(57) Реферат / Формула:
Данное изобретение относится к композициям химерных и гуманизированных антител, которые связываются с молекулой CTLA4 человека, и их использованию в иммунотерапии рака и для уменьшения аутоиммунных побочных эффектов по сравнению с другими иммунотерапевтическими средствами.
Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201891128 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2016.12.14
(51) Int. Cl.
A61K 39/00 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) C12P 21/08 (2006.01) C07K16/00 (2006.01)
(54)
ХИМЕРНЫЕ И ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ CTLA4 МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
(31) 62/267,735; 62/309,169; 62/359,036
(32) 2015.12.15; 2016.03.16; 2016.07.06
(33) US
(86) PCT/US2016/066698
(87) WO 2017/106372 2017.06.22
(71) Заявитель: ОНКОИММЬЮН, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Лю Ян, Чжэн Пань, Девенпорт Мартин (US)
(74) Представитель:
Харин А.В., Котов И.О., Буре Н.Н., Стойко Г.В. (RU) (57) Данное изобретение относится к композициям химерных и гуманизированных антител, которые связываются с молекулой CTLA4 человека, и их использованию в иммунотерапии рака и для уменьшения аутоиммунных побочных эффектов по сравнению с другими иммунотерапевтиче-скими средствами.
ХИМЕРНЫЕ И ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИ-ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ CTLA4 МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
Область изобретения
5 Данное изобретение относится к химерным и гуманизированным антителам, которые связываются с молекулой CTLA4 человека и к способам их использования.
Уровень техники
Иммунная система человека и других млекопитающих отвечает за обеспечение защиты от инфекции и болезней. Такая защита обеспечивается как гуморальным
ю иммунным ответом, так и клеточным иммунным ответом. Гуморальный ответ
приводит к синтезу антител и других биомолекул, которые способны распознавать и нейтрализовать чужие мишени (антигены). В противоположность этому, клеточный иммунный ответ включает активацию макрофагов, нейтрофилов, естественных клеток-киллеров (ЕКК) и антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов Т-
15 клеток и высвобождают различные цитокины в ответ на распознавание антигена.
Способность Т-клеток оптимально опосредовать иммунный ответ против антигена требует двух различных сигнальных взаимодействий. Во-первых, антиген, который экспонируется на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК), должен быть
20 представлен в антиген-специфичных наивных Т-клетках в виде ГКГС: пептидного комплекса (1, 2). Такое представление подает сигнал через Т-клеточный рецептор (ТКР), который направляет Т-клетку для инициирования иммунного ответа, который будет специфичным для представленного антигена. Во-вторых, серия костимулирующих сигналов, опосредующих взаимодействие между АПК и
25 различными поверхностными молекулами Т-клеток, запускает сначала активацию и пролиферацию Т-клеток и, в конечном счете, их ингибирование (3-5). Таким образом, первый сигнал придает специфичность иммунному ответу, тогда как второй сигнал служит для определения характера, величины и продолжительности ответа при ограничении аутоиммунитета. Особое значение среди этих вторых сигнальных
зо молекул является связывание между В7.1 (CD80) (6) и В7.2 (CD86) (7-9) лигандами
антигенпрезентирующих клеток и рецепторами CD28 и CTLA4 (10-12) Т-лимфоцита.
Антиген цитотоксических Т-лимфоцитов-4 (CTLA4) признан ключевым регулятором адаптивных иммунных ответов, который играет центральную роль в поддержании периферической толерантности и в формировании репертуара возникающих Т-клеточных реакций и, следовательно, терапевтической мишени для лечения рака и 5 воспаления. Было показано, что лечение анти- CTLA4 антителами является мощным инструментом для усиления противоопухолевого иммунитета в доклинических моделях (10). Монотерапия антителом против CTLA4 способствовала отторжению трансплантируемых опухолей различного происхождения.
Основываясь на перспективных доклинических модельных исследованиях опухолей, ю клинический потенциал антител против CTLA4 был исследован при различных злокачественных новообразованиях человека. Хотя анти-СТ1_А4 (Ипилимумаб, продаваемый как Ервой) продемонстрировал эффективность при лечении меланомы, лечение и нацеливание CTLA4 связано с токсичностью, подобной автоиммунной. Характерные побочные эффекты от ингибирования CTLA4 обычно называются 15 иммуноопосредованными нежелательными явлениями (иоНЯ), а наиболее
распространенными иоНЯ являются кожная сыпь, гепатит, колит и эндокринопатии, особенно гипопитуитаризм. Таким образом, существует желание улучшить терапевтический потенциал анти-СТ1_А4 антител, повышая эффективность при одновременном снижении ассоциированных иоНЯ.
20 Другая цель области иммунотерапии и лечения опухолей является сочетание различных ингибиторов иммунного контроля для усиления противоопухолевой активности, особенно против слабо иммуногенных опухолей. Однако этот подход связан с риском дальнейшего увеличения аутоиммунных побочных эффектов, еще раз подчеркивая необходимость выборочной модуляции иммунитета к раку без
25 усиления аутоиммунитета.
Дальнейшие исследования лигандов рецептора CD28 привели к идентификации и характеристике серии связанных молекул В7 ("суперсемейство В7") (32-33). В настоящее время существует несколько известных членов семейства: В7.1 (CD80), В7.2 (CD86), лиганд индуцибельного костимулятора (ICOS-L), лиганд зо запрограммированной клеточной гибели-1 (PD-L1; В7-Н1), лиганд
запрограммированной клеточной гибели-2 (PD-L2; B7-DC), В7-НЗ, В7-Н4 и В7-Н6 (3536).
В7-Н1 широко экспрессируется в разных тканях человека и мыши, таких как сердце, плацента, мышцы, печень плода, селезенка, лимфатические узлы и тимус для обоих 5 видов, а также печени, легких и почек только у мышей (37). В7-Н1 (PD-L1, CD274) является особенно важным элементом суперсемейства В7, поскольку он играет ключевую роль в формировании иммунного ответа к опухолям (38; U.S. Pat. Nos. 6803192; 7794710; United States Patent Application Publication Nos. 20 05/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; PCT Publication No. WO 01/39722; WO 10 02/086083).
Программированная клеточная гибель-1 ("PD-1") представляет собой рецептор В7-Н1, а также B7-DC. PD-1 представляет собой I тип мембранного белка расширенного семейства регуляторов CD28/CTLA4 Т-клеток (39; United States Patent Application Publication No. 2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667; U.S. Pat. Nos. 6808710; 15 7101550; 7488802; 7635757; 7722868; PCT Publication No. WO 01/14557). По сравнению с CTLA4, PD-1 в более широком плане отрицательно регулирует иммунные ответы. PD-1 экспрессируется на активированных Т-клетках, В-клетках и моноцитах (40-41) и на низких уровнях в естественных клетках киллерах (ЕКК) Т-клеток (42-43).
20 Было обнаружено, что взаимодействие В7-Н1 и PD-1 обеспечивает критический
отрицательный костимулирующий сигнал к Т-, и В-клеткам (43) и функционирует как индуктор гибели клеток (39). Роль В7-Н1 и PD-1 в ингибировании активации и пролиферации Т-клеток предпологает, что эти биомолекулы могут служить терапевтическими мишенями для лечения воспаления и рака. Следовательно, было
25 предложено и продемонстрировано использование анти-PDI и анти-В7-Н1 для лечения инфекций и опухолей и повышения модуляции адаптивного иммунного ответа, что является эффективным для лечения ряда опухолей человека. Однако не все субъекты реагируют или имеют полные ответы на лечение анти-PD-l или анти-В7-Н1, и поэтому существует большой интерес к комбинированию анти-PD-l или
зо анти-В7-Н1 с другими ингибиторами контрольных точек иммунного ответа для усиления противоопухолевой активности.
4-1BB (также известный как CD137 и TNFRSF9) представляет собой другую молекулу контрольной точки иммунного ответа. Наилучшим образом охарактеризованная активность CD137 представляет собой костимуляторную активность для активированных Т-клеток. Сшивание CD137 усиливает пролиферацию Т-клеток, 5 секрецию IL-2, выживаемость и цитолитическую активность. Кроме того, подобно анти-СТ1_А4, анти-4-1ВВ антитела могут усиливать иммунную активность для устранения опухолей у мышей (27-29). Однако, в отличие от тенденции анти-СТ1_А4 антител к обострению аутоиммунных заболеваний, было показано, что раковые терапевтические анти-4-1 ВВ мкАТ отменяют развитие аутоиммунных заболеваний у
ю мышей, страдающих волчанкой, при которой они ингибируют продукцию анти-дцДНК-антител и снижают почечную патологию (25, 26). Ранее, данные продемонстрировали, что можно уменьшить аутоиммунные побочные эффекты лечения анти-СТ1_А4 в опухолевой модели рака толстой кишки мыши путем комбинированного лечения анти-СТ1_А4 с анти-4-1 ВВ антителом, одновременно
15 повышая противоопухолевую активность (19). Это демонстрирует, что можно
компенсировать аутоиммунные побочные эффекты анти-СТ1_А4-опухолевой терапии.
Доклинический скрининг анти-человеческий CTLA4 антител чреват трудностями, потому что in vitro иммунологические корреляты иногда малозначительны, о чем свидетельствует опыт с анти-мышиный CTLA4 антителами. Те же анти-мышиный
20 СТ1_А4-антитела, которые индуцируют мощный противоопухолевый иммунитет in vivo , могут иметь непостоянные эффекты на Т-клетки in vitro. Анти-СТ1_А4 антитела усиливали пролиферацию Т-клеток в ответ на аллоантиген, но подавляли пролиферацию Т-клеток в ответ на костимуляцию анти-CD 28 (30, 31). Кроме того, взаимодействие CTLA4 с антителом может способствовать или ингибировать
25 пролиферацию различных субпопуляций Т-клеток в одной и той же культуре (32). Это осложнение можно преодолеть, если изучить ответы Т-клеток человека на модели грызунов.
Описанные в данном документе анти-СТ1_А4 антитела представляют собой аннтитела с уменьшенными аутоиммунными побочными эффектами при зо использовании для усиления иммунных реакций и для использования в
противоопухолевой терапии. Кроме того, эти антитела могут использоваться в комбинации с другими ингибиторами контрольных точек, такими как анти-PD-l и
анти-4-1 ВВ, для усиления противоопухолевой активности при нейтрализации аутоиммунных побочных эффектов.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к композициям антител и их антигенсвязывающим 5 фрагментам, которые связываются с человеческой молекулой CTLA4, и их использованием для иммунотерапии рака с уменьшенными аутоиммунными побочными эффектами. В частности, изобретение относится к антителам с усиленной СТ1_А4-блокирующей активностью для лигандов CTLA4 В7.1 и В7.2, усиленной эффекторной функции или восстановленному связыванию с растворимым ю CTLA4 относительно связанной с мембраной или иммобилизованной CTLA4.
Антитело может содержать вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, содержащую вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и
15 вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую
аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Антитело может также содержать вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27, 28 или 29 и вариабельную аминокислотную последовательность
20 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30, 31 или 32. Антитело может содержать вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательности CDR, представленные в SEQ ID NO: 21, 22 и 23, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательности CDR, представленные в SEQ ID NO: 24, 25 и 26. Более конкретно, антитело может
25 содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность CDR2, представленную в SEQ ID NO: 33, 34 или 35 и вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательности CDR, представленные в SEQ ID NO: 36, 37 или 38.
Константные области тяжелой цепи иммуноглобулина антитела могут содержать зо аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3 или 4. Константная область тяжелой цепи иммуноглобулина антитела может также
содержать мутацию. Относительно последовательности цепи hlgG1 в SEQ ID NO: 3, мутация может быть M135Y, S137T, Т139Е, S181A, Е216Аили К217Аили их комбинацией. Преимущественно, константная область тяжелой цепи иммуноглобулина антитела может содержать все шесть мутаций. Антитело может 5 содержать аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, и аминокислотную последовательность легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8. Антитело может также содержать аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую ю аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, 11 или 13, и аминокислотную последовательность легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, 17 или 19. Антитело может быть способным связывать человеческий CTLA4. Антитело также может ингибировать связывание CTLA4 человека с В7-1 или В7-2.
15 Кроме того, в данном документе предлагается антигенсвязывающий фрагмент антител, описанных в данном документе.
Также в данном документе представлена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество антител, описанных в данном документе. Фармацевтическая композиция может содержать физиологически 20 приемлемый носитель или наполнитель.
В другом аспекте, представленном в данном документе, представлены способы усиления одной или нескольких иммунных функций или ответов у субъекта, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиций анти-СТ1_А4 антитела и фармацевтических композиций, описанных в данном документе. В
25 конкретном варианте реализации изобретения, представленном в данном документе, предлагаются способы предотвращения, лечения и/или управления болезнью, в которой желательно активировать или усиливать одну или несколько иммунных функций или ответов. Болезнью может быть рак, который может быть злокачественной опухолью человека. В частности, злокачественное
зо новообразование человека может быть меланомой, раком легкого, раком молочной железы, гепатоцеллюлярной карциномой, карциномой яичников, карциномой
предстательной железы, Ходжкинской или неходжкинской лимфомой, острой миелогенной лейкемией, хронической миелогенной лейкемией, острой лимфоцитарной лейкемией, хроническим лимфоцитарным лейкозом или почечно-клеточной карциномой. В другом варианте реализации изобретения, заболевание, 5 подлежащее лечению, представляет собой инфекционное заболевание. Описанный в данном документе способ может минимизировать аутоиммунные побочные эффекты, связанные с иммунотерапией.
В других конкретных вариантах осуществления способ включает комбинированную терапию, в которой композиции анти-СТ1_А4 антитела, описанные в данном
ю документе, вводят субъекту в сочетании с другой терапией, которая может
активировать или усиливать одну или несколько иммунных функций или ответов. В другом варианте реализации изобретения, композиции анти-СТ1_А4 антитела, описанные в данном документе, вводят в качестве стимулятора в комбинации с антигенной композицией. В конкретном примере осуществления изобретения,
15 композиции антит-СТ1_А4 антител, описанные в данном документе, вводят в
комбинации с вакцинной композицией для индукции или активации или усиления иммунного ответа, вызванного вакцинной композицией.
В конкретном примере осуществления изобретения, композиции анти-СТ1_А4 антитела, описанные в данном документе, вводят субъекту в сочетании с одной или
20 несколькими другими терапиями, которые нацелены на различные
иммуномодулирующие пути. В предпочтительном варианте реализации изобретения, активность терапии, нацеленной на другой иммуномодулирующий путь, является комплементарной или синергичной с композициями анти-СТ1_А4 антител, описанных в данном документе. В одном случае композиции анти-СТ1_А4 антител, описанные в
25 данном документе, вводят в комбинации с другими ингибиторами контрольных точек или с небольшими онкоиммунологическими модуляторами, такими как ингибиторы индоламина 2,3-диоксигеназы (ИДО). В другом случае, композиции анти-СТ1_А4 антител, описанные в данном документе, вводят в комбинации с иммуностимулирующими молекулами. Конкретные варианты осуществления
зо изобретения включают комбинацию композиций анти-СТ1_А4 антител, описанных в данном документе, с анти-PD-l (пембролизумаб (Кейтруда) или Ниволумаб (Опдиво)), анти-В7-Н1 (атезолизумаб (Тецентрик) или дурвалумаб), анти-В7-НЗ, анти-В7-Н4,
aHTM-LAG3, анти-~ПтЗ, анти-СО40, анти-ОХ40, анти-BTLA, анти-С027, анти-ICOS или анти-41 ВВ. В другом варианте реализации изобретения, композиции анти-СТ1_А4 антител, описанные в данном документе, и вторая иммуностимулирующая молекула объединяются в одно биспецифическое антитело.
5 В другом варианте реализации, анти-человеческий CTLA4 антитело, описанное в данном документе, может преимущественно связываться с человеческим CTLA-4, экспрессируемым на поверхности клетки по отношению к растворимой молекуле CTLA4. Анти-человеческий CTLA4 может связываться с челевеческим CTLA4 и преимущественно регулировать экспрессию В7.1 или В7.2 in vivo. Антитело может ю содержаться в композиции для использования при модулиляции иммунных реакций (иммунотерапия) и лечении рака.
Изобретение также относится к способу скрининга анти-человеческий CTLA4 мкАТ с предпочтительной активностью. Доклинический скрининг анти-человеческий CTLA4 мкАТ чреват затруднениями, поскольку иммунологические корреляции in vitro для
15 иммунологии рака и аутоиммунного неблагоприятного воздействия не определены. Значительные аутоиммунные побочные эффекты наблюдались в клинических испытаниях с человеческим анти-СТ1_А4 (Ипилимумаб), особенно в сочетании с анти-PD-l . Чтобы идентифицировать анти-СТ1_А4 антитела, связанные с уменьшеннной иммунной токсичностью, антитела, демонстрирующие противоопухолевую
20 активность у гуманизированных мышей, могут быть подвергнуты скринингу на их способность уменьшать аутоиммунные побочные эффекты in vivo с использованием мышей с нокин гена CTLA4 человека.
В другом варианте реализации, изобретение относится к способу скрининга античеловеческий CTLA4 мкАТ с усиленным противоопухолевым эффектом, в котором 25 антитела демонстрируют усиленное локальное деплетирование клеток Трег в опухолевой микросреде.
В еще одном варианте реализации, изобретение относится к способам мониторинга блокирующих эффектов анти-СТ1_А4 антител in vivo путем контроля уровней экспрессии В7.1 и В7.2 на иммунных клетках, таких как антигенпрезентирующие зо клетки (АПК). Изобретение дополнительно рассматривает биомаркеры для
измерения биологической активности анти-С~П_А4 in vivo и контроля явных ответов
на лечение анти-СТ1_А4 путем измерения экспрессии уровня В7.1 и В7.2 на иммунных клетках ex vivo.
Чтобы картировать СТ1_А4-связывающий эпитоп исходного антитела L3D10 и гуманизированных вариантов, РР4631 и РР4637, использовался факт, что мышиные 5 и человеческие белки CTLA4 являются перекрестно-реактивными к В7-1, но не к анти-СТ1_А-4. Соответственно, был синтезирован ряд мутантов белка CTLA-4FC человека, в котором кластеры аминокислот из белка CTLA-4 человека были заменены аминокислотами из белка Ctla-4 мыши. Поскольку анти-С~П_А-4, используемые в данном исследовании, не связываются с мышиным Ctla-4, ю связывание анти-человеческий CTLA-4 антител может быть отменено, когда ключевые остатки связывающего антитела эпитопа заменяются мышиными аминокислотами.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Схематическая диаграмма химерных (слева) и гуманизированных (справа) 15 антител L3D10 с новой комбинацией мутаций в Fc-области lgG1. Положения мутаций в Fc-области идентифицируются по их номеру положения аминокислоты, а аминокислоты идентифицируются по их одному буквенному коду, причем буква перед номером, представляет заменяемую аминокислоту, и буква после числа, представляет введенную аминокислоту. Вариабельная область антител изображена 20 с открытыми овалами, а последовательность человека изображена с серыми
прямоугольниками. V = вариабельная область; С = константная область; L = легкая цепь; Н = тяжелая цепь.
Фиг. 2. CTLA4 связывание химерных L3D10 и 10D1 с планшетом с иммобилизованной CTLA4, как определено ИФА. В планшеты для ИФА вносили 1
25 мкг/мл белка CTLA4-His (Sino Biological, Китай). Данную концентрацию
биотинилированных связывающих белков добавляли, и связывание измеряли с использованием HRP-конъюгированного стрептавидина. 10D1-1 и -2 представляют собой две независимые материальные серии одного и того же антитела. B7.1-FC представляет собой положительный контроль, a Fc представляет собой
зо отрицательный контроль.
Фиг. 3. Конкурентный анализ L3D10. 10D1 менее эффективен в блокировании химерного связывания L3D10 с CTLA4, чем химерный L3D10. Эксперимент проводили, как изображено на фиг. 2, за исключением того, что биотинилированный химерный L3D10 смешивали сданной концентрацией немеченых CTLA4-5 связывающих белков или CTLA4-FC перед добавлением к планшетам для ИФА. Обратите внимание, что гораздо лучше блокировать немеченым L3D10, чем 10D1, что свидетельствует о том, что эти сайты связывания антител не идентичны.
Фиг. 4. Блокирование связывания CTLA4 с планшет-иммобилизованной В7.1. Белок В7.1 Fc наносили на планшеты для ИФА в концентрации 0,5 мкг/мл. После промывки
ю и блокирования биотинилированный белок CTLA4-FC добавляли в концентрации 0,25 мкг/мл в присутствии заданных концентраций конкурирующих белков. Показанные данные представляют собой средние значения двух повторностей при оптической плотности 405 нм. В то время как B7.1-FC, химерные L3D10 и CTLA4-FC блокируют взаимодействие CTLA4: В7.1 дозозависимым образом, две отдельные серии 10D1-
15 антител не блокируются при всех тестируемых дозах. Биотинилирование CTLA4 не разрушает эпитопы 10D1 на CTLA4, так как оба участка 10D1 демонстрируют сильное связывание с биотинилированным CTLA4 (данные не представлены).
Фиг. 5. Блокирование связывания CTLA4 с планшет-иммобилизованной В7.2. Белок B7.2Fc наносили на планшеты для ИФА в концентрации 0,5 мкг/мл. После промывки 20 и блокирования биотинилированный белок CTLA4-FC добавляли в концентрации 0,25 мкг/мл в присутствии заданных концентраций конкурирующих белков. В то время как химерный L3D10 блокирует взаимодействие CTLA4: В7.2 дозозависимым образом, две отдельные серии антител 10D1 не смогли полностью блокировать взаимодействие CTLA4: В7.2 даже при самой высокой концентрации.
25 Фиг. 6. Как 10D1, так и L3D10 эффективно блокируют взаимодействие B7-CTLA4 с использованием растворимых В7-1 и В7-2 и иммобилизованных CTLA4-FC. Добавляли различные дозы анти-человеческий CTLA4 мкАТ вместе с 0,25 мкг/мл биотинилированного человеческого CTLA4-FC к планшетам с нанесенным человеческим В7-1 Fc. Количество CTLA4, связанного в планшетах, измеряли с
зо использованием стрептовидина, конъюгированного с HRP. Показанные данные
представляют собой средние значения двух повторностей и представляют собой два независимых эксперимента.
Фиг. 7. Блокирование связывания CTLA4 с поверхностью клетки, экспрессирующей
87.1. К клеткам ЯКХ, экспрессирующим В7.1 добавляли биотинилированный белок
5 CTLA4-FC в концентрации 0,5 мкг/мл в присутствии заданной концентрации
конкурирующих белков. Связывание биотинилированного слитого белка с клетками ЯКХ, трансфицированных мышиными или человеческими В7-1 и В7-2, детектировалось при помощи проточной цитометрии. Количество связанных рецепторов измеряли с использованием коньюгата фикоэритрин-стрептавидин. ю Показанные данные представляют собой среднее значение интенсивности флуоресценции трипликатов. В то время как химерный L3D10 блокирует взаимодействие CTLA4: В7.1 дозозависимым образом, две отдельные серии 10D1 антител не блокировались при всех тестируемых дозах.
Фиг. 8. Блокирование связывания CTLA4 с поверхностью клеток, экспрессирующих 15 мышиный В7.1. Слабое, но детектируемое блокирование взаимодействия мышиного В7-1-человеческого CTLA4 при помощи 10D1, когда тВ7-1 экспрессируется на клетках ЯКХ. Различные дозы анти-человеческий CTLA4 мкАТ добавляли вместе с
0. 25 мкг/мл человеческого CTLA4-FC к клеткам ЯКХ, экспрессирующим мышиный В7-
1. Показанные данные представляют собой средние значения и СОС или данные 20 трипликатов и представляют собой два независимых эксперимента.
Фиг. 9. Блокирование связывания CTLA4 с поверхностью клетки, экспрессирующей
87.2. К клеткам ЯКХ, экспрессирующим В7.2 добавляли биотинилированный белок
CTLA4-FC в концентрации 0,5 мкг/мл в присутствии заданной концентрации
конкурирующих белков. В то время как химерный L3D10 блокирует взаимодействие
25 CTLA4: В7.2 дозозависимым образом, две отдельные серии антител 10D1 не смогли полностью блокировать взаимодействие CTLA4: В7.2 даже при самой высокой концентрации. Данные, показанные на этой фигуре, повторялись не менее 5 раз.
Фиг. 10. 10D1 связывается с биотинилированным человеческим CTLA4-FC лучше, чем L3D10. Различные дозы анти-человеческий CTLA4 мкАТ или контрольного IgG зо наносились на планшеты. Биотинилированный CTLA4-FC добавляли в концентрации 0,25 мкг/мл. Количество CTLA4, связанного в планшетах, измеряли с использованием
стрептовидина, конъюгированного с HRP. Показанные данные представляют собой средние значения двух повторностей и представляют собой два независимых эксперимента.
Фиг. 11. L3D10, но не 10D1 блокирует взаимодействие между полигистиндин-5 нацеленными CTLA4 и клеткам ЯКХ, экспрессирующими человеческий В7-1. Клетки ЯКХ, экспрессирующие человеческий В7-1 инкубировали с полигистидин-нацеленным CTLA4, наряду с антителами заданной концентрации, количество CTLA4-FC детектировали с помощью ФЭ-стрептавидина и измеряли FACSCanto II. Показанные данные представляют собой средние значения интенсивности ю флуоресценции трех образцов и представляют собой два независимых эксперимента.
Фиг. 12. Химерный L3D10 индуцирует полную ремиссию установленных опухолей в сингенной модели МС38. Верхняя панель изображает экспериментальную схему, а нижние панели показывают кинетику роста опухолей МС38 у мышей, которые получали либо контрольный IgG (нижняя левая панель, п = 6), либо химерный L3D10 15 (нижняя правая панель, п = 5).
Фиг. 13. Терапевтический эффект химерных L3D10 и 10D1 в модели опухоли меланомы МС38. Для исследования использовали мышей с нокин CTLA4 человека с массой тела около 20 граммов.Опухолевые клетки МС38 1x106 инъецировали подкожно мышам Ctla4h/h, когда опухоль достигала диаметра 0,5 см, мышей с
20 опухолью, рандомизировали в три группы с 5 или 6 мышами в каждой. Мышей затем лечили (и/п): инъекция/100 мкг 10D1, химерного L3D10 или контрольного hlgGFc на 7, 10, 13 и 16 дни, как показано стрелками. Показаны результаты двух экспериментов (левая и правая секции), и показанные данные представляют собой среднее значение и СО размера опухоли (п = 6 на группу в левой секции, п = 5 на группу в
25 правой секции). L3D10 и 10D1 имеют сходный терапевтический эффект в этой
модели и могут одновременно вызвать полную ремиссию образованных опухолей. Диаметры (а!) опухоли рассчитывали по следующей формуле: D = D=V(ab), V = ab2/2, где а - наибольшая длинна диаметра, ab - наименьшая длина диаметра. Статистический анализ проводили с помощью двуфакторного дисперсионного
зо анализа повторных измерений ANOVA (время обработки X). Для левой секции: Р =
10D1 по сравнению с hlgGFc: 5.71 е-07; L3D10 по сравнению с hlgGFc: Р = 5.53е-07; 10D1 по сравнению с L3D10: Р = 0,869.
Фиг. 14. Эффективное подавление МС38 с помощью анти-СТ1_А-4 мкАТ у мышей CTLA4h/m. Как и на фиг. 13, исключается использование гетерозиготных мышей 5 CTLA4h/m. Показанные данные представляют собой средние значения и СОС
диаметров опухолей (6 мышей на группу); 10D1 по сравнению с hlgGFc: Р = 0,0011; L3D10 по сравнению с hlgGFc: Р = 5.55е-05; 10D1 по сравнению с L3D10: Р = 0,0346.
