|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Настоящее изобретение относится к новому вектору для иммуностимуляции и способам его применения в иммунотерапии, в частности иммунотерапии рака. Новый вектор содержит последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие лиганд 4-1BB (4-1BBL, CD137-лиганд), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2, причем указанный вектор обеспечивает повышенную экспрессию 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2. В частности, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, расположены в векторе в направлении от 5'-конца к 3'-концу в последовательном порядке 1, 2, 3, при условии, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в положении 1. Варианты реализации настоящего изобретения включают вирусные частицы, содержащие указанный новый вектор, а также раковые клетки или иммунные клетки, трансдуцированные или трансфицированные указанным новым вектором.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к новому вектору для иммуностимуляции и способам его применения в иммунотерапии, в частности иммунотерапии рака. Новый вектор содержит последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие лиганд 4-1BB (4-1BBL, CD137-лиганд), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2, причем указанный вектор обеспечивает повышенную экспрессию 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2. В частности, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, расположены в векторе в направлении от 5'-конца к 3'-концу в последовательном порядке 1, 2, 3, при условии, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в положении 1. Варианты реализации настоящего изобретения включают вирусные частицы, содержащие указанный новый вектор, а также раковые клетки или иммунные клетки, трансдуцированные или трансфицированные указанным новым вектором.
(19)
Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201891681 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.02.23
(51) Int. Cl.
C07K14/54 (2006.01) C07K14/55 (2006.01)
C07K 14/705 (2006.01)
C12N15/86 (2006.01)
(54) НОВАЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩАЯ ВЕКТОРНАЯ СИСТЕМА
(31) 16157423.1
(32) 2016.02.25
(33) EP
(86) PCT/EP2017/054216
(87) WO 2017/144602 2017.08.31
(71) Заявитель:
ПРОВЕКС МЕДИКАЛ ГМБХ (DE)
(72) Изобретатель:
Шнидерс Франк, Мигель Андреа, Бирман-Флайшхауэр Каролин (DE)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к новому вектору для иммуностимуляции и способам его применения в иммунотерапии, в частности иммунотерапии рака. Новый вектор содержит последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие лиганд 4-1BB (4-1BBL, €Б137-лиганд), одноцепо-чечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2, причем указанный вектор обеспечивает повышенную экспрессию 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2. В частности, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, расположены в векторе в направлении от 5'-конца к 3'-концу в последовательном порядке 1, 2, 3, при условии, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в положении 1. Варианты реализации настоящего изобретения включают вирусные частицы, содержащие указанный новый вектор, а также раковые клетки или иммунные клетки, трансдуцированные или трансфицирован-ные указанным новым вектором.
НОВАЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩАЯ ВЕКТОРНАЯ СИСТЕМА
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение в целом относится к области иммунологии и более конкретно к области иммунотерапии. В частности, в настоящем изобретении предложена новая векторная система для иммуностимуляции и способы ее применения при иммунотерапии. Новая векторная система характеризуется одним или более векторами, содержащими последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие лиганд 4-1ВВ (4-1BBL, СТЛ37-лиганд), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Иммунная система обеспечивает средства для распознавания и уничтожения чужеродных агентов, таких как бактерии или вирусы, а также поврежденных, больных или патологических клеток в организме, включая раковые клетки. Ключевыми участниками ответов иммунной системы являют макрофаги и природные клетки-киллеры, которые обеспечивают общий, или неспецифический, уровень иммунной защиты. Другие типы клеток, включая цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) и В-лимфоциты, действуют против конкретных мишеней. Реакции (ответы) иммунной системы включают гуморальные ответы, при которых В-клетки вырабатывают антигенспецифические антитела, и опосредуемые клетками ответы, при которых антигены или антигенсодержащие клетки распознаются и разрушаются различными типами Т-клеток с помощью различных механизмов. Опосредуемые клетками иммунные ответы, включая ответ ЦТЛ, считаются ключевыми для устранения опухолевых клеток и инфицированных вирусом клеток.
Принято считать, что природная способность иммунной системы детектировать и уничтожать патологические клетки предотвращает развитие многих видов рака. Тем не менее, некоторые раковые клетки выработали стратегии уклонения от уничтожения иммунной системой. Например, существует несколько различных механизмов, которые могут быть использованы раковыми клетками для подавления иммунных ответов. Раковые клетки также могут подвергаться генетическим изменениям, которые приводят к потере связанных с раком антигенов, делая их менее "видимыми" для иммунной системы. Аналогичные факторы применимы в отношении различных вирусов, которые также применяют стратегии уклонения от иммунного надзора, что приводит к неспособности иммунной системы хозяина контролировать вирусную инфекцию.
Целью иммунотерапии является преодоление этих барьеров для эффективного иммунного ответа. Разные виды биологической терапии, основанные на иммунотерапии, восстанавливают или увеличивают активность конкретных компонентов иммунной системы или противодействуют иммуносупрессорным сигналам, вырабатываемым раковыми клетками или во время вирусных инфекционных заболеваний. ЦТЛ вызывают гибель опухолевых клеток, помимо всего прочего, антигенспецифическим образом. Следовательно, агенты, которые способствуют активации Т-клеток и придают сильные цитолитические и воспалительные свойства, являются оптимальными кандидатами для усиления опухолеспецифического иммунитета.
По-прежнему необходимы новые формы терапии, и одно из основных направлений разработки иммунотерапевтических средств основано на технологии переноса генов. Генная терапия является общепризнанным способом обеспечения иммунной терапии. Нереплицирующиеся вирусы и вирусные векторы были первоначально предложены 20 лет назад в качестве противоопухолевых агентов, способы воздействия которых основаны, помимо всего прочего, на модуляции иммунной системы (например, ИЛ-2) (см., например, Crofts and Krimsky, 2005, Hum Gene Ther. 16: 169-177). В WO 2004/035799 описан аденовирусный вектор, содержащий последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12), лиганд костимулирующего белка 4-1ВВ (4-1BBL) и ИЛ-2, для генной терапии при лечении инфекционных заболеваний и рака.
Настоящее изобретение относится к иммунотерапии на основе нового вектора, которая представляет собой улучшенный вариант, по сравнению с предшествующими подходами генной терапии, который эффективно превращает неактивную иммунную микросреду в активную иммунную микросреду и обеспечивает тем самым лечение рака и вирусных инфекций.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к вектору, содержащему последовательности нуклеиновых кислот генов, кодирующих лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2, причем указанный вектор обеспечивает повышенную экспрессию 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2. В частности, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, расположены в векторе в направлении от 5'-конца к 3'-концу в последовательном порядке 1, 2, 3, при условии, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в положении 1. Настоящее изобретение также относится к способам и вариантам применения нового
вектора для превращения неактивной иммунной микросреды в активную иммунную микросреду и лечения тем самым рака или инфекционных заболеваний. Способы и композиции согласно настоящему изобретению включают конструирование и исследование заявленного вирусного вектора, который вызывает иммунный ответ против раковых клеток и вирусных инфекций, для усиления и/или стимуляции иммунитета против рака и вирусных инфекций.
Аспекты настоящего изобретения включают:
1. Вектор, содержащий последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие
лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2, и дополнительно
содержащий по меньшей мере одну регуляторную последовательность нуклеиновой
кислоты, предпочтительно промоторную последовательность, обеспечивающую
повышенный уровень экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12
и ИЛ-2.
2. Вектор по п. 1, который характеризуется тем, что указанный уровень экспрессии 4-1BBL повышен по сравнению с уровнем экспрессии 4-1BBL, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl (Фигура 20).
3. Вектор по п. 1 или 2, который характеризуется тем, что указанный уровень экспрессии оцИЛ-12 снижен и/или уровень экспрессии ИЛ-2 повышен по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и/или ИЛ-2, полученными с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl (Фигура 20).
4. Вектор по любому из пп. 1-3, который характеризуется тем, что указанные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, расположены в направлении от 5'-конца к 3'-концу в последовательном порядке 1, 2, 3, при условии, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, не находится в положении 1.
5. Вектор по любому из пп. 1-4, который характеризуется тем, что указанный вектор представляет собой любой из аденовирусного вектора, вектора на основе аденоассоциированного вируса, лентивирусного вектора, вектора на основе вируса простого герпеса, поксвирусного вектора, РНК-вектора, плазмидного вектора, вектора на основе наночастиц и депротеинизированной ДНК.
6. Вектор по любому из пп. 1-5, который характеризуется тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 4-1BBL, представляет собой кДНК человека, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, представляет собой кДНК человека и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2, представляет собой кДНК человека.
2.
7. Вектор по любому из пп. 1-6, который характеризуется тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 4-1BBL, по меньшей мере на 70% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ Ш NO: 1, причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок 4-1BBL, способный специфически связывать активированные Т-клетки.
8. Вектор по любому из пп. 1-6, который характеризуется тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2, по меньшей мере на 70% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ Ш N0: 3, причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок ИЛ-2, обладающий иммуностимулирующей активностью.
9. Вектор по любому из пп. 1-6, который характеризуется тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, по меньшей мере на 70% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ Ш N0: 5, причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок оцИЛ-12, обладающий иммуностимулирующей активностью.
10. Вектор по любому из пп. 1-9, который характеризуется тем, что указанные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие оцИЛ-12 и ИЛ-2, расположены в 3'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL.
11. Вектор по п. 10, который характеризуется тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2, расположена в 3'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, расположена в 3'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ИЛ-2.
12. Вектор по п. 10 или п. 11, который характеризуется тем, что промотор расположен в 5'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL, но не в 5'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей оцИЛ-12 и/или ИЛ-2.
13. Вектор по любому из пп. 1-12, который характеризуется тем, что указанные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, соединены с помощью сайтов внутренней посадки рибосомы (IRES).
14. Раковая клетка или иммунная клетка, трансдуцированная или трансфицированная с применением вектора по любому из пп. 1-13.
15. Лекарственное средство, содержащее вектор по любому из пп. 1-13 или раковую клетку или иммунную клетку по п. 14.
2.
16. Вектор по любому из пп. 1-13, раковая клетка или иммунная клетка по п. 14, или лекарственное средство по п. 15 для применения при лечении, или для применения в способе лечения, рака, вирусной инфекции и/или расстройства иммунной системы.
17. Вектор для применения по п. 16, или раковая клетка или иммунная клетка для применения по п. 16, или лекарственное средство для применения по п. 16, которые характеризуются тем, что указанный рак представляет собой любой из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака предстательной железы, лимфомы, рака кожи, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, меланомы, злокачественной меланомы, рака яичников, рака головного мозга, первичной карциномы головного мозга, рака головы и шеи, глиомы, глиобластомы, рака печени, немелкоклеточного рака легких, карциномы головы или шеи, карциномы молочной железы, карциномы яичников, карциномы легких, немелкоклеточной карциномы легких, опухоли Вильмса, карциномы шейки матки, карциномы яичек, карциномы мочевого пузыря, карциномы поджелудочной железы, карциномы желудка, карциномы толстой кишки, карциномы предстательной железы, карциномы мочеполовой системы, карциномы щитовидной железы, карциномы пищевода, миеломы, множественной миеломы, карциномы надпочечников, карциномы почек, карциномы эндометрия, карциномы коры надпочечников, злокачественной инсулиномы поджелудочной железы, злокачественной карциноидной карциномы, хориокарциномы, грибкового микоза, злокачественной гиперкальциемии, гиперплазии шейки матки, лейкоза, острого лимфолейкоза, хронического лимфолейкоза, острого миелобластного лейкоза, хронического миелобластного лейкоза, хронического гранулоцитарного лейкоза, острого гранулоцитарного лейкоза, лейкоза ворсистых клеток, нейробластомы, рабдомиосаркомы, саркомы Капоши, истинной полицитемии, эссенциальной тромбоцитемии, ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, саркомы мягких тканей, мезотелиомы, остеогенной саркомы, первичной макроглобулинемии и ретинобластомы.
18. Вектор по любому из пп. 1-13, или раковая клетка или иммунная клетка по п. 14, или лекарственное средство по п. 15, для применения при предотвращении или лечении, или для применения в способе предотвращения или лечения, метастазов рака.
Подробное описание одного или более вариантов реализации настоящего изобретения представлено в прилагаемых чертежах и в описании ниже. Другие признаки, объекты и преимущества будут понятны из описания и чертежей, а также формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фигуре 1 представлены результаты сравнения экспрессии трансгенов ИЛ-12, ИЛ-2 и 4-1BBL и ответа ИФН-у для ImOl мыши и человека. Значения MOI (множественности заражения) указаны в [скобках]; "т"= мышь; "hu"= человек.
На Фигуре 2 представлена схематическая генная карта челночной плазмиды pEl.l Im02. кДНК трех терапевтических генов 4-1BBL (CD137L) человека, ИЛ-2 человека и одноцепочечного ИЛ-12 человека расположены в трицистронной конструкции, соединены сайтами внутренней посадки рибосомы (IRES) и запускаются промотором цитомегаловируса (ЦМВ). Полиаденилирование транскрипта индуцируется сигналом, происходящим из SV40. Кассета для экспрессии для Im02 проиллюстрирована как предшественник плазмиды для переноса на основе плазмиды рЕ 1.1, подходящий для субклонирования в плазмиду, несущую, например, ДНК аденовирусного вектора.
На Фигуре 3 представлены результаты сравнения экспрессии трансгенов и ответа ИФН-у для Im02 и более раннего варианта вектора ImO 1. Значения MOI (множественности заражения) указаны в [скобках]. Указанные точки данных представляют собой среднее значение для четырех индивидуальных доноров с четырьмя повторами для каждого из них.
На Фигуре 4 представлены результаты сравнения Im02 и ImOl в модели на основе ткани мочевого пузыря. "Т"= опухолевая ткань мочевого пузыря; "В"= нормальная ткань мочевого пузыря.
На Фигуре 5 представлены результаты сравнения Im02 и ImOl при разных уровнях дозы. Доза инф.в.ч. означает дозу инфекционных вирусных частиц. "Т"= опухолевая ткань мочевого пузыря; "В"= нормальная ткань мочевого пузыря.
На Фигуре 6 представлен тепловой график, иллюстрирующий активацию разных типов иммунных клеток в совместной культуре клеток карциномы мочевого пузыря человека RT-4 с мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК) человека. В последующих строках представлены основные и активированные ("действующие") типы иммунных клеток. В качестве контролей использовали клетки RT-4 без вектора ("контроль") и клетки, трансдуцированные пустым аденовирусным вектором ("AdO"). Th = хелперные Т-клетки; Тс = цитотоксические Т-клетки (CD8+ Т-клетки); PC = плазматические клетки; NK = природные клетки-киллеры; mono = моноциты; DC = дендритные клетки; neutro = нейтрофилы.
На Фигуре 7 представлены результаты гистологического исследования после окрашивания гематоксилином и эозином образцов, стимулированных с применением Im02 или AdO, или необработанных образцов в качестве контроля. А: опухолевая ткань мочевого пузыря без культуры; В: опухолевая ткань мочевого пузыря, 108 инф.в.ч. AdO,
через 6 дней после обработки; С: опухолевая ткань мочевого пузыря, 10 инф.в.ч. Im02, через 6 дней после обработки.
На Фигуре 8 представлены результаты гистологического исследования после окрашивания гематоксилином и эозином образцов стимулированных Im02 или нестимулированных образцов. Верхняя панель: уротелиальная опухолевая ткань без культуры, нижняя панель: опухолевая ткань мочевого пузыря, стимулированная с применением 108 инф.в.ч. Im02, через 6 дней после обработки.
На Фигуре 9 представлены результаты исследования клеток-мишеней и механизмов поглощения с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Панель 1: обзор (правое изображение) и фрагмент (А): поглощение частицы без везикулы неизвестным типом клеток. Фрагмент (В), белый: везикулярное поглощение частиц клеткой, имеющей морфологию клетки Лангерганса/макрофага/дендритной клетки. Панель 2: обзор (В) и фрагмент (А): везикулярное поглощение аденовирусной частицы клеткой, имеющей морфологию клетки Лангерганса/макрофага/дендритной клетки. Панель 3: обзор (В) и фрагмент (А): поглощение аденовирусных частиц с помощью сильной везикулярной структуры клеткой, имеющей морфологию лимфоцитов. Панель 4: обзор (В) и фрагмент (А): поглощение аденовирусных частиц без везикулы клеткой, имеющей морфологию фибробластов. Панель 5: обзор (В) и фрагмент (А): большие группы аденовирусных частиц без везикулы, поглощенные неизвестным типом клеток-мишеней. Панель 6: обзор: аденовирусные частицы, не охваченные везикулами (белые стрелки), между распространенными везикулярными структурами в клетке-мишени с морфологическими признаками эпителиальной или опухолевой клетки. Фрагмент (А): изображение ранних стадий эндоцитоза аденовирусной частицы, прикрепленной к плазматической мембране. Фрагмент (В): пиноцитоз аденовирусной частицы в большой везикуле, также содержащей другие невирусные структуры.
На Фигуре 10 представлены результаты сравнения дифференциальной экспрессии в образцах нормальной ткани мочевого пузыря и опухолевой ткани мочевого пузыря. Im02 означает аденовирусный вектор, описанный в примере 2. AdO означает пустой аденовирусный вектор, использованный в качестве контроля, п = количество образцов тканей мочевого пузыря/опухоли.
На Фигуре 11 представлены результаты исследования различных трансфектантов в культуре клеток. GFP = зеленый флуоресцентный белок. CAR = рецептор Коксаки и аденовируса. MOI = множественность заражения (количество инфекционных вирусных частиц на клетку-мишень).
На Фигуре 12 представлены результаты исследования влияния сульфата протамина на экспрессию трансгенов и индукцию ИФН-у; Im02 означает аденовирусный вектор, описанный в примере 2; AdO = пустой аденовирусный вектор, использованный в качестве контроля, инф.в.ч. = инфекционные вирусные частицы. "Т"= опухолевая ткань мочевого пузыря; "В"= нормальная ткань мочевого пузыря.
На Фигуре 13 представлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность 4-1BBL человека (CD137L).
На Фигуре 14 представлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность ИЛ-2 человека.
На Фигуре 15 представлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность одноцепочечного ИЛ-12 человека (оцИЛ-12), содержащая субъединицы р40 и р35 ИЛ-12 человека, соединенные линкером. Линкерная последовательность выделена жирным шрифтом и подчеркнута в последовательностях, представленных в SEQ Ш N0: 5 и 6, соответственно.
На Фигуре 16 представлены нуклеотидные и аминокислотные последовательности субъединиц 35 кДа и 40 кДа ИЛ-12 человека.
На Фигуре 17 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ Ш N0: 11) челночного вектора hu pEl.l Im02, изображенного на Фигуре 2. Нуклеотидная последовательность содержит в общей сложности 7845 п.о. Промотор ЦМВ, 4-1BBL человека, EMCV IRES, ИЛ-2 человека, PV IRES, оцИЛ-12 человека и поли A SV40 могут быть идентифицированы в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 11, следующим образом: промотор ЦМВ: п.о. 484-1059; 4-1BBL человека: п.о. 10801844; EMCV IRES: п.о. 1885-2388; ИЛ-2 человека: п.о. 2409-2870; PV IRES: п.о. 29143545; оцИЛ-12 человека: субъединица р40 п.о. 3581-4564, линкер п.о. 4565-4609, субъединица р35 п.о. 4610-5203; и полиА SV40: п.о. 5271-5510.
На Фигуре 18 представлен схематический обзор и нуклеотидная последовательность кассеты для экспрессии, содержащей ЦМВ, 4-1BBL человека, EMCV IRES, ИЛ-2 человека, PV IRES, оцИЛ-12 человека и полиА SV40, содержащейся в челночной плазмиде hu pEl.l Im02, изображенной на Фигуре 2, и в последовательности, представленной в SEQ Ш NO: 11 (Фигура 17), соответственно.
На Фигуре 19 представлены уровни экспрессии трансгенов 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12 для Im02 и векторов, экспрессирующих отдельные гены, при различных MOI, а также ответ ИФН-у. Ось внизу, обозначенная "4-lBBL+ клетки (%)", означает клетки, которые являются положительными в отношении экспрессии 4-1BBL. Столбик с левой стороны указывает на комбинацию ИЛ-12 и ИЛ-2, каждый при [5] MOI, с различными MOI для 48
1BBL ([10], [25], [50] и [100]). Im02 означает аденовирусный вектор, описанный в примере 2. MOI = множественность заражения (т.е. количество инфекционных вирусных частиц на клетку-мишень). Результаты оценки уровней экспрессии трансгенов 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, а также ответ ИФН-у для Im02 и комбинации векторов, экспрессирующих отдельные гены, указывают на то, что экспрессия ИФН-у зависит от повышения уровней 4-1BBL.
На Фигуре 20 представлена схематическая генная карта челночной плазмиды pEl.l ImOl. кДНК трех терапевтических генов 4-1BBL человека (CD137L), ИЛ-2 человека и одноцепочечного ИЛ-12 человека расположены в трицистронной конструкции, соединены сайтами внутренней посадки рибосомы (IRES) и запускаются промотором цитомегаловируса (ЦМВ). Полиаденилирование транскрипта индуцируется сигналом, происходящим из SV40. Кассета для экспрессии для ImOl проиллюстрирована как предшественник плазмиды для переноса на основе плазмиды рЕ 1.1, подходящий для субклонирования в плазмиду, несущую, например, ДНК аденовирусного вектора.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем документе и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного также охватывают множественные формы соответствующих терминов, если из контекста явно не следует иное. В этой связи, например, ссылка на "антиген" включает множество таких антигенов, и ссылка на "клетку" или "конкретную клетку" включает ссылку на одну или более клеток и их эквивалентов (например, множество клеток), известных специалистам в данной области техники, и т. д. Аналогичным образом, ссылка на "соединение" или "композицию" включает множество таких соединений или композиций и относится к одному или более соединениям или композициям, соответственно, если из контекста явно не следует иное. Термин "приблизительно", при упоминании числа или числового диапазона, означает, что упомянутое число или числовой диапазон представляют собой аппроксимацию в пределах экспериментальной изменчивости (или в пределах статистической ошибки эксперимента), и, следовательно, число или числовой диапазон могут варьироваться от 1% до 15% от указанного числа или числового диапазона. Термин "содержащий" (и родственные ему термины, такие как "содержат" или "содержит", или "имеет", или "включая") не предназначен для исключения признака в других определенных вариантах реализации, например, вариант реализации любого химического соединения, композиции, способа или процесса или тому подобного, описанных в настоящем документе, может "состоять из" или "состоять по существу из" описанных признаков.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Несмотря на то, что способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут быть использованы при реализации раскрытых способов и композиций, в настоящем документе описаны примерные способы, устройства и материалы.
Термин "последовательности, оптимизированные по кодонам" обычно относится к нуклеотидным последовательностям, которые были оптимизированы для конкретного вида хозяина путем замены любых кодонов, частота использования которых менее чем приблизительно 20%. Нуклеотидные последовательности, которые были оптимизированы для экспрессии в конкретном виде-хозяине путем устранения нетипичных последовательностей полиаденилирования, устранения сигналов сплайсинга экзона/интрона, устранения транспозоноподобных повторов и/или оптимизации содержания GC в дополнение к оптимизации кодонов, называются в настоящем документе "последовательности с повышенной экспрессией".
В настоящем документе термин "промоторная область" используется в его обычном смысле для обозначения нуклеотидной области, содержащей регуляторную последовательность ДНК, причем указанная регуляторная последовательность происходит из гена, который способен связывать РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию последующей (в 3'-направлении) кодирующей последовательности. Регуляторная последовательность может быть гомологичной или гетерологичной по отношению к желательной последовательности гена. Например, может быть использован широкий диапазон промоторов, включая промотор вируса или промотор млекопитающих, описанные в настоящем документе. Промотор ориентирован относительно последовательности ДНК так, что он способен инициировать транскрипцию указанной последовательности ДНК.
Термин "регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты" относится в совокупности к промоторным последовательностям, сигналам полиаденилирования, последовательностям терминации транскрипции, регуляторным областям, расположенным в 5'-направлении, точкам начала репликации, энхансерам и т.п., которые в совокупности обеспечивают репликацию, транскрипцию и трансляцию кодирующей последовательности в клетке-реципиенте. Не все из указанных управляющих последовательностей всегда должны присутствовать, пока выбранная кодирующая последовательность способна реплицироваться, транскрибироваться и транслироваться в
соответствующей клетке-хозяине. Специалист в данной области техники может легко идентифицировать регуляторную последовательность нуклеиновой кислоты из общедоступных баз данных и материалов. Помимо этого специалист в данной области техники может идентифицировать регуляторную последовательность, которая применима для предполагаемого применения, например, в условиях in vivo, ex vivo или in vitro. Предпочтительно термин "регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты" относится к промотору или промоторной последовательности.
В различных вариантах реализации термин "регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты" также относится к последовательностям IRES (сайтам внутренней посадки рибосомы). Это относится, в частности, к различным предпочтительным вариантам реализации, в которых термин "регуляторные последовательности нуклеиновых кислот" включает один промотор на трицистронную кассету экспрессии/вектор экспрессии, содержащий последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, и дополнительно включает последовательность IRES для каждого цистрона, которая не локализована непосредственно после промотора. Как полагают, и как было продемонстрировано, комбинация промотора и последовательностей IRES обеспечивает улучшенный уровень экспрессии или скорость экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии или скоростью экспрессии ИЛ-2 и оцИЛ-12 в трицистронной кассете для экспрессии/векторе экспрессии, содержащем последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12 (в указанном порядке), с промотором для 4-1BBL и последовательностями IRES для ИЛ-2 и оцИЛ-12.
Выражения "функционально размещенный", "функционально соединенный", "под контролем" и "под транскрипционным контролем" означают, что промотор находится в правильном функциональном положении и/или ориентации в отношении последовательности нуклеиновой кислоты, чтобы управлять инициацией транскрипции и/или экспрессией этой последовательности. Промотор может быть использован в комбинации с "энхансером", который относится к цис-действующей регуляторной последовательности, участвующей в транскрипционной активации последовательности нуклеиновой кислоты, или может быть использован без него.
В WO 2004/035799 описан аденовирусный вектор, содержащий конструкцию для экспрессии, содержащую гены одноцепочечного ИЛ-12 (оцИЛ-12), лиганд а 4-1ВВ (4-1BBL) и ИЛ-2 мыши/человека в указанном порядке в направлении от 5'-конца к З'-концу, т. е. ген, кодирующий оцИЛ-12, находится в положении 1, ген, кодирующий 4-1BBL, находится в положении 2, и ген, кодирующий ИЛ-2, находится в положении 3. Данная
конструкция для экспрессии представлена на Фигуре 1 в WO 2004/035799, и соответствующий вектор был назван "Ad-З". В настоящем изобретении внутренним кодом вектора для упомянутого ранее вектора "Ad-З" является "Im01", см. также пример 1 настоящего изобретения.
Экспрессия трансгенов оцИЛ-12, 4-1BBL и ИЛ-2 для ImOl мыши и человека выявила, что уровень экспрессии трансгенов очевидным образом различается у видов мыши и человека, как показано в примере 1 и на Фигуре 1 настоящего изобретения. Примечательно, что экспрессия ImOl, несущего гены оцИЛ-12 человека, 4-1BBL человека и ИЛ-2 человека ("Im01 человека" или "hu Im01"), привела к заметному повышению экспрессии ИЛ-12 по сравнению с экспрессией ImOl, несущего гены оцИЛ-12 мыши, 4-1BBL мыши и ИЛ-2 мыши ("Im01 мыши" или "m Im01"). В этой связи, несмотря на одинаковую структуру вектора ImOl мыши и ImOl человека в отношении организации порядка генов оцИЛ-12, 4-1BBL и ИЛ-2, наблюдали заметные различия в уровне экспрессии транс генов. По меньшей мере некоторые из этих различий в экспрессии трансгенов между ImO l мыши и ImO l человека были совершенно неожиданными.
Вектор согласно настоящему изобретению имеет новую структуру в отношении трех генов, кодирующих оцИЛ-12, 4-1BBL и ИЛ-2. Новый вектор обеспечивает повышенную экспрессию 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2. В частности, вектор согласно настоящему изобретению содержит кассету для экспрессии, в которой три последовательности нуклеиновых кислот (или три гена), кодирующие оцИЛ-12, 4-1BBL и ИЛ-2, расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2 и 3, при условии, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в положении 1. Такая структура нового вектора обеспечивает, помимо всего прочего, повышенную экспрессию 4-1BBL по сравнению с группировкой сходных генов в ImOl человека, одновременно с уменьшением экспрессии ИЛ-12. Был обнаружен неожиданный факт, что такая структура нового вектора приводит к увеличению ответа ИФН-у (см. пример 3 и Фигуру 3, а также пример 11 и Фигуру 19 настоящего изобретения). Было доказано, что неожиданные эффекты, обеспеченные новым вектором согласно настоящему изобретению, особенно благоприятны для иммунотерапии пациентов, нуждающихся в такой терапии. В частности, было показано, что вектор согласно настоящему изобретению особенно эффективен для превращения неактивной иммунной микросреды в активную иммунную микросреду, обеспечивая тем самым лечение рака или вирусных инфекций. Соответственно, вектор согласно настоящему изобретению является особенно подходящим для применения при иммунотерапии рака. Например, на Фигурах 4 и 5 настоящего изобретения показано, что вектор согласно настоящему изобретению
проявляет улучшенный эффект при иммуностимуляции в микроокружении опухоли по сравнению с более ранним вектором ImOl, как описано в соответствующих примерах 4 и 5. Кроме того, исследование транскриптома выявило, что профиль экспрессии терапевтического гена вектора согласно настоящему изобретению является уникальным и превосходным, в частности, он превосходит профиль более раннего вектора ImOl (см. пример 6 и таблицы 1 и 2). Помимо этого, как показано на Фигуре 6, исследование экспрессии генов активации основных типов иммунных клеток выявило, что активация хелперных Т-клеток и цитотоксических Т-клеток (CD8+ Т-клеток) с помощью вектора согласно настоящему изобретению превосходит активацию аналогичных иммунных клеток с помощью более раннего вектора ImOl (см. пример 7).
