|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Настоящее изобретение относится к растениям с увеличенным количеством цветков, стручков и увеличенной массой тысячи семян (TSW). В частности, настоящее изобретение относится к растениям Brassica, в которых экспрессия цитокинин-оксидазы 5 или цитокинин-оксидазы 5 и 3 функционально снижена. Предоставляются растения рода Brassica, включающие мутантные CKX аллели, и растения рода Brassica, в которых экспрессия CKX снижена. Также предоставляются способы и средства получения растений рода Brassica с увеличенным количеством цветков, стручков и увеличенной массой тысячи семян (TSW). 
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к растениям с увеличенным количеством цветков, стручков и увеличенной массой тысячи семян (TSW). В частности, настоящее изобретение относится к растениям Brassica, в которых экспрессия цитокинин-оксидазы 5 или цитокинин-оксидазы 5 и 3 функционально снижена. Предоставляются растения рода Brassica, включающие мутантные CKX аллели, и растения рода Brassica, в которых экспрессия CKX снижена. Также предоставляются способы и средства получения растений рода Brassica с увеличенным количеством цветков, стручков и увеличенной массой тысячи семян (TSW).
Евразийское (21) 201890964 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.01.31
(22) Дата подачи заявки 2016.10.13
(51) Int. Cl.
A01H 5/10 (2006.01) C12N 9/06 (2006.01) C12N15/82 (2006.01)
(54) РАСТЕНИЯ РОДА BRASSICA С ИЗМЕНЕННЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ СЕМЕННОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ
(31) 15190256.6
(32) 2015.10.16
(33) EP
(86) PCT/EP2016/074560
(87) WO 2017/064173 2017.04.20
(71) Заявитель:
БАЙЕР КРОПСАЙЕНС НВ (BE)
(72) Изобретатель:
Ламмертин Фрейя (BE), Ботс Марк (NL), Лага Беньямин, Шмидт Ральф-Кристиан, Шмидт Юлия, Мушель
Селин (BE)
(74) Представитель:
Беляева Е.Н. (BY)
(57) Настоящее изобретение относится к растениям с увеличенным количеством цветков, стручков и увеличенной массой тысячи семян (TSW). В частности, настоящее изобретение относится к растениям Brassica, в которых экспрессия ци-токинин-оксидазы 5 или цитокинин-оксидазы 5 и 3 функционально снижена. Предоставляются растения рода Brassica, включающие мутантные CKX аллели, и растения рода Brassica, в которых экспрессия CKX снижена. Также предоставляются способы и средства получения растений рода Brassica с увеличенным количеством цветков, стручков и увеличенной массой тысячи семян
(TSW).
mvsynfpsqihllmitilviittlltpittntsslpwnilsndnfagklttasssvesaat
safes
rnkwndrmsaaipeedvfyavgflrsagf
lnrvrtgelnlkskgqwdvphpwlnlfvpksqisrfdygvfkgiilrnnittgpllvyprak
dnweafdqenmeilkfcedanmgviqylpyhSSqegWvrhfgprwnifverkykydpkmilSpgqnilqkinSS
Растения рода Brassica с измененными характеристиками семенной
продуктивности
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[1] Настоящее изобретение относится к растениям рода Brassica и частям таких растений, в частности, к растениям вида Brassica napus, с измененным количеством цветков, стручков и характеристиками семенной продуктивности. Настоящее изобретение относится также к нуклеиновым кислотам, кодирующим цитокинин-оксидазы (СКХ) из Brassica napus, и их индуцированными вариантными аллелям, которые влияют на характеристики количества цветков, стручков и семенной продуктивности в растениях Brassica napus.
ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[2] Повышение продуктивности в сельском хозяйстве - это постоянная цель, которая необходима для удовлетворения растущей потребности в продуктах питания для людей и животных, а также других продуктах растительного происхождения, учитывая рост населения Земли и постоянное уменьшение площадей с оптимальными характеристиками, которые можно отвести под сельскохозяйственные угодья.
[3] Цитокинин представляет собой фитогормон, который влияет на многие аспекты роста и развития растения. Он стимулирует образование и активность меристем побегов, он участвует в создании тканей, где происходит потребление и хранение продуктов фотосинтеза, замедляет старение листьев, подавляет рост корня и ветвление, а также играет важную роль в прорастании семян и в реакции стрессовые условия (Мок and Мок, 2001, Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 52, 89-118). Химические свойства и физиология цитокинина широко изучены, кроме того, изучены регуляция биосинтеза цитокинина, метаболизм и сигнальная трансдукция.
[4] Цитокинин-оксидазы (CKX), также именуемые цитокинин дегидрогеназы, регулируют гомеостаз фитогормона, цитокинина. Они катализируют необратимый распад цитокининов: изопентениладенина, зеатина, а также их рибозидов в одиночном ферментативном этапе путем окислительного расщепления боковой цепи. Геном Arabidopsis thaliana кодирует семь генов СКХ, в то время как геном риса включает, по меньшей мере, десять представителей семейства СКХ. Отдельные белки СКХ имеют различные каталитические свойства, подклеточную локализацию и профили экспрессии в отношении временного паттерна, фазы развития и ткани. Ферменты СКХ отвечают за практически полный цикл метаболизма цитокининов и инактивируют этот гормон. Из-за того, что изменения в уровне или функциональности белка СКХ и последующие изменения в активности СКХ приводят к изменению концентрации цитокинина в тканях, ферменты СКХ играют важную роль в контроле местных уровней цитокинина и участвуют в регулировании цитокинин-зависимых процессов. (Schmiilling et al., 2003, J. Plant Res. 116, 241-252). Для изменения морфологии, биохимии, физиологии и развития растений использовалась модуляция экспрессии гена СКХ и активности белка СКХ с использованием способов биотехнологии.
[5] В документе WO2001/96580 описаны способы для стимулирования роста корня и/или усиления образования боковых или придаточных корней и/или для изменения геотропизма корней, которые включают экспрессию цитокинин-оксидазы растения или включают экспрессию другого белка, в результате чего снижается уровень активных цитокининов в растениях или частях растений. Также описаны новые белки цитокинин-оксидазы растений, нуклеотидные последовательности, кодирующие белки цитокинин-оксидазы растений, а также векторы, клетки-хозяева, трансгенные клетки и растения, включающие такие последовательности. В документе также описано применение таких последовательностей для улучшения характеристик, связанных с корнями, включая повышение урожайности и/или повышение ранней активности роста и/или изменения отношения корень/стебель и/или улучшения устойчивости к полеганию и/или улучшения стойкости к условиям засухи и/или стимулирования размножения эксплантатов in vitro и/или изменения
судьбы клеток и/или развития растения и/или морфологии растения и/или биохимии растения и/или физиологии растения. Также описано применение таких последовательностей в вышеуказанных способах. Описаны способы идентификации и получения белков и соединений, взаимодействующих с белками цитокинин-оксидазы, а также описано применение таких соединений в качестве регуляторов роста растений или гербицидов.
[6] В документе WO2003/050287 также описаны способы для стимулирования роста корня и/или усиления образования боковых или придаточных корней и/или для изменения геотропизма корней, которые включают экспрессию цитокинин-оксидазы растения или включают экспрессию другого белка, в результате чего снижается уровень активных цитокининов в растениях или частях растений. Также предоставлены способы увеличения размера и/или массы семени, размера и/или массы зародыша и размер и/или массы семядоли. Такие способы включают экспрессию цитокинин-оксидазы растения или экспрессию другого белка, в результате чего снижается уровень активных цитокининов в растениях или частях растений. В этом документе также описаны новые белки цитокинин-оксидазы растений, нуклеотидные последовательности, кодирующие белки цитокинин-оксидазы растений, а также векторы, клетки-хозяева, трансгенные клетки и растения, включающие указанные последовательности. Также описано применение таких последовательностей для улучшения характеристик, связанных с корнями, включая повышение урожайности и/или повышение ранней активности роста и/или изменения отношения корень/стебель и/или улучшения устойчивости к полеганию и/или улучшения стойкости к условиям засухи и/или стимулирования размножения эксплантатов in vitro и/или изменения судьбы клеток и/или развития растения и/или морфологии растения и/или биохимии растения и/или физиологии растения. Наконец, описанная технология также относится к применению таких последовательностей в вышеуказанных способах, а также способах идентификации и получения белков и соединений, взаимодействующих с белками цитокинин-оксидазы, а также к применению таких соединений в качестве регуляторов роста растений или гербицидов.
[7] В документе WO2005/123926 описаны способы и композиции для увеличения выхода семян растения. Способы включают экспрессию цитокинин-оксидазы в алейроне и/или зародыше семени. Также описаны векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую цитокинин-оксидазу, которая функционально связана с промотором, способным инициировать экспрессию в алейроне и/или зародыше семени, в клетках-хозяевах, трансгенных клетках и растениях, содержащих такие последовательности. Также предоставляется применение таких последовательностей для повышения урожайности.
[8] В документе US2006123507 описан ген СКХ, который регулирует увеличение и снижение количества частей растения, несущих семена (включая цветковую чешую с самими цветками, плоды и семена), зерновых культур, который был успешно изолирован и идентифицирован путем анализа сцепления между генными локусами. Кроме того, также были описаны способы селекции, в которых используется этот ген для увеличения количества частей растения, несущих семена (включая цветковую чешую с самими цветками, плоды и семена), растений.
[9] В документе US2013/014291 описаны последовательности, подобные цитокинин-оксидазе (из Zea mays), и способы их применения. Эти последовательности могут быть использованы во множестве способов, включая модулирование развития корня, цветков, листьев и/или побегов, размера и/или массы семян, модулирование стойкости к условиям абиотического стресса и устойчивости к патогенам.
[10] В работе Cervinkova et al. (2013 J. Exp. Bot. 64, 2805-2815) описаны растения табака с увеличенной устойчивостью к стрессовым условиям вследствие повышенных температур и засухи с эктопически усиленной экспрессией цитокинин-оксидазы/дегидрогеназы.
[11] В работе Kollmer et al. (2014, Plant J. 78, 359-371) указывается, что сверхэкспрессия цитозольной цитокинин-оксидазы/дегидрогеназы (СКХ7) из Arabidopsis вызывает специфические изменения в росте корня и дифференциации ксилемы.
[12] WO2011/004003 относится к изолированным клеткам растений и растениям, включающим разрушение, по меньшей мере, в одном гене СКХЗ и в одном дополнительном гене, кодирующем цитокинин-оксидазу/дегидрогеназу, отличном от СКХЗ, а также к способам получения таких растений и к способам увеличения выхода семян в растении и/или увеличения высоты растения.
[13] В работе Batrina et al. (2011, The Plant Cell 23, 69-80) указывается, что размер и активность апикальной меристемы побега регулируются факторами транскрипции и сигналами транскрипции с низкой молекулярной массой, включая гормон растений цитокинин. Статус цитокинина меристемы зависит от различных факторов, включая метаболический распад гормона, который катализируется ферментами цитокинин-оксидазы/дегидрогеназы (СКХ). В этом документе описывается, что СКХЗ и СКХ5 регулируют активность репродуктивнеых меристем Arabidopsis thaliana. Экспрессия СКХЗ происходит в центральном домене WUSCHEL (WUS), в то время как СКХ5 демонстрирует более широкую меристемную экспрессию. Двойные скхЗ скх5 мутанты в Arabidopsis thaliana образуют соцветия и цветковые меристемы большего размера. Увеличенный размер домена WUS и усиленное образование примордия указывают на двойную функцию цитокинина в определении ниши для стволовой клетки и задержке дифференцировки клеток. В соответствии с этим мутация отрицательного гена-регулятора сигнальной системы цитокинина, ARABIDOPSIS HISTIDINE PHOSPHOTRANSFER PROTEIN б, который экспрессируется в боковой меристеме, приводит к дальнейшей задержке дифференцировки клеток. Конечная дифференцировка клеток также была замедлена в цветках chx3 скх5, в которых образовалось большее количество клеток, и которые увеличились в размере, что подтверждает роль цитокинина в регуляции размера цветков. Кроме того, более высокая активность скхЗ скх5 в ткани плаценты привела к появлению дополнительных семезачатков, в результате чего было получено увеличенное количество семян на стручок. В совокупности эти результаты подтверждают важную роль цитокинина в развитии репродуктивных органов. При увеличении содержания цитокинина наблюдалось увеличение на -55% выхода семян в Arabidopsis thaliana,
что указывает на то, что сила тканей, где происходит потребление и хранение продуктов фотосинтеза, является фактором, влияющим на урожайность.
[14] В работе Song et et al. (2015 J. Exp. Bot. 66 стр. 5067-5082) указывается, что профиль экспрессии генов Brassica napus указывает на участие членов генных семейств IPT, СКХ, транспорта сахарозы, апопластной инвертазы и аминокислотной пермеазы в развитии листьев, цветков, стручков и семян. В этой публикации описана идентификация генного семейства, связанного с разложением цитокинина (ВпСКХХ -ВпСКХП), в В. napus, а также гомологи из В. oleracea и В. гора. Номера доступа последовательностей не опубликованы (несмотря на то, что предполагается, что в приложении 1, содержащем вспомогательные данные, должны содержатся такие данные). BnCKXl и 4 были идентифицированы как цели для TILLING, EcoTILLING и MAS для улучшения выхода семян без отрицательного влияния на выход кормов и качество кормовой капусты {Brassica napus, сорт Greenland), которая разводится для вегетативного роста и производства биомассы.
[15] Таким образом, до настоящего момента существует необходимость в получении нефункциональных вариантных аллелей генов СКХЗ и СКХ5 из В. napus, которые могут быть использованы для изменения полученного количества цветков, количества стручков и семян, а также семенных характеристик в Brassica napus.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[16] Авторами изобретения было обнаружено, что путем контроля количества и/или типов аллелей генов СКХ5 или СКХ5 и СКХЗ, которые "функционально экспрессированы" в указанных растениях, т.е. экспрессия которых приводит к получению функциональных (биологически активных) белков СКХ5 или СКХ5 и СКХЗ в растениях рода Brassica, можно обеспечить изменение количества цветков, стручков и семян на растение.
[17] Путем комбинирования определенных индуцированных вариантных аллелей генов СКХ5 или СКХ5 и СКХЗ, что приводит к уменьшению уровня функционального белка СКХ5 или СКХ5 и СКХЗ, может быть увеличено количество
цветков на растение, в частности, может быть увеличено количество цветков на основном стебле в тепличных условиях или в условиях полевых испытаний. Кроме того, в условиях полевых испытаний может быть увеличено количество стручков на основном стебле, а также количество семян на стручок на основном стебле. Также может быть обеспечено увеличение массы тысячи семян (TSW), в частности, увеличение TSW без существенного отрицательного эффекта на выход, в отличие от других подходов, при которых обеспечивается увеличение TSW, однако это компенсируется более низким выходом по количеству семян.
[18] В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения предоставляется растение рода Brassica, содержащее, по меньшей мере, один ген СКХ5, включающий, по меньшей мере, один мутантный СКХ5 аллель в геноме, в частности, указанный мутантный СКХ5 аллель является мутантным аллелем гена СКХ5, включающим нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих последовательностей: нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ Ш N0: 19 или SEQ Ш N0: 23; нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ Ш N0: 20 или SEQ Ш N0: 23; и нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ Ш N0: 21 или SEQ ID N0: 24.
[19] Растение рода Brassica может включать два гена СКХ5 и может быть выбрано из группы, состоящей из Brassica napus, Brassica juncea и Brassica carinata. Указанное растение может также содержать, по меньшей мере, два мутантных СКХ5 аллеля или, по меньшей мере, три мутантных СКХ5 аллеля или, по меньшей мере, четыре мутантных СКХ5 аллеля.
[20] В соответствии с частным вариантом осуществления изобретения мутантный СКХ5 аллель может быть выбран из следующих аллелей: мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ Ш N0: 19 или положению 465 SEQ Ш N0: 20; мутантный СКХ5 аллель, содержащий
замещение G на А в положении, соответствующем положению 399 SEQ Ш N0: 19 или положению 399 SEQ Ш N0: 20; мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ Ш N0: 22 или положению 399 SEQ ID N0: 23.
[21] В соответствии с еще одним из вариантов осуществления изобретения растение также может включать, по меньшей мере, два гена СКХЗ, также включающих, по меньшей мере, два мутантных СКХЗ аллеля в геноме, в частности, указанный мутантный СКХЗ аллель является мутантным аллелем гена СКХЗ, включающим нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих последовательностей: нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 7, SEQ ID N0: 10; SEQ ГО N0: 13 или SEQ ГО N0: 16; нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 8, SEQ ГО NO: 11; SEQ ГО N0: 14 или SEQ ГО N0: 17; и нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 9, SEQ ID N0: 12; SEQ ID N0: 15 или SEQ ID N0: 18.
[22] Растение рода Brassica может содержать четыре гена СКХЗ, при этом указанное растение рода Brassica выбрано из группы, состоящей из Brassica napus, Brassica juncea и Brassica carinata и может также содержать, по меньшей мере, два мутантных СКХЗ аллеля или, по меньшей мере, три мутантных СКХЗ аллеля или, по меньшей мере, четыре мутантных СКХЗ аллеля или, по меньшей мере, пять мутантных СКХЗ аллелей или, по меньшей мере, шесть мутантных СКХЗ аллелей или, по меньшей мере, семь мутантных СКХЗ аллелей или, по меньшей мере, восемь мутантных СКХЗ аллелей.
[23] В соответствии с частным вариантом осуществления изобретения мутантный СКХЗ аллель может быть выбран из следующих аллелей: мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2244 SEQ ГО N0: 7 или положению 1093 SEQ ГО N0: 8; мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2482 SEQ ГО N0: 10
или положению 1168 SEQ Ш NO: 11; мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 1893 SEQ Ш N0: 13 или положению 876 SEQ Ш N0: 14; мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2171 SEQ Ш N0: 16 или положению 982 SEQ ID N0: 17.
[24] Растение рода Brassica может быть гомозиготным для мутантного СКХЗ аллеля и/или для мутантного СКХ5 аллеля.
[25] Такие растения могут иметь увеличенное количество цветков на растение или имеющее увеличенное количество стручков на растении, например, увеличенное количество стручков или цветков на главном стебле растения, или может иметь увеличенную массу тысячи семян.
[26] Изобретением также предоставляются клетки растения, стручки, семена или потомство растения, которое характеризуется присутствием мутантных аллелей, описанных в настоящем документе.
[27] Настоящим изобретением также предоставляется мутантный аллель гена Brassica СКХЗ или СКХ5, при этом указанный ген СКХ5 выбран из группы, состоящей из следующих последовательностей: нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 19 или SEQ ГО N0: 23; (Ь) нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 20 или SEQ ГО N0: 23; и нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 21 или SEQ ГО N0: 24; при этом указанный ген СКХЗ выбран из группы, состоящей из следующих последовательностей: нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 7, SEQ ГО N0: 10; SEQ ГО N0: 13 или SEQ ГО N0: 16; нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 8, SEQ ГО N0: 11; SEQ ГО N0: 14
или SEQ Ш NO: 17; и нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ID N0: 9, SEQ ГО N0: 12; SEQ ГО N0: 15 или SEQ ГО N0: 18.
[28] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения предоставляется мутантный аллель, выбранный из группы, состоящей из следующих аллелей:
a. мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ ГО N0: 19 или положению 465 SEQ ГО N0: 20;
b. мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 399 SEQ ГО N0: 19 или положению 399 SEQ ГО N0: 20; и
c. мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ ГО N0: 22 или положению 399 SEQ ГО N0: 23;
d. мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2244 SEQ ГО N0: 7 или положению 1093 SEQ ГО N0: 8;
e. мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2482 SEQ ГО N0: 10 или положению 1168 SEQ ГО N0: 11;
f. мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 1893 SEQ ГО N0: 13 или положению 876 SEQ ГО N0: 14;
g. мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2171 SEQ ГО N0: 16 или положению 982 SEQ ГО N0: 17.
[29] Изобретением также предоставляется химерный ген, включающий следующие функционально связанные фрагменты ДНК:
(a) промотор, экспрессируемый в растениях;
(b) область ДНК, которая при транскрипции дает молекулу РНК или белка, которая подавляет экспрессию или активность одного или нескольких генов или белков СКХ5 или СКХ5 и СКХЗ] и, при необходимости,
(c) 3'-концевая область, участвующая в терминации транскрипции и
полиаденилировании.
[30] Еще один вариант осуществления изобретения относится к способу идентификации мутантного СКХ5 или СКХЗ аллеля в соответствии с описанием в настоящем документе в биологическом образце, при этом указанный способ включает определение присутствия мутантной специфической области СКХ5 или СКХЗ в нуклеиновой кислоте, присутствующей в указанном биологическом образце.
[31 ] Еще один вариант осуществления изобретения относится к способу определения статуса зиготности мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля в соответствии с описанием в настоящем документе в растении рода Brassica, растительном материале или семени растения, при этом указанный способ включает определение присутствия мутантной специфической области СКХЗ или СКХ5 и/или соответствующей области дикого типа в геномной ДНК указанного растения, растительного материала или семени.
[32] Изобретением также предоставляется комплект для идентификации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля в соответствии с описанием в настоящем документе в биологическом образце, при этом указанный набор включает набор, по меньшей мере, из двух праймеров, причем указанный набор выбран из группы, состоящей из следующих элементов:
(а) набор праймеров, в котором один из указанных праймеров специфически распознает 5' - или 3'-фланкирующую область мутантного аллеля, а второй праймер специфически распознает область мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, и
(b) набор праймеров, в котором один из указанных праймеров специфически распознает 5'- или 3'-фланкирующую область мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, а второй праймер специфически распознает примыкающую область между 3'- или 5'-фланкирующей областью и областью мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, соответственно; или указанный комплект включает набор, по меньшей мере, из одного зонда, при этом указанный зонд выбран из группы, состоящей из следующих зондов:
(a) зонд, который специфически распознает область мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, и
(b) зонд, который специфически распознает примыкающую область между 3'- или 5'-фланкирующей областью и областью мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля.
[33] Также изобретением предоставляется способ переноса, по меньшей мере, одного выбранного мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля в соответствии с описанием в настоящем документе из одного растения в другое растение, при этом указанный способ включает следующие этапы:
(a) идентификация первого растения, включающего, по меньшей мере, один выбранный мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, с использованием описанного способа,
(b) скрещивание первого растения со вторым растением, не содержащим, по меньшей мере, одного выбранного мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, и сбор F1 гибридных семян, полученных в результате указанного скрещивания,
(c) при необходимости, идентификация растений F1, включающих, по меньшей мере, один выбранный мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, с использованием описанного способа,
(d) обратное скрещивание растений F1, включающих, по меньшей мере, один
выбранный мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, со вторым растением, не содержащим, по меньшей мере, одного выбранного мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, для получения, по меньшей мере, одного поколения
(х), и сбор ВСх семян, полученных в результате указанного скрещивания, и
(е) идентификация в каждом поколении ВСх растений, содержащих, по меньшей мере, один выбранный мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, с использованием описанного способа.
[34] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретением предоставляется способ увеличения количества цветков на растение, содержащий введение, по меньшей мере, одного мутантного СКХ5 или одного мутантного СКХ5 и одного мутантного СКХЗ аллеля в растение рода Brassica; или введение химерного гена, описанного в настоящем документе, в растение рода Brassica.
[35] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретением предоставляется способ увеличения количества стручков на растение, включающий введение, по меньшей мере, одного мутантного СКХ5 или одного мутантного СКХ5 и одного мутантного СКХЗ аллеля в растение рода Brassica; или введение химерного гена, описанного в настоящем документе, в растение рода Brassica.
[36] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретением предоставляется способ увеличения массы тысячи семян, включающий введение, по меньшей мере, одного мутантного СКХ5 или одного мутантного СКХ5 и одного мутантного СКХЗ аллеля в растение рода Brassica; или введение химерного гена, описанного в настоящем документе, в растение рода Brassica.
[37] В соответствии с частным вариантом осуществления изобретением предоставляется растение рода Brassica, выбранное из группы, состоящей из следующих растений:
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ Ш N0: 19 или положению 465 SEQ Ш N0: 20, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCEVIB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCEVIB 42464;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 399 SEQ Ш N0: 19 или положению 399 SEQ Ш N0: 20, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCEVIB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCEVIB 42465;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ Ш N0: 22 или положению 399 SEQ Ш N0: 23, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCEVIB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCEVIB 42464;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2244 SEQ Ш N0: 7 или положению 1093 SEQ ID N0: 8, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCEVIB 42464;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2482 SEQ ГО N0: 10 или положению 1168 SEQ ГО N0: 11, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCEVIB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCEVIB 42464;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 1893 SEQ ГО N0: 13 или положению 876 SEQ ГО N0: 14, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCEVIB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCEVIB 42464;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2171 SEQ Ш N0: 16 или положению 982 SEQ Ш N0: 17, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCEVIB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCEVIB 42464;
[38] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретением предоставляется применение мутантного аллеля СКХ5 или мутантных аллелей СКХ5 и СКХЗ в соответствии с описанием в настоящем документе или химерного гена в соответствии с описанием в настоящем документе для увеличения количества цветков на растение, количества стручков на растение или увеличения массы тысячи семян в растениях рода Brassica или для производства рапсового масла или рапсового жмыха.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[39] Фиг. 1: Выравнивание аминокислотных последовательностей белков, кодированных AtCKXb из Arabidopsis thaliana (SEQ Ш NO: 3); аллелем ВпСКХЗ-А1 дикого типа (SEQ ID N0: 9); аллелем ВпСКХЗ-А 1 YIIN501 (SEQ ГО N0: 25); аллелем ВпСКХЗ-А2 дикого типа (SEQ ГО N0: 12) и аллелем ВпСКХЪ-А2 YIIN502 (SEQ ГО N0: 26). Прямоугольники и стрелки обозначают консервативные мотивы и сайты, указанные в Таблице 1.
[40] Фиг. 2: Выравнивание аминокислотных последовательностей белка, кодированного AtCKX3 из Arabidopsis thaliana (SEQ ГО NO: 3); аллелем ВпСКХЗ-С1 дикого типа (SEQ ГО N0: 15); аллелем ВпСКХЗ-С\ YIIN521 (SEQ ГО N0: 27); аллелем ВпСКХЗ-С2 дикого типа (SEQ ГО N0: 18) или аллелем ВпСКХЪ-С\ YIIN531 (SEQ ГО N0: 28). Прямоугольники и стрелки обозначают консервативные мотивы и сайты, указанные в Таблице 1.
[41] Фиг. 3: Выравнивание аминокислотных последовательностей белка, кодированного AtCKX5 из Arabidopsis thaliana (SEQ ГО NO: 6); аллелем ВпСКХ5-А\ дикого типа (SEQ ГО N0: 21); аллелем ВпСКХ5-К\ YIIN801 (SEQ ГО N0: 29); аллелем ВпСКХ5-М YIIN805 (SEQ ГО N0: 30); аллелем ВпСКХЪ-Cl дикого типа (SEQ ГО N0: 24) или аллелем ВпСКХЗ-С\ YIIN811 (SEQ ГО N0: 31). Прямоугольники и стрелки обозначают консервативные мотивы и сайты, указанные в Таблице 2.
ОБЩИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[42] При использовании по тексту настоящего документа термин "плод" растения рода Brassica означает орган растения рода Brassica, который развивается из гинецея, состоящего из сросшихся плодолистиков, который после оплодотворения вырастает в семянку или стручок, которые содержат развивающиеся семена.
[43] Термин "культурное растение" относится к виду растения, который выращивается как сельскохозяйственная культура, например, следующие виды: Brassica napus (ААСС, 2n=38), Brassica juncea (ААВВ, 2n=36), Brassica carinata
(BBCC, 2n=34), Brassica rapa (syn. B. campestris) (AA, 2n=20), Brassica oleracea (CC, 2n=18) или Brassica nigra (BB, 2n=16). Это определение не включает сорные растения, такие как Arabidopsis thaliana.
[44] При использовании по тексту настоящего документа термин "растение рода Brassicay> относится к аллотетраплоидным или амфидиплоидным растениям Brassica napus (ААСС, 2n=38), Brassica juncea (ААВВ, 2n=36), Brassica carinata (BBCC, 2n=34), or to diploid Brassica rapa (syn. B. campestris) (AA, 2n=20), Brassica oleracea (CC, 2n=18) или Brassica nigra (BB, 2n=16).
[45] При использовании по тексту настоящего документа термин "культурный масличный рапс" относится к масличному рапсу, который растения, который выращивается как сельскохозяйственная культура, например, следующие виды: Brassica napus, Brassica juncea, Brassica carinata, Brassica rapa (syn. B. campestris), Brassica oleracea или Brassica nigra.
[46] Термин "нуклеотидная последовательность" (или "молекула нуклеиновой кислоты") относится к молекуле ДНК или РНК в одно- или двухцепочечной форме, в частности, ДНК, кодирующей белок или фрагмент белка согласно данному изобретению. Термин "эндогенная нуклеотидная последовательность" относится к нуклеотидной последовательности, которая встречается в естественных условиях в клетке растения, например, эндогенный аллель гена СКХЗ или СКХ5, который присутствует в ядерном геноме клетки Brassica. Термин "изолированная нуклеотидная последовательность" означает нуклеотидную последовательность, которая более не находится в своем природном окружении, например, находится in vitro или в рекомбинантной клетке-хозяине бактерии или растения.
[47] Термин "ген" означает последовательность ДНК, содержащую участок (транскрибируемый участок), который транскрибируется в молекулу РНК (например, пре-мРНК, содержащую интронные последовательности, которая затем сплайсируется в зрелую мРНК, или которая сплайсируется напрямую в мРНК, без интронных последовательностей) в клетке, функционально связанной с регуляторными участками (например, с промотором). Таким образом, ген может,
включать несколько функционально связанных последовательностей, таких, как промотор, 5'-лидерная последовательность, включающая, например, последовательности, участвующие в инициации трансляции, кодирующий (белок) участок (кДНК или геномную ДНК), а также З'-нетранслируемую последовательность, включающую, например, сайты терминации транскрипции. Термин "эндогенный ген" используется для проведения различия с чужеродными генами, трансгенами или химерными генами; термин "эндогенный ген" означает ген растения из определенного рода, вида или сорта растений, который не был введен в такое растение путем трансформации (т.е. не является трансгеном), но который обычно присутствует в растениях этого рода, вида или сорта растений, или который введен в такое растение из растений другого рода, вида или сорта растений, в котором он обычно присутствует, с помощью традиционных методов селекции или путем соматической гибридизации, например, путем слияния протопластов. Аналогичным образом, термин "эндогенный аллель" гена означает аллель, который не был введен в растение или ткань растения путем трансформации растения, но, например, создан путем мутагенеза растения и/или селекции или получен путем скриннинга природных популяций растений или путем генного таргетинга.
[48] "Экспрессия гена" или "генная экспрессия" означает процесс, в котором ДНК участок, который функционально связан с соответствующими регуляторными участками, в частности, с промотором, транскрибируется в молекулу РНК. Затем молекула РНК подвергается дальнейшему процессингу (с помощью посттранскрипционных процессов) в клетке, например, путем сплайсинга РНК и инициации трансляции и трансляции в аминокислотную цепочку (белок) и терминации трансляции с помощью стоп-кодонов трансляции. Термин "функционально связан" в настоящем документе используется для того, чтобы указать, что вырабатывается функциональный белок, термин "функционально не связан" используется для того, чтобы указать, что вырабатывается белок со сниженной функциональностью (биологической активностью) или нефункциональный белок, или что белок не вырабатывается (см. ниже).
[49] Термин "белок" относится к молекуле, состоящей из цепочки аминокислот, независимо от специфического механизм действия, размера, 3-мерной структуры или происхождения. Таким образом, белком могут именоваться "фрагмент" или "часть" белка СКХЗ или СК5. Термин "изолированный белок" означает белок, который более не находится в своем природном окружении, например, находится in vitro или в рекомбинантной клетке-хозяине бактерии или растения. Термин "аминокислоты" являются основными составными элементами белков и ферментов. Они встроены в белки путем переноса РНК в соответствии с генетическим кодом, при этом происходит расшифровка матричной РНК рибосомами. Во время конечной сборки белка и после нее, содержание аминокислот обуславливает пространственные и биохимические свойства белка или фермента. Аминокислотный каркас определяет первичную последовательность белка, однако свойства белка определяются характером боковых цепей. Термин "подобные аминокислоты" при использовании по тексту настоящего документа относится к аминокислотам, имеющим подобные боковые аминокислотные цепи, то есть аминокислотам, имеющим полярные, неполярные и практически нейтральные боковые цепи. Термин "не подобные аминокислоты" при использовании по тексту настоящего документа относится к аминокислотам, имеющим разные боковые аминокислотные цепи, например, аминокислота с полярной боковой цепью не подобна аминокислоте с неполярной боковой цепью. Полярные боковые цепи обычно присутствуют на поверхности белка, где они могут взаимодействовать с водной средой в клетках ("гидрофильные" аминокислоты). С другой стороны, неполярные аминокислоты обычно расположены в центральной части белка, где они могут взаимодействовать с подобными неполярными соседствующими аминокислотами ("гидрофобные" аминокислоты). Примерами аминокислот, имеющих полярные боковые цепи, могут быть аргинин, аспарагин, аспартат, цистеин, глутамин, глутамат, гистидин, лизин, серии и треонин (все гидрофильные, за исключением цистеина, который является гидрофобным). Примерами аминокислот, имеющих неполярные боковые цепи, могут быть аланин, глицин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин и триптофан (все гидрофобные, за исключением глицина, который является нейтральным).
[50] Термин "ген" в настоящем документе относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей белок цитокинин-оксидазы/дегидрогеназы (СКХ), который является ферментом (ЕС1.5.99.12 и ЕС1.4.3.18), с помощью которого происходит окислительное разложение цитокинина. Например, при распаде активного цитокинина типа изопентениладенина получается аденин и ненасыщенный альдегид, З-метил-2-бутенал. Ферменты СКХ являются FAD-зависимыми оксид азами.
[51] При использовании по тексту настоящего документа термин "аллель(и)" означает любую одну или любые несколько альтернативных форм гена в определенном локусе. В диплоидной (или амфидиплоидной) клетке организма, аллели определенного гена находятся в определенном месте или в локусе в хромосоме. Один аллель присутствует в каждой хромосоме пары гомологичных хромосом.
[52] При использовании по тексту настоящего документа термин "гомологичные хромосомы" означает, что хромосомы содержат информацию для тех же биологических характеристик и содержат те же гены, в тех же местах, однако другие аллели таких генов. Гомологичные хромосомы - это хромосомы, которые образуют пары в ходе мейоза. Негомологичные хромосомы, которые представляют все биологические характеристики организма, образуют набор, количество таких наборов в клетке называется плоидностью. Диплоидные организмы содержат два набора негомологичных хромосом, где каждая гомологичная хромосома унаследована от другого родителя. В амфидиплоидных видах присутствует, в основном, два набора диплоидных геномов, при этом хромосомы двух геномов именуются гомологичными хромосомами (и, аналогичным образом, локусы или гены двух геномов именуются гомологичными локусами или генами). Диплоидные или амфидиплоидые растительные виды могут включать в себя большое число различных аллелей в определенном локусе.
[53] При использовании по тексту настоящего документа термин "гетерозиготный" означает генетическое условие, когда два различных аллеля находятся в специфическом локусе, однако при этом они расположены индивидуально на
соответствующих парах гомологичных хромосом клетке. С другой стороны, при использовании по тексту настоящего документа термин "гомозиготный" означает генетическое условие, когда два идентичных аллеля находятся в специфическом локусе, однако при этом они расположены индивидуально на соответствующих парах гомологичных хромосом клетке.
[54] Термин "локус" означает определенное место или места, или участок на хромосоме, где находится, например, ген или генетический маркер. Например, выражение "локус СКХЗ-А1" относится к положению на хромосоме генома А, где находится ген СКХЗ-А1 (и два СКХЗ-А1 аллеля); выражение "локус СКХЗ-А2" относится к положению на хромосоме генома А, где находится ген СКХЗ-А2 ((и два СКХ-А2 аллеля), при этом выражение "локус СКХЗ-CI" относится к положению на хромосоме генома С, где находится ген СКХЗ-CI (и два СКХЗ-CI аллеля), и выражение "локус СКХЗ-С2" относится к положению на хромосоме генома С, где находится ген СКХЗ-С2 (и два СКХЗ-С2 аллеля). Аналогичным образом, выражение "локус СКХ5-А1" относится к положению на хромосоме генома А, где находится ген СКХ5-А1 (и два СКХ5-А1 аллеля), при этом выражение "локус СКХ5-С1" относится к положению на хромосоме генома С, где находится ген СКХ5-С1 (и два СКХ5-С1 аллеля).
[55] При упоминании по тексту термина "растение" или "растения" согласно данному изобретению подразумевается, что, за исключением случаев, когда прямо указано иное, настоящее изобретение также включает части растения (клетки, ткани или органы, семянки, семена, отделенные части, такие как корни, листья, цветки, пыльца и т.д.), потомство растений, которое сохраняет отличительные характеристики родителей (в особенности, характеристики, относящиеся к растрескиванию плодов), такое как семя, полученное путем самоопыления или скрещивания, например, гибридное семя (полученное путем скрещивания двух инбредных родительских линий), гибридные растения и части растений, полученный из таких растений.
[56] В настоящем документе выражение "молекулярный анализ" или "молекулярный тест" относится к анализу, с помощью которого осуществляется определение
(напрямую или косвенно) присутствия или отсутствия одного или нескольких СКХЗ ияиСКХ5 аллелей в одном или нескольких локусах СКХЗ или СКХ5 (например, для Brassica napus, в одном или нескольких локусах СКХЗ -Al, СКХЗ-А2, СКХЗ -С1, СКХЗ-С2, СКХ5-А1 или СКХ5-С1). В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения такой анализ позволяет определить является ли какой-либо СКХЗ и/или СКХ5 аллель (дикого типа или индуцированный вариант) является гомозиготным или гетерозиготным в этом локусе в отдельном растении.
