EA201891639A1 20190628 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2019\PDF/201891639 Полный текст описания EA201891639 20170224 Регистрационный номер и дата заявки AU2016900701 20160226 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок IB2017/051054 Номер международной заявки (PCT) WO2017/145097 20170831 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21906 Номер бюллетеня [**] АМИНОКИСЛОТНЫЕ И ПЕПТИДНЫЕ КОНЪЮГАТЫ И СПОСОБ КОНЪЮГАЦИИ Название документа [8] C07C229/02, [8] C07C227/16, [8] C07C321/12, [8] C07K 14/00, [8] C07K 14/435, [8] C07K 1/02 Индексы МПК [NZ] Бримбл Маргарет Энн, [NZ] Уильямс Джеффри Мартин, [NZ] Данбар Питер Родерик, [NZ] Вердон Дэниел Сведения об авторах [NZ] ОКЛЕНД ЮНИСЕРВИСЕС ЛИМИТЕД Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201891639a*\id
больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Изобретение относится к аминокислотным и пептидным конъюгатам, способам получения аминокислотных и пептидных конъюгатов, конъюгатам, полученным данными способами, и лекарственным препаратам, содержащим данные конъюгаты. Предметом рассмотрения являются способы вызывания иммунного ответа у пациента и способы вакцинирования пациента, способы использования конъюгатов для этой цели и способы использования для этой цели конъюгатов при изготовлении лекарственных препаратов.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к аминокислотным и пептидным конъюгатам, способам получения аминокислотных и пептидных конъюгатов, конъюгатам, полученным данными способами, и лекарственным препаратам, содержащим данные конъюгаты. Предметом рассмотрения являются способы вызывания иммунного ответа у пациента и способы вакцинирования пациента, способы использования конъюгатов для этой цели и способы использования для этой цели конъюгатов при изготовлении лекарственных препаратов.

Евразийское (21) 201891639 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07C 229/02 (2006.01)
2019.06.28 C07C227/16 (2006.01)
C07C 321/12 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки C07K14/00 (2006.01)
2017.02.24 C07K14/435 (2006.01)
C07K 1/02 (2006.01)
(54) АМИНОКИСЛОТНЫЕ И ПЕПТИДНЫЕ КОНЪЮГАТЫ И СПОСОБ КОНЪЮГАЦИИ
(31) 2016900701
(32) 2016.02.26
(33) AU
(86) PCT/IB2017/051054
(87) WO 2017/145097 2017.08.31
(88) 2017.10.05
(71) Заявитель:
ОКЛЕНД ЮНИСЕРВИСЕС ЛИМИТЕД (NZ)
(72) Изобретатель:
Бримбл Маргарет Энн, Уильяме Джеффри Мартин, Данбар Питер Родерик, Вердон Дэниел (NZ)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU)
(57) Изобретение относится к аминокислотным и пептидным конъюгатам, способам получения аминокислотных и пептидных конъюгатов, конъюга-там, полученным данными способами, и лекарственным препаратам, содержащим данные конъ-югаты. Предметом рассмотрения являются способы вызывания иммунного ответа у пациента и способы вакцинирования пациента, способы использования конъюгатов для этой цели и способы использования для этой цели конъюгатов при изготовлении лекарственных препаратов.
АМИНОКИСЛОТНЫЕ И ПЕПТИДНЫЕ КОНЪЮГАТЫ И СПОСОБ
КОНЪЮГАЦИИ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к аминокислотным и пептидным конъюгатам, способам получения аминокислотных и пептидных конъюгатов, конъюгатам, полученным данными способами, лекарственным препаратам, содержащим данные конъюгаты, способам вызывания иммунного ответа у пациента и способам вакцинирования пациента, способам использования конъюгатов для этой цели и способам использования для этой цели конъюгатов при изготовлении лекарственных препаратов. Изобретение также относится к способам получения композиций, полезных при синтезе аминокислотных и пептидных конъюгатов по настоящему изобретению, и к таким композициям.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Синтетические пептидные вакцины обычно содержат синтетическую копию иммуногенной части белковых антигенов. Такой подход к разработке вакцин обладает рядом преимуществ, включая: простоту синтеза, исключение потенциально биологически-токсичных побочных продуктов и непосредственное определение параметров.
Ключевой проблемой при разработке пептидных вакцин является отсутствие иммуногенности, проявляемой пептидами в качестве единственных составных частей вакцины. Обычно существует необходимость включения в вакцину адъюванта, предназначенного для активации составных частей врожденной иммунной системы (например, адъюванта Фрейнда).
Альтернативной стратегией при разработке пептидной вакцины является создание самоадъювантных вакцин, в которых исследуемая пептидная антигенная детерминанта ковалентно связана с соответствующим адъювантом. Такие самоадъювантные вакцины обладают улучшенным поглощением антигенов, презентированием и созреванием дендритных клеток по сравнению с простым взаимодействием антигена с внешним адъювантом.
Было разработано более самоадъювантных вакцин, но сложность заключается в приготовлении вакцин.
Существует постоянная потребность в новых самоадъювантных вакцинах и новых способах создания самоадъювантных вакцин. Целью настоящего
изобретения является частичное удовлетворение этих потребностей и/или, по меньшей мере, предоставление общественности полезного выбора.
Другие цели изобретения станут очевидными из следующего описания, которое приводится только в качестве примера.
5 Любое рассмотрение документов, фактов, материалов, устройств, изделий
и т.п., включенное в настоящее описание, предназначено исключительно для конкретных условий настоящего изобретения. Это не следует принимать за признание, что любые или все эти вопросы являются частью предшествующего уровня техники или являются общеизвестными сведениями в области, относящейся к 10 настоящему изобретению, как это существовало до даты приоритета.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте, настоящее изобретение в целом выражается в соединении аминокислотного или пептидного конъюгата формулы (I):
15 (I) где
m и w независимы и каждое представляет собой целое число от 0 до 7, a v представляет собой целое число от 0 до 5, при условии, что:
20 сумма m, v, и w, по меньшей мере, равна 3; а
сумма т и w составляет от 0 до7; п равно 1 или 2;
Z1 и Z2 независимы и каждое выбирается из группы, состоящей из: -О-, -NR-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -С(0)0-, -ОС(О)-, -C(0)NR-, -NRC(O)-, -C(0)S-, -25 SC(O)-, -OC(0)0-, -NRC(0)0-, -OC(0)NR-, и -NRC(0)NR-;
Rl, R2, Rx, Ry, R4, R5, R6 и R7, при каждом конкретном m, v, w, и n, каждое независимо представляет собой водород или С1-6 алифатическую группу;
R, R3 и R8 каждое независимо представляет собой водород или С1-6
алифатическую группу;
30 R9 представляет собой водород, С1-6 алифатическую группу,
аминозащитную группу, 1_3-С(0)-, или А2;
L1 и L2 каждое независимо выбирается из С5-21 алифатической группы или С4-20 гетероалифатической группы;
L3 представляет собой С1-21 алифатическую группу или С2-20
гетероалифатическую группу;
5 А1 представляет собой аминокислоту, пептид, ОН, ОР1, Nhh или NHP2,
где Р1 представляет собой карбоксилзащитную группу, а Р2 представляет собой карбоксамидзащитную группу;
А2 представляет собой аминокислоту или пептид;
где любая алифатическая или гетероалифатическая группа, 10 присутствующая в любом из R, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Rx, Ry, LI, L2 и L3, необязательно, замещена;
или его фармацевтически приемлемой солью или сольватом.
Любой из вариантов осуществления или параметры, описанные здесь, 15 могут относиться к любому из аспектов настоящего изобретения по отдельности или в сочетании с любым одним или несколькими вариантами осуществления или параметрами, описанными здесь, если не указано иное или явно не противоречит контексту.
20 В различных вариантах осуществления,
Rl, R2, Rx, Ry, R4, R5, R6 и R7, при каждом конкретном m, v, w, и п, каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил, С2-6 алкенил, С2-6 алкинил или СЗ-6 циклоалкил;
R, R3 и R8 каждое независимо представляет собой водород, С1-6 25 алкил, С2-6 алкенил, С2-6 алкинил или СЗ-6 циклоалкил;
R9 представляет собой водород, С1-6 алкил, С2-6 алкенил, С2-6 алкинил, СЗ-6 циклоалкил, аминозащитную группу, L3-C(0)- или А2;
L1 и L2 каждое независимо выбирается из С5-21 алкила, С5-21
алкенила, С5-21 алкинила или С4-20 гетероалкила;
30 L3 представляет собой С1-21 алкил, С5-21 алкенил, С5-21 алкинил,
СЗ-6 циклоалкил или С2-20 гетероалкил;
А1 представляет собой аминокислоту, пептид, ОН, ОР1, NH2 или NHP2,
где Р1 представляет собой карбоксилзащитную группу, а Р2 представляет собой
карбоксамидзащитную группу;
35 А2 представляет собой аминокислоту или пептид;
где любой алкил, алкенил, циклоалкил или гетероалкил, присутствующий в любом из R, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Rx, Ry, LI, L2 и L3, необязательно замещен;
В различных вариантах осуществления,
Rl, R2, Rx, Ry, R4, R5, R6 и R7, при каждом конкретном m, v, w, и п, каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил, С2-6 алкенил или СЗ-6 циклоалкил;
5 R, R3 и R8 каждое независимо представляет собой водород, С1-6
алкил, С2-6 алкенил или СЗ-6 циклоалкил;
R9 представляет собой водород, С1-6 алкил, С2-6 алкенил, СЗ-6 циклоалкил, аминозащитную группу, 1_3-С(0)- или А2;
L1 и L2 каждое независимо выбирается из С5-21 алкила, С5-21 10 алкенила или С4-20 гетероалкила;
L3 представляет собой С1-21 алкил, С5-21 алкенил, СЗ-6 циклоалкил или С2-20 гетероалкил;
А1 представляет собой аминокислоту, пептид, ОН, ОР1, NH2 или NHP2, где Р1 представляет собой карбоксилзащитную группу, а Р2 представляет собой 15 карбоксамидзащитную группу;
А2 представляет собой аминокислоту или пептид;
где любой алкил, алкенил или гетероалкил, присутствующий в любом из R, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Rx, Ry, LI, L2 и L3, необязательно, замещен;
20 В различных вариантах осуществления,
Rl, R2, Rx, Ry, R4, R5, R6 и R7, при каждом конкретном m, v, w, и п, каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил или СЗ-6 циклоалкил;
R, R3 и R8 каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил или СЗ-6 циклоалкил;
25 R9 представляет собой водород, С1-6 алкил, СЗ-6 циклоалкил,
аминозащитную группу, L3-C(0)- или А2;
L1 и L2 каждое независимо выбирается из С5-21 алкила, С5-21 алкенила или С4-20 гетероалкила;
L3 представляет собой С1-21 алкил, С2-21 алкенил, СЗ-6 циклоалкил 30 или С2-20 гетероалкил;
А1 представляет собой аминокислоту, пептид, ОН, ОР1, NH2 или NHP2, где Р1 представляет собой карбоксилзащитную группу, а Р2 представляет собой карбоксамидзащитную группу;
А2 представляет собой аминокислоту или пептид;
35 где любой алкил, алкенил или гетероалкил, присутствующий в любом
из R, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Rx, Ry, LI, L2 и L3, необязательно, замещен;
В различных вариантах осуществления,
Rl, R2, Rx, Ry, R4, R5, R6 и R7, при каждом конкретном m, v, w, и n, каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил или СЗ-6 циклоалкил;
R, R3 и R8 каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил или СЗ-6 циклоалкил;
5 R9 представляет собой водород, С1-6 алкил, СЗ-6 циклоалкил,
аминозащитную группу, 1_3-С(0)- или А2;
L1 и L2 каждое независимо выбирается из С5-21 алкила или С4-20 гетероалкила;
L3 представляет собой С1-21 алкил, СЗ-6 циклоалкил или С2-20
10 гетероалкил;
А1 представляет собой аминокислоту, пептид, ОН, ОР1, NH2 или NHP2, где Р1 представляет собой карбоксилзащитную группу, а Р2 представляет собой карбоксамидзащитную группу;
А2 представляет собой аминокислоту или пептид;
15 где любой алкил, циклоалкил или гетероалкил, присутствующий в
любом из R, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Rx, Ry, LI, L2 и L3, необязательно, замещен;
В различных вариантах осуществления, Z1 и Z2 каждый независимо 20 выбирается из группы, состоящей из -С(0)0-, -C(0)NR-, and -C(0)S-.
В различных вариантах осуществления, соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (IA):
R1 R2 R4 R5 R? R7
1_1_ С(О) 0^v '-^ V '..T-R- 4 'гпг-с(°)- А1
25 В различных вариантах осуществления, v составляет от 0 до 4, от 0 до 3,
или от 0 до 2, или v равно 0 или 1, например, 0.
В некоторых вариантах осуществления, m составляет от 0 до 3. В примерах осуществления, v равно 0.
В различных вариантах осуществления, m и w каждое независимо 30 составляет от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 0 до 2, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3 или от 1 до 2.
В различных вариантах осуществления, m и w каждое независимо составляет от 0 до 5.
В некоторых вариантах осуществления, m и w каждое независимо составляет от 1 до 4.
В различных вариантах осуществления, m составляет от 1 до 6, например, от 2 до 6, от 1 до 5 или от 2 до 5. В различных вариантах осуществления, m составляет от 1 до 5. В различных вариантах осуществления, m составляет от 1 до 3. В примерах осуществления, m равно 2.
В различных вариантах осуществления, w равно 1 или 2. В примерах осуществления, w равно 1.
В различных вариантах осуществления, сумма m и w составляет от 0 до 6, от 0 до 5, от 0 до 4, от 0 до 3, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, от 2 до 7, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4 или от 2 до 3.
В различных вариантах осуществления, сумма m и w составляет от 2 до 7.
В некоторых вариантах осуществления, сумма m и w составляет от 2 до 5.
В примерах осуществления, сумма m и w равна 3.
В различных вариантах осуществления, v составляет от 0 до 3, m и w каждое независимо составляет от 0 до 5, а сумма m и w составляет от 2 до 7.
В различных вариантах осуществления, v составляет от 1 или 0, m и w каждое независимо составляет от 0 до 5, а сумма m и w составляет от 2 до 7.
В различных вариантах осуществления, v равно 1 или 0, m и w каждое независимо составляет от 1 до 4, а сумма m и w составляет от 2 до 7.
В различных вариантах осуществления, v равно 1 или 0, m и w каждое независимо составляет от 1 до 4, а сумма m и w составляет от 2 до 5.
В некоторых вариантах осуществления, v равно 1 или 0, m составляет от 1 до 6, a w равно 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления, v равно 1 или 0, m составляет от 1 до 5, a w равно 1 или 2.
В некоторых вариантах осуществления, v равно 0 или 1, m составляет от 1 до 3, a w равно 1 или 2.
В примерах осуществления, v равно 0, m равно 2, a w равно 1.
В примерах осуществления, п равно 1.
В некоторых вариантах осуществления, L1 и L2 каждое независимо представляет собой С5-21 алифатическую группу, например, С9-21 алифатическую группу, С11-21 алифатическую группу или СИ-, С13-, С15-, С17- или С19 5 алифатическую группу.
В некоторых вариантах осуществления, L1 и L2 каждое независимо представляет собой С5-21 алкил.
В некоторых вариантах осуществления, L1 и L2 каждое независимо представляет собой С9-21 алкил. В некоторых вариантах осуществления, L1 и L2 10 каждое независимо представляет собой С11-21 алкил.
В разных примерах осуществления, L1 и L2 каждое независимо представляет собой СИ, С13, С15, С17, или С19 алкил, предпочтительно, п-алкил.
В различных специально рассматриваемых вариантах осуществления, L1 и L2 каждое независимо представляет собой С15 алкил.
15 В различных вариантах осуществления, L1 и L2 каждое независимо
содержит линейную цепочку из 9-21 атомов углерода.
В примерах осуществления, L1 и L2 каждое независимо представляет собой линейный С15 алкил.
В некоторых вариантах осуществления, L3 представляет собой С1-21
20 алкил.
В различных вариантах осуществления, L3 представляет собой метил или линейный С15 алкил.
В примерах осуществления, L3 представляет собой метил (т.е., R9 представляет собой ацетил).
25 В некоторых вариантах осуществления, аминозащитная группа
предоставляет собой Вое, Fmoc, Cbz (карбоксибензил), Nosyl (о- или р-нитрофенилсульфонил), Врос (2-4-бифенилизопропоксокарбонил) и Dde (1-4,4-диметил-2,6-диоксогексилиден этил).
В некоторых вариантах осуществления, аминозащитная группа 30 предоставляет собой Вое или Fmoc.
В некоторых вариантах осуществления, аминозащитная группа предоставляет собой Fmoc.
В некоторых вариантах осуществления, карбоксилзащитная группа представляет собой трет-бутил, бензил или аллил.
5 В некоторых вариантах осуществления, карбоксилзащитная группа
предоставляет собой Dmcp или тритил.
В некоторых вариантах осуществления, R1 и R2, при каждом конкретном т, каждое независимо представляет собой С1-6 алкил или водород. В различных специально рассматриваемых вариантах осуществления, R1 и R2, при каждом 10 конкретном т, каждое независимо представляет собой водород.
В различных вариантах осуществления, R3 представляет собой С1-6 алкил или водород. В различных специально рассматриваемых вариантах осуществления, R3 представляет собой водород.
В различных вариантах осуществления, R4 и R5, при каждом конкретном 15 w, каждое независимо представляет собой С1-6 алкил или водород, предпочтительно водород. В различных специально рассматриваемых вариантах осуществления, R4 и R5, при каждом конкретном w, каждое независимо представляет собой водород.
В различных вариантах осуществления, Rx и Ry, при каждом конкретном v, каждое независимо представляет собой С1-6 алкил или водород. В различных 20 специально рассматриваемых вариантах осуществления, Rx и Ry, при каждом конкретном v, каждое представляет собой водород.
В различных вариантах осуществления, R6 и R7, при каждом конкретном п, каждое независимо представляет собой С1-6 алкил или водород. В различных специально рассматриваемых вариантах осуществления, R6 и R7 каждое 25 представляет собой водород.
В различных вариантах осуществления, R8 независимо представляет собой С1-6 алкил или водород. В примерах осуществления, R8 представляет собой водород.
В различных вариантах осуществления, R9 представляет собой С1-6 30 алкил, водород, аминозащитную группу, 1_3-С(0)- или А2. В примерах осуществления, R9 представляет собой водород, аминозащитную группу, 1_3-С(0)-или А2.
В различных вариантах осуществления, R8 представляет собой водород, а R9 представляет собой водород, аминозащитную группу, 1_3-С(0)- или А2.
В различных вариантах осуществления, R8 и R9 каждое представляет собой водород или R9 представляет собой 1_3-С(0) или А2.
В различных примерах осуществления, R8 представляет собой водород, а
R9 представляет собой 1_3-С(0). В различных специально рассматриваемых вариантах осуществления, R9 представляет собой 1_3-С(0), где L3 представляет собой метил.
В различных вариантах осуществления, соединение формулы (I) 10 представляет собой соединение формулы (IF):
(IF)
где m представляет собой целое число от 2 до 6, предпочтительно 2; а
оставшиеся переменные соответствуют определению в соединении
15 формулы (I) или в любом ее осуществлении.
В различных вариантах осуществления соединение формулы (IF) представляет собой соединение формулы (IF-1):
R\ /R2 R4 R5 R6 R7
(IB)
В различных вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой соединение формулы (IB):
где
к представляет собой целое число от 0 до 4, а
Ra, Rb, и Rc каждое независимо представляет собой водород или С1-6 алифатическую группу.
5 В различных вариантах осуществления соединение формулы (IB)
представляет собой соединение формулы (1С):
(1С)
В различных вариантах осуществления, к составляет от 0 до 3, от 0 до 2, 10 от 0 до 1, от 1 до 4, от 1 до 3 или от 1 до 2, или к равно 0 или 1.
В некоторых вариантах осуществления, к составляет от 0 до 3.
В некоторых вариантах осуществления, к равно 0 или 1.
В примерах осуществления, к равно 0.
В некоторых вариантах осуществления, к равно v.
15 В различных вариантах осуществления, Ra, Rb и Rc каждое независимо
представляет собой водород, С1-6 алкил, С2-6 алкенил, С2-6 алкинил или СЗ-6 циклоалкил.
В различных вариантах осуществления, Ra, Rb и Rc каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил, С2-6 алкенил или СЗ-6 циклоалкил.
20 В различных вариантах осуществления, Ra, Rb и Rc каждое независимо
представляет собой водород, С1-6 алкил или СЗ-6 циклоалкил.
В различных вариантах осуществления, Ra, Rb и Rc каждое независимо выбирается из водорода, С1-6 алкила, предпочтительно водорода. В примерах осуществления, Ra, Rb и Rc каждое представляет собой водород.
25 В различных вариантах осуществления, соединение формулы (I)
представляет собой соединение формулы (ID):
(ID)
В некоторых вариантах осуществления, соединение представляет собой соединение формулы (ID), где L1 и L2 каждое представляет собой линейный С15 5 алкил.
В различных вариантах осуществления, L1 и L2 каждое независимо представляет собой С11-21 алкил, m равно 2, v равно 0, w равно 1, R1 и R2 в каждом конкретном случае представляют собой водород, R3 представляет собой водород, a R4 и R5 каждое представляют собой водород.
10 В различных вариантах осуществления, п равно 1, R6, R7 и R8 каждое
представляют собой водород, a R9 представляет собой водород, аминозащитную группу, 1_3-С(0)- или А2.
В различных вариантах осуществления, п равно 1, R6, R7 и R8 каждое представляют собой водород, a R9 представляет собой водород, аминозащитную 15 группу или 1_3-С(0), где L3 представляет собой линейный С15 алкил или метил
В различных вариантах осуществления, L1 и L2 каждое независимо представляет собой С11-21 алкил, m равно 2, v равно 0, w равно 1, R1 и R2 в каждом конкретном случае представляют собой водород, R3 представляет собой водород, R4 и R5 каждое представляет собой водород, п равно 1, R6, R7 и R8 каждое 20 представляет собой водород, a R9 представляет собой водород, аминозащитную группу или 1_3-С(0), где L3 представляет собой линейный С15 алкил или метил.
В различных вариантах осуществления соединение формулы (I) имеет формулу (IE):
В различных вариантах осуществления соединение формулы (I) имеет формулу (IEE):
(IEE).
В различных вариантах осуществления соединение формулы (I) имеет формулу (IE-1):
(IE-1)
В различных вариантах осуществления соединение формулы (I) имеет формулу (IEE-1):
(IEE-1)
В различных вариантах осуществления соединение формулы (I) имеет формулу (IE-2):
(IE-2)
В различных вариантах осуществления соединение формулы (I) имеет формулу (IEE-2):
(IEE-2)
В различных вариантах осуществления соединение формулы (I) имеет формулу (IEE-3):
(IEE-3)
В различных вариантах осуществления соединение формулы (I) имеет формулу (IEE-4):
В различных вариантах осуществления, аминокислота аминокислотного или пептидного конъюгата, с которым конъюгированы липидные фрагменты, представляет собой цистеиновый остаток.
Специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение понятно, что в некоторых вариантах осуществления фрагменты L1-Z1- и L2-Z2-могут представлять собой группы жирных кислот, например, сложные эфиры жирных кислот. В различных вариантах осуществления, фрагменты могут представлять собой насыщенные или ненасыщенные сложные эфиры жирных кислот. В некоторых вариантах осуществления жирная кислота является насыщенной.
В различных вариантах осуществления, жирная кислота представляет собой С4-22 жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления, жирная кислота представляет собой С6-22 жирную кислоту.
В некоторых вариантах осуществления, жирная кислота представляет собой С10-22 жирную кислоту. В некоторых специально рассматриваемых вариантах осуществления, жирная кислота представляет собой С12-22 жирную кислоту. В различных примерах осуществления, жирная кислота представляет собой С12, С14, 5 С16, С18 или С20 жирную кислоту.
В некоторых вариантах осуществления, жирная кислота представляет собой лауриновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, арахиновую кислоту, пальмитолеиновую кислоту, олеиновую кислоту, элаидиновую кислоту, линолевую кислоту, а-линоленовую кислоту и 10 арахидоновую кислоту.
В различных вариантах осуществления, жирная кислота представляет собой лауриновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту.
В некоторых примерах осуществления, жирная кислота представляет 15 собой пальмитиновую кислоту (а фрагменты L1-Z1- и L2-Z2- каждый представляет собой пальмитоильные группы).
В различных вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой аминокислотный конъюгат.
В некоторых вариантах осуществления, А1 представляет собой ОН, ОР1, 20 NH2 или NHP2 и/или R9 представляет собой водород, С1-6 алкил, СЗ-6 циклоалкил, аминозащитную группу или L3-C (О).
В некоторых вариантах осуществления, А1 представляет собой ОР1 или ОН, и/или R9 представляет собой водород, аминозащитную группу или L3-C (О).
В различных вариантах осуществления, А1 представляет собой ОН, ОР1, 25 NH2 или NHP2, a R9 представляет собой водород, С1-6 алкил, СЗ-6 циклоалкил, аминозащитную группу или L3-C (О).
В различных вариантах осуществления, А1 представляет собой ОН или ОР1, a R9 представляет собой водород, аминозащитную группу или L3-C (О).
В различных вариантах осуществления, R9 представляет собой водород, 30 аминозащитную группу или L3-C (О). В некоторых вариантах осуществления R9 представляет собой водород или L3-C (О).
В различных вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой пептидный конъюгат.
В различных вариантах осуществления, А1 и/или А2 представляет собой аминокислоту или пептид.
5 В некоторых вариантах осуществления, А1 и/или А2 представляет собой
пептид.
В одном варианте осуществления, А1 и/или А2 представляет собой пептид, включающий антигенную детерминанту.
В некоторых вариантах осуществления, А1 и/или А2 представляет собой 10 пептид, включающий пептидную антигенную детерминанту.
В другом варианте осуществления, А1 и/или А2 представляет собой пептид, где пептид включает пептидную антигенную детерминанту.
В некоторых вариантах осуществления, А1 и/или А2 представляет собой пептид, замещенный антигенной детерминантой.
15 В некоторых вариантах осуществления, антигенная детерминанта
сопрягается с пептидом с помощью линкерной группы.
В некоторых вариантах осуществления, А1 представляет собой пептид.
В некоторых примерах осуществления, А1 представляет собой пептид, а R9 не представляет собой А2 (т.е., R9 не представляет собой аминокислоту или 20 пептид).
В различных вариантах осуществления, пептид содержит антигенную детерминанту.
В различных вариантах осуществления, антигенная детерминанта представляет собой пептидную антигенную детерминанту.
25 В некоторых вариантах осуществления, антигенная детерминанта
сопрягается или связывается с помощью линкерной группы.
В различных вариантах осуществления, аминокислота пептидного конъюгата, с которым конъюгированы липидные фрагменты, представляет собой N-концевой аминокислотный остаток.
В различных вариантах осуществления, А1 представляет собой серии или пептид, включающий серии в качестве первого N-концевого аминокислотного остатка.
В некоторых вариантах осуществления, А1 представляет собой пептид, 5 включающий серии в качестве первого N-концевого аминокислотного остатка.
В различных вариантах осуществления, пептидный конъюгат включает одну или более солюбилизирующих групп.
В некоторых вариантах осуществления, солюбилизирующая группа включает аминокислотную последовательность, содержащую два или более 10 гидрофильных аминокислотных остатка в пептидной цепи.
В различных вариантах осуществления, солюбилизирующая группа представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую последовательность из двух или более последовательных гидрофильных аминокислотных остатков в пептидной цепи.
15 В различных вариантах осуществления, два или более гидрофильных
аминокислотных остатка примыкают к сериновому остатку.
В некоторых вариантах осуществления, А1 и/или А2 представляет собой пептид, включающий солюбилизирующую группу.
В различных вариантах осуществления, А1 и/или А2 представляет собой 20 пептид, содержащий солюбилизирующую группу, содержащую аминокислотную последовательность, включающую два или более гидрофильных аминокислотных остатка в пептидной цепи.
В некоторых вариантах осуществления, А1 представляет собой пептид, содержащий солюбилизирующую группу, содержащую аминокислотную 25 последовательность, включающую два или более гидрофильных аминокислотных остатка в пептидной цепи.
В некоторых вариантах осуществления, А1 представляет собой пептид, содержащий серии в качестве первого N-концевого аминокислотного остатка и солюбилизирующую группу, содержащую аминокислотную последовательность, 30 включающую два или более гидрофильных аминокислотных остатка в пептидной цепи, примыкающей к серину.
В некоторых вариантах осуществления, соединение содержит линкер или одну или более аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит линкер или одну или более аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления пептид содержит пептидную 5 антигенную детерминанту, связанную посредством линкера с аминокислотой, с которой связаны липидные фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит две или более антигенных детерминанты.
В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит антигенный
10 пептид.
В некоторых вариантах осуществления, линкер представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую примерно от 2 до 20, от 2 до 18, от 2 до 16, от 2 до 14, от 2 до 12, от 2 до 10 или от 2 до 8 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления, соединение формулы (I) содержит 15 3 или более, 4 или более или 5 или более примыкающих аминокислот.
В различных вариантах осуществления, пептидный конъюгат представляет собой липопептид.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой самоадъювантный пептид.
20 В некоторых вариантах осуществления, А1 и/или А2 каждое независимо
представляет собой пептид, содержащий примерно от 8 до 220, от 8 до 200, от 8 до 175, от 8 до 150, от 8 до 125, от 8 до 100, от 8 до 90, от 8 до 80, от 8 до 70, от 8 до 60, от 8 до 50, от 8 до 40, от 8 до 30, от 8 до 25, от 8 до 20 или от 8 до 15 аминокислот. В одном примерном варианте осуществления, А1 и А2 каждое
25 независимо представляет собой пептид, содержащий примерно от 8 до 60 аминокислот.
В других вариантах осуществления, А1 и/или А2 каждое независимо представляет собой пептид, содержащий примерно от 8 до 220, от 8 до 200, от 8 до 175, от 8 до 150, от 8 до 125, от 8 до 100, от 8 до 90, от 8 до 80, 8 до 70, от 8 до 60, 30 от 8 до 50, от 8 до 40, от 8 до 30, от 8 до 25, от 8 до 20 или от 8 до 15 аминокислот.
В других вариантах осуществления, А1 и/или А2 каждое независимо представляет собой пептид, содержащий примерно от 5 до 150, от 5 до 125, от 5 до
100, от 5 до 75, от 5 до 60, от 5 до 50, от 5 до 40, от 5 до 30, от 5 до 25, от 5 до 20, от 8 до 150, от 8 до 125, от 8 до 100, от 8 до 75, от 8 до 60, от 8 до 50, от 8 до 40, от 8 до 30, от 8 до 25 или от 8 до 20 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления, А1 и/или А2 каждое независимо представляет собой пептид, где пептид содержит от 8 до 60 аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления, А1 и/или А2 каждое независимо представляет собой пептид, содержащий или замещенный пептидной антигенной детерминантой, где пептидная антигенная детерминанта содержит от 8 до 60 аминокислот.
Подходящие пептидные антигенные детерминанты включают, без ограничения, детерминанты, описаны в патенте WO 2016/103192, зарегистрированном 22 декабря 2015 г., содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
В различных вариантах осуществления, пептид включает, по существу состоит из одной или более антигенных детерминант EBV LMP2. В различных вариантах осуществления, одна или более антигенных детерминант EBV LMP2 являются антигенными детерминантами MHCI. В различных вариантах осуществления, пептид включает одну или более антигенных детерминант EBV LMP2, выбранных из любой группы из SEQ ID NO: 76-101. В различных вариантах осуществления, пептид включает пептид, содержащий или состоящий из 8 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-75. В различных вариантах осуществления, пептид включает пептид, содержащий или состоящий из 12 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-75. В различных вариантах осуществления, пептид включает пептид, содержащий или состоящий из 15 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-75, или содержащий или состоящий из 20 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-75.
В различных вариантах осуществления, пептид включает рекомбинантный пептид, содержащий или состоящий из 12 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-75. В различных вариантах осуществления рекомбинантный пептид включает или состоит из 15 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-75, или включает или состоит из 20 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-75.
В различных вариантах осуществления пептид включает, состоит или состоит по существу из аминокислотной последовательности, выбранной из любой группы из SEQ ID NO: 1-75.
В различных вариантах осуществления пептид включает, состоит или 5 состоит по существу из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
(a) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaa2Xaa3Xaa4DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL
[SEQ ID N0:1], где Xaai отсутствует или представляет собой S или
10 гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой
гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
(b) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
15 последовательности Ха a iXa а гХа а 3D RH S DYQP LGTQDQS LYLG LQH DG N DG L [SEQ ID
N0:2], где Xaal отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти гидрофильных аминокислот;
20 (с) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaa2DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL [SEQ ID N0:3], где Xaal отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, Хааг отсутствует или представляет собой от одной до четырех гидрофильных аминокислот;
25 (d) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности SKKKKDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL [SEQ ID N0:4];
(e) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL [SEQ ID N0:5];
(f) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
30 последовательности XaaiXaa2Xaa3Xaa4SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA
[SEQ ID N0:6], где Xaal отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, Хааг отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой
гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
(д) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaa2Xaa3SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA
5 [SEQ ID N0:7], где Xaal отсутствует или представляет собой S или
гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти гидрофильных аминокислот;
(п) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
10 последовательности XaaiXaa2SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA [SEQ ID
N0:8], где Xaal отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой от одной до четырех гидрофильных аминокислот;
(i) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
15 последовательности SKKKKSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA [SEQ ID
N0:9];
(j) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности SLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA [SEQ ID N0:10];
(к) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
20 последовательности Хаа iXa а 2Ха а зХа a 4S DYQP LGTQDQS LYLG LQH DG N DG L [SEQ ID
N0:11], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную
аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную
аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более
25 гидрофильных аминокислот;
(I) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaa2Xaa3SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL [SEQ ID
N0:12], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
аминокислоту, Хааг отсутствует или представляет собой гидрофильную
30 аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти
гидрофильных аминокислот;
(т) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности XaaiXaa2SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL [SEQ ID N0:13], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
аминокислоту, а Хаа2 отсутствует или представляет собой от одной до четырех гидрофильных аминокислот;
(п) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности SKKKKSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL [SEQ ID N0:14];
5 (о) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности SDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGL [SEQ ID N0:15];
(р) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaa2Xaa3Xaa4DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA
10 [SEQ ID N0:16], где Xaai отсутствует или представляет собой S или
гидрофильную аминокислоту, Хааг отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
15 (q) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности
XaaiXaa2Xaa3DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA [SEQ
ID N0:17], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
аминокислоту, Хааг отсутствует или представляет собой гидрофильную
20 аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти
гидрофильных аминокислот;
(г) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaa2DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA [SEQ ID
25 N0:18], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
аминокислоту, а Хааг отсутствует или представляет собой от одной до четырех гидрофильных аминокислот;
(s) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
30 SKKKKDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA [SEQ ID
N0:19];
(t) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
DRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEA [SEQ ID N0:20];
(u) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaa2Xaa3Xaa4LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL
[SEQ ID N0:21], где Xaai отсутствует или представляет собой S или
гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой
5 гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой
гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
(v) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaazXaasLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL
10 [SEQ ID N0:22], где Xaai отсутствует или представляет собой S или
гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти гидрофильных аминокислот;
(w) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
15 последовательности XaaiXaa2LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL [SEQ ID
N0:23], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, а Хааг отсутствует или представляет собой от одной до четырех гидрофильных аминокислот;
(х) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
20 последовательности SKKKKLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL [SEQ ID
N0:24];
(у) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности LLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLL [SEQ ID N0:25];
(z) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
25 последовательности
XaaiXaa2Xaa3Xaa4LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA [SEQ ID N0:26], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную
30 аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более
гидрофильных аминокислот;
(аа) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaazXaasLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA [SEQ ID N0:27],
35 где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти гидрофильных аминокислот;
(bb)8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
5 последовательности XaaiXaa2LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA
[SEQ ID N0:28], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, а Хааг отсутствует или представляет собой от одной до четырех гидрофильных аминокисло;
(сс) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
10 последовательности SKKKKLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA [SEQ
ID N0:29];
(dd)8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA [SEQ ID N0:30];
15 (ее) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaazXaasXaa^MLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL [SEQ ID N0:31], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную
20 аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более
гидрофильных аминокислот;
(ff) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaazXaasLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL [SEQ ID
N0:32], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
25 аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную
аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти гидрофильных аминокислот;
(gg)8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaa2LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL [SEQ ID N0:33],
30 где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
аминокислоту, а Хааг отсутствует или представляет собой от одной до четырех гидрофильных аминокислот;
(hh)8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности SKKKKLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL [SEQ ID N0:34];
(ii) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности LMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILL [SEQ ID N0:35];
(jj) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaazXaasXaa^LICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA [SEQ
5 ID N0:36], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
10 (kk) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaazXaasLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA [SEQ ID N0:37], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти
15 гидрофильных аминокислот;
(II) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaa2LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA [SEQ ID
N0:38], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
аминокислоту, а Хаа2 отсутствует или представляет собой от одной до четырех
20 гидрофильных аминокислот;
(mm) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности SKKKKLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA [SEQ ID N0:39];
(nn)8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности LLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLA [SEQ ID N0:40];
25 (оо) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности
XaaiXaa2Xaa3Xaa4LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIA
GGSI [SEQ ID N0:41], где Xaai отсутствует или представляет собой S или
гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой
30 гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой
гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
(рр)8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaazXaasLNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGS
I [SEQ ID N0:42], где Xaai отсутствует или представляет собой S или
гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой
гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от
5 одной до десяти гидрофильных аминокислот;
(qq)8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaazLNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI
[SEQ ID N0:43], где Xaai отсутствует или представляет собой S или
10 гидрофильную аминокислоту, а Хаа2 отсутствует или представляет собой от
одной до четырех гидрофильных аминокислот;
(гг) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
SKKKKLNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI [SEQ
15 ID N0:44];
(ss) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
LNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSI [SEQ ID N0:45];
20 (tt) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности
XaaiXaa2Xaa3Xaa4FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA [SEQ ID
N0:46], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную
25 аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную
аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
(uu)8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
30 XaaiXaa2Xaa3FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA [SEQ ID
N0:47], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, Хааг отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти гидрофильных аминокислот;
(vv) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaa2FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA [SEQ ID N0:48],
где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
5 аминокислоту, а Хаа2 отсутствует или представляет собой от одной до четырех
гидрофильных аминокислот;
(ww) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности SKKKKFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA [SEQ ID N0:49];
10 (хх) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности FLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASA [SEQ ID N0:50];
(уу) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
15 XaaiXaa2Xaa3Xaa4LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL [SEQ ID N0:51], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну
20 или более гидрофильных аминокислот;
(zz) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaa2Xaa3LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL
[SEQ ID N0:52], где Xaai отсутствует или представляет собой S или
25 гидрофильную аминокислоту, Хааг отсутствует или представляет собой
гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти гидрофильных аминокислот;
(ааа) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
30 XaaiXaazLQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL [SEQ ID
N0:53], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, а Хаа2 отсутствует или представляет собой от одной до четырех гидрофильных аминокислот;
(bbb) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
SKKKKLQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL [SEQ ID N0:54];
(ccc) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
5 LQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLL [SEQ ID N0:55];
(ddd) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaa2Xaa3Xaa4SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLI
FLIGFA [SEQ ID N0:56], где Xaai отсутствует или представляет собой S или
10 гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой
гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
(еее) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
15 последовательности
XaaiXaa2Xaa3SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIG FA [SEQ ID N0:57], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, Хааг отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от
20 одной до десяти гидрофильных аминокислот;
(fff) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaa2SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA
[SEQ ID N0:58], где Xaai отсутствует или представляет собой S или
25 гидрофильную аминокислоту, а Хааг отсутствует или представляет собой от
одной до четырех гидрофильных аминокислот;
(999) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
SKKKKSGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA
30 [SEQ ID N0:59];
(hhh) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
SGNRTYGPVFM(C)(S)LGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFA [SEQ ID N0:60];
(iii) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaa2Xaa3Xaa4SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP
[SEQ ID N0:61], где Xaai отсутствует или представляет собой S или
5 гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой
гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
СШ) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
10 последовательности
XaaiXaa2Xaa3SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP [SEQ ID N0:62], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, Хааг отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти
15 гидрофильных аминокислот;
(kkk) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaa2SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP [SEQ ID
N0:63], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
20 аминокислоту, а Хааг отсутствует или представляет собой от одной до четырех
гидрофильных аминокислот;
(III) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
SKKKKSNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP [SEQ ID 25 N0:64];
(mmm) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
SNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPP [SEQ ID N0:65];
(nnn) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
30 последовательности
XaaiXaa2Xaa3Xaa4GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAA S [SEQ ID N0:66], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой
35 гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну
или более гидрофильных аминокислот;
(ооо) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaazXaasGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS
[SEQ ID N0:67], где Xaai отсутствует или представляет собой S или
5 гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой
гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти гидрофильных аминокислот;
(ррр) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
10 XaaiXaa2GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS [SEQ
ID N0:68], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную аминокислоту, а Хааг отсутствует или представляет собой от одной до четырех гидрофильных аминокислот;
(qqq) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из 15 последовательности
SKKKKGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS [SEQ ID N0:69];
(ггг)8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
20 GNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAAS [SEQ ID
N0:70];
(sss) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaa2Xaa3Xaa4AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT
25 [SEQ ID N0:71], где Xaai отсутствует или представляет собой S или
гидрофильную аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
30 (ttt) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности
XaaiXaazXaasAAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT [SEQ
ID N0:72], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
аминокислоту, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную
35 аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти
гидрофильных аминокислот;
(uuu) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
XaaiXaazAAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT [SEQ ID
N0:73], где Xaai отсутствует или представляет собой S или гидрофильную
5 аминокислоту, а Хаа2 отсутствует или представляет собой от одной до четырех
гидрофильных аминокислот;
(vvv) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
SKKKKAAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT [SEQ ID 10 N0:74];
(www) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
AAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLT [SEQ ID N0:75];
(ххх) последовательность из любой из SEQ ID NO: 1-75.
15 (УУУ) 8 или более примыкающих аминокислотных остатков из
любой из ESNEEPPPPY[SEQ ID NO: 76],
SNEEPPPPY [SEQ ID NO: 77],
HSDYQPLGT [SEQ ID NO: 78],
PLGTQDQSL [SEQ ID NO: 79],
20 PLGTQDQSLY [SEQ ID NO: 80],
PLGTQDQSLY [SEQ ID NO: 80],
LGTQDQSLY [SEQ ID NO: 81],
GTQDQSLYL [SEQ ID NO: 82],
GTQDQSLYL [SEQ ID NO: 83],
25 GTQDQSLYLG [SEQ ID NO: 84],
QSLYLGLQH [SEQ ID NO: 85],
SLYLGLQHD [SEQ ID NO: 86],
SLYLGLQHD [SEQ ID NO: 86],
GLQHDGNDGL [SEQ ID NO: 87],
30 GNDGLPPPPY [SEQ ID NO: 88],
GLPPPPYSP [SEQ ID NO: 89],
GLPPPPYSPR [SEQ ID NO: 90],
GLPPPPYSPR [SEQ ID NO: 90],
PRDDSSQHIY [SEQ ID NO: 91],
35 RDDSSQHIY [SEQ ID NO: 92],
HIYEEAGRG [SEQ ID NO: 93],
ILLARLFLY [SEQ ID NO: 94],
SSCSSCPLSKI [SEQ ID NO: 95],
LLWTLVVLL [SEQ ID NO: 96],
FLYALALLL [SEQ ID NO: 97],
5 CLGGLLTMV [SEQ ID NO: 98],
LIVDAVLQL [SEQ ID NO: 99], LTAGFLIFL [SEQ ID NO: 100], TVCGGIMFL [SEQ ID NO: 101],
(zzz) последовательности из любой из SEQ ID NO: 76-101,
10 (aaaa) или любой комбинации из двух или более (a)-(zzz) выше.
В одном примере осуществления, пептид включает одну или более антигенных детерминант, полученных из латентного мембранного белка 2 (LMP2), например, из полноразмерного EBV LMP2 (аминокислоты 1-497). В одном специально рассматриваемом варианте осуществления, пептид включает, по существу состоит, 15 или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8 или более примыкающих аминокислотных остатков из любой SEQ ID NO: 4, 5, 9, 10, 14, 15, 19, 20, 24, 25, 29, 30, 34, 35, 39, 40, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 59, 60, 64, 65, 69, 70, 74 или 75.
В другом специально рассматриваемом варианте осуществления, пептид 20 включает, по существу состоит, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 12 или более примыкающих аминокислотных остатков из любой SEQ ID NO: 4, 5, 9, 10, 14, 15, 19, 20, 24, 25, 29, 30, 34, 35, 39, 40, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 59, 60, 64, 65, 69, 70, 74 или 75.
В другом специально рассматриваемом варианте осуществления, пептид 25 включает, по существу состоит, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 15 или более, 18 или более, 20 или более, или 25 или более примыкающих аминокислотных остатков из любой SEQ ID NO: 4, 5, 9, 10, 14, 15, 19, 20, 24, 25, 29, 30, 34, 35, 39, 40, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 59, 60, 64, 65, 69, 70, 74 или 75.
30 В одном варианте осуществления, пептид включает, состоит или состоит
по существу из аминокислотной последовательности, выбранной из любой группы из SEQ ID NO: 4, 5, 9, 10, 14, 15, 19, 20, 24, 25, 29, 30, 34, 35, 39, 40, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 59, 60, 64, 65, 69, 70, 74 или 75.
В другом специально рассматриваемом варианте осуществления, пептид 35 включает, по существу состоит, или состоит из аминокислотной последовательности,
выбранной из группы, состоящей из 15 или более, 18 или более, 20 или более, или 25 или более примыкающих аминокислотных остатков из любой SEQ ID NO: 1-75.
В одном варианте осуществления, пептид включает, состоит или состоит по существу из аминокислотной последовательности, выбранной из любой группы из 5 SEQ ID NO: 1-75.
В одном варианте осуществления, пептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из любой группы из SEQ ID NO: 76-101. В одном примере осуществления, пептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из любой группы из SEQ ID NO: 76-93.
10 В одном варианте осуществления, пептид включает аминокислотную
последовательность, выбранную из любой из двух или более групп из SEQ ID NO: 76-101. В одном примере осуществления, пептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из любой из двух или более групп из SEQ ID NO: 76-93.
15 В различных вариантах осуществления, пептид включает, состоит или
состоит по существу из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
(а) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности
20 XaaiXaa2Xaa3Xaa4GARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPL [SEQ ID
N0:102], где Xaai отсутствует или представляет собой S, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
25 (Ь) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaa2Xaa3GARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPL [SEQ ID N0:103], где Xaai отсутствует или представляет собой S, Хааг отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти гидрофильных
30 аминокислот;
(с) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности XaaiXaa2GARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPL [SEQ ID N0:104], где Xaai отсутствует или представляет собой S, а Хааг отсутствует или представляет собой от одной до четырех гидрофильных аминокислот;
(d) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности SKKKKGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPL [SEQ ID N0:105];
(e) последовательности из любой SEQ ID NO: 102-105;
5 (f) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности GARGPESRLLEFYLAM PFATPM EAELARRSLAQDAPPL [SEQ ID N0:106];
(g) последовательности из SEQ ID NO: 106;
(h) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из 10 последовательности LAMPFATPM [SEQ ID N0:107];
(i) последовательности из SEQ ID NO: 107;
(j) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности FATPMEAEL [SEQ ID N0:108];
(к) последовательности из SEQ ID NO: 108;
15 (I) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaazXaasXaa^PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR [SEQ ID N0:109], где Xaai отсутствует или представляет собой S, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или
20 представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
(т) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaazXaasVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR [SEQ ID
N0:110], где Xaai отсутствует или представляет собой S, Хаа2 отсутствует или
представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или
25 представляет собой от одной до десяти гидрофильных аминокислот;
(п) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности XaaiXaa2VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR [SEQ ID N0:111], где Xaai отсутствует или представляет собой S, а Хааг отсутствует или представляет собой от одной до четырех гидрофильных аминокислот;
30 (о) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности SKKKKVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR [SEQ ID N0:112];
(р) последовательности из любой из SEQ ID NO: 109-112;
(q) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR [SEQ ID N0:113];
(г) последовательности из SEQ ID NO: 113;
5 (s) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности EFTVSGNIL [SEQ ID N0:114];
(t) последовательности из SEQ ID N0: 114;
(и) 8 ИЛИ более примыкающих аминокислотных остатка из
последовательности XaaiXaazXaasXaa^QQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR [SEQ ID
10 N0:115], где Xaai отсутствует или представляет собой S, Хаа2 отсутствует или
представляет собой гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
(v) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
15 последовательности XaaiXaazXaasLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR [SEQ ID
N0:116], где Xaai отсутствует или представляет собой S, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти гидрофильных аминокислот;
(w) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
20 последовательности XaaiXaa2LQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR [SEQ ID
N0:117], где Xaai отсутствует или представляет собой S, а Хаа2 отсутствует или представляет собой от одной до четырех гидрофильных аминокислот;
(х) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности SKKKKLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR [SEQ ID N0:118];
25 (у) любой последовательности из SEQ ID N0: 115-118;
(z) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности LQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR [SEQ ID N0:119];
(аа) последовательности из SEQ ID N0: 119;
(bb) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из
30 последовательности SLLMWITQCFLPVF [SEQ ID N0:120];
(сс) последовательности из SEQ ID NO: 120;
(dd) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности SLLMWITQC [SEQ ID N0:121];
(ее) последовательности из SEQ ID NO: 121;
(ff) или любой комбинации из двух или более (а)-(ее) выше.
В одном примере осуществления, пептидную антигенную детерминанту получают из NY-ESO-1. В одном специально рассматриваемом варианте осуществления, пептид включает, по существу состоит, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8 или более примыкающих аминокислотных остатков из любой SEQ ID NO: 106, 107, 108, ИЗ, 114, 119, 120 и 121.
В одном варианте осуществления, пептид включает, состоит или состоит по существу из аминокислотной последовательности, выбранной из любой группы из SEQ ID NO: 106, 107, 108, ИЗ, 114, 119, 120 и 121.
В одном варианте осуществления, пептид включает, состоит или состоит по существу из аминокислотной последовательности, выбранной из любой группы из SEQ ID NO: 106, 113 и 119.
В одном варианте осуществления, пептид включает, состоит или состоит по существу из аминокислотной последовательности, выбранной из любой группы из SEQ ID NO: 105, 112 и 118.
В различных вариантах осуществления, пептид включает, по существу состоит, или состоит из одной или более овальбуминных антигенных детерминант. В различных вариантах осуществления, одна или более овальбуминных антигенных детерминант являются антигенными детерминантами MHCI. В различных вариантах осуществления, одна или более овальбуминных антигенных детерминант являются антигенными детерминантами МНСП.
