|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Согласно настоящему изобретению предложены кодон-оптимизированные последовательности фактора VIII, векторы и клетки-хозяева, содержащие кодон-оптимизированные последовательности фактора VIII, полипептиды, кодируемые кодон-оптимизированными последовательностями фактора VIII, и способы получения таких полипептидов. Согласно настоящему изобретению также предложены способы лечения расстройств системы свертывания крови, таких как гемофилия, включающие введение субъекту кодон-оптимизированной последовательности нуклеиновой кислоты фактора VIII или кодируемого указанной последовательностью полипептида.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Согласно настоящему изобретению предложены кодон-оптимизированные последовательности фактора VIII, векторы и клетки-хозяева, содержащие кодон-оптимизированные последовательности фактора VIII, полипептиды, кодируемые кодон-оптимизированными последовательностями фактора VIII, и способы получения таких полипептидов. Согласно настоящему изобретению также предложены способы лечения расстройств системы свертывания крови, таких как гемофилия, включающие введение субъекту кодон-оптимизированной последовательности нуклеиновой кислоты фактора VIII или кодируемого указанной последовательностью полипептида.
Евразийское (21) 201891731 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.01.31
(51) Int. Cl. C12N 9/64 (2006.01)
(54) ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ ГЕНЫ ФАКТОРА VIII
(31) 62/289,696; 62/409,739
(32) 2016.02.01; 2016.10.18
(33) US
(86) PCT/US2017/015879
(87) WO 2017/136358 2017.08.10
(71) Заявитель:
БИОВЕРАТИВ ТЕРАПЬЮТИКС ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Тан Слюан, Лиу Тонгао (US)
(74) Представитель:
Строкова О.В., Гизатуллина Е.М., Глухарёва А.О., Угрюмов В.М. (RU)
(57) Согласно настоящему изобретению предложены кодон-оптимизированные последовательности фактора VIII, векторы и клетки-хозяева, содержащие кодон-оптимизированные последовательности фактора VIII, полипептиды, кодируемые кодон-оптимизированными последовательностями фактора VIII, и способы получения таких полипептидов. Согласно настоящему изобретению также предложены способы лечения расстройств системы свертывания крови, таких как гемофилия, включающие введение субъекту кодон-оптимизи-рованной последовательности нуклеиновой кислоты фактора VIII или кодируемого указанной последовательностью полипептида.
ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ ГЕНЫ ФАКТОРА VIII
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
[0001] Содержание поданного в электронном виде как текстовый файл ASCII
(Название: 2159_469PC02_Sequencel_isting_ST25.txt; Размер: 204 138 Б; и дата создания: 31 января 2017 г.) перечня последовательностей включено в настоящий документ полностью посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0002] Путь коагуляции крови частично включает образование ферментативного
комплекса фактора Villa (FVIIIa) и фактора IXa (FIXa) (комплекс Х-азы) на поверхности тромбоцитов. FIXa представляет собой сериновую протеазу с относительно слабой каталитической активностью без кофактора FVIIIa. Комплекс Х-азы расщепляет фактор X (FX) с образованием фактора Ха (FXa), который, в свою очередь, взаимодействует с фактором Va (FVa) с расщеплением протромбина и образованием тромбина. Гемофилия А представляет собой расстройство системы свертывания крови, вызываемое мутациями и/или делециями в гене FVIII (FVIII), приводящими к дефициту активности FVIII (Peyvandi et al. 2006). В некоторых случаях у пациентов понижены уровни FVIII в результате присутствия ингибиторов FVIII, таких как антитела против FVIII.
[0003] Гемофилия А характеризуется спонтанной геморрагией и избыточным
кровотечением. Со временем многократные кровотечения в мышцах и суставах, которые часто начинаются в раннем детстве, приводят к гемофильной артропатии и необратимому повреждению суставов. Указанное повреждение прогрессирует и может приводить к серьезному ограничению подвижности суставов, атрофии мышц и хронической боли (см. источник: Rodriguez-Merchan, Е.С., Semin. Thromb. Hemost. 29:87-96 (2003), включенный в настоящий документ полностью посредством ссылки).
[0004] Лечение заболевания может проводиться с применением заместительной
терапии, нацеленной на восстановление активности FVIII до 1-5% от нормальных уровней для предотвращения спонтанного кровотечения (см., например, источник: Mannucci, P.M., et al., N. Engl. J. Med.344:1773-9 (2001), полностью включенный в настоящий документ посредством ссылки). Существуют доступные происходящие из плазмы и рекомбинантные продукты FVIII для лечения эпизодов кровотечения по мере необходимости или для предотвращения возникновения эпизодов кровотечения путем профилактического лечения. Основанные на времени полужизни указанных продуктов (10-12 ч) (White G.C., et al.,Thromb. Haemost. 77:660-7 (1997); Morfini, M., Haemophilia 9 (suppl 1):94-99; описание 100 (2003)) схемы лечения требуют частого внутривенного введения, как правило, от двух до трех раз еженедельно для профилактики и 1-3 раза ежедневно при лечении по мере
необходимости (Manco-Johnson, M.J., et al., N. Engl. J. Med. 357:535-544 (2007)); все указанные выше источники включены в настоящий документ полностью посредством ссылки. Такое частое введение является неудобным и затратным.
[0005] Основное препятствие для предоставления пациентам недорогостоящего
рекомбинантного белка FVIII заключается в высокой стоимости коммерческого производства. Белок FVIII неудовлетворительно экспрессируется в гетерологичных экспрессионных системах, в количествах, на 2-3 порядка величины меньших, чем белки аналогичного размера. (Lynch et al., Hum. Gene. Ther; 4:259-72 (1993). Неудовлетворительная экспрессия FVIII отчасти обусловлена присутствием ингибирующих экспрессию FVIII цис-действующих элементов в кодирующей последовательности FVIII, таких как сайленсерные транскрипционные элементы (Hoeben et al., Blood 85:2447-2454 (1995)), подобные областям прикрепления к матриксу последовательности (MARS) (Fallux et al., Mol. Cell. Biol. 16:4264-4272 (1996)) и ингибирующие удлинение транскрипционные элементы (Koeberl et al., Hum. Gene. Ther.; 6:469-479 (1995)).
[0006] Прогресс в понимании биологии экспрессии FVIII привел к разработке более
активных вариантов FVIII. Например, биохимические исследования показали, что В-домен
FVIII не является обязательным для кофакторной активности FVIII. Делеция В-домена
приводила к 17-кратному увеличению уровней мРНК по сравнению с полноразмерным FVIII
дикого типа, и к 30% увеличению количества секретируемого белка. (Toole et al., Proc Natl
Acad Sci USA 83:5939-42 (1986)). Это привело к разработке концентрата белка FVIII с
делециями в В-домене (BDD), который в настоящее время широко применяется в
клинической практике. Недавние исследования, однако, показывают, что полноразмерный
и BDD hFVIII подвергаются неправильной укладке в просвете ЭР, что приводит к активации
отклика неструктурированных белков (ОНБ) и апоптозу гепатоцитов мыши.
[0007] Соответственно, в данной области техники существует потребность в
нахождении последовательностей FVIII, эффективно экспрессируемых в гетерологичных системах.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Предложены кодон-оптимизированные молекулы нуклеиновой кислоты,
кодирующие полипептид с активностью FVIII. Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида фактора VIII (FVIII), и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-2277 и 23202
1791 последовательности SEQ ID NO: 3 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; и при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII.
[0009] Согласно настоящему изобретению также предложена выделенная
молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-2277 и 2320^374 последовательности SEQ ID NO: 5 или (ii) 1792-2277 и 2320^374 последовательности SEQ ID NO: 6; и при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII.
[0010] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 2. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 70. Согласно другому варианту реализации настоящего
изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 71.
[0011] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом
указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой
кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере
приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере
приблизительно 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%
или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям
нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3.
[0012] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 4.
[0013] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 582277 и 2320^374 последовательности SEQ ID NO: 5.
[0014] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 582277 и 2320^374 последовательности SEQ ID NO: 6.
[0015] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложен способ увеличения экспрессии полипептида с активностью FVIII у субъекта,
включающий введение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты или вектора согласно
описанию в настоящем документе нуждающемуся в этом субъекту, отличающийся тем, что
экспрессия указанного полипептида увеличивается относительно экспрессии,
обеспечиваемой референсной молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO:
16, или вектором, содержащим указанную референсную молекулу нуклеиновой кислоты.
[0016] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложен способ лечения расстройства системы свертывания крови, включающий: введение нуждающемуся в этом субъекту молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или полипептида согласно описанию в настоящем документе. ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0017] Е1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида фактора VIII (FVIII), и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-2277 и 23201791 последовательности SEQ ID NO: 3 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; и при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII.
[0018] Е2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е1,
отличающаяся тем, что указанная первая последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 3 или нуклеотиды 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4.
[0019] ЕЗ. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е1 или Е2,
отличающаяся тем, что указанная вторая последовательность нуклеотидов обладает по
меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3, или 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 4.
[0020] Е4. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е1 или Е2,
отличающаяся тем, что указанная вторая последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3, или 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 4.
[0021] Е5. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 или (ii) 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6; и при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII.
[0022] Е6. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е5,
отличающаяся тем, что указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотиды 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5, или 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6.
[0023] Е7. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е5 или Е6,
отличающаяся тем, что указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 5 или нуклеотидам 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 6.
[0024] Е8. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е5 или Е6,
отличающаяся тем, что указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотиды 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 5 или нуклеотиды 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 6.
[0025] Е9. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой
кислоты, обладающую по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 1.
[0026] ЕЮ. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е9,
отличающаяся тем, что указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 1.
[0027] Е11. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом
указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой
кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере
приблизительно 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%
или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям
нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 2.
[0028] Е12. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно ЕЮ,
отличающаяся тем, что указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 2.
[0029] Е13. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 70.
[0030] Е14. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е13,
отличающаяся тем, что указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 70.
[0031] Е15. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 71.
[0032] Е16. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е15,
отличающаяся тем, что указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 71.
[0033] Е17. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом
указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой
кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере
приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере
приблизительно 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%
или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям
нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3.
[0034] Е18. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е17,
отличающаяся тем, что указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3.
[0035] Е19. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 4.
[0036] Е20. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е19,
отличающаяся тем, что указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 4.
[0037] Е21. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 582277 и 2320^374 последовательности SEQ ID NO: 5.
[0038] Е22. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е21,
отличающаяся тем, что указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5.
[0039] Е23. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 582277 и 2320^374 последовательности SEQ ID NO: 6.
[0040] Е24. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е23,
отличающаяся тем, что указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6.
[0041] Е25. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. Е1-
Е24, отличающаяся тем, что указанная последовательность нуклеотидов дополнительно
содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид.
[0042] Е26. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е25,
отличающаяся тем, что указанный сигнальный пептид представляет собой FVIII сигнальный пептид.
[0043] Е27. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е25 или Е26,
отличающаяся тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, кодон-оптимизирована.
[0044] Е28. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. Е25-
Е27, отличающаяся тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты,
кодирующая сигнальный пептид, обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%,
по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере
96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%
идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1-57
последовательности SEQ ID NO: 1; (ii) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO:
2; (iii) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 3; (iv) нуклеотидов 1-57
последовательности SEQ ID NO: 4; (v) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO:
5; (vi) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 6; (vii) нуклеотидов 1-57
последовательности SEQ ID NO: 70; (viii) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID
NO: 71; или (ix) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 68.
[0045] E29. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. Е1-
Е28, отличающаяся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты обладает одним или более свойством, выбранным из группы, состоящей из следующих свойств: (а) индекс адаптации кодонов для человека указанной молекулы нуклеиновой кислоты или ее части увеличен относительно последовательности SEQ ID NO: 16;
(b) частота оптимальных кодонов указанной последовательности нуклеотидов или ее части увеличена относительно последовательности SEQ ID N0:16;
(c) указанная последовательность нуклеотидов или ее часть содержит больший процент нуклеотидов G/C по сравнению с процентом нуклеотидов G/C в последовательности SEQ ID N0: 16;
(d) относительная частота использования синонимичного кодона указанной последовательности нуклеотидов или ее части увеличена относительно последовательности SEQ ID N0: 16;
(e) эффективное число кодонов указанной последовательности нуклеотидов или ее части снижено по сравнению с последовательностью SEQ ID N0: 16;
(f) указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше последовательностей MARS/ARS (последовательности SEQ ID N0: 21 и 22) относительно последовательности SEQ ID N0: 16;
(g) указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше дестабилизирующих элементов (последовательности SEQ ID N0: 23 и 24) относительно последовательности SEQ ID N0: 16; и
(h) любая комбинация перечисленного.
[0046] ЕЗО. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. Е1-
Е29, дополнительно содержащая гетерологичную последовательность нуклеотидов.
[0047] Е31. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно ЕЗО,
отличающаяся тем, что указанная гетерологичная последовательность нуклеотидов кодирует гетерологичную последовательность аминокислот, которая представляет собой удлиняющий время полужизни агент.
[0048] Е32. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно ЕЗО или Е31,
отличающаяся тем, что указанная гетерологичная последовательность аминокислот представляет собой константную область иммуноглобулина или ее часть, трансферрин, альбумин или последовательность PAS.
[0049] ЕЗЗ. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно ЕЗО или Е31,
отличающаяся тем, что указанная гетерологичная последовательность аминокислот представляет собой Fc-область.
[0050] Е34. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. Е30-
ЕЗЗ, отличающаяся тем, что указанная гетерологичная последовательность аминокислот соединена с N-концом или с С-концом последовательности аминокислот, кодируемой указанной последовательностью нуклеотидов, или инсертирована между двумя аминокислотами в последовательности аминокислот, кодируемой указанной последовательностью нуклеотидов.
[0051] Е35. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно Е34,
отличающаяся тем, что указанная гетерологичная последовательность аминокислот
инсертирована между двумя аминокислотами в одном или более сайтах инсерции, выбранных из таблицы 3.
[0052] Е36. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. Е30-
Е35, которая кодирует мономерно-димерную гибридную молекулу, содержащую FVIII.
[0053] Е37. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. Е1-
Е36, отличающаяся тем, что указанный полипептид FVIII представляет собой полноразмерный FVIII или FVIII сделециями в В-домене.
[0054] Е38. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. Е1-
Е37, функционально связанная по меньшей мере с одной последовательностью контроля транскрипции.
[0055] Е39. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.
Е1-Е38.
[0056] Е40. Вектор согласно Е39, отличающийся тем, что указанный вектор
представляет собой вирусный вектор.
[0057] Е41. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по
любому из пп. Е1-Е32, или вектор согласно Е39 или Е40.
[0058] Е42. Клетка-хозяин согласно Е41, выбранная из группы, состоящей из:
клетки СНО, клетки НЕК293, клетки ВНК21, клетки PER.C6, клетки NS0 и клетки САР.
[0059] Е43. Полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты по любому
из пп. Е1-Е37, или вектором согласно Е39 или 40, или продуцируемый клеткой-хозяином согласно Е41 или Е42.
[0060] Е44. Способ получения полипептида с активностью FVIII, включающий:
культивирование клетки-хозяина согласно Е41 или Е42 в условиях, обеспечивающих продуцирование полипептида с активностью FVIII; и выделение указанного полипептида с активностью FVIII.
[0061] Е45. Способ согласно Е44, отличающийся тем, что экспрессия указанного
полипептида с активностью FVIII увеличивается по сравнению с экспрессией в клетке-хозяине, культивируемой в тех же условиях, содержащей референсную последовательность нуклеотидов, содержащую SEQ ID NO: 16.
[0062] Е46. Способ увеличения экспрессии полипептида с активностью FVIII у
субъекта включающий введение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. Е1-Е38, или вектора согласно Е39 или Е40 нуждающемуся в этом субъекту, отличающийся тем, что экспрессия указанного полипептида увеличивается относительно экспрессии, обеспечиваемой референсной молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO: 16, или вектором, содержащим указанную референсную молекулу нуклеиновой кислоты.
[0063] Е47. Способ увеличения экспрессии полипептида с активностью FVIII,
включающий культивирование клетки-хозяина согласно Е41 или Е42 в условиях, при
которых происходит экспрессия полипептида с активностью FVIII молекулой нуклеиновой кислоты, отличающийся тем, что экспрессия указанного полипептида с активностью FVIII увеличивается по сравнению с экспрессией в клетке-хозяине, культивируемой в тех же условиях, содержащей референсную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16.
[0064] Е48. Способ по любому из Е44-Е47, отличающийся тем, что экспрессия
полипептида FVIII увеличивается по меньшей мере приблизительно 2-кратно, по меньшей
мере приблизительно 3-кратно, по меньшей мере приблизительно 4-кратно, по меньшей
мере приблизительно 5-кратно, по меньшей мере приблизительно 6-кратно, по меньшей
мере приблизительно 7-кратно, по меньшей мере приблизительно 8-кратно, по меньшей
мере приблизительно 9-кратно, по меньшей мере приблизительно 10-кратно, по меньшей
мере приблизительно 11-кратно, по меньшей мере приблизительно 12-кратно, по меньшей
мере приблизительно 13-кратно, по меньшей мере приблизительно 14-кратно, по меньшей
мере приблизительно 15-кратно, по меньшей мере приблизительно 20-кратно, по меньшей
мере приблизительно 25-кратно, по меньшей мере приблизительно 30-кратно, по меньшей
мере приблизительно 35-кратно, по меньшей мере приблизительно 40-кратно, по меньшей
мере приблизительно 50-кратно, по меньшей мере приблизительно 60-кратно, по меньшей
мере приблизительно 70-кратно, по меньшей мере приблизительно 80-кратно, по меньшей
мере приблизительно 90-кратно или по меньшей мере приблизительно 100-кратно.
[0065] Е49. Способ улучшения выхода полипептида с активностью FVIII,
включающий культивирование клетки-хозяина согласно Е41 или Е42 в условиях, обеспечивающих продуцирование полипептида с активностью FVIII молекулой нуклеиновой кислоты, отличающийся тем, что выход полипептида с активностью FVIII увеличивается по сравнению с экспрессией в клетке-хозяине, культивируемой в тех же условиях, содержащей референсную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16.
[0066] Е50. Способ лечения расстройства системы свертывания крови
включающий: введение нуждающемуся в этом субъекту молекулы нуклеиновой кислоты по
любому из пп. Е1-Е38, вектора согласно Е39 или Е40, или полипептида согласно Е43.
[0067] Е51. Способ согласно Е50, отличающийся тем, что указанное расстройство
системы свертывания крови характеризуется дефицитом FVIII.
[0068] Е52. Способ согласно Е50, отличающийся тем, что указанное расстройство
системы свертывания крови представляет собой гемофилию.
[0069] Е53. Способ согласно Е50, отличающийся тем, что указанное расстройство
системы свертывания крови представляет собой гемофилию А.
[0070] Е54. Способ по любому из Е50-Е53, отличающийся тем, что активность
FVIII в плазме через 24 часа после введения увеличивается по сравнению с активностью у субъекта, которому вводили референсную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую
SEQ ID NO: 16, вектор, содержащий референсную молекулу нуклеиновой кислоты, или
полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты.
[0071] Е55. Способ согласно Е54, отличающийся тем, что активность FVIII в
плазме увеличивается по меньшей мере приблизительно 2-кратно, по меньшей мере
приблизительно 3-кратно, по меньшей мере приблизительно 4-кратно, по меньшей мере
приблизительно 5-кратно, по меньшей мере приблизительно 6-кратно, по меньшей мере
приблизительно 7-кратно, по меньшей мере приблизительно 8-кратно, по меньшей мере
приблизительно 9-кратно, по меньшей мере приблизительно 10-кратно, по меньшей мере
приблизительно 11-кратно, по меньшей мере приблизительно 12-кратно, по меньшей мере
приблизительно 13-кратно, по меньшей мере приблизительно 14-кратно, по меньшей мере
приблизительно 15-кратно, по меньшей мере приблизительно 20-кратно, по меньшей мере
приблизительно 25-кратно, по меньшей мере приблизительно 30-кратно, по меньшей мере
приблизительно 35-кратно, по меньшей мере приблизительно 40-кратно, по меньшей мере
приблизительно 50-кратно, по меньшей мере приблизительно 60-кратно, по меньшей мере
приблизительно 70-кратно, по меньшей мере приблизительно 80-кратно, по меньшей мере
приблизительно 90-кратно или по меньшей мере приблизительно 100-кратно.
[0072] Е56. Вектор согласно Е39 или 40, отличающийся тем, что указанный вектор
представляет собой лентивирусный вектор.
[0073] Е57. Вектор по любому из пп. Е39, Е40 и Е56, дополнительно содержащий
тканеспецифический промотор, тканеспецифический энхансер, или как
тканеспецифический промотор, так и тканеспецифический энхансер.
[0074] Е58. Вектор согласно Е57, отличающийся тем, что указанный
тканеспецифический промотор и/или указанный тканеспецифический энхансер селективно усиливает экспрессию трансгена в клетках печени.
[0075] Е59. Вектор согласно Е57 или Е58, отличающийся тем, что указанный
тканеспецифический промотор содержит последовательность промотора, выбранную из группы, состоящей из промотора тиретина мыши (mTTR), промотора эндогенного фактора VIII человека (F8), промотора альфа-1-антитрипсина человека (hAAT), минимального промотора альбумина человека и промотора альбумина мыши.
[0076] Е60. Вектор по любому из пп. Е57-Е59, отличающийся тем, что указанный
тканеспецифический промотор содержит mTTR промотор.
[0077] Е61. Способ лечения расстройства системы свертывания крови,
включающий: введение нуждающемуся в этом субъекту вектора по любому из пп. Е56-Е60. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0078] На фиг. 1A-1J представлены кодон-оптимизированные последовательности
нуклеотидов, кодирующий фактор VIII сделециями в В-домене (SEQ ID NO: 17). На фиг. 1А приведена последовательность нуклеотидов coFVIII-3 (SEQ ID N0:1). На фиг. 1В приведена последовательность нуклеотидов coFVIII-4 (SEQ ID NO: 2). На фиг. 1С
приведена последовательность нуклеотидов coFVIII-5 (SEQ ID NO: 70). На фиг. 1D приведена последовательность нуклеотидов coFVIII-6 (SEQ ID NO: 71). На фиг. 1Е приведена последовательность нуклеотидов coFVIII-52 (SEQ ID NO: 3). На фиг. 1F приведена последовательность нуклеотидов coFVIII-62 (SEQ ID NO: 4). На фиг. 1G приведена последовательность нуклеотидов coFVIII-25 (SEQ ID NO: 5). На фиг. 1Н приведена последовательность нуклеотидов coFVIII-26 (SEQ ID NO: 6). На фиг. 11 и 1J приведены последовательности нуклеотидов и аминокислот, соответственно, сделециями в В-домене (BDD-FVIII) (SEQ ID NO: 16 и 17, соответственно).
[0079] На фиг. 2A-2J показана корректировка смещения частоты использования
кодонов в кодон-оптимизированных последовательностях нуклеотидов, кодирующих BDD-
FVIII. На фиг. 2А приведена относительная частота использования кодонов в
последовательности нуклеотидов дикого типа (до оптимизации кодонов), кодирующей
BDD-FVIII, например, неоптимизированный BDD-FVIII. Индекс адаптации кодонов для
человека (CAI) неоптимизированной последовательности BDD-FVIII составляет 74%. На
фиг. 2В приведена относительная частота использования кодонов во варианте
последовательности coFVIII-1, который имеет CAI для человека, составляющий 88%. На
фиг. 2С приведена относительная частота использования кодонов во варианте
последовательности coFVIII-З, который имеет CAI для человека, составляющий 91%. На
фиг. 2D приведена относительная частота использования кодонов во варианте
последовательности coFVIII-4, который имеет CAI для человека, составляющий 97%. На
фиг. 2Е приведена относительная частота использования кодонов во варианте
последовательности coFVIII-5, который имеет CAI для человека, составляющий 83%. На
фиг. 2F приведена относительная частота использования кодонов во варианте
последовательности coFVIII-6, который имеет CAI для человека, составляющий 83%. На
фиг. 2G приведена относительная частота использования кодонов во варианте
последовательности coFVIII-52, который имеет CAI для человека, составляющий 91%. На
фиг. 2Н приведена относительная частота использования кодонов во варианте
последовательности coFVIII-62, который имеет CAI для человека, составляющий 91%. На
фиг. 21 приведена относительная частота использования кодонов во варианте
последовательности coFVIII-25, который имеет CAI для человека, составляющий 88%. На
фиг. 2J приведена относительная частота использования кодонов во варианте
последовательности coFVIII-26, который имеет CAI для человека, составляющий 88%.
[0080] На фиг. 3 представлена плазмидная карта FVIII-303, содержащего coFVIII-1
в остове pcDNA3 под контролем ЕТ - усиленного промотора транстиретина, который расположен в 5'-направлении сайта начала трансляции coFVIII-1 и содержит синтетический энхансер, энхансер mTIR и промотор mTIR.
[0081] На фиг. 4 представлен график активности FVIII в плазме у мышей НетА
после гидродинамической инъекции 5 мкг FVIII-303 (coFVIII-1; кружки) или 5 мкг FVI11-311
(BDD-FVIII; квадраты). Активность FVIII в плазме определяли с применением специфического хромогенного анализа на FVIII через 24, 48 и 72 часа после инъекции. Приведены уровни относительной активности через 72 часа, нормированные по уровню экспрессии FVIII-311.
[0082] На фиг. 5 приведена плазмидная карта pLV-coFVIII-52, содержащего coFVIII-
52 в лентивирусной плазмиде под контролем промотора ЕТ, который расположен в 5'-направлении от сайта начала трансляции coFVIII-52 и содержит синтетический энхансер, энхансер mTTR и промотор mTTR.
[0083] На фиг. 6А-6С приведены графические представления активности FVIII в
плазме у мышей НетА после гидродинамической инъекции различных кодирующих FVIII
нуклеотидов. Активность FVIII в плазме определяли с применением специфического
хромогенного анализа на FVIII через 24, 48 и 72 часа после инъекции. На фиг. 6А показана
активность FVIII в плазме у мышей НетА после гидродинамической инъекции 5 мкг LV-
coFVI 11-1 (закрашенные кружки), 5 мкг LV-coFVIII-З (треугольники), 5 мкг LV-coFVIII-4
(перевернутые треугольники), 5 мкг LV-coFVIII-5 (ромбы) или 5 мкг LV-coFVIII-6
(незакрашенные кружки). На фиг. 6В показана активность FVIII в плазме у мышей НетА
после гидродинамической инъекции 5 мкг LV-coFVIII-1 (кружки), 5 мкг LV-coFVIII-25
(треугольники) или 5 мкг LV-coFVIII-26 (перевернутые треугольники). На фиг. 6С показана
активность FVIII в плазме у мышей НетА после гидродинамической инъекции 20 мкг LV-
2116 (последовательность нуклеотидов BDD-FVIII без оптимизации кодонов(\Л/Т);
незакрашенные кружки), 20 мкг LV-coFVIII-1 (треугольники), 20 мкг LV-coFVIII-52 (квадраты)
или 20 мкг LV-coFVIII-62 (закрашенные кружки). Для каждой плазмиды показаны
относительные уровни активности через 72 часа, нормированные по уровням экспрессии
LV-coFVIII-1 (фиг. 6А, 6В, и 6С) и/или LV-2116 (фиг. 6С), согласно указанному.
[0084] На фиг. 7 показана активность FVIII в плазме у мышей НетА 24 дней после
инъекции в дозе 1Е8 ТЕ/мышь лентивирусного вектора, содержащего coFVIII-1, coFVIII-5, coFVIII-52, coFVIII-6 или coFVIII-62, относительно контрольного LV-2116 (BDD-FVIII), по оценке с применением FVIII-специфического хромогенного анализа. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению.
[0085] На фиг. 8А-8С приведены различные кодон-оптимизированные
последовательности нуклеотидов, кодирующие BDD-FVIII, слитый с XTEN. На фиг. 8А приведена последовательность нуклеотидов coFVIII-52-XTEN (SEQ ID NO: 19), где последовательность нуклеотидов, кодирующая XTEN длиной 144 аминокислоты ("XTENH4"; SEQ ID NO: 18; выделена подчеркиванием), инсертирована в последовательность нуклеотидов coFVIII-52. На фиг. 8В приведена последовательность нуклеотидов coFVI 11-1 -XTEN (SEQ ID NO: 20), где последовательность нуклеотидов, кодирующая XTEN длиной 144 аминокислоты ("XTENi44"; SEQ ID NO: 18; выделена подчеркиванием), инсертирована в последовательность нуклеотидов coFVIII-1. На фиг. 8С
приведена последовательность нуклеотидов coFVIII-6-XTEN (SEQ ID NO: 72), где последовательность нуклеотидов, кодирующая XTEN длиной 144 аминокислоты ("XTENH4"; SEQ ID NO: 18; выделена подчеркиванием), инсертирована в последовательность нуклеотидов coFVIII-6 (например, по остатку аминокислоты 745, соответствующему остатку в зрелой последовательности FVIII).
[0086] На фиг. 9 приведена плазмидная карта pLV-coFVIII-52-XTEN, который
содержит coFVIII-52-XTEN в лентивирусном векторе под контролем промотора ЕТ. Лентивирусные векторы, содержащие каждую из оставшихся кодон-оптимизированных молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид с активностью FVIII согласно описанию в настоящем документе, конструировали таким же образом, что и pLV-coFVIII-52-XTEN, в который инсертировали туже последовательность XTEN для замены В-домена FVIII.
[0087] На фиг. 10А и 10В показана активность FVIII у мышей НетА после инъекции
плазмидной ДНК (фиг. 10А) или лентивирусного вектора (фиг. 10В), содержащих различные кодон-оптимизированные последовательности нуклеотидов, кодирующие BDD-FVIII. На фиг. 10А представлен график активности FVIII в плазме у мышей НетА после гидродинамической инъекции 5мкг FVIII-311 (кодирующая BDD-FVIII без оптимизации кодонов последовательность нуклеотидов; квадраты), 5 мкг FVIII-303 (coFVIII-1; маленькие кружки) или FVIII-306 (C0FVIII-I-XTEN144; большие кружки). Для каждой плазмиды приведена относительная активность через 72 часа, нормированная по FVIII-311. На фиг. 10В показана активность FVIII в плазме у мышей НетА через 21 день после инъекции в дозе 1Е8 ТЕ/мышь лентивирусного вектора, содержащего coFVIII-52 или coFVIII-52-XTEN, относительно контрольного LV-2116 (BDD-FVIII), по оценке с применением FVIII-специфического хромогенного анализа. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению.
[0088] На фиг. 11А приведена последовательность аминокислот полноразмерного
зрелого фактора VIII человека. На фиг. 11В приведена последовательность аминокислот полноразмерного фактора фон Виллебранда человека (SEQ ID NO: 44). На фиг. 11С и 11D приведены последовательности аминокислот и нуклеотидов, соответственно, полипептида XTEN длиной 42 аминокислот (XTEN АЕ42-4; последовательности SEQ ID NO 46 и 47, соответственно). Последовательности аминокислот различных полипептидов XTEN длиной 144 аминокислоты приведены на фиг. 11Е, 11G, 111, 11 К, 11М, 110, 11Q, 11S, 11U, и 11W (последовательности SEQ ID NO: 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 и 66, соответственно), и соответствующие последовательности нуклеотидов приведены на фиг. 11F, 11Н, 11J, 11L, 11N, 11Р, 11R, 11Т, 11V и 11Х (последовательности SEQ ID № 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 и 67, соответственно). На фиг. 11Y приведена последовательность нуклеотидов промотора ЕТ (SEQ ID NO: 69). На фиг. 11Z приведена последовательность
нуклеотидов соFVIII-1 (SEQ ID NO: 68) (см. международную публикацию №WO 2014/127215, SEQ ID NO: 1).
[0089] На фиг. 12A представлен график активности FVIII в плазме (МЕ/мл) у мышей
НетА возрастом 14 дней после в/в введения приблизительно 1,5 ЕЮ ТЕ/кг LV-wtBDD-FVIII (кружки), LV-coFVIII-6 (квадраты) или LV-coFVIII-6XTEN (треугольники). На фиг. 12В графически представлено число копий вектора (VCN) через 150 дней после лечения мышей НетА возрастом 14 дней, которым вводили в/в приблизительно 1,5 ЕЮ ТЕ/кг лентивирусных векторов, экспрессирующих wtBDD-FVIII, coFVIII-1, coFVIII-3, coFVIII-4, coFVIII-5, coFVIII-6, coFVIII-52, coFVIII-62, coFVIII-25 или coFVIII-26. На фиг. 12C представлен график активности FVIII в плазме (МЕ/мл) через 21 день после лечения мышей НетА возрастом 14 дней, которым вводили в/в приблизительно 1,5 ЕЮ ТЕ/кг лентивирусных векторов, экспрессирующих wtBDD-FVIII, coFVIII-1, coFVIII-3, coFVIII-4, coFVIII-5, coFVIII-6, coFVIII-52, coFVIII-62, coFVIII-25 или coFVIII-26.
[0090] На фиг. 13A и 13В приведены графики, иллюстрирующие уровни активности
FVIII (фиг. 13А) и уровни антитела против FVIII (фиг. 13В) в плазме у пяти мышей НетА, получавших лечение лентивирусом, экспрессирующим вариант coFVIII-5. Однопометным животным НетА возрастом 14 дней вводили путем внутривенной инъекции приблизительно 1,5 ЕЮ ТЕ/кг лентивируса, экспрессирующего вариант coFVIII-5. Каждой мыши присваивали номер (т.е. 1, 2, 3, 4 и 5; фиг. 13А и 13В).
[0091] На фиг. 14 графически представлена корреляция между уровнем экспрессии
LV-FVIII, подтвержденным активностью FVIII в плазме через 21 день после лентивирусного лечения, и присутствием антител против FVIII. Каждая точка данный соответствует одной мыши НетА. Каждой мыши путем внутривенной инъекции вводили дозу 1,5 ЕЮ ТЕ/кг лентивируса, экспрессирующего один из вариантов со FVIII согласно описанию в настоящем документе. Горизонтальными линиями обозначена средняя активность FVIII в плазме.
[0092] На фиг. 15 графически представлена корреляция между числом копий
вектора (VCN) на клетку через 150 дней после лентивирусного лечения и присутствием антител против FVIII. Каждая точка данных соответствует одной мыши НетА. Каждой мыши путем внутривенной инъекции вводили дозу 1,5 ЕЮ ТЕ/кг лентивируса, экспрессирующего один из вариантов coFVIII согласно описанию в настоящем документе. Горизонтальными линиями обозначено среднее число VCN.
[0093] На фиг. 16А и 16В приведены графики, иллюстрирующие уровни активности
FVIII (фиг. 16А) и уровни антитела против FVIII (фиг. 16В) в плазме у двух мышей НетА (coFVIII-52-А и coFVIII-52-В), получавших лечение лентивирусом, экспрессирующим вариант coFVIII-52. Однопометным животным НетА возрастом 14 дней вводили путем внутривенной инъекции приблизительно 1,5 ЕЮ ТЕ/кг лентивируса, экспрессирующего вариант coFVIII-52. На фиг. 16С и 16D приведены снимки, демонстрирующие окрашивание
РНК на экспрессию FVIII при гибридизации in situ (темные пятна) в ткани печени,
полученной от мышей coFVIII-52-А (фиг. 16С) и coFVIII-52-В (фиг. 16D) с фиг. 16А и 16В.
[0094] На фиг. 17 приведен график, отражающий долгосрочную экспрессию FVIII у
новорожденных мышей НетА, получавших лечение лентивирусом, экспрессирующим варианты FVIII дикого типа сделециями в В-домене (wtBDD-FVIII; треугольники), coFVIII-52XTEN (кружки) или COFVIII-6XTEN (перевернутый треугольник). Новорожденным мышам НетА вводили путем внутривенной инъекции приблизительно 1,5 А10 ТЕ/кг лентивируса, экспрессирующего wtBDD-FVIII, coFVIII-52XTEN или coFVIII-6XTEN. Активность FVIII в плазме измеряли на протяжении приблизительно 16 недель.
[0095] На фиг. 18 приведен график уровней FVIII в кровотоке у новорожденных
собак НетА (S3 или К4) после введения 1,3 х Ю9 единиц трансдукции/кг лентивирусного вектора, содержащего нуклеотид, кодирующий фактор VIII, слитый с XTEN (SEQ ID NO: 72; LV-coFVIII-6-XTEN). Квадраты, соединенные сплошной линией, соответствуют образцам A4TB-S3, а треугольники, соединенные пунктирной линией, соответствуют образцам АЧТВ-К4. По оси Y отмечена активность FVIII в плазме, представленная в виде процентов от нормы, при этом нормальная активность FVIII у человека составляет 100%. По оси X отмечены дни после лентивирусного лечения, при этом лентивирусное лечение проводят на 0 день.
[0096] На фиг. 19А-19С приведены графические представления гемостаза цельной
крови у нестимулированных собак: НетА (фиг. 19А), S3 через 2 недели после лентивирусного лечения (фиг. 19В) и К4 через 2 недели после лентивирусного лечения (фиг. 19С) по результатам мониторинга в анализе методом ротационной тромбоэластометрии (ROTEM). На каждом чертеже приведены время сворачивания крови (СТ) в секундах (с), время образования сгустка (CFT) в секундах (с), угол альфа (а) в градусах (°), амплитуда через 5 минут после СТ (А5) в миллиметрах (мм), амплитуда через 20 минут после СТ (А20) в миллиметрах (мм) и максимальная твердость сгустка (MCF) в миллиметрах (мм). 19А-19С. На фиг. 19D приведена таблица, где приведен обобщенный нормальный диапазон для каждого из показателей: СТ, CFT, а, А5, А2 и MCF, представленных на фиг. 19А-19С. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0097] В настоящем изобретении предложены кодон-оптимизированные гены,
кодирующие полипептиды, обладающие активностью фактора VIII (FVIII). Настоящее изобретение относится к кодон-оптимизированным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды, обладающие активностью фактора VIII, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим оптимизированные молекулы нуклеиновых кислот, полипептидам, кодируемым оптимизированными молекулами нуклеиновых кислот, и способам получения таких полипептидам. Настоящее изобретение также относится к способам лечения расстройств системы свертывания крови, таких как гемофилия, включающим введение
субъекте оптимизированной последовательности нуклеиновой кислоты фактора VIII, вектора, содержащего указанную оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, или полипептида, который она кодирует. Настоящее изобретение обеспечивает удовлетворение важной потребности, существующей в данной области техники, за счет получения оптимизированных последовательностей фактора VIII, демонстрирующих повышенную экспрессию в клетках-хозяевах, увеличенный выход белка фактора VIII при применении способов получения рекомбинантного фактора VIII, и потенциально обеспечивает большую терапевтическую эффективность при применении в способах генной терапии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, последовательность которой гомологична последовательности нуклеотидов, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1-14, 70 и 71.
[0098] Примеры конструкций согласно настоящему изобретению
проиллюстрированы прилагаемыми чертежами и перечнем последовательностей. Для обеспечения ясного понимания настоящего описания и формулы изобретения ниже приводятся определения. I. Определения
[0099] Следует отметить, что обозначающий объект термин в единственном числе
относится к одному или более указанным объектам: например, следует понимать, что
"последовательность нуклеотидов" соответствует одной или более последовательностям
нуклеотидов. Соответственно, термины в единственном числе, термины "один или более"
и "по меньшей мере один" могут применяться в настоящем документе взаимозаменяемо.
[0100] Термин "приблизительно" в настоящем документе означает
приблизительно, ориентировочно, примерно или в некоторой области. При использовании термина "приблизительно" в сочетании с диапазоном числовых значений он модифицирует указанный диапазон путем расширения верхних и нижних границ относительно приведенных численных значений. В целом, термин "приблизительно" применяют в настоящем документе для модификации численного значения в большую или меньшую сторону от указанного значения с дисперсией 10% в направлении вверх или вниз (выше или ниже).
[0101] Термин "выделенный" в настоящем описании обозначает биологический
материал (клетку, полипептид, полинуклеотид или их фрагмент, вариант или производное), который был извлечен из оригинальной среды (среды, в которой он находится в естественных условиях). Например, полинуклеотид, присутствующий в естественном состоянии в растении или организме животного, не является выделенным, однако тот же полинуклеотид, отделенный от смежных нуклеиновых кислот, в которых он находится в естественных условиях, считают "выделенным". Конкретный уровень очищения не
является необходимым. Полученные рекомбинантным способом полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках-хозяевах, считают выделенными для целей настоящего изобретения, как и природные или рекомбинантные полипептиды, которые были отделены, фракционированы или частично или по существу очищены с применением любой подходящей техники.
[0102] "Нуклеиновые кислоты", "молекулы нуклеиновых кислот",
"олигонуклеотид" и "полинуклеотид" используются взаимозаменяемо и относятся к фосфоэфирной полимерной форме рибонуклеозидов (аденозина, гуанозина, уридина или цитидина; "молекулы РНК") или дезоксирибонуклеозидов (дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, дезокситимидина или дезоксицитидина; "молекулы ДНК"), или любым их фосфоэфирным аналогам, таким как фосфотиоаты и сложные тиоэфиры, либо в однонитевой форме, либо в форме двунитевой спирали. Двунитевые спирали могут представлять собой спирали ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК. Термин "молекула нуклеиновой кислоты" и, в частности, молекула ДНК или РНК, относится только к первичной и вторичной структуре молекулы, и не ограничивается какими-либо конкретными третичными формами. Соответственно, указанный термин включает двунитевую ДНК, обнаруживаемую, в том числе, в линейных или кольцевых молекулах ДНК (например, рестрикционных фрагментах), плазмидах, суперспирализованной ДНК и хромосомах. При обсуждении структуры конкретных двунитевых молекул ДНК последовательности могут быть описаны в настоящем документе, в соответствии с общепринятой нормой, путем указания только последовательности с направлением 5'-> 3' вдоль нетранскрибируемой нити ДНК (т.е. нити, имеющей последовательность, гомологичную мРНК). "Рекомбинантная молекула ДНК" представляет собой молекулу ДНК, которая подверглась молекулярно-биологическим манипуляциям. ДНК включает кДНК, геномную ДНК, плазмидную ДНК, синтетическую ДНК и полусинтетическую ДНК, однако не ограничивается перечисленным. "Композиция с нуклеиновыми кислотами" согласно настоящему изобретению содержит одну или более нуклеиновых кислот согласно описанию в настоящем документе.
[0103] В настоящем документе "кодирующая область" или "кодирующая
последовательность" представляет собой часть полинуклеотида, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя "стоп-кодон" (TAG, TGA или ТАА), как правило, не транслируется в аминокислоту, он может считаться частью кодирующей области, однако любые фланкирующие последовательности, например промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и т.п., не являются частью кодирующей области. Границы кодирующей области, как правило, определяет стартовый кодон на 5'-конце, кодирующем аминоконец итогового полипептида, и стоп-кодон трансляции на З'-конце, кодирующем карбоксильный конец итогового полипептида. Две или более кодирующих областей могут находиться в одной полинуклеотидной конструкции,
например, на одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например,
на отдельных (разных) векторах. Отсюда следует, что один вектор может содержать только
одну кодирующую область, или две или более кодирующих областей.
[0104] Определенные белки, секретируемые клетками млекопитающих,
ассоциированы с секреторным сигнальным пептидом, который отщепляется от зрелого белка после инициации экспорта растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Специалистам в данной области техники известно, что сигнальные пептиды обычно слиты с N-концом полипептида, и отщепляются от полного или "полноразмерного" полипептида с образованием секретируемой или "зрелой" формы указанного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации используют природный сигнальный пептид или функциональное производное указанной последовательности, сохраняющее способность направлять секрецию полипептида, функционально с ним связанного. Как вариант, может быть использован гетерологичный сигнальный пептид млекопитающих, например, сигнальный пептид тканевого активатора плазминогена (ТРА) человека или В-глюкуронидазы мыши, или их функциональные производные.
[0105] Термин "(расположенный) в З'-направлении" относится к
последовательности нуклеотидов, локализованной в направлении 3' по отношению к референсной последовательности нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации расположенные в З'-направлении последовательности нуклеотидов относятся к последовательностям, расположенным за точкой начала транскрипции. Например, инициирующий трансляцию кодон гена локализован в З'-направлении от сайта начала транскрипции.
[0106] Термин "(расположенный) в 5'-направлении" относится к
последовательности нуклеотидов, локализованный в направлении 5' по отношению к референсной последовательности нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации расположенные в 5'-направлении последовательности нуклеотидов относятся к последовательностям, локализованным с 5'-стороны от кодирующей области или точки начала транскрипции. Например, большинство промоторов локализованы в 5'-направлении от сайта начала транскрипции.
[0107] В настоящем документе термин "регуляторная область гена" или
"регуляторная область" относится к последовательностям нуклеотидов, локализованным в 5'-направлении (некодирующие 5'-последовательности), в составе или в З'-направлении (некодирующий З'-последовательности) от кодирующей области, и оказывающим влияние на транскрипцию, процессинг РНК, стабильность или трансляцию ассоциированной кодирующей области. Регуляторные области могут включать промоторы, лидерные последовательности трансляции, интроны, последовательности распознавания полиаденилирования, сайты процессинга РНК, сайты связывания эффекторов и структуры
типа "стебель-петля". Если предполагается экспрессировать кодирующую область в эукариотической клетке, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции обычно локализованы в направлении 3' по отношению к кодирующей последовательности.
[0108] Полинуклеотид, который кодирует генный продукт, например, полипептид,
может включать промотор и/или другие элементы контроля экспрессии (например, транскрипции или трансляции), функционально ассоциированные с одной или более кодирующими областями. При наличии функциональной связи кодирующая область генного продукта, например, полипептида, ассоциирована с одной или более регуляторными областями таким образом, что экспрессия указанного генного продукта находится под влиянием или контролем указанной регуляторной области или областей. Например, кодирующая область и промотор "функционально ассоциированы", если индукция функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей генный продукт, кодируемый указанной кодирующей областью, и если природа связи между промотором и кодирующей областью не влияет на способность указанного промотора направлять экспрессию указанного генного продукта или не взаимодействует со способностью ДНК-матрицы к транскрипции. Другие элементы контроля экспрессии, помимо промотора, например энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, могут также быть функционально ассоциированы с кодирующей областью для направления экспрессии генных продуктов.
[0109] "Последовательности контроля транскрипции" относятся к регуляторным
последовательностям ДНК, таким как промоторы, энхансеры, терминаторы и т.п., которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине. Различные области контроля транскрипции известны специалистам в данной области техники. Указанные области включают, без ограничения, области контроля транскрипции, которые функционируют в клетках позвоночных, такие как, не ограничиваясь перечисленными, сегменты промоторов и энхансеров цитомегаловирусов (немедленный ранний промотор, в сочетании с интрон-А), вируса обезьян 40 (ранний промотор) и ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие области контроля транскрипции включают области, происходящие из генов позвоночных, например, актина, белков теплового шока, бычьего гормона роста и В-глобина кролика, а также другие последовательности, способные контролировать генную экспрессию в эукариотических клетках. Дополнительные подходящие области контроля транскрипции включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также индуцируемые лимфокинами промоторы (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами).
[0110] Аналогичным образом, различные элементы контроля трансляции известны
специалистам в данной области техники. Указанные элементы включают, не ограничиваясь перечисленным, сайты связывания рибосом, кодоны инициации и
терминации трансляции, а также элементы, происходящие из пикорнавирусов (в частности, участок внутренней посадки рибосомы, или IRES, также называемый последовательностью CITE).
[0111] Термин "экспрессия" в настоящем документе относится к процессу,
посредством которого полинуклеотид продуцирует генный продукт, например, РНК или полипептид. Он включает, без ограничения, транскрипцию полинуклеотида в матричную РНК (мРНК), транспортную РНК (тРНК), малую шпилечную РНК (мшРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК) или любой другой РНК-продукт, а также трансляцию мРНК в полипептид. Экспрессия обеспечивает получение "генного продукта". В настоящем документе генный продукт может представлять собой либо нуклеиновую кислоту, например, матричную РНК, полученную путем транскрипции гена, или полипептид, который транслируется с транскрипта. Генные продукты, описанные в настоящем документе, дополнительно включают нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, такими как полиаденилирование или сплайсинг, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, такими как метилирование, гликозилирование, добавление липидов, связывание с другими белковыми субъединицами или протеолитическое расщепление. Термин "выход" в настоящем документе относится к количеству полипептида, полученного путем экспрессии гена.
[0112] Термин "вектор" относится к любой основе для клонирования и/или
переноса нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Вектор может представлять собой
репликон, к которому может быть прикреплен другой сегмент нуклеиновой кислоты для
осуществления репликации присоединенного сегмента. Термин "репликон" относится к
любому генетическому элементу (например, плазмиде, фагу, космиде, хромосоме, вирусу),
который функционирует в качестве автономной единицы репликации in vivo, т.е.
способному к репликации под собственным контролем. Термин "вектор" включает как
вирусные, так и невирусные основы для введения нуклеиновой кислоты в клетку in vitro, ex
vivo или in vivo. В данной области техники известно и используется значительное число
векторов, в том числе, например, плазмиды, модифицированные вирусы эукариот или
модифицированные бактериальные вирусы. Инсерция полинуклеотида в подходящий
вектор может осуществляться путем лигирования подходящих фрагментов
полинуклеотида в выбранный вектор с комплементарными липкими концами.
[0113] Могут быть сконструированы векторы, кодирующие селектируемые маркеры
или репортеры, которые обеспечивают выбор или идентификацию клеток, включивших указанный вектор. Экспрессия селектируемых маркеров или репортеров позволяет осуществить идентификацию и/или выбор клеток-хозяев, которые включают и экспрессируют другие кодирующие области, которые содержит вектор. Примеры селектируемых маркерных генов, известных и используемых в данной области техники, включают: гены, обеспечивающие устойчивость к ампициллину, стрептомицину,
гентамицину, канамицину, гигромицину, гербициду биалафосу, сульфонамиду и т.п.; и гены, которые используют в качестве фенотипических маркеров, т.е. регуляторные гены антоцианов, ген изопентанилтрансферазы и т.п. Примеры репортеров, известных и используемых в данной области техники, включают: люциферазу (Luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), р-галактозидазу (LacZ), р-глюкуронидазу (Gus) и т.п. Селектируемые маркеры могут также считаться репортерами.
[0114] Термин "селектируемый маркер" относится к идентифицирующему фактору,
как правило, гену устойчивости к антибиотику или химической устойчивости, который может быть выбран на основании эффекта, обеспечиваемого маркерным геном, т.е. устойчивости к антибиотику, устойчивости к гербициду, колориметрическим маркерам, ферментам, флуоресцентным маркерам и т.п., при этом указанный эффект применяют для отслеживания наследования представляющей интерес нуклеиновой кислоты, и/или для идентификации клетки или организма, унаследовавшей или унаследовавшего представляющую интерес нуклеиновую кислоту. Примеры селектируемых маркерных генов, известных и используемых в данной области техники, включают: гены, обеспечивающие устойчивость к ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, гигромицину, гербициду биалафосу, сульфонамиду и т.п.; и гены, которые используют в качестве фенотипических маркеров, т.е. регуляторные гены антоцианов, ген изопентанилтрансферазы и т.п.
[0115] Термин "репортерный ген" относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей
идентифицирующий фактор, который может быть идентифицирован на основании эффекта указанного репортерного гена, при этом указанный эффект применяют для отслеживания наследования представляющей интерес нуклеиновой кислоты, для идентификации клетки или организма, унаследовавшей или унаследовавшего представляющую интерес нуклеиновую кислоту, и/или для измерения индукции генной экспрессии или транскрипции генов. Примеры репортерных генов, известных и используемых в данной области техники, включают: люциферазу (Luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), р-галактозидазу (LacZ), р-глюкуронидазу (Gus) и т.п. Селектируемые маркерные гены могут также считаться репортерными генами.
[0116] "Промотор" и "последовательность промотора" используются
взаимозаменяемо и относятся к последовательности ДНК, способной контролировать экспрессию кодирующей последовательности или функциональной РНК. В общем случае кодирующая последовательность локализована в направлении 3' по отношению к последовательности промотора. Промоторы могут полностью происходить из природного гена, или состоять из разных элементов, происходящих из разных промоторов, встречающихся в природе, или даже содержать синтетические сегменты ДНК.
Специалистам в данной области техники понятно, что разные промоторы могут направлять
экспрессию гена в разных тканях или типах клеток, или на разных стадиях развития, или в
ответ на разные условия среды или физиологические условия. Промоторы, вызывающие
экспрессию гена в большинстве типов клеток большую часть времени обычно называют
"конститутивными промоторами". Промоторы, вызывающие экспрессию гена в
специфическом типе клеток, обычно называют "клеточно-специфическими промоторами"
или "тканеспецифическими промоторами". Промоторы, вызывающие экспрессию гена на
специфической стадии развития или дифференцировки клеток обычно называют
"специфическими для стадии развития промоторами" или "специфическими для стадии
дифференцировки клеток промоторами". Промоторы, индуцируемые и вызывающие
экспрессию гена после воздействия на клетку или обработки клетки агентом,
биологической молекулой, химическим агентом, лигандом, светом или т.п., который
индуцирует указанный промотор, обычно называют "индуцируемыми промоторами", или
"регулируемыми промоторами". Также известно, что, поскольку в большинстве случаев
точные границы регуляторных последовательностей не были полностью определены,
фрагменты ДНК разной длины могут обладать идентичной промоторной активностью.
[0117] Последовательность промотора, как правило, ограничена на З'-конце сайтом
инициации транскрипции и продолжается в 5'-направлении (5'), включая минимальное
число оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на уровнях,
детектируемо выше фоновых. В составе последовательности промотора обнаруживается
сайт инициации транскрипции (который может быть успешно определен, например, путем
картирования с применением нуклеазы S1), а также связывающие белки домены
(консенсусные последовательности), отвечающие за связывание РНК-полимеразы.
[0118] Термины "рестрикционная эндонуклеаза" и "рестрикционный фермент"
используются взаимозаменяемо и относятся к ферменту, который связывается со
специфической последовательностью нуклеотидов в двунитевой ДНК и разрезает ее.
[0119] Термин "плазмида" относится к экстрахромосомному элементу, часто
несущему ген, не являющийся частью центрального метаболизма клетки, как правило, в
форме кольцевых молекул двунитевой ДНК. Такие элементы могут представлять собой
автономно реплицирующиеся последовательности, последовательности,
интегрирующиеся в геном, последовательности фагов или нуклеотидов, линейной,
кольцевой или суперспирализованной одно- или двунитевой ДНК или РНК, происходящие
из любого источника, в которых ряд последовательностей нуклеотидов были объединен
или рекомбинирован с получением уникальной конструкции, которая способна вводить в
клетку промоторный фрагмент и последовательность ДНК для выбранного генного
продукта, наряду с подходящей нетранслируемой З'-последовательностью.
[0120] Эукариотические вирусные векторы, подходящие для применения,
включают, не ограничиваясь перечисленными, аденовирусные векторы, ретровирусные
векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, поксвирусные векторы, например, на основе вируса осповакцины, бакуловирусные векторы или герпесвирусные векторы. Невирусные векторы включают плазмиды, липосомы, электрически заряженные липиды (цитофектины), ДНК-белковые комплексы и биополимеры.
[0121] "Клонирующий вектор" относится к "репликону", который представляет
собой единицу длины нуклеиновой кислоты, которая последовательно реплицируется и
содержит точку начала репликации, например, плазмиду, фаг или космиду, к которому
может быть прикреплен другой сегмент нуклеиновой кислоты для осуществления
репликации присоединенного сегмента. Определенные клонирующие векторы способны к
репликации в клетках одного типа, например, в бактериях, и экспрессии в других, например,
эукариотических клетках. Клонирующие векторы, как правило, содержат одну или более
последовательностей, которые могут быть использованы для выбора клеток, содержащих
указанный вектор и/или один или более сайтов множественного клонирования для
инсерции представляющих интерес последовательностей нуклеиновых кислот.
[0122] Термин "экспрессионный вектор" относится к основе, разработанной для
обеспечения экспрессии инсертированной последовательности нуклеиновой кислоты после инсерции в клетку-хозяина. Указанную инсертированную последовательность нуклеиновой кислоты функционально связывают с регуляторными областями согласно описанию выше.
[0123] Векторы вводят в клетки-хозяева с применением способов, хорошо
известных в данной области техники, таких как трансфекция, электропорация, микроинъекция, трансдукция, слияние клеток, ДЭАЕ-декстран, осаждение фосфатом кальция, липофекция (слияние с лизосомой), применение генной пушки или переносчика ДНК-вектора.
[0124] "Культура", "культивировать" и "культивирование" в настоящем документе
означает инкубацию клеток in vitro в условиях, обеспечивающих рост или деление клеток, или поддержание клеток в живом состоянии. "Культивируемые клетки" в настоящем документе означает клетки, размножаемые in vitro.
[0125] В настоящем документе термин "полипептид" предусматривает как
единственный "полипептид", так и множество "полипептидов" и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно соединенных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин "полипептид" относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот, и не относятся к специфической длине продукта. Соответственно, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, "белок", "цепь аминокислот" или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей из двух или более аминокислот, включен в определение "полипептида", и термин "полипептид" может быть использован вместо любого из указанных терминов или взаимозаменяемо с ними. Предполагается также, что термин "полипептид" относится к
продуктам пост-экспрессионных модификаций указанного полипептида, в том числе, без ограничения, гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления или модификации не встречающимися в природе аминокислотами. Полипептид может происходить из естественного биологического источника или быть получен с помощью рекомбинантной технологии, однако не обязательно транслирован с заданной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым способом, в том числе путем химического синтеза.
[0126] Термин "аминокислота" включает аланин (Ala или А); аргинин (Arg или R);
аспарагин (Asn или N); аспарагиновую кислоту (Asp или D); цистеин (Cys или С); глутамин (Gin или Q); глутаминовую кислоту (Glu или Е); глицин (Gly или G); гистидин (His или Н); изолейцин (Не или I): лейцин (Leu или L); лизин (Lys или К); метионин (Met или М); фенилаланин (Phe или F); пролин (Pro или Р); серии (Ser или S); треонин (Thr или Т); триптофан (Тгр или W); тирозин (Туг или Y); и валин (Val или V). Нетрадиционные аминокислоты также входят в объем настоящего изобретения и включают норлейцин, орнитин, норвалин, гомосерин и другие аналоги остатков аминокислот, такие как описанные в Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991). Для получения таких не встречающихся в природе остатков аминокислот могут применяться процедуры согласно источникам: Noren et al. Science 244:182 (1989) и Ellman et al., выше. Вкратце, указанные процедуры включают химическую активацию супрессорной тРНК не встречающимся в природе остатком аминокислоты с последующей in vitro транскрипцией и трансляцией РНК. Введение нетрадиционной аминокислоты может также быть достигнуто с применением методов химии пептидов, известных в данной области техники. В настоящем документе термин "полярная аминокислота" включает аминокислоты, имеющие суммарный нулевой заряд, но ненулевые частичные заряды в различных частях боковых цепей (например, М, F, W, S, Y, N, Q, С). Указанные аминокислоты могут принимать участие в гидрофобных взаимодействиях и электростатических взаимодействиях. В настоящем документе термин "заряженная аминокислота" включает аминокислоты, которые могут иметь суммарный ненулевой заряд на боковых цепях (например, R, К, Н, Е, D). Указанные аминокислоты могут принимать участие в гидрофобных взаимодействиях и электростатических взаимодействиях.
[0127] Также настоящее изобретение охватывает фрагменты или варианты
полипептидов, и любую их комбинацию. Термин "фрагмент" или "вариант" в отношении полипептидных связывающих доменов или связывающих молекул согласно настоящему изобретению включает любые полипептиды, которые сохраняют по меньшей мере некоторые из свойств (например, аффинность связывания FcRn для связывающего FcRn домена или варианта Fc, активность коагуляции варианта FVIII или активность связывания FVIII в отношении фрагмента VWF) референсного полипептида. Фрагменты полипептидов
включают протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты, помимо специфических фрагментов антител, описанных в различных разделах настоящего документа, однако не включают встречающийся в природе полноразмерный полипептид (или зрелый полипептид). Варианты полипептидных связывающих доменов или связывающих молекул согласно настоящему изобретению включают фрагменты согласно описанию выше, а также полипептиды с измененными последовательностями аминокислот в результате замен, делеций или инсерций аминокислот. Варианты могут быть природными или не встречающимися в природе. Не встречающиеся в природе варианты могут быть получены с применением известных в данной области техники техник мутагенеза. Варианты полипептидов могут содержать консервативные или неконсервативные замены аминокислот, делеций или добавления.
[0128] "Консервативная замена аминокислоты" представляет собой такую замену
аминокислоты, при которой остаток аминокислоты заменяют на остаток аминокислоты с аналогичной боковой цепью. В данной области техники были определены семейства остатков аминокислот с аналогичными боковыми цепями, в том числе основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицином, аспарагином, глутамином, серином, треонином, тирозином, цистеином), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Соответственно, если аминокислоту в полипептиде заменяют на другую аминокислоту из того же семейства боковых цепей, указанную замену считают консервативной. Согласно другому варианту реализации отрезок аминокислот может быть консервативным образом заменен на структурно аналогичный отрезок, отличающийся порядком и/или составом представителей семейства боковых цепей.
[0129] Термин "процент идентичности" в данной области техники обозначает
взаимоотношения двух или более последовательностей полипептидов, или двух или более последовательностей полинуклеотидов, определенные путем сравнения указанных последовательностей. В данной области техники "идентичность", в соответствующих обстоятельствах, также означает степень родства последовательностей полипептидов или последовательностей полинуклеотидов по результатам оценки совпадений между отрезками таких последовательностей. Расчет "идентичности" может быть легко произведен с применением известных способов, включая описанные в источниках: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.)
Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (yon Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); и Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991), но не ограничиваясь перечисленными способами. Предпочтительные способы определения идентичности разработаны таким образом, чтобы обеспечивать достижение наилучшего совпадения тестируемых последовательностей. Способы определения идентичности закодированы в компьютерных программах в открытом доступе. Выравнивание последовательностей и расчеты процента идентичности могут быть выполнены с применением программного обеспечения для анализа последовательностей, такого как программа Megalign из пакета для биоинформационных вычислений LASERGENE (DNASTAR Inc., Мэдисон, Висконсин), пакета программ GCG (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Мэдисон, Висконсин), В LAST P, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)), и DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Мэдисон, Висконсин 53715, США). В контексте настоящего документа следует понимать, что при применении для анализа аналитического программного обеспечения результаты указанного анализа основаны на "установленных по умолчанию значениях" упоминаемой программы, если не указано иное. В настоящем документе "установленные по умолчанию значения" означают любой набор значений или показателей, загружаемых исходно с программным обеспечением при первом запуске. Для определения процента идентичности оптимизированной последовательности BDD FVIII согласно настоящему изобретению и референсной последовательности для расчета процента идентичности используют только нуклеотиды в референсной последовательности, соответствующие нуклеотидам в оптимизированной последовательности BDD FVIII согласно настоящему изобретению. Например, при сравнении полноразмерной последовательности нуклеотидов FVIII, содержащей В-домен, с оптимизированной последовательностью нуклеотидов FVIII с делециями в В-домене (BDD) согласно настоящему изобретению для расчета процента идентичности используют частичное выравнивание, включающее домены А1, А2, A3, С1 и С2. Нуклеотиды в части полноразмерной последовательности FVIII, кодирующей В-домен (которые вызвали бы большой "пропуск" при выравнивании), не считают несовпадающими. Кроме того, при определении процента идентичности оптимизированной последовательности BDD FVIII согласно настоящему изобретению, или определенной ее части (например, нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID N0:3), и референсной последовательности, процент идентичности рассчитывают путем деления числа совпадающих при выравнивании нуклеотидов на общее число нуклеотидов в полной последовательности оптимизированной последовательности BDD-FVIII, или определенной ее части, согласно описанию в настоящем документе.
[0130] В настоящем документе "нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам в
оптимизированной последовательности BDD FVIII согласно настоящему изобретению"
идентифицируют путем выравнивания оптимизированной последовательности BDD FVIII согласно настоящему изобретению для максимизации идентичности референсной последовательности FVIII. Номер, используемый для идентификации эквивалентной аминокислоты в референсной последовательности FVIII, основан на номере, используемом для идентификации соответствующей аминокислоты в оптимизированной последовательности BDD FVIII согласно настоящему изобретению.
[0131] "Слитый", или "химерный" белок содержит первую последовательность
аминокислот, соединенную с второй последовательностью аминокислот, с которой он не соединен в естественных условиях. Последовательности аминокислот, которые в норме присутствуют в отдельных белках, могут быть совмещены в слитом полипептиде, или последовательности аминокислот, которые в норме присутствуют в одном белке, могут быть по-новому размещены в слитом полипептиде, например, при слиянии домена фактора VIII согласно настоящему изобретению с доменом lg Fc. Слитый белок получают, например, путем химического синтеза, или путем получения и трансляции полинуклеотида, в котором закодированы области пептида, взаимосвязанные требуемым образом. Химерный белок может дополнительно содержать вторую последовательность аминокислот, ассоциированную с указанной первой последовательностью аминокислот за счет ковалентной непептидной связи или нековалентной связи.
[0132] В настоящем документе термин "сайт инсерции" относится к положению в
полипептиде FVIII или его фрагменте, варианте или производном, находящемся непосредственно за положением, в котором может быть инсертирован гетерологичный фрагмент, в 5'-направлении. "Сайт инсерции" обозначают номером, который представляет собой номер аминокислоты в зрелом природном FVIII (SEQ ID NO: 15; фиг. 11 А), которому соответствует сайт инсерции, расположенный в направлении N-конца непосредственно за положением инсерции. Например, выражение "аЗ содержит гетерологичный фрагмент в сайте инсерции, который соответствует аминокислоте 1656 последовательности SEQ ID NO: 15" означает, что указанный гетерологичный фрагмент локализован между двумя аминокислотами, соответствующими аминокислоте 1656 и аминокислоте 1657 последовательности SEQ ID NO: 15.
[0133] Выражение "в З'-направлении непосредственно за аминокислотой" в
настоящем документе относится к положению, следующему сразу за концевой карбоксильной группой указанной аминокислоты. Аналогичным образом, выражение "в 5'-направлении непосредственно за аминокислотой" относится к положению, следующему сразу за концевой аминогруппой указанной аминокислоты.
[0134] Термины "инсертированный", "инсертирован", "инсертирован в" или
грамматически связанные с ними термины в настоящем документе относятся к положению гетерологичного фрагмента в рекомбинантном полипептиде FVIII относительно аналогичного положения в природном зрелом FVIII человека. В настоящем документе
указанные термины относятся к сравнительным характеристикам рекомбинантного полипептида FVIII относительно природного зрелого FVIII человека, и не определяют, не подразумевают и не указывают на какие-либо способы или процессы, с помощью которых был получен указанный рекомбинантный полипептид FVIII.
[0135] В настоящем документе термин "время полужизни" относится к
биологическому времени полужизни конкретного полипептида in vivo. Время полужизни
может быть представлено периодом времени, необходимым для выведения из кровотока
и/или других тканей животного половины введенного субъекту количества. При построении
кривой выведения определенного полипептида как функции времени указанная кривая, как
правило, является двухфазной, с быстрой а-фазой и более медленной р-фазой. а-фаза,
как правило, соответствует установлению равновесного состояния введенного Fc-
полипептида между внутри- и внесосудистым пространством, и отчасти определена
размером указанного полипептида, р-фаза, как правило, соответствует катаболизму
указанного полипептида во внутрисосудистом пространстве. Согласно некоторым
вариантам реализации FVIII и химерные белки, содержащие FVIII, являются монофазными,
и, соответственно, лишены альфа-фазы, характеризуясь наличием исключительно бета-
фазы. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации термин "время
полужизни" в настоящем документе относится к времени полужизни полипептида в р-фазе.
[0136] Термин "соединенный" в настоящем документе относится к первой
последовательности аминокислот или последовательности нуклеотидов, ковалентно или нековалентно присоединенной к второй последовательности аминокислот или последовательности нуклеотидов, соответственно. Первая аминокислота или последовательность нуклеотидов может быть прямо присоединена или размещена рядом с второй последовательностью аминокислот или нуклеотидов, или, как вариант, переходная последовательность может ковалентно соединять указанную первую последовательность с указанной второй последовательностью. Термин "соединенный" означает не только слияние первой последовательности аминокислот с второй последовательностью аминокислот на С-конце или N-конце, однако также включает инсерцию первой последовательности аминокислот (или второй последовательности аминокислот) целиком между любыми двумя аминокислотами в указанной второй последовательности аминокислот (или первой последовательности аминокислот, соответственно). Согласно одному варианту реализации указанная первая последовательность аминокислот может быть соединена с второй последовательностью аминокислот пептидной связью или линкером. Указанная первая последовательность нуклеотидов может быть соединена с второй последовательностью нуклеотидов фосфодиэфирной связью или линкером. Линкер может представлять собой пептид или полипептид (для полипептидных цепей) или нуклеотид или нуклеотидную цепь (для
нуклеотидных цепей), или любой химический фрагмент (как для полипептидных, так и для
полинуклеотидных цепей). Термин "соединенный" также обозначается дефисом (-).
[0137] В настоящем документе термин "ассоциированный" ("связанный")
относится к ковалентной или нековалентной связи, образуемой между первой цепью
аминокислоты и второй цепью аминокислоты. Согласно одному варианту реализации
термин "ассоциированный" ("связанный") означает ковалентную непептидную связь или
нековалентную связь. Указанная связь может быть обозначена двоеточием, т.е. (:).
Согласно другому варианту реализации указанный термин означает ковалентную связь, за
исключением пептидной связи. Например, аминокислота цистеин содержит тиольную
группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик с тиольной группой
на втором остатке цистеина. В большинстве встречающихся в природе молекул IgG
области СН1 и CL связаны дисульфидной связью, а два тяжелых цепи связаны двумя
дисульфидными связями в положениях, соответствующих положениям 239 и 242 в системе
нумерации Kabat (положение 226 или 229, система нумерации EU). Примеры ковалентных
связей включают, не ограничиваясь перечисленными, пептидную связь, металлическую
связь, водородную связь, дисульфидную связь, сигма-связь, пи-связь, дельта-связь,
гликозидную связь, агостическую связь, изогнутую связь, диполярную связь, обратное пи-
донирование, двойную связь, тройную связь, четверную связь, пятерную связь, шестерную
связь, сопряжение, гиперсопряжение, ароматичность, гаптичность или антисвязывание.
Неограничивающие примеры нековалентной связи включают ионную связь (например,
катионную пи-связь или солевую связь), металлическую связь, водородную связь
(например, диводородную связь, диводородный комплекс, низкобарьерную водородную
связь или симметрическую водородную связь), ван-дер-ваальсову силу, лондоновские
дисперсионные силы, механическую связь, галогенную связь, аурофильность,
интеркаляция, стэкинг, энтропийную силу или химическую полярность.
[0138] Термин "мономерно-димерный гибрид" в настоящем документе относится к
химерному белку, содержащему первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, которые связаны друг с другом дисульфидной связью, при этом первая цепь содержит фактор свертывания крови, например, фактор VIII, и первую Fc-область; а вторая цепь содержит, состоит по существу или состоит из второй Fc-области без фактора свертывания крови. Мономерно-димерная гибридная конструкция, соответственно, представляет собой гибрид, содержащий мономерный компонент, который содержит только один фактор свертывания крови, и димерный компонент, который содержит две Fc-области.
[0139] Гемостаз, в настоящем документе, означает остановку или замедление
кровотечения или геморрагии; или остановку или замедление кровотока через кровеносный сосуд или часть организма.
[0140] Гемостатическое расстройство в настоящем документе означает
генетически наследуемое или приобретенное состояние, характеризующееся тенденцией к геморрагии, либо спонтанной, либо в результате травмы, ввиду нарушенной способности или неспособности к образованию фибринового сгустка. Примеры таких расстройств включают гемофилии. Три основных формы представлены гемофилией А (дефицит фактора VIII), гемофилией В (дефицит фактора IX или "болезнь Кристмаса") и гемофилией С (дефицит фактора XI, слабая тенденция к кровотечению). Другие гемостатические расстройства включают, например, болезнь фон Виллебранда, дефицит фактора XI (дефицит плазменного предшественника тромбопластина, ППТ), дефицит фактора XII, дефицит или структурные аномалии фибриногена, протромбина, фактора V, фактора VII, фактора X или фактора XIII, синдром Бернара-Сулье, который представляет собой дефект или дефицит GPIb. GPIb, рецептор фактора фон Виллебранда (vWF), может быть дефектным, обуславливать недостаточность первичного образования сгустка (первичного гемостаза) и увеличивать тенденцию к кровотечению), и тромбастению Гланцманна и Негели (тромбастения Гланцманна). При печеночной недостаточности (острой и хронической формах) наблюдается недостаточное продуцирование факторов коагуляции печенью; это может повышать риск кровотечения.
[0141] Выделенные молекулы нуклеиновых кислот, выделенные полипептиды или
векторы, содержащие выделенную молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, могут применяться профилактически. В настоящем документе термин "профилактическое лечение" относится к введению молекулы до эпизода кровотечения. Согласно одному варианту реализации у нуждающегося в общем гемостатическом агенте субъекта осуществляется или будет осуществляться хирургическое вмешательство. Полинуклеотид, полипептид или вектор согласно настоящему изобретению может быть введен до или после хирургического вмешательства в качестве профилактики. Полинуклеотид, полипептид или вектор согласно настоящему изобретению может быть введен во время или после хирургического вмешательства для контроля эпизода острого кровотечения. Хирургическое вмешательство может включать, не ограничиваясь перечисленным, трансплантацию печени, резекцию печени, стоматологические процедуры или трансплантацию стволовых клеток.
[0142] Выделенные молекулы нуклеиновых кислот, выделенные полипептиды или
векторы согласно настоящему изобретению также применяют для лечения по мере необходимости. Термин "лечение по мере необходимости" относится к введению выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, выделенного полипептида или вектора в ответ на симптомы эпизода кровотечения или до активности, которая может вызывать кровотечение. Согласно одному аспекту лечение по мере необходимости может быть проведено у субъекта при начале кровотечения, например, после повреждения, или когда ожидается кровотечение, например, до хирургического вмешательства. Согласно другому
аспекту лечение по мере необходимости может быть проведено до занятий видами
активности, который повышают риск кровотечения, например, контактными видами спорта.
[0143] В настоящем документе термин "острое кровотечение" относится к эпизоду
кровотечения независимо от первопричины. Например, у субъекта может иметься травма, уремия, наследственное расстройство системы свертывания крови (например, дефицит фактора VII) тромбоцитарное расстройство или устойчивость в результате выработки антител к факторам свертывания крови.