[57] При использовании по тексту настоящего документа выражение "дикого типа" относится к типичной форме растения или гена, которая наиболее распространена в природе. Термин "растение дикого типа" относится к растению с наиболее распространенным фенотипом такого растения в природной популяции. Термин "аллель дикого типа" относится к аллелю гена, который необходим для получения фенотипа дикого типа. Напротив, термин "индуцированное вариантное растение" (или "мутантное растение") относится к растению с фенотипом, отличающимся от фенотипа такого растения в природной популяции, или к растению, которое было получено путем вмешательства человека, например, путем мутагенеза, а термин "индуцированный вариантный аллель" относится к аллелю гена, который требуется для получения вариантного (или мутантного) фенотипа.
[58] При использовании по тексту настоящего документа термин "СКХЗ дикого типа" означает природный СКХЗ аллель, который находится в растениях семейства Brassicaceae, в частности, в растениях рода Brassica, который кодирует функциональный белок СКХЗ. При использовании по тексту настоящего документа термин "СКХ5 дикого типа" означает природный СКХ5 аллель, который находится в растениях семейства Brassicaceae, в частности, в растениях рода Brassica, который кодирует функциональный белок СКХ5.
[59] Напротив, при использовании по тексту настоящего документа термин "вариантный СКХЗ" (или "индуцированный вариантный СКХЗ" или "мутантный СКХЗ") относится к СКХЗ аллелю, который не кодирует функциональный белок СКХЗ, т.е. СКХЗ аллель, кодирующий нефункциональный белок СКХЗ; при использовании по тексту настоящего документа термин "нефункциональный белок
СКХЗ" относится к белку СКХЗ без биологической активности или со существенно сниженной биологической активностью по сравнению с соответствующим функциональным белком СКХЗ дикого типа, или который совсем не кодирует белок СКХЗ. Такой "мутантный СКХЗ аллель" (также именуемый "нокаут-аллель" или "инактивированный аллель") представляет собой СКХЗ аллель дикого типа, который содержит одну или несколько мутаций в нуклеотидной последовательности, в результате чего мутации предпочтительно приводят к существенному снижению количества (абсолютного или относительного) функционального белка СКХЗ в клетке in vivo. При использовании по тексту настоящего документа термин "полностью инактивированный СКХЗ аллель" означает мутантный СКХЗ аллель, в результате присутствия которого обеспечивается, по меньшей мере, увеличение количества цветков и/или стручков на таком растении, в частности, на основном стебле такого растения (потенциально - в комбинации с другим СКХ аллелем, таким, например, как мутантный СКХ5 аллель). Аналогичным образом, при использовании по тексту настоящего документа термин "вариантный СКХ5" (или "индуцированный вариантный СКХ5" или "мутантный СКХ5") относится к СКХ5 аллелю, который не кодирует функциональный белок СКХ5, т.е. СКХ5 аллель, кодирующий нефункциональный белок СКХ5; при использовании по тексту настоящего документа термин "нефункциональный белок СКХ5" относится к белку СКХ5 без биологической активности или со существенно сниженной биологической активностью по сравнению с соответствующим функциональным белком СКХ5 дикого типа, или который совсем не кодирует белок СКХ5. Такой "мутантный СКХ5 аллель" (также именуемый "нокаут-аллель" или "инактивированный аллель") представляет собой СКХ5 аллель дикого типа, который содержит одну или несколько мутаций в нуклеотидной последовательности, в результате чего мутации предпочтительно приводят к существенному снижению количества (абсолютного или относительного) функционального белка СКХ5 в клетке in vivo. При использовании по тексту настоящего документа термин "полностью инактивированный СКХ5 аллель" означает мутантный СКХ5 аллель, в результате присутствия которого обеспечивается, по меньшей мере, увеличение количества
цветков и/или стручков на таком растении, в частности, на основном стебле такого растения (потенциально - в комбинации с другим СКХ аллелем, таким, например, как мутантный СКХЗ аллель).
[60] Мутантные аллели нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок СКХЗ, в настоящем документе обозначаются "скхЗ" (например, для Brassica napus, скхЗ-aI, скхЗ-а2, скхЗ-с! или скхЗ-с2, соответственно). Мутантные аллели нуклеотидных последовательностей, кодирующих белок СКХ5, в настоящем документе обозначаются "скх5" ((например, для Brassica napus, ckx5-al шшскх5-с1, соответственно). Мутантные аллели могут представлять собой "природные мутантные аллели", т.е. мутантные аллели, которые встречаются в природе (например, которые получены самопроизвольно, без применения человеком мутагенов) или "индуцированные мутантные аллели", которые введены при вмешательстве человека, например, путем мутагенеза.
[61] Термин "полностью инактивированный мутантный СКХЗ аллель" означает, например, СКХЗ аллель дикого типа, который содержит одну или несколько мутаций в нуклеотидной последовательности, например, одну или несколько нонсенс-мутаций или миссенс-мутаций. В частности, такой полностью инактивированный мутантный СКХЗ аллель представляет собой СКХЗ аллель дикого типа, который содержит мутацию, в результате которой предпочтительно обеспечивается получение белка СКХЗ или укороченного белка СКХЗ, в котором отсутствует, по меньшей мере, один консервативный мотив, например, сигнальный пептид, содержащий аминокислотные радикалы в положениях, соответствующих положениям 1-31 AtCKX3 (SEQ Ш NO: 3); FAD-связывающая область, содержащая радикалы в положениях, соответствующих положениям 66 - 243 AtCKX3 (SEQ Ш NO: 3); FAD-связывающие аминокислотные радикалы, содержащие аминокислоты в положениях, соответствующих положениям 100 - 104 AtCKX3 (SEQ Ш NO: 3); FAD-связывающие аминокислотные радикалы, содержащие аминокислоты в положениях, соответствующих положениям 105 - 106 AtCKX3 (SEQ Ш NO: 3); FAD-связывающий гистидин в положении, соответствующем положению 105 АгСКХЗ (SEQ Ш NO: 3); FAD-связывающая аминокислота в положении, соответствующем
положению ПО AtCKX3 (SEQ Ш NO: 3); FAD-связывающая аминокислота в положении, соответствующем положению 167 AtCKX3 (SEQ Ш NO: 3); FAD-связывающая аминокислота в положении, соответствующем положению 172 AtCKX3 (SEQ Ш NO: 3); FAD-связывающие аминокислоты в положениях, соответствующих положениям 178 - 182 AtCKX3 (SEQ Ш NO: 3); FAD-связывающая аминокислота в положении, соответствующем положению 233 AtCKX3 (SEQ Ш NO: 3); FAD-связывающая аминокислота в положении, соответствующем положению 476 AtCKX3 (SEQ Ш NO: 3); цитокинин-связывающие аминокислоты в положениях 244 - 517 AtCKX3 (SEQ Ш N0:3); мотив GIWeVPFIPWLNL в положениях, соответствующих положениям 374 - 385 AtCKX3 (SEQ Ш N0: 3) или мотиву PGQxIF в положениях, соответствующих положениям 512 - 517 AtCKX3 (SEQ Ш N0: 3), таким образом, что биологическая активность белка СКХЗ снижается или полностью подавляется, или в результате таких мутаций предпочтительно обеспечивается существенное снижение количества функционального белка СКХЗ или к отсутствию производства белка СКХЗ. Последнее может быть обеспечено путем удаления всей нуклеотидной последовательности, кодирующей СКХЗ, или с помощью делеций, включающих 5'-конец СКХЗ-кодирующей области.
[62] Термин "полностью инактивированный мутантный СКХ5 аллель" означает, например, СКХ5 аллель дикого типа, который содержит одну или несколько мутаций в нуклеотидной последовательности, например, одну или несколько нонсенс-мутаций или миссенс-мутаций. В частности, такой полностью инактивированный мутантный СКХ5 аллель представляет собой СКХ5 аллель дикого типа, который содержит мутацию, в результате которой предпочтительно обеспечивается получение белка СКХ5 или укороченного белка СКХ5, в котором отсутствует, по меньшей мере, один консервативный мотив, например, сигнальный пептид, содержащий аминокислотные радикалы в положениях, соответствующих положениям 1-24 AtCKX3 (SEQ Ш N0: 6); FAD-связывающая область, содержащая радикалы в положениях, соответствующих положениям 63 - 241 AtCKX5 (SEQ Ш N0: 6); FAD-связывающие аминокислотные радикалы, содержащие аминокислоты в положениях, соответствующих положениям 97-101 AtCKX5 (SEQ Ш N0: 6); FAD
связывающие аминокислотные радикалы, содержащие аминокислоты в положениях, соответствующих положениям 102 - 103 AtCKX5 (SEQ Ш NO: 6); FAD-связывающий гистидин в положении, соответствующем положению 102 AtCKX5 (SEQ Ш NO: 6); FAD-связывающая аминокислота в положении, соответствующем положению 107 AtCKX5; FAD-связывающая аминокислота в положении, соответствующем положению 165 AtCKX5 (SEQ Ш NO: 6); FAD-связывающая аминокислоту в положении, соответствующем положению 170 AtCKX5 (SEQ Ш NO: 6); FAD-связывающие аминокислоты в положениях, соответствующих положениям 176 - 180 AtCKX5 (SEQ Ш NO: 6); FAD-связывающая аминокислота в положении, соответствующем положению 231 AtCKX5 (SEQ Ш NO: 6); FAD-связывающая аминокислота в положении, соответствующем положению 479 AtCKX5 (SEQ Ш NO: 6); цитокинин-связывающие аминокислоты в положениях 242 - 520 AtCKX5 (SEQ Ш N0:6); мотив GrWeWHPWLNL в положениях, соответствующих положениям 374 -385 AtCKX5 (SEQ Ш NO: 6) или мотиву PGQxIF в положениях, соответствующих положениям 515 - 520 AtCKX5 (SEQ Ш NO: 6), таким образом, что биологическая активность белка СКХ5 снижается или полностью подавляется, или в результате таких мутаций предпочтительно обеспечивается существенное снижение количества функционального белка СКХ5 или к отсутствию производства белка СКХ5. Последнее может быть обеспечено путем удаления всей нуклеотидной последовательности, кодирующей СКХ5, или с помощью делеций, включающих 5'-конец СКХ5-кодирующей области.
[63] Согласно настоящему изобретению выражения "соответствующее положение" или "положение, соответствующее положению" означает, что в положении с указанным номером нуклеотиды/аминокислоты могут быть отличными, однако соседние нуклеотиды/аминокислоты являются идентичными. Указанные нуклеотиды/аминокислоты, замена, делеция или вставка которых может осуществляться, также охватываются термином "соответствующее положение". Эталонной последовательностью может быть последовательность АгСКХЗ или AtCKX5 из Arabidopsis thaliana. Сведения по соответствию между эталонными последовательностями белков СКХЗ и СКХ5 из Arabidopsis thaliana и
аминокислотными последовательностями белков СКХЗ и СКХ5 из Brassica napus в соответствии с примерами приведены в Таблицах 1 и 2.
[64] Для того, чтобы установить, соответствует ли определенный нуклеотид или аминокислотный радикал в определенной нуклеотид ной/аминокислотной последовательности СКХЗ или СКХ5 определенному положению в другой нуклеотидной или аминокислотной последовательности СКХЗ или СКХ5, специалисты могут использовать известные средства и способы, например, средства выравнивания последовательностей, вручную или с использованием компьютерных программ, таких как BLAST (Altschul et al. (1990), Journal of Molecular Biology, 215, 403-410); "BLAST" означает "Basic Local Alignment Search Tool", т.е. "средство поиска основного локального выравнивания" или ClustalW (Thompson et al. (1994), Nucleic Acid Res., 22, 4673-4680) или с использованием любой другой программы, которая может применяться для выравнивания последовательностей. Выравнивание аминокислотных последовательностей СКХЗ и СКХ5 Arabidopsis и Brassica приведено, например, в Фиг. 1 - 3.
[65] Выражение "существенно уменьшенное количество функционального белка СКХЗ или СКХ5" относится к уменьшению количества функционального белка СКХЗ или СКХ5, соответственно, которое вырабатывается клеткой, включающей мутантный СКХ аллель, по меньшей мере, на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% (т.е. когда функциональный белок СКХЗ или СКХ5 клеткой не вырабатывается) по сравнению с количеством функционального белка, которое вырабатывается клеткой, не содержащей мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля. Это определение включает производство "нефункционального" белка СКХЗ или СКХ5 (например, укороченного белка СКХЗ или СКХ5), который не имеет биологической активности in vivo, снижение абсолютного количества функционального белка СКХЗ или СКХ5 (например, случай, когда функциональный белок СКХЗ или СКХ5 не вырабатывается из-за мутации в гене СКХЗ или СКХ5), производство белка СКХЗ или СКХ5 с существенно сниженной биологической активностью по сравнению с активностью функционального белка дикого типа (например, белка СКХЗ или СКХ5, в котором один или несколько аминокислотных радикалов, которые имеют
критическое значения для биологической активности кодированного белка СКХЗ или СКХ5, замещены другими аминокислотными радикалами), и/или с отрицательным эффектом доминантных отрицательных белков СКХЗ или СКХ5 на другие функциональные и/или частично функциональные белки СКХЗ или СКХ5.
[66] При использовании по тексту настоящего документа термин "мутантный белок СКХЗ или СКХ5" относится к белку СКХЗ или СКХ5, кодированному мутантной нуклеотидной последовательностью СКХЗ или СКХ5 ("скхЗ или скх5 аллель"), при этом в результате такой мутации обеспечивается существенное снижение или полное подавление активности СКХЗ или СКХ5 in vivo по сравнению с активностью белка СКХЗ или СКХ5, кодированного немутантной последовательностью СКХЗ или СКХ5 дикого типа ("СКХЗ аллель" и, соответственно, "СКХ5 аллель").
[67] При использовании по тексту настоящего документа термин "мутагенез" или "индуцированная вариация" относится к процессу, при котором клетки растений (например, множество клеток семян или клеток других частей, например, пыльцы и т.д. растений рода Brassica) подвергаются воздействию с использованием техники, вызывающей мутации в ДНК клеток, такой, например, как контакт с мутагенным агентом, таким как, например, химическое вещество (например, этилметилсульфонат (EMS), этилнитрозомочевина (ENU), и т.д.) или ионизирующее излучение (нейтронами (например, мутагенез с использованием быстрых нейтронов и т.д.), альфа-излучение, гамма-излучение (например, излучение, которое генерируется источником с кобальтом 60), рентгеновское излучение, ультрафиолетовое излучение и т.д.) или комбинация двух или нескольких таких техник. Таким образом, необходимый мутагенез одного или несколько СКХ аллелей может быть обеспечен с применением химических средств, таких как воздействие на одну или несколько тканей растений этилметилсульфонатом (EMS), этилнитрозомочевиной и т.д., физическими средствами, такими как рентгеновское излучение и т.д. или гамма-излучением, например, гамма-излучением, которое генерируется источником с кобальтом 60. В то время как мутации, полученные с использованием облучения, зачастую вызывают большие делеции или другие обширные поражения, такие как транслокации или сложные перестройки, мутации, полученные с использованием
химических мутагенов, зачастую обеспечивают местные поражения, такие как точечные мутации. Например, EMS алкилирует гуаниновые основания, что приводит к ошибочному спариванию оснований: алкилированный гуанин спаривается с тиминовым основанием, что обычно приводит к транзициям G/C в А/Т. После мутагенеза осуществляется получение растений рода Brassica из обработанных клеток с использованием известных техник. Например, может осуществляться посев полученных семян растений рода Brassica в соответствии с традиционными способами выращивания растений, после самоопыления на таких растениях образуются семена. В качестве альтернативы, может осуществляться экстрагирование удвоенных гаплоидных саженцев для непосредственного образования гомозиготных растений, например, в соответствии с описанием в публикации Coventry et al. (1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canada). Может осуществляться сбор дополнительных семян, которые образуются в результате такого самоопыления в настоящем поколении или в будущих поколениях, а также их скриннинг на присутствие мутантных СО" аллелей. Известны различные техники скриннинга для получения специфических мутантных аллелей, например, в методе Deleteagene(tm) (Delete-a-gene; Li et al., 2001, Plant J 27: 235-242) используется анализ на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) для скриннинга делеционных мутантов, которые получены путем мутагенеза с использованием быстрых нейтронов, в методе TILLING (поиск индуцированных локальных нарушений в геномах; McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol 18:455-457) осуществляется идентификация EMS-индуцированных точечных мутаций и т.д. Дополнительные техники, которые могут быть использованы для скриннинга и определения присутствия специфических мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, описаны в разделе "Примеры". Мутагенез может включать неспецифический мутагенез или может включать нацеленный мутагенез. Мутагенез может привести к эпимутациям, которые вызывают эпигенетический сайленсинг.
[68] Термин "генный таргетинг" в настоящем документе означает к направленной модификации генов, в которой используется такие механизмы, как гомологическая
рекомбинация, исправление ошибок спаривания или сайт-специфический мутагенез. Этот способ может использоваться для замены, вставки и удаления эндогенных последовательностей или последовательностей, которые были ранее введены в клетки растения. Способы генного таргетинга описаны, например, в WO 2006/105946 или WO2009/002150.
[69] При использовании по тексту настоящего документа термина "не встречающийся в природе" или "культурный" в отношении растения он означает растение, геном которого были изменен человеком. Например, трансгенное растение представляет собой растение, не встречающееся в природе, которое содержит молекулу экзогенной нуклеиновой кислоты, например, химерный ген, содержащий транскрибированную область, которая при транскрипциии дает биологически активную молекулу РНК, которая способна снизить экспрессию эндогенного гена, например, ген СКХЗ или СКХ5, и, следовательно, которое является генетически модифицированным человеком. Кроме того, растение, которое содержит мутацию в эндогенном гене, например, мутацию в эндогенном гене СКХЗ или СКХ5 (например, в регуляторном элементе или в кодирующей последовательности) в результате воздействия мутагенного агента, также считается растением, не встречающимся в природе, так как такое растение является генетически модифицированным человеком. Кроме того, растение определенного вида, например, Brassica napus, которое содержит мутацию в эндогенном гене, например, в эндогенном гене СКХЗ или СКХ5, и при этом такая мутация не встречается в этом виде растения в природе, в результате, например, применения направленных процессов скрещивания, таких как, например, скрещивание с использованием маркера и селекция или интрогрессия, в отношении растения этого же вида или другого вида, такого как Brassica juncea или rapa, то такое растение также считается растением, не встречающимся в природе. Напротив, растение, содержащее лишь спонтанные или природные мутации, т.е. растение не было генетически модифицировано человеком, не является растением, не встречающимся в природе, в соответствии с определением в настоящем документе, следовательно, настоящее изобретение не включает такие растения. Специалистам понятно, что, при том, что растения, не встречающиеся в природе, как правило,
включает измененную нуклеотидную последовательность относительно нуклеотидной последовательности растения, встречающегося в природе, такие растения, не встречающиеся в природе, также могут быть генетически модифицированы человеком без изменения нуклеотидной последовательности, например, путем модификации паттерна метилирования.
[70] Термин "ортолог" гена или белка в настоящем документе относится к гомологичному гену или белку, который находится в другом виде, и который имеет ту же функцию, что и соответствующий ген или белок, но (обычно) последовательность которого отличается с того времени, когда происходит разделение видов, имеющих такие гены (т.е. гены видов, эволюционировавших от общего предка в результате видообразования). Таким образом, ортологи генов СКХЗ or СКХ5 Brassica napus могут быть идентифицированы в других видах растений (например, в других видах растений, имеющих стручки, такие как растения семейств Brassicaceae или Fabaceae, например, в видах рода Phaseolus, или в сое (Glycine max)) на основании сравнения последовательностей (например, на основании процента идентичности последовательности при сравнении всей последовательности или отдельных доменов) и/или на основании функционального анализа.
[71] Термин "сорт" в настоящем документе используется в соответствии с Международной конвенцией по охране новых сортов растений (УЛОВ) и относится к группе растений в одном ботаническом таксоне низшего известного уровня, при этом такая группа может определяться экспрессией характеристик, полученных из определенного генотипа или комбинации генотипов, она отличается от любой другой группы растений экспрессией, по меньшей мере, одной из указанных характеристик, и она рассматривается как единство в отношении возможности размножения без изменений (стабильная группа).
[72] При использовании по тексту настоящего документа термины "содержащий" и "включающий" указывают на присутствие заявленных частей, этапов или компонентов, однако не исключают присутствия одной или нескольких дополнительных частей, этапов или компонентов. Таким образом, растение,
имеющее определенную характеристику, может иметь дополнительные характеристики.
[73] По тексту настоящего документа единственное число терминов (например, "растение" или "корень") включает также множественное число (например, "несколько растений" или "несколько корней"). Таким образом, при упоминании по тексту настоящего документа какого-либо элемента в единственном числе подразумевается также, что может присутствовать несколько таких элементов, за исключением случаев, когда из контекста очевидно следует, что присутствует лишь один такой элемент. Таким образом, например, "любой X", как правило, означает "по меньшей мере один X" или "один или несколько X".
[74] Для целей изобретения термин "идентичность последовательности" двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, выраженная в процентном соотношении, относится к количеству положений в двух оптимально выравниваемых последовательностях с идентичными остатками, которое умножается на сто и делится на количество сравниваемых положений. Разрыв, то есть положение в выравнивании, где в одной последовательности какой-либо остаток присутствует, а в другой отсутствует, рассматривается как положение с неидентичными остатками. Термин "оптимальное выравнивание" двух последовательностей определяется путем выравнивания двух последовательностей по всей длине в соответствии с алгоритмом глобального выравнивания Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53) in The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS, Rice et al, 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277; see e.g. http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) с использованием установок по умолчанию (штраф на внесение делеции =10 (для нуклеотидов) /10 (для белков) и штраф за продолжение делеции = 0.5 (для нуклеотидов) / 0,5 (для белков)). Для нуклеотидов по умолчанию используется матрица замен EDNAFULL, а для белков - EBLOSUM62.
[75] При использовании по тексту настоящего документа термин "практически идентичный" или "в значительной степени подобный" относится к
последовательностям, которые, при оптимальном выравнивании в соответствии с определением выше, имеют, по меньшей мере, определенный минимальный процент идентичности последовательности (в соответствии с определением ниже).
[76] "Жесткие условия гибридизации" используются для идентификации нуклеотидных последовательностей, которые существенно идентичны с определенной нуклеотидной последовательностью. Жесткость условий зависит от определенной последовательности и в различных случаях будет различной. Обычно жесткие условия означает следующее: температура составляет на 5°С ниже точки плавления (Тт) для определенной последовательности при определенной ионной силе и рН. Тш - это температура (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% целевой последовательности гибридизирует с подобранным зондом. Обычно строгие условия будут выбраны таким образом, что концентрация солей составляет приблизительно 0,02 моль при рН 7 и температуре, по меньшей мере, 60°С. Снижение концентрации солей и/или повышение температуры увеличивает жесткость условий. Жесткие условия для РНК-ДНК гибридизации (нозерн-блоттинг с использованием, например, зонда длиной 100 нуклеотидов) представляют собой, например, такие условия, которые включают, по меньшей мере, одну промывку в 0,2 х SSC при 63°С в течение 20 минут, или эквивалентные условия.
[77] "Условия высокой жесткости" могут быть обеспечены путем, например, гибридизации при 65 °С в водном растворе, содержащем 6х SSC (стандартный солевой раствор) (в состав 20 X SSC входят 3,0 М NaCl, 0,3 М N-цитрата, значение рН 7,0), 5х раствор Денхардта (в состав 100Х раствора Денхардта входят 2% фиколл, 2% поливинилпирролидона, 2% альбумина бычьей сыворотки), 0,5% додецилсульфата натрия (SDS) и 20 цг/мл денатурированного ДНК-носителя (одноцепочечной ДНК из молок рыбы, со средней длиной 120 - 3000 нуклеотидов) в качестве неспецифического конкурирующего средства. После гибридизации может осуществляться промывка при условиях высокой жесткости в ходе нескольких этапов, конечная промывка (приблизительно 30 мин.) осуществляется при температуре гибридизации в 0,2-0,lx SSC, 0,1% SDS.
[78] Термин "условия умеренной жесткости" относится к условиям аналогичным условиям гибридизации в вышеописанным растворе, при температуре приблизительно 60-62 °С. Промывка при условиях умеренной жесткости может осуществляться при температуре гибридизации в lx SSC, 0,1% SDS.
[79] Термин "условия низкой жесткости" относится к условиям аналогичным условиям гибридизации в вышеописанным растворе, при температуре приблизительно 50-52 °С. Промывка при условиях низкой жесткости может осуществляться при температуре гибридизации в 2х SSC, 0,1% SDS. См. также Sambrook et al. (1989) и Sambrook and Russell (2001).
[80] Термины "увеличение урожайности" или "увеличенный выход семян" или "увеличенный выход зерен" относятся к получению большего количества семян или зерен, которое собрано с множества растений, каждое из которых включает мутантныеСОЗ или СКХЫСКХ5 аллели по настоящему изобретению, по сравнению с количеством семян или зерен, которое собрано с такого же количества изогенных растений, не содержащих мутантные СКХ5 или СКХЫСКХ5 аллели. Урожайность, как правило, выражается в единицах объема (объема собранных семян или зерен) на единицы площади, например, в бушелях на акр или кг/га (тем не менее, могут быть использованы другие единицы, например, грамм на делянку или даже грамм на растение). Увеличение урожайности, как правило, выражается в процентном отношении, при этом урожайность эталонного или контрольного растения принимается за 100% урожайность, а урожайность растений по настоящему изобретению выражается в процентах от урожайности контрольного растения. Увеличение урожайности может составлять, по меньшей мере, 101%, по меньшей мере, 102%, по меньшей мере, 103%, по меньшей мере, 105%, по меньшей мере, 108% или, по меньшей мере, 110%.
[81] Термин "масса тысячи семян" (TSW) относится к массе 1000 семян или зерен в граммах. Термин "увеличение массы тысячи семян" относится к большей массе 1000 семян или зерен, которые собраны с растений, которые включают мутантные СКХ5 или СКХЫСКХ5 аллели по настоящему изобретению, по сравнению с массой 1000
семян или зерен, собранных с такого же количества изогенных растений, не содержащих мутантные СКХ5 или CKX3ICKX5 аллели.
[82] Термины "увеличенное количество цветков" или "увеличенное количество цветков на основном стебле" относятся к получению большего количества цветков на растениях или, соответственно, большего количества цветков на основном стебле растений, которые включают мутантные СКХ5 или CKX3ICKX5 аллели по настоящему изобретению, по сравнению с количеством цветков на растениях или, соответственно, количеством цветков на основном стебле растений, предпочтительно изогенных растений, не содержащих мутантные СКХ5 или CKX3ICKX5 аллели.
[83] Термины "увеличенное количество стручков" или "увеличенное количество стручков на основном стебле" относятся к получению большего количества стручков на растениях или, соответственно, большего количества стручков на основном стебле растений, которые включают мутантные СКХ5 или CKX3ICKX5 аллели по настоящему изобретению, по сравнению с количеством стручков на растениях или, соответственно, количеством стручков на основном стебле растений (например, изогенных растений), не содержащих мутантные СКХ5 или СКХЫСКХ5 аллели.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[84] Растение Brassica napus (геном ААСС, 2п=4х=38), которое является аллотетраплоидным (амфидиплоидным) видом, содержащим, в основном, два диплоидных генома (геном А и С) из-за происхождения от диплоидных предшественников. Растение Brassica napus включает четыре гена СКХЗ в геноме; два гена СКХЗ расположены в геноме А (в дальнейшем именуются СКХЗ-А1 и СКХЗ-А2), и два гена СКХЗ расположены в геноме С (в дальнейшем именуются СКХЗ-CI и СКХЗ-С2). Растение Brassica napus также включает два гена СКХ5 в геноме; один ген СКХ5 расположен в геноме А (в дальнейшем именуются СКХ5-АТ), и один ген СКХ5 расположены в геноме С (в дальнейшем именуются СКХ5-С1). Авторами изобретения было обнаружено, что в результате присутствия мутантных аллелей СКХ5 или мутантных аллелей СКХ5 и СКХЗ увеличивается количество цветков на
растение, в частности, количество цветков на основном стебле. Кроме того, может быть увеличено количество стручков на основном стебле, а также количество семян на стручок на основном стебле. Также может быть обеспечено увеличение массы тысячи семян (TSW), в частности, увеличение TSW без существенного отрицательного эффекта на выход семян.
[85] Настоящее изобретение относится к растениям рода Brassica, в которых экспрессия СКХ5 или СКХ5 и СКХЗ функционально снижена. Функционально сниженная экспрессия может выражаться в снижении производства белка СКХЗ/СКХ5 и/или его активности.
[86] Таким образом, в соответствии с первым аспектом предоставляется растение рода Brassica, содержащее, по меньшей мере, один ген, предпочтительно два гена СКХ5, отличающееся тем, оно включает, по меньшей мере, один мутантный СКХ5 аллель в геноме. В соответствии с еще одним аспектом предоставляется растение рода Brassica, содержащее, по меньшей мере, один ген СКХ5 и, по меньшей мере, два гена СКХЗ, предпочтительно два гена СКХ5 и четыре гена СКХЗ, отличающееся тем, оно включает, по меньшей мере, один мутантный СКХ5 аллель и один мутантный СКХЗ аллель в геноме.
[87] В соответствии с еще одним аспектом изобретения мутантный СКХЗ аллель является мутантным аллелем гена СКХЗ, включающим нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих последовательностей:
нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ Ш N0: 7, SEQ Ш N0: 10; SEQ Ш N0: 13 или SEQ Ш N0: 16;
нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ID N0: 8, SEQ ГО N0: 11; SEQ ГО N0: 14 или SEQ ГО N0: 17; и
нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ID N0: 9, SEQ ГО N0: 12; SEQ ГО N0: 15 или SEQ ГО N0: 18; и
мутантный СКХ5 аллель является мутантным аллелем гена СКХ, включающим нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих последовательностей:
нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 19 или SEQ ГО N0: 23; нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 20 или SEQ ГО N0: 23; и нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 21 или SEQ ГО N0: 24.
[88] В соответствии с еще одним аспектом изобретения растение по настоящему изобретению представляет собой растение рода Brassica, содержащее два гена СКХ5 и четыре гена СКХЗ, при этом указанное растение рода Brassica выбрано из группы, состоящей из Brassica napus, Brassica juncea и Brassica carinata. В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения растение по настоящему изобретению включает, по меньшей мере, два мутантных СКХ5 аллеля или, по меньшей мере, три мутантных СКХ5 аллеля или четыре мутантных СКХ5 аллеля или, по меньшей мере, два, три или четыре мутантных СКХ5 аллеля и три мутантных СКХЗ или, по меньшей мере, четыре мутантных СКХЗ аллеля или, по меньшей мере, пять мутантных СКХЗ аллелей или, по меньшей мере, шесть мутантных СКХЗ аллелей или, по меньшей мере, семь мутантных СКХЗ аллелей или, по меньшей мере, восемь мутантных СКХЗ аллелей.
[89] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения растения по настоящему изобретению содержат мутантный СКХ5 аллель, выбранный из группы, состоящей из следующих аллелей:
мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ Ш N0: 19 или положению 465 SEQ ID N0: 20;
мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 399 SEQ Ш N0: 19 или положению 399 SEQ Ш N0: 20;
мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ Ш N0: 22 или положению 399 SEQIDNO: 23;
или растения содержат мутантный СКХЗ аллель, выбранный из группы, состоящей из
следующих аллелей:
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2244 SEQ Ш N0: 7 или положению 1093 SEQ ID N0: 8;
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2482 SEQ Ш N0: 10 или положению 1168 SEQIDNO: 11;
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 1893 SEQ Ш N0: 13 или положению 876 SEQ ID N0: 14;
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2171 SEQ Ш N0: 16 или положению 982 SEQIDNO: 17.
[90] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения растения по настоящему изобретению содержат, по меньшей мере, один вариантный СКХ5 белок, при этом такой вариантный СКХ5 белок состоит из аминокислотной
последовательности, выбранной из группы, состоящей из следующих последовательностей:
- аминокислотная последовательность SEQ Ш N0: 29;
- аминокислотная последовательность SEQ Ш N0: 30; или
- аминокислотная последовательность SEQ Ш N0: 31.
[91] Растения по настоящему изобретению в дополнение к вариантному СКХ5 белку могут содержать, по меньшей мере, один вариантный СКХЗ белок, при этом такой вариантный СКХЗ белок состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из следующих последовательностей:
- аминокислотная последовательность SEQ Ш N0: 25;
- аминокислотная последовательность SEQ Ш N0: 26;
- аминокислотная последовательность SEQ Ш N0: 27; или
- аминокислотная последовательность SEQ Ш N0: 28.
[92] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения указанное растение является гомозиготным для мутантного СКХ5 аллеля или является гомозиготным для обоих аллелей: мутантного СКХ5 аллеля и мутантного СКЗ аллеля. В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения указанное растение имеет увеличенное количество цветков на растение. В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения указанное растение имеет увеличенное количество стручков на растение. В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения указанное растение имеет увеличенную массу тысячи семян.
[93] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения предоставляется клетка растения, стручок, семя или потомство растения по настоящему изобретению.
[94] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения предоставляется растение рода Brassica, в котором снижена экспрессия, по меньшей
мере, одного гена СКХ5 или, по меньшей мере, одного гена СКХ5 и, по меньшей мере, одного гена СКХЗ. Экспрессия может быть снижена, например, путем введения химерного гена в указанное растение, содержащее область ДНК, которая дает молекулу РНК или белка, которая подавляет экспрессию одного или нескольких генов СКХ5 или СКХ5 и СКХЗ. В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения предоставляется химерный ген, включающий следующие функционально связанные фрагменты ДНК:
i. промотор, экспрессируемый в растениях;
ii. область ДНК, которая при транскрипции дает молекулу РНК или белка, которая подавляет экспрессию одного или нескольких кодирующих генов СКХ5 или СКХ5 и СКХЗ; и, при необходимости,
iii. 3'-концевая область, участвующая в терминации транскрипции и полиаденилировании.
[95] Указанная область ДНК может дать молекулу смысловой РНК, способную подавлять экспрессию одного или нескольких генов СКХ5 или СКХЗ путем косупрессии. После транскрипции из транскрибированной области ДНК будет получена молекула так называемой смысловой РНК, которая способна снизить экспрессию гена СКХ5 или СКХЗ в целевом растении или клетке растения транскрипционным или посттранскрипционным образом. Транскрибированная область ДНК (и полученная молекула РНК) содержит, по меньшей мере, 19 или 20 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере, с 95% идентичности последовательности, предпочтительно с полной идентичностью последовательности с частью нуклеотидной последовательности одного или нескольких функциональных генов СКХ5 или СКХЗ, присутствующих в клетке растения или в растении. Таким образом, такая область ДНК может содержать, по меньшей мере, 19 или 20 последовательных нуклеотидов следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID N0: 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16 или 17 для РНК, подавляющей СКХЗ, и/или SEQ ГО NO: 19, 20, 22 или 23 для РНК, подавляющей СКХ5.
[96] Указанная область ДНК может дать молекулу антисмысловой РНК, способную подавлять экспрессию одного или нескольких генов СКХ5 или СКХЗ. После транскрипции из транскрибированной области ДНК будет получена молекула так называемой антисмысловой РНК, которая способна снизить экспрессию гена СКХ5 или СКХЗ в целевом растении или клетке растения транскрипционным или посттранскрипционным образом. Транскрибированная область ДНК (и полученная молекула РНК) содержит, по меньшей мере, 20 последовательных нуклеотидов, по меньшей мере, с 95% идентичности последовательности с комплементарной цепью нуклеотидной последовательности одного или нескольких функциональных генов СКХ5 или СКХЗ, присутствующих в клетке растения или в растении. Таким образом, такая область ДНК может содержать, по меньшей мере, 19 или 20 последовательных нуклеотидов комплементарной цепи следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID N0: 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16 или 17 для РНК, подавляющей СКХЗ, и/или SEQ ГО N0: 19, 20, 22 или 23 для РНК, подавляющей СКХ5.
[97] Минимальная нуклеотидная последовательность антисмысловой или смысловой области РНК длиной приблизительно 20 нуклеотидов гена СКХ5 или СКХЗ может содержаться в молекуле РНК большего размера, длина которой может варьироваться от 20 нуклеотидов до длины равной размеру целевого гена. Таким образом, длина указанных антисмысловых или смысловых нуклеотидных областей может составлять приблизительно от 21 нуклеотидов до приблизительно 1300 нуклеотидов, например, 21 нуклеотид, 40 нуклеотидов, 50 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 200 нуклеотидов, 300 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов или даже приблизительно 1300 нуклеотидов или больше. Более того, для целей настоящего изобретения не требуется, чтобы нуклеотидная последовательность используемой ингибиторной СКХ5 или СКХЗ РНК-молекулы или кодирующей области трансгена была полностью идентичной или комплементарной к эндогенному гену СКХ5 или СКХЗ, экспрессия которого в клетке растения должна быть снижена. Чем больше длина последовательности, тем меньше жесткость условий для идентичности всей последовательности. Таким образом, общая идентичность последовательности смысловых или антисмысловых областей с нуклеотидной последовательностью
эндогенного гена СКХ5 или СКХЗ или его комплементарной цепи может составлять приблизительно 40 % или 50 % или 60 % или 70 % или 80 % или 90 % или 100 %. Тем не менее, как было указано, антисмысловые или смысловые области должны содержать нуклеотидную последовательность из 20 последовательных нуклеотидов приблизительно с 95 - 100 % идентичностью последовательности относительно нуклеотидной последовательности эндогенного гена СКХ5 или СКХЗ. Такая идентичность последовательности, составляющая приблизительно 95 - 100%, может распространяться приблизительно на 50, 75 или 100 нуклеотидов. Очевидно, что могут быть использованы все комбинации указанных значений длины и идентичности последовательности, как в смысловой, так и в антисмысловой ориентации.