Новый вектор согласно настоящему изобретению содержит три гена, кодирующих лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2, причем указанные гены расположены в направлении от 5'-конца к 3'-концу так, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в самом левом положении (5'-направлении) относительно указанных трех генов. Соответственно, новый вектор согласно настоящему изобретению содержит три гена, кодирующих лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2, причем указанные гены расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2 и 3, при условии, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в положении 1. Более конкретно вектор содержит последовательности нуклеиновых кислот генов, кодирующих 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, причем указанные гены расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2 и 3, при условии, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в положении 1. Более конкретно вектор содержит последовательности нуклеиновых кислот генов, кодирующих 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, причем указанные последовательности нуклеиновых кислот указанных генов расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2 и 3, при условии, что последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего оцИЛ-12, не находится в положении 1.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения новый вектор содержит конструкцию для экспрессии (или кассету для экспрессии), содержащую три гена (более конкретно последовательности нуклеиновых кислот трех генов), кодирующих лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2, причем указанные гены расположены в кассете для экспрессии так, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в самом левом положении (5'-направлении) относительно кассеты для экспрессии. Самое левое положение кассеты для экспрессии может быть более конкретно описано как положение на 5'-конце кассеты для экспрессии. Помимо этого самое левое
положение кассеты для экспрессии может быть более конкретно описано как положение непосредственно после промотора, регулирующего транскрипцию трех генов кассеты для экспрессии. Промотор может представлять собой промотор, который является частью кассеты для экспрессии, или промотор, который расположен в 5'-направлении относительно кассеты для экспрессии. Расположение трех трансгенов (т. е. трех генов, кодирующих 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2) в кассете для экспрессии может быть более конкретно описано так, что последовательности нуклеиновых кислот указанных трех генов расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2, и 3, при условии, что последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего оцИЛ-12, не находится в положении 1 трех генов кассеты для экспрессии.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения новый вектор согласно настоящему изобретению содержит конструкцию для экспрессии (или кассету для экспрессии), содержащую три гена, кодирующих лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2, в которой указанные гены расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2 и 3, при условии, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в положении 1. Более конкретно вектор содержит конструкцию для экспрессии (или кассету для экспрессии), содержащую последовательности нуклеиновых кислот генов, кодирующих 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, в которой указанные гены расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2 и 3, при условии, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в положении 1. Более конкретно вектор содержит конструкцию для экспрессии (или кассету для экспрессии), содержащую последовательности нуклеиновых кислот генов, кодирующих 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, в которой указанные последовательности нуклеиновых кислот указанных генов расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2 и 3, при условии, что последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего оцИЛ-12, не находится в положении 1. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения кассета для экспрессии или конструкция для экспрессии согласно настоящему изобретению содержит промотор. Промотор может быть более конкретно описан как промотор, регулирующий транскрипцию кассеты для экспрессии (или конструкции для экспрессии). Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения кассета для экспрессии содержит один промотор, который расположен в 5'-направлении (или на 5'-конце) относительно кассеты для экспрессии (или в 5'-направлении относительно 5'-конца кассеты для экспрессии).
Как описано в настоящем документе, "положение 1" формулировки, содержащей оговорку, упомянутой выше, может быть более конкретно описано как положение 1 указанного последовательного порядка 1, 2 и 3.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения расположение трех генов, кодирующих оцИЛ-12, 4-1BBL и ИЛ-2, в направлении от 5'-конца к З'-концу означает расположение трех генов, кодирующих оцИЛ-12, 4-1BBL и ИЛ-2, в направлении от 5'-конца к З'-концу относительно кассеты для экспрессии или конструкции для экспрессии согласно настоящему изобретению, содержащей три гена, кодирующих лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2. Соответственно, направление от 5'-конца к З'-концу относится к направлению от 5'-конца к З'-концу кассеты для экспрессии (или конструкции для экспрессии) или промотора кассеты для экспрессии.
Согласно различным другим вариантам реализации настоящего изобретения расположение трех генов, кодирующих оцИЛ-12, 4-1BBL и ИЛ-2, в направлении от 5'-конца к З'-концу означает расположение трех генов, кодирующих оцИЛ-12, 4-1BBL и ИЛ-2, в направлении от 5'-конца к З'-концу относительно промотора, который не является частью кассеты для экспрессии (или конструкции для экспрессии) согласно настоящему изобретению, но расположен в 5'-направлении относительно кассеты для экспрессии (или конструкции для экспрессии), т. е. в направлении 5'-конца относительно кассеты для экспрессии (или конструкции для экспрессии). В настоящем документе направление от 5'-конца к З'-концу относится к направлению от 5'-конца к З'-концу промотора, расположенного слева от 5'-конца кассеты для экспрессии (или конструкции для экспрессии). Промотор, расположенный слева от кассеты для экспрессии (или слева от 5'-конца кассеты для экспрессии), может быть более конкретно описан как промотор, регулирующий транскрипцию кассеты для экспрессии (или конструкции для экспрессии).
Помимо этого направление от 5'-конца к З'-концу может относиться к направлению от 5'-конца к З'-концу промотора, расположенного слева от конкретного гена из трех транс генов согласно настоящему изобретению (т.е. кодирующих оцИЛ-12, 4-1BBL и ИЛ-2), который находится в самом левом положении относительно указанных трех транс генов.
Вектор согласно настоящему изобретению содержит новую структуру в отношении трех генов, кодирующих оцИЛ-12, 4-1BBL и ИЛ-2, которая также может быть описана так, что указанные три гена расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2 и 3, при условии, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в положении 1, причем указанное положение 1 находится в 3'-направлении
относительно промотора, в частности, в 3'-направлении относительно промотора для экспрессии указанных трех генов. Соответственно, применительно к кассете для экспрессии (или конструкции для экспрессии) согласно настоящему изобретению, содержащей три гена, кодирующих лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2, указанные три гена расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2 и 3, при условии, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в положении 1, причем указанное положение 1 находится в 3'-направлении относительно промотора, в частности, в 3'-направлении относительно промотора для транскрипции/экспрессии указанной кассеты для экспрессии (или конструкции для экспрессии).
Как описано в настоящем документе, "расположенный слева" может быть более конкретно описано как "расположенный непосредственно слева". Помимо этого "расположенный на 5'-конце" или "расположенный слева от 5'-конца" может быть более конкретно описано как "расположенный на 5'-конце сайта инициации транскрипции" или "расположенный слева от 5'-конца сайта инициации транскрипции".
Новый вектор согласно настоящему изобретению способен экспрессировать гены (или последовательности нуклеиновых кислот генов), кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2. Соответственно, более конкретно новый вектор согласно настоящему изобретению представляет собой вектор экспрессии, еще более конкретно рекомбинантный вектор экспрессии.
Как описано в настоящем документе, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения термин "последовательности нуклеиновых кислот генов, кодирующих 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2" означает "последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2", и наоборот. Соответственно, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения термин "последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего 4-lBBL" означает "последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 4-lBBL", и наоборот. Соответственно, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения термин "последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего оцИЛ-12" означает "последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12", и наоборот, и "последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего ИЛ-2" означает "последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2", и наоборот. Аналогичным образом, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения термин "последовательности нуклеиновых кислот генов, кодирующих оцИЛ-12 и ИЛ-2" означает "последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие оцИЛ-12 и ИЛ-2", и наоборот. Как дополнительно
описано в настоящем документе, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения термин "гены, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2" означает "последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2", и наоборот. Соответственно, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения термин "ген, кодирующий 4-lBBL" означает "последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 4-lBBL", и наоборот. Аналогичным образом, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения термин "гены, кодирующие оцИЛ-12 и ИЛ-2" означает "последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие оцИЛ-12 и ИЛ-2", и наоборот.
Новый вектор согласно настоящему изобретению обеспечивает более высокую экспрессию 4-1BBL по сравнению с экспрессией оцИЛ-12 и ИЛ-2. Соответственно, настоящее изобретение также относится к векторной системе, содержащей один или более векторов, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие по меньшей мере лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2, причем указанная векторная система обеспечивает более высокую экспрессию 4-1BBL по сравнению с экспрессией оцИЛ-12 и ИЛ-2. Более высокая экспрессия 4-1BBL регулируется различной силой промоторов, регулирующих транскрипцию трех транс генов. Указанный один или более векторов представляют собой векторы экспрессии, способные экспрессировать последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2. Более конкретно векторы экспрессии представляют собой рекомбинантные векторы экспрессии. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения векторная система, содержащая один или более векторов, обеспечивает получение более высоких или повышенных уровней 4-1BBL при постоянных уровнях ИЛ-12 и ИЛ-2. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения векторную систему, содержащую один или более векторов, можно применять в медицинских условиях для того чтобы по меньшей мере 5% раковых клеток или клеток иммунной системы, трансдуцированных или трансфицированных новым вектором/векторной системой или вирусной частицей, описанными в настоящем документе, экспрессировали 4-1BBL.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к векторной системе, содержащей один или более векторов, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, причем указанная векторная система обеспечивает выработку более высоких или повышенных уровней 4-1BBL при постоянных уровнях ИЛ-12 и ИЛ-2. Это отражает результат, представленный на Фигуре 19, который свидетельствует о том, что экспрессия ИФН-у зависит от повышения
уровней 4-1BBL. Комбинации постоянных уровней ИЛ-12 и ИЛ-2, оба при MOI [5], с повышением уровней 4-1BBL при MOI вплоть до [100] приводят к увеличению активности ИФН-у при средних уровнях ИЛ-12, как показано на Фигуре 19. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения векторную систему согласно настоящему изобретению можно применять в медицинских условиях, предпочтительно при лечении рака, с повышенными уровнями 4-1BBL при постоянных уровнях ИЛ-12 и ИЛ-2. В частности, векторную систему можно применять в медицинских условиях с вектором, кодирующим 4-1BBL, при MOI [10] и вектором, кодирующим ИЛ-2 и ИЛ-12, при MOI [5]. Векторную систему также можно применять в медицинских условиях с вектором, кодирующим 4-1BBL, при MOI [10] и двумя векторами, каждый из которых кодирует ИЛ-2 и ИЛ-12, соответственно, при MOI [5]. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения векторную систему можно применять в медицинских условиях с вектором, кодирующим 4-1BBL, при MOI [25] и одним или двумя векторами, кодирующими ИЛ-2 и ИЛ-12, при MOI [5]. Согласно различным другим вариантам реализации настоящего изобретения векторную систему можно применять в медицинских условиях с вектором, кодирующим 4-1BBL, при MOI [50] и одним или двумя векторами, кодирующими ИЛ-2 и ИЛ-12, при MOI [5]. Согласно различным другим вариантам реализации настоящего изобретения векторную систему можно применять в медицинских условиях с вектором, кодирующим 4-1BBL, при MOI [100] и одним или двумя векторами, кодирующими ИЛ-2 и ИЛ-12, при MOI [5]. Предпочтительно величина MOI, применяемая для вектора, кодирующего 4-1BBL, позволяет достичь того, что по меньшей мере 5% раковых клеток или клеток иммунной системы, трансдуцированных или трансфицированных новым вектором/векторной системой или вирусной частицей, описанными в настоящем документе, экспрессируют 4-1BBL.
Медицинские условия, упомянутые выше, включают, не ограничиваются ими, лечение рака или вирусных инфекций. Предпочтительно медицинские условия означают лечение рака, более предпочтительно лечение разновидностей солидного рака или солидных опухолей.
Новая векторная система согласно настоящему изобретению способна экспрессировать гены (или последовательности нуклеиновых кислот генов), кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2. Соответственно, более конкретно новая векторная система согласно настоящему изобретению представляет собой векторную систему экспрессии, содержащую один или более векторов экспрессии, еще более конкретно рекомбинантную векторную систему экспрессии, содержащую один или более рекомбинантных векторов экспрессии. Согласно различным предпочтительным вариантам реализации тип вектора
одного или более векторов, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, является одинаковым для всех векторов векторной системы. Вектор, как правило, относится к типу, который способен переносить последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2. Соответственно, вектор относится к типу, способному включать последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2. Предпочтительно каждый из одного или более векторов, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, представляет собой любой из аденовирусного вектора, ретровирусного вектора, лентивирусного вектора, поксвирусного вектора, вектора на основе осповакцины, предпочтительно MVA, аденовирусного вектора, вектора на основе аденоассоциированного вируса, вектора на основе вируса простого герпеса, вектора на основе альфа-вируса и вектора на основе вируса кори. Более предпочтительно каждый из одного или более векторов, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, представляет собой аденовирусный вектор, ретровирусный вектор, поксвирусный вектор, вектор на основе вируса осповакцины, предпочтительно MVA, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса или вектор на основе вируса простого герпеса. Еще более предпочтительно каждый из одного или более векторов, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, представляет собой аденовирусный вектор, вектор на основе вируса простого герпеса или вектор на основе осповакцины, предпочтительно MVA.
Настоящее изобретение демонстрирует взаимосвязь между экспрессией ИФН-у и повышением уровней 4-1BBL применительно к иммуностимулирующей векторной системе, которая основана на одном или более векторах, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2. Как описано в примере 11 и показано на Фигуре 19, экспрессия трансгенов 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, а также ответ ИФН-у для Im02 и комбинаций векторов, экспрессирующих отдельные гены, указывают на то, что экспрессия ИФН-у зависит от повышения уровней 4-1BBL. Комбинации постоянных уровней ИЛ-12 и ИЛ-2, оба при MOI [5], с повышением уровней 4-1BBL при MOI вплоть до [100] приводят к увеличению индукции ИФН-у при умеренном уровне ИЛ-12, как показано на Фигуре 19. Важным результатом настоящего изобретения является то, что максимальная индукция ИФН-у и связанная с ней иммунная активация могут быть достигнуты не только с помощью специфического расположения последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, как
показано в векторе Im02, но также с помощью альтернативных вариантов реализации, которые обеспечивают повышенную или более высокую экспрессию 4-1BBL по сравнению с экспрессией оцИЛ-12 и ИЛ-2. Соответственно, настоящее изобретение относится к вектору, содержащему последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, причем указанный вектор обеспечивает выработку более высоких или повышенных уровней 4-1BBL при постоянных уровнях ИЛ-12 и ИЛ-2. Более конкретно настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, и дополнительно содержащему по меньшей мере одну регуляторную последовательность нуклеиновой кислоты, обеспечивающую повышенный или более высокий уровень экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2. Этот аспект отражает результат, который свидетельствует о том, что вектор Im02, как было показано, обеспечивает более высокий уровень экспрессии 4-1BBL по сравнению с экспрессией оцИЛ-12 и ИЛ-2, и что комбинации постоянных уровней ИЛ-12 и ИЛ-2, оба при MOI [5], с повышением уровней 4-1BBL при MOI вплоть до [100] приводят к увеличению индукции ИФН-у при умеренном уровне ИЛ-12, как обсуждалось выше.
На Фигурах 3 и 19 показано, что уровень экспрессии 4-1BBL, полученный с помощью вектора или векторной системы согласно настоящему изобретению, повышен по сравнению с уровнем экспрессии 4-1BBL, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl. Соответственно, в предпочтительном варианте реализации уровень экспрессии 4-1BBL повышен по сравнению с уровнем экспрессии 4-1BBL, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImO 1.
На Фигурах 3 и 19 также показано, что уровень экспрессии оцИЛ-12 снижен по сравнению с уровнем экспрессии оцИЛ-12, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl. Соответственно, в предпочтительном варианте реализации уровень экспрессии оцИЛ-12 снижен по сравнению с уровнем экспрессии оцИЛ-12, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImO 1.
На Фигурах 3 и 19 также показано, что уровень экспрессии ИЛ-2 повышен по сравнению с уровнем экспрессии ИЛ-2, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl. Соответственно, в предпочтительном варианте реализации уровень экспрессии ИЛ-2 повышен по сравнению с уровнем экспрессии ИЛ-2, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImO 1.
В объем настоящего изобретения включен вектор, содержащий последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, и дополнительно содержащий по меньшей мере одну регуляторную последовательность нуклеиновой
кислоты, обеспечивающую повышенный или более высокий уровень экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнем экспрессии 4-1BBL, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl. Предпочтительно уровень экспрессии оцИЛ-12 снижен по сравнению с уровнем экспрессии оцИЛ-12, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl, и/или уровень экспрессии ИЛ-2 повышен по сравнению с уровнем экспрессии ИЛ-2, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl. Более конкретно по меньшей мере одна регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты обеспечивает сниженный уровень экспрессии оцИЛ-12 по сравнению с уровнем экспрессии оцИЛ-12, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl, и/или по меньшей мере одна регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты обеспечивает повышенный уровень экспрессии ИЛ-2 по сравнению с уровнем экспрессии ИЛ-2, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl.
Конструкция для экспрессии вектора ImOl изображена в примере 1 и содержит промотор ЦМВ, два элемента IRES, оцИЛ-12, 4-1BBL, ИЛ-2 и сигнал полиА, расположенные в направлении от 5'-конца к З'-концу в следующем последовательном порядке: 5'-ЦМВ-оцИЛ-12-ПШ8-4-1ВВЬ-ЖЕ8-ИЛ-2-сигнал полиА-3'.
Более конкретно конструкция для экспрессии вектора ImOl соответствует конструкции для экспрессии вектора, обозначенного "Ad-З", представленного на Фигуре 1 в WO 2004/035799 А2. Конструкция для экспрессии вектора "Ad-З" включена в настоящий документ посредством ссылки. На Фигуре 1 в WO 2004/035799 А2 обозначение "Ad-З" означает полный вектор, несущий соответствующую конструкцию для экспрессии или кассету для экспрессии, представленную на указанной Фигуре 1. Соответственно, конструкция для экспрессии вектора "Ad-З" означает конструкцию для экспрессии, изображенную в нижней строке на Фигуре 1 в WO 2004/035799 А2. В настоящем изобретении конструкция для экспрессии вектора ImOl предпочтительно соответствует конструкции для экспрессии вектора Ad-З, представленного на Фигуре 1 в WO 2004/035799 А2, и содержащей кДНК человека из последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих оцИЛ-12, 4-1BBL и ИЛ-2. Соответственно, конструкция для экспрессии вектора ImOl, упомянутая в настоящем изобретении, содержит следующие элементы, расположенные в направлении от 5'-конца к З'-концу в следующем последовательном порядке: 5'-ЦМВ-оцИЛ-12 человека-РУ-ГОЕ8-4-1ВВЬ человека-ЕМСУ-Ш?8-ИЛ-2 человека-полиА SV-40-3'.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения ссылка на "уровни экспрессии, полученные с помощью конструкции для экспрессии вектора Im01"
означает "уровни экспрессии, полученные с помощью вектора Im01". Вектор ImOl представляет собой аденовирусный вектор. Соответственно, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения ссылка на "уровни экспрессии, полученные с помощью вектора Im01" включает аденовирусный вектор, содержащий конструкцию для экспрессии вектора "Ad-З", представленного на Фигуре 1 в WO 2004/035799 А2, с кДНК человека из последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих оцИЛ-12, 4-1BBL и ИЛ-2. Более конкретно ссылка на "уровни экспрессии, полученные с помощью вектора Im01" означает уровни экспрессии, полученные с помощью аденовирусного вектора, содержащего следующие элементы, расположенные в направлении от 5'-конца к З'-концу в следующем последовательном порядке: 5'-ЦМВ-оцИЛ-12 человека-РУ-ПШ8-4-1ВВЬ человека-ЕМСУ-ЖЕ8-ИЛ-2 человека-полиА SV-40-3'. Соответственно, согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения ссылка на "уровни экспрессии, полученные с помощью конструкции для экспрессии вектора Im01" означает "уровни экспрессии, полученные с помощью конструкции для экспрессии вектора Im01", как показано на Фигуре 20. Соответственно, со ссылкой на Фигуру 20, вектор ImOl означает челночный вектор hu pEl.l ImOl. Конструкция для экспрессии вектора ImOl, представленная на Фигуре 20, включает промотор ЦМВ, оцИЛ-12 человека, PV IRES, 4-1BBL человека, EMCV IRES, ИЛ-2 человека и полиА SV40. Нуклеотидная последовательность челночного вектора hu pEl.l ImOl, изображенная на Фигуре 20, содержит в общей сложности 7845 п.о. Нуклеотидные последовательности промотора ЦМВ, оцИЛ-12 человека, PV IRES, 4-1BBL человека, EMCV IRES, ИЛ-2 человека и полиА SV40 могут быть идентифицированы в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш NO: 11 (Фигура 17), где показана нуклеотидная последовательность челночного вектора hu pEl.l Im02, изображенного на Фигуре 2. Нуклеотидные последовательности промотора ЦМВ, оцИЛ-12 человека, PV IRES, 4-1BBL человека, EMCV IRES, ИЛ-2 человека и полиА SV40 челночного вектора hu pEl.l ImOl представляют собой соответствующие нуклеотидные последовательности промотора ЦМВ, 4-1BBL человека, EMCV IRES, ИЛ-2 человека, PV IRES, оцИЛ-12 человека и полиА SV40 челночного вектора hu pEl.l Im02.
Согласно различным предпочтительным вариантам реализации ссылка на "уровни экспрессии, полученные с помощью конструкции для экспрессии вектора Im01" означает уровни экспрессии, полученные с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl, клонированной или субклонированной в плазмиду или вектор, несущий, например, ДНК аденовирусного вектора. Более предпочтительно ссылка на "уровни экспрессии, полученные с помощью конструкции для экспрессии вектора Im01" означает уровни
экспрессии, полученные с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl, клонированной или субклонированной в аденовирусный вектор.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения тип вектора является аналогичным для вектора, содержащего последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, и вектора, содержащего конструкцию для экспрессии вектора ImOl. Вектор, как правило, относится к типу, который способен переносить последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2. Следовательно, вектор относится к типу, способному включать последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2. Предпочтительно каждый из одного или более векторов, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, представляет собой любой из аденовирусного вектора, ретровирусного вектора, лентивирусного вектора, поксвирусного вектора, вектора на основе вируса осповакцины, предпочтительно MVA, аденовирусного вектора, вектора на основе аденоассоциированного вируса, вектора на основе вируса простого герпеса, вектора на основе альфа-вируса и вектора на основе вируса кори. Более предпочтительно каждый из одного или более векторов, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, представляет собой аденовирусный вектор, ретровирусный вектор, поксвирусный вектор, вектор на основе вируса осповакцины, предпочтительно MVA, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса или вектор на основе вируса простого герпеса. Еще более предпочтительно каждый из одного или более векторов, содержащих последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, представляет собой аденовирусный вектор, вектор на основе вируса простого герпеса или вектор на основе вируса осповакцины, предпочтительно MVA.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения ссылка на "уровни экспрессии, полученные с помощью конструкции для экспрессии вектора Im01" или "уровни экспрессии, полученные с помощью вектора Im01" означает уровни экспрессии, полученные путем применения стандартной системы экспрессии в условиях in vitro, содержащей линию опухолевых клеток, предпочтительно клетки человека А549, которые будут трансдуцированы с применением вектора (т.е., вектора или векторной системы согласно настоящему изобретению, или вектора ImOl, или вектора, предпочтительно аденовирусного вектора, содержащего конструкцию для экспрессии вектора ImOl), и последующего нанесения иммунных клеток из крови человека в качестве клеток-мишеней.
Соответственно, настоящее изобретение относится к вектору, содержащему последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, и дополнительно содержащему по меньшей мере одну регуляторную последовательность нуклеиновой кислоты, обеспечивающую повышенный уровень экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2, причем уровни экспрессии определяют в системе экспрессии в условиях in vitro (или количественном способе исследования экспрессии), содержащем линию опухолевых клеток, предпочтительно линию клеток человека А549, трансдуцированных с применением вектора, предпочтительно аденовирусного вектора, содержащего конструкцию для экспрессии вектора ImOl, и иммунные клетки из крови человека, предпочтительно мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК).
В настоящем изобретении термины уровень экспрессии или уровень экспрессии трансгена и скорость экспрессии или скорость экспрессии трансгена могут быть использованы взаимозаменяемо.
Уровни экспрессии 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, обеспечиваемые вектором или векторной системой согласно настоящему изобретению, индуцируют иммунный ответ, который является специфическим в отношении трансгена, т.е., специфическим для уровней экспрессии 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, обеспечиваемых вектором или векторной системой согласно настоящему изобретению. Уровни экспрессии, обеспечиваемые вектором или векторной системой согласно настоящему изобретению, индуцируют иммунный ответ, который особенно специфичен для повышенного уровня экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2. Предпочтительно уровни экспрессии 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, обеспечиваемые вектором или векторной системой согласно настоящему изобретению, индуцируют иммунный ответ, который особенно специфичен для повышенного уровня экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2, причем уровень экспрессии 4-1BBL повышен по сравнению с уровнем экспрессии 4-1BBL, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl. Более предпочтительно уровни экспрессии 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, обеспечиваемые вектором или векторной системой согласно настоящему изобретению, индуцируют иммунный ответ, который особенно специфичен для повышенного уровня экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2, причем уровень экспрессии оцИЛ-12 снижен и/или уровень экспрессии ИЛ-2 повышен по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и/или ИЛ-2, обеспеченными с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl. Еще более предпочтительно уровни экспрессии 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, обеспечиваемые вектором или векторной системой
согласно настоящему изобретению, индуцируют иммунный ответ, который особенно специфичен для повышенного уровня экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2, причем уровень экспрессии 4-1BBL повышен по сравнению с уровнем экспрессии 4-1BBL, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl, и при этом уровень экспрессии оцИЛ-12 снижен и/или уровень экспрессии ИЛ-2 повышен по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и/или ИЛ-2, полученными с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl.
Специфический в отношении трансгена иммунный ответ предпочтительно означает специфический в отношении трансгена ответ ИФН-у или специфическую в отношении трансгена экспрессию или выработку ИФН-у. Уровни цитокинов, включая уровни ИФН-у, могут быть регулярно количественно исследованы с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения специфический в отношении трансгена иммунный ответ, индуцированный уровнями экспрессии 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, детектируют или определяют с помощью количественного исследования в условиях in vitro, предпочтительно ИФА.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, экспрессируются одним вектором с двух отдельных регуляторных последовательностей нуклеиновых кислот, причем одна регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты расположена в 5'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL, и другая регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты расположена в 5'-направлении относительно кассеты для экспрессии, содержащей последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие ИЛ-2 и оцИЛ-12. Предпочтительно указанная кассета для экспрессии содержит последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие ИЛ-2 и оцИЛ-12, расположенные в направлении от 5'-конца к З'-концу в порядке 5'-ИЛ-2-оцИЛ-12-3'. В соответствии с настоящим изобретением две регуляторные последовательности нуклеиновых кислот обеспечивают повышенный или более высокий уровень экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2 и/или обеспечивают повышенный или более высокий уровень экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнем экспрессии 4-1BBL, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl. Предпочтительно две регуляторные последовательности нуклеиновых кислот также или дополнительно обеспечивают сниженный уровень экспрессии оцИЛ-12 по сравнению с уровнем экспрессии оцИЛ-12, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl, и/или повышенный
уровень экспрессии ИЛ-2 по сравнению с уровнем экспрессии ИЛ-2, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl. Предпочтительно регуляторные последовательности нуклеиновых кислот представляют собой промоторные последовательности.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, экспрессируются одним вектором с трех отдельных регуляторных последовательностей нуклеиновых кислот, причем одна регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты расположена в 5'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL, одна регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты расположена в 5'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ИЛ-2, и одна регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты расположена в 5'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей оцИЛ-12. В соответствии с настоящим изобретением три регуляторные последовательности нуклеиновых кислот обеспечивают повышенный или более высокий уровень экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2 и/или обеспечивают повышенный или более высокий уровень экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнем экспрессии 4-1BBL, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl. Предпочтительно три регуляторные последовательности нуклеиновых кислот также или дополнительно обеспечивают сниженный уровень экспрессии оцИЛ-12 по сравнению с уровнем экспрессии оцИЛ-12, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl, и/или повышенный уровень экспрессии ИЛ-2 по сравнению с уровнем экспрессии ИЛ-2, полученным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl. Предпочтительно регуляторные последовательности нуклеиновых кислот представляют собой промоторные последовательности.
Как описано в настоящем документе, регуляторная (ые) последовательность (и) нуклеиновой кислоты предпочтительно означает промотор (ы) (последовательность (и)) или более конкретно последовательность (и) промотора (ов) экспрессии). Сильные промоторы, которые можно применять для получения предполагаемого повышенного или более высокого уровня экспрессии 4-1BBL, включают, не ограничиваются ими, любой из: промотора цитомегаловируса (ЦМВ), промотора фактора удлинения альфа 1 (EF1A), промотора вируса саркомы Рауса (RSV), промотора вируса обезьян 40 (SV40). Промотор ЦМВ является особенно предпочтительным промотором. Упомянутые промоторы могут быть использованы в различных вариантах реализации настоящего изобретения и
представляют собой предпочтительные промоторы, которые могут обеспечить повышенный уровень экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2. Это относится, в частности, к вариантам реализации, в которых три последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, расположены в трицистронной кассете в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2, 3, при этом указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая 4-1BBL, расположена в 5'-направлении относительно последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих ИЛ-2 и оцИЛ-12, предпочтительно указанные три последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в следующем порядке: 5'-4-1ВВЬ-ИЛ-2-оцИЛ-12-3'.
Промоторы, которые можно применять для получения предполагаемой экспрессии ИЛ-2 и/или ИЛ-12, включают, не ограничиваясь ими, промотор фосфоглицераткиназы (PGK) и убиквитина С (UBC). Указанные промоторы могут быть использованы в различных вариантах реализации настоящего изобретения и представляют собой предпочтительные промоторы, которые могут обеспечить предполагаемый уровень экспрессии ИЛ-2 и ИЛ-12. В частности, упомянутые промоторы можно применять в вариантах реализации, в которых последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, экспрессируются одним вектором с двух отдельных регуляторных последовательностей нуклеиновых кислот, причем одна регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты расположена в 5'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL, и другая регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты расположена в 5'-направлении относительно кассеты для экспрессии, содержащей последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие ИЛ-2 и оцИЛ-12. Упомянутые промоторы также можно применять в вариантах реализации, в которых последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, экспрессируются одним вектором с трех отдельных регуляторных последовательностей нуклеиновых кислот, причем одна регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты расположена в 5'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL, одна регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты расположена в 5'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ИЛ-2, и одна регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты расположена в 5'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей оцИЛ-12.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты вектора, содержащего последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, обеспечивает аналогичный уровень экспрессии или соотношение уровней экспрессии 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, которое получают при применении вектора Im02.