Фиг. 15. Терапевтический эффект химерных L3D10 и 10D1 в модели опухоли меланомы B16-F1. Для исследования использовали мышей с нокин CTLA4 человека ю с массой тела около 20 граммов. Стрелки указывают время лечения (50 мкг
lj/мышь/лечение). Данные представляют собой средние значения и СО размера опухоли (п = 4 на группу). L3D10 обладают сходным терапевтическим эффектом в этой модели и способны задерживать рост опухоли в этой агрессивной и недостаточно иммуногенной модели опухоли.
15 Фиг. 16. Анализ для измерения блокировки CTLA4 in vivo. В7.1 или В7.2 связывается на дендритных клетках, и клетки связываясь, снижают регуляцию CTLA4 на поверхности Т-клеток. Однако связывание блокирующих анти-СТ1_А4 антител препятствует связыванию В7.1/В7.2 с CTLA4 и, таким образом, предотвращает подавление В7.1 и В7.2, что приводит к суммарному увеличению экспрессии
20 В7.1/В7.2. Однако, с химерной Т-клеткой экспрессирующей человеческоий и
мышиный CTLA4, антитела, которые связывают CTLA4 человека, не препятствуют связыванию В7.1/В7.2 с мышиным CTLA4, что восстанавливает ингибирование В7.1/В7.2.
Фиг. 17A-F. 10D1 не блокирует взаимодействие B7-CTLA4 in vivo. Используя анализ, 25 описанный на фиг. 11, клетки мышей, при лечении анти-СТ1_А4 антителами,
использовали для анализа экспрессии В7.1 и В7.2. На фиг. 17А изображена схема эксперимента. Вкратце, мыши с учетом возраста и пола получали, интраперитонально, 500 мкг антител или их контроли. Через 24 часа после инъекции мышей умерщвляли, а клетки их селезенки окрашивали анти-CDHc, CD11Ь, анти-В7-зо 1 и анти-В7-2 мкАТ. На фиг. 17В изображены для наглядности данные,
показывающие фенотип CD11chl ДК, анализированных для экспрессии В7. На фиг.
17C изображены для наглядности гистограммы, показывающие уровни В7-1 на ДК мышей, которые получали контроль lgG1-Fc, L3D10 или 10D1. Данные на верхней панели показывают эффект антитела у гомозиготных нокин-мышей, тогда как на нижней панели показан эффект антител у гетерозиготных мышей. На фиг. 17D, 5 изображено как и на фиг. 17С, исключение экспрессии В7-2. Данные, показанные на фиг. 17С и D являются наглядными данными тех 3 мышей на группу и повторялись один раз стремя мышами на группу. На фиг. 17Е изображено, что у мышей гомозиготных по CTLA4 человека, L3D10, но не 10D1 индуцировало экспрессию В7-1 (левая панель) и В7-2 (правая панель). Показанные данные являются
ю суммированными из двух экспериментов с участием только 6 мышей на группу. В каждом эксперименте средние данные у контрольных мышей искусственно определяются как 100%, и в экспериментальных группах нормализуется против контроля. На фиг. 17F как и фиг. 17Е, исключается использование гетерозиготных мышей. Ни L3D10, ни 10D1 не блокируют взаимодействие B7-CTLA4 у мышей,
15 которые кодоминантно экспрессируют как мышиные, так и человеческие гены Ctla4.
Фиг. 18. L3D10 связывается с человеческим, но не с мышиным CTLA4. Данные представляют собой точечные графики внутриклеточного окрашивания CTLA4 среди гейтированных клеток Cd3+ Cd4+, с использованием клеток селезенки мышей Ctla4h/h (вверху) или Ctla4m/m (внизу). В качестве контроля использовали анти-мышиный 20 CTLA4 мкАТ 4F10.
Фиг. 19. Терапевтический эффект химерных L3D10 и 10D1 у мышей CTLA4h/m. На верхней панели изображена схема эксперимента. Мышей Ctla4h/h стимулировали клеточной линией МС38 рака толстой кишки, и когда опухоль достигла размера приблизительно 5 мм в диаметре, мышей обрабатывали 4 раза контрольным
25 человеческим IgG-Fc, L3D10 или 10D1 и наблюдали размер опухоли после 6
недельного периода. На нижней панели изображена кинетика роста опухолей МС38 у мышей, которые получали либо контрольный IgG, либо химерный L3D10, либо 10D1 (п = 6 на группу). Несмотря на очевидные различия активности блокирования CTLA4 in vivo, как показано на фиг. 16, как L3D10, так и 10D1 демонстрируют сильную
зо противоопухолевую активность против модели МС38 у химерных мышей CTLA4m/h.
Фиг. 20A-B. 10D1 и L3D10 оказывают сходное терапевтическое действие на рост меланомы В16. 1 х105 клеток опухоли В16 инъецировали (п/к) мышам Ctla4h/h (п = 4-5) и лечили (и/п) с помощью 100 мкг (фиг. 20А) или 250 мкг (фиг. 20В) 10D1, L3D10 или контрольным IgGFc на 11, 14, 17 день (фиг. 20А) или на 2, 5 день и на 8 (фиг. 20В), 5 как показано стрелками. Фиг. 20А, 10D1 по сравнению с hlgGFc: Р = 0,0265; L3D10 по сравнению с hlgGFc: 10D1 по сравнению с L3D10: Р = 0,0487; Р = 0,302. Фиг. 20В, 10D1 сравнительно с hlgGFc: Р = 0,00616; L3D10 сравнительно с hlgGFc: Р = 0,0269: 10D1 по сравнению с L3D10: Р = 0,370. Данные представляют собой среднее значение ± СОС 4-5 мышей на группу. Статистический анализ проводили с помощью ю двуфакторного дисперсионного анализа повторных измерений ANOVA.
Фиг. 21А-В. Иммунотерапевтические эффекты между L3D10 и 10D1 у Ctla4h/h (фиг. 21 А) и Ctla4m/h (фиг. 21В) мышей, которые умерщвлялись перед полным отторжением, чтобы оценить деплетирование Трег в микроокружении опухоли. Показанные данные представляют собой средние значения и СОС диаметров 15 опухоли двух независимых экспериментов с участием 5 мышей на группу.
Фиг. 22A-F. Блокирование взаимодействия B7-CTLA4 не способствует раковой иммунотерапевтической активности анти-СТ1_А4 мкАТ. На фиг. 22А изображен сравнительный иммунотерапевтический эффект, несмотря на значительную различную активность блокирования с помощью двух анти-СТ1_А4 мкАТ. 5x105
20 опухолевых клеток МС38 вводили (п/к) мышам Ctla4h/h (п = 6) и лечили (и/п) при помощи 100 мкг 10D1, L3D10 или контрольного hlgG-Fc на 7, 10, 13 и 16 дни, как показано стрелками. Данные представляют собой среднее значение ± СОС из шести мышей на группу. Статистический анализ проводили с помощью двуфакторного дисперсионного анализа повторных измерений ANOVA. 10D1 по сравнению с hlgG-Fc:
25 Р = 5.71е"07; L3D10 по сравнению с hlgG-Fc: Р = 5.53е-07; 10D1 по сравнению с L3D10: Р = 0,869. Данные представляют собой три независимых эксперимента. Фиг. 22В. У мышей, антитела не блокируют взаимодействие B7-CTLA4, и не индуцируют устойчивое отторжение опухоли. Как и на фиг. 22А, исключается использование гетерозиготных мышей, которые экспрессировали как мышиный, так и человеческий
зо CTLA4. 10D1 по сравнению с hlgG-Fc: Р = 0,0011; L3D10 по сравнению с hlgG-Fc: Р = 5,55е-05; 10D1 по сравнению с L3D10: Р = 0,0346. Данные представляют собой три независимых эксперимента. Фиг. 22C-F, блокирование взаимодействия B7-CTLA4 не
способствует селективному деплетированию Трег в микроокружении опухоли. Фиг. 22С и D. Независимо от их способности блокировать взаимодействие B7-CTLA4, L3D10 и 10D1 не удаляют Трег в селезенке. Показанные данные представляют собой % клеток Foxp3+ среди клеток селезенки CD4 Т-клеток в Ctla4h/h(cpHr. 22С) и 5 Ctla4m/h (фиг. 22D) мыши. п= 6. е и f, как L3D10, так и 10D1 удаляют Трег среди инфильтрирующих опухоль CD4 Т-клеток в Ctla4h/h (фиг. 22Е) и Ctla4m/h (фиг. 22F) мыши. Данные, показанные в c-f, представляют собой % от Трег в 17 (эксперимент 1) или 19 дней (эксперимент 2) после заражения опухолевыми клетками и через 10 или 12 дней после начала 4 анти-СТ1_А4-терапии мкАТ, как показано стрелками.
ю Фиг. 23A-F. Оценка активности блокирования обычно используемых анти-мышиный CTLA4 мкАТ 9Н10 и 9D9. Фиг. 23А и В изображают, что 9Н10 не блокирует взаимодействие B7-CTLA4, если В7-1 (фиг. 23А) и В7-2 (фиг. 23В) наносились на планшеты. Биотинилированный мышиный CTLA4-FC слитый белок инкубировали на планшетах, с внесенным В7, в присутствии контрольного IgG или анти-мышиный
15 CTLA4 мкАТ 9D9 и 9Н10 заданной концентрации. Связывание CTLA4
обнаруживается стрептавидином, конъюгированным с HRP. Показанные данные представляют собой две повторности двух независимых экспериментов. Фиг. 23С и D изображают, что 9D9 и 9Н10 проявляют дифференциальное связывание с растворимыми (фиг. 23С) и связанными в планшетах CTLA4-FC (фиг. 23D).
20 Показанные данные представляют собой две повторности, по меньшей мере, двух независимых экспериментов. Фиг. 23Е и F изображают эффекты анти-мышиный CTLA4 мкАТ 9D9 и 9Н10 на уровнях В7-1 (фиг. 23Е) и В7-2 (фиг. 23F) на CD11cft/ ДК из клеток селезенки WT (Ctla4m/m) через 24 часа после лечения 500 мкг антител, и/п. Данные суммированы из 6 независимых мышей на группу в двух независимых
25 экспериментах с участием 3 мышей на каждую группу.
Фиг. 24A-D. Отдельные in vivo и in vivo блокирующие активности анти-мышиный CTLA4 мкАТ 4F10. Фиг. 24А и В изображает влияние 4F10 на взаимодействие CTLA4-Fc с планшетами, с нанесенным В7-1 (фиг. 24А) или В7-2 (фиг. 24В). Биотинилированный мышиный CTLA4-FC слитый белок инкубировали в планшетах, с зо нанесенным В7, в присутствии контрольного IgG или анти-мышиный CTLA4 мкАТ 4F10 заданной концентрации. Связывание CTLA4 обнаруживается стрептавидином, конъюгированным с HRP. Показанные данные представляют собой две повторности
двух независимых экспериментов. Фиг. 24С и D изображено влияние 4F10 на экспрессию В7-1 и В7-2. Сводные данные по В7-1 (фиг. 24С) и В7-2 (фиг. 24D) от 6 мышей на группу. Уровни В7 в контрольной группе, обработанной IgG, искусственно определяются как 100%.
5 Фиг. 25. Побочные эффекты химерных L3D10 и 10D1 в комбинации с анти-PD-l На верхней панели изображена схема эксперимента. Для исследования использовались 10-дневные, только самки, мыши с нокин CTLA4 человека, с весом тела более 4 граммов. Они получали указанные белки или их комбинации. Стрелки указывают время лечения (100 мкг/мышь/лечение). Показанные данные представляют собой ю средние значения и СО % веса. Химерные L3D10 и 10D1 обладают сравнимым
терапевтическим эффектом рака у взрослых мышей (фиг. 13), но заметные побочные эффекты наблюдаются, когда 10D1 комбинируется с анти-PD-l мкАТ.
Фиг. 26. Побочные эффекты химерных L3D10 и 10D1 в комбинации с анти-PD-l График изображает конечный вес тела на 42 день у мышей из эксперимента, 15 изображенного на фиг. 25, которые получали либо контрольный IgG, 10D1 + анти-PD-1, либо химерный L3D10 + анти-PD-l (п = 5 на группу). Значительное снижение веса наблюдается в комбинации анти-PDI+IODI, которое не наблюдалась в комбинации анти- PD-1+химерный L3D10.
Фиг. 27. Патологические эффекты химерного L3D10 и 10D1 в сочетании с анти-PD-l 20 Для дальнейшего изучения относительной токсичности L3D10 по сравнению с 10D1 при введении в комбинации с анти-PD-l мы рассмотрели общую анатомию мышей, описанных выше на фиг. 26. Матка/яичник/мочевой пузырь и тимус были заметно меньше у мышей, получавших 10D1 + PD-1, тогда как органы у мышей, обработанных L3D10 + анти-PD-l, были сопоставимы с контролем hlgG. В противоположность 25 этому, сердца, иссеченные из мышей, обработанных 10D1, выглядели большими по размеру с заметно более белым видом.
Фиг. 28A-D. Лечение 10D1 в комбинации с анти-PD-l приводит к аномальному эритропоэзу. Учитывая различия в сердцах, наблюдаемые на фиг. 27, мы рассмотрели эритропоэз у мышей и наблюдали явные различия в мышах, зо получавших 10D1 + анти-PD-l по сравнению с группами, получавших лечение L3D10 + анти-PD-l или контрольным антителом (hlgG), которые были сравнительно
аналогичными. Костный мозг мышей, получавших лечение 10D1 + анти-PD-l, имел заметно более белый цвет (фиг. 28А), а изолированная кровь была почти полностью белой по цвету (фиг. 28В). В соответствии с этим, когда мы проанализировали дифференцировку эритроцитов с использованием распределения маркеров CD119 и 5 CD71, мы наблюдали статистически значимое снижение количества клеток, находившихся на IV стадии развития у мышей, получавших 10D1 + анти-PD-l. Типичные профили FACS (проточной цитометрии) показаны на фиг. 28С, тогда как сводные данные изображены на фиг. 28D.
На фиг. 29. Анализ проточной цитометрии антиэритроцитарных антител. Образцы ю крови мышей NOD.SCID.II2rg-/- (NSG) окрашивали образцами плазмы мышей,
которые получали лечение антителом в течение перинатального периода. Сыворотка от мышей NSG и эритроциты этих же мышей использовались в качестве отрицательного контроля. Вся сыворотка использовалась в разведении 1:50. Эти данные показывают, что никакие мыши не продуцировали антиэритроцитарные 15 антитела.
Фиг. 30. Патология сердца у мышей, получавших химерный L3D10 и 10D1 в комбинации с анти-PD-l. Чтобы дополнительно определить токсичность L3D10 по сравнению с 10D1 в комбинации с анти-PD-l, мы провели гистологический анализ сердца у мышей, изображенных на фиг. 26. Мыши, получавшие 10D1 + анти-PD-l, 20 демонстрировали высокий уровень инфильтрации Т-клеток, который не наблюдался у мышей, получавших L3D10 + анти-PD-l или мышей, получавших человеческиий контрольный IgG.
Фиг. 31. Патология легкого у мышей, получавших химерный L3D10 и 10D1 в комбинации с анти-PD-l. Для дополнительного определения токсичности L3D10 по 25 сравнению с 10D1 в комбинации с анти-PD-l, мы провели гистологический анализ сердца у мышей, изображенных на фиг. 26. Мыши, получавшие 10D1 + анти-PD-l, демонстрировали высокий уровень инфильтрации Т-клеток, который не наблюдался у мышей, получавших L3D10 + анти-PD-l или мышей, получавших человеческиий контрольный IgG.
зо Фиг. 32. Патология слюнной железы у мышей, получавших химерный L3D10 и 10D1 в комбинации с анти-PD-l. Для дополнительного определения токсикологии L3D10 по
сравнению с 10D1 в комбинации с анти-PD-l, мы провели гистологический анализ слюны у мышей, описанных на фиг. 26. Мыши, получавшие 10D1 + анти-PD-l, показали гораздо более высокий уровень инфильтрации Т-клеток, чем наблюдавшийся у мышей, получавших L3D10 + анти-PD-l или мышей, получавших 5 человеческий контрольный IgG.
Фиг. 33A-F. Патология почек и печени у мышей, получавших химерные L3D10 и 10D1 в комбинации с анти-PD-l. Для дополнительного определения токсичности L3D10 по сравнению с 10D1 в комбинации с анти-PD-l, мы провели гистологический анализ почек и печени у мышей, описанных на фиг. 26. Фиг. ЗЗА-С представляют собой ю срезы почки и фиг. 33D-E представляют собой срезы печени. Мыши, получавшие 10D1 + anti-PD-1, показали высокий уровень инфильтрации Т-клеток, чем наблюдемый у мышей, получавших L3D10 + анти-PD-l или мышей, получавших человеческий контрольный IgG.
Фиг. 34. Оценки токсичности мышей, получавших химерный L3D10 и 10D1, в 15 комбинации с анти-PD-l. Эти данные по тканям, если фиг. 30-33 суммировать,
демонстрируют высокую оценку токсичности у мышей, получавших 10D1 + анти-PD-l по сравнению с L3D10 + анти-PD-l, который имеет оценки лишь незначительно выше, чем контрольная мышиная группа hlgG.
Фиг. 35. 10D1 + анти-PD-l не обладают значительной токсичностью у мышей Ctla4h/m, 20 о чем свидетельствует нормальный привес у мышей, которые получали лечение антителом в течение перинатального периода. Мыши получали лечение с данным антителом или комбинациями на 10, 13, 16, 19 и 22 дни интраперитонально (100 мкг/мышь/инъекция/антитело). Мышей взвешивали по меньшей мере один раз в 3 дня.
25 Фиг. 36. L3D10 и 10D1 показывают аналогичные паттерны связывания в планшетах с иммобилизированным CTLA4. В планшеты для ИФА вносили 1 мкг/мл белка CTLA4-His (Sino Biological, Китай). Данную концентрацию биотинилированных связывающих белков добавляли и связывание измеряли с использованием HRP-конъюгированного стрептавидина. 10D1-1 и -2 представляют собой две независимые серии веществ
зо одного и того же антитела. hlgG-Fc представляет собой отрицательный контроль человеческого lg.
Фиг. 37. L3D10 демонстрирует снижение связывание растворимого CTLA4. Заданную концентрацию анти-человеческий CTLA4 мкАТ вносили в планшет на ночь, после промывки и блокирования бычьим сывороточным альбумином, добавляли биотинилированный CTLA4-FC в концентрации 0,25 мкг/мл. После инкубации и 5 промывки количество захваченного CTLA4-FC измеряли с помощью стрептавидина, меченного HRP.
Фиг. 38. Выравнивание вариабельных областей гуманизированного антитела с исходной последовательностью антител L3D10. Вариабельная область тяжелой цепи (верхняя часть) (SEQ ID NO: 62-64) и вариабельная область (нижняя) легкой цепи
ю (SEQ ID NOS: 70-72) последовательностей гуманизированного антитела
выравниваются с исходным антителом L3D10 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 57; легкая цепь: SEQ ID NO: 65) и соответствующие каркасные области человеческого антитела (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 58-61; легкая цепь: SEQ ID NOS: 66-69). Обратные мутации к исходной последовательности мыши указаны желтым цветом. Новые
15 аминокислоты, то есть аминокислотные остатки, не присутствующие в
последовательности исходного антитела или в соответствующей структуре человеческого антитела, выделены зеленым цветом. Мутации, вводимые в последовательности CDR2, показаны фиолетовыми. Последовательности CDR показаны красным цветом на ocHOBewww.bioinf.org.uk/abs/.
20 Фиг. 39А-В. Противоопухолевая активность гуманизированных антител L3D10 по сравнению с 10D1. Используя модель опухоли мыши МС38 у мышей с нокин CTLA4 человека, мы рассмотрели противоопухолевую активность гуманизированных антител L3D10 по сравнению с химерным антителом L3D10 и 10D1. На верхней панели изображен график лечения для эксперимента in vivo; мышам вводили в
25 общей сложности 4 дозы антител каждые 3 дня, начиная с 7-го дня после инокуляции. Все гуманизированные антитела (п = 6 на группу) полностью уничтожили опухоли и были сопоставимы с 10D1 (нижняя панель).
Фиг. 40. Противоопухолевая активность гуманизированных антител L3D10 у мышей CTLA4h/m. На верхней панели изображен график лечения для эксперимента in vivo; зо мыши Ctla4h/m получали контрольный hlg или одно из трех различных античеловеческий CTLA4 мкАТ в дозах 30 (-30, сплошные линии) или 10 (-10, пунктирные
линии) мг на инъекцию в указанные даты после инъекции опухоли МС38. Размеры опухоли измеряли один раз в три дня.
Фиг. 41. Терапевтический эффект анти-СТ1_А-4 мкАТ при минимальной опухолевой модели B16-F1. Используя модель опухоли мыши B16-F1 у мышей с нокин CTLA4 5 человека, мы рассмотрели противоопухолевую активность гуманизированных
антител L3D10. 1 *105 В16 опухолевых клеток вводили (п.к.) мышам Ctla4h/h (п = 5-6). В дни 2, 5 и 8 мыши получали лечение контрольным lg, 10D1, химерным L3D10 или РР4637 и РР4638 (250 мкг/мышь, и/п). Распространяемость и размеры опухоли измерялись через день. 10D1 по сравнению с hlgGFc: Р = 0,00616; L3D10 по ю сравнению с hlgGFc: Р = 0,0269; 10D1 по сравнению с L3D10: Р = 0,370; РР4637 по сравнению с hlgGFc: Р = 0,0005; РР4637 по сравнению с 10D1: Р = 0,805; РР4638 по сравнению с hlgGFc: Р = 0,0016; РР4638 по сравнению с 10D1: Р = 0,856. Данные представляют собой среднее значение ± СОС 5-6 мышей на группу. Размеры опухолей считались как 0 для мышей, у которых никогда не развилась опухоль.
15 Фиг. 42. Сравнение между 10D1, РР4631 и РР4637 самок для их комбинированной токсичности с анти-PD-l мкАТ. Самок мышей CTLA4h/h лечили на 10 или 11 день после рождения при помощи 4 инъекций антител (100 мкг/мышь/инъекция, один раз в три дня) или контролем Fc, как указано в условных обозначениях. Мышей взвешивали один раз каждые 3 дня. Приведенные данные представляют собой
20 средние значения и СОС % привеса после периода 30 дней. Всех мышей умерщвляли на 43-й день для гистологического анализа. Количество мышей, используемых для каждой группы, показано в круглых скобках условных обозначений.
Фиг. 43. Комбинированная терапия 10D1 и анти-PD-l вызывает анемию, тогда как с PP4631+anti-PD-1 или PP4637+anti-PD-1 этого не происходит. Приведенные данные 25 представляют собой гематокрит 43-дневных мышей, которые получили четыре лечения антител на 11, 14, 17 и 20 день в дозах 100 мкг/мышь/антитела.
Фиг. 44А-В. Комбинированная терапия 10D1+anti-PD-1 вызывает системную активацию Т-клеток, тогда как с PP4631+anti-PD-1 или PP4637+anti-PD-1 этого не происходит. Показанные данные представляют собой % CD4 (верхние панели) и CD8 зо Т-клеток (нижние панели) с фенотипами наивных клеток (CD44l0CD62Lhl), клеток
центральной памяти (CD44hiCD62Lhi) и эффекторных клеток памяти (CD44h'CD62LI°)
Т-клеток в периферической крови (фиг. 44А) или в селезенке (фиг. 44В). Клетки получали от 43-дневных мышей, которые получали антитела 4 раза на 11, 14, 17 и 20 день в дозах 100 мкг/мышь/антитела.
Фиг. 45. Гуманизация L3D10 не влияет на связывание с иммобилизованным CTLA4. 5 Способность гуманизированных антител L3D10 связывать иммобилизованный CTLA4 определяли, как описано на фиг. 36. На оси X показана концентрация анти-СТ1_А-4 мкАТ, добавленная в раствор. Гуманизация не влияет на связывание с иммобилизованным CTLA4, и все 3 гуманизированные антитела продемонстрировали сходное связывание с исходным химерным антителом L3D10 и ю 10D1. Аналогичные закономерности наблюдались при использовании CTLA4-lg вместо CTLA-4-his.
Фиг. 46. Гуманизация дополнительно снижает связывание L3D10 с растворимым CTLA4. Способность гуманизированных антител L3D10 связывать растворимый CTLA4 определяли, как описано на фиг. 37. На оси X показана концентрация CTLA-15 4мкАТ, нанесенных на планшеты для ИФА. Гуманизация дополнительно снижает связывание с растворимым CTLA4 относительно исходного 1_ЗО10-химерного антитела. Аналогичные закономерности наблюдались при использовании CTLA4-lg вместо CTLA-4-his.
Фиг. 47А-В. РР4631, РР4638 и РР4637 не блокируют взаимодействия B7-CTLA-4 in 20 vitro. На фиг. 47А изображено блокирование взаимодействия В7-1-CTLA-4 с
помощью анти-человеческий CTLA-4 мкАТ 10D1, РР4631, РР4637 и L3D10. B7-1Fc
иммобилизировали в концентрации 0,5 мкг/мл. Биотинилированный CTLA4-FC
добавляли в концентрации 0,25 мкг/мл вместе с заданными дозами антител.
Показанные данные представляют собой средние значения дупликатов при 25 оптической плотности 405 нм. На фиг. 47В изображено блокирование
взаимодействия B7-2-CTLA-4 анти-человеческий CTLA-4 мкАТ 10D1 и L3D10. Как и
на фиг. 47А, исключается, что B7-2-FC был иммобилизирован.
Фиг. 48. РР4631 и РР4637 не блокируют взаимодействия B7-CTLA-4 in vivo, о чем свидетельствует отсутствие их влияния на экспрессию В7-1 и В7-2 на дендритных зо клетках. Сводные данные по уровням В7-1 (а) и В7-2 (Ь) от 3 мышей на группу.
Уровни B7 в контрольной группе, обработанной IgG, искусственно определяются как 100%.
Фиг. 49. РР4637, который обладает лучшим профилем безопасности в сочетании с анти-PD-l мкАТ (см. Фиг. 42), представляя собой наиболее эффективный при 5 отторжении опухоли на основе отторжения опухоли при самых низких
терапевтических дозах. Мыши Ctla4h/m получали контрольный IgFc или одно из трех различных анти-человеческий CTLA4 мкАТ при дозах 30 (-30, сплошные линии) или 10 (-10, пунктирные линии) мкг на инъекцию в указанные даты. Размеры опухоли измеряли один раз в три дня. При 10 мкг/инъекция, РР4637 (HL32) представляется ю наиболее эффективным в индуцировании отторжения опухоли.
Фиг. 50. Оценка чистоты гуманизированного антитела. Временно експрессируемые гуманизированные L3D10 антитела очищали хроматографией на белке А и образцы из всех 3 антител оценивали с помощью востановленного и не востановленного электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Очищенные белки 15 продуцировали гель-полосы, указывающие на размер молекулы антитела как в восстановленных так и невосстановленных условиях электрофореза в полиакриламидном геле. На полосах "связанная", показана какнепрерывающая колонка белка А, указывая, что большая часть белка антитела прилегает к колонке белка А.
20 Фиг. 51. Эксклюзионная хроматография (ВЭЖХ) временно экспрессированного белка. Образцы белка для каждого из гуманизированных антител анализировали с помощью ВЭЖХ после одностадийной хроматографии белка А. Верхняя панель: антитело РР4631. Средняя панель: антитело РР4637. Нижняя панель: антитело РР4638.
25 Фиг. 52. Анализ при помощи капиллярного электрофореза в присутствии
додецилсульфата натрия (CE-SDS) временно экспрессированного белка. Образцы белка для каждого из гуманизированных антител анализировали с помощью CE-SDS после одностадийной хроматографии белка А. Левые панели показывают результаты в невосстановленных условиях, а правые панели показывают результаты при
зо восстановленных условиях. Верхняя панель: антитело РР4631. Средняя панель: антитело РР4637. Нижняя панель: антитело РР4638.