[0144] Термины "лечить" и "лечение" в настоящем документе относятся,
например, к снижению тяжести заболевания или состояния; снижению продолжительности заболевания; облегчению одного или более симптомов, ассоциированных с заболеванием или состоянием; обеспечению благоприятных эффектов у субъекта с заболеванием или состоянием, необязательно с излечением указанного заболевания или состояния, или профилактике одного или более симптомов, ассоциированных с заболеванием или состоянием. Согласно одному варианту реализации термин "лечить" или "лечение" означает поддержание у субъекта минимальной остаточной концентрации FVIII, составляющей по меньшей мере приблизительно 1 МЕ/дл, 2 МЕ/дл, 3 МЕ/дл, 4 МЕ/дл, 5 МЕ/дл, 6 МЕ/дл, 7 МЕ/дл, 8 МЕ/дл, 9 МЕ/дл, 10 МЕ/дл, 11 МЕ/дл, 12 МЕ/дл, 13 МЕ/дл, 14 МЕ/дл, 15 МЕ/дл, 16 МЕ/дл, 17 МЕ/дл, 18 МЕ/дл, 19 МЕ/дл или 20 МЕ/дл путем введения выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, выделенного полипептида или вектора согласно настоящему изобретению. Согласно другому варианту реализации лечить или лечение означает поддержание минимальной остаточной концентрации FVIII, составляющей от приблизительно 1 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 2 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 3 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 4 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 5 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 6 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 7 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 8 до приблизительно 20 МЕ/дл, от приблизительно 9 до приблизительно 20 МЕ/дл или от приблизительно 10 до приблизительно 20 МЕ/дл. Лечение заболевания или состояния может также включать поддержание активности FVIII у субъекта на уровне, сопоставимом по меньшей мере приблизительно с 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% активности FVIII у субъекта без гемофилии. Минимум минимальной остаточной концентрации, необходимый для лечения, может быть измерен одним или более известными способами и может быть скорректирован (увеличен или уменьшен) для каждого индивидуума.
[0145] "Введение" в настоящем документе означает предоставление субъекту
фармацевтически приемлемой кодирующей фактор VIII молекулы нуклеиновой кислоты, полипептида фактора VIII или вектора, содержащего кодирующую фактор VIII молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению с использованием
фармацевтически приемлемого маршрута. Маршруты введения могут быть внутривенными, как, например, внутривенная инъекция и внутривенная инфузия. Дополнительные маршруты введения включают, например, подкожное, внутримышечное, пероральное, назальное и легочное введение. Указанные молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды и векторы могут быть введены в составе фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно вспомогательное вещество.
[0146] В настоящем документе выражение "нуждающийся в этом субъект"
включает субъектов, таких как субъекты-млекопитающие, для которых было бы
благоприятным введение молекулы нуклеиновой кислоты, полипептида или вектора
согласно настоящему изобретению, например, для улучшения гемостаза. Согласно одному
варианту реализации указанные субъекты включают, не ограничиваясь перечисленными,
индивидуумов с гемофилией. Согласно другому варианту реализации указанные субъекты
включают, не ограничиваясь перечисленными, индивидуумов, у которых выработался
ингибитор FVIII и, соответственно, нуждающихся в обходной терапии. Указанный субъект
может быть взрослым или несовершеннолетним (например, возрастом менее 12 лет).
[0147] В настоящем документе термин "фактор свертывания крови" относится к
молекулам или их аналогам, встречающимся в природе или полученным рекомбинантным способом, которые предотвращают кровотечение или уменьшают продолжительность эпизода кровотечения у субъекта. Другими словами, он означает молекулы, обладающие прокоагулирующей активностью, т.е. отвечают за преобразование фибриногена в сеть из нерастворимого фибрина, что вызывает коагуляцию, или сворачивание крови. "Активируемый фактор свертывания крови" представляет собой фактор свертывания крови в неактивной форме (например, в форме зимогена), которая способна к преобразованию в активную форму.
[0148] Свертывающая активность в настоящем документе означает способность
принимать участие в каскаде биохимических реакций, завершающемся образованием фибринового сгустка и/или уменьшением тяжести, продолжительности или частоты эпизода геморрагии или кровотечения.
[0149] В настоящем документе термины "гетерологичный" или "экзогенный"
относятся к таким молекулам, которые в норме не обнаруживаются в определенных условиях, например, в клетке или в полипептиде. Например, экзогенная или гетерологичная молекула может быть введена в клетку и присутствовать в ней исключительно после осуществления манипуляций с указанной клеткой, например, путем трансфекции или других форм генетического конструирования; или гетерологичная последовательность аминокислот может присутствовать в белке, в котором она не обнаруживается в естественных условиях.
[0150] В настоящем документе термин "гетерологичная последовательность
нуклеотидов" относится к последовательности нуклеотидов, которая не встречается в
естественных условиях вместе с определенной последовательностью полинуклеотидов.
Согласно одному варианту реализации указанная гетерологичная последовательность
нуклеотидов кодирует полипептид, способный продлевать время полужизни FVIII.
Согласно другому варианту реализации указанная гетерологичная последовательность
нуклеотидов кодирует полипептид, который увеличивает гидродинамический радиус FVIII.
Согласно другим вариантам реализации указанная гетерологичная последовательность
нуклеотидов кодирует полипептид, который улучшает одно или более
фармакокинетических свойств FVIII, значимо не влияя на его биологическую активность
или функцию (например, прокоагулянтную активность). Согласно некоторым вариантам
реализации FVIII соединен или связан с полипептидом, кодируемым указанной
гетерологичной последовательностью нуклеотидов линкером. Неограничивающие
примеры полипептидных фрагментов, кодируемых гетерологичными
последовательностями нуклеотидов, включают, в том числе, константную область
иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающий
фрагмент, трансферрин, полипептиды PAS согласно заявке на патент США №
20100292130, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, С-концевой
пептид (СТР) р-субъединицы хорионического гонадотропина человека, связывающую
альбумин малую молекулу, последовательность XTEN, связывающие FcRn фрагменты
(например, полные Fc-области или их части, которые связываются с FcRn),
одноцепочечные Fc-области (ScFc-области, например, согласно описанию в US
2008/0260738, WO 2008/012543 или WO 2008/1439545), полиглициновые линкеры,
полисериновые линкеры, пептиды и короткие полипептиды из 6-40 аминокислот двух типов
аминокислот, выбранных из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутамата
(Е) и пролина (Р) с различными степенями вторичной структуры, от менее чем 50% до
более чем 50%, или две или более комбинации перечисленного. Согласно некоторым
вариантам реализации полипептид, кодируемый указанной гетерологичной
последовательностью нуклеотидов, соединен с неполипептидным фрагментом.
Неограничивающие примеры неполипептидными фрагментами включают
полиэтиленгликоль (ПЭГ), связывающие альбумин малые молекулы, полисиаловую
кислоту, гидроксиэтилкрахмал (ГЭК), их производные или любые их комбинации.
[0151] В настоящем документе термин "Fc-область" определен как часть
полипептида, которая соответствует Fc-области природного lg, т.е. образована димерной связью соответствующих Fc-доменов двух тяжелых цепей. Природная Fc-область образует гомодимер с другой Fc-областью. Напротив, термин "генетически слитая Fc-область" или "одноцепочечная Fc-область" (scFc-область) в настоящем документе относится к синтетической димерной Fc-области, состоящей из Fc-доменов, генетически соединенных в составе одной полипептидной цепи (т.е. закодированных в одной непрерывной генетической последовательности).
[0152] Согласно одному варианту реализации "Fc-область" относится к части
одной тяжелой цепи lg с началом в шарнирной области непосредственно за сайтом расщепления папаином в 5'-направлении (т.е. остатком 216 в IgG, при условии, что первый остаток константной области тяжелой цепи имеет номер 114) и окончанием на С-конце антитела. Соответственно, полный Fc-домен содержит по меньшей мере шарнирный домен, домен СН2 и домен СНЗ.
[0153] Fc-область константной области lg, в зависимости от изотипа lg, может
включать домены СН2, СНЗ и СН4, а также шарнирную область. Химерные белки,
содержащие Fc-область lg, отличаются рядом желательных свойств, включая повышенную
стабильность, увеличенное время полужизни в сыворотке (см. Capon et al., 1989, Nature
337:525), а также связывание с Fc-рецепторами, такими как неонатальный Fc-рецептор
(FcRn) (патенты США №6086875, №6485726, №6030613; WO 03/077834; US2003-
0235536А1), которые включены в настоящий документ полностью посредством ссылки.
[0154] "Референсная последовательность нуклеотидов", используемая в
настоящем документе для сравнения с последовательностью нуклеотидов согласно
настоящему изобретению, представляет собой последовательность полинуклеотидов, по
существу идентичную последовательности нуклеотидов согласно настоящему
изобретению, за исключением того, что части, соответствующие последовательности FVIII,
не оптимизированы. Например, референсная последовательность нуклеотидов для
молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из кодон-оптимизированной
последовательности BDD FVIII SEQ ID NO: 1 и гетерологичной последовательности
нуклеотидов, которая кодирует одноцепочечную Fc-область, соединенную с SEQ ID NO: 1
на З'-конце, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, состоящую из
оригинальной (или "исходной") последовательности BDD FVIII SEQ ID NO: 16 (фиг. 11) и
идентичной гетерологичной последовательности нуклеотидов, которая кодирует
одноцепочечную Fc-область, соединенную с SEQ ID NO: 16 на З'-конце.
[0155] "Индекс адаптации кодонов" в настоящем документе относится к мере
смещения частоты использования кодонов. Индекс адаптации кодонов (CAI) измеряет отклонение определенной кодирующей белок генной последовательности относительно референсного набора генов (Sharp РМ and Li WH, Nucleic Acids Res. 15(3):1281-95 (1987)). CAI вычисляют путем определения геометрического среднего веса, ассоциированного с каждым кодоном, на протяжении длины генной последовательности (измеренной в кодонах):
CAI = ex?(l/L*t\n(wt(l))),
i=i (I)
[0156] Для каждой аминокислоты рассчитывают вес каждого из кодонов в CAI как
отношение наблюдаемой частоты кодона (fi) и частоты синонимичного кодона (fj) для
указанной аминокислоты:
[0157] Формула 2:
W\= -^- ij ? [синонимичные кодоны для аминокислоты] (II)
[0158] В настоящем документе термин "оптимизированный" в отношении
последовательностей нуклеотидов относится к последовательности полинуклеотидов, которая кодирует полипептид, при этом указанная последовательность полинуклеотидов была мутирована для усиления свойства указанной последовательности полинуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации оптимизацию осуществляют для увеличения уровней транскрипции, увеличения уровней трансляции, увеличения равновесных уровней мРНК, увеличения или уменьшения связывания регуляторных белков, например, общих транскрипционных факторов, увеличения или уменьшения сплайсинга; или увеличения выхода полипептида, продуцируемого указанной последовательностью полинуклеотидов. Примеры изменений, которые могут быть внесены в последовательность полинуклеотидов для ее оптимизации, включают оптимизацию кодонов, оптимизацию содержания G/C, удаление последовательностей повторов, удаление богатых AT элементов, удаление скрытых сайтов сплайсинга, удаление цис-действующих элементов, которые репрессируют транскрипцию или трансляцию, добавление или удаление последовательностей поли-Т или поли-А, добавление вокруг сайта начала транскрипции последовательностей, которые усиливают транскрипцию, таких как консенсусные последовательности Козак, удаление последовательностей, которые способны формировать структуры типа "стебель-петля", удаление дестабилизирующих последовательностей, и две или более комбинации перечисленного.
Последовательность полинуклеотидов, кодирующая белок FVIII
[0159] Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение
относится к кодон-оптимизированным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептид с активностью FVIII. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полинуклеотид кодирует полноразмерный полипептид FVIII. Согласно другим вариантам реализации указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид FVIII с делециями в В-домене (BDD), при этом весь делетирован В-домен FVIII или его часть. Согласно одному конкретному варианту реализации указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, содержащий последовательность аминокислот, обладающую по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей
мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательности SEQ ID NO: 17 (фиг. 1J) или ее фрагменту. Согласно одному варианту реализации указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид с последовательностью аминокислот последовательности SEQ ID NO: 17 или ее фрагмента.
[0160] Согласно некоторым вариантам реализации указанная молекула
нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует полипептид FVIII, содержащий сигнальный пептид или его фрагмент. Согласно другим вариантам реализации указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид FVIII, в котором отсутствует сигнальный пептид. Согласно некоторым вариантам реализации указанный сигнальный пептид содержит аминокислот 1-19 последовательности SEQ ID NO: 17.
[0161] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 3 или (ii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; и при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII. Согласно одному конкретному варианту реализации указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 3. Согласно другому варианту реализации указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4. Согласно другим вариантам реализации указанная первая последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 3 или нуклеотиды 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4.
[0162] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 3 или (ii) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; и при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII. Согласно одному варианту реализации указанная первая последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 3 или нуклеотиды 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 4. Согласно другому варианту реализации указанная вторая последовательность нуклеотидов обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 3 или 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 4. Согласно одному конкретному варианту реализации указанная вторая последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 3 или 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 4. Согласно еще одному варианту реализации указанная вторая последовательность нуклеотидов обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3 или 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 4 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 3 или 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 4 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена). Согласно одному конкретному варианту реализации указанная вторая последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3 или 17922277 и 2320^374 последовательности SEQ ID NO: 4 (т.е. нуклеотиды 1792^374 последовательности SEQ ID NO: 3 или 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 4 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена).
[0163] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность
нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 или (ii) 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6; и при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII. Согласно некоторым вариантам реализации указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5. Согласно другим вариантам реализации указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6. Согласно одному конкретному варианту реализации указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотиды 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 или 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6. Согласно некоторым вариантам реализации указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты, соединенная с указанной второй последовательностью нуклеиновой кислоты из перечисленных выше, обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 5 или нуклеотиды 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 6. Согласно другим вариантам реализации указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты, соединенная с указанной второй последовательностью нуклеиновой кислоты из перечисленных выше, обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 5 или нуклеотидам 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 6.
[0164] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или (ii) 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); и при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII. Согласно некоторым вариантам реализации указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена). Согласно другим вариантам реализации указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена). Согласно одному конкретному варианту реализации указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотиды 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 или 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 (т.е. нуклеотиды 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 или 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена). Согласно некоторым вариантам реализации указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты, соединенная с указанной второй последовательностью нуклеиновой кислоты из перечисленных выше, обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 5 или нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 6. Согласно другим вариантам реализации указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты, соединенная с указанной второй последовательностью нуклеиновой кислоты из перечисленных выше, обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по
меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 5 или нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 6.
[0165] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 1, (ii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 2, (iii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 70 или (iv) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 71; и при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII. Согласно другим вариантам реализации указанная первая последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 1, нуклеотиды 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 2, (iii) нуклеотиды 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 70 или (iv) нуклеотиды 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 71.
[0166] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 1, (ii) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 2, (iii) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 70 или (iv) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 71; и при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII. Согласно одному варианту реализации указанная первая последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 1, нуклеотиды 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 2, (iii) нуклеотиды 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 70 или (iv) нуклеотиды 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 71. Согласно другому варианту реализации указанная
вторая последовательность нуклеотидов, соединенная с указанной первой последовательностью нуклеотидов, обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 2, (iii) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 70 или (iv) нуклеотидов 17924374 последовательности SEQ ID NO: 71. Согласно одному конкретному варианту реализации указанная вторая последовательность нуклеотидов, соединенная с указанной первой последовательностью нуклеотидов, содержит (i) нуклеотиды 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, (ii) нуклеотиды 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 2, (iii) нуклеотиды 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 70 или (iv) нуклеотиды 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 71. Согласно другим вариантам реализации указанная вторая последовательность нуклеотидов, соединенная с указанной первой последовательностью нуклеотидов, обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-2277 и 23204374 последовательности SEQ ID NO: 1, (ii) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 2, (iii) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 70 или (iv) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 71. Согласно одному варианту реализации указанная вторая последовательность нуклеотидов содержит (i) нуклеотиды 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, (ii) нуклеотиды 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 2, (iii) нуклеотиды 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 70 или (iv) нуклеотиды 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 71.
[0167] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, (ii) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 2, (iii) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 70 или (iv) нуклеотидов 1792-4374 последовательности
SEQ ID NO: 71; и при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть
вместе обладают активностью полипептида FVIII. Согласно одному конкретному варианту
реализации указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержит (i)
нуклеотиды 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, (ii) нуклеотиды 1792-4374
последовательности SEQ ID NO: 2, (iii) нуклеотиды 1792-4374 последовательности SEQ ID
NO: 70 или (iv) нуклеотиды 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 71. Согласно
некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена выделенная
молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая
содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую
часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую
С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная вторая последовательность
нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей
мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%
идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-
4374 последовательности SEQ ID NO: 1, (ii) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374
последовательности SEQ ID NO: 2, (iii) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374
последовательности SEQ ID NO: 70 или (iv) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374
последовательности SEQ ID NO: 71 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ
ID NO: 1, нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 2, нуклеотидам 1792-
4374 последовательности SEQ ID NO: 70 или нуклеотидам 1792-4374 последовательности
SEQ ID NO: 71 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); и при этом
указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью
полипептида FVIII. Согласно одному варианту реализации указанная вторая
последовательность нуклеиновой кислоты содержит (i) нуклеотиды 1792-2277 и 2320-4374
последовательности SEQ ID NO: 1, (ii) нуклеотиды 1792-2277 и 2320-4374
последовательности SEQ ID NO: 2, (iii) нуклеотиды 1792-2277 и 2320-4374
последовательности SEQ ID NO: 70 или (iv) нуклеотиды 1792-2277 и 2320-4374
последовательности SEQ ID NO: 71 (т.е. нуклеотиды 1792-4374 последовательности SEQ
ID NO: 1, нуклеотиды 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 2, нуклеотиды 1792-4374
последовательности SEQ ID NO: 70 или нуклеотиды 1792-4374 последовательности SEQ
ID NO: 71 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена).
[0168] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%
идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 1 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена). Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 1 (т.е. нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или нуклеотиды 584374 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 1-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 1 (т.е. нуклеотиды 1-4374 последовательности SEQ ID NO: 1 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или нуклеотиды 1-4374 последовательности SEQ ID NO: 1.
[0169] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 2. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 2. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательности SEQ ID NO: 2.
Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 2 (т.е. нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 2 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 2. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 1-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 2 (т.е. нуклеотиды 1-4374 последовательности SEQ ID NO: 2 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или нуклеотиды 14374 последовательности SEQ ID NO: 2.
[0170] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 70. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 70 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 70 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена). Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательности SEQ ID NO: 70. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 70 (т.е. нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 70 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 70. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 1-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 70 (т.е. нуклеотиды 1-4374
последовательности SEQ ID NO: 70 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент
В-домена) или нуклеотиды 1-4374 последовательности SEQ ID NO: 70.
[0171] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом
указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой
кислоты, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере
87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей
мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по
меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к
последовательностям нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 71. Согласно
другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит
последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 85%, по
меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%,
по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере
96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%
идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374
последовательности SEQ ID NO: 71 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ
ID NO: 71 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена). Согласно
другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты
обладает по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по
меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%,
по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере
98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательности SEQ
ID NO: 71. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность
нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO:
71 (т.е. нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 71 без нуклеотидов,
кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или нуклеотиды 58-4374
последовательности SEQ ID NO: 71. Согласно другим дополнительным вариантам
реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 1-2277 и
2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 71 (т.е. нуклеотиды 1-4374
последовательности SEQ ID NO: 71 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент
В-домена) или нуклеотиды 1-4374 последовательности SEQ ID NO: 71.
[0172] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере
94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 3. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 3 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена). Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательности SEQ ID NO: 3. Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3 (т.е. нуклеотиды 584374 последовательности SEQ ID NO: 3 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 3. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3 (т.е. нуклеотиды 1-4374 последовательности SEQ ID NO: 3 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или нуклеотиды 1-4374 последовательности SEQ ID NO: 3.
[0173] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 4. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 23204374 последовательности SEQ ID NO: 4 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 4 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена). Согласно
другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательности SEQ ID NO: 4. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 4 (т.е. нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 4 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или нуклеотиды 584374 последовательности SEQ ID NO: 4. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 1-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 4 (т.е. нуклеотиды 1-4374 последовательности SEQ ID NO: 4 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или нуклеотиды 1-4374 последовательности SEQ ID NO: 4.
[0174] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 584374 последовательности SEQ ID NO: 5. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 582277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 (т.е. нуклеотидам 58^374 последовательности SEQ ID NO: 5 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена). Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательности SEQ ID NO: 5. Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или нуклеотиды 58-4374
последовательности SEQ ID NO: 5. Согласно другим дополнительным вариантам
реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 1-2277 и
2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 (т.е. нуклеотидам 1-4374
последовательности SEQ ID NO: 5 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-
домена) или нуклеотиды 1-4374 последовательности SEQ ID NO: 5.
[0175] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 584374 последовательности SEQ ID NO: 6. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 582277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 (т.е. нуклеотидам 58^374 последовательности SEQ ID NO: 6 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена). Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательности SEQ ID NO: 6. Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 (т.е. нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 6. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов содержит нуклеотиды 1-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 (т.е. нуклеотиды 1-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена) или нуклеотиды 1-4374 последовательности SEQ ID NO: 6.
[0176] Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность
нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид. Согласно некоторым вариантам реализации указанный сигнальный
пептид представляет собой сигнальный пептид FVIII. Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, кодон-оптимизирована. Согласно одному конкретному варианту реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 1; (ii) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 2; (iii) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 3; (iv) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 4; (v) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 5; (vi) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 6; (vii) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 70; (viii) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 71; или (ix) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 68.
[0177] Последовательности SEQ ID NO: 1-6, 70 и 71 представляют собой
оптимизированные версии последовательности SEQ ID NO: 16, стартовой, или "исходной" последовательности, или последовательности нуклеотидов FVIII "дикого типа". SEQ ID NO: 16 кодирует FVIII человека сделециями в В-домене. Хотя последовательности SEQ ID NO: 1-6, 70 и 71 происходят из специфической формы FVIII сделециями в В-домене (SEQ ID NO: 16), следует понимать, что настоящее изобретение также относится к оптимизированным версиям нуклеиновых кислот, кодирующим другие версии FVIII. Например, другие версии FVIII могут включать полноразмерный FVIII, другие FVIII с делециями в В-домене (описанные ниже) или другие фрагменты FVIII, сохраняющие активность FVIII.
[0178] "Полипептид с активностью FVIII" в настоящем документе означает
функциональный полипептид FVIII, играющий свою обычную роль в коагуляции, если не указано иное. Термин "полипептид с активностью FVIII" включает его функциональный фрагмент, вариант, аналог или производное, который(ое) сохраняет функцию полноразмерного фактора VIII дикого типа в пути коагуляции. Термин "полипептид с активностью FVIII" используют взаимозаменяемо с терминами "белок FVIII", "полипептид FVIII" или "FVIII". Примеры функций FVIII включают, не ограничиваясь перечисленными, способность активировать коагуляцию, способность действовать в качестве кофактора фактора IX, или способность к образованию теназного комплекса с фактором IX в присутствии Са2+ и фосфолипидов, который затем преобразует фактор X в активированную форму Ха. Согласно одному варианту реализации полипептид с активностью FVIII содержит две полипептидных цепи, первая из которых содержит тяжелую цепь FVIII, а вторая содержит легкую цепь FVIII. Согласно другому варианту реализации указанный полипептид с активностью FVIII представляет собой одноцепочечный FVIII.
Одноцепочечный FVIII может содержать одну или более мутаций или замен остатка аминокислоты 1645 и/или 1648, нумерация которого соответствует зрелой последовательности FVIII. См. международную заявку PCT/US2012/045784, включенную в настоящий документ полностью посредством ссылки. Белок FVIII может представлять собой белок FVIII человека, свиней, собачьих, крысы или мыши. Кроме того, при сравнении FVIII человека и других видов были идентифицированы консервативные остатки, предположительно, необходимые для функционирования (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6251632).
[0179] Значение термина "В-домен" FVIII в настоящем документе соответствует
известному в данной области техники В-домену, определяемому идентичностью внутренней последовательности аминокислот и сайтами протеолитического расщепления тромбином, например, остаткам Ser741 -Arg1648 полноразмерного FVIII человека. Другие домены FVIII человека заданы следующими остатками аминокислот: А1, остатки А1а1 -Arg372; А2, остатки Ser373 - Агд740; A3, остатки Ser1690 - Ile2032; С1, остатки Агд2033 -Asn2172; С2, остатки Ser2173 - Туг2332. Последовательность АЗ-С1-С2 включает остатки Ser1690 - Туг2332. Остальную часть последовательности, остатки Glu1649 - Arg1689, обычно называют активационным пептидом легкой цепи FVIII. Локализация границ всех доменов, в том числе В-доменов, для FVIII свиней, мышей и собачьих также известна в данной области техники. Примером BDD FVIII является REFACTO(r), рекомбинантный BDD FVIII (Wyeth Pharmaceuticals, Inc.).
[0180] "FVIII с делециями в В-домене" может содержать все или некоторые
делеций, раскрытые в патентах США 6316226; №6346513; №7041635; №5789203; №6060447; №5595886; №6228620; №5972885; №6048720; №5543502; №5610278; №5171844; №5112950; №4868112; и №6458563, каждый из которых включен в настоящий документ полностью посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность FVIII с делециями в В-домене согласно настоящему изобретению содержит любую из делеций, описанных в патенте США №6316226 (колонка 4, строке 4 -колонка 5, строка 28; и примеры 1-5) (а также в US 6346513). Согласно некоторым вариантам реализации FVIII сделециями в В-домене согласно настоящему изобретению содержит делецию, описанную в патенте США №5789203 (колонка 2, строки 26-51, и примеры 5-8) (а также в US 6060447, US5595886 и US6228620). Согласно некоторым вариантам реализации FVIII с делециями в В-домене содержит делецию, описанную в патенте США № 5972885 (колонка 1, строки 25 - колонка 2, строка 40); в патенте США № 6048720 (колонка 6, строки 1-22 и пример 1); в патенте США № 5543502 (колонка 2, строки 17-46); в патенте США №5171844 (колонка 4, строка 22 - колонка 5, строка 36); в патенте США № 5112950 (колонка 2, строки 55-68, фиг. 2; и пример 1); в патенте США №4868112 (колонка 2, строка 2 - колонка 19, строка 21 и таблица 2); в патенте США №7041635 (колонка 2, строка 1 - колонка 3, строка 19; колонка 3, строка 40 - колонка 4, строка 67;
колонка 7, строка 43 - колонка 8, строка 26; и колонка 11, строка 5 - колонка 13, строка 39); или в патенте США №6458563 (колонка 4, строки 25-53). Согласно некоторым вариантам реализации FVIII с делециями в В-домене содержит делецию большей части В-домена, однако сохраняет аминоконцевые последовательности В-домена, имеющие существенное значение для протеолитического процессинга in vivo первичного продукта трансляции с образованием двух полипептидных цепей, согласно описанию в WO 91/09122, включенном в настоящий документ полностью посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам реализации FVIII с делециями в В-домене конструируют с делециями аминокислот 7471638, т.е. практически полной делецией В-домена. См. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990), включенный в настоящий документ полностью посредством ссылки. FVIII сделециями в В-домене может также содержать делецию аминокислот 7711666 или аминокислот 868-1562 FVIII. См. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988), включенный в настоящий документ полностью посредством ссылки. Дополнительные делеций в В-домене, предусмотренные настоящим изобретением, включают, например: делецию аминокислот 982-1562, включительно, или 760-1639, включительно (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797-1562, включительно (Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741-1646, включительно (Kaufman (опубликованная РСТ-заявка WO 87/04187)), 747-1560, включительно (Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564)), 741-1648 (Pasek (РСТ-заявка №88/00831)), 816-1598, включительно; или 741-1689, включительно (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597)); каждый из перечисленных источников включен в настоящий документ полностью посредством ссылки. Каждая из вышеперечисленных делеций может быть осуществлена в любой последовательности FVIII.
[0181] Ряд функциональных молекул FVIII, в том числе с делециями в В-домене,
описаны в следующих патентах: US 6316226 и US 6346513, выданных Baxter; US 7041635, выданном ln2Gen; US 5789203, US 6060447, US 5595886 и US 6228620, выданных Chiron; US 5972885 и US 6048720, выданных Biovitrum, US 5543502 и US 5610278, выданных Novo Nordisk; US 5171844, выданном Immuno Ag; US 5112950, выданном Transgene S.A.; US 4868112, выданном Genetics Institute, каждый из которых включен в настоящий документ полностью посредством ссылки. Оптимизация кодонов
[0182] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложена
выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеиновой кислоты была кодон-оптимизирована. Согласно другому варианту реализации указанная стартовая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид с активностью FVIII и подвергнутая оптимизации кодонов, представляет собой последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам
реализации указанная последовательность, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, кодон-оптимизирована для экспрессии у человека. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, кодон-оптимизирована для экспрессии у мыши. Последовательности SEQ ID NO: 16, 70 и 71 представляют собой кодон-оптимизированные версии последовательности SEQ ID NO: 16, оптимизированные для экспрессии у человека.
[0183] Термин "кодон-оптимизированный" в отношении генов или кодирующих
областей молекул нуклеиновой кислоты для трансформации различных хозяев относится к изменению кодонов в указанном гене или указанных кодирующих областях молекул нуклеиновой кислоты, соответствующему типичному для организма хозяина использованию кодонов, без изменения полипептида, кодируемого указанной ДНК. Такая оптимизация включает замену по меньшей мере одного, или более чем одного, или значимого числа кодонов одним или более кодонами, чаще используемыми в генах указанного организма.
[0184] Расхождения в последовательности нуклеотидов, которая содержит кодоны,
кодирующие аминокислоты любой полипептидной цепи, позволяют использовать вариации последовательности, кодирующей ген. Поскольку каждый кодон состоит из трех нуклеотидов, а нуклеотиды, содержащие ДНК, ограничены четырьмя специфическими основаниями, существует 64 возможные комбинации нуклеотидов, 61 из которых кодируют аминокислоты (оставшиеся три кодона кодируют сигналы окончания трансляции). "Генетический код", показывающий, какие кодоны кодируют соответствующие аминокислоты, приведен в настоящем документе в таблице 1. В результате многие аминокислоты определены более чем одним кодоном. Например, аминокислоты аланин и пролин кодируют четыре триплета, серии и аргинин - шесть триплетов, а триптофан и метионин кодирует всего один триплет. Указанная вырожденность обеспечивает возможность варьирования состава оснований ДНК в широком диапазоне без изменения последовательности аминокислот в белках, кодируемых указанной ДНК. Таблица 1: Стандартный генетический код
TTT Phe (F)
ттс
TTA Leu (L) TTG
TCT Ser (S)
тсс
TCA TCG
TAT Туг (Y) TAC
TAA Стоп TAG Стоп
TGT Cys (С) TGC
TGA Стоп
TGG Trp (W)
CTT Leu (L)
стс
СТА
CCT Pro (Р)
ССС
ССА
CAT His (Н) САС
САА Gin (Q)
CGT Arg (R)
CGC
CGA
CTG
CCG
CAG
CGG
ATT lie (1)
АТС
ATA
ATG Met (M)
ACT Thr (T)
ACC
АСА
ACG
AAT Asn (N) AAC
AAA Lys (K) AAG
AGT Ser (S) AGC
AGA Arg (R) AGG
GTT Val (V)
GTC
GTA
GTG
GCT Ala (A) GCC GCA GCG
GAT Asp (D) GAC
GAA Glu (E) GAG
GGT Gly (G)
GGC
GGA
GGG
[0185] У многих организмов наблюдается смещение в сторону применения
конкретных кодонов для кодирования инсерции конкретной аминокислоты в растущей пептидной цепи. Предпочтительное использование кодонов, или смещение использования кодонов, различия в использовании кодонов у разных организмов, возможно в результате вырожденности генетического кода, и хорошо описано для многих организмов. Смещение использования кодонов часто коррелирует с эффективностью трансляции матричной РНК (мРНК), в свою очередь, предположительно, зависящей в том числе от свойств транслируемых кодонов и доступности конкретных молекул транспортной РНК (тРНК). Преобладание выбранных тРНК в клетке обычно отражает кодоны, чаще всего используемые при синтезе пептидов. Соответственно, гены могут быть индивидуализированы для оптимальной генной экспрессии в заданном организме на основании оптимизации кодонов.
[0186] На основании значительного числа генных последовательностей, доступных
для широкого спектра видов животных, растений и микроорганизмов, были рассчитаны относительные частоты использования кодонов. Доступны таблицы использования кодонов, например, "База данных по использованию кодонов", доступная по ссылке www.kazusa.or.jp/codon/ (проверена 18 июня 2012 г.). См. Nakamura, Y., et al. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000).
[0187] Случайное распределение кодонов с оптимизированной частотой для
кодирования заданной последовательности полипептида может быть выполнено вручную путем расчета частоты использования кодонов для каждой аминокислоты, с последующим случайным распределением кодонов для последовательности полипептида. Кроме того, для расчета оптимальной последовательности могут применяться различные алгоритмы и компьютерное программное обеспечение.
[0188] Согласно некоторым вариантам реализации указанная молекула
нуклеиновой кислоты отличается одним или более из следующих свойств: (а) указанная молекула нуклеиновой кислоты или ее часть отличается повышенным индексом адаптации кодонов для человека относительно индекса последовательности SEQ ID NO: 16; (b) указанная последовательность нуклеотидов или ее часть отличается повышенной частотой использования оптимальных кодонов относительно последовательности SEQ ID N0:16; (с) указанная последовательность нуклеотидов или ее часть содержит больший процент нуклеотидов G/C по сравнению с процентом нуклеотидов G/C в последовательности SEQ ID NO: 16; (d) указанная последовательность нуклеотидов или ее часть отличается повышенной относительной частотой использования синонимичного кодона относительно последовательности SEQ ID NO: 16; (е) указанная последовательность нуклеотидов или ее часть отличается пониженным эффективным числом кодонов относительно последовательности SEQ ID NO: 16; (f) указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше последовательностей MARS/ARS (последовательности SEQ ID NO: 21 и 22) относительно последовательности SEQ ID NO: 16; (g) указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше дестабилизирующих элементов (последовательности SEQ ID NO: 23 и 24) относительно последовательности SEQ ID NO: 16; (i) указанная последовательность нуклеотидов не содержит последовательности поли-Т, (j) указанная последовательность нуклеотидов не содержит последовательности поли-А; или (к) любой их комбинацией. Согласно некоторым вариантам реализации указанные молекулы нуклеиновой кислоты обладают по меньшей мере двумя, по меньшей мере тремя, по меньшей мере четырьмя, по меньшей мере пятью, по меньшей мере шестью, по меньшей мере семью, по меньшей мере восемью, по меньшей мере девятью или десятью характеристиками по (a)-(j). Индекс адаптации кодонов
[0189] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложена
выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов согласно настоящему документу, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, при этом индекс адаптации кодонов для человека увеличен относительно индекса последовательности SEQ ID NO: 16. Например, указанная последовательность нуклеотидов может иметь индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно 0,75 (75%), по меньшей мере приблизительно 0,76 (76%), по меньшей мере приблизительно 0,77 (77%), по меньшей мере приблизительно 0,78 (78%), по меньшей мере приблизительно 0,79 (79%), по меньшей мере приблизительно 0,80 (80%), по меньшей мере приблизительно 0,81 (81%), по меньшей мере приблизительно 0,82 (82%), по меньшей мере приблизительно 0,83 (83%), по меньшей мере приблизительно 0,84 (84%), по меньшей мере приблизительно 0,85 (85%), по меньшей мере приблизительно 0,86 (86%), по меньшей мере приблизительно 0,87 (87%),
по меньшей мере приблизительно 0,88 (88%), по меньшей мере приблизительно 0,89 (89%), по меньшей мере приблизительно 0,90 (90%), по меньшей мере приблизительно 0,91 (91%), по меньшей мере приблизительно 0,92 (92%), по меньшей мере приблизительно 0,93 (93%), по меньшей мере приблизительно 0,94 (94%), по меньшей мере приблизительно 0,95 (95%), по меньшей мере приблизительно 0,96 (96%), по меньшей мере приблизительно 0,97 (97%), по меньшей мере приблизительно 0,98 (98%) или по меньшей мере приблизительно 0,99 (99%). Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно .88 (88%). Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно .91 (91%). Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно .91 (97%).
[0190] Согласно одному конкретному варианту реализации настоящего
изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (ii) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; или (iv) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом индекс адаптации кодонов для человека указанной последовательности нуклеотидов увеличен относительно индекса последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно 0,75 (75%), по меньшей мере приблизительно 0,76 (76%), по меньшей мере приблизительно 0,77 (77%), по меньшей
мере приблизительно 0,78 (78%), по меньшей мере приблизительно 0,79 (79%), по меньшей мере приблизительно 0,80 (80%), по меньшей мере приблизительно 0,81 (81%), по меньшей мере приблизительно 0,82 (82%), по меньшей мере приблизительно 0,83 (83%), по меньшей мере приблизительно 0,84 (84%), по меньшей мере приблизительно 0,85 (85%), по меньшей мере приблизительно 0,86 (86%), по меньшей мере приблизительно 0,87 (87%), по меньшей мере приблизительно 0,88 (88%), по меньшей мере приблизительно 0,89 (89%), по меньшей мере приблизительно 0,90 (90%) или по меньшей мере приблизительно .91 (91%). Согласно одному конкретному варианту реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно .88 (88%). Согласно другому варианту реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно .91 (91%).
[0191] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 или (ii) 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6; при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом индекс адаптации кодонов для человека указанной последовательности нуклеотидов увеличен относительно индекса последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно 0,75 (75%), по меньшей мере приблизительно 0,76 (76%), по меньшей мере приблизительно 0,77 (77%), по меньшей мере приблизительно 0,78 (78%), по меньшей мере приблизительно 0,79 (79%), по меньшей мере приблизительно 0,80 (80%), по меньшей мере приблизительно 0,81 (81%),
по меньшей мере приблизительно 0,82 (82%), по меньшей мере приблизительно 0,83 (83%), по меньшей мере приблизительно 0,84 (84%), по меньшей мере приблизительно 0,85 (85%), по меньшей мере приблизительно 0,86 (86%), по меньшей мере приблизительно 0,87 (87%) или по меньшей мере приблизительно 0,88 (88%). Согласно одному конкретному варианту реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно .83 (83%). Согласно другому варианту реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно .88 (88%).
[0192] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 или 71 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); и при этом индекс адаптации кодонов для человека указанной последовательности нуклеотидов увеличен относительно индекса последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно 0,75 (75%), по меньшей мере приблизительно 0,76 (76%), по меньшей мере приблизительно 0,77 (77%), по меньшей мере приблизительно 0,78 (78%), по меньшей мере приблизительно 0,79 (79%), по меньшей мере приблизительно 0,80 (80%), по меньшей мере приблизительно 0,81 (81%), по меньшей мере приблизительно 0,82 (82%), по меньшей мере приблизительно 0,83 (83%), по меньшей мере приблизительно 0,84 (84%), по меньшей мере приблизительно 0,85 (85%), по меньшей мере приблизительно 0,86 (86%), по меньшей мере приблизительно 0,87 (87%) или по меньшей мере приблизительно 0,88 (88%). Согласно одному конкретному варианту реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно .75 (75%). Согласно другому варианту
реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно .83 (83%). Согласно другому варианту реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно .88 (88%). Согласно другому варианту реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно .91 (91%). Согласно другому варианту реализации указанная последовательность нуклеотидов имеет индекс адаптации кодонов для человека, составляющий по меньшей мере приблизительно .97 (97%).
[0193] Согласно некоторым вариантам реализации выделенная молекула
нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению отличается повышенной частотой использования оптимальных кодонов (FOP) относительно последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам реализации FOP выделенной молекулы нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере приблизительно 40, по меньшей мере приблизительно 45, по меньшей мере приблизительно 50, по меньшей мере приблизительно 55, по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 64, по меньшей мере приблизительно 65, по меньшей мере приблизительно 70, по меньшей мере приблизительно 75, по меньшей мере приблизительно 79, по меньшей мере приблизительно 80, по меньшей мере приблизительно 85 или по меньшей мере приблизительно 90.
[0194] Согласно другим вариантам реализации выделенная молекула нуклеиновой
кислоты согласно настоящему изобретению отличается повышенной относительной частотой использования синонимичного кодона (RCSU) относительно последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам реализации RCSU выделенной молекулы нуклеиновой кислоты превышает 1,5. Согласно другим вариантам реализации RCSU выделенной молекулы нуклеиновой кислоты превышает 2,0. Согласно некоторым вариантам реализации RCSU выделенной молекулы нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере приблизительно 1,5, по меньшей мере приблизительно 1,6, по меньшей мере приблизительно 1,7, по меньшей мере приблизительно 1,8, по меньшей мере приблизительно 1,9, по меньшей мере приблизительно 2,0, по меньшей мере приблизительно 2,1, по меньшей мере приблизительно 2,2, по меньшей мере приблизительно 2,3, по меньшей мере приблизительно 2,4, по меньшей мере приблизительно 2,5, по меньшей мере приблизительно 2,6 или по меньшей мере приблизительно 2,7.
[0195] Согласно другим вариантам реализации выделенная молекула нуклеиновой
кислоты согласно настоящему изобретению отличается пониженным эффективным числом кодонов относительно последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам реализации выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается
эффективным числом кодонов, составляющим менее чем приблизительно 50, менее чем приблизительно 45, менее чем приблизительно 40, менее чем приблизительно 35, менее чем приблизительно 30, или менее чем приблизительно 25. Согласно одному конкретному варианту реализации выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается эффективным числом кодонов, составляющим приблизительно 40, приблизительно 35, приблизительно 30, приблизительно 25 или приблизительно 20. Оптимизация содержания G/C
[0196] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов согласно описанию в настоящем документе, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит больший процент нуклеотидов G/C по сравнению с процентом нуклеотидов G/C в последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации содержание G/C в указанной последовательности нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, составляет по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 46%, по меньшей мере приблизительно 47%, по меньшей мере приблизительно 48%, по меньшей мере приблизительно 49%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 51%, по меньшей мере приблизительно 52%, по меньшей мере приблизительно 53%, по меньшей мере приблизительно 54%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 56%, по меньшей мере приблизительно 57%, по меньшей мере приблизительно 58%, по меньшей мере приблизительно 59% или по меньшей мере приблизительно 60%.
[0197] Согласно одному конкретному варианту реализации настоящего
изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID
NO: 3; (ii) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; или (iv) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит больший процент нуклеотидов G/C по сравнению с процентом нуклеотидов G/C в последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам реализации содержание G/C в указанной последовательности нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, составляет по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 46%, по меньшей мере приблизительно 47%, по меньшей мере приблизительно 48%, по меньшей мере приблизительно 49%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 51%, по меньшей мере приблизительно 52%, по меньшей мере приблизительно 53%, по меньшей мере приблизительно 54%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 56%, по меньшей мере приблизительно 57% или по меньшей мере приблизительно 58%. Согласно одному конкретному варианту реализации содержание G/C в указанной последовательности нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, составляет по меньшей мере приблизительно 58%.
[0198] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5; (ii) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6; (iii) нуклеотидов 17922277 и 2320^374 последовательности SEQ ID NO: 5 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена), или (iv) 1792-2277 и 2320^374 последовательности SEQ ID NO: 6 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); при этом указанная N-концевая часть и указанная С
концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит больший процент нуклеотидов G/C по сравнению с процентом нуклеотидов G/C в последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации содержание G/C в указанной последовательности нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, составляет по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 46%, по меньшей мере приблизительно 47%, по меньшей мере приблизительно 48%, по меньшей мере приблизительно 49%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 51%, по меньшей мере приблизительно 52%, по меньшей мере приблизительно 53%, по меньшей мере приблизительно 54%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 56% или по меньшей мере приблизительно 57%. Согласно одному конкретному варианту реализации содержание G/C в указанной последовательности нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, составляет по меньшей мере приблизительно 52%. Согласно другому варианту реализации содержание G/C в указанной последовательности нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, составляет по меньшей мере приблизительно 55%. Согласно другому варианту реализации содержание G/C в указанной последовательности нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, составляет по меньшей мере приблизительно 57%.
[0199] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 или 71 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); и при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит больший процент нуклеотидов G/C по сравнению с процентом нуклеотидов G/C в последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации содержание G/C в указанной последовательности нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, составляет по меньшей
мере приблизительно 45%. Согласно одному конкретному варианту реализации содержание G/C в указанной последовательности нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, составляет по меньшей мере приблизительно 52%. Согласно другому варианту реализации содержание G/C в указанной последовательности нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, составляет по меньшей мере приблизительно 55%. Согласно другому варианту реализации содержание G/C в указанной последовательности нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, составляет по меньшей мере приблизительно 57%. Согласно другому варианту реализации содержание G/C в указанной последовательности нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, составляет по меньшей мере приблизительно 58%. Согласно еще одному варианту реализации содержание G/C в указанной последовательности нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, составляет по меньшей мере приблизительно 60%.
[0200] "Содержание G/С" (или содержание гуанина-цитозина), или "процент
нуклеотидов G/С", относится к проценту азотистых оснований в молекуле ДНК, представляющих собой гуанин или цитозин. Содержание G/С может быть рассчитано по следующей формуле:
G -\-С -7-^-77-77 х 100 Л + Т -\-G + С (ill)
[0201] Гены человека являются высокогетерогенными в отношении содержания
G/С, при этом некоторые гены отличаются содержанием G/С, составляющим всего 20%, а
другие гены отличаются содержанием G/С, составляющим до 95%. В целом, богатые G/C
гены отличаются более высокими уровнями экспрессии. Фактически, было
продемонстрировано, что увеличение содержания G/С в гене может приводить к
увеличению экспрессии указанного гена, в основном за счет увеличения транскрипции и
более высоких стационарных уровней мРНК. см. Kudla et al., PLoS Biol., 4(6): e180 (2006).
Последовательности, подобные области прикрепления к матриксу
[0202] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов согласно описанию в настоящем документе, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше последовательностей MARS/ARS, чем последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 6, самое большее 5, самое большее 4, самое большее 3 или самое большее 2 последовательности MARS/ARS. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII,
содержит самое большее 1 последовательность MARS/ARS. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, не содержит последовательности MARS/ARS.
[0203] Согласно одному конкретному варианту реализации настоящего
изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (ii) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; или (iv) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше последовательностей MARS/ARS, чем последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 6, самое большее 5, самое большее 4, самое большее 3 или самое большее 2 последовательности MARS/ARS. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 1 последовательность MARS/ARS. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, не содержит последовательности MARS/ARS.
[0204] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида
FVIII; при этом указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5; (ii) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6; (iii) нуклеотидов 17922277 и 2320^374 последовательности SEQ ID NO: 5 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); или (iv) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше последовательностей MARS/ARS, чем последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 6, самое большее 5, самое большее 4, самое большее 3 или самое большее 2 последовательности MARS/ARS. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 1 последовательность MARS/ARS. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, не содержит последовательности MARS/ARS.
[0205] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по
отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 или 71 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 или 71 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 или 71 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); и при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше последовательностей MARS/ARS, чем последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 6, самое большее 5, самое большее 4, самое большее 3 или самое большее 2 последовательности MARS/ARS. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 1 последовательность MARS/ARS. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, не содержит последовательности MARS/ARS.
[0206] В последовательности нуклеотидов FVIII человека были идентифицированы
богатые AT элементы, характеризующиеся сходством последовательностей с автономно реплицирующимися последовательностями (ARS) и областями прикрепления к ядерному матриксу (MARS) Saccharomyces cerevisiae. (Fallux et al., Mol. Cell. Biol. 16:4264-4272 (1996). Было продемонстрировано, что один из указанных элементов связывает ядерные факторы in vitro и репрессирует экспрессию репортерного гена хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT). Там же. Было выдвинуто предположение, что указанные последовательности могут вносить вклад в репрессию транскрипции гена FVIII человека. Соответственно, согласно одному варианту реализации в гене FVIII согласно настоящему изобретению устраняют все последовательности MAR/ARS. В исходной последовательности FVIII (SEQ ID NO: 16) присутствуют четыре последовательности MAR/ARS АТАТТТ (SEQ ID NO: 21) и три последовательности MAR/ARS АААТАТ (SEQ ID NO: 22). Все указанные сайты были мутированы для уничтожения последовательностей MAR/ARS в оптимизированных последовательностях FVIII (последовательности SEQ ID NO: 1-6). Локализация каждого из указанных элементов, а также последовательность соответствующих нуклеотидов в оптимизированных последовательностях представлены в таблице 2 ниже.
1447
ATA I I I
АТСТТ Т
АТСТТ С
АТСТТ С
АТСТТ С
АТСТТС
АТСТТ С
АТСТТС
АТСТТ С
1577
АААТАТ
АААТС Т
AGATC Т
АААТС Т
АААТС Т
AGATC Т
AGATC Т
АААТСТ
АААТС Т
1585
АААТАТ
AAGTA Т
AAGTA С
AAGTA С
AAGTA Т
AAGTA С
AAGTA С
AAGTA С
AAGTA Т
2231
ATA I I I
АСАТС А
АТАТС А
АСАТС А
АСАТС А
АСАТСТ
АТАТС Т
АСАТС Т
АТАТС Т
3054
АААТАТ
АААСА Т
GAATA Т
GAACA Т
GAACA Т
GAACA Т
GAATA Т
GAACA Т
GAATA Т
3788
ATA I I I
АТАТС Т
АТАТС Т
АСАТС Т
АСАТС Т
АСАТСТ
АСАТС Т
АСАТС Т
АСАТС Т
Богатые AU элементы последовательности (А
RE)
2468
1. АТТТ ТАТТ
АСТТС АТС
АСТТС АТС
АСТТС АТТ
АСТТС АТТ
АСТТТА ТТ
АСТТТ АТС
АСТТТА ТТ
АСТТТ АТС
3790
2. АТТТ ТТАА
АТСТТ ТАА
АТСТТ САА
АТСТТ САА
АТСТТ САА
АТСТТС АА
АТСТТ САА
АТСТТС АА
АТСТТ САА
Последовательности поли-А/поли-Т
3273
АААААА А
GAAAA АА
GAAGA AG
GAAGA AG
GAAGA AG
GAAGA AG
CAAGA AG
GAAGA AG
CAAGA AG
4195
ТТТТТТ
ТТСТТ Т
ТТСТТ С
ТТСТТС
ТТСТТ С
ТТСТТС
ТТСТТ С
ТТСТТС С
ТТСТТ СС
Сайты сплайсинга
2203
GGTGAT
GGGG АС
GGCG АС
GGGGA С
GGGGA С
GGAGA С
GGAGA С
GGAGA С
GGAGA С
Дестабилизирующие последовательности
[0207] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов согласно описанию в настоящем документе, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше дестабилизирующих элементов, чем последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 9, самое большее 8, самое большее 7, самое большее 6 или самое большее 5 дестабилизирующих элементов. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 4, самое большее 3, самое большее 2 или самое большее 1
дестабилизирующий элемент. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, не содержит дестабилизирующего элемента.
[0208] Согласно одному конкретному варианту реализации настоящего
изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (ii) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; или (iv) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше дестабилизирующих элементов, чем последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 9, самое большее 8, самое большее 7, самое большее 6 или самое большее 5 дестабилизирующих элементов. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 4, самое большее 3, самое большее 2 или самое большее 1 дестабилизирующий элемент. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, не содержит дестабилизирующего элемента.
[0209] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по
меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5; (ii) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6; (iii) нуклеотидов 17922277 и 2320^374 последовательности SEQ ID NO: 5 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); или (iv) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше дестабилизирующих элементов, чем последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 9, самое большее 8, самое большее 7, самое большее 6 или самое большее 5 дестабилизирующих элементов. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 4, самое большее 3, самое большее 2 или самое большее 1 дестабилизирующий элемент. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, не содержит дестабилизирующего элемента.
[0210] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по
отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 или 71 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); и при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше дестабилизирующих элементов, чем последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 9, самое большее 8, самое большее 7, самое большее 6 или самое большее 5 дестабилизирующих элементов. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 4, самое большее 3, самое большее 2 или самое большее 1 дестабилизирующий элемент. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, не содержит дестабилизирующего элемента.
[0211] В исходной последовательности FVIII (SEQ ID NO: 16) присутствует десять
дестабилизирующих элементов: шесть последовательностей ATTTA (SEQ ID NO: 23) и четыре последовательности TAAAT (SEQ ID NO: 24). Согласно одному варианту реализации последовательности указанных сайтов были мутированы для уничтожения дестабилизирующих элементов в оптимизированных последовательностях FVIII SEQ ID NO: 1-6, 70 и 71. Локализация каждого из указанных элементов, а также последовательность соответствующих нуклеотидов в оптимизированных последовательностях представлены в таблице 2. Потенциальные сайты связывания промотора
[0212] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов согласно описанию в настоящем документе, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше потенциальных сайтов связывания промотора, чем последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 9, самое большее 8, самое большее 7, самое большее 6 или самое большее 5 потенциальных сайтов связывания промотора. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 4, самое большее 3, самое большее 2 или самое большее 1 потенциальный сайт связывания промотора. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность
нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, не содержит потенциального сайта связывания промотора.
[0213] Согласно одному конкретному варианту реализации настоящего
изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (ii) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; или (iv) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше потенциальных сайтов связывания промотора, чем последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 9, самое большее 8, самое большее 7, самое большее 6 или самое большее 5 потенциальных сайтов связывания промотора. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 4, самое большее 3, самое большее 2 или самое большее 1 потенциальный сайт связывания промотора. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, не содержит потенциального сайта связывания промотора.
[0214] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по
меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5; (ii) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6; (iii) нуклеотидов 17922277 и 2320^374 последовательности SEQ ID NO: 5 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); или (iv) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше потенциальных сайтов связывания промотора, чем последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 9, самое большее 8, самое большее 7, самое большее 6 или самое большее 5 потенциальных сайтов связывания промотора. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 4, самое большее 3, самое большее 2 или самое большее 1 потенциальный сайт связывания промотора. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, не содержит потенциального сайта связывания промотора.
[0215] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по
отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 или 71 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); и при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше потенциальных сайтов связывания промотора, чем последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 9, самое большее 8, самое большее 7, самое большее 6 или самое большее 5 потенциальных сайтов связывания промотора. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, содержит самое большее 4, самое большее 3, самое большее 2 или самое большее 1 потенциальный сайт связывания промотора. Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид с активностью FVIII, не содержит потенциального сайта связывания промотора.
[0216] ТАТА-боксы представляют собой регуляторные последовательности, часто
обнаруживаемые в промоторных областях у эукариот. Они служат в качестве сайта связывания ТАТА-связывающего белка (ТВР), общего транскрипционного фактора. ТАТА-боксы обычно содержат последовательность TATAA (SEQ ID NO: 28) или близкий к ней вариант. При этом ТАТА-боксы в составе кодирующей последовательности могут ингибировать трансляцию полноразмерного белка. В последовательности дикого типа BDD FVIII (SEQ ID NO: 16) присутствует десять потенциальных последовательностей связывания промотора: пять последовательностей TATAA (SEQ ID NO: 28) и пять последовательностей TTATA (SEQ ID NO: 29). Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3 или по меньшей мере 4 из сайтов связывания промотора устранены из генов FVIII согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере 5 из сайтов связывания промотора устранены из генов FVIII согласно настоящему изобретению. Согласно другим вариантам реализации по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или по меньшей мере 8 из сайтов связывания промотора устранены из генов FVIII согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации по меньшей мере 9 из сайтов связывания промотора устранены из генов FVIII согласно настоящему изобретению. Согласно одному конкретному варианту реализации все сайты связывания промотора устранены из генов FVIII согласно настоящему изобретению. Локализация каждого потенциального сайта связывания промотора и последовательность соответствующих нуклеотидов в оптимизированных последовательностях представлены в таблице 2.
Другие цис-действующие негативные регуляторные элементы
[0217] Помимо последовательностей MAR/ARS, дестабилизирующих элементов и
потенциальных промоторных сайтов, описанных выше, в последовательности дикого типа
BDD FVIII (SEQ ID NO: 16) может быть идентифицировано несколько дополнительных
потенциальных ингибиторных последовательностей. В неоптимизированной
последовательности BDD FVIII могут быть идентифицированы два богатых AU элемента
последовательности (ARE) (АТТТТАТТ (последовательности SEQ ID NO: 30); и АТТТТТАА
(SEQ ID NO: 31), наряду с поли-А-сайтом (ААААААА; SEQ ID NO: 26), поли-Т-сайтом
(ТТТТТТ; SEQ ID NO: 25), и сайтом сплайсинга (GGTGAT; SEQ ID NO: 27). Один или более
из указанных элементов может быть удален из оптимизированных последовательностей
FVIII. Локализация каждого из указанных сайтов и последовательность соответствующих
нуклеотидов в оптимизированных последовательностях представлены в таблице 2.
[0218] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (ii) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; или (iv) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов не содержит одного или более цис-действующего негативного регуляторного элемента, например, сайта сплайсинга, последовательности поли-Т, последовательности поли-А, последовательности ARE или любых их комбинаций.
[0219] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5; (ii) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6; (iii) нуклеотидов 17922277 и 2320^374 последовательности SEQ ID NO: 5 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); или (iv) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 (т.е. нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов не содержит одного или более цис-действующего негативного регуляторного элемента, например, сайта сплайсинга, последовательности поли-Т, последовательности поли-А, последовательности ARE или любых их комбинаций.
[0220] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 или 71 без нуклеотидов, кодирующих В
домен или фрагмент В-домена); и при этом указанная последовательность нуклеотидов не содержит одного или более цис-действующего негативного регуляторного элемента, например, сайта сплайсинга, последовательности поли-Т, последовательности поли-А, последовательности ARE или любых их комбинаций.
[0221] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (ii) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; или (iv) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов не содержит сайта сплайсинга GGTGAT (SEQ ID NO: 27). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов
58-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (ii) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; или (iv) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов не содержит последовательности поли-Т (SEQ ID NO: 25). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (ii) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; или (iv) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов не содержит последовательности поли-А (SEQ ID NO: 26). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере
приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (ii) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 3; (iii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; или (iv) нуклеотидов 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII; и при этом указанная последовательность нуклеотидов не содержит элемента ARE (SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31).
[0222] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 или 71 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); и при этом указанная последовательность нуклеотидов не содержит сайта сплайсинга GGTGAT (SEQ ID NO: 27). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности
аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 или 71 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); и при этом указанная последовательность нуклеотидов не содержит последовательности поли-Т (SEQ ID NO:
25) . Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 или 71 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); и при этом указанная последовательность нуклеотидов не содержит последовательности поли-А (SEQ ID NO:
26) . Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности аминокислот, выбранной из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 и 71 (т.е. нуклеотидам 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 или 71 без нуклеотидов, кодирующих В-домен или фрагмент В-домена); и при этом указанная
25)
последовательность нуклеотидов не содержит элемента ARE (SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31).
[0223] Согласно другим вариантам реализации оптимизированная
последовательность FVIII согласно настоящему изобретению не содержит одного или более из противовирусных мотивов, структур типа "стебель-петля" и последовательностей повторов.
[0224] Согласно другим дополнительным вариантам реализации нуклеотиды,
окружающие сайт начала транскрипции, заменяют на консенсусную последовательность Козак (GCCGCCACCATGC (SEQ ID NO: 32), при этом выделенные подчеркиванием нуклеотиды представляют собой стартовый кодон). Согласно другим вариантам реализации могут быть добавлены или удалены сайты рестрикции для облегчения процесса клонирования.
Гетерологичные последовательности нуклеотидов
[0225] Согласно некоторым вариантам реализации выделенные молекулы
нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению дополнительно содержат гетерологичную последовательность нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации выделенные молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению дополнительно содержат по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеотидов. Указанная гетерологичная последовательность нуклеотидов может быть соединена с оптимизированными последовательностями нуклеотидов BDD-FVIII согласно настоящему изобретению на 5'-конце, на З'-конце, или инсертирована в середину оптимизированной последовательности нуклеотидов BDD-FVIII. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации гетерологичная последовательность аминокислот, кодируемая указанной гетерологичной последовательностью нуклеотидов, соединена с N-концом или с С-концом последовательности аминокислот FVIII, кодируемой указанной последовательностью нуклеотидов, или инсертирована между двумя аминокислотами в последовательности аминокислот FVIII. Согласно некоторым вариантам реализации указанная гетерологичная последовательность аминокислот может быть инсертирована между двумя аминокислотами в одном или более сайтах инсерции, выбранных из таблицы 3. Согласно некоторым вариантам реализации указанная гетерологичная последовательность аминокислот может быть инсертирована в полипептид FVIII, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, в любом сайте из описанных в международных публикациях WO 2013/123457 А1. WO 2015/106052 А1 или патентной публикации США 2015/0158929 А1, которые включены в настоящий документ полностью посредством ссылок.
[0226] Согласно некоторым вариантам реализации указанная гетерологичная
последовательность аминокислот, кодируемая указанной гетерологичной
последовательностью нуклеотидов, инсертирована в В-домен или его фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации указанная гетерологичная последовательность аминокислот инсертирована в FVIII в З'-направлении непосредственно за аминокислотой, соответствующей аминокислоте 745 зрелого FVIII человека (SEQ ID N0:15). Согласно одному конкретному варианту реализации указанный FVIII содержит делецию аминокислот в положениях 746-1646, соответствующих зрелому FVIII человека (SEQ ID N0:15), и указанная гетерологичная последовательность аминокислот, кодируемая указанной гетерологичной последовательностью нуклеотидов, инсертирована в З'-направлении непосредственно за аминокислотой в положении 745, соответствующем зрелому FVIII человека (SEQ ID N0:15).
[0227] Согласно другим вариантам реализации выделенные молекулы нуклеиновой
кислоты согласно настоящему изобретению дополнительно содержат два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь гетерологичных последовательностей нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации все указанные гетерологичные последовательности нуклеотидов идентичны. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одна гетерологичная последовательность нуклеотидов отличается от других гетерологичных последовательностей нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения могут быть предусмотрены две, три, четыре, пять, шесть или более чем семь гетерологичных последовательностей нуклеотидов совместно.
[0228] Согласно некоторым вариантам реализации гетерологичная
последовательность нуклеотидов кодирует последовательность аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность аминокислот, кодируемая указанной гетерологичной последовательностью нуклеотидов, представляет собой гетерологичный фрагмент, который может увеличивать время полужизни ( "удлиняющий время полужизни агент") молекулы FVIII.
[0229] Согласно некоторым вариантам реализации указанный гетерологичный
фрагмент представляет собой пептид или полипептид с неструктурированными или структурированными характеристиками, которые ассоциированы с удлинением времени полужизни in vivo при включении в белок согласно настоящему изобретению. Неограничивающие примеры включают альбумин, фрагменты альбумина, Fc-фрагменты иммуноглобулинов, С-концевой пептид (СТР) р-субъединицы хорионического гонадотропина человека, последовательность НАР, последовательность XTEN, трансферрин или его фрагмент, полипептид PAS, полиглициновые линкеры, полисериновые линкеры, связывающие альбумин фрагменты; или любые фрагменты, производные, варианты или комбинации указанных полипептидов. Согласно одному конкретному варианту реализации указанная гетерологичная последовательность аминокислот представляет собой константную область иммуноглобулина или ее часть, трансферрин, альбумин или последовательность PAS. Согласно некоторым аспектам гетерологичный фрагмент включает фактор фон Виллебранда или его фрагмент. Согласно другим родственным аспектам гетерологичный фрагмент может включать сайт прикрепления (например, аминокислоту цистеин) для неполипептидного фрагмента, такого как полиэтиленгликоль (ПЭГ), гидроксиэтилкрахмал (ГЭК), полисиаловая кислота; или любые производные, варианты или комбинации указанных элементов. Согласно некоторым аспектам гетерологичный фрагмент содержит аминокислоту цистеин, которая функционирует в качестве сайта прикрепления для неполипептидного фрагмента, такого как полиэтиленгликоль (ПЭГ), гидроксиэтилкрахмал (ГЭК), полисиаловая кислота; или любые производные, варианты или комбинации указанных элементов.
[0230] Согласно одному специфическому варианту реализации первая
гетерологичная последовательность нуклеотидов кодирует первый гетерологичный
фрагмент, который представляет собой удлиняющую время полужизни молекулу, которая
известна в данной области техники, а вторая гетерологичная последовательность
нуклеотидов кодирует второй гетерологичный фрагмент, который может также
представлять собой удлиняющую время полужизни молекулу, известную в данной области
техники. Согласно некоторым вариантам реализации указанный первый гетерологичный
фрагмент (например, первый Fc-фрагмент) и указанный второй гетерологичный фрагмент
(например, второй Fc-фрагмент) ассоциированы друг с другом с образованием димера.
Согласно одному варианту реализации указанный второй гетерологичный фрагмент
представляет собой второй Fc-фрагмент, при этом указанный второй Fc-фрагмент
соединен или ассоциирован с указанным первым гетерологичным фрагментом, например,
первым Fc-фрагментом. Например, указанный второй гетерологичный фрагмент
(например, второй Fc-фрагмент) может быть соединен с первым гетерологичным
фрагментом (например, первым Fc-фрагментом) линкером или связан с первым
гетерологичным фрагментом ковалентной или нековалентной связью.
[0231] Согласно некоторым вариантам реализации указанный гетерологичный
фрагмент представляет собой полипептид, содержащий, состоящий по существу из; или состоящий из по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере приблизительно 200, по меньшей мере приблизительно 300, по меньшей мере приблизительно 400, по меньшей мере приблизительно 500, по меньшей мере приблизительно 600, по меньшей мере приблизительно 700, по меньшей мере приблизительно 800, по меньшей мере приблизительно 900, по меньшей мере приблизительно 1000, по меньшей мере приблизительно 1100, по меньшей мере приблизительно 1200, по меньшей мере приблизительно 1300, по меньшей мере приблизительно 1400, по меньшей мере приблизительно 1500, по меньшей мере приблизительно 1600, по меньшей мере приблизительно 1700, по меньшей мере приблизительно 1800, по меньшей мере приблизительно 1900, по меньшей мере приблизительно 2000, по меньшей мере приблизительно 2500, по меньшей мере приблизительно 3000 или по меньшей мере приблизительно 4000 аминокислот. Согласно другим вариантам реализации указанный гетерологичный фрагмент представляет собой полипептид, содержащий, состоящий по существу из; или состоящий из приблизительно 100-200 аминокислот, приблизительно 200-300 аминокислот, приблизительно 300-400 аминокислот, приблизительно 400-500 аминокислот, приблизительно 500-600 аминокислот, приблизительно 600-700 аминокислот, приблизительно 700-800 аминокислот, приблизительно 800-900 аминокислот, или приблизительно 900-1000 аминокислот.
[0232] Согласно некоторым вариантам реализации гетерологичный фрагмент
улучшает одно или более фармакокинетических свойств белка FVIII, значимо не влияя на его биологическую активность или функцию.
[0233] Согласно некоторым вариантам реализации гетерологичный фрагмент
увеличивает время полужизни белка FVIII согласно настоящему изобретению in vivo и/или in vitro. Согласно другим вариантам реализации гетерологичный фрагмент облегчает визуализацию или локализацию белка FVIII согласно настоящему изобретению или его фрагмента (например, фрагмента, содержащего гетерологичный фрагмент, после протеолитического расщепления белка FVIII). Визуализация и/или локализация белка FVIII согласно настоящему изобретению или его фрагмента может быть осуществлена in vivo, in vitro, ex vivo, или в их комбинациях.
[0234] Согласно другим вариантам реализации гетерологичный фрагмент
увеличивает стабильность белка FVIII согласно настоящему изобретению или его фрагмента (например, фрагмента, содержащего гетерологичный фрагмент, после протеолитического расщепления белка FVIII). В настоящем документе термин "стабильность" относится к известной в данной области техники мере сохранения одного или более физических свойств белка FVIII под действием условий среды (например, повышенной или пониженной температуры). Согласно определенным аспектам указанное физическое свойство может представлять собой поддержание ковалентной структуры белка FVIII (например, отсутствие протеолитического расщепления, нежелательного окисления или деамидирования). Согласно другим аспектам указанное физическое свойство может также представлять собой присутствие белка FVIII с правильной укладкой (например, отсутствие растворимых или нерастворимых агрегатов или преципитатов). Согласно одному аспекту стабильность белка FVIII измеряют путем анализа биофизического свойства белка FVIII, например, термической стабильности, рН-профиля разворачивания, стабильного удаления гликозилирования, растворимости, биохимической функции (например, способности связываться с белком, рецептором или лигандом) и т.п., и/или их комбинаций. Согласно другому аспекту биохимическую функцию демонстрирует аффинность связывания указанного взаимодействия. Согласно одному аспекту мерой стабильности белка является термическая стабильность, т.е. устойчивость к термической стимуляции. Стабильность может быть измерена с применением способов, известных в данной области техники, таких как ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), ЭХ (эксклюзионная хроматография), ДСР (динамическое светорассеяние) и т.п. Способы измерения термической стабильности включают дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК), дифференциальную сканирующую флуориметрию (ДСФ), круговой дихроизм (КД) и анализ с термической стимуляцией, однако не ограничиваются перечисленными способами.
[0235] Согласно определенным аспектам белок FVIII, кодируемый молекулой
нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один
удлиняющий время полужизни агент, т.е. гетерологичный фрагмент, который увеличивает
время полужизни белка FVIII in vivo относительно времени полужизни соответствующего
белка FVIII in vivo без такого гетерологичного фрагмента. Время полужизни белка FVIII in
vivo может быть определено с применением любых способов, известных специалистам в
данной области техники, например, анализов активности (хромогенный анализ или
одностадийный АЧТВ-анализ свертывания), ИФА ELISA, ROTEM(tm)n т.п.
[0236] Согласно некоторым вариантам реализации присутствие одного или более
удлиняющих время полужизни агентов приводит к увеличению времени полужизни белка FVIII по сравнению с временем полужизни соответствующего белка без одного или более таких удлиняющих время полужизни агентов. Время полужизни белка FVIII, содержащего удлиняющий время полужизни агент, по меньшей мере приблизительно в 1,5 раз, по меньшей мере приблизительно в 2 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,5 раза, по меньшей мере приблизительно в 3 раза, по меньшей мере приблизительно в 4 раза, по меньшей мере приблизительно в 5 раз, по меньшей мере приблизительно в 6 раз, по меньшей мере приблизительно в 7 раз, по меньшей мере приблизительно в 8 раз, по меньшей мере приблизительно в 9 раз, по меньшей мере приблизительно в 10 раз, по меньшей мере приблизительно в 11 раз или по меньшей мере приблизительно в 12 раз превышает время полужизни in vivo соответствующего белка FVIII без такого удлиняющего время полужизни агента.
[0237] Согласно одному варианту реализации время полужизни белка FVIII,
содержащего удлиняющий время полужизни агент, приблизительно 1,5-20-кратно, приблизительно 1,5- 15-кратно или приблизительно 1,5-10-кратно превышает время полужизни in vivo соответствующего белка без такого удлиняющего время полужизни агента. Согласно другому варианту реализации время полужизни белка FVIII, содержащего удлиняющий время полужизни агент, увеличивается приблизительно 2-10-кратно, приблизительно 2-9-кратно, приблизительно 2-8-кратно, приблизительно 2-7-кратно, приблизительно 2-6-кратно, приблизительно 2-5-кратно, приблизительно 2-4-кратно, приблизительно 2-3-кратно, приблизительно 2,5-10-кратно, приблизительно 2,5-9-кратно, приблизительно 2,5-8-кратно, приблизительно 2,5-7-кратно, приблизительно 2,5-6-кратно, приблизительно 2,5-5-кратно, приблизительно 2,5-4-кратно, приблизительно 2,5-3-кратно, приблизительно 3-10-кратно, приблизительно 3-9-кратно, приблизительно 3-8-кратно, приблизительно 3-7-кратно, приблизительно 3-6-кратно, приблизительно 3-5-кратно, приблизительно 3-4-кратно, приблизительно 4-6-кратно, приблизительно 5-7-кратно или приблизительно 6-8-кратно по сравнению с временем полужизни in vivo соответствующего белка без такого удлиняющего время полужизни агента.
[0238] Согласно другим вариантам реализации время полужизни белка FVIII,
содержащего удлиняющий время полужизни агент, составляет по меньшей мере
приблизительно 17 часов, по меньшей мере приблизительно 18 часов, по меньшей мере
приблизительно 19 часов, по меньшей мере приблизительно 20 часов, по меньшей мере
приблизительно 21 час, по меньшей мере приблизительно 22 часа, по меньшей мере
приблизительно 23 часа, по меньшей мере приблизительно 24 часа, по меньшей мере
приблизительно 25 часов, по меньшей мере приблизительно 26 часов, по меньшей мере
приблизительно 27 часов, по меньшей мере приблизительно 28 часов, по меньшей мере
приблизительно 29 часов, по меньшей мере приблизительно 30 часов, по меньшей мере
приблизительно 31 час, по меньшей мере приблизительно 32 часа, по меньшей мере
приблизительно 33 часа, по меньшей мере приблизительно 34 часа, по меньшей мере
приблизительно 35 часов, по меньшей мере приблизительно 36 часов, по меньшей мере
приблизительно 48 часов, по меньшей мере приблизительно 60 часов, по меньшей мере
приблизительно 72 часа, по меньшей мере приблизительно 84 часа, по меньшей мере
приблизительно 96 часов или по меньшей мере приблизительно 108 часов.
[0239] Согласно другим дополнительным вариантам реализации время полужизни
белка FVIII, содержащего удлиняющий время полужизни агент, составляет от приблизительно 15 часов до приблизительно двух недель, от приблизительно 16 часов до приблизительно одной недели, от приблизительно 17 часов до приблизительно одной недели, от приблизительно 18 часов до приблизительно одной недели, от приблизительно 19 часов до приблизительно одной недели, от приблизительно 20 часов до приблизительно одной недели, от приблизительно 21 часа до приблизительно одной недели, от приблизительно 22 часов до приблизительно одной недели, от приблизительно 23 часов до приблизительно одной недели, от приблизительно 24 часов до приблизительно одной недели, от приблизительно 36 часов до приблизительно одной недели, от приблизительно 48 часов до приблизительно одной недели, от приблизительно 60 часов до приблизительно одной недели, от приблизительно 24 часов до приблизительно шесть дней, от приблизительно 24 часов до приблизительно пяти дней, от приблизительно 24 часов до приблизительно четырех дней, от приблизительно 24 часов до приблизительно трех дней; или от приблизительно 24 часов до приблизительно двух дней.
[0240] Согласно некоторым вариантам реализации среднее время полужизни у
субъекта белка FVIII, содержащего удлиняющий время полужизни агент, составляет приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 21 час, приблизительно 22 часа, приблизительно 23 часа, приблизительно 24 часа (1 день), приблизительно 25 часов, приблизительно 26 часов, приблизительно 27 часов, приблизительно 28 часов, приблизительно 29 часов, приблизительно 30 часов, приблизительно 31 час, приблизительно 32 часа, приблизительно 33 часа, приблизительно
34 часа, приблизительно 35 часов, приблизительно 36 часов, приблизительно 40 часов, приблизительно 44 часа, приблизительно 48 часов (2 дня), приблизительно 54 часа, приблизительно 60 часов, приблизительно 72 часа (3 дня), приблизительно 84 часа, приблизительно 96 часов (4 дня), приблизительно 108 часов, приблизительно 120 часов (5 дней), приблизительно шесть дней, приблизительно семь дней (одну неделю), приблизительно восемь дней, приблизительно девять дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 11 дней, приблизительно 12 дней, приблизительно 13 дней или приблизительно 14 дней.