Один или более векторов из нового вектора/векторной системы согласно настоящему изобретению может представлять собой любой из аденовирусного вектора, вектора на основе аденоассоциированного вируса, лентивирусного вектора, ретровирусного вектора, вектора на основе вируса простого герпеса, поксвирусного вектора, РНК-вектора, плазмидного вектора, вектора на основе наночастиц, а также депротеинизированной ДНК (naked DNA) или их комбинации.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения один или более векторов из нового вектора/векторной системы представляют собой вирусные векторы. Вирусные векторы могут быть живыми, ослабленными, условно компетентными по репликации или дефицитными по репликации, а также могут представлять собой не патогенный (дефектный), компетентный по репликации вирусный вектор.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения один или более векторов из нового вектора/векторной системы согласно настоящему изобретению выбраны из генома ретровирусного вектора, генома лентивирусного вектора, генома поксвирусного вектора, генома вектора на основе вируса осповакцины, генома аденовирусного вектора, генома вектора на основе аденоассоциированного вируса, генома вируса простого герпеса, генома вектора на основе альфа-вируса, плазмидной ДНК и РНК.
Желательным является включение защитных признаков вирусного вектора, например, неспособности к интеграции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения неспособность к интеграции можно придать с помощью элементов векторного генома, но также она может быть обусловлена элементами упаковывающей системы (например, нефункциональный белок интегразы, который может не являться частью векторного генома, а поставляется в виде транс-действующего элемента).
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения один или более векторов из нового вектора/векторной системы согласно настоящему изобретению представляют собой репликативные векторы. Предпочтительно репликативные векторы представляют собой реплицирующиеся вирусные векторы, более предпочтительно реплицирующиеся аденовирусные векторы. Согласно различным другим вариантам реализации настоящего изобретения один или более векторов из нового
вектора/векторной системы согласно настоящему изобретению представляют собой нерепликативные векторы, предпочтительно не компетентные по репликации вирусные векторы, более предпочтительно не компетентные по репликации аденовирусные векторы.
Если один или более векторов из нового вектора/векторной системы согласно настоящему изобретению представляют собой РНК-векторы, то они могут содержать вставленные модифицированные рибонуклеотиды.
Примерные вирусные векторы согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, поксвирусные векторы, векторы на основе вируса осповакцины, аденовирусные векторы, векторы на основе аденоассоциированного вируса, векторы на основе вируса простого герпеса и векторы на основе альфа-вируса. Предпочтительно вирусный вектор представляет собой аденовирусный вектор.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аденовирусный вектор или вектор на основе аденоассоциированного вируса можно применять для экспрессии трех генов лиганда 4-1ВВ (4-1BBL), одноцепочечного ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2. Было описано несколько аденовирусных векторных систем и способов введения векторов (см., например, Mercier et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101:6188-93).
Ретровирусные векторы могут включать векторы на основе вируса лейкоза мышей (MuLV), вируса лейкоза гиббона (GaLV), экотропных ретровирусов, вируса иммунодефицита обезьян (SIV), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и их комбинаций.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения один или более векторов из нового вектора/векторной системы согласно настоящему изобретению представляют собой ретровирусный вектор, предпочтительно лентивирусный вектор. Подходящие основанные на геноме лентивирусные векторы для генной терапии человека включают векторы на основе вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), ВИЧ-2, вируса иммунодефицита кошек (FIV), вируса инфекционной анемии лошадей, вируса везикулярного стоматита (VSV) и вируса иммунодефицита обезьян (SIV).
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой плазмидную ДНК или космидную ДНК. Плазмидная ДНК или космидная ДНК, содержащая один или более полинуклеотидов, кодирующих по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, описанных в настоящем документе, может быть легко сконструирована с использованием стандартных методик, хорошо известных в данной области техники. Вектор, как правило, может быть сконструирован в форме плазмиды,
которая затем может быть трансфецирована в упаковывающую или продуцирующую клеточную линию. Плазмида обычно содержит последовательности, пригодные для репликации плазмиды в бактериях. Такие плазмиды хорошо известны в данной области техники. Помимо этого векторы, которые включают точку начала репликации прокариот, также могут содержать ген, экспрессия которого обеспечивает детектируемый или селективный маркер, такой как устойчивость к лекарственным препаратам.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложены рекомбинантные векторы экспрессии, содержащие полинуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, которые индуцируют иммунный ответ при инфекционном заболевании или раке. Для управления экспрессией 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2 кодирующие полинуклеотидные последовательности в каждом векторе должны содержать по меньшей мере одну подходящую последовательность для управления экспрессией (также называемую последовательностью или элементом, регулирующим экспрессию), которая функционально соединена с кодирующей полинуклеотидной последовательностью (последовательностями). Элементы для управления экспрессией, которые можно применять для регулирования экспрессии кодируемых полипептидов, известны в данной области техники и включают, но не ограничиваются ими, индуцируемые промоторы, конститутивные промоторы, сигналы секреции, энхансеры, лидерные последовательности и другие регуляторные последовательности.
Как описано в настоящем документе, вектор экспрессии может содержать по меньшей мере одну регулирующую экспрессию последовательность (последовательность для управления экспрессией). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, если вектор экспрессии содержит геном вирусного вектора, экспрессия 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2 является желательной в конкретных клетках-мишенях. Как правило, например, в вирусном векторе полинуклеотидная последовательность, кодирующая 4-1BBL, оцИЛ-12 и/или ИЛ-2, расположена между последовательностями 5'-LTR и З'-LTR. Помимо этого кодирующая (ие) нуклеотидная (ые) последовательность (и) предпочтительно функционально соединена (ы) с другими генетическими или регуляторными последовательностями или элементами с получением функциональной взаимосвязи, например, с регуляторными последовательностями транскрипции, включая промоторы или энхансеры, которые регулируют экспрессию генов, кодирующих 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, конкретным способом. В отношении конструкций вирусных векторов "внутренний" промотор/энхансер представляет собой тот, который расположен между последовательностями 5'-LTR и З'-LTR в вирусном векторе и функционально соединен с
кодирующей полинуклеотидной последовательностью, представляющей интерес. Внутренний промотор/энхансер может представлять собой любую комбинацию промотора, энхансера или промотора/энхансера, которая, как известно, повышает экспрессию гена, с которым она находится в функциональной взаимосвязи. "Функциональная взаимосвязь" и "функционально соединенный" означают, но не ограничиваются этим, что последовательность находится в правильном положении и ориентации относительно промотора и/или энхансера так, что представляющая интерес последовательность будет экспрессирована при контакте промотора и/или энхансера с соответствующими молекулами. В некоторых случаях пригодные регуляторные последовательности транскрипции представляют собой те, активность которых строго регулируется, как по времени, так и пространственно. Выбор внутреннего промотора/энхансера основан на желательном профиле экспрессии трех генов 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2 и специфических свойствах известных промоторов/энхансеров. Соответственно, внутренний промотор может быть конститутивно активным. Неограничивающие примеры конститутивных промоторов, которые можно применять, включают промотор ЦМВ. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения новый вектор/векторная система содержит внутренний промотор/энхансер, который обеспечивает более высокую экспрессию 4-1BBL по сравнению с оцИЛ-12 и ИЛ-2. Многие энхансеры в вирусных геномах и в геномах млекопитающих были идентифицированы и охарактеризованы (см., например, общедоступные базы данных, такие как GenBank).
Энхансеры, как правило, представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно длиной от 10 до 300 п.о., которые действуют на промотор, чтобы увеличить его транскрипцию. Многие энхансерные последовательности из генов млекопитающих и вирусов эукариотических клеток известны в настоящее время. Примеры включают энхансер SV40 на участке позднего начала репликации (п.о. 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на участке позднего начала репликации и энхансеры аденовирусов. Энхансер может быть сплайсирован в вектор в положении 5'-конца или 3'-конца в полинуклеотидную последовательность, кодирующую ген (ы), представляющий (ие) интерес, но предпочтительно расположен на участке в 5'-направлении относительно промотора. Энхансер можно применять в комбинации с гетерологичным промотором. Специалист в данной области техники может выбрать подходящий энхансер на основании желательного профиля экспрессии 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения промотор может быть тканеспецифическим промотором. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения промотор является промотором, специфичным для клетки-мишени. Помимо этого могут быть выбраны промоторы, обеспечивающие индуцируемую экспрессию 4-1BBL, оцИЛ-12 и/или ИЛ-2. Ряд систем для индуцируемой экспрессии известен в данной области техники, включая систему, чувствительную к тетрациклину, систему лактозного оператора-репрессора, а также промоторы, чувствительные к ряду внешних или физиологических изменений, включая тепловой шок, ионы металлов, интерфероны, гипоксию, стероиды и радиацию. Комбинацию промоторов также можно применять для получения желательной экспрессии каждого из трех генов, кодирующих 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2. Специалист в данной области техники сможет выбрать промотор на основании желательного профиля экспрессии полинуклеотидной последовательности (ей) в организме или ткани-мишени, или клетке-мишени, представляющей интерес.
Как описано в настоящем документе, вектор экспрессии, содержащий геном вирусного вектора, может содержать по меньшей мере один промотор, чувствительный к РНК-полимеразе II или III. Такой промотор может быть функционально соединен с полинуклеотидной последовательностью (последовательностями), кодирующей (ими) по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и/или ИЛ-2, и также может быть соединен с последовательностью терминации. Помимо этого может быть встроено более одного промотора РНК-полимеразы II или III. Промоторы РНК-полимеразы II и III хорошо известны специалисту в данной области техники.
При нацеливании доставки рекомбинантного вектора экспрессии, включая геном вирусного вектора, к конкретной клетке-мишени или ткани-мишени для индукции опосредуемого клетками иммунного ответа, векторный геном обычно будет содержать промотор, который распознается клеткой-мишенью или тканью-мишенью, и который функционально соединен с последовательностью (последовательностями), представляющей (ими) интерес, вирусными компонентами (если вектор представляет собой вирусный вектор) и другими последовательностями, обсуждаемыми в настоящем документе.
Промоторы могут быть индуцируемыми, конститутивными, временно активными или специфичными для тканей. Индуцируемые промоторы являются полезными инструментами в области генной инженерии, поскольку экспрессия генов, с которыми они функционально соединены, может быть включена или выключена, например, в конкретной ткани. Индуцируемые промоторы могут быть сгруппированы как
регулируемые химическими сигналами промоторы и регулируемые физическими сигналами промоторы. Типичные регулируемые химическими сигналами промоторы включают, но не ограничиваются ими, регулируемый стероидами промотор (например, промотор на основе рецептора глюкокортикоидов крысы (GR), промотор на основе рецептора эстрогенов человека (ER)), регулируемые металлом промоторы (например, промоторы на основе гена металлотионеина) и промоторы, связанные с патогенезом (например, промоторы на основе белка, связанного с патогеном Arabidopsis и маиса (PR)). Типичные регулируемые физическими сигналами промоторы включают, но не ограничиваются ими, терморегулируемые промоторы (например, промоторы теплового шока) и регулируемые светом промоторы (например, промотор SSU сои). Другие примерные промоторы хорошо известны специалисту в данной области техники.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения можно применять немедленный ранний промотор гена цитомегаловируса человека (ЦМВ), ранний промотор SV40 и длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса. В область настоящего изобретения также включено применение других вирусных промоторов, промоторов клеток млекопитающих или промоторов бактериофагов, которые хорошо известны в данной области техники, для достижения экспрессии полинуклеотидов. Специалист в данной области техники сможет выбрать подходящий промотор на основании конкретных обстоятельств. В данной области техники описано много различных промоторов, а также способы функционального соединения промотора с полинуклеотидной последовательностью, которая должна быть экспрессирована. Нативные промоторные последовательности, а также многие гетерологичные промоторы можно применять для непосредственной экспрессии в упаковывающей клетке и клетке-мишени или ткани-мишени. Гетерологичные промоторы, как правило, применяют, поскольку они обычно обеспечивают более эффективную транскрипцию и более высокие выходы желательного белка по сравнению с нативным промотором. Промотор может быть получен, например, из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус свиного гриппа, аденовирус, вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и вирус обезьян 40 (SV40). Промотор также может представлять собой, например, гетерологичный промотор млекопитающих, например, промотор актина или промотор иммуноглобулина, промотор теплового шока или промотор, обычно связанный с нативной последовательностью, при условии, что такие промоторы совместимы с клеткой-мишенью или тканью-мишенью. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения промотор представляет собой природный вирусный промотор в вирусной системе экспрессии. Согласно некоторым
вариантам реализации настоящего изобретения промотор представляет собой промотор, специфичный для опухолевых клеток.
Векторы экспрессии также могут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности часто обнаруживаются в 5'-концевых и иногда 3'-концевых нетранслируемых областях эукариотических или вирусных ДНК или кДНК и хорошо известны в данной области техники.
Новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению может дополнительно кодировать один или более иммуногенов, которые включают, но не ограничиваются ими, иммуногены из онкогенного вируса (например, ВЭБ, ВПЧ, ВГВ, ВГС, HTLV и KSHV) и связанные с опухолью антигены. Предпочтительно связанный с опухолью антиген представляет собой связанный с опухолью антиген из рака мочевого пузыря, рака печени, карциномы клеток Меркеля, карциномы почек, рака предстательной железы, мезотелиомы, рака поджелудочной железы, меланомы, рака молочной железы, рака толстой кишки, рака легких, рака яичников. Более предпочтительно связанный с опухолью антиген получен из рака мочевого пузыря. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения связанный с опухолью антиген представляет собой любой из р53, Ras, с-Мус, A-Raf, B-Raf, C-Raf, NY-ESO-1, LAGE-1, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, CT7, CT10, GAGE, ГМРЗ, BK Т-антигена, MART-1, DAM-6, NA88-A, GplOO, PSA, PSM, тирозиназы, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, MUC1, MUC2, рецепторов TRK, PRAME, P15, SART-1, SART-2, SART-3, антигена опухоли Вильмса (WT1), AFP, CEA, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, RAGE, 707-AP, BCR-ABL, регуляторного фактора интерферона 4 (IRF4), связанного с опухолью трансдуктора кальциевого сигнала 1 (TACSTD1), TACSTD2, рецепторных тирозинкиназ, рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), рецептора фактора роста тромбоцитов (PDGFR), рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), цитоплазматических тирозинкиназ, src-семейства, ядерного фактора каппа В (NF-кВ), рецепторов Notch, c-Met, регулируемых внеклеточными сигналами киназ (ERK), PMSA, PR-3, MDM2, мезотелина, карциномы почек 5Т4, 8М22-альфа, STEAD, hTERT, точечных разрывов при транслокации при саркоме, ЕрСАМ, NA17, РАХЗ, ALK, рецептора андрогенов, циклина Bl, MYCN, BORIS, белка сперматозоидов 17, SSX2, В7НЗ, TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2 и сходного с fos антигена 1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ, в котором связанный с опухолью антиген выбран из антигена рака мочевого пузыря. Согласно одному варианту реализации настоящего
изобретения антиген рака мочевого пузыря представляет собой любой из СТА, NY-ESO-1, LAGE-1, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10, СТ7, СТ10, GAGE, PRAME; BAGE; RAGE, SAGE, HAGE, MPHOSPH1, DEPDCI, ГМРЗ и MAGE-А, а также BK T-антигена.
В случае если вектор экспрессии представляет собой геном вирусного вектора, геном вирусного вектора, как правило, может быть сконструирован в форме плазмиды, которая может быть трансфицирована в упаковывающую или продуцирующую клеточную линию для выработки конструкции генома вирусного вектора. Плазмида обычно содержит последовательности, пригодные для репликации плазмиды в бактериях. Такие плазмиды хорошо известны в данной области техники. Помимо этого векторы, которые содержат точку начала репликации прокариот, также могут содержать ген, экспрессия которого обеспечивает детектируемый или селективный маркер, такой как устойчивость к лекарственным препаратам.
Специалисты в данной области техники поймут, что модификация кодирующей последовательности для усиления ее экспрессии у конкретного хозяина может быть предпочтительной. Генетический код является избыточными благодаря 64 возможным кодонам, однако большинство организмов предпочтительно используют подгруппу этих кодонов. Кодоны, которые чаще всего используются у вида, называются оптимальными кодонами, а те, которые не используются очень часто, классифицируются как редкие или малоиспользуемые кодоны. Кодоны могут быть заменены, чтобы моделировать предпочтительное использование кодонов у хозяина, этот процесс иногда называют "оптимизация кодонов" или "контроль видового отклоняющего влияния на кодоны". Оптимизированные кодирующие последовательности, содержащие кодоны, предпочтительные для конкретного прокариотического или эукариотического хозяина, могут быть получены, например, для увеличения скорости трансляции или для получения транскриптов рекомбинантных РНК, имеющих желательные свойства, такие как более длительный период полужизни, по сравнению с транскриптами, полученными из неоптимизированной последовательности. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность (и) нуклеиновой кислоты, кодирующая (ие) по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и/или ИЛ-2, оптимизирована по кодонам для экспрессии у человека. Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 4-1BBL, представляет собой кДНК человека (ген человека 4-1BBL), последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, представляет собой кДНК человека (ген
оцИЛ-12 человека) и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2, представляет собой кДНК человека (ген ИЛ-2 человека).
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность (и) нуклеиновой кислоты нового вектора/векторной системы согласно настоящему изобретению представляет (ют) собой последовательности кДНК. Последовательности нуклеиновых кислот генов 4-1BBL, оцИЛ-12 и/или ИЛ-2, содержащиеся в новом векторе/векторной системе согласно настоящему изобретению, можно рассматривать как гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот. Термины последовательность (и) нуклеиновой кислоты и полинуклеотид (ы) могут быть использованы в настоящем документе взаимозаменяемо. Как описано в настоящем документе, термин "последовательность нуклеиновой кислоты" может включать как одноцепочечные, так и двухцепочечные последовательности нуклеиновых кислот. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность ДНК.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой ДНК-вектор. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения вектор представляет собой РНК-вектор. Новый вектор согласно настоящему изобретению может быть более конкретно описан как кольцевой вектор, еще более конкретно как кольцевой вектор экспрессии. Как описано в настоящем документе, термин "вектор" может включать как одноцепочечные, так и двухцепочечные векторы, включая, но не ограничиваясь ими, одноцепочечные и двухцепочечные ДНК-векторы.
Как описано в настоящем документе, последовательности нуклеиновых кислот генов, кодирующих 4-1BBL, включают последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие варианты 4-1BBL, в частности варианты 4-1BBL, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 2 (Фигура 13). Такие варианты последовательностей более подробно описаны в настоящем документе ниже. Аналогичным образом, последовательности нуклеиновых кислот генов, кодирующих ИЛ-2, включают последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие варианты ИЛ-2, в частности варианты ИЛ-2, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 4 (Фигура 14). Такие варианты последовательностей более подробно описаны в настоящем документе ниже. Также последовательности нуклеиновых кислот генов, кодирующих оцИЛ-12, включают последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие варианты оцИЛ-12, в частности варианты оцИЛ-12, содержащие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ IDNO: 6 (Фигура 15). Такие варианты последовательностей более подробно описаны в настоящем документе ниже.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения (i) последовательность нуклеиновой кислоты (гена), кодирующая 4-1BBL, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ Ш NO: 1, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты оптимизирована по кодонам для экспрессии у человека, (ii) последовательность нуклеиновой кислоты (гена), кодирующая ИЛ-2, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ Ш N0: 3, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты оптимизирована по кодонам для экспрессии у человека, и/или (ш) последовательность нуклеиновой кислоты (гена), кодирующая оцИЛ-12, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ Ш N0: 5, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты оптимизирована по кодонам для экспрессии у человека.
4-1ВВ является членом семейства рецепторов фактора некроза опухолей (ФИО). CD 137 обозначает 4-1ВВ в соответствии с номенклатурой CD. В настоящем изобретении термины CD 137 и 4-1ВВ могут быть использованы взаимозаменяемо. Соответственно, в настоящем изобретении термины лиганд 4-1ВВ (4-1BBL) и лиганд CD 137 также могут быть использованы взаимозаменяемо. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 4-1BBL (или лиганд CD 13 7), по меньшей мере на 70% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш NO: 1 (Фигура 13), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок 4-1BBL, способный специфически связывать активированные Т-клетки, предпочтительно CD4+ хелперные клетки и CD8+ Т-клетки. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 4-1BBL, по меньшей мере на 80% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш NO: 1 (Фигура 13), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок 4-1BBL, способный специфически связывать активированные Т-клетки, предпочтительно CD4+ хелперные клетки и CD8+ Т-клетки. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 4-1BBL, по меньшей мере на 90% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш NO: 1 (Фигура 13), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок 4-1BBL, способный специфически связывать активированные Т-клетки, предпочтительно CD4+ хелперные клетки и CD8+ Т-клетки. Еще более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 4-1BBL, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш NO: 1 (Фигура 13), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой
кислоты кодирует белок 4-1BBL, способный специфически связывать активированные Т-клетки, предпочтительно CD4+ хелперные клетки и CD8+ Т-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты 4-1BBL, описанные выше, проявляют аналогичную специфичность связывания в отношении Т-клеток, предпочтительно CD4+ хелперных клеток и CD8+ Т-клеток, как и нативный 4-1BBL, кодируемый последовательностью, представленной в SEQ Ш NO: 1 (Фигура 13). Согласно особенно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 4-1BBL, содержит (или состоит из нее) последовательность, представленную в SEQ Ш NO: 1 (Фигура 13). Согласно различным предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения вариант последовательности нуклеиновой кислоты 4-1BBL человека, описанный в настоящем документе, не является нуклеотидной последовательностью, кодирующей 4-1BBL мыши. Соответственно, в различных предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению не содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую 4-1BBL мышиного происхождения.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2, по меньшей мере на 70% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 3 (Фигура 14), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок ИЛ-2, обладающий иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2, по меньшей мере на 80% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 3 (Фигура 14), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок ИЛ-2, обладающий иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2, по меньшей мере на 90% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 3 (Фигура 14), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок ИЛ-2, обладающий иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Еще более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична или
идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 3 (Фигура 14), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок ИЛ-2, обладающий иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты ИЛ-2, описанные выше, проявляют аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и нативный ИЛ-2, кодируемый последовательностью, представленной в SEQ Ш N0: 3 (Фигура 14). Согласно особенно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2, содержит (или состоит из нее) последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 3 (Фигура 14). Согласно различным предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения вариант последовательности нуклеиновой кислоты ИЛ-2 человека, описанный в настоящем документе, не является нуклеотидной последовательностью, кодирующей ИЛ-2 мыши. Соответственно, согласно различным предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению не содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ИЛ-2 мышиного происхождения.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, по меньшей мере на 70% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 5 (Фигура 15), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок оцИЛ-12, обладающий иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, по меньшей мере на 80% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 5 (Фигура 15), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок оцИЛ-12, обладающий иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, по меньшей мере на 90% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 5 (Фигура 15), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок оцИЛ-12, обладающий иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+
Т-клеток. Еще более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 5 (Фигура 15), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок оцИЛ-12, обладающий иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Как описано в настоящем документе, белок считается белком оцИЛ-12, если он содержит аминокислотную последовательность, содержащую две субъединицы нативного белка ИЛ-12 в виде гибридного белка. Последовательность, представленная в SEQ Ш N0: 5 (Фигура 15), представляет собой последовательность гена, кодирующего субъединицы 40 кДа и 35 кДа ИЛ-12 человека, соединенные линкером. В нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 5, изображенной на Фигуре 15, линкерная последовательность выделена жирным шрифтом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты оцИЛ-12, описанные выше, обладают аналогичной иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и нативный оцИЛ-12, кодируемый последовательностью, представленной в SEQ Ш N0: 5 (Фигура 15). Согласно особенно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, содержит (или состоит из нее) последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 5 (Фигура 15). Согласно различным предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения вариант последовательности нуклеиновой кислоты оцИЛ-12 человека, описанный в настоящем документе, не является нуклеотидной последовательностью, кодирующей оцИЛ-12 мыши. Соответственно, в различных предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению не содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую оцИЛ-12 мышиного происхождения.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты (ген) 4-1BBL кодирует полипептид 4-1BBL, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 2 (Фигура 13), причем указанный полипептид 4-1BBL способен специфически связывать активированные Т-клетки, предпочтительно активированные CD4+ хелперные Т-клетки и CD8+ Т-клетки. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты (ген) 4-1BBL кодирует полипептид 4-1BBL, содержащий аминокислотную
последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 2 (Фигура 13), причем указанный полипептид 4-1BBL способен специфически связывать Т-клетки, предпочтительно активированные CD4+ хелперные Т-клетки и CD8+ Т-клетки. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты (ген) 4-1BBL кодирует полипептид 4-1BBL, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 2 (Фигура 13), причем указанный полипептид 4-1BBL способен специфически связывать активированные Т-клетки, предпочтительно CD8+ Т-клетки. Еще более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты (ген) 4-1BBL кодирует полипептид 4-1BBL, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 2 (Фигура 13), причем указанный полипептид 4-1BBL способен специфически связывать активированные Т-клетки, предпочтительно активированные CD4+ хелперные Т-клетки и CD8+ Т-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты нуклеотидных последовательностей (ген) 4-1BBL, описанные выше, кодируют полипептиды 4-1BBL, которые проявляют аналогичную специфичность связывания в отношении Т-клеток, предпочтительно в отношении CD8+ Т-клеток, как и нативный 4-1BBL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 2 (Фигура 13). Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты (ген) 4-1BBL кодирует полипептид, содержащий (или состоящий из нее) аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 2 (Фигура 13).
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты (ген) ИЛ-2 кодирует полипептид ИЛ-2, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 4 (Фигура 14), причем указанный полипептид ИЛ-2 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты (ген) ИЛ-2 кодирует полипептид ИЛ-2, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4 (Фигура 14), причем указанный полипептид ИЛ-2 обладает иммуностимулирующей активностью,
предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты (ген) ИЛ-2 кодирует полипептид ИЛ-2, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 4 (Фигура 14), причем указанный полипептид ИЛ-2 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Еще более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты (ген) ИЛ-2 кодирует полипептид ИЛ-2, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 4 (Фигура 14), причем указанный полипептид ИЛ-2 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты нуклеотидных последовательностей ИЛ-2, описанные выше, кодируют полипептиды ИЛ-2, которые проявляют аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и нативный ИЛ-2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 4 (Фигура 14). Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты (ген) ИЛ-2 кодирует полипептид, содержащий (или состоящий из нее) аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 4 (Фигура 14).
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты (ген) оцИЛ-12 кодирует полипептид оцИЛ-12, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 6 (Фигура 15), причем указанный полипептид оцИЛ-12 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении моноцитов, хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты (ген) оцИЛ-12 кодирует полипептид оцИЛ-12, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 6 (Фигура 15), причем указанный полипептид оцИЛ-12 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении моноцитов, хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Более предпочтительно
последовательность нуклеиновой кислоты (ген) оцИЛ-12 кодирует полипептид оцИЛ-12, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 6 (Фигура 15), причем указанный полипептид оцИЛ-12 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении моноцитов, хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Еще более предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты (ген) оцИЛ-12 кодирует полипептид оцИЛ-12, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 6 (Фигура 15), причем указанный полипептид оцИЛ-12 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении моноцитов, хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты нуклеотидных последовательностей оцИЛ-12, описанные выше, кодируют полипептиды оцИЛ-12, которые проявляют аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и нативный оцИЛ-12, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 6 (Фигура 15). Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты (ген) оцИЛ-12 кодирует полипептид, содержащий (или состоящий из нее) аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 6 (Фигура 15).
Как описано в настоящем документе, можно применять один или более поли- или мультицистронных блоков для экспрессии, которые содержат две или три полинуклеотидные последовательности, кодирующие два или все три белка, т.е., две полинуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует по меньшей мере (i) 4-1BBL или оцИЛ-12, или (ii) 4-1BBL или ИЛ-2, или (ш) оцИЛ-12 или ИЛ-2; или три полинуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 или 4-1BBL, соответственно. Использование мультицистронных векторов (или блоков для экспрессии) уменьшает общее количество молекул нуклеиновых кислот и, следовательно, может избежать возможных трудностей, связанных с координированием экспрессии из нескольких векторных геномов. В мультицистронном векторе различные элементы, которые должны быть экспрессированы, могут быть функционально соединены с одним или более промоторами (и при необходимости с другими элементами для управления экспрессией).
При использовании нескольких промоторов может наблюдаться взаимное ингибирование промоторов. Особенно высокие скорости экспрессии могут быть достигнуты при использовании векторов, которые являются по меньшей мере трицистронными и которые дополнительно характеризуются тем, что они содержат только один промотор на каждую кассету для экспрессии и помимо этого содержат последовательность IRES для каждого цистрона, которая не локализована непосредственно справа от промотора. Считается, что комбинация промоторов и последовательностей IRES (сайтов внутренней посадки рибосомы) обеспечивает улучшенную экспрессию белка. Применение различных последовательностей IRES может обеспечить дополнительное преимущество, которое заключается в том, что частота рекомбинации между этими последовательностями может быть сведена к минимуму. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения IRES получен из EMCV (вируса энцефаломиокардита). Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения IRES получен из PV (полиовируса). Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения новый вектор/векторная система содержит два IRES между тремя транс генами 4-1BBL (CD137L), ИЛ-2 и одноцепочечным ИЛ-12, причем один IRES может представлять собой IRES EMCV и другой IRES может представлять собой PV IRES. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения новый вектор/векторная система содержит два IRES между тремя транс генами 4-1BBL (CD137L), ИЛ-2 и одноцепочечным ИЛ-12, причем оба IRES могут представлять собой IRES EMCV, или оба IRES могут представлять собой PV IRES. При использовании тетрацистронных векторов может быть полезно разделить их на разные кассеты экспрессии. В этом случае предпочтительно один промотор присутствует в одной кассете экспрессии. Разделение на две кассеты экспрессии, которые предпочтительно расположены на максимально возможном расстоянии друг от друга, обеспечивает пространственное разделение промоторов, уменьшая тем самым взаимное ингибирование.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению содержит три гена 4-1BBL (CD137L), ИЛ-2 и одноцепочечный ИЛ-12, расположенных в указанном порядке (т.е., в направлении от 5'-конца к З'-концу, при этом ген, кодирующий ИЛ-2, расположен в 3'-направлении относительно гена, кодирующего 4-1BBL, и ген, кодирующий оцИЛ-12, расположен в 3'-направлении относительно гена, кодирующего ИЛ-2) в трицистронной конструкции, соединенной с помощью сайтов внутренней посадки рибосомы (IRES). Предпочтительно три гена представляют собой гены 4-1BBL человека (CD137L), ИЛ-2 человека и одноцепочечного ИЛ-12 человека. Более предпочтительно три гена
запускаются промотором цитомегаловируса (ЦМВ), т.е., векторная система содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно трицистронной конструкции, содержащей три гена 4-1BBL человека (CD137L), ИЛ-2 человека и одноцепочечного ИЛ-12 человека. Еще более предпочтительно полиаденилирование транскрипта индуцируется сигналом, происходящим из SV40, т. е. новый вектор/векторная система содержит ген, кодирующий сигнал полиаденилирования SV40, расположенный в 3'-направлении относительно трицистронной конструкции, содержащей три гена 4-1BBL человека (CD137L), ИЛ-2 человека и одноцепочечного ИЛ-12 человека (оцИЛ-12 человека). Еще более предпочтительно векторная ДНК представляет собой ДНК аденовирусного вектора.
