(57) Реферат / Формула:
Изобретение относится к способам и композициям для получения T-клеток. Изобретение также относится к терапевтическим способам, в которых используют сконструированные T-клетки. Например, в некоторых аспектах способы включают получение композиции трехмерного клеточного агрегата, содержащего стромальные клетки и гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники в бессыворочной среде для получения T-клеток.
Евразийское (21) 201891059 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2016.10.28
(51) Int. Cl.
C12N 5/0783 (2010.01) C12N 5/00 (2006.01) A61K 35/17 (2014.01) C07K14/725 (2006.01) C07K16/00 (2006.01)
(54) СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ Т-КЛЕТОК ИЗ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И
ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ Т-КЛЕТОК
(31) 62/248,931; 62/265,204; 62/359,456
(32) 2015.10.30; 2015.12.09; 2016.07.07
(33) US
(86) PCT/US2016/059375
(87) WO 2017/075389 2017.05.04
(71) Заявитель:
ДЗЕ РИДЖЕНТС ОФ ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ КАЛИФОРНИЯ (US)
(72) Изобретатель:
Крукс Гай М., Монтел-Хаген Амели К., Сит Кристофер С. (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Изобретение относится к способам и композициям для получения T-клеток. Изобретение также относится к терапевтическим способам, в которых используют сконструированные T-клетки. Например, в некоторых аспектах способы включают получение композиции трехмерного клеточного агрегата, содержащего стромальные клетки и гема-топоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники в бессыворочной среде для получения T-клеток.
д Неделя 3 Неделя 4 Неделя 5 Неделя 6 Неделя 7
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-549992ЕА/085
СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ Т-КЛЕТОК ИЗ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ Т-КЛЕТОК
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США № 62/284931, поданной 30 октября 2015 г., временной заявки на патент США № 62/265204, поданной 9 декабря 2015 г., и временной заявки на патент США № 62/359456, поданной 7 июля, 2016. Содержание каждого вышеприведенного описания намеренно включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме без оговорок.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящее изобретение было осуществлено при государственной поддержке в рамках гранта № HL066992, выданного Национальными институтами здравоохранения США (National Institutes of Health). Государство имеет определенные права на настоящее изобретение.
1. Область техники, к которой относится изобретение
[0003] Настоящее изобретение в целом относится к области культивирования и развития клеток. Более конкретно, изобретение касается получения T-клеток из стволовых клеток или клеток-предшественников .
2. Описание уровня техники
[0004] Современные методы Т-клеточной терапии (в том числе подходы с использованием сконструированных TCR и CAR-T) основаны на генетической модификации аутологичных T-клеток периферической крови (то есть Т-клетки для модификации выделяют у того же пациента, которому они будут введены). Аутологичный подход необходим в виду аллореактивности донорных T-клеток при трансплантации аллогенным (чужеродным) реципиентам, что может привести к синдрому повреждения тканей у реципиента, известному как реакция "трансплантат против хозяина" (РТПХ). Однако использование персонифицированной терапии аутологичными сконструированными Т-клетками является чрезвычайно трудоемким и дорогостоящим, а также имеет неопределенную масштабируемость,
несмотря на быстрое продвижение на рынок терапии аутологичными клетками, находящейся в настоящее время на последних стадиях клинических испытаний. Кроме того, терапия аутологичными сконструированными Т-клетками невозможна или имеет пониженную эффективность у пациентов, у которых нормальные Т-клетки не могут быть собраны в достаточном объеме (например, у пациентов с лимфопенией), или у пациентов, у которых Т-клетки функционально ослаблены (например, у пациентов с ВИЧ/СПИДом; у пожилых пациентов, в результате возрастной дисфункции иммунной системы). Учитывая эти многочисленные проблемы, способы получения терапевтических неаллореактивных готовых к применению сконструированных T-клеток являются большой неудовлетворенной коммерческой потребностью в области адоптивной клеточной терапии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] В настоящем изобретении описаны способы получения сконструированных T-клеток и композиций полученных T-клеток. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки являются неаллореактивными и экспрессируют экзогенный TCR и/или CAR. Такие Т-клетки могут использоваться для терапии "готовыми к использованию" Т-клетками и не требуют использования собственных T-клеток пациента. Таким образом, способы по настоящему изобретению обеспечивают более экономичную, менее трудоемкую Т-клеточную иммунотерапию. Также описаны иммунотерапевтические способы с использованием таких Т-клеток.
[0006] Аспекты раскрытия относятся к новой трехмерной системе культивирования клеток для получения T-клеток из менее дифференцированных клеток, таких как эмбриональные стволовые клетки, плюрипотентные стволовые клетки, гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники, или стволовых клеток или клеток-предшественников, описанных в настоящем документе и известных в данной области. В конкретных вариантах осуществления эта система включает использование бессывороточной среды. В некоторых аспектах в новой системе используется бессывороточная среда, которая подходит для развития нервных клеток, для культивирования трехмерного клеточного агрегата,
включающего стромальные клетки, и стволовые клетки или клетки-предшественники продуцируют Т-клетки или, более конкретно, антиген-специфичные Т-клетки или Т-клетки, которые прошли позитивную или негативную селекцию in vitro. В вариантах осуществления настоящего изобретения 3D клеточный агрегат культивируют в бессывороточной среде, содержащей инсулин, в течение времени, достаточного для in vitro дифференциации стволовых клеток или клеток-предшественников в Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки проходят позитивную селекцию, которая дает Т-клетки с высокой авидностью к специфическим антигенам.
[0007] Соответственно, аспекты настоящего изобретения относятся к композиции клеточной культуры, содержащей трехмерный (3D) клеточный агрегат и среду. В некоторых вариантах осуществления 3D клеточный агрегат содержит: а) выбранную популяцию стромальных клеток; и/или Ь) выбранную популяцию стволовых клеток или клеток-предшественников. В частности, предполагается, что а) или Ь) компонент может быть исключен или по существу исключен в конкретных вариантах осуществления. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько клеток, в частности, стромальные клетки, могут экспрессировать лиганд Notch. В некоторых вариантах осуществления лиганд Notch является экзогенным. В некоторых вариантах осуществления лиганд Notch является эндогенным. В других вариантах осуществления среда может содержать добавленный извне лиганд Notch. В других вариантах осуществления добавленный извне лиганд Notch может быть присоединен к твердой подложке или иммобилизован. Например, в некоторых вариантах осуществления стромальные клетки имеют экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую лиганд Notch, которая может быть введена (или была введена ранее) в клетки путем трансфекции или трансдукции. В некоторых вариантах осуществления культуральная композиция может не содержать лиганд Notch или может не содержать добавленный извне лиганд Notch.
[0008] Используемый в настоящем изобретении термин "лиганд Notch" включает интактные (полноразмерные) , частичные (усеченная форма) или модифицированные (содержащие одну или несколько
мутаций, например, консервативные мутации) лиганды Notch, а также лиганды Notch любых видов или их фрагменты, которые сохраняют по меньшей мере одну активность или функцию полноразмерного лиганда Notch. Также термин включает пептиды, которые имитируют лиганды Notch. Лиганды Notch могут быть "каноническими лигандами Notch" или "неканоническими лигандами Notch". Канонические лиганды Notch характеризуются внеклеточными доменами, обычно содержащими N-концевой (NT) домен, за которым следует домен Delta/Serrate/LAG-2 (DSL) и множественные тандемно расположенные повторы, подобные повторам эпидермального фактора роста (EGF) . Домен DSL вместе с фланкирующим доменом NT и первыми двумя повторами EGF, содержащими мотивы, подобные мотивам белков Delta и OSM-11 (DOS), как правило, требуется для связывания канонических лигандов с Notch. Внутриклеточные домены некоторых канонических лигандов содержат мотив карбокси-концевого РЭО-95/01д/го-1-лиганда (PDZL), который играет роль, независимую от сигнального пути Notch. У лигандов DSL С. elegans отсутствует мотив DOS, но они, как предполагается, объединяются с лигандами, содержащими только DOS, для активации сигнального пути Notch. Характерные канонические лиганды Notch включают, но не ограничиваются ими, Дельта-подобный лиганд 4 (DLL4), Дельта-подобный лиганд 1 (DLL1), Jagged 1 (JAG1), Jagged 2 (JAG2), Дельта-подобный лиганд 3 (DLL3) и Х-дельта 2; другие сходные типичные канонические лиганды рассматриваются в дополнительных вариантах осуществления изобретения.
[0009] Неканонические лиганды Notch, лишенные домена DSL (Delta/Serrate/LAG-2), обладают структурным разнообразием и включают интегральные и GPI-связанные мембранные белки, а также различные секретируемые белки. Если в настоящем изобретении указывается "фрагмент лиганда Notch" или "фрагмент канонического лиганда Notch", то предполагается, что фрагмент представляет собой фрагмент, который связывает Notch. Примеры неканонических лигандов Notch включают, но не ограничиваются ими, Контактин-1, N0V/CCN3, Контактин-б, Периостин/0ЭЕ-2, DLK2/EGFL9, Pref-1/DLK1/FA1, DNER, Тромбоспондин-2, MAGP-1/MFAP2, Тромбоспондин-3, MAGP-2/MFAP5, Тромбоспондин-4 и Нетрин-1.
[0010] В некоторых вариантах осуществления среда дополнительно содержит витамины. В некоторых вариантах осуществления среда содержит 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 следующих веществ (и любой диапазон этих значений): биотин, DL-альфа-токоферолацетат, DL-альфа-токоферол, витамин А, хлорид холина, пантотенат кальция, пантотеновая кислота, никотинамид фолиевой кислоты, пиридоксин, рибофлавин, тиамин, инозитол, витамин В12, либо среда включает их комбинации или их соли. В некоторых вариантах осуществления среда содержит или по существу состоит из биотина, DL альфа-токоферолацетата, DL альфа-токоферола, витамина А, хлорида холина, пантотената кальция, пантотеновой кислоты, никотинамида фолиевой кислоты, пиридоксина, рибофлавина, тиамина, инозитола и витамина В12. В некоторых вариантах осуществления витамины включают или по существу состоят из биотина, DL-альфа-токоферолацетата, DL-альфа-токоферола, витамина А или их комбинаций или их солей. В некоторых вариантах осуществления среда дополнительно содержит белки. В некоторых вариантах осуществления белки включают альбумин или альбумин бычьей сыворотки, фракцию BSA, каталазу, инсулин, трансферрин, супероксиддисмутазу или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления среда дополнительно содержит одно или несколько из следующих веществ: кортикостерон, D-галактоза, этаноламин, глутатион, L-карнитин, линолевая кислота, линоленовая кислота, прогестерон, путресцин, селенит натрия или трийод-Ъ-тиронин, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления среда содержит одно или несколько следующих веществ: добавка В-27(r), добавка В-27(r), не содержащая Хепо, добавка GS21(tm) или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления среда содержит или дополнительно содержит аминокислоты, моносахариды, неорганические ионы. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты включают аргинин, цистин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, глутамин, фенилаланин, треонин, триптофан, гистидин, тирозин или валин, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления неорганические ионы включают натрий, калий, кальций, магний, азот или фосфор,
или их комбинации или соли. В некоторых вариантах осуществления среда дополнительно содержит одно или несколько следующих веществ: молибден, ванадий, железо, цинк, селен, медь или марганец, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления среда содержит или по существу состоит из одного или нескольких витаминов, описанных в настоящем изобретении, и/или одного или нескольких белков, описанных в настоящем изобретении, и/или одного или нескольких следующих веществ: кортикостерон, D-галактоза, этаноламин, глутатион, L-карнитин, линолевая кислота, линоленовая кислота, прогестерон, путресцин, селенит натрия или трийод-Ъ-тиронин, добавка В-27(r), добавка В-27(r), не содержащая Хепо, добавка GS21(tm), аминокислота (такая как аргинин, цистин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, глутамин, фенилаланин, треонин, триптофан, гистидин, тирозин или валин), моносахарид, неорганический ион (такой как натрий, калий, кальций, магний, азот и/или фосфор) или их соли, и/или молибден, ванадий, железо, цинк, селен, медь или марганец.
[ООН] Среда в определенных аспектах может быть получена с использованием среды для культивирования клеток животных в качестве основной среды, такой как любая из AIM V, X-VIV0-15, NeuroBasal, EGM2, TeSR, ВМЕ, BGJb, CMRL 1066, Glasgow MEM, Improved MEM Zinc Option, IMDM, Среда 199, Eagle MEM, ocMEM, DMEM, Ham, RPMI-1640 и среда Fischer, а также любая их комбинация, но среда может быть конкретно не ограничена ими, если ее можно использовать для культивирования клеток животных. В частности, среда может не содержать Хепо или быть с определенным химическим составом.
[0012] Среда может быть средой, содержащей сыворотку или не содержащей сыворотку, или средой, не содержащей Хепо. С точки зрения предотвращения загрязнения гетерогенными компонентами животного происхождения сыворотка может быть получена у того же животного, чьи и стволовые клетки. Бессывороточная среда относится к среде, не содержащей необработанную или неочищенную сыворотку, и, соответственно, может включать среду с очищенными компонентами крови или компонентами тканей животного (такими как
факторы роста).
[0013] Среда может содержать любые альтернативные варианты сыворотки или не содержать их. Альтернативные варианты сыворотки могут включать вещества, которые, соответственно, содержат альбумин (такой как богатый липидами альбумин, бычий альбумин, заменители альбумина, такие как рекомбинантный альбумин или гуманизированный альбумин, растительный крахмал, декстраны и белковые гидролизаты), трансферрин (или другие переносчики железа), жирные кислоты, инсулин, предшественники коллагена, микроэлементы, 2-меркаптоэтанол, З'-тиолглицерин или их эквиваленты. Альтернативные варианты сыворотки могут быть получены способом, описанным, например, в международной публикации № 98/30679 (включена в настоящее описание в полном объеме). Альтернативно, для большего удобства могут быть использованы любые коммерчески доступные вещества. Коммерчески доступные вещества включают замену сыворотки Knockout (KSR), липидный концентрат с определенным химическим составом (Gibco) и Glutamax (Gibco).
[0014] В других вариантах осуществления среда может быть
бессывороточной средой, подходящей для развития клеток.
Например, среда может содержать добавку В-27(r), добавку В-27(r) без
Хепо (доступна во всемирной паутине по адресу
thermofisher.com/us/en/home/technical-resources/media-formulation .250.html), добавку NS21 (Chen et al. , J Neurosci Methods, 2008 Jun 30, 171 (2) : 239-247, включена в настоящее описание в полном объеме), добавку GS21(tm) (доступна во всемирной паутине на сайте amsbio.com/B-27.aspx) или их комбинации, в концентрации, эффективной для получения T-клеток из 3D клеточного агрегата.
[0015] В некоторых вариантах осуществления среда может содержать один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более следующих веществ: витамины, такие как биотин; DL альфа-токоферолацетат; DL альфа-токоферол; витамин А (ацетат); белки, такие как BSA (альбумин бычьей сыворотки) или альбумин человека,
свободная от жирных кислот фракция V; каталаза; рекомбинантный инсулин человека; трансферрин человека; супероксиддисмутаза; другие компоненты, такие как кортикостерон; D-галактоза; этаноламин НС1; глутатион (восстановленный); L-карнитин НС1; линолевая кислота; линоленовая кислота; прогестерон; путресцин 2НС1; селенит натрия; и/или ТЗ (трийод-1-тиронин).
[0016] В других вариантах осуществления среда может
содержать добавленную извне аскорбиновую кислоту. Среда может
также содержать одну или несколько добавленных извне жирных
кислот или липидов, аминокислоты (такие как незаменимые
аминокислоты), витамин(ы), факторы роста, цитокины,
антиоксиданты, 2-меркаптоэтанол, пировиноградную кислоту, буферные агенты и/или неорганические соли.
[0017] Один или несколько компонентов среды могут быть добавлены в концентрации по меньшей мере не более или приблизительно 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 180, 200, 250 нг/л, нг/мл, мкг/мл, мг/мл, или находиться в любом диапазоне этих значений.
[0018] Используемая среда может быть дополнена по меньшей мере одним добавленным извне цитокином в концентрации от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 500 нг/мл, более предпочтительно, от 1 нг/мл до 100 нг/мл или по меньшей мере 0, 1, 0, 5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 150, 180, 200, 250 нг/л, нг/мл, мкг/мл, мг/мл, или находиться в любом диапазоне этих значений. Подходящие цитокины включают, но не ограничиваются ими, лиганд FLT3 (FLT3L), интерлейкин 7 (IL-7), фактор стволовых клеток (SCF) , тромбопоэтин (ТРО) , IL-2, IL-4, IL-6, IL-15, IL-21, TNF-альфа, TGF-бета, интерферон-гамма, интерферон-лямбда, TSLP, тимопентин, плеотрофин и/или мидкин. В частности, культуральная среда может включать по меньшей мере один из FLT3L и IL-7. Более конкретно, культура может включать как FLT3L, так и IL-7.
[0019] В некоторых вариантах осуществления 3D клеточный агрегат может содержать определенный или неопределенный экзогенный внеклеточный матрикс, такой как коллаген, желатин,
поли-Ъ-лизин, поли-Б-лизин, ламинин и фибронектин, и их смеси, например Matrigel(tm), и препараты лизированных клеточных мембран. В других вариантах осуществления 3D агрегат не содержит экзогенный матрикс или каркас.
[0020] Другие условия культивирования могут быть определены соответсвующим образом. Например, температура культивирования может составлять от приблизительно 2 0 до 4 0°С, например по меньшей мере не более или приблизительно 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40°С (или может быть в любом диапазоне этих значений) , при этом температура может быть выше или ниже этих значений. Концентрация С02 может составлять приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9 или 10% (или находится в любом диапазоне этих значений), например, приблизительно от 2 до 10%, например, приблизительно от 2 до 5%, или быть в любом диапазоне этих значений. Кислородный потенциал может составлять по меньшей мере или равно приблизительно 1, 5, 8, 10, 2 0%, или быть в любом диапазоне этих значений.
[0021] Стромальные клетки и стволовые клетки или клетки-предшественники могут присутствовать в любом соотношении, например, приблизительно 100:1, 80:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и/или 1:100, или в любом диапазоне этих значений.
[0022] В некоторых вариантах осуществления стромальные клетки могут представлять собой линию мышиных стромальных клеток, линию стромальных клеток человека, выбранную популяцию первичных стромальных клеток, выбранную популяцию стромальных клеток, дифференцированных из плюрипотентных стволовых клеток in vitro, или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления стромальные клетки дифференцируются из одной и той же популяции стволовых клеток или клеток предшественников, которые используются в качестве исходных веществ в описанных в настоящем изобретении способах. В некоторых вариантах осуществления стромальные клетки дифференцируются из клеток человека. В некоторых вариантах осуществления стромальные клетки дифференцируются от плюрипотентных стволовых клеток человека. В
некоторых вариантах осуществления стромальные клетки дифференцируются из клеток HSPC или PSC, имеющих человеческое или другое происхождение.
[0023] В других вариантах осуществления стромальные клетки или их предшественники могут быть генетически модифицированы. Например, стромальные клетки могут экспрессировать экзогенный комплекс гистосовместимости человека (МНС). В других вариантах осуществления стромальные клетки могут экспрессировать экзогенную антиген-специфическую костимулирующую молекулу, цитокин, антиген или белок внеклеточного матрикса, или любой регулятор T-клеток, как и любую биоактивную молекулу или гены, которые модулируют дифференцировку, пролиферацию или функцию Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления стромальные клетки (или клетки-предшественники) сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать антиген или молекулу HLA.
[0024] В некоторых вариантах осуществления клеточный агрегат содержит или дополнительно содержит опухолевые клетки или опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления клеточный агрегат содержит экзогенный основной комплекс гистосовместимости (МНС). В некоторых вариантах осуществления МНС является МНС человека. В некоторых вариантах осуществления клеточный агрегат содержит экзогенную антиген-специфическую костимулирующую молекулу, цитокин, антиген или белок внеклеточного матрикса, или любой регулятор T-клеток, как и любую биоактивную молекулу или гены, которые модулируют дифференцировку, пролиферацию или функцию T-клеток. В некоторых вариантах осуществления стромальные клетки (или клетки-предшественники) сконструированы для того, чтобы экспрессировать антиген или молекулу HLA.
[0025] В некоторых вариантах осуществления стволовые клетки или клетки-предшественники могут быть выбраны из эмбриональных стволовых клеток, гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников, клеток, выделенных из костного мозга, пуповинной крови, периферической крови, тимуса, или стволовые клетки или клетки-предшественники могут быть дифференцированы из эмбриональных стволовых клеток (ESC) или индуцированных
плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) in vitro. Стволовые клетки или клетки-предшественники из первичной ткани или ESC или iPSC могут быть по природе человеческими или принадлежать животным, исключая человека (например, мыши,) .
[0026] В других вариантах осуществления стволовые клетки
или клетки-предшественники могут быть генетически
модифицированными. Например, стволовые клетки или клетки-предшественники могут экспрессировать экзогенный рецептор Т-клеток (TCR) или химерный антигенный рецептор (CAR), или оба этих рецептора. В других вариантах осуществления стволовые клетки или клетки-предшественники могут экспрессировать экзогенный TCR, связанный с инвариантной естественной киллерной Т-клеткой (iNKT). В еще одном варианте осуществления стволовые клетки или клетки-предшественники экспрессируют экзогенный антиген-специфичный TCR или имеют экзогенную генетическую модификацию генов, которые модулируют дифференцировку, деление или функцию Т-клеток.
[0027] В некоторых вариантах осуществления стволовые клетки или клетки-предшественники, используемые в композициях для культивирования и в способах, описанных в настоящем изобретении, являются клетками, которые ранее были заморожены. В некоторых вариантах осуществления клетки никогда не были заморожены. В некоторых вариантах осуществления клетки пассировали по меньшей мере, не более или строго 0, 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 15,
20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 раз (или в любом диапазоне этих значений).
[0028] В некоторых вариантах осуществления любая клеточная популяция, такая как стромальные клетки, стволовые клетки или клетки-предшественники или Т-клетка, полученная из них, может содержать по меньшей мере, приблизительно или не более 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24, 25, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1х103, 2х103, ЗхЮ3, 4х103, 5х103, 6х103, 7х103, 8х103, 9х103, 1х104, 2х104, ЗхЮ4, 4х103,5х104, 6х104, 7х104, 8х104, 9х104, lxlO5, 2х105, ЗхЮ5, 4хЮ5, 5хЮ5, 6хЮ5, 7хЮ5, 8хЮ5, 9хЮ5, 1хЮ6 или 2хЮ6
21,
клеток (или любой диапазон этих значений). В конкретных вариантах осуществления количество стволовых клеток или клеток-предшественников составляет от 1 до 200000.
[0029] Аспекты раскрытия также относятся к способу
получения композиции T-клеток из стволовых клеток или клеток-
предшественников, причем способ включает культивирование
трехмерного (3D) клеточного агрегата, содержащего: а) выбранную
популяцию стромальных клеток, которые экспрессируют лиганд
Notch; b) выбранную популяцию стволовых клеток или клеток-
предшественников; где 3D клеточный агрегат культивируют в
бессывороточной среде, содержащей инсулин, в течение времени,
достаточного для in vitro дифференциации стволовых клеток или
клеток-предшественников в Т-клетки. Композиция для
культивирования может включать в себя любые варианты, описанные в настоящем изобретении в качестве компонентов композиции для культивирования и культуральной среды. Кроме того, клетки, используемые в аспектах способа по настоящему изобретению, могут быть любыми стволовыми клетками или клетками-предшественниками, или стромальными клетками, описанными в настоящем изобретении, подходящими для использования в композиции для культивирования.
[0030] Композиции и способы, описанные в настоящем изобретении, могут быть модифицированы таким образом, чтобы способ предназначался для получения T-клеток с определенным фенотипом. В некоторых вариантах осуществления способы предназначены для получения Т-клетки с фенотипом: CD4+CD8~ Т-клеток, CD4~CD8+ Т клеток, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO-CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD34+CD5+CD7+, CD34+CD5+CD7-, естественных киллерных T-клеток, регуляторных T-клеток, антиген-специфичных T-клеток, внутриэпителиальных Т-лимфоцитов, или клеток, которые представляют собой CD45+, CDllb+, CDllb-, CD15+, CD15-, CD24+, CD24-, CD114+, CD114-, CD182+, CD182-, CD4+, CD4-,
CD14+, CD14-, CDlla+, CDlla-, CD91+, CD91-, CD16+, CD16-, CD3+, CD3-, CD25+, CD25-, Foxp3+, Fox3p-, CD8+, CD8-, CD19+, CD19-, CD20+, CD20-, CD24+, CD24, CD38+, CD38-, CD22+, CD22-, CD61+, CD61-, CD16+, CD16-, CD56+, CD56-, CD31+, CD31-, CD30+, CD30-, CD38+ и/или CD38-, или их комбинации. В качестве примера, внутриэпителиальные лимфоциты (IEL) могут быть получены путем экспрессии когнатного антигена в стромальных клетках.
[0031] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает центрифугирование стволовых клеток или клеток-предшественников и стромальных клеток с образованием 3D клеточного агрегата. Способы могут включать культивирование трехмерного (3D) клеточного агрегата. 3D клеточный агрегат содержит выбранную популяцию стромальных клеток, которые экспрессируют экзогенный лиганд Notch; и выбранную популяцию стволовых клеток или клеток-предшественников. Любой из альтернативных вариантов ингредиентов среды может быть таким, как описано выше.
[0032] В других вариантах осуществления культивирование может включать использование центрифугирования с образованием 3D клеточного агрегата. Культивирование может длиться в течение любого периода времени, например, по крайней мере не более или строго приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 4 6, 4 7 или 4 8 часов, днями или неделями, или в течение любого диапазона этих значений. В дополнительных вариантах осуществления культивирование может включать или может не включать пассирование клеток.
[0033] В некоторых вариантах осуществления способы
дополнительно включают эндогенно-экспрессируемые TCR из
дифференцированных in vitro T-клеток. В некоторых вариантах
осуществления способ дополнительно включает праймирование Т-
клеток. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки
праймированы антиген-презентирующими клетками. В некоторых
вариантах осуществления антиген-презентирующие клетки
презентируют опухолевые антигены.
[0034] В других вариантах осуществления могут быть предложены способы или стадии, включающие введение T-клеток из 3D клеточного агрегата индивиду, нуждающемуся в таком введении, или дополнительную дифференцировку T-клеток из 3D клеточного агрегата.
[0035] В некоторых вариантах осуществления Т-клетки из 3D клеточного агрегата не экспрессируют эндогенный TCR из-за аллельного исключения. В других вариантах осуществления Т-клетки из 3D клеточного агрегата экспрессируют экзогенный TCR или CAR.
[0036] Могут быть приведены способы получения Т-клеток, включающие культивирование композиции клеточной культуры, как описано выше, с образованием T-клеток. Могут быть также приведены способы, описанные выше, которые могут быть дополнительно определены как способ получения антиген-специфичных T-клеток, где клетки-предшественники экспрессируют экзогенный антиген-специфичный TCR или CAR.
[0037] Могут быть приведены способы получения T-клеток, или любым из способов культивирования могут быть получены Т-клетки из 3D клеточного агрегата. В некоторых аспектах способы могут дополнительно включать определение числа, выбор в отношении или против, или увеличение числа CD4+CD8~ Т клеток, CD4~CD8+ Т клеток, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO-CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO-CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD34+CD5+CD7+, CD34+CD5+CD7-, естественных киллерных T-клеток, регуляторных T-клеток, антиген-специфических T-клеток, используя тетрамер или анти-TCR антитела, CAR T-клеток, используя модифицированные антигены, трансдуцированных T-клеток, используя флуоресцентные маркеры, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления внутриэпителиальные лимфоциты представляют собой CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления исключены
внутриэпителиальные лимфоциты, такие как CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8- и/или CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa.
[0038] Могут быть приведены способы повышения числа Т-клеток у индивида или лечения заболевания или состояния у индивида, причем способ включает введение индивиду эффективного количества T-клеток или антиген-специфичных Т-клеток, полученных, как описано в настоящем изобретении, или любых Т-клеток по настоящему изобретению, таких как клетки, которые содержат экзогенный TCR. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки имеют маркер клеточной поверхности, описанный в настоящем изобретении.
[0039] Индивидом может быть любое животное, в частности мышь, нечеловеческий примат или человек. В дополнительных аспектах индивид может быть определен, как страдающий или подверженный риску аутоиммунного заболевания, злокачественного новообразования, инфекции, иммунодефицита или их комбинации.
[0040] В дополнительных вариантах осуществления может быть приведен способ получения T-клеток, которые не взаимодействуют с аутоантигеном, включающий культивирование трехмерного (3D) клеточного агрегата в бессывороточной среде при концентрации, эффективной для получения T-клеток из 3D клеточного агрегата. В некоторых аспектах 3D клеточный агрегат содержит: а) выбранную популяцию стромальных клеток, которые экспрессируют экзогенный лиганд Notch, и Ь) выбранную популяцию стволовых клеток или клеток-предшественников, где одна или несколько клеток а) или Ь) экспрессируют экзогенный аутоантиген; таким образом, 3D клеточный агрегат продуцирует Т-клетки, которые не взаимодействуют с аутоантигеном. В других аспектах одна или несколько клеток а) или Ь) экспрессируют или не экспрессируют экзогенный ауто-МНС.
[0041] Аспекты настоящего изобретения относятся к Т-клеткам, полученным способами, описанными в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки обладают специфическим фенотипом, имеют маркер клеточной поверхности или характеристику, описанные в настоящем
изобретении.
[0042] Соответственно, аспекты настоящего изобретения относятся к выделенной Т-клетке или к популяции Т-клеток, содержащей химерный антигенный рецептор (CAR), где Т-клетки имеют фенотип внутриэпителиального лимфоцита. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки представляют собой TCR-. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки представляют собой CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки представляют собой CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки представляют собой CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит CD19 CAR. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки дополнительно содержат экзогенный TCR. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки представляют собой CD3+. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки представляют собой CD4+CD8~ Т-клетки, CD4~ CD8+ Т-клетки, CD34+ CD7+ CDla+ клетки, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-, CD3+ TCRab+ CD4 + CD8- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO-CD45RA+ CD27+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CDla+ клетки, CD34+CD5+CD7+, CD34+CD5+CD7-, естественные киллерные Т-клетки, регуляторные Т-клетки, антиген-специфические Т-клетки, внутриэпителиальные Т-лимфоциты, или клетки, которые представляют собой CD45+, CDllb+, CDllb-, CD15+, CD15-, CD24+, CD24-, CD114+, CD114-, CD182+, CD182-, CD4+, CD4-, CD14+, CD14-, CDlla+, CDlla-, CD91+, CD91-, CD16+, CD16-, CD3+, CD3-, CD25+, CD25-, Foxp3+, Fox3p-, CD8+, CD8-, CD19+, CD19-, CD20+, CD20-, CD24+, CD24, CD38+, CD38-, CD22+, CD22-, CD61+, CD61-, CD16+, CD16-, CD56+, CD56-, CD31+, CD31-, CD30+, CD30-, CD38+ или CD38-, или их комбинации. Другие аспекты относятся к выделенной Т-клетке или к популяции T-клеток, где Т-клетки экспрессируют экзогенный TCR или CAR, и где Т-клетки представляют собой CD4+CD8- Т-клетки, CD4~CD8+ Т-клетки, CD34+ CD7+ CDla+ клеток CD3+
TCRab+, CD3+ TCRgd+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8+, CD3+, CD3+ CD4+ CD4 + , CD3+ CDCR+ CD4 + , CD3+ CDCR+ CD8+ CD4+ CD4+ CD4+ CD4+ CD4 + CD4+ CDR+ CD8+ CD4-CD45RO-CD45RA+ CCR7 + , CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-CD4 5RO-CD4 5RA+ CD27+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CDla+ клетки CD34+CD5+CD7+, CD34+CD5+CD7-, естественные киллерные Т-клетки, регуляторные Т-клетки, антиген-специфичные Т-клетки, внутриэпителиальные Т-лимфоциты, клетки, которые представляют собой CD45+, CDllb+, CDllb-, CD15+, CD15-, CD24+, CD24-, CD114+, CD114-, CD182+, CD182-, CD4+, CD4-, CD14+, CD14-, CDlla+, CDlla-, CD91+, CD91-, CD16+, CD16-, CD3+, CD3-, CD25+, CD25-, Foxp3+, Fox3p-, CD8+, CD8-, CD19+, CD19-, CD20 +, CD20-, CD24+, CD24, CD38+, CD38-, CD22+, CD22-, CD61+, CD61-, CD16+, CD16-, CD56+, CD56-, CD31+, CD31-, CD30+, CD30-, CD38+, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки представляют собой популяцию T-клеток, и популяция Т-клеток содержит по меньшей мере 50% клеток, которые представляют собой зрелые наивные монопозитивные CD8 или CD4 клетки. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки содержат по меньшей мере не больше или строго 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% зрелых наивных монопозитивных CD8 и/или CD4 клеток (или любой диапазон этих значений). В некоторых вариантах осуществления клетки экспрессируют TCR, связанный с экзогенной инвариантной естественной киллерной Т-клеткой (iNKT). В некоторых вариантах осуществления клетки дифференцированы in vitro из стволовых клеток или клеток-предшественников. В некоторых вариантах осуществления стволовые клетки или клетки-предшественники выбраны из эмбриональных стволовых клеток, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, мезодермальных клеток человека, мезодермальных клеток-предшественников, клеток-предшественников эмбриональных мезодермальных клеток человека, гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников, клеток, выделенных из костного мозга, клеток, выделенных из пуповинной крови, клеток, выделенных из периферической крови, клеток, выделенных из тимуса, или клеток, которые были дифференцированы из эмбриональных стволовых клеток (ESC) или
индуцированных in vitro, плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) В некоторых вариантах осуществления эндогенный TCR был супрессирован посредством аллельного исключения.
[0043] В дополнительных вариантах осуществления для
введения экзогенных нуклеиновых кислот в клетки или для
редактирования геномной ДНК могут быть использованы любые
композиции или способы генетической модификации, такие как
редактирование генов, гомологичная рекомбинация или
негомологичная рекомбинация, РНК-опосредованная генетическая доставка или обычные способы доставки нуклеиновых кислот. Неограничивающие примеры способов генетической модификации могут включать способы редактирования генов, например методики CRISPR/CAS9, с использованием нуклеазы цинковых пальцев или TALEN.
[0044] Генетическая модификация может также включать введение маркера селекции или скрининга, который облегчает селекцию или скрининг, или визуализацию in vitro или in vivo. В частности, in vivo визуализирующие агенты или "суицидные" гены могут быть экзогенно экспрессированы или могут быть добавлены к исходным клеткам или клеткам потомства. В дальнейших аспектах способы могут включать адаптивную клеточную терапию под визуальным контролем.
[0045] Аспекты настоящего описания относятся к способу
лечения пациента, включающему введение пациенту
дифференцированной in vitro Т-клетки или предшественника Т-
клетки, содержащих экзогенный TCR и/или CAR. В некоторых
вариантах осуществления рассматривается применение
дифференцированной in vitro Т-клетки или предшественника Т-клетки, содержащих экзогенный TCR и/или CAR. Экзогенный TCR может иметь любую определенную антигенную специфичность. В некоторых вариантах осуществления он будет выбран по отсутствию или сниженной аллореактивности у предполагаемого реципиента (примеры включают определенные вирус-специфичные TCR, ксено-специфические TCR или антиген-специфичные TCR при раке яичка). В примере, где экзогенный TCR не является аллореактивным, во время дифференцирования T-клеток экзогенный TCR подавляет
перегруппировку и/или экспрессию эндогенных локусов TCR посредством процесса развития, называемого аллельным исключением, что приводит к Т-клеткам, которые экспрессируют только неаллореактивный экзогенный TCR и, таким образом, они не являются аллореактивными. В некоторых вариантах выбор экзогенного TCR может необязательно определяться по отсутствию аллореактивности. В некоторых вариантах осуществления эндогенные гены TCR были модифицированы путем редактирования генома, так что они не экспрессируют белок. Способы генного редактирования, такие как способы, использующие систему CRISPR/Cas9, хорошо известны в данной области и описаны в настоящем изобретении.
[004 6] В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем изобретении способы относятся к стволовым клеткам или клеткам-предшественникам, экспрессирующим экзогенный TCR, и где способ, композиция или клетки дополнительно содержат вариант осуществления, описанный в настоящем изобретении. В этом случае стволовые клетки или клетки-предшественники могут быть дифференцированы in vitro. В некоторых вариантах осуществления стволовые клетки или клетки-предшественники представляют собой клетки CD34+.
[0047] В некоторых вариантах осуществления Т-клетка содержит экзогенный TCR и дополнительный антиген- или лиганд-распознающий рецептор. В некоторых вариантах осуществления дополнительный антиген-распознающий рецептор представляет собой антиген-распознающий рецептора, основанный на распознавании CDR (участок, определяющий комплементарность) . В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR включает белки, экспрессируемые из генов TCR-альфа и TCR-бета. В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR содержит белки, экспрессируемые из генов TCR-гамма и TCR-дельта. В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR включает белки, экспрессируемые из генов TCR-альфа и TCR-бета, а антиген-распознающий рецептор включает белки, экспрессированные из генов TCR-гамма и TCR-дельта. В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR содержит белки, экспрессируемые из генов TCR-гамма и TCR-дельта, а антиген-распознающий рецептор содержит белки, экспрессируемые из генов
TCR-альфа и TCR-бета.
[0048] В некоторых вариантах осуществления дополнительный
антиген-распознающий рецептор не является молекулой TCR. В
некоторых вариантах осуществления дополнительный антиген-
распознающий рецептор представляет собой молекулу химерного
антигенного рецептора (CAR). В некоторых вариантах осуществления
CAR является опухолевым антиген-специфичным CAR (то есть CAR,
который распознает опухолевой антиген). В некоторых вариантах
осуществления CAR является вирусным антиген-специфичным CAR (то
есть CAR, который распознает вирусный антиген). В этих вариантах
осуществления экзогенный TCR опосредует аллельное исключение во
время развития T-клеток, но при трансплантации пациентам
предполагаемая противоопухолевая или противовирусная
реактивность опосредуется CAR, а экзогенный TCR является инертным "пассажиром".
[004 9] В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR
является специфичным для первого антигена, а дополнительный
антиген-распознающий рецептор является специфичным для второго
антигена. Так создают Т-клетку с двойной специфичностью, одну
специфичность придает дополнительный антигенный рецептор, а
другую специфичность придает экзогенный TCR. В некоторых
вариантах осуществления первый и второй антигены являются
антигенами злокачественных клеток, экспрессируемыми
злокачественными клетками пациента. Например, у пациента может
быть известное злокачественное новообразование, или антигены
злокачественного новообразования у пациента могут быть
экспериментально определены. В некоторых вариантах осуществления
эти антигены известны в данной области как связанные со
злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах
осуществления антигены определены экспериментально. Например,
злокачественные клетки пациента могут быть выделены и
проанализированы на экспрессию белков клеточной поверхности или
на иммуногенные неоантигены. Если первый и второй антигены
являются злокачественными антигенами, экспрессируемыми
злокачественными клетками пациента, то Т-клетки обладают двойной специфичностью для одних и тех же злокачественных клеток.
Преимущество в данном случае заключается в ограничении ускользания от иммунологического надзора злокачественного новообразования, если один из антигенов будет потерян при антигенном ингибировании (или за счет других механизмов). Таким образом, экзогенный TCR, используемый для индукции аллельного исключения, придает функциональную противоопухолевую или противовирусную специфичность, приводящую к образованию Т-клеток с двойной мишеневой специфичностью. Примером может служить сконструированная неаллореактивная CAR-T-клетка, в которой CAR опосредует специфичность против опухолевого антигена А, а неаллореактивный TCR опосредует специфичность против опухолевого антигена В (последний МНС-ограниченным образом). Нацеливание на более чем один антиген, экспрессированный популяцией клеток-мишеней, может повысить эффективность и уменьшить вероятность пропуска резистентных клонов.
[0050] В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR представляет собой вирус-специфичный TCR, ксено-специфичный TCR, TCR, специфичный для злокачественных клеток, бактерия-специфичный TCR или антиген-специфичный TCR для рака яичек. Антигены, которые связывают экзогенный TCR, могут быть известны в данной области или могут быть экспериментально определены при анализе ответов T-клеток на клетки, экспрессирующие такие антигены.
[0051] В некоторых вариантах осуществления Т-клетки являются аллогенными для реципиента.
[0052] В некоторых вариантах осуществления пациент страдает злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления способ предназначен для лечения злокачественного новообразования у индивида. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование выбрано из рака легких, рака предстательной железы, рака яичников, рака яичек, рака мозга, рака кожи, меланомы, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака желудка, рака пищевода, рака трахеи, рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, рака печени, рака молочной железы, рака яичников, злокачественного новообразования в лимфатической системе, включая лимфому и множественную миелому, лейкоза,
саркомы кости или мягких тканей, рака шейки матки и рака вульвы.
[0053] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение антигена, который может быть очищен, конъюгирован с другими молекулами или презентирован клеткой или подобным клетке носителем, где антиген распознается экзогенным TCR. Это можно сделать для того, чтобы вызвать in vivo деление вводимых Т-клеток.
[0054] В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают приведение T-клеток в контакт с активирующей композицией перед введением пациенту. Например, Т-клетки могут быть активированы следующим образом:
Подгруппы Т-клеток
CTL
Thl/Th2
ТЫ7
Treg
Th2/Th9
Активированы
анти-
анти-
анти-
IFN-oc
IL6;
IL-2;
IL-4
с помощью
CD3/28;
CD3/CD28-;
CD3/CD28-;
IL-
IL-7;
анти-СБ2;
IL-2; РМА;
IL-2; РМА;
IL-15
IL-2, IL-
иономицин;
иономицин;
21, IL-15,
РИА;
РИА;
IL-7, РМА;
перванадат
ерванадат
иономицин;
РИА;
перванадат
[0055] Наборы для активации T-клеток также являются коммерчески доступными. Примеры наборов включают анти-биотиновые частицы (например, MACSiBead или DYNABEADS(r)) и биотинилированные антитела против CD2, CD3 и CD2 8 человека. Анти-биотиновые частицы с биотинилированными антителами используют для имитации антиген-презентирующих клеток и активации покоящихся Т-клеток РВМС, а также очищенных Т-клеток. Деление Т-клеток достигается путем культивирования и реактивации на 14-й день культивирования. Другие наборы могут включать напрямую конъюгированные анти-СБЗ/2 8 микробусы; комплексы мультимерных антител; или в них можно использовать антитела, нацеленные на альтернативные Т-клеточные белки, такие как CD2. Т-клетки также могут быть активированы, например, митогенами, такими как СопА, РНА и PWM.
[0056] В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR не является аллореактивным. Термин "неаллореактивный" относится к белку, который не вызывает иммунореактивность при трансплантации реципиенту. В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR является инертным, что означает, что он не вызывает клинически значимой токсичности.
[0057] В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется микробная инфекция или он подвержен риску ее развития. В некоторых вариантах осуществления у пациента был проведен тест на наличие микробной инфекции. В некоторых вариантах осуществления первый и второй антигены представляют собой вирусные антигены, экспрессированные одним и тем же типом вируса, или клетками, инфицированными указанным типом вируса. В некоторых вариантах осуществления первый и второй антигены являются антигенами бактериальных клеток, экспрессированными одной и той же бактерией или в клетках, инфицированных указанной бактерией. В некоторых вариантах осуществления первый и второй антигены представляют собой антигены микробных клеток, экспрессируемые клетками одно и того же микроба, или клетками, инфицированными указанным микробом.
[0058] В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR представляет собой специфический TCR NY-ES0-1.
[0059] В некоторых вариантах осуществления способ
дополнительно включает введение антиген-презентирующей клетки
пациенту. В некоторых вариантах осуществления антиген-
презентирующая клетка представляет собой дендритную клетку. В
некоторых вариантах осуществления антиген-презентирующая клетка
представляет собой искусственную антиген-презентирующую клетку.
В некоторых вариантах осуществления на антиген-презентирующую
клетку сажают антиген, который распознается экзогенным TCR.
Способы помещения антигена на антиген-презентирующую клетку
хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах
осуществления антиген-презентирующие клетки являются
аутологичными. Выделенные антиген-презентирующие клетки (которые могут быть выделены у пациента, получающего лечение) обычно обрабатывают агентом созревания, таким как IL-4 и/или GM-CSF.
Затем антиген-презентирующие клетки могут быть активированы антигеном (таким как антиген, специфичный для экзогенного TCR) с получением АРС, несущих антиген. В некоторых вариантах осуществления АРС, на которых находится антиген, культивируют (приводят в контакт) с провоспалительными цитокинами, такими как LPS, интерферон-гамма, TNF-a, IL-ip, IL-б и/или PGE2. Способ может дополнительно включать замораживание АРС, несущих антиген, оттаивание АРС, несущих антиген, и введение пациенту АРС, несущих антиген.
[0060] Экзогенный TCR также может быть использован для направленного аллельного исключения и/или придания антигенной специфичности или дополнительных функций сконструированным регуляторным/супрессорным Т-клеткам, полученным из стволовых клеток и клеток-предшественников, независимо от трансдукции дополнительным антигеном или лигандным рецептором.
[0061] В некоторых вариантах осуществления
дифференцированная in vitro Т-клетка сконструирована как регуляторная Т-клетка. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка дополнительно включает экспрессию F0XP3. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка сконструирована или выбрана для экспрессии F0XP3. В некоторых вариантах осуществления экспрессия F0XP3 является конститутивной. Экспрессия F0XP3 может придать регуляторную функцию Т-клетке. Следовательно, Т-клетки могут быть супрессорными Т-клетками, которые могут использоваться для подавления аутоиммунной реакции или аллореактивности у пациента. Возможными примерами такого подхода является введение экзогенного TCR в стволовые клетки или клетки-предшественники, которые также были сконструированы для получения Т-регуляторных клеток F0XP3 с аллельным исключением; в этом случае экзогенный TCR может необязательно быть выбран по пониженной аллореактивности.
[0062] В некоторых вариантах осуществления любого из вышеописанных способов индивид страдает или имеет риск развития аутоиммунного заболевания, реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) или отторжения трансплантата. Индивидом может быть
индивид, у которого такое заболевание диагностировано, или индивид, у которого на основании генетического или семейного анамнеза была определена предрасположенность к такому заболеванию. Индивидом может быть также индивид, который готовится к трансплантации, или которому была осуществлена пересадка. В некоторых вариантах осуществления этот способ предназначен для лечения аутоиммунного заболевания, РТПХ или отторжения трансплантата.
[0063] Также в рамках настоящего описания представлены сконструированные Т-клетки, например клетки, описанные в способах, приведенных в настоящем изобретении. Соответственно, некоторые аспекты относятся к in vitro дифференцированной Т-клетке, содержащей экзогенный TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой вирус-специфический TCR, ксено-специфический TCR, TCR, специфичный для злокачественных клеток, бактерия-специфичный TCR или антиген-специфичный TCR для рака яичек. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки дополнительно содержат дополнительный антиген- или лиганд-распознающий рецептор. В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR содержит белки, экспрессируемые из генов TCR-альфа и TCR-бета. В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR содержит белки, экспрессируемые из генов TCR-гамма и TCR-дельта. В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR представляет собой сконструированную молекулу, которая имитирует сигнальный путь TCR. В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR содержит белки, экспрессированные из генов TCR-альфа и TCR-бета, а антиген-распознающий рецептор включает белки, экспрессированные из генов TCR-гамма и TCR-дельта. В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR содержит белки, экспрессированные из генов TCR-гамма и TCR-дельта, а антиген-распознающий рецептор содержит белки, экспрессированные из генов TCR-альфа и TCR-бета. В некоторых вариантах осуществления дополнительный антиген-распознающий рецептор не является молекулой TCR. В некоторых вариантах осуществления дополнительный антиген-распознающий рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах
осуществления CAR представляет собой опухолевый антиген-
специфичный CAR. В некоторых вариантах осуществления CAR
представляет собой вирусный антиген-специфичный CAR. В некоторых
вариантах осуществления экзогенный TCR является специфичным для
первого антигена, а дополнительный антиген-распознающий рецептор
является специфичным для второго антигена. В некоторых вариантах
осуществления первый и второй антигены являются антигенами
злокачественных клеток, экспрессируемыми клетками
злокачественного новообразования. В некоторых вариантах осуществления первый и второй антигены представляют собой вирусные антигены, экспрессируемые вирусом или клетками, инфицированными указанным вирусом. В некоторых вариантах осуществления первый и второй антигены являются антигенами бактериальных клеток, экспрессированными клетками бактерии или клетками, инфицированными указанной бактерией. В некоторых вариантах осуществления экзогенный TCR представляет собой специфический TCR NY-ES0-1. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка дополнительно включает экспрессию F0XP3. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка сконструирована или выбрана для экспрессии F0XP3. В некоторых вариантах осуществления экспрессия F0XP3 является конститутивной.
[0064] В некоторых вариантах осуществления клетки содержат: CD4+CD8- Т-клетки, CD4~CD8+ Т-клетки, CD34+ CD7+ CDla+ клетки, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD8 + CD4- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO-CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CDla+ клетки, CD34+CD5+CD7+, CD34+CD5+CD7-, естественные киллерные Т-клетки или регуляторные Т-клетки, антиген-специфичные Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления исключены CD4+CD8~ Т-клетки, CD4~CD8+ Т-клетки, CD34+ CD7+ CDla+ клетки, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO-CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO-
CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD3+
TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CDla+ клетки,
CD34+CD5+CD7+, CD34+CD5+CD7-, ествественные киллерные Т-клетки,
регуляторные Т-клетки, антиген-специфичные Т-клетки. В некоторых
вариантах осуществления клетки содержат маркер клеточной
поверхности, описанный в настоящем изобретении, или клетки не
экспрессируют маркер клеточной поверхности, описанный в
настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления
клетки содержат внутриэпителиальные лимфоциты (IEL). В некоторых
вариантах осуществления внутриэпителиальные лимфоциты
представляют собой CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления исключены внутриэпителиальные лимфоциты, такие как CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8- и/или CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa.
[0065] Другие аспекты относятся к способу доставки агента к
экспрессирующим экзогенные TCR Т-клеткам пациента с указанными
Т-клетками, экспрессирующими экзогенные TCR, включающему
введение пациенту агента, конъюгированного с антигеном, где
антиген распознается экзогенным TCR. В некоторых вариантах
осуществления экзогенный TCR является инертным. В некоторых
вариантах осуществления агент является агентом уничтожения.
Например, агент может быть цитотоксическим агентом, который
уничтожает клетку при приведении агента-антигена в контакт с TCR
на поверхности клетки. Средства уничтожения включают, но не
ограничиваются ими, например, метотрексат, аминоптерин, б-
меркаптопурин, б-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил декарбазин;
алкилирующие агенты, такие как мехлорэтамин, тиоэпа хлорамбуцил,
мелфалан, кармустин (BSNU), митомицин С, ломустин (CCNU), 1-
метилнитрозомочевину, циклофосфамид, мехлорэтамин, бусульфан,
дибромманнитол, стрептозотоцин, митомицин С, цис-дихлордиамин
платины (II) (DDP) цисплатин и карбоплатин (параплатин);
антрациклины включают даунорубицин (ранее дауномицин),
доксорубицин (адриамицин), деторубицин, карминомицин,
идарубицин, эпирубицин, митоксантрон и бисантрин; антибиотики
включают дактиномицин (актиномицин D) , блеомицин, калихеамицин,
митрамицин и антрамицин (АМС); антимитотоические агенты, такие
как алкалоиды барвинка, винкристин и винбластин, паклитаксел
(таксол), рицин, экзотоксин Pseudomonas, гемцитабин, цитохалазин
В, грамицидин D, бромид этидия, эметин, этопозид, тенопозид,
колхицин, дигидрокси антрацин дион, 1-дегидротестостерон,
глюкокортикоиды, прокаин, тетракаина, лидокаин, пропранолол,
пуромицин, прокарбазин, гидроксимочевина, аспарагиназа,
кортикостероиды, митотан (О, Р'-(DDD) ) , интерфероны и смеси этих агентов уничтожения. Другие агенты уничтожения включают, но не ограничиваются ими, химиотерапевтические агенты, такие как карбоплатин, цисплатин, паклитаксел, гемцитабин, калихеамицин, доксорубицин, 5-фторурацил, митомицин С, актиномицин D, циклофосфамид, винкристин и блеомицин.
[0066] Дальнейшие аспекты связаны со способом in vitro селекции и выделения сконструированных Т-клеток по настоящему изобретению (то есть in vitro дифференцированной Т-клетки, экспрессирующей экзогенный TCR). Способ включает приведение композиции, содержащей Т-клетки, в контакт с агентом, который специфически связывается с экзогенным TCR с образованием комплекса areHT-TCR-экспрессирующая клетка, и очистку комплекса areHT-TCR-экспрессирующая клетка от композиции. Агентом может быть антитело, которое специфически связывается с экзогенным TCR, мультимером пептид-МНС или любой другой молекулой, которая специфически распознает экзогенный TCR. В некоторых вариантах осуществления агент присоединен к твердой подложке. Твердая подложка может быть бусиной (например, магнитной или сефарозной), пластиной, такой как чашка для культивирования ткани, покровное стекло или матрица. Твердая подложка также может быть очищающей колонкой. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение вторичной молекулы, которая специфически связывается с агентом. Вторичной молекулой может быть, например, вторичное антитело, которое связывается с первичным антителом. В некоторых вариантах осуществления вторичная молекула присоединена к твердой
подложке. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает отделение твердой подложки и связанных молекул от композиции. Разделение может быть выполнено путем смывания несвязанных молекул с твердой подложки и/или с помощью других методов разделения, таких как центрифугирование или разделение на колонке. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает промывку твердой подложки и связанных молекул один или несколько раз. В некоторых вариантах осуществления первичная или вторичная молекула может быть конъюгирована с флуоресцентной молекулой, и разделение может проводиться путем проточной цитометрии/сортировки клеток с активированной флуоресценцией. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает диссоциацию агента из комплекса areHT-TCR-экспрессирующая клетка. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает дополнительную очистку TCR-экспрессирующих клеток на основе включения или исключения других маркеров Т-клеток, например CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CCR7/CD197, CD62L, CD27, CD28 и CDla. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает культивирование очищенных TCR-экспрессирующих клеток. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает замораживание очищенных TCR-экспрессирующих клеток.
[0067] Другие аспекты относятся к способу создания in vitro дифференцированной Т-клетки, экспрессирующей экзогенный TCR, описанный в настоящем изобретении, где способ включает перенос экзогенного TCR или TCR-производного в стволовую клетку или клетку-предшественник иммунной клетки; и дифференцировку стволовой клетки или клетки-предшественника иммунной клетки в Т-клетку или клетку-предшественник Т-клетки. Дифференцирование может быть осуществлено способами, известными в данной области, или в соответствии с описанными в настоящем изобретении способами дифференциации/культивирования. В некоторых вариантах осуществления стволовая клетка или клетка-предшественник контактирует с когнатными молекулами МНС и/или пептидными молекулами перед, одновременно и/или после контакта с дифференцирующим агентом.
[0068] В некоторых вариантах осуществления дифференцировка стволовой клетки или клетки-предшественника иммунной клетки в Т-клетку включает одновременное культивирование стволовой клетки или клетки-предшественника иммунной клетки со стромальными клетками, эктопически экспрессирующими лиганд Notch. В некоторых вариантах осуществления стромальные клетки представляют собой клетки 0Р9. В некоторых вариантах осуществления лиганд Notch представляет собой дельта-подобный лиганд 1 (Dili). В некоторых вариантах осуществления лиганд Notch описан в настоящем изобретении или известен в данной области, например, описан в патенте США 7795404, который включен в настоящее описание в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает приведение одновременно культивируемых стволовых клеток или клеток-предшественников иммунных клеток и стромальных клеток в контакт с лигандом Flt-З и/или IL-7 и/или фактором стволовых клеток/лигадом Kit и/или тромбопоэтином. В некоторых вариантах осуществления дифференцировка стволовой клетки или клетки-предшественника иммунной клетки в Т-клетку включает: культивирование трехмерного (3D) клеточного агрегата, содержащего: а) выбранную популяцию стромальных клеток, которые экспрессируют экзогенный лиганд Notch; b) выбранную популяцию стволовых клеток или клеток-предшественников; в бессывороточной среде, содержащей добавку В-27(r), добавку В-27(r), не содержащую Хепо, добавку GS21TM, аскорбиновую кислоту, лиганд Flt-3, IL-7 или их комбинацию, с концентрацией, эффективной для получения Т-клеток из 3D клеточного агрегата, в котором 3D клеточный агрегат продуцирует Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает один или несколько вариантов осуществления, описанных ниже.
[0069] В некоторых вариантах осуществления популяция Т-клеток или композиция клеток содержат: CD4+CD8~ Т-клетки, CD4~CD8+ Т-клетки, CD34+ CD7+ CDla+ клетки, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-
CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+
CD27+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+
CDla+ клетки, CD34 + CD5+CD7 +, CD34 + CD5+CD7-, естественные
киллерные Т-клетки или регуляторные Т-клетки и/или антиген-
специфичные Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления
исключены CD4+CD8- Т-клетки, CD4~CD8+ Т-клетки, CD34+ CD7+ CDla+
cells, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-, CD3+
TCRab+ CD8+ CD4-, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+, CD3+
TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO-
CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+
TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-
CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CDla+ клетки, CD34+CD5+CD7+,
CD34+CD5+CD7-, естественные киллерные Т-клетки, регуляторные Т-
клетки и/или антигенспецифические Т-клетки. В некоторых
вариантах осуществления внутриэпителиальные лимфоциты
представляют собой CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa, или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления исключены внутриэпителиальные лимфоциты, такие как CD4- CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8- и/или CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa.
[0070] В некоторых вариантах осуществления популяция Т-клеток или композиция клеток содержит по меньшей мере или не более 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% (или любой диапазон этих значений) живых клеток с фенотипом и/или клеточным маркером, описанным в настоящем изобретении. Клетки могут быть выделены из АТО 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 недели (или любого производного диапазона этих значений).
[0071] В некоторых вариантах осуществления популяция Т-клеток или композиция клеток имеет соотношение 1:0,1, 1:0,2, 1:0,3, 1:0,4, 1:0,5, 1:0,6, 1:0,7, 1:0,8, 1:0,9, 1:1, 1:1,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4, 1:1,5, 1:1,6, 1:1,7, 1:1,8, 1:1,9, 1:2, 1:2,1, 1:2,2, 1:2,3, 1:2,4, 1:2,5, 1:2,6, 1:2,7, 1:2,8, 1:2,9, 1:3, 1:3,1, 1:3,2, 1:3,3, 1:3,4, 1:3,5, 1:3,6, 1:3,7, 1:3,8,
6, 1:6,1, 1:6,2, 1:6,3, 1:6,4, 1:6,5, 6,9, 1:7, 1:7,1, 1:7,2, 1:7,3, 1:7,4, 7,8, 1:7,9, 1:8, 1:8,1, 1:8,2, 1:8,3, 8,7, 1:8,8, 1:8,9, 1:9, 1:9,1, 1:9,2, 1:9,4, 1:9,5, 1:9,6, 1:9,7, 1:9,8, 1:9,9, 1:10, 1:10,5, 1:11, 1:11,5, 1:12, 1:12,5, 1:13, 1:13,5, 1:14, 1:14,5, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 или 1:50 (или любой диапазон этих значений) живые клетки:клетки с фенотипом и/или клеточным маркером, описанным в настоящем изобретении, или соотношение клетки с фенотипом и/или клеточным маркером, описанным в настоящем изобретении, или соотношение клетки с фенотипом и/или описанным в настоящем изобретении клеточным маркером:живые клетки.
[0072] Как используется в настоящем изобретении единственное число может означать один или несколько. Как используется в формуле изобретения настоящего документа, при использовании в сочетании со словом "содержащий", единственное число может означать один или несколько.
[0073] Использование термина "или" в формуле изобретения
используется для обозначения "и/или", если явно не указаны
только альтернативы, или альтернативы являются
взаимоисключающими, хотя в описании подтверждено определение, которое относится только к альтернативам и "и/или". Как используется в настоящем изобретении термин "другой" может означать по меньшей мере второй или более. Предполагается, что один или несколько вариантов осуществления, описанные в настоящем изобретении, могут быть специально исключены из формулы изобретения.
[0074] На протяжении всей заявки термин "приблизительно" используется для обозначения того, что значение включает в себя присущий вариант ошибки для устройства, метода, используемого для определения этого значения, или варианта, который имеется для исследуемых объектов.
[0075] Термин "состоящий из" или "по существу состоящий из" может быть заменен термином "содержащий" в любом варианте, описанном в настоящем изобретении.
[0076] Другие объекты, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из нижеследующего подробного описания. Следует понимать, однако, что подробное описание и конкретные примеры, с указанием предпочтительных вариантов осуществления изобретения, приведены только в иллюстративных целях, так как различные изменения и модификации в рамках сущности и объема изобретения станут очевидны специалистам в данной области из этого подробного описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0077] Приведенные ниже рисунки являются частью настоящего описания и включены для дополнительной иллюстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Изобретение может быть лучше понято посредством ссылки на один или несколько этих рисунков в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных в настоящем изобретении.
[0078] ФИГ. 1А-1В: Получение Т-клеток человека из пуповинной крови (СВ) CD34+HSPC в искусственных органоидах тимуса (АТО). CD34+ HSPC СВ были дифференцированы в течение 7 недель в АТО. А) Еженедельный анализ АТО, показывающий прогресс развития CD3+T CRaP+T-клеток ("ворота" для CD14- CD56- клеток для того, чтобы исключить моноциты и NK-клетки, соответственно). В) Еженедельный анализ АТО с воротами для клеток CD3+ TCRa|3+, показывающий развитие зрелых CD8+ и CD4+ Т-клеток.
[0079] ФИГ. 2А-2В: Получение антиген-специфичных TCR-сконструированных Т-клеток из CD34+ HSPC пуповинной крови в АТО и повышение позитивной селекции путем экспрессии молекулы МНС человека в АТО. CD34+ HSPC СВ были трансдуцированы лентивирусом, кодирующим TCR, специфичным для NY-ESO-I157-165 в контексте HLA-А*02:01 и дифференцированы в АТО в течение б недель. А) Получение зрелых наивных антигенспецифических CD8+ Т-клеток в АТО, что показано экспрессией TCR (обнаружено с использованием тетрамера HLA-A*02: OI/NY-ESO-I157-165) , CD3, CD8, CD45RA, CD27 и
CCR7. Каждая панель представляет собой последовательные ворота последней панели. В) Улучшение позитивной селекции и получения зрелых антигенспецифических Т-клеток в АТО, модифицированных и экспрессирующих HLA-A*02:01 в компарменте стромальных клеток АТО.
[0080] ФИГ. 3A-G: Эффективность и воспроизводимость развития Т-клеток человека в системе АТО. (а) Схема модели АТО.
(Ь) Кинетика дифференцировки Т-клеток из СВ CD34+CD3-HSPC в указанные недели ("ворота" для CD14-CD56- клеток для того, чтобы исключить миелоидные и NK-клетки, соответственно). (с) Поддержание клеток-предшественников тимических CD34+ Т-клеток с ранним фенотипом в АТО на основе двух схем классификации
("ворота" для CD34+ клеток, как показано в (b) ) . (d) Иммунофлуоресцентное окрашивание CD3 в 4-х недельных органоидах, продуцируемых клетками СВ HSPC и клетками MS-5 (слева) или MS5-hDLLl (то есть АТО) (справа) . (е) Итоговое увеличение клеток в биологическом репликате СВ АТО (п=18), инициированное 2-5х104 HSPC в соотношении HSPC к стромальным клеткам от 1:10 до 1:30.