[0241] Один или более удлиняющих время полужизни агентов могут быть слиты с
С-концом или N-концом FVIII или инсертированы в FVIII.
1. Константная область иммуноглобулина или ее часть
[0242] Согласно другому аспекту гетерологичный фрагмент содержит одну или
более константных областей иммуноглобулина или их частей (например, Fc-область).
Согласно одному варианту реализации выделенная молекула нуклеиновой кислоты
согласно настоящему изобретению дополнительно содержит гетерологичную
последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует константную область
иммуноглобулина или ее часть. Согласно некоторым вариантам реализации указанная
константная область иммуноглобулина или ее часть представляет собой Fc-область.
[0243] Константная область иммуноглобулина состоит из доменов, обозначаемых
СН (константные тяжелые домены) (СН1, СН2 и т.п.). В зависимости от изотипа (т.е. IgG,
IgM, IgA, IgD или IgE) константная область может состоять из трех или четырех доменов
СН. Константные области некоторых изотипов (например, IgG) также содержат шарнирную
область. См. Janeway et al. 2001, Immune-biology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.
[0244] Константная область иммуноглобулина или ее часть для получения белка
FVIII согласно настоящему изобретению могут быть получены из ряда различных источников. Согласно одному варианту реализации константная область иммуноглобулина или ее часть происходит из иммуноглобулина человека. Следует понимать, однако, что константная область иммуноглобулина или ее часть может происходить из иммуноглобулина другого вида млекопитающих, в том числе, например, вида грызуна (например, мыши, крысы, кролика, морской свинки) или не являющегося человеком примата (например, шимпанзе, макака). Кроме того, константная область иммуноглобулина или ее часть может происходить из иммуноглобулина любого класса, в том числе IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и иммуноглобулина любого изотипа, в том числе lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4. Согласно одному варианту реализации используют изотип lgG1 человека.
[0245] Различные генные последовательности константной области
иммуноглобулинов (например, генные последовательности константной области человека) доступны в форме открытых для общего доступа депозитов. Может быть выбрана
последовательность доменов константной области, обладающая конкретной эффекторной функцией (или не имеющая конкретной эффекторной функции) или содержащая конкретную модификацию для снижения иммуногенности. Были опубликованы многие последовательности антител и кодирующих антитела генов, и подходящие последовательности константных областей lg (например, шарнирные последовательности, СН2 и/или СНЗ, или их части) могут быть получены из указанных последовательностей с применением техник, известных в данной области техники. Генетический материал, полученный с применением любых из перечисленных выше способов, может быть затем изменен или синтезирован с получением полипептидов согласно настоящему изобретению. Следует также иметь в виду, что в объем настоящего изобретения входят аллели, варианты и мутации последовательностей ДНК константной области.
[0246] Последовательности константной области иммуноглобулина или ее части
могут быть клонированы, например, с применением полимеразной цепной реакции и праймеров, которые выбирают для амплификации домена, представляющего интерес. Для клонирования последовательности константной области иммуноглобулина или ее части из антитела мРНК может быть выделена из клеток гибридомы, селезенки или лимфатических клеток, и обратно транскрибирована в ДНК; и гены антитела могут быть амплифицированы посредством ПЦР. Способы ПЦР-амплификации подробно описаны в патентах США №4683195; №4683202; 4800159; 4965188; и, например, в источниках: "PCR Protocols: А Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270). ПЦР может быть инициирована консенсусными праймерами константных областей или более специфическими праймерами на основе опубликованных последовательностей ДНК и аминокислот тяжелых и легких цепей. ПЦР также может применяться для выделения клонов ДНК, кодирующих легкие и тяжелые цепи антител. В указанном случае может осуществляться скрининг библиотек с применением консенсусных праймеров или гомологичных зондов большего размера, таких как зонды для константных областей мышь. Многочисленные наборы праймеров, подходящие для амплификации генов антител, известны в данной области техники (например, 5'-праймеры на основе N-концевой последовательности очищенных антител (Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); для быстрой амплификации концов кДНК (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); лидерных последовательностей антител (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). Клонирование последовательностей антител дополнительно описано в патенте США № 5658570 (Newman et al.) с датой подачи заявки 25 января 1995 г., который включен в настоящий документ посредством ссылки.
[0247] Константная область иммуноглобулина для применения согласно
настоящему изобретению может включать все домены и шарнирную область, или их части.
Согласно одному варианту реализации константная область иммуноглобулина или ее часть содержит домен СН2, домен СНЗ и шарнирную область, т.е. Fc-область или партнер для связывания FcRn.
[0248] В настоящем документе термином "Fc-область" определена часть
полипептида, которая соответствует Fc-области природного lg, т.е. образованной
димерной связью соответствующих Fc-доменов двух тяжелых цепей lg. Природная Fc-
область образует гомодимер с другой Fc-областью. В отличие от этого, термин
"генетически слитая Fc-область" или "одноцепочечная Fc-область" (scFc-область) в
настоящем документе относится к синтетической димерной Fc-области, состоящей из Fc-
доменов, генетически соединенных в составе одной полипептидной цепи (т.е. кодируемых
одной непрерывной генетической последовательностью). См. международную публикацию
№WO 2012/006635, включенную в настоящий документ полностью посредством ссылки.
[0249] Согласно одному варианту реализации "Fc-область" относится к части
одной тяжелой цепи lg, начинающейся в шарнирной области сразу за сайтом расщепления папаином в 5'-направлении (т.е. остатком 216 в IgG, при условии, что первый остаток константной области тяжелой цепи имеет номер 114) и заканчивающейся на С-конце антитела. Соответственно, полная Fc-область содержит по меньшей мере шарнирный домен, домен СН2 и домен СНЗ.
[0250] Константная область иммуноглобулина или ее часть может являться
партнером для связывания FcRn. FcRn активен в эпителиальных тканях во взрослом возрасте и экспрессируется в просвете кишечника, легочных путях, на назальных поверхностях, вагинальных поверхностях, поверхности ободочной и прямой кишки (патент США № 6485726). Партнер для связывания FcRn является частью иммуноглобулина, которая связывается с FcRn.
[0251] Рецептор FcRn был выделен из организма млекопитающих нескольких
видов, в том числе из организма человека. Известны последовательности FcRn человека,
FcRn обезьян, FcRn крысы и FcRn мыши (Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). Рецептор
FcRn связывает IgG (но не иммуноглобулины других классов, таких как IgA, IgM, IgD и IgE)
при относительно низких значениях рН, активно транспортирует IgG трансцеллюлярно в
люминально- серозном направлении, и затем высвобождает IgG при относительно более
высоких значениях рН, обнаруживаемых в интерстициальных жидкостях. Он
экспрессируется в эпителиальной ткани во взрослом возрасте (патенты США №6485726,
№6030613, №6086875; WO 03/077834; US2003-0235536A1), в том числе в легочном и
кишечном эпителии (Israel et al. 1997, Immunology 92:69), проксимальном почечном
тубулярном эпителии (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), а также
назальном эпителии, вагинальных поверхностях и поверхностях желчных протоков.
[0252] Партнеры для связывания FcRn, подходящие для применения согласно
настоящему изобретению, включают молекулы, которые могут быть специфически связаны
рецептором FcRn, в том числе целый IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты, которые включают полную связывающую область рецептора FcRn. Область Fc-части IgG, которая связывается с рецептором FcRn, была описана на основании рентгеновской кристаллографии (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Основная зона контакта Fc и FcRn расположена возле стыка доменов СН2 и СНЗ. Контакты Fc-FcRn полностью находятся в составе одной тяжелой цепи lg. Партнеры для связывания FcRn включают целый IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты IgG, которые включают полную связывающую область FcRn. Основные сайты контакта включают остатки аминокислот 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена СН2, а также остатки аминокислот 385-387, 428 и 433436 домена СНЗ. Любая упоминаемая нумерация аминокислот иммуноглобулинов, фрагментов или областей иммуноглобулинов основана на источнике: Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.
[0253] Fc-области или партнеры для связывания FcRn, связанные с FcRn, могут
эффективно перемещаться через эпителиальные барьеры посредством FcRn,
обеспечивая таким образом неинвазивный способ системного введения требуемой
терапевтической молекулы. Кроме того, слитые белки, содержащие Fc-область или
партнер для связывания FcRn, подвергаются эндоцитозу клетками, экспрессирующими
FcRn. Однако вместо того, чтобы быть помеченными как подлежащие разложению,
указанные слитые белки проходят рециклинг и повторно попадают в кровоток, с
увеличением таким образом времени полужизни in vivo указанных белков. Согласно
некоторым вариантам реализации указанные части константных областей
иммуноглобулинов представлены Fc-областью или партнером для связывания FcRn,
которые обычно связываются, посредством дисульфидных связей и других
неспецифических взаимодействий, с другой Fc-областью или другим партнером для
связывания FcRn с образованием димеров и мультимеров более высокого порядка.
[0254] Два рецептора FcRn могут связывать одну молекулу Fc. Данные
кристаллографии предполагают, что каждая молекула FcRn связывает один полипептид
гомодимера Fc. Согласно одному варианту реализации соединение партнера для
связывания FcRn, например, Fc-фрагмента IgG, с биологически активной молекулой
обеспечивает способ доставки указанной биологически активной молекулы перорально,
буккально, сублингвально, ректально, вагинально, в виде аэрозоля, вводимого назально
или через легкие, или доставки через глаза. Согласно другому варианту реализации белок
FVIII может быть введен инвазивным способом, например, подкожно, внутривенно.
[0255] Область партнера для связывания FcRn представляет собой молекулу или
ее часть, которая может быть специфически связана рецептором FcRn с последующим активным транспортом рецептором FcRn указанной Fc-области. Специфическое связывание относится к двум молекулам, образующим комплекс, относительно
стабильный в физиологических условиях. Специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью и емкостью от низкой до умеренной, в отличие от неспецифического связывания, которое обычно отличается низкой аффинностью при емкости от умеренной до высокой. Как правило, связывание считают специфическим при значении константы аффинности КА выше 106 М"1, или выше 108 М"1. При необходимости, неспецифическое связывание может быть снижено, по существу без влияния на специфическое связывание, путем использования варьирующих условий связывания. Подходящие условия связывания, такие как концентрация молекул, ионная сила раствора, температура, время, предоставляемое для связывания, концентрация блокирующего агента (например, сывороточного альбумина, молочного казеина) и т.п., могут быть оптимизированы специалистом с применением рутинных техник.
[0256] Согласно некоторым вариантам реализации белок FVIII, кодируемый
молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, содержит одну или более усеченных Fc-областей, достаточных, тем не менее, для придания указанной Fc-области связывающих свойств в отношении Fc-рецептора (FcR). Например, часть Fc-области, которая связывается с FcRn (т.е. связывающая часть FcRn), содержит аминокислоты в приблизительных положениях 282-438 lgG1, в соответствии с нумерацией EU (тогда как первичные сайты контакта представлены аминокислотами 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена СН2, и остатками аминокислот 385-387, 428 и 433-436 домена СНЗ. Соответственно, Fc-область согласно настоящему изобретению может содержать или состоять из связывающей FcRn части. Связывающие FcRn части могут происходить из тяжелых цепей любого изотипа, в том числе IgGI, lgG2, lgG3 и lgG4. Согласно одному варианту реализации используют связывающую FcRn часть из антитела изотипа lgG1 человека. Согласно другому варианту реализации используют связывающую часть FcRn из антитела изотипа lgG4 человека.
[0257] Fc-область может быть получена из ряда различных источников. Согласно
одному варианту реализации Fc-область полипептида происходит из иммуноглобулина человека. Следует, однако, понимать, что Fc-фрагмент может происходить из иммуноглобулин млекопитающего другого вида, в том числе, например, вида грызуна (например, мыши, крысы, кролика, морской свинки) или не являющегося человеком примата (например, шимпанзе, макака). Кроме того, полипептид Fc-доменов или их частей может происходить из иммуноглобулина любого класса, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и иммуноглобулина любого изотипа, в том числе lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4. Согласно другому варианту реализации используют изотип lgG1 человека.
[0258] Согласно некоторым вариантам реализации вариант Fc обеспечивает
изменение по меньшей мере одной эффекторной функции, сообщаемой Fc-фрагментом, содержащим указанный Fc-домен дикого типа (например, улучшение или снижение способности указанной Fc-области к связыванию с Fc-рецепторами (например, FcyRI,
FcyRII или FcyRHI) или белками комплемента (например C1q), или к запуску антитело-зависимой цитотоксичности (АЗКЦ), фагоцитоза или комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ)). Согласно другим вариантам реализации указанный вариант Fc сконструирован так, чтобы содержать остаток цистеина.
[0259] Fc-область согласно настоящему изобретению может включать известные из
уровня техники варианты Fc, которые, как известно, обеспечивают изменение (например, усиление или снижение) эффекторной функции и/или связывание FcR или FcRn. В частности, Fc-область согласно настоящему изобретению может содержать, например, изменение (например, замену) в одном или более из положений аминокислот, описанных в международных РСТ-публикациях WO88/07089A1, W096/14339A1, WO98/05787A1, W098/23289A1, W099/51642A1, W099/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, и WO06/085967A2; патентных публикациях США US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; или патентах США №5648260; №5739277; №5834250; №5869046; №6096871; №6121022; №6194551; №6242195; №6277375; №6528624; №6538124; №6737056; №6821505; №6998253; №7083784; №7404956 и №7317091, все из которых включены посредством ссылок в настоящий документ. Согласно одному варианту реализации указанное специфическое изменение (например, специфическая замена одной или более аминокислот, описанная в данной области техники) может быть осуществлена в одном или более из описанных положений аминокислот. Согласно другому варианту реализации могут быть осуществлены разные изменения в одном или более из описанных положений аминокислот (например, разные замены в одном или более положениях аминокислот, описанных в данной области техники).
[0260] Fc-область или партнер для связывания FcRn IgG может быть
модифицирован(а) в соответствии с хорошо известными процедурами, такими как сайт-направленный мутагенез и т.п., с получением модифицированного IgG, или Fc-фрагментов, или их частей, которые будет связывать FcRn. Такие модификации включают модификации, отдаленные от сайтов контакта FcRn, а также модификации в составе сайтов контакта, которые обеспечивают сохранение связывание с FcRn или даже усиливают его. Например, могут быть выполнены без значимого снижения аффинности связывания Fc в отношении FcRn следующие замены одиночных остатков аминокислот в Fc lgG1 человека (Fc 7J1): Р238А, S239A, К246А, К248А, D249A, М252А, Т256А, Е258А, Т260А, D265A, S267A, Н268А, Е269А, D270A, Е272А, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, Е283А, Н285А, N286A, Т289А, К290А, R292A, Е293А, Е294А, Q295A, Y296F, N297A, S298A,
Y300F, R301A, V303A, V305A, Т307А, L309A, Q311A, D312A, N315A, К317А, Е318А, К320А, К322А, S324A, К326А, A327Q, Р329А, A330Q, Р331А, ЕЗЗЗА, К334А, Т335А, S337A, К338А, К340А, Q342A, R344A, Е345А, Q347A, R355A, Е356А, М358А, Т359А, К360А, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, Е380А, Е382А, S383A, N384A, Q386A, Е388А, N389A, N390A, Y391F, К392А, L398A, S400A, D401A, D413A, К414А, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, Е430А, N434A, Т437А, Q438A, К439А, S440A, S444A и К447А, где, например, Р238А соответствует замене пролина дикого типа на аланин в положении № 238. Например, согласно специфическому варианту реализации предусмотрена мутация N297A, устраняющая высококонсервативный сайт N-гликозилирования. Помимо аланина, для замены аминокислот дикого типа могут быть использованы другие аминокислоты в положениях, перечисленных выше. Мутации могут быть введены в Fc точечно, обеспечивая получение более чем сотни Fc-областей, отличных от природной Fc. Кроме того, могут быть одновременно введены комбинации из двух, трех или более указанных индивидуальных мутаций, что обеспечивает получение сотен дополнительных Fc-областей.
[0261] Некоторые из описанных выше мутаций могут придавать новые
функциональные свойства Fc-области или партнеру для связывания FcRn. Например, согласно одному варианту реализации предусмотрена мутация N297A, устраняющая высококонсервативный сайт N-гликозилирования. Эффект указанной мутации заключается в снижении иммуногенности, с увеличением таким образом времени полужизни Fc-области в кровотоке, и в обеспечении неспособности Fc-области к связыванию с FcURI, FcURIIA, FcURIIB и FcURIIIA, без разрушения аффинности в отношении FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Дополнительным примером новой функциональности, возникающей в результате описанных выше мутаций, в некоторых случаях может быть увеличенная аффинность в отношении FcRn по сравнению с диким типом. Указанная увеличенная аффинность может отражать увеличение скорости связывания, уменьшение скорости диссоциации, или как увеличение скорости связывания, так и уменьшение скорости диссоциации. Примеры мутаций, предположительно обеспечивающих увеличенную аффинность в отношении FcRn, включают, не ограничиваясь перечисленными, Т256А, Т307А, Е380А и N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
[0262] Кроме того, по меньшей мере три рецептора Fc-гамма человека, по-
видимому, распознают сайт связывания на IgG в составе нижней шарнирной области, как правило, аминокислоты 234-237. Соответственно, другой пример новой функциональности и потенциально пониженной иммуногенности может возникать в результате мутаций указанной области, например, путем замены аминокислот 233-236 lgG1 человека "ELLG" (SEQ ID NO: 45) на соответствующую последовательность из lgG2 "PVA" (с делецией одной аминокислоты). Было показано, что FcURI, FcURII и FcURIII, которые опосредуют
различные эффекторные функции, не связываются с lgG1 после введения таких мутаций. Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77; и Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.
[0263] Согласно другому варианту реализации указанная константная область
иммуноглобулина или ее часть содержит последовательность аминокислот в шарнирной области или ее части, которая образует одну или более дисульфидных связей с второй константной областью иммуноглобулина или ее частью. Указанная вторая константная область иммуноглобулина или ее часть может быть соединена с вторым полипептидом, с соединением таким образом белка FVIII и указанного второго полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации указанный второй полипептид представляет собой фрагмент энхансера. В настоящем документе термин "фрагмент энхансера" относится к молекуле, фрагменту или компоненту полипептида, который способен усиливать прокоагулянтную активность FVIII. Указанный фрагмент энхансера может представлять собой кофактор, такой как растворимый тканевый фактор (sTF) или прокоагулянтный пептид. Соответственно, при активации FVIII фрагмент энхансера обеспечивает усиление активности FVIII.
[0264] Согласно некоторым вариантам реализации белок FVIII, кодируемый
молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, содержит замену аминокислоты в константной области иммуноглобулина или ее части (например, варианты Fc), которая изменяет антиген-независимые эффекторные функции константной области lg, в частности, время полужизни белка в кровотоке. 2. Области scFc
[0265] Согласно другому аспекту гетерологичный фрагмент содержит scFc-область
(одноцепочечный Fc). Согласно одному варианту реализации выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению дополнительно содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует scFc-область. scFc-область содержит по меньшей мере две константных области иммуноглобулина или их части (например, Fc-фрагменты или домены (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более Fc-фрагментов или доменов)) в составе одной линейной полипептидной цепи, которые способны к укладке (например, внутримолекулярной или межмолекулярной укладке) с образованием одной функциональной scFc-области, соединенные пептидным Fc-линкером. Например, согласно одному варианту реализации полипептид согласно настоящему изобретению способен к связыванию, за счет scFc-области, по меньшей мере с одним Fc-рецептором (например, рецептором FcRn, FcyR (например, FcyRIII); или с белком комплемента (например, C1q)), обеспечивая увеличение времени полужизни или запуск иммунной эффекторной функции (например, антителозависимой цитотоксичности (АЗКЦ), фагоцитоза или комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ); и/или увеличение выполнимости производства).
3. СТР
[0266] Согласно другому аспекту гетерологичный фрагмент содержит один С-
концевой пептид (СТР) р-субъединицы хорионического гонадотропина человека или его фрагмент, вариант или производное. Известно, что один или более пептидов СТР, инсертированные в рекомбинантный белок, увеличивают время полужизни указанного белка in vivo. См., например, патент США №5712122, включенный в настоящий документ полностью посредством ссылки.
[0267] Примеры пептидов СТР включают
DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (SEQ ID NO: 33) или SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 34). См., например, опубликованную заявку на патент США US 2009/0087411 А1, включенную в настоящий документ посредством ссылки.
4. Последовательность XTEN
[0268] Согласно некоторым вариантам реализации гетерологичный фрагмент
содержит одну или более последовательностей XTEN, их фрагментов, вариантов или производных. В настоящем документе "последовательность XTEN" относится к полипептидам увеличенной длины с не встречающимися в природе, по существу не повторяющимися последовательностями, состоящими в основном из малых гидрофильных аминокислот, при этом указанная последовательность отличается низкой степенью или отсутствием вторичной или третичной структуры в физиологических условиях. В качестве гетерологичного фрагмента последовательности XTEN могут служить удлиняющим время полужизни фрагментов. Кроме того, XTEN может обеспечивать требуемые свойства, в том числе улучшенные фармакокинетические показатели и характеристики растворимости, но не ограничиваясь указанным.
[0269] Включение гетерологичного фрагмента, содержащего последовательность
XTEN, в белок согласно настоящему изобретению может придавать указанному белку одно или более из следующих благоприятных свойств: конформационную гибкость, улучшенную водорастворимость, высокую степень устойчивости к протеазам, низкую иммуногенность, низкую степень связывания с рецепторами млекопитающих или улучшенный гидродинамический радиус (или радиус Стокса).
[0270] Согласно определенным аспектам последовательность XTEN может
улучшать фармакокинетические свойства, например, удлинять время полужизни in vivo или увеличивать площадь под кривой (AUC), так что белок согласно настоящему изобретению остается in vivo и обладает прокоагулянтной активностью на протяжении более длительного периода времени по сравнению с таким же белком, не содержащим гетерологичным фрагментом XTEN.
[0271] Согласно некоторым вариантам реализации последовательность XTEN,
подходящая для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой
пептид или полипептид, содержащий более чем приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 или 2000 остатков аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации XTEN представляет собой пептид или полипептид, содержащий более чем приблизительно 20 - приблизительно 3000 остатков аминокислот, от более чем 30 до приблизительно 2500 остатков, от более чем 40 до приблизительно 2000 остатков, от более чем 50 до приблизительно 1500 остатков, от более чем 60 до приблизительно 1000 остатков, от более чем 70 до приблизительно 900 остатков, от более чем 80 до приблизительно 800 остатков, от более чем 90 до приблизительно 700 остатков, от более чем 100 до приблизительно 600 остатков, от более чем 110 до приблизительно 500 остатков, или от более чем 120 до приблизительно 400 остатков. Согласно одному конкретному варианту реализации XTEN содержит последовательность аминокислот длиной более 42 аминокислот и менее 144 аминокислот.
[0272] Последовательность XTEN согласно настоящему изобретению может
содержать один или более мотив с последовательностью, содержащей 5-14 (например, 9-
14) остатков аминокислот, или последовательность аминокислот, по меньшей мере на
80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной мотиву с
последовательностью, которая содержит, по существу состоит или состоит из 4-6 типов
аминокислот (например, 5 аминокислот), выбранных из группы, состоящей из глицина (G),
аланина (А), серина (S), треонин (Т), глутамата (Е) и пролина (Р). См. US 2010-0239554 А1.
[0273] Согласно некоторым вариантам реализации XTEN содержит мотивы с
неперекрывающимися последовательностями, при этом приблизительно 80%, или по меньшей мере приблизительно 85%, или по меньшей мере приблизительно 90%, или приблизительно 91%, или приблизительно 92%, или приблизительно 93%, или приблизительно 94%, или приблизительно 95%, или приблизительно 96%, или приблизительно 97%, или приблизительно 98%, или приблизительно 99%, или приблизительно 100% последовательности состоит из нескольких единиц неперекрывающихся последовательностей, выбранных из одного семейства мотивов, выбранных из таблицы 4, образующих семейство последовательностей. В настоящем документе "семейство" означает, что XTEN содержит мотивы, выбранные только из одной категории мотивов из таблицы 4; т.е. AD, АЕ, AF, AG, AM, AQ, ВС или BD XTEN, и что любые другие аминокислоты в XTEN, не относящиеся к семейству мотивов, выбирают для достижения необходимого свойства, например, обеспечивающего включение сайта рестрикции кодирующими нуклеотидами, включение последовательности расщепления или лучшее связывание с FVIII. Согласно некоторым вариантам реализации семейств XTEN последовательность XTEN содержит несколько единиц из мотивов с неперекрывающимися последовательностями из семейства мотивов AD, или семейства мотивов АЕ, или семейства мотивов AF, или семейства мотивов AG, или семейства
мотивов AM, или семейства мотивов AQ, или семейства ВС, или семейства BD, при этом итоговая XTEN демонстрирует гомологию в диапазоне, описанном выше. Согласно другим вариантам реализации XTEN содержит несколько единиц из мотивов последовательностей из двух или более семейств мотивов из таблицы 2А. Указанные последовательности могут быть выбраны таким образом, чтобы обеспечивать требуемые физические/химические характеристики, в том числе такие свойства, как общий заряд, гидрофильность, отсутствие вторичной структуры, или отсутствие повторяемости, за счет аминокислотного состава мотивов, более подробно описанного ниже. Согласно вариантам реализации, описанным выше в настоящем параграфе, мотивы, включенные в XTEN, могут быть выбраны и собраны с применением способов, описанных в настоящем документе, с получением XTEN длиной приблизительно 36 - приблизительно 3000 остатков аминокислот.
Таблица 4. Мотивы последовательностей XTEN из 12 аминокислот и семейства мотивов
Семейство мотивов*
ПОСЛЕДОВАТЕЛ ЫН ОСТЬ МОТИВА
SEQ ID NO:
GESPGGSSGSES
GSEGSSGPGESS
GSSESGSSEGGP
GSGGEPSESGSS
АЕ, AM
GSPAGSPTSTEE
АЕ, AM, AQ
GSEPATSGSETP
АЕ, AM, AQ
GTSESATPESGP
АЕ, AM, AQ
GTSTEPSEGSAP
AF, AM
GSTSESPSGTAP
AF, AM
GTSTPESGSASP
AF, AM
GTSPSGESSTAP
AF, AM
GSTSSTAESPGP
AG, AM
GTPGSGTASSSP
AG, AM
GSSTPSGATGSP
AG, AM
GSSPSASTGTGP
AG, AM
GASPGTSSTGSP
GEPAGSPTSTSE
GTGEPSSTPASE
GSGPSTESAPTE
GSETPSGPS ETA
GPSETSTSEPGA
Семейство мотивов*
ПОСЛЕДОВАТЕЛ ЬН ОСТЬ МОТИВА
SEQ ID NO:
GSPSEPTEGTSA
GSGASEPTSTEP
GSEPATSGTEPS
GTSEPSTSEPGA
GTSTEPSEPGSA
G STAG S ETST Е А
GSETATSGSETA
100
GTSESATSESGA
101
GTSTEASEGSAS
102
* Индивидуальные последовательности мотивов, при совместном использовании в
различных пермутациях образующие "семейство последовательностей"
[0274] Примеры последовательностей XTEN, которые могут применяться в
качестве гетерологичных фрагментов в химерных белках согласно настоящему
изобретению, описаны, например, в патентных публикациях США 2010/0239554 А1,
2010/0323956 А1, 2011/0046060 А1, 2011/0046061 А1, 2011/0077199 А1, или 2011/0172146
А1, или международных патентных публикациях WO 2010091122 А1, WO 2010144502 А2,
WO 2010144508 А1, WO 2011028228 А1, WO 2011028229 А1 или WO 2011028344 А2,
каждая из которых полностью включена посредством ссылки в настоящий документ.
[0275] XTEN может иметь варьирующую длину для инсерции или связывания с
FVIII. Согласно одному варианту реализации длина последовательности или последовательностей XTEN выбирают на основании свойства или функции слитого белка, которые необходимо обеспечить. В зависимости от предполагаемого свойства или функции XTEN может представлять собой последовательность короткой или промежуточной длины или более длинную последовательность, которая может служить в качестве носителя. Согласно некоторым вариантам реализации XTEN включает короткие сегменты, содержащие от приблизительно 6 до приблизительно 99 остатков аминокислот, сегменты промежуточной длины от приблизительно 100 до приблизительно 399 остатков аминокислот, и более длинные сегменты длиной от приблизительно 400 до приблизительно 1000, и до приблизительно 3000 остатков аминокислот. Соответственно, XTEN, инсертированная в FVIII или соединенная с FVIII, может иметь длину, равную приблизительно 6, приблизительно 12, приблизительно 36, приблизительно 40, приблизительно 42, приблизительно 72, приблизительно 96, приблизительно 144, приблизительно 288, приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 576, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 800, приблизительно 864, приблизительно 900, приблизительно 1000, приблизительно 1500, приблизительно 2000,
приблизительно 2500, или до приблизительно 3000 остатки аминокислот длиной. Согласно
другим вариантам реализации длина последовательностей XTEN составляет от
приблизительно 6 до приблизительно 50, от приблизительно 50 до приблизительно 100, от
приблизительно 100 до 150, от приблизительно 150 до 250, от приблизительно 250 до 400,
от приблизительно 400 до приблизительно 500, от приблизительно 500 до приблизительно
900, от приблизительно 900 до 1500, от приблизительно 1500 до 2000, или от
приблизительно 2000 до приблизительно 3000 остатков аминокислот длиной. Точная
длина XTEN, инсертированной в FVIII или соединенного с FVIII, может варьировать без
нежелательного влияния на активность FVIII. Согласно одному варианту реализации одна
или более из XTEN, используемых в настоящем документе, имеет длину 42 аминокислоты,
72 аминокислоты, 144 аминокислоты, 288 аминокислот, 576 аминокислот или 864
аминокислоты, и может быть выбрана из одного или более семейства
последовательностей XTEN; т.е. AD, АЕ, AF, AG, AM, AQ, ВС или BD.
[0276] Согласно некоторым вариантам реализации последовательность XTEN для
применения согласно настоящему изобретению по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%,
90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична
последовательности, выбранной из группы, состоящей из АЕ42, AG42, АЕ48, АМ48, АЕ72,
AG72, АЕ108, AG108, АЕ144, AF144, AG144, АЕ180, AG180, АЕ216, AG216, АЕ252, AG252,
АЕ288, AG288, АЕ324, AG324, АЕ360, AG360, АЕ396, AG396, АЕ432, AG432, АЕ468, AG468,
АЕ504, AG504, AF504, АЕ540, AG540, AF540, AD576, АЕ576, AF576, AG576, АЕ612, AG612,
АЕ624, АЕ648, AG648, AG684, АЕ720, AG720, АЕ756, AG756, АЕ792, AG792, АЕ828, AG828,
AD836, АЕ864, AF864, AG864, АМ875, АЕ912, АМ923, АМ1318, ВС864, BD864, АЕ948,
АЕ1044, АЕ1140, АЕ1236, АЕ1332, АЕ1428, АЕ1524, АЕ1620, АЕ1716, АЕ1812, АЕ1908,
АЕ2004А, AG948, AG 1044, AG 1140, AG 1236, AG 1332, AG 1428, AG 1524, AG 1620, AG 1716,
AG1812, AG1908, AG2004, и любой их комбинации. См. US 2010-0239554 А1. Согласно
одному конкретному варианту реализации XTEN содержит АЕ42, АЕ72, АЕ144, АЕ288,
АЕ576, АЕ864, AG 42, AG72, AG144, AG288, AG576, AG864 или любую их комбинацию.
[0277] Примеры последовательностей XTEN, которые могут применяться в
качестве гетерологичных фрагментов в химерном белке согласно настоящему изобретению, включают XTEN АЕ42-4 (SEQ ID NO: 46, кодируемая SEQ ID NO: 47; фиг. 11C и 11D, соответственно), XTEN 144-2A (SEQ ID NO: 48, кодируемая SEQ ID NO: 49; фиг. 11E и 11F, соответственно), XTEN A144-3B (SEQ ID NO: 50, кодируемая SEQ ID NO: 51; фиг. 11G и 11H, соответственно), XTEN AE144-4A (SEQ ID NO: 52, кодируемая SEQ ID NO: 53; фиг. 111 и 11J, соответственно), XTEN АЕ144-5А (SEQ ID NO: 54, кодируемая SEQ ID NO: 55; фиг. 11К и 11L, соответственно), XTEN AE144-6B (SEQ ID NO: 56, кодируемая SEQ ID NO: 57; фиг. 11M и 11N, соответственно), XTEN AG144-1 (SEQ ID NO: 58, кодируемая SEQ ID NO: 59; фиг. 110 и 11P, соответственно), XTEN AG144-A (SEQ ID NO: 60, кодируемая SEQ ID NO: 61; фиг. 11Q и 11R, соответственно), XTEN AG144-B (SEQ ID NO: 62,
кодируемая SEQ ID NO: 63; фиг. 11S и 11T, соответственно), XTEN AG144-C (SEQ ID NO: 64, кодируемая SEQ ID NO: 65; фиг. 11U и 11V, соответственно) и XTEN AG144-F (SEQ ID NO: 66, кодируемая SEQ ID NO: 67; фиг. 11W и 11X, соответственно). Согласно одному конкретному варианту реализации XTEN кодирует SEQ ID N0:18.
[0278] Согласно некоторым вариантам реализации менее чем 100% аминокислот
XTEN выбирают из глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутамата (Е) и пролина (Р), или менее чем 100% указанной последовательности состоит из последовательностей мотивов из таблицы 2А или последовательности XTEN, предложенных в настоящем изобретении. Согласно таким вариантам реализации остальные остатки аминокислот XTEN выбирают из любой другой из 14 природных L-аминокислот, однако могут быть преимущественно выбраны из гидрофильных аминокислот, так, чтобы последовательность XTEN содержала по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере приблизительно 99% гидрофильных аминокислот. Содержание гидрофобных аминокислот в XTEN, применяемой в конъюгированных конструкциях, может составлять менее 5%, или менее 2%, или менее 1%. Гидрофобные остатки, менее благоприятные для конструирования XTEN, включают триптофан, фенилаланин, тирозин, лейцин, изолейцин, валин и метионин. Кроме того, последовательности XTEN могут содержать менее чем 5%, или менее чем 4%, или менее чем 3%, или менее чем 2%, или менее чем 1%, или не содержать следующие аминокислоты: метионин (например, чтобы избежать окисления), или аспарагин и глутамин (чтобы избежать дезамидирования).
[0279] Одна или более последовательностей XTEN может быть инсертирована на
С-конце или на N-конце последовательности аминокислот, кодируемой указанной последовательностью нуклеотидов, или инсертирована между двумя аминокислотами в последовательности аминокислот, кодируемой указанной последовательностью нуклеотидов. Например, XTEN может быть инсертирована между двумя аминокислотами в одном или более сайтах инсерции, выбранных из таблицы 3. Примеры пермиссивных сайтов в составе FVIII, подходящих для инсерции XTEN, можно найти, например, в международной публикации WO 2013/123457 А1 или публикации США №2015/0158929 А1, которые включены в настоящий документ полностью посредством ссылки. 5. Альбумин или его фрагмент, производное или вариант
[0280] Согласно некоторым вариантам реализации гетерологичный фрагмент
содержит альбумин или его функциональный фрагмент. Сывороточный альбумин человека (HSA, или НА), белок длиной 609 аминокислот в полноразмерной форме, отвечает за значительную часть осмотического давления сыворотки, а также функционирует в качестве носителя эндогенных и экзогенных лигандов. Термин "альбумин" в настоящем документе включает полноразмерный альбумин или его функциональный фрагмент, вариант, производное или аналог. Примеры альбумина, или
его фрагментов или вариантов описаны в патентных публикациях США 2008/0194481А1,
2008/0004206 А1, 2008/0161243 А1, 2008/0261877 А1, или 2008/0153751 А1, или
опубликованных РСТ-заявках 2008/033413 А2, 2009/058322 А1, или 2007/021494 А2,
которые включены в настоящий документ полностью посредством ссылок.
[0281] Согласно одному варианту реализации белок FVIII, кодируемый молекулой
нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, содержит альбумин, его фрагмент или вариант, дополнительно соединенный с вторым гетерологичным фрагментом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК и ПЭГ. 6. Альбумин-связывающий фрагмент
[0282] Согласно некоторым вариантам реализации указанный гетерологичный
фрагмент представляет собой альбумин-связывающий фрагмент, который содержит
альбумин-связывающий пептид, бактериальный альбумин-связывающий домен,
альбумин-связывающий фрагмент антитела, или любые их комбинации.
[0283] Например, альбумин-связывающий белок может представлять собой
бактериальный альбумин-связывающий белок, антитело или фрагмент антитела, в том числе доменные антитела (см. патент США №6696245). Альбумин-связывающий белок, например, может представлять собой бактериальный альбумин-связывающий домен, например, один из стрептококковых белков G (Konig, Т. and Skerra, А. (1998) J. Immunol. Methods2'\Q, 73-83). Другие примеры альбумин-связывающих пептидов, которые могут применяться в качестве партнера для конъюгации, представлены, например, пептидами, содержащими консенсусную последовательность Cys-Xaa 1-Хаа 2-Хаа з-Хаа 4-Cys, где Хаа 1 представляет собой Asp, Asn, Ser, Thr или Trp; Хаа 2 представляет собой Asn, Gin, Н представляет собой lie, Leu или Lys; Хаа з представляет собой Ala, Asp, Phe, Trp или Туг; и Хаа 4 представляет собой Asp, Gly, Leu, Phe, Ser или Thr, согласно описанию в заявке на патент США 2003/0069395 или статье Dennis с соавторами (Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043).
[0284] Домен 3 из стрептококкового белка G, согласно описанию в источниках:
Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996) и Linhult et al., Protein Sci. 11:206-213 (2002), представляет собой пример бактериального альбумин-связывающего домена. Примеры альбумин-связывающих пептидов включают ряд пептидов, содержащих коровую последовательность DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 35). см. например, Dennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002). Примеры альбумин-связывающих фрагментов антител описаны в источниках: Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007); Roovers et al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007); и Holt et al., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008), которые включены в настоящий документ полностью посредством ссылок. Примером такого альбумин-связывающего фрагмента является 2-(3
малеимидопропанамидо)-6-(4-(4-иодофенил)бутанамидо)гексаноат (метка "Albu")
согласно описанию в источнике: Trussel et al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009).
[0285] Жирные кислоты, в частности, длинноцепочечные жирные кислоты (ДЦЖК) и
подобные длинноцепочечным жирным кислотам альбумин-связывающие соединения, могут применяться для продления времени полужизни in vivo белков FVIII согласно настоящему изобретению. Примером ДЦЖК-подобного альбумин-связывающего соединения является 16-(1-(3-(9-(((2,5-диоксопирролидин-1-илокси)карбонилокси)-метил)-7-сульфо-9Н-флуорен-2-иламино)-3-оксопропил)-2,5-диоксопирролидин-3-илтио)гексадекановая кислота (см., например, WO 2010/140148). 7. Последовательность PAS
[0286] Согласно другим вариантам реализации гетерологичный фрагмент
представляет собой последовательность PAS. Последовательность PAS, в настоящем документе, означает последовательность аминокислот, содержащую в основном остатки аланина и серина, или содержащую с основном остатки аланина, серина и пролина, при этом указанная последовательность аминокислот образует случайную спиральную конформацию в физиологических условиях. Соответственно, указанная последовательность PAS представляет собой строительный блок, полимер аминокислот или последовательность кассеты, содержащую, по существу состоящую или состоящую из аланина, серина и пролина, которая может применяться в качестве части гетерологичного фрагмента химерного белка. Тем не менее, специалисту в данной области техники известно, что полимер аминокислот также может формировать случайную спиральную конформацию при добавлении остатков, отличных от аланина, серина и пролина в качестве микрокомпонентов последовательности PAS. Термин "микрокомпонент" в настоящем документе означает, что в последовательность PAS может быть добавлено определенное количество аминокислот, отличных от аланина, серина и пролина, например, до приблизительно 12%, т.е. приблизительно 12 из 100 аминокислот последовательности PAS, до приблизительно 10%, т.е. приблизительно 10 из 100 аминокислот последовательности PAS, до приблизительно 9%, т.е. приблизительно 9 из 100 аминокислот, до приблизительно 8%, т.е. приблизительно 8 из 100 аминокислот, приблизительно 6%, т.е. приблизительно 6 из 100 аминокислот, приблизительно 5%, т.е. приблизительно 5 из 100 аминокислот, приблизительно 4%, т.е. приблизительно 4 из 100 аминокислот, приблизительно 3%, т.е. приблизительно 3 из 100 аминокислот, приблизительно 2%, т.е. приблизительно 2 из 100 аминокислот, приблизительно 1%, т.е. приблизительно 1 из 100 аминокислот. Указанные аминокислоты, отличные от аланина, серина и пролина, могут быть выбраны из группы, состоящей из Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Туг и Val.
[0287] В физиологических условиях отрезок последовательности PAS образует
случайную спиральную конформацию и, таким образом, может опосредовать увеличенную
стабильность белка FVIII in vivo и/или in vitro. Поскольку случайный спиральный домен сам по себе не обеспечивает стабильную структуру или функцию, биологическая активность, опосредованная белком FVIII, по существу сохраняется. Согласно другим вариантам реализации последовательности PAS, образующие случайный спиральный домен, биологически инертны, в частности, применительно к протеолизу в плазме крови, иммуногенности, изоэлектрической точке /электростатическому поведению, связыванию или интернализации рецепторов клеточной поверхности, однако, тем не менее, являются биоразлагаемыми, что обеспечивает выраженные преимущества по сравнению с синтетическими полимерами, такими как ПЭГ.
[0288] Неограничивающие примеры последовательностей PAS, образующих
случайную спиральную конформацию, включают последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 36), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 37), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 38), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 39), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 40), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 41) и ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 42) или любых их комбинаций. Дополнительные примеры последовательностей PAS известны, например, из патентной публикации США №2010/0292130 А1 и опубликованной РСТ-заявки WO 2008/155134 А1.
8. Последовательность НАР
[0289] Согласно некоторым вариантам реализации указанный гетерологичный
фрагмент представляет собой богатый глицином гомоаминокислотный полимер (НАР). Указанная последовательность НАР может содержать последовательность из повторяющихся остатков глицина длиной по меньшей мере 50 аминокислот, по меньшей мере 100 аминокислот, 120 аминокислот, 140 аминокислот, 160 аминокислот, 180 аминокислот, 200 аминокислот, 250 аминокислот, 300 аминокислот, 350 аминокислот, 400 аминокислот, 450 аминокислот или 500 аминокислот. Согласно одному варианту реализации указанная последовательность НАР способна удлинять время полужизни фрагмента, слитого или соединенного с указанной последовательностью НАР. Неограничивающие примеры последовательности НАР включает, однако не ограничиваются (Gly)n, (Gly4Ser)n или S(Gly4Ser)n, где п равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20. Согласно одному варианту реализации п равно 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40. Согласно другому варианту реализации п равно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, или 200.
9. Трансферрин или его фрагмент
[0290] Согласно некоторым вариантам реализации указанный гетерологичный
фрагмент представляет собой трансферрин или его фрагмент. Для получения белков FVIII согласно настоящему изобретению может применяться любой трансферрин. Согласно
примеру, ТФ человека дикого типа (ТФ) представляет собой содержащий 679 аминокислот белок с массой приблизительно 75 кДа (без учета гликозилирования), с двумя основными доменами, N (приблизительно 330 аминокислот) и С (приблизительно 340 аминокислот), которые, предположительно, возникли в результате дупликации гена. См. номера доступа GenBank NM001063, ХМ002793, М12530, ХМ039845, ХМ 039847 и S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/), все из которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. Трансферрин содержит два домена, домен N и домен С. Домен N содержит два субдомена, домен N1 и домен N2, а домен С содержит два субдомена, домен С1 и домен С2.
[0291] Согласно одному варианту реализации гетерологичный фрагмент
трансферрина включает вариант сплайсинга трансферрина. Согласно одному примеру вариант сплайсинга трансферрина может представлять собой вариант сплайсинга трансферрина человека, например, под номером доступа Genbank ААА61140. Согласно другому варианту реализации относящаяся к трансферрину часть химерного белка включает один или более доменов последовательности трансферрина, например, домен N, домен С, домен N1, домен N2, домен С1, домен С2 или любые их комбинации.
10. Рецепторы выведения
[0292] Согласно некоторым вариантам реализации указанный гетерологичный
фрагмент представляет собой рецептор выведения, его фрагмент, вариант или производное. LRP1 представляет собой интегральный мембранный белок с массой 600 кДа, участвующий в опосредованном рецепторами выведении различных белков, таких как фактор X. См., например, Narita et al., Blood 91:555-560 (1998).
11. Фактор фон Виллебранда или его фрагменты
[0293] Согласно некоторым вариантам реализации указанный гетерологичный
фрагмент представляет собой фактор фон Виллебранда (VWF) или один или более его фрагментов.
[0294] VWF (также известный как F8VWF) представляет собой большой
мультимерный гликопротеин, присутствующий в плазме крови и конститутивно продуцируемый в эндотелии (в тельцах Вейбеля-Палада), мегакариоцитах (а-гранулах тромбоцитов) и субэндотелиальной соединительной ткани. Основной мономер VWF представляет собой белок размером 2813 аминокислоты. Каждый мономер содержит ряд специфических доменов со специфической функцией, домены D' и D3 (которые вместе связываются с фактором VIII), домен А1 (который связывается с тромбоцитарным рецептором GPIb, гепарином и/или, возможно, коллагеном), домен A3 (который связывается с коллагеном), домен С1 (в котором домен RGD связывается с тромбоцитарным интегрином аИЬрЗ при его активации), и домен типа "цистеиновый узел" на С-конце белка (одинаковый у VWF, тромбоцитарного фактора роста (ТРФ),
трансформирующего фактора роста р (TGFP) и хорионического гонадотропина р человека (PHCG)).
[0295] Последовательность мономера размером 2813 аминокислот VWF человека
имеет номер доступа в Genbank NP000543.2. Последовательность нуклеотидов,
кодирующая VWF человека имеет номер доступа в Genbank NM000552.3. SEQ ID NO: 44
(фиг. 11В) представляет собой последовательность аминокислот, кодируемую SEQ ID NO:
43. Домен D' включает аминокислоты 764-866 последовательности SEQ ID NO: 44. Домен
D3 включает аминокислоты 867-1240 последовательности SEQ ID NO: 44.
[0296] В плазме 95-98% циркулирующего FVIII тесно связано в нековалентном
комплексе с полноразмерным VWF. Образование указанного комплекса важно для
поддержания надлежащих уровней FVIIII в плазме in vivo. Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-
96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). При активации FVIII в
результате протеолиза в положениях 372 и 740 в тяжелой цепи и в положении 1689 с легкой
цепи, VWF, связанный с FVIII, отсоединяется от активированного FVIII.
[0297] Согласно некоторым вариантам реализации гетерологичный фрагмент
представляет собой полноразмерный фактор фон Виллебранда. Согласно другим вариантам реализации указанный гетерологичный фрагмент представляет собой фрагмент фактора фон Виллебранда. В настоящем документе термин "фрагмент VWF", или "фрагменты VWF" для применения согласно настоящему изобретению, означает любые фрагменты VWF, взаимодействующие с FVIII и сохраняющие по меньшей мере одно или более свойств FVIII, в норме обеспечиваемых полноразмерным VWF, например, предотвращение преждевременную активацию FVIIIa, предотвращение преждевременного протеолиза, предотвращение связи с фосфолипидными мембранами, которая может приводить к преждевременному выведению, предотвращение связывания с рецепторами выведения FVIII, которые могут связывать свободный FVIII, но не FVIII, связанный с VWF, и/или стабилизация взаимодействий тяжелой цепи и легкой цепи FVIII. Согласно конкретному варианту реализации гетерологичный фрагмент представляет собой фрагмент (VWF), содержащий домен D' и домен D3 VWF. Фрагмент VWF, содержащий указанный домен D' и указанный домен D3 может дополнительно содержать домен VWF, выбранный из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена A3, домена D1, домена D2, домена D4, домена В1, домена В2, домена ВЗ, домена С1, домена С2, домена СК, одного или более их фрагментов, и любых их комбинаций. Дополнительные примеры полипептида с активностью FVIII, слитого с фрагментом VWF, описаны в предварительной заявке на патент США № 61/667901, поданной 3 июля 2012 г., и публикации США № 2015/0023959 А1, обе из которых включены в настоящий документ полностью посредством ссылок.
12. Линкерные фрагменты
[0298] Согласно некоторым вариантам реализации указанный гетерологичный
фрагмент представляет собой пептидный линкер.
[0299] В настоящем документе термины "пептидные линкеры" или "линкерные
фрагменты" относятся к последовательности пептида или полипептида (например,
последовательности синтетического пептида или полипептида), которая соединяет два
домена в линейной последовательности аминокислот полипептидной цепи.
[0300] Согласно некоторым вариантам реализации гетерологичные
последовательности нуклеотидов, кодирующие пептидные линкеры, могут быть инсертированы между оптимизированными последовательностями полинуклеотидов FVIII согласно настоящему изобретению и гетерологичной последовательностью нуклеотидов, кодирующей, например, один из гетерологичных фрагментов, описанных выше, например, альбумин. Пептидные линкеры могут обеспечивать гибкость молекулы химерного полипептида. Линкеры, как правило, не расщепляются, однако такое расщепление может быть желательным. Согласно одному варианту реализации указанные линкеры не удаляются при процессинге.
[0301] Тип линкера, который может присутствовать в химерном белке согласно
настоящему изобретению, представлен расщепляемым протеазой линкером, который содержит сайт расщепления (т.е. субстрат с сайтом расщепления протеазой, например, фактор Xla, Ха, или сайт расщепления тромбином) и может включать дополнительные линкеры с N-концевой стороны, с С-концевой стороны, или с обеих сторон от сайта расщепления. Указанные расщепляемые линкеры, при включении в конструкцию согласно настоящему изобретению, приводят к образованию химерной молекулы, содержащей гетерологичный сайт расщепления.
[0302] Согласно одному варианту реализации полипептид FVIII, кодируемый
молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, содержит два или
более Fc-домена или фрагмента, соединенных посредством cscFc-линкера с
образованием Fc-области, содержащейся в одной полипептидной цепи. Указанный cscFc-
линкер фланкирован по меньшей мере одним сайтом внутриклеточного процессинга, т.е.
сайтом, расщепляемым внутриклеточным ферментом. Расщепление полипептида по
меньшей мере в одном сайте внутриклеточного процессинга приводит к образованию
полипептида, который содержит по меньшей мере две полипептидных цепи.
[0303] Другие пептидные линкеры могут необязательно быть использованы в
конструкции согласно настоящему изобретению, например, для соединения белка FVIII с Fc-областью. Некоторые примеры линкеров, которые могут применяться согласно настоящему изобретению, включают, например, полипептиды, содержащие аминокислоты GlySer, что более подробно описано ниже.
[0304] Согласно одному варианту реализации указанный пептидный линкер
является синтетическим, т.е. не встречающимся в природе. Согласно одному варианту реализации пептидный линкер включает пептиды (или полипептиды) (которые могут встречаться или не встречаться в природе), которые содержат последовательность аминокислот, соединяющую или генетически сливающую первую линейную последовательность аминокислот с второй линейной последовательностью аминокислот, с которой он не соединен в естественных условиях или не слит генетически в природе. Например, согласно одному варианту реализации указанный пептидный линкер может содержать не встречающиеся в природе полипептиды, которые представляют собой модифицированные формы встречающихся в природе полипептидов (например, содержащие мутацию, такую как добавление, замена или делеция). Согласно другому варианту реализации указанный пептидный линкер может содержать не встречающиеся в природе аминокислоты. Согласно другому варианту реализации указанный пептидный линкер может содержать встречающиеся в природе аминокислоты в линейной последовательности, которая не встречается в природе. Согласно еще одному варианту реализации указанный пептидный линкер может содержать встречающуюся в природе последовательность полипептида.
[0305] Например, согласно некоторым вариантам реализации пептидный линкер
может применяться для слияния идентичных Fc-фрагментов, с образованием таким образом гомодимерной scFc-области. Согласно другим вариантам реализации пептидный линкер может применяться для слияния разных Fc-фрагментов (например, Fc-фрагмента дикого типа и варианта Fc-фрагмента), с образованием таким образом гетеродимерной scFc-области.
[0306] Согласно другому варианту реализации пептидный линкер содержит или
состоит из линкера gly-ser. Согласно одному варианту реализации scFc- или cscFc-линкер содержит по меньшей мере часть шарнира иммуноглобулина и линкера gly-ser. В настоящем документе термин "линкер gly-ser" относится к пептиду, который состоит из остатков глицина и серина. Согласно некоторым вариантам реализации указанный линкер gly-ser может быть инсертирован между двумя другими последовательностями пептидного линкера. Согласно другим вариантам реализации линкер gly-ser присоединен к одному концу или к обоим концам другой последовательности пептидного линкера. Согласно другим вариантам реализации два или более линкеров gly-ser включены в пептидный линкер в виде группы. Согласно одному варианту реализации пептидный линкер согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере часть верхней шарнирной области (например, происходящей из молекулы lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4), по меньшей мере часть средней шарнирной области (например, происходящей из молекулы lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4) и ряд остатков аминокислот gly/ser.
[0307] Длина пептидных линкеров согласно настоящему изобретению составляет
по меньшей мере одну аминокислоту и может варьировать. Согласно одному варианту реализации длина пептидного линкера согласно настоящему изобретению составляет от приблизительно 1 до приблизительно 50 аминокислот. В указанном контексте термин "приблизительно" означает +/- два остатка аминокислот. Поскольку длина линкера должна быть представлена положительным целым числом, длина от приблизительно 1 до приблизительно 50 аминокислот означает длину от 1-3 до 48-52 аминокислот. Согласно другому варианту реализации длина пептидного линкера согласно настоящему изобретению составляет от приблизительно 10 до приблизительно 20 аминокислот. Согласно другому варианту реализации длина пептидного линкера согласно настоящему изобретению составляет от приблизительно 15 до приблизительно 50 аминокислот. Согласно другому варианту реализации длина пептидного линкера согласно настоящему изобретению составляет от приблизительно 20 до приблизительно 45 аминокислот. Согласно другому варианту реализации длина пептидного линкера согласно настоящему изобретению составляет от приблизительно 15 до приблизительно 35, или от приблизительно 20 до приблизительно 30 аминокислот. Согласно другому варианту реализации длина пептидного линкера согласно настоящему изобретению составляет приблизительно 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 1000 или 2000 аминокислот. Согласно одному варианту реализации длина пептидного линкера согласно настоящему изобретению составляет 20 или 30 аминокислот.
[0308] Согласно некоторым вариантам реализации указанный пептидный линкер
может содержать по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90 или по меньшей мере 100 аминокислот. Согласно другим вариантам реализации указанный пептидный линкер может содержать по меньшей мере 200, по меньшей мере 300, по меньшей мере 400, по меньшей мере 500, по меньшей мере 600, по меньшей мере 700, по меньшей мере 800, по меньшей мере 900 или по меньшей мере 1000 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации указанный пептидный линкер может содержать по меньшей мере приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 аминокислот. Указанный пептидный линкер может содержать 1-5 аминокислот, 1-10 аминокислот, 1-20 аминокислот, 10-50 аминокислот, 50-100 аминокислот, 100-200 аминокислот, 200-300 аминокислот, 300-400 аминокислот, 400-500 аминокислот, 500-600 аминокислот, 600-700 аминокислот, 700-800 аминокислот, 800-900 аминокислот, или 900-1000 аминокислот.
[0309] Пептидные линкеры могут быть введены в последовательности
полипептидов с применением техник, известных в данной области техники. Модификации могут быть подтверждены путем анализа последовательностей ДНК. Плазмидная ДНК может применяться для трансформации клеток-хозяев для стабильного продуцирования получаемых полипептидов. Мономерно-димерные гибриды
[0310] Согласно некоторым вариантам реализации выделенные молекулы
нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, которые дополнительно содержат гетерологичную последовательность нуклеотидов, кодируют мономерно-димерную гибридную молекулу, содержащую FVIII.
[0311] Термин "мономерно-димерный гибрид" в настоящем документе относится к
химерному белку, содержащему первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, которые связаны друг с другом дисульфидной связью, при этом указанная первая цепь содержит фактор VIII и первую Fc-область, и вторая цепь содержит, состоит по существу или состоит из второй Fc-области без FVIII. Указанная мономерно-димерная гибридная конструкция, соответственно, представляет собой гибрид с мономерным компонентом, содержащим только фактор свертывания крови, и димерным компонентом, содержащим две Fc-области. Элемент контроля экспрессии
[0312] Согласно некоторым вариантам реализации молекула нуклеиновой кислоты
или вектор согласно настоящему изобретению дополнительно содержит по меньшей мере одну последовательность контроля экспрессии. Последовательности контроля экспрессии в настоящем документе представлены любыми регуляторными последовательностями нуклеотидов, такими как последовательность промотора или комбинация промотора с энхансером, которая облегчает эффективную транскрипцию и трансляцию кодирующей нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана. Например, выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может быть функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля транскрипции. Генная последовательность контроля экспрессии может представлять собой, например, промотор млекопитающих или вирусный промотор, такой как конститутивный или индуцируемый промотор. Конститутивные промоторы млекопитающих включают, не ограничиваясь перечисленными, промоторы следующих генов: гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (ГФРТ), аденозиндезаминазы, пируваткиназы, промотор бета-актина и другие конститутивные промоторы. Примеры вирусных промоторов, который конститутивно функционируют в эукариотических клетках, включают, например, промоторы цитомегаловируса (CMV), вируса обезьян (например, SV40), папилломавируса, аденовируса, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса саркомы Рауса, цитомегаловируса, длинные концевые повторы (LTR) вируса лейкоза Молони и
других ретровирусов, и тимидинкиназный промотор вируса простого герпеса. Специалистам в данной области техники известны и другие конститутивные промоторы. Промоторы, подходящие для применения в качестве генных экспрессионных последовательностей согласно настоящему изобретению также включают индуцируемые промоторы. Экспрессия индуцируемых промоторов происходит в присутствии индуцирующего агента. Например, индукция промотора металлотионеина, способствующая транскрипции и трансляции, происходит в присутствии определенных ионов металлов. Специалистам в данной области техники известны и другие индуцируемые промоторы.
[0313] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения
предусмотрена экспрессия трансгена под контролем тканеспецифического промотора
и/или энхансера. Согласно другому варианту реализации указанный промотор или другая
последовательность контроля экспрессии селективно усиливает экспрессию указанного
трансгена в клетках печени. Примеры специфических для печени промоторов включают,
не ограничиваясь перечисленными, промотор тиретина мыши (mTTR), промотор
эндогенного фактора VIII человека (F8), промотор альфа-1-антитрипсина человека (hAAT),
минимальный промотор альбумина человека и промотор альбумина мыши. Согласно
конкретному варианту реализации указанный промотор содержит промотор mTTR.
Промотор mTTR описан в источнике: R. Н. Costa et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:4697. Промотор
F8 описан в источнике: Figueiredo and Brownlee, 1995, J. Biol. Chem. 270:11828-11838.
[0314] Уровни экспрессии могут быть дополнительно повышены с применением
одного или более энхансеров для достижения терапевтической эффективности. Один или более энхансеров может быть использован либо отдельно, либо совместно с одним или более промоторными элементами. Как правило, последовательность контроля экспрессии содержит совокупность энхансерных элементов и тканеспецифический промотор. Согласно одному варианту реализации энхансер содержит одну или более копий энхансера а-1-микроглобулин/бикунина (Rouet et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:20765-20773; Rouetetal., 1995, Nucleic Acids Res. 23:395-404; Rouet etal., 1998, Biochem. J. 334:577-584; III et al., 1997, Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30). Согласно другому варианту реализации энхансер происходит из специфических для печени сайтов связывания транскрипционных факторов, таких как EBP, DBP, HNF1, HNF3, HNF4, HNF6, с Enh1, включающих HNF1, (смысловая последовательность)^ NF3, (смысловая nocneflOBaTenbHOCTb)-HNF4, (антисмысловая nocneflOBaTenbHOCTb)-HNF1, (антисмысловая nocneflOBaTenbHOCTb)-HNF6, (смысловая последовательность)-ЕВР, (антисмысловая nocneflOBaTenbHOCTb)-HNF4 (антисмысловая последовательность).
[0315] Согласно конкретному примеру промотор, подходящий для применения
согласно настоящему изобретению, содержит SEQ ID NO: 69 (т.е. промотор ЕТ; фиг. 11Y), который также известен под номером GenBank AY661265. См. также Vigna et al., Molecular
Therapy 11(5)763 (2005). Примеры других подходящих векторов и генных регуляторных
элементов приведены в WO 02/092134, ЕР1395293, или патентах США №6808905, 7745179
или 7179903, полностью включенных посредством ссылки в настоящий документ.
[0316] В общем случае последовательности контроля экспрессии должны
включать, по необходимости, нетранскрибируемые 5'- и нетранслируемые 5'-последовательности, задействованные в инициации транскрипции и трансляции, соответственно, такие как ТАТА-бокс, кэпирующая последовательность, последовательность СААТ и т.п. В частности, такие нетранскрибируемые 5'-последовательности включают промоторную область, которая включает последовательность промотора для контроля транскрипции функционально присоединенной кодирующей нуклеиновой кислоты. Генные экспрессионные последовательности необязательно включают энхансерные последовательностей или активаторные 5'-последовательности, если это необходимо. Векторные системы
[0317] Некоторые варианты реализации настоящего изобретения относятся к
векторам, содержащим одну или более кодон-оптимизированных молекул нуклеиновой
кислоты, кодирующих полипептид с активностью FVIII, описанный в настоящем документе,
клеткам-хозяевам, содержащим указанные векторы, и способам лечения расстройства
системы свертывания крови с применением указанных векторов. Настоящее изобретение
удовлетворяет важную потребность, существующую в данной области техники,
обеспечивая вектор, содержащий оптимизированную последовательность FVIII, которая
демонстрирует повышенную экспрессию у субъекта и потенциально обеспечивает
большую терапевтическую эффективность при применении в способах генной терапии.
[0318] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложен вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID
NO: 3 или (ii) нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 4; и при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII. Согласно другим вариантам реализации указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида FVIII, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII; при этом указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 5; (ii) нуклеотидов 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 6; (iii) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5; или (iv) нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6; и при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII.
[0319] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложен вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом
указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой
кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере
приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере
приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере
приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере
приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по
отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID
NO: 1 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 1; и
функционально связана с промотором, с целевой последовательностью, или с ними
обоими. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность
нуклеиновой кислоты содержит (i) нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 1
или (ii) нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 1.
[0320] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложен вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 2 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 2; и функционально связана с промотором, с целевой последовательностью, или с ними обоими. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит (i) нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 2 или (ii) нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 2.
[0321] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложен вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 70 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 70; и функционально связана с промотором, с целевой последовательностью, или с ними обоими. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит (i) нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 70 или (ii) нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 70.
[0322] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложен вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 71 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 71; и функционально связана с промотором, с целевой последовательностью, или с ними обоими. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты
содержит (i) нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 71 или (ii) нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 71.
[0323] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложен вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 3 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3; и функционально связана с промотором, с целевой последовательностью, или с ними обоими. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит (i) нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 3 или (ii) нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3.
[0324] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложен вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом
указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой
кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере
приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере
приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере
приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере
приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по
отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID
NO: 4 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 4; и
функционально связана с промотором, с целевой последовательностью, или с ними
обоими. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность
нуклеиновой кислоты содержит (i) нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 4
или (ii) нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 4.
[0325] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложен вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере
приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере
приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере
приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере
приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по
отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID
NO: 5 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5; и
функционально связана с промотором, с целевой последовательностью, или с ними
обоими. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность
нуклеиновой кислоты содержит (i) нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 5
или (ii) нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5.
[0326] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения
предложен вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую
последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, при этом
указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой
кислоты, обладающую по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере
приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере
приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере
приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере
приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере
приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью по
отношению к последовательностям (i) нуклеотидов 58-4374 последовательности SEQ ID
NO: 6 или (ii) нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6; и
функционально связана с промотором, с целевой последовательностью, или с ними
обоими. Согласно другим вариантам реализации указанная последовательность
нуклеиновой кислоты содержит (i) нуклеотиды 58-4374 последовательности SEQ ID NO: 6
или (ii) нуклеотиды 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6.
[0327] Подходящие векторы согласно настоящему изобретению включают
экспрессионные векторы, вирусные векторы и плазмидные векторы. Согласно одному
варианту реализации указанный вектор представляет собой вирусный вектор.
[0328] В настоящем документе экспрессионный вектор относится к любой
конструкции нуклеиновой кислоты, которая содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции инсертированной кодирующей последовательности, или, в случае вирусного РНК-вектора, необходимые элементы для репликации и трансляции при введении в подходящую клетку-хозяина. Экспрессионные векторы могут включать плазмиды, фагмиды, вирусы и их производные.
[0329] Экспрессионные векторы согласно настоящему изобретению включают
оптимизированные полинуклеотиды, кодирующие белок BDD FVIII, описанный в настоящем документе. Согласно одному варианту реализации оптимизированные
кодирующие последовательности белка BDD FVIII функционально связаны с последовательностью контроля экспрессии. В настоящем документе две последовательности нуклеиновых кислот функционально связаны, если они ковалентно связаны способом, позволяющим каждому компоненту - последовательности нуклеиновой кислоты сохранять функциональность. Кодирующую последовательность и генную последовательность контроля экспрессии называют функционально связанными, если они ковалентно связаны способом, позволяющим поместить экспрессию или транскрипцию, и/или трансляцию кодирующей последовательности под влияние или контроль указанной генной последовательности контроля экспрессии. Две последовательности ДНК называют функционально связанными, если индукция промотора в расположенной в 5'-направлении генной экспрессионной последовательности приводит к транскрипции указанной кодирующей последовательности, и если природа связи между указанными двумя последовательностями ДНК (1) не приводит к введению мутации со сдвигом рамки, (2) не влияет на способность промоторной области направлять транскрипцию кодирующей последовательности, или (3) не влияет на способность соответствующего РНК-транскрипта к трансляции в белок. Соответственно, генная экспрессионная последовательность функционально связана с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если указанная генная экспрессионная последовательность способна осуществлять транскрипцию указанной кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты таким образом, что итоговый транскрипт транслируется в требуемый белок или полипептид.
[0330] Вирусные векторы включают, не ограничиваясь перечисленными,
последовательности нуклеиновых кислот из следующих вирусов: ретровируса, такого как вирус лейкоза мышей Молони, вирус саркомы мышей Харви, вирус опухоли молочной железы мышей и вирус саркомы Рауса; лентивируса; аденовируса; аденоассоциированного вируса; вирусов SV40-Tnna; полиомавирусов; вирусов Эпштейна-Барр; папилломавирусов; вируса герпеса; вируса осповакцины; полиовируса; и РНК-вируса, такого как ретровирус. Могут быть легко использованы другие векторы, хорошо известные в данной области техники. Определенные вирусные векторы основаны на нецитопатических эукариотических вирусах, в которых несущественные гены были заменены геном, представляющим интерес. Нецитопатические вирусы включают ретровирусы, жизненный цикл которых включает обратную транскрипцию геномной вирусной РНК в ДНК с последующей интеграцией провируса в ДНК клетки-хозяина. Ретровирусы были одобрены для испытаний генной терапии у человека. Большинство подходящих ретровирусов представлены дефектными по репликации вирусами (т.е. способными направлять синтез требуемых белков, однако неспособными производить инфекционную частицу). Такие генетически измененные ретровирусные экспрессионные векторы в целом полезны для высокоэффективной трансдукции генов in vivo. Стандартные
протоколы для получения дефектных по репликации ретровирусов (в том числе этапы
включения экзогенного генетического материала в плазмиду, трансфекции пакующей
линии клеток плазмидой, продуцирования рекомбинантных ретровирусов пакующей
линией клеток, сбора вирусных частиц из тканевой культуральной среды и инфекции
целевых клеток вирусными частицами) представлены в источнике: Kriegler, М., Gene
Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990); и Murry,
E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).
[0331] Согласно одному варианту реализации указанный вирус представляет собой
аденоассоциированный вирус, двунитевой ДНК-вирус. Может быть сконструирован дефектный по репликации аденоассоциированный вирус, способный инфицировать широкий диапазон типов клеток и видов. Он также обладает такими преимуществами, как стабильность при нагревании и воздействии жидких растворителей; высокая частота трансдукции в разнообразных линий, в том числе в гематопоэтических клетках; и отсутствие ингибирования суперинфекции, что, соответственно, позволяет проводить нескольких серий трансдукции. Сообщалось, что аденоассоциированный вирус может быть интегрирован в клеточную ДНК человека сайт-специфическим образом, с минимизацией таким образом вероятности инсерционного мутагенеза и вариабельности экспрессии инсертированного гена, характерных для ретровирусной инфекции. Кроме того, мониторинг инфекций аденоассоциированным вирусом дикого типа в тканевой культуре на протяжении более чем 100 пассажей в отсутствие селективного давления отбора показал, что геномная интеграция аденоассоциированного вируса представляет собой относительно стабильное явление. Аденоассоциированный вирус может также функционировать экстрахромосомно.
[0332] Согласно другому варианту реализации указанный вирусный вектор
представляет собой аденоассоциированный вирус (ААВ), после произведенных манипуляций несущий полинуклеотид, кодирующий белок FVIII согласно описанию в настоящем документе. Были описаны общие способы получения рекомбинантных ААВ (рААВ). См., например, патент США 8734809, 2013/0195801, а также цитируемые в нем источники. Согласно некоторым вариантам реализации вектор рААВ содержит один или более инвертированных концевых повторов (ITR) ААВ и представляющий интерес трансген (например, оптимизированную последовательность полинуклеотидов FVIII). Согласно некоторым вариантам реализации способы получения рААВ включают культивирование требуемой клетки-хозяина, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую капсидный белок ААВ или его фрагмент; функциональный ген rep; вектор рААВ, состоящий из инвертированных концевых повторов (ITR) ААВ и представляющего интерес трансгена; и обладает достаточными хелперными функциями для обеспечения упаковки рекомбинантного ААВ-вектора в капсидные белки ААВ. Материалы и способы для осуществления указанных и связанных с ними процедур были описаны, например, в
патенте США 8734809, 2013/0195801, PCT/US1997/015692, PCT/US2002/033692,
PCT/US2002/033630, WO2007/148971, WO00/20561, WO03/042361 и WO2007/04670.
[0333] Одна или более разных последовательностей ААВ-вектора, происходящие
практически из любого серотипа могут применяться в соответствии с настоящим
изобретением. Выбор конкретной последовательности ААВ-вектора определяется
известными показателями, такими как представляющий интерес тропизм, требуемый
выход вектора и т.п. Обычно серотипы ААВ имеют геномные последовательности со
значимой гомологией на уровне аминокислот и нуклеиновых кислот, что обеспечивает
набор родственных генетических функций, продуцирование родственных вирионов, а
также аналогичные репликацию и сборку. Геномная последовательность различных
серотипов ААВ и общий обзор геномного сходства приведены, например, в источниках:
номер доступа GenBank U89790; номер доступа GenBank J01901; номер доступа GenBank
AF043303; номер доступа GenBank AF085716; Chlorini et al. (1997, J. Vir. 71: 6823-33);
Srivastava et al. (1983, J. Vir. 45:555-64); Chlorini et al. (1999, J. Vir. 73:1309-1319); Rutledge
et al. (1998, J. Vir. 72:309-319); и Wu et al. (2000, J. Vir. 74: 8635-47). Серотипы ААВ 1, 2, 3, 4
и 5 представляют собой иллюстративный источник последовательностей нуклеотидов ААВ
для применения в контексте настоящего изобретения. ААВ6, ААВ7, ААВ8 или ААВ9 или
недавно разработанные ААВ-подобные частицы, полученные с применением, например,
техник перестановки генов капсида и библиотек ААВ-капсидов, или полученные из недавно
сконструированных, разработанных или выделенных ITR, также подходят для
определенных вариантов применения настоящего изобретения. См. Dalkara, D et al. (2013),
Sci. Transl. Med. 5(189): 189ra76; Kotterman, MA Nat. Rev. Genet. (2014) 15(7):455.
[0334] При этом согласно определенным вариантам реализации интерес
представляют ААВ-векторы со значимым тропизмом в отношении печени и родственных тканей для экспрессии белков FVIII согласно описанию в настоящем документе. Неограничивающие примеры включают серотипы ААВ 1, 2, 6 и 8. См., например, Torres-Torranteras et al. (2014) 22: 901 и цитируемые в нем источники.
[0335] Согласно другим вариантам реализации указанный вектор происходит из
лентивируса. Согласно некоторым вариантам реализации указанный вектор представляет собой вектор из рекомбинантного лентивируса, способного инфицировать неделящиеся клетки.
[0336] Лентивирусный геном и провирусная ДНК как правило, содержат три гена,
обнаруживаемых в ретровирусах: gag, pol и env, которые фланкированы двумя последовательностями длинных концевых повторов (LTR). Ген gag кодирует внутренние структурные (матриксные, капсидные и нуклеокапсидные) белки; ген pol кодирует РНК-направляемую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу), протеазу и интегразу; и ген env кодирует гликопротеины вирусной оболочки. 5'- и З'-LTR' способствуют транскрипции и полиаденилированию РНК вириона. LTR содержит все остальные цис-действующие
последовательности, необходимые для вирусной репликации. Лентивирусы содержат
дополнительные гены, в том числе vif, vpr, tat, rev, vpu, nef и vpx (в HIV-I, HIV-2 и/или SIV).
[0337] Рядом с 5'-LTR расположены последовательности, необходимые для
обратной транскрипции генома (сайт связывания праймера тРНК) и эффективного капсидирования вирусной РНК в частицы (Psi-сайт). Если последовательности, необходимые для капсидирования (или упаковки ретровирусной РНК в инфекционные вирионы), отсутствуют в вирусном геноме, цис-дефект предотвращает капсидирование геномной РНК.
[0338] Однако итоговый мутант сохраняет способность направлять синтез всех
белков вириона. Согласно настоящему изобретению предложен способ получения рекомбинантного лентивируса, способного инфицировать неделящуюся клетку, включающий трансфекцию подходящей клетки-хозяина двумя или более векторами, выполняющими пакующие функции, а именно, gag, pol и env, а также rev и tat. Согласно описанию ниже в настоящем документе для определенных вариантов применения благоприятными являются векторы без функционального гена tat. Соответственно, например, первый вектор может обеспечивать нуклеиновую кислоту, кодирующую вирусный ген gag и вирусный ген pol, а другой вектор может обеспечивать нуклеиновую кислоту, кодирующую вирусный ген env для получения пакующей клетки. Введение вектора, обеспечивающего гетерологичный ген, в настоящем документе идентифицированного как вектор для переноса, в указанную пакующую клетку дает клетку-продуцент, которая высвобождает инфекционные вирусные частицы, несущие представляющий интерес чужеродный ген.