Соответственно, в одном предпочтительном варианте новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению содержит кассету для экспрессии, содержащую (i) три гена 4-1BBL человека (CD137L), ИЛ-2 человека и одноцепочечного ИЛ-12 человека, расположенные в указанном порядке (т.е., в направлении от 5'-конца к З'-концу, при этом ген, кодирующий ИЛ-2, расположен в 3'-направлении относительно гена, кодирующего 4-1BBL, и ген, кодирующий оцИЛ-12, расположен в 3'-направлении относительно гена, кодирующего ИЛ-2) в трицистронной конструкции, соединенной с помощью сайтов внутренней посадки рибосомы (IRES), (ii) промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно трицистронной конструкции, содержащей три гена 4-1BBL человека (CD137L), ИЛ-2 человека и одноцепочечного ИЛ-12 человека, и (iii) ген, кодирующий сигнал полиаденилирования SV40, расположенный в 3'-направлении относительно указанной трицистронной конструкции, причем указанный вектор представляет собой аденовирусный вектор.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению содержит конструкцию для экспрессии, в которой три гена 4-1BBL (CD137L), ИЛ-2 и одноцепочечного ИЛ-12 расположены, как показано в любом из пунктов (a)-(f) ниже (Пром. = промотор):
(е) - Пром
44-1BBL - чИЛ-2 - Пром.
чоцИЛ-12 -
(f) - Пром
44-1BBL - Пром
чИЛ-2 - Пром.
чоцИЛ-12 -
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения новый вектор согласно настоящему изобретению содержит промотор, расположенный в 5'-направлении относительно (конструкции для экспрессии, содержащей) трех генов 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, расположенных в порядке, описанном в другом месте. Предпочтительно ген 4-1BBL человека находится в положении 1 трех генов нового вектора, более конкретно в положении 1 конструкции для экспрессии, содержащей указанные три гена.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения новый вектор согласно настоящему изобретению содержит кассету для экспрессии, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 70% гомологична или идентична последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ Ш N0: 12 (Фигура 18), причем экспрессия варианта последовательности нуклеиновой кислоты обеспечивает аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и экспрессия кассеты для экспрессии, содержащей последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 12. Предпочтительно кассета для экспрессии содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% гомологична или идентична последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ Ш N0: 12 (Фигура 18), причем экспрессия варианта последовательности нуклеиновой кислоты обеспечивает аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и экспрессия кассеты для экспрессии, содержащей последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 12. Более предпочтительно кассета для экспрессии содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90% гомологична или идентична последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ Ш N0: 12 (Фигура 18), причем экспрессия варианта последовательности нуклеиновой кислоты обеспечивает аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и экспрессия кассеты для экспрессии, содержащей последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 12. Еще более предпочтительно кассета для экспрессии содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%
гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 12 (Фигура 18), причем экспрессия варианта последовательности нуклеиновой кислоты обеспечивает аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и экспрессия кассеты для экспрессии, содержащей последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 12. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения новый вектор согласно настоящему изобретению содержит кассету для экспрессии, содержащую (или состоящую из нее) последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ Ш N0: 12 (Фигура 18).
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения новый вектор согласно настоящему изобретению содержит кассету для экспрессии, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 70% гомологична или идентична последовательности эталонной кассеты для экспрессии, содержащей следующие последовательности нуклеиновых кислот, представленные в SEQ Ш N0: 11 (Фигура 17): (i) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 1080-1844 (4-1BBL человека), (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 18852388 (EMCV IRES), (iii) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 2409-2870 ((ИЛ-2 человека), (iv) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 2914-3545 (PV IRES), и (v) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 3581-5203 (оцИЛ-12 человека, содержащий субъединицы р40 и р35 ИЛ-12 человека, соединенные линкером), причем экспрессия варианта кассеты для экспрессии обеспечивает аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и экспрессия указанной эталонной кассеты для экспрессии. Предпочтительно кассета для экспрессии содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% гомологична или идентична последовательности указанной эталонной кассеты для экспрессии, причем экспрессия варианта кассеты для экспрессии обеспечивает аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и экспрессия указанной эталонной кассеты для экспрессии. Более предпочтительно кассета для экспрессии содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90% гомологична или идентична последовательности указанной эталонной кассеты для экспрессии, причем экспрессия варианта кассеты для экспрессии обеспечивает аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и экспрессия
указанной эталонной кассеты для экспрессии. Еще более предпочтительно кассета для экспрессии содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична или идентична последовательности указанной эталонной кассеты для экспрессии, причем экспрессия варианта кассеты для экспрессии обеспечивает аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и экспрессия указанной эталонной кассеты для экспрессии. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения новый вектор согласно настоящему изобретению содержит кассету для экспрессии, содержащую (или состоящую из них) следующие последовательности нуклеиновых кислот, представленные в SEQ Ш N0: 11 (Фигура 17): (i) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 10801844 (4-1BBL человека), (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 1885-2388 (EMCV IRES), (iii) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 2409-2870 (ИЛ-2 человека), (iv) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 2914-3545 (PV IRES), и (v) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 3581-5203 (оцИЛ-12 человека, содержащий субъединицы р40 и р35 ИЛ-12 человека, соединенные линкером).
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения новый вектор согласно настоящему изобретению содержит кассету для экспрессии, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 70% гомологична или идентична последовательности эталонной кассеты для экспрессии, содержащей следующие последовательности нуклеиновых кислот, представленные в SEQ Ш NO: 11 (Фигура 17): (i) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 484-1059 (промотор ЦМВ), (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 10801844 (4-1BBL человека), (iii) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 1885-2388 (EMCV IRES), (iv) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 2409-2870 (ИЛ-2 человека), (v) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 2914-3545 (PV IRES), (vi) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 3581-5203 (оцИЛ-12 человека, содержащий субъединицы р40 и р35 ИЛ-12 человека, соединенные линкером), и (vii) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 5271-5510 (полиА SV40), причем экспрессия варианта кассеты для экспрессии обеспечивает аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и экспрессия указанной эталонной кассеты для экспрессии. Предпочтительно кассета для экспрессии содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере
на 80% гомологична или идентична последовательности указанной эталонной кассеты для экспрессии, причем экспрессия варианта кассеты для экспрессии обеспечивает аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и экспрессия указанной эталонной кассеты для экспрессии. Более предпочтительно кассета для экспрессии содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90% гомологична или идентична последовательности указанной эталонной кассеты для экспрессии, причем экспрессия варианта кассеты для экспрессии обеспечивает аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и экспрессия указанной эталонной кассеты для экспрессии. Еще более предпочтительно кассета для экспрессии содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична или идентична последовательности указанной эталонной кассеты для экспрессии, причем экспрессия варианта кассеты для экспрессии обеспечивает аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и экспрессия указанной эталонной кассеты для экспрессии. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения новый вектор согласно настоящему изобретению содержит кассету для экспрессии, содержащую (или состоящую из них) следующие последовательности нуклеиновых кислот, представленные в SEQ Ш N0: 11 (Фигура 17): (i) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 4841059 (промотор ЦМВ), (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 1080-1844 (4-1BBL человека), (iii) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 1885-2388 (EMCV IRES), (iv) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 2409-2870 (ИЛ-2 человека), (v) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 2914-3545 (PV IRES), (vi) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 3581-5203 (оцИЛ-12 человека, содержащий субъединицы р40 и р35 ИЛ-12 человека, соединенные линкером), и (vii) последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую п.о. 5271-5510 (полиА SV40).
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения векторная система содержит три гена 4-1BBL (CD137L), ИЛ-2 и одноцепочечного ИЛ-12, расположенные в трех отдельных векторах. Предпочтительно три гена представляют собой гены человека 4-1BBL (CD137L), ИЛ-2 и одноцепочечного ИЛ-12. Более предпочтительно каждый из трех генов запускается промотором цитомегаловируса (ЦМВ), т. е. каждый вектор содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении
относительно гена 4-1BBL человека (CD137L), ИЛ-2 человека и одноцепочечного ИЛ-12 человека, соответственно. Еще более предпочтительно полиаденилирование транскрипта индуцируется сигналом, происходящим из SV40, т. е., каждая векторная система содержит ген, кодирующий сигнал полиаденилирования SV40, расположенный в 3'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L), ИЛ-2 человека и одноцепочечного ИЛ-12 человека (оцИЛ-12 человека), соответственно. Еще более предпочтительно векторная ДНК каждого отдельного вектора представляет собой ДНК аденовирусного вектора.
Соответственно, в одном предпочтительном варианте реализации, векторная система содержит три аденовирусных вектора, каждый из которых содержит (i) ген 4-1BBL человека (CD137L), ИЛ-2 человека или одноцепочечного ИЛ-12 человека, (ii) промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L), ИЛ-2 человека и одноцепочечного ИЛ-12 человека, соответственно, и (iii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал полиаденилирования SV40, расположенную в 3'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L), ИЛ-2 человека и одноцепочечного ИЛ-12 человека, соответственно.
Согласно различным аспектам векторная система содержит три гена 4-1BBL (CD137L), ИЛ-2 и одноцепочечного ИЛ-12, расположенные в двух отдельных векторах. В частности, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения один из двух векторов содержит гены 4-1BBL (CD137L) и ИЛ-2, и другой вектор содержит ген одноцепочечного ИЛ-12. Предпочтительно гены представляют собой гены человека для 4-1BBL (CD137L), ИЛ-2 и одноцепочечного ИЛ-12. Более предпочтительно гены запускаются промотором цитомегаловируса (ЦМВ), т.е., вектор, содержащий гены 4-1BBL человека (CD137L) и ИЛ-2 человека, содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L) в том случае, если ген 4-1BBL человека (CD137L) расположен в 5'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека, или расположенный в 5'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека в том случае, если ген ИЛ-2 человека расположен в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L), и вектор, содержащий ген оцИЛ-12 человека, содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека. Еще более предпочтительно полиаденилирование транскрипта индуцируется сигналом, происходящим из SV40, т. е. каждый из двух векторов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал полиаденилирования SV40, т. е., вектор, содержащий гены 4-1BBL человека (CD137L) и ИЛ-2 человека, содержит ген, кодирующий сигнал полиаденилирования SV40, расположенный в 3'-направлении
относительно гена ИЛ-2 человека в том случае, если ген 4-1BBL человека (CD137L) расположен в 5'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека, или содержит ген, кодирующий сигнал полиаденилирования SV40, расположенный в 3'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L) в том случае, если ген ИЛ-2 человека расположен в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L), и вектор, содержащий ген оцИЛ-12 человека, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал полиаденилирования SV40, расположенную в 3'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека. Еще более предпочтительно векторная ДНК каждого отдельного вектора представляет собой ДНК аденовирусного вектора.
Соответственно, в одном предпочтительном варианте реализации, векторная система содержит два аденовирусных вектора, один из которых содержит гены 4-1BBL человека (CD137L) и ИЛ-2 человека, и другой содержит ген оцИЛ-12 человека, причем (i) вектор, содержащий гены 4-1BBL человека (CD137L) и ИЛ-2 человека, дополнительно содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L) в том случае, если ген 4-1BBL человека (CD137L) расположен в 5'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека, или расположенный в 5'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека в том случае, если ген ИЛ-2 человека расположен в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L), и при этом вектор, содержащий ген оцИЛ-12 человека, содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека, и (ii) вектор, содержащий гены 4-1BBL человека (CD137L) и ИЛ-2 человека, также дополнительно содержит ген, кодирующий сигнал полиаденилирования SV40, расположенный в 3'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека в том случае, если последовательность нуклеиновой кислоты 4-1BBL человека (CD137L) расположена в 5'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека, или ген, кодирующий сигнал полиаденилирования SV40, расположенный в 3'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L) в том случае, если ген ИЛ-2 человека расположен в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L), и при этом вектор, содержащий ген оцИЛ-12 человека, содержит ген, кодирующий сигнал полиаденилирования SV40, расположенный в 3'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека.
Согласно различным другим вариантам реализации настоящего изобретения векторная система содержит два отдельных вектора, причем один из двух векторов содержит гены 4-1BBL (CD137L) и одноцепочечного ИЛ-12 (оцИЛ-12), и другой вектор содержит ген ИЛ-2. Предпочтительно гены представляют собой гены человека для 4-1BBL (CD137L), оцИЛ-12 и ИЛ-2. Более предпочтительно гены запускаются промотором
цитомегаловируса (ЦМВ), т. е. вектор, содержащий гены 4-1BBL человека (CD137L) и оцИЛ-12 человека, содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L) в том случае, если ген 4-1BBL человека (CD137L) расположен в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека, или расположенный в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека в том случае, если ген оцИЛ-12 человека расположен в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L), и вектор, содержащий ген ИЛ-2 человека, содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека. Еще более предпочтительно полиаденилирование транскрипта индуцируется сигналом, происходящим из SV40, т. е. каждый из двух векторов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал полиаденилирования SV40, т. е. вектор, содержащий гены 4-1BBL человека (CD137L) и оцИЛ-12 человека, содержит ген, кодирующий сигнал полиаденилирования SV40, расположенный в 3'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека в том случае, если ген 4-1BBL человека (CD137L) расположен в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека, или содержит ген, кодирующий сигнал полиаденилирования SV40, расположенный в 3'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L) в том случае, если ген оцИЛ-12 человека расположен в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L), и вектор, содержащий ген ИЛ-2 человека, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал полиаденилирования SV40, расположенную в 3'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека. Еще более предпочтительно векторная ДНК каждого отдельного вектора представляет собой ДНК аденовирусного вектора.
Соответственно, в одном предпочтительном варианте реализации, векторная система содержит два аденовирусных вектора, один из которых содержит гены 4-1BBL человека (CD137L) и оцИЛ-12 человека, и другой содержит ген ИЛ-2 человека, причем (i) вектор, содержащий гены 4-1BBL человека (CD137L) и оцИЛ-12 человека, дополнительно содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L) в том случае, если ген 4-1BBL (CD137L) человека расположен в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека, или расположенный в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека в том случае, если ген оцИЛ-12 человека расположен в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L), и при этом вектор, содержащий ген ИЛ-2 человека, содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека, и (ii) вектор, содержащий гены 4-1BBL человека (CD137L) и оцИЛ-12 человека, также дополнительно содержит ген, кодирующий
сигнал полиаденилирования SV40, расположенный в 3'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека в том случае, если ген 4-1BBL человека (CD137L) расположен в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека, или содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал полиаденилирования SV40, расположенную в 3'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L) в том случае, если ген оцИЛ-12 человека расположен в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L), и при этом вектор, содержащий ген ИЛ-2 человека, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал полиаденилирования SV40, расположенную в 3 '-направлении относительно гена ИЛ-2 человека.
Согласно различным другим вариантам реализации настоящего изобретения векторная система содержит два отдельных вектора, причем один из двух векторов содержит гены ИЛ-2 и одноцепочечного ИЛ-12 (оцИЛ-12), и другой вектор содержит ген 4-1BBL (CD137L). Предпочтительно гены представляют собой гены человека для ИЛ-2, оцИЛ-12 и 4-1BBL (CD137L). Более предпочтительно гены запускаются промотором цитомегаловируса (ЦМВ), т. е. вектор, содержащий гены ИЛ-2 человека и оцИЛ-12 человека, содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно ИЛ-2 человека в том случае, если ген ИЛ-2 человека расположен в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека, или расположенный в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека в том случае, если ген оцИЛ-12 человека расположен в 5'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека, и вектор, содержащий ген 4-1BBL (CD137L) человека, содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L). Еще более предпочтительно полиаденилирование транс крипта индуцируется сигналом, происходящим из SV40, т. е. каждый из двух векторов содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал полиаденилирования SV40, т. е. вектор, содержащий гены ИЛ-2 человека и оцИЛ-12 человека, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал полиаденилирования SV40, расположенную в 3'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека в том случае, если ген ИЛ-2 человека расположен в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека, или содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал полиаденилирования SV40, расположенную в 3'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека в том случае, если ген оцИЛ-12 человека расположен в 5'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека, и вектор, содержащий ген 4-1BBL человека (CD137L), содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал полиаденилирования SV40, расположенную в 3'-направлении относительно гена 4-1BBL
человека (CD137L). Еще более предпочтительно векторная ДНК каждого отдельного вектора представляет собой ДНК аденовирусного вектора.
Соответственно, в одном предпочтительном варианте реализации, векторная система содержит два аденовирусных вектора, один из которых содержит гены ИЛ-2 человека и оцИЛ-12 человека, и другой содержит ген 4-1BBL человека (CD137L), причем (i) вектор, содержащий гены ИЛ-2 человека и оцИЛ-12 человека, дополнительно содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека в том случае, если ген ИЛ-2 человека расположен в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека, или расположенный в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека в том случае, если ген оцИЛ-12 человека расположен в 5'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека, и при этом вектор, содержащий ген 4-1BBL человека (CD137L), содержит промотор ЦМВ, расположенный в 5'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L), и (ii) вектор, содержащий гены ИЛ-2 человека и оцИЛ-12 человека, также дополнительно содержит ген, кодирующий сигнал полиаденилирования SV40, расположенный в 3'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека в том случае, если ген ИЛ-2 человека расположен в 5'-направлении относительно гена оцИЛ-12 человека, или содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал полиаденилирования SV40, расположенную в 3'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека в том случае, если ген оцИЛ-12 человека расположен в 5'-направлении относительно гена ИЛ-2 человека, и при этом вектор, содержащий ген 4-1BBL человека (CD137L), содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнал полиаденилирования SV40, расположенную в 3'-направлении относительно гена 4-1BBL человека (CD137L).
В случае вирусных частиц согласно настоящему изобретению блоки экспрессии дополнительно содержат последовательность, кодирующую молекулу оболочки/капсида или один или более факторов, необходимых для получения желаемой векторной частицы в упаковывающих клетках.
Элементы сайтов внутренней посадки рибосомы (IRES) используют для создания полигенных, или мульти- или полицистронных, транскриптов. Элементы IRES могут обойти модель сканирования рибосом в случае трансляции, зависимой от 5-метилированного кэпа, и начать трансляцию на внутренних сайтах. Элементы IRES могут быть соединены с гетерологичными открытыми рамками считывания. Несколько открытых рамок считывания, каждая из которых отделена с помощью IRES, могут быть совместно транскрибированы с получением мульти- или полицистронных транскриптов.
Каждый компонент, который должен быть экспрессирован в мультицистронном векторе экспрессии, может быть отделен элементом IRES, чтобы обеспечить раздельную экспрессию различных белков с одного и того же промотора. Инструменты, которые можно использовать для разделения генетических элементов в мультицистронном векторе, в частности, элементов IRES, известны в данной области техники. Эффективность конкретного мультицистронного вектора может быть легко испытана путем детектирования экспрессии каждого из генов с использованием стандартных протоколов.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность (и) нуклеиновой кислоты, кодирующая (ие) по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, расположена (ы) в одном векторе, причем последовательность (и) нуклеиновой кислоты, кодирующая (ие) оцИЛ-12 и ИЛ-2, расположена (ы) в 3'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL. Такой вектор считается мультицистронным вектором экспрессии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мультицистронный вектор экспрессии представляет собой трицистронный вектор экспрессии, содержащий последовательности нуклеиновых кислот (генов), кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, причем гены расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2, 3, при условии, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в положении 1. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность (и) нуклеиновой кислоты, кодирующая (ие) оцИЛ-12 и ИЛ-2, расположена (ы) в 3'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL. Предпочтительно в мультицистронном или трицистронном векторе экспрессии последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2, расположена в 3'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, расположена в 3'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ИЛ-2. Согласно различным вариантам реализации полицистронной или трицистронной экспрессии промотор расположен в 5'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL, но не в 5'-направлении относительно последовательности (ей) нуклеиновой кислоты, кодирующей (их) оцИЛ-12 и/или ИЛ-2.
Согласно некоторым вариантам реализации полицистронного или трицистронного вектора экспрессии последовательность (и) нуклеиновой кислоты, кодирующая (ие) по
меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и/или ИЛ-2, соединена (ы) с помощью сайтов внутренней посадки рибосомы (IRES).
В конкретном примере геном вирусного вектора содержит последовательность энхансера/промотора, предпочтительно последовательность энхансера/промотора цитомегаловируса (ЦМВ); последовательности R и U5 из 5'-LTR вируса; необязательно упаковывающую последовательность; внутренний энхансер; внутренний промотор; один или более полинуклеотидов, кодирующих по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и/или ИЛ-12; элемент U3 с делецией его энхансерной последовательности; и последовательности R и U5 З'-LTR вируса. Конструирование векторного генома может быть осуществлено с использованием любых подходящих методик генной инженерии, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, стандартные методики расщепления рестрикционными эндонуклеазами, лигирования, трансформации, очистки плазмиды и секвенирования ДНК, например, описанные, например, в Sambrook et al. (1989 and 2001 editions; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).
Также можно применять векторы, сконструированные для кратковременной экспрессии в клетках млекопитающих. Кратковременная экспрессия включает применение вектора экспрессии, который способен эффективно реплицироваться в клетке-хозяине так, что клетка-хозяин накапливает много копий вектора экспрессии и, в свою очередь, синтезирует высокие уровни полипептида, кодируемого полинуклеотидом в векторе экспрессии. См. Sambrook et al., выше, pp. 16.17-16.22, 1989. Другие векторы и способы, подходящие для адаптации для экспрессии полипептидов, хорошо известны в данной области техники и могут быть легко адаптированы к конкретным обстоятельствам.
С помощью методик, предложенных в настоящем документе, и знаний в данной области техники специалист в данной области техники установит, что эффективность конкретной системы экспрессии может быть испытана путем трансфекции упаковывающих клеток вектором, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую репортерный белок, и измерения экспрессии с использованием подходящей методики, например, измерения флуоресценции конъюгата зеленого флуоресцентного белка. Другие подходящие репортерные гены хорошо известны в данной области техники.
Согласно настоящему изобретению также предусмотрено, что в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению может содержать нативный ИЛ-12 вместо оцИЛ-12, т. е. может содержать последовательность нуклеиновой кислоты (гена), кодирующую нативный ИЛ-12. ИЛ-12 представляет собой соединенный дисульфидными связями гетеродимерный цитокин, состоящий из двух кодируемых по отдельности субъединиц р35 и р40. Согласно
различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты (гена) может кодировать нативный ИЛ-12 человека. Соответственно, в различных вариантах реализации настоящего изобретения новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению может содержать три гена, кодирующих (i) лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), (ii) субъединицы р40 и р35 ИЛ-12, и (iii) ИЛ-2, в которой указанные гены расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2 и 3, при условии, что ген (ы), кодирующий (ие) субъединицы и р35 ИЛ-12 и р40 ИЛ-12, не находится (не находятся) в положении 1.
В различных вариантах реализации настоящего изобретения новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению может содержать три гена, кодирующих лиганд 4-1 (4-1BBL), нативный ИЛ-12 и ИЛ-2, в которой указанные гены расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2 и 3, при условии, что ген (ы), кодирующий (ие) субъединицы р35 и р40 ИЛ-12, не находится (не находятся) в положении 1, причем ген (ы), кодирующий (ие) субъединицы р40 и р35 ИЛ-12, может (могут) содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 70% гомологична или идентична последовательностям нуклеиновых кислот, представленным в SEQ Ш N0: 7 и 9 (Фигура 16), причем указанный вариант последовательностей нуклеиновых кислот кодирует белок ИЛ-12, обладающий иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Предпочтительно ген (ы), кодирующий (ие) субъединицы р35 и р40 ИЛ-12, может (могут) содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 80% гомологична или идентична последовательностям нуклеиновых кислот, представленным в SEQ Ш N0: 7 и 9 (Фигура 16), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок ИЛ-12, обладающий иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Более предпочтительно ген (ы), кодирующий (ие) субъединицы р40 и р35 ИЛ-12, может (могут) содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90% гомологична или идентична последовательностям нуклеиновых кислот, представленным в SEQ Ш N0: 7 и 9 (Фигура 16), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок ИЛ-12, обладающий иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Еще более предпочтительно ген (ы), кодирующий (ие) субъединицы р40 и р35 ИЛ-12, может (могут) содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%,
98% или 99% гомологична или идентична последовательностям нуклеиновых кислот, представленным в SEQ Ш N0: 7 и 9 (Фигура 16), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок ИЛ-12, обладающий иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения ген (ы), кодирующий (ие) субъединицы р40 и р35 ИЛ-12, может (могут) содержать последовательности нуклеиновых кислот, представленные в SEQ Ш N0: 7 и 9 (Фигура 16). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты субъединиц р35 и р40 ИЛ-12, описанные выше, проявляют аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и субъединицы р35 и р40 ИЛ-12, кодируемые последовательностями, представленными в SEQ ID N0: 7 и 9.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения ген (ы) субъединиц р40 и р35 ИЛ-12 кодирует (ют) полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 70% гомологична или идентична аминокислотным последовательностям, представленным в SEQ Ш N0: 8 и 10 (Фигура 16), причем указанный полипептид обладает аналогичной иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Предпочтительно ген (ы) субъединиц р40 и р35 ИЛ-12 кодирует (ют) полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 70% гомологична или идентична аминокислотным последовательностям, представленным в SEQ Ш N0: 8 и 10 (Фигура 16), причем указанный полипептид обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Более предпочтительно ген (ы) субъединиц р40 и р35 ИЛ-12 кодирует (ют) полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 90% или 95% гомологична или идентична аминокислотным последовательностям, представленным в SEQ Ш N0: 8 и 10 (Фигура 16), причем указанный полипептид обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Еще более предпочтительно ген (ы) субъединиц р40 и р35 ИЛ-12 кодирует (ют) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 8 и 10 (Фигура 16).
Предпочтительно вариант последовательности нуклеиновой кислоты субъединиц р35 и р40 ИЛ-12 человека, описанных в настоящем документе, не является нуклеотидной последовательностью, кодирующей субъединицы р35 и р40 ИЛ-12 мыши.
Соответственно, предпочтительно новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению, содержащая три гена, кодирующих лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), субъединицы р35 и р40 ИЛ-12 и ИЛ-2, описанные выше (т. е., где указанные гены расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2 и 3, при условии, что ген (ы), кодирующий (ие) субъединицы р35 и р40 ИЛ-12 не находится (не находятся) в положении 1), не содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую субъединицы р35 и р40 ИЛ-12 мышиного происхождения.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложены векторные частицы. Настоящее изобретение относится к вирусным частицам, содержащим векторную систему согласно настоящему изобретению. Векторная частица содержит любой из нового вектора/векторной системы, описанных в настоящем документе, которые содержат один или более векторов, содержащих полинуклеотидную последовательность (последовательности), кодирующую (ие) по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и/или ИЛ-2. Настоящее изобретение также относится к способам доставки векторной системы согласно настоящему изобретению, кодирующей по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и/или ИЛ-2 (описанные в настоящем документе), в клетку-мишень. Такие способы включают приведение в контакт (т. е., разрешающее взаимодействие) клетки-мишени с носителем, который доставляет векторную систему согласно настоящему изобретению. Согласно конкретным вариантам реализации способы доставки нового вектора/векторной системы включают приведение клетки в контакт путем введения субъекту векторной частицы, которая содержит новый вектор/векторную систему согласно настоящему изобретению, которая содержит один или более векторов, содержащих полинуклеотидную последовательность (последовательности), кодирующую (ие) по меньшей мере 4-1BBL, оцИЛ-12 и/или ИЛ-2.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения векторная частица представляет собой вирусную векторную частицу, и один или более векторов нового вектора/векторной системы представляют собой любой из РНК-вектора, плазмидного вектора, вектора на основе наночастиц, а также депротеинизированной ДНК. Согласно другим определенным вариантам реализации векторная частица представляет собой частицу, полученную из бактерий, таких как, например, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Mycobacterium bovis, Escherichia coli, Shigella spp. и Yersinia spp., и один или более векторов векторной системы представляют собой любой из РНК-вектора, плазмидного вектора, вектора на основе наночастиц, а также депротеинизированной ДНК.
Типичные вирусные векторные частицы включают частицу лентивирусного вектора, которая содержит геном лентивирусного вектора; частицу поксвирусного вектора, которая
содержит геном поксвирусного вектора; частицу вектора на основе вируса осповакцины, которая содержит геном вектора на основе вируса осповакцины; частицу аденовирусного вектора, которая содержит геном аденовирусного вектора; частицу вектора на основе аденоассоциированного вируса, которая содержит геном вектора на основе аденоассоциированного вируса; частицу вектора на основе вируса простого герпеса, которая содержит геном вируса простого герпеса (например, вирус простого герпеса I или II); или частицу вектора на основе альфа-вируса, которая содержит геном вектора на основе альфа-вируса.
Векторные частицы (например, описанные в настоящем документе вирусные векторные частицы) могут быть инъецированы в условиях in vivo, в частности, в опухоль, где частицы обеспечивают иммуностимулирующий эффект путем экспрессии 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2. Количество вирусных частиц составляет по меньшей мере ЗхЮ6 инф.в.ч. (инфекционных вирусных частиц) и может составлять по меньшей мере 1х107 инф.в.ч., по меньшей мере ЗхЮ7 инф.в.ч., по меньшей мере 1х108 инф.в.ч., по меньшей мере ЗхЮ8 инф.в.ч., по меньшей мере 1х109 инф.в.ч. или по меньшей мере ЗхЮ9 инф.в.ч. Клетки из злокачественной (опухолевой) ткани или инфицированной патогеном ткани могут быть использованы через определенные промежутки времени для измерения экспрессии 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, например, путем наблюдения экспрессии маркера, такого как GFP или люцифераза, если они совместно экспрессируются полинуклеотидной последовательностью, присутствующей в векторной системе, включенной в векторную частицу. В частности, для определения экспрессии 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2 могут быть измерены Т-клетки из злокачественной (опухолевой) ткани или инфицированной патогеном ткани реципиентов, обработанных векторными частицами.
