas pantotropha, Hydrogenomonas eutropha, Hydrogenomonas facilis, и другие Hydrogenomonas sp.; Hydrogenobacter thermophiles, Hydrogenobacter halophilus, Hydrogenobacter hydrogenophilus, и другие Hydrogenobacter sp.; Hydrogenophilus islandicus и другие Hydrogenophilus sp.; Hydrogenovibrio marinus и другие Hydrogenovibrio sp.; Hydrogenothermus marinus и другие Hydrogenothermus sp.; Helicobacter pylori и другие Helicobacter sp.; Xanthobacter autotrophicus, Xanthobacter flavus и другие Xanthobacter sp.;
Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga patter onii, Hydrogenophaga pseudoflava и другие Hydrogenophaga sp.; Bradyrhizobium japonicum и другие Bradyrhizobium sp.; Ralstonia eutropha и другие Ralstonia sp.; Alcaligenes eutrophus, Alcaligenes facilis, Alcaligenes hydrogenophilus, Alcaligenes latus, Alcaligenes paradoxus, Alcaligenes ruhlandii и другие Alcaligenes sp.; Amycolata sp.; Aquaspirillum autotrophicum и другие Aquaspirillum sp.; Arthrobacter strain 11/X, Arthrobacter methylotrophus, и другие Arthrobacter sp.; Azospirillum lipoferum и другие Azospirillum sp.; Variovorax paradoxus, и другие Variovorax sp.; Acidovoraxfacilis, и другие Acidovorax sp.; Bacillus schlegelii, Bacillus tusciae и другие Bacillus sp.; Calderobacterium hydrogenophilum и другие Calderobacterium sp.; Derxia gummosa и другие Derxia sp.; Flavobacterium autothermophilum и другие Flavobacterium sp.; Microcyclus aquaticus и другиеMicrocyclus; Mycobacterium gordoniae и jxpyruoMycobacterium sp.; Paracoccus denitrificans и другие Paracoccus sp.; Persephonella marina, Persephonella guaymasensis и другие Persephonella sp.; Renobacter vacuolatum и другие Renobacter sp.; Streptomycetes coelicoflavus, Streptomycetes griseus, Streptomycetes xanthochromogenes, Streptomycetes thermocarboxydus, и другие Streptomycetes sp.; Thermocrinis ruber и другие Thermocrinis sp.; Wautersia sp.; цианобактерии, включая, но не ограничиваясь этим, Anabaena oscillarioides, Anabaena spiroides, Anabaena cylindrica, и другие Anabaena sp., и Arthrospiraplatensis, Arthrospira maxima и другие Arthrospira sp.; зеленые водоросли, включая, но не ограничиваясь этим, Scenedesmus obliquus и другие Scenedesmus sp., Chlamydomonas reinhardii и другие Chlamydomonas sp., Ankistrodesmus sp., Rhaphidiumpolymorphium и другие Rhaphidium sp; а также ассоциации микроорганизмов, которые включают в себя оксигидрогеновые микроорганизмы.
[196] В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения изобретение относится к композициям, в которых происходит, и способам использования хемоавтотрофного метаболизма для получения АТФ для поддержки биосинтетических реакций, потребляющих АТФ и поддержания клеток, без совместного производства метана или короткоцепочечных органических кислот, таких как уксусная или масляная кислоты посредством реакций сохранения энергии для получения АТФ, который использует неорганические доноры электронов и акцепторы электронов, включая, но не ограничиваясь этим, реакцию окисления водорода кислородом.
[197] Охарактеризовано множество различных микроорганизмов, способных расти в присутствии угарного газа в качестве источника электронов и/или источника
углерода (т.е. карбоксидотрофных микроорганизмов). В некоторых случаях карбоксидотрофные микроорганизмы могут также использовать Н2 в качестве донора электронов и/или расти миксотрофно. В некоторых случаях карбоксидотрофные микроорганизмы представляют собой факультативные хемолитоавтотрофы. [Biology of the Prokaryotes, edited by J Lengeler, G. Drews, H. Schlegel, John Wiley & Sons, Jul 10, 2009, включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы включают один или более из следующих карбоксидотрофных микроорганизмов: Acinetobacter sp.; Alcaligenes carboxydus и другие Alcaligenes sp.; Arthrobacter sp.; Azomonas sp.; Azotobacter sp.; Bacillus schlegelii и другие Bacillus sp.; Hydrogenophagapseudoflava и другие Hydrogenophaga sp.; Pseudomonas carboxydohydrogena, Pseudomonas carboxydovorans, Pseudomonas compransoris, Pseudomonas gazotropha, Pseudomonas thermocarboxydovorans и другие Pseudomonas sp.; Rhizobium japonicum и другие Rhizobium sp.; Streptomyces G26 Streptomyces thermoautotrophicus и другие Streptomyces sp.. В некоторых вариантах реализации данного изобретения используется карбоксидотрофный микроорганизм. В некоторых вариантах реализации изобретения используется карбоксидотрофный микроорганизм, способный к хемолитоавтотрофии. В некоторых вариантах реализации изобретения используется карбоксидотрофный микроорганизм, который способен использовать Н2 в качестве донора электронов при дыхании и/или биосинтезе.
[198] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы включают облигатные и/или факультативные хемоавтотрофные микроорганизмы, включающие одно или более из следующего: Acetoanaerobium sp.; Acetobacterium sp.; Acetogenium sp.; Achromobacter sp.; Acidianus sp.; Acinetobacter sp.; Actinomadura sp.; Aeromonas sp.; Alcaligenes sp.; Alcaliqenes sp.; Aquaspirillum sp.; Arcobacter sp.; Aureobacterium sp.; Bacillus sp.; Beggiatoa sp.; Butyribacterium sp.; Carboxydothermus sp.; Clostridium sp.; Comamonas sp.; Dehalobacter sp.; Dehalococcoide sp.; Dehalospirilium sp.; Desulfobacterium sp.; Desulfomonile sp.; Desulfotomaculum sp.; Desulfovibrio sp.; Desulfurosarcina sp.; Ectothiorhodospira sp.; Enterobacter sp.; Eubacterium sp.; Ferroplasma sp.; Halothibacillus sp.; Hydrogenobacter sp.; Hydrogenomonas sp.; Leptospirillum sp.; Metallosphaera sp.; Methanobacterium sp.; Methanobrevibacter sp.; Methanococcus sp.; Methanococcoides sp.; Methanogenium sp.; Methanolobus sp.; Methanomicrobium sp.; Methanoplanus sp.; Methanosarcina sp.; Methanospirillum sp.; Methanothermus sp.; Methanothrix sp.; Micrococcus sp.; Nitrobacter sp.;
Nitrobacteraceae sp., Nitrococcus sp., Nitrosococcus sp.; Nitrospina sp., Nitrospira sp., Nitrosolobus sp.; Nitrosomonas sp.; Nitrosospira sp.; Nitrosovibrio sp.; Nitrospina sp.; Oleomonas sp.; Paracoccus sp.; Peptostreptococcus sp.; Planctomycetes sp.; Pseudomonas sp.; Ralstonia sp.; Rhodobacter sp.; Rhodococcus sp.; Rhodocyclus sp.; Rhodomicrobium sp.; Rhodopseudomonas sp.; Rhodospirillum sp.; Shewanella sp.; Siderococcus sp.; Streptomyces sp.; Sulfobacillus sp.; Sulfolobus sp.; Thermothrix sp., Thiobacillus sp.; Thiomicrospira sp.; Thioploca sp.; Thiosphaera sp.; Thiothrix sp.; Thiovulum sp.; окислители серы; окислители водорода; окислители железа; ацетогены; и метаногены; ассоциации микроорганизмов, которые содержат хемоавтотрофы; хемоавтотрофы, встречающиеся в природе, по крайней мере, в одном из: гидротермальные источники, геотермальные источники, горячие источники, холодные просачивания, подземные водоносные горизонты, соленые озера, соленосные формации, шахты, кислые шахтные воды, шахтные отходы, нефтяные скважины, сточные воды нефтеперерабатывающих заводов, угольные пласты, глубокие недра; сточные воды и очистные сооружения; геотермальные электростанции, сульфатарные поля, и почвы; и экстремофилы, выбранные из одного или более термофилов, гипертермофилов, ацидофилов, галофилов и психрофилов.
[199] Такие организмы также включают, но не ограничиваются этим, экстремофилов, которые могут выдерживать экстремальные условия при различных параметрах окружающей среды, таких как температура, радиация, давление, гравитация, вакуум, высыхание, соленость, рН, давление кислорода и химические вещества. К ним относятся гипертермофилы, такие как Pyrolobus fumarii; термофилы, такие как Synechococcus lividis; мезофилы и психрофилы, такие как Psychrobacter. Экстремально термофильные метаболизаторы серы, такие как Thermoproteus sp., Pyrodictium sp., Sulfolobus sp., Acidianus sp.. Толерантные к радиации организмы включают Deinococcus radiodurans. Толерантные к давлению организмы включают пьезофилов или барофилов. Толерантные к высыханию и ангидробротические организмы включают ксерофилов; микроорганизмы и грибы. Солеустойчивые организмы включают галофилы, такие как Halobacteriacea и Dunaliella salina. Толерантные к рН микроорганизмы включают алкалифилов, таких как Natronobacterium, Bacillus firmus OF4, Spirulina spp. и ацидофилов, таких как Cyanidium caldarium, Ferroplasma sp. Толерантные к газу организмы, которые выдерживают наличие чистого С02, включают Cyanidium caldarium и толерантные к
металлам организмы включают металлотолерантов, таких как Ferroplasma acidarmanus, Ralstonia sp.
[200] В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение также относится к композиции, в которой микроорганизм представляет собой водородоокисляющый хемоавтотроф и/или карбоксидотроф и/или метилотроф и/или метанотроф. В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение также предлагает композицию, в которой микроорганизм способен расти в присутствии синтез-газа и/или генераторного газа и/или пиролизного газа в качестве единственного донора электронов и/или источника восстановленных атомов водорода и/или источника углерода. В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение также предлагает композицию, в которой микроорганизм способен расти на необработанном неочищенном глицерине в качестве единственного донора электронов и/или источника восстановленных атомов водорода и/или источника углерода.
[201] В некоторых вариантах реализации данного изобретения используемые микроорганизмы являются природными и/или не генетически модифицированными (не ГМО) микроорганизмами и/или непатогенными и/или зависят от конкретных условий окружающей среды, обеспечиваемых биопроцессами, которые отсутствуют в окружающей среде.
[202] В некоторых вариантах реализации данного изобретения используются микроорганизм или ассоциация микроорганизмов, выделенных из образцов окружающей среды и обогащенных желаемыми микроорганизмами, с использованием способов, известных в области микробиологии, путем роста в присутствии целевых доноров электронов, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из: водород и/или СО и/или синтез-газ и/или метан и акцепторов электронов, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из: кислород и/или нитрат и/или трехвалентное железом и/или СОг, и условий окружающей среды (например, температура, рН, давление, DO, соленость, наличие различных примесей и загрязняющих веществ и т. д.).
[203] В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение также предлагает способ, в котором доноры электронов использующиеся при биосинтезе и/или дыхании включают, но не ограничиваются этим, один или более из следующих восстановителей: аммиак; аммоний; монооксид углерода; дитионит; элементарная сера; водород; метабисульфиты; оксид азота; нитриты; сульфаты, такие как тиосульфата, включая, но не ограничиваясь этим, тиосульфат натрия
(№28203) или тиосульфат кальция (СаБгОз); сульфиды, такие как сероводород; сульфиты; тионаты; тиониты.
[204] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой метанотроф. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм является представителем рода Methylococcus. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой Methylococcus capsulatus. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм представляет собой метилотроф. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм является представителем рода Methylobacterium. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм взят из одного или нескольких из следующих видов: Methylobacterium zatmanii; Methylobacterium extorquens; Methylobacterium chloromethanicum.
[205] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм согласно заявленному изобретению не зависит от света в отношении роста и/или для синтеза одного или более из следующего: аминокислоты и/или белки и/или другие питательные вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм согласно заявленному изобретению не требует какого-либо типа сахара или любого другого органического соединения или любого типа фиксированного углерода для роста и/или для синтеза одного или более из следующего: аминокислоты и/или белки и/или другие питательные вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм согласно заявленному изобретению представляет собой факультативный микроорганизм. [206] Производство органических молекул с длиной углеродных цепей большей, чем С4, наиболее часто и эффективно осуществляется биологически посредством путей анаболического биосинтеза, таких как биосинтез жирных кислот [Fischer, Klein-Marcuschamer, Stephanolpoulos, Metabolic Engineering (2008) 10, 295-304] и различные пути биосинтеза аминокислот. Исходной молекулой, входящей в путь биосинтеза жирных кислот, является ацетил-кофермент А (ацетил-СоА), центральный метаболит, из которого можно получить много ценных биохимических веществ. В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение использует микроорганизмы с естественным путем конверсии СО, СО2 и/или Н2 и/или СН4 в ацетил-СоА. В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение использует микроорганизмы, которые могут фиксировать СО и/или СО2 посредством цикла восстановления трикарбоновых кислот, цикла Кальвина-Бенсона-Бассама и/или пути Вуда-Льюнгдаля. В некоторых вариантах реализации
изобретения изобретение использует микроорганизмы, которые фиксируют С1 соединения посредством метанотрофного пути. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы природным путем продуцируют ферменты, которые катализируют фиксацию газообразного неорганического углерода с образованием одного или более из ацетил-КоА, пирувата, малонил-КоА, используя газообразные доноры электронов, такие как присутствующие в синтез-газе и/или в генераторном газе в качестве восстановителей, причем такие ферментативные белки, включают, но не ограничиваясь этим, ацетил-КоА-синтазу, ацетил-КоА-синтазудисульфидредуктазу, кобаламидный кориноид/железо-серный белок, дегидрогеназу монооксида углерода, гидрогеназу и метилтрансферазу. [207] В отличие от метаногенных, ацетогенных и сольвентогенных путей, присутствующих у метаногенов и ацетогенов, соответственно, которые могут продуцировать короткоцепочечные органические соединения (С 1-С4) с итоговым производством АТФ или нулевым итоговыми потреблением (т. е. АТФ-нейтральны), анаболические пути биосинтеза, такие как синтез жирных кислот включают итоговое потребление АТФ. Например, следующее дает итоговую реакцию для синтеза пальмитиновой кислоты (С 16), начиная с ацетил-СоА:
8Ацетил-КоА + 7АТФ + Н20 + 14NADPH + 14Н+ -> Пальмитиновая кислота + 8КоА +
14NADP+ + 7ADP + 7Pt
[208] Недостатком использования облигатного метаногена или ацетогена в процессе GTC для получения молекул, полученных путем анаболического биосинтеза, таких как аминокислоты, белки или липиды, является обязательное использование СОг в качестве акцептора электронов при дыхании для производства АТФ, который необходим для анаболического биосинтеза, такого как синтез жирных кислот или синтез аминокислот. Если Н2 представляет собой донор электронов, то количество АТФ, полученного в расчете на Н2, потребляемого для дыхания ацетогена или метаногена, является относительно низким: один АТФ на 4Нг при производстве метана в результате дыхания [Thauer, R. К., Kaster, А. К., Seedorf, Н., Buckel, W. & Hedderich, R. Methanogenic archaea: ecologically relevant differences in energy conservation. Nat Rev Microbiol 6, 579-591, doi:nrmicrol931 [pii], включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.] или производстве уксусной кислоты, и один АТФ на IOH2 при получении масляной кислоты. [Papoutsakis, Biotechnology & Bioengineering (1984) 26, 174-187; Heise, Muller, Gottschalk, J. Bacteriology (1989) 5473-5478; Lee, Park, Jang, Nielsen, Kim, Jung, Biotechnology &
Bioengineering (2008) 101(2) 209-228, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.]
[209] В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к микроорганизму или композициям, содержащим микроорганизм, причем микроорганизм способен продуцировать АТФ из неорганического донора электронов, такого как, но не ограничиваясь этим, FL; и/или СО без синтеза метана или короткоцепочечных органических кислот (короткоцепочечные органические кислоты, содержащие углеродные цепи длиной от двух до четырех атомов углерода). В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения изобретение относится к микроорганизму или композициям, содержащим микроорганизм, причем микроорганизм продуцирует АТФ из неорганического донора электронов, такого как, но не ограничиваясь этим, Нг и/или СО, в сочетании с акцептором электронов, отличающимся от СОг, который используется при дыхании. [210] В некоторых вариантах реализации данного изобретения применяется окисляющие водород и/или СО-окисляющие и/или СНгОкисляющие микроорганизмы, которые используют более электроотрицательные акцепторы электронов в реакциях запасания энергии для производства АТФ, такие как, но не ограничиваясь этим, О2. Например, гидрогенотрофные оксигидрогеновые или водородные микроорганизмы, которые сочетают реакцию кислородного окисления водорода, 2 Н2 + О2 -> 2 Н2О, с получением АТФ, могут продуцировать больше АТФ в пересчете на Н2 и/или другой донор электронов, потребляемый для дыхания, нежели ацетогены или метаногены, которые используют СО2 в качестве акцептора электронов при дыхании. Например, водородные микроорганизмы могут продуцировать по меньшей мере два АТФ в расчете на один Н2, потребляемый при дыхании [Bongers, J. Bacteriology, (Oct 1970) 145-151, включена в данный документе полном объеме посредством ссылки .], что в восемь раз больше АТФ, продуцируемого в расчете на Н2, потребляемый при дыхании, чем то, что может быть получено в микроорганизмах, в которых проходит метаногенез или ацетогенез, используя Н2 в качестве донора электронов и СО2 в качестве акцептора электронов при дыхании. По этой причине применение микроорганизмов, которые могут использовать более электроотрицательные акцепторы электронов при дыхании и в производстве АТФ, такие как, но не ограничиваясь этим, водородные микроорганизмы, для анаболического биосинтеза, такого как, но не ограничиваясь этим, биосинтез аминокислот или белков или жирных кислот из синтез-газа или Н2, может быть более эффективным, чем использование ацетогенов или метаногенов,
таких как те, которые в настоящее время используются в биологических технологиях GTC.
[211] В некоторых вариантах реализации изобретения реакция окисления водорода кислородом, используемая при дыхании, ферментативно связана с окислительным фосфорилированием. В некоторых вариантах реализации изобретения АТФ и/или другие внутриклеточные носители энергии, полученные таким образом, используются в анаболическом синтезе аминокислот и/или белков. В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к водородному микроорганизму или композициям, содержащим водородный микроорганизм, причем микроорганизм содержит по меньшей мере ноль или одну или более экзогенных нуклеиновых кислот, которые кодируют ноль или более ферментов, чтобы обеспечить возможность биосинтеза полезных продуктов на основе углерода, представляющих интерес включая, но не ограничиваясь этим, химические вещества, мономеры, полимеры, белки, полисахариды, витамины, биологически активные добавки, антибиотики или фармацевтические продукты или их промежуточные продукты из углеродосодержащего газообразного сырья, включая, но не ограничиваясь этим, синтез-газ или генераторный газ или отходы СО2 в сочетании с возобновляемыми Н2 или СО или метаносодержащими газами. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения изобретение относится к микроорганизму или композициям, содержащим микроорганизм, причем микроорганизму требуется меньше 4Н2 для получения одного АТФ при дыхании. В других неограничивающих вариантах реализации изобретения изобретение относится к микроорганизму или композициям, содержащим микроорганизм, причем микроорганизм продуцирует более чем один АТФ в расчете на один Н2, потребленный при дыхании. В других неограничивающих вариантах реализации изобретения изобретение относится к микроорганизму или композициям, содержащим микроорганизм, причем микроорганизм продуцирует по меньшей мере два АТФ в расчете на один Н2, потребляемый при дыхании, или по меньшей мере 2,5 АТФ в расчете на один Н2, потребляемый при дыхании. [212] В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к композиции, содержащей микроорганизм, который конвертирует синтез-газ и/или генераторный газ и/или газообразный СО2 и/или Н2 и/или СО и/или СН4 в одно или более органических соединений, причем менее 10% массы органических соединений, продуцируемых микроорганизмом, представляет собой метан. В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к композиции,
содержащей микроорганизм, который конвертирует указанные газообразные субстраты в одно или более органических соединений; причем менее 10% массы полученных органических соединений представляют собой свободные органические кислоты с длиной углеродной цепи в четыре атома углерода или менее. [213] В некоторых вариантах реализации данного изобретения микроорганизм восстанавливает СОг, образуя клеточный материал и Н2О. В некоторых вариантах реализации изобретения энергия, необходимая для метаболических путей, которые выполняют это восстановление, получается путем окисления водорода молекулярным кислородом. В некоторых вариантах реализации данного изобретения биологическая система и/или компоненты функционируют непосредственно как восстановитель СО2, но не производитель О2. В некоторых вариантах реализации изобретения О2, используемый в дыхании, получают из другой системы и подают в биологическую систему и/или компоненты. В некоторых вариантах реализации изобретения другая система включает электролиз и/или термолиз воды. [214] Преимущество использования оксигидрогеновых микроорганизмов относительно строго анаэробных ацетогенных или метаногенных микроорганизмов для применений с улавливанием углерода и/или применений конверсии синтез-газа представляет собой более высокую кислородную толерантность к оксигидрогеновым микроорганизмам. В некоторых вариантах реализации изобретения используется микроорганизм, который выдерживает аэробные и/или микроаэробные условия. Кислородные микроорганизмы обычно имеют преимущество перед строго анаэробными ацетогенными или метаногенными микроорганизмами в применении с улавливанием углерода из дымовых газов из-за более высокой кислородной толерантности оксигидрогенных микроорганизмов. Поскольку промышленный дымовой газ является одним из предполагаемых источников СО2 для определенных вариантов реализации данного изобретения, относительно высокая толерантность к кислороду оксигидрогеновых микроорганизмов по сравнению с облигатными анаэробными метаногенами или ацетогенами может позволять легче переносить содержание О2 2-6% в обычных дымовых газах. В некоторых вариантах реализации данного изобретения содержание 2% или более О2 в дымовом газе, содержащем СО2, или входной газовой смеси любого другого типа, выдерживается культурой микроорганизмов и/или используется в микробном дыхании. [215] Еще одно преимущество использования оксигидрогеновых микроорганизмов для применений улавливания углерода и/или применения конверсии синтез-газа над использованием ацетогенов заключается в том, что
получение АТФ посредством дыхания, вызванное реакцией кислородного окисления водорода, приводит к образованию продукта в виде воды, который легко может быть включен в технологический поток в сравнении с обычно нежелательными продуктами ацидогенеза, представляющими собой уксусную кислоту или масляную кислоту, которые могут нанести вред микроорганизмам путем снижения рН раствора или накопления до ингибирующего или токсического уровня. В некоторых вариантах реализации изобретения основным продуктом клеточного дыхания является вода.
[216] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм способен расти на необработанном неочищенном глицерине и/или глюкозе и/или метаноле и/или ацетате в качестве единственного донора электронов и источника углерода. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм способен расти миксотрофно на источнике органического углерода и использовать неорганический донор электронов или источник углерода.
[217] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы, предлагаемые в изобретении, содержат клеточную линию, выбранную из эукариотических растений, водорослей, цианобактерий, зеленых серных бактерий, зеленых несерных бактерий, пурпурных серных бактерий, пурпурных несерных бактерий, экстремофилов, дрожжей, грибов, протеобактерий, их модифицированных вариантов и синтетических организмов. В некоторых вариантах реализации изобретения используется Спирулина.
[218] В некоторых вариантах реализации изобретения используются пурпурные несерные бактерии, которые включают, но не ограничиваются этим, следующие роды: Phaeospirillum, Rhodobaca, Rhodobacter, Rhodomicrobium, Rhodopila, Rhodopseudomonas, Rhodothalassium, Rhodospirillum, Rodovibrio, и Roseospira. [219] Жидкие культуры, используемые для выращивания клеток согласно изобретению, могут быть размещены в любой из емкостей для культивирования, известных и используемых в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения крупномасштабное производство в емкости биореактора может быть использовано для получения больших количеств желаемой молекулы и/или биомассы.
[220] Другое преимущество некоторых вариантов реализации данного изобретения относится к емкостям биореактора, которые содержат, изолируют и/или защищают культуральную среду. Типовые емкости для культивирования, которые могут быть использованы в некоторых неограничивающих вариантах реализации
данного изобретения для культивирования и выращивания микроорганизмов для получения органических соединений, включая, но не ограничиваясь одно или более из следующего: аминокислоты, белки и другие питательные вещества; включают те, которые известны специалистам в области широкомасштабного культивирования микроорганизмов. Такие емкости для культивирования, которые могут использоваться в некоторых вариантах реализации данного изобретения, включают, но не ограничиваются этим, одно или более из следующего: аэролифтный реактор; колонны биологических скрубберов; пузырьковые колонны; реакторы с мешалкой; реакторы с непрерывным перемешиванием; противоточные, с восходящим потоком, реакторы с увеличенным придонным слоем; реакторы для ферментативного разложения и, в частности, системы реакторов разложения, такие как известные в области очистки сточных и канализационных вод или биоремедиации; фильтры, включая, но не ограничиваясь этим, биологические фильтры, вращающиеся контакторные биологические фильтры, вращающиеся диски, почвенные фильтры; реакторы с псевдоожиженным слоем; газлифтные ферментеры; реакторы с иммобилизованными клетками; петлевые реакторы; мембранные реакторы с биопленками; реакторы с воздушным перемешиванием; реакторы с увеличенной площадью контакта фаз (packed-bed reactor); реакторы идеального вытеснения; статические смесители; реакторы с орошаемым слоем; и/или вертикальные биореакторы. Основание емкости, обшивка, стены, футеровка и/или верхние части в некоторых вариантах реализации изобретения могут быть выполнены из одного или нескольких материалов, включая, но не ограничиваясь этим, битум, цемент, керамику, глину, бетон, эпоксидную смолу, стекловолокно, стекло, щебень, пластмассы, песок, герметик, почву, стали или другие металлы и их сплавы, камень, смолу, древесину и любую их комбинацию. В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых микроорганизмы либо требуют едкую среду для роста, и/или продуцируют едкие химические вещества в результате реакции фиксации углерода, стойкие к коррозии материалы, известные в области техники и инженерном деле, могут использоваться для внутренней отделки емкости, контактирующей со средой для выращивания.
[221] Культивирование микроорганизмов в данном изобретении в некоторых вариантах реализации изобретения выполняется для проведения генетических модификаций и/или для получения органических соединений и, в частности, в некоторых вариантах реализации изобретения, одного или более из следующего: аминокислоты, белки и другие питательные вещества. Культивирование
микроорганизмов с целью генетической манипуляции обычно выполняется в небольшом масштабе и часто в условиях, которые способствуют отбору генетически модифицированных признаков.
[222] Культивирование микроорганизмов, нацеленное на коммерческое производство органических соединений и, в частности, аминокислот, белков и других питательных веществ, обычно выполняется в биореакторах в гораздо большем масштабе (например, при объемах биореактора 500 л, 1000 л 5000 л, 10000 л, 50 000 л, 100 000 л, 1000000 л и более). В некоторых вариантах реализации изобретения хемоавтотрофы согласно данному изобретению выращиваются в жидкой среде внутри биореактора с использованием способов согласно изобретению. В некоторых вариантах реализации изобретения биореактор, содержащий микроорганизмы, сконструирован из непрозрачных материалов, которые поддерживают культуру в полной или почти полной темноте. Биореакторы, изготовленные из непрозрачных материалов, таких как сталь и/или другие металлические сплавы и/или железобетон и/или стекловолокно и/или различные высокопрочные пластмассовые материалы, могут быть спроектированы с большими рабочими объемами. В некоторых вариантах реализации данного изобретения используются ферментеры, изготовленные из стали или других металлических сплавов, которые имеют объем 50 000 литров и более. В некоторых вариантах реализации данного изобретения используются биореакторы, способные иметь внутри более высокое давление относительно давления в окружающем пространстве. В некоторых вариантах реализации данного изобретения используются яйцевидные или цилиндрические реакторы для ферментативного разложения или биореакторы вертикального исполнения, объем которых составляет 3,000,000 литров и более. В некоторых вариантах реализации изобретения биореактор, содержащий микроорганизм, не позволяет проникать свету в часть или большую часть или весь объем жидкости. В некоторых вариантах реализации изобретения бактериальная клетка или клетка микроорганизма культивируется без значительного или любого воздействия света. В некоторых вариантах реализации изобретения преобразование электричества в свет не требуется.
[223] Следуя способам согласно данному изобретению, в некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы выращиваются и содержатся для получения аминокислот или белков или других питательных веществ или цельноклеточных продуктов в среде, содержащей газообразный источник углерода, такой как, но не ограничиваясь этим, синтез-газ или генераторный газ или
остаточный газ, пиролизный газ или газовые смеси Н2 и С02, при отсутствии света; причем такой рост известен как хемоавтотрофный рост. В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к способам культивирования клеток для крупномасштабного производства аминокислот или белков или других питательных веществ или цельноклеточных продуктов. В некоторых вариантах реализации изобретения изобретение относится к способам культивирования клеток в биореакторах объемом 50,000 литров или более, которые обычно изготавливаются из недорогих, прочных и непрозрачных материалов, таких как сталь или другие металлические сплавы или железобетон или грунт. Размер, глубина и конструкция таких биореакторов определяют то, что клетки будут выращены в полной или почти полной темноте. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы культивируют для синтеза аминокислот или белков или других питательных веществ или цельноклеточных продуктов в соответствии со способами данного изобретения в среде, содержащей газообразный неорганический углерод в качестве первичного или единственного источника углерода, и без какого-либо воздействия света. Этот тип роста известен как хемоавтотрофный рост. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения микроорганизм, используемый в этапе фиксации СО2, не является фотосинтетическим. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения конструкция биореактора не ограничивает культуру в тонких слоях или имеет прозрачные стенки для обеспечения доступности света во всей емкости, как это обычно необходимо для фотосинтезирующих микроорганизмов.
[224] В некоторых вариантах реализации данного изобретения хемоавтотрофы способны получать энергию, необходимую для роста, непосредственно с помощью окислительно-восстановительных химических реакций, а не солнечного света, в то время как потребление СО2 облегчает и/или позволяет проводить непрерывные процессы улавливания СО2 днем и ночью круглый год при всех погодных условиях без какого-либо искусственного освещения. Напротив, водоросли и высшие растения в итоге могут стать производителями С02 в ночное время или при низких уровнях освещенности. Из-за отсутствия требований к освещению в некоторых вариантах реализации данного изобретения традиционное, проверенное оборудование и инфраструктура, взятые из коммерческих биопроцессов, которые изготовлены из непрозрачных материалов, непрозрачны для видимого света, применяются в некоторых вариантах реализации данного изобретения без необходимость какого-либо искусственного освещения. В некоторых вариантах
реализации данного изобретения увеличение пропускной способности системы обеспечивается вертикальным масштабированием, а не только масштабированием по горизонтали. Это контрастирует с фототрофными подходами с использованием водорослей, цианобактерий или высших растений для улавливания СОг. Хотя для фотосинтетических систем были предложены различные схемы вертикального выращивания, с практической и экономической точки зрения, фототрофные системы должны масштабироваться горизонтально, например, в мелководных прудах или фотобиореакторах в случае водорослей. Это приводит к значительному географическому влиянию и множеству негативных воздействий на окружающую среду.