[0339] В соответствии с описанной выше конфигурацией векторов и чужеродных
генов, второй вектор может обеспечивать нуклеиновую кислоту, кодирующую ген вирусной оболочки (env). Ген env может происходить практически из любого подходящего вируса, в том числе из ретровирусов. Согласно некоторым вариантам реализации белок env представляет собой амфотропный белок оболочки, который обеспечивает трансдукцию клеток человека и других видов.
[0340] Примеры генов env ретровирусного происхождения включают, не
ограничиваясь перечисленными: вирус лейкоза мышей Молони (MoMuLV, или MMLV), вирус саркомы мышей Харви (HaMuSV, или HSV), вирус опухоли молочной железы мышей (MuMTV, или MMTV), вирус лейкоза гиббонов (GaLV, или GALV), вирус иммунодефицита человека (HIV) и вирус саркомы Рауса (RSV). Также могут применяться другие гены env, такие как VSV G - белок G вируса везикулярного стоматита (VSV), гены env вирусов гепатита и гриппа.
[0341] Вектор, обеспечивающий последовательность нуклеиновой кислоты
вирусного env, функционально связан с регуляторными последовательностями, описанными в различных разделах настоящего документа.
[0342] Согласно некоторым вариантам реализации указанный вектор включает
лентивирусный вектор, в котором гены ВИЧ-вирулентности env, vif, vpr, vpu и nef были делетированы без нарушения способности указанного вектора к трансдукции неделящихся клеток.
[0343] Согласно некоторым вариантам реализации указанный вектор включает
лентивирусный вектор, который содержит делецию области U3 повтора З'-LTR. Делеция
области U3 может представлять собой полную делецию или частичную делецию.
[0344] Согласно некоторым вариантам реализации лентивирусным вектором
согласно настоящему изобретению, содержащим последовательность нуклеотидов FVIII, описанную в настоящем документе, может быть трансфицирована клетка с (а) первой последовательностью нуклеотидов, содержащей гены gag, pol, или gag и pol; и (b) второй последовательностью нуклеотидов, содержащей гетерологичный ген env; при этом в указанном лентивирусном векторе отсутствует функциональный ген tat. Согласно другим вариантам реализации указанная клетка дополнительно трансфицирована четвертой последовательностью нуклеотидов, содержащей ген rev. Согласно некоторым вариантам реализации в указанном лентивирусном векторе отсутствуют функциональные гены, выбранные из vif, vpr, vpu, vpx и nef, или их комбинации.
[0345] Согласно некоторым вариантам реализации лентивирусный вектор содержит
одну или более последовательностей нуклеотидов, кодирующих белок gag, элемент ответа
Rev, центральный полипуриновый тракт (сРРТ) или любую их комбинацию.
[0346] Примеры лентивирусных векторов описаны в W09931251, W09712622,
W09817815, W09817816 и W09818934, которые включены в настоящий документ полностью посредством ссылки.
[0347] Другие векторы включают плазмидные векторы. Плазмидные векторы были
подробно описаны в данной области техники и хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. За последние несколько лет было обнаружено, что плазмидные векторы являются благоприятными, в частности, для доставки генов в клетки in vivo за счет их неспособности к репликации в геноме и интеграции в геном хозяина. Указанные плазмиды, однако, содержат промотор, совместимый с клеткой-хозяином, могут экспрессировать пептид с гена, функционально закодированного в пределах указанной плазмиды. Некоторые часто используемые плазмиды, доступные у коммерческих поставщиков, включают pBR322, pUC18, pUC19, различные плазмиды pcDNA, pRC/CMV, различные плазмиды pCMV, pSV40 и pBlueScript. Дополнительные примеры специфических плазмид включают pcDNA3.1, кат.№ V79020; pcDNA3.1/Hygro, кат.№ V87020; pcDNA4/myc-His, кат.№ V86320; и pBudCE4.1, кат.№ V53220, все от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния). Специалистам в данной области техники хорошо известны и другие плазмиды. Кроме того, плазмиды могут быть
индивидуализированы с применением стандартных техник молекулярной биологии для удаления и/или добавления специфических фрагментов ДНК. Тканеспецифическая экспрессия
[0348] Согласно некоторым вариантам реализации полезно включение в состав
вектора одной или более целевых последовательностей микроРНК, которые, например,
функционально связаны с оптимизированным трансгеном FVIII. Соответственно, согласно
настоящему изобретению также предложена по меньшей мере одна целевая
последовательность микроРНК, функционально связанная с оптимизированной
последовательностью нуклеотидов FVIII или иным образом инсертированная в вектор.
Более чем одна копия целевой последовательности микроРНК, включенная в вектор,
может увеличивать эффективность системы. Также предусмотрены другие целевые
последовательности микроРНК. Например, в векторах, которые экспрессируют более чем
один трансген, указанные трансгены могут находиться под контролем более чем одной
целевой последовательности микроРНК, при этом указанные последовательности
микроРНК могут быть одинаковыми или разными. Целевые последовательности микроРНК
могут быть расположены тандемно, однако предусмотрены и другие варианты
расположения. Трансгенная экспрессионная кассета, содержащая целевые
последовательности микроРНК, может также быть инсертирована в вектор в
антисмысловой ориентации. Антисмысловая ориентация может быть полезной при
получении вирусных частиц, чтобы избежать экспрессии генных продуктов, которые могут
в ином случае быть токсичными для клеток-продуцентов. Согласно другим вариантам
реализации указанный вектор содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 копий той же или другой
целевой последовательности микроРНК. Однако согласно некоторым другим вариантам
реализации указанный вектор не включает каких-либо целевых последовательностей
микроРНК. Выбор того, включать или не включать целевую последовательность микроРНК
(и какое количество включать), осуществляют на основании известных показателей, таких
как предполагаемая целевая ткань, требуемый уровень экспрессии и т.п.
[0349] Согласно одному варианту реализации целевая последовательность
представляет собой целевую miR-223, которая, как было описано, наиболее эффективно блокирует экспрессию в коммитированных миелоидных клетках-предшественниках и по меньшей мере частично в более примитивных ГСК. Целевая miR-223 может блокировать экспрессию в дифференцировавших миелоидных клетках, в том числе гранулоцитах, моноцитах, макрофагах, миелоидных дендритных клетках. Целевая miR-223 может также подходить для применения в генной терапии, основанной на устойчивой трансгенной экспрессии в лимфоидной или эритроидной линии. Целевая miR-223 может также очень эффективно блокировать экспрессию в ГСК человека.
[0350] Согласно другому варианту реализации указанная целевая
последовательность представляет собой целевую miR142 (tccataaagt aggaaacact аса (SEQ
ID NO: 43)). Согласно одному варианту реализации указанный вектор содержит 4 копии
целевых последовательностей miR-142. Согласно некоторым вариантам реализации
комплементарная последовательность специфических для гематопоэтических клеток
микроРНК, таких как miR-142 (142Т), включена в нетранслируемую З'-область вектора,
например, лентивирусных векторов (LV), что делает кодирующий трансген транскрипт
восприимчивым к опосредованной микроРНК понижающей регуляции. Применение
указанного способа позволяет предотвратить трансгенную экспрессию в
антигенпрезентирующих клетках (АПК) гематопоэтических линий, при ее сохранении в
негематопоэтических клетках (Brown et al., Nat Med 2006). Указанная стратегия может
обеспечивать строгий посттранскрипционный контроль трансгенной экспрессии и,
соответственно, позволяет обеспечить стабильную доставку и долгосрочную экспрессию
трансгенов. Согласно некоторым вариантам реализации регуляция miR-142
предотвращает иммуно-опосредованное выведение трансдуцированных клеток и/или
индуцирует антиген-специфические регуляторные Т-клетки (T-reg) и опосредует
устойчивую иммунологическую толерантность к кодируемому трансгеном антигену.
[0351] Согласно некоторым вариантам реализации целевая последовательность
представляет собой мишень miR-181. В источнике Chen C-Z and Lodish Н, Seminars in Immunology (2005) 17(2):155-165 описана miR-181, микроРНК, специфически экспрессируемая в В-клетках костного мозга мышь (Chen and Lodish, 2005), а также указано, что некоторые микроРНК человека связаны с лейкозами.
[0352] Целевая последовательность может быть полностью или частично
комплементарна микроРНК. Термин "полностью комплементарная" означает, что целевая последовательность содержит последовательность нуклеиновой кислоты, на 100% комплементарную последовательности микроРНК, которая ее распознает. Термин "частично комплементарная" означает, что целевая последовательность только отчасти комплементарна последовательности микроРНК, которая ее распознает, при этом указанная частично комплементарная последовательность все еще распознается указанной микроРНК. Другими словами, частично комплементарная целевая последовательность в контексте настоящего изобретения эффективно распознает соответствующую микроРНК и обеспечивает предотвращение или снижение трансгенной экспрессии в клетках, экспрессирующих указанную микроРНК. Примеры целевых последовательностей микроРНК описаны в WO2007/000668, WO2004/094642, WO2010/055413 или WO2010/125471, которые включены в настоящий документ полностью посредством ссылки. Клетки-хозяева
[0353] Согласно настоящему изобретению также предложена клетка-хозяин,
содержащая молекулу нуклеиновой кислоты или вектор согласно настоящему изобретению. В настоящем документе термин "трансформация" используется в широком
смысле и относится к введению ДНК в реципиентную клетку-хозяина, что изменяет генотип и, соответственно, приводит к изменению реципиентной клетки.
[0354] "Клетки-хозяева" относится к клеткам, которые были трансформированы
векторами, сконструированными с применением техник рекомбинантной ДНК и кодирующие по меньшей мере один гетерологичный ген. Клетки-хозяева согласно настоящему изобретению предпочтительно происходят от млекопитающих; наиболее предпочтительно, происходят из организма человека или мыши. Специалисты в данной области техники могут определить предпочтительные конкретные линии клеток-хозяев, которые наилучшим образом подходят для заданных целей. Примеры линий клеток-хозяев включают, не ограничиваясь перечисленными, СНО, DG44 и DUXB11 (линии клеток яичника китайского хомячка, лишенные ДГФР), HELA (карцинома шейки матки человека), CVI (линия клеток почки обезьяны), COS (производная линия CVI с Т-антигеном SV40), R1610 (фибробласты китайского хомячка), BALBC/3T3 (фибробласты мыши), НАК (линия клеток почки хомяка), SP2/0 (миелома мыши), Р3-Х63-Ад3.653 (миелома мыши), BFA-1с1ВРТ (бычьи эндотелиальные клетки), RAJI (лимфоциты человека), PER.C6(r), NS0, САР, ВНК21 и НЕК 293 (почка человека). Согласно одному конкретному варианту реализации указанная клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из: клетки СНО, клетки НЕК293, клетки ВНК21, клетки PER.C6(r), клетки NS0 и клетки САР. Линии клеток-хозяев, как правило, доступны в коммерческих организациях, в Американской коллекции тканевых культур тканей или описаны в опубликованных источниках.
[0355] Введение выделенных молекул нуклеиновой кислоты или векторов согласно
настоящему изобретению в клетку-хозяина может осуществляться с применением
различных техник, хорошо известных специалистам в данной области техники. Указанные
техники включают, не ограничиваясь перечисленными, трансфекцию (в том числе
электрофорез и электропорацию), слияние протопластов, осаждение фосфатом кальция,
слияние клеток с покрытой оболочкой ДНК, микроинъекцию и инфекцию интактным
вирусом. См. источник: Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp.
470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). Наиболее
предпочтительным является введение плазмиды в клетку-хозяина посредством
электропорации. Трансформированные клетки культивируют в условиях, подходящих для
получения легких цепей и тяжелых цепей, и анализируют синтез белка тяжелой и/или
легкой цепей. Примеры техник анализа включают твердофазный иммуноферментный
анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (РИА) или анализ с сортировкой клеток с
активированной флуоресценцией (FACS), иммуногистохимическое исследование и т.п.
[0356] Клетки-хозяева, содержащие выделенные молекулы нуклеиновой кислоты
или векторы согласно настоящему изобретению, культивируют в подходящей ростовой среде. В настоящем документе термин "подходящая ростовая среда" означает среду, содержащую питательные вещества, необходимый для роста клеток. Питательные
вещества, необходимые для клеточного роста, могут включать источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины, минеральные вещества и факторы роста. Необязательно, указанные среды могут содержать один или более факторов для выбора. Необязательно, указанные среды могут содержать телячью сыворотку или фетальную бычью сыворотку (ФБС). Согласно одному варианту реализации указанные среды по существу не содержат IgG. Ростовая среда обычно является селективной для клеток, содержащих конструкцию ДНК, за счет, например, отбора по чувствительности к лекарственному средству или дефициту имеющего существенное значение питательного вещества, который восполняется селектируемым маркером, расположенным на конструкции ДНК или котрансфицированным вместе с указанной конструкцией ДНК. Культивируемые клетки млекопитающих обычно выращивают на коммерчески доступных содержащих или не содержащих сыворотку средах (например, MEM, DMEM, DMEM/F12). Согласно одному варианту реализации указанная среда представляет собой CDoptiCHO (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Согласно другому варианту реализации указанная среда представляет собой CD17 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Выбор среды, подходящей для конкретной используемой линии клеток, находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники. Получение полипептидов
[0357] Согласно настоящему изобретению также предложен полипептид,
кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Согласно другим вариантам реализации указанный полипептид согласно настоящему изобретению кодирует вектор, содержащий выделенные молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Согласно другим дополнительным вариантам реализации полипептид согласно настоящему изобретению продуцирует клетка-хозяин, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
[0358] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения также
предложен способ получения полипептида с активностью FVIII, включающий культивирование клетки-хозяина согласно настоящему изобретению в условиях, обеспечивающих продуцирование полипептида с активностью FVIII, и выделение указанного полипептида с активностью FVIII. Согласно некоторым вариантам реализации экспрессия полипептида с активностью FVIII увеличивается относительно экспрессии в клетке-хозяине, культивируемой в таких же условиях, но содержащей референсную последовательность нуклеотидов, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16, исходную генную последовательность FVIII.
[0359] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен
способ увеличения экспрессии полипептида с активностью FVIII, включающий культивирование клетки-хозяина согласно настоящему изобретению в условиях, при
которых происходит экспрессия полипептида с активностью FVIII молекулой нуклеиновой кислоты, при этом экспрессия указанного полипептида с активностью FVIII увеличивается относительно экспрессии в клетке-хозяине, культивируемой в таких же условиях, но содержащей референсную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16.
[0360] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен
способ улучшения выхода полипептида с активностью FVIII, включающий культивирование клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих продуцирование полипептида с активностью FVIII молекулой нуклеиновой кислоты, при этом выход полипептида с активностью FVIII увеличивается по сравнению с экспрессией в клетке-хозяине, культивируемой в тех же условиях, содержащей референсную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16.
[0361] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен
способ улучшения выхода полипептида с активностью FVIII, культивирование клетки-хозяина, содержащей последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид, отличающийся тем, что индекс адаптации кодонов З'-части указанной последовательности нуклеотидов увеличивается относительно 5'-части указанной последовательности нуклеотидов; при этом выход указанного полипептида с активностью FVIII увеличивается по сравнению с экспрессией в клетке-хозяине, культивируемой в тех же условиях, содержащей референсную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам реализации индекс адаптации кодонов 5'-части указанной последовательности нуклеотидов увеличивается, уменьшается или остается неизменным относительно индекса оптимизации кодонов последовательности SEQ ID NO: 16.
[0362] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен
способ улучшения выхода полипептида с активностью FVIII, культивирование клетки-хозяина, содержащей последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид, отличающийся тем, что индекс адаптации кодонов 5'-части указанной последовательности нуклеотидов увеличивается относительно З'-части указанной последовательности нуклеотидов; при этом выход полипептида с активностью FVIII увеличивается по сравнению с экспрессией в клетке-хозяине, культивируемой в тех же условиях, содержащей референсную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам реализации индекс адаптации кодонов З'-части указанной последовательности нуклеотидов увеличивается, уменьшается или остается неизменным относительно индекса оптимизации кодонов последовательности SEQ ID NO: 16.
[0363] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен
способ улучшения выхода полипептида с активностью FVIII, культивирование клетки
хозяина, содержащей последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид, отличающийся тем, что индекс адаптации кодонов части указанного нуклеотида, кодирующей С-концевую часть указанного полипептида, увеличивается относительно части указанного нуклеотида, кодирующей N-концевую часть указанного полипептида; при этом выход полипептида с активностью FVIII увеличивается по сравнению с экспрессией в клетке-хозяине, культивируемой в тех же условиях, содержащей референсную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам реализации индекс адаптации кодонов части указанного нуклеотида, кодирующей N-концевую часть указанного полипептида, увеличивается, уменьшается или остается неизменным относительно индекса оптимизации кодонов последовательности SEQ ID NO: 16.
[0364] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен
способ улучшения выхода полипептида с активностью FVIII, культивирование клетки-хозяина, содержащей последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид, отличающийся тем, что индекс адаптации кодонов части указанного нуклеотида, кодирующей N-концевую часть указанного полипептида, увеличивается относительно части указанного нуклеотида, кодирующей С-концевую часть указанного полипептида; при этом выход полипептида с активностью FVIII увеличивается по сравнению с экспрессией в клетке-хозяине, культивируемой в тех же условиях, содержащей референсную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам реализации индекс адаптации кодонов части указанного нуклеотида, кодирующей С-концевая часть указанного полипептида, увеличивается, уменьшается или остается неизменным относительно индекса оптимизации кодонов последовательности SEQ ID NO: 16.
[0365] Согласно определенным вариантам реализации улучшения выхода
полипептида с активностью FVIII 5'-часть указанной последовательности нуклеотидов, при надлежащем выравнивании, приблизительно соответствует нуклеотидам 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 1, нуклеотидам 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 1 или их фрагментам. Согласно другим вариантам реализации полипептид, кодируемый 5'-частью указанного нуклеотида, при надлежащем выравнивании, приблизительно соответствует аминокислотам 1-497 последовательности SEQ ID NO: 17, аминокислотам 20-497 последовательности SEQ ID NO: 17 или их фрагменту. Согласно некоторым вариантам реализации часть указанной последовательности нуклеотидов, кодирующей N-концевую часть полипептида, при надлежащем выравнивании, приблизительно соответствует нуклеотидам 1-1791 последовательности SEQ ID NO: 1, нуклеотидам 581791 последовательности SEQ ID NO: 1 или их фрагменту. Согласно некоторым вариантам реализации З'-часть указанной последовательности нуклеотидов, при надлежащем выравнивании, приблизительно соответствует нуклеотидам 1792-4374
последовательности SEQ ID NO: 1 или их фрагменту. Согласно другим вариантам реализации полипептид, кодируемый З'-частью указанного нуклеотида, при надлежащем выравнивании, приблизительно соответствует аминокислотам 498-1458 последовательности SEQ ID NO: 17 или их фрагменту. Согласно некоторым вариантам реализации часть указанной последовательности нуклеотидов, кодирующая С-концевую часть указанного полипептида, при надлежащем выравнивании, приблизительно соответствует нуклеотидам 1792-4374 последовательности SEQ ID NO: 1 или их фрагменту
[0366] Согласно некоторым вариантам реализации экспрессия полипептида FVIII
увеличивается по меньшей мере приблизительно 1,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 2-кратно, по меньшей мере приблизительно 3-кратно, по меньшей мере приблизительно 4-кратно, по меньшей мере приблизительно 5-кратно, по меньшей мере приблизительно 6-кратно, по меньшей мере приблизительно 7-кратно, по меньшей мере приблизительно 8-кратно, по меньшей мере приблизительно 9-кратно, по меньшей мере приблизительно 10-кратно, по меньшей мере приблизительно 11-кратно, по меньшей мере приблизительно 12-кратно, по меньшей мере приблизительно 13-кратно, по меньшей мере приблизительно 14-кратно, по меньшей мере приблизительно 15-кратно, по меньшей мере приблизительно 20-кратно, по меньшей мере приблизительно 25-кратно, по меньшей мере приблизительно 30-кратно, по меньшей мере приблизительно 35-кратно, по меньшей мере приблизительно 40-кратно, по меньшей мере приблизительно 50-кратно, по меньшей мере приблизительно 60-кратно, по меньшей мере приблизительно 70-кратно, по меньшей мере приблизительно 80-кратно, по меньшей мере приблизительно 90-кратно, по меньшей мере приблизительно 100-кратно, по меньшей мере приблизительно 150-кратно или по меньшей мере приблизительно 200-кратно по сравнению с экспрессией в клетке-хозяине, культивируемой в тех же условиях, содержащей референсную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16.
[0367] Различные способы доступны для рекомбинантного получения белка FVIII из
оптимизированной молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Полинуклеотид с требуемой последовательностью может быть получен путем твердофазного синтеза ДНК de novo или путем ПЦР-мутагенеза ранее подготовленного полинуклеотида. Одним из способов получения замены, инсерции, делеций или изменения (например, изменения кодона) в последовательности нуклеотидов является опосредованный олигонуклеотидами мутагенез. Например, стартовую ДНК изменяют путем гибридизации олигонуклеотида, кодирующего требуемую мутацию, с одноцепочечной ДНК-матрицей. После гибридизации применяют ДНК-полимеразу для синтеза полной второй комплементарной нити матрицы, которая включает олигонуклеотидный праймер. Согласно одному варианту реализации достаточно применения генетического конструирования, например, ПЦР-мутагенеза на основе
праймеров, для включения изменения согласно определению в настоящем документе, с получением полинуклеотида согласно настоящему описанию.
[0368] Для получения рекомбинантного белка оптимизированную
последовательность полинуклеотидов согласно настоящему изобретению, кодирующую белок FVIII, инсертируют в подходящую экспрессионную основу, т.е. в вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции инсертированной кодирующей последовательности, или, в случае вирусного РНК-вектора, необходимые элементы для репликации и трансляции.
[0369] Последовательность полинуклеотидов согласно настоящему изобретению
инсертируют в вектор в надлежащей рамке считывания. Указанным экспрессионным вектором затем трансфицируют подходящую целевую клетку, которая будет экспрессировать указанный полипептид. Техники трансфекции, известные в данной области техники, включают, не ограничиваясь перечисленными, осаждение фосфатом кальция (Wigler et al. 1978, Cell 14 : 725) и электропорацию (Neumann et al. 1982, EMBO, J. 1 : 841). Различные системы хозяев/ экспрессионных векторов могут быть использованы для экспрессии белков FVIII, описанных в настоящем документе, в эукариотических клетках. Согласно одному варианту реализации указанная эукариотическая клетка представляет собой клетку животного, в том числе клетки млекопитающих (например, клетки НЕК293, PER.C6(r), СНО, ВНК, Cos, HeLa). Последовательность полинуклеотидов согласно настоящему изобретению может также кодировать сигнальную последовательность, которая обеспечивает секрецию белка FVIII. Специалисту в данной области техники будет понятно, что при трансляции белка FVIII сигнальная последовательность отщепляется клеткой с образованием зрелого белка. Различные сигнальные последовательности известны в данной области техники, например, сигнальная последовательность природного фактора VII, сигнальная последовательность природного фактора IX и сигнальная последовательность легкой цепи IgK мыши. Как вариант, если сигнальная последовательность не включена, белок FVIII может быть выделен путем лизиса клеток.
[0370] Белок FVIII согласно настоящему изобретению может быть синтезирован у
трансгенного животного, такого как грызун, коза, овца, свинья или корова. Термин "трансгенные животные" относится к не являющимся человеком животным, включившим чужеродный ген в геном. Поскольку указанный ген присутствует в тканях зародышевой линии, он переходит от родителей к потомству. Экзогенные гены вводят в одноклеточные эмбрионы (Brinster et al. 1985, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82:4438). В данной области техники известны способы получения трансгенных животных, в том числе трансгенных животных, которые продуцируют молекулы иммуноглобулина (Wagner et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight et al. 1983, Cell 34 : 335; Brinster et al. 1983, Nature 306: 332; Ritchie
et al. 1984, Nature 312: 517; Baldassarre et al. 2003, Theriogenology 59: 831; Robl et al. 2003,
Theriogenology 59: 107; Malassagne et al. 2003, Xenotransplantation 10 (3): 267).
[0371] Экспрессионные векторы могут кодировать метки, обеспечивающие
простоту очищения или идентификации полученного рекомбинантным способом белка. Примеры включают, не ограничиваясь перечисленными, вектор pUR278 (Ruther et al. 1983, EMBO J. 2: 1791), в котором кодирующая белок FVIII согласно настоящему описанию последовательность может быть лигирована в рамку с кодирующей lac-Z областью, так что продуцируется гибридный белок; векторы pGEX могут применяться для экспрессии белков с глутатион-Б-трансферазной (GST) меткой. Указанные белки обычно растворимы и могут легко быть очищены из клеток путем адсорбции на глутатион-агарозных гранулах с последующей элюцией в присутствии свободного глутатиона. Указанные векторы включают сайты расщепления (например, PreCission Protease (Pharmacia, Пипак, Нью-Джерси)) для простоты удаления метки после очищения.
[0372] Для целей настоящего изобретения могут применяться многочисленные
экспрессионные векторные системы. Указанные экспрессионные векторы, как правило, способны к репликации в организмах-хозяевах либо в виде эписом, либо в виде интегральной части хромосомной ДНК хозяина. Экспрессионные векторы могут включать последовательности контроля экспрессии, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, промоторы (например, ассоциированные с ними в естественных условиях или гетерологичные промоторы), энхансеры, сигнальные последовательности, сигналы сплайсинга, энхансерные элементы и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительно, последовательности контроля экспрессии представляют собой эукариотические промоторные системы в векторах, способных к трансформации или трансфекции эукариотических клеток-хозяев. Экспрессионные векторы могут также задействовать элементы ДНК, которые происходят из вирусов животных, таких как вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус полиомы, аденовирус, вирус осповакцины, бакуловирус, ретровирусы (RSV, MMTV или MOMLV), цитомегаловирус (CMV) или вирус SV40. Другие включают применение полицистронных систем с внутренними сайтами связывания рибосом.
[0373] Обычно, экспрессионные векторы содержат селективные маркеры
(например, устойчивость к ампициллину, устойчивость к гигромицину, устойчивость к тетрациклину или неомицину) для обеспечения детекции указанных клеток, трансформированных требуемыми последовательностями ДНК (см., например, Itakura et al., патент США 4704362). Клетки, которые интегрировали указанную ДНК в хромосомы, могут быть выбраны путем введения одного или более маркеров, которые обеспечивают выбор трансфицированных клеток-хозяев. Указанный маркер может обеспечивать прототрофность у ауксотрофного хозяина, устойчивость к биоцидам (например, антибиотикам) или устойчивость к тяжелым металлам, таким как медь. Ген селектируемого
маркера может быть либо прямо соединен с последовательностями ДНК для экспрессии, либо введены в ту же клетку путем котрансформации.
[0374] Примером вектора, подходящего для экспрессии оптимизированной
последовательности FVIII, является NEOSPLA (Патент США №6159730). Указанный вектор
содержит цитомегаловирусный промотор/энхансер, главный промотор бетаглобина мыши,
точку начала репликации SV40, последовательность полиаденилирования бычьего
гормона роста, экзон 1 и экзон 2 неомицинфосфотрансферазы, ген и лидерная
последовательность дигидрофолатредуктазы. Было обнаружено, что указанный вектор
обеспечивает очень высокий уровень экспрессии антител при включении генов
вариабельных и константных областей, трансфекцию клеток с последующим отбором на
содержащей G418 среде с амплификацией в присутствии метотрексата. Векторные
системы также описаны в патентах США №5736137 и № 5658570, каждый из которых
включен в настоящий документ полностью посредством ссылки. Указанная система
обеспечивает высокие уровни экспрессии, например, > 30 пг/клетку/сутки. Другие примеры
векторных систем раскрыты, например, в патенте США № 6413777.
[0375] Согласно другим вариантам реализации полипептиды согласно настоящему
изобретению могут быть экспрессированы с применением полицистронных конструкций. В указанных экспрессионных системах несколько представляющих интерес генных продуктов, например, несколько полипептидов мультимерного связывающего белка, могут быть получены из одной полицистронной конструкции. Указанные системы имеют преимущество, заключающееся в использовании участка внутренней посадки рибосомы (IRES) для обеспечения относительно высоких уровней полипептидов в эукариотических клетках-хозяевах. Совместимые последовательности IRES раскрыты в патенте США №6193980, который также включен в настоящий документ.
[0376] В более общем случае, после получения вектора или последовательности
ДНК, кодирующей полипептид, указанный экспрессионный вектор может быть введен в
подходящую клетку-хозяина, то есть указанные клетки-хозяева могут быть
трансформированы. Введение плазмиды в клетку-хозяина может осуществляться с
применением различных техник, хорошо известных специалистам в данной области
техники, согласно описанию выше. Трансформированные клетки культивируют в условиях,
подходящих для получения полипептида FVIII, и анализируют на синтез полипептида FVIII.
Примеры техник анализа включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA),
радиоиммунологический анализ (RIA) или сортировка клеток с активированной
флуоресценцией (FACS), иммуногистохимическое исследование и т.п.
[0377] При описании процессов для выделения полипептидов из рекомбинантных
хозяев термины "клетка" и "культура клеток" используются взаимозаменяемо для обозначения источника полипептида, если явным образом не указано иное. Другими словами, выделение полипептида из "клеток" может означать выделение либо из
центрифугированных цельных клеток, либо из культуры клеток, содержащей и среду, и суспендированные клетки.
[0378] Линия клеток-хозяев, используемая для экспрессии белка, предпочтительно
происходит от млекопитающих; наиболее предпочтительно, от человека или мыши, поскольку выделенные нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению были оптимизированы для экспрессии в клетках человека. Примеры линий клеток-хозяев были описаны выше. Согласно одному варианту реализации способа получения полипептида с активностью FVIII клетка-хозяин представляет собой клетку НЕК293. Согласно другому варианту реализации способа получения полипептида с активностью FVIII клетка-хозяин представляет собой клетку СНО.
[0379] Гены, кодирующие полипептиды согласно настоящему изобретению, могут
также быть экспрессированы в клетках, не принадлежащих млекопитающим, таких как
бактерии или дрожжи, или растительные клетки. В указанном отношении следует
понимать, что различные одноклеточные не являющиеся млекопитающими
микроорганизмы, такие как бактерии, могут также быть трансформированы; т.е.
способные к расти в культуре или в при ферментации. Бактерии, чувствительные к
трансформации, включают представителей Enterobacteriaceae, такие как штаммы
Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, такие как Bacillus subtilis; Pneumococcus;
Streptococcus и Haemophilus influenzae. Следует также иметь в виду, что при экспрессии у
бактерий полипептиды, как правило, входят в состав телец включения. Полипептиды
должны быть выделены, очищены и затем собраны в функциональные молекулы.
[0380] Как вариант, оптимизированные последовательности нуклеотидов согласно
настоящему изобретению могут быть включены в трансгены для введения в геном трансгенного животного и последующей экспрессии в молоке указанного трансгенного животного (см., например, Deboer et al., US 5741957, Rosen, US 5304489, и Meade et al., US 5849992). Подходящие трансгены включают кодирующие последовательности полипептидов, функционально связанные с промотором и энхансером специфического для молочной железы гена, такого как казеин или бета-лактоглобулин.
[0381] Получение in vitro позволяет масштабирование для получения больших
количеств требуемых полипептидов. Техники культивирования клеток млекопитающих в условиях культивирования тканей известны в данной области техники и включают гомогенную суспензионную культуру, например, в аэролифтном реакторе или в реакторе непрерывного действия с перемешиванием, или иммобилизированную или инкапсулированную культуру клеток, например, в полых волокнах, микрокапсулах, на агарозных микрогранулах или керамических картриджах. Если необходимо и/или желательно, растворы полипептидов могут быть очищены с применением обычных хроматографических способов, например, гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе или (иммуно-)аффинной
хроматографии, например, после преимущественного биосинтеза синтетического
полипептида шарнирной области, или до или после этапа хроматографии гидрофобных
взаимодействий (HIC), описанного в настоящем документе. Последовательность
аффинной метки (например, метка His(6)), может необязательно быть присоединена или
включена в последовательность полипептида для облегчения последующего очищения.
[0382] После экспрессии белок FVIII может быть очищен в соответствии со
стандартными процедурами, известными в данной области техники, включая осаждение сульфатом аммония, аффинную колоночную хроматографию, очищение посредством ВЭЖХ, гель-электрофорез и т.п. (см., в целом, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). По существу чистые белки, гомогенные по меньшей мере приблизительно на 90-95%, являются предпочтительными, а гомогенные на 98-99% или более являются наиболее предпочтительными для фармацевтического применения. Фармацевтическая композиция
[0383] Композиции, содержащие выделенную молекулу нуклеиновой кислоты,
полипептид с активностью FVIII, кодируемый указанной молекулой нуклеиновой кислоты,
вектор или клетку-хозяин согласно настоящему изобретению, могут содержать
подходящий фармацевтически приемлемый носитель. Например, они могут содержать
вспомогательные вещества и/или рецептурные средства, которые облегчают введение
активных соединений в составы, разработанные для доставки в место действия.
[0384] Фармацевтическая композиция может быть введена в состав для
парентерального введения (т.е. внутривенного, подкожного или внутримышечного) путем болюсной инъекции. Составы для инъекций могут быть представлены единичной лекарственной формой, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с добавлением консерванта. Указанные композиции могут быть представлены такими формами, как суспензии, растворы или эмульсии на масляных или водных основах, и содержат рецептурные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Как вариант, активный ингредиент может быть представлен порошковой формой для восстановления в подходящей основе, например, апирогенной воде.
[0385] Подходящие составы для парентерального введения также включают
водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например, водорастворимые соли. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть введены в виде подходящих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или основы включают жирные масла, например, кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, например, этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, в том числе, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и декстран. Необязательно, указанная суспензия может также содержать стабилизаторы.
Липосомы также могут применяться для инкапсулирования молекул согласно настоящему изобретению для доставки в клетки или интерстициальное пространство. Примерами фармацевтически приемлемых носителей являются физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и антимикотические агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты, вода, солевой раствор, забуференный фосфатом солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция содержит изотонические агенты, например, сахара, полиатомные спирты, такие как маннит, сорбит; или хлорид натрия. Согласно другим вариантам реализации указанные композиции содержат фармацевтически приемлемые вещества, такие как смачивающие агенты, или незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, который продлевают срок хранения или увеличивают эффективность активных ингредиентов.
[0386] Композиции согласно настоящему изобретению могут быть представлены
различными формами, включая, например, жидкость (например, инъецируемые и инфузируемые растворы), дисперсии, суспензии, полутвердые и твердые лекарственные формы. Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтического применения.
[0387] Указанная композиция может быть введена в состав раствора,
микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высоких концентраций лекарственного средства. Стерильные инъецируемые растворы могут быть получены путем включения требуемого количества активного ингредиента в подходящий растворитель с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизующей фильтрацией. Обычно дисперсии получают путем включения активного ингредиент в стерильную основу, которая содержит основную дисперсионную среда и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов предпочтительными способами получения состава являются вакуумная сушка и сублимационная сушка с получением порошка активного ингредиента с любым дополнительным требуемым ингредиентом из предварительно стерилизованного фильтрацией раствора. Надлежащую текучесть раствора может обеспечивать, например, применение покрытия, такого как лецитин, за счет сохранения требуемого размера частиц в случае дисперсии, и применение поверхностно-активных веществ. Продленная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута за счет включения в композицию агента, задерживающего абсорбцию, например, солей - моностеаратов и желатина.
[0388] Активный ингредиент может быть включен в состав или устройство для
контролируемого высвобождения. Примеры таких составов и устройств включают
импланты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут применяться биоразлагаемые биосовместимые полимеры, например, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких составов и устройств известны в данной области техники. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[0389] Инъецируемые депо-составы могут быть получены путем формирования
микроинкапсулированных матриц с лекарственным средством в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарственного средства и полимера, а также природы используемого полимера, можно контролировать скорость высвобождения лекарственного средства. Другие примеры биоразлагаемых полимеров представлены полиортоэфирами и полиангидридами. Инъецируемые депо-составы также могут быть получены путем заключения лекарственного средства в липосомы или микроэмульсии.
[0390] В композиции могут быть включены дополнительные активные соединения.
Согласно одному варианту реализации химерный белок согласно настоящему
изобретению введен в состав с другим фактором свертывания крови, или его вариантом,
фрагментом, аналогом или производным. Например, указанный фактор свертывания крови
включает, не ограничиваясь перечисленными, фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX,
фактор X, фактор XI, фактор XII, фактор XIII, протромбин, фибриноген, фактор фон
Виллебранда или рекомбинантный растворимый тканевой фактор (rsTF) или
активированные формы чего-либо из перечисленного. Фактор свертывания крови в составе
гемостатического агента может также включать антифибринолитические лекарственные
средства, например, эпсилон-амино-капроновую кислоту, транексамовую кислоту.
[0391] Схемы дозирования могут быть скорректированы для обеспечения
оптимального требуемого ответа. Например, может быть введен один болюс, может быть введено несколько дробных доз на протяжении периода времени, или доза может быть пропорционально снижена или увеличена в соответствии с требованиями, обусловленными терапевтической ситуацией. Благоприятно получение составов с парентеральными композициями в виде единичных лекарственных форм для обеспечения простоты введения и однородности дозы. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980).
[0392] Помимо активного соединения, жидкая лекарственная форма может
содержать инертные ингредиенты, такие как вода, этиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот сорбитана.
[0393] Неограничивающие примеры подходящих фармацевтических носителей
также описаны в источнике: Remington's Pharmaceutical Sciences, Е. W. Martin. Некоторые примеры вспомогательных веществ включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. Указанная композиция может также содержать рН-буферизующие реагенты, и смачивающие или эмульгирующие агенты.
[0394] Фармацевтическая композиция для перорального введения может
принимать форму таблеток или капсул, получаемых стандартным способом. Указанная
композиция может также быть получена в виде жидкости, например, сиропа или суспензии.
Указанная жидкость может включать суспендирующие агенты (например, сироп сорбита,
производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры), эмульгирующие
агенты (лецитин или аравийскую камедь), неводные основы (например, миндальное масло,
масляные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла)
и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновую
кислоту). Указанные составы могут также включать вкусоароматические, красящие и
подслащивающие агенты. Как вариант, указанная композиция может быть представлена
сухим продуктом для восстановления водой или другой подходящей основой.
[0395] Композиция для буккального введения может принимать форму таблеток или
пастилок для рассасывания в соответствии со стандартными протоколами.
[0396] Введение соединений в соответствии с настоящим изобретением путем
ингаляции может удобным образом осуществляться в форме распыляемого аэрозоля со вспомогательными веществами или без вспомогательных веществ, или в форме спрей-аэрозоля из упаковки под давлением или небулайзера, необязательно с пропеллентом, например, дихлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафторметаном, диоксидом углерода или другим подходящим газом. В случае аэрозоля под давлением единица дозирования может быть определена с помощью использования клапана для доставки отмеренного количества. Могут быть получены капсулы и картриджи, например, из желатина, для применения в ингаляторе или инсуффляторе, содержащие порошковую смесь указанного соединения и подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.
[0397] Указанная фармацевтическая композиция может также быть представлена
составом для ректального введения, таким как суппозиторий или удерживающая клизма, например, содержащим стандартные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.
[0398] Согласно одному варианту реализации фармацевтическая композиция
содержит полипептид, обладающий активностью фактора VIII, оптимизированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный полипептид, обладающий
активностью фактора VIII, вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, или клетку-хозяина, содержащую указанный вектор, и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят путем, выбранным из группы, состоящей из местного введения, интраокулярного введения, парентерального введения, интратекального введения, субдурального введения и перорального введения. Парентеральное введение может представлять собой внутривенное или подкожное введение.
[0399] Согласно другим вариантам реализации указанную композицию применяют
для лечения связанного с кровотечением заболевания или состояния у нуждающегося в этом субъекта. Указанное связанное с кровотечением заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из связанного с кровотечением расстройства системы коагуляции, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, геморрагии, геморрагии в мышцах, геморрагии в полости рта, травмы, черепно-мозговой травмы, желудочно-кишечного кровотечения, интракраниальной геморрагии, интраабдоминальной геморрагии, интраторакальной геморрагии, перелома кости, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и любых их комбинаций. Согласно другим дополнительным вариантам реализации у указанного субъекта запланирована хирургическая операция. Согласно другим дополнительным вариантам реализации лечение является профилактическим или проводится по мере необходимости. Способы лечения
[0400] Согласно настоящему изобретению предложен способ лечения
расстройства системы свертывания крови, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или полипептида согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации указанное расстройство системы свертывания крови характеризуется дефицитом FVIII. Согласно некоторым вариантам реализации указанное расстройство системы свертывания крови представляет собой гемофилию. Согласно некоторым вариантам реализации указанное расстройство системы свертывания крови представляет собой гемофилию А. Согласно некоторым вариантам реализации способа лечения расстройства системы свертывания крови активность FVIII в плазме через 24 часа после введения увеличивается по сравнению с активностью у субъекта, которому вводили референсную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16, вектор, содержащий референсную молекулу нуклеиновой кислоты, или полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты.
[0401] Согласно некоторым вариантам реализации активность FVIII в плазме
увеличивается приблизительно через 6 часов, приблизительно через 12 часов,
приблизительно через 18 часов, приблизительно через 24 часа, приблизительно через 36 часов, приблизительно через 48 часов, приблизительно через 3 дня, приблизительно через 4 дня, приблизительно через 5 дней, приблизительно через 6 дней, приблизительно через 7 дней, приблизительно через 8 дней, приблизительно через 9 дней, приблизительно через 10 дней, приблизительно через 11 дней, приблизительно через 12 дней, приблизительно через 13 дней, приблизительно через 14 дней, приблизительно через 15 дней, приблизительно через 16 дней, приблизительно через 17 дней, приблизительно через 18 дней, приблизительно через 19 дней, приблизительно через 20 дней, приблизительно через 21 день, приблизительно через 22 дня, приблизительно через 23 дня, приблизительно через 24 дня, приблизительно через 25 дней, приблизительно через 26 дней, приблизительно через 27 дней или приблизительно через 28 дней после введения, по сравнению с активностью у субъекта, которому вводили референсную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16, вирусный вектор, содержащий референсную молекулу нуклеиновой кислоты, или полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации активность FVIII в плазме увеличивается приблизительно через 24 часа после введения по сравнению с активностью у субъекта, которому вводили референсную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16, вирусный вектор, содержащий референсную молекулу нуклеиновой кислоты, или полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты. Согласно другому варианту реализации активность FVIII в плазме увеличивается приблизительно через 21 день после введения по сравнению с активностью у субъекта, которому вводили референсную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16, вирусный вектор, содержащий референсную молекулу нуклеиновой кислоты, или полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты.
[0402] Согласно некоторым вариантам реализации активность FVIII в плазме после
введения увеличивается по меньшей мере приблизительно 1,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 2-кратно, по меньшей мере приблизительно 3-кратно, по меньшей мере приблизительно 4-кратно, по меньшей мере приблизительно 5-кратно, по меньшей мере приблизительно 6-кратно, по меньшей мере приблизительно 7-кратно, по меньшей мере приблизительно 8-кратно, по меньшей мере приблизительно 9-кратно, по меньшей мере приблизительно 10-кратно, по меньшей мере приблизительно 11-кратно, по меньшей мере приблизительно 12-кратно, по меньшей мере приблизительно 13-кратно, по меньшей мере приблизительно 14-кратно, по меньшей мере приблизительно 15-кратно, по меньшей мере приблизительно 20-кратно, по меньшей мере приблизительно 25-кратно, по меньшей мере приблизительно 30-кратно, по меньшей мере приблизительно 35-кратно, по меньшей мере приблизительно 40-кратно, по меньшей мере приблизительно 50-кратно, по меньшей мере приблизительно 60-кратно, по меньшей мере приблизительно 70-кратно, по меньшей мере
приблизительно 80-кратно, по меньшей мере приблизительно 90-кратно, по меньшей мере приблизительно 100-кратно, по меньшей мере приблизительно 150-кратно, по меньшей мере приблизительно 200-кратно, по меньшей мере приблизительно 250-кратно, по меньшей мере приблизительно 300-кратно, по меньшей мере приблизительно 350-кратно, по меньшей мере приблизительно 400-кратно, по меньшей мере приблизительно 450-кратно или по меньшей мере приблизительно 500-кратно по сравнению с активностью у субъекта, которому вводили референсную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16, вирусный вектор, содержащий референсную молекулу нуклеиновой кислоты, или полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации активность FVIII в плазме после введения увеличивается по меньшей мере приблизительно на 150%, по меньшей мере приблизительно на 200%, по меньшей мере приблизительно на 250%, по меньшей мере приблизительно на 300%, по меньшей мере приблизительно на 350%, по меньшей мере приблизительно на 400%, по меньшей мере приблизительно на 450%, по меньшей мере приблизительно на 500%, по меньшей мере приблизительно на 550%, по меньшей мере приблизительно на 600%, по меньшей мере приблизительно на 650%, по меньшей мере приблизительно на 700%, по меньшей мере приблизительно на 750%, по меньшей мере приблизительно на 800%, по меньшей мере приблизительно на 850%, по меньшей мере приблизительно на 900%, по меньшей мере приблизительно на 950%, по меньшей мере приблизительно на 1000%, по меньшей мере приблизительно на 1500%, по меньшей мере приблизительно на 2000%, по меньшей мере приблизительно на 2500%, по меньшей мере приблизительно на 3000%, по меньшей мере приблизительно на 3500%, по меньшей мере приблизительно на 4000%, по меньшей мере приблизительно на 4500%, по меньшей мере приблизительно на 5000%, по меньшей мере приблизительно на 5500%, по меньшей мере приблизительно на 6000%, по меньшей мере приблизительно на 7000%, по меньшей мере приблизительно на 8000%, по меньшей мере приблизительно на 9000%, по меньшей мере приблизительно на 10 000% по сравнению с нормальными физиологическими уровнями для циркулирующего FVIII. Согласно одному варианту реализации активность FVIII в плазме после введения увеличивается по меньшей мере приблизительно на 3000-5000% по сравнению с нормальными физиологическими уровнями для циркулирующего FVIII. Согласно некоторым вариантам реализации через 24 часа после введения плазмиды, содержащей кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, или через 21 день после введения лентивирусного или ААВ-вектора, содержащего кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, активность FVIII в плазме увеличивается по меньшей мере приблизительно 6-кратно по сравнению с активностью у субъекта, которому вводили референсную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16, вектор,
содержащий референсную молекулу нуклеиновой кислоты, или полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации через 24 часа после введения плазмиды, содержащей кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, или через 21 день после введения лентивирусного или ААВ-вектора, содержащего кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, активность FVIII в плазме увеличивается по меньшей мере приблизительно 10-кратно по сравнению с активностью у субъекта, которому вводили референсную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16, вектор, содержащий референсную молекулу нуклеиновой кислоты, или полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации через 24 часа после введения плазмиды, содержащей кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, или через 21 день после введения лентивирусного или ААВ-вектора, содержащего кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, активность FVIII в плазме увеличивается по меньшей мере приблизительно 23-кратно по сравнению с активностью у субъекта, которому вводили референсную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16, вектор, содержащий референсную молекулу нуклеиновой кислоты, или полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации через 24 часа после введения плазмиды, содержащей кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, или через 21 день после введения лентивирусного или ААВ-вектора, содержащего кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, активность FVIII в плазме увеличивается по меньшей мере приблизительно 18-кратно по сравнению с активностью у субъекта, которому вводили референсную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16, вектор, содержащий референсную молекулу нуклеиновой кислоты, или полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации через 24 часа после введения плазмиды, содержащей кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, или через 21 день после введения лентивирусного или ААВ-вектора, содержащего кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, активность FVIII в плазме увеличивается по меньшей мере приблизительно 30-кратно по сравнению с активностью у субъекта, которому вводили референсную молекулу
нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16, вектор, содержащий референсную молекулу нуклеиновой кислоты, или полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации через 24 часа после введения плазмиды, содержащей кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, или через 21 день после введения лентивирусного или ААВ-вектора, содержащего кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, активность FVIII в плазме увеличивается по меньшей мере приблизительно 50-кратно по сравнению с активностью у субъекта, которому вводили референсную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16, вектор, содержащий референсную молекулу нуклеиновой кислоты, или полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации через 24 часа после введения плазмиды, содержащей кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, или через 21 день после введения лентивирусного или ААВ-вектора, содержащего кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, активность FVIII в плазме увеличивается по меньшей мере приблизительно 100-кратно по сравнению с активностью у субъекта, которому вводили референсную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую SEQ ID NO: 16, вектор, содержащий референсную молекулу нуклеиновой кислоты, или полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты.
[0403] Настоящее изобретение также относится к способу лечения, облегчения или
предотвращения гемостатического расстройства у субъекта, включающему введение терапевтически эффективного количества выделенной молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению или полипептида с активностью FVIII, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Лечение, облегчение и предотвращение путем применения выделенной молекулы нуклеиновой кислоты или кодируемого ей полипептида может представлять собой обходную терапию. У субъекта, получающего обходную терапию, может быть уже выработан ингибитор фактора свертывания крови, например, ингибитор FVIII, или существует возможность выработки ингибитора фактора свертывания крови.
[0404] Молекулы нуклеиновых кислот, векторы, или полипептиды согласно
настоящему описанию обеспечивают лечение или предотвращение гемостатического расстройства, способствуя образованию фибринового сгустка. Полипептид с активностью FVIII, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, может активировать представителя каскада коагуляции. Указанный фактор свертывания крови может являться участником внешнего пути, внутреннего пути, или обоих путей.
[0405] Молекулы нуклеиновых кислот, векторы или полипептиды согласно
настоящему изобретению могут применяться для лечения гемостатических расстройств,
лечение которых, по имеющимся данным, может быть проведено с применением FVIII.
Гемостатические расстройства, лечение которых может проводиться с применением
способов согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь
перечисленными, гемофилию А, гемофилию В, болезнь фон Виллебранда, дефицит
фактора XI (дефицит плазменного предшественника тромбопластина, ППТ), дефицит
фактора XII, а также дефициты или структурные аномалии фибриногена, протромбина,
фактора V, фактора VII, фактора X или фактора XIII, гемартроз, мышечное кровотечение,
кровотечение в полости рта, геморрагию, геморрагию в мышцах, геморрагию в полости рта,
травму, черепно-мозговую травму, желудочно-кишечное кровотечение, интракраниальную
геморрагию, интраабдоминальную геморрагию, интраторакальную геморрагию, перелом
кости, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном
пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище
подвздошно-поясничной мышцы. Композиции для введения субъекту включают молекулы
нуклеиновой кислоты, которые содержат оптимизированную последовательность
нуклеотидов согласно настоящему изобретению, кодирующую фактор свертывания крови
FVIII (для применения в генной терапии), а также молекулы полипептида FVIII.
[0406] Согласно некоторым вариантам реализации указанное гемостатическое
расстройство представляет собой наследственное расстройство. Согласно одному
варианту реализации указанный субъект страдает гемофилией А. Согласно другим
вариантам реализации указанное гемостатическое расстройство является результатом
дефицитом FVIII. Согласно другим вариантам реализации указанное гемостатическое
расстройство может быть результатом дефектного фактора свертывания крови FVIII.
[0407] Согласно другому варианту реализации указанное гемостатическое
расстройство может представлять собой приобретенное расстройство. Указанное приобретенное расстройство может быть результатом основного вторичного заболевания или состояния. Указанное независимое состояние может представлять собой, например, однако без ограничений, рак, аутоиммунное заболевание или беременность. Указанное приобретенное расстройство может быть результатом пожилого возраста или применения медикамента для лечения основного вторичного расстройства (например, химиотерапии при раке).
[0408] Настоящее изобретение также относится к способам лечения субъекта, не
страдающего гемостатическим расстройством или вторичным заболеванием или состоянием, приводящим к гемостатическому расстройству. Настоящее изобретение, соответственно, относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в общем гемостатическом агенте, включающему введение терапевтически эффективного количества выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или полипептида FVIII
согласно настоящему изобретению. Например, согласно одному варианту реализации у указанного субъекта, нуждающегося в общем гемостатическом агенте, осуществляется или будет осуществляться хирургическое вмешательство. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор или полипептид FVIII согласно настоящему изобретению может быть введен(а) до или после хирургического вмешательства в качестве профилактики. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор или полипептид FVIII согласно настоящему изобретению может быть введен(а) во время или после хирургического вмешательства для контроля эпизода острого кровотечения. Хирургическое вмешательство может включать, не ограничиваясь перечисленными, трансплантацию печени, резекцию печени или трансплантацию стволовых клеток.
[0409] Согласно другому варианту реализации выделенная молекула нуклеиновой
кислоты, вектор или полипептид FVIII согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения субъекта с эпизодом острого кровотечения, не страдающего гемостатическим расстройством. Указанный эпизод острого кровотечения может быть результатом тяжелой травмы, например, хирургического вмешательства, автомобильной аварии, ранения, рваной огнестрельной раны или любого другого травмирующего события, приводящего к неконтролируемому кровотечению.
[0410] Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор или белок FVIII может
применяться для профилактического лечения субъекта с гемостатическим расстройством.
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор или белок FVIII может применяться
для лечения эпизода острого кровотечения у субъекта с гемостатическим расстройством.
[0411] Согласно другому варианту реализации экспрессия белка FVIII путем
введения выделенной молекулы нуклеиновой кислоты или вектора согласно настоящему изобретению не индуцирует иммунный ответ у субъекта. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммунный ответ включает выработку антител против FVIII. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммунный ответ включает секреция цитокинов. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммунный ответ включает активацию В-клеток, Т-клеток, или как В-клеток, так и Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанный иммунный ответ представляет собой ингибиторный иммунный ответ, при этом указанный иммунный ответ у субъекта уменьшает активность белка FVIII относительно активности FVIII у субъекта, у которого не развился иммунный ответ. Согласно некоторым вариантам реализации экспрессия белка FVIII путем введения выделенной молекулы нуклеиновой кислоты или вектора согласно настоящему изобретению предотвращает ингибиторный иммунный ответ против указанного белка FVIII или белка FVIII, экспрессированного с выделенной молекулы нуклеиновой кислоты или вектора.
[0412] Согласно некоторым вариантам реализации выделенную молекулу
нуклеиновой кислоты, вектор, или композицию с белком FVIII согласно настоящему
изобретению вводят в комбинации по меньшей мере с одним другим агентом, который
способствует гемостазу. Указанный другой агент, который способствует гемостазу,
представляет собой терапевтическое средство с продемонстрированной свертывающей
активностью. Согласно одному примеру, однако без ограничений, указанный
гемостатический агент может включать фактор V, фактор VII, фактор IX, фактор X, фактор
XI, фактор XII, фактор XIII, протромбин или фибриноген, или активированные формы
любого из вышеперечисленных агентов. Указанный фактор свертывания крови или
гемостатический агент может также включать антифибринолитические лекарственные
средства, например, эпсилон-амино-капроновую кислоту, транексамовую кислоту.
[0413] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанная
композиция (например, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор или
полипептид FVIII) представляет собой такую композицию, в которой FVIII присутствует в
активируемой форме при введении субъекту. Такая активируемая молекула может быть
активирована in vivo в сайте сворачивания крови после введения субъекту.
[0414] Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор или полипептид FVIII
может быть введен внутривенно, подкожно, внутримышечно, или через любую слизистую оболочку, например, перорально, сублингвально, буккально, сублингвально, назально, ректально, вагинально или через легкие. Белок FVIII может быть имплантирован в составе биополимерной твердой подложки или соединен с ней таким образом, чтобы обеспечить медленное высвобождение химерного белка в требуемый сайт.
[0415] Фармацевтическая композиция для перорального введения может
принимать форму таблеток или капсул, получаемых стандартным способом. Указанная
композиция может также быть получена в виде жидкости, например, сиропа или суспензии.
Указанная жидкость может включать суспендирующие агенты (например, сироп сорбита,
производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры), эмульгирующие
агенты (лецитин или аравийскую камедь), неводные основы (например, миндальное масло,
масляные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные
масла), и консерванты (например метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновую
кислоту). Указанные составы могут также включать вкусоароматические, красящие и
подслащивающие агенты. Как вариант, указанная композиция может быть представлена
сухим продуктом для восстановления водой или другой подходящей основой.
[0416] Композиция для буккального и сублингвального введения может принимать
форму таблеток, пастилок для рассасывания или быстро растворяющихся пленок в соответствии со стандартными протоколами.
[0417] Для введения путем ингаляции доставка полипептидов с активностью FVIII
для применения в соответствии с настоящим изобретением может удобным образом осуществляться в форме спрей-аэрозоля из упаковки под давлением или небулайзера (например, в ФСБ) с подходящим пропеллентом, например, дихлордифторметаном,
трихлорфторметаном, дихлортетрафторметаном, диоксидом углерода или другим подходящим газом. В случае аэрозоля под давлением единица дозирования может быть определена с помощью использования клапана для доставки отмеренного количества. Могут быть получены капсулы и картриджи, например, из желатина, для применения в ингаляторе или инсуффляторе, содержащие порошковую смесь указанного соединения и подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.
[0418] Согласно одному варианту реализации используют парентеральный
маршрут введения выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или полипептида
FVIII. Термин парентеральный в настоящем документе включает внутривенное,
внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или
вагинальное введение. Внутривенная форма парентерального введения является
предпочтительной. При том, что все указанные формы введения явным образом включены
в объем настоящего изобретения, желательно, чтобы форма для введения представляла
собой раствор для инъекций, в частности, для внутривенной или внутриартериальной
инъекции или капельного вливания. Как правило, подходящая фармацевтическая
композиция для инъекций может содержать буфер (например, ацетатный, фосфатный или
цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат),
необязательно, стабилизирующий агент (например, альбумин человека) и т.п. Однако
согласно другим способам, совместимым с настоящим документом, выделенная молекула
нуклеиновой кислоты, вектор или полипептид FVIII может быть доставлен(а) прямо в сайт,
содержащий нежелательную клеточную популяцию, с увеличением таким образом
воздействия на пораженную заболеванием ткань терапевтического агента.
[0419] Составы для парентерального введения включают стерильные водные или
неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются
пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и
инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители
включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензий, в том числе солевой
раствор и буферизованные среды. Согласно настоящему изобретению фармацевтически
приемлемые носители включают, не ограничиваясь перечисленными, 0,01-0,1М и,
предпочтительно, 0,05М фосфатный буфер или 0,8% солевой раствор. Другие обычные
парентеральные основы включают растворы фосфата натрия, раствор Рингера с
декстрозой, декстрозы и хлорида натрия, раствор Рингера с лактатом, или нелетучие
масла. Внутривенные основы включают восполнители жидкостей и питательных веществ,
восполнители электролитов, например, на основе раствора Рингера с декстрозой, и т.п.
Могут также присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например,
противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы, и т.п.
[0420] Более конкретно, фармацевтические композиции, подходящие для
инъецирования, включают стерильные водные растворы (при наличии
водорастворимости) или дисперсии, и стерильные порошки для экстемпорального
приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсий. В таких случаях
композиция должна быть стерильной и текучей в степени, обеспечивающей простоту
введения через шприц. Она должна быть стабильной в условиях приготовления и
хранения, и, предпочтительно, быть защищена от действия загрязняющих
микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой
растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол,
полиатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль, и
т.п.), и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, с
применением покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера
частиц в случае дисперсии, а также применения поверхностно-активных веществ.
[0421] Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто путем
применения различных антибактериальных и антимикотических агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях предпочтительно включение в композицию изотонических агентов, например, Сахаров, полиатомных спиртов, таких как маннит, сорбит; или хлорида натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может быть обеспечена путем включения в композицию агента, который задерживает абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
[0422] В любом случае, стерильные инъецируемые растворы могут быть получены
путем включения активного соединения (например, собственно полипептида или полипептида в комбинации с другими активными агентами) в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных в настоящем документе, при необходимости, с последующей стерилизующей фильтрацией. Обычно дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильную основу, которая содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка, которые обеспечивают получение порошка активного ингредиента с любым дополнительным требуемым ингредиентом из ранее простерилизованного фильтрацией раствора. Составы для инъекций обрабатывают, наполняют ими контейнеры, такие как ампулы, мешки, бутылки, шприцы или флаконы, и герметизируют в асептических условиях в соответствии со способами, известными в данной области техники. Кроме того, может осуществляться упаковка и продажа указанных составов в форме набора. Такие готовые изделия предпочтительно содержат этикетки или упаковочные вкладыши, указывающие, что ассоциированные с ними композиции подходят для лечения субъекта, страдающего от расстройств свертывания крови или предрасположенного к таким расстройствам.
[0423] Указанная фармацевтическая композиция может также быть представлена
составом для ректального введения в виде суппозитория или удерживающей клизмы, например, содержащим стандартные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.
[0424] Эффективные дозы композиций согласно настоящему изобретению для
лечения состояний варьируют в зависимости от многих разных факторов, в том числе
способа введения, целевого сайта, физиологического состояния пациента, от того,
представляет ли собой пациент человека или животное, других вводимых медикаментов,
и того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациент
представляет собой человека, однако получать лечение также могут не являющиеся
человеком млекопитающие, в том числе трансгенные млекопитающие. Дозировки для
лечения могут быть титрованы с применением рутинных способов, известных
специалистам в данной области техники, для оптимизации безопасности и эффективности.
[0425] Дозировки для введения плазмиды, содержащей кодон-оптимизированный
ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, или полипептид, кодируемый указанным кодон-оптимизированным геном, могут варьировать в диапазоне от 1000 мкг/кг до 0,1 нг/кг масса тела. Согласно одному варианту реализации дозировки варьируют в диапазоне от 1 мкг/кг до 100 мкг/кг. Дозировки для введения лентивирусного вектора, содержащего кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII) согласно описанию в настоящем документе, могут варьировать в диапазоне от 103 до 1015 ТЕ/кг. Дозировки для введения ААВ-вектора, содержащего кодон-оптимизированный ген, кодирующий полипептиды с активностью фактора VIII (FVIII), согласно описанию в настоящем документе, могут варьировать в диапазоне от 105 до 1018 VG/кг.
[0426] Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, плазмида, вектор или
полипептид FVIII может быть введен в виде одной дозы или в виде нескольких доз, при этом указанные несколько доз могут быть введены подряд или через специфические интервалы времени. Для определения оптимальных диапазонов доз и/или схем введения могут применяться анализы in vitro. Анализы in vitro для измерения активности факторов свертывания крови известны в данной области техники. Кроме того, эффективные дозы могут быть экстраполированы на основании кривых зависимости ответа от дозы, полученных в моделях на животных, например, для собак с гемофилией (Mount et al. 2002, Blood 99 (8): 2670).
[0427] Промежуточные дозы из приведенных выше диапазонов также входят в
объем настоящего изобретения. Такие дозы могут вводиться субъектам ежедневно, через день, еженедельно или в соответствии с любой другой схемой, определенной путем эмпирического анализа. Примером лечения является введение в нескольких дозировках на протяжении пролонгированного периода, например, по меньшей мере шести месяцев.
Согласно некоторым способам два или более полипептидов могут быть введены одновременно, в этом случае дозировка каждого вводимого полипептида находится в пределах указанных диапазонов.
[0428] Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор или полипептиды FVIII
согласно настоящему изобретению могут быть введены многократно. Интервалы между
введением каждой дозы могут быть ежедневными, еженедельными, ежемесячными или
ежегодными. Интервалы могут также быть неравномерными, основанными на измеренных
уровнях модифицированного полипептида или антигена в крови пациента. Как вариант,
полипептиды могут быть введены в виде состава для продолжительного высвобождения,
в этом случае необходимо менее частое введение. Дозировка и частота варьируют в
зависимости от времени полужизни полипептида или полинуклеотида у пациента.
[0429] Дозировка и частота введения могут варьировать в зависимости от того,
является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактическом применении композиции, содержащие выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, вектор или полипептид FVIII, или их коктейль вводят пациенту, у которого пока отсутствует болезненное состояние, для повышения устойчивости пациента или минимизации эффектов заболевания. Такое количество определено как "профилактически эффективная доза". Относительно низкую дозу вводят через относительно длительные интервалы на протяжении продолжительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение на протяжении всей жизни.
[0430] Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор или полипептиды FVIII
согласно настоящему изобретению могут необязательно быть введены в комбинации с
другими агентами, эффективными для лечения расстройства или состояния
нуждающемуся в лечении (например, профилактическом или терапевтическом) пациенту.
[0431] В настоящем документе введение выделенных молекул нуклеиновых кислот,
векторов или полипептидов FVIII согласно настоящему изобретению в совокупности или в комбинации со вспомогательной терапией означает последовательное, одновременное, коэкстенсивное, параллельное, совместное или единовременное введение или применение указанной терапии и описанных полипептидов. Специалистам в данной области техники будет понятно, что указанное введение или применение различных компонентов комбинированной терапевтической схемы может быть распределено во времени для повышения общей эффективности лечения. Специалист (например, лечащий врач) сможет легко определить эффективные комбинированные терапевтические схемы без излишнего экспериментирования на основании выбранной вспомогательной терапии и изложенных в настоящем описании принципов.
[0432] Следует также иметь в виду, что выделенная молекула нуклеиновой
кислоты, вектор или полипептид FVIII согласно настоящему изобретению может применяться в совокупности или в комбинации с агентом или агентами (например, для
осуществления комбинированной терапевтической схемы). Примеры агентов, с которыми может быть скомбинирован полипептид или полинуклеотид согласно настоящему изобретению, включают агенты, которые представляют современный стандарт лечения конкретного расстройства, лечение которого проводится. Природа таких агентов может быть химической или биологической. Термин "биологический" или "биологический агент" относится к любому фармацевтически активному агенту, полученному из живых организмов и/или их продуктов, который предназначен для применения в качестве терапевтического средства.
[0433] Количество агента для применения в комбинации с полинуклеотидами или
полипептидами согласно настоящему изобретению может варьировать у разных субъектов, или может соответствовать известному в данной области техники. См., например, Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287 ((Joel G. Hardman etai, eds., 9th ed. 1996). Согласно другому варианту реализации вводят количество такого агента, соответствующее стандарту лечения.
[0434] Как обсуждалось ранее, полинуклеотиды и полипептиды согласно
настоящему изобретению могут быть введены в фармацевтически эффективном
количестве для лечения расстройств свертывания крови in vivo. В указанном отношении,
следует понимать, что полипептиды или полинуклеотиды согласно настоящему
изобретению могут быть введены в состав, облегчающий введение и способствующий
стабильности активного агента. Предпочтительно, фармацевтические композиции в
соответствии с настоящим изобретением содержат фармацевтически приемлемый,
нетоксичный, стерильный носитель, такой как физиологический солевой раствор,
нетоксичные буферы, консерванты и т.п. Разумеется, фармацевтические композиции
согласно настоящему изобретению могут быть введены в виде одной или нескольких доз
для обеспечения фармацевтически эффективного количества полипептида.
[0435] Для оценки функции системы коагуляции доступен ряд тестов: тест на
активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), хромогенный анализ, анализ ROTEM(r), тест на протромбиновое время (ПТВ) (также используемый для определения MHO), тесты на фибриноген (часто выполняемый по методу Клаусса), подсчет тромбоцитов, тестирование функции тромбоцитов (часто на анализаторе функции тромбоцитов PFA-100), тромбиновое время (ТВ), время кровотечения, тест смешивания (определяющий, происходит ли коррекция аномалии при смешивании плазма пациента с нормальной плазмой), анализы на факторы коагуляции, антифосфолипидные антитела, D-димер, генетические тесты (например, на лейденскую мутацию фактора V, мутацию протромбина G20210A), время разбавленного яда гадюки Рассела (dRWT), различные тесты на функцию тромбоцитов, тромбоэластографию (TEG или Sonoclot), тромбоэластометрию (ТЕМ(r), например, ROTEM(r)), или время лизиса эуглобина (ELT).
[0436] Тест АЧТВ представляет собой показатель эффективности, измеряющий
эффективность как "внутреннего" пути (также называемого путем контактной активации), так и общего пути коагуляции. Указанный тест часто используется для измерения свертывающей активности коммерчески доступных рекомбинантных факторов свертывания крови, например, FVIII или FIX. Его применяют в сочетании с тестом на протромбиновое время (ПТВ), в котором измеряют внешний путь.
[0437] Анализ ROTEM(r) обеспечивает информацию об общей кинетике гемостаза:
время сворачивания крови, образования сгустка, стабильности и лизиса сгустка. Разные показатели при тромбоэластометрии зависят от активности системы коагуляции плазмы, функции тромбоцитов, фибринолиза, или многих факторов, который влияют на указанные взаимодействия. Указанный анализ может обеспечить полную картину вторичного гемостаза. Генная терапия
[0438] Согласно настоящему изобретению предложен способ увеличения
экспрессии полипептида с активностью FVIII у субъекта, включающий введение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению нуждающемуся в этом субъекту, при этом экспрессия указанного полипептида увеличивается относительно референсной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO: 16. Согласно настоящему изобретению также предложен способ увеличения экспрессии полипептида с активностью FVIII у субъекта, включающий введение вектора согласно настоящему изобретению нуждающемуся в этом субъекту, при этом экспрессия указанного полипептида увеличивается относительно вектора, содержащего референсную молекулу нуклеиновой кислоты.
[0439] Исследовали соматическую генную терапию в качестве возможного лечения
гемофилии А. Генная терапия представляет собой особенно привлекательный вариант
лечения гемофилии ввиду потенциальной способности излечивать указанное заболевание
за счет непрерывного эндогенного продуцирования FVIII после однократного введения
вектора. Для гемофилии А хорошо подходит подход с замещением генов, поскольку ее
клинические проявления полностью обусловлены недостаточностью одного генного
продукта (FVIII), который циркулирует в незначительных количествах (200 нг/мл) в плазме.
[0440] Белок FVIII согласно настоящему изобретению может быть получен in vivo у
млекопитающего, например, у пациента-человека, с применением генно-терапевтического подхода; терапевтически благоприятным может быть лечение связанного с кровотечением заболевания или расстройства, выбранного из группы, состоящей из связанного с кровотечением расстройства системы коагуляции, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, геморрагии, геморрагии в мышцах, геморрагии в полости рта, травмы, черепно-мозговой травмы, желудочно-кишечного кровотечения, интракраниальной геморрагии, интраабдоминальной геморрагии, интраторакальной
геморрагии, перелома кости, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. Согласно одному варианту реализации связанное с кровотечением заболевание или расстройство представляет собой гемофилию. Согласно другому варианту реализации указанное связанное с кровотечением заболевание или расстройство представляет собой гемофилию А. Указанное лечение включает введение оптимизированной кодирующей FVIII нуклеиновой кислоты, функционально связанной с подходящими последовательностями контроля экспрессии. Согласно определенному варианту реализации указанные последовательности включены в вирусный вектор. Подходящие вирусные векторы для такой генной терапии включают аденовирусные векторы, лентивирусные векторы, бакуловирусные векторы, векторы на основе вируса Эпштейн-Барр, паповавирусные векторы, векторы на основе вируса осповакцины, векторы на основе вируса простого герпеса и векторы на основе адено-ассоциированного вируса (ААВ). Вирусный вектор может представлять собой дефектный по репликации вирусный вектор. Согласно другим вариантам реализации аденовирусный вектор содержит делецию в гене Е1 или гене ЕЗ. Согласно другим вариантам реализации указанные последовательности включены в невирусный вектор, известный специалистам в данной области техники.
[0441] Все из различных аспектов, вариантов реализации и дополнительных
возможностей, описанных в настоящем документе, могут быть скомбинированы в любых или во всех вариантах.
[0442] Все публикации, патенты и патентные заявки, упоминаемые в настоящем
описании, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент или патентная заявка был(а) конкретным и индивидуальным образом включена посредством ссылки.
[0443] После ознакомления с общим описанием настоящего изобретения,
дальнейшее понимание может быть достигнуто путем обращения к примерам, приведенным в настоящем описании. Указанные примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения. ПРИМЕРЫ
Пример 1. Стратегия оптимизации кодонов
[0444] Было получено восемь кодон-оптимизированных вариантов BDD FVIII путем
контроля смещения частоты использования кодонов, в том числе coFVIII-3 (SEQ ID NO: 1; фиг. 1A), coFVIII-4 (SEQ ID NO: 2; фиг. 1B), coFVIII-5 (SEQ ID NO: 70; фиг. 1С), coFVIII-6 (SEQ ID NO: 71; фиг. 1D), coFVIII-52 (SEQ ID NO: 3; фиг. 1E), coFVIII-62 (SEQ ID NO: 4; фиг. 1F), coFVIII-25 (SEQ ID NO: 5; фиг. 1G) и coFVIII-26 (SEQ ID NO: 6; фиг. 1H). Для облегчения оптимизации кодонов использовали онлайн-инструмент Eugene согласно существующему описанию (см. Gaspar et al., "EuGene: maximizing synthetic gene design for heterologous
expression," Bioinformatics 28:2683-84 (2012)); и отслеживали ряд параметров использования кодонов, таких как индекс адаптации кодонов (CAI) и относительная частота использования синонимичного кодона (RSCU) (таблица 5). Все варианты корректировали до CAI > 83% и RSCU > 1,63, при том, что исходная последовательность FVIII сделециями в В-домене до оптимизации имела CAI, равный 74%, и RSCU, равную 1,12 (таблица 5). Таблица 5: Параметры оптимизации кодонов
Исход ный BDD FVIII
coFVIII -3
coFVIII -4
coFVIII -5
coFVIII -6
coFVIII -52
coFVIII -62
coFVIII -25
coFVI II-26
Индекс адаптации кодонов (CAI; %)
Частота использования оптимальных кодонов (FOP)
Содержание GC (%)
44,10
52,10
60,80
55,7
55,9%
58,30
58,30
57,30
57,60
Относительная частота
использования синонимичного кодона (RSCU)
1,12
2,32
2,72
1,63
1,63
2,22
2,19
2,04
2,58
Смещение пар кодонов
0,19
0,43
0,04
0,11
0,11
0,27
0,27
0,23
0,48
Эффективное число кодонов
54,2
25,6
22,8
39,7
39,1
30,9
31,4
34,1
26,7
[0445] Помимо общего увеличения CAI, для указанных восьми вариантов было
предусмотрено три класса, основанных на распределении CAI в кодирующей области, представленных на фиг. 2, со сравнением с неоптимизированной последовательностью BDD FVIII (фиг. 2А). Первый класс включает варианты BDD FVIII с равномерным распределением высокого CAI во всей кодирующей области (см. фиг. 2C-2F). Первый класс включает coFVIII-З (фиг. 2С), coFVIII-4 (фиг. 2D), coFVIII-5 (фиг. 2Е), coFVIII-6 (фиг. 2F), а также ранее описанный coFVIII-1 (см. международную публикацию №WO 2014/127215 (SEQ ID NO: 1)) (фиг. 2B). Второй класс включает варианты BDD-FVIII с более
низким CAI на N-концевой половине кодирующей последовательности и более высоким
CAI на С-концевой половине кодирующей последовательности (см. фиг. 2G и 2Н). Второй
класс включает coFVIII-52 (фиг. 2G) и coFVIII-62 (фиг. 2Н). Третий класс содержит варианты
BDD FVIII с более высоким CAI на N-концевой половине кодирующей последовательности
и более низким CAI на С-концевой половине кодирующей последовательности (см. фиг. 21
и 2J). Третий класс включает coFVIII-25 (фиг. 21) и coFVII 1-26 (фиг. 2J).