(f) Встречаемость моноцитов (CD14+), NK-клеток (CD56+) или Т
(CD7+CD5+) ("ворота" для всех клеток); а также (д) встречаемость Т-клеток и клеток-предшественников ("ворота" для CD14-CD56-клеток) в б-и недельных биологических репликатах АТО (п=18).
[0081] ФИГ. 4А-С: Рекапитуляция тимопоэза и развитие наивных Т-клеток в АТО. Сравнение дифференцировки Т-клеток в период 12-й недели СВ АТО и постнатальных тимоцитов человека с "воротами" для (а) всех CD14-CD56- и (b) CD3 + TCRa|3+ клеток, (с) Получение незрелых (CD4 5RA-CD4 5RO+) и зрелых (CD4 5RA+CD4 5R0-) наивных Т-клеток в 12-и недельном АТО или тимусе ("ворота" для CD3 + TCRa.p+ клеток с указанными "субворотами" для CD8SP или CD4SP).
[0082] ФИГ. 5A-F: Получение Т-клеток из нескольких источников и подмножеств HSPC. Эффективное развитие Т-клеток на б-и недельных АТО стимулировали CD34+ CD3- HSPC пуповинной крови (СВ) человека, зрелого костного мозга (ВМ), G-CSF мобилизованной периферической крови (МРВ) или немобилизованной периферической
крови (РВ) . "ворота" для (а) всех CD14-CD56- клеток и (b) CD14-CD56-CD3 + TCRa.p+ Т-клеток. (с) Т-клеточная дифференцировка из гематопоэтических стволовых клеток (HSC) с обогащенными фракциями Lin-CD34 + CD38-, взятых из СВ, ВМ и МРВ на б-ой неделе АТО, "ворота" для CD14-CD56- или (d) CD14-CD56-CD3+TCRaP+ Т-клетки. (е) Т-клеточная дифференцировка в 3-й недельных АТО, стимулированная зрелыми HSC ВМ и подгруппами клеток-предшественников с "воротами" для CD14-CD56- клеток и (f) CD34+ клетки, как показано на (е).
[0083] ФИГ. 6А-Е: Многообразие TCR и функция Т-клеток, полученных из АТО. (а) Получение физиологического многообразия TCR в CD8SP Т-клетках 7-и недельных АТО (п=5) или тимуса человека (п=4), как показано с помощью анализа проточной цитометрии с использованием VP TCR. (Ь) Внутриклеточное окрашивание на продукцию интерферона у и IL-4 в отсортированных клетках DP, CD8SP и CD4SP, полученных в АТО и обработанных РМА/иономицином в течение 12 часов, (с) Пролиферация (разведение CFSE) и активация (повышение активности CD25) клеток CD8SP, полученных из АТО, в ответ на анти-СОЗ/С028 и IL-2. (d) Сопоставимые ответы CD8SP клеток, выделенных из АТО, стимулированных HSPC пуповинной крови (СВ), костного мозга (ВМ) или мобилизованной периферической крови (МРВ), как показано по продукции интерферона у в ответ на РМА/иономицин (показано в сравнении с анализом пустого канала), и (е) сопоставимое in vitro увеличение клеток по сравнению с начальным количеством клеток в ответ на анти-СВЗ/СБ28 и IL-2.
[0084] ФИГ. 7A-G: Дифференцировка и исключение аллелей Т-
клеток с сконструрованными TCR в АТО. (а) Эффективное получение
HLA-A*0201/NY-ESO-li57-i65 специфичных Т-клеток со
сконструированными TCR в 7-и недельных АТО, стимулированных TCR-
трансдуцированными (верхний ряд) или ложно трансдуцированными
(нижний ряд) HSPC СВ. На графиках показаны "ворота" для CD14-
СБ5б-клеток и последующие "субворота", указанные выше каждого
графика. (Ь) Повышенное общее количество клеток в б-и недельных
TCR-трансдуцированных АТО по сравнению с ложно
трансдуцированными АТО давало ЗхЮ4 HSPC СВ при соотношении 1:20
HSPC к стромальным клеткам, (с) Увеличение количества клеток в
5-и недельных TCR-трансформированных АТО за счет уменьшения
количества как HSPC, так и стромальных клеток. АТО продуцировали
либо с ЗхЮ4, либо 7,5хЮ3 TCR-трансдуцированными HSP СВ при
соотношении 1:20 HSPC к стромальным клеткам, (d) Цитотоксическое
праймирование CD8SP Т-клеток с трансдуцированными TCR,
продуцированных АТО. Продукция интерферона у и мобилизация
мембраны CD107a после совместного культивирования с клетками
К5 62 или искусственными К5 62 АРС, экспрессирующими CD8 0 и
родственный пептид-МНС (Т-клетки с "воротами" для
CD3 + TeTpaMep+CD8SP) . (е) Увеличение количества CD8SP Т-клеток TCR-трансдуцированных или ложно трансдуцированных АТО в ответ на анти-СБЗ/СБ28 и IL-2. (f) Многообразие VJ3 TCR в CD8SP клетках TCR-трансдуцированных (п=3) или нетрансдуцированных (п=5) АТО. Количество V|3, определяемое проточной цитометрией, с "воротами" для TeTpaMepa+CD3+CD8SP клеток TCR-трансдуцированных АТО (п=3) или CD3+CD8SP клеток из нетрансдуцированных АТО (n=5). (д) Характерные графики проточной цитометрии (f) , показывающие увеличение трансдуцированной цепи V|313.1 в TeTpaMep+CD3 + CD8SP клетках TCR-трансдуцированных АТО. CD3+CD8SP Т-клетки нетрансдуцированных АТО или тимуса человека показаны для сравнения.
[0085] ФИГ. 8А-С: Улучшенная позитивная селекция Т-клеток
со сконструированными TCR МНС-модифицированных АТО. (а) Схема
подхода к моделированию гемопоэтической и/или стромальной
"ауто"экспрессии МНС в АТО. Гематопоэтическая экспрессия HLA-
А*02:01 достигалась с помощью донорных единиц СВ с типом HLA, и
стромальная экспрессия достигалась путем трансдукции клеток MS4-
hDLLl лентивирусом, экспрессирующим HLA-A*02:01. Все HSPC были
трансдуцированы NY-ESO-1-специфическим TCR с рестрикцией HLA-
А*02:01. (Ь) Синергетические эффекты стромальной и
гемопоэтической "ауто"экспрессии МНС на позитивную селекцию тетрамер+С08ЭР Т-клеток в АТО. Клетки селектировали по "воротам" для CD14-CD56-, и последующие "субворота" показаны выше
графиков. (с) Улучшенное созревание Т-клеток со
сконструированными TCR до фенотипа зрелых наивных Т-клеток в АТО и экспрессией стромальных клеток HLA-A*02:01, как показано по увеличению CD45RA, CD27 и CCR7 и снижению CD45RO и CDla. На всех графиках показаны "ворота" для TeTpaMep+CD3+CD8SP Т-клеток.
[0086] ФИГ. 9А-В: Деление клеток АТО и дифференцировка Т-клеток связаны с числом HSPC и соотношением HSPC:стромальные клетки. Данные о клеточном делении и количеством Т-клеток из б-и недельных АТО, полученных с (а) различным числом CD34+CD3- HSPC СВ и постоянным числом стромальных клеток (MS5-hDLLl) или (Ь) различным числом HSPC и стромальных клеток. Оптимальное суммарное деление и увеличение зрелых Т-клеток наблюдалось при наименьшем числе HSPC на входе к АТО (7500 клеток) и при соотношении HSPC и стромальных клеток 1:20-1:40.
[0087] ФИГ. 10A-G: Т-клеточная дифференцировка в АТО в высокой степени воспроизводима и не подвержена воздействию партий добавок В27, В27 без Хепо, или стромальной иррадиации. Отсутствие значительного эффекта различных партий В27 на (а) общий выход клеток АТО, (Ь) дифференцировку миелоидных (CD14+) или NK-клеток (CD56+) или (с) дифференцировку В-клеток (CD19+) или Т-клеток в б-и недельных АТО, продуцированных из одного образца СВ и культивированных с 4 различными партиями добавки В27 (с маркировкой A-D). Технический повтор АТО (п=2-3) показан для каждой партии В27. Все АТО начинались с ЗхЮ4 HSPC при соотношении HSPC к стромальным клеткам 1:20. (d) Замена добавки В27 на добавку В27 без Хепо не повлияла на количество клеток или (е) дифференцирование Т-клеток в б-и недельных АТО. (f) АТО, продуцируемые клетками MS5-hDLLl, облученными в указанных дозах, показали сопоставимую Т-клеточную дифференцировку ("ворота" для всех СВ14-СБ5б-клеток) или (д) "ворота" для CD3 + TCRa|3+ клеток, как показано в (f).
[0088] ФИГ. 11А-С: Улучшенная позитивная селекция в АТО по сравнению с системами монослоев. (а) Улучшенная Т-клеточная позитивная селекция и созревание в АТО (то есть MS5-hDLLl в 3D культуре с RB2 7) по сравнению с монослойными со-культурами. б-и
недельные монослойные культуры (слева) сравнивали с 3D органоидными культурами (справа) и также поводили сравнительные перекрестные сравнения с 0P9-DL1, как указано. Стандартной средой для монослойных со-культур 0P9-DL1 была среда МЕМа/2 0% FCS, а стандартной средой для АТО была среда RB2 7, как описано в разделе Способы. Также показаны монослойные культуры или культуры органоидов с использованием родительской линии клеток MS-5 (не трансдуцированы DLL1). На всех графиках показаны "ворота" для С014-С045-клеток или "субворота" для CD3 + TCRa|3+, как указано выше. (Ь) Процент и (с) кратность деления релевантных клеточных популяций в стандартных монослойных культурах 0P9-DL1 по сравнению с б-и недельными АТО. Культуры инициировали параллельно, используя одни и те же единицы СВ. АТО начинали с ЗхЮ4 HSPC при соотношении HSPC к стромальным клеткам 1:20.
[0089] ФИГ. 12А-С: Рекапитуляция тимопоэза и фенотипов наивных Т-клеток в АТО. (а) Прогрессивная дифференцировка CD3 + TCRa|3+CD8SP и CD4SP клеток в АТО между 6-10 неделями. АТО культивировали параллельно от одного и того же донора HSPC СВ и последовательно анализировали в указанные недели. Клетки селектировали по "воротам" для CD14-CD56-TCRa.p+CD3 + клеток, а последующие "субворота" (CD8SP или CD4SP) указаны выше графиков. (Ь, с) Дополнительные маркеры, характеризующие наивные CD8SP и CD4SP Т-клетки, полученные из 12-и недельных АТО, сравнивали с соответствующими популяциями в тимусе человека. Все клетки селектировали по "воротам" для CD14-CD56-CD3 + TCRa.p+ и "субворотам" для (b) CD8SP или (с) CD4SP клеток.
[0090] ФИГ. 13A-F: Продукция Т-клеток из нескольких источников и подгрупп HSPC. (а) Поддержание CD34+ клеток в б-и недельных АТО из различных образцов пуповинной крови (СВ) человека, зрелого костного мозга (ВМ), мобилизированной периферической крови G-CSF (МРВ) или HSPC немобилизированной периферической крови (РВ) . (Ь) Подгруппа клеток-предшественников Т-клеток с фенотипом CD34+ с "воротами" для CD34+ клеток, как показано в (а) . (с) Кратность деления всех клеток и релевантных
подгрупп Т-клеток в б-и недельных АТО, используя источники HSPC, как показано в (а) . Кратность деления зависит от начального количества HSPC. АТО начинали с ЗхЮ4 CD34+CD3-HSPC клеток на АТО при соотношении HSPC к стромальным клеткам 1:20. (d) Поддержание CD34+ клеток и (е) предшественники Т-клеток с фенотипом CD34+ в б-и недельных АТО, инициированных из фракций гемопоэтических стволовых клеток (HSC), обогащенных (Lin-CD34+CD38-) из различных источников HSPC. (f) Кратность деления всех клеток в 3-х недельных АТО, инициированных очищенными подгруппами гемопоэтических клеток ВМ и подгрупп клеток-предшественников. АТО начинали с 2-4x104 клеток каждой популяции на АТО при соотношении HSPC к стромальным клеткам 1:15-1:40. Данные относятся к исходному количеству HSPC.
[0091] ФИГ. 14А-В: Эффективность и воспроизводимость развития Т-клеток человека в системе АТО. (а) Количество типов клеток в б-и недельных АТО. Верхняя панель: количество моноцитов
(CD14+), NK-клеток (CD56+), В-клеток (CD19+), HSPC (CD34+) или Т-клеточных линий (CD7+CD5+) ("ворота" для всех живых клеток). Средняя панель: предшественники Т-клеток и количество TCR+ Т-клеток ("ворота" для CD14-CD56- клеток). Нижняя панель: количество DP и зрелых монопозитивных (SP) CD8 и CD4 Т-клеток
("ворота" для CD3 + TCRa.p+ клеток) . (Ь) Общее количество клеток и CD3 + TCRa.p+CD8SP Т-клеток, продуцированных в б-и недельных АТО с 7,5-22,5хЮ3 HSPC СВ на АТО. Данные показаны для 11 биологических повторов (полосы ошибок указывают на стандартное отклонение).
[0092] ФИГ. 15A-D: Продукция Т-клеток из нескольких источников и подгрупп HSPC. (а) Дифференцировка Т-клеток в течение 12 недель в АТО, продуцированных из 7500 CD34+CD3-клеток, выделенных из СВ, неонатального тимуса, ВМ или МРВ. Среднее и SD количество клеток-предшественников Т-клеток и зрелых Т-клеток показано для трех технических повторов на ткань, и данные представляют два разных эксперимента. (Ь) Число всех клеток и CD3 + TCRaP+CD8SP Т-клеток из АТО, показанных в (а) . (с) Потенциал дифференциации Т-клеток зрелых ВМ HSPC (CD34+lin-) и подгрупп клеток-предшественников (LMPP и CLP) в б-и недельных
АТО (ворота указаны) . (d) Число всех клеток и CD3 + TCRa|3+CD8SP Т-клеток из АТО, показанных в (с) . Показаны среднее значение и SD технических триплексов, и данные представляют три биологических повтора.
[0093] ФИГ. 16A-F: Разнообразие TCR и функция Т-клеток, полученных из АТО. (а) Получение разнообразия TCR в CD3+TCRaP+CD8SP Т-клетках из 7-и недельных АТО (п=5) или тимуса человека (п=4), как показано с помощью анализа проточной цитометрии частоты экспрессии семейства VP TCR. (b) Многообразие
клонотипов TCR в CD3+TCRaP+CD8SP Т-клетках из АТО, тимуса и наивных Т-клеток периферической крови (РВ) путем глубокого секвенирования Va TCR и (с) областей VP CDR3 TCR. Показано количество отдельных клонотипов. Данные представляют три биологических повторения. (d) Получение полифункциональных цитокинов с помощью полученных из АТО CD3 + TCRa.p+CD8SP Т-клеток, обработанных РМА/иономицином в течение б часов. Данные представляют три разных эксперимента. (е) Пролиферация (разведение CFSE) и активация (увеличение CD25 и 4-1ВВ) CD3 + TCRa.p+CD8SP клеток, полученных из АТО, через 5 дней в ответ на aHTH-CD3/CD28 и IL-2. Данные представляют два самостоятельных эксперимента. (f) Пост-АТО деление CD3+TCRaP+CD8SP Т-клеток, полученных из АТО, по сравнению с исходным числом клеток в ответ на aHTH-CD3/CD28 и IL-2 через 7 и 14 дней. Показаны среднее значение и SD технических триплексов, и данные представляют три биологических повтора.
[0094] ФИГ. 17A-F: Дифференцировка и аллельное исключение Т-клеток со сконструированными TCR в АТО. (а) Коэкспрессия CD8a
и CD8P и отсутствие экспрессии CD56 и CD16 на CD3 + TCRa.p+TeTpaMep+ Т-клетках из TCR-трансдуцированных АТО СВ, что указывает на обычное развитие Т-клеток. Данные представляют собой 3 биологических повтора. (Ь) Повышенный общий выход клеток и выход клеток относительно исходного числа HSPC в TCR-трансдуцированных по сравнению с ложно-трансдуцированными АТО на б или 7 неделе, продуцируемыми 7,5-18х103 исходными HSPC СВ. Показаны среднее и
SD биологических повторных экспериментов (ложно- n=3, TCR п=8, **р=0,002). (с) Цитотоксическое праймирование Т-клеток с сконтруированными TCR, полученных из АТО, с помощью искусственных антиген-презентирующих клеток (аАРС). Продукция цитокинов и мембранная мобилизация CD107a CD3+TeTpaMep+CD8SP Т-клеток в ответ на клетки К562 или аАРС К562, которые экспрессируют CD80, и одноцепочечные тримеры HLA-A*02:01, запусакающие презентацию нерелевантного (MARTI26-35) или когнатного (NY-ESOI156-165) пептида. Данные представляют собой три биологических повторения. (d) Пролиферация (разведение CFSE) и активация (повышение CD25) CD3+TeTpaMep+CD8SP Т-клеток, полученных из АТО, в ответ на нерелевантные (MART1) или когнатные (NY-ES0-1) аАРС в течение 72 часов. Данные представляют два биологических повтора. (е) Пост-АТО деление CD3+TCRaP+CD8SP Т-клеток, полученных из АТО, из TCR-трансдуцированных АТО по сравнению с исходным числом клеток в ответ на анти-СОЗ/С028 и IL-2 или IL-7/IL-15 через 7 и 14 дней. Показаны среднее значение и SD технических триплексов, и данные представляют три биологических повтора, (f) Аллельное исключение эндогенного VP TCR в CD3+TCRaP+TeTpaMep+CD8SP клетках из TCR-трансдуцированных (п=3) по сравнению с нетрансдуцированными
(п=5) АТО, как показано с помощью анализа проточной цитометрии. Величины ошибок представляют собой SD.
[0095] ФИГ. 18A-F: Антиген-специфическое уничтожение
опухолевых клеток с помощью Т-клеток со сконструированными TCR,
продуцируемых АТО. (а,Ь) Цитотоксичность in vitro Т-клеток со
сконструированными TCR, продуцируемых АТО, в отношении антиген-
положительных опухолевых клеток. CD8SP Т-клетки из HLA-
А*02:01/ОТ-ЕЗО-1157-165-специфичных TCR-трансдуцированных АТО
активированы с помощью анти-СОЗ/28+1Ъ-2 в течение 36 часов и их
совместно инкубировали с клетками К5 62, клетки К5 62
трансдуцировали одноцепочечными тримерами HLA-A*02:01,
презентирующими (MART126-35) или когнатный (NY-ESO1156-165) пептид
(K562-MART-1 и K562-ESO, соответственно), или HLA-A*02:01+NY-ESO-1+U2 6 6 клеточной лини множественной миеломы. (а) Процент
ранних (аннексии V+DAPI-) или поздних (аннексии V+ DAPI+)
апоптотических опухолевых клеток определяли проточной
цитометрией в 9 часов. Соотношение эффектор:мишень (Е:Т)
рассчитывали на основе процента тетрамер+ Т-клеток в начале
совместного культивирования. Данные представляют собой два
биологических повтора. (Ь) Специфическая гибель клеток для
анализов цитотоксичности, показанных в (а). Общее число аннексии
V+ клеток было скорректировано для спонтанной (неспецифической)
клеточной смерти в лунках, в которых не были добавлены Т-клетки.
(с) Сохраняющаяся антиген-специфичность после длительной пост-
АТО активации/деления Т-клеток. CD8SP Т-клетки, выделенные из
TCR-трансдуцированных АТО, делились в течение 14 дней вместе с
анти-СБЗ/2 8 и IL-2 и проводили анализы цитотоксичности, как
описано в (а) . Для сравнения приведены анализы с использованием
TCR-трансдуцированных CD8+ Т клеток периферической крови донора
после деления в течение 14 дней в одинаковых условиях, (d-f) in
vivo контроль опухоли с помощью Т-клеток с сконстуированными TCR
из АТО. CD8SP Т-клетки TCR-трансдуцированных АТО были
активированы/делились в течение 14 дней, как описано в (с) . (d)
5,7х106 Т-клетки (включая Т-клетки 4,5х106 антиген-специфичные Т-
клетки при окрашивании тетрамером) или PBS вводили путем
внутривенной инъекции мышам NSG, которым подкожно имплантировали
за 3 дня до этого 2,5х105 опухолевыми клетками K562-ESO или К562-
MART, трансдуцированными люциферазой. (е) Ответ опухолевых
клеток K562-ESO по сравнению с K562-MART1 на CD8SP АТО.
Биолюминесценцию регистрировали в указанные моменты времени.
Показаны средние и SD для 2-3 мышей на группу (PBS n=2, TCR-
трансдуцированные Т-клетки АТО с K562-ESO п=3 или K562-MART1
п=2) (**р=0,00033, ****р=0,000066). (f) Изображение
биолюминесценции выбранных мышей из анализов, описанных в пунктах (d) и (е) . Обратите внимание, что средний ряд показывает единственную мышь из всех трех мышей, несущих K562-ESO, обработанных Т-клетками CD8SP АТО, у которой росла опухоль.
[0096] ФИГ. 19: АТО образуют твердые тканеподобные структуры. Окрашивание гематоксилином и эозином, показывающее
тканевую архитектуру б-и недельных 3D культур, образуемых HSPC СВ и MS5-hDLLl (то есть АТО) (слева) , родительские клетки MS-5 (в центре) или только клетки MS5-hDLLl (справа). 100-кратное увеличение (верхний ряд) или 400-кратное увеличение (нижний ряд) .
[0097] ФИГ. 20А-В: Первоначальное число HSPC на АТО влияет на клеточный выход на каждую HSPC, но не на общий выход клеток или Т-клеточную дифференцировку. (а) Общее количество клеток и выход на каждое начальное число HSPC на б-ой неделе АТО, полученных с различным количеством CDSP+CD3 HSPC СВ (0,3-30x10 3 на АТО) и постоянное количество стромальных клеток MS5-hDLLl
(1,5х105 за АТО) . Сравнение показано справа с более крупными АТО
(используя ЗОхЮ3 HSPC и бхЮ5 стромальные клетки при соотношении 1:20). (Ь) Предшественники Т-клеток и количество зрелых Т-клеток в АТО, как описано в (а) . Показаны среднее и SD АТО в трех повторах. Данные представляют собой два биологических повтора.
[0098] ФИГ. 21А-К: Т-клеточная дифференцировка в АТО в высокой степени воспроизводима и не подвержена воздействию партий добавок В2 7, В2 7 без Хепо, или стромальной иррадиации. Отсутствие значительного эффекта различных партий В27 на (а) детерминацию Т-клеточной дифференцировки или (Ь) общее количество клеток в б-и недельных АТО, продуцированных из одного образца СВ (7,5х103 CD34+CD3- HSPC на АТО) и культивированных с 4 различными партиями добавки В27 (с маркировкой A-D) . Репликация АТО (п=2-3) показана для каждой партии В27. (е) Замена добавки В27 на добавку В27 без Хепо не оказала существенного влияния на дифференцировку Т-клеток или (f) общее количество клеток в б-и недельных АТО. Облучение стромальных клеток MS5-hDLLl 20-80 Гр перед образованием АТО мало влияло на дифференцировку Т-клеток
(g-i) или (j) на общее число CD3 + TCRa|3+CD8SP Т-клеток. Показаны среднее и SD АТО в трех повторах. Данные представляют собой два самостоятельных эксперимента. Диаграммы проточной цитометрии в
(h) показывают Т-клетки с "воротами" для CD3 + TCRa|3+, показанные в (д) . (к) Сбор клеток из АТО путем механического разрушения через б недель давал суспензию из > 99% гемопоэтических CD45+
клеток (вверху) и <0,5% GFP+ стромальных клеток (внизу). Количество клеток человека и мыши показана для 8 биологических повторов АТО.
[0099] ФИГ. 22: Улучшенная позитивная селекция в АТО по сравнению с системами монослойных культур. Число моноцитов (CD14+), NK-клеток (CD56+), В-клеток (CD19+), HSPC (CD34+) или Т-клеточных линий (CD7+CD5+) и клеток-предшественников Т-клеток и число Т-клеточных типов в монослойных культурах 0P9-DL1 по сравнению с АТО через б недель (последовательные ворота указаны на каждом графике). Культуры начинали с использования той же единицы СВ для монослоев и культур АТО. Данные представляют собой три биологических повтора.
[0100] ФИГ. 23А-В: Рекапитуляция тимопоэза и фенотип наивных Т-клеток в АТО. (а) Число клеток HLA-DR+ в АТО СВ по сравнению с постнатальным тимусом ("ворота" для CD45+ клеток). (Ь) Множественные популяции HLA-DR+ антиген-презентирующих клеток (АРС) присутствуют в б-и недельных АТО. Над каждым графиком показаны последующие "ворота". HLA-DR+ популяции включают моноциты (CD14+), гранулоциты (CD66b+), В-клетки (CD19+), HSPC (CD34+), плазмоцитоидные DC (CD303+CD123+), CLEC9A+ DC (CD141 + CLEC9A+) и CDlc+ DC (CDlc+CLEC9A-) . Для сравнения показан парный анализ из постнатального тимуса. Данные в (а) и (Ь) представляют собой три биологических повтора.
[0101] ФИГ. 24А-В: Раннее начало коммитирования Т-клеток из LMPP и CD24-CLP в 3-недельных АТО, обнаруживаемое по (а) раннему появлению DP и (Ь) по клеткам-предшественникам Т-клеткам, коммитированным по CD34+CD7+. Данные в Ь) представлены для "ворот" для CD34+ клеток, как показано в а) . Данные представляют собой два биологических повтора.
[0102] ФИГ. 25А-Е: Разнообразие TCR и подтверждение функциональности Т-клеток, полученных из АТО. (a) RAG1 и RAG2 экспрессируются в CD3+CD4+CD8+ (DP), полученных из АТО, но в не зрелых CD3+CD8SP Т-клетках, аналогичных тимоцитам человека. Количественный ОТ-ПЦР анализ для RAG1 и RAG2 показан относительно экспрессии В2М в FACS-сортированных популяциях Т-клеток, полученных из АТО и постнатального тимуса. Показаны
среднее и SD реакций в трех повторах. (Ь) Получение разнообразия TCR в CD3 + TCRa|3+CD8SP Т-клетках, выделенных из 7-и недельных АТО (п=5) или тимуса человека (п=4), как показано с помощью анализа проточной цитометрии частоты экспрессии семейства VP TCR. (с) Продукция цитокинов из 12-и недельных АТО CD4SP Т-клеток, обработанных РМА/иономицином в течение б часов. Данные представляют два биологических повтора. (d) Пролиферация (разведение CTV) и активация (увеличение CD25) пуповинной крови (СВ) и CD4SP Т-клеток, полученных из АТО (12-и недельные), через 5 дней в ответ на анти-СОЗ/С028 и IL-2. Данные представляют два самостоятельных эксперимента. (е) Пост-АТО деление CD4SP Т-клеток, полученных из АТО, по сравнению с исходным числом клеток в ответ на анти-СВЗ/СБ28 и IL-2 через 7 и 14 дней. Показаны среднее значение и SD технических трехкратных повторов.
[0103] ФИГ. 26A-D: Дифференцировка и аллельное исключение Т-клеток со сконструированными TCR в АТО. (а) Т-клетки со сконструированными TCR, полученные из АТО, сохраняют обычный фенотип Т-клеток, несмотря на деление и повторное стимулирование. CD8SP Т-клетки из АТО, продуцированные из HSPC СВ, трансдуцированные HLA-A*0201/NY-ESO-li57_i65 специфическими TCR активировали бусами с анти-СОЗ/28+1Ъ-2, увеличенными по IL-2, и повторно стимулировали бусами с анти-СБЗ/28 на 14-й день. Сохраненная поверхностная коэкспрессия CD8a и CD8P были подтверждены проточной цитометрией. Данные характерны для двух биологических повторов. (Ь) Проточный цитометрический анализ VP CD3+TCRaP+TeTpaMep+CD8SP Т-клеток из TCR-трансдуцированных АТО СВ. Данные характерны для 5 биологических повторов. (с) Образование Т-клеток со сконструированными TCR из TCR-трансдуцированных HSPC СВ в АТО, используя HLA-A* 02 : 01/MARTl26-35 специфический TCR. Показана дифференцировка на б-й неделе ("ворота" для всех CD14-CD56- клеток из АТО, с последующими "воротами", показанными выше каждого графика). Данные представляют собой два биологических повтора. (d) Антиген-специфическое праймирование MAR-1 специфических и NY-ES0-1-специфических Т-клеток со сконструированными TCR, продуцируемых
АТО, с помощью искусственных антиген-презентирующих клеток (аАРС), которые экспрессируют CD80 и HLA-A*02:01 одноцепочечный тример, презентируя пептид MARTl26-35 или NY-ESOI156-165 • Показана мембранная мобилизация CD107a и внутриклеточное окрашивание IFNy на б ч.
[0104] ФИГ. 27А-В: Улучшенная позитивная селекция Т-клеток со сконструированными TCR в АТО с модифицированным МНС. (а)
Улучшенная продукция CD3 + TCRa|3+TeTpaMep+CD8SP Т-клеток с
созданными TCR в б-и недельных АТО, продуцируемых TCR-
трансдуцированными HSPC СВ из одного донора и либо стандартными,
либо HLA-A* 02:01-трансдуцированными М35-ЬБЪЫ-стромальными
клетками. Последующие "ворота" показаны над каждым графиком. (Ь) Нормальное созревание Т-клеток с созданными TCR до зрелого фенотипа наивных Т-клеток в АТО с модифицированными МНС, как показано в (а) . Клетки селектированы по "воротам" для CD3+V|3l3. l + TeTpaMep+CD8SP Т-клеток. Данные представляют собой три биологических повтора.
[0105] ФИГ. 28А-С: Немодифицированная линия стромальных клеток HS27a человека не поддерживает дифференцировку Т-клеток. Линию стромальных клеток человека (HS27a) использовали в системе АТО без вектор-опосредованной экспрессии лиганда Notch. Были тестированы CD34+ HSPC трех разных образцов пуповинной крови:
(а) Е37, (b) Е43, (с) Е68. На 4-ой неделе ни один из доноров пуповинной крови не мог продуцировать CD5+CD7+ Т-клетки, коммитированные по отсутствию сигнального пути Notch. Показаны данные для "ворот" для CD45+CD56-CD14-, если не указано иное.
[0106] ФИГ. 29A-F: экспрессия лиганда Notch в линии стромальных клеток HS27a человека может поддерживать дифференцировку Т-клеток в АТО. Показаны данные из АТО, полученного с помощью HS27a, сконструированных с помощью лентивирусной трансдукции и экспрессирующих hDLLl. CD34+ HSPC тех же трех образцов пуповинной крови, показанных На ФИГ. 28:
(a, b) Е37, (с, d) Е43 и (е, f) Е68. Данные с использованием HS27a-hDLLl АТО сравнивают с данными, полученными с использованием стромальных клеток MS5-hDLLl в качестве
положительного контроля. На 4-й неделе все три донора пуповинной крови продуцировали CD5+CD7+ коммитированные Т-клетки в обоих HSA-hDDLl и MS5-hDLLl АТО. Показаны данные для "ворот" для CD45+CD56-CD14-, если не указано иное.
[0107] ФИГ. 30: Большинство CD8+ клеток, полученных в 4-х недельных HS27a-DLLl АТО, не экспрессируют CD3 или TCRab. Показаны данные сравнения MS5-hDLLl АТО и HS27a-DLLl АТО.
[0108] ФИГ. 31А-С: HS27a-hDLLl АТО могут поддерживать дифференцировку зрелых Т-клеток. Дифференцировка Т-клеток в MS 5-hDLLl АТО и HS27a-hDLLl АТО (через четыре недели) показана с использованием трех различных групп пуповинной крови (а) Е37, (b) Е43, (с) Е68. Показаны данные для "ворот" CD45+CD56-CD14- с дополнительными "воротами" для CD3+TCRab на правых панелях.
[0109] ФИГ. 32А-В: Дифференцировка Т-клеток из клеток-предшественников клеток эмбриональной мезодермы человека (hEMP) (полученных из hESC) в 5-й недельной АТО. В (а) показаны "ворота" для популяции CD56-CD14- Т-клеток. В (Ь) показаны "ворота" для CD56-CD14- клеток с дополнительными "воротами", как показано (нижний ряд).
[ОНО] ФИГ. ЗЗА-В: Кинетика Т-клеточной дифференциации из hEMP в АТО. В (а) показаны "ворота" для популяции, показанных через 3, 5 и 7 недель. В (Ь) показаны дополнительные анализы дифференциации на 7-ой неделе, показывающие, что CD3+TCRab клетки представляют собой CD8ab+.
[0111] ФИГ. 34А-В: hES-производные hEMP продуцируют Т-клетки со зрелым фенотипом наивных клеток. Показаны анализы на 5-й неделе АТО: (а) популяция TCRab+CD3+ состоит из CD4+ и CD8 + клеток и DP-клеток. Дополнительный анализ (Ь) клеток CDSP8 и (с) клеток CDSP4.
[0112] ФИГ. 35А-В: Экспрессия маркеров созревания в Т-клетках, полученных из hEMP. В (а) показан анализ клеток CD8SP на 5-ой неделе. В (Ь) показан анализ клеток CD4SP на 5-ой неделе.
[0113] ФИГ. 36: Образование Т-клеток воспроизводимо в множественных линиях hESC. hEMP продуцировались из трех различных линий hESC, образованных Т-клетками в системе АТО.
[0114] ФИГ. 37: Образование Т-клеток из iPSC с использованием системы АТО. На этой фигуре показано, что линия iPSC (HLA.A02.02, фибробласты кожи здорового донора) продуцировала Т-клетки в системе АТО. Приведены данные б-й недели.
[0115] ФИГ. 38А-В: Недифференцированные hESC,
непосредственно агрегирование в АТО, могут продуцировать Т-клетки. Показаны популяции Т-клеток 5-и (а) и 7-и (Ь) недельных АТО.
[0116] ФИГ. 39: Продукция зрелых Т-клеток из hEMP в системе АТО с использованием стромальных клеток, экспрессирующих JAG1.
[0117] ФИГ. 40: Т-клетки, продуцированные в системе АТО из hEMP, показывают разнообразный репертуар Vb TCR. Показан проточный цитометрический анализ использования Т-клеток семейства Vb TCR, продуцируемых АТО (CD8SP) из hEMP на 5-й неделе. Результаты сравнивались для использования семейства Vb TCR в тимоцитах.
[0118] ФИГ. 41А-В: Т-клетки, полученные из hESC, проявляют
пролиферацию и увеличение CD25 в ответ на aHTH-CD3/CD28 и IL2.
CD8 SP Т-клетки, полученные в АТО из hESC (5-ая неделя), были
функционально протестированы in vitro. (а) Выделенные клетки
окрашивали CTV (Cell Tracker Violet) и инкубировали с
активационными бусами CD3/CD2 8 в течение 5 дней. Клетки
подвергали множественным клеточным делениям, как показано
разбавлением CTV и активацией и экспрессией CD25. (Ь) Выделенные
клетки обрабатывали РМА/иономицином в течение б часов, и
внутриклеточное окрашивание показало продуцирование
цитотоксических цитокинов (IFNg, IL2, TNFa).
[0119] ФИГ. 42: Схема образования сконструированных Т-клеток из hESC в системе АТО. HI hESC трансдуцировали вектором optlG4 (NY-ESO TCR), экспрессирующим GFP. Линию hESC HI NY-ESO TCR создавали путем выделения клеток GFP+ и их деления. Затем клетки подвергали тому же протоколу, который описан выше, для индукции дифференциации Т-клеток.
[0120] ФИГ. 43А-В: Характеризация Т-клеток с NY-ESO со сконструированными TCR. Показаны данные FACS (а) на 3-ей недели
и (b) на 5-ой недели. Показаны данные из нетрансдуцированных hESC (HI) и TCR-трансдуцированных hESC. Сконструированные Т-клетки, продуцируемые АТО из hESC, идентифицировали путем экспрессии GFP и тетрамера и экспрессии маркеров дифференциации Т-клеток (DP, CD3+/TCR+ CD8SP).
[0121] ФИГ. 44А-В: Было обнаружено, что (а) сконструированные hESC-полученные CD8SP Т-клетки показывают фенотип зрелых наивных клеток, и (Ь) что маркеры созревания экспрессированы в Т-клетках, полученных из ES.
[0122] На ФИГ. 45 показано, что выделенные клетки NY-ESO TCR CD8SP подвергаются активации на CD3/2 8 или стимуляции аАРС через пять дней после АТО (5-ая неделя).
[0123] На ФИГ. 4 6 показано, что выделенные клетки NY-ESO TCR CD8SP продуцировали цитотоксические цитокины (IFNg, IL2, TNFa) в ответ на стимуляцию.
[0124] На ФИГ. 47 показана специфическая активация сконструированных Т-клеток, полученных из hESC, (hEMP) в ответ на клетки искусственные антиген-презентирующие клетки (К562). Анализ показал продукцию цитотоксических цитокинов (IFNg, IL2, TNFa) и дегрануляцию (CD107a) в ответ на аАРС, экспрессирующих когнатный (NY-ES0), но нерелевантный пептид (MART-1).
[0125] На ФИГ. 48 показано, что TCR-трансдуцированные Т-клетки, продуцируемые ES, показали активное деление в ответ на анти-СБЗ/СБ28.
[0126] На ФИГ. 49 показаны данные с использованием различных вариантов добавки В2 7 с дефицитом по одному компоненту
(инсулин (-инс), Вит А, антиоксиданты (АО)) или без ксенобиотиков (без Хепо) по сравнению со стандартной (полной) добавкой В27 (полн.). Культуры АТО инициировали с помощью CDSP+ CD3- HSPC пуповинной крови и анализировали на б-ой неделе. Показано общее число клеток и % культур, которые представляют собой клетки-предшественники CD5+CD7+ Т-клеток.
[0127] На ФИГ. 50 показаны данные с использованием различных вариантов добавки В2 7 с дефицитом по одному компоненту
(инсулин (-инс), Вит А, антиоксиданты (АО)) или без ксенобиотиков (без Хепо) по сравнению с полной добавкой В27
(полн.). Данные показывают, что инсулин необходим для коммитирования Т-клеток, а витамин А и антиоксиданты способствуют клеточному выходу.
[0128] На ФИГ. 51 показана разработка 2ого поколения CD19-мишеневых CAR, используемого в последующих экспериментах.
[0129] На ФИГ. 52 показан анализ FACS CAR-трансдуцированных СВ АТО, демонстрирующий, что экспрессия CAR (то есть GFP+) в АТО в значительной степени ограничена клетками Т-линии (CD5+ и CD7+), которые представляют собой CD3-TCRab- и CD3-TCRgd-.
[0130] На ФИГ. 55 показан анализ FACS CAR-трансдуцированных СВ АТО, демонстрирующий, что CAR- Т-клетки, полученные из АТО, демонстрируют необычную дифференцировку Т-клеток, то есть CD5+CD7+CD3-TCRab-CD4-CD8-. Для сравнения показаны ложно-трансдуцированные АТО.
[0131] На ФИГ. 54 показано, что CAR- Т-клетки, полученные из СВ АТО, демонстрируют фенотип наивных Т-клеток (CD4 5RA+) и являются фенотипически зрелыми (CD27+CCR7+).
[0132] На ФИГ. 55 показано, что CAR-T-клетки, полученные из СВ АТО, экспрессируют CD2 и внутриклеточный CD3e
[0133] ФИГ. 56А-В: CAR-T-клетки, полученные из СВ АТО, представляют собой CD4-CD8- (DN) или экспрессируют CD8aa гомодимеры (а) и экспрессируют CD5 6 и CD16, связанные с IEL (и NK-клетками) (Ь).
[0134] На ФИГ. 57 показана гипотетическая модель селекции агонистов CAR-T-клеток в АТО.
[0135] На ФИГ. 58 показано восстановление комплексной экспрессии CD3/TCR (но не экспрессии CD4 или CD8) в CAR-T клетках из СВ АТО с помощью TCR ко-трансдукции.
[0136] На ФИГ. 59 показана функциональная реконструкция TCR в CAR+ TCR+ Т-клетках, полученных из СВ АТО. CAR-T-клетки, полученные в АТО, которые со-е (пропуск!!)
[0137] На ФИГ. 60 показаны функциональные анализы CD19 CAR-T-клеток, полученных из СВ АТО. Высвобождение цитокинов и активация CAR-T-клеток в ответ на клетки CD19+ (клетки К562,
трансдуцированные CD19-вектором, клетки Nalm6 и Raji) (анализировали без дополнительной активации/костимуляции).
[0138] На ФИГ. 61 показан анализ цитотоксичности для CAR-T-клеток, полученных из СВ АТО. Мишенями CD19+ являются Nalm6, а контроли CD19- являются К562 (нетрансдуцированные).
[0139] На ФИГ. 62 показаны в СВ-АТО, что продукция IEL-подобных CD8aa CAR-T-клеток (предположительно через выбор агонистов) наблюдается в разных коактивационных и scFv-доменах конструкций CAR.
[0140] На ФИГ. 63 показано, что CAR-трансдуцированные ES-клетки клетки могут продуцировать CAR-T-клетки в АТО. Клетки селектированы по "воротам" для CD45+. Показаны анализы на 1-4-ой неделе АТО из hEMP, продуцированных либо из нетрансдуцированных HI hESC, либо CAR-трансдуцированных hESC
[0141] На ФИГ. 64 показано, что АТО-полученные CAR-T-клеток из ES-клеток человека демонстрируют необычную дифференцировку Т-клеток. Клетки селектированы по "воротам" для CD4 5+. Показаны анализы на 1-4-й неделе АТО из hEMP, продуцируемых либо из нетрансдуцированных HI hESC, либо CAR-трансдуцированных hESC.
[0142] На ФИГ. 65 показано, что CAR-T-клетки, полученные из АТО, из ES-клеток человека не экспрессируют СБ8бета. Показаны данные двух экспериментов (657 и 659) в показанных точках времени. Клетки были получены из hEMP, продуцированного либо из нетрансдуцированных HI hESC, либо из CAR-трансдуцированных hESC, и были селектированы по "воротам" для CD45+.
[0143] На ФИГ. 66А-В показано, что CAR-T-клетки, полученные из АТО, из ES-клеток человека продуцируют цитокины в ответ на РМА/иономицин. Показана активация с помощью внутриклеточного окрашивания гамма-интерферона и TNF альфа в (а) и гамма-интерферона и IL-2 в (Ь). Данные взяты из 5-й недельных АТО.
[0144] На ФИГ. 67 показано, что CAR-T-клетки, полученные из АТО, из ES-клеток человека продуцируют цитокины и дегранулируют в ответ на CD19+-клетки-мишени (клетки Cdl9+K562, Nalm6, RAJI), но не родительские (Cdl9-) К562 клетки. Данные получены с 5-го недельных hESC-ATO и клеток, селектированных по "воротам" для CD7 + CD4 5RA+.
[0145] На ФИГ. 68 показано, что обе системы, АТО (MS5-DLL1) и монослой (0P9-DLL1), позволяют поддерживать клетки-предшественники CD34+ Т-клеток и коммитирование кеток-предшественников CD5+CD7+ Т-клеток. Показаны 4-х недельные СВ-АТО, селектированные по "воротам" как показано, полученные из трех различных образцов СВ (Е37, Е43, Е68).
[0146] На ФИГ. 69 показано, что обе системы, АТО и 0Р9-DLL1, обеспечивают коммитирование клеток в клетки Т-клеточной линии, как показано по экспрессии CD5 и CD7. Однако, система АТО значительно превосходит по продукции CD4+CD8+ двойных позитивных клеток (DP) . Показаны 4-х недельные СВ-АТО, селектированные по "воротам", как показано, полученные из трех различных образцов СВ (Е37, Е43, Е68).
[0147] На ФИГ. 70 показана активная продукция активной популяции TCRab+CD3+ клеток, которые являются DP и CD8SP в системе СВ-АТО, но не в системе монослоя 0P9-DLL1. Показаны 4-х недельные СВ-АТО, селектированные по "воротам", как показано, полученные из трех различных образцов СВ (Е37, Е43, Е68).
[0148] На ФИГ. 71 показано числовое представление данных, представленных На ФИГ. 70.
ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
I. Введение
[014 9] Описаны композиции и способы получения неаллореактивных Т-клеток, которые могут быть аллогенными для пациента-реципиента. Такие композиции и способы представляют важный прогресс в данной области, который заключается в предоставлении более экономичных, менее трудоемких способов лечения и иммунотерапии у индивидуумов, у которых невозможна аутологичная терапия Т-клетками. Кроме того, предложены новые композиции и способы для получения сконструированных Т-клеток. Эти композиции и способы были созданы на основе, в частности, открытия композиции клеточной культуры, содержащей 3D культуру искусственного тимуса (АТО), в которой используются высоко стандартизированные бессывороточные компоненты и линия стромальных клеток, для обеспечения активной и высокой воспроизводимой дифференциации Т-клеток от HSPC человека. В
некоторых вариантах осуществления было обнаружено, что дифференцировка Т-клеток в АТО очень подобна эндогенному тимопоэзу и, в отличие от монослойных сокультур, поддерживает эффективную позитивную селекцию функциональных CD3 + TCRa|3+CD8+ и СБ4+Т-клеток с разнообразным репертуаром TCR и антиген-наивными фенотипом.
[0150] В качестве неограничивающего примера композиция клеточной культуры может быть использована по крайней мере для продукции наивных антиген-специфичных Т-клеток с аллельным исключением и сконструированными TCR, полученных из HSPC, трансдуцированных TCR, специфичным для антигена, такого как NY-ESO-1-ассоциированный антиген.
[0151] В еще одном варианте осуществления было показано с помощью этой трансгенной системы TCR, что позитивная селекция в АТО запускается с помощью собственного МНС на аутологичных гематопоэтических клетках, но также может контролироваться экспрессией стромальных клеток собственного МНС для моделирования или усиления позитивной селекции in vitro.
[0152] Таким образом, композиции 3D клеточный культуры, например, АТО, предлагают простую стандартную и высоко стандартизованную модель полного Т-клеточного развития, что способно содействовать широкому спектру исследований, связанных с гемопоэзом, иммунной регенерацией, иммунитетом хозяина и клеточной иммунотерапией.
[0153] Способы и композиции, описанные в настоящем изобретении, обеспечивают значительный вклад в прогресс этой технологии. Вариант осуществления искусственных органоидов тимуса дает несколько преимуществ по сравнению с ранее известными способами дифференцирования Т-клеток из HSPC. Преимущества включают, но не ограничиваются одним или несколькими из следующих:
АТО полностью обеспечивают все стадии дифференциации Т-клеток из гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC), включая, и самое главное, зрелые наивные Т-клетки (как CD4SP, так и CD8SP
Возможность образования зрелых Т-клеток из HSPC в АТО позволяет модифицировать систему АТО для получения сконструированных Т-клеток путем экспрессии генов (например, TCR или CAR) в HSPC
Система АТО также может быть модифицирована путем экспрессии генов в стромальном компартменте (MS5)
Культуры АТО могут быть бессывороточными и, таким образом, не имеют ограничения по колебаниям фетальной телячьей сыворотки
(FCS) в зависимости от производимой партии, или не имеют проблем для клинического применения со средой, содержащей FCS.
[0154] Сравнение с другими моделями in vitro Т-клеточной дифференциации HSPC человека показывает различия и демонстрирует преимущества способов и клеток, предложенных в настоящем изобретении. Например, система 0P9-DL1 считалась золотым стандартом дифференциации Т-клеток из HSPC человека приблизительно с 2005 года. Система (разработанная лабораторией Juan Carlos Zuniga-Pflucker, Toronto, Canada, Торонто, Канада) использует монослой из линии стромальных клеток мыши (ОР9), трансдуцированной дельта-подобным лигандом 1 лиганда Notch
(DLL1, также называемым DL1) для индукции коммитирования Т-клеток из HSPC мыши (Schmitt et al, Immunity, 2002) или человека
{La Motte-Mohs, Blood 2005) . HSPC сокультивируют на монослое OP9-DL1 в среде, содержащей фетальную бычью сыворотку и цитокины. В одном из вариантов этой системы используется DLL4 вместо DLL1 (OP9-DLL4); результаты с DLL4 существенно не отличаются от DLL1.
[0155] Однако в системе OP9-DL1 существуют проблемы. Например, существует незначительная продукция зрелых Т-клеток. Хотя монослои OP9-DL1 (или OP9-DLL4) могут вызывать ранние стадии коммитирования Т-клеток (CD7+CD5+/- клетки) из HSPC пуповинной крови (СВ), дифференцировка после стадии CD4+CD8+
(DP) в значительной степени неэффективна и дает незначительное количество или не дает вовсе монопозитивные (SP) по CD8+ или CD4+ зрелые Т-клетки (см., LaMotte Mohs , BLOOD 2005). Это показано на фигуре 4 от La Motte-Mohs, Blood 2005. В более поздней публикации группы Zuniga-Pflucker (Awong et alr BMC
Immunol 2011) показаны данные 60-70-дневных культур OP9-DL1/HSPC СВ с, в лучшем случае, -2-4% зрелых CD8+ клеток, то есть CD8+CD3+CDla-CD27+ клетки (На ФИГ. 1 в статье Awong 8% CD8+, 40% были CD3+CD2 7+).
[0156] Другие лидирующие группы, публикующие данные о модели OP9-DL1, находятся в Бельгии (различные документы от Vandekerckhove, Plum, Taghon). Подобно группе Zuniga-Pflucker, бельгийская группа показала, в лучшем случае, 5% CD3+TCRab+ клеток и очень редко, если вообще были, какие-либо SP8 и SP4 при использовании HSPC СВ (de Smedt et al. Haematologica r 2011) . Следует отметить, что в другом документе этой группы было отмечено увеличение числа зрелых Т-клеток, поскольку культуры были инициированы HSPC, выделенным из тимуса человека. В тимусе, CD34+ HSPC преимущественно содержат про-Т-клетки, которые уже были подвергнуты воздействию тимических сигналов для дифференцировки Т-клеток и, таким образом, праймированы на продукцию Т-клеток. См., ФИГ. 2А, Van Coppernolle et al, 2009 (HSPC полученные из тимуса).
[0157] В качестве еще одного доказательства плохой дифференциации зрелых Т-клеток в системе OP9-DL1, в таблице 1 статьи Awong et al, 2011, показан выход в таких культурах: каждая одинарная CD34+CD38- HSPC СВ продуцировала только 0,271,16 TCRab+CD3+ клеток (п=б). Для сравнения, система АТО может продуцировать 1000-2000 TCRab+CD3+ клеток на каждую HSPC СВ {Seet et al, 2016) .
[0158] Другие доказательства показывают, что OP9-DL1 еще хуже работает с другими (не-СВ) клиническими источниками HSPC. Почти все документы, в которых использовали OP9-DL1, используют HSPC СВ, потому что другие источники (например, костный мозг, ВМ или мобилизованная периферическая кровь (МРВ)) еще более неэффективны и ненадежны, чем СВ.
[0159] Группа Plum непосредственно сравнивала HSPC из СВ и ВМ на линии стромальных клеток OP9-DL1 (De Smedt et alr Hematologica 2011) . На фигуре 2 в статье группы Plum показано, что культуры, инициированные HSPC из ВМ, имеют -10% количество DP и TCRab+CD3+ клеток по сравнению с HSPC из СВ (1-2% против
12% DP и 0,7% против 5% CD3 + TCRab+ из ВМ против СВ, соответственно).
[0160] Для сравнения, система АТО представляет собой высокоэффективный способ дифференциации для всех источников HSPC (ВМ, МРВ, покоящихся РВ, тимус, СВ) (см., Seet et al, 2016).
[0161] Кроме того, OP9-DL1 не выживает в бессывороточной среде. Авторы изобретения не смогли воспроизвести результаты АТО из MS5-DL1 с использованием OP9DL-1 в ЗО-агрегатах и среде RB27. По-видимому, OP9-DL1 не выживают в бессывороточных условиях.
[0162] Ранее разработанная эмбриональная органная культура тимуса (FTOC) представляет собой 3D культуру, состоящую из интактного фрагмента фетального тимуса человека, который засевается HSPC человека и растет в средах, содержащих фетальную телячью сыворотку, использующих границу раздела жидкость-воздух. Нет необходимости в трансдукции, поскольку лиганд Notch поступает из эпителиальных клеток тимуса человека (ТЕС). В большинстве статей о системе FTOC она используется для дифференциации Т-клеток мыши {Anderson et al, Аппи Rev Immunol. 1996) .
[0163] Кроме того, FTOC не подходят для клинического применения из-за присутствия аллогенных Т-клеток человека, которые сохраняются в интактном фрагменте тимуса; в дополнительном анализе показана большая экспериментальная изменчивость и трудности с количественным анализом. Ограниченная доступность эмбриональной ткани человека полностью исключает клиническое применение и делает даже экспериментальное применение FTOC очень сложным. FTOC была заменена на 0P9-DL1 или OP9-DLL4 из-за вышеуказанных ограничений.
[0164] Постнатальные органоиды тимуса были разработаны группой Crooks для изучения микроокружения тимуса {Chung et al, Stem Cells 2014). Они состоят из 3D культур, образованных ТЕС и мезенхимой тимуса человека, полученных из постнатального тимуса, культивируемых отдельно в виде монослоев в течение 10-21 дней, а затем центрифугированных вместе с HSPC пуповинной крови с образованием 3D агрегатов. Эта модель по своей концепции сходна с АТО, но отличается: 1. использованием первичной ткани тимуса,
2. потребностью в сыворотке, 3. зависимостью от экспрессии эндогенного лиганда Notch из ТЕС, а не трансдукции. Однако существует проблема, связанная с постнатальными органоидами тимуса: Первичную ткань тимуса человека очень трудно получить, поскольку ее получают у пациентов во время проведения кардиохирургии и, следовательно, она доступна редко и только из ограниченного числа учреждений. Кроме того, качество и количество стромы тимуса сильно различается, и поэтому дифференцировка Т-клеток недостаточна, а выход слабый. Поскольку ткань тимуса является аллогенной для HSPC СВ, то модель вызывает иммунологические проблемы. По всем этим причинам эта модель нецелесообразна для клинического применения и проблематична для экспериментального использования с точки зрения количественного определения и воспроизводимости. По причинам, рассмотренным более подробно ниже, предлагаемые способы и композиции дают преимущества по сравнению с ранее разработанными способами. II. Определения
[0165] Термин "экзогенный TCR" относится к гену TCR или производному гена TCR, который переносится (то есть посредством методик генного переноса/трансдукции/трансфекции) в клетку in vitro. Экзогенные гены TCR вводят в геном клетки-рецепиента. В некоторых вариантах осуществления встраивание представляет собой случайное встраивание. Случайное встраивание гена TCR легко достигается способами, известными в данной области. В некоторых вариантах осуществления гены TCR встраивают в эндогенные локусы (такие как эндогенные локусы гена TCR). В некоторых вариантах осуществления клетки содержат один или несколько генов TCR, которые встроены в локусы, которые не являются эндогенными локусами. В некоторых вариантах осуществления клетки дополнительно содержат гетерологичные последовательности, такие как маркер или ген устойчивости.
[0166] Термин "химерный антигенный рецептор" или "CAR" относится к сконструированным рецепторам, в которые прививают произвольную специфичность, связанную с иммунной эффекторной клеткой. Такие рецепторы используются для прививки специфичности моноклонального антитела, связанную с Т-клеткой; с переносом
кодирующей последовательности с помощью ретровирусных или
лентивирусных векторов. Рецепторы называются химерными,
поскольку они состоят из частей из разных источников. Наиболее
распространенной формой таких молекул являются слитые
конструкции одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv),
полученные из моноклональных антител, слитых с трансмембранным
СБЗ-дзета и эндодоменом; CD2 8 или 41ВВ внутриклеточных доменов
или их комбинации. Такие молекулы приводят к передаче сигнала в
ответ на распознавание scFv его мишени. Примером такой
конструкции является 14g2a-Zeta, которая является слитой
конструкцией scFv, полученной из гибридомы 14д2а (которая
распознает дисиалоганглиозид GD2) . Если Т-клетки экспрессируют
эту молекулу (что обычно достигается за счет трансдукции
онкоретровирусного вектора), то они распознают и убивают клетки-
мишени, которые экспрессируют GD2 (например, клетки
нейробластомы). Для нацеливания на злокачественные В-клетки
исследователи перенаправили специфичность Т-клеток с помощью
химерного иммунорецептора, специфичного для молекул В-клеточной
линии, CD19. Вариабельные части тяжелой и легкой цепи
иммуноглобулина слиты с помощью гибкого линкера, образуя scFv.
Этому scFv предшествует сигнальный пептид для направления
формирующегося белка в эндоплазматический ретикулум и
последующую поверхностную экспрессию (это расщепление). Гибкий
спейсер позволяет scFv ориентироваться в разных направлениях,
чтобы обеспечивает связывание с антигеном. Трансмембранный домен
представляет собой обычную гидрофобную альфа-спираль, обычно
полученную из исходной молекулы сигнального эндодомена, которая
торчит внутрь клетки и передает желаемый сигнал.
[0167] Термин "антиген" относится к веществу, которое вызывает в иммунной системе выработку антител против него, или на которое отвечает Т-клетка. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой пептид длиной 5-50 аминокислот или по крайней мере не более 5 или 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250 или 300 аминокислот, или любой диапазон этих значений.
[0168] Термин "аллогенный для реципиента" означает клетки, которые не выделены из этого реципиента. В некоторых вариантах осуществления клетки не выделены у пациента. В некоторых вариантах осуществления клетки не выделены у генетически подходящего индивидуума (такого как родственник с совместимыми генотипами).
[0169] Термин "инертный" относится к тому, что не вызывает нежелательной клинической токсичности. Это может быть либо целевая токсичность, либо нецелевая токсичность. "Инертность" может основываться на известных или прогнозируемых клинических данных по безопасности.
[0170] Термин "без Хепо (XF)" или "без животных компонентов (ACF)", если используется в отношении к среде, внеклеточному матриксу или условию культивирования, относится к среде, внеклеточному матриксу или условию культивирования, при которых по существу нет гетерогенных компонентов, полученных у животных. Для культивирования клеток человека любые белки животного, исключая человека, такого как мышь, могут быть компонентами Хепо. В некоторых аспектах в матриксе без Хепо могут по существу отсутствовать любые компоненты, полученные у животного, исключая человека, то есть, исключая фидерные клетки мыши или Matrigel(tm). Matrigel(tm) представляет собой солюбилизированный препарат базальной мембраны, экстрагированный из саркомы Энгельбрет-Холм-Ройма (EHS) мыши, опухоли, богатой белками внеклеточного матрикса, с включением ламинина (основного компонента), коллагена IV, гепаринсульфатпротеогликанов и энактина/нидогена.
[0171] Термин "определенный", если используется в отношении среды, внеклеточного матрикса или условия культуры, относится к среде, внеклеточному матриксу или условию культивирования, при которых известны природа и количества приблизительно всех компонентов.
[0172] "Химически определенная среда" относится к среде, для которой известна химическая природа приблизительно всех ингредиентов и их количества. Такие среды также называются синтетическими средами. Примеры химически определенной среды включают TeSR(tm).
[0173] Клетки "в основном не содержат" определенные реагенты или элементы, такие как сыворотка, ингибиторы сигнализации, животные компоненты или фидерные клетки, экзогенные генетические элементы или элементы векторов, как используется в настоящем изобретении, если они имеют менее 10% элемента(ов) , и "по существу не содержат" некоторые реагенты или элементы, если они имеют менее 1% элемента(ов). Однако, еще более желательны клеточные популяции, в которых менее 0,5% или менее 0,1% общей популяции клеток содержат экзогенные генетические элементы или элементы векторов.
[0174] Культура, матрикс или среда "по существу не содержат" определенные реагенты или элементы, такие как сыворотка, ингибиторы сигнализации, животные компоненты или фидерные клетки, если культура, матрикс или среда, соответственно, имеют уровень этих реагентов ниже, чем уровень обнаруживаемый при использовании обычных способов детекции, известных специалисту в данной области техники, или эти агенты не были случайно добавлены в культуру, матрикс или среду. Бессывороточная среда может по существу не содержать сыворотку.
[0175] "Периферические клетки крови" относятся к клеточным компонентам крови, включая эритроциты, лейкоциты и тромбоциты, которые находятся в циркулирующем пуле крови.
[0176] "Гематопоэтические стволовые клетки и клетки-
предшественники" или "гемопоэтические клетки-предшественники"
относятся к клеткам, которые относятся к гематопоэтической
линии, но способны к дальнейшей гемопоэтической дифференциации и
включают гемопоэтические стволовые клетки, мультипотентные
гемопоэтические стволовые клетки (гематобласты), предшественники
миелоидных клеток, предшественники мегакариоцитов,
предшественники эритроцитов и предшественники лимфоидных клеток. "Гемопоэтические стволовые клетки (HSC)" представляют собой мультипотентные стволовые клетки, которые приводят к образованию всех типов клеток крови, включая миелоидные (моноциты и макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты/тромбоциты, дендритные клетки) и лимфоидные линии (Т-клетки, В-клетки, NK-клетки).
[0177] Гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники могут не экспрессировать или экспрессировать CD34. Гемопоэтические стволовые клетки могут коэкспрессировать CD133 и быть негативными по экспрессии CD38, позитивными по CD90, негативными по CD45RA, негативными по маркерам линии, или их комбинациям. Гемопоэтические клетки предшественники включают CD34(+)/CD38(+) клетки и CD34(+)/ CD45RA(+)/lin(-)CD10+ (обычные лимфоидные клетки-предшественники), CD34(+)CD4 5RA(+)lin(-)CD10(-)CD62L(hi) (лимфоидные праймированные мультипотентные клетки-предшественники), CD34(+)CD45RA(+)lin(-)CD10(-)CD123+ (клетки-предшественники гранулоцитов-моноцитов), CD34(+)CD45RA(-)lin(-)CD10(-)CD123+ (обычные миелоидные клетки-предшественники) или CD34(+)CD45RA(-)lin(-)CD10(-)CD123- (клетки-предшественники мегакариоцитов-эритроцитов).
[0178] "Вектор" или "конструкция" (иногда обозначаемая как "носитель" для доставки гена или переноса гена) относится к макромолекуле, комплексу молекул или вирусной частице, содержащим полинуклеотид, который должен быть доставлен в клетку-хозяин либо in vitro, либо in vivo. Полинуклеотид может быть линейной или круговой молекулой.
[0179] "Плазмида", общий тип вектора, является молекулой внехромосомной ДНК, отделенной от хромосомной ДНК, которая способна реплицироваться независимо от хромосомной ДНК. В некоторых случаях она является круговой и двухцепочечной.
[0180] Под "экспрессионной конструкцией" или "кассетой экспрессии" понимают молекулу нуклеиновой кислоты, которая способна направлять транскрипцию. Экспрессионная конструкция включает по меньшей мере промотор или структуру, функционально эквивалентную промотору. Также могут быть включены дополнительные элементы, такие как энхансер и/или сигнал терминации.
[0181] Термин "экзогенный", при использовании в отношении белка, гена, нуклеиновой кислоты или полинуклеотида в клетке или организме относится к белку, гену, нуклеиновой кислоте или полинуклеотиду, которые были введены в клетку или организм искусственными способами, или в отношении клетки, которая была
выделена и затем введена в другие клетки или в организм искусственными способами. Экзогенная нуклеиновая кислота может быть нуклеиновой кислотой другого организма или клетки или может быть одной или несколькими дополнительными копиями нуклеиновой кислоты, которая естественным образом находится в организме или клетке. Экзогенная клетка может быть клеткой другого организма или может быть клеткой того же организма. В качестве неограничивающего примера экзогенная нуклеиновая кислота находится в хромосомном положении, отличном от положения в природных клетках, или, иначе, фланкирована последовательностью нуклеиновой кислоты отличной от той, которая фланкирует ее в природе.