[225] В таких случаях, как вертикальное выращивание, где в противном случае требуется искусственное освещение для выращивания фотосинтетического организма, такого как водоросли или высшие растения, в некоторых вариантах реализации изобретения с вертикальным выращиванием преобразование электричества в свет не требуется для конверсии СО2. В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения электролиз воды заменяет преобразование электричества в свет, поддерживая автотрофное поглощение СО2 и биосинтез. В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения существует большое преимущество в области энергоэффективности при преобразовании электричества в доноры электронов, такие как, но не ограничиваясь этим, водород посредством электролиза в сравнении с преобразованием электричества в свет. Система на основе водорослей или высших растений, выращиваемая с искусственным освещением сталкивается с неэффективным использованием энергии света водорослями и неэффективным преобразованием электрической энергии в энергию света. В некоторых вариантах реализации данного изобретения сопоставимые с точки зрения поглощения СО2 и/или производства биомассы, культура водорослей или высших растений, выращенных при искусственном освещении, потребуют больше электроэнергии, чем система улавливания СО2 и/или производства биомассы согласно данному изобретению. В некоторых вариантах реализации данного изобретения сопоставимые с точки зрения поглощения СО2 и/или производства биомассы, культура водорослей или высших растений, выращенных при искусственном освещении, потребуют по меньшей мере в 10 раз больше электроэнергии, чем система улавливания СО2 и/или производства биомассы согласно данному изобретению. Для водорослей или высших растений, выращенных при
искусственном освещении, требования к отводу тепла почти прямо пропорциональны количеству входящей электроэнергии. В некоторых вариантах реализации данного изобретения требования к отводу тепла ниже, чем для сравнимой системы на основе водорослей или высших растений относительно улавливания СОг и/или производства биомассы при выращивании с искусственным освещением. В некоторых вариантах реализации данного изобретения требования к отводу тепла по меньшей мере в 10 раз ниже, чем для сравнимой системы на основе водорослей или высших растений относительно улавливания СО2 и/или производства биомассы при выращивании с искусственным освещением. [226] В некоторых вариантах реализации данного изобретения относительно высокая устойчивость к неблагоприятным условиям, обеспечиваемая отделением биопроцесса от окружающей среды, позволяет биопроцессу согласно данному изобретению функционировать в условиях, неблагоприятных для открытых систем на основе водорослей или традиционного сельского хозяйства. В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения низкие температуры зимой используются для снижения затрат на технологическое охлаждение, вызванных тем, что реакция Н2 и СО2 для получения белка является экзотермической.
[227] Чтобы представить иллюстрацию применения биореактора в некоторых вариантах реализации данного изобретения, биореактор, содержащий питательную среду, инокулируют клетками-продуцентами. Как правило, вначале идет лаг-фаза перед тем, как количество клеток начнет удваивается После лаг-фазы время удвоения клеток уменьшается, и культура переходит в фазу логарифмического роста. В конечном итоге после фазы логарифмического роста происходит увеличение времени удвоения клеток, которое, не желая ограничиваться теорией, считается результатом либо ограничения переноса массы, истощения питательных веществ, в том числе азота или минеральных источников, либо увеличения концентрации ингибирующих химических веществ или дистанционных микроб-микробных взаимодействий. Рост замедляется, а затем прекращается, когда культура переходит в стационарную фазу. В некоторых вариантах реализации изобретения существует фаза арифметического роста, предшествующая стационарной фазе. Для сбора клеточной массы культуру в определенных вариантах реализации изобретения собирают в логарифмической фазе и/или арифметической фазе и/или в стационарной фазе. Накопление липидов обычно может быть вызвано истощением источника азота или другого ключевого питательного вещества, за исключением источника углерода
или источника электронов (например, водорода). У ряда видов это сигнализирует клеткам о запасании липидов, полученных из избыточных источников углерод и энергии.
[228] Биореактор или ферментер используют для культивирования клеток на различные фазы их физиологического цикла. Биореактор используется для культивирования клеток, которые могут поддерживаться на определенных фазах их кривой роста. Использование биореакторов выгодно во многих отношениях для культивирования хемоавтотрофного роста. В некоторых вариантах реализации изобретения богатая белком клеточная масса, которая используется для получения белков или кормов для животных, выращивается до высоких плотностей в жидкой суспензии. Как правило, в биореакторе облегчается контроль условий роста, включая контроль растворенного диоксида углерода, кислорода и других газов, таких как водород, а также других растворенных питательных веществ, микроэлементов, температуры и рН.
[229] В некоторых вариантах реализации изобретения условия процесса используются для усиления воздействия на биосинтез нативных или экспрессированных ферментов. В некоторых вариантах реализации изобретения условие процесса, используемое для усиления воздействия на нативные или экспрессированные ферменты, представляет собой температуру. [230] Питательная среда, а также газы могут быть добавлены в биореактор в виде отдельных партий или периодически или в ответ на обнаруженное истощение или запрограммированное заданное значение или непрерывно в течение периода, когда культура выращивается и/или поддерживается. В некоторых вариантах реализации изобретения биореактор при инокуляции заполняется исходной партией питательной среды и/или газов в начале роста, и после инокуляции не добавляется дополнительная питательная среда и/или газы. В некоторых вариантах реализации изобретения питательная среда и/или газы добавляют периодически после инокуляции. В некоторых вариантах реализации изобретения питательная среда и/или газ добавляют после инокуляции в ответ на обнаруженное истощение питательных веществ и/или газа. В некоторых вариантах реализации изобретения питательную среду и/или газ добавляют непрерывно после инокуляции. В некоторых вариантах реализации изобретения добавленная питательная среда не содержит каких-либо органических соединений.
[231] В некоторых вариантах реализации изобретения инокуляция культуры в биореактор осуществляется с помощью способов, включающих (но не
ограничиваясь этим) перенос культуры из существующей культуры, обитающей в другом биореакторе, или инкубацию из посевного материала, полученного в инкубаторе. В некоторых вариантах реализации изобретения посевной материал штамма может транспортироваться и храниться в формах, включая, но не ограничиваясь этим, порошок, жидкую, замороженную или лиофилизированную форму, а также любую другую подходящую форму, которая может быть легко опознана специалистом в данной области техники. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения резервные бактериальные культуры хранятся в метаболически неактивном, лиофилизированном состоянии до тех пор, пока они не потребуется для перезапуска. В некоторых вариантах реализации изобретения при получении культуры в очень большом реакторе культуры выращивают и стабилизируют в постепенно все больших емкостях среднего масштаба перед инокуляцией емкости полного масштаба.
[232] В некоторых вариантах реализации изобретения биореакторы имеют механизмы, позволяющие перемешивать питательную среду, которые включают, но не ограничиваются этим, одно или более из следующего: вращающиеся мешалки, лопасти, импеллеры или турбины; вращающиеся, качающиеся или поворотные сосуды; газлифты, разбрызгивание; рециркуляцию культуральной жидкости из нижней части емкости в верхнюю часть через рециркуляционный трубопровод, пропускание культуральной жидкости через контурный и/или статический смеситель. Культуральную среду можно перемешивать непрерывно или периодически.
[233] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм, содержащий питательную среду, может быть удален из биореакторов согласно данного изобретения частично или полностью, периодически или непрерывно, и в некоторых вариантах реализации изобретения заменен свежей бесклеточной средой для поддержания культуры клеток в определенных вариантах реализации изобретения в фазе экспоненциального роста и/или для пополнения истощенных питательных веществ в среде для роста и/или удаления ингибирующих отходов. [234] Отверстия, которые являются стандартными в биореакторах, могут быть использованы для введения или удаления газов, жидкостей, твердых веществ и/или суспензий в и/или из емкости биореактора, содержащего микроорганизмы согласно данному изобретению. Многие биореакторы имеют несколько отверстий для разных целей (например, отверстия для добавления среды, добавления газа, зондов для измерения рН и DO, отбора проб), и указанное отверстие может использоваться для
различных целей в ходе брожения. Например, отверстие может использоваться для добавления питательной среды в биореактор в один момент времени и в другое время может использоваться для отбора проб. Предпочтительно, многократное использование отверстия для отбора проб может быть выполнено без введения загрязнений или инвазивных видов в среду для роста. Клапан или другой привод, обеспечивающий управление потоком проб или непрерывным отбором проб, может быть установлен в отверстие для отбора проб. В некоторых вариантах реализации изобретения биореакторы снабжены, по меньшей мере, одним отверстием, подходящим для инокуляции культуры, который может дополнительно использоваться для других применений, включая добавление среды или газа. Отверстия биореактора позволяют контролировать состав газа и скорость потока в культуральной среде. Например, отверстия могут использоваться в качестве впускных отверстий биореактора для газа, через который закачиваются газы. [235] В некоторых вариантах реализации изобретения газы, которые могут закачиваться в биореактор, включают в себя, но не ограничиваются этим, одно или более из следующего: синтез-газ,генераторный газ, пиролизный газ, газообразный водород, СО, СО2, О2, воздух, смеси воздух/СОг, природный газ, биогаз, метан, аммиак, азот, благородные газы, такие как аргон, а также другие газы. В некоторых вариантах реализации изобретения СО2, закачиваемый в систему, может поступать из источников, включая, но не ограничиваясь этим: СО2 в результате газификации органического вещества; СОг в результате прокаливания известняка, СаСОз, для производства негашеной извести, CaO; СО2 в результате парового реформинга метана, такой как побочный продукт СО2 при производстве аммиака, метанола или водорода; СО2 в результате сжигания, инсинерации или факельного сжигания; побочный продукт СОг при анаэробной или аэробной ферментации сахара; побочный продукт СО2 метанотрофного биопроцесса; СО2 в результате очистки сточных вод; побочный продукт СО2 в результате производства фосфата натрия; геологическое или геотермальное производство или выброс СО2; СО2, извлеченный из кислотного газа или природного газа. В некоторых вариантах реализации изобретения источником углерода является СО2 и/или бикарбонат и/или карбонат в морской воде или других водных массах поверхностных или подземных вод. В некоторых вариантах реализации изобретения источником углерода является СО2 из атмосферы. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения СО2 улавливается из замкнутого пространства в качестве части замкнутой системы жизнеобеспечения, используя оборудование, такое как, но не ограничиваясь этим,
система удаления СО2 (CDRA), которая используется в Международной Космической Станции (МКС).
[236] В некоторых вариантах реализации данного изобретения дымовые газы, содержащие углекислый газ, улавливаются из дымовой трубы при температуре, давлении и составе газа, характерных для необработанных выхлопных газов, и направляются с минимальной модификацией в реакционные емкости, в которых происходит фиксация углерода. В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых примеси, вредные для организмов, отсутствуют в дымовом газе, модификация дымового газа при входе в реакционные емкости может быть ограничена сжатием, необходимым для прокачки газа через реакторную систему и/или теплообмена, необходимого для снижения температуры газа до значения, подходящего для предоставления микроорганизмам. В некоторых вариантах реализации изобретения СО2, присутствующий в дымовом газе или другом потоке смешанного газа, очищается и/или концентрируется перед введением в биореактор с использованием технологий и процессов улавливания углерода, хорошо известных в данной области техники.
[237] В вариантах реализации изобретения, в которых дымовой газ, содержащий углекислый газ, транспортируется через систему для растворения углекислого газа в растворе (такой как хорошо известная в области улавливания углерода и/или конверсии с помощью микроорганизмов), очищенный дымовой газ с пониженным содержанием СО2 (который обычно содержит в основном инертные газы, такие как азот), может в определенных вариантах реализации изобретения высвобождается в атмосферу.
[238] В некоторых вариантах реализации данного изобретения источником углерода является СО2 и/или СО, содержащиеся в промышленных дымовых газах и газообразных отходах и/или из природных источников, включая, но не ограничиваясь этим, геологические и геотермальные источники. В некоторых вариантах реализации изобретения дымовые газы или отработанные газы, содержащие СОг и/или СО, выделяются одной или более следующих отраслей или секторов: нефть; электричество; природный газ; цемент; химическое производство; сталь; металлургия; ферментация; очистка сточных вод. В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения относительно небольшой требуемый размер земли облегчает совместную локализацию биопроцесса с промышленными объектами, производящими СО2 и/или другие углеродные отходы, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из
следующего: электростанции на ископаемом топливе; нефтеперерабатывающие заводы; фабрики по переработке песка; буровые работы по добыче природного газа или нефти; дистилляторы этанола; цементные производства; производства алюминия, производства хлоралкали, сталелитейные заводы; геотермальные электростанции. В некоторых вариантах реализации данного изобретения отработанное тепло, связанное с промышленными источниками дымовых газов, далее используется в процессе производства согласно данному изобретению для этапов, включая, но не ограничиваясь этим, высушивание биомассы. [239] В некоторых вариантах реализации изобретения газы, в дополнение к углекислому газу или вместо углекислого газа, в качестве альтернативного источника углерода либо растворяют в растворе, либо подают в культуральную жидкость и/или растворяют непосредственно в культуральной жидкости, включая, но не ограничиваясь этим, газообразные доноры электронов и/или источники углерода (например, водород и/или СО и/или метановый газ). В некоторых вариантах реализации данного изобретения входящие газы могут включать другие доноры электронов и/или акцепторы электронов и/или источники углерода и/или минеральные питательные вещества, такие как, но не ограничиваясь этим, другие составляющие газа и примеси синтез-газа (например, углеводороды); аммиак; сероводород; и/или другие газы, содержащие сероводород; и/или 02; и/или содержащие минералы частицы и золу.
[240] В некоторых вариантах реализации данного изобретения газы растворяются в культуральной жидкости согласно данному изобретению, включая, но не ограничиваясь этим, газообразные доноры электронов, такие как, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: водород, угарный газ, метан, сероводород или другие газы, содержащие сероводород; газообразные источники углерода, такие как, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: СОг, СО, СН4; и акцепторы электронов, такие как, но не ограничиваясь этим, кислород, как в составе воздуха (например, 20,9% кислорода), так и в виде чистого О2, либо в качестве газа, обогащенного О2. В некоторых вариантах реализации изобретения растворение этих и других газов в растворе достигается с использованием системы компрессоров, расходомеров и регуляторов потока, известных специалистам в области технологии ферментации, которые подаются в одну или более из следующих широко используемых систем для диспергирования газа в растворе: барботажное оборудование; диффузоры, включая, но не ограничиваясь этим, купольное, трубчатое, дисковое или тороидное исполнение; аэраторы,
предназначенные для подачи крупных или мелких пузырьков; оборудование типа Вентури. В некоторых вариантах реализации данного изобретения аэрация поверхности и/или перенос газовой массы также могут быть выполнены с использованием лопастных аэраторов и тому подобного. В некоторых вариантах реализации данного изобретения растворение газа усиливается путем механического смешивания с помощью импеллера или турбины, а также с помощью гидравлических ножниц для уменьшения размера пузырьков. После прохождения через реакторную систему, содержащую микроорганизмы, которые поглощают газы, в некоторых вариантах реализации изобретения остаточные газы могут либо возвращаться обратно в биореактор, либо сжигаться для технологического тепла, либо сжигатся на факеле, либо закачиваться под землю, либо выпускаться в атмосферу. В некоторых вариантах реализации данного изобретения используется Н2 в качестве донора электронов, Н2 можно подавать в культуральную емкость либо путем барботирования его в культуральной среде, либо путем его диффузии через проницаемую для водорода и непроницаемую для воды мембрану, известную в данной области техники, которая взаимодействует с жидкой культуральной средой. [241] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы растут и размножаются в присутствии Н2 и СО2 и других растворенных питательных веществах в микроаэробных условиях. В некоторых вариантах реализации изобретения химические вещества С1, такие как, но не ограничиваясь этим, угарный газ, метан, метанол, формиат или муравьиная кислота и/или смеси, содержащие химические соединения С1, включая, но не ограничиваясь этим, различные композиции синтез-газа, полученные из различных газифицированных, пиролизированных или прошедших паровой реформинг источников фиксированного углерода биохимически конвертируются в длинноцепочечные органические вещества (например, С2 или более и, в некоторых вариантах реализации изобретения, С 5 или молекулы с более длинными углеродными цепями) при одном или более из следующих условий: аэробные, микроаэробные, бескислородные, анаэробные и/или факультативные условия.
[242] Контролируемое количество кислорода также может поддерживаться в культуральной жидкости в некоторых вариантах реализации данного изобретения, и в некоторых вариантах реализации изобретения кислород будет активно растворяться в растворе, подаваемом в культуральную жидкость и/или непосредственно растворятся в культуральной жидкости. В некоторых аэробных или микроаэробных вариантах реализации данного изобретения, которые требуют
закачки воздуха или кислорода в культуральную жидкость для поддержания целевых уровней DO, пузырьки кислорода могут быть введены в культуральную жидкость, имея при этом оптимальный диаметр для смешивания и переноса кислорода. В Environmental Journal May/June 1999 pgs. 307-315. сообщается, что это значение составляло 2 мм . В некоторых аэробных вариантах реализации данного изобретения для достижения такого диаметра пузырьков может быть использован способ дробления пузырьков кислорода, как описано в патенте США № 7,332,077. В некоторых вариантах реализации изобретения избегаются пузырьки, средним диаметром более 7,5 мм и/или закупорка.
[243] В некоторых вариантах реализации изобретения предмет изобретения конвертирует газообразное горючее, включая, но не ограничиваясь этим, синтез-газ, генераторный газ, пиролизный газ, биогаз, остаточный газ, дымовые газы, СО, СОг, Н2 и их смеси. В некоторых вариантах реализации изобретения теплотворная способность газообразного горючего составляет по меньшей мере 100 БТЕ на стандартный кубический фут (скф). В некоторых вариантах реализации данного изобретения биореактор используется для содержания и выращивания микроорганизмов, который оснащен мелкопузырчатыми диффузорами и/или импеллеры с большими сдвиговыми усилиями для подачи газа. [244] В некоторых вариантах реализации изобретения кислород используется в качестве акцептора электронов при дыхании микроорганизма, используемого для биосинтеза аминокислот, или белков, или других питательных веществ, или цельноклеточных продуктов. В некоторых вариантах реализации изобретения сильные акцепторы электронов, включая, но не ограничиваясь этим, 02, используются для максимизации эффективности и выхода продуктов, полученных с помощью анаболических путей, таких как аминокислоты, жирные кислоты или витамины. Ключевая проблема с использованием О2 в качестве акцептора электронов заключается в том, чтобы поддерживать соответствующие уровни О2, чтобы аэробные микробы могли хорошо расти и эффективно производить анаболические продукты, а также поддерживать соответствующие и безопасные уровни легковоспламеняющихся смесей Н2 и О2, а также других смесей газообразное топливо/Ог в биореакторе для минимизации риска взрыва. В некоторых вариантах реализации обычные или специализированные конструкции реактора используются для контроля О2 в культуральной жидкости на уровне, оптимальном для микроорганизмов, при этом избегая опасных газовых смесей. В некоторых вариантах реализации изобретения используются конструкции биореактора, которые избегают
опасных смесей Н2 и О2, обеспечивая при этом микроорганизмы необходимыми уровнями этих газов для клеточной энергии, фиксации углерода и для получения аминокислоты или белка, или других питательных веществ или цельных клеток. [245] Введение и/или повышение скорости входящего потока газа в биореактор может усилить перемешивание культуры и вызвать турбулентность, если входное отверстие для газа расположено под поверхностью жидкой среды, так что газ поднимается в виде пузырьков или барботирует вверх через среду. В некоторых вариантах реализации изобретения перемешивание усиливается за счет турбулентности, создаваемой пузырьками газа и/или барботированием и/или газом, проходящим через жидкую среду. В некоторых вариантах реализации изобретения биореактор содержит выпускные отверстия для выхода газа и сброса давления. В некоторых вариантах реализации изобретения впускные и выпускные отверстия предпочтительно оснащены контрольной запорной арматурой для предотвращения обратного потока газа.
[246] В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых в биореакторе происходят реакции хемосинтеза, один или более типов доноров электронов и один или более типов акцептора электронов закачиваются или иным образом добавляются либо в виде болюсного добавления, либо периодически, или непрерывно в питательную среду, содержащую хемоавтотрофные организмы, в реакционную емкость. Реакция хемосинтеза, обусловленная переносом электронов от донора электронов к акцептору электронов при клеточном дыхании, фиксирует неорганический углекислый газ и/или другие растворенные карбонаты и/или другие оксиды углерода в органические соединения и биомассу.
[247] В некоторых вариантах реализации изобретения используется питательная среда для роста культуры и производства, содержащая водный раствор, содержащий подходящие минералы, соли, витамины, кофакторы, буферы и другие компоненты, необходимые для роста микроорганизмов, известные специалистам в данной области техники [Bailey and Ollis, Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd ed; pp 383-384 and 620-622; McGraw-Hill: New York (1986)].
[248] В некоторых вариантах реализации изобретения химические вещества, используемые для поддержания и роста культур микроорганизмов, как известно в данной области техники, включены в состав питательной среды согласно данному изобретению. В некоторых вариантах реализации изобретения эти химические вещества могут включать, но не ограничиваются этим, одно или более из следующего: источники азота, такие как аммиак, аммоний (например, хлорид
аммония (NH4C1), сульфат аммония ((NH4)2S04)), нитрат (например, калий нитрат (KNO3)), мочевину или органический источник азота; фосфат натрия (Na2HP04), фосфат калия (КН2Р04), фосфорная кислота (Н3Р04), дитиофосфат калия (K3PS202), ортофосфат калия (К3Р04), дикалийфосфат (К2НР04)); сульфат; дрожжевой экстракт; хелатированное железо; калий (например, фосфат калия (КН2Р04), нитрат калия (KN03), иодид калия (КГ), бромид калия (КВг)); и другие неорганические соли, минералы и микроэлементы (например, хлорид натрия (NaCl), сульфат магния (MgS04 7Н20) или хлорид магния (MgCl2), хлорид кальция (СаС12) или карбонат кальция (СаС03), сульфат марганца (MnS04 7Н20) или хлорид марганца (МпС12), или хлорид железа (FeCl3), сульфат железа (FeS04 7Н20) или хлорид железа (FeCl2 4Н20), бикарбонат натрия (NaHC03) или карбонат натрия (Na2C03), сульфат цинка (ZnS04) или хлорид цинка (ZnCl2), молибдат аммония (NH4Mo04) или молибдат натрия (Na2Mo04 2Н20), сульфат меди (CuS04) или хлорид меди (СиС12 2Н20), хлорид кобальта (СоС12 6Н20), хлорид алюминия (А1С13 6Н20), хлорид лития (LiCl), борная кислота (Н3В03), хлорид никеля (МС12 6Н20), хлорид олова (SnCl2 Н20), хлорид бария (ВаС12 2Н20), селенат меди (CuSe04 5Н20) или селенит натрия (Na2Se03), метаванадат натрия (NaV03), соли хрома). В некоторых вариантах реализации изобретения можно использовать среду с минеральными солями (MSM), приготовленную согласно Schlegel et al. ["Thermophilic bacteria", Jakob Kristjansson, Chapter 5, Section III, CRC Press, (1992)].
[249] Аспекты изобретения относятся к росту и/или экспрессии бактериальных клеток. Бактериальные клетки, связанные с изобретением, могут быть культивированы в некоторых вариантах реализации изобретения в средах любого типа (обогащенных или минимальных), включая ферментационную среду и любую композицию. Как понятно специалисту в данной области техники, обычная оптимизация позволит использовать различные типы среды. Выбранная среда может быть дополнена различными дополнительными компонентами. Некоторые неограничивающие примеры дополнительных компонентов включают глюкозу, антибиотики, IPTG для индукции гена и микроэлементную добавку АТСС. Аналогичным образом, другие аспекты среды и условия роста клеток согласно изобретению могут быть оптимизированы с помощью обычных экспериментов. Например, рН и температура являются неограничивающими примерами факторов, которые могут быть оптимизированы. В некоторых вариантах реализации изобретения такие факторы, как выбор среды, добавок к среде и температура, могут влиять на уровни производства желаемой молекулы. В некоторых вариантах
реализации изобретения концентрация и количество дополнительного компонента могут быть оптимизированы. В некоторых вариантах реализации изобретения оптимизируется частота дополнения среды одним или более дополнительными компонентами и время, в течение которого среда культивируется до отбора желаемой молекулы.
[250] В некоторых вариантах реализации изобретения зола, полученная при сжигании или газификации биомассы, содержит минеральные питательные вещества, которые могут быть использованы в данном изобретении. В некоторых вариантах реализации изобретения сжигаемая или газифицируемая биомасса, которая приводит к образованию золы, содержащей минералы, включает, но не ограничивается этим, одно или более из следующего: навоз, фекальные массы и/или мочу. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения моча используется в качестве источника питательных веществ, включая, но не ограничиваясь этим, источник азота. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения моча разбавляется водой. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения моча и/или продукты сжигания и/или газификации используются в качестве питательных веществ для биологического организма согласно данному изобретению. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения первичные продукты сжигания и/или газификации, включающие, но не ограничивающиеся этим, С02, водяной пар, Н2, СО и/или неорганические минеральные питательные вещества в золе, могут быть легко использованы биологическими организмами согласно данному изобретение. [251] Конечными продуктами аэробного разложения органического вещества обычно являются углекислый газ, вода, нитраты, фосфаты, сульфаты и аналогичные соединения с высокой степенью окисления. В некоторых вариантах реализации данного изобретения СО2 и/или вода и/или неорганические минеральные питательные вещества, полученные в результате биохимической очистки сточных вод, используются в качестве источников исходного сырья и/или питательных веществ и/или акцепторов электронов в данном изобретении. В некоторых вариантах реализации данного изобретения СН4 и/или СО2 и/или вода и/или аммиак и/или сероводород и/или другие неорганические минеральные питательные вещества, полученные в результате анаэробного расщепления при очистке сточных вод, используются в качестве исходного сырья и/или источника питательных веществ в данном изобретение. В некоторых вариантах реализации изобретения
гумус используется в качестве источника углерода и/или акцептора электронов или донора.
[252] Аквакультурное загрязнение, которое может включать азотное, в формах, включая, но не ограничиваясь этим, аммиак, а также фосфорное и мертвую рыбу, становится широко распространенным явлением, особенно в Азии, где расположены 90 процентов выращиваемой рыбы. В некоторых вариантах реализации данного изобретения аквакультурное загрязнение используется в качестве источника питательных веществ, включая, но не ограничиваясь этим, азот и/или фосфор для микроорганизмов согласно данному изобретению. В некоторых вариантах реализации изобретения отходы, которые обычно поступают на канализацию или очистные сооружения или полигон, вместо этого используются для производства питательных веществ при проведении микробиологического процесса согласно данному изобретению. В некоторых вариантах реализации изобретения эти потоки отходов включают, но не ограничиваются этим, одно или более из следующего: аммиак, мочевина, моча, фекалии, рыбные отходы и/или другие животные отходы. В некоторых вариантах реализации изобретения микробиологический аспект данного изобретения позволяет увеличить количество воды и/или питательных веществ, которые могут быть рециркулированы через систему аквакультуры, и/или уменьшить выбросы системы аквакультуры. В некоторых вариантах реализации изобретения доноры электронов и/или источники углерода, включают, но не ограничиваются этим, одно или более из следующего: FL-, СО, СН4, СО2; и/или другие питательные вещества и/или вода образуются из рыбных отходов и/или других отходов животных, включая, но не ограничиваясь этим, фекалии и/или рыбные отходы, такие как рыбьи головы, и/или остатки других животных и/или клеточная масса микроорганизмов и/или органическое вещество, не поддающееся очистке сточных вод с помощью известных способов, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: газификация, пиролиз, сжигание и/или анаэробное расщепление. В некоторых вариантах реализации изобретения Н2О и/или СО2 и/или другие конденсируемые и неконденсируемые газы и/или зольный остаток и/или тепло, которые образуются при газификации и/или пиролизе и/или сжигании, используются в данном изобретении в качестве исходных материалов или сырья, такого как, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: СО2 в качестве источника углерода; Н2О в качестве источника технологической воды; конденсируемые и/или неконденсируемые газы в качестве исходного сырья и источников питательных веществ; зола в качестве неорганического источника
минеральных питательных веществ и/или источника основания для контроля рН; тепло в качестве источника технологического тепла и/или энергии. Патогенные микроорганизмы могут выжить в процессе анаэробной обработки отходов. В некоторых вариантах реализации изобретения все патогенные микроорганизмы, присутствующие в необработанных отходах, которые являются сырьем, поступающих в этот процесс, уничтожаются с помощью вышеупомянутой стадии газификации и/или пиролиза и/или сжигания или стадий, ведущих к одной или более стадиям улавливания С1 и биоконверсии.
[253] В некоторых вариантах реализации изобретения питательные вещества, продуцируемые посредством биопроцесса микроорганизмов согласно данному изобретению, используются в рециркуляции систем сельского хозяйства, аквакультуры, аквапоники или гидропоники. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения организмы, продуцируемые в указанных системах рециркуляции аквакультуры или аквапоники, включают, но не ограничиваются этим, одно или более из следующего: тилапия, лосось, кобия, форель, тилапия, сом, карп, креветки, моллюски. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения резервуары для рыбы в указанной системе рециркуляции аквакультуры расположены на суше либо плавают в толще воды. В некоторых вариантах реализации данного изобретения микробиологический биопроцесс используется в качестве источника питательных веществ для плавучей рыбоводческой фермы. В некоторых таких вариантах реализации изобретения плавучая рыбоводческая ферма расположена на модифицированном нефтяном танкере или другом крупном морском судне. В некоторых вариантах реализации изобретения, данное изобретение используется в качестве источника питательных веществ для плавучих или заякоренных клеток для рыбы. В некоторых таких вариантах реализации изобретения клетки используются для выращивания лосося. [254] Некоторые варианты реализации данного изобретения, использующие исходные материалы из отходов и/или питательные вещества, приводят к замыканию пищевой цепи.
[255] В некоторых вариантах реализации данного изобретения нет необходимости в пахотных землях и/или пресной воде и/или пестицидах и/или гербицидах и/или антибиотиках. В некоторых вариантах реализации изобретения потребность в удобрении (например, неорганических минералах или органических питательных веществах для роста микроорганизмов) частично или полностью удовлетворяется с использованием источников отходов, включая, но не ограничиваясь этим, одно или
более из следующего: зола, биомасса, канализационные воды, сточные воды. В некоторых вариантах реализации данного изобретения морская вода используется в качестве источника технологической воды и/или неорганического углерода и/или других минеральных питательных веществ и/или удобрений.