Фиг. 53A-C. Профиль заряда изоформ и дезамидирование гуманизированных антител L3D10, определяемых с помощью капиллярного изоэлектрического фокусирования (КИЭФ). Уровень деамидирования белка при высоком рН-стрессе определяли путем сравнения гуманизированных антител L3D10 до и после стресс-5 обработки высоким рН в течение двух разных периодов времени (5 часов и 12,5 ч), анализировали с помощью анализа КИЭФ. Фиг. 53А-С изображены профили для антител РР4631, РР4637 и РР4638, соответственно.
Фиг. 54А-С. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК). Термический анализ гуманизированных антител L3D10. Чтобы определить термическую ю стабильность и температуры плавления различных антител, они подвергались термическому анализу дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). На фиг. 54А-С изображены нормализованные кривые ДСК для антител РР4631, РР4637 и РР4638, соответственно.
Фиг. 55. Выравнивание внеклеточных доменов CTLA-4 человека, макаки и мыши.
15 Аминокислотные последовательности человека (Нт, показанные красным) (SEQ ID NO: 73), макаки (Mk, показанные черным) и мыши (Ms, показанные зеленым) внеклеточного домена белка CTLA-4 выравниваются, и консервативные аминокислоты (относительно человеческой последовательности) изображены с тире (-). В порядке отношения к выравниванию, последовательность мыши имеет
20 удаление и вставку (относительно последовательностей человека и обезьяны) в положениях, выделенных желтым цветом. Известный сайт связывания В7-1 lg показан жирным и подчеркнутым. Последовательности демонстрируют, что последовательности человека и обезьяны являются высококонсервативными, тогда как последовательность мыши имеет ряд аминокислотных различий. На основе этого
25 выравнивания последовательности, были разработаны 11 мутантных (М1-М11) (SEQ ID NOS: 40-50) человеческих CTLA-4FC белков, которые включают мышиные специфические аминокислоты - аминокислоты, включенные в каждый мутантный белок, изображены синим цветом.
Фиг. 56А-В. Композиция аминокислотной последовательности ДТ и мутантных белков зо CTLA-4FC. ДНК-конструкции, кодирующие белок CTLA-4FC ДТ (SEQ ID NO: 39) и 11 мутантных белков (SEQ ID NOS: 40-50), включающие мышиные Ctla-4 аминокислоты,
были сконструированы, как изображено. Аминокислотные последовательности предназначены для зрелых белков, включая часть Fc lgG1, но не сигнальный пептид. Известный сайт связывания В7-1 lg показан большими синими буквами и подчеркнут двумя линиями. Заменяемые мышиные аминокислотные остатки в мутанте показаны 5 в нижнем регистре красным. Часть lgG1 Fc-белков подчеркнута.
Фиг. 57. Мутация в М11 (АА103-106, YLGI> fcGm) избирательно отменяет связывание антитела с человеческим CTLA-4. Показанные данные представляют собой две повторности, изображающие связывание B7-1Fc (a), L3D10 (b), РР4631 (с) и РР4637 (d), связывающиеся с hCTLA4-Fc, внесенными в планшеты (открытые круги), ю mCTLA4-Fc (заполненные треугольники), М11 (заполненные круги) и lgG1-Fc (открытые треугольники).
Фиг. 58. Сопоставление L3D10, РР4631 и РР4637 с эпитопом, смежным с сайтом связывания В7-1, в 3-D структуре комплекса B7-1-CTLA4. Момент связывания В7-1 окрашен в красный цвет, а эпитоп антитела окрашен в фиолетовый. В7-1 изображен 15 над CTLA4 с заполненной пробелом лентой, a CTLA-4 изображается как незаполненная лента.
Фиг. 59. Композиция аминокислотной последовательности ДТ (SEQ ID NO: 39) и мутантных белков CTLA-4Fc, М12-М17 (SEQ ID NO: 51-56). Конструкции ДНК, кодирующие 6 мутантных белков CTLA-4Fc, М12-М17, включая мышиные Ctla-4
20 аминокислоты, были сконструированы, как показано. Аминокислотные
последовательности предназначены для зрелых белков, включая часть Fc lgG1, но не сигнальный пептид. Известный сайт связывания В7-1 lg показан большими синими буквами и подчеркнут двумя линиями. Заменяемые мышиные аминокислотные остатки в мутанте показаны в нижнем регистре красным. Часть lgG1 Fc-белков
25 подчеркнута.
Фиг. 60А-С. Мутационный анализ выявил различные требования к привязке для 10D1 (фиг. 60А), РР4631 (фиг. 60В) и РР4637 (фиг. 60С) к CTLA-4. Мутанты CTLA-4FC вносились на всю ночь при 4°С в концентрации 1 мкм/мл. После блокировки с помощью БСА добавляли концентрацию биотинилированных мкАТ анти-СТ1_А-4 и зо инкубировали в течение 2 часов. После промывки несвязанных антител, связанные антитела детектировались с помощью стрептавидина, меченного HRP.
Фиг. 61A-B. Терапевтический эффект анти-4-1 ВВ и анти-СТ1_А-4 антител как при минимальном заболевании (фиг. 61 А), так и при установленных опухолевых (фиг. 61В) моделях. На фиг. 61А изображена терапия минимального заболевания. Мышам C57BL/6 инокулировали подкожно 5x105 клеток МС38. На 2, 9 и 16 дни после 5 инъекции опухолевых клеток, инъецировали контрольные антитела хомяка и IgG крысы, анти-СТ1_А-4 и/или анти-4-1 ВВ антитела. Размеры опухоли измеряли путем физического обследования. Приведенные данные представляют собой кинетику роста опухолей, с каждой линией, представляющей рост опухоли у одной мыши. Представленные размеры представляют собой результат более длинного и ю короткого диаметра опухоли. На фиг. 61В изображена терапия установленных
опухолей. Как и на фиг. 61 А, исключается, что терапия началась на 14-й день после индкуции опухоли; все мыши имели установленные опухоли размером от 9 до 60 мм2 до начала лечения с помощью мкАТ. Комбинированный эффект двух антител на установленные опухоли повторяли 3 раза.
15 Фиг. 62. CD8 Т-клетки, но не CD4 или ЕКК-клетки, являются значимыми для отторжения опухоли, вызванной антителом. Мыши-опухоленосители, деплетировались CD4, CD8 или ЕКК-клетками путем трех инъекций антител, специфических для CD4, CD8 или NK1.1, на 9, 12 и 16 дни после инокуляции опухолевых клеток (*). Терапевтические антитела (анти-СТ1_А-4 плюс анти-4-1 ВВ)
20 вводились на 9, 16 и 23 дни (вертикальные стрелки). Приведенные данные
представляют собой средние значения и СОС размеров опухоли (п = 3). Р <0,05 для С08-деплетированной группы, по сравнению с каждой из других групп (f).
Фиг. 63А-В. Комбинированная терапия уменьшала реакцию хозяина на анти-СТ1_А-4 антитела. Хомяковые анти-мышиный-СТ1_А-4 (фиг. 63А) или крысиные
25 антимышиный-4-1 ВВ (фиг. 63В) антитела вносились в планшеты для ИФА. К планшетам добавляли различные разведения сывороток из групп 5 мышей. Относительные количества связанных антител определяли с использованием реагента вторичной стадии (биотинилированные козьи антимышиные антитела, которые были деплетированы реакционной способностью к IgG крысы и хомяка
зо путем абсорбции). Показанные данные представляют собой среднее значение и СОС оптической плотности при 490 нм. Аналогичное снижение реакции антител хозяина к
анти-СТ1_А-4 и 4-1 ВВ наблюдалось, когда мыши без опухолей получали те же антитела (данные не показаны).
Фиг. 64А-В. Комбинированная терапия анти-4-1 ВВ и L3D10 (анти-человеческий-CTLA4) антителом у мышей с нокин CTLA4 человека. На фиг. 64А изображен 5 терапевтический эффект. Мышам с нокин CTLA4 человека подкожно инокулировали 5x105 опухолевых клеток МС38. Через два дня, группы из 7 мышей получали крысиный и мышиный IgG, анти-4-1 ВВ и мышиный IgG, L3D10 и крысиный IgG, или L3D10 и анти-4-1 ВВ, как указано стрелками. Показанные данные представляют собой среднее значение объема опухоли и СОС (п = 7). Все процедуры значительно
ю уменьшали рост опухоли (Р <0,001), а в группе лечения с двойными антителами
значительно уменьшался размер опухоли по сравнению с контролем (Р <0,0001) или антителом L3D10 (Р = 0,0007) или применением анти-4-1 ВВ антитела (Р = 0,03). Все мыши-опухоленосители, умерщвлялись, когда контрольная группа, обработанная IgG, достигла критериев раннего удаления. На фиг. 64В изображен длительный
15 иммунитет у мышей, которые получали комбинированную терапию. Мыши без опухолей, в группе, получавшие двойные антитела, развивали длительный иммунитет к опухоли МС38. На 110 день после первого заражения опухолевыми клетками, получившие двойные антитела, мышам без опухоли или контрольным наивным мышам вводили подкожно 5x105 опухолевых клеток. Рост опухоли
20 контролировали при медицинском осмотре. Обратите внимание, что все мыши, которые отвергли опухоли к первому осмотру, были полностью устойчивы к повторному заражению, в то время как у всех здоровых мышей был прогрессирующий рост опухоли.
Определения
25 Используемый в данном документе термин "антитело" предназначен для
обозначения молекулы иммуноглобулина, которая обладает сайтом распознавания антигена "вариабельной области". Термин "вариабельная область" предназначен для выделения такой области иммуноглобулина из доменов, которые широко распространены среди антител (таких как Fc- домен антитела). Вариабельная
зо область содержит "гипервариабельную область", остатки которой ответственны за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит аминокислотные
остатки из "гипервариабельной области" или "CDR" (т.е. обычно примерно с остатками 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и приблизительно с остатками 27-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (НЗ) в вариабельном домене тяжелой цепи; 44) и/или эти остатки из "гипервариабельной петли" (т.е. 5 остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91 -96 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 2632 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (НЗ) в вариабельной области тяжелой цепи, 45). "Каркасная область" или "FR" остатки представляют собой эти же остатки вариабельной области, отличные от остатков гипервариабельной области, как определено в данном документе. Термин "антитело" включает в себя
ю моноклональные антитела, мультиспецифические антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, синтетические антитела, химерные антитела, верблюжьи антитела, одноцепочечные антитела, дисульфидсвязанные Fvs (sdFv), внутриклеточные антитела и анти-идиотипические (анти-ld) антитела (включая, например, анти-ld и анти-анти-ld антитела к антителам по изобретению). В частности,
15 такие антитела включают молекулы иммуноглобулина любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 и lgA2) или подкласса.
Используемый в данном документе термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела относится к одной или нескольким частям антитела, которые содержат
20 гипервариабельную область антител ("CDR") и необязательно каркасные остатки, которые содержат антиген-распознающий участок "вариабельной области" и проявляют способность иммуноспецифически связывать антиген. Такие фрагменты включают Fab ', F (ab1). Sub.2, Fv, одноцепочечные (ScFv) и их мутанты, природные варианты и слитые белки, содержащие сайт распознавания антигена "вариабельной
25 области" антитела и гетерологичный белок (например, токсин, сайт распознавания антигена для другого антигена, фермент, рецептор или рецепторный лиганд и т.д.). Используемый в данном документе термин "фрагмент" относится к пептиду или полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность по меньшей мере из 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 смежных
зо аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 смежных аминокислотных
остатков, по меньшей мере 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 60 смежных аминогрупп, по меньшей мере 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере, 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 смежных аминокислотных остатков, 5 по меньшей мере 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 175 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 смежных аминокислотных остатков или менее 250 смежных аминокислотных остатков.
Человеческие, химерные или гуманизированные антитела особенно ю предпочтительны для использования in vivo у людей, однако мышиные антитела или антитела других видов могут быть преимущественно использованы для многих применений (например, в анализах in vitro или in situ, при раннем использовании in vivo и т.д.).
"Химерное антитело" представляет собой молекулу, в которой различные части 15 антитела получают из различных молекул иммуноглобулина, таких как антитела, имеющие вариабельную область, полученную из антитела, отличного от человека, и константной области иммуноглобулина человека. Химерные антитела, содержащие один или несколько CDR из видов, не относящихся к человеку, и каркасных областей из молекулы иммуноглобулина человека, могут быть получены с использованием 20 различных методов, известных в данной области, включая, например,
трансплантацию антигенсвязывающей области (ЕР 239400; International Publication No. WO 91/09967; and U.S. Pat. Nos. 5225539, 5530101, and 5585089), венирование или перекладку (ЕР 592106; ЕР 519596; 46-48), перестановку цепей (U.S. Pat. No. 5565332).
25 Изобретение относится, в частности, к "гуманизированным антителам".
Используемый в данном документе термин "гуманизированное антитело" относится к иммуноглобулину, содержащему каркасную область человека и один или несколько CDR от иммуноглобулина не человека (обычно мыши или крысы). Нечеловеческий иммуноглобулин, обеспечивающий CDR, называется "донором", а человеческий
зо иммуноглобулин, обеспечивающий структуру, называется "акцептором".
Константные области не обязательно должны присутствовать, но если они есть, они
должны быть, по существу, идентичными константным областям иммуноглобулина человека, то есть по меньшей мере приблизительно на 85-90%, предпочтительно примерно на 95% или более идентичны. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, по существу 5 идентичны соответствующим частям естественных последовательностей
человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело представляет собой антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина. Например, гуманизированное антитело не будет охватывать типичное химерное антитело, поскольку, например, вся вариабельная область
ю химерного антитела является не человеческой. Говорят, что донорское антитело было "гуманизировано" в процессе "гуманизации", поскольку ожидается, что результирующее гуманизированное антитело связывается с тем же антигеном, что и донорное антитело, которое обеспечивает CDR. По большей части гуманизированными антителами являются человеческие иммуноглобулины
15 (антитела-реципиенты), в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменяются остатками гипервариабельной области из нечеловеческих видов (донорских антител), таких как мыши, крыса, кролик или примат, отличный от человека, имеющий желаемую специфичность, сродство и способность. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина
20 заменяются соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того,
гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в антителе-реципиенте или в донорском антителе. Эти модификации сделаны для дальнейшего улучшения характеристик антител. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все по меньшей мере одно и, как правило,
25 два вариабельных домена, в которых все или практически все гипервариабельные области соответствуют тем, которые имеет иммуноглобулин, отличный от человека, и все или практически все FR являются теми же последовательностями человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина
зо (Fc), как правило, иммуноглобулина человека, который иммуноспецифически
связывается с полипептидом Fc.gamma.RIIB, который был изменен путем введения аминокислотных остатков, делеции или добавления (т.е. мутаций).
PCT/US2016/066698 31 Подробное описание сущности изобретения
Было показано, что антитело против человеческого белка CTLA4, Ипилимумаб, увеличивает выживаемость больных раком, либо как единственный иммунотерапевтический агент, либо в сочетании с другими терапевтическими 5 агентами, такими как, не ограничиваясь, антит-PD-l антителом(13-15). Однако терапевтический эффект связан со значительными побочными эффектами (13-18). Существует большая потребность в разработке новых антит-СТ1_А4 антител для достижения лучшего терапевтического эффекта и/или меньшего аутоиммунного неблагоприятного эффекта. Изобретатели обнаружили анти-СТ1_А4 антитело, ю которое, к удивлению, может быть использовано для индуцирования отторжения раковых клеток, одновременно уменьшает аутоиммунные побочные эффекты, связанные с иммунотерапией.
В данном документе предлагаются композиции антител и их антигенсвязывающих фрагментов. Изобретение также относится к варианту реализации таких молекул, где 15 молекула представляет собой моноклональное антитело, человеческое антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело.
В частности, изобретение относится к молекуле, содержащей антигенсвязывающий фрагмент антитела, который иммуноспецифически связывается с CTLA4 и, в частности, с CTLA4 человека, предпочтительно экспрессируемым на поверхности 20 живой клетки при эндогенной или трансфицированной концентрации. Изобретение, в частности, относится к варианту реализации такой молекулы, где антигенсвязывающий фрагмент связывается с CTLA4 и где живая клетка представляет собой Т-клетку.
Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим 25 фрагментам, которые способны иммуноспецифически связываться с CTLA4. В некоторых вариантах реализации такие молекулы дополнительно способны блокировать связывание В7.1 и В7.2 с CTLA4.
Изобретение также относится к варианту реализации таких молекул, где молекула представляет собой моноклональное антитело, человеческое антитело, химерное зо антитело или гуманизированное антитело. Изобретение включает варианты
реализации, в которых такие антитела представляют собой моноспецифические, биспецифические, триспецифические или мультиспецифические.
Изобретение также относится к варианту реализации таких молекул или антител, которые связываются с CTLA4, и где их антигенсвязывающий фрагмент содержит 5 шесть CDR, где CDR содержит CDR анти-СТ1_А4 антитела L3D10. Конкретно,
антитело содержит три легких цепи и три CDR тяжелой цепи анти-СТ1_А4 антитела L3D10.
Изобретение также относится к варианту реализации вышеописанных антител, где антитело детектируется при помощи метки или содержит конъюгированный токсин, ю лекарственный препарат, рецептор, фермент, рецепторный лиганд.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество любой из вышеописанных композиций антител и физиологически приемлемый носитель или наполнитель. Предпочтительно, композиции согласно изобретению содержат профилактически или 15 терапевтически эффективное количество гуманизированных антител изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.
В конкретном варианте реализации термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США или другой
20 общепризнанной фармакопее для использования на животных и, более конкретно, на людях. Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному), наполнителю или носителю, с которым вводится лекарство. Такими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, в том числе масла, животные, растительные или
25 синтетические, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Вода представляет собой предпочтительный носитель, когда фармацевтическая композиция вводится внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, особенно для инъекционных растворов. Подходящие
зо фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу,
желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина,
тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция, если желательно, может также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или рН-буферное средство. Эти композиции могут принимать форму растворов, 5 суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, композиций с замедленным высвобождением и тому подобное.
Как правило, ингредиенты композиций согласно изобретению могут поставляться либо отдельно, либо смешиваться вместе в виде стандартной дозировки, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или концентрата без воды в герметично
ю закрытом контейнере, таком как ампула или саше, указывая количество активного агента. Там, где композиция должна вводиться путем инфузии, ее можно внести в инфузионный флакон, содержащий воду или физиологический раствор фармацевтической степени чистоты. Когда композицию вводят путем инъекции, может быть предусмотрена ампула стерильной воды для инъекций или
15 физиологического раствора, так что ингредиенты могут быть смешаны до введения.
Композиции согласно изобретению могут быть составлены в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваются ими, соединения, образованные с анионами, такими как соединения, полученные из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и тех, которые 20 образуются с катионами, такими как соединения, полученные из натрия, калия, аммония, кальций, гидроксида железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.
Изобретение также относится к применению описанных в данном документе композиций антител и их фармацевтических композиций для усиления иммунных
25 реакций. Положительная модуляция иммунной системы особенно желательна при лечении рака и хронических инфекций, и, таким образом, настоящее изобретение имеет смысл при лечении таких расстройств. Используемый в данном документе термин "рак" относится к новообразованию или опухоли в результате аномального неконтролируемого роста клеток. Используемый в данном документе рак явно
зо включает лейкозы и лимфомы. Термин относится к заболеванию, включающему клетки, которые могут метастазировать в дистальные участки.
Соответственно, способы и композиции согласно изобретению могут также быть полезны при лечении или профилактике различных видов рака или других аномальных пролиферативных заболеваний, включая (но не ограничиваясь ими) следующее: карциному, включая рак мочевого пузыря, молочной железы, толстой 5 кишки, почек, печени, легких, яичников, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи; включая плоскоклеточную карциному; гематопоэтические опухоли лимфоидной линии, включая лейкемию, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Беркетца; гематопоэтические опухоли миелоидной
ю линии, включая острые и хронические миелоидные лейкозы и промиелоцитарный лейкоз; опухоли мезенхимного происхождения, включая фибросаркому и рабдомиосаркому; другие опухоли, включая меланому, семиномию, тетратокарциному, нейробластому и глиому; опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы;
15 опухоли мезенхимного происхождения, включая фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому; и другие опухоли, включая меланому, ксенодермальную пигментацию, кератоактантому, семиномию, фолликулярный рак щитовидной железы и тератокарциному. Также предполагается, что раковые образования, вызванные аберрациями при апоптозе, также будут лечиться способами и композициями
20 согласно изобретению. Такие раки могут включать, но не ограничиваются ими,
фолликулярные лимфомы, карциномы с мутациями р53, гормонозависимые опухоли молочной железы, предстательной железы и яичника и предраковые поражения, такие как семейный аденоматозный полипоз и миелодиспластические синдромы. В конкретных вариантах реализации, злокачественные или диспролиферативные
25 изменения (такие как метаплазии и дисплазии) или гиперпролиферативные
нарушения лечаться или предотвращаются способами и композициями согласно изобретению в яичниках, мочевом пузыре, груди, толстой кишке, лёгком, коже, поджелудочной железе или матке. В других конкретных вариантах реализации, саркома, меланома или лейкемия лечатся или предотвращаются способами и
зо композициями согласно изобретению.
В другом варианте реализации изобретения, композиции антител и их антигенсвязывающих фрагментов могут быть использованы с другими
противоопухолевыми терапиями, включая, но не ограничиваясь ими, текущую стандартную и экспериментальную химиотерапию, гормональную терапию, биологическую терапию, иммунотерапию, лучевую терапию или хирургию. В некоторых вариантах осуществления, молекулы согласно изобретению могут 5 вводиться в комбинации с терапевтически или профилактически эффективным количеством одного или нескольких агентов, терапевтических антител или других агентов, известных специалистам в данной области для лечения и/или профилактики рака, аутоиммунного заболевания, инфекционных заболеваний или интоксикации. Такие агенты включают, например, любой из рассмотренных выше модификаторов ю биологического ответа, цитотоксинов, антиметаболитов, алкилирующих агентов, антибиотиков или антимитотических агентов, а также иммунотерапевтических средств.
В предпочтительном варианте реализации изобретения, композиции антител и их антигенсвязывающих фрагментов могут быть использованы с другими
15 противоопухолевыми иммунотерапиями. В таком варианте реализации, молекулы согласно изобретению вводят в комбинации с молекулами, которые нарушают или усиливают альтернативные иммуномодулирующие пути (такие как TIM3, TIM4, ОХ40, CD40, GITR, 4-1-ВВ, В7-Н1, PD-1, В7-НЗ, В7-Н4, LIGHT, BTLA, ICOS, CD27 или LAG3) или модулируют активность молекул-эффекторов, таких как цитокины (например, IL-4,
20 IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, GF-бета, IFNg, Flt3, BLys) и хемокины (например, CCL21) для усиления иммуномодулирующих эффектов. Конкретные варианты реализации включают биспецифическое антитело, содержащее композиции антит-СТ1_А4 антитела, описанные в данном документе, и анти-PD-l (пембролизумаб (Кейтруда)) или Ниволумаб (Опдиво)), анти-В7-Н1 (атезолизумаб (Тецентрик) или дирвалумаб),
25 анти-В7-НЗ, анти-В7-Н4, анти-LIGHT, анти-ЦМЗЗ, анти-Т1МЗ, анти-Т1М4 анти-СО40, анти-ОХ40, анти-GITR, анти-BTLA, анти-С027, анти-ICOS или анти-4-1. В еще одном варианте реализациии молекулы изобретения вводят в комбинации с молекулами, которые активируют различные стадии или аспекты иммунного ответа для достижения более широкого иммунного ответа. В более предпочтительном варианте
зо реализации композиции антитела и их антигенсвязывающих фрагментов
объединены с анти-PD-l или анти-4-1 ВВ антителами без усиления аутоиммунных побочных эффектов.
Другой вариант реализации изобретения включает биспецифическое антитело, которое содержит антитело, связывающиеся с CTLA4, соединенным с антителом, которое связывает другие иммуностимулирующие молекулы. Конкретные варианты реализации включают биспецифическое антитело, содержащее композиции, анти-5 CTLA4 антитела, описанные в данном документе, и анти-PD-l, анти-В7-Н1, анти-В7-НЗ, анти-В7-Н4, анти-LIGHT, анти-ЦМЗЗ, анти-Т1МЗ, анти-Т1М4, анти-СО40, анти-ОХ40, анти-GITR, анти-BTLA, анти-С027, анти-ICOS или анти-4-1 ВВ. Изобретение также относится к применению таких антител, которые используются для лечения рака.
ю Способы введения композиций антител согласно изобретению включают, но не ограничиваются ими, парентеральное введение (например, внутрикожные, внутримышечные, интраперитонеальные, внутривенные и подкожные), эпидуральные и мукозальные (например, интраназальные и оральные пути). В конкретном варианте реализации, антитела согласно изобретению вводят
15 внутримышечно, внутривенно или подкожно. Композиции можно вводить любым удобным способом, например, путем инфузии или болюсной инъекции путем абсорбции через эпителиальные или слизистые оболочки (например, слизистой оболочки полости рта, слизистой оболочки прямой кишки и кишечника и т.д.), и могут вводиться вместе с другими биологически активными агентами. Введение может
20 быть системным или локальным.
Еще один вариант реализации изобретения касается контроля блокирующих эффектов анти-СТ1_А4 антител in vivo путем контроля уровней экспрессии В7.1 и В7.2 на иммунных клетках, таких как антигенпрезентирующие клетки (АПК). CTLA4 экспрессируется преимущественно среди Трег, где он подавляет аутоиммунные
25 заболевания путем регуляции снижения уровня экспрессии В7-1 и В7-2 на АПК, таких как дендритные клетки. Поэтому, повышение экспрессии молекул В7, В7.1 и В7.2, может быть индикатором блокады взаимодействий B7-CTLA4 in vivo. В конкретном варианте реализации периферические или внутриопухолевые иммунные клетки удаляются из субъекта до и после лечения анти-СТ1_А4, и анализируются ex vivo для
зо снижения уровня В7.1 и/или В7.2 на поверхности иммунной клетки, где присутствие блокирующих анти-СТ1_А4 антител предотвращает связывание В7.1/В7.2 эндогенным CTLA4, что, в свою очередь, предотвращает снижение экспрессии В7.1 и В7.2, что
приводит к увеличению общего уровня В7.1/В7.2. В предпочтительном варианте реализации уровень В7.1 и В7.1 измеряется на антигенпрезентирующих клетках. В наиболее предпочтительном варианте реализации уровень В7.1 и В7.1 измеряется на дендритных клетках.
5 В еще одном варианте реализации, изменение (уменьшение) В7.1 и В7.2 на
иммунных клетках после лечения анти-СТ1_А4 используют в качестве биомаркера для измерения биологической активности анти-СТ1_А4 антител in vivo и мониторинга явных ответов на лечение анти-СТ1_А4, путем измерения экспрессии уровня В7.1 и/или В7.2 на иммунных клетках и сравнения уровня экспрессии до и после лечения, ю В предпочтительном варианте реализации уровень экспрессии В7.1 и/или В7.2 контролируется все время в ходе терапии анти-СТ1_А4.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение химерного анти-С"П_А4 антитела
Используя мышей с нокин CTLA4 человекаи мышей hu-PBL-Scid, ранее было 15 продемонстрировано, что мышиные анти-СТ1_А4 антитела уменьшали рост опухоли и определили L3D10 как наиболее эффективные среди тестируемых в планшетах мкАТ. Однако ни одно из полученных антител не могло достичь полного отторжения опухоли даже при использовании в относительно высоких дозах (> 10 мг/кг) и до образования пальпируемых опухолей (как в начале второго дня) после индукции 20 опухолевыми клетками (19-21).