В различных вариантах осуществления, пептид включает, по существу состоит, или состоит из:
(а) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности XaaiXaazXaasXaa^ISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT [SEQ ID N0:124], где Xaai отсутствует или представляет собой S, Хаа2 отсутствует или представляет собой гидрофильную аминокислоту, Хааз отсутствует или
представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хаа4 отсутствует или представляет собой одну или более гидрофильных аминокислот;
(b) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности XaaiXaa2Xaa3 KISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT [SEQ ID
5 N0:125], где Xaai отсутствует или представляет собой S, Хаа2 отсутствует или
представляет собой гидрофильную аминокислоту, а Хааз отсутствует или представляет собой от одной до десяти гидрофильных аминокислот;
(c) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности XaaiXaa2 KISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT [SEQ ID
10 N0:126], где Xaai отсутствует или представляет собой S, а Хаа2 отсутствует или
представляет собой от одной до четырех гидрофильных аминокислот;
(d) 8 или более примыкающих аминокислотных остатка из последовательности SKKKKKISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT [SEQ ID N0:127];
15 (е) последовательности из любой из SEQ ID N0: 124-127;
(f) 8 или более примыкающих аминокислотных остатков из последовательности KISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT [SEQ ID N0:128];
(g) последовательности из SEQ ID N0: 128;
(h) 8 или более примыкающих аминокислотных остатков из
20 последовательности SIINFEKL [SEQ ID N0: 129];
(i) последовательности из SEQ ID N0: 129;
(j) 8 или более примыкающих аминокислотных остатков из последовательности ISQAVHAAHAEINEAGR [SEQ ID N0: 130];
(к) последовательности из SEQ ID N0: 130;
25 (I) или любой комбинации из двух или более (а)-(к) выше.
В различных вариантах осуществления, пептид включает одну или более овальбуминных антигенных детерминант, выбранных из любой группы из SEQ ID N0: 124-130. В различных вариантах осуществления, пептид включает пептид, содержащий или состоящий из 8 или более примыкающих аминокислот из любой 30 аминокислотной последовательности из SEQ ID N0: 124-130.
В различных вариантах осуществления пептид включает, состоит или состоит по существу из аминокислотной последовательности, выбранной из любой группы из SEQ ID NO: 124-130.
В одном варианте осуществления, пептидный конъюгат включает две или 5 более антигенных детерминанты, например, две или более пептидных антигенных детерминанты.
В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат включает антигенный пептид.
В специально рассматриваемых вариантах осуществления, пептид 10 представляет собой синтетический пептид.
В различных вариантах осуществления соединение формулы (I) представляет собой изолят формулы (I).
В различных вариантах осуществления соединение формулы (I) 15 представляет собой чистое, очищенное или по существу чистое соединение формулы (I).
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в способе получения соединения формулы (XV), причем способ включает осуществление 20 реакции
эпоксида формулы (XVI):
R1 R2 (XVI); и
аминокислотного партнера по конъюгации, содержащего тиол формулы
25 (III):
R V
(III)
в условиях, способствующих конъюгации эпоксида с аминокислотным партнером по конъюгации и получению соединения формулы (XV):
(XV)
где
Х10 представляет собой L1-Z1-, -ОН, -SH, -NHR, HNRC(0)0-, Р10-О-, 5 P11-S-, P12-NR- или P12-NRC(0)0-;
XII представляет собой Х10 или -ОН, -SH, -NHR, или HNRC(0)0- когда Х10 представляет собой Р10-О-, P11-S-, P12-NR-, или P12-NRC(0)0- а указанные условия способствуют удалению Р10, Р11 или Р12;
Р10, Р11 и Р12 каждое независимо представляет собой защитную
10 группу;
m представляет собой целое число от 2 до 6; а
n, LI, Zl, R, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 и А1 соответствуют определению в соединении формулы (I) или в любом ее осуществлении; или его соли или сольвату.
В различных вариантах осуществления, m составляет от 2 до 5, от 2 до 4 или от 2 до 3. В примерах осуществления, m равно 2.
В различных вариантах осуществления, Х10 представляет собой L1-Z1-20 или -ОН, -SH, -NHR, Р10-О-, P11-S-, или P12-NR-; а XII представляет собой Х10 или -ОН, -SH, или -NHR.
В различных вариантах осуществления, Х10 представляет собой L1-Z1-, -ОН, или Р10-О-; а XII представляет собой Х10 или -ОН.
В различных вариантах осуществления, Х10 представляет собой L1-С(0)0-, ОН, или Р10-О-; XII представляет собой L1-C(0)0-, Р10-О-, или ОН.
В различных вариантах осуществления, Х10 представляет собой L1-30 С(0)0- или Р10-О-; XII представляет собой L1-C(0)0-, Р10-О-, или ОН.
В примерах осуществления, Х10 представляет собой Р10-О-; XII представляет собой Р10-О- или ОН.
35 В различных вариантах осуществления, R9 не представляет собой водород
и/или А1 не представляет собой ОН.
В различных вариантах осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации, представляет собой пептид, включающий партнер по конъюгации, содержащий 15 или менее, 14 или менее, 13 или менее, 12 или менее, 11 или менее, 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее или 3 или менее аминокислотных остатков.
В различных вариантах осуществления, С-конец аминокислоты, включающей партнера по конъюгации, защищен карбоксилзащитной группой или карбоксамидзащитной группой, и/или Na-аминогруппа аминокислоты, включающая партнера по конъюгации, защищена аминозащитной группой.
В примерах осуществления, R9 представляет собой аминозащитную
группу.
В различных вариантах осуществления, А1 представляет собой ОР1 или NHP2. В некоторых вариантах осуществления, А1 представляет собой ОР1.
В примерах осуществления, R9 представляет собой аминозащитную группу, а А1 представляет собой ОР1.
В различных вариантах осуществления, способ включает осуществление реакции эпоксида и аминокислотного партнера по конъюгации в присутствии кислоты, например сильной кислоты.
В некоторых вариантах осуществления, кислота представляет собой хлористоводородную кислоту, серную кислоту или их смесь.
В некоторых вариантах осуществления, кислота представляет собой кислоту Льюиса, например, BF3.
В других вариантах осуществления, способ включает осуществление реакции эпоксида и аминокислотного партнера по конъюгации в нейтральных условиях.
В различных вариантах осуществления, нейтральные условия включают протонный растворитель, такой как спирт, например этанол.
В других вариантах осуществления, способ включает осуществление реакции эпоксида и аминокислотного партнера по конъюгации в присутствии основания, например,слабого основания.
5 В некоторых вариантах осуществления, основание представляет собой
органический амин, например триэтиламин.
В различных вариантах осуществления, способ включает получение эпоксида путем осуществления реакции алкена формулы (XVII):
R3 m
10 R1 R2
(XVII)
и окислителя в условиях, способствующих эпоксидированию алкена.
В различных вариантах осуществления, окислитель представляет собой 15 пероксид, такой как органический пероксид, например, т-хлорпероксибензойную кислоту, или органический N-оксид, например, N-оксид пиридина.
В различных вариантах осуществления, способ включает получение эпоксида путем осуществления реакции соединения формулы (XVII-A), где LG 20 представляет собой уходящую группу:
R3 LG
(XVII-A)
и основания в условиях, способствующих эпоксидированию.
25 В различных вариантах осуществления соединение формулы (XVII-A)
получают из L-аспарагиновой кислоты.
В различных вариантах осуществления, способ дополнительно включает в себя получение единственного стереоизомера или стереоизомерно обогащенной 30 смеси эпоксида формулы (XVI).
В различных вариантах осуществления, получение единственного стереоизомера или стереоизомерно обогащенной смеси эпоксида формулы (XVI) включает разделение рацемической смеси эпоксида.
В различных вариантах осуществления, способ дополнительно включает в себя получение единственного стереоизомера или стереоизомерно обогащенной смеси соединения формулы (XVII-A).
В различных вариантах осуществления, способ включает превращение соединения формулы (XV) в аминокислотный или пептидный конъюгат формулы (IF) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват по настоящему изобретению, посредством одной или более дополнительных стадий синтеза:
В различных вариантах осуществления, способ включает превращение соединения формулы (XV) в аминокислотный или пептидный конъюгат формулы (IF-15 1) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват по настоящему изобретению, посредством одной или более дополнительных стадий синтеза:
20 В различных вариантах осуществления, одна или более стадий синтеза
включают превращение гидроксильной группы, связанной с углеродом, к которому присоединено R3, в L2-Z2-.
В различных вариантах осуществления, одна или более стадий синтеза 25 включают ацилирование соединения формулы (XV) с возможностью замены атома водорода гидроксильной группы, связанной с углеродом, к которому присоединено R3, на 1_2-С(0)-.
В различных вариантах осуществления, XII представляет собой Р10-О-30 или ОН, а одна или более стадий синтеза включают ацилирование соединения формулы (XV) с возможностью замены Р10 или атома водорода гидроксильной группы из XII на Ll-C(O)-, и/или ацилирование соединения формулы (XV) с
возможностью замены атома водорода гидроксильной группы, связанный с углеродом, к которому присоединено R3, на 1_2-С(0)-.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в соединении формулы (XV):
где
10 XII представляет собой L1-Z1-, -ОН, -SH, -NHR, HNRC(0)0-, Р10-О-,
P11-S-, P12-NR- или P12-NRC(0)0-;
Р10, Р11 и Р12 каждое независимо представляет собой защитную
группу;
m представляет собой целое число от 2 до 6;
15 n, LI, Zl, R, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 и А1 соответствуют
определению в соединении формулы (I) или в любом его осуществлении; или их соли или сольвату.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в 20 использовании соединения формулы (XV) или (XVI) при синтезе аминокислотного или пептидного конъюгата формулы (IF) по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли или сольвату.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в способе получения соединения формулы (XX), причем способ включает осуществление реакции
соединения формулы (XXI):
RX RV
(XXI); и
аминокислотного партнера по конъюгации, содержащего тиол формулы
R6 R7
HS-Hryc(°)-A1
R8 NR9 (III)
в условиях, способствующих конъюгации соединения формулы (XXI) и аминокислотного партнера по конъюгации и получению соединения формулы (XX):
R1 R2 R4 R5 Rf R7
-C(O) -A1
40-^)v
5 Rx Ry
(XX)
где
Rm и Rn каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил,
арил или гетероарил;
10 LG представляет собой уходящую группу;
m и w независимо каждое представляет собой целое число от 0 до 7, a v представляет собой целое число от 0 до 5, при условии, что:
сумма m, v, и w, по меньшей мере, равна 3; а
15 сумма т и w составляет от 0 до 7; а
n, Rx, Ry, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 и А1 соответствуют определению в соединении формулы (I) или в любом его осуществлении; или их соли или сольвату.
20 В различных вариантах осуществления, Rm и Rn каждое независимо
выбирается из водорода, С1-6 алкила или арила.
В некоторых вариантах осуществления, Rm представляет собой водород, С1-6 алкил или арил, a Rn представляет С1-6 алкил или арил.
В различных вариантах осуществления, уходящая группа представляет собой галогенид (например, хлора, брома или йода) или сульфонат (например, тозилат или мезилат).
30 В различных вариантах осуществления, значения m и v таковы, что
данное соединение включает 5-7-членный циклический ацеталь.
В некоторых вариантах осуществления, циклический ацеталь представляет собой 6-членный циклический ацеталь.
В различных вариантах осуществления, циклический ацеталь представляет собой 5-членный циклический ацеталь, a w представляет собой целое число, больше чем 1.
В различных вариантах осуществления, m равно 2а v равно 1.
В различных вариантах осуществления, R9 не представляет собой водород и/или А1 не представляет собой ОН.
В различных вариантах осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации, представляет собой пептид, включающий партнера по конъюгации, содержащий 15 или менее, 14 или менее, 13 или менее, 12 или менее, 11 или менее, 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, б или менее, 5 или менее, 4 или менее или 3 или менее аминокислотных остатков.
В различных вариантах осуществления, С-конец аминокислоты, включающей партнера по конъюгации, защищен карбоксилзащитной группой или карбоксамидзащитной группой, и/или Na-аминогруппа аминокислоты, включающая партнера по конъюгации, защищена аминозащитной группой.
В примерах осуществления, R9 представляет собой аминозащитную
группу.
В различных вариантах осуществления, А1 представляет собой ОР1 или NHP2. В некоторых вариантах осуществления, А1 представляет собой ОР1.
В примерах осуществления, R9 представляет собой аминозащитную группу, а А1 представляет собой ОР1.
В различных вариантах осуществления, способ включает осуществление реакции соединения формулы (XXI) и аминокислотного партнера по конъюгации формулы (III) в присутствии основания.
В некоторых вариантах осуществления, основание представляет собой органический амин, например триэтиламин, N-метилморфолин или коллидин.
В различных вариантах осуществления, циклический ацеталь формулы (XXI) используется в виде единственного стереоизомера или смеси, обогащенной стереоизомерами.
5 В различных вариантах осуществления, способ включает превращение
соединения формулы (XX) в аминокислотный или пептидный конъюгат формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват по настоящему изобретению, посредством одной или более дополнительных стадий синтеза:
В различных вариантах осуществления, способ включает превращение соединения формулы (XX) в аминокислотный или пептидный конъюгат формулы (IA) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват по настоящему изобретению, посредством одной или более стадий синтеза:
L1- С(0) О
L2 С(0) О-U) у
RX RV
(IA)
20 В различных вариантах осуществления, одна или более стадий синтеза
включают удаление ацеталя в соединении формулы (XX) с получением соединения формулы (XXIII-1):
(XXIII-1)
В различных вариантах осуществления, где Rm, необязательно, замещен арилом, например фенилом или метоксизамещенным фенилом, способ включает
(ХХШ-З)
В различных вариантах осуществления, одна или более стадий синтеза включают: превращение гидроксильной группы, связанной с углеродом, к которому присоединены R1 и R2 в соединении формулы (XXIII-1), в L1-Z1-; и/или превращение гидроксильной группы, связанной с углеродом, к которому 15 присоединены Rx и Ry, в L2-Z2.
В различных вариантах осуществления одна или более стадий синтеза
включают:
превращение гидроксильной группы, связанной с атомом углерода, к 20 которому присоединены Rx и Ry в соединении формулы (XXIII-2), в L2-Z2-; удаление группы RmRnCH- для получения гидроксильной группы и превращение гидроксильной группы в L1-Z1; или
превращение гидроксильной группы, связанной с углеродом, к которому присоединены Rx и Ry в соединении формулы (XXIII-2), в L1-Z1-; удаление группы 25 RmRnCH- для получения гидроксильной группы и превращение гидроксильной группы в L2-Z2-.
В различных вариантах осуществления, превращение указанной гидроксильной группы в L1-Z1- или L2-Z2- включает ацилирование, с возможностью замены атома водорода гидроксильной группы на Ll-C(O)- или 1_2-С(0)-.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в соединении формулы (XX):
40-^)v
5 (XX) где
Rm и Rn каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил, арил или гетероарил.
m и w независимо каждое представляет собой целое число от 0 до
10 7, a v представляет собой целое число от 0 до 5,
при условии, что:
сумма m, v, и w, по меньшей мере, равна 3; а сумма т и w составляет от 0 до 7; а n, Rx, Ry, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 и А1 соответствуют 15 определению в соединении формулы (I) или в любом его осуществлении; или их соли или сольвату.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в использовании соединения формулы (XX) или (XXI) при синтезе аминокислотного или пептидного конъюгата формулы (IA) по настоящему изобретению или его 20 фармацевтически приемлемой соли или сольвату.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в способе получения аминокислотного или пептидного конъюгата формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли или сольват по настоящему изобретению; 25 способе включающем осуществление реакции:
первого липидсодержащего партнера по конъюгации, включающего двойную углерод-углеродную связь;
второго липидсодержащего партнера по конъюгации, включающего
двойную углерод-углеродную связь; и
30 аминокислотного партнера по конъюгации, содержащего тиол,
в условиях, способствующих конъюгации первого липидсодержащего партнера по конъюгации и второго липидсодержащего партнера по конъюгации с аминокислотным партнером по конъюгации и получению аминокислотного или
пептидного конъюгата формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвату,
где в аминокислотном или пептидном конъюгате атом серы из тиола аминокислотного партнера по конъюгации, конъюгирует с атомом углерода из 5 двойной углерод-углеродной связи первого липидсодержащего партнера по конъюгации, а атом углерода из двойной углерод-углеродной связи первого липидсодержащего партнера по конъюгации конъюгирует с атомом углерода из двойной углерод-углеродной связи второго липидсодержащего партнера по конъюгации.
В одном варианте осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации представляет собой пептидсодержащий партнер по конъюгации, а липидсодержащие партнеры по конъюгации сопряжены с пептидом из пептидсодержащего партнера по конъюгации.
15 В некоторых вариантах осуществления, липидсодержащие партнеры по
конъюгации конъюгируют с аминокислотой из аминокислотного партнера по конъюгации или с пептидом из пептидсодержащего партнера по конъюгации.
В некоторых вариантах осуществления, липидсодержащие партнеры по конъюгации конъюгируют с аминокислотой из аминокислотного партнера по 20 конъюгации.
Соответственно, другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в способе получения пептидного конъюгата формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата по настоящему изобретению; 25 способе включающем осуществление реакции:
первого липидсодержащего партнера по конъюгации, включающего двойную углерод-углеродную связь;
второго липидсодержащего партнера по конъюгации, включающего
двойную углерод-углеродную связь; и
30 пептидсодержащего партнера по конъюгации, включающего тиол,
в условиях, способствующих конъюгации первого липидсодержащего
партнера по конъюгации и второго липидсодержащего партнера по конъюгации с
пептидсодержащим партнером по конъюгации и получению пептидного конъюгата
формулы (I) или его соли или сольвата,
35 где в пептидном конъюгате атом серы из тиола петидсодержащего
партнера по конъюгации, конъюгирует с атомом углерода из двойной углерод-углеродной связи первого липидсодержащего партнера по конъюгации, а атом углерода из двойной углерод-углеродной связи первого липидсодержащего партнера
по конъюгации конъюгирует с атомом углерода из двойной углерод-углеродной связи второго липидсодержащего партнера по конъюгации.
В другом варианте осуществления конъюгат представляет собой 5 липопептид, так что способ предназначен для получения липопептида.
В различных вариантах осуществления, первый и второй липидсодержащие партнеры конъюгации имеют одинаковую структуру (то есть, первый и второй липидсодержащие партнеры по конъюгации идентичны).
10 В различных вариантах осуществления, способ включает конъюгирование
атома серы из тиола с атомом углерода из двойной углерод-углеродной связи первого липидсодержащего партнера по конъюгации, а затем конъюгирование атома углерода из двойной углерод-углеродной связи, в которой указанный тиол конъюгирован с атомом углерода двойной углерод-углеродной связи второго
15 липидсодержащего партнера по конъюгации.
В различных вариантах осуществления, первый липидсодержащий партнер по конъюгации представляет собой соединение формулы (ПА):
(ПА)
20 второй липидсодержащий партнер по конъюгации представляет собой
соединение формулы (ПВ):
R? R2 ?"
L,_z1> V^4
Ra (ПВ); и
аминокислотный партнер по конъюгации имеет структуру формулы
25 (III):
R6 R7 нз-Нтус(°)-А1
R V (III); и
где Ra, Rb, Rc, LI, L2, Zl, Z2, Rl, R2, Rx, Ry, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Al, k, v и n соответствуют определению в соединении формулы (I) или в любом его осуществлении.
В различных вариантах осуществления, аминокислотный или пептидный конъюгат представляет собой соединение формулы (IB):
Rx Ry (IB)
где Ra, Rb, Rc, LI, L2, Zl, Z2, Rl, R2, Rx, Ry, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9,
Al, k, v и п соответствуют определению в соединении формулы (I) или в любом его осуществлении.
В различных вариантах осуществления, липидсодержащие партнеры по конъюгации находятся в стехиометрическом избытке по отношению к аминокислотному партнеру по конъюгации.
В различных вариантах осуществления, молярное соотношение липидсодержащих партнеров по конъюгации (объединенных) с аминокислотным партнером по конъюгации, составляет, по меньшей мере, 7:1.
В различных вариантах осуществления, первый липидсодержащий партнер по конъюгации представляет собой соединение формулы (НА-1):
второй липидсодержащий партнер по ко
нъюгации представляет собой
соединение формулы (ПВ):
аминокислотный партнер по конъюгации имеет структуру формулы
R6 R7
нз-Нтус(°)-А1
R NR9
(Ш); и
5 конъюгат представляет собой соединение формулы (1С):
R1 R2 Rbv Rc R4R5 R' R7
J?) ,T^4r^-S^V^C(0)- A1
L1-C(0)-0^ ;k Д А з s n [
н Ra / R A
/ R8 R9
L2-C(0)-0-U) v
Rx Ry (1С)
где Ra, Rb, Rc, LI, L2, Zl, Z2, Rl, R2, Rx, Ry, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Al, k, v и n соответствуют определению в соединении формулы (I) или в любом его 10 осуществлении.
В различных вариантах осуществления, L1 представляет собой С11-21 алкил; к составляет от 0 до 3, предпочтительно 0; а каждое Ra, Rb и Rc представляет собой водород.
В различных вариантах осуществления, L2 представляет собой С11-21 15 алкил; v составляет от 0 до 3, предпочтительно 0; а каждое R3, R4 и R5 представляет собой водород.
В различных вариантах осуществления, п равно 1, R6, R7 и R8 каждое представляет собой водород, a R9 представляет собой водород, аминозащитную группу, L3-C(0)- или А2.
20 В различных вариантах осуществления, п равно 1, R6, R7 и R8 каждое
представляет собой водород, a R9 представляет собой водород, аминозащитную группу или L3-C(0), где L3 представляет собой линейный С15 алкил или метил.
В различных вариантах осуществления, соединения формулы (ПА) и (ПВ) каждое представляет собой винилпальмитат.
25 В различных вариантах осуществления, аминокислотный партнер по
конъюгации представляет собой: цистеин; защищенный цистеин (включая Na-амин и/или карбоксилзащитный цистеин); или пептид, содержащий остаток цистеина
(включая Na-амин или остаток карбоксилзащитного цистеина); например, N-концевой остаток цистеина (включая остаток Na-аминзащитного цистеина).
В некоторых вариантах осуществления, способ включает осуществление реакции винилпальмитата и Na-аминзащитного цистеина, например, Fmoc-Cys-OH, 5 Boc-Cys-OH, Fmoc-Cys-OPl или Boc-Cys-OPl. В некоторых вариантах осуществления, карбоксильная группа Na-аминзащитного цистеина защищена.
В одном варианте осуществления, условия, способствующие конъюгации липидсодержащего партнера по конъюгации с аминокислотным партнером по конъюгации, включают в себя образование одного или более свободных радикалов. 10 В одном варианте осуществления, условия, способствующие конъюгации липидсодержащего партнера по конъюгации с пептидсодержащим партнером по конъюгации, включают в себя образование одного или более свободных радикалов.
В некоторых вариантах осуществления, образование одного или более свободных радикалов инициируется термически и/или фотохимически. В некоторых
15 вариантах осуществления, образование одного или более свободных радикалов инициируется термическим и/или фотохимическим разложением свободнорадикального инициатора. В некоторых вариантах осуществления, образование одного или более свободных радикалов инициируется термическим разложением термоинициатора и/или фотохимическим разложением
20 фотохимического инициатора.
В некоторых вариантах осуществления, термическое разложение свободнорадикального инициатора включает нагревание реакционной смеси до подходящей температуры. В некоторых вариантах осуществления, реакционную смесь нагревают до температуры, составляющей от 40 °С до 200 °С, от 50 °С до 180
25 °С, от 60 °С до 150 °С, от 65 °С до 120 °С, от 70 °С до 115 °С, от 75 °С до 110 °С или от 80 °С до 100 ° С. В других вариантах осуществления, реакционную смесь нагревают до температуры составляющей, по меньшей мере, около 40 °С, по меньшей мере, около 50 °С, по меньшей мере, около 60 °С или, по меньшей мере, около 65 °С. В одном специально рассматриваемом варианте осуществления
30 реакционную смесь нагревают до температуры около 90 °С.
В некоторых вариантах осуществления, фотохимическое разложение свободнорадикального инициатора включает облучение ультрафиолетовым светом, предпочтительно имеющим частоту, совместимую с боковыми цепочками встречающихся в природе аминокислот. В специально рассматриваемом варианте 35 осуществления ультрафиолетовый свет имеет длину волны, составляющую около 365
нм. В примерах осуществления, фотохимическое разложение свободнорадикального инициатора осуществляют при температуре окружающей среды.
В одном специально рассматриваемом варианте осуществления, термический инициатор представляет собой 2,2'-азобисизобутиронитрил (AIBN). В 5 одном специально рассматриваемом варианте осуществления, фотоинициатор представляет собой 2,2-диметокси-2-фенилацетофенон (DMPA).
В некоторых вариантах осуществления, реакция протекает в жидкой среде. В одном варианте осуществления, жидкая среда содержит растворитель. В одном варианте осуществления, растворитель выбирается из группы, состоящей из 10 N-метилпирролидона (NMP), диметилсульфоксида (DMSO), 1\1,1\1-диметилформамида (DMF), дихлорметана (DCM), 1,2-дихлорэтана и их смесей. В одном специально рассматриваемом варианте осуществления, растворитель включает NMP, DMF, DMSO или их смесь.
В одном специально рассматриваемом варианте осуществления, 15 растворитель включает DMSO или NMP. В примерах осуществления, растворитель содержит NMP.
В некоторых вариантах осуществления, реакция протекает в присутствии одной или более добавок, которые подавляют образование побочных продуктов и/или повышают выход или глубину превращения требуемого соединения формулы 20 (I).
В различных вариантах осуществления, одна или более добавок представляет собой посторонний тиол, кислоту, органосилан или комбинацию любых двух или более из них.
В некоторых примерах осуществления, посторонний или экзогенный тиол 25 выбирают из группы, состоящей из восстановленного глутатиона (GSH), 2,2'-этилендиоксидиэтантиола (DODT), 1,4-дитиотреитола (DTT), белка и стерически затрудненных тиолов. В специально рассматриваемом варианте осуществления, посторонний или экзогенный тиол представляет собой DTT. В некоторых вариантах осуществления, посторонний или экзогенный тиол представляет собой стерически 30 затрудненный тиол, например трет-бутилмеркаптан.
В различных вариантах осуществления, кислотная добавка представляет собой сильную неорганическую или органическую кислоту. В различных вариантах осуществления, кислота представляет собой сильную органическую кислоту. В некоторых вариантах осуществления, кислота представляет собой TFA.
В различных вариантах осуществления, органосилан представляет собой триалкилсилан, например TIPS.
В некоторых вариантах осуществления, одну или более добавок выбирают из группы, состоящей из TFA, трет-бутилмеркаптана, TIPS и комбинаций любых двух 5 или более из них.
В некоторых вариантах осуществления, одна или более добавок представляют собой комбинацию кислоты и постороннего тиола, например, TFA и трет-бутилмеркаптана.
В других вариантах осуществления, одна или более добавок представляют 10 собой комбинацию кислоты и органосилана, например, TFA и TIPS.
В других вариантах осуществления, одна или более добавок представляют собой комбинацию постороннего тиола и органосилана и, необязательно, кислоты, например комбинацию t-BuSH и TIPS, и TFA.
В некоторых вариантах осуществления, реакция протекает в течение 15 периода времени, примерно составляющего: от 5 минут до 48 часов, от 5 минут до 24 часов, от 5 минут до 12 часов, от 5 минут до 6 часов, от 5 минут до 3 часов, от 5 минут до 2 часов или от 5 минут до 1 часа. В примерах осуществления реакция протекает в течение периода времени примерно составляющего от 5 минут до 1 часа. В некоторых вариантах осуществления, реакция протекает до тех пор, пока один из 20 партнеров по конъюгации не будет поглощен, по меньшей мере, на 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% или 100%.
В некоторых вариантах осуществления, реакция протекает в основном без
кислорода.
В различных вариантах осуществления, аминокислотный партнер по 25 конъюгации, представляет собой пептидсодержащий партнер по конъюгации.
В одном варианте осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации включает антигенную детерминанту. В одном варианте осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации включает антигенную детерминанту, например, пептидную антигенную детерминанту.
30 В одном варианте осуществления, аминокислотный партнер по
конъюгации включает две или более антигенных детерминанты. В одном варианте осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации включает две или более антигенных детерминанты.
В одном варианте осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации состоит из пептида.
В одном варианте осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации состоит из пептида, содержащего пептидную антигенную детерминанту. В одном варианте осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации состоит из пептида. В одном варианте осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации состоит из пептида, содержащего пептидную антигенную детерминанту.
В некоторых вариантах осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации содержит антигенную детерминанту, связанную с аминокислотой аминокислотного партнера по конъюгации. В некоторых вариантах осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации содержит антигенную детерминанту, связанную с пептидсодержащий партнером по конъюгации. В некоторых вариантах осуществления, антигенная детерминанта сопрягается с пептидом с помощью линкерной группы.
В некоторых вариантах осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации содержит антигенную детерминанту, связанную с аминокислотой аминокислотного партнера по конъюгации с помощью линкерной группы. В некоторых вариантах осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации содержит пептидную антигенную детерминанту, связанную с пептидом с помощью линкерной группы.
В некоторых вариантах осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации и/или пептидсодержащий партнер по конъюгации включает антигенный пептид.
В одном варианте осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации и/или пептидный конъюгат включает синтетический пептид. В некоторых вариантах осуществления, синтетический пептид представляет собой пептид, полученный способом твердофазного синтеза пептидов (SPPS).
В различных вариантах осуществления, способ включает сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата или аминокислоты пептидного конъюгата с аминокислотой или аминокислотой пептида и получение пептидного конъюгата.
В различных вариантах осуществления, способ включает сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата с аминокислотой или аминокислотой пептида и получение пептидного конъюгата.
В различных вариантах осуществления, пептид содержит антигенную детерминанту. В различных вариантах осуществления, антигенная детерминанта представляет собой пептидную антигенную детерминанту.
В некоторых вариантах осуществления, способ включает сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата с аминокислотой или пептидом и получение пептидного конъюгата.
В некоторых вариантах осуществления, сопряжение пептида включает индивидуальное сопряжение одной или более аминокислот и/или одного или более пептидов.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата или аминокислоты пептидного конъюгата с аминокислотой или пептидом и получение пептидного конъюгата, включающего линкерную группу или одну или более ее аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает сопряжение аминокислоты пептидного конъюгата, включающего линкерную группу или одну или более ее аминокислот с аминокислотой или пептидом, и получение пептидного конъюгата, включающего пептидную антигенную детерминанту, связанную с аминокислотой, с которой, с помощью линкерной группы, конъюгированы липидные фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления, аминокислота пептидного конъюгата, с которым конъюгированы липидные фрагменты, представляет собой N-концевой аминокислотный остаток.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата или аминокислоты пептидного конъюгата с аминокислотой или пептидом и получение пептидного конъюгата, включающего пептидную антигенную детерминанту.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает сопряжение антигенной детерминанты с аминокислотой аминокислотного конъюгата или аминокислотой пептидного конъюгата.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает сопряжение пептидной антигенной детерминанты с аминокислотой аминокислотного конъюгата или аминокислотой пептидного конъюгата.
В некоторых вариантах осуществления, антигенная детерминанта сопрягается или связывается с пептидом с помощью линкерной группы.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает сопряжение антигенной детерминанты с пептидом пептидного конъюгата.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает сопряжение пептидной антигенной детерминанты с пептидом пептидного конъюгата.
В некоторых вариантах осуществления, антигенная детерминанта сопрягается с пептидом с помощью линкерной группы.
В различных вариантах осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации состоит из аминокислоты, например, цистеина (включая Na-амин и/или защищенные цистеины с С-концом).
В различных вариантах осуществления, С-конец аминокислотного партнера по конъюгации защищен защитной группой и/или Na-аминогруппа аминокислотного партнера по конъюгации, защищена защитной группой.
В различных вариантах осуществления, карбоксильная группа С-конца аминокислоты защищена карбоксильной защитной группой или карбоксамидзащитной группой и/или Na-аминогруппа аминокислоты защищена аминозащитной группой.
В различных вариантах осуществления, карбоксильная группа С-конца аминокислоты защищена карбоксильной защитной группой и/или Na-аминогруппа аминокислоты защищена аминозащитной группой.
В различных вариантах осуществления, карбоксильная группа С-конца пептида защищена карбоксильной защитной группой и/или Na-аминогруппа пептида защищена аминозащитной группой.
В некоторых вариантах осуществления, аминокислотный остаток, включающий тиол, представляет собой концевой аминокислотный остаток. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотный остаток, включающий тиол, представляет собой N-концевой остаток.
В некоторых вариантах осуществления, А1 и/или R9 представляют собой группу, отличную от аминокислоты или пептида, а способ включает сопряжение аминокислоты или пептида с возможностью замены А1 и/или R9 на аминокислоту или пептид.
В некоторых вариантах осуществления, А1 представляет собой группу, отличную от аминокислоты или пептида, а способ включает сопряжение аминокислоты или пептида с возможностью замены А1 на аминокислоту или пептид.
В некоторых вариантах осуществления, А1 представляет собой ОН, ОР1, NH2 или NHP2, или R9 представляет собой водород, аминозащитную группу или L3-С(О), а способ включает сопряжение аминокислоты или пептида с возможностью замены А1 и/или R9 на аминокислоту или пептид.
В некоторых вариантах осуществления, А1 представляет собой ОН, ОР1, NH2 или NHP2, и R9 представляет собой водород, аминозащитную группу или L3-С(О), а способ дополнительно включает сопряжение аминокислоты или пептида с возможностью замены А1 и/или R9 на аминокислоту или пептид.
В некоторых вариантах осуществления, сопряжение пептида включает индивидуальное сопряжение одной или более аминокислот и/или одного или более пептидов.
В некоторых вариантах осуществления, сопряжение аминокислоты или пептида дает пептидный конъюгат, включающий пептидную антигенную детерминанту. В некоторых вариантах осуществления, сопряжение аминокислоты или пептида дает пептидный конъюгат, включающий линкерную группу или одну или более ее аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, сопряжение аминокислоты или пептида дает пептидный конъюгат, включающий пептидную антигенную детерминанту, связанную с аминокислотой, с которой с помощью линкерной группы, конъюгированы липидные фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления, осуществляют ацилирование содержащей тиол Na-аминогруппы аминокислоты, с которым конъюгированы липидные фрагменты. В некоторых вариантах осуществления, R9 в аминокислотном партнере по конъюгации, включающем тиол, представляет собой L3-C (О)-.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает ацилирование Na-аминогруппы аминокислоты аминокислотного конъюгата или аминокислотного остатка пептидного конъюгата, с которым конъюгированы липидные фрагменты. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает ацилирование Na-аминогруппы С2-20 жирной кислотой, например, ацетилом.
В некоторых вариантах осуществления, R9 представляет собой водород или аминозащитную группу, а способ дополнительно включает ацилирование
аминокислотного конъюгата или пептидного конъюгата с возможностью замены водорода или аминозащитной группы в R9 на 1_3-С(0).
В некоторых вариантах осуществления, ацилирование аминокислотного конъюгата или пептидного конъюгата с возможностью замены аминозащитной группы в R9 на L3-C (О), включает удаление аминозащитной группы в R9 и образование водорода в R9.
В некоторых вариантах осуществления, аминокислота аминокислотного партнера по конъюгации включает тиол. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотный остаток пептидсодержащего партнера по конъюгации включает тиол.
В некоторых вариантах осуществления, тиол представляет собой тиол цистеинового остатка.
В некоторых вариантах осуществления, цистеиновый остаток представляет собой концевой остаток. В некоторых вариантах осуществления, цистеиновый остаток представляет собой N-концевой остаток.
В некоторых вариантах осуществления ацилируется аминогруппа цистеинового остатка.
В одном варианте осуществления, аминогруппа ацилируется С2-20 жирной кислотой.
В одном примере осуществления, жирная кислота С2-20 представляет собой ацетил или пальмитоил. В другом примере осуществления, жирная кислота С2-20 представляет собой ацетил.
В некоторых вариантах осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации и/или пептидный конъюгат содержит от 8 до 220, от 8 до 200, от 8 до 175, от 8 до 150, от 8 до 125, от 8 до 100, от 8 до 90, от 8 до 80, от 8 до 70, от 8 до 60, от 8 до 50, от 8 до 40, от 8 до 30, от 8 до 25, от 8 до 20 или от 8 до 15 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, петидсодержащий партнер по конъюгации, содержит от 8 до 220, от 8 до 200, от 8 до 175, от 8 до 150, от 8 до 125, от 8 до 100, от 8 до 90, от 8 до 80, от 8 до 70, от 8 до 60, от 8 до 50, от 8 до 40, от 8 до 30, от 8 до 25, от 8 до 20 или от 8 до 15 аминокислот.
В одном примере осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации и/или пептидный конъюгат, включает пептид, содержащий от 8 до 60 аминокислот. В одном примере осуществления, пептид содержит от 8 до 60 аминокислот.
В других вариантах осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации и/или пептидный конъюгат содержит от 5 до 220, от 8 до 220, от 5 до 175, от 8 до 175, от 8 до 150, от 10 до 150, от 15 до 125, от 20 до 100, от 20 до 80, от 20 до 60, от 25 до 100, от 25 до 80, от 25 до 60, от 30 до 80, от 40 до 60 или от 50 5 до 60 аминокислот. В других вариантах осуществления, петидсодержащий партнер по конъюгации, содержит от 5 до 220, от 8 до 220, от 5 до 175, от 8 до 175, от 8 до 150, от 10 до 150, от 15 до 125, от 20 до 100, от 20 до 80, от 20 до 60, от 25 до 100, от 25 до 80, от 25 до 60, от 30 до 80, от 40 до 60 или от 50 до 60 аминокислот.
В других вариантах осуществления, аминокислотный партнер по 10 конъюгации и/или пептидный конъюгат, содержат от 5 до 150, от 5 до 125, от 5 до 100, от 5 до 75, от 5 до 60, от 5 до 50, от 5 до 40, от 5 до 30, от 5 до 25, от 5 до 20, от 8 до 150, от 8 до 125, от 8 до 100, от 8 до 75, от 8 до 60, от 8 до 50, от 8 до 40, от 8 до 30, от 8 до 25 или от 8 до 20 аминокислот. В других вариантах осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации содержит от 5 до 150, от 5 до 125, от 5 15 до 100, от 5 до 75, от 5 до 60, от 5 до 50, от 5 до 40, от 5 до 30, от 5 до 25, от 5 до 20, от 8 до 150, от 8 до 125, от 8 до 100, от 8 до 75, от 8 до 60, от 8 до 50, от 8 до 40, от 8 до 30, от 8 до 25 или от 8 до 20 аминокислот.
В различных вариантах осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации, представляет собой короткий пептид. В некоторых вариантах 20 осуществления, короткий пептид включает менее чем 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, и 3 аминокислот.
В одном варианте осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации и/или пептидный конъюгат, содержат одну или более солюбилизирующих групп. В одном варианте осуществления, пептидсодержащий 25 партнер по конъюгации включает одну или более солюбилизирующих групп.
В некоторых вариантах осуществления, солюбилизирующая группа представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую два или более гидрофильных аминокислотных остатка в пептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления, солюбилизирующая группа представляет собой
30 аминокислотную последовательность, содержащую последовательность из двух или более последовательных гидрофильных аминокислотных остатков в пептидной цепи. В одном варианте осуществления, гидрофильные аминокислотные остатки представляют собой катионные аминокислотные остатки. В одном варианте осуществления, катионные аминокислотные остатки представляют собой
35 аргининовые или лизиновые остатки. В одном специально рассматриваемом варианте осуществления, катионные аминокислотные остатки представляют собой
лизиновые остатки. В одном варианте осуществления, последовательность содержит от 2 до 20, от 2 до 15, от 2 до 10, от 3 до 7 или от 3 до 5 аминокислот. В одном варианте осуществления, солюбилизирующая группа представляет собой три-, тетра-, пента-, гекса- или гепта- лизиновую последовательность. В одном специально рассматриваемом варианте осуществления, солюбилизирующая группа представляет собой тетрализиновую последовательность.
В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат и/или аминокислотный партнер по конъюгации, содержит сериновый остаток, примыкающий к аминокислотному остатку, с которым конъюгированы липидные фрагменты. В специально рассматриваемом варианте осуществления, пептид пептидсодержащего партнера по конъюгации включает сериновый остаток, примыкающий к аминокислотному остатку, с которым конъюгированы липидные фрагменты. В примере осуществления, аминокислотный остаток, с которым конъюгированы липидные фрагменты, представляет собой N-конец. В специально рассматриваемом варианте осуществления, пептид дополнительно содержит естественную последовательность из двух или более гидрофильных аминокислотных остатков, примыкающих к сериновому остатку.
В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат и/или аминокислотный партнер по конъюгации, содержит естественную последовательность из двух или более гидрофильных аминокислотных остатков, примыкающих к сериновому остатку.
В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат и/или аминокислотный партнер по конъюгации содержит только природные аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации содержит только природные аминокислоты. В других вариантах осуществления 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 97% или более или 99% или более аминокислотных остатков в пептиде представляют собой природные аминокислоты.
В других вариантах осуществления, 75% или более, 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 97% или более, или 99% или более аминокислотных остатков в пептидном конъюгате и/или аминокислотном партнере по конъюгации представляют собой природные аминокислоты.
В примерах осуществления, пептидный конъюгат и/или аминокислотный партнер по конъюгации содержит пептид, включающий пептидную антигенную детерминанту. В примерах осуществления, пептид, включающий пептидсодержащий
партнер по конъюгации, содержит одну или более пептидных антигенных детерминант.
В различных вариантах осуществления, пептид включает, по существу состоит из одной или более антигенных детерминант EBV LMP2. В различных вариантах осуществления, одна или более антигенных детерминант EBV LMP2 являются антигенными детерминантами MHCI. В различных вариантах осуществления, пептид включает одну или более антигенных детерминант EBV LMP2, выбранных из любой группы из SEQ ID NO: 76-101. В различных вариантах осуществления, пептид включает пептид, содержащий или состоящий из 12 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-75. В различных вариантах осуществления, пептид включает пептид, содержащий или состоящий из 15 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-75, или содержащий или состоящий из 20 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-75.
В различных вариантах осуществления, пептид включает рекомбинантный пептид, содержащий или состоящий из 12 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-75. В различных вариантах осуществления рекомбинантный пептид включает или состоит из 15 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-75, или включает или состоит из 20 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-75.
В одном примере осуществления, пептидную антигенную детерминанту получают из NY-ESO-1. В одном предполагаемом варианте осуществления, пептид включает, по существу состоит, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8 или более примыкающих аминокислотных остатков из любой SEQ ID NO: 106, 107, 108, ИЗ, 114, 119, 120 и 121.
В различных вариантах осуществления, пептид включает, по существу состоит, или состоит из одной или более антигенных детерминант NY-ESO-1. В различных вариантах осуществления, одна или более антигенных детерминант NY-ESO-1 являются антигенными детерминантами MHCI. В различных вариантах осуществления, пептид включает, по существу состоит, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8 или более примыкающих аминокислотных остатков из любой SEQ ID NO: 106, 107, 108, 113, 114, 119, 120 и 121. В различных вариантах осуществления, пептид включает пептид, содержащий или состоящий из 12 или более примыкающих аминокислот из
любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 106, 107, 108, 113, 114, 119, 120 и 121. В различных вариантах осуществления, пептид включает пептид, содержащий или состоящий из 15 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 106, 107, 108, 113, 114, 119, 120 и 121 или содержащий или состоящий из 20 или более примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 106, 107, 108, ИЗ, 114, 119, 120 и 121.
В одном специально рассматриваемом варианте осуществления, реакционноспособные функциональные группы аминокислот пептидсодержащего партнера по конъюгации, являются незащищенными.
В некоторых вариантах осуществления, одна или более реакционноспособных функциональных групп одной или более аминокислот пептидного конъюгата являются незащищенными.
В некоторых вариантах реакционноспособных функциональных конъюгата являются незащищенными.
В некоторых вариантах реакционноспособных функциональных аминокислотного партнера по конъюгации
осуществления, одна или более групп аминокислоты аминокислотного
осуществления, одна или более групп одной или более аминокислот являются незащищенными.
В некоторых вариантах осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации содержит пептид, в котором реакционноспособные функциональные группы боковых цепочек аминокислот пептида являются незащищенными, за исключением любых тиолов, отличных от тиола, который должен вступать в реакцию.
В некоторых специально рассматриваемых вариантах осуществления, реакционноспособные функциональные группы аминокислот пептида пептидсодержащего партнера по конъюгации, являются незащищенными.
В некоторых специально рассматриваемых вариантах осуществления, реакционноспособные функциональные группы аминокислот пептида пептидсодержащего партнера по конъюгации, являются незащищенными, за исключением любых тиолов, отличных от тиола, который должен вступать в реакцию.
Специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение понятно, что пептид пептидного конъюгата и/или пептидсодержащего партнера
конъюгации может быть, как описано здесь, необязательно, замещен, модифицирован или связан с различными другими фрагментами для получения пептидного конъюгата и/или пептидсодержащего партнера по конъюгации.
В некоторых вариантах осуществления, способ включает:
синтезирование аминокислотной последовательности пептида способом твердофазного синтеза пептидов (SPPS);
сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата или аминокислоты пептидного конъюгата с пептидом, связанным способом твердофазного синтеза пептидов SPPS, с возможностью получения: пептидного конъюгата, включающего пептидную антигенную детерминанту, пептидного конъюгата, включающего линкерную группу или одну или более ее аминокислот, или пептидный конъюгат, включающий пептидную антигенную детерминанту, связанную с аминокислотой, с которой с помощью линкерной группы конъюгированы липидные фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления, способ включает:
осуществление реакции липидсодержащих партнеров по конъюгации и аминокислотного партнера по конъюгации с получением аминокислотного или пептидного конъюгата;
синтезирование аминокислотной последовательности пептида способом твердофазного синтеза пептидов (SPPS);
сопряжение аминокислоты данного аминокислотного конъюгата или аминокислоты данного пептидного конъюгата с пептидом, связанным способом твердофазного синтеза пептидов SPPS, с возможностью получения: пептидного конъюгата, включающего пептидную антигенную детерминанту, пептидного конъюгата, включающего линкерную группу или одну или более ее аминокислот, или пептидный конъюгат, включающий пептидную антигенную детерминанту, связанную с аминокислотой, с которой с помощью линкерной группы конъюгированы липидные фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает ацилирование Na-аминогруппы аминокислоты аминокислотного конъюгата или аминокислоты, с которой конъюгированы липидные фрагменты из любых пептидных конъюгатов.
В некоторых вариантах осуществления, способ включает отщепление пептидного конъюгата от твердофазного носителя.
В некоторых вариантах осуществления, способ включает:
синтезирование аминокислотной последовательности пептида пептидсодержащего партнера по конъюгации способом твердофазного синтеза пептидов (SPPS); и
осуществление реакции липидсодержащих партнеров по конъюгации и 5 пептидсодержащего партнера по конъюгации в соответствии с любым из описанных здесь вариантов осуществления.
В примерах осуществления, способ включает:
синтезирование аминокислотной последовательности пептида
пептидсодержащего партнера по конъюгации способом SPPS;
10 отщепление пептида от твердофазного носителя; и
осуществление реакции липидсодержащих партнеров по конъюгации и пептидсодержащего партнера по конъюгации в соответствии с любым из описанных здесь вариантов осуществления.
В одном варианте осуществления, пептидсодержащий партнер по 15 конъюгации не подвергается очищению до реакции с липидсодержащими партнерами по конъюгации.
В некоторых вариантах осуществления, одна или более защитных групп удаляются при отщеплении пептида от твердофазного носителя. В некоторых вариантах осуществления, удаляются все защитные группы, присутствующие в 20 пептиде.
В одном варианте осуществления способ SPPS представляет собой Fmoc-
SPPS.
В некоторых вариантах осуществления, аминокислотный остаток в пептиде пептидсодержащего партнера по конъюгации, включающего тиол, который 25 должен вступать в реакцию, представляет собой N-концевой аминокислотный остаток, а данный способ включает ацилирование N-концевой аминогруппы перед отщеплением пептида от твердофазного носителя. В специально рассматриваемых вариантах осуществления, N-концевой остаток представляет собой цистеиновый остаток.
30 В одном варианте осуществления, способ дополнительно включает
отделение пептидного конъюгата от реакционной среды и, необязательно, очистку пептидного конъюгата.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в способе получения пептидного конъюгата, способе включающем:
получение аминокислотного или пептидного конъюгата формулы (I) по настоящему изобретению или его соли или сольвата, и
сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата или аминокислоты пептидного конъюгата с аминокислотой или аминокислотой пептида и получение пептидного конъюгата.
В различных вариантах осуществления, продукт пептидного конъюгата представляет собой соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль в соответствии с настоящим изобретением.
В различных вариантах осуществления, аминокислота аминокислотного конъюгата сопрягается в условиях, при которых уменьшается эпимеризация а-углерода аминокислоты. В различных вариантах осуществления, условия таковы, что происходит эпимеризация менее чем 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 3, 2 или 1% на моль аминокислоты. В различных вариантах осуществления, условия, при которых уменьшается эпимеризация, включают использование РуВОР в качестве сопрягающего реагента. В различных вариантах осуществления, условия включают использование РуВОР и 2,4,6-триметилперидина.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в использовании аминокислотного или пептидного конъюгата формулы (I) по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата в синтезе иммуногенного пептидного конъюгата.
В различных вариантах осуществления, иммуногенный пептидный конъюгат представляет собой соединение формулы (I) в соответствии с настоящим изобретением или его фармацевтически приемлемую соль.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в аминокислотном конъюгате или пептидном конъюгате по настоящему изобретению, полученными способом в соответствии с настоящим изобретением.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в пептидном конъюгате, полученном способом в соответствии с настоящим изобретением.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в составе, включающем аминокислотный или пептидный конъюгат формулы (I) по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли или сольвату.
В различных вариантах осуществления, состав включает изолят, чистое, очищенное или по существу чистое соединение формулы (I) или его соль или сольват.
В различных вариантах осуществления, состав включает, по меньшей мере, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, или 99 мас.% соединение формулы (I) или его соли или сольвата.
В различных вариантах осуществления, состав по существу не содержит аминокислотные или пептидсодержащие соединения, за исключением соединений формулы (I).
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в лекарственном препарате, включающем эффективное количество пептидного конъюгата формулы (I) по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата и фармацевтически приемлемый носитель.
В различных вариантах осуществления, лекарственный препарат по формуле изобретения включает эффективное количество двух или более соединений пептидного конъюгата формулы (I) по настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления, лекарственный препарат представляет собой иммуногенный состав.
В одном варианте осуществления, лекарственный препарат не включает внешний адъювант.
В некоторых вариантах осуществления, лекарственный препарат представляет собой вакцину.