[0182] Термин "соответствует" используется в настоящем
изобретении для обозначения, что полинуклеотидная
последовательность гомологична (то есть идентична, не строго
эволюционно связана) со всей или частью ссылочной
полинуклеотидной последовательности, или что полипептидная
последовательность идентична ссылочной полипептидной
последовательности. Напротив, термин "комплементарный"
используется в настоящем изобретении для обозначения того, что комплементарная последовательность гомологична всей или части ссылочной полинуклеотидной последовательности. Для иллюстрации, нуклеотидная последовательность "ТАТАС" соответствует ссылочной последовательности "ТАТАС" и является комплементарной ссылочной последовательности "GTATA".
[0183] "Ген", "полинуклеотид", "кодирующая область", "последовательность", "сегмент", "фрагмент" или "трансген", который "кодирует" конкретный белок, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется и необязательно также транслируется в генетический продукт, например, полипептид, in vitro или in vivo при помещении под контроль подходящих регуляторных последовательностей. Кодирующая область может присутствовать либо в кДНК, либо в геномной ДНК, либо в форме РНК. При наличии в форме ДНК молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной (то есть смысловой нитью) или двухцепочечной. Границы кодирующей области определяются
стартовым кодоном на 5' (амино) конце и стоп-кодоном трансляции на 3' (карбокси) конце. Ген может включать, но этим не ограничивается, кДНК из прокариотической или эукариотической мРНК, последовательности геномной ДНК из прокариотической или эукариотической ДНК и синтетические последовательности ДНК. Последовательность терминации транскрипции обычно расположена 3' относительно генной последовательности.
[0184] Термин "клетка" в настоящем изобретении используется
в самом широком смысле, понимаемом в данной области, и относится
к живому организму, который является структурной единицей ткани
многоклеточного организма, окружен мембранной структурой,
которая отделяет ее снаружи, обладает способностью к
саморепликации, и имеет генетическую информацию и механизм для
ее экспрессии. Клетки, используемые в настоящем изобретении,
могут быть природными клетками или искусственно
модифицированными клетками (например, слитыми клетками, генетически модифицированными клетками и тому подобное).
[0185] Используемый в настоящем изобретении термин
"стволовая клетка" относится к клетке, способной к
саморепликации и плюрипотентности или мультипотентности. Как
правило, стволовые клетки могут регенерировать поврежденную
ткань. Стволовые клетки по настоящему изобретению могут быть, но
не ограничиваются ими, эмбриональными стволовыми (ES) клетками,
индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками или
тканевыми стволовыми клетками (также называемыми
тканеспецифическими стволовыми клетками или соматическими стволовыми клетками).
[0186] "Эмбриональные стволовые (ES) клетки" являются плюрипотентными стволовыми клетками, полученными из эмбрионов на ранних стадиях. ES-клетка была впервые создана в 1981 году, а также использовалась для получения нокаутных мышей с 198 9 года. В 1998 году была создана человеческая ES-клетка, которая в настоящее время становится доступной для регенеративной медицины.
[0187] В отличие от ES-клеток, тканевые стволовые клетки
обладают ограниченным потенциалом дифференцировки. Тканевые
стволовые клетки присутствуют в определенных местах в тканях и
имеют недифференцированную внутриклеточную структуру.
Следовательно, плюрипотентность тканевых стволовых клеток обычно низкая. Тканевые стволовые клетки имеют более высокое соотношение ядро/цитоплазма и имеют мало внутриклеточных органелл. Большинство стволовых клеток ткани имеют низкую плюрипотентность, длительный клеточный цикл и пролиферативную способность за пределами жизни человека. Тканевые стволовые клетки разделяют на категории, основанные на сайтах, из которых производятся клетки, таких как кожная система, пищеварительная система, система костного мозга, нервная система и тому подобное. Тканевые стволовые клетки в кожной системе включают эпидермальные стволовые клетки, стволовые клетки волосяного фолликула и тому подобное. Тканевые стволовые клетки в пищеварительной системе включают панкреатические (обычные) стволовые клетки, стволовые клетки печени и тому подобное. Тканевые стволовые клетки в системе костного мозга включают гемопоэтические стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки и тому подобное. Тканевые стволовые клетки в нервной системе включают нервные стволовые клетки, стволовые клетки сетчатки и тому подобное.
[0188] "Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки",
обычно сокращенно указываемые как клетки iPS или iPSC, относятся
к типу плюрипотентной стволовой клетки, искусственно полученной
из неплюрипотентных клетки, обычно соматической клетки взрослого
человека или окончательно дифференцированной клетки, такой как
фибробласт, гемопоэтическая клетка, миоцит, нейрон,
эпидермальная клетка или тому подобное, путем введения
определенных факторов, называемых факторами
перепрограммирования.
[0189] "Плюрипотентность" относится к стволовой клетке, которая может дифференцироваться во все клетки, составляющие одну или несколько тканей или органов, или, в частности, любой из трех зародышевых слоев: эндодерма (внутренняя слизистая
оболочка желудка, желудочно-кишечный тракт, легкие), мезодерма (мышцы, кости, крови, урогенитальный тракт) или эктодерма (эпидермальные ткани и нервная система). "Плюрепотентные стволовые клетки", используемые в настоящем изобретении, относятся к клеткам, которые могут дифференцироваться в клетки, происходящие из любого из трех зародышевых слоев, например, прямые потомки тотипотентных клеток или индуцированные плюрипотентные клетки.
[0190] Под "функционально связанным" со ссылкой на молекулы нуклеиновой кислоты подразумевается, что две или более молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекула нуклеиновой кислоты, подлежащая транскрибированию, промотор и энхансерный элемент) соединены таким образом, чтобы обеспечить транскрипцию молекулы нуклеиновой кислоты. Под "функционально связанным" со ссылкой на молекулы пептида и/или полипептида подразумевается, что две или более пептидных и/или полипептидных молекул связаны таким образом, чтобы получить единую полипептидную цепь, то есть слитый полипептид, имеющий по меньшей мере одно свойство каждого пептидного и/или полипептидного компонента слитой конструкции. Слитый полипептид является, в частности, химерным, то есть состоящим из гетерологичных молекул.
III. Т-клеточный рецептор (TCR) и способы продукции экзогенных TCR
[0191] Т-клеточный рецептор или TCR представляет собой молекулу на поверхности Т-лимфоцитов (Т-клеток), которая ответственна за распознавание фрагментов антигена в виде пептидов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). TCR состоит из двух различных белковых цепей (то есть, представляет собой гетеродимер). В 95% Т-клеток у людей TCR состоит из альфа цепи (а; также в настоящем изобретении называется "а") и бета цепи (|3; также в настоящем изобретении называется "b"), а 5% Т-клеток TCR состоит из гамма и дельта (у/5) цепей. Это соотношение изменяется во время онтогенеза и при заболеваниях, а также у разных видов.
[0192] Если TCR взаимодействует с пептидом антигена и МНС (пептид/МНС), то Т-лимфоцит активируется за счет сигнальной трансдукции, то есть серии биохимических событий, опосредуемых связанными ферментами, со-рецепторами, специализированными адаптивными молекулами и активированными или высвобожденными транскрипционными факторами. TCR представляет собой мембранный гетеродимерный белок, соединенный дисульфидной связью, обычно состоящий из в вышей степени разнообразных альфа (а) и бета (|3) цепей, экспрессированных в виде части комплекса с неизменными молекулами цепи CD3. Т-клетки, экспрессирующие этот рецептор, называются а:|3 (или оф или ab) Т-клетками, несмотря на то, что незначительная часть Т-клеток экспрессирует альтернативный рецептор, образованный вариабельной гамма (у, также обозначаемой в настоящем изобретении как "д") и дельта (8, также обозначаемой в настоящем изобретении как "d") цепями, называемыми уб (или gd) Т-клетками.
[0193] Каждая цепь состоит из двух внеклеточных доменов:
вариабельной (V) области и константной (С) области, оба домена
суперсемейства иммуноглобулина (IgSF), образующие
антипараллельные р-слои. Константная область находится ближе к центру от клеточной мембраны и следует за трансмембранной областью и коротким цитоплазматическим хвостом, а вариабельная область связывается с комплексом пептид/МНС.
[0194] Вариабельный домен а-цепи и р-цепи TCR имеет три гипервариабельные или определяющие комплементарность области (CDR), при этом вариабельная область р-цепи имеет дополнительную область гипервариабельности (HV4), которая обычно не вступает в контакт с антигеном и, следовательно, не считается CDR.
[0195] Остатки расположены в двух областях TCR, на границе а- и р-цепей и в каркасной области р-цепи, которая, как считается, находится проксимально от комплекса сигнальной трансдукции CD3. CDR3 является основным CDR, ответственным за распознавание обработанного антигена, хотя, как было показано, CDR1 альфа-цепи взаимодействует с N-концевой частью пептида
антигена, a CDR1 р-цепи взаимодействует с С-концевой частью этого пептида. Считается, что CDR2 распознает МНС. Считается, что CDR4 |3-цепи не участвует в распознавании антигена, но, как было показано, взаимодействует с суперантигенами. Константная область домена TCR состоит из коротких связующих последовательностей, в которых остаток цистеина образует дисульфидные связи, что образует связь между двумя цепями.
[0196] Так как TCR является членом белка IgSF, то его можно
сравнить с антителами и BCR. В терминах сходства TCR
представляет собой половину антитела с тяжелой и легкой цепью,
за исключением того, что тяжелая цепь не имеет своей
кристаллизующейся фракции (Fc) (Примечание: в процессе развития
альфа TCR подвергается рекомбинации VJ, поэтому он похожа на
легкую цепь; бета TCR подвергается рекомбинации VDJ, поэтому он
похожа на тяжелую цепь). Таким образом, TCR в процессе развития
подобен одному из антителосвязывающих фрагментов антитела. Две
субъединицы TCR скручены вместе. В то время как в антителе
область Fc используется для связывания с Fc-рецепторами на
врожденных лейкоцитах, TCR уже находится на клеточной мембране.
Однако, он сам не способен опосредовать сигнальную трансдукцию
из-за своего короткого цитоплазматического хвоста, поэтому TCR
нужен CD3 и дзета для осуществления сигнальной трансдукции на
своем месте, так же как антителу требуется связывание с FcR для
инициирования сигнальной трансдукции. Таким образом,
взаимодействие MHC-TCR-CD3 для Т-клеток функционально аналогично взаимодействию Ag-Ig-FcR для миелоидных лейкоцитов и взаимодействию Ag-Ig-CD79 для В-клеток.
[0197] Способы получения антигенспецифичных TCR известны в
данной области. Способы могут включать, например, 1) синтез
известных или спрогнозированных пептидных эпитопов,
рестриктированных по HLA, полученных из представляющих интерес белков (например, опухолевые антигены, неоантигены из данных секвенирования и тому подобное); 2) презентирование их через антигенпрезентирующую клетку (для деления) или тетрамер (для прямого сортинга) в пул Т-клеток, из которых будут
экстрагированы последовательности TCR (например, лимфоциты,
инфильтрирующие опухоль, в случае Т-клеток, специфичных к
опухолевым антигенам); 3) селекцию или скрининг
антигенспецифических Т-клеток (например, FACS сортинг антиген-специфичных Т-клеток на основе связывания тетрамера); 4) клонирование (с помощью ОТ-ПЦР) и секвенирование генов TCR (то есть альфа- и бета-цепей или гамма- и дельта-цепей TCR); клонирование и секвенирование можно выполнять либо на популяционном уровне, либо на уровне отдельных клеток; и 5) подтверждение и анализ специфичности TCR путем, например, исследования функции клонов TCR путем трансдуцирования Т-клеток периферической крови этими последовательностями и оценки их реакционной способности в отношении клеток-мишеней, которые экспрессируют когнатный комплекс пептид-МНС. Реактивность обычно измеряется на основе продукции цитокинов (например, интерферона гамма).
IV. Композиции клеточной культуры и способы
[0198] 3D культуральные композиции, такие как искусственные органоиды тимуса (АТО), представляют собой оптимизированный, высокоэффективный и высоковоспроизводимый стандарт для in vitro продукции Т-клеток человека из стволовых клеток. В отличие от существующих экспериментальных моделей для дифференциации Т-клеток, в некоторых аспектах трехмерных культуральных композиций используют бессывороточные условия, не допускают использования ткани тимуса человека или запатентованных каркасов и способствуют позитивной селекции и активной продукции полностью функциональных зрелых Т клеток человека из стволовых клеток. В качестве возможной коммерческой платформы для создания Т-клеток^л vitro, трехмерные культуральные композиции обеспечивают эффективность, воспроизводимость, масштабируемость и снижение затрат и рабочей силы по сравнению с конкурирующими технологиями. Неограниченное коммерческое применение может включать in vitro экспериментальное моделирование развития Т-клеток человека и in vitro продукцию сконструированных Т-клеток для иммунотерапии из различных источников стволовых клеток.
[0199] В некоторых вариантах осуществления может быть предложена оптимизированная трехмерная (3D) культуральная система для продукции функциональных Т-клеток in vitro из человеческих стволовых клеток и/или клеток-предшественников (HSPC). Полученные 3D клеточные структуры можно назвать искусственными органоидами тимуса (АТО).
[0200] В конкретных вариантах осуществления эта система может включать агрегацию в 3D структуре HSPC человека со стромальными клетками, экспрессирующими лиганд Notch, в присутствии оптимизированной среды, содержащей лиганд FLT3 (FLT3L), интерлейкин 7 (IL-7), В27 и аскорбиновую кислоту. Также могут быть условия, допускающие культивирование на границе раздела воздух-жидкость. Было установлено, что комбинированная сигнализация внутри АТО растворимых факторов (цитокины, аскорбиновая кислота, компоненты В27 и факторы стромальных клеток) вместе с 3D взаимодействиями "клетка-клетка" между гематопоэтическими и стромальными клетками облегчает коммитирование Т-клеточной линии, позитивную селекцию и эффективную дифференцировку в функциональные зрелые Т-клетки.
[0201] В конкретных вариантах осуществления может быть предложен способ 3D культуральной композиции (например, продукция АТО), как разработано, включающий агрегацию мышиных стромальных клеток линии MS-5, трансдуцированных DLL1 (MS5-hDLLl в настоящем изобретении) с CD34+ HSPC, выделенными из пуповинной крови человека, костного мозга или G-CSF мобилизированной периферической крови. Около 1x106 HSPC смешивают с клетками MS5-hDLLl при оптимизированном соотношении (обычно 1:10 HSPC к стромальным клеткам).
[0202] Например, агрегирование достигается путем центрифугирования смешанной клеточной суспензии ("компактизация агрегации") с последующей аспирацией безклеточного супернатанта. В конкретных вариантах осуществления клеточный осадок можно затем может быть аспирирован в виде суспензии в 5-10 мкл среды для дифференциации и перенесен в виде капли на культуральные нейлоновые вставки Tranwell размером 0,4 мкм, которые плавают в
лунке со средой для дифференциации, обеспечивая контакт дна вставки со средой, а верхней части - с воздухом.
[0203] Например, среда для дифференцировки состоит из RPMI-1640, 5 нг/мл FLT3L человека, 5 нг/мл IL-7 человека, 4% бессывороточной добавки В2 7 и 3 0 мкМ L-аскорбиновой кислоты. Среда может быть полностью заменена каждые 3-4 дня вокруг культуральных вставок. В течение первых 2 недель культивирования клеточные агрегаты могут самоорганизоваться как АТО, и происходить раннее коммитирование и дифференцировка в Т-клеточные линии. В некоторых аспектах АТО культивируют в течение по меньшей мере б недель, чтобы обеспечить оптимальную дифференцировку Т-клеток. Получение гемопоэтических клеток из АТО осуществляется путем дезагрегирования АТО с помощью пипетирования.
[0204] Модификации в протоколе позволяют использовать альтернативные компоненты с различным воздействием на эффективность, а именно:
[0205] Основная среда RPMI может быть заменена на некоторые коммерчески доступные альтернативами (например, IMDM).
[0206] Используемой линией стромальных клеток является MS-5, ранее описанная клеточная линия костного мозга мыши (Itoh et al, 1989), однако MS-5 может быть заменена на аналогичные линии мышиных стромальных линий (например, 0Р9, S17), линии стромальные клеток человека (например, HS-5, HS-27a), первичные стромальные клетки человека или стромальные клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека.
[0207] Стромальную клеточную линию трансдуцируют с помощью лентивируса, кодирующего кДНК DLL1 человека; однако способ доставки гена, а также ген лиганда Notch может быть изменен. Альтернативные гены лиганда Notch включают DLL4, JAG1, JAG2 и другие. Лиганды Notch также включают лиганды, которые описаны в патентах США 7795404 и 8377886, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки. Лиганды Notch дополнительно включают Дельта 1, 3 и 4 и Jagged 1, 2.
[0208] Тип и источник HSPC могут включать костный мозг, пуповинную кровь, периферическую кровь, тимус или другие
первичные источники; или HPSC, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека (ESC) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC).
[0209] Цитокиновые условия могут изменяться: например, уровни FLT3L и IL-7 могут быть изменены для изменения кинетики дифференцировки Т-клеток; могут быть добавлены другие гемопоэтические цитокины, такие как фактор стволовых клеток
(лиганд SCF/KIT), тромбопоэтин (ТРО), IL-2, IL-15.
[0210] В некоторые компоненты также может быть введена генетическая модификация с получением антигенспецифических Т-клеток и для моделирования позитивной и негативной селекции. Примеры таких модификаций включают: трансдукцию HSPC лентивирусным вектором, кодирующим антигенспецифический рецептор Т-клеток (TCR) или химерный рецептор антигена (CAR) с получением антигенспецифических наивных Т-клеток с аллельным исключением; трансдукцию HSPC геном/ами для непосредственного коммитирования в клеточную линию специализированных лимфоидных клеток. Например, трансдукция HSPC инвариантным естественным Т-киллером
(iNKT), связанным с TCR, с получением функциональных клеток iNKT в АТО; трансдукция линии стромальных клеток АТО (например, MS 5-hDLLl) генами МНС человека для повышения позитивной селекции созревания как Т-клеток со сконструированными TCR, так и без них в АТО; и/или трансдукция линии стромальных клеток АТО антигеном плюс костимулирующими молекулами или цитокинами для повышения позитивной селекции CAR Т-клеток в АТО.
V. Условия для клеточного культирования
[0211] Условия для культивирования клеток могут быть предоставлены для культуры 3D клеточных агрегатов, описанных в настоящем изобретении, и для получения Т-клеток и/или их позитивной/негативной селекции. В некоторых аспектах исходные клетки выбранной популяции могут содержать по меньшей мере или приблизительно 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 клеток или любой диапазон этих значений. Начальная клеточная популяция может иметь плотность посева по меньшей мере или приблизительно 10, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 клеток/мл, или любой диапазон этих значений.
B. Контейнеры для культуры
[0212] Культуральный сосуд, используемый для
культивирования 3D клеточных агрегатов или их клеток-потомков, может включать, но конкретно не ограничивается ими: колбу, колбу для тканевой культуры тканей, чашку, чашку Петри, чашку для тканевой культуры, мультичашку, микропланшет, микролуночный планшет, мультипланшет, мультилуночный планшет, микропластину, камерную пластину, пробирку, кювету, камеры CellSTACK(r), мешок для культивирования и роллерный флакон, если в нем можно культивировать стволовые клетки. Стволовые клетки можно культивировать в объеме по меньшей мере или равном приблизительно 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 мл, 100 мл, 150 мл, 200 мл, 250 мл, 300 мл, 350 мл, 400 мл, 450 мл, 500 мл, 550 мл, 600 мл, 800 мл, 1000 мл, 1500 мл или в любом диапазоне этих значений, в зависимости от потребностей культуры. В определенном варианте осуществления культуральный сосуд может быть биореактором, который может относиться к любому устройству или системе, в которой возможно поддержание биологически активной среды. Биореактор может иметь объем по меньшей мере или равный приблизительно 2, 4, 5, б, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 литров, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 кубических метров или любой диапазон этих значений.
[0213] Культуральный сосуд может быть с клеточной адгезией или без нее, и может быть выбран в зависимости от цели. Культуральный сосуд с клеточной адгезией может быть покрыт любым из субстратов для адгезии клеток, таким как экстрацеллюлярный матрикс (ЕСМ), для улучшения адгезионной способности поверхности сосуда к клеткам. Субстрат для клеточной адгезии может быть любым материалом, предназначенным для прикрепления стволовых клеток или фидерных клеток (если используются). Субстрат для клеточной адгезии включает коллаген, желатин, поли-Ъ-лизин, поли-0-лизин, ламинин и фибронектин и их смеси, например, Matrigel(tm), и препараты лизированных клеточных мембран.
C. Компоненты матрикса
[0214] В способах или композициях для культивирования могут быть использованы различные определенные компоненты матрикса. Например, рекомбинантный коллаген IV, фибронектин, ламинин и витронектин в комбинации могут быть использованы для покрытия поверхности культивирования в качестве средства получения твердой подложки для роста плюрипотентных клеток, как описано в публикации Ludwig et al. (2006а, 2006b), включенной в качестве ссылки в полном объеме.
[0215] Композиция матрикса может быть иммобилизована на поверхности для поддержания клеток. Состав матрикса может включать один или несколько белков экстрацеллюлярного матрикса (ЕСМ) и водный растворитель. Термин "экстрацеллюлярный матрикс" хорошо известен в данной области. Его компоненты включают один или несколько из следующих белков: фибронектин, ламинин, витронектин, тенаскин, энактин, тромбоспондин, эластин, желатин, коллаген, фибриллин, мерозин, анкорин, хондронектин, связывающий белок, костный сиалопротеин, остеокальцин, остеопонтин, эпинектин, гиалуронектин, ундулин, эпилигрин и Калинин. Другие белки экстрацеллюлярного матрикса описаны в публикации Kleinman et al., (1993), включенной в настоящем изобретении в качестве ссылки. Предполагается, что термин "экстрацеллюлярный матрикс" включает неизвестный в настоящее время экстрацеллюлярный матрикс, который может быть обнаружен в будущем, поскольку его характеристика в качестве экстрацеллюлярного матрикса будет легко определяема специалистами в данной области.
[0216] В некоторых аспектах общая концентрация белка в композиции матрикса может составлять от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 1 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления общая концентрация белка в композиции матрикса составляет от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 300 мкг/мл. В более предпочтительных вариантах общая концентрация белка в композиции матрикса составляет от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 200 мкг/мл.
[0217] Белки экстрацеллюлярного матрикса (ЕСМ) могут быть природными и очищенными из тканей человека или животных. Альтернативно, белки ЕСМ могут быть созданы методами генной
инженерии или быть синтетическими по своей природе. Белки ЕСМ могут быть полноразмерным белком или иметь форму пептидных фрагментов, нативными или сконструированными. Примеры белка ЕСМ, который может использоваться в матриксе для клеточной культуры, включают ламинин, коллаген I, коллаген IV, фибронектин и витронектин. В некоторых вариантах осуществления композиция матрикса включает пептидные фрагменты фибронектина, полученные синтетическим путем, или рекомбинантного фибронектина.
[0218] В других вариантах осуществления композиция матрикса включает смесь из по меньшей мере фибронектина и витронектина. В некоторых других вариантах композиция матрикса, предпочтительно, в ключ а е т л аминин.
[0219] Композиция матрикса предпочтительно включает белок экстрацеллюлярного матрикса одного типа. В некоторых вариантах осуществления композиция матрикса включает фибронектин, в частности, для использования при культивировании клеток-предшественников. Например, подходящую композиция матрикса можно получить путем разведения фибронектина человека, такого как фибронектин человека, продаваемый компанией Becton, Dickinson & Co. Franklin Lakes, NJ (BD) (номер в каталоге # 354008), в физиологическом растворе, забуференном фосфатом Дульбекко
(DPBS), до концентрация белка от 5 мкг/мл до приблизительно 200 мкг/мл. В конкретном примере композиция матрикса включает фрагмент фибронектина, такой как RetroNectin(r). RetroNectin(r) представляет собой белок (574 аминокислот) размером ~63 кДа, который содержит центральный домен, связывающий клетку (повтор типа III, 8,9,10), высокоаффинный гепарин-связывающий домен II
(повтор типа III, 12, 13, 14) и сайт CS1 в альтернативно сплайсированной области IIICS человеческого фибронектина.
[0220] В некоторых других вариантах композиция матрикса может включать ламинин. Например, подходящая композиция матрикса может быть получена путем разведения ламинина (Sigma-Aldrich
(St. Louis, Mo); номер в каталоге # L6274 и L2020) в физиологическом растворе, забуференном фосфатом Дульбекко
(DPBS), до концентрации белка от 5 мкг/мл до приблизительно 200 мкг/мл.
[0221] В некоторых вариантах осуществления композиция матрикса не содержит Хепо, поскольку матрикс или белки, ее составляющие, являются только человеческими. Это может требоваться для некоторых исследовательских применений. Например, в матриксе, не содержащем Хепо, для культивирования клеток человека могут быть использованы компоненты матрикса человеческого происхождения, из которых могут быть исключены любые компоненты животного, исключая человека. В некоторых аспектах Matrigel(tm) может быть исключен как субстрат из композиции для культивирования. Matrigel(tm) представляет собой желатиновую белковую смесь, секретируемую опухолевыми клетками мыши и коммерчески доступную от компании BD Biosciences (Нью-Джерси, США) . Эта смесь воссоздает сложную внеклеточную среду, обнаруживаемую во многих тканях, и она часто используется специалистами в клеточной биологии в качестве субстрата для клеточной культуры, но она может вносить нежелательные антигены Хепо или загрязнители.
VI. Маркеры селекции или скрининга
[0222] В некоторых вариантах осуществления могут быть in vitro или in vivo идентифицированы клетки, содержащие экзогенную нуклеиновую кислоту, путем включения маркера в вектор экспрессии или в экзогенную нуклеиновую кислоту. Такие маркеры придают идентифицируемое изменение клетке, что позволяет легко идентифицировать клетки, содержащие вектор экспрессии. Как правило, маркер селекции может быть маркером, который придает свойство, которое делает возможным селекцию. Маркером позитивной селекции может быть маркер, в присутствие которого возможна его селекция, при этом маркер негативной селекции представляет собой маркер, присутствие которого препятствует его селекции. Примером маркера позитивной селекции является маркер устойчивости к лекарственным средствам.
[0223] Обычно включение маркера селекции по
чувствительности к лекарственному препарату способствует клонированию и идентификации трансформантов, например, гены,
которые придают устойчивость к неомицину, пуромицину, гигромицину, DHFR, GPT, цеоцину и гистидинолу, являются эффективными маркерами селекции. Кроме маркеров, придающим фенотип, который допускает возможность отличить трансформанты на основании применения условий, также рассматриваются другие типы маркеров, включая маркеры скрининга, такие как GFP, которые основаны на колориметрическом анализе. Альтернативно, можно использовать ферменты скрининга в качестве маркеров негативной селекции, такие как тимидинкиназа вируса простого герпеса (tk) или хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT). Специалисту в данной области также будет известно как использовать иммунологические маркеры, возможно, в сочетании с анализом FACS. Применяемый маркер не считается важным, если он способен одновременно экспрессироваться с нуклеиновой кислотой, кодирующей генный продукт. Другие примеры маркеров селекции и скрининга хорошо известны специалисту в данной области.
[0224] Селектируемые маркеры могут включать маркер по типу репортерного гена, используемый в лабораторной микробиологии, молекулярной биологии и генной инженерии, для указания на успешную трансфекции или другие процедуры, предназначенные для введения чужеродной ДНК в клетку. Селектируемые маркеры часто являются генами устойчивости к антибиотикам; клетки, которые были подвергнуты процедуре введения чужеродной ДНК, выращивают на среде, содержащей антибиотик, и те клетки, которые могут расти, успешно принимают и экспрессируют введенный генетический материал. Примеры селектируемых маркеров включают: ген Abicr или ген Neo из Тп5, который придает устойчивость к антибиотику генетицину.
[0225] Маркер скрининга может содержать репортерный ген, который позволяет исследователю различать желаемые и нежелательные клетки. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения используют репортерные гены для обозначения конкретных клеточных линий. Например, репортерный ген может быть расположен в пределах экспрессионных элементов и под контролем элементов регуляции желудочков или предсердий, которые обычно связаны с кодирующей областью селективного гена
желудочков или предсердий для одновременной экспрессии. Репортер позволяет выделить клетки конкретной линии, не помещая их под действие лекарства или другого селективного давления, или иного воздействия с риском для жизнеспособности клеток.
[0226] Примеры таких репортеров включают гены, кодирующие белки поверхности клетки (например, CD4, НА-эпитоп), флуоресцентные белки, антигенные детерминанты и ферменты (например, р-галактозидаза). Вектор, содержащий клетки, может быть выделен, например, с помощью FACS, используя флуоресцентно-меченые антитела к белку или субстратам клеточной поверхности, которые могут быть преобразованы в флуоресцентные продукты с помощью фермента, кодируемого вектором.
[0227] В конкретных вариантах осуществления репортерный ген представляет собой флуоресцентный белок. Был разработан широкий спектр генетических вариантов флуоресцентного белка, в которых представлены спектральные профили флуоресцентного излучения, охватывающие почти весь спектр видимого света (см. таблицу 1 в качестве неограничивающих примеров). Усилия мутагенеза в первоначальном флуоресцентном белке медузы Aequorea victoria привели к появлению новых флуоресцентных зондов, которые изменяются в цвете от синего до желтого и являются одними из наиболее широко используемых in vivo репортерных молекул в биологических исследованиях. Флуоресцентные белки с большей длиной волны и излучением в оранжевой и красной спектральных областях, были разработаны из морского анемона, Discosoma striata, и коралловых рифов, относящихся к классу Anthozoa. Другие виды были получены для создания подобных белков с флуоресцентным излучением в области голубого, зеленого, желтого, оранжевого спектра и длинноволновой части красной области спектра. Продолжаются научно-исследовательские разработки по улучшению яркости и стабильности флуоресцентных белков, тем самым повышая их общую эффективность.
Таблица 1 Свойства флуоресцентных белков
Белок
Излучение
Испускание
Коэффици
Квантовый
in vivo
Относительная
(Сокраще
Максимум
Максимум
ент
выход
Структура
яркость (% от
ние)
(HM)
(HM)
молярной
ЭКСТИНКЦ ИИ
EGFP)
GFP (масс.)
395/475
509
21000
0,77
Мономер*
Зеленые флуоресцентные белки
EGFP
484
507
56000
0, 60
Мономер*
100
AcGFP
480
505
50000
0, 55
Мономер*
TurboGFP
482
502
70000
0, 53
Мономер*
110
Emerald
487
509
57500
0, 68
Мономер*
116
Azami Green
492
505
55000
0,74
Мономер
121
ZsGreen
493
505
43000
0,91
Тетрамер
117
Синие флуоресцентные белки
EBFP
383
445
29000
0,31
Мономер*
Sapphire
399
511
29000
0, 64
Мономер*
Sapphire
399
511
44000
0, 60
Мономер*
Голубые флуоресцентные белки
ECFP
439
476
32500
0,40
Мономер*
mCFP
433
475
32500
0,40
Мономер
Cerulean
433
475
43000
0, 62
Мономер*
CyPet
435
477
35000
0,51
Мономер*
AmCyanl
458
489
44000
0,24
Тетрамер
Midori-
Ishi
Cyan
472
495
27300
0,90
Димер
mTFPl (Teal)
462
492
64000
0,85
Мономер
162
Желтые флуоресцентные белки
EYFP
514
527
83400
0, 61
Мономер*
151
Topaz
514
527
94500
0, 60
Мономер*
169
Venus
515
528
92200
0, 57
Мономер*
156
mCitrine
516
529
77000
0,76
Мономер
174
YPet
517
530
104000
0,77
Мономер*
238
PhiYFP
525
537
124000
0,39
Мономер*
144
ZsYellow 1
529
539
20200
0, 42
Тетрамер
mBanana
540
553
6000
0,7
Мономер
Оранжевые и красные флуоресцентные белки
Kusabira Orange
548
559
51600
0, 60
Мономер
mOrange
548
562
71000
0, 69
Мономер
146
dTomato
554
581
69,000
0, 69
Димер
142
dTomato-Tandem
554
581
138000
0, 69
Мономер
283
DsRed
558
583
75 000
0,79
Тетрамер
176
DsRed2
563
582
43800
0, 55
Тетрамер
DsRed-Expres s (Tl)
555
584
38000
0,51
Тетрамер
DsRed-Мономер
556
586
35000
0,10
Мономер
mTangeri ne
568
585
38000
0,30
Мономер
mStrawbe rry
574
596
90000
0,29
Мономер
AsRed2
576
592
56200
0, 05
Тетрамер
mRFPl
584
607
50000
0,25
Мономер
JRed
584
610
44000
0,20
Димер
mCherry
587
610
72000
0,22
Мономер
HcRedl
588
618
20000
0, 015
Димер
mRaspber ry
598
625
86000
0, 15
Мономер
HcRed-Tandem
590
637
160000
0, 04
Мономер
mPlum
590
649
41000
0,10
Мономер
AQ143
595
655
90000
0, 04
Тетрамер
* Слабый димер
VII. Экзогенное редактирование генов
[0228] В некоторых вариантах осуществления
сконструированною нуклеазы можно использовать для введения последовательностей экзогенных нуклеиновых кислот для генетической модификации любых клеток, используемых в настоящем изобретении, в частности, исходных клеток, таких как стромальные клетки или стволовые клетки или клетки-предшественники в способах или композициях для культивирования.
[0229] Редактирование генома или геномное редактирование с помощью сконструированных методами генной инженерии нуклеаз (GEEN) представляет собой тип генной инженерии, в которой в геном встраивают, заменяют или удаляют ДНК, используя искусственно созданные нуклеазы, или "молекулярные ножницы". Нуклеазы создают специфический двухцепочечный разрыв (DSB) в желаемых местах в геноме и используют эндогенные механизмы клетки для восстановления сделанного разрыва посредством природных процессов гомологичной рекомбинации (HR) и негомологичного концевого соединения (NHEJ).
[0230] Неограничивающие примеры сконструированных нуклеаз включают в себя: нуклеазы цинковых пальцев (ZFN), эффекторные нуклеазы подобные активаторам транскрипции (TALEN), систему CRISPR/Cas9 и мегануклеазы, сконструированные путем перестройки хоуминг эндонуклеаз. Любая из сконструированных нуклеаз, известных в данной области, может быть использована в некоторых аспектах способов и композиций.
[0231] Для того, чтобы понять функцию гена или белка, обычно при генном анализе проводят вмешательство в ген или белок специфичным для последовательности образом и контролируют его воздействие на организм. Однако в некоторых организмах трудно или невозможно осуществить сайт-специфический мутагенез, и поэтому необходимо использовать более косвенные способы, такие как сайленсинг интересующего гена с помощью короткой интерферирующей РНК (siRNA). Однако разрушение гена под действием siRNA может быть различным и неполным. Геномное редактирование нуклеазами, такими как ZFN, отличается от siRNA тем, что сконструированная нуклеаза способна модифицировать специфичность ДНК-связывания и, следовательно, может в принципе
разрезать любое мишеневое положение в геноме и вносить модификацию эндогенных последовательностей генов, на которые невозможно специфически нацелиться с помощью обычных RNAi. Кроме того, специфичность ZFN и TALEN усиливается, поскольку для распознавания соответствующей части мишени и последующего направления в соседние последовательности требуется две ZFN.
[0232] Мегануклеазы, обычно встречающиеся у
микробиологических видов, обладают уникальным свойством, так как обладают очень длинными последовательностями распознавания (> 14 п.о.), что делает их природу очень специфичной. Это факт можно использовать для создания сайт-специфических DSB при геномном редактировании; однако проблема заключается в том, что известно недостаточное количество мегагануклеаз, для того, чтобы охватить все возможные мишеневые последовательности, а то количество, которое известно является недостаточным. Для решения этой проблемы были использованы способы мутагенеза и высокоэффективные способы скрининга для создания вариантов мегануклеаз, которые распознают уникальные последовательности. Некоторым группам удалось слить различные мегануклеазы и создать гибридные ферменты, которые распознают новую последовательность. Другие группы пытались изменить аминокислоты мегануклеаз, взаимодействующих с ДНК, для создания специфических мегануклеаз по методу, называемому рациональное конструирование мегануклеаз (патент США 8 021867 В2, включенный в настоящий документ в качестве ссылки).
[0233] Преимуществом мегануклеаза является возможность
вызывать меньшую токсичность в клетках по сравнению с такими
подходами, как ZFN, вероятно, из-за более строгого распознавания
последовательностей ДНК; однако конструирование
последовательности специфических ферментов для всех возможных последовательностей является дорогостоящим и времязатратным, поскольку в нем используются комбинаторные возможности, которые применяются в таких методах, как ZFN и TALEN. Таким образом, имеются как преимущества, так и недостатки.
[0234] В отличие от мегануклеаз, концепция, лежащая в основе ZFN и TALEN, в большей степени основана на ферменте с
неспецифической рестрикцией ДНК, который затем будет связываться со специфической последовательностью ДНК, распознающей пептиды, такие как цинковые пальцы и эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALE) . Один из способов заключался в том, чтобы найти эндонуклеазу, чей сайт распознавания ДНК и сайт расщепления были отделены друг от друга, ситуация, которая не является частой для рестрикционных ферментов. Как только этот фермент был бы обнаружен, его участок расщепления можно было бы удалить, чтобы фермент стал крайне неспецифичным, поскольку не имел бы способности к распознаванию. Затем этот кусок можно было бы связать с пептидами, распознающими последовательность, что обеспечило бы в высшей степени высокую специфичность. Примером рестрикционного фермента с такими свойствами является Fokl. Кроме того, преимущество Fokl заключается в необходимости димеризации для приобретения нуклеазной активности, и это означает, что специфичность резко возрастает, поскольку каждый партнер нуклеазы распознает уникальную последовательность ДНК. Для усиления этого эффекта были сконструированы нуклеазы Fokl, которые могут функционировать только в виде гетеродимеров и обладают повышенной каталитической активностью. Нуклеазы с гетеродимерной функцией могли бы позволить избежать возможности нежелательной активности гомодимера и, таким образом, повысить специфичность DSB.
[0235] Хотя нуклеазная часть как ZFN, так и TALEN имеет сходные свойства, разница между этими сконструированными нуклеазами связана с их пептидом, распознающим ДНК. В ZFN используются цинковые пальцы Cys2-His2, а в TALEN используются TALE. Оба этих пептидных домена, распознающих ДНК, обладают характеристиками, которые естественным образом встречаются в комбинациях в их белках. Цинковые пальцы Cys2-His2 обычно возникают из повторов, которые разделены 3 п.о. и встречаются в различных комбинациях в различных пептидах, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, таких как факторы транскрипции. TALE, с другой стороны, обнаруживаются в повторах с соотношением распознавания один к одному между аминокислотами и распознанными нуклеотидными парами. Поскольку как цинковые пальцы, так и TALE
возникают из повторяющихся структур, то можно попытаться использовать различные комбинации для создания широкого спектра специфичности последовательности. Цинковые пальцы были чаще использованы в таких терминах и подходах, таких как модульная сборка (когда цинковые пальцы, связанные с триплетной последовательностью, присоединяются в ряд, покрывая требуемую последовательность), OPEN (низкая строгость отбора пептидных доменов по сравнению с триплетными нуклеотидами, а затем отбор с жесткой строгостью пептидной комбинации по сравнению с конечной мишенью в бактериальных системах), и для создания сайт-специфических нуклеаз наряду с другими способами использовали бактериальный одногибридный скрининг библиотек цинковых пальцев. VIII. Доставка экзогенных генов
[0236] В некоторых вариантах осуществления может быть сконструирован вектор, содержащий последовательности экзогенных нуклеиновых кислот для генетической модификации любых клеток, используемых в настоящем изобретении, в частности, исходных клеток, таких как стромальные клетки или стволовые клетки, или клетки-предшественники, в способах или композициях для культивирования. Подробное описание компонентов этих векторов и способов доставки описаны ниже.
А. Вектор
[0237] Специалисты в данной области, по-видимому, обладают оборудованием для конструирования вектора посредством стандартных рекомбинантных методов (см., например, Maniatis et al. , 198 8 и Ausubel et al. , 1994, оба документа включены в настоящий документ в качестве ссылки).
[0238] Векторы могут также содержать другие компоненты или функциональные группы, которые дополнительно модулируют доставку генов и/или экспрессию генов, или которые в противном случае придают полезные свойства целевым клеткам. К таким другим компонентам относятся, например, компоненты, которые влияют на связывание или нацеливание на клетки (включая компоненты, которые опосредуют клеточное или тканеспецифическое связывание); компоненты, которые влияют на поглощение клеткой нуклеиновой кислоты вектора; компоненты, которые влияют на расположение
полинуклеотида внутри клетки после поглощения (такие как агенты, опосредующие ядерную локализацию); и компоненты, которые влияют на экспрессию полинуклеотида.
[0239] Такие компоненты также могут включать маркеры, такие как маркеры детекции и/или маркеры селекции, которые могут использоваться для детекции или селекции клеток, которые поглотили и экспрессируют нуклеиновую кислоту, доставленную вектором. Такие компоненты могут быть представлены в качестве природной особенности вектора (например, использование определенных вирусных векторов, которые имеют компоненты или функциональные возможности, опосредующие связывание и поглощение), или векторы могут быть модифицированы и обеспечивать такие функциональные возможности. В данной области известно большое разнообразие таких векторов, и они, как правило, доступны. Если вектор сохраняется в клетке-хозяине, то вектор может быть стабильно реплицирован клетками во время митоза в качестве автономной структуры, включенной в геном клетки-хозяина, или сохраняться в ядре или цитоплазме клетки-хозяина .
В. Регуляторные элементы
[0240] Кассеты экспрессии эукариот, введенные в векторы,
прежде всего содержат (в направлении от 5'-3') эукариотический
промотор транскрипции, функционально связанный с
последовательностью, кодирующей белок, сигналы сплайсинга, включающие в себя промежуточные последовательности, и последовательность терминации транскрипции/полиаденилирования.
i. Промотор/Энхансеры
[0241] "Промотор" представляет собой контрольную последовательность, являющуюся областью последовательности нуклеиновой кислоты, которая контролирует инициацию и скорость транскрипции. Он может содержать генетические элементы, к которым могут присоединяться регуляторные белки и молекулы, такие как РНК-полимераза и другие факторы транскрипции, для инициации специфической транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты. Фразы "функционально расположенная",
"функционально связанная", "под контролем" и "под контролем транскрипции" означают, что промотор находится в правильном функциональном положении и/или ориентации по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты для осуществления контроля инициации транскрипции и/или экспрессии этой последовательности.
[0242] Промотор обычно содержит последовательность, функция которой связана с определением местонахождения исходного сайта для синтеза РНК. Наиболее известным примером такой последовательности является ТАТА-бокс, но у некоторых промоторов, у которых отсутствует ТАТА-бокс, например, у промотора гена терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы млекопитающего и у промотора поздних генов SV4 0, отдельный элемент, перекрывающий сайт начала транскрипции, сам помогает присоединиться к месту инициации. Дополнительные промоторные элементы регулируют частоту инициации транскрипции. Как правило, они расположены в области 30-110 п.о. в направлении 3'-5' от сайта начала, хотя было показано, что ряд промоторов содержит функциональные элементы, расположенные в направлении 5'-3' от сайта начала. Чтобы поставить кодирующую последовательность "под контроль" промотора, можно разместить 5' конец сайта инициации транскрипции транскрипционной рамки считывания в направлении 5'-3' относительно (то есть 3') выбранного промотора. Промотор в положении "3'-5'" стимулирует транскрипцию ДНК и способствует экспрессии кодируемой РНК.
[0243] Интервал между промоторными элементами часто является гибким, так что функция промотора сохраняется, если элементы инвертируются или перемещаются относительно друг друга. В промоторе tk промежуток между промоторными элементами может быть увеличен до 50 п.о., прежде чем активность начнет снижаться. В зависимости от промотора, судя по всему, отдельные элементы могут функционировать либо совместно, либо независимо для активации транскрипции. Промотор может использоваться или не использоваться в сочетании с "энхансером", который относится к
цис-действующей регуляторной последовательности, участвующей в активации транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты.
[0244] Промотор может быть естественным образом связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, что может быть получено путем выделения 5' некодирующих последовательностей, расположенные в направлении 3'-5' относительно кодирующего сегмента и/или экзона. Такой промотор можно назвать "эндогенным". Аналогично, энхансер может быть естественным образом связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, расположенной 5'-3' или 3'-5' относительно этой последовательности. Альтернативно, могут быть получены некоторые преимущества при расположении сегмента кодирующей нуклеиновой кислоты под контроль рекомбинантного или гетерологичного промотора, который относится к промотору, который обычно не связан с последовательностью нуклеиновой кислоты в своем обычном состоянии. Рекомбинантный или гетерологичный энхансер относится также к энхансеру, который обычно не связан с последовательностью нуклеиновой кислоты в своем обычном состоянии. Такие промоторы или энхансеры могут включать промоторы или энхансеры других генов и промоторы или энхансеры, выделенные из любого другого вируса, или прокариотической или эукариотической клетки, и промоторы или энхансеры, которые не являются "природными", то есть содержащие различные элементы различных транскрипционных регуляторных областей и/или мутации, которые изменяют экспрессию. Например, промоторы, которые наиболее часто используются в конструкции рекомбинантной ДНК, включают промоторную систему р-лактамаза (пенициллиназа), лактозу и триптофан (trp). В дополнение к получению последовательностей нуклеиновых кислот промоторов и энхансеров синтетическим образом последовательности могут быть получены с использованием методик рекомбинатного клонирования и/или амплификации нуклеиновых кислот, включая ПЦР(tm), в связи с описанными в настоящем изобретении композициями (см. патенты США №№ 4683202 и 5928906, каждый включен в настоящее описание в качестве ссылки). Кроме того, предполагается, что также могут использоваться контрольные
последовательности, которые направляют транскрипцию и/или экспрессию последовательностей в неядерных органеллах, таких как митохондрии, хлоропласты и тому подобное.
[0245] Естественно, важно использовать промотор и/или
энхансер, который эффективно направляет экспрессию сегмента ДНК
в органелле, клеточном типе, ткани, органе или организме,
выбранном для экспрессии. Специалистам в области молекулярной
биологии обычно известно, как использовать промоторы, энхансеры
и комбинации клеточных типов для экспрессии белка (см.,
например, публикацию Sambrook et al. 1989, включена в настоящий
документ в качестве ссылки). Используемые промоторы могут быть
конститутивными, тканеспецифичными, индуцируемыми и/или
эффективными в соответствующих условиях для непосредственной высокоэффективной экспрессии введенного сегмента ДНК, например, имеющего преимущества при крупномасштабном производстве рекомбинантных белков и/или пептидов. Промотор может быть гетерологичным или эндогенным.
[024 6] Кроме того, для индукции экспрессии также можно использовать любую комбинацию промотор/энхансера (как, например, the Eukaryotic Promoter Data Base EPDB, на веб сайте epd.isb-sib.ch/). Использование цитоплазматической системы экспрессии ТЗ, Т7 или SP6 является еще одним их возможных вариантов осуществления. Эукариотические клетки могут поддерживать цитоплазматическую транскрипцию определенных бактериальных промоторов, если представлена соответствующая бактериальная полимераза, либо как часть комплекта доставки, либо как дополнительная генетическая экспрессирующая конструкция.
[0247] Неограничивающие примеры промоторов включают ранние или поздние промоторы вирусов, например, ранний или поздний промоторы SV4 0, промоторы ранней стадии цитомегаловируса (CMV), ранние промоторы вируса саркомы Рауса (RSV); промоторы эукариотических клеток, такие как, например, промотор бета-актина (Ng, 198 9; Quitsche et al. , 1989), промотор GADPH (Alexander et al., 1988, Ercolani et al., 1988), промотор металлотионеинов (Karin et al. , 1989; Richards et al. , 1984); и промоторы последовательно соединенных элементов отклика, такие
как промоторы элементов отклика циклического AMP (ere), промотор элементов отклика сыворотки (sre), промотор эфира форбола (ТРА) и промоторы элементов отклика (tre) вблизи с мимимальным ТАТА-боксом. Также возможно использовать последовательности промотора гормона роста человека (например, минимальный промотор гормона роста человека, описанный в Genbank, номер доступа Х05244, нуклеотид 283-341) или промотор опухоли молочной железы мыши
(доступный из АТСС, номер в каталоге АТСС 4 50 07). Конкретным примером может служить промотор фосфоглицераткиназы (PGK).
ii. Участки расщепления протеазой/саморасщепляющиеся пептиды и внутренние сайты связывания рибосом
[0248] Подходящие сайты расщепления протеаз и саморасщепляющиеся пептиды известны специалисту в данной области
(см., например, Ryan et al. , 1997; Scymczak et al. , 2004) . Примерами сайтов расщепления протеазы являются сайты расщепления протеаз NIa потивируса (например протеаза вируса гравировки табака), протеаз НС потивируса, протеаз PI (Р35) потивируса, протеаз Nla биовируса, протеаз, кодирующих РНК-2 биовируса, протеаз L афтовируса, протеаз 2А энтеровируса, протеаз 2А риновируса, протеаз ЗС пикорнавируса, протеаз 24К комовируса, протеаз 24К неповируса 24К, ЗС-подобных протеаз RTSV
(сферический вирус риса тунгро), ЗС-подобных протеаз PY\IF
(вирус желтого пятна пастернака), тромбина, фактора Ха и энтерокиназы. Из-за высокой строгости расщепления могут быть использованы сайты расщепления протеаз TEV (вирус гравировки табака).
[024 9] Примеры саморасщепляющихся пептидов (также называемые "цис-действующие гидролитические элементы", CHYSEL, см. DeFelipe (2002), получены из пептидов 2А потивируса и кардиовируса. Частные саморасщепляющиеся пептиды могут быть выбраны из 2А пептидов, полученных из FMDV (вирус ящура), вируса лошадиного ринита А, вируса Thosea asigna и вируса болезни Тешена у свиней.
[0250] Специфичный сигнал инициации также может использоваться для эффективного перевода кодирующих последовательностей в полицистронной мРНК. Эти сигналы включают
инициирующий кодон ATG или смежные последовательности. Должны быть предусмотрены экзогенные сигналы контроля транскрипции, включая кодон инициации ATG. Специалист в данной области легко сможет определить такие сигналы и обеспечить необходимыми. Хорошо известно, что инициирующий кодон должен быть "в рамке" с рамкой считывания желательной кодирующей последовательности для обеспечения трансляции всей вставки. Экзогенные сигналы контроля транскрипции и инициирующие кодоны могут быть либо природными, либо синтетическими. Эффективность экспрессии можно повысить за счет включения подходящих элементов транскрипции.
[0251] В некоторых вариантах осуществления используются
элементы внутренних сайтов связывания рибосомы (IRES) для
создания мультигенных или полицистронных мРНК. Элементы IRES
могут обходить модель сканирования рибосом 5' метилированной кэп-
зависимой трансляции и начинать трансляцию на внутренних сайтах
(Pelletier and Sonenberg, 1988). Были описаны элементы IRES двух
членов семейства пикорнавирусов (полиомиелит и
энцефаломиокардит) (Pelletier and Sonenberg, 1988), а также IRES из мРНК млекопитающих (Macejak and Sarnow, 1991). Элементы IRES могут быть связаны с гетерологичными открытыми рамками считывания. Несколько открытых рамок считывания могут быть транскрибированы вместе, каждая отделена с помощью IRES, создавая полицистронные мРНК. С помощью элемента IRES каждая открытая рамка считывания доступна для рибосом для эффективной трансляции. Множественные гены могут быть эффективно экспрессированы, используя единственный промотор/энхансер для транскрибирования одной мРНК (см. патенты США №№ 5925565 и 5935819, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки).
iii. Множественные сайты клонирования
[0252] Векторы могут включать множественный сайт клонирования (MCS), являющийся областью нуклеиновой кислоты, которая содержит множество сайтов рестрикционных ферментов, каждый из которых может использоваться в сочетании со стандартной рекомбинантной технологией для ферментативного
воздействия на вектор (см., например, Carbonelli et al. , 1999, Levenson et al. , 1998 и Cocea, 1997, включены в настоящее описание в качестве ссылки). "Воздействие рестрикционными ферментами" относится к каталитическому расщеплению молекулы нуклеиновой кислоты ферментом, который функционирует только в определенных местах молекулы нуклеиновой кислоты. Многие из этих рестрикционных ферментов являются коммерчески доступными. Использование таких ферментов широко известно специалистам в данной области. Часто вектор линеаризуют или фрагментируют с помощью рестрикционного фермента, который разрезает внутри MCS, чтобы обеспечить лигирование экзогенных последовательностей с вектором. "Лигирование" относится к процессу образования фосфодиэфирных связей между двумя фрагментами нуклеиновой кислоты, которые могут быть смежными или не быть смежными. Методики с участием рестрикционных ферментов и реакции лигирования хорошо известны специалистам в области рекомбинантной технологии.
iv. Сайты сплайсинга
[0253] Большинство транскрибируемых молекул эукариотической РНК будут подвергнуты сплайсингу РНК для удаления интронов из первичных транскриптов. Для векторов, содержащих геномные эукариотические последовательности, могут быть необходимы донорные и/или акцепторные сайты сплайсинга, чтобы обеспечить правильный процессинг транскрипта для экспрессии белка (см., например, публикацию Chandler et al., 1997, включена в настоящее описание в качестве ссылки).
v. Сигналы терминации
[0254] Векторы или конструкции могут содержать по меньшей мере один сигнал терминации. "Сигнал терминации" или "терминатор" состоит из последовательностей ДНК, участвующих в специфической терминации транскрипции РНК РНК-полимеразой. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления подразумевается сигнал терминации, который заканчивает получение транскрипта РНК. Для получения желаемых уровней мРНК может потребоваться терминатор in vivo.
[0255] В эукариотических системах область терминатора может
также содержать специфические последовательности ДНК, которые
обеспечивают сайт-специфическое расщепление нового транскрипта,
чтобы открыть доступ к сайту полиаденилирования. Это является
сигналом для добавления специализированной эндогенной полимеразы
участка, протяженностью приблизительно 200 А остатков (полиА) к
З'-концу транскрипта. Молекулы РНК, модифицированные polyA-
хвостом, по-видимому, более стабильны и более эффективно
транслируются. Таким образом, в других вариантах осуществления,
связанных с эукариотами, терминатор содержит сигнал для
расщепления РНК, и сигнал терминации запускает
полиаденилирование мРНК. Элементы сайта терминации и/или полиаденилирования могут служить для повышения уровня мРНК и для сведения к минимуму сквозного прочитывания кассеты в другие последовательности.
[0256] Рассматриваемые терминаторы включают в себя любой известный терминатор транскрипции, описанный в настоящем изобретении или известный специалисту в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, например, последовательности терминации генов, такие как, например, терминатор бычьего гормона роста, или последовательности терминации вирусов, такие как, например, терминатор SV4 0. В некоторых вариантах осуществления в сигнале терминации может отсутствовать транскрибируемая или транслируемая последовательности, например, в результате усечения последовательности.
vi. Сигналы полиаденилирования
[0257] При экспрессии, в частности, эукариотической экспрессии, обычно включают сигнал полиаденилирования для осуществления правильного полиаденилирования транскрипта. Природа сигнала полиаденилирования не считается важной для успешной реализации этого действия, и может быть использована любая такая последовательность. Характерные варианты осуществления включают в себя сигнал полиаденилирования SV4 0 или сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, удобный и, как известно, хорошо функционирующий в различных клетках-мишенях.
Полиаденилирование может повысить стабильность транскрипта или может способствовать цитоплазматическому транспорту, vii. Точка репликации
[0258] Для деления вектора в клетке-хозяине он может содержать одну или несколько точек начала репликации (часто называемых "ori"), например последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую oriP EBV, как описано выше, или генно-инженерный oriP с аналогичной или усиленной функцией при программировании дифференциации, которая представляет собой специфическую последовательность нуклеиновой кислоты, с которой начинается репликация. Альтернативно, можно использовать точку начала репликации другого экстрахромосомно-реплицирующегося вируса, как описано выше, или автономно реплицируемую последовательность (ARS).
С. Векторная доставка
[0259] При генетической модификации или введении экзогенных нуклеиновых кислот в исходные клетки культуральной композиции или способы можно использовать любые подходящие способы доставки нуклеиновой кислоты для трансформации клетки, как описано в настоящем изобретении или как известно специалисту в данной области. Такие способы включают, но не ограничиваются, прямую доставку ДНК, например ex vivo трансфекция (Wilson et al., 1989, Nabel et al, 1989), путем инъекции (патенты США №№ 5994624, 5981274, 5945100, 5780448, 5736524, 5702932, 5665610, 5589466 и 5580859, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки), включая микроинъекцию (Harland and Weintraub, 1985; патент США 5789215, включенный в настоящий документ в качестве ссылки); путем электропорации (патент США 5384253, включенный в настоящий документ в качестве ссылки; Tur-Kaspa et al. , 1986; Potter et al., 1984); путем осаждения фосфатом кальция (Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al. r 1990); с использованием DEAE-декстрана, а затем полиэтиленгликоля (Gopal, 1985); с помощью ультразвука (Fechheimer et al. r 1987); путем липосомальной трансфекции (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al. r 1979; Nicolau et al. r 1987; Wong et al. , 1980; Kaneda et al. , 1989; Kato et al. , 1991)
и рецептор-опосредованной трансфекции (Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988); путембомбардировки микрочастицами (заявки PCT №№ WO 94/09699 и 95/06128; патенты США №№ 5610042; 5322783, 5563055, 5550318, 5538877 и 5538880, и каждый включен в настоящий документ в качестве ссылки); путем перемешивания с волокнами из карбида кремния (Kaeppler et al. r 1990; патенты США №№ 5302523 и 5464765, включены в настоящий документ в качестве ссылки); с помощью трансформации, опосредованной Agrobacterium (патенты США №№ 5591616 и 5565055, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки); посредством PEG-опосредованной трансформации протопластов (Omirullehet al. r 1993; патенты США №№ 4684611 и 4952500, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки); путем обезвоживания/обратным захватом ДНК при ингибировании (Potrykus et al. r 1985) и любую комбинацию этих способов. Благодаря применению таких методик, органелла(ов), клетка(клетки), ткань(ткани) или организм(ы) могут быть стабильно или временно трансформированы, i. Липосомально-опосредованная трансфекция
[0260] В определенном варианте осуществления нуклеиновая кислота может быть заключена в липидный комплекс, такой как, например, липосома. Липосомы являются везикулярными структурами, характеризующимися бислойной фосфолипидной мембраной и внутренней водной средой. Многослойные липосомы имеют несколько липидных слоев, разделенных водной средой. Они образуются спонтанно при суспендировании фосфолипидов в избыточном водном растворе. Липидные компоненты подвергаются самоперестраиванию перед образованием закрытых структур и захватывают воду и растворенные вещества между липидными бислоями (Ghosh and Bachhawat, 1991). Также рассматривается нуклеиновая кислота в комплексе с липофектамином (Gibco BRL) или Superfect (Qiagen). Количество используемых липосом может изменяться в зависимости от природы липосомы, а также от используемой клетки, например, можно использовать от приблизительно 5 до приблизительно 2 0 мкг вектора ДНК на 1-10 млн клеток.
[0261] Доставка нуклеиновой кислоты, опосредуемая липосомами, и экспрессия чужеродной ДНК in vitro крайне
эффективны (Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al. r 1987) . Была также продемонстрирована возможность доставки, опосредуемая липосомами, и экспрессии чужеродной ДНК в культивированных эмбрионах цыплят, HeLa и клеток гепатомы (Wong et al. , 1980).
[0262] В некоторых вариантах осуществления липосома может находится в комплексе с гемагглютинирующим вирусом (HVJ). Было показано, что это облегчает слияние с клеточной мембраной и способствует проникновению в клетку ДНК, инкапсулированной в липосому (Kaneda et al. r 1989) . В других вариантах осуществления липосома может находится в комплексе или использоваться в сочетании с ядерными негистоновыми хромосомными белками (HMG-1) (Kato et al. r 1991) . В еще одном варианте осуществления липосома может находится в комплексе или использоваться в сочетании с HVJ и HMG-1. В других вариантах осуществления носитель для доставки может содержать лиганд и липосому.
ii. Электропорация
[0263] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота вводится в клетку посредством электропорации. Электропорация включает воздействие на суспензию клеток и ДНК высоковольтного электрического разряда. Клетки-реципиенты могут быть более восприимчивы к трансформации при механическом повреждении. Кроме того, количество используемых векторов может изменяться в зависимости от природы клеток, например, можно использовать от приблизительно 5 до приблизительно 2 0 мкг вектора ДНК на 1-10 млн клеток.
[0264] Трансфекция эукариотических клеток с использованием
электропорации довольно эффективна. Таким образом
трансфицировали мышиные пре-В лимфоциты генами каппа-иммуноглобулина человека (Potter et al. r 1984) и трансфецировали гепатоциты крыс геном хлорамфениколацетилтрансферазы (Tur-Kaspa et al. , 1986).
iii. Фосфат кальция
[0265] В других вариантах осуществления нуклеиновую кислоту вводят в клетки, используя осаждение фосфатом кальция. Используя эту методику трансфецировали KB человека 5 ДНК аденовируса
(Graham and Van Der Eb, 1973) . Кроме того, этим же образом трансфицировали клетки L мыши (А9), мыши С127, СНО, CV-1, ВНК, NIH3T3 и HeLa геном неомицинового маркера (Chen and Okayama, 1987), и трансфицировали гепатоциты крыс множеством маркерных генов (Rippe et al., 1990). iv. DEAE-декстран
[0266] В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота доставляется в клетку с помощью DEAE-декстрана, а затем полиэтиленгликоля. Таким образом, репортерные плазмиды вводили в мышиные клетки миеломы и эритролейкоза (Gopal, 1985) .
IX. Применение клеточной культуры
[0267] Композиция для культивирования, описанная в настоящем изобретении, может быть использована для получения Т-клеток, которые имеют коммерческое или клиническое применение, как показано ниже.
[0268] Может быть предложен способ получения in vitro
антиген-специфичных Т-клеток из стволовых клеток для
иммунотерапии. Применение Т-клеток, генетически
сконструированных и отвечающих на специфические антигены, является перспективным исследовательским подходом для адаптивной клеточной терапии при злокачественных и инфекционных заболеваниях. Стратегии на основе сконструированных Т-клеток включают трансдукцию рецепторами Т-клеток (TCR) и химерными рецепторами антигенов (CAR) для придания антигенной специфичности; и генные модификации для улучшения эффективности или безопасности пересаженных Т-клеток (например, путем подавления ингибиторного сигнального пути, удаления вирусных корецепторов или введения так называемых "суицидальных" генов).
[0269] На сегодняшний день в исследованиях терапевтических сконструированных Т-клеток использовали Т-клетки периферической крови. Этот подход показал эффективность в клинических испытаниях для некоторых злокачественных и инфекционных заболеваний, однако остается затруднительным по следующим причинам. Во-первых, количество адаптивно пересажанных Т-клеток снижается со временем in vivo, что приводит к возможной потере опухолевого- или вирус-специфичного иммунитета. Во-вторых, часто
требуется ex vivo активация и деление Т-клеток для облегчения эффективной трансдукции генов, и это может привести к истощению Т-клеток и уменьшению иммунного потенциала. В-третьих, в случае Т-клеток со сконструированными TCR, неправильное спаривание трансгенных и эндогенных цепей TCR может приводить к гибридным рецепторам со сниженной возможностью распознавать антиген или нецелевой токсичностью/аутоиммунностью (или в случае Т-клеток CAR остаточная экспрессия эндогенного TCR на высоко активированных Т-клетках также может приводить к нецелевой токсичности).