[256] В некоторых вариантах реализации изобретения концентрации химических питательных веществ (например, доноров электронов и акцепторов и источников углерода и различных минеральных питательных веществ) поддерживаются внутри биореактора близко к оптимальным или при оптимальных уровнях для оптимального поглощения углерода и/или фиксации, и/или конверсии и/или получения органических соединений, которые варьируют в зависимости от используемого микроорганизма, но известны или определяемы без избыточных экспериментов специалистом в данной области культивирования микроорганизмов. [257] В некоторых вариантах реализации данного изобретения один или более из следующих параметров отслеживаются и/или контролируются в биореакторе: уровни отходов; рН; температура; соленость; растворенный кислород; растворенный углекислый газ; скорости потока жидкости; скорость перемешивания; давление газа. В некоторых вариантах реализации изобретения рабочие параметры, влияющие на хемоавтотрофный рост, отслеживаются датчиками (например, датчиком растворенного кислорода или окислительно-восстановительным датчиком для измерения концентраций донора/акцептора электронов) и/или контролируются вручную или автоматически на основе обратной связи от датчиков с помощью использования оборудования, включая, но не ограничиваясь этим, приводную запорную арматуру, насосы и мешалки. В некоторых вариантах реализации изобретения температура входящей культуральной среды, а также поступающих газов регулируется средствами, таким как, но не ограничиваясь этим, охладители, нагреватели и/или теплообменники.
[258] В некоторых вариантах реализации данного изобретения культура микроорганизмов и биологическая реакция поддерживаются с использованием непрерывного притока и удаления питательной среды и/или биомассы в постоянном состоянии, где популяция клеток и параметры окружающей среды (например, плотность клеток, рН, DO, химические концентрации) поддерживаются на постоянном уровне с течением времени. В некоторых вариантах реализации изобретения постоянный уровень является оптимальным уровнем для конверсии исходного сырья и/или получения целевых органических соединений. В некоторых вариантах реализации изобретения плотности клеток можно контролировать путем
прямого отбора проб, посредством корреляции оптической плотности с плотностью клеток и/или с помощью анализатора размера частиц. В некоторых вариантах реализации изобретения время гидравлического удержания среды и время удержания биомассы могут быть разделены таким образом, чтобы обеспечить независимый контроль как химических параметров культуральной среды, так и плотности клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения степени разбавления могут поддерживаться достаточно высокими, чтобы время гидравлического удержания было относительно низким по сравнению с временем удержания биомассы, в результате чего получается культуральная жидкость с высокой степенью восаолнения для роста клеток и/или конверсии исходного сырья и/или получения органических соединений. В определенных вариантах реализации изобретения степень разбавления устанавливаются при оптимальном технико-экономическом компромиссе между культуральной жидкостью и восполнением питательных веществ и/или удалением отходов, и увеличенными затратами на технологические процессы перекачивания, увеличенной подачей сырья и другими требованиями, которые увеличиваются с увеличением степеней разбавления. [259] В некоторых вариантах реализации данного изобретения контролируется рН культуры микроорганизмов. В некоторых вариантах реализации изобретения рН контролируется в оптимальном диапазоне для поддержания и/или роста микроорганизмов и/или роста и/или конверсии исходного сырья и/или получения органических соединений и/или выживания. Для предотвращения снижения рН в определенных вариантах реализации изобретения этап нейтрализации может быть осуществлен непосредственно в среде биореактора или перед рециркуляцией среды обратно в емкость для культивирования через контур рециркуляции. Нейтрализацию кислоты в культуральной жидкости в некоторых вариантах реализации изобретения можно осуществлять путем добавления оснований, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: известняк, известь, гидроксид натрия, аммиак, гидроксид аммония, каустический калий, оксид магния, оксид железа, щелочная зола. В некоторых вариантах реализации изобретения используемое основание получено из источника, не выделяющего диоксида углерода, такого как встречающиеся в природе щелочные минералы, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: оксид кальция, оксид магния, оксид железа, железная руда, оливин, содержащий оксид металла, серпентин, содержащий оксид металла, ультрамафические отложения, содержащие оксиды металлов, и жидкости из подземных щелочных соленых водоносных
горизонтов. Если известняк используется для нейтрализации, то, как правило, выделяется углекислый газ. В некоторых вариантах реализации изобретения этот СО2 может быть собран или направлен обратно в биореактор для поглощения в процессе хемосинтеза и/или использован и/или секвестрирован каким-либо другим способом, а не высвобожден в атмосферу.
[260] В некоторых вариантах реализации изобретения зола, образующаяся при сжигании, инсинерации или газификации биомассы, используется для контроля рН. В некоторых вариантах реализации изобретения сжигаемая или газифицируемая биомасса, которая приводит к образованию щелочной золы, включает, но не ограничивается этим, одно или более из следующего: навоз, фекальные массы и/или мочу.
[261] В некоторых вариантах реализации данного изобретения водная суспензия хемоавтотрофных микроорганизмов конвертирует один или более доноров электронов и СО2 в протоплазму. В некоторых вариантах реализации изобретения водная суспензия окисляющих водород микроорганизмов может быть использована для конверсии водорода и углекислого газа в бактериальную протоплазму. В некоторых вариантах реализации изобретения водная суспензия окисляющих монооксиды микроорганизмов может быть использована для конверсии угарного газа и водорода и/или воды в протоплазму. В некоторых вариантах реализации изобретения водная суспензия окисляющих метан микроорганизмов может быть использована для конверсии метана в протоплазму. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизм в суспензии представляет собой бактерию или архею. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения водная суспензия или биопленка окисляющих Н2 хемоавтотрофных микроорганизмов конвертирует Н2 и СО2 вместе с некоторыми другими растворенными минеральными питательными веществами в биохимические вещества и протоплазму. В некоторых вариантах реализации изобретения другие растворенные минеральные питательные вещества включают, но не ограничиваются этим, источник азота, источник фосфора и источник калия. В некоторых вариантах реализации изобретения полученная протоплазма имеет пищевую ценность для людей и/или других животных и/или других гетеротрофов. В некоторых вариантах реализации изобретения некоторые биохимические вещества, которые имеют питательную ценность и/или ценность в различных применениях органической химии или топлива, могут быть экстрагированы из протоплазмы и/или внеклеточной культуральной жидкости. В некоторых вариантах реализации изобретения
внутриклеточная энергия для стимулирования этого производства протоплазмы происходит в результате окисления донора электрона с помощью акцептора электронов. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения донор электронов включает, но не ограничивается этим, одно или более из следующего: Н2; СО; СН4. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения акцептор электронов включает, но не ограничивается этим, О2. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения продукт реакции с выделением энергии или дыхания включает, но не ограничивается этим, воду. В некоторых вариантах реализации изобретения внутриклеточная энергия, полученная в результате дыхания, используется для стимулирования этого синтеза биохимических веществ и протоплазмы из СО2, сохраняется и переносится в биохимических молекулах, включая, но не ограничиваясь этим, АТФ. Для водородных микроорганизмов, используемых в некоторых вариантах реализации данного изобретения, акцептором электронов является О2, а продуктом дыхания является вода.
[262] В некоторых вариантах реализации изобретения продуцирование белка и распределение молекул аминокислот оптимизировано с помощью одного или более из следующих способов: контроль условий биореактора, контроль уровней питательных веществ, генетическое модифицирование клеток. В некоторых вариантах реализации данного изобретения пути получения аминокислот или белков или других питательных веществ или цельноклеточных продуктов контролируются и оптимизируются для производства химических продуктов путем поддержания конкретных условий роста (например, уровней азота, кислорода, фосфора, серы, микроэлементов, таких как неорганические ионы, и, если присутствуют, любых регуляторных молекул, которые обычно не могут считаться источником питательных веществ или источником энергии). В некоторых вариантах реализации данного изобретения уровень растворенного кислорода (DO) можно оптимизировать, поддерживая культуральную жидкость в аэробных, микроаэробных, бескислородных, анаэробных или факультативных условиях в зависимости от требований организмов. Факультативная среда считается такой, которая имеет верхние аэробные слои и анаэробные нижние слои, что вызвано расслоением водного столба. Биосинтез аминокислот или белков или других питательных веществ или цельноклеточных продуктов микроорганизмами, описанными в данному изобретении, может происходить во время фазы логарифмического роста или после нее во время стационарной фазы, когда удвоение
клеток прекращается, при условии наличия достаточного количества углерода и энергии, и других источников питательных веществ. [263] Конкретные примеры биореакторов, условий культивирования, гетеротрофного и хемотрофного роста, поддержания, и способов получения аминокислот или белков или других питательных веществ или цельноклеточных продуктов, описанных в данном документе, могут быть скомбинированы любым подходящим способом для повышения эффективности роста микроорганизмов и производств аминокислот или белка, или другого питательного вещества, или цельноклеточного продукта.
[264] В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения биосинтетическое восстановление СОг использует акцептор электронов О2 и/или донор электронов Н2, которые получают в результате электролиза воды. В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения часть О2, получаемого в результате электролиза воды, и весь Н2 подают в водную суспензию микроорганизмов согласно данному изобретению. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения молярное соотношение Н2, подаваемого в водную суспензию микроорганизмов к количеству вещества О2, составляет более чем 2:1. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения, в которых акцептор электронов О2 и донор электронов Н2 получают в результате электролиза воды, остается избыток О2 после того, как выполнены все метаболические требования микроорганизмов к Н2 и О2 согласно данному изобретению. В некоторых таких вариантах реализации изобретения избыток О2 подается человеку и/или другим аэробным формам жизни и/или сохраняется и продается в виде химического побочного продукта.
[265] В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения СО2 удаляется из промышленного дымового газа или перехватывается из геологического источника, который иначе естественным образом выделяется в атмосферу, или он удаляется из атмосферы замкнутого помещения. В некоторых вариантах реализации изобретения неорганические питательные соли подаются в начале процесса и/или одновременно с газами. В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы растут и размножаются в присутствии Н2 и СО2 и неорганических солях (питательных веществах). В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы окисляют Н2 в качестве источника энергии для синтеза протоплазмы. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения клетки собираются с определенной фиксированной частотой: поддерживая
стационарную популяцию и скорость поглощения газа. Определенные неограничивающие варианты реализации данного изобретения используются в применениях для поддержания жизнеспособности в замкнутом цикле. В некоторых неограничивающих вариантах реализации данное изобретение может быть использовано для вытеснения или замены реакции Сабатье, которая превращает Н2 и СО2 в метан. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения вместо получения метана из Н2 и СО2 через реакцию Сабатье, производятся питательные вещества, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: белок, жиры и полисахариды с использованием Н2 и СО2. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретение выполняет полезные функции, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: восстановление СО2; синтез биомассы, требующей минимальной модификации для употребления в пищу; и утилизация мочевины и других питательных веществ мочи. В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения используются СО2 и/или СО и/или минеральные питательные вещества в золе, полученной в результате газификации, реформинга или сжигания жидких и/или твердых биологических и/или других отходов на основе углерода. Входящие материалы и исходящие продукты неограничивающего примера процесса, представленного для иллюстративных целей, показаны на Фигуре 29. Неограничивающая схематическая блок-схема процесса, приведенного для иллюстративных целей, показана на Фигуре 30.
[266] В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения выполняются одна или более следующих функций: восстановление СО2; синтез клеточного материала, который может быть использован в качестве источника пищи или питательных веществ; уменьшение отрицательных последствий азотных отходов и утилизация мочевины, аммиака, аммония и/или нитрата.
[267] В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения используется закрытая емкость для культивирования, и в емкость подаются водород, кислород и СО2 под давлением. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения поток газов в камеру управляется газовыми датчиками для поддержания фиксированных концентраций Н2, О2 и СО2 в камере. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения газы и культуральная среда перемешиваются для максимизации диффузии газа в жидкость с помощью механического перемешивания в емкости. В некоторых
неограничивающих вариантах реализации изобретения газы водород и кислород подаются с помощью электролизера воды, а СО2 захватывается из источника отходов или источника, обычно выбрасываемого в атмосферу или воздух помещения. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения технологический поток направляется в узел сбора биомассы. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения для отделения твердых веществ от жидкости используется центробежное действие. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения жидкость рециркулируется или отправляется на очистку, например на установку для очистки воды. В некоторых вариантах реализации изобретения вода, полученная в результате дыхания микроорганизмов и/или гетеротрофов, которые питаются питательными веществами, продуцируемыми микроорганизмами, может быть рециркулирована в электролизную ячейку и/или обратно в биореактор. В некоторых вариантах реализации изобретения вод, как побочный продукт, может использоваться для частичного удовлетворения потребности в воде для электролитического производства Н2. В некоторых вариантах реализации изобретения вода, как побочный продукт, является сопутствующим продуктом, который может быть очищен и продан или использован для роста растений или других организмов или иным образом предоставлен другим потребителям воды. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения нежелательные вещества, которые могли бы образоваться в системе, удалялись в блоке очистки воды. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения очищенная вода повторно используется в ячейке для электролиза воды. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения питательный состав подают в культуральную емкость для поддержания целевой композиции культуральной среды. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения моча используется в качестве питательного вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения полученная биомасса обрабатывается для использования в качестве пищевых продуктов или других биопродуктов.
[268] В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения непрерывная культура или полунепрерывная культура, или полунепрерывная культура с подпиткой одного или нескольких микроорганизмов согласно данному изобретению представляет собой промежуточную стадию трехэтапного замкнутого цикла жизнеобеспечения, направленного на преобразование человеческих метаболических отходов: мочевины и углекислого
газа, в кислород для дыхания и источник пищи и/или пищевую добавку. В этих вариантах реализации данного изобретения в дополнение к этапу хемоавтотрофной фиксации СО2 двумя другими этапами полного цикла являются: (1) сбор и извлечение СОг, удаляемого из атмосферы помещения, и (2) электролиз воды для обеспечения помещения кислородом для дыхания и побочного продукта водорода, который подается в газовую фазу закрытой культуральной емкости. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения бактерии используют отходы мочевины в качестве частичного или единственного источника азота во время роста вместе с отходами СО2 в качестве источника углерода. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения собранный избыток клеток из стационарной культуры представляет собой потенциальную пищу для людей, животных или других гетеротрофов и/или удобрение для растений. [269] Не ограничиваясь теорией, считается, что относительно высокий FCR рыб и других организмов аквакультуры обусловлен такими факторами, как хладнокровность и жизнь в жидкой среде и, следовательно, меньшими затратами на борьбу с гравитацией. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения организмы, которые питаются белками и/или другим питательным веществом, продуцируемым согласно данному изобретению, представляют собой виды, предназначенные для производства пищевых продуктов, которые являются хладнокровными. В некоторых вариантах реализации изобретения организмы, питающиеся белком и/или другими питательными веществами, продуцируемыми согласно данному изобретению, представляют собой гетеротрофные организмы, которые не являются теплокровными, такие как, но не ограничиваясь этим, микроорганизмы, грибы, культуры клеток животных и/или холоднокровные животные. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения клетки и/или организмы живут в жидкой среде. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения организмы представляют собой сидячие организмы.
[270] В некоторых вариантах реализации изобретения белок и/или другие питательные вещества, полученные в соответствии с данным изобретением, используются в способах и технологиях для выращивания рыбы, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: садки; прудовая культура; культура в клетках; системы рециркуляции; интегрированная мультитрофическая аквакультура; комплексное сельское хозяйство и аквакультура; аквапоника.
[271] Данное изобретение относится к биореакторам, которые содержат клетку, которая содержит по меньшей мере одну эндогенную или экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует фермент пути синтеза аминокислоты или белка или другого питательного вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения система содержит два или более, три или более, или четыре или более биореакторов, по меньшей мере один из которых содержит клетку, которая содержит по меньшей мере одну эндогенную или экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует фермент пути синтеза аминокислоты, или белка, или другого питательного вещества. В некоторых вариантах реализации изобретения система биореакторов содержит, по меньшей мере, первый и второй биореакторы, причем первый биореактор содержит клетку, которая содержит по меньшей мере одну эндогенную или экзогенную нуклеотидную последовательность, которая кодирует фермент пути синтеза аминокислоты или белка или другого питательного вещества; причем второй биореактор содержит микроорганизм, полученный из другого вида, причем микроорганизм из другого вида содержит по меньшей мере одну эндогенную или экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения система биореакторов содержит первый биореактор, который содержит клетку согласно данному изобретению, и второй биореактор, содержащий клетку зоопланктона и/или водорослевого микроорганизма, дрожжей, бактерий, гриба, животного и/или растения. В некоторых вариантах реализации изобретения система содержит первый биореактор, который содержит клетку согласно данному изобретению, и второй резервуар или емкость, содержащий многоклеточное животное и/или аквакультуру.
[272] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы согласно данному изобретению используются для питания водных фильтраторов. В некоторых вариантах реализации изобретения водные фильтраторы собирают клетки и/или биосинтетические продукты согласно данному изобретению из жидкой суспензии. В некоторых вариантах реализации изобретения затраты, связанные с разделением твердых частиц и/или обезвоживанием и/или высушиванием биомассы, исключаются путем сбора клеток и/или биосинтетических продуктов согласно данному изобретению посредством активности обитающих в воде фильтраторов. Венусы представляют собой моллюски, которые фильтруют воду через свою раковину с помощью двух коротких сифонов, поглощая планктон, бактерии и кислород. Устрицы потребляют азотсодержащие соединения (нитраты и аммиак),
фосфаты, планктон, детрит, бактерии и растворенное органическое вещество, удаляя их из воды. В определенном варианте реализации данного изобретения используются фильтраторы, такие как, но не ограничиваясь ими, венусы и/или устрицы. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения используется Восточная устрица Crassostrea virginica. В некоторых вариантах реализации данного изобретения, в которых используются организмы-фильтраторы, тиляпия и/или белый толстолобик и/или пестрый толстолоб включены в состав фильтраторов. См., например, Taub, Ballard, К, Palmer, F. (1973) Production Of Shellfish By Continuous Algal Culture. Proc. Nat. Shellfish Assoc. 63; 10-11 (Abstr.) и Taub, F. B. et al. 1973. Algal culture as aquaculture feed. Research in fisheries, которые включены в полном объеме в данный документ посредством ссылки. [273] В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения микроорганизмы согласно данному изобретению поддерживаются в симбиотической связи и/или трофической связи с другими живыми организмами. В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения микроорганизмы согласно данному изобретению подаются в виде корма организмам-фильтраторам, таким как, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: пищевые моллюски; устрицы; двустворчатые моллюски; и/или другие моллюски; креветки; зоопланктон; и/или рыбы-фильтраторы. В некоторых вариантах реализации изобретения организмы, питающиеся белком и другими питательными веществами, продуцируемыми в соответствии с данным изобретением, можно выращивать в контейнерах природного или искусственного происхождения, включая, но не ограничиваясь этим, биореакторы; колонны биологических скрубберов; реакторы с увеличенной площадью контакта фаз; реакторы идеального вытеснения; чаны; резервуары и, в частности, системы резервуаров, таких как известные в области техники аквакультуры, аквапоники и гидропоники; реакторы для ферментативного разложения; башни; пруды; бассейны; резервуары; скважины; лагуны; цистерны; пещеры; каверны; шахтные стволы; и карьеры. Стенки контейнера, границы или обшивка структуры, содержащей организмы, могут состоять из одного или более материалов, включая, но не ограничиваясь этим, стали, другие металлы и их сплавы, пластмассы, стекловолокно, керамику, стекло, бетон, цемент, смолу, битум, герметик, древесину, почву, песок, глину, камень и любую их комбинацию. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения организмы, такие как, но не ограничиваясь этим,
организмы-фильтраторы, также могут выращиваться в более открытых структурах, таких как садки.
[274] В некоторых вариантах реализации данного изобретения дополнительный углекислый газ может быть секвестрирован на технологических стадиях, происходящих последовательно или параллельно стадиям процесса хемосинтеза, где диоксид углерода и/или другие растворенные карбонаты реагируют с минералами, включая, но не ограничиваясь этим, оксиды или гидроксиды или растворенные катионы металлов с образованием карбонатного или бикарбонатного продукта. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный углекислый газ и/или другие растворенные карбонаты могут быть секвестрированы посредством каталитического действия организмов, которые конвертируют углекислый газ и/или растворенный бикарбонат и/или растворенный карбонат и/или растворенные катионы металлов в твердые карбонаты или биоминералы на биологической стадии/стадиях.
[275] В некоторых вариантах реализации изобретения один или более организмов, которые естественным образом превращают углекислый газ и/или растворенный бикарбонат и/или растворенный карбонат и/или растворенные катионы металлов в твердые карбонаты или биоминералы, питаются микроорганизмами и/или питательными веществами, полученными из микроорганизмов согласно данному изобретению. В некоторых указанных вариантах реализации изобретения организмы продуцируют карбонатсодержащие материалы, включая, но не ограничиваясь этим, материал раковины или рифа. В некоторых вариантах реализации изобретения организмы, производящие карбонатсодержащие материалы, являются фильтраторами. Из всего количества произведенных моллюсков от 75 до 90% часто содержат раковины. Эти раковины состоят из 95% карбоната кальция, а остальная часть представляет собой органическое вещество и другие соединения. [276] В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения питательные вещества, полученные при микробиологическом процессе согласно данному изобретению, используются для выращивания моллюсков, которые содержат 75-90% по массе материала раковины, который имеет содержание карбоната кальция около 95%. В некоторых вариантах реализации изобретения организмы, продуцирующие материалы, содержащие карбонат, включают, но не ограничиваются этим, одно или более из следующего: пищевые моллюски; устрицы; двустворчатые моллюски, другие моллюски и кораллы. В некоторых указанных вариантах реализации изобретения съедобный продукт представляет собой,
например, но не ограничиваясь этим, мясо, а также твердый несъедобный материал, содержащий карбонат, включая, но не ограничиваясь этим, каровины. В некоторых вариантах реализации изобретения организмы, продуцирующие мясо и раковины, включают, но не ограничиваются этим, пищевые моллюски, устрицы, двустворчатые моллюски и другие моллюски.
[277] В некоторых вариантах реализации изобретения количество углерода, который секвестрируется в твердом карбонатном биоматериале, превышает количество углерода, который содержится в съедобных частях организма. В некоторых вариантах реализации изобретения углерод, который секвестрирован в раковину, в некоторой степени уменьшает количество углерода, который теряется в виде СО2 в трофической конверсии биомассы микроорганизмов, полученной в соответствии с данным изобретением, в съедобную биомассу моллюсков путем предоставления биомассы микроорганизмов в качестве корма для аквакультуры. В некоторых вариантах реализации изобретения количество углерода, который секвестрируется в карбонатных материалах, включая, но не ограничиваясь этим, раковины или кораллы, превышает количество углерода, который теряется в упомянутой трофической конверсии, так что происходит увеличение итогового количества углерода, захваченного при трофической конверсии клеточной массы микроорганизмов в, включая, но не ограничиваясь этим, моллюски или кораллы. [278] В некоторых вариантах реализации изобретения углерод, который секвестрируется в карбонатном биоматериале согласно данному изобретению, секвестрируется из атмосферы в течение гораздо более длительного периода времени, чем углерод, который фиксируется в биомассе микроорганизмов. В некоторых вариантах реализации изобретения углерод, который секвестрируется в карбонатном биоматериале согласно данному изобретению, секвестрируется из атмосферы в течение гораздо более длительного периода времени, чем углерод, который содержится в мягких тканях организмов, которые питаются микроорганизмами и/или их питательными веществами, продуцируемыми в соответствии с данным изобретением. В некоторых вариантах реализации изобретения углерод, который захватывается в карбонатных биоматериалах, включая, но не ограничиваясь этим, раковины и/или кораллы, секвестрируется более ста лет. См., например, М. R. Hamester, P. S. Balzer, and D. Becker, "Characterization of calcium carbonate obtained from oyster and mussel shells and incorporation in polypropylene," Materials Research, vol. 15, pp. 204-208, 2012. [Интернет]. Доступ: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext &pid=S1516
14392012000200006 &nrm=iso, and G.-L. Yoon, B.-T. Kim, B.-O. Kim, and S.-H. Han, "Chemical-mechanical characteristics of crushed oyster-shell," Waste Management, vol. 23, no. 9, pp. 825-834, Jan. 2003. [Интернет]. Доступ: http://dx.doi.org/10.1016/s0956-053x(02)00159-9, а также презентация Ингрида Лупач (Ingrid Lupatsch) из Центра Исследований Устойчивой Аквакультуры (Centre for Sustainable Aquaculture Researc), Университета Суонси, Великобритания, под названием "Studies On Energy And Protein Requirements Of Juvenile Pacific Oyster Crassostrea Gigas Fed Live Chaetoceros Muelleri", которые включены в полном объеме в данный документ посредством ссылки.
[279] Некоторые варианты реализации данного изобретения относятся к периодической или полунепрерывной системе культивирования зоопланктона и/или системе аквакультуры для роста организмов-фильтраторов. Некоторые неограничивающие варианты реализации данного изобретения могут включать реактор для культивирования; систему скрининга, сконфигурированную для содержания зоопланктона и/или организмов-фильтраторов в реакторе; блок подачи микроорганизмов, в котором один или более микроорганизмов согласно данному изобретению подаются в качестве корма зоопланктону и/или организму -фильтратору; систему регулировки рН и контроля; и систему подачи кислорода. В некоторых вариантах реализации изобретения яйца организмов-фильтраторов собирают. В некоторых вариантах реализации изобретения яйца, которые собирают, представляют собой яйца артемий. В некоторых вариантах реализации изобретения яйца артемий собирают с поверхности воды резервуара, где артемий выращиваются. В некоторых вариантах реализации изобретения собранные яйца затем очищают и/или замораживают и/или подвергают засаливанию и/или высушиванию. [280] Дополнительная особенность некоторых неограничивающих вариантов реализации данного изобретения относится к источнику, производству или повторного использования доноров электронов, используемых хемоавтотрофными микроорганизмами, для фиксации углекислого газа и/или другого сырья С1 в органические соединения. Доноры электронов, используемые для улавливания углекислого газа и фиксации углерода, могут быть получены или повторно использованы в некоторых вариантах реализации данного изобретения электрохимически или термохимически с использованием энергии из ряда различных технологий возобновляемой энергии и/или источников энергии с низким выделением углерода, включая, но не ограничиваясь этим: фотоэлектрическая энергия, солнечная тепловая энергия, энергия ветра, гидроэлектроэнергия, ядерная,
геотермальная, геотермальная с повышенным КПД преобразования, энергия тепла океана, энергия океанских волн и приливов. Многие из восстанавливающих неорганических химических веществ, на которых могут развиваться хемоавтотрофы (например, Н2, СО, H2S, двуокись железа, аммоний, Мп2+), могут быть легко получены с использованием электрохимических и/или термохимических процессов, хорошо известных в технике и науке химической инженерии, энергия для которых может быть получена с помощью возобновляемой энергии и/или источников энергии с низким выделением углерода, включая, но не ограничиваясь этим, фотоэлектрическую энергию, солнечную тепловую энергию, энергию ветра, гидроэлектроэнергию, ядерную, геотермальную, геотермальную с повышенным КПД преобразования, энергию тепла океана, энергию океанских волн и приливов. [281] В некоторых вариантах реализации данного изобретения, которые используют молекулярный водород в качестве донора электронов, Н2 производится способами, хорошо известными в области техники и науки химической технологии и технологического проектирования, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: посредством электролиза воды, включая, но не ограничиваясь этим, подходы с использованием протон-обменных мембран (ПЭМ), жидких электролитов, таких как КОН, щелочного электролиза, электролиза с использованием электролита на основе твёрдых полимеров, электролиз при высоком давлении, электролиз водяных паров при высокой температуре (HTES); и/или с помощью термохимического расщепления воды способами, включающими, но не ограничивающимися этим, цикл оксида железа, цикл оксид церия (ГУ)-оксид церия (III), цикл цинк-оксид цинка, цикл йод-сера, цикл медь-хлор, цикл кальций-бром-железо, гибридный цикл серы; и/или электролиз сероводорода; и/или с помощью термохимического расщепления сероводорода; и/или других электрохимических или термохимических процессов, которые, как известно, приводят к получению водорода с низкими или отсутствующими выбросами углекислого газа, включая, но не ограничиваясь этим: реформинг паров метана с возможностью улавливания и секвестрования углерода (CCS); газификация угля с возможностью CSS; Кварнер-процесс и другие процессы, обеспечивающие получение чистого углерода в качестве продукта; газификация или пиролиз биомассы с возможностью CSS. В некоторых вариантах реализации данного изобретения подход получения Н2 включает, но не ограничивается этим, электролиз, проводимый с помощью возобновляемой электрической энергии и/или электричества из источника с низкими выбросами ПГ. В некоторых вариантах реализации данного изобретения электролиз обеспечивается
одним или более из следующего: солнечная энергия, включая, но не ограничиваясь этим, фотоэлектрическая энергия и/или солнечная тепловая энергия; энергия ветра; гидроэлектроэнергия; ядерная; геотермальная; геотермальная с повышенным КПД преобразования; энергия тепла океана; энергия океанских волн и приливов. [282] В некоторых вариантах реализации данного изобретения микробиологический биопроцесс интегрируется с и обеспечивает питательные вещества сельскохозяйственному или аквакультурному процессу. В некоторых вариантах реализации изобретения требования к электричеству и/или теплу упомянутого сельскохозяйственного или аквакультурного процесса удовлетворяются с использованием возобновляемой энергии и/или энергии из источника с низким выделением ПГ.
[283] В некоторых вариантах реализации данного изобретения возобновляемая энергия, получаемая в часы непикового спроса в электрической сети, используется для производства сырья Н2 для процесса. В некоторых вариантах реализации данного изобретения хранение на месте газов Н2 и С02 позволяет отделять производство электроэнергии от электросети только в периоды, когда возобновляемая генерация превышает потребность в электроэнергии. В определенных вариантах реализации изобретения производимая электроэнергия может, как обычно, поступать в электросеть в периоды более высокого спроса. В некоторых вариантах реализации данного изобретения процесс не нарушает подачу электроэнергии из возобновляемых источников, а скорее обеспечивает возможность более полного использования производства электроэнергии из возобновляемых источников, таких как, но не ограничиваясь этим, ветровая и солнечная энергия. Некоторые варианты реализации данного изобретения позволяют продолжать использовать и производить электроэнергию из возобновляемых источников даже в периоды, когда генерация электроэнергии превышает потребность в электросети (например, внепиковая ветровая или солнечная генерация). [284] В определенном варианте реализации данного изобретения доноры электронов водорода не обязательно производятся с низкими или отсутствующими выбросами углекислого газа, однако водород образуется из отходов, экологически безопасных или малоценных источников энергии и/или углерода с использованием способов, известных в области химической технологии и технологического проектирования. Такие способы включают, но не ограничиваются этим, газификацию, пиролиз, реформинг с водяным паром или автотермический реформинг сырья, например, но не ограничиваясь этим, одного или более из
следующего: твердых бытовых отходов, черного щелока, сельскохозяйственных отходов, древесных отходов, труднодоступного природного газа, биогаза, сернистого газа, гидратов метана, жидкого нефтяного газа, нефтяного кокса, шин, сточных вод, навоза, соломы, морских водорослей и бурых водорослей, и малоценной лигноцеллюлозной биомассы в целом.