Термин "компетентный по репликации аденовирусный вектор" относится к любому аденовирусному вектору, который не является дефектным в отношении любой функции гена, необходимой для репликации вируса в конкретных клетках или тканях. Вектор должен быть способен реплицироваться и поддаваться упаковке, но может реплицироваться только при определенных условиях в конкретных клетках или тканях.
Аденовирус (Ad) представляет собой большой (приблизительно 36 т.п.о.) ДНК-содержащий вирус, который инфицирует людей, но имеет широкий круг хозяев. Существует приблизительно 50 серотипов аденовируса человека, которые делятся на шесть семейств на основе молекулярных, иммунологических и функциональных критериев. Практически каждый человек зрелого возраста инфицирован наиболее распространенными серотипами аденовируса, основным эффектом которых являются симптомы, сходные с простудой. Аденовирусная инфекция клеток-хозяев приводит к
поддержанию аденовирусной ДНК в виде эписом, что снижает потенциальную генотоксичность, связанную с интегрирующимися векторами. Аденовирусы также структурно устойчивы, и перегруппировка генома не детектировалась после интенсивной амплификации.
Аденовирусные векторы, использованные в настоящем изобретении, могут представлять собой любые аденовирусные векторы, подходящие для применения в способе лечения человека или животного. В другом варианте различные типы аденовирусных векторов можно применять в соответствии с настоящим изобретением. Векторы также могут быть модифицированы любым способом, известным в данной области техники, например, путем удаления, вставки, изменения или модификации любых областей вируса. Могут быть получены векторы, репликация которых является опухолеспецифической. Например, аденовирусный вектор может содержать модификации в El, ЕЗ и/или Е4, такие как введение опухолеспецифических промоторов, делеции областей и вставки трансгенов.
Ad-5 человека представляет собой серотип аденовируса человека, который хорошо охарактеризован генетически и биохимически (GenBank М73260, АС_000008). Соответственно, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения аденовирус представляет собой компетентный по репликации серотип Ad5 или гибридный серотип, содержащий компонент Ad5. Аденовирус может представлять собой штаммом дикого типа или может быть генетически модифицирован для усиления селективности в отношении опухоли, например, путем ослабления способности вируса реплицироваться в нормальных неделящихся клетках, не затрагивая способность вируса реплицироваться в опухолевых клетках. Не ограничивающие примеры аденовирусов, включенных в объем настоящего изобретения, включают Delta-24, Delta-24-RGD, ICOVIR-5, ICOVIR-7, ONYX-015, ColoAdl и H101. Согласно одному конкретному варианту реализации настоящего изобретения аденовирус представляет собой Delta-24 или Delta-24-RGD. Аденовирус Delta-24 происходит из аденовируса типа 5 (Ad-5) и содержит делецию 24 пар оснований в части CR2 гена Е1 А. Delta-24-RGD дополнительно содержит последовательность RGD-4C. Делеция Е1 А повышает селективность вируса в отношении раковых клеток; последовательность RGD-4C увеличивает инфекционность вируса в глиомах.
Помимо этого остов аденовирусного вектора может быть из любого серотипа. Кроме того, векторы могут представлять собой химерные векторы, например, Ad5/3. В качестве примера "вектор Ad5/3" относится к химерному вектору, содержащему части векторов Ad5 и Ad3.
Аденовирус является привлекательной системой доставки, и его применение является общепринятым при переносе генов в нескольких вариантах терапевтического применения. Аденовирус проникает в восприимчивую клетку-хозяина через рецептор на клеточной поверхности и затем подвергается интернализации.
Отсутствие или наличие низких уровней рецепторов Коксаки и аденовирусов (CAR) на разных типах опухолей может ограничивать эффективность аденовируса. Модификация капсида обеспечивает независимую от CAR инфекцию клетки-мишени. Поглощение аденовируса в ткани-мишени также может быть улучшено путем добавления поликатионных соединений, сходных с трансфектантами. В настоящем документе было продемонстрировано (см. пример 10), что поглощение аденовируса особенно улучшалось при применении трансфектанта сульфата протамина. Соответственно, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения сульфат протамина применяют для трансфекции векторных систем согласно настоящему изобретению, предпочтительно для трансфекции аденовирусной векторной системы согласно настоящему изобретению.
Как правило, для эффективного полиаденилирования транскрипта при его экспрессии включают сигнал полиаденилирования. Характер сигнала полиаденилирования, как полагают, не является решающим для успешной реализации настоящего изобретения, и можно применять любую такую последовательность. Предпочтительные варианты реализации включают сигнал полиаденилирования SV40 и/или сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота, который является удобным и/или хорошо функционирует в различных клетках-мишенях. Транскрипционный сайт терминации также предусмотрен согласно настоящему изобретению в качестве элемента конструкции для экспрессии. Такие элементы могут служить для повышения уровня транскрипта и/или для сведения к минимуму сквозного считывания с кассеты на другие последовательности.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки, инфицированные новым вектором/векторной системой согласно настоящему изобретению, могут быть идентифицированы в условиях in vitro путем включения репортерного гена в векторную систему. Обычно селективный репортер представляет собой репортер, который придает свойство, обеспечивающее возможность отбора. Положительный селективный репортер представляет собой репортер, в случае которого присутствие репортерного гена обеспечивает его отбор, в то время как отрицательный селективный репортер представляет собой репортер, присутствие которого препятствует его отбору. Примером положительного селективного маркера является маркер
устойчивости к лекарственным препаратам. Другие типы репортеров включают пригодные для скрининга репортеры, такие как GFP (зеленый флуоресцентный белок).
В вариантах реализации настоящего изобретения можно применять современные технологии платформ вирусных векторов, предназначенные для создания вакцин или конструкций для генной терапии. Аспекты конструирования вирусных векторов включают вставку генетического материала в вирусный вектор и подтверждение конструкции путем определения характеристик и секвенирования нуклеиновой кислоты, вируса и вирусного продукта. Затем вирусный вектор подвергают ряду исследований целесообразности, предназначенных для оценки масштабируемости.
Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую новый вектор/векторную систему согласно настоящему изобретению.
Помимо этого настоящее изобретение относится к композиции, содержащей новый вектор/векторную систему или вирусную частицу, описанные в настоящем документе. Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей полинуклеотид, описанный в настоящем документе, т. е., полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую новый вектор/векторную систему согласно настоящему изобретению.
Безотносительно к какой-либо теории, авторы настоящего изобретения полагают, что применение нового вектора/векторной системы, экспрессирующей 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, приводит к локальной выработке цитокинов в опухоли или вокруг нее, которая будет направлять индуцированные системно или локально опухолеспецифические цитотоксические Т-клетки к очагу рака. Эффективность иммунотерапии разных видов рака, вирусных инфекций и расстройств иммунной системы будет значительно повышена с помощью иммуностимулирующего действия, обеспеченного указанным механизмом. Иммуностимулирующее действие, обеспеченное новым вектором/векторной системой согласно настоящему изобретению, было продемонстрировано в примерах.
В объем настоящего изобретения включены композиции, содержащие новый вектор/векторную систему или вирусную частицу, описанные в настоящем документе, для применения в качестве лекарственного средства. Настоящее изобретение относится к лекарственному средству, содержащему новый вектор/векторную систему или вирусную частицу, описанные в настоящем документе. Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, содержащему полинуклеотид, описанный в настоящем документе, т. е., полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую новый вектор/векторную систему согласно настоящему изобретению.
В объем настоящего изобретения включен новый вектор/векторная система или вирусная частица, описанные в настоящем документе, для применения в качестве терапевтической вакцины, более конкретно для применения в качестве терапевтической вакцины для лечения рака или вирусных инфекций.
Настоящее изобретение также относится к иммунной клетке или клетке рака, трансдуцированной или трансфицированной новым вектором/векторной системой, или вирусной частицей, описанными в настоящем документе. Подходящие трансдуцированные или трансфицированные клетки можно применять для терапии в условиях ex vivo, в частности, терапии рака в условиях ex vivo. Согласно различным вариантам реализации таких видов терапии по меньшей мере 5% раковых клеток, трансдуцированных или трансфицированных новым вектором/векторной системой или вирусной частицей, описанными в настоящем документе, экспрессируют 4-1BBL.
Согласно настоящему изобретению раковая клетка предпочтительно представляет собой клетку опухоли, т. е. опухолевую клетку, более конкретно клетку плотной опухоли.
Помимо этого настоящее изобретение относится к композиции, содержащей такую иммунную клетку или раковую клетку, трансдуцированную или трансфицированную новым вектором/векторной системой или вирусной частицей, описанными в настоящем документе. Кроме того, настоящее изобретение относится к лекарственному средству, содержащему такую иммунную клетку или раковую клетку, трансдуцированную или трансфицированную новым вектором/векторной системой или вирусной частицей, описанными в настоящем документе. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения иммунная клетка представляет собой Т-клетку, NK-клетку, тип клеток моноцитарной линии дифференцировки (макрофаги, дендритные клетки, клетки Лангерганса, тучные клетки), фибробласт. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения по меньшей мере 5% раковых клеток, трансдуцированных или трансфицированных новым вектором/векторной системой или вирусной частицей, описанными в настоящем документе, экспрессируют 4-1BBL.
Новый вектор/векторную систему или вирусные частицы согласно настоящему изобретению можно применять в способах лечения или устранения рака, вирусных инфекций и/или расстройств иммунной системы. Полинуклеотид согласно настоящему изобретению также можно применять при лечении рака, вирусных инфекций и/или расстройств иммунной системы. Композицию или лекарственное средство согласно настоящему изобретению, описанные выше, также можно применять для лечения рака, вирусных инфекций и/или расстройств иммунной системы. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения новый вектор/векторную систему или
вирусные частицы согласно настоящему изобретению можно рассматривать как активные агенты. Помимо этого в различных вариантах реализации полинуклеотида согласно настоящему изобретению, т. е., полинуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую новый вектор/векторную систему согласно настоящему изобретению, а также раковые клетки, трансдуцированные или трансфицированные новым вектором/векторной системой или вирусной частицей, описанными в настоящем документе, можно рассматривать как активные агенты. Это применимо, в частности, в отношении терапевтических способов лечения, описанных в настоящем документе.
Настоящее изобретение относится к способу лечения или устранения рака, инфекционного вирусного заболевания (вирусной инфекции) или расстройства иммунной системы, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества нового вектора/векторной системы или вирусной частицы согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к способу лечения или устранения рака, инфекционного вирусного заболевания (вирусной инфекции) или расстройства иммунной системы, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества полинуклеотида согласно настоящему изобретению, т. е. полинуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую новый вектор/векторную систему согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к способу лечения или устранения рака, инфекционного вирусного заболевания (вирусной инфекции) или расстройства иммунной системы, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества иммунной клетки или раковой клетки согласно настоящему изобретению, т. е., иммунной клетки или раковой клетки, трансдуцированной или трансфицированной новым вектором/векторной системой или вирусной частицей, описанными в настоящем документе. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения способ лечения или устранения рака осуществляют как терапию в условиях ex vivo, включая получение раковых клеток у пациента, трансдукцию или трансфекцию аутологичных раковых клеток с применением векторной системы или вирусной частицы, описанных в настоящем документе, и введение пациенту аутологичных раковых клеток, трансдуцированных или трансфицированных новым вектором/векторной системой или вирусной частицей, описанными в настоящем документе. Настоящее изобретение также относится к способу лечения или устранения рака, инфекционного вирусного заболевания (вирусной инфекции) или расстройства иммунной системы, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом,
терапевтически эффективного количества лекарственного средства или композиции согласно настоящему изобретению, описанных выше.
В настоящем документе термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству активного агента, композиции или лекарственного средства, описанных в настоящем документе, которое по меньшей мере устраняет неблагоприятные эффекты заболевания или расстройства (например, рака или инфекционного заболевания).
Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения рак представляет собой любой из рака молочной железы, рака предстательной железы, лимфомы, рака кожи, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, меланомы, злокачественной меланомы, рака яичников, рака головного мозга, карциномы головного мозга, рака головы и шеи, глиомы, глиобластомы, рака печени, рака мочевого пузыря, рака легких, карциномы головы или шеи, карциномы молочной железы, карциномы яичников, карциномы легких, немелкоклеточной карциномы легких, опухоли Вильмса, карциномы шейки матки, карциномы яичек, карциномы мочевого пузыря, карциномы поджелудочной железы, рака предстательной железы, карциномы толстой кишки, карциномы предстательной железы, карциномы мочеполовой системы, карциномы щитовидной железы, карциномы пищевода, миеломы, множественной миеломы, карциномы надпочечников, карциномы почек, карциномы коры надпочечников, злокачественной инсулиномы поджелудочной железы, злокачественной карциноидной карциномы, хориокарциномы, грибкового микоза, злокачественной гиперкальциемии, гиперплазии шейки матки, лейкоза, острого лимфолейкоза, хронического лимфолейкоза, острого миелобластного лейкоза, хронического миелобластного лейкоза, хронического гранулоцитарного лейкоза, острого гранулоцитарного лейкоза, лейкоза ворсистых клеток, нейробластомы, рабдомиосаркомы, саркомы Капоши, истинной полицитемии, эссенциальной тромбоцитемии, ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, саркомы мягких тканей, мезотелиомы, остеогенной саркомы, первичной макроглобулинемии и ретинобластомы.
В других предпочтительных вариантах рак представляет собой любой из меланомы, метастазов рака, аденокарциномы, тимомы, лимфомы, саркомы, рака легких, рака толстой кишки, ходжкинской лимфомы, рака матки, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичников, рака шейки матки, рака почек и рака поджелудочной железы. Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения рак представляет собой урогенитальный рак, предпочтительно рак мочевого пузыря. В других особенно предпочтительных вариантах реализации рак представляет собой рак печени. В других особенно предпочтительных вариантах реализации рак представляет собой рак
кожи. Средства и способы согласно настоящему изобретению также особенно полезны в способах лечения или профилактики метастазов рака.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения рак содержит одну или более опухолей, которые доступны для прямой инъекции в опухоль или вокруг нее активного агента (например, векторной системы или вирусной частицы) или композиции, или лекарственного средства согласно настоящему изобретению. Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения рак содержит плотную опухоль или представляет собой плотную опухоль. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения плотная опухоль представляет собой карциному, саркому или лимфому. В связи с этим, несмотря на то, что лимфомы обычно считаются жидкими опухолями, доступные "плотные" опухоли могут образовываться в лимфатическом узле и, следовательно, их можно лечить в соответствии со способами и вариантами применения, описанными в настоящем документе.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения инфекционное заболевание представляет собой инфекционное заболевание, вызванное патогенной бактерией. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения инфекционное заболевание представляет собой инфекционное заболевание, вызванное вирусом. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения инфекционное заболевание представляет собой инфекционное заболевание, вызванное патогенным паразитом, простейшими или грибками.
Вирусные заболевания, которые можно лечить, защищать от них и/или контролировать их течение в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются ими, те, которые вызваны гепатитом типа А, гепатитом типа В, гепатитом типа С, гриппом (например, вирусом гриппа А или вирусом гриппа В), ветряной оспой, аденовирусом, вирусом простого герпеса типа I (HSV-I), вирусом простого герпеса типа II (HSV-II), риновирусом, эховирусом, ротавирусом, респираторно-синцитиальным вирусом, вирусом папилломы, паповавирусом, цитомегаловирусом, эхиновирусом, арбовирусом, хантавирусом, вирусом Коксаки, вирусом эпидемического паротита, вирусом кори, вирусом краснухи, полиовирусом, вирусом черной оспы, вирусом Эпштейна-Барр, вирусом иммунодефицита человека типа I (ВИЧ-1), вирусом иммунодефицита человека типа II (ВИЧ-П), вирусом Эбола, вирусом Зика и агентами вирусных заболеваний, таких как вирусный менингит, энцефалит, лихорадка денге или черная оспа.
Бактериальные заболевания, вызванные бактериями, которые можно лечить, защищать от них и/или контролировать их течение в соответствии с настоящим
изобретением, включают, но не ограничиваются ими, болезнь Лайма, сибирскую язву, столбняк, холеру, чуму, дифтерию, хламидиоз и коклюш.
Протозоозы, вызванные простейшими, которые можно лечить, защищать от них и/или контролировать их течение в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются ими, лейшманиоз и малярию. Паразитарные заболевания, вызванные паразитами, которые можно лечить, защищать от них и/или контролировать их течение в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются ими, хламидиоз и риккетсиоз.
В настоящем изобретении расстройство иммунной системы характеризуется подавлением иммунной системы, в частности, подавлением иммунного ответа. Новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению позволяет контролировать такие расстройства иммунной системы путем превращения неактивной иммунной микросреды в активную иммунную микросреду, обеспечивая тем самым лечение расстройства иммунной системы.
Аналогичным образом, в настоящем изобретении рак может быть охарактеризован подавлением иммунной системы, в частности, подавлением иммунного ответа. Соответственно, новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению позволяет контролировать или лечить рак путем превращения неактивной иммунной микросреды в активную иммунную микросреду, обеспечивая тем самым лечение или контроль рака.
Помимо этого в настоящем изобретении инфекционное заболевание может быть охарактеризовано подавлением иммунной системы, в частности, подавлением иммунного ответа. Соответственно, новый вектор/векторная система согласно настоящему изобретению позволяет контролировать или лечить инфекционные заболевания путем превращения неактивной иммунной микросреды в активную иммунную микросреду, обеспечивая тем самым лечение или контроль инфекционного заболевания.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения векторная система присутствует в концентрации не более 1 х 1011 инф.в.ч., предпочтительно не более 1 х Ю10 инф.в.ч., более предпочтительно не более 1х109 инф.в.ч., еще более предпочтительно не более 1> <107 или 1х106 инф.в.ч. на единицу дозы. Это применимо, в частности, но не ограничивается ими, к терапевтическим способам лечения, описанным в настоящем документе.
Помимо этого согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения вирусная частица присутствует в концентрации не более 1x10й инф.в.ч., предпочтительно не более 1х1010 инф.в.ч., более предпочтительно не более 1х109 инф.в.ч., еще более
предпочтительно не более 1х107 или 1х106 инф.в.ч. на единицу дозы. Это применимо, в частности, но не ограничивается ими, к терапевтическим способам лечения, описанным в настоящем документе.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения 5хЮ6 инф.в.ч. (инфекционных вирусных частиц) нового вектора/векторной системы или вирусной частицы согласно настоящему изобретению вводят пациенту, нуждающемуся в этом. Согласно различным другим вариантам реализации настоящего изобретения 5хЮ7 инф.в.ч. нового вектора/векторной системы или вирусной частицы согласно настоящему изобретению вводят пациенту, нуждающемуся в этом. Согласно различным другим вариантам реализации настоящего изобретения 5хЮ8 инф.в.ч. нового вектора/векторной системы или вирусной частицы согласно настоящему изобретению вводят пациенту, нуждающемуся в этом.
В настоящем документе термины "лекарственное средство" или "фармацевтическая композиция" могут быть использованы взаимозаменяемо. Лекарственное средство или фармацевтическая композиция может быть в любой форме, например, твердой, полутвердой или жидкой форме, подходящей для введения. Состав может представлять собой любой из, но не ограничиваясь ими, раствора, эмульсии или суспензии. Средства и способы приготовления фармацевтических препаратов согласно настоящему изобретению известны специалистам в данной области техники, и они могут быть произведены с помощью способа, который сам по себе известен. Лекарственное средство (или фармацевтическая композиция) может быть введено в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом или разбавителем. Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в данной области техники и включают, но не ограничиваются ими, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, аминокислоты, стерильный изотонический водный буфер и их комбинации.
Активные агенты (например, новый вектор/векторная система или вирусные частицы), композиции и лекарственные средства согласно настоящему изобретению могут быть введены парентерально. Растворы или суспензии таких активных соединений могут быть получены в воде, подходящим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии также могут быть получены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях в маслах. Иллюстративными маслами являются масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло или минеральное масло. Обычно вода, физиологический раствор, водный раствор декстрозы и раствор сходного
сахара, а также гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, являются предпочтительными жидкими носителями, особенно для инъекционных растворов. В обычных условиях хранения и использования такие препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов. Составы для парентеральной и непарентеральной доставки лекарственных препаратов известны в данной области техники и изложены в руководстве Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, Mack Publishing (1995), которое полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
Фармацевтические формы, пригодные для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть текучей в той степени, чтобы обеспечить легкую проходимость через иглу. Форма должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), подходящие их смеси и растительные масла.
Субъекты, подлежащие лечению в соответствии с настоящим изобретением, являются субъектами, которые подвержены риску развития или у которых развился рак, инфекционное заболевание или расстройство иммунной системы. Такие субъекты включают человека и животных, отличных от человека, предпочтительно млекопитающих или виды птиц. Примерные субъекты-млекопитающие включают, помимо прочего, человека, приматов, отличных от человека, собак, кошек, грызунов, крупный рогатый скот, лошадей, овец и свиней. Примерные субъекты-птицы включают, но не ограничиваются ими, курицу, перепелку, индейку, утку или гуся.
Эффективное количество терапевтического или профилактического активного агента, композиции или лекарственного средства согласно настоящему изобретению определяется на основании предполагаемой цели, например, стимуляции иммунного ответа против опухоли или инфекционного заболевания. Специалистам в данной области техники хорошо известно, как применять доставку генов в условиях in vivo и в условиях ex vivo. Для вирусных векторов обычно готовят исходный раствор вирусного вектора. В зависимости от типа вируса и достижимого титра субъекту будет доставлено по меньшей мере приблизительно, не более чем приблизительно, или приблизительно 1 х 104, 1х105, 1хЮ6, 1хЮ7, 1хЮ8, 1хЮ9, lxlO10, lxlO11 или lxlO12 инфекционных вирусных частиц, или
любое значение или диапазон, который находится в пределах указанных значений. В других аспектах вирусный (ые) вектор (ы) в соответствии с настоящим изобретением можно вводить однократно или многократно. Вирусный (ые) вектор (ы) можно вводить в дозе 1 х 105 инфекционных вирусных частиц (инф.в.ч.), 5х 105 инф.в.ч., по меньшей мере 1 хЮ6 инф.в.ч., 5х106 или приблизительно 5> <106 инф.в.ч., 1> <107, по меньшей мере 1> <107 инф.в.ч., 1 х Ю8 или приблизительно 1> <108 инф.в.ч., по меньшей мере 1> <108 инф.в.ч., приблизительно или по меньшей мере 5> <108 инф.в.ч., 1> <109 или по меньшей мере 1> <109 инф.в.ч., 5хЮ9 или по меньшей мере 5хЮ9 инф.в.ч., 1хЮ10 инф.в.ч. или по меньшей мере 1 хЮ10 инф.в.ч., 5хЮ10 или по меньшей мере 5хЮ10 инф.в.ч., 1 хЮ11 или по меньшей мере 1 хЮ11, 1 хю12 или по меньшей мере lxlO12, 1хЮ13 или по меньшей мере 1хЮ13 инф.в.ч. Например, вирусный (ые) вектор (ы) можно вводить в дозе от примерно 107 до 1013 инф.в.ч., приблизительно 108-1013 инф.в.ч., приблизительно 108-1012 инф.в.ч. или приблизительно 109-1012 инф.в.ч.
Терапевтический эффект может быть достигнут уже при однократном введении активного агента (например, векторной системы или вирусной частицы), композиции или лекарственного средства согласно настоящему изобретению. С другой стороны, лечение может включать несколько введений.
Эффективная доза векторов зависит по меньшей мере от субъекта, нуждающегося в лечении, типа заболевания и стадии заболевания. Доза может варьироваться, например, от приблизительно lxlO8 инф.в.ч. (инфекционных вирусных частиц) до приблизительно lxlO14 инф.в.ч., в частности, от приблизительно lxlO9 инф.в.ч. до приблизительно lxlO13 инф.в.ч., и более конкретно от приблизительно 5х109 инф.в.ч. до приблизительно 1хЮ12 инф.в.ч.
Введение активного агента (например, векторной системы или вирусной частицы), композиции или лекарственного средства согласно настоящему изобретению можно осуществлять любым подходящим способом, известным специалисту в данной области техники. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения введение осуществляют путем внутриопухолевой, внутриартериальной, внутривенной, внутриплевральной, внутривезикулярной, внутриполостной или перитонеальной инъекции или путем перорального введения. В другом варианте реализации настоящего изобретения введение осуществляют внутримышечно, внутрикожно, подкожно, парентерально, интраназально, внутритрахеально, чрескожно, интраспинально, окулярно или интракраниально. Также возможно комбинировать различные пути введения. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения введение осуществляют путем внутриопухолевого введения, т. е. путем введения активного агента
(например, векторной системы или вирусной частицы), композиции или лекарственного средства согласно настоящему изобретению в опухоль.
Активный агент (например, векторную систему или вирусную частицу), композицию или лекарственное средство согласно настоящему изобретению также можно применять совместно (одновременно, последовательно или параллельно) с другими терапевтическими агентами или терапевтическими способами или комбинацией способов лечения. Например, терапевтические способы или варианты применения согласно настоящему изобретению могут дополнительно включать радиотерапию, химиотерапию, введение других лекарственных препаратов, например, антител, нацеленных на механизмы роста опухоли, мишеней контрольной точки иммунных клеток, раковых вакцин, или любые клинические операции.
Как описано в настоящем документе, способы и варианты применения предусмотрены для иммунной стимуляции (т. е. индукции, контроля и/или активации и/или стимуляции механизмов иммунного ответа применительно к лечению рака, инфекционного заболевания или расстройства иммунной системы, в частности, для привлечения или вовлечения клеток, индуцированных, активированных и/или стимулированных с помощью иммунной стимуляции, к представляющему интерес сайту (например, к опухоли или очагу инфицирования слизистой оболочки)). Клетки иммунной системы, которые участвуют в иммунном ответе, обычно называются клетками иммунной системы и включают лимфоциты и нелимфоидные клетки, такие как вспомогательные клетки. Лимфоциты представляют собой клетки, которые специфически распознают и отвечают на чужеродные антигены. Основные классы лимфоцитов включают В-лимфоциты (В-клетки), Т-лимфоциты (Т-клетки) и природные клетки-киллеры (NK), которые являются крупными гранулярными лимфоцитами. В-клетки способны вырабатывать антитела. Т-лимфоциты дополнительно подразделяются и включают хелперные Т-клетки (CD4+ Т-клетки) и цитолитические или цитотоксические Т-клетки (CD8+ Т-клетки). Хелперные клетки секретируют цитокины, которые способствуют пролиферации и дифференцировке Т-клеток и других клеток, включая В-клетки и макрофаги, и привлекают и активируют воспалительные лейкоциты. Другая подгруппа Т-клеток, называемых регуляторными Т-клетками или супрессорными Т-клетками, активно подавляет активацию иммунной системы и предотвращает патологическую аутореактивность, т. е. аутоиммунное заболевание.
Способы иммуностимуляции, описанные в настоящем документе, как полагают, индуцируют опосредуемый клетками иммунный ответ с участием различных типов Т-клеток. При опосредуемом клетками ответе различные типы Т-лимфоцитов устраняют
антиген с помощью ряда механизмов. Например, хелперные Т-клетки, способные распознавать специфические антигены, могут реагировать путем высвобождения растворимых медиаторов, таких как цитокины, для привлечения дополнительных клеток иммунной системы для участия в иммунном ответе. Цитотоксические Т-клетки также способны специфически распознавать антиген и могут реагировать путем связывания и разрушения или повреждения антигенсодержащей клетки или частицы.
Иммунный ответ у хозяина или субъекта может быть определен с помощью любого количества хорошо известных иммунологических способов, известных специалистам в данной области техники. Как описано в настоящем документе, способы и методики определения присутствия и уровня иммунного ответа включают, например, резонансный перенос энергии флуоресценции, поляризацию флуоресценции, резонансный перенос энергии флуоресценции с временным разрешением, сцинтилляционные количественные исследования сближения, количественные исследования репортерного гена, применение тушащего флуоресценцию субстрата фермента, применение хромогенного субстрата фермента и электрохемилюминесценцию, иммунологические количественные исследования (такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунологический анализ, иммуноблоттинг, иммуногистохимия и т. п.), поверхностный плазмонный резонанс, клеточные количественные исследования, такие как те, в которых используют репортерные гены, и функциональные количественные исследования (например, количественные исследования, которые позволяют измерить иммунную функцию и иммунную реактивность).
Подходящие количественные исследования включают, но не ограничиваются ими, определение присутствия и уровня растворимых антител, растворимых медиаторов, таких как цитокины (например, ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-6, ИЛ-23, ФНО-а и TGF-Р), лимфокины, хемокины, гормоны, факторы роста и т.п., а также других растворимых небольших пептидов, углеводов, нуклеотидов и/или липидных медиаторов в условиях in vivo или in vitro. Уровни цитокинов могут быть определены в соответствии со способами, описанными и используемыми в данной области техники, включая, например, ИФА, ELISPOT, окрашивание внутриклеточных цитокинов, а также проточную цитометрию и их комбинации (например, окрашивание внутриклеточных цитокинов и проточная цитометрия).
Иммунологические количественные исследования также включают определение изменений состояния активации клеток путем анализа измененных функциональных или структурных свойств клеток иммунной системы, например, пролиферации клеток, измененной подвижности, индукции специализированных видов активности, таких как
специфическая экспрессия генов или цитолитическое поведение; созревания клеток, такого как созревание дендритных клеток в ответ на стимул; изменения взаимосвязи между ответом ТЫ и ответом Th2; клеточной дифференцировки клетками иммунной системы, включая измененные профили экспрессии поверхностного антигена или начало апоптоза (запрограммированной гибели клеток). Другие способы также доступны для измерения маркеров клеточной поверхности, чтобы идентифицировать различные популяции иммунных клеток, таких как, но не ограничиваясь ими, антигенспецифические CD4+ и/или CD8+ Т-клетки, эффекторные Т-клетки памяти (Tern), Т-клетки центральной памяти (Теш) и/или резидентные Т-клетки памяти в тканях (Тип). Способы проведения указанных и сходных количественных исследований описаны в литературе. Количественные исследования цитотоксичности для определения активности ЦТЛ (или активности CD8+ Т-клеток) могут быть выполнены с использованием любых из нескольких методик и способов, обычно применяемых в данной области техники.