В одном варианте осуществления, лекарственный препарат включает эффективное количество двух или более пептидных конъюгатов по настоящему изобретению, например, лекарственный препарат включает эффективное количество трех или более пептидных конъюгатов по настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления, лекарственный препарат включает эффективное количество одного или более пептидных конъюгатов по настоящему изобретению вместе описанными здесь одним или более пептидами, или их любой комбинации. Например, лекарственный препарат включает эффективное количество двух или более пептидных конъюгатов по настоящему изобретению и один или более описанных здесь пептидов, или эффективное количество одного или более
пептидных конъюгатов по настоящему изобретению и два или более описанных здесь пептидов.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в способе вакцинирования или вызывания иммунного ответа у пациента, включая введение нуждающемуся пациенту эффективного количества одного или более соединений пептидного конъюгата формулы (I) по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, или эффективного количества лекарственного препарата по настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в использовании одного или более соединений пептидного конъюгата формулы (I) по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, или лекарственного препарата по настоящему изобретению, при изготовлении лекарственного средства для вакцинирования или вызывания иммунного ответа у пациента.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в одном или более соединениях пептидного конъюгата данной формулы (I) по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, или лекарственного препарата по настоящему изобретению для вакцинирования или вызывания иммунного ответа у пациента.
В другом аспекте настоящее изобретение в целом выражается в одном или более соединениях пептидного конъюгата данной формулы (I) по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, или лекарственного препарата по настоящему изобретению для вакцинирования или вызывания иммунного ответа у пациента.
В различных вариантах осуществления, способ, использование, одно или более соединений или лекарственный препарат предназначены для вызывания иммунного ответа у пациента.
В различных вариантах осуществления, способ, использование, одно или более соединений или лекарственный препарат предназначены для вакцинирования пациента.
В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение пациенту одного или более описанных здесь пептидов и одного или более пептидных конъюгатов по настоящему изобретению, или двух или более пептидных конъюгатов
по настоящему изобретению, например одного или более пептидов в комбинации с одним или более пептидными конъюгатами.
В некоторых вариантах осуществления, один или более описанных здесь пептидов и один или более пептидных конъюгатов по настоящему изобретению или два или более пептидных конъюгатов по настоящему изобретению, например один или более пептидов в комбинации с одним или более пептидными конъюгатами используются для вакцинирования или вызывания иммунного ответа у пациента или при изготовлении лекарственного средства для вакцинирования или вызывания иммунного ответа у пациента.
В некотором варианте осуществления, используют или вводят два или более пептидных конъюгата.
В некоторых вариантах осуществления, два или более пептидных конъюгата или один или более пептидов и один или более пептидных конъюгатов используются или вводятся одновременно, последовательно или по отдельности.
Центры асимметрии могут существовать в описанных здесь соединениях. Центры асимметрии могут обозначаться как (R) или (S) в зависимости от конфигурации заместителей в трехмерном пространстве у хирального углеродного атома. Все стереохимически изомерные формы соединений, включая диастереомерные, энантиомерные и эпимерные формы, а также d-изомеры и I-изомеры и их смеси, включая энантиомерно обогащенные и диастереомерно обогащенные смеси стереохимических изомеров, входят в объем изобретения.
Отдельные энантиомеры синтезируют из имеющихся в продаже энантиомерночистых исходных материалов или путем приготовления энантиомерных смесей и разделения смеси на отдельные энантиомеры. Способы разделения включают превращение энантиомерной смеси в смесь диастереомеров и отделение диастереомеров, например, путем рекристаллизации или хроматографии и любыми другими подходящими способами, известными в отрасли техники, к которой относится данное изобретение. Исходные материалы определенной стереохимии имеются в продаже или изготавливаются, а при необходимости разделяются способами хорошо известными в отрасли техники, к которой относится данное изобретение.
Соединения, описанные здесь, могут также существовать как конформационные или геометрические изомеры, включающие цис, транс, син, анти, (Е) и (Z) изомеры. Все данные изомеры и любые их смеси входят в объем изобретения.
Также в объем изобретения входят любые таутомерные изомеры или их смеси из описанных соединений. Специалисту в данной области техники очевидно, что широкий спектр функциональных групп и других структур способен демонстрировать таутомерию. Примерами являются, не ограничиваясь, кето-енольная, имин-енаминная и тиокетон-енотиольная таутомерия.
Соединения, описанные здесь, могут также существовать в виде изотопологов и изотопомеров, где один или более атомов в соединениях заменены различными изотопами. Подходящие изотопы включают, например, 1Н, 2Н (D), 3Н (Т), 12С, 13С, 14С, 1бО и 180. Специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение очевидны процедуры включения таких изотопов в описанные здесь соединения. Изотопологи и изотопомеры, описанных здесь соединений, также входят в объем изобретения.
Также в объем изобретения входят соли описанных здесь соединений, включая фармацевтически приемлемые соли. Данные соли включают соли присоединения кислоты, соли присоединения основания и четвертичные соли основания азотсодержащих групп.
Соли присоединения кислоты получают осуществлением реакции соединений, в форме свободного основания, с неорганическими или органическими кислотами. Примерами неорганических кислот являются, не ограничиваясь: хлористоводородная, бромистоводородная, азотная, серная и фосфорная кислота. Примерами органических кислот являются, не ограничиваясь: уксусная, трифторуксусня, пропионовая, янтарная, гликолевая, молочная, янтарная, винная, лимонная, аскорбиновая, малеиновая, фумаровая, пировиноградная, аспарагиновая, глутаминовая, стеариновая, салициловая, метансульфоновая, бензолсульфоновая, изэтиновая, сульфаниловой, адипиновая, масляная и пивалиновая.
Соли присоединения основания получают осуществлением реакций соединений, в форме свободной кислоты, с неорганическими или органическими основаниями. Примерами неорганических солей присоединения основания являются: соли щелочных металлов, соли щелочноземельных металлов и другие физиологически приемлемые соли металлов, например, соли алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия или цинка. Примерами органических солей присоединения основания являются: первичные, вторичные и третичные аммониевые соли, например, соли триметиламина, диэтиламина, этаноламина, диэтаноламина и этилендиамина.
Четвертичные соли основных азотсодержащих групп в соединениях получают, например, осуществлением реакций соединений с галоидными алкилами,
такими как метил, этил, пропил; и бутилхлоридами, бромидами и йодидами; диалкилсульфатами, такими как диметил, диэтил, дибутил; и диамилсульфатами и тому подобное.
Описанные здесь соединения могут образовываться или существовать в виде сольватов с различными растворителями. Если растворитель представляет собой воду, то сольват можно назвать гидратом, например моногидратом, дигидратом или тригидратом. Все сольватированные формы и несольватированные формы описанных здесь соединений входят в объем изобретения.
Используемые в формулах общие химические обозначения имеют свое обычное значение.
Термин "алифатический" охватывает насыщенные и ненасыщенные, неароматические, неразветвленные, разветвленные, ациклические и циклические углеводороды. Специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение понятно, что алифатические группы включают, например, алкильную, алкенильную, алкинильную, циклоалкильную и циклоалкенильную группы и их смеси, например, циклоалкила с алкилом, циклоалкенила с алкилом и циклоалкила с алкенилом. В различных вариантах осуществления, алифатические группы включают от 1 до 12, от 1 до 8, от 1 до 6 или от 1 до 4 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления, алифатические группы включают от 5 до 21, от 9 до 21 или от 11 до 21 атомов углерода, например, 11, 13, 15, 17 или 19 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления, алифатическая группа является насыщенной.
Термин "гетероалифатический" охватывает алифатические группы, в которых один или более атомов углерода цепочки и/или кольца независимо заменены гетероатомом, предпочтительно гетероатомом, выбранным из кислорода, азота и серы. В некоторых вариантах осуществления гетероалифатическая группа является насыщенной. Примерами гетероалифатических групп являются линейные или разветвленные, гетероалкильные, гетероалкенильные и гетероалкинильные группы.
Термин "алкил" охватывает насыщенные углеводородные группы с неразветвленной и разветвленной цепочкой. В некоторых вариантах осуществления, алкильные группы включают от 1 до 12, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6 или от 1 до 4 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления, алкильные группы включают от 5 до 21, от 9 до 21 или от 11 до 21 атомов углерода, например, 11, 13, 15, 17 или 19 атомов углерода. Примерами неразветвленных алкильных групп являются, не ограничиваясь, метил, этил, п-пропил, n-бутил, п-пентил, n-гексил, п-гептил и n-октил. Примерами разветвленных алкильных групп являются, не
ограничиваясь, изопропил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, неопентил, изопентил и 2,2-диметилпропил.
Термин "алкенил" охватывает неразветвленные и разветвленные алкильные группы, имеющие, по меньшей мере, одну двойную связь между двумя атомами углерода. В некоторых вариантах осуществления, алкенильные группы включают от 2 до 12, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до б или от 2 до 4 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления, алкенильные группы включают от 5 до 21, от 9 до 21 или от 11 до 21 атомов углерода, например, 11, 13, 15, 17 или 19 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления, алкенильные группы имеют одну, две или три двойные углерод-углеродные связи. Примерами алкенильных групп являются, не ограничиваясь, винил, аллил, -СН=СН(СНз), -СН=С(СНз)2, -С(СНз) = СН2 и -С(СНз)=СН(СНз).
Термин "алкинил" охватывает неразветвленные и разветвленные алкильные группы, имеющие, по меньшей мере, одну тройную связь между двумя атомами углерода. В некоторых вариантах осуществления, алкинильная группа включает от 2 до 12, от 2 до 10, от 2 до 8, от 2 до б или от 2 до 4 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления, алкинильные группы имеют одну, две или три тройные углерод-углеродные связи. Примерами являются, не ограничиваясь, -С=СН, -С=СНз, -СН2С=СНз и -С=СН2СН(СН2СНз)2.
Термин "гетероалкил" охватывает алкильные группы, в которых один или более атомов углерода цепочки заменены гетероатомом, предпочтительно гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из кислорода, азота и серы. В некоторых вариантах осуществления, гетероалкил является насыщенным. Гетероалкильные группы включают, например, полиэтиленгликоль и полиэтиленгликолевый эфир, и тому подобное.
Термин "циклоалкил" охватывает моно-, би- или трициклические алкильные группы. В некоторых вариантах осуществления, циклоалкинильные группы включает от 3 до 12, от 3 до 10, от 3 до 8, от 3 до 6, от 3 до 5 атомов углерода в кольце (ах). В некоторых вариантах осуществления, циклоалкильные группы имеют 5 или 6 атомов углерода в кольце. Примерами моноциклических циклоалкильных групп являются, не ограничиваясь, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил. В некоторых вариантах осуществления, циклоалкинильная группа включает от 3 до 8, от 3 до 7, от 3 до 6, от 4 до 6, от 3 до 5 или от 4 до 5 атомов углерода в кольце. Бициклические и трициклические кольцевые системы охватывают мостиковые, спиро-конденсированные циклоалкильные кольцевые системы. Примерами бициклических
и трициклических кольцевых циклоалкильных систем являются, не ограничиваясь, бицикло-2.1.1-гексанил, бицикло-2.2.1-гептанил, адамантил и декалинил.
Термин "циклоалкенил" охватывает неароматические циклоалкильные группы, имеющие, по меньшей мере, одну двойную связь между двумя атомами углерода. В некоторых вариантах осуществления, циклоалкенильные группы имеют одну, две или три двойные связи. В некоторых вариантах осуществления, циклоалкенильные группы включает от 4 до 14, от 5 до 14, от 5 до 10, от 5 до 8, от 5 до 6 атомов углерода в кольце (ах). В некоторых вариантах осуществления, циклоалкенильные группы имеют 5, 6, 7 или 8 атомов углерода в кольце. Примерами циклоалкенильных групп являются циклогексенил, циклопентенил, циклогексадиенил, бутадиенил, пентадиенил и гексадиенил.
Термин "арил" охватывает циклические ароматические углеводородные группы, которые не содержат каких-либо кольцевых гетероатомов. Арильные группы включают моноциклические, бициклические и трициклические кольцевые системы. Примерами арильных групп являются, не ограничиваясь, фенил, азуленил, гепталенил, бифенил, флуоренил, фенантренил, антраценил, инденил, инданил, пентаниленил и нафтил. В некоторых вариантах осуществления, арильные группы включает от 6 до 14, от 6 до 12 или от 6 до 10 атомов углерода в кольце (ах). В некоторых вариантах осуществления, арильные группы представляют собой фенил или нафтил. Арильные группы включают ароматические алифатические конденсированные кольцевые системы. Примерами являются, не ограничиваясь, инданил и тетрагидронафтил.
Термин "гетероциклический" охватывает неароматические кольцевые системы, содержащие 3 или более кольцевых атома, один или более из которых представляют собой гетероатом. В некоторых вариантах осуществления, гетероатом представляет собой азот, кислород или серу. В некоторых вариантах осуществления, гетероциклическая группа содержит один, два, три или четыре гетероатома. В некоторых вариантах осуществления, гетероциклические группы включают моноциклические, бициклические и трициклические кольца, имеющие от 3 до 16, от 3 до 14, от 3 до 12, от 3 до 10, от 3 до 8 или от 3 до 6 кольцевых атомов. Гетероциклические группы включают частично ненасыщенные и насыщенные кольцевые системы, например, имидазолинил и имидазолидонил. Гетероциклические группы включают конденсированные и мостиковые кольцевые системы, содержащие гетероатом, например хинуклидинил. Гетероциклические группы включают, не ограничиваясь, азиридинил, азетидинил, азепанил, диазепанил, 1,3-диоксанил, 1,3-диоксоланил, изоксазолидинил, морфолинил, пиперазинил, пиперидинил, пиранил,
пиразолидинил, пирролинил, пирролидинил, тетрагидрофуранил, тетрагидротиенил, тиадиазолидинил и тритианил.
Термин "гетероарил" охватывает ароматические кольцевые системы, содержащие 5 или более кольцевых атома, один или более из которых представляют собой гетероатом. В некоторых вариантах осуществления, гетероатом представляет собой азот, кислород или серу. В некоторых вариантах осуществления, гетероарильные группы включают моноциклические, бициклические и трициклические кольцевые системы, имеющие от 5 до 16, от 5 до 14, от 5 до 12, от 5 до 10, от 5 до 8 или от 5 до 6 кольцевых атомов. Гетероарильные группы включают, не ограничиваясь, пирролил, пиразолил, триазолил, тетразолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил, пиридинил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил, тиофенил, бензотиофенил, фуранил, бензофуранил, индолил, азандолил (пирролопиридинил), индазолил, бензимидазолил , пиразолопиридинил, триазолопиридинил, бензотриазолил, бензоксазолил, бензотиазолил, имидазопиридинил, изоксазолопиридинилксантинил, гуанинил, хинолинил, изохинолинил, тетрагидрохинолинил, хиноксалинил и хиназолинил. Гетероарильные группы включают конденсированные кольцевые системы, в которых все кольца являются ароматическими, например, индолильными, и конденсированные кольцевые системы, в которых только одно из колец является ароматическим, например, 2,3-дигидроиндолил.
Термин "гало" или "галоген" охватывает F, CI, Вг и I.
Термин "гетероатом" охватывает кислород, азот, серу или фосфор. В некоторых вариантах осуществления, гетероатом выбирается из группы, состоящей из кислорода, азота и серы.
Используемый здесь термин "замещенный" означает, что один или более атомов водорода в указанной группе замещены одним или несколькими независимо выбранными подходящими заместителями при условии, что не превышается главная валентность каждого атома, к которому присоединяется заместитель (и), а замена приводит к стабильному соединению. В различных вариантах осуществления, необязательно, заместители в описанных здесь соединениях включают, не ограничиваясь, галоген, CN, NO2, ОН, NH2, NHR10, NR10R20, С1-6 галогеналкил, С1-6 галогеналкокси, C(0)NH2, C(O)NHR10, C(O)NR10R20, SO2RIO, OR10, SR10, S(O)R10, C(O)R10, и Cl-6 алифатическую группу, где RIO и R20 каждое независимо представляет собой С1-6 алифатическую групп, например, С1-6 алкил.
Используемый здесь термин "карбоксильная защитная группа" означает группу, которая способна легко удаляться с получением ОН-группы карбоксильной
группы, и защищает карбоксильную группу от нежелательной реакции во время синтеза. Данные защитные группы описаны в работе "Protective Groups in Organic Synthesis* под редакцией Т. W. Greene и др. (John Wiley & Sons, 1999) и работе "Amino Acid-Protecting Groups" под редакцией Fernando Albericio (при участии Albert 5 Isidro-Llobet и Mercedes Alvarez) в журнале Chemical Reviews 2009 (109) 2455-2504. Примерами являются, не ограничиваясь, алкильные и силильные группы, например, метил, этил, трет-бутил, метоксиметил, 2,2,2-трихлорэтил, бензил, дифенилметил, триметилсилил и трет-бутилдиметилсилил и тому подобное.
Используемый здесь термин "аминозащитная группа" означает группу, 10 которая способна легко удаляться с получением Nhh группы аминогруппы, и защищает аминогруппу от нежелательной реакции во время синтеза. Данные защитные группы описаны в работе "Protective Groups in Organic Synthesis* под редакцией Т. W. Greene и др. (John Wiley & Sons, 1999) и работе "Amino Acid-Protecting Groups" под редакцией Fernando Albericio (при участии Albert Isidro-Llobet 15 и Mercedes Alvarez) в журнале Chemical Reviews 2009 (109) 2455-2504. Примерами являются, не ограничиваясь, ацильные группы и ацилоксигруппы, например ацетил, хлорацетил, трихлорацетил, о-нитрофенилацетил, о-нитрофеноксиацетил, трифторацетил, ацетоацетил, 4-хлорбутирил, изобутирил, пиколиноил, аминокапроил, бензоил, метоксикарбонил, 9-флуоренилметоксикарбонил, 2,2,220 трифторэтоксикарбонил, 2-триметилсилилэтоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил, бензилоксикарбонил, р-нитробензилоксикарбонил, 2,4-дихлорбензилоксикарбонил и тому подобное. Другими примерами являются Cbz (карбоксибензил), нозил (о- или р-нитрофенилсульфонил), Врос (2-4-бифенилизопропоксикарбонил) и Dde (1-4,4-диметил-2,6-диоксогексилиденэтил).
25 Используемый здесь термин "карбоксамидзащитная группа" означает
группу, которая способна легко удаляться с получением Nhh группы карбоксамидной группы, и защищает карбоксамидную группу от нежелательной реакции во время синтеза. Данные защитные группы описаны в работе "Protective Groups in Organic Synthesis* под редакцией Т. W. Greene и др. (John Wiley & Sons, 1999) и работе
30 "Amino Acid-Protecting Groups* под редакцией Fernando Albericio (при участии Albert Isidro-Llobet и Mercedes Alvarez) в журнале Chemical Reviews 2009 (109) 2455-2504. Примерми являются, не ограничиваясь, 9-ксантенил (Хап), тритил (Trt), метилтритил (Mtt), циклопропилдиметилкарбинил (Cpd) и диметилциклопропилметил (Dmcp).
Используемый здесь термин "и/или" означает "и", или "или", или и то, и
35 другое.
Окончание "(ы)" после имени существительного охватывает формы единственного и множественного числа или и то, и другое.
Термин "содержащий", используемый в этом описании, означает "состоящий, по меньшей мере, частично из". При интерпретации каждого утверждения в этом описании, которое включает термин "содержащий", могут присутствовать и другие значения, кроме тех, которые предварены этим термином. Подобные термины, такие как "содержать" и "содержит", должны интерпретироваться таким же образом. "Включающий" также следует интерпретировать подобным образом.
Изобретение в широком смысле состоит из частей, элементов и признаков, упомянутых или указанных в описании заявки по отдельности или вместе, в любых комбинациях из двух или более указанных частей, элементов или признаков, и где упомянутые конкретные целые числа, которые имеют известные эквиваленты в отрасли техники, к которой относится данное изобретение, то такие известные эквиваленты считаются включенными в данное описание, как если бы они были изложены по отдельности.
Предполагается, что ссылка на раскрытый здесь диапазон чисел, (например, от 1 до 10), также включает ссылку на все рациональные числа в этом диапазоне (например, 1; 1,1, 2, 3, 3,9, 4, 5, 6, 6,5, 7, 8, 9 и 10), а также на любой диапазон рациональных чисел в этом диапазоне (например, от 2 до 8, от 1,5 до 5,5 и от 3,1 до 4,7) и, следовательно, на все поддиапазоны всех диапазонов явно раскрытых здесь. Это лишь конкретные примеры, а все возможные перечисленные комбинации числовых значений между наименьшим значением и наивысшим значением, должны рассматриваться аналогичным образом, как явно указанные в этой заявке.
Хотя настоящее изобретение в целом описано выше, специалистам в данной области техники понятно, что изобретение этим не ограничивается и что изобретение также включает в себя варианты осуществления, описание которых является примерами осуществления.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Изобретение описывается со ссылкой на прилагаемые рисунки.
На Рисунке 1 представлена хроматограмма после облучения раствора AcCSKKKKNLVPC(tBu)VATV эквивалентов) и DMPA при длине волны 365 нм. Пик
ВЭЖХ реакционной смеси 1, винилпальмитата (70 а (11,05 мин): остаточный
исходный пептид 1; b (18,58 мин): монопамитоилированный пептид 2; с (26,66 мин): биспальмитоилированный пептид 3; е, f: сульфоксиды 2 и 3; *: побочные продукты фотоинициатора DMPA. Колонка: Phenomenex Gemini С18 (Зц, ИОА, 4,6 х 150 мм); элюент А, вода / 0,1% TFA; элюент В: MeCN/0,1% TFA; градиент: 5-95% В, 5 более 30 мин при 1 мл/мин.
На Рисунке 2 представлен масс-спектр с низким разрешением пика Ь, изображенного на Рисунке 1: m/z (ESI) 999,9 [М+2Н+].
На Рисунке 3 представлен масс-спектр с низким разрешением пика с, изображенного на Рисунке 1: m/z (ESI) 1141,3 [М+2Н+].
10 На Рисунках 4А-4С представлены графики, показывающие результаты
анализа агонизма TLR с использованием пептидных конъюгатов и HekBlue(tm), как описано здесь в примерах. А: Получение SEAP в клетках HEK-Blue(tm)-mTLR2 (слева) и HEK-Blue(tm)-hTLR2 (справа), вызванное агонистами 520, 550, 530, 540, 510 или PBS. В: Получение SEAP в клетках HEK-Blue(tm)-mTLR2 (слева) и HEK-Blue(tm)-hTLR2
15 (справа), вызванное агонистами 520 (серые полосы) и 530 (черные полосы). С: Получение SEAP в клетках HEK-Blue(tm)-mTLR2 (слева) и HEK-Blue(tm)-hTLR2 (справа), вызванное агонистами 550 (серые полосы) и 530 (черные полосы).
На Рисунках 4D и 4Е представлены графики, показывающие активацию клона Т-клеток в ответ на D: агонисты 521 (черные полосы), 551 (заштрихованные 20 наискось полосы) и 511 (серые полосы); Е: агонисты 552 (заштрихованные наискось полосы), 512 (черные полосы) и 500 (серые полосы).
На Рисунке 5 представлен спектр ХН-ЯМР биспамитолированного пептида
На Рисунках 6А и 6В представлены графики, показывающие результаты 25 анализов агонизма TLR в клетках HEK-Blue(tm)-mTLR2 (Рисунок 6А) и HEK-Blue(tm)-hTLR2 (Рисунок 6В) с использованием PamlCys-SKKKK-NH2 и (R)- и (S)-конструкций Pam2Cys-SKKKK, Pam3Cys-SKKKK и homoPam2Cys-SKKKK, перечисленные в Таблице 4, как описано в Примере 8, при различных концентрациях: 10"6 моль/л (черные полосы), 10"7 моль/л (темно-серые полосы), 10"8 30 моль/л (средние серые полосы), 10"9 моль/л (заштрихованные наискось полосы), 10" 10 моль/л (светло-серые полосы) и 10"11 моль/л (заштрихованные квадратами полосы).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предлагает соединения аминокислотного и пептидного конъюгата формулы (I), как определено здесь. Авторы изобретения обнаружили, что такие конъюгаты обладают удивительной иммуногенной активностью.
Соединения аминокислотного и пептидного конъюгата формулы (I) получают способами и методами, описанными здесь.
Исходные материалы и/или промежуточные продукты, полезные в данных способах, получают с использованием известных методов синтетической химии (например, методов описанных авторами Louis F Fierer и Магу F, в работе "Reagents for Organic Synthesis* т. 1-19, Wiley, New York (1967-1999) или в книге "Beilsteins Handbuch der organischen Chemie", 4-е изд. Springer-Verlag Berlin, включая дополнения (также доступные через онлайн-базу данных Beilstein) или имеющиеся в продаже для некоторых вариантов осуществления.
Приготовление соединений может включать защиту и снятие защиты с различных химических групп. Специалист в данной области способен легко определить необходимость защиты и снятия защиты, а также выбор подходящих защитных групп. Защитные группы и способы защиты и снятия защиты хорошо известны в отрасли техники, к которой относится данное изобретение (см., напр., Т. W. Greene и P. G. М. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis*, 3- изд., Wiley & Sons, Inc., New York (1999)).
Как показано в Схеме Al ниже, соединения формулы (IF), которые являются соединениями формулы (I), где w равно 1, v равно 0, a m составляет от 2 до 6, предпочтительно 2, получают способом, включающим конъюгацию эпоксида с аминокислотным партнером по конъюгации.
Настоящее изобретение предлагает способ получения соединения 5 формулы (XV), включающий осуществление реакции эпоксида формулы (XVI) и аминокислотного партнера по конъюгации, содержащего тиол формулы (III) в условиях, способствующих получению соединения формулы (XV) путем конъюгации тиола с эпоксидом.
Аминокислотный партнер по конъюгации, вступающий в реакцию с 10 эпоксидом, может состоять из аминокислоты, например защищенного Na-амина и/или защищенного С-концевого цистеина. Кроме того, аминокислотный партнер по конъюгации, может содержать пептид, например короткий пептид. В таких вариантах осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации, может содержать около 15 аминокислотных остатков или менее, например 5, 4 или 3 аминокислотных остатка. 15 Na-аминогруппа аминокислотного партнера по конъюгации, предпочтительно защищена или иным образом замещена (т.е. не находится в форме свободной аминогруппы -NH2) для предотвращения вступления в реакцию во время реакции конъюгации. С-конец аминокислотного партнера по конъюгации также может быть защищен.
20 Х10 в соединении формулы (XVI) может представлять собой защищенную
гидроксильную, тиоловую, аминную или карбаматную группу (Р10-О-, P11-S-, Р12-NR-, or P12-NRC(0)0-, соответственно) из которых впоследствии могут быть образованы L1-Z1- и L2-Z2-. Если Х10 является защищенной группой, то защитная группа может быть удалена в реакции конъюгации с получением соединения
25 формулы (XV), где XII представляет собой соответствующую группу со снятой защитой. Например, когда Х10 представляет собой Р10-О-группу, реакция
конъюгации способна создать соответствующую гидроксильную группу XII в соединении формулы (XV).
Эпоксид формулы (XVI) содержит стереогенный центр у атома углерода, к которому присоединен R3. Таким образом, единственный стереоизомер эпоксида или 5 стереоизомерно обогащенной смеси эпоксида может использоваться в реакции для управления стереохимией атома углерода, к которому присоединен R3 в соединении формулы (XV) и последующим образовавшимся продуктам, включая соединение формулы (IF). В отрасли техники, к которой относится данное изобретение, известны различные способы получения энантиомерночистых или энантиомернообогащенных 10 смесей эпоксидов. В различных вариантах осуществления, получение единственного стереоизомера или стереоизомерно обогащенной смеси эпоксида формулы (XVI) включает разделение рацемической смеси эпоксида. Например, разделение рацемической смеси эпоксида кинетическим гидролизом, как описано Jacobsen et al., Science, 1997, 277, 936-938.
15 Эпоксид формулы (XVI) получают осуществлением реакции алкена
формулы (XVII) с окислителем в условиях, способствующих эпоксидированию алкена. В отрасли техники, к которой относится данное изобретение, известны многочисленные методы эпоксидирования алкенов. В некоторых вариантах осуществления, эпоксидирование осуществляют реакцией алкена с пероксидом или
20 органическим N-оксидом в качестве окислителя. Примерами подходящих пероксидов являются органические пероксиды, например, m-хлорпероксибензойная кислота. Примерами N-оксидов являются, например, N-оксид пиридина и тому подобное. Для специалистов в отрасли техники, к которой относится данное изобретение очевидны и другие подходящие окислители. Реакцию можно осуществлять в жидкой
25 реакционной среде, содержащей подходящий растворитель, например, дихлорметан. Алкены формулы (XVII) имеются в продаже или получают из имеющихся в продаже прекурсоров с использованием стандартных методов синтетической химии.
Специалистам в данной области техники понятно, что некоторые группы Х10 могут быть подвержены окислению в реакции эпоксидирования, например,
30 когда Х10 содержит аминогруппу (которая способна образовывать N-оксид) или тиоэфирную группу (которая способна образовывать, напр., сульфоксиды или сульфоны). Такие группы могут быть защищены во время реакции для предотвращения окисления или восстановления обратно в требуемую группу в подходящей точке синтетической последовательности после проведения реакции
35 эпоксидирования.
Кроме того, эпоксид формулы (XVI) получают обработкой соединения формулы (XVII-A), где LG представляет собой подходящую уходящую группу, например, галоген, с основанием в подходящем растворителе для вытеснения уходящей группы, как показано в схеме А2.
5 Схема А2. Эпоксидирование путем вытеснения уходящей группы.
Соединения формулы (XVII-A) имеются в продаже или получают из имеющихся в продаже прекурсоров. В некоторых вариантах осуществления, соединения формулы (XVII-A) преимущественно получают из энантиомерночистой а-10 аминокислоты. Реакция эпоксидирования протекает стереоспецифически со стереохимической инверсией углерода, к которому присоединяется R3.
Например, как показано в схеме А2-1, соединение формулы (XVII-A1), которое соответствует соединению формулы (XVII-A), где m равно 2, а каждое R1 и R2, и R3, R4 и R5 представляют собой водород, Х10 представляет собой -ОН, a LG 15 представляет собой бром, получают из L-аспарагиновой кислоты (см. Volkmann, R. А. и др. J. Org. Chem., 1992, 57, 4352-4361).
L-аспарагиновую кислоту можно превратить в бромянтарную кислоту (АА-1) при температуре от -10 до 0 °С, например, обработкой нитритом натрия и сильной кислотой, такой как серная кислота, для получения азотистой кислоты в 20 реакционной смеси в присутствии бромида натрия. Реакция протекает стереоспецифически с полным сохранением стереохимии.
Восстановление бромянтарной кислоты (АА-1) до бромдиола (XVII-A1) осуществляется с использованием подходящего восстановителя, например, путем обработки бораном или борандиметилсульфидным комплексом в THF при 25 температуре -78 °С, что допускает нагрев реакционной смеси до комнатной температуры. Эпоксидирование, с получением соединения формулы (XVI-la), осуществляется реакцией в дихлорметане при комнатной температуре бромдиола (XVII-A1) с основанием, например карбонатом цезия. Как отмечено выше, реакция протекает стереоспецифически с полной стереохимической инверсией.
30 Противолежащий энантиомер эпоксида (XVI-la) получают из D-
аспарагиновой кислоты тем же способом.
Обращаясь снова к Схеме А1, соединение формулы (XV) может быть 5 впоследствии превращено на одной или более стадиях синтеза в аминокислоту или пептидный конъюгат формулы (IF). На одной или более стадиях, гидроксильная группа, связанная с углеродом, к которому присоединено R3, превращается в группу L2-Z2-.
Если XII не представляет собой L1-Z1-, то на одной или более стадиях 10 также осуществляется превращение XII в L1-Z1-. Группы L1-Z1- и L2-Z2- могут вводиться одновременно или последовательно в любом порядке.
В некоторых вариантах осуществления, одна или более стадий включают ацилирование соединения формулы (XV) с возможностью замены атома водорода гидроксильной группы, связанной с углеродом, к которому присоединено R3, на L2-15 С(О)-.
В примерах осуществления, Х10 представляет собой Р10-О- или ОН; а XII представляет собой Р10-О- или ОН.
В различных вариантах осуществления, XII представляет собой Р10-О-20 или ОН, а одна или более стадий синтеза включают ацилирование соединения формулы (XV) с возможностью замены Р10 или атома водорода гидроксильной группы из XII на Ll-C(O)-, и/или замены атома водорода гидроксильной группы, связанной с углеродом, к которому присоединено R3 на 1_2-С(0)-.
25 В некоторых вариантах осуществления, как показано ниже в Схеме A3 и
описано в Примерах, способ включает осуществление реакции эпоксида формулы (XVI-1), имеющего защищенную гидроксильную группу, с аминокислотой, включающей аминокислотного партнера по конъюгации формулы (III), с получением соединения формулы (XV-la).
Реакцию конъюгации осуществляют в кислых условиях, осуществлением 5 реакции эпоксида и тиола в присутствии кислоты, например, хлористоводородной кислоты, серной кислоты или их смеси. Реакцию можно осуществлять в жидкой реакционной среде, включающей подходящий растворитель, например, дихлорметан, при температуре, составляющей примерно от -10 до 50 °С, например, от 0 до 40 °С.
Гидроксильная защитная группа Р10 выбирается таким образом, чтобы она могла удаляться в условиях способствующих конъюгации, и за счет этой способности удаляется во время реакции конъюгации с получением требуемого диола формулы (XV-la). Подходящие защитные группы очевидны для специалистов 15 в отрасли техники, к которой относится данное изобретение, и могут включать, например, кислотонеустойчивые силиловые защитные группы.
Кроме того, реакцию конъюгации можно осуществлять с использованием эпоксида формулы (XVI), где Х10 представляет собой гидроксильную группу, такую 20 как у эпоксида формулы (XVI-la).
Диол формулы (XV-la) может быть превращен в соединение формулы (IF-1) реакцией с соединениями формулы (VI-1) и (VI) в условиях способствующих этерификации, где X представляет собой ОН или подходящую уходящую группу 25 (например, галогенид, такой как хлор или бром).
Условия, способствующие этерификации, зависят от природы соединения формулы (IV) и/или (VI-1). Например, если X представляет собой ОН, то реакцию
проводят в жидкой среде, содержащей подходящий растворитель, такой как THF, в присутствии основания, такого как DMAP, и активирующего агента, такого как N, N'-диизопропилкарбодиимид (DIC).
5 В различных вариантах осуществления, соединение формулы (VI) и (VI-1)
идентичны. Например, соединение формулы (VI) и (VI-1) каждое может представлять собой пальмитиновую кислоту. В таких вариантах осуществления, превращение диола формулы (XV-la) в соединение формулы (IF-1) может осуществляться за одну стадию.
В некоторых вариантах осуществления, могут вводиться различные группы L1 и L2 путем осуществления реакции диола со стоихиометрическим количеством соединения формулы (VI-1) или (VI) для этерификации более реакционноспособного из двух спиртов и последующего осуществления реакции 15 полученного сложного эфира с другим соединением формулы (VI) или (VI-1), чтобы эстерифицировать второй спирт диола.
В других вариантах осуществления, способ включает осуществление реакции эпоксида формулы (XVI-1) и аминокислоты, включающей аминокислотного 20 партнера по конъюгации формулы (III), с получением соединения формулы (XV-lb), как показано ниже в Схеме А4. В таких вариантах осуществления, гидроксильная защитная группа Р10 стабильна и не удаляется в условиях реакции конъюгации.
Защищенный спирт формулы (XV-lb) обеспечивает беспрепятственное 25 проникновение к соединениям формулы (IF-1), где L1 и L2 различны. В некоторых вариантах осуществления, например, когда существует слабая селективность между спиртами диола формулы (XV-la), более удобным является использование соединения формулы (XV-lb) для проникновения к таким соединениям, а не к диолу формулы (XV-la).
Для получения защищенного сложного эфира (XVIII) 3_ сульфанилгидроксильную группу соединения формулы (XV-lb) ацилируют соединением формулы (VI) в условиях способствующих этерификации, а затем защитную группу Р10 удаляют с получением спирта формулы (XIX). Условия 10 удаления защитной группы зависят от используемой защитной группы. Например, можно использовать разбавленный HF для удаления силиловых защитных групп, таких как TBDMS, TBDPS и т.п. Спирт формулы (XIX) затем ацилируют соединением формулы (VI-1) в условиях способствующих этерификации с получением требуемого соединения формулы (IF-1).
Специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение очевидно, что гидроксильные группы, например, из соединений формулы (XV-la), (XV-lb) и (XIX), могут быть превращены в различные другие функциональные группы, такие как тиолы и амины, для проникновения соединений формулы (I), 20 имеющих L1-Z1- и L2-Z2- группы, отличные от сложных эфиров.
Например, соединение формулы (XV-lb) можно использовать для получения тиоэфирных и амидных аналогов соединения формулы (IF-1), как показано ниже в Схеме А5. Для получения амидного аналога (IF-3) гидроксильная 25 группа в соединении формулы (XV-lb) сначала превращается в азид и затем восстанавливается до соответствующего амина. Реакцию проводят в
модифицированных условиях реакции Мицунобу (например, L. Rokhum и др., J. Chem. Sci, 2012, 124, 687-691) с использованием РРпз, Ъ, имидазола и Na№ с получением азида, а затем РРпз для восстановления амина из азида. Кроме того, азид получают сначала превращением гидроксильной группы в подходящую 5 уходящую группу, например тозильную или мезильную группу, а затем обработкой NaN3.
Ацилирование амина соединением формулы (VI) дает амид формулы (XVIII-2). Реакцию ацилирования осуществляют реакцией карбоновой кислоты 10 формулы (VI) в присутствии основания, например DMAP, и активирующего агента, например DIC, в подходящем растворителе, например THF. Снятие защиты защитной группы Р10 и этерификация полученного спирта (XIX-2) дает соединение формулы (IF-3).
15 Схема А5. Получение тиоэфиров и амидов с помощью соединения
формулы (XV-lb).
Тиоэфирный аналог (IF-2) сначала получают осуществлением реакции соединения формулы (XV-lb) в условиях реакции Мицунобу (например, РРпз, диэтилазодикарбоксилат (DEAD)) и улавливанием требуемой тиокислоты формулы (VI-2), например тиопальмитовой кислоты, с получением соединения формулы 5 (XVIII-1) (см., напр., О. Schulze и др., Carbohydrate Res., 2004, 339, 1787-1802). Снятие защиты защитной группы Р10 и этерификация полученного спирта (XIX-1) дает соединение формулы (IF-2).
Тиоэфир и амидные аналоги бисэфира (IF-1) также получают из 10 соединения формулы (XIX), как показано в Схеме А6. Соединение формулы (XIX) превращают в соединение формулы (IF-4) способами, аналогичными описанными выше для превращения формулы соединения (XV-lb) в соединение формулы (XVIII-1).
15 Подобным образом соединение формулы (XIX) превращают в соединение
формулы (IF-5) способами, аналогичными описанными выше для превращения формулы соединения (XV-lb) в соединение формулы (XVIII-2).
Схема А6. Получение тиоэфиров и амидов с помощью соединения 20 формулы (XIX).
Другие аналоги бисэфира (IF-1) получают заменой соединения формулы 25 (XIX) в Схеме А6 на соединение формулы (XIX-1) или (XIX-2), а затем следованием описанным синтетическим последовательностям.
Многочисленные другие соединения формулы (IF) получают аналогичными способами, что очевидно специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение.
Соединения формулы (VI), (VI-1), (VI-2) и (VI-3) имеются в продаже или получают из имеющихся в продаже прекурсоров с использованием стандартных методов синтетической химии.
Соединения формулы (I) также получают способом, включающим конъюгацию аминокислотного партнера по конъюгации и ацеталя, как показано в Схеме В1.
Схема В1. Получение соединений формулы (I) с помощью ацеталя (XXI).
Настоящее изобретение предлагает способ получения соединения формулы (XX), включающий реакцию аминокислотного партнера по конъюгации формулы (III) и ацеталя формулы (XXI), где LG представляет собой подходящую уходящую группу в условиях, способствующих получению соединения формулы (I). В ходе реакции, тиол соединения формулы (III) вытесняет уходящую группу (LG) в ацетале формулы (XXI). Уходящая группа включает, не ограничиваясь, галоген (например, хлора, брома или йода) или сульфонат (например, тозилат или мезилат). Для специалистов в отрасли техники, к которой относится данное изобретение очевидны и другие подходящие уходящие группы.
Размер ацетального кольца в соединении формулы (XXI) может изменяться. Ацетальное кольцо может содержать от 5 до 7 кольцевых атомов (т.е. может быть 5-7-членным циклическим ацеталем). В некоторых вариантах осуществления, циклический ацеталь представляет собой 6-членный циклический ацеталь. Следует понимать,что если циклический ацеталь представляет собой 5-членный циклический ацеталь, то для получения соединение формулы (I), w равно, по меньшей мере, 2 (чтобы сумма m, v и w составляла не менее 3).
Аминокислотный партнер по конъюгации, вступающий в реакцию с ацеталем, может состоять из аминокислоты, например защищенного Na-амина и/или защищенного С-концевого цистеина. Кроме того, аминокислотный партнер по конъюгации, может содержать пептид, например короткий пептид. В таких вариантах 5 осуществления, аминокислотный партнер по конъюгации, может содержать около 15 аминокислотных остатков или менее, например 5, 4 или 3 аминокислотных остатка. Na-аминогруппа аминокислотного партнера по конъюгации, предпочтительно защищена или иным образом замещена (т.е. не находится в форме свободной аминогруппы -Nhh) для предотвращения вступления в реакцию во время реакции 10 конъюгации. С-конец аминокислотного партнера по конъюгации также может быть защищен.
Реакцию конъюгации можно проводить в присутствии основания. Например, реакцию проводят в присутствии органического амина в подходящем растворителе, например DMF, при температуре около 50°С. Подходящие 15 органические амины включают, не ограничиваясь, триэтиламин, N-метилморфолин, коллидин и тому подобное.
Соединение формулы (XXI) может быть представлено в стереоизомерно чистой форме или в виде стереоизомерно обогащенной смеси путем осуществления реакции стереоизомерно чистой или стереоизомерно обогащенной смеси соединения 20 с соединением формулы (XXII). Предпочтительно использовать имеющиеся в продаже стереоизомерно чистые соединения формулы (XXII), такие как (4R)- или (4S)- (2,2-диметил-1,3-диоксан-4-ил-метанол).
Другие соединения формулы (XXII) получают обычными способами, известными в отрасли техники, к которой относится данное изобретение. Как
25 показано в Схеме В1-1, соединение формулы (ХХП-В), где Рд представляет собой подходящую защитную гидроксильную группу, способно вступать в реакцию с соединением формулы (XXII-C1) с получением ацеталя формулы (XXII-D), который затем превращается в соединение формулы (XXII) путем удаления защитной группы Рд. Кроме того, соединение формулы (ХХП-В) способно вступать в реакцию с
30 ациклическим ацеталем формулы (XXII-C2), где каждое из Ro и Rp независимо представляет собой С1-4 алкил. Реакцию ацетилирования осуществляют в подходящем растворителе, таком как дихлорметан с использованием кислоты, например, камфорсульфоновой кислоты.
Условия удаления защитной группы Рд зависят от используемой защитной 35 группы. Например, силилэфирная защитная группа, такая как TBDMS, удаляется обработкой источником фтора, таким как фторидтетрабутиламмоний (TBAF), в
подходящем растворителе, таком как THF. См., например, С. R. Reddy и др. (Tetrahedron Letters, 2010, 51 (44) 5840-5842); и Sauret-Cladiere и др. (Tetrahedron Asymmetry, 1997, 8 (3), 417-423).
Обращаясь снова к Схеме В1, соединения формулы (XXI) получают из соединений формулы (XXII) реакцией с подходящим прекурсором уходящей группы. Например, тозилатные или мезилатные уходящие группы получают реакцией с 10 тозилхлоридом или мезилхлоридом в присутствии основания и подходящего растворителя, а йодоуходящую группу получают реакцией с PPhi3 и h.
Соединение формулы (XX) может быть впоследствии превращено на одной или более стадиях синтеза в соединение формулы (I), например соединение формулы (IA).
15 Одна или более стадий синтеза могут включать удаление ацеталя с
получением диола формулы (XXIII-1). Гидроксильная группа, связанная с углеродом, к которому присоединены R1 и R2 в соединении формулы (XXIII-1), может быть превращена в L1-Z1-; и/или гидроксильная группа, связанная с углеродом, к которому присоединены Rx и Ry, может быть превращена в L2-Z2.
20 Например, как показано в Схеме В2, ацеталь в соединении формулы (XX)
удаляется с получением диола формулы (XXIII-1) в результате обработки кислотой, такой как р-толуолсульфоновая кислота, в растворителе, таком как дихлорметан. Диол формулы (XXIII-1) может быть превращен в бисэфирное соединение формулы (IA) в результате одной или более стадий ацилирования, способом аналогичным
25 превращению соединения формулы (XV-la) в соединение формулы (IF-1).
Схема В2. Получение бисэфирных конъюгатов формулы (IA).
Кроме того, в различных вариантах осуществления, где Rm, необязательно, замещен арилом, например фенилом или метоксизамещенным фенилом, одна или более стадий синтеза включает удаление ацеталя с получением 5 соединения формулы (XXIII-2) или (ХХШ-З). Одна или более стадий могут включать: превращение гидроксильной группы, связанной с атомом углерода, к которому присоединены Rx и Ry в соединении формулы (XXIII-2), в L2-Z2-; удаление группы RmRnCH- с получением гидроксильной группы и превращение гидроксильной группы в L1-Z1; или превращение гидроксильной группы, связанной с углеродом, к 10 которому присоединены Rx и Ry в соединении формулы (XXIII-2), в L1-Z1-; удаление группы RmRnCH- с получением гидроксильной группы и превращение гидроксильной группы в L2-Z2-. Данные способы допускают введение различных групп L1-Z1 и L2-Z2.
Как показано в Схеме ВЗ, ацеталь в соединении формулы (XX) можно 15 удалить, например, обработкой подходящим восстанавливающим агентом, например диизобутилалюминийгидридом (DIBAL). Полученное соединение формулы (XXIII-2) затем ацилируется соединением формулы (VI) для введения требуемой 1_2-С(0)0-группы. Удаление группы RmRnCH- для получения соединения формулы (XXV-2) осуществляется гидрогенолизом (напр., для бензильной или р-метоксибензильной 20 группы) или любым другим подходящим способом с учетом природы RmRnCH-группы. Затем соединение формулы (XXV-2) превращают в соединение формулы (IA) путем ацилирования соединением формулы (IV-1). Стадии ацилирования осуществляются описанным здесь способом в отношении получения соединения формулы (IF-1).
25 Схема ВЗ. Получение бисэфирных конъюгатов с помощью соединения
формулы (XXIII-2).
Специалистам в данной области техники очевидно, что соединения формулы (IA) можно получать из соединений формулы (ХХШ-З) заменой соединений формул (XXIII-2), (VI) и (VI-1) в Схеме ВЗ на соединения формул (ХХШ-З), (VI-1) и 5 (VI) соответственно, а затем следованием описанным синтетическим последовательностям.
Гидроксильные группы, полученные при удалении ацетальной или RmRnCH-группы, такие как соединения формулы (XXIII-1), (XXIII-2), (ХХШ-З) и (XXV-2), можно превращать в различные другие функциональные группы, например, 10 тиолы и амины, для проникновения соединений формулы (I), имеющих Z1 и Z2 группы.
Следует понимать, что амидные и тиоэфирные аналоги бисэфирного соединения формулы (IA) можно получать способами, аналогичными 15 вышеописанным в отношении амидных и тиоэфирных аналогов бисэфирного соединения формулы (IF-1).
Настоящее изобретение также предлагает способ получения соединений формулы (I) посредством тиол-ен реакции. Способ включает осуществление реакции 20 первого липидсодержащего партнера по конъюгации, включающего двойную углерод-углеродную связь, второго липидсодержащего партнера по конъюгации, включающего двойную углерод-углеродную связь, и аминокислотного партнера по
конъюгации, содержащего тиол, в условиях, способствующих конъюгации первого и второго липидсодержащих партнеров по конъюгации с аминокислотным партнером по конъюгации. Каждый липидсодержащий партнер по конъюгации, включает и, следовательно, в ходе реакции обеспечивает получение соединением формулы (I) 5 липидного фрагмента, где один содержит L1, а другой содержит L2.
Тиол-ен реакция включает добавление тиола через неароматическую двойную углерод-углеродную связь (т.е. гидротиолирование двойной углерод-углеродной связи). Реакция протекает при посредстве механизма свободных радикалов. В реакции имеют место три выраженные фазы: инициирование, 10 сопряжение и терминация.
Как правило, образование радикалов приводит к получению электрофильного тиильного радикала, который распространяется в пределах ен-группы алкена, образуя радикал с углеродом по центру, а передача цепи из дополнительной молекулы тиола подавляет радикал на углероде с получением 15 конечного продукта.
Не вдаваясь в теорию, изобретатели считают, что в способе по настоящему изобретению тиол конъюгирует с атомом углерода двойной углерод-углеродной связи первого липидсодержащего партнера по конъюгации, с образованием углеродного радикального центра, а данный углеродный радикальный 20 центр вместо подавления, затем конъюгируют с атомом углерода двойной углерод-углеродной связи второго липидсодержащего партнера по конъюгации с получением соединения формулы (I).
Способ, таким образом, касается аминокислотных и пептидных конъюгатов формулы (I), в котором атом серы из тиола конъюгирует с атомом 25 углерода из двойной углерод-углеродной связи первого липидсодержащего партнера по конъюгации, а атом углерода из двойной углерод-углеродной связи первого липидсодержащего партнера по конъюгации конъюгирует с атомом углерода из двойной углерод-углеродной связи второго липидсодержащего партнера по конъюгации.
30 Первый и второй липидсодержащие партнеры конъюгации могут быть
одинаковы или отличны друг от друга. Специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение очевидно, что одновременное осуществление реакции липидсодержащих партнеров по конъюгации способно дать смесь (потенциально до четырех различных) соединений формулы (I). Соответственно, в некоторых
35 вариантах осуществления, первый и второй липидсодержащие партнеры конъюгации одинаковы.
Тиол ен-реакция может представлять собой региоселективную реакцию, по отношению к которой атом углерода двойной углерод-углеродной связи первого липидсодержащего партнера по конъюгации конъюгирован с тиолом, а также по отношению к которой атом углерода двойной углерод-углеродной связи второго 5 липидсодержащего партнера по конъюгации конъюгирован с атомом углерода двойной углерод-углеродной связи первого липидсодержащего партнера по конъюгации. Специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение очевидно, что в ходе реакции могут образовываться различные региоизомеры.
10 В некоторых вариантах осуществления, способ включает осуществление
реакции первого липидсодержащего партнера по конъюгации формулы (ПА) и второго липидсодержащего партнера по конъюгации формулы (ПВ) с тиолсодержащим аминокислотным партнером по конъюгации (III) в условиях способствующих получению соединения формулы (IB) (Схема С1).
15 Схема С1. Получение соединений формулы (IB) с помощью тиол ен-
реакции.
Условия, способствующие образованию соединения формулы (IB) могут 20 изменяться. В различных вариантах осуществления условия, способствующие образованию соединения формулы (IB), включают реакцию с тиолом стехиометрически избыточного липидсодержащего партнера для конъюгации где, например, стехиометрическое соотношение липидсодержащих партнеров по конъюгации (ПА) и (ПВ) (объединенных) с аминокислотным партнером по
конъюгации составляет, по меньшей мере, 7:1, например, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1 или 70:1.