[0446] Без связи с конкретной теорией, было выдвинуто предположение, что более
высокий CAI может коррелировать с более быстрой трансляцией белка, и указанные три класса могут соответствовать разным скоростям в течение полного цикла синтеза белка. Например, трансляция области, имеющей более низкий CAI, может происходить медленно относительно трансляции области, имеющей более высокий CAI. В таком случае трансляция, например, N-концевой половины coFVIII-52 белка coFVIII-62, которая имеет более низкий CAI, может изначально происходить медленно и сопровождаться последующей более быстрой трансляцией С-концевой половины, имеющей более высокий CAI. Это может быть благоприятным для укладки белка и посттрансляционной модификация во время трансляции без замедления процесса синтеза белка в целом. Противоположный эффект можно наблюдать для вариантов coFVIII-25 и coFVIII-26, имеющих более высокий CAI N-концевой половины и более низкий CAI С-концевой половины.
[0447] Для обеспечения стабильности мРНК все кодон-оптимизированные
варианты FVIII были скорректированы с устранением нескольких сайтов, в том числе скрытых сайтов сплайсинга, сайтов полиаденилирования незрелых последовательностей, мотивов нестабильности РНК (ARE) и последовательностей повторов, и для коррекции содержания GC (см. таблицу 2).
Пример 2. Клонирование и экспрессия вариантов coFVIII с плазмиды pcDNA3
[0448] Экспрессионные плазмиды, содержащие различные варианты FVIII,
разрабатывали для экспрессии in vivo. Неоптимизированные полинуклеотиды BDD FVIII (фиг. 11; SEQ ID NO: 16) и coFVIII-1 (фиг. 11Z; SEQ ID NO: 68) клонировали в остов pcDNA3 (Invitrogen), при этом промотор CMV заменяли на промотор ЕТ (см. фиг. 3). Итоговые плазмиды, FVIII-311 (BDD FVIII) и FVIII-303 (coFVIII-1), управляют экспрессией неоптимизированных BDD FVIII и coFVIII-1, соответственно.
[0449] Экспрессию FVIII-311 и FVIII-303 in vivo оценивали на мышах НетА путем
гидродинамической инъекции ДНК FVIII-303 или FVIII-311 в дозе 5 мкг/мышь. Образцы плазмы собирали через 24, 48 и 72 часа после инъекции, и определяли активность FVIII с применением специфического хромогенного анализа на FVIII.
[0450] Как видно на фиг. 4, активность FVIII в плазме мышей, получавших лечение
FVIII-311 (BDD FVIII; квадраты), составляла 74 ± 43 мЕ/мл через 72 часа после инъекции, тогда как активность FVIII в плазме мышей, получавших лечение FVIII-303 (coFVIII-1;
кружки), составляла 452 ± 170 мЕ/мл через 72 часа после инъекции (фиг. 4). Указанный результат соответствует приблизительно шестикратному увеличению экспрессии coFVI 11-1 относительно неоптимизированного BDD FVIII.
Пример 3. Клонирование и экспрессия вариантов coFVIII с применением лентивирусной векторной системы
[0451] Для дополнительной оценки уровня экспрессии кодон-оптимизированных
вариантов BDD FVIII кодирующие последовательности клонировали в лентивирусные плазмиды под контролем промотора ЕТ (см. источники: Amendola et al., "Coordinate dual-gene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters," Nature Biol. 23:108-16 (2005); международная публикация WO 2000/066759 A1). Плазмидная карта pLV-coFVIII-52 представлена на фиг. 5; плазмиды, содержащие неоптимизированный BDD FVIII (LV-2116), coFVIII-1 (LV-coFVIII-1), coFVIII-3 (LV-coFVIII-3), coFVIII-4 (LV-coFVIII-4), coFVIII-5 (LV-coFVIII-5), и coFVIII-6 (LV-coFVIII-6), coFVIII-62 (LV-coFVIII-62), coFVIII-25 (LV-coFVIII-25) и coFVIII-26 (LV-coFVIII-26), конструировали таким же способом, за исключением того, что в каждом случае фрагмент coFVIII-52 заменяли на заданную кодирующую последовательность с применением сайтов Nhel и Sail (таблица 6). Таблица 6: Экспрессионные плазмиды, кодирующие варианты FVIII
Идентификатор плазмиды
Описание
FVIII-303 (coFVIII-1)
coFVIII-1 под контролем промотора ET в pcDNA3
FVIII-311 (BDD FVIII)
Исходный BDD-FVIII под контролем промотора ЕТ в pcDNA3
LV-2116 (BDD FVIII)
Исходный BDD-FVIII под контролем промотора ЕТ в лентивирусной плазмиде
LV-coFVIII-1
coFVIII-1 под контролем промотора ЕТ в лентивирусной плазмиде
LV-coFVIII-3
coFVIII-З под контролем промотора ЕТ в лентивирусной плазмиде
LV-coFVIII-4
coFVIII-4 под контролем промотора ЕТ в лентивирусной плазмиде
LV-coFVIII-5
coFVIII-5 под контролем промотора ЕТ в лентивирусной плазмиде
LV-coFVIII-6
coFVIII-6 под контролем промотора ЕТ в лентивирусной плазмиде
LV-coFVIII-52
coFVIII-52 под контролем промотора ЕТ в лентивирусной плазмиде
LV-coFVI 11-62
coFVI 11-62 под контролем промотора ET в лентивирусной плазмиде
LV-coFVI 11-25
со FVIII-25 под контролем промотора ЕТ в лентивирусной плазмиде
LV-coFVI 11-26
coFVI 11-26 под контролем промотора ЕТ в лентивирусной плазмиде
[0452] Лентивирусные кодон-оптимизированные варианты FVIII оценивали у мышей
НетА путем гидродинамической инъекции в дозе 5 мкг ДНК/мышь (фиг. 6А, 6В) или 20 мкг ДНК/мышь (фиг. 6С). Как видно на фиг.6, для каждого из coFVIII-З (фиг. 6А; треугольники), соFVIII-4 (фиг. 6А; перевернутые треугольники), coFVIII-5 (фиг. 6А; ромбы), coFVIII-6 (фиг. 6А; незакрашенные кружки), coFVIII-25 (фиг. 6В; треугольники), coFVIII-26 (фиг. 6В; перевернутые треугольники), coFVI 11-52 (фиг. 6С; квадраты) и coFVI 11-62 (фиг. 6С; закрашенные кружки) наблюдалась более высокая активность FVIII по сравнению с coFVIII-1 (фиг. 6А, кружки; фиг. 6В, кружки; и фиг. 6С, треугольники). В частности, для coFVIII-25 и coFVIII-26 наблюдался аналогичный уровень экспрессии через 72 часа после инъекции, обеспечивающий активность, приблизительно в 3 раза превышающую активность, обеспечиваемую coFVI 11-1 (фиг. 6В), что транслируется в 24-кратно повышенную активность FVIII по сравнению с неоптимизированным исходным BDD FVIII (см. фиг. 4). Как coFVIII-52 (квадраты), так и coFVIII-62 (закрашенные кружки) обеспечивали даже более высокий уровень экспрессии через 72 часа после инъекции, с наблюдаемым 6-кратным и 4-кратным увеличением экспрессии, соответственно, относительно со FVIII-1 (треугольники), и 50-кратным и 30-кратным увеличением экспрессии, соответственно, относительно неоптимизированного исходного BDD FVIII (незакрашенные кружки) (фиг. 6С). Эти данные показывают, что комбинация более низкого CAI на N-концевой половине кодирующей последовательности и более высокого CAI на С-концевой половине кодирующей последовательности может быть более благоприятной для экспрессии FVIII, чем обратное распределение CAI.
Пример 4: Долгосрочная лентивирусная экспрессия кодон-оптимизированных вариантов FVIII у мышей НетА
[0453] Для вариантов, идентифицированных как запускающие высокие уровни
экспрессии FVIII у мышей НетА через 72 часа после гидродинамической инъекции, оценивали долгосрочную экспрессию FVIII путем опосредованного лентивирусными векторами переноса генов. Лентивирусные векторы продуцировали в клетках 293Т посредством транзиентной трансфекции и концентрировали путем ультрацентрифугирования приблизительно до 5Е9 ТЕ/мл. Затем указанные лентивирусные векторы вводили 12-14-дневным мышам НетА путем ретроорбитальной инъекции в дозе 1Е8 ТЕ/мышь. Через 21 день после лентивирусной инъекции средняя
активность FVIII в плазме составляла приблизительно 0,04 МЕ/мл у мышей, которым инъецировали LV-2116 (BDD FVIII; фиг. 7). Каждый из coFVIII-1, coFVIII-5, coFVIII-52, соFVIII-6 и coFVIII-62 обеспечивал более высокий уровень FVIII в кровотоке через 21 день после инъекции относительно контрольного LV-2116 (неоптимизированного FVIII с делециями в В-домене). В частности, инъекция coFVI11-1 и coFVIII-5 обеспечивала уровни активности FVIII в плазме, составляющие приблизительно 1,8 МЕ/мл, coFVIII-52 обеспечивал уровень активности FVIII в плазме, составляющий приблизительно 4,9 МЕ/мл, соFVIII-6 обеспечивал уровни активности FVIII в плазме, составляющий приблизительно 4,6 МЕ/мл; и coFVIII-62 обеспечивал уровень активности FVIII в плазме, составляющий приблизительно 2,5 МЕ/мл, через 21 день после инъекции (фиг. 7). Уровни FVIII в плазме, наблюдаемые у мышей, которым инъецировали LV-coFVIII-6 и LV-coFVIII-52, 4,6 МЕ/мл и 4,9 МЕ/мл, соответственно, более чем 100-кратно превышают уровни в плазме, наблюдаемые у мышей, которым инъецировали контрольный LV-2116 (неоптимизированный BDD-FVIII). Пример 5. Слитые конструкции coFVIII-XTEN
[0454] Тестировали способность XTEN к улучшению равновесной экспрессии FVIII.
Сначала кодирующую последовательность XTEN размером 144 аминокислот ("XTENH4"; SEQ ID NO: 18) инсертировали в положении нуклеотида 1193 (или после первых 764 аминокислот кодируемого полипептида) coFVIII-52 и coFVIII-1 с получением coFVIII-52-XTEN (фиг. 8А; SEQ ID NO: 19) и coFVIII-1-XTEN (фиг. 8В; SEQ ID NO: 20), соответственно. Затем последовательность coFVIII-1-XTEN клонировали в остов pcDNA3 (Invitrogen) под контролем промотора ЕТ, согласно описанию выше, для создания экспрессионной плазмиды FVIII-306; и последовательность coFVIII-52-XTEN клонировали в лентивирусную плазмиду под контролем промотора ЕТ, согласно описанию выше, для создания pLV-coFVIII-52-XTEN (фиг. 9). FVIII-306 (coFVI 11-1 -XTEN) вводили мышам НетА в дозе 5 мкг ДНК/мышь путем гидродинамической инъекции. По сравнению с FVIII-303 (coFVIII-1; фиг. 10А, маленькие кружки) и FVIII-311 (BDD FVIII; фиг. 10А, квадраты) слияние XTEN144 С coFVIII-1 (FVIII-306; фиг. 10А, большие кружки) обеспечивало приблизительно 5-кратное и 33-кратное повышение экспрессии FVIII, соответственно, у мышей НетА через 72 часа после инъекции. Эффект инсерции XTEN на экспрессию FVIII также оценивали у мышей НетА с применением лентивирусного вектора (фиг. 10В). LV-coFVIII-52-XTEN вводили 12-14-дневным мышам НетА в дозе 1Е8 ТЕ/мышь путем ретроорбитальной инъекции. По сравнению с LV-coFVIII52 и LV-2116 (BDD-FVIII) слияние XTENi44 с coFVIII-52 (фиг. 10В) обеспечивало приблизительно 4-кратное и 450-кратное повышение экспрессии FVIII, соответственно, у мышей НетА через 21 день после инъекции.
[0455] Лентивирусные векторы, содержащие каждый из coFVIII-3, co-FVIII-4,
coFVIII-5, coFVIII-6, coFVIII-62, coFVIII-25 и coFVIII-26, слитые сXTENm и с промотором ЕТ,
получают согласно описанию выше. Тестируют экспрессию белков FVIII указанными векторами.
Пример 6. Экспрессия конструкций coFVIII
[0456] Кодон-оптимизированные варианты FVIII клонировали в лентивирусные
плазмиды, что иллюстрирует фиг. 9, с применением стандартных техник молекулярного
клонирования. Лентивирусные векторы затем продуцировали в клетках НЕК293
посредством транзиентной трансфекции и выделяли ультрацентрифугированием.
[0457] Лентивирусные векторы с FVIII вводили мышам НетА возрастом 14 дней
путем внутривенной инъекции варианта LV-FVIII в дозе 1,5Е10 ТЕ/кг. Активность FVIII в плазме измеряли на 21 день после лечения LV-FVIII; число копий вектора (VCN) на клетку измеряли в образцах некропсии печени, собранных у получавших лечение LV-FVIII животных на 150 день после лечения LV-FVIII. В то время как значения VCN были аналогичными у всех животных независимо от того, какие из вариантов LV-FVIII вводили (фиг. 12В), уровни активности FVIII у животных, получавших лечение вариантами coFVIII, в 30-100 раз превышали уровни у животных, получавших лечение wtBDD-FVIII (фиг. 12А и 12С; таблица 7). Эти данные показывают, что оптимизация кодонов FVIII улучшает экспрессию FVIII в случае лентивирусного вектора.
Пример 7. Опосредованный экспрессией трансгена FVIII иммунный ответ у мышей НетА после лентивирусного лечения
[0458] У получавших лечение LV-FVIII мышей из примера 6 оценивали
долгосрочную экспрессию FVIII и образование антител против FVIII. Экспрессия FVIII, что подтверждается активностью FVIII в плазме, варьировала среди животных в пределах одной группы лечения (фиг. 13А). Например, у трех мышей (обозначенных 1, 2 и 3), получавших лечение лентивирусным вектором, экспрессирующих вариант coFVIII-5, наблюдалась устойчивая экспрессия FVIII на протяжении приблизительно 16 недель, тогда как у трех однопометных животных (обозначенных 4, 5 и 6), которые получали лечение тем же лентивирусным вектором, наблюдалось резкое снижение уровней активности FVIII в плазме приблизительно через 10 недель после лечения (фиг. 13А). Устойчивая активность FVIII в плазме, наблюдаемая у мышей 1, 2 и 3, коррелировала с недетектируемыми или очень низкими уровнями антител против FVIII (фиг. 13В; мыши 1, 2 и 3). И напротив, у мышей, у которых наблюдалось резкое снижение активности FVIII в плазме, также наблюдалось увеличение уровней антител против FVIII (фиг. 13В; мыши 4, 5 и 6). Эти данные предполагают, что экспрессия трансгена FVIII индуцирует образование антител против FVIII в подгруппе животных, и образующиеся в итоге антитела против FVIII элиминировали трансгенный белок FVIII из кровотока.
[0459] Оценивали взаимосвязь между экспрессией FVIII и образование антител
против FVIII. Получавших лечение LV-FVIII мышей из примера 6 разделяли на две группы: мыши, отрицательные по антителу против FVIII, и мыши, положительные по антителу против FVIII. Как видно на фиг.14, экспрессия трансгенного FVIII на физиологических уровнях не индуцирует иммунный ответ на трансгенный FVIII (фиг. 14, кружки). Однако, превышающая физиологические уровни экспрессия FVIII, по-видимому, индуцирует образование антител против FVIII; таким образом, чем выше уровень экспрессии FVIII, тем выше вероятность индукции антитела против FVIII. Эти данные предполагают, что благоприятным может быть поддержание физиологических уровней экспрессии FVIII у пациентов, получающих генную терапию FVIII.
[0460] Для определения того, приводит ли индуцируемый экспрессией FVIII
иммунный ответ к утрате экспрессирующих трансген клеток печени, оценивали число копий вектора (фиг. 15) и уровень транскрипции РНК FVIII (фиг. 16) в образцах некропсии печени положительных и отрицательных по антителу против FVIII мышей. Как видно на фиг.15, распределение числа копий вектора было одинаковым у положительных и отрицательных по антителу против FVIII мышей, что указывает на сохранение клеток, интегрировавших LV-FVIII, несмотря на выработку антитела против FVIII. Это предполагает, что опосредованная LV-FVIII трансгенная экспрессия FVIII не индуцирует ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) против экспрессирующих FVIII клеток печени. Для дополнительного подтверждения указанных результатов оценивали транскрипцию РНК
FVIII по гибридизации РНК in situ (фиг. 16С и 16D). К моменту взятия образцов печени у мыши coFVIII-52-В отсутствовал детектируемый FVIII в кровотоке и высокий уровень антител против FVIII (фиг. 16А и 16В). Однако сигнал транскрипции РНК и число положительных по РНК FVIII клеток в ткани печени от мыши coFVIII-52-В были сопоставимы с показателями мыши FVIII-52-A, у которой содержалось приблизительно 4 МЕ/мл FVIII в кровотоке в момент некропсии. Таким образом, экспрессия FVIII не индуцировала ответ CTL у экспериментальных мышей НетА.
Пример 8. Долгосрочная экспрессия FVIII у получающих лечение LV-FVIII новорожденных мышей НетА
[0461] Для оценки эффективности применения лентивирусной системы для
лечения педиатрических HemA-пациентов путем нацеливания на печень 2-дневным мышам НетА вводили путем инъекции в височную вену приблизительно 1,5 ЕЮ ТЕ/кг LV-coFVI II-52XTEN, LV-coFVI II6-XTEN или лентивирусного вектора, экспрессирующего wtBDD-FVIII. Устойчивая долгосрочная экспрессия FVIII наблюдалась в обоих вариантах и контроле, демонстрируя, что целостный каскад экспрессии FVIII сохранялся в делящихся клетках печени получавших лечение мышей (фиг. 17). Эти данные предполагают, что LV-FVIII может потенциально быть использован для лечения как педиатрических, так и взрослых HemA-пациентов.
Пример 9. Оценка LV-FVIII у новорожденных собак НетА
[0462] Для дополнительной оценки эффективности LV-FVIII в моделях на более
крупных животных двум новорожденным недельным щенкам НетА (обозначенным S3 и К4) вводили путем внутривенной инъекции 1,3 х Ю9 ТЕ/кг LV-coFVIII-6-XTEN. Указанная доза была более чем в 10 раз ниже дозы, ранее использованной в моделях на мышах НетА. После введения лентивирусных векторов активность FVIII в плазме отслеживали с применением одноэтапного анализа свертывания (АЧТВ) (фиг. 18), а гемостаз цельной крови - с применением ротационного тромбоэластометрического (ROTEM) анализа (фиг. 19A-19D). До лечения LV-FVIII уровень FVIII у S3 составлял 0,7% от нормального (фиг. 18). После лечения лентивирусным вектором уровень FVIII у S3 увеличивался до 79% и 103% от нормального на 7 день и 14 день, соответственно (фиг. 18). У К4 уровень до FVIII введения составлял 1,4% от нормального (фиг. 18). После лечения лентивирусным вектором уровень FVIII увеличивался до 22% и 25% от нормального на 6 день и 14 день, соответственно (фиг. 18).
[0463] В соответствии с уровнем FVIII, у обоих животных наблюдалась
нормализация результатов ROTEM через 2 недели после лечения (фиг. 19А-19С), что демонстрирует благоприятный терапевтический эффект, опосредованный LV-FVIII. Терапевтически благоприятный уровень экспрессии FVIII, обеспечиваемый LV-FVIII у собаки НетА, подтверждает потенциал для применения LV-FVIII для лечения гемофилии А.
Пример 10. Оценка LV-FVIII у новорожденных мышей НетА
[0464] Генная терапия лентивирусными векторами (LV) ex vivo для замещения
генов продемонстрировала клиническую эффективность для нескольких показаний, и
многолетнее наблюдение у получавших пациенты не выявило данных, которые
свидетельствовали бы о туморогенезе. Системная доставка LV-FIX опосредует устойчивую
экспрессию FIX и хорошо переносится в моделях гемофилии на животных. Большая
пакующая емкость, способность к поддержанию долгосрочной трансгенной экспрессии за
счет генной интеграции, отсутствие пред существующих антител против LV в популяциях
человека и обнадеживающие профили in vivo, продемонстрированные в доклинических и
клинических условиях, делают LV многообещающей основой для доставки генов in vivo, в
частности, кандидатных генов с кДНК большого размера, таких как FVIII.
[0465] Для оценки потенциала применения LV-FVIII для лечения гемофилии А
(НетА) кодон-оптимизированные варианты FVIII человека (hFVIII), помещенные под
контроль специфического для гепатоцитов промотора, встраивали в систему LV, которая
содержит несколько копий микроРНК-142 целевых последовательностей для минимизации
экспрессии FVIII в антигенпрезентирующих клетках и снижения вероятности индукции
антител против FVIII. Векторы LV-hFVIII получали путем транзиентной трансфекции клеток
293Т, с последующей 1000-кратной концентрацией путем ультрацентрифугирования и
оценкой в моделях НетА на мышах. После внутривенного введения LV-hFVIII отслеживали
уровень hFVIII в кровотоке по активности FVIII и анализам на антигены, оценивали
эффективность LV-трансдукции в печени путем измерения числа копий ДНК LV с
применением количественной ПЦР и трансгенной РНК посредством гибридизации in situ; и
измеряли антитела против hFVIII с применением ИФА ELISA на антитело против hFVIII.
[0466] Устойчивая экспрессия FVIII наблюдалась для всех вариантов LV-hFVIII у
мышей НетА, которые получали лечение в неонатальном периоде. В дозе 1.5Е10 единиц трансдукции/кг LV, кодирующий кодон-оптимизированный hFVIII (LV-cohFVIII) обеспечивал 30-100-кратно более высокие уровни FVIII в кровотоке по сравнению с LV, кодирующим hFVIII дикого типа (фиг. 12С), при этом число копий вектора в клетках печени и процент положительных по РНК FVIII клеток было сопоставимым во всех протестированных группах (фиг. 12В). Комбинация оптимизации кодонов с XTEN (LV-cohFVIII-XTEN), неструктурированным гидрофильным полипептидом, который, предположительно, увеличивает время полужизни в кровотоке посредством увеличения гидродинамического размера нагрузки, приводила к активность FVIII 30-50 МЕ/мл в плазме, что соответствует 3000-5000% от нормального уровня FVIII в кровотоке (фиг. 12А, фиг. 17). Кроме того, антитела против hFVIII были детектированы только у мышей с уровнем hFVIII выше физиологического (фиг. 14), однако ответ цитотоксических Т-лимфоцитов против трансдуцированных LV клеток у положительных по антителу против hFVIII мышей не наблюдался (фиг. 15 и 16A-16D). Полученный авторами изобретения результат
подтверждает потенциал дальнейшей разработки LV-FVIII для генной терапии гемофилии A in vivo.
[0467] Приведенное выше описание специфических вариантов реализации
раскрывает общую природу настоящего изобретения настолько подробно, что другие смогут, используя сведения, известные из уровня техники, без излишнего экспериментирования легко модифицировать и/или адаптировать для различных вариантов применения такие специфические варианты реализации, не отступая от общих принципов настоящего изобретения. Соответственно, предполагается, что такие адаптации и модификации соответствуют сути и входят в диапазон эквивалентов описанных вариантов реализации, на основании принципов и указаний, изложенных в настоящем документе. Следует понимать, что формулировки или терминология в настоящем документе приведены для описания, а не для ограничения, таким образом, терминология или формулировки в настоящем описании должны быть интерпретированы специалистом в свете изложенных принципов и указаний.
[0468] Другие варианты реализации настоящего изобретения будут очевидны
специалистам в данной области техники после изучения настоящего описания и практической реализации изобретения согласно описанию в настоящем документе. Предполагается, что настоящее описание и примеры являются иллюстративными, при этом объем и сущность настоящего изобретения определены приведенной формулой изобретения.
[0469] Все патенты и публикации, упоминаемые в настоящем документе, полностью
включены в настоящий документ посредством ссылок.
[0470] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительных
заявок на патент США №62/289696, поданной 1 февраля 2016 г., и №62/409739, поданной 18 октября 2016 г., полностью включенных в настоящий документ посредством ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> BIOVERATIV THERAPEUTICS INC./ БИОВЕРАТИВ ТЕРАПЕВТИКС ИНК.
<120> OPTIMIZED FACTOR VIII GENES/ ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ ГЕНЫ ФАКТОРА VIII
<130> 2159.469PC02
<150> 62/409739 <151> 2016-10-18
<150> 62/289696
<151> 2016-02-01 <160> 103
<170> PatentIn, версия 3.5
<210> 1 <211> 4374
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-5 <400> 1
atgcaaatcg aactgagcac ctgtttcttc ctctgcctgc tgagattctg tttctccgcg 60
acccgccgat actacctggg agcagtggag ctctcctggg attacatgca gagcgacctt 120
ggggagctgc ccgtggatgc caggttccct ccccgggtgc caaagtcgtt tccgttcaac 180
acctccgtgg tgtacaagaa aactctgttc gtggagttca ccgaccacct gttcaatatc 240
gccaagccca gacctccctg gatggggctg ttgggaccta ccatccaagc ggaggtgtac 300
gacactgtgg tcatcactct gaagaacatg gcctcgcatc ccgtgtccct gcacgccgtg 360
ggagtgtctt actggaaagc gtccgagggg gccgaatacg acgaccagac ctcgcagaga 420
gaaaaggaag atgacaaggt gttcccagga ggatcgcaca cctacgtgtg gcaagtgttg 480
aaggagaacg gcccaatggc ctccgacccg ctgtgcctga cctactcgta cctgtcccac 540
gtggacctcg tgaaggacct caactcggga ctgattggag ccctgctggt ctgcagggaa 600
ggctcactgg cgaaagaaaa gactcagacc ttgcacaagt tcattctgct gttcgctgtg 660
ttcgacgagg ggaagtcgtg gcacagcgag actaagaact ccctgatgca agatagagat 720
gccgcctccg cccgggcctg gcctaagatg cacaccgtga acggttacgt gaaccgctcc 780
ctccctggcc tgattggatg ccaccggaag tccgtgtact ggcacgtgat cgggatgggg 840
accacccccg aggtgcacag catcttcctg gaaggtcaca catttctcgt gcgcaaccac 900
cggcaggcct ccctggaaat cagccccatt accttcctca ctgcccagac tctgctgatg 960
gacctgggac agttcctgct gttctgccat atctcctccc accaacatga cggaatggag 1020
gcatacgtga aggtcgattc ctgccctgag gaaccccagc tccgcatgaa gaacaatgag 1080
gaagccgagg actacgacga cgacctgacg gatagcgaga tggatgtggt ccggttcgat 1140
gacgataaca gcccttcctt catccaaatt cgctcggtgg caaagaagca ccccaagacc 1200
tgggtgcatt acattgcggc ggaagaagag gactgggatt atgccccgct tgtcctcgct 1260
cctgacgacc ggagctacaa gagccagtac ctgaacaacg gtccacagag gatcggtaga 1320
aagtacaaga aggtccgctt catggcctat accgacgaaa ccttcaaaac tagagaggcc 1380
atccaacacg aatccggcat cctgggcccg ctcttgtacg gagaagtcgg cgacaccctt 1440
ctcattatct tcaagaacca ggcttcccgg ccgtacaaca tctatccgca tgggatcact 1500
gacgtgcgcc cactgtactc gcggcgcctg cccaagggtg tcaaacacct gaaggatttt 1560
ccgatccttc cgggagaaat cttcaagtac aagtggaccg tgaccgtgga agatggccca 1620
actaagtctg accctagatg cctcacccgc tactactcat ccttcgtcaa catggagcgc 1680
gacctggcca gcggactgat cggcccgctg ctgatttgct acaaggaatc agtggaccaa 1740
cggggaaacc agatcatgtc ggataagagg aacgtcatcc tcttctccgt gtttgacgaa 1800
aaccggtcgt ggtacctgac tgaaaacatc cagcggttcc tccccaaccc cgcgggcgtg 1860
cagctggaag atcctgagtt tcaggcatca aacatcatgc actccattaa cggctacgtg 1920
ttcgattcgc tgcagctgag cgtgtgtctg cacgaagtgg cctactggta catcctgtcc 1980
attggtgccc agactgactt cctgtccgtg tttttctccg gctacacgtt caagcacaag 2040
atggtgtacg aggacaccct gaccctcttc cctttttccg gcgaaactgt gtttatgagc 2100
atggagaatc ccggcctgtg gatcttgggc tgccacaaca gcgacttccg taacagagga 2160
atgactgcgc tgctcaaggt gtccagctgc gacaagaaca ccggagacta ttatgaggac 2220
tcatacgagg acatctccgc ctacctcctg tccaagaata acgccattga acctcggagc 2280
ttcagccaga acccacccgt gcttaagaga catcaacggg agatcactag gaccaccctg 2340
cagtcagacc aggaggaaat cgactacgat gacaccatct cggtcgagat gaagaaggag 2400
gactttgaca tctacgacga agatgaaaac cagagcccga ggtcgttcca aaagaaaacc 2460
cgccactact ttattgctgc tgtcgagcgg ctgtgggact acggaatgtc gtcctcgccg 2520
cacgtgctcc gcaaccgagc ccagagcggc tcggtgccgc aattcaagaa ggtcgtgttc 2580
caggagttca ctgacgggag cttcactcag cctttgtacc ggggagaact caatgaacat 2640
ctcggcctcc tcggacctta catcagagca gaagtggaag ataacatcat ggtcactttc 2700
cgtaaccaag ccagccgccc gtactcgttc tactcctccc tcatttctta cgaagaggac 2760
cagcggcagg gcgcagaacc gcgcaagaac ttcgtgaagc ccaacgaaac caagacctac 2820
ttctggaaag tgcagcatca tatggccccg actaaggacg agtttgactg caaagcctgg 2880
gcctacttct ccgatgtgga cttggagaag gacgtccact ccggcctcat cggtcccctg 2940
ctcgtgtgcc ataccaatac cctgaacccc gcacacggtc gccaggtcac cgtgcaggag 3000
ttcgctctgt tcttcactat cttcgacgaa actaagtcct ggtacttcac cgagaacatg 3060
gagaggaact gcagagcccc ctgtaacatc cagatggagg acccgacgtt caaggaaaac 3120
taccggttcc acgccattaa cggatacatc atggatacgc tgccgggtct tgtgatggcc 3180
caggatcaac ggatcagatg gtacttattg tcgatgggca gcaacgagaa catccactct 3240
attcacttct ccggtcatgt gttcactgtg cggaagaagg aagagtacaa gatggccctg 3300
tacaaccttt atcccggagt gttcgaaact gtggaaatgc tgccgtcgaa ggccggcatt 3360
tggcgcgtgg agtgtttgat tggagaacat ctccatgcgg ggatgtcaac cctgttcctg 3420
gtgtatagca acaagtgcca gactccgctt gggatggcgt caggacacat tagggatttc 3480
cagatcactg cgtccggcca gtacggccaa tgggccccta agctggcccg cctgcattac 3540
tccggatcca ttaacgcctg gtcaaccaag gagccattct cctggatcaa ggtggacctt 3600
ctggccccca tgattatcca cggaattaag acccaggggg cccggcagaa gttctcctca 3660
ctgtacatca gccagttcat aatcatgtac tccctggacg gaaagaagtg gcaaacctac 3720
agggggaaca gcaccggcac actgatggtc tttttcggaa atgtggactc ctccgggatt 3780
aagcataaca tcttcaaccc tccgattatc gctcggtaca ttagacttca ccctacccac 3840
tacagcattc gctccaccct gcggatggaa ctgatgggct gcgatctgaa ctcgtgcagc 3900
atgccgttgg gaatggagtc caaagcaatt tccgacgcgc agatcaccgc ctcgtcctac 3960
tttaccaaca tgttcgccac gtggtcaccg tccaaggccc ggctgcacct ccagggaaga 4020
tccaacgcat ggcggccaca ggtcaacaac cctaaggagt ggctccaggt ggacttccag 4080
aaaaccatga aggtcaccgg agtcacaacc cagggagtga agtcgctgct gacttctatg 4140
tacgtcaagg agttcctgat ctccagcagc caggacgggc accagtggac cctgttcttc 4200
caaaatggaa aggtcaaggt gtttcagggc aatcaggatt cattcacccc ggtggtgaac 4260
tcccttgatc cacccctcct gacccgctac cttcgcatcc acccacagtc ctgggtgcac 4320
cagatcgcgc tgaggatgga ggtcctggga tgcgaagccc aggacctgta ctga 4374
<210> 2 <211> 4374
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-4 <400> 2
atgcagatcg agctgagcac gtgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttcagcgcc 60
accaggaggt actacctggg cgccgtggag ctgagctggg actacatgca gagcgacctg 120
ggcgagctgc ccgtggacgc caggttcccc cccagggtgc ccaagagctt ccccttcaac 180
acgagcgtgg tgtacaagaa gaccctgttc gtggagttca ccgaccatct gttcaatatc 240
gccaagccca ggcccccctg gatggggctg ctggggccca cgatccaggc cgaggtgtac 300
gacaccgtgg tcatcaccct gaagaacatg gccagccacc ccgtgagcct gcacgccgtg 360
ggcgtgagct actggaaggc cagcgagggc gccgagtacg acgaccagac cagccagagg 420
gagaaggagg acgacaaggt gttccccggc ggcagccaca cctacgtgtg gcaggtgctg 480
aaggagaatg ggcccatggc cagcgacccc ctgtgcctga cctactctta cctgagccac 540
gtggatctgg tgaaggacct gaacagcggc ctgatcggcg ccctgctggt gtgcagggag 600
ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gttcgccgtg 660
ttcgacgagg gcaagagctg gcacagcgag accaagaaca gcctgatgca ggatagggac 720
gccgccagcg ccagggcctg gcccaagatg cacaccgtga acggctacgt gaacaggtct 780
ctgcccggcc tgatcggctg ccacaggaag agcgtgtact ggcacgtgat cggcatgggg 840
accacccccg aggtgcacag catcttcctg gagggccaca cgttcctggt gaggaatcac 900
aggcaggcca gcctggagat cagcccgatc accttcctga ccgcccagac cctgctgatg 960
gacctggggc agttcctgct gttctgccat atcagctctc accagcacga cggcatggag 1020
gcctacgtga aggtggatag ctgccccgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaacgag 1080
gaggccgagg actacgacga cgacctgacc gacagcgaga tggacgtggt gaggttcgac 1140
gacgacaata gcccgagctt catccagatc aggagcgtgg ccaagaagca ccccaagacc 1200
tgggtgcatt acatcgccgc cgaggaggag gattgggact acgcccccct ggtgctggcc 1260
cccgacgaca ggtcttacaa gagccagtac ctgaacaacg ggccccagag gatcggcagg 1320
aagtacaaga aggtgaggtt catggcctac accgacgaga ccttcaagac cagggaggcg 1380
atccagcacg agagcgggat cctggggccc ctgctgtacg gcgaggtggg cgacacgctg 1440
ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccgtacaata tctaccccca cgggatcacc 1500
gacgtgaggc ccctgtactc taggaggctg cccaagggcg tgaagcacct gaaggacttc 1560
cccatcctgc ccggcgagat cttcaagtac aagtggaccg tgaccgtgga ggacgggccc 1620
acgaagagcg accccaggtg cctgaccagg tactacagct ctttcgtgaa catggagagg 1680
gacctggcca gcggcctgat cgggcccctg ctgatctgct acaaggagag cgtggatcag 1740
aggggcaacc agatcatgag cgacaagagg aacgtgatcc tgttcagcgt gttcgacgag 1800
aataggtctt ggtacctgac cgagaatatc cagaggttcc tgcccaaccc cgccggcgtg 1860
cagctggagg atcccgagtt ccaggccagc aacatcatgc acagcatcaa cggctacgtg 1920
ttcgacagcc tgcagctgag cgtgtgcctg cacgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980
atcggcgccc agaccgactt cctgagcgtg ttcttcagcg gctacacctt caagcacaag 2040
atggtgtacg aggataccct gaccctgttc cccttcagcg gcgagaccgt gttcatgagc 2100
atggagaacc ccggcctgtg gatcctgggc tgccataact ccgacttcag gaataggggc 2160
atgaccgccc tgctgaaggt gagctcttgc gacaagaaca ccggcgacta ctacgaggat 2220
agctacgagg atatcagcgc ctacctgctg agcaagaaca acgccatcga gcccaggtct 2280
ttcagccaga acccccccgt gctgaagagg caccagaggg agatcaccag gacgaccctg 2340
cagagcgacc aggaggagat cgactacgac gacacgatca gcgtggagat gaagaaggag 2400
gatttcgaca tctacgacga ggacgagaat cagagcccca ggtctttcca gaagaagacc 2460
aggcattact tcatcgccgc cgtggagagg ctgtgggact acggcatgag cagctctccc 2520
cacgtgctga ggaatagggc ccagagcggc agcgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc 2580
caggagttca ccgacggcag cttcacccag cccctgtaca ggggcgagct gaacgagcac 2640
ctgggcctgc tggggcccta catcagggcc gaggtggagg ataacatcat ggtgaccttc 2700
aggaatcagg ccagcaggcc ctatagcttc tatagctctc tgatcagcta cgaggaggat 2760
cagaggcagg gcgccgagcc caggaagaac ttcgtgaagc ccaacgagac caagacctac 2820
ttctggaagg tgcagcacca catggccccc acgaaggacg agttcgactg caaggcctgg 2880
gcctacttca gcgacgtgga tctggagaag gacgtgcaca gcggcctgat cgggcccctg 2940
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaacccc gcccacggca ggcaggtgac cgtgcaggag 3000
ttcgccctgt tcttcaccat cttcgacgag accaagagct ggtacttcac cgagaatatg 3060
gagaggaatt gcagggcccc ctgcaatatc cagatggagg acccgacctt caaggagaat 3120
tacaggttcc acgccatcaa cggctacatc atggacacgc tgcccggcct ggtcatggcc 3180
caggatcaga ggatcaggtg gtatctgctg agcatgggga gcaacgagaa tatccacagc 3240
atccacttca gcggccacgt gttcaccgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg 3300
tacaatctgt accccggcgt gttcgagacc gtggagatgc tgcccagcaa ggccgggatc 3360
tggagggtgg agtgcctgat cggcgagcac ctgcacgccg gcatgagcac gctgttcctg 3420
gtgtactcta acaagtgcca gacccccctg gggatggcca gcggccacat cagggacttc 3480
cagatcaccg ccagcggcca gtacggccag tgggccccca agctggccag gctgcactat 3540
tccggaagca tcaacgcctg gagcacgaag gagcccttca gctggatcaa ggtggatctg 3600
ctggccccca tgatcatcca cgggatcaag acccagggcg ccaggcagaa gttcagctct 3660
ctgtatatca gccagttcat catcatgtac tctctggacg gcaagaagtg gcagacctac 3720
aggggcaaca gcaccggcac gctgatggtg ttcttcggca acgtggactc tagcgggatc 3780
aagcacaata tcttcaaccc ccccatcatc gccaggtaca tcaggctgca ccccacccat 3840
tactctatca ggtctaccct gaggatggag ctgatgggct gcgacctgaa cagctgcagc 3900
atgcccctgg ggatggagag caaggccatc agcgacgccc agatcaccgc cagctcttac 3960
ttcaccaaca tgttcgccac ctggagcccg agcaaggcca ggctgcacct gcagggcagg 4020
tctaacgcct ggaggcccca ggtgaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggatttccag 4080
aagaccatga aggtgaccgg cgtgaccacg cagggcgtga agagcctgct gaccagcatg 4140
tacgtgaagg agttcctgat cagctctagc caggacggcc accagtggac cctgttcttc 4200
cagaacggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggata gcttcacccc cgtggtgaac 4260
agcctggacc cccccctgct gaccaggtat ctgaggatcc acccccagag ctgggtgcac 4320
cagatcgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgcgaggccc aggatctgta ttga 4374
<210> 3 <211> 4374
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-52 <400> 3
atgcaaatcg aactgagcac ctgtttcttc ctctgcctgc tgagattctg tttctccgcg 60
acccgccgat actacctggg agcagtggag ctctcctggg attacatgca gagcgacctt 120
ggggagctgc ccgtggatgc caggttccct ccccgggtgc caaagtcgtt tccgttcaac 180
acctccgtgg tgtacaagaa aactctgttc gtggagttca ccgaccacct gttcaatatc 240
gccaagccca gacctccctg gatggggctg ttgggaccta ccatccaagc ggaggtgtac 300
gacactgtgg tcatcactct gaagaacatg gcctcgcatc ccgtgtccct gcacgccgtg 360
ggagtgtctt actggaaagc gtccgagggg gccgaatacg acgaccagac ctcgcagaga 420
gaaaaggaag atgacaaggt gttcccagga ggatcgcaca cctacgtgtg gcaagtgttg 480
aaggagaacg gcccaatggc ctccgacccg ctgtgcctga cctactcgta cctgtcccac 540
gtggacctcg tgaaggacct caactcggga ctgattggag ccctgctggt ctgcagggaa 600
ggctcactgg cgaaagaaaa gactcagacc ttgcacaagt tcattctgct gttcgctgtg 660
ttcgacgagg ggaagtcgtg gcacagcgag actaagaact ccctgatgca agatagagat 720
gccgcctccg cccgggcctg gcctaagatg cacaccgtga acggttacgt gaaccgctcc 780
ctccctggcc tgattggatg ccaccggaag tccgtgtact ggcacgtgat cgggatgggg 840
accacccccg aggtgcacag catcttcctg gaaggtcaca catttctcgt gcgcaaccac 900
cggcaggcct ccctggaaat cagccccatt accttcctca ctgcccagac tctgctgatg 960
gacctgggac agttcctgct gttctgccat atctcctccc accaacatga cggaatggag 1020
gcatacgtga aggtcgattc ctgccctgag gaaccccagc tccgcatgaa gaacaatgag 1080
gaagccgagg actacgacga cgacctgacg gatagcgaga tggatgtggt ccggttcgat 1140
gacgataaca gcccttcctt catccaaatt cgctcggtgg caaagaagca ccccaagacc 1200
tgggtgcatt acattgcggc ggaagaagag gactgggatt atgccccgct tgtcctcgct 1260
cctgacgacc ggagctacaa gagccagtac ctgaacaacg gtccacagag gatcggtaga 1320
aagtacaaga aggtccgctt catggcctat accgacgaaa ccttcaaaac tagagaggcc 1380
atccaacacg aatccggcat cctgggcccg ctcttgtacg gagaagtcgg cgacaccctt 1440
ctcattatct tcaagaacca ggcttcccgg ccgtacaaca tctatccgca tgggatcact 1500
gacgtgcgcc cactgtactc gcggcgcctg cccaagggtg tcaaacacct gaaggatttt 1560
ccgatccttc cgggagaaat cttcaagtac aagtggaccg tgaccgtgga agatggccca 1620
actaagtctg accctagatg cctcacccgc tactactcat ccttcgtcaa catggagcgc 1680
gacctggcca gcggactgat cggcccgctg ctgatttgct acaaggaatc agtggaccaa 1740
cggggaaacc agatcatgtc ggataagagg aacgtcatcc tcttctccgt gtttgacgaa 1800
aaccggtcgt ggtacctgac cgagaacatc cagaggttcc tgcccaaccc tgctggggtg 1860
cagctggagg accccgagtt ccaggccagc aacatcatgc acagcatcaa tggctacgtg 1920
ttcgacagcc tgcagctgag cgtgtgcctg cacgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980
atcggcgccc agaccgactt cctgagcgtg ttcttctctg gctacacctt caagcacaag 2040
atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttcagcg gggagactgt cttcatgagc 2100
atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaaca gcgacttcag gaacaggggc 2160
atgactgccc tgctgaaagt ctccagctgt gacaagaaca ccggggacta ctacgaggac 2220
agctacgagg acatcagcgc ctacctgctg agcaagaaca atgccatcga gcccaggagc 2280
ttctctcaga accccccagt gctgaagagg caccagaggg agatcaccag gaccaccctg 2340
cagtctgacc aggaggagat cgactatgat gacaccatca gcgtggagat gaagaaggag 2400
gacttcgaca tctacgacga ggacgagaac cagagcccca ggagcttcca gaagaagacc 2460
aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgtc cagcagcccc 2520
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc agcgtgcccc agttcaagaa agtcgtgttc 2580
caggagttca ccgacggcag cttcacccag cccctgtaca gaggggagct gaacgagcac 2640
ctgggcctgc tgggccccta catcagggcc gaggtggagg acaacatcat ggtgaccttc 2700
aggaaccagg ccagcaggcc ctacagcttc tacagcagcc tgatcagcta cgaggaggac 2760
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgaaac caagacctac 2820
ttctggaagg tgcagcacca catggccccc accaaggacg agttcgactg caaggcctgg 2880
gcctacttct ctgacgtgga cctggagaag gacgtgcact ctggcctgat tggccccctg 2940
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag 3000
ttcgccctgt tcttcaccat cttcgatgaa accaagagct ggtacttcac tgagaacatg 3060
gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggagg accccacctt caaggagaac 3120
tacaggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtcatggcc 3180
caggaccaga ggatcaggtg gtatctgctg agcatgggca gcaacgagaa catccacagc 3240
atccacttct ctggccacgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg 3300
tacaacctgt accctggggt gttcgaaacc gtggagatgc tgcccagcaa ggccggcatc 33 60
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcacgccg gcatgagcac cctgttcctg 3420
gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcct ctggccacat cagggacttc 3480
cagatcactg cctctggcca gtacggccag tgggccccca agctggccag gctgcactac 3540
tccggaagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttca gctggatcaa agtggacctg 3600
ctggccccca tgatcatcca cggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttctccagc 3660
ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggacg gcaagaagtg gcagacctac 3720
aggggcaaca gcaccggcac cctgatggtg ttcttcggca acgtggacag cagcggcatc 3780
aagcacaaca tcttcaaccc ccccatcatc gccagataca tcaggctgca ccccacccac 3840
tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa cagctgcagc 3900
atgcccctgg gcatggagag caaggccatc tctgacgccc agatcactgc ctccagctac 3960
ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc agcaaggcca ggctgcacct gcagggcagg 4020
agcaatgcct ggaggcccca ggtcaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag 4080
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtga agagcctgct gaccagcatg 4140
tacgtgaagg agttcctgat ctccagcagc caggacggcc accagtggac cctgttcttc 4200
cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggaca gcttcacccc tgtggtcaac 4260
agcctggacc cccccctgct gaccagatac ctgaggatcc acccccagag ctgggtgcac 4320
cagatcgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggacctgta ctga 4374
<210> 4 <211> 4374
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-62
<400> 4
atgcagattg agctgtccac ttgtttcttc ctgtgcctcc tgcgcttctg tttctccgcc 60
actcgccggt actaccttgg agccgtggag ctttcatggg actacatgca gagcgacctg 120
ggcgaactcc ccgtggatgc cagattcccc ccccgcgtgc caaagtcctt cccctttaac 180
acctccgtgg tgtacaagaa aaccctcttt gtcgagttca ctgaccacct gttcaacatc 240
gccaagccgc gcccaccttg gatgggcctc ctgggaccga ccattcaagc tgaagtgtac 300
gacaccgtgg tgatcaccct gaagaacatg gcgtcccacc ccgtgtccct gcatgcggtc 360
ggagtgtcct actggaaggc ctccgaagga gctgagtacg acgaccagac tagccagcgg 420
gaaaaggagg acgataaagt gttcccgggc ggctcgcata cttacgtgtg gcaagtcctg 480
aaggaaaacg gacctatggc atccgatcct ctgtgcctga cttactccta cctttcccat 540
gtggacctcg tgaaggacct gaacagcggg ctgattggtg cacttctcgt gtgccgcgaa 600
ggttcgctcg ctaaggaaaa gacccagacc ctccataagt tcatcctttt gttcgctgtg 660
ttcgatgaag gaaagtcatg gcattccgaa actaagaact cgctgatgca ggaccgggat 720
gccgcctcag cccgcgcctg gcctaaaatg catacagtca acggatacgt gaatcggtca 780
ctgcccgggc tcatcggttg tcacagaaag tccgtgtact ggcacgtcat cggcatgggc 840
actacgcctg aagtgcactc catcttcctg gaagggcaca ccttcctcgt gcgcaaccac 900
cgccaggcct ctctggaaat ctccccgatt acctttctga ccgcccagac tctgctcatg 960
gacctggggc agttccttct cttctgccac atctccagcc atcagcacga cggaatggag 1020
gcctacgtga aggtggactc atgcccggaa gaacctcagt tgcggatgaa gaacaacgag 1080
gaggccgagg actatgacga cgatttgact gactccgaga tggacgtcgt gcggttcgat 1140
gacgacaaca gccccagctt catccagatt cgcagcgtgg ccaagaagca ccccaaaacc 1200
tgggtgcact acatcgcggc cgaggaagaa gattgggact acgccccgtt ggtgctggca 1260
cccgatgacc ggtcgtacaa gtcccagtat ctgaacaatg gtccgcagcg gattggcaga 1320
aagtacaaga aagtgcggtt catggcgtac actgacgaaa cgtttaagac ccgggaggcc 1380
attcaacatg agagcggcat tctgggacca ctgctgtacg gagaggtcgg cgataccctg 1440
ctcatcatct tcaaaaacca ggcctcccgg ccttacaaca tctaccctca cggaatcacc 1500
gacgtgcggc cactctactc gcggcgcctg ccgaagggcg tcaagcacct gaaagacttc 1560
cctatcctgc cgggcgaaat cttcaagtat aagtggaccg tcaccgtgga ggacgggccc 1620
accaagagcg atcctaggtg tctgactcgg tactactcca gcttcgtgaa catggaacgg 1680
gacctggcat cgggactcat tggaccgctg ctgatctgct acaaagagtc ggtggatcaa 1740
cgcggcaacc agatcatgtc cgacaagcgc aacgtgatcc tgttctccgt gtttgatgaa 1800
aacagatcct ggtacctgac cgagaacatc cagaggttcc tgcccaaccc tgctggggtg 1860
cagctggagg accccgagtt ccaggccagc aacatcatgc acagcatcaa tggctacgtg 1920
ttcgacagcc tgcagctgag cgtgtgcctg cacgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980
atcggcgccc agaccgactt cctgagcgtg ttcttctctg gctacacctt caagcacaag 2040
atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttcagcg gggagactgt cttcatgagc 2100
atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaaca gcgacttcag gaacaggggc 2160
atgactgccc tgctgaaagt ctccagctgt gacaagaaca ccggggacta ctacgaggac 2220
agctacgagg acatcagcgc ctacctgctg agcaagaaca atgccatcga gcccaggagc 2280
ttctctcaga accccccagt gctgaagagg caccagaggg agatcaccag gaccaccctg 2340
cagtctgacc aggaggagat cgactatgat gacaccatca gcgtggagat gaagaaggag 2400
gacttcgaca tctacgacga ggacgagaac cagagcccca ggagcttcca gaagaagacc 2460
aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgtc cagcagcccc 2520
catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc agcgtgcccc agttcaagaa agtcgtgttc 2580
caggagttca ccgacggcag cttcacccag cccctgtaca gaggggagct gaacgagcac 2640
ctgggcctgc tgggccccta catcagggcc gaggtggagg acaacatcat ggtgaccttc 2700
aggaaccagg ccagcaggcc ctacagcttc tacagcagcc tgatcagcta cgaggaggac 2760
cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgaaac caagacctac 2820
ttctggaagg tgcagcacca catggccccc accaaggacg agttcgactg caaggcctgg 2880
gcctacttct ctgacgtgga cctggagaag gacgtgcact ctggcctgat tggccccctg 2940
ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag 3000
ttcgccctgt tcttcaccat cttcgatgaa accaagagct ggtacttcac tgagaacatg 3060
gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggagg accccacctt caaggagaac 3120
tacaggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtcatggcc 3180
caggaccaga ggatcaggtg gtatctgctg agcatgggca gcaacgagaa catccacagc 3240
atccacttct ctggccacgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg 3300
tacaacctgt accctggggt gttcgaaacc gtggagatgc tgcccagcaa ggccggcatc 3360
tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcacgccg gcatgagcac cctgttcctg 3420
gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcct ctggccacat cagggacttc 3480
cagatcactg cctctggcca gtacggccag tgggccccca agctggccag gctgcactac 3540
tccggaagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttca gctggatcaa agtggacctg 3600
ctggccccca tgatcatcca cggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttctccagc 3660
ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggacg gcaagaagtg gcagacctac 3720
aggggcaaca gcaccggcac cctgatggtg ttcttcggca acgtggacag cagcggcatc 3780
aagcacaaca tcttcaaccc ccccatcatc gccagataca tcaggctgca ccccacccac 3840
tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa cagctgcagc 3900
atgcccctgg gcatggagag caaggccatc tctgacgccc agatcactgc ctccagctac 3960
ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc agcaaggcca ggctgcacct gcagggcagg 4020
agcaatgcct ggaggcccca ggtcaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag 4080
aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtga agagcctgct gaccagcatg 4140
tacgtgaagg agttcctgat ctccagcagc caggacggcc accagtggac cctgttcttc 4200
cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggaca gcttcacccc tgtggtcaac 4260
agcctggacc cccccctgct gaccagatac ctgaggatcc acccccagag ctgggtgcac 4320
cagatcgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggacctgta ctga 4374
<210> 5 <211> 4374
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-25 <400> 5
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc 60
accaggagat actacctggg cgccgtggag ctgagctggg actacatgca gtctgacctg 120
ggcgagctgc cagtggacgc caggttcccc cccagagtgc ccaagagctt ccccttcaac 180
accagcgtgg tgtacaagaa gaccctgttc gtggagttca ctgaccacct gttcaacatc 240
gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccca ccatccaggc cgaggtgtac 300
gacaccgtgg tcatcaccct gaagaacatg gccagccacc ccgtctccct gcacgccgtg 360
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggc gccgagtacg acgaccagac cagccagagg 420
gagaaggagg acgacaaggt gttccctggg ggcagccaca cctacgtgtg gcaggtcctg 480
aaggagaacg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctga cctacagcta cctgagccac 540
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag 600
ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gttcgccgtg 660
ttcgacgagg gcaagagctg gcactctgaa accaagaaca gcctgatgca ggacagggac 720
gccgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacaccgtca acggctacgt caacaggagc 780
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag agcgtgtact ggcatgtgat cggcatgggc 840
accacccctg aggtgcacag catcttcctg gagggccaca ccttcctggt caggaaccac 900
aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctga ccgcccagac cctgctgatg 960
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atctccagcc accagcacga cggcatggag 1020
gcctacgtga aagtggacag ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaacgag 1080
gaggccgagg actatgatga cgacctgacc gacagcgaga tggacgtggt caggttcgac 1140
gacgacaaca gccccagctt catccagatc aggagcgtgg ccaagaagca ccccaagacc 1200
tgggtgcact acatcgctgc tgaggaggag gactgggact atgcccccct ggtgctggcc 1260
cctgatgaca ggagctacaa gagccagtac ctgaacaatg gcccccagag gattggcagg 1320
aagtacaaga aagtcaggtt catggcctac actgatgaaa ccttcaagac cagggaggcc 1380
atccagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtacg gggaggtggg ggacaccctg 1440
ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaaca tctaccccca tggcatcacc 1500
gacgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cctaaggggg tgaagcacct gaaagacttc 1560
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggacggcccc 1620
accaagagcg accccaggtg cctgaccaga tactacagca gcttcgtcaa catggagagg 1680
gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag 1740
aggggcaacc agatcatgag cgacaagagg aacgtgatcc tgttctctgt cttcgacgag 1800
aacaggagct ggtacctgac tgaaaacatc cagcggttcc tccccaaccc cgcgggcgtg 1860
cagctggaag atcctgagtt tcaggcatca aacatcatgc actccattaa cggctacgtg 1920
ttcgattcgc tgcagctgag cgtgtgtctg cacgaagtgg cctactggta catcctgtcc 1980
attggtgccc agactgactt cctgtccgtg tttttctccg gctacacgtt caagcacaag 2040
atggtgtacg aggacaccct gaccctcttc cctttttccg gcgaaactgt gtttatgagc 2100
atggagaatc ccggcctgtg gatcttgggc tgccacaaca gcgacttccg taacagagga 2160
atgactgcgc tgctcaaggt gtccagctgc gacaagaaca ccggagacta ttatgaggac 2220
tcatacgagg acatctccgc ctacctcctg tccaagaata acgccattga acctcggagc 2280
ttcagccaga acccacccgt gcttaagaga catcaacggg agatcactag gaccaccctg 2340
cagtcagacc aggaggaaat cgactacgat gacaccatct cggtcgagat gaagaaggag 2400
gactttgaca tctacgacga agatgaaaac cagagcccga ggtcgttcca aaagaaaacc 2460
cgccactact ttattgctgc tgtcgagcgg ctgtgggact acggaatgtc gtcctcgccg 2520
cacgtgctcc gcaaccgagc ccagagcggc tcggtgccgc aattcaagaa ggtcgtgttc 2580
caggagttca ctgacgggag cttcactcag cctttgtacc ggggagaact caatgaacat 2640
ctcggcctcc tcggacctta catcagagca gaagtggaag ataacatcat ggtcactttc 2700
cgtaaccaag ccagccgccc gtactcgttc tactcctccc tcatttctta cgaagaggac 2760
cagcggcagg gcgcagaacc gcgcaagaac ttcgtgaagc ccaacgaaac caagacctac 2820
ttctggaaag tgcagcatca tatggccccg actaaggacg agtttgactg caaagcctgg 2880
gcctacttct ccgatgtgga cttggagaag gacgtccact ccggcctcat cggtcccctg 2940
ctcgtgtgcc ataccaatac cctgaacccc gcacacggtc gccaggtcac cgtgcaggag 3000
ttcgctctgt tcttcactat cttcgacgaa actaagtcct ggtacttcac cgagaacatg 3060
gagaggaact gcagagcccc ctgtaacatc cagatggagg acccgacgtt caaggaaaac 3120
taccggttcc acgccattaa cggatacatc atggatacgc tgccgggtct tgtgatggcc 3180
caggatcaac ggatcagatg gtacttattg tcgatgggca gcaacgagaa catccactct 3240
attcacttct ccggtcatgt gttcactgtg cggaagaagg aagagtacaa gatggccctg 3300
tacaaccttt atcccggagt gttcgaaact gtggaaatgc tgccgtcgaa ggccggcatt 3360
tggcgcgtgg agtgtttgat tggagaacat ctccatgcgg ggatgtcaac cctgttcctg 3420
gtgtatagca acaagtgcca gactccgctt gggatggcgt caggacacat tagggatttc 3480
cagatcactg cgtccggcca gtacggccaa tgggccccta agctggcccg cctgcattac 3540
tccggatcca ttaacgcctg gtcaaccaag gagccattct cctggatcaa ggtggacctt 3600
ctggccccca tgattatcca cggaattaag acccaggggg cccggcagaa gttctcctca 3660
ctgtacatca gccagttcat aatcatgtac tccctggacg gaaagaagtg gcaaacctac 3720
agggggaaca gcaccggcac actgatggtc tttttcggaa atgtggactc ctccgggatt 3780
aagcataaca tcttcaaccc tccgattatc gctcggtaca ttagacttca ccctacccac 3840
tacagcattc gctccaccct gcggatggaa ctgatgggct gcgatctgaa ctcgtgcagc 3900
atgccgttgg gaatggagtc caaagcaatt tccgacgcgc agatcaccgc ctcgtcctac 3960
tttaccaaca tgttcgccac gtggtcaccg tccaaggccc ggctgcacct ccagggaaga 4020
tccaacgcat ggcggccaca ggtcaacaac cctaaggagt ggctccaggt ggacttccag 4080
aaaaccatga aggtcaccgg agtcacaacc cagggagtga agtcgctgct gacttctatg 4140
tacgtcaagg agttcctgat ctccagcagc caggacgggc accagtggac cctgttcttc 4200
caaaatggaa aggtcaaggt gtttcagggc aatcaggatt cattcacccc ggtggtgaac 4260
tcccttgatc cacccctcct gacccgctac cttcgcatcc acccacagtc ctgggtgcac 4320
cagatcgcgc tgaggatgga ggtcctggga tgcgaagccc aggacctgta ctga 4374
<210> 6 <211> 4374
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-26 <400> 6
atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc 60
accaggagat actacctggg cgccgtggag ctgagctggg actacatgca gtctgacctg 120
ggcgagctgc cagtggacgc caggttcccc cccagagtgc ccaagagctt ccccttcaac 180
accagcgtgg tgtacaagaa gaccctgttc gtggagttca ctgaccacct gttcaacatc 240
gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccca ccatccaggc cgaggtgtac 300
gacaccgtgg tcatcaccct gaagaacatg gccagccacc ccgtctccct gcacgccgtg 360
ggggtgagct actggaaggc ctctgagggc gccgagtacg acgaccagac cagccagagg 420
gagaaggagg acgacaaggt gttccctggg ggcagccaca cctacgtgtg gcaggtcctg 480
aaggagaacg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctga cctacagcta cctgagccac 540
gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag 600
ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gttcgccgtg 660
ttcgacgagg gcaagagctg gcactctgaa accaagaaca gcctgatgca ggacagggac 720
gccgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacaccgtca acggctacgt caacaggagc 780
ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag agcgtgtact ggcatgtgat cggcatgggc 840
accacccctg aggtgcacag catcttcctg gagggccaca ccttcctggt caggaaccac 900
aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctga ccgcccagac cctgctgatg 960
gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atctccagcc accagcacga cggcatggag 1020
gcctacgtga aagtggacag ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaacgag 1080
gaggccgagg actatgatga cgacctgacc gacagcgaga tggacgtggt caggttcgac 1140
gacgacaaca gccccagctt catccagatc aggagcgtgg ccaagaagca ccccaagacc 1200
tgggtgcact acatcgctgc tgaggaggag gactgggact atgcccccct ggtgctggcc 1260
cctgatgaca ggagctacaa gagccagtac ctgaacaatg gcccccagag gattggcagg 1320
aagtacaaga aagtcaggtt catggcctac actgatgaaa ccttcaagac cagggaggcc 1380
atccagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtacg gggaggtggg ggacaccctg 1440
ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaaca tctaccccca tggcatcacc 1500
gacgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cctaaggggg tgaagcacct gaaagacttc 1560
cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggacggcccc 1620
accaagagcg accccaggtg cctgaccaga tactacagca gcttcgtcaa catggagagg 1680
gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag 1740
aggggcaacc agatcatgag cgacaagagg aacgtgatcc tgttctctgt cttcgacgag 1800
aacaggagct ggtacctcac tgaaaacatc cagaggttcc tcccaaaccc cgcaggagtg 1860
caactggagg accctgagtt tcaggcctcg aatatcatgc actcgattaa cggttacgtg 1920
ttcgactcgc tgcagctgag cgtgtgcctc catgaagtcg cttactggta cattctgtcc 1980
atcggcgccc agactgactt cctgagcgtg ttcttttccg gttacacctt taagcacaag 2040
atggtgtacg aagataccct gaccctgttc cctttctccg gcgaaacggt gttcatgtcg 2100
atggagaacc cgggtctgtg gattctggga tgccacaaca gcgactttcg gaaccgcgga 2160
atgactgccc tgctgaaggt gtcctcatgc gacaagaaca ccggagacta ctacgaggac 2220
tcctacgagg atatctcagc ctacctcctg tccaagaaca acgcgatcga gccgcgcagc 2280
ttcagccaga acccgcctgt gctgaagagg caccagcgag aaattacccg gaccaccctc 2340
caatcggatc aggaggaaat cgactacgac gacaccatct cggtggaaat gaagaaggaa 2400
gatttcgata tctacgacga ggacgaaaat cagtcccctc gctcattcca aaagaaaact 2460
agacactact ttatcgccgc ggtggaaaga ctgtgggact atggaatgtc atccagccct 2520
cacgtccttc ggaaccgggc ccagagcgga tcggtgcctc agttcaagaa agtggtgttc 2580
caggagttca ccgacggcag cttcacccag ccgctgtacc ggggagaact gaacgaacac 2640
ctgggcctgc tcggtcccta catccgcgcg gaagtggagg ataacatcat ggtgaccttc 2700
cgtaaccaag catccagacc ttactccttc tattcctccc tgatctcata cgaggaggac 2760
cagcgccaag gcgccgagcc ccgcaagaac ttcgtcaagc ccaacgagac taagacctac 2 82 0
ttctggaagg tccaacacca tatggccccg accaaggatg agtttgactg caaggcctgg 2880
gcctacttct ccgacgtgga ccttgagaag gatgtccatt ccggcctgat cgggccgctg 2940
ctcgtgtgtc acaccaacac cctgaaccca gcgcatggac gccaggtcac cgtccaggag 3000
tttgctctgt tcttcaccat ttttgacgaa actaagtcct ggtacttcac cgagaatatg 3060
gagcgaaact gtagagcgcc ctgcaatatc cagatggaag atccgacttt caaggagaac 3120
tatagattcc acgccatcaa cgggtacatc atggatactc tgccggggct ggtcatggcc 3180
caggatcaga ggattcggtg gtacttgctg tcaatgggat cgaacgaaaa cattcactcc 3240
attcacttct ccggtcacgt gttcactgtg cgcaagaagg aggagtacaa gatggcgctg 3300
tacaatctgt accccggggt gttcgaaact gtggagatgc tgccgtccaa ggccggcatc 3360
tggagagtgg agtgcctgat cggagagcac ctccacgcgg ggatgtccac cctcttcctg 3420
gtgtactcga ataagtgcca gaccccgctg ggcatggcct cgggccacat cagagacttc 3480
cagatcacag caagcggaca atacggccaa tgggcgccga agctggcccg cttgcactac 3540
tccggatcga tcaacgcatg gtccaccaag gaaccgttct cgtggattaa ggtggacctc 3600
ctggccccta tgattatcca cggaattaag acccagggcg ccaggcagaa gttctcctcc 3660
ctgtacatct cgcaattcat catcatgtac agcctggacg ggaagaagtg gcagacttac 3720
aggggaaact ccaccggcac cctgatggtc tttttcggca acgtggattc ctccggcatt 3780
aagcacaaca tcttcaaccc accgatcata gccagatata ttaggctcca ccccactcac 3840
tactcaatcc gctcaactct tcggatggaa ctcatggggt gcgacctgaa ctcctgctcc 3900
atgccgttgg ggatggaatc aaaggctatt agcgacgccc agatcaccgc gagctcctac 3960
ttcactaaca tgttcgccac ctggagcccc tccaaggcca ggctgcactt gcagggacgg 4020
tcaaatgcct ggcggccgca agtgaacaat ccgaaggaat ggcttcaagt ggatttccaa 4080
aagaccatga aagtgaccgg agtcaccacc cagggagtga agtcccttct gacctcgatg 4140
tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc caggacgggc accagtggac cctgttcttc 4200
caaaacggaa aggtcaaggt gttccagggg aaccaggact cgttcacacc cgtggtgaac 4260
tccctggacc ccccactgct gacgcggtac ttgaggattc atcctcagtc ctgggtccat 4320
cagattgcat tgcgaatgga agtcctgggc tgcgaggccc aggacctgta ctga 4374
<210> 7 <211> 1734
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> coFVIII-52-NT58
<400> 7
gcgacccgcc gatactacct gggagcagtg gagctctcct gggattacat gcagagcgac 60
cttggggagc tgcccgtgga tgccaggttc cctccccggg tgccaaagtc gtttccgttc 120
aacacctccg tggtgtacaa gaaaactctg ttcgtggagt tcaccgacca cctgttcaat 180
atcgccaagc ccagacctcc ctggatgggg ctgttgggac ctaccatcca agcggaggtg 240
tacgacactg tggtcatcac tctgaagaac atggcctcgc atcccgtgtc cctgcacgcc 300
gtgggagtgt cttactggaa agcgtccgag ggggccgaat acgacgacca gacctcgcag 360
agagaaaagg aagatgacaa ggtgttccca ggaggatcgc acacctacgt gtggcaagtg 420
ttgaaggaga acggcccaat ggcctccgac ccgctgtgcc tgacctactc gtacctgtcc 480
cacgtggacc tcgtgaagga cctcaactcg ggactgattg gagccctgct ggtctgcagg 540
gaaggctcac tggcgaaaga aaagactcag accttgcaca agttcattct gctgttcgct 600
gtgttcgacg aggggaagtc gtggcacagc gagactaaga actccctgat gcaagataga 660
gatgccgcct ccgcccgggc ctggcctaag atgcacaccg tgaacggtta cgtgaaccgc 720
tccctccctg gcctgattgg atgccaccgg aagtccgtgt actggcacgt gatcgggatg 780
gggaccaccc ccgaggtgca cagcatcttc ctggaaggtc acacatttct cgtgcgcaac 840
caccggcagg cctccctgga aatcagcccc attaccttcc tcactgccca gactctgctg 900
atggacctgg gacagttcct gctgttctgc catatctcct cccaccaaca tgacggaatg 960
gaggcatacg tgaaggtcga ttcctgccct gaggaacccc agctccgcat gaagaacaat 1020
gaggaagccg aggactacga cgacgacctg acggatagcg agatggatgt ggtccggttc 1080
gatgacgata acagcccttc cttcatccaa attcgctcgg tggcaaagaa gcaccccaag 1140
acctgggtgc attacattgc ggcggaagaa gaggactggg attatgcccc gcttgtcctc 1200
gctcctgacg accggagcta caagagccag tacctgaaca acggtccaca gaggatcggt 1260
agaaagtaca agaaggtccg cttcatggcc tataccgacg aaaccttcaa aactagagag 1320
gccatccaac acgaatccgg catcctgggc ccgctcttgt acggagaagt cggcgacacc 1380
cttctcatta tcttcaagaa ccaggcttcc cggccgtaca acatctatcc gcatgggatc 1440
actgacgtgc gcccactgta ctcgcggcgc ctgcccaagg gtgtcaaaca cctgaaggat 1500
tttccgatcc ttccgggaga aatcttcaag tacaagtgga ccgtgaccgt ggaagatggc 1560
ccaactaagt ctgaccctag atgcctcacc cgctactact catccttcgt caacatggag 1620
cgcgacctgg ccagcggact gatcggcccg ctgctgattt gctacaagga atcagtggac 1680
caacggggaa accagatcat gtcggataag aggaacgtca tcctcttctc cgtg 1734
<210> 8 <211> 2583
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-52-CT <400> 8
tttgacgaaa accggtcgtg gtacctgacc gagaacatcc agaggttcct gcccaaccct 60
gctggggtgc agctggagga ccccgagttc caggccagca acatcatgca cagcatcaat 120
ggctacgtgt tcgacagcct gcagctgagc gtgtgcctgc acgaggtggc ctactggtac 180
atcctgagca tcggcgccca gaccgacttc ctgagcgtgt tcttctctgg ctacaccttc 240
aagcacaaga tggtgtatga ggacaccctg accctgttcc ccttcagcgg ggagactgtc 300
ttcatgagca tggagaaccc tggcctgtgg atcctgggct gccacaacag cgacttcagg 360
aacaggggca tgactgccct gctgaaagtc tccagctgtg acaagaacac cggggactac 420
tacgaggaca gctacgagga catcagcgcc tacctgctga gcaagaacaa tgccatcgag 480
cccaggagct tctctcagaa ccccccagtg ctgaagaggc accagaggga gatcaccagg 540
accaccctgc agtctgacca ggaggagatc gactatgatg acaccatcag cgtggagatg 600
aagaaggagg acttcgacat ctacgacgag gacgagaacc agagccccag gagcttccag 660
aagaagacca ggcactactt cattgctgct gtggagaggc tgtgggacta tggcatgtcc 720
agcagccccc atgtgctgag gaacagggcc cagtctggca gcgtgcccca gttcaagaaa 780
gtcgtgttcc aggagttcac cgacggcagc ttcacccagc ccctgtacag aggggagctg 840
aacgagcacc tgggcctgct gggcccctac atcagggccg aggtggagga caacatcatg 900
gtgaccttca ggaaccaggc cagcaggccc tacagcttct acagcagcct gatcagctac 960
gaggaggacc agaggcaggg ggctgagccc aggaagaact ttgtgaagcc caatgaaacc 1020
aagacctact tctggaaggt gcagcaccac atggccccca ccaaggacga gttcgactgc 1080
aaggcctggg cctacttctc tgacgtggac ctggagaagg acgtgcactc tggcctgatt 1140
ggccccctgc tggtgtgcca caccaacacc ctgaaccctg cccatggcag gcaggtgact 1200
gtgcaggagt tcgccctgtt cttcaccatc ttcgatgaaa ccaagagctg gtacttcact 1260
gagaacatgg agaggaactg cagggccccc tgcaacatcc agatggagga ccccaccttc 1320
aaggagaact acaggttcca tgccatcaat ggctacatca tggacaccct gcctggcctg 1380
gtcatggccc aggaccagag gatcaggtgg tatctgctga gcatgggcag caacgagaac 1440
atccacagca tccacttctc tggccacgtg ttcactgtga ggaagaagga ggagtacaag 1500
atggccctgt acaacctgta ccctggggtg ttcgaaaccg tggagatgct gcccagcaag 1560
gccggcatct ggagggtgga gtgcctgatt ggggagcacc tgcacgccgg catgagcacc 1620
ctgttcctgg tgtacagcaa caagtgccag acccccctgg gcatggcctc tggccacatc 1680
agggacttcc agatcactgc ctctggccag tacggccagt gggcccccaa gctggccagg 1740
ctgcactact ccggaagcat caatgcctgg agcaccaagg agcccttcag ctggatcaaa 1800
gtggacctgc tggcccccat gatcatccac ggcatcaaga cccagggggc caggcagaag 1860
ttctccagcc tgtacatcag ccagttcatc atcatgtaca gcctggacgg caagaagtgg 1920
cagacctaca ggggcaacag caccggcacc ctgatggtgt tcttcggcaa cgtggacagc 1980
agcggcatca agcacaacat cttcaacccc cccatcatcg ccagatacat caggctgcac 2040
cccacccact acagcatcag gagcaccctg aggatggagc tgatgggctg tgacctgaac 2100
agctgcagca tgcccctggg catggagagc aaggccatct ctgacgccca gatcactgcc 2160
tccagctact tcaccaacat gtttgccacc tggagcccca gcaaggccag gctgcacctg 2220
cagggcagga gcaatgcctg gaggccccag gtcaacaacc ccaaggagtg gctgcaggtg 2280
gacttccaga agaccatgaa ggtgactggg gtgaccaccc agggggtgaa gagcctgctg 2340
accagcatgt acgtgaagga gttcctgatc tccagcagcc aggacggcca ccagtggacc 2400
ctgttcttcc agaatggcaa ggtgaaggtg ttccagggca accaggacag cttcacccct 2460
gtggtcaaca gcctggaccc ccccctgctg accagatacc tgaggatcca cccccagagc 2520
tgggtgcacc agatcgccct gaggatggag gtgctgggct gtgaggccca ggacctgtac 2580
tga 2583
<210> 9 <211> 1734
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-62-NT58 <400> 9
gccactcgcc ggtactacct tggagccgtg gagctttcat gggactacat gcagagcgac 60
ctgggcgaac tccccgtgga tgccagattc cccccccgcg tgccaaagtc cttccccttt 120
aacacctccg tggtgtacaa gaaaaccctc tttgtcgagt tcactgacca cctgttcaac 180
atcgccaagc cgcgcccacc ttggatgggc ctcctgggac cgaccattca agctgaagtg 240
tacgacaccg tggtgatcac cctgaagaac atggcgtccc accccgtgtc cctgcatgcg 300
gtcggagtgt cctactggaa ggcctccgaa ggagctgagt acgacgacca gactagccag 360
cgggaaaagg aggacgataa agtgttcccg ggcggctcgc atacttacgt gtggcaagtc 420
ctgaaggaaa acggacctat ggcatccgat cctctgtgcc tgacttactc ctacctttcc 480
catgtggacc tcgtgaagga cctgaacagc gggctgattg gtgcacttct cgtgtgccgc 540
gaaggttcgc tcgctaagga aaagacccag accctccata agttcatcct tttgttcgct 600
gtgttcgatg aaggaaagtc atggcattcc gaaactaaga actcgctgat gcaggaccgg 660
gatgccgcct cagcccgcgc ctggcctaaa atgcatacag tcaacggata cgtgaatcgg 720
tcactgcccg ggctcatcgg ttgtcacaga aagtccgtgt actggcacgt catcggcatg 780
ggcactacgc ctgaagtgca ctccatcttc ctggaagggc acaccttcct cgtgcgcaac 840
caccgccagg cctctctgga aatctccccg attacctttc tgaccgccca gactctgctc 900
atggacctgg ggcagttcct tctcttctgc cacatctcca gccatcagca cgacggaatg 960
gaggcctacg tgaaggtgga ctcatgcccg gaagaacctc agttgcggat gaagaacaac 1020
gaggaggccg aggactatga cgacgatttg actgactccg agatggacgt cgtgcggttc 1080
gatgacgaca acagccccag cttcatccag attcgcagcg tggccaagaa gcaccccaaa 1140
acctgggtgc actacatcgc ggccgaggaa gaagattggg actacgcccc gttggtgctg 1200
gcacccgatg accggtcgta caagtcccag tatctgaaca atggtccgca gcggattggc 1260
agaaagtaca agaaagtgcg gttcatggcg tacactgacg aaacgtttaa gacccgggag 1320