[98] Эффективность вышеуказанных химерных генов для понижающей регуляции уровня генной экспрессии, опосредованной антисмысловой или смысловой РНК, может также быть усилена включением элементов ДНК, что приведет к экспрессии аберрантных, не полиаденилированных ингибиторных молекул РНК СКХ5 или СКХЗ. Одним таким ДНК-элементом, который может использоваться для такой цели, является область ДНК, кодирующая самосплайсирующий рибозим в соответствии с описанием в документе WO 00/01133. Эффективность также может быть усилена с помощью полученных молекул РНК с ядерной локализацией или с сигналами удержания в соответствии с описанием в документе WO 03/076619.
[99] Из указанной области ДНК может быть получена молекула двухцепочечной РНК, способную подавлять экспрессию генов СКХ5 или СКХЗ. После транскрипции области ДНК РНК способна образовывать молекулу дсРНК путем традиционного спаривания оснований между смысловой и антисмысловой областью, при этом смысловая и антисмысловая области являются нуклеотидными последовательностями в соответствии с описанием в настоящем документе выше. Химерные гены, кодирующие дсРНК, снижающие экспрессию СКХ5 или СКХЗ, по настоящему изобретению могут также содержать интрон, например, гетерологичный интрон, расположенный, например, в спейсерной области между смысловой и
антисмысловой областью РНК в соответствии с описанием в документе WO 99/53050 (который включен в настоящую заявку посредством ссылки). Для того, чтобы обеспечить создание такого трансгена можно использовать векторы, описанные в документе WO 02/059294 А1.
[100] Указанная область ДНК также может дать молекулу пре-миРНК, которая преобразуется в миРНК, способную направлять расщепление мРНК СКХ5 или СКХЗ. миРНК - это эндогенные РНК малого размера, которые регулируют генную экспрессию в растениях, а также в других эукариотах. В растениях процессинг таких РНК, имеющих длину приблизительно 21 нуклеотид, осуществляется из областей типа "стебель - петля" длинных эндогенных пре-миРНК с помощью активности расщепления DICERLIKE 1 (DCL1). миРНК растений являются высоко комплементарными к консервативным целевым мРНК и направляют расщепление целей. Представляется, что миРНК являются ключевыми компонентами в регулировании генной экспрессии сложных систем путей, участвующих в развитии, помимо прочего.
[101] При использовании по тексту настоящего документа термин "миРНК" - это молекула РНК длиной приблизительно 20 - 22 нуклеотида, которая может быть загружена комплекс RISC (РНК-индуцируемый комплекс выключения гена), и которая направляет расщепление целевой молекулы РНК, при этом молекула РНК содержит нуклеотидную последовательность, существенно комплементарную к нуклеотидной последовательности молекулы миРНК, в результате чего может иметь место одна или несколько следующих ошибок спаривания:
- ошибка спаривания между нуклеотидом у 5'-конца указанной миРНК и соответствующей нуклеотидной последовательностью в целевой молекуле РНК;
- ошибка спаривания между одним из нуклеотидов от положения 1 до положения 9 указанной миРНК и соответствующей нуклеотидной последовательностью в целевой молекуле РНК;
- три ошибки спаривания между одним из нуклеотидов от положения 12 до положения 21 указанной миРНК и соответствующей нуклеотидной
последовательностью в целевой молекуле РНК, при условии, что нет более двух последовательных ошибок спаривания;
- ошибки спаривания не допускаются в положениях 10 и 11 миРНК (все положения в миРНК указаны, начиная от 5'-конца молекулы миРНК).
[102] При использовании по тексту настоящего документа термин "молекула пре-миРНК" означает молекулу РНК длиной приблизительно 100 - 200 нуклеотидов, предпочтительно длиной приблизительно 100 - 130 нуклеотидов, которая может принимать вторичную структуру, содержащую стебель дсРНК и одноцепочечную петлю РНК, а также содержащую нуклеотидную последовательность миРНК и ее комплементарную последовательность миРНК* в двухцепочечном стебле РНК. Предпочтительно, миРНК и комплементарная последовательность расположены на расстоянии приблизительно 10-20 нуклеотидов от свободных концов стебля миРНК дсРНК. Длина и последовательность одноцепочечной петлевой области не имеют критического значения и могут существенно варьироваться, например, длина может варьироваться в диапазоне, например, 30 - 50 нуклеотидов. Предпочтительно, разница в свободной энергии между неспаренной и спаренной структурой РНК составляет -20 - -60 ккал/моль, в частности, приблизительно -40 ккал/моль. Комплементарность между миРНК и миРНК* не обязательно должна быть идеальной, допустимы приблизительно 1-3 петли неспаренных нуклеотидов. Вторичная структура, принятая молекулой РНК, может быть спрогнозирована с использованием компьютерных алгоритмов, которые обычно используются в этой области, таких как mFold, UNAFold и RNAFold. Конкретная нить стебля дсРНК из пре-миРНК, которая высвобождается DCL активностью и загружается в комплекс RISC, определяется степенью комплементарности у 5'-конца, при этом в комплекс RISC загружается нить, которая у 5'-конца в наименьшей степени участвует в связывании водорода между нуклеотидами различных нитей расщепленного стебля дсРНК, и она будет определять специфичность к последовательности для деградации целевой молекулы РНК. Тем не менее, если эмпирически молекула миРНК из определенной синтетической пре-миРНК молекулы не является функциональной из-за того, что в комплекс RISC загружена "неправильная" нить, будет сразу же
очевидно, что эта проблема может быть решена путем смены положения молекулы миРНК и ее комплементарной последовательности на соответствующих нитях стебля дсРНК молекулы пре-миРНК. Как известно специалистам, связывание между А и U, содержащее две водородные связи, или между G и U, содержащее две водородные связи, является менее прочным, чем связывание между G и С, содержащее три водородные связи.
[103] Молекулы миРНК могут быть заключены в природных молекулах пре-миРНК, однако они также могут быть введены в скаффолды существующей молекулы пре-миРНК путем смены нуклеотидной последовательности молекулы миРНК, процессинг которой обычно осуществляется из такой существующей молекулы пре-миРНК для нуклеотидной последовательности другой целевой миРНК. Скаффолд пре-миРНК также может быть полностью синтетическим. Аналогичным образом, синтетические молекулы миРНК могут содержаться внутри скаффолдов существующей молекулы пре-миРНК или скаффолдов синтетической молекулы пре-миРНК; из таких скаффолдов может осуществляться процессинг синтетических молекул миРНК.
[104] Кроме того, в изобретении может использоваться растение рода Brassica, содержащее, по меньшей мере, два гена СКХ5 или СКХЗ, в котором активность белка СКХ5 или СКХЗ снижена, например, растение рода Brassica, содержащее ДНК-конструкт растения, который кодирует доминантно-негативный белок СКХ5 или СКХЗ, или ДНК-конструкт, который кодирует инактивирующие антитела к белкам СКХ5 или СКХЗ, или ДНК-конструкт, который кодирует белок, который специфически инактивирует белок СКХ5 ил СКХЗ, например, белок со специфическим СКХ5 или СКХЗ-связывающим доменом и активностью расщепления белка. Термин "инактивирующие антитела к белкам СКХ5 или СКХЗ" означает антитела или их части, которые специфически связывают, по меньшей мере, некоторые эпитопы белков СКХ5 или СКХЗ PGAZ, и которые подавляют активность целевого белка. Активность белка СКХ5 или СКХЗ также может быть снижена, например, путем агрегирования белков СКХ5 или СКХЗ (см., например,
WO2007/071789), или путем скаффолдинга целевых белков (см., например, WO2009/030780).
[105] Указанное растение рода Brassica, содержащее, по меньшей мере, два гена СКХ5 или СКХ, в котором снижена экспрессия, по меньшей мере, одного гена СКХ5 или СКХЗ, может, например, представлять собой растение рода Brassica, содержащее четыре гена СКХ5 или СКХЗ, при этом указанное растение рода Brassica выбрано из группы, состоящей из Brassica napus, Brassica juncea и Brassica carinata. В указанном растении рода Brassica может быть снижена экспрессия, по меньшей мере, одного, по меньшей мере, двух, по меньшей мере, трех или четырех генов СКХ5 или СКХЗ.
[106] Таким образом, в соответствии с первым аспектом предоставляется растение рода Brassica, содержащее, по меньшей мере, один ген, предпочтительно два гена СКХ5, отличающееся тем, оно включает, по меньшей мере, один мутантный СКХ5 аллель в геноме. В соответствии с еще одним аспектом предоставляется растение рода Brassica, содержащее, по меньшей мере, один ген СКХ5 и, по меньшей мере, два гена СКХЗ, предпочтительно два гена СКХ5 и четыре гена СКХЗ, отличающееся тем, оно включает, по меньшей мере, один мутантный СКХ5 аллель и один мутантный СКХЗ аллель в геноме.
[107] Указанное растение рода Brassica, содержащее, по меньшей мере, один ген СКХ5, предпочтительно два гена СКХ5, в котором снижена экспрессия, по меньшей мере, одного гена СКХ5, и содержащее, по меньшей мере, два, предпочтительно четыре гена СКХЗ, в котором снижена экспрессия, по меньшей мере, одного гена СКХЗ, может, например, представлять собой растение рода Brassica, содержащее два гена СКХ5, при этом указанное растение рода Brassica выбрано из группы, состоящей из Brassica napus, Brassica juncea и Brassica carinata. В указанном растении рода Brassica может быть снижена экспрессия, по меньшей мере, одного, по меньшей мере, двух, по меньшей мере, трех или четырех генов СКХЗ и/или может быть снижена экспрессия, по меньшей мере, одного, по меньшей мере, двух генов СКХ5. Согласно изобретению растения по настоящему изобретению могут быть использованы для целей скрещивания.
[108] В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предоставляется мутантный аллель гена Brassica СКХЗ или СКХ5, отличающийся тем, что указанный ген СКХЗ выбран из группы, состоящей из следующих последовательностей:
нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ Ш N0: 7, SEQ Ш N0: 10; SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 16;
нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 8, SEQ Ш NO: 11; SEQ Ш NO: 14 или SEQ Ш NO: 17; и
нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 9, SEQ Ш NO: 12; SEQ Ш NO: 15 или SEQ Ш NO: 18; и
при этом СКХ5 ген, включает нуклеотидную последовательность, выбранную из
группы, состоящей из следующих последовательностей:
нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 19, SEQ Ш NO: 22, SEQ ID NO: 23;
нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 20 или SEQ Ш NO: 23; и нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 21 или SEQ Ш NO: 24.
[109] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения указанный мутантный аллель выбран из группы, состоящей из следующих аллелей:
мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ Ш N0: 19 или положению 465 SEQ ID N0: 20;
мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 399 SEQ Ш N0: 19 или положению 399 SEQ ID N0: 20;
мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ Ш N0: 22 или положению 399 SEQIDNO: 23;
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2244 SEQ Ш N0: 7 или положению 1093 SEQ ID N0: 8;
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2482 SEQ Ш N0: 10 или положению 1168 SEQIDNO: 11;
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 1893 SEQ Ш N0: 13 или положению 876 SEQ ID N0: 14;
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2171 SEQ Ш N0: 16 или положению 982 SEQIDNO: 17.
[110] Кроме того, предоставляются способы получения и комбинирования мутантных СКХ аллелей и СКХ аллелей дикого типа в растениях рода Brassica, с помощью которых в таких растениях увеличивается количество цветков или стручков или увеличивается TSW. Также, один из вариантов осуществления изобретения относится к применению таких растений для переноса мутантных СКХ аллелей в другие растения, а также к продуктам, полученным из описанных растений. Кроме того, предоставляются комплекты и способы для маркер-вспомогательной селекции (MAS) для комбинирования или детекции генов и/или
аллелей СКХ. Все варианты осуществления изобретения описаны более подробно в настоящем документе ниже.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ
[111] Предоставляются нуклеотидные последовательности дикого типа СКХЗ и СКХ5, кодирующие функциональные белки СКХЗ и СКХ5 и мутантные нуклеотидные последовательности СКХЗ и СКХ5 (включающие одну или несколько мутаций, предпочтительно мутаций, которые приводят к полному подавлению или существенному снижению биологической активности кодированного белка СКХЗ или СКХ5 или к прекращению вырабатывания белка СКХЗ или СКХ5) генов СКХЗ и СКХ5 из семейства Brassicaceae, в частности, из видов рода Brassica, в особенности, из Brassica napus. Например, виды рода Brassica, включающие геном А и/или С, могут включать различные аллели генов СКХЗ-А или СКХЗ-С или СКХ5-А или СКХ5-С, которые могут идентифицироваться и комбинироваться в одном растении по настоящему изобретению. В дополнение, для получения мутаций в аллелях СКХЗ и СКХ5 дикого типа могут быть использованы способы генного таргетинга или мутагенеза, в результате чего могут быть получены мутантные аллели СКХЗ и СКХ5 для применения в соответствии с изобретением. Так как путем скрещивания и селекции специфические СКХЗ и СКХ5 аллели предпочтительно комбинируются в растении, в соответствии с одним вариантом осуществления изобретения нуклеотидные последовательности СКХЗ и/или СКХ5 предоставляются в самом растении (т.е. эндогенно), например, в растении рода Brassica, предпочтительно в растении рода Brassica, которое может скрещиваться с Brassica napus, или которое может использоваться "синтетическое" растение Brassica napus. Гибридизация между различными видами Brassica описана в литературе, например, в следующей работе: Snowdon (2007, Chromosome research 15: 85-95). Межвидовая гибридизация может, например, использоваться для передачи генов от, например, генома С в В. napus (ААСС) в геном С ъ В. carinata (BBCC), или даже от, например, генома С ъ В. napus (ААСС) в геном В в В. juncea (ААВВ) (с помощью спорадического события незаконной рекомбинации между их геномами С и В). "Ресинтезированные" или
"синтетические" линии Brassica napus могут быть получены путем скрещивания их оригинальных предков, В. oleracea (CC) и В. rapa (AA). Барьеры межвидовой и межродовой несовместимости могут быть успешно преодолены при скрещивании между видами родов Brassica и их родственниками, например, с использованием техник эмбрионального спасения или слияния протопластов (см., например, вышеупомянутую работу Snowdon).
[112] Тем не менее, в соответствии с настоящим изобретением также предоставляются изолированные нуклеотидные последовательности СКХЗ и СКХ 5 (например, изолированные из растения путем клонирования или полученные синтетически путем ДНК-синтеза), а также их варианты и фрагменты, так как они могут быть использованы для определения того, какая последовательность присутствует в растении или в части растения эндогенно, кодирует ли последовательность функциональный или нефункциональный белок или она не кодирует белок (например, путем экспрессии в рекомбинантной клетке-хозяине в соответствии с описанием ниже), а также для селекции и переноса специфических аллелей из одного растения в другое, для создания растения с необходимой комбинацией функциональных и мутантных аллелей.
[113] Нуклеотидные последовательности генов СКХЗ и СКХ5 были выделены из Brassica napus (BnCKX3-AJ, ВпСКХЗ-А2, ВпСКХЗ-CJ и ВпСКХЗ-С2; ВпСКХ5-А1 и ВпСКХ5-С1) в соответствии с перечнем последовательностей. Указаны последовательности СКХЗ и СКХ5 дикого типа, в то время как мутантные последовательности СКХ этих последовательностей, а также последовательности, имеющие существенное сходство с этими последовательностями, описаны в настоящем документе ниже и в разделе "Примеры" со ссылкой на последовательности СКХЗ и СКХ5 дикого типа. Геномная ДНК, кодирующая белок СКХЗ и СКХ5, из Brassica napus, Brassica rapa, Brassica oleracea и Brassica nigra содержит четыре интрона.
[114] Согласно настоящему изобретению термин "нуклеотидные последовательности ВпСКХЗ-А1" или "вариантные нуклеотидные последовательности ВпСКХЗ-А1"
означает нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш N0: 9, или нуклеотидные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 7 или имеющие последовательность кДНК, имеющую, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 8. Эти нуклеотидные последовательности могут также именоваться "существенно сходными" или "существенно идентичными" с последовательностями СКХЗ, указанными в перечне последовательностей.
[115] Согласно настоящему изобретению термин "нуклеотидные последовательности ВпСКХЗ-А2" или "вариантные нуклеотидные последовательности ВпСКХЗ-А2" означает нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 12, или нуклеотидные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 10, или имеющие последовательность кДНК, имеющую, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 11. Эти нуклеотидные последовательности могут также именоваться "существенно сходными" или "существенно идентичными" с последовательностями СКХ, указанными в перечне последовательностей.
[116] Согласно настоящему изобретению термин "нуклеотидные последовательности ВпСКХЗ-С1" или "вариантные нуклеотидные последовательности ВпСКХЗ-С1"
означает нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш N0: 15, или нуклеотидные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 13, или имеющие последовательность кДНК, имеющую, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 14. Эти нуклеотидные последовательности могут также именоваться "существенно сходными" или "существенно идентичными" с последовательностями СКХ, указанными в перечне последовательностей.
[117] Согласно настоящему изобретению термин "нуклеотидные последовательности ВпСКХЗ-С2" или "вариантные нуклеотидные последовательности ВпСКХ-С2" означает нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 18, или нуклеотидные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 16, или имеющие последовательность кДНК, имеющую, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 17. Эти нуклеотидные последовательности могут также именоваться "существенно сходными" или "существенно идентичными" с последовательностями СКХ, указанными в перечне последовательностей.
[118] Согласно настоящему изобретению термин "нуклеотидные последовательности ВпСКХ5-А1" или "вариантные нуклеотидные последовательности ВпСКХ5-А1" означает нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш N0: 21, или нуклеотидные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 19, или имеющие последовательность кДНК, имеющую, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 20. Эти нуклеотидные последовательности могут также именоваться "существенно сходными" или "существенно идентичными" с последовательностями СКХЗ, указанными в перечне последовательностей.
[119] Согласно настоящему изобретению термин "нуклеотидные последовательности ВпСКХ5-С1" или "вариантные нуклеотидные последовательности ВпСКХ5-С1" означает нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 24, или нуклеотидные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 22, или имеющие последовательность кДНК, имеющую, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 23. Эти нуклеотидные последовательности могут также именоваться "существенно сходными" или "существенно идентичными" с последовательностями СКХ, указанными в перечне последовательностей.
[120] Таким образом, изобретением предоставляются нуклеотидные последовательности, кодирующие белки СКХЗ и СКХ5, дикого типа и функциональные, включая их варианты и фрагменты (в соответствии с определением ниже), а также мутантные нуклеотидные последовательности таких белков, фрагментов и вариантов, при этом мутация в нуклеотидной последовательности предпочтительно приводит к вставке, делеции или замене одной или нескольких аминокислот по сравнению с белком СКХЗ или СКХ5 дикого типа. Предпочтительно, мутации в нуклеотидной последовательности приводят к одному или нескольким изменениям аминокислоты (т.е., в отношении аминокислотной последовательности дикого типа, к вставке, делеции и/или замене одной или нескольких аминокислот), что приводит к существенному снижению биологической активности или к полному исчезновению биологической активности белка СКХЗ или СКХ5. Термин "существенное снижение или полное подавление биологической активности белка СКХЗ или СКХ5" в настоящем документе относится к уменьшению или подавлению субстрат-связывающей активности и/или каталитической способности белка СКХЗ или СКХ5 таким образом, чтобы обеспечивалось увеличение количества цветков, стручков или увеличение TSW растения, экспрессирующего мутантный белок СКХЗ или СКХ5 по сравнению с растением, экспрессирующим соответствующий белок СКХЗ или СКХ5 дикого типа.
[121] Для определения функциональности специфического аллеля/белка СКХ в растениях, в частности, в растениях рода Brassica, можно определять количество цветков на растениях путем подсчета в соответствии с описанием в настоящем документе, в разделе "Примеры" ниже, а также путем микроскопических исследований, чтобы исследовать, например, влияют ли и каким образом влияют мутации в СКХ5 или в СКХ5 и СКХЗ на меристемы, в частности, на меристемы цветков. В качестве альтернативы, функциональность специфического аллеля/белка СКХ может оцениваться с использованием известных специалистам технологий рекомбинантных ДНК, например, путем экспрессии СКХЗ или СКХ5 в клетке-хозяине (например, бактерии, такой как Е. coli) и оценке, например, субстрат
связывающей активности или катализа in vitro окисления цитокинина, например, изопентенил аденина.
[122] Настоящим изобретением предоставляются как эндогенные, так и изолированные нуклеотидные последовательности. Также предоставляются фрагменты последовательностей СКХЗ или СКХ5 и вариантных нуклеотидных последовательностей СКХЗ или СКХ5 в соответствии определением выше, для использования в качестве праймеров или зондов и в качестве компонентов в соответствии с еще одним аспектом изобретения (см. ниже). Фрагмент нуклеотидной последовательности СКХЗ или СКХ5 или СКХ или ее варианта (в соответствии определением) может иметь различную длину, например, по меньшей мере, 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 200, 500, 800, 1000 или 1500 последовательных нуклеотидов соответствующей последовательности СКХ или СКХ (или вариантной последовательности).
Нуклеотидные последовательности, кодирующие функциональные белки СКХЗ или СКХ5
[123] Нуклеотидные последовательности, указанные в перечне последовательностей, кодируют функциональные белки СКХЗ или СКХ5 дикого типа из Brassica napus. Таким образом, эти последовательности являются эндогенными по отношению к растениям рода Brassica, из которых они были изолированы. Может осуществляться скриннинг других видов культурных растений, сортов, линий скрещивания или диких образцов рода Brassica на присутствие других СКХЗ или СКХ5 аллелей, кодирующих те же белки СКХЗ или СКХ5 или их варианты. Например, для идентификации СКХЗ или СКХ5 аллелей, эндогенных для других растений рода Brassica, таких как различные сорта, линии или образцы Brassica napus, могут быть использованы техники гибридизации нуклеиновых кислот (например, Саузерн-блоттинг с использованием жестких условий гибридизации) или техники на основе ПНР, однако также может осуществляться скриннинг растений, органов и тканей растений Brassica juncea (в частности, СКХЗ или СКХ5 аллелей в А-геноме), Brassica carinata (в частности, СКХЗ или СКХ5 аллелей в С-геноме) и Brassica rapa (в
частности, СКХЗ или СКХ5 аллелей в А-геноме) и Brassica oleracea (в частности, СКХЗ или СКХ5 аллелей в С-геноме) на присутствие других СКХЗ или СКХ5 аллелей дикого типа. Для скриннинга таких растений, органов и тканей растений на присутствие СКХЗ или СКХ5 аллелей могут быть использованы нуклеотидные последовательности СКХЗ или СКХ5, указанные в перечне последовательностей или их варианты или фрагменты. Например, в качестве зондов или праймеров могут быть использованы целые последовательности или фрагменты. Например, могут быть использованы специфические или вырожденные праймеры для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки СКХЗ или СКХ5 из геномной ДНК растения, органа растения или ткани. Эти нуклеотидные последовательности СКХЗ или СКХ5 могут быть изолированы и секвенированы с использованием стандартных техник молекулярной биологии. Затем может использоваться биоинформационный анализ для характеризации аллелей, например, для определения, какому СКХЗ или СКХ5 аллелю соответствует последовательность, и какой белок СКХ5 или СКХЗ или вариант белка кодируется этой последовательностью.
[124] Анализ того, кодирует ли нуклеотидная последовательность функциональный белок СКХЗ или СКХ5, может осуществляться с использованием техник рекомбинантных ДНК, известных специалистам, например, путем теста на генетическую комплементацию с использованием, например, растения Arabidopsis, которое является гомозиготным для полностью инактивированного скхЗ или скх5 мутантного аллеля (или для обоих аллелей), или растения Brassica napus, которое является гомозиготным для полностью инактивированного скЗ или скх5 мутантного аллеля (или для обоих аллелей), или всех генов СКХЗ-Al, СКХЗ-А2, СКХЗ-CI и/или СКХЗ-С2 и/или СКХ5-Al и СКХ5-С1.
[125] Кроме того, очевидно, что нуклеотидные последовательности СКХЗ или СКХ5 и их варианты (или фрагменты таких последовательностей или вариантов) могут быть идентифицированы in silico, путем скриннинга баз данных нуклеотидных последовательностей на наличие существенно подобных последовательностей.
Аналогичным образом, нуклеотидная последовательность может быть синтезирована химическим путем. Также предоставляются фрагменты молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, описанных ниже.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие мутантные белки СКХЗ или СКХ5
[126] Еще один вариант осуществления изобретения относится к нуклеотидным последовательностям, содержащим одну или несколько нуклеотидных делеций, вставок или замен относительно нуклеотидных последовательностей дикого типа, а также к фрагментам таких молекул мутантных нуклеотидных последовательностей. Такие мутантные нуклеотидные последовательности (которые именуются последовательности скхЗ или скх5) могут быть получены и/или идентифицированы с использованием различных известных способов в соответствии с описанием ниже. Аналогично вышесказанному, такие молекулы нуклеиновой кислоты предоставляются как в эндогенной, так и в изолированной форме. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения мутации приводят к одному или несколько изменениям (делециям, вставкам и/или заменам) в аминокислотной последовательности кодированного белка СКХЗ или СКХ5 (т.е. это не является молчащей мутацией). В еще одном варианте осуществления изобретения мутации в нуклеотидной последовательности приводят к существенному снижению биологической активности или к полному исчезновению биологической активности кодированного белка СКХЗ или СКХ5 по сравнению с белком дикого типа.
[127] Таким образом, молекулы нуклеиновой кислоты могут содержать одну или несколько мутаций, таких как:
(a) миссенс-мутация, представляющая собой изменение нуклеотидной
последовательности, в результате которого происходит замена одной аминокислоты
на другую;
(b) "нонсенс-мутация" или "стоп-кодон-мутация", представляющая собой изменение
нуклеотидной последовательности, в результате которого происходит введение
преждевременного стоп-кодона и, таким образом, терминация трансляции (в
результате чего получают укороченный белок); гены растения содержат стоп-кодоны трансляции "TGA" (UGA в РНК), "ТАА" (UAA в РНК) и "TAG" (UAG в РНК); таким образом, любая нуклеотидная замена, вставка или делеция, которая приводит к тому, что один из этих кодонов попадает в транслируемую зрелую мРНК (в рамку считывания), приводит к терминации трансляции;
(с) "инсерционная мутация" в одной или нескольких аминокислотах, когда один или несколько кодонов добавляются к кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты;
(с) "делеционная мутация" в одной или нескольких аминокислотах, когда один или несколько кодонов удаляются из кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты;
(е) "мутация со сдвигом рамки", которая приводит к трансляции нуклеотидной последовательности в другой рамке после мутации. Мутация со сдвигом рамки может быть обусловлена различными причины, например, вставка, делеция или дупликация одного или нескольких нуклеотидов, номер которых не делится на 3.
[128] Как было указано, желательно, чтобы мутации в нуклеотидной последовательности предпочтительно приводили к существенному снижению или полному подавлению биологической активности мутантного белка in vivo, или к отсутствию производства белка. В основном, любая мутация, которая приводит к тому, что белок содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную вставку, делецию и/или замену относительно белка дикого типа, может привести к существенному снижению или полному подавлению биологической активности белка. Тем не менее, очевидно, что мутации в определенных частях белка с большей вероятностью приводят к снижению функции мутантного белка СКХЗ или СКХ5, например, мутации, в результате которых получают укороченные белки, при этом отсутствуют значимые части функциональных доменов, такие как FAD-связывающий мотив, цитокинин-связывающий мотив, мотив GIWeVPHPWLNL и/или мотив PGQxIF.
[129] Аминокислотные положения консервативных мотивов и каталитических радикалов в последовательностях белка СКХЗ и СКХ5 Arabidopsis и Brassica указаны в Таблицах 1 и 2.
[130] Оптимальное выравнивание нуклеотидной последовательности СКХЗ и СКХ5 Arabidopsis (SEQ Ш NO: 1, 2, 4 и 5) и аминокислотных последовательностей (SEQ Ш N0: 3 и 6) с нуклеотидными последовательностями СКХЗ и СКХ5, в частности, нуклеотидными и аминокислотными последовательностями СКХЗ и СКХ5 Brassica по настоящему изобретению позволяет определить положения соответствующих консервативных доменов и аминокислот в этих последовательностях Brassica (см. Таблицы 1 и 2 для последовательностей СКХЗ и СКХ5 Brassica).
[131] Таким образом, в соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения предоставляются нуклеотидные последовательности, включающие один или несколько вышеописанных типов мутаций. В еще одном варианте осуществления изобретения предоставляются последовательности скхЗ/скх5-, включающие одну или несколько стоп-кодон (нонсенс) мутаций, одну или несколько миссенс-мутаций и/или одну или несколько мутаций со сдвигом рамки. Любые из вышеуказанных мутантных нуклеотидных последовательностей предоставляются per se (в изолированной форме), а также растения и части растений, включающие такие последовательности эндогенно. В таблицах, приведенных ниже, описаны наиболее предпочтительные скхЗ/скх5 аллели, и указаны зарегистрированные номера семян Brassica napus, содержащих один или несколько скхЗ/скх5 аллелей.
[132] При использовании по тексту настоящего документа термин "нонсенс-мутация" в СКХЗ или СКХ5 аллеле означает мутацию в СКХЗ или СКХ5 аллеле, при этом один или несколько стоп-кодонов трансляции вводятся в кодирующую ДНК и соответствующую последовательность мРНК соответствующего СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа. Стоп-кодонами трансляции являются TGA (UGA в мРНК), ТАА (UAA) и TAG (UAG). Таким образом, любая мутация (делеция, вставка или замена), которая приводит к образованию внутрирамочного стоп-кодона, приведет к терминации трансляции и усечению аминокислотной цепи. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, включающий нонсенс-мутацию, представляет собой СКХЗ или СКХ5 аллель, в который введен внутрирамочный стоп-кодон в последовательность СКХЗ или СКХ5
кодона посредством одного нуклеотида, например, посредством мутации CAG в TAG, TGG в TAG, TGG в TGA или САА в ТАА. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, включающий нонсенс-мутацию, представляет собой СКХЗ или СКХ5 аллель, в который введен внутрирамочный стоп-кодон в последовательность СКХЗ или СКХ5 кодона посредством замены двух нуклеотидов, например, посредством мутации CAG в ТАА, TGG в ТАА или CGG в TAG или TGA. В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, включающий нонсенс-мутацию, представляет собой СКХЗ или СКХ5 аллель, в который введен внутрирамочный стоп-кодон в последовательность СКХЗ или СКХ5 кодона посредством замены трех нуклеотидов, например, посредством мутации CGG в ТАА. В укороченном белке отсутствуют аминокислоты, кодированные кодирующей ДНК после мутации (т.е. С-концевая часть белка СКХЗ или СКХ5), и в нем сохраняются аминокислоты, кодированные кодирующей ДНК перед мутацией (т.е. N-концевая часть белка СКХЗ или СКХ5). В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, содержащий нонсенс-мутацию, представляет собой СКХЗ или СКХ5, где нонсенс-мутация присутствует в любом месте перед PGQXIF-мотивом в положениях, соответствующих положениям 512-517 в SEQ Ш N0: 3, так, чтобы отсутствовал, по меньшей мере, консервативный домен PGQXIF. Чем более усечен мутантный белок СКХЗ или СКХ5 по сравнению с белком СКХЗ или СКХ5 дикого типа, тем вероятнее, что усечение приведет к существенному снижению активности или к полному исчезновению активности белка СКХЗ или СККХ5. Таким образом, в соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения предоставляется мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, включающий нонсенс-мутацию, которая приводит к получению укороченного белка длиной приблизительно менее 517 или 518, или 516 (без полного сайта связывания цитокинина), приблизительно менее 244 или 245, или 243 (без полного сайта связывания цитокинина), приблизительно менее 233, или 234 аминокислот (без FAD-связывающей аминокислоты в положении 233) или еще меньшей длиной.
Консервативные области и домены, которые более не присутствуют в определенных YIIN аллелях, указаны в Таблицах 1 и 2.
[133] В соответствии с описанием в разделе "Примеры" очевидно, что СКХ аллели, укороченные в положении, соответствующем положению 364 SEQ Ш N0: 3 (YTNN501), или соответствующем положению SEQ Ш N0: 3, у которых отсутствует цитокинин-связывающий мотив, мотив GIWeVPHPWLNL и мотив PGQxIF, а также FAD-связывающий сайт в положении, соответствующем положению SEQ Ш N0: 3 или положению 479 SEQ Ш N0: 6, которые имеют наибольшую длину из укороченных белков СКХ, указанных в разделе "Примеры", способствуют увеличению количества цветков и увеличению массы тысячи семян. Следовательно, в соответствии с частным вариантом осуществления изобретения СКХЗ или СКХ5 аллель по настоящему изобретению кодирует укороченный белок, в котором отсутствует мотив GIWeVPHPWLNL и мотив PGQxIF, а также FAD-связывающий сайт в положении, соответствующем положению 476.
[134] Очевидно, что возможные мутации не ограничены вышеуказанными мутациями, и понятно, что аналогичные стоп-мутации могут присутствовать в других скхЗ/скх5 аллелях, помимо тех, которые указаны в перечне последовательностей и в приведенных выше таблицах.
[135] При использовании по тексту настоящего документа термин "миссенс-мутация" в СКХЗ или СКХ5 аллеле означает любую мутацию (делецию, вставку или замену) в СКХЗ или СКХ5 аллеле, при этом один или несколько кодонов в кодирующей ДНК и соответствующей последовательности мРНК соответствующего СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа изменены, что приводит к замене одной или нескольких аминокислот в белке СКХЗ или СКХ5 дикого типа на одну или несколько других аминокислот в мутантном белке СКХЗ или СКХ5. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, содержащий миссенс-мутацию, представляет собой СКХЗ или СКХ5 аллель, в котором одна или несколько консервативных аминокислот, указанных выше или в Таблице 1 или 2, змаещены. Более вероятно, что миссенс-мутации, которые приводят
к замещению, например, аминокислоты в положении, соответствующем положениям 100- 104, 105 - 106, ПО, 153, 167, 172, 178 - 182, 233, 476, 374-385 или 512-517 в SEQ Ш NO: 3, приведут к существенному снижению активности или к полному исчезновению активности белка СКХЗ. Аналогичным образом, более вероятно, что миссенс-мутации, которые приводят к замещению, например, аминокислоты в положении, соответствующем положениям 97 - 101, 102 - 103, 107, 165, 170, 176 -180, 231, 479, 374 - 385 или 515 - 520 в SEQ ID NO: 6, приведут к существенному снижению активности или к полному исчезновению активности белка СКХ5.
[136] При использовании по тексту настоящего документа термин "мутация со сдвигом рамки" в СКХЗ или СКХ5 аллеле означает мутацию (делецию, вставку, дупликацию и т.д.) в СКХЗ или СКХ5 аллеле, которая приводит к трансляции нуклеотидной последовательности в другой рамке после мутации. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, содержащий мутацию со сдвигом рамки, представляет собой СКХЗ или СКХ5 аллель, содержащий мутацию со сдвигом рамки перед кодоном, кодирующим первую аминокислоту мотива PGQxIF, соответствующую положению 512 в SEQ ГО NO: 3 или 515 в SEQ ГО NO: 6, или содержащий мутацию со сдвигом рамки перед кодоном, кодирующим первую аминокислоту мотива GIWeVPHPWLNL, соответствующую положению 374 в SEQ ГО NO: 3 или 374 в SEQ ГО NO: 6, или содержащий мутацию со сдвигом рамки перед кодоном, кодирующим первую аминокислоту цитокинин-связывающего мотива, соответствующую положению 244 в SEQ ГО NO: 3 или 242 в SEQ ГО NO: 6, или содержащий мутацию со сдвигом рамки перед кодоном, кодирующим первую аминокислоту мотива FAD, соответствующую положению 66 в SEQ ГО NO: 3 или положению 63 SEQ ГО NO: 8; 6, или содержащий мутацию со сдвигом рамки перед кодоном, кодирующим FAD-связывающие аминокислоты в положении, соответствующем положениям 100 - 104, 105 - 106, ПО, 153, 167, 172, 178 - 182, 233, 476, 374 - 385 или 512 - 517 в SEQ ГО NO: 3, или соответствующем положениям 97 - 101, 102 - 103, 107, 165, 170, 176 - 180, 231, 479, 374 - 385 или 515 - 520 в SEQ ГО NO: 6.
[137] Мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель может представлять собой СКХЗ или СКХ5 аллель, который не участвует в получении белка СКХЗ или СКХ5. Примерами мутантных аллелей, которые не вырабатывают белок, являются аллели, имеющие мутации, которые ведут к отсутствию производства или деградации мРНК, например, мутации в промоторных областях, в результате которых ведут не производится мРНК, стоп-кодон-мутации, приводящие к деградации мРНК (нонсенс-опосредованная деградация; см., например, Baker and Parker, 2004, Curr Opin Cell Biol 16:293), мутации сайта сплайсинга, приводящие к деградации мРНК ( см., например, Isken and Maquat, 2007, Genes Dev 21:1833), или мутации в кодирующей белок последовательности, содержащей мутацию или делецию инициирующего кодона ATG, в результате чего белок не производится, или крупные делеции, приводящие к отсутствию (части) кодирующей белок последовательности.