Поскольку мышиные антитела представляли собой подклассы lgG1, которые не обладают сильной антителозависимой клеточной цитотоксичностью (АЗКЦ), и поскольку АЗКЦ может участвовать в отторжении опухоли, Fc мкАТ модифицировали несколькими способами для достижения лучшего иммунотерапевтического эффекта. 25 Во-первых, мышиный lgG1, который является слабым в АЗКЦ, был заменен для получения химерного антитела с человеческим lgG1, который обладает сильной АЗКЦ активностью. Во-вторых, на основе известного уровня техники в литературе (22) , три мутации (S298A, ЕЗЗЗА и К334А) были введены в СН для увеличения активности АЗКЦ. В-третьих, были введены три мутации (M252Y, S254T и Т256Е) для
увеличения периода полувыведения антитела in vivo (23). Конструкция нового химерного антитела изображена на фиг. 1, левая панель.
Для конструирования антитела, вариабельные области гибридомы L3D10 были сначала идентифицированы посредством секвенирования ДНК с использованием 5 стандартных методов, известных в данной области техники. Нуклеотидные
последовательности были переведены в аминокислоты, перечисленные в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Нормальная последовательность человеческого lgG1 Fc и последовательность Fc-мутанта описаны в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно. Аминокислоты и кодоны оптимизированной нуклеотидной ю последовательности в последовательностях тяжелой и легкой цепи раскрыты в SEQ ID NO: 5-8.
ДНК, соответствующая SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7 была синтезирована и вставлена в векторы экспрессии, и векторы сконструированной последовательности были трансфицированы в клетки НЕК293. Вкратце, клетки НЕК293 высевали во
15 встряхиваемую колбу за день до трансфекции и выращивали с использованием сред с известным химическим составом, не содержащих сыворотку. ДНК-конструкты для экспрессии трансфицировали в 0,5 литрах суспензии клеток НЕК293, используя стандартную методику для временной трансфекции. Через 20 часов клетки отбирали для определения жизнеспособности и количества жизнеспособных клеток, и
20 измеряли титр (Octet QKe, ForteBio). Дополнительные показания были получены во время серийных временных трансфекций. Культуру отбирали на 5-й день. Из серийный временных трансфекций, кондиционированную среду для L3D10 получали и осветляли путем центрифугирования и фильтрации. Супернатант пропускали через колонку с белком А и элюировали буфером с низким рН. Фильтрацию с
25 использованием мембранного фильтра 0,2 мкм проводили перед аликвотированием. После очистки и фильтрации концентрацию белка рассчитывали по ОП280 и коэффициенту экстинкции. В общей сложности 43,2 мг lg-белков получали из одного цикла трансфекции.
Пример 2. Сайты связывания химерного L3D10 антитела только частично зо перекрываются 10D1
Было показано, что в клинике анти-СТ1_А4-антитело, Ипилимумаб, улучшает выживаемость больных раком, но вызывает значительное аутоиммунное нежелательное явление. Для оценки сравнительных сайтов связывания химерного антитела L3D10 и 10D1, сравнивали связывание с CTLA4 и способность антител 5 конкурировать за связывание с CTLA4. Хотя оба антитела связываются с
иммобилизованными белками CTLA4 при сопоставимом эффекте (фиг. 2), 10D1 не полностью блокирует связывание химерного L3D10 с CTLA4 (фиг. 3). Как и ожидалось, немеченый L3D10 полностью блокирует связывание меченного L3D10, указывая, что сайты связывания антител L3D10 и 10D1 только частично ю перекрываются.
Пример 3. Более эффективное блокирование взаимодействий CTLA4: В7.1 и CTLA4: В7.2 посредством химерного антитела L3D10, по сравнению с 10D1
Сообщалось, что анти-человеческий CTLA4 мкАТ, 10D1, может блокировать взаимодействие B7-CTLA4, если растворимые В7-1 и В7-2 использовались для
15 взаимодействия с иммобилизованным CTLA4 (49). Так как В7-1 и В7-2
функционируют как костимулирующие, поверхностно-молекулярные формы клетки, мы оценили способность анти-СТ1_А4 антител блокировать взаимодействие В7-CTLA4 с использованием иммобилизованных В7-1 и В7-2. Используя конкурентный анализа ИФА, устанавливали способности L3D10 и 10D1 блокировать связывание
20 слитого белка CTLA4, CTLA4-lg, как с планшет-мобилизированными так и с
экспрессируемыми на поверхности клетки В7.1 и В7.2. Для этих экспериментов использовали химерное анти-человеческий СТ1_А4-мкАТ с аффинностью (2,3 нМ), которое аналогично 10D1 (4 нМ) (49).Для анализа иммобилизации в планшетах, В7.1 Fc или B7.2Fc вносили в планшеты для ИФА в концентрации 1 мкг/мл на всю
25 ночь при 4°С или на 2 часа при 37°С. Биотинилированный CTLA4-FC смешивали с заданными концентрациями B7.1-Fc, 10D1 или химерного L3D10. Количество CTLA4-Fc, связанного с В7.1 в планшете, определяют с использованием стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Как изображено на фиг. 4, в то время как химерные L3D10, B7.1Fc и CTLA4-FC эффективно блокировали взаимодействие
зо CTLA4-Fc: В7.1, две отдельные части материала 10D1 не смогли блокировать взаимодействие. L3D10 демонстрирует значительную блокировку связывания с иммобилизованной в планшете В7.1 в концентрациях всего лишь 0,2 мкг/мл, достигая
50% ингибирования (ИК50) в концентрации около 3 мкг/мл. Аналогичным образом, L3D10 блокировал связывание CTLA4-FC в планшете с иммобилизованной В7.2 с ИК50 в концентрации 0,03 мкг/мл, тогда как 10D1 из двух разных серий веществ проявляли минимальное блокирование ИК50 приблизительно при 200 мкг/мл (Фиг. 5). 5 Однако, в соответствии с ранними сведениями (49), антитело 10D1 сильно
ингибирует взаимодействие В7-1-CTLA4 в противоположном эксперименте, когда иммобилизованная в планшете CTLA4 используется для взаимодействия с растворимым В7-1 (Фиг. 6).
Для экспериментов по связыванию с белками клеточной мембраны, когда В7.1 ю экспрессируется на поверхности клеток ЯКХ, L3D10 блокирует связывание CTLA4-FC, но 10D1 из двух разных серий веществ не проявляет подобного эффекта, даже при использовании в концентрации 512 мкг/мл (Фиг. 7). В то время как намного менее мощные, чем у L3D10, высокие дозы 10D1 достигали примерно 25% блокирования между человеческим CTLA4 и мышиным В7-1 (фиг. 8). Для В7.2, экспрессированного 15 на поверхности клеток ЯКХ, L3D10 снова блокировался, тогда как 10D1 только
частично блокировался, причем ингибирование менее 50% наблюдалось даже при использовании 10D1 в концентрации 512 мкг/ мл (Фиг. 9).
Потенциальным препятствием является то, что биотинилирование может повлиять на связывание 10D1 с CTLA4-FC. Для решения этой проблемы мы сравнили
20 связывание L3D10 и 10D1 с биотинилированным CTLA4-FC, используемым в анализе блокирования. Как изображено на фиг. 10, 10D1 более эффективен, чем L3D10 при связывании биотинилированного CTLA4-FC. Таким образом, неудача блокирования посредством 10D1 была обусловлена недостаточным связыванием с биотинилированным CTLA4-FC. Аналогичная картина наблюдается, когда
25 полигистидиновый меченный CTLA4 использовался для взаимодействия с
человеческим В7-1, трансфицированным в клетки ЯКХ (фиг. 11). Взятые вместе, наши данные предполагают, что способность антитела 10D1 блокировать взаимодействие B7-CTLA4 в значительной степени зависит от используемого анализа с минимальной не детектируемой блокирующей активностью, если В7-1 и
зо В7-2 иммобилизованы, тогда как антитело L3D10 является надежным блокатором для взаимодействия B7-CTLA4 независимо от того, был ли иммобилизован белок В7.
Пример 4. Химерное антитело L3D10 более эффективно, чем немодифицированное L3D10, в индукции отторжения опухоли
Ранее сообщалось, что мышиный L3D10 оказался неспособным вызвать полную ремиссию опухолей МС38, даже тогда, когда наблюдались значительные задержки 5 (19 20) .Чтобы определить, может ли химерный L3D10 вызвать полную ремиссию у сингенных мышей, 1x106 МС38 опухолевых клеток трансплантировали сингенным мышам C57BL/6. Через неделю, когда опухоль достигает около 5 мм в диаметре, мышей лечили либо контрольныйм IgG, либо химерным L3D10 мкАТ в дозе, которая составляет лишь половину того, что использовалось в предыдущих исследованиях с
ю мышиным L3D10. Как изображено на фиг. 12, несмотря на возможную
иммуногенность последовательности lg человека, было обнаружено, что химерный L3D10 вызывает полную ремиссию у всех тестируемых мышей. Поскольку лечение было начато, когда была установлена значительная опухолевая нагрузка, что намного сложнее, чем когда опухоли не были явными (19), эти эксперименты
15 показывают, что химерный L3D10 является более эффективным, чем немодифицированный L3D10.
Пример 5. Химерное антитело L3D10 обладает эквивалентной активностью как и 10D1, вызывая отторжение опухоли
Доступность мышей с нокин гена CTLA4 человека(20) обеспечивала 20 беспрецедентную возможность протестировать биологическую активность химерного анти-человеческий CTLA-4 антитела в клинике с использованием анти-СТ1_А-4 мкАТ, 10D1. В этой гуманизированной мышиной модели, ген CTLA4, кодирующий продукт со 100% идентичностью к белку CTLA-4 человека экспрессируется под контролем мышиного эндогенного локуса Ctla4. Когда противоопухолевую активность химерных 25 L3D10 и 10D1 непосредственно сравнивали в МС38 опухолевой модели у мышей с нокин CTLA4 человека, стало очевидным, что оба антитела были сопоставимы по вызыванию отторжения опухоли, тогда как опухоли в контрольной группе с IgG постепенно прогрессировали. На фиг. 13 изображены результаты лечения антителом на размер опухоли в двух экспериментах.
зо Интересный вопрос заключается в том, должны ли анти-С~П_А-4 мкАТ
взаимодействовать со всеми CTLA-4 (то есть достичь целевого насыщения), чтобы
оказывать иммунотерапевтическое действие. F1 мыши из CTLA4h/h и CTLA4m/m мыши экспрессируют как мышиный, так и человеческий CTLA-4-белок кодоминантным образом. Интересно, что, как изображено на фиг. 14, как химерные L3D10, так и 10D1 эффективно индуцировали отторжение опухоли, даже несмотря на то, что 5 приблизительно 50% белка CTLA-4 (то есть мышиной версии белка) не могут быть связаны анти-человеческий CTLA-4 мкАТ. Важно отметить, что L3D10 является более терапевтически эффективным, чем 10D1 в этой терапии, то есть когда дозы гена ограничены (Р 0,05).
Предыдущие исследования продемонстрировали, что анти-мышиный Ctla-4 мкАТ не ю могут вызывать отторжение клеточной линии меланомы B16-F1 без комбинации с другими терапевтическими средствами. Таким образом, противоопухолевый эффект химерных антител L3D10 и 10D1 также тестировали с использованием этой более интенсивной опухолевой модели В16 у мышей с нокин CTLA4 человека. Как изображено на фиг. 15, в то время как ни L3D10, ни Ипилимумаб не способны 15 вызвать отторжение установленных опухолей, оба они вызывают статистически значимое замедление роста опухоли, в то время как различия между разными антителами не являются статистически значимыми.
Пример 6. Блокирование CTLA4 in vivo
CTLA4 экспрессируется преимущественно среди Трег, где он подавляет 20 аутоиммунные заболевания с помощью регуляции В7-1 и В7-2 на дендритных
клетках (50). Поскольку целевая мутация Ctla4 (50) и лечение с блокирующим анти-CTLA4 мкАТ (51) активировали экспрессию В7-1 и В7-2 на дендритных клетках, было высказано предположение, что физиологическая функция CTLA4 на Трег заключается в снижении В7 на ДК. Таким образом, усиление В7 использовалось как 25 показание для блокады in vivo взаимодействий B7-CTLA4 и способствовало
разработке анализа с использованием Т-клеток у мышей Ctla4h/h, которые имели гомозиготный нокин человеческого гена CTLA4.
Как показано на фиг. 16, поверхностно-экспрессированный В7.1 или В7.2 связывает CTLA4 на поверхности Т-клеток, что приводит к снижению регуляции экспрессии В7.1 зо и В7.2. Однако связывание блокирующих анти-СТ1_А4 антител предотвращает
связывание В7.1/В7.2, что предотвращает подавление В7.1 и В7.2, что приводит к
общему увеличению экспрессии В7.1/В7.2. Однако, с химерной Т-клеточной экспрессией человеческого и мышиного CTLA4, антитела, которые связывают CTLA4 человека, не препятствуют связыванию В7.1/В7.2 с мышиным CTLA4, что восстанавливает ингибирование В7.1/В7.2.
5 Описаны гуманизированные мыши CTLA4, которые экспрессируют ген CTLA4 с 100% -ной идентичностью к человеческому белку CTLA4 под контролем эндогенного локуса Ctla4 мыши (20). Гомозиготные нокинмыши (CTLA4hm) возвратно скрещивались с C57BL/6 в течение как минимум 10 поколений. Гетерозиготных мышей (CTLA4hlm) получали путем скрещивания CTLA4h/h с мышами ДТ BALB/c.
ю Для тестирования клинически доказанной терапевтики анти-СТ1_А4 мкАТ, 10D1, мы вводили очень высокие дозы анти-СТ1_А4 мкАТ (500 мкг/мышь, что составляет примерно 25 мг/кг или в 8 раз большую дозу, используемую в клинике) мышам Cf/a4h/h или Cf/a4m/h и получали клетки селезенки для измерения уровней В7-1 и В7-2 на Cd11chl ДК через 24 часа после инъекции (фиг. 17А- В). Как показано на фиг. 17С-Е,
15 по сравнению с мышами Cf/a4h/h, которые получали человеческий lgG1-Fc, ДК мышей, получавших химерные L3D10, имели статистически достоверное увеличение экспрессии В7.1 в Т-клетках, экспрессирующих человеческий CTLA4, но не в Т-клетках, экспрессирующих CTLA4 как человека, так и мыши. Аналогичные результаты были получены для В7.2, как изображено на фиг. 17С-Е. Значение
20 увеличения В7-2 сопоставимо с тем, что было достигнуто с использованием блокирования анти-СТ1_А4 мкАТ в совместной культуре Трег-ДК человека(бб).
Чтобы дополнительно подтвердить специфичность анализа in vivo, мы тестировали, может ли L3D10 регулировать В7 у мышей Cf/a4m/h, в которых мышиный и человеческий CTLA4 экспрессируются кодоминантно. Поскольку по меньшей мере 50%
25 CTLA4 не связывается с анти-человеческий CTLA4, ожидается, что они будут менее эффективны в блокировании взаимодействия B7-CTLA4. Действительно, антитело не вызывало усиление В7-1 и В7-2 на ДК мышей Cf/a4m/h (фиг. 17С, D, F). Полное отсутствие блокирования при использовании L3D10 на мышах Cf/a4m/h, позволяет предположить, что CTLA4 кодируется аллелем мыши, который не связывается с
зо L3D10 (фиг. 18), является достаточным снижения регуляции экспрессии В7. Таким образом, наши данные показали, что при дозах, которые по меньшей мере в 8 раз
превышают максимальную дозу, используемую в клинике, 10D1 не блокирует взаимодействие B7-CTLA4, когда В7 либо иммобилизуется в планшете, либо закрепляется на клеточной мембране, как in vivo, так и in vitro.
Полное отсутствие блокирования при использовании L3D10 на мышах Cf/a4m/h, 5 позволяет предположить, что CTLA4 кодируется аллелем мыши, который не связывается с L3D10 (фиг. 18), является достаточным снижения регуляции экспрессии В7. Для сравнения, 10D1 не увеличивал экспрессию В7.1 или В7.2. Согласно модели, это предполагает, что L3D10 блокирует активность CTLA4 in vivo, тогда как 10D1 - нет.
ю Однако, несмотря на очевидные различия в активности блокирования, L3D10 и 10D1 проявляют сильную противоопухолевую активность против модели МС38 у химерных мышей CTLA4m/h, как изображено на фиг. 19. В то время как опухоль постепенно прогрессировала у мышей, получавших контрольный lg, полное отторжение достигалось одним из анти-С~П_А4 мкАТ. В нескольких экспериментах два антитела
15 сравнимы в случае отторжения опухоли. В другой модели опухоли, меланоме В16, оба антитела индуцировали подобное замедление роста опухоли, хотя полное отторжение не достигалось ни с помощью одного ни другим антителом (фиг. 20).
Пример 7. Противоопухолевые эффекты связаны с внутриопухолевым деплетированием Трег
20 Иммунная регуляция in vivo является результатом баланса между активацией
иммунных клеток и иммунными контрольными точками. В частности, регуляторные Т-клетки (Трег) представляют собой субпопуляцию Т-клеток, которые регулируют иммунную систему, поддерживают толерантность к аутоантигенам и подавляют аутоиммунное заболевание. Недавние исследования показали, что терапевтическая
25 эффективность анти-мышиный CTLA4 мкАТ зависит от подкласса Fc и Fc-рецептора хозяина, который, в свою очередь, влияет на антителозависимую селективную цитотоксичность Трег в микросреде опухоли (52, 53). Поскольку дифференциальная блокирующая активность CTLA4 in vivo, по-видимому, не приводит к различиям в противоопухолевой активности, мы попытались установить механизм(ы) действия, с
зо помощью которого происходит противоопухолевое действие, и наблюдали за Трег в микросреде опухоли. Для этого мы взяли одну мышь с опухолью МС38 до того, как
отторжения были завершены (фиг. 21) и проанализировали частоту Трег у нокин мышей Ctla4h/h, которые получали контрольный lg, 10D1 или L3D10. Хотя ни одно из антител не уменьшает Трег в селезенке (фиг. 22С), оба уменьшали Трег в микросреде опухоли (фиг. 22Е). Интересно, что 10D1, но не L3D10, увеличивал Трег 5 в селезенке. Увеличение Тгед в селезенке посредством 10D1, повторяет клинический вывод о том, что Ипилимумаб увеличивал экспрессию FOXP3 при помощи лейкоцитов периферической крови (54). Так как блокирующие и неблокирующие антитела сравнимы при деплетировании Трег в микросреде опухоли, блокирование взаимодействия B7-CTLA4 не способствует деплетированию Трег. Поскольку 10D1
ю не блокирует взаимодействие B7-CTLA4 in vivo и все же оказывает терапевтический эффект у мышей Cf/a4h/h с меланомой, блокирование этого взаимодействия не требуется для его терапевтического эффекта. Кроме того, поскольку два мкАТ с резко отличающимся эффектом блокирования имеют сравнимый терапевтический эффект и селективное деплетирование Трег в микросреде опухоли, блокирование
15 взаимодействия CTLA4-B7 не усиливает терапевтический эффект антитела.
Чтобы обосновать это наблюдение, мы проверили терапевтический эффект двух анти-СТ1_А4 мкАТ у мышей Ctla4m/h, в которых анти-человеческий CTLA4 мкАТ могут связываться с максимальным количеством 50% молекул CTLA4, и в которых ни то, ни другое антитело не может блокировать взаимодействие B7-CTLA4 для достижения
20 регуляции В7 на дендритных клетках (фиг. 16). Опять же, оба антитела вызывают быстрое отторжение опухолей МС38, хотя L3D10 несколько эффективнее, чем 10D1 (фиг. 22В). Соответственно, оба антитела селективно уменьшают Трег в микросреде опухоли (фиг. 22D и 21F). Эти генетические данные также продемонстрировали несостоятельность блокирования CTLA4 при отторжении опухоли и локальном
25 деплетировании Трег и тем самым опровергли преобладающую гипотезу о том, что анти-СТ1_А4 мкАТ индуцирует иммунитет против рака посредством блокирования взаимодействия B7-CTLA4 (10).
Пример 8. Оценка активности блокирования широко используемых анти-мышиный CTLA4 мкАТ 9Н10 и 9D9
зо Было предложено, что CTLA4 является внутренним отрицательным регулятором в регуляции Т-клеток на основе стимуляторного эффекта как интактного, так и Fab
двух анти-мышиный CTLA4 мкАТ (30, 31), 4F10 и 9Н10, хотя данные не были представлены для демонстрации того, что эти антитела блокируют взаимодействие B7-CTLA4. Относительно недавно сообщалось, что третьи анти-мышиный CTLA4 мкАТ, 9D9, оказывают терапевтическое действие на мышей-опухоленосителей, и 5 вызывает локальное деплетирование Трег в микросреде опухоли (52). Поэтому мы решили протестировать все три коммерчески доступные анти-мышиный CTLA4 мкАТ, которые, как было показано, индуцируют отторжение опухоли из-за их способности блокировать взаимодействие B7-CTLA4 в физиологически соответствующих конфигурациях. В качестве первого теста мы использовали увеличение количества
ю анти-СТ1_А4 мкАТ (до 2000 кратного молярного избытка по сравнению с CTLA4-Fc), чтобы блокировать связывание биотинилированного CTLA4-FC с иммобилизованными в планшетах В7-1 и В7-2. Как изображено на фиг. 23А, анти-мышиный CTLA4 мкАТ 9Н10 не блокировали взаимодействие B7-1-CTLA4 даже при самой высокой концентрации, хотя умеренное блокирование наблюдалась при
15 использовании 9D9 в очень высоких концентрациях. Хотя мкАТ 9D9 эффективно блокировали взаимодействие B7-2-CTLA4, 9Н10 оказались неэффективными (фиг. 23В). Интересно, что в то время как 9D9 демонстрирует сильное связывание с растворимым CTLA4-Fc, 9Н10 демонстрирует плохое связывание (фиг. 23с), хотя он более эффективен, чем 9D9 при связывании иммобилизованного мышиного CTLA4-
20 Fc (фиг. 23D). Поскольку отсутствие какой-либо блокирующей активности при
использовании 9Н10 в этом анализе может просто отражать его плохое связывание с растворимым CTLA4-FC, мы снова использовали увеличение экспрессии В7-1 и В7-2 на дендритных клеток у мышей ДТ (CTLA4m/m) для измерения блокирование in vivo взаимодействия B7-CTLA4. Как изображено на фиг. 23Е и F, 9Н10 не активировали
25 экспрессию В7-1 на ДК, в то время как 9D9 увеличивали уровень В7-1 на 15% (Р <0,05). Интересно, что в то время как 9D9 явно повышал В7-2 на ДК, 9Н10 не оказывал подобного эффекта. Поэтому 9Н10, первое и наиболее широко изученное опухолевое иммунотерапевтическое анти-СТ1_А4 мкАТ не блокирует взаимодействие B7-CTLA4. Следовательно, блокирование взаимодействия B7-CTLA4 не
зо способствует индукции противоопухолевого иммунитета с помощью анти-мышиный CTLA4 мкАТ. Поскольку оба мкАТ показывают сопоставимый иммунотерапевтический эффект и сопоставимое уменьшение Трег в микросреде опухоли (52), локальное уменьшение Трег, а не блокирование взаимодействия В7-
CTLA4, дает унифицированное объяснение терапевтического эффекта анти-мышиный CTLA4 мкАТ. Интересно отметить, что в то время как 4F10 блокировал взаимодействие B7-CTLA4 \п vitro, он не вызывал усиление В7 на ДК in vivo (фиг. 24).
В совокупности мы продемонстрировали, что клинически доказанные 5 терапевтические анти-человеческий CTLA4 мкАТ (10D1) и два анти-мышиный CTLA4 мкАТ (9Н10 и 4F10) проявляют иммунотерапевтический эффект без блокирования взаимодействия B7-CTLA4 в физиологически значимых условиях. Кроме того, такое блокирование не требовалась для отторжения опухоли даже для мкАТ (L3D10), которые могут сильно блокировать взаимодействие B7-CTLA4. Поскольку
ю терапевтический эффект по существу одинаковый для антител с 1000-кратным различием в блокировании взаимодействия B7-CTLA4, такое блокирование не способствует терапевтическому действию против рака анти-С~П_А4 мкАТ. Эти данные опровергают гипотезу о том, что анти-С~П_А4 мкАТ обеспечивают иммунотерапевтический эффект посредством блокирования контрольной точки (55).
15 Из-за опровержения преобладающей гипотезы наши данные свидетельствуют о том, что терапевтический эффект анти-СТ1_А4 мкАТ не может быть оптимизирован путем улучшения активности блокирования анти-СТ1_А4 мкАТ. В этом контексте особенно интересно отметить, что Тремелимумаб, превосходящий блокирование взаимодействия B7-CTLA4 (56), не достиг клинической точки в клиническом
20 испытании фазы III (57). Между тем, демонстрируя сильную корреляцию между отторжением опухолей локального деплетирования Трег и опровержением участия блокирования взаимодействия B7-CTLA4 в опухолевом иммунитете, наша работа благоприятствует гипотезе о том, что локальное деплетирование Трег в опухолевой микросреде является основным механизмом терапевтического анти-СТ1_А4 мкАТ, и,
25 следовательно, предлагают новые подходы к разработке следующего поколения анти-СТ1_А4 мкАТ для иммунотерапии рака.
Наконец, накопление генетических данных мышей предполагает, что первоначальная концепция (30, 31), о том что CTLA4 отрицательно регулирует активацию Т-клеток, и что такая регуляция достигнута посредством SHP-2 (58, 59), зо возможно, нуждается в повторном рассмотрении (60). Таким образом, хотя тяжелые аутоиммунные заболевания у мышей Ctla4_/" были использованы для поддержки точки зрения о CTLA4 как о внутриклеточном отрицательном регуляторе активации
Т-клеток (61, 62), с тех пор появилось по меньшей мере три линии генетических данных которые не согласуются с этой точкой зрения. Во-первых, специфическая для линии делеция гена Ctla4 в Трег, но не в эффекторных Т-клетках, достаточна для повторения аутоиммунного фенотипа, наблюдаемого у мышей с делецией гена Ctla4 5 в генеративной линии (50). Эти данные свидетельствуют о том, что аутоиммунитет у мышей Ctla4_/" не был обусловлен отсутствием внутриклеточного отрицательного регулятора CTLA4 в эффекторных Т-клетках. Во-вторых, у химерных мышей, состоящих из клеток ДТ и Ctla4_/" Т-клеток, аутоиммунный фенотип был предотвращен сосуществованием Т-клеток ДТ (63). Эти данные снова убедительно
ю утверждают, что аутоиммунные заболевания не были вызваны отсутствием
внутриклеточного отрицательного регулятора. Отсутствие эффекта внутриклеточного отрицательного регулятора также подтверждается тем фактом, что у химерных мышей не наблюдалось преимущественного увеличения Ctla4_/" Т-клеток во время вирусной инфекции (64). В-третьих, Т-клеточная специфическая делеция Shp2,
15 которая была предложена для опосредования отрицательной регуляции CTLA4 (58, 59), оказывала скорее уменьшение, чем усиление активации Т-клеток (65). В контексте этих генетических данных, о которых сообщалось, учитывая, что CTLA4 предполагался как отрицательный регулятор для активации Т-клеток, наши данные, представленные в данном документе, требуют пересмотра блокирования
20 контрольных точек CTLA4 при иммунотерапии рака.
Пример 9. Химерный L3D10 проявляет снижение иммунных нежелательных явлений при использовании в комбинации с другими иммунотерапевтическими антителами
Недавние клинические исследования показали, что комбинированная терапия между 25 анти-PD-l и анти-СТ1_А4 мкАТ дополнительно повышает уровень выживаемости пациентов с меланомой конечной стадии. Однако у 55% пациентов, получавших комбинированную терапию, развились 3 и 4 степени иммуноопосредованных нежелательных явлений (иоНЯ). Поэтому крайне важно устанавливать антитела с меньшей токсичностью. Мы разработали модель in vivo, в которой анализируются зо иоНЯ, связанные с комбинированной терапией анти-СТ1_А-4 и анти-PD-l мкАТ, наблюдаемых в клинике. В этой модели мы лечили мышей с нокин гена CTLA4 человека (CTLA4h/h) в течение перинатального периода высокими дозами анти-PD-l
и анти-СТ1_А-4 мкАТ. Мы обнаружили, что, хотя молодые мыши переносят лечение отдельными мкАТ, комбинированная терапия с анти-PD-l и 10D1 вызывает тяжелые иоНЯ с множественным воспалением органов, анемией и, как изображено на фиг. 25, сильную задержку роста. Для сравнения, когда комбинировали с анти-PD-l, 5 химерный L3D10 проявлял только слабые иоНЯ, что подтверждается нормальным увеличением привеса.