[285] В некоторых вариантах реализации данного изобретения синтез-газ или генераторный газ, содержащий Н2 и/или СО и/или СО2, используют в качестве донора электронов и/или в качестве источника углерода. В некоторых вариантах реализации изобретения Н2 и/или СО и/или СО2, содержащиеся в синтез-газе или генераторном газе, дополняются Н2, полученным с использованием возобновляемого источника энергии и/или источника энергии с низкими выбросами ПГ и процесса конверсии, такого как один или более из описанных в данном документе. [286] В некоторых вариантах реализации изобретения газификация, пиролиз, сжигание и/или анаэробные расщепление, используемые для получения доноров электронов и/или источников углерода, которые используются в биопроцессе согласно данному изобретению, также обеспечивают получение полезных побочных продуктов, включая, но не ограничиваясь этим, электричество и/или технологическое тепло, которые используются в микробиологическом биопроцессе и/или связанной с ним сельскохозяйственной или аквакультурной системой и/или направляются в электросеть или электростанцию или иным образом предоставляются окружающим потребителям.
[287] В некоторых вариантах реализации изобретения технологическое тепло, вырабатываемое в качестве побочного продукта получения водорода и/или СО с помощью таких способов, как газификация, пиролиз или паровой реформинг, аккумулируется и используется в другом этапе процесса конверсии для повышения общей эффективности использования энергии. Химический и/или тепловой и/или электрический сопутствующий продукт может сопровождать получение молекулярного водорода и/или СО, который может быть использован, насколько это возможно, в другом этапе процесса конверсии согласно некоторым вариантам реализации данного изобретения, например, чтобы повысить эффективность. [288] В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный химический побочный продукт (например, помимо того, что может быть использован в процессе конверсии согласно некоторым вариантам реализации данного изобретения), может быть подготовлен для продажи с целью получения дополнительного потока дохода. Продукт в виде избыточного тепла или
электроэнергии при производстве молекулярного водорода и/или СО (например, за помимо того, что можно использовать в процессе) может поставляться для продажи, например, для использования в другом химическом и/или биологическом процессе с помощью способов, известных в области техники и науке теплообмена и теплопередачи, а также для генерации и передачи электроэнергии, включая, но не ограничиваясь этим, преобразование технологического тепла в электроэнергию в форме, которая может быть продана в электрическую сеть. [289] В некоторых вариантах реализации данного изобретения, в которых используется Н2 в качестве донора электронов, может быть получен химический сопутствующий продукт, образующийся при получении Н2, с использованием возобновляемой энергии и/или энергии, для которой не характерны выбросы СО2. Если, например, вода используется в качестве источника водорода, то кислород может быть побочным продуктом расщепления воды в процессах, включая, но не ограничиваясь этим, электролиз или термохимическое разделение воды. В некоторых вариантах реализации данного изобретения, в которых используется вода в качестве источника водорода и водородные микроорганизмы микроорганизмов, часть побочного продукта, который представляет собой кислород, может быть использована для получения АТФ и/или других внутриклеточных носителей энергии посредством дыхания с реакцией окисления водорода кислородом. В некоторых вариантах реализации изобретения количество кислорода, полученного с помощью расщепления воды, превышает количество, которое требуется в процессе дыхания для поддержания оптимальных условий для фиксации углерода и получения органических соединений водородными микроорганизмами и/или другими аэробными организмами в системе, может быть переработано в форму, пригодную для продажи, посредством этапов процесса, известных в области технике и науки о коммерческом производстве газообразного кислорода.
[290] Доноры электронов в некоторых вариантах реализации данного изобретения также могут быть получены из или очищены от загрязнителей или отходов, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: технологический газ; остаточный газ; отработанный газ при добыче нефти усовершенствованными способами; труднодоступный природный газ; биогаз; свалочный газ; и газы, содержащие сероводород. В некоторых вариантах реализации данного изобретения остаточный газ, содержащий Н2 и/или СН4 и/или СО, используется в качестве источника донора электронов и/или углерода. В некоторых вариантах реализации
изобретения остаточные газы с нефтеперерабатывающего завода используются в качестве источника доноров электронов и/или углерода. [291] В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения органические соединения, содержащие только один атом углерода, образуются путем газификации и/или пиролиза биомассы и/или другого органического вещества (например, биомассы и/или другого органического вещества из отходов или малоценных источников); и/или посредством метанового парового реформинга метана или природного газа (например, труднодоступного природного газа или природного газа, который в противном случае был бы сожжен на факеле или выброшен в атмосферу), или биогаза, или свалочного газа, и предоставлялся в виде синтез-газа и/или другого газа или потоков соединений С1 в культуру микроорганизмов; причем в некоторых вариантах реализации изобретения отношение водорода к угарному газу в синтез-газе или генераторном газе можно регулировать с помощью таких средств, как реакция конверсии водяного газа, и/или где соотношение водорода к СО2 может регулироваться с помощью таких средств, как захват углерода, до подачи газов в культуру микроорганизмов. [292] В некоторых вариантах реализации изобретения биомасса, полученная согласно данному изобретению, превращается в корм для животных или включается в состав корма для животных или используется в качестве источника питания человека.
[293] Значительная доля высших растений является несъедобной для многих разных животных, включая, но не ограничиваясь этим, людей и других нежвачных. Это может привести к многочисленным недостаткам, включая переход энергии и углерода в нежелательные побочные продукты или отходы. Это может снизить выход желаемых продуктов и добавить дополнительное трудности в переработке и удалении отходов.
[294] В некоторых вариантах реализации данного изобретения больший поток углерода и/или энергии направляется в целевые продукты биомассы, чем для сопоставимых с точки зрения поглощения СО2 и/или производства биомассы высшие культурные растения. В некоторых вариантах реализации изобретения соотношение несъедобных и съедобных частей биомассы, полученной в данном изобретении, ниже, чем для культуры высших растений. [295] В некоторых вариантах реализации изобретения культура высшего растения, выращенная при искусственном освещении, потребует, по меньшей мере, в тридцать раз больше электроэнергии на единицу веса произведенной съедобной
биомассы в сравнении с данным изобретением. Цикл роста культур высших растений относительно длинный, так что производство продуктов является периодическим, и потребление обычно не соответствует производству. Это несоответствие между производством и потреблением обычно требует относительно масштабного консервирования и хранения для предотвращения потерь. [296] В некоторых вариантах реализации данного изобретения производство биомассы микроорганизмами согласно данному изобретению и потребление продуктов биомассы животными или другими гетеротрофами гораздо более точно совпадают, чем у сопоставимой системы, основанной на культурах высших растений. В некоторых вариантах реализации данного изобретения потребность в консервировании и/или хранении биомассы ниже, чем у сопоставимой системы, основанной на культурах высших растений. В некоторых вариантах реализации данного изобретения присутствует меньшее количество пищевых отходов, чем у сопоставимых культур высших растений.
[297] В некоторых вариантах реализации изобретения микроорганизмы согласно данному изобретению производят по меньшей мере 1 мг продукта на основе углерода, представляющего интерес, на литр суспензии жидкой культуры. В некоторых примерах продукт секретируется организмом в культуральную среду. В других примерах продукт сохраняется в организме в процессе ферментации. В некоторых случаях продукт может быть извлечен путем лизирования клеток и отделения продукта. В других случаях продукт может иметь коммерческую ценность в интактном организме без значительной подготовки или очистки продукта из организма.
[298] В некоторых вариантах реализации изобретения извлечение биосинтетических химических продуктов и/или отработанных питательных веществ из водного культур ал ьного раствора может быть осуществлено с использованием оборудования и технологий, известных в области разработки процессов, и предназначенных для химических продуктов конкретных вариантов реализации данного изобретения, включая, но не ограничиваясь этим: экстрагирование растворителем; экстрагирование водой; дистилляцию; фракционную дистилляцию; осаждение; химическое осаждение; абсорбцию с помощью щелочного раствора; абсорбцию или адсорбцию на активированном угле, ионообменной смоле или молекулярном сите; модификацию рН раствора и/или окислительно-восстановительного потенциала, испарители, фракционные кристаллизаторы,
сепараторы твердых и жидких веществ, нанофильтрацию и все комбинации вышеуказанного.
[299] В некоторых вариантах реализации данного изобретения осуществляется отделение клеточной массы от жидкой суспензии. В некоторых вариантах реализации изобретения это разделение осуществляют способами, известными в области культивирования микроорганизмов. Примеры способов сбора клеточной массы приведены, например, в заявке РСТ № WO08/00558, опубликованной 8 января 1998 года; патенте США №. 5,807,722; патенте США № 5,593,886 и патенте США № 5,821,111, включенных в данный документ в полном объеме посредством ссылки, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: центрифугирование; флокуляцию; флотацию; фильтрацию с использованием мембранной, половолоконной, спирально намотанной или керамической фильтрующей системы; вакуумную фильтрацию; тангенциальную поточную фильтрацию; осветление; осаждение; гидроциклон. В некоторых вариантах реализации изобретения, в которых клеточную массу можно иммобилизовать на матриксе, ее можно собирать способами, включая, но не ограничиваясь этим, гравитационное осаждение или фильтрацию, и отделять от питательного субстрата соскребанием или силами сдвига жидкости.
[300] В некоторых вариантах реализации изобретения жидкость, оставшаяся после удаления клеточной массы, может быть закачана в систему для удаления и/или извлечения растворенных химических продуктов биопроцесса и/или непрореагировавших питательных веществ. В некоторых вариантах реализации изобретения непрореагировавшие питательные вещества и/или вода извлекаются и повторно используются по мере возможности и/или в определенных вариантах реализации изобретения, продаются в качестве побочного продукта и/или надлежащим образом утилизируются. В некоторых вариантах реализации изобретения удаление отходов и/или загрязнителей и/или любых ингибирующих и/или вредных соединений с использованием способов и технологий, известных в данной области техники, проводят до возвращения воды и/или непрореагировавших питательных веществ в биореактор/биореакторы.
[301] В некоторых вариантах реализации данного изобретения, включающих применение хемоавтотрофных микроорганизмов, раствор окисленных катионов металлов может оставаться после этапа или этапов хемосинтетической реакции. В других неограничивающих вариантах реализации изобретения раствор, богатый растворенными катионами металлов, также может образовываться из частиц и
примесей, внесенных при подаче газа из определенных источников, например, из угольной электростанции или газификации угля или твердых бытовых отходов (ТБО).
[302] В некоторых вариантах реализации данного изобретения, в которых катионы металлов присутствуют в технологическом потоке, которые предпочтительно должны быть удалены, технологический поток можно очистить от катионов металлов способами, включая, но не ограничиваясь этим: осаждение на железном ломе, стальной шерсти, меди или цинковой пыли; химическое осаждение в виде осадка сульфида или гидроксида; электровыделение на плите конкретного металла; абсорбцию на активированном угле или ионообменной смоле, модификацию рН раствора и/или окислительно-восстановительного потенциала, обратный осмос и/или экстракцию растворителем. В некоторых вариантах реализации данного изобретения извлеченные металлы могут быть переработаны и/или проданы с целью получения дополнительного потока дохода. [303] В некоторых вариантах реализации изобретения свободные и/или растворенные органические молекулы могут быть высвобождены из микроорганизмов в раствор технологического потока с помощью средств, включая, но не ограничиваясь этим, клеточную экскрецию или секрецию или лизис клеток. [304] В некоторых вариантах реализации изобретения извлечение и/или повторное использование химических продуктов и/или непрореагировавших питательных веществ из водного культурального раствора может быть осуществлена в некоторых вариантах реализации данного изобретения с использованием оборудования и технологий, известных в области разработки процессов, и предназначенных для химических продуктов конкретных вариантов реализации данного изобретения, включая, но не ограничиваясь этим: экстрагирование растворителем; экстрагирование водой; дистилляцию; фракционную дистилляцию; осаждение; химическое осаждение; абсорбцию с помощью щелочного раствора; абсорбцию или адсорбцию на активированном угле, ионообменной смоле или молекулярном сите; модификацию рН раствора и/или окислительно-восстановительного потенциала, испарители, фракционные кристаллизаторы, сепараторы твердых и жидких веществ, нанофильтрацию, обратный осмос и все комбинации вышеуказанного.
[305] В некоторых вариантах реализации изобретения химические продукты и/или непрореагировавшие питательные вещества поступают в среду, которая поддерживает рост других организмов. В некоторых вариантах реализации
изобретения отработанная вода и непрореагировавшие питательные вещества используются для орошения и удобрения высших растений. Тилапия и другие водные животные, способны поглощать минералы из культуральной воды. В некоторых вариантах реализации изобретения непрореагировавшие минеральные питательные вещества поступают в среду выращивания Тилапии и/или других водных животных. В некоторых вариантах реализации данного изобретения неорганические питательные вещества поступают из хемоавтотрофного биореактора согласно данному изобретению в систему аквакультуры, содержащую животных, включая, но не ограничиваясь этим, тилапию и стимулируют производство живых пищевых организмов и растений в системе культивирования, включая, но не ограничиваясь этим, фитопланктон. В некоторых вариантах реализации изобретения неорганические и/или органические питательные вещества из отходов биореактора используются в качестве удобрения, которое увеличивает первичную продукцию пруда и/или других огороженных участков, используемых в аквакультуре и/или аквапонике и/или гидропонике.
[306] В некоторых вариантах реализации изобретения вырабатываемая хемоавтотрофно биомасса согласно данному изобретению, полученная из источников углерода, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: СО2, СО, СН4, СН3ОН; или иным образом применяется к системе сельского хозяйства и/или аквакультуры и/или аквапоники и/или гидропоники, где она дополняет и/или заменяет органические удобрения, непосредственно стимулируя высшие трофические уровни, обеспечивая органические вещества и детрит. В некоторых вариантах реализации изобретения указанное органическое вещество представляет собой непосредственный источник пищи для видов, включая, но не ограничиваясь этим, виды, которые могут питаться детритом и побочными продуктами растений, включая, но не ограничиваясь этим, Тилапию. [307] В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения сухой вес органического вещества, получаемого хемоавтотрофным путем, используется ежедневно в расчете на 2-4% биомассы рыбы. В некоторых из этих вариантов реализации изобретения контролируется DO и/или рН и/или прозрачность воды в огороженных участках аквакультуры. В некоторых из этих вариантов реализации изобретения входящее органическое вещество суспендируется, если DO падает ниже 4,0 мг/л и/или рН превышает 9,0 и/или прозрачность воды падает ниже 25 см.
[308] В некоторых вариантах реализации изобретения органическое вещество и/или неорганические питательные вещества, вытекающие из биореактора согласно данному изобретению используются для питания поликультуры. В некоторых вариантах реализации изобретения поликультура включает тилапию и/или карпа и/или креветку. См. например, Nile tilapia - Fertilizers and fertilization, Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), http://www.fao.org/fishery/affris/species-profiles/nile-tilapia/fertilizers-and-fertilization/еп/, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
[309] В некоторых вариантах реализации данного изобретения питательные вещества, продуцируемые в микробиологическом процессе согласно данному изобретению, используются для удобрения прудов, в которых реализуется поликультура. В некоторых вариантах реализации изобретения питательные вещества, полученные при микробиологическом процессе согласно донному изобретению, используются для удобрения культурных растений, включая, но не ограничиваясь этим, рис. В некоторых вариантах реализации изобретения питательные вещества, продуцируемые в микробиологическом процессе согласно данному изобретению, подаются в интегрированную мультитрофическую систему аквакультуры, которая включает, но не ограничивается этим, одно или более из следующего: рыбу, абалон, моллюски, водоросли, бурые водоросли и/или других беспозвоночных, включая, но не ограничиваясь этим, морские огурцы. [310] Высокая скорость роста, достигаемая некоторыми хемоавтотрофными видами, может позволить им соответствовать или превосходить самые высокие показатели фиксации углерода и/или производства биомассы на единицу биомассы, которые могут быть достигнуты фотосинтезирующими микроорганизмами. В некоторых вариантах реализации изобретения может быть получена избыточная биомасса. В некоторых вариантах реализации изобретения избыточный прирост клеточной массы может быть удален из системы для получения побочного продукта биомассы. В некоторых вариантах реализации изобретения избыточный прирост клеточной массы может быть удален из системы для поддержания желательной (например, оптимальной) популяции микроорганизмов и плотности клеток в культуре микроорганизмов для сохранения высоких скоростей улавливания и фиксации углерода и/или коэффициентов конверсии исходного сырья. [311] В некоторых вариантах реализации изобретения химические вещества, которые используются в процессах для извлечения химических продуктов и/или
повторного использования питательных веществ и воды и/или удаления отходов, имеют низкую токсичность для человека и в случае, когда они попадают в технологический поток, который возвращается обратно в биореактор, проявляют низкую или отсутствующую токсичность для конкретных микроорганизмов, используемых в этом конкретном варианте реализации изобретения. [312] В некоторых вариантах реализации данного изобретения, если избыток клеток был удален из культуры во время процесса сбора/отделения/извлечения продукта, удаленные избыточные клетки могут быть возвращены обратно в клеточную культуру в биореакторе вместе со свежими питательными средами в некоторых случаях, так что достаточное и/или оптимальное количество и плотность клеток сохраняются на этапе или этапах реакции биореакторов. В некоторых вариантах реализации изобретения это может способствовать достижению целевого и/или оптимального преобразования исходного сырья и/или производству органических соединений. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки, удаленные системой сбора/отделения/из влечения продукта, могут быть возвращены обратно в емкость для культивирования, например, с использованием воздушного или гейзерного насоса. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки, возвращенные обратно в культуральную емкость, не подвергаются воздействию флокулирующий агентов, если только эти агенты не являются не токсичными для микроорганизмов.
[313] Чтобы облегчить переработку продукта биомассы в полезные продукты, собранные клетки микроорганизма в некоторых вариантах реализации изобретения могут быть разрушены с использованием хорошо известных способов, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: измельчение в шаровой мельнице, кавитационное давление, ультразвуковую обработку, гомогенизацию или механическое измельчение.
[314] Собранная биомасса в некоторых вариантах реализации изобретения может быть высушена на стадии или стадиях процесса. Высушивание биомассы может быть выполнено в определенных вариантах реализации данного изобретения с использованием хорошо известных технологий, включая, но не ограничиваясь этим, один или более из следующих способов: центрифугирование, сушка в барабанной сушилке, выпаривание, сушка вымораживанием, нагревание, распылительная сушка, вакуумная сушка и/или вакуумная фильтрация. В некоторых вариантах реализации данного изобретения отходящее тепло может использоваться для высушивания биомассы. В определенных вариантах реализации изобретения отходящее тепло от
промышленного источника дымового газа, используемого в качестве источника углерода, можно использовать для высушивания биомассы. В некоторых вариантах реализации изобретения тепловой побочный продукт при образовании доноров электронов и/или источника углерода С1, как обсуждалось выше, можно использовать для высушивания биомассы.
[315] В некоторых вариантах реализации изобретения биомасса дополнительно обрабатывается после сушки или, обрабатывается без предшествующей стадии сушки для облегчения отделения и производства полезных биохимических веществ. В некоторых вариантах реализации изобретения эта дополнительная обработка включает отделение белкового или липидного содержимого или витаминов или других целевых биохимических веществ от микробной биомассы. В некоторых вариантах реализации изобретения отделение липидов может быть выполнено с использованием неполярных растворителей для извлечения липидов, таких как, но не ограничиваясь этим, одно или более из: гексана, циклогексана, этилового эфира, спирта (изопропанола, этанола и т. д.), трибутил фосфата, диоксида углерода в сверхкритическом состоянии, оксида триоктилфосфина, вторичных и третичных аминов или пропана. В некоторых вариантах реализации изобретения другие полезные биохимические вещества могут быть экстрагированы с использованием растворителей, включая, но не ограничиваясь этим, один или более из: хлороформа, ацетона, этилацетата и тетрахлорэтилена.
[316] В некоторых вариантах реализации изобретения данное изобретение относится к способу получения аминокислот и/или белков путем объединения в биореакторе или растворе одного или более путей биосинтеза, включая, но не ограничиваясь этим, путь биосинтеза аминокислот, газ, содержащий углерод, и модифицированный или встречающийся в природе микроорганизм, который конвертирует углеродсодержащий газ, такой как синтез-газ, генераторный газ, СОг, угарный газ и смеси вышеуказанного и газообразного водорода; и/или соединения С1, газообразные или жидкие, включая, но не ограничиваясь этим, метанол или метан, в аминокислоты и/или белки. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислоты и/или белки включены в состав корма для животных с использованием процессов, известных в области техники и науки о химии, химической технологии и науке о продуктах питания.
[317] В некоторых вариантах реализации данного изобретения белковая биомасса, полученная согласно изобретению, используется в качестве альтернативного источника белка. В некоторых вариантах реализации изобретения он используется в
качестве заменителя рыбной муки или казеина, или сыворотки, или соевой муки. В некоторых вариантах реализации данного изобретения белки, полученные в соответствии с изобретением, используются в кормовых или удобряющих приготовлениях вместо рыбной муки или казеина, или сыворотки, или соевой муки, или других растительных белков. В некоторых неограничивающих вариантах реализации данного изобретения белковые продукты не имеют дефицита каких-либо незаменимых аминокислотах. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения белковые продукты не имеют дефицита лизина и/или метионина. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения белковая биомасса не содержит значительных количеств антипитательных факторов. В некоторых вариантах реализации изобретения белковая биомасса не содержит значительных количеств одного или более из следующих веществ: госсипола, глюкозинолатов, сапонинов, ингибиторов трипсина. В некоторых вариантах реализации изобретения белковая биомасса используется в качестве нетрадиционного источника белка, который подходит для видов, включая, но не ограничиваясь этим, Oreochromis niloticus.
[318] Модификация водородных микроорганизмов описана в заявке на патент США № 2013/0089899, поданной 19 сентября 2012 года, и имеющей название "INDUSTRIAL FATTY ACID ENGINEERING GENERAL SYSTEM FOR MODIFYING FATTY ACIDS". Эта заявка включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.
[319] Использование водородных микроорганизмов для конверсии синтез-газа, генераторного газа или других газообразных смесей Н2 и С02 и/или СО в молекулы с высокой плотностью энергии описано в заявке на патент США № 2013/0149755, поданной 26 октября 2012 г. под названием "USE OF OXYHYDROGEN MICROORGANISMS FOR NON-PHOTOSYNTHETIC CARBON CAPTURE AND CONVERSION OF INORGANIC AND/OR CI CARBON SOURCES INTO USEFUL ORGANIC COMPOUNDS)). Эта заявка включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей.
[320] Использование хемотрофных микроорганизмов для конверсии С02 в полезные органические химические вещества описано в международной заявке PCT/US2010/001402, поданной 05/12/2010, опубликованной в США в виде заявки № 2013/0078690 и имеющей название "BIOLOGICAL AND CHEMICAL PROCESS UTILIZING CHEMOAUTOTROPHIC MICROORGANISMS FOR THE CHEMOSYTHETIC FIXATION OF CARBON DIOXIDE AND/OR OTHER
INORGANIC CARBON SOURCES INTO ORGANIC COMPOUNDS, AND THE GENERATION OF ADDITIONAL USEFUL PRODUCTS)). Эта заявка включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей. [321] Аспекты изобретения относятся к модифицированным организмам для использования в производстве молекул для промышленного применения. Используемый в контексте данного документа термин "модифицированные организмы" и "модифицированный микроорганизм" и "не встречающийся в природе микроорганизм" используются взаимозаменяемо и относятся к организмам, которые рекомбинантно экспрессируют нуклеиновые кислоты, содержащие по меньшей мере один экзогенный ген. В некоторых вариантах реализации изобретения такие нуклеиновые кислоты кодируют ферменты, как указанно в данном документе. Гомологи и аллели генов, связанных с изобретением, могут быть идентифицированы с помощью обычных способов. Также объектом изобретения являются нуклеиновые кислоты, называемые "праймерами" или "наборами праймеров", которые гибридизуются в жестких условиях с описанными в данном документе генами. Используемый в контексте данного документа термин "строгие условия" относится к параметрам, которые известны в данной области техники. Параметры гибридизации нуклеиновой кислоты можно найти в ссылках, в которых описаны такие способы, например Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012, или Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York.
[322] Дополнительная особенность некоторых вариантов реализации данного изобретения относится к модификации микроорганизмов согласно данному изобретению с помощью искусственных средств, включая, но не ограничиваясь этим, ускоренный мутагенез (например, использование ультрафиолетового света или химических обработок), генную инженерию или генетическую модификацию, гибридизацию, синтетическую биологию или традиционное селективное разведение. Возможные модификации микроорганизмов включают, но не ограничиваются этим, способы, направленные на увеличение количества и/или качества аминокислот и/или витаминов и/или белка.
Преобразования после процесса
Производство кормов для животных или аквакультуры
[323] В некоторых вариантах реализации изобретения белок и/или белковая биомасса, полученные в соответствии с данным изобретением, затем превращаются в корм для животных с использованием способов и процессрв, хорошо известных в области техники и науки о химии, химической инженерии и науки о продуктах питания. В некоторых вариантах реализации изобретения корм, полученный согласно изобретению, используется для выращивания организмов, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: другие микроорганизмы, дрожжи, грибы, зоопланктон, моллюски или другие беспозвоночные; рыба; птицы; млекопитающие. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения рыба включает, но не ограничивается этим, одно или более из: тилапию; лосось; кобию. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения птицы включают, но не ограничиваются этим, цыплят или индюков. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения млекопитающие включают, но не ограничиваются этим, одно или более из: кроликов, коз, овец, свиней, коров. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения корма, полученные в соответствии с данным изобретением, используются для выращивания живого корма, которой, в свою очередь, используется для поддержания личинок рыб в первые недели жизни. В некоторых вариантах реализации изобретения этот живой корм включает зоопланктон. В некоторых вариантах реализации изобретения корма, полученные в соответствии с данным изобретением, используют для выращивания организмов зоопланктона, включая, но не ограничиваясь этим, одно или более из следующего: коловратки [Phylum Rotifera]; отряд Cladoceran (например, Daphnia sp., Moina sp.); подкласс Copepoda (например, Cyclops); морская креветка (Anemia sp.).
[324] В некоторых вариантах реализации данного изобретения более 90% азота из белка, производимого бактерией, поглощается организмом, который потребляет аминокислоты или пептиды, или белки, или белковую биомассу. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки микроорганизма согласно данному изобретению проходят кипячение перед подачей в качестве корма другому организму. В других вариантах реализации изобретения клетки подвергают обработке ультразвуком или иным образом лизируются или разрываются перед подачей в качестве корма другому организму.
[325] Одной из основных проблем в использовании биосистем для производства продуктов питания является обеспечение правильного баланса между количеством белка, углеводов и жира. Системы микрорганизмов, обычно рассматриваемые для
синтеза пищевых продуктов, как правило, приводят к тому, что биомасса содержит непропорционально много белка. В некоторых вариантах реализации данного изобретения используется масличный штамм, который производит более высокую долю жиров и масел по сравнению с содержанием белка. В некоторых вариантах реализации изобретения используемый масличный штамм относится к роду Rhodococcus.
[326] В некоторых вариантах реализации изобретения используется штамм, продуцирующий углевод или полисахарид, который производит более высокую долю углеводов или полисахарида по сравнению с содержанием белка. В некоторых вариантах реализации изобретения используемый штамм, продуцирующий углеводы или полисахариды, представляет собой Hydrogenovibrio marinus.
Производство карбонатсодержащих материалов
[327] В некоторых вариантах реализации изобретения белок и/или другие питательные вещества, полученные согласно данному изобретению, используются для выращивания организмов, которые биосинтезируют карбонатсодержащие биоматериалы, включая, но не ограничиваясь этим, раковины и/или кораллы. В раковинах мидий и устриц присутствует высокое содержание карбоната кальция, которые могут быть использованы в медицинских приготовлениях, в строительстве или в качестве наполнителя в полимерных материалах.
[328] В некоторых вариантах реализации изобретения карбонат кальция из раковин мидий и/или устриц и/или других моллюсков и/или кораллов, выращенных в соответствии с данным изобретением, используется в качестве строительного материала. В некоторых вариантах реализации изобретения он используется в качестве заполнителя.
[329] В некоторых вариантах реализации изобретения раковины, полученные в соответствии с данным изобретением, включают, но не ограничиваясь этим, раковины устриц и/или двустворчатых моллюсков и/или гребешков используются в качестве покрытия или искусственных элементов ландшафта. В некоторых вариантах реализации изобретения раковины используются в качестве альтернативы гравийным и/или щебеночным покрытиям. В некоторых вариантах реализации изобретения раковины используются для укладки дорог и/или дорожек и/или патио и/или внутренних дворов и/или площадок для бочче. В некоторых вариантах реализации изобретения раковины, включая, но не ограничиваясь этим, раковины устриц, используются в качестве материала для ландшафтного дизайна и/или в
качестве богатого питательными веществами материала для улучшения почв и/или в качестве отпугивающего средства (детеррента) против вредителей. [330] В некоторых вариантах реализации изобретения раковины устриц и/или другие раковины или известковые материалы, полученные в соответствии с данным изобретением, используются вместе с зольной пылью и/или доменным шлаком в композициях строительных материалов. См., например, G.-L. Yoon, В.-Т. Kim, В.-О. Kim, S.-H. Han, "Chemical-mechanical characteristics of crushed oyster-shell," Waste Management, vol. 23, no. 9, pp. 825-834, Jan. 2003. [Интернет]. Доступ: http://dx.doi.org/10.1016/s0956-053x(02)00159-9,;E.-I. Yang, S.-T. Yi, Y.-M. Leem, "Effect of oyster shell substituted for fine aggregate on concrete characteristics: Part i. fundamental properties," Cement and Concrete Research, vol. 35, no. 11, pp. 2175-2182, Nov. 2005. [Интернет]. Доступ: http://dx.doi.Org/10.1016/j.cemconres.2005.03.016; H. Yoon, S. Park, K. Lee, and J. Park, "Oyster shell as substitute for aggregate in mortar," Waste Management & Research, vol. 22, no. 3, pp. 158-170, Jun. 2004. [Интернет]. Доступ: http://dx.doi.org/10.1177/0734242x04042456, которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
[331] В некоторых вариантах реализации изобретения раковины, полученные согласно данному изобретению, включают, но не ограничиваются этим, раковины устриц, измельчают и используют в качестве ингредиента в дорожном покрытии. В некоторых вариантах реализации изобретения грунтобетон производится с использованием раковин, полученных в соответствии с данным изобретением. В некоторых вариантах реализации изобретения С02, испускаемый в процессе производства негашеной извести, повторно улавливается и повторно используется микроорганизмами согласно данному изобретению. В некоторых вариантах реализации изобретения строительный материал изготовлен из раковин, полученных в соответствии с данным изобретением.