[138] Таким образом, мутантные СКХЗ или СКХ5 аллели по настоящему изобретению могут включать нуклеотидные последовательности, которые содержат, по меньшей мере, 90%, но менее 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 7, SEQ Ш NO: 10, SEQ Ш NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ Ш NO: 19 или SEQ Ш NO: 22; или могут включать нуклеотидные последовательности, включающие кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, но менее 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 8, SEQ Ш NO: 11, SEQ Ш NO: 14, SEQ Ш NO: SEQ Ш NO: 17, SEQ Ш NO: 20 или SEQ Ш NO: 23; или могут включать нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, но менее 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ Ш NO: 15, SEQ Ш NO: 18, SEQ Ш NO: 21 или SEQ ID NO: 24. Идентичность последовательности в указанном диапазоне - по меньшей мере, 90% идентичности последовательности, может составлять, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 93% или, по меньшей мере, 95% или, по меньшей мере, 96% или, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 98% или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности. Тем не менее, мутантные СКХЗ или СКХ5 аллели по настоящему изобретению не могут включать нуклеотидные последовательности, которые содержат 100% идентичности
последовательности с вышеуказанными последовательностями. Кроме того, мутантные СКХЗ или СКХ5 аллели по настоящему изобретению могут включать идентичность последовательности с вышеуказанными последовательностями, которая составляет менее 90%, например, когда удаляется часть гена СКХЗ или СКХ5 дикого типа или удаляется весь ген. В этом случае мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель может также относится к генному л оку су, соответствующему генному локусу СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, где присутствует СКХЗ или СКХ5 аллель, имеющий менее 100% идентичности последовательности с аллелем дикого типа, или где удален полный ген СКХЗ или СКХ5 или его часть.
Аминокислотные последовательности по настоящему изобретению
[139] Предоставляются аминокислотные последовательности СКХЗ и СКХ5 дикого типа (функциональные) и мутантные аминокислотные последовательности СКХЗ и СКХ5 (включающие одну или несколько мутаций, предпочтительно мутаций, которые приводят к полному подавлению или существенному снижению биологической активности кодированного белка СКХЗ или СКХ5) из семейства Brassicaceae, в частности, из видов рода Brassica, в особенности, из Brassica napus, Brassica rapa, Brassica oleracea и Brassica nigra, а также из других видов культурных растений рода Brassica. Например, виды рода Brassica, включающие геном А и/или С, могут кодировать различные аминокислоты СКХЗ-А или СКХ5-А или СКХЗ-С или СКХ5 -С. В дополнение, для получения мутаций в аллелях СКХЗ и СКХ5 дикого типа могут быть использованы способы генного таргетинга или мутагенеза, в результате чего могут быть получены мутантные аллели, кодирующие другие мутантные белки СКХЗ и СКХ5. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения предоставляются аминокислотные последовательности СКХЗ или СКХ5, дикого типа или мутантные в растении рода Brassica (т.е. эндогенно). Тем не менее, в соответствии с настоящим изобретением также предоставляются изолированные аминокислотные последовательности СКХЗ или СКХ5 (например, изолированные из растения или полученные синтетически), а также их варианты и фрагменты.
[140] Полное подавление или существенное снижение биологической активности белка СКХ5 или СКХЗ означает снижение активности, по меньшей мере, на 10% или, по меньшей мере, на 20% или, по меньшей мере, на 40% или, по меньшей мере, 60% или, по меньшей мере, на 80% или, по меньшей мере, на 90% или, по меньшей мере, на 95% или, по меньшей мере, на 98% или снижение активности на 100%, когда активность белка не обнаруживается, по сравнению с функциональным белком СКХ5 или СКХЗ, например, функциональным белком СКХ5 или СКХЗ, кодированным СКХЗ или СКХ5 аллелем дикого типа. Активность цитокинин-оксидазы может определяться, например, в соответствии с описанием в Liberos-Minotta and Tipton (1995) Analytical Biochemistry 231, 339-341 или Frebort et al.(2002) Analytical Biochemistry 306, 1-7 (оба источника включены в настоящий документ посредством ссылки).
[141] Аминокислотные последовательности белков СКХЗ и СКХ5 были выделены из Brassica napus в соответствии с перечнем последовательностей. Указаны последовательности СКХЗ и СКХ5 дикого типа, в то время как мутантные последовательности СКХЗ и СКХ5 этих последовательностей, а также последовательности, имеющие существенное сходство с этими последовательностями, описаны в настоящем документе ниже со ссылкой на последовательности СКХЗ и СКХ5 дикого типа.
[142] В соответствии с описанием выше, длина белков СКХЗ или СКХ5 из растений рода Brassica, описанных в настоящем документе, составляет приблизительно 520 аминокислот, такие белки включают несколько структурных и функциональных доменов.
[143] Согласно настоящему изобретению термин "аминокислотные последовательности ВпСКХЗ-А1" или "вариантные аминокислотные последовательности ВпСКХЗ-А1" означает аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 9. Эти аминокислотные последовательности могут
также именоваться "существенно сходными" или "существенно идентичными" с последовательностями СКХЗ, указанными в перечне последовательностей.
[144] Согласно настоящему изобретению термин "аминокислотные последовательности ВпСКХЗ-А2" или "вариантные аминокислотные последовательности ВпСКХЗ-А2" означает аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш N0: 12. Эти аминокислотные последовательности могут также именоваться "существенно сходными" или "существенно идентичными" с последовательностями СКХЗ, указанными в перечне последовательностей.
[145] Согласно настоящему изобретению термин "аминокислотные последовательности ВпСКХЗ-С1" или "вариантные аминокислотные последовательности ВпСКХЗ-С1" означает аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 97%, 98%), 99%) или 100%) идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 15. Эти аминокислотные последовательности могут также именоваться "существенно сходными" или "существенно идентичными" с последовательностями СКХЗ, указанными в перечне последовательностей.
[146] Согласно настоящему изобретению термин "аминокислотные последовательности ВпСКХЗ-С2" или "вариантные аминокислотные последовательности ВпСКХЗ-С2" означает аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 18. Эти аминокислотные последовательности могут также именоваться "существенно сходными" или "существенно идентичными" с последовательностями СКХЗ, указанными в перечне последовательностей.
[147] Согласно настоящему изобретению термин "аминокислотные последовательности ВпСКХ5-А1" или "вариантные аминокислотные последовательности ВпСКХ5-А1" означает аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш N0: 21. Эти аминокислотные последовательности могут также именоваться "существенно сходными" или "существенно идентичными" с последовательностями СКХ5, указанными в перечне последовательностей.
[148] Согласно настоящему изобретению термин "аминокислотные последовательности ВпСКХ5-С1" или "вариантные аминокислотные последовательности ВпСКХ5-С1" означает аминокислотные последовательности, имеющие, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с SEQ Ш NO: 24. Эти аминокислотные последовательности могут также именоваться "существенно сходными" или "существенно идентичными" с последовательностями СКХ5, указанными в перечне последовательностей.
[149] Таким образом, изобретением предоставляются аминокислотные последовательности белков СКХЗ или СКХ5 дикого типа и функциональных белков СКХЗ или СКХ5, включая варианты и фрагменты таких аминокислотных последовательностей (в соответствии с определением ниже), а также мутантные аминокислотные последовательности таких белков, фрагментов и вариантов, при этом мутация в аминокислотной последовательности предпочтительно приводит к существенному снижению или полному подавлению биологической активности белка СКХЗ или СКХ5 по сравнению с биологической активностью соответствующего белка СКХЗ или СКХ5 дикого типа. Термин "существенное снижение или полное подавление биологической активности белка СКХЗ или СКХ5" в настоящем документе относится к уменьшению или подавлению субстрат-связывающей активности или каталитической активности таким образом, чтобы
обеспечивалось увеличение количества цветков, стручков и/или увеличение TSW растения, экспрессирующего мутантный белок СКХЗ или СКХ5 по сравнению с растением, экспрессирующим соответствующий белок СКХЗ или СКХ5 дикого типа, по сравнению с количеством цветков, стручков или TSW соответствующего растения дикого типа.
[150] Настоящим изобретением предоставляются как эндогенные, так и изолированные аминокислотные последовательности. Также предоставляются фрагменты аминокислотных последовательностей СКХЗ или СКХ5 и вариантных аминокислотных нуклеотидных последовательностей СКХЗ или СКХ5 в соответствии определением выше. Фрагмент аминокислотной последовательности СКХЗ или СКХ5 или ее варианта (в соответствии определением) может иметь различную длину, например, по меньшей мере, 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 150, 175, 200, 150, 300, 350 или 400 последовательных аминокислот соответствующей последовательности СКХЗ или СКХ5 (или вариантной последовательности). Примерами таких фрагментов для белков СКХЗ являются фрагменты, состоящие из любых аминокислотных последовательностей SEQ Ш NO: 25, SEQ Ш NO: 26, SEQ Ш NO: 27 или SEQ Ш NO: 28. Примерами таких фрагментов для белков СКХ5 являются фрагменты, состоящие из любых аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 29, SEQ Ш NO: 30 или SEQ Ш NO: 31.
Аминокислотные последовательности функциональных белков СКХЗ или СКХ5
[151] Аминокислотные последовательности, указанные в перечне последовательностей, являются функциональными белками СКХЗ или СКХ5 и белками СКХЗ или СКХ5 дикого типа из Brassica napus. Таким образом, эти последовательности являются эндогенными по отношению к растениям рода Brassica, из которых они были изолированы. Может осуществляться скриннинг других видов культурных растений, сортов, линий скрещивания или диких образцов рода Brassica на присутствие других функциональных белков СКХЗ или СКХ5 с теми же аминокислотными последовательностями или их вариантами в соответствии с описанием выше.
[152] Кроме того, очевидно, что аминокислотные последовательности СКХЗ или СКХ5 и их варианты (или фрагменты таких последовательностей или вариантов) могут быть идентифицированы in silico, путем скриннинга баз данных аминокислотных последовательностей на наличие существенно подобных последовательностей. Также предоставляются фрагменты молекул аминокислот по настоящему изобретению.
Аминокислотные последовательности мутантных белков СКХЗ или СКХ5 [153] Еще один вариант осуществления изобретения относится к аминокислотным последовательностям, содержащим одну или несколько аминокислотных делеций, вставок или замен относительно аминокислотных последовательностей дикого типа, а также к фрагментам таких молекул мутантных аминокислотных последовательностей. Такие мутантные аминокислотные последовательности могут быть получены и/или идентифицированы с использованием различных известных способов в соответствии с описанием выше. Аналогично вышесказанному, такие молекулы аминокислоты предоставляются как в эндогенной, так и в изолированной форме.
[154] В одном варианте осуществления изобретения мутации в аминокислотной последовательности приводят к существенному снижению биологической активности или к полному исчезновению биологической активности белка СКХЗ или СКХ5 по сравнению с белком дикого типа. Как было указано, в основном, любая мутация, которая приводит к тому, что белок содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную вставку, делецию и/или замену относительно белка дикого типа, может привести к существенному снижению или полному подавлению биологической активности. Тем не менее, очевидно, что мутации в определенных частях белка с большей вероятностью приводят к снижению функции мутантного белка СКХЗ или СКХ5, например, мутации, в результате которых получают укороченные белки, при этом отсутствуют или замещены значимые части консервативных доменов в соответствии с описанием в Таблицах 1 или 2.
[155] Таким образом в соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения предоставляются мутантные белки СКХЗ или СКХ5, содержащие одну или несколько делеционных или инсерционных мутаций, где делеции или вставки приводят к получению мутантного белка с существенно сниженной активностью или с отсутствием активности in vivo. Такими мутантными белками СКХЗ или СКХ5 являются мутантные белки СКХЗ или СКХ5 со вставкой или делецией, по меньшей мере, 1, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 100, 150, 175, 180, 200, 250, 300, 350, 400 или большего количества аминокислот по сравнению с белком СКХЗ или СКХ5 дикого типа, при этом делеции или вставки приводят к получению мутантного белка с существенно сниженной активностью или с отсутствием активности in vivo.
[156] В соответствии с еще одним из вариантов осуществления изобретения предоставляются мутантные белки СКХЗ или СКХ5, которые являются укороченными, в результате чего получают мутантный белок с существенно сниженной активностью или с отсутствием активности in vivo. Такими укороченными белками СКХЗ или СКХ5 являются белки СКХЗ или СКХ5, в которых отсутствует функциональные домены в С-концевой части соответствующего белка СКХЗ или СКХ5 дикого типа, и в которых сохраняется N-концевая часть соответствующего белка СКХЗ или СКХ5 дикого типа. Таким образом, в соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения предоставляется укороченный белок СКХЗ или СКХ5, содержащий N-концевую часть соответствующего белка СКХЗ или СКХ5 дикого типа вплоть до первой аминокислоты PGQxIF-мотива (в положении, соответствующем положению 512 в SEQ Ш NO: 3), но не включая такую аминокислоту. Чем более усечен мутантный белок по сравнению с белком дикого типа, тем вероятнее, что усечение приведет к существенному снижению активности или к полному исчезновению активности белка СКХЗ или СКХ5. Таким образом, в соответствии с еще одним из вариантов осуществления изобретения предоставляется укороченный белок СКХЗ или СКХ5, включающий N-концевую часть соответствующего белка СКХЗ или СКХ5 дикого типа, в котором отсутствует весь FAD-связывающий фрагмент или его часть, и/или в
котором отсутствует весь цитокинин-связывающий мотив (в соответствии с описанием выше) или его часть.
[157] В соответствии с еще одним из вариантов осуществления изобретения предоставляются мутантные белки СКХЗ или СКХ5, которые содержат одну или несколько мутаций по типу замены, в результате чего получают мутантный белок с существенно сниженной активностью или с отсутствием активности in vivo. Такими мутантными белками СКХЗ или СКХ5 являются белки СКХЗ или СКХ5, в которых замещены консервативные аминокислотные радикалы, имеющие специфическую функцию, функцию связывания субстрата или каталитическую функцию в соответствии с описанием выше. Таким образом, в соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения предоставляются мутированные белки СКХЗ или СКХ5, содержащие замену консервативного аминокислотного радикала, имеющего биологическую функцию, например, консервативных аминокислот цитокинин-связывающего мотива, FAD-связывающего мотива, мотива GIWeVPHPWLNL или мотива PGQxIF.
Способы по настоящему изобретению
[158] Мутантные скхЗ или скх5 аллели могут быть получены (например, путем индуцированного мутагенеза или генного таргетинга) и/или идентифицированы с использованием различных традиционных способов, например, с использованием методов на основе 1ТЦР для амплификации всей геномной ДНК иди кДНК скхЗ или скх5 или ее части.
[159] После мутагенеза с использованием известных техник из обработанных семян выращиваются растения, или растения получаются из обработанных клеток. Например, может осуществляться посев мутировавших семян Brassica в соответствии с традиционными способами выращивания растений, после самоопыления на таких растениях образуются семена. В качестве альтернативы, может осуществляться экстрагирование удвоенных гаплоидных саженцев из обработанных клеток микроспор или пыльцы для непосредственного образования гомозиготных растений,
например, в соответствии с описанием в публикации Coventry et al. (1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canada). Может осуществляться сбор дополнительных семян, которые образуются в результате такого самоопыления в настоящем поколении или в последующих поколениях, а также их скриннинг на присутствие мутантных СКХ аллелей, с использованием техник обычных в данной области, например, техник на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) (амплификация скхЗ/скх5 аллелей) или техник на основе гибридизации, например, Саузерн-блоттинг, скрининг ВАС-библиотеки и других подобных техник и/или прямое секвенирование скхЗ/скх5 аллелей. Для скриннинга на присутствие точечных мутаций (так называемых однонуклеотидных полиморфизмов или SNP) в мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелях могут быть использованы традиционные методы детекции SNP, например, техник на основе олиголигирования, техник на основе достроек по одному основанию или техник на основе разнице в сайтах рестрикции, таких как TILLING.
[160] В соответствии с описанием выше мутагенизация (как спонтанная, так и индуцированная) специфического СКХЗ или СКХ5 аллеля приводит к присутствию одной или нескольких нуклеотидных делеций, вставок или замен (далее - "область мутации") в полученном мутантном СКХЗ или СКХ5 аллеля. Таким образом, мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель может характеризоваться местонахождением и конфигурацией одной или нескольких нуклеотидных делеций, вставок или замен в СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа. Сайт в СКХЗ или СКХ5 аллеле дикого типа, где присутствует одна или несколько нуклеотидных делеций, вставок или замен, соответственно, в настоящем документе также именуется "мутационная область или последовательность". При использовании по тексту настоящего документа термин "5'- или 3'-фланкирующая область" относится к области или последовательности ДНК в мутантном СКХЗ или СКХ5 аллеля (или соответствующего аллеля дикого типа) длиной, по меньшей мере, 20 п.о., предпочтительно, по меньшей мере, 50 п.о., по меньшей мере, 750 п.о. , по меньшей мере, 1500 п.о., и до 5000 п.о. ДНК, отличной от ДНК, содержащей одну или нескольких нуклеотидных делеций, вставок или
замен, предпочтительно ДНК из мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля (или соответствующего аллеля дикого типа), которая (5'-фланкирующая область) примыкает к и расположена непосредственно перед областью мутации, или которая (3'-фланкирующая область) примыкает к и расположена непосредственно после области мутации в мутантном СКХЗ или СКХ5 аллеле (или соответствующем СКХЗ или СКХ5 аллеле дикого типа). При использовании по тексту настоящего документа термин "примыкающая область" относится к области ДНК в мутантном СКХЗ или СКХ5 аллеле (или в соответствующем аллеле дикого типа), где область мутации и 5'-или 3'-фланкирующая область соединены друг с другом. Таким образом, последовательность, которая охватывает примыкающую область между областью мутации и 5'- или 3'-фланкирующей областью, включает мутационную последовательность, а также смежную с ней фланкирующую последовательность.
[161] Вариантные СКХ5 или СКХЗ аллели также могут быть идентифицированы путем идентификации локусов количественного признака в отношении количества цветков, стручков или семян на стручок и идентификации лежащих в основе генов СКХ. Аналогичным образом, вариантные СКХЗ или СКХ5 аллели также могут быть идентифицированы путем фенотипического скриннинга в отношении количества цветков, стручков или семян на стручок или побег или размера меристемы соцветия и идентификации лежащих в основе генов/аллелей СКХЗ или СКХ5.
[162] Средства, разработанные для идентификации специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля или растения или растительного материала, содержащего специфический мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, или продуктов, которые содержат растительный материал, содержащий специфический мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, основаны на специфических геномных характеристиках специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля по сравнению с геномными характеристиками соответствующего СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, таких как специфическая рестрикционная карта геномной области, содержащей область мутации, молекулярные маркеры или последовательность фланкирующих областей и/или областей мутации.
[163] После секвенирования специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля с использованием техник молекулярной биологии могут быть разработаны праймеры и зонды, которые специфически распознают последовательность в 5'-фланкирующих, 3'-фланкирующих областях и/или областях мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля в нуклеиновой кислоте (ДНК или РНК) образца. Например, для идентификации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля в биологических образцах (например, в образцах растений, растительного материала или продуктов, содержащих растительный материал) может быть разработан метод на основе ПЦР. В таком методе на основе ПЦР могут быть использованы, по меньшей мере, два специфических праймера: один из праймеров распознает последовательность внутри 5' или 3'-фланкирующей области мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, а второй - последовательность внутри 3' или 5'--фланкирующей области мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, соответственно; или один из праймеров распознает последовательность внутри 5' или 3'-фланкирующей области мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, а второй - последовательность внутри области мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля; или один из праймеров распознает последовательность внутри 5' или 3'-фланкирующей области мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, а второй - последовательность, охватывающую примыкающую область между 3' или 5' фланкирующей областью и областью мутации специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля (в соответствии с описанием ниже), соответственно.
[164] Способ, который может использоваться для идентификации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля по настоящему изобретению, который включает амплификационный анализ биологического образца с использованием набора, по меньшей мере, из двух праймеров, причем указанный набор выбран из группы, состоящей из следующих элементов:
(а) набор праймеров, в котором один из указанных праймеров специфически распознает 5'- или 3'-фланкирующую область мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, а второй праймер специфически распознает область мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, и
(b) набор праймеров, в котором один из указанных праймеров специфически распознает 5'- или 3'-фланкирующую область мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, а второй праймер специфически распознает примыкающую область между 3'- или 5'-фланкирующей областью и областью мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, соответственно.
[165] Длина последовательности праймеров предпочтительно составляет 15 - 35 нуклеотидов, которые при оптимизированных условиях П1 IP "специфически распознают" последовательность с 5'- или 3'-фланкирующей областью, последовательность внутри области мутации или последовательность, которая охватывает примыкающую область между 3' или 5'-фланкирующей областью и областью мутации специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, таким образом, происходит амплификация специфического фрагмента ("специфический мутантный СКХЗ или СКХ5 фрагмент" или дискриминирующий ампликон) из образца нуклеиновой кислоты, содержащей специфический мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель. Это означает, что при оптимизированных условия П1 IP происходит амплификация лишь целевого мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, и никакой другой последовательности в геноме растения.
[166] В целях изобретения могут быть использованы следующие П1 IP праймеры: - олигонуклеотиды длиной в диапазоне от 17 нуклеотидов приблизительно до 200 нуклеотидов, включающие нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, из 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 последовательных нуклеотидов, выбранных из 5' или 3'-фланкирующей последовательности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля или ее комплементарной последовательности (т.е., например, 5' или 3'-фланкирующей последовательности относительно одной или нескольких нуклеотидных делеций, вставок или замен в мутантном СКХЗ или СКХ5 аллеле по изобретению, например, 5' или 3'-фланкирующей последовательности относительно вышеуказанных нонсенс-мутаций, миссенс-мутаций или мутаций со сдвигом рамки или 5' или 3'-фланкирующей последовательности относительно стоп-кодон-мутаций, которые
указаны выше в Таблицах, или вышеуказанных мутаций по типу замены или их комплементарных последовательностей) (праймеры, распознающие 5'-фланкирующие последовательности); или - олигонуклеотиды длиной в диапазоне от 17 нуклеотидов приблизительно до 200 нуклеотидов, включающие нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, из 17 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 20 нуклеотидов, выбранных из последовательности области мутации специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля или ее комплементарной последовательности (т.е., например, последовательности нуклеотидов, удаленных или замещенных в генах СКХЗ или СКХ5 по изобретению или ее комплементарной последовательности) (праймеры, распознающие мутационные последовательности).
[167] Длина праймеров может быть больше, чем указанные 17 последовательных нуклеотидов, и может составлять, например, 18, 19, 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 нуклеотидов или больше. Праймеры могут целиком состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из указанных нуклеотидных последовательностей фланкирующих последовательностей и последовательностей мутации. Тем не менее, нуклеотидная последовательность праймеров у их 5'-конца (т.е. вне 17 последовательных нуклеотидов, расположенных в 3'-конце) является менее критической. Таким образом, 5' последовательность зонда может состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из фланкирующих или мутационных последовательностей, в зависимости от ситуации, однако может также содержать несколько (например, 1, 2, 5, 10) ошибок спаривания. 5' последовательность праймеров может полностью состоять из нуклеотидной последовательности, не связанной с фланкирующими или мутационными последовательностями, например, нуклеотидной последовательности, представляющей участок распознавания рестрикционного фермента. Длина таких несвязанных последовательностей или фланкирующих последовательностей ДНК с ошибками спаривания предпочтительно не должна превышать 100, более предпочтительно не должна превышать 50 или даже не должна превышать или 25 нуклеотидов.
[168] Более того, подходящие праймеры могут состоять из или включать нуклеотидную последовательность, охватывающую примыкающую область между фланкирующими и мутационными последовательностями (т.е. например, примыкающую область между 5' или 3'-фланкирующей последовательностью относительно одной или нескольких нуклеотидных делеций, вставок или замен в мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелях по изобретению и последовательностью одной или нескольких нуклеотидных вставок или замен или 3'- или 5'-фланкирующей последовательностью, соответственно, относительно одной или нескольких нуклеотидных делеций, например, примыкающую область между 5' или 3'-фланкирующей последовательностью относительно вышеуказанных нонсенс-мутаций, миссенс-мутаций или мутаций со сдвигом рамки в генах СКХЗ илиСОЗ по изобретению в соответствии с описанием выше и последовательностью вышеуказанных нонсенс-мутаций, миссенс-мутаций или мутаций со сдвигом рамки, или примыкающую область между 5' или 3'-фланкирующей последовательностью относительно потенциальной вышеуказанной стоп-кодон-мутации или вышеуказанных мутаций по типу замены и последовательностью стоп-кодон-мутации или мутаций по типу замены, соответственно), при условии, что указанная нуклеотидная последовательность не получена исключительно из мутационной области или фланкирующих областей.
[169] Специалисту понятно, что правильно подобранные пары П1 IP праймеров не должны содержать последовательностей, комплементарных по отношению друг к другу.
[170] Для целей изобретения термин "комплементарная последовательность к нуклеотидной последовательности, представленной SEQ Ш No: X" означает нуклеотидную последовательность, которая может быть получена из представленной нуклеотидной последовательности путем замены нуклеотидов комплементарными нуклеотидами в соответствии с правилами Чаргаффа (А <-"Т; GoC) и считывания последовательности в направлении от 5' к 3', т.е. в направлении противоположном направлению представленной нуклеотидной последовательности.
[171] Примеры праймеров, которые могут быть использованы для идентификации специфических мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, описаны в разделе "Примеры".
[172] При использовании по тексту настоящего документа термин "нуклеотидная последовательность SEQ Ш NO: Z от положения X до положения Y" означает нуклеотидную последовательность, включающую обе нуклеотидных конечных точки.
[173] Предпочтительно длина амплифицированного фрагмента составляет 50 - 1000 нуклеотидов, например, 50 - 500 нуклеотидов или 100 - 350 нуклеотидов. Специфические праймеры могут иметь последовательность, идентичность последовательности которой составляет 80% - 100% относительно последовательности внутри 5'- или 3'-фланкирующей области, относительно последовательности внутри области мутации или последовательности, которая охватывает примыкающую область между 3' или 5'-фланкирующей областью и областями мутации специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, при условии, что ошибки спаривания все же позволяют осуществлять идентификацию специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля с помощью этих праймеров при оптимизированных условиях ПЦР. Диапазон допустимых ошибок считывания может быть с легкостью определен экспериментально и известен специалистам.
[174] Детекция и/или идентификация мутантного специфического фрагмента СКХЗ или СОЗможет осуществляться различными способами, например, путем определения размера после гельэлектрофореза или капиллярного электрофореза или с использованием методов детекции на основе флуоресценции. Кроме того, может осуществляться прямое секвенирование мутантных СКХЗ или СКХ5 специфических фрагментов. Специалистам также известны другие сиквенс-специфичные способы детекции амплифицированных фрагментов ДНК.
[175] Стандартные ПЦР-протоколы описаны в литературе, например, в публикации "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 3rd Edition, 2006) и в других публикациях. Оптимальные условия для ПЦР, включая последовательность
специфических праймеров, указаны в протоколе ШГР-идентификации для каждого специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля. Однако очевидно, что может потребоваться корректировка количества параметров в протоколе ШГР-идентификации для соответствия конкретным лабораторным условиям, а также может потребоваться незначительно модифицирование таких параметров для получения аналогичных результатов. Например, при применении другого способа получения ДНК может потребоваться корректировка, например, в отношении количества праймеров, концентрации полимеразы, MgCh или используемых условий отжига. Аналогичным образом, при выборе других праймеров необходимо подобрать другие оптимальные условия протокола ПНР-идентификации. Тем не менее, такие корректировки очевидны для специалистов, более подробная информация, относящаяся к таким корректировкам, приведена в действующих руководствах по применению ПЦР, например, в публикациях, указанных выше.
[ 176] Примеры протоколов ШГР-идентификации, которые могут быть использованы для идентификации специфических мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, описаны в разделе "Примеры".
[177] В качестве альтернативы, специфические праймеры могут быть использованы для амплификации мутантного СКХЗ или СКХ5 специфического фрагмента, который может использоваться в качестве а "специфического зонда" для идентификации специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля в биологических образцах. Контактирование нуклеиновой кислоты биологического образца с зондом при условиях, обеспечивающих возможность гибридизации зонда с соответствующим фрагментом в нуклеиновой кислоте приводит к образованию гибрида нуклеиновой кислоты/зонда. Может осуществляться детекция образования этого гибрида (например, путем мечения нуклеиновой кислоты или зонда), при этом образование этого гибрида указывает на присутствие специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля. Такие способы идентификации на основании гибридизации с использованием специфического зонда (на твердофазном носителе или в растворе) были описаны в литературе. Такой специфический зонд предпочтительно
представляет собой последовательность, которая при оптимизированных условиях специфически гибридизирует с областью внутри 5' или 3' фланкирующей области и/или внутри области мутации специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля (которая именуется в настоящем документе "специфическая область мутантного СКХЗ или СКХ5"). Предпочтительно, специфический зонд содержит последовательность длиной 10 - 1000 п.о., 50 - 600 п.о., 100 - 500 п.о., 150 - 350 п.о., которая, по меньшей мере, на 80%, предпочтительно на 80 - 85%, более предпочтительно на 85 - 90%, в частности, предпочтительно на 90 - 95%, наиболее предпочтительно на 95% - 100% идентична (или комплементарна) нуклеотидной последовательности специфической области. Предпочтительно, специфический зонд содержит последовательность длиной приблизительно 13 - 100 смежных нуклеотидов идентичных (или комплементарных) специфической области специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля.
[178] Способ, который может использоваться для идентификации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, - это способ, который включает гибридизационный анализ биологического образца с использованием, по меньшей мере, одного специфического зонда, причем указанный зонд выбран из группы, состоящей из следующих зондов:
(a) зонд, который специфически распознает область мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, и
(b) зонд, который специфически распознает примыкающую область между 3'- или 5'-фланкирующей областью и областью мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля.
[179] В целях изобретения могут быть использованы следующие специфические зонды:
- олигонуклеотиды длиной в диапазоне от 13 нуклеотидов приблизительно до 1000 нуклеотидов, включающие нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, из 13 последовательных нуклеотидов, выбранных из 5' или 3'-фланкирующей последовательности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля или ее комплементарной последовательности (т.е., например, 5' или 3'-фланкирующей
последовательности относительно одной или нескольких нуклеотидных делеций, вставок или замен в мутантном СКХЗ или СКХ5 аллеле по изобретению, например, 5' или 3'-фланкирующей последовательности относительно вышеуказанных нонсенс-мутаций, миссенс-мутаций или мутаций со сдвигом рамки или 5' или 3'-фланкирующей последовательности относительно стоп-кодон-мутаций, которые указаны выше в Таблицах, или вышеуказанных мутаций по типу замены) или последовательности, имеющей, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности с такой последовательностью (зонды, распознающие 5'-фланкирующие последовательности); или - олигонуклеотиды длиной в диапазоне от 13 нуклеотидов приблизительно до 1000 нуклеотидов, включающие нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, из 13 последовательных нуклеотидов, выбранных из мутационной последовательности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля или ее комплементарной последовательности (т.е., например, последовательности нуклеотидов, вставленных или замещенных в генах СКХЗ или СКХ5 по изобретению или ее комплементарной последовательности) или последовательности, имеющей, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности с такой последовательностью (зонды, распознающие мутационные последовательности).
[180] Зонды могут целиком состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из указанных нуклеотидных последовательностей фланкирующих последовательностей и последовательностей мутации. Тем не менее, нуклеотидная последовательность зондов у их 5' или 3'-конца является менее критической. Таким образом, 5' или 3' последовательности зонда могут состоять из нуклеотидной последовательности, выбранной из фланкирующих или мутационных последовательностей, в зависимости от ситуации, однако может также состоять из нуклеотидной последовательности, не связанной с фланкирующими или мутационными последовательностями. Длина таких несвязанных последовательностей предпочтительно не должна превышать 50, более
предпочтительно не должна превышать 25 или даже не должна превышать 20 или 15 нуклеотидов.
[181] Более того, подходящие зонды могут состоять из или включать нуклеотидную последовательность, охватывающую примыкающую область между фланкирующими и мутационными последовательностями (т.е. например, примыкающую область между 5' или 3'-фланкирующей последовательностью относительно одной или нескольких нуклеотидных делеций, вставок или замен в мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелях по изобретению и последовательностью одной или нескольких нуклеотидных вставок или замен или 3'- или 5'-фланкирующей последовательностью, соответственно, относительно одной или нескольких нуклеотидных делеций, например, примыкающую область между 5' или 3'-фланкирующей последовательностью относительно вышеуказанных нонсенс-мутаций, миссенс-мутаций или мутаций со сдвигом рамки в генах СКХЗ илиСОЗ по изобретению в соответствии с описанием выше и последовательностью вышеуказанных нонсенс-мутаций, миссенс-мутаций или мутаций со сдвигом рамки, или примыкающую область между 5' или 3'-фланкирующей последовательностью относительно потенциальных стоп-кодон-мутаций, которые указаны выше в Таблицах, или вышеуказанных мутаций по типу замены или их комплементарных последовательностей, соответственно), при условии, что указанная нуклеотидная последовательность не получена исключительно из мутационной области или фланкирующих областей.
[182] Примеры специфических зондов, которые могут быть использованы для идентификации специфических мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, описаны в разделе "Примеры".
[183] Детекция и/или идентификация мутантной специфической области СКХ5 или СКХЗ, которая гибридизирует со специфичным зондом, может осуществляться различными способами, например, путем определения размера после гельэлектрофореза или с использованием методов детекции на основе флуоресценции. Специалистам также известны другие сиквенс-специфичные
способы детекции "мутантной специфической области СКХ5 или СКХЗ", которая гибридизирует со специфичным зондом.
[184] В качестве альтернативы, растение или части растения, включающие один или несколько мутантных скх5 или скх5 и скхЗ аллелей, могут быть получены и идентифицированы с использованием других способов, например, с использованием способа "Delete-a-gene(tm)", в котором применяется П1 IP для скриннинга делеционных мутантов, полученных путем мутагенеза с использованием быстрых нейтронов (рассматривается в публикации Li and Zhang, 2002, Funct Integr Genomics 2:254-258), путем TILLrNG-подхода (поиск индуцированных локальных нарушений в геномах), с помощью которого осуществляется идентификация EMS-индуцированных точечных мутаций с использованием денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (DFTPLC) для детекции изменений пар оснований путем гетеродуплексного анализа (McCallum et al, 2000, Nat Biotech 18:455, and McCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442) и т.д. Как упоминалось, в TILLING-подходе используется скрининг высокой производительности в отношении мутаций (например, путем Cel 1-расщепления гетеродуплексов мутантной ДНК-ДНК дикого типа и детекции с использованием системы секвенирующего геля). Таким образом, настоящее изобретение также включает применение TILLrNG-подхода для идентификации растений или частей растений, включающих один или несколько мутантных скх5 или скхЗ аллелей, и способы получения и идентификации таких растений, органов, тканей и семян растений. Таким образом, в соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения способ согласно данному изобретению включает этапы мутагенеза семян растений (например, EMS-мутагенез), создания пула отдельных растений или ДНК, ПЦР-амплификация целевой области, образование гетеродуплексов и детекция высокой производительности, идентификация мутантного растения, секвенирование мутантного ПЦР-продукта. Следует понимать, что другие методы мутагенеза и/или селекции могут также быть использованы для создания таких мутантных растений.
[185] Вместо индуцирования мутаций в СКХЗ или СКХ5 аллелях может осуществляться идентификация природных мутантных аллей (полученных в результате спонтанных мутаций) способами, известными специалистам. Например, для скриннинга множества растений или частей растений на присутствие природных мутантных ckx3/ckx5 аллелей может применяться способ ECOTJLLING (Henikoff et al. 2004, Plant Physiology 135(2):630-6). Что касается вышеуказанных техник мутагенеза, предпочтительно осуществляется скриннинг растений рода Brassica, содержащих геном А и/или С, чтобы идентифицированный скхЗ/скх5 аллель затем мог быть введен в другие виды рода Brassica, такие как Brassica napus, путем скрещивания (внутри- или межвидовое скрещивание) и селекции. В способе ECOTJLLING осуществляется скриннинг природных полиморфизмов в линиях скрещивания или в родственных видах в соответствии с методологией TILLING, описанной выше, когда отдельные растения или пулы растений используются для ПЦР-амплификации целевого скхЗ/скх5, образования гетеродуплексов и анализа высокой производительности. После этого может осуществляться отбор отдельных растений, содержащих необходимую мутацию, которые впоследствии могут быть использованы в селекционной программе для встраивания целевого мутантного аллеля.
[186] Затем может осуществляться секвенирование идентифицированного мутантного аллеля, а также сравнение последовательности с аллелем дикого типа для идентификации мутаций. При необходимости, может осуществляться тестирование функциональности в соответствии с описанием выше. С использованием этого подхода может осуществлять идентификация множества мутантных скхЗ/скх5 аллелей (и растений рода Brassica, содержащих один или несколько таких аллелей). Целевые мутантные аллели могут комбинироваться с целевыми аллелями дикого типа с использованием методов скрещивания и селекции в соответствии с описанием ниже. Наконец, получают одиночные растения, включающие необходимое количество мутантных скхЗ/скх5 аллелей и необходимое количество СКХЗ и СКХ5 аллелей дикого типа.
[187] Также для обнаружения специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля могут быть использованы олигонуклеотиды, применимые в качестве ШГР-праймеров или специфических зондов, для разработки способа определения статуса зиготности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля.
[188] Для определения статуса зиготности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля может быть разработан анализ на основе П1 IP для определения присутствия специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля и/или соответствующего аллеля дикого типа.