[0270] Продукция сконструированных Т-клеток de novo из стволовых клеток, используя АТО, важна для снятия этих ограничений со сконструированных Т-клеток следующими путями: 1) введение гена TCR или CAR в HSPC (которые являются претимическими) подавляет перегруппировку эндогенных локусов TCR в развивающихся Т-клетках (аллельное исключение), в результате образуются Т-клетки, которые экспрессируют только трансгенный рецептор антигена, что снижает риск нецелевой токсичности из-за неправильного спаривания цепи TCR или экспрессии клонированного TCR; и 2) HSPC эффективно продуцируют антиген-специфичные Т-клетки с фенотипом наивных неистощенных клеток, тем самым повышая качество и долговечность Т-клеток, доступных для адаптивной терапии. Кроме того, продукция антиген-специфичных Т-клеток с аллельным исключением делает возможным разработать библиотеки стандартных антиген-специфичных Т-клеток, которые при экспрессии эндогенных донорных TCR могут использоваться в аллогенных донорах без риска реакции трансплантат против хозяина (GVHD). Несмотря на эти преимущества, в настоящее время не существует коммерческих подходов для разработки антиген-специфичных Т-клеток из стволовых клеток или клеток-предшественников .
[0271] Конкретные примеры клинического применения, при котором вполне могла бы использоваться система АТО, включают:
[0272] in vitro продукцию аутологичных TCR- и/или CAR-сконструированных Т-клеток из HSPC для адаптивной клеточной противоопухолевой или антивирусной иммунотерапии. Аутологичные
источники HSPC включают пуповинную кровь, костный мозг и мобилизованную периферическую кровь.
[0273] in vitro продукцию аутологичных TCR- и/или CAR-сконструированных Т-клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека, включая iPSC.
[0274] in vitro продукцию аллогенных (HLA-совместимых или HLA-модифицированных) TCR- или CAR-сконструированных Т-клеток из HSPC или плюрипотентных стволовых клеток в качестве коммерчески масштабируемого стандартного продукта для адаптивной клеточной терапии. Как обсуждалось выше, в результате аллельного исключения Т-клетки, продуцируемые из TCR- и/или CAR-трансдуцированных претимических HSPC, не экспрессируют эндогенный TCR и не должны нести риск нецелевого GVHD при пересадке аллогенным реципиентам. Стволовые клетки, используемые для этой цели, могут быть дополнительно выбраны или генетически модифицированы для увеличения приживления потомок Т-клеток в аллогенных хозяевах (например, используя HLA-совместимые HSPC или путем модификации генов локусов HLA или лигандов NK-клеток для уменьшения аллоиммунного распознавания).
[0275] Модификация генов неантигенных рецепторов в стволовых клетках, с введением или без введения TCR и/или CAR, для усиления in vivo функции Т-клеток, полученных из АТО. Примеры включают генетическую инактивацию или нокаут коингибирующих рецепторов, таких как PD-1, TIM-3 или LAG-3; ингибиторных сигнальных путей, таких как TGF|3; или корецепторов для проникновения вирусов, таких как CCR5.
[0276] Применение 3D культуральных агрегатов в качестве
органоидов тимуса для моделирования эффектов фармацевтических
или биологических соединений на развитие и функцию Т-клеток,
например, в анализах на лекарственную токсичность. Это
применение можно распространить на применение АТО с
аутологичными клетками пациента для моделирования
фармакогеномных взаимодействий у пациента или взаимодействий, специфичных для заболевания.
[0277] Способ и композиции могут быть предложены для использования исследовательского инструмента для изучения развития Т-клеток. Как описано выше, 3D клеточные агрегаты, такие как АТО, являются мощным инструментом для изучения развития Т-клеток человека из разных источников стволовых клеток, включая стволовые клетки и клетки-предшественники, гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (HSPC) и плюрипотентные стволовые клетки человека, включая эмбриональные стволовые клетки (ESC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC).
[0278] Экспериментальные методы, используемые в настоящее время в лабораториях для моделирования развития Т-клеток, имеют несколько важных ограничений:
[0279] В системах 0P9-DL1 и сходных системах стромальных клеток на основе монослоя используются иммортализованные линии клеток костного мозга мыши, трансдуцированные лигандом Notch (обычно DLL1 или DLL4 мыши) в качестве "фидерного слоя" HSPC. Совместное культивирование in vitro HSPC человека на 0P9-DL1 приводит к коммитированию Т-клеточной линии, однако позитивная селекция Т-клеток в значительной степени нарушена, что приводит к выраженному дефициту зрелых функциональных Т-клеток в этих системах. Системы стромальных клеток для со-культивирования также крайне трудоемки, и эффективность и воспроизводимость зависят от множества переменных, включая партию фетальной телячьей сыворотки.
[0280] В способах культивирования эмбриональных органоидов тимуса (FTOC) используют интактную или реорганизованную ткань тимуса мыши или эмбриональную ткань тимуса человека, обедненную гематопоэтическими клетками, в качестве микросреды для изучения in vitro развития Т-клеток из HSPC. Эти способы крайне трудоемки и приводят к получению Т-клеток с низкой эффективностью, представляя ограниченную способность для количественных анализов, демонстрируют высокую экспериментальную изменчивость из-за возраста и качества ткани и ограничены доступностью первичной ткани тимуса.
[0281] В органоидах на основе матрикса обычно используют первичные стромальные клетки тимуса или аналогичные типы клеток (например, дермальные фибробласты), высеваемые на биологический матрикс. Эти системы ограничены низкой эффективностью и масштабируемостью, плохой воспроизводимостью и ограниченной доступностью запатентованных матриксов.
[0282] Ксеногенные (мышиные) модели развития Т-клеток человека in vivo в высокой степени зависят от эффективности дифференцировки Т-клеток и недостаточны в количественном отношении, и в большом числе подходов также требуется имплантация иммунодефицитным мышам эмбрионального тимуса человека, печени и клеток костного мозга или фрагментов.
[0283] В отличие от этих подходов, в АТО используют "стандартные" компоненты и бессывороточные условия для снижения биологической изменчивости, обусловленной использованием первичной ткани или фетальной телячьей сыворотки; и избегают запатентованных матриксов. Важно отметить, что АТО содействует значительно улучшенной позитивной селекции, позволяющей исследовать зрелые Т-клетки и Т-клетки позитивной/негативной селекции in vitro. Таким образом, АТО могут иметь коммерческое применение в качестве инструмента для изучения развития Т-клеток in vitro.
[0284] Способы и композиции, описанные в настоящем изобретении, также можно использовать в качестве инструмента для разработки новых антиген-специфичных TCR для терапии злокачественных новообразований или других терапевтически актуальных антигенов. Например, Т-клетки, полученные из АТО, могут быть выбраны на основе реактивности в отношении опухолевых антигенов или неоантигенов, используя опубликованные способы и антиген-специфичные последовательности TCR, идентифицированные из этих отвечающих Т-клетках, используя опубликованные способы. Поскольку авторы выдвигают гипотезу о том, что АТО может обеспечить продукцию Т-клеток с минимальной негативной селекций или без нее, могут быть получены TCR с высокой авидностью к самоантигенам, предоставляя новый репертуар TCR, который отличается от эндогенных пулов "обученных в тимусе" Т-клеток.
Второй способ заключается в введении опухолевого антигена во время развития Т-клеток в АТО, что должно индуцировать селекцию агонистов (и IEL-подобную дифференцировку) реактивных клонов Т-клеток по мере их развития в АТО; эти клетки и их последовательности TCR затем могут быть идентифицированы стандартными методами. Выделенные последовательности TCR также могут быть использованы в нижеприведенных применениях и способах, описанных в настоящем изобретении, для адаптивной иммунотерапии.
[0285] Способы и композиции, описанные в настоящем изобретении, могут также включать способы и композиции для увеличения количества эмбриональных стволовых клеток и/или клеток-предшественников. Способы, известные в данной области, такие как способы, описанные в US 20060205072, US 7344881, US 20060205071, US 20020076747 и US 20030044978 (которые включены в настоящий документ в качестве ссылки) могут быть включены в композиции и способы по настоящему изобретению.
[0286] Способы и композиции, описанные в настоящем изобретении, могут также включать способы и композиции для усиления пролиферативной способности клеток, таких как ES-клетки, HSPC/PSC и/или CD34+ клетки. Примеры соединений включают HSC835 (реализуемый на рынке фирмой Novartis), который обеспечивает увеличение CD34+ клеток ex vivo. Другие соединения описаны в патенте США 8927281, который включен в настоящем изобретении в качестве ссылки.
X. Источник исходных клеток
[0287] Исходные клетки, такие как плюрипотентные стволовые клетки или гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники, могут быть использованы в определенных композициях или способах дифференцировки в выбранную Т-клеточную линию. Стромальные клетки могут использоваться для сокультивирования со стволовыми клетками или клетками-предшественниками .
А. Стромальные клетки
[0288] Стромальные клетки являются клетками соединительной ткани какого-либо органа, например, костного мозга, тимуса,
слизистой оболочке матки (эндометрия), предстательной железы и яичника. Это клетки сохраняют функцию паренхимных клеток этого органа. Фибробласты (также известны как мезенхимальные стромальные клетки/MSC) и перициты являются одними из наиболее распространенных типов стромальных клеток.
[0289] Известно, что взаимодействие между стромальными клетками и опухолевыми клетками играет важную роль в развитии злокачественного новообразования и его прогрессировании. Кроме того, регулируя локальные цитокиновые сети (например, M-CSF, LIF) , были описаны стромальные клетки костного мозга для участия в гематопоэзе человека и в воспалительных процессах.
[0290] Стромальные клетки в костном мозге, тимусе и других гематопоэтических органах регулируют развитие гемопоэтических и иммунных клеток через взаимодействия клетки-клеточный лиганд-рецептор и через высвобождение растворимых факторов, включая цитокины и хемокины. Стромальные клетки в этих тканях образуют ниши, которые регулируют поддержание стволовых клеток, специфичность линии и коммитирование, и дифференцировку в клетки эффекторного типа.
[0291] Строма состоит из клеток, не являющихся злокачественными клетками-хозяевами. Стромальные клетки также предоставляют экстрацеллюлярный матрикс, на котором могут развиваться ткань-специфические типы клеток, а в некоторых случаях и опухоли.
В. Гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники
[0292] Из-за значительных медицинских возможностей гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников была проделана большая работа по улучшению методов дифференциации гемопоэтических клеток-предшественников из эмбриональных стволовых клеток. У взрослого человека гемопоэтические стволовые клетки, присутствующие в основном в костном мозге, продуцируют гетерогенные популяции гемопоэтических (CD34+) клеток-предшественников, которые дифференцируются во все клетки системы крови. У взрослого человека гемопоэтические клетки-предшественники пролиферируют и дифференцируются, что приводит к
получению сотен миллиардов зрелых кровяных клеток в день.
Гемопоэтические клетки-предшественники также присутствуют в
пуповинной крови. In vitro эмбриональные стволовые клетки
человека могут быть дифференцированы в гемопоэтические клетки-
предшественники. Количество гемапоэтических клеток-
предшественников также может быть увеличено из образца
периферической крови, как описано ниже. Гемапоэтические клетки
могут иметь человеческое происхождение, мышиное происхождение
или происхождение из любых других видов млекопитающих.
[0293] Выделение гемопоэтических клеток-предшественников включает любые методы селекции, в том числе клеточные сортировщики, магнитное разделение с использованием покрытых антителом магнитных бус, собранных колонок; аффинную хроматографию; цитотоксические агенты, присоединенные к моноклональному антителу или используемые в сочетании с моноклональным антителом, включая, но не ограничиваясь ими, комплемент и цитотоксины; и "пэннинг" с антителом, прикрепленным к твердому матриксу, например, к пластине, или с помощью любого другого удобного способа.
[0294] Использование способов разделения или выделения включает в себя, но не ограничивается ими, способы, которые основаны на различиях в физических свойствах (центрифугирование в градиенте плотности и проточное элютриационное центрифугирование), свойствах клеточной поверхности (аффинность лектина и антитела) и витальных свойствах окрашивания (краситель, связывающийся с митохондриями, rhol23 и краситель, связывающийся с ДНК, Hoechst 33342). Методики, обеспечивающие точное разделение, включают, но не ограничиваются ими, FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток) или MACS (сортировка магнитно-активированных клеток), которые могут иметь разную степень сложности, например, каналы для детекции рассеивания приглушенного света и волнового сопротивления и т. Д.
[0295] Антитела, используемые в предшествующих методиках
или методах, используемых для оценки чистоты клеток (например,
проточная цитометрия), могут быть конъюгированы с
идентифицируемыми агентами, включая, но не ограничиваясь ими, ферменты, магнитные бусы, коллоидные магнитные бусы, гаптены, флуорохромы, соединения металлов, радиоактивные соединения, лекарственные средства или гаптены. Ферменты, которые могут быть конъюгированы с антителами, включают, но не ограничиваются ими, щелочную фосфатазу, пероксидазу, уреазу и р-галактозидазу. Флуорохромы, которые могут быть конъюгированы с антителами, включают, но не ограничиваются ими, изотиоцианат флуоресцеина, изотиоцианат тетраметилборамина, фикоэритрин, аллофикоцианины и красный краситель Texas Red. В отношении дополнительных флуорохромов, которые могут быть конъюгированы с антителами, см. Haugland, Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992-1994) . Соединения металлов, которые могут быть конъюгированы с антителами, включают, но не ограничиваются ими, ферритин, коллоидное золото и, в частности, коллоидные суперпарамагнитные бусы. Гаптены, которые могут быть конъюгированы с антителами, включают, но не ограничиваются ими, биотин, дигоксигенин, оксазалон и нитрофенол. Радиоактивные соединения, которые могут быть конъюгированы или введены в антитела, известны в данной области и включают, но не ограничиваются ими, технеций 99m (99ТС), 1251 и аминокислоты, содержащие любые радионуклиды, включая, но не ограничиваясь ими, 14С, 3Н и 35S.
[0296] Можно использовать другие методы позитивной селекции, которые обеспечивают точное разделение, например, аффинные колонки и тому подобное. Способ должен допускать удаление остаточного количества менее чем приблизительно 2 0%, предпочтительно, менее чем приблизительно 5%, нецелевых клеточных популяций.
[0297] Клетки могут быть выбраны на основании свойств рассеяния света, а также экспрессии различных антигенов на клеточной поверхности. Очищенные стволовые клетки имеют низкое боковое светорассеивание и низкие профили среднего прямого рассеяния в анализе FACS. Препараты цитоспина показывают, что
обогащенные стволовые клетки имеют средний размер зрелых лимфоидных клеток и зрелых гранулоцитов.
[0298] Также возможно обогатить инокулирующую популяцию клетками CD34+ перед культивированием, используя, например, способ Sutherland et al. (1992), и который описан в патенте США № 4714680. Например, клетки подвергают негативной селекции для удаления клеток, которые экспрессируют маркеры специфической линии. В иллюстративном варианте осуществления популяция клеток может быть подвергнута негативной селекции для истощения не-CD34+ гемопоэтических клеток и/или конкретных подмножеств гематопоэтических клеток. Негативная селекция может быть осуществлена на основе экспрессии различных молекул клеточной поверхности, включая маркеры Т-клеток, такие как CD2, CD4 и CD8; В-клеточные маркеры, такие как CD10, CD19 и CD2 0; маркер моноцитов CD14; маркер NK-клеток CD2, CD16 и CD5 6 или любые специфические маркеры линии. Негативная селекция может быть осуществлена на основе экспрессии различных молекул клеточной поверхности, таких как коктейль антител (например, CD2, CD3, CDllb, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123 и CD235a), которые могут использоваться для разделения других типов клеток, например, посредством MACS или разделительной колонки.
[0299] Используемый в настоящем изобретении термин негативная по (LIN-) линия относится к клеткам, не имеющим по меньшей мере одного маркера, связанного с клетками коммитированной линии, например маркеры, связанные с Т-клетками
(например, CD2, 3, 4 и 8), В-клетками (например, CD10, 19 и 20), миелоидными клетками (например, CD14, 15, 16 и 33), клетками естественного киллера ("NK") (например, CD2, 16 и 56), RBC
(такие как гликофорин А), мегакариоцитами (CD41), тучными клетками, эозинофилами или базофилами или другими маркерами, такими как CD3 8, CD71 и HLA-DR. Предпочтительно маркеры, специфичные для линии, включают, но не ограничиваются ими, по меньшей мере один из CD2, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD33, CD38, HLA-DR и CD71. Более предпочтительно, LIN- будут включать по меньшей мере CD14 и CD15. Дополнительная очистка может быть достигнута путем позитивной селекции для, например, c-kit+ или
Thy-1+. Дальнейшее обогащение может быть получено с помощью митохондриального связывания красителя родамина 123 и селекции родамин+ клеток способами, известными в данной области. Высокообогащенная композиция может быть получена путем селективного выделения клеток, которые представляют собой CD34+, предпочтительно, CD34+LIN-, и, наиболее предпочтительно, CD34+Thy-1+ LIN-. Популяции, высокообогащенные стволовыми клетками, и способы их получения хорошо известны специалистам в данной области, см., например, способы, описанные в PCT/US94/09760; PCT/US94/08574 и PCT/US94/10501.
[0300] Для разделения клеток путем первоначального удаления клеток спрогнозированной линии можно использовать различные методики. Моноклональные антитела особенно эффективны для идентификации маркеров, связанных с конкретными клеточными линиями и/или стадиями дифференцировки. Антитела могут быть прикреплены к твердой подложке, чтобы обеспечить грубое разделение. Используемые методики разделения должны максимально повысить сохранение жизнеспособности собираемой фракции. Для получения "относительно грубых" разделений могут быть использованы различные методики различной эффективности. Такими разделениями являются разделения, при которых до 10%, обычно не более чем приблизительно 5%, предпочтительно, не более 1% от всех присутствующих клеток являются нежелательными клетками, которые остаются в клеточной популяции, которая должна быть сохранена. Конкретная используемая методика будет зависеть от эффективности разделения, связанной цитотоксичности, легкости и скорости осуществления и необходимости в сложном оборудовании и/или технических навыков.
[0301] Выбор клеток-предшественников не обязательно достигается только с маркером, специфичным для клеток. Можно получить популяции обогащенных клеток используя комбинацию негативной селекции и позитивной селекции.
С. Источники клеток крови
[0302] Гемапоэтические стволовые клетки (HSC) обычно находятся в костном мозге, но их можно вывести в кровь, процесс, называемый мобилизацией, используемый клинически для сбора
большого числа HSC в периферической крови. Одним мобилизующим средством выбора является гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF).
[0303] CD34+ гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники, которые циркулируют в периферической крови, могут быть собраны методами афереза либо в невозмущенном состоянии, либо после мобилизации после внешнего введения гемопоэтических факторов роста, таких как G-CSF. Количество стволовых клеток или клеток-предшественников, собранных после мобилизации, больше, чем количество, полученное после афереза в невозмущенном состоянии. В конкретном аспекте настоящего изобретения источником клеточной популяции является индивид, клетки которого не были мобилизованы по действием внешних факторов, потому что нет необходимости в обогащении гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников in vivo.
[0304] Популяции клеток для использования в описанных в настоящем изобретении способах могут представлять собой клетки млекопитающих, такие как клетки человека, клетки нечеловеческих приматов, клетки грызунов (например, мыши или крысы), бычьи клетки, овечьи клетки, свиные клетки, лошадиные клетки, клетки овец, собачьи клетки и кошачьи клетки или их смесь. Клетки нечеловеческих приматов включают клетки макаки резус. Клетки могут быть получены у животного, например, человека, или они могут быть клетками клеточных линий. Если клетки получены у животного, то они могут быть использованы как таковые, например, как неразделенные клетки (то есть смешанная популяция); их, возможно, сначала создают в культуре, например, путем трансформации; или они могут быть подвергнуты предварительной очистке. Например, популяцию клеток можно подвергнуть позитивной или негативной селекции на основе экспрессии маркеров клеточной поверхности; можно стимулировать одним или несколькими антигенами in vitro или in vivo; можно обработать одним или несколькими биологическими модификаторами in vitro или in vivo; или комбинацией любой или всех этих возможностей.
[0305] Популяции клеток включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), цельную кровь или их фракции, содержащие смешанные популяции, клетки селезенки, клетки костного мозга, инфильтрационные лимфоциты опухолей, клетки, полученные при лейкаферезе, ткань биопсии, лимфатические узлы, например лимфоузлы из опухоли. Подходящие доноры включают иммунизированных доноров, неиммунизированных (наивных) доноров, доноров, получавших или не получавших лечение. Донор, получавший "лечение" представляет собой донора, который подвергся воздействию одного или нескольких биологических модификаторов. Донор, не получавший "лечение", представляет собой донора, который не подвергался воздействию одного или нескольких биологических модификаторов.
[0306] Например, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) могут быть получены, как описано в соответствии со способами, известными в данной области. Примеры таких способов обсуждаются в статье Kim et al. (1992); Biswas et al. (1990); Biswas et al. (1991).
[0307] Способы получения клеток-предшественников из популяций клеток также хорошо известны в данной области. Количество клеток-предшественников может быть увеличено с помощью различных цитокинов, таких как hSCF, hFLT3 и/или IL-3 (Akkina et al. , 1996), или клетки CD34+ могут быть обогащены с помощью MACS или FACS. Как указано выше, для обогащения клеток CD34+ могут также использоваться методики негативной селекции.
[0308] Также возможно получить клеточный образец индивида, а затем обогатить его желательным типом клеток. Например, из крови могут быть выделены РВМС и/или CD34+ гемапоэтические клетки, как описано в настоящем изобретении. Клетки также могут быть выделены из других клеток с помощью различных методик, таких как выделение и/или активация путем связывания антитела с эпитопом на поверхности клетки желаемого типа клеток. Другой способ, который может быть использован, включает негативную селекцию с помощью антител к маркерам клеточной поверхности для селективного обогащения специфическим клеточным типом, не активируя клетку путем рецепторного взаимодействия.
[0309] Клетки костного мозга могут быть получены из подвздошного гребня, бедер, голени, позвоночника, ребер или других медуллярных пространств. Костный мозг может быть взят у пациента и выделен посредством различных методик разделения и промывки. Пример процедуры выделения клеток костного мозга включает следующие стадии: а) отделяли на центрифуге суспензии костного мозга в трех фракциях и собирали промежуточную фракцию или лейкоцитарную пленку; Ь) фракцию лейкоцитарной пленки стадии (а) еще раз центрифугировали в разделительной жидкости, обычно Ficoll (товарный знак Pharmacia Fine Chemicals АВ), и собирали промежуточную фракцию, которая содержит клетки костного мозга; и с) промывали собранную фракцию стадии (Ь) для выделения клеток костного мозга, возможных для повторного переливания. D. Плюрипотентные стволовые клетки
[0310] Клетки, подходящие для композиций и способов,
описанных в настоящем изобретении, могут быть гемопоэтическими
стволовыми клетками, и клетки-предшественники также могут быть
получены при дифференциации плюрипотентных стволовых клеток in
vitro. В некоторых вариантах осуществления клетки, используемые
в способах, описанных в настоящем изобретении, представляют
собой плюрипотентные стволовые клетки (эмбриональные стволовые
клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки),
непосредственно высеваемые в АТО. В других вариантах
осуществления клетки, используемые в способах и композициях,
описанных в настоящем изобретении, являются производными или
потомками PSC, такими как, но не ограничиваясь ими, клетками-
предшественниками мезодермы, гематоэндотелиальными клетками-
предшественниками или гемопоэтическими клетками-
предшественниками .
[0311] Термин "плюрипотентная стволовая клетка" относится к клетке, способной приводить к образованию клеток всех трех зародышевых слоев, то есть эндодермы, мезодермы и эктодермы. Хотя теоретически плюрипотентная стволовая клетка может дифференцироваться в любую клетку организма, экспериментальное определение плюрипотентности обычно основано на дифференциации плюрипотентной клетки в несколько типов клеток каждого
зародышевого слоя. В некоторых вариантах осуществления
плюрипотентная стволовая клетка представляет собой эмбриональную
стволовую клетку (ES), полученную из внутренней клеточной массы
бластоциста. В других вариантах осуществления плюрипотентная
стволовая клетка представляет собой индуцированную
плюрипотентную стволовую клетку, полученную путем
перепрограммирования соматических клеток. В некоторых вариантах осуществления плюрипотентная стволовая клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку, полученную переносом ядер соматических клеток.
[0312] Эмбриональные стволовые клетки (ES) представляют собой плюрипотентные клетки, полученные из внутренней клеточной массы бластоциста. ES клетки могут быть выделены путем удаления внешнего слоя трофэктодермы развивающегося эмбриона, а затем культивирования внутренней массы клеток на питающем слое нерастущих клеток. При соответствующих условиях образуются колонии пролиферирующих, недифференцированных ES клеток. Колонии могут быть удалены, диссоциированы в отдельные клетки, а затем реплицированы на свежем питающем слое. Реплицированные клетки могут продолжать пролиферировать, создавая новые колонии недифференцированных ES клеток. Затем новые колонии могут быть удалены, диссоциированы и повторно высеяны с возможностью роста. Этот процесс "субкультивирования" или "пассирования" недифференцированных ES клеток можно повторять несколько раз для получения клеточных линий, содержащих недифференцированные ES клетки (патенты США №№ 5843780, 6200806, 7029913). "Первичная клеточная культура" представляет собой культуру клеток, непосредственно полученных из ткани, такой как внутренняя клеточная масса бластоцисты. "Субкультура" представляет собой любую культуру, полученную из культуры первичных клеток.
[0313] Способы получения мышиных ES клеток хорошо известны. В одном из способов предимплантационную бластоцисту из мышиного штамма 12 9 обрабатывают мышиной антисывороткой для удаления трофоэктодермы, и внутреннюю клеточную массу культивируют на слое фидерных клеток химически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов в среде, содержащей эмбриональную
телячью сыворотку. Колонии недифференцированных ES клеток, которые развиваются, субкультивируют на питательных слоях эмбриональных мышиных фибробластов в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки с получением популяций ES клеток. В некоторых способах мышиные ES клетки можно выращивать в отсутствие питающего слоя путем добавления цитокина ингибирующего фактора лейкоза (LIF) к культуральной среде, содержащей сыворотку (Smith, 2 000). В других способах мышиные ES клетки можно выращивать в бессывороточной среде в присутствии костного морфогенетического белка и LIF (Ying et al., 2003).
[0314] Человеческие ES клетки могут быть получены из бластоцист, используя ранее описанные способы (Thomson et al. , 1995; Thomson et al. , 1998; Thomson and Marshall, 1998; Reubinoff et al, 2000.) В одном из способов 5-дневные бластоцисты человека подвергают воздействию кроличьей антисыворотки к клеткам селезенки человека, а затем подвергают воздействию комплемента морской свинки в разведении 1:5 для лизиса клеток трофэктодермы. После удаления лизированных клеток трофэктодермы из интактной внутренней клеточной массы внутреннюю клеточную массу культивируют на питающем слое гамма-инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов и в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки. Через 9-15 дней комки клеток, полученные из внутренней клеточной массы, могут быть химически (то есть под действием трипсина) или механически диссоциированы и реплицированы в свежей среде, содержащей фетальную телячью сыворотку и питающий слой эмбриональных фибробластов мыши. При дальнейшей пролиферации колонии с недифференцированной морфологией отбирают микропипеткой, механически диссоциируют в комки и они реплицируются (см. патент США № 6833269). ES-подобная морфология отличается компактными колониями с явно высоким отношением ядра к цитоплазме и видимыми ядрышками. Получающиеся ES клетки можно постоянно пассировать путем кратковременной трипсинизации или путем отбора отдельных колоний микропипеткой. В некоторых способах человеческие ES клетки можно выращивать без сыворотки путем культивирования ES клеток на питающем слое фибробластов в присутствии основного
фактора роста фибробластов (Amit et al., 2000). В других способах человеческие ES клетки можно выращивать без слоя фидерных клеток путем культивирования клеток на белковом матриксе, таком как Matrigel(tm) или ламинин, в присутствии "кондиционированной" среды, содержащей основной фактор роста фибробластов (Xu et al., 2001). Среду предварительно кондиционируют путем сокультивирования с фибробластами.
[0315] Известны также способы выделения ES клеток резус-обезьян и обыкновенных игрунков (Thomson and Marshall, 1998; Thomson et al., 1995; Thomson and Odorico, 2000) .
[0316] Другим источником ES клеток являются ES клеточные линии. Известны различные линии клеток мыши и линии ES клеток человека, и определены условия их роста и деления. Например, была создана клеточная линия мыши CGR8 из внутренней клеточной массы эмбрионов мышей штамма 12 9, и культуры клеток CGR8 можно выращивать в присутствии LIF без питающих слоев. В качестве еще одного примера, Thompson et al. создали ES клеточные линии HI, Н7, Н9, Н13 и Н14 человека. Кроме того, были разработаны субклоны Н9.1 и Н9.2 линии Н9.
[0317] Источником ES клеток может быть бластоциста, клетки, полученные при культивирования внутренней клеточной массы бластоцисты, или клетки, полученные из культур созданных клеточных линий. Таким образом, как используется в настоящем изобретении, термин "ES клетки" может относиться к клеткам внутренней клеточной массы бластоцисты, ES клеткам, полученным из культур внутренней клеточной массы, и ES клеткам, полученным из культур линий ES-клеток.
[0318] Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS)
представляют собой клетки, которые имеют характеристики ES
клеток, но их получают путем перепрограммирования
дифференцированных соматических клеток. Индуцированные
плюрипотентные стволовые клетки были получены различными способами. В одном из способов взрослые фибробласты дермы человека трансфицируют транскрипционными факторами Oct4, Sox2, с-Мус и Klf4, используя ретровирусную трансдукцию (Takahashi et al. , 2007) . Трансфицированные клетки высевают на фидерные клетки
SNL (мышиные клетки клеточной линии фибробластов, которые продуцируют LIF) в среде, дополненной основным фактором роста фибробластов (bFGF). Приблизительно через 25 дней в культуре появляются колонии, напоминающие колонии ES клеток человека. Колонии, напоминающие колонии ES клеток, собирают и размножают на фидерных клетках в присутствии bFGF.
[0319] Основываясь на клеточных характеристиках, колонии, напоминающие колонии ES клеток, представляют собой индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки морфологически сходны с ES клетками человека и экспрессируют различные маркеры ES клеток человека. Кроме того, при выращивании в условиях, которые, как известно, приводят к дифференциации ES клеток человека, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки дифференцируются соответствующим образом. Например, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут дифференцироваться в клетки со структурой нейронов и нейронными маркерами.
[0320] В другом способе эмбриональные фибробласты человека или фибробласты новорожденных трансфицируют четырьмя генами, 0ct4, Sox2, Nanog и Lin2 8, используя лентивирусную трансдукцию (Yu et al. , 2007) . Через 12-20 дней после инфицирования можно увидеть колонии с морфологией ES клеток человека. Колонии собирают и выращивают. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, образующие колонии, морфологически сходны с ES клетками человека, экспрессируют различные клеточные маркеры ES клеток и после инъекции мышам образуют тератомы, имеющие нервную ткань, хрящ и эпителий кишечника.
[0321] Также известны способы получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток у мыши (Takahashi and Yamanaka, 2 006). Для индукции iPS клеток обычно требуется экспрессия или воздействие по меньшей мере одного члена семейства Sox и по меньшей мере одного члена семейства Oct. Считается, что Sox и Oct занимают центральное место в иерархии факторов регуляции транскрипции, которая определяет принадлежность ES клеток. Например, Sox может быть Sox-1, Sox-2, Sox-3, Sox-15 или Sox-18; Oct может быть Oct-4. Эффективность перепрограммирования могут
повысить дополнительные факторы, например, Nanog, Lin28, Klf4 или с-Мус; конкретными наборами факторов перепрограммирования может быть набор, содержащий Sox-2, Oct-4, Nanog и, необязательно, Lin-28; или содержащий Sox-2, 0ct4, Klf и, необязательно, с-Мус.
[0322] Клетки IPS, такие как ES клетки, имеют характерные антигены, которые могут быть идентифицированы или подтверждены иммуногистохимией или проточной цитометрией с использованием антител против SSEA-1, SSEA-3 и SSEA-4 (Developmental Studies Hybridoma Bank, National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda Md.) и TRA-1-60 и TRA-1-81 (Andrews et al., 1987) . Плюрепотентность эмбриональных стволовых клеток может быть подтверждена путем инъекции приблизительно (0,5-10)х106 клеток в мышцы задней конечности 8-12-недельных самцов мышей SCID. Развиваются тератомы, которые демонстрируют по крайней мере один клеточной тип каждого из трех зародышевых слоев.
XI. Генетическое изменение дифференцированных клеток
[0323] Клетки в некоторых вариантах осуществления могут
быть получены и содержать одно или несколько генетических
изменений за счет генной инженерии клеток перед или после
дифференцировки (US 2002/0168766). Клетка называется
"генетически измененной", "генетически модифицированной" или "трансгенной", если в эту клетку была перенесена экзогенная нуклеиновая кислота или полинуклеотид любым подходящим средством искусственной манипуляции, если клетка является клеткой-потомком первоначально измененной клетки, которая унаследовала полинуклеотид. Например, клетки могут быть подвергнуты обработке для усиления своего потенциала репликации за счет генетического изменения клеток и экспрессии теломеразной обратной транскриптазы перед или после своего развития в клеточные линии с ограниченной возможностью развития или окончательно дифференцированные клетки (US 2003/0022367).
[0324] В некоторых вариантах осуществления могут быть идентифицированы клетки, содержащие экзогенную конструкцию
нуклеиновой кислоты in vitro или in vivo, путем включения
маркера в вектор экспрессии, такого как маркер селекции или
маркер для скрининга. Такие маркеры придают идентифицируемое
изменение клетке, позволяющее легко идентифицировать клетки,
содержащие вектор экспрессии, или помогают обогащать или
идентифицировать дифференцированные сердечные клетки, используя
тканеспецифический промотор. Например, в аспектах
дифференцировки кардиомиоцитов могут использоваться
кардиоспецифические промоторы, такие как промоторы сердечного тропонина I (cTnl), сердечного тропонина Т (сТпТ), тяжелой цепи саркомерного миозина (МНС), GATA-4, Nkx2.5, N-кадгерина, (31-адренорецептора, ANF, семейства транскрипционных факторов MEF-2, креатинкиназы MB (СК-МВ), миоглобина или предсердного натрийуретического фактора (ANF). В аспектах дифференцировки нейронов могут использоваться нейроспецифические промоторы, включая, но не ограничиваясь ими, TuJ-1, Мар-2, Dcx или Synapsin. В аспектах дифференциации гепатоцитов могут использоваться определенные специфические для энтодермы и/или гепатоцит-специфические промоторы, включая, но не ограничиваясь ими, ATT, СурЗа4, ASGPR, FoxA2, HNF4a или AFP.
[0325] Как правило, маркер селекции представляет собой маркер, который наделяет свойством, позволяющим осуществлять селекцию. Маркерем позитивной селекции может быть маркер, в присутствии которого возможна его селекция, при этом маркер негативной селекции представляет собой маркер, присутствие которого препятствует его селекции. Примером маркера позитивной селекции является маркер устойчивости к лекарственным средствам.
[0326] Обычно включение маркера селекции, чувствительного к лекарственному препарату, способствует клонированию и идентификации трансформантов, например, гены, которые придают устойчивость к неомицину, пуромицину, гигромицину, DHFR, GPT, цеоцину и гистидинолу, являются эффективными маркерами селекции. Кроме маркеров, придающим фенотип, который допускает возможность отличить трансформанты на основании применения условий, также рассматриваются другие типы маркеров, включая маркеры скрининга,
такие как GFP, которые основаны на колориметрическом анализе. Альтернативно, можно использовать ферменты, такие как хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT). Специалисту в данной области также будет известно как использовать иммунологические маркеры, возможно, в сочетании с анализом FACS. Применяемый маркер не считается важным, если он способен одновременно экспрессироваться с нуклеиновой кислотой, кодирующей генный продукт. Другие примеры маркеров селекции и скрининга хорошо известны специалисту в данной области.
XII. Лечение заболеваний и состояний
[0327] Способы могут быть использованы в отношении индивидов с положительным тестом на такие расстройства, у которых есть один или несколько симптомов расстройства, или которые, как считается, подвержены риску развития такого состояния или сходного состояния. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы, описанные в настоящем изобретении, используют для лечения воспалительного или аутоиммунного компонента заболевания, указанного в настоящем изобретении, и/или известного в данной области.
[0328] Некоторые аспекты раскрытия касаются лечения
злокачественного новообразования и/или применения раковых
антигенов. Злокачественным новообразованием, подлежащим лечению,
или антигеном может быть антиген, связанный с любым
злокачественным новообразованием, известным в данной области,
или, например, эпителиальным раком (например, груди, желудочно-
кишечного тракта, легких), раком простаты, раком мочевого
пузыря, раком легких (например, мелкоклеточным раком легких),
раком толстой кишки, раком яичника, раком мозга, раком желудка,
карциномой почек, раком поджелудочной железы, раком печени,
раком пищевода, раком головы и шеи или колоректальным раком. В
некоторых вариантах осуществления злокачественное
новообразование, подлежащее лечению, или антиген представляет собой следующие виды злокачественных новообразований: адренокортикальный рак, агногенная миелоидная метаплазия, злокачественные новообразования при СПИДе (например, лимфома при СПИДе), анальный рак, рак аппендикса, астроцитома (например,
мозжечковая и церебральная), базально-клеточная карцинома, рак
желчных протоков (например, внепеченочных желчных путей), рак
мочевого пузыря, рак кости, (остеосаркома и злокачественная
фиброзная гистиоцитома), опухоль головного мозга (например,
глиома, глиома ствола головного мозга, астроцитома мозжечка или
церебральная астроцитома (например, пилоцитарная астроцитома,
диффузная астроцитома, анапластическая (злокачественная)
астроцитома), злокачественная глиома, эпендимома,
олигоденглиома, менингиома, менингиосаркома, краниофарингиома,
гемангиобластома, медуллобластома, супратенториально
расположенные примитивные нейроэктодермальные опухоли, глиома
зрительного нерва и гипоталамическая глиома, и глиобластома),
рак молочной железы, бронхиальные аденомы/карциноиды,
карциноидная опухоль (например, карциноидная опухоль желудочно-
кишечного тракта), карцинома с неизвестной первичной
локализацией, лимфома центральной нервной системы, рак шейки
матки, рак толстой кишки, колоректальный рак, хронические
миелопролиферативные расстройства, рак эндометрия (например, рак
матки), эпендимома, рак пищевода, опухоли семейства саркомы
Юинга, рак глаз (например, внутриглазная меланома и
ретинобластома), рак желчного пузыря, рак желудка (желудочный),
карциноидная опухоль желудочно-кишечного тракта,
гастроинтестинальная стромальная опухоль (GIST),
герминогенноклеточные опухоли (например, экстракраниальные,
экстрагональные, яичников), гестационная трофобластическая
опухоль, рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный (печеночный) рак
(например, печеночная карцинома и гептома), гипофарингеальный
рак, островково-клеточная (эндокринные опухоли поджелудочной
железы) карцинома, рак гортани, лейкоз, рак губ и ротовой
полости, рак полости рта, рак печени, рак легких (например,
мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого,
аденокарцинома легкого и плоскоклеточный рак легкого),
лимфоидное новообразование (например, лимфома), медуллобластома,
рак яичников, мезотелиома, метастатический плоскоклеточный рак
шеи, рак полости рта, синдром множественной эндокринной
неоплазии, миелодиспластические синдромы,
миелодиспластические/миелопролиферативные заболевания, рак
полости носа и рак параназального синуса, рак носоглотки,
нейробластома, нейроэндокринный рак, рак орофарингеальной
системы, рак яичников (например, рак эпителия яичника,
герминогенная опухоль яичников, опухоль яичника с низкой
злокачественностью), рак поджелудочной железы, рак
паращитовидной железы, рак полового члена, перитонеальный рак,
рак глотки, феохромоцитома, пинеобластома и супратенториальные
примитивные нейроэктодермальные опухоли, опухоль гипофиза,
плевропульмонарная бластома, лимфома, первичная лимфома
центральной нервной системы (микроглиома), легочный
лимфангиомиоматоз, рак прямой кишки, рак почек, рак почечной
лоханки и мочеточника (транзиторный клеточный рак) ,
рабдомиосаркома, рак слюнных желез, рак кожи (например,
немеланома (например, плоскоклеточный рак), меланома и карцинома
клеток Меркеля), рак тонкой кишки, плоскоклеточный рак, рак
яичек, рак горла, тимома и тимичная карцинома, рак щитовидной
железы, туберозный склероз, рак уретры, вагинальный рак, рак
вульвы, опухоль Вильмса и посттрансплантационное
лимфопролиферативное заболевание (PTLD), аномальная сосудистая пролиферация, связанная с факоматозами, отек (например, связанный с опухолями головного мозга) или синдром Мейга.
[0329] Некоторые аспекты раскрытия относятся к лечению аутоиммунного состояния и/или к применению аутоиммунного антигена. Аутоиммунное заболевание, подлежащее лечению, или антиген может быть антигеном, связанным с любым аутоиммунным состоянием, известным в данной области, или, например, диабет, отторжение трансплантата, GVHC, артрит (ревматоидный артрит, такой как острый артрит, хронический ревматоидный артрит, подагра или подагрический артрит, острый подагрический артрит, острый иммунологический артрит, хронический воспалительный артрит, дегенеративный артрит, артрит, вызванным коллагеном II типа, инфекционный артрит, артрит Лайма, пролиферативный артрит, псориатический артрит, болезнь Стилла, артрит позвоночника и ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, хронический деформирующий артрит, деформирующий артрит, первичный
хронический полиартрит, реактивный артрит и анкилозирующий
спондилоартрит), воспалительные гиперпролиферативные кожные
заболевания, псориаз, такой как бляшковидный псориаз, гуттатный
псориаз, пустулезный псориаз и псориаз ногтей, атопия,
включающая атопические заболевания, такие как сенная лихорадка и
синдром Джоба, дерматит, включая контактный дерматит,
хронический контактный дерматит, эксфолиативный дерматит,
аллергический дерматит, аллергический контактный дерматит,
герпетиформный дерматит, нуммулярный дерматит, себорейный
дерматит, неспецифический дерматит, первичный ирритантный
контактный дерматит и атопический дерматит, Х-связанный гипер-
IgM синдром, аллергические воспалительные заболевания глаз,
крапивница, такая как хроническая аллергическая крапивница и
хроническая идиопатическая крапивница, включая хроническую
аутоиммунную крапивницу, миозит, полимиозит/дерматомиозит,
ювенильный дерматомиозит, токсический эпидермальный некролиз,
склеродермия (включая системную склеродермию), склероз, такой
как системный склероз, рассеянный склероз (MS), такой как
спинально-оптическая форма MS, первичный прогрессирующий MS
(PPMS) и интермиттирующая форма MS (RRMS), прогрессирующий
системный склероз, атеросклероз, артериосклероз, рассеянный
склероз, атаксический склероз, оптикомиелит (NMO),
воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона, аутоиммунные желудочно-кишечные заболевания, колиты, такие как язвенный колит, неспецифический язвенный колит, микроскопический колит, коллагеновый колит, полипозный колит, некротизирующий энтероколит и трансмуральный колит, и аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника), воспаление кишечника, гангренозная пиодермия, узелковая эритема, первичный склерозирующий холангит, респираторный дистресс-синдром, в том числе острый респираторный дистресс-синдром или репираторный дистресс-синдром у взрослых (ARDS), менингит, воспаление сосудистой оболочки глаза или ее части, ирит, хориоидит, аутоиммунное гематологическое заболевание, ревматоидный спондилит, ревматоидный синовит, наследственная ангиодистрофия, повреждение черепно-мозгового нерва, например, при менингите,
герпес беременных, пемфигоид беременных, мошоночный зуд, аутоиммунная преждевременная недостаточность яичников, внезапная потеря слуха при аутоиммунном состоянии, IgE-опосредованные заболевания, такие как анафилаксия и аллергический и атопический ринит, энцефалит, такой как энцефалит Расмуссена, лимбический и/или стволовой энцефалит, увеит, такой как передний увеит, острый передний увеит, гранулематозный увеит, негранулематозный увеит, факоантигенный увеит, задний увеит или аутоиммунный увеит, гломерулонефрит (GN), сопровождающийся нефротическим синдромом или без него, такой как хронический или острый гломерулонефрит, такой как первичный GN, иммунный GN, мембранозный GN (мембранозная нефропатия), идиопатический мембранозный GN или идиопатическая мембранная нефропатия, мембрано- или мембранозный пролиферативный GN (MPGN), в том числе 1-ого и 11-ого типа, а также быстро прогрессирующий GN, пролиферативный нефрит, аутоиммунный полигландулярный синдром с эндокринной недостаточностью, баланит, включая баланит плазмоциркулярный Зуна, баланопостит, центробежная кольцевидная эритема, серый дерматоз, мультиформная эритема, кольцевидная гранулема, блестящий лишай, склероатрофичесий лишай, простой хронический лишай, шиловидный лишай, плоский лишай, ламеллярный ихтиоз, эпидермолитический гиперкератоз, предраковый кератоз, гангренозная пиодермия, аллергические состояния и реакции, аллергическая реакция, экзема, в том числе аллергическая или атопическая экзема, астероидная экзема, дисгидротическая экзема и везикулярная ладонно-подошвенная экзема, астма, такая как бронхиальная астма (asthma bronchiale) и аутоиммунная астма, состояния, связанные с Т-клеточной инфильтрацией и хроническими воспалительными реакциями, иммунные реакции против чужеродных антигенов, таких как группы крови плода А-В-0 во время беременности, хроническое воспалительное заболевание легких, аутоиммунный миокардит, дефицит адгезии лейкоцитов, волчанка, включая волчаночный нефрит, энцефалит при волчанке, детская волчанка, почечная волчанка, непочечные симптомы волчанки, внепочечные симптомы волчанки и красная дискоидная волчанка, облысение при волчанке, системная красная волчанка (SLE), такая
как кожная SLE или подострая кожная SLE, неонатальная волчанка
(NLE) и диссеминированная красная волчанка, ювенильный сахарный
диабет (тип I), включая инсулинозависимый сахарный диабет у
детей (IDDM) и сахарный диабет типа II у взрослых (диабет типа
II) и аутоиммунный диабет. Также рассматриваются иммунные
ответы, связанные с острой и отсроченнной
гиперчувствительностью, опосредованной цитокинами и Т-лимфоцитами, саркоидоз, гранулематоз, включая лимфоматоидный гранулематоз, гранулематоз Вегенера, агранулоцитоз, васкулиты, в том числе васкулит, васкулит крупных сосудов (в том числе ревматическая полимиалгия и гигантоклеточный артериит (Такаяси)), васкулит средних сосудов (включая болезнь Кавасаки и узелковый полиартериит/узелковый периартериит), микроскопический полиартериит, иммуновоскулит, васкулит ЦНС, кожный васкулит, гиперчувствительный васкулита, некротизирующий васкулит, такой как системный некротизирующий васкулит, и васкулит, связанный с ANCA, такой как васкулит или синдром Черджа-Стросса (CSS) и васкулит мелких сосудов, связанный с ANCA, темпоральный артериит, апластическая анемия, аутоиммунная апластическая анемия, анемия с положительной пробой Кумбса, анемия Даймонда-Блэкфана, гемолитическая анемия или иммунная гемолитическая анемия, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), болезнь Аддисона, аутоиммунная нейтропения, панцитопения, лейкопения, заболевания, связанные с диапедезом лейкоцитов, воспалительные расстройства ЦНС, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, синдром множественного повреждения органов, например после сепсиса, травмы или кровоизлияния, заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело, заболевание с образованием антител к базальной мембране клубочков, антифосфолипидный синдром, аллергический неврит, болезнь/синдром Бехчета, синдром Кастмана, синдром Гудпасчера, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, пемфигоид, такой как буллезный пемфигоид и кожный пемфигоид, пемфигус (в том числе пемфигус обыкновенный, листовидная пузырчатка, рубцующий пемфигоид и эритематозная пузырчатка), аутоиммунные полиэндокринопатии, болезнь или синдром Рейтера, термический
ожог, преэклампсия, болезни иммунного комплекса, такие как
иммунокомплексный нефрит, нефрит, опосредованный антителами,
полинейропатии, хроническая невропатия, такая как полинейропатия
IgM или IgM-опосредованная нейропатия, аутоиммунная или иммуно-
опосредованная тромбоцитопения, такая как идиопатическая
тромбоцитопеническая пурпура (ITP), включая хронический или
острый ITP, склерит, такой как идиопатический кератосклерит,
эписклерит, аутоиммунное заболевание яичек и яичника, включая
аутоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотиреоз,
гипопаратиреоз, аутоиммунные эндокринные заболевания, включая
тиреоидит, такой как аутоиммунный тиреоидит, болезнь Хашимото,
хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото) или подострый
тиреоидит, аутоиммунная болезнь щитовидной железы,
идиопатический гипотиреоз, болезнь Грейвса, полигландулярные синдромы, такие как аутоиммунные полигландулярные синдромы (или аутоиммунный полигландулярный синдром), паранеопластические синдромы, включая неврологические паранеопластические синдромы, такие как миастенический синдром Ламберт-Итона или синдром Итона-Ламберта, синдром мышечной скованности, энцефаломиелит, такой как аллергический энцефаломиелит (encephalomyelitis allergica) и экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЕАЕ), экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, миастения гравис, например, тимома-связанная миастения, дегенерация мозжечка, нейромиотония, опсоклонус или синдром опсоклонуса-миоклонуса (OMS) и сенсорная невропатия, мультифокальная моторная невропатия, синдром Шихана, аутоиммунный гепатит, хронический гепатит, волчаночный гепатит, гигантоклеточный гепатит, хронический активный гепатит или аутоиммунный хронический активный гепатит, лимфоидный интерстициальный пневмонит (LIP), облитерирующий бронхиолит (без трансплантации) против NSIP, синдром Гийена-Барре, болезнь Бергера (нефропатия IgA), идиопатическая IgA-нефропатия, линейный дерматит IgA, острый лихорадочный нейтрофильный дерматоз, субкорнеальный пустулезный дерматит, транзиторный акантолитический дерматоз, цирроз, такой как первичный билиарный цирроз и пневмоцирроз, синдром аутоиммунной энтеропатии, целиакия или глютеновая
болезнь, целиакия спру (глютеновая энтеропатия), рефрактерная
спру, идиопатическая спру, криоглобулинемия, боковой
амиотрофический склероз (ALS; болезнь Лу Герига), ишемическая
болезнь сердца, аутоиммунное заболевание уха, такое как
аутоиммунное заболевание внутреннего уха (AIED), аутоиммунная
потеря слуха, полихондрия, такая как рефрактерная или
рецидивирующая или рецидивирующая полихондрия, альвеолярный
протеиноз легких, синдром Когана/несифилитический
интерстициальный кератит, паралич Белла, болезнь/синдром Свита,
аутоиммунная розацеа, боль в пояснице, амилоидоз,
доброкачественный лимфоцитоз, первичный лимфоцитоз, который
включает в себя моноклональный В-клеточный лимфоцитоз (например,
доброкачественная моноклональная гаммапатия и моноклональная
гаммапатия неопределенного характера, MGUS), периферическая
невропатия, паранеопластический синдром, каналопатии, такие как
эпилепсия, мигрень, аритмия, мышечные расстройства, глухота,
слепота, периодического паралич и каналопатия ЦНС, аутизм,
воспалительная миопатия, фокальный или сегментарный или
фокально-сегментарный гломерулосклероз (FSGS), эндокринная
офтальмопатия, увеоретинит, хориоретинит, аутоиммунное
гепатологическое расстройство, фибромиалгия, множественная
эндокринная недостаточность, синдром Шмидта, воспаление
надпочечников, атрофия желудка, пресенильная деменция,
демиелинизирующие заболевания, такие как аутоиммунные
демиелинизирующие заболевания и хроническая воспалительная
демиелинизирующая полинейропатия, синдром Дресслера, гнездная
алопеция, тотальная алопеция, синдром CREST (кальциноз, феномен
Рейно, пищеводная дискинезия, склеродермия) и телеангиэктазия),
мужское и женское аутоиммунное бесплодие, например, из-за
антитело против сперматозоидов, смешанная болезнь соединительной
ткани, болезни Чагаса, ревматическая лихорадка, привычный
выкидыш, легкое фермера, мультиформная эритема,
посткардиотомический синдром, синдром Кушинга, легкое "любителя птиц", аллергический гранулематозный ангиит, доброкачественный лимфоцитарный ангиит, синдром Альпорта, альвеолит, такой как аллергический альвеолит и фиброзный альвеолит, интерстициальная
болезнь легких, реакция переливания, проказа, малярия,
паразитарные заболевания, такие как лейшманиоз, кипаносомоз,
шистосомоз, аскаридоз, аспергиллез, синдром Сампера, синдром
Каплана, лихорадка Денге, эндокардит, эндокардиальный фиброз,
диффузный интерстициальный фиброз легких, интерстициальный
фиброз легких, фиброз легких, идиопатический легочный фиброз,
кистозный фиброз, эндофтальмит, стойкая возвышающаяся эритема,
эритробластоз плода, эозинофильный фасциит, синдром Шульмана,
синдром Фелти, филяриатоз, циклит, такой как хронический циклит,
гетерохронический циклит, иридоциклит (острый или хронический)
или циклит Фуха, пурпура Геноха-Шенлейна, вирус иммунодефицита
человека (ВИЧ), тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID),
синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), эховирусная
инфекция, сепсис, эндотоксемия, панкреатит, тиреоксикоз,
парвовирусная инфекция, вирусная инфекция краснухи,
поствакцинальные синдромы, врожденная краснуха, вирусная
инфекция Эпштейна-Барра, эпидемический паротит, синдром Эвана,
аутоиммунный гипогонадизм, хорея Сиденгама, постстрептококковый
нефрит, облитерирующий тромбангиит, тиреотоксикоз, спинная
сухотка, хориоидит, гигантоклеточная полимиалгия, хронический
гиперчувствительный пневмонит, синдром сухого глаза,
эпидемический кератоконъюнктивит, идиопатический почечный синдром, нефропатия минимальных изменений, доброкачественное семейное и ишемически-реперфузионное повреждение, реперфузия органов трансплантата, аутоиммунные заболевания сетчатки, воспаление суставов, бронхит, хроническая обструктивная пневмония/легочная болезнь, силикоз, афтах, афтозный стоматит, атеросклеротические расстройства, асперниогенез, аутоиммунный гемолиз, болезнь Боке, криоглобулинемия, контрактура Дюпюитрена, факоанафилактический эндофтальмит, аллергический энтерит, узловая эритема при проказе, идиопатический лицевой паралич, синдром хронической усталости, ревматизм, болезнь Хаммана-Рича, нейросенсорная тугоухость, пароксизмальная гемоглобинурия, гипогонадизм, илеит регионарный, лейкопения, мононуклеозная инфекция, поперечный миелит, первичная идиопатическая микседема, нефроз, симпатическое воспаление глаз, гранулематозный орхит,
панкреатит, острый полирадикулоневрит, гангренозная пиодермия,
тиреоидит де Кервена, приобретенная атрофия селезенки,
доброкачественная тимома, витилиго, синдром токсического шока,
пищевое отравление, состояния, связанные с Т-клеточной
инфильтрацией, дефицит лейкоцитарной адгезии, иммунные ответы,
связанные с острой и отсроченной гиперчувствительностью,
опосредованной цитокинами и Т-лимфоцитами, заболевания,
связанными с диапедезом лейкоцитов, синдром множественного
повреждения органов, заболевания, связанные с комплексом
антиген-антитело, заболевание с образованием антител к базальной
мембране клубочков, аллергический неврит, аутоиммунная
полиэндокринопатия, оофорит, первичная микседема, аутоиммунный
атрофический гастрит, симпатическая офтальмия, ревматические
заболевания, смешанная болезнь соединительной ткани,
нефротический синдром, инсулит, полиэндокринная недостаточность,
аутоиммунный полигландулярный синдром типа I, идиопатический
гипопаратиреоз у взрослых (AOIH), кардиомиопатия, такая как
дилатационная кардиомиопатия, эпидермолиз буллезный
приобретенный (ЕВА), гемохроматоз, миокардит, нефротический
синдром, первичный склерозирующий холангит, гнойный или
негнойный синусит, острый или хронический синусит, этмоидный,
лобный, верхнечелюстной или феноидальный синусит, расстройство,
связанное с эозинофилами, такое как эозинофилия, легочная
инфильтрационная эозинофилия, синдром эозинофилии-миалгии,
синдром Лоффлера, хроническая эозинофильная пневмония,
тропическая легочная эозинофилия, бронхопневмонический
аспергиллез, аспергиллома или гранулемы, содержащие эозинофилы, анафилаксия, серонегативные спондилоартриты, полиэндокринное аутоиммунное заболевание, склерозирующий холангит, склерит, эписклерит, хронический кандидоз кожи и слизистых, синдром Брутона, транзиторная гипогаммаглобулинемия новорожденных, синдром Вискотта-Олдрича, атаксия телеангиэктазия, ангиэктазия, аутоиммунные расстройства, связанные с коллагеновой болезнью, ревматизм, неврологическое заболевание, лимфаденит, снижение реакции кровяного давления, сосудистая дисфункция, повреждение тканей, сердечно-сосудистая ишемия, гипералгезия, почечная
ишемия, церебральная ишемия и заболевание, сопровождающее
васкуляризацию, аллергические заболевания с
гиперчувствительностью, гломерулонефриты, реперфузионное
повреждение, ишемическое реперфузионное расстройство,
реперфузионное повреждение миокарда или других тканей,
лимфоматозный трахеобронхит, воспалительные дерматозы, дерматозы
с острыми воспалительными компонентами, множественная органная
недостаточность, буллезные заболевания, кортикальный некроз
почек, острый гнойный менингит или другие воспалительные
заболевания центральной нервной системы, воспалительные
заболевания глаза и псевдоопухоли орбиты, синдромы, связанные с
трансфузионными гранулоцитами, токсичность, вызванная
цитокинами, нарколепсия, острое тяжелое воспаление, хроническое
трудно поддающееся лечению воспалителение, пиелит,
эндартериальная гиперплазия, язвенная болезнь, вальвулит,
реакция трансплантат против хозяина, контактная
гиперчувствительность, гиперреактивность дыхательных путей и эндометриоз.
[0330] Другие аспекты касаются лечения или профилактики микробной инфекции и/или применения микробных антигенов. Микробная инфекция, подлежащая лечению или предотвращению, или антиген может быть антигеном, связанным с любой микробной инфекцией, известной в данной области, или, например, сибирской язвой, раком шейки матки (вирусом папилломы человека), дифтерией, гепатитом А, гепатитом В, гемофилией гриппа типа b
(Hib), папилломавирусом человека (HPV) , гриппом (инфлюенция), японским энцефалитом (JE), болезнью Лайма, корью, менингококком, оспой обезьян, свинкой, коклюшем, пневмококком, полиомиелитом, бешенством, ротавирусом, краснухой, лишаем (опоясывающий лишай), оспой, столбняком, тифом, туберкулезом (ТВ), варицелла-зостер
(ветряная оспа) и желтой лихорадкой.
[0331] В некоторых вариантах осуществления способы и композиции могут быть предназначены для вакцинации индивидуума для предотвращения инфекции. XIII. Примеры
[0332] Следующие примеры включены для демонстрации
предпочтительных вариантов осуществления изобретения.
Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что методики, описанные в следующих далее примерах, представляют собой методики, обнаруженные авторами с целью надлежащего функционирования при осуществлении настоящего изобретения и, таким образом, могут считаться предпочтительными вариантами его осуществлении. Однако специалистам в данной области в свете настоящего описания следует понимать, что в конкретных описанных вариантах осуществления могут быть продкланы различные изменения без отхода от сущности и объема изобретения с получением аналогичных или сходных результатов.
Пример 1 - Создание 3D органоидной системы для получения Т-клеток
[0333] Создание стандартной 3D органоидной системы для
развития Т-клеток человека - Целью было придать способность
линиям стромальных клеток, трансдуцированных лигандом Notch,
примером которых является система 0P9-DL1, создавать
стандартизированную систему искусственных органоидов тимуса для
изучения роли 3D взаимодействий при дифференциации и селекции Т-
клеток. Клетки 0P9-DL1 нестабильны в долгоживущей культуре, при
этом для поддержания Т-клеточного потенциала и предотвращения
адипогенной трансформации требуется замена клеток каждые
несколько дней. Поскольку для 3D культур требуется стабильность
в течение нескольких недель, то было предложено найти культуру и
клеточные компоненты, которые давали бы пролонгированные
интактные культуры. Более того, эффективность системы 0P9-DL1
очень чувствительна к биологическим изменениям в фетальной
телячьей сыворотке (FCS), и поэтому авторы также стремились
определить бессывороточные условия культивирования, которые
могли бы воспроизводимо поддерживать Т-клеточную
дифференцировку.
[0334] Было обнаружено, что RPMI, дополненная бессыворотчной добавкой В27, FLT3L, IL-7 и аскорбиновой кислотой (RB27, в настоящем изобретении), способствовала Т-клеточной дифференциации в системе 0P9-DL1 в той же степени, что и в
стандартных сывороточных условиях, однако жизнеспособность стромальных клеток и деление гемопоэтических клеток было слабым. Напротив, линия мышиных стромальных клеток костного мозга MS-5 длительно сохраняла жизнеспособность в RB27, однако, как и ожидалось, не поддерживала Т-клеточную дифференцировку. Поэтому авторы трансдуцировали клетки MS-5 полноразмерной кДНК DLL1 человека (в настоящем изобретении MS5-hDLLl) для создания Т-поддерживающей линии с длительной стабильностью в RB27. Было отдано предпочтение DLL1, так как было показано, что он является физиологически значимым лигандом Notch, экспрессируемым в тимусе человека. Для исследования Т-клеточной дифференциации в этих условиях, CD34+ HSPC пуповинной крови (СВ) FACS-истощали по CD3+ клеткам и высевали на монослои MS5-hDLLl. Совместные культуры MS5-hDLLl в бессыворочной RB27 поддерживали коммитирование Т-клеточной линии и раннюю Т-клеточную дифференцировку из HSPC СВ. Деление гематопоэтических клеток было ниже на MS5-hDLLl в RB27, чем на системе 0P9-DL1, в условиях стандартной среды, однако чистота и степень Т-клеточной дифференциации были сходны между системами. MS5-hDLLl поддерживала р-селекцию клеток-предшественников Т-клеток, что давало небольшое количество CD3+ TCRa.p+ клеток, однако, как и в системе 0P9-DL1, их значительная часть останавливалась на стадии DP, что свидетельствует об ослабленной позитивной селекции).