[332] В некоторых вариантах реализации изобретения полученный карбонатный материал, включая, но не ограничиваясь этим, раковины и/или кораллы представляет собой отражающий материал. В некоторых вариантах реализации изобретения такие карбонатные материалы имеют высокое альбедо. В некоторых вариантах реализации изобретения такие карбонатные материалы используются в отражающих поверхностях и геоинженерии для уменьшения или противодействия глобальному потеплению. В некоторых вариантах реализации изобретения карбонатные материалы используются в отражающих малых архитектурных формах. В некоторых вариантах реализации изобретения карбонатные материалы используются
в более светлых или отражающих дорогах и автомагистралях. См., например, RG Watts, Engineering Response to Global Climate Change: Planning a Research and Development Agenda, Taylor & Francis, 1997. [Интернет]. Доступ: https://books.google.com/books?id=nArq-K7ZiacC, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
[333] В некоторых вариантах реализации изобретения известковые материалы, изготовленные в соответствии с данным изобретением, включая, но не ограничиваясь этим, раковины устриц, используются для изготовления гранул для битумной черепицы. В некоторых вариантах реализации изобретения указанная черепица осветляется и/или имеет повышенную отражательную способность и/или имеет повышенное альбедо. В некоторых вариантах реализации изобретения раковины, полученные в соответствии с данным изобретением, включая, но не ограничиваясь этим, раковины устриц, используются в качестве верхнего покрытия в светлом или светоотражающем асфальте. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения срок службы такого асфальта больше, чем у черного асфальта из-за более низкой УФ-деградации и/или проявляет более низкую тенденцию к текучести при более низкой температуре. В некоторых вариантах реализации изобретения раковины или другие карбонатные материалы согласно данному изобретению используются в пустотах цементного раствора верхней части дорожного покрытия, для получения теплоотражающих дорожных покрытий. См., например, Ishiguro and М. Yamanaka, "Heat control of pavement surface temperature using recycled materials,)) на Третьей Международной Конференции по Экологически Безопасным Строительным Материалам и Технологиям, P. Claisse, Е. Ganjian, и Т. Naik, Eds., Университета Ковентри и Центра по Использованию Побочных Продуктов Университета Висконсин-Милуоки, Aug. 2013. [Интернет]. Доступ: http://www.claisse.info/Proceedings.htm и "А Comparison of Six Environmental Impacts of Portland Cement Concrete and Asphalt Cement Concrete Pavements by John W. Gadja and Martha G. VanGeem", которые включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации изобретения известковые материалы, включая, но не ограничиваясь этим, раковины устриц, полученные в соответствии с данным изобретением, используются в качестве заполнителя в проницаемом бетоне. В некоторых вариантах реализации изобретения известковые материалы, полученные в соответствии с данным изобретением, могут быть объединены с другими переработанными отходными цементными материалами, такими как зольная пыль или доменный шлак, в композициях строительных
материалов. См., например, диссертацию на получение диплома магистра К. N. Kelley, "Use of recycled oyster shells as aggregate for pervious concrete,)), Университет Флориды, 2009 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации изобретения раковины, полученные в соответствии с данным изобретением, не содержат обнаруживаемых количеств Hg или РЬ. В некоторых вариантах реализации изобретения для реконструкции рифов используются раковины, кораллы или другие карбонатные материалы, полученные в соответствии с данным изобретением. В некоторых вариантах реализации изобретения раковины или другие карбонатные материалы, полученные в соответствии с данным изобретением, продаются в индустрию кормов для птицеводства.
[334] Это изобретение не ограничено в его применении к деталям конструкции и расположению компонентов, изложенных в описании или проиллюстрированных на графических материалах. Изобретение может быть реализовано в других варианта реализации изобретения и быть реализовано на практике или выполняться различными способами.
[335] Следующие примеры предназначены для иллюстрации, но не ограничения объема изобретения.
ПРИМЕРЫ Пример 1
[336] Штамм Cupriavidus necator DSM 531 был выращен в присутствии смеси газов Н2, СОг и О2 в качестве единственного источника энергии и углерода для роста.
[337] Следующий протокол был использован для экспериментов, проведенных с использованием смеси газов в газонепроницаемых бутылях. [338] Экспериментальный инокулум: 5% об., взятые из другой культуры, выращенной в присутствии Н2 в бутыли.
[339] Начальную культуру выращиваемую в присутствии Н2 в бутыли, инокулировали 5% инокулята Cupriavidus necator, выращенного в лизогенном бульоне (LB) и выращивали ~72 часа на газовой смеси Н2/СО2/О2 после инокуляции из исходной культуры, выращенной в LB. Изначальный инокулят, выращенный в LB, был восстановлен из глицеринового исходного раствора, хранящегося при -80 °С.
[340] Выращивание в бутылях на газе проводили в закрытых и запечатанных стеклянных бутылях Wheaton емкостью 160 мл (номер продукта VWR 16171-385). Объем жидкой среды составлял 20 мл. Бутыли были закрыты резиновой пробкой (VWR # 100483-774) и алюминиевым уплотнителем (VWR # 89047-008) с использованием ручного обжимного устройства Wheaton (VWR # 80078-996). 20 мл рабочий объем содержал 19 мл минимальной солевой среды (MSM), как описано в Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, p. 87, табл. 4 + 1 мл инокулята (т.е. 5% инокулята).
[341] MSM дозировали в бутыли и добавляли газообразные соединения следующим образом: Стерильную MSM переносили в бутыли в стерильных условиях. 5%-ный инокулят, выращенный на газе, инокулировали в бутыли в стерильных условиях, и бутыли были закупорены резиновыми пробками и герметизированы. Газовую смесь добавляли при давлении 15 фунтов/кв.дюйм в бутыли через коллектор. После добавления газовой смеси уплотнение было обжато с помощью алюминия для герметизации бутылей. Затем бутыли помещали в инкубатор со встряхиванием.
[342] Следующие экспериментальные результаты были получены для 16 бутылей (14 экспериментальных повторов, 2 контрольных), инкубированных при 30 °С, 250 об/мин. Все 16 бутылей продували одновременно газообразной смесью 67% Н2, 24% воздуха (4,8% О2), 9% СОг с использованием коллектора, как описано выше. Состав газа, протекающий через коллектор, был подтвержден с использованием газовой хроматографии (ГХ) перед подключением бутылей. Бутыли выводили из эксперимента для анализа в 7 точках времени. Два отрицательных контроля выводили из эксперимента при ТО и в последний момент времени соответственно. Бутыли отрицательного контроля проходили такую же обработку как и экспериментальные бутыли за исключением инокулята и были использованы для детектирования любых загрязнений и/или абиотических потерь или утечки газа из свободного пространства бутыли. Данные измерений давления газа были получены для отрицательных контролей для наблюдения за любой абиотической сорбцией СО2 и Н2 жидкой средой и/или потерями газа из-за утечки.
Отбор проб и аналитические процедуры
[343] Все образцы брали в стерильных условиях с использованием шприцев и игл для экспериментов с бутылями. Оптическую плотность (OD) измеряли с
использованием спектрофотометра Beckman Coulter DU720 UV/Vis при 650 нм с использованием образцов объемом 100 мкл.
[344] В каждый момент времени для анализа были выведены из эксперимента от одного до трех экспериментальных бутылей (повторностей). Потребление газа в бутылях измеряли с помощью манометра, подключенного к игле. Давление газа в свободном пространстве измеряли для каждой выведенной из эксперимента бутыли, и образец газа свободного пространства отбирали с помощью газонепроницаемого шприца для анализа газовой хроматографии (ГХ). Для анализа проб газа свободного пространства с помощью ГХ использовали 100-мкл образец газа свободного пространства, вводимый в ГХ с помощью газонепроницаемого шприца. Содержание Н2, СО2, О2 и N2 газа свободного пространства бутылей определяли количественно в каждый момент времени. Для отбора проб жидкой среды мембрану бутылей протирали с помощью EtOH и все жидкое содержимое бутыли отбирали в 30 мл шприц с помощью присутствующего в бутыли давления. 100 мкл образца пипетировали для измерения OD при 650 нм. Образцы центрифугировали при 12,000 G в течение 15 минут при температуре 4 °С. Гранулы ресуспендировали в 10 мл стерильного PBS, встряхивали и подвергали вакуумной фильтрации через предварительно взвешенные 0,45 мкм фильтры. Фильтры высушивали и взвешивали концентрат биомассы + фильтр, чтобы определить сухую массу биомассы. Сухую массу клеток, собранных на мембранных фильтрах (0,45 мкм) определяли путем сушки при 60 °С в течение 24 часов и охлаждения до комнатной температуры в эксикаторе и взвешивания. Этот цикл сушки и повторного взвешивания продолжали до тех пор, пока вес не оставался постоянным. Была определена корреляция между OD и плотностью биомассы (сухая клеточная масса в расчете на объем). [345] Корреляция между OD и плотностью биомассы показана на Фигуре 2. Кривая роста для этого эксперимента показана на Фигуре 3. OD, измеренное для отдельных повторов эксперимента, представлено символами ромба, а среднее значение OD представлено сплошной линией. Логарифмический рост происходил между 9 и 30 часами. Изменение давления газа в свободном пространстве из-за потребления газов растущей культурой показано на Фигуре 4. [346] Взяв за основу закон идеального газа (PV = nRT) для газов в свободном пространстве, были рассчитаны общие молы газов, с учетом температурных изменений в точках сбора. Доля каждого соответствующего газа в свободном пространстве каждой бутыли определяли с помощью ГХ. Используя результаты измерения газа свободного пространства и измеренные сухие массы, было
определено соотношение клеточной массы к молям потребления Н2. На Фигуре 5 показана измеренная сухая биомасса для каждой бутыли, выведенной из эксперимента, нанесенная на график относительно молей потребленного Н2, как определено с помощью измерения давления в свободном пространстве и анализа ГХ для каждой соответствующей бутыли. Эти результаты показали, что от 6,7 до 7,2 г сухой массы клеток синтезировалось на моль потребляемого Н2 или 3,3-3,6 г клеточной массы на грамм Н2.
Пример 2
[347] Штамм Cupriavidus necator DSM 531 был выращен до плотности сухой клеточной массы 38 г/л в присутствии смеси газов Н2, С02 и 02 в качестве единственного источника энергии и углерода для роста.
[348] Следующий протокол был использован для экспериментов, проведенных с использованием смеси газов, включающей Н2, С02 и 02 в биореакторе с механическим перемешиванием.
[349] Устройство: Культуру выращивали в полунепрерывном режиме с использованием изготовленного на заказ 500 мл стеклянного ферментера с верхней пластиной РЕЕК. Температуру и рН отслеживали и контролировали с помощью коммерческого контроллера (Electrolab, Fermac 360, Великобритания). Для перемешивания использовали сочетание магнитных мешалок и непрерывной рециркуляции при 280 мл/мин. Рециркуляцию можно было проводить либо отбирая жидкость из нижней части в реакторе и возвращая в свободное пространство через распылители для контроля вспенивания или запускать в обратном направлении для рециркуляции газа свободного пространства и пены в нижнюю часть культуральной жидкости. Осуществлялась подача сжатого газа Н2, сжатого С02 и комнатного воздуха, давление каждого из которых регулировалось на уровне 20 фунтов на квадратный дюйм. Н2 и воздух подавались на регулятор подачи (Matheson G2-4D151-E401/E401, 20 фунтов на квадратный дюйм), который устанавливал относительную долю газов. Затем газовую смесь Н2/воздух подавали в каждый ферментер через расходомер с переменным сечением; скорость потока для каждого ферментера той же композиции Н2/воздуха может регулироваться игольчатым клапаном расходомера. Газ С02 разделялся и доставлялся на индивидуальные расходомеры переменного сечения на каждом ферментере. Линии С02 и Н2/воздух объединяли в одну линию подавали в ферментер. Манометр использовался для отслеживания давления подачи газа в ферментер. Газ смешивали с культуральной
жидкостью ферментера с помощью четырех 2-мкм диффузионных устройств (р/п KEG592, http://morebeerxom/products/diffusion-stone-2-micron-oxygen.htm и выпускали из реактора через конденсатор в пеноулавливающую бутыль, затем в выпускную систему.
[350] Среда: Среда, используемая для этого эксперимента, описана в Примере 1. Контроль рН проводили с использованием 2N NH4OH или 2N NaOH. 2N NH4OH получали из 5 М NH4OH, Fluke 318612 (хранимом при 4 °С) (120 мл) + автоклавированная milliQ-HiO (180 мл).
[351] Автотрофный инокулят: Инокулят Cupriavidus necator DSM 531 был взят из культуры, выращенной в бутили в присутствии Н2/СО2/О2. Инокулят был приготовлен из стоковых растворов в глицерине 0,5 мл, хранящихся при -80 °С для штамма DSMZ 531. Восстановленные культуры начинали выращивать на газовой смеси Н2/СО2/О2 в соответствии с протоколом выращивания в бутылях, описанным в Примере 1, с добавлением 0,5 мл глицеринового стокового раствора к 20 мл минимальной солевой среды (MSM) в газонепроницаемой бутыли. Эта исходная бутыль затем использовалась для пересевания, 1 мл к 20 мл свежей MSM, в 2 бутыли при стандартном газе Н2/СО2/О2 в свободном пространстве. Эти бутыли инкубировали при температуре 30 °С, 250 об/мин. Первоначальное восстановление из глицеринового стокового раствора на газе заняло 2 дня, а пересеянной культуре потребовался еще один день, чтобы вырасти. Две культуры в бутылях были использованы в качестве инокулята для биореактора. Была определена оптическая плотность (OD) инокулята, а также был взят образец для анализа ДНК. Инокулят, выращенный на газе имел OD ~1. Ферментер инокулировали с получением исходного OD ~0,1. Другими словами, культуральную жидкость из бутылей разбавляли в биореакторе в соотношении 1:10. Инокулят переносили из бутылей в биореактор с использованием шприца объемом 60 мл. После инокуляции было получено значение OD То. Как правило, все измерения OD проводились с помощью спектрофотометра Beckman Coulter DU720 UV/Vis. [352] Эксплуатация ферментера: Добавление основания - рН контролировали с помощью 2N NH4OH Контроль пены - если пеной было заполнено более чем Уг свободного пространства и пенообразование не контролировалось распылением или рециркуляцией в свободном пространстве, тогда использовался противовспениватель. (А8011, Sigma Antifoam С Emulsion, www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a801 l?lang=en ®ion=US)
Питательная добавка - в дополнение к азотному питательному веществу, обеспеченному за счет добавления основания NH4OH, во время проведения эксперимента добавляли другие минеральные питательные вещества, чтобы продлить рост и предотвратить любые ограничения со стороны минеральных питательных веществ.
[353] На Фигуре 6 изображен пример кривой роста водородного микроорганизма Cupriavidus necator, выращенного в присутствии газового субстрата Н2/СО2/О2 согласно данному протоколу. Финальная OD, измеренная при 650 нм, составляла 132, а конечная плотность сухой биомассы составляла 38 грамм/литр при росте на газовом субстрате Н2/СО2/О2. Логарифмический рост продолжался первые полтора дня; однако биомасса все еще накапливалась с линейной скоростью до прекращения эксперимента на 5-й день.
Пример 3
[354] Микроорганизмы рода Rhodococcus и рода Cupriavidus были протестированы на их способность расти на разных источниках углерода (Фигура 7). Колонии из штаммов, выращенных на пластинах агара LB при 30 °С, переносили в колбы, содержащие 10% (об./об.) указанных сред на срок 3-20 дней при 30 °С и 250 об/мин. R opacus, штамм DSM 44193 проявлял рост только в условиях гетеротрофного роста, что было выявлено при измерении оптической плотностью (OD) при 650 нм на среде MSM (1 л Среды A: 9rNa2HP04.12H20, 1.5гН2Р04, 1.0г NH4CI и 0.2г MgS04.7H20 на 1 л; 10 мл среды В: 50 мг цитрата аммония железа и 100 мг СаСЬ на 100 мл; 10 мл среды С: 5 г№НСОз на 100 мл и 1 мл раствора микроэлементов и минеральных веществ: 100 мг ZnS04.7H20, 30 мгМпСЬ. 4НгО, 300 мгНзВОз, 200 мг СоС12.6Н20, 10 мг СиС12.2Н20, 20 мгМС12.6Н20 и 30мг Na2Mo04.2H20 на 1 л), дополненный 40 г/л глюкозы. R opacus, штамм DSM 43205 продемонстрировал одинаковые темпы роста в гетеротрофных условиях, достигая OD = 9,0. Штамм DSM 43205 также проявил способность расти в хемоавтотрофных условиях (среда MSM , дополненная 66,7% Н2, 9,5% С02, 5% 02 и 18,8% N2). Rhodococcus sp. (DSM 3346) продемонстрировал рост в гетеротрофных условиях и хемоавтотрофных условиях (Среда DSMZ 81:1л минеральной среды для хемолитотрофного роста: 2.9 rNa2HP04.2H20, 2.3 гКН2Р04, 1.0gNH4Cl, 0.5 г MgS04.7H20, 0.5 rNaHC03, O.Olg СаС12.Н20 и 0.05 г цитрата Fe(NH4) на 1 л; и 5 мл раствора микроэлементов и минеральных веществ, дополненная 80% Н2, 10% СО2 и 10% О2). Cupriavidus necator (DSM 531) смог расти в гетеротрофных и хемоавтотропных условиях (среды, описанные для штамма DSM 43205) (Фигура 7).
Cupriavidus necator (DSM 531), трансформированный с помощью pSeqC02, смог расти на средах LB, дополненных канамицином 300, 400 и 500 мкг/мл с OD600, равным 1,47, 1,52 и 1,51 соответственно. Нетрансформированные клетки проявляли рост в контроле (только LB) и некоторый рост при 300 мкг/мл канамицина, в то время как рост не наблюдался при 400 и 500 мкг/мл канамицина.
Пример 4
[355] В одной группе экспериментов колонии штаммов Rhodococcus, выращенных на пластинках агара LB при температуре 30 °С, переносили в газонепроницаемые бутыли, содержащие указанные среды роста и газовые смеси. (Изначальный инокулят, выращенный в LB, был предварительно восстановлен из глицеринового исходного раствора, хранящегося при -80 °С). Выращивание в бутылях на газе проводили в закрытых и запечатанных стеклянных бутылях Wheaton емкостью 160 мл (номер продукта VWR 16171-385). Объем жидкой среды составлял от 10 до 20 мл. Бутыли были закрыты резиновой пробкой (VWR # 100483-774) и алюминиевым уплотнителем (VWR # 89047-008) с использованием ручного обжимного устройства Wheaton (VWR # 80078-996). Стерильную среду для роста переносили в бутыли в стерильных условиях. Инокулят был введен в бутыли в стерильных условиях, и бутыли были закупорены резиновыми пробками и герметизированы. Газовую смесь добавляли в бутыли. После добавления газовой смеси уплотнение было обжато с помощью алюминия для герметизации бутылей. Затем бутыли помещали в инкубатор со встряхиванием. Бутыли инкубировали при температуре 30 °С, 250 об/мин. Все образцы брали в стерильных условиях с использованием шприцев и игл. Рост оценивали путем измерения оптической плотности (OD) на спектрофотометре при 650 нм.
[356] Rhodococcus opacus, штамм DSM 43205 проявлял рост в хемоавтотрофных условиях в следующих средах: среда MSM (1 л среда А: 9 rNa2HP04.12H20, 1.5 г Н2РО4, 1.0 rNHjCl и 0.2 г MgS04.7H20 на 1 л; 10 мл среда В: 50 мг цитрата аммония железа и 100 мг СаС12 на 100 мл; 10 мл среда С: 5 rNaHC03 на 100 мл; и 1 мл раствора микроэлементов и минеральных веществ: 100 мг ZnS04.7H20, 30 мгМпС12. 4Н20, 300 мгНзВОз, 200 мг СоС12.6Н20, 10 мг СиС12.2Н20, 20 мгМС12.6Н20 и 30мг Na2Mo04.2H20 на 1 л), дополненная газовой смесью, содержащей 66,7% Н2, 9,5% С02, 5% 02 и 18,8% N2. Объем жидкости составлял 20 мл, а объем газа свободного пространства составлял 140 мл.
[357] Rhodococcus sp. DSM 3346 проявлял рост в хемоавтотрофных условиях в следующих средах: среда DSMZ 81 (1 л минеральной среды для хемолитотрофного роста: 2.9 rNa2HP04.2H20, 2.3 гКН2Р04, 1.0gNH4Cl, 0.5 rMgS04.7H20, 0.5 г NaHC03, O.Olg СаС12.2Н20 и 0.05 г цитрата Fe(NH4) на 1 л; и 5 мл раствора микроэлементов и минеральных веществ), дополненная газовой смесью, которая содержала 80% Н2, 10% С02 и 10% 02. Объем жидкости составлял 10 мл, а объем газа свободного пространства составлял 150 мл.
[358] Клетки собирали через 72 часа, и профили жирных кислот, содержащихся в нейтральных липидах, таких как триацилглицерин (TAG), производимые каждым штаммом, определяли с помощью газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ/МС). Профили жирных кислот DSM 43205 изображен на Фигуре 8, а профиль жирных кислот DSM 3346 изображен на Фигуре 9. На Фигурах 8 и 9 изображены конкретные типы цепей жирных кислот по оси X в зависимости от процентного содержания каждого соответствующего типа жирной кислоты, которое является частью суммарного количеству жирных кислот, выделенных из нейтральной липидной фракции, которое отложено по оси Y. DSM43205 продуцировал 36%, 6% и 27% 16, 17 и 18-углеродных жирных кислот соответственно в виде доли от общего количества жирных кислот. DSM 3346 продуцировал 66%, 4% и 27% 16, 17и 18-углеродных жирных кислот соответственно в виде доли от общего количества жирных кислот.
Пример 5
[359] Rhodococcus opacus, штамм DSM 43205 культивировали в биореакторе с использованием среды MSM, как описано выше, и газовой смеси Н2/С02/02. Состав газовой смеси составлял 66,7% Н2, 9,5% С02, 5% 02 и 18,8% N2. Клеточную массу отделяли от супернатанта культуры с помощью центрифугирования. Супернатант отбрасывали и для осадка биомассы проводили экстрагирование хлороформом/метанолом (С/М). Гравиметрический анализ сырого экстракта из биомассы показал, что 40% биомассы содержит липиды, которые растворимы в хлороформе/метаноле, и 14% содержит липиды, которые растворимы в гексане. Липиды наносили на колонки Silica-60, и различные липидные группы разделяли и элюировали из колонки с помощью органического растворителя, включая гексан, хлороформ, изопропанол, метанол и ацетон. Было проведено мягкое щелочное метилирование для метилирования липидов, не состоящих из жирных кислот, и кислое метилирование было проведено для метилирования жирных кислот.
Метиловые эфиры жирных кислот (FAME) анализировали с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС).
[360] Для анализа FAME соединения детектировали на Agilent 6890N ГХ/МС (Agilent, Santa Clara, С А) с использованием колонки 60 м FTP1 х 0,25 мм ГО. Образцы помещали в объемные вставки ГХ с конечным объемом в гексане 50 мкл. Образцы вводили с использованием автоматического дозатора, температура дозатора составляла 250 °С и анализ проводили в разделяющем режиме (8:1) с начальной температурой ГХ 100 °С, ростом температуры 10 °С/мин до конечной температуры 150 °С, затем ростом температуры 3 °С/мин до 250 °С, наконец, ростом температуры 10 °С/мин до 312 °С, которую удерживали в течение 7 минут. Идентификация пиков была проведена использованием библиотеки NIST08 и сравнения с известными стандартами (Supelco 37 Component FAME Mix). Количественное определение проводили с помощью внешнего стандарта, добавленному к каждому образцу перед инъекцией (метил ундеканоат), а эффективность экстракции количественно определяли по внутреннему стандарту (1,2-динонадеканоил-зп-глицеро-3-фосфохолин). [524] Анализ ГХ/МС выявил, что штамм DSM 43205 Rhodococcus opacus, культивированный в газовой смеси, продуцирует триацилглицерины, которые содержат большое количество омега-7 жирных кислот, включая пальмитолеиновую кислоту (С 16:1, также известную как 9-гексадеценовая кислота) и вакценовую кислоту (С 18:1, также известную как 11-октадеценовая кислота). Дальнейший анализ содержания липидов показал в виде доли от общего содержания жирных кислот 13% С 16:1 омега-7 жирной кислоты (пальмитолеиновой кислоты) и21%С18:1 омега-7 жирной кислоты (вакценовая кислота).
Пример 6
[361] Штамм Rhodococcus opacus DSM 43205 был выращен в присутствии смеси газов Н2, СОг и О2 в качестве единственных источников энергии и углерода для роста в бутыли объемом 1 л. Инокулят восстанавливали путем смешивания воды + аликвота стокового раствора MSM, хранящегося при -80 °С. Используемая среда представляла собой MSM, как описано выше. Аликвоту из стокового раствора, хранящегося при -80 °С, инокулировали в MSM (20 мл) в маленькой бутыли. Выращивание в бутылях на газе проводили, как описано выше, в закрытой и запечатанной стеклянной бутыли Wheaton объемом 160 мл с газовой смесью,
состоящей из 67% Н2, 24% воздуха (4,8% 02), 9% С02. Бутыль помещали в инкубатор со встряхиванием и инкубировали при температуре 30 °С, 250 об/мин. [362] После примерно 72 часов роста инокулят высокой плотности для пересева был приготовлен из культуры в бутыли путем центрифугирования и ресуспендирования в свежей MSM. Инокулят высокой плотности инокулировали в 100 мл MSM в стеклянной бутыли объемом 1 л с газонепроницаемой крышкой, имеющей две запорные арматуры, которые допускали приток и отток газа. Газовую смесь в следующем соотношении подавали в свободное пространство бутыли объемом 1 л: Н2: 71%; 02: 4.2%; N2: 15.8%; С02: 9.0%.
[363] После добавления газа герметичную однолитровую бутыль помещали в инкубатор со встряхиванием при температуре 28 °С и 200 об/мин. Газы обновлялись один раз в день. Культура росла на газе до тех пор, пока финальная OD при 650 нм не достигла OD = 1,27.
[364] Секвенирование ДНК проводили для извлеченных в конце клеток после роста на газе в бутыли объемом 1 л для подтверждения идентичности штамма конечной культуры. 16S рРНК-последовательности определяли с использованием праймеров 27F и 800R. С обоими праймерами лучшие совпадения BLAST были идентифицированы как Rhodococcus sp., Rhodococcus opacus, Rhodococcus wrastislaviensis, номера GenBank EU127452.1, AB032565.1 и AY940038.1 соответственно.
Пример 7
[365] Многочисленные оксигидрогеновые виды являются общедоступными или могут быть выделены с использованием способов, которые описаны в данном документе. Например, по меньшей мере 238 различных штаммов Rhodococcus и по меньшей мере 55 различных штаммов Cupriavidus доступны в общественной коллекции штаммов DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), а также штаммы из многих других родов, которые включают оксигидрогеновые микроорганизмы, включая Hydrogenovibrio, Rhodopseudomonas, Hydrogenobacter, Xanthobacter и Hydrogenothermus. Оксигидрогеновые штаммы также могут быть получены обычными способами, такими как выделение из образцов почвы или образцов геотермальной жидкости с использованием способов обогащения.
[366] Тестирование штаммов на оксигидроновый рост и способность продуцировать органическое соединение, в том числе с числом атомов углерода С 5
или более, включая, но не ограничиваясь этим, аминокислоты и белки при заявленных хемосинтетических условиях, является обычным в данной области техники. Например, способность штамма Rhodococcus расти в оксигидрогеновых условиях с использованием С02 в качестве источника углерода может быть реализована, как описано выше в Примерах 4-6. Другие способы выращивания в оксигидрогеновых условиях (условиях для водородных организмов) с использованием СО2 в качестве источника углерода описаны в "Thermophilic bacteria", Jakob Kristjansson, Chapter 5, Section III, CRC Press, 1992, pp. 86-88, и было обнаружено, что они хорошо работают с широким набором различных штаммов, полученных из большого количества родов. Оценка производства органических соединений, таких как химически синтезированные оксигидрогеновыми видами, также является обычной в данной области техники. Например, можно использовать газовую хроматографию и масс-спектрометрию (ГХ/МС), как описано в Примере 5. Другие способы включают экстрагирование липидов, тонкослойную хроматографию (ТСХ), газовую хроматографию (ГХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и масс-спектрометрию (МС), как описано в Waltermann et al. (2000) "Rhodococcus opacus strain PD630 as a new source of high-value single-cell oil? Isolation and characterization of triacylglycerols and other storage lipids)) Microbiology 146:1143-1149.
Пример 8
[367] Примерно пять килограммов биомассы (сухая масса) было произведено штаммом DSM 531 Cupriavidus necator, выращеным в присутствии смеси газов Н2, СО2 и О2 в качестве единственного источника энергии и углерода для роста. Из этой биомассы экстрагировали и анализировали растворимые в гексане масла. Следующий протокол использовался для производства биомассы из исходного сырья Н2, СО2, and О2 в биореакторах с мешалкой, а затем экстрагирования маслов из биомассы.
[368] Устройство: Культуры С. necator выращивали в полунепрерывном режиме, используя два 20-литровых реактора Applikon Biotechnology (Applikon). [369] Биореактор: Каждый биореактор состоял из стеклянной емкости, установленной на подставке с верхней пластиной из нержавеющей стали с эластомерным уплотнителем. Верхняя пластина имела отверстия для многочисленных соединений, все из которых имели эластомерное уплотнение для предотвращения утечки газа в реактор или из него. Эти соединения обеспечивали
возможность размещения термодатчиков, датчиков для измерения рН, датчиков для измерения растворенного кислорода, впускных отверстий для газа, впускных отверстий для жидкости, выпускных отверстий для газа, отверстий для отбора проб жидкости ит. д..
[370] Датчики Биореактора: Температурный датчик, расположенный в термокармане, использовался для отслеживания температуры и для управления нагревателем. Датчик рН использовался для отслеживания рН и, при необходимости, контроля добавления в реактор буферных растворов с более высоким или более низким рН. Для контроля добавления пеногасителя использовался датчик пены. Датчик растворенного кислорода использовался для измерения уровней кислорода в жидкости реактора и могли использоваться для управления перемешиванием или открытия/закрытия потока газа в реактор. Все датчики были запитаны, управлялись и обеспечивали входящую информацию контроллеру/консоли биореактора. [371] Перемешивание: Мешалка проходила через верхнюю пластину с полным уплотнением и магнитной муфтой. У мешалки был внешний двигатель, который представлял собой отдельное устройство, который размещался вокруг внешней части вала мешалки. Скорость двигателя контролировалась внешним контроллером, который позволял точно контролировать скорости вращения.