[189] Для определения статуса зиготности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля могут быть разработаны два праймера, которые специфически распознают СКХЗ или СКХ5 аллель дикого типа таким образом, чтобы они были направлены друг к другу, и чтобы они имели область мутации, расположенную между праймерами. Такими праймерами могут являться праймеры, которые специфически распознают 5'- или 3'-фланкирующие последовательности, соответственно. Такой набор праймеров позволяет осуществлять одновременную диагностическую ШГР-амплификацию мутанта, а также соответствующего СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа.
[190] В качестве альтернативы, для определения статуса зиготности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля могут быть разработаны два праймера, которые специфически распознают СКХЗ или СКХ5 аллель дикого типа таким образом, чтобы они были направлены друг к другу, и чтобы один из них специфически распознавал область мутации. Такими праймерами могут являться праймеры, которые специфически распознают последовательность 5'- или 3'-фланкирующей области и область мутации СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, соответственно. Такой набор праймеров вместе с третьим праймером, который специфически распознает последовательность области мутации в мутантном СКХЗ или СКХ5 аллеле, позволяет осуществлять одновременную диагностическую ПЦР-амплификацию мутантного гена СКХЗ или СКХ5, а также соответствующего гена СКХЗ или СКХ5 дикого типа.
[191] В качестве альтернативы, для определения статуса зиготности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля могут быть разработаны два праймера, которые специфически распознают СКХЗ или СКХ5 аллель дикого типа таким образом, чтобы они были направлены друг к другу, и чтобы один из них специфически распознавал примыкающую область между 5'- или 3'-фланкирующей областью и областью мутации. Такими праймерами могут являться праймеры, которые специфически распознают 5'- или 3'-фланкирующую последовательность и примыкающую область между областью мутации и 3'- или 5'-фланкирующей областью СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, соответственно. Такой набор праймеров вместе с третьим праймером, который специфически распознает примыкающую область между областью мутации и 3'- или 5'-фланкирующей областью мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, соответственно, позволяет осуществлять одновременную диагностическую ПЦР-амплификацию мутантного гена СКХЗ или СКХ5, а также гена СКХЗ или СКХ5 дикого типа.
[ 192] В качестве альтернативы, статус зиготности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля может быть определен с использованием альтернативного набора праймеров, которые специфически распознают мутантные СКХЗ или СКХ5 аллели и СКХЗ или СКХ5 аллели дикого типа.
[193] Способ, который может использоваться для определения статуса зиготности мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, включает амплификационную реакцию геномной ДНК указанного растения, клетки, части, семени или потомства указанного растения, которая осуществляется с использованием набора, по меньшей мере, из двух или, по меньшей мере, трех праймеров, причем, по меньшей мере, два из указанных праймеров специфически распознают СКХЗ или СКХ5 аллель дикого типа, при этом, по меньшей мере, два праймера выбраны из группы, состоящей из следующих элементов:
(а) первый праймер, который специфически распознает 5'- или 3'-фланкирующую область мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля и СКХЗ или
СКХ5 аллеля дикого типа, и второй праймер, который специфически распознает область мутации СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, и (Ь) первый праймер, который специфически распознает 5'- или 3'-фланкирующую область мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля и СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, и второй праймер, который специфически распознает примыкающую область между 3'- или 5'-фланкирующей областью и областью мутации СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, соответственно, и
причем, по меньшей мере, два из указанных праймеров специфически распознают СКХЗ или СКХ5 аллель дикого типа, при этом, по меньшей мере, два праймера выбраны из группы, состоящей из следующих элементов:
(a) первый праймер, который специфически распознает 5'- или 3'-
фланкирующую область мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля и СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, и третий праймер, который специфически распознает область мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, и
(b) первый праймер, который специфически распознает 5'- или 3'-
фланкирующую область мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля и СКХЗ или
СКХ5 аллеля дикого типа, и третий праймер, который специфически
распознает примыкающую область между 3'- или 5'-фланкирующей
областью и областью мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля,
соответственно.
[194] Если растение является гомозиготным для мутантного гена СКХЗ или СКХ5 или соответствующего гена СКХЗ или СКХ5 дикого типа, с помощью диагностического ШГР-анализа, описанного выше, можно получить одиночный П1IP-продукт, который является типичным, предпочтительно типичным по длине, для мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля или для СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа. Если растение является гетерозиготным для мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, будут получены два специфических ШГР-продукта, что отражает амплификацию мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля или СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа.
[195] Идентификация продуктов П1 IP специфических к мутантным СКХЗ или СКХ5 или к СКХЗ или СКХ5 дикого типа, может осуществляться, например, путем определения размера после гельэлектрофореза или капиллярного электрофореза (например, для мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, содержащих некоторое количество нуклеотидных вставок или делеций, что приводит к разнице в размере между фрагментами, амплифицированными из СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа и мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, таким образом, чтобы могла осуществляться визуальная сепарация указанного фрагмента на геле); путем оценки присутствия или отсутствия двух различных фрагментов после гельэлектрофореза или капиллярного электрофореза, при этом при необходимости может осуществляться диагностическая ПЦР-амплификация мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля отдельно от диагностической ШГР-амплификации СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа; путем прямого секвенирования амплифицированного фрагмента; или методами детекции на основе флуоресценции.
[196] Примеры праймеров, которые могут быть использованы для определения статуса зиготности специфических мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, описаны в разделе "Примеры".
[197] В качестве альтернативы, для определения статуса зиготности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля может быть разработан анализ на основе гибридизации для определения присутствия специфического мутантного СКХЗ ияиСКХ5 аллеля и/или СКХЗ или СКХ5 специфического аллеля дикого типа.
[198] Для определения статуса зиготности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля могут быть разработаны два специфических зонда, которые распознают СКХЗ или СКХ5 аллель дикого типа таким образом, чтобы каждый зонд специфически распознавал последовательность в СКХЗ или СКХ5 аллеле дикого типа, и чтобы область мутации была расположена между последовательностями, распознаваемыми зондами. Такими зондами могут являться зонды, которые специфически распознают 5'- или 3'-фланкирующие последовательности, соответственно. Применение одного или, предпочтительно, обоих таких зондов
позволяет осуществлять одновременную диагностическую гибридизацию мутанта, а также соответствующего СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа.
[199] В качестве альтернативы, для определения статуса зиготности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля могут быть разработаны два специфических зонда, которые распознают СКХЗ или СКХ5 аллель дикого типа таким образом, чтобы один из зондов специфически распознавал последовательность в СКХЗ или СКХ5 аллеле дикого типа перед областью мутации или после области мутации, предпочтительно перед областью мутации, и чтобы один из зондов специфически распознавал область мутации. Такими зондами могут являться зонды, которые специфически распознают последовательность 5'- или 3'-фланкирующей области, предпочтительно 5'-фланкирующей области, и область мутации СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, соответственно. Применение одного или, предпочтительно, обоих зондов, при необходимости, вместе с третьим зондом, который специфически распознает последовательность области мутации в мутантном СКХЗ или СКХ5 аллеле, позволяет осуществлять диагностическую гибридизацию мутантного гена СКХЗ или СКХ5 и гена СКХЗ или СКХ5 дикого типа.
[200] В качестве альтернативы, для определения статуса зиготности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля может быть разработан специфический зонд, который специфически распознает СКХЗ или СКХ5 аллель дикого типа таким образом, чтобы зонд специфически распознавал примыкающую область между 5'-или 3'-фланкирующей областью, предпочтительно, 5'-фланкирующей областью, и областью мутации СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа. Этот зонд, при необходимости, вместе со вторым зондом, который специфически распознает примыкающую область между 5'- или 3'-фланкирующей областью, предпочтительно, 5'-фланкирующей областью, и областью мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, позволяет осуществлять диагностическую гибридизацию мутантного гена СКХЗ или СКХ5 и гена СКХЗ или СКХ5 дикого типа.
[201] В качестве альтернативы, статус зиготности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля может быть определен с использованием альтернативного набора
зондов, которые специфически распознают мутантные СКХЗ или СКХ5 аллели и СКХЗ или СКХ5 аллели дикого типа.
[202] Способ, который может использоваться для определения статуса зиготности мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, включает гибридизационный анализ геномной ДНК указанного растения, клетки, части, семени или потомства указанного растения, который осуществляется с использованием набора, по меньшей мере, из двух специфических зондов, причем, по меньшей мере, один из указанных специфических зондов специфически распознает СКХЗ или СКХ5 аллель дикого типа, при этом, по меньшей мере, один указанный зонд выбран из группы, состоящей из следующих элементов:
(a) первый зонд, который специфически распознает 5'- или 3'-фланкирующую
область мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля и СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, и второй зонд, который специфически распознает область мутации СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа,
(b) первый зонд, который специфически распознает 5'- или 3'-фланкирующую
область мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля и СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, и второй зонд, который специфически распознает примыкающую область между 3'- или 5'-фланкирующей областью и областью мутации СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, соответственно, и
(c) зонд, который специфически распознает примыкающую область между
5'- или 3'-фланкирующей областью и областью мутации СКХЗ или СКХ5
аллеля дикого типа, и
причем, по меньшей мере, один из указанных специфических зондов специфически распознает мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, при этом, по меньшей мере, один зонд выбран из группы, состоящей из следующих элементов: (а) первый зонд, который специфически распознает 5'- или 3'-фланкирующую область мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля и СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, и третий зонд, который специфически распознает область мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля,
(b) первый зонд, который специфически распознает 5'- или 3'-фланкирующую
область мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля и СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа, и третий зонд, который специфически распознает примыкающую область между 5'- или 3'-фланкирующей областью и областью мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, и
(c) зонд, который специфически распознает примыкающую область между 5' -
или 3'-фланкирующей областью и областью мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля.
[203] Если растение является гомозиготным для мутантного гена СКХЗ или СКХ5 или соответствующего гена СКХЗ или СКХ5 дикого типа, с помощью диагностического гибридизационного анализа, описанного выше, можно получить одиночный специфический продукт гибридизации, например, один или несколько фрагментов гибридизирующей ДНК (рестрикционных фрагментов), который является типичным, предпочтительно типичным по длине, для мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля или для СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа. Если растение является гетерозиготным для мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, будут получены два специфических продукта гибридизации, что отражает гибридизацию мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля или СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа.
[204] Идентификация продуктов гибридизации, специфических к мутантным СКХЗ или СКХ5 или к СКХЗ или СКХ5 дикого типа, может осуществляться, например, путем определения размера после гельэлектрофореза или капиллярного электрофореза (например, для мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, содержащих некоторое количество нуклеотидных вставок или делеций, что приводит к разнице в размере между фрагментами гибридизирующей ДНК (рестрикционными фрагментами), амплифицированными из СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа и мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, таким образом, чтобы могла осуществляться визуальная сепарация указанного фрагмента на геле); путем оценки присутствия или отсутствия двух различных специфических продукта гибридизации после гельэлектрофореза или капиллярного электрофореза, при этом при необходимости
может осуществляться диагностическая гибридизация мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля отдельно от диагностической гибридизации СКХЗ или СКХ5 аллеля дикого типа; путем прямого секвенирования фрагментов гибридизирующей ДНК (рестрикционных фрагментов); или методами детекции на основе флуоресценции.
[205] Примеры зондов, которые могут быть использованы для определения статуса зиготности специфических мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, описаны в разделе "Примеры".
[206] Кроме того, могут быть разработаны способы детекции, специфические для специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, которые отличаются от способов амплификации на основе ПЦР или гибридизации, с использованием представленной в настоящем документе информации о специфической последовательности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля. Такие альтернативные способы детекции включают способы детекции с помощью линейной сигнальной амплификации на основе инвазивного расщепления определенных структур нуклеиновой кислоты, которые также известны как технология Invader(tm) (в соответствии с описанием, например, в патенте США 5,985,557 "Инвазивное расщепление нуклеиновых кислот", 6,001,567 "Детекция нуклеотидных последовательностей с помощью направленного расщепления Invader" или в работе Lyamichev et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 292, которые включены в настоящий документ посредством ссылки), способы детекции на основе ОТ-ПЦР, такие как Taqman (линейные разрушаемые зонды) или другие способы детекции, такие как SNPlex. Вкратце, в соответствии с технологией Invader(tm), например, может осуществляться гибридизация целевой мутационной последовательности, с использованием меченного первого олигонуклеотида нуклеиновой кислоты, который включает нуклеотидную последовательность мутационной последовательности или последовательности, которая охватывает примыкающую область между 3'-фланкирующей областью и областью мутации, и второго олигонуклеотида нуклеиновой кислоты, который включает 5'-фланкирующую последовательность, которая примыкает к и расположена
непосредственно после мутационной последовательности, при этом первый и второй олигонуклеотиды перекрывают друг друга, по меньшей мере, на один нуклеотид. Кроме того, например, может осуществляться гибридизация целевой мутационной последовательности, с использованием меченного первого олигонуклеотида нуклеиновой кислоты, который является комплементарным к нуклеотидной последовательности мутационной последовательности или последовательности, которая охватывает примыкающую область между 5'-фланкирующей областью и областью мутации, и второго олигонуклеотида нуклеиновой кислоты, который является комплементарным к 3'-фланкирующей последовательности, которая примыкает к и расположена непосредственно после мутационной последовательности, при этом первый и второй олигонуклеотиды перекрывают друг друга, по меньшей мере, на один нуклеотид. Двойная или тройная структура, которую получают в результате такой гибридизации, обеспечивает возможность селективного расщепления зонда с использованием фермента (Cleavase(r)), при этом целевая последовательность остается интактной. Затем осуществляется детекция расщепленного меченного зонда, потенциально с использованием промежуточного этапа, в результате чего обеспечивается дальнейшая амплификация сигнала. В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения первый олигонуклеотид нуклеиновой кислоты содержит у своего 5'-конца 5'-флэп, который не соответствует или не является комплементарным к целевым мутантным последовательностям или целевым последовательностям дикого типа, и содержит непосредственно после флэпа примыкающую область между 3' -фланкирующей областью и областью мутации, при этом мутационная последовательность расположена у 5'-конца указанной примыкающей области, а указанный второй олигонуклеотид нуклеиновой кислоты содержит 5'-фланкирующую последовательность, которая примыкает к и расположена непосредственно перед областью мутации, а у 3'-конца непосредственно после 5'-фланкирующей последовательности содержит один дополнительный нуклеотид, который может представлять собой любой нуклеотид. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения первый олигонуклеотид нуклеиновой кислоты содержит
у своего 5'-конца 5'-флэп, который не соответствует или не является комплементарным к целевым мутантным последовательностям или целевым последовательностям дикого типа, и содержит непосредственно после флэпа последовательность, комплементарную к примыкающей области между 5'-фланкирующей областью и областью мутации, и комплементарную к мутационной последовательности, расположенной у 5'-конца указанной примыкающей области, а указанный второй олигонуклеотид нуклеиновой кислоты является комплементарным к 3'-фланкирующей последовательности, которая примыкает к и расположена непосредственно перед областью мутации, а у 3'-конца непосредственно после комплементарной 3'-фланкирующей последовательности он содержит один дополнительный нуклеотид, который может представлять собой любой нуклеотид. Длина последовательности, которая соответствует или является комплементарной к примыкающей области в первом олигонуклеотиде, может составлять, по меньшей мере, 5 или, по меньшей мере, 8 или, по меньшей мере, 10 или, по меньшей мере, 15 или, по меньшей мере, 20 или, по меньшей мере, 25 или, по меньшей мере, 30 или, по меньшей мере, 40 или, по меньшей мере, 50 нуклеотидов. Длина последовательности, которая соответствует или является комплементарной к фланкирующей области во втором олигонуклеотиде, может составлять, по меньшей мере, 5 или, по меньшей мере, 8 или, по меньшей мере, 10 или, по меньшей мере, 15 или, по меньшей мере, 20 или, по меньшей мере, 25 или, по меньшей мере, 30 или, по меньшей мере, 40 или, по меньшей мере, 50 нуклеотидов. Длина 5'-флэпа в первом олигонуклеотиде может составлять, по меньшей мере, 3 или, по меньшей мере, 5 или, по меньшей мере, 8 или, по меньшей мере, 10 или, по меньшей мере, 15 или, по меньшей мере, 20 нуклеотидов.
[207] Способ, который может использоваться для идентификации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, представляет собой способ, который включает гибридизационный анализ биологического образца с использованием:
(а) меченного первого олигонуклеотида нуклеиновой кислоты, который включает первую нуклеотидную последовательность мутационной последовательности или последовательности, которая охватывает
примыкающую область между 3'-фланкирующей областью и областью мутации, и второго олигонуклеотида нуклеиновой кислоты, который включает 5'-фланкирующую последовательность, которая примыкает к и непосредственно расположена после мутационной последовательности, при этом первый и второй олигонуклеотиды перекрывают друг друга, по меньшей мере, на один нуклеотид; или (Ь) меченного первого олигонуклеотида нуклеиновой кислоты, который является комплементарным к нуклеотидной последовательности мутационной последовательности или последовательности, которая охватывает примыкающую область между 5'-фланкирующей областью и областью мутации, и второго олигонуклеотида нуклеиновой кислоты, который является комплементарным к 3'-фланкирующей последовательности, которая примыкает к и непосредственно расположена после мутационной последовательности, при этом первый и второй олигонуклеотиды перекрывают друг друга, по меньшей мере, на один нуклеотид.
[208] Идентификация мутантных СКХЗ или СКХ5 аллеле также может осуществляться путем определения последовательности СКХЗ или СКХ5 аллелей. Секвенирование может осуществляться с использованием стандартных способов, известных специалистам.
[209] При использовании по тексту настоящего документа термин "комплект" относится к набору реагентов, который предназначается для осуществления способа по изобретению, в частности, для идентификации специфического мутантного СКХЗ ияиСКХ5 аллеля в биологических образцах или для определения статуса зиготности растительного материала, содержащего специфический мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель. В частности, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения комплект по изобретению включает, по меньшей мере, два специфических праймера в соответствии с описанием выше для идентификации специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля или, по меньшей мере, два или
три специфических праймера для определения статуса зиготности. При необходимости, комплект также может включать любой другой реагент, описанный в настоящем документе в протоколе ШГР-идентификации. В качестве альтернативы, в соответствии с другим вариантом осуществления изобретения комплект может включать, по меньшей мере, один специфический зонд, который специфически гибридизирует с нуклеиновой кислотой биологических образцов для идентификации присутствия специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля в соответствии с описанием выше, для идентификации специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, или комплект может включать, по меньшей мере, два или три специфических зонда для определения статуса зиготности. При необходимости, комплект также может включать любой другой реагент (в том числе, помимо прочего, буфер для гибридизации, для амплификации или метку) для идентификации специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля в биологических образцах с использованием специфического зонда.
[210] Комплект по изобретению может использоваться (при этом его компоненты могут быть специально корректироваться) для целей контроля качества (например, для контроля чистоты посевных серий), для детекции присутствия или отсутствия специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля в растительном материале или материале, который содержит растительный материал, или который был получен из растительного материала, включая, помимо прочего, продукты питания или корма.
[211] При использовании по тексту настоящего документа термин "праймер" включает любые нуклеиновые кислоты, которые способны инициировать синтез возникающей нуклеиновой кислоты в матрица-зависимом процессе, таком как ПЦР. Как правило, праймеры представляют собой олигонуклеотиды длиной от 10 до 30 нуклеотидов, однако также могут быть использованы последовательности большей длины. Могут быть использованы праймеры в двухцепочечной форме, несмотря на то, что предпочтительной является одноцепочечная форма. В качестве праймеров могут быть использованы зонды, однако они предназначаются для связывания
целевой ДНК или РНК, и нет необходимости в их использовании в процессе амплификации.
[212] При использовании по тексту настоящего документа в отношении специфических праймеров термин "распознавать" относится к тому факту, что специфические праймеры специфически гибридизируют с нуклеотидной последовательностью в специфическом мутантном СКХЗ или СКХ5 аллеле при условиях, заданных в соответствии со способом (таких как условия протокола ШГР-идентификации), при этом определяется специфичность с помощью присутствующих положительных и отрицательных контролей.
[213] При использовании по тексту настоящего документа в отношении специфических зондов термин "гибридизировать" относится к тому факту, что зонд связывается со специфической областью в нуклеотидной последовательности специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля при стандартных условиях жесткости. При использовании по тексту настоящего документа термин "стандартные условия жесткости" относится к условиям гибридизации, описанным в настоящем документе, или к обычным условиям гибридизации, которые описаны в публикации Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY), при этом гибридизация, например, может включать следующие этапы: 1) иммобилизация фрагментов геномной ДНК растений или ДНК ВАС-библиотеки на фильтре, 2) предварительная гибридизация фильтра в течение 1 - 2 ч. при 65°С в 6 X SSC, 5 X раствора Денхардта, 0,5% SDS и 20 цг/мл денатурированной ДНК-носителя, 3) добавление меченного гибридизационного зонда, 4) инкубация в течение 16-24 ч., 5) однократная промывка фильтра в течение 30 мин. при 68°С в 6Х SSC, 0,1 %SDS, 6) трехкратная промывка фильтра (два раза - в течение 30 мин. в 30 мл и один раз в течение 10 мин. в 500 мл) при 68°С в 2 X SSC, 0,1 %SDS, и 7) прикладывание фильтра к рентгеновской пленке на 4 - 48 ч. при -70°С.
[214] При использовании по тексту настоящего документа термин "биологический образец" означает образец растения, растительного материала или продукта,
содержащего растительный материал. Предпочтительно биологический образец содержит нуклеиновые кислоты, такие как ДНК или РНК. Термин "растение" включает ткани растения на любой стадии зрелости, а также любые клетки, ткани или органы, полученные от любого такого растения, включая, помимо прочего, любые семена, листья, стебли, цветки, корни, одиночные клетки, гаметы, культуры клеток, культуры ткани или протопласты. При использовании по тексту настоящего документа термин "растительный материал" означает материал, который получен из растения. Термин "продукты, содержащие растительный материал" относится к пищевым продуктам, кормам и другим продуктам, которые получают с использованием растительного материала, или в которые может попасть растительный материал. Очевидно, что в контексте настоящего изобретения такие биологические образцы тестируются на присутствие нуклеиновых кислот, специфических для специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, что подразумевает присутствие нуклеиновых кислот в образцах. Таким образом, описанные в настоящем документе способы идентификации специфического мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля в биологических образцов относятся к идентификации в биологических образцах нуклеиновых кислот, содержащих специфический мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель.
[215] Настоящее изобретение также относится к комбинации специфических СКХЗ или СКХ5 аллелей в одном растении, к переносу одного или нескольких специфических мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей из одного растения в другое, к растениям, содержащим один или несколько специфических мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, к потомству, полученному из этих растений, к клеткам и частям таких растений, а также к семенам, полученным из таких растений.
[216] Таким образом, в соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения предоставляется способ комбинирования двух или более выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей в одном растении, при этом указанный способ включает следующие этапы:
(a) получение и/или идентификация двух или более растений, каждое из которых содержит один или несколько выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей в соответствии с описанием выше,
(b) скрещивание первого растения, содержащего один или несколько
выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, со вторым растением, содержащим один или несколько выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, сбор F1 семян, полученных в результате указанного скрещивания, и, при необходимости, идентификация F1 растений, включающих один или несколько выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей из первого растения вместе одним или несколькими выбранными мутантными СКХЗ или СКХ5 аллелями из второго растения в соответствии с описанием выше,
(c) при необходимости, повторение этапа (Ь) до тех пор, пока не будет получено растение F1, включающие все выбранные мутантные СКХ5 или СКХ5 и СКХЗ аллели,
(d) при необходимости,
идентификация растения F1, которое является гомозиготным или гетерозиготным для выбранного мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля путем определения статуса зиготности мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей в соответствии с описанием выше, или получение растений, которые являются гомозиготными для одного или нескольких выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, путем осуществления одного из следующих этапов:
экстракция удвоенных гаплоидов из обработанных микроспор или клеток пыльцы растений F1, которые содержат один или несколько выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей в соответствии с описанием выше,
самоопыление растений F1, включающих один или несколько выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей для получения одного или нескольких поколений (у), сбор Fl Sy
семян, полученных в результате указанного самоопыления, и идентификация Fl Sy растений, которые являются гомозиготными для одного или нескольких мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей в соответствии с описанием выше.
[217] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения предоставляется способ переноса одного или нескольких мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей из одного растения в другое растение, при этом указанный способ включает следующие этапы:
(a) получение и/или идентификация первого растения, включающего один
или несколько выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей в
соответствии с описанием выше, или получение первого растения путем
комбинирования одного или нескольких выбранных мутантных СКХЗ
или СКХ5 аллелей в одном растений в соответствии с описанием выше
(причем первое растение является гомозиготным или гетерозиготным
для одного или нескольких мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей),
(b) скрещивание первого растения, содержащего один или несколько
мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, со вторым растением, не содержащим один или несколько мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, сбор F1 семян, полученных в результате указанного скрещивания, (где семена являются гетерозиготными для мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, если первое растение являлось гомозиготным для такого мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, и где половина семян является гетерозиготной, а вторая половина семян является незиготическими для мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля (т.е. не содержит мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель), если первое растение являлось гетерозиготным для такого мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля), и, при необходимости, идентификация растений F1, содержащих один или несколько выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей в соответствии с описанием выше,
(c) обратное скрещивание растений F1, включающих один или несколько
выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, со вторым растением,
не содержащим одного или нескольких выбранных мутантных СКХЗ или
СКХ5 аллелей, для получения одного или нескольких поколений (х),
сбор ВСх семян, полученных в результате указанного скрещивания, и
идентификация в каждом поколении ВСх растений, включающих один
или несколько выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей в
соответствии с описанием выше,
(d) при необходимости, получение ВСх растений, которые являются
гомозиготными для одного или нескольких выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей, путем осуществления одного из следующих этапов: экстракция удвоенных гаплоидов из обработанных микроспор или клеток пыльцы растений ВСх, которые содержат один или несколько целевых мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей в соответствии с описанием выше,
самоопыление растений ВСх, включающих один или несколько целевых мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей для получения одного или нескольких поколений (у), сбор ВСх Sy семян, полученных в результате указанного самоопыления, и идентификация ВСх Sy растений, которые являются гомозиготными для одного или нескольких целевых мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей в соответствии с описанием выше.
[218] Указанный способ переноса одного или нескольких мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей из одного растения в другое растение также может использоваться для комбинирования одного или нескольких мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей в одном растении, при этом указанный способ комбинирования, по меньшей мере, двух выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей включает следующие этапы:
(а) идентификация, по меньшей мере, двух растений, каждое из которых
включает, по меньшей мере, один выбранный мутантный СКХЗ или
СКХ5 аллель,
(b) скрещивание указанных, по меньшей мере, двух растений и сбор F1 гибридных семян, полученных в результате указанного, по меньшей мере, одного скрещивания, и
(c) при необходимости, идентификация растений F1, включающих, по меньшей мере, два выбранных мутантных СКХЗ или СКХ5 аллеля.
[219] Идентификация указанных растений, включающих, по меньшей мере, один выбранный мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, может осуществляться с использованием способов в соответствии с описанием в настоящем документе.
[220] В соответствии с одним аспектом изобретения первое и второе растение являются растениями семейства Brassicaceae, в частности, растениями рода Brassica, в особенности растениями Brassica napus или культурными растениями других видов рода Brassica. В соответствии с другим аспектом изобретения первое растение представляет собой растение семейства Brassicaceae, в частности, растение рода Brassica, в особенности, растение Brassica napus или культурное растение других видов рода Brassica, а второе растение представляет собой растение из линии скрещивания из семейства Brassicaceae, в частности, из линии скрещивания из рода Brassica, в особенности, из линии скрещивания Brassica napus или из линии скрещивания другого вида культурных растений из рода Brassica. При использовании по тексту настоящего документа "линия скрещивания" предпочтительно означает гомозиготную растительную линию, которая отличается от других растительных линий предпочтительным генотипом и/или фенотипом, и которая используется для получения гибридного потомства.
[221] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения предоставляется способ получения растения, в частности, культурного растения Brassica, например, растения Brassica napus, с увеличенным количеством цветков, стручков или увеличенной массой тысячи семян, при этом указанный способ включает комбинирование мутантных СКХ5 или СКХ5 и СКХЗ аллелей в одном растении рода Brassica и/или перенос мутантных СКХ5 или СКХ5 и СКХЗ аллелей в одно растение рода Brassica в соответствии с описанием выше.
[222] В соответствии с изобретением также предоставляется способ увеличения количества цветков, стручков или массы тысячи семян, включающий введение, по меньшей мере, одного мутантного СКХ5 или, по меньшей мере, одного мутантного СКХ5 и, по меньшей мере, одного мутантного СКХЗ аллеля в растение рода Brassica; или включающий введение химерного гена по настоящему изобретению в растение рода Brassica.
[223] Мутантные СКХЗ или СКХ5 аллели могут быть введены в указанные растения рода Brassica с использованием описанных в настоящем документе способов, включая комбинирование мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей по настоящему изобретению в растении рода Brassica и/или перенос мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей по настоящему изобретению в растение рода Brassica. Кроме того, мутантные СКХЗ или СКХ5 аллели могут быть введены, например, посредством мутагенеза или генного таргетинга. Указанный способ может также включать идентификацию присутствия мутантных СКХЗ или СКХ5 аллелей с использованием описанных в настоящем документе способов.
[224] Химерный ген по настоящему изобретению может быть введен в растения рода Brassica с использованием трансформации.
[225] Способ увеличения количества цветков на растение, количества стручков или увеличения массы тысячи семян, включающий следующие этапы:
(а) получение клеток растения с одним или несколькими химерными генами для получения трансгенных клеток растения, при этом указанный химерный ген, включает следующие функционально связанные фрагменты ДНК:
i. промотор, экспрессируемый в растениях;
ii. область ДНК, которая при транскрипции дает молекулу РНК или белка, которая подавляет экспрессию или белковую активность одного или нескольких генов/белков СКХ5 или двух генов или
белков СКХ5 и одного или нескольких СКХЗ генов или белков; и, при необходимости, iii. 3'-концевая область, участвующая в терминации транскрипции и полиаденилировании;
(b) регенерация популяции трансгенных растительных линий из указанной клетки трансгенного растения; и
(c) идентификация растительной линии с увеличенным количеством цветков в указанной популяции трансгенных растительных линий.
[226] Средства для получения химерных генов хорошо известны специалистам. Способы получения химерных генов и векторов, в том числе химерных генов пригодных для трансформации растений, описаны в документах US4971908, US4940835, US4769061 и US4757011. Химерный ген также может содержать одну или несколько дополнительных нуклеотидных последовательностей.
[227] Указанный химерный ген может быть введен в указанное растение рода Brassica plant путем трансформации. При использовании в настоящем документе термин "трансформация" относится к введению (или переносу) нуклеиновой кислоты в организм-реципиент, например, в растение или в любые части или ткани растения, включая клетки растения, протопласты, каллюсы, корни, клубни, семена, стебли, листья, саженцы, зародыши и пыльцу. Трансгенными растениями называются растения, содержащие трансформированную нуклеотидную последовательность. Термины "трансформированный", "трансгенный" и "рекомбинантный" относятся к организмам-хозяевам, таким как растение, в которые была введена гетерологичная молекула нуклеиновой кислоты (например, кассета экспрессии или рекомбинантный вектор). Трансформированная нуклеиновая кислота может быть стабильно встроена в геном растения.
[228] При использовании по тексту настоящего документа термин "трансгенное растение" относится к растению, в геном которого (например, в ядерный или пластидный геном) стабильно встроена трансформированная нуклеиновая кислота.
Другими словами, трансгенными растениями называются растения, содержащие трансформированную нуклеотидную последовательность. Термины "трансгенный" и "рекомбинантный" относятся к организмам-хозяевам, таким как растения, в которые была введена молекула гетерологичной нуклеиновой кислоты (например, промотор, химерный ген или вектор в соответствии с описанием в настоящем документе). Нуклеиновая кислота может быть стабильно встроена в геном растения.
[229] Техники трансформации хорошо известны специалистам, такие техники включают агробактериальную трансформацию. Агробактериальная трансформация хлопка описана, например, в патенте США 5,004,863, в патенте США 6,483,013 и в WO2000/71733. Трансформация растений также может осуществляться путем обстрела из биобаллистической пушки: На частицы золота или вольфрама наносится ДНК, и затем производится обстрел клеток молодых растений или зародышей растений. С помощью этого способа также можно трансформировать пластиды растения. Вирусная трансформация (трансдукция) может использоваться для транзиентной или стабильной экспрессии гена, в зависимости от характера вирусного генома. Необходимый генетический материал упаковывается в соответствующий растительный вирус, и растение инфицируется модифицированным вирусом. Потомство инфицированных растений не заражено вирусом, а также не содержит введенного гена. Соответствующие способы вирусной трансформации описаны, например, в WO 90/12107, WO 03/052108 или WO 2005/098004. Другие соответствующие способы, известные специалистам, включают микроинъекции, электропорацю интактных клеток, индуцированную полиэтиленгликолем трансформацию протопластов, электропорацию протопластов, индуцированную липосомами трансформацию, трансформация, индуцированная нитевидными кристаллами кремния и т.д. Указанный трансген может быть стабильно встроен в геном указанной клетки растения с получением трансформированной клетки растения. Затем полученные таким образом трансформированные клетки растения могут регенерироваться в зрелые трансформированные растения, способные к размножению.
[230] В соответствии с одним аспектом изобретения растение по настоящему изобретению представляет собой растение рода Brassica, содержащее, по меньшей мере, один ген СКХ5, по меньшей мере, два гена СКХЗ, с увеличенным количеством цветков или увеличенной массой тысячи семян в результате комбинирования шести мутантных аллелей по настоящему изобретению в растении рода Brassica и/или переноса шести мутантных аллелей по настоящему изобретению в растение рода Brassica в соответствии с описанием выше (четыре СКХЗ аллеля и два СКХ5 аллеля).
[231] В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения предоставляется способ получения гибридного семени или растения рода Brassica или растения рода Brassica, которые содержат, по меньшей мере, два гена СКХ5 и, по меньшей мере, четыре гена СКХЗ, в частности, гибридного семени или растения Brassica napus, с увеличенным количеством цветков или массой тысячи семян, при этом указанный способ включает следующие этапы:
(a) получение и/или идентификация первого растения, включающего первый и второй выбранный мутантный СКХ5 аллель в гомозиготном состоянии, и второго растения, включающего, по меньшей мере, один выбранный мутантный СКХ аллель в гомозиготном состоянии в соответствии с описанием выше,
(b) скрещивание первого и второго растения и сбор F1 гибридных семян, полученных в результате скрещивания.
[232] В соответствии с одним аспектом изобретения первым или вторым выбранным мутантным СКХ5 аллелем может являться тот же мутантный СКХ5 аллель, что и третий выбранный мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, таким образом, чтобы F1 гибридные семена являлись гомозиготными для одного мутантного СКХ5 аллеля и гетерозиготными для другого аллеля. В соответствии с другим аспектом изобретения первое растение используется в качестве мужского родительского растения, второе растение используется в качестве женского родительского растения.
[233] При упоминании по тексту термина "растение" или "растения" согласно данному изобретению подразумевается, что, за исключением случаев, когда прямо
указано иное, настоящее изобретение также включает части растения (клетки, ткани или органы, семянки, семена, отделенные части, такие как корни, листья, цветки, пыльца и т.д.), потомство растений, которое сохраняет отличительные характеристики родителей (в особенности, характеристики, относящиеся к растрескиванию плодов), такое как семя, полученное путем самоопыления или скрещивания, например, гибридное семя (полученное путем скрещивания двух инбредных родительских линий), гибридные растения и части растений, полученный из таких растений.
[234] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения клетки растений по изобретению, т.е. клетки растений, включающие, по меньшей мере, один мутантный СКХ5 или, по меньшей мере, один мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, или клетки растений, в которых снижена экспрессия, по меньшей мере, одного гена СКХ5 или, по меньшей мере, одного гена СКХ5 и одного гена СКХЗ, а также клетки растений, полученные способами по изобретению, могут представлять собой не размножающиеся клетки.
[235] Полученные растения по настоящему изобретению могут быть использованы в обычной схеме селекции для получения других растений с теми же характеристиками или для введения характеристик присутствия, по меньшей мере, одного мутантного СКХ5 аллеля с пониженной экспрессией, по меньшей мере, одного СКХ5 в другие сорта того же вида или в растения родственных видов или в гибридные растения. Полученные растения также могут быть использованы для создания материала для размножения. Растения по настоящему изобретению также могут быть использованы для получения гамет, семян (включая измельченные семена и жмых из семян), масла из семян, зиготных или соматических зародышей, потомства или гибридов растений, полученных способами по настоящему изобретению. Также изобретение включает семена, полученный из растений по настоящему изобретению.
[236] При использовании по тексту настоящего документа выражение "создание материала для размножения" относится к любым известным специалистам средствам
для получения других растений, частей или семян растений, такое выражение включает, помимо прочего, способы вегетативного размножения (например, размножение отводками, деление, прививка (почками), микроклональное размножение, столоны или плети, запасающие органы, такие как луковицы, клубнелуковицы, клубни и ризомы, разрезание или разделение клубней или луковиц), половое размножение (скрещивание с другим растением) и бесполое размножение (например, апогамогония, соматическая гибридизация).
[237] При использовании по тексту настоящего документа термины "содержать" и "включать" указывают на присутствие заявленных свойств, целых чисел, этапов или компонентов или их групп, однако не исключают присутствия или дополнительного наличия одного или нескольких других свойств, целых чисел, этапов, компонентов или их групп. Таким образом, например, нуклеиновая кислота или белок, включающий последовательность нуклеотидов или аминокислот, может включать большее количество нуклеотидов или аминокислот, чем фактически указано, т.е. они могут быть встроены в нуклеиновую кислоту или белок большего размера. Химерный ген, включающий нуклеиновую кислоту, которая функционально или структурно определена, может включать дополнительные области ДНК и т.д.