Для дальнейшего изучения относительной токсичности химерного L3D10 по сравнению с 10D1 при введении в комбинации с анти-PD-l, мы изучили патологические эффекты у нокин-мышей CTLA4h/h через 42 дня после введения. Как
ю изображено на фиг. 26, конечный вес тела (день 42) у мышей, получавших L3D10 + анти-PD-l, был подобен мышам, получавшим отрицательное контрольное антитело hlgG. Однако, для сравнения, вес мышей, получавших 10D1 + анти-PD-l, был намного ниже. Соответственно, когда мы изучили общую анатомию этих мышей, матка/яичник/мочевой пузырь и тимус, то они были заметно меньше у мышей,
15 получавших 10D1 + PD-1 (фиг. 27). Опять же, органы у мышей, получавших L3D10 + анти-PD-l, были сопоставимы с контролем hlgG. Для сравнения, сердца, иссеченные из мышей, получавших 10D1, оказались немного большими по размеру с заметно более белым видом. В результате мы решили изучить эритропоэз у мышей и наблюдали явные различия у мышей, получавших 10D1 + анти-PD-l, относительно
20 групп, получавших L3D10 + анти-PD-l или контрольное антитело, которые были довольно похожи. Как изображено на фиг. 27А, костный мозг мышей, получавших 10D1 + анти-PD-l, имел заметно более белый цвет, а изолированная кровь была почти полностью белой по цвету (фиг. 28Ь). В соответствии с этим, мы более внимательно изучили клетки крови, находящиеся на различных стадиях развития с
25 использованием маркеров CD71 и CD119. Типичные профили FACS показаны на фиг. 28С, тогда как сводные данные изображены на фиг. 28D. Эти данные показали статистически значимое снижение количества клеток, находящихся на стадии IV развития у мышей, получавших 10D1 + анти-PD-l (фиг. 28D).
Чтобы исследовать возможный механизм анемии у мышей, получавших 10D1, мы зо тестировали, способно ли лечение 10D1 + PD-1 индуцировать антиэритроцитарные антитела. Как изображено на фиг. 29, антиэритроцитарные антитела не обнаружены.
Таким образом, развитие специфических эритроцитарных аутоантител, не отвечает за анемию у мышей, получавших анти-PD-l +10D1.
Чтобы дополнительно определить токсикологию L3D10 по сравнению с 10D1 в комбинации с анти-PD-l, мы провели гистологический анализ сердца (фиг. 30), 5 легких (фиг. 31), слюнной железы (фиг. 32) и почек и печени (фиг. 33) после
фиксации в 10% формалине в течение не менее 24 часов. В каждой из изученных тканей, мыши, получавшие 10D1 + анти-PD-l, демонстрировали высокий уровень инфильтрации Т-клеток. Показатель токсичности, основанный на выраженности воспаления, суммирован на фиг. 34, в котором изображены оценки высокой ю токсичности мышей, получавших 10D1 + анти-PD-l по сравнению с L3D10 + анти-PD-1, который имеет оценки лишь незначительно выше, чем контрольная группа мышей с hlgG.
Пример 10. L3D10 снижает связывание растворимого CTLA4.
L3D10 и 10D1 показывают аналогичные паттерны связывания с иммобилизированной 15 в планшете CTLA4 (фиг. 36). В качестве возможного объяснения снижения токсичности L3D10 по сравнению с 10D1, в частности увеличение инфильтрации/активности Т-клеток, связанной с 10D1, мы решили изучить связывание с растворимым CTLA4. Мы решили посмотреть на это, потому что связь между полиморфизмом CTLA4 и множественными аутоиммунными заболеваниями 20 связана с дефектным образованием растворимого CTLA4 (nature 2003, 423: 506-511) и подавлением экспрессии изоформы SCTLA4, увеличившей возникновение диабета I типа у мышей ((Diabetes 2011, 60:1955-1963). Кроме того, растворимый CTLA4 (абатасепт и белатасепт) представляет собой широко используемый препарат для подавления иммунитета. В соответствии с этой идеей, когда мы изучали 25 относительное связывание с растворимым CTLA4, мы наблюдали заметное снижение связывания L3D10 (фиг. 37).
Мы продемонстрировали, что анти-СТ1_А-4 мкАТ индуцируют устойчивое внедрение опухоли у гетерозиготных мышей Ctla4h/m, в которых только 50% молекул CTLA-4 могут связываться с анти-человеческий CTLA-4 мкАТ. Чтобы определить, достаточно зо ли взаимодействия 50% CTLA-4 для индукции иоНЯ, мы лечили Ctla4h/m мышей анти-PD-l + 10D1. Как изображено на фиг. 35, anti-PD-1 + 10D1 не смогли вызвать потерю
веса у мышей Ctla4h/m. Таким образом, иоНЯ и иммунитет к раку могут быть генетически не связаны.
Активность in vivo демонстрирует, что L3D10 антитело сохраняет свою противоопухолевую активность, но проявляет сниженное аутоиммунное 5 нежелательное явление, наблюдаемое с другими иммунотерапевтическими антителами, такими как 10D1, что указывает на возможность усиления противоопухолевой активности без обострения аутоиммунных нежелательных явлений. Соответственно, аутоиммунные побочные эффекты не являются необходимой ценой для иммунитета против рака и представляется возможным не
ю связывать эти два показателя. Характеристика L3D10 показала, что его способность блокировать взаимодействие CTLA4 с В7.1 и В7.2 более эффективна, чем с 10D1, и это связано с различием в сайте связывания CTLA4 между антителами. Кроме того, L3D10 был слит с Fc-доменом модифицированого человеческого lgG1, который имеет мутации, придающие сильную АЗКЦ активность, которая усиливает
15 терапевтический эффект антитела. Дополнительная характеристика демонстрирует, что L3D10 и 10D1 связываются с иммобилизованным CTLA4 с аналогичным профилем связывания. Однако L3D10 демонстрирует гораздо более низкую аффинность связывания с растворимым CTLA4, чем 10D1. В совокупности наши данные показывают, что антитело L3D10 обладает большим потенциалом для
20 клинического применения при лечении больных раком с менее тяжелыми нежелательными явлениями.
Пример 11. Гуманизация L3D10
Процесс гуманизации начинается с создания моделированной трехмерной гомологичной структуры антител, и создания профиля исходного антитела на основе
25 структурного моделирования. Для реализации, акцепторные каркасные области идентифицировались на основе общей идентичности последовательности каркасной области, соответствия границ раздела, аналогично классифицированных канонических позиций CDR и наличия сайтов N-гликозилирования, которые необходимо было бы удалить. Для гуманизированной конструкции были выбраны
зо одна легкая цепь (LC) и одна каркасная область тяжелой цепи (НС).
Гуманизированные антитела конструировали путем создания множества гибридных последовательностей, которые сливают отдельные части последовательности исходного антитела с гуманизированной каркасной последовательностью, включая трансплантацию последовательностей CDR в каркасные области. Определенные 5 последовательности CDR исходного антитела L3D10 представлены как SEQ ID NO: 21-26, как указано в таблице 1А ниже:
Используя 30-модель, эти гуманизированные последовательности были методично ю проанализированы визуально и с помощью компьютерного моделирования для выделения последовательностей, которые, скорее всего, сохраняли бы связывание антигена. Цель заключалась в том, чтобы максимизировать количество гуманизированной последовательности в конечных гуманизированных антителах, сохраняя при этом первоначальную специфичность антител.
15 Три гуманизированные легкие цепи (LC1, LC2 и LC3) и три гуманизированные тяжелые цепи (НС1, НС2 и НСЗ) были разработаны на основе выбранных акцепторных каркасных областей. Каждая из трех последовательностей НС или LC была из одной и той же генеративной линии, с различными обратными мутациями к исходной последовательности мыши, как изображено на фиг. 38. Аминокислотные
20 последовательности гуманизированной вариабельной области и их оптимизированная кодирующая нуклеотидная последовательность перечислены в Seq ID NOS: 9-20 Последовательности CDR2 как гуманизированной тяжелой, так и легкой цепей содержат аминокислотные изменения относительно исходной последовательности антител L3D10 и перечислены в SEQ ID NOS 33-38, как указано
25 ниже в таблице 1 В.
Таблица 1В: CDR2 последовательности вариабельных областей гуманизированного антитела.
П ос л е до вате л ь н ост ь антитела
Последовательность CDR2
SEQID N0
НС1
YIWYDGNTNFHPSLKSR
НС2
YIWYDGNTNFHSSLKSR
НСЗ
YIWYDGNTNFHSPLKSR
LC1
AATNLQS
LC2
AATNLQD
LC3
AATSLQS
Легкие и тяжелые гуманизированные цепи теперь могут комбинироваться для создания вариантов полностью гуманизированных антител. Все возможные комбинации гуманизированных легкой и тяжелой цепи были проверены на уровень 5 их экспрессии и антигенсвязывающую аффинность для идентификации антител, которые проявляют себя как аналогичные к исходным антителам.
Был использован новый инструмент для расчета показателя гуманизации моноклональных антител (24). Этот показатель означает, как выглядит подобная человеческой последовательность вариабельной области антитела, что является ю важным фактором при гуманизации антител. Показатели гуманизации для исходных и гуманизированных антител показаны ниже в таблицах 2 и 3. Основываясь на нашем методе, для тяжелых цепей показатель 79 или выше свидетельствует о подобии человеческим; для легких цепей показатель 86 или выше свидетельствует о подобии человеческим.
15 Таблица 2: Данные гуманизированной легкой цепи и показатели гуманизации.
Название цепи
Примечание
Полная длина (каркасная область
+ CDR) Пороговое значение = 86
Только каркасные
области Пороговое значение = 90
L2872 (Химерный исходный)
Легкая цепь
71,3
78,2
L3106 (LC1)
Равномерно гуманизированная
86,5
96,8
L3107 (LC2)
Равномерно гуманизированная
83,6
94,0
L3108 (LC3)
Равномерно гуманизированная
88,8
98,1
Таблица 3: Данные гуманизированной тяжелой цепи и показатели гуманизации.
Название цепи
Примечание
Полная длина (каркасная
Только каркасные области
область + CDR)
Пороговое значение = 79
Пороговое значение = 84
H2872 (Химерный исходный)
Исходный
62,0
70,3
Н3106 (НС1)
Равномерно гуманизированная
80,4
90,7
Н3107 (НС2)
Равномерно гуманизированная
78,9
89,4
Н3108(НСЗ)
Равномерно гуманизированная
80,5
93,0
Гены полной длины антител были сконструированы путем первого синтеза последовательностей вариабельной области. Последовательности были оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих. Эти последовательности 5 вариабельной области затем клонировали в векторы экспрессии, которые уже содержат человеческие Fc-домены; для тяжелой цепи использовались каркасные последовательности hlgG1 (M252Y, S254T, Т256Е, S298A, ЕЗЗЗА, К334А). Кроме того, для сравнения вариабельной области исходных химерных тяжелых и легких цепей, были сконструированы химерные цепи полного размера, используя одни и те же ю каркасные Fc-последовательности.
Все 9 гуманизированных антител подвергались мелкомасштабному производству в 0,01 литре. Количество химерного исходного антитела также увеличивали для прямого сравнения. Плазмиды для указанных тяжелых и легких цепей трансфицировали в суспензионные клетки НЕК293 с использованием химически 15 определенных сред в отсутствие сыворотки для получения антител. Целые антитела в кондиционированной среде очищали с использованием среды MabSelect SuRe Protein A (GE Healthcare). 10 тестируемых антител показаны ниже в таблице 4.
HC1 + LC2
Гуманизированное HC1 + LC3
Н3106
L3108
4632
Гуманизированное НС2 + LC1
Н3107
L3106
4633
Гуманизированное НС2 + LC2
Н3107
L3107
4634
Гуманизированное НС2 + LC3
Н3107
L3108
4635
Гуманизированное НСЗ + LC1
Н3108
L3106
4636
Гуманизированное НСЗ + LC2
Н3108
L3107
4637
Гуманизированное НСЗ + LC3
Н3108
L3108
4638
Химерное исходное
Н2872
L2872
4629
Аффинность 9 гуманизированных комбинаций антител и химерного исходного антитела к антигену (huCTLA4) оценивали с помощью Octet. Кинетические эксперименты с множеством концентраций проводились на системе Octet Red96 5 (ForteBio). Биосенсоры анти-hlgG Fc (ForteBio, # 18-5064) гидратировали в разбавителе для образца (0,1% БСА в ФСБ и 0,02% Твин 20) и предварительно проводили кондиционирование при рН 1,7 Глицина. Антиген разбавляли с использованием 7-точечного 2-кратного серийного разведения, начинающегося с 600 нМ разбавителя для образца. Все антитела разбавляли до 10 мкг/мл разбавителем
ю для образцов и затем иммобилизовали на биосенсоры анти-hlgG Fc в течение 120 секунд. После того, как базовые линии были установлены в течение 60 секунд в образце-разбавителе, биосенсоры были перемещены в лунки, содержащие антиген, в последовательности концентраций для измерения ассоциации. Ассоциация наблюдалась в течение 120 секунд, и диссоциация наблюдалась в течение 180
15 секунд для каждого белка, представляющего интерес в разбавителе для образца. Аффинность связывания характеризовалась установкой кинетических сенсорных диаграмм к моновалентной связывающей модели (связывание 1: 1). Полные кинетические измерения суммированы ниже в таблице 5.
Пример 12. Противоопухолевая активность гуманизированных анти-СТ1_А4 антител
5 Основываясь на относительной аффинности связывания и показателях гуманизации, мы выбрали 3 антитела для дальнейшей оценки:
РР4631 - высокая аффинность и хорошая экспрессия
РР4637 - высокая аффинность и хорошая экспрессия
РР4638 - немного более низкая аффинность, но наивысший показатель гуманизации
ю Материал для каждого из этих антител продуцировали с помощью временного
синтеза в клетках НЕК293 в масштабе 0,1 литра с последующей очисткой белком А. Аффинность связывания очищенных антител была подтверждена при помощи Octet-анализа, как показано ниже в таблице 6.
PP4637
huCTLA4
7.1E-09
2.7E+05
1.9E-03
0,0294
0,9899
PP4638
huCTLA4
9,4E-09
2,3E+05
2.1E-03
0,0211
0,9919
PP4631
huCTLA4
7,4E-09
2,3E+05
1.7E-03
0,0191
0,9919
PP4637
huCTLA4
8,4E-09
2,6E+05
2,2E-03
0,0248
0,9899
PP4638
huCTLA4
1.1E-08
2,1E+05
2,2E-03
0,0150
0,9934
Мы оценили противоопухолевую активность этих трех гуманизированных антител по сравнению с 10D1 и химерным антителом L3D10, используя сингенную модель опухоли мыши МС38 у мышей с нокин CTLA4 человека, описанных выше в примере 5. 5 На фиг. 39А изображен график лечения для эксперимента in vivo; мышам вводили в общей сложности 4 дозы антител каждые 3 дня, начиная с 7-го дня после введения. Как изображено на фиг. 39В, все гуманизированные антитела полностью уничтожили опухоль и были сопоставимы с 10D1.
В другом эксперименте мы оценивали противоопухолевую активность ю гуманизированных антител РР4631 и РР4637 по сравнению с 10D1 и химерным антителом L3D10 с использованием сингенной модели опухоли мыши МС38 у гетерозиготных мышей Ctla4h/m, описанных в примере 5 (фиг. 14) при двух разных дозах. Как изображено на фиг. 40, тогда как все мкАТ были неотличимы при использовании в концентрации 30 мкг/мышь/инъекция (1,5 мг/кг), РР4637 был более 15 эффективен в концентрации 10 мкг/мышь/инъекция (0,5 мг/кг), тогда как РР4631 и 10D1 показали сравнимую активность.
Противоопухолевую активность гуманизированных антител по сравнению с 10D1 и химерным антителом L3D10 также продемонстрировали с использованием сингенной модели опухоли мышиной меланомы B16-F1 у мышей с нокин CTLA4 человека, как 20 изображено на фиг. 41. Мышам давали в общей сложности 3 дозы антител каждые 3 дня, начиная со 2-го дня после введения. Как изображено на фиг. 41, L3D10 и гуманизированные антитела замедляли рост опухоли и были сопоставимы с 10D1.
Пример 13. Гуманизированные клоны L3D10 поддерживают превосходные профили безопасности по сравнению с 10D1.
Чтобы проверить, можно ли поддерживать превосходные профили безопасности L3D10 после гуманизации, мы сравнили РР4631 и РР4637 с 10D1 для установления их нежелательных явлений при использовании в комбинации с анти-PD-l. Как изображено на фиг. 42, как РР4631, так и РР4637 менее токсичны, чем 10D1 при 5 использовании в комбинации с анти-PD-l.
В соответствии с нарушением эритропоэза, описанным на фиг. 28, мыши, получавшие 10D1 плюс анти-PD-l, анемичны на основании общего анализа крови (OAK), тогда как те, которые получали анти-PD-l + РР4631 и анти-PD-l + РР4637, имеют в основном обычные профили OAK, как изображено на фиг. 43. Более того, ю анализ профилей Т-клеток в лимфоцитах переферической крови (ЛПК) выявляет надежную системную активацию как CD4 Т-клеток,так и CD8 у мышей, которые получали 10D1 + anti-PD-1, но не те, которые получали анти-PD-l + РР4631 или анти-PD-l + РР4637 (фиг. 44), что также подтверждает идею о том, что мкАТ анти-СТ1_А-4 на основе L3D10 не вызывают системной активации Т-клеток.
15 Пример 14. Характеристики связывания гуманизированных анти-СТ1_А4 антител
Чтобы подтвердить, что гуманизированные антитела сохраняют свои характеристики связывания для CTLA4, мы изучили связывание с иммобилизованной и связанной в планшете CTLA4. Как изображено на фиг. 45, гуманизация не влияет на связывание с иммобилизованным CTLA4, и все 3 гуманизированные антитела демонстрируют
20 сходное связывание с исходным химерным антителом L3D10. Однако гуманизация дополнительно снижает связывание L3D10 с растворимым CTLA4, как показано на фиг. 46. Основываясь на уменьшении связывания с растворимым CTLA4, предполагается, что 3 гуманизированных антитела будут вызывать равное отторжение опухоли с еще меньшими аутоиммунными побочными эффектами, чем
25 L3D10.
Мы продемонстрировали, что химерный L3D10 обладает 1000-кратной более высокой блокирующей активностью, чем 10D1. Интересной предоставляется возможность того, что блокирование взаимодействий B7-CTLA-4 может объяснить отсутствие иоНЯ. Как изображено на фиг. 47 и 48, ни РР4631, ни РР4637 не зо блокируют взаимодействия B7-CTL-A4 in vitro и in vivo. Тот факт, что РР4631 и
PP4637 демонстрируют сниженные иоНЯ, также подтвердили, что блокирование взаимодействия B7-CTLA-4 не отвечает за повышение безопасности L3D10.
Учитывая предлагаемую роль CTLA-4 в защите от аутоиммунных заболеваний, мы предложили уменьшить связывание с растворимым CTLA-4 в качестве основного 5 механизма для улучшения профилей безопасности. Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали рост привеса среди самок мышей, которые получали анти-PD-l + анти-СТ1_А-4 мкАТ в течение перинатального периода в качестве основного показателя для иоНЯ. Как изображено на фиг. 42, значительное снижение привеса наблюдалось у мышей, которые получали как 10D1, так и анти-PD-l, тогда как те, ю которые получили РР4637 + anti-PD-1, имели самый низкий иоНЯ, за которым следуют РР4631, а затем L3D10. Строгая обратная корреляция с уменьшенной привязкой к sCTLA-4 согласуется с центральной гипотезой.
Пример 15. Определение технологических свойств гуманизированных анти-CTLA4 антител
15 Чтобы оценить потенциал развития и производства трех различных
гуманизированных антител, был проведен ряд аналитических методов для характеристики различных антител.
Характеристика
Метод
Производство
Временная экспрессия в клетках НЕК293 с последующей 1-ступенчатой очисткой белка А
Чистота
Эксклюзионная хроматография (ЭХ)
Чистота
Капиллярный электрофорез (в восстановленных и невосстановленных условиях)
Негликозилированный
Капиллярный электрофорез (восстановленные условия)
Деамидирование
Капиллярное изоэлектрическое фокусирование (КИЭФ) и жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ/МС) после ДМ-стресс-терапии
Термостабильность
Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)
Окисление
Пептидное картирование
Специфичность связывания
ЯКХ, 293 пустой ячейки FACS
В качестве исходной оценки были рассчитаны потенциальные значения 20 молекулярной массы и изоэлектрической точки трех ведущих антител-кандидатов на основе аминокислотных последовательностей. Как показано в таблице 7, все
антитела были довольно похожими, хотя антитело имело несколько более низкую ИЭТ.
5 Оценка выхода продукта
Для оценки продуктивности различных антител клетки НЕК293 временно трансфицировали векторами, экспрессирующими тяжелые и легкие цепи различных антител. Затем эти клетки культивировали во встряхиваемых колбах в течение 6 дней с использованием бессывороточной среды. Через 6 дней супернатант собирали ю и антитела очищали с помощью одностадийной хроматографии на белке А. Как следует из таблицы 8 ниже, антитела РР4631 и РР4637 демонстрировали сходные выходы белка, тогда как антитело РР4638 получали с гораздо более низким относительным выходом.
Для оценки чистоты временно экспрессируемых антител образцы анализировали с помощью восстанавливающего и невосстанавливающего электрофореза в полиакриламидном геле. Как изображено на фиг. 50, образцы из всех 3 антител продуцировали гель-полосы, указывающие на молекулу антитела, и что образцы 20 были относительно чистыми после очистки белком А.
Эксклюзионная хроматография
Для дальнейшего изучения чистоты и агрегации различных антител после временной экспрессии, мы проводили эксклюзионную хроматографию очищенных белков. Вкратце, 50 мкг фильтрованного (с использованием фильтра 0,22 мкм) образца использовали для разделения с помощью ЭХ с использованием колонки TOSOH 5 G3000 SWxl 5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали ФСБ рН 7,4. Как показано ниже в таблице 9, все гуманизированные антитела показывают чистоту более 90% после очистки белком А. Антитела РР4631 и РР4637 демонстрировали аналогичные низкие уровни агрегатов с более высокой молекулярной массой (ММ) и деградацию с образцами антител с большей частью белка в основном пике. В ю противоположность этому, антитело РР4638 имело более высокий уровень агрегации и некоторой деградации. Хроматограммы ЭХ изображены на фиг. 51.
Капиллярный электрофорез (КЭ)
15 Капиллярный электрофорез использовали для количественного определения белка в пиковых полосах как в восстановленных, так и в невосстановленных условиях, а также количества негликозилированного белка тяжелой цепи. Вкратце, 100 мкг образца разбавляли в CE-SDS буфере для образца вместе с йодацетамидом (невосстановленные условия) или (3-меркаптоэтанолом (восстановленные условия)
20 вместе с 2 мкл стандартного белка 10 кДа. Образцы затем обрабатывали в течение 10 мин при 70°С. Для разделения РА-800, 50 мкм ВД использовался капилляр с голым плавлением кварца; общая длина 20,2 см; разделительное напряжение 15 кВ; ОП220 для детектирования. Как показано ниже в таблице 10, все три белка продемонстрировали высокий уровень чистоты, соответствующий SDS-PAGE, и все
25 они были высокогликозилированы. Хроматограммы CE-SDS показаны на фиг. 52.
Таблица 10: Капиллярный электрофорез
Антитело
Невосстановленные %
Востановленные %
Негликозилированная
тяжелая цепь
PP4631
97,3
99,5
0,3
PP4637
97,2
99,5
0,4
PP4638
96,9
99,4
0,4
Деамидирование: Капиллярное изоэлектрическое фокусирование (КИЭФ) и жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ/МС)
Уровень деамидирования белка при высоком рН-стрессе определяли путем сравнения антител с и без высокочувствительной стресс-обработке в течение двух разных периодов времени (5 часов и 12,5 часов), а затем анализ КИЭФ и ЖХ/МС.
Профиль заряда изоформ и изоэлектрические точки различных антител определяли с помощью капиллярного изоэлектрического фокусирования (КИЭФ). Вкратце, образцы подвергали замене буфера в 20 мМ Tris рН 8,0, а затем 100 мкг белка образца смешивали с амфотерным электролитом, метилцеллюлозой вместе с маркерами ИЭТ 7,05 и ИЭТ 9,77. Для анализа использовали iCE3(tm)c ВД капилляров 100 мкм; 1,5 кВ плюсЗ кВ; ОП28оДля детектирования. Для деамидирования при стресс-обработке, образцы обрабатывали 500 мМ ЫаНСОз в течение 5 ч или 12,5 ч, затем исследовали с помощью КИЭФ и ЖХ/МС. Результаты анализа показаны ниже в таблице 11, а графики ЖХ/МС изображены на фиг. 53 Все три антитела показывают рассчитанное увеличение количества дезамидированных типов со стрессовыми условиями и соответствующие точки основного пика. Как рассчитано по аминокислотной последовательности, ИЭТ антитела РР4637 немного ниже, чем для РР4631 и РР4638 (таблица 7), а наблюдаемые более высокие ИЭТ по сравнению с рассчитанными ИЭТ предположительно указывает на гликозилирование.
34,4
57,6
2,7
12,5ч
45,9
46,5
2,3
Термический анализ дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)
Чтобы определить термическую стабильность и температуры плавления различных антител, они подвергались термическому анализу дифференциальной сканирующей 5 калориметрии (ДСК). Вкратце, 2 мг/мл образцов в ФСБ, рН 7,4, выводились на
заданный температурный режим от 15°С до 105°С со скоростью 1°С/мин. Изменения Ср с температурой контролировался как для проб, так и для буфера (в качестве фона). Кривые Ср в зависимости от температуры получали с вычитанием фона, а пики показывали Тт (температуру плавления) аналитов. Как показано ниже в ю таблице 12, все три антитела демонстрируют такую же высокую температуру плавления. Кривые ДСК для трех антител изображены на фиг. 54
Окисление: Пептидное картирование
15 Окислительную модификацию гуманизированных антител оценивали путем
пептидного картирования с использованием ЖХ-МС с окислительным стрессом или без него. Образцы денатурировали при 65°С в присутствии 6М GnCI (гуанидин хлорид) и 5 мМ (3-МЕ ((3-меркаптоэтанол), затем ацетилировали иодацетамидом. Обработанные образцы затем расщепляют трипсином (Promega, степень чистоты
20 для секвенирования) при 55°С и расщепленную смесь разделяли методом обратно-фазной ЖХ на колонке С18 (ACQUITY UPLC ВЕН130 С18, 2,1x100 мм, 1,7 мкм) и анализировали с помощью масс-спектрометрии (Waters XEVO-G2S QTOF) с использованием инструментов анализа Masslynx и Biophatmlynx. Для анализа окислительного стресса образцы обрабатывали 0,05% или 0,1% Н2О2 в течение 1
25 часа, затем исследовали с помощью ЖХ-МС. Результаты показаны ниже в таблицах 13-16.