[372] Нагрев/Охлаждение: Реактор нагревали с помощью внешней нагревающей оболочки, в которой использовался пропорционально-интегрально-дифференциальный контроллер с обратной связью (РШ), управляемый датчиком температуры Pt 100 через контроллер системы биореактора. Для поддержания температуры также был установлен охлаждающий стержень для предотвращения перегрева среды двигателем мешалки.
[373] Крепление Биореактора: Системы биореактора были установлены на металлических держателях штатива. Для прикрепления этого штатива к креплениям стойки, расположенным внутри вытяжного шкафа, были прикреплены зажимы или цепи, чтобы предотвратить опрокидывание реактора. Весь штатив и установку реактора помещали в мелкий пластиковый контейнер для обеспечения вторичной защитной оболочки.
[374] Схема биореакторов и вспомогательных систем, изображена на Фигуре 10. Два биореактора объемом 20 л были расположены в вытяжном шкафу, как показано на Фигуре 11. Биореакторы были установлены внутри вытяжного шкафа для локализации выбросов газообразного водорода. Все элементы управления и источники газа были расположены за пределами вытяжного шкафа, а также газовые
баллоны, контроллеры реактора, расходомеры массы, датчики водорода и газораспределительные запорные арматуры. На Фигуре 11 изображены два реактора объемом 20 л, используемые для выращивания С. necator в присутствии газов Н2, СО2 и О2 в качестве единственного источника энергии и углерода. [375] Контроллер/Консоль: Контроллер/консоль системы биореактора содержали компоненты, которые контролировали и управляли системой биореактора. Эти устройства обеспечивали питание, контроль температуры, контроль перемешивания, принимали входные сигналы от датчиков, включали и выключали питающие насосы (для кислот, оснований, антивспенивателя и дополнительных питательных веществ) на основе входящих данных датчиков и использовались для включения/отключения потоков газа с помощью электромагнитных запорных арматур и ротаметров. Из-за отсутствия всех компонентов, изготовленных из нержавеющей стали эти блоки не использовались для управления водородом, чтобы свести к минимуму риск утечки водорода. Контрольные/консольные блоки были расположены за пределами вытяжного шкафа, отдельно от биореакторов, чтобы свести к минимуму воздействие водорода в случае утечки и свести к минимуму время, которое операторы проводят, работая непосредственно возле биореакторов. На Фигуре 12 изображены контроллеры Applikon и консоли, которые использовались для контроля работы реакторов. На Фигуре 12 представлены контроллеры, консоли, мешалки, система обнаружения взрывоопасных газов, расходомеры массы, контроллеры уровня, основные контрольные резервуары, резервуар для добавления среды и резервуар для контролирования пены. Все элементы управления реактора находились снаружи вытяжного шкафа.
[376] Подача Газа: Газ подавался в нижнюю часть биореактора через барботажное устройство, которое пропускалось через верхнюю пластину. Запорная арматура, расположенная непосредственно снаружи реактора обеспечивала возможность ручного отключения потока газа в каждом реакторе по-отдельности. Линия подачи газа, подключенная к реактору, представляла собой гибкую линию из нержавеющей стали с 0,2-микронным фильтром, установленным на верхней части реактора, чтобы минимизировать возможное загрязнение. Расходомеры массы, расположенные за пределами вытяжного шкафа, использовались для контроля скоростей потока в реакторы. Линии между баллонами и расходомерами массы имели как ручные, так и электромагнитные запорные арматуры для ручного и автоматического перекрытия газов. Электромагнитные запорные арматуры были подключены к датчикам
взрывоопасных газов, которые автоматически перекрывали потоки газа в случае, когда водород был обнаружен в лаборатории или в вытяжном шкафу. [377] Хранение Газа: Для хранения водородных баллонов использовался газовый шкаф. Газовый шкаф был установлен на месте и включал вентиляцию и спринклеры. В газовом шкафу было достаточно места для хранения нескольких баллонов, чтобы обеспечить легкое переключение между старым и новым баллонами. [378] Защитные Устройства: Детекторы взрывоопасного газа использовались для определения присутствия водорода в лаборатории. Много датчиков было расположено в стратегических позициях вокруг лаборатории и в вытяжном шкафу. Эти детекторы газа были сконфигурированы для отключения электромагнитных запорных арматур на линиях подачи газа, которые отключали поток газа к реакторам в случаях, если был обнаружен водород.
[379] Перистальтический Насос: В вытяжной шкаф был установлен дополнительный перистальтический насос. Этот насос использовался для переноса свежей среды в реакторы в начале выращивания в полунепрерывнаом режиме и использовался для удаления среды и биомассы в конце выращивания в полунепрерывном режиме.
[380] Хранение Среды: Пластиковые бутыли или стеклянные бутыли использовались для хранения свежих сред и биомассы, собранной после выращивания в полунепрерывном режиме.
[381] Среда: Среда MSM, используемая для этого эксперимента, описана в Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, p. 87, Таблица 4.
[382] Инокулят: Инокулят Cupriavidus necator был приготовлен из стоковых растворов в глицерине 0,5 мл, хранящихся при -80 °С для штамма DSMZ 531. Восстановленные культуры начинали выращивать на газовой смеси Н2/СО2/О2 в соответствии с протоколом выращивания в бутылях, описанным в Примере 1, с добавлением 0,5 мл глицеринового стокового раствора к 20 мл минимальной солевой среды (MSM) в газонепроницаемой бутыли. Инокулят был предоставлен в нескольких контейнерах, которые были объединены внутри бокса микробиологической безопасности в единой стерильной бутыли со средой, снабженной стерильной сборной крышкой для переноса. Был определен OD инокулята и сделан штриховой посев. Затем инокулят переносили в реактор с использованием стерильной трубки для переноса и перистальтического насоса.
После инокуляции реактора была определена стартовая OD полунепрерывной культуры с помощью взятия образца.
[383] Подготовка и Добавление Среды: Все среды были подготовлены с использованием протоколов, представленных в Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, p. 87, Таблица 4, за исключением больших количеств, необходимых для 20-литрового масштаба. Основной компонент среды (А) был приготовлен в бутылях Nalgene объемом 20 л, оснащенных стерильной сборной крышкой для переноса жидкости и фильтрующими узлами. Среда была автоклавирована в бутылях и перенесена в автоклавированные реакторы с использованием стерильных трубок и перистальтических насосов, чтобы избежать загрязнения. Меньшие компоненты среды (В и D) были приготовлены в больших резервуарах и стерилизованы путем переноса растворов с помощью шприца через одноразовый стерильный 0,2-микронный фильтр непосредственно в реактор с использованием мембран. Использование мембран минимизировало риск загрязнения, поскольку это позволяло избежать открытия реактора. Четвертый меньший компонент среды (С) был обработан способом, аналогичным А, в том, что более крупный резервуар, снабженный стерильной крышкой для переноса, был подготовлен со средой, автоклавирован, и среду переносили с использованием стерильных трубок и перистальтического насоса.
[384] Подготовка и Запуск Биореактора: Перед запуском свежеинокулированных культур в полунепрерывном режиме, биореактор был подготовлен для автоклавирования. Верхняя пластина реактора была смонтирована на месте. Линии переноса были соединены, зажаты, а конец был покрыт фольгой и запечатан индикаторной лентой для стерилизации автоклавированием. Фильтр 0,2 микрона был подключен к впускному отверстию газа барботажного устройства для стерилизации поступающих газов. Выпускную линию зажимали и запечатывали фольгой. Были установлены термокарман, конденсатор, датчик уровня пены, охлаждающий змеевик, устройство для отбора проб, регулируемая трубка для отбора жидкости и датчик растворенного кислорода. Отверстие для датчика рН было закрыто и запечатано фольгой. Затем реактор подвергали автоклавированию в течение 60 минут при температуре 131 °С с сухим циклом. Датчик рН был стерилизован сочетанием кратковременной обработки пламенем, этанола и ультрафиолетовым (UV) излучением. После того как биореактор был автоклавирован и охлажден до комнатной температуры, датчик рН был вставлен в реактор, в то время как реактор и датчик находились внутри бокса
микробиологической безопасности. Затем реактор был установлен в вытяжном шкафу; т.е. линии охлаждения, линии передачи, электронные элементы управления, нагреватель, двигатель мешалки и т. д. были подключены. Как можно быстрее компонент среды А переносили в реактор, чтобы свести к минимуму время, в течение которого датчик рН был сухим. Контроль температуры и перемешивание были включены и, при необходимости, также водяное охлаждение. Когда температура среды достигла желаемой температуры, компоненты среды В, С и D были перенесены в реактор с помощью способов, описанных выше. Затем был запущен контроль рН.
[385] Инокулирование Биореактора: Свежую инокуляцию выполняли, как описано выше. В ряде запусков среда и биомасса предыдущей полунепрерывной культуры, удалялись с помощью перистальтического насоса, за исключением остаточного объема, обычно составляющего менее одного литра, который использовался для инокуляции следующей полунепрерывной культуры. При инокуляции остаточным объемом предыдущей полунепрерывной культуры, после удаления основной массы культуры стерильный компонент среды А при комнатной температуре переносили в биореактор и включали нагрев. Остальные компоненты среды В, С и D затем переносили с помощью способов, описанных выше. Затем включали поток газа, перемешивание, и включали контроль рН. На этом этапе считалось, что выращивание началось, и были получены стартовые значения OD. После того, как реактор достиг рабочей температуры, включалось охлаждение. [386] Состав Газа и Расход: Состав газовой смеси представлял собой 66,7% Н2, 23,8%воздух, 5% 02 и 9,5% СО2. Коэффициенты контролировались с помощью контроллеров расхода массы. Расход газа составлял от 0,05 до 0,3 об/об/мин общего расхода газа. Типичные значения расхода газа составляли 0,05 об/об/мин в выходные дни и 0,2 об/об/мин в течение недели, когда оба реактора находились в эксплуатации и контроль пены был включен. В запусках, которые не использовали контроль пены, для снижения уровня пены до управляемых уровней использовались типичные значения от 0,05 до 0,075 об/об/мин.
[387] Контроль рН: Гидроксид аммония (2,0 М) использовали для контроля рН среды в биореакторе. Раствор гидроксида аммония получали с помощью автоклавирования 1200 мл воды MilliQ в бутыли объемом 2 л для среды, снабженной стерильной крышкой для переноса и фильтрующим узлом, и добавления 800 мл стерилизованного с помощью фильтра гидроксида аммония 5,0 М внутри бокса микробиологической безопасности. Гидроксид аммония автоматически переносился
в реактор с помощью перистальтического насоса, который управлялся контроллером биореактора с использованием сигнала датчика рН.
[388] Добавление/Изменение Состава Питательных Веществ: Используемые растворы для внесения питательных веществ были такими же, как используемые для исходных сред, однако с отличающимися количествами. Другие минеральные питательные вещества добавлялись чтобы продлить рост и предотвратить любые ограничения со стороны минеральных питательных веществ. Растворы для внесения изменений либо добавляли непосредственно в реактор, используя шприц, и стерилизацию через фильтр 0,2 мкм, либо добавляли через стерильные трубки, которые оставались подключенными к реактору с использованием перистальтического насоса. Общий объем реактора также регулярно корректировался вручную (обычно ежедневно) путем удаления небольших порций реакционной среды и биомассы для поддержания рабочего объема приблизительно 15,5 л. Это было сделано для компенсации увеличения количества воды из-за добавления модифицирующих растворов питательных веществ и генерации воды в результате клеточного дыхания для поддержания стабильной кинетики перемешивания и предотвращения переполнения.
[389] Отбор образцов: Небольшие аликвоты раствора среды отбирались из биореактора через узел отбора жидких образцов через регулярные промежутки времени. Они использовались для проведения измерений OD600 с помощью Eppendorf Biophotometer Plus, а также для получения микроцентрифугированных образцов для анализа ДНК. Микрофугированные образцы центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин и декантировали и хранили при температуре -20 °С. [390] Контроль Уровня Пены: После достижения OD приблизительно 15, пена начинает заполнять свободное пространство, и если ее уровень не будет контролироваться, пена будет легко заполнять 2-литровый расширительный резервуар в течение ночи, при использовании скорости потока газа 0,2 об/об/мин. Датчик пены использовался для определения присутствия пены включения насоса, который подавал эмульсию раствора пеногасителя на основе кремния. Расход газа и скорости мешалки регулировали по мере необходимости в полунепрерывных культурах 11 и 12 для предотвращения чрезмерного образования пены. При расходе газа от 0,05 об/об/мин до 0,075 об/об/мин биореакторы могли работать без пеногасителя. Однако пена заполняет свободное пространство реактора; в результате чего небольшое количество поступает в расширительную емкость для пены через выпускное отверстие для газа.
[391]
Температура, рН и OD контролировались и регистрировались. Чистоту клеток контролировали с помощью штрихового посева на чашках. В общей сложности 9 полунепрерывных культур С. necator были выращены в 20-л масштабе. Финальные оптические плотности (OD) полунепрерывных культур, обычно составляли от 30 до 50. Результаты этих полунепрерывных культур, выращенных в 20-литровом масштабе, представлены в Таблице 1 ниже.
Полунепр ерывная Культура №
Mac штаб
Pea кто р:
Дата начал а
Дата завер шени я
Нача льная OD
Фина льная OD
Продолжит ельность (часов)
Общи й
диапа зон
расхо да газа
(об/об
/мин)
Диапазо н
скорости перемеш ивания (об/мин
Инокуля тор
3 л
9/4
9/6
0,63
57,7
0,10,5
850
240 мл С. necator , выращен ного на газе в бутылях
3 л
9/9
9/13
2,96
32,4
103
0,2- 1
900
~ 200 мл полунепр ерывной культуры 1
3 л
9/16
9/20
99,9
0,2- 1
10001200
-200 мл полунепр
ерывной культуры 2
20 л
9/23
10/3
0,94
248
од-
о,з
600-800
-600 мл полунепр
ерывной культуры j
20 л
10/1
10/9
6,7
188
0,05 -0,2
200
-650 мл полунепр
ерывной культуры 4
20 л
10/4
10/11
0,085
165
0,05 -0,2
800-900
-400 мл С.
necator, выращен ного на сахаре в чашках
20 л
10/11
10/18
1,2
168
0,05 -0,2
200-850
-500 мл полунепр
ерывной культуры 6
20 л
10/11
10/18
42,5
167
0,05 -0,2
800-980
<1 л полунепр ерывной культуры 6
20 л
10/18
10/25
3,5
49,4
165
0,05 -0,2
750-850
<1 л полунепр ерывной культуры 7
20 л
10/18
10/24
1,9
39,2
143
0,05 -0,2
800-950
<1 л полунепр ерывной культуры 8
11 (SI)
20 л
11/1
11/7
2,34
29,2
143
0,04 -0,2
800-850
-750 мл полунепр
ерывной культуры
литровом и 20-литровом масштабе.
[392] Восемь полунепрерывных культур достигли конечного значения OD выше 39, одна, которая была выращена с более низким расходом газа (#11), достигла OD 30, а одна полунепрерывная культура, которая ограничивалась низкой скоростью перемешивания (#5), достигла лишь OD 6,7. Наивысшее значение OD составляло 50 в полунепрерывной культуре #7. Всю выращенную биомассу центрифугировали из культуральной жидкости.
[393] Центрифугирование и Хранение Биомассы: Для центрифугирования культуральной жидкости, собранной после выращивания полунепрерывной культуры для извлечения биомассы использовалась центрифуга Beckman Coulter Allegra X-12R. Allegra-12R имеет охлаждение до -10 °С и оснащена бакет-ротором SX4750 рассчитанным на скорость 3750 об/мин и имеет емкость 3 л. После выращивания полунепрерывной культуры биомасса и среда были перенесены из биореактора с помощью перистальтического насоса в полипропиленовые канистры объемом 10 л. Канистры с биомассой и средой хранились в холодильнике до тех пор, пока они не были центрифугированы. Биомассу центрифугировали по 3 литра за один раз, разделяя на четыре поликарбонатные бутыли объемом 750 мл. Центрифугирование проводили при 3750 об/мин при температуре 4 °С в течение 30 минут. Супернатант декантировали и стерилизовали гипохлоритом натрия перед утилизацией. Обезвоженная биомасса в пределах каждой отдельной полунепрерывной культуры была объединена и хранилась в полипропиленовых бутылях в холодильнике.
Пример 9
Разрушение Клеток и Экстракция Масел из Влажной Биомассы Cupriavidus necator
[394] Эффективную экстракцию масел из влажных клеточных образцов получали с использованием описанной ниже процедуры экстракции масел изопропанолом/гексаном. Используя эту процедуру, сырой гексановый экстракт извлекали из биомассы С. necator, выращенного на СОг в качестве единственного источника углерода, из которого микроорганизм производил масло. На Фигуре 13 изображена пробирка, содержащая сырой гексановый экстракт из С. necator, который содержит масло и полимеры. На Фигуре 14 изображены образцы масла, извлеченные из С. necator, выращенного в присутствии углекислого газа в качестве единственного источника углерода и Н2 как единственного источника водорода и электронов.
[395] Для оценки содержания воды влажной биомассы были маркированы два пустых флакона и определена их масса, 1 грамм влажной биомассы помещали в каждый флакон и высушивали в течение 12 часов при 60 °С с использованием вакуумного сушильного шкафа (Binder Safety Vacuum Oven, Модель VDL 115-90300040). Образцы обрабатывались в двух экземплярах. [396] Для изучения параметров процесса и условий для проведения экстрагирования липидов с использованием растворителей гексана и 2-пропанола 10 г (А1) и 9,4 г (А2) влажной биомассы смешивали с 33,5 мл и 31,5 мл 2- пропанола соответственно. Затем клеточную суспензию переносили в химические стаканы объемом 250 мл, стаканы выдерживали на ледяной бане и обрабатывали ультразвуком в периодическом режиме в течение 20 минут. Влажную биомассу обрабатывали ультразвуком с 2-пропаном для полного разрушения клеток, клеточного лизиса и для извлечения масел из клеток микроорганизмов. Использовалось ультразвуковое устройство QSonica Q700. Датчик температуры был погружен в стакан для регистрации изменения температуры во время обработки ультразвуком. Разрушение клеток с использованием ультразвуковых волн или ультразвука является очень распространенным способом клеточного лизиса; ультразвук представляет собой циклическую волну звукового давления с частотами от 20 кГц до нескольких гигагерц. Во время цикла низкого давления высокоинтенсивные ультразвуковые волны создают небольшие пузырьки вакуума в жидкости. Когда пузырьки достигают объема, при котором они больше не могут поглощать энергию, они резко схлопываются во время цикла высокого давления и возникающие разрывающие силы разрушают оболочку клеток. Как изображено на Фигуре 15, после полного разрушения клетки цвет биомассы изменялся с коричневого на сливочный. Суспензия биомассы перед обработкой ультразвуком
изображена слева на Фигуре 15 и после обработки ультразвуком справа. Первоначальная суспензия биомассы была вязкой, но после обработки ультразвуком вязкость образца уменьшалась, возможно, из-за эффекта фрагментации макромолекул.
[397] После лизиса клеток с помощью обработки ультразвуком в 2-пропаноле в А1 и А2 добавляли 33,5 мл и 31,5 мл гексана и инкубировали при температуре 60 °С в течение часа. Смесь перемешивали при 100 об/мин. Спустя час времени реакции образцы переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 3200 g в течение 15 минут с использованием настольной центрифуги (Eppendorf centrifuge R). Супернатант, который представляет собой смесь гексана, 2-пропанола и растворенных масел, липидов и полимеров, переносили в колбу Rotavap и перегоняли при температуре 60 °С с использованием ротационного испарителя (Rotavap R-210/215). Гексан и 2-пропанол выпаривали при температуре 60 °С и давлении вакуума менее 200 мбар. После выпаривания гексана и 2-пропанола получали около 4 г масел желтого цвета. Одна стадия дистилляция не обеспечила отделение масел от полимеров, вместо этого смесь полимеров и масел желтого цвета затвердевала внутри колбы со смесью. Гексан добавляли и использовали для растворения масел из смеси с полимерами, осаждали полимеры желтого цвета и проводили вторую стадию дистилляции для выделения и получения масел.
Экстракция влажной биомассы партиями от 200 г до 250 г
[398] После подтверждения результатов экстрагирования в малом масштабе была начата работа над экстрагированием в большем масштабе. 4 кг влажной биомассы С. necator разделяли на 20 партий (0,2 кг в каждой партии) для экстрагирования и каждую партию переносили в колбу со встяхиванием. В каждую колбу добавляли 650 мл изопропанола. На 1,5 г влажной биомассы использовали 5 мл растворителя 2-пропанола. Биомасса тщательно перемешивалась с 2-пропанолом для создания однородной суспензии.
[399] После получения однородной суспензии для лизирования клеток использовалась ультразвуковая обработка. Ультразвуковое устройство QSonica Q700 работало в непрерывном режиме для полного разрушения клеток. Проточная ячейка ультразвукового устройства была прикреплена к сонотроду, а трубки были соединены с входным и выходным отверстиями проточной ячейки. Впускная трубка на проточной ячейке проходила через перистальтический насос и была погружена в колбу, содержащую суспензию биомассы, в то время как выпускная трубка
проточной ячейки размещалась в той же колбе, чтобы обеспечить циркуляцию. Для осуществления полного лизиса клеток рассеивалось от 1 до 1,2 кДж энергии на грамм влажной биомассы. Датчик температуры был погружен в стакан с образцом для регистрации изменения температуры во время обработки ультразвуком. [400] Каждая из 20 партий, полученных из исходных из 4 кг, обрабатывалась ультразвуком в периодическом режиме со 100%-ной амплитудой в течение 30 минут с интервалами в 30 секунд между каждой обработкой ультразвуком длительностью 1 мин.
[401] После обработки ультразвуком с 2-пропанолом добавляли 5 мл гексана на грамм влажной биомассы, затем образцы инкубировали с использованием Kuhner Shaker X при температуре 60°С в течение часа. К каждой партии добавляли 650 мл гексана, которую затем инкубировали в течение 60 минут при температуре 60 °С. [402] Образцы переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали, используя центрифугу Eppendorf centrifuge R при 3200g в течение 15 минут. Каждая партия биомассы была разделена в 4x400 мл пробирки Eppendorf centrifuge R. Скорость вращения центрифуги была установлена на 4000 об/мин, что эквивалентно 3200 g для ротора радиусом 18 см.
[403] После отделения клеточного осадка органические экстракты, т.е. супернатант, переносили в колбу ротационного испарителя (Rotavap). Ротационный испаритель использовали для отделения масел и полимеров от гексана и 2-пропанола. Гексан и 2-пропанол выпаривали при температуре 60 °С и давлении 200100 мбар, и масло высушивали, избавляясь от растворителя. Гексан и 2-пропанол нагревали с помощью нагревающей бани при температуре 60 °С. Перемешивающая колба ротационного испарителя обеспечивает эффективную теплопередачу для быстрого испарения и предотвращает локального перегрева, обеспечивая при этом плавное перемешивание органического экстракта. Испаряющую колбу равномерно вращали, и через паропровод парообразная форма гексана и 2-пропанола переносилась в конденсатор. В принимающей колбе собирался конденсированный гексан и 2-пропанол. Температура кипения гексана и 2-пропанола составляет 69 и 82 °С при 1013 мбар соответственно. Однако гексан и 2-пропанол можно перегонять при температуре 40 °С в вакууме 120 и 360 мбар соответственно. Отмечается, что эффективность испарения зависит от давления дистилляции, температуры нагревающей бани и скорости вращения, а также от размера испарительной колбы. [404] Для более крупномасштабного экстрагирования были достигнуты оптимальные условия дистилляции при давлении вакуума 100 мбар и нагреве с
помощью водяной бани до 60 °С; однако после выпаривания гексана и 2-пропанола желтая смесь полимеров/масел оставалась внутри колбы для перемешивания. Для отделения масел от полимеров желтого цвета был повторно использован гексан и затем полимеры отделяли с помощью центрифуги.
[405] Смесь полимер/масло/гексан повторно нагревали до температуры 60 °С в течение 10 минут, переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали при 3200 об/мин в течение 5 минут. После повторного нагрева и центрифугирования масло отделяли, выделяли и анализировали. Было обнаружено, что масляный экстракт содержит преимущественно насыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты С16 и С18, включая пальмитиновую кислоту - основную составляющую пальмового масла. Из 4 кг влажной биомассы С. necator, которая соответствовала примерно 1 кг сухой биомассы, извлекали 80 г сырого гексанового экстракта (т.е. растворимых в гексане масел).
[406] В общей сложности около 230 мл масла было экстрагировано из различных образцов Cupriavidus necator, полученных из Н2 и С02 в качестве единственного источника водорода, электронов и углерода, в соответствии со способами, описанными в данном разделе. Это соответствует примерно 210 г масла. Из этого общего количества около 160 мл (140 г) масла экстрагировали из образцов, полученных при выращивании полунепрерывных культур в объеме 20 л, описанных в данном разделе, а остальное - из других непрерывных и полунепрерывных культур на субстратах Н2/СО2.
Анализ сырого экстракта масла
[407] Масло, произведенное из СОг и экстрагированное из С. necator, загружали в колонку с кремниевой кислотой и разделяли на фракции нейтральных липидов (НЛ), полярных липидов (ПЛ) и свободных жирных кислот (СЖК). Липиды в каждой фракции анализировали на распределение ацильных цепей, сначала превращая в метиловый эфир, а затем анализируя способом газовой хроматографии. Молекулярные массы отдельных пиков были подтверждены с помощью ГХ/МС. Массовая доля метилового эфира (мае %) для распределения жирных ацильных углеродных цепей рассчитывалась по размеру площадей пиков, используя относительные коэффициенты чувствительности детектора, определенные с помощью аналитических стандартов. На Фигуре 16 изображен профиль длин цепей жирных кислот, которые присутствовали в маслах, экстрагированных из Cupriavidus necator. Основным компонентом масел является С 16:0, что представляет собой
пальмитиновую кислоту. Пальмитиновая кислота также является основным компонентом пальмового масла.
[408] Было обнаружено, что остаточная биомасса, оставшаяся после экстрагирования масел, имеет высокое содержание РНВ и белка.
Пример 10
Производство Аминокислот из Сырья Синтез-газа или Его Компонентов [409] Штаммы Cupriavidus necator DSM 531 и DSM541 культивировали с использованием газовой смеси Н2/СО2/О2 и среды с минеральными солями для ферментации. Культуру выращивали в течение 96 часов в 20 мл среды MSM (1 л Среды А: 9 rNa2HP04.12H20, 1.5гН2Р04, 1.0 rNH4Cl и 0.2 rMgS04.7H20 на 1 л; 10 мл среда В: 50 мг цитрата аммония железа и 100 мг СаСЬ на 100 мл; 10 мл Среды С: 5 rNaHC03 на 100 мл; и 1 мл раствора микроэлементов и минеральных веществ: 100 мг ZnS04 7Н20, 30 мг МпС12.4Н20, 300 мг Н3В03, 200 мг СоС12, 6Н20, 10 мг СиС12, 2Н20, 20 мгМС12. 6Н20 и 30 MrNa2Mo04.2H20 на 1 л) в бутыли, дополненной 66,7% Н2, 9,5% С02, 5% 02 и 18,8% N2 при температуре 30 °С и 200 об/мин. [410] Для обнаружения лизина в среде для роста 1 мл клеток (OD = 0,1) разделяли центрифугированием (10000 об/мин, 5 мин при комнатной температуре) и дополнительно фильтровали супернатант (200 мкл) (0,22 мкм). Образцы супернатантов собирали и анализировали для выделения аминосодержащих соединений, таких как аминокислоты, включая лизин, тирозин и фенилаланин, как указано в Таблице 2. Лизин представляет собой молекулу с шестью атомами углерода, а тирозин и фенилаланин представляют с собой молекулу с девятью атомами углерода. Было отмечено, что штамм С. necator DSM541 секретирует в среду более высокие концентрации лизина, тирозина и фенилаланина по сравнению с штаммом С. necator DSM531. Анализ проводили с использованием 200 мкл стерильной фильтрованной культуральной среды. Соединения были выделены и дериватизированы с использованием набора для очистки и дериватизации (например, EZ-FaaST (Phenomenex) с последующей жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией для разделения и идентификации соединений, которые секретировались бактериальными штаммами в среду (Таблица 2). Уровни лизина, обнаруженные в среде штамма DSM 541, были в 125 раз выше, чем у DSM 531.