Глубина превращения аминокислотного партнера по конъюгации в соединении формулы (IB) может меняться. Предпочтительным является 5 превращение, по меньшей мере, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 или 70% аминокислотного партнера по конъюгации в соединение формулы (IB). Глубина превращения определяется методом ВЭЖХ.
Как отмечено выше, не вдаваясь в теорию, изобретатели считают, что при таких условиях реакция алкена формулы (IA) с тиолом формулы (III) приводит к 10 образованию углерода формулы (X), с радикалом по центру, который улавливается вторым алкеном формулы (ПВ), а не подавляется отщеплением протона из тиола другой молекулы формулы (III), чтобы получить требуемый аминокислотный или пептидный конъюгат.
В ходе реакции получают смесь стереоизомеров, поскольку невозможно 15 контролировать или влиять на стереохимию образования связи между атомом углерода, с которым связан R3, и атомом углерода, с которым связаны Rb и Rc, вследствие образующегося промежуточного радикала. В ходе реакции обычно получают смесь эпимеров относительно атома углерода, с которым связан R3.
В некоторых вариантах осуществления, Z1 и Z2 в липидсодержащих 20 партнерах по конъюгации представляют собой -С(0)0-, а соединение формулы (I), образованное способом тиол ен-реакции, представляет собой соединение формулы
(IC) , как определено здесь.
В примерных вариантах осуществления, способ тиол ен-реакции по настоящему изобретению включает осуществление реакции аминокислотного 25 партнера по конъюгации, включающего структуру формулы (III) с липидсодержащими партнерами по конъюгации формулы (ПА) и (ПВ), которые представляют собой сложные виниловые эфиры, с получением соединения формулы
(ID) . Реакцию проводят, например, в соответствии с нижеописанными Примерами,
путем облучения реакционной смеси, включающей: аминокислотного партнера по
30 конъюгации; липидсодержащие партнеры по конъюгации; фотохимический инициатор, например DMPA. Допускается включение одной или более добавок, которые уменьшают образование продуктов, таких как стерически затрудненный тиол (например, трет-бутилмеркаптан), кислота (например, TFA) или органосилан (например, триизопропилсилан) или комбинацию любых двух или более из них.
35 Реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в подходящем
растворителе, например NMP, в течение требуемого периода времени, например 30 минут.
Реакцию обычно инициируют посредством образования одного или более свободных радикалов в реакционной смеси. Один или более свободных радикалов 5 получают любым способом, известным в отрасли техники, к которой относится данное изобретение. Свободные радикалы генерируют термическим и/или фотохимическим способом. Один или более инициаторов свободных радикалов могут использоваться для инициирования образования свободных радикалов. Подходящие свободнорадикальные инициаторы включают термические инициаторы и 10 фотоинициаторы.
Свободные радикалы генерируются термическими инициаторами в результате нагревания. Скорость разложения термического инициатора и образование свободных радикалов зависит от инициатора и температуры нагрева инициатора. Более высокие температуры обычно приводят к более быстрому 15 разложению. Специалист в данной области техники способен подобрать подходящую температуру для нагревания инициатора без ненужного экспериментирования.
В продаже имеются многочисленные термические инициаторы. Примерами
термических инициаторов являются, не ограничиваясь, трет-амилпероксибензоат,
1,Г-азобисциклогексанкарбонитрил, 2,2'-азобисизобутиронитрил (AIBN),
20 бензоилпероксид, трет-бутилгидропероксид, трет-бутилперсацетат, трет-бутил пероксид, трет-бутилпероксибензоат, трет-бутилпероксиизопроп ил карбонат, лауроилпероксид, перуксусная кислота и персульфат калия.
Свободные радикалы получают из фотоинициаторов в результате облучения светом. Частота света, необходимая для стимулирования разложения 25 фотоинициаторов и образования свободных радикалов, зависит от инициатора. Многие фотоинициаторы инициируются ультрафиолетом.
Свет конкретной длины волны или диапазона длины волны может использоваться для избирательного облучения инициатора, где липидсодержащие партнеры по конъюгации или аминокислотный партнер по конъюгации, например, 30 пептидсодержащий партнер по конъюгации, содержат фоточувствительные группы. В некоторых вариантах осуществления, используется длина волны (частота) излучения около 365 нм. Свет данной частоты обычно совместим с боковыми цепями, встречающихся в природе аминокислот.
В продаже имеется разнообразный ассортимент фотоинициаторов. 35 Примерами фотоинициаторов являются, не ограничиваясь, ацетофенон, анизоин,
антрахинон, антрахинон-2-сульфоновая кислота, бензил, бензоин,
бензойноэтиловый эфир, бензойноизобутиловый эфир, бензойнометиловый эфир,
бензофенон, 3,3',4,4'- бензофенонтетракарбоновыйдиангидрид, 4-бензоилбифенил,
2-бензил-2-ди метила мино-4'-морфол и нобутирофенон, 4'-
5 бисдиэтиламинобензофенон, 4,4'-бисдиметиламинобензофенон, камфорхинон, 2-
хлортиоксантен-9-он, дибензосуберенон, 2,2-диэтоксиацетофенон, 4,4'-
дигидроксибензофенон, 2,2-диметокси-2-фенилацетофенон (DMPA), 4-
диметиламинобензофенон, 4,4'-диметилбензил, 2,5-диметилбензофенон, 3,4-
диметилбензофенон, 4'-этоксиацетофенон, 2-этилантрахинон, 3'-
10 гидроксиацетофенон, 4'-гидроксиацетофенон, 3-гидроксибензофенон, 4-
гидроксибензофенон, 1-гидроксициклогексилфенилкетон, 2-гидрокси-2-
метилпропиофенон, 2-метилбензофенон, 3-метилбензофенон, метибензоилформиат,
2-метил-4'-метилтио-2-морфолинопропиофенон, фенантренхинон, 4'-
феноксиацетофенон и тиоксантен-9-он.
15 Специалист в данной области техники способен выбрать подходящие
свободнорадикальные инициаторы для использования в данном способе с учетом природы, например, липидсодержащих партнеров по конъюгации, аминокислотного партнера по конъюгации, пептидсодержащего партнера по конъюгации и любых других компонентов, присутствующих в реакционной смеси. В некоторых вариантах
20 осуществления, инициатор присутствует в реакции в стехиометрическом отношении относительно исходного материала, содержащего тиол, составляющем примерно от 20:1 до 0,05:1, примерно от 10:1 до 0,05:1, примерно от 5:1 до 0,05:1, примерно от 3:1 до 0,5:1.
Липидсодержащие партнеры по конъюгации и аминокислотный партнер по 25 конъюгации, например, пептидсодержащий партнер по конъюгации, получают с использованием известных методов синтетической химии (например, методов описанных авторами Louis F Fierer и Магу F, в работе "Reagents for Organic Synthesis* т. 1-19, Wiley, New York (1967-1999) или в книге "Beilsteins Handbuch der organischen Chemie", 4-e Ed. Springer-Verlag Berlin, включая дополнения (также 30 доступные через онлайн-базу данных Beilstein) или имеющиеся в продаже для некоторых вариантов осуществления.
Например, соединения формулы (ПА-1) липидсодержащих партнеров по конъюгации получают осуществлением реакции соединения формулы (VI), где X представляет собой ОН или подходящую уходящую группу, с соединением формулы 35 (VII), где Y представляет собой Н, металл или металлоид или ацил (например, алкилкарбонил) в условиях, способствующих этерификации (или трансэтерификации, где Y представляет собой ацильную группу) (Схема С2).
Способы этерификации (или трансэтерификации) хорошо известны в отрасли техники, к которой относится данное изобретение. Например, если X 5 представляет собой хлор, a Y представляет собой Н, то реакцию осуществляют в присутствии основания, например пиридина или триэтиламина, в подходящем растворителе. Хлорангидрид способен превращаться в реакционной смеси в более реакционноспособный вид (напр., в соответствующий йодид с использованием йодида натрия). Температура, при которой осуществляется реакция, зависит от 10 реакционной способности кислотных видов и используемого растворителя.
Например, сложные виниловые эфиры формулы (ПА-1) получают в результате трансэтерификации с винилацетатом (который получают в промышленном масштабе в результате реакции уксусной кислоты и ацетилена или уксусной кислоты и этилена с подходящим катализатором) с использованием 15 кислотного или металлического катализатора. См., например, ЕР0376075А2 и S. К. Кагтее, журнал института Oil Palm Res., 2012, 1518-1523.
Виниловые сложные эфиры формулы (ПА-1) также получают добавлением карбоновой кислоты к концевой ацетиленовой связи в присутствии катализатора (обычно комплекса палладия или рутения). См., например, V. Cadierno, J. Francos, J. 20 Gimeno Organometallics, 2011, 30, 852-862; S. Wei, J. Pedroni, A. Meissner, A. Lumbroso, H.-J. Drexler, D. Heller, B. Breit, Chem. Eur. J., 2013, 19, 12067-12076. Ацетилены без концевой связи также могут вступать в реакцию. См., например, N. Tsukada, A. Takahashi, Y. Inoue, Tetrahedron Lett., 2011, 52, 248-250 и M. Rotem, Y. Shvo, J. Organometallic Chem. 1993, 448, 159-204.
25 Другие примеры способов получения виниловых сложных эфиров
формулы (ПА-1) включают: реакцию дивинил ртути с ароматическими и алифатическими кислотами (см., например, D. J. Foster, Е. Tobler, J. Am. Chem. Soc. 1961, 83, 851]; Си (П)-катализированную этерификацию аренкарбоновых кислот с триметоксивинилсиланом в присутствии AgF (см., например, F. Luo, С. Pan, P. Qian, J.
30 Cheng, Synthesis 2010, 2005); реакцию переноса цепи винила из винилацетата к первичным и вторичным спиртам, а также к карбоксильным кислотам с каталитической системой, состоящей из 2 моль % [AuCI(PPhi3)] и 2 моль % АдОАс
(см., например, A. Nakamura, М. Tokunaga, Tetrahedron Lett. 2008, 49, 3729); и катализированную миграцию винильной группы из Ir-комплексов ([Ir (cod) CI] 2 / Р (ОМе) 3) (см., например, Н. Nakagawa, Y. Okimoto, S. Sakaguchi, Y. Ishii, Tetrahedron Lett. 2003, 44, 103).
5 Специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение
очевидны другие подходящие способы получения соединений формулы (П-А).
Соединения формулы (ПВ-1) липидсодержащего партнера по конъюгации получают аналогичным образом, где соединения формулы (ПА-1) и (ПВ-1) различны.
10 В продаже имеются многочисленные соединения формулы (VI). Другие
соединения получают из имеющихся в продаже прекурсоров с использованием стандартных методов синтетической химии. Например, соединения формулы (VI), где X представляет собой хлор, получают обработкой тионилхлоридом соответствующей карбоновой кислоты в подходящем растворителе или смеси растворителей.
15 Аналогично, соединения формулы (VII) также имеются в продаже или
получают из имеющихся в продаже прекурсоров с использованием стандартных методов синтетической химии.
Порядок введения в реакционный сосуд липидсодержащих партнеров по конъюгации и аминокислотного партнера по конъюгации, например, 20 пептидсодержащего партнера по конъюгации и любых других компонентов, присутствующих в реакционной смеси, может меняться. Реакцию можно осуществлять в виде однореакторой процедуры.
В реакции может меняться соотношение липидсодержащих партнеров конъюгации к аминокислотному партнеру по конъюгации, например 25 пептидсодержащему партнеру по конъюгации. В некоторых вариантах осуществления, объединенное мольное соотношение первого липидсодержащего партнера по конъюгации и второго липидсодержащего партнера по конъюгации (т.е. общее) с аминокислотным партнером по конъюгации, составляет, по меньшей мере, 7:1, например, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1 или 70:1.
30 Реакцию можно осуществлять при любой подходящей температуре. В
некоторых вариантах осуществления, реакцию осуществляют при температуре примерно от -25°С до 200°С, примерно от -10°С до 150°С, примерно от 0°С до 125°С, примерно от комнатной температуры до 100°С. В некоторых вариантах
осуществления, реакцию осуществляют при температуре менее чем 200°С, менее чем 175°С, менее чем 150°С, менее чем 125°С или менее чем 100°С.
В некоторых вариантах осуществления, реакция осуществляют при температуре выше температуры окружающей среды. В одном варианте 5 осуществления, реакцию осуществляют при температуре, составляющей от 40 до 200°С, от 50 до 150°С, от 60 до 100°С, от 65 до 90°С или от 70 до 80°С. В некоторых вариантах осуществления, реакцию осуществляют при температуре выше чем 40°С, выше чем 50°С, выше чем 75°С, выше чем 100°С или выше чем 150°С.
Температура реакции может зависеть от образования свободных 10 радикалов в ходе реакции. Для контроля скорости реакции подбирается соответствующая температура. В ходе реакции температуру можно регулировать для контроля скорости реакции.
Если свободные радикалы генерируются термически (напр., с использованием термического инициатора), то реакцию обычно осуществляют при 15 температуре выше температуры окружающей среды. Температура будет зависеть от реакционной способности видов, из которых образуются свободные радикалы.
Если свободные радикалы генерируются фотохимически, то реакция осуществляется преимущественно при температуре окружающей среды. В некоторых вариантах осуществления, представляется желательным охлаждение реакционной 20 смеси для замедления скорости реакции или, наоборот, нагревания реакционной смеси для увеличения скорости реакции.
Специалист в данной области техники способен подобрать подходящие температуры для осуществления способа с учетом реакционной способности исходных материалов и других присутствующих реагентов.
25 Температуру, при которой осуществляют реакцию, можно регулировать
путем нагревания или охлаждения реакционной смеси подходящим способом, известным в отрасли техники, к которой относится данное изобретение. Реакционную смесь можно подогреть, например, теплообменником, находящимся внутри реакционного сосуда, обогреванием при подаче теплоносителя в рубашку,
30 окружающую реакционный сосуд, или погружением реакционного сосуда в нагретую жидкость (напр., масляную или песчаную баню). В некоторых примерах осуществления, реакционную смесь нагревают микроволновым излучением.
Прогресс реакции контролируется любыми подходящими средствами, например, способом тонкослойной хроматографии (ТСХ) или способом
высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Реакция продолжается до полного завершения, что контролируется поглощением, по меньшей мере, одного из исходных материалов. В некоторых вариантах осуществления, реакция продолжается от 1 минуты до 7 дней, от 5 минут до 72 часов, от 10 минут до 48 часов, от 10 минут до 24 часов. В других вариантах осуществления реакция продолжается менее чем 72 часа, менее чем 48 часов, менее чем 24 часа, менее чем 12 часов, менее чем 6 часов, менее чем 4 часа, менее чем 2 часа, или менее чем 1 час.
В некоторых вариантах осуществления, реакцию проводят до поглощения, по меньшей мере, около 50%, по меньшей мере, около 60%, по меньшей мере, около 70%, по меньшей мере, около 75%, по меньшей мере, около 80%, по меньшей мере, около 85%, по меньшей мере, около 90 %, по меньшей мере, около 95%, по меньшей мере, около 97%, по меньшей мере, около 99% аминокислотного партнера по конъюгации. Поглощение исходных материалов контролируется любым подходящим способом, например ВЭЖХ.
Реакционную смесь смешивают любым подходящим способом, известным в отрасли техники, к которой относится данное изобретение, например, с помощью магнитной или механической мешалки. Используемый метод зависит от масштаба реакции.
Реакцию обычно осуществляют в жидкой реакционной среде. Жидкая реакционная среда может содержать растворитель. Примерами подходящих растворителей являются: N-метилпирролидон (NMP), диметилформамид, дихлорметан, 1,2-дихлорэтан, хлороформ, четыреххлористый углерод, вода, метанол, этанол, диметилсульфоксид, трифторуксусная кислота, уксусная кислота, ацетонитрил и их смеси.
Растворитель выбирают исходя из растворимости исходных материалов и других присутствующих реагентов, например, инициатора свободных радикалов. В некоторых вариантах осуществления, липидсодержащие партнеры по конъюгации являются гидрофобными. Гидрофобность или гидрофильность аминокислотного партнера по конъюгации меняется в зависимости, например, от аминокислотной последовательности пептида пептидсодержащего партнера по конъюгации. Присутствие солюбилизирующей группы в пептидсодержащем партнере по конъюгации, может повысить растворимость в полярных растворителях, например воде. Специалист в данной области техники способен подобрать подходящий растворитель без ненужного экспериментирования.
Реакцию можно осуществлять по существу без присутствия кислорода. Кислород способен подавлять свободные радикалы, образовавшиеся в ходе реакции. Реакционную смесь можно дегазировать инертным газом (например, азотом или аргоном), который по существу не содержит кислорода, для удаления любого 5 растворенного кислорода до образования свободных радикалов. Кроме того, отдельные компоненты реакционной смеси могут быть дегазированы инертным газом, который по существу не содержит кислорода, до их объединения в реакционном сосуде. Реакцию можно осуществлять в атмосфере инертного газа, который по существу не содержит кислорода.
10 Способ по настоящему изобретению можно осуществлять при давлении
окружающей среды.
Добавка, подавляющая образование нежелательных побочных продуктов и/или увеличивающая выход или глубину превращения в требуемый продукт, может включаться в реакционную смесь тиол-ен реакции по настоящему изобретению. 15 Одна или более добавок могут представлять собой посторонний тиол, кислоту, органосилан или комбинацию любых двух или более из них.
Авторы изобретения обнаружили, что в некоторых вариантах осуществления включение постороннего или экзогенного тиола в качестве добавки в реакционную смесь снижает образование нежелательных продуктов. В некоторых 20 вариантах осуществления посторонний тиол способен повысить эффективность или глубину превращения требуемой тиол-ен реакции. Примерами подходящих посторонних тиолов являются, не ограничиваясь, восстановленный глутатион, DODT, DTT, белок, стерически затрудненные тиолы и тому подобное.
В некоторых вариантах осуществления, посторонний тиол представляет
25 собой DTT.
В других вариантах осуществления, посторонний тиол представляет собой стерически затрудненный тиол. Неограничивающими примерами подходящего стерически затрудненного постороннего тиола являются трет-бутилмеркаптан и 1-метилпропилмеркаптан.
30 Не вдаваясь в теорию изобретатели считают, что в некоторых вариантах
осуществления посторонний тиол, например трет-бутилмеркаптан, способен образовать протон для подавления промежуточного радикала, образованного при воспроизведении радикала формулы (X) алкеном формулы (ПВ) с получением требуемого соединения формулы (IB), а полученный тиильный радикал способен
воспроизводить реакцию путем образования другого моля тиильного радикала из аминокислотного партнера по конъюгации формулы (III).
Очевидно, что в определенных вариантах осуществления, посторонние тиолы способны преждевременно подавлять реакцию путем образования протона 5 радикала формулы (X). В таких вариантах осуществления, посторонний тиол и объемная доля, в которой он используется, выбираются таким образом, чтобы оптимизировался выход или глубину превращения в (определено способом ВЭЖХ), соединение формулы (IB).
В различных вариантах осуществления, посторонний тиол присутствует в 10 реакции в стехиометрическом отношении относительно аминокислотного партнера по конъюгации, составляющем примерно от 200:1 до примерно 0,05:1, от 100:1 до 0,05:1, от 80:1 до 0,05:1, от 60:1 до 0,05:1, от 40:1 до 0,05:1, от 20:1 до примерно 0,05:1, от 10:1 до примерно 0,5:1, от 5:1 до примерно 1:1 или от 3:1 до примерно 1:1. В некоторых вариантах осуществления, стерически затрудненный тиол, 15 например t-BuSH, присутствует в реакции в стехиометрическом отношении относительно аминокислотного партнера по конъюгации, составляющем от примерно 100:1 до 0,05:1, например, примерно 80:1, примерно 40:1 или примерно 3:1.
В некоторых вариантах осуществления, включение кислоты также способно уменьшить образование нежелательных побочных продуктов. Кислота
20 может представлять собой сильную неорганическую кислоту, например HCI, или органическую кислоту, например TFA. В некоторых вариантах осуществления, добавка представляет собой TFA. Не вдаваясь в теорию, изобретатели считают, что снижение рН реакционной смеси способно привести к протонированию богатых электронами остатков боковых цепей, например лизина и т.д., которые в противном
25 случае могли бы участвовать в переносах одного электрона и образовывать радикальные виды в ходе реакции. В различных вариантах осуществления, реакционная смесь содержит от примерно 0,01 до 25, от 0,01 до 15, от 0,01 до 10 или от 1 до 10% об/об кислотной добавки. В некоторых вариантах осуществления, реакционная смесь содержит от 1 до 10% об/об TFA, например 5% об/об TFA.
30 Авторы изобретения обнаружили, что в некоторых вариантах
осуществления, использующих трет-бутилмеркаптан и TFA в качестве добавок в реакционную смесь, можно уменьшить образование нежелательных продуктов и увеличить глубину превращения исходного материала в требуемый продукт. Соответственно, в некоторых примерах осуществления, реакционная смесь включает
35 комбинацию кислоты и экзогенного тиола, например комбинацию сильной
органической кислоты и стерически затрудненного тиола, например комбинацию TFA и трет-бутилмеркаптана.
В качестве добавки в тиол-ен реакцию также может использоваться органосилан. Органосиланы представляют собой восстанавливающие агенты на основе радикалов, активность которых может модулироваться путем изменения заместителей на атоме кремния. В различных вариантах осуществления, органосилан представляет собой соединение формулы (Rq)3SiH, где Rq в каждом конкретном случае независимо представляет собой водород или органическую группу, например алкил или арил, при условии, что, по меньшей мере, один Rq не является водородом. Примерами органосиланов являются, не ограничиваясь, триэтилсилан (TES), трифенилсилан, дифенилсилан, триизопропилсилан (TIPS) и тому подобное. В различных вариантах осуществления, органосилан представляет собой триалкилсилан, например TIPS или TES.
Не вдаваясь в теорию, изобретатели считают, что, как и в случае с посторонним тиолом, в некоторых вариантах осуществления органосилан, например TIPS, способен действовать как донор водорода для получения требуемого соединения формулы (IB) и способствовать воспроизведению реакции.
В различных вариантах осуществления, органосилан присутствует в реакции в стехиометрическом отношении относительно аминокислотного партнера по конъюгации, составляющем примерно от 200:1 до примерно 0,05:1, от 100:1 до 0,05:1, от 80:1 до 0,05:1, от 60:1 до 0,05:1, от 40:1 до 0,05:1, от 20:1 до 0,05:1, от 10:1 до 0,5:1, от 5:1 до примерно 1:1 или от 3:1 до примерно 1:1. В некоторых вариантах осуществления, триалкилсилан, например TIPS, присутствует в реакции в стехиометрическом отношении относительно аминокислотного партнера по конъюгации, составляющем от примерно 100:1 до 0,05:1, например, примерно 80:1 или примерно 40:1.
Органосилан может использоваться в качестве добавки в сочетании с посторонним тиолом. Кроме того, органосилан может использоваться взамен постороннего тиола. Также допускается присутствие кислоты, например TFA. Авторы изобретения обнаружили, что в некоторых вариантах осуществления, использование в ходе реакции TIPS вместе с TFA, но без какого-либо постороннего тиола, способно обеспечить более высокую глубину превращения в требуемое соединение формулы (IB), чем при использовании комбинации TIPS, t-BuSH и TFA.
Добавка обычно используется в количестве, достаточном для минимизации образования нежелательных продуктов, без неблагоприятного
воздействия на ход реакции или на любые, необязательные, последующие стадии способа.
Продукты, образующиеся в ходе реакции и превращенные в требуемый продукт, определяются, например, способом ВЭЖХ.
Концентрация в реакционной смеси липидсодержащих партнеров по конъюгации и аминокислотного партнера по конъюгации, например, пептидсодержащего партнера по конъюгации, способна, соответственно, влиять на ход реакции. Специалисты в отрасли техники, к которой относится данное изобретение, способны менять концентрацию липидсодержащих партнеров по конъюгации и пептидсодержащего партнера по конъюгации в реакционной смеси, например, для оптимизации выхода и чистоты без ненужного экспериментирования.
В некоторых вариантах осуществления, тиолсодержащий исходный материал присутствует в концентрации, составляющей от примерно 0,05 мМ до примерно 1 М, от примерно 0,5 мМ до примерно 1 М, от примерно 1 мМ до примерно 1 М. В некоторых вариантах осуществления, концентрация составляет, по меньшей мере, примерно 0,05 мМ, 0,5 мМ или 1 мМ.
В некоторых вариантах осуществления, концентрация исходных материалов, содержащих алкены, составляет, по меньшей мере, примерно 0,05 мМ, 0,5 мМ или 1 мМ.
В некоторых вариантах осуществления, аминокислотный конъюгат или пептидный конъюгат отделяют от реакционной среды после реакции и, необязательно, очищают. Конъюгат отделяют от реакционной среды любым подходящим способом, известным в отрасли техники, к которой относится данное изобретение, например, путем осаждения.
В некоторых вариантах осуществления, аминокислотный или пептидный конъюгат очищают после отделения его от реакционной среды. Например, конъюгат очищают с использованием ВЭЖХ и одного или более подходящих растворителей.
Настоящее изобретение также предлагает способ получения пептидного конъюгата, способ включающий:
получение аминокислотного или пептидного конъюгата формулы (I) по изобретению или его соли или сольвата, и
сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата или аминокислоты пептидного конъюгата с аминокислотой или аминокислотой пептида и получение пептидного конъюгата.
Полученный пептидный конъюгат и/или пептидсодержащий партнер по конъюгации, и/или пептиды, сопряженные способами по настоящему изобретению, могут содержать синтетический пептид. Синтетические пептиды получают способом твердофазного пептидного синтеза (SPPS).
Основным принципом твердофазного пептидного синтеза (SPPS) является ступенчатое добавление аминокислот к наращиваемой полипептидной цепи, прикрепленной посредством молекулы линкера к твердофазному носителю, обычно частице смолы, которая позволяет осуществлять отщепление и очищение после завершения наращивания полипептидной цепи. Вкратце, твердофазный носитель смолы и исходная аминокислота сопрягаются друг с другом с помощью молекулы линкера. Такие матрицы смола-линкер-кислота имеются в продаже.
Аминокислота, подлежащая сопряжению со смолой, защищена на своем Na-конце химической защитной группой.
Аминокислота может также иметь защитную группу боковой цепи. Данные защитные группы предотвращают нежелательные или вредные реакции в процессе формирования новой пептидной связи между подлежащей сопряжению карбоксильной группой аминокислоты и незащищенной Na-аминогруппой пептидной цепи, присоединенной к смоле.
Подлежащую сопряжению аминокислоту подвергают реакции с незащищенной Na-аминогруппой N-концевой аминокислоты пептидной цепи, увеличивая длину пептидной цепи на одну аминокислоту. Подлежащая сопряжению карбоксильная группа аминокислоты активируется подходящим химическим активирующим агентом для стимулирования хода реакции с Na-аминогруппой пептидной цепи. При получении Na-защитную группу N-концевой аминокислоты пептидной цепи удаляют для сопряжения со следующим аминокислотным остатком. Этот метод состоит из множества повторяющихся стадий, позволяющих при возможности применять автоматизацию. Специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение очевидно, что пептиды способны сопрягаться с Na-аминогруппой, связанной с твердой фазой аминокислоты или пептидом, вместо отдельной аминокислоты, например, когда требуется конвергентный пептидный синтез.
По достижении требуемой последовательности аминокислот, пептид отщепляется от твердофазного носителя молекулы линкера.
SPPS может осуществляться методом непрерывного потока или методом дозированного потока. Непрерывный поток позволяет в реальном времени
контролировать спектрофотометром ход реакции, но имеет два отличительных недостатка: реагенты, контактирующие с пептидом на смоле, разбавляются, а масштаб ограничивается сильнее из-за физических ограничений размера твердофазной смолы. Метод дозированного потока осуществляют в реакционном сосуде с фильтрацией и он является более полезным, поскольку реагенты доступны и могут добавляться вручную или автоматически.
Для защиты N-альфа-аминоконца обычно используются два типа защитных групп: "Вое" (трет-бутилокси карбон ил) и "Fmoc" (9-флуоренилметилоксикарбонил). Реагенты для метода Вое относительно недороги, но сильно коррозионноактивны и требуют дорогостоящего оборудования и более строгих мер предосторожности. Обычно более предпочтительным является метод Fmoc, который использует менее коррозионноактивные, хотя и более дорогостоящие реагенты.
Для способа SPPS имеется широкий ассортимент твердофазных носителей. Используемый для синтеза твердофазный носитель представляет собой синтетическую смолу, синтетическую полимерную пленку или кремниевую или силикатную поверхность (например, стекло с контролируемым размером пор), подходящую для целей синтеза. Обычно используют смолу, полистирольные суспензии или полистирол-полиэтиленгликоль, или полимерные носители, например полиамид. Примерами смол, функционализированных линкерами, подходящими для метода Вое, является смола РАМ, оксимовая смола SS, фенольная смола, бромированную смола Ванга и бромированная смола РРОА. Примерами смол, подходящих для метода Fmoc, являются: аминометилполистирольные смолы, смола АМРВ-ВНА, амидная смола Sieber, амидная смола Ринка, смола Tentagel S АС, 2-хлортритилхлоридная смола, спиртовая 2-хлортритильную смола, смола TentaGel S Trt-OH, Кнорр-2-хлортритильная смола, гидразин-2-хлортритильная смола, смола ANP, фотомеченная смола Fmoc, смола НМВА-МВНА, смола TentaGel S НМВ, ароматическая надежно связующая смола, смола BAI и смола Гтос-гидроксиламин-2-хлортритил. Другими примерами смол являются: смола PL Cl-Trt, PL-оксимовая смола и смола PL-HMBA. Обычно смолы взаимозаменяемы.
В литературе для каждой смолы описаны подходящие условия сопряжения для прикрепления исходного мономера или субъединицы.
Приготовление твердофазного носителя включает сольватирование носителя в подходящем растворителе (например, диметилформамиде). Твердая фаза обычно увеличивается в объеме во время сольватации, что в свою очередь
увеличивает удельную площадь поверхности, доступную для осуществления синтеза пептида.
Затем линкерную молекулу присоединяют к носителю для соединения пептидной цепи с твердофазным носителем. Молекулы линкера обычно 5 сконструированы таким образом, что последующее отщепление образует либо свободную кислоту, либо амид на С-конце. Линкеры обычно не зависят от смолы. Примерами линкеров являются пептидные кислоты, например, 4-гидроксиметилфеноксиацетил-4'-метилбензгидриламин (НМР) или пептидные амиды, например производные бензгидриламина.
10 Первая аминокислота пептидной последовательности может быть
присоединена к линкеру после присоединения линкера к твердофазному носителю или присоединена к твердофазному носителю с использованием линкера, который включает в себя первую аминокислоту пептидной последовательности. Линкеры, которые включают аминокислоты, имеются в продаже.
15 Следующей стадией является снятие защиты с Na-аминогруппы первой
аминокислоты. Снятие защиты с Na-аминогруппы для способа Fmoc SPPS осуществляется обработкой слабым основанием (например, пиперазином или пиперидином). Защитные группы боковой цепи удаляются умеренным ацидолизом (например, трифторуксусной кислотой (TFA)). Снятие защиты с Na-аминогруппы для
20 Вое SPPS осуществляется с использованием, например, TFA.
После снятия защиты, удлинение аминокислотной цепи или сопряжение происходит за счет образования пептидных связей. Данный процесс требует активации, подлежащей сопряжению C-a-карбоксильной группы аминокислоты. Это осуществляется в результате использования в реакционной смеси, например,
25 реагентов, предварительно сформированных симметричных ангидридов, активных сложных эфиров, галогенангидридов или защищенных уретаном N-карбоксиангидридов. Метод использования в реакционной смеси позволяет одновременно осуществлять активирование и сопряжение. Сопрягающие реагенты включают производные карбодиимида, например, ^^-дициклогексилкарбодиимид
30 или ^^диизопропилкарбодиимид. Сопрягающие реагенты также включают
производные солей урония или фосфония из бензотриазола. Примерами данных
солей урония и фосфония являются: HBTU (0-1Н-бензотриазол-1-ил-^^^,^-
тетраметилуронийгексафторфосфат), ВОР (бензотриазол-1-ил-окси-трис-
диметиламинофосфонийгексафторфосфат), РуВОР (бензотриазол-1-ил-окси-
35 трипирролидинофосфоний гексафторфосфат), PyAOP, HCTU (0-1Н-6-хлорбензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат), TCTU (0-1Н-6
хлорбензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилуронийтетрафторборат), HATU (0-7-азабензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат), TATU (0-7-азабензотриазол-1-ил-1,1,3,3-тетраметилуронийтетрафторборат), TOTU (О-цианоэтоксикарбонилметиленамино-N, N, N', N''-тетраметилуронийтетрафторборат) и 5 HAPyU (О-бензотриазол-1-ил-оксибиспирролидиноуронийгексафторфосфат). В некоторых вариантах осуществления, сопрягающий реагент представляет собой HBTU, HATU, ВОР или РуВОР.
После синтезирования требуемой аминокислотной последовательности от смолы отщепляется пептид. Условия, используемые в этом процессе, зависят от
10 чувствительности аминокислотного состава пептида и защитных групп боковой цепи. Как правило, отщепление проводят в среде, содержащей множество поглощающих веществ для подавления реакционноспособных ионов карбония, производных от защитных групп и линкеров. Обычными отщепляющими агентами являются, например, TFA и фтористый водород (HF). В некоторых вариантах осуществления,
15 где пептид связан с твердофазным носителем посредством линкера, пептидная цепь отщепляется от твердофазного носителя путем отщепления пептида от линкера.
Условия, используемые для отщепления пептида от смолы, позволяют попутно удалять одну или более защитных групп боковой цепи.
Использование защитных групп в SPPS хорошо себя зарекомендовало.
20 Примерами общих защитных групп являются, не ограничиваясь: ацетамидометил
(Аст), ацетил (Ас), адамантилокси (AdaO), бензоил (Bz), бензил! (Bzl), 2-
бромбензил, бензилокси (BzIO), бензилоксикарбонил (Z), бензилоксиметил (Вот), 2-
бромбензилоксикарбонил (2-Br-Z), трет-бутокси (tBuO), трет-бутоксикарбонил (Вое),
трет-бутоксиметил (Bum), трет-бутил (tBu), трет-бутилтио (tButhio), 2-
25 хлорбензилоксикарбонил (2-CI-Z), циклогексилокси (сНхО), 2,6-дихлорбензил (2,6-
DiCI-Bzl), 4,4'-диметоксибензгидрил (Mbh), 1-4,4-диметил-2,6-
диоксоциклогексилиден-3-метилбутил (ivDde), 4-1\1-1-4,4-диметил-2,6-
диоксоциклогексилиден-3-метилбутиламинобензилокси (ODmab), 2,4-динитрофенил (Dnp), флуоренилметоксикарбонил (Fmoc), формил (For), мезитилен-2-сульфонил 30 (Mts), 4-метоксибензил (MeOBzl), 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил (Mtr), 4-метокситритил (Mmt), 4-метилбензил (MeBzl), 4-метилтритил (Mtt), З-нитро-2-пиридинсульфонил (Npys), 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил (Pbf), 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил (Рте), тозил (Tos), трифторацетил (Tfa), триметилацетомидометил (Тает), тритил (Trt) и ксантил (Хап).
35 Когда одна или более боковых цепей аминокислот пептида содержат
функциональные группы, например, дополнительные карбоксильные группы,
аминогруппы, гидроксигруппы или тиольные группы, то могут потребоваться дополнительные защитные группы. Например, если используется методика Fmoc, то для защиты Агд могут использоваться Mtr, Pmc, Pbf; для защиты Asn и Gin могут использоваться Trt, Tmob; для защиты Тгр и Lys может использоваться Вое; для 5 защиты Asp, Glu, Ser, Thr и Туг может использоваться tBu; а для защиты Cys могут использоваться Acm, tBu, tButhio, Trt и Mmt. Специалисту в данной области техники очевидно, что существует множество других подходящих комбинаций.
Способы SPPS, описанные выше, хорошо известны в отрасли техники, к которой относится данное изобретение. См., например, Atherton и Sheppard, "Solid
10 Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach*, New York: IRL Press, 1989; Stewart и Young: "Solid-Phase Peptide Synthesis 2-е изд.," Rockford, Illinois: Pierce Chemical Co., 1984; Jones, "The Chemical Synthesis of Peptides,* Oxford: Clarendon Press, 1994; Merrifield, J. Am. Soc. 85:2146-2149 (1963); Marglin, А. и Merrifield, R.B. Annu. Rev. Biochem. 39:841-66 (1970); и Merrifield R.B. JAMA. 210(7): 1247-54 (1969); и "Solid
15 Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach* (W.C. Chan и P.D. White, изд. Oxford University Press, 2000). Оборудование для автоматического синтеза пептидов или полипептидов можно приобрести у поставщиков, например, у компании Perkin Elmer/Applied Biosystems (Foster City, CA), и эксплуатировать в соответствии с инструкциями изготовителя.
20 После отщепления от смолы пептид может быть отделен от реакционной
среды, например, центрифугированием или фильтрацией. Затем пептид можно очищать, например, с помощью ВЭЖХ и с использованием одного или более подходящих растворителей.
Авторы изобретения обнаружили, что в некоторых вариантах 25 осуществления пептидсодержащий партнер по конъюгации, обеспечивает преимущество, состоящее в отсутствии очистки после отщепления пептида из смолы.
Авторы изобретения обнаружили, что в некоторых вариантах осуществления способ тиол-ен реакции по настоящему изобретению обеспечивает преимущество, состоящее в использовании пептидсодержащего партнера по 30 конъюгации, где пептид не содержит защитную группу Na-аминогруппы или любые защитные группы боковой цепи. Реакция обычно является селективной для реакции тиола и неароматической двойной углерод-углеродной связи.
В способах по настоящему изобретению существует необходимость защиты защитной группой тиольных групп, присутствующих в пептидсодержащем 35 партнере по конъюгации (напр., в цистеиновых остатках пептида) для предотвращения нежелательных параллельных реакций. Тиоловые группы
защищаются защитной группой, которая не удаляется в условиях, используемых для удаления одной или более других защитных групп, присутствующих в пептиде, или для отщепления пептида от смолы.
Как правило, пептид синтезируется с использованием аминокислот, 5 содержащих соответствующие защитные группы. Специалист в данной области техники способен подобрать подходящие защитные группы без ненужного экспериментирования.
Аминокислотный партнер по конъюгации и/или липидсодержащие партнеры по конъюгации могут содержать одну или более ненасыщенных углерод-
10 углеродных связей в дополнение к двойным углерод-углеродным связям липидсодержащих партнеров по конъюгации, которые должны вступать в реакцию. Специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение очевидно, что, в таких вариантах осуществления, селективность, вступающего в реакцию тиола с двойной углерод-углеродной связью может зависеть, например, от стерического
15 и/или электронного окружения двойной углерод-углеродной связи относительно одной или более дополнительных ненасыщенных углерод-углеродных связей. В некоторых вариантах осуществления, вступающие в реакцию двойные углерод-углерод связи активируются, по отношению к любым другим ненасыщенным углерод-углеродным связям, в аминокислотном партнере по конъюгации и
20 липидсодержащем партнере по конъюгации. В некоторых вариантах осуществления, вступающие в реакцию двойные углерод-углерод связи активируются, по отношению к любым другим ненасыщенным углерод-углеродным связям, в пептидсодержащем партнере по конъюгации и липидсодержащем партнере по конъюгации.
В некоторых вариантах осуществления, Na-аминогруппа аминокислоты 25 содержащего тиол аминокислотного партнера по конъюгации ацилируется, например ацетил и руется. В некоторых вариантах осуществления, способы по настоящему изобретению могут включать ацилирование, например ацетилирование, Na-аминогруппы аминокислоты аминокислотного партнера по конъюгации, включающего двойную углерод-углеродную связь или тиола, которые должны 30 вступать в реакцию.
Если пептидсодержащий партнер по конъюгации синтезируется способом SPPS, то ацилирование может осуществляться до или после отщепления от смолы. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотный остаток пептидсодержащего партнера по конъюгации, включающего тиол, который должен вступать в реакцию, 35 представляет собой N-концевой аминокислотный остаток, например цистеин, а
данный способ включает ацилирование N-концевой аминогруппы перед отщеплением пептида.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает ацилирование, например ацетилирование, Na-аминогруппы аминокислоты аминокислотного конъюгата или аминокислотного остатка пептидного конъюгата, с которым конъюгированы липидные фрагменты.
Ацилирование Na-аминогруппы аминокислоты осуществляют реакцией аминокислоты или пептида с ацилирующим реагентом в присутствии основания в подходящем растворителе, например DMF. Неограничивающими примерами ацилирующих реагентов являются: галоидангидриды, например хлорангидриды, такие как ацетилхлорид, и кислотные ангидриды, например уксусный ангидрид. Данные реагенты имеются в продаже или получают способами, хорошо известными в отрасли техники, к которой относится данное изобретение. Неограничивающими примерами подходящих оснований являются: триэтиламин, диизопропилэтиламин, 4-метилморфолин и тому подобное.
В других вариантах осуществления, синтез пептида пептидсодержащего партнера по конъюгации, включает сопряжение аминокислоты или пептида, содержащего аминокислоту, которая ацилирована, например ацетилирована, в Na-аминогруппе и включает тиол, который должен вступать в реакцию с одной или более аминокислотами и/или одним или более пептидами.
В некоторых вариантах осуществления, способ включает сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата с аминокислотой или пептидом и получение пептидного конъюгата. В некоторых вариантах осуществления, способ включает сопряжение с помощью SPPS аминокислоты аминокислотного конъюгата с аминокислотой или пептидом, связанным с твердофазным носителем смолы. В некоторых вариантах осуществления, способ включает сопряжение с помощью SPPS аминокислоты аминокислотного конъюгата с пептидом, связанным с твердофазным носителем смолы. Способ может включать синтез с помощью SPPS пептида, связанного с твердофазным носителем смолы.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата или аминокислоты пептидного конъюгата с аминокислотой или пептидом и получение пептидного конъюгата, включающего пептидную антигенную детерминанту. В некоторых вариантах осуществления, подлежащий сопряжению пептид включает пептидную антигенную детерминанту. Других вариантах осуществления, пептидная антигенная
детерминанта образуется при сопряжении. Спряжение можно осуществлять описанным здесь способом SPPS.
В некоторых вариантах осуществления, способ включает сопряжение с помощью SPPS аминокислоты аминокислотного конъюгата с пептидом, связанным с твердофазным носителем смолы, для получения пептидного конъюгата, включающего пептидную антигенную детерминанту.
В одном варианте осуществления, пептид пептидного конъюгата, который подлежит сопряжению, связан с твердофазным носителем смолы, а способ включает сопряжение аминокислоты пептидного конъюгата, подлежащей сопряжению с аминокислотой или пептидом, с получением пептидного конъюгата, включающего пептидную антигенную детерминанту.
В некоторых вариантах осуществления, способ включает сопряжение с помощью SPPS аминокислоты пептидного конъюгата с аминокислотой или пептидом, связанным с твердофазным носителем смолы, для получения пептидного конъюгата, включающего пептидную антигенную детерминанту.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает сопряжение антигенной детерминанты, например с пептидной антигенной детерминанты с аминокислотным конъюгатом или пептидным конъюгатом. Если способ включает сопряжение пептидной антигенной детерминанты, то сопряжение осуществляется описанным здесь способом SPPS.
В некоторых вариантах осуществления, антигенная детерминанта, например пептидная антигенная детерминанта, сопрягается или связывается с помощью линкерной группы. В некоторых вариантах осуществления, линкерная группа представляет собой аминокислотную последовательность, например последовательность из двух или более, трех или более или четырех или более примыкающих аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, линкер содержит от 2 до 20, от 2 до 18, от 2 до 16, от 2 до 14, от 2 до 12, от 2 до 10, от 4 до 20, от 4 до 18, от 4 до 16, от 4 до 14, от 4 до 12 или от 4 до 10 аминокислот.
Специалисту в данной области техники очевидно, что сопряжение аминокислоты или пептида с другой аминокислотой или пептидом, как описано здесь, может включать образование пептидной связи между Na-концом аминокислоты или аминокислоты пептида одного партнера по сопряжению и С-концом аминокислоты или аминокислоты пептида другого партнера по сопряжению.
В некоторых вариантах осуществления, способ по настоящему изобретению включает синтез с помощью SPPS аминокислотной последовательности пептида пептидсодержащего партнера по конъюгации и осуществление реакции пептидсодержащего партнера по конъюгации.
5 В некоторых вариантах осуществления, способ по настоящему
изобретению включает синтез с помощью SPPS аминокислотной последовательности пептида пептидсодержащего партнера по конъюгации и осуществление реакции липидсодержащих партнеров по конъюгации с пептидсодержащий партнером по конъюгации.
10 В некоторых вариантах осуществления, синтез аминокислотной
последовательности пептида пептидсодержащего партнера по конъюгации с помощью SPPS, включает сопряжение аминокислоты или пептида с аминокислотой или пептидом, связанным с твердофазным носителем смолы, с получением аминокислотной последовательности пептида или ее части. В некоторых вариантах
15 осуществления, синтезирование аминокислотной последовательности всего пептида пептидсодержащего партнера по конъюгации осуществляется способом SPPS.
Пептидсодержащий партнер по конъюгации, можно подвергнуть реакции, например, со связанными с твердофазным носителем смолы липидсодержащими партнерами по конъюгации способом тиол-ен реакции. Кроме того, пептид может 20 быть отщеплен от твердофазного носителя смолы и, необязательно, очищен до вступления в реакции, например, с липидсодержащими партнерами по конъюгации.
Пептидный конъюгат и/или аминокислотный партнер по конъюгации, например, пептидсодержащий партнер по конъюгации, может содержать одну или более солюбилизирующих групп. Одна или более солюбилизирующих групп 25 повышают растворимость, например, пептидсодержащего партнера по конъюгации в полярных растворителях, таких как вода. В примерах осуществления, солюбилизирующая группа не оказывает неблагоприятного воздействия на биологическую активность пептидного конъюгата.
Присутствие солюбилизирующей группы дает определенное преимущество 30 при приготовлении и/или введении пептидного конъюгата в качестве лекарственного препарата.
В некоторых вариантах осуществления, солюбилизирующая группа связана с пептидом пептидного конъюгата и/или пептидсодержащего партнера по конъюгации. В некоторых вариантах осуществления, солюбилизирующая группа 35 связана с пептидом пептидсодержащего партнера по конъюгации. В некоторых
вариантах осуществления, пептидный конъюгат и/или пептид пептидсодержащего партнера по конъюгации включают солюбилизирующую группу. В некоторых вариантах осуществления, пептид пептидсодержащего партнера по конъюгации включает солюбилизирующую группу.
В некоторых вариантах осуществления, солюбилизирующая группа связана с боковой цепью аминокислоты в пептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления, солюбилизирующая группа связана с С-концом или N-концом пептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления, солюбилизирующая группа связана между двумя аминокислотными остатками в пептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления, солюбилизирующая группа связана с Na-аминогруппой одного аминокислотного остатка в пептидной цепи и карбоксильной группой другого аминокислотного остатка в пептидной цепи.
Примерами подходящих солюбилизирующих групп являются, не ограничиваясь: гидрофильные аминокислотные последовательности или полиэтиленгликоли (PEG).
В одном варианте осуществления, солюбилизирующая группа представляет собой гидрофильную аминокислотную последовательность, содержащую два или более гидрофильных аминокислотных остатка в пептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления, солюбилизирующая группа представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую последовательность из двух или более последовательных гидрофильных аминокислотных остатков в пептидной цепи. Данные солюбилизирующие группы образуются путем добавления каждой аминокислоты солюбилизирующей группы к пептидной цепи с помощью SPPS.
В другом варианте осуществления, солюбилизирующая группа представляет собой полиэтиленгликоль. В некоторых вариантах осуществления, полиэтиленгликоль связан с Na-аминогруппой одного аминокислотного остатка в пептидной цепи и карбоксильной группой другого аминокислотного остатка в пептидной цепи.
В некоторых вариантах осуществления, полиэтиленгликоль содержит примерно: от 1 до 100, от 1 до 50, от 1 до 25, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 15, от 1 до 10 , от 2 до 10 или от 2 до 4 мономерных звеньев этиленгликоля. Способы сопряжения полиэтиленгликолей с пептидами широко известны.
В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат и/или пептидсодержащий партнер по конъюгации включает антиген, например антигенный
пептид. В одном варианте осуществления пептид пептидного конъюгата или пептидсодержащий партнер по конъюгации, представляет собой или включает антиген, или антиген, связанный с пептидом, необязательно, с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации 5 включает антиген, например антигенный пептид. В одном варианте осуществления пептид пептидсодержащего партнера по конъюгации, представляет собой или включает антиген, или антиген, связанный с пептидом, необязательно, с помощью линкера.
В одном варианте осуществления, антиген содержит пептид, включающий 10 антигенную детерминанту. В одном варианте осуществления, пептид, включающий антигенную детерминанту, представляет собой гликопептид, включающий антигенную детерминанту. В одном варианте осуществления, антиген содержит гликопептид, включающий антигенную детерминанту.
В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат и/или 15 пептидсодержащий партнер по конъюгации включает антигенную детерминанту. В некоторых вариантах осуществления, пептид пептидного конъюгата и/или пептидсодержащего партнера по конъюгации включает антигенную детерминанту. В некоторых вариантах осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации включает антигенную детерминанту. В некоторых вариантах осуществления, пептид 20 пептидсодержащего партнера по конъюгации включает антигенную детерминанту.
В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат и/или пептидсодержащий партнер по конъюгации включает две или более антигенных детерминанты, например, пептид пептидного конъюгата и/или пептидсодержащего партнера по конъюгации включает две или более антигенных детерминанты.
25 В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат и/или
пептидсодержащий партнер по конъюгации представляет собой или включает гликопептид, включающий антигенную детерминанту. В некоторых вариантах осуществления, пептид пептидного конъюгата и/или пептидсодержащего партнера по конъюгации представляет собой гликопептид. В некоторых вариантах
30 осуществления, пептидный конъюгат и/или пептидсодержащий партнер по конъюгации включает гликопептид, включающий антигенную детерминанту, связанную с пептидом пептидного конъюгата и/или пептидсодержащего партнера по конъюгации. В некоторых вариантах осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации представляет собой или включает гликопептид, включающий
35 антигенную детерминанту. В некоторых вариантах осуществления, пептид пептидсодержащего партнера по конъюгации представляет собой гликопептид. В
некоторых вариантах осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации содержит гликопептид, включающий антигенную детерминанту, связанную с пептидом пептидсодержащего партнера по конъюгации.
В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат и/или 5 пептидсодержащий партнер по конъюгации включает участок протеолитического расщепления. В некоторых вариантах осуществления, пептид пептидного конъюгата и/или пептидсодержащего партнера по конъюгации включает участок протеолитического расщепления. В некоторых вариантах осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации включает участок протеолитического 10 расщепления. В некоторых вариантах осуществления, пептид пептидсодержащего партнера по конъюгации включает участок протеолитического расщепления.
В некоторых вариантах осуществления, пептид пептидного конъюгата и/или пептидсодержащего партнера по конъюгации включает одну или более линкерных групп. В некоторых вариантах осуществления, пептид 15 пептидсодержащего партнера по конъюгации включает одну или более линкерных групп.