Модификаторы
Номер фрагмента
начало
конец
Модификации сайтов
Последовательность
Окисление(%) РР4637
Окисление 0 ч
0,05% Н202 Окисление 1 ч
0,1% Н202-окисление 1 ч
Окисление М(1)
1:Т001
DIQMTQSPSSLSASVGDR
0,4
0,5
0,5
2:Т036
425
447
436
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
0,7
1,7
3,0
Модификаторы
Номер фрагмента
начало
конец
Модификации сайтов
Последовательность
Окисление(%) РР4638
Окисление 0 ч
0,05% Н202 Окисление 1 ч
0,1% Н202-окисление 1 ч
Окисление М(1)
1:Т001
DIQMTQSPSSLSASVGDR
0,7
0,7
0,6
2:Т036
425
447
436
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
0,9
1,6
2,8
Специфичность связывания
Специфичность связывания различных антител определяли путем оценки способности обнаруживать неспецифическое связывание с двумя различными клеточными линиями, которые не экспрессируют CTLA4 (ЯКХ и НЕК293) 5 относительно 10D1 при двух разных концентрациях. Вкратце, 100 мкг/мл или 20 мкг/мл образцов (или эталонного мкАТ) в ФСБ инкубировали с 3x1 Ое6 клеток/мл (ЯКХ или НЕК293). Меченное ФИТЦ кроличье антитело против IgG человека (Boster, Wuhuan, China), использовали для обнаружения, и связывания мишени мкАТ клетками измеряли FACS. Как показано ниже в таблице 17, антитела РР4631 ю и РР4637 демонстрируют очень низкое связывание и хорошую специфичность, тогда как антитело РР4638 проявляет неспецифическую активность связывания с контрольными клеточными линиями.
Пример 16. Картирование эпитопов L3D10 и гуманизированных антител
Чтобы картировать СТ1_А4-связывающий эпитоп исходного антитела L3D10 и гуманизированных вариантов, РР4631 и РР4637, использовался, как 5 преимущество тот факт, что мышиные и человеческие белки CTLA4 являются
перекрестно-реактивными к В7-1, но не к анти-СТ1_А-4 антителам. Соответственно, мы разработали ряд мутантов человеческого белка CTLA-4FC, в котором кластеры аминокислот из человеческого CTLA-4 белка были заменены мышиным Ctla-4 белком. Поскольку анти-С~П_А-4 антитела, используемые в данном исследовании, ю не связываются с мышиным Ctla-4, связывание анти-человеческий CTLA-4
антител, когда ключевые остатки связывающего эпитопа антитела заменяются мышиными аминокислотами.
ДНК-векторы, кодирующие 11 мутантных белков CTLA-4Fc (М1-М11) (SEQ ID NO: 40-50), были сконструированы на основе последовательности CTLA-4FC человека 15 дикого типа, и белки были получены с помощью временной трансфекции в
НЕК293 в масштабе 0,01 мл с последующей очисткой с помощью одностадийной хроматографии на белке А.
Связывание анти-СТ1_А4 антител с белками CTLA4FC осуществляли с помощью ИФА. Планшеты с внесенными белками CTLA-4FC в концентрации 1 мкг/мл, 20 биотинилированными антителами или слитым белок В7-1 Fc затем
использовались в растворимой фазе в анализе связывания, при этом количество связанного белка измеряли с использованием пероксидазы хрена (HRP) коньюгированной со стрептавидином.
AHTH-CTLA-4 антитела перекрестно не реагируют с мышиными Ctla-4, что, по-25 видимому, отражает различия в аминокислотной последовательности между человеческим и мышиным CTLA-4 во внеклеточном домене. На фиг. 55 изображено выравнивание CTLA-4 внеклеточных доменов человека, макаки и мыши и выделение консервативной последовательности между человеком и макакой, показывает многочисленные различия между последовательностями
мыши и приматов. Из-за сохранения мотива связывания MYPPPY, мышиные и человеческие CTLA4 белки являются перекрестно-реактивными для В7-1 (72).
Чтобы отобразить связывающий эпитоп анти-СТ1_А-4 антител, мы создали ряд СТ1_А-4Рс-мутантных неперекрещивающихся белков, которые включают кластеры 5 мышиных специфических аминокислот в человеческую последовательность
CTLA-4. Аминокислоты, включенные в каждый из 11 мутантов, изображены на фиг. 55, а аминокислотные последовательности ДТ и мутантных белков CTLA-4FC изображены на фиг. 56. Эти белки были получены путем временной трансфекции в клетках НЕК293, и выход показан в таблице 18. Многие из мутаций, по-видимому, ю влияют на экспрессию белка, что видно из их выходов относительно человеческого белка CTLA-4FC ДТ.
Мутант 8
1,61
Мутант 9
0,01
Мутант 10
0,04
Мутант 11
1,70
Способность химерного L3D10 и гуманизированных антител РР4631 и РР4637 связывать иммобилизованные мутантные конструкты CTLA-4FC впоследствии определяли с помощью ИФА, для этого в планшеты вносили мутантные 5 конструкции CTLA-4 и биотинилированные анти-СТ1_А-4 антитела, или В7-1 lg контрольный белок, и связывание измеряли с использованием конъюгированного с HRP стрептавидина. Результаты анализа связывания показаны в таблицах 19-22. Как и ожидалось, все 4 связывающих белка демонстрировали хорошее дозозависимое связывание с белком ДТ CTLA-4FC. Однако мутации, которые
ю были введены в белки М9 и М10, по-видимому, изменяют общую структуру, и эти мутанты не смогли связывать В7-1 Fc. Мутации, введенные в М2 и М4, также частично изменяли конформацию CTLA-4, как показано уменьшенным связыванием по отношению к белку ДТ. В соответствии с этим понятием, все 4 из этих мутантов (М2, М4, М9 и М10) экспрессировались с гораздо меньшим выходом
15 (таблица 18). Напротив, используя связывание с белком ДТ CTLA-4FC и
связывание белков В7-1 Fc в качестве контролей, М11 явно выделяется как белок, который хорошо экспрессируется, эффективно связывает B7-1Fc, но не связывает два гуманизированных анти-CTLA- 4 антитела. Его связывание с исходным L3D10 также уменьшается примерно в 100 раз (таблица 20). Как и ожидалось, мутации,
20 которые влияют на общую структуру, также влияют на связывание с анти-СТ1_А-4 антителами.
Биотин-
Биотин
Биотин-
Биотин
Биотин-
Биотин
Биотин-
L3D10
-L3D10
hB7-1
-hB7-1
HL12
-HL12
HL32
Конц. AT
mCTLA4-
hlg-Fc
mCTLA4
hlg-Fc
-Fc
0.19
0.198
0.202
0.191
0.189
0.184
0.18
0.185
10 нг/мл
0.201
0.201
0.338
0.181
0.179
0.188
0.185
0.179
10 нг/мл
0.18
0.182
0.318
0.164
0.165
0.162
0.17
0.181
100 нг/мл
0.303
0.315
1.635
0.176
0.171
0.177
0.185
0.176
100 нг/мл
0.314
0.326
1.668
0.165
0.162
0.163
0.165
0.171
1000 нг/мл
0.942
1.385
3.569
0.18
0.177
0.182
0.184
0.183
1000 нг/мл
0.94
1.475
3.353
0.179
0.172
0.177
0.176
0.187
mCTLA4
hlgG
mCTLA4
hlgG
mCTLA4
hlgG
mCTLA4
hlgG
5MOTMH-L3D10
Биотин-
¦hB7-1
Биотин-Н1_12
Биотин-Н1_32
Поскольку L3D10 сохранял значительное связывание с М11, мы проверили, специфично ли связывание. Мы вносили в планшеты человеческие CTLA4-FC (hCTLA4Fc), мышиные CTLA4-Fc (mCTLA4-Fc), контрольные lgG1-Fc или всем мутантные hCTLA4-Fc и измерили их связывание с В7-1 Fc вместе с L3D10, РР4631 и РР4637. Основная часть данных представлена в таблице 23. Как изображено на фиг. 57, биотинилированный В7-1 связывает hCTLA-4, mCTLA-4 и М11 одинаково хорошо. Специфика анализа демонстрируется отсутствием связывания с lgG1-Fc. Интересно, в то время как связывание L3D10 с М11 сильнее, чем у lgG1-Fc и mCTLA4-Fc, значительное связывание с lgG1-Fc предполагает, что химерное антитело, связывающееся с М11, может быть неспецифическим. В противоположность этому, ни одно из гуманизированных антител не связывается с контролем М11, mCTLA-4 и контрольным lgG1-Fc. Эти данные показывают, что мутации, введенные в М11, избирательно препятствовали связыванию L3D10, РР4631 и РР4637 с CTLA-4.
Используя известную сложную структуру 133, мы картировали эпитоп CTLA-4 в трехмерной структуре. Как изображено на фиг. 58, эпитоп, распознаваемый этими мкАТ, расположен в области, покрытой В7-1. Таким образом, связывание L3D10, РР4631 и РР4637 с CTLA-4 будет взаимоисключающим по сравнению с В7-1. Слабое блокирование РР4631 и РР4637 обусловлено более низкой авидностью, чем отличающимися связывающими доменами.
Воспользовавшись тем фактом, что мышиные и человеческие CTLA4 являются перекрестно-реактивными для В7-1, но анти-человеческий CTLA-4 не перекрестно реагируют с белком Ctla-4 мыши, мы смогли картировать связывающий эпитоп, полученных антител L3D10 с помощью ИФА. Используя несколько мутантов человеческих белков CTLA-4FC, в которых кластеры аминокислот из человеческого белка CTLA-4 были заменены аминокислотами из мышиного белка Ctla-4, мы четко демонстрируем, что, когда мы заменяем 4 аминокислоты, которые непосредственно соответствуют известному связывающему домену В7-1 CTLA-4, дозозависимое связывание антител в значительной степени прекращается. Тот факт, что связывающий эпитоп, непосредственно примыкает к В7-1-связывающему домену, хорошо коррелирует с установленной способностью антител L3D10 блокировать взаимодействия B7-CTLA-4 как in vitro, так и in vivo. Поскольку растворимый CTLA4 образуется путем слияния С-концевых аминокислот внеклеточного домена IgV с внутриклеточным доменом, можно
предположить, что антитело, которое связывается с полиморфными остатками С-концевых доменов (всего 18 аминокислот из С-конца), более вероятно, потеряет реакционную способность к растворимому CTLA-4, в котором большой внутриклеточный домен слит с С-концом внеклеточного домена.
Чтобы дополнительно исследовать связывающий домен анти-СТ1_А4 антител, были разработаны 6 дополнительных мутантных слитых белков CTLA4-FC, обозначенных М12-М17 (SEQ ID NOS: 51-56) (фиг. 59), которые использовались для сравнения связывания анти-СТ1_А4-антител 10D1 (фиг. 60А), РР4631 (фиг. 60В) и РР4637 (фиг. 60С). Как изображено на фиг. 60, мутации в М11, которые находятся в положениях Y103L104I106, нейтрализуют связывание с 10D1, РР4631 и РР4637, демонстрируя, что сайты связывания для 10D1, РР4631 и РР4637 включают в себя остатки Y103L104I106. Важно отметить, что дополнительная мутация в А29> Y восстановила связывание CTLA-4 с мутациями в Y103|_104I106C РР4631 и РР4637. Эти данные показывают, что положение А29 в CTLA4 важно для связывания антител РР4631 и РР4637, но не 10D1.
Пример 17. AHTM-CTLA-4 МКАТ синергирует с анти-4-1 ВВ в индуцировании отторжения опухоли
Исследования на животных моделях показали, что противоопухолевый ответ, вызванный моноклональным анти-СТ1_А-4 (мкАТ), по меньшей мере частично обусловлен антигенспецифическим Т-клеточным ответом против нормальных "само" дифференцирующихся антигенов (73, 74). Тенденция анти-СТ1_А-4 антител к обострению аутоиммунных заболеваний хорошо подтверждена у мышей (75-78). Это определение было дополнительно подтверждено и оказалось основным ограничением в более поздних испытаниях на людях, в ходе которых у пациентов развивались тяжелые аутоиммунные проявления, требующие прекращения лечения (79). С другой стороны, было показано, что раковые терапевтические анти-4-1 ВВ мкАТ прекращают развитие аутоиммунных заболеваний у мышей, подверженных волчанке (24, 25).
Тот факт, что анти-4-1 ВВ мкАТ могут стимулировать противоопухолевые реакции и уменьшать аутоиммунные проявления, повышает интригующую возможность того, что комбинация этого антитела с анти-СТ1_А-4 мкАТ может привести к отторжению рака без аутоиммунитета. В этом исследовании анти-СТ1_А-4 и анти-4-1 ВВ комбинировали для индукции отторжения крупных установленных опухолей.
Комбинированное действие анти-мышиный CTLA-4 и антимышиный 4-1 ВВ антител при индукции CD8 Т-клеточно-опосредованного отторжения опухоли.
Две модели, одна из которой минимальная болезнь и одна из крупных установленных опухолей, использовались для тестирования противоопухолевого эффекта комбинации анти-мышиный-4-1 ВВ и анти-мышиный-С^А-4 мкАТ. Мышей C57BL/6 стимулировали подкожным введением клеток рака толстой кишки МС38, и в разное время после введения опухолевых клеток, антитела вводили мышам, стимулированным опухолевыми клетками, и размер и частоту опухоли контролировали путем медицинского осмотра.
В модели минимальной болезни мыши получали хомячий IgG плюс крысиный IgG, анти-4-1 ВВ плюс хомячий IgG (только анти-4-1 ВВ), aHTH-CTLA-4 плюс крысиный IgG (только против CTLA-4 группа) или анти-4-1 ВВ в сочетании с aHTH-CTLA-4, начиная с 48 часов после инокуляции опухолевых клеток. Антитела вводили интраперитонально (и/п) на 2, 9 и 16 дни. Лечение либо только 4-1 ВВ или aHTH-CTLA-4 мкАТ приводило к задержке роста опухоли у 1 из 5 мышей в каждой группе, отвергающей опухоли, тогда как 4 из 5 мышей, получавших как aHTH-CTLA-4, так и анти-4-1 ВВ мкАТ были без опухолей в конце эксперимента. На фиг. 61А изображены измерения роста опухоли для каждой мыши. Чтобы сравнить темпы роста между группами, к данным была применена линейная модель со случайными эффектами. Комбинированная терапия значительно уменьшала суточный рост размера опухоли на 4,6 мм2/сут по сравнению только с aHTM-CTLA-4 (р = 0,0094). Кроме того, комбинированная терапия значительно уменьшала рост на 8,4 мм2/сут по сравнению с анти-4-1 ВВ (р = 0,0006). В дополнение к темпу роста, фактические размеры опухоли сравнивались между группами лечения через шесть недель после первоначальной индукции опухоли. Средний размер опухоли в течение шести недель был значительно меньше для мышей, учитывая комбинированную терапию (27,5 мм2) по сравнению с мышами, получавшими либо aHTH-CTLA-4 (137,8 мм2, р = 0,0251), либо анти-4-1 ВВ отдельно (287,6, р = 0,0006). Таким образом, при установлении минимальной опухолевой нагрузки, комбинация анти-4-1 ВВ и aHTH-CTLA-4 мкАТ приводит к значительной задержке роста опухоли по сравнению с анти-4-1 ВВ или aHTH-CTLA-4 отдельно.
Чтобы определить, можно ли противоопухолевый эффект комбинированной терапии мкАТ небольшой опухолевой нагрузки применить как лечение при
большей опухолевой нагрузке, мышей с установленными опухолями лечили антителами. Мышей дикого типа C57BL/6 стимулировали подкожной инокуляцией клеток рака толстой кишки МС38. Допускался рост опухолей в течение 14 дней, и в указанный срок, мышей с установленными опухолями (обычно> 7 мм в диаметре) отбирали и случайным образом разделяли на четыре группы лечения: хомячий IgG плюс крысиный IgG, анти-4-1 ВВ плюс хомячий IgG, анти- CTLA-4 плюс крысиный IgG и анти-4-1 В В мкАТ в комбинации с aHTH-CTLA-4 мкАТ. Антитела вводили и/п на 14, 21 и 28 дни после стимуляции опухоли. Как изображено на фиг. 61В, лечение aHTH-CTLA-4 мкАТ не препятствовало росту опухоли по сравнению с контрольным лечением IgG, хотя отторжение наблюдалось у одной из восьми мышей в группе. Лечение анти-4-1 ВВ мкАТ несколько замедляло рост опухоли, но только одна из восьми мышей отторгала опухоль. В противоположность этому, комбинированная терапия с использованием aHTH-CTLA-4 и анти-4-1 ВВ мкАТ привела к уничтожению опухолей у 7 из 8 мышей и предотвращению дальнейшего роста опухоли у оставшейся мыши. Как и ранее, темпы роста между группами сравнивались путем применения к данным линейной модели со случайными эффектами. Комбинированная терапия значительно уменьшала суточный рост размера опухоли на 10,6 мм2/сут по сравнению с aHTH-CTLA-4 (р <0,0001). Кроме того, комбинированная терапия значительно уменьшала рост на 6,2 мм2 /сут по сравнению с анти-4-1 ВВ (р = 0,0002). В дополнение к темпу роста, фактические размеры опухоли сравнивались между группами лечения через восемь недель после первоначальной стимуляции опухоли. Установленный средний размер опухоли на восьмой неделе был значительно меньше у мышей, получавших комбинированную терапию (-1,7 мм2, 95% ДИ: -10,8, 7,5 мм2) по сравнению с мышами, получавшими либо aHTH-CTLA-4 (404,9 мм2, 95% ДИ: 285,4, 524,4 мм2; р <0,0001) или анти-4-1 ВВ отдельно (228,4 мм2, 95% CI: 200,4, 689,9 мм2; р = 0,0004). Таким образом, комбинация мкАТ также, по-видимому, значительно замедляет рост опухоли по сравнению с aHTH-CTLA-4 или анти-4-1 ВВ отдельно, так же и при больших опухолевых нагрузках.
Известно, что МС38 образует метастазы в печени. 80 Чтобы оценить влияние терапевтических антител на метастазы в печени, все мыши, включенные в эксперименты, были проанализированы гистологически на предмет метастазирования печени. Как показано в таблице 24, приблизительно 60% мышей, получавших контрольный lg, имели микрометастазы в печени. Лечение
или aHTH-CTLA-4 или анти-4-1 ВВ приводили к уменьшению скорости метастазирования, хотя снижение не достигало статистической значимости. Примечательно, что только у 1/22 мышей в группе, получавшей оба антитела, были метастазы в печени. Используя модель логистической регрессии, мы обнаружили, что вероятность метастазирования печени у мышей с учетом только анти-4-1 ВВ была примерно в 4,7 раза выше, чем вероятность для мышей, получавших как анти-4-1 ВВ, так и aHTH-CTLA-4 (95% ДИ: 1,6, 13,7; р = 0,0050). Аналогичным образом, вероятность метастазирования печени была в 3,6 раза выше у мышей, получавших только aHTH-CTLA-4, по сравнению с мышами, получавшими оба лечения (95% ДИ: 1,3, 10,2; р = 0,0174). Таким образом, комбинированная терапия значительно снижает метастазирование печени с помощью МС38 по сравнению с лечением только одним антителом.
* Данные обобщены из 4 независимых экспериментов. После окрашивания Н &Е (гематоксилином-эозином) исследовали по меньшей мере по два среза печени.
Чтобы определить, какая субпопуляция иммунных клеток способствовала противоопухолевому эффекту, вызванному комбинированной терапией мкАТ, основные субпопуляции лимфоцитов были деплетированы моноклональными антителами. Опухолевые клетки МС38 вводили подкожно. Когда опухоли были пальпируемы, мышей-опухоленосителей разделяли на четыре группы. Каждая группа получала серию интраперитонеальных инъекций антител для деплетирования различных субпопуляций иммунных клеток, включая деплетирование CD4 лимфоцитов с анти-Сй4 мкАТ (GK 1.5), деплетирование CD8 Т-клеток с анти-Сй8 мкАТ (2.4.3) и деплетирование ЕКК-клеток с анти-ЫК1,1 мкАТ (РК136), без деплетирования нормальным крысиным IgG. Кроме того, все мыши во всех группах получали aHTH-CTLA-4 плюс анти-4-1 ВВ мкАТ один раз в неделю в течение трех недель. Адекватное деплетирование субпопуляций иммунных клеток оценивали с помощью проточной цитометрии периферической крови, взятой у мышей непосредственно перед завершением эксперимента (данные не показаны). Как и ожидалось, мыши без деплетирования иммунных клеток реагировали на лечение aHTH-CTLA-4 в комбинации с анти-4-1 ВВ мкАТ (фиг. 62). Аналогичным образом, деплетирование ЕКК-клеток и Сй4-Т-клеток не влияло на противоопухолевую активность комбинированной aHTH-CTLA-4 и анти-4-1 ВВ терапии мкАТ. Однако деплетирование С08-Т-клеток, тем не менее, останавливает противоопухолевую активность при комбинированной терапии антителами. На 28-й день, установленный средний размер опухоли для мышей с деплетированием Сй8-Т-клеток (92,3 мм2, 95% ДИ: 64,5, 120,1 мм2) был значительно выше средних размеров опухоли у мышей без деплетирования иммунных клеток (28,7 мм2, 95% ДИ: -17,1, 74,4 мм2), мышей с деплетированными Сй4-Т-клетками (16,7 мм2, 95% ДИ: 1,0, 32,4 мм2) и мышей с истощенными ЕКК-клетками (9,3 мм2, 95% ДИ: -8,3, 26,9 мм2). Эти данные демонстрируют, что противораковое действие aHTH-CTLA-4 и анти-4-1 ВВ-моноклональных антител зависит от CD8 Т-клеток.
Анти-4-1 ВВ-антитело уменьшало ответ антител на ксеногенные aHTH-CTLA-4.
Одним из препятствий для повторной терапии антителами является усиление гуморального иммунного ответа организма-хозяина к терапевтическим антителам.
81 Поскольку 4-1 ВВ, как известно, снижает ответ антител на белки, мы оценивали влияние анти-4-1 ВВ антител на гуморальный иммунный ответ организма-хозяина на aHTH-CTLA-4. Как изображено на фиг. 63, было обнаружено, что у мышей, получавших либо контрольный IgG, либо анти-4-1 ВВ, практически, а то и совсем отсутствовал ответ на анти-антитела. В соответствии со способностью анти-CTLA-4 мкАТ обеспечивать CD4 Т-клеточные ответы82, мыши, получавшие aHTH-CTLA-4 плюс крысиный IgG, развивали значительный гуморальный иммунный ответ организма-хозяина против введенного антитела 4F10 и крысиного IgG (фиг. 63А-В). Этот ответ был снижен более чем в 30 раз, когда анти-4-1 ВВ вводили совместно с aHTH-CTLA-4 мкАТ. Эти данные свидетельствуют о том, что антит-4-1 ВВ могут потенциально увеличить продолжительность других совместно вводимых терапевтических белков за счет снижения гуморального иммунного ответа организма-хозяина на терапевтические средства.
У_мышей с нокин CTLA4 человека, комбинация анти-мышиный 4-1 ВВ и античеловеческий CTLA-4 антител вызывала отторжение опухоли и долговременный иммунитет к раку.
Поскольку анти-4-1 ВВ уменьшает образование антител против aHTH-CTLA-4, интересной проблемой является то, происходит ли усиление отторжения опухоли анти-4-1 ВВ исключительно из-за его эффекта в подавлении гуморальной реакции. Этот человеческий ген CTLA4 в нокин-мышах позволил нам проверить, может ли противоопухолевое действие анти-человеческий CTLA4 антител усиливаться анти-4-1 ВВ антителом. Как изображено на фиг. 64А, в то время как оба античеловеческий CTLA-4 (L3D10) и в отдельности анти-4-1 ВВ (2А), вызывали замедление роста опухоли, комбинация двух антител привела к наиболее значимому отторжению опухоли. Соответственно, в группах, получавших aHTH-CTLA-4, 4-1 ВВ или два антитела, 1/7, 2/7, 5/7, у мышей никогда не развивались опухоли, тогда как все мыши в группе, не получавшие антител, развивали опухоли. Поскольку анти-человеческий CTLA-4 антитело имеет мышиное происхождение, воздействие 4-1ВВ-антитела не может быть связано с его подавлением антител к терапевтическим aHTH-CTLA-4 антителам. Более того, наши данные также показали, что превосходный эффект комбинированной терапии, скорее всего, применим к иммунотерапии на основе анти-человеческий CTLA-4 антител.
Чтобы проверить, были ли мыши, обработанные двумя антителами, не восприимчивы к дополнительной стимуляции опухолевыми клетками, мы заражали их опухолевыми клетками через 110 дней после первой стимуляции опухолевыми клетками. Как изображено на фиг. 64В, все пять мышей, получавших два антитела, отторгали опухолевые клетки в первом цикле, и не развивали опухоль, тогда как у контрольных наивных мышей был прогрессирующий рост опухоли. Таким образом, комбинированная терапия также вызывала долговременный иммунитет к раковым клеткам.
Одним из препятствий для иммунотерапии на основе белка является иммунитет хозяина к терапевтическим белкам. В случае антител, хозяин может монтировать антитела к ксенотипическим, аллотипическим и идиотипическим эпитопам.81 Ксенотипический ответ может быть устранен полной гуманизацией, хотя другие ответы анти-антител требуют особых рассмотрений. Препятствие более очевидно для aHTH-CTLA-4 антитела, поскольку оно является само по себе адъювантом. Предыдущая работа Mittler et al. продемонстрировала значительное подавление зависимого Т-клеточного гуморального иммунного ответа.83 Наши данные показывают, что совместное введение анти-4-1 ВВ антител снижает ответ организма на aHTH-CTLA-4 антитело, что предполагает еще одно преимущество комбинированной терапии с использованием aHTH-CTLA-4 и анти-4-1 ВВ антитела.
В совокупности наши данные показывают, что комбинированная терапия aHTH-CTLA-4 и анти-4-1 ВВ антителами предлагает три основных преимущества: повышенный эффект в отношении иммунитета к раку, взаимное подавление аутоиммунных побочных эффектов и улучшение ответов анти-антител.
Все публикации и патенты, упомянутые в данном изобретении, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно указаны для включения посредством ссылки в полном объеме. Хотя изобретение было описано в связи с его конкретными вариантами реализации, следует понимать, что оно может дополнительно модифицироваться, и данная заявка предназначена для покрытия любых вариантов, применений или адаптаций согласно изобретению, следующих, в общем, принципам изобретения и таким отклонениям от существа изобретения, которые входят в известную или
обшепринятую практику в области техники, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к основным признакам, описанным выше.
Ссылки
1. Townsend ARM, Tothbard J, Gotch FM, Bahadur G, Wraith D, McMichael AJ. The epitope of influenza nucleoprotein recognized by cytotoxic lymphocytes can be defined with short synthetic peptides. Cell. 1986; 44:959-68.
2. Zinkernagel RM, Doherty PC. Restriction of in vitro T cell-mediated cytotoxicity in lymphocytic choriomeningitis within a syngeneic or semiallogeneic system. Nature. 1974; 248:701-2.
3. Lafferty KJ, Prowse SJ, Simeonovic CJ, Warren HS. Immunobiology of tissue transplantation: a return to the passenger leukocyte concept. Annu Rev Immunol. 1983; 1:143-73.
4. Liu Y, Linsley PS. Costimulation of T-cell growth. Curr Opin Immunol. 1992; 4(3):265-70.
5. Schwartz RH. Costimulation of T lymphocytes: the role of CD28, CTLA4, and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy. Cell. 1992;71 (7): 1065-8.
6. Freeman GJ, Freedman AS, Segil JM, Lee G, Whitman JF, Nadler LM. B7, a new member of the lg superfamily with unique expression on activated and neoplastic В cells. J Immunol. 1989; 143(8):2714-22.
7. Freeman GJ, Gribben JG, Boussiotis VA, Ng JW, Restivo VA, Jr., Lombard LA, et al. Cloning of B7-2: a CTLA4 counter-receptor that costimulates human T cell proliferation [see comments]. Science. 1993;262(5135):909-11.