[238] Перечень последовательностей, который находится в файле с названием "BCS15-2012_ST25.txt" размером 142 килобайт (измерение размера файла осуществлялось в ОС Microsoft Windows(r)), и который содержит 45 последовательностей, с SEQ Ш NO: 1 по SEQ ГО N0: 45, подан для регистрации вместе с настоящим документом путем подачи в электронном виде, указанный перечень включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[239] В описании изобретения и в разделе "Примеры" имеются ссылки на следующие последовательности:
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
SEQ Ш NO: 1: Arabidopsis thaliana СКХЗ геномная последовательность At5g56970 SEQ Ш N0:2: Arabidopsis thaliana СКХЗ кДНК последовательность (кодирующая последовательность)
SEQ Ш N0:3: Arabidopsis thaliana СКХЗ аминокислотная последовательность SEQ ГО N0:4: Arabidopsis thaliana СКХ5 геномная последовательность Atlg75450 SEQ ГО N0:5: Arabidopsis thaliana СКХ5 кДНК последовательность (кодирующая последовательность)
SEQ ГО N0:6: Arabidopsis thaliana СКХ5 аминокислотная последовательность
SEQ ГО N0:7: Brassica napus СКХЗ-А1 геномная последовательность
SEQ ГО N0:8: Brassica napus СКХЗ-А1 кДНК последовательность (кодирующая
последовательность)
SEQ ГО N0:9: Brassica napus СКХЗ-А1 аминокислотная последовательность
SEQ ГО N0:10: Brassica napus СКХЗ-А2 геномная последовательность
SEQ ГО N0:11: Brassica napus СКХЗ-А2 кДНК последовательность (кодирующая
последовательность)
SEQ ID N0:12: Brassica napus СКХЗ-А2 аминокислотная последовательность
SEQ ГО N0:13: Brassica napus СКХЗ-CI геномная последовательность
SEQ ГО N0:14: Brassica napus СКХЗ-CI кДНК последовательность (кодирующая
последовательность)
SEQ ГО N0:15: Brassica napus СКХЗ-CI аминокислотная последовательность
SEQ ГО N0:16: Brassica napus СКХЗ-С2 геномная последовательность
SEQ ГО N0:17: Brassica napus СКХЗ-С2 кДНК последовательность (кодирующая
последовательность)
SEQ ГО N0:18: Brassica napus СКХЗ-С2 аминокислотная последовательность
SEQ ГО N0:19: Brassica napus СКХ5-А1 геномная последовательность
SEQ ГО N0:20: Brassica napus СКХ5-А1 кДНК последовательность (кодирующая
последовательность)
SEQ ГО N0: 21: Brassica napus СКХ5-А1 аминокислотная последовательность SEQ ГО N0:22: Brassica napus СКХ5-С1 геномная последовательность
SEQ Ш N0:23: Brassica napus CKX5-C1 кДНК последовательность (кодирующая последовательность)
SEQ ГО N0:24: Brassica napus СКХ5-С1 аминокислотная последовательность SEQ ГО N0:25: Brassica napus СКХЗ-А1 YIIN501 аминокислотная последовательность SEQ ГО N0:26: Brassica napus СКХЗ-А2 YIIN512 аминокислотная последовательность SEQ ГО N0:27: Brassica napus СКХЗ-CI YIIN521 аминокислотная последовательность SEQ ГО N0:28: Brassica napus СКХЗ-С2 YIIN531 аминокислотная последовательность SEQ ГО N0:29: Brassica napus СКХ5-А1 YIIN801 аминокислотная последовательность SEQ ГО N0:30: Brassica napus СКХ5-А1 YIIN805 аминокислотная последовательность SEQ ГО N0:31: Brassica napus СКХ5-С1 YIIN811 аминокислотная последовательность
SEQ ГО N0:
32:
KASP
Праймер
BnCKX3-Al WT аллель
SEQ ГО N0:
33:
KASP
Праймер
BnCKX3-Al YIIN501 аллель
SEQ ГО N0:
34:
KASP
Праймер
BnCKX3-A2 WT аллель
SEQ ГО N0:
35:
KASP
Праймер
BnCKX3-A2 YIIN512 аллель
SEQ ГО N0:
36:
KASP
Праймер
BnCKX3-Cl WT аллель
SEQ ГО N0:
37:
KASP
Праймер
BnCKX3-Cl YIIN521 аллель
SEQ ГО N0:
38:
KASP
Праймер
BnCKX3-C2 WT аллель
SEQ ГО N0:
39:
KASP
Праймер
BnCKX3-C2 YIIN531 аллель
SEQ ГО N0:
40:
KASP
Праймер
BnCKX5-Al WT аллель
SEQ ГО N0 .
41:
KASP
Праймер
BnCKX5-YIIN801 WT аллель
SEQ ГО N0:
42:
KASP
Праймер
BnCKX5-Al WT аллель
SEQ ГО N0:
43:
KASP
Праймер
BnCKX5-Al Y1TN805 аллель
SEQ ГО N0:
44:
KASP
Праймер
BnCKX5Cl WT аллель
SEQ ГО N0: 45:
KASP
Праймер
BnCKX5-Cl YHN811 аллель
ПРИМЕРЫ
[240] Если иное не указано в разделе "Примеры", все технологии рекомбинантных ДНК осуществляют согласно стандартным протоколам в соответствии с описанием в работе Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, томе I и II работы Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA и томе I и II работы Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK). Стандартные методы и материалы молекулярной биологии для работы с растениями описаны в Plant Molecular Biology Labfax (1993), R.R.D. Croy, которая совместно опубликована BIOS Scientific Publications Ltd (Великобритания) и Blackwell Scientific Publications (Великобритания). Стандартные материалы и способы осуществления полимеразной цепной реакции описаны в публикации Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, и в McPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, 1- изд., Springer Verlag, Германия.
ПРИМЕР 1 - Изоляция ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК ГЕНОВ СКХЗ и СКХ5
[241] Определение нуклеотидных последовательностей СКХЗ и СКХ5 из Brassica napus осуществляли следующим образом.
[242] Изоляцию геномной ДНК из Brassica napus осуществляли с использованием стандартных процедур. Фрагменты генов СКХЗ и СКХ5 изолировали путем ПЦР на геномной ДНК В. napus с использованием праймеров на основании генной последовательности СКХЗ и СКХ5 A. thaliana в соответствии с описанием. Производили клонирование продуктов ПЦР, и осуществляли определение последовательности.
[243] Затем последовательности СКХЗ и СКХ5 из продуктов ПЦР использовали при запросе в ходе поиска гомологии для линии Brassica napus во внутренней базе данных с помощью BLAST. В В. napus было идентифицировано четыре гена СКХЗ и два гена СКХ5. Гены и кодирующие области последовательностей СКХЗ и СКХ5 были определены с использованием информации о маркерах экспрессируемой
последовательности и путем сравнения с информации о последовательности гена СКХЗ At5g56970 и СКХ5 Atlg75450 Arabidopsis. Последовательности СКХЗ и СКХ5 Brassica имеют пять экзонов.
[244] SEQ ID N0: 7, 10, 13 и 16 являются геномными последовательностями BnCKX3-AJ, Вп СКХЗ-А2, Вп СКХЗ-С 1 и Вп СКХЗ-С2, соответственно, В. napus. SEQ ГО NO: 8, 11, 14 и 17 являются кДНК (кодирующими последовательностями) Вп СКХЗ-А1, Вп СКХЗ-А2, Вп СКХЗ-С 1 и Вп СКХЗ-С2, соответственно. Аминокислотные последовательности белков, кодируемых Вп СКХЗ-А1, Вп СКХЗ-А2, Вп СКХЗ-CI иВп СКХЗ-С2, определены последовательностями SEQ ГО N0: 9, 12, 15 и 18, соответственно.
[245] SEQ ГО N0: 19 и 22 являются геномными последовательностями ВпСКХ5-А1 и Вп СКХ5-С1, соответственно, В. napus. SEQ ГО N0: 20 и 23 являются кДНК (кодирующими последовательностями) ВпСКХ5-А1 и Вп СКХ5-С1, соответственно. Аминокислотные последовательности белков, кодируемых Вп СКХЗ-А1 и Вп СКХ5-С1, определены последовательностями SEQ ГО N0: 21 и 24, соответственно.
ПРИМЕР 2 - ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗОЛЯЦИЯ МУТАНТНЫХ СКХЗ и СКХ5 АЛЛЕЛЕЙ
[246] Мутации в генах СКХЗ и СКХ5 Brassica napus, идентифицированные в Примере 1, были созданы и идентифицированы следующим образом:
- 30 ООО семян из элитной линии скрещивания масличного рапса весенней посадки (семена МО) были предварительно пропитаны деионизированной или дистилированной водой в течение 2 ч. на влажной фильтровальной бумаге. Половину семян обработали 0,8% EMS, а вторую половину - 1% EMS (Sigma: М0880), после чего семена инкубировали в течение 4 ч.
- Семена, прошедшие мутагенез (семена Ml), промыли трижды и высушивали в вытяжном шкафу в течение ночи. 30 ООО растений Ml выращивали в почве, производилось их самоопыление дл получения семян М2. Для каждого отдельного Ml растения производили сбор семян М2.
- Выращивали (дважды) растения 4800 М2, полученные из различных растений Ml, и были получены образцы ДНК из образцов листьев каждого отдельного растения М2 в соответствии с методом СТАВ (Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15).
- Осуществляли скриннинг образцов ДНК на присутствие точечных мутаций в генах СКХЗ и СКХ5, в результате которых происходит введение стоп-кодона или введение другой аминокислоты кодирующих белок областях генов СКХЗ и СКХ5, путем прямого секвенирования с использованием стандартных техник секвенирования (LGC) и анализа последовательностей на присутствие точечных мутаций с использованием программного обеспечения NovoSNP (VTB Antwerp).
- Таким образом, были идентифицированы мутантные аллели генов СКХЗ и СКХ5, указанные в Таблице 3.
*Семена растений, включающих аллели YIIN501, YINN512, YIIN521, YIIN531, YIIN801 и YIIN811, в гомозиготном состоянии были зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB), Фергюсон-билдинг, Крэйбстоун Истейт, Баксберн, Абердин, АВ 21 9YA UK, в соответствии с Будапештским договором, 5 октября 2015 г., номер доступа NCIMB 42464; семена растений, включающих аллели YIIN501, YINN512, YIIN521, YIIN531, YIIN805 и YIIN811 в гомозиготном состоянии были
зарегистрированы в NCEVIB, Фергюсон-билдинг, Крэйбстоун Истейт, Баксберн, Абердин, АВ 21 9YA UK, в соответствии с Будапештским договором, 5 октября 2015 г., номер доступа NCIMB 42465.
Пример 3 - Идентификация растений рода Brassica, содержащих мутантные СКХ5 или СКХ5 и СКХЗ аллели Brassica
[247] Растения рода Brassica, содержащие мутации в генах СКХ5 и СКХЗ, идентифицированные в Примере 2, были идентифицированы следующим образом: Для каждого мутантного гена СКХЗ или СКХ5, идентифицированного в образце ДНК растения М2, выращивали, по меньшей мере, 50 растений М2, полученных из того же растения Ml, что и растение М2, содержащее мутацию СКХЗ или СКХ5; из образцов листьев каждого отдельного растения М2 были получены образцы ДНК.
Осуществляли скриннинг образцов ДНК на присутствие идентифицированных точечных мутаций СКХЗ и СКХ5 в соответствии с описанием выше в Примере 4. Производилось самоопыление гетерозиготных и гомозиготных (определенных с помощью электроферографии) растений М2, включающих те же мутации, и осуществлялся сбор семян МЗ.
Пример 4 - Анализ растений рода Brassica, содержащих мутантные СКХ5 и СКХЗ аллели Brassica в тепличных условиях
[248] В тепличных условиях выращивали растения рода Brassica, гомозиготные для мутаций во всех генах СКХ5 и СКХЗ, до полной зрелости. Обобщающие результаты по количеству цветков на растениях рода Brassica, гомозиготных для мутаций во всех генах СКХ5 и СКХЗ в условиях вегетационной камеры без применения техник принудительного опыления (отсутствие мешков для опыления и насекомых-опылителей). Специфической целью было определение абсолютного эффекта СКХ5/СКХЗ мутантов на количество цветков на растение и распределение эффекта по ветвям растения.
[249] Исследования проводили в отношении следующих растений рода Brassica:
Происхождение
Сокращенное название
BC4S4 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531/YIIN801/YIIN811) (А1А1/А2А2/С1С1/С2С2/А1А1/С1С1)
СКХЗ/СКХ5 6х(1)
BC4S4 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531/YIIN801/YIIN811) (-/-/-/-/-)
CKX3/CKX5WTS(1)
BC4S4 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531/YIIN805/YIIN811) (А1А1/А2А2/С1С1/С2С2/А1А1/С1С1)
СКХЗ/СКХ5 бх (2)
BC4S4 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531/YIIN805/YIIN811) (-/-/-/-/-)
СКХЗ/СКХ5 WTS (2)
Оригинальная линия Brassica, которая не подвергалась мутагенезу.
[250] В ходе исследований производили расчет и измерения для следующих переменных параметров:
[251] В Таблице 4 приведены сводные данные, полученные путем ANOVA-анализа (вариационного анализа со случайным блоковым эффектом), для переменных, включая проверку достоверности (р <0,05) в отношении сопоставления мутантных линий и соответствующих сегрегантов дикого типа (*), а также сопоставления сегрегантов дикого типа (WTS) и контрольных растений дикого типа (WT) (**). Необходимо отметить, что отсутствие статистической разницы не подразумевает эквивалентности.
[252] Таблица 4: Суммарная оценка
GENOTYPES
NBR
NFL
NFLM
NFLS1
NFLS2
NFLS3
NFLS4
NFLS5
NFLS6
NFLS7
СКХЗ/СКХ5 6х(1)
6.3*
926.2*
131.0*
135.9
162.7*
162.3*
157.1"
134.5*
42.8
0.0
СКХЗ/СКХ5 WTS (1)
5.6
616.1
101.7**
128.1
107.3
121.6
77.7**
57.0
21.2
1.7
СКХЗ/СКХ5 6х(2)
5.4
838.5*
137.8*
161.7*
163.9*
164.6*
141.4
69.2
0.0
0.0
СКХЗ/СКХ5 WTS (2)
5.8
623.1
92.8
98.7
122.9
115.0
110.6
71.5
11.7
0.0
5.8
584.5
90.7
105.8
101.4
103.9
115.5
62.0
5.4
0.0
11.4
10.0
12.7
34.6
30.3
27.8
44.2
78.7
257.1
> 999
GENOTYPES
PFLM
PFLS1
PFLS2
PFLS3
PFLS4 PFLS5
% %
PFLS6
PFLS7
СКХЗ/СКХ5 6х(1)
14.2*
14.7*
17.5
17.6
16.9 14.5*
4.7
0.0
СКХЗ/СКХ5 WTS (1)
16.6
21.0
17.5
19.9 12.8** 8.9
3.0
0.2
СКХЗ/СКХ5 6х(2)
16.5*
19.4
19.6
19.6
16.6 8.1
0.0
0.0
СКХЗ/СКХ5 WTS (2)
15.1
15.9
19.8
18.4
18.0 11.1
1.5
0.0
15.6
18.2
17.3
17.9
19.6 10.4
0.9
0.0
15.7
33.4
29.5
27.5
41.6 78.2
258.4
> 999
* мутант, имеющий значительные отличия от WTS
WTS, имеющие значительные отличия от контрольного
растения WT
[253] Обе линии растений рода Brassica, гомозиготных для мутаций во всех генах СКХ5 и СКХЗ демонстрируют значительное увеличение в количестве цветков. Увеличенное количество цветков равномерно распределено по ветвям с цветками.
Пример 5 - Анализ растений рода Brassica, содержащих мутантные СКХ5 и СКХЗ аллели Brassica в полевых условиях
[254] В полевых условиях выращивали растения рода Brassica, гомозиготные для мутаций во всех генах СКХ5, во всех генах СКХЗ и во всех генах СКХ5 и СКХЗ, в различных локациях в Европе и Северной Америке.
[255] Исследования проводили в отношении следующих растений рода Brassica:
Происхождение
Сокращенное название
BC4S4 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531/YIINS01/YIINS11) (А1А1/А2А2/С1С1/С2С2/А1А1/С1С1)
СКХЗ/СКХ5 6х (1)
BC4S4 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531/YIIN801/YIIN811) {-/-/-/-/-/-)
СКХЗ/СКХ5 WTS (1)
BC4S4 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531/YIIN805/YIIN811) (А1А1/А2А2/С1С1/С2С2/А1А1/С1С1)
СКХЗ/СКХ5 6х (2)
BC4S4 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531/YIIN805/YIIN811) {-/-/-/-/-/-)
СКХЗ/СКХ5 WTS (2)
BC4S3 (YIIN801/YIIN811) (А1А1/С1С1)
СКХ5 2х (1)
BC4S3 (YIIN801/YIIN811) (--/--)
СКХ5 WTS (1)
BC4S3 (YIIN805/YIIN811) (А1А1/С1С1)
СКХ5 2х (2)
BC4S3 (YIIN805/YIIN811) (--/--)
СКХ5 WTS (2)
BC5S3 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531) (А1А1/А2А2/С1С1/С2С2)
СКХЗ 4х
BC5S3 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531) {-/-/-/-)
СКХЗ WTS
Оригинальная линия Brassica, которая не подвергалась мутагенезу.
[256] В ходе исследований производили расчет и измерения для следующих переменных параметров:
Переменный параметр
Аббревиатура
Стадия
Шкала или единица
Шкала 1
Шкала 5
Шкала 9
Количество цветков на основном стебле
NFLM
цветение
количество/растение
Цветение - конец
EOF
90%, конец цветения
дней после посева
Высота растения
HICM
конец цветения
Количество стручков на основном стебле
NPOD
зрелость
количество/растение
2 SPODM: среднее значение для 4 старших стручков на основном стебле
[257] В Таблицах 5 и 6 приведены сводные данные, полученные путем ANOVA-анализа (вариационного анализа со случайным блоковым эффектом), для переменных (Таблица 5 - для полевых испытаний в Европе, Таблица 6 - для полевых испытаний в Северной Америке), включая проверку достоверности (р <0,05) в отношении сопоставления мутантных линий и соответствующих сегрегантов дикого типа (*), а также сопоставления сегрегантов дикого типа (WTS) и контрольных растений дикого типа (WT) (**). Необходимо отметить, что отсутствие статистической разницы не подразумевает эквивалентности.
[258] В целом, можно сделать следующие выводы:
a. большее количество цветков на основном стебле (без учета боковых ветвей)
b. большее количество стручков на основном стебле
c. большее количество семян на стручок на основном стебле (без учета боковых ветвей)
d. большая TSW (семена в целом, основной стебель + боковые ветви)
e. ограниченный эффект на выход семян
f. доказуемый эффект на выход семян на растение отсутствует, что может быть обусловлено вариабельностью в плотности посева растений от делянки к делянке и в расстоянии между растениями на одной делянке.
[259] Более конкретно:
a. Мутант ckx3/ckx5 6х (1) демонстрирует наивысшее увеличение количества цветков (29%) и количества стручков (33%) на основном стебле, однако лишь 11% увеличение TSW и 13% увеличение количества семян на стручок на основном стебле. Эффект на выход семян отсутствует.
b. Оба СКХ5 мутанта демонстрируют промежуточный эффект на TSW, количество цветков и стручков на основной ветви, а также отсутствие эффекта на выход семян. Неясно наиболее высокое положение YITN805/YIIN811 в отношении количества семян на стручок на основном стебле без прямой корреляции с результатами параметров для других мутантов.
Пример 6 - Детекция и/или перенос мутантных генов СКХ5 и СКХЗ в (элитные) линии Brassica
[260] Для отбора растений, включающих точечные мутации в СКХ5 или СКХЗ аллелях, может применяться прямое секвенирование с использованием стандартных техник секвенирования, известных специалистам, например, техник, описанных в Примере 2. В качестве альтернативы, могут быть разработаны анализы на основе ПЦР для определения растений, содержащих специфические точечные мутации в СКХ5 или СКХЗ аллелях, и их отделения от растений, не включающих такие специфические точечные мутации. Были разработаны следующие KASP-анализы для детекции присутствия или отсутствия мутантных аллелей, идентифицированных в Примере 2, а также определения их статуса зиготности (см., Таблицу 3):
- Матричная ДНК:
- Геномная ДНК, изолированная из листового материала гомозиготных или гетерозиготных мутантных растений рода Brassica (содержащих мутантный СКХ5 или СКХЗ аллель, который именуется в настоящем документе "СКХх-Xx-YIINxxx").
- Контрольная ДНК дикого типа: Геномная ДНК, изолированная из листового материала мутантных растений рода Brassica (содержащих эквивалент дикого типа мутантного СКХ5 или СКХЗ аллеля, который именуется в настоящем документе "WT").
- Положительная контрольная ДНК: Геномная ДНК, изолированная из листового материала гомозиготных мутантных растений рода Brassica, в отношении которого известно, что она содержит CKXx-Xx-YIINxxx.
- Праймеры и зонды для мутантных генов СКХ5 или СКХЗ и соответствующих целевых генов СКХ5 или СКХЗ дикого типа указаны в Таблице 7.
Пример 7: Дальнейший анализ растений рода Brassica, содержащих мутантные СКХ5 и СКХЗ аллели Brassica в тепличных условиях
[261] В тепличных условиях выращивали растения рода Brassica, гомозиготные для мутаций во всех генах СКХ5 и СКХЗ, и производили их фенотипирование. Следует отметить, что растения выращивали в горшках большего размера по сравнению с горшками, используемыми для тепличных испытаний в Примере 4. Предполагалось, что при выращивании растений с большей плотностью в горшках меньшего размера обеспечивается большая точность результатов в полевых испытаниях.
[262] Исследования проводили в отношении следующих растений рода Brassica:
Происхождение
Сокращенное название
BC4S4 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531/YIIN801/YIIN811) (А1А1/А2А2/С1С1/С2С2/А1А1/С1С1)
CKX3/CKX5 бх (1) Мутант 1
BC4S4 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531/YIIN801/YIIN811) (-/-/-/-/-) сегрегант дикого типа
CKX3/CKX5 WTS (1)
BC4S4 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531/YIIN805/YIIN811) (А1А1/А2А2/С1С1/С2С2/А1А1/С1С1)
CKX3/CKX5 бх (2) Мутант 2
BC4S4 (YIIN501/YIIN512/YIIN521/YIIN531/YIIN805/YIIN811) (-/-/-/-/-) сегрегант дикого типа
CKX3/CKX5 WTS (2)
Оригинальная линия Brassica, которая не подвергалась мутагенезу.
[263] В ходе исследований производили расчет и измерения для следующих переменных параметров:
Переменный параметр
Аббревиатура
Стадия
Единица
Количество стеблей
NBR
зрелость
Количество цветков на основном стебле
NFLM 1
зрелость
Количество цветков на боковых стеблях
NFLS 1+2
зрелость
Количество стручков на основном стебле
NPODM 3
зрелость
Количество стручков на боковых стеблях
NPODS2+3
зрелость
Выход семян (масса) основного стебля
YLDWM
семя
(точность в мг)
Выход семян (масса) боковых ветвей
YLDWS 2
семя
(точность в мг)
Выход семян (количество семян)
YLDSM
семя
Производили расчет для следующих переменных параметров:
Переменный параметр
Аббревиатура
Единица
Формула
Процент цветков на основном стебле, общий
PFLM 1
NfLM
PF!.M tflO
Ni-L
Процент цветков, боковые ветви, общий
PFLS 1+2
NPLS PFf.S - -T7T-' mo
JUL
Процент незавязавшихся цветков/стручков, общий
PABR
HtL -NfVD
PARR * 1 Q(l
NhL
Процент незавязавшихся цветков/стручков на основном стебле
PABRM
Nf-LM - PIPULW Nt LM
Процент незавязавшихся цветков/стручков на боковых ветвях
PABRS 2
itLLS - NPUDS
PASRS- ,(tm) '1no
Количество стручков на основном стебле
NPOD 3
NFOD = NFODM 4 jVfffUi'
Процент стручков на основном стебле, общий
PPODM 3
Процент стручков, боковые ветви, общий
PPODS 2+3
NPDDS
PFOas- ,v(tm)^1(tn
Выход семян (общая масса)
YLDW
(точность в мг)
Г WW = YLDWM +- YL.DWS
Процентный выход семян (масса) на основном стебле, общий
PYLDWM
VLDWM
Процентный выход семян (масса) на боковых ветвях, общий
PYLDWS2
YLDWS
Выход семян (общее количество семян)
YLDS
YWS = YLUSM 4 YLDSS
Процентный выход семян (количество семян) на основном стебле, общий
PYLDSM
YWSfi PYf.IMM - . 1 no
Процентный выход семян (количество семян) на боковых ветвях, общий
PYLDSS 2
YLDSS
Количество семян на стручок (среднее, на растение)
SPOD
YLDS *(tm)а-MOD
Количество семян на стручок на основном стебле
SPODM
YLDSM
Количество семян на стручок на боковых ветвях
SPODS 2
YLDSS SPODS-NPODS
Масса семени (средняя на растение)
(точность в мкг)
YLDW ¦(tm)'- YLDS * ШП0
Масса семян на основном стебле
SWM
(точность в мкг)
YLDW it
2 для каждой боковой ветви отдельно (количество ветвей от верха к низу, от S1 до Sx, при этом x=NBR-l)
3 все стручки с утолщением
[264] В Таблице 8 приведены сводные данные, полученные путем ANOVA-анализа для переменных, включая проверку достоверности (р <0,05) в отношении сопоставления мутантных линий и соответствующих сегрегантов дикого типа (*), а также сопоставления сегрегантов дикого типа (WTS) и контрольных растений дикого типа (WT) (**). Необходимо отметить, что отсутствие статистической разницы не подразумевает эквивалентности.
PFLS8
5.9
6.1
6.3
5.8
7.7
56.6
PFLS9
6.7
4.6
4.7
4.4
3.5
78.6
PFLS10
5.5
3.4**
3.9
3.9**
1.0
99.6
PFLS11
4.8*
1.5
1.6
2.0
0.3
153.9
PFLS12
2.7*
0.4
0.4
0.0
0.3
301.4
NPOD
518*
380**
436
418
424
9.8
NPODM
90*
79*
11.0
NPODS
428*
322**
357
359
363
11.2
NPODS1
45*
26.2
NPODS2
48*
25.3
NPODS3
44**
23.5
NPODS4
23.9
NPODS5
43**
27.2
NPODS6
33**
31*
32.7
NPODS7
27**
36**
36.8
NPODS8
63.7
NPODS9
32*
80.3
NPODS10
28*
16**
101.3
NPODS11
26*
153.5
NPODS12
16*
300.4
PPODM
17.4*
15.5
18.3*
14.3
14.5
12.8
PPODS
82.6*
84.5
81.7*
85.7
85.5
2.4
PPODS1
8.8
9 5**
9.3
8.3
7.6
27.7
PPODS2
9.2
10.3
10.0
9.8
10.2
22.7
PPODS3
9.4*
11.5
10.5
11.1
12.1
22.1
PPODS4
9.0*
11.3
10.7
11.3
10.7
21.2
PPODS5
9.1*
11.2
10.7
11.4
11.9
24.5
PPODS6
7.0*
8.8
6.9*
9.8
10.3
29.0
PPODS7
5.1*
7.1
7.2
8.5**
10.3
34.5
PPODS8
5.5
5.8
5.6
5.8
7.6
62.0
PPODS9
6.3
4.1
4.7
4.2
3.2
83.3
PPODS10
5.4*
3.2**
4.1
3.7**
0.9
103.3
PPODS11
4.9*
1.4
1.6
1.9
0.2
155.7
PPODS12
2.9*
0.3
0.5
0.0
0.3
300.0
PABR
21.5
23.8
18.7*
22.5
22.1
23.4
PABRM
9.7*
15.2
11.5
14.5
15.3
44.0
PABRS
23.6
25.1
20.1
23.7
23.2
25.2
PABRS1
22.3
21 9**
19.0
23.3
27.9
42.0
PABRS2
20.1
24.1
20.0
24.7
25.5
40.8
PABRS3
20.0
25.1
18.8*
25.2
22.8
42.2
PABRS4
25.1
21.5
18.4
22.5
22.8
41.0
PABRS5
24.5
22.8
17.8
20.9
23.4
40.5
PABRS6
29.7
27.1**
27.8
22.1
18.7
51.3
PABRS7
35.4
29.4**
25.4
22.8
18.5
46.8
PABRS8
29.4
29.0
31.9
23.2
23.4
55.3
PABRS9
29.8
34.1
21.7
27.5
29.3
47.2
PABRS10
23.8
31.9
17.8
26.4
32.1
46.2
PABRS11
18.1*
30.5
17.0
23.6
34.4
41.0
PABRS12
14.1*
48.6**
17.4
#N/A
21.1
36.9
YLDW
9.757*
11.775**
9.631*
13.525**
14.962
13.3
YLDWM
2.298
2.192**
2.330*
2.050**
2.445
16.8
YLDWS
7.459*
9.583**
7.301*
11.475**
12.639
15.8
YLDWS1
0.788*
1.030
0.838
0.958
0.978
36.1
YLDWS2
0.898*
1.269
0.886*
1.407
1.443
32.8
YLDWS3
0.920*
1.323**
1.006*
1.579**
1.827
24.1
YLDWS4
0.878*
1.282**
1.059*
1.411**
1.638
25.8
YLDWS5
0.926*
1.282**
1.065*
1.447**
1.763
26.0
YLDWS6
0.746*
1.079**
0.664*
1.463**
1.638
28.1
YLDWS7
0.525*
0.883**
0.665*
1.206**
1.629
32.3
YLDWS8
0.395
0.641**
0.466*
0.871
1.134
66.3
YLDWS9
0.444
0.360
0.306*
0.555
0.381
96.4
YLDWS10
0.426
0.300
0.218
0.375**
0.126
111.0
YLDWS11
0.338*
0.109
0.095
0.205**
0.029
182.4
YLDWS12
0.214*
0.025
0.033
0.000
0.052
328.5
PYLDWM
24.1*
18.9
24.5*
15.2
16.3
20.8
PYLDWS
75.9*
81.1**
75.5*
84.8
84.5
5.5
PYLDWS1
8.1
8.8**
8.6*
7.1
6.5
32.9
PYLDWS2
9.2*
10.7
9.1
10.3
9.6
26.7
PYLDWS3
9.4*
11.2
10.6
11.5
12.2
18.7
PYLDWS4
8.8*
10.8
10.9
10.4
11.0
21.9
PYLDWS5
9.3*
10.9
11.2
10.7
11.8
23.6
PYLDWS6
7.5*
9.1**
7.0*
10.8
11.0
28.0
PYLDWS7
5.4*
7.5**
7.0*
8.9**
10.9
33.9
PYLDWS8
4.0
5 2**
4.7
6.4
7.5
61.8
PYLDWS9
4.5
2.9
3.1
4.1
2.6
89.3
PYLDWS10
4.4*
2.7
2.1
2.7**
0.8
102.8
PYLDWS11
3.5*
1.1
0.9
2 ~j * *
0.2
176.1
PYLDWS12
2.4*
0.2
0.4
0.0
0.3
329.2
YLDS
2745*
3453**
2590*
4234**
4641
12.5
YLDSM
660
659**
643
653**
761
17.4
YLDSS
2085*
2794**
1948*
3581**
3917
15.0
YLDSS1
218*
289
227*
283
294
39.1
YLDSS2
257*
370
236*
423
426
33.0
YLDSS3
259*
381**
278*
483**
557
22.9
YLDSS4
243*
368**
280*
443**
516
26.6
YLDSS5
257*
369**
284*
444**
543
26.7
YLDSS6
208*
327**
180*
460**
519
28.2
YLDSS7
149*
267**
177*
387**
518
32.0
YLDSS8
112
190**
125*
290
368
66.7
YLDSS9
124
107
77*
183
121
98.7
YLDSS10
116
53*
119**
111.8
YLDSS11
93*
67**
190.2
YLDSS12
60*
327.1
PYLDSM
24.5*
19.4**
25.2*
15.5
16.4
21.9
PYLDSS
75.5*
80.6**
74.8*
84.5
84.4
5.9
PYLDSS1
7.9
8.4**
8.6*
6.7
6.3
35.4
PYLDSS2
9.3
10.7
9.0
9.9
9.2
27.8
PYLDSS3
9.4*
11.0
10.8
11.3
12.0
19.3
PYLDSS4
8.7*
10.7
10.7
10.4
11.1
23.2
PYLDSS5
9.1
10.6
11.1
10.5
11.7
24.1
PYLDSS6
7.5*
9.3**
7.0*
10.9
11.2
27.9
PYLDSS7
5.5*
7.7**
6.9*
9 1* *
11.2
34.2
PYLDSS8
4.0
5.3**
4.7*
6.8
7.8
61.6
PYLDSS9
4.5
3.0
2.9
44**
2.6
88.9
PYLDSS10
4.2*
2.6**
1.9
2.8**
0.8
101.8
PYLDSS11
3.4*
1.1
0.8
1.7**
0.2
178.1
PYLDSS12
2.3*
0.2
0.3
0.0
0.3
330.9
SPOD
5.3*
9 1**
6.0*
10.2**
11.0
14.9
SPODM
7.3*
11.4
8.2*
11.1**
12.6
19.4
SPODS
4.9*
8.7**
5.5*
10.1
10.9
16.5
SPODS1
4.8*
8.1
6.1*
8.2
9.0
34.0
SPODS2
5.6*
9.8
5.7*
10.4
9.8
36.1
SPODS3
5.6*
g 0**
6.4*
10.6
11.5
28.7
SPODS4
5.2*
g Cj**
6.4*
9.6**
11.7
31.4
SPODS5
5.4*
g Q**
6.6*
9.6
10.8
29.0
SPODS6
5.1*
9 7**
6.6*
11.7
12.1
28.8
SPODS7
5.1*
10.1**
6.1*
11.3
12.1
31.9
SPODS8
3.9*
8.3**
5.6*
11.9
11.2
31.5
SPODS9
3.6*
6.1**
4.1*
10.2
8.6
34.3
SPODS10
5.7
6.9
3.1*
7.3
9.0
61.8
SPODS11
3.5*
6.5
3.1*
7.9
6.8
47.7
SPODS12
3.8*
7.1
4.3
#N/A
8.7
31.8
3.555*
3.414**
3.720*
3.194
3.228
4.4
SWM
3.494*
3.330**
3.641*
3.150
3.209
4.1
SWS
3.577*
3.434**
3.757*
3.203
3.233
4.9
SWS1
3.646
3.603**
3.769*
3.443
3.370
8.1
SWS2
3.515
3.434
3.762*
3.321
3.430
6.5
SWS3
3.574
3.472**
3.659*
3.269
3.280
6.8
SWS4
3.643*
3.475**
3.803*
3.202
3.213
6.9
SWS5
3.633*
3.497**
3.747*
3.266
3.263
6.5
SWS6
3.595*
3.310
3.653*
3.182
3.173
7.8
SWS7
3.535*
3.342**
3.779*
3.126
3.155
7.3
SWS8
3.549*
3.382**
3.615*
2.999
3.142
7.6
SWS9
3.538*
3.314
3.949*
3.030**
3.271
7.2
SWS10
3.668*
3.426
4.093*
3.127**
3.548
7.8
SWS11
3.676*
3.214**
4.077*
3.151**
4.085
4.4
SWS12
3.625
3.664
4.067
#N/A
3.981
8.4
[265] Мутанты СКХ демонстрируют повышенный эффект на количество стручков (NPOD) на основном стебле и двух первых боковых ветвях, в результате чего получают более высокое общее количество стручков. Эффект снижается для боковых ветвей, что приводит к отрицательному эффекту на высоту средней боковой ветви, однако этот эффект снова наблюдается на нижних ветвях, без значительного эффекта на общее количество стручков из-за малого количества резвившихся стручков на нижних ветвях. С учетом эффекта влияния каждой ветви на общее количество стручков (PPOD) видно, что основной стебель становится более определяющим по сравнению с растениями дикого типа.
[266] Повышенный эффект на количество стручков усиливается уменьшением количества незавязавшихся цветков и стручков на основном стебле и первых 4 боковых ветвях.
[267] Повышенный доминантный эффект на основной стебель приводит к повышению массы семян на основном стебле, однако масса семян снижается на всех боковых ветвях, что приводит к общему снижению выхода по массе семян. Это объясняет, почему отрицательный эффект на выход семян в полевых испытаниях не был таким сильным, т.к. при большей плотности растений наблюдается значительное уменьшение количества боковых ветвей.
[268] Нейтральный эффект на количество семян на основном стебле свидетельствует об увеличении размера семян, что подтверждается результатами по массе семян. Для всех ветвей наблюдается увеличенная масса (размер) семени.
[269] Ниже приводятся сводные данные по различным вариантам осуществления изобретения:
1. Растение рода Brassica, содержащее, по меньшей мере, один ген СКХ5, включающий, по меньшей мере, один мутантный СКХ5 аллель в геноме.
2. Растение по п. 1, отличающееся тем, что указанный мутантный СКХ5 аллель является мутантным аллелем гена СКХ5, включающим нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих последовательностей:
(a) нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ Ш N0: 19 или SEQ ГО N0: 23;
(b) нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 20 или SEQ ГО N0: 23; и
(c) нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 21 или SEQ ГО N0: 24.
3. Растение по пп. 1 или 2, представляющее собой растение рода Brassica, содержащее два гена СКХ5, при этом указанное растение рода Brassica выбрано из группы, состоящей из Brassica napus, Brassica juncea и Brassica carinata.