[0335] Затем авторы использовали MS5-hDLLl/6e3CbiBopoT04Hyio RB2 7 для создания стандартизованной системы 3D искусственных органоидов тимуса (АТО). Для создания АТО клетки MS5-hDLLl агрегировали с CD34+ HSPC пуповинной крови (СВ) человека, истощенной по Т-клеткам. Чтобы максимально увеличить доступность и воспроизводимость, авторы старались не использовать запатентованные матриксы или экзогенный ЕСМ, а вместо этого использовали подход с центробежной реагрегацией, адаптированный на основе реагрегированных культур органоидов тимуса (RT0C) мыши. Поскольку данные RT0C также продемонстрировали, что культуры с границей раздела водной и воздушной поверхностей улучшают развитие Т-клеток, то АТО помещали на коммерчески
доступные 0,4 мкм вкладыши Transwell, дно которых позволяло поддерживать контакт со средой, а верхняя часть с воздухом. В отличие от монослойных совместных культур, для которых требуется последовательный перенос гемопоэтических клеток к новым стромальным слоям, АТО культивировали интактными вплоть до 10 недель, проводя только замену среды и цитокина со стороны вкладыша два раза в неделю. После размещения АТО формировали целостные 3D структуры. АТО имели исключительно клеточную структуру при световой микроскопии ко 2-ой неделе и оставались стабильными по внешнему виду до 10-й недели. В некоторых вариантах осуществления структуры были инкапсулированы.
[0336] АТО, инициированные CD34+ CD3-HSPC СВ, показали ускоренную кинетику дифференциации Т-линии по сравнению с монослойными совместными культурами 0P9-DL1 или MS5-hDLLl. Т-клеточное коммитирование на 2-ой неделе АТО отмечалось по явному возникновению Т-коммитированного раннего фенотипа CD34+ CDla+ CD7+ клеток-предшественников тимуса (ЕТР), а также по перекрывающимся фенотипам рго-Т1 и рго-Т2. Как и ожидалось, Т-клеточная дифференцировка после стадии CD34+ CDla+ CD7+ не наблюдалась в органоидах, созданных с помощью родительской клеточной линии MS-5, вместо этого она поддерживала развитие миелоидных и В-клеток. В АТО CD34- CD7+ CD5+ CD4- CD8- ("двойные негативные", DN) предшественники Т-клеток представляли большинство клеток на 2-й неделе, но затем их число уменьшалось с обратным увеличением популяций незрелых монопозитивных (ISP) CD7+ CD4+ CD3- и и двойных позитивных (DP) CD4+ CD8+. Вместе, ранняя Т-клеточная дифференцировка в АТО была упорядоченной и очень напоминала дифференцировку в нативном тимусе человека.
[0337] Авторы затем рассмотрели эффективность р-селекции и полизитивной селекции в рамках АТО. Предшественники DP АТО показали поверхностную экспрессию CD3 и TCRaP уже на 2-ой неделе, которая усиливалась до б-ой недели, что указывает на успешное прохождение р-селекции. Количество CD3+ TCRa.p+ клеток DP в АТО было сравнимо с количеством их в тимусе человека, оба этих количества были выше количества в монослойных культурах 0P9-DL1
и MS5-hDLLl. Важно отметить, что зрелые монопозитивные CD3+ TCRa|3+ CD8+ и CD4+ (SP) Т-клетки возникали в АТО на 4-ой неделе, и их количество увеличивалось к 7-ой недели, что соответствовало функциональной позитивной селекции в АТО. Количество CD3+ TCRa.p+ CD8+ и CD4+ клеток SP на 7-ой неделе АТО было выше, чем в сопоставимых образцах монослойных совместных культур 0P9-DL1 и MS5-hDLLl, соответственно. В то время как в АТО отмечали как CD3+ TCRaP+ CD8+, так и CD4+ клетки SP, соотношение CD8+ клеток к CD4+ клеткам было выше, чем в тимусе человека, что указывает на относительное преобладание клеток с позитивной селекцией по CD8+ в АТО. Наконец, CD3+ TCRy <3+ клетки легко идентифицировали в АТО, и они в основном были CD8- CD4-, что аналогично картине в тимусе. В совокупности эти данные демонстрируют, что АТО способствуют быстрой и надежной Т-клеточной дифференциации и значительно улучшают позитивную селекцию зрелых Т-клеток человека по сравнению с системами монослойных культур.
[0338] Получение многообразия и функциональных TCR, наивных Т-клеток в АТО - Авторы далее проверили, экспрессировали ли Т-клетки, полученные в АТО, разнообразие TCR, и были ли Т-клетки функционально зрелыми. В CD3+ CD8 Т-клетах SP, полученных в АТО, анализ проточной цитометрии с использованием сегментов цепи VP TCR показал распределение, сравнимое с распределением CD8 клеток SP, выделенных из тимусов человека, соответствующее многообразным поликлональным репертуарам TCR. CD3+ TCRa.p+ Т-клетки SP, полученные в АТО, также показали фенотип зрелых наивных клеток на основании снижения CD4 5RO и повышения CD4 5RA, CD27 и CCR7. Следует отметить, что подмножество как CD3+ TCRa.p+ CD8, так и CD4 клеток SP было CD4 5RO+ CD4 5RA-, однако они были идентифицированы как незрелые Т-клетки, возникающие из предшественников DP, а не Т-клетки памяти, из-за своей экспрессии CDla, которая, подобно CD45RO, снижается во время созревания внутри тимуса и перед выходом из тимуса. Затем авторы тестировали способность Т-клеток, полученных из АТО, пройти активацию и размножение клона в ответ на антигенные стимулы. Как и ожидалось, очищенные CD8 Т-клетки SP, полученные в АТО,
экспрессировали интерферон гамма (IFNg) в ответ на миметики активации сигнального пути TCR РМА/иономицин и подвергались пролиферации, индуцированной их активацией, в ответ на лигирование CD3/2 8 и IL-2, что было показано по разведению CFSE и повышеной регуляции CD2 5. Таким образом, АТО могут генерировать функциональные наивные Т-клетки с разнообразным репертуаром TCR.
[0339] Получение Т-клеток из множественных гемопоэтических тканей - Предыдущие сообщения показали, что развитие Т-клеток из взрослых источников HSPC, включая мобилизованную периферическую кровь, крайне неэффективно в системе 0P9-DL1. И наоборот, развитие Т-клеток может быть особенно эффективным из CD34+ HSPC, выделенных из СВ и постнатального тимуса, из-за высокого количества коммитированных клеток-предшественников лимфоидных и Т-клеток, соответственно. Поэтому авторы тестировали способность АТО к поддержанию развития Т-клеток из очищенных CD34+ HSPC, выделенных из периферической крови, G-CSF мобилизированной периферической крови и стационарного костного мозга взрослых. Авторы обнаружили, что развитие Т-клеток в АТО протекало из всех источников с эффективностью, аналогичной пуповинной крови, и приводило к сходному количеству зрелых CD4+ и CD8+ Т-клеток. Кроме того, очищенные CD34+ Lin- CD38- CD45RA- HSPC, которые высоко обогащены гемопоэтическими стволовыми клетками, из пуповинной крови, костного мозга и мобилизованной периферической крови, продуцировали Т-клетки с аналогичной эффективностью. Таким образом, АТО позволяют разрабатывать клинически значимые источники HSPC, а также могут служить ценным исследовательским инструментом для изучения потенциала линии Т-клеток и дифференциации Т-клеток из множества типов стволовых клеток и клеток-предшественников.
[0340] Структурные аспекты АТО - Затем авторы исследовали структурные аспекты Т-клеточной дифференциации в АТО. Сериальные срезы, окрашенные гематоксилином и эозином (Н &Е) АТО между 2-6 неделями продемонстрировали компактную и клеточную тканеподобную организацию. Иммунофлуоресцентное окрашивание по CD3 показало, что CD3+ клетки образовывали плотные кластеры, преимущественно на
внешнем крае АТО. Таким образом, Т-клеточное развитие в АТО происходит в пределах клеточной архитектуры, которая облегчает контакт "клетка-клетка" многочисленных гемопоэтических клеток, напоминая условия в тимусе человека.
[0341] Дифференцировка и аллельное исключение
сконструированных антиген-специфичных Т-клеток в АТО Принудительная экспрессия TCR в Т-клетках периферической крови со специфичностью в отношении комплекса пептид злокачественной клетки или вирусный пептид-МНС (рМНС) является перспективным подходом при противоопухолевой и противовирусной иммунотерапии. Образование de novo антиген-специфичных Т-клеток из HSPC может предоставить значительные преимущества с точки зрения безопасности и эффективности по сравнению с TCR-трансдукцией периферических Т-клеток. Так как АТО продуцировали функциональные Т-клетки, авторы исследовали эту систему на способность к образованию антиген-специфичных Т-клеток со сконструированными TCR из CD34+ HSPC.
[0342] CD34+ HSPC пуповинной крови здоровых доноров трансдуцировали ранее описанной лентивирусной конструкцией TCRa|3, специфичной для пептида NY-ESO-I157-165 злокачественных клеток, презентированного HLA-A*0201. Дифференцировку антиген-специфичных клеток в АТО контролировали с помощью тетрамера HLA-A*0201/NY-ESO-li57_i65 и антитела против трансдуцированного сегмента VP13.1. В АТО была четкая дифференцировка позитивных по тетрамеру клеток во время начального анализа на 3-ей неделе, все были положительными по VP13.1 и поверхностному CD3. Интересно, что коэкспрессия CD3 и трансдуцированного TCR была впервые замечена в CD34- CD7+ CD5+ клетках DN, а также CD4 ISP-подобных и DP-подобных клетках-предшественниках Т-клеток, однако, начиная с 4-6 недели она постепенно ограничивалась популяциями DP и CD8 SP. Это согласовывалось с обходом р-селекции на стадии DN в присутствии функционального TCR, после чего следовала относительно постоянная дифференцировка, и соответствующий МНС класс I ограничивался позитивной селекцией. Напротив, ложно-трансдуцированные клетки контрольных АТО показали нормальную
экспрессию CD3 и TCRaP на стадии DP, после чего следовала позитивная селекция как CD8+, так и CD4+ Т-клеток. Эти наблюдения согласуются с аллельным исключением эндогенных TCR лосусов а и Р трансгенным TCR. Действительно, > 95% тетрамер+ CD3+ CD8 SP клеток экспрессировали трансдуцированный сегмент VP13.1, исключая альтернативные сегменты.
[0343] Авторы далее подтвердили, что антиген-специфичные Т-клетки, полученые из АТО, были функционально зрелыми. Подобно CD8 SP Т-клеткам ложно-трансдуцированных АТО, тетрамер+ CD8 SP клетки созревали до зрелого наивного фенотипа CD45RA+ CD45RO-св1анизкий CD27+ CCR7+. Как и в контрольных АТО, остальные CD45RO+ клетки были CDla+, что соответствует недавнему выходу из пула DP, в противоположность активированному фенотипу/фенотипу клеток памяти. Тетрамер+ CD8 SP Т-клетки (или эквивалентные TCRa.p+ CD8 SP клетки ложно-трансдуцированных АТО) сортировали и подвергали воздействию искусственных антиген-презентирующих клеток (аАРС) на основе К562, которые коэкспрессируют HLA-A*0201, бета-2-микро глобулин, CD80 и либо пептид NY-ESO-li57_i65 (ES0+), либо нерелевантный контрольный пептид MART-1 (MART1+). Как и ожидалось, антиген-специфичные Т-клетки продуцировали гамма-интерферон и дегранулировали (как отмечено по мембранному трафику LAMPl/CD107a) в ответ на ES0+, а не в ответ на MART1 + аАРС. Т-клетки ложно-трансдуцированных АТО не подвергались значительной активации в ответ на аАРС. Антиген-специфичные Т-клетки также подвергались пролиферации в ответ на ES0+ аАРС. Стабильный рост in vitro, опосредованный аАРС, может поддерживаться более 14 дней. Наконец, аАРС-праймированные антиген-специфичные Т-клетки продемонстрировали антиген-специфичное уничтожение опухолевых клеток при антигенной стимуляции HLA-A*02 01+ мишеневыми клетками К5 62, в которые вводили пептид NY-ES0-1, а не пептид MART1. В итоге, АТО предлагают надежную систему для de novo продукции и манипуляции функциональными антиген-специфичными Т-клетками.
[0344] Было показано, что АТО можно манипулировать в целях конкретного изучения и улучшения процесса позитивной селекции.
Позитивная селекция в тимусе происходит благодаря взаимодействию
развивающихся тимоцитов и кортикальных эпителиальных клеток
(сТЕС) . Было сделано предположение, что в АТО, в которых
отсутствует сТЕС, позитивная селекция опосредуется
взаимодействием с ауто-МНС на аутологичных гемопоэтических клетках. Для проверки этого предположения, СВ HSPC HLA-A*0201-позитивных и негативных доноров трансдуцировали HLA-A* 02 01/NY-ESO-li57-i65 специфическим TCR, как указано выше, и они дифференцировали в Т-клетки в АТО. Используя эту модель, авторы обнаружили, что донорные HLA-A*0201 увеличивали процент CD8SP клеток и, кроме того, вызывали качественных изменения, связанные с улучшенной позитивной селекцией, так как активировали CCR7. Интересно отметить, что эктопическая экспрессия HLA-A*02:01 в стромальных клетках MS5-hDLLl в АТО умеренно повышала процент CD8SP в HLA-A*02:01 негативных доноров АТО и значительно улучшала ее в АТО с донорными HLA-A*02:01+ HSPC. Это указывает на то, что с АТО можно производить манипулирования, трансдуцируя человеческими HLA для усиления продукции антиген-специфичных Т-клеток с позитивной селекцией, и что АТО, используемые в сочетании с аллогенными TCR и МНС-трансдуцированной стромой, дают точно определенную систему для исследований механизма позитивной селекции в Т-клетках человека.
Пример 2 - Искусственные органоиды тимуса вызывают позитивную селекцию и аллельное исключение Т-клеток со сконструированными TCR из гемапоэтических стволовых клеток человека
[0345] Терапия со сконструированными Т-клетками
обеспечивает беспрецедентные возможности лечения злокачественных
новообразований и хронических вирусных инфекций. Способность
производить сконструированные Т-клетки непосредственно из
гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников
(HSPC) представляет возможность преодолеть ключевые
терапевтические ограничения, связанные с использованием Т-клеток периферической крови, включая аллореактивность. В настоящем изобретении описана клинически значимая система искусственных органоидов тимуса (АТО), которая поддерживает высокоэффективное
in vitro дифференцирование и позитивную селекцию нативных Т-клеток человека и Т-клеток человека со сконсруированными TCR из пуповинной крови, костного мозга и HSPC периферической крови. Т-клетки, полученные из АТО, показали фенотип наивных клеток, разнообразный репертуар TCR и TCR-зависимую активацию и пролиферацию. Т-клетки со сконструированными TCR, полученные из АТО, также созревали до фенотипа наивных клеток и, кроме того, показавали почти полное отсутствие эндогенной экспрессии TCR, что соответствует аллельному исключению. Таким образом, АТО представляют собой простой и прямой метод получения наивных неаллореактивных Т-клеток для адаптивной клеточной терапии.
[0346] Адоптивная клеточная терапия с использованием Т-клеток, сконструированных и экспрессирующих антиген-специфичные рецепторы Т-клеток (TCR), обеспечивает целенаправленное и теоретически лечебное действие в отношении злокачественных новообразований и хронических вирусных инфекций. Существующие в настоящее время подходы основаны на генетической модификации и ex vivo делении зрелых циркулирующих Т-клеток. Эти подходы имеют важные терапевтические ограничения, в том числе ограниченную активность in vivo после повторной инфузии и некорректное спаривание трансдуцированных и эндогенных цепей TCR, и возможное снижение антиген-специфичной реактивности или индукции аутоиммунитета. Кроме того, аллореактивность, приобретаемая за счет эндогенной экспрессии TCR, ограничивает большинство подходов к применению аутологичных Т-клеток, что в конечном итоге может ограничить доступ к терапии из-за увеличения стоимости, ограниченной производственной способности и невозможности применения у пациентов при определении лимфопении. In vitro продукция сконструированных Т-клеток из гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC) может решить эти проблемы, одновременно обеспечивая de novo продукцию наивных антиген-специфичных Т-клеток и подавляя эндогенную экспрессию TCR посредством аллельного исключения.
[0347] Из-за пространственно-временной сложности развития Т-клеток в тимусе способы in vitro Т-клеточной дифференцировка до сих пор не могли в полной мере повторить развитие Т-клеток
человека. Одним из основных преимуществ таких способов было обнаружение того, что линии стромальных клеток мыши, трансдуцированные лигандом Notch, могут поддерживать дифференцировку Т-клеток in vitro из HSPC мыши или человека, как показано в классической системе совместного культивирования 0Р9-DL1. В этой и подобных монослойных системах HSPC человека проходит коммитирование в сторону развития линий Т-клеток и ранней дифференциации Т-клеток. Тем не менее, нарушена позитивная селекция клеток-предшественников Т-клеток с производительной перестройкой TCR, и наблюдается минимальное созревание в CD8+ или CD4+ монопозитивные (SP) Т-клетки. Авторы и другие исследовали показали, что трехмерные (3D) органоидные системы с применением мышиной или человеческой ткани тимуса поддерживают улучшенную позитивную селекцию и созревание Т-клеток человека in vitro. Однако эти системы не подходят для образования Т-клеток для терапевтического применения из-за низкой активности клеток, высокой экспериментальной изменчивости и зависимости от первичной ткани тимуса. Таким образом, авторы изобретения разработали систему искусственных органоидов, способную поддерживать дифференцировку и позитивную селекцию Т-клеток человека из HSPC, сохраняя при этом ключевые трансляционные свойства, такие как стандартизированные компоненты, воспроизводимость и масштабируемость.
[0348] В этом примере описано создание системы
искусственных органоидов тимуса (АТО) , основанной на линии
стромальных клеток, трансформированных DLL1, и не содержащей
сыворотки, стандартных компонентов. В отличие от монослойных
систем, АТО поддерживали активную in vitro дифференцировку,
позитивную селекцию и созревание CD3+ TCRa|3+ CD8SP и CD4SP Т-
клеток человека из пуповинной крови человека, костного мозга и
CD34+ HSPC периферической крови. Зрелые Т-клетки, полученные из
АТО, показали антигенный фенотип наивных клеток, разнообразный
репертуар TCR и активацию/пролиферацию в ответ на антигенные
стимулы. АТО также поддерживали высокоэффективную
дифференцировку антиген-специфичных Т-клеток со
сконструированными TCR из HSPC, трансдуцированными TCR, рестриктированными по HLA-A*02:01, специфичным для опухолевого антигена NY-ES0-1. Сконструированные Т-клетки, полученные из АТО, продемонстрировали фенотип наивных клеток, и подвергались антигенной активации и цитотоксическому праймированию. Позитивная селекция Т-клеток со сконструированными TCR дополнительно усиливалась экспрессией когнатного главного комплекса гистосовместимости (МНС) в стромальных клетках АТО. Наконец, Т-клетки со сконструированными TCR, продуцированные АТО, демонстрировали почти полное отсутствие эндогенной экспрессии TCR, согласующуюся с индукцией аллельного исключения во время развития, и предлагая прямой и эффективный подход к созданию неаллореактивных сконструированных Т-клеток для адаптивной клеточной терапии. А. Результаты
1. Разработка оптимизированной системы искусственных органоидов тимуса для дифференцировки Т-клеток человека in vitro
[034 9] Одной из целей было разработать клинически осуществимую систему органоидов, которая могла бы поддерживать in vitro позитивную селекцию и созревание Т-клеток человека из HSPC. Чтобы избежать использования первичной ткани тимуса, DLL1-трансдуцированные стромальные клеточные линии исследовали на способность поддерживать развитие Т-клеток человека в 3D культурах органоидов. Поскольку авторами и другими исследователями было отмечено, что дифференцировка Т-клеток в системе 0P9-DL1 значительно различается в зависимости от конкретных партий эмбриональной телячьей сыворотки и частых изменений стромальных клеток, то авторы настоящего изобретения также стремились определить бессывороточные условия, способные постоянно поддерживать Т-клеточную дифференцировку в культурах органоидов. Чтобы избежать использования запатентованных матриксов, авторы настоящего изобретения использовали способ реагрегации уплотнения, который, как было показано, эффективен для органоидов из тканей тимуса, в которых стромальные клетки агрегируют вместе с HSPC при центрифугировании и размещаются на вставках клеточной культуры на границе раздела воздух-жидкость
(ФИГ. ЗА) . В этих 3D культурах авторы идентифицировали линию стромальных клеток костного мозга мыши MS-5, трансдуцированную DLL1 человека (в настоящем изобретении MS5-hDLLl), как эффективно поддерживающую дифференцировку Т-клеток человека из Т-клеток, истощенных по CD34 + , из HSPC пуповинной крови (СВ) . Кроме того, авторы идентифицировали RPMI, дополненную В2 7, многокомпонентной добавкой, используемой в культурах нейронов и эмбриональных стволовых клеток, и FLT3L, IL-7 и аскорбиновой кислотой (в настоящем изобретении "RB27") в качестве новой бессывороточной среды, которая постоянно поддерживает активную дифференцировку Т-клеток человека в культурах органоидов MS5-hDLLl.
[0350] Эта оптимизированная система искусственных органоидов тимуса (АТО) вызывала быстрое и активное коммитирование в сторону Т-клеточной линии из CD34+ CD3-CB HSPC, как показано по преобладанию CD5+ CD7+ клеток и появлению CD4 ISP и CD4+ CD8+ (DP) клеток ко 2-ой неделе (ФИГ. ЗВ) . Зрелые клетки CD3+ TCRa|3+ возникали уже на 2-ой неделе и со временем увеличились, достигая в среднем 25% на б-ой неделе (ФИГ. ЗВ и G) . CD3+ TCRa.p+ клетки были преимущественно DP на ранних сроках, но постепенно созревали до CD8SP и, в меньшей степени, до CD4SP Т-клеток, что согласуется с позитивной селекций в АТО.
[0351] АТО сохраняли дифференцировку Т-клеток из примитивных клеток-предшественников даже в длительной культуре. На б-ой неделе присутствовали все три фенотипические стадии клеток-предшественников Т-клеток тимуса, включая мультипотентные CD34+CD7-CDla- клетки-предшественники ранних стадий развития тимуса (ЕТР) и следующие за ними CD34+CD7+CDla- и CD34+CD7+CDla+ клетки-предшественники Т-линии (ФИГ. ЗС) . Фенотипы клеток-предшественников Рго-Т1 и рго-Т2 также были идентифицированы во фракции CD34+ на основе альтернативной схемы классификации (ФИГ. ЗС) . Количество CD19+ В-клеток снижалось со временем, а количество NK и миелоидных клеток было низким постоянно (ФИГ. ЗВ, F-G) . Гистологические срезы АТО продемонстрировали плотную тканеподобную архитектуру, богатую лимфоидными клетками (данные
не показаны), кластеры которых были положительными по CD3 (ФИГ. 3D). Количество клеток в АТО по сравнению с исходным количеством HSPC в среднем увеличилось в 80 раз к б-ой неделе (ФИГ. ЗЕ) , и, несмотря на то, что наблюдались различия в количестве различных биологических единиц СВ, клетки-предшественники и зрелые Т-клетки последовательно образовывались из всех образцов (п=18)
(ФИГ. 3G). Общее число клеток также находилось в обратной зависимости от первоначального количества клеток и соотношения HSPC к стромальным клеткам, при некоторых комбинациях оно увеличивалось вплоть до в 8 00 раз по сравнению с исходным количеством HSPC (ФИГ. 9А, В). Наблюдалась высокая степень воспроизводимости клеточного деления и дифференциации Т-клеток во всех технических повторах (п=11) и в различных партиях В27
(п=4) (ФИГ. 10А-С). Крайне важно для клинического применения, что сравнимая дифференцировка Т-клеток наблюдалась в АТО при использовании среды с добавлением В27 без Хепо (содержащая сывороточный альбумин человека) (ФИГ. 10D-E), или полученной с облученными стромальными клетками (ФИГ. 10F-B).
[0352] По сравнению с монослойной культуральной системой OP9-DL1, использующей СВ HSPC того же донора, в АТО была обнаружена значительная продукция CD3+ TCRa|3+ Т-клеток (ФИГ. 11А-С). В соответствии с предыдущими отчетами, монослои OP9-DL1 поддерживали эффективное коммитирование в сторону Т-линии (CD7+ CD5+) и прогрессирование через стадии ЕТР, про-Т и CD4 ISP, но неэффективно продуцировали DP, CD3+ TCRa|3+ и зрелые SP клетки, все из них легко развивались в АТО (ФИГ. 11В-С). Действительно, для оптимальной позитивной селекции и созревания требуются все три компонента системы АТО: трехмерная структура, стромальные клетки MS5-hDLLl и среда RB27 (ФИГ. НА) . В отличие от MS5-hDLLl, OP9-DL1 плохо выживали в RB2 7 и показывали слабую дифференцировку Т-клеток в культурах органоидов. Родительская линия клеток MS-5, лишенная экспрессии DLL1, не поддерживала развитие Т-клеток ни в монослойной культуре, ни в 3D культуре
(ФИГ. НА) .
[0353] Таким образом, АТО предоставляют стандартизованную, не содержащую сыворотки систему органоидов, которая поддерживает активную и воспроизводимую дифференцировку Т-клеток из CD34+ HSPC, обеспечивая позитивную селекцию TCRa|3+ и TCRy8+ Т-клеток человека.
2. Рекапитуляция развития наивных Т-клеток тимуса в АТО [0354] Т-клеточная дифференцировка в длительно существующих АТО была следующей задачей для сравнения с таковой в постнатальном тимусе человека. СВ АТО на 12-ой неделе показали сходное количество коммитированных Т-линий (CD5+ CD7+) и CD34+ клеток-прешественников Т-клеток по сравнению с тимусом (ФИГ. 4А) , а число DP и SP предполагало большую степень созревания Т-клеток в 12-и недельных АТО по сравнению с тимусом (ФИГ. 4А) .
Как и в тимусе, большинство CD3+ клеток в АТО были TCRa|3+, меньшее количество, но постоянное, составляла популяция TCRy8+ (ФИГ. 4А) . Среди клеток CD3+ TCRa(3+, полученных из АТО, образование зрелых CD8SP и CD4SP Т-клеток увеличивалось между неделями 6-12 (ФИГ. 4В и ФИГ. 12А) . В отличие от тимуса, АТО показали пропорционально меньшее количество CD4SP Т-клеток по сравнению с CD8SP Т-клетками, что возможно отражает более медленную кинетику развития CD4+ Т-клеток; CD4+ клетки продолжали увеличиваться в количестве до 12-й недели, самой удаленной точки анализа (ФИГ. 4В и ФИГ. 12А) .
[0355] Как и в тимусе, CD3+ TCRa|3+ CD8SP и CD4SP Т-клетки, полученные в АТО, прошли стадии созревания от фенотипа "незрелых наивных" (CD45RA-CD45RO+CD27+ CCR7-CDlAhi) до фенотипа "зрелых наивных" (CD45RA+CD45R0-CD27+CCR7+CDlaio) клеток (ФИГ. 4С и ФИГ. 12А-С) . В АТО это происходило между б и 12 неделями и давало более высокое количество зрелых наивных Т-клеток на 12-й неделе АТО, чем в тимусе (ФИГ. 4С и ФИГ. 12В-С) . Как незрелые, так и зрелые подмножества наивных клеток коэкспрессировали CD62L и CD28, с подмножественной коэкспрессией CD127 и CD31, последняя связана с новыми эмигрирующими Т-клетками тимуса в крови (ФИГ. 12В-С). Маркер активации CD25 не экспрессировался на CD8SP Т-клетках, полученных из АТО, но наблюдался на подмножестве CD4SP
Т-клеток (ФИГ. 12В-С). В совокупности эти данные демонстрируют значительную точность дифференциации Т-клеток в АТО по сравнению с тимусом человека, что завершается появлением подлинных наивных Т-клеток, сходных с клетками, которые обнаруживаются в тимусе и крови.
3. Т-клеточная дифференцировка из нескольких источников и подмножеств HSPC
[0356] Эффективная дифференцировка Т-клеток с аналогичными
количествами клеток-предшественников и CD3+ TCRa|3+ Т-клеток была
отмечена из всех клинически значимых источников HSPC, то есть из
зрелого костного мозга (ВМ), G-CSF мобилизованной периферической
крови (МРВ) и немобилизованной периферической крови (РВ) (ФИГ.
5А-В и ФИГ. 13А, В). Общее количество клеток также было
сопоставимо во всех источниках HSPC (ФИГ. 13С). Фракции, высоко
насыщенные гемопоэтическими стволовыми клетками (HSC) (Lin-
CD34+CD38) из СВ, ВМ или МРВ продемонстрировали аналогичную
активную дифференцировку Т-клеток (ФИГ. 5C-D и ФИГ. 13D-E), что
указывает на то, что Т-клеточный потенциал этих источников не
зависит от ранее существовавших предшественников,
коммитированных в лимфоидном направлении.
[0357] Дифференцировка Т-клеток в АТО также инициировалась из очищенных лимфоидных предшественников. Через три недели лимфоидоподобные мультипотентные предшественники (LMPP) зрелого ВМ и обычные CD24-лимфоидные предшественники (CLP) дифференцировались через стадии CD4 ISP и DP быстрее и эффективнее, чем HSC или нефракционированные CD34+ HSPC (ФИГ. 5E-F) . Напротив, CD24+ CLP, которые обладают преимущественно В-клеточным потенциалом и потенциалом NK-клеток, плохо развиваются в АТО и имеют низкий выход клеток (ФИГ. 13F). Таким образом, АТО могут служить инструментом для оценки потенциала Т-клеточных линий из популяций человеческих стволовых клеток и клеток-предшественников .
3. Разнообразие TCR и функция Т-клеток, полученных из АТО
[0358] Затем авторы настоящего изобретения охарактеризовали разнообразие TCR и функцию зрелых Т-клеток, полученных из АТО.
Потоковая цитометрия CD3+ TCRa|3+ CD8SP Т-клеток, полученных из
АТО, в отношении общих VJ3 сегментов TCR показала поразительное похожее разнообразие с аналогичными структурами соответствующих CD8SP Т-клеток из тимуса человека (ФИГ. 6А) . Важно отметить, что не наблюдалось ни перекоса V|3, ни клональной селекции, что противоречило преобладанию в АТО необычных подмножеств Т-клеток или клонально расширенных зрелых Т-клеток, соответственно.
[0359] CD8SP Т-клетки, полученные из АТО, демонстрировали
высокую продукцию IFNy и слабую продукцию IL-4 в ответ на
РМА/иономицин, что соответствует цитотоксическому фенотипу (ФИГ.
6В) . CD4SP клетки продуцировали как IFNy+, так и IL-4 + , что
согласуется с Thl и Тп2-поляризацией, соответственно; и
несколько клеток DP отвечали на стимуляцию, что соответствует их
незрелому состоянию (ФИГ. 6В) . CD8SP клетки, полученные из АТО,
также подвергались пролиферации и активации CD2 5 в ответ на
анти-СОЗ/С028 антитела и IL-2 (ФИГ. 6С) . Кроме того, клетки
CD8SP, полученные из СВ, ВМ или МРВ АТО, демонстрировали сходную
продукцию IFNy в ответ на РМА/иономицин (ФИГ. 6D) и in vitro
деление в ответ на анти-СОЗ/С028 и IL-2 (ФИГ. 6Е) . В итоге,
зрелые Т-клетки, продуцируемые АТО, демонстрировали
физиологическое разнообразие TCR и функциональные ответы на антигенные стимулы.
5. Продукция наивных Т-клеток со сконструированными TCR в
АТО
[0360] Затем авторы изобретения адаптировали АТО для in vitro продукции Т-клеток со сконструированными TCR из HSPC. CD34+CD3- HSPC СВ трансформировали лентивирусным вектором, кодирующим а- и [3-цепи ограниченных по HLA-A*02:01 TCR, специфичного в отношении NY-ESO-I157-165 • Через шесть недель TCR-трансдуцированные АТО показали сходное количество CD5+CD7+ Т-коммитированных клеток по сравнению с ложно-трансдуцированными
контролями, но количество CD3+ TCRa|3+ Т-клеток было заметно увеличено, большинство из этих клеток экспрессировали трансдуцированный TCR, как видно по окрашиванию тетрамером или
антителом против трансдуцированной цепи V|313.1 (ФИГ. 7А) . Количество CD8SP клеток было сходно для тетрамер+ клеток и CD3 + TCRa.p+ клеток ложно-трансдуцированных контролей, однако тетрамер+CDSSP клетки проявляли ускоренное созревание до фенотипа зрелых клеток (то есть CD45RA+CD45R0-CD27+CCR7+CDlal0) (ФИГ. 7А) . Как и в случае нетрансдуцированных АТО, дифференцировка в фенотип эффекторных клеток/клеток памяти не наблюдалась (ФИГ. 7А).
[0361] Трансдукция TCR также приводила к увеличению общего числа клеток в АТО (ФИГ. 7В), большинство из которых были тетрамер+СОЗ+ Т-клетками. Общее количество клеток по сравнению с исходными HSPC обычно было в 150 раз больше в TCR-трансдуцированных АТО (ФИГ. 7А) , но может быть дополнительно повышено до более 7 00 раз, с ограничением по количеству исходных HSPC и стромальных клеток на АТО (ФИГ. 7С) . Таким образом, одна единица АТО, инициированная 7500 TSP-трансдуцированными HSPC, может дать приблизительно 5x106 клеток, из которых приблизительно 7,5х105 (15%) представляют собой зрелые наивные Т-клетки с фенотипом TeTpaMep+CD3+CD8SP (ФИГ. 7А-С).
[0362] CD8SP клетки, полученные из АТО, из TCR-трансдуцированных АТО подвергали антиген-специфической активации и дегрануляции, как измерено по продукции IFNy и мембранной мобилизации CD107a, соответственно, в ответ на искусственные антиген-презентирующие клетки, экспрессирующие когнатный пептид-МНС и CD80, а не родительский К562 (ФИГ. 7D) . Кроме того, CD8SP Т-клетки из TCR-трансдуцированных АТО претерпевали эквивалентное деление in vitro в ответ на анти-СВЗ/СБ28 и IL-2, как и клетки из ложно-трансдуцированных АТО (ФИГ. 7Е).
[0363] Анализ разнообразия VP в Т-клетках со сконструированными TCR из АТО выявил более 98% тетрамер+ CD8SP Т-клеток, экспрессующих только трансдуцированный сегмент VP13.1 (ФИГ. 7F-G), что согласуется почти с полным аллельным исключением эндогенной экспрессии TCR во время дифференциации Т-клеток со сконструированными TCR. Таким образом, АТО поддерживали активную дифференцировку функциональных Т-клеток со
сконструированными TCR из HSPC и введение TCR усиливало клеточное деление и способствовало дифференциации зрелых наивных Т-клеток, лишенных эндогенной экспрессии TCR.
6. Улучшенная позитивная селекция Т-клеток со сконструированными TCR в модифицированных по МНС АТО
[0364] Позитивная селекция в тимусе опосредована взаимодействием TCR на клетках-предшественниках Т-клеток и ауто-МНС на стромальных и гематопоэтических клетках тимуса. Таким образом, было изучено, может ли гемопоэтическая или стромальная экспрессия "ауто" МНС в АТО улучшить позитивную селекцию Т-клеток со сконструированными TCR. Для проверки влияния гемопоэтической экспрессии аутоМНС на позитивную селекцию в АТО использовали доноры позитивные или негативные по HLA-A*02:01, и экспрессию МНС стромальных клеток исследовали по продукции АТО с использованием клеток MS5-hDLLl, трансдуцированных HLA-A*02:01
(ФИГ. 8А). Во всех случаях HSPC трансдуцировали NY-ES0-1-специфическим TCR, рестриктированными по HLA-A*02:01, и количество TeTpaMep+CD3+CD8SP Т-клеток использовали в качестве показателя позитивной селекции. Гемопоэтическая экспрессия HLA-А*02:01 оказывала лишь незначительное влияние на позитивную селекцию тетрамер+CDSSP Т-клеток (ФИГ. 8В). Напротив, экспрессия HLA-A*02:01 в стромальных клетках АТО заметно улучшала позитивную селекцию тетрамер+CDSSP Т-клеток и обладала синергизмом с донорной гемопоэтической экспрессией HLA-02:01
(ФИГ. 8В). Т-клетки со сконструированными TCR в МНС-модифицированных АТО также демонстрировали повышенное созревание до фенотипа зрелых наивных клеток, включая активацию CCR7 (ФИГ. 8С) , что согласуется с улучшенной позитивной селекцией. Таким образом, АТО, содержащие TCR-трансдуцированные HSPC и МНС-трансдуцированные стромальные клетки, представляют собой универсальную систему для моделирования позитивной селекции Т-клеток человека in vitro, а также простой способ усиления позитивной селекции и созревания полученных in vitro Т-клеток со сконструированными TCR для адаптивной клеточной терапии. В. Комментарии
[035] Способность точно повторять тимопоэз in vitro создает уникальную возможность для получения сконструированных Т-клеток с желательными терапевтическими свойствами, включая наивное по антигену состояние и отсутствие эндогенной экспрессии TCR. Как показано в настоящем изобретении, используя стандартизованные готовые компоненты, система АТО точно повторяет тимопоэз из HSPC, результатом чего является получение зрелых CD3 + TCRa|3+CD8SP и CD4SP Т-клеток, которые очень напоминают наивные Т-клетки из тимуса или периферической крови.
[0366] АТО предоставляют различные биологические и трансляционные преимущества по сравнению с существующими способами дифференциации Т-клеток in vitro, такими как система 0P9-DL1. Во-первых, АТО способствуют позитивной селекции и созреванию Т-клеток человека, оба этих процесса нарушены в монослойных системах. Улучшенная позитивная селекция в АТО зависит от 3D структуры, тогда как монослойные культуры с идентичными компонентами АТО, приводят к неэффективной дифференциации Т-клеток. Это согласуется с поддержанием позитивной селекции, хотя и с низкой эффективностью, в FTOC или в реагрегированных 3D культурах, использующих компоненты тимуса. Возможно, что 3D взаимодействия поддерживают развитие Т-клеток за счет увеличения валентности и/или продолжительности контакта между клетками-предшественниками Т-клеток и лигандами развития, такими как DLL1, или селективными лигандами, такими как сам МНС. Альтернативно, 3D конфигурация может облегчать перекрестные взаимодействия между стромальными и гемопоэтическими клетками или оказывать сигналы развития на предшественники Т-клеток посредством механических усилий и/или метаболических изменений, которые невозможны в 2D.
[0367] Еще одним важным достижением системы АТО по сравнению с существующими методами является высокоэффективная дифференцировка Т-клеток из клинически значимых зрелых источников HSPC, включая костный мозг и покоящуюся или мобилизованную периферическую кровь. Исследования, использующие систему 0P9-DL1, показывают неэффективное развитие TCRa|3+ Т
клеток из СВ, ВМ или МРВ16-19, а данные для покоящихся HSPC периферической крови не приводятся. Сообщается об улучшенном развитии Т-клеток на 0P9-DL1 с CD34+ клетками, полученными из постнатального тимуса, что соответствует праймированию этих популяций клеток-предшественников микроокружением тимуса, однако тимус человека остается непрактичным источником HSPC для терапевтического применения.
[0368] Система АТО также предлагает техническую простоту, воспроизводимость и потенциальную масштабируемость. Применение бессывороточной среды позволяет избежать видимой изменчивости, наблюдаемой в монослойных системах с эмбриональной телячьей сывороткой, а способность поддерживать АТО интактными в течение всего периода культивирования (вплоть до 12 недель), осуществляя только замену среды, позволяет избежать необходимый для монослойных систем частый перенос клеток на свежие стромальные клетки. Применение стандартных компонентов и, особенно, избежание первичных стромальных клеток или запатентованных матриксов, а также способность сочетать продукцию АТО с реагентами, не содержащими Хепо, и облучением стромальных клеток должны облегчать переход АТО на платформу клинического применения для продукции Т-клеток для адаптивной терапии. Простота системы также позволяет прямое применение способа в лабораториях, интересующихся моделированием развития Т-клеток человека и позитивной селекции.
[0369] Как показано в настоящем изобретении, система АТО является высокоэффективным способом получения in vitro наивных Т-клеток со сконструированными TCR из HSPC. Дифференцировка Т-клеток со сконструированными TCR из HSPC человека была показана в системе 0P9-DL1, однако в этих случаях было нарушено созревание клеток CD8SP (как правило, представляя только 0-2% культуры), а наивысшая эффективность достигалась при использовании CD34+ клеток, полученных из тимуса. Напротив, АТО поддерживали активную позитивную селекцию Т-клеток со сконструированными TCR из HSPC СВ с аналогичными результатами, наблюдаемыми при использовании HSPC МРВ (не показано). Фенотип зрелых наивных Т-клеток, полученный в АТО, может быть явным
преимуществом сконструированных клеток, полученных из АТО, по сравнению с модифицированными Т-клетками периферической крови, на основе исследований, демонстрирующих, что улучшение in vivo выживаемости и активности адаптивно пересаженных Т-клеток коррелирует с менее активированными фенотипами. Улучшенная позитивная селекция сконструированных Т-клеток в АТО путем экспрессии когнатного МНС в стромальных клетках обеспечивает дальнейший путь повышения качества и выхода Т-клеток, полученных из АТО.
[0370] Наличие в АТО трансдуцированного TCR на всех стадиях
дифференцировки Т-клеток опосредовало практически полное
аллельное исключение эндогенных локусов TCR, что согласуется с
in vivo исследованиями с пересаженными HSPC человека и мыши.
Экспрессия потенциально аллореактивных эндогенных TCR на
сконструированных Т-клетках периферической крови является
серьезным препятствием для разработки масштабируемых стандартных
Т-клеток для адаптивной терапии, в настоящее время требующих
трудоемкой индивидуальной продукции аутологичных
сконструированных Т-клеток. Стратегии развития аллогенных сконструированных Т-клеток для терапии включают повреждение эндогенной экспрессии TCR/CD3, используя инструменты для редактирования генов или TCR-трансдукцию вирус-специфических Т-клеток; однако оба этих подхода требуют сложных манипуляций и увеличения количества генно-модифицированных Т-клеток, что может подвергать риску in vivo функцию. Применение АТО для продукции de novo сконструированных наивных Т-клеток с аллельным исключением, таким образом, является высокоэффективной альтернативной стратегией продукции неаллореактивных Т-клеток для адаптивной клеточной терапии.
С. Способы
1. Выделение CD34+CD3- HSPC человека
[0371] Неонатальную пуповинную кровь получали из плаценты после обычных родов в UCLA. Костный мозг (ВМ) получали у здоровых взрослых доноров из материала аллогенных доноров ВМ в UCLA или приобретали у компании AllCells Inc. (Alameda, СА) . G-CSF мобилизованной периферической крови получали при согласии
здоровых взрослых доноров, подвергающихся аферезу для аллогенной
трансплантации стволовых клеток в UCLA. Немобилизованную
периферическую кровь получали у здоровых взрослых доноров в
лаборатории UCLA CFAR Virology Core. Все образцы тканей получали
в соответствии с протоколами или исключениями, одобренными IRB
UCLA. Все образцы обогащали мононуклеарными клетками путем
центрифугирования с градиентом Ficoll-Paque (GE Healthcare Life
Sciences, Pittsburgh, PA), а затем осуществляли позитивную
селекцию CD34+ клеток с помощью магнитной сортировки клеток
(MACS), используя набор CD34 MicroBead Kit UltraPure (Miltenyi,
Auburn CA) . Фракции, обогащенные CD34+ клетками,
криоконсервировали после MACS, если не указано иное. Перед использованием клетки оттаивали, и остальные Т-клетки исключали FACS сортировкой CD34+ СБЗ-клеток, которые сразу же высевали в АТО или трансдуцировали, как описано ниже. В некоторых экспериментах HSC обогащали FACS сортировкой Lin-CD34+CD38-клеток перед посевом в АТО. HLA-типирование HSPC проводили с помощью UCLA Immunogenetics Center, используя олигонуклеотидные бусы, специфичные по последовательности (SSO), с высокой разрешающей способностью.
2. Выделение подмножеств клеток-предшественников костного мозга человека
[0372] CD34+ HSPC обогащали из свежих аспиратов ВМ, как указано выше, и немедленно отсортировали с помощью FACS популяции стволовых клеток/клеток-предшественников на основе позитивной экспрессии CD45 и при отсутствии экспрессии маркеров линии (CD3, CD14, CD19, CD56 и CD235a, "Lin-"), объединенных со следующими маркерами: общее число HSPC (CD34+), HSC (CD34+CD38-CD4 5RA), LMPP (CD34+CD38+CD45RA+CD10-CD62Lhi), CD24- CLP (CD34+CD38+CD45RA+CD10+CD24-) и CD24+ CLP (CD34+CD38+CD45RA+CD10 CD24+) .
3. Выделение тимоцитов человека
[0373] Постнатальный тимус человека получали в соответствии с протоколами изъятия IRB как утилизированного материала пациентов, перенесших операцию на сердце, в госпитале Children's
Hospital Los Angeles (CHLA). Фрагменты тимуса мелко измельчали в RPMI и разрушали путем пипетирования с высвобождением тимоцитов в суспензию и затем пропускали через нейлоновый фильтр размером 7 0 мкм. Клетки анализировали свежими в тот же или на следующий день. В проточном цитометрическом анализе клеток-предшественников из тимуса и АТО, использованы следующие поверхностные фенотипы: ранние предшественники тимуса (ЕТР; CD34+CD7-CDla-), CDla- про-Т (CD34+CD7+CDla-) и CDla+ про-Т (CD34+CD7+CDla+); или CD5- про-Т (про-Т1; CD34+CD7+CD5-) и CD5+ про-Т (про-Т2; CD34+CD7+CD5+). Т-клетки и клетки-предшественники из тимуса и АТО определяли как CD14-CD56- в сочетании со следующими фенотипами: общее число Т-клеточных линий (CD7+CD5+), двойные негативные (DN; CD4-CD8-), CD4 незрелые монопозитивные (CD4ISP; CD5+CD4+CD3), двойные позитивные (DP; CD4+CD8+), CD8SP (CD3 + TCRaP+CD8 + CD4-) , CD4SP (CD3 + TCRa,p+CD8-CD4 +) , незрелые наивные (CD4 5RA-CD4 5RO+, которые представляли собой CD8SP или CD4SP), зрелые наивные (CD45RA+CD45RO-, которые представляли собой CD8SP или CD4SP) . Фенотипы незрелых и зрелых клеток подтверждали совместным окрашиванием CDla, CD27, CD28 и CCR7. 4. Клеточные линии
[0374] Линию стромальных клеток MS-5 мыши получали в качестве подарка. Для получения MS5-hDLLl клетки MS-5 трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим DLL1 и GFP человека. 5% клеток с максимальной экспрессией GFP сортировали по FACS и пассировали в DMEM/10% FCS. Стабильную экспрессию подтверждали проточной цитометрией по экспрессии GFP через несколько недель культивирования. Клетки MS5-hDLLl-A2.1 создавали путем трансдуцирования клеток MS5-hDLLl с помощью лентивирусного вектора с HLA-A*02:01 человека (подарок доктора David Baltimore, Caltech), а затем путем FACS-сортировки трансдуцированных клеток с помощью антитела, распознающего HLA-А2 (ВВ7.2) человека (Biolegend, San Diego, СА) . Линия клеток 0P9-DL1 была подарена доктором Juan Carlos Zuniga-Pflucker (университет в Торонто) и ее пассировали в МЕМа (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)/20% FBS в колбах, покрытых
желатином 0,1%. Линию клеток К5 62 получали из АТСС. Клеточная линия K562-CD80/HLA-A*02:01/NY-ESO-1 аАРС была подарена доктором Antoni Ribas (UCLA).
5. Культуры искусственных органоидов тимуса (АТО) [0375] Клетки MS5-hDLLl (или MS-5 или 0P9-DL1, как указано) собирали путем трипсинизации и ресуспендировали в культуральной среде АТО без содержания сыворотки ("RB27"), состоящей из RPMI 1640 (Corning, Manassas, VA), 4% добавки В27 (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY) , 30 мМ гидрата сесквимагниевой соли 2-фосфата L-аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) , восстановленной в PBS, 1% пенициллин/стрептомицин (Bio-Products Gemini, West Sacramento, CA) , 1% глутамакс
(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY), 5 нг/мл rhFLT3L и 5 нг/мл rhIL-7 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) . RB27 готовили еженедельно. 4% B2 7 без Хепо заменяли В2 7 в указанных экспериментах. В зависимости от эксперимента (1,5-б)х105 клеток MS5-hDLLl объединяли с 5х102-1х105 очищенными CD34+ СБЗ-клетками
(или другими популяциями HSPC, как указано) на АТО в 1,5 мл-овых пробирках Эппендорфа и центрифугировали при 300 g в течение 5 мин при температуре 4°С в центрифуге с бакет-ротором. Супернатанты осторожно удаляли? и осадок клеток кратковременно ресуспендировали на Вортексе. Для каждого АТО, 0,4 мкм вставки transwell Millicell (EMD Millipore, Billerica, MA; PICM0RG50) помещали в б-луночный планшет, содержащий 1 мл RB2 7 на лунку. Для размещения АТО вставки вынимали и ставили на край пластины для слива избыточной среды. Клеточную суспензию доводили до 5-8 мкл на АТО, всасывали с помощью наконечника 2 0 мкл-овой пипетки и высевали путем образования капли на конце наконечника пипетки, которую осторожно помещали на вставку. Клеточную вставку помещали обратно в лунку, содержащую 1 мл RB2 7. Среду полностью заменяли каждые 3-4 дня, аспирируя вокруг клеточной вставки, а затем заменяя 1 мл свежей RB27/цитокины. АТО культивировали таким образом в течение 12 недель. В указанные моменты времени клетки АТО собирали, добавляя в каждую лунку буфер FACS
(PBS/0,5% альбумина бычьей сыворотки/2 мМ EDTA) и быстро
дезагрегируя АТО пипетированием 1 мл-овой пипеткой "Р1000", а затем пропуская через 7 0 мкм нейлоновый фильтр. В некоторых экспериментах суспензии единичных клеток MS5-hDLLl подвергались у-облучению в указанных дозах перед использованием в АТО.
6. Культуры Т-клеточных монослоев
[0376] Монослойные культуры OP9-DL1 получали, как описано ранее в данной области. Вкратце, OP9-DL1 высевали на 12-и луночные планшеты, покрытые 0,1% желатина за 1-2 дня перед использованием для достижения 70-80% конфлюенции. Среду аспирировали из монослоев и 1х104-1, 5х104 очищенных CD34+ CD3-HSPC, высевали на стромальные монослои в 2 мл среды, состоящей из МЕМа, 20% FBS, 30 мМ L-аскорбиновой кислоты, 5 нг/мл rhFLT3L и 5 нг/мл rhIL-7. В некоторых экспериментах MS-5 или MS5-hDLLl заменяли на OP9-DL1, a RB27 заменяли в качестве культуральной среды. Клетки переносили на новые монослои стромальных клеток каждые 4-5 дней путем сбора клеток, фильтрования через 7 0 мкм нейлоновый сетчатый фильтр и повторного засева в свежую среду. При достижении конфлюенции клетки разделяли на несколько лунок, содержащих свежие слои стромальных клеток. Культуры поддерживали вплоть до 10 недель.
7. Лентивирусные векторы и трансдукция
[0377] Полноразмерную кодирующую последовательность DLL1 человека клонировали с помощью ОТ-ПЦР из набора универсальных эталонных РНК человека (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) в лентивирусный вектор третьего поколения pCCL-c-MNDU3-X-IRES-eGFP (подарок от доктора Donald Kohn, UCLA). Лентивирусный вектор HLA-A*02:01 pHAGE6-HGHSS-HLAA2.1-IRES-ZsGreen был подарен доктором David Baltimore (Caltech). Лентивирусный вектор третьего поколения, кодирующий а- и [3-цепи оптимизированного по кодонам TCR, специфичный для HLA-A*02: OI/NY-ESO-I157-165/ ранее был описан, и был подарен доктором Antoni Ribas (UCLA). Упаковку и концентрацию лентивирусных частиц выполняли, как описано выше. Вкратце, клетки 293Т (АТСС) совместно трансфицировали лентивирусной векторной плазмидой, pCMV-AR8.9 и pCAGGS-VSVG, используя TransIT 293Т (Mirus Bio, Madison, WI) в течение 17
часов с последующей обработкой 2 0 мМ бутиратом натрия в течение 8 часов с последующим образованием клеточных супернатантов в бессывороточной UltraCulture в течение 4 8 часов. Супернатанты концентрировали с помощью фильтрации в тангенциальном потоке с использованием фильтров Amicon Ultra-15 100К (EMD Millipore, Billerica, MA) по протоколу производителя и хранили при -80°С. Для трансдукции HSPC 1х105-1х106 FACS, отсортированные по CD34+ CD3-HSPC, высевали в б-луночные необработанные планшеты, покрытые 20 мкг/мл ретронектином (Clontech, Mountain View, СА) в 1 мл X-VIVO-15 (Lonza, Basel, Switzerland) , дополненном 50 нг/мл рекомбинантного SCF человека, FLT3L и ТРО и 10 нг/мл IL-3 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) , в течение 12-18 часов, после чего добавляли концентрированный линтивирусный супернатант при множественности заражения (MOI), равной 100. Ложно-трансдуцированные клетки культивировали в идентичных условиях, но без добавления вектора. Клетки собирали через 24 часа после трансдукции, промывали и высевали в АТО. TSP-трансдуцированные HSPC были получены из HLA-A*02:01+ СВ, если не указано иного. 8. Иммуногистохимия
[0378] Для получения изображений с окрашиванием гематоксилином и эозином (Н &Е) АТО погружали в Histogel
(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY) и фиксировали в течение ночи в 10% нейтрализованном буферном формалине
(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY). 5 мкм-овые срезы и окрашивание Н &Е выполняли с помощью UCLA Translational Pathology Core Laboratory (TPCL). Для иммунофлуоресцентной визуализации АТО выделяли путем разрезания культуральной вставки вокруг каждого АТО скальпелем с последующим погружением мембраны и АТО в Tissue-Tek OCT (VWR Radnor, РА) и замораживанием на сухом льду. 5% замороженных срезов фиксировали в 10%-ном нейтрализованном буфером формалине и окрашивали анти-СБЗ (клон UCHT1, Biolegend, San Diego, СА) при разведении 1:50 в течение ночи при 4°С, затем инкубировали при комнатной температуре с антимышиным IgG, конъюгированным с AlexaFluor 594 (H+L) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Изображения с Н &Е и
иммунофлуоресценцией получали на Zeiss Aziolmager М2 с AxioCam MRM и программным обеспечением AxioVision (Zeiss, Jena, Germany).
9. Внутриклеточное цитокиновое окрашивание
[0379] CD8SP, CD4SP клетки или клетки DP из АТО сортировали FACS, используя антитела против CD8 и антитела против CD4 и наносили на 9б-луночные планшеты с U-образным дном в 2 00 мкл AIM V (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY) с 5% ной сывороткой AB человека, инактивированной нагреванием (Bem-Products Gemini, West Sacramento, СА) . В каждую лунку добавляли коктейль РМА/иономицин/коктейль ингибиторов транспортных белков или коктейль ингибиторов транспортных белков в качестве контроля
(оба от eBioscience, San Diego, СА) и инкубировали в течение ночи. Клетки окрашивали по CD3, CD4 и CD8 (Biolegend, San Diego, СА) и красителем UV455 для определения жизнеспособности
(eBioscience, San Diego, СА) , затем фиксировали и пермеабилизировали набором для внутриклеточного окрашивания
(eBioscience, San Diego, СА) и окрашивали цитокины антителами против IFNy и IL-4 (Biolegend, San Diego, СА).
10. Анализ активации и пролиферации Т-клеток
[0380] Для анализов пролиферации CFSE CD8SP Т-клетки, полученные из АТО, сортировали по FACS и метили 5 мкМ CFSE (Biolegend, San Diego, СА) согласно протоколу производителя. Меченые клетки инкубировали с анти-СОЗ/С028 бусами (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY) в AIM V, дополненном 5%-ной сывороткой АВ и 20 нг/мл rhIL-2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ), или только IL-2 для CD25 (Biolegend, San Diego, СА) и анализировали проточной цитометрией на 5-й день. Для in vitro анализов увеличения количества клеток 1x104 сортированных FACS CD8SP Т-клетки, полученных из АТО, высевали в 9б-луночные планшеты с U-образным дном в 200 мкл среды Immunocult XF (Stem Cell Technologies, Vancouver, ВС, Canada) с добавлением 20 нг/мл rhIL-2 и lx aHTH-CD3/CD28-тетрамерного комплекса антител (Stem Cell Technologies, Vancouver, ВС, Canada). Свежую среду и цитокины добавляли каждые 2-3 дня с заменой на более крупные
лунки по мере необходимости. Свежий анти-СВЗ/СБ28 добавляли на 7 и 14 день. Клетки подсчитывали еженедельно с помощью гемацитометра.
11. Анализ праймирования CTL искусственных АРС (аАРС) [0381] 5х104 всех CD8SP Т-клеток, полученных из АТО,
сортировали с б-й недели TCR-трансдуцированных АТО, и совместно культивировали, используя аАРС на основе К562, экспрессирующие CD80 и HLA-A*02: 01/B2M/NY-ESO-li57-i65 одноцепочечный тример (подарок доктора Antoni Ribas, UCLA) или родительские клетки К5 62 в 9б-луночных планшетах с U-образным дном в 2 00 мкл AIM V/5% АВ сыворотке человека при соотношении 5:1 Т-клетка:К562 в течение ночи. В лунки добавляли СБ170а-АРС-антитело (Biolegend, San Diego, СА) при конечном разведении 1:50 вместе с коктейлем ингибиторов транспортных белков (eBioscience, San Diego, СА) в течение последних 4 часов культивирования, а затем фиксировали, пермеабилизовали и проводили внутриклеточное цитокиновое окрашивание, как описано выше.
12. Анализ V|3 TCR
[0382] Общее число клеток с 7-й недели АТО или постнатальные тимусы окрашивали по CD3, CD4, CD8 и TCRy8 в сочетании с набором IOTest Beta Mark TCR V (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) . CD3 + TCRgd-CD8 + CD4- клетки селектировали для анализа V|3. В случае TCR-трансдуцированных АТО на б-ой неделе все клетки АТО также метили HLA-A*02: OI/NY-ESO-I157-165 тетрамером, конъюгированным с АРС (MBL International, Woburn, MA) , и селектировали по CD3 + TCRy8-TeTpaMep+CD8 + CD4- для анализа V(3.
13. Проточная цитометрия и антитела
[0383] Каждое окрашивание при проточной цитометрии проводили в PBS/0,5% BSA/2 мМ ЭДТА в течение 30 мин на льду. Ко всем образцам за 5 мин до окрашивания антителами добавляли FcX (Biolegend, San Diego, СА) . Для окрашивания тетрамера к клеткам добавляли РЕ или АРС-конъюгированные тетрамеры (MBL International, Woburn, MA) при конечном разведении 1:50 при комнатной температуре в течение 10 минут, затем на льду добавляли антитела в течение дополнительных 2 0 минут. Во все
образцы перед анализом добавляли DAPI. Анализ проводили на LSRII Fortessa и FACS на аппарате ARIA или ARIA-Hinstrument (BD Biosciences, San Jose, СА) в центре UCLA Broad Stem Cell Research Center Flow Cytometry Core. Для всех анализов клетки DAPI+ селектировали, а единичные клетки селектировали на основе FSC-H по сравнению с FSC-W и профилями SSC-H по сравнению с профилями SSC-W. Клоны антител, используемые для поверхностного и внутриклеточного окрашивания, были получены от компании Biolegend (San Diego, СА) : CDla (HI149) , CD3 (UCHT1), CD4 (RPA-T4), CD5 (UCHT2), CD8 (RPA-T8), CD10 (6H6), CD14 (M5E2), CD19 (HIB19) , CD24 (ML5) , CD25 (BC96) , CD27 (0323), CD28 (CD28.2), CD31 (WM59), CD34 (581), CD38 (HIT2), CD45 (HI30), CD45RA (HI100), CD45RO (UCHL1), CD56 (HCD56), CD107a (H4A3), CD127 (A019D5), CD235a (HI264), CCR7 (G043H7), HLA-A2 (BB7.2), interferon у (4S.B3), IL-4 (MP4-25D2), TCRocP (IP26), TCRyS (Bl), VP13.1 (H131), коктейль для линий клеток человека (CD3, CD14, CD19, CD20, CD56) ; или от компании BD Biosciences (San Jose, СА): CD7 (М-Т701) и (DREG-56).
Пример 3: Искусственные органоиды тимуса вызывают позитивную селекцию и аллельное исключение Т-клеток со сконструированными TCR из гемапоэтических стволовых клеток человека
[0384] Терапия со сконструированными Т-клетками
обеспечивает беспрецедентные возможности лечения злокачественных
новообразований и хронических вирусных инфекций. Способность
производить сконструированные Т-клетки непосредственно из
гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников
(HSPC) представляет возможность преодолеть ключевые
терапевтические ограничения, связанные с использованием Т-клеток периферической крови, включая аллореактивность. В этом примере описана клинически значимая система искусственных органоидов тимуса (АТО), которая поддерживает высокоэффективное in vitro дифференцирование и позитивную селекцию нативных Т-клеток человека и Т-клеток человека со сконструированными TCR из пуповинной крови, костного мозга и HSPC периферической крови. Т
клетки, полученные из АТО, показывали фенотип наивных клеток, разнообразный репертуар TCR и TCR-зависимую активацию и пролиферацию. Т-клетки со сконструированными TCR, полученные из АТО, также созревали до фенотипа наивных клеток и, кроме того, показывали антиген-специфическое уничтожение опухоли in vitro и in vivo, и почти полное отсутствие эндогенной экспрессии VJ3 TCR, что соответствует индукции аллельного исключения. Таким образом, АТО представляют собой эффективные способ получения наивных и потенциально неаллореактивных Т-клеток для адаптивной клеточной терапии.
[0385] Адоптивная клеточная терапия с использованием Т-клеток, сконструированных и экспрессирующих антиген-специфичные рецепторы Т-клеток (TCR), обеспечивает целенаправленное и теоретически лечебное действие в отношении злокачественных новообразований и хронических вирусных инфекций. Существующие в настоящее время подходы основаны на генетической модификации и ex vivo делении зрелых циркулирующих Т-клеток. Эти подходы имеют некоторые важные терапевтические ограничения, в том числе ограниченную активность in vivo после повторной инфузии и некорректное спаривание трансдуцированных и эндогенных цепей TCR, а также возможное снижение антиген-специфичной реактивности или индукции аутоиммунитета. Кроме того, аллореактивность, приобретаемая за счет эндогенной экспрессии TCR, ограничивает большинство подходов к применению аутологичных Т-клеток, что в конечном итоге может ограничить доступ к терапии из-за увеличения стоимости, ограниченной производственной способности и невозможности применения у пациентов при определении лимфопении. In vitro продукция сконструированных Т-клеток из гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC) может решить эти проблемы, одновременно обеспечивая о!е novo продукцию наивных антиген-специфичных Т-клеток и подавляя эндогенную экспрессию TCR посредством аллельного исключения.
[0386] Из-за пространственно-временной сложности развития Т-клеток в тимусе способы in vitro Т-клеточной дифференцировка до сих пор не могли в полной мере повторить развитие Т-клеток
человека. Одним из основных преимуществ таких способов было обнаружение того, что линии стромальных клеток мыши, трансдуцированные лигандом Notch, могут поддерживать дифференцировку Т-клеток in vitro из HSPC мыши или человека, как показано в классической системе совместного культивирования 0Р9-DL1. В этой и подобных монослойных системах HSPC человека проходит коммитирование в сторону развития линий Т-клеток и ранней дифференциации Т-клеток. Тем не менее, нарушена позитивная селекция клеток-предшественников Т-клеток с производительной перестройкой TCR, и наблюдается минимальное созревание в CD8+ или CD4+ монопозитивные (SP) Т-клетки. Авторы и другие исследовали показали, что трехмерные (3D) органоидные системы с применением мышиной или человеческой ткани тимуса поддерживают улучшенную позитивную селекцию и созревание Т-клеток человека in vitro. Однако эти системы не подходят для образования Т-клеток для терапевтического применения из-за низкой активности клеток, высокой экспериментальной изменчивости и зависимости от первичной ткани тимуса. Таким образом, авторы изобретения разработали систему искусственных органоидов, способную поддерживать дифференцировку и позитивную селекцию Т-клеток человека из HSPC, сохраняя при этом ключевые трансляционные свойства, такие как стандартизированные компоненты, воспроизводимость и масштабируемость.