В конкретных вариантах реализации наблюдается увеличение в 2-50 раз количества локальных инфильтрирующих антигенспецифических Т-клеток в соответствии с описанными в настоящем документе способами и вариантами применения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения наблюдается увеличение в 2-40 раз, увеличение в 2-30 раз, увеличение в 2-20 раз, увеличение в 2-10 раз, увеличение в 3-8 раз, увеличение в 4-7 раз или 5-6 раз количества локально инфильтрирующих (например, инфильтрирующих опухоль) антигенспецифических Т-клеток. Обычно увеличение количества локально инфильтрирующих антигенспецифических Т-клеток сопоставляют с количеством локально инфильтрирующих антигенспецифических Т-клеток, присутствующих в отсутствие введения, или сопоставляют с соответствующим контролем. Способы и варианты применения, описанные в настоящем документе, как полагают, обеспечивают увеличение статистически, биологически и/или клинически значимым путем количества локально инфильтрирующих антигенспецифических Т-клеток по сравнению с соответствующим контролем в отсутствие введения активного агента, композиции или лекарственного средства согласно настоящему изобретению.
Биологический образец может быть получен от субъекта для определения присутствия и уровня иммунного ответа у субъекта, которого лечили с применением активного агента (например, векторной системы или вирусной частицы), композиции или лекарственного средства согласно настоящему изобретению в соответствии со способами, описанными в настоящем документе. В настоящем документе "биологический образец" может представлять собой образец крови (из которого может быть получена сыворотка или плазма крови), образец афереза, образец биопсии, образец биопсии опухоли,
биологические жидкости (например, легочной смыв, асциты, смывы слизистой оболочки, синовиальную жидкость), костный мозг, лимфатические узлы, эксплантат ткани, органную культуру или любой другой препарат ткани или клетки от субъекта или биологического источника.
В отношении всех иммунологических количественных способов исследований и способов, описанных в настоящем документе для определения иммунного ответа, специалист в данной области техники также легко определит и поймет, какие контроли соответствующим образом включены при реализации указанных способов. Концентрации компонентов реакции, буферы, температура и период времени, достаточный для обеспечения взаимодействия компонентов реакции, могут быть определены и/или скорректированы в соответствии со способами, известными специалисту в данной области техники.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ увеличения количества Т-клеток в микроокружении опухоли, включающий введение субъекту, имеющему опухоль, активного агента (например, векторной системы или вирусной частицы), композиции или лекарственного средства согласно настоящему изобретению в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, индуцируя тем самым иммунный ответ против опухоли.
Специалист в области медицины поймет, что термины "лечить" и "лечение" относятся к медицинскому контролю заболевания, расстройства или состояния субъекта (т.е. пациента). Обычно подходящая доза и схема лечения обеспечивают активный агент (например, векторную систему или вирусную частицу), композицию или лекарственное средство согласно настоящему изобретению в количестве, достаточном для обеспечения терапевтической и/или профилактической пользы. Терапевтическая и/или профилактическая польза включает, например, улучшенный клинический исход, как терапевтическое лечение, так и профилактические или превентивные меры, при которых целью является предотвращение или замедление или задержка (уменьшение) нежелательного физиологического изменения или расстройства, или предотвращение или замедление или задержка (уменьшение) распространения или степени тяжести такого заболевания или расстройства. Благоприятные или желательные клинические исходы лечения субъекта включают, но не ограничиваются ими, уменьшение выраженности, ослабление или облегчение симптомов, которые возникают или связаны с заболеванием или расстройством, подлежащим лечению; уменьшение частоты симптомов; улучшение качества жизни; более длительный безрецидивный статус (т.е., уменьшение вероятности возникновения или предрасположенности субъекта к возникновению симптомов, на
основании которых ставится диагноз заболевания); уменьшение степени заболевания; стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) состояние заболевания; задержку или замедление прогрессирования заболевания; улучшение или ослабление патологического состояния; и ремиссию (будь то частичную или полную), независимо от того, является она детектируемой или недетектируемой; и/или общую выживаемость. "Лечение" также может означать увеличение периода выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью, если пациент не получал лечение. Субъектами, нуждающимися в лечении, являются те, у кого уже имеется заболевание или расстройство, а также субъекты, подверженные риску развития заболевания или расстройства.
Молекулы нуклеиновых кислот, включая векторные системы в соответствии с настоящим изобретением, могут быть доставлены в клетку в соответствии с любым из нескольких способов, описанных в данной области техники. Подходящие способы доставки, известные специалистам в данной области техники, включают, но не ограничиваются ими, инкапсулирование в липосомах, доставку путем ионофореза или путем включения в другие носители, такие как биоразлагаемые полимеры; гидрогели; циклодекстрины; сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты (PLGA) и микросферы PLCA; биоразлагаемые нанокапсулы; и биоадгезивные микросферы, или доставку с помощью белковых векторов.
Настоящее изобретение относится к комбинации белков, содержащей лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), ИЛ-2 и одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12), причем количество 4-1BBL превышает количество оцИЛ-12 и ИЛ-2.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения лиганд 4-1ВВ содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 2 (Фигура 13), причем указанный лиганд 4-1ВВ способен специфически связывать Т-клетки, предпочтительно активированные CD4+ хелперные Т-клетки и CD8+ Т-клетки. Предпочтительно лиганд 4-1ВВ содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 2 (Фигура 13), причем указанный лиганд 4-1ВВ способен специфически связывать Т-клетки, предпочтительно CD8+ Т-клетки. Более предпочтительно лиганд 4-1ВВ содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 2 (Фигура 13), причем указанный лиганд 4-1ВВ способен специфически связывать Т-клетки, предпочтительно активированные CD4+ хелперные Т-клетки и CD8+ Т-клетки. Еще более
предпочтительно лиганд 4-1ВВ содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 2 (Фигура 13), причем указанный лиганд 4-1ВВ способен специфически связывать Т-клетки, предпочтительно активированные CD4+ хелперные Т-клетки и CD8+ Т-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты 4-1BBL, описанные выше, проявляют аналогичную специфичность связывания в отношении Т-клеток, предпочтительно в отношении активированных CD4+ хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и нативный 4-1BBL, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 2 (Фигура 13).
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность белка ИЛ-2 по меньшей мере на 70% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 4 (Фигура 14), причем указанный белок ИЛ-2 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Предпочтительно последовательность белка ИЛ-2 по меньшей мере на 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 4 (Фигура 14), причем указанный белок ИЛ-2 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Более предпочтительно последовательность белка ИЛ-2 по меньшей мере на 90% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 4 (Фигура 14), причем указанный белок ИЛ-2 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Еще более предпочтительно последовательность белка ИЛ-2 по меньшей мере на 95% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 4 (Фигура 14), причем указанный белок ИЛ-2 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты ИЛ-2, описанные выше, проявляют аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и нативный ИЛ-2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 4 (Фигура 14).
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения белок оцИЛ-12 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%
гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 6 (Фигура 15), причем указанный белок оцИЛ-12 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении моноцитов, хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Предпочтительно белок оцИЛ-12 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6 (Фигура 15), причем указанный белок оцИЛ-12 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении моноцитов, хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Более предпочтительно белок оцИЛ-12 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6 (Фигура 15), причем указанный белок оцИЛ-12 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении моноцитов, хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток. Еще более предпочтительно белок оцИЛ-12 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична или идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6 (Фигура 15), причем указанный белок оцИЛ-12 обладает иммуностимулирующей активностью, предпочтительно стимулирующей активностью в отношении моноцитов, Т-хелперов и CD8+ Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты зсИЛ-2, описанные выше, проявляют аналогичную иммуностимулирующую активность, предпочтительно стимулирующую активность в отношении моноцитов, хелперных Т-клеток и CD8+ Т-клеток, как и нативный зсИЛ-2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 6 (Фигура 15).
Как описано в настоящем документе, белок считается белком оцИЛ-12, если он содержит аминокислотную последовательность, содержащую две субъединицы р35 и р40 нативного белка ИЛ-12 в виде гибридного белка. Последовательности, представленные в SEQ Ш N0: 8 и 10, представляют собой аминокислотную последовательность субъединиц 40 кДа и 35 кДа ИЛ-12 человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты оцИЛ-12, описанные выше, проявляют аналогичную иммуностимулирующую активность, как и нативный оцИЛ-12, кодируемый аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ Ш N0: 8 и 10. Предпочтительно линкер оцИЛ-12 согласно настоящему изобретению представляет собой пептидный или полипептидный линкер. В объем настоящего изобретения включены варианты оцИЛ-12, описанные в настоящем документе, в которых, в частности, линкерная последовательность, выделенная жирным шрифтом на Фигуре 15 (SEQ Ш N0: 5 и 6),
модифицирована, в частности, в отношении длины линкерной последовательности. Длина аминокислотной последовательности линкера может быть выбрана эмпирическим путем или на основании структурной информации, или с использованием комбинации двух подходов. Специалисты в данной области техники поймут, что существует множество таких последовательностей, которые различаются по длине или составу, которые могут служить в качестве линкеров, при этом требуется учитывать, что они не должны быть слишком длинными или слишком короткими.
Новый вектор/векторная система или вирусные частицы согласно настоящему изобретению могут быть упакованы в виде наборов. Наборы могут необязательно включать один или более компонентов, таких как инструкции по применению и введению, устройства (например, для введения субъекту композиции или композиций) и дополнительные реагенты и компоненты, такие как трубки, контейнеры, например, флаконы и шприцы для реализации способов и вариантов применения. Наборы, содержащие полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую векторную систему согласно настоящему изобретению, также включены в объем настоящего изобретения. В объем настоящего изобретения также включены наборы, содержащие раковую клетку, трансдуцированную или трансфицированную векторной системой или вирусной частицей согласно настоящему изобретению. В объем настоящего изобретения также включены наборы, содержащие активный агент, композицию или лекарственное средство согласно настоящему изобретению.
В объем настоящего изобретения также включены наборы, содержащие новый вектор/векторную систему согласно настоящему изобретению и необязательно полинуклеотидную последовательность, кодирующую фактор созревания.
В соответствии с настоящим описанием в объем настоящего изобретения включены, но не ограничиваются ими, следующие пункты, которые необходимо рассматривать применительно к аспектам и вариантам реализации, описанным в настоящем документе в другом месте:
1. Вектор, содержащий последовательности нуклеиновых кислот генов, кодирующих лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2, причем указанные гены расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2, 3, при условии, что ген, кодирующий оцИЛ-12, не находится в положении 1.
2. Вектор по п. 1, который характеризуется тем, что указанный вектор представляет собой любой из аденовирусного вектора, вектора на основе аденоассоциированного вируса, лентивирусного вектора, ретровирусного вектора, вектора на основе вируса
1.
простого герпеса, поксвирусного вектора, РНК-вектора, плазмидного вектора, вектора на основе наночастиц, а также депротеинизированной ДНК.
3. Вектор по п. 2, который характеризуется тем, что указанный РНК-вектор содержит вставленные модифицированные рибонуклеотиды.
4. Вектор по любому из пп. 1-3, который характеризуется тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего 4-1BBL, представляет собой кДНК человека, последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего оцИЛ-12, представляет собой кДНК человека и/или последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего ИЛ-2, представляет собой кДНК человека.
5. Вектор по любому из пп. 1-4, который характеризуется тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего 4-1BBL, по меньшей мере на 70% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш NO: 1 (Фигура 13), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок 4-1BBL, способный специфически связывать Т-клетки, предпочтительно активированные Т-клетки.
6. Вектор по любому из пп. 1-4, который характеризуется тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего ИЛ-2, по меньшей мере на 70% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 3 (Фигура 14), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок ИЛ-2, обладающий иммуностимулирующей активностью.
7. Вектор по любому из пп. 1-4, который характеризуется тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего оцИЛ-12, по меньшей мере на 70% гомологична или идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 5 (Фигура 15), причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок оцИЛ-12, обладающий иммуностимулирующей активностью.
8. Вектор по любому из пп. 1-7, который характеризуется тем, что указанные последовательности нуклеиновых кислот генов, кодирующих оцИЛ-12 и ИЛ-2, расположены в 3'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты гена, кодирующего 4-1BBL.
9. Вектор по п. 8, который характеризуется тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего ИЛ-2, расположена в 3'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты гена, кодирующего 4-1BBL, и последовательность нуклеиновой кислоты гена, кодирующего оцИЛ-12, расположена в 3'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ИЛ-2.
3.
10. Вектор по п. 8 или 9, который характеризуется тем, что промотор расположен в 5'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты гена, кодирующего 4-1BBL, но не в 5'-направлении относительно последовательностей нуклеиновых кислот генов, кодирующих оцИЛ-12 и/или ИЛ-2,
11. Вектор по любому из пп. 8-10, который характеризуется тем, что указанные последовательности нуклеиновых кислот генов, кодирующих 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, соединены сайтами внутренней посадки рибосомы (IRES).
12. Вирусная частица, содержащая вектор по любому из пп. 1-11.
13. Полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты,
кодирующую вектор по любому из пп. 1-11.
14. Раковая клетка или иммунная клетка, трансдуцированная или трансфицированная вектором по любому из пп. 1-11 или вирусной частицей по п. 12.
15. Композиция, содержащая вектор по любому из пп. 1-11, вирусную частицу по п. 12, полинуклеотид по п. 13 или раковую клетку или иммунную клетку по п. 14.
16. Лекарственное средство, содержащее вектор по любому из пп. 1-11, вирусную частицу по п. 12, полинуклеотид по п. 13 или раковую клетку или иммунную клетку по п. 14.
17. Вектор по любому из пп. 1-11, вирусная частица по п. 12, полинуклеотид по п. 13, раковая клетка или иммунная клетка по п. 14, композиция по п. 15 или лекарственное средство по п. 16 для применения в способе лечения рака, вирусной инфекции и/или расстройства иммунной системы.
18. Вектор для применения в соответствии с п. 17, вирусная частица для применения в соответствии с п. 17, полинуклеотид для применения в соответствии с п. 17, раковая клетка или иммунная клетка для применения в соответствии с п. 17, композиция для применения в соответствии с п. 17, или лекарственное средство для применения в соответствии с п. 17, причем указанный рак представляет собой любой из рака молочной железы, рака предстательной железы, лимфомы, рака кожи, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, меланомы, злокачественной меланомы, рака яичников, рака головного мозга, первичной карциномы головного мозга, рака головы и шеи, глиомы, глиобластомы, рака печени, рака мочевого пузыря, немелкоклеточного рака легких, карциномы головы или шеи, карциномы молочной железы, карциномы яичников, карциномы легких, немелкоклеточной карциномы легких, опухоли Вильмса, карциномы шейки матки, карциномы яичек, карциномы мочевого пузыря, карциномы поджелудочной железы, карциномы желудка, карциномы толстой кишки, карциномы предстательной железы, карциномы мочеполовой системы, карциномы щитовидной железы, карциномы
14.
пищевода, миеломы, множественной миеломы, карциномы надпочечников, карциномы почек, карциномы эндометрия, карциномы коры надпочечников, злокачественной инсулиномы поджелудочной железы, злокачественной карциноидной карциномы, хориокарциномы, грибкового микоза, злокачественной гиперкальциемии, гиперплазии шейки матки, лейкоза, острого лимфолейкоза, хронического лимфолейкоза, острого миелобластного лейкоза, хронического миелобластного лейкоза, хронического гранулоцитарного лейкоза, острого гранулоцитарного лейкоза, лейкоза ворсистых клеток, нейробластомы, рабдомиосаркомы, саркомы Капоши, истинной полицитемии, эссенциальной тромбоцитемии, ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, саркомы мягких тканей, мезотелиомы, остеогенной саркомы, первичной макроглобулинемии и ретинобластомы.
19. Вектор по любому из пп. 1-11, вирусная частица по п. 12, композиция по п. 13 или лекарственное средство по п. 14 для применения в способе предотвращения или лечения метастазов рака.
20. Вектор для применения по любому из пп. 17-19, который характеризуется тем, что указанная векторная система присутствует в концентрации не более 1 х 1011 инф.в.ч. (инфекционных вирусных частиц), предпочтительно не более 1 х Ю10 инф.в.ч., более предпочтительно не более lxlO9 инф.в.ч., еще более предпочтительно не более lxlO7 инф.в.ч. или lxlO6 инф.в.ч. на единицу дозы.
21. Вирусная частица для применения по любому из пп. 17-19, которая характеризуется тем, что указанная вирусная частица присутствует в концентрации не более 1 х Ю11 инф.в.ч., предпочтительно не более 1хЮ10 инф.в.ч., более предпочтительно не более 1хЮ9 инф.в.ч., еще более предпочтительно не более lxlO7 инф.в.ч. или lxlO6 инф.в.ч. на единицу дозы.
22. Комбинация белков, содержащая лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), ИЛ-2 и одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12), причем количество 4-1BBL превышает количество оцИЛ-12иИЛ-2.
Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами, клеточными линиями, родами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена исключительно для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения.
Нижеследующие примеры представлены в качестве иллюстрации и не являются ограничивающим.
Другие варианты реализации и варианты применения будут очевидны для специалиста в данной области техники в соответствии с настоящим описанием. Нижеследующие примеры представлены лишь в качестве иллюстрации различных вариантов реализации и не должны быть истолкованы, как ограничивающие настоящее изобретение каким-либо образом.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Экспрессия трансгенов ИЛ-12, ИЛ-2 и 4-1BBL, а также ответ ИФН-у для ImOl мыши и человека
ImOl представляет собой аденовирусный вектор, содержащий конструкцию для экспрессии, содержащую гены человека для одноцепочечного ИЛ-12, 4-1BBL и ИЛ-2 в порядке, представленном на следующей схеме:
Конструкция вектора ImOl описана в WO 2004/035799, и представленная выше схема приведена на Фигуре 1 в WO 2004/035799. В WO 2004/036799 вектор назван "Ad-З". В настоящем изобретении внутренним кодом вектора для более раннего варианта вектора является ImO 1.
Клетки линии А549 человека и клетки линии Нера1-6 мыши трансдуцировали в течение одного часа с применением ImOl, несущего три гена человека или мыши, соответственно, при указанной множественности заражения (MOI, числа, указанные в [скобках]). Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) или лимфоциты мыши добавляли через 4 часа после трансдукции, и супернатанты собирали для количественного исследования цитокинов через 34 часа совместного культивирования. Уровни цитокинов детектировали с помощью ИФА (eBioscience). Опухолевые клетки отделяли от подложки и количественно исследовали методом проточной цитометрии для оценки экспрессии 4-1BBL. Согласно полученным результатам, даже несмотря на то, что структура вектора мыши и вектора человека идентична, уровень экспрессии трансгенов четко различался для видов человека и мыши, причем при применении ImOl человека экспрессия ИЛ-12 была в 15 раз выше, чем при применении ImOl мыши. В клинических условиях такие повышенные уровни ИЛ-12 могут быть токсичными и ограничивают терапевтическое применение.
Пример 2: Обзор дизайна вектора и исследования
1т02
Вектор согласно настоящему изобретению разрабатывали и получали для имитационного исследования терапии в условиях ex vivo. Вектор основан на аденовирусном векторе и назван Im02 (внутренний код вектора "Im02"). Im02 содержал конструкцию для экспрессии, содержащую гены человека для 4-1BBL, ИЛ-2 и одноцепочечного ИЛ-12 (оцИЛ-12) в порядке, представленном на следующей схеме:
На Фигуре 2 представлена схема генной карты челночной плазмиды pEl.l Im02. Кассета для экспрессии Im02 показана в виде предшественника плазмиды для переноса на основе плазмиды рЕ 11, подходящего для субклонирования в плазмиду, несущую, например, ДНК аденовирусного вектора. Более конкретно кассета для экспрессии, содержащаяся в аденовирусном векторе Im02, представляла собой кассету для экспрессии, представленную на Фигуре 18, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ Ш N0: 12. Было установлено, что вектор согласно настоящему изобретению индуцировал механизмы иммунной защиты против опухолевых клеток при раке мочевого пузыря путем поливалентной модификации внутриопухолевого иммунного микроокружения.
Обзор когорт пациентов
В качестве модели исследования новой векторной системы выбрали культуры образцов биопсии опухоли человека в условиях ex vivo. Образцы были предоставлены клиникой урологии больницы Асклепиос, Гамбург-Бармбек. В общей сложности исследовали 244 образца опухолей и 270 контрольных биопсий нормальной ткани мочевого пузыря у 43 пациентов. У восьми пациентов образцы собирали во время трансуретральной резекции (ТУР), основную часть образцов, включенных в исследование, получили в результате цистэктомии. В данном исследовании ткани опухоли и мочевого пузыря исследовали на самых разных стадиях заболевания, от ранней до поздней стадии. Исследовали образцы от 16 женщин и 27 мужчин. Предварительная обработка в этой когорте пациентов включала последовательные ТУР, химиотерапию или антиандрогенную терапию из-за сопутствующей диагностики рака предстательной железы.
Пример 3. Экспрессия трансгенов 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, а также ответ ИФН-у для Im02 и более раннего вектора ImOl
Сравнивали экспрессию трансгенов 4-1BBL, ИЛ-2 и ИЛ-12, а также ответ ИФН-у для Im02 (см. пример 2) и более раннего вектора ImOl (см. пример 1).
Клетки А549 человека трансдуцировали в течение одного часа с применением ImOl или Im02 при MOI (множественность заражения, т.е. количество инфекционных вирусных частиц на клетку-мишень), указанной на Фигуре 3 (значения MOI приведены в скобках). Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) добавляли через 4 часа после трансдукции, и супернатанты собирали для количественного исследования цитокинов через 34 часа совместного культивирования. Уровни цитокинов детектировали с помощью ИФА. Опухолевые клетки отделяли от подложки, и 4-1ВВЬ-положительные клетки детектировали методом проточной цитометрии. Указанные точки данных представляют собой среднее значение для четырех индивидуальных доноров с четырьмя повторами для каждого из них.
Как показано на Фигуре 3, расположение генов 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12 в Im02 обеспечивало повышенную экспрессию 4-1BBL по сравнению с расположением тех же генов в ImOl, с одновременным снижением уровня ИЛ-12, что приводило к увеличению ответа ИФН-у.
В частности, расположение генов 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12 в Im02 привело в среднем к 1,7-кратному увеличению экспрессии 4-1BBL и 1,5-кратному увеличению экспрессии ИЛ-2, по сравнению с расположением генов в более раннем векторе ImOl. Эти данные согласуются с 2,6-кратным снижением уровня экспрессии ИЛ-12. При расположении генов в Im02 молярное соотношение ИЛ-2/ИЛ-12 в среднем увеличивалось с 2,5% до 9,1%. Помимо этого более высокая экспрессия ИЛ-2 и 4-1BBL привела к 1,4-кратному увеличению индукции ИФН-у, которое детектировали при всех диапазонах доз, М012,5, 5, 10 и 50.
Im02 обеспечивал ответ ИФН-у, который превосходил ответ для ImOl. В результате этого Im02 проявлял улучшенный эффект при иммуностимуляции по сравнению с более ранним вектором ImOl.
Пример 4: Сравнение отдельных векторов и Im02 и ImOl в тканевой модели
Исследовали варианты лечения с однократным введением с применением аденовирусных векторов, экспрессирующих только оцИЛ-12, ИЛ-2 или 4-1BBL, а также Im02 и ImOl (см. пример 1 для получения дополнительной информации о последнем).
Чтобы исследовать действие Im02 на микроокружение опухоли, создавали имитационную модель терапии, основанную на образцах недиссоциированной опухолевой ткани. Использовали образцы, полученные в результате трансуретральной резекции или цистэктомии мочевого пузыря.
Ткани опухоли мочевого пузыря ("Т") и нормальные ткани мочевого пузыря ("В") трансдуцировали с использованием 108 инф.в.ч. (инфекционных вирусных частиц) Im02
или ImOl. Жизнеспособность образцов тканей опухоли и мочевого пузыря контролировали в супернатантах культуральной среды с использованием ферментативного количественного исследования на основе высвобождения ЛДГ. Экспрессию трансгенов и ответ ИФН-у измеряли с помощью ИФА в супернатанте культуры на 6 день после трансдукции. Результаты представлены на Фигуре 4. Даже при высоких уровнях экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2 по отдельности ответ ИФН-у близок к неспецифическому сигналу. Этот результат указывал на кооперативное действие трех генов в тканях мочевого пузыря и опухолевых тканях. Кроме того, Im02 привел к увеличению уровня ИЛ-2 и ответа ИФН-у по сравнению с ImOl. На Фигуре 4 представлены результаты, свидетельствующие об улучшенном действии Im02 при иммуностимуляции в микроокружении опухоли, по сравнению с более ранним вектором ImOl.
Пример 5: Сравнение Im02 и ImOl при разных уровнях дозы
Сравнивали действие повышающихся доз Im02 и ImOl (см. пример 2 и 3 для получения дополнительной информации об этих векторах) на экспрессию трансгенов и ответ ИФН-у в микроокружении опухоли.
Образцы опухолей получали от индивидуальных пациентов, и соответствующие пары опухолевых тканей мочевого пузыря ("Т") и нормальных тканей мочевого пузыря ("В") исследовали при уровнях доз 107 и 108 инф.в.ч. (инфекционных вирусных частиц). Экспрессию измеряли на 6 день с помощью ИФА. Результаты представлены на Фигуре 5. При разных уровнях дозы Im02 обеспечивал ответ ИФН-у, который превосходил ответ для ImOl. Полученные результаты указывали на то, что Im02 при разных уровнях дозы проявлял улучшенный эффект при иммуностимуляции в микроокружении опухоли по сравнению с более ранним вектором ImOl.
Пример 6: Определение профиля экспрессии генов для Im02 и ImOl
Исследование транскриптома проводили, чтобы показать профиль экспрессии терапевтического гена для Im02. В частности, для того чтобы получить полный профиль активации лейкоцитов под действием Im02 и ImOl, опухолевые клетки из эксперимента с совместным культивированием опухолевых клеток и МКПК трансдуцировали с использованием Im02, ImOl и AdO (пустой вектор), и проводили анализ активности гена мРНК (анализ экспрессии всего генома Illumina Chip НТ12) лейкоцитов. С этой целью периферические лейкоциты добавляли к совместной культуре после трансдукции. Лейкоциты на нетрансдуцированных опухолевых клетках использовали в качестве контроля. Через 4, 24, 32, 48, 72 и 96 часов лейкоциты собирали, и РНК выделяли и очищали. После проверки качества РНК подвергали обратной транскрипции в
комплементарную ДНК (кДНК), вводили метку в соответствии с протоколом для гранулы-чипа, загружали на гранулы-чипы НТ12 и выполняли сканирование (Life &Brain, Департамент генетики человека в Боннском университете). Полученные данные переносили в программное обеспечение GenomeStudio (Illumina). Впоследствии данные оценивали с использованием программного обеспечения ГРА(r) (Ingenuity). Проводили основной анализ, который выявил различно регулируемые процессы. Чтобы получить общее представление о регулируемых процессах и проиллюстрировать их значимость и вовлеченное количество молекул, проводили анализ процессов с помощью IPA(r). См. Таблицы 1 и 2:
Таблица 1: Im02, пять наиболее сильно регулируемых процессов через 24 часа
Название
Р-значение
Кол-во молекул
Межклеточная передача сигналов и взаимодействие
8,05х10-17-7,51х10-3
Гибель и выживаемость клеток
1,27х10-и-7,77х10-3
Клеточные функции и поддержание
8,69xl0-u-7,16xl0-3
Размножение и пролиферация клеток
1,39х10-9-7,16х10-3
Нарушение функции клеток
3,44х10-8-3,39х10-3
Развитие и функция физиологической системы
Название
Р-значение
Кол-во молекул
Развитие и функция гематологической системы
8,05х10-17-7,51х10-3
Перемещение иммунных клеток
8,05х10-17-7,51х10-3
Развитие ткани
4,10х10-7-6,95х10-3
Кроветворение
1,04х10-6-6,95х10-3
Морфология ткани
2,17х10-6-6,95х10-3
Полученные результаты указывали на то, что Im02 обеспечивал иммуностимуляцию, которая характеризовалась "опосредуемым клетками иммунным ответом" с участием 61 регулируемого гена (см. таблицу 1, нижняя часть) среди пяти наиболее сильно регулируемых процессов развития и функции физиологической системы (в соответствии с достоверностью и количеством вовлеченных молекул). Для ImOl (см. таблицу 2, нижняя часть) эта функция (т.е., "опосредуемый клетками иммунный ответ") не входила в пять наиболее сильно регулируемых процессов развития и функции физиологической системы, поскольку в данном исследовании только 28 молекул дифференциально регулировались. Другие системы, упомянутые в таблице (например, гематологическая система, перемещение иммунных клеток, морфология тканей и общее развитие тканей), указывали на обширные изменения, вызванные поливалентной иммунной терапией. На основании данных анализа транскриптома следовало, что профиль экспрессии терапевтического гена для Im02 являлся уникальным и превосходным, в частности, он превосходил профиль экспрессии для более раннего вектора ImOl.
Регулируемые процессы были отнесены к специфично регулируемым (клеточным) функциям с использованием программного обеспечения IP A(r) (Ingenuity Pathway Analysis, Qiagen). Это позволяет получить более точную информацию об активации/инактивации биологических процессов.
Полученные результаты указывали на то (данные не представлены), что пять наиболее сильно индуцированных функций включали активацию лимфоцитов, активацию мононуклеарных лейкоцитов, цитотоксичность лейкоцитов, дифференцировку мононуклеарных лейкоцитов и активацию Т-лимфоцитов (Т-клеток).
Пример 7: Анализ экспрессии генов для определения активации основных типов иммунных клеток
Активацию основных типов иммунных клеток в течение 96 часов исследовали с использованием программного обеспечения CELLMIX, которое позволяет анализировать данные по экспрессии генов, чтобы определить присутствие и состояние активации всех основных типов иммунных клеток. Тепловой график на Фигуре 6 иллюстрирует активацию всех основных подтипов иммунных клеток крови, за исключением В-клеток (мононуклеарных клеток периферической крови, МКПК) в течение 4 дней (96 часов) в совместной культуре с клетками карциномы мочевого пузыря человека RT-4. Как показано на Фигуре 6, активация хелперных Т-клеток и цитотоксических Т-клеток с помощью Im02 превосходила активацию аналогичных клеток иммунной системы с помощью ImO 1.
Пример 8: Результаты исследования ткани в условиях ex vivo Установление тканевого профиля с помощью гистологии
Изменение качества ткани и клеточного состава контролировали в срезах тканей после фиксации формалином и заливки парафином или после замораживания и фиксации ткани. Общее качество оценивали после окрашивания гематоксилином-эозином (ГЭ).