8. Hathcock KS, Laszlo G, Dickler HB, Bradshaw J, Linsley P, Hodes RJ. Identification of an alternative CTLA4 ligand costimulatory for T cell activation [see comments]. Science. 1993;262(5135):905-7.
9. Wu Y, Guo Y, Liu Y. A major costimulatory molecule on antigen-presenting cells, CTLA4 ligand A, is distinct from B7. J Exp Med. 1993; 178(5): 1789-93.
10. Leach DR, Krummel MF, Allison JP. Enhancement of antitumor immunity by CTLA4 blockade [see comments]. Science. 1996;271 (5256): 1734-6.
11. Linsley PS, Brady W, Urnes M, Grosmaire LS, Damle NK, Ledbetter JA. CTLA4 is a second receptor for the В cell activation antigen B7. J Exp Med. 1991;174(3):561-9.
12. Linsley PS, Clark EA, Ledbetter JA. T-cell antigen CD28 mediates adhesion with В cells by interacting with activation antigen B7/BB-1. Proc Natl Acad Sci USA. 1990;87(13):5031-5.
13. Hodi FS, Mihm MC, Soiffer RJ, Haluska FG, Butler M, Seiden MV, et al. Biologic activity of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 antibody blockade in previously vaccinated metastatic melanoma and ovarian carcinoma patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100(8):4712-7. PubMed PMID: 12682289.
14. Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, Weber RW, Sosman JA, Haanen JB, et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 2010;363(8):711-23. Epub 2010/06/08. doi: 10.1056/NEJMoa1003466. PubMed PMID: 20525992; PubMed Central PMCID: PMC3549297.
15. Larkin J, Chiarion-Sileni V, Gonzalez R, Grob JJ, Cowey CL, Lao CD, et al. Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanoma. N Engl J Med. 2015;373(1):23-34. Epub 2015/06/02. doi: 10.1056/NEJMoa1504030. PubMed PMID: 26027431.
16. Ribas A, Hodi FS, Callahan M, Konto C, Wolchok J. Hepatotoxicity with combination of vemurafenib and ipilimumab. N Engl J Med. 2013;368(14): 1365-6. Epub 2013/04/05. doi: 10.1056/NEJMc1302338. PubMed PMID: 23550685.
17. Delyon J, Mateus C, Lambert T. Hemophilia A induced by ipilimumab. N Engl J Med. 2011;365(18): 1747-8. Epub 2011/11/04. doi: 10.1056/NEJMc1110923. PubMed PMID: 22047582.
18. Fadel F, El Karoui K, Knebelmann B. Anti-CTLA4 antibody-induced lupus nephritis. N Engl J Med. 2009;361(2):211-2. Epub 2009/07/10. doi: 10.1056/NEJMc0904283. PubMed PMID: 19587352.
19. Kocak E, Lute K, Chang X, May KF, Jr., Exten KR, Zhang H, et al. Combination therapy with anti-CTL antigen-4 and anti-4-1 BB antibodies enhances cancer immunity and reduces autoimmunity. Cancer Res. 2006;66(14):7276-84. Epub 2006/07/20. doi: 10,1158/0008-5472.CAN-05-2128. PubMed PMID: 16849577.
20. Lute KD, May KF, Lu P, Zhang H, Kocak E, Mosinger B, et al. Human CTLA4-knock-in mice unravel the quantitative link between tumor immunity and autoimmunity induced by anti-CTLA4 antibodies. Blood. 2005. PubMed PMID: 16037385.
21. May KF, Roychowdhury S, Bhatt D, Kocak E, Bai XF, Liu JQ, et al. Anti-human CTLA4 monoclonal antibody promotes T cell expansion and immunity in a hu-PBL-SCID model: a new method for preclinical screening of costimulatory monoclonal antibodies. Blood. 2005;105:1114-20. PubMed PMID: 15486062.
22. Shields RL, Namenuk AK, Hong K, Meng YG, Rae J, Briggs J, et al. High resolution mapping of the binding site on human lgG1 for Fc gamma Rl, Fc gamma Rll, Fc gamma Rill, and FcRn and design of lgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem. 2001 ;276(9):6591-604. Epub 2000/11/30. doi: 10.1074/jbc.M009483200. PubMed PMID: 11096108.
23. Dall'Acqua WF, Woods RM, Ward ES, Palaszynski SR, Patel NK, Brewah YA, et al. Increasing the affinity of a human lgG1 for the neonatal Fc receptor: biological consequences. J Immunol. 2002;169(9):5171-80. Epub 2002/10/23. PubMed PMID: 12391234.
24. Gao SH, Huang K, Tu H, Adler AS. Monoclonal antibody humanness score and its applications. BMC biotechnology. 2013; 13:55. Epub 2013/07/06. doi: 10,1186/14726750-13-55. PubMed PMID: 23826749; PubMed Central PMCID: PMC3729710.
25. Sun Y, Chen HM, Subudhi SK, et al. Costimulatory molecule-targeted antibody therapy of a spontaneous autoimmune disease. Nat Med 2002.8: 1405-13
26. Foell J, Strahotin S, O'Neil SP, et al. CD137 costimulatory T cell receptor engagement reverses acute disease in lupus-prone NZB x NZW F1 mice. J Clin Invest 2003.111: 1505-18
27. Melero I, Shuford WW, Newby SA, et al. Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors. Nat Med 1997.3: 682-5
28. May KF, Jr., Chen L, Zheng P and Liu Y Anti-4-1 BB monoclonal antibody enhances rejection of large tumor burden by promoting survival but not clonal expansion of tumor-specific CD8+ T cells. Cancer Res 2002,62: 3459-65
29. Ye Z, Hellstrom I, Hayden-Ledbetter M, et al. Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BB. Nat Med 2002.8: 343-8
30. Walunas, T.L., et al., CTLA4 can function as a negative regulator of T cell activation. Immunity, 1994. 1(5): p. 405-13.
31. Krummel, M.F. and J.P. Allison, CD28 and CTLA4 have opposing effects on the response of T cells to stimulation. J Exp Med, 1995. 182(2): p. 459-65.
32. Anderson, D.E., et al., Paradoxical inhibition of T-cell function in response to CTLA4 blockade; heterogeneity within the human T-cell population. Nat Med, 2000. 6(2): p. 211-4.
33. Coyle, A. J. et al. (2001) "The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function," Nature Immunol. 2(3):203-209.
34. Sharpe, A. H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126.
35. Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223,1-223,7.
36. Flajnik, M. F. et al. (2012) "Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC," Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2.
37. Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298.
38. Flies, D. B. et al. (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity," J. Immunother. 30(3):251-260
39. Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death," EMBO J. 11:38873895.
40. Agata, Y. et al. (1996) "Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And В Lymphocytes," Int. Immunol. 8(5):765-772.
41. Yamazaki, Т. et al. (2002) "Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T Cells And APC," J. Immunol. 169:5538-5545.
42. Nishimura, H. et al. (2000) "Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1 -Deficient Mice," J. Exp. Med. 191:891 -898.
43. Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298.
44. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).
45 Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917.
46. Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498.
47. Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7:805.
48. Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969
49. Keler, T. et al. Activity and safety of CTLA4 blockade combined with vaccines in cynomolgus macaques. J. Immunol. 171, 6251-6259 (2003).
50. Wing, K. et al. CTLA4 control over Foxp3+ regulatory T cell function. Science 322, 271-275, doi: 10.1126/science.1160062 (2008).
51. Schwartz, R. S. The new immunology-the end of immunosuppressive drug therapy? N. Engl. J. Med. 340, 1754-1756, doi: 10.1056/NEJM199906033402209 (1999).
52. Simpson, T. R. et al. Fc-dependent depletion of tumor-infiltrating regulatory T cells co-defines the efficacy of anti-CTLA4 therapy against melanoma. J. Exp. Med. 210, 1695-1710, doi: 10.1084/jem.20130579 (2013).
53. Selby, M. J. et al. Anti-CTLA-4 antibodies of lgG2a isotype enhance antitumor activity through reduction of intratumoral regulatory T cells. Cancer immunology research 1, 32-42, doi: 10.1158/2326-6066.CIR-13-0013 (2013).
54. Maker, A. V., Attia, P. & Rosenberg, S. A. Analysis of the cellular mechanism of antitumor responses and autoimmunity in patients treated with CTLA4 blockade. J. Immunol. 175, 7746-7754 (2005).
46.
55. Korman, A. J., Peggs, K. S. & Allison, J. P. Checkpoint blockade in cancer immunotherapy. Adv. Immunol. 90, 297-339, doi:10.1016/S0065-2776(06)90008-X (2006).
56. Ribas, A. et al. Tremelimumab (CP-675,206), a cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 blocking monoclonal antibody in clinical development for patients with cancer. Oncologist 12, 873-883, doi: 10.1634/theoncologist. 12-7-873 (2007).
57. Ribas, A. et al. Phase III randomized clinical trial comparing tremelimumab with standard-of-care chemotherapy in patients with advanced melanoma. J. Clin. Oncol. 31, 616-622, doi:10.1200/JCO.2012.44.6112 (2013).
58. Lee, К. M. et al. Molecular basis of T cell inactivation by CTLA4 [In Process Citation]. Science 282, 2263-2266 (1998).
59. Marengere, L. E. et al. Regulation of T cell receptor signaling by tyrosine phosphatase SYP association with CTLA4 [published errata appear in Science 1996 Dec 6;274(5293)1597 and 1997 Apr 4;276(5309):21 ]. Science 272, 1170-1173 (1996).
60. Liu, Y. Is CTLA4 a negative regulator for T-cell activation? Immunol. Today 18, 569-572 (1997).
61. Tivol, E. A. et al. Loss of CTLA4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA4. Immunity 3, 541-547 (1995).
62. Waterhouse, P. et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in CTLA4 [see comments]. Science 270, 985-988 (1995).
63. Bachmann, M. F., Kohler, G., Ecabert, В., Мак, Т. W. & Kopf, M. Cutting edge: lymphoproliferative disease in the absence of CTLA4 is not T cell autonomous. J. Immunol. 163, 1128-1131 (1999).
64. Bachmann, M. F. et al. Normal pathogen-specific immune responses mounted by CTLA4-deficient T cells: a paradigm reconsidered. Eur. J. Immunol. 31, 450-458 (2001).
65. Nguyen, Т. V., Ke, Y., Zhang, E. E. & Feng, G. S. Conditional deletion of Shp2 tyrosine phosphatase in thymocytes suppresses both pre-TCR and TCR signals. J. Immunol. 177, 5990-5996 (2006).
46.
66. Qureshi, О. S. et al. Trans-endocytosis of CD80 and CD86: a molecular basis for the cell-extrinsic function of CTLA-4. Science 332, 600-603,
doi: 10.1126/science. 1202947 (2011).
67. Ueda, H. et al. Association of the T-cell regulatory gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease. Nature 423, 506-511 (2003).
68. Magistrelli, G. et al. A soluble form of CTLA-4 generated by alternative splicing is expressed by nonstimulated human T cells. Eur. J. Immunol. 29, 3596-3602,
doi: 10.1002/(SICI)1521 -4141 (199911 )29:11 <3596: :AID-IMMU3596 >3.0.CO;2-Y(1999).
69. Kremer, J. M. et al. Treatment of rheumatoid arthritis by selective inhibition of T-cell activation with fusion protein CTLA4lg. N. Engl. J. Med. 349, 1907-1915, doi:10.1056/NEJMoa035075 (2003).
70. Abrams, J. R. et al. CTLA4lg-mediated blockade of T-cell costimulation in patients with psoriasis vulgaris. J. Clin. Invest. 103, 1243-1252, doi: 10.1172/JCI5857 (1999).
71. Gerold, K. D. et al. The soluble CTLA-4 splice variant protects from type 1 diabetes and potentiates regulatory T-cell function. Diabetes 60, 1955-1963, doi: 10.2337/db11-0130 (2011).
72. Peach RJ, Bajorath J, Brady W, Leytze G, Greene J, Naemura J, et al. Complementarity determining region 1 (CDR1)- and CDR3-analogous regions in CTLA-4 and CD28 determine the binding to B7-1. J Exp Med. 1994;180(6):2049-58.
73. van Elsas, A., Hurwitz, A. A. & Allison, J. P. Combination immunotherapy of B16 melanoma using anti-cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) and granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing vaccines induces rejection of subcutaneous and metastatic tumors accompanied by autoimmune depigmentation. J. Exp. Med. 190, 355-366 (1999).
74. van Elsas, A. et al. Elucidating the autoimmune and antitumor effector mechanisms of a treatment based on cytotoxic T lymphocyte antigen-4 blockade in combination with a B16 melanoma vaccine: comparison of prophylaxis and therapy. J. Exp. Med. 194, 481-489. (2001).
69.
75. Karandikar, N. J., Vanderlugt, C. L, Walunas, T. L, Miller, S. D. & Bluestone, J. A. CTLA-4: a negative regulator of autoimmune disease. J. Exp. Med. 184, 783-788 (1996).
76. Luhder, F., Chambers, C, Allison, J. P., Benoist, C. & Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 12204-12209 (2000).
77. Hurwitz, A. A., Sullivan, T. J., Sobel, R. A. & Allison, J. P. Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) limits the expansion of encephalitogenic T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)-resistant BALB/cmice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3013-3017 (2002).
78. Piganelli, J. D., Poulin, M., Martin, Т., Allison, J. P. & Haskins, K. Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CD152) regulates self-reactive T cells in BALB/c but not in the autoimmune NOD mouse. J. Autoimmun. 14, 123-131 (2000).
79. Phan, G. Q. et al. Cancer regression and autoimmunity induced by cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 blockade in patients with metastatic melanoma. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100, 8372-8377 (2003).
80. Eisenthal, A. et al. Antitumor effects of recombinant interleukin-6 expressed in eukaryotic cells. Cancer Immunol. Immunother. 36, 101-107(1993).
81. Schroff, R. W., Foon, K. A., Beatty, S. M., Oldham, R. K. & Morgan, A. C, Jr. Human anti-murine immunoglobulin responses in patients receiving monoclonal antibody therapy. Cancer Res. 45, 879-885 (1985).
82. Kearney, E. R. et al. Antigen-dependent clonal expansion of a trace population of antigen- specific CD4+ T cells in vivo is dependent on CD28 costimulation and inhibited by CTLA-4. J. Immunol. 155, 1032-1036 (1995).
83. Mittler, R. S., Bailey, T. S., Klussman, K., Trailsmith, M. D. & Hoffmann, M. K. Anti-4-1 BB monoclonal antibodies abrogate T cell-dependent humoral immune responses in vivo through the induction of helper T cell anergy. J. Exp. Med. 190, 15351540 (1999).
69.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ОНКОИММЬЮН, ИНК. ЛЮ Ян ЧЖЭН Пань ДЕВЕНПОРТ Мартин
<120> Химерные и гуманизированные анти-человеческий CTLA4 моноклональные антитела и их использование
<130> 060275.0600.03PC00
<150> 62/267,735
<151> 2015-12-15
<150> 62/359,036
<151> 2016-07-06
<150> 62/309,169
<151> 2016-03-16 <160> 73
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1 <211> 107
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Phe Cys Gln His Leu Trp Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 2
<211> 125
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 2
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Tyr Asp Gly Asn Thr Asn Phe His Ser Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Glu Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Thr Glu Gly His Tyr Tyr Gly Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 329
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 4 <211> 329
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сконструированный фрагмент
<400> 4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 5 <211> 1437 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Оптимизированный фрагмент
<400> 5
atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt tcctgagcct ggccttcgag 60
ctgagctacg gccaggtgca gctgaaagag tctggccctg gcctggtggc cccttcccag 120
tccctgtcta tcacctgtac cgtgtccggc ttctccctga cctcctacgg cctgtcttgg 180
gtgcgacagc ctcctggcaa gggcctggaa tggctgggag tgatttggta cgacggcaac 240
accaacttcc actccgccct gatctcccgg ctgaccatct ccaaggacaa ctccaagtcc 300
caggtgttcc tggaactgaa ctccctgcag accgacgaca ccgccaccta ctactgcgct 360
aagaccgagg gccactacta cggctccaac tacggctact acgccctgga ctattggggc 420
cagggcacct ccgtgaccgt gtcctctgct agcaccaagg gccccagcgt gttccctctg 480
gcccccagca gcaagagcac cagcggcgga accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac 540
tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg aacagcggcg ctctgaccag cggagtgcac 600
accttccctg ccgtgctgca gagcagcggc ctgtactccc tgagcagcgt ggtgaccgtg 660
cccagcagca gcctgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac 720
accaaggtgg acaagaaggt ggagcctaag agctgcgaca agacccacac ctgccctccc 780
tgccccgccc ccgagctgct gggcggaccc agcgtgttcc tgttccctcc caagcccaag 840
gacaccctgt acatcacccg cgaacccgag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac 900
gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag 960
accaagcctc gggaggagca gtacaacgcc acctaccgcg tggtgagcgt gctgaccgtg 1020
ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg 1080
cccgctccca tcgcagccac catcagcaag gccaagggcc agccccggga gcctcaggtg 1140
tacaccctgc cccccagccg cgacgagctg accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg 1200
gtgaagggct tctacccctc cgacatcgcc gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag 1260
aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc 1320
aagctgaccg tggacaagtc ccggtggcag cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg 1380
cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctga gcctgagccc cggatag 1437
<210> 6
<211> 478
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Оптимизированный фрагмент
<400> 6
Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly
20 25 30
Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val
35 40 45
Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Pro
50 55 60
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Tyr Asp Gly Asn
65 70 75 80
Thr Asn Phe His Ser Ala Leu Ile Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp
85 90 95
Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Glu Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp
100 105 110
Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Glu Gly His Tyr Tyr Gly
115 120 125
Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
145 150 155 160
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
165 170 175
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
180 185 190
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
195 200 205
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
210 215 220
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
225 230 235 240
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475
<210> 7 <211> 705
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Оптимизированный фрагмент
<400> 7
atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct gggtgcccgg ctccaccgga 60
gacatccaga tgacccagtc ccccgcctcc ctgtctgtgt ctgtgggcga gacagtgacc 120
atcacctgtc gggcctccga gaacatctac tccaacctgg cctggtatca gcagaagcag 180
ggcaagtccc ctcagctgct ggtgtacgcc gccaccaatc tggctgatgg cgtgccctcc 240
agattctccg gctctggctc tggcacccag tactccctga agatcaactc cctgcagtcc 300
gaggacttcg gcacctactt ttgccagcac ctgtggggca ccccctacac ctttggcggc 360
ggaacaaagc tggaaatcaa gcggaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccctccc 420
agcgacgagc agctgaagtc tggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 480
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 540
gagagcgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccaggga 660
ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gctaa 705
<210> 8
<211> 234
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> Химерная
<400> 8
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Val Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn
85 90 95
Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Phe Cys Gln His Leu Trp
100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230
<210> 9
<211> 478
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированный фрагмент антитела
<400> 9
Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
20 25 30
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
35 40 45
Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Leu Ser Trp Ile Arg Gln Pro
50 55 60
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Tyr Asp Gly Asn
65 70 75 80
Thr Asn Phe His Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp
85 90 95
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Glu Gly His Tyr Tyr Gly
115 120 125
Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
145 150 155 160
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
165 170 175
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
180 185 190
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
195 200 205
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
210 215 220
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
225 230 235 240
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475
<210> 10 <211> 1440 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированный фрагмент антитела
<400> 10
atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt tcctgagcct ggccttcgag 60
ctgagctacg gccaggtgca gctgcaggaa tctggccctg gcctcgtgaa gccctccgag 120
acactgtctc tgacctgcac cgtgtccggc ttctccctga cctcctacgg cctgtcttgg 180
atcagacagc cccctggcaa gggcctggaa tggatcggct acatttggta cgacggcaac 240
accaacttcc accccagcct gaagtccaga gtgaccatct ccaaggacac ctccaagaac 300
cagttctctc tgaagctgtc ctccgtgacc gccgctgaca ccgccgtgta ctactgtgct 360
aagaccgagg gccactacta cggctccaac tacggctact acgccctgga ctattggggc 420
cagggcacct ctgtgaccgt gtcctctgct agcaccaagg gccccagcgt gttccctctg 480
gcccccagca gcaagagcac cagcggcgga accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac 540
tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg aacagcggcg ctctgaccag cggagtgcac 600
accttccctg ccgtgctgca gagcagcggc ctgtactccc tgagcagcgt ggtgaccgtg 660
cccagcagca gcctgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac 720
accaaggtgg acaagaaggt ggagcctaag agctgcgaca agacccacac ctgccctccc 780
tgccccgccc ccgagctgct gggcggaccc agcgtgttcc tgttccctcc caagcccaag 840
gacaccctgt acatcacccg cgaacccgag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac 900
gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag 960
accaagcctc gggaggagca gtacaacgcc acctaccgcg tggtgagcgt gctgaccgtg 1020
ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg 1080
cccgctccca tcgcagccac catcagcaag gccaagggcc agccccggga gcctcaggtg 1140
tacaccctgc cccccagccg cgacgagctg accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg 1200
gtgaagggct tctacccctc cgacatcgcc gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag 1260
aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc 1320
aagctgaccg tggacaagtc ccggtggcag cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg 1380
cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctga gcctgagccc cggatagtaa 1440
<210> 11 <211> 478
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированный фрагмент антитела
<400> 11
Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
20 25 30
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
35 40 45
Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Leu Ser Trp Ile Arg Gln Pro
50 55 60
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Tyr Asp Gly Asn
65 70 75 80
Thr Asn Phe His Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp
85 90 95
Thr Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Glu Gly His Tyr Tyr Gly
115 120 125
Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
145 150 155 160
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
165 170 175
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
180 185 190
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
195 200 205
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
210 215 220
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
225 230 235 240
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475
<210> 12 <211> 1440
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Гуманизированное антитело <400> 12
atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt ctgagctacg gccaggtgca gctgcaggaa tctggccctg acactgtctc tgacctgcac cgtgtccggc ttctccctga atcagacagc cccctggcaa gggcctggaa tggatcggct accaacttcc actcctccct gaagtccaga gtgaccatct caggtgtctc tgaagctgtc ctccgtgacc gccgctgaca aagaccgagg gccactacta cggctccaac tacggctact cagggcaccc tcgtgaccgt gtcctctgct agcaccaagg gcccccagca gcaagagcac cagcggcgga accgccgccc tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg aacagcggcg accttccctg ccgtgctgca gagcagcggc ctgtactccc cccagcagca gcctgggcac ccagacctac atctgcaacg accaaggtgg acaagaaggt ggagcctaag agctgcgaca tgccccgccc ccgagctgct gggcggaccc agcgtgttcc gacaccctgt acatcacccg cgaacccgag gtgacctgcg gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac gtggacggcg accaagcctc gggaggagca gtacaacgcc acctaccgcg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca cccgctccca tcgcagccac catcagcaag gccaagggcc tacaccctgc cccccagccg cgacgagctg accaagaacc gtgaagggct tctacccctc cgacatcgcc gtggagtggg aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg gacagcgacg aagctgaccg tggacaagtc ccggtggcag cagggcaacg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctga
<210> 13
<211> 478 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированное антитело tcctgagcct ggccttcgag 60
gcctcgtgaa gccctccgag 120
cctcctacgg cctgtcttgg 180
acatttggta cgacggcaac 240
ccaaggacac ctccaagtcc 300
ccgccgtgta ctactgtgct 360
acgccctgga ctattggggc 420
gccccagcgt gttccctctg 480
tgggctgcct ggtgaaggac 540
ctctgaccag cggagtgcac 600
tgagcagcgt ggtgaccgtg 660
tgaaccacaa gccctccaac 720
agacccacac ctgccctccc 780
tgttccctcc caagcccaag 840
tggtggtgga cgtgagccac 900
tggaggtgca caacgccaag 9 60
tggtgagcgt gctgaccgtg 1020
aggtgagcaa caaggccctg 1080
agccccggga gcctcaggtg 1140
aggtgagcct gacctgcctg 1200
agagcaacgg ccagcctgag 1260
gcagcttctt cctgtacagc 1320
tgttcagctg cagcgtgatg 1380
gcctgagccc cggatagtaa 1440
<400> 13
Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
20 25 30
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
35 40 45
Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Leu Ser Trp Ile Arg Gln Pro
50 55 60
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Tyr Asp Gly Asn
65 70 75 80
Thr Asn Phe His Ser Pro Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
85 90 95
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Glu Gly His Tyr Tyr Gly
115 120 125
Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
145 150 155 160
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
165 170 175
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
180 185 190
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
195 200 205
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
210 215 220
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
225 230 235 240
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475
<210> 14
<211> 1440
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> Гуманизированное антитело
<400> 14
atggacccca agggcagcct gagctggaga atcctgctgt tcctgagcct ggccttcgag 60
ctgagctacg gccaggtgca gctgcaggaa tctggccctg gcctcgtgaa gccctccgag 120
acactgtctc tgacctgcac cgtgtccggc ttctccctga cctcctacgg cctgtcttgg 180
atcagacagc cccctggcaa gggcctggaa tggatcggct acatttggta cgacggcaac 240
accaacttcc actccccact gaagtccaga gtgaccatct ccgtggacac ctccaagaac 300
cagttctctc tgaagctgtc ctccgtgacc gccgctgaca ccgccgtgta ctactgtgct 360
aagaccgagg gccactacta cggctccaac tacggctact acgccctgga ctattggggc 420
cagggcaccc tcgtgaccgt gtcctctgct agcaccaagg gccccagcgt gttccctctg 480
gcccccagca gcaagagcac cagcggcgga accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac 540
tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg aacagcggcg ctctgaccag cggagtgcac 600
accttccctg ccgtgctgca gagcagcggc ctgtactccc tgagcagcgt ggtgaccgtg 660
cccagcagca gcctgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac 720
accaaggtgg acaagaaggt ggagcctaag agctgcgaca agacccacac ctgccctccc 780
tgccccgccc ccgagctgct gggcggaccc agcgtgttcc tgttccctcc caagcccaag 840
gacaccctgt acatcacccg cgaacccgag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac 900
gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag 960
accaagcctc gggaggagca gtacaacgcc acctaccgcg tggtgagcgt gctgaccgtg 1020
ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg 1080
cccgctccca tcgcagccac catcagcaag gccaagggcc agccccggga gcctcaggtg 1140
tacaccctgc cccccagccg cgacgagctg accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg 1200
gtgaagggct tctacccctc cgacatcgcc gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag 1260
aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc 1320
aagctgaccg tggacaagtc ccggtggcag cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg 1380
cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctga gcctgagccc cggatagtaa 1440
<210> 15 <211> 234
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированное антитело
<400> 15
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Leu Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Leu Trp
100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230
<210> 16
<211> 705
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> Гуманизированное антитело
<400> 16
atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct gggtgcccgg ctccaccgga 60
gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 120
atcacctgtc gggcctccga gaacatctac tccaacctgg cctggtatca gcagaagccc 180
ggcaaggccc ctaagctgct gctgtacgcc gccaccaatc tgcagtctgg cgtgccctcc 240
agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga ccatcagctc cctgcagccc 300
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcat ctgtggggca ccccctacac ctttggcgga 360
ggcaccaagc tggaaatcaa gcggaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccctccc 420
agcgacgagc agctgaagtc tggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 480
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 540
gagagcgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccaggga 660
ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gctaa 705
<210> 17
<211> 234
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированное антитело
<400> 17
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Leu Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe 100 105
Cys Gln His Leu Trp
110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230
<210> 18
<211> 705
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированное антитело
<400> 18
atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct gggtgcccgg ctccaccgga 60
gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 120
atcacctgtc gggcctccga gaacatctac tccaacctgg cctggtatca gcagaagcag 180
ggcaaggccc ctaagctgct gctgtacgcc gccaccaatc tgcaggatgg cgtgccctcc 240
agattctccg gctctggctc tggcaccgac tacaccctga ccatcagctc cctgcagccc 300
gaggacttcg ccacctactt ttgccagcat ctgtggggca ccccctacac ctttggccag 360
ggcaccaagc tggaaatcaa gcggaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccctccc 420
agcgacgagc agctgaagtc tggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 480
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 540
gagagcgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccaggga 660
ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gctaa
705
<210> 19
<211> 234
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированное антитело
<400> 19
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Leu Trp
100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230
<210> 20 <211> 705
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированное антитело
<400> 20
atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctct gggtgcccgg ctccaccgga 60
gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 120
atcacctgtc gggcctccga gaacatctac tccaacctgg cctggtatca gcagaagccc 180
ggcaaggccc ctaagctgct gatctacgcc gccaccagtc tgcagtctgg cgtgccctcc 240
agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga ccatcagctc cctgcagccc 300
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcat ctgtggggca ccccctacac ctttggcgga 360
ggcaccaagg tggaaatcaa gcggaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccctccc 420
agcgacgagc agctgaagtc tggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 480
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 540
gagagcgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccaggga 660
ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gctaa 705
<210> 21
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный фрагмент
<400> 21
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> Пептидный фрагмент
<400> 22
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5
<210> 23
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный фрагмент
<400> 23
Gln His Leu Trp Gly Thr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 24
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный фрагмент
<400> 24
Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Leu Ser
1 5 10
<210> <211> <212> <213>
25 17
Белок
Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный фрагмент
<400> 25
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Asn Thr Asn Phe His Ser Ala Leu Ile Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 26
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный фрагмент
<400>
Thr Glu Gly His Tyr Tyr Gly Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 27
<211> 149
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированное антитело
<400> 27
Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
20 25 30
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
35 40 45
Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Leu Ser Trp Ile Arg Gln Pro
50 55 60
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Tyr Asp Gly Asn
65 70 75 80
Thr Asn Phe His Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp
85 90 95
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Glu Gly His Tyr Tyr Gly
115 120 125
Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser 145
<210> 28
<211> 149
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> Гуманизированное антитело
<400> 28
Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
20 25 30
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
35 40 45
Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Leu Ser Trp Ile Arg Gln Pro
50 55 60
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Tyr Asp Gly Asn
65 70 75 80
Thr Asn Phe His Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp
85 90 95
Thr Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Glu Gly His Tyr Tyr Gly
115 120 125
Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser 145
<210> 29
<211> 149
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированное антитело
<400> 29
Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg Ile Leu Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly
20 25 30
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
35 40 45
Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Leu Ser Trp Ile Arg Gln Pro
50 55 60
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Tyr Asp Gly Asn
65 70 75 80
Thr Asn Phe His Ser Pro Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp
85 90 95
Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Glu Gly His Tyr Tyr Gly
115 120 125
Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser 145
<210> 30
<211> 127
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированное антитело
<400> 30
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Leu Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Leu Trp
100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 31
<211> 127
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированное антитело
<400> 31
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Leu Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Leu Trp
100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 32
<211> 127
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированное антитело
<400> 32
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Leu Trp
100 105 110
Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 33
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный фрагмент
<400> 33
Tyr Ile Trp Tyr Asp Gly Asn Thr Asn Phe His Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
Arg
<210> <211> <212> <213>
34 17
Белок
Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный фрагмент
<400> 34
Tyr Ile Trp Tyr Asp Gly Asn Thr Asn Phe His Ser Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 35
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный фрагмент
<400> 35
Tyr Ile Trp Tyr Asp Gly Asn Thr Asn Phe His Ser Pro Leu Lys Ser
1 5 10 15
Arg
<210> 36
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный фрагмент
<400> 36
Ala Ala Thr Asn Leu Gln Ser 1 5
<210> 37
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептид
<400> 37
Ala Ala Thr Asn Leu Gln Asp 1 5
<210> 38
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептид
<400> 38
Ala Ala Thr Ser Leu Gln Ser 1 5
<210> 39
<211> 358
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 39
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp
50 55 60
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu
85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln
100 105 110
Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 40
<211> 357
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 40
Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115 120 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 41
<211> 358
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 41
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser His Gly
1 5 10 15
Leu Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp
50 55 60
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu
85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln
100 105 110
Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 42
<211> 359
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 42
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Ser His Asn Thr Asp
20 25 30
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
35 40 45
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
85 90 95
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
100 105 110
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu
115 120 125
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro
130 135 140
Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
165 170 175
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
180 185 190
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
195 200 205
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
210 215 220
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
225 230 235 240
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
245 250 255
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
260 265 270
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
275 280 285
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
290 295 300
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
305 310 315 320
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
325 330 335
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 43
<211> 358
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 43
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Thr Asn Asp Gln Met Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp
50 55 60
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu
85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln
100 105 110
Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 44
<211> 358
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> Слитый белок
<400> 44
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly Phe Leu Asp Asp
50 55 60
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu
85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln
100 105 110
Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 45
<211> 358
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 45
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Thr Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp
50 55 60
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu
85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln
100 105 110
Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 46
<211> 358
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 46
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Tyr
50 55 60
Pro Phe Cys Ser Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu
85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln
100 105 110
Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 47
<211> 358
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 47
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp
50 55 60
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu
85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln
100 105 110
Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 48
<211> 359
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 48
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp
50 55 60
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Ala Met Val Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
85 90 95
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
100 105 110
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu
115 120 125
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro
130 135 140
Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
165 170 175
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
180 185 190
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
195 200 205
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
210 215 220
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
225 230 235 240
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
245 250 255
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
260 265 270
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
275 280 285
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
290 295 300
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
305 310 315 320
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
325 330 335
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 49 <211> 359
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 49
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp
50 55 60
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Ala Met Met Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Lys Val
85 90 95
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
100 105 110
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu
115 120 125
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro
130 135 140
Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
165 170 175
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
180 185 190
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
195 200 205
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
210 215 220
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
225 230 235 240
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
245 250 255
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
260 265 270
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
275 280 285
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
290 295 300
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
305 310 315 320
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
325 330 335
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 50
<211> 358
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 50
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
20 25 30
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
35 40 45
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp
50 55 60
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu
85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly Asn Gly Thr Gln
100 105 110
Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 51
<211> 357
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 51
Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115 120 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 52
<211> 357
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 52
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115 120 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 53
<211> 357
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 53
Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115 120 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 54
<211> 357
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400>
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115 120 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 55
<211> 357
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 55
Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115 120 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 56
<211> 357
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок
<400> 56
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Glu Gly Met Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115 120 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 57
<211> 125
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 57
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Tyr Asp Gly Asn Thr Asn Phe His Ser Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
Glu Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Thr Glu Gly His Tyr Tyr Gly Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 58
<211> 25
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 58
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25
<210> 59
<211> 14
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 59
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 60
<211> 31
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 60
Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu
1 5 10 15
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 61
<211> 11
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 61
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
<210> 62
<211> 125
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированная
<400> 62
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Trp Tyr Asp Gly Asn Thr Asn Phe His Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Thr Glu Gly His Tyr Tyr Gly Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 63
<211> 125
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированная
<400> 63
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
Gly Tyr Ile Trp Tyr Asp Gly Asn Thr Asn Phe His Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Thr Glu Gly His Tyr Tyr Gly Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 64
<211> 125
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированная
<400> 64
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Trp Tyr Asp Gly Asn Thr Asn Phe His Ser Pro Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Thr Glu Gly His Tyr Tyr Gly Ser Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 65
<211> 107
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Phe Cys Gln His Leu Trp Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 66
<211> 23
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20
<210> 67
<211> 15
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 67
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 68 <211> 32
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 68
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 69
<211> 10
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 69
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 70
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированная
<400> 70
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Leu Trp Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 71 <211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированная
<400> 71
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Leu Trp Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 72
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Гуманизированная
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Leu Trp Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 73
<211> 124
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 73
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp 115 120
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело, содержащее: (а) вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:1; и (Ь) вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.