gccattcaac atgagagcgg cattctggga ccactgctgt acggagaggt cggcgatacc 1380
ctgctcatca tcttcaaaaa ccaggcctcc cggccttaca acatctaccc tcacggaatc 1440
accgacgtgc ggccactcta ctcgcggcgc ctgccgaagg gcgtcaagca cctgaaagac 1500
ttccctatcc tgccgggcga aatcttcaag tataagtgga ccgtcaccgt ggaggacggg 1560
cccaccaaga gcgatcctag gtgtctgact cggtactact ccagcttcgt gaacatggaa 1620
cgggacctgg catcgggact cattggaccg ctgctgatct gctacaaaga gtcggtggat 1680
caacgcggca accagatcat gtccgacaag cgcaacgtga tcctgttctc cgtg 1734
<210> 10 <211> 2583
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-62-CT <400> 10
tttgatgaaa acagatcctg gtacctgacc gagaacatcc agaggttcct gcccaaccct 60
gctggggtgc agctggagga ccccgagttc caggccagca acatcatgca cagcatcaat 120
ggctacgtgt tcgacagcct gcagctgagc gtgtgcctgc acgaggtggc ctactggtac 180
atcctgagca tcggcgccca gaccgacttc ctgagcgtgt tcttctctgg ctacaccttc 240
aagcacaaga tggtgtatga ggacaccctg accctgttcc ccttcagcgg ggagactgtc 300
ttcatgagca tggagaaccc tggcctgtgg atcctgggct gccacaacag cgacttcagg 360
aacaggggca tgactgccct gctgaaagtc tccagctgtg acaagaacac cggggactac 420
tacgaggaca gctacgagga catcagcgcc tacctgctga gcaagaacaa tgccatcgag 480
cccaggagct tctctcagaa ccccccagtg ctgaagaggc accagaggga gatcaccagg 540
accaccctgc agtctgacca ggaggagatc gactatgatg acaccatcag cgtggagatg 600
aagaaggagg acttcgacat ctacgacgag gacgagaacc agagccccag gagcttccag 660
aagaagacca ggcactactt cattgctgct gtggagaggc tgtgggacta tggcatgtcc 720
agcagccccc atgtgctgag gaacagggcc cagtctggca gcgtgcccca gttcaagaaa 780
gtcgtgttcc aggagttcac cgacggcagc ttcacccagc ccctgtacag aggggagctg 840
aacgagcacc tgggcctgct gggcccctac atcagggccg aggtggagga caacatcatg 900
gtgaccttca ggaaccaggc cagcaggccc tacagcttct acagcagcct gatcagctac 960
gaggaggacc agaggcaggg ggctgagccc aggaagaact ttgtgaagcc caatgaaacc 1020
aagacctact tctggaaggt gcagcaccac atggccccca ccaaggacga gttcgactgc 1080
aaggcctggg cctacttctc tgacgtggac ctggagaagg acgtgcactc tggcctgatt 1140
ggccccctgc tggtgtgcca caccaacacc ctgaaccctg cccatggcag gcaggtgact 1200
gtgcaggagt tcgccctgtt cttcaccatc ttcgatgaaa ccaagagctg gtacttcact 1260
gagaacatgg agaggaactg cagggccccc tgcaacatcc agatggagga ccccaccttc 1320
aaggagaact acaggttcca tgccatcaat ggctacatca tggacaccct gcctggcctg 1380
gtcatggccc aggaccagag gatcaggtgg tatctgctga gcatgggcag caacgagaac 1440
atccacagca tccacttctc tggccacgtg ttcactgtga ggaagaagga ggagtacaag 1500
atggccctgt acaacctgta ccctggggtg ttcgaaaccg tggagatgct gcccagcaag 1560
gccggcatct ggagggtgga gtgcctgatt ggggagcacc tgcacgccgg catgagcacc 1620
ctgttcctgg tgtacagcaa caagtgccag acccccctgg gcatggcctc tggccacatc 1680
agggacttcc agatcactgc ctctggccag tacggccagt gggcccccaa gctggccagg 1740
ctgcactact ccggaagcat caatgcctgg agcaccaagg agcccttcag ctggatcaaa 1800
gtggacctgc tggcccccat gatcatccac ggcatcaaga cccagggggc caggcagaag 1860
ttctccagcc tgtacatcag ccagttcatc atcatgtaca gcctggacgg caagaagtgg 1920
cagacctaca ggggcaacag caccggcacc ctgatggtgt tcttcggcaa cgtggacagc 1980
agcggcatca agcacaacat cttcaacccc cccatcatcg ccagatacat caggctgcac 2040
cccacccact acagcatcag gagcaccctg aggatggagc tgatgggctg tgacctgaac 2100
agctgcagca tgcccctggg catggagagc aaggccatct ctgacgccca gatcactgcc 2160
tccagctact tcaccaacat gtttgccacc tggagcccca gcaaggccag gctgcacctg 2220
cagggcagga gcaatgcctg gaggccccag gtcaacaacc ccaaggagtg gctgcaggtg 2280
gacttccaga agaccatgaa ggtgactggg gtgaccaccc agggggtgaa gagcctgctg 2340
accagcatgt acgtgaagga gttcctgatc tccagcagcc aggacggcca ccagtggacc 2400
ctgttcttcc agaatggcaa ggtgaaggtg ttccagggca accaggacag cttcacccct 2460
gtggtcaaca gcctggaccc ccccctgctg accagatacc tgaggatcca cccccagagc 2520
tgggtgcacc agatcgccct gaggatggag gtgctgggct gtgaggccca ggacctgtac 2580
tga 2583
<210> 11 <211> 1734
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-25-NT58 <400> 11
gccaccagga gatactacct gggcgccgtg gagctgagct gggactacat gcagtctgac 60
ctgggcgagc tgccagtgga cgccaggttc ccccccagag tgcccaagag cttccccttc 120
aacaccagcg tggtgtacaa gaagaccctg ttcgtggagt tcactgacca cctgttcaac 180
atcgccaagc ccaggccccc ctggatgggc ctgctgggcc ccaccatcca ggccgaggtg 240
tacgacaccg tggtcatcac cctgaagaac atggccagcc accccgtctc cctgcacgcc 300
gtgggggtga gctactggaa ggcctctgag ggcgccgagt acgacgacca gaccagccag 360
agggagaagg aggacgacaa ggtgttccct gggggcagcc acacctacgt gtggcaggtc 420
ctgaaggaga acggccccat ggcctctgac cccctgtgcc tgacctacag ctacctgagc 480
cacgtggacc tggtgaagga cctgaactct ggcctgattg gggccctgct ggtgtgcagg 540
gagggcagcc tggccaagga gaagacccag accctgcaca agttcatcct gctgttcgcc 600
gtgttcgacg agggcaagag ctggcactct gaaaccaaga acagcctgat gcaggacagg 660
gacgccgcct ctgccagggc ctggcccaag atgcacaccg tcaacggcta cgtcaacagg 720
agcctgcctg gcctgattgg ctgccacagg aagagcgtgt actggcatgt gatcggcatg 780
ggcaccaccc ctgaggtgca cagcatcttc ctggagggcc acaccttcct ggtcaggaac 840
cacaggcagg ccagcctgga gatcagcccc atcaccttcc tgaccgccca gaccctgctg 900
atggacctgg gccagttcct gctgttctgc cacatctcca gccaccagca cgacggcatg 960
gaggcctacg tgaaagtgga cagctgccct gaggagcccc agctgaggat gaagaacaac 1020
gaggaggccg aggactatga tgacgacctg accgacagcg agatggacgt ggtcaggttc 1080
gacgacgaca acagccccag cttcatccag atcaggagcg tggccaagaa gcaccccaag 1140
acctgggtgc actacatcgc tgctgaggag gaggactggg actatgcccc cctggtgctg 1200
gcccctgatg acaggagcta caagagccag tacctgaaca atggccccca gaggattggc 1260
aggaagtaca agaaagtcag gttcatggcc tacactgatg aaaccttcaa gaccagggag 1320
gccatccagc atgagtctgg catcctgggc cccctgctgt acggggaggt gggggacacc 1380
ctgctgatca tcttcaagaa ccaggccagc aggccctaca acatctaccc ccatggcatc 1440
accgacgtga ggcccctgta cagcaggagg ctgcctaagg gggtgaagca cctgaaagac 1500
ttccccatcc tgcctgggga gatcttcaag tacaagtgga ctgtgactgt ggaggacggc 1560
cccaccaaga gcgaccccag gtgcctgacc agatactaca gcagcttcgt caacatggag 1620
agggacctgg cctctggcct gattggcccc ctgctgatct gctacaagga gtctgtggac 1680
cagaggggca accagatcat gagcgacaag aggaacgtga tcctgttctc tgtc 1734
<210> 12 <211> 2583
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-25-CT <400> 12
ttcgacgaga acaggagctg gtacctgact gaaaacatcc agcggttcct ccccaacccc 60
gcgggcgtgc agctggaaga tcctgagttt caggcatcaa acatcatgca ctccattaac 120
ggctacgtgt tcgattcgct gcagctgagc gtgtgtctgc acgaagtggc ctactggtac 180
atcctgtcca ttggtgccca gactgacttc ctgtccgtgt ttttctccgg ctacacgttc 240
aagcacaaga tggtgtacga ggacaccctg accctcttcc ctttttccgg cgaaactgtg 300
tttatgagca tggagaatcc cggcctgtgg atcttgggct gccacaacag cgacttccgt 360
aacagaggaa tgactgcgct gctcaaggtg tccagctgcg acaagaacac cggagactat 420
tatgaggact catacgagga catctccgcc tacctcctgt ccaagaataa cgccattgaa 480
cctcggagct tcagccagaa cccacccgtg cttaagagac atcaacggga gatcactagg 540
accaccctgc agtcagacca ggaggaaatc gactacgatg acaccatctc ggtcgagatg 600
aagaaggagg actttgacat ctacgacgaa gatgaaaacc agagcccgag gtcgttccaa 660
aagaaaaccc gccactactt tattgctgct gtcgagcggc tgtgggacta cggaatgtcg 720
tcctcgccgc acgtgctccg caaccgagcc cagagcggct cggtgccgca attcaagaag 780
gtcgtgttcc aggagttcac tgacgggagc ttcactcagc ctttgtaccg gggagaactc 840
aatgaacatc tcggcctcct cggaccttac atcagagcag aagtggaaga taacatcatg 900
gtcactttcc gtaaccaagc cagccgcccg tactcgttct actcctccct catttcttac 960
gaagaggacc agcggcaggg cgcagaaccg cgcaagaact tcgtgaagcc caacgaaacc 1020
aagacctact tctggaaagt gcagcatcat atggccccga ctaaggacga gtttgactgc 1080
aaagcctggg cctacttctc cgatgtggac ttggagaagg acgtccactc cggcctcatc 1140
ggtcccctgc tcgtgtgcca taccaatacc ctgaaccccg cacacggtcg ccaggtcacc 1200
gtgcaggagt tcgctctgtt cttcactatc ttcgacgaaa ctaagtcctg gtacttcacc 1260
gagaacatgg agaggaactg cagagccccc tgtaacatcc agatggagga cccgacgttc 1320
aaggaaaact accggttcca cgccattaac ggatacatca tggatacgct gccgggtctt 1380
gtgatggccc aggatcaacg gatcagatgg tacttattgt cgatgggcag caacgagaac 1440
atccactcta ttcacttctc cggtcatgtg ttcactgtgc ggaagaagga agagtacaag 1500
atggccctgt acaaccttta tcccggagtg ttcgaaactg tggaaatgct gccgtcgaag 1560
gccggcattt ggcgcgtgga gtgtttgatt ggagaacatc tccatgcggg gatgtcaacc 1620
ctgttcctgg tgtatagcaa caagtgccag actccgcttg ggatggcgtc aggacacatt 1680
agggatttcc agatcactgc gtccggccag tacggccaat gggcccctaa gctggcccgc 1740
ctgcattact ccggatccat taacgcctgg tcaaccaagg agccattctc ctggatcaag 1800
gtggaccttc tggcccccat gattatccac ggaattaaga cccagggggc ccggcagaag 1860
ttctcctcac tgtacatcag ccagttcata atcatgtact ccctggacgg aaagaagtgg 1920
caaacctaca gggggaacag caccggcaca ctgatggtct ttttcggaaa tgtggactcc 1980
tccgggatta agcataacat cttcaaccct ccgattatcg ctcggtacat tagacttcac 2040
cctacccact acagcattcg ctccaccctg cggatggaac tgatgggctg cgatctgaac 2100
tcgtgcagca tgccgttggg aatggagtcc aaagcaattt ccgacgcgca gatcaccgcc 2160
tcgtcctact ttaccaacat gttcgccacg tggtcaccgt ccaaggcccg gctgcacctc 2220
cagggaagat ccaacgcatg gcggccacag gtcaacaacc ctaaggagtg gctccaggtg 2280
gacttccaga aaaccatgaa ggtcaccgga gtcacaaccc agggagtgaa gtcgctgctg 2340
acttctatgt acgtcaagga gttcctgatc tccagcagcc aggacgggca ccagtggacc 2400
ctgttcttcc aaaatggaaa ggtcaaggtg tttcagggca atcaggattc attcaccccg 2460
gtggtgaact cccttgatcc acccctcctg acccgctacc ttcgcatcca cccacagtcc 2520
tgggtgcacc agatcgcgct gaggatggag gtcctgggat gcgaagccca ggacctgtac 2580
tga 2583
<210> 13 <211> 1734
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-26-NT58
<400> 13
gccaccagga gatactacct gggcgccgtg gagctgagct gggactacat gcagtctgac 60
ctgggcgagc tgccagtgga cgccaggttc ccccccagag tgcccaagag cttccccttc 120
aacaccagcg tggtgtacaa gaagaccctg ttcgtggagt tcactgacca cctgttcaac 180
atcgccaagc ccaggccccc ctggatgggc ctgctgggcc ccaccatcca ggccgaggtg 240
tacgacaccg tggtcatcac cctgaagaac atggccagcc accccgtctc cctgcacgcc 300
gtgggggtga gctactggaa ggcctctgag ggcgccgagt acgacgacca gaccagccag 360
agggagaagg aggacgacaa ggtgttccct gggggcagcc acacctacgt gtggcaggtc 420
ctgaaggaga acggccccat ggcctctgac cccctgtgcc tgacctacag ctacctgagc 480
cacgtggacc tggtgaagga cctgaactct ggcctgattg gggccctgct ggtgtgcagg 540
gagggcagcc tggccaagga gaagacccag accctgcaca agttcatcct gctgttcgcc 600
gtgttcgacg agggcaagag ctggcactct gaaaccaaga acagcctgat gcaggacagg 660
gacgccgcct ctgccagggc ctggcccaag atgcacaccg tcaacggcta cgtcaacagg 720
agcctgcctg gcctgattgg ctgccacagg aagagcgtgt actggcatgt gatcggcatg 780
ggcaccaccc ctgaggtgca cagcatcttc ctggagggcc acaccttcct ggtcaggaac 840
cacaggcagg ccagcctgga gatcagcccc atcaccttcc tgaccgccca gaccctgctg 900
atggacctgg gccagttcct gctgttctgc cacatctcca gccaccagca cgacggcatg 960
gaggcctacg tgaaagtgga cagctgccct gaggagcccc agctgaggat gaagaacaac 1020
gaggaggccg aggactatga tgacgacctg accgacagcg agatggacgt ggtcaggttc 1080
gacgacgaca acagccccag cttcatccag atcaggagcg tggccaagaa gcaccccaag 1140
acctgggtgc actacatcgc tgctgaggag gaggactggg actatgcccc cctggtgctg 1200
gcccctgatg acaggagcta caagagccag tacctgaaca atggccccca gaggattggc 1260
aggaagtaca agaaagtcag gttcatggcc tacactgatg aaaccttcaa gaccagggag 1320
gccatccagc atgagtctgg catcctgggc cccctgctgt acggggaggt gggggacacc 1380
ctgctgatca tcttcaagaa ccaggccagc aggccctaca acatctaccc ccatggcatc 1440
accgacgtga ggcccctgta cagcaggagg ctgcctaagg gggtgaagca cctgaaagac 1500
ttccccatcc tgcctgggga gatcttcaag tacaagtgga ctgtgactgt ggaggacggc 1560
cccaccaaga gcgaccccag gtgcctgacc agatactaca gcagcttcgt caacatggag 1620
agggacctgg cctctggcct gattggcccc ctgctgatct gctacaagga gtctgtggac 1680
cagaggggca accagatcat gagcgacaag aggaacgtga tcctgttctc tgtc 1734
<210> 14 <211> 2583
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-26-CT <400> 14
ttcgacgaga acaggagctg gtacctcact gaaaacatcc agaggttcct cccaaacccc 60
gcaggagtgc aactggagga ccctgagttt caggcctcga atatcatgca ctcgattaac 120
ggttacgtgt tcgactcgct gcagctgagc gtgtgcctcc atgaagtcgc ttactggtac 180
attctgtcca tcggcgccca gactgacttc ctgagcgtgt tcttttccgg ttacaccttt 240
aagcacaaga tggtgtacga agataccctg accctgttcc ctttctccgg cgaaacggtg 300
ttcatgtcga tggagaaccc gggtctgtgg attctgggat gccacaacag cgactttcgg 360
aaccgcggaa tgactgccct gctgaaggtg tcctcatgcg acaagaacac cggagactac 420
tacgaggact cctacgagga tatctcagcc tacctcctgt ccaagaacaa cgcgatcgag 480
ccgcgcagct tcagccagaa cccgcctgtg ctgaagaggc accagcgaga aattacccgg 540
accaccctcc aatcggatca ggaggaaatc gactacgacg acaccatctc ggtggaaatg 600
aagaaggaag atttcgatat ctacgacgag gacgaaaatc agtcccctcg ctcattccaa 660
aagaaaacta gacactactt tatcgccgcg gtggaaagac tgtgggacta tggaatgtca 720
tccagccctc acgtccttcg gaaccgggcc cagagcggat cggtgcctca gttcaagaaa 780
gtggtgttcc aggagttcac cgacggcagc ttcacccagc cgctgtaccg gggagaactg 840
aacgaacacc tgggcctgct cggtccctac atccgcgcgg aagtggagga taacatcatg 900
gtgaccttcc gtaaccaagc atccagacct tactccttct attcctccct gatctcatac 960
gaggaggacc agcgccaagg cgccgagccc cgcaagaact tcgtcaagcc caacgagact 1020
aagacctact tctggaaggt ccaacaccat atggccccga ccaaggatga gtttgactgc 1080
aaggcctggg cctacttctc cgacgtggac cttgagaagg atgtccattc cggcctgatc 1140
gggccgctgc tcgtgtgtca caccaacacc ctgaacccag cgcatggacg ccaggtcacc 1200
gtccaggagt ttgctctgtt cttcaccatt tttgacgaaa ctaagtcctg gtacttcacc 1260
gagaatatgg agcgaaactg tagagcgccc tgcaatatcc agatggaaga tccgactttc 1320
aaggagaact atagattcca cgccatcaac gggtacatca tggatactct gccggggctg 1380
gtcatggccc aggatcagag gattcggtgg tacttgctgt caatgggatc gaacgaaaac 1440
attcactcca ttcacttctc cggtcacgtg ttcactgtgc gcaagaagga ggagtacaag 1500
atggcgctgt acaatctgta ccccggggtg ttcgaaactg tggagatgct gccgtccaag 1560
gccggcatct ggagagtgga gtgcctgatc ggagagcacc tccacgcggg gatgtccacc 1620
ctcttcctgg tgtactcgaa taagtgccag accccgctgg gcatggcctc gggccacatc 1680
agagacttcc agatcacagc aagcggacaa tacggccaat gggcgccgaa gctggcccgc 1740
ttgcactact ccggatcgat caacgcatgg tccaccaagg aaccgttctc gtggattaag 1800
gtggacctcc tggcccctat gattatccac ggaattaaga cccagggcgc caggcagaag 1860
ttctcctccc tgtacatctc gcaattcatc atcatgtaca gcctggacgg gaagaagtgg 1920
cagacttaca ggggaaactc caccggcacc ctgatggtct ttttcggcaa cgtggattcc 1980
tccggcatta agcacaacat cttcaaccca ccgatcatag ccagatatat taggctccac 2040
cccactcact actcaatccg ctcaactctt cggatggaac tcatggggtg cgacctgaac 2100
tcctgctcca tgccgttggg gatggaatca aaggctatta gcgacgccca gatcaccgcg 2160
agctcctact
tcactaacat
gttcgccacc
tggagcccct
ccaaggccag
gctgcacttg
cagggacggt
caaatgcctg
gcggccgcaa
gtgaacaatc
cgaaggaatg
gcttcaagtg
gatttccaaa
agaccatgaa
agtgaccgga
gtcaccaccc
agggagtgaa
gtcccttctg
acctcgatgt
atgtgaagga
gttcctgatt
agcagcagcc
aggacgggca
ccagtggacc
ctgttcttcc
aaaacggaaa
ggtcaaggtg
ttccagggga
accaggactc
gttcacaccc
gtggtgaact
ccctggaccc
cccactgctg
acgcggtact
tgaggattca
tcctcagtcc
tgggtccatc
agattgcatt
gcgaatggaa
gtcctgggct
gcgaggccca
ggacctgtac
tga
2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2583
<210> 15
<211> 2332
<212> PRT/Белок
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
740 745 750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys
755 760 765
Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn
770 775 780
Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro
785 790 795 800
His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe
805 810 815
Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser
820 825 830
Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val
835 840 845
Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly
850 855 860
Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser
865 870 875 880
Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala
885 890 895
Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His
900 905 910
Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro
915 920 925
Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp
930 935 940
Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp
945 950 955 960
Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys
965 970 975
Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys
980 985 990
Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala
995 1000 1005
Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu
1010 1015 1020
Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu
1025 1030 1035
Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp
1040 1045 1050
Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr
1055 1060 1065
Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly
1070 1075 1080
Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys
1085 1090 1095
Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His
1100 1105 1110
Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln
1115 1120 1125
Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe
1130 1135 1140
Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr
1145 1150 1155
Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn
1160 1165 1170
Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His
1175 1180 1185
Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys Lys Glu Thr
1190 1195 1200
Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val Thr
1205 1210 1215
Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg
1220 1225 1230
Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu
1235 1240 1245
Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys
1250 1255 1260
His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu
1265 1270 1275
Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys
1280 1285 1290
Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr
1295 1300 1305
Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu
1310 1315 1320
Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr
1325 1330 1335
Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr
1340 1345 1350
Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser
1355 1360 1365
Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala
1370 1375 1380
Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser
1385 1390 1395
Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser
1400 1405 1410
Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val
1415 1420 1425
Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu
1430 1435 1440
Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu
1445 1450 1455
Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys
1460 1465 1470
Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr
1475 1480 1485
Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys
1490 1495 1500
Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu
1505 1510 1515
Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile
1520 1525 1530
Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg
1535 1540 1545
Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp
1550 1555 1560
Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu
1565 1570 1575
Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys
1580 1585 1590
Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His
1595 1600 1605
Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu
1610 1615 1620
Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln
1625 1630 1635
Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr
1640 1645 1650
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile
1655 1660 1665
Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp
1670 1675 1680
Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
1685 1690 1695
Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
1700 1705 1710
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
1715 1720 1725
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe
1730 1735 1740
Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
1745 1750 1755
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
1760 1765 1770
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
1775 1780 1785
Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
1790 1795 1800
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys
1805 1810 1815
Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys
1820 1825 1830
Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
1835 1840 1845
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu
1850 1855 1860
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu
1865 1870 1875
Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu
1880 1885 1890
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu
1895 1900 1905
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly
1910 1915 1920
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln
1925 1930 1935
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile
1940 1945 1950
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1955 1960 1965
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe
1970 1975 1980
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val
1985 1990 1995
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
2000 2005 2010
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala
2015 2020 2025
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
2030 2035 2040
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
2045 2050 2055
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
2060 2065 2070
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
2075 2080 2085
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
2090 2095 2100
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
2105 2110 2115
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
2120 2125 2130
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
2135 2140 2145
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
2150 2155 2160
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
2165 2170 2175
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
2180 2185 2190
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
2195 2200 2205
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
2210 2215 2220
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
2225 2230 2235
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
2240 2245 2250
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
2255 2260 2265
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe
2270 2275 2280
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp
2285 2290 2295
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
2300 2305 2310
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala
2315 2320 2325
Gln Asp Leu Tyr 2330
<210> 16
<211> 4371
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> BDD-FVIII (неоптимизированный; "исходный"), последовательность нуклеотидов
<400> 16
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280
ttctctcaaa acccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340
cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400
gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460
cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520
catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580
caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640
ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700
agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760
cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820
ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880
gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940
ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000
tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060
gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120
tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180
caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240
attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300
tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360
tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420
gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480
cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540
tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600
ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660
ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720
cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780
aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840
tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900
atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960
tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020
agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080
aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140
tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200
cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260
tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320
cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta c 4371
<210> 17 <211> 1438
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> BDD-FVIII ( неоптимизированный; "исходный"), последовательность аминокислоты
<400> 17
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His
740 745 750
Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile
755 760 765
Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp
770 775 780
Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
785 790 795 800
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly
805 810 815
Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser
820 825 830
Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser
835 840 845
Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
850 855 860
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr
865 870 875 880
Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile
885 890 895
Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe
900 905 910
Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His
915 920 925
Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
930 935 940
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro
945 950 955 960
Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln
965 970 975
Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr
980 985 990
Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro
995 1000 1005
Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg
1010 1015 1020
Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu
1025 1030 1035
Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met
1040 1045 1050
Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val
1055 1060 1065
Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn
1070 1075 1080
Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys
1085 1090 1095
Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His
1100 1105 1110
Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln
1115 1120 1125
Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile
1130 1135 1140
Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg
1145 1150 1155
Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro
1160 1165 1170
Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His
1175 1180 1185
Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr
1190 1195 1200
Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp
1205 1210 1215
Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe
1220 1225 1230
Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro
1235 1240 1245
Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser
1250 1255 1260
Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn
1265 1270 1275
Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp
1280 1285 1290
Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr
1295 1300 1305
Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn
1310 1315 1320
Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val
1325 1330 1335
Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly
1340 1345 1350
Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile
1355 1360 1365
Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn
1370 1375 1380
Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro
1385 1390 1395
Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg
1400 1405 1410
Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu
1415 1420 1425
Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 1430 1435
<210> 18 <211> 450
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность нуклеотидов XTEN
<400> 18
ggcgcgccaa catcagagag cgccacccct gaaagtggtc ccgggagcga gccagccaca 60
tctgggtcgg aaacgccagg cacaagtgag tctgcaactc ccgagtccgg acctggctcc 120
gagcctgcca ctagcggctc cgagactccg ggaacttccg agagcgctac accagaaagc 180
ggacccggaa ccagtaccga acctagcgag ggctctgctc cgggcagccc agccggctct 240
cctacatcca cggaggaggg cacttccgaa tccgccaccc cggagtcagg gccaggatct 300
gaacccgcta cctcaggcag tgagacgcca ggaacgagcg agtccgctac accggagagt 360
gggccaggga gccctgctgg atctcctacg tccactgagg aagggtcacc agcgggctcg 420
cccaccagca ctgaagaagg tgcctcgagc 450
<210> 19 <211> 4824
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-52-XTEN <400> 19
atgcaaatcg aactgagcac ctgtttcttc ctctgcctgc tgagattctg tttctccgcg 60
acccgccgat actacctggg agcagtggag ctctcctggg attacatgca gagcgacctt 120
ggggagctgc ccgtggatgc caggttccct ccccgggtgc caaagtcgtt tccgttcaac 180
acctccgtgg tgtacaagaa aactctgttc gtggagttca ccgaccacct gttcaatatc 240
gccaagccca gacctccctg gatggggctg ttgggaccta ccatccaagc ggaggtgtac 300
gacactgtgg tcatcactct gaagaacatg gcctcgcatc ccgtgtccct gcacgccgtg 360
ggagtgtctt actggaaagc gtccgagggg gccgaatacg acgaccagac ctcgcagaga 420
gaaaaggaag atgacaaggt gttcccagga ggatcgcaca cctacgtgtg gcaagtgttg 480
aaggagaacg gcccaatggc ctccgacccg ctgtgcctga cctactcgta cctgtcccac 540
gtggacctcg tgaaggacct caactcggga ctgattggag ccctgctggt ctgcagggaa 600
ggctcactgg cgaaagaaaa gactcagacc ttgcacaagt tcattctgct gttcgctgtg 660
ttcgacgagg ggaagtcgtg gcacagcgag actaagaact ccctgatgca agatagagat 720
gccgcctccg cccgggcctg gcctaagatg cacaccgtga acggttacgt gaaccgctcc 780
ctccctggcc tgattggatg ccaccggaag tccgtgtact ggcacgtgat cgggatgggg 840
accacccccg aggtgcacag catcttcctg gaaggtcaca catttctcgt gcgcaaccac 900
cggcaggcct ccctggaaat cagccccatt accttcctca ctgcccagac tctgctgatg 960
gacctgggac agttcctgct gttctgccat atctcctccc accaacatga cggaatggag 1020
gcatacgtga aggtcgattc ctgccctgag gaaccccagc tccgcatgaa gaacaatgag 1080
gaagccgagg actacgacga cgacctgacg gatagcgaga tggatgtggt ccggttcgat 1140
gacgataaca gcccttcctt catccaaatt cgctcggtgg caaagaagca ccccaagacc 1200
tgggtgcatt acattgcggc ggaagaagag gactgggatt atgccccgct tgtcctcgct 1260
cctgacgacc ggagctacaa gagccagtac ctgaacaacg gtccacagag gatcggtaga 1320
aagtacaaga aggtccgctt catggcctat accgacgaaa ccttcaaaac tagagaggcc 1380
atccaacacg aatccggcat cctgggcccg ctcttgtacg gagaagtcgg cgacaccctt 1440
ctcattatct tcaagaacca ggcttcccgg ccgtacaaca tctatccgca tgggatcact 1500
gacgtgcgcc cactgtactc gcggcgcctg cccaagggtg tcaaacacct gaaggatttt 1560
ccgatccttc cgggagaaat cttcaagtac aagtggaccg tgaccgtgga agatggccca 1620
actaagtctg accctagatg cctcacccgc tactactcat ccttcgtcaa catggagcgc 1680
gacctggcca gcggactgat cggcccgctg ctgatttgct acaaggaatc agtggaccaa 1740
cggggaaacc agatcatgtc ggataagagg aacgtcatcc tcttctccgt gtttgacgaa 1800
aaccggtcgt ggtacctgac cgagaacatc cagaggttcc tgcccaaccc tgctggggtg 1860
cagctggagg accccgagtt ccaggccagc aacatcatgc acagcatcaa tggctacgtg 1920
ttcgacagcc tgcagctgag cgtgtgcctg cacgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980
atcggcgccc agaccgactt cctgagcgtg ttcttctctg gctacacctt caagcacaag 2040
atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttcagcg gggagactgt cttcatgagc 2100
atggagaacc ctggcctgtg gatcctgggc tgccacaaca gcgacttcag gaacaggggc 2160
atgactgccc tgctgaaagt ctccagctgt gacaagaaca ccggggacta ctacgaggac 2220
agctacgagg acatcagcgc ctacctgctg agcaagaaca atgccatcga gcccaggagc 2280
ttctctcaga acggcgcgcc aacatcagag agcgccaccc ctgaaagtgg tcccgggagc 2340
gagccagcca catctgggtc ggaaacgcca ggcacaagtg agtctgcaac tcccgagtcc 2400
ggacctggct ccgagcctgc cactagcggc tccgagactc cgggaacttc cgagagcgct 2460
acaccagaaa gcggacccgg aaccagtacc gaacctagcg agggctctgc tccgggcagc 2520
ccagccggct ctcctacatc cacggaggag ggcacttccg aatccgccac cccggagtca 2580
gggccaggat ctgaacccgc tacctcaggc agtgagacgc caggaacgag cgagtccgct 2640
acaccggaga gtgggccagg gagccctgct ggatctccta cgtccactga ggaagggtca 2700
ccagcgggct cgcccaccag cactgaagaa ggtgcctcga gccccccagt gctgaagagg 2760
caccagaggg agatcaccag gaccaccctg cagtctgacc aggaggagat cgactatgat 2820
gacaccatca gcgtggagat gaagaaggag gacttcgaca tctacgacga ggacgagaac 2880
cagagcccca ggagcttcca gaagaagacc aggcactact tcattgctgc tgtggagagg 2940
ctgtgggact atggcatgtc cagcagcccc catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc 3000
agcgtgcccc agttcaagaa agtcgtgttc caggagttca ccgacggcag cttcacccag 3060
cccctgtaca gaggggagct gaacgagcac ctgggcctgc tgggccccta catcagggcc 3120
gaggtggagg acaacatcat ggtgaccttc aggaaccagg ccagcaggcc ctacagcttc 3180
tacagcagcc tgatcagcta cgaggaggac cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac 3240
tttgtgaagc ccaatgaaac caagacctac ttctggaagg tgcagcacca catggccccc 3300
accaaggacg agttcgactg caaggcctgg gcctacttct ctgacgtgga cctggagaag 3360
gacgtgcact ctggcctgat tggccccctg ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct 3420
gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag ttcgccctgt tcttcaccat cttcgatgaa 3480
accaagagct ggtacttcac tgagaacatg gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc 3540
cagatggagg accccacctt caaggagaac tacaggttcc atgccatcaa tggctacatc 3600
atggacaccc tgcctggcct ggtcatggcc caggaccaga ggatcaggtg gtatctgctg 3660
agcatgggca gcaacgagaa catccacagc atccacttct ctggccacgt gttcactgtg 3720
aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg tacaacctgt accctggggt gttcgaaacc 3780
gtggagatgc tgcccagcaa ggccggcatc tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac 3840
ctgcacgccg gcatgagcac cctgttcctg gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg 3900
ggcatggcct ctggccacat cagggacttc cagatcactg cctctggcca gtacggccag 3960
tgggccccca agctggccag gctgcactac tccggaagca tcaatgcctg gagcaccaag 4020
gagcccttca gctggatcaa agtggacctg ctggccccca tgatcatcca cggcatcaag 4080
acccaggggg ccaggcagaa gttctccagc ctgtacatca gccagttcat catcatgtac 4140
agcctggacg gcaagaagtg gcagacctac aggggcaaca gcaccggcac cctgatggtg 4200
ttcttcggca acgtggacag cagcggcatc aagcacaaca tcttcaaccc ccccatcatc 4260
gccagataca tcaggctgca ccccacccac tacagcatca ggagcaccct gaggatggag 4320
ctgatgggct gtgacctgaa cagctgcagc atgcccctgg gcatggagag caaggccatc 4380
tctgacgccc agatcactgc ctccagctac ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc 4440
agcaaggcca ggctgcacct gcagggcagg agcaatgcct ggaggcccca ggtcaacaac 4500
cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc 4560
cagggggtga agagcctgct gaccagcatg tacgtgaagg agttcctgat ctccagcagc 4620
caggacggcc accagtggac cctgttcttc cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc 4680
aaccaggaca gcttcacccc tgtggtcaac agcctggacc cccccctgct gaccagatac 4740
ctgaggatcc acccccagag ctgggtgcac cagatcgccc tgaggatgga ggtgctgggc 4800
tgtgaggccc aggacctgta ctga 4824
<210> 20 <211> 4824
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-1-XTEN
<400> 20
atgcagattg agctgtctac ttgctttttc ctgtgcctgc tgaggttttg cttttccgct 60
acacgaaggt attatctggg ggctgtggaa ctgtcttggg attacatgca gagtgacctg 120
ggagagctgc cagtggacgc aaggtttccc cctagagtcc ctaagtcatt ccccttcaac 180
actagcgtgg tctacaagaa aacactgttc gtggagttta ctgatcacct gttcaacatc 240
gcaaagccta ggccaccctg gatgggactg ctggggccaa caatccaggc cgaggtgtac 300
gacaccgtgg tcattacact taagaacatg gcctcacacc ccgtgagcct gcatgctgtg 360
ggcgtcagct actggaaggc ttccgaagga gcagagtatg acgatcagac ttcccagaga 420
gaaaaagagg acgataaggt gtttcctggc ggatctcata cctacgtgtg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gccctatggc ctccgaccct ctgtgcctga cctactctta tctgagtcac 540
gtggacctgg tcaaggatct gaacagcggc ctgatcggag ccctgctggt gtgcagggaa 600
ggaagcctgg ctaaggagaa aacccagaca ctgcataagt tcattctgct gttcgccgtg 660
tttgacgaag ggaaatcatg gcacagcgag acaaagaata gtctgatgca ggacagggat 720
gccgcttcag ccagagcttg gcccaaaatg cacactgtga acggctacgt caatcgctca 780
ctgcctgggc tgatcggctg ccaccgaaag agcgtgtatt ggcatgtcat cgggatgggc 840
accacacctg aagtgcactc cattttcctg gagggacata cctttctggt ccgcaaccac 900
cgacaggctt ccctggagat ctctccaatt accttcctga cagcacagac tctgctgatg 960
gacctggggc agttcctgct gttttgccac atcagctccc accagcatga tggcatggag 1020
gcttacgtga aagtggactc ttgtcccgag gaacctcagc tgcggatgaa gaacaatgag 1080
gaagcagaag actatgacga tgacctgacc gactccgaga tggatgtggt ccgattcgat 1140
gacgataaca gcccctcctt tatccagatt agatctgtgg ccaagaaaca ccctaagaca 1200
tgggtccatt acatcgcagc cgaggaagag gactgggatt atgcaccact ggtgctggca 1260
ccagacgatc gctcctacaa atctcagtat ctgaacaatg ggccacagag gattggcaga 1320
aagtacaaga aagtgcggtt catggcatat accgatgaga ccttcaagac tcgcgaagcc 1380
atccagcacg agagcggcat cctgggacca ctgctgtacg gagaagtggg agacaccctg 1440
ctgatcattt tcaagaacca ggccagccgg ccttacaata tctatccaca tgggattaca 1500
gatgtgcgcc ctctgtacag caggagactg ccaaagggcg tcaaacacct gaaggacttc 1560
ccaatcctgc ccggagaaat cttcaagtac aagtggactg tcaccgtcga ggatggcccc 1620
actaagagcg accctcggtg cctgacccgc tactattcta gtttcgtgaa tatggaaaga 1680
gatctggcaa gcggactgat cggaccactg ctgatttgtt acaaagagag cgtggatcag 1740
agaggcaacc agatcatgtc cgacaagcgg aatgtgattc tgttcagtgt ctttgacgaa 1800
aacaggtcat ggtacctgac cgagaacatc cagagattcc tgcctaatcc agctggggtg 1860
cagctggaag atcctgagtt tcaggcatct aacatcatgc atagtattaa tggctacgtg 1920
ttcgacagtt tgcagctgag cgtgtgcctg cacgaggtcg cttactggta tatcctgagc 1980
attggggcac agacagattt cctgagcgtg ttcttttccg gctacacttt taagcataaa 2040
atggtctatg aggacacact gactctgttc cccttcagcg gcgaaaccgt gtttatgagc 2100
atggagaatc ccggactgtg gattctgggg tgccacaaca gcgatttcag aaatcgcgga 2160
atgactgccc tgctgaaagt gtcaagctgt gacaagaaca ccggggacta ctatgaagat 2220
tcatacgagg acatcagcgc atatctgctg tccaaaaaca atgccattga accccggtct 2280
tttagtcaga atggcgcgcc aacatcagag agcgccaccc ctgaaagtgg tcccgggagc 2340
gagccagcca catctgggtc ggaaacgcca ggcacaagtg agtctgcaac tcccgagtcc 2400
ggacctggct ccgagcctgc cactagcggc tccgagactc cgggaacttc cgagagcgct 2460
acaccagaaa gcggacccgg aaccagtacc gaacctagcg agggctctgc tccgggcagc 2520
ccagccggct ctcctacatc cacggaggag ggcacttccg aatccgccac cccggagtca 2580
gggccaggat ctgaacccgc tacctcaggc agtgagacgc caggaacgag cgagtccgct 2640
acaccggaga gtgggccagg gagccctgct ggatctccta cgtccactga ggaagggtca 2700
ccagcgggct cgcccaccag cactgaagaa ggtgcctcga gccctccagt gctgaagcgg 2760
caccagcgcg agatcacccg cactaccctg cagagtgatc aggaagagat cgactacgac 2820
gatacaattt ctgtggaaat gaagaaagag gacttcgata tctatgacga agatgagaac 2880
cagagtcctc gatcattcca gaagaaaacc aggcattact ttattgccgc agtggagcgg 2940
ctgtgggatt atggcatgtc ctctagtcct cacgtgctgc gaaatagggc ccagtcagga 3000
agcgtcccac agttcaagaa agtggtcttc caggagttta cagacgggtc ctttactcag 3060
ccactgtaca ggggcgaact gaacgagcac ctgggactgc tggggcccta tatcagagca 3120
gaagtggagg ataacattat ggtcaccttc agaaatcagg cctctcggcc ttacagtttt 3180
tattcaagcc tgatctctta cgaagaggac cagcgacagg gagctgaacc acgaaaaaac 3240
ttcgtgaagc ctaatgagac caaaacatac ttttggaagg tgcagcacca tatggcccca 3300
acaaaagacg agttcgattg caaggcatgg gcctattttt ctgacgtgga tctggagaag 3360
gacgtgcaca gtggcctgat tggcccactg ctggtgtgcc atactaacac cctgaatcca 3420
gcccacggcc ggcaggtcac tgtccaggag ttcgctctgt tctttaccat ctttgatgag 3480
acaaagagct ggtacttcac cgaaaacatg gagcgaaatt gcagggctcc atgtaacatt 3540
cagatggaag accccacatt caaggagaac taccgctttc atgctatcaa tggatacatc 3600
atggatactc tgcccgggct ggtcatggca caggaccaga gaatccggtg gtatctgctg 3660
agcatgggca gcaacgagaa tatccactca attcatttca gcgggcacgt gtttactgtc 3720
aggaagaaag aagagtacaa gatggccctg tacaacctgt atcccggcgt gttcgaaacc 3780
gtcgagatgc tgcctagcaa ggccggaatc tggagagtgg aatgcctgat tggagagcac 3840
ctgcatgctg ggatgtctac cctgtttctg gtgtacagta ataagtgtca gacacccctg 3900
ggaatggcat ccgggcatat cagggatttc cagattaccg catctggaca gtacggacag 3960
tgggcaccta agctggctag actgcactat tccggatcta tcaacgcttg gtccacaaaa 4020
gagcctttct cttggattaa ggtggacctg ctggccccaa tgatcattca tggcatcaaa 4080
actcagggag ctcggcagaa gttctcctct ctgtacatct cacagtttat catcatgtac 4140
agcctggatg ggaagaaatg gcagacatac cgcggcaata gcacaggaac tctgatggtg 4200
ttctttggca acgtggacag cagcggaatc aagcacaaca ttttcaatcc ccctatcatt 4260
gctagataca tccggctgca cccaacccat tattctattc gaagtacact gaggatggaa 4320
ctgatgggat gcgatctgaa cagttgttca atgcccctgg ggatggagtc caaggcaatc 4380
tctgacgccc agattaccgc cagctcctac ttcactaata tgtttgctac ctggagccct 4440
tccaaagcaa gactgcacct gcaaggccgc agcaacgcat ggcgaccaca ggtgaacaat 4500
cccaaggagt ggttgcaggt cgattttcag aaaactatga aggtgaccgg ggtcacaact 4560
cagggcgtga aaagtctgct gacctcaatg tacgtcaagg agttcctgat ctctagttca 4620
caggacggac atcagtggac actgttcttt cagaacggga aggtgaaagt cttccagggc 4680
aatcaggatt cctttacacc tgtggtcaac agtctagacc ctccactgct gaccagatac 4740
ctgagaatcc accctcagtc ctgggtgcac cagattgccc tgagaatgga agtgctggga 4800
tgcgaggccc aggatctgta ctga
4824
<210> 21
<211> 6
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MAR/ARS
<400> 21
atattt
<210> 22
<211> 6
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MAR/ARS
<400> 22
aaatat
<210> 23
<211> 5
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> дестабилизирующий элемент
<400> 23
attta
<210> <211> <212> <213>
<220> <223>
<400>
taaat
24 5
DNA/ ДНК
Искусственная последовательность
дестабилизирующий элемент
<210> 25
<211> 6
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> сайт поли-Т
<400> tttttt
<210> <211>
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> сайт поли-А
<400> 26
aaaaaaa
<210> 27
<211> 6
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> сайт сплайсинга
<400> 27
ggtgat 6
<210> 28
<211> 5
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TATA-бокс
<400> 28
tataa 5
<210> 29
<211> 5
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TATA-бокс
<400> 29
ttata 5
<210> 30
<211> 8
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> богатый AU элемент последовательности
<400> 30
attttatt 8
<210> 31
<211> 8
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> богатый AU элемент последовательности <400> 31
atttttaa 8
<210> 32
<211> 13
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная последовательность Kozak
<400> 32
gccgccacca tgc 13
<210> 33
<211> 32
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид CTP
<400> 33
Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
20 25 30
<210> 34
<211> 28
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид CTP
<400> 34
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 20 25
<210> 35 <211> 11
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> коровая последовательность альбумин-связывающего пептида
<400> 35
Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 36
<211> 20
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность PAS
<400> 36
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala 20
<210> 37
<211> 20
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность PAS
<400> 37
Ala Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser 20
<210> 38
<211> 20
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность PAS
<400> 38
Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser Ser
<210> 39 <211> 19
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность PAS
<400> 39
Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser
<210> 40
<211> 20
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность PAS
<400> 40
Ser Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ser Pro Ala 20
<210> 41
<211> 24
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность PAS
<400> 41
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala 20
<210> 42
<211> 20
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность PAS
<400> 42
Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala 20
<210> 43
<211> 23
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> целевая miR142
<400> 43
tccataaagt aggaaacact aca 23
<210> 44
<211> 2332
<212> PRT/Белок
<213> Homo sapiens
<400> 44
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420
425
430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675
680
685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
740 745 750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys
755 760 765
Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn
770 775 780
Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro
785 790 795 800
His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe
805 810 815
Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser
820 825 830
Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val
835 840 845
Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly
850 855 860
Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser
865 870 875 880
Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala
885 890 895
Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His
900 905 910
Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro
915 920 925
Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp
930 935 940
Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp
945 950 955 960
Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys
965 970 975
Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys
980 985 990
Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala
995 1000 1005
Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu
1010 1015 1020
Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu
1025 1030 1035
Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp
1040 1045 1050
Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr
1055 1060 1065
Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly
1070 1075 1080
Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys
1085 1090 1095
Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His
1100 1105 1110
Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln
1115 1120 1125
Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe
1130 1135 1140
Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr
1145 1150 1155
Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn
1160 1165 1170
Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His
1175
1180
1185
Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys Lys Glu Thr
1190 1195 1200
Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val Thr
1205 1210 1215
Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg
1220 1225 1230
Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu
1235 1240 1245
Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys
1250 1255 1260
His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu
1265 1270 1275
Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys
1280 1285 1290
Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr
1295 1300 1305
Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu
1310 1315 1320
Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr
1325 1330 1335
Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr
1340 1345 1350
Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser
1355 1360 1365
Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala
1370 1375 1380
Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser
1385 1390 1395
Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser
1400 1405 1410
Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val
1415
1420
1425
Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu
1430 1435 1440
Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu
1445 1450 1455
Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys
1460 1465 1470
Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr
1475 1480 1485
Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys
1490 1495 1500
Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu
1505 1510 1515
Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile
1520 1525 1530
Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg
1535 1540 1545
Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp
1550 1555 1560
Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu
1565 1570 1575
Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys
1580 1585 1590
Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His
1595 1600 1605
Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu
1610 1615 1620
Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln
1625 1630 1635
Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr
1640 1645 1650
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile
1655
1660
1665
Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp
1670 1675 1680
Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
1685 1690 1695
Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
1700 1705 1710
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
1715 1720 1725
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe
1730 1735 1740
Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
1745 1750 1755
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
1760 1765 1770
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
1775 1780 1785
Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
1790 1795 1800
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys
1805 1810 1815
Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys
1820 1825 1830
Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
1835 1840 1845
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu
1850 1855 1860
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu
1865 1870 1875
Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu
1880 1885 1890
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu
1895
1900
1905
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly
1910 1915 1920
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln
1925 1930 1935
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile
1940 1945 1950
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1955 1960 1965
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe
1970 1975 1980
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val
1985 1990 1995
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
2000 2005 2010
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala
2015 2020 2025
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
2030 2035 2040
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
2045 2050 2055
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
2060 2065 2070
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
2075 2080 2085
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
2090 2095 2100
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
2105 2110 2115
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
2120 2125 2130
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
2135
2140
2145
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
2150 2155 2160
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
2165 2170 2175
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
2180 2185 2190
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
2195 2200 2205
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
2210 2215 2220
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
2225 2230 2235
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
2240 2245 2250
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
2255 2260 2265
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe
2270 2275 2280
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp
2285 2290 2295
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
2300 2305 2310
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala
2315 2320 2325
Gln Asp Leu Tyr 2330
<210> 45
<211> 4
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> аминокислоты 233-236 IgG1 человека
<400> 45
Glu Leu Leu Gly
<210> 46
<211> 42
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AE42-4, последовательность белка
<400> 46
Gly Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
1 5 10 15
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
20 25 30
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Ala Ser Ser 35 40
<210> 47 <211> 126
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AE42-4, последовательность ДНК <400> 47
ggcgcgccag gttctcctgc tggctccccc acctcaacag aagaggggac aagcgaaagc 60 gctacgcctg agagtggccc tggctctgag ccagccacct ccggctctga aacccctgcc 120 tcgagc 126
<210> 48
<211> 144
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AE144-2A, последовательность белка
<400> 48
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly
1 5 10 15
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
20 25 30
Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
35 40 45
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
65 70 75 80
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
85 90 95
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu
100 105 110
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
130 135 140
<210> 49 <211> 450
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AE144-2A, последовательность ДНК <400> 49
ggcgcgccaa ccagtacgga gccgtccgag gggagcgcac caggaagccc ggctgggagc 60
ccgacttcta ccgaagaggg tacatctacc gaaccaagtg aaggttcagc accaggcacc 120
tcaacagaac cctctgaggg ctcggcgcct ggtacaagtg agtccgccac cccagaatcc 180
gggcctggga caagcacaga accttcggaa gggagtgccc ctggaacatc cgaatcggca 240
accccagaat cagggccagg atctgagccc gcgacttcgg gctccgagac gcctgggaca 300
tccaccgagc cctccgaagg atcagcccca ggcaccagca cggagccctc tgagggaagc 360
gcacctggta ccagcgaaag cgcaactccc gaatcaggtc ccggtacgag cgagtcggcg 420
accccggaga gcgggccagg tgcctcgagc 450
<210> 50
<211> 144
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AE144-3B, последовательность белка
<400> 50
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser
20 25 30
Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
35 40 45
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly
65 70 75 80
Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
85 90 95
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Thr Glu
100 105 110
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
115 120 125
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
130 135 140
<210> 51 <211> 450
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AE144-3B, последовательность ДНК <400> 51
ggcgcgccaa gtcccgctgg aagcccaact agcaccgaag aggggacctc agagtccgcc 60
acccccgagt ccggccctgg ctctgagcct gccactagcg gctccgagac tcctggcaca 120
tccgaaagcg ctacacccga gagtggaccc ggcacctcta ccgagcccag tgagggctcc 180
gcccctggaa caagcaccga gcccagcgaa ggcagcgccc cagggacctc cacagagccc 240
agtgaaggca gtgctcctgg caccagcacc gaaccaagcg agggctctgc acccgggacc 300
tccaccgagc caagcgaagg ctctgcccct ggcacttcca ccgagcccag cgaaggcagc 360
gcccctggga gccccgctgg ctctcccacc agcactgagg agggcacatc taccgaacca 420
agtgaaggct ctgcaccagg tgcctcgagc 450
<210> 52
<211> 144
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AE144-4A, последовательность белка
<400> 52
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
35 40 45
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
65 70 75 80
Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
85 90 95
Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly
100 105 110
Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
130 135 140
<210> 53 <211> 450
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AE144-4A, последовательность ДНК <400> 53
ggcgcgccaa cgtccgaaag tgctacccct gagtcaggcc ctggtagtga gcctgccaca 60
agcggaagcg aaactccggg gacctcagag tctgccactc ccgaatcggg gccaggctct 120
gaaccggcca cttcagggag cgaaacacca ggaacatcgg agagcgctac cccggagagc 180
gggccaggaa ctagtactga gcctagcgag ggaagtgcac ctggtacaag cgagtccgcc 240
acacccgagt ctggccctgg ctctccagcg ggctcaccca cgagcactga agagggctct 300
cccgctggca gcccaacgtc gacagaagaa ggatcaccag caggctcccc cacatcaaca 360
gaggagggta catcagaatc tgctactccc gagagtggac ccggtacctc cactgagccc 420
agcgagggga gtgcaccagg tgcctcgagc
450
<210> 54
<211> 144
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AE144-5A, последовательность белка
<400> 54
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly
35 40 45
Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu
50 55 60
Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
85 90 95
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser
100 105 110
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
115 120 125
Thr Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly
130 135 140
<210> 55 <211> 450
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AE144-5A, последовательность ДНК <400> 55
ggcgcgccaa catcagagag cgccacccct gaaagtggtc ccgggagcga gccagccaca 60 tctgggtcgg aaacgccagg cacaagtgag tctgcaactc ccgagtccgg acctggctcc 120
gagcctgcca ctagcggctc cgagactccg ggaacttccg agagcgctac accagaaagc
180
ggacccggaa ccagtaccga acctagcgag ggctctgctc cgggcagccc agccggctct 240
cctacatcca cggaggaggg cacttccgaa tccgccaccc cggagtcagg gccaggatct 300
gaacccgcta cctcaggcag tgagacgcca ggaacgagcg agtccgctac accggagagt 360
gggccaggga gccctgctgg atctcctacg tccactgagg aagggtcacc agcgggctcg 420
cccaccagca ctgaagaagg tgcctcgagc 450
<210> 56 <211> 144
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AE144-6B, последовательность белка
<400> 56
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
20 25 30
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly
35 40 45
Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala
50 55 60
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
85 90 95
Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala
100 105 110
Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly
130 135 140
<210> 57
<211> 450
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AE144-6B, последовательность ДНК
<400> 57
ggcgcgccaa catctaccga gccttccgaa ggctctgccc ctgggacctc agaatctgca 60
acccctgaaa gcggccctgg aacctccgaa agtgccactc ccgagagcgg cccagggaca 120
agcgagtcag caacccctga gtctggaccc ggcagcgagc ctgcaacctc tggctcagag 180
actcccggct cagaacccgc tacctcaggc tccgagacac ccggctctcc tgctgggagt 240
cccacttcca ccgaggaagg aacatccact gagcctagtg agggctctgc ccctggaacc 300
agcacagagc caagtgaggg cagtgcacca ggatccgagc cagcaaccag cgggtccgag 3 60
actcccggga cctctgagtc tgccacccca gagagcggac ccggcacttc aaccgagccc 420
tccgaaggat cagcaccagg tgcctcgagc 450
<210> 58
<211> 144
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AG144-1, последовательность белка
<400> 58
Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser
1 5 10 15
Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr
20 25 30
Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser
50 55 60
Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr
65 70 75 80
Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser
85 90 95
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser
100 105 110
Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser
115 120 125
Ser Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser
130 135 140
<210> 59 <211> 450
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AG144-1, последовательность ДНК <400> 59
ggcgcgccac ccgggtcgtc cccgtcggcg tccaccggaa cagggccagg gtcatccccg 60
tcagcgtcga ctgggacggg acccgggaca cccggttcgg ggactgcatc ctcctcgcct 120
ggttcgtcca ccccgtcagg agccacgggt tcgccgggaa gcagcccaag cgcatccact 180
ggtacagggc ctggggcttc accgggtact tcatccacgg ggtcaccggg aacgcccgga 240
tcggggacgg cttcctcatc accaggatcg tcaacaccct cgggcgcaac gggcagcccc 300
ggaacccctg gttcgggtac ggcgtcgtcg agccccggtg cgagcccggg aacaagctcg 360
acaggatcgc ctggggcgtc acccggcacg tcgagcacag gcagccccgg aacccctgga 420
tcgggaaccg cgtcgtcaag cgcctcgagc 450
<210> 60
<211> 144
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AG144-A, последовательность белка
<400> 60
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr
20 25 30
Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
85 90 95
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly
100 105 110
Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
<210> 61 <211> 450
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AG144-A, последовательность ДНК <400> 61
ggcgcgccag gtgcctcgcc gggaacatca tcaactggtt cacccgggtc atccccctcg 60
gcctcaaccg ggacgggtcc cggctcatcc cccagcgcca gcactggaac aggtcctggc 120
actcctggtt ccggtacggc atcgtcatcc ccgggaagct caacaccgtc cggagcgaca 180
ggatcacctg gctcgtcacc ttcggcgtca actggaacgg ggccaggggc ctcacccgga 240
acgtcctcga ctgggtcgcc tggtacgccg ggatcaggaa cggcctcatc ctcgcctggg 300
tcctcaacgc cctcgggtgc gactggttcg ccgggaactc ctggctcggg gacggcctcg 360
tcgtcgcctg gggcatcacc ggggacgagc tccacggggt cccctggagc gtcaccgggg 420
acctcctcga caggtagccc ggcctcgagc 450
<210> 62
<211> 144
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AG144-B, последовательность белка
<400> 62
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
20 25 30
Thr Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr
65 70 75 80
Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro
85 90 95
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro
100 105 110
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
<210> 63 <211> 450
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AG144-B, последовательность ДНК <400> 63
ggcgcgccag gtacaccggg cagcggcacg gcttcgtcgt cacccggctc gtccacaccg 60
tcgggagcta cgggaagccc aggagcgtca ccgggaacgt cgtcaacggg gtcaccgggt 120
acgccaggta gcggcacggc cagcagctcg ccaggttcat cgaccccgtc gggagcgact 180
gggtcgcccg gatcaagccc gtcagcttcc actggaacag gacccgggtc gtcgccgtca 240
gcctcaacgg ggacaggacc tggttcatcg acgccgtcag gggcgacagg ctcgcccgga 300
tcgtcaacac cctcgggggc aacggggagc cctggtgcgt cgcctggaac ctcatccacc 360
ggaagcccgg gggcctcgcc gggtacgagc tccacgggat cgcccggagc gtcccccgga 420
acttcaagca cagggagccc tgcctcgagc 450
<210> 64
<211> 144
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AG144-C, последовательность белка
<400> 64
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro
1 5 10 15
Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
20 25 30
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Thr Pro Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
85 90 95
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr
100 105 110
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
<210> 65 <211> 450
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AG144-C, последовательность ДНК <400> 65
ggcgcgccag gtacacccgg atcgggtaca gcgtcatcga gccccggtgc gtcacctggt 60
acgtcgagca cggggtcgcc aggggcgtcc cctgggacgt cctcaacagg ctcgcccggt 120
gcgtcacccg gcacgtcgtc cacgggttca cctggtagct ccccttccgc gtccactggc 180
accgggcctg gaactccggg gagcggcaca gcgagctcgt cgccgggagc atcgcctggg 240
acatcgagca ccgggtcgcc aggagcatcg cccggaacat ccagcacagg aagccccggc 300
gcgtcgcccg ggacatcaag cacaggttcc ccgggatcga gcacgccgtc cggagccact 360
ggatcaccag ggagctcgac accttccggc gcaacgggat cgcccggagc cagcccgggt 420
acgtcaagca ctggctcccc tgcctcgagc 450
<210> 66
<211> 144
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AG144-F, последовательность белка
<400> 66
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
20 25 30
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
35 40 45