[0387] В этом примере описано создание системы
искусственных органоидов тимуса (АТО) , основанной на линии
стромальных клеток, трансформированных DLL1, и не содержащей
сыворотки, стандартных компонентов. В отличие от монослойных
систем, АТО поддерживали активную in vitro дифференцировку,
позитивную селекцию и созревание CD3+ TCRa|3+ CD8SP и CD4SP Т-
клеток человека из пуповинной крови человека, костного мозга и
CD34+ HSPC периферической крови. Зрелые Т-клетки, полученные из
АТО, показали антигенный фенотип наивных клеток, разнообразный
репертуар TCR и активацию/пролиферацию в ответ на антигенные
стимулы. АТО также поддерживали высокоэффективную
дифференцировку антиген-специфичных Т-клеток со
сконструированными TCR из HSPC, трансдуцированными TCR, рестриктировонными по HLA-A*02:01, специфичным для опухолевого антигена NY-ES0-1. Позитивная селекция Т-клеток со сконструированными TCR дополнительно усиливалась экспрессией когнатного главного комплекса гистосовместимости (МНС) в стромальных клетках АТО. Т-клетки со сконструированными TCR, полученные из АТО, продемонстрировали фенотип наивных клеток и подвергались антигенной активации с активным уничтожением опухоли in vitro и in vivo. Наконец, Т-клетки со сконструированными TCR, продуцированные АТО, демонстрировали почти полное отсутствие эндогенной экспрессии VJ3 TCR, согласующуюся с индукцией аллельного исключения во время развития, и предлагая прямой и эффективный подход к созданию неаллореактивных сконструированных Т-клеток для адаптивной клеточной терапии. I. Результаты
А. Разработка оптимизированной системы искусственных органоидов тимуса для дифференцировки Т-клеток человека in vitro
[0388] Одной из целей было разработать клинически осуществимую систему органоидов, которая могла бы поддерживать in vitro позитивную селекцию и созревание Т-клеток человека из HSPC. Чтобы избежать использования первичной ткани тимуса, авторы исследовали DLLl-трансдуцированные стромальные клеточные линии на способность поддерживать развитие Т-клеток человека в 3D культурах органоидов. Было отмечено, что дифференцировка Т-клеток в системе 0P9-DL1 значительно различается в зависимости от конкретных партий эмбриональной телячьей сыворотки, и авторы настоящего изобретения стремились определить бессывороточные условия, способные постоянно поддерживать Т-клеточную дифференцировку в культурах органоидов. Чтобы избежать использования запатентованных матриксов, использовали способ реагрегации уплотнения, который, как было показано, эффективен для органоидов из тканей тимуса, в которых стромальные клетки агрегируют вместе с HSPC при центрифугировании и размещаются на вставках клеточной культуры на границе раздела воздух-жидкость
(ФИГ. ЗА) . В этих 3D культурах авторы идентифицировали линию стромальных клеток костного мозга мыши MS-5, трансдуцированную DLL1 человека (в настоящем изобретении MS5-hDLLl), как эффективно поддерживающую дифференцировку Т-клеток человека из Т-клеток, истощенных по CD34 + , из HSPC пуповинной крови (СВ) . Кроме того, авторы идентифицировали RPMI, дополненную В2 7, многокомпонентной добавкой, используемой в культурах нейронов и эмбриональных стволовых клеток, и FLT3L, IL-7 и аскорбиновой кислотой (в настоящем изобретении "RB27") в качестве новой бессывороточной среды, которая постоянно поддерживает активную дифференцировку Т-клеток человека в культурах органоидов MS5-hDLLl.
[0389] Эта оптимизированная система искусственных органоидов тимуса (АТО) вызвала быстрое и активное коммитирование в сторону Т-клеточной линии из CD34+CD3 HSPC СВ, как показано по преобладанию CD5+CD7+ клеток и появлению CD4+CD3- незрелых монопозитивных (ISP) клеток и CD4+CD8+ (DP) ко
2-ой неделе (ФИГ. ЗВ) . Более зрелые клетки CD3 + TCRa|3+ возникали уже на 4-ой неделе и со временем увеличились, достигая в среднем -30% на б-ой неделе (ФИГ. ЗВ и 14А). Также образовывалась меньшая фракция CD3 + TCRy5+ Т-клеток (ФИГ. 14А) . CD3 + TCRa|3+ клетки были преимущественно DP на ранних сроках (ФИГ. 14А), но постепенно созревали до CD8SP и, в меньшей степени, до CD4SP Т-клеток, что согласуется с позитивной селекций в АТО.
[0390] CD34+ клетки-предшественники оставались
обнаруживаемыми в АТО во всех исследованных моментах времени, и на б-ой неделе все еще включали все три фенотипические стадии клеток-предшественников Т-клеток тимуса: мультипотентные С034+С07-С01а-клетки-предшественники тимуса ранних стадий (ЕТР) и CD34+CD7+CDla- и CD34+CD7+CDla+ предшественники Т-клеток последующих стадий развития (ФИГ. ЗС) . Фенотипы клеток-предшественников Рго-Т1 и рго-Т2 также были идентифицированы во фракции CD34+ на основе альтернативной схемы классификации (ФИГ. ЗС) . Количество CD19+ В-клеток снижалось со временем, а количество NK и миелоидных клеток было низким постоянно (ФИГ.
ЗВ, 14А) . Гистологические срезы АТО продемонстрировали плотную тканеподобную архитектуру, богатую лимфоидными клетками (ФИГ. 19), кластеры которых были позитивны по CD3 (ФИГ. 3D).
[0391] Каждый АТО обычно давал ~2х106 всех клеток на б-ой неделе (ФИГ. 14В) ; однако выход клеток АТО на HSPC был обратно пропорционален количеству высеянных HSPC и отношению HSPC к стромальным клеткам с выходом 4-5000 клеток на HSPC, полученных с наименьшими отношениями (ФИГ. 2OA) . Количество клеток-предшественников и зрелых Т-клеток в АТО было одинаковыми для начального количества HSPC и соотношениям (ФИГ. 20В), за исключением АТО с большим количеством стромальных клеток (6x105 на АТО), где было показано нарушение развития зрелых Т-клеток. Таким образом, для дальнейших экспериментов использовали меньшие АТО с оптимальным соотношением HSPC к стромальным клеткам, равным 1:20 (обычно 7500 HSPC:6xl05 стромальных клеток на АТО) . Наблюдались степень воспроизводимости и клеточного выхода, и дифференциации Т-клеток во всех технических повторах (п=11) и четырех различных партиях В27 (ФИГ. 21A-D). Что касается важности перехода, то сравнимая дифференцировка Т-клеток и выход клеток также наблюдали в АТО при использовании среды с добавлением В2 7 без Хепо (содержащая сывороточный альбумин человека) (ФИГ. 21E-F) или содержащей облученные стромальные клетки (ФИГ. 21G-J). Восстановление гемопоэтических клеток, продуцируемых в АТО, достигали простым механическим разрушением и сбором клеточной суспензии, что давало > 99% CD45+ гемопоэтических клеток и <0,5% стромальных клеток (ФИГ. 21К).
[0392] При сравнении с монослойной культуральной системой OP9-DL1, использующей HSPC СВ того же донора, в АТО была обнаружена значительная продукция CD3 + TCRa|3+ Т-клеток (ФИГ. НА, 22) . В соответствии с предыдущими отчетами, монослои OP9-DL1 поддерживали эффективное коммитирование в сторону Т-линии (CD7+ CD5+) и прогрессирование через стадии ЕТР, про-Т и CD4 ISP, но неэффективно продуцировали DP, CD3+ TCRa|3+ и зрелые SP клетки, все из них легко развивались в АТО (ФИГ. НА, 22) . Действительно, для оптимальной позитивной селекции и созревания
требуются все три компонента системы АТО: трехмерная структура, стромальные клетки MS5-hDLLl и среда RB27 (ФИГ. НА) , поскольку OP9-DL1 слабо выживали в RB2 7 и показывали слабое сохранение дифференциации Т-клеток в 3D культурах. Родительская линия клеток MS-5, лишенная экспрессии DLL1, не поддерживала развитие Т-клеток ни в монослойной культуре, ни в 3D культуре (ФИГ. НА) .
[0393] Таким образом, АТО предоставляют стандартизованную, не содержащую сыворотки 3D систему, которая поддерживает активную и воспроизводимую дифференцировку Т-клеток из CD34+ HSPC, обеспечивая позитивную селекцию TCRa|3+ Т-клеток человека.
В. Рекапитуляция развития наивных Т-клеток тимуса в АТО
[0394] Т-клеточная дифференцировка в АТО была следующей задачей для сравнения с таковой в постнатальном тимусе человека. СВ АТО на 12-ой неделе показали сходное количество коммитированных Т-линий (CD5+CD7+) и CD34+ клеток-предшественников по сравнению с тимусом (ФИГ. 4А) . Как и в тимусе, большинство CD3+ клеток в АТО были TCRa|3+, меньшее количество, но легко обнаруживаемая популяция TCRy8+ также стабильно обнаруживалась (ФИГ. 4А) . Среди клеток CD3 + TCRa|3+, полученных из АТО, образование зрелых CD8SP и CD4SP Т-клеток увеличивалось между неделями 6-12 (ФИГ. 4В и ФИГ. 12АА-С). В отличие от тимуса, АТО показывали пропорционально меньшее количество CD4SP Т-клеток по сравнению с CD8SP Т-клетками.
[0395] Как и в тимусе, CD3 + TCRa|3+CD8SP и CD3+CRa|3+CD4SP Т-клетки, полученные в АТО, прошли стадии созревания от фенотипа "незрелых наивных" (CD45RA-CD45RO+CD27+ CCR7-CD1A) до фенотипа "зрелых наивных" (CD45RA+CD45RO-CD27+CCR7+CDlah) клеток (ФИГ. 4С, 12А-С). В АТО это происходило между б и 12 неделями и давало более высокое количество зрелых наивных Т-клеток на 12-й неделе АТО, чем в тимусе (ФИГ. 4С, 12В-С) . Как незрелые, так и зрелые подмножества наивных клеток коэкспрессировали CD62L и CD2 8 с подмножественной коэкспрессией CD127 и CD31, последний маркер связан с новыми эмигрирующими Т-клетками тимуса в крови (ФИГ. 12В-С). Маркер активации CD25 не экспрессировался на CD8SP Т-клетках, полученных из АТО, но наблюдался на подмножестве CD4SP
Т-клеток (ФИГ. 12В-С). В совокупности эти данные демонстрируют значительную точность дифференциации Т-клеток в АТО по сравнению с тимусом человека, что завершается появлением подлинных наивных Т-клеток, сходных с клетками, которые обнаруживаются в тимусе и крови.
[0396] Учитывая позднее появление зрелых CD4SP Т-клеток в АТО, было сделано предположение, что дендритные клетки также могут развиваться в АТО и опосредовать позитивную селекцию посредством экспрессии класса МНС II. Действительно, в АТО редко встречаются клетки HLA-DR+ в количестве, аналогичном количеству в тимусе (ФИГ. 2ЗА) . Дополнительный анализ этой популяции показал антиген-презентирующие клетки, включая моноциты, В-клетки и плазмоцитоидные, СЪЕС9А+и CDlc+ дендритные клетки, все из них также присутствуют в тимусе (ФИГ. 2 3В).
С. Т-клеточная дифференцировка из нескольких источников и подмножеств HSPC
[0397] Эффективная дифференцировка Т-клеток в АТО с аналогичными количествами клеток-предшественников и CD3+ TCRa|3+ Т-клеток была отмечена из всех клинически значимых источников HSPC, то есть из зрелого костного мозга (ВМ), G-CSF мобилизованной периферической крови (МРВ) и немобилизованной периферической крови (РВ) (ФИГ. ЗА-В, 15А-В, ФИГ. 13А-В). HSPC из этих источников, а также из тимуса, демонстрировали различную кинетику дифференциации Т-клеток (ФИГ. 15А), однако выход Т-клеток был сопоставим с источником HSPC (ФИГ. 3d) . Высокообогащенные фракции гемопоэтических стволовых клеток (HSC)
(Lin-CD34+CD38) из СВ, ВМ или МРВ продемонстрировали аналогичную активную дифференцировку Т-клеток (ФИГ. 5C-D и ФИГ. 13D-E).
[0398] АТО также индуцировали дифференцировку Т-клеток из очищенных лимфоидных клеток-предшественников, выделенных из ВМ
(ФИГ. 15C-D). Лимфоидно-праймерные мультипотентные клетки-предшественники (LMPP) и СБ2 4-общие лимфоидные предшественники
(CLP) дифференцировались быстрее, чем HSC (не показаны) или нефракционированные CD34+lin-HSPC (ФИГ. 24А-В). Напротив, CD24+ CLP, которые обладают главным образом потенциалом клеток В и NK,
привели к плохой дифференцировке Т-клеток и выходу клеток в АТО (ФИГ. 15C-D, 2 4А). Таким образом, АТО могут служить инструментом для оценки потенциала Т-клеточных линий из популяций человеческих стволовых клеток и клеток-предшественников.
D. Разнообразие TCR и функция Т-клеток, полученных из АТО
[0399] Подобно тимусу, RAG1 а также RAG2 экспрессировались
в DP, полученных из АТО (ФИГ. 2 5А) . Анализ проточной цитометрии семейства VJ3 TCR CD3 + TCRa|3+ CD8SP (ФИГ. 16А) и CD3 + TCRa|3+CD4SP (ФИГ. 25В) Т-клеток, полученных из АТО, показал поразительное похожее разнообразие с аналогичными структурами соответствующих Т-клеток из тимуса человека. Кроме того, крайне разнообразный репертуар TCR в CD3 + TCRa|3+CD8SP был обнаружен при глубоком секвенировании областей Va и VJ3 CDR3 TCR, сравнимых с таковыми в клетках CD8SP тимуса и РВ наивных CD8+ Т-клетках (ФИГ. 16В-С) . Важно отметить, что не наблюдалось перекоса V|3, что противоречило преобладанию в АТО необычных подмножеств Т-клеток или клонально расширенных зрелых Т-клеток.
[0400] CD8SP Т-клетки, полученные из АТО, проявляли полифункциональную продукцию IFNy, TNFa и IL-2 в ответ на РМА/иономицин, что соответствует цитотоксическому фенотипу (ФИГ. 16D), а также активной пролиферации и повышению активности CD25 и 4-1ВВ в ответ на стимуляцию анти-СОЗ/С028 и IL-2 (ФИГ. 16Е) . CD4SP клетки, продуцируемые в АТО, давали IFNy и IL-2 и пролиферировали в ответ на анти-СВЗ/СБ28 и IL-2 (ФИГ. 25C-D). Количество CD8SP (ФИГ. 16F) и CD4SP (ФИГ. 25Е), выделенное из АТО, увеличивалось в 60 раз и в 40 раз, соответственно, в течение 14 дней при анти-СВЗ/СБ28 и IL-2. В итоге, зрелые Т-клетки, продуцируемые АТО, демонстрировали физиологическое разнообразие TCR и функциональные ответы на антигенные стимулы.
E. Продукция наивных Т-клеток со сконструированными TCR в
АТО
[0401] Затем авторы изобретения адаптировали АТО для in vitro продукции Т-клеток со сконструированными TCR из HSPC. CD34+CD3- HSPC СВ, трансдуцированные лентивирусным вектором, кодирующим оптимизированные по кодону а- и [3-цепи ограниченных
по HLA-A*02:01 TCR, специфичного в отношении пептида NY-ESO-l157_ 165. Через 7 недель TCR-трансдуцированные АТО показывали сходное количество CD5+CD7+ клеток Т-линии по сравнению с ложно-трансдуцированными контролями, но количество CD3+ TCRa|3+ Т-клеток было заметно увеличено, большинство из этих клеток экспрессировали трансдуцированный TCR, как видно по окрашиванию тетрамером или антителом против трансдуцированной цепи V|3l3.1
(ФИГ. 7А). Количество CD8SP клеток было сходно для CD3 + TCRa.p+TeTpaMep+ клеток и CD3 + TCRa.p+ клеток ложно-трансдуцированных контролей, однако тетрамер+CDSSP клетки проявляли ускоренное созревание до фенотипа зрелых клеток (то есть CD45RA+CD45RO-CD27 + CCR7 + CDlalG) (ФИГ. 7А) . Следует отметить, что тетрамер+CDSSP клетки отражали обычный фенотип CD8a.p Т-клеток без экспрессии CD16 или CD5 6, маркеров, связанных с NK-клетками и внутриэпителиальными лимфоцитами (ФИГ. 17А).
[0402] Трансдукция TCR также приводила к значительному увеличению выхода клеток из АТО (в среднем -450 клеток на HSPC)
(ФИГ. 17В), большинство из которых были СОЗ+тетрамер+ Т-клетками. Таким образом, одна единица АТО, инициированная 7500 TSP-трансдуцированными HSPC, обычно давала ~4х106 клеток, из которых приблизительно 15% (бхЮ5 были CD+TeTpaMep+CD8SPCD45RA+ зрелыми наивными Т-клетки на 7 неделе (ФИГ. 7А-С).
[0403] Полученные из АТО клетки CD8SP из TCR-трансдуцированных АТО подвергали антигенспецифической активации
(продукция IFN, TNF и IL-2), дегрануляции (мембранная мобилизация CD107a) (ФИГ. 17С) и пролиферации (ФИГ. 17ED) в ответ на искусственные антигенпрезентирующие клетки (аАРС), экспрессирующие CD80 и тример когнатный HLA-A*02:01/пептид NY-ESO-1/одноцепочечный МНС, но не на аАРС с нерелевантным НАА-А* 02:01/MART-1 или родительские клетки К562. Кроме того, CD8SP Т-клетки, выделенные из TCR-трансдуцированных АТО, показывали активное деление в ответ на анти-СВЗ/СБ28 и IL-2 или IL-7/IL-15
(ФИГ. 17Е). Кроме того, тетрамер+ клетки сохраняли обычный фенотип CD8a даже после длительного деления и реактивации (ФИГ. 2 6А) .
[0404] Анализ проточной цитометрии разнообразия VJ3 в полученных из АТО Т-клетках со сконструированными TCR выявил более 98% тетрамер+ CD8SP Т-клеток, экспрессирующих только трансдуцированный сегмент V|313.1 (ФИГ. 7F, 26В), что согласуется почти с полным аллельным исключением эндогенной экспрессии VJ3 во время дифференциации Т-клеток со сконструированными TCR в АТО. Таким образом, АТО поддерживали активную дифференцировку функциональных Т-клеток со сконструированными TCR из HSPC и введение TCR усиливало клеточное деление и способствовало дифференциации зрелых наивных Т-клеток, в которых отсутствовала
экспрессия эндогенного VJ3 TCR.
[0405] Чтобы проверить, могут ли вышеуказанные данные выходить за рамки NY-ESO-1 TCR, получали АТО, используя оптимизированный по кодону HLA-A*02:01-рестриктированный по MART-1-специфичный TCR. CD3+TeTpaMep+CD8SP, выделенные из этих АТО, показывали фенотип наивных Т-клеток (ФИГ. 2 6С) и повышенную
поверхностную экспрессию IFNy и CD107a в ответ на аАРС MART-1, а не на аАРС NY-ES0-1 (ФИГ. 26D).
F. Улучшенная позитивная селекция Т-клеток со
сконструированными TCR в модифицированных по МНС АТО
[0406] Позитивная селекция в тимусе опосредована взаимодействием TCR на клетках-предшественниках Т-клеток и ауто-МНС на стромальных и гематопоэтических клетках тимуса. Таким образом, было изучено, может ли стромальная экспрессия "ауто" МНС в АТО улучшить позитивную селекцию Т-клеток со сконструированными TCR. HPSC позитивные по HLA-A*02:01 трансдуцировали HLA-A*02:01-рестриктированным по NY-ES0-1-специфичным TCR и объединяли с контрольными стромальными клетками MS5-hDLLl или MS5-hDLLl, трансдуцированными HLA-A*02:01 (ФИГ. 27А) . Экспрессия HLA-A*02:01 в стромальных клетках АТО улучшала позитивную селекцию TeTpaMep+CD3+CD8SP Т-клеток (ФИГ. 2 7А) , сохраняя при этом нормальную дифференцировку до зрелого фенотипа наивных клеток (ФИГ. 2 7В).
G. Антиген-специфичное уничтожение опухоли с помощью
продуцируемых в АТО Т-клеток со сконструированными TCR
[0407] В дальнейшем авторы анализировали антиген-специфическую цитотоксичность продуцируемых в АТО Т-клеток со сконструированными TCR. Очищенные CD8SP Т-клетки, выделенные из NYO-ESO-1-специфичных TCR-трансдуцированных АТО и активированных in vitro в течение 3 6 часов, активно индуцировали апоптоз в экспрессирующих NY-ESO-1 клеточных линиях (клетки К5 62, трансдуцированные комплексом HLA-A*02:01/NY-ESO-1 рМНС; и клеточная линия множественной миеломы HLA-A*02:01+ U266, в которой эндогенно экспрессируется антиген NY-ESO-1), но показывали небольшую активность в отношении родительских клеток К5 62 или клеток К5 62, экспрессирующих нерелевантный HLA-А*02:01/MART-1 рМНС (ФИГ. 18А-В). Кроме того, антиген-специфическая цитотоксичность сохранялась после длительного (14-дневного) деления in vitro, что соответствовало поддержанию обычного фенотипа Т-клеток (ФИГ. 18С); цитотоксичность была сходна цитотоксичности TCR-трансдуцированных CD8+ Т-клеток СВ, деление которых проходило в то же время (ФИГ. 18С) . В соответствии с этими результатами увеличенные в количестве продуцируемые в АТО Т-клетки со сконструированными TCR способны значительно контролировать тяжесть заболевания у мышей NSG, которым подкожно прививали опухоли К5 62, экспрессирующие когнатные (K562-ESO), но не неродственные антигены (K562-MART1) рМН (ФИГ. 18D-F).
II. Комментарии
[0408] Способность точно повторять тимопоэз in vitro создает уникальную возможность для получения сконструированных Т-клеток с желательными терапевтическими свойствами, включая наивное по антигену состояние и отсутствие экспрессии эндогенных TCR. Как показано в настоящем изобретении, используя стандартизованные готовые к использованию компоненты, система АТО эффективно инициирует и поддерживает нормальные этапы Т-клеточного коммитирования и их дифференциации из HSPC, в результате чего продуцируются зрелые CD3 + TCRa|3+CD8SP и CD3 + TCRa.p+CD4SP Т-клетки, очень напоминающие обычные наивные Т-клетки из тимуса и периферической крови.
[0409] АТО дают различные биологические и прикладные
преимущества по сравнению с существующими способами in vitro
дифференциации Т-клеток. Во-первых, АТО способствуют позитивной
селекции и созреванию Т-клеток человека, оба этих процесса
нарушены в монослойных системах. Улучшенная позитивная селекция
в АТО зависит от 3D структуры, тогда как монослойные культуры с
идентичными компонентами приводили к неэффективной
дифференциации Т-клеток. Это согласуется с наблюдаемой позитивной селекцией, хотя и с низкой эффективностью, в FTOC или в реагрегированных 3D культурах, в которых используются компоненты тимуса. Возможно, что 3D взаимодействия поддерживают улучшенное развитие Т-клеток за счет увеличения валентности и/или продолжительности контакта между предшественниками Т-клеток и лигандами развития, такими как DLL1, или селективными лигандами, такими как ауто-МНС. Альтернативно, 3D конфигурация может облегчать перекрестные взаимодействия между стромальными и гемопоэтическими клетками или оказывать сигналы развития на предшественники Т-клеток посредством механических усилий и/или метаболических изменений, которые невозможны в 2D.
[0410] Еще одним важным преимуществом системы АТО по сравнению с существующими способами является высокоэффективная дифференцировка Т-клеток из клинически значимых зрелых источников HSPC, включая пуповинную кровь, костный мозг и покоящуюся или мобилизованную периферическую кровь. Существующие в настоящее время системы монослоев показывают неэффективное
развитие TCRa|3+ Т-клеток из СВ, ВМ или МРВ; а данные для покоящихся HSPC периферической крови не приводятся.
[0411] Как показано в настоящем изобретении, система АТО также может продуцировать наивные Т-клетки со сконструированными TCR из HSPC. Дифференцировка Т-клеток со сконструированными TCR из HSPC человека была показана в системе 0P9-DL1, однако при этом сообщалось о нарушении созревания клеток CD3+CD8SP (как правило, представляя только 0-2% культур), а наивысшая эффективность достигалась при использовании CD34+ клеток, полученных из тимуса. Напротив, АТО поддерживали активную
позитивную селекцию Т-клеток со сконструированными TCR из HSPC СВ с аналогичными результатами, наблюдаемыми при использовании HSPC МРВ (не показано). Фенотип зрелых наивных Т-клеток, который достигался в АТО, может также иметь явное преимущество полученных в АТО сконструированных клеток по сравнению с модифицированными Т-клетками периферической крови, на основе исследований, демонстрирующих, что улучшенное in vivo выживание и активность адаптивно пересаженных Т-клеток коррелируют с менее дифференцированными активированными фенотипами. Улучшенная позитивная селекция наивных Т-клеток со сконструированными TCR путем экспрессии когнатного МНС в стромальных клетках АТО, обеспечивает дальнейший путь повышения выхода зрелых продуцируемых в АТО антиген-специфичных Т-клеток.
[0412] Наличие в АТО трансдуцированных TCR на всех стадиях дифференцировки Т-клеток опосредовало практически полное
аллельное исключение эндогенных локусов VJ3 TCR, что согласуется с
in vivo исследованиями с пересаженными HSPC человека и мыши.
Экспрессия потенциально аллореактивных эндогенных TCR на
сконструированных Т-клетках периферической крови является
серьезным препятствием для разработки масштабируемых готовых к
использованию Т-клеток для адаптивной терапии, требующих в
каждом случае трудоемкого получения аутологичных
сконструированных Т-клеток. Стратегии разработки аллогенных сконструированных Т-клеток для терапии включают повреждение экспрессии эндогенного TCR/CD3, используя редактирование генов или TCR-трансдукцию вирус-специфических Т-клеток; однако оба этих подхода требуют сложных манипуляций и увеличения количества генно-модифицированных Т-клеток, что может подвергать риску in vivo функцию. Применение АТО для продукции de novo сконструированных наивных Т-клеток с аллельным исключением, таким образом, является высокоэффективной альтернативной стратегией продукции неаллореактивных Т-клеток для адаптивной клеточной терапии.
[0413] Система АТО также предлагает техническую простоту, воспроизводимость и потенциальную масштабируемость. Применение
бессывороточной среды позволяет избежать видимой изменчивости,
наблюдаемой в монослойных системах с эмбриональной телячьей
сывороткой, а способность поддерживать АТО интактными в течение
всего периода культивирования (вплоть до 20 недель), осуществляя
только замену среды, позволяет избежать необходимый для
монослойных систем частый перенос клеток на свежие стромальные
клетки. Популяции Т-клеток с высокой чистотой легко собираются
из АТО путем механической диссоциации и могут быть дополнительно
очищены стандартными методами для удаления <0,5% загрязняющих
стромальных клеток. Применение готовых к использованию
компонентов и, особенно, отказ от первичных стромальных клеток
или запатентованных матриксов, а также способность сочетать
продукцию АТО с реагентами, не содержащими Хепо, и облучением
стромальных клеток, должны облегчать переход АТО на платформу
клинического применения для продукции Т-клеток для адаптивной
терапии. Простота системы, кроме того, позволяет непосредственно
использовать способ в лабораториях, интересующихся
моделированием развития Т-клеток человека и позитивной селекции. III. Способы
А. Выделение CD34+CD3- HSPC человека
[0414] Неонатальную пуповинную кровь получали из утилированного спинного мозга и плаценты из поставок UCLA. Костный мозг (ВМ) получали у здоровых взрослых доноров из материала аллогенных доноров ВМ в UCLA или приобретали у компании AllCells Inc. (Alameda, СА). G-CSF мобилизованной периферической крови получали при согласии здоровых взрослых доноров, подвергшихся аферезу для аллогенной трансплантации стволовых клеток в UCLA. Немобилизованную периферическую кровь получали у здоровых взрослых доноров в лаборатории UCLA CFAR Virology Core. Все образцы тканей получали в соответствии с протоколами или исключениями, одобренными IRB UCLA. Все образцы обогащали мононуклеарными клетками путем центрифугирования с градиентом Ficoll-Paque (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) , а затем осуществляли позитивную селекцию CD34 + клеток с помощью магнитной сортировки клеток (MACS), используя набор CD34 MicroBead Kit UltraPure (Miltenyi, Auburn СА) .
Фракции, обогащенные CD34+ клетками, криоконсервировали после MACS, если не указано иное. Перед использованием клетки оттаивали, и остальные Т-клетки исключали FACS сортировкой CD34+ СБЗ-клеток, которые сразу же высевали в АТО или трансдуцировали, как описано ниже. В некоторых экспериментах HSC обогащали FACS по Lin-CD34+CD38- клеткам перед посевом в АТО. HSPC, используемые в экспериментах по трансдукции TCR, получали из HLA-A*02:01+ СВ. Высокоэффективное HLA-A2 типирование проводили в центре UCLA Immunogenetics Center, используя бусы с олигонуклеотидами, специфичными по последовательностям (SSO).
B. Выделение подмножеств клеток-предшественников костного мозга человека
[0415] CD34+ HSPC обогащали из свежих аспиратов ВМ, как указано выше, и немедленно отсортировали с помощью FACS популяции стволовых клеток/клеток-предшественников на основе позитивной экспрессии CD45 и при отсутствии экспрессии маркеров линии (CD3, CD14, CD19, CD56 и CD235a, "Lin-"), объединенных со следующими маркерами: общее число HSPC (CD34+), HSC (CD34+CD38-CD45RA) , LMPP (CD34 + CD38 + CD45RA+CD10-CD62L hi) , CD24- CLP (CD34+CD38+CD45RA+CD10+CD24-) и CD24+ CLP (CD34+CD38+CD45RA+CD10 CD24+) .
C. Выделение тимоцитов человека
[0416] Постнатальный тимус человека получали в соответствии с протоколами изъятия IRB в качестве утилизированного материала пациентов, перенесших операцию на сердце, в госпитале Children's Hospital Los Angeles (CHLA). Фрагменты тимуса мелко препарировали в RPMI и разрушали путем пипетирования с высвобождением тимоцитов в суспензию, затем пропускали через нейлоновый фильтр размером 7 0 мкм. Клетки анализировали свежими в тот же или на следующий день. В проточном цитометрическом анализе клеток-предшественников из тимуса и АТО использованы следующие поверхностные фенотипы: ранние предшественники тимуса (ЕТР; CD34+CD7-CDla-), CDla- про-Т (CD34+CD7+CDla-) и CDla+ про-Т (CD34+CD7+CDla+); или CD5- про-Т (про-Т1; CD34+CD7+CD5-) и CD5+ про-Т (про-Т2; CD34+CD7+CD5+). Т-клетки и клетки
предшественники из тимуса и АТО определяли как CD14-CD56- в сочетании со следующими фенотипами: общее число Т-клеточных линий (CD7+CD5+), двойные негативные (DN; CD4-CD8-), CD4 незрелые монопозитивные (CD4ISP; CD5+CD4+CD3), двойные позитивные (DP; CD4 + CD8+), CD8SP (CD3 + TCRa|3+CD8 + CD4-) , CD4SP
(CD3 + TCRa|3+CD8-CD4+) , незрелые наивные (CD4 5RA-CD4 5RO+, которые представляли собой CD8SP или CD4SP), зрелые наивные
(CD4 5RA+CD4 5RO-, которые представляли собой CD8SP или CD4SP). Фенотипы незрелых и зрелых клеток подтверждали совместным окрашиванием CDla, CD27, CD28 и CCR7.
D. Выделение первичных Т-клеток человека
[0417] Т-клетки тимуса выделяли из препаратов тимоцитов, как описано выше, и CD8+ Т-клетки периферической крови и пуповинной крови выделяли из мононуклеарных фракций клеток, как описано выше. Выделение CD8+ Т-клеток из всех источников осуществлялось с помощью обогащения магнитными бусами в отношении CD8SP Т-клеток, используя набор CD8+ T-cell Isolation
(Miltenyi). В некоторых экспериментах Т-клетки тимуса дополнительно очищали FACS для истощения CD4 ISP или клеток-предшественников DP и Т-клеток РВ для выделения наивных Т-клеток
(CD45RO-CCR7+).
E. Клеточные линии
[0418] Линию стромальных клеток MS-5 мыши получали в качестве подарка. Для получения MS5-hDLLl клетки MS-5 трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим DLL1 и GFP человека. 5% клеток с максимальной экспрессией GFP сортировали по FACS и пассировали в DMEM/10% FCS. Стабильную экспрессию подтверждали проточной цитометрией на экспрессию GFP через несколько недель культивирования и экспрессию Dili подтверждали qRT-ПЦР и секвенированием ДНК. Клетки MS5-hDLLl-A2.1 создавали путем трансдуцирования клеток MS5-hDLLl с помощью лентивирусного вектора с HLA-A*02:01 человека (подарок доктора David Baltimore, Caltech), а затем путем сортировки FACS трансдуцированных клеток с помощью антитела, распознающего HLA-A2 (ВВ7.2) человека (Biolegend, San Diego, СА) . Линия клеток 0P9-DL1
(экспрессирующая Dill мыши) была подарена доктором Juan Carlos Zuniga-Pflucker (университет в Торонто), и ее пассировали в МЕМа
(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)/20% FBS в колбах, покрытых желатином 0,1%. Линию клеток К5 62 получали из АТСС и поддерживали в RPMI/10% FCS. аАРС К562 получали путем ко-трансдукции клеток К5 62 лентивирусными векторами, кодирующими полноразмерный человеческий CD8 0 и одноцепочечные тримеры HLA-А*02: 01/B2M/NY-ESO-H57-165 или MART-l26-35 (SCT; передано в дар David Baltimore, Caltech. Клетки-мишени К562 создавали путем трансдукции только SCT. Клетки-мишени К562 in vivo создавали путем последовательной трансдукции лентивирусным вектором с люциферазой светлячка (передано в дар доктором Donald Kohn, UCLA), а затем SCT. Трансдуктанты К562 сортировали FACS перед использованием. Линия клеток множественной миеломы U2 6 6 была передана в дар доктором John Chute (UCLA), и ее поддерживали в RPMI/10% FCS.
F. Культуры искусственных органоидов тимуса (АТО) [0419] Клетки MS5-hDLLl (или MS-5 или OP9-DL1, как указано) собирали путем трипсинизации и ресуспендировали в культуральной среде АТО без содержания сыворотки ("RB27"), состоящей из RPMI 1640 (Corning, Manassas, VA), 4% добавки В27 (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY) , 30 мкМ гидрат сесквимагниевой соли 2-фосфата L-аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) , восстановленной в PBS, 1% пенициллин/стрептомицин (Bio-Products Gemini, West Sacramento, СА), 1% глутамакса
(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY), 5 нг/мл rhFLT3L и 5 нг/мл rhIL-7 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) . RB27 готовили еженедельно. 4% B2 7 без Хепо заменяли В2 7 в указанных экспериментах. В зависимости от эксперимента (1,5-б)х105 клеток MS5-hDLLl объединяли с Зх102-1х105 очищенными CD34+ СОЗ-клетками
(или другими популяциями HSPC, как указано) на АТО в 1,5 мл-овых пробирках Эппендорфа и центрифугировали при 300 д в течение 5 мин при температуре 4°С в центрифуге с бакет-ротором. Супернатанты осторожно удаляли, и осадок клеток кратковременно ресуспендировали на Вортексе. Для каждого АТО 0,4 мкм вставки
transwell Millicell (EMD Millipore, Billerica, MA; PICM0RG50) помещали в б-луночный планшет, содержащий 1 мл RB2 7 на лунку. Для размещения АТО вставки вынимали и ставили на край пластины для слива избыточной среды. Клеточную суспензию доводили до 5-8 мкл на АТО, всасывали с помощью наконечника 2 0 мкл-овой пипетки и высевали путем образования капли на конце наконечника пипетки, которую осторожно помещали на вставку. Клеточную вставку помещали обратно в лунку, содержащую 1 мл RB2 7. Среду полностью заменяли каждые 3-4 дня, аспирируя вокруг клеточной вставки, а затем заменяя 1 мл свежей RB27/ цитокины. АТО культивировали таким образом в течение 2 0 недель. В указанные моменты времени клетки АТО собирали, добавляя в каждую лунку буфер FACS (PBS/0,5% альбумин бычьей сыворотки/2 мМ EDTA) и быстро дезагрегируя АТО пипетированием 1 мл-овой пипеткой "Р1000", а затем пропуская через 7 0 мкм нейлоновый фильтр. В некоторых экспериментах суспензии единичных клеток MS5-hDLLl подвергались у-облучению в указанных дозах перед использованием в АТО. G. Сокультуры Т-клеточных монослоев
[0420] Монослойные культуры OP9-DL1 получали, как описано ранее. Вкратце, клетки OP9-DL1 высевали в 12-и луночные планшеты, покрытые 0,1% желатином, за 1-2 дня перед использованием для достижения 70-80% конфлюенции. Среду аспирировали из монослоев и 1х104-1, 5х104 очищенных CD34+ CD3-HSPC высевали на стромальные монослои в 2 мл среды, состоящей из МЕМа, 20% FBS, 30 мМ L-аскорбиновой кислоты, 5 нг/мл rhFLT3L и 5 нг/мл rhIL-7. В некоторых экспериментах MS-5 или MS5-hDLLl заменяли на OP9-DL1, a RB27 заменяли в качестве культуральной среды. Клетки переносили на новые монослои стромальных клеток каждые 4-5 дней путем сбора клеток, фильтрования через 7 0 мкм нейлоновый сетчатый фильтр и повторного засева в свежую среду. При достижении конфлюенции клетки разделяли на несколько лунок, содержащих свежие слои стромальных клеток. Культуры поддерживали вплоть до 10 недель.
II. Лентивирусные векторы и трансдукция
[0421] Полноразмерную кодирующую последовательность DLL1 человека клонировали с помощью ОТ-ПЦР из набора универсальных эталонных РНК человека (Agilent Technologies, Santa Clara, СА) в лентивирусный вектор третьего поколения pCCL-c-MNDU3-X-IRES-eGFP
(подарок от доктора Donald Kohn, UCLA). CD80 человека клонировали аналогичным образом в pCCL-c-MNDU3. Лентивирусный вектор третьего поколения, кодирующий оптимизированные по кодонам а и Р (Vbl3.1) цепи TCR, специфичного в отношении HLA-А*02: 01/NY-ESO-li57-i65 (получены из клона TCR 1G4), ранее был описан и передан в дар доктором Antoni Ribas (UCLA). Оптимизированный по кодонам HLA-A* 02: 01/MART-l26-35 специфический TCR (полученный из клона TCR F5) был передан в дар доктором Donald Kohn (UCLA). Кодирующие последовательности одноцепочечных тримеров HLA-A*02:01 и HLA-A* 02 : 01/B2M/NY-ESO-li57-i65 или HLA-А* 02 : 01/B2M/MART-12б-з5 были переданы в дар доктором David Baltimore (Caltech) , и их субклонировали в pCCL-c-MNDU3-X-IRES-mStrawberry. Упаковку и концентрацию лентивирусных частиц выполняли, как описано выше. Вкратце, клетки 2 93Т (АТСС) совместно трансфицировали лентивирусной векторной плазмидой, PCMV-AR8.9 и pCAGGS-VSVG, используя TransIT 293Т (Mirus Bio, Madison, WI) в течение 17 часов с последующей обработкой 20 мМ бутиратом натрия в течение 8 часов с последующим образованием клеточных супернатантов в бессывороточной UltraCulture в течение 4 8 часов. Супернатанты концентрировали с помощью тангенциальной фильтрации потока с использованием фильтров Amicon Ultra-15 100К
(EMD Millipore, Billerica, MA) при 4000xg в течение 40 минут при температуре 4°С и хранили в виде аликвот при -8 0°С. Для трансдукции HSPC 1х105-1х106 FACS, отсортированные CD34+ CD3-HSPC, высевали в б-луночные необработанные планшеты, покрытые 2 0 мкг/мл ретронектином (Clontech, Mountain View, СА) в 1 мл X-VIVO-15 (Lonza, Basel, Switzerland) , дополненном 50 нг/мл рекомбинантного SCF человека, FLT3L и ТРО и 10 нг/мл IL-3
(Peprotech, Rocky Hill, NJ) , в течение 12-18 часов, после чего добавляли концентрированный линтивирусный супернатант при множественности заражения (MOI), равной 100. Ложно
трансдуцированные клетки культивировали в идентичных условиях,
но без добавления вектора. Клетки собирали через 24 часа после
трансдукции, промывали и высевали в АТО. Для трансдукции Т-
клеток периферической крови CD8+ Т-клетки здоровых доноров
выделяли с помощью магнитной негативной селекции, используя
набор CD8+ Т cell Isolation (Miltenyi) и
активировали/увеличивали их количество в AIM V/5% человека АВ с помощью бус aHTH-CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific) и 20 нг/мл IL-2 в течение 4 дней перед трансдукцией, как описано ранее. Трансдуцированные Т-клетки затем делились в IL-2 (20 нг/мл) перед использованием.
I. Иммуногистохимия
[0422] Для получения изображений с окрашиванием гематоксилином и эозином (Н &Е) АТО погружали в Histogel
(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY) и фиксировали в течение ночи в 10% нейтрализованном буферном формалине
(ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY) . 5 мкм-овые срезы и окрашивание Н &Е выполняли с помощью UCLA Translational Pathology Core Laboratory (TPCL). Для иммунофлуоресцентной визуализации АТО выделяли путем разрезания культуральной вставки вокруг каждого АТО скальпелем с последующим погружением мембраны и АТО в Tissue-Tek OCT (VWR Radnor, РА) и замораживанием на сухом льду. 5% замороженных срезов фиксировали в 10%-ном нейтрализованном буфером формалине и окрашивали анти-СБЗ (клон UCHT1, Biolegend, San Diego, СА) при разведении 1:50 в течение ночи при 4°С с последующей инкубацией с антимышиным IgG, конъюгированным с AlexaFluor 594 (H+L) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) при комнатной температуре. Изображения с Н &Е и иммунофлуоресценцией получали на Zeiss Aziolmager М2 с AxioCam MRM и программным обеспечением AxioVision (Zeiss, Jena, Germany).
J. Анализы Т-клеточных цитокинов
[0423] Зрелые клетки CD8SP или CD4SP из АТО выделяли с помощью магнитной негативной селекции, используя наборы CD8+ или CD4+ Isolation (Miltenyi) и сортировали с помощью FACS для
дальнейшего разрушения клеток CD4 5RO+ (содержащие незрелые наивные Т-клетки и предшественники CD4ISP). Очищенные популяции Т-клеток высевали в 9б-луночные планшеты с U-образным дном в 2 00 мкл AIM V (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY) с 5% сывороткой AB человека (Bem-Products Gemini, West Sacramento, СА) . В каждую лунку добавляли РМА/иономицин/коктейль ингибиторов транспортных белков или коктейль ингибиторов транспортных белков в качестве контроля (eBioscience, San Diego, СА) и инкубировали в течение б ч. Клетки окрашивали по CD3, CD4 и CD8 (Biolegend, San Diego, СА) и красителем UV455 для определения жизнеспособности (eBioscience, San Diego, СА) перед фиксацией и пермеабилизацией набором для внутриклеточного окрашивания (eBioscience, San Diego, СА) и внутриклеточного окрашивания антителами против IFNy, TNF-a, IL-2, IL-4 или IL-17A (Biolegend, San Diego, CA).
К. Анализ активации и пролиферации Т-клеток
[0424] Для анализов пролиферации CFSE продуцируемые в АТО CD8SP или CD4SP Т-клетки выделяли помощью негативной селекции MACS, как указано выше (с последующей очисткой FACS CD4SP Т-клеток, как описано выше) и метили 5 мкМ CFSE (Biolegend, San Diego, СА) согласно протоколу производителя. Меченые клетки инкубировали с бусами анти-СОЗ/С028 (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY) в AIM V, дополненной 5%-ной сывороткой АВ и 20 нг/мл rhIL-2 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) и содержащей CD25 или 4-1BB (Biolegend, San Diego, СА) и анализировали проточной цитометрией на 5-й день. В некоторых экспериментах CFSE заменяли на CellTrace Violet (CTV, ThermoFisher) и метили по протоколу производителя. Для in vitro анализа клеточного деления, 5x103-1x104 продуцированные в АТО CD8SP или CD4SP Т-клетки выделяли, как указано выше, высевали в 9б-луночные планшеты с U-образным дном в 2 00 мкл и активировали/увеличивали в количестве с помощью бус анти-СОЗ/28 и либо 20 нг/мл IL-2, либо 5 нг/мл IL-7 и 5 нг/мл IL-15 (Peprotech) . Бусы удаляли на 4-й день, и свежую среду и цитокины добавляли каждые 2-3 дня, перенося в более крупные лунки, если необходимо. Клетки подсчитывали еженедельно
с помощью гемацитометра. В некоторых экспериментах клетки рестимулировали свежими бусами анти-СВЗ/СБ28 на 14-й день.
L. Анализ праймирования CTL искусственных АРС (аАРС) [0425] 1х105 всех продуцированных в АТО СВ8ЭР-Т-клеток выделяли из б-и недельных TCR-трансдуцированных АТО с помощью MACS, как указано выше, и сокультивировали с продуцированных в К5 62 аАРС, экспрессирующих CD8 0 и одноцепочечные тримеры HLA-А*02 : 01/B2M/NY -ES0-1157-1 65 или HLA-A* 02 : 01/B2M/MART-126-з5 или родительские клетки К562 в 9б-луночных планшетах с U-образным дном в 2 00 мкл AIM V/5% сыворотки АВ человека при соотношении Т-клетки:К5б2, равном 4:1. В лунки добавляли СО170а-АРС-антитело (Biolegend, San Diego, СА) при конечном разведении 1:50 вместе с коктейлем ингибиторов транспорта белков (eBioscience, San Diego, СА) на протяжении всего культивирования. Затем клетки окрашивали на поверхностные маркеры, фиксировали, пермеабилизировали и внутриклеточно окрашивали на цитокины, как описано выше.
М. Фенотипический анализ VP TCR
[0426] Общее число клеток с 7-й недели АТО или постнатальные тимусы окрашивали по CD3, CD4, CD8 и TCRy8 в сочетании с набором IOTest Beta Mark TCR V (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) . CD3 + TCRy8-CD8 + CD4-^eTKH селектировали для анализа V|3, и семейство VJ3 определяли по проценту FITC+, РЕ+ или FITC+PE+ клеток, представляющих 3 разных антитела VJ3 на пробирку. Для анализа VJ3 TCR-трансдуцированных АТО все клетки б-7-и недельных АТО дополнительно метили тетрамером HLA-A*02:01/NY-ESO-li57_i65f конъюгированным с АРС (MBL International, Woburn, MA) в течение 10 минут перед окрашиванием поверхностных антител, и клетки селектировали по CD3 + TCRy8-TeTpaMep+CD8 + CD4- для анализа
vp.
N. Секвенирование репертуара TCR
[0427] Общую РНК очищали от 40000-200000 CD8SP из АТО или тимуса или CD4 5RO- CCR7+ наивных CD8+ Т-клеток из РВ с помощью FACS, используя набор RNeasy Micro (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию и качество РНК
определяли с использованием чипа Agilent RNA 6000 Nano.
Библиотеку целевых кДНК, содержащую перегруппированные
вариабельные гены TCR, получали с помощью 5'-RACE с набором
SMARTer PCR cDNA Synthesis (Clontech) с последующими
модификациями. Первую цепь кДНК получали из 3,5-500 нг общей
РНК, используя протокол производителя, но заменяя поли-dT-
праймер (5'-T30VN-3') . Библиотеки двухцепочечных кДНК TCRa и TCR(3
получали независимо друг от друга с помощью полу"гнездовой" ПЦР,
используя набор для ПЦР Advantage 2 (Clontech). В первоначальной
амплификации кДНК TCRa использовали 0,5 мкл реакции первой цепи
(=2,5 мкл разведения 1:5 в ТЕ) со смесью универсальных прямых
праймеров Universal Primer Mix от производителя и пары обратных
праймеров, которые связывали TRAC (5'-
GCCACAGCACTGTTGCTCTTGAAGTCC-3' (SEQ ID N0:1)). Полу"гнездовую"
амплификацию кДНК TCRa проводили с прямым праймером Primer НА
от производителя и обратными праймерами со штрих-кодами, которые
связывали ТРАС (5'-X5GGCAGGGTCAGGGTTCTGGAT-3' (SEQ ID NO: 2), где
X5 представляет собой 5-и нуклеотидных образец-специфичный
штрих-код, обеспечивающий объединение образцов перед глубоким
секвенированием) . Амплификация кДНК TCR(3 была сходна, но
первоначальную амплификацию проводили с использованием обратного
праймера, который связывал TRBC (5'-CCACCAGCTCAGCTCCACGTG-3 (SEQ
ID N0:3)), и полу"гнездовую" амплификацию проводили с помощью
праймеров со штрих-кодами, которые связывали TRBC (5'-
X5GGGAACACSTSTKTTCAGGTCCTC-3' (SEQ ID N0:4)). Препараты кДНК TCRa
и TCR(3 очищали с помощью набора DNA Clean и Concentrator-5 (Zymo
Research) . Препараты кДНК TCRa и TCR(3 из десяти образцов
объединяли перед лигированием адаптеров Illumina и 2x150 п.о.
парно-концевого секвенирования на секвенаторе MiSeq (Illumina).
После демультиплексирования с использованием образец-
специфических штрих-кодов, считывания выравнивали с
пользовательской базой данных, содержащей все возможные
комбинации человеческих последовательностей TRAV, TRAJ, TRBV,
TRBD и TRBJ, загруженных из базы данных IMGT с использованием
BLAT. Лучшие совпадения BLAT идентифицировали с помощью утилиты pslCDnaFilter для пакета BLAT, используя опции "-maxAligns=l-ignoreIntrons", и частоту клонотипов рассчитывали, используя пользовательские скрипты Perl.
О. Анализы цитотоксичности1п vitro
[0428] CD8SP Т-клетки выделяли из АТО путем механического разрушения и магнитной негативной селекции, как описано выше. Т-клетки, активированные в 9б-луночном круглодонном планшете, помещали в AIM V/5% сыворотку АВ человека с бусами анти-СВЗ/СБ28 (ThermoFisher Scientific) и 20 нг/мл IL-2 на 36 часов. Для продолжительного деления клетки затем культивировали в IL-2 вплоть до 14 дней. Для анализов цитотоксичности 2-кратные серийные разведения Т-клеток высевали в 9б-луночные круглодонные планшеты, начиная с 1х105 клеток на лунку в AIM V/5% сыворотке АВ человека. Клетки-мишени К5 62, трансдуцированные одноцепочечными тримерами HLA-A* 02 : 01/NY-ESO-li57-i65 или HLA-A* 02 : 01/MART-126_35 или HLA-A*02:01+U2бб, которые эндогенно экспрессируют NY-ESO-1, высевали при 5x104 клеток на лунку. Апоптотическую клеточную гибель клеток-мишеней количественно оценивали окрашиванием аннексином V/DAPI в 9 часов. Процент антиген-специфичных Т-клеток определяли окрашиванием тетрамером и использовали для ретроспективного расчета соотношения эффектор:мишень (Е:Т) в каждой лунке. Т-клеточную специфичную гибель клеток рассчитывали путем вычитания процента клеток-мишеней аннексина V+ в лунках, не получавших Т-клеток, из лунок, которые получали Т-клетки.
[0429] Анализ опухолей in vivo
[0430] Все эксперименты на животных проводили в
соответствии с протоколом, одобренным Комитетом по исследованию
животных в UCLA. Мышам NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlWj1/SzJ (NSG) в
возрасте 4-6-и недель (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)
подкожно имплантировали 2xl05 клеток-мишеней K562,
трансдуцированных одноцепочечными тримерами HLA-A*02:01/NY-ESO-Ii57-i65 или MART-l26-35 и люциферазой светлячков (как описано выше) . Мышей визуализировали на опухолевую биолюминесценцию на 3-й день путем внутрибрюшинной инъекции люциферина.
Продуцированные в АТО CD8SP Т-клетки выделяли и активировали/увеличивали в количестве, как указано выше, в течение 14 дней. 5,7х106 (содержащие 4,5х106 антиген-специфичных Т-клеток, определяемые окрашиванием тетрамером в день инъекции) вводили путем инъекции через ретроорбитальную вену на третий день после имплантации опухоли. Также выполняли инъекцию PBS контрольным мышам. Опухолевую биолюминисценцию повторяли каждые 3-4 дня в течение по меньшей мере 21 дня, после чего мышей умерщвляли по критерию распространенности болезни. Р. Проточная цитометрия и антитела
[0431] Каждое окрашивание при проточной цитометрии проводили в PBS/0,5% BSA/2 мМ ЭДТА в течение 30 мин на льду. FcX (Biolegend, San Diego, СА) добавляли ко всем образцам за 5 мин до окрашивания антителами. Для окрашивания тетрамера РЕ или АРС-конъюгированные тетрамеры HLA-A* 02 : 01/NY-ESO-ii57_i65 или HLA-А*02: 01/MART-126-35 (MBL International, Woburn, MA) добавляли к клеткам при конечном разведении 1:50 при комнатной температуре в течение 10 минут перед добавлением антител в течение дополнительных 2 0 минут на льду. DAPI добавляли во все образцы перед анализом. Анализ проводили на LSRII Fortessa и FACS на аппарате ARIA или ARIA-Hinstrument (BD Biosciences, San Jose, СА) в центре UCLA Broad Stem Cell Research Center Flow Cytometry Core. Для всех анализов селектировали DAPI+ клетки, и отдельные клетки селектировали на основе FSC-H против FSC-W и SSC-H против SSC-W. Клоны антитела, использованные для поверхностного и внутриклеточного окрашивания, приобретали у компании Biolegend (San Diego, СА) : CDla (HI149) , CD3 (UCHT1), CD4 (RPA-T4), CD5 (UCHT2), CD8 (SKI), CD10 (6H6), CD14 (M5E2), CD19 (HIB19), CD24 (ML5) , CD25 (BC96) , CD27 (0323), CD28 (CD28.2), CD31 (WM59), CD34 (581), CD38 (HIT2), CD45 (HI30), CD45RA (HI100), CD45RO (UCHL1), CD56 (HCD56), CD107a (H4A3), CD127 (A019D5), CD235a (HI264), CCR7 (G043H7), HLA-A2 (BB7.2), интерферон у (4S.B3), IL-2 (MQ1-17H12), IL-4 (MP4-25D2), IL-17A (BL168), TCRa|3 (IP26), TCRy5 (Bl), TNFa (Mabll), V|3l3.1 (H131), коктейль линии человека
(CD3, CD14, CD19, CD20, CD56); и BD Biosciences (San Jose, CA): CD7 (M-T701) и CD62L (DREG-56).
Пример 4: Различные стромальные клетки могут использоваться в модельной системе АТО.
[0432] Для того, чтобы система АТО была более применимой, проверяли другие стромальные клеточные линии на предмет их способности заменять MS5-hDLLl, имеющие мышиное происхождение. Клетки HS27a представляют собой линию клеток костного мозга человека и являются лучшим кандидатом, поскольку они секретируют низкие уровни факторов роста. Клеточная линия HS27a, экспрессирующая лиганд Notch (hDLLl), была получена трансдуцированием клеток HS27a hDLLl. Клетки, экспрессирующие высокие уровни hDLLl, очищали FACS и увеличивали их количество. В отсутствие сигнального пути Notch клетки HS27a в системе АТО не смогли поддерживать дифференцировку Т-клеток (ФИГ. 2 8А-С). Было обнаружено, что HS27a, в дополнение к стромальным клеткам MS5, способны поддерживать дифференцировку Т-клеток в системе АТО в трех разных образцах пуповинной крови, ФИГ. 2 9А-С. Как показано на ФИГ. 30, большинство клеток в активной популяции клеток CD8+, наблюдаемых в АТО HS27a-DLLl, не являются обычными клетками CD8SP, так как не экспрессируют CD3 и TCRab. Использование маркеров созревания показывает, что стромальные клетки HS27a-hDLLl могут поддерживать дифференцировку зрелых Т-клеток с образованием клеток TCRab+CD3+ CD8SP и CD4SP из трех разных препаратов пуповинной крови (ФИГ. 31А-С). Однако эффективность ниже, чем в АТО MS5-hDLLl.
Пример 5: Различные источники стволовых клеток и клеток-предшественников могут быть дифференцированы в Т-клетки, используя систему АТО.
[0433] Система АТО, описанная в настоящем изобретении, является эффективной и активной моделью для создания функциональных наивных Т-клеток in vitro из гемопоэтических стволовых клеток человека (из разных источников). Эта система была адаптирована для создания зрелых функциональных наивных Т-клеток человека из эмбриональных стволовых клеток человека
(hESC). Авторы изобретения идентифицировали популяцию
эмбриональных мезодермальных клеток-предшественников (hEMP), которая соответствует самым ранним клеткам-предшественникам, коммитированным в направлении мезодермы, и которые могут привести к возникновению всех мезодермальных линий (гладкие мышцы, кардиомиоциты, линии гемапотоэтических клеток, линии мезенхимальных клеток). Эту популяцию hEMP определяют по потери экспрессии маркера Epcam (CD32 6) и усилению экспрессии CD5 6, и ее можно легко выделить с помощью FACS (см., например, Evseenko et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Aug 3; 107 (31): 13742-7) . Вкратце, hESC, культивированные на MEF (мышиные эмбриональные фибробласты), могут быть перенесены в матригель при 80-90% конфлюенции. После переноса (0-ой день) клетки культивировали в среде, содержащей актинин, ВМР4, VEGF, bFGF. Через 1-2 дня добавляли новую среду, содержащую ВМР4, VEGF и bFGF. На 3-4-й день клетки можно сортировать в зависимости от их потери ЕРСАМ и усиления экспрессии CD5 6. Система АТО, основанная на ES, была создана путем выделения популяции hEMP и агрегирования ее со стромальными клетками MS5-hDLLl. Эти протоколы требуют двухнедельной гемопоэтической индукции, питая АТО средой EGM2 и гематопоэтическими цитокинами (SB и SFT3) перед индукцией дифференциации Т-клеток, используя среду RPMI-B27 (с добавлением SCF/IL7/Flt3L). Было обнаружено, что 3D агрегация на стадии hEMP поддерживает продукцию Т-клеток. Получение АТО из выделенных CD34+, дифференцированных из hEMP на клетках ОР9 (без АТО), не поддерживала дифференцировку Т-клеток (данные не показаны). На ФИГ. 32 показаны популяции Т-клеток, полученные из АТО с hESC в качестве выбранной популяции стволовых клеток. На ФИГ. 33 показана кинетика дифференциации Т-клеток в системе АТО из hESC и продукции клеток CD8ab SP. Как показано на ФИГ. 34-35, Т-клетки, образующиеся в системе АТО из hESC, экспрессируют маркеры фенотипа зрелых наивных клеток, аналогичные тому, которые наблюдаются при использовании пуповинных клеток крови. Как показано на ФИГ. 36, применение hESC воспроизводится в разных источниках стволовых клеток. На ФИГ. 3 6 показана дифференцировку Т-клеток из системы АТО (4-ая неделя) из трех различных линий hESC. Система АТО позволила продуцировать зрелые
Т-клетки из линии iPSC (ФИГ. 37). Кроме того, 3D агрегация
недифференцированных hESC (вместо выделенных hEMP), а затем
использование различной среды для дифференциации, как описано
выше, также позволяет продуцировать Т-клетки (ФИГ. 38) . Кроме
того, в системе АТО можно использовать несколько лигандов Notch.
Как показано на ФИГ. 39, система АТО также может поддерживать
созревание Т-клеток из hESC, если стромальная клеточная линия
экспрессирует hJAGl вместо hDLLl. Было также обнаружено, что Т-
клетки, продуцированные в системе АТО из hESC, показывали
разнообразный репертуар Vb TCR (ФИГ. 40) . Как показано на ФИГ.
41, полученные из hESC Т-клетки демонстрируют пролиферацию и
повышенную экспрессию CD25 в ответ на анти-СОЗ/С028 и IL2.
Выделенные клетки окрашивали CTV (Cell Tracker Violet) и
инкубировали с активационными бусами CD3/CD2 8 в течение 5 дней.
Клетки подвергали множественным клеточным делениям, как показано
с помощью разведения CTV и активацией, показанной с помощью
экспрессии CD2 5 (ФИГ. 41А) . В другом эксперименте выделенные
клетки обрабатывали РМА/Ionomycine в течение б часов, и
внутриклеточное окрашивание показывало продуцирование
цитотоксических цитокинов (IFNg, IL2, TNFa) в ответ на стимуляцию (ФИГ. 41В).
[0434] Затем была предпринята попытка определить, могут ли Т-клетки, которые были сконструированы для экспрессии экзогенного TCR, быть продуцированы из системы АТО с клетками hESC в качестве исходного вещества. HI hESC трансдуцировали вектором optlG4 (NY-ESO TCR), экспрессирующим GFP. Линию hESC HI NY-ESO TCR создавали путем выделения клеток GFP+ и их деления. Затем клетки подвергали тому же протоколу, который описан выше, для индукции дифференциации Т-клеток. Это показано на ФИГ. 42. Сконструированные Т-клетки, полученные в АТО из hESC, могут контролироваться экспрессией GFP и тетрамера. Эти клетки шли по классическому способу дифференциации Т-клеток (DP, CD3+/TCR+ CD8SP) (ФИГ. 43) . На пятой неделе сконструированные CD8SP Т-клетки, полученные из hESC, демонстрируют фенотип зрелых наивных клеток: CD45 RA+, CD27 + , CD62L+, CD31+ (ФИГ. 44А-В) . Сконструированные CD8 SP Т-клетки, полученные в АТО из hESC (5
ая неделя), были функционально протестированы in vitro. Выделенные клетки окрашивали CTV (Cell tracker Violet) и инкубировали с активирующими бусами CD3/CD2 8 или в присутствии
(аАРС), экспрессирующих CD8 0 и одноцепочечный тример когнатного HLA-A*02:01/пептид NY-ESO-1-МНС, или нерелевантный НАА-А* 02:01/MART-1 аАРС в течение 5 дней. Клетки подвергали множественным клеточным делениям, как показано с помощью разведения CTV и активацией, показанной с помощью экспрессии CD25 в ответ на активацию CD3/28 и аАРС, экспрессирующих когнатный пептид (ФИГ. 45) . В этом анализе клетки не выживали в присутствии аАР, экспрессирующего нерелевантный пептид. В другом эксперименте выделенные клетки обрабатывали РМА/иономицином в течение б часов. Внутриклеточное окрашивание показывало продукцию цитотоксических цитокинов (IFNg, IL2, TNFa) в ответ на стимуляцию (ФИГ. 4 6) . Клетки также подвергались дегрануляции, как показано с помощью экспрессии CD107a (ФИГ. 46) . В двух индивидуальных анализах выделенные клетки инкубировали в присутствии искусственных антиген-презентирующих клеток (аАРС), экспрессирующих CD8 0, и одноцепочечного тримера когнатного HLA-А*02:01/пептид NY-ESO-1-МНС или нерелевантного НАА-А*02:01/MART-1 аАРС в течение б часов. Анализ показывал продукцию цитотоксических цитокинов (IFNg, IL2, TNFa) и дегрануляцию
(CD107a) в ответ на аАРС, экспрессирующих когнатный пептид, а не нерелевантный пептид. Один из характерных экспериментов показан на ФИГ. 47. Затем выделенные клетки тестировали на их способность к пролиферации. Их активировали бусами CD3/CD2 8 в течение 4 дней и поддерживали в течение 2 недель в среде V AIM, дополненной 5% сывороткой человека и IL2 (20 нг/мл). Результаты показывают 20-кратное увеличение клеток на 2-ой недели (ФИГ. 48) .