В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат и/или пептидсодержащий партнер по конъюгации включает линкерную группу. В некоторых вариантах осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации 20 включает линкерную группу.
В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат и/или пептидсодержащий партнер по конъюгации включает антигенную детерминанту, связанную с пептидом пептидного конъюгата и/или пептидсодержащего партнера по конъюгации с помощью линкерной группы. В некоторых вариантах осуществления, 25 пептидсодержащий партнер по конъюгации включает антигенную детерминанту, связанную с пептидом пептидсодержащего партнера по конъюгации с помощью линкерной группы.
Примерами линкерных групп являются, не ограничиваясь: аминокислотные последовательности (например, пептид), полиэтиленгликоль, 30 алкильные аминокислоты и тому подобное. В некоторых вариантах осуществления, линкер представляет собой или включает участок протеолитического расщепления. В некоторых вариантах осуществления, линкер представляет собой или включает солюбилизирующую группу.
В некоторых вариантах осуществления, линкер связывается между двумя 35 аминокислотными остатками пептидной цепи.
В некоторых вариантах осуществления, линкерная группа связывается с Na-аминогруппой одного аминокислотного остатка в пептидном конъюгате и/или пептидсодержащем партнере по конъюгации и карбоксильной группой другого аминокислотного остатка в пептидсодержащем партнере по конъюгации. В некоторых вариантах осуществления, линкерная группа связывается с Na-аминогруппой одного аминокислотного остатка в пептидсодержащем партнере по конъюгации и карбоксильной группой другого аминокислотного остатка в пептидсодержащем партнере по конъюгации.
В некоторых вариантах осуществления, ликерная группа способна отщепляться in vivo от аминокислот, с которыми она связана. В некоторых вариантах осуществления, ликерная группа способна отщепляться in vivo с помощью гидролиза. В некоторых вариантах осуществления, ликерная группа способна отщепляться in vivo с помощью ферментативного гидролиза. Линкерные группы вводятся любым подходящим способом, известным в отрасли техники, к которой относится данное изобретение.
Способ дополнительно включает сопряжение антигенной детерминанты с аминокислотой аминокислотного конъюгата или пептидом пептидного конъюгата. Антигенная детерминанта может связываться с помощью линкерной группы, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления, антигенная детерминанта представляет собой пептидную антигенную детерминанту. В некоторых вариантах осуществления, способ включает сопряжение гликопептида, включающего антигенную детерминанту.
Следует понимать, что в соответствии с настоящим изобретением в некоторых требуемых вариантах осуществления пептидные конъюгаты поддерживают соответствующее поглощение, обработку и презентирование антигенпрезентирующими клетками. Желательно, чтобы липидсодержащий конъюгат не мешал презентированию антигенпрезентирующими клетками какого-либо антигенного пептида, присутствующего в конъюгате. Представленные здесь примеры показывают, что в соответствии с настоящим изобретением конъюгаты презентированы антигенпрезентирующими клетками по сравнению с неконъюгированными родственными пептидами.
Подтверждение идентичности синтезированных пептидов достигается, например, анализом аминокислот, масс-спектрометрией, расщеплением по Эдману и тому подобное.
Способ по настоящему изобретению дополнительно включает отделение аминокислотного конъюгата от жидкой реакционной среды. Кроме того, способ по
настоящему изобретению дополнительно включает отделение пептидного конъюгата от жидкой реакционной среды. Могут использоваться любые подходящие способы отделения, известные в отрасли техники, к которой относится данное изобретение, например, осаждение и фильтрация. Затем конъюгат можно очищать, например, с помощью ВЭЖХ и с использованием одного или более подходящих растворителей.
Настоящее изобретение также относится к аминокислотным конъюгатам и пептидным конъюгатам, полученным способами в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение также относится к соединению формулы (I), которое представляет собой аминокислотный конъюгат.
Настоящее изобретение также относится к соединению формулы (I), которое представляет собой пептидный конъюгат.
Пептидные конъюгаты могут быть чистыми, очищенными или в целом
чистыми.
Используемый здесь термин "очищенный" не подразумевает абсолютную чистоту, скорее, он является относительным термином, который описывает рассматриваемый материал более чистым, чем в той среде, в которой он находился ранее. Например, на практике материал обычно, подвергают фракционированию для удаления различных других компонентов, а полученный материал по существу сохраняет требуемую биологическую активность или активности. Термин "по существу очищенный" относится к материалам, которые, по меньшей мере, на 60% без примесей, предпочтительно, по меньшей мере, на 75% без примесей и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 90% без примесей, по меньшей мере, на 95% без примесей, по меньшей мере, около 98% без примесей или более других компонентов, с которыми они могут быть связаны во время производства.
Термин "а-аминокислота" или "аминокислота" относится к молекуле, содержащей как аминогруппу, так и карбоксильную группу, связанную с углеродом, которому дано название а-углерод. Подходящие аминокислоты включают без ограничения как D-, так и L-изомеры природных аминокислот, а также неприродные аминокислоты, полученные органическим синтезом или другими путями метаболизма. Если в контексте явно не указано иное, то используемый здесь термин аминокислота охватывает аналоги аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления, пептидсодержащий партнер по конъюгации содержит только природные аминокислоты. Термин "природная
аминокислота" относится к любой из двадцати аминокислот, обычно встречающихся в пептидах, синтезированных в природе, и известных под сокращением в виде одной буквы: A, R, N, С, D, Q, Е, G, Н, I, L, К, М, F, Р, S, Т, W, Y и V.
Термин "аналог аминокислоты" или "неприродная аминокислота" относится к молекуле, которая структурно сходна с аминокислотой и которая может быть замещена аминокислотой. Аминокислотные аналоги включают, без ограничения, соединения, которые, как определено здесь, структурно идентичны аминокислоте, если не считать включения одной или более дополнительных метиленовых групп между аминогруппой и карбоксильной группой (напр., а-амино-3-карбоксикислотами), или замещения аминогруппы или карбоксильной группы аналогичной реакционноспособной группой (напр., замещение первичного амина вторичным или третичным амином или замещение карбоксильной группы сложным эфиром или карбоксамидом).
Если не указано иное, то специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение очевидно, что при осуществлении описанных здесь способов могут использоваться обычные методы молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии. Данные методы подробно описаны в литературе, например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, второе издание (Sambrook и др., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, изд., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, и изд., 1987); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, изд.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, изд., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel и.др., изд., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis и др., изд., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan и др., изд., 1991); The Immunoassay Handbook (David Wild, изд., Stockton Press NY, 1994); Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow и др., изд., 1987); и Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert, и N.A. Staines, изд., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993).
Термин "пептид" и тому подобное используют здесь для обозначения любого полимера аминокислотных остатков любой длины. Полимер может быть линейным или нелинейным (напр., разветвленным) и может содержать модифицированные аминокислоты или аналоги аминокислот. Термин также охватывает аминокислотные полимеры, которые были модифицированы естественным путем или путем вмешательства, например, путем образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой модификации или манипуляции, например, конъюгации с мечением биоактивными компонентами.
Авторы изобретения обнаружили, что пептидные конъюгаты по настоящему изобретению обладают иммунологической активностью.
Клеточно-опосредованный иммунитет в основном обусловлен воздействием Т-лимфоцитов. Патогенные антигены локализируются на поверхности антигенпрезентирующих клеток (таких как макрофаги, В-лимфоциты и дендритные клетки), связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости ГКГС класса I или ГКГС класса П. Презентация патогенного антигена, сопряженного с ГКГС класса II, активирует ответ клетки-помощника (CD4+) Т-клетки. При связывании Т-клетки с антиген-комплексом ГКГС класса II, CD4+ Т-клетки выделяют цитокины и индуцируют пролиферацию.
Презентация патогенных антигенов, связанных с молекулами ГКГС класса I, активирует цитотоксический ответ (CD8+) Т-клетки. При связывании Т-клетки с антиген-комплексом ГКГС класса I клетки CD8+ выделяют перфорин и другие медиаторы, что приводит к гибели клеток-мишеней. Не вдаваясь в теорию, изобретатели считают, что в некоторых вариантах осуществления усиленный ответ с помощью клеток CD8+ достигается в присутствии одной или более антигенных детерминант, распознаваемых клетками CD4+.
Способы оценки и контроля начала или прогрессирования клеточно-опосредованной реакции у пациента хорошо известны в отрасли техники, к которой относится данное изобретение. Удобные примерные способы представляют собой способы, например, указанные здесь, в которых оценивается присутствие или уровень одного или более цитокинов, связанных с клеточной реакцией. Подобным образом, клеточные способы оценки или контроля начала и прогрессирования клеточной реакции могут применяться в настоящем изобретении и могут включать анализ пролиферации или активации клетки, включая анализ, нацеленный на идентификацию активации или расширения одной или более популяций иммунных клеток, например Т-лимфоцитов.
В некоторых вариантах осуществления, способы по изобретению вызывают клеточно-опосредованный иммунный ответ и гуморальный ответ.
Гуморальный иммунный ответ опосредуется секретируемыми антителами, продуцируемыми В-клетками. Секретируемые антитела связываются с антигенами, презентированными на поверхности инвазивных агентов, помечая их для уничтожения.
Вновь, способы оценки и контроля начала или прогрессирования гуморального ответа хорошо известны в отрасли техники, к которой относится
данное изобретение. Сюда относятся анализы связывания антител, ELISA, кожная инъекционная проба и тому подобное.
Не вдаваясь в теорию, изобретатели считают, что в некоторых вариантах осуществления пептидные конъюгаты стимулируют толл-подобные рецепторы (TLR).
Толл-подобные рецепторы (TLR) являются высококонсервативными рецепторами распознавания структур (PRR), которые распознают ассоциированные с патогеном характерные молекулярные структуры и передают сигналы опасности в клетку (Kawai, Т., Akira, S., Immunity 2011, 34, 637-650). TLR2 представляет собой рецептор клеточной поверхности, локализированный на различных типах клеток, включая дендритные клетки, макрофаги и лимфоциты (Coffman, R. L, Sher, А., Seder, R. A., Immunity 2010, 33, 492-503).
TLR2 распознает широкий спектр микробных компонентов, включая липополисахариды, пептидогликаны и липотейхоевую кислоту. Он уникален среди TLR тем, что формирует гетеродимеры с TLR1 или TLR6, обладает способностью образовывать комплексы с другими PRR и объясняет широкий диапазон агонистов для TLR2 (Feldmann, М., Steinman, L, Nature 2005, 435, 612-619). При связывании лиганда и гетеродимеризации передача сигналов происходит по пути MyD88, что приводит к активации NFKB И последующему продуцированию воспалительных и эффекторных цитокинов.
Ди- и три-ацилированные липопептиды, полученные из компонентов клеточной оболочки бактерии, широко исследовались в качестве агонистов TLR2 (Eriksson, Е. М. Y., Jackson, D. С, Curr. Prot. and Pept. Sci. 2007, 8, 412-417). Было констатировано, что липопептиды способствуют созреванию дендритных клеток, вызывая позитивную регуляцию костимулирующих молекул на поверхности клетки и улучшенную презентацию антигена. Также было констатировано, что липопептиды стимулируют высвобождение макрофагами цитокинов и способствуют активации лимфоцитов, включая В-клетки и CD8+ Т-клетки.
В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат обладает активностью агониста TLR2. В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат обладает активностью агониста TLR2, сравнимой с Pam3CSK4. В некоторых вариантах осуществления, пептидный конъюгат обладает активностью агониста TLR2, составляющей, по меньшей мере, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90% по сравнению с Pam3CSK4. В некоторых вариантах осуществления, например, в вариантах осуществления, в которых требуется модулированный иммунный ответ, пептидный конъюгат обладает меньшей активностью агониста TLR2, по сравнению с активностью Pam3CSK4. Например,
пептидный конъюгат обладает активностью агониста TLR2, составляющей менее примерно 50%, менее примерно 40%, менее примерно 30%, менее примерно 20% или менее примерно 10%, по сравнению с активностью Pam3CSK4.
В некоторых вариантах осуществления, пептид пептидного конъюгата и/или аминокислотного партнера по конъюгации, включает аминокислотный сериновый остаток, примыкающий к аминокислоте, с которым в пептид конъюгируются липидные фрагменты. В некоторых вариантах осуществления, серии связан с С-концом аминокислоты. Присутствие серинового аминокислотного остатка в этой позиции способно усилить связывание TLR2.
Специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение очевидно, что пептидный конъюгат может включать антигенную детерминанту, например, две или более антигенных детерминанты. Антигенная детерминанта сопрягается или связывается с пептидом с помощью линкерной группы. В некоторых вариантах осуществления, антигенная детерминанта представляет собой пептидную антигенную детерминанту. Специалисту в данной области техники очевидно, что в настоящем изобретении может применяться широкий выбор пептидных антигенных детерминант.
Антигены
Следует понимать, что было описано и пригодно для использования в настоящем изобретении большое количество антигенов, например опухолевых антигенов или антигенов из различных патогенных организмов. Предметом рассмотрения являются все способные вызывать иммунный ответ антигены, независимо оттого, описаны они сейчас или нет.
Соответственно, в зависимости от выбора антигена, конъюгаты по настоящему изобретению находят применение в иммунотерапии, включая, не ограничиваясь, лечение и профилактику инфекционных заболеваний, лечение и профилактику рака, а также лечение повторных вирусных заболеваний во время или после иммуносупрессии, например, у пациентов, перенесших трансплантацию костного мозга или трансплантацию гематопоэтических стволовых клеток.
Также предметом рассмотрения являются антигены, включающие одну или более аминокислотных замен, например, одну или более консервативных аминокислотных замен.
"Консервативная аминокислотная замена" представляет собой консервативную аминокислотную замену, в которой аминокислотный остаток
заменен другим остатком, имеющим химически подобную или дериватизированную боковую цепь. Например, в отрасли техники, к которой относится данное изобретение, были определены семейства аминокислотных остатков, имеющих похожие боковые цепи. Эти семейства включают, например, аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии , треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). В настоящем изобретении также рассматриваются аминокислотные аналоги (например, фосфорилированные или гликозилированные аминокислоты), а также пептиды, замещенные неприродными аминокислотами, включая, не ограничиваясь, N-алкилированные аминокислоты (напр., N-метиламинокислоты) , D-аминокислоты, 3_ аминокислоты и у-аминокислоты.
Специальным предметом рассмотрения являются фрагменты и варианты
антигенов.
"Фрагмент" пептида представляет собой субпоследовательность пептида, которая выполняет функцию необходимую для ферментативной или связывающей активности и/или обеспечивает трехмерную структуру пептида, например, трехмерную структуру полипептида.
Используемый здесь термин "вариант" относится к пептидным последовательностям, включая, например, пептидные последовательности, отличные от специфично-идентифицированных последовательностей, где один или более аминокислотных остатков удаляются, замещаются или добавляются. Варианты представляют собой природные варианты или неприродные варианты. Варианты представляют собой варианты из одного и того же или других видов и могут охватывать гомологи, паралоги и ортологи. В некоторых вариантах осуществления, варианты пептидов, включают пептиды, обладающие биологической активностью, которые являются такими же или похожими на пептиды дикого типа. Термин "вариант" со ссылкой на пептиды охватывает, как определено здесь, все формы пептидов.
Специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение очевидно, что конъюгаты по настоящему изобретению в определенных вариантах осуществления особенно подходят для стимулирования ответов Т-клеток, например,
при лечении неопластических заболеваний, включая рак. Специальным предметом рассмотрения являются конъюгаты по настоящему изобретению, включающие один или более опухолевых антигенов. Следует понимать, что опухолевые антигены, являющиеся предметом рассмотрения при получении пептидных конъюгатов в соответствии с изобретением, обычно включают один или более пептидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, включая, например, лекарственные препараты в соответствии с изобретением, может присутствовать один или более дополнительных опухолевых антигенов, где один или более опухолевых антигенов не содержат пептида. Опухолевые антигены обычно классифицируются как уникальные антигены, так и общие антигены, причем последняя группа включает дифференцировочные антигены, специфические противораковые антигены и сверхэкспрессирующие антигены. Примеры каждого класса антигенов подлежат использованию в настоящем изобретении. Ниже обсуждаются типичные опухолевые антигены, используемые при лечении, например, при иммунотерапевтическом лечении или вакцинации против неопластических заболеваний, включая рак. В частности специальным предметом рассмотрения являются соединения, вакцины и композиции, включающие один или более полученных антигенов, использующие данные способы иммунизации.
В некоторых вариантах осуществления, опухолевый антиген представляет собой пептидсодержащий опухолевый антиген, такой как полипептидный опухолевый антиген или гликопротеиновые опухолевые антигены. В некоторых вариантах осуществления, опухолевый антиген представляет собой сахаридсодержащий опухолевый антиген, такой как гликолепидный опухолевый антиген или ганглиозидный опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления, опухолевый антиген представляет собой полинуклеотидсодержащий опухолевый антиген, который экспрессирует полипептидсодержащий опухолевый антиген, например, векторную конструкцию РНК или векторную конструкцию ДНК, например, плазмидную ДНК.
Опухолевые антигены, подходящие для использования в настоящем изобретении, охватывают широкий спектр молекул, таких как (а) пептидсодержащие опухолевые антигены, включая пептидные антигенные детерминанты (которые могут варьироваться по длине, например, от 8 до 20 аминокислот в длину, хотя длины вне этого диапазона также распространены), липополипептиды и гликопротеины, (Ь) сахаридсодержащие опухолевые антигены, включая полисахариды, муцины, ганглиозиды, гликолипиды и гликопротеины, включая и (с) полинуклеотиды, которые экспрессируют антигенные полипептиды. Вновь, специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение очевидно, что опухолевый антиген, присутствующий в конъюгате или композиции по настоящему изобретению,
обычно будет содержать пептид. Однако предметом рассмотрения являются варианты осуществления изобретения, где один или более конъюгатов содержат опухолевый антиген, который сам по себе не содержит пептид, но, например, связан с аминокислотным партнером по конъюгации или пептидсодержащиим партнером по конъюгации. Аналогичным образом предметом рассмотрения являются композиции по настоящему изобретению, в которых присутствует один или более опухолевых антигенов, которые сами по себе не содержат пептид.
В некоторых вариантах осуществления опухолевые антигены представляют собой, например, (а) полноразмерные молекулы, связанные с раковыми клетками, (б) их гомологи и модифицированные формы, включая молекулы с удаленными, добавленными и/или замещенными частями, и (с) их фрагменты, при условии, что указанные фрагменты остаются антигенными или иммуногенными. В некоторых вариантах осуществления, опухолевые антигены получают в рекомбинантной форме. В некоторых вариантах осуществления, опухолевые антигены включают, например, антигены, рестриктированные по главному комплексу гистосовместимости Класса I, распознаваемые CD8+ лимфоцитами или антигены рестриктированные по главному комплексу гистосовместимости Класса II, распознаваемые CD4+ лимфоцитами. В некоторых вариантах осуществления, опухолевые антигены включают синтетические пептиды, включающие антигены, рестриктированные по главному комплексу гистосовместимости Класса I, распознаваемые CD8+ лимфоцитами или антигены рестриктированные по главному комплексу гистосовместимости Класса II, распознаваемые CD4+ лимфоцитами.
Общие опухолевые антигены, как правило, считаются нативными, не мутированными последовательностями, которые экспрессируются опухолями из-за эпигенетических изменений, которые допускают дерепрессию находящихся в процессе развития репрессированных генов. Соответственно, общие антигены обычно являются предпочтительными для сверхэкспрессированных или дифференцированно-ассоциированных антигенов, поскольку в здоровых тканях отсутствует экспрессия. Кроме того, одни и те же антигены могут воздействовать на нескольких больных раком пациентов. Например, раково-тестикулярный антиген NY-ESO-1 присутствует у большинства пациентов со множественными опухолевыми очагами и у значительно меньшего числа пациентов с меньшим числои очагов. В другом примере, опухолевые антигены молочной железы NYBR-1 и NYBR-1.1 встречаются у части пациентов с раком молочной железы. Таким образом, общие опухолевые антигены представляют собой выгодную цель для разработки.
Предметом рассмотрения является использование в конъюгатах, в соответствии с настоящим изобретением, общих опухолевых антигенов, например, раково-тестикулярных антигенов, включая NY-ESO-1, CTSP-1, CTSP-2, CTSP-3, CTSP-4, SSX2 и SCP1, и антигенов рака молочной железы NYBR-1 и NYBR- 1.1.
В одном примере осуществления пептид пептидсодержащего партнера по конъюгации, или пептидный конъюгат включает одну или более антигенных детерминант, полученных из NY-ESO-1. В одном варианте осуществления, пептид включает одну или более антигенных детерминант, полученных из остатков NY-ESO-1 79-116. В одном варианте осуществления, пептид включает одну или более антигенных детерминант, полученных из остатков NY-ESO-1 118-143. В одном варианте осуществления, пептид включает одну или более антигенных детерминант, полученных из остатков NY-ESO-1 153-180.
В одном специально рассматриваемом варианте осуществления пептид пептидсодержащего партнера по конъюгации или пептидный конъюгат, включает, по существу состоит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8 или более примыкающих, 10 или более примыкающих, 12 или более примыкающих, 15 или более примыкающих, 20 или более примыкающих или 25 или более примыкающих аминокислот из любой SEQ ID NO: 1-20.
В различных вариантах осуществления, пептид включает более чем одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из любой SEQ ID NO: 1-20. В одном варианте осуществления, пептид включает одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4-7, 12, 13, и 18-20.
Аналогично, вакцина Sipuleucel-T (АРС8015, Provenge(tm)) против рака простаты, включает антиген простатической кислой фосфатазы (РАР), присутствующий в 95% клеток рака предстательной железы. Благодаря этому, по меньшей мере, частичному потенциалу действенности у значительной части больных раком предстательной железы, вакцина Sipuleucel-T была одобрена FDA в 2010 году для использования в лечении бессимптомного, гормонорезистентного рака предстательной железы. Предметом специального рассмотрения является использование РАР-антигена в конъюгатах по настоящему изобретению.
Уникальными антигенами считаются антигены, которые уникальны для индивидуума или приемлемы для небольшой части раковых пациентов и, как правило, являются результатом мутаций, ведущих к уникальным белковым последовательностям. Типичными примерами уникальных опухолевых антигенов являются мутированные антигены Ras и мутированные антигены р53. Специалистам
в отрасли техники, к которой относится данное изобретение очевидно, что способы по настоящему изобретению допускают использование готового препарата конъюгатов, содержащего один или более уникальных опухолевых антигенов, например, для вызова специфического ответа Т-клети на один или более уникальных опухолевых антигенов, например, в препаратах персонифицированной терапии.
Соответственно, репрезентативные опухолевые антигены включают, не ограничиваясь: (а) антигены семейства полипептидов RAGE, BAGE, GAGE и MAGE, например GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 и MAGE-12 (которые могут использоваться, например, для лечения меланомы легких, головы и шеи, НМРЛ, опухолей молочной железы, желудочно-кишечного тракта и мочевого пузыря); (Ь) мутированные антигены, например р53 (связанные с различными твердыми опухолями, например, раком толстой и прямой кишки, раком легких, раком головы и шеи), p21/Ras (связанные , например, с меланомой, раком поджелудочной железы и раком толстой и прямой кишки), CDK4 (связанные с меланомой), MUM1 (связанные, например, с меланомой), каспазу-8 (связанную, например, с раком головы и шеи), CIA 0205 (связанный, например, с раком мочевого пузыря), HLA-A2-R1701, бета-катенин (связанный, например, с меланомой), TCR (связанный, например, с Т-клеточной неходжкинской лимфомой), BCR-abl (связанный, например, с хроническим миелолейкозом), триозофосфатизомераза, МА 0205, CDC-27 и LDLR-FUT; (с) сверхэкспрессированные антигены, например, Galectin 4 (связанный, например, с раком толстой и прямой кишки), Galectin 9 (связанный, например, с болезнью Ходжкина), протеиназа 3 (связанная, например, с хронической гранулоцитной лейкемией), антиген-1 опухоли Вильма (WT 1, связанный, например, с различными лейкозами), карбоан гид раза (связанная, например, с раком почки), альдолаза А (связанная, например, с раком легких), PRAME (связанная, например, с меланомой), HER-2/позитив. (связанный, например, с раком молочной железы, толстой кишки, легкого и яичников), альфа-фетопротеин (связанный, например, с гепатомой), KSA (связанный, например, с раком толстой и прямой кишки), гастрин (связанный, например, с раком поджелудочной железы и желудка), теломеразный каталитический белок, MUC-1 (связанный, например, с раком молочной железы и яичников), G-250 (связанный, например, с почечно-клеточной карциномой), р53 (связанный, например, с раком молочной железы, толстой кишки) и карциноэмбриональный антиген (связанный, например, с раком молочной железы, раком легкого и раком желудочно-кишечного тракта, таким как рак толстой и прямой кишки); (d) общие антигены, например меланома-меланоцитарный дифференцировочный антиген, такой как MART-l/Melan A, gplOO, MC1R, рецептор меланоцитостимулирующего гормона, тирозиназа, родственный
тирозиназе белок-1/TRPl и родственный тирозиназе белок-2/ТЯР2 (связанный, например, с меланомой); (е) ассоциированные с предстательной железой антигены, такие как РАР, антиген простатической сыворотки (PSA), PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, ассоциированный, например, с раком предстательной железы; (f) идиотипы иммуноглобулина (связанные, например, с миеломой и лимфомами В-клеток); и (д) другие опухолевые антигены, такие как полипептид- и сахаридсодержащие антигены, включающие (i) гликопротеины, такие как сиалил Тп и сиалил Le.sup.x (связанный, например, с раком молочной железы и раком толстой и прямой кишки), а также различные муцины; гликопротеины сопряжены с белком носителем (например, MUC-1 сопряжены с KLH); (N) липополипептиды (например, MUC-1, связаны с липидным фрагментом); (iii) полисахариды (например, синтетический гексасахарид Globo Н), которые сопряжены с белками носителями (например, с KLH), (iv) ганглиозиды, такие как GM2, GM12, GD2, GD3 (ассоциированные, например, с опухолью мозга, раком легких, меланомой), которые также сопряжены с белками носителями (например, KLH).
Другие репрезентативные опухолевые антигены, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают: TAG-72 (См., напр., патент США. № 5 892 020; антиген карциномы человека (См., напр., патент США № 5 808 005); антигены ТР1 и ТРЗ из клеток остеокарциномы (См., напр., патент США № 5 855 866); антиген Томсона-Фриденрайха (TF) из клеток аденокарциномы (См., напр., патент США № 5 110 911); антиген КС-4 из аденокарциномы предстательной железы человека (См., напр., патент США № 4 743 543); антиген рака толстой и прямой кишки человека (См., напр., патент США № 4 921 789); антиген СА125 из цистаденокарциномы (См., напр., патент США № 4 921 790); антиген DF3 из карциномы молочной железы человека (См., напр., патент США № 4 963 484 и 5 053 489); антиген опухоли молочной железы человека (См., напр., патент США № 4 939 240); антиген р97 меланомы человека (См., напр., патент США № 4 918 164); антиген карциномы или родственного орозомукоида (CORA) (см., например, патент США № 4 914 021); Т и Тп гаптены в гликопротеинах карциномы молочной железы человека, гликопротеин карциномы молочной железы MSA; антиген MFGM карциномы молочной железы; антиген DU-PAN-2 карциномы поджелудочной железы; антиген СА125 карциномы яичников; антиген YH206 карциномы легкого, альфафетопротеиновый (AFP) антиген гепатоцеллюлярной карциномы; карциноэмбриональный антиген (СЕА) антигена рака толстой и прямой кишки; эпителиальный опухолевый антиген (ЕТА) антигена рака молочной железы; тирозиназу; продукт онкогена белка-регулятора экспрессии альфа-фетопротеина; gp75; gplOO; EBV-LMP 1 и 2; EBV-EBNA 1, 2 и ЗС; HPV-E4, 6, 7; С017-1А; GA733; др72; р53; протеиназу 3; теломеразу; и ганглиозиды. Предметом рассмотрения
являются эти и другие опухолевые антигены, независимо от того, были ли они описаны в настоящее время, которые предназначены для использования в настоящем изобретении.
В некоторых вариантах осуществления, опухолевые антигены получают из 5 мутированных или измененных клеточных компонентов. Типичные примеры измененных клеточных компонентов включают, не ограничиваясь: ras, р53, Rb, измененный белок, кодируемый геном опухоли Вильмса, убиквитин, муцин, белок кодируемый генами DCC, АРС и МСС, а также рецепторы или рецептор-подобные структуры с "ней", рецептор тиреоидного гормона, рецептор фактора роста 10 тромбоцитов (PDGF), рецептор инсулина, рецептор фактора роста эпидермиса (EGF) и рецептор колониестимулирующего фактора (CSF).
Полинуклеотидсодержащие антигены, используемые в настоящем изобретении, включают полинуклеотиды, которые кодируют перечисленные выше полипептидные опухолевые антигены. В некоторых вариантах осуществления, 15 полинуклеотидсодержащие антигены включают, не ограничиваясь, векторные конструкции ДНК или РНК, такие как плазмидные векторы (например, pCMV), которые способны экспрессировать полипептидные опухолевые антигены in vivo.
В настоящем изобретении также рассматривается получение конъюгатов, содержащих вирусные антигены, которые способны стимулировать Т-клетку, чтобы 20 вызывать эффективный антивирусный иммунитет у пациентов, которые имеют или имели подавленный иммунитет, например, у пациентов, которые перенесли трансплантацию костного мозга, трансплантацию гематопоэтических стволовых клеток или подвергаются иммуносупрессии иным образом.
Аналогично, предметом рассмотрения являются предназначенные для 25 использования в настоящем изобретении антигены, полученные из вирусов связанных с увеличением числа случаев рака, или как считается, вызывают рак, например, вируса папилломы человека, вируса гепатита А и вируса гепатита В.
Например, в некоторых вариантах осуществления опухолевые антигены включают, не ограничиваясь, антигены вируса р15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, Н4-
30 RET, IGH-IGK, MYL-RAR, вируса Эпштейна Барра, антигены вируса папилломы человека (HPV), включая Е6 и Е7, антигены вируса гепатита В и С, антигены лимфотропного Т-клеточного вируса, TSP-180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23Н1, TAG-72- 4, СА 19-9, СА 72-4, САМ 17.1, NuMa, K-ras, р16, TAGE, PSCA, СТ7, 43-9F, 5Т4, 791 Tgp72, бета-HCG, ВСА225, ВТАА, СА 125, СА 15-3 (СА 27,29\ВСАА), СА
35 195, СА 242, СА-50, САМ43, CD68\KP1, СО-029, FGF-5, Ga733 (ЕрСАМ), НТдр-175, М344, МА-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, ТА-90 (белок
связывания Мас-2\С-ассоциированный белок циклофилина), TAAL6, TAG72, TLP, TPS и тому подобное.
В некоторых вариантах осуществления, опухолевые антигены включают вирусные белки, вовлеченные в онкогенез, такие как антигены вируса Эпштейна 5 Барра, вируса папилломы человека (HPV), включая Е6 и Е7 и гепатита В и С, и лимфотропного Т-клеточного вируса.
Следует понимать, что такие вирусные белки, а также различные другие вирусные белки могут являться мишенями для активности Т-клеток, например, при лечении вирусных заболеваний. Настоящее изобретение, фактически, полезно при
10 любой инфекции, когда известно, что активность Т-клеток играет роль в иммунитете (эффективно при всех вирусных инфекциях и многих бактериальных инфекциях, например туберкулезе). Описанные здесь инфекционные болезни приведены только в качестве примера и никоим образом не предназначены для ограничения объема изобретения. Следует понимать, что настоящее изобретение полезно при лечении
15 различных других заболеваний и состояний.
Типичные антигены, используемые при вакцинации против патогенных организмов, обсуждаются ниже. В частности специальным предметом рассмотрения являются соединения, вакцины и композиции, включающие один или более полученных антигенов, использующие данные способы иммунизации.
20 Антигены туберкулеза
Следует понимать, что был описан ряд антигенов М.туберкулеза, подходящих для использования в настоящем изобретении. Предметом рассмотрения являются все способные вызывать иммунный ответ антигены М.туберкулеза, независимо от того, описаны они сейчас или нет.
25 Примеры антигенов М. туберкулеза, пригодные для использования,
включают раннюю антигенную целевую группу (ESAT)-6, Ag85A, Ag85B (МРТ59), Ag85B, Ag85C, MPT32, MPT51, MPT59, MPT63, MPT64, MPT83, MPB5, MPB59, MPB64, MTC28, Mtb2, Mtb8.4, Mtb9.9, Mtb32A, Mtb39, Mtb41, TB10.4, TB10C, TB11B, TB12.5, TBI ЗА, TB14, TB15, TB15A, TB16, TB16A, TB17, TB18, TB21, TB20.6, TB24, TB27B,
30 TB32, TB32A, ТВЗЗ, TB38, TB40.8, TB51, TB54, TB64, CFP6, CFP7, CFP7A, CFP7B, CFP8A, CFP8B, CFP9, CFP10, CFP11, CFP16, CFP17, CFP19, CFP19A, CFP19B, CFP20, CFP21, CFP22, CFP22A, CFP23, CFP23A, CFP23B, CFP25, CFP25A, CFP27, CFP28, CFP28B, CFP29, CFP30A, CFP30B, CFP50, CWP32, hspX (альфа-кристаллический антиген), АРА, сухой туберкулин, очищенный от белков среды (PPD), ST-CF, РРЕ68,
35 LppX, PstS-1, PstS-2, PstS-3, HBHA, GroEL, GroEL2, GrpES, LHP, 19kDa липопротеин,
71kDa, RD1-ORF2, RD1-ORF3, RD1-ORF4, RD1-ORF5, RD1-ORF8, RD1-ORF9A, RD1-ORF9B, Rvl984c, Rv0577, Rvl827, BfrB, Tpx. Rvl352, Rvl810, PpiA, Cut2, FbpB, FbpA, FbpC, DnaK, FecB, Ssb, RpIL, FixA, FixB, AhpC2, Rv2626c, Rvl211, Mdh, Rvl626, Adk, CIpP, SucD (Belisle et al, 2005; US 7 037 510; US 2004/0057963; US 2008/0 199 493; US 2008/0 267 990), или, по меньшей мере, одну антигенную часть или антигенную детерминанту Т-клетки любого из вышеупомянутых антигенов.
Антигены гепатита
Был описан ряд антигенов гепатита, подходящих для использования в настоящем изобретении. Типичные антигены гепатита С включают С - р22, El - др35, Е2 - др70, NS1 - р7, NS2 - р23, NS3 - р70, NS4A - р8, NS4B - р27, NS5A - р56/58 и NS5B - р68, подходящие для применения в настоящем изобретении, вместе с одной или более антигенными частями или полученными из них антигенными детерминантами (по одному или в комбинации). Предметом рассмотрения являются все способные вызывать иммунный ответ антигены гепатита, независимо от того, описаны они сейчас или нет.
Антигены гриппа
Был описан ряд антигенов гриппа, подходящих для использования в настоящем изобретении. Типичные антигены гриппа, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают РВ, РВ2, РА, любой из белков гемагглютинина (НА) или нейрамимидазы (NA), NP, М и NS, вместе с одной или несколькими антигенными частями или полученными из них антигенными детерминантами (по одному или в комбинации). Предметом рассмотрения являются все способные вызывать иммунный ответ антигены гриппа, независимо от того, описаны они сейчас или нет.
Антигены сибирской язвы
Ряд антигенов В. сибирской язвы идентифицированы в качестве потенциальных кандидатов для разработки вакцины и полезны в настоящем изобретении. Например, РА83 является одним из таких антигенов для разработки вакцин. В настоящее время доступна только одна лицензированная FDA вакцина против сибирской язвы, называемая "Адсорбированная сибиреязвенная вакцина" (AVA) или BioThrax(r). Данная вакцина получена из бесклеточного супернатанта неинкапсулированного штамма В. сибирской язвы, адсорбированного адъювантом алюминия. РА является основным иммуногеном в AVA. Другие примеры антигенов сибирской язвы, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают: защитный антиген (РА или РА63), LF и EF (белки), капсулу полигамма-D
глутамата, споровый антиген (специфические компоненты эндоспоры), BcIA (специфические белки экзоспория) , ВхрВ (споро-ассоциированный белок) и секретируемые белки. Предметом рассмотрения являются все способные вызывать иммунный ответ антигены сибирской язвы вместе с одной или более антигенными частями или полученными из них антигенными детерминантами, независимо от того, описаны они сейчас или нет.
Антигены туляремии
Ряд антигенов F. туляремии идентифицированы в качестве потенциальных кандидатов для разработки вакцины и полезны в настоящем изобретении. Например, АсрА и Ig 1С представляют собой антигены, подходящие для разработки вакцины. Другие примеры антигенов туляремии, подходящих для использования в настоящем изобретении, включают: О-антиген, CPS, белки наружной мембраны (напр., FopA), липопротеины (напр., Tul4), секретируемые белки и липополисахарид. Предметом рассмотрения являются все способные вызывать иммунный ответ антигены туляремии вместе с одной или более антигенными частями или полученными из них антигенными детерминантами, независимо от того, описаны они сейчас или нет.
Антигены бруцеллеза
Ряд антигенов В.бруцеллеза идентифицированы в качестве потенциальных кандидатов для разработки вакцины и полезны в настоящем изобретении. Например, Отр16 является одним из таких антигенов для разработки вакцин. Другие примеры антигенов бруцеллеза, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают: О-антиген, липополисахарид, белки наружной мембраны (напр., Отр16), секретируемые белки, рибосомные белки (напр., L7 и L12), бактериоферритин, р39 (предполагаемый периплазматическй связывающий белок), groEL (белок теплового шока), люмазинсинтаза, поверхностный белок BCSP31, липопротеин PAL16.5 ОМ, каталаза, периплазматический белок 26 kDa, 31 kDa Omp31, 28 kDa Omp, 25 kDa Omp и липопротеин 10 kDa. Предметом рассмотрения являются все способные вызывать иммунный ответ антигены бруцеллеза вместе с одной или более антигенными частями или полученными из них антигенными детерминантами, независимо от того, описаны они сейчас или нет.
Антигены менингита
Ряд антигенов N.менингококка идентифицированы в качестве потенциальных кандидатов для разработки вакцины и полезны в настоящем изобретении. Например, Cys6, РогА, РогВ, FetA и ZnuD представляют собой антигены, подходящими для разработки вакцин. Другие примеры антигенов менингита,
подходящие для использования в настоящем изобретении, включают: О-антиген, связывающий белок фактора Н (fHbp), TbpB, NspA, NadA, белки наружной мембраны, CPS группы В, секретируемые белки и липополисахарид. Предметом рассмотрения являются все способные вызывать иммунный ответ антигены менингита вместе с одной или более антигенными частями или полученными из них антигенными детерминантами, независимо от того, описаны они сейчас или нет.
Антигены лихорадки денге
Ряд антигенов флавивируса идентифицированы как потенциальные кандидаты для разработки вакцины при лечении лихорадки денге и полезны в настоящем изобретении. Например, белки оболочки вируса денге El - Е4 и мембранные белки Ml - М4 являются антигенами, подходящими для разработки вакцины. Другие примеры антигенов лихорадки денге, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают: С, ргеМ, 1, 2А, 2В, 3, 4А, 4В и 5. Предметом рассмотрения являются все способные вызывать иммунный ответ антигены лихорадки денге вместе с одной или более антигенными частями или полученными из них антигенными детерминантами, независимо от того, описаны они сейчас или нет.
Антигены лихорадки Эбола
Ряд антигенов вируса Эбола идентифицированы как потенциальные кандидаты на разработку вакцины для лечения лихорадки Эбола и полезны в настоящем изобретении. Например, заирский филовирус Эбола и суданский вирус Эбола, антигены шипа вириона геликопротеинового предшественники ZEBOV-GP и SEBOV-GP, соответственно, пригодны для разработки вакцины. Другие примеры антигенов вируса Эбола, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают: NP, vp35, vp40, GP, vp30, vp24 и L. Предметом рассмотрения являются все способные вызывать иммунный ответ антигены вируса Эбола вместе с одной или более антигенными частями или полученными из них антигенными детерминантами, независимо оттого, описаны они сейчас или нет.
Антигены лихорадка Западного Нила
Ряд антигенов лихорадки Западного Нила идентифицированы как потенциальные кандидаты для разработки вакцины для лечения инфекции и полезны в настоящем изобретении. Например, антиген оболочки флавивируса (Е) из вируса Западного Нила (WNV) представляет собой нетоксичный белок, экспрессированный на поверхности вирионов WNV (WNVE) и пригоден для разработки вакцины. Другие примеры антигенов WNV, подходящие для
использования в настоящем изобретении, включают: Ср, Prm, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5.
Предметом рассмотрения являются все способные вызывать иммунный ответ антигены лихорадки Западного Нила вместе с одной или более антигенными частями или полученными из них антигенными детерминантами, независимо от того, описаны они сейчас или нет.
Вышеуказанные или родственные антигены являются примерными, а не ограничивающими объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также содержащему эффективное количество изобретению или его фармацевтически фармацевтически приемлемый носитель.
относится к лекарственному препарату, пептидного конъюгата по настоящему приемлемой соли или растворителя и
В соответствии с настоящим изобретением лекарственные препараты могут содержать эффективное количество двух или более пептидных конъюгатов или их смесь. В некоторых вариантах осуществления, лекарственные препараты могут содержать один или более пептидных конъюгатов и один или более пептидов, как описано здесь.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к носителю (адъюванту или несущей лекарственное вещество среде), который может вводиться пациенту вместе с пептидным конъюгатом по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью или растворителем и фармацевтически приемлемым носителем.
Фармацевтически приемлемые носители, которые могут использоваться в композициях, включают, не ограничиваясь: ионообменные смолы, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, самоэмульгирующиеся системы лекарственной доставки (SEDDS), такие как сукцинат d-a-токоферол полиэтиленгликоля 1000, поверхностно-активные вещества, используемые в фармацевтических лекарственных формах, например Твин, или другие аналогичные полимерные матрицы доставки, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, неполные глицеридные смеси насыщенных растительных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, натрия моногидрофосфат, дикалия гидрофосфат, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, полиакрилаты, воски, полиэтилен
полиоксипропиленовый блок- полимеры, полиэтиленгликоль и ланолин. Также для усиления доставки могут с успехом использоваться: циклодекстрины, такие как а-, 3- и у-циклодекстрин, или их химически модифицированные производные, такие как гидроксиалкилциклодекстрины, включая 2- и З-гидроксипропил-З-циклодекстрины или другие солюбилизированные производные. Масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или диспергирующее вещество, или карбоксиметилцеллюлозу, или аналогичные диспергирующие реагенты, которые обычно используются в составе фармацевтически приемлемых лекарственных форм, таких как эмульсии и суспензии.
Композиции составлены таким пациенту по любому выбранному пути пероральный прием или парентеральное внутримышечное и внутривенное).
образом, чтобы их можно было вводить введения, включая, не ограничиваясь, введение (включая местное, подкожное,
Например, композиции могут быть составлены с соответствующим фармацевтически приемлемым носителем (включая эксципиенты, разбавители, вспомогательные вещества и их комбинации), выбранным с учетом предполагаемого пути введения и обычной фармацевтической практики. Например, композиции вводятся перорально в виде порошка, жидкости, таблетки или капсулы или местно в виде мази, крема или лосьона. Подходящие составы могут содержать по мере необходимости дополнительные реагенты, включая эмульгирующие, антиоксидантные, ароматизирующие или красящие реагенты, и могут адаптироваться для немедленного, замедленного, модифицированного, устойчивого, импульсного или контролируемого высвобождения.
Композиции составляются с целью оптимизации биодоступности, иммуногенности или для сохранения концентрации плазмы, крови или ткани в иммуногенном или терапевтическом диапазоне, в том числе в течение длительного периода времени. Контролируемые препараты доставки также могут использоваться для оптимизации концентрации антигена, например в месте действия.
Композиции могут составляться для периодического введения, например для обеспечения непрерывного воздействия. Стратегии для вызова полезного иммунологического ответа представляют собой стратегии, которые используют одну или более "бустерных" вакцинаций, и они хорошо известны и одобрены в отрасли техники, к которой относится данное изобретение.
Композиции могут вводиться парентерально. Примеры парентеральных лекарственных форм включают: водные растворы, изотонический раствор или 5%
раствор активного реагента в глюкозе, или другие хорошо известные фармацевтически приемлемые эксципиенты. В качестве фармацевтических эксципиентов для доставки терапевтического реагента могут использоваться, например, циклодекстрины или другие солюбилизирующие агенты, хорошо известные специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение.
Примеры лекарственных форм, подходящих для перорального введения, включают, не ограничиваясь: таблетки, капсулы, пастилки для рассасывания или подобные формы, или любые жидкие формы, такие как сиропы, водные растворы, эмульсии и тому подобное, способные создать терапевтически эффективное количество композиции. Капсулы могут содержать любые типичные фармацевтически приемлемые материалы, например, желатин или целлюлозу. Таблетки составляются в соответствии с обычными процедурами путем прессования смесей активных ингредиентов с твердым носителем и скользящим веществом. Примерами твердых носителей являются крахмал и сахарный бентонит. Активные ингредиенты также вводятся в виде таблетки с твердой оболочкой или капсулы, содержащей связующее вещество, например лактозу или маннитол, обычный наполнитель и таблетирующий агент.
Примерами лекарственных форм, подходящих для трансдермального введения, являются, не ограничиваясь: трансдермальные пластыри, трансдермальные бинты и тому подобное.
Примерами лекарственных форм, подходящих для местного введения композиций, являются: любой лосьон, ватная палочка, спрей, мазь, паста, крем, гель и т. д., независимо от того, наносятся ли они непосредственно на кожу или через посредника, например с помощью ватного диска, пластыря и тому подобное.
Примерами лекарственных форм, подходящих для введения суппозиториев композиций, являются: любая твердая лекарственная форма, вставленная в отверстие тела, в частности, вставленнная ректально, вагинально и уретрально.
Примерами лекарственных форм, подходящих для инъекции композиций, являются: болюсное введение, например однократное или многократное введение путем внутривенной инъекции, подкожного и внутримышечного введения или перорального введения.
Примерами лекарственных форм, подходящих для введения композиций длительного действия являются: гранулы пептидных конъюгатов или твердых форм,
в которых пептидные конъюгаты заключены в матрицу биоразлагаемых полимеров, микроэмульсий, липосом или микрокапсулированы.
Примерами инфузионных устройств для композиций являются: инфузионные насосы для подачи требуемого количества доз или равновесного введения и имплантируемые дозаторы лекарственных средств.
Примерами имплантируемых инфузионных устройств для композиций являются: любая твердая форма, в которую инкапсулированы пептидные конъюгаты, или диспергированы по всему биоразлагаемому полимеру или синтетическому полимеру, например, силикону, силиконовому каучуку, силастику или аналогичному полимеру.
Примерами лекарственных форм, подходящих для трансмукозального введения композиции являются: растворы длительного действия для клизмы, вагинальные суппозитории, тампоны, кремы, гели, пасты, пены, аэрозоли, порошки и аналогичные препараты, содержащие в дополнение к активным ингредиентам такие носители, которые известны и соответствуют отрасли техники, к которой относится данное изобретение. Такие лекарственные формы включают формы, подходящие для ингаляции или инсуффляции композиций, включая композиции, содержащие растворы и/или суспензии в фармацевтически приемлемых, водных или органических растворителях или их смесях, и/или порошках. Для трансмукозального введения композиций используется любая слизистая оболочка, но обычно используют носовые, внутриротовые, вагинальные и ректальные ткани. Препараты, подходящие для назального введения композиций, вводятся в жидкой форме, например, в виде назального спрея, назальных капель или путем аэрозольного введения с помощью ингалятора, включая водные или масляные растворы полимерных частиц. Препараты получают в виде водных растворов, например, растворе хлорида натрия, растворах бензилового спирта или других подходящих консервантов, стимуляторов абсорбции для повышения биодоступности, фторуглеродов и/или других солюбилизирующих или диспергирующих агентов, известных в отрасли техники, к которой относится данное изобретение.
Примерами лекарственных форм, подходящих для внутри ротового или подязычного введения композиций являются: пастилки для рассасывания, таблетки и тому подобное. Примерами лекарственных форм, подходящих для офтальмологического введения композиций, являются вставки и/или композиции, содержащие растворы и/или суспензии в фармацевтически приемлемых, водных или органических растворителях.
Примеры препаратов композиций, включая вакцины, можно найти, например, у Sweetman, S. С. (Ed.). Martindale. The Complete Drug Reference, 33rd Edition, Pharmaceutical Press, Chicago, 2002, 2483 pp.; Aulton, M. E. (Ed.) Pharmaceutics. The Science of Dosage Form Design. Churchill Livingstone, Edinburgh, 5 2000, 734 pp.; и, Ansel, H. C, Allen, L. V. и Popovich, N. G. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed., Lippincott 1999, 676 pp. Эксципиенты, используемые в производстве систем доставки лекарств, описаны в различных публикациях, известных специалистам в отрасли техники, к которой относится данное изобретение, включая, например, Kibbe, Е. Н. Handbook of Pharmaceutical
10 Excipients, 3rd Ed., American Pharmaceutical Association, Washington, 2000, 665 pp. USP также предоставляет примеры пероральных лекарственных форм с модифицированным высвобождением, включая препараты, приготовленные в виде таблеток или капсул. См., например, The United States Pharmacopeia 23/National Formulary 18, The United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville MD, 1995
15 (здесь и далее "USP"), где также описаны испытания лекарственного средства, оказывающего специфический лечебный эффект при конкретной болезни для определения способности его высвобождения из таблеток и капсул с продленным высвобождением активного вещества и модифицированным высвобождением. Испытание USP для определения способности высвобождения из таблеток и капсул с
20 продленным высвобождением активного вещества и модифицированным высвобождением основано на растворении единицы дозирования лекарственного средства относительно истекшего времени испытания. Описания различной аппаратуры для испытания и порядок проведения можно найти в USP. Дальнейшие указания относительно анализа лекарственных форм с продленным высвобождением
25 предоставлены F.D.A. (См., Guidance for Industry. Extended release oral dosage forms: development, evaluation, and application of in vitro/in vivo correlations. Rockville, MD: Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration, 1997).
Хотя композиция может содержать один или более внешних адъювантов, но в некоторых вариантах осуществления это необязательно. В некоторых вариантах 30 осуществления, пептидный конъюгат включает антигенную детерминанту и является самоадъювантным.
Настоящее изобретение относится к способу вакцинации или способу вызывания иммунного ответа у пациента, включающему введение пациенту эффективного количества пептидного конъюгата в соответствии с настоящим 35 изобретением. Настоящее изобретение также относится к применению пептидного конъюгата для вакцинации или вызывания иммунного ответа у пациента и использованию пептидного конъюгата при изготовлении лекарственного средства для вакцинации или вызывания иммунного ответа у пациента.
Настоящее изобретение также относится к способу вакцинации или способу вызывания иммунного ответа у пациента, включающему введение пациенту эффективного количества лекарственного препарата в соответствии с настоящим изобретением. Настоящее изобретение также относится к применению лекарственного препарата для вакцинации или вызывания иммунного ответа у пациента и использованию одного или более пептидных конъюгатов при изготовлении лекарственного средства для вакцинации или вызывания иммунного ответа у пациента.