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser
65 70 75 80
Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
85 90 95
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr
100 105 110
Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala
115 120 125
Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
130 135 140
<210> 67 <211> 450
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> XTEN AG144-F, последовательность ДНК <400> 67
ggcgcgccag gctccagccc ctccgcgagc acgggaaccg gaccaggttc gtcaccctca 60
gcatcaacgg ggacgggacc gggggcgtca ccaggaacgt cctccaccgg ctcgccgggt 120
gcatcacccg gaacgtcatc gaccggatcg ccagggagct cgacgccatc aggcgcaaca 180
ggatcacctg gctcaagccc tagcgcgtca accggcacgg gtccgggtgc ctcccctggc 240
acgtccagca ccggatcacc cggatcgagc ccatccgcct caaccggaac cggacccggt 300
acaccagggt cgggaacagc ctcctcgtca ccaggctcct caaccccctc gggagccacg 360
ggttcgcccg gttcgtcaac gccttccgga gcaactggta gccccggagc atcgccagga 420
acttcgagca cggggtcgcc cgcctcgagc 450
<210> 68
<211> 4374
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-1, последовательность ДНК
<400> 68
atgcagattg agctgtctac ttgctttttc ctgtgcctgc tgaggttttg cttttccgct 60
acacgaaggt attatctggg ggctgtggaa ctgtcttggg attacatgca gagtgacctg 120
ggagagctgc cagtggacgc aaggtttccc cctagagtcc ctaagtcatt ccccttcaac 180
actagcgtgg tctacaagaa aacactgttc gtggagttta ctgatcacct gttcaacatc 240
gcaaagccta ggccaccctg gatgggactg ctggggccaa caatccaggc cgaggtgtac 300
gacaccgtgg tcattacact taagaacatg gcctcacacc ccgtgagcct gcatgctgtg 360
ggcgtcagct actggaaggc ttccgaagga gcagagtatg acgatcagac ttcccagaga 420
gaaaaagagg acgataaggt gtttcctggc ggatctcata cctacgtgtg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gccctatggc ctccgaccct ctgtgcctga cctactctta tctgagtcac 540
gtggacctgg tcaaggatct gaacagcggc ctgatcggag ccctgctggt gtgcagggaa 600
ggaagcctgg ctaaggagaa aacccagaca ctgcataagt tcattctgct gttcgccgtg 660
tttgacgaag ggaaatcatg gcacagcgag acaaagaata gtctgatgca ggacagggat 720
gccgcttcag ccagagcttg gcccaaaatg cacactgtga acggctacgt caatcgctca 780
ctgcctgggc tgatcggctg ccaccgaaag agcgtgtatt ggcatgtcat cgggatgggc 840
accacacctg aagtgcactc cattttcctg gagggacata cctttctggt ccgcaaccac 900
cgacaggctt ccctggagat ctctccaatt accttcctga cagcacagac tctgctgatg 960
gacctggggc agttcctgct gttttgccac atcagctccc accagcatga tggcatggag 1020
gcttacgtga aagtggactc ttgtcccgag gaacctcagc tgcggatgaa gaacaatgag 1080
gaagcagaag actatgacga tgacctgacc gactccgaga tggatgtggt ccgattcgat 1140
gacgataaca gcccctcctt tatccagatt agatctgtgg ccaagaaaca ccctaagaca 1200
tgggtccatt acatcgcagc cgaggaagag gactgggatt atgcaccact ggtgctggca 1260
ccagacgatc gctcctacaa atctcagtat ctgaacaatg ggccacagag gattggcaga 1320
aagtacaaga aagtgcggtt catggcatat accgatgaga ccttcaagac tcgcgaagcc 1380
atccagcacg agagcggcat cctgggacca ctgctgtacg gagaagtggg agacaccctg 1440
ctgatcattt tcaagaacca ggccagccgg ccttacaata tctatccaca tgggattaca 1500
gatgtgcgcc ctctgtacag caggagactg ccaaagggcg tcaaacacct gaaggacttc 1560
ccaatcctgc ccggagaaat cttcaagtac aagtggactg tcaccgtcga ggatggcccc 1620
actaagagcg accctcggtg cctgacccgc tactattcta gtttcgtgaa tatggaaaga 1680
gatctggcaa gcggactgat cggaccactg ctgatttgtt acaaagagag cgtggatcag 1740
agaggcaacc agatcatgtc cgacaagcgg aatgtgattc tgttcagtgt ctttgacgaa 1800
aacaggtcat ggtacctgac cgagaacatc cagagattcc tgcctaatcc agctggggtg 1860
cagctggaag atcctgagtt tcaggcatct aacatcatgc atagtattaa tggctacgtg 1920
ttcgacagtt tgcagctgag cgtgtgcctg cacgaggtcg cttactggta tatcctgagc 1980
attggggcac agacagattt cctgagcgtg ttcttttccg gctacacttt taagcataaa 2040
atggtctatg aggacacact gactctgttc cccttcagcg gcgaaaccgt gtttatgagc 2100
atggagaatc ccggactgtg gattctgggg tgccacaaca gcgatttcag aaatcgcgga 2160
atgactgccc tgctgaaagt gtcaagctgt gacaagaaca ccggggacta ctatgaagat 2220
tcatacgagg acatcagcgc atatctgctg tccaaaaaca atgccattga accccggtct 2280
tttagtcaga atcctccagt gctgaagagg caccagaggg agatcacccg cactaccctg 2340
cagagtgatc aggaagagat cgactacgac gatacaattt ctgtggaaat gaagaaagag 2400
gacttcgata tctatgacga agatgagaac cagagtcctc gatcattcca gaagaaaacc 2460
aggcattact ttattgccgc agtggagcgg ctgtgggatt atggcatgtc ctctagtcct 2520
cacgtgctgc gaaatagggc ccagtcagga agcgtcccac agttcaagaa agtggtcttc 2580
caggagttta cagacgggtc ctttactcag ccactgtaca ggggcgaact gaacgagcac 2640
ctgggactgc tggggcccta tatcagagca gaagtggagg ataacattat ggtcaccttc 2700
agaaatcagg cctctcggcc ttacagtttt tattcaagcc tgatctctta cgaagaggac 2760
cagcgacagg gagctgaacc acgaaaaaac ttcgtgaagc ctaatgagac caaaacatac 2820
ttttggaagg tgcagcacca tatggcccca acaaaagacg agttcgattg caaggcatgg 2880
gcctattttt ctgacgtgga tctggagaag gacgtgcaca gtggcctgat tggcccactg 2940
ctggtgtgcc atactaacac cctgaatcca gcccacggcc ggcaggtcac tgtccaggag 3000
ttcgctctgt tctttaccat ctttgatgag acaaagagct ggtacttcac cgaaaacatg 3060
gagcgaaatt gcagggctcc atgtaacatt cagatggaag accccacatt caaggagaac 3120
taccgctttc atgctatcaa tggatacatc atggatactc tgcccgggct ggtcatggca 3180
caggaccaga gaatccggtg gtatctgctg agcatgggca gcaacgagaa tatccactca 3240
attcatttca gcgggcacgt gtttactgtc aggaagaaag aagagtacaa gatggccctg 3300
tacaacctgt atcccggcgt gttcgaaacc gtcgagatgc tgcctagcaa ggccggaatc 3360
tggagagtgg aatgcctgat tggagagcac ctgcatgctg ggatgtctac cctgtttctg 3420
gtgtacagta ataagtgtca gacacccctg ggaatggcat ccgggcatat cagggatttc 3480
cagattaccg catctggaca gtacggacag tgggcaccta agctggctag actgcactat 3540
tccggatcta tcaacgcttg gtccacaaaa gagcctttct cttggattaa ggtggacctg 3600
ctggccccaa tgatcattca tggcatcaaa actcagggag ctcggcagaa gttctcctct 3660
ctgtacatct cacagtttat catcatgtac agcctggatg ggaagaaatg gcagacatac 3720
cgcggcaata gcacaggaac tctgatggtg ttctttggca acgtggacag cagcggaatc 3780
aagcacaaca ttttcaatcc ccctatcatt gctagataca tccggctgca cccaacccat 3840
tattctattc gaagtacact gaggatggaa ctgatgggat gcgatctgaa cagttgttca 3900
atgcccctgg ggatggagtc caaggcaatc tctgacgccc agattaccgc cagctcctac 3960
ttcactaata tgtttgctac ctggagccct tccaaagcaa gactgcacct gcaaggccgc 4020
agcaacgcat ggcgaccaca ggtgaacaat cccaaggagt ggttgcaggt cgattttcag 4080
aaaactatga aggtgaccgg ggtcacaact cagggcgtga aaagtctgct gacctcaatg 4140
tacgtcaagg agttcctgat ctctagttca caggacggac atcagtggac actgttcttt 4200
cagaacggga aggtgaaagt cttccagggc aatcaggatt cctttacacc tgtggtcaac 4260
agtctagacc ctccactgct gaccagatac ctgagaatcc accctcagtc ctgggtgcac 4320
cagattgccc tgagaatgga agtgctggga tgcgaggccc aggatctgta ctga 4374
<210> 69 <211> 577
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Промотор ET, последовательность ДНК
<400> 69
ctcgaggtca attcacgcga gttaataatt accagcgcgg gccaaataaa taatccgcga 60
ggggcaggtg acgtttgccc agcgcgcgct ggtaattatt aacctcgcga atattgattc 120
gaggccgcga ttgccgcaat cgcgaggggc aggtgacctt tgcccagcgc gcgttcgccc 180
cgccccggac ggtatcgata agcttaggag cttgggctgc aggtcgaggg cactgggagg 240
atgttgagta agatggaaaa ctactgatga cccttgcaga gacagagtat taggacatgt 300
ttgaacaggg gccgggcgat cagcaggtag ctctagagga tccccgtctg tctgcacatt 360
tcgtagagcg agtgttccga tactctaatc tccctaggca aggttcatat ttgtgtaggt 420
tacttattct ccttttgttg actaagtcaa taatcagaat cagcaggttt ggagtcagct 480
tggcagggat cagcagcctg ggttggaagg agggggtata aaagcccctt caccaggaga 540
agccgtcaca cagatccaca agctcctgcc accatgg 577
<210> 70
<211> 4374
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-5
<400> 70
atgcaaatcg aactgagcac ctgtttcttc ctctgcctgc tgagattctg tttctccgcg 60
acccgccgat actacctggg agcagtggag ctctcctggg attacatgca gagcgacctt 120
ggggagctgc ccgtggatgc caggttccct ccccgggtgc caaagtcgtt tccgttcaac 180
acctccgtgg tgtacaagaa aactctgttc gtggagttca ccgaccacct gttcaatatc 240
gccaagccca gacctccctg gatggggctg ttgggaccta ccatccaagc ggaggtgtac 300
gacactgtgg tcatcactct gaagaacatg gcctcgcatc ccgtgtccct gcacgccgtg 360
ggagtgtctt actggaaagc gtccgagggg gccgaatacg acgaccagac ctcgcagaga 420
gaaaaggaag atgacaaggt gttcccagga ggatcgcaca cctacgtgtg gcaagtgttg 480
aaggagaacg gcccaatggc ctccgacccg ctgtgcctga cctactcgta cctgtcccac 540
gtggacctcg tgaaggacct caactcggga ctgattggag ccctgctggt ctgcagggaa 600
ggctcactgg cgaaagaaaa gactcagacc ttgcacaagt tcattctgct gttcgctgtg 660
ttcgacgagg ggaagtcgtg gcacagcgag actaagaact ccctgatgca agatagagat 720
gccgcctccg cccgggcctg gcctaagatg cacaccgtga acggttacgt gaaccgctcc 780
ctccctggcc tgattggatg ccaccggaag tccgtgtact ggcacgtgat cgggatgggg 840
accacccccg aggtgcacag catcttcctg gaaggtcaca catttctcgt gcgcaaccac 900
cggcaggcct ccctggaaat cagccccatt accttcctca ctgcccagac tctgctgatg 960
gacctgggac agttcctgct gttctgccat atctcctccc accaacatga cggaatggag 1020
gcatacgtga aggtcgattc ctgccctgag gaaccccagc tccgcatgaa gaacaatgag 1080
gaagccgagg actacgacga cgacctgacg gatagcgaga tggatgtggt ccggttcgat 1140
gacgataaca gcccttcctt catccaaatt cgctcggtgg caaagaagca ccccaagacc 1200
tgggtgcatt acattgcggc ggaagaagag gactgggatt atgccccgct tgtcctcgct 1260
cctgacgacc ggagctacaa gagccagtac ctgaacaacg gtccacagag gatcggtaga 1320
aagtacaaga aggtccgctt catggcctat accgacgaaa ccttcaaaac tagagaggcc 1380
atccaacacg aatccggcat cctgggcccg ctcttgtacg gagaagtcgg cgacaccctt 1440
ctcattatct tcaagaacca ggcttcccgg ccgtacaaca tctatccgca tgggatcact 1500
gacgtgcgcc cactgtactc gcggcgcctg cccaagggtg tcaaacacct gaaggatttt 1560
ccgatccttc cgggagaaat cttcaagtac aagtggaccg tgaccgtgga agatggccca 1620
actaagtctg accctagatg cctcacccgc tactactcat ccttcgtcaa catggagcgc 1680
gacctggcca gcggactgat cggcccgctg ctgatttgct acaaggaatc agtggaccaa 1740
cggggaaacc agatcatgtc ggataagagg aacgtcatcc tcttctccgt gtttgacgaa 1800
aaccggtcgt ggtacctgac tgaaaacatc cagcggttcc tccccaaccc cgcgggcgtg 1860
cagctggaag atcctgagtt tcaggcatca aacatcatgc actccattaa cggctacgtg 1920
ttcgattcgc tgcagctgag cgtgtgtctg cacgaagtgg cctactggta catcctgtcc 1980
attggtgccc agactgactt cctgtccgtg tttttctccg gctacacgtt caagcacaag 2040
atggtgtacg aggacaccct gaccctcttc cctttttccg gcgaaactgt gtttatgagc 2100
atggagaatc ccggcctgtg gatcttgggc tgccacaaca gcgacttccg taacagagga 2160
atgactgcgc tgctcaaggt gtccagctgc gacaagaaca ccggagacta ttatgaggac 2220
tcatacgagg acatctccgc ctacctcctg tccaagaata acgccattga acctcggagc 2280
ttcagccaga acccacccgt gcttaagaga catcaacggg agatcactag gaccaccctg 2340
cagtcagacc aggaggaaat cgactacgat gacaccatct cggtcgagat gaagaaggag 2400
gactttgaca tctacgacga agatgaaaac cagagcccga ggtcgttcca aaagaaaacc 2460
cgccactact ttattgctgc tgtcgagcgg ctgtgggact acggaatgtc gtcctcgccg 2520
cacgtgctcc gcaaccgagc ccagagcggc tcggtgccgc aattcaagaa ggtcgtgttc 2580
caggagttca ctgacgggag cttcactcag cctttgtacc ggggagaact caatgaacat 2640
ctcggcctcc tcggacctta catcagagca gaagtggaag ataacatcat ggtcactttc 2700
cgtaaccaag ccagccgccc gtactcgttc tactcctccc tcatttctta cgaagaggac 2760
cagcggcagg gcgcagaacc gcgcaagaac ttcgtgaagc ccaacgaaac caagacctac 2820
ttctggaaag tgcagcatca tatggccccg actaaggacg agtttgactg caaagcctgg 2880
gcctacttct ccgatgtgga cttggagaag gacgtccact ccggcctcat cggtcccctg 2940
ctcgtgtgcc ataccaatac cctgaacccc gcacacggtc gccaggtcac cgtgcaggag 3000
ttcgctctgt tcttcactat cttcgacgaa actaagtcct ggtacttcac cgagaacatg 3060
gagaggaact gcagagcccc ctgtaacatc cagatggagg acccgacgtt caaggaaaac 3120
taccggttcc acgccattaa cggatacatc atggatacgc tgccgggtct tgtgatggcc 3180
caggatcaac ggatcagatg gtacttattg tcgatgggca gcaacgagaa catccactct 3240
attcacttct ccggtcatgt gttcactgtg cggaagaagg aagagtacaa gatggccctg 3300
tacaaccttt atcccggagt gttcgaaact gtggaaatgc tgccgtcgaa ggccggcatt 3360
tggcgcgtgg agtgtttgat tggagaacat ctccatgcgg ggatgtcaac cctgttcctg 3420
gtgtatagca acaagtgcca gactccgctt gggatggcgt caggacacat tagggatttc 3480
cagatcactg cgtccggcca gtacggccaa tgggccccta agctggcccg cctgcattac 3540
tccggatcca ttaacgcctg gtcaaccaag gagccattct cctggatcaa ggtggacctt 3600
ctggccccca tgattatcca cggaattaag acccaggggg cccggcagaa gttctcctca 3660
ctgtacatca gccagttcat aatcatgtac tccctggacg gaaagaagtg gcaaacctac 3720
agggggaaca gcaccggcac actgatggtc tttttcggaa atgtggactc ctccgggatt 3780
aagcataaca tcttcaaccc tccgattatc gctcggtaca ttagacttca ccctacccac 3840
tacagcattc gctccaccct gcggatggaa ctgatgggct gcgatctgaa ctcgtgcagc 3900
atgccgttgg gaatggagtc caaagcaatt tccgacgcgc agatcaccgc ctcgtcctac 3960
tttaccaaca tgttcgccac gtggtcaccg tccaaggccc ggctgcacct ccagggaaga 4020
tccaacgcat ggcggccaca ggtcaacaac cctaaggagt ggctccaggt ggacttccag 4080
aaaaccatga aggtcaccgg agtcacaacc cagggagtga agtcgctgct gacttctatg 4140
tacgtcaagg agttcctgat ctccagcagc caggacgggc accagtggac cctgttcttc 4200
caaaatggaa aggtcaaggt gtttcagggc aatcaggatt cattcacccc ggtggtgaac 4260
tcccttgatc cacccctcct gacccgctac cttcgcatcc acccacagtc ctgggtgcac 4320
cagatcgcgc tgaggatgga ggtcctggga tgcgaagccc aggacctgta ctga 4374
<210> 71 <211> 4374
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-6 <400> 71
atgcagattg agctgtccac ttgtttcttc ctgtgcctcc tgcgcttctg tttctccgcc 60
actcgccggt actaccttgg agccgtggag ctttcatggg actacatgca gagcgacctg 120
ggcgaactcc ccgtggatgc cagattcccc ccccgcgtgc caaagtcctt cccctttaac 180
acctccgtgg tgtacaagaa aaccctcttt gtcgagttca ctgaccacct gttcaacatc 240
gccaagccgc gcccaccttg gatgggcctc ctgggaccga ccattcaagc tgaagtgtac 300
gacaccgtgg tgatcaccct gaagaacatg gcgtcccacc ccgtgtccct gcatgcggtc 360
ggagtgtcct actggaaggc ctccgaagga gctgagtacg acgaccagac tagccagcgg 420
gaaaaggagg acgataaagt gttcccgggc ggctcgcata cttacgtgtg gcaagtcctg 480
aaggaaaacg gacctatggc atccgatcct ctgtgcctga cttactccta cctttcccat 540
gtggacctcg tgaaggacct gaacagcggg ctgattggtg cacttctcgt gtgccgcgaa 600
ggttcgctcg ctaaggaaaa gacccagacc ctccataagt tcatcctttt gttcgctgtg 660
ttcgatgaag gaaagtcatg gcattccgaa actaagaact cgctgatgca ggaccgggat 720
gccgcctcag cccgcgcctg gcctaaaatg catacagtca acggatacgt gaatcggtca 780
ctgcccgggc tcatcggttg tcacagaaag tccgtgtact ggcacgtcat cggcatgggc 840
actacgcctg aagtgcactc catcttcctg gaagggcaca ccttcctcgt gcgcaaccac 900
cgccaggcct ctctggaaat ctccccgatt acctttctga ccgcccagac tctgctcatg 960
gacctggggc agttccttct cttctgccac atctccagcc atcagcacga cggaatggag 1020
gcctacgtga aggtggactc atgcccggaa gaacctcagt tgcggatgaa gaacaacgag 1080
gaggccgagg actatgacga cgatttgact gactccgaga tggacgtcgt gcggttcgat 1140
gacgacaaca gccccagctt catccagatt cgcagcgtgg ccaagaagca ccccaaaacc 1200
tgggtgcact acatcgcggc cgaggaagaa gattgggact acgccccgtt ggtgctggca 1260
cccgatgacc ggtcgtacaa gtcccagtat ctgaacaatg gtccgcagcg gattggcaga 1320
aagtacaaga aagtgcggtt catggcgtac actgacgaaa cgtttaagac ccgggaggcc 1380
attcaacatg agagcggcat tctgggacca ctgctgtacg gagaggtcgg cgataccctg 1440
ctcatcatct tcaaaaacca ggcctcccgg ccttacaaca tctaccctca cggaatcacc 1500
gacgtgcggc cactctactc gcggcgcctg ccgaagggcg tcaagcacct gaaagacttc 1560
cctatcctgc cgggcgaaat cttcaagtat aagtggaccg tcaccgtgga ggacgggccc 1620
accaagagcg atcctaggtg tctgactcgg tactactcca gcttcgtgaa catggaacgg 1680
gacctggcat cgggactcat tggaccgctg ctgatctgct acaaagagtc ggtggatcaa 1740
cgcggcaacc agatcatgtc cgacaagcgc aacgtgatcc tgttctccgt gtttgatgaa 1800
aacagatcct ggtacctcac tgaaaacatc cagaggttcc tcccaaaccc cgcaggagtg 1860
caactggagg accctgagtt tcaggcctcg aatatcatgc actcgattaa cggttacgtg 1920
ttcgactcgc tgcagctgag cgtgtgcctc catgaagtcg cttactggta cattctgtcc 1980
atcggcgccc agactgactt cctgagcgtg ttcttttccg gttacacctt taagcacaag 2040
atggtgtacg aagataccct gaccctgttc cctttctccg gcgaaacggt gttcatgtcg 2100
atggagaacc cgggtctgtg gattctggga tgccacaaca gcgactttcg gaaccgcgga 2160
atgactgccc tgctgaaggt gtcctcatgc gacaagaaca ccggagacta ctacgaggac 2220
tcctacgagg atatctcagc ctacctcctg tccaagaaca acgcgatcga gccgcgcagc 2280
ttcagccaga acccgcctgt gctgaagagg caccagcgag aaattacccg gaccaccctc 2340
caatcggatc aggaggaaat cgactacgac gacaccatct cggtggaaat gaagaaggaa 2400
gatttcgata tctacgacga ggacgaaaat cagtcccctc gctcattcca aaagaaaact 2460
agacactact ttatcgccgc ggtggaaaga ctgtgggact atggaatgtc atccagccct 2520
cacgtccttc ggaaccgggc ccagagcgga tcggtgcctc agttcaagaa agtggtgttc 2580
caggagttca ccgacggcag cttcacccag ccgctgtacc ggggagaact gaacgaacac 2640
ctgggcctgc tcggtcccta catccgcgcg gaagtggagg ataacatcat ggtgaccttc 2700
cgtaaccaag catccagacc ttactccttc tattcctccc tgatctcata cgaggaggac 2760
cagcgccaag gcgccgagcc ccgcaagaac ttcgtcaagc ccaacgagac taagacctac 2820
ttctggaagg tccaacacca tatggccccg accaaggatg agtttgactg caaggcctgg 2880
gcctacttct ccgacgtgga ccttgagaag gatgtccatt ccggcctgat cgggccgctg 2940
ctcgtgtgtc acaccaacac cctgaaccca gcgcatggac gccaggtcac cgtccaggag 3000
tttgctctgt tcttcaccat ttttgacgaa actaagtcct ggtacttcac cgagaatatg 3060
gagcgaaact gtagagcgcc ctgcaatatc cagatggaag atccgacttt caaggagaac 3120
tatagattcc acgccatcaa cgggtacatc atggatactc tgccggggct ggtcatggcc 3180
caggatcaga ggattcggtg gtacttgctg tcaatgggat cgaacgaaaa cattcactcc 3240
attcacttct ccggtcacgt gttcactgtg cgcaagaagg aggagtacaa gatggcgctg 3300
tacaatctgt accccggggt gttcgaaact gtggagatgc tgccgtccaa ggccggcatc 3360
tggagagtgg agtgcctgat cggagagcac ctccacgcgg ggatgtccac cctcttcctg 3420
gtgtactcga ataagtgcca gaccccgctg ggcatggcct cgggccacat cagagacttc 3480
cagatcacag caagcggaca atacggccaa tgggcgccga agctggcccg cttgcactac 3540
tccggatcga tcaacgcatg gtccaccaag gaaccgttct cgtggattaa ggtggacctc 3600
ctggccccta tgattatcca cggaattaag acccagggcg ccaggcagaa gttctcctcc 3660
ctgtacatct cgcaattcat catcatgtac agcctggacg ggaagaagtg gcagacttac 3720
aggggaaact ccaccggcac cctgatggtc tttttcggca acgtggattc ctccggcatt 3780
aagcacaaca tcttcaaccc accgatcata gccagatata ttaggctcca ccccactcac 3840
tactcaatcc gctcaactct tcggatggaa ctcatggggt gcgacctgaa ctcctgctcc 3900
atgccgttgg ggatggaatc aaaggctatt agcgacgccc agatcaccgc gagctcctac 3960
ttcactaaca tgttcgccac ctggagcccc tccaaggcca ggctgcactt gcagggacgg 4020
tcaaatgcct ggcggccgca agtgaacaat ccgaaggaat ggcttcaagt ggatttccaa 4080
aagaccatga aagtgaccgg agtcaccacc cagggagtga agtcccttct gacctcgatg 4140
tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc caggacgggc accagtggac cctgttcttc 4200
caaaacggaa aggtcaaggt gttccagggg aaccaggact cgttcacacc cgtggtgaac 4260
tccctggacc ccccactgct gacgcggtac ttgaggattc atcctcagtc ctgggtccat 4320
cagattgcat tgcgaatgga agtcctgggc tgcgaggccc aggacctgta ctga 4374
<210> 72 <211> 4824
<212> DNA/ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-6-XTEN <400> 72
atgcagattg agctgtccac ttgtttcttc ctgtgcctcc tgcgcttctg tttctccgcc 60
actcgccggt actaccttgg agccgtggag ctttcatggg actacatgca gagcgacctg 120
ggcgaactcc ccgtggatgc cagattcccc ccccgcgtgc caaagtcctt cccctttaac 180
acctccgtgg tgtacaagaa aaccctcttt gtcgagttca ctgaccacct gttcaacatc 240
gccaagccgc gcccaccttg gatgggcctc ctgggaccga ccattcaagc tgaagtgtac 300
gacaccgtgg tgatcaccct gaagaacatg gcgtcccacc ccgtgtccct gcatgcggtc 3 60
ggagtgtcct actggaaggc ctccgaagga gctgagtacg acgaccagac tagccagcgg 42 0
gaaaaggagg acgataaagt gttcccgggc ggctcgcata cttacgtgtg gcaagtcctg 480
aaggaaaacg gacctatggc atccgatcct ctgtgcctga cttactccta cctttcccat 540
gtggacctcg tgaaggacct gaacagcggg ctgattggtg cacttctcgt gtgccgcgaa 600
ggttcgctcg ctaaggaaaa gacccagacc ctccataagt tcatcctttt gttcgctgtg 660
ttcgatgaag gaaagtcatg gcattccgaa actaagaact cgctgatgca ggaccgggat 720
gccgcctcag cccgcgcctg gcctaaaatg catacagtca acggatacgt gaatcggtca 780
ctgcccgggc tcatcggttg tcacagaaag tccgtgtact ggcacgtcat cggcatgggc 840
actacgcctg aagtgcactc catcttcctg gaagggcaca ccttcctcgt gcgcaaccac 900
cgccaggcct ctctggaaat ctccccgatt acctttctga ccgcccagac tctgctcatg 960
gacctggggc agttccttct cttctgccac atctccagcc atcagcacga cggaatggag 1020
gcctacgtga aggtggactc atgcccggaa gaacctcagt tgcggatgaa gaacaacgag 1080
gaggccgagg actatgacga cgatttgact gactccgaga tggacgtcgt gcggttcgat 1140
gacgacaaca gccccagctt catccagatt cgcagcgtgg ccaagaagca ccccaaaacc 1200
tgggtgcact acatcgcggc cgaggaagaa gattgggact acgccccgtt ggtgctggca 1260
cccgatgacc ggtcgtacaa gtcccagtat ctgaacaatg gtccgcagcg gattggcaga 1320
aagtacaaga aagtgcggtt catggcgtac actgacgaaa cgtttaagac ccgggaggcc 1380
attcaacatg agagcggcat tctgggacca ctgctgtacg gagaggtcgg cgataccctg 1440
ctcatcatct tcaaaaacca ggcctcccgg ccttacaaca tctaccctca cggaatcacc 1500
gacgtgcggc cactctactc gcggcgcctg ccgaagggcg tcaagcacct gaaagacttc 1560
cctatcctgc cgggcgaaat cttcaagtat aagtggaccg tcaccgtgga ggacgggccc 1620
accaagagcg atcctaggtg tctgactcgg tactactcca gcttcgtgaa catggaacgg 1680
gacctggcat cgggactcat tggaccgctg ctgatctgct acaaagagtc ggtggatcaa 1740
cgcggcaacc agatcatgtc cgacaagcgc aacgtgatcc tgttctccgt gtttgatgaa 1800
aacagatcct ggtacctcac tgaaaacatc cagaggttcc tcccaaaccc cgcaggagtg 1860
caactggagg accctgagtt tcaggcctcg aatatcatgc actcgattaa cggttacgtg 1920
ttcgactcgc tgcagctgag cgtgtgcctc catgaagtcg cttactggta cattctgtcc 1980
atcggcgccc agactgactt cctgagcgtg ttcttttccg gttacacctt taagcacaag 2040
atggtgtacg aagataccct gaccctgttc cctttctccg gcgaaacggt gttcatgtcg 2100
atggagaacc cgggtctgtg gattctggga tgccacaaca gcgactttcg gaaccgcgga 2160
atgactgccc tgctgaaggt gtcctcatgc gacaagaaca ccggagacta ctacgaggac 2220
tcctacgagg atatctcagc ctacctcctg tccaagaaca acgcgatcga gccgcgcagc 2280
ttcagccaga acggcgcgcc aacatcagag agcgccaccc ctgaaagtgg tcccgggagc 2340
gagccagcca catctgggtc ggaaacgcca ggcacaagtg agtctgcaac tcccgagtcc 2400
ggacctggct ccgagcctgc cactagcggc tccgagactc cgggaacttc cgagagcgct 2460
acaccagaaa gcggacccgg aaccagtacc gaacctagcg agggctctgc tccgggcagc 2 52 0
ccagccggct ctcctacatc cacggaggag ggcacttccg aatccgccac cccggagtca 2580
gggccaggat ctgaacccgc tacctcaggc agtgagacgc caggaacgag cgagtccgct 2640
acaccggaga gtgggccagg gagccctgct ggatctccta cgtccactga ggaagggtca 2700
ccagcgggct cgcccaccag cactgaagaa ggtgcctcga gcccgcctgt gctgaagagg 2760
caccagcgag aaattacccg gaccaccctc caatcggatc aggaggaaat cgactacgac 2820
gacaccatct cggtggaaat gaagaaggaa gatttcgata tctacgacga ggacgaaaat 2880
cagtcccctc gctcattcca aaagaaaact agacactact ttatcgccgc ggtggaaaga 2940
ctgtgggact atggaatgtc atccagccct cacgtccttc ggaaccgggc ccagagcgga 3000
tcggtgcctc agttcaagaa agtggtgttc caggagttca ccgacggcag cttcacccag 3060
ccgctgtacc ggggagaact gaacgaacac ctgggcctgc tcggtcccta catccgcgcg 3120
gaagtggagg ataacatcat ggtgaccttc cgtaaccaag catccagacc ttactccttc 3180
tattcctccc tgatctcata cgaggaggac cagcgccaag gcgccgagcc ccgcaagaac 3240
ttcgtcaagc ccaacgagac taagacctac ttctggaagg tccaacacca tatggccccg 3300
accaaggatg agtttgactg caaggcctgg gcctacttct ccgacgtgga ccttgagaag 3360
gatgtccatt ccggcctgat cgggccgctg ctcgtgtgtc acaccaacac cctgaaccca 3420
gcgcatggac gccaggtcac cgtccaggag tttgctctgt tcttcaccat ttttgacgaa 3480
actaagtcct ggtacttcac cgagaatatg gagcgaaact gtagagcgcc ctgcaatatc 3540
cagatggaag atccgacttt caaggagaac tatagattcc acgccatcaa cgggtacatc 3600
atggatactc tgccggggct ggtcatggcc caggatcaga ggattcggtg gtacttgctg 3660
tcaatgggat cgaacgaaaa cattcactcc attcacttct ccggtcacgt gttcactgtg 3720
cgcaagaagg aggagtacaa gatggcgctg tacaatctgt accccggggt gttcgaaact 3780
gtggagatgc tgccgtccaa ggccggcatc tggagagtgg agtgcctgat cggagagcac 3840
ctccacgcgg ggatgtccac cctcttcctg gtgtactcga ataagtgcca gaccccgctg 3900
ggcatggcct cgggccacat cagagacttc cagatcacag caagcggaca atacggccaa 3960
tgggcgccga agctggcccg cttgcactac tccggatcga tcaacgcatg gtccaccaag 4020
gaaccgttct cgtggattaa ggtggacctc ctggccccta tgattatcca cggaattaag 4080
acccagggcg ccaggcagaa gttctcctcc ctgtacatct cgcaattcat catcatgtac 4140
agcctggacg ggaagaagtg gcagacttac aggggaaact ccaccggcac cctgatggtc 4200
tttttcggca acgtggattc ctccggcatt aagcacaaca tcttcaaccc accgatcata 4260
gccagatata ttaggctcca ccccactcac tactcaatcc gctcaactct tcggatggaa 4320
ctcatggggt gcgacctgaa ctcctgctcc atgccgttgg ggatggaatc aaaggctatt 4380
agcgacgccc agatcaccgc gagctcctac ttcactaaca tgttcgccac ctggagcccc 4440
tccaaggcca ggctgcactt gcagggacgg tcaaatgcct ggcggccgca agtgaacaat 4500
ccgaaggaat ggcttcaagt ggatttccaa aagaccatga aagtgaccgg agtcaccacc 4560
cagggagtga agtcccttct gacctcgatg tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc 4620
caggacgggc accagtggac cctgttcttc caaaacggaa aggtcaaggt gttccagggg 4680
aaccaggact cgttcacacc cgtggtgaac tccctggacc ccccactgct gacgcggtac 4740
ttgaggattc atcctcagtc ctgggtccat cagattgcat tgcgaatgga agtcctgggc 4800
tgcgaggccc aggacctgta ctga 4824
<210> 73
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AD
<400> 73
Gly Glu Ser Pro Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ser
1 5 10
<210> 74
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мотив AD
<400> 74
Gly Ser Glu Gly Ser Ser Gly Pro Gly Glu Ser Ser
1 5 10
<210> 75
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мотив AD
<400> 75
Gly Ser Ser Glu Ser Gly Ser Ser Glu Gly Gly
Pro
<210> 76
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мотив AD
<400> 76
Gly Ser Gly Gly Glu Pro Ser Glu Ser Gly Ser Ser
1 5 10
<210> 77
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AE, AM
<400> 77
Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu
1 5 10
<210> <211>
78 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AE, AM, AQ
<400> 78
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro
<210> <211>
79 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AE, AM, AQ
<400> 79
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro
1 5 10
<210> 80
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AE, AM, AQ <400> 80
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro
1 5 10
<210> 81
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AF, AM
<400> 81
Gly Ser Thr Ser Glu Ser Pro Ser Gly Thr Ala Pro
1 5 10
<210> 82
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AF, AM
<400> 82
Gly Thr Ser Thr Pro Glu Ser Gly Ser Ala Ser Pro
1 5 10
<210> 83
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AF, AM
<400> 83
Gly Thr Ser Pro Ser Gly Glu Ser Ser Thr Ala Pro
1 5 10
<210> <211>
84 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AF, AM
<400> 84
Gly Ser Thr Ser Ser Thr Ala Glu Ser Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 85
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AG, AM
<400> 85
Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro
1 5 10
<210> <211>
86 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AG, AM
<400> 86
Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro
<210> 87
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AG, AM
<400> 87
Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro
1 5 10
<210> 88
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AG, AM
<400> 88
Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro
1 5 10
<210> 89
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AQ
<400> 89
Gly Glu Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Ser Glu
1 5 10
<210> 90
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AQ
<400> 90
Gly Thr Gly Glu Pro Ser Ser Thr Pro Ala Ser Glu
1 5 10
<210> <211>
91 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AQ
<400> 91
Gly Ser Gly Pro Ser Thr Glu Ser Ala Pro Thr Glu
<210> <211>
92 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> мотив AQ
<400> 92
Gly Ser Glu Thr Pro Ser Gly Pro Ser Glu Thr Ala
<210> 93
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мотив AQ
<400> 93
Gly Pro Ser Glu Thr Ser Thr Ser Glu Pro Gly Ala
1 5 10
<210> 94
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мотив AQ
<400> 94
Gly Ser Pro Ser Glu Pro Thr Glu Gly Thr Ser Ala
1 5 10
<210> 95
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мотив BC
<400> 95
Gly Ser Gly Ala Ser Glu Pro Thr Ser Thr Glu Pro
1 5 10
<210> 96
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мотив BC
<400> 96
Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Thr Glu Pro Ser
1 5 10
<210> 97
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мотив BC
<400> 97
Gly Thr Ser Glu Pro Ser Thr Ser Glu Pro Gly Ala
1 5 10
<210> 98
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мотив BC
<400>
Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Pro Gly Ser Ala
1 5 10
<210> 99
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мотив BD
<400> 99
Gly Ser Thr Ala Gly Ser Glu Thr Ser Thr Glu Ala
1 5 10
<210> 100
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мотив BD
<400> 100
Gly Ser Glu Thr Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Ala
1 5 10
<210> 101
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мотив BD
<400> 101
Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Ser Glu Ser Gly Ala
1 5 10
<210> 102
<211> 12
<212> PRT/Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мотив BD
<400> 102
Gly Thr Ser Thr Glu Ala Ser Glu Gly Ser Ala Ser
1 5 10
<210> <211> <212>
103 1607
PRT/ Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> coFVIII-6-XTEN, Последовательность белка
<400> 103
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225
230
235
240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740
745
750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Gly Ala Pro Thr
755 760 765
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr
770 775 780
Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser
785 790 795 800
Gly Pro Gly Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr
805 810 815
Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro
820 825 830
Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr
835 840 845
Glu Glu Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser
850 855 860
Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
865 870 875 880
Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr
885 890 895
Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser Thr Glu Glu Gly Ala
900 905 910
Ser Ser Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr
915 920 925
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser
930 935 940
Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn
945 950 955 960
Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala
965 970 975
Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val
980 985 990
Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val
995
1000
1005
Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr
1010 1015 1020
Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile
1025 1030 1035
Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln
1040 1045 1050
Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu
1055 1060 1065
Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys
1070 1075 1080
Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met
1085 1090 1095
Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
1100 1105 1110
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly
1130 1135 1140
Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
1145 1150 1155
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1160 1165 1170
Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1175 1180 1185
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1190 1195 1200
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1205 1210 1215
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1220 1225 1230
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1235
1240
1245
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1250 1255 1260
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1265 1270 1275
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1280 1285 1290
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1295 1300 1305
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1310 1315 1320
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1325 1330 1335
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1340 1345 1350
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1355 1360 1365
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1370 1375 1380
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1385 1390 1395
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1400 1405 1410
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1415 1420 1425
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1430 1435 1440
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1445 1450 1455
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1460 1465 1470
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1475
1480
1485
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1490 1495 1500
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1505 1510 1515
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1520 1525 1530
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1535 1540 1545
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1550 1555 1560
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1565 1570 1575
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1580 1585 1590
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr
1595 1600 1605
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, которая содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую N-концевую часть полипептида фактора VIII (FVIII), и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую С-концевую часть полипептида FVIII;
(a) где указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты обладает:
(i) по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-1791 последовательности SEQ ID NO: 3;
(ii) по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-1791 последовательности SEQ ID NO: 4;
(iii) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 5; или
(iv) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-1791 последовательности SEQ ID NO: 6;
(b) где указанная вторая последовательность нуклеотидов обладает:
(i) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3;
(ii) по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 4;
(iii) по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%
(i)
идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 5; или
(iv) по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 1792-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 6; или (с) любая комбинация (а) и (Ь); и
при этом указанная N-концевая часть и указанная С-концевая часть вместе обладают активностью полипептида FVIII.
2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид с активностью FVIII, где указанная последовательность нуклеотидов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая обладает:
(i) по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 1;
(ii) по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 2;
(iii) по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 70;
(iv) по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 71;
(v) по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 3;
(vi) по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по
меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей
165
мере приблизительно 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 2320-4374 последовательности SEQ ID NO: 4;
(vii) по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 23204374 последовательности SEQ ID NO: 5;
(viii) по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью по отношению к последовательностям нуклеотидов 58-2277 и 23204374 последовательности SEQ ID NO: 6; или
(ix) или любой комбинацией пп. (i) - (viii).
3. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1 или п. 2, отличающаяся тем, что указанная последовательность нуклеотидов дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид, при этом указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью по отношению к последовательностям:
(i) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 1;
(ii) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 2;
(iii) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 3;
(iv) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 4;
(v) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 5;
(vi) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 6;
(vii) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 70;
(viii) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 71; или
(ix) нуклеотидов 1-57 последовательности SEQ ID NO: 68.
4. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты обладает одним или более свойством, выбранным из группы, состоящей из следующих свойств:
(a) индекс адаптации кодонов для человека указанной молекулы нуклеиновой кислоты или ее части увеличен относительно последовательности SEQ ID NO: 16;
(b) частота оптимальных кодонов указанной последовательности нуклеотидов или ее
части увеличена относительно последовательности SEQ ID N0:16;
166
(c) указанная последовательность нуклеотидов или ее часть содержит больший процент нуклеотидов G/С по сравнению с процентом нуклеотидов G/С в последовательности SEQ ID NO: 16;
(d) относительная частота использования синонимичного кодона указанной последовательности нуклеотидов или ее части увеличена относительно последовательности SEQ ID NO: 16;
(e) эффективное число кодонов указанной последовательности нуклеотидов или ее части снижено по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 16;
(f) указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше последовательностей MARS/ARS (последовательности SEQ ID NO: 21 и 22) относительно последовательности SEQ ID NO: 16;
(g) указанная последовательность нуклеотидов содержит меньше дестабилизирующих элементов (последовательности SEQ ID NO: 23 и 24) относительно последовательности SEQ ID NO: 16; и
(h) любая комбинация перечисленного.
5. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-4, дополнительно содержащая гетерологичную последовательность нуклеотидов, кодирующую гетерологичную последовательность аминокислот.
6. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 5, отличающаяся тем, что указанная гетерологичная последовательность аминокислот представляет собой константную область иммуноглобулина или ее часть, XTEN, трансферрин, альбумин или последовательность PAS.
7. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 5 или 6, отличающаяся тем, что указанная гетерологичная последовательность аминокислот соединена с N-концом или с С-концом последовательности аминокислот, кодируемой указанной последовательностью нуклеотидов, или инсертирована между двумя аминокислотами в последовательности аминокислот, кодируемой указанной последовательностью нуклеотидов, в одном или более сайтах инсерции, выбранных из таблицы 3.
8. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что указанный полипептид FVIII представляет собой полноразмерный FVIII или FVIII с делецией В-домена.
9. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-8.
10. Вектор по п. 9, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой лентивирусный вектор
11. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-8 или вектор по п. 9 или 10.
12. Полипептид, продуцированный клеткой-хозяином по п. 11.
13. Способ получения полипептида с активностью FVIII, включающий: культивирование клетки-хозяина по п. 11 в условиях, обеспечивающих продуцирование полипептида с активностью FVIII, и выделение указанного полипептида с активностью FVIII.
14. Способ увеличения экспрессии полипептида с активностью FVIII у субъекта, включающий введение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-8 или вектора по п. 9 или 10 нуждающемуся в этом субъекту, причем экспрессия указанного полипептида увеличивается применительно к референсной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID NO: 16, или вектором, содержащим указанную референсную молекулу нуклеиновой кислоты.
15. Способ лечения расстройства системы свертывания крови, включающий: введение нуждающемуся в этом субъекту молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-8, вектора по п. 9 или 10, или полипептида по п. 12.
ATGCAGATCGAACTGAGCACCTGCTTCTTTCT'GTGCCTGCTGAJ3GTTTTGCTTTAGCGCCACCAGGAGATA_CTA_TCTGGGCGC CCTCCAACrCACCTCCCACTATATCCACrCTCATCTCCCCCAACTCCCAGTCCATCCCACCTTTCCCCCGACACTCCCCAAAA GCTTTCCCTTTAATACCAGCGTGGTGTATAAGAAAACCCTGTTTGTGGAATTCACTGATCATCTGTTTAATArCGCCAAGCCC AGCCCCCCCTCCATCCCCCTCCTCCCCCCCACCATCCAGCCCCAACTCTATCATACCCTCCTCATCACCCTCAAAAACATCCC CAGCCATCCAGrGAGCCTGCATGCTGTGGGCGTGTCCTATTGGAAAGCCTCTGAAGGCGCCGAGTATGATGATGAGACCAGCC AGAGGGAAAAAGAAGATGATAAAGTCTTTCCT'GGGGGCAGCCATACCTATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAAAATGGCCCCATG СССАСССАГССССТСТСССТСАССТАТАССТАТСТСАСССАТСТССАССТССТСААССАТСТСААСАССССССТСАТТССССС CCTGCTGGTGTGCAGGGAAGGCAGCCTGGCCAAAGAAAAAACCCAGACCCTGCATAAGTTTATCCTGCTGTTTGCCGTGTTTG ATCAACCCAAAACCTCCCATTCTCAAACCAAAAACACCCTCATCCACGACACCCATCCCCCCTCTCCCACCCCCTGCCCCAAA ATGCATACCGTGAATGGCTATGTGAATAGGAGCCTGCCTGGCCTGATTGGCTGCCACAGGAAAAGCGTGTATTGGCATGTGAT CGGCATGGGCACCACCCCCGAAGTGCATAGCATCTTTCTGGAAGGCCATACCTTCCTGGTCAGGAACCACAGGCAGGCCAGCC TGGAAATCAGCCCCATCACCTTCCTGACCGCCCAGACCCTGCTGATGGATCTGGGCCAGTTTCTGCTGTTTTGCCACATCTCC AGCCATCAGCArGATGGCATGGAAGCCTATGrGAAAGTCGATAGCTGCCCCGAAGAACCCCAGCTGAGGATGAAAAACAATGA AGAAGCCGAAGACTATGATGATGATCTGACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGATAATAGCCCCAGCTTTA TCCAGATCAGGAGCGTGGCCAAAAAACAT'CCCAAGACCTGGGTGCATTATATCGCTGCTGAGGAAGAAGATTGGGACTATGCC CCCCTGCTGCTGGCCCCTGATCATACCAGCTATAAAACCCACTATCTCAACAATCCCCCCCACACGATTCGCACCAACTATAA AAAAGTCAGGTTTATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACCAGGGAAGCCATCCAGCATGAGTCTGGCATCCTGGGCCCCC TGCTGTATCCCCAACTCCCCCACACCCTCCTCATCATCTTTAAAAATCACCCCACCACGCCCTATAATATCTATCCCCATCCC ATGACTCArCTCACCCCCCTCTACACCACCACCGTCCCCAAACCCCTCAAACATCTCAAACATTTTCGCATCCTCCCTCCCCA AATCTTTAAGTATAAATGGACTGTGACTGTGGAAGATGGCCCCACCAAAAGCGATCCCAGGTGCCTGACCAGGTATTATTCCA ССТТТСТСААТАТССААССССАТСТССССТСГССССТСАТТСССССССТССТСАТСТССТАТАААСАСТСТСТССАССАСАСС GGCAATCAGATCATGAGCGATAAAAGGAATGrCATCCTGTTCTCTGTCTTTGATGAGAATAGGAGCTGGTACCTGACCGAAAA CATCCAGAGGTrTCTGCCCAATCCCGCCGGCGTGCAGCTGGAAGATCCCGAGTTTCAGGCCAGCAATATCATGCATAGCATCA ATGGCTATGTCrTTGATAGCCTGCAGCTGAGCGTGTGCCTGCATGAGGTGGCCTATTGGTATATCCTGAGCATCGGCGCCCAG ACCGATTTTCTGAGCGTGTTTTTCTCTGGCTATACCTTTAAACATAAAATGGTGTATGAGGACACCCTGACCCTGTTTCCCTT CTCTGGCGAAACCGTGTTTATGAGCATGGAAAATCCCGGCCTGTGGATCGTGGGCTGCCACAACAGCGATTTCAGGAACAGGG GCATGACTGCCCTGCTGAAAGTCTCCAGCTGCGATAAAAACACTGGGGACTATTATGAGGACAGCTATGAGGACATCAGCGCC TATCTGCTGACCAACAACAATCCCATCCAACCCACCACCTTTACCCACAATCCCCCACTCCTCAAAAGCGATCACACCCAAAT CACCAGGACCACCCTGCAGTCTGATCAGGAAGAAATCGACTATGATGATACCATCAGCGTGGAAATGAAGAAAGAAGATTTTG ATATCTATGATGAACATCAAAATCACACCCCCACCACCTTTCACAACAAAACCACGCATTACTTCATCCCTCCTCTCCAAACC CTGTGGGACTArGGCATGTCCAGCAGCCCCCATGTGCTGAGGAACAGGGGCCAGTCT GGCAGCGTGCCCGAGTTTAAAAAAGT CGTCTTTCACGACTTTACCGATGCCACCrTTACCCACCCCCTGTATAGCCCCCAACTCAATGAACATCTCCCCCTGCTGCCCC CCTACATCACGCCCCAACTCCAACATAArATCATCCTCACCTTCACCAACCACCCCACCACCCCCTACACCTTTTATTCCACC CTGATCAGCTArGAGGAAGATCAGAGGCAGGGGGCTGAGCCCAGGAAAAACTTTGTGAAACCCAATGAAACCAAGACCTACTT TTCCAAAGTCCACCATCATATGCCCCCCACCAAC CATCAATTTCATTGCAAACCCTCCCCCTACTTCTCTCATCTGCACCTGC AAAAAGATGTGCATAGCGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGGTGTGCCACACCAATACCCTGAACCCTGCCCATGGCAGGCAGGTG ACTGTGCAGGAGTTTGCCCTGTTCTTTACCArCTTTGATGAAACCAAAAGCTGGTACTTCACCGAAAACATGGAAAGGAACTG CAGGGCCCCCTGCAACATCCAGATGGAAGATCCCACCTTTAAAGAAAATTATAGGTTCCATGCCATCAATGGCTATATCATGG ATA_CCCTGCCTGGCCTGGTCATGGCCCAGGACCAGAGGATCAGGTGGTATCTGCTGAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCAT AGCATCGATTTGTCTGGCCATGTCTTTAGGGTGAGGAAAAAAGAAGAGTATAAAATGGCCCTGTATAATGTGTACCCTGGGGT GTTTGAAACCGTGGAAATGCTGCCCAGCAAAGCCGGCATCTGGAGGGTGGAATGCCTGATTGGCGAACATCTGCATGCTGGCA TCACCACCCTCTTTCTCCTCTATACCAATAAGTCCCACACCCCCCTCCGCATGCCCTCTCCCCATATCACGCATTTTCACATC ACTGCCTCTGGCCAGTATGGCCAGTGGGCCCCCAAACTGGCCAGGCTGCATTATTCCGGAAGCATCAATGCCTGGAGCACCAA AGAACCCTrTACCTCCATCAAACTCCATCTCCTCCCCCCCATCATCATCCATCCCATCAACACCCACCCCCCCACGCAGAAAT TTTCCACCCTCrACATCAGCCACTTTATCATCATCTATACCCTCCATCGGAAAAAATCCCACACCTATAGGCGGAATACCACC GGCACCCTGATGGTGTTCTTTGGCAATGrGGACAGCAGCGGCATCAAACATAATATCTTTAATCCCCCCATCATCGCCAGGTA TATCAGCCTCCATCCCACCCATTATACCATCAGCACCACCCTCACGATGCAACTCATCCCCTCCCATCTCAACACCTCCACCA TGCCCCTGGGCATGGAAAGCAAAGCCATCAGCGATGCCCAGATCACTGCCTCCAGCTACTTCACTAATATGTTTGCCACCTGG AGCCCCAGCAAACCCACCCTCCATCTCCACGCCACCACCAATCCCTCGACCCCCCACCTCAACAATCCCAAAGAATCCCTCCA GGTCGATTrTCAGAAAACCATGAAAGTCACTGGGGTGACCACCCAGGGGGTGAAAAGCCTGCTGACCAGCATGTATGTGAAAG AGTTTCTGATCrCCAGCAGCCAGGATGGCCArCAGTGGACCCTGTTCTTTCAGAATGGCAAAGTCAAAGTCTTT CAGGGCAAT CAGGACAGCTTTACCCCTGTGGTGAATAGCCT'GGATCCCCCCCTGCTGACCAGGTATCTGAGGATCCATCCCCAGAGCTGGGT GCATCAGATCGCCCTGAGGATGGAAGTGCTGGGCTGCGAAGCCCAGGACCTGTACTGA
ATGCAGATCGAGCTGAGCACGTGCTTCTTCCTGTGCCTGCTGAGGTTCTGCTTCAGCGCCACCAGGAGGTACTACCTGGGCGC CGTGGAGCTGAGCTGGGACTACATGCAGAGCGACCTGGGCGAGCTGCCCGTGGACGCCAGGTTCCCCCCCAGGGTGCCCAAGA GCTTCCCCTTCAACACGAGCGTGGTGTACAAGAAGACCCrGTTCGTGGAGTTCACCGACCArCTGTTCAATArCGCCAAGCCC АССССССССТССАТСССССТССГСССССССАССАТССАСССССАССГСТАССАСАСССТССГСАТСАСССТСААСААСАГССС CACCCACCCCCTCAGCCTGCACGCCCTGGGCCTGACCTACTGCAAGCCCACCGAGCGCCCCGAGTACGACGACCACACCAGCC AGAGGGAGAAGGAGGACGACAAGGTGTTCCCCGGCGGCAGCCACACCTACGTGTGGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGGCCCATG ?ССАСССАСССССТСТСССТСАССТАСТСГТАССТ CACCCACCTCGATCTCCTCAAGCACCTGAACACCCCCCTCATCCGCCC CCTGCTGGTGTGCAGGGAGGGCAGCCTGGCCAAGGAGAAGACCCAGACCCTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTCGCCGTGTTCG ACGAGGGCAAGAGCTGGCACAGCGAGACCAAGAACAGCCrGATGCAGGATAGGGACGCCGCCAGCGCCAGGGCCTGGCCCAAG ATGCACACCGTGAACGGCTACGT'GAACAGGTCTCTGCCCGGCCTGArCGGCTGCCACAGGAAGAGCGTGTACT'GGCACGT'GAT CGGCATGGGGACCACCCCCGAGGTGCACAGCA.TCTTCCTGGA.GGGCCACACGTTCCTGGTGAGGAATCACAGGCAGGCCAGCC TCCACATCACCCCGATCACCTTCCT?ACCGGCCACACCCrCCTCATGGACCTGCCGCACTTCCTCCTCTTCTGGGATATCACC T С T С AC С AC С AC CAC С С CAT С С AC С С С ГАС СТ СААС С Г С CAT АС С Т G С С С С САС CAG С С С САС СТ САС САГ СААСААСААС СА GGAGGCCGAGGACTACGACGACGACCTGACCGACAGCGAGATGGACGTGGTGAGGTTCGACGACGACAATAGCCCGAGCTTCA TCCAGATCAGGAGCGTGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCATTACATCGCCGCCGAGGAGGAGGATTGGGACTACGCC CCCCTGGTGCTGGCCCCCGACGACAGGTCrTA.CAAGAGCCAGTACCTGAACAACGGGCCCCAGAGGATCGGCAGGAAGTACAA GAAGGTGAGGTTCATGGCCTACACCGACGAGA.CCTTCAAGACCAGGGAGGCGATCCAGCACGAGAGCGGGATCCTGGGGCCCC ТССТСТАСССССАССТСССССАСАСССТССТСАТСАТСГГСААСААССАССССАССАСССССГАСААТАТСТАСССССАСССС ATCACCGACGTGAGGCCCCTGTACTCTAGGAGGCTGCCCAAGGGCGTGAAGCACCrGAAGGACTTCCCCATCCTGCCCGGCGA GATCTTCAAGTACAAGTGGACCGTGACCGTCGAGGACGGGCCCACGAAGAGCGACCCCAGGTGCCTGACCAGGTACTACAGCT СТТТССТСААСАГССАСАСССАССТССССАССССССТСАГССССССССТССТСАТСТССТАСААССАСАСССГССАТСАСАСС GGCAACCAGATCATGAGCGACAAGAGGAACGTGATCCTGTTCAGCGTGTTCGACGAGAATAGGTCTTGGTACCTGACCGAGAA TATCCAGAGGTTCCTGCCCAACCCCGCCGGCGTGCAGCrGGAGGATCCCGAGrTCCAGGCCAGCAACATCATGCACAGCATCA ACGGCTACGTGTrCGACAGCCTGCAGCTGAGCGTGTGCCI'GCACGAGGTGGCCTACTGGTACATCCTGAGCAT'CGGCGCCCAG ACCGACTTCCTGAGCGTGTTCTrCAGCGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGrGTACGAGGAT'ACCCTGACCCTGTTCCCCTT САССССССАСАСССТСТТСАТСАССАТССАСААССССССССТСТССАТССТССССГСССАТААСТСССАСГТСАССААТАССС С CAT С AC С С С С С Г С СТ С ААС С Т САС С Т С Г Г С С САС ААСААСАС С С С С САС ТАСТАС САС САГАС С ТАС САС CAT AT CAG С С С С TACCTGCTGAGCAAGAACAACGCCATCGAGCCCAGGTCTTTCAGCCAGAACCCCCCCGTGCTGAAGAGGCACCAGAGGGAGAT CACCAGGACGACCCTGCAGAGCGACCAGGAGGAGATCGACTACGACGACACGATCAGCGTGGAGATGAAGAAGGAGGATTTCG ACATCTACGACGAGGACGAGAATCAGAGCCCCAGGTCrrTCCAGAAGAAGACCAGGCATTACTTCATCGCCGCCGTGGAGAGG CTGTGGGACTACGGCATGAGCAGCTCTCCCCACGTGCTGAGGAATAGGGCCCAGAGCGGCAGCGTGCCCCAGTTCAAGAAGGT CCTCTTCCACCACTTCACCCACGCCACCrrCACCCACCCCCTCTACACCCCCGAGCTGAACGACCACCTCGGCCTCCTCGGGC CCTACATCAGGGCCGAGGTGGAGGATAACATCATGGTGACCTTCAGGAATCAGGCCAGCAGGCCCTATAGCTTCTATAGCTCT СТСАТСАССТАССАССАССАТСАСАСССАССССССССАССССАССААСААСГГССГСААССССААССАСАССААСАССТАСТТ СТССААССТССАССАССАСАТСССССССАССААССАССАСТТССАСГССААССССГСССССТАСТТСАСССАССТССАТСТСС AGAAGGACGTGCACAGCGGCCTGATCGGGCCCCTGCTGGTGTGCCACACCAACACCCTGAACCCCGCCCACGGCAGGCAGGTG ACCGTGCAGGAGTTCGCCCTGTrCTTCACCATCTTCGACGAGACCAAGAGCTGGTACTTCACCGAGAATATGGAGAGGAATTG CA.GGGCC CCCTGCAATATCCAGATGGAGGACCCGA.ee TTCAAGGAGAATTACAGGTTCCACGCCA.TCAACGGCTA.CATCATGG ACACGCT &CCCGGCCTGGTCATGGCCCAGGATCAGAGGArCAGGTGGTATCTGCTGAGCATGGGGAGCAACGAGAATATCCAC АССАТССАСТТСАССССССАССГСТТСАСССТСАССААСААССАССАСТАСААСАГСССССГСТАСААТСГСГАССССССССТ СТТССАСАСССТССАСАТССТССССАССААСССССССАГСТССАСССТССАСГСССТСАТСССССАССАССТССАСССССССА TGAGCACGCTGTrCCTGGTGTACTCTAACAAGTGCCAGACCCCCCTGGGGATGGCCAGCGGCCACATCAGGGACTTCCAGATC AGCGCCAGCGGCCAGTACGGCCAGTGGGCCCGCAAGCTGGCGAGGGTGCACTATTGGGGAAGGATCAACGCCTGGAGCACGAA GGAGCCCTTCAGCTGGATCAAGGTGGATCTGCTGGCCCCCATGArCATCCACGGGATCAAGACCCAGGGCGCCAGGCAGAAGT TCAGCTCT CT GTATA_T CAGCCAGTT CAT CAT CAT GT AC T СТ С T G GAC G G CAAGAAGT G G CAGAC CTACAGGGG С AA CAG С A_C С GGCACGCTGATGGTGTTCTTCGGCAACGTGGACTCTAGCGGGATCAAGCACAATArCTTCAACCCCCCCATCATCGCCAGGTA CATCAGGCTGCACCCCACCCATT'ACTCTAT'CAGGTCTACCCTGAGGATGGAGCTGATGGGCTGCGACCTGAACAGCTGCAGCA ТСССССТССССАГССАСАССААССССАГСАСССАСССССАСАТСАСССССАССТСГТАСТТСАССААСАТСТГССССАССТСС ACCCCGACCAACGCCACCCTCCACCTCCACCCCACCTCTAACCCCTCCACCCCCCACCTCAACAACCCCAACCACTCCCT'GCA GGTGGATTTCCAGAAGACCATGAAGGTGACCGGCGTGACCACGCAGGGCGTGAAGAGCCTGCrGACCAGCATGTACGTGAAGG AGTTCCTGATCAGCT CTAGCCAGGACGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAGAACGGCAAGGTGAAGGTGTTCCAGGGCAAC CA_GGATAGCTTCACCCCCGTGGrGAACAGCCTGGA_CCCCCCCCTGCrGA_CCAGGTATCTGAGGATCCACCCCCAGAGCTGGGT GCACCAGATCGCCCTGAGGATGGAGGTGCrGGGCTGCGAGGCCCAGGATCTGTATTGA
AT G CAAAT С GAACTGAGCAC С T GT TT CTT С CT CT GC С TG С T GAGATT CT G TTT CT С С G CGAC CC G С С GATACTAC CT G G GA GCAGT GG AG С T CT С CT GG GATTACAT G СAGAGC GAC CTT GG GGAGC TG С С С GT G GAT G CCAG GTT CCCTCCCCGGGTGCCAAAGTCGTTTCCGTT СAACAC CTCCGTGGTG TACAAGAAAACTCT GTTC GTGGAGTTCACCGACCACCTGTTСААТАГС G С СAAG CCCAGACCTCCCT GGAT G GGGCTGTTG GGAC СТАССАТС СAAGC G GAG GT GTAC GACACTGTGGT CATCACT CT GAAGAACAT GG CC T С G СAT С С С GTGTC CC T GC ACGCCGTGGGAGT GTCTTACTG GAAAG CGT С С GA GGG GG CC G AAT AC GAC GAC CAGAC CT CG CAG AG AG AAAAG G AAGATGAC AAG GT GTTCCCAGGAGGATCGCACACCTACGTGTGGCAftGTGTTGAAGGAGAACGGCCCAATGGCCTCCGACCCGCTGTGCCTGACCTACTCG TACCTGTCCCACGTGGACCTCGT G AAG GAC CT CAACT С G GG AC T G AT TG G AGC С CT G CTG GT CT G С AGG G AAG G С T CACTG GC GAAAG AAAAG ACT CAGAC CT T GC AC AAGT TCATT CT G CT GTT С G С T G T GTT С GAC GAG GG GAAGT CGTGGCACAGC GAGACTAAGAAC ТС С С T GATGCAAGATAGAGATGCCGCCTCCGCCCGGGCCTGGCCTAAGATGCACACCGTGAACGGTTACGTGAACCGCTCCCTCCCTGGCCTG ATTGGATGCCACC GGAAG TCCGTGTACTGG CACGTGATC GGGATGGG GAC САС С С С С GAG GT GCACAGCATCTTCCTG GAA GGTCACA CATTTCTCGTGCG CAAC CACCGGCAGGCCTCCCT GGAAAT CAGCCCCAT TACCTT С CTCA CT GC С CAGAC T CT G С T GAT GGAC CT G GG AC AGTT С CT GC TGTT С T G С С AT AT CT С CT С С САС CAAC AT GAC G G AATG G AGG CATAC GT GAAGG T С GAT T С С T G С С СТ GA GGAAC С С CAGCTCCG CAT GAAGAAC AAT GAG GAAGC С GAGGAC TACGACGACGACCT GAC G GATAGC GAGATGGATGTGGTCCGGTTC GATGACG AT AAC AG CCCTTCCTTCATC С AAATT CGCTCGGT GGC AAAG AAG С AC CC С AAGAC CTGGGTGCAT T ACAT T G С G G С G GAAGAA GAG GA CTGG GATTATG CCCCGCTTGTCCTCGCTCCT GAC GAC CGGAGC TACAAG AG CCAGTAC CT GAAC AAC GG T С CACAGAG GAT CGGTAGA AAG TACAA GAA GGTCCGCTTCAT G GC CTATAC CGAC GAAAC CTT С AAAACTAGAGAG GCCATCCAACAC G AAT С С G G CATC CT GGGCC С G С T CTT GTAC GGAGAAG TCGGCGACACCCTTCT CAT TATCTTCAAGAAC CAG GCTTCCCGGCCG T ACAAC AT CT AT С С GC AT GGG AT САС T G AC GT GC GC CC AC T GT AC T С GC G GC G С CTG CCC AAGG G T GTC AAACACCT GAAG GATT ГТ С С G AT С С ТТ С С G G GAGAAATC Т Т С AAG TACAAGTG GACCGTGACCGTG GAAGAT G G CC CAAC TAAGT CTG АСС CTAGAT GCCTCACCCGCTACTACTCATCCTTCGT CAAC А TGGAGCGC GAC CTGGCCAGCG G AC TG АТС G GCCCGCTGCTGATTTGC TACAAG GAAT CAGTG GACCAACGGG GAAAC CAGATC AT GTC G G ATAAGAG GAAC GTCATCCTCTTCTCCGTGTTT GAC GAAAAC CGGTCGTGGTACCT GAC TGAAAAC AT CCAGCGGTTCCTCCCCAAC CCCGCGGGCGTGCAGCTGGAAGAT CC T GAGTTTCAGG CATCAAACAT CAT G СACT С CATTAACGGCTACGTGTTC GATT CGCTGCAGC TGAGCGTGTGTCTGCACGAAGTGGCCTACTGGTACATCCTGTCCATTGGTGCCCAGACTGACTTCCTGTCCGTGTTTTTCTCCGGCTA С AC GTT CAAGC AC AAG AT GG T G TACG AGGACACC CTGACCCTCTTCCCTTTTTCCGGCGAAACTGTGTTTATGAGCATGGAGAATCCC GGCCTGTG GAT CTTGGGCTGC С AC AA CAG С GACT ТС С GT AAC AGAG GAAT GACTG С G CTG CT CAAGG TG T CCAGCTGC GAC AA GAACA С С G GAGACTAT TATGAGG AC T С AT AC GAG GACAT CTCCGCCTACCTCCT GT CCAAGAATAAC GC С AT TGAAC С T С G GAG CT TC AGC С A GAACCCACCCGTGCTTAAGAGACATCAACGGGAGATCACTAGGACCACCCTGCAGTCAGACCAGGAGGAAATCGACTACGATGACACC ATCTCGGTCGA GATGAAG AAG GAG GACTTT GACATC T AC GAC GAAGATG AAAAC CAGAGC CCGAGGTCGTTC С AAAAGAAAAC CCGCC ACTACTTTATT GCTGCTGTCGAGCGGCTGTGGGACTACGGAATGTCGTCCTCGCCGCACGTGCTCCGCAACCGAGCCCAGAGC GGCTC GGTGCCGCAATTCAAGAAGGTCGTGTTCCAGGAGTTCACTGACGGGAGCTTCACTCAGCCTTTGTACCGGGGAGAACTCAATGAACAT CTCGGCCTCCT CGGACCTTACAT С AG AGCAGAAGTC-G AAGAT AAC AT CATGGTCACTTTC CGTAAC CAAGCCAGCCGCCCGTACTCGT TCTACTCCTCC CT CAT T T С T T AC GAA GAG GAC CA GCG GC AG G G С GCAGAAC CG С G CAAGAAC ГТ С GT GAAG С С CAAC GAAA CC AAG AC CTACTTCTG GAAA GTGCAGCAT CATAT GG С С С CGAC TAAGGAC GAGT TT GACTG CAAAGC CTGGGCCTACTTCTCC GAT GT GGAC T T G GAGAAG GAC GT CC AC T С С GG С С T С AT С GGT С С CC ТС-С ТС GT G Т G СС АТАС СААТАС С CTGAA СС С С G САС AC G GT С G С CAG GT САС С G TGCAGGAGTTC GCTCTGTTCTT САСТ АТСТТ С GA CGAAACT AAGTC С TG GTACTT САС CGAGAAC AT GG AG AG GAACT G CAGA GC С С С CTG TAACAT CCAGAT G GAGGAC С С GAC GTT CAAG GAAAACT AC CGGTTCCACGC CATTAA CGGATACATCATG GATAC GCTGCCGGGT CTT GTGAT GGC CC AGG AT CAAC G GAT CAGAT GGTACTTATTGTCGATGGG CAG CAAC GAGAA CAT С САС T С ТАТТ САСТТС ТС CGG Т С ATGTGTTCACTGTGCG GAAGAAG G AAGAGTACAA GATGGCCCTGTACAAC CTTTAT CCCGGAGTGT TCGAAAC TGTG GAAATG CTGCC G Т С GAAG G С CG GC AT Т Т G GC G С GT GG AGT GTTTGAT Т GG AGAACAT С ТС С ATG С G G G GAT GT СААС С СТ G Т Т С СТ G GT GTATA GC ААС AAGTGCCAGACTC CGCTTGGGATGGCGTCAGGACACATTAGGGATTTCCAGATCACTGCGTC CGGCCAGTACGGCCAATGGGC СССТА AGCTGGCCCGCCTGCATTACTCCG GAT CCATTAACGC С Т GG Т СААС С AAG GAG С САТТ CTCCTGGAT CAAG GTGGACCTTCTGGCCCC CATGATTATCCACGGAATTAAGACCCAGGGGGCCCGGCAGAAGTTCTCCTCACTGTACATCAGCCAGTTCATAATCATGTACTCCCTG GACG GAAA GAA GT GGC AAAC С T AC AG G GG GAACAGC ACC GGC ACACT GAT GGTCTTTTTC GGAAAT GTGGACTCCTCCG GGAT TAAGC AT AACAT CTTCAACCCTCCGATTATCGCTCG GTACAT TAGACTTCACCCTACCCACTACAGCATTCGCTCCACCCTGCG GATG GAAC T GATGGGCTG CGAT CTGAACTCGTGCAG CAT G С CGTTGGGAAT G GAGT CC AAAG CAATTTC CGAC GCG CAGAT CACCGCCTCGTCC TAG TTTACCAACATGTTCGCCACGTGGTCACCGTCCAAGGCCCGGCTGCACCTCCAGGGAAGATCCAACGCATGGCGGCCACAGGT CAACA ACC CTAAG GAGTG GCTCCAGGTGGAC TTCCA GAAAAC CAT GAAG GT С AC С G GAGT CACAA CC CAG GGAG T GAAGT С G CT GC TGAC T T С TAT GTAC GT CAAG GAGTTCCT GAT CTCCAGCAGC CAG C-AC GGG CAC CAGTG GAC CCTGTTCTTC CAAAAT G GAAAG GT CAAGGTGT TT CAGGGCAATCAGGATTCATTCACCCCGGTGGTGAACTCCCTTGATCCACCCCTCCTGACC CGCTACCTTCGCATCCACCCACAGTCCT G G G T GCAC CAGAT CGC GC T GAG GATG GAG GT С CT GGGAT GCGAAGCCCAG GAC CTGTACTGA
AT G CAGATT GA GC TGT CCAC T T GT TT CTT С CT GT GCCTC CT G С G С TT CT GTTTCT С С GCCAC TC G С С G G TACTAC CTT G GA GC CGT GG AG С TTT CAT GG GACT AC ATG С AGAG С GAC CT G GG CGAAC TCCCCGTGGATGC CAGATTCCCC CCCCGCGTGC CAAAGT С CTTC CCC T T TAACAC CTCCGTGGT GT ACAAGAAAACC CT CTTT GTCGAGT T С AC T G AC CAC CTGTT CAA CATC G С CAAG CCGCGCCCACCTTGGATG GGCCTCCTG GGAC CGACC AT T CAAG С TGAAGT GTACGAC AC CGTGGTGAT CACCCTGAAGAA CAT GGC G T С С САС С С С GTGTC CC T GC AT G С G GTC GGA GT GT С CTAC T G GAAG GC CT С С GAAGGAG CT G AG TAC GAC GACCAGACTAGC CAG CGG G AAAAG GAG GACGATAAAGT GT T С С С GG G CG GC TCG СATAC TTAC G TGT G G CAA GTCCT GAAGGAAAAC G GACCTAT G GC AT CC GAT CCTCTGTGCCT GAC TT ACT CC TACCTTTC CCATGTGGAC CTCGTGAAGGACCT GAACAGC GGG С T G AT T G GT G QACTT CTCGT GTGCCGCGAAGGTTCGCTC GCTAAGG AAAAGACC CAGAC CC T С СATAAGT T СAT С CTTTT GT TCG CT G T GT T С GAT GAAG GAAAGT CATGGCATTCC GAAACTAAGAACTCG CT GAT G CAG GACC GG GAT GC CGC С T CAG CC С G С G CCTGGCC TAAAAT G С AT ACAGTCAACGGAT AC G TGAAT С G G T С ACT G CC CG GGC TC AT С G GTTGT CA CA GAAAG ТС С G T G T ACT G G CACGTCATC GGC AT G G G CACTACG С CT GAAGT GCACTCCATCTTCCTG GAAGG GCACA CCTTCCTCGTGCG CAAC CACCGCCAGGCCTCTCT GGAAATCT С С С С GAT TAC CTTTCTGACC GCCCAGACTCTGCT CAT GGAC CTG GG GC AGT T С CTTCTC TT С T GC CAC AT CT CCAG С GAT CAGCAC G AC G G AAT G G AG GCCTACGT GAAGG T G G AC T CAT G С С С G GAAGAAC С T CAGTTGCG GAT GAAGAAC AAC GAG GAGG С С GAGGACTAT GAC GAC GATT T GACT GACT CC GA GAT GGAC G T С G T G С G GTTC GATGACG AC AACAGC С CCAG CT T С АТС CAGATT CG CAG С GT GGCC AAG AAG САС С С CAAAAC CTGGGTG CAC TACATCGCGGCC G AGGAA GAAGA TT G G GACTACG CCCCGTTGGTGCTGG CAC С С GAT GACCGGT С GTACAAG T С С CAGTATCT GAAC AAT GGTCCGCAGCG GATTG GC AGA AAG TACAA GAAAGTGC GGTTCATGGC GTACACTGACGAAAC GTTTAAGACC С GGGAG GCC AT TC AAC AT G AGAG С G G САГТ CT GGGAC CACTGCT GTAC GGAGAGG TCGGC GAT AC С CT G CT CATCATC T T С AAAAAC CAGGCCTCCCGGCCT TACAA CAT CT AC С СГС AC GGAAT CAC С GAC GT GC GG CC ACT С T AC T С G С GG С G С CTG CCGAAGGG С GT CAAG CAC CTGAAAGA CTTCCCTATCCTGCCGGG CGAAATC T TC AAGTATAAGTG GACC GTCACCGTG GAGGAC G G GC CCACC AAG AG С GAT С CTAGGT GT CTGAC TCG GTAC TACT С CAG CTTC GT GAACA TG GAAC G G GAC CT GGC AT CG G GAC T С ATT G GACC GCTGC TGAT С T G С TACAAAGAGT CGGTGGAT CAAC G С G G CAAC CAGATC AT GTC CG ACAAG С G CAAC GT GAT CC T G TT CT CC GT GTTT GATGAAAA CAGAT CCTGGTACCT CACTGAAAACAT С С AGAG GTT С CT CC CAAAC CC С G CAGGAGT GC AAC T G GAG GAC С С TGAGTTTCAGGCC TC GAAT AT CAT G CACT CGATTAA CGG T TAC G T GT T С GACT CG CT GCAGC TG AG С GT GT GC CT CC ATGAAG T С G CT TACT G GTACATTC TGTCCATCGGCG С CCAGACTGAC TTCCTGAGCGTGTTCTTTTCCGGTTA С AC CT TTAAGCACAAG AT GG T G TAC G AAGATACC CT GAC С С T GTT С С CT TT CTCC GG С GAAA CGGTGTTCATGTC GAT G GAGAACC CG GGTCTGTG GATTCTGG GAT GC С AC AA CAG С GACT TT CGGAAC CGCGGAATGACTGCCCTGCT GAAGG TGTCCTCATGC GACAA GAACA CC G GAGACTACTACGAGGAC T С CT AC GAG GATAT CTCAGCC TACCTCCTGTC CAAGAACAAC GC GAT С GAG С С G С G CAG CT TCAGC CA GAAC С С G С CTGTG CT GAAGAG GCAC С AG С GAGAAATTAC CCGGACCACCCTC QAATC GGATCAGGAG GAAAT С GACTAC GACGACAC С AT С T С G GT GGAAATGAAGAAG G AAGATTT С GATATCTAC GAC GAG GAC GAAAAT CAGTCC CC TC G С T С AT T С С AAAAGAAAACTAGAC AC TACTTTATC GCCGCGGTG GAAA GACT GTGGGACTAT GGAAT GTCATCCAGCCCT CACGTC CT T С G G AAC С G G G С С CAGAGC GGATC GG T G С CT CAGTTC AAG AAAG TGGTGTTCCAG GAGTT CAC CGAC G G С AG С TT CACC CAG CC GC TGT AC С G G G GAGAACT GAA CGAAC AC CT G G G С CT GCT CGGT С CC TACAT С С G CG С G GAAGTGGAGGAT AACAT CAT G GTGACCTTC CGTAACCAAG СИ CCAGA.CCTTACTCCT TC TAT TCCTCCCT GAT С T CAT AC GAG GAG GAC CAGCGCC AAG GC G С С GAG С С CCG CAAGAAC TTCGTCAAGCC CAAC GAGA CT AAGAC CTACTTCTG GAAG GTC CAACAC CATATGGCCC CGACCAAGGAT G AGT T T GACTGCAAGGC CT GGGCCTACTTCTCCGACGT GGACC TT GAGAAG GAT GT CC AT T CC GGC С T G AT CG G G С С GCTGCT С GT G T GT CACAC CAACACC CTGAACC С AGC G С AT G GAC G С CAG GT CAC CG TC С AG GAGTTT GCTCT GT TC T T CAC CATTTTT GA CGAAACT AAGT CCTGGTACTT CACCGAGAAT AT GGAGC G AAACT GTAGAGCGCC CTG CAATAT С CAGAT G GAA GAT С С GACTTT CAAG GAGAAC TAT AG AT T С CACGCCAT CAACG GGTACAT СAT G GATACT CT GC CGGGG CT G GT CAT GGC CC AGGAT CAG AG G AT TC G GT G GT ACTT GCT G T С AAT G G GAT CGAAC GAAAACAT T С AC T С CATT CACTTCTC CGG TC ACGTGTT CACT GT GCG CAAGAAG GAG GAGTACAA GATGGCGC T G T AC AAT CT GTAC С С CG GG GTGT T С GAAAC T G T G GAGATG CT G CC GTC CAAG G С CG GCAT CTG GAG AGT G GAGT G С CTGATCGGAGAGCAC С T С CAC GCG G G GAT GT CC AC С С T С T T С CT G GT GTACT CGAAT AAG T G С CAGAC CCCGCTGGGCATGGCCTCGGG CCACATC AGAGAC TT С CAGATCACAGCAAG CGGAC AAT AC GGC CAAT GG GC GC С GA AGCTGGCCCGCTT GCACTACTCCGGATCGAT САД CGCAT GGT С С AC С AAG GAACC GTTCT CGTGGAT TAAGGT G GAC CT CCTG GCCCC TAT GATTAT CCAC GGAAT TAAGACCCAGGGCG CC AGGCAGAAGTT CT С С T С С CTGTACAT CTCGCAATTCAT CAT CAT GTA CAGCC TG GAC G G GAAGAAGT GGC AG ACT TAC AG GG GAAACT CCACC GGC AC С CT GAT G GTCTTTTTC GG CAAC G T GG ATT С С T С С G GCAT TAAGC AC AAC AT CTTCAA CC С AC CGAT CAT AGC CAGATATATTAGGC T С С AC С С CAC TCACTACT CAAT CCGCTCAACTCTTCGGATG GAACT CAT G G G GT G CGAC CT GAACT CCTG CT CCAT G С CGTTGGGGAT GGAAT CAAAG GCTATTAG CGAC GC С С AG AT CAC С G С GAG CT CCT AC TT CAC TAACAT GTTCGCCACCTGGAGCCCCTC CAAGGCC AGGC T G CACT T G CAGG GACGGTC AAATG CCTGGCGGCCG CAAGT GAACA AT С С GAAG GAATGGC TTCAAGTGGATTTC CAAAAGACCATGAAAG T GAC С G GAGT CAC CACCCAGGGAGT GAAGT С С CTTCTGACC TC GAT GTAT GT GAAG GAGTTCCT GAT TAGCAG CAGC CAGGACG G GCAC CAGTG GACC CT GTT CT ТСС AAAAC GCAAAG GT CAA GGTGT TC CAG G G GAAC CA GGAC TCGTTCACACCCGTGGT GAACTCC CTG GAC С С С С С AC TGCTGACG CGGT ACTT GAG CATT CAT CCTCAGTCCT GG G T С CAT CAGAT TGCATTGC GAAT G GAAGT С CT GGGCT GC G AG G С С CAG GACCT GTACT GA
ATGCAAAICGAACTGAGCACCTCTTTCrTCCTCTCCCTCCTCAGATTCTCTTTCTCCGCGACCCGCCGATACTACCTCGGAGC AGTGGAGCTCTCCTGGGATTACATGCAGAGCGACCTTGGGGAGCrGCCCGTGGATGCCAGGrTCCCTCCCCGGGTGCCAAAGT CGTTrCCGTTCAACACCTCCGTGGTGTACAAGAAAACTCTGTTCGTGCAGTTCACCGACCACCTGTTCAATATCGCCAAGCCC AGAC CT С С С TGGAT G GG G CT G T T G GGAC СТАС СAT С CAAC С G GAG G7GT AC G AC AC T GT G GT CAT С ACT С T GAAGAAC AT GGC CTCGCATCCCGTGTCCCTCCACGCCGTGGGAGTGTCTTACTGGAAACCGTCCGAGCGGCCCGAATACGACGACCAGACCTCGC AGAG AG AAAAGGAAGAT GAC AAG GTGTTCCCAG GAG GAT С G С AC AC CTAC GT GT G G CAAGT G T TGAAG GAGAACGGCC CAAT G GCCTCCGACCCCCTGTGCCTGACCTACTCGTA.CCTGTCCCACCTGGACCTCGTGAAGGACCrCAACTCGGGA.CTGATTGGAGC CCTGCTGGTCTGCAGGGAAGGCTCACTGGCGAAAGAAAAGAJTCAGACCTTGCACAAGTTCATTCTGCTGTTCGCTGTGTTCG ACGAGGGGAAGTCGTCGCACAGCGACACTAAGAACTCCCTGATGCAAGATAGACATCCCGCCTCCGCCCCGGCCTGGCCTAAG AT GCACACCGT GAAC GGT TAC GT GAACC G CT С CCTCCCTGGCCT G ATT G GAT GC CAC С G GAAGTC С GTGTACTGGCACGTGAT CGGGATGGGGACCACCCCCGAGGTGCACAGCA.TCTTCCTGGAAGGTCACACATTTCTCGTGCGCAACCACCGGCAGGCCTCCC TGGAAATCAGCCCCATTACCTTCCTCACTGCCCAGACTCTGCTGATGGACCTGGGACAGTTCCTGCTGTTCTGCCAT7JCTCC TC С С AC CAA CAT GAC С GAAT GGAGCCATACGTCAAGGTCGATTCCTGCCCTGAG GAAC CCCAGCTCCG CAT GAAGAAC AAT GA GG AAG С С GAGGACT AC GAC GAC G AC С T G ACG GATAG С GAG AT GGATGTGGTCCGGTTCGATGACGATAACAGCCCTTCCTTCA TC CAAAT TCGCTCGGTGG CAAAG AAG С AC CC С AAG AC CTCGGT GC ATTAC AT TGCGGCG GAAGAAG AG GAC TGGGATTATGCC CC G С ГТ G T С CT С G С T С С T GAC GAC С G GAG CT AC AAC-AG С С AG TAC CTGAACAAC G G T С С AC AGAG GAT CGG T AGAAAG TACAA GAAG GTCCGCTTCATCCCCTATACCCAC GAAAC CTT С AAAAC TAG AC AGC CCATCCAACAC GAAT CCGGCATCCTGGGCCCGC TCTTGTACGGAGAAGTCGGCGACACCCTTCTCATTATCTTCAAGAACCAGGCTTCCCGGCCGTACAACATCTATCCGCATGGG ATCACTCACGTGCCCCCA.CTCTACTCGCGGCGCCTGCCCAAGGGrCTCAAACACCTCAACGATTTTCCGATCCTTCCCGGAGA AAT С TT С AAGT ACAAG TGGACCGT GACC GTG GAAG AT G GC С CAAC TAAGT CT GAC С С T AGAT GCCTCACCCGC TAC TACT CAT CCTTCGTCAACATCGACCCCCACCTCGCCACCCGACTCATCGGCCCCCTCCTGATTTGCTACAAGGAATCAGTGGACCAACGG GG AAAC CAGAT CAT GT С G GAT AA GAG GAACG T CATCCTCTTCTCC GTGTTTGACGARAACCGGTCGTGGTAC CTGAC CGAGAA CATCCAGAGGTTCCTGCJICAA^^^ ATjSGCTACGTGTJTC GAC A(KC M
м CGACTTC стщюсоте
CAGC GG &^GACJIGTCJTTCATGAGCATjsGAGAACC CTGGC CTGTGGATCC Jp^^^^^_^^^^AACAGC_GACTTC_AGGAACAGGG
CACC AGGAC CACCC T G С AGT CTG AC С AG GAGGA GA T C_GAC TATGA T GA С А С CAT СAGCG T G GAGAT GAAGAApJGAG GA С T T Cp
At^TCTACGAC^AGGACJ^GAACCAGAGC
ЈTST &g_GM TATQGCAT.QTCC AG
CCJTAC^CAGGGCC GACj G TG GAG GAC AA С AT CA TGGTGAC CTTCAGGAAC CA^CCAGCAGGCCC TACAGC TTCTACAGCAGC CTGATCAGC JACj|AGGAGGACCAGAGG_C AGGGGGC JGAGC CCAGGAAGAACTjrTGTGAAGCCj^TGAAAC CAAGACCJTAC TT
H-ZFjmb^-PJ^ Я ЈЈЈ/i9^TPJ-i*s 9 PPi-i^? ?Д^5???^ ??*J.^-^PJ^ Я Я ?РД^Т TЈ?L9-Ti ^ДЯй"? т??