2. Антитело, содержащее: (а) вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27, 28 или 29; и (Ь) вариабельную аминокислотную последовательность легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30, 31 или 32.
3. Антитело, содержащее: (а) вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательности CDR, представленные в SEQ ID NO: 21, 22 и 23; и (Ь) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательности CDR, представленные в SEQ ID NO: 24, 25 и 26.
4. Антитело по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что константные области тяжелой цепи иммуноглобулина содержат аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3 или 4.
5. Антитело, содержащее: (а) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0:6; и (Ь) аминокислотную последовательность легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8.
6. Антитело, содержащее: (а) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, 11 или 13; и (Ь) аминокислотную последовательность легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, 17 или 19.
7. Антитело по любому из пп. 1-6, отличающееся тем, что антитело способно связывать человеческий CTLA4.
8. Антитело по любому из пп.1-7, отличающееся тем, что антитело характеризуется сниженым связыванием с растворимым CTLA4.
9. Антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из пп. 1-8.
10. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-9, и физиологически приемлемый носитель или наполнитель.
11. Способ лечения рака, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по п. 10 субъекту, нуждающегося в этом.
12. Способ по п. 11, дополнительно включающий введение дополнительного агента, выбранного из группы, состоящей из анти-PD-l или анти-4-1 ВВ.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что анти-PD-l или анти-4-1 ВВ антитела и анти-СТ1_А4 антитело комбинируются в одну молекулу в виде биспецифических антител.
14. Способ по п.11, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция индуцирует сильное удаление Трег и локальную активацию Т-клеток в микроокружении опухоли, но минимальную системную активацию Т-клеток.
10.
Химерное L3D10
Гуманизирован ное L3D10
Фиг. 1
Фиг. 2
0.0J 1 < 1 1
0.625 2.5 10 40
Концентрация связывающих агентов (мкг/мл)
Фиг. 3
Фиг. 4
"й* <У <У ^
Концентрация (мкг/мл)
Фиг. 5
2.5ч
Фиг. 6
i i
-T-
Концентрация (мкг/мл)
Фиг. 7
Фиг. 8
Фиг. 9
10/68
Фиг. 10
11/68
Фиг. 11
12/68
Лечение антителом
-пм лв мг-зя 106 и/п 2м и/п 3е и/п 4е и/п Контрольное умерщвление
i 1 1 1 1 1 1 1-*
Д° Д7 Д10 Д13 Д16 Д23 ДЗЗ 2см
5 9 13 17 21 25 29 33 38 43 5 9 13 17 21 25 29 33 38 43
Дни после инокуляции MC38 Дни после инокуляции МС38
Фиг. 12
5 9 13 17 21 25 29 33 38 43 7 9 11 13 1 5 1 7 1 9
Дни после инокуляции МС38 Дни после инокуляции МС38
Фиг. 13
14/68
Размер опухоли у мыши CTLA4
Фиг. 14
15/68
Размер опухоли у мыши hCTLA4-KI
10 12 14 16 18 20 22 24
Дни после инокуляции В1б
Фиг. 15
16/68
Экспрессируемый на поверхности В7.1 или В7.2 , связываетCTLA4 на поверхности Т-клеток, которыйснижаетэкспрессию В7.1/ В7.2.
В7.1/В7.2
¦h CTLA4h
CTIA4m Блокирующее антитело
Используя химерные Т-клеткиэкспрессирующие, как человеческий так и мышиный CTLA4, анти- CTLA4 антитела не препятствуют связыванию В7.1/ В7.2 с мышиными CTLA4, что возобновлет ингибирование В7.1/ В7.2.
Фиг. 16
День 1 (24 ч) Анализ
Лечение анти- ^ hCTLA4 антителом щ
500 мкг/мышь 1
Спленоциты
> i
S-FC --изотип _ С086
IDiO: *> ¦¦ изотип 13010; > ~ < изотип
Мышь ;
? !-Ctla4""
/а V
ч. мышь;
Ctla4h/h
150 53
кз,
н,з, н.з.
Мышь Ctla4' о ;
1ИН
^ 1,00 н rrt
с; : *ТГ4
О 6
18/68
Фиг. 18
Дни после инокуляции МС38
19/68
20/68
Фиг. 20
21/68
a b
Фиг. 21
Размер опухоли мыши CTLA4 h/l' Размер опухоли мыши с CTLA4
22/68
Фиг. 22
"3 30
g го о
|- о
а: н
70-
60-
S0-
40 •
30-
го -
О. h-
> *** н.:
("А
о ,
-•- Хомячий IgG
¦¦- МРС-1!
•*¦ 409 s.
•*• 9НЮ
гоо
ISO
га т
100
IgG 909 9H10
Концентрация (мкг/мл)
о- о- u
Концентрация (мкг/мл)
1.C
-•- Хомячий IgG
МРС-11 -" 9 Г" ¦*" 9Н10
ID CO О U
(c) 200
so-о
-qp-
Лиф(tm)
• IgG
к 9D9
* 9Н10
", V ¦3- CJ* *Y v
Концентрация (мкг/мл)
Концентрация (мкг/мл)
24/68
¦ Хомячий IgG
' 4F1Q \ |Хомячий IgG
4 FIG \
o- o- o- o- o- V
Концентрация (мкг/мл)
Концентрация (мкг/мл)
200 •
150 -100 ¦ 50 0
• hlgG-Fc S5 4F10 200 ISO
(tm) 100
higG-Fc 4F10
Фиг. 24
25/68
рождение lpe и/п 2pe и/п Зр и/п 4е и/п
15 мыши hCTLA4-KI
,,. j ...ш^^шт^^^ 1. и1..и..ш.и.|...и.|.....|.
День 10 ДО Д10 Д13 Д16 Д19 Д28 Д30
Фиг. 25
26/68
Вес мыши hCTLA4-KI (12.30.15-День 42)
Конечный вес тела на 42 день
22 20 18Н 16 141210
Фиг. 26
27/68
Вилочковая железа (половина)
Сердце
28/68
0 10 10
ФИТЦ-А: :aHTH-mlgG(H+L)
Сыворотка NSG Без сыворотки
Ctrl lgG-fc
Анти-PDl +10D1
Анти-PDl +10D1
Название образца
Название субпопуляции
Кол-во
Среднее ФИТЦ-А
0401-E006-D42J\ISG-G3-NSG.fcs
красные кровяныетельца
95496
339
0401-E006-D42J\ISG-Blankfcs
Красные кровяныетельца
96695
337
0401-E006-D42J\ISG-l.fcs
Красные кровяныетельца
96863
339
0401-E006-D42_NSG4.fcs
Красные кровяныетельца
96761
346
0401-E006-D42_NSG-7.fcs
Красные кровяныетельца
96428
346
0401-E006-D42J\ISG-ll.fcs
Красные кровяныетельца
96728
345
0401-E006-D42J\ISG-14.fcs
Красные кровяныетельца
96212
339
0401-E006-D42J\ISG-G2-5.fcs
Красные кровяныетельца
96543
345
0401-E006-D42J\ISG-G2-8.fcs
Красные кровяныетельца
96059
351
0401-E006-D42J\ISG-G2-12.fcs
Красные кровяныетельца
96222
349
0401-E006-D42J\ISG-G2-15.fcs
Красные кровяныетельца
96356
345
0401-E006-D42J\ISG-G3-3.fcs
Красные кровяныетельца
96334
344
0401-E006-D42J\ISG-G3-6.fcs
Красные кровяныетельца
96487
351
0401-E006-D42J\ISG-G3-9.fcs
Красные кровяныетельца
96040
349
04Ol-E006-D42_NSG-G3-13.fcs
Красные кровяныетельца
95997
374
04Ol-E006-D42_NSG-G3-16.fcs
Красные кровяныетельца
96388
344
Фиг. 29
F1 *> ? -S-m'-; .>
ШШШШШШш
ШШвШШшШШШвк
л.:
Фиг. 30
31/68
Фиг. 31
A. hlg
B. L3D10+анти-PD1
C. 10D1 +анти- PDl
32/68
Фиг. 32
Фиг. 33
34/68
Показатель кардиальной токсичности (День 42- Н &.Е) Показатель легочной токсичности (День 42- Н &Е) Показатель печоночной токсичности (День 42-J.J &E)
(tm) 3
S 2 о
1= 1
га 3
га ~
а: 2
1= 1
i 5
S 4
а: Н
Показатель почечной токсичности (День 42-Ц &Е) Показатель токсичности слюнной железы (День 42-Н &Е) Суммарный показатель токсичности (День 42 Н &Е)
я з
(tm) 3
25 =; 20 га 15 (tm) 10 -"Ч=-
ФИГ. 34
35/68
Фиг. 35
36/68
1*6
1.20.80.40.0
ш я
1 1 1 г~
Концентрация (мкг/мл)
10D1-1 "*" 10D1-2 L3D10 hlgG-Fc
Фиг. 36
37/68
"Г"
"Т"
"Т"
* ^ 4? Л*" & *
<У "У *У V чг
не- 10D1-1 -*- 10D1-2 L3D10 -*- higG-Fc
Концентрация (мкг/мл)
Фиг. 37
38/68
Аминокислотная последовательность VH L3D10 (исходная)
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGLSWVRQPPGKGLEWLGVIWYDGNTNFHSALISRLTISKDNSKSQVFLELNSLQTDDTATYYCAKTEGHYYGSNYGYYALDYWGQGTSVTVSS
Каркасная область тяжелой цепи
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS WIRQPPGKGLEWIG VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR WGQGTLVTVSS
Гуманизированная VH с аминокислотной последовательностью 1 (НС1) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGLSWIRQPPGKGLEWIGYIWYDGNTNFHPSLKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAKTEGHYYGSNYGYYALDYWGQGTSVTVSS
Гуманизированная VH с аминокислотной последовательностью 2 (НС2) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGLSWIRQPPGKGLEWIGYIWYDGNTNFHSSLKSRVTISKDTSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKTEGHYYGSNYGYYALDYWGQGTLVTVSS
Гуманизированная VH с аминокислотной последовательностью 3 (НСЗ) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGLSWIRQPPGKGLEWIGYIWYDGNTNFHSPLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAKTEGHYYGSNYGYYALDYWGQGTLVTVSS
Аминокислотная последовательность VL L3D10 (исходная)
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGTYFCQHLWGTPYTFGGGTKLEIK
Каркасная область легкой цепи
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKLLIY GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC FGQGTKLEIK
Гуманизированная VL с аминокислотной последовательностью 1 (НС1)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLQYAATNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHLWGTPYTFGGGTKLEIK
Гуманизированная VL с аминокислотной последовательностью 2 (НС2) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKAPKLL§YAATNLQDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQHLWGTPYTFGQGTKLEIK
Гуманизированная VL с аминокислотной последовательностью 3 (НСЗ)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYAATSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHLWGTPYTFGGGTK§EIK
Фиг. 38
39/68
ЧПгамип" 5X10*MC38 Ги/П Зби/п 4 зи самцов I ¦ м/г. ¦ , ¦
hCTLA-KI "*"Т ПЛ
ДО Д7 ДЮ д13 д16 Д20
Фиг. 39
40/68
п/к 5> 10e5 MCS8
и/п Abs 1оеи/п 2De и/п 3е и/п 4е и/п
I I I I s_
4/29 5/6 5/9 5/13 5/16
Фиг. 40
41/68
Фиг. 41
42/68
250 S 200
I 100 50 0
Привес (Е018-Е019-К1-О11-Самки)
О 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 Дни после лечения
Фиг. 42
43/68
45' 40-
I 35.
1 30-|
25-гон >
~3E~
ФИГ. 43
44/68
F ИЗ m
Ч> О (Й. "у*
га Я 20-
OS Л,
I- О
J + S' I "1
а. о
P о Ё g-"
§ ^ 25
> < Q
л и го.
i +
о о w ? u
(D m 10 ¦в- s -§- ? s
s "0-
ao-
<_) 40-
!~ О
> < U
л +
т m
Л О
5 <->
-J-
#• -- " *
a: s
P s
CD a.
t Q "•
? u л + т m eo.
e <-> ".
а: m
¦е- ь "
-е-1
т s ".
ФИГ. 44А
45/68
; v
: +
i "•
: О
! V
i m
: Q
> U
I- m -° Ё
T 5 л s
с, ra га с a.
i P О
""v
^ т U
?.8 Si 40-
О CO U
h- _ ^
e 2 1
fc 8
> < +
л CO ,
I о •
со (J
s +
га с +
ЈP§№
¦ a
x +
О CO
¦e-l
5? <->
Фиг. 44B
46/68
1.6
1,2 0.8
0.0
?*~~"[ • m m и_.
10D1-1
10D1-2
L3D10
РР4631
РР4637
РР4638
hlgG-Fc
^ ~ъ ~* *
<"¦
Концентрация (мкг/мл)
Фиг. 45
47/68
3,0-j
2,5-
2.0-
1.5-
1,0-
0.5-
0.0-
10D1-1
10D1-2
L3D10
PP4631
PP4637
PP4638
MgG-Fc
* -Л* *ЛЧ m
<5p 4* * &¦
Концентрация (мкг/мл)
Фиг. 46
48/68
0.5 0.0-
VV 4V ЧУ <0' *b'
Концентрация (мкг/мл)
Концентрация (мкг/мл)
Фиг. 47
49/68
200-
150
• hlgG-Fc 8S PP4S31 A PP4637
5 150H
• hlgG-Fc
Ш PP4631 4 PP4637
? 100-1
8 50^
Фиг. 48
50/68
Фиг. 49
51/68
Восстановленные
He восстановленные
.'ЧМЩ'.ШЮС
_Ь I.JIIIIOt.
1 = РР4631
2 = РР4637
3 = РР4638
Фиг. 50
РР4638
Фиг. 51
53/68
PP4631
грации
JL.O..
Время миграции
... У
V 1
< ... : ,i
Г Г7
Фиг. 52
54/68
о о
g Зона ДМ
PP4631
PP4631 ДМ5ч
PP4631 ДМ 12,5 ч
Фиг. 53A
55/68
Зона ДМ !!
РР4637
РР4637 ДМ 5 ч
РР4637 ДМ 12,5 ч
Фиг. 53В
56/68
Зона ДМ 5
РР4638
i РР4638дм5ч
РР4638 ДМ 12,5 ч
Фиг. 53С
57/68
58/68
1 10 20 30 40 50 60
Hm MHVAQPAWLAS SRGIAS FVCEYAS PGKAT EVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTF
Mk n
Ms iq-t-s h-v p -shn-d tnd-m t-ftek-tvg-
Мут Ml M2 МЗ M4 Мб M5
70 80 90 100 110 120
Hm LDDSICTGTSSGNOVNLTIOGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTOIYVIDPEPC
Mk m
Ms -ypf-s - fnesr v 1 fv-m
Мут M7 M8 M9 M10 Mil
...124
Hm PDSD
Mk
Ms
Фиг. 55
59/68
CTLA-4FC ДТ
AMHVAOPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLROADSOVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNOVNLTIOGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTOIYVIDPEPCP DSDOEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
CTLA-4FC Ml
iqvtqPsWLASSRGIAS FVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQWLT^
SDOEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
CTLA-4FC M2
AMHVAOPAVVLASShGlASFpCEYASPGKATEVRVTVLROADSOVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNOVNLTIOGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTOIYVIDPEPCP DSDOEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
CTLA-4FC M3
AMHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPshnTdEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC PDSDOEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
CTLA-4FC M4
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRtnDqmVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNOVNLTIOGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTOIYVIDPEPCP DSDOEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGO
CTLA-4FC M5
AMHVAQ PAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATftekntvgFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMXP_P_EYYLGIGNGTQIYVIDPEPCP DSDOEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
Фиг. 5 6A
60/68
CTLA-4FC Мб
AMHVAOPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLROADSOVTEVCAtTYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNOVNLTIOGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTOIYVIDPEPCP DSDOEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
CTLA-4FC M7
AMHVAOPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLROADSOVTEVCAATYMMGNELTFLDypfcsGTSSGNOVNLTIOGLRAMDTGLYICICVELMYPPPYYLGIGNGTOIYVIDPEPCP DSDOEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
CTLA-4FC M8
AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLROADSOVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTfnesrVNLTIOGLRAMDTGLYICKV'ELMYPPPYYLGIGNGTOIYVIDPEPCP DSDOEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
CTLA-4FC M9
AMHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLROADSOVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNOVNLTIOGLRAMvDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTOIYVIDPEPC PDSDOEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
CTLA-4FC M10
AMHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLROADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMMDTGLY1CKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC PDSDOEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
CTLA-4FC Mil
AMHVAQPAWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYEEEYfvGmGNGTQIYVIDPEPCP DSDOEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
Фиг. 5 6B
61/68
Фиг. 57
62/68
Фиг. 58
63/68
CTLA-4FC ДТ
AMHVAQPAWLASSRGIASE^CEYASPGKATETOVTVLRpaDSOVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIOGLRAMDTGbYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCP DSDOEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFrarWDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGOPREPOVYTLPPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
CTLA-4FC Ml2
iqvtqPSWLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATftekn^
SDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CTLA-4FC M13
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKvTETOVTVLRQADSQVTEVCAATYmGNELTFLDDSICTGTSSGNQTOLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYfvGmGNGTQIYVIDPEPCPD SDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEWFmYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CTLA-4FC Ml4
iqvtqPSVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATfteknt^
SDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELЪGGSSVFLFPPKPKDTШISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEtffiSNGQPENHYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CTLA-4FC Ml5
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKvTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYeGIGNGTQIYVIDPEPCPD SDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYV^
TISKAKGQPREPQWTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK CTLA-4FC Ml6
iqvtqPsVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLROADSOVTEVCAATftelcntvqFLDDSICTGTfnesrVNLTIOGLRAMDTGLYICKVEШYPPPYfvGmGNGTQIYVIDPEPCPD SDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLyltRePEVTCVWDVSHEDPEVKFmYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CTLA-4FC Ml7
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKyTEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELT^
SDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFmYVDGVEVHNJAKTKPRJEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHHHYTQKSLSLSPGK
Фиг. 5 9
64/68
¦+¦ flThCTlA4Fc
M12 MK Ш4 MIS
Ml?
5 4
о г
flTtiCTLMFt -я- Ml--А- Ш2
-S3- Ш5
0 0 002 0.02 0.2 Концентрация биотин-lODl (мкг/мл)
0 0 002 0 В2 0 2 Концентрация биотин-РР4631 (мкг/мл)
/7/
s*. flThCTWFc "- М11 •*- M1J
•*- \т
M1i> М16 *¦ Ml 7
¦;* hlgGFc
С 0.002 0.02 0.2 Концентрация 6иотин-РР4637 (мкг/мл)
Фиг. 60
65/68
Фиг. 62
67/68
Фиг. 63
Фиг. 64
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
PCT/US2016/066698 4 WO/2017/106372
PCT/US2016/066698 3 WO/2017/106372
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698 30 WO/2017/106372
PCT/US2016/066698 33 WO/2017/106372
PCT/US2016/066698 33 WO/2017/106372
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
PCT/US2016/066698 34 WO/2017/106372
PCT/US2016/066698 37 WO/2017/106372
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
PCT/US2016/066698 40 WO/2017/106372
PCT/US2016/066698 40 WO/2017/106372
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
PCT/US2016/066698 56 WO/2017/106372
PCT/US2016/066698 59 WO/2017/106372
PCT/US2016/066698 59 WO/2017/106372
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
PCT/US2016/066698 78 WO/2017/106372
PCT/US2016/066698 78 WO/2017/106372
PCT/US2016/066698 89 WO/2017/106372
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
PCT/US2016/066698 92 WO/2017/106372
PCT/US2016/066698 92 WO/2017/106372
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
PCT/US2016/066698 2 WO/2017/106372
PCT/US2016/066698 2 WO/2017/106372
WO/2017/106372
1/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
1/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
1/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
1/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
2/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
2/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
3/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
3/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
4/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
4/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
5/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
5/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
7/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
7/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
7/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
7/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
7/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
7/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
8/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
8/68
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
PCT/US2016/066698 58 WO/2017/106372
PCT/US2016/066698 58 WO/2017/106372
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
PCT/US2016/066698 63 WO/2017/106372
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
PCT/US2016/066698 63 WO/2017/106372
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
PCT/US2016/066698 63 WO/2017/106372
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
PCT/US2016/066698 63 WO/2017/106372
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ к ответу на уведомление от 14.09.2018
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
WO/2017/106372
PCT/US2016/066698