Пример 6: добавление среды АТО
[0435] Компоненты добавки В2 7 тестировали для определения их относительного вклада в систему АТО. В приведенной ниже таблице представлены компоненты добавки В27:
Витамины
Биотин
DL альфа токоферолацетат
DL альфа токоферол
Витамин А (ацетат)
BSA, фракция V без жирных кислот
Каталаза
Белки
Рекомбинантный инсулин человека
Трансферрин человека
Супероксиддисмутаза
Кортикостерон
D-галактоза
Этаноламин НС1
Глутатион (восстановленный)
L-карнитин НС1
Другие компоненты
Линолевая кислота
Линоленовая кислота
Прогестерон
Путресцин 2НС1
Натрий селенит
ТЗ (трийод-Ъ-тиронин)
[0436] АТО пуповинной крови (начатые с CD34+CD3- HSPC) были созданы для определения того, какие компоненты добавки В2 7 являются существенными. Полная (стандартная) В27 ("полн. В27") сравнивалась с четырьмя добавками, которые идентичны, за исключением удаления одного компонента (все поставляются одним и тем же производителем) : без витамина А (В27-Вит А) , без антиоксидантов (В27-АО), без инсулина (В27-инсулин) и без ксенобиотических компонентов (В27 без Хепо). Данные показаны из двух независимых экспериментах, оба на б-ую неделю. Графики показывают общее количество клеток на входе (верхний) и % коммитированных Т-клеток (CD5+CD7+) (внизу). Как показано на ФИГ. 4 9-50, было определно, что инсулин необходим для Т-клеточного коммитирования в системе АТО, и что витамин А и антиоксиданты способствуют делению клеток. Кроме того, формула В27 без Хепо дает аналогичные результаты для дифференциации и деления Т-клеток в АТО по сравнению с добавкой, содержащей Хепо.
В заключение, инсулин необходим для продукции Т-клеток в АТО, свободный от ксенобиотиков представляет собой эквивалентен полному В2 7, а Вит А и антиоксиданты увеличивают выход клеток, но не являются существенными для дифференциации Т-клеток.
Пример 7: Продукция CAR-T-клеток из клеток гемопоэтических клеток/клеток-предшественников человека с использованием системы искусственных органоидов тимуса (АТО).
[0437] В этом исследовании авторы изобретатения попытались определить эффекты передачи сигналов CAR на нормальную дифференцировку Т-клеток в АТО, определить функцию in vitro и in vivo и противоопухолевую эффективность продуцированных в АТО CAR-T-клеток и определить способность CAR опосредовать аллельное исключение TCR. С этой целью CAR19-нацеленные CAR трансдуцировали в CD34+CD3- HSPC пуповинной крови. Затем эти клетки подвергали системе АТО в течение 4-6 недель.
[0438] Как показано на ФИГ. 52, экспрессия CAR в АТО в основном ограничена клетками Т-линии. Поскольку химерные рецепторы антигенов (CAR) не зависят от субъединиц CD3 или TCR для поверхностной экспрессии и сигнализации, то они могут быть экспрессированы в нескольких клеточных линиях. Линию CD34+CD3-СВ HSPC, трансдуцированную вектором, кодирующим CD19-специфический CAR 2-го поколения (CD28/CD33eTa) и eGFP, на выходе тестировали в стандартных культурах АТО (например, стромальные клетки MS5-hDLLl, среда RB27, дополненная 5 нг/мл FLT3L и 5 нг/мл IL-7) . Вкратце, 7500 трансдуцированных HSPC агрегировали в соотношении HSPC:стромальные клетки 1:20 и культивировали, как описано в течение 4 недель. Через 4 недели АТО разрушали, а общее число клеток человека анализировали на маркеры линий (показано в настоящем изобретении). Было очень мало моноцитов eGFP+ (CAR+) (CD14+), гранулоцитов (CD66b+), В-клеток (CD19+) или NK-клеток (CD56+). Большинство CAR+ клеток представляли собой CD5+ и CD7+, что соответствовало Т-клеточной линии. Следует отметить, что CAR+ клетки демонстрируют практически полное отсутствие экспрессии CD3, TCRab и TCRgd, что говорит о необычной дифференцировке Т-клеток.
[0439] Продуцированные в АТО CAR-T-клетки отображают необычную Т-клеточную дифференцировку. Клетки 4-й недели АТО, инициированные с использованием либо ложно-, либо CD19-специфических (CD28/CD33eTa) CAR-трансдуцированных СВ HSPC 2-го поколения, анализировали на маркеры Т-клеток. Клетки, трансдуцированные CAR (селекция по GFP+), были преимущественно коммитированы по Т-линии (CD5+CD7+), но не имели обычный паттерн Т-клеточной дифференциации DP в SP. Вместо этого большинство клеток были DN или CD8SP (средний ряд) . Кроме того, не было доказательств поверхностной экспрессии CD3/TCR в АТО CAR-T клетках. Это показано на ФИГ. 53. Несмотря на необычную Т-клеточную дифференцировку, полученные в АТО CAR-T-клетки (из CD19-специфичных CAR-трансдуцированных СВ HSPC 2-го поколения
(CD2 8/CD33eTa)) продемонстрировали фенотип нормальных наивных Т-клеток, характеризующийся как CD4 5RA+CD4 5RO- с ко-экспрессией CD27 и CCR7 (ФИГ. 54) . Эти клетки также соэкспрессировали CD62L
(не показано).
[0440] Полученные в АТО CAR-T-клетки экспрессируют CD2 внутриклеточный CD3. Как показано на ФИГ. 55, полученные в АТО CAR-T-клетки (из CD19-специфичных (CD28/CD33eTa) CAR-трансдуцированных HSPC 2-го поколения) совместно экспрессируют CD5, CD7, CD2 и внутриклеточный CD3, что подтверждает их идентичность в качестве клеток Т-клеточной линии.
[0441] Полученные в АТО CAR-T-клетки представляют собой либо DN, либо CD8aa+. CAR-T-клетки, полученные из АТО (из CD19-специфичного 2-го поколения (CD28/CD33eTa) CAR-трансдуцированных HSPC СВ) , не экспрессируют CD86eTa (ФИГ. 56А), в отличие от обычных Т-клеток либо из тимуса человека, либо из Т-клеток, полученных из АТО из TCR-трансдуцировонных HSPC. Они также экспрессируют маркеры, характерные для Т-клеток, включая CD5 6 и CD16 (ФИГ. 5 6В). В итоге, CAR-T-клетки, полученные из АТО, напоминают внутриэпителиальные лимфоциты человека (IEL).
[0442] Предполагается, что такая IEL-подобная
дифференцировка CAR-T-клеток в АТО обусловлена селекцией агонистов (то есть активной сигнализацией через CAR), которая
происходит либо посредством взаимодействия с когнатным антигеном в АТО, либо через тоническую передачу сигнала через CAR. Активная сигнализация во время ранней дифференциации Т-клеток
(например, на стадии DN) приводит к тому, что развивающаяся Т-клетка обходит обычную дифференцировку Т-клеток и входит в неклассическую дифференцировку в IEL-подобную линию (ФИГ. 57).
[0443] CAR-T-клетки, полученные из АТО, могут экспрессировать TCR, если он ко-трансдуцирован CAR. HSPC СВ, ко-трансдуцированные CAR (СП9-специфическое 2-е поколение
(CD28/CD33eTa) и/или TCR (оптимизированный по кодону 1G4 TCR) культивировали в АТО в течение 4 недель, что давало CAR+ клетки
(GFP+), которые соэкспрессируют CD3 и трансдуцированный TCR
(показан по окрашиванию тетрамера) (ФИГ. 58) . Это соответствует их идентичности как Т-клеток (поскольку субъединицы CD3 необходимы для экспрессии TCR). Следует отметить, что трансдукция TCR не влияет на необычную IEL-подобную дифференцировку CAR-T-клеток в АТО.
[0444] CAR-T-клетки, полученные из АТО, которые ко-экспрессируют трансдуцированный TCR, активируются антигенной сигнализацией CAR и TCR. Все GFP+ клетки, полученные АТО из HSPC СВ, ко-трансдуцированные CAR (СП9-специфическое 2-е поколение
(CD2 8/CD33eTa) или CAR и TCR (оптимизированный по кодону 1G4 TCR) выделяли из АТО в возрасте б недель и совместно инкубировали в течение б часов с неспецифическими клетками К5 62, клетками К562, трансдуцированными CD19 (мишени CAR), или одноцепочечным тримером HLA-A*02:01/B2M/NYESO1157-165 (мишени TCR) . Активацию Т-клеток анализировали путем внутриклеточного окрашивания на гамма-интерферон и поверхностного окрашивания на CD107a. Т-клетки котрансдуцированных CAR+ TCR АТО отвечали как на целые клетки CAR, так и на TCR-мишеневые клетки (ФИГ. 59).
[0445] CD19 CAR-T-клетки, полученные из АТО, функционируют
в ответ на клетки CD19+ без дополнительной
активации/костимуляции. Все GFP+ клетки, полученные из АТО HSPC СВ, трансдуцированные CAR (СП9-специфичное 2-ое поколение
(CD28/CD33eTa), выделяли из б-и недельных АТО и совместно инкубировали в течение б часов вместе с неспецифическими
клетками К5 62, клетками К5 62, трансдуцированными CD19 (CAR мишени), линиями клеток лейкоза CD19+ Nairn-б или линиями клеток лимфомы CD19+ Raji. Активацию Т-клеток анализировали путем внутриклеточного окрашивания на гамма-интерферон, TNFa и IL-2, и поверхностного окрашивания на CD107a. CAR-T-клетки, полученные из АТО, подвергали активации в ответ на мишеневые клетки без добавления экзогенных цитокинов (ФИГ. 60).
[0446] На ФИГ. 61 показано, что CD19 CAR-T-клетки, полученные из АТО, являются цитотоксичными. Все GFP+ клетки, полученные из АТО HSPC СВ, трансдуцированные CAR (CD19-специфичное 2-ое поколение (CD28/CD33eTa) , выделяли из б-и недельных АТО и совместно инкубировали в течение б часов вместе с неспецифическими клетками К562, линией клеток лейкоза CD19+ Nairn-б при различных соотношениях эффектор:мишень (Е:Т). Апоптоз линий опухолевых клеток измеряли окрашиванием аннексином V/DAPI.
[0447] Как показано на ФИГ. 62, IEL-подобная дифференцировка (т.е. выбор агонистов) в АТО наблюдалась с различными конструкциями CAR. HSPC СВ, трансдуцированные различными конструкциями CAR: CD19-специфическое 1-го поколения (СБЗзета), 2-е поколение (CD28/CD33eTa или 4-1ВВ/С03зета); или СБ2-специфическое 2-е поколение (CD28/CD33eTa) . Дифференцировку в АТО оценивали через б недель ("ворота" по трансдуцированным GFP+ клеткам). Сходная IEL-подобная дифференцировка Т-клеток наблюдалась со всеми конструкциями CAR.
Пример 8: CAR-T-клеточная дифференцировка из CAR-трансдуцированных ES-клеток в АТО.
[0448] CAR-T-клетки, полученные из АТО, из ES-клеток человека продуцируют цитокины в ответ на РМА/иономицин. Полученные из HI или Hl-CAR CD45+ клетки из 5-ти недельных АТО обрабатывали РМА/иономицином в течение б часов. Активация показана по внутриклеточному окрашиванию для интерферона гамма и IL-2 .
[0449] Т-клеточная дифференцировка из клеток HI или HI,
трансдуцированных CD19-специфическим 2ьт поколением
(CD2б/СБЗзета) CAR. Линию H1-CAR стабильно трансдуцировали лентивирусом, кодирующим CAR и eGFP. Клетки HI или H1-CAR
дифференцировали на стадии hEMP, как описано, и отсортированные hEMP агрегировали с клетками MS5-hDLLl и дифференцировали, как описано (вкратце, после ингибирования в среде EGM2+TGF6eTa в течение 1 недели добавляли SCF, FLT3L, ТРО и IL-3 в течение 1 недели, а затем среду меняли с RB27 на SCF, FLT3L и IL-3 для культур АТО в течение до б дополнительных недель. CD45+ клетки показаны выше с 1-4 недель после начала культивирования АТО. Т-клеточная дифференцировка показана путем соэкспрессии CD5 и CD7. Было обнаружено, что CAR-трансдуцированные клетки ES человека могут продуцировать CAR-T-клетки в АТО (ФИГ. 63).
[0450] HI или Hl-CAR-полученные CD45+ клетки с 1-4 недель после начала культивирования АТО показывают отсутствие нормальных маркеров созревания Т-клеток, аналогично полученным в АТО CAR-T-клеткам HSPC СВ. Т-клетки DP стадии отсутствовали, большинство клеток являются DN. CD4dim клетки в HI и H1-CAR АТО, вероятно, являются незрелыми монопозитивными предшественниками Т-клеток CD4 (ISP4) . Как показано на ФИГ. 64, полученные в АТО CAR-T-клетки из клеток ES человека демонстрируют необычную Т-клеточную дифференцировку. Как показано на ФИГ. 65, полученные в АТО CAR-T-клетки из клеток ES человека не экспрессируют CD8beTa. Полученные из HI или Hl-CAR CD45+ клетки с 1-4 недель после начала культивирования АТО показывают отсутствие CD86eTa, аналогично полученным в АТО CAR-T-клеткам HSPC СВ. Кроме того, было обнаружено, что полученные в АТО Т-клетки из клеток ES человека продуцируют цитокины в ответ на РМА/иономицин (ФИГ. 66А-В). Полученные из HI или Hl-CAR CD45+ клетки из 5-ти недельных АТО обрабатывали РМА/иономицином в течение б часов. Активация показана внутриклеточным окрашиванием интерферона гамма и TNF альфа (ФИГ. ббА) или интерферона гамма и IL-2 (ФИГ. ббВ) . Наконец, было обнаружено, что полученные в АТО CAR-T-клетки из клеток ES человека продуцируют цитокины и дегранулируют в ответ на клетки-мишени (ФИГ. 67) . Полученные из Hl-CAR все GFP+ клетки 4-й недели АТО были совместно культивированы с клетками CD19-K562, клетками К562, трансдуцированными CD19, или клеточными линиями CD19+ Nairn-б или RAJI в течение б часов. Активацию измеряли окрашиванием
поверхности на CD107a и внутриклеточным окрашиванием на интерферон-гамма. Для анализа были селектированы фенотипы зрелых (CD45RA+) CAR-T-клеток.
Пример 9: Преимущества системы АТО для Т-клеточной дифференциации.
A. Некоторые преимущества экспрессии TCR в HSPC/АТО по
сравнению с стандартным способом иммунотерапии
трансдуцированными Т-клетками периферической крови (РВ) с TCR
[0451] Т-клетки РВ имеют ранее существовавший разнообразный репертуар TCR, если они трансдуцированы так, что экспрессируют специфические противоопухолевые TCR. Таким образом, неправильное спаривание эндогенных цепей TCR с трансгенным TCR может происходить с аутологичными клетками; это может привести к уменьшению противоопухолевой специфичности или продукции новых аутореактивных неправильно парных TCR. В результате аллельного исключения эндогенной перегруппировки TCRB в продуцированных в АТО Т-клетках со сконструированными TCR риск неправильного спаривания трансдуцированных и эндогенных цепей TCR должен быть значительно уменьшен.
[0452] Как упоминалось выше, экспрессия TCR во время ранней дифференциации Т-клеток в АТО приводит к аллельному исключению эндогенного TCR(3 цепей (см. Seet et al.) . Это явление повышает терапевтическую возможность использования аллогенных HSPC для продукции Т-клеток, которые не будут реагировать против пациента. Напротив, аллогенные Т-клетки из РВ не могут быть терапевтически использованы, поскольку их разнообразный эндогенный репертуар TCR будет нести риск реакции трансплантат против хозяина (РТПХ). Аллельное исключение, индуцированное в системе АТО, могло бы таким образом обеспечить возможность разработки "готовых к применению" продуктов из аллогенных доноров для иммунотерапии
B. Некоторые преимущества экспрессии химерных рецепторов антигенов (CAR) в HSPC/АТО по сравнению со стандартным подходом трансдуцирующих Т-клеток с CAR РВ
B.
[0453] Обычный подход к CART клеточной терапии заключается
в экспрессии CAR в РВ. Клетки CART, полученные таким образом,
также экспрессируют разнообразные TCR из эндогенной экспрессии.
В противоположность CAR трансдукция HSPC продуцирует Т-клетки с
СБЗ-ТСК-фенотипом, сходным внутриэпитеальным лимфоцитам (IEL) .
Отсутствие экспрессии TCR должно предотвращать РТПХ у аллогенных
реципиентов, что представляет возможность получения
универсального продукта.
C. Преимущества АТО по сравнению с OP9-DL1 для создания Т-клеток со сконструированными TCR из HSPC
[0454] Группа Bart Vandekerckhove в Бельгии использовала 0P9-DL1 для продукции незрелых предшественников Т-клеток либо из TCR-трансдуцированных CD34+ про-Т-клеток тимуса, либо CD34+ мобилизованных HSPC периферической крови (МРВ) (Snauwaert, et. al, Leukemia r 2014) . В этой системе, однако, <1% клеток были зрелыми CD8+ Т-клетками на 14-й день (про-Т тимуса) или на 33-ий день (МРВ). Большинство TCR-трансдуцированных клеток были блокированы на стадии DP, что соответствует низкой способности 0P9-DL1 поддерживать созревание Т-клеток. Способы по настоящему изобретению дают более зрелые CD8+ Т-клетки.
D. Преимущества использования АТО по сравнению с OP9-DL1 для Т-клеточной дифференциации из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC)
[0455] 0P9-DL1 (или D114) ранее была единственной системой Т-клеточной дифференциации из hPSC (либо hESC, либо hiPSC). В случае 0P9-DL1 выход клеток из PSC очень низок, а Т-клеточная дифференцировка даже хуже, чем в HSPC СВ. Напротив, Т-клеточная дифференцировка из hPSC (как hESC, так и iPSC) является высокоэффективной в системе АТО. Зрелые наивные клетки CD8 и CD4 SP продуцировались еще быстрее из PSC, чем из HSPC СВ. Способность продуцировать зрелые Т-клетки из hPSC означает, что действительно "готовый к применению" продукт можно легко получить посредством редактирования гена hPSC для удаления или замены иммунореактивных генов. Единственный полученные из PSC Т-клеточный продукт может быть доступен нескольким потенциальным пациентам, что решает существующее ограничение по времени и
затратам при создании персонифицированных продуктов. Кроме того, можно было бы избежать проблемы сбора достаточного количества аутологичных Т-клеток у пациентов с лимфопенией после химиотерапии.
Е. Сравнение Т-клеточной дифферециации из пуповинной крови в системе АТО и OP9-DLL1
[0456] В предыдущих примерах приведено сравнение между системой АТО с использованием клеток CD34+ пуповинной крови и стромальных клеток MS5-hDLLl и существующим в настоящее время протоколом дифференциации Т-клеток человека in vitro: система 0P9-D111. Для приведения дополнительных доказательств превосходства системы АТО над 0P9-DLL1 были созданы АТО из 3-х различных доноров пуповинной крови (Е37, Е43, Е68) и их сравнивали на дифференцировку на строме 0P9-DLL1. На ФИГ. 68 показано поддержание предшественников CD34+ и Т-клеток в обеих системах на 4-й неделе (ФИГ. 68). Обе системы обеспечивают коммитирование клеток в клетки Т-клеточной линии, как показано по экспрессии CD5 и CD7. Тем не менее, система АТО значительно превосходит по продукции двойных позитивных клеток CD4CD8 (DP) (ФИГ. 69) . Уже на 4-й неделе система АТО позволяет получить активную популяцию клеток TCRab+CD3+, а некоторые из них уже являются CD8SP, тогда как 0P9-hDLLl горазде менее эффективена и количество жизнеспособных клеток, полученных из системы 0Р9-hDLLl не позволяет получить достаточное количество Т-клеток для терапевтической и коммерческой жизнеспособности (ФИГ. 70) . Числовое представление данных ФИГ. 7 0 показано на ФИГ. 71.
~к ~к ~к
[0457] Все способы, раскрытые и заявленные в настоящем изобретении, могут быть сделаны и выполнены без чрезмерного экспериментирования в свете настоящего описания. Хотя композиции и способы по настоящему изобретению были описаны с точки зрения предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области техники будет очевидно, что могут быть осуществлены варианты в способах и стадиях или в последовательности стадий описанного способа, не отступая от концепции, сущности и объема изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что некоторые
агенты, которые являются как химически, так и физиологически сходным, могут быть заменены агентами, описанными в настоящем изобретении, и при этом будут достигнуты одинаковые или сходные результаты. Считается, что все такие сходные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области, находятся в пределах сущности, объема и концепции изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения. ССЫЛКИ
Следующие ссылки, в той степени, в которой они предоставляют примеры деталей процедур или другие детали, дополняющие приведенные в настоящем изобретении, специально включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Aasen and Belmonte, Nat. Protoc, 5(2):371-382, 2010.
Abboud et al., Blood, 58:1148-1154, 1981.
Adams, J. Virol., 61(5) :1743-1746, 1987.
Aiyar et al., EMBO J., 17 (21):6394-6403, 1998.
Akkina et al., J. Virol., 70 (4):2581-2585, 1996.
Alexander et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:50925096, 1988 .
Altmann et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 (38) : 1418814193, 2006.
Amit et al., Dev. Bio., 227:271-278, 2000.
Anderson and Jenkinson, J Immunol. 2008 Dec 1; 181 (11) :74356.
Andrews et al. , In: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, Robertson (Ed.), IRL Press, 207-246,1987. Animal Cell Culture, Freshney (Ed.), 1987.
Aravind and Landsman, Nucleic Acids Res., 26(19) : 4413-4421,
1998 .
Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1994. Awong, et al, BMC Immunol. 2011 Mar 23;12:22. Baer et al., Biochemistry, 39:7041-7049, 2000. Baer et al., Nature, 310 (5974) :207-211, 1984. Bain et al., Biochem. J., 408 (3) :297-315, 2007. Bennett et al, J. Biol. Chem., 277:34, 2002.
Bertrand et al., J. Mol Biol., 333 (2):393-407, 2003. Bingham, Cell, 90 (3):385-387, 1997.
Biswas et al., Annals NY Acad. Sci., 590:582-583, 1990.
Biswas, et al., J. Clin. Microbiol., 29:2228-2233, 1991.
Bochkarev et al., Cell, 84 (5) :791-800, 1996.
Bode et al., Biol. Chem., 381:801-813, 2000.
Bode et al., Gene Ther. Mol. Biol., 6:33-46, 2001.
Bode et al., Science, 255 (5041) :195-197, 1992.
Bublitz, Mol. Cell Biochem., 108 (2) :141-4, 1991.
Byrne et al., Nature, 450 (7169) :497-502, 2007.
Carbonelli et al. , FEMS Microbiol. Lett., 177 (1):75-82,
1999.
Chadwick et al., Blood, 102 (3) :906-15, 2003.
Chandler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(8):3596601, 1997.
Chang, et al., Frontiers in Bioscience, 12:4393-4401, 2007. Chaudhuri et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(18):1008510089, 2001.
Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7 (8):2745-2752, 1987. Chen et al. , Cell, 133:1106-1117, 2008.
Chesne et al. , In: Liver Cells and Drugs, Guillouzo (Ed.), John Libbey Eurotext, London, 343-350, 1988
Chin et al., Molecular Brain Res., 137 (1-2) :193-201, 2005.
Chow et al. , Cytometry Commun. Clinical Cytometry, 46:7278, 2001.
Christ et al., Haematologica, 92(9):1165-72, 2007. Chung, et al, Stem Cells, 2014 Sept 32:2386-96 Clark et al, J Clin Invest. 2005 Nov; 115 (11) : 3239-4 9 . Epub 2005 Oct 13.
Cocea, Biotechniques, 23(5):814-816, 1997.
Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 1987 and 1995.
DaCosta et al., Molec. Pharmacol., 65 (3):744-752, 2004. Davies et al., Biochem J., 351:95-105, 2000.
de Gouville et al. , Drug News Perspective, 19(2) :85-90,
De Oliveira, et al, Hum Gene Ther. 2013 Oct;24(10):824-39. deFelipe, Prog. Brain Res., 136:215-38, 2002. Delaney et al., Nat. Med., 16 (2) :232-236, 2010. Dhar et al., Cell, 106 (3) :287-296, 2001. Doe et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 32:89-98, 2007. Doevendans et al., J. Mol. Cell Cardiol., 32:839, 2000. Downey et al., J. Biol. Chem., 271 (35) :21005- 21011, 1996. Eliasson and Jonsson, J. Cell Physiol., 222 (1):17-22, 2010. Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro, 1993. English et al., Trends in Pharmac. Sci., 23(l):40-45, 2002. Ercolani et al., J. Biol. Chem., 263:15335-15341,1988. Ermakova et al., J. Biol. Chem., 271 (51):33009-33017, 1996. Evans et. al. , Nature, 292:154, 1981.
Evans, et al., In: Cancer Principles and Practice of Oncology, Devita et al. (Eds.), Lippincot-Raven, NY, 1054-1087, 1997 .
Fauser et al., Stem Cells, 1:73-80, 1981
Fechheimer et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 84:84 63-84 67,
1987 .
Fernandes et al., Nature Cell Biology, 6:1082-1093, 2004. Fernandes, et al., J. Biotechnology, 132 (2):227-236, 2007. Fischer et al., J. Virol., 71:5148-5146, 1997. Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 6:334 8-3352,
1979.
Frame et al, Biochemical J., 359:1-16, 2001.
Frappier and O'Donnell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 (23) : 10875-10879, 1991.
Gahn and Schildkraut, Cell, 58 (3):527-535, 1989.
Gahn and Sugden, J. Virol., 69 (4):2633-2636, 1995.
Garrick et al., Nat. Genet., 18:56-59, 1998.
Gebhart and Wang, J. Cell Sci., 56233-244, 1982.
Gellibert, et al., J. Med. Chem., 49 (7) :2210-2221, 2006.
Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1993.
Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987.
Ghosh and Bachhawat, In: Liver Diseasesr Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands, Wu et al. (Eds.), Marcel Dekker, NY, 87-104, 1991.
Giannoni, et al, Mol Ther. 2013 May;21(5):1044-54.
Golde et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:593-596, 1980.
Gomez-Lechon et al., Anal. Biochem., 236:296, 1996.
Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985.
Gould et al, Intl. J. Neuropsychopharmacology, 7:387-390,
2004 .
Gould et al, Pharmacological Res., 48:49-53, 2003.
Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973.
Greber et al., Stem Cells, 25:455-464, 2007.
Gschweng et al, Cancer Res. 2014 Sep 15; 74 (18):5173-83.
Guide to Techniques in Mouse Development, 1993.
Harb et al., PLoS One, 3(8):e3001, 2008.
Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101 (3) :1094-1099,
1985.
Haugland, In: Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicalsr 1992-1994.
Hegde et al., Nature, 359(6395) :505-512, 1992.
Hess et al., Blood, 104 (6) :1648-55, 2004.
Hu and Yang, Cell Mol Immunol. 2012 May;9(3):232-6.
Hung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (4 ) : 18 65-187 0,
2001.
Igelmund et al., Pflugers Arch., 437:669, 1999. In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Guillouzo (Ed.), Academic Press, 411-431, 1997.
Inman et al., Molec. Pharmacol., 62(1):65-74, 2002. Ishizaki, et al., Mol. Pharmacol., 57:976-983, 2000. Itoh, et al, Exp Hematol. 1989 Feb;17(2):145-53. Jainchill et al. , J. Virol., 4:549, 1969.
Jenke et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101 (31), 1132211327, 2004.
Julien et al., Virology, 326(2) :317-328, . 2004.
Kadaja-Saarepuu et al. , Oncogene, 27 (12):1705-1715, 2008.
Kaeppler et al., Plant Cell Reports 9: 415 418, 1990.
Kaminska et al., Acta Biochimica Polonica, 52 (2) :329-337,
Kanda et al., Mol. Cell. Biol., 21 (10) :3576-3588, . 2001.
Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989.
Karin et al. Cell, 36:371-379,1989.
Kato et al, J. Biol. Chem., 266:3361 3364, 1991.
Keller et al., Curr. Opin. Cell Biol., 7(6):862-9, 1995.
Keller et al., Curr. Opin. Cell Biol., 7:862-869, 1995.
Kennedy and Sugden, Mol. Cell. Biol., 23 (19) :6901-6908,
2003 .
Kennedy et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:1426914274, 2003.
Kim et al., J. Biol. Chem., 275 (40) :31245-31254, 2000. Kim et al., J. Virol., 66:3879-3882, 1992. Kim et al., Virology, 239 (2) :340-351, 1997. Kim et al., Xenobiotica, 38 (3):325-339, 2008. Kirchmaier and Sugden, J. Virol., 69(2):1280-1283, 1995. Kirchmaier and Sugden, J. Virol., 72 (6) :4657-4666, 1998. Kirkeby et al., Biochem. Biophys. Meth., 24:225, 1992. Klein et al, Neoplasia, 8:1-8, 2006.
Kleinman et al., J. Biometer. Sci. Polymer Edn. , 5:1-11,
1993 .
Klimanskaya et al., Lancet., 365:P1636-1641, 2005. Kodama et al., J. Cell. Physiol., 112:89, 1982. La Motte-Mohs, et al, Blood. 2005 Feb 15; 105 (4) :1431-9. Langle-Rouault et al., J. Virol., 72 (7) :6181-6185, 1998. Lapenna, et al, PLoS One. 2013 Jul 23;8 (7) :e69572. Leight and Sugden, Mol. Cell Bio., 21:4149-61, 2001. Levenson et al., Hum. Gene Ther., 9(8):1233-1236, 1998. Levitskaya et al., Nature, 375 ( 6533) :685-688, 1995. Levitskaya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (23) :12616-12621, 1997.
Lindner and Sugden, Plasmid, 58:1-12, 2007.
Loh et al., Blood, 113 (22):5476-5479, 2009.
Ludwig et al., Nat. Biotechnol., 24 (2) :185-187, 2006b.
Ludwig et al., Nat. Methods, 3(8):637-46, 2006a.
Lusis, Blood, 57:13-21, 1981.
Macejak and Sarnow, Nature, 353:90-94, 1991.
Mackey and Sugden, Mol. Cell. Biol., 19 (5) :3349-3359, 1999.
Mackey et al., J. Virol., 69(10) :6199-6208, 1995.
Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988.
Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994.
Manzini et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 (47):1767217677, 2006.
Marechal et al., J. Virol., 73 (5) :4385-4392, 1999. Martin, et al. , Nature Immunology, 6:111-184, 2005. Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7634, 1981. Marvin et al., Genes Dev., 15:316, 2001.
Mattingly et al, J. Pharmacol. Experimen. Therap., 316:456465, 2006.
Meek et al, BMC Immunol. 2011 Feb 18;12:17. Middleton and Sugden, J. Virol., 66(1):489-495, 1992. Miyoshi et al, J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 9:227-237,
1998 .
Mohtashami et al, Int Immunol. 2013 Oct;25(10):601-11.
Nabel et al., Science, 244 (4910) : 1342-1344, 1989.
Nakajima et al. , Cancer Chemother. Pharmacol., 52:319-324,
2003 .
Nakano et al., Science, 272, 722, 1996. Nanbo and Sugden, EMBO J., 26:4252-62, 2007. Narazaki et al., Circulation, 118(5): 498-506, 2008. Ng et al., Development, 132 (5) : 873-84, 2005. Ng, Nuc. Acid Res., 17:601-615,1989. Nicola, et al., Blood, 54:614-627, 1979.
Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190,
1982 .
Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987. Niller et al., J. Biol. Chem., 270 (21) :12864-12868, 1995. Noble et al, Proc. Natl. Acad. Science, USA, 102:6990-6995,
Ockerman, Clin. Chim. Acta, 17:201, 1968. Ogawa et al., J. Cell Sci., 120:55-65, 2007. Okabe, J. Cell. Phys., 110:43-49, 1982.
Omirulleh et al., Plant Mol. Biol., 21(3):415-428, 1993. Palamaro et al, Int Immunol. 2013 Dec;25(12):703-14. Passonneau and Lauderdale, Anal. Biochem., 60:405-415,
1974
PCT Appln.
2005/123902
PCT Appln.
1998/30679
PCT Appln.
2001/088100
PCT Appln.
2001/51616
PCT Appln.
2002/076976
PCT Appln.
2003/004626
PCT Appln.
2003/050251
PCT Appln.
2003/059913
PCT Appln.
2003/062225
PCT Appln.
2003/062227
PCT Appln.
2003/062227
PCT Appln.
2004/039796
PCT Appln.
2005/080554
PCT Appln.
2005/123902
PCT Appln.
2007113505
PCT Appln.
2008/006583
PCT Appln.
2008/094597
PCT Appln.
2010/0003757
PCT Appln.
94/09699
PCT Appln.
95/06128
PCT Appln.
98/30679
PCT Appln.
99/20741
Pelletier
and
Sonenberg, Nature, 334
(6180):320-325, 1988.
Piechaczek
al., Nucleic Acids Res.
, 27(2):426-428, 1999.
Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199 (2) :169-177, 1985. Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7161-7165,
1984
Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy, 1998.
Quitsche et al., J. Biol. Chem., 264:9539-9545,1989. Rawlins et al., Cell, 42((3):859-868, 1985.
Reisman and Sugden, Mol. Cell. Biol., 6 (11):3838-3846,
1986.
Reisman et al., Mol. Cell. Biol., 5(8):1822-1832, 1985. Richards et al., Cell, 37:263-272, 1984.
Rinehart et al., J. Clinical Oncol., 22:4456-44 62, 2004. Ring et al., Diabetes, 52:588-595, 2003. Rippe, et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990. Ritzi et al., J. Cell Sci., 116(Pt 19):3971-3984, 2003. Rossi et al., Cell, 132:681-696, 2008.
Ryan et al., J. Gen. Virol., 78:( Pt 4):699-723, 1997.
Sambrook et al. , In: Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Sasaki et al., Pharmacol. Ther., 93:225-232, 2002.
Scalia et al., J. Cell. Biochem., 82:610, 2001.
Schaarschmidt et al., EMBO J., 23 (1) :191-201, . 2004 .
Schaffer et al.; Gene, 302 (1-2):73-81, 2003.
Schepers et al., EMBO J., 20 (16) :4588-4602, 2001.
Schmitt, et al, Nat Immunol. 2004 Apr;5(4) :410-7 .
Schneider et al., Genes Dev., 15:304, 2001.
Scymczak et al., Nat. Biotechnol., 22(5):589-94 2004.
Sears et al., J. Virol., 11(21):11767-11780, 2003.
Sears et al. , J. Virol., 78(21):11487-11505, 2004.
Sheehan and Hrapchak, In: Theory and Practise of Histotechnology, 2nd Ed., Battelle Memorial Institute, Columbus, OH, 1987.
Shiojiri, J. Embryol. Exp. Morph., 62:139, 1981. Shire et al. , J. Virol., 73(4 ):2587-2595, 1999. Smith, In: Origins and Properties of Mouse Embryonic Stem Cells, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 2000.
Snauwaert, et al, Leukemia. 2014 Apr;28(4):830-41.
Su et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 (23) :10870-19874,
Sugden and Warren, J. Virol., 63 (6) :2644-2649, 1989.
Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106 (37) :1572015725, 2009.
Sutherland et al., Exp. Hematol., 20:590, 1992. Suzuki et al., Cancer Res., 67 (5) :2351-2359, 2007. Suzuki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:1029410299., 2006.
Takahashi and Yamanaka, Cell., 12 б (4):663-67 б, 2006. Takahashi et al., Cell, 126(4):663-76, 2007. Takahashi et al. , Cell, 131:861-872, 2007.
Thompson, In: Selected Histochemical and Histopathological Methods, Tomas (Ed.), Sprungfleld, IL, 1966.
Thomson and Marshall, Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165,
1998 .
Thomson and Odorico, Trends Biotechnol., 18(2):53-57, 2000. Thomson et al. Proc. Natl. Acad. Scie. USA, 92:7844-7848,
1995.
Thomson et al., Science, 282:114, 1998.
Tojo, et al., Cancer Science, 96(11):791-800, 2005,
Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986.
Patent
683,202
Patent
684,611
Patent
714,680
Patent
952,500
Patent
302,523
Patent
322,783
Patent
384,253
Patent
464,765
Patent
478,838
Patent
538,877
Patent
538,880
Patent
550,318
Patent
563,055
Patent
563,055
Patent
580,859
Patent
589,466
Patent
591,616
S .
Patent
5,610,042
S .
Patent
5,656,610
S .
Patent
5,702,932
S .
Patent
5,728,581
S .
Patent
5,736,524
S .
Patent
5,780,448
S .
Patent
5,789,215
S .
Patent
5,843,780
S .
Patent
5,925,565
S .
Patent
5,928,906
S .
Patent
5,935,819
S .
Patent
5,945,100
S .
Patent
5,981,274
S .
Patent
5,994,624
S .
Patent
6,200,806
S .
Patent
6,602,711
S .
Patent
6, 833, 269
S .
Patent
7,029,913
S .
Publn.
2002/0076976
S .
Publn.
2002/0086005
S .
Publn.
2002/0168766
S .
Publn.
2003/0022367
S .
Publn.
2003/0059913
S .
Publn.
2003/0062225
S .
Publn.
2003/0062227
S .
Publn.
2003/0087919
S .
Publn.
2003/0125344
S .
Publn.
2003/0211603
S .
Publn.
2004/0002507
S .
Publn.
2004/0039796
S .
Publn.
20040002508
S .
Publn.
20040014755
S .
Publn.
2005/0192304
S .
Publn.
2005/0209261
S .
Publn.
2007/0116680
S .
Publn.
2007/0238170
S .
Publn.
2008/0038820
S .
Publn.
2008/0171385
S .
Publn.
2008/0226558
S .
Publn.
2008/0254003
S .
Publn.
20080004287
Publn.
20080038820
S .
Publn.
20080226558
S .
Publn.
20080254003
S .
Publn.
2009/0047739
Van Coppernolle, et al, J Immunol. 2009 Oct 15;183(8):485970.
van der Laarse et al., Biotech Histochem.. 67:303, 1992. Van Lent, et al, J Immunol. 2007 Oct 15;179(8):4959-68. Vatakis, et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Dec 20;108(51):E1408-16.
Vodyanik et al., Blood, 108(6):2095-105, 2006.
Wagman, Current Pharmaceutical Design, 10:1105-1137, 2004.
Wang et al. , Mol. Cell. Biol., 26(3) :1124-1134, 2006.
Wang et al., Nat. Biotechnol., 25(3):317-8, 2007.
Watabe and Miyazono, Cell Res., 19:103-115, 2009.
Watanabe et al., Nat. Neurosci., 8(3):288-96, 2005.
Wege, et al, Curr Top Microbiol Immunol. 2008;324:149-65.
Wilson et al., Science, 244:1344-134 6, 1989.
Wobus et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 27:752, 1995,
Wong et al., Gene, 10:87 94, 1980.
Wrzesinski et al. , Clinical Cancer Res., 13(18) :5262-5270,
2007 .
Wu and Wu, Biochemistry, 27: 887-892, 1988.
Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429 4432, 1987.
Wu et al., J. Virol., 76(5) :2480-2490, 2002.
Wysokenski and Yates, J. Virol., 63(6):2657-2666, 1989.
Xu et al., Cell Stem Cell, 3:196-206., 2008.
Xu et al., Nat. Biotechnol., 19:971-974, 2001.
Yasmineh et al., Clin. Biochem., 25:109, 1992.
Yates and Guan, J. Virol., 65(1):483-488, 1991.
Yates et al. , J. Virol., 74(10) :4512-4522, 2000.
Yates et al. , Nature, 313:812-815, 1985.
Yates et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3806-3810,
1984 .
Yates, Cancer Cells, (6)197-205, 1988.
Ye et al., Blood, 114(27):5473-5480, 2009.
Yin et al., Science, 301 (5638) :1371-1374, 2003.
Ying et al., Cell, 115:281-292, 2003.
Ying, Nature, 453:519-23, 2008.
Yoshida et al. , Cell Stem Cell, 5(3):237-41, 2009.
Yu and Thompson, Genes Dev. 22(15):1987-97, 2008.
Yu et al., Science, 318:1917-1920, 2007.
Yu et al., Sciefice, 324 (5928):797-801, 2009.
Zhang et al., Angew. Chem., Int. Ed., 48:2542-2545, 2009.
Zhang et al. , Bioorganic Med. Chem. Letters; 10:2825-2828,
2000 .
Zhang, et al. , Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. , 23(1) : 82-86, 2009.
Zhao, et al, Cancer Res. 2007 Mar 15; 67 (6) :2425-9. Zhou et al., EMBO J., 24(7 ) :1406-1417, 2005
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA
<120> СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ Т-КЛЕТОК ИЗ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ
СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Т-КЛЕТОК
<130> UCLA.P0014WO
<150> 62/248,931
<151> 2015-10-30
<150> 62/265,204
<151> 2015-12-09
<150> 62/359,456
<151> 2016-07-07
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер
<400> 1
gccacagcac tgttgctctt gaagtcc 27
<210> 2
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер
<220> <221> <222> <223>
misc_feature (1)..(5)
5 нуклеотидный штрихкод, специфический
для образца
<400> 2
nnnnnggcag ggtcagggtt ctggat
<210> 3
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер
<400> 3
ccaccagctc agctccacgt g
<210> <211> <212> <213>
28 ДНК
Искусственная последовательность
<220> <223>
Синтетический праймер
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> 5 нуклеотидный штрихкод, специфический для образца
<400> 4
nnnnngggaa cacsttkttc aggtcctc
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения композиции Т-клеток из стволовых клеток
или клеток-предшественников, включающий культивирование
трехмерного (3D) клеточного агрегата, содержащего:
a) выбранную популяцию стромальных клеток, которые экспрессируют лиганд Notch;
b) выбранную популяцию стволовых клеток или клеток-предшественников ;
где 3D клеточный агрегат культивируют в бессывороточной среде, содержащей инсулин, биотин, трасферрин и альбумин в течение времени, достаточного для in vitro дифференциации стволовых клеток или клеток-предшественников в Т-клетки.
2. Способ получения композиции Т-клеток из стволовых клеток
или клеток-предшественников, включающий культивирование
трехмерного (3D) клеточного агрегата, содержащего:
a) выбранную популяцию стромальных клеток, которые экспрессируют лиганд Notch;
b) выбранную популяцию стволовых клеток или клеток-предшественников ;
где 3D клеточный агрегат культивируют в бессывороточной среде, содержащей инсулин, в течение времени, достаточном для in vitro дифференциации стволовых клеток или клеток-предшественников в Т-клетки.
3. Способ по п.2, в котором лиганд Notch представляет собой экзогенный лиганд Notch.
4. Способ по п. 2 или 3, дополнительно включающий центрифугирование стволовых клеток или клеток-предшественников и стромальных клеток с образованием 3D клеточного агрегата.
5. Способ по любому из пп. 2-4, в котором среда дополнительно содержит добавленную извне аскорбиновую кислоту.
6. Способ по любому из пп. 2-5, в котором среда
дополнительно содержит добавленный извне лиганд FLT3L (FLT3L),
интерлейкин 7 (IL-7), фактор стволовых клеток (SCF),
тромбопоэтин (ТРО), фактор стволовых клеток (SCF) , тромбопоэтин
(ТРО) , IL-2, IL-4, IL-6, IL-15, IL-21, TNF-альфа, TGF-бета,
интерферон-гамма, интерферон-лямбда, TSLP, тимопентин,
4.
плеотрофин, мидкин или их комбинации.
7. Способ по любому из пп. 2-6, в котором среда
дополнительно содержит витамины.
8. Способ по п. 7, в котором витамины включают биотин, DL-альфа-токоферолацетат, DL-альфа-токоферол, витамин А, холин хлорид, кальция пантотенат, пантотеновую кислоту, никотинамид, фолиевую кислоту, пиридоксин, рибофлавин, тиамин, инозит, витамин В12 или их комбинации или их соли.
9. Способ по п. 8, в котором витамины включают биотин, DL-альфа-токоферолацетат, DL-альфа-токоферол, витамин А или их комбинации или их соли.
10. Способ по любому из пп. 2-9, в котором среда
дополнительно содержит белки.
11. Способ по п.10, в котором белки включают альбумин или альбумин бычьей сыворотки, фракцию BSA, каталазу, инсулин, трансферрин, супероксиддисмутазу или их комбинации.
12. Способ по любому из пп. 2-11, в котором среда дополнительно содержит кортикостерон, D-галактозу, этаноламин, глутатион, L-карнитин, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, прогестерон, путресцин, селенит натрия или трийодо-1-тиронин, или их комбинации.
13. Способ по любому из пп. 2-12, в котором среда содержит добавку В-27(r), добавку В-27(r) без Хепо, добавку GS21TM или их комбинации.
14. Способ по любому из пп. 2-13, в котором среда содержит или дополнительно содержит аминокислоты, моносахариды, неорганические ионы.
15. Способ по п.14, в котором аминокислоты включают
аргинин, цистин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, глутамин,
фенилаланин, треонин, триптофан, гистидин, тирозин или валин или
их комбинации.
16. Способ по п.14, в котором неорганические ионы включают
натрий, калий, кальций, магний, азот или фосфор или их
комбинации или соли.
17. Способ по любому из пп. 2-16, в котором среда
дополнительно содержит молибден, ванадий, железо, цинк, селен, медь или марганец или их комбинации.
18. Способ по любому из пп. 2-17, в котором 3D клеточный агрегат содержит определенный экзогенный экстрацеллюлярный матрикс.
19. Способ по любому из пп. 2-17, в котором 3D клеточный агрегат не содержит экзогенный матрикс или каркас.
20. Способ по любому из пп. 2-19, в котором стромальные клетки имеют экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую лиганд Notch.
21. Способ по любому из пп. 2-20, в котором лиганд Notch является интактным, частичным или модифицированным DLL4, DLL1, JAG1, JAG2 или их комбинацией.
22. Способ по любому из пп. 2-21, в котором стволовые клетки или клетки-предшественники выбраны из эмбриональных стволовых клеток (ESC), индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), человеческих эмбриональных мезодермальных клеток-предшественников, гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников, клеток, выделенных из костного мозга, клеток, выделенных из пуповинной крови, клеток, выделенных из периферической крови, клеток, выделенных из тимуса, или клеток, которые были дифференцированы из ESC или iPSC in vitro.
23. Способ по любому из пп. 2-22, в котором соотношение между стромальными клетками и стволовыми клетками или клетками-предшественниками составляет от 1:5 до 1:20.
24. Способ по любому из пп. 2-23, в котором стромальные клетки представляют собой линию стромальных клеток мыши, линию стромальных клеток человека, выбранную популяцию первичных стромальных клеток, выбранную популяцию стромальных клеток, дифференцированных из плюрипотентных стволовых клеток in vitro, или их комбинацию.
25. Способ по любому из пп. 2-23, в котором стромальные клетки представляют собой выбранную популяцию стромальных клеток, дифференцированных из гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников in vitro.
26. Способ по любому из пп. 2-25, в котором стромальные
клетки экспрессируют экзогенный главный комплекс
гистосовместимости человека (МНС).
27. Способ по любому из пп. 2-2 6, в котором стромальные
клетки экспрессируют экзогенную антиген-специфическую
костимулирующую молекулу или цитокин.
28. Способ по любому из пп. 2-27, в котором стромальные клетки экспрессируют экзогенный антиген.
29. Способ по любому из пп. 2-2 8, в котором стволовые клетки или клетки-предшественники предварительно были заморожены.
30. Способ по любому из пп. 2-28, в котором стволовые клетки или клетки-предшественники никогда не были заморожены.
31. Способ по любому из пп. 2-30, в котором стволовые клетки или клетки-предшественники экспрессируют экзогенный рецептор Т-клеток (TCR) или химерный антигенный рецептор (CAR), или оба эти рецептора.
32. Способ по любому из пп. 2-30, в котором стволовые клетки или клетки-предшественника экспрессируют эндогенный рецептор Т-клеток (TCR) или химерный антигенный рецептор (CAR), или оба эти рецептора.
33. Способ по любому из пп. 2-32, в котором стволовые клетки или клетки-предшественники экспрессируют TCR, связанные с экзогенной инвариантной естественной киллерной Т-клеткой (iNKT).
34. Способ по любому из пп. 23-3, в котором стволовые клетки или клетки-предшественники экспрессируют экзогенные антиген-специфичные TCR, маркер селекции или скрининга, маркер отслеживания in vivo или маркер для визуализации in vivo, или имеют экзогенную генетическую модификацию локуса HLA, рецептор естественных клеток киллеров или лиганд.
35. Способ по любому из пп. 23-4, в котором число ствловых клеток или клеток-предшественников составляет от 1000 до 200000.
36. Способ по любому из пп. 2-35, в котором
культивирование проводят в течение периода от двух до десяти
недель.
37. Способ по любому из пп. 2-36, в котором
культивирование не включает пассирование клеток.
36.
38. Способ по любому из пп. 2-37, дополнительно включающий детекцию числа CD4+CD8- Т клеток, CD4-CD8+ Т клеток, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD3+ TCRab+ клеток, CD3+ TCRgd+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- клеток, CD3 + TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-CD45RO- CD45RA+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+ клеток, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD34+CD5+CD7+ клеток, CD34+CD5+CD7- клеток, естественных киллерных Т-клеток, регуляторных Т-клеток, внутриэпителиальных лимфоцитов (IEL), антиген-специфичных Т-клеток, используя тетрамер или анти-TCR антител, CAR Т-клеток, используя модифицированные антигены, трансдуцированных Т-клеток, используя флуоресцентные маркеры, или их комбинации.
39. Способ по любому из пп. 2-3 8, дополнительно включающий селекцию CD4+CD8- Т клеток, CD4-CD8+ Т клеток, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD3+ TCRab+ клеток, CD3+ TCRgd+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-CD45RO- CD45RA+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO-CD45RA+ CD27+ клеток, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD34+CD5+CD7+ клеток, CD34+CD5+CD7- клеток, естественных киллерных Т-клеток, регуляторных Т-клеток, внутриэпителиальных лимфоцитов (IEL), антиген-специфичных Т-клеток, используя тетрамер или анти-TCR антител, CAR Т-клеток, используя модифицированные антигены, трансдуцированных Т-клеток, используя флуоресцентные маркеры, или их комбинации.
40. Способ по п.2 9, дополнительно включающий увеличение числа CD4+CD8- Т клеток, CD4-CD8+ Т клеток, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD3+ TCRab+ клеток, CD3+ TCRgd+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8-CD45RO- CD45RA+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ клеток, CD3+
36.
TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO-CD45RA+ CD27+ клеток, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD34+CD5+CD7+ клеток, CD34+CD5+CD7- клеток, естественных киллерных Т-клеток, регуляторных Т-клеток, внутриэпителиальных лимфоцитов (IEL), антиген-специфичных Т-клеток, используя тетрамер или анти-TCR антител, CAR Т-клеток, используя модифицированные антигены, трансдуцированных Т-клеток, используя флуоресцентные маркеры, или их комбинации.
41. Способ по любому из пп. 2-4 0, дополнительно включающий введение Т-клеток из 3D клеточного агрегата индивиду, который в этом нуждается.
42. Способ по любому из пп. 2-4 0, дополнительно включающий Т-клеточную дифференцировку из 3D клеточного агрегата.
43. Способ по любому из пп. 2-42, в котором Т-клетки из 3D клеточного агрегата не экспрессируют эндогенные TCR в результате аллельного исключения.
44. Способ по любому из пп. 2-43, в котором Т-клетки из 3D клеточного агрегата экспрессируют экзогенные TCR или CAR.
45. Способ по любому из пп. 2-44, в котором период времени составляет от 2 до 16 недель.
46. Способ по любому из пп. 2-45, в котором Т-клетки подвергаются позитивной селекции.
47. Способ по любому из пп. 2-4 6, в котором клеточный агрегат дополнительно содержит опухолевые клетки или опухолевый антиген.
48. Способ по любому из пп. 2-47, где способ дополнительно включает выделение эндогенно-экспрессируемых TCR из Т-клеток.
49. Способ по п.48, дополнительно включающий праймирование Т-клеток.
50. Способ по п.49, в котором Т-клетки праймированы
антиген-презентирующими клетками.
51. Способ по п.50, в котором антиген-презентирующие клетки презентируют опухолевые антигены.
52. Композиция клеточной культуры, содержащая:
а) трехмерный (3D) клеточный агрегат, содержащий:
i) выбранную популяцию стромальных клеток, которые экспрессируют лиганд Notch;
ii) выбранную популяцию стволовых клеток или клеток-предшественников; и
Ь) бессывороточную среду, содержащую инсулин.
53. Композиция по п.52, в которой лиганд Notch является
экзогенным лигандом Notch.
54. Композиция по п. 52 или 53, в которой среда дополнительно содержит добавленную извне аскорбиновую кислоту.
55. Композиция по любому из пп. 52-54, в которой среда дополнительно содержит добавленный извне лиганд FLT3L (FLT3L), интерлейкин 7 (IL-7), фактор стволовых клеток (SCF) , фактор стволовых клеток (SCF), тромбопоэтин (ТРО), IL-2, IL-4, IL-6, IL-15, IL-21, TNF-альфа, TGF-бета, интерферон-гамма, интерферон-лямбда, TSLP, тимопентин, плеотрофин, мидкин или их комбинацию.
56. Композиция по любому из пп. 52-55, в которой среда дополнительно содержит витамины.
57. Композиция по п.56, в которой витамины включают биотин, DL-альфа-токоферолацетат, DL-альфа-токоферол, витамин А, холин хлорид, кальция пантотенат, пантотеновую кислоту, никотинамид, фолиевую кислоту, пиридоксин, рибофлавин, тиамин, инозит, витамин В12 или их комбинации или их соли.
58. Композиция по п.56, в которой витамины включают биотин, DL-альфа-токоферолацетат, DL-альфа-токоферол, витамин А или их комбинации или их соли.
59. Композиция по любому из пп. 52-58, в которой среда дополнительно содержит белки.
60. Композиция по п.59, в которой белки включают альбумин или альбумин бычьей сыворотки, фракцию BSA, каталазу, инсулин, трансферрин, супероксиддисмутазу или их комбинации.
61. Композиция по любому из пп. 52-60, в котором среда дополнительно содержит кортикостерон, D-галактозу, этаноламин, глутатион, L-карнитин, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, прогестерон, путресцин, селенит натрия или трийодо-1-тиронин, или их комбинации.
62. Композиция по любому из пп. 52-61, в котором среда
содержит добавку В-27(r), добавку В-27(r) без Хепо, добавку GS21TM или их комбинации.
63. Композиция по любому из пп. 52-62, в которой среда содержит или дополнительно содержит аминокислоты, моносахариды, неорганические ионы или их комбинации.
64. Композиция по п.63, в которой аминокислоты включают аргинин, цистин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, глутамин, фенилаланин, треонин, триптофан, гистидин, тирозин или валин или их комбинации.
65. Композиция по п.63, в которой неорганические ионы включают натрий, калий, кальций, магний, азот или фосфор или их комбинации или соли.
66. Композиция по любому из пп. 52-65, в которой среда дополнительно содержит молибден, ванадий, железо, цинк, селен, медь или марганец или их комбинации.
67. Композиция по любому из пп. 52-66, в которой 3D
клеточный агрегат содержит определенный экзогенный
экстрацеллюлярный матрикс.
68. Композиция по любому из пп. 52-67, в которой 3D клеточный агрегат не содержит экзогенный матрикс или каркас.
69. Композиция по любому из пп. 52-68, в которой
стромальные клетки имеют экзогенную нуклеотидную
последовательность, кодирующую лиганд Notch.
70. Композиция по любому из пп. 52-69, в которой лиганд Notch является интактным, частичным или модифицированным DLL4, DLL1, JAG1, JAG2 или их комбинацией.
71. Композиция по любому из пп. 52-7 0, в которой стволовые
клетки или клетки-предшественники выбраны из ESC, iPSC,
человеческих эмбриональных мезодермальных клеток-
предшественников, гемопоэтических стволовых клеток или клеток-
предшественников, клеток, выделенных из костного мозга, клеток,
выделенных из пуповинной крови, клеток, выделенных из
периферической крови, клеток, выделенных из тимуса, или клеток,
которые были дифференцированы из ESC или iPSC in vitro.
72. Композиция по любому из пп. 52-71, в которой
соотношение между стромальными клетками и стволовыми клетками или клетками-предшественниками составляет от 1:5 до 1:20.
73. Композиция по любому из пп. 52-72, в которой стромальные клетки представляют собой линию стромальных клеток мыши, линию стромальных клеток человека, выбранную популяцию первичных стромальных клеток, выбранную популяцию стромальных клеток, дифференцированных из плюрипотентных стволовых клеток in vitro, или их комбинацию.
74. Композиция по любому из пп. 52-7 3, в котором стромальные клетки представляют собой выбранную популяцию стромальных клеток, дифференцированных из гемопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников in vitro.
75. Композиция по любому из пп. 52-7 4, в которой стволовые клетки или клетки-предшественники предварительно были заморожены.
76. Композиция по любому из пп. 52-7 4, в которой стволовые клетки или клетки-предшественники никогда не были заморожены.59. Композиция по любому из пп. 52-7 6, в которой стромальные клетки экспрессируют экзогенный главный комплекс гистосовместимости человека (МНС).
77. Композиция по любому из пп. 52-7 6, в которой
стромальные клетки экспрессируют экзогенную антиген-специфичную
костимулирующую молекулу, цитокин, антиген или белок
экстрацеллюлярного матрикса или любую другую биоактивную
молекулу или гены, которые модулируют дифференцировку,
пролиферацию или функцию Т-клеток.
78. Композиция по любому из пп. 52-7 7, в которой стволовые клетки или клетки-предшественники экспрессируют экзогенный рецептор Т-клеток (TCR) или химерный антигенный рецептор (CAR), или оба эти рецептора.
79. Композиция по любому из пп. 52-7 8, в которой стволовые клетки или клетки-предшественники экспрессируют TCR, связанные с экзогенной инвариантной естественной киллерной Т-клеткой (iNKT).
80. Композиция по любому из пп. 52-7 9, в которой стволовые клетки или клетки-предшественники экспрессируют экзогенный антиген-специфичный TCR или имеют экзогенную генетическую
75.
модификацию генов, которые модулируют дифференцицию, деление или функцию Т-клеток.
81. Композиция по любому из пп. 52-8 0, в которой число стволовых клеток или клеток-предшественников составляет от 1 до 200000.
82. Способ получения Т-клеток, включающий культивирование композиции клеточной культуры по любому из пп. 52-81, продуцируя, таким образом, Т-клетки.
83. Способ по п.82, дополнительно определенный как способ получения антиген-специфичных Т-клеток, в котором клетки-предшественники экспрессируют экзогенные антиген-специфичные TCR или CAR.
84. Способ по любому из пп. 82-83, дополнительно включающий детекцию числа CD4+CD8- Т клеток, CD4-CD8+ Т клеток, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD3+ TCRab+ клеток, CD3+ TCRgd+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- клеток, CD3 + TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-CD45RO- CD45RA+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+ клеток, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD34+CD5+CD7+ клеток, CD34+CD5+CD7- клеток, естественных киллерных Т-клеток, регуляторных Т-клеток, внутриэпителиальных лимфоцитов (IEL), антиген-специфичных Т-клеток, используя тетрамер или анти-TCR антител, CAR Т-клеток, используя модифицированные антигены, трансдуцированных Т-клеток, используя флуоресцентные маркеры, или их комбинации.
85. Способ по любому из пп. 82-84, дополнительно включающий увеличение числа CD4+CD8- Т клеток, CD4-CD8+ Т клеток, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD3+ TCRab+ клеток, CD3+ TCRgd+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO-CD45RA+ CCR7+ клеток, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ клеток, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+
81.
клеток, CD34+ CD7+ CDla+ клеток, CD34+CD5+CD7+ клеток, CD34+CD5+CD7- клеток, естественных киллерных Т-клеток, регуляторных Т-клеток, внутриэпителиальных лимфоцитов (IEL), антиген-специфичных Т-клеток, используя тетрамер или анти-TCR антител, CAR Т-клеток, используя модифицированные антигены, трансдуцированных Т-клеток, используя флуоресцентные маркеры, или их комбинации.
86. Выделенная Т-клетка или популяция Т-клеток, содержащая химерный антигенный рецептор (CAR), где Т-клетки имеют фенотип внутриэпителиального лимфоцита.
87. Т-клетки по п.87, где Т-клетки являются TCR-.
88. Т-клетки по п.86, где Т-клетки представляют собой CD4-CD8+, CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, CD4- CD8-, TCRab+, TCRgd+, CD5+CD7+, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-, CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa, или их комбинации.
89. Выделенные Т-клетки по п.88, где Т-клетки представляют собой CD5+CD7+CD3-CD4-CD8-.
90. Выделенные Т-клетки по п.89, где Т-клетки представляют собой CD5+CD7+CD3-CD4-CD8aa.
91. Выделенные Т-клетки по любому из пп. 86-90, в которых CAR содержит CD19 CAR.
92. Выделенные Т-клетки по любому из пп. 8 6-91, где Т-клетки дополнительно содержат экзогенные TCR.
93. Выделенные Т-клетки по п.92, где Т-клетки представляют собой CD3+.
94. Выделенные Т-клетки по любому из пп. 88-93, где Т-клетки представляют собой CD4+CD8- Т клетки, CD4-CD8+ Т клетки, CD34+ CD7+ CDla+ клетки, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+ клетки, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- клетки, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- клетки, CD3 + TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ клетки, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-CD45RO- CD45RA+ клетки, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ клетки, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CCR7+ клетки, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+ клетки, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CDla+ клетки, CD34+CD5+CD7+ клетки, CD34+CD5+CD7- клетки, ествественные киллерные Т-клетки, регуляторные Т-клетки, антиген-специфичные Т-клетки, внутриэпителиальные Т-лимфоциты или клетки, которые
86.
представляют собой CD45+, CDllb+, CDllb-, CD15+, CD15-, CD24+, CD24-, CD114+, CD114-, CD182+, CD182-, CD4+, CD4-, CD14+, CD14-, CDlla+, CDlla-, CD91+, CD91-, CD16+, CD16-, CD3+, CD3-, CD25+, CD25-, Foxp3+, Fox3p-, CD8+, CD8-, CD19+, CD19-, CD20+, CD20-, CD24+, CD24^, CD38+, CD38-, CD22+, CD22-, CD61+, CD61-, CD16+, CD16-, CD56+, CD56-, CD31+, CD31-, CD30+, CD30-, CD38+ или CD38-их комбинации.