Предметом рассмотрения является введение или использование описанных здесь одного или более пептидов и/или одного или более пептидных конъюгатов, например одного или более пептидов, описанных здесь, вместе с одним или более пептидными конъюгатами для вакцинации или вызывания иммунного ответа у пациента.
Если вводятся или используются два или более пептидных конъюгата или один или более пептидов и один или более пептидных конъюгата, то два или более пептидных конъюгата или один или более пептидов и один или более пептидных конъюгатов могут вводиться или использоваться одновременно, последовательно, или по отдельности.
"Пациент" относится к позвоночному млекопитающему, например
человеку. Млекопитающие включают, не ограничиваясь: людей,
сельскохозяйственных животных, животных используемых в спорте, домашних
животных, приматов, мышей и крыс.
"Эффективное количество" представляет собой количество, достаточное для получения целительных или требуемых результатов, включая клинические результаты. Эффективное количество вводится одним или несколькими различными путями введения.
Эффективное количество будет варьироваться в зависимости, среди прочих факторов, от обнаруженного заболевания, тяжести заболевания, возраста и относительного здоровья пациента, действенности вводимого соединения, способа введения и требуемого лечения. Специалист в данной области способен определить соответствующие дозировки с учетом любых других соответствующих факторов.
Эффективность композиции оценивается in vitro и in vivo. Например, композиция может испытываться in vitro или in vivo на ее способность вызывать клеточно-опосредованный иммунный ответ. Для исследований in vivo композицию можно давать или вводить животному (напр., мыши), а затем оценивать ее влияние
на вызов иммунного ответа. На основании результатов можно определить соответствующий диапазон доз и путь введения.
Композицию можно вводить в виде разовой дозы или по схеме введения многократных доз. Схема введения многократных доз может использоваться в режиме первичной иммунизации и/или в режиме бустерной иммунизации.
В некоторых вариантах осуществления, вызывание иммунного ответа приводит к повышению или усилению иммунного ответа. В примерах осуществления, вызывание иммунного ответа активирует гуморальный и клеточно-опосредованный ответ.
В некоторых вариантах осуществления, вызывание иммунного ответа создает иммунитет.
Иммунный ответ вызывается для лечения заболевания или состояния. Специалисту в данной области техники очевидно, что описанные здесь пептидные конъюгаты полезны для лечения множества заболеваний и состояний, в зависимости, например, от природы антигенной детерминанты.
В некоторых вариантах осуществления, заболевания или состояния выбраны из тех из них, которые связаны с различными описанными здесь антигенами.
В некоторых вариантах осуществления, инфекционное заболевание, рак или повторное вирусное заболевание после трансплантации костного мозга или последующая индукция глубокой иммуносупрессии связаны с любой другой причиной.
Используемый здесь термин "лечение" и связанные с ним термины, такие как "ход лечения" и "проведение лечения" относятся в целом к лечению человека или животного у которых достигается требуемый терапевтический эффект. Терапевтический эффект может представлять собой, например, ингибирование, снижение, аугментацию, прекращение или профилактику заболевания или состояния.
Композиции могут использоваться для вызывания общего и/или мукозного иммунитета. Повышенный общий и/или мукозный иммунитет отражается в усиленном иммунном ответе ТН1 и/или ТН2. Усиленный иммунный ответ может включать увеличение продуцирования IgGl и/или IgG2a, и/или IgA.
ПРИМЕРЫ 1. Пример 1
Данный пример описывает получение, в соответствии с изобретением, пептидного конъюгата 3 посредством тиол-ен реакции.
5 1.1 Общие сведения и способы
Защищенные аминокислоты и связующие реагенты приобретались в компании GL-Biochem (Шанхай). Смолы, используемые в твердофазных синтезах, представляли собой смолы марки TentaGel(r), дериватизированные линкером, а первый (С-концевой) остаток пептидной последовательности из компании Rapp 10 Polymere GmbH (Тюбинген) и другие растворители и реагенты марки Novabiochem(r) были получены из компании Sigma (Сент-Луис, Миссури).
Описанный ниже синтез пептида осуществляли с использованием стандартного итерационного способа Fmoc твердофазного синтеза пептидов в синтезаторе пептида Tribute(tm) (Protein Technologies International, Tucson, AZ).
15 Типичный цикл снятия защиты и связывания, проведенный по шкале 0,1
ммоль, привел к удалению защитной группы Fmoc из связанной со смолой аминокислоты после двух обработок 20% пиперидином в DMF (4 мл х 5 мин), а затем промывки смолы DMF. В отдельном сосуде Fmoc аминокислоту (0,5 ммоль) и связующий агент (1-бисдиметиламинометилен-1Н-1,2,3-триазоло-4,5-Ь-пиридиний-
20 3-оксид гексафторфосфат (HATU), 0,45 ммоль) растворяли в ДМФ (1,5 мл) и добавляли основание (4-метилморфолин (NMM), 1 ммоль). После перемешивания в течение 1 минуты данный раствор переносили в смолу, которую перемешивали при комнатной температуре (RT) в течение 1 часа, сушили и промывали.
Отщепление пептида (шкала 0,1 ммоль) достигалось суспендированием 25 смолы в 5 мл трифторуксусной кислоты (TFA), содержащей 5% (об/об) этандитиола (EDT), и перемешиванием при комнатной температуре в течение 3 часов. Затем добавляли триизопропилсилан (TIPS) до 1% (об/об) и продолжали перемешивание еще в течение пяти минут перед сливом TFA в охлажденный диэтиловый эфир (40 мл). Осаждаемый материал осаждали центрифугированием, эфир отбрасывали, 30 осадок промывали один раз эфиром (25 мл) и сушили на воздухе или лиофилизировали.
Обращенную фазу (RP)-HPLC осуществляли в системе HPLC Dionex Ultimate 3000 с УФ-детектированием при длине волны 210 нм или 225 нм. Для полупрепаративной очистки образец пептида вводили в обращенно-фазную колонку
Phenomenex Gemini C18 (5u, HOA, 10x250 мм), уравновешенную в подходящей смеси элюента А (вода/0,1% TFA) и элюента В (MeCN/0,1% TFA), а затем для элюирования составляющих компонентов генерировали увеличивающийся градиент элюента В. Анализ ВЭЖХ проводили аналогичным образом на колонке Phenomenex 5 Gemini С18 (3u, HOA, 4,6 x 150 мм).
Масс-спектры с низким разрешением получали на масс-спектрометре Agilent Technologies 6120 Quadrapole.
Спектры ЯМР получали на спектрометра Bruker BRX400, работающем на частоте 400 МГц для гН ЯМР и 100 МГц для 13С ЯМР.
10 1.2 Синтез пептида
Пептид 1 (последовательность приведена в Таблице 1) синтезировали, как описано выше в разделе Общие сведения и описывали ниже (Схема 1).
Пептид представляет собой комбинацию хорошо известного CMV рр65 пептида (NLVPMVATV [SEQ ID No: 122]), где остаток метионина заменен остатком Cys 15 (tBu), чтобы избежать нежелательных побочных реакций в этом месте в тиол-ен реакции, дериватизированного на N-конце с помощью полилизиновой солюбилизирующей метки и свободной тиоловой группы.
20 (i) Итеративный Fmoc-SPPS; (ii) Fmoc-Cys (Trt)-OH, HATU, NMM, DMF; (iii)
20% пиперидин/DMF; (iv) АсгО/NMM, DMF; (v) TFA/EDT.
После синтеза пептидной последовательности до предконцевой аминокислоты, используя итеративный Fmoc-SPPS, вводили Fmoc-цистеин в виде N
концевого остатка пептида на смоле путем реакции Fmoc-Cys(Trt)-OH, HATU и 4-метилморфолина в DMF. Группу Fmoc удаляли, используя 20% пиперидин в DMF.
Полученную аминогруппу превращали в ацетамид путем обработки смесью 20% уксусного ангидрида в DMF (2 мл) и 4-метилморфолина (1 ммоль).
После отщепления пептида от смолы с помощью TFA/EDT и его осаждения в эфире твердое вещество растворяли в воде/MeCN в соотношении 1:1 и лиофилизировали. Затем пептид очищали способом ВЭЖХ с обращенной фазой с получением материала со степенью очистки больше 95%.
Пептидный конъюгат 3 синтезировали из пептида 1 тиол-ен реакцией, как показано ниже (Схема 2).
Схема 2
(vi) винилпальмитат, DMPA, tBuSH, NMP, 365 нм, глубина превращения 83% исходя из ВЭЖХ (49% 2; 34% 3).
Пептидный субстрат 1 (1,7 мг, 1 мкмоль) и винилпальмитат (20 мг, 70 цмоль, семьдесят эквивалентов) взвешивали в небольшом полипропиленовом флаконе, оснащенном магнитной мешалкой и затем добавляли 100 цл дегазированной NMP, с последующим добавлением 0,5 цмоль DMPA и 3 цмоль 'BuSH
(путем добавления 10 цл раствора 6,5 мг DMPA и 17 цл 'BuSH в 0,5 мл дегазированного NMP). Сосуд продували азотом и облучали в течение 30 минут при длине волны 365 нм и интенсивном перемешивании смеси.
Анализ образца реакционной смеси с помощью ВЭЖХ (см. Рисунок 1) показал некоторое остаточное исходное вещество (пик а) и образование как моно-памитоилированного пептида 2, так и бис-памитоилированного пептида 3 (пики b и с, соответственно).
Затем добавляли воду и ацетонитрил (по 200 цл каждого) и лиофилизировали полученную смесь, а компоненты выделяли способом ВЭЖХ с обращенной фазой.
1.4 Анализ пептидного конъюгата 3
Масс-спектры с низким разрешением пиков b и с, изображенные на Рисунке 1 представлены на Рисунках 2 и 3 соответственно.
Масс-спектр пика с подтверждает введение второй 2-пальмитоилоксиэтильной группы в пептидный субстрат (М+282).
Не вдаваясь в теорию, считается, что после облучения реакционной смеси, содержащей тиолированный пептид, образуемый тиильный радикал затем реагирует с молекулой винилпальмитата с получением промежуточного радикала 4 (Схема 3), который затем либо (i) подавляется, с получением моно-пальмитоилированного продукта 2, или (М) вступает в реакцию с другой молекулой винилпальмитата, с получением более неполярного бис-пальмитоилированного продукта 3. Считается, что эти два пути являются конкурентоспособными, причем концентрации винилпальмитата, использованные в этом эксперименте (семьдесят эквивалентов), благоприятствуют теломеризации, чтобы получить продукт 3. Размножения более высокого порядка не наблюдалось (т. е. отсутствовали продукты, являющиеся результатом добавления более двух молекул винилпальмитата).
Схема 3
HS H31C15> S^ H3ICIAO^S
AcNH-Cys-SKKKKNLVPC(tBu)VATV > AcNH-Cys-SKKKKNLVPC(tBu)VATV
л ^- °
4 промежуточных - м
Ультрафиолет радикала f RT^O^^^
ч Теломеризация после подавления
RSH ч Подавление
' н31с15 о
о ° 5
H3lCi5^0^^S> H31C16'^4O'^'N
AcNH-Cys-SKKKKNLVPC(tBu)VATV AcNH-Cys-SKKKKNLVPC(tBu)VATV
Очевидным было некоторое окисление продуктов 2 и 3 (Рисунок 1, пики е 5 и f оба М+16), предположительно, на вновь образованном тиоэфире. Возможно это связано с трудностью исключения кислорода из используемой мелкомасштабной системы. Эти оксиды могут быть легко разложены соответствующими тиоэфирами.
2. Пример 2
Данным примером исследуется:
10 1. мутация и человеческий агонизм TLR2 по настоящему
изобретению в двух вариантах - homoPam2Cys(NH2)-SKKKK и homoPam2Cys(NHAc)-SKKKK - по сравнению с известными агонистами TLR2 PamlCys-SKKK, Pam2Cys-SKKKK и Pam3Cys-SKKKK. Во всех случаях агонисты приготовлялись в лабораторных условиях и выделялись способом ВЭЖХ с
15 обращенной фазой, как описано в Примере 1, за исключением Pam3Cys-
SKKK, который приобретался в компании InvivoGen. Кроме того, удерживание агонизма TLR2, в ходе конъюгирования с антигенной детерминантой короткого пептида, оценивали по сравнению с Pam3Cys-SKKKK. Как описано в настоящем изобретении, в данном примере homoPam2Cys(NHAc)-SKKK-,NLV
20 получали как продукт 3 (выделялся способом ВЭЖХ с обращенной фазой, как
описано в Примере 1), за исключением того, что последовательность пептидного конъюгта представляла собой NLVPMVATVK(Ac). Таким же образом получали соответствующий Pam2Cys-SKKKK-NLVPMVATVK(Ac).
2. Высвобождение и презентирование конъюгированных коротких
25 синтетических пептидов и длинных синтетических пептидов на родственном
клоне CD8+ Т-клетки. Как описано в настоящем изобретении, в данном примере homoPam2Cys(NHAc)-SKKK-,NLV получали как продукт 3 (выделялся
способом ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано в Примере 1), за
исключением того, что последовательность пептидного конъюгта
представляла собой NLVPMVATVK(Ac), а не NLVP(Tbu)VATVK(Ac), чтобы
сохранить распознавание Т-клетки пептида. Высвобождение и
5 презентирование сравнивали с результатами, полученными с помощью
пептидподходящих конструкций PamlCys-SKKKK и Pam2Cys-SKKKK.
3. Обработка и презентирование конъюгированного длинного синтетического пептида в родственный клон CD8+ Т-клетки. Как описано в настоящем изобретении homoPam2Cys(NHAc)-SKKK-'VPG' получали как
10 продукт 3 (выделялся способом ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано в
Примере 1, за исключением того, что последовательность пептидного конъюгата представляла собой VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR (SEQ ID No: 113). Обработка и презентирование HLA-A2, рестриктированной антигенной детерминанты EFTVSGNIL (SEQ ID No: 114), из этой более длинной
15 последовательности сравнивали с таковой, наблюдаемой только с длинным
пептидом, и с помощью пептидподходящей конструкции PamlCys-SKKKK.
Все конструкции, используемые при исследовании агонизма TLR2 и обработке и презентировании пептидов в CD8+ Т-клетках, обозначены как показано в Таблице 2 ниже:
20 Таблица 2. Пептидные конъюгаты
Липидный/линкерный компонент
Пептид
ИД № пептидной последовательности
500
VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR
510
PamlCys-SKKKK
511
PamlCys-SKKKK
NLVPMVATVK(Ac)
122
512
PamlCys-SKKKK
VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR
520
Pam2Cys-SKKKK
Н/Д
521
Pam2Cys-SKKKK
NLVPMVATVK(Ac)
122
530
Pam3Cys-SKKKK
540
Homo-Pam2Cys(NH2)-SKKKK
550
Homo-Pam2Cys(NHAc)-
SKKKK
551
Homo-Pam2Cys(NHAc)-SKKKK
NLVPMVATVK(Ac)
122
552
Homo-Pam2Cys(NHAc)-
VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR
113
2.1 Агонизм толл-подобного рецептора 2 (TLR2), использующего клетку HekBlue
Среда выявления HEK-Blue(tm), HEK-Blue(tm)-hTLR2 и HEK-Blue(tm)-mTLR2 приобретались в компании InvivoGen. Эти клетки HEK-Blue получали путем 10 котрансфекции как гена-репортера SEAP (секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы), так и TLR2 человека или мыши соответственно. Ген-репортер SEAP находится под регуляцией минимальным стимулятором IFN-B, слитым с пятью АР-1 и пятью сайтами связывания NFkB. Клетки культивировали в соответствии с инструкциями изготовителя.
15 В день анализа агонисты TLR 510, 520, 530, 540, 550 или PBS
(негативная регуляция) добавляли в указанных концентрациях к 20 мкл свободной от эндотоксина воды в 96-луночном планшете. Клетки -hTLR2 HEK-Blue(tm) или клетки -hTLR2 HEK-Blue(tm) ресуспендировали при ~2,78х105 клеток/мл в среде обнаружения HEK-Blue(tm) и в каждую лунку добавляли 180 мкл клеточной суспензии (~5х104 20 клеток). Клетки инкубировали в течение 10-12 часов при температуре 37 °С в 5% СО2. Уровень экспрессии SEAP определяли количественно с использованием спектрофотометра для прочтения планшетов EnSpire (PerkinElmer) при длине волны 635 нм. Данные представлены как среднее значение +/- SD ABS или значения mABS (635 нм) для трех параллельных лунок после вычитания фона.
2.2.1 Выводы
В HEK-Blue(tm)-mTLR2 и в HEK-Blue(tm)-hTLR2 homoPam2Cys (NHAc) -SKKKK вызвал эквивалентное продуцирование SEAP для наиболее эффективного испытываемого агониста (Pam2Cys-SKKKK) при длине волны более 1 нм и 5 сопоставимое продуцирование в суб-нМ-концентрациях (Рисунок 4А). В обеих системах homoPam2Cys(NHAc)-SKKKK был явно более мощным агонистом, чем Pam3Cys-SKKKK или homoPam2Cys(NH2)-SKKKK. homoPam2Cys(NH2)-SKKKK вызвал эквивалентное продуцирование SEAP для Pam3Cys-SKKKK в HEK-Blue(tm)-mTLR2 и сопоставимое продуцирование в HEK-Blue(tm)-hTLR2 (Рисунок 4А). Оба
10 homoPam2Cys(NHAc/NH2)-SKKKK представляли собой явно более мощные агонисты TLR2, чем PamlCYs-SKKKK. Важно отметить, что в отличие от PamlCys-SKKKK, которые не активны в HEK-Blue(tm)-mTLR2 при суб-мкМ концентрациях, homoPam2Cys(NHAc/NH2) -SKKKK активны в концентрациях HEK-Blue(tm)-mTLR2 и суб-нМ концентрациях -hTLR2 (Рисунок 4А), усиливая будущие применения в
15 трансгенных мышиных моделях. Эти данные показывают, что homoPam2Cys(NHAc/NH2)-SKKKK демонстрирует сравнимую биологическую функцию и активность с известными мощными агонистами TLR1/2 и TLR2/6 Pam3Cys и Pam2Cys.
В обоих HEK-Blue(tm)-mTLR2 и -hTLR2 конъюгирование пептида 20 NLVPMVATVK(Ac) с Pam2Cys-SKKKK вызывало относительную потерю агонизма по сравнению с неконъюгированным Pam3Cys-SKKKK (Рисунок 4В). Было ли это обусловлено построением агрегации, конкретно не было определено. Напротив, конъюгирование пептида NLVPMVATVK(Ac) с homoPam2Cys(NHAc)-SKKKK не приводило к какой-либо потере агонизма, a homoPam2Cys(NHAc)-SKKKK-25 NLVPMVATVK(Ac) оставался более мощным агонистом, чем Pam3Cys-SKKKK, особенно при нМ концентрациях (Рисунок 4С). Эти данные показывают, что homoPam2Cys сохраняет растворимость и биоактивность более сильно, чем Pam2Cys после конъюгирования с гидрофобным пептидным карго и может иметь некоторое отношение к относительной биодоступности этих конструкций in vivo.
30 2.2. Пептидная обработка и презентирование в CD8+ Т-клеточных
клонах
Трансформированные вирусом Эпштейна-Барра TLR2+ HLA-A2+ лимфобластоидные В-клеточные линии (LCL) использовали в качестве антигенпрезентирующих клеток во всех методах обработки и анализа 35 презентирования. LCL инкубировали в течение 16 часов в RF10+ пептиде/конструкции в указанных концентрациях. Необработанные LCL
инкубировали только в RF10. Инкубацию LCL/конструкции проводили на 96-луночных планшетах (U-образное дно, компании BD Biosciences) или на 48 луночных планшетах (плоское дно, компании BD Biosciences) в зависимости от характера анализа и количества LCL, необходимого на каждую обработку. После инкубации LCL 5 тщательно промывали RPMI 1640 для удаления несвязанной конструкции/пептида.
Для проточно-цитометрического обнаружения клоны CD8+ Т-клетки до посева в лунки АРС предварительно окрашивали 0,5 мкМ CellTrace(tm) Violet ("CTV") (компании Life Technologies(tm)) следуя инструкции изготовителя. Загруженные,
10 промытые LCL и CTV-окрашенные клоны Т-клетки высевали в 96-луночные планшеты (U-образное дно) в соотношении 4:1 (LCL: Т-клетка) в двух экземплярах (типичные числа используемых клеток составляли 1,25х104 клеток/мл для Т-клеток и 5х104 клеток/мл для АРС). После посева планшеты аккуратно центрифугировали ( <300 х д, 3 минуты), создавая немедленное взаимодействие, и инкубировали в
15 течение 26 часов в стандартном инкубаторе клеточной культуры.
Для обнаружения активации Т-клеток образцы окрашивали анти-С08:
AlexaFluor700 и анти-С0137:РЕ-антителами (оба компании Biolegend). Образцы
инкубировали на льду в течение 30 минут в темноте, а затем дважды промывали 20 промывочным буфером для удаления несвязанного антитела. DAPI (конечная
концентрация 1 мкг/мл) добавляли к каждому образцу непосредственно перед
сбором данных, чтобы исключить живые/неживые клетки.
Сбор данных осуществляли с использованием BD FACSAria II с
программным обеспечением FACSDiva, а анализ данных выполняли с 25 использованием программного обеспечения FlowJo (Treestar). Данные представлены
в виде среднего % + SD живых клонированных клеток, положительных для
экспрессии CD137 (Рисунок 4D-E).
2.2.1 Выводы
30 homoPam2Cys(NHAc)-SKKKK-NLV (551) вызвал сопоставимую активацию
клона Т-клетки в NLV-HecyLMe^Pam2Cys-SKKKK (521) и высокую активацию клона Т-клеток в NLV-Hecyu^-PamlCys-SKKKK (511), вслед за интернализацией и презентированием пептида с помощью LCL (Рисунок 4D). Пунктирные и сплошные линии на рисунке 4D представляют собой фоновую активацию клона Т-клетки и
35 активацию, вызванную коинкубацией с LCL, загруженным 10 нМ свободным пептидом NLV, соответственно. Поскольку пептид NLVPMVATVK(Ac) представляет собой от начала до конца антигенную детерминанту Т-клетки, то в этой системе не требуется обработка пептида, а активация Т-клетки определяется путем
интернализации конструкции, высвобождения пептида и его передачи в путь МНС I LCL.
homoPam2Cys(NHAc)-SKKKK-VPG (552) вызвал высокую активацию клона 5 Т-клетки в VPG-HecyLMen-PamlCys-SKKKK (512), а обе конструкции были выше только в одном пептиде VPG (500) после интернализации и презентирования антигенной детерминанты с помощью LCL (рисунок 4Е). Поскольку высвобождение, например, через активность пептидазы, минимальной антигенной детерминанты EFTVSGNIL из длинного пептида VPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR необходимо для
10 активации Т-клетки, то эти данные свидетельствуют о том, что конъюгация длинных синтетических пептидов с фрагментами homoPam2Cys улучшает обработку и презентирование антигенной детерминанты с помощью TLR2+ антигенпрезентирующих клеток, предположительно путем нацеливания пептида на эндо/лизосомальный путь вслед за связыванием поверхности TLR1/2 или TLR2/6 и
15 предполагает, что конъюгация способна улучшить распознавание in vivo пептидных антигенных детерминант с помощью родственных Т-клеток. Пунктирная линия на рисунке 4Е представляет собой фоновую активацию клона Т-клетки.
3. Пример 3
20 Данный пример описывает получение, в соответствии с изобретением,
аминокислотного конъюгата 6 посредством тиол-ен реакции.
3.1 Способ
Облучение раствора общим объемом 1 мкл длиной волны 365 нм, состоящего из Fmoc-Cys-OH (3,4 мг, 10 цмоль), винилпальмитата (141 мг, 500 цмоль)
25 и DMPA (0,5 мг, 2 цмоль), растворенного в CH2CI2 (около 850 цл) в течение 60 минут дает смесь продуктов, состоящую из моно-пальмитоилированного Fmoc-Cys 5 в качестве основного компонента и бис-пальмитоилированного Fmoc-Cys б (m/z ESI, 908,5 [М + Н]) в качестве второстепенного компонента (Схема 4). После выпаривания растворителя каждый компонент выделяют колоночной
30 хроматографией на двуокиси кремния, элюируя сначала смесью 4:1 гексан/этилацетат, переходя затем на смесь 2:1 гексан/этилацетат и в конце на смесь 1:1 гексан/этилацетат. Это давало продукт 5 (4,6 мг, 75%) и продукт б (0,9 мг, 10%).
Схема 4
о о
HN.Fmoc Н31С16^Ч^ 0 н^^тос Н31С16^0
о ° н31с15^о'
Ультрафиолет 5
Данный способ синтеза применим из-за дешевых исходных материалов, 5 осуществления реакции в больших масштабах и относительно легкого выделения продукта.
Однако глубина превращения (по ВЭЖХ) в продукт 6 была низкой, а механизм реакции диктует, что вновь образованный хиральный центр способен обеспечить смесь эпимеров во вновь образованном хиральном центре.
10 4. Пример 4
Данный пример описывает синтез, в соответствии с изобретением, аминокислотного конъюгата 6.
4.1 Способ
Затем осуществляли химический синтез из легкодоступного 3-бутенола, 15 как описано в схеме 5.
Бис-памитолированный продукт б можно получать с различными N-концевыми защитными группами путем реакции с защищенным цистеином, имеющим требуемую защитную группу.
Эпоксид может быть разделен (например, с использованием 20 кинетического гидролиза: М. Tokunaga, 1 F. Larrow, F. Kakiuchi, E. N. Jacobsen, Science, 1997, 277, 936-938) чтбы получить предпочтительный диастереоизомер.
Схема 5
?р I О R-Cys-OlBu \
OTBDMS ?Н Н31С15" О
t / 6 R = Fmoc *R,SorR/S
ОН ОН
102А 102В
R- или S- энантимеры
(i) TBDMS-C1, imidazole, CH2C12; (ii) mcpba; (iii) CH2C12, HC1/H2S04; (iv) Пальмитиновая кислота, DIC, DMAP, THF; (v) Трифторуксусная
Стадия i
100
К перемешиваемому раствору трет-бутилдиметилсилилхлорида (10,60 г, 70 ммоль) и имидазола (4,77 г, 70 ммоль) в CH2CI2 (200 мл) при комнатной температуре добавляли по капле З-бутен-1-ол 100 (5,98 мл, 69 ммоль) в течение 10 мин. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 90 мин. Смесь затем разбавляли ЕГ.2С1 (150 мл) и промывали водой (3 х 100 мл) и соляным раствором (50 мл). Органический слой сушили над безводным MgS04 и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали фильтрованием через силикагель с получением 101 (11,99 г, 91%) в виде бесцветной жидкости.
Стадия П
1 3 О 101 102
Раствор алкена 101 (2,00 г, 10,74 ммоль) в CH2CI2 (10 мл) перемешивали при комнатной температуре. Раствор тСРВА (2,78 г, 16,12 ммоль) в CH2CI2 (25 мл), который сушили над безводным Na2S04, добавляли по капле к перемешиваемому раствору в течение 30 мин. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Смесь затем разбавляли Ег.гО (70 мл), фильтровали через слой Celite(r) и промывали насыщенным водным раствором ЫагБгОз (30 мл), 2М водным раствором NaOH (30 мл) и соляным раствором (30 мл). Органический слой сушили над безводным MgS04 и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (петролейный эфир-ЕЮАс, 3:1) с получением 102 (1,85 г, 85%) в виде бесцветного масла.
SH 6r^^s
TBSOv^/X^ + L^COztBu OH OH 2l^C02tBu
NHFmoc NHFmoc
102 200 103
Раствор тиола 200 (0,53 г, 1,34 ммоль) в CH2CI2 (4 мл) и свежеприготовленную смесь метанола, конц. соляной кислоты и конц. серной кислоты (100:7:1, 2 мл) перемешивали при 0 °С в течение 30 мин. Затем к смеси добавляли эпоксид 102 и полученный раствор нагревали в колбе с обратным холодильником при 40 °С в течение 19 часов. Смесь затем разбавляли CH2CI2 (30 мл), фильтровали через слой Celite(r) и промывали соляным растовором (30 мл). Водный слой экстрагировали CH2CI2 (3 х 30 мл), объединенные органические экстракты сушили над безводным МдБСч и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (гексан-ЕЮАс, 1:3) с получением 103 (0,50 г, 77%) в виде бесцветного масла.
Стадия iv
C15H31 7 о
OH OH L^C02tBu > N J4
2 1
FmocHN" "~C02tBu 103 201
Т с15н31^о,*^г
NHFmoc К перемешиваемому раствору диола 103 (0,327 г, 0,67 ммоль) и пальмитиновой кислоты (0,516 г, 2,01 ммоль) в THF (9 мл) при комнатной температуре добавляли диизопропилкарбодиимид (0,414 мл, 2,68 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (0,01 г, 0,07 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 19 часов. Затем смесь разбавляли EtOAc (30 мл), фильтровали через слой Celite(r) и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (CH2CI2) с получением 201 (0,301 г, 47%) в виде желтого масла.
Стадия у
Раствор диэфира 201 (0,35 г, 0,364 ммоль) в трифторуксусной кислоте (2 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего смесь концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-5 хроматографией (гексан-ЕЮАс, 9:1 -> 0:1) с получением 6 (0,33 г, знач. кол-во) в виде бесцветного масла.
Fmoc-Cys-OH описан в литературе: Н.-К. Cui, Y. Guo, Y. Не, F.-L. Wang, H.-H. Chang, Y. J. Wang, F.-M. Wu, C.-L. Tian, L. Lu, Angew. Chem. Int. Eng., 2013, 52(36), 9558-9562.
10 4.2 Анализ аминокислотного конъюгата 6
Аминокислотный конъюгат 6, синтезированный описанным выше в разделе 4.1 способом, имел те же аналитические свойства, что и для 6, полученного облучением раствора Fmoc-цистеина и винилпальмитата, как описано в Примере 3 (масс-спектры были одинаковы).
15 Спектр ХН ЯМР биспамитоилированного Fmoc-Cys 6 представлен на
Рисунке 5. Полученные характеристики: ХН NMR (400 Мгц, CDCb) 5 7,75 (2Н, d, Fmoc Аг-Н), 7,60 (2Н, d, Fmoc Аг-Н), 7,39 (2Н, t, Fmoc Ar-H), 7,31 (2Н, t, Fmoc Аг-Н), 5,75 (1H, широкий d, NH), 5,06 (1H, m, H-2'), 4,66 (1H, m, H-l), 4,40 (2H, d, CH2 (Fmoc)), 4,26 (1H, t, CH (Fmoc)), 4,11 (2H, m, H-4'), 3,13 (1H, 2x dd, H-2), 3,06 (1H, 2x dd, H-
20 2), 2,76 (2H, m, H-l'), 2,28 (4H, m, H-l"), 2,03, (1H, m, H-3'), 1,94 (1H, m, H-3'), 1,59 (4H, m, H-2"), 1,24 (48H, m, 14xCH2 (пальмитоил)), 0,88 (6H, t, 2хСНз (пальмитоил)). MS (ESI-TOF): m/z [M + H] 908,6065; Cs^seNOsS требует [M + H] 908,6069.
4.3 Получение и использование энантиомерночистых эпоксидов 102А и 102В
25 Диастереомерночистый аминокислотный конъюгат 6 получают с
использованием энантиомерного эпоксида 102А или энантиомерного эпоксида 102В, полученного стереоспецифически из энантиомерночистого исходного материала. Полученный энантиомерный эпоксид можно подвергнуть реакции с тиолом 200 в соответствии с процедурой, аналогичной описанной выше на стадии (iii) раздела 4.1,
или с дисульфидом 804, как описано ниже, для получения соответствующего диастереомерночистого диола ЮЗА или 103В, который затем может быть превращен, как описано здесь, в соответствующий диастереомерночистый конъюгат 6А или 6В.
5 Энантиомерночистый эпоксид 102А и энантиомерночистый эпоксид 102В
получали из L-аспарагиновой кислоты и D-аспарагиновой кислоты соответственно, следуя процедуре, описанной в работе Volkmann R. A. et al. J. Org. Chem., 1992, 57, 4352-4361 для получения (RJ-2-гидроксиэтилоксирана (102A) из L-аспарагиновой кислоты.
10 (5)-2-бромянтарная кислота
К раствору бромида натрия (15,46 г, 150,24 ммоль) в 6N H2SC4 (33 мл) при О °С добавляли L-аспарагиновую кислоту (5,00 г, 37,56 ммоль). К полученной смеси добавляли порциями нитрит натрия (3,11 г, 45,07 ммоль) в течение 90 мин. Реакционную смесь перемешивали при 0 °С еще в течение 2 часов. Смесь затем
15 разбавляли Н2О (17 мл) и экстрагировали с помощью ЕГ.2С1 (100 мл). Водный слой разбавляли соляным раствором (20 мл) и дополнительно экстрагировали с помощью ЕГ.2С1 (3 х 100 мл). Объединенные органические экстракты сушили над безводным Na2S04 и концентрировали в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (2,98 г, 41%) в виде белого твердого вещества. Сырой продукт
20 использовали на последующих стадиях синтеза без дополнительной очистки. [O]D19,7 -71,5 (с 0,46 в EtOAc) (lit -73,5 (с 6,0 в EtOAc); 5н (400 МГц; DMSO) 12,8 (2Н, шир. s, 2 х СО2Н), 4,54 (1Н, dd, J = 8,5, 6,4 Гц, Н-1), 3,10 (1Н, dd, J = 17,2, 8,6 Гц, Н-2), 2,90 (1Н, dd, J = 17,1, 6,4 Гц, Н-2); 5с (100 МГц; DMSO) 171,0 (С, СО2Н), 170,1 (С, СО2Н), 40,5 (СН, С-1), 39,5 (СН2, С-2). Спектроскопические данные согласуются с
25 данными, приведенными в литературе.
(/?)-2-бромянтарная кислота
(к.)-2-бромянтарную кислоту получали следуя процедуре, описанной выше для получения (S) -2-бромянтарной кислоты, но с использованием D-аспарагиновой кислоты вместо L-аспарагиновой кислоты. [O]D20'2 +66,5 (с 0,2 в 30 EtOAc). Полученные спектроскопические данные соответствовали данным для (S)-2-бромянтарной кислоты.
(5)-2-бром-1,4-бутандиол
К раствору (5)-2-бромянтарной кислоты (2,98 г, 15,20 ммоль) в THF (35 мл) при -78 °С добавляли по капле в течение 90 мин комплекс BH3"DMS (4,33 мл,
45,61 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при -78 ° С в течение 2 часов, затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали еще в течение 60 часов. Затем реакционную смесь охлаждали до 0 °С и медленно добавляли МеОН (15 мл). Затем смесь концентрировали в вакууме и остаток разбавляли МеОН (15 мл). 5 Этот процесс повторяли 3 раза, получая указанное в заголовке соединение (2,55 г, знач. кол-во) в виде желтого масла. Сырой продукт использовали на последующих стадиях синтеза без дополнительной очистки. [O]D19,6 -36,8 (с 0,5 в СНСЬ); 5н (400 МГц, CDCb) 4,34 (1Н, dq, J = 7,7, 5,3 Гц, Н-2), 3,92-3,78 (4Н, m, H-l, Н-4), 2,40 (2Н, br s, 2 х ОН), 2,20-2,06 (2Н, т, Н-3); 5с (100 МГц; CDCb) 67,1 (СН2, С-1), 60,1 (СН2, 10 С-4), 55,2 (СН, С-2), 37,8 (СН2, С-3). Спектроскопические данные согласуются с данными, приведенными в литературе.
(/?)-2-бром-1,4-бутандиол
(к.)-2-бром-1,4-бутандиол получали следуя процедуре, описанной выше для получения (5у)-2-бром-1,4-бутандиола, но с использованием (к.)-2-бромянтарной 15 кислоту вместо (Б)-2-бромянтарной кислоты. [O]D21,3 +20,0 (с 0,17 в СНСЬ). Полученные спектроскопические данные соответствовали данным для (SJ-2-бром-1,4-бутандиола.
(/?)-2-гидроксиэтилоксиран (102А)
К раствору (5)-2-бром-1,4-бутандиола (2,31 г, 13,76 ммоль) в CH2CI2 (46 20 мл) при комнатной температуре добавляли CS2CO3 (8,74 г, 24,77 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 72 часов. Затем реакционную смесь фильтровали через слой Celite(r) и концентрировали в вакууме с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла с количественно оцениваемой глубиной превращения. Сырой материал использовали 25 на последующих стадиях синтеза без дополнительной очистки. [O]D22,9 +35,0 (с 0,61 в СНСЬ); 5н (400 МГц; CDCb) 3,83-3,79 (2Н, m, Н-1), 3,12-3,08 (1Н, т, Н-3), 2,81 (1Н, dd, J = 4,8, 4,1 Гц, Н-4), 2,60 (1Н, dd, J = 4,8, 2,8 Гц, Н-4), 2,03-1,95 (1Н, т, Н-2), 1,78 (1Н, t, J = 5,4 Гц, ОН), 1,71 (1Н, dq, J = 14,6, 5,9 Гц, Н-2); 5с (100 МГц; CDCb) 60,0 (СН2, С-1), 50,5 (СН, С-3), 46,5 (СН2, С-4), 34,6 (СН2, С-2). 30 Спектроскопические данные согласуются с данными, приведенными в литературе.
(5)-2-гидроксиэтилоксиран (102В)
(5)-2-гидроксиэтилоксиран (102В) получали, следуя процедуре, описанной выше для получения (к.)-2-гидроксиэтилоксирана (102А), но используя (к.)-2-бром-1,4-бутандиол вместо (5)-2-бром-1,4-бутандиола. [O]D22,9 -35,2 (с 0,23 в
СНСЬ). Полученные спектроскопические данные соответствовали данным для (S)-2-бром-1,4-бутандиола.
Получение диастереомерночистого 6А
C02tBu
нсх
FmocHN4 ^|
'''О
5 К перемешиваемому раствору дисульфида 804 (1,59 г, 2,06 ммоль) в
CH2CI2 (10 мл) при 0 °С добавляли цинковый порошок (0,94 г, 14,42 ммоль) и свежеприготовленную смесь метанола, конц. соляной кислоты и конц. серной кислоты (100:7:1, 5 мл). Полученную смесь перемешивали при 0 °С в течение 30 мин, после чего добавляли эпоксид 102А (0,73 г, 8,24 ммоль). Реакционную смесь
10 перемешивали при 55 °С в течение 17 часов. Смесь затем разбавляли CH2CI2 (30 мл), фильтровали через слой Celite(r) и промывали соляным раствором (50 мл). Водный слой экстрагировали CH2CI2 (3 х 50 мл), объединенные органические экстракты сушили над безводным МдБСч и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (гексан-EtOAc, 1:3) с получением 103
15 (1,72 г, 88%) в виде бесцветного масла.
Rf 0,15 (гексан-ЕЮАс 1:3); [a]D20'2 -3,5 (с 0,32 в СНСЬ); у"акс(беспримесный)/см-1 3347, 2976, 1703, 1518, 1449, 1413, 1369, 1335, 1249, 1151; 5н (400 МГц; CDCb) 7,77 (2Н, d, J = 7,5, FmocH), 7,61 (2Н, d, J = 7,2 Гц, FmocH), 7,40 (2H, t, J = 7,4 Гц, FmocH), 7,32 (2H, t, J = 7,5 Гц, FmocH), 5,81 (1H, d, J
20 = 8,0 Гц, NH), 4,53-4,50 (1H, m, H-l), 4,40 (2H, d, J = 6,8 Гц, FmocCH2), 4,23 (1H, t, J = 7,0 Гц, FmocCH), 3,94-3,88 (1H, m, H-4), 3,85-3,81 (2H, m, H-6), 3,03 (1H, dd, J = 14,0, 4,2 Гц, H-2), 2,94 (1H, dd, J = 14,3, 6,1 Гц, H-2), 2,82 (1H, dd, J = 14,0, 2,9 Гц, H-3), 2,56 (1H, dd, J = 14,0, 9,0 Гц, H-3), 1,74-1,71 (1H, m, H-5), 1,50 (9H, s, С(СНз)з); 5c (100 МГц; CDCb) 141,3 (C, Fmoc), 127,8 (CH, Fmoc), 127,1 (CH, Fmoc),
25 125,1 (CH, Fmoc), 120,0 (CH, Fmoc), 83,1 (С, С(СНз)з), 69,9 (CH, C-4), 67,2 (CH2, FmocCH2), 61,2 (CH2, C-6), 54,7 (CH, C-l), 47,1 (CH, FmocCH), 41,2 (CH2, C-3), 37,5
37,5 (СН.2, С-5), 35,7 (СН2, С-2), 28,0 (3 х СНз, С(СНз)з); HRMS (ESI+) [М + Na]+ 510,1921 расчет для CzeHssNNaOeS 510,1921.
Диастереомерночистый диол ЮЗА затем превращали в диастереомерночистый конъюгат 6А, следуя аналогичным процедурам, описанным 5 на этапах iv и v раздела 4.1 выше.
Получение диастереомерночистого 6В
C02tBu
FmocHN4*
HCL
•0 s он 24]/co2tBu
C°2tBu Tur:
NHFmoc
К перемешиваемому раствору дисульфида 804 (2,01 г, 2,53 ммоль) в CH2CI2 (14 мл) при 0°С добавляли цинковый порошок (1,15 г, 17,51 ммоль) и
10 свежеприготовленную смесь метанола, конц. соляной кислоты и конц. серной кислоты (100:7:1, 7 мл). Полученную смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин, после чего добавляли эпоксид 102В (0,89 г, 10,11 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 55°С в течение 17 часов. Смесь затем разбавляли CH2CI2 (30 мл), фильтровали через слой Celite(r) и промывали соляным раствором (50 мл). Водный
15 слой экстрагировали CH2CI2 (3 х 50 мл), объединенные органические экстракты сушили над безводным МдБСч и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (гексан-EtOAc, 3:1) с получением 103В (2,17 г, 88%) в виде бесцветного масла.
Rf 0,15 (гесан-EtOAc l:3);[a]D22 +8,5 (с 0,3 в СНСЬ);
20 Утах(беспримесный)/см-1 3347, 2976, 1703, 1518, 1449, 1413, 1369, 1335, 1249, 1151; 5н (400 МГц; CDCb) 7,77 (2Н, d, J = 7,5 Гц, FmocH), 7,61 (2Н, d, J = 7,4 Гц, FmocH), 7,40 (2Н, t, J = 7,4 Гц, FmocH), 7,32 (2H, t, J = 7,5 Гц, FmocH), 5,74 (1H, d, J = 7.0 Гц, NH), 4,51-4,47 (1H, m, H-l), 4,42-4,39 (2H, m, FmocCH2), 4,24 (1H, t, J = 7,0 Гц, FmocCH), 3,93 (1H, br s, H-4), 3,85-3,81 (2H, m, H-6), 3,31 (1H, br s, OH-4),
25 3,00-2,78 (2H, m, H-2), 2,80 (1H, dd, J = 13,5, 3,2 Гц, H-3), 2,55 (1H, dd, J = 13,8, 8,4, Гц, H-3), 2,36 (1H, br s, OH-6) 1,73 (2H, q, J = 5,3, H-5), 1,50 (9H, s, С(СНз)з); 5c
(100 МГц; CDCb) 141,3 (С, Fmoc), 127,8 (СН, Fmoc), 127,1 (СН, Fmoc), 125,1 (СН, Fmoc), 120,0 (СН, Fmoc), 83,1 (С, С(СНз)з), 69,9 (СН, С-4), 67,2 (СН2, FmocCH2), 61,2 (СН2, С-6), 54,7 (СН, С-1), 47,1 (СН, FmocCH), 41,2 (СН2, С-3), 37,5 37,5 (СН2, С-5), 35,7 (СН2, С-2), 28,0 (3 х СНз, С(СНз)з); HRMS (ESI+) [М + Na]+ 510,1921 расчет для 5 C26H33NNa06S 510,1921.
Диастереомерночистый диол 103В затем превращали в диастереомерночистый конъюгат 6В, следуя аналогичным процедурам, описанным на этапах iv и v раздела 4.1 выше.
5. Пример 5
10 Пептидные конъюгаты по изобретению 10А и 10В, содержащие
пептидную последовательность SKKKKVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR [SEQ ID No: 112], получали используя б, как описано и изображено ниже (Схема б).
Схема б
= resin + linker
Am-(J *- SKKKKVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR-
AA = amino acid
О О
R^O R-^O
L ,Ra v L Ra
О > HN > ~ О > HN
^^^0X^N^S> 4^-^4^--SKKKKVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR R^JL4Q^Jvv^S > -> _,^sv^SKKKKVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR
О о
7: R = CH3(CH2)i4 ; Ra = Fmoc ,... 10A: R - CH3(CH2)14 ; Ra - H
R = CH3(CH2)14;Ra = H * "' 1": R = CH3(CH2)14; Ra = Ac
R = CH3(CH2)i4 ; Ra = Ac
(i) Итеративный Fmoc-SPPS; (ii) бис-памитолированный Fmoc-Cys-OH 6, РуВОР, коллидин, DMF; (iii) 20% пиперидин/DMF; (iv) Ac20/NMM, DMF; (v) TFA/EDT.
Целевую последовательность пептида синтезировали с использованием стандартных методов итерации Fmoc SPPS, как описано выше.
20 После сопряжения предконцевого аминокислотного остатка связанная
смолой пептидная цепь подвергалась дериватизированию с аминокислотным конъюгатом б с использованием РуВОР (бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфонийгексафторфосфат) и коллидина в DMF. Условия сопряжения аминокислотного конъюгата снижают склонность а-углеродной
25 аминокислоты к эпимеризации в ходе активации. Аминокислотный конъюгат (0,075 ммоль) и РуВОР (0,1 ммоль) объединяли и растворяли в DMF (0,3 мл). Добавляли
беспримесный 2,4,6-триметилпиридин (0,1 ммоль). После перемешивания в течение 30 секунд раствор переносили на смолу (0,025 ммоль), затем перемешивали в течение 90 минут, осушали и промывали (DMF).
Затем группу Fmoc удаляли, используя 20% пиперидина в DMF, чтобы 5 получить 8.
Пептид 8 затем превращали в соответствующий ацетамид 9 путем обработки смесью 20% уксусного ангидрида в DMF (2 мл) и 4-метилморфолина (1 ммоль).
Кроме того, пептид 8 отщепляли от смолы, чтобы получить 10 соответствующий пептидный конъюгат 10А. Смолу (0,015 ммоль) в 1 мл трифторуксусной кислоты, содержащей 5% (об/об) этандитиола, перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Затем супернатант сливали через спекшийся материал в охлажденный диэтиловый эфир (10 мл). Смолу затем дополнительно промывали в 1 мл TFA, который также добавляли к эфиру. 15 Осажденный материал осаждали центрифугированием, осадок один раз промывали эфиром (5 мл) до растворения в 1:1 MeCN/вода (+ 0,1% tfa) и лиофилизировали.
Пептид 9 отщепляли от смолы, используя ту же самую процедуру.
Очистку 10А и 10В проводили способом ВЭЖХ с обращенной фазой, используя колонки Phenomenex Gemini С18 (5u, HOA) 10x250 мм с элюентом А, 20 представляющим собой воду (+0,1% tfa) и элюентом В, представляющим собой MeCN (+0,1% tfa). После впрыска неочищенного образца пептида в колонку получали градиент от 5% В до 95% В в течение 30 минут при скорости потока 4 мл/мин, а требуемое вещество продукта собирали из колонки при элюировании и сушили вымораживанием.
25 10А: m/z (ESI) 1363,8 [М+ЗН+]. ВЭЖХ анализ: Колонка: Phenomenex
Proteo С12 (4ц, 90А, 4,6 х 250 мм); элюент А, вода/0,1% TFA; элюент В: MeCN/0,1% TFA; градиент: 5-95% В, более 30 мин при 1 мл/мин. Время удержания: 23,4 мин.
10В: m/z (ESI) 1377,7 [М+ЗНГ]. ВЭЖХ анализ: Колонка: Phenomenex Proteo С12 (4ц, 90А, 4,6 х 250 мм); элюент А, вода/0,1% TFA; элюент В: MeCN/0,1% 30 TFA; градиент: 5-95% В, более 30 мин при 1 мл/мин. Время удержания: 25,2 мин.
6. Пример 6
Тиол-ен реакцию пептида 1 и винилпальмитата осуществляли в соответствии с общей процедурой, описанной ниже, в различных условиях, как обобщено в Таблице 2.
6.1 Синтез пептида 1
5 Пептид 1 получали описанным ниже способом.
Аминометилполистирольная смола (100 мг, 0,1 ммоль, доза 1,0 ммоль/г) реагировала с Fmoc-Val-HMPP (НМРР = гидроксиметилфеноксиуксусная кислота) (105 мг, 0,2 ммоль) и DIC (31 мкл, 0,2 ммоль) в смеси дихлорметана и DMF (2 мл, 1,9:0,1 об/об) в течение 1 часа при комнатной температуре. Завершение сопряжения
10 контролировали с использованием теста Кайзера, а процедуру сопряжения повторяли со свежеприготовленным реагентом при неполном сопряжении. Твердофазный пептидный синтез остальной части пептидной последовательности осуществляли в синтезаторе пептида Tribute (Protein technologies Inc.) с использованием HATU/DIPEA, в течение 40 минут при комнатной температуре для
15 каждой стадии сопряжения, и 20% раствора пиперидина в DMF (об/об), причем операцию повторяли дважды в течение 5 минут при комнатной температуре для каждой стадии снятия защиты Fmoc.
После синтеза пептидной последовательности завершали N-концевое ацетилирование, используя 20% -ный раствор уксусного ангидрида в DMF (об/об) и 20 DIPEA (0,25 мл) в течение 15 минут при комнатной температуре.
Связанный со смолой пептид отщепляли обработкой TFA/TIPS/hhO/DODT (10 мл, 94:1:2,5:2,5 об/об/об/об) в течение 2 часов при комнатной температуре. После выпаривания TFA в потоке азота, пептид осаждали в холодном диэтиловом эфире, выделяли центрифугированием, дважды промывали холодным диэтиловым 25 эфиром, растворяли в ацетонитриле: вода, содержащая 0,1% TFA (1:1, об/об), и лиофилизировали с получением неочищенного пептида.
Очистка способом ВЭЖХ с обращенной фазой с использованием полупрепаративной колонки Phenomenex Gemini С-18 (5 мк 10,0 х 250 мм) давала пептид 1 (74 мг, 43% в расчете на 0,1 ммоль), [(М+2Н)2+, расчет. 858,5, фактически 30 858,6 Da)].
6.2 Общий порядок проведения тиол-ен реакции
Маточный раствор 1: DMPA (6,5 мг, 25,3 мкмоль) в дегазированном /V-метил-2-пирролидоне (0,5 мл).
Маточный раствор 2: винилпальмитат в дегазированном Л/-метил-2-пирролидоне (требуемая концентрация).