Как показано на Фигуре 7, Im02 индуцировал гистологические перегруппировки (С), которые не наблюдали при использовании контрольного вектора AdO (В) или векторов, кодирующих отдельные гены (данные не представлены). Индуцированные Im02 морфологические изменения, наблюдаемые в опухолевых тканях (Фигура 7, панель С), включали количество и распределение инфильтратов иммунных клеток в отношении тканей, обработанных контрольным вектором AdO/AdNull (панель В) или векторами, кодирующими отдельные гены (данные не представлены).
Помимо этого на Фигуре 8 представлены результаты, указывающие на то, что Im02 индуцировал явные гистологические изменения распределения и частоты инфильтратов лейкоцитов. Стрелка на нижней панели на Фигуре 8 указывает на область опухоли с
признаками гибели клеток. Эти морфологические изменения обеспечивают гистологическое доказательство индуцированного Im02 иммунного ответа. Идентификация типов клеток-мишеней
Для того чтобы установить, помимо всего прочего, тип клеток-мишеней, поглощающих частицы аденовируса, путь поглощения, который идентифицируют на основании присутствия и морфологии мембранных везикул, и относительное количество частиц на клетку, ткани, трансдуцированные Im02, исследовали методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).
Опухолевую ткань после цистэктомии иссекали и трансдуцировали путем погружения образца в 500 мкл культуральной среды, содержащей 108 инф.в.ч. Im02, в течение 1 часа при 37 °С, поглощение останавливали путем замены среды ледяным раствором для фиксации, содержащим 2% глутарового альдегида. Образцы тканей затем обрабатывали с помощью стандартных процедур, и изображения получали с помощью просвечивающей электронной микроскопии, обеспечиваемой Vironova SA, Стокгольм, Швеция.
В случае положительного окрашивания, согласно результатам просвечивающей электронной микроскопии, аденовирусные частицы идентифицировали на основании их размера приблизительно 80 нм и по геометрии частиц. Результаты представлены на Фигуре 9. Через один час трансдукции аденовирусные частицы Im02 детектировали в различных типах клеток, согласно результатам определения с помощью ультраструктурных морфологических исследований. Присутствие и морфология везикулярных структур вокруг аденовирусных частиц указывали на механизм поглощения.
На основании индивидуальной морфологии различные типы клеток обнаруживали как клетки-мишени в образцах карциномы мочевого пузыря, включая опухолевые клетки (не показаны), клетки соединительной ткани (фибробласт, панель 4) стромы опухоли и иммунные клетки. Аденовирусные частицы детектировали в клетках, имевших морфологию лимфоцитов (панель 3) и моноцитов (панель 2). При карциноме мочевого пузыря морфология моноцитов указывает на наличие клеток Лангерганса, макрофагов или дендритных клеток.
Важно отметить, что этот результат имеет особое значение для установления механизма действия, поскольку описано, что все идентифицированные иммунные клетки-мишени подвергаются активации и дифференцировке в разные типы эффекторных клеток после трансдукции цитокинами, несмотря на то, что было показано, что экспрессия 4-1BBL поддерживает процессы активации, при его экспрессии в антигенпрезентирующих
клетках и на лимфоцитах, с помощью обратной передачи сигнала (Ju et al., 2009, International Immunology, 21(10), 1135-1144).
Путь поглощения и относительное количество: аденовирусные частицы обнаруживали в цитоплазме клеток-мишеней в разных местоположениях и с различным окружением. Классическое поглощение опосредуется после связывания с рецептором Коксаки и аденовируса с последующим переносом в эндоцитозные везикулы.
Предполагается, что данный путь активен на панели 6А, где изображение частицы получено в процессе образования везикул. На панели 6В аденовирусная частица расположена в большой везикуле, также содержащей другие неопределенные структуры, что указывает на пиноцитозный путь поглощения. На панели ЗА аденовирусная частица была захвачена в замкнутой мембранной структуре, что указывает на более поздние стадии эндоцитозного поглощения.
Воздействие Im02 на образцы ткани в течение лишь одного часа было выбрано в соответствии с будущим интравезикулярным протоколом инстилляции. В данной тканевой модели частицы достигали областей на глубине нескольких клеточных слоев. Были выявлены регулярные группы до 30 аденовирусных частиц на клетку (панель 5А).
Пример 9: Сравнение дифференциальной экспрессии в образцах нормальной ткани мочевого пузыря и опухоли мочевого пузыря
Нормальную ткань и опухолевую ткань мочевого пузыря трансдуцировали с использованием 108 инф.в.ч. Im02. Культуры поддерживали до 6 дня. Дифференциальную экспрессию определяли по сравнению с образцами, обработанными AdO (пустой аденовирусный вектор) в качестве контроля. На Фигуре 10 представлены результаты для пула из 9 образцов нормальной ткани мочевого пузыря и 10 образцов опухолевой ткани мочевого пузыря. Общая стимуляция (т. е. индукция процессов иммунного ответа) была выше в опухолевых тканях, чем в нормальных тканях мочевого пузыря (см. Фигуру 10). Этот эффект указывает на различия в микроокружении между нормальными и опухолевыми тканями, например, различия в количестве инфильтратов иммунных клеток или уровне супрессии близи опухолевых клеток.
Пример 10: Исследование трансфектантов для поглощения аденовируса
Поглощение аденовируса в интактную ткань мочевого пузыря может быть улучшено путем добавления сходных с трансфектантами поликатионных соединений. Было установлено, что при перфузии образцов ткани Im02 в условиях ex vivo сульфат протамина (10 мкг/мл) обеспечивал поглощение аденовирусного продукта независимо от экспрессии рецептора Коксаки и аденовируса (CAR) при скрининге соединения-кандидата в ряде клеточных линий (см. Фигуру 11). Как сообщалось, линия клеток карциномы
мочевого пузыря человека RT-4 экспрессирует CAR, тогда как линия клеток карциномы толстой кишки мыши СТ-26 не экспрессирует его. Аденовирусный продукт готовили в буферах, указанных в подписи к Фигуре 11. Линию клеток рака мочевого пузыря человека RT-4 и CAR-негативную линию клеток рака толстой кишки мыши СТ-26 трансдуцировали с использованием Ad-GFP (аденовирусный вектор, несущий GFP) при разных значениях множественности заражения на клетку-мишень (MOI: множественность заражения). Результаты представлены как процент GFP-положительных клеток через 48 часов после трансдукции, измеренный методом проточной цитометрии. Полученные результаты свидетельствовали о том, что в обеих клеточных линиях сульфат протамина в концентрации 10 мкг/мл обеспечивал максимальную эффективность трансдукции.
Сокращения: буфер Merck: 5 мМ Трис, рН=8,0, 75 мМ NaCl, 5% сахарозы, 0,005% полисорбата 80, 1 мМ MgCh; все дополнительные добавки приготовлены в буфере Merck; хитозан: 1%, маннит: 1 М; протамин: 10 мкг/мл сульфата протамина, плюроновая кислота F68: 0,001%; приготовленные смеси: смесь сахарозы, маннита и плюроновой кислоты F68. Указана основная формула буфера Merck без вспомогательных добавок-трансфектантов. На присутствие CAR указывает достаточная трансдукция при низкой множественности заражения (MOI, количество инфекционных вирусных частиц на клетку-мишень). В отсутствие CAR поглощение достигается только с помощью низкоаффинного поглощения посредством опосредуемого интегринами поглощения. Эффект без добавки проиллюстрирован в RT-4 (приблизительно 25% трансдукция при MOI 100) по сравнению с СТ-26 ( <5% трансдукция при MOI 5000). Добавление 10 мкг/мл сульфата протамина увеличивало трансдукцию в 2 раза в RT-4 и в 3 раза в СТ-26.
Кооперативное адъювантное действие сульфата протамина также было обнаружено в культуре тканей в условиях ex vivo (см. Фигуру 12). Опухолевые ткани мочевого пузыря и нормальные ткани мочевого пузыря трансдуцировали 108 инф.в.ч. Im02 или AdO (пустой аденовирусный вектор) с добавлением 10 мкг/мл сульфата протамина или без него. Экспрессию трансгенов и экспрессию ИФН-у в ответ на цитокины измеряли на 6 день после трансдукции в супернатанте культуры с помощью ИФА. В присутствии 10 мг/мл сульфата протамина экспрессия ИФН-у в ответ на цитокины была более высокой даже при еще более низкой экспрессии трансгенов, это свидетельствовало о том, что Im02 в присутствии сульфата протамина стимулировал большее количество иммунных клеток.
На основании результатов, полученных на панели клеточных линий, и оценки состояния клеток-мишеней, данный состав применяли в имитационном исследовании терапии в условиях ex vivo.
Пример 11: Экспрессия трансгенов 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12 для Im02 и векторов, экспрессирующих отдельные гены, при различных MOI, а также ответ ИФН-у
Результаты исследования экспрессии транс генов 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12, ответа ИФН-у для Im02, а также комбинации векторов, экспрессирующих отдельные гены, указывали на то, что экспрессия ИФН-у зависела от повышения уровней 4-1BBL.
Клетки линии А549 человека трансдуцировали в течение одного часа с использованием Im02 или комбинаций аденовирусных векторов, экспрессирующих отдельные гены оцИЛ-12, ИЛ-2 и 4-1BBL, соответственно, при множественности заражения (MOI, т.е. количество инфекционных вирусных частиц на клетку-мишень), указанной числами в скобках (см. Фигуру 19). Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) добавляли через 4 часа после трансдукции, и супернатанты собирали для количественного исследования цитокинов через 34 часа совместного культивирования. Уровни цитокинов детектировали с помощью ИФА. Опухолевые клетки отделяли от подложки, и 4-1ВВЬ-положительные клетки детектировали методом проточной цитометрии. Приведенные точки данных представляют собой среднее значение для четырех индивидуальных доноров с четырьмя повторами для каждого из них.
Как показано на Фигуре 19, векторы, несущие отдельные гены, экспрессирующие ИЛ-12, ИЛ-2 и 4-1BBL по отдельности, при MOI [5] индуцировали основные уровни вплоть до 4,2 нг/мл ИФН-у. Комбинация ИЛ-12 и ИЛ-2 существенно не увеличивала этот уровень. Комбинации постоянных уровней ИЛ-12 и ИЛ-2, оба при MOI [5], с повышением уровней 4-1BBL при MOI вплоть до [100] приводили к увеличению индукции ИФН-у при умеренных уровнях ИЛ-12.
Важно отметить, что экспрессия ИЛ-12 не должна неограниченно увеличиваться, как при экспрессии с помощью вектора ImOl, описанного в примере 3 (см. Фигуру 3). Считается, что высокая экспрессия ИЛ-12 индуцирует подавление иммунной активации и вызывает токсичность. Данное условие высокой экспрессии ИФН-у и умеренной экспрессии ИЛ-12 выполняется вектором согласно настоящему изобретению, в частности, путем расположения 4-1BBL, ИЛ-2 и ИЛ-12, показанного в векторе Im02.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Provecs Medical GmbH
<120> НОВАЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩАЯ ВЕКТОРНАЯ СИСТЕМА
<130> PCT1024 6 6FZRPpau
<140> not yet assigned <141> 2016-02-25
<150> EP16157423.1
<151> 2016-02-25 <160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 765
<212> DNA <213> Human
<400> 1
atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60
gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120
ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180
tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240
cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300
ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360
acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420
tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480
gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540
ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600
ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660
agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720
acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aataa 765
<210> 2
<211> 254
<212> PRT
<213> Human
<400> 2
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 245 250
<210> 3
<211> 462
<212> DNA
<213> Human
<400> 3
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420
tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactt ga 462
<210> <211> <212> <213> 4
153 PRT
Human
<400> 4
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150
<210> 5 <211> 1623 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of human single-chain IL-12
<400> 5
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagtggtggc ggtggaagcg gcggtggcgg aagcggcggt 1020
ggcggcagca gaaacctccc cgtggccact ccagacccag gaatgttccc atgccttcac 1080
cactcccaaa acctgctgag ggccgtcagc aacatgctcc agaaggccag acaaactcta 1140
gaattttacc cttgcacttc tgaagagatt gatcatgaag atatcacaaa agataaaacc 1200
agcacagtgg aggcctgttt accattggaa ttaaccaaga atgagagttg cctaaattcc 1260
agagagacct ctttcataac taatgggagt tgcctggcct ccagaaagac ctcttttatg 1320
atggccctgt gccttagtag tatttatgaa gacttgaaga tgtaccaggt ggagttcaag 1380
accatgaatg caaagcttct gatggatcct aagaggcaga tctttctaga tcaaaacatg 1440
ctggcagtta ttgatgagct gatgcaggcc ctgaatttca acagtgagac tgtgccacaa 1500
aaatcctccc ttgaagaacc ggatttttat aaaactaaaa tcaagctctg catacttctt 1560
catgctttca gaattcgggc agtgactatt gatagagtga tgagctatct gaatgcttcc 1620
taa
1623
<210> 6
<211> 540
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of human single-chain IL-12
<400> 6
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
325 330 335
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp
340 345 350
Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala
355 360 365
Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro
370 375 380
Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr
385 390 395 400
Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser
405 410 415
Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu
420 425 430
Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile
435 440 445
Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala
450 455 460
Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe
465 470 475
Leu Asp Gln Asn Met 480
Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu
485 490 495
Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr
500 505 510
Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val
515 520 525
Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
530 535 540
<210> 7 <211> 987 <212> DNA
<213> Human
<400> 7
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagttag 987
<210> 8 <211> 328
<212> PRT <213> Human
<400> 8
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln
245 250
Val Glu Val Ser Trp 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser 260 265
Tyr Phe Ser Leu Thr 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg 275 280
Glu Lys Lys Asp Arg
285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile 290 295
Cys Arg Lys Asn Ala
300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr
305 310 315
Ser Ser Ser Trp Ser 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 325
<210> 9 <211> 762 <212> DNA
<213> Human
<400> 9
atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60
catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120
ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180
gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240
gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300
gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 360
ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 420
aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 480
atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 540
atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 600
atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 660
gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 720
gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct aa 762
<210> 10 <211> 253 <212> PRT
<213> Human
<400> 10
Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala
1 5 10 15
Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg
20 25 30
Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val
35 40 45
Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro
50 55 60
Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg
65 70 75 80
Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr
85 90 95
Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys
100 105 110
Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu
115 120 125
Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys
130 135 140
Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser
145 150 155 160
Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn
165 170 175
Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn
180 185 190
Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser
195 200 205
Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys
210 215 220
Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala
225 230 235 240
Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser 245 250
<210> 11 <211> 7845 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of the shuttle vector hu pE1.1
<400> 11
ttaacatcat caataatata ccttattttg gattgaagcc aatatgataa tgagggggtg 60
gagtttgtga cgtggcgcgg ggcgtgggaa cggggcgggt gacgtagtag tgtggcggaa 120
gtgtgatgtt gcaagtgtgg cggaacacat gtaagcgacg gatgtggcaa aagtgacgtt 180
tttggtgtgc gccggtgtac acaggaagtg acaattttcg cgcggtttta ggcggatgtt 240
gtagtaaatt tgggcgtaac cgagtaagat ttggccattt tcgcgggaaa actgaataag 300
aggaagtgaa atctgaataa ttttgtgtta ctcatagcgc gtaatatttg tctagggaga 360
tcttctagac ccgggagcgg ccggccgctg tcgaccgtaa ctataacggt cctaaggtag 420
cgaaccacgt caggtcgagt gttcatgaat ggaagatatc tgcgccctag cgccggcgag 480
ctctagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca 540
taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca 600
ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg 660
gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg 720
ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc 780
ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg 840
atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca 900
agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt 960
ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg 1020
gaggtctata taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagac ggaccgacca 1080
tggaatacgc ctctgacgct tcactggacc ccgaagcccc gtggcctccc gcgccccgcg 1140
ctcgcgcctg ccgcgtactg ccttgggccc tggtcgcggg gctgctgctg ctgctgctgc 1200
tcgctgccgc ctgcgccgtc ttcctcgcct gcccctgggc cgtgtccggg gctcgcgcct 1260
cgcccggctc cgcggccagc ccgagactcc gcgagggtcc cgagctttcg cccgacgatc 1320
ccgccggcct cttggacctg cggcagggca tgtttgcgca gctggtggcc caaaatgttc 1380
tgctgatcga tgggcccctg agctggtaca gtgacccagg cctggcaggc gtgtccctga 1440
cggggggcct gagctacaaa gaggacacga aggagctggt ggtggccaag gctggagtct 1500
actatgtctt ctttcaacta gagctgcggc gcgtggtggc cggcgagggc tcaggctccg 1560
tttcacttgc gctgcacctg cagccactgc gctctgctgc tggggccgcc gccctggctt 1620
tgaccgtgga cctgccaccc gcctcctccg aggctcggaa ctcggccttc ggtttccagg 1680
gccgcttgct gcacctgagt gccggccagc gcctgggcgt ccatcttcac actgaggcca 1740
gggcacgcca tgcctggcag cttacccagg gcgccacagt cttgggactc ttccgggtga 1800
cccccgaaat cccagccgga ctcccttcac cgaggtcgga ataagaacgc tagctcttgt 1860
gactggcgcg cctgatcaat cgatgtttaa acgttatttt ccaccatatt gccgtctttt 1920
ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt 1980
tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg 2040
gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca 2100
cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg 2160
gcacaacccc agtgcgacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc 2220
tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct 2280
gatctggggc ctcggtgcac atgctttacg tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta 2340
ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgattctc gagactagtc 2400
gtacgaccat gtacaggatg caactcctgt cttgcattgc actaagtctt gcacttgtca 2460
caaacagtgc acctacttca agttctacaa agaaaacaca gctacaactg gagcatttac 2520
tgctggattt acagatgatt ttgaatggaa ttaataatta caagaatccc aaactcacca 2580
ggatgctcac atttaagttt tacatgccca agaaggccac agaactgaaa catcttcagt 2640
gtctagaaga agaactcaaa cctctggagg aagtgctaaa tttagctcaa agcaaaaact 2700
ttcacttaag acccagggac ttaatcagca atatcaacgt aatagttctg gaactaaagg 2760
gatctgaaac aacattcatg tgtgaatatg ctgatgagac agcaaccatt gtagaatttc 2820
tgaacagatg gattaccttt tgtcaaagca tcatctcaac actgacttga acgcgtgcta 2880
gcaggcccgg ccggccttgt taaagacagg atgaagctta aaacagctct ggggttgtac 2940
ccaccccaga ggcccacgtg gcggctagta ctccggtatt gcggtaccct tgtacgcctg 3000
ttttatactc ccttcccgta acttagacgc acaaaaccaa gttcaataga agggggtaca 3060
aaccagtacc accacgaaca agcacttctg tttccccggt gatgtcgtat agactgcttg 3120
cgtggttgaa agcgacggat ccgttatccg cttatgtact tcgagaagcc cagtaccacc 3180
tcggaatctt cgatgcgttg cgctcagcac tcaaccccag agtgtagctt aggctgatga 3240
gtctggacat ccctcaccgg tgacggtggt ccaggctgcg ttggcggcct acctatggct 3300
aacgccatgg gacgctagtt gtgaacaagg tgtgaagagc ctattgagct acataagaat 3360
cctccggccc ctgaatgcgg ctaatcccaa cctcggagca ggtggtcaca aaccagtgat 3420
tggcctgtcg taacgcgcaa gtccgtggcg gaaccgacta ctttgggtgt ccgtgtttcc 3480
ttttatttta ttgtggctgc ttatggtgac aatcacagat tgttatcata aagcgaattg 3540
gattgcgtac gcggaccgaa ctagtttcgc cgcctccaac atgtgtcacc agcagttggt 3600
catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc gtggccatat gggaactgaa 3660
gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat gcccctggag aaatggtggt 3720
cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg accttggacc agagcagtga 3780
ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa gagtttggag atgctggcca 3840
gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg ctcctgctgc ttcacaaaaa 3900
ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag aaagaaccca aaaataagac 3960
ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc acctgctggt ggctgacgac 4020
aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga ggctcttctg acccccaagg 4080
ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc agaggggaca acaaggagta 4140
tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca gctgctgagg agagtctgcc 4200
cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat gaaaactaca ccagcagctt 4260
cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac ttgcagctga agccattaaa 4320
gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac acctggagta ctccacattc 4380
ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag agcaagagag aaaagaaaga 4440
tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc cgcaaaaatg ccagcattag 4500
cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc gaatgggcat ctgtgccctg 4560
cagtggtggc ggtggaagcg gcggtggcgg aagcggcggt ggcggcagca gaaacctccc 4620
cgtggccact ccagacccag gaatgttccc atgccttcac cactcccaaa acctgctgag 4680
ggccgtcagc aacatgctcc agaaggccag acaaactcta gaattttacc cttgcacttc 4740
tgaagagatt gatcatgaag atatcacaaa agataaaacc agcacagtgg aggcctgttt 4800
accattggaa ttaaccaaga atgagagttg cctaaattcc agagagacct ctttcataac 4860
taatgggagt tgcctggcct ccagaaagac ctcttttatg atggccctgt gccttagtag 4920
tatttatgaa gacttgaaga tgtaccaggt ggagttcaag accatgaatg caaagcttct 4980
gatggatcct aagaggcaga tctttctaga tcaaaacatg ctggcagtta ttgatgagct 5040
gatgcaggcc ctgaatttca acagtgagac tgtgccacaa aaatcctccc ttgaagaacc 5100
ggatttttat aaaactaaaa tcaagctctg catacttctt catgctttca gaattcgggc 5160
agtgactatt gatagagtga tgagctatct gaatgcttcc taaaaaccgg cccggccggc 5220
cccgcggccg ctcgagccta agcttctaga taagatatcc gatccaccgg atctagataa 5280
ctgatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca 5340
cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt 5400
gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt 5460
ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta gcgccggcgg 5520
gtcgacagcc tagtggtacc cacgaggtgg caggagctgc atcgatgtcg cttcctcgct 5580
cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 5640
ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 5700
ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 5760
cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 5820
actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 5880
cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 5940
tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 6000
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 6060
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 6120
agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 6180
tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 6240
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 6300
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 6360
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 6420
aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 6480
atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 6540
gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc acagagtggc agagactgca 6600
ttcgaaaacg tttgaattga taattattat catttgcggg tcaattctta gaaaaactca 6660
tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc atatttttga 6720
aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag gattgcaaga 6780
tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc 6840
tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga atccggtgag 6900
aatggcaaaa gcttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg 6960
tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga 7020
cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc 7080
aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc ttctaatacc 7140
tggaatgctg ttttcccggg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg 7200
ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag tctgaccatc 7260
tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca 7320
tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc 7380
catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggcct cgagcaagac 7440
gtttcccgtt gaatatggct cataacaccc cttgtattac tgtttatgta agcagacagt 7500
tttattgttc atgcgaaaac gtttgaattg ataattatta tcatttgcgg gtcctttccg 7560
gcgatccgcc ttgttacggg gcggcgacct cgcgggtttt cgctatttat gaaaattttc 7620
cggtttaagg cgtttccgtt cttcttcgtc ataacttaat gtttttattt aaaataccct 7680
ctgaaaagaa aggaaacgac agctgaaagc gagctttttg gcctctgtcg tttcctttct 7740
ctgtttttgt ccgtggaatg aacaatggaa gtcggcctcg tgatacgcct atttttatag 7800
gttaatgtca tgataataat ggtttcttag cgatatttaa attaa 7845
<210> 12 <211> 5545
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of the expression cassette comprising CMV,
human 4-1BBL, EMCV IRES, human IL-2, PV IRES, human scIL-12, and SV40polyA as contained in hu pE1.1
<400> 12
taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60
agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120
tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180
ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240
tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300
ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatatttgt ctagggagat 360
cttctagacc cgggagcggc cggccgctgt cgaccgtaac tataacggtc ctaaggtagc 420
gaaccacgtc aggtcgagtg ttcatgaatg gaagatatct gcgccctagc gccggcgagc 480
tctagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 540
aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 600
taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 660
agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 720
cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 780
tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 840
tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 900
gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 960
caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 1020
aggtctatat aagcagagct ggtttagtga accgtcagat ccgctagacg gaccgaccat 1080
ggaatacgcc tctgacgctt cactggaccc cgaagccccg tggcctcccg cgccccgcgc 1140
tcgcgcctgc cgcgtactgc cttgggccct ggtcgcgggg ctgctgctgc tgctgctgct 1200
cgctgccgcc tgcgccgtct tcctcgcctg cccctgggcc gtgtccgggg ctcgcgcctc 1260
gcccggctcc gcggccagcc cgagactccg cgagggtccc gagctttcgc ccgacgatcc 1320
cgccggcctc ttggacctgc ggcagggcat gtttgcgcag ctggtggccc aaaatgttct 1380
gctgatcgat gggcccctga gctggtacag tgacccaggc ctggcaggcg tgtccctgac 1440
ggggggcctg agctacaaag aggacacgaa ggagctggtg gtggccaagg ctggagtcta 1500
ctatgtcttc tttcaactag agctgcggcg cgtggtggcc ggcgagggct caggctccgt 1560
ttcacttgcg ctgcacctgc agccactgcg ctctgctgct ggggccgccg ccctggcttt 1620
gaccgtggac ctgccacccg cctcctccga ggctcggaac tcggccttcg gtttccaggg 1680
ccgcttgctg cacctgagtg ccggccagcg cctgggcgtc catcttcaca ctgaggccag 1740
ggcacgccat gcctggcagc ttacccaggg cgccacagtc ttgggactct tccgggtgac 1800
ccccgaaatc ccagccggac tcccttcacc gaggtcggaa taagaacgct agctcttgtg 1860
actggcgcgc ctgatcaatc gatgtttaaa cgttattttc caccatattg ccgtcttttg 1920
gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt 1980
cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg 2040
aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac 2100
ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg 2160
cacaacccca gtgcgacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct 2220
caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg 2280
atctggggcc tcggtgcaca tgctttacgt gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag 2340
gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgattctcg agactagtcg 2400
tacgaccatg tacaggatgc aactcctgtc ttgcattgca ctaagtcttg cacttgtcac 2460
aaacagtgca cctacttcaa gttctacaaa gaaaacacag ctacaactgg agcatttact 2520
gctggattta cagatgattt tgaatggaat taataattac aagaatccca aactcaccag 2580
gatgctcaca tttaagtttt acatgcccaa gaaggccaca gaactgaaac atcttcagtg 2640
tctagaagaa gaactcaaac ctctggagga agtgctaaat ttagctcaaa gcaaaaactt 2700
tcacttaaga cccagggact taatcagcaa tatcaacgta atagttctgg aactaaaggg 2760
atctgaaaca acattcatgt gtgaatatgc tgatgagaca gcaaccattg tagaatttct 2820
gaacagatgg attacctttt gtcaaagcat catctcaaca ctgacttgaa cgcgtgctag 2880
caggcccggc cggccttgtt aaagacagga tgaagcttaa aacagctctg gggttgtacc 2940
caccccagag gcccacgtgg cggctagtac tccggtattg cggtaccctt gtacgcctgt 3000
tttatactcc cttcccgtaa cttagacgca caaaaccaag ttcaatagaa gggggtacaa 3060
accagtacca ccacgaacaa gcacttctgt ttccccggtg atgtcgtata gactgcttgc 3120
gtggttgaaa gcgacggatc cgttatccgc ttatgtactt cgagaagccc agtaccacct 3180
cggaatcttc gatgcgttgc gctcagcact caaccccaga gtgtagctta ggctgatgag 3240
tctggacatc cctcaccggt gacggtggtc caggctgcgt tggcggccta cctatggcta 3300
acgccatggg acgctagttg tgaacaaggt gtgaagagcc tattgagcta cataagaatc 3360
ctccggcccc tgaatgcggc taatcccaac ctcggagcag gtggtcacaa accagtgatt 3420
ggcctgtcgt aacgcgcaag tccgtggcgg aaccgactac tttgggtgtc cgtgtttcct 3480
tttattttat tgtggctgct tatggtgaca atcacagatt gttatcataa agcgaattgg 3540
attgcgtacg cggaccgaac tagtttcgcc gcctccaaca tgtgtcacca gcagttggtc 3600
atctcttggt tttccctggt ttttctggca tctcccctcg tggccatatg ggaactgaag 3660
aaagatgttt atgtcgtaga attggattgg tatccggatg cccctggaga aatggtggtc 3720
ctcacctgtg acacccctga agaagatggt atcacctgga ccttggacca gagcagtgag 3780
gtcttaggct ctggcaaaac cctgaccatc caagtcaaag agtttggaga tgctggccag 3840
tacacctgtc acaaaggagg cgaggttcta agccattcgc tcctgctgct tcacaaaaag 3900
gaagatggaa tttggtccac tgatatttta aaggaccaga aagaacccaa aaataagacc 3960
tttctaagat gcgaggccaa gaattattct ggacgtttca cctgctggtg gctgacgaca 4020
atcagtactg atttgacatt cagtgtcaaa agcagcagag gctcttctga cccccaaggg 4080
gtgacgtgcg gagctgctac actctctgca gagagagtca gaggggacaa caaggagtat 4140
gagtactcag tggagtgcca ggaggacagt gcctgcccag ctgctgagga gagtctgccc 4200
attgaggtca tggtggatgc cgttcacaag ctcaagtatg aaaactacac cagcagcttc 4260
ttcatcaggg acatcatcaa acctgaccca cccaagaact tgcagctgaa gccattaaag 4320
aattctcggc aggtggaggt cagctgggag taccctgaca cctggagtac tccacattcc 4380
tacttctccc tgacattctg cgttcaggtc cagggcaaga gcaagagaga aaagaaagat 4440
agagtcttca cggacaagac ctcagccacg gtcatctgcc gcaaaaatgc cagcattagc 4500
gtgcgggccc aggaccgcta ctatagctca tcttggagcg aatgggcatc tgtgccctgc 4560
agtggtggcg gtggaagcgg cggtggcgga agcggcggtg gcggcagcag aaacctcccc 4620
gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 4680
gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 4740
gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta 4800
ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact 4860
aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt 4920
atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg 4980
atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg 5040
atgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg 5100
gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca 5160
gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct aaaaaccggc ccggccggcc 5220
ccgcggccgc tcgagcctaa gcttctagat aagatatccg atccaccgga tctagataac 5280
tgatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac 5340
acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg 5400
cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 5460
tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttag cgccggcggg 5520
tcgacagcct agtggtaccc acgag 5545
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Вектор, содержащий последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие лиганд 4-1ВВ (4-1BBL), одноцепочечный ИЛ-12 (оцИЛ-12) и ИЛ-2, и дополнительно содержащий по меньшей мере одну регуляторную последовательность нуклеиновой кислоты, предпочтительно промоторную последовательность, обеспечивающую повышенный уровень экспрессии 4-1BBL по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и ИЛ-2.
2. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что указанный уровень экспрессии 4-1BBL повышен по сравнению с уровнем экспрессии 4-1BBL, обеспеченным с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl (Фигура 20).
3. Вектор по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный уровень экспрессии оцИЛ-12 снижен и/или уровень экспрессии ИЛ-2 повышен по сравнению с уровнями экспрессии оцИЛ-12 и/или ИЛ-2, обеспеченными с помощью конструкции для экспрессии вектора ImOl (Фигура 20).
4. Вектор по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что указанные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, расположены в направлении от 5'-конца к З'-концу в последовательном порядке 1, 2, 3, при условии, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, не находится в положении 1.
5. Вектор по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой любой из аденовирусного вектора, вектора на основе аденоассоциированного вируса, лентивирусного вектора, вектора на основе вируса простого герпеса, поксвирусного вектора, РНК-вектора, плазмидного вектора, вектора на основе наночастиц, а также депротеинизированной ДНК.
6. Вектор по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 4-1BBL, представляет собой кДНК человека, указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, представляет собой кДНК человека и/или указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2, представляет собой кДНК человека.
7. Вектор по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая 4-1BBL, по меньшей мере на 70% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ Ш NO: 1, причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок 4-1BBL, способный специфически связывать активированные Т-клетки.
8. Вектор по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2, по меньшей мере на 70% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ Ш N0: 3, причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок ИЛ-2, обладающий иммуностимулирующей активностью.
9. Вектор по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, по меньшей мере на 70% идентична последовательности нуклеиновой кислоты SEQ Ш N0: 5, причем указанный вариант последовательности нуклеиновой кислоты кодирует белок оцИЛ-12, обладающий иммуностимулирующей активностью.
10. Вектор по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что указанные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие оцИЛ-12 и ИЛ-2, расположены в 3'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL.
11. Вектор по п. 10, отличающийся тем, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ИЛ-2, расположена в 3'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая оцИЛ-12, расположена в 3'-направлении относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ИЛ-2.
12. Вектор по п. 10 или п. 11, отличающийся тем, промотор расположен в 5'-направлении относительно указанной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей 4-1BBL, но не в 5'-направлении относительно указанной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей оцИЛ-12 и/или ИЛ-2.
13. Вектор по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что указанные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие 4-1BBL, оцИЛ-12 и ИЛ-2, соединены с помощью сайтов внутренней посадки рибосомы (IRES).
14. Раковая клетка или иммунная клетка, трансдуцированная или трансфицированная с применением вектора по любому из пп. 1-13.
15. Лекарственное средство, содержащее вектор по любому из пп. 1-13 или раковую клетку или иммунную клетку по п. 14.
16. Вектор по любому из пп. 1-13, раковая клетка или иммунная клетка по п. 14, или лекарственное средство по п. 15 для применения в способе лечения рака, вирусной инфекции и/или расстройства иммунной системы.
17. Вектор для применения по п. 16, или раковая клетка или иммунная клетка для применения по п. 16, или лекарственное средство для применения по п. 16,отличающиеся
тем, что указанный рак представляет собой любой из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака предстательной железы, лимфомы, рака кожи, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, меланомы, злокачественной меланомы, рака яичников, рака головного мозга, первичной карциномы головного мозга, рака головы и шеи, глиомы, глиобластомы, рака печени, немелкоклеточного рака легких, карциномы головы или шеи, карциномы молочной железы, карциномы яичников, карциномы легких, немелкоклеточной карциномы легких, опухоли Вильмса, карциномы шейки матки, карциномы яичек, карциномы мочевого пузыря, карциномы поджелудочной железы, карциномы желудка, карциномы толстой кишки, карциномы предстательной железы, карциномы мочеполовой системы, карциномы щитовидной железы, карциномы пищевода, миеломы, множественной миеломы, карциномы надпочечников, карциномы почек, карциномы эндометрия, карциномы коры надпочечников, злокачественной инсулиномы поджелудочной железы, злокачественной карциноидной карциномы, хориокарциномы, грибкового микоза, злокачественной гиперкальциемии, гиперплазии шейки матки, лейкоза, острого лимфолейкоза, хронического лимфолейкоза, острого миелобластного лейкоза, хронического миелобластного лейкоза, хронического гранулоцитарного лейкоза, острого гранулоцитарного лейкоза, лейкоза ворсистых клеток, нейробластомы, рабдомиосаркомы, саркомы Капоши, истинной полицитемии, эссенциальной тромбоцитемии, ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, саркомы мягких тканей, мезотелиомы, остеогенной саркомы, первичной макроглобулинемии и ретинобластомы.
18. Вектор по любому из пп. 1-13, или раковая клетка или иммунная клетка по п. 14, или лекарственное средство по п. 15, для применения в способе предотвращения или лечения метастазов рака.
Фигура 2: Схематическая генная карта челночной плазмиды рЕ1.1 Im02
Фигура 4: Сравнение Im02 и Im01 в модели на основе ткани мочевого пузыря
500400300200100-
20j 15105-
0.5j 0.40.30.20.1-
0.0130.9
-135.6
0.06
- 2.5 О
0.07
¦97.2
J). 03
А А|А
-?-64.6 q0
О(c)
18.7
•15.4
О О
-А-0.38
А А
^ ^
AAA* 0.82
А' В
а 0-27
0.2
-s5*- 0-06
о ИЛ-12 п ИЛ-2 А ИФН-у
ИЛ-12
ИЛ-2
4-1BBL
Im01
Im02
Фигура 5: Сравнение различных уровней дозы Im01 и Im02
зоо-
200100-
20--
15-
10-
-o-Q 0.6
а.-
¦11.7
¦е-- 94.0
0.7
°о°
-5.3
О -А-
о о
-(c) 25.0
О О
-4.9 А
- 0.73 АААА 1-34
О ИЛ-12 н ИЛ-2 А ИФН-у
0.6-г 0.40.20.0-
.0.05 А
¦0.1
^ ^
0.15 ИДН
. 0.32
' 0.03
о ^
-а*
0.16
0.32
-0.05
_И_- 0.06
В 3А"
"0.3
10'
10в
10'
10в
1т01
Im02
Доза (инф.в.ч.)
Фигура 6: Тепловой график, иллюстрирующий активацию разных типов иммунных клеток в совместной культуре клеток карциномы RT-4 человека с МКПК человека
0.4
Активно. 1
хелперные
Т-клетки
0.3
0.2
Активир. цитотокс. .1 Т-клетки
0.1
^ J*L ?
Активир. NK-кпетки
Моноциты
Активир. моноциты
Активир. ДК
Нейтрофилы
Фигура 7: Гистологическое исследование образцов, стимулированных с применением Im02 или AdO
Г ¦ - г" ¦ v. . ¦
.¦ 'J" V... i- ( ' ч ¦" .
ШШШжШШШШШШ
- .'Vs
...Фигура 7 продолж.
¦ ^ . •'¦ - .¦.¦'¦: -.: -'::.v:> -
мшшш
'V':.
1. ! .
Фигура 8: Гистологическое исследование образцов, стимулированных с применением Im02 или без него
Без обработки О день
J t.
л..
108 инф в ч Im02 6 день
Фигура 9: Исследование клеток-мишеней и механизма поглощения с помощью просвечивающей электронной микроскопии
Панели 1 и 2:
2 мкм
тшшшшшж М|1||НИ
...Фигура 9 продолж.
Панель 6:
^¦1
Фигура 10: Сравнение дифференциальной экспрессии в образцах нормальной ткани мочевого пузыря и опухоли мочевого пузыря
Мочевой пузырь
п = 9lm02 n = 5AdO
Опухоль
п = 101т02 п = 6 AdO
Z-показатель
Миграция гранулоцитов Хемотаксис гранулоцитов Активация гранулоцитов
Гранулоциты
Активация эозинофилов Эозинофилы
I-I-1-I-т
2 - 1 С 1 i-'
Значение
Хемотаксис моноцитов
Движение клеток моноцитов Моноциты
Движение клеток макрофагов Апоптоз макрофагов Макрофаги Привлечение макрофагов
Миграция дендритных клеток Дендритные клетки
NK-клетки
Активация антигенпрезентирующих клеток Хемотаксис антигенпрезентирующих клеток АПК
Перемещение NK-клеток
Движение клеток Т-лимфоцитов Хемотаксис Т-лимфоцитов Количество Т-лимфоцитов Цитотоксичность Т-лимфоцитов Активация Т-лимфоцитов Привлечение Т-лимфоцитов Гибель клеток Т-лимфоцитов T-клеточный ответ Связывание Т-лимфоцитов Дифференциация Т-лимфоцитов Апоптоз Т-лимфоцитов
Т-клетки
Привлечение Th1 -клеток
Th-клетки
Количество CD8+ Т-лимфоцитов Цитотоксичность цитотоксических Т-клеток
С08-клетки
Фигура 11: Исследование различных трансфектантов в клеточной культуре
Клетки RT-4 (экспрессирующие CAR)
Клетки СТ-26 (не экспрессирующие CAR)
Фигура 12: Влияние сульфата протамина на экспрессию трансгенов и индукцию ИФН-
7(Н
49.3
60-
504030" 14.8
20-
с; кДгп
10т 1 9876543210-
0.2
0.8
2.9
1.3
6.3
0.04
23.6
0.3
1.8
1=1 ИЛ-12 EI3 ИЛ-2 ИФН-у
108 инф.в.ч. Im02 без сульфата протамина
108 инф.в.ч. Im02 с сульфатом протамина
Фигура 13: Нуклеотидная и аминокислотная последовательность 4-1BBL человека
SEQ ID NO: 1: Нуклеотидная последовательность 4-1BBL человека (765 нуклеотидов; происхождение: 4-1BBL человека):
ATGGAATACGCCTCTGACGCTTCACTGGACCCCGAAGCCCCGTGGCCTCCCGCGCCCCGCGCTCGCGC CTGCCGCGTACTGCCTTGGGCCCTGGTCGCGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGCTGCCGCCTGCG CCGTCTTCCTCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCG AGACTCCGCGAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCAT GTTTGCGCAGCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAG GCCTGGCAGGCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCC AAGGCTGGAGTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGG CTCCGTTTCACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGA CCGTGGACCTGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTG CACCTGAGTGCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCA 3CTTACCCAGGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTT :ACCGAGGTCGGAATAA
SEQ ID NO: 2: аминокислотная последовательность 4-1 BBL человека (254 аминокислотных остатка; транслированная последовательность нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1; происхождение: 4-1 BBL человека):
MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASP RLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELWA KAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLL HLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
Фигура 14: Нуклеотидная и аминокислотная последовательность ИЛ-2 человека
SEQ ID NO: 3: нуклеотидная последовательность ИЛ-2 человека (462 нуклеотида; происхождение: ИЛ-2 человека):
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGCACCTAC TTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGA ATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAG AAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAA TTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTC TGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAA TTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTGA
SEQ ID NO: 4: аминокислотная последовательность ИЛ-2 человека (153 аминокислотных остатка; транслированная последовательность нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3; происхождение: ИЛ-2 человека):
4YRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPK ^ATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVE TLNRWITFCQSIISTLT
Фигура 15: Нуклеотидная и аминокислотная последовательность одноцепочечного ИЛ-12 человека (оцИЛ-12)
SEQ ID NO: 5: нуклеотидная последовательность одноцепочечного ИЛ-12 человека (1623 нуклеотида; происхождение: искусственное):
ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCAT ATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGG TGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTC TTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCA CAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCA CTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTAT TCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAG CAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAG GGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAG AGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTT :TTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTC 3GCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACA RTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTC AGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCAT CTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGT GGCGGCAGCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCA AAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCA CTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCA TTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTG CCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGA TGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTTCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTA GATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCC ACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATG CTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAA
...Фигура 15 продолж.
SEQ ID NO: 6: аминокислотная последовательность одноцепочечного ИЛ-12 человека (540 аминокислотных остатков; транслированная последовательность нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5; происхождение: искусственное):
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYWELDWYPDAPGEMWLTCDTPEEDGITWTLDQSSEV LGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNY SGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEE SLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLT FCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGG GGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLP LELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFL DQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
Фигура 16: Нуклеотидные и аминокислотные последовательности субъединиц 35 кДа и 40 кДа ИЛ-12 человека
SEQ ID NO: 7: нуклеотидная последовательность субъединицы 40 кДа ИЛ-12 (987 нуклеотидов; происхождение: ИЛ-12 человека, GenBank NM 002187):
ATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCTCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCAT ATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTATGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGG TGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGAAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTC TTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCA CAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCATTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCA CTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGAACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTAT TCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGCTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAG CAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGGGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAG GGGACAACAAGGAGTATGAGTACTCAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAG \GTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGGATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTT :TTCATCAGGGACATCATCAAACCTGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTC 3GCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACA RTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGAGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTC AGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAATGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCAT CTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCCCTGCAGTTAG
SEQ ID NO: 8: аминокислотная последовательность субъединицы 40 кДа ИЛ-12 (328 аминокислотных остатков; транслированная последовательность нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 7; происхождение: ИЛ-12 человека, GenBank NM 002187):
MCHQQLVI SWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYWELDWYPDAPGEMWLTCDTPEEDGITWTLDQSSEV LGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNY SGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEE SLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLT FCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
...Фигура 16 продолж.
SEQ ID NO: 9: нуклеотидная последовательность субъединицы 35 кДа ИЛ-12 (762 нуклеотида; происхождение: ИЛ-12 человека, GenBank NM 000882):
ATGTGGCCCCCTGGGTCAGCCTCCCAGCCACCGCCCTCACCTGCCGCGGCCACAGGTCTGCATCCAGC GGCTCGCCCTGTGTCCCTGCAGTGCCGGCTCAGCATGTGTCCAGCGCGCAGCCTCCTCCTTGTGGCTA CCCTGGTCCTCCTGGACCACCTCAGTTTGGCCAGAAACCTCCCCGTGGCCACTCCAGACCCAGGAATG TTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAACATGCTCCAGAAGGCCAGACA AACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGATATCACAAAAGATAAAACCA GCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTTGCCTAAATTCCAGAGAGACC TCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTTATGATGGCCCTGTGCCTTAG TAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCATGAATGCAAAGCTTCTGATGG ATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTGATGAGCTGATGCAGGCCCTG AATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCGGATTTTTATAAAACTAAAAT CAAGCTCTGCATACTTCTTCATGCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTATTGATAGAGTGATGAGCTATC TGAATGCTTCCTAA
SEQ ID NO: 10: аминокислотная последовательность субъединицы 35 кДа ИЛ-12 (253 аминокислотных остатка; транслированная последовательность нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9; происхождение: ИЛ-12 человека, GenBank NM 000882):
MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGM FPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRET SFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQAL NFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
Фигура 17: Нуклеотидная последовательность челночного вектора hu рЕ1.1 Im02, представленного на Фигуре 2
SEQ ID NO: 11: нуклеотидная последовательность челночного вектора hu рЕ1.1 Im02, представленного на Фигуре 2 (7845 нуклеотидов; происхождение: искусственное):
TTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGT GACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGT GTGGCGGAACACATGTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGGTGTACACAG GAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTT GGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGC GTAATATTTGTCTAGGGAGATCTTCTAGACCCGGGAGCGGCCGGCCGCTGTCGACCGTAACTATAACG GTCCTAAGGTAGCGAACCACGTCAGGTCGAGTGTTCATGAATGGAAGATATCTGCGCCCTAGCGCCGG CGAGCTCTAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAAC TTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTAT GTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGC :CACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAAT 3GCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTA rTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGA CTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAAC GGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGG GAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGACGGACCGACCATGGAATAC GCCTCTGACGCTTCACTGGACCCCGAAGCCCCGTGGCCTCCCGCGCCCCGCGCTCGCGCCTGCCGCGT ACTGCCTTGGGCCCTGGTCGCGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGCTGCCGCCTGCGCCGTCTTCC TCGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGC GAGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCA GCTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAG GCGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGA GTCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTC ACTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACC TGCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGT GCCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCA GGGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGT CGGAATAAGAACGCTAGCTCTTGTGACTGGCGCGCCTGATCAATCGATGTTTAAACGTTATTTTCCAC CATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTA GGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTG
GAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGA CAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCG ACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTG AAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACGTG TGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAA CACGATTCTCGAGACTAGTCGTACGACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTC TTGCACTTGTCACAAACAGTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCAT TTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGAT GCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAG AACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGAC TTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATA TGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCT CAACACTGACTTGAACGCGTGCTAGCAGGCCCGGCCGGCCTTGTTAAAGACAGGATGAAGCTTAAAAC AGCTCTGGGGTTGTACCCACCCCAGAGGCCCACGTGGCGGCTAGTACTCCGGTATTGCGGTACCCTTG TACGCCTGTTTTATACTCCCTTCCCGTAACTTAGACGCACAAAACCAAGTTCAATAGAAGGGGGTACA AACCAGTACCACCACGAACAAGCACTTCTGTTTCCCCGGTGATGTCGTATAGACTGCTTGCGTGGTTG \AAGCGACGGATCCGTTATCCGCTTATGTACTTCGAGAAGCCCAGTACCACCTCGGAATCTTCGATGC 3TTGCGCTCAGCACTCAACCCCAGAGTGTAGCTTAGGCTGATGAGTCTGGACATCCCTCACCGGTGAC 3GTGGTCCAGGCTGCGTTGGCGGCCTACCTATGGCTAACGCCATGGGACGCTAGTTGTGAACAAGGTG TGAAGAGCCTATTGAGCTACATAAGAATCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCCAACCTCGGAGCA GGTGGTCACAAACCAGTGATTGGCCTGTCGTAACGCGCAAGTCCGTGGCGGAACCGACTACTTTGGGT GTCCGTGTTTCCTTTTATTTTATTGTGGCTGCTTATGGTGACAATCACAGATTGTTATCATAAAGCGA ATTGGATTGCGTACGCGGACCGAACTAGTTTCGCCGCCTCCAACATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATC TCTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTA TGTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTG AAGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACC ATCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCA TTCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAG AACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGG CTGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGG GGTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACT CAGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTG GATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACC TGACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGT ACCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAG AGCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAA
TGCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGC CCTGCAGTGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCAGAAACCTCCCCGTG GCCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAA CATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAG ATATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGT TGCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTT TATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCA TGAATGCAAAGCTTCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATT GATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACC GGATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATGCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTA TTGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAAAAACCGGCCCGGCCGGCCCCGCGGCCGCTCGAG CCTAAGCTTCTAGATAAGATATCCGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCATAATCAGCCATACCACA TTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAA TGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAA ATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCT TAGCGCCGGCGGGTCGACAGCCTAGTGGTACCCACGAGGTGGCAGGAGCTGCATCGATGTCGCTTCCT :GCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTA VTACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGC :AGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACA AAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCT GGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCC TTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCT CCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGT CTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAG AGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGA CAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCC GGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAA AGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTT AAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGT TTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC ACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCACAGAGTGGCAGAGAC TGCATTCGAAAACGTTTGAATTGATAATTATTATCATTTGCGGGTCAATTCTTAGAAAAACTCATCGA GCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTC TGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATTGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGAT TCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGA AATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGT
TCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGA TTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCA ACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACC TGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATG CTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCAT TGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAG ATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTT GGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTAC TGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGCGAAAACGTTTGAATTGATAATTATTATCATTTGC GGGTCCTTTCCGGCGATCCGCCTTGTTACGGGGCGGCGACCTCGCGGGTTTTCGCTATTTATGAAAAT TTTCCGGTTTAAGGCGTTTCCGTTCTTCTTCGTCATAACTTAATGTTTTTATTTAAAATACCCTCTGA AAAGAAAGGAAACGACAGCTGAAAGCGAGCTTTTTGGCCTCTGTCGTTTCCTTTCTCTGTTTTTGTCC GTGGAATGAACAATGGAAGTCGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAAT GGTTTCTTAGCGATATTTAAATTAA
Фигура 18: Схематический обзор и нуклеотидная последовательность кассеты для экспрессии, содержащей ЦМВ, 4-1BBL человека, EMSV IRES, ИЛ-2 человека, PV IRES, оцИЛ-12 человека и полиА SV40, содержащейся в hu рЕ1.1 Im02, изображенном на Фигуре 2 и SEQ ID N0: 11 (Фигура 17), соответственно
Схематический обзор кассеты для экспрессии, содержащей ЦМВ, 4-1BBL человека, EMSV IRES, ИЛ-2 человека, PV IRES, оцИЛ-12 человека и полиА SV40, содержащейся в челночном векторе hu рЕ1.1 Im02, изображенном на Фигуре 2:
цмв
EMCV IRES
PV IRES
4-1 BBL человека
г- Ь
ИЛ-2 человека
оцИЛ-12
ПолиА SV40
р40
Линкер р35
1000
2000
4000
5000
Кассета Im02 (5545 по)
.. .Фигура 18 продолж.
SEQ ID NO: 12: нуклеотидная последовательность кассеты для экспрессии, содержащей ЦМВ. 4-1BBL человека. EMCV IRES. ИЛ-2 человека. PV IRES. оцИЛ-12 человека и полиА SV40, содержащейся в челночном векторе hu рЕ1.1 Im02, изображенном на Фигуре 2 и SEQ ID NO: 11 (Фигура 17), соответственно (5545 нуклеотидов; происхождение: искусственное):
TAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTG ACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTG TGGCGGAACACATGTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGGTGTACACAGG AAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTG GCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCG TAATATTTGTCTAGGGAGATCTTCTAGACCCGGGAGCGGCCGGCCGCTGTCGACCGTAACTATAACGG TCCTAAGGTAGCGAACCACGTCAGGTCGAGTGTTCATGAATGGAAGATATCTGCGCCCTAGCGCCGGC GAGCTCTAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACT TACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATG RTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCC :ACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATG 3CCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTAT RAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGAC TCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACG GGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGG AGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGACGGACCGACCATGGAATACG CCTCTGACGCTTCACTGGACCCCGAAGCCCCGTGGCCTCCCGCGCCCCGCGCTCGCGCCTGCCGCGTA CTGCCTTGGGCCCTGGTCGCGGGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGCTGCCGCCTGCGCCGTCTTCCT CGCCTGCCCCTGGGCCGTGTCCGGGGCTCGCGCCTCGCCCGGCTCCGCGGCCAGCCCGAGACTCCGCG AGGGTCCCGAGCTTTCGCCCGACGATCCCGCCGGCCTCTTGGACCTGCGGCAGGGCATGTTTGCGCAG CTGGTGGCCCAAAATGTTCTGCTGATCGATGGGCCCCTGAGCTGGTACAGTGACCCAGGCCTGGCAGG CGTGTCCCTGACGGGGGGCCTGAGCTACAAAGAGGACACGAAGGAGCTGGTGGTGGCCAAGGCTGGAG TCTACTATGTCTTCTTTCAACTAGAGCTGCGGCGCGTGGTGGCCGGCGAGGGCTCAGGCTCCGTTTCA CTTGCGCTGCACCTGCAGCCACTGCGCTCTGCTGCTGGGGCCGCCGCCCTGGCTTTGACCGTGGACCT GCCACCCGCCTCCTCCGAGGCTCGGAACTCGGCCTTCGGTTTCCAGGGCCGCTTGCTGCACCTGAGTG CCGGCCAGCGCCTGGGCGTCCATCTTCACACTGAGGCCAGGGCACGCCATGCCTGGCAGCTTACCCAG GGCGCCACAGTCTTGGGACTCTTCCGGGTGACCCCCGAAATCCCAGCCGGACTCCCTTCACCGAGGTC GGAATAAGAACGCTAGCTCTTGTGACTGGCGCGCCTGATCAATCGATGTTTAAACGTTATTTTCCACC ATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAG
GGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGG AAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGAC AGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCGA CGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGA AGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACGTGT GTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAAC ACGATTCTCGAGACTAGTCGTACGACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCT TGCACTTGTCACAAACAGTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATT TACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATG CTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGA ACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACT TAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATAT GCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTC AACACTGACTTGAACGCGTGCTAGCAGGCCCGGCCGGCCTTGTTAAAGACAGGATGAAGCTTAAAACA GCTCTGGGGTTGTACCCACCCCAGAGGCCCACGTGGCGGCTAGTACTCCGGTATTGCGGTACCCTTGT ACGCCTGTTTTATACTCCCTTCCCGTAACTTAGACGCACAAAACCAAGTTCAATAGAAGGGGGTACAA \CCAGTACCACCACGAACAAGCACTTCTGTTTCCCCGGTGATGTCGTATAGACTGCTTGCGTGGTTGA \AGCGACGGATCCGTTATCCGCTTATGTACTTCGAGAAGCCCAGTACCACCTCGGAATCTTCGATGCG rTGCGCTCAGCACTCAACCCCAGAGTGTAGCTTAGGCTGATGAGTCTGGACATCCCTCACCGGTGACG GTGGTCCAGGCTGCGTTGGCGGCCTACCTATGGCTAACGCCATGGGACGCTAGTTGTGAACAAGGTGT GAAGAGCCTATTGAGCTACATAAGAATCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCCAACCTCGGAGCAG GTGGTCACAAACCAGTGATTGGCCTGTCGTAACGCGCAAGTCCGTGGCGGAACCGACTACTTTGGGTG TCCGTGTTTCCTTTTATTTTATTGTGGCTGCTTATGGTGACAATCACAGATTGTTATCATAAAGCGAA TTGGATTGCGTACGCGGACCGAACTAGTTTCGCCGCCTCCAACATGTGTCACCAGCAGTTGGTCATCT CTTGGTTTTCCCTGGTTTTTCTGGCATCTCCCCTCGTGGCCATATGGGAACTGAAGAAAGATGTTTAT GTCGTAGAATTGGATTGGTATCCGGATGCCCCTGGAGAAATGGTGGTCCTCACCTGTGACACCCCTGA AGAAGATGGTATCACCTGGACCTTGGACCAGAGCAGTGAGGTCTTAGGCTCTGGCAAAACCCTGACCA TCCAAGTCAAAGAGTTTGGAGATGCTGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGAGGCGAGGTTCTAAGCCAT TCGCTCCTGCTGCTTCACAAAAAGGAAGATGGAATTTGGTCCACTGATATTTTAAAGGACCAGAAAGA ACCCAAAAATAAGACCTTTCTAAGATGCGAGGCCAAGAATTATTCTGGACGTTTCACCTGCTGGTGGC TGACGACAATCAGTACTGATTTGACATTCAGTGTCAAAAGCAGCAGAGGCTCTTCTGACCCCCAAGGG GTGACGTGCGGAGCTGCTACACTCTCTGCAGAGAGAGTCAGAGGGGACAACAAGGAGTATGAGTACTC AGTGGAGTGCCAGGAGGACAGTGCCTGCCCAGCTGCTGAGGAGAGTCTGCCCATTGAGGTCATGGTGG ATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATGAAAACTACACCAGCAGCTTCTTCATCAGGGACATCATCAAACCT GACCCACCCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATTAAAGAATTCTCGGCAGGTGGAGGTCAGCTGGGAGTA CCCTGACACCTGGAGTACTCCACATTCCTACTTCTCCCTGACATTCTGCGTTCAGGTCCAGGGCAAGA
GCAAGAGAGAAAAGAAAGATAGAGTCTTCACGGACAAGACCTCAGCCACGGTCATCTGCCGCAAAAAT GCCAGCATTAGCGTGCGGGCCCAGGACCGCTACTATAGCTCATCTTGGAGCGAATGGGCATCTGTGCC CTGCAGTGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCAGAAACCTCCCCGTGG CCACTCCAGACCCAGGAATGTTCCCATGCCTTCACCACTCCCAAAACCTGCTGAGGGCCGTCAGCAAC ATGCTCCAGAAGGCCAGACAAACTCTAGAATTTTACCCTTGCACTTCTGAAGAGATTGATCATGAAGA TATCACAAAAGATAAAACCAGCACAGTGGAGGCCTGTTTACCATTGGAATTAACCAAGAATGAGAGTT GCCTAAATTCCAGAGAGACCTCTTTCATAACTAATGGGAGTTGCCTGGCCTCCAGAAAGACCTCTTTT ATGATGGCCCTGTGCCTTAGTAGTATTTATGAAGACTTGAAGATGTACCAGGTGGAGTTCAAGACCAT GAATGCAAAGCTTCTGATGGATCCTAAGAGGCAGATCTTTCTAGATCAAAACATGCTGGCAGTTATTG ATGAGCTGATGCAGGCCCTGAATTTCAACAGTGAGACTGTGCCACAAAAATCCTCCCTTGAAGAACCG GATTTTTATAAAACTAAAATCAAGCTCTGCATACTTCTTCATGCTTTCAGAATTCGGGCAGTGACTAT TGATAGAGTGATGAGCTATCTGAATGCTTCCTAAAAACCGGCCCGGCCGGCCCCGCGGCCGCTCGAGC CTAAGCTTCTAGATAAGATATCCGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCATAATCAGCCATACCACAT TTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAAT GCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAA TTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTT \GCGCCGGCGGGTCGACAGCCTAGTGGTACCCACGAG
Фигура 19: Экспрессия трансгенов 4-1BBL, ИЛ-2 и оцИЛ-12 для Im02 и векторов, экспрессирующих отдельные гены, при разных MOI, а также ответ ИФН-у
0,0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 5 10 15 20 25 30 35 40 цГ/мп
J I I I | | I I I I I I I I HI/MJI
IH 7.5
IL-12 [5]
0.02
4.2
0.02
IL-2 [5]
H 0.6
H 0.5
4-1 BBL [5]
0.1
( 0.8
Ш < з.з
IL-12 [5]
IL-2 [5]
ШИШ-i o.3
H 7.1 5,4
i 15.5
]-l 12.4
4-1 BBL [25]
4 17.2
4-1 BBL [100]
ттшшш i2i.o
33.5
Im02 [5]
0.2
]-I 10.9 9.6
? ИЛ-12 Ш ИЛ-2
П ИФН-у шшз 4-1 BBL
4-1BBL+ клетки (%)
2/31
2/31
2/31
7/31
7/31
8/31
8/31
9/31
9/31
10/31
10/31
11/31
11/31
12/31
12/31
16/31
16/31
26/31
26/31
26/31
26/31
26/31
26/31
26/31
26/31
26/31
26/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
30/31
31/31
31/31
|