AGAAGGACGTGC AC TC^GGCC TjSATTGG ACJTGTGp.AGGAGjrTCGC.CCTG^ CAGGGCC_CC CTGj^CATCCAGATG
AC AC CCTGC CTGGC С T Gjj/ГСA TG GC С CAGGA CЈ_AGAGJ3AT CAGG T GGT AT С TGC T GAG^C AT GG^GCAG CAAC GA GAACA T С С AC
GTTC GAAAC CGmSGAGATGCTG^CCATCM TG_GAGGGTGGAG_TGCCT TGAGCACCC TGTTC CTGjsTSTACAGC AACAAGTGC CAGAC CC CCC TGGGCATTCCCTCJTGGCj^CATC^
AC^GCCO^CTGGCJJMTAqraCCACT
GGAGCCCJTTCAG^TGGATCA^GTGG^^
TC_TC С AGCC TGFTAC АТС AGCC AG
GGj^CCC_TGATGJ3T^T^CTTCGj3C^
CATCAGGCTGCACCCCACCCAC^^^
TGCC С CT_G G G C^T G GAGAGCAAG G С CAT С T С1TGAC GC_CCAGAT/^TGCC TCCAGCTAC TTCACCAftCATGTTTSC CACCTGG
AGCC CCAGC AB.GGC CMGCTGCACCTGCAGGGCAG TG_GAGGC_CC CAGCTCAajTAAC^
№T6GACJTTCCAS№№CCAT6M AMTCCTT^TC^TCCAGCAGCCAGGA
CAGGACAGC JTCAC CCCJTGTGG_TCAaCAGCCTGGACCCCC CC_CTGCT_GAC CAGATAC_CTGAGJ^TCCA_CCCCC_AGAGCjrGGGjr GCAC CAGATCGC CCTGAGGATGGAGGTGCTGGGCTGTGAGGCCCAGGACC TGTACTGA
Подчеркивание сплошной линией = coFVIII-52-NT58 (SEQ ID NO: 7) Подчеркивание пункту но нижние и = coFVIII-52-СТ (SEQ ID NO: 8)
ATGCACATTGAGCTGTCCACTTCTTTCTTCCTCTCCCTCCTCCCCTTCTCTTTCTCCGCCACTCGCCGCTACTACCTTGGAGC CGTGGAGCTTTCATGGGACTACATGCAGAGCGACCTGGGCGAACTCCCCGTGGATGCCAGATTCCCCCCCCGCGTGCCAAAGT CCTTCCCCTTTAACACCT CGGT GGTGTACAAGAAAACCCTCTTTCTCCAG TT CACT CA.CCACCTGTTCAACATCGCCAAGCCG CGCCCACCTT GGAT GGGCCTCCTGGGACC GAC CAT T CAAG CT GAAGT GTACGACACCGTGGT GAT С AC С С T GAAGAAC AT GGC GTC CCACC CCGTGTCCCT GCAT CCGCTCGGAGTGTCCTACTCGAAGGCCTCCCAAGCACCTCACTACGACCACCACACTACC С AG С G G G AAAAGGAG GAC GAT AAAGT GTTCCCGGGCGGCTCGCATACTTACGTGTGG CAAGT С CT GAAG GAAAAC GGACCTATG GCATCCCATCCTCTGTCCCTCACTTACTCCTACCTTTCCCATCTCGACCTCCTCAACGACCTGAACAGCGCGCTGATTGGTGC ACTTCTCGTGTGCCGCGAAGGTTCGCTCGCTAAGGAAAAGACCCAGACCCTCCATAAGTTCATCCTTTTGTTCGCTGTGTTCG ATGAAGCAAAGTCATGCCATTCCGAAACTAAGAACTCGCTGATGCAGCACCCCCATCCCGCCTCAGCCCGCGCCTCGCCTAAA AT G С AT ACAGT С AAC G G ATAC GT GAAT С G GT CACT G С С С G С G CT С AT С G G TT GT CAC AC AAAGT С С G T GT ACT G GC AC GT С AT CCGCATCGCCACTACGCCTGAACTGCACTCCATCTTCCTGGAAGGGCACACCTTCCTCCTGCGCAACCACCGCCACGCCTCTC TGGAAATCTCCCCGATTACCTTTCTGACCGCCCAGACTCTGCTCATGGACCTGGGGCAGTTCCTTCTCTTCTGCCACATCTCC AC С С AT CAG CAC GAC G GAAT GGAGGCCTACGTGAAGGTGGACTCATGCCCG GAAGAAC CTCAGTTGCG GAT GAAGAAC AAC GA GG AG G С С GAG GACT AT GAC GAC GAT T T G AC T GACT С С GAG AT GGACGTCGTGCGGTTCGATGACGACAACAGCCCCAGCTTCA TC CAGAT TCGCAGCGTCGC С AAC AAC CACCC С AAAAC CTCGCTGCAC TAC AT CCCGCCCGAC GAAG AACAT TCGGACTACCCC CCGTTGGTGCTGGCACCCGATGACCGGTCGTACAAGTCCCAGTATCTGAACAATGGTCCGCAGCGGATTGGCAGAAAGTACAA GAAAGT GCGGTTCATGGCGTACACTGAC GAAAC GTT T AAC AC CCCGCAGCCCATTCAACATGAGACCGCCATTCTCGCACCAC TGCTGTACGGAGAGGTCGGCGATACCCTGCTCATCATCTTCAAAAACCAGGCCTCCCGGCCTTACAACATCTACCCTCACGGA ATCACCGACGTGCCGCCACTCTACTCGCGGCGCCTGCCGAAGGGCCTCAAGCACCTCAAAGACTTCCCTATCCTGCCCGGCGA AAT CTT С AAGT AT AAG T G GAC CGTCACCGTG GAGGAC G GG С С CAC CAAGAG С GAT CCTAGGTGTCTGACTCGG TAC TACT CCA CCTTCGTGAACAT CGAAC GGCACCTCGCATCGGGACTCATTCCACCGCTGCTGATCTGCTACAAAGAGTCCGTGGATCAACGC GG CAAC CAGAT CAT GT С С GAC AAG С G CAAC GTGATCCTGTTCTCCGT GTTTGATGAAAACAGATCCTGGTAC CTSAC CGAGAA CA T С С AGAG GT T7C С T G C_C СAAC_C С T GCT GG GGT GC AGCT G GAGGA С C_C С GApJTT С С AGG С С A G_C AAC АТС A TGC AC ApC AT CA ATj3GCTACGTGr^C GAC AGCC ТДСА^
ACJ:GACTJTC CT_GAGCGT_GTTC та
CAGC GG^GAGA^TGTC^TC^TGAGCAJTGGAGAACC CTGGC CTjJTGGATCC TGGGCTGC^ACM^AGCGl^TTCl^GM^^GGG
РРЛТ Я??-Л^ Я tPPJLQ Я ^Р/^ &ЯЛ-ш^ Я Я^РшЯ T Я2-И &Я Я^?.Я Я Я?? &Я JA'v^^PiA'-i 5ЈPiV-z Я ^ЪРО^Я^ЗЯ &ТР &Я^Я РРР.
ТАСС TGC_TGAGC_AAGAACAATGC_
CA С С AGрAC CACCC TGC AGTCT.GACCAGGAGGAGATC_GAC ТATGA Т GA С А С CAT СAGCG Т GG AGATGAAGAAGJ3AG GAC_Т Т Ср
ACATCTACGAC <5AGGACJ^GAAC_C^
CTJ3TGGGAC TAT.GGCAT.GTCC AG
CGJTGTTO^GGMTTCACCGACM
CCJTACAT_CAGGGCC GAGGTG GAG GAC АДСAT СДTG G TG AC CTTCAGGAAC CAGJ3CCAGJZAGGCJICTAj^
CTjJATCAGC TACj^GGAGGAC CAGAGGCAGGGGGC TGAGC CCAGGAAGAACTjTTGTGAAGCC^CAATGAAAC CAAGACC_TAC TT
РХ^^^Р-йТ ЯЯ'^Я.Я ?РРД^IFPPi's Я PPP.ЈЈ 9??±ЯЯЬ9? &Я ТХЯ?? ?!?Р.?.??РР^ Я ТРР.Р. Я ЯТ??. ¦? Tf-^T P/^PJ-zT РРА*-;? TPPi
AGAAGGACGJGC AC JC^GGCC TjSAT^
??ЛЯ Т PP.^Ј GAG_TT С G С_С С Т GTT С Т Т СА С С А Т_С ТТ CGAT GAAA С С AAG AG С TGG ТАСТТ СACJT GAGAAC^T GG_AGA G GAAC TG CAGGGCCjTCCTGJIAACArCCAGATGGAG
ЛСАС CCTGC CTGGC С Tp_G TC A T_G GC С CA G^A C_C AGAGGAT СAG_G T G G_TAT С TGC T GA_G_CAT GGG С AGC AAC GA_GAA СA_T С С AЈ AGJ^TCCAC TTCJTC TGGj:CAC GTGTT^^
PXTJ* Pi^V^ ? TPP.Ј ^PP.^^PPPJz Р/ PPAT. ? TPPJiP/ ^PJ^Pi Я 9ЈPЈ ¦? ТРР.Р. 9^PJ-Vi9 Я JPP.^P PP.PJi Р/РЛ
JGAGCACCC JGTTC CTGJ3TGTACAGCAACAAGTGC CAGAC ССССС TGGGC ATGGCCTCTGGC^CACATCAGGGACTTCC_AGAT_C
ACjrGCCTCTGGC^AGTACGGCCAGT
Gt^GCCCJTTCA^CTGGATCAAAGTGGM
JPJE? CAG^CC TG_TAC АТС AGCC AGT
CAJTC AGG_CTGCACC CCACCCAC_TAra
2§ЈЈ PPJ^PfA^S^^^MS???^???J.GAS ?ЯЯ?АЗМ <гАС7Я <:9 ТС.ЯЛ9СT?Ј. TTS^c CAACATGJ.T.^G9 9h14T99.
AGCC CCAGC AAGGC С AGG С T G CA С С T GC_AG GGC AG GAGCAATGC С TG_GAGGCCC САОДТСААСААССLCCAAGGAGTGGpCTGCA G(5TGGACJTTCCAGAAGACCATGAAGG^
^P-^T Я т ?РРА?? Я &?.Я%-Я?РшЯ ЯЫР? &Я TPP-^9 PPX-I Т ТРХ^ 9 РA'-i^TPPJ^^PPLTi Р/^^РЛ'? РJXP.9?Рр1*?= ??Р.
CAGGACAGC TTCAC CCCJTGTGGTCAACAGCC MGACC_CCC CCCTGCTGAC CAGATACCJTGAGj^TCCACCCCCAGAGCJTGGG^ GCAC CAGATCGC CC TGAGGATGGAGGTGCTGGGCTGTGAGGCCCAGGACC TGTACTGA
Подчеркивание сплошной линией = coFVIII-62-NT58 (SEQ ID NO: 9) D°SiJ§E.,iM_BililiJ§I'^UtiL^lPl'P^JliU'i'S^ = coFVIII-62-СТ (SEQ ID NO: 10)
Фиг. 1G: coFVIII-25 - SEQ ID N0:5
ATCCACATT'CAGCTCACCACCTCCTTCTTCCTCTCCCTCCTCACCTiCTCCTTCTCTCCfCACCACCACATACTACC'rCGCCCC CGTGGAGCrGAGCTGGGACTACATGCAGTCTGACCTGGGGGAGCTGCCAGTGGACGGCAGGTTCGCCCCCAGAGTGCCCAAGA ССТТСССС'Г'Г С AACAC С AG CG 1 GGT GT ACAAGAAC AC ССТСТТССГС GAGT T GACT GAC CAC С T GT T С AACAT С G С CAAGC С С ACGCCCCCCTGGATGGGCCTGCTGGGCCCCACCATCCAGGCCGAGGTGTACGACACCGTGGTCATCACCCTGAAGAACATGGC CAGCCACCCCGrCTCCC'I'GCACCCCCTCCCCGTGAGCTACTGCAAGGCCTCTGAGGGCGCCCAGTACGACGACCACACCACCC AGAGGGAGAAGCAGGACGACAAGGTGTTCCCTGGGGGCAGCCAC/tCCTACGTGTGGCAGGTCCTGJVAGGAGA/tCGGCCCCATG GCCTCTCA.CCCCCTGTGCCTCA.CCTACACCTACCTGACCCACGTGGACCTGGTGAACGACCTGAACTCTGCCCTGATTCGCGC CCTGCTGGTGTG CAGG GAG GG С AG С CT G G С С AAGGAG AAG AC CCAGACCCTG CACAAGT T С AT С CT G С T GT T С G С С GT GT T CG AC GAG G С С AAG AGCT С CC ACT С TGAAAC CAAGAAC AG С С T GAT G С AC CACAC GCACCCCCCCTCTGCCAGCGCCTCGCC CAAG ATGCACACCGT CAAC G GC TAC GTCAACAG GAGCCTGCCTGGCCT GAT TGGCTGC CAC AG GAAGAG С GT GTACT G GCAT GT GAT CGGCA.TCCCCACCACCCCTGAGCTGCACAGCATCTTCCTCGACCCCCACACCTTCCTGCTCAGCAACCACAGCCACGCCACCC TGGAGATCAGCCCCATCACCTTCCTGACCGCCCAGACCCTGCTG/tTGGACCTGCGCCACTTCCTGCTGTTCTGCCACATCTCC AGCCACCAC CAC GACCGCATCGACCCCTACCT GAAAG TCCACACCTGCCCTGACGAGCCCCAGCTGAG GAT GAAG AAC AAC GA GGAG G С С GAG GACTAT GAT GAC GAC CT GAC С GACAG С GAG AT G GAC GTGGTCAGGTTCGAC GAC GACAAC AG CCCCACCTTCA T С CAGAT CAGGAGCCTGGC С AAGAACC AC С С CAAC AC CTCGGTGCAC TACAT CGCTCCT GAC GAG GAG GAC T G G GACT AT С CC CCCCTGGTGCTGGCCCCT GAT GACAGGAG С TACAAGAG CCAG TAC CT GAAC AAT G GC С С С С AG-AG GAT TGG CAG GAAGTAC AA G AAAGT CAG GTT CAT С C-C CT ACACT GAT GAAAC CTT С AAC AC CAGG GAGG С CAT С СAGCAT GAG T С T G G СAT С CT С GG С С С CC TGCTGTACGGGGAGGTGGGGGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCAGGCCCTA'CAACATCTACCCCCATGGC AT CACCCACGT С AGG С CC CTG T ACAGCAG GAGGCTC-C CT AAC G GG G? GAAG CAC CT С AAAG ACT Г С С С CAT С С Г G С С T G GC GA G AT С TT С AAGT ACAAG T G GAC T GT G ACT GT G GAGG AC G GC С С CAC CAAGAG С GAC С С CAG G T G С CT GAC С AGATAC ГАС AG CA CC'rTCCTCAACATGCAGAGCCA.CCTCGCCTCTCCCCTCATTCGCCCCCTGCTGATCTGCTACAAGCAGTCTGTGG.AC CAGAGG G G С AAC CAG AT CATG AGC GAC AAGAGGAAC G T GAT С С T GT T С T CT GT CTTCGAC GAGAACAOGAGCTGGTAC CTGACTGAAAA CATC CAGЈGGTrCCTCCC_CM ACj3GCTACGTG_rjTCGATjTCGCTC АЯТ^АСТТС CTGJTCCGT.GTTTT.TCTCC^GC
TTCC GGC_GAAACjrGTGTjTTATGAGCAT_^ CCGGC CTJ3TGGATCTTGЈGCTG_CCACAACAGMACTTCjTGTAACAGAG
GAAT GACJT G С GCT GC T СAAGG TG_TC С AG С T GC GAC AAG AA CAC С G GAG AC TAJT TAT GAG GACJT С ATAC_GAG GA^C AT CT7C С G C_C
?Д??ТСС^ТССЛ45АЛЕАЛСРР.С^Т?ЛА &С^^^
РА?/ЕА?РЛС.?АЧЧС.?РРА9.ТРА^?РАЧ?^РРЛ^Т^^^
ACATCTACGACGAAGATGAAA^
C_TGTGGGAC TACJ3GAATCTCGT_CCTCG_CCGCACGTGCTCC GCAAC С GAG С С СД <5AG CGG С T CGG Т G С C_G^АА^Т С AAG АА G G_T
C_GTGTTC_CAGGAGTTCAC_TGAMG
CTЈACAT_qAGAG_qAGAAGT^
CTj^JTTj:rTACj^GAGGACCMCGG_CAG
PXIPjАААЗД! РРАЯР^ГРА^УРР.Р. Я PPPlAЈ TTJ^G GACJ3AG Т TTGA С Tp_CAAAG_C С Т GGG С С TAG Т ТС ТС С GAT GT G GAC Т Т G_G
AGAAGGA03TCC_ACTCCЈGCCT№
ACЈGTGC_AGGAGjrTCGC;rC^
CAGAGCC_CC CTGJTAAC ArCCAGATG№
MAC GC^GC CGGJSTCTT^TGA^
TC_TATTCAC TTCJTCCGGTCATGT
PXЈP. Я^^Я T 9AAAXP^!FP.(-i9. Я ?PiP.AAPPi-i9. Я PPAT. T JPLP.9 Я PPX? ?APXP. T ^ЕРЛ Т ТРРА Р^АРДТ: Я ?Р.?АТРР.РЛ РРА
TGTC AACCC TG^TCCTGG^TGTAJTAGCAACAAG^TGC CAGAC TCOSC TTjSG^J <3GCGTCAGGACACATTAGGG^^
AP^?^PJЈЈPGPJSP^A4?^PPAATPGЈ9.?PPXA^
G_GAGCCATrCTC_CTGGATCAAGG
TCTC CTC AC TG_rACATCAGCCAGTTCATAATCATGTACTC С C_TG GACp_GAAA GAAG TGG С AAAC С T AC AG G G G_GAA С A_GCA C_C GGj^CACJTGATGjSTCTTJTTTCGG^
PA^'i"APA^'4' i PA^*s Я ?? &.Я ?АЯ?А?АЯР.^Т ^ РРЛ 4' PPA^ Я Я'?ИЯ Я РУ?АЧ? Я?2-$Ш РР?й? PA2\PJЈ^ЈA4Ј9, РJPi'-i^PPA
TG_CC GTTjSGGAATGGAGjTCCAAAGCAM
TCACC3T_CCAAG_GCCCGG_CTGC^
G(5TGGACjrTCCAGAAAAC_CATGA^
AGJTTCCTj^TCЈCCAGCAGCCAG^
CMGATT_CATTCACCCCM
Подчеркивание сплошной линией = coFVIII-25-NT58 (SEQ ID NO: 11) D2B &ЈQ№Ј3iiЈЈI?XU\LTy\Plt9!iJ2,ltЈ§i2 = coFVIII-25-СТ (SEQ ID NO: 12)
GCAC CAGATCGC GCTGAGGATGGAGGTC CTGGGATGCGAAGCCCAGGACCTGTACTGA
ATGCACATTGACCTCACCACCTCCTTCTtCCl'CtCCCTCCfCAGCCTCTCCTrcrCTCCCACCAGCAGATACTACCTCGGCGC CGTGGAGCTGAGCTGGGACTACATGCAGTCTGACCTGGGCGAGCTGCCAGTGGACGCCAGGTTCCCCCCCAGAGTGCCCA/tGA GCTTCCCCTTCAACACCAGCGTGGTGTACAAGAAGACCCTGTTCGrGCAGTTCACTGACCACCTGTrCAACATCGCCAAGCCC AGGCCCCCCTGGJATGGGCCTGCTGGGCCGCACCATCCAGGCCGAGGTGTACGACACCGTGGTGATCACCCTGAAGAP.CATGGC
CAGCCACCCCGTCTCCCTGCACGCCGTGGGGGTGAGCTACRGCAAGGCCTCTGAGGGCGCCGAGTACGACGACCAGACCAGCC AGAGGGAGAAGGAGGACGACAAGGTGTTCCCTGGGGGCACCCACACCTACGTGTGGCAGGTCCTGAAGGAGMCGGCCCCATG GCCTCTGACCCCCTGTGCCTGACCTACAGCTACCTGAGCCACGTGGACCTGGRGAAGGACCTGAACTCTGGCCTGAITGGGGC CCTGCTGGTGTGCAGGGAGGGCAGCCTGGCCAAGGAGAAGACCCAGACCCTGCACAAGTRCATCCTGCTGTTCGCCGTGTT'CG ACGAGGGCAAGAGCTGGCACTCTGAAACCAAGAACAGCCTGATGCAGGACAGGGACGCCGCCTCTGCCAGGGCCTGGCCCAP.G ATGCACACCGTCAACGGCTACGTCAACAGGAGCCTGCCTGGCCTGATTGGCTGCCACAGGAAGAGCGTGTACTGGCATGTGAT CGGCATGGGCACCACCCCTGAGGTGCACAGCATCTTCCTGGACGCCCACACCRTCCTGGRCAGGAACCACAGGCAGGCCAGCC RGGAGATCAGCCCCATCACCTTCCTGACCGCCCAGACCCTGCTGARGGACCTGGGCCAGRTCCTGCTGTTCTGCCAMRCRCC AGCCACCAGCACGACGGCATGGAGGCCTACGTGAAAGTGGACAGCTGCCCTGACGAGCCCCAGCTGAGGATGAAGAP.CAACGA GGAGGCCGAGGACTATGATGACGACCTGACCGACAGCGAGATGGACGTGGTCACGTTCGACGACGACAACAGCCCCAGCTT'CA RCCAGATCAGGAGCGTGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATCGCTGCTGAGGAGGAGGACTGGGACTATGCC CCCCTGGTGCTGGCCCCTGATGACAGGAGCTACAAC-AGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGAGGATTGGCAGGALGRACAA GAAAGTCAGGTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACCAGGGAGCCCATCCAGCATGAGTCTGGCATCCTGGGCCCCC RGCTGTACGGGGAGGTGGGGGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAACATCTACCCCCATGGC ATCACCCACGTCAGGCCCCTGTACAGCAGGAGGCTGCCTAAGGGGCTCAAGCACCTCAAAGACTTCCCCATCCTGCCTGGGGA GATCTTCAAGTACAAGTGGACTGTGACTGTGGAGGACGGCCCCACCAAGAGCGACCCGAGGTGCCTGACCAGATACIACAGCA GCTTCGTCAACATGGAGAGGGACCTGGCCTCTGGCCTGATRGGCCCCCTGCTGARCTGCRACAAGGAGTCTGTGGAC С AGAG G GG CAACC AG AT CAT GAG С GACAAGAG GAAC GTGATCCTGTRCTCTGT CTTCGACGAGAACAGGAGCTGGTAC CTCAC TGAAAA PAIS ^Я*?^^?? Т^^ЛКЯ^ЕОрЛ1^^
ACJ3GTTACGTGT_TCGACJTCGCTЈ^
tfl &iQSЖК 9Т??!?9§2:Я?П:91:Л'?Т:9SSSS 91^№? &ЪЯ№ &Ъ1§92^ &9?№9 &2АЯЯ92!^999Л§Т29ЛЯ'?12:.
СТСС GGC_GAAAC_GGTCTlCAT^rCGATC SS &SHSSSH'iSSEi': ЙКй??ЯК^Я^^ЙЙКЭЕЙ
GAATGAC.TGCCC.TGCTGMGGTC^ TACCTCCJTGTCC_AAGAACAAC^^
ТАСС CGGAC CACCC ICCАДТС G_GATCAGGAGGAAATCGAC TACJ^CGACACCATCTCЈGTGGAAATG^ ATATCTACGACGAGGACGMAAT
CTJ3TGGGAC TATJ3GAATGTCATC_CAGCC_CT SpAM СРЯ?С ссМАесЯЧАТсЯ^1есЯТ^A^TJESA^AAApX
GGJTGTTCj^GGAjjTTCACCGACMCMCT
ССТДСАТСС G CpC G рАДЗ TGGApGATAA CAT CA_TG G TG AC CTTCC GTAAC CAAGCATCCAGACC ТТДСТСС JTCTATTCCTCC CTGATCTCATAC№GGAGGACC^
РЛ^^ДР-ЗД! 9 F???ЛТА21?1?? Я ЯРРш^Я 9Р?.Я?$Т? &Я !F!EX^Ј ???Р.Я? Я Tivi*-; ????? I ?Д??Т ЈvA^Ј T"JЈ
AGAftGGATGTCCATTCOSGCCT^ AC_CGTCC_AGGAGJITTGC^CTGTTC JAGAGCGCC CTGJ^TATCCAGATGGAAGATCЈ
ATAC TCTGC CGG_GGCTGGTCATGGCCCAGGATCAGMGATTCGGTGGjrAC TTj^TGTCAATGG_GATCнGAACGAAAACДTTCAC JC_CATTCAC TTC_IC CGG_1CACCTGTTCA
GTTC GAAAC TG.TGGAGATGCTGC.CGTCC.AAGGCCGGC АТС TGJSAGAGjroGAG.TGCCTGATCGGAGAGCA
TGTC CACCC TCTTC CTGGTGTMTCGAATAAGTGC CAGAC CCC GC TGGGC ATjMCCTCGGGCCACATCAGAGACT
АЯД5 Я2 & &Я PPA^ЈJA^^flrFA^T ЯРРшЯ Я P.^pj^ PPJ^ Я Я ?¦ ? "АЯ T РРР.ЯЈ2"PPA 4 РA^Ј'f Р А^-й ТРРА9 Я А^
GGAftCCGJTTCTCJSTGGATTAAGOT^
ТСТС СТССС TGTAC ATCTCGCAftTTCATCATCATGTACAGCC_TGGACM GG_Ј^CCCJTGATGj3TCT^TTTC^GCAAC^^ JATTAGGCTCCACC ССАСТСАС_ТАСТС^ JGCCGTTGGGGATGGAATCAAAGGC
AGCC CCT_CCAAGGC СAp_G С TG CA С T T G_C AG G GACG G T_CAAATGC С TG_GCGGC03CAAGTGAACAA^
AGTGGATJTTCCAAAAGACCATGAAAOT
AGJTTCCTGATTAGCAGCAGCCAGGAC^
C &SGACTCGTTCACACCC.G^
CC ATCAGATTGC ATTGC GAATGGAAGTCCTGGGCTGCGAGGCCCAGGACC TGTACTGA
Подчеркивание сплошной линией = coFVIII-25-NT58 (SEQ ID NO: 13) D9B &ЈQ№Ј3iiЈЈI?XU\LTy\Plt9!iJ2,ltЈ§i2 = coFVIII-25-СТ (SEQ ID NO: 14)
Фиг. II: BDD-FVIII (неоптиллизированная; "исходная" последовательность нуклеотидов (SEQ ID N0:16)
ATG CA AATAG AG CTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTG CCTTTTG CG ATTCTG CTTT AG T G CCACC AG AAG ATACT ACCTG G GTG СAG TG GAACT GTCATGG G ACTATATGC A AAGTG ATCTCGGTGAGCTG CCTG TGGACG CAAG ATTTCCTC CTAG AG TG CC AAA ATCTTTTCC ATTC A ACACCTC AGTCGTG TACAAAA AG ACTCTGTTTGTAGAATTCACG G АТС ACCTTTTCAAC ATCGCT A AG CCAAG G CCACCCT GGATGGGTCTGCTAG GTCCT ACC ATCCAG G CTG A6GTTTATG ATAC AGTGGTCATT AC ACTTAAG A AC ATGG CTTCCCATCCTGTC AGTCTTCATG CTGTTG GTGTATCCTACTG GAAAG CTTCTG AGG G AG CTG AATATG ATG АТС AG ACCAGTC AA AG GGAGAAAGAA GATG ATAAAGTCTTCCCTG G TG G AAGCC ATAC AT ATG TCTG GCAGGTCCTG AAAG AG AATGGTCC AATGG CCTCTGACCCACTGT GCCTT ACCTACTC AT ATCTTTCTCATG TG G ACCTGGT AAA AG ACTTG AATTC AG G CCTC ATTGG AGCCCT ACT AG TATGTAG AG AA GGGAGTCTGGCCAAGG AAAAG AC AC AG ACCTTG CAC AAATTTAT ACT ACTTTTTG CTGT ATTTG ATG AAG G GAAA AG TTGGC ACT CAG A AAC A AAG AACTCCTTG ATG С AGG ATAG GGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGG CCTA AAATG CAC ACAGTC AATGG TT ATG T AAAC AGGTCTCTG CCAGGTCTGATTG G ATGCC ACAG G AAATC AGTCT ATTG GCATG TG ATTG G A ATGGG С ACCACTCCTG AAGTG CACTC AATATTCCTCG A AG G TCAC AC ATTTCTTGTG AGG AACCATC GCC AG GCGTCCTTGG A AATCTCGCC AAT A ACTTTCCTTA CT GCTCAAACACTCTTGATGGACCnGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTC AAAGT AG ACAGCTGTCCAGAGGAAC CCC AACTACG A ATG A AA AATA ATG A AG AAG CGG AAG ACTATGATG ATG АТСТТ ACT6 AT TCTG AAATG G ATGTG GTC AGGTTTG ATG ATG AC A ACTCTCCTTCCTTTATCC AAATTCG CTCAG TTG CCA AG A AG CATC СТА AAACT TG G G TACATTAC ATTG CTG CTGAAG AG GAG GACTG GG ACTATG CTCCCTTAGTCCTCG CCCCCGATGACAG AAGTT ATA AAAGTC AAT ATTTGAAC AATGG CCCTCAGCGG ATTGGT AGG A AGT AC AA AAA AG TCCG ATTT ATG G С ATAC ACAG ATG AA ACCTTTAAG AC TCG TG AAGCT ATTC AG С ATG AATCAG G AAT CTTG G G ACCTTTACTTTATG GGGAAGTTGGAG AC ACACT GTTG ATTAT ATTT AAG A АТС AAGC AAG С AG ACC ATAT AACATCTACCCTCA CG 6 AATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTC AAG G AG ATT ACC A AAAG GT6T A AAAC ATTTG AAGGATTTTCCAATTCTG CC AGG AG A A ATATTCAAATAT AAATG GACAGTGACTGTAGAAGATGG GCC A ACTA AAT CAGATCCTCGGTGCCTGACCCG CT ATT ACTCTAGTTTCGTTA ATATG GAGAGAGATCTAG CTTC AG G ACTC ATTG G CCCTCTCCTC A TCTGCTACAAAG AATCTGT AG АТС AAAG AG G A AACCAG ATAATGTCAG AC AAG A G G A ATG TC ATCCTG TTTTCTGT ATTTG ATG A G AACCG AAGCTG GTACCTCACAG AG A ATATAC AACG CTTTCTCCCCA ATCCAG CTGGAGTGCAG CTTG AGG ATCC AG AGTTCC A A GCCTCCAACATCATG CAC AG С ATCAATG G CT ATGTTTTTG ATAGTTTG CAGTT GTC AG TTTGTTTG С ATG AG G TG GC ATACT GGTA CATTCTAAG С ATTG GAG CAC AG ACTG ACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTG G ATAT ACCTTCA A ACAC AA AATG GTCTATG AAG ACAC ACTC ACCCTATTCCC ATTCTCAG GAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAG GTCTATG GATTCTG G G G TG CC ACAACTC AG ACTTT CGGAACAGAGGCATGACCG CCTT ACTG AAG GTTTCTAGTTGTG АСА AG AAC ACTG GTGATTATTACGAGGACAGTTATGA AG ATATTTC AG С AT ACTTG CTG AGTAAA AAC AATG CCATTGAACCAAGAAG CTTCTCTC AAAACCC ACCAG TCTTGAAACGCCATC AACG G G AAAT AACT CGTACTACTCTTC AGTC AG АТС AAG AG G A AATTGACTATG ATG ATACCATATC AG TTGA AATG AAG AAGG A AG ATTTTG AC ATTTATG ATG AG G ATG AAAATC AG AGCCCCCGCAG CTTTC A AA AG AAA AC ACG AC ACT ATTTT ATTGCTG CAGTG G AG AGG CTCTG G G ATTATG GGATGAGTAGCTCC CC ACATGTTCTA AG A AAC AG GGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGA AAGTT GTTTTCC AG G AATTTACTG ATG G CTCCTTTACTC AG CCCTT AT ACCGTGG AG AACTAA ATGAACATTTG G G ACTCCTGG G G CC AT AT ATA AG AG С AGAAG TTGAAGATAATATCATG GTAACTTTCAG AAATCAGGCCTCTCG TCCCTATTCCTTCTATTCTAG CCTT ATTTCTTAT G AG G A AG ATCAG AG G С AAG G AGC AG AAC CTAG AAA AAACTTTG TCAAG CCTAATG A AACC AAAACTTACTTTTG G A AAGTG С AAC АТС ATATGG CACCC ACTAAAG ATG AGTTTG ACTGC AAAGCCTG GG CTT ATTTCTCTG ATGTTG ACCTG G A AAAAG AT GTGCACTCAGGCCTGATTGGAC CCCTTCTG GTCTGCCACACT A AC AC ACTG AACCCTG CTC ATGG GAG AC AAGTG ACAGTACAGG AATTTG CTCTG TTTTTC ACC ATCTTTG ATG AG ACC A AAAGCTG GTACTTC ACTG AAA ATATG G A AAG AA ACTG С AG GG CTCCCTG С AATATCCAGATGGAAG ATCCCACTTTT AAAG AGA ATT ATC6CTTCCATGCAATCAATGG CT AC AT AATGG ATACACT ACCTG G CTT AGTA ATG GCTCAGGATCAAAGG ATTCG ATG GTAT CTG CTCAG С ATG GG CA G С AATG A A AAC ATCC ATTCTATT С ATTTC AG T G G A CATGTGTTC ACTGTACG A AAAAAAG AG GAG TATA AAATG GC ACTGTACA ATCTCT ATCC AG GTGTTTTTG AGACAGTG G AAATGT ТАСС ATCCA AAG CTGG AATTTG GCG GGTGGAATGCCTTATTGGCGAG CATCTAC ATG CTGGGATGAG CAC ACTTTTTCTG GTG T A CAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGG AATGG CTTCT GGAC ACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTC AG GAC AATATG G ACAG TGGGCCCCAAAGCTGG CCAG ACTTC ATTATTCCG G АТС AATC A ATG CCTGGAGCACCAAGGAGC CCTTTTCTTG GATCAAGGTGG ATCTGTTGGCACCAATG ATT ATTC ACG G С ATCAAGACCCAG GGTGCCCGTCAG AAGTTCTCC AG CCTCTAC ATCTCTCAG TTTATC A TCATGT ATAGTCTTG ATG GGAAGAAGTGG CAG ACTTATCG AG G AA ATTCCACTG GAAC CTTA ATG GTCTTCTTTGGCAATGTGGAT TCATCTG GG ATA AAAC АСА ATATTTTTAACCCTCCAATTATTG CTC 6 AT ACATCCGTTTG С ACCCA ACTC ATT ATAGC ATTCG CAG С ACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTT AAAT AGTTGCAGCATGCCATTGGG AATGG AGAGTAAAGCAATATCAGATGCAC AG ATTACTG CTTC ATCCTACTTTACC AAT ATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTC AAAAG CTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATG CCTG GAGACCTCAGGTG AATAATCCA A AAG AGTGG CTG С AAG TGG ACTTC CAGAAGACAATG AAAGTC ACAG G AGTAACT ACTC AG G GAGT AA AATCT CTG CTT ACCAG С ATGTATGTG A AG GAGTTCCTCATCTCCAGCAG TCAAG ATGG CC АТС AG TG G ACTCTCTTT TTTCAG AATG G С AAAGTAAAGG TTTTTCAG GGAAATCAAG ACTCCTTCAC AC CTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACT6AC TCG CT ACCTTCG A ATTCACCCCCAG AGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGG CAC AG G ACCT С TAC
*BDD = FVIII с делециями в В-домене
Фиг. 1J: BDD-FVIII (неоптиллизированная; "исходная" последовательность нуклеотидов (SEQ ID N0:17)
ATRRVV LG AVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSF PFNTSWYKKTLFVE FTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAE VYDTWITLK
MMASHPVSLHAVGVSyWKASEGAEVDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTVVWQVLKENGPMASDPLCLTVSVLSHVDLVKDLNSGUGA
LLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKM HTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGT
TPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAVVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLT
DSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHyiAAEEEDWDVAPLVLAPDORSVKSQyLNNGPQRIGRKVKKVRFMAYTDETFKTR
EAIQHESGILGPLLTOEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLySRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKVKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYY
SSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFqASNIMHSIWGYVF
DSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSC
DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSqNPPVLKFlHQREITRTTLqSDQEEIDYDDTISUEMKKEDFQIYDEDENQSPRSFCilCKTR
HyFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYFiGELNEHLGLLGPyiRAEVEDMIMVTFRNQASRPYSF
YSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVT
VQEFALFFTIFDETKSWyFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKEMYRFHAINGYIMDTLPGLVMAqDQRIRWyLLSMGSNENIHSIHFSG
HVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECUGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWA
PKLARLHySGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYlSQFIIMYSLDG KKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKH
MIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNP
KEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLlSSSQOGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPaSW
VHQIALRMEVLGCEAQDLY
*BDD = FVIII с делециями в В-домене
Фиг. 2А - неоптиллизированный BDD FVIII
О 437 874 1311 1748 2185 2Ш2. ШШ 34SS 3933 4370
Относительное положение кодонов
CAI для человека = 74%
437 874 1311 1748 ?185 2622 3496 3933
Относительное положение кодонов
CAI для человека = 88%
Предпочтител ьный ко дон
Редкий ко дон
BDD FVIII = FVIII с делециями в В-домене
Предпочтит ельный ко дон
Редкий кодон
43-7 Ь?4 1Ш 1748 2165 Ш2 3059 3496 3933 4370 Относительное положение кодонов
CAI для человека = 91%
Редкий кодон
0 43? 874- 1311 1748 21SS 2Ш 34% 3933 4370
Относительное положение кодонов
CAI для человека = 97%
н I Л . , . ,
О О 43? т 1311 17№ ПШ 2 &Z1 Ш9 Ы96 3933 437$ Относительное положение кодонов CAI для человека = 83%
О 437 т 1311 1748 Ш5 2622 3059 34S6 3333 4370 Относительное положение кодонов
CAI для человека = 83%
Предпочтит
ельный
кодон
Редкий кодон
43? 874 1311 1748 2165 2622 3059 3496 3933 4370 Относительное положение кодонов CAI для человека = 91%
Относительное положение кодонов CAI для человека = 91%
Относительное положение кодонов CAI для человека = 88%
О 43? 874 1311 Z%m Ш2 Эт 3496 3933 43?"
Относительное положение кодонов CAI для человека = 88%
Фиг. 3: Плазмидные карты экспрессионных плазмид с кодон-оптиллизированнылл FVIII
точка начала pUC
AmpR
синтетический энхансер
/энхансер mTTR
/ /ЕТ-усиленный промотор
/ /транстиретина
промотор mTTR ^Э'-НТО mTTR
"^Nhel (561)
Последовательность Козак
FVIII-303
9208 п.о.
SV40 поли-А Зеоцин
промотор ЕМ-7.,-промотор и точка начала SV40 ^ точка начала репликации fl
BGH поли-А
Xhol (4954)
coFVIII-1
Фиг. 4: Активность FVIII у мышей НетА
2000 л
Время (ч) BDD FVIII = FVIII с делециями в В-домене
Фиг. 5: Плазмидные карты экспрессионных плазмид с кодон-оптимизированным FVIII
точка начала репликации фага fl pUC19
SV40 поли-А oriR \ ¦ SK-LTR4 ciR3RU6\ 142-ЗрТ \\ 142-ЗрТ 142-ЗрТ V
142-ЗоТ ,,Y-v| Мутированная последовательность у^^^т*-мутантный WPRE й§" (tm)
pUC1S
¦¦3 Ч ¦9 \.
SAII (9549) ||
pLV-coFVIII-52
11531 п.о.
промотор CMV IE-I RU6
coFVIif-62
ф ч SK-LTR4 / ч #\ PBS SL123 ^/ 1tN4 SUmgag \ ttenvRFI
RRЈ
\ \ ¦ denvRFS
\\ \ PPT
синтетическийэнхансер \ ,энхансер mTTR
\ ЈT
: промотор mTTR
V-HTO mTTR
Nine I (5160)
Фиг. 6А: Сравнение coFVIII-3, со FVIII-4, coFVIII-5 и coFVIII-6 с coFVIII-1
1200-t
0 24 48 72 % 12
Время (ч)
Время (ч)
Фиг. 6В: Сравнение coFVIII-25 и coFVIII-26 с coFVIII-1
*wtBDD-FVIII = неоптимизированный FVIII с делециями в В-домене
Фиг. 7: Опосредованная лентивирусным вектором активность
FVIII у мышей NemA
*LV-2116 = FVIII с делециями в В-домене под управлением промотора ЕТ в лентивирусной плазмиде
Подчеркивание = последовательность нуклеотидов XTEN (SEQ ID NO: 18)
Подчеркивание = последовательность нуклеотидов XTEN (SEQ ID NO: 18)
Подчеркивание = последовательность нуклеотидов XTEN (SEQ ID NO: 18)
точка начала репликации фага fl
SV40 поли-А
d"3RU5
142-ЗоТ \
142-3 рТ\ \ \ \ V 142-ЗрТх 4 v\ \
AmoR
-Л 4
142 ЗрТ 'V
Мутированная - , последовательность ' мутантный WPRE ^
SAII (9999)
pLV-coFVIII-52-XTEN
11981 п.о.
промотор CMV
РВ S $1123
'SL4 тцщ
X ТЕ N14 4
Л\ \\
\ \ \ синтетический энхансер
п \ ^
\\ \ энхансер mTTR
¦ \
\ промотор mTTR
Nhe I (5160)
Фиг. 10А: Активность FVIII у мышей НетА после гидродинамической инъекции плазмидной ДНК
Относительный уровень
{coFVHM ХТШм*" |
t80D-FҐlill * 1
Время (ч)
^wtBDD-FVIII = неоптимизированный FVIII с делециями в В-домене
Фиг. 10В: Активность FVIII у мышей НетА через 21 день после
лентивирусной инъекции
20^
го гз
15-
10*
^ LLT
о- I
CQ S I0,2" > 0,1" 0,0*
*LV-2116 = FVIII с делециями в В-домене под управлением промотора ЕТ в лентивирусной плазмиде
г. НА: Полноразмерный зрелый фактор FVIII человека, последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 15)
UVCBSBlAimcffLHKRUFAW
rpEyHSSRE6HTf-LVR^HRQASLЈ"P!TaTAQTLlN,^lGQFLU D5EWDWRFD"NSPSfiQIKVAKKH?KW^HYIMEEEDWDYAPLVlAPDDSSYK5QҐLMNQPQRiGRKYK!a'RfSvWVTDETFKTR
ЈA"HEm6mY <^6DtUire!"^OT^
SSfVNMEROLASGLIGPLLiCYKEWDQRGNQMSDKRWI^
D^NTSDYVEDSYEDiSAYLL5KN^tt§EPЯSFSONSRHPSrRGKa-^^ATTP?^J0!EWDPWFAHRTP^^?KЮNWSSDLLML^.ROSf1TPH
е151^1ОЕАШШО01^А105Н"515ШТНдаОШН5еШ
NUW6rD4rS^6PPSMPVHY:miDrTlFeilCKbSPlTЈ
KMMEMVQaSKЈGPIPP3AQNP0MSFFKMt4PESARWSQSTHSmSLMS6QSPSPKQA'SL6Pt^E^NaSERNmVG!;GEf
ТСШ*ИМКН1ТР &таЮУЫ?КШгА1ТС$Р1$^
ESSHFLCX;AfCKNNL$lA8lTLЈMTG[> Q4EV6Sl6TSAT^
^C^QCTtfiAilRVNCANIUWCVmfW^^
ААШКШ> ВЕУтА] <аШЕ"?80^^
AAWKLWDVGivBSSPNVLSNfWlSGW^QfK^AT^
ISҐEEDQSQGAEPRK!4r^'SPhiET^WFWKVQ:--iHMAPTKDEfDCKAWAYrSOVDLEKDVHSeLffiPLLVCH(tm)TLMPAHGn;QWyOE
FA^FTirornCSWVfTEMMEMiatAIWiW
TVRKKEEҐKhMLYNLҐPGVFEWЈML~*SSftGruVRVECLfGEHLHA^
RLNYSGS?^iДVVSrKEPFSWЖVDLLAPM;^HG^TQGAftQKf5SLYISaf'SIM?SLDGSШйTYRGMSrSTL^Л'FFS^fVDSSGIXИP^SFN PP:|ARYiSLHPTHYSRSTLRMEA^GCQLNSCSMPLGMESKA!SDAQ!TASSYFTNViFATWSPSKARLH^G^SMAWRmV^f-JP WlRMeVUSCfAQW-V
Фиг. 11В: Полноразмерный фактор фон Виллебранда, последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 44)
ATRRYYL6AVЈtSWQYMQ^LGЈLF4^ARfPPlWPKSf PF^TOW
NMASHPVSLHAvt^^YWKASEGAEYDDQTSWE^EODKVFPGCiSH rYVWCP/LKENGPMA &> PlCLTYSYIJiHVDlVKiXNS6UGA
LLVCREGSLASEOWLHKflLLfAVTOE6K5WHSETKNSLMQDRDAASAMWPKMHTVNGVVh!RSLPGLffiCHSKSyWHVISM6T
rPЈVH№tfGHTaVimHRQASIliSt4mTAQ^
WEMDWWDQONSPSFIQlRSVAiaHPKIWmi'iA^E
EA10Hl^ll6mYX> ЈV6raUimC^
$5Я^ЕШ/^1КРШСУ1^0О№^
DSLaiSVaHЈVAn"R$SGAQnmSVFFSGYTFKH^
DK^TGaYYIDSYEO^AYtESKNblASEPRSFSQNSftHPSTRamfNAniPENDlEKTDPWFAHRTPMPKlQNVSSSDaMlLRQSP-TPH GLSL^LQEAKYm-SODPbPGAUJSTOSlSFAimraPQLN^
NLA.AGTDHTSSLCPPSM?VHYDSQtD1TL?6msaTESGG?lSLSEЈNhiDSKlLESC4MNSQESSWGKNVSSTBGRLFSGKRAHGP АиД*ОМА1ГКУ5! &и(tm)кТ5МК^ТМ!Ш> "ОСР51
S^MEMVQQKKEGPiPPOAQNPD^ISFf KMLFLPE &ARWiQKTHGKfJSbNSGQGPSPSQLVSLGPE KSVЈ6QNFISEKMKVW6 <{3EF TraVElKMVFPSSRNLPLTNLQ^ENNTHNQtlCKS^^
vuwmmsrwmcwAHf^se^NLEm^^
TQWSKNMKHlTPSTLTamYNEKEKGAiTQSPLSDCLTSSHSPQANRSPLPlAKVSSFPSiRPiYLTRVLFQDSJSSHLPAASYRKKDSGVQ ESSHFLQ6ASXhlNLSl> \SLTLEMTGDQREVCSL6TSAThiSv7YKKVEMWLPKP0LPKT56SVELLPI <4'HsYQKDiFPTETS^GSPGHLDL \^CSLLQGT?GAIKWMEANR?GKVPRRVATЁSSA^KTPSKLLDPLAW0NH?6TC^Pi SYEEDQRQGAEPHKNFVKPNETSTYFWKVQHH^APTKDЈFOCKAWAVfSDVDLEKDyHSGLiGPLLWHTNTLhiPAHGRQVT\'QE
MlfPnFDETlCSWYraNMEWCJW^^
T\mKKEEY*№".YNlYP6WETVEMlPSKAGIWRVE^^
%ч^яыАутк1РИШ(УША*М1Ш1п^^^
PP|iAftYiRLHPTHYSIRSTlR№ELM <3COLN5CS№PLG^
(X = любая природная аминокислота)
GAPG$PA6$PT$TSЈGTSKATPES636$PPAT$GSe'PAtj$
Фиг. IIP: XTEN AE42-4, последовательность ДНК (SEQ ID NO: 47)
QGCCKXKXACGTTCTOT^^
OXs AGCC AGCCACCTCC66C TCT 6AAACCCCIG CCTCGAGC
Фиг. HE: XTEN AE144-2A, последовательность белка (SEQ ID NO: 48)
TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTESGTSTEPSEGSAPGTSTSPSEGSAPGTSESATPESGPGTS'S'EPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSCSE TP6TSTE PSEGSATOTSTE PSESSAPGTSESATPSSS PGTSSSATPESG "S
Фиг. 11F: XTEN AE144-2A, последовательность ДНК (SEQ ID NO: 49)
G6CGCGCCAACCAGTACGGAGCC6TCCGAG66GAGCGCACCAGGAA6CCC6GCTGGGAGCCCGACTTCTACCSAAGA6GSTACA TCTACCGAACCAAGTGAAGGTTCAGCACCAGGCACCTCAACAGAACCCTCTGAGGGCTCGGCGCCTGGrACAAGTGAGTCCGCCAC СССАеААТСС06ССаС0еАСААЬСАСА6ААССТТС60АА &ебА6ТеССССТ6СА,АСАТ?.С0ААТС60СААССССА0ААГСАСее CCAGGAlCTeAGCCCGCGACTrCGGGCTCCGAGACGCCTSGGACATCCACCGAGCCCTCCGAAGGATCAGCCCCAGGCACCAGCA CGGAGCCCTCTbAGGGAAGCGCACCTGGTAGCAGCGAAAGCGCAACTCCCGAATCAGGTCCCGGTACGAGCGAGTCGGCGACCCC 66 AGAG CG GG CCAG6TGCCTC6 AGC
Фиг. 11G: XTEN AE144-3B, последовательность белка (SEQ ID NO: 50)
SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAU'ESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTS PSffiSA PGTSTEPS E6SAP65PAGSPTST EE6TSTE P5E GSAPG
Фиг. 11H: XTEN AE144-3B, последовательность ДНК (SEQ ID NO: 51)
G6CGCGCCAAGTCCC6CTG6AAGCCCAACTAGCACC6AAGAGGG6ACCTCAGAGTCCGCCACCCCCGA6TCCGGCCCTGG CTCTG АбССТбССАСТА{^б <КТСС6А6АСТСХТ06САСАТССбАААбС6СТАСАССШ
GA6GGaCCGCCCCrGGAACMGCACXtmG{XCA6C6AAGGCAGCCK:CCCAtKKiACaCCACAGA ССТбе <ЖСА5САСС6ААССАА6СбАеб^^
CCGAGCCCAGreMGGCAGCGCCCa'GGW^
AGGCTCfeCACCAGeTGCCTCGAGC
Фиг. HI: XTEN AE144-4A, последовательность белка (SEQ ID NO: 52)
TSESATPESGr> GSE?ATSGSETPGTSESATPESGPGsEPATSGSETP6TSESATPESGPGTSTEFSEGSAPGTSESATPES6P6SPA6SPTST E*fiSPA^TSTgЈ6SPA6^TST?ECTSfSATPE^I"STSrePSЂGSAt"S
Фиг. 11J: XTEN AE144-4A, последовательность ДНК (SEQ ID NO: 53)
GGC,GCGC,CAACGTCCGAAA6TGCTACCCCTGA <3TCA"GGCtCTGGTAGTGAGCCTGCCACAAGCGGAAGCGAAACTCCGG6GACCT CAS AGTCTGCCACTCCCG AATC6G6GCCAG 6CTCT6 AACCC 6CCACTTCASSC A6C6AAACACCA6C AACATCG 6 AG A6CSCT AC CCCGGAGAGCGGGCCAG3AACTAGTACTGAGCCTAGCGAGGGAA6TGCACCTGGTACAAGCGA6TCCGCCA"CCCGAGTCTGG CCCTGGCTCTCCAGC66GCTCACCCAC6AGCACT6AAC'AG6GCTCTCCCGCTG6CAGCCCAACGTCGACA6AA6AAGGATCACCA GCAGGCTCCCCCACATCAACAGAGGAGGGTACATCAGAATCTGCTACTCCCGAGASTGGACCCGGTACCTCCACTGAGCCCAGCG АШВ 6 AGT6CACCAG STGCCTCG AGC
TSESATPBfiPGSePAT$S$m> GTSEW^
65> E PATSSSETPGrSE 5АГРЕ SS PSSPAGSPTSTE EGSPAGSPTSTEEG
Фиг. 11L: XTEN AE144-5A, последовательность ДНК (SEQ ID NO: 55)
t,ni f4 t CGC AC 5 MGt С-ГСАсААТСЧ: ArfCCGk t WtOAoGtAGTt AGAtk. t CAx < AAt Г AO. v Ak-I С Ui WCAu &^AGAGKwCtAGGGAGat КлК*Л CKVfAtu (CAt.l^A^GAAGG^Tk.AttAtCbG^ "KfcCUAkvAUA CT6 AAG AAG6 TSCO C6 AЂC
Фиг. ИМ: XTEN AE144-6B, последовательность белка (SEQ ID NO: 56)
TSTSPSЈeSAP6TSESATPES6PGTSESArpESC(^TSEWTPESe"5SEPATS6SЈTPfiSE!> ATSGSETPC!SPASSPTSTЈEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPCSEPATSSSETP6TSESATPESGP6TSTEPSEGSAPC;
Фиг. UN: XTEN AE144-6B, последовательность ДНК (SEQ ID NO: 57)
GGCC^-GKMCATCTACCGAGCCTT^
GAAA6TGCCACTCCCGA6AGCG6CCC4GG6ACAAGC6AGTCAGCAACCCCTGAGTCTGGACCCGGCA6C.6AGCCTGCAACCTCT'SG CTCAGAGACTGXG6CTCAGAAЈCCGCTACCTCA6^
AACATCCAcrGAGCCIAGtGAGGGCTCTGCCCCTGGAACCAGCACAGAGCCAAGTGAGGGCAGTGCACCASGATCCeAGCCAGCAA
CtAGCGGGTCCGAGACTCCCGGGACCTtTGAGTCTGCC^
G CACCAGGTG CCTCGAGC
Фиг. 110: XTEN AE144-1, последовательность белка (SEQ ID NO: 58)
PGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTP^
TGSPtnPGSGTASSSPSASPG'reSTGSPGASPGTSSTGSPGTPSSGTASSS
Фиг. IIP: XTEN AE144-1, последовательность ДНК (SEQ ID NO: 59)
GGCCC6CGACCCGGGTCGTCCCCGTCGGCGTCCACCGGAACAGGGCCA6GS1CATCCCCGTCAGCGTC6ACTGGGACGGGACCCGG GACACCC6GTTCGGGGACTGCATCCTCCTCGCCTG8TTCGTCCACCCCGTCAGGAGCCAC6GGTTCGCCGGGMGCAGCCCAA6CSC ATCCACTGGTACAG ACCASGATCGTCAACACCCTCGGGCGCAACGG6CAGCCCCGGMCCCCTGGTTCGGGTACGGCGTCGTCGAGCCCCG6T6CGAGCC
CGGCMeAAGXSCGACAGGATCGCXTGGGGCGTCAtt^^
GTCGTCAAS CG CCTCGAGC
Фиг. HQ: XTEN AE144-A, последовательность белка (SEQ ID NO: 60)
GASPCTSSr $?Р€г55ТР5еАТ65Рв1> 556ТА555Р6.А$геТ5ЕТ6$Р6А5РйтаТ"5Р
Фиг. 11R: XTEN AE144-A, последовательность ДНК (SEQ ID NO: 61)
GGCGCGCCAGGTGCCTC.GCCCKiGAACATCATC.AACTGGTTCACCCGGGTCArCCCCCTCGGCCTCAACCGGGACGGG!'CCCGGC!'CA TCCCCCAfiCGCCAGCACTGGAACAGGrcrrGGrAClCnGGTTCCGGrACfjGCAlCGTCATf CtCGGGAAGCTCAACACCGlCCGGA GCGACAGGATCACCTGGCTCGTCACCTTCGGCGTCAACtGGAACGGGGCCAGGGGCCTCAtC.CGGAACGTCCTCGACl'GGGTCGCCT G6TAC6CCGGGATCAGGAACGCiCCTtATCC1CGCCTGGGTCCn:AACGCCCT№GGTGCGACT6GTTtecCGGGAACTCClGGariS GGGACGGCCtCGrCGTCGCCTGGGGCArCACCGGGGACGAGCTCCACGGGGTCCCCTGGAGCGTCACCGGGGACCTCCTCGACAGG TAG CCCGGCCTCG AGC
6SP6SSIT'S^lЈiSPGftS№TSiTfiS> 4MtSP6;TSST6W^SP6TS &TCSP
Фиг. ИТ: XTEN AE144-B, последовательность ДНК (SEQ ID NO: 63)
6 <ЮХ6ССА66ТАа":С <^^
GfCACCCiGG4ACis?CGlCAACGGGG К ACCGGG1 ACGCЈAGG1 АбССбСАССБСОКЮ^^ГСбССАЁбТТСАП^АСССШ^СШ
<зАвсбАа-жбтсбасбеАтсмбсссбТс^спш"^
CC№GnCA?CGACGeCQCA6GGGCaftCAGGC)CGCa &GAresf^
TGGAACCTCATCCACCG6AAGCCCGG6C6CCTCGCCGCGTACGA6CTCCACGGGATCGCCCGGAGC6TCCCCCGSAACTTGV\GCA CA6GG ASCCCT GCCTC6A6C
Фиг. Ill): XTEN AE144-C, последовательность белка (SEQ ID NO: 64)
GTPeSGTAKSPGASPGTSSTGSPGASKsT^^^
6S^6ASPGtSSTGS?Gm"GArGs?GSTSSGATGSWASPGT'BTSSP
Фиг. 11V: XTEN AE144-6C, последовательность ДНК (SEQ ID NO: 65)
GGCGCGCCAGGTACACCCGGATCGGGTACAGCGTCATCGAGCCCCGGIGCGTCACCTGGTACGTCGAGCACGGGGTCGCCAGGGGC GTCCCCrGG АствжАСйХзесстееААстссййес^
СА56АШ".ГСесССввААШССАбСЖА6бААее^
CCSTCCGGASCCACTGGATCACCA666AGCTCGACACCTTCCGGCGCAACGGG ATCGCCCG6AGCCAGCCCG6GTA.CG TCAAGCAC TSGCrCCCCTGCCTCGAGC
Фиг. 11W: XTEN AE144-F, последовательность белка (SEQ ID NO: 66)
6SS"^"T6P6SSPSASTST6PGASP &T$STG$P6ASP6nST6SPS^^ TGPGTPGSGTASSSPGSSTPSCATGSPGSSTPSGATGSPGASPGT^TGSP
Фиг. ИХ: XTEN AE144-F, последовательность ДНК (SEQ ID NO: 67)
GGrC4'G:CAC4K,TCCA3CvXfTf.CGCSAGCAeCGGAACfGl3ACCAfiGTTCCTCACCCT <~ACCATCAACGGGGA01CCACCGGGGG
CGTCACrAGGAAC6TCCTCcACCGGCTC6CCGGGTGCATCACCCGG*.ACuTCATCCACCGGATCGCCAG"GACCTC6ACGCi:ATCAG
GOrfMCA^ATCACeTGUtTCAAGaCTA^
CLoG*TCGA^CCCAICCGCC^CAACCGGAACC6GACtC6GTACACCAGGCT(.GGljAACAGCCTf;CTCGTCACCAGGCTCCTLAACCL Ci%Tt4-rGAiiCC4i*GG*> rfCGtrfGGTIt лП A WVrtTTt;"! riGAS.'^AllGG'^Gn'in'iGAGfftlt'^trACsG^itaTrGACC^ni GSSTCGCCCGCCTCSAGC
Фиг. 11Y: промотор ET, последовательность ДНК (SEQ ID NO: 69)
CTCSAGGTEMTTCACGC6A6TTMT AATTACCAGC6C6GGЈC^^
&CTGGTAAnATTAACCTCGCGAATATTGATTCGAGGCCGCGS,TT6CCGCAATC6CGAGGG6CAGGTGACCTTIGCCCA6C6C6C6T VCGCCCCGCCCCGGACGGTAtCGATAAGcnAGGAGCn^GGCTGCAGGtCGAGGGCACr &GGAGGATGnGAGTAACsAFGL> AAAA CrACrGATGACCCTVGCAGAGACAGAGTA'FTAGGACATGTTTGAACAGGGGCCGGGCGATCACCAGGTAGCICTAGAGGATCCCCGT' СТ6ТСГ6САСАТПС6ТА6А6С6АСПСТТСС5АТАСТО
TTGACTAAGTCAATAATCAGMrCAGCAGGTfTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCtTGGGTTGGAAGGAGtjGGGTATAASA GCCCtTTCACCAGGAGAAGCCGTCACAGAGATCCACAAGCTCCTGCCACCATGG
Фиг. 11Z: coFVIII-1 - последовательность ДНК (SEQ ID NO: 68)
ATCXAGATTGAGtnfGTCTACTrbCT
At.KsK-l ibGEsAI f АСА! GC AG At? TGACC I GGGAGAGC! GC t AG f Ws At-G CAAGG 11 ICCttCtAGAGItCt1AAG!CATiCU.U K-AACACTAGCGTCffiTaACAAGAAAAtACTm
KACTGOGGGGCCAACAAtCCAGGtXGAGGtGTACGACACCGTGGlCATIACACTrAAbAACAIGGCCKACACCCCG'tGAGCCrGC
ATGCTGTGGGCGTCAGCTACTGGAAGGCTTCCGAAGGAGCAGAGTATGAt^TCAt^CTTCCCAGAGAGAAAAAGAGGACC^TAAG
GrGtTICCrGGCGGATOCAl^CtACGlGl GGCAGGTCnCAAAGAGAArGGCCXTAIGGCCfCtGACCCrCTGfGCC'fGACCtACT
aTATCTGACaCACGTGGACtTGGTC^^
AGGAGAAAACXCAGACACTGCATAAGTfCATTCfGCTGTTC^
6TCTGATGCAeGACAC <^eATGCtЧ5CTTCA6CCA6AGCTTeGCCCAAMrGCACACrSTйAAC6eCTAC6TCAATC6CrCACrGCCTG
GGCTGATC6GC1GCCACC6AAA6AGCG f GTAft 6ИЗСАТ6> САТСйС6АТ6б6САССАСАССТбАА6Т5САСТССАП"ГТССГ66Ав6
&ЖАТАССТТТГГабГСС"СААССАСС6АСА6ССТТСССГ6^А6АТСТСГССААП'АССТ?ССТЙАСАеСАСА6АСТГГ6СТ6АТ66АС
CfGGGGCAGttCCfGCl'GlTITGCttCAIC^GCtCCC^CCAGCAVGATGGXrAtGGAGGCnACGl'GAAAG'iGGACTCnGTCCCGAGG
AACCTCASn'GCGGATGAAGAACAATGAGGAAGCAGAAGACTATGACGATCAC.CTGACC.GACTCCGAGATGGATGTGGTCCGATTC
6ATGAC6ATAACAGCCCCR;CTTOTCCA6ATTA6ATCTGFGGCCAAGAAAC^XiTAAGACATGGGTCCATTACATrj;CAGCCGA66
A^GA66ACrGGGATTAT6CACCACTG6TGCrG6CACCA6ACGATCGCTCCTACAAATCTCAGTATCr6AACAATGGGCCACA6AGGA
mGCA6AAAGTA T CC TGGG ACCACTGCT6 T ACGG AG AAGTGGG AG ACACCCTGCT6 ATCATTTfCAAGAACCAG GCC AG CCG GCCTT AC AATATCT ATCC ACAlXGGArrACAGATGTGCGCCCTCTt^ACAGCAGGAGACTGCCAAAGGGCGTCAAACACCTGAAGGACTTCCCAATCCTGCCCeG AGAAATCTTCAAGTACAAGTGGACTGtCACCGTCGAGGATSGCCCCACTAAGAGCGACCCTCGGTGCfTGACCCGCTACtATTCTAGT TrCXTGAATATGGAAASACATaWAACXXGACTGATC^
CAGATCATGtCCGAt^AGCfiGAATGTGATTCTGTTCAGTGTCTTTGACGAAMCAGGTCATGGTACCT
rCCTGCtrTMTCCAGCTCGGGTGCAGCTGGMGATOT^ CAGTTTG CAGO 6 AG CtWCTGCCTSt ACG ASG"^ rmCCGGCTACACtmMGCATAAMTGGTCTATGAGGA^^
GG^GMTCCCGGACTGTQGATlCTGGGGTGCCACAACAGCGATnCAGAAAIXGCGSAATGACICKCCTGCTGAAAG'TGTCAAGCTG TGACAAGAACACtGGGGACTACTATGAAGATTCATACG^
GTCTnTAGTCAGAATCCTCCASTGCTGAAGAGGCACCAGAGGGAGATCACCCGCACTACCCFGCAGAGTGATCAGGAAGAGATCGA CTACGACGATACAAmaGTGGAAATGAAGAAAGAGGAC^
AAGAMACCAGGCATTACmAITGCCGCASTGSAGCGGCTGTGGGATTATGGCATGTCCTaAGTCaCACGTGaGCSAAATAGG GttCAGTCAGGMGCGTCtCACAGTTCAAGAMGTGCT
GAACTGAACGAGCACCTGGGACT6CTGG6GCCCTATATCAGAGCAGAAGTGGA6GATAACATTATGGTCACCTTCAGAAATCA6GCC
TCTCGGCCTTACAGTTTTTATTCAAGCCTG АТС TCTTAC GAAG AGG ACCAG CG ACAG G GAG CTG AACCACG AAAAAACTTCGT6AAGC
CTAATGAGACCAAAACATACTTrrG6AAG6TGCAGCACCAT,ATGGCCCCAACAAAAGACGAGTTCGA1TGC.ftAGGCATGGGCCTATTT
TTCTGACGTG6ATCTGGAGAAGGACGTGCACAGT6GCtTGATTCiGtCCACTGCTG6TCTGCCATACTAACACCCTG.AATCCAGCCCAC
GGCCGGCAGGTCACT'GTCCAGGAGTTCGCTCTGTTCtTTACCATCTTTGATGAGACAAAGAGCTGGTACTTCACCGA.AAACATGGAGC
GMAFTGCAGGGfTCCATGlAACAn'CAGATGGAAGACCCCACATrCAAGGAGAACTACCGCTTTCATGCTATCAATGGATACATCAT
GGATACTCTGCCCGGGCTGGTCATG6CACAGGACCA6AGAA~CCGGT6GTATCTGCTGAGCATGGGCAGCAACGAGAATATCCACTC
AATTCATTTCAGCGGGCAr.6IGTTTACTGTCAGGAAGAMGAAGASTAC4AGATGGCCCrGTACAACCtGTATCCCGGCGTGTTCGAA
AtCGTCGAGATGCKitrrAGCAAGGCCSCAATtTC^^
nTCTGGTGTACAGTAATMGTGTCAGACACCXCTGGGAATGGCATCCGGGCATATCAGGGATTTCCAGATTACCGCATCTGGACAGT ACGGAf AGTGGGCACCfAAGCTGGCTAGAOGCACrAnffi
GGTGGACCrGCTGCXCCCAATCATCArrCATGGCATCAAAACTCAGGGAGCTCGGCAGAAGTTaXCtCTCTGTACATCrCACAGrrTA TCATCATGTACAGf CT &GATGGGAAGAAATGGCAGACATACtGCGGCAATAGCAf AGGAACTCT6A rGGTGTTCTTTGGCAACGTGG АСАвСАСС?> СААТСАА6САСМСАГтХААТССССС1АГСАТТССТАСАТАСАТСС6ССТ6САСССМСССАГГАПСШТСС."6Т ACACTG AG GATGGAACTGATGG6ATGCG ATCTG AAC AGTTGTTCAATViCCXCTGGGGATGGAfSTCCAAGGCAATCTt'TGACGCCCAG AnACCGCCAGCTCCTACTTCACTAATATGTTTGCTACCTGGAGCCCTTCCAAAGCAAGACTGCACCTGCAAGGCCGCAGCAACGCA.TG GCGACCACAGGTGAACAATCCCAAGGAGTGGTTGCAGGTCGATTIfTCAGAAAACTATGAAGGTGACCGGGGTCACAACTC-AGGGCG TGAAMGTCTGcrGACCTCAATGmCGTCAAGGAGTTCCrGATCTcrAGTTCAtAGGACGGACATCAGTCGACACTcmcTrrCAGAA CGGGAAGGT6AAASTOTCCAGGGCAATCAGGATTCCTTTACACCTGTGGTCAACAGTCTAGACCCTCCACTGCTGACCAGATACCTG AGAATCCACCCTCAGTCCTGGGTGC ACCAGAT14'jCCCT6A6AA1G6AAGTGCI4'KjGAtGC6A &G(X.CAGGATC!'GTACT6A
и О I
<
0,01
Фиг. 12В
(11
> s о-z m
О I
1Л 0)
ОД.
0,01 i"""f> у" у *" ""1"" у"
-" N ^ Ik А А%
* i4 i4 / X4
0,01 I ^ "u.| ::.."."-¦-.-¦ ¦ шши u uu"- u........ fuuu,r , uu.,,,,
Отрицательные по Положительные по
антителу против FVIII антителу против FVIII
мыши мыши
0,011- --г •-• • • "
Отрицательные по Положительные по
антителу против FVIII антителу против FVIII
мыши мыши
Фиг. 16А
ш s I-о о. с
<
1000 100 10 1
0,1 0,01
Фиг. 16В
о s ш " " ж Время после лечения LV (недели)
Фиг. 16С
11 ~Ш " Ш
Время после лечения LV (недели) Фиг. 16D
Недели после лечения LV
Дни после лентивирусного лечения
2015-09-21 11:36
СТ: *7194с
CFT: - с
А10:-мм
А20: - мм
MCF: - мм
Фиг. 19В
2017-01-18 11:00
2: образец через 2 недели
СТ: 167 с А10: 53 мм
CFT:65c I а: 77° А20: 59 мм i MCF: 61 мм
ill
lifll
ЧЁИ Ш1
шЩшт
2017-01-19 12:29
2: образец через 2 недели
СТ: 356 с
CFT: 117 с
а: 67°
А10: 55 мм
А20. 61 мм
MCF: 61 мм
Фиг. 19D
Параметр
Описание параметра
Нормальный диапазон
СТ (секунды)
Время сворачивания крови
120-480
CFT (секунды)
Время образования сгустка
60-240
а (")
Угол альфа
27-60
А5 (мм)
Амплитуда через 5 минут после СТ
н/о
А20 (мм)
Амплитуда через 20 минут после СТ
н/о
MCF (мм)
Максимальная твердость сгустка
40-60
(19)
(19)
(19)
<220>
<220>
<220>
164
164
164
167
167
1/44
Фиг. 1А: coFVIII-3 - SEQ ID N0:1
1/44
Фиг. 1А: coFVIII-3 - SEQ ID N0:1
2/44
Фиг. IB: coFVIII-4 - SEQ ID N0:2
2/44
Фиг. IB: coFVIII-4 - SEQ ID N0:2
3/44
Фиг. 1С: coFVIII-5 - SEQ ID N0:70
3/44
Фиг. 1С: coFVIII-5 - SEQ ID N0:70
4/44
Фиг. ID: coFVIII-6 - SEQ ID N0:71
4/44
Фиг. ID: coFVIII-6 - SEQ ID N0:71
5/44
Фиг. IE: coFVIII-52 - SEQ ID N0:3
5/44
Фиг. IE: coFVIII-52 - SEQ ID N0:3
6/44
Фиг. IF: coFVIII-62 - SEQ ID N0:4
6/44
Фиг. IF: coFVIII-62 - SEQ ID N0:4
7/44
8/44
Фиг. 1Н: coFVIII-26 - SEQ ID N0:6
10/44
10/44
11/44
11/44
11/44
11/44
12/44
Фиг. 2C-COFVIII-3
12/44
Фиг. 2C-COFVIII-3
12/44
Фиг. 2C-COFVIII-3
12/44
Фиг. 2C-COFVIII-3
12/44
Фиг. 2C-COFVIII-3
12/44
Фиг. 2C-COFVIII-3
13/44
Фиг. 2Е - coFVIII-5
13/44
Фиг. 2Е - coFVIII-5
14/44
Фиг. 2G -coFVIII-52
14/44
Фиг. 2G -coFVIII-52
14/44
Фиг. 2G -coFVIII-52
14/44
Фиг. 2G -coFVIII-52
15/44
Фиг. 21 - coFVIII-25
15/44
Фиг. 21 - coFVIII-25
16/44
16/44
16/44
16/44
16/44
16/44
16/44
16/44
17/44
17/44
18/44
18/44
18/44
18/44
18/44
18/44
21/44
Фиг. 6С: Сравнение coFVIII-52 и coFVIII-62 с BDD-FVIII и coFVIII-1
20/44
21/44
Фиг. 6С: Сравнение coFVIII-52 и coFVIII-62 с BDD-FVIII и coFVIII-1
20/44
23/44
Фиг. 8А: coFVIII-52-XTEN - SEQ ID N0:19
23/44
Фиг. 8А: coFVIII-52-XTEN - SEQ ID N0:19
24/44
Фиг. 8В: coFVIII-1-XTEN - SEQ ID N0:20
24/44
Фиг. 8В: coFVIII-1-XTEN - SEQ ID N0:20
25/44
Фиг. 8С: coFVIII-6-XTEN - SEQ ID N0:72
25/44
Фиг. 8С: coFVIII-6-XTEN - SEQ ID N0:72
26/44
Фиг. 5: Плазмидная карта pLV-coFVIII-52-XTEN
26/44
Фиг. 5: Плазмидная карта pLV-coFVIII-52-XTEN
26/44
Фиг. 5: Плазмидная карта pLV-coFVIII-52-XTEN
26/44
Фиг. 5: Плазмидная карта pLV-coFVIII-52-XTEN
26/44
Фиг. 5: Плазмидная карта pLV-coFVIII-52-XTEN
26/44
Фиг. 5: Плазмидная карта pLV-coFVIII-52-XTEN
26/44
Фиг. 5: Плазмидная карта pLV-coFVIII-52-XTEN
26/44
Фиг. 5: Плазмидная карта pLV-coFVIII-52-XTEN
26/44
Фиг. 5: Плазмидная карта pLV-coFVIII-52-XTEN
26/44
Фиг. 5: Плазмидная карта pLV-coFVIII-52-XTEN
27/44
27/44
28/44
28/44
28/44
28/44
28/44
28/44
28/44
28/44
28/44
28/44
31/44
Фиг. ПС: XTEN АЕ42-4, последовательность белка (SEQ ID NO: 46)
31/44
Фиг. ПС: XTEN АЕ42-4, последовательность белка (SEQ ID NO: 46)
32/44
Фиг. ПК: XTEN АЕ144-5А, последовательность белка (SEQ ID NO: 54)
32/44
Фиг. ПК: XTEN АЕ144-5А, последовательность белка (SEQ ID NO: 54)
33/44
Фиг. US: XTEN AE144-B, последовательность белка (SEQ ID NO: 62)
33/44
Фиг. US: XTEN AE144-B, последовательность белка (SEQ ID NO: 62)
100
35/44
34/44
100
35/44
34/44
100
35/44
34/44
100
35/44
34/44
100
35/44
36/44
37/44
37/44
40/44
40/44
40/44
40/44
41/44
Фиг. 17
41/44
Фиг. 17
42/44
Фиг. 18
42/44
Фиг. 18
43/44
Фиг. 19А
43/44
Фиг. 19А
43/44
Фиг. 19А
43/44
Фиг. 19А
43/44
Фиг. 19А
43/44
Фиг. 19А
43/44
Фиг. 19А
43/44
Фиг. 19А
44/44
Фиг. 19С
44/44
Фиг. 19С
44/44
Фиг. 19С
44/44
Фиг. 19С
44/44
Фиг. 19С
44/44
Фиг. 19С
44/44
Фиг. 19С
44/44
Фиг. 19С
44/44
Фиг. 19С
44/44
Фиг. 19С
44/44
Фиг. 19С
44/44
Фиг. 19С
|