Пептид 1 (1,71 мг, 1,0 мкмоль) растворяли в маточном растворе 1 (10 мкл, 0,5 мкмоль) с последующим добавлением трет-бутилтиола и/или 5 триизопропилсилана, трифторуксусной кислоты (5% об/об) и маточного раствора 2. Реакционную смесь облучали на длине волны 365 нм с использованием УФ-лампы при комнатной температуре, после чего образцы с 30-минутными интервалами отбирали для анализа LC-MS. Аналитический образец охлаждали путем погружения в воду качества Milli-Q и анализировали с использованием колонки Phenomenex Gemini 10 С-18 (5 мк 4,6 х 150 мм).
Таблица 3: Конъюгация пептида 10 и винилпальмитата 1 в NMPa с использованием DMPAb в качестве свободнорадикального инициатора
Ввод Винилпальмита fBuSHc TIPSC Глубина Продукты'1
тс 1 (экв.) (экв.) (экв.) превращения'1
1 7 0 0 58 2 (84%)
3 (16%)
2 7 3 0 69 2 (97%)
3 (3%)
3 70 3 0 84 2 (65%)
3 (35%)
4 70 80 0 93 2 (76%)
3 (24%)
5 70 80 40 94 2 (88%)
3 (12%)
6 70 40 40 88 2 (95%)
3 (5%)
7 70 80 80 94 2 (95%)"
3 (5%)
8 70 0 80 78 2 (67%)
3 (33%)
9 7 80 80 60 2 (98%)
3 (2%)
10 20 80 80 81 2 (> 99%)
3 ( <1%)
И 35 80 80 92 2 (97%)
(%)
3 (3%)
12 100 80 80 90 2 (95%)
3 (5%)
13d 70 80 80 26 2 (> 99%)
3 ( <1%)
14е 70 80 80 91 2 (96%)
a 30-минутное время реакции с 5% TFA в конечном объеме реакции; ь 0,5 молярного эквивалента относительно пептида 1; с молярный эквивалент относительно пептида 1; d диметилсульфоксид в качестве растворителя; е N,N'-диметилформамид в качестве растворителя; f глубина превращение пептида 1, моно-аддукта 2 и бис-аддукта 3 основана на интегрировании соответствующих пиков профиля ВЭЖХ с обращенной фазой при длине волны 210 нм. Относительные количества 2 и 3 приведены в процентах; 9 72% выделенный выход после очистки ВЭЖХ с обращенной фазой.
7. Пример 7
Данный пример описывает синтез, в соответствии с изобретением, аминокислотных конъюгатов из различных исходных материалов.
7.1 Синтез аминокислотного конъюгата 806 из спирта 800
Стадия i
3 (4%)
К перемешиваемому раствору 4-пентин-1-ола 800 (5 мл, 53,72 ммоль) в CH2CI2 (150 мл) при комнатной температуре добавляли имидазол (3,66 г, 53,72 ммоль) и трет-бутилдиметилсилилхлорид (8,10 г, 53,72 ммоль). Реакционную смесь
10 перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Смесь затем разбавляли ЕГ.2О (200 мл) и промывали водой (3 х 100 мл) и солевым раствором (100 мл). Органический слой сушили над безводным Na2S04 и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали фильтрованием через силикагель с получением указанного в заголовке соединения 801 (10,64 г, знач. кол-во.) в виде
15 бесцветной жидкости. На последующих стадиях синтеза использовали алкин 801 без определения параметров.
К перемешиваемому раствору алкина 801 (14,08 г, 70,00 ммоль) в гексане (150 мл) при комнатной температуре добавляли хинолин (11,75 мл, 100,00 ммоль) и катализатор Линдара (1,408 г). Емкость с реакционной смесью соединяли с 5 заполненным Н2 баллоном (1 атм) и содержимое перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов. Смесь затем фильтровали через слой Celite(r) и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (петролейный эфир-ЕЮАс, 9:1) с получением указанного в заголовке соединения 802 (14,09 г, 99%) в виде бесцветной жидкости.
10 Rf 0,88 (петролейный эфир-ЕЮАс 9:1); 5н (400 МГц; CDCb) 5,82 (1Н, ddt,
J = 17,0, 10,2, 6,7 Гц, Н-4), 5,02 (1Н, d, J = 17,1 Гц, На-5), 4,95 (1Н, d, J = 10,4 Гц, НЙ-5), 3,62 (2Н, t, J = 6,5 Гц, Н-1), 2,10 (2Н, q, J = 7,2 Гц, Н-3), 1,61 (2Н, р, J = 7,0 Гц, Н-2), 0,90 (9Н, s, SiC(CH5)3), 0,05 (6Н, s, Si(CH3)2); 5с (100 МГц; CDCb) 138,6 (СН, С-4), 114,5 (СН2, С-5), 62,6 (СН2, С-1), 32,0 (СН2, С-2), 30,5 (СН2, С-3), 26,0 (3 х
15 СНз, SiC(CH3)3), 18,4 (С, SiC(CH3)3), -5,3 (2 х СНз, Si(CH3)2). Спектроскопические данные согласуются сданными, приведенными в литературе.
Стадия Ш
TBSO
802
К перемешиваемому раствору алкена 802 (8,646 г, 43,16 ммоль) в СН2СЬ 20 (100 мл) при комнатной температуре добавляли тСРВА (8,191 г, 47,47 ммоль).
Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов.
Смесь затем фильтровали через слой Celite(r), разбавляли Et20 (100 мл) и промывали
насыщенным водным раствором ЫаНСОз (3 х 100 мл) и соляным раствором (100 мл).
Органический слой сушили над безводным Na2S04 и концентрировали в вакууме. 25 Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (петролейный
эфир-ЕЮАс, 9:1) с получением указанного в заголовке соединения 803 (8,09 г,
87%) в виде бесцветной жидкости.
Rf 0,51 (петролейный эфир-ЕЮАс 9:1); 5н (400 МГц; CDCb) 3,70-3,60 (2Н,
m, Н-1), 2,96-2,92 (1Н, т, Н-4), 2,75 (1Н, dd, J = 5,0, 4,0 Гц, Н-5), 2,47 (1Н, dd, J = 30 5,0, 2,8 Гц, Н-5), 1,73-1,53 (4Н, т, Н-2, Н-3), 0,89 (9Н, s, SiC(CH5)3), 0,04 (6Н, s,
Si(CH3)2); 5с (100 МГц; CDCb) 62,7 (СН2, С-1), 52,2 (СН, С-4), 47,1 (СН2, С-5), 29,1
(СН2, С-2), 29,0 (СН2, С-3), 25,9 (3 х СНз, SiC(CH3)3), 18,3 (С, SiC(CH3)3), -5,3 (2 х
СНз, Si(G-b)2), Спектроскопические данные согласуются с данными, приведенными в
литературе.
Стадия iv
3 5
TBSO^^Cl - TBSO^> J
803 803a
К перемешиваемому раствору рацемического эпоксида 803 (8,272 г, 38,24
5 ммоль), (R,R)-(+)-N, 1\Г-бис-3,5-ди-трет-бутилсалицилиден-1,2-
циклогександиаминкобальта (II) (0,121 г, 0,19 ммоль) и ледяной уксусной кислоты
(0,04 мл, 0,76 ммоль) в THF (0,35 мл) при 0 °С добавляли по капле воду (0,38 мл).
Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов.
Затем смесь концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали 10 колоночной флэш-хроматографией (петролейный эфир-ЕЮАс, 9:1) с получением
указанного в заголовке соединения 803а (4,12 г, 49%) в виде желтого масла
Rf 0,51 (петролейный эфир-ЕЮАс 9:1); [a]D21'4+4,65 (с 1,15 in СНСЬ); 5н
(400 МГц; CDCb) 3,70-3,60 (2Н, т, Н-1), 2,96-2,92 (1Н, т, Н-4), 2,75 (1Н, dd, J =
5,0, 4,0 Гц, Н-5), 2,47 (1Н, dd, J = 5,0, 2,8 Гц, Н-5), 1,73-1,53 (4Н, т, Н-2, Н-3), 0,89 15 (9Н, s, SiC(CH5)3), 0,04 (6Н, s, Si(CH3)2); 5с (100 МГц; CDCb) 62,7 (СН2, С-1), 52,2
(СН, С-4), 47,1 (СН2, С-5), 29,1 (СН2, С-2), 29,0 (СН2, С-3), 25,9 (3 х СН3, SiC(CH3)3),
18,3 (С, SiC(CH3)3), -5,3 (2 х СН3, Si(CH3)2). Спектроскопические данные согласуются
с данными, приведенными в литературе.
20 Стадия v
C02tBu
TBSO^^J ¦ s'S - 6H2Uc02tBu
NHFmoc
NHFmoc
803a 804 805
L^CCtBu T
К имеющщемуся в продаже перемешиваемому раствору дисульфида 804 (0,751 г, 0,94 ммоль) в СН2С12 (5 мл) при 0 °С добавляли цинковый порошок (0,508 г, 7,78 ммоль) и свежеприготовленную смесь метанола, конц. соляной кислоты и конц.
25 серной кислоты (100:7:1, 2 мл). Полученную смесь перемешивали при 0 °С в течение 30 мин. Затем смесь перемешивали при 65 °С в течение 5 мин, после чего добавляли эпоксид 803а (0,839 г, 3,88 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 65 °С в течение 19 часов. Смесь затем разбавляли ЕЮАс (50 мл), фильтровали через слой Celite(r) и промывали соляным раствором (50 мл). Водный слой
30 экстрагировали ЕЮАс (3 х 50 мл), а объединенные органические экстракты сушили над безводным Na2S04 и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт
очищали колоночной флэш-хроматографией (гексан-ЕЮАс, 1:3) с получением указанного в заголовке соединения 805 (0,568 г, 60%) в виде бесцветного масла.
Rf 0,34 (гексан-ЕЮАс 1:3); [а]о21'° -26,7 (с 0,03 in СНСЬ); у"акс(беспримесный)/ст-1 3321, 2931, 1706, 1532, 1450, 1369, 1248, 1152, 1050; 5н 5 (400 МГц; СНСЬ) 7,76 (2Н, d, J = 7,5 Гц, FmocH), 7,61 (2Н, d, J = 7,2 Гц, FmocH), 7,40 (2Н, t, J = 7,4 Гц, FmocH), 7,31 (2H, t, J = 7,4 Гц, FmocH), 5,90 (1H, d, J = 7,8 Гц, NH), 4,51 (1H, dd, J = 12,3, 5,2 Гц, H-l), 4,39 (2H, d, J = 7,1 Гц, FmocCH2), 4,23 (1H, t, J = 7,1 Гц, FmocCH), 3,73-3,58 (ЗН, m, Н-4, H-7), 3,03 (1H, dd, J = 13,9, 4,4 Гц, H-2), 2,95 (1H, dd, J = 13,9, 5,7 Гц, H-2), 2,80 (1H, dd, J = 13,6, 2,9 Гц, H-3), 2,53
10 (1H, dd, J = 13,6, 8,9 Гц, H-3), 1,72-1,61 (4H, m, Н-5, H-6), 1,49 (9H, s, С(СНз)з)); 5c (100 МГц; СНСЬ) 169,8 (С, C02tBu), 156,1 (С, FmocCO), 143,9 (С, Fmoc), 141,1 (С, Fmoc), 127,9 (CH, Fmoc), 127,2 (CH, Fmoc), 125,3 (CH, Fmoc), 120,1 (CH, Fmoc), 83,2 (С, С(СНз)з), 70,1 (CH, C-4), 67,3 (CH2, FmocCH2), 62,8 (CH2, C-7), 54,7 (CH, C-l), 47,2 (CH, FmocCH), 41,2 (CH2, C-3), 35,5 (CH2, C-2), 33,4 (CH2, C-5), 29,2 (CH2, C-6),
15 28,1 (3 x СНз, С(СНз)з); HRMS (ESI+) [M + Na]+ 524,2077 расчет для C^HssNNaOeS 524,2075.
Стадия vi
20 К перемешиваемому раствору диола 805 (0,114 г, 0,243 ммоль) и
пальмитиновой кислоты (0,18 г, 0,702 ммоль) в THF (3 мл) при комнатной температуре добавляли Л/,Л/'-диизопропилкарбодиимид (0,145 мл, 0,936 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (0,011 г, 0,094 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 17 часов. Затем смесь фильтровали через слой
25 Celite(r), разбавляли ЕЮАс (30 мл), фильтровали через слой Celite(r) и промывали 1М лимонной кислотой (30 мл) соляным раствором (30 мл) и концентрировали в вакууме. Остаток затем повторно растворяли в TFA (3 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 45 мин. Реакционную смесь снова концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-
30 хроматографией (гексан-ЕЮАс, 9:1 ^ 0:1) с получением указанного в заголовке соединения 806 (0,220 г, 98%) в виде бесцветного масла.
Rf 0,15 (петролейный эфир-ЕЮАс 1:1); [a]D21'3 +10,0 (с 0,08 в СНСЬ); у"акс(беспримесный)/см-1 2919, 2851, 1723, 1521, 1521, 1221, 1108, 1054; 5н (400 МГц; СНСЬ) 7,76 (2Н, d, J = 7,5 Гц, FmocH), 7,62 (2Н, d, J = 7,4 Гц, FmocH), 7,39 (2Н,
t, J = 7,4 Гц, FmocH), 7,30 (2H, td, J = 11,2, 0,9 Гц, FmocH), 5,78 (1H, d, J =7,6 Гц, NH), 5,04-4,95 (1H, m, H-4), 4,60 (1H, dd, J = 12,2, 5,2 Гц, H-l), 4,38 (2H, d, J = 7,2 Гц, FmocCH2), 4,24 (2H, t, J = 7,1 Гц, FmocCH), 4,13-3,99 (2H, m, H-7), 3,16 (1H, dd, J = 13,9, 4,5 Гц, H-2), 3,04 (1H, dd, J = 14,0, 5,3 Гц, H-2), 2,78-2,70 (2H, m, H-3), 5 2,34-2,25 (4H, m, 2 x РатСН2аалкил), 1,74-1,56 (8H, m, 2 x РатСНгралкил, Н-5, H-6), 1,32-1,22 (48H, m, 24 x РатСН2алкил), 0,88 (6H, t, J = 6,9 Гц, 2 x РатСНзалкил); 5c (100 МГц; СНС1з) 174,3 (С, C02H), 174,0 (С, РатСОг), 173,5 (С, PamCCh), 156,0 (С, FmocCO), 143,7 (С, Fmoc), 141,3 (С, Fmoc), 127,8 (СН, Fmoc), 127,1 (СН, Fmoc), 121,2 (СН, Fmoc), 120,0 (СН, Fmoc), 72,1 (СН, С-4), 67,5 (СН2, 10 FmocCH2), 63,8 (СН2, С-7), 53,6 (СН, С-1), 47,1 (СН, FmocCH), 36,5 (СН2, С-3), 34,6 (СН2, РатСН2аалкил), 34,5 (СН2, РатСН2аалкил), 34,3 (СН2, С-2), 31,9 (2 х СН2, РатСН2алкил), 29,7-29,2 (21 х СН2, РатСН2алкил, С-5), 25,0 (2 х СН2, РатСН2ралкил), 24,6 (СН2, С-6), 22,7 (2 х СН2, РатСН2алкил), 14,1 (2 х СНз, РатСНзалкил); HRMS (ESI+) [М + Na]+944,6045 расчет для CssHsyNNaOsS 944,6028.
7.1.2 Синтез аминокислотного конъюгата 811 из спирта 807
Стадия i
К перемешиваемому раствору 5-гексен-1-ол 807 (5,00 мл, 41,64 ммоль) в 20 СН2С12 (150 мл) при комнатной температуре добавляли имидазол (2,86 г, 43,06 ммоль) и трет-бутилдиметилсилилхлорид (6,34 г, 42,06 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 19 часов. Смесь затем разбавляли Et20 (400 мл) и промывали водой (200 мл) и солевым раствором (200 мл), сушили над безводным Na2S04 и концентрировали в вакууме. Неочищенный 25 продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (петролейный эфир) с получением указанного в заголовке соединения 808 (8,846 г, знач. кол-во) в виде бесцветного масла.
Rf 0,90 (петролейный эфир-ЕЮАс 9:1); 5н (400 МГц; CDCb) 5,81 (1Н, ddt, J = 17,1, 10,1, 6,7 Гц, Н-5), 5,00 (1Н, dq, J = 17,2, 1,7 Гц, На-6), 4,94 (1Н, d, J = 10,5 30 Гц, НЙ-6), 3,61 (2Н, t, J = 6,2 Гц, Н-1), 2,06 (2Н, q, J = 7,1 Гц, Н-4), 1,59-1,50 (2Н, т, Н-2), 1,47-1,39 (2Н, т, Н-3), 0,89 (9Н, s, SiC(CH5)3), 0,05 (6Н, s, Si(CH3)2); 5с (100 МГц; CDCb) 139,0 (СН, С-5), 114,3 (СН2, С-6), 63,1 (СН2, С-1), 33,5 (СН2, С-4), 32,3 (СН2, С-2), 26,0 (3 х СНз, SiC(CH3)3), 25,2 (СН2, С-3), 18,4 (С, SiC(CH3)3), -5,3 (2 х
СНз, Si(CH3)2). Спектроскопические данные согласуются с данными, приведенными в литературе.
Стадия П
808 809
5 К перемешиваемому раствору алкена 808 (7,58 г, 35,35 ммоль) в CH2CI2
(150 мл) при комнатной температуре добавляли тСРВА (9,15 г, 53,05 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Затем смесь разбавляли Et20 (200 мл), фильтровали через слой Celite(r), промывали 2М водным раствором NaOH (200 мл) и солевым растором (200 мл), сушили над
10 безводным ЫагБСч и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (петролейный эфир-ЕЮАс, 9:1) с получением указанного в заголовке соединения 809 (6,91 г, 85%) в виде бесцветного масла.
Rf 0,60 (гексан-ЕЮАс-ЕЮАс 9:1); 5н (400 МГц; CDCb) 3,61 (2Н, t, J = 6,0 Гц, Н-1), 2,93-2,88 (2Н, т, Н-5), 2,74 (1Н, dd, J = 5,0, 4,0 Гц, Н-6), 2,46 (1Н, dd, J =
15 5,0, 3,0 Гц, Н-6), 1,63-1,46 (6Н, т, Н-2, Н-3, Н-4), 0,89 (9Н, s, SiC(CH5)3), 0,04 (6Н, s, Si(CH3)2); 5с (100 МГц; CDCb) 63,0 (СН2, С-1), 52,3 (СН, С-5), 47,1 (СН2, С-6), 32,6 (СН2, С-4), 32,3 (СН2, С-2), 26,0 (3 х СНз, SiC(CH3)3), 22,3 (СН2, С-3), 18,4 (С, Б1С(СНз)з), -5,3 (2 х СНз, Si(CH3)2). Спектроскопические данные согласуются с данными, приведенными в литературе.
20 Стадия Ш
К перемешиваемому раствору рацемического эпоксида 809 (5,887 г, 25,56
ммоль), (R,R)-(+)-N, 1\Г-бис-3,5-ди-трет-бутилсалицилиден-1,2-
циклогександиаминкобальта (II) (0,083 г, 0,13 ммоль) и ледяной уксусной кислоты
25 (0,03 мл, 0,51 ммоль) в THF (0,3 мл) при 0°С добавляли по капле воду (0,253 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов. Затем смесь концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (петролейный эфир-ЕЮАс, 9:1) с получением указанного в заголовке соединения 809а (2,913 г, 49%) в виде желтого масла.
30 Rf 0,60 (гексан-ЕЮАс 9:1); [а]о20'4 +5,0 (с 0,02 in СНСЬ); 5н (400 МГц;
CDCb) 3,61 (2Н, t, J = 6,0 Гц, Н-1), 2,93-2,88 (2Н, т, Н-5), 2,74 (1Н, dd, J = 5,0, 4,0 Гц, Н-6), 2,46 (1Н, dd, J = 5,0, 3,0 Гц, Н-6), 1,63-1,46 (6Н, т, Н-2, Н-3, Н-4), 0,89
(9Н, s, SiC(CH5)3), 0,04 (6H, s, Si(CH3)2); 5c (100 МГц; CDCb) 63,0 (CH2, C-l), 52,3 (CH, C-5), 47,1 (CH2, C-6), 32,6 (CH2, C-4), 32,3 (CH2, C-2), 26,0 (3 x СНз, SiC(CH3)3), 22,3 (CH2, C-3), 18,4 (C, SiC(CH3)3), -5,3 (2 x СНз, Si(CH3)2). Спектроскопические данные согласуются сданными, приведенными в литературе.
5 Стадия iv
NHFmoc
809a 804 810
К перемешиваемому раствору дисульфида 804 (0,500 г, 0,649 ммоль) в CH2CI2 (5 мл) при 0 °С добавляли цинковый порошок (0,300 г, 4,54 ммоль) и свежеприготовленную смесь метанола, конц. соляной кислоты и конц. серной
10 кислоты (100:7:1, 2 мл). Полученную смесь перемешивали при 0 °С в течение 30 мин. Затем смесь перемешивали при 65 °С в течение 5 мин, после чего добавляли эпоксид 809а (0,600 г, 2,60 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 65 °С в течение 19 часов. Смесь затем разбавляли ЕЮАс (50 мл), фильтровали через слой Celite(r) и промывали соляным раствором (50 мл). Водный слой экстрагировали ЕЮАс
15 (3 х 50 мл), а объединенные органические экстракты сушили над безводным Na2S04 и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (гексан-ЕЮАс, 4:1 ^ 1:3) с получением указанного в заголовке соединения 810 (0,553 г, 83%) в виде бесцветного масла.
Rf 0,39 (гексан-ЕЮАс 1:3); [а]о21'2 -25,0 (с 0,07 в СНСЬ);
20 Утах(беспримесный)/см-1 3343, 2934, 2862, 1705, 1513, 1450, 1369, 1344, 1248, 1152; 5н (400 МГц; СНСЬ) 7,76 (2Н, d, J = 7,5 Гц, FmocH), 7,61 (2Н, d, J = 7,0 Гц, FmocH), 7,40 (2Н, t, J = 7,4 Гц, FmocH), 7,30 (2H, td, J = 11,2, 1,1 Гц, FmocH), 5,88 (1H, d, J = 7,8 Гц, NH), 4,52 (1H, dd, J = 12,5, 5,2 Гц, H-l), 4,39 (2H, d, J = 8,1 Гц, FmocCH2), 4,23 (1H, t, J = 7,1 Гц, FmocCH), 3,70-3,59 (ЗН, m, Н-4, H-8), 3,03 (1H, dd,
25 J = 13,7, 4,7 Гц, H-2), 2,94 (1H, dd, J = 13,7, 5,4 Гц, H-2), 2,80 (1H, dd, J = 13,6, 3,4 Гц, H-3), 2,51 (1H, dd, J = 13,4, 8,7 Гц, H-3), 1,60-1,38 (15H, m, Н-5, Н-6, H-7, С(СНз)з)); 5c (100 МГц; СНСЬ) 169,7 (C, C02tBu), 156,0 (C, FmocCO), 143,8 (C, Fmoc), 141,3 (C, Fmoc), 127,8 (CH, Fmoc), 127,1 (CH, Fmoc), 125,2 (CH, Fmoc), 120,0 (CH, Fmoc), 83,1 (С, С(СНз)з), 69,8 (CH, C-4), 67,2 (CH2, FmocCH2), 62,5 (CH2, C-8), 54,6
30 (CH, C-l), 47,1 (CH, FmocCH), 41,1 (CH2, C-3), 35,8 (CH2, C-5), 35,4 (CH2, C-2), 32,4 (CH2, C-7), 28,0 (3 x СНз, С(СНз)з), 21,9 (CH2, C-6); HRMS (ESI+) [М + Na]+ 538,2226 расчет для СгвНзуЫЫаОбБ 538,2234.
К перемешиваемому раствору диола 810 (0,190 г, 0,370 ммоль) и пальмитиновой кислоты (0,284 г, 1,10 ммоль) в THF (3 мл) при комнатной температуре добавляли Л/,Л/'-диизопропилкарбодиимид (0,226 мл, 1,47 ммоль) и 45 диметиламинопиридин (0,018 г, 0,147 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 17 часов. Затем смесь фильтровали через слой Celite(r), разбавляли ЕЮАс (50 мл), фильтровали через слой Celite(r) и промывали 1М лимонной кислотой (30 мл) соляным раствором (30 мл) и концентрировали в вакууме. Остаток затем повторно растворяли в TFA (3 мл) и перемешивали при
10 комнатной температуре в течение 45 мин. Реакционную смесь снова концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (гексан-ЕЮАс, 9:1 ^ 0:1) с получением указанного в заголовке соединения 811 (0,301 г, знач. кол-во) в виде бесцветного масла.
Rf 0,20 (петролейный эфир-ЕЮАс 1:1); [a]D21'2 +10,0 (с 0,07 в СНСЬ);
15 Утах(беспримесный)/см-1 3331, 2917, 2850, 1728, 1692, 1532, 1467, 1451, 1244, 1221, 1198, 1175; 5н (400 МГц; СНСЬ) 7,76 (2Н, d, J = 7,5 Гц, FmocH), 7,62 (2Н, d, J = 7,2 Гц, FmocH), 7,40 (2Н, t, J = 7,4 Гц, FmocH), 7,30 (2H, td, J = 11,2, 1,0 Гц, FmocH), 5,82 (1H, d, J = 7,9 NH), 5,03-4,92 (1H, m, H-4), 4,71-4,60 (1H, m, H-l), 4,40 (2H, d, J = 7,0 Гц, FmocCH2), 4,24 (1H, t, J = 7,1 Гц, FmocCH), 4,11-4,00 (2H, m, H-8),
20 3,15 (1H, dd, J = 13,9, 4,4 Гц, H-2), 3,04 (1H, dd, J = 13,8, 5,8 Гц, H-2), 2,78-2,65 (2H, m, H-3), 2,31 (2H, t, J = 7,6 Гц, РатСН2аалкил), 2,28 (2H, t, J = 7,6 Гц, PamCH2a алкил), 1,74-1,55 (8Н, т, 2 х РатСНзалкил, Н-5, Н-7), 1,45-1,17 (50Н, т, 24 х РатСН2алкил, Н-6), 0,88 (6Н, t, J = 6,8 Гц, 2 х РатСНзалкил); 5с (100 МГц; СНСЬ) 174,3 (С, СОгН), 174,0 (С, РатСОг), 173,9 (С, РатСОг), 156,1 (С, FmocCO), 143,7 (С,
25 Fmoc), 141,3 (С, Fmoc), 127,8 (СН, Fmoc), 127,1 (СН, Fmoc), 125,2 (СН, Fmoc), 120,0 (СН, Fmoc), 72,4 (СН, С-4), 67,4 (СН2, FmocCH2), 64,0 (СН2, С-8), 53,6 (СН, С-1), 47,1 (СН, FmocCH), 36,6 (СН2, С-3), 34,6 (СН2, РатСН2аалкил), 34,5 (СН2, РатСН2аалкил), 34,4 (СН2, С-2), 32,7 (СН2, С-5), 32,0 (2 х СН2, РатСН2алкил), 29,7-29,3 (20 х СН2, РатСН2алкил), 28,3 (СН2, С-7) , 25,0 (2 х СН2, РатСНзалкил), 25,0 (2 х СН2,
30 РатСНзалкил), 22,7 (2 х СНг, РатСН2алкил), 21,7 (СН2, С-6), 14,4 (2 х СНз, РатСНзалкил); HRMS (ESI+) [М + 1\1а]+ 958,6239 расчет для CseHsgNNaOsS 958,6238.
7.1.3 Синтез аминокислотного конъюгата 820 из алкена 814
А) Синтез алкена 814 из спирта 812
Стадия i
НО^^^^Щ. > TBSO'
812 813
К перемешиваемому раствору 6-пентин-1-ола 812 (3,33 мл, 26,75 ммоль) в CH2CI2 (80 мл) при комнатной температуре добавляли имидазол (1,76 г, 27,01 5 ммоль) и трет-бутилдиметилсилилхлорид (4,07 г, 27,01 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Смесь затем разбавляли Et.20 (100 мл) и промывали водой (3 х 100 мл) и солевым раствором (100 мл). Органический слой сушили над безводным Na2S04 и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали фильтрованием через силикагель с 10 получением алкина 813 (5,68 г, знач. кол-во) в виде бесцветной жидкости. На последующих стадиях синтеза использовали алкин 813 без определения параметров.
Стадия П
TBSO
813
15 К перемешиваемому раствору алкина 813 (5,34 г, 25,18 ммоль) в гексане
(140 мл) при комнатной температуре добавляли хинолин (4,18 мл, 35,26 ммоль) и катализатор Линдара (0,53 г). Емкость с реакционной смесью соединяли с заполненным Н2 баллоном (1 атм) и содержимое перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Смесь затем фильтровали через слой Celite(r) и
20 концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (петролейный эфир-ЕЮАс, 9:1) с получением указанного в заголовке соединения 814 (5,34 г, знач. кол-во) в виде бесцветной жидкости.
Rf 0,91 (петролейный эфир-ЕЮАс 9:1); 5н (400 МГц; CDCb) 5,81 (1Н, ddt, J = 17,0, 10,3, 6,7 Гц, Н-6), 4,99 (1Н, dd, J =17,0 Гц, На-7) 4,93 (1Н, dd, J = 10,1 Гц,
25 НЙ-7), 3,60 (2Н, t, J = 6,6 Гц, Н-1), 2,05 (2Н, q, J = 7,0 Гц, Н-5), 1,56-1,31 (6Н, m, Н-2, Н-3, Н-4), 0,89 (9Н, s, SiC(CH5)3), 0,05 (6Н, s, Si(CH3)2); 5с (100 МГц; CDCb) 139,1 (СН, С-6), 114,2 (СН2, С-7), 63,2 (СН2, С-1), 33,8 (СН2, С-5), 33,7 (СН2, С-4), 28,7 (СН2, С-3), 26,0 (3 х СН3, SiC(CH3)3), 25,3 (СН2, С-2), 18,4 (С, SiC(CH3)3), -5,3 (2 х СН3, Si(CH3)2). Спектроскопические данные согласуются с данными, приведенными в
30 литературе.
В) Синтез алкена 814 из спирта 815
но' - - -ОН - TBSO-^-^-ОН
815 816
К перемешиваемому раствору 1,6-гександиола 815 (16,00 г, 135,39 ммоль) в CH2CI2 (150 мл) при комнатной температуре добавляли имидазол (9,22 г, 135,39 ммоль) и трет-бутилдиметилсилилхлорид (20,41 г, 135,39 ммоль). 5 Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 19 часов. Смесь затем фильтровали, промывали Н2О (100 мл) и солевым раствором (100 мл), сушили над безводным ЫагБСч и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (петролейный эфир-ЕЮАс, 4:1) с получением указанного в заголовке соединения 816 (25,13 г, 80%) в виде 10 бесцветной жидкости. На последующих стадиях синтеза использовали спирт 816 без определения параметров.
Стадия П
TBSO v v v TBSO
816 817
К перемешиваемому раствору спирта 816 (4,90 г, 21,10 ммоль) в CH2CI2 15 (11 мл) при 0 °С добавляли диметилсульфоксид (11,08 мл, 154,05 ммоль), Et_3N (14,71 мл, 105,52 ммоль) и комплекс серного ангидрида пиридина (9,89 г, 63,31 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут. Смесь затем охлаждали водой (20 мл) и экстрагировали ЕЮАс (2 х 50 мл). Объединенные органические экстракты промывали водой (50 мл) и солевым растором (50 мл), 20 сушили над безводным Na2S04 и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (петролейный эфир-ЕЮАс, 9:1) с получением указанного в заголовке соединения 817 (4,71 г, 97%) в виде бесцветного масла. На последующих стадиях синтеза использовали альдегид 817 без опредления параметров.
25 Стадия Ш
TBSO ^ ^ TBSO
817 814
К перемешиваемому раствору метилтрифенилфосфониумбромида (4,60 г, 12,89 ммоль) в THF (30 мл) при температуре -78 °С по капле добавляли раствор п-бутиллития (7,16 мл, 1,8 М, 12,89 ммоль). Полученную смесь нагревали до 30 комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Затем реакционную смесь охлаждали до -78 °С и по капле добавляли альдегид 817 (2,56 г, 11,21 ммоль) в THF (6 мл). Реакционную смесь перемешивали при -78 °С в течение 3 часов и затем
нагревали до комнатной температуры и перемешивали еще 15 часов. Затем смесь охлаждали насыщенным водным раствором NhUCI (10 мл) и экстрагировали EtOAc (3 х 70 мл). Объединенные органические экстракты промывали водой (2 х 50 мл) и солевым растором (50 мл), сушили над безводным Na2S04 и концентрировали в 5 вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (петролейный эфир-ЕЮАс, 99:1) с получением указанного в заголовке соединения 814 (2,5 г, 98%) в виде бесцветной жидкости.
Rf 0,91 (петролейный эфир-ЕЮАс 9:1); 5н (400 МГц; CDCb) 5,81 (1Н, ddt, J = 17,0, 10,3, 6,7 Гц, Н-6), 4,99 (1Н, dd, J =17,0 Гц, На-7) 4,93 (1Н, dd, J = 10,1 Гц,
10 НЙ-7), 3,60 (2Н, t, J = 6,6 Гц, Н-1), 2,05 (2Н, q, J = 7,0 Гц, Н-5), 1,56-1,31 (6Н, m, Н-2, Н-3, Н-4), 0,89 (9Н, s, SiC(CH5)3), 0,05 (6Н, s, Si(CH3)2); 5с (100 МГц; CDCb) 139,1 (СН, С-6), 114,2 (СН2, С-7), 63,2 (СН2, С-1), 33,8 (СН2, С-5), 33,7 (СН2, С-4), 28,7 (СН2, С-3), 26,0 (3 х СНз, SiC(CH3)3), 25,3 (СН2, С-2), 18,4 (С, SiC(CH3)3), -5,3 (2 х СНз, Si(G-b)2). Спектроскопические данные согласуются с данными, приведенными в
15 литературе.
С) Синтез аминокислотного конъюгата 820 из алкена 814 Стадия i
13 5 7
814 818
К перемешиваемому раствору алкена 814 (4,30 г, 18,40 ммоль) в СН2СЬ 20 (40 мл) при комнатной температуре добавляли тСРВА (4,46 г, 25,84 ммоль).
Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 7 часов.
Смесь затем фильтровали через слой Celite(r), разбавляли Et20 (60 мл) и промывали
насыщенным водным раствором ЫаНСОз (3 х 100 мл) и соляным раствором (100 мл).
Органический слой сушили над безводным Na2S04 и концентрировали в вакууме. 25 Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (петролейный
эфир-ЕЮАс, 9:1) с получением указанного в заголовке соединения 818 (4,30 г,
96%) в виде бесцветной жидкости.
Rf0,63 (петролейный эфир-ЕЮАс 9:1); 5н (400 МГц; CDCb) 3,60 (2Н, t, J =
6,5 Гц, Н-1), 2,92-2,88 (1Н, т, Н-6), 2,74 (1Н, t, J = 4,5 Гц, Н-7), 2,46 (1Н, dd, J = 30 5,0, 2,8 Гц, Н-7), 1,56-1,36 (8Н, т, Н-2, Н-3, Н-4, Н-5), (9Н, s, SiC(CH5)3), 0,04 (6Н,
s, Si(CH3)2); 5с (100 МГц; CDCb) 63,1 (СН2, С-1), 52,3 (СН, С-6), 47,1 (СН2, С-7), 32,8
(СН2, С-5), 32,5 (СН2, С-2), 26,0 (3 х СНз, SiC(CH3)3), 25,8 (СН2, С-4), 25,7 (СН2, С-3),
18,4 (С, Б1С(СНз)з), -5,3 (2 х СНз, Si(G-b)2). Спектроскопические данные согласуются
сданными, приведенными в литературе.
6 2 4 6 ''О
818 818a
К перемешиваемому раствору рацемического эпоксида 818 (2,23 г, 9,13
ммоль), (R,R)-(+)-N, 1\Г-бис-3,5-ди-трет-бутилсалицилиден-1,2-
циклогександиаминкобальта (II) (0,03 г, 0,05 ммоль) и ледяной уксусной кислоты 5 (0,01 мл, 0,18 ммоль) в THF (0,1 мл) при 0 °С добавляли по капле воду (0,09 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов. Затем смесь концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (петролейный эфир-ЕЮАс, 9:1) с получением указанного в заголовке соединения 818а (1,09 г, 49%) в виде желтого масла.
10 Rf 0,63 (петролейный эфир-ЕЮАс 9:1); [a]D21'3 +4,2 (с 0,90 in СНСЬ); 5н
(400 МГц; CDCb) 3,60 (2Н, t, J = 6,5 Гц, Н-1), 2,92-2,88 (1Н, т, Н-6), 2,74 (1Н, t, J = 4,5 Гц, Н-7), 2,46 (1Н, dd, J = 5,0, 2,8 Гц, Н-7), 1,56-1,36 (8Н, т, Н-2, Н-3, Н-4, Н-5), (9Н, s, SiC(CH5)3), 0,04 (6Н, s, Si(CH3)2); 5с (100 МГц; CDCb) 63,1 (СН2, С-1), 52,3 (СН, С-6), 47,1 (СН2, С-7), 32,8 (СН2, С-5), 32,5 (СН2, С-2), 26,0 (3 х СНз, SiC(CH3)3),
15 25,8 (СН2, С-4), 25,7 (СН2, С-3), 18,4 (С, SiC(CH3)3), -5,3 (2 х СНз, Si(CH3)2). Спектроскопические данные согласуются с данными, приведенными в литературе.
Стадия Ш
C02tBu
NHFmoc
X02tBu NHFmoc
818a 804 819
К перемешиваемому раствору дисульфида 804 (0,30 г, 0,375 ммоль) в 20 CH2CI2 (1 мл) при 0 °С добавляли цинковый порошок (0,20 г, 3,01 ммоль) и свежеприготовленную смесь метанола, конц. соляной кислоты и конц. серной кислоты (100:7:1, 1 мл). Полученную смесь перемешивали при 0 °С в течение 30 мин, после чего добавляли эпоксид 818а (0,344 г, 1,13 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 70 °С в течение 17 часов. Смесь затем разбавляли ЕЮАс (30 мл), 25 фильтровали через слой Celite(r) и промывали соляным раствором (30 мл). Водный слой экстрагировали ЕЮАс (3 х 30 мл), а объединенные органические экстракты сушили над безводным МдБСч и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-хроматографией (гексан-ЕЮАс, 1:3) с получением указанного в заголовке соединения 819 (0,350 г, 88%) в виде бесцветного масла.
30 Rf 0,4 (гексан-ЕЮАс 1:3); [а]о20'8 -20,0 (с 0,03 в ЕЮАс);
у"акс(беспримесный)/см-1 3365, 3933, 1703, 1514, 1450, 1369, 1343, 1248, 1151,
1046; 5н (400 МГц; MeOD) 7,79 (2Н, d, J = 7,5 Гц, FmocH), 7,68 (2Н, d, J = 7,4 Гц, FmocH), 7,39 (2H, t, J = 7,4 Гц, FmocH), 7,31 (2H, t, J = 4,7 Гц, FmocH), 4,34 (2H, d, J = 7,1 Гц, FmocCH), 4,28 (1H, dd, J = 8,2, 5,1 Гц, H-l), 4,23 (1H, t, J = 7,0 Гц, FmocCH2), 3,72-3,61 (1H, m, H-4), 3,57-3,79 (2H, m, H-9), 3,01 (1H, dd, J = 13,8, 5,0 5 Гц, H-2), 2,86 (1H, dd, J = 13,7, 8,3 Гц, H-2), 2,69 (1H, dd, J = 13,4, 4,9 Гц, H-3), 2,60 (1H, dd, J = 13,4 , 7,0 Гц, H-3), 1,57-1,34 (17H, m, Н-5, Н-6, Н-7, H-8, С(СНз)з); 5c (100 МГц; MeOD) 171,8 (C, C02tBu), 158,1 (C, FmocCO), 145,3 (C, Fmoc), 142,6 (C, Fmoc), 128,8 (CH, Fmoc), 128,2 (CH, Fmoc), 126,4 (CH, Fmoc), 121,0 (CH, Fmoc), 83,3 (С, С(СНз)з), 71,9 (CH, C-4), 68,2 (CH2, FmocCH2), 62,9 (CH2, C-9), 56,5 (CH, C-l), 10 50,2 (CH, FmocCH), 40,8 (CH2, C-3), 37,3 (CH2, C-5), 35,5 (CH2, C-2), 33,6 (CH2, C-8), 28,3 (3 x СНз, С(СНз)з), 26,9 (CH2, С-7), 26,6 (СН2, С-6); HRMS (ESI+) [М + Na]+ 552,2390 расчет для СгэНзэЫЫаОбБ 552,2393.
Стадия iv
C02tBu NHFmoc
О NHFmoc 819 820
15 К перемешиваемому раствору диола 819 (0,168 г, 0,317 ммоль) и
пальмитиновой кислоты (0,244 г, 0,951 ммоль) в THF (4,6 мл) при комнатной температуре добавляли Л/,Л/'-диизопропилкарбодиимид (0,191 мл, 1,269 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (0,016 г, 0,127 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 17 часов. Затем смесь фильтровали через слой
20 Celite(r), разбавляли ЕЮАс (30 мл), фильтровали через слой Celite(r) и промывали 1М лимонной кислотой (30 мл) соляным раствором (30 мл) и концентрировали в вакууме. Остаток затем повторно растворяли в TFA (3 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 45 мин. Реакционную смесь снова концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали колоночной флэш-
25 хроматографией (гексан-ЕЮАс, 9:1 ^ 0:1) с получением указанного в заголовке соединения 820 (0,301 г, знач. кол-во) в виде бесцветного масла.
Rf 0,21 (петролейный эфир-ЕЮАс 1:1); [a]D20'8 +7,5 (с 0,24 в СНСЬ); у"акс(беспримесный)/см-1 3319, 2919, 2851, 1722, 1521, 1471, 1450, 1221, 1055; 5н (400 МГц; CDCb) 7,76 (2Н, d, J = 7,6 Гц, FmocH), 7,61 (2Н, d, J = 7,3 Гц, FmocH),
30 7,40 (2Н, t, J = 7,7 Гц, FmocH), 7,30 (2H, td, J = 11,2, 1,1 Гц, FmocH), 5,82, (1H, d, J = 7,7 Гц, NH), 5,00-4,94 (1H, m, H-4), 4,64 (1H, dd, J = 12,3, 5,6 Гц, H-l), 4,40 (2H, d, J = 7,1 Гц, FmocCH), 4,24 (1H, t, J = 7,1 Гц, FmocCH2), 4,10-4,00 (2H, m, H-9), 3,14 (1H, dd, J = 13,8, 4,3 Гц, H-2), 3,04 (1H, dd, J = 13,8, 5,6 Гц, H-2), 2,76-2,67 (2H, m H-3), 2,31 (2H, t, J = 7,6 Гц, РатСН2аалкил), 2,28 (2H, t, J = 7,6 Гц, РатСН2аалкил),
1,65-1,56 (8Н, m, 2 х РатСНгралкил, Н-8, Н-5), 1,39-1,18 (52Н, т, 24 х РатСНгалкил, Н-6, Н-7), 0,88 (6Н, t, J = 6,9 Гц, 2 х РатСНзалкил); 5с (100 МГц; CDCb) 174,4 (С, С02Н), 156,1 (С, FmocCO), 143,7 (С, Fmoc), 141,3 (С, Fmoc), 127,8 (СН, Fmoc), 127,1 (СН, Fmoc), 125,2 (СН, Fmoc), 120,0 (СН, Fmoc), 72,4 (СН, С-4), 5 67,5 (СН2, FmocCH2), 64,2 (СН2, С-9), 53,6 (СН, С-1), 47,1 (СН, FmocCH), 36,5 (СН2, С-3), 34,6 (СН2, С-2), 34,3 (2 х СН2, РатСН2аалкил), 33,0 (СН2, С-5), 31,9 (2 х СН2, РатСНгалкил) 29,7-28,4 (21 х СНг, РатСНгалкил, С-8), 25,5 (СНг, С-7), 25,0 (2 х СНг, РатСНгралкил), 24,8 (СНг, С-6), 22,7 (2 х СНг, РатСНгалкил), 14,1 (2 х СНз, РатСНзалкил); HRMS (ESI+) [М + Na]+972,6358 расчет для CsyHgiNNaOsS 972,6392.
8. Пример 8
Данный пример демонстрирует агонизм TLR (R) - и (S) - конструкций Pam2Cys-SKKKK, homoPam2Cys-SKKKK и Pam3Cys-SKKKK.
15 8.1 Способ
Энантиомерные эпимерные (R) - и (S) - версии Pam2Cys-SKKKK, homoPam2Cys-SKKKK и Pam3Cys-SKKKK получали в лабораторных условиях методами, аналогичными тем, которые описаны в Примерах (Примеры 4 и 5). Кроме того, были получены парные наборы агонистов SKKKK-NH2 и SKKKK-NAc с целью 20 оценки с помощью h-Pam-2-Cys и Pam-2-Cys влияния С-концевой модификации на агонизм TLR. Полученные агонисты перечислены в Таблице 4.
Агонизм TLR2 агонистов в Таблице 4 исследовали в клетках HEK-Blue(tm)-mTLR2 (Рисунок 6А) и HEK-Blue(tm)-hTLR2 (Рисунок 6В), следуя аналогичной 25 процедуре, описанной в разделе 2.1 Примера 2, путем серий разведений 6-1одю (от 10"6 М до 10"11 М). (R/S -Pam-1-Cys-NH2 тестировали только на Ю-6 и Ю-9 М. Данные представлены как средние значения +/- SD поглощения (635 нм) для трех параллельных лунок обработанных только средой после вычитания фона, причем пунктирные линии, представляющие поглощение в лунках.
(R)-homo-Pam2Cys-SKKKK-NH2
(R) hPam2C-NH2
(S)-homoPam2Cys-SKKKK-NH2
(S) hPam2C-NH2
(R)-homoPam2Cys-SKKKK-NHAc
(R) hPam2C-NAc
(S)-homoPam2Cys-SKKKK-NHAc
(S) hPam2C-NAc
(R)-Pam3Cys-SKKKK-NH2
(R) ParmC
(S)-Pam3Cys-SKKKK-NH2
(S) РатзС
Схема 7. Структуры PamlCys-, (R)- и (S)-Pam2Cys-, (R)- и (S)-Pam3Cys-, и (R)- и (S)-homoPam2Cys- приведены в Table 4.
NH2
H31C15 О'
H31C15 О.
H31C15 °
PanijCys
NH2
^f4
Нз1С15^0 9
о I ну^с15н31
H31C15A> ^S^f4
Н31С15 О'
(S)-Pam2Cys
(S)-Pam3Cys
(S)-homoPam2Cys
H31C1C O.
О = NH2
H31C15 °
(R)-Pam2Cys
8.2 Выводы
Н31С15 О'
Н31С15 О'
HN^C15H31
(R)-Pam3Cys
Н31С15 О
NH2
ныс^о^3^^ о
(R)-homoPam2Cys
8.2.1 Биоактивность конструкции для mTLR2 и hTLR2
PamlCys-SKKKK-NH2 проявлял агонизм для hTLR2 при 10"6 М но не при 10" 9 М, и не проявлял агонизма при любой концентрации для mTLR2. Напротив, все тестируемые конструкции Pam2Cys, homoPam2Cys и Pam3Cys демонстрировали
10 агонизм как для mTLR2, так и для hTLR2. Как правило, эпимерные и подходящие С-концевые конструкции homoPam2Cys и Pam2Cys, демонстрировали сопоставимую прочность и структуру агонизма в серии разведений и являлись значительно более мощными агонистами, чем подходящие эпимерные Pam3Cys, как для mTLR2, так и для hTLR2 (вызывание продуцирование NFKB при более чем в 10-раз меньшей
15 концентрации, чем Pam3Cys).
8.2.2
Влияние на стереохимию (R)- по сравнению с (S)
Во всех проверенных наборах конструкций парные (R)- версии демонстрировали более сильный агонизм, чем (S)- версии как для mTLR2, так и для hTLR2. (R)-Pam3Cys сохраняет продуцирование NFKB при при более чем в 10-раз меньшей концентрации, чем (S)-Pam3Cys как для mTLR2, так и для hTLR2. (R)-5 homoPam2Cys сохраняет продуцирование NFKB при более чем в 10-раз меньшей концентрации, чем (S)-homoPam2Cys как для mTLR2, так и для hTLR2, независимо от С-концевой модификации. (R)-Pam2Cys сохраняет продуцирование NFKB при более чем в 100-раз меньшей концентрации, чем (S)-Pam2Cys как для mTLR2, так и для hTLR2, независимо от С-концевой модификации. Интересно, что хотя (R)-10 homoPam2Cys и (R)-Pam2Cys были сравнимыми агонистами по сериям разведений 1одю как в mTLR2, так и в hTLR2, однако (S)-homoPam2Cys был более мощным агонистом, чем (S)-Pam2Cys как в mTLR2, так и в hTLR2, вызывая продуцирование NFKB при более чем в 10-100-раз меньшей концентрации. (S)-Pam2Cys проявлял сходную мощность и структуру агонизма в (S)-Pam3Cys.
8.2.3 Влияние С-конца-NH2 и-NAc
При сравнении с подходящим эпимерным homoPam2Cys-SKKKK, имеющим С-конец -NH2 и С-конец -NAc, ни для mTLR2, ни для HTLR2 не наблюдалось никакого дифференциального агонизма. При сравнении с подходящим эпимерным Pam2Cys-
20 SKKKK, имеющим С-конец -NH2 и С-конец -NAc, для hTLR2 не наблюдалось никакого дифференциального агонизма. При сравнении с подходящим эпимерным (S)-Pam2Cys-SKKKK, имеющим С-конец -NH2 и С-конец -NAc, для mTLR2 не наблюдалось никакого дифференциального агонизма. Увеличение в продуцировании NKKB при 10" 10 и Ю-11 М только наблюдалось при сравнении (R)-Pam2Cys-SKKKK-NH2 с (R)-
25 Pam2Cys-SKKKK-NAc для mTLR2.
9. Пример 9
Пептидные конъюгаты по изобретению 821 и 822 , содержащие пептидную последовательность SKKKKVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR [SEQ ID N0: 30 127], получали используя 6, как описано и изображено ниже (Схема 8).
Пептидная последовательность SKKKKKISOAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT (SEQ ID N0: 127) включает две иммуногенных пептидных антигенных детерминанты (подчеркнуто), соединенных одним Е, полученным из яичного белка (OVA) (основной составляющей куриного 35 яичного белка). OVA полезен в качестве модельного антигена у мышей, поскольку опухолевые клетки могут быть сконструированы/трансфектированы для его экспрессии.
Подробности антигенных детерминант:
SIINFEKL: Н-К2Ь рестриктирован (мышиный МНС класс I), распознаваем CD8+ Т-клетками. OVA аминокислоты 257-264.
ISQAVHAAHAEINEAGR: I-Ad рестриктирован (мышиный МНС класс II), распознаваем CD4+ Т-клетками. OVA аминокислоты 323-339.