Таблица 2. Секретируемые аминосодержащие соединения С. necator
Соединение
Контр
ОЛЬ
DSMZ 531: С
necator
DSMZ 541: С.
necator
мкмоль/л
мкмоль/л
кратность отличий
Glu
Глютаминовая кислота
0.1952
11.556
40.614
3.5
Sar
Саркозин
1.7232
2.5708
36.4692
14.2
Ser
Серии
1.7688
7.9428
35.8164
4.5
Gly
Глицин
9.4757
10.3272
35.0351
3.4
Ala
Алании
0.6504
5.996
32.3436
5.4
Thr
Треонин
0.216
5.4152
22.9456
4.2
Val
Валин
0.0984
4.182
21.5904
5.2
Изолейцин
0.0272
2.1476
14.0068
6.5
Орн
Орнитин
0.9324
10.4876
13.056
1.2
His
Гистидин
0.99
2.3816
12.0852
5.1
Arg
Аргинин
0.2988
0.4112
9.3428
22.7
Phe
Фенилаланин
0.1
3.4216
8.6652
2.5
Lys
Лизин
0.1012
0.063
7.9088
125.5
Tyr
Тирозин
0.386
2.9448
7.3972
2.5
Cit
Цитозин
0.3332
0.6572
6.8248
10.4
Asp
Аспарагиновая кислота
2.1964
3.2776
4.6132
1.4
Gin
Глютамин
0.1412
1.2548
4.2944
3.4
Pro
Пролин
0.0477
1.2567
4.1107
3.3
Leu
Лейцин
0.054
2.5558
3.7205
1.5
Trp
Триптофан
0.0352
0.9464
2.7072
2.9
Met
Метионин
0.0156
1.3944
1.614
1.2
Tpr
Трг
0.034
0.5208
0.8052
1.5
В-Ala
В-Аланин
2.0904
0.6688
0.3
SAM
Аденозилмети онин
0.5604
SAH
1.194
2.3232
0.2812
0.1
Аденозилгомо цистеин
MetSo
Сульфоксид метионина
0.0128
0.3696
0.2528
0.7
Hcy-PCA
Нсу-РСА
0.024
0.1944
0.2344
1.2
a-AAA
а-ААА
0.0096
0.2008
0.1492
0.7
АРА
АРА
0.0248
0.134
5.4
Put
Путрацин
0.1912
15.0568
0.128
0.0
Cys-PCA
Cys-PCA
0.0392
0.7148
0.1272
0.2
GSH-PCA
GSH-PCA
0.0056
0.0052
0.0468
9.0
Spd
Spd
0.0652
0.0728
0.0444
0.6
3-His
3-His
0.0264
0.0384
0.0276
0.7
Cy2
Су2
0.0364
0.0628
0.0128
0.2
Cth
Cth
0.0072
0.0072
0.0124
1.7
CysGly-PCA
CysGly-PCA
0.002
0.01
0.0112
1.1
Erg
Erg
0.0076
0.0512
0.0084
0.2
Hcy2
Hcy2
0.0116
0.008
0.0048
0.6
Пример 11
[411] Штамм Hydrogenovibrio marinus DSM 11271 был выращен до плотности сухой клеточной массы более 8 г/л в присутствии смеси газов Н2, СО2 и О2 в качестве единственного источника энергии и углерода для роста. Следующий протокол был использован для экспериментов, проведенных с использованием смеси газов, включающей Н2, СО2 и О2 в биореакторе с механическим перемешиванием. [412] Устройство: Культуру выращивали в полунепрерывном режиме с использованием изготовленного на заказ стеклянного ферментера объемом 500 мл с верхней пластиной РЕЕК; барботажной трубкой, имеющей с одной стороны пористую стеклянную фритту, соединенной с трубкой для подачи газа с фильтром 0,2 мкм; отверстием с диафрагмой для внесения модификаций; погружной трубкой на дно с узлом асептического отбора образцов, конденсатором, соединенным через трубку с расширительной емкостью с фильтром 0,2 мкм на выпускном отверстии
газа; отверстием для подачи оснований и трубкой для подачи оснований с муфтой Люэра для стерильного шприца; заземляющим электродом; отверстием для подачи пеногасителя; датчиком рН/температуры; окислительно-восстановительным датчиком (ORP). Температуру контролировали на уровне 37 °С и рН на уровне 6,5, используя коммерческий контроллер (Electrolab, Fermac 360, Соединенное Королевство). Целевая температура поддерживалась с помощью нагревательной пластины на дне реактора и встроенного стеклянного кожуха для водяного охлаждения. РН поддерживали на уровне 6,5, используя 6N NH4OH. Реактор размещался пластине для перемешивания (VWR 12365-344) и для перемешивания использовали магнитную мешалку (крестовидная форма, VWR 'spinplus' # 58947828). Скорость перемешивания на пластине для перемешивания была выставлена на 300-400 об/мин. Расход газа в биореактор составлял 1 об/об/мин. Осуществлялась подача сжатого газа Н2, сжатого СОг и комнатного воздуха, давление каждого из которых регулировалось на уровне 20 фунтов на квадратный дюйм. Н2 и СО2 подавались на регулятор подачи (Matheson G2-4D151-E401/E401, 20 фунтов на квадратный дюйм), который устанавливал относительную долю газов. Воздух поступал на расходомер с переменной площадью поперечного сечения (Key Instruments 1G03 R5). Газообразная смесь Н2/С02 из регулятора подачи смешивалась с воздухом, а затем подавалась в ферментер через расходомер с переменной площадью поперечного сечения. Манометр использовался для отслеживания давления подачи газа в ферментер. Входящий газ протекал через фильтр 0,2 мкм (Pall, р/п 4251), а затем диспергировался в культуральной жидкости ферментера через одну пористую фритту из стекла пирекс (40-60 мкм, Sigma-Aldrich CLS3953312-C) и выпускался из реактора через конденсатора (с рубашкой и охлаждением) в расширительную емкость для пены объемом 2 л, затем через еще один фильтр 0,2 мкм (Pall, р/п 4251) и, наконец, в выпускную систему. Подача СО2 был установлена на минимум с.1. = 5 (с.1. = осевая линия поплавка), а для других газов подача была настроена таким образом, чтобы достичь целевого состава газа с помощью вычислений в соответствии с таблицами расходомеров, измерения состава с помощью ГХ и регулирования и повторного измерения, с.1. Н2 = 25, с.1. воздуха = 45 использовали для получения газовой смеси, имеющей соответствующие пропорции СО2/О2/Н2 составляющие 11/6.3/59. Постоянный мониторинг О2 во впускных и выпускных линиях проводился с использованием датчика Foxy. Рандомизированные образцы газа были взяты для анализа ГХ (в пакеты из фольги объемом 1 л, skcinc.com р/п 262-01).
[413] Среда: Один литр базовой среды содержал 2,0 г К2НР04, 1.0 г КН2Р04, 5.0 г (NH4)2S04, 29.3 rNaCl, 0.2 г MgSO4-7H20, 10.0 мг СаС12, 10.0 мг FeS04.7H20, 0.6 мг NiS04.7H20 и 2,0 мл раствора микроэлементов. Использовался раствор микроэлементов, как указано в Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, p. 87, Таблица 4.
[414] Автотрофный инокулят: 10%-ный инокулят для инокуляции, выращенный на газе, был получен в двух бутылях с пробками объемом по 500 мл, содержащими 50 мл жидкой среды. Инокулят, объемом 61,5 мл, OD600 0,75, вводили в биореактор через погружную трубку в нижний уровень жидкости, чтобы предотвратить диспергирование в свободном пространстве. После инокуляции линию промывали фильтрованным воздухом для удаления остаточного инокулята в погружной трубке. [415] Эксплуатация ферментера: Добавление оснований - рН контролировали с помощью 6N NH4OH; Добавки питательных веществ - В дополнение к азотному питательному веществу, обеспечиваемому добавлением основания NH4OH, добавляли 0,2 г FeS04.7H20, когда культуральная жидкость имела OD = 3 и 2 г MgS04,7H20, когда культуральная жидкость имела OD =10. Количество поступающего 02 составляло примерно 5%, а количество исходящего 02 варьировалось в пределах 3-4%. Образцы отбирали из трубки, проходящей на дно реактора, используя систему асептического отбора образцов с бутылями объемом по 25 мл. Результаты секвенирования ДНК подтвердили наличие Н. marinus и не наблюдалось никакого заражения на чашках с агаром, на которых ежедневно проводился штриховой посев в течение всего выращивания.
[416] В Таблице 3 показана плотность сухой клеточной массы (CDW), измеренная в разные моменты времени во время выращивания. Плотность CDW достигала более 8 г/л в течение 5-го дня. Содержание растворимых в хлороформе/метаноле липидов и растворимых в гексане липидов, соответственно, в процентах от биомассы, отобранной в различные моменты времени, также приведено в Таблице 3. Липиды анализировали с помощью ГХ/МС с использованием способов, описанных выше, и было обнаружено, что они содержат жирные кислоты длиной от 14 до 20 атомов углерода.
образца
(мл)
(г/л)
2.78
4.556
7.068
19.34
11.12
6.88
0.72
3.79
6.776
11.824
18.42
2.83
8.12
0.43
4.79
7.492
14.18
20.59
6.31
8.99
2.39
5.79
8.296
24.13
6/07
8.26
1.53
Пример 12
[417] Штамм Rhodopseudomonas capsulata DSM 1710 был выращен до OD, составляющей 4,5 в присутствии смеси газов Н2, СО2 и О2 в качестве единственного источника энергии и углерода для роста. Следующий протокол был использован для экспериментов, проведенных с использованием смеси газов, включающей Н2, СО2 и О2 в однолитровой герметичной бутыли, в которую подавался непрерывный поток газов.
[418] Устройство: Культуру выращивали в полунепрерывном режиме, используя специально изготовленную систему, содержащую однолитровые бутыли для подачи растворителей для жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД), которые использовались в качестве бутылей для культивирования. В эти однолитровые бутыли с культурой непрерывно подавали газы из системы газовых баллонов; газосмесителей; фильтров (0,2 мкм); расходомеров; и увлажнителей. Эта система подачи газа и бутылей для культивирования схематически изображена на Фигуре 18. Газы распределялись и смешивались с раствором с использованием пористой стеклянной фритты. Бутыли для культивирования содержали 200 мл жидкой среды и были обернуты алюминиевой фольгой для предотвращения проникновения света в среду. Температуру контролировали путем погружения культуральных бутылей в водяную баню. рН не контролировался за исключением добавления химических буферов в среду. Газ выводился из культуральных бутылей через фильтр 0,2 мкм, и вся система была установлена внутри вытяжного шкафа. Подача газа осуществлялась с помощью сжатой газовой смеси Н2 и СО2 и отдельной емкости сжатого О2. Целевая газовая смесь для эксперимента составляла 10% О2, 5% СО2, и 85% Н2. Расходомер из емкости газовой смеси Н2/СО2 был установлен на 25, а из емкости О2 был установлен на 34. Это привело к получению газовой смеси 10,5% О2, 5% СО2 и 84,5% Н2, при измерении с помощью ГХ (детектор Shimadzu GC-8A, TCD и колонка Alltech CTRI), что было достаточно близко к целевой смеси для проведения эксперимента.
[419] Среда: 970 мл воды DI; 20 мг Na2.EDTA; 12 мг FeS04.7H20; 200 мг MgS04.7H20; 75 мг СаС12.2Н20; 1 rNaCl; 1 г (NH4)2S04; 1 мг тиамина НС1; 15 мкг биотина; 1 мл раствора микроэлементом. Раствор микроэлементов: 250 мл воды DI; 700 мгНзВОз; 398 MrMnS04.H20; 188 MrNa2Mo04.2H20; 60 мг ZnS04.7H20; 10 мг Си(Ж)з)2. рН был доведен до 7,2 перед автоклавированием. После автоклавирования добавляли 30 мл стерильного раствора с 1,2 г КН2Р04 и 1.8 г К2НР04. рН повторно доводили до рН = 7,2.
[420] Инокулят: 10%-ный инокулят, полученный из культуры R. capsulata, выращивался фотогеротрофно при свете при перемешивании со скоростью 250 об/мин. Среду RCVB, описанную в Wall, J.D., Johansson, В. С, Gest, Н. (1977) А pleiotropic mutant of Rhodopseudomonas capsulata defective in nitrogen metabolism. Arch. Microbiol. 115:259-263 использовали для фотогеротрофного роста инокулята, который имел темно-зеленый цвет. Этот фотогеротрофно выращенный инокулят, в свою очередь, был получен из глицеринового стокового раствора штамма, хранящегося при температуре -80 °С.
[421] Эксплуатация: 10%-ный инокулят имел стартовое значение OD 0,15. После восьми дней роста на газе OD достигла 4,5. OD измеряли с использованием спектрофотометра Beckman Coulter DU720 UV/Vis при 650 нм. Цвет хемоавтотрофно выращенной культуры был темно-красным. Мокрые препараты культуры микроскопировались с использованием фазово-контрастной оптики и лабораторного микроскопа Axioskop (Zeiss, Германия). Микрофотографии были получены с помощью устройства MacroFIRE (Optronics, Galeta, СА) с использованием программного обеспечения PictureFrame (Optronics, Galeta, СА) для обработки изображений и хранения данных. Микрофотография R. capsulata изображена на Фигуре 19. После хемоавтотрофного роста культуру центрифугировали при 10000 х g в течение 15 минут при температуре 4 °С. Затем супернатант сливали и осадок биомассы временно хранили при температуре -20 °С и затем сушили вымораживанием. Изображение осадка биомассы R. capsulata, полученной после центрифугирования, изображено на Фигуре 20. Таким образом, было извлечено в общей сложности 2,59 грамма влажной биомассы из одной однолитровой бутыли R. capsulata, при выращивании на Н2 и С02 в качестве единственного источника водорода, электронов и углерода для биосинтеза. Липиды экстрагировали и анализировали с помощью ГХ/МС с использованием способов, описанных выше, и было обнаружено, что они содержат жирные кислоты, которые в основном состоят из 16 или 18 атомов углерода.
Пример 13
[422] Штамм Hydrogenobacter thermophilus DSM 6534 был выращен в однолитровой газонепроницаемой бутыли в присутствии смеси газов FL-, С02 и О2 в качестве единственных источников энергии и углерода для роста. Живую культуру Н. thermophilus DSM 6534 в бутыли под газовым свободным пространством получили из Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). Эта живая культура использовалась для получения 10%-ного инокулята в бутыли объемом 160 мл, содержащей среду MSM, описанную в "Thermophilic bacteria", Jakob Kristjansson, Chapter 5, Section III, CRC Press, 1992, pp. 86-88 под атмосферой H2:C02:02 в соотношении 8:1:1. Начальная OD при 600 нм после инокуляции составляла 0,03. Температуру бутыли поддерживали на уровне 70 °С, погружая бутыль в нагретую водяную баню. Никакой перемешивание не применялось. Наблюдалось, что среда стала мутной, и через 65 часов OD при измерении составила 0,354 - увеличение более чем в десять раз. Затем эту бутыль пересевали в виде 10%-ного инокулята в однолитровую газонепроницаемую бутыль, содержащую 120 мл среды MSM и атмосферу Н2:СОг:02 в соотношении 8:1:1. Бутылку для культивирования выдерживали при температуре 70 °С с использованием водяной бани без перемешивания. В течение 64 часов свободное газовое пространство обновлялось один раз, a OD увеличилась до 0,25. В течение следующих 24 часов OD увеличилась до 0,42. Газы свободного пространства снова охлаждались, а через два дня OD при измерении составила 0,56. 1 мл культуральной жидкости отбирали для выделения и секвенирования ДНК.
[423] Была определена последовательность 16S рРНК, и лучшее совпадение BLAST было идентифицировано как штамм Hydrogenobacter thermophilus ТК-6. Культуральную жидкость затем извлекали из однолитровой бутыли и центрифугировали при 10000 х в течение 15 минут при температуре 4 °С. Осадок влажной биомассы, полученный после центрифугирования, имел массу 212 мг. Экстракцию гексаном влажной биомассы выполняли, как описано в примере выше. Из влажной биомассы получили 15,2 мг растворимых в гексане липидов, или 7,2% массы влажной биомассы состояло из растворимых в гексане липидов. Липиды экстрагировали и анализировали с помощью ГХ/МС с использованием способов, описанных выше, и было обнаружено, что они содержат относительно высокую долю жирных кислот с углеродной цепью длиной 20 атомов.
Пример 14
[424] Штамм Xanthobacter autotrophicus DSM 432 был выращен до плотности сухой клеточной массы 14 г/л в присутствии смеси газов FL-, СОг и О2 в качестве единственного источника энергии и углерода для роста. Использовался следующий протокол для эксперимента, проведенного с использованием смеси газов, содержащей Н2, СОг, и О2, в биореакторе с мешалкой. [425] Устройство: Культуру выращивали в полунепрерывном режиме с использованием двухлитрового стеклянного ферментера, схематически изображенного на Фигуре 21, с верхней пластиной, схематически изображенной на Фигуре 22. Температуру и рН отслеживали и контролировали с помощью датчиков рН и температуры и коммерческого контроллера. рН регулировали с помощью автоматического добавления 2N NaOH. Отверстия в биореакторе использовались для подачи питательных добавок и пеногасителя; подачи инокулята; основания; свежей среды; и асептического отбора образцов. Перемешивание обеспечивалась турбиной, и газы пропускались через стеклянную фритту. Схема реактора схематично изображена на Фигуре 23. Она содержала манометры; газовые расходомеры; предохранительную и контрольную запорную арматуру; 0,2 микронные фильтры; сосуд биореактора, датчики, исполнительные механизмы и контроллеры; конденсатор и пеноуловитель; и выпускной газоотвод. Осуществлялась подача сжатого газа Н2, сжатого СО2 и комнатного воздуха, давление каждого из которых регулировалось на уровне 20 фунтов на квадратный дюйм. Схема системы подачи газа изображена на Фигуре 24. Н2 и СО2 подавались на регулятор подачи (Matheson G2-4D151-E401/E401, 20 фунтов на квадратный дюйм), который устанавливал относительную долю газов. Параметры, используемые в регуляторе подачи, представляли собой с.1. Н2 = 35; с.1 СО2=10; и с.1 воздуха=55. Это привело подачи в биореактор газовой смеси, представляющей собой 64% Н2, 11%) СОг, 5,4%) Ог, при измерении с помощью ГХ (Shimadzu GC-8A, TCD-детектор и колонка Alltech CTRI).
[426] Среда: Среда MSM, используемая для этого эксперимента, описана в Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, p. 87, Таблица 4.
[427] Инокулят: Штамм Xanthobacter autotrophicus DSM 432 выращивали из одного флакона стокового глицеринового раствора, хранящегося при температуре
80 °C, который переносили в 200 мл MSM в однолитровой газонепроницаемой бутыли. Давление газа Н2/СО2/О2 в свободном пространстве составляло 10 фт/кв. дюйм. Содержимое бутыли для культивирования перемешивали со скоростью 150 об/мин при температуре 30 °С.
[428] Эксплуатация ферментера: Перед инокуляцией 1,3 литра MSM переносили в емкость биореактора. РН доводили до 6,8 с использованием NaOH. Температуру устанавливали на уровне 30 °С и скорость перемешивания устанавливали на уровне 500 об/мин. Образцы отбирали дважды в день для анализа OD и липидов с помощью узла асептического отбора образцов. Все измерения OD проводились с помощью спектрофотометра Beckman Coulter DU720 UV/Vis. Один раз в день образцы исследовались под микроскопом для проверки морфологии клеток. Все образцы культуральной жидкости центрифугировали при 12000 х g. 1 мл супернатанта хранили для анализа NH4+ при температуре -20 °С. Осадок влажной биомассы временно хранили при температуре -80 °С и затем сушили вымораживанием. [429] Корреляция между OD60o и CDW (мг/мл) изображена на Фигуре 25. Линейное приближение этой корреляции представляло собой CDW = 0,9944*(ОБбоо) + 0,4101 с R2 = 0,957. На Фигуре 26 изображена кривая роста водородного микроорганизма Xanthobacter autotrophicus, выращенного на газовом субстрате Н2/СО2/О2 в соответствии с данным протоколом. Финальная OD, измеренная при 600 нм, составляла 14.8, а конечная CDW составляла 13.8 грамм/литр при росте на газовом субстрате Н2/СО2/О2. После короткого периода логарифмического роста в начале выращивания биомасса аккумулировалась с линейной скоростью до окончания выращивания на шестой день. Липиды экстрагировали и анализировали с помощью ГХ/МС с использованием способов, описанных выше, и было обнаружено, что они содержат относительно высокую долю жирных кислот с углеродной цепью длиной 18 атомов.
Пример 15
[430] Следующие расчеты, которые учитывают только геометрические факторы и природно более высокую производительность водородных штаммов, выращенных на СО2, наглядно иллюстрируют преимущества применения водородных микроорганизмов, как описано в данном документе, над этими биопроцессами на основе фотосинтезирующих организмов. Во-первых, для сравнения, средняя производительность биомассы на единицу площади или удельная продуктивность в США для водорослей, выращенных в прудах на СО2, составляет 13,2 г/м2/сут [ANL,
NREL, PNNL 2012. Renewable diesel from algal lipids: an integrated Baseline for cost, emissions and resource potential from a harmonized model. ANL/ESD/12-4; NREL/TP-5100-55431; PNNL-21437. Argonne II: Argonne National Laboratory; Golden CO: National Renewable Energy Laboratory; Richland WA: Pacific Northwest National Laboratory].
[431] Водородный штамм Cupriavidus necator выращивался на H2 и С02 в стандартных серийно выпускаемых лабораторных биореакторах до получения плотности сухой биомассы выше 40 г/л в течение 6 дней. Это соответствует средней объемной производительности примерно 7 г/л/сут. Чтобы перевести эту продемонстрированную объемную производительность в прогнозируемую удельную производительность в промышленном масштабе, следует отметить, что культивация водородных организмов совместима с коммерчески зарекомендовавшими себя промышленными биореакторами и оборудованием, используемым во всей отрасли ферментации. Эти биореакторы часто содержат рабочие объемы, имеющие глубину водяного столба от десяти до сорока метров [Mads О. Albaek, Krist Gernaey, Morten S. Hansen, Stuart M. Stocks. Evaluation of the efficiency of alternative enzyme production technologies (2012).; Richard Westlake. Large-scale Continuous Production of Single Cell Protein. Chemie Ingenieur Technik, 58:934-937 (January 1986]. Напротив, из-за требований к освещению и сложностей из-за затенения, когда организмы на поверхности препятствуют попаданию света на организмы в нижних слоях, водорослевые пруды, как правило, ограничиваются глубиной всего около десяти сантиметров. Средняя хемоавтотрофная объемная производительность 7 г/л/сут, масштабированная до глубины водяного столба 10-40 м, обеспечивала бы удельную продуктивность от 70 000 до 280 000 г/м2/сут для случаев с глубиной водяного столюа 10 и 40 м соответственно. Это представляет собой от 5000 до 20000 раз большее преимущество по сравнению с продуктивностью микроводорослей на С02 на единицу площади. Следует отметить, что сами микроводоросли могут иметь в 220 раз более высокую продуктивность по сравнению с сельскохозяйственными культурами высших растений, таких как соя или кукуруза. Поэтому водородные микроорганизмы, применяемые в данном изобретении, могут иметь по меньшей мере 10000-кратное преимущество в удельной продуктивности биомассы и улавливании С02 над традиционными сельскохозяйственными культурами и системами.
[432] Было обнаружено, что простые изменения конструкции биореактора могут увеличить объемную продуктивность С. necator до 1 г/л/час (то есть 24 г/л/сут) на
субстратах H2 и СО2. Эти простые механические улучшения увеличивают коэффициент массопередачи подачи газа в раствор (KLa) в биореакторах с мешалкой, что приводит к значительному повышению продуктивности. Кроме того, увеличение объемов реактора, в частности вертикальных размеров, приведет к увеличению перенос массы газов с низкой растворимостью, таких как Н2 и О2, за счет увеличения гидростатического давления при увеличении высоты водяного столба. Используя комбинацию улучшений конструкции реактора для увеличения Кьа и увеличения гидростатического давления с увеличением масштабов, продуктивность биомассы не менее 2 г/л/ч (т. е. 48 г/л/день) является консервативно достижимой. [433] Эти расчеты из эмпирических наборов данных демонстрируют революционный потенциал водородных систем для интенсификации биологического поглощения СО2 в практичных небольших единицах площади для получения полезной биомассы и производства белка.
Пример 16
[434] Интегрированная система может иметь стехиометрию, как изображено на Фигуре 30.
[435] Формула реакции биосинтеза представляет собой реакцию, полученную из эмпирических данных для водородного микроорганизма Cupriavidus necator с использованием 16,4 молекул водорода и 3,2 молекул кислорода для восстановления 4,5 молекул СО2 в клеточный материал. Предполагается, что источником азота является мочевина. Окисление пищи кислородом в организме человека для производства СО2 показано в формуле для Пищеварения, Дыхания и Экскреции человека, причем азотистые отходы считаются мочевиной. В формуле электролиза предполагается подача энергии для расщепления воды и получения кислорода и водорода, требуемых в уравнениях биосинтеза и дыхания. Эта сбалансированная система является идеализированной ситуацией для закрытой системы с участием человеческого экипажа и Cupriavidus necator.
[436] В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения энергоэффективность восстановления СО2, производимого С. necator, составляет более 40 процентов. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения энергоэффективность электролиза воды в пространстве (космосе) составляет более 70 процентов. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения энергоэффективность электролиза составляет более 75 процентов. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения
итоговая энергетическая эффективность всей цепи системы СОг-в-продукт (то есть от электричества до белковой биомассы) составляет более 28 процентов. В некоторых неограничивающих вариантах реализации изобретения эта итоговая эффективность всей системы более чем в десять раз превышает эффективность эквивалентной фотосинтетической системы. В некоторых вариантах реализации изобретения фиксированная масса системы, включающей электролизер и хемоавтотрофный биореактор, ниже, чем масса фотобиореакторов и осветительных приборов для эквивалентной системы водорослей. В некоторых вариантах реализации изобретения фиксированная масса системы, включающей электролизер и хемоавтотрофный биореактор, ниже, чем масса фотобиореакторов и осветительных приборов для эквивалентной системы водорослей и/или масса осветительных приборов и гидропонной системы и/или плантаторов для эквивалентной системы сельскохозяйственных культур высших растений.
Пример 17
[437] На Фигуре 31 изображена общая схема технологического процесса для некоторых вариантов реализации данного изобретения, которая имеет (А) стадию процесса генерации доноров электронов (например, доноров электронов, представляющих собой молекулярный водород), пригодных для поддержки хемосинтеза, с помощью входного потока энергии и неорганического химического сырья (например, воды); (В) с последующей доставкой полученных доноров электронов, представляющих собой Н2 и акцепторов электронов, представляющих собой 02, воды, минеральных питательных веществ, а также СО2, взятого из точечного источника промышленного дымового газа или другого источника СО2, на стадию реакции химиосинтеза (С) или стадии, проходящие в одном или более биореакторов (4), в которых используются оксигидрогеновые микроорганизмы для захвата и фиксации углекислого газа и создания белковой биомассы посредством реакций хемосинтеза; (D) параллельно происходит получение избыточных химических побочных продуктов, полученных на стадии генерации донора электронов (например, О2); с последующими стадиями (Е) процесса извлечения продуктов биомассы из технологического потока; и (F) повторное использование неиспользуемых питательных веществ и технологической воды, а также клеточной массы, необходимой для поддержания культуры микроорганизмов, обратно в стадии реакции фиксации углерода (т.е. обратно в биореакторы).
[438] В конкретном варианте реализации изобретения, изображенном на Фигуре 31, дымовой газ, содержащий СОг, захватывается из точечного источника или эмиттера. Такие источники или эмиттеры включают, но не ограничиваются этим, электростанции, нефтеперерабатывающие заводы или производители цемента. Доноры электронов (например, Н2), необходимые для хемосинтеза, могут быть получены из сырья в виде неорганических химических веществ и энергии. В некоторых вариантах реализации изобретения водород образуется в результате процесса, во время которого не происходит выбросов углекислого газа. Типовые процессы генерации водорода, во время которых не происходит выбросов углекислого газа, включают, например, электролитические или термохимические процессы, известные в данной области техники, которые обеспечиваются энергией от источников энергии, включая, но не ограничиваясь этим, фотоэлектрическую энергию и/или солнечную тепловую энергию, энергию ветра, гидроэлектроэнергию, ядерную, геотермальную, геотермальную с повышенным КПД преобразования, энергию тепла океана, энергию океанских волн, энергию приливов. Дымовой газ может прокачиваться через биореакторы (4), содержащие оксигидрогеновые микроорганизмы, вместе с донорами электронов и акцепторами электронов, необходимыми для проведения хемосинтеза и среду, подходящую для поддержания культуры микроорганизмов и фиксации углерода посредством хемосинтеза. В неограничивающем наборе вариантов реализации изобретения, изображенном на Фигуре 31, доноры электронов, представляющие собой водород, и акцепторы электронов, представляющие собой кислород и углекислый газ сжимаются и непрерывно подаются в культуральную жидкость вместе с другими питательными веществами, необходимыми для хемосинтеза, поддержания и роста культуры, причем они закачиваются в один или более биореакторов, содержащих один или более водородных микроорганизмов, таких как, но не ограничиваясь этим, один или более из следующих: Cupriavidus necator, Rhodococcus opacus и/или других Rhodococcus sp., Hydrogenovibrio marinus, Rhodopseudomonas capsulata, Hydrogenobacter thermophilus, и/или Xanthobacter autotrophicus. В наборе неограничивающих вариантов реализации изобретения, изображенном на Фигуре 31, кислород используется в качестве акцептора электронов в реакции хемосинтеза для внутриклеточного производства АТФ в реакции окисления водорода кислородом, связанной с окислительным фосфорилированием. Кислород может быть получен из дымового газа и/или он может быть образован в результате реакции расщепления воды, используемой для получения водорода, и/или он может быть получен из
воздуха. На Фигуре 31 углекислый газ из дымового газа используется в качестве акцептора электронов (не респираторно, анаболически) для синтеза органических соединений, в том числе посредством биохимических путей, в которых используется АТФ, продуцируемый во время реакции окисления водорода кислородом, и НАДН и/или НАДФН, продуцируемых во время внутриклеточного ферментативно катализируемого восстановления НАД+ или НАДФ+ с помощью Н2. Культура клеток может непрерывно протекать в биореакторы и выводиться из них. После того, как культура клеток выходит из биореакторов, клеточная масса может быть отделена от жидкой среды (5). Разделение твердой и жидкой фаз можно осуществлять с использованием способов и оборудования, хорошо известных в данной области техники, таких как, но не ограничиваясь этим, центрифуги непрерывного действия или с помощью пропускания культуральной жидкости через мембранные фильтры для отделения клеточной массы от жидкости. Клеточная масса, необходимая для пополнения популяции культуры клеток на желательном (например, оптимальном) уровне, может быть возвращена обратно в биореактор. Избыточная клеточная масса может быть высушена (8) с образованием продукта сухой биомассы, который может быть подвергнут последующей переработке (9) в различные кормовые, белковые, пищевые продукты, удобрения, химические или топливные продукты. Последующая переработка белковой биомассы в приготовления корма для животных и/или растительных удобрений может быть выполнена в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники. После этапа разделения клеток внеклеточные химические продукты реакции хемосинтеза могут быть выведены из технологического потока и извлечены. Затем удаляются любые нежелательные отходы, которые могут присутствовать (7). При необходимости в биореактор может быть добавлена замещающая вода и/или питательные вещества для компенсации любых потерь из-за отбора биомассы и/или других выводящих потоков.
Пример 18 Скрининг хемоавтотрофных штаммов [439] Штаммы сначала подвергали скринингу на предмет хемоавтотрофного роста на чашках с использованием емкости Almore's Vacu-Quick. Перспективные штаммы затем тестировали в жидкой культуре.
[440] Минимальную солевую среду (MSM) готовили, как описано выше, объединяли и асептически добавляли в чашки с агарозой (1,5%). Были протестированы 162 штамма-кандидата из следующих родов: Cupriavidus;
Xanthobacter; Dietzia; Gordonia; Mycobacterium; Nocardia; Pseudonocardia; Arthrobacter; Alcanivorax; Rhodococcus; Streptomyces; Rhodopseudomonas; Rhodobacter; и Acinetobacter.
[441] Каждый штамм помещали на чашку с минимальной солевой средой (MSM) + агароза (1,5%). Затем все соответствующие чашки помещали в емкость Almore's Vacu-Quick. На дне каждой камеры укладывалось стерильное бумажное полотенце, пропитанное стерильной водой, для поддержания влажности в камере и предотвращения высыхания чашек во время инкубации. Затем из газонепроницаемых камер, заполненных чашками, откачивали воздух; с последующей подачей газовой смеси Н2:С02:воздух (70/10/20). Газы обеспечивали единственный источник энергии и углерода для роста. Газовые камеры инкубировали при температуре 30 °С в течение 7-10 дней, каждый день пропуская свежую газовую смесь.