95. Выделенные Т-клетки или популяция Т-клеток, где Т-
клетки экспрессируют эндогенные TCR или CAR и, где Т-клетки
представляют собой CD4+CD8- Т клетки, CD4-CD8+ Т клетки, CD34+
CD7+ CDla+ клетки, CD3+ TCRab+, CD3+ TCRgd+, CD3+ TCRab+ CD4+
CD8-, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4-, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO-
CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+, CD3+ TCRab+ CD4+
CD8- CD45RO- CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO-
CD45RA+ CCR7+, CD3+ TCRab+ CD4+ CD8- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD3+
TCRab+ CD8+ CD4- CD45RO- CD45RA+ CD27+, CD34+ CD7+ CDla+ клетки,
CD34+CD5+CD7+, CD34+CD5+CD7-, естественные киллерные Т-клетки,
регуляторные Т-клетки, антиген-специфичные Т-клетки,
внутриэпителиальные Т-лимфоциты, CD4 5+, CDllb+, CDllb-, CD15+,
CD15-, CD24+, CD24-, CD114+, CD114-, CD182+, CD182-, CD4+, CD4-,
CD14+, CD14-, CDlla+, CDlla-, CD91+, CD91-, CD16+, CD16-, CD3+,
CD3-, CD25+, CD25-, Foxp3+, Fox3p-, CD8+, CD8-, CD19+, CD19-,
CD20+, CD20-, CD24+, CD24^, CD38+, CD38-, CD22+, CD22-, CD61+,
CD61-, CD16+, CD16-, CD56+, CD56-, CD31+, CD31-, CD30+, CD30-,
CD38+ или CD38- клетки или клетки с их комбинацией.
96. Т-клетки по любому из пп. 86-96, где Т-клетки представляют собой популяцию Т-клеток и где популяция Т-клеток содержит по меньшей мере 50% клеток, которые являются зрелыми наивными монопозитивными CD8 или CD4 клетками.
97. Т-клетки по любому из пп. 8 6-96, которые экспрессируют TCR, связанные с экзогенной инвариантной естественной киллерной Т-клеткой (iNKT).
98. Т-клетки по любому из пп. 8 6-97, которые были
дифференцированы in vitro из стволовых клеток или клеток-
предшественников .
99. Т-клетки по п.98, где стволовые клетки или клетки-
предшественники выбраны из ESC, iPSC, человеческих эмбриональных
мезодермальных клеток-предшественников, гемопоэтических
стволовых клеток или клеток-предшественников, клеток, выделенных из костного мозга, клеток, выделенных из пуповинной крови, клеток, выделенных из периферической крови, клеток, выделенных из тимуса, или клеток, которые были дифференцированы из ESC или iPSC in vitro.
100. Т-клетки по любому из пп. 86-99, где эндогенный TCR супрессирован посредством аллельного исключения.
101. Способ лечения пациента, включающий введение пациенту дифференцированных in vitro Т-клеток или предшественников Т-клеток, содержащих экзогенный TCR.
102. Способ по п.101, в котором Т-клетка содержит
экзогенный TCR и дополнительный антиген- или лиганд-распознающий
рецептор.
103. Способ по п. 101 или 102, в котором экзогенный TCR содержит TCR из NKT.
104. Способ по любому из пп. 101-103, в котором экзогенный TCR содержит белки, экспрессированные из генов TCR-альфа и TCR-бета .
105. Способ по любому из пп. 101-103, в котором экзогенные TCR содержит белки, экспрессированные из генов TCR-гамма и TCR-дельта .
106. Способ по любому из пп. 101-103, в котором экзогенный TCR содержит белки, экспрессированные из генов TCR-альфа и TCR-бета, и рецептор распознавания антигена содержит белки, экспрессированные из генов TCR-гамма и TCR-дельта.
107. Способ по любому из пп. 101-103, в котором экзогенный TCR содержит белки, экспрессированные из генов TCR-гамма и TCR-дельта, и рецептор распознавания антигена содержит белки, экспрессированные из генов TCR-альфа и TCR-бета.
108. Способ по п.102, в котором дополнительный рецептор распознавания антигена не является молекулой TCR.
109. Способ по любому из пп. 101-108, в котором экзогенный TCR представляет собой сконструированную молекулу, которая имитирует сигнальный путь TCR.
103.
110. Способ по п.102 или 108, в котором дополнительный рецептор распознавания антигена представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
111. Способ по п.110, в котором CAR является антиген-специфичным опухолевым CAR.
112. Способ по любому из пп. 102-111, в котором экзогенный TCR специфичен в отношении первого антигена, а дополнительный антиген распознающий рецептор специфичен в отношении второго антигена.
113. Способ по п.122, в котором первый и второй антигены являются антигенами злокачественных клеток, экспрессируемыми злокачественными клетками пациента.
114. Способ по любому из пп. 101-113, в котором экзогенный TCR представляет собой вирус-специфичный TCR, ксено-специфичный TCR, TCR, специфичный для злокачественных клеток, бактерия-специфичный TCR или антиген-специфичный TCR для рака яичек.
115. Способ по любому из пп. 101-114, в котором Т-клетки являются аллогенными для реципиента.
116. Способ по любому из пп. 101-115, в котором пациент страдает злокачественным новообразованием.
117. Способ по п.116, в котором способ предназначен для лечения злокачественного новообразования у индивида.
118. Способ по п.116 или 117, в котором злокачественное новообразование выбрано из рака легких, рак предстательной железы, рака яичников, рака яичек, рака мозга, рака кожи, меланома, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака желудка, рака пищевода, рака трахеи, рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, рака печени, рака молочной железы, рака яичников, злокачественного новообразования в лимфатической системе, включая лимфому и множественную миелому, лейкоз, саркомы кости или мягких тканей, рака шейки матки и рака вульвы.
119. Способ по любому из пп. 101-118, дополнительно включающий введение антигена, где антиген распознается экзогенным TCR.
120. Способ по п.119, в котором антиген очищен, конъюгирован с другими молекулами или презентирован клеткой или
103.
подобным клетке носителем.
121. Способ по любому из пп. 101-120, в котором экзогенный TCR не является аллореактивным.
122. Способ по любому из пп. 101-121, в котором экзогенный TCR является инертным.
12 3. Способ по любому из пп. 101-122, в котором CAR является CAR, специфичным в отношении вирусного антигена, или CAR, специфичным в отношении бактериального антигена.
124. Способ по любому из пп. 101-115 или 119-123, в котором у пациент имеется микробная инфекция или он подвержен риску ее развития.
125. Способ по п.124, в котором первый и второй антигены представляют собой вирусные антигены, экспрессированные одним и тем же типом вируса, или клетками, инфицированными указанным типом вируса.
12 6. Способ по п.124, в котором первый и второй антигены являются антигенами бактериальных клеток, экспрессированными одной и той же бактерией или в клетках, инфицированных указанной бактерией.
127. Способ по любому из пп. 101-123, в котором экзогенный TCR представляет собой специфический TCR NY-ESO-1.
128. Способ по любому из пп. 101-127, в котором способ дополнительно включает введение антиген-презентирующей клетки пациенту.
12 9. Способ по п.12 8, в котором антиген-презентриующая клетка представляет собой дендритную клетку.
130. Способ по п.128, в котором антиген-презентрирующая клетка является искусственой антиген-презентриующей клеткой.
131. Способ по любому из пп. 128-130, в котором антиген-презентирующая клетка несет антиген, который распознается экзогенным TCR или CAR.
132. Способ по любому из пп. 101-131, в котором Т-клетка дополнительно содержит экспрессию FOXP3.
133. Способ по п.132, в котором Т-клетка является сконструированной или выбрана для экспрессии FOXP3.
134. Способ по п.133, в котором экспрессия FOX3 является
130.
конститутивной.
135. Способ по любому из пп. 132-134, в котором индивид страдает или имеет риск развития аутоиммунного заболевания, реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) или отторжения трансплантата.
136. Способ по п.135, в котором способ предназначен для лечения аутоиммунного заболевания, РТПХ или отторжения трансплантата.
137. In vitro дифференцировкадифференцированная Т-клетка или предшественник Т-клеток, содержащие экзогенные TCR.
138. Т-клетка по п.137, в которой TCR представляет собой вирус-специфический TCR, ксено-специфический TCR, TCR, специфичный для злокачественных клеток, бактерия-специфичный TCR или антиген-специфичный TCR для рака яичек.
139. Т-клетка по п.137 или 138, где Т-клетки дополнительно содержат дополнительный рецептор распознавания антигена.
140. Т-клетка по п.138 или 139, в которой экзогенный TCR содержит белки, экспрессированные из генов TCR-альфа и TCR-бета.
141. Т-клетка по п.138 или 139, в которой экзогенный TCR содержит белки, экспрессированные из генов TCR-гамма и TCR-дельта .
142. Т-клетка по п.139, в которой экзогенный TCR содержит
белки, экспрессированные из генов TCR-альфа и TCR-бета, и
рецептор распознавания антигена содержит белки,
экспрессированные из генов TCR-гамма и TCR-дельта.
143. Т-клетка по п.139, в которой экзогенный TCR содержит
белки, экспрессированные из генов TCR-гамма и TCR-дельта, и
рецептор распознавания антигена содержит белки,
экспрессированные из генов TCR-альфа и TCR-бета.
144. Т-клетка по п.139, в которой дополнительный рецептор распознавания антигена не является молекулой TCR.
145. Т-клетка по п.139 или 144, в которой дополнительный рецептор распознавания антигена представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
146. Т-клетка по п.145, в которой CAR является антиген-специфичным опухолевым CAR.
135.
111. Т-клетка по п.145, в которой CAR является CAR, специфичным для антигена вируса.
148. Т-клетка по любому из пп. 138-144, в которой экзогенный TCR специфичен в отношении первого антигена, а дополнительный антиген распознающий рецептор специфичен в отношении второго антигена.
14 9. Т-клетка по п.14 8, в которой первый и второй антигены являются антигенами злокачественных клеток, экспрессированными клетками злокачественного новообразования.
150. Т-клетка по п.148, в которой первый и второй антигены представляют собой вирусные антигены, экспрессированные вирусом или клетками, инфицированными указанным вирусом.
151. Т-клетка по п.148, в которой первый и второй антигены являются антигенами бактериальных клеток, экспрессированными клетками бактерии или клетками, инфицированными указанной бактерией.
152. Т-клетка по любому из пп. 137-149, в которой экзогенный TCR представляет собой специфичный TCR NY-ESO-1.
153. Т-клетка по любому из пп. 137-152, где Т-клетка дополнительно содержит экспрессию FOXP3.
154. Т-клетка по п.153, где Т-клетка является
сконструированной или выбрана для экспрессии FOXP3.
155. Т-клетка по п.154, в которой экспрессия FOX3 является конститутивной.
156. Способ доставки агента к Т-клеткам, экспрессирующим
экзогенные TCR, пациента с указанными Т-клетками,
экспрессирующими экзогенные TCR, включающий введение пациенту
агента, конъюгированного с антигеном, где антиген распознается
экзогенным TCR.
157. Способ по п.156, в котором экзогенный TCR является инертным.
158. Способ по п.156 или 157, в котором агент является агентом уничтожения.
159. Способ селекции и выделения in vitro Т-клеток по любому из пп. 137-155, включающий приведение композиции, содержащей Т-клетки, в контакт с агентом, который специфически
155.
связывается с экзогенным TCR с получением комплекса areHT-TCR-экспрессирующая клетка, и очистки комплекса areHT-TCR-экспрессирующая клетка из композиции.
160. Способ по п.159, в котором агент представляет собой антитело.
161. Способ по п.159, в котором агент представляет собой мультимер пептид-МНС.
162. Способ по любому из пп. 159-161, в котором агент прикреплен к твердой подложке.
163. Способ по любому из пп. 159-161, где способ
дополнительно включает введение вторичной молекулы, которая
специфически связывается с агентом.
164. Способ по п.163, в котором вторичная молекула присоединена к твердой подложке.
165. Способ по любому из пп. 162-164, в котором способ дополнительно включает отделение твердой подложки и связанных молекул от композиции.
166. Способ по п.165, в котором способ дополнительно включает промывку твердой подложки и связанных молекул один или несколько раз.
167. Способ по любому из пп. 159-165, в котором агент или вторичная молекула конъюгирована с флуоресцентной молекулой.
168. Способ по любому из пп. 159-167, в котором очистка комплекса areHT-TCR-экспрессирующая клетка, включает проточную цитометрию, сортировку клеток с активированной флуоресценцией (FACS), бусы и/или колонки.
169. Способ по любому из пп. 159-168, в котором очистка комплекса areHT-TCR-экспрессирующая клетка включает очистку на основе других маркеров Т-клеток.
170. Способ по п.169, в котором другие маркеры Т-клеток представляют собой один или несколько из CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CCR7/CD197, CD62L, CD27, CD28 и CDla.
171. Способ по любому из пп. 159-170, дополнительно включающий диссоциацию агента из комплекса areHT-TCR-экспрессирующая клетка.
172. Способ по любому из пп. 159-166, дополнительно
включающий культивирование очищенных клеток, экспрессирующих TCR.
173. Способ по любому из пп. 159-172, дополнительно включающий замораживание очищенных клеток, экспрессирующих TCR.
174. Способ получения Т-клетки по любому из пп. 137-155, включающий
a) перенос экзогенного TCR или производного TCR в стволовую
клетку или клетку-предшественник; и
b) дифференцировку стволовой клетки или клетки-
предшественника в Т-клетку или предшественник Т-клетки.
175. Способ по п.174, в котором стволовую клетку или клетку-предшественник приводили в контакт с когнатными молекулами МНС и/или пептида перед, одновременно и/или после контакта с дифференцирующим агентом.
17 6. Способ по п.174 или 175, в котором дифференцировка стволовой клетки или клетки-предшественника в Т-клетку включает со-культивирование стволовых клеток или клеток-предшественников со стромальными клетками, экспрессирующими лиганд Notch.
177. Способ по п.17 6, в котором стромальные клетки представляют собой клетки 0Р9, MS5 или HS27.
178. Способ по п.176 или 177, в котором лиганд Notch является Дельта-подобным 1 (Dili).
17 9. Способ по любому из пп. 17 6-17 8, дополнительно включающий приведение в контакт сокультурированных стволовых клеток или клеток-предшественников и стромальных клеток с лигандом Flt-З и/или IL-7.
180. Способ по п.174 или 175, в котором дифференцировка стволовой или иммунной клетки-предшественника в Т-клетку включает способ по любому из пп. 2-52.
181. Способ увеличения числа Т-клеток у индивида или лечения заболевания или состояния у индивида, включающий введение индивиду эффективного количества Т-клеток или антигенспецифических Т-клеток, полученных по любому из пп. 2-52, или Т-клетки по любому из пп. 137-155 или 86-100.
182. Способ по п.181, где индивид может быть определен, как страдающий или подверженный риску аутоиммунного заболевания,
180.
злокачественного новообразования, инфекции, иммунодефицита или их комбинации.
183. Способ по п.118 или 182, где Т-клетки являются регуляторными Т-клетками.
184. Способ по п.183, в котором индивид был определен как страдающий или подверженный риску аутоиммунного заболевания.
185. Способ получения Т-клеток, которые не взаимодействуют с аутоантигеном, включающий культивирование трехмерного (3D) клеточного агрегата с бессывороточной средой при концентрации, эффективной для получения Т-клеток из 3D клеточного агрегата, где 3D клеточный агрегат содержит: а) выбранную популяцию стромальных клеток, которые экспрессируют лиганд Notch, и Ь) выбранную популяцию стволовых клеток или клеток-предшественников, где одна или несколько клеток а) или Ь) экспрессируют экзогенный аутоантиген; таким образом, 3D клеточный агрегат продуцирует Т-клетки, которые не взаимодействуют с аутоантигеном.
186. Способ по п.185, в котором одна или несколько клеток а) или Ь) экспрессируют экзогенный ауто-МНС.
По доверенности
Неделя 6
Неделя 7
Ворота: CD14
> Тетрамер+CD3+
" CD8+
"> CD45RA+
00 л
U 1
r--
ос -(J л
CD3
CD4
H-^~r~T~T~p^f|-I-|~"1~|-Т~ГТТ|
CD45RA
CD27
т J
u -
CD3
CD4
CD45RA
CD27
ФИГ.2А-2В
CD34+CD3-
hspc Центрифугирование /
\ ^ /у'
~" - . ' '.1 II
Перенос на
i-fc"*r 0,4 мкм-овую
мембрану
Культивирование в течение 6-12 недель
В RB27 / IL-7 / FLT3L /
Аскорбиновая кислота
ФИГ.ЗА
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
Неделя 5 Неделя 6 Неделя 7
¦ ЕТР Ш CD 1а- Pro-T CD1a+ Pro-T
ФИГ.ЗС
150
f ? 100
S 100
о о
го о.
3" ю о
I- CD О
80 60 4020
Q ^кцри^
.л с?
(О 80 Ю О О
О 40 СО 8 Ю О О
^ 6 О
О 4
CD О 20
CD О
с5>
OMr.3D-3G
АТО, 12-ая неделя
ФИГ.4А
АТО. 12-ая неделя
CD4
Ь CD3+TCRop+
ФИГ.4В
9/133 АТО. 12-ая неделя
CD3+TCRap+CD8SP
-9.51
88.0
,4.25
70.1
СС 2
Ю j Q
9.G1
86.2
||||1Г
О *32
1.12
СИ •
a -о 7.33
1С ,'•
18.3
CD45RA -
CD3+TCRaf3+
.2.12
79.7
¦ -. -:У1> .
14.0
I if i I
,1.09
6.24
ОС ¦
о -о 45.2
47.4
¦ i 1 f 1
CD45RA
Тимус
S :
о :,
68.S
CD45RA
Q О 70.1
12.3
a о
15 6
'ЛЬ
0.30
CD45RA
11/133
С СВ HSC ВМ HSC МРВ HSC
ФИГ.5Е
ВМ Lin- CD34+ ВМ HSC
ВМ LMPP ВМ CD24- CLP
ВМ CD24+ CLP
0,15 j 0.035 ; 0,68 . 1.93 ; 0
. 23,5 - 74.9 . 57.SP ' ' 40.21 - 1.31 96.1 0.S8 ^96 7 . 72.4 2 ¦
ГЧГЧ < I if * E > ЯП * i 1 " I * 1 - ГШП Ft r 1 " I ¦ h т-"Ч "1 • 1 • 1 * ГЩ1 • I ' I l S
CD7
ФИГ.5Р
CD8+
CD4+
1,27
1.27
.# •. " *
¦ w
Интерферон у
ФИГ.6А-6В
С Без стимуляции
i 3,28
43,8
Q :
1 < ПЯ ¦ Г 1 I II
CFSE
CFSE
d Без стимуляции СВ
РМА/иономицин ВМ
со со
Интерферону >
ФИГ.6С-60
TCR-трансдуцированные
CD3+TCRap+
етраме
со.
О .
CD3
О. CD
S -СО
89,0
Vp13.1
00 Ji
Q I о m
^"^ "¦ HOT
CD4
11?
г I I ~% I 1
CD8SP
s.%
,4,!b
9bJ ¦ J 22
bS,; -8.68
3 18
0 24
8 :M1
1?,?
P4 3
CD45RA
Ложно-трансдуцированные
CD3+TCRap+
g *
О ¦
Q. CD
p..
CD 0.019
со '
0.14
O.ii
CD3SP
46.4
Ю *
о -,.
CD3
Q О
Vp13 1
CD4
.4-1.2
-f) 17
г го
.... .i
-6,8?
0.J4
В ;?i ",
-lb 1
го ,
О q2s
0Л5
64.J
CD45RA
ФИГ.7А
Общее число клеток С Общее число клеток
Соотношение клеток 1:20 1:20
0 5 10 15 20 25
Дней в культуре
ФИГ.7В-7Е
CO со Q О
CD =Г О Q.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
L. ^ _
98.4%
1 * I
•не трансдуцированные (n=5) "TCR-трансдуцированные (n=3)
"5 ,°5 ,> v
40 <5 Л
Тимоциты
He трансдуцированные TCR-трансдуцированные
,?813.1
VSO.6
-3.07
1.06
/'"
. •.: <*;
VS8
4.37
• ¦ ' "l"4 1
Vp-FITC
,?(ШД : 3.15
VS13.6 1.90
90.6'-;'¦:
VB8
4.40
I""!" 'ИВ' 4' •
,VB13 1
VS13.6
^98.5
0.16
?68
:138
0> Mr.7F-7G
Строма контроля
А*02:01+СТрОМа
A*02:01-HSPC А*02;01+HSPC А*02:01-HSPC А*02:01+ HSPC
¦ • • •
TCR
HLA-A*02:01
HSPC MS5-hDLL4
Строма контроля
А*02:01- HSPC А*02:01+ HSPC CD3+TCRa(3+
А*02:01+Строма
A*02:01-HSPC А*02:01+HSPC
аз .
р.!
\ #
аз ...
51 8
78 6
•ду--"-
V013.1
CD3+TCRoP+
Vp13.1
5 " ^Tks i
1 62
; 2 об
i ч t
CD4
CD4
ФИГ.8А-8В
Строма контроля
А*02:01 +СТрОМа
A*02:01-HSPC А*02:01+ HSPC
А*02:01- HSPC А*02:01+ HSPC
^ 2
76.3
76 &
ЗЬ. 3
14 8
• j^if^ i 14,5
р*у*----
i ~? _.> ( .
l" '
m > ¦ "
J f '¦'
Ю -
^ i
1 " MM '" "1 ' I Ч r
50, S
18 S
?0.6
.5S 1
18 9 -52 0
21.1
-24 1
63,4 .US
S5> S
8 ¦
0.56
CM j
U 6 06
1 45 '1.15
0.1?
g !
о /4'°
.64.0 j
Ш :
CD45RA
12.9
8 ?4
0 41
3.4? - &."
0.7Й .6S4
20 6 :14 4 ( 19.1
¦ t mm 11 ' ч ¦ i i " i
ffliP
20 1
О 1
< I i 1
12 8
8 '(tm)
t ¦ i' 11 ¦ if
CD45RA
2.66
S4 6
11 !
11 4
G.07
1 9 11
."If
45 4
f if 4 f
ФИГ.8С
a f ,.oj ¦
! -Ill
первонач. число HSPC (хЮ4) o.os 0.1 1 2 5 первонач. число MS5-hDLL4 (хЮ5) 6 6 6 6 6
СООТНОШеНИе HSPC/СТрОМа 1:1200 1:600 1:60 1:30 1.12
g 20
0 15
Q 10 О
1 5
I о
CD3+TCRa|+
0.05 0.1 1 2 5
6 6 6 6 6
1:1200 1:600 1:60 1.30 1:12
1 2 5 6 6 6 1:1200 1:600 1:60 1:30 1:12
1000
800
600
OCT
400
атн
200
1 25
CD3+TCRap+
CD8SP
N3 СО
первонач. число HSPC (хЮ4) §,es 01 1 2 5 первонач. число MS5-hDLL4 (хЮ5) s в в § в соотношение HSPC/строма 1:"0О 1*00 1бо ьт 1:12
0 05 0.1 1 2 5
6 6 6 6 6
1:1200 1:600 1:60 1:30 1:12
0.05 01 1 2 б 6 6 в 6 6 1:1200 1:600 1:60 1:30 1:12
Общее число клеток
CD3+TCRaB+
CD8SP
О I-03
о с; о
соотношение HSPC/строма A> V* ^ <*A> * ^
первонач. число HSPC (х103)" зо во 120 ?.i н з в 3757.5 " " первонач. число MS5-hDLL4(x105) в в в Б
8 О
о о
I-03
о о.
5040
зо-;
к- к ч
10-1 о ;
ч?ч*\^
15 30 ВО VJ0 7.S 15 3 6 3,75 7.1 16 30 в 6 6 в 3 3 3 3 1.6 1.6 1.6 1.6 . 15i
о о
о о
о а.
ь- 5
..ддПП.1Ш.
15 30 "0 120 7.Б 1S 3 6 6 8 6 6 3333
ч- ч- к-3.7S 7.5 15 30 1.6 1.6 1,6 1.S
сЗ о
соотношение HSPC/строма А* о" ^ А*о* * первонач. число HSPC (x103)is зо во 120 ?.§ is з s первонач. число MS5-hDLL4(x105) в е б е з з з з
3.75 7.S 1S 30 1.6 1.6 1.6 1.6
CD3+TCRap+
СЕ О
со о.
251
105 0
л? л6 ч* Ч' Ч ч- к
15 30 "О 120 7 5 16 3 6 6 6 S в 3333
3 76 * 5 15 30
1.5 1.6 1.6 *.в;
со со
Общее число клеток
CD14+
CD56+
II 40
х со 20
CD СЦ
о р Ю
V v
40 -, 30 20 ] 10
А В С D
А В С D
CD19+
CD34+
CD5+CD7+
CD4 ISP
Т *,ж w
А В С D
10 8 6
4 2 О
"* Л .V
А В С D
100-, 80 60 40 20 -I О
А В С D
40 30 20 10
** '* V ^
А В С D
CD8SP
CD4SP
ФИГ.10А-10Е
не облученные
25/133 20 Гр
40 Гр
80 Гр
1.32
1.85
1.64
1.49
О 1
0.074
О 100
0.21
0 45
'•*!"" '''1 " " 1 '*
(tm)(-' 'Ч
CD19
Q О
| 96 0
97.0
CD7
да Q
J '4.
CD4
CD3
g не облученные
20 Гр
40 Гр
80 Гр
14.4
00 ¦
о J
О .
0.19
О 14
0.20
0.17
О 14
0 25
0.17
0.29
CD4
OMMOF-MG
Монослой
ora+TCRfjp4
OP9-DL1 МЕМа/20% FCS
PJl"
Q I
0O 4
D -О '
CD19
CD3
CD4
OP3-DL1 RB27
Q О
CD19
CD3
CD4
MS5 RB27
Sir
о , о .
оэ .
1 о
го .
о о
СОЮ
CD5
CD4
CD3
CD4
MS5-hDLL4 RB27
(АТО)
еа.
CD19
CD5
CD4
CD3
CD4
CD3+TCRap+
OP9-DL1 MEMa/20% FCS
GDI 9
D J
О .
CD5
1 ЩЁ
со *
О • 'чб
О -
CD4
CD3
со •
CD4
0P9-DL1 RB27
§J31
CD19
о 1
о ,
CD5
CD4
Ш CD3
CD4
MSS RB27
О 1 ¦
CD19
CD5
CD4
еа -
!Г "
?0 ¦
Q "=*
С 04
MS5-hDLL4 RB27
(АТО)
,1 **
CD19
\ 1 93 ? ;
CD5
со ¦
CD4
ФИГ.11А
О МОНОСЛОЙ OP9-DL1 (МЕМа/20% FCS) ¦I АТО MS5-hDLL4 (RPMI-B27)
о I-
100
Q О
100-1
80-
? бон
о о.
40-
° 204
Q О
I- in CD
20-
0 1 ГЛ*~ п,"
<р # #
& с? *г
ФИГ.11В
? МОНОСЛОЙ OP9-DL1 (МЕМа/20% FCS) Ш АТО MS5-hDLL4 (RPMI-B27)
CD3+TCRaP+
CD3+TCRaP+CD8SP
CD3+TCRaP+
ATO неделя 6
ATO
неделя 8
ATO неделя 10
1.98
00 "
О - (tm) CD4
00 *
Q 2.0S
О _
CD4
0.79
6.29 I
О ' "" . . , .,." , ,
CD4
CD45RA
CD45RA
и. -
s ¦
о ," " ,,""L CD45RA
14.0
,26.2
14.6
-S0.8
8.40
,10.2
18.8
-•49.5 '
21.5
.3.66
19.4
-33 8
43 2
31.8
CD45RA
О О 3
О ' ,
CD45RA
о , ...I. ." .Л
CD45RA
см Q О
f4,
31.8 ! J20.9
173
... -з '. . •
29.1
N. '
a •
373 i ^ -J 32.7
,17.4
65,5 [ J 14.8
49.3
11.9
: I4- " ' OH 4
5.SI ; ^ J24 1
CO CO
ФИГ.12В-12С
АТО неделя 12 а
Тимус
CD3+TCRap+CDSSP
,2.39
97.3 О J0.89
73.3 .136
СО J
23.4 О _178
-J 0.060
2.11
9S S
'¦¦ "*(tm) " '
^^^^^^^^^^
40.58
0.15
i '*m"!
,58.1
... . .
ATO
неделя 12
-3 2i
79.1 jo.ll
i ;
0.4S
4 1.38
1 ]
97.9
: 20.2 О jo.se
98.9
8 l°;JL"
0.49
CD45RA
,0.20
17.7
jl.09
81,0 1
,1.19
64.3
..' %
iO.40
34.1
Тимус
LJ : 11.9
о -, (tm),
,584 - > &.
9.96
rli
1 :ШШ
.12 0
19.6
со .
CM J Q -0 23
.26.7
со 3
Q .40 5
U . ".,
18.9 -28.8
16.8 .2.82
12.8 ! О i70.9
CD45RA
МРВ
- 3-Ь7
.. 1.26
1.62
со ;
I 0,93
1 I I I 1
0.17
I 0,026
0.06S
CD19
ЕТР
CD1a- Pro-T - CD1a+Pro-T
27.0
17.9'
17.8
46.5
5 : о 9.66
58.4
1 * ¦ 1
6.12
•".6
г ¦ i ( it
20.6
!> !> .6
* ¦ i ¦ * 1 i|
5.04
f I i t il
CD7
Общее число клеток
CD3+TCRap+
CD3+TCRap+CD8SP
ФИГ.13А-13С
СВ HSC
ВМ HSC МРВ HSC
Общее число клеток (неделя 3)
0> Mr.13D-13F
О 100-ш
§ 80-
g 6000
| 40-I-
= 20-ш
2 о-
Ш ЮОп
*804
S 604
5 404
О 204
ш о о-
+ 804 СО
О 60Н
со.
200-
О 40-
ш о
ФИГ.14А
4х"6н
ЗхЮ
2хЮ6- #•
1хЮ6-
Общее число клеток
2x10
1x10
CD8SP
ФИГ.14В
-•- Пуповинная кровь
- Тимус
Спинной мозг
~JfL~ Мобилизованная
периферическая кровь
CD5+CD7+ * CD4ISP
Неделя с Неделя
Неделя
Неделя Неделя
Общее число клеток
CD8SP
Пуповинная кровь Тимус
Спинной мозг
Мобилизованная периферическая кровь
О I-
си т
тт%-\
со оэ
со со
ФИГ.15В
CD34+
Общее число клеток
CD8SP
2.5x104п
10 9 8
со со
со со
,кш- АТО Тимус РВ
ФИГ.16В
90656 считываний 151140 считываний 98081 считываний 1840 уникальных (2.02%) 2069 уникальных (1.36%) 2111 уникальных (2.15%) о
со со
ФИГ.16С
V(3
158539 считываний 265661 считываний 34848 считываний
1302 уникальных (0.82%) 1516 уникальных (0.57%) 1053 уникальных (3%)
Не стимулированные РМА/иономицин
В Не стимулированные Анти-СОЗ/28 +IL-2
О 50-
<
? 40-
s зоН
аЗ 20-О
8 ю-
3- о-
"Т(tm)
Дни
(DMM6F
-1.64
--
95.5
-2.82
0.О63
¦ 1 >
0.53 j
СО . Ю 4 Q 98 5
0.38
I I и, • 1 1Г-т,
CD16
ФИГ.17А
<
6x10S
4x106
800-.
600-
g 400-cu
2x106-
-у
Ложные TCR ATO ATO
g 200-> <
m ,
Ложные TCR ATO ATO
ФИГ.17В
Q. CD
-8-
Q. CD
K562
J3.41
0.18
_ 93.5
топ-! ¦ I
2.91
'"4 "I 1
Jll.
MART1 aAPC NY-ESO-1 aAPC
23.0
- r.
25.4
1 r-i
CD107a
,0.66
'98.9'-
IL-2
0.24
0.20
15.4
4.03
1 "i 1 'i-'i • ¦", 'i
ФИГ.17С
MART1 aAPC NY-ESO-1 аАРС
см i
Q О J
93.2
3.02
т'1"""| "1-1-Г1 Г Т Т Г I" Г Г ТТ| I | 7 Г I f ! !Т"| t ft Г| Т 1 Г fr Т П|'
CFSE
ФИГ.170
200-1
IL-2
200п
IL-7/IL-15
о о
150
150-
g 100
100-
50-
о о
Г"
-г-
День
День
ФИГ.17Е
Q_ CO oo Q О
10^ 90 80 70
98.4%
не трансдуцированные (n=5) TCR-трансдуцированные (n=3)
CD О
со со
iIilL.u
<Ъ , "Ъ л Ч Щ А Л ч А <
<ь- <ь- ^
^ ^ 4 ^ ^ & 4"
K562-ESO
90 80 70 60 50 40 30 н 20 10
U266
со со
л* ч> ч* кО
ч* ч- ^
КЬ "> к. <о ", у ч- ч- к> ^
Соотношение Е:Т~-~
1:3 1:6
Соотношение Е:Т
50 1
1- о.
35 i
-е-
30 -
т о
20 -
оце
кле
15 -
1:2.3 1:4.6 1:9.2 Соотношение Е:Т
1:4 1:8 1:16 1:32 Соотношение Е:Т
ФИГ.18В-С
о о
Q_ СС
СС СО
О CD
CD X
8*109
Опухоль K562-ESO
*-PBS
АТО CD8SP Т-клетки ****
Q.i"io9-
гчГ о 4x109-
"> 2x109-
0 4 I *~\ I ¦ i-т-I-Т(tm)"1 ¦ i-г-н О 2 4 6 8 10 12 14 1S 18 20 22
Дней
,9_,
АТО CD8SP Т-клетки
4x10
¦ Опухоль K562-MART1
¦ Опухоль K562-ESO
g-3"109-
гчГ
" 2x109-
CD О
~с= 1хЮ9-1
О- г -1 | j -, -|-,-j 1 1 1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Дней
(DMM8D-F
Дней о 3 7 10 14
MS5-hDLL1 + HSPC
MS5 + HSPC
MS5-hDLL1
50 мкм
50 мкм
50 мкм
50 мкм
50 мкм
50 мкм
соотношение HSPC/строма
первонач. число MS5-hOLL1 (хЮ5) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
ФИГ.20А
CD34+
CD4 ISP
CD5+CD7+
о 10 со
5 8 X
-° к
соотношение HSPC/строма
о а.
# # ^ # #
первонач. число HSPC (х10^) JQ 15 7.5 3 1.5 о.75 0.3
первоначальное число 1 5 1g 1 5 15 1g 15 1д MS5-HDLL1 (хЮ5)
о сЗ
х л
о а.
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
^ # ,f / / /
30 15 7.5 3 1.5 0.75 0.3
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
* 100п
О 80-
ннни
! HSPC/строма ^ # # ч.#* к# ^
первонач. число HSPC (хЮ3) 30 1 5 7.5 3 1.5 0.75 0.3
первоначальное число 15 16 16 16 15 16 0
MS5-HDLL1 (х10э)
CD3+TCRap+
* ** # # ч** ^ #
30 15 7.5 3 1.8 0.75 0.3 30 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 S
aj 40
со.- 30-
О ю-
CD8SP
lllllll
v-° * * ./ N# N# 30 15 7.5 3 1.5 0.75 0.3
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
CD14*
CD56+
CD19+
CD34+
CD5+CD7+
О 40-
> <
^ эо-
20-
03 О
ABC
4030
2010
~АА
-I 1 1 1-
А В С D
10 8 6 4
-I 1 1 1-
А В С D
10 8
84 2 0
_n ! ! !-
А В С D
win
i i
А В С D~
СП hO
CO CO
CD4 ISP
CD3+TCRy5-
CD3+TCRap+
? 40
30-
о о
¦4 20-
10-
О О н
о а.
ABC
10080
60-
earn-
0J-i-i г
А В С D
30 20 10 0
А В С D
10080 60 4020 0
-i i 1 1-
А В С D
о н аз
CD8SP
CD4SP
Общее число клеток
С2.
15-
4x10е-
О О 10
о с; о
2x10е-
о о-
А В С
-! ! ! !-
А 8 С D
со со
0 10003
§ 80-> <
¦? 60-
1 40-
а> 20-
CD5+CD7+
В27 Без Хепо
о н а>
100-
g 80 О
^ во-
0 *°" н
5 20
1 в
827
1
Без Хепо
4030 20 10
еоз+текар-
В27 Без Хепо
СО.
(c) at
о 20
со О О
§. о
CD8SP
827 Без Хепо
Общее число клеток
3"106н
•- ш
1*106-
1Ё27 Без Хепо
fl> MT.21F
Не облученные 20 Гр
40 Гр
80 Гр
"300
Q О 1.32
CD19
CD7
J 476
CD3
(DMr.21G
CD34+
CD5+CD7+
о I-a>
CD4 ISP
5 5 "о
jj i s- I 8°- щ mm J_ и
со ИВ m 60- BH jj^H НЦ
<Я \5 ч.^
I 11 ¦ I I llll
<Я ч.^ 4.^
2Л-
CD О
1.00.5-
о o.o-
II..
<Я <^ <^
? DP
llll
<Я \5 ч.^
40-
CD8SP
llll
CO CO
Общее число клеток
CD45+ клетки
2.5*10*-i 2.0*104 _|_
1.6*1 он
::::и1мЖ|_
I Н
о о.
100-1 9998979695-
со со
CD8SP
Стромальные клетки
1.0п
2 о.вН
> < _Q CQ
0.60.40.2-
О. 0.0-
Монослой OP9-DL1 АТО
100-
80-
]Q 60-CQ
X 40-
§> . 20-
CD14+ CD56+ CD19+ CD34+CD5-CD7+
? 80-
ti 604
ю о о
¦ 40
О О н
§_ о-
CD4 ISP DP
20-1
ci 15-ю о о
¦ 10-
CD3+TCRap+
20-i
5.15-a a: о
^ ю
со О
О О.
О с
CD8SP
ФИГ.22
со со
сБ^ 2Н
CZ х
Q CD J- 1-
<С о
АТО ТимуС
ФИГ.23А
Общее число клеток АТО
HLA-DR+
HLA-DR+ CD14-CD66b-
АТО неделя 6
Тимус
Q j
CD14
CD14
CD19
ATO неделя 6
Тимус
CD303 CD141 CLEC9A
ВМ Lin- CD34+
ВМ LMPP ВМ CD24- CLP
ВМ CD24+ CLP
ВМ Lin- CD34+
ВМ LMPP
ВМ CD24- С LP ВМ CD24+ CLP ЕТР Я CD1a-Pro-T CD1a+ Pro-T
О 15
0.68
1.93
Q 215
О :
'74.9
1.31
0.58
7г.4
26.8
CD7
ФИГ.24А-В
о о
CD Q.
О О
.0 О
5.0 -4.0 3.0
2.0 1.0
0.0
RAG1
5.0 -
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
RAG 2
DP 8SP DP 8SP
DP 8SP DP 8SP
Тимус АТО
Тимус ATO
ФИГ.25А
i Тимоциты (n=4) ¦ ATO (n=5)
О CL
CD CO
CO CO
ФИГ.25С-0 С
0.052
0,033
'T-г-т-TiTwtp
IL-2
IL-4
IL-17a
СВ CD4SP He стимулированный
СВ CD4SP AHTH-CD3/28 +IL-2
ATO CD4SP AHTH-CD3/28 +IL-2
ю _
см Щ
¦Г1 "| г г ' | "'|
''"Ч г-пт(tm), г-гт|т(tm)1-
CTV
CD О
80-
60-
CD CD
-О I- О
о 40-
го о.
ФИГ.25Е
V317
?р16 0.041
0.10
V321.3
0.10
.V318
vps.i
,Vpl3.1
V &13.6
-0.048
0.048
• -98.6
0.22
VP20
Vb8
-99,9 ¦ '
0.048
г i -frr-i г т -fr-irr т
-1.17
,_rlF4 г-ттрт(tm) г~>
,Vpl3.2
Vp4
: 0.074
4 ' ~J||p'
V &7.2
-99.9
0,037
FITC
CD3+TCRap+
MART-1 тетрамер+
ГО Q. I- CD
< i
95.1
CD3 CD8SP
CD3
CD4
ос i
Ю 1
Q :
О 24.4
О О
,25.9
71.9
jl.lS
1.01 |
' Г-1-"ИГ 1 ' 1 1
CD45RA
CD45RA
ФИГ.26С
MART-1 aAPC
NY-ESO-1 aAPC
NY-ESO-1
TCR
MART-1 TCR
Q. CD
-8-
Q. CD
,0.50
0.068
- 97aW
. ¦ j*
2.00
,2.29
17.4
¦ 0
33.3
47.0
,3.54
8.12
1 а|ИЕ
Ч ШШтт
.64.8 -
23.5
,0.15
0.32
84.6 "¦
1 ТЧЧ 1 ' 11
14.9
CD107a
ФИГ.260
68/133
Строма контроля А*02:01+ Строма
CD14-CD56-
82.0
Vp13.1
CD3+TCRap+Vp 13.1 +Тетрамер-
20.9
да - L
О .
CD4
1.10
"4 • • 4""1
o.m
ФИГ.27А
69/133
Строма контроля А*02:01+Строма CD3+TCRap+vpi 3.1 +Тетрамер+С085Р
О -
а ]
О :.
77.2
11.6
85.7
,11.5
87.5
Г*.
Q I О ¦
1,29
'0.66
О О
^1.2
3.33
. .. -.I'-v.;.
-* . ¦ '
- -
^ ^^^^^ ¦ '¦}.".
¦79.5
.-pj
CD45RA
ФИГ.27В
CD 34+
Г 7?-. 83 ?
' ГТ"Ж"'"'Т
CD7
COS • pro? 0
T "1 111
CD5+ CD7+
С 07 . COS
CD7
CD4
ФИГ.28В
CD34+
CPU* CI> T 1
Ifl
' -CDIJ (j J CDS P"t.T
CD7
CD5+ CD7+
сот. ГР;
cos
"2 1 53
U -I "
COS
CD7
CD4
CD34+
CD19
35.2
CD7
COiJ • preT 0
4 CDla prst 3 63
¦ 1 ¦ -T ' 1 "I ' I
[IPs 79.8
Q 1 u
CD7
CDS' proT 0 56
CO CO
CD5+ CD7+
CD7
CD4
HS27a-hDLLl
~Т ^1ГГГ|ТГ ГЩ|1 llflirr|: Т Т Т ft Г Т I |ППЩ
CD19
u -
"i ргггдп r¦рттг1,гг1 1-г-тц"nmj p-п |uiq r
CD19
MS5-hDLLl
HS27a-hDLLl
CD7
CD34+
СГ34 •
, 4 fi;
CD:,T proT
CDS • pruT ill 3
*H 1
U -
CD7
7S,6
го :
Q -
U -
CD7
tOla pruT об.6 "1 ¦ ' ' I1 "I
CDl.t. prr.T
'С01л рюТ" 10 9
1.П
a* и
ПР5
102
CD7
CTPs
CD7
i ? I I fill
COS • pruT
л з;
CDS PraT 5 44,
CO CO
MS5-hDLLl
HS27a-hDLLl
LO -
u ^
CD7
CD7
CD4
CD34+
MS5-hDLLl
9 64
CDla - proT 12 7
in-
ETPs
8.32
S 1111111 НИ
CD19
CD7
CD7
HS27a-hDLLl
CDI9 •
0 96
TO :
ETP 33 3
CDl*- pfOT
6 0S
"CDIJ proT" 46-7
mi Q1 u-
ETPs
CDS 4 proT
31 3
COS ProT
19.S
CD19
CD7
CD7
- 33 2
|iri > 1" 1Ц(v 1 (I' ri,l ' 1 "fffff i i ч I'"*"§ i
CD8+
CPJ, TCRao 17 б
.Q -
1"""Ж'Т'"|
CD3
CD- "CRJb 0 23
CO CO
-pirn
MS5-hDLLl
HS27a-hDLLl
MS5-hDLLl
HS27a-hDLLl
MS5-hDLLl
HS27a-hDLLl
CD3+ TCRab+ CD3+ TCRab+
CD3 CD4 CD3 CD4
ФИГ.31С
CD i Ю i
f 11Ц11 I Щ|11Ц <1Щ
CD14
¦ CDU CD56 776
CD14-CD56
CD4
CD45 RA >
CD45 RA >
7 недель
CD14-CD56-
CD3
TCRab+ CD3+
¦ 1,77
96.2
о 9
о 10
t ¦ ¦ i i • ¦ •!• i
CD8b
ФИГ.ЗЗВ
TCRab+ CD3+
CD8SP
1 J JJ
It:*
S8.S
CO4IR0 Об
G ' СИ
" "6 I
00 ГМ a
Q.1
oo oo
CO CO
CD45RA
ФИГ.34В
CD4SP
ОС LD
s " ' !
г г V. - в А
52Д
Q -
! i*
: й4
00 fsl О
' Qi 1W
Si •>
" t )"
' - -; •
: Q"
31J
-, , ,. , -
OO CO
CO CO
CD45RA
ФИГ.34С
1 0.43
Q6 093
1 2.SS
3S.3
1 9.06
42.0
11111 it
¦¦¦ :,¦ Q7 78.2
If* I 1 I 9 ГЧ1:
U - 63
IrHI""
Q3 42.0
f I I f t t If ITflj I
Q3o,
U -731
ЯР1 • 1 '
41.4
i i r fl]iir| i i i irirt|
CD45RA
CO CD
CO CO
0.20
QI 1 3.19
Q2 4.9?
rsl
S2M
If If Tf rrr <| I I If !ТГ1| 1
Frill Г ЩШЙ T 1 I ¦ Г111
15.9
75 9
! If I Г I ЩШЩ * t T f I (i If Г t IfHIIf tTI f Illlf
CD45RA
1 1.59
- 29.1
63 3
4 I Iff tfF|
Q4 20.3
QI 16 52
Q2 41.8
31.3
I I I 11 t f CD45RA
~ Q5
0.2 S
1 Q8
- 24.0
7S.8
IT f i г I ЩШЩ 1 r r |tin
t If Г
CO CO
CD45RA
ФИГ.35В
ФИГ.38А
CD45+CD56-
CD5+CD7+
CD3
CD4
CD14-CD56-
TCRab+CD3+
CD14 > CD3 > CD4 >
CD14- CD56-
CD14- CD56-
CD3+ TCRab+
соа
14 4
r> ..> i-..m-.> iniT-
CD3
СОЯ
. -I.
0 380"
S ,
CD4
1.71
CO CD
CO CO
О :
Q j
Незрелые 33.6
r--
4 3 17
Q7 ? 46
U U
г 718
11,3
i 25 3
ii.2
CD45RA
CD45RA
CD45RA
Тимус (n=3)
Н1 АТО (п=1)
CD8+
IL-2
No CD3/CD28
IL-2
CD3/CD28
CD4 > CTV > CTV
Не стимулированные
Q5 '¦ 0.14
Li. i
_ 99.9 ¦ "
IL2
hESC
Трансдукция (вектор opt1G4)
Оптимизированный по кодонам
Тип GFP+
NY-ESO TCR hESC
TCRu
TCR6
| VVPRE
T2A
Р2А
Ny-ESO TCR hESC клетки
NY-ESO TCR hEMP
Центрифугирование
EGIV12
EGM2 IL3, ТРО, Flt3L, SCF
Культивирование в течение 5-7 недель
RPMI/B27/AA SCF, IL-7, Flt3L
СО СО
ATO система
Клеточный осадок
2 недели:
перенос гемопоэтическая индукция на 0,4 мкм
мембрану
MS5-hDLL1 клетки
ФИГ.44А
TCRab+CD3+
CD8SP
CD4
TCRab+CD3+ Тетрамер-
CD8SP
H1 -
NY-ESO
TCR
oo J G О
r,",,
CD4
CD45RA
CD45RA
u 1
о и
"|4Stt| 1 f !|Н
CD3
CD4
CD8SP
CWjRO
3.6?
аз е
10.012
0.5 S
4 1
ч Q3
47 9
• ч,, ют т '1
1 '1
1 0.89
с"1 00 -
ГМ а 1 5,03
О 4
(J Jos
-0 77
57.8
Q7 16.4
СО СО
CD45RA
CD8SP
1046
т в.ы
10.68
1Л ГМ
О U
1о.зз
§0.6
4""f-т-т-iiKHf
CD45RA
K562-CD80- K562-CD80-
Без стимуляции IL2 IL2CD3/CD28 1073ESO 1161MART
Клеток обнаружено не было
Ч(tm)Г - • ¦ I • • " I
CTV
CTV
CTV
CTV
-> CTV
о ч
Клеток обнаружено не было
!"¦¦ I ' ' '""1 г-ттщтч
CTV
CTV
> CTV
-* CTV
+ CTV
Без
стимуляции
PMA/lo
i к 0,18
^9S =
CD107a
J2.6
:iltif
CD107a
K562-CD80-1161MART
K562-CD80-1073ESO
CD107a
NY-ESO H1 ATO
NY-ESO H1 ATO
2.5x105-|
S 2.0x10s-
g 1.5x10s-o
* 1.0x10s- ^ 5.0x104-O
0.0+ 0
6 8
Дни
10 12 14
25n
20-
|l5-
gio-
§_ 5
6 8
Дни
10 12 14
о go
со со
ФИГ.48
о н
109/133
Количество клеток на 6-ой неделе
CD5+ CD7+ клетки
150-
ФИГ.50
CD4+ CD8+ DP
CD3+ TCRab+
CD8+ SP
со со
0> 2.8 n
a> 2.0-c;
4 1.5-О 1.0-
0.5-
0.0
lgG4? CD4 T2A
шарнир тм I WPRE
CD19 scFv lgG4 спейсер CD28 | СРЗ"| eGFP
ФИГ.51 S
CD19R/CD28 Ложно-TD CAR
СВАТО 4 недели
1С At
Внутриклеточный CD3e
Тимус
TCR АТО
CD19R/CD28 CAR АТО
Ложно-TD АТО CD3+TCRab+ Т клетки
CD19R/CD28 CAR АТО
0.37
D . СО а
Q .
CD56
,97.7
О J0-44
f "¦ ш
CD16
Низкоаффинный сигнал \
sp i Позитивная селекция
4 4
Высокоаффинный сигнал и к , )
( CAR )
\ DN
\ Селекция по агонисту/ ¦ развитие IEL
Высокоаффинный сигнал (СВ8-независимый)
/ CAR ¦ Селекция по агонисту/ vDN/sp; развитие IEL
Без стимуляции
К562
K562-CD19
K562-A2.1/ESO
CAR
CAR+TCR
CD107a
О -0.72
J96.7
1.16
2.56
0.82
1.79
ФИГ 60 Без стимуляции
К562 K562-CD19
17.2 -070 97.7 -0.88
1,64 0,76
96.4
NALM-6
,0.20
1 91 0.42
I Ч I' 1 * # ¦ 4 t I
97.7
1.64
' I I
CD69
Без СТИМУЛЯЦИИ К562
KS82-CD1S
NALM-6
-0 025 6.26Е-3 -1.16
0.46 95.1
i -ii
CO CO
CD 107a
.0.63
2 199,4
f I НИ is 1
Э.40Е-3 ,1.01
0 ]98.6'
J Соотношение E:T
K562
80 -Аннексии V+DAPI+ 'Аннексии V+ DAPI-
70 60 50 40 30 20 10
ФИГ.61
GD13R
GD1SRI41ВВ
CD19R/CD28
GD2/CD28
о и i
;51
s, "г
ComD PerCP-Cv5-S-A . CD7
-.3 3 _3' .3* .3
Come-РегСР-Cv5-5-А . CD7 • i if
ComD РегСР CvS S A .. CD7
J • m "'¦¦¦¦i 1
Como-PerCP-CvS-S-A : CD7
Hl-CAR
<
<
CO CO
¦ i
47s, щш.-
м.., ,
¦ 1 II
.3 з :з
t".,..,m.,v,"t
.3 э :з
ComD РегСР- Cv5 -5 А : CD7
Come РегСР Cv5 -5 А :: CD7
ComD РегСР Cv5 5 A :: CD7
Como PerCP-Cv5 5 A :: CD7
<
Q U
<
'йштж
u <
,.,,(-. т, ,,,,,, . ,,,, . ,
r i ¦ -I ¦ t
Como BV610-A :• CD4
ComD 8V610-A :: CD4
Como-BV610 A : CD4
Como BV610 A .: CD4 po
со со
Hl-CAR
<
<3
< i
? 8 1
5 ^
J I
f"" "ИИ I
" ¦¦¦¦ -I . ' ¦¦ ' 1
l " ¦ ' ни I ' • "i
.г з :a' ;з5
Como BV610 A :¦ CDA
ComD 8V610 A :: CD4
Como BV610 A :: CDA
Como-BVG10-A :: CD4
"'1
li§§
Como-BVSOO-A:: CD56 (HCD56)
Como-BV500-A :: CD56 (HCDSI
CJ)
Hl-CAR
9 IS*
<
CO CO
ComD-BVSOO-A:: CD56 IHCD56)
ComD-BV500-A :: CD56 0HCD5I
ФИГ.66А
Без стимуляции
PMA/lo
<
? о
0.22
0,010
т-Г Т f ТП^| г~~г~г%тгтщ-
ComD 8V450-A :; TNFa
со со
HTTP://www.eapatis.com/getimage.asp?src=//eapatis2012/Data/EATXT/,0.26
0.088
47.6
Hl-CAR
E о и
' 1
чь J99.6
0.088
<
IS.
Е о и -.0
I 14.9
Si-
36.7
I t ' l I 1 1 ¦""I
1 4 с
.з' :J .э
, 1 * - s
Como-BV450-A ;; TNFa
Como-BV450-A :: TNFa
Без стимуляции
PMA/Io
Como-BV610-A :: IL-2
ro 00
CO CO
.^-0.33
0.022
Hl-CAR
1 да
0 ' '• ,:-]96.8
2.83
<
0 ]
Яг1
32.7
?irrri| f " 'fiim I J ч"ги|
- S 4 S
;a 13 :o
ComD-BV610-A :: IL-2
1Ч1 ПИД' Tlf ГГП|
. .. :S . - -S
Como-BV610-A :: IL-2
K562
K562-CD19
Nalm6
RAJ I
123
0.10 m .сЧ24.2
9.86
./.53.6
Comp-APC-A ::CD107a
Согпр-АРС-А COI07J
i !
13.5
1 "4
is*
:> " 10s
Comp-APC-aC"o?"
CO CO
ФИГ.67
Образцы костного мозга
АТО
CD34+
OP9-DL1
CD34+
ATG
OP9-DL1
азцы костного мозга
Е43
а" и
CD7
1Л *
Q J U
CD7
CD7
CD5+ CD7+
in!
a и
in Q (J
АТО
Первоначальное число клеток: 15000 клеток
5x10е
4x10s
ело
нед
3x106
2x10е
бще
1 х106
CD5+CD7+
TCRab+ CD3+
CDS
о I-
> <
I-03
100806040-
on.
О I-
50-1 40-
> < _Q 30-CQ
^ 20-
15-1
О I-
> < 10-|
0.8-
о I-
§ 0,6-> <
со 0.4-
0.2-
(19)
(19)
(19)
183
183
184
184
193
194
2006.
196
196
197
2005.
197
2005.
198
198
2005.
2005.
199
200
1991.
202
202
203
203
205
205
6/133
6/133
6/133
6/133
6/133
6/133
6/133
6/133
6/133
8/133
8/133
8/133
8/133
8/133
8/133
8/133
8/133
8/133
14/133
14/133
14/133
14/133
14/133
14/133
14/133
14/133
14/133
14/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
17/133
18/133
18/133
19/133
19/133
20/133
20/133
20/133
20/133
20/133
20/133
20/133
20/133
20/133
20/133
20/133
20/133
20/133
20/133
20/133
20/133
21/133
21/133
21/133
21/133
ФИГ.9А
ФИГ.9А
ФИГ.9А
ФИГ.9А
ФИГ.9А
ФИГ.9А
ФИГ.9В
ФИГ.9В
ФИГ.9В
ФИГ.9В
ФИГ.9В
ФИГ.9В
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
24/133
26/133
26/133
26/133
26/133
26/133
26/133
26/133
26/133
26/133
26/133
26/133
27/133
27/133
27/133
27/133
27/133
27/133
27/133
27/133
ФИГ.12А
ФИГ.12А
ФИГ.12А
ФИГ.12А
ФИГ.12А
31/133
31/133
31/133
31/133
31/133
31/133
31/133
31/133
31/133
31/133
31/133
31/133
33/133
32/133
33/133
32/133
33/133
32/133
33/133
32/133
33/133
32/133
33/133
32/133
33/133
32/133
33/133
32/133
33/133
32/133
33/133
34/133
33/133
34/133
33/133
34/133
33/133
34/133
33/133
34/133
ФИГ.15А
ФИГ.15А
ФИГ.15А
ФИГ.15А
ФИГ.15С
ФИГ.15С
38/133
38/133
ФИГ.16А
ФИГ.16А
ФИГ.16А
ФИГ.16А
ФИГ.16А
ФИГ.16А
42/133
42/133
42/133
42/133
42/133
42/133
43/133
43/133
43/133
43/133
43/133
43/133
44/133
44/133
44/133
44/133
44/133
44/133
44/133
44/133
44/133
44/133
44/133
44/133
ФИГ.17Р
ФИГ.17Р
ФИГ.17Р
ФИГ.17Р
ФИГ.17Р
ФИГ.17Р
ФИГ.17Р
ФИГ.17Р
ФИГ.18А
ФИГ.18А
ФИГ.18А
ФИГ.18А
ФИГ.18А
ФИГ.18А
ФИГ.18А
ФИГ.18А
47/133
47/133
ФИГ.19
ФИГ.19
ФИГ.19
ФИГ.19
ФИГ.19
ФИГ.20В
ФИГ.20В
ФИГ.20В
ФИГ.20В
ФИГ.21А-В
ФИГ.21А-В
ФИГ.21А-В
ФИГ.21А-В
ФИГ.21А-В
ФИГ.21А-В
ФИГ.21А-В
ФИГ.21А-В
20-
20-
ФИГ.21С-Е
ФИГ.21С-Е
20-
20-
ФИГ.21С-Е
ФИГ.21С-Е
20-
20-
ФИГ.21С-Е
ФИГ.21С-Е
20-
20-
ФИГ.21С-Е
ФИГ.21С-Е
20-
20-
ФИГ.21С-Е
ФИГ.21С-Е
54/133
54/133
55/133
55/133
55/133
55/133
55/133
55/133
55/133
55/133
55/133
55/133
55/133
55/133
ФИГ.211
ФИГ.211
ФИГ.211
ФИГ.211
ФИГ.211
ФИГ.211
ФИГ.2и-К
ФИГ.2и-К
ФИГ.2и-К
ФИГ.2и-К
ФИГ.2и-К
ФИГ.2и-К
ФИГ.2и-К
ФИГ.2и-К
61/133
60/133
61/133
60/133
61/133
60/133
61/133
60/133
61/133
60/133
61/133
60/133
61/133
60/133
61/133
60/133
61/133
62/133
61/133
62/133
61/133
62/133
ФИГ.25В
ФИГ.25В
ФИГ.25В
ФИГ.25В
65/133
100-!
65/133
100-!
65/133
100-!
65/133
100-!
65/133
100-!
65/133
100-!
65/133
100-!
65/133
100-!
65/133
100-!
65/133
100-!
ФИГ.26В
ФИГ.26В
ФИГ.26В
ФИГ.26В
67/133
67/133
67/133
67/133
67/133
67/133
67/133
67/133
67/133
67/133
67/133
67/133
67/133
67/133
ФИГ.29А
ФИГ.29А
ФИГ.29В
CD5+ CD7+
ФИГ.29В
CD5+ CD7+
CD4
CD4
ФИГ.29В
CD5+ CD7+
ФИГ.29В
CD5+ CD7+
CD4
CD4
ФИГ.29С
ФИГ.29С
ФИГ.29С
ФИГ.29С
ФИГ.29С
ФИГ.29С
ФИГ.290
CD5+ CD7+
ФИГ.290
CD5+ CD7+
ФИГ.290
CD5+ CD7+
ФИГ.290
CD5+ CD7+
ФИГ.29Е
ФИГ.29Е
ФИГ.29Е
ФИГ.29Е
ФИГ.29Е
ФИГ.29Е
ФИГ.29Е
ФИГ.29Е
ФИГ.29Е
ФИГ.29Е
CD5+ CD7+
CD5+ CD7+
CD4
CD4
CD3
CD3
CD3
CD3
CD3
CD3
CD3
CD3
CD3
CD3
CD3
CD3
ФИГ.32А
ФИГ.32А
ФИГ.32А
ФИГ.32А
ФИГ.32А
ФИГ.32А
CD4
CD4
86/133
86/133
86/133
86/133
86/133
86/133
ФИГ.35А
ФИГ.35А
ФИГ.35А
ФИГ.35А
ФИГ.35А
ФИГ.35А
ФИГ.35А
ФИГ.35А
ФИГ.35А
ФИГ.35А
ФИГ.35А
92/133
92/133
ФИГ.38В
ФИГ.38В
ФИГ.38В
ФИГ.38В
ФИГ.39
ФИГ.39
ФИГ.39
ФИГ.39
ФИГ.39
ФИГ.39
ФИГ.39
ФИГ.39
ФИГ.40
ФИГ.40
ФИГ.41А
ФИГ.41А
ФИГ.41А
ФИГ.41А
ФИГ.41А
ФИГ.41А
ФИГ.41В
ФИГ.41В
ФИГ.41В
ФИГ.41В
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
ФИГ.42
TCRab+CD3+
TCRab+CD3+
ФИГ.43А
ФИГ.43А
TCRab+CD3+
TCRab+CD3+
ФИГ.43В
ФИГ.43В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
TCRab+CD3+
ФИГ.44В
ФИГ.45
ФИГ.45
ФИГ.45
ФИГ.45
ФИГ.45
ФИГ.45
ФИГ.45
ФИГ.45
ФИГ.46
ФИГ.46
ФИГ.47
ФИГ.47
113/133
113/133
ФИГ.54
ФИГ.54
ФИГ.56В
ФИГ.56В
ФИГ.56В
ФИГ.56В
ФИГ.56В
ФИГ.56В
ФИГ.57
ФИГ.57
ФИГ.57
ФИГ.57
ФИГ.57
ФИГ.57
ФИГ.57
ФИГ.57
ФИГ.59
ФИГ.59
ФИГ.59
ФИГ.59
ФИГ.59
ФИГ.59
ФИГ.59
ФИГ.59
ФИГ.59
ФИГ.62
ФИГ.62
ФИГ.62
ФИГ.62
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
ФИГ.63
ФИГ.63
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
ФИГ.63
ФИГ.63
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
ФИГ.63
ФИГ.63
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
ФИГ.63
ФИГ.63
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
ФИГ.63
ФИГ.63
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
ФИГ.63
ФИГ.63
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
ФИГ.64
ФИГ.64
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
ФИГ.64
ФИГ.64
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
ФИГ.64
ФИГ.64
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
ФИГ.64
ФИГ.64
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
ФИГ.64
ФИГ.64
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
ФИГ.64
ФИГ.64
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
ФИГ.64
ФИГ.64
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
ФИГ.64
ФИГ.64
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
ФИГ.65
ФИГ.65
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
ФИГ.65
ФИГ.65
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
ФИГ.65
ФИГ.65
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
659 Неделя 1
659 Неделя 3
657 Неделя 4
657 Неделя 2
ФИГ.65
ФИГ.65
ФИГ.66В
ФИГ.66В
ФИГ.66В
ФИГ.66В
ФИГ.66В
ФИГ.66В
ФИГ.66В
ФИГ.66В
ФИГ.66В
ФИГ.66В
ФИГ.66В
ФИГ.66В
ФИГ.66В
ФИГ.68
ФИГ.68
ФИГ.69
ФИГ.69
ФИГ.69
ФИГ.69
ФИГ.70
ФИГ.70
ФИГ.71
ФИГ.71
ФИГ.71
ФИГ.71
ФИГ.71
ФИГ.71
ФИГ.71
ФИГ.71