= смола + линкер ДА- H2N-SKKKKKISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT-
АА = аминокислота
О > HN'
I-SKKKKKISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT-
R or S
823: R = CH3(CH2)i4 ; Ra = Fmoc
824: R = CH3(CH2)i4 ; Ra = H ^ ~~' '"
NH2 = H
N-SKKKKKISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT
R a
* _
821: R - СН3(СНг)14 ; -R < Конфигурацией *
822: R = СН3(СН2)и ; =S конфигурацией
Схема 8. (i) Итеративный Fmoc-SPPS; (ii) R)- или (S)- бис-памитолированный Fmoc-Cys-OH б, РуВОР, коллидин, DMF; (iii) 20% пиперидин/DMF; (iv) Ac20/NMM, DMF; (v) TFA/EDT/вода.
Целевую последовательность пептида синтезировали с использованием стандартных методов итерации Fmoc SPPS, как описано выше.
После сопряжения предконцевого аминокислотного остатка связанная смолой пептидная цепь подвергалась дериватизированию с требуемым диастереоизомером аминокислотного конъюгата 6 с использованием РуВОР (бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфонийгексафторфосфат) и коллидина в DMF. Условия сопряжения аминокислотного конъюгата снижают склонность а-углеродной аминокислоты к эпимеризации в ходе активации. Аминокислотный конъюгат (0,032 ммоль) и РуВОР (0,033 ммоль) объединяли и растворяли в DMF (0,25 мл). Добавляли беспримесный 2,4,6-триметилпиридин (0,05 ммоль). После перемешивания в течение 30 секунд раствор переносили на смолу (0,016 ммоль),
затем перемешивали в течение 90 минут, осушали и промывали (DMF) для получения 823.
Затем группу Fmoc удаляли, используя 20% пиперидина в DMF, чтобы получить 824.
Пептид 824 отщепляли от смолы, чтобы получить пептидный конъюгат
821 с R-конфигурацией в указанной позиции (Схема 8) или пептидный конъюгат
822 с S-конфигурацией в указанной позиции. Смолу (0,016 ммоль) в 1,5 мл трифторуксусной кислоты, содержащей 2,5% (об/об) этандитиола и 2,5% об/об воды, перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем супернатант сливали через спекшийся материал в охлажденный диэтиловый эфир (10 мл). Смолу затем дополнительно промывали в 1 мл TFA, который также добавляли к эфиру. Осажденный материал осаждали центрифугированием, осадок один раз промывали эфиром (5 мл) до растворения в 1:1 MeCN/вода (+ 0,1% tfa) и лиофилизировали.
Очистку 821 и 822 проводили способом ВЭЖХ с обращенной фазой, используя колонки Phenomenex Gemini С18 (5р, 110А) 10x250 мм с элюентом А, представляющим собой воду (+0,1% tfa) и элюентом В, представляющим собой MeCN (+0,1% tfa). После впрыска неочищенного образца пептида в колонку получали градиент: от 5% В до 45% В в течение 3 минут и последующий градиент от 45% В до 65% В в течение 16 минут при скорости потока 4 мл/мин. Требуемое вещество продукта собирали из колонки при элюировании и сушили вымораживанием.
Номер Структура
821
Н31С15 •" ,°
S > Г SKKKKKISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT NH2
H3lCi5
Н31С15 •" ,°
S > Г SKKKKKISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT NH2
821: m/z (ESI) 1191,5 [М+4Н+]. ВЭЖХ анализ: Колонка: Phenomenex Gemini С18 (Зц, HOA, 4,6 х 150 мм); элюент А, вода / 0,1% TFA; элюент В: MeCN/0,1% TFA; градиент: 5-95% В, более 30 мин при 1 мл/мин. Время удержания: 20,9 мин.
5 822: m/z (ESI) 1191,5 [М+4Н+]. ВЭЖХ анализ: Колонка: Phenomenex
Gemini С18 (Зц, 110А, 4,6 х 150 мм); элюент А, вода / 0,1% TFA; элюент В: MeCN/0,1% TFA; градиент: 5-95% В, более 30 мин при 1 мл/мин. Время удержания: 20,8 мин.
Объем изобретения не ограничивается только вышеупомянутыми 10 примерами. Специалисту в данной области техники очевидно, что возможно много вариантов, не выходящих за пределы объема изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Auckland UniServices Limited Brimble, Margaret A Dunbar, Peter R Williams, Geoffrey M
<12 0> АМИНОКИСЛОТНЫЕ И ПЕПТИДНЫЕ КОНЪЮГАТЫ И СПОСОБ КОНЪЮГАЦИИ
<130> 849864
<150> AU 2016900701
<151> 2016-02-26 <160> 130
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
<223> Xaa1 is absent or is S or a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa4 is absent or is one or more hydrophilic amino acids
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln
1 5 10 15
Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25 30
<210> 2
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
<223> Xaal is absent or is S or a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or is from 1 to 10 hydrophilic amino acids
<400> 2
Xaa Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp
1 5 10 15
Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25 30
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S or a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is from one to four hydrophilic amino acids
<400> 3
Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25 30
<210> 4
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 4
Ser Lys Lys Lys Lys Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly
20 25 30
Leu
<210> <211> <212> <213>
28 PRT
Artificial
<220> <223>
Synthetic peptide sequence
<400> 5
Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu 20 25
<210> 6
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
<223> Xaa1 is absent or is S or a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is absent or a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa4 is absent or is one or more hydrophilic amino acids
<400> 6
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp
Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His
20 25 30
Ile Tyr Glu Glu Ala 35
<210> 7
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S or a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or is from one to ten hydrophilic amino acids
<400> 7
Xaa Xaa Xaa Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly
1 5 10 15
Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile
20 25 30
Tyr Glu Glu Ala 35
<210> 8
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S or a hydrophilic amino acid
<221> <222> <223>
MISC_FEATURE (2)..(2)
Xaa2 is absent or is from one to four hydrophilic amino acids
<400> 8
Xaa Xaa Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
1 5 10 15
Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr
20 25 30
Glu Glu Ala 35
<210> <211> <212> <213>
PRT
Artificial
<220> <223>
Synthetic peptide sequence
<400> 9
Ser Lys Lys Lys Lys Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn
1 5 10 15
Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln
20 25 30
His Ile Tyr Glu Glu Ala 35
<210> <211> <212> <213>
<220> <223>
<400>
10 33 PRT
Artificial
Synthetic peptide sequence
Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro
1 5 10 15
Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu
20 25 30
Ala
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S or a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa4 is absent or is one or more hydrophilic amino acids
<400> 11
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser
1 5 10 15
Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25
<210> 12
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S or a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or is from one to ten hydrophilic amino acids
<400> 12
Xaa Xaa Xaa Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu
Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu 20 25
<210> 13
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S or a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is from one to four hydrophilic amino acids
<400> 13
Xaa Xaa Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25
<210> <211> <212> <213>
14 30 PRT
Artificial
<220> <223>
<400>
Synthetic peptide sequence
Ser Lys Lys Lys Lys Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25 30
<210> 15
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly
1 5 10 15
Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25
<210> 16
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 16
Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln
1 5 10 15
Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
20 25 30
Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr
35 40 45
Glu Glu Ala 50
<210> 17
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 17
Xaa Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp
1 5 10 15
Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro
20 25 30
Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu
35 40 45
Glu Ala 50
<210> 18
<211> 49
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 18
Xaa Xaa Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro
20 25 30
Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu
35 40 45
Ala
<210> 19
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 19
Ser Lys Lys Lys Lys Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly
20 25 30
Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile
35 40 45
<210> 20
<211> 47
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 20
Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu
1 5 10 15
Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala
35 40 45
<210> 21
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 21
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser
1 5 10 15
Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe
20 25 30
Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
35 40
<210> 22
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220> <221> <222>
misc_feature (1)..(3)
<400> 22
Xaa Xaa Xaa Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser
1 5 10 15
Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu
20 25 30
Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
<210> 23
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 23
Xaa Xaa Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr
20 25 30
Ala Leu Ala Leu Leu Leu
<210> 24
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 24
Ser Lys Lys Lys Lys Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys
1 5 10 15
Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu
20 25 30
Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
35 40
<210> 25
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 25
Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser
1 5 10 15
Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu
20 25 30
Ala Leu Leu Leu
<210> 26
<211> 44
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 26
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile
1 5 10 15
Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg
20 25 30
Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
35 40
<210> 27
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220> <221> <222>
misc_feature (1)..(3)
<400> 27
Xaa Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys
1 5 10 15
Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu
20 25 30
Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
35 40
<210> 28
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 28
Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser
1 5 10 15
Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe
20 25 30
Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
35 40
<210> 29
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 29
Ser Lys Lys Lys Lys Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala
20 25 30
Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
35 40 45
<210> 30
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 30
Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr
20 25 30
Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
35 40
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 31
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile
1 5 10 15
Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu
20 25 30
<210> 32
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
Xaa Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys
1 5 10 15
Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu
20 25
<210> 33
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 33
Xaa Xaa Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser
1 5 10 15
Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu
20 25
<210> 34
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 34
Ser Lys Lys Lys Lys Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu
20 25 30
<210> 35
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 35
Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu
20 25
<210> 36
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 36
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu
20 25 30
Leu Leu Ala
<210> 37
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 37
Xaa Xaa Xaa Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser
1 5 10 15
Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
20 25 30
Leu Ala
<210> 38
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 38
Xaa Xaa Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys
1 5 10 15
Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
20 25 30
Ala
<210> 39
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 39
Ser Lys Lys Lys Lys Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro
1 5 10 15
Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu
20 25 30
Leu Leu Leu Ala
<210> 40
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 40
Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu
1 5 10 15
Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
20 25 30
<210> 41
<211> 61
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 41
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu
1 5 10 15
Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro
20 25 30
Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu
35 40 45
Leu Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile
50 55 60
<210> 42
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 42
Xaa Xaa Xaa Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp
1 5 10 15
Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu
20 25 30
Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu
35 40 45
Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile
50 55 60
<210> 43
<211> 59
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 43
Xaa Xaa Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr
1 5 10 15
Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser
20 25 30
Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu
35 40 45
Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile 50 55
<210> 44
<211> 62
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 44
Ser Lys Lys Lys Lys Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu
1 5 10 15
Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys
20 25 30
Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala
35 40 45
Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile
50 55 60
<210> 45
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 45
Leu Asn Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val
1 5 10 15
Val Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile
20 25 30
Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala
35 40 45
Ser Ala Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile 50 55
<210> 46
<211> 48
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 46
Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu
1 5 10 15
Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu
20 25 30
Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala
35 40 45
<210> 47
<211> 47
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
Xaa Xaa Xaa Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala
20 25 30
Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala
35 40 45
<210> 48
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 48
Xaa Xaa Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile
1 5 10 15
Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg
20 25 30
Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala
35 40 45
<210> 49
<211> 49
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 49
Ser Lys Lys Lys Lys Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu
20 25 30
Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser
35 40 45
<210> 50
<211> 44
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 50
Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu Ile Cys Ser
1 5 10 15
Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe
20 25 30
Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala
35 40
<210> 51
<211> 55
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 51
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu
1 5 10 15
Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly
20 25 30
Gly Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val
35 40 45
Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu
50 55
<210> 52
<211> 54
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 52
Xaa Xaa Xaa Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly
20 25 30
Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val Leu
35 40 45
Gln Leu Ser Pro Leu Leu
<210> 53
<211> 53
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 53
Xaa Xaa Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ile
1 5 10 15
Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly Ile
20 25 30
Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln
35 40 45
Leu Ser Pro Leu Leu
<210> 54
<211> 56
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 54
Ser Lys Lys Lys Lys Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys
20 25 30
Gly Gly Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala
35 40 45
Val Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu
50 55
<210> 55
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 55
Leu Gln Gly Ile Tyr Val Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala
1 5 10 15
Tyr Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly Ile Met Phe
20 25 30
Leu Ala Cys Val Leu Val Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln Leu Ser
35 40 45
Pro Leu Leu
<210> 56
<211> 56
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 56
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr
20 25 30
Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe
35 40 45
Leu Ile Phe Leu Ile Gly Phe Ala 50 55
<210> 57
<211> 55 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 57
Xaa Xaa Xaa Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Ser
1 5 10 15
Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val
20 25 30
Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu
35 40 45
Ile Phe Leu Ile Gly Phe Ala 50 55
<210> 58
<211> 54
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 58
Xaa Xaa Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Ser Leu
1 5 10 15
Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met
20 25 30
Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile
35 40 45
Phe Leu Ile Gly Phe Ala 50
<210> 59
<211> 57
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 59
Ser Lys Lys Lys Lys Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met
1 5 10 15
Cys Ser Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu
20 25 30
Thr Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly
35 40 45
Phe Leu Ile Phe Leu Ile Gly Phe Ala 50 55
<210> 60
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 60
Ser Gly Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Ser Leu Gly Gly
1 5 10 15
Leu Leu Thr Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met Ser Asn
20 25 30
Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu
35 40 45
Ile Gly Phe Ala 50
<210> 61
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 61
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro
1 5 10 15
Tyr Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr
20 25 30
Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly
35 40 45
Leu Pro Pro
<210> 62
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 62
Xaa Xaa Xaa Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro Tyr
1 5 10 15
Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln
20 25 30
Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
35 40 45
Pro Pro
<210> 63
<211> 49
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 63
Xaa Xaa Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro Tyr Trp
1 5 10 15
Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp
20 25 30
Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro
35 40 45
Pro
<210> 64
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 64
Ser Lys Lys Lys Lys Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp
1 5 10 15
Pro Tyr Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly
20 25 30
Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp
35 40 45
Gly Leu Pro Pro
<210> 65
<211> 47
<212> PRT
<213> Artificial
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 65
Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Pro Tyr Trp Gly Asn
1 5 10 15
Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser
20 25 30
Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro
35 40 45
<210> 66
<211> 55
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 66
Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro
1 5 10 15
Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser
20 25 30
Met Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp
35 40 45
Leu Ala Ala Ile Ala Ala Ser 50 55
<210> 67
<211> 54
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
Xaa Xaa Xaa Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg
1 5 10 15
Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met
20 25 30
Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu
35 40 45
Ala Ala Ile Ala Ala Ser 50
<210> 68
<211> 53 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 68
Xaa Xaa Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp
1 5 10 15
Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met Asn
20 25 30
Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala
35 40 45
Ala Ile Ala Ala Ser 50
<210> 69
<211> 56
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 69
Ser Lys Lys Lys Lys Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser
1 5 10 15
Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly
20 25 30
Ser Met Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe
35 40 45
Trp Leu Ala Ala Ile Ala Ala Ser 50 55
<210> 70
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 70
Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser
1 5 10 15
Ser Gln His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met Asn Pro Val
20 25 30
Cys Leu Pro Val Ile Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala Ile
35 40 45
Ala Ala Ser 50
<210> 71
<211> 54
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 71
Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val
1 5 10 15
Ser Thr Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu
20 25 30
Ala Ala Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu Thr
35 40 45
Pro Val Thr Val Leu Thr 50
<210> 72
<211> 53
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 72
Xaa Xaa Xaa Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val Ser
1 5 10 15
Thr Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu Ala
20 25 30
Ala Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu Thr Pro
35 40 45
Val Thr Val Leu Thr 50
<210> 73
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 73
Xaa Xaa Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val Ser Thr
1 5 10 15
Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu Ala Ala
20 25 30
Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu Thr Pro Val
35 40 45
Thr Val Leu Thr 50
<210> 74
<211> 55
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 74
Ser Lys Lys Lys Lys Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Thr Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu
20 25 30
Leu Ala Ala Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu
35 40 45
Thr Pro Val Thr Val Leu Thr 50 55
<210> 75
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 75
Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val Ser Thr Val Val
1 5 10 15
Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu Ala Ala Val Ala
20 25 30
Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg Lys Leu Leu Thr Pro Val Thr Val
35 40 45
Leu Thr 50
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 76
Glu Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr
1 5 10
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 77
Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr 1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 78
His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Thr 1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 79
Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu 1 5
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 80
Pro Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr
1 5 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence <400> 81
Leu Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr 1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 82
Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu 1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 83
Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu 1 5
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 84
Gly Thr Gln Asp Gln Ser Leu Tyr Leu Gly
1 5 10
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
Gln Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His 1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 86
Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp 1 5
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 87
Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu
1 5 10
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 88
Gly Asn Asp Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr
1 5 10
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 89
Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro 1 5
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence <400> 90
Gly Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg
1 5 10
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 91
Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr
1 5 10
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 92
Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr 1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 93
His Ile Tyr Glu Glu Ala Gly Arg Gly
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 94
Ile Leu Leu Ala Arg Leu Phe Leu Tyr 1 5
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 95
Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile
1 5 10
<210> <211> <212> <213>
PRT
Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 96
Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu Leu
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 97
Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu 1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 98
Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 99
Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln Leu 1 5
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 100
Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu 1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 101
Thr Val Cys Gly Gly Ile Met Phe Leu
1 5
<210> 102 <211> 42 <212> PRT
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE <222>
<223> Xaa1 is absent or is S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa4 is absent or is one or more hydrophilic amino acids
<400> 102
Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe
1 5 10 15
Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg
20 25 30
Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu
35 40
<210> 103
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or is from one to ten hydrophilic amino acids
<400> 103
Xaa Xaa Xaa Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr
1 5 10 15
Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg
20 25 30
Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu 35 40
<210> 104
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is from one to four hydrophilic amino acids
<400> 104
Xaa Xaa Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu
1 5 10 15
Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser
20 25 30
Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu 35 40
<210> 105
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 105
Ser Lys Lys Lys Lys Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu
1 5 10 15
Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala
20 25 30
Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu
35 40
<210> 106
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 106
Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met
1 5 10 15
Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala
20 25 30
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 107
Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met 1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 108
Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu 1 5
<210> 109
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE <222>
<223> Xaa1 is absent or is S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa4 is absent or is one or more hydrophilic amino acids
<400> 109
Xaa Xaa Xaa Xaa Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser
1 5 10 15
Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg
20 25 30
<210> 110
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or is from one to ten hydrophilic amino acids
<400> 110
Xaa Xaa Xaa Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly
1 5 10 15
Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg 20 25
<210> 111
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is from one to four hydrophilic amino acids
<400> 111
Xaa Xaa Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn
1 5 10 15
Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg 20 25
<210> 112
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 112
Ser Lys Lys Lys Lys Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val
1 5 10 15
Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg
20 25 30
<210> 113
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 113
Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg 20 25
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 114
Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu
1 5
<210> 115
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<221> MISC_FEATURE
<222>
<223> Xaa1 is absent or is S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa4 is absent or is one or more hydrophilic amino acids
<400> 115
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln
1 5 10 15
Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg
20 25 30
<210> 116
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or is from one to ten hydrophilic amino acids
<400> 116
Xaa Xaa Xaa Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5 10 15
Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg
20 25 30
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is from one to four hydrophilic amino acids
<400> 117
Xaa Xaa Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe
1 5 10 15
Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg
20 25 30
<210> <211> <212> <213>
<220> <223>
<400>
118
33 PRT
Artificial
Synthetic peptide sequence
118
Ser Lys Lys Lys Lys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr
1 5 10 15
Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg
20 25 30
Arg
<210> 119
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 119
Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro
1 5 10 15
Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg 20 25
<210> 120
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 120
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe
1 5 10
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 121
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys 1 5
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 122
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5
<210> 123
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 123
Cys Ser Lys Lys Lys Lys Asn Leu Val Pro Cys Val Ala Thr Val
1 5 10 15
<210> 124
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220> <223>
Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa4 is absent or is one or more hydrophilic amino acids
<400> 124
Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu
1 5 10 15
Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr
20 25 30
Glu Trp Thr 35
<210> 125
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1 is absent or is S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is a hydrophilic amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa3 is absent or is from one to ten hydrophilic amino acids
Xaa Xaa Xaa Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile
1 5 10 15
Asn Glu Ala Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu
20 25 30
Trp Thr
<210> 126
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
<223> Xaa1 is absent or is S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa2 is absent or is from one to four hydrophilic amino acids
<400> 126
Xaa Xaa Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn
1 5 10 15
Glu Ala Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp
20 25 30
Thr
<210> <211> <212> <213>
127
PRT
Artificial
<220> <223>
<400>
Synthetic peptide sequence
127
Ser Lys Lys Lys Lys Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala
1 5 10 15
Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
20 25 30
Thr Glu Trp Thr 35
<210> 128
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 128
Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala
1 5 10 15
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr
20 25 30
<210> 129
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400> 129
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5
<210> <211> <212> <213>
130 17 PRT
Artificial
<220> <223>
<400>
Synthetic peptide sequence
130
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly
1 5 10 15
Arg
где
m и w независимы и каждое представляет собой целое число от 0 до 7, a v представляет собой целое число от 0 до 5, при условии, что:
сумма m, v, и w, по меньшей мере, равна 3; а
сумма т и w составляет от 0 до 7; п равно 1 или 2;
Z1 и Z2 независимы и каждое выбирается из группы, состоящей из: -О-, -NR-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -С(0)0-, -ОС(О)-, -C(0)NR-, -NRC(O)-, -C(0)S-, -SC(O)-, -OC(0)0-, -NRC(0)0-, -OC(0)NR-, и -NRC(0)NR-;
Rl, R2, Rx, Ry, R4, R5, R6 и R7, при каждом конкретном m, v, w, и n, каждое независимо представляет собой водород или С1-6 алифатическую группу;
R, R3 и R8 каждое независимо представляет собой водород или С1-6 алифатическую группу;
R9 представляет собой водород, С1-6 алифатическую группу, аминозащитную группу, 1_3-С(0)- или А2;
L1 и L2 каждое независимо выбирается из С5-21 алифатической группы или С4-20 гетероалифатической группы;
L3 представляет собой С1-21 алифатическую группу или С2-20 гетероалифатическую группу;
А1 представляет собой аминокислоту, пептид, ОН, ОР1, NH2 или NHP2, где Р1 представляет собой карбоксилзащитную группу, а Р2 представляет собой карбоксамидзащитную группу;
А2 представляет собой аминокислоту или пептид;
где любая алифатическая или гетероалифатическая группа, присутствующая в любом из R, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Rx, Ry, LI, L2 и L3 необязательно замещена;
или их фармацевтически приемлемую соль или сольват.
Соединение по п.1, отличающееся тем, что:
Rl, R2, Rx, Ry, R4, R5, R6 и R7, при каждом конкретном m, v, w, и п, каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил или СЗ-6 циклоалкил;
R, R3 и R8 каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил или СЗ-6 циклоалкил;
R9 представляет собой водород, С1-6 алкил, СЗ-6 циклоалкил, аминозащитную группу, 1_3-С(0)- или А2;
L1 и L2 каждое независимо выбирается из С5-21 алкила, С5-21 алкенила или С4-20 гетероалкила;
L3 представляет собой С1-21 алкил, С2-21 алкенил, СЗ-6 циклоалкил или С2-20 гетероалкил;
А1 представляет собой аминокислоту, пептид, ОН, ОР1, NH2 или NHP2, где Р1 представляет собой карбоксилзащитную группу, а Р2 представляет собой карбоксамидзащитную группу;
А2 представляет собой аминокислоту или пептид;
где любой алкил, алкенил или гетероалкил, присутствующий в любом из R, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Rx, Ry, LI, L2 и L3, необязательно замещен.
Соединение по п.1 или 2, отличающееся тем, что Z1 и Z2 каждое независимо выбирают из группы, состоящей из -С(0)0-, -C(0)NR- и -C(0)S-.
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что соединение представляет собой соединение формулы (IA):
R1 R2 R4 R5 R6 R7
L1- С(О) O^rr^P^S
L2 С(0)-О-ЬО у R8 V
RX RV
(IA)
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что v составляет от 0 до 3.
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что v равно 0.
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что m и w каждое независимо составляет от 0 до 5.
8. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что m и w каждое независимо составляет от 1 до 4.
9. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что сумма m и w составляет от 2 до 7.
5 10. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что сумма m и w составляет от 2 до 5.
11. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что
сумма m и w равна 3.
12. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что
10 m составляет от 1 до 3.
13. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что m равно 2.
14. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что w равно 1 или 2.
15 15. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что w равно 1.
16. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что п
равно 1.
17. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что
20 L1 и L2 каждое независимо представляет собой С5-21 алкил.
18. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что L1 и L2 каждое независимо представляет собой линейный С15 алкил.
19. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что L3 представляет собой метил или линейный С15 алкил.
25 20. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что L3 представляет собой метил.
21. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что аминозащитная группа представляет собой Вое или Fmoc.
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что R1 и R2 при каждом конкретном т, каждое независимо представляет собой С1-6 алкил или водород, предпочтительно водород.
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что R3 представляет собой С1-6 алкил или водород, предпочтительно водород.
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что R4 и R5 при каждом конкретном w, каждое независимо представляет собой С1-6 алкил или водород, предпочтительно водород.
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что Rx и Ry при каждом конкретном v, каждое независимо представляет собой С1-6 алкил или водород, предпочтительно водород.
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что R6 и R7 при каждом конкретном п, каждое независимо представляет собой С1-6 алкил или водород, предпочтительно водород.
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что R8 независимо представляет собой С1-6 алкил или водород, предпочтительно водород.
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что R9 представляет собой С1-6 алкил, водород, аминозащитную группу, 1_3-С(0) или А2, предпочтительно, водород, аминозащитную группу, 1_3-С(0) или А2.
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что соединение представляет собой соединение формулы (IF):
(IF)
где m представляет собой целое число от 2 до 6, а оставшиеся переменные соответствуют определению в любом предшествующем пункте.
Соединение по п.29, отличающееся тем, что соединение представляет собой соединение формулы (IF-1):
L1 C(O) СГ ¦ m ^ * 'rf
R8 V
L2-C(O)-О R3 (IF-1)
Соединение по любому из пп. 1-28, отличающееся тем, что соединение представляет собой соединение формулы (IB):
R° Ra
(IB)
1 D2 Rbv Rc R4 R5 Rf R7
где
к представляет собой целое число от 0 до 4; а
Ra, Rb и Rc каждое независимо представляет собой водород или С1-6 алифатическую группу.
32. Соединение по п.31, отличающееся тем, что соединение формулы (IB) представляет собой соединение формулы (1С):
|_2-С(0)-0-Щ v Rx Ry
(1С)
15 33. Соединение по п. 31 или 32, отличающееся тем, что к составляет от 0 до 3.
34. Соединение по любому из пп. 31-33, отличающееся тем, что к равно 0.
35. Соединение по любому из пп. 31-34, отличающееся тем, что Ra, Rb и Rc каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил или СЗ-6 циклоалкил, предпочтительно водород.
34.
Соединение по любому из пп. 31-35, отличающееся тем, что Ra, Rb и Rc каждое независимо выбирается из водорода или С1-6 алкила, предпочтительно, водорода.
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что соединение представляет собой соединение формулы (ID):
L1- С(0) О
(ID)
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что соединение формулы (I) имеет формулу (IEE-3):
(IEE-3)
Соединение по любому из пп. 1-37, отличающееся тем, что соединение формулы (I) имеет формулу (IEE-4):
(IE)
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что соединение формулы (I) имеет формулу (IE):
41. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что
А1 представляет собой ОН, ОР1, NH2 или NHP2, a R9 представляет собой
водород, С1-6 алкил, СЗ-6 циклоалкил, аминозащитную группу или 1_3-С(0).
42. Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что
5 А1 представляет собой ОН или ОР1, a R9 представляет собой водород,
аминозащитную группу или 1_3-С(0).
43. Соединение по любому из пп. 1-40, отличающееся тем, что А1 и/или А2
представляют собой аминокислоту или пептид.
44. Соединение по любому из пп. 1-40 и п. 43, отличающееся тем, что пептид
10 включает антигенную детерминанту.
45. Соединение по п. 44, отличающееся тем, что антигенная детерминанта представляет собой пептидную антигенную детерминанту.
46. Соединение по п. 44 или 45, отличающееся тем, что антигенная детерминанта сопрягается или связывается с помощью линкерной группы.
15 47. Соединение по любому из пп. 1-40 и пп. 43-46 отличающееся тем, что аминокислота пептидного конъюгата, с которым конъюгированы липидные фрагменты, представляет собой N-концевой аминокислотный остаток.
48. Соединение по любому из пп. 1-40 и пп. 43-47 отличающееся тем, что А1 представляет собой серии или пептид, включающий серии в качестве первого
20 N-концевого аминокислотного остатка.
49. Соединение по любому из пп. 1-40 и пп. 43-48, отличающееся тем, что А1 и/или А2 представляют собой пептид, включающий солюбилизирующую группу.
50. Соединение по п.49, отличающееся тем, что солюбилизирующая группа
25 включает аминокислотную последовательность, содержащую два или более
гидрофильных аминокислотных остатка в пептидной цепи.
51. Соединение по п.50, отличающееся тем, что два или более гидрофильных
аминокислотных остатка примыкают к сериновому остатку.
52. Соединение по любому из пп. 1-40 и пп. 43-51, отличающееся тем, что пептид
30 включает, по существу состоит, или состоит из аминокислотной
последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8 или более
примыкающих аминокислот из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1-121.
Соединение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что, необязательно, заместители выбираются из группы, состоящей из галогена, CN, N02, ОН, NH2, NHR10, NR10R20, С1-6 галогеналкила, С1-6 галогеналкокси, C(0)NH2, C(O)NHR10, C(O)NR10R20, SO2RIO, OR10, SR10, S(O)R10, C(O)R10 и Cl-6 алифатической группы; где RIO и R20 каждое независимо представляет собой С1-6 алифатическую группу, например С1-6 алкил.
Способ получения аминокислотного или пептидного конъюгата формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата по любому из предшествующих пунктов; способ включающий реакцию:
первого липидсодержащего партнера по конъюгации, включающего двойную углерод-углеродную связь;
второго липидсодержащего партнера по конъюгации, включающего двойную углерод-углеродную связь; и
аминокислотного партнера по конъюгации, включающего тиол,
в условиях, способствующих конъюгации первого липидсодержащего партнера по конъюгации и второго липидсодержащего партнера по конъюгации с аминокислотным партнером по конъюгации и получению аминокислотного или пептидного конъюгата формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата,
где в аминокислотном или пептидном конъюгате, атом серы из тиола аминокислотного партнера по конъюгации конъюгирует с атомом углерода из двойной углерод-углеродной связи первого липидсодержащего партнера по конъюгации, а атом углерода из двойной углерод-углеродной связи первого липидсодержащего партнера по конъюгации конъюгирует с атомом углерода из двойной углерод-углеродной связи второго липидсодержащего партнера по конъюгации.
Способ по п. 54, отличающийся тем, что первый и второй липидсодержащие партнеры конъюгации имеют одинаковую структуру.
Способ по п. 54 или 55, отличающийся тем, что способ включает конъюгирование атома серы из тиола с атомом углерода из двойной углерод-углеродной связи первого липидсодержащего партнера по конъюгации, а затем конъюгирование атома углерода из двойной углерод-углеродной связи,
в которой указанный тиол конъюгирован с атомом углерода двойной углерод-углеродной связи второго липидсодержащего партнера по конъюгации.
Способ по любому из пп. 54-56, отличающийся тем, что:
первый липидсодержащий партнер по конъюгации представляет собой соединение формулы (ПА):
Rx Ry R (ПА)
второй липидсодержащий партнер по конъюгации представляет собой соединение формулы (ПВ):
R] R2 Rb
аминокислотный партнер по конъюгации включает структуру формулы
(III):
R6 R7
R8 V
(Ш); и
где Ra, Rb, Rc, LI, L2, Zl, Z2, Rl, R2, Rx, Ry, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Al, k, v и n соответствуют определению в любом из предшествующих пунктов.
Способ по любому из пп. 54-57, отличающийся тем, что аминокислотный или пептидный конъюгат представляет собой соединение формулы (IB):
R1 R2 Rb4 Rc R4 R5 Rf R7
где Ra, Rb, Rc, LI, L2, Zl, Z2, Rl, R2, Rx, Ry, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, Al, k, v и n соответствуют определению в любом из предшествующих пунктов.
59. Способ по любому из пп. 54-58, отличающийся тем, что липидсодержащие партнеры по конъюгации находятся в стехиометрическом избытке по отношению к аминокислотному партнеру по конъюгации.
5 60. Способ по любому из пп. 54-59, отличающийся тем, что условия,
способствующие конъюгации липидсодержащего партнера по конъюгации с
аминокислотным партнером по конъюгации, включают в себя образование
одного или более свободных радикалов, инициируемых термическим
разложением термоинициатора и/или фотохимическим разложением
10 фотохимического инициатора.
61. Способ по п. 60, отличающийся тем, что термический инициатор представляет собой AIBN, а фотохимический инициатор представляет собой DMPA.
15 62. Способ по п. 60 или 61, отличающийся тем, что фотохимическое разложение свободнорадикального инициатора включает облучение ультрафиолетовым светом, предпочтительно имеющим частоту, совместимую с боковыми цепочками встречающихся в природе аминокислот, предпочтительно составляющую 365 нм.
63. Способ по любому из пп. 54-62, отличающийся тем, что реакция осуществляется в жидкой среде, содержащей растворитель, где растворитель включает NMP, DMF, DMSO или их смесь.
25 64. Способ по п. 63, отличающийся тем, что растворитель выключает NMP.
65. Способ по любому из пп. 54-64, отличающийся тем, что реакция протекает в присутствии одной или более добавок, которые подавляют образование побочных продуктов и/или повышают выход или глубину превращения
30 требуемого соединения формулы (I).
66. Способ по п. 65, отличающийся тем, что одна или более добавок представляет собой посторонний тиол, кислоту, органосилан или комбинацию любых двух или более из них.
67. Способ по п.66, отличающийся тем, что посторонний тиол представляет собой стерически затрудненный тиол, например трет-бутилмеркаптан.
68. Способ по п. 66 или 67, отличающийся тем, что кислота представляет собой
40 сильную органическую кислоту, например TFA.
Способ по любому из пп. 66-68, отличающийся тем, что органосилан представляет собой триалкилсилан, например TIPS.
Способ по любому из пп. 66-69, отличающийся тем, что аминокислотный конъюгат или пептидный конъюгат отделяют от реакционной среды после реакции и, необязательно, очищают.
Способ получения соединения формулы (XX), способ, включающий реакцию эпоксида формулы (XVI):
R3 а
R1 R2 (XVI); и
аминокислотного партнера по конъюгации, включающего тиол формулы (III):
R6 R7 HS-K^C(°)-A1
R8 V (III)
в условиях, способствующих конъюгации эпоксида и аминокислотного партнера по конъюгации и получению соединения формулы (XV):
где
Х10 представляет собой L1-Z1-, -ОН, -SH, -NHR, HNRC(0)0-, Р10-О-, P11-S-, P12-NR- или P12-NRC(0)0-;
XII представляет собой Х10 или -ОН, -SH, -NHR, или HNRC(0)0- когда Х10 представляет собой Р10-О-, P11-S-, P12-NR-, или P12-NRC(0)0- а указанные условия способствуют удалению Р10, Р11 или Р12;
Р10, Р11 и Р12 каждое независимо представляет собой защитную группу;
m представляет собой целое число от 2 до 6; а
n, LI, Zl, R, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 и Al соответствуют определению в соединении формулы (I) или соответствуют определению в любом предшествующем пункте; или их соли или сольвату.
Способ по п.71, отличающийся тем, что Х10 представляет собой L1-C(0)0-, ОН или Р10-О-; а XII представляет собой L1-C(0)0-, Р10-О- или ОН.
Способ по п. 71 или 72, отличающийся тем, что способ включает осуществление реакции эпоксида и аминокислотного партнера по конъюгации в присутствии кислоты.
Способ по любому из пп. 71-73, отличающийся тем, что способ включает получение эпоксида путем осуществления реакции алкена формулы (XVII):
(XVII)
и окислителя в условиях, способствующих эпоксидированию алкена.
Способ по любому из пп. 71-73, отличающийся тем, что способ включает получение эпоксида путем реакции соединения формулы (XVII-A), где LG представляет собой уходящую группу:
(XVII-A)
и основания в условиях, способствующих эпоксидированию.
Способ по любому из пп.71-75, отличающийся тем, что способ включает превращение соединения формулы (XV) в аминокислотный или пептидный конъюгат формулы (IF), по любому из предшествующих пунктов, или их фармацевтически приемлемую соль или сольват, посредством одной или более дополнительных стадий синтеза:
(IF)
Способ по п. 76, отличающийся тем, что XII представляет собой Р10-О- или ОН, а одна или более стадий синтеза включают ацилирование соединения формулы (XV) с возможностью замены Р10 или атома водорода гидроксильной группы из XII на Ll-C(O)-, и/или ацилирование соединения формулы (XV) с возможностью замены атома водорода гидроксильной группы, связанный с углеродом, к которому присоединено R3, на 1_2-С(0)-.
Способ получения соединения формулы (XX), способ, включающий реакцию соединения формулы (XXI):
R1 R2 R4 R5
Ч0-(T()V RX RV (XXI); и
аминокислотного партнера по конъюгации, включающего тиол формулы (III):
R6 R7
-С (О)-А1
HS^ х 'п
R8 V (Ш),
в условиях, способствующих конъюгации соединения формулы (XXI) и аминокислотного партнера по конъюгации и получению соединения формулы (XX):
(XX)
где
Rm и Rn каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил, арил или гетероарил.
LG представляет собой уходящую группу;
m и w независимы и каждое представляет собой целое число от 0 до 7, a v представляет собой целое число от 0 до 5, при условии, что:
сумма m, v, и w, по меньшей мере, равна 3; а сумма т и w составляет от 0 до7; а п, Rx, Ry, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 и Al соответствуют определению в соединении формулы (I) или соответствуют определению в любом предшествующем пункте; или их соли или сольвату.
Способ по п.78, отличающийся тем, что Rm и Rn каждое независимо выбирается из водорода, С1-6 алкила или арила.
Способ по п.78 или 79, отличающийся тем, что, Rm представляет собой водород, С1-6 алкил или арил, a Rn представляет С1-6 алкил или арил.
Способ по любому из пп. 78-80, отличающийся тем, что значения m и v таковы, что данное соединение включает 5-7-членный циклический ацеталь.
Способ по п. 81, отличающийся тем, что циклический ацеталь представляет собой 6-членный циклический ацеталь.
Способ по любому из пп.78-82, отличающийся тем, что способ включает реакцию соединения формулы (XXI) и аминокислотного партнера по конъюгации формулы (III) в присутствии основания.
Способ по любому из пп.78-83, отличающийся тем, что способ включает превращение соединения формулы (XX) в аминокислотный или пептидный конъюгат формулы (I) по любому из предшествующих пунктов или их фармацевтически приемлемую соль или сольват посредством одной или более дополнительных стадий синтеза:
Способ по п. 84, отличающийся тем, что одна или более стадий синтеза включают удаление ацеталя в соединении формулы (XX) с получением соединения формулы (XXIII-1):
(XXIII-1)
Способ по п. 84, отличающийся тем, что Rm, необязательно, замещен арилом, например фенилом или метоксизамещенным фенилом, а способ включает удаление ацеталя в соединении формулы (XX) с получением соединения формулы (XXIII-2) или (ХХШ-З) :
(ХХШ-З)
Способ по п. 85, отличающийся тем, что одна или более стадий синтеза включают превращение гидроксильной группы, связанной с углеродом, к которому присоединены R1 и R2 в соединении формулы (XXIII-1), в L1-Z1-; и/или превращение гидроксильной группы, связанной с углеродом, к которому присоединены Rx и Ry, в L2-Z2.
Способ по п. 86, отличающийся тем, что стадии синтеза включают:
превращение гидроксильной группы, связанной с атомом углерода, к которому присоединены Rx и Ry в соединении формулы (XXIII-2), в L2-Z2-; удаление группы RmRnCH- для получения гидроксильной группы и превращение гидроксильной группы в L1-Z1; или
превращение гидроксильной группы, связанной с углеродом, к которому присоединены Rx и Ry в соединении формулы (XXIII-2), в L1-Z1-; удаление группы RmRnCH- для получения гидроксильной группы и превращение гидроксильной группы в L2-Z2-.
Способ по п. 87 или 88 В отличающийся тем, что превращение указанной гидроксильной группы в L1-Z1- или L2-Z2- включает ацилирование, с возможностью замены атома водорода гидроксильной группы на Ll-C(O)- или 1_2-С(0)-.
Способ по любому из пп. 54-89, отличающийся тем, что аминокислотный партнер по конъюгации представляет собой пептидсодержащий партнер по конъюгации.
Способ по п. 90, отличающийся тем, что пептидсодержащий партнер по конъюгации включает антигенную детерминанту.
Способ по любому из пп. 54-91, отличающийся тем, что аминокислотный партнер по конъюгации состоит из пептида.
Способ по любому из пп. 54-92, отличающийся тем, что аминокислотный партнер по конъюгации, представляет собой пептидсодержащий партнер по конъюгации, содержащий 15 или менее, 14 или менее, 13 или менее, 12 или менее, 11 или менее, 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее или 3 или менее аминокислотных остатков.
Способ по любому из пп. 54-89, отличающийся тем, что аминокислотный партнер по конъюгации состоит из аминокислоты.
Способ по любому из пп. 54-94, отличающийся тем, что, С-конец аминокислотного партнера по конъюгации, защищен защитной группой, и/или Na-аминогруппа аминокислотного партнера по конъюгации, защищена защитной группой.
96. Способ по любому из пп. 54-93 и п. 95, отличающийся тем, что аминокислотный остаток, включающий тиол, представляет собой N-концевой аминокислотный остаток.
5 97. Способ по любому из пп. 54-96, отличающийся тем, что тиол представляет собой тиол цистеинового остатка.
98. Способ по любому из пп.54-97, отличающийся тем, что R9 в аминокислотном партнере по конъюгации, включающем тиол, представляет собой 1_3-С(0) -.
99. Способ по любому из пп. 54-70, 76, 77 и 84-98 отличающийся тем, что способ включает сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата формулы (I) или аминокислоты пептидного конъюгата формулы (I) с аминокислотой или аминокислотой пептида и получение пептидного конъюгата.
100. Способ получения пептидного конъюгата, способ включающий:
получение аминокислотного или пептидного конъюгата формулы (I) по любому из пп. 1-53 или его соли или сольвата, и
сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата или
20 аминокислоты пептидного конъюгата с аминокислотой или аминокислотой
пептида и получение пептидного конъюгата.
101. Способ по п.99 или 100, отличающийся тем, что способ включает сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата с аминокислотой или
25 аминокислотой пептида и получение пептидного конъюгата.
102. Способ по любому из пп 99-101 отличающийся тем, что, способ включает сопряжение аминокислоты аминокислотного конъюгата или аминокислоты пептидного конъюгата с аминокислотой или пептидом и получение пептидного
30 конъюгата, включающего пептидную антигенную детерминанту.
103. Способ по любому из пп 99-102 отличающийся тем, что, способ включает сопряжение антигенной детерминанты с аминокислотой аминокислотного конъюгата или аминокислотой пептидного конъюгата.
104. Способ по п. 100 или 101, отличающийся тем, что пептид включает
антигенную детерминанту.
105. Способ по любому из пп. 91, 103 и 104, отличающийся тем, что антигенная
детерминанта представляет собой пептидную антигенную детерминанту.
106. Способ по п. 105, отличающийся тем, что антигенная детерминанта
5 сопрягается или связывается с помощью линкерной группы.
107. Способ по любому из пп. 99-106, отличающийся тем, что аминокислота пептидного конъюгата, с которым конъюгированы липидные фрагменты, представляет собой N-концевой аминокислотный остаток.
108. Способ по любому из пп. 54-70, 76, 77 и 84-107, отличающийся тем, что способ дополнительно включает ацилирование Na-аминогруппы аминокислоты аминокислотного конъюгата или аминокислотного остатка пептидного конъюгата, с которым конъюгированы липидные фрагменты.
109. Способ по п. 108, отличающийся тем, что аминогруппу ацилируют С2-20 жирной кислотой, такой как ацетил.
110. Способ по любому из пп.54-109, отличающийся тем, что пептидный конъюгат
20 или аминокислотный партнер по конъюгации включает одну или более
солюбилизирующих групп.
111. Способ по п. 110, отличающийся тем, что солюбилизирующая группа представляет собой аминокислотную последовательность, включающую
25 последовательность из двух или более последовательных гидрофильных
аминокислотных остатков в пептидной цепи.
112. Способ по любому из пп. 54-110, отличающийся тем, что пептидный конъюгат и/или аминокислотный партнер по конъюгации, включает сериновый остаток,
30 примыкающий к аминокислотному остатку, с которым конъюгированы
липидные фрагменты.
113. Аминокислотный или пептидный конъюгат формулы (I) по любому из пп.1-53 или его соль или сольват, полученные способом по любому из пп. 54-112.
35 114.
Лекарственный препарат, содержащий эффективное количество соединения пептидного конъюгата по любому из пп.1-53и 113 или его фармацевтически приемлемая соль или сольват и фармацевтически приемлемый носитель.
117.
118.
119.
Лекарственный препарат по п. 114, включающий эффективное количество двух или более соединений пептидного конъюгата по любому из пп.1-53 и п. ИЗ.
Способ вакцинирования или вызывания иммунного ответа у пациента, включая введение нуждающемуся пациенту эффективного количества одного или более соединений пептидного конъюгата по любому из пп. 1-53 и п. 113 или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, или эффективного количества лекарственного препарата по п. 114 или 115.
Применение одного или более соединений пептидного конъюгата по любому из пп. 1-53 и п. 113 или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата или лекарственного препарата по п. 114 или п. 115 при изготовлении лекарственного средства для вакцинации или вызывания иммунного ответа у пациента.
Одно или более соединений пептидного конъюгата по любому из пп.1-53 и п. 113 или его фармацевтически приемлемая соль или сольват или лекарственный препарат по п.114 или 115 для вакцинации или вызывания иммунного ответа у пациента.
Соединение формулы (XV):
120.
где
XII представляет собой L1-Z1-, -ОН, -SH, -NHR, HNRC(0)0-, Р10-О-, P11-S-, P12-NR- или P12-NRC(0)0-;
Р10, Р11 и Р12 каждое независимо представляет собой защитную группу;
m представляет собой целое число от 2 до 6; и
n, LI, Zl, R, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 и А1 соответствуют определению в соединении формулы (I) или соответствуют определению в любом предшествующем пункте; или их соли или сольвату.
Соединение формулы (XX):
где
Rm и Rn каждое независимо представляет собой водород, С1-6 алкил, арил или гетероарил.
m и w независимы и каждое представляет собой целое число от 0 до 7, a v представляет собой целое число от 0 до 5, при условии, что:
сумма m, v, и w, по меньшей мере, равна 3; а сумма т и w составляет от 0 до 7; а n, Rx, Ry, Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 и Al соответствуют определению в соединении формулы (I) или соответствуют определению в любом предшествующем пункте, или их соли или сольвату.
1/8
'ВО- 500.6
§87,1
ввел
994 6
РИСУНОК 2
РИСУНОК 3
mTLR2
hTLR2
1200-
1100
1000-
900
800-
с ю
700-
"?,
600-
500
<
400-
300
200
100-
[mol/L-1]
[mol/L-1]
mTLR2
HTLR2
10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-5 10-6 10-7 10-6 10-9 10-10
[mol/L-1] [mol/Ы]
mTLR2
hTLR2
10-6 10-7 10-8 10-9
[mol/L-1]
10-6 10-7 10-8 10-Э [mol/Ы]
D E
, , ... . .¦¦ ¦ U - г 1- ""П"
10uM 1uM ЮОпМ 10uM 1uM 100nM
mTLR2
г- -¦- г-
' 1-
1.0-
0,9-
03-
03-
ч <-
6.2' 01-
-1' -
о.о-
•г •
& О С
mTLR2
[moVL] mm 10
-10'-''
. 50
hTLR2
hTLR2
(moi.'L]
1.7*1 251М
О г* 054 0П
1.75-,
1.5Q-! 25
1 00
ь 7S-
ею-
0 2*.
0.00
I
00 00
" ^ еР
^ ЧФ <Р
^ с/ ^ о* О О v v
^ ^ # ^
1/203
1/203
(19)
1/203
1/203
(19)
1/203
1/203
(19)
8/203
9/203
11/203
10/203
13/203
13/203
25/203
26/203
28/203
28/203
37/203
37/203
37/203
37/203
41/203
41/203
42/203
42/203
(III):
(III):
42/203
42/203
(III):
(III):
43/203
43/203
45/203
45/203
45/203
45/203
45/203
45/203
46/203
46/203
47/203
47/203
(III):
51/203
50/203
(III):
51/203
50/203
(III):
51/203
50/203
(III):
51/203
50/203
53/203
53/203
81/203
82/203
84/203
84/203
85/203
86/203
88/203
88/203
145/203
146/203
145/203
146/203
148/203
148/203
153/203
152/203
Стадия Ш
153/203
152/203
Стадия Ш
153/203
152/203
Стадия Ш
153/203
152/203
Стадия Ш
153/203
152/203
Стадия Ш
153/203
154/203
Стадия Ш
153/203
154/203
Стадия Ш
155/203
155/203
158/203
158/203
158/203
158/203
158/203
158/203
160/203
160/203
160/203
160/203
163/203
164/203
Стадия Н
163/203
164/203
Стадия Н
163/203
164/203
Стадия Н
166/203
166/203
166/203
166/203
166/203
166/203
169/203
170/203
Стадия v
172/203
172/203
Стадия i
Стадия i
173/203
174/203
Стадия Н
176/203
176/203
176/203
176/203
176/203
176/203
178/203
178/203
178/203
178/203
178/203
178/203
178/203
178/203
178/203
178/203
179/203
179/203
181/203
180/203
822.
181/203
180/203
822.
181/203
180/203
822.
181/203
180/203
822.
181/203
182/203
822.
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<220>
<210> 11 <211> 29
<210> 11 <211> 29
<210> 11 <211> 29
<210> 11 <211> 29
<210> 11 <211> 29
<210> 11 <211> 29
<210> 11 <211> 29
<210> 11 <211> 29
<210> 11 <211> 29
<210> 11 <211> 29
<210> 11 <211> 29
<210> 11 <211> 29
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400>
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400>
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400>
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400>
Tyr Glu Glu Ala 50
Tyr Glu Glu Ala 50
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400>
<400>
<220>
<220>
<400>
<400>
Ala
Ala
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<220>
<400>
<400>
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<210> 81 <211> 9
<210> 81 <211> 9
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400>
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<400>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
MISC_FEATURE
MISC_FEATURE
Gln Asp Ala Pro Pro Leu 35
Gln Asp Ala Pro Pro Leu 35
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<220>
<223> Synthetic peptide sequence
<220>
<210> 117
<210> 117
<400> 125
<400> 125
<400> 125
<400> 125
<400> 125
<400> 125
183/203
183/203
185/203
185/203
31.
187/203
186/203
31.
187/203
186/203
31.
187/203
186/203
31.
187/203
188/203
31.
187/203
188/203
31.
187/203
188/203
189/203
189/203
190/203
190/203
191/203
191/203
191/203
191/203
191/203
191/203
191/203
191/203
192/203
192/203
193/203
193/203
199/203
198/203
199/203
198/203
201/203
116.
201/203
116.
201/203
116.
201/203
116.
201/203
116.
201/203
116.
202/203
202/203
РИСУНОК 4А
РИСУНОК 4А
РИСУНОК 4А
РИСУНОК 4А
РИСУНОК 4А
РИСУНОК 4А
РИСУНОК 4А
РИСУНОК 4А
РИСУНОК 4B
РИСУНОК 4B
РИСУНОК 4B
РИСУНОК 4B
РИСУНОК 4C
РИСУНОК 4C
РИСУНОК 4C
РИСУНОК 4C
РИСУНОК 4E
РИСУНОК 4D
РИСУНОК 4E
РИСУНОК 4D
РИСУНОК 5
РИСУНОК 5
РИСУНОК 6А
РИСУНОК 6А
РИСУНОК 6В
РИСУНОК 6В
РИСУНОК 6В
РИСУНОК 6В
РИСУНОК 6В
РИСУНОК 6В