[442] Из чашек, где был выявлен хемоавтотрофный рост/колонии, колонии отбирали и затем помещали на свежие чашки с минимальной солевой средой (MSM) + агароза (1,5%), а затем проводили вторую инкубацию в емкости Almore's Vacu-Quick, в которой присутствовали Нг и СОг и воздух (70/10/20). Штаммы, которые проявили сильный рост колоний при этой второй инкубации, затем подвергались хемоавтотрофному тестированию в жидкой минимальной солевой среде (MSM). [443] Эксперименты проводили в пробирках Hungate (Chemglass CLS-4209-10, анаэробные, 18 х 150 мм) с рабочим объемом 5 мл, закрытых плотными неопреновыми резиновыми пробками (Wheaton Science Products, №: 224100331), обжатых алюминиевой крышкой. Пробирки продували газовой смесью Н2:С02:воздух (70/10/20) с использованием газового коллектора, предназначенного для высокопроизводительного скрининга. В пробирки подавалась свежая газовая смесь каждый день.
[444] Пробирки инкубировали в шейкере Multitron Pro Infors НТ под углом 45° при 600 об/мин и температуре 30 °С в течение 96 часов. Оптическую плотность при 600 нм измеряли с помощью спектрофотометра (Genesys 10S, UV-Vis spectrophotometer, Thermo Scientific) каждые 24 часа. [445] Следующие штаммы бактерий были идентифицированы как хемоатротрофные на водородной смеси: Arthrobacter methylotrophus DSM 14008; Rhodococcus opacus DSM 44304; Rhodococcus opacus DSM 44311; Xanthobacter autotrophicus DSM 431; Rhodococcus opacus DSM 44236; Rhodococcus ruber DSM 43338; Rhodococcus opacus DSM 44315; Cupriavidus metallidurans DSM 2839;
Rhodococcus aetherivorans DSM 44752; Gordonia desulfuricans DSM 44462; Gordonia polyisoprenivorans DSM 44266; Gordoniapolyisoprenivorans DSM 44439; Gordonia rubripertincta DSM 46039; Rhodococcuspercolatus DSM 44240; Rhodococcus opacus DSM 43206; Gordonia hydrophobica DSM 44015; Rhodococcus zopfii DSM 44189; Gordonia westfalica DSM 44215, Xanthobacter autotrophicus DSM 1618; Xanthobacter autotrophicus DSM 2267; Xanthobacter autotrophicus DSM 3874; Streptomycetes coelicoflavus DSM 41471; Streptomycetes griseus DSM 40236; Streptomycetes sp. DSM 40434; Streptomycetes xanthochromogenes DSM 40111; Streptomycetes thermocarboxydus DSM 44293; Rhodobacter sphaeroides DSM 158. [446] Полный технический анализ проводился на водородных штаммах, выращенных в жидких средах MSM, с водородной смесью в качестве единственного источника углерода и энергии. Было отмечено, что С. necator DSM 531 и DSM 541 накапливают более 70% и более 80% общего белка по массе соответственно в случае образцов, взятых во время фазы арифметического роста. Также наблюдались, что как С. necator DSM 531, так и DSM 541 синтезировали витамины, включая витамин В1, витамин В2 и витамин В12.
Пример 19
[447] В некоторых вариантах реализации данного изобретения используются возобновляемые источники энергии периодического действия, такие как солнечная энергия и ветер, для получения Нг, необходимого для фиксации углерода. Источник СОг представляет собой промышленный источник, например, электростанцию. Электролизеры обычно потребляют энергию во время периодов низкого спроса на электроэнергию и высоким уровнем энергоснабжения из возобновляемых источников. Во время таких периодов низкого спроса и высокого уровня генерации энергии из возобновляемых источников, не имеющих выбросов СО2 производство электроэнергии достигает 95% в таких регионах, как Техас, Шотландия и Германия. Таким образом, электролизер потребляет энергию, получение которой не сопровождается выбросами СО2 для производства Н2 из воды и не потребляет или потребляет небольшую часть энергии, производство которой сопровождается выбросами СО2. В таких регионах на периоды с высоким уровнем возобновляемой энергии и низким спросом в электросети приходится примерно 50% времени, и, как ожидается, электролизер будет работать примерно 50% времени. Хранения резервуаров Н2 и СО2 непосредственно на месте сглаживает различия во времени между выделением СО2 из промышленного источника и производством Н2 из
электролизера, что обеспечивает непрерывный поток обоих этих газов в биопроцесс с фиксацией СО2. Хемоавтотрофные водородные микроорганизмы конвертируют СО2, Н2 и минеральные питательные вещества (т.е. NPK) в биомассу с высоким содержанием белка (см. Фигуру 32). О2 от электролизера превышает потребность микроаэробного процесса с водородными организмами. Этот избыток О2 может быть продан в качестве побочного продукта в виде чистого газа или подаваться обратно для сжигания ископаемого топлива или в силовую установку с целью повышения тепловой эффективности установки и увеличения концентрации СО2 в потоке дымовых газов, выходящих из установки. Повышенная концентрация СО2 облегчает этап улавливания углерода.
[448] В некоторых вариантах реализации изобретения общий процесс согласно изобретению объединяет три основные части, в двух из которых могут применять коммерчески доступные единицы, и хемоавтотрофный биопроцесс с фиксацией СО2 и связанные с ним стадии последующей обработки, описанные в данном документе. Две коммерчески доступные единицы на передней панели для обеспечения СО2 и Н2 в биопроцесс представляют собой: получение СО2 из дымовых газов; и электролиз воды с использованием в основном энергии из возобновляемых источников. Для достижения углеродной нейтральности система может быть расположена в регионах с высоким уровнем периодической генерации энергии из возобновляемых источников. Электролизерный блок потребляет электроэнергию только в периоды низкого спроса на электроэнергию и избыточного производства энергии из возобновляемых источников. Это уменьшает нагрузку на электрическую сеть, вызванную периодической генерацией энергии из возобновляемых источников. Основным действующим применением для технологии электролиза является преобразование Н2, произведенного в периоды избыточной подачи возобновляемой энергии обратно в электрическую сеть в периоды высокого спроса и низкой подачи энергии из возобновляемых источников - и эффект от этого идет по цепи ценности от Н2 до электричества. Описанный в данном документе процесс конвертирует Н2 и СО2 в белок - в результате продолжается в цепь создания добавленной стоимости, от Н2 до белка.
[449] Хотя вышеописанное изобретение было описано в деталях с помощью графических материалов и примеров с целью ясности понимания, специалистам в данной области техники будет очевидно, что некоторые изменения и модификации могут быть осуществлены на практике без отхода от сущности и объема
изобретения. Таким образом, описание не следует понимать как ограничивающее объем изобретения, который указан в прилагаемой формуле изобретения. [450] Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в данном документе, включены в данный документ в полном объеме посредством ссылки для всех целей и в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были специально и индивидуально обозначены как включенные посредством ссылки.
Список литературы
1. J. Е. Bailey and D. F. Ollis. Biochemical Engineering Fundamentals. Chemical engineering. McGraw-Hill, 1986.
2. L. Bongers. Energy generation and utilization in hydrogen bacteria. Journal of bacteriology, 104(1): 145-151, October 1970.
3. G. L. Drake, C. D. King, W. A. Johnson, and E. A. Zuraw. Study of life support systems for space missions exceeding one year in duration. Technical Report SP-134, NASA, April 1966.
4. Curt R. Fischer, Daniel Klein-Marcuschamer, and Gregory Stephanopoulos. Selection and optimization of microbial hosts for biofuels production. Metabolic Engineering, 10(6):295-304, November 2008.
5. Michele R. Hamester, Pal ova S. Balzer, and Daniela Becker. Characterization of calcium carbonate obtained from oyster and mussel shells and incorporation in polypropylene. Materials Research, 15:204-208, 2012.
6. R. Heise, V. Miiller, and G. Gottschalk. Sodium dependence of acetate formation by the acetogenic bacterium acetobacterium woodii. Journal of Bacteriology, 171(10):5473-5478, October 1989.
7. Michael Hiigler, Carl O. Wirsen, Georg Fuchs, Craig D. Taylor, and Stefan M. Sievert. Evidence for autotrophic C02 fixation via the reductive tricarboxylic acid cycle by members of the s subdivision of proteobacteria. Journal of Bacteriology, 187(9): 3020-3 027, May 2005.
8. J. K. Kristjansson. Thermophilic Bacteria. Taylor & Francis, 1992.
9. Sang Y. Lee, Jin H. Park, Seh H. Jang, Lars K. Nielsen, Jaehyun Kim, and Kwang S. Jung. Fermentative butanol production by Clostridia. Biotechnol. Bioeng., 101(2):209-228, October 2008.
10. J. Lengeler, G. Drews, and H. Schlegel. Biology of the Prokaryotes. Wiley, 2009.
11. L. G. Ljungdahl. The autotrophic pathway of acetate synthesis in acetogenic bacteria. Annual Review of Microbiology, 40(l):415-450, 1986.
12. Akane Miura, Masafumi Kameya, Hiroyuki Arai, Masaharu Ishii, and Yasuo Igarashi. A soluble NADH-dependent fumarate reductase in the reductive tricarboxylic acid cycle of
hydrogenobacter thermophilus TK-6. Journal of bacteriology, 190(21):7170-7177, November 2008.
13. Eleftherios T. Papoutsakis. Equations and calculations for fermentations of butyric acid bacteria. Biotechnol. Bioeng, 26(2): 174-187, February 1984.
14. Kathleen M. Scott and Colleen M. Cavanaugh. C02 uptake and fixation by endosymbiotic chemoautotrophs from the bivalve solemya velum. Applied and Environmental Microbiology, 73(4): 1174-1179, February 2007.
15. J. M. Shively, G. van Keulen, and W. G. Meijer. Something from almost nothing: carbon dioxide fixation in chemoautotrophs. Annual review of microbiology, 52:191-230, 1998.
16. Arnold J. Smith, Jack London, and Roger Y. Stanier. Biochemical basis of obligate autotrophy in Blue-Green algae and thiobacilli. Journal of Bacteriology, 94(4):972-983, October 1967.
17. F. B. Taub, F. E. Palmer, R. E. Condrey, R. B. Kern, K. A. Ballard, and D. F. Kalamasz. Algal culture as aquaculture feed. Research in fisheries, 1973.
18. Frieda B. Taub. Closed ecological systems. Annual Review of Ecology and Systematics, 5:139-160, 1974.
19. Rudolf K. Thauer, Anne-Kristin Kaster, Henning Seedorf, Wolfgang Buckel, and Reiner Hedderich. Methanogenic archaea: ecologically relevant differences in energy conservation. Nature Reviews Microbiology, 6(8):579-591, June 2008.
20. Gil-Lim Yoon, Byung-Tak Kim, Baeck-Oon Kim, and Sang-Hun Han. Chemical-mechanical characteristics of crushed oyster-shell. Waste Management, 23(9):825-834, January 2003.
21. Hyunsuk Yoon, Sangkyu Park, Kiho Lee, and Junboum Park. Oyster shell as substitute for aggregate in mortar. Waste Management & Research, 22(3): 158-170, June 2004.
22. Closed Ecological Systems Annual Review of Ecology and Systematics, Vol. 5 (1974), pp. 139-160 by Frieda B. Taub, and G. L. Drake, C. D. King, W. A. Johnson, and E. A. Zuraw, "Study of life support systems for space missions exceeding one year in duration," NASA, Tech. Rep. SP-134, Apr. 1966
13.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТНИЯ
1. Биологический и химический способ улавливания и конверсии неорганических и/или органических молекул, содержащих только один атом углерода, в органические молекулы, содержащие два или более атомов углерода, продуцируемые путем анаболического биосинтеза, включающий:
введение неорганических и/или органических молекул, содержащих только один атом углерода, в среду, пригодную для поддержания хемоавтотрофных микроорганизмов;
введение газообразного субстрата в среду, пригодную для поддержания хемоавтотрофных микроорганизмов;
причем неорганические и/или органические молекулы, содержащие только один атом углерода, используются микроорганизмом в качестве источника углерода для роста и/или биосинтеза;
конверсию указанных неорганических и/или органических молекул, содержащих только один атом углерода, в продукты из органических молекул, содержащих два или более атомов углерода, в указанной среде посредством по меньшей мере одной хемосинтетической реакции фиксации углерода и по меньшей мере одного анаболического пути биосинтеза, который содержится в пределах указанных хемоавтотрофных микроорганизмов;
причем хемосинтетическая реакция фиксации и анаболический путь биосинтеза, по меньшей мере, частично питаются химической и/или электрохимической энергией, обеспечиваемой донорами электронов и акцепторами электронов, которые были произведены химически и/или электрохимически и/или термохимически и/или введены в указанную среду из по крайней мере, одного источника, внешнего по отношению к среде.
2. Способ по п. 1, в котором указанный микроорганизм представляет собой бактериальную клетку.
3. Способ по п. 1, в котором указанный газообразный субстрат содержит СОг в качестве источника углерода.
4. Способ по п. 1, в котором указанный газообразный субстрат содержит Н2 и/или О2 в качестве источника энергии.
5. Способ по п. 1, в котором указанный газообразный субстрат содержит пиролизный газ или генераторный газ или синтез-газ.
6. Способ по п. 1, в котором указанный газообразный субстрат содержит смесь газов, содержащую Н2 и/или СОг и/или СО.
7. Способ по п. 1, в котором указанный микроорганизм продуцирует аминокислоты и/или белок и/или витамины и/или биомассу при культивировании в присутствии газового субстрата в условиях, подходящих для роста указанного микроорганизма и производства биопродуктов.
8. Способ по п. 1, в котором указанный микроорганизм представляет собой Cupriavidus sp. или Ralstonia sp.
9. Способ по п. 1, в котором указанный микроорганизм представляет собой Cupriavidus necator.
10. Способ по п.1, в котором указанные микроорганизмы и/или питательные вещества, полученные с помощью указанных микроорганизмов, используются в качестве корма или для обеспечения питания одного или более других организмов.
11. Способ по п. 1, в котором указанные микроорганизмы представляют собой водородные микроорганизмы.
12. Способ по п. 11, в котором указанный газообразный субстрат содержит Н2 и/или СО2.
13. Способ по п. 11, в котором указанный газообразный субстрат представляет собой пиролизный газ или генераторный газ или синтез-газ.
14. Способ по п. 13, в котором указанный газообразный субстрат получен из твердых бытовых отходов, черного щелока, сельскохозяйственных отходов, древесных отходов, труднодоступного природного газа, биогаза, сернистого газа, гидратов метана, шин, нефтяного кокса, сточных вод, навоза, соломы, лигноцеллюлозных энергетических культур, лигнина, растительных остатков, жмыха, опилок, остатков лесного хозяйства,
10.
пищевых отходов, отходов дорожного покрытия, отходов пластмассы, свалочного газа, келпа, водорослей и/или лигноцеллюлозной биомассы.
15. Способ по п.1, в котором аминокислоты и/или белок и/или витамины и/или биомасса извлекаются из культуральной среды.
16. Способ по п.1, в котором указанные доноры электронов и/или молекулы, содержащие только один атом углерода, образуются посредством термохимического процесса, действующего на органическое вещество, включающего по меньшей мере одно из: газификацию; пиролиз; паровой реформинг; автореформинг.
17. Способ по п.1, в котором указанные доноры электронов и/или органические молекулы, содержащие только один атом углерода, образуются посредством парового реформинга метана.
18. Способ по п. 16 или п. 17, в котором соотношение водорода и угарного газа в получаемом на выходе газе при газификации и/или пиролизе и/или автореформинге и/или паровом реформинге регулируется с использованием реакции конверсии водяного газа до подачи газа микроорганизмам.
19. Способ по п. 1, в котором микроорганизмы включают микроорганизмы, выбранные из одного или более из следующих родов: Cupriavidus sp., Rhodococcus sp., Hydrogenovibrio sp., Rhodopseudomonas sp., Hydrogenobacter sp., Gordonia sp., Arthrobacter sp., Streptomycetes sp. Rhodobacter sp., и/или Xanthobacter.
20. Способ по п.1, в котором указанные доноры электронов включают, но не ограничиваются этим, один или более из следующих восстановителей: аммиак; аммоний; монооксид углерода; дитионит; элементарная сера; углеводороды; водород; метабисульфиты; оксид азота; нитриты; сульфаты, такие как тиосульфаты, включая, но не ограничиваясь этим, тиосульфат натрия (МагБгОз) или тиосульфат кальция (СаБгОз); сульфиды, такие как сероводород; сульфиты; тионаты; тиониты; переходные металлы или их сульфиды, оксиды, халькогениды, галогениды, гидроксиды, оксигидроксиды, фосфаты, сульфаты или карбонаты, в растворенных или твердых фазах; и электроны проводимости или валентной зоны в материалах твердотельных электродов.
15.
21. Способ по п. 1, в котором указанные акцепторы электронов содержат одно или более из следующего: диоксид углерода; кислород; нитриты; нитраты; ионы трехвалентного железа или других переходных металлов; сульфаты; или дыры зоны проводимости или валентной зоны в материалах твердотельных электродов.
22. Способ по п. 1, в котором этапу биологической конверсии предшествует один или более этапов химической предварительной обработки, в которых указанные доноры электронов и/или акцепторы электронов и/или источники углерода и/или минеральные питательные вещества, необходимые микроорганизму, производятся и/или очищаются из по меньшей мере, одного входящего химического вещества и/или повторно используются из химических веществ, появляющихся на стадии фиксации углерода, и/или полученных из или содержащихся в потоке отходов других промышленных, горнодобывающих, сельскохозяйственных, сточных или отходообразующих процессов.
23. Способ по п.1, в котором указанные доноры электронов и/или акцепторы электронов производятся или повторно используются с применением возобновляемых, альтернативных или традиционных источников энергии, которые обеспечивают низкий уровень выбросов парниковых газов, причем упомянутые источники энергии выбраны, по меньшей мере, из одной из фотоэлектрической, солнечной тепловой, ветровой, гидроэлектрической, ядерной, геотермальной, геотермальной с повышенным КПД преобразования, тепловой океанической, энергии волн и энергии приливов океана.
24. Способ по п. 1, в котором указанные доноры электронов и/или акцепторы электронов производятся с использованием электросети в периоды, когда производство электроэнергии в электросети превышает потребность в электроэнергии, причем резервуары хранения буферизуют генерацию указанных доноров электронов и/или акцепторов электронов и их потребление в хемосинтетической реакции.
25. Способ по п. 1, в котором указанный органический химический продукт включает соединения с углеродными скелетами, которые содержат пять атомов углерода или более.
26. Способ по п. 1, в котором молекулярный водород действует как донор электронов и производится способом, использующим по меньшей мере одно из следующего: электролиз воды; термохимическое расщепление воды; электролиз солевого раствора; электролиз и/или термохимическое расщепление сероводорода.
15.
27. Способ по п. 26, в котором электролиз воды для получения водорода осуществляется с использованием одного или более из следующего: протонообменные мембраны (РЕМ), жидких электролитов, таких как КОН, щелочного электролиза, электролиза с использованием электролита на основе твёрдых полимеров, электролиза при высоком давлении, электролиз водяных паров при высокой температуре (HTES).
28. Способ по п. 26, в котором термохимическое расщепление воды для получения водорода осуществляется с использованием одного или более из следующего: цикл оксида железа, цикл оксид церия (ГУ)-оксид церия (III), цикл цинк-оксид цинка, цикл йод-сера, цикл медь-хлор, цикл кальций-бром-железо, гибридный цикл серы.
29. Способ по п.1, в котором молекулярный водород действует в качестве донора электронов и производится посредством электрохимических или термохимических процессов, которые, как известно, обеспечивают получение водорода с низкими или отсутствующими выбросами углекислого газа, включая одно или более из следующего: реформинг паров метана с возможностью улавливания и секвестрования углерода (CCS); газификация угля с возможностью CCS; Кварнер-процесс и другие процессы, обеспечивающие получение чистого углерода в качестве продукта; газификация или пиролиз биомассы с возможностью CCS; пиролиз биомассы, обеспечивающий получение биоугольного побочного продукта.
30. Способ производства аминокислот и/или белка и/или витаминов и/или биомассы, включающий культивирование микроорганизма, как указано в п. 1, в биореакторе, который содержит газообразный субстрат и культуральную среду, которая содержит другие питательные вещества для роста и производства биопродукта в условиях, которые пригодны для выращивания микроорганизма и производства аминокислот и/или белка и/или витаминов и/или биомассы, причем указанный микроорганизм продуцирует аминокислоты и/или белок и/или витамины и/или биомассу.
31. Способ по п.1, в котором по меньшей мере, одна реакция хемосинтеза и, по меньшей мере, один анаболический путь биосинтеза приводят к образованию биохимикатов, включающих по меньшей мере одно из: аминокислоты; пептиды; белки; липиды; полисахариды; и/или витамины.
15.
32. Способ по п.1, в котором биомасса и/или биохимикаты получают во время указанной, по меньшей мере, одной реакции хемосинтеза, причем биомасса и/или биохимикаты имеют применение в качестве по меньшей мере одного из следующего: источника органического углерода и/или азота для ферментации; источника питательных веществ для роста других микробов или организмов; источника питательных веществ или пищевого ингредиента для людей; корма для животных; сырья или химического промежуточного продукта для производства или химических процессов; источников фармацевтических, лекарственных или питательных веществ; удобрения; почвенной добавки; и/или стабилизаторов грунта.
33. Способ по п.32, в котором указанный источник углерода и/или азота из указанной реакции хемосинтеза используется в ферментации для получения биохимических веществ, включая, по меньшей мере, одно из: коммерческие ферменты, антибиотики, аминокислоты, белки, пищевые продукты, пищевые ингредиенты; витамины, липиды, биопластики, полисахариды, биологически активные добавки, фармацевтические препараты.
34. Способ по п.32, в котором указанный корм для животных используется для кормления одного или более из: крупного рогатого скота, овец, цыплят, свиней, рыб, моллюсков, насекомых, беспозвоночных и кораллов.
35. Способ по п. 34, в котором указанные моллюски или кораллы при выращивании с использованием питательных веществ, биосинтезированных из С1 источников, производят карбонатные материалы, которые фиксируют СОг в твердой минерализованной форме с высоким альбедо.
15.
in to о
<|
о ю
Кислот (пример!
Может производить по меньшей мере в восемь раз больше АТФ в расчете на потребляемый Н2 или СО в сравнении с метаногенами или ацетогенами
Анаболический синтез более эффективен, больше углерода может быть переведено в желаемый продукт биомассы, а не в продукты дыхания, такие как метан или короткоцепочечная органическая кислота (С2- С4)
Фиг. 1
ю о
to -(^
Средняя 0D# Значения OD
1.4
\2 1
0OJ8
0.4 02 0
Г ¦ *-*
* "
1 1 1 1-
О 10 20 Э0 40 SO
Время (часов)
S Q
Ш 1С
-(c)ST e
20 30
Время (часов)
1000
100
0.1
0.01
IOD
1 2 3 4 5 6
Фиг. 6
Условия роста
Организм
Гетеротрофно
Хемоавтотрофно
R. орасие (DSM 44193}
9.00 (6d)
0.00
R. opacus
(DSM 43205}
S.00(6d)
1.00 (Sd)
Rhodococcus sp. (DSM 3346)
2.40 (3d)
0.51 (9d)
Cupriavidus necator (DSM 531)
2.20 (3d)
0.23 (3d)
Фиг. 7
Реактор 1 (20п/16л рабочего обема)
, Верхняя пластина реактора обеспечивает герметичное зластомерное уплотнение для всех соединений и сквозных каналов
Датчики температуры, растворенного кислорода и давления
- Барботажное устройство
*• Внешняя нагревающая оболочка
j Контроллер 5 реактора (
Сигналы и кон I роль реактора 1
Вытяжной шкаф комнатного типа
Культуральные бутыли на водяной бане, 200 мл бульона/бутыль
Фиг. 18
PCT/US2017/023110 14 WO/2017/165244
r ^
ШШШШт
Фиг. 19
Подача среды
Питательные добавки и противопенная присадка через порт перегородки
Подача инокулята через газовый баллон в нижний слой жидкости
" ¦
, Т
Добавление 2N NaOH для поддержания ph 6,8
Датчики: рН/температуры, заземляющий электрод
т I
! !
Узел асептического отбора образцов в бутыли w/25 мл
Устройство для перемешивания
Биореактор 2 л (рабочий объем 1,5 л)
Фиг. 21
Верхняя пластина 2 л гхг
1. Конденсер
2. Перегородка для антивспенивателейи питательных добавок
3. Пробка
4. Барботажное устройство (стеклянная фритта)
5. Пробка
6. рН/температура
7. Пробка
8. Подача инокулята
9. Основание
10. Подача среды
11. Линия для откачки со дна/получения образца
12. Заземляющий электрод рН
G 9
Предохранительное вентиляционное устройство PRV1
Газовая смесь
фильтр
0,2 мкм
Контрольный клапан
Расходомер газа
ферментера
Стеклянная фритта для дисперсии газа
конд?н:атор
фильтр НЕРА
0,2 мкм
Образец отходящего > газа и выпускное отверстие
Образец пены
Образец поступающего газа
2 л ловушка
для пены
Конфигурация реактора объемом 2 л, газовые линии
Фиг. 23
Газовая смесь
. ?
Н/т\
> 1"~
С02 Н2
к Реактору
Вочдух
16 14 12 10
у = 0Я944х +0.4101 Н2 = 0.9Ь/
2 8 U
3 6
U 4
10 OD600
Фиг. 25
Возобновляемая энергия
Замена корма для аквакультуры и рыбной муки с высоким содержанием
белка
С02 из
дымовых газов
Фиг. 27
ОСНОВА: 1 человеко-день
Фиг. 29
ОТСЕК ЭКИПАЖА
Воздух,.
насыщенный С02
Воз без С02
Пища
Отходы
Газоочиститель С02
Переработка отходов
со2
Соли+Н,0
Электролиз
Биосинтез Н2-микроорганизмов
биомасса
Переработка пищевых продуктов
Переваривание, дыхание и экскреция человека C^C^N + SOj -" 4.5С02 + 2.5НаО + 0.5CH4NjO
Биосинтез Ж4Н2 + 4*5С02+i.202 + CSCH*N30 •? C^OjN + 13.SH20
Электролиз 164Н20 -> lMHj + &20,
Подача неорганических химикатов - +энергия
Потери тепла
Побочный
химический
продукт
--{ 6. Контроллер
клеточная
масса
Среда без клеток
L_ -_
Тепло
Собранная
клеточная масса
' Отходы
Белковые продукты, включая корм для
животных или другие питательные вещества или нутрицевтики
Фиг. 31
со2 Н20
Природный газ
Солнечная ^"""Ц^ энергия со2
Электролизер
_н,с>
ПРОИЗВОДСТВО;
электричества: превышает спрос
Биопроцесс газа
Приготовление U питательных веществ? ^
удобрения \J
Корм
Высокое содержание белка и других необходимых питательных веществ
Ветер
Избыток О2 продается
н2о
Электричество
Электрическая Производство электричества
сеть соответствует спросу
Фиг. 32
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
PCT/US2017/023110 4 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 3 WO/2017/165244
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
PCT/US2017/023110 50 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 55 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 55 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 64 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 64 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 65 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 65 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 66 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 66 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 67 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 67 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 68 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 68 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 69 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 69 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 70 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 70 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 71 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 71 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 72 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 72 WO/2017/165244
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
PCT/US2017/023110 74 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 74 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 75 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 75 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 76 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 76 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 77 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 77 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 78 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 78 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 79 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 79 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 80 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 80 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 81 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 81 WO/2017/165244
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
PCT/US2017/023110 84 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 84 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 85 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 85 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 86 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 86 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 87 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 87 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 88 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 88 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 89 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 89 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 90 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 90 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 91 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 91 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 92 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 92 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 93 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 93 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 94 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 94 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 95 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 95 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 96 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 96 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 97 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 97 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 98 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 98 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 99 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 99 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 100 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 100 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 101 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 101 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 102 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 102 WO/2017/165244
103
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
103
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
PCT/US2017/023110 104 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 104 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 105 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 105 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 106 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 106 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 107 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 107 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 108 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 108 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 109 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 109 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 110 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 110 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 111 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 111 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 112 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 112 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 113 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 113 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 114 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 114 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 115 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 115 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 116 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 116 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 117 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 117 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 118 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 118 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 119 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 119 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 120 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 120 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 121 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 121 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 122 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 122 WO/2017/165244
123
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
123
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
PCT/US2017/023110 124 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 124 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 125 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 125 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 126 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 126 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 127 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 127 WO/2017/165244
WO/2017/165244
128
PCT/US2017/0231
WO/2017/165244
128
PCT/US2017/0231
129
WO/2017/165244
PCT/US2017/0231
129
WO/2017/165244
PCT/US2017/0231
130
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
130
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
PCT/US2017/023110 131 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 131 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 132 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 132 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 133 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 133 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 134 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 134 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 135 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 135 WO/2017/165244
136
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
136
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
137
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
137
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
PCT/US2017/023110 138 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 138 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 139 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 139 WO/2017/165244
140
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
140
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
PCT/US2017/023110 141 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 141 WO/2017/165244
142
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
142
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
143
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
143
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
PCT/US2017/023110 144 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 144 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 145 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 145 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 146 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 146 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 147 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 147 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 148 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 148 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 149 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 149 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 150 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 150 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 151 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 151 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 152 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 152 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 153 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 153 WO/2017/165244
154
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
154
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
PCT/US2017/023110 155 WO/2017/165244
PCT/US2017/023110 155 WO/2017/165244
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 3
Фиг. 3
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 3
Фиг. 3
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 5
Фиг. 5
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 5
Фиг. 5
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 5
Фиг. 5
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 5
Фиг. 5
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 5
Фиг. 5
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 13
Фиг. 13
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 20
Фиг. 20
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 22
Фиг. 22
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 22
Фиг. 22
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 22
Фиг. 22
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 22
Фиг. 22
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 22
Фиг. 22
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 22
Фиг. 22
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 24
Фиг. 24
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 24
Фиг. 24
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 24
Фиг. 24
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 24
Фиг. 24
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 24
Фиг. 24
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 26
Фиг. 26
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 26
Фиг. 26
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 26
Фиг. 26
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 26
Фиг. 26
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 30
Фиг. 30
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 30
Фиг. 30
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 30
Фиг. 30
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 30
Фиг. 30
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 30
Фиг. 30
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 30
Фиг. 30
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 30
Фиг. 30
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
WO/2017/165244
PCT/US2017/023110
Фиг. 30
Фиг. 30