4. Растение по любому из пп. 1-3, содержащее, по меньшей мере, два мутантных СКХ5 аллеля или, по меньшей мере, три мутантных СКХ5 аллеля или, по меньшей мере, четыре мутантных СКХ5 аллеля.
5. Растение по любому из пп. 1-4, отличающееся тем, что указанный мутантный аллель СКХ5 выбран из группы, состоящей из следующих аллелей:
(а) мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ ГО N0: 19 или положению 465 SEQ ГО N0: 20;
(b) мутантный CKX5 аллель, содержащий замещение G на А в положении,
соответствующем положению 399 SEQ ID N0: 19 или положению 399 SEQ ГО N0: 20; и
(c) мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении,
соответствующем положению 465 SEQ ГО N0: 22 или положению 399 SEQIDNO: 23.
6. Растение по любому из пп. 1-5, которое является гомозиготным для мутантного СКХ5 аллеля.
7. Растение по любому из пп. 1-6, дополнительно содержащее, по меньшей мере, два гена СКХЗ, также включающих, по меньшей мере, два мутантных СКХЗ аллеля в геноме.
8. Растение по п. 7, отличающееся тем, что указанный мутантный СКХЗ аллель является мутантным аллелем гена СКХЗ, включающим нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих последовательностей:
(a) нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 7, SEQ ГО N0: 10; SEQ ГО NO: 13 или SEQ ГО NO: 16;
(b) нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 8, SEQ ГО N0: 11; SEQ ГО N0: 14 или SEQIDNO: 17; и
(c) нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 9, SEQ ГО N0: 12; SEQ ГО N0: 15 или SEQIDNO: 18.
9. Растение по п. 7 или 8, представляющее собой растение рода Brassica, содержащее четыре гена СКХЗ, при этом указанное растение рода Brassica выбрано из группы, состоящей из Brassica napus, Brassica juncea и Brassica carinata.
9.
10. Растение по любому из пп. 7-9, содержащее, по меньшей мере, два мутантных СКХЗ аллеля или, по меньшей мере, три мутантных СКХЗ аллеля или, по меньшей мере, четыре мутантных СКХЗ аллеля или, по меньшей мере, пять мутантных СКХЗ аллелей или, по меньшей мере, шесть мутантных СКХЗ аллелей или, по меньшей мере, семь мутантных СКХЗ аллелей или, по меньшей мере, восемь мутантных СКХЗ аллелей.
11. Растение по любому из пп. 7-10, отличающееся тем, что указанный мутантный аллель СКХЗ выбран из группы, состоящей из следующих аллелей:
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2244 SEQ ID N0: 7 или положению 1093 SEQ ГО N0: 8;
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2482 SEQ ГО N0: 10 или положению 1168 SEQIDNO: 11;
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 1893 SEQ ГО N0: 13 или положению 876 SEQ ГО N0: 14;
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2171 SEQ ГО N0: 16 или положению 982 SEQIDNO: 17.
12. Растение по любому из пп. 1-5, которое является гомозиготным для мутантного СКХЗ аллеля.
13. Растение рода Brassica, содержащее, по меньшей мере, два гена СКХ5, в котором снижена экспрессия, по меньшей мере, одного гена СКХ5.
14. Растение по любому из пп. 1 - 13, которое имеет увеличенное количество цветков на растение.
15. Растение по любому из пп. 1-13, которое имеет увеличенную массу тысячи семян.
12.
16. Клетка растения, стручок, семя или потомство растения по любому из пп. 1 - 15.
17. Мутантный аллель гена Brassica СКХЗ или СКХ5, отличающийся тем, что указанный ген СКХ5 выбран из группы, состоящей из следующих последовательностей:
(a) нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ Ш N0: 19 или SEQ ГО N0: 23;
(b) нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 20 или SEQ ГО N0: 23; и
(c) нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 21 или SEQ ГО N0: 24; при этом СКХЗ ген выбран из группы, состоящей из следующих последовательностей:
(d) нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 7, SEQ ГО N0: 10; SEQ ГО N0: 13 или SEQ ГО N0: 16;
(e) нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 8, SEQ ГО N0: 11; SEQ ГО N0: 14 или SEQIDNO: 17; и
(f) нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную
последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 9, SEQ ГО N0: 12; SEQ ГО N0: 15 или SEQIDNO: 18.
18. Мутантный аллель по п. 17, выбранный из группы, состоящей из следующих аллелей:
а. мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ ГО N0: 19 или положению 465 SEQ ГО N0: 20;
b. мутантный CKX5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 399 SEQ ID N0: 19 или положению 399 SEQ ГО N0: 20; и
c. мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ ГО N0: 22 или положению 399 SEQ ГО N0: 23;
d. мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2244 SEQ ГО N0: 7 или положению 1093 SEQ IDNO: 8;
e. мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2482 SEQ ГО N0: 10 или положению 1168 SEQ IDNO: 11;
f. мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 1893 SEQ ГО N0: 13 или положению 876 SEQ ГО N0: 14;
g. мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2171 SEQ ГО N0: 16 или положению 982 SEQ ГО N0: 17.
19. Химерный ген, включающий следующие функционально связанные фрагменты ДНК:
(a) промотор, экспрессируемый в растениях;
(b) область ДНК, которая при транскрипции дает молекулу РНК или белка, которая подавляет экспрессию или активность одного или нескольких генов или белков СКХ5 или СКХ5 и СКХЗ; и, при необходимости,
(c) 3'-концевая область, участвующая в терминации транскрипции и полиаденилировании.
20. Способ идентификации мутантного СКХЗ или СКХЗ аллеля по п. 17 или 18 в биологическом образце, при этом указанный способ включает определение присутствия мутантной специфической области СКХ5 или СКХЗ в нуклеиновой кислоте, присутствующей в указанном биологическом образце.
20.
21. Способ определения статуса зиготности мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля по п. 17 или 18 в растении рода Brassica, растительном материале или семени растения, при этом указанный способ включает определение присутствия мутантной специфической области СКХЗ или СКХ5 и/или соответствующей области дикого типа в геномной ДНК указанного растения, растительного материала или семени.
22. Комплект для идентификации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля по п. 17 или 18 в биологическом образце, при этом указанный набор включает набор, по меньшей мере, из двух праймеров, причем указанный набор выбран из группы, состоящей из следующих элементов:
(a) набор праймеров, в котором один из указанных праймеров специфически распознает 5'- или 3'-фланкирующую область мутантного аллеля, а второй праймер специфически распознает область мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, и
(b) набор праймеров, в котором один из указанных праймеров специфически распознает 5'- или 3'-фланкирующую область мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, а второй праймер специфически распознает примыкающую область между 3'- или 5'-фланкирующей областью и областью мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, соответственно;
или указанный комплект включает набор, по меньшей мере, из одного зонда, при этом указанный зонд выбран из группы, состоящей из следующих зондов:
(a) зонд, который специфически распознает область мутации мутантного
СКХЗ или СКХ5 аллеля, и
(b) зонд, который специфически распознает примыкающую область между
3'- или 5'-фланкирующей областью и областью мутации мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля.
23. Способ переноса, по меньшей мере, одного выбранного мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля по п. 17 или 18 из одного растения в другое растение, при этом указанный способ включает следующие этапы:
23.
(a) идентификация первого растения, включающего, по меньшей мере, один выбранный мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, с использованием способа по п. 22,
(b) скрещивание первого растения со вторым растением, не содержащим, по меньшей мере, одного выбранного мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, и сбор F1 гибридных семян, полученных в результате указанного скрещивания,
(c) при необходимости, идентификация растений F1, включающих, по меньшей мере, один выбранный мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, с использованием способа по п. 22,
(d) обратное скрещивание растений F1, включающих, по меньшей мере, один выбранный мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, со вторым растением, не содержащим, по меньшей мере, одного выбранного мутантного СКХЗ или СКХ5 аллеля, для получения, по меньшей мере, одного поколения (х), и сбор ВСх семян, полученных в результате указанного скрещивания, и
(e) идентификация в каждом поколении ВСх растений, включающих, по меньшей мере, один выбранный мутантный СКХЗ или СКХ5 аллель, с использованием способа по п. 22.
24. Способ увеличения количества цветков на растении, включающий следующие этапы:
a. введение, по меньшей мере, одного мутантного СКХ5 или, по меньшей мере, одного мутантного СКХ5 и одного мутантного СКХЗ аллеля в растение рода Brassica; или
b. или введение химерного гена по п. 19 в растение рода Brassica.
25. Способ увеличения массы тысячи семян растения рода Brassica, включающий следующие этапы:
a. введение, по меньшей мере, одного мутантного СКХ5 или, по
меньшей мере, одного мутантного СКХ5 и одного мутантного СКХЗ
аллеля в растение рода Brassica; или
b. или введение химерного гена по п. 19 в растение рода Brassica.
26. Способ увеличения количества стручков на растении, включающий следующие этапы:
a. введение, по меньшей мере, одного мутантного СКХ5 или, по меньшей мере, одного мутантного СКХ5 и одного мутантного СКХЗ аллеля в растение рода Brassica; или
b. или введение химерного гена по п. 19 в растение рода Brassica.
27. Способ производства семян, включающий посев семян по п. 16, выращивание растений из указанных семян и сбор семян с указанных растений.
28. Растение рода Brassica, выбранное из группы, состоящей из следующих растений:
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ ГО N0: 19 или положению 465 SEQ ГО N0: 20, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCIMB 42464;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 399 SEQ ГО N0: 19 или положению 399 SEQ ГО N0: 20, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCIMB 42465;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ ГО N0: 22 или положению 399 SEQ ГО N0: 23, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCIMB 42464;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2244 SEQ ГО N0: 7 или положению 1093 SEQ ГО N0: 8, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной
коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCFMB 42464;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2482 SEQ ID N0: 10 или положению 1168 SEQ ГО N0: 11, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCFMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCIMB 42464; растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 1893 SEQ ГО N0: 13 или положению 876 SEQ ГО N0: 14, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCFMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCIMB 42464; растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2171 SEQ ГО N0: 16 или положению 982 SEQ ГО N0: 17, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCIMB 42464;
29. Применение мутантного аллеля СКХ5 или мутантных аллелей СКХ5 и СКХЗ по п. 17 или 18 или химерного гена по п. 19 для увеличения количества цветков на растение, количества стручков на растение или увеличения массы тысячи семян в растениях рода Brassica.
30. Применение растений рода Brassica по любому из пп. 1-15 или семян по п. 27 для получения рапсового масла или рапсового жмыха.
31. Способ получения пищевых продуктов, кормов или промышленной продукции, включающий следующие этапы:
а. получение растения или его части по любому из пп. 1-15 или семян по п. 27, и
b. получение пищевых продуктов, кормов или промышленной продукции из растения или его части.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что
a. пищевым продуктом или кормом является растительное масло, мука (в том числе кормовая мука), зерно, крахмал или белок; или
b. промышленной продукцией является биотопливо, химические вещества промышленного назначения, фармацевтический или нутрицевтический препарат.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Байер КропСайенс НВ
<120> Растения рода Brassica с измененными характеристиками семенной продуктивности
<130> BCS15-2012
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3325
<212> ДНК
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 1
aaaagactta tttctcaaaa aaaatggcga gttataatct tcgttcacaa gttcgtctta 60
tagcaataac aatagtaatc atcattactc tctcaactcc gatcacaacc aacacatcac 120
cacaaccatg gaatatcctt tcacacaacg aattcgccgg aaaactcacc tcctcctcct 180
cctccgtcga atcagccgcc acagatttcg gccacgtcac caaaatcttc ccttccgccg 240
tcttaatccc ttcctccgtt gaagacatca cagatctcat aaaactctct tttgactctc 300
aactgtcttt tcctttagcc gctcgtggtc acggacacag ccaccgtggc caagcctcgg 360
ctaaagacgg agttgtggtc aacatgcggt ccatggtaaa ccgggatcga ggtatcaagg 420
tgtctaggac ctgtttatat gttgacgtgg acgctgcgtg gctatggatt gaggtgttga 480
ataaaacttt ggagttaggg ttaacgccgg tttcttggac ggattatttg tatttaacag 540
tcggtgggac gttatcaaac ggcggaatta gtggacaaac gtttcggtac ggtccacaga 600
tcactaatgt tctagagatg gatgttatta ctggtacgta ccacgatctt tttcacacag 660
agattaaaaa aaacagtaat agtgatttta acttcgtacg tttctgatag acaacaaaga 720
acttcgtacg tttttcgaag ttttttcgtc tttttcattt tagatctgcg cggccatttt 780
tggttatgct attgtttgtt tgtattgttt gtctctgttt atttatttct cgaacttgtt 840
gatagctttt cttcttttca cacatcaatc taatcacctt ttttggtctt aagattagaa 900
agaagatacg gactaggtaa aaataggtgg ttgtaaacgt agacgcatta aaaaaatatt 9 60
ggttttttta ttttttgata agcaaaattg gtggttggtc taagattata aacttgatat 1020
taatgcaaag gtcgatctag caatagaaga ttaatcaata ttcttggtgt tttaacaaca 1080
gattatttca tcattaaaat cgtgaaacaa agaaattttg gtagtataca ttacgtgtag 1140
ttttgttagt ttattaaaaa aaatagtata tagttttgtt aaaacgcgat ttatttagta 1200
acacattagt atattacacg tttaaccaac taaacttttt tttttgaata attatgttct 1260
atatttctta ctcaaattat gcaaatttcg tggattcgaa gtcaaatttc tgcgaaattt 1320
acatggtcat atattataaa actgttcata taacccggtg aacaaacaga caattaaggg 1380
tttgaatggt tacggcggtt ggggcggaca caaccgtcaa tagatcagac cgttttttat 1440
ttaccattca tcaattatat tccgcagtgg tttggggtaa aaaaaataga agaaaaccgc 1500
agcggaccaa ttccataccg tttttacata caaataaaca tggtgcgcaa cggtttattg 1560
tccgcctcaa aaatgaaatg gactaaaccg cagataaatt agaccgcttt gtccgctgcc 1620
tccattcata gactaaaaaa aaacaaccaa aaaaaaaatg gtcccacgcc catgatttta 1680
cacgaggttt cttgtggcgt aaggacaaaa ctcaaaagtt cataacgttt ggtcctaacc 1740
aggtgtaatg gattaagtaa cagtcaattt tcttattata gctgtatcca ttatgtccac 1800
atatgcatcc atatacatta cactgttggt ctcaagtgta gttagattac gaagactttc 1860
aagttccatt ttttggttag gagataaaca taatttaatg ataccgactt tagcactcta 1920
ggctcaaaac aagtacagaa gagaatagtt ttatttcaaa ctcgttgcat tgttgtatca 1980
attaattgtg ttagtctttg tatattctta cataacggtc caagtttgtt gaaatagttt 2040
acttactaaa cttttcctaa tggggtcaaa ttttatttta taggaaaagg agagattgca 2100
acttgttcca aggacatgaa ctcggatctt ttcttcgcgg tgttaggagg tttgggtcaa 2160
ttcggcatta taacaagagc cagaattaaa cttgaagtag ctccgaaaag ggtatgttaa 2220
atttgtaaat tatgcaacta cagaaaattc tatgaaattt atgaatgaac atatatgcat 2280
ttttggattt ttgtaggcca agtggttaag gtttctatac atagatttct ccgaattcac 2340
aagagatcaa gaacgagtga tatcgaaaac ggacggtgta gatttcttag aaggttccat 2400
tatggtggac catggcccac cggataactg gagatccacg tattatccac cgtccgatca 2460
cttgaggatc gcctcaatgg tcaaacgaca tcgtgtcatc tactgccttg aagtcgtcaa 2520
gtattacgac gaaacttctc aatacacagt caacgaggtc cgtacataca tacaatcata 2580
aatcatacat gtataattgg gagatcttta tgcattattc aattatatta atttacttta 2640
gttatttaac ttatgcagga aatggaggag ttaagcgata gtttaaacca tgtaagaggg 2700
tttatgtacg agaaagatgt gacgtatatg gatttcctaa accgagttcg aaccggagag 2760
ctaaacctga aatccaaagg ccaatgggat gttccacatc catggcttaa tctcttcgta 2820
ccaaaaactc aaatctccaa atttgatgat ggtgttttta agggtattat cctaagaaat 2880
aacatcacta gcggtcctgt tcttgtttat cctatgaatc gcaacaagta agtttaactc 2940
gatattgcaa aatttactat ctacattttc gttttggaat ccgaaatatt cttacaagct 3000
aattttatgc ggcgttttta ggtggaatga tcggatgtct gccgctatac ccgaggaaga 3060
tgtattttat gcggtagggt ttttaagatc cgcgggtttt gacaattggg aggcttttga 3120
tcaagaaaac atggaaatac tgaagttttg tgaggatgct aatatggggg ttatacaata 3180
tcttccttat cattcatcac aagaaggatg ggttagacat tttggtccga ggtggaatat 3240
tttcgtagag agaaaatata aatatgatcc caaaatgata ttatcaccgg gacaaaatat 3300
atttcaaaaa ataaactcga gttag 3325
<210> 2 <211> 1572 <212> ДНК
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 2
atggcgagtt ataatcttcg ttcacaagtt cgtcttatag caataacaat agtaatcatc 60
attactctct caactccgat cacaaccaac acatcaccac aaccatggaa tatcctttca 120
cacaacgaat tcgccggaaa actcacctcc tcctcctcct ccgtcgaatc agccgccaca 180
gatttcggcc acgtcaccaa aatcttccct tccgccgtct taatcccttc ctccgttgaa 240
gacatcacag atctcataaa actctctttt gactctcaac tgtcttttcc tttagccgct 300
cgtggtcacg gacacagcca ccgtggccaa gcctcggcta aagacggagt tgtggtcaac 360
atgcggtcca tggtaaaccg ggatcgaggt atcaaggtgt ctaggacctg tttatatgtt 420
gacgtggacg ctgcgtggct atggattgag gtgttgaata aaactttgga gttagggtta 480
acgccggttt cttggacgga ttatttgtat ttaacagtcg gtgggacgtt atcaaacggc 540
ggaattagtg gacaaacgtt tcggtacggt ccacagatca ctaatgttct agagatggat 600
gttattactg gaaaaggaga gattgcaact tgttccaagg acatgaactc ggatcttttc 660
ttcgcggtgt taggaggttt gggtcaattc ggcattataa caagagccag aattaaactt 720
gaagtagctc cgaaaagggc caagtggtta aggtttctat acatagattt ctccgaattc 780
acaagagatc aagaacgagt gatatcgaaa acggacggtg tagatttctt agaaggttcc 840
attatggtgg accatggccc accggataac tggagatcca cgtattatcc accgtccgat 900
cacttgagga tcgcctcaat ggtcaaacga catcgtgtca tctactgcct tgaagtcgtc 960
aagtattacg acgaaacttc tcaatacaca gtcaacgagg aaatggagga gttaagcgat 1020
agtttaaacc atgtaagagg gtttatgtac gagaaagatg tgacgtatat ggatttccta 1080
aaccgagttc gaaccggaga gctaaacctg aaatccaaag gccaatggga tgttccacat 1140
ccatggctta atctcttcgt accaaaaact caaatctcca aatttgatga tggtgttttt 1200
aagggtatta tcctaagaaa taacatcact agcggtcctg ttcttgttta tcctatgaat 1260
cgcaacaagt ggaatgatcg gatgtctgcc gctatacccg aggaagatgt attttatgcg 1320
gtagggtttt taagatccgc gggttttgac aattgggagg cttttgatca agaaaacatg 1380
gaaatactga agttttgtga ggatgctaat atgggggtta tacaatatct tccttatcat 1440
tcatcacaag aaggatgggt tagacatttt ggtccgaggt ggaatatttt cgtagagaga 1500
aaatataaat atgatcccaa aatgatatta tcaccgggac aaaatatatt tcaaaaaata 1560
aactcgagtt ag 1572
<210> 3
<211> 523
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 3
Met Ala Ser Tyr Asn Leu Arg Ser Gln Val Arg Leu Ile Ala Ile Thr
1 5 10 15
Ile Val Ile Ile Ile Thr Leu Ser Thr Pro Ile Thr Thr Asn Thr Ser
20 25 30
Pro Gln Pro Trp Asn Ile Leu Ser His Asn Glu Phe Ala Gly Lys Leu
35 40 45
Thr Ser Ser Ser Ser Ser Val Glu Ser Ala Ala Thr Asp Phe Gly His
50 55 60
Val Thr Lys Ile Phe Pro Ser Ala Val Leu Ile Pro Ser Ser Val Glu
65 70 75 80
Asp Ile Thr Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Leu Ser Phe
85 90 95
Pro Leu Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser His Arg Gly Gln Ala Ser
100 105 110
Ala Lys Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Arg Asp
115 120 125
Arg Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Cys Leu Tyr Val Asp Val Asp Ala
130 135 140
Ala Trp Leu Trp Ile Glu Val Leu Asn Lys Thr Leu Glu Leu Gly Leu
145 150 155 160
Thr Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly Thr
165 170 175
Leu Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Phe Arg Tyr Gly Pro Gln
180 185 190
Ile Thr Asn Val Leu Glu Met Asp Val Ile Thr Gly Lys Gly Glu Ile
195 200 205
Ala Thr Cys Ser Lys Asp Met Asn Ser Asp Leu Phe Phe Ala Val Leu
210 215 220
Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Lys Leu
225 230 235 240
Glu Val Ala Pro Lys Arg Ala Lys Trp Leu Arg Phe Leu Tyr Ile Asp
245 250 255
Phe Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Val Ile Ser Lys Thr Asp
260 265 270
Gly Val Asp Phe Leu Glu Gly Ser Ile Met Val Asp His Gly Pro Pro
275 280 285
Asp Asn Trp Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Pro Ser Asp His Leu Arg Ile
290 295 300
Ala Ser Met Val Lys Arg His Arg Val Ile Tyr Cys Leu Glu Val Val
305 310 315 320
Lys Tyr Tyr Asp Glu Thr Ser Gln Tyr Thr Val Asn Glu Glu Met Glu
325 330 335
Glu Leu Ser Asp Ser Leu Asn His Val Arg Gly Phe Met Tyr Glu Lys
340 345 350
Asp Val Thr Tyr Met Asp Phe Leu Asn Arg Val Arg Thr Gly Glu Leu
355 360 365
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Gln Trp Asp Val Pro His Pro Trp Leu Asn
370 375 380
Leu Phe Val Pro Lys Thr Gln Ile Ser Lys Phe Asp Asp Gly Val Phe
385 390 395 400
Lys Gly Ile Ile Leu Arg Asn Asn Ile Thr Ser Gly Pro Val Leu Val
405 410 415
Tyr Pro Met Asn Arg Asn Lys Trp Asn Asp Arg Met Ser Ala Ala Ile
420 425 430
Pro Glu Glu Asp Val Phe Tyr Ala Val Gly Phe Leu Arg Ser Ala Gly
435 440 445
Phe Asp Asn Trp Glu Ala Phe Asp Gln Glu Asn Met Glu Ile Leu Lys
450 455 460
Phe Cys Glu Asp Ala Asn Met Gly Val Ile Gln Tyr Leu Pro Tyr His
465 470 475 480
Ser Ser Gln Glu Gly Trp Val Arg His Phe Gly Pro Arg Trp Asn Ile
485 490 495
Phe Val Glu Arg Lys Tyr Lys Tyr Asp Pro Lys Met Ile Leu Ser Pro
500 505 510
Gly Gln Asn Ile Phe Gln Lys Ile Asn Ser Ser
515 520
<210> 4 <211> 3905 <212> ДНК
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 4
ataaacgcac aaactcgtta aatttgtacg aatataattt tttttaaaac actcgttata 60
atatattaaa gtttcaccca aaccgaaaaa agagagaatc tgtgcatgtt gctcagaaaa 120
tcttcaaagc gtaatctggg cttacgttag ctctcacgaa cccccaagga tcttctatat 180
atgttttttc atttccccat aaaatctttc attatctaaa aaatattatt atcgtatctt 240
ttttcttcta tatattcttc ctcctcaatc ttgattcttg tttcttgagt attctttgat 300
gaatcgtgaa atgacgtcaa gctttcttct cctgacgttc gccatatgta aactgatcat 360
agccgtgggt ctaaacgtgg gccccagtga gctcctccgc atcggagcca tagatgtcga 420
cggccacttc accgtccacc cttccgactt agcctccgtc tcctcagact tcggtatgct 480
gaagtcacct gaagagccat tggccgtgct tcatccatca tcggccgaag acgtggcacg 540
actcgtcaga acagcttacg gttcagccac ggcgtttccg gtctcagccc gaggccacgg 600
ccattccata aacggacaag ccgcggcggg gaggaacggt gtggtggttg aaatgaacca 660
cggcgtaacc gggacgccca agccactcgt ccgaccggat gaaatgtatg tggatgtatg 720
gggtggagag ttatgggtcg atgtgttgaa gaaaacgttg gagcatggct tagcaccaaa 780
atcatggacg gattacttgt atctaaccgt tggaggtaca ctctccaatg caggaatcag 840
tggtcaagct tttcaccatg gtcctcaaat tagtaacgtc cttgagctcg acgttgtaac 900
tggttagtat taaaacattc aagttcatat attttaaatg cttttgtctg aagttttact 960
aataacaaga aattgatacc aaaaagtagg gaaaggagag gtgatgagat gctcagaaga 1020
agagaacaca aggctattcc atggagttct tggtggatta ggtcaatttg ggatcatcac 1080
tcgagcacga atctctctcg aaccagctcc ccaaagggta atattttttt aatgactagc 1140
tatcaaaaat ccctggcggg tccatacgtt gtaatctttt tagtttttac tgttgatggt 1200
attttttata tattttggat aataaaaccc taaaatggta tattgtgatg acaggtgaga 1260
tggatacggg tattgtattc gagcttcaaa gtgtttacgg aggaccaaga gtacttaatc 1320
tcaatgcatg gtcaattaaa gtttgattac gtggaaggtt ttgtgattgt ggacgaagga 1380
ctcgtcaaca attggagatc ttctttcttc tctccacgta accccgtcaa gatctcctct 1440
gttagttcca acggctctgt tttgtattgc cttgagatca ccaagaacta ccacgactcc 1500
gactccgaaa tcgttgatca ggtcactttc attattcact tagaaaaaag cgatattttc 1560
attttttata ttgatgaata tctggaagga tttaacgcta tgcgactatt gggaaatcat 1620
tatgaaaaaa tatttagttt atatgattga aagtggtctc catagtattt ttgttgtgtc 1680
gactttatta taacttaaat ttggaagagg acatgaagaa gaagccagag aggatctaca 1740
gagatctagc ttttccacct gaacttaata atgcacattt atataattat ttttcttctt 1800
ctaaagttta gtttatcact agcgaattaa tcatggttac taattaagta gtggacaggg 1860
tcatggacca ctcactcacc aaataatgat tcctctttac tcttaagttt aattttaata 1920
aaaccaactc tactggaatc ttaacttatc cttggttttg gtaggctttt atagcaacac 1980
ggttttttta attttcctat tccagatttt gtatattaaa tgtcgatttt ttttcttttt 2040
gtttcaggaa gttgagattc tgatgaagaa attgaatttc ataccgacat cggtctttac 2100
aacggattta caatatgtgg actttctcga ccgggtacac aaggccgaat tgaagctccg 2160
gtccaagaat ttatgggagg ttccacaccc atggctcaac ctcttcgtgc caaaatcaag 2220
aatctctgac ttcgataaag gcgttttcaa gggcattttg ggaaataaaa caagtggccc 2280
tattcttatc taccccatga acaaagacaa gtaagtcttg acattaccat tgattactac 2340
ttctaaattt cttctctaga aaaaagaata aaacgagttt tgcattgcat gcatgcaaag 2400
ttacacttgt ggggattaat tagtggtcca agaaaaaaag tttgtcaaaa ttgaaaaaaa 2460
ctagacacgt ggtacatggg attgtccgaa aaacgttgtc cacatgtgca tcgaaccagc 2520
taagattgac aacaacactt cgtcggctcg tatttctctt tttgttttgt gaccaaatcc 2580
gatggtccag attgggttta tttgttttta agttcctaga actcatggtg ggtgggtccc 2640
aatcagattc tcctagacca aaccgatctc aacgaaccct ccgcacatca ttgattatta 2700
cattaatata gatattgtcg ttgctgacgt gtcgtaattt gatgttattg tcagatggga 2760
cgagaggagc tcagccgtga cgccggatga ggaagttttc tatctggtgg ctctattgag 2820
atcagcttta acggacggtg aagagacaca gaagctagag tatctgaaag atcagaaccg 2880
tcggatcttg gagttctgtg aacaagccaa gatcaatgtg aagcagtatc ttcctcacca 2940
cgcaacacag gaagagtggg tggctcattt tggggacaag tgggatcggt tcagaagctt 3000
aaaggctgag tttgatccgc gacacatact cgctactggt cagagaatct ttcaaaaccc 3060
atctttgtct ttgtttcctc cgtcgtcgtc ttcttcgtca gcggcttcat ggtgacacag 3120
gacaaaacca agaggaaagt agtagttgag aaatattctt cctgatgtat atatatgacc 3180
taatagagaa gcatcagaga gattaggttg ggtcttttgt tagtaggggt tttaaaatta 3240
gagtagaaga ttcaaaatta gtcaaattta ttgtgttgtt tttatacatc acggattttg 3300
gaaatgggtt tgggacagct taaacccaat taaattaaaa atagacaaca aacctcaaag 33 60
actgttttgg actattttac attttttttg gttgatcgag gtttatactt tatcgtcgtg 3420
gaaccaccat cgggtctcct ttggagatct tccgttctta caattcttca catatcggtc 3480
attatcggtt ggtcgttgct gcaacaaaac aagccaagcg agacgaaggt tcagcttcag 3540
caacaaagag atcaaagttt atatattaat ggtgagtgta agagctgtaa gtaccttttc 3600
agtcgagctt gagagcatgg agaggatgct aatgcagata gaactcaccg tcatggctgg 3660
agaccacgaa tcatacaaaa tatctgcaac gatgatacac aacatcagat acttcttcca 3720
ggaggcctat gttaaataat aagctactga aatttgagtg tacccttgga tctaaaagca 3780
aaatctcaag caatatgagt ttcgaagagg gtcttatctt cgggtaagac ttcaaatgag 3840
tttaggtata caaacgactt atgttacctc tcacattgtg attattaata tattagagat 3900
catac 3905
<210> 5
<211> 1623
<212> ДНК
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 5
atgaatcgtg aaatgacgtc aagctttctt ctcctgacgt tcgccatatg taaactgatc 60
atagccgtgg gtctaaacgt gggccccagt gagctcctcc gcatcggagc catagatgtc 120
gacggccact tcaccgtcca cccttccgac ttagcctccg tctcctcaga cttcggtatg 180
ctgaagtcac ctgaagagcc attggccgtg cttcatccat catcggccga agacgtggca 240
cgactcgtca gaacagctta cggttcagcc acggcgtttc cggtctcagc ccgaggccac 300
ggccattcca taaacggaca agccgcggcg gggaggaacg gtgtggtggt tgaaatgaac 360
cacggcgtaa ccgggacgcc caagccactc gtccgaccgg atgaaatgta tgtggatgta 420
tggggtggag agttatgggt cgatgtgttg aagaaaacgt tggagcatgg cttagcacca 480
aaatcatgga cggattactt gtatctaacc gttggaggta cactctccaa tgcaggaatc 540
agtggtcaag cttttcacca tggtcctcaa attagtaacg tccttgagct cgacgttgta 600
actgggaaag gagaggtgat gagatgctca gaagaagaga acacaaggct attccatgga 660
gttcttggtg gattaggtca atttgggatc atcactcgag cacgaatctc tctcgaacca 720
gctccccaaa gggtgagatg gatacgggta ttgtattcga gcttcaaagt gtttacggag 780
gaccaagagt acttaatctc aatgcatggt caattaaagt ttgattacgt ggaaggtttt 840
gtgattgtgg acgaaggact cgtcaacaat tggagatctt ctttcttctc tccacgtaac 900
cccgtcaaga tctcctctgt tagttccaac ggctctgttt tgtattgcct tgagatcacc 960
aagaactacc acgactccga ctccgaaatc gttgatcagg aagttgagat tctgatgaag 1020
aaattgaatt tcataccgac atcggtcttt acaacggatt tacaatatgt ggactttctc 1080
gaccgggtac acaaggccga attgaagctc cggtccaaga atttatggga ggttccacac 1140
ccatggctca acctcttcgt gccaaaatca agaatctctg acttcgataa aggcgttttc 1200
aagggcattt tgggaaataa aacaagtggc cctattctta tctaccccat gaacaaagac 1260
aaatgggacg agaggagctc agccgtgacg ccggatgagg aagttttcta tctggtggct 1320
ctattgagat cagctttaac ggacggtgaa gagacacaga agctagagta tctgaaagat 1380
cagaaccgtc ggatcttgga gttctgtgaa caagccaaga tcaatgtgaa gcagtatctt 1440
cctcaccacg caacacagga agagtgggtg gctcattttg gggacaagtg ggatcggttc 1500
agaagcttaa aggctgagtt tgatccgcga cacatactcg ctactggtca gagaatcttt 1560
caaaacccat ctttgtcttt gtttcctccg tcgtcgtctt cttcgtcagc ggcttcatgg 1620
tga 1623
<210> 6
<211> 540
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 6
Met Asn Arg Glu Met Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ile
1 5 10 15
Cys Lys Leu Ile Ile Ala Val Gly Leu Asn Val Gly Pro Ser Glu Leu
20 25 30
Leu Arg Ile Gly Ala Ile Asp Val Asp Gly His Phe Thr Val His Pro
35 40 45
Ser Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser Asp Phe Gly Met Leu Lys Ser Pro
50 55 60
Glu Glu Pro Leu Ala Val Leu His Pro Ser Ser Ala Glu Asp Val Ala
65 70 75 80
Arg Leu Val Arg Thr Ala Tyr Gly Ser Ala Thr Ala Phe Pro Val Ser
85 90 95
Ala Arg Gly His Gly His Ser Ile Asn Gly Gln Ala Ala Ala Gly Arg
100 105 110
Asn Gly Val Val Val Glu Met Asn His Gly Val Thr Gly Thr Pro Lys
115 120 125
Pro Leu Val Arg Pro Asp Glu Met Tyr Val Asp Val Trp Gly Gly Glu
130 135 140
Leu Trp Val Asp Val Leu Lys Lys Thr Leu Glu His Gly Leu Ala Pro
145 150 155 160
Lys Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser
165 170 175
Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala Phe His His Gly Pro Gln Ile Ser
180 185 190
Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Val Thr Gly Lys Gly Glu Val Met Arg
195 200 205
Cys Ser Glu Glu Glu Asn Thr Arg Leu Phe His Gly Val Leu Gly Gly
210 215 220
Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Ser Leu Glu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Gln Arg Val Arg Trp Ile Arg Val Leu Tyr Ser Ser Phe Lys
245 250 255
Val Phe Thr Glu Asp Gln Glu Tyr Leu Ile Ser Met His Gly Gln Leu
260 265 270
Lys Phe Asp Tyr Val Glu Gly Phe Val Ile Val Asp Glu Gly Leu Val
275 280 285
Asn Asn Trp Arg Ser Ser Phe Phe Ser Pro Arg Asn Pro Val Lys Ile
290 295 300
Ser Ser Val Ser Ser Asn Gly Ser Val Leu Tyr Cys Leu Glu Ile Thr
305 310 315 320
Lys Asn Tyr His Asp Ser Asp Ser Glu Ile Val Asp Gln Glu Val Glu
325 330 335
Ile Leu Met Lys Lys Leu Asn Phe Ile Pro Thr Ser Val Phe Thr Thr
340 345 350
Asp Leu Gln Tyr Val Asp Phe Leu Asp Arg Val His Lys Ala Glu Leu
355 360 365
Lys Leu Arg Ser Lys Asn Leu Trp Glu Val Pro His Pro Trp Leu Asn
370 375 380
Leu Phe Val Pro Lys Ser Arg Ile Ser Asp Phe Asp Lys Gly Val Phe
385 390 395 400
Lys Gly Ile Leu Gly Asn Lys Thr Ser Gly Pro Ile Leu Ile Tyr Pro
405 410 415
Met Asn Lys Asp Lys Trp Asp Glu Arg Ser Ser Ala Val Thr Pro Asp
420 425 430
Glu Glu Val Phe Tyr Leu Val Ala Leu Leu Arg Ser Ala Leu Thr Asp
435 440 445
Gly Glu Glu Thr Gln Lys Leu Glu Tyr Leu Lys Asp Gln Asn Arg Arg
450 455 460
Ile Leu Glu Phe Cys Glu Gln Ala Lys Ile Asn Val Lys Gln Tyr Leu
465 470 475 480
Pro His His Ala Thr Gln Glu Glu Trp Val Ala His Phe Gly Asp Lys
485 490 495
Trp Asp Arg Phe Arg Ser Leu Lys Ala Glu Phe Asp Pro Arg His Ile
500 505 510
Leu Ala Thr Gly Gln Arg Ile Phe Gln Asn Pro Ser Leu Ser Leu Phe
515 520 525
Pro Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ser Trp
530 535 540
<210> 7
<211> 2796
<212> ДНК
<220> <221>
<213> Brassica napus
экзон <222> (1)..(613) <223> экзон1
<220>
<221> экзон
<222> (1546)..(1673)
<223> экзон2
<220>
<221> экзон
<222> (1780)..(2040)
<223> экзон3
<220>
<221> экзон
<222> (2154)..(2422)
<223> экзон4
<220>
вариация
<222> (2244)..(2244)
<221> <222>
<223> замещение C на T в YIIN501
<220>
<221> экзон
<222> (2508)..(2796)
<223> экзон5
<400> 7
atg gtg agc tat aat ttt cca tca caa att cat ctt cta atg ata acg 48
Met Val Ser Tyr Asn Phe Pro Ser Gln Ile His Leu Leu Met Ile Thr
1 5 10 15
ata tta gtt atc atc aca act ctt tta act ccg atc aca acc aac aca 96
Ile Leu Val Ile Ile Thr Thr Leu Leu Thr Pro Ile Thr Thr Asn Thr
20 25 30
tca tca cta ccg tgg aat atc ctt tcc aat gac aac ttc gcc gga aaa 144 Ser Ser Leu Pro Trp Asn Ile Leu Ser Asn Asp Asn Phe Ala Gly Lys
35 40 45
ctc act acc gca tca tcc tcc gtc gaa tca gct gcc act gat ttc ggc 192
Leu Thr Thr Ala Ser Ser Ser Val Glu Ser Ala Ala Thr Asp Phe Gly
50 55 60
cac atc acc aaa atc ttt ccc tcc gcc gtc tta aac cct tcc tcc gtc 240
His Ile Thr Lys Ile Phe Pro Ser Ala Val Leu Asn Pro Ser Ser Val
65 70 75 80
caa gac atc acc gat ctt ata aaa ctt tct ttc gat tct caa tcc tct 288 Gln Asp Ile Thr Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Ser Ser
85 90 95
ttt cct cta gcc gct cgt ggc cac gga cac agc cac cgt ggt caa gcc 336
Phe Pro Leu Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser His Arg Gly Gln Ala
100 105 110
gcg gct aaa gac gga gtc gtg gtc aac atg cgg tca atg gta aac agg 384
Ala Ala Lys Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Arg
115 120 125
gac cga ggc atc aag gtg tct agg acc ggt tta tat gct gac gtg gac 432
Asp Arg Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Ala Asp Val Asp
130 135 140
agc gcg tgg cta tgg atc gag gtg ttg aat aaa acg ttg gag tta ggg 480
Ser Ala Trp Leu Trp Ile Glu Val Leu Asn Lys Thr Leu Glu Leu Gly
145 150 155 160
ctg acg ccg gtt tct tgg acg gat tat ttg tat tta acg gtc ggt gga 528
Leu Thr Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly
165 170 175
acg tta tct aac ggc ggt ata agc gga caa acg ttt cgg tat ggt cca 576
Thr Leu Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Phe Arg Tyr Gly Pro
180 185 190
cag atc agt aat gtt tta gag atg gat gtt att act g gtacgtacca 623
Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu Met Asp Val Ile Thr 195 200
tgatgatttt ttacatgcat tctaaatata tgaaacagta atgactttta cttcgtacat 683
ttggcaataa tatgtttatg tgttgatagc cacgagctat atattttttt aaaaattatt ttacattatg acaaaaaaaa ggtttcttgt gtaatggatt tgcatcattc tgttgctctc ataagataaa ctgaaactcg tgttttaccc aaaaaatatc ctcttgtttg tgttcttctt gtgattttat tttttgacaa tctataattt gtaataaatg aagacaaatg tggcataagg taagtaacag cacatacacc aaatgtagtt ttaatgagac ttgcattagt ggaattttat gtacgttttt tttgtaccgt ttcacacatc gttttttttc cgttaacaaa cttacatatt agattagatt aaaatcaacc acacaagtca tcagttttct tttttgacaa agttaacgat cgacttcaac tgaaaaagtt cgtcttttct ttgtctcttg tagctaatca taatttgata ttatattata atgaacgttt acgtaactgt aaaaatggtc caagtttata tattatagct catatatata gattttctag actttaggct ttaagagtaa ttaagatctg ttctatttat cattattgag ctgaattctg agttaagaac cgctgaatct tcataaaacc ccacgcttga aattttggtc gtatccatta tatacataca ttccattgtg caaaacagcg ctttctaact tgcgctcact ttctaaaact tagaaaaaca ttaacaaatt caaatgtttg actgcgattt cggtgaccaa tttttcacga ctaaccaggt tgtccacaca ttaatacaac tggttaagag atagtcttat tggtcagttt
743 803 863 923 983 1043 1103 1163 1223 1283 1343 1403 1463 1523 1574
1622
1670
1723
1782
1830
1878
1926
1974
cgt gtc atc tac tgc ctt gaa gtc gtc aag tat tac gac gaa act tcc
Arg Val Ile Tyr Cys Leu Glu Val Val Lys Tyr Tyr Asp Glu Thr Ser
315 320 325
caa cac tca gtc aac gag gtccgtacac attatacata attgtacaag 2070
Gln His Ser Val Asn Glu 330
tatagtcaca atctttactc ataacgaagc cactcttcca taattataat tttattgatt 2130
gctcaatcat ttagacaatg cag gaa atg gag gag tta agc gac agt tta aac 2183
Glu Met Glu Glu Leu Ser Asp Ser Leu Asn 335 340
tat gaa cga ggg ttt gtg tac gag aaa gat gtg acg tat atg gat ttc 2231
Tyr Glu Arg Gly Phe Val Tyr Glu Lys Asp Val Thr Tyr Met Asp Phe
345 350 355 360
tta aac cgg gtt cga acc gga gag cta aaa ctg aaa tcc aaa ggc aag 2279 Leu Asn Arg Val Arg Thr Gly Glu Leu Lys Leu Lys Ser Lys Gly Lys
365 370 375
tgg gat gtt cca cat cca tgg ctt aat ctt ttc gta cca aaa tct cag 2327 Trp Asp Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Phe Val Pro Lys Ser Gln
380 385 390
att tca aga ttc gag tat ggc gtt ttt aag ggt att atc ctt aga aat 2375
Ile Ser Arg Phe Glu Tyr Gly Val Phe Lys Gly Ile Ile Leu Arg Asn
395 400 405
aac atc act acc ggt ccc ctt ctt gtt tat ccc atg aac cgc aac aa 2422
Asn Ile Thr Thr Gly Pro Leu Leu Val Tyr Pro Met Asn Arg Asn Lys
410 415 420
gtaagttata atcaatatag ccacattatc tacagtttca aaattttcaa atgcgaaata 2482
cttaaatctc gaggttttaa ttcag g tgg aat gat cga atg tcg acc gtt ata 2535
Trp Asn Asp Arg Met Ser Thr Val Ile 425 430
ccc gag gaa gat gta ttt tat gct gta gga ttt tta cga tcg gcg agt 2583
Pro Glu Glu Asp Val Phe Tyr Ala Val Gly Phe Leu Arg Ser Ala Ser
435 440 445
ttt gac aat tgg gat gat tat gaa aaa gaa aac atg gaa gta tta aag 2631
Phe Asp Asn Trp Asp Asp Tyr Glu Lys Glu Asn Met Glu Val Leu Lys
450 455 460 465
ttt tgt gag gat gct aat atg agg gtc ata caa tat ctt cct tac tat 2679
Phe Cys Glu Asp Ala Asn Met Arg Val Ile Gln Tyr Leu Pro Tyr Tyr
470 475 480
gca tca caa gaa gga tgg gtt ggc cat ttt ggt ccg agg tgg aat att 2727
Ala Ser Gln Glu Gly Trp Val Gly His Phe Gly Pro Arg Trp Asn Ile
485 490 495
ttt ctc gaa aga aaa tat aga tat gat cct aga atg ata ttg tcc cct 2775 Phe Leu Glu Arg Lys Tyr Arg Tyr Asp Pro Arg Met Ile Leu Ser Pro
500 505 510
gga caa aat ata ttt cca taa 2796 Gly Gln Asn Ile Phe Pro 515
<210> 8
<211> 1560
<212> ДНК
<213> Brassica napus
<220>
<221> вариация <222> (1093)..(1093)
<223> замещение C на T в YIIN501
<400> 8
atggtgagct ataattttcc atcacaaatt catcttctaa tgataacgat attagttatc 60
atcacaactc ttttaactcc gatcacaacc aacacatcat cactaccgtg gaatatcctt 120
tccaatgaca acttcgccgg aaaactcact accgcatcat cctccgtcga atcagctgcc 180
actgatttcg gccacatcac caaaatcttt ccctccgccg tcttaaaccc ttcctccgtc 240
caagacatca ccgatcttat aaaactttct ttcgattctc aatcctcttt tcctctagcc 300
gctcgtggcc acggacacag ccaccgtggt caagccgcgg ctaaagacgg agtcgtggtc 360
aacatgcggt caatggtaaa cagggaccga ggcatcaagg tgtctaggac cggtttatat 420
gctgacgtgg acagcgcgtg gctatggatc gaggtgttga ataaaacgtt ggagttaggg 480
ctgacgccgg tttcttggac ggattatttg tatttaacgg tcggtggaac gttatctaac 540
ggcggtataa gcggacaaac gtttcggtat ggtccacaga tcagtaatgt tttagagatg 600
gatgttatta ctggaaaagg agagattgca acttgttcca aagacatgaa ctcagatctt 660
ttctatgccg cgttaggagg tttaggtcaa ttcggaatta taacgagagc aagaatcaaa 720
ctcgaattag ctccgaaaaa ggctaaatgg ttaaggtttc tatacactga tttctctgag 780
tttacaagag atcaagaacg attgatatca gaaacgaacg ggccacattt cctggaaggt 840
tctgttatgt tagaccatgg cccacctgat aactggcggt ccacttacta tccaccgtcc 900
gagcacatga ggatcgtctc aatggtcaaa caacatcgtg tcatctactg ccttgaagtc 960
gtcaagtatt acgacgaaac ttcccaacac tcagtcaacg aggaaatgga ggagttaagc 1020
gacagtttaa actatgaacg agggtttgtg tacgagaaag atgtgacgta tatggatttc 1080
ttaaaccggg ttcgaaccgg agagctaaaa ctgaaatcca aaggcaagtg ggatgttcca 1140
catccatggc ttaatctttt cgtaccaaaa tctcagattt caagattcga gtatggcgtt 1200
tttaagggta ttatccttag aaataacatc actaccggtc cccttcttgt ttatcccatg 1260
aaccgcaaca agtggaatga tcgaatgtcg accgttatac ccgaggaaga tgtattttat 1320
gctgtaggat ttttacgatc ggcgagtttt gacaattggg atgattatga aaaagaaaac 1380
atggaagtat taaagttttg tgaggatgct aatatgaggg tcatacaata tcttccttac 1440
tatgcatcac aagaaggatg ggttggccat tttggtccga ggtggaatat ttttctcgaa 1500
agaaaatata gatatgatcc tagaatgata ttgtcccctg gacaaaatat atttccataa 1560
<210> 9
<211> 519
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 9
Met Val Ser Tyr Asn Phe Pro Ser Gln Ile His Leu Leu Met Ile Thr
1 5 10 15
Ile Leu Val Ile Ile Thr Thr Leu Leu Thr Pro Ile Thr Thr Asn Thr
20 25 30
Ser Ser Leu Pro Trp Asn Ile Leu Ser Asn Asp Asn Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Leu Thr Thr Ala Ser Ser Ser Val Glu Ser Ala Ala Thr Asp Phe Gly
50 55 60
His Ile Thr Lys Ile Phe Pro Ser Ala Val Leu Asn Pro Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Asp Ile Thr Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Ser Ser
85 90 95
Phe Pro Leu Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser His Arg Gly Gln Ala
100 105 110
Ala Ala Lys Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Arg
115 120 125
Asp Arg Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Ala Asp Val Asp
130 135 140
Ser Ala Trp Leu Trp Ile Glu Val Leu Asn Lys Thr Leu Glu Leu Gly
145 150 155 160
Leu Thr Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly
165 170 175
Thr Leu Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Phe Arg Tyr Gly Pro
180 185 190
Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu Met Asp Val Ile Thr Gly Lys Gly Glu
195 200 205
Ile Ala Thr Cys Ser Lys Asp Met Asn Ser Asp Leu Phe Tyr Ala Ala
210 215 220
Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Lys
225 230 235 240
Leu Glu Leu Ala Pro Lys Lys Ala Lys Trp Leu Arg Phe Leu Tyr Thr
245 250 255
Asp Phe Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Glu Thr
260 265 270
Asn Gly Pro His Phe Leu Glu Gly Ser Val Met Leu Asp His Gly Pro
275 280 285
Pro Asp Asn Trp Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Pro Ser Glu His Met Arg
290 295 300
Ile Val Ser Met Val Lys Gln His Arg Val Ile Tyr Cys Leu Glu Val
305 310 315 320
Val Lys Tyr Tyr Asp Glu Thr Ser Gln His Ser Val Asn Glu Glu Met
325 330 335
Glu Glu Leu Ser Asp Ser Leu Asn Tyr Glu Arg Gly Phe Val Tyr Glu
340 345 350
Lys Asp Val Thr Tyr Met Asp Phe Leu Asn Arg Val Arg Thr Gly Glu
355 360 365
Leu Lys Leu Lys Ser Lys Gly Lys Trp Asp Val Pro His Pro Trp Leu
370 375 380
Asn Leu Phe Val Pro Lys Ser Gln Ile Ser Arg Phe Glu Tyr Gly Val
385 390 395 400
Phe Lys Gly Ile Ile Leu Arg Asn Asn Ile Thr Thr Gly Pro Leu Leu
405 410 415
Val Tyr Pro Met Asn Arg Asn Lys Trp Asn Asp Arg Met Ser Thr Val
420 425 430
Ile Pro Glu Glu Asp Val Phe Tyr Ala Val Gly Phe Leu Arg Ser Ala
435 440 445
Ser Phe Asp Asn Trp Asp Asp Tyr Glu Lys Glu Asn Met Glu Val Leu
450 455 460
Lys Phe Cys Glu Asp Ala Asn Met Arg Val Ile Gln Tyr Leu Pro Tyr
465 470 475 480
Tyr Ala Ser Gln Glu Gly Trp Val Gly His Phe Gly Pro Arg Trp Asn
485 490 495
Ile Phe Leu Glu Arg Lys Tyr Arg Tyr Asp Pro Arg Met Ile Leu Ser
500 505 510
Pro Gly Gln Asn Ile Phe Pro 515
<210> 10
<211> 2991
<212> ДНК
<213> Brassica napus
экзон (1)..(607)
<220> <221> <222>
<223> экзон1
экзон
(1710)..(1834)
<220> <221> <222>
<223> экзон2
экзон
(1944)..(2204)
<220> <221> <222>
<223> экзон3
экзон
(2311)..(2579)
<220> <221> <222>
<223> экзон4
<220> <221> <222> <223>
вариация
(2482)..(2482)
замещение C на T в YIIN512
экзон
(2703)..(2991)
<220> <221> <222>
<223> экзон5
<400> 10
atg gca agt aat aat ttt cca tcc caa agt cat ctt cta gta ata ata
Met Ala Ser Asn Asn Phe Pro Ser Gln Ser His Leu Leu Val Ile Ile
1 5 10 15
ata ttt atc aca act ctt tta act ccg atc aca acc aac aca tca cca
Ile Phe Ile Thr Thr Leu Leu Thr Pro Ile Thr Thr Asn Thr Ser Pro
20 25 30
caa cca tgg aat atc ctt tcc aac gac aac ttc gcc gga aaa ctc acc
Gln Pro Trp Asn Ile Leu Ser Asn Asp Asn Phe Ala Gly Lys Leu Thr
35 40 45
144
tcc gca tcc tcc tcc gtc gaa gca gct tcc atc gat ttc ggc cac gtc 192
Ser Ala Ser Ser Ser Val Glu Ala Ala Ser Ile Asp Phe Gly His Val
50 55 60
acc aaa att cta ccc tcc gcc gtc tta aac cct tcc tcc gtc caa gac 240
Thr Lys Ile Leu Pro Ser Ala Val Leu Asn Pro Ser Ser Val Gln Asp
65 70 75 80
atc atc gat ctc ata aaa ctt tct ttc gac tct caa tcc tct ttc cct 288 Ile Ile Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Ser Ser Phe Pro
85 90 95
ata gcc gct cgt ggc cac gga cac agc ttc cgt ggc caa gcc gct gct 336
Ile Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser Phe Arg Gly Gln Ala Ala Ala
100 105 110
aaa gac gga gtc gtg gtc aac atg cgg tca atg gta aac gag gac cga 384
Lys Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Glu Asp Arg
115 120 125
ggc ata aag gtg tct agg acc ggt tta tat gcg gac gtg gac act gcg 432
Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Ala Asp Val Asp Thr Ala
130 135 140
tgg cta tgg att gag gtg ttg aat aaa acg ttg gag ttg ggg tta acg 480
Trp Leu Trp Ile Glu Val Leu Asn Lys Thr Leu Glu Leu Gly Leu Thr
145 150 155 160
ccg gtt tct tgg acg gac tat ttg tat tta acg gtc ggt gga acg tta 528
Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu
165 170 175
tcc aac ggc gga ata agc gga caa acg tct cgg tac ggt cca cag atc 576
Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Ser Arg Tyr Gly Pro Gln Ile
180 185 190
agt aat gtt ctt gag ctg gat att att act g gtacgtacca tgatttttac 627 Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Ile Ile Thr 195 200
atatattcca aatctatgca atacttactt cgtacgtttg acgacaaaaa taaaatacaa 687
taaaaacgta cgttttttta gatctgggtg gtcacttgtg tttatgctct tgttttgttt 747
aatattgtgt cttttttacg tatttgtcga acttgttgat agcttttctt gttttcacac 807
atctagctaa tcacattatt tttgcgtcta agagtagaaa gaaacacggg ctatgtataa 867
aataagtggt tgtaagaaaa gatttttctt tgttgtagtg atagaagatt tagcattatt 927
gtttttttgc aacagaaatt tcaaattaaa attcgtgaaa gatacgtgta ataatatata 987
gtctctactt gaaagtgttg cacaaaaaaa aagtctctac ttgaaagttg aaacagaaca 1047
atttttttga ttttatgttc atattacgat tttgtactaa cgctatatat aacaagttac 1107
taactaaata gtttttgaaa ttttgaaatt tataatttct tacatattat ggatgtttcg 1167
tcgaatctaa ttttgttctc cgcgaaattt acataatggt cacgccgcgc acgttaatgt 1227
tatgtaattg ttcatataaa ccggtgacaa acaaatatta aaaatggtcc cacgcgtatg 1287
ttttttcacg aggtttcttg tggcatagag acaaaactca aaatcttata acgtttggtc 1347
ataattaacc aggtgtaatg aatttaagta acagtcaatt ttcttattat agctaatagt
1407
tgtaccacta tgtccacata tgcatccata attccatata cgaacactgt tggtctgaag 1467
tttagttcgt ttacgaagac tttctagttc caaagtttgg ttaggactta ggagataaga 1527
tatattaatg ggaccgactt taacatttta ggcttaaaac aacgatagtt ttatttgaaa 1587
ctcgttgcat cttttatata aactatgata ttctttgtat agtattacgg tccaaatatg 1647
ttgaaatagt ttaagactga actttctaat taggtcagct atttttcccc ggaactttat 1707
ag ga aaa ggg gag att gca act tgt tcc aac gac atg aac tca gat 1753
Gly Lys Gly Glu Ile Ala Thr Cys Ser Asn Asp Met Asn Ser Asp
205 210 215
ctt ttc tac gcg gcg tta gga ggt ttg ggt caa ttc gga att ata aca 1801
Leu Phe Tyr Ala Ala Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr
220 225 230
aga gcc agg att aaa ctc gaa tta gct cca aaa agggtatgtt atattaatat 1854 Arg Ala Arg Ile Lys Leu Glu Leu Ala Pro Lys
235 240
gtaaattatt caatatatat tttatataag taagaataat ttaccgaaat ttttgattaa 1914
atatatctct tttgttggaa acttttcag gct aaa tgg tta agg ttt cta tac 1967
Ala Lys Trp Leu Arg Phe Leu Tyr
245 250
act gat ttc tct gaa ttc aca aga gat caa gaa cga ttg ata tca gaa 2015
Thr Asp Phe Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Glu
255 260 265
gcg ggc ggt tta cat ttc ttg gaa ggt tcc gtt atg ctt gac cat ggc 2063
Ala Gly Gly Leu His Phe Leu Glu Gly Ser Val Met Leu Asp His Gly
270 275 280
cca cct gat aac tgg aga tct act tac tat cca ccg tcc gat cac ttg 2111 Pro Pro Asp Asn Trp Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Pro Ser Asp His Leu
285 290 295 300
agg atc gtc tca atg ata aaa cga cac cgt gtc atc tac tgt ctc gaa 2159
Arg Ile Val Ser Met Ile Lys Arg His Arg Val Ile Tyr Cys Leu Glu
305 310 315
gtc gtc aag tat tac gac gaa ttt tct caa cac tca gtc aac gag 2204
Val Val Lys Tyr Tyr Asp Glu Phe Ser Gln His Ser Val Asn Glu
320 325 330
gtccgtacac atatacacaa gtataattag gatctccact cacaattaaa aaactctatc 2264 ttatattata tgtttattaa ttttctcaat tatttaaact ttgcag gaa atg gag 2319
Glu Met Glu
gag tta agc gag agt tta aac ttt gta aga ggg ttt gtg tac gag aaa 2367
Glu Leu Ser Glu Ser Leu Asn Phe Val Arg Gly Phe Val Tyr Glu Lys
335 340 345 350
gat gtg acg tat ata gat ttc ttg aac cgg gtt cga acg gga gag cta 2415
Asp Val Thr Tyr Ile Asp Phe Leu Asn Arg Val Arg Thr Gly Glu Leu
355 360 365
aac ctg aaa tcc aaa ggc caa tgg gat gtt cca cat cca tgg ctt aat 2463 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Gln Trp Asp Val Pro His Pro Trp Leu Asn
370
375
380
ctc ttt gta cca aaa tct cag att tca aga ttt gat tat ggt gtc ttt
Leu Phe Val Pro Lys Ser Gln Ile Ser Arg Phe Asp Tyr Gly Val Phe
385 390 395
2511
aag ggt att atc ctt aga aat aac atc act acc ggt cca ctt ctt gtt
Lys Gly Ile Ile Leu Arg Asn Asn Ile Thr Thr Gly Pro Leu Leu Val
400 405 410
2559
tat ccc atg aag cgc att at gtaagttaaa atatagagcg atcatccatt
Tyr Pro Met Lys Arg Ile Met 415 420
2609
caatttttta tattaaagtt cttactaaat gtttatggcc tccaaaattt cagctttgtg 2669
tttaaataac tgacttttaa ggttttgctt cag g tgg aat gat caa atg tcc 2721
Trp Asn Asp Gln Met Ser 425
acc gct ata ccc gaa gaa gat gta ttt tat gcg gta ggg ttc tta cga
Thr Ala Ile Pro Glu Glu Asp Val Phe Tyr Ala Val Gly Phe Leu Arg
430 435 440
2769
tct gcg gag ttt gat aat tgg gag gct tat gat aaa gaa aat atg gag
Ser Ala Glu Phe Asp Asn Trp Glu Ala Tyr Asp Lys Glu Asn Met Glu
445 450 455
2817
gta ttg atg ttt tgt gag gat gct aaa atg gat gtc ata cag tat ctt
Val Leu Met Phe Cys Glu Asp Ala Lys Met Asp Val Ile Gln Tyr Leu
460 465 470 475
2865
cct tat cat gca tca caa gaa gga tgg gtt aga cat ttt ggt ccg agg
Pro Tyr His Ala Ser Gln Glu Gly Trp Val Arg His Phe Gly Pro Arg
480 485 490
2913
tgg aat act ttt gta gag aga aaa tat aaa tac gat cct aaa atg ata
Trp Asn Thr Phe Val Glu Arg Lys Tyr Lys Tyr Asp Pro Lys Met Ile
495 500 505
2961
ttg tct cca gga caa aat ata ttt caa taa
Leu Ser Pro Gly Gln Asn Ile Phe Gln 510 515
2991
<210> 11
ДНК
<211> 1554
<212>
<213> Brassica napus
<220>
<221> вариация
<222> (1168)..(1168)
<223> замещение C на T в YIIN512
<400> 11
atggcaagta ataattttcc atcccaaagt catcttctag taataataat atttatcaca 60
actcttttaa ctccgatcac aaccaacaca tcaccacaac catggaatat cctttccaac 120
gacaacttcg ccggaaaact cacctccgca tcctcctccg tcgaagcagc ttccatcgat 180
ttcggccacg tcaccaaaat tctaccctcc gccgtcttaa acccttcctc cgtccaagac
240
atcatcgatc tcataaaact ttctttcgac tctcaatcct ctttccctat agccgctcgt 300
ggccacggac acagcttccg tggccaagcc gctgctaaag acggagtcgt ggtcaacatg 3 60
cggtcaatgg taaacgagga ccgaggcata aaggtgtcta ggaccggttt atatgcggac 42 0
gtggacactg cgtggctatg gattgaggtg ttgaataaaa cgttggagtt ggggttaacg 480
ccggtttctt ggacggacta tttgtattta acggtcggtg gaacgttatc caacggcgga 540
ataagcggac aaacgtctcg gtacggtcca cagatcagta atgttcttga gctggatatt 600
attactggaa aaggggagat tgcaacttgt tccaacgaca tgaactcaga tcttttctac 660
gcggcgttag gaggtttggg tcaattcgga attataacaa gagccaggat taaactcgaa 720
ttagctccaa aaagggctaa atggttaagg tttctataca ctgatttctc tgaattcaca 780
agagatcaag aacgattgat atcagaagcg ggcggtttac atttcttgga aggttccgtt 840
atgcttgacc atggcccacc tgataactgg agatctactt actatccacc gtccgatcac 900
ttgaggatcg tctcaatgat aaaacgacac cgtgtcatct actgtctcga agtcgtcaag 9 60
tattacgacg aattttctca acactcagtc aacgaggaaa tggaggagtt aagcgagagt 1020
ttaaactttg taagagggtt tgtgtacgag aaagatgtga cgtatataga tttcttgaac 1080
cgggttcgaa cgggagagct aaacctgaaa tccaaaggcc aatgggatgt tccacatcca 1140
tggcttaatc tctttgtacc aaaatctcag atttcaagat ttgattatgg tgtctttaag 1200
ggtattatcc ttagaaataa catcactacc ggtccacttc ttgtttatcc catgaagcgc 1260
attatgtgga atgatcaaat gtccaccgct atacccgaag aagatgtatt ttatgcggta 1320
gggttcttac gatctgcgga gtttgataat tgggaggctt atgataaaga aaatatggag 1380
gtattgatgt tttgtgagga tgctaaaatg gatgtcatac agtatcttcc ttatcatgca 1440
tcacaagaag gatgggttag acattttggt ccgaggtgga atacttttgt agagagaaaa 1500
tataaatacg atcctaaaat gatattgtct ccaggacaaa atatatttca ataa 1554
<210> 12 <211> 517
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 12
Met Ala Ser Asn Asn Phe Pro Ser Gln Ser His Leu Leu Val Ile Ile
1 5 10 15
Ile Phe Ile Thr Thr Leu Leu Thr Pro Ile Thr Thr Asn Thr Ser Pro
20 25 30
Gln Pro Trp Asn Ile Leu Ser Asn Asp Asn Phe Ala Gly Lys Leu Thr
35 40 45
Ser Ala Ser Ser Ser Val Glu Ala Ala Ser Ile Asp Phe Gly His Val
50 55 60
Thr Lys Ile Leu Pro Ser Ala Val Leu Asn Pro Ser Ser Val Gln Asp
65 70 75 80
Ile Ile Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Ser Ser Phe Pro
85 90 95
Ile Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser Phe Arg Gly Gln Ala Ala Ala
100 105 110
Lys Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Glu Asp Arg
115 120 125
Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Ala Asp Val Asp Thr Ala
130 135 140
Trp Leu Trp Ile Glu Val Leu Asn Lys Thr Leu Glu Leu Gly Leu Thr
145 150 155 160
Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu
165 170 175
Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Ser Arg Tyr Gly Pro Gln Ile
180 185 190
Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Ile Ile Thr Gly Lys Gly Glu Ile Ala
195 200 205
Thr Cys Ser Asn Asp Met Asn Ser Asp Leu Phe Tyr Ala Ala Leu Gly
210 215 220
Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Lys Leu Glu
225 230 235 240
Leu Ala Pro Lys Arg Ala Lys Trp Leu Arg Phe Leu Tyr Thr Asp Phe
245 250 255
Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Glu Ala Gly Gly
260 265 270
Leu His Phe Leu Glu Gly Ser Val Met Leu Asp His Gly Pro Pro Asp
275 280 285
Asn Trp Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Pro Ser Asp His Leu Arg Ile Val
290 295 300
Ser Met Ile Lys Arg His Arg Val Ile Tyr Cys Leu Glu Val Val Lys
305 310 315 320
Tyr Tyr Asp Glu Phe Ser Gln His Ser Val Asn Glu Glu Met Glu Glu
325 330 335
Leu Ser Glu Ser Leu Asn Phe Val Arg Gly Phe Val Tyr Glu Lys Asp
340 345 350
Val Thr Tyr Ile Asp Phe Leu Asn Arg Val Arg Thr Gly Glu Leu Asn
355 360 365
Leu Lys Ser Lys Gly Gln Trp Asp Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu
370 375 380
Phe Val Pro Lys Ser Gln Ile Ser Arg Phe Asp Tyr Gly Val Phe Lys
385 390 395 400
Gly Ile Ile Leu Arg Asn Asn Ile Thr Thr Gly Pro Leu Leu Val Tyr
405 410 415
Pro Met Lys Arg Ile Met Trp Asn Asp Gln Met Ser Thr Ala Ile Pro
420 425 430
Glu Glu Asp Val Phe Tyr Ala Val Gly Phe Leu Arg Ser Ala Glu Phe
435 440 445
Asp Asn Trp Glu Ala Tyr Asp Lys Glu Asn Met Glu Val Leu Met Phe
450 455 460
Cys Glu Asp Ala Lys Met Asp Val Ile Gln Tyr Leu Pro Tyr His Ala
465 470 475 480
Ser Gln Glu Gly Trp Val Arg His Phe Gly Pro Arg Trp Asn Thr Phe
485 490 495
Val Glu Arg Lys Tyr Lys Tyr Asp Pro Lys Met Ile Leu Ser Pro Gly
500 505 510
Gln Asn Ile Phe Gln 515
<210> 13 <211> 2776
<212> ДНК
<213> Brassica napus
<220>
<221> экзон <222> (1)..(613) <223> экзон1
экзон
(1525)..(1652)
<220> <221> <222>
<223> экзон2
экзон
(1759)..(2019)
<220> <221> <222>
<223> экзон3
<220> <221> <222> <223>
вариация
(1893)..(1893)
замещение G на A в YIIN521
экзон
(2133)..(2401)
<220> <221> <222>
<223> экзон4
экзон
(2488)..(2776)
<220> <221> <222>
<223> экзон5
<400> 13
atg gtg agc tat aat ttt cca tca caa att cat ctt cta atg ata acg
Met Val Ser Tyr Asn Phe Pro Ser Gln Ile His Leu Leu Met Ile Thr
1 5 10 15
ata tta gta atc atc aca act ctt ttc act ccg atc aca acc aac aca
Ile Leu Val Ile Ile Thr Thr Leu Phe Thr Pro Ile Thr Thr Asn Thr
20 25 30
tca tca cta cca tgg aat atc ctt tcc aat gac aac ttc gcc cga aaa Ser Ser Leu Pro Trp Asn Ile Leu Ser Asn Asp Asn Phe Ala Arg Lys
35 40 45
144
ctc act act gca tca tcc tcc gtc gaa tca gct gcc act gat ttc ggc
Leu Thr Thr Ala Ser Ser Ser Val Glu Ser Ala Ala Thr Asp Phe Gly
50 55 60
192
cac atc acc aaa atc ttt ccc tcc gcc gtc tta aac cct tcc tcc gtc
His Ile Thr Lys Ile Phe Pro Ser Ala Val Leu Asn Pro Ser Ser Val
65 70 75 80
240
caa gac atc acc gat ctt ata aaa ctt tct ttc gat tct caa tct tct Gln Asp Ile Thr Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Ser Ser
85 90 95
288
ttt cct cta gcc gct cgt ggc cac gga cac agc cac cgt ggt caa gcc
Phe Pro Leu Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser His Arg Gly Gln Ala
100 105 110
336
gcg gct aat gac gga gtc gtg gtc aac atg cgg tca atg gta aac agg
Ala Ala Asn Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Arg
115 120 125
384
gac cga ggc atc aag gtg tct agg aca ggt tta tat gct gac gtg gac Asp Arg Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Ala Asp Val Asp
130 135 140
agc gcg tgg cta tgg atc gag gtg ttg aat aaa acg ttg gag tta ggg 480
Ser Ala Trp Leu Trp Ile Glu Val Leu Asn Lys Thr Leu Glu Leu Gly
145 150 155 160
ctg acg ccg gtt tct tgg acg gat tat ttg cat tta acg gtc ggt gga 528
Leu Thr Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu His Leu Thr Val Gly Gly
165 170 175
acg tta tct aac ggc ggt ata agc gga caa act ttt cgg tat ggt cca 576
Thr Leu Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Phe Arg Tyr Gly Pro
180 185 190
cag atc agt aat gtt tta gag atg gat gtt att act g gtacgtacca 623
Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu Met Asp Val Ile Thr 195 200
tgatgatttt ttacatgcat tctaaatata tgaaacagta atgactttta cttcgtacat 683
ttggcaataa aaaaaatatc gtacgttttt cgtcttttct ttaagatctg tgcgctcact 743
ttatgtttat gctcttgttt gtttgtactg tttgtgtctt gttctattta tttctataac 803
ttgttgatag ctgttcttct tttcacacat ttagctaatc acattattga gtagaaaaac 863
acacgagcta tgtgatttta tggttttttc taatttgata atgaattact gttaaaaaat 923
tatattataa gttaataacc aaatgtttga aaatttattt ctataatttc ttacatatta 983
tgacgtttcg ctgaatctac tgcgaatttt acatgatggt aataaatgag atcagattac 1043
gtaactgttc ataaaacccg gtgaccaaac aaacaaaaaa gacaaatgaa aatcaaccaa 1103
aaatggtccc acacttgatt tttcacgagg tttcttgttg gcataaggac acaagtcaca 1163
agtttataaa ttttggtcct aaccaggtgt aatggattta agtaacagtc agttttctta 1223
ttatagctgt atccattatg tccacacatg catccattcc atatacacct ttttgacaac 1283
atatatatat atatatatat atacatacat taatacaact gttgctctca aatgtagtta 1343
gttaacgatg actttctagt tccattgtgt ggttaagaga taagataaat taatgagacc 1403
gacttcaaca ctttaggctc aaaacagcga tagtctaatc tgaaactcgt tgcatttgtt 1463
gaaaaagttt taagagtaac tttctaactt ggtcagtttt gttttacccg gaattttata 1523
g ga aaa gga gag att gca act tgt tcc aaa gac atg aac tca gat ctt 1571
Gly Lys Gly Glu Ile Ala Thr Cys Ser Lys Asp Met Asn Ser Asp Leu
205 210 215 220
ttc tat gcc gcg tta gga ggt tta ggt caa ttc gga att ata acg aga 1619
Phe Tyr Ala Ala Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg
225 230 235
gca aga atc aaa ctc gaa tta gct ccg aaa aat gtatgttata tatgtaaatt 1672 Ala Arg Ile Lys Leu Glu Leu Ala Pro Lys Asn
240 245
atataataat atttatgtta tattagctat ttaaatctat ataaaataat aaataaacat 1732
atctgcaaat tttggaaaat tttcag gct aaa tgg tta agg ttt cta tac act 1785
Ala Lys Trp Leu Arg Phe Leu Tyr Thr
250
255
gat ttc tct gag ttt aca aga gat caa gaa cga ttg ata tca gaa acg 1833
Asp Phe Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Glu Thr
260 265 270
aac ggg cta cat ttc ctg gaa ggt tct gtt atg tta gac cat ggc cca 1881
Asn Gly Leu His Phe Leu Glu Gly Ser Val Met Leu Asp His Gly Pro
275 280 285
cct gat aac tgg cgg tcc act tac tat cca ccg tcc gag cac atg agg 1929
Pro Asp Asn Trp Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Pro Ser Glu His Met Arg
290 295 300
atc gtc tca atg gtc aaa caa cat cgt gtc atc tac tgc ctt gaa gtc 1977
Ile Val Ser Met Val Lys Gln His Arg Val Ile Tyr Cys Leu Glu Val
305 310 315 320
gtc aag tat tac gac gaa act tcc caa cac tca gtc aac gag 2019 Val Lys Tyr Tyr Asp Glu Thr Ser Gln His Ser Val Asn Glu 325 330
gtccgtacac attatacata attgtacaag tatagtcacg atctttactc ataacgaagc 2079 cactcttcca taattataat tttattgatt gatcaatcat ttaaacaatg cag gaa 2135
Glu 335
atg gag gag tta agc gac agt tta aac tat gaa cga ggg ttt gtg tac 2183
Met Glu Glu Leu Ser Asp Ser Leu Asn Tyr Glu Arg Gly Phe Val Tyr
340 345 350
gag aaa gat gtg acg tat atg gat ttc tta aac cgg gtt cga acc gga 2231
Glu Lys Asp Val Thr Tyr Met Asp Phe Leu Asn Arg Val Arg Thr Gly
355 360 365
gag cta aaa ctg aaa tcc aaa ggc cag tgg gat gtt cca cat cca tgg 2279 Glu Leu Lys Leu Lys Ser Lys Gly Gln Trp Asp Val Pro His Pro Trp
370 375 380
ctt aat ctt ttc gta cca aaa tct cag att tca aga ttc gag tat ggc 2327
Leu Asn Leu Phe Val Pro Lys Ser Gln Ile Ser Arg Phe Glu Tyr Gly
385 390 395
gtt ttt aag ggt att atc ctt aga aat aac atc act act ggt ccc ctt 2375
Val Phe Lys Gly Ile Ile Leu Arg Asn Asn Ile Thr Thr Gly Pro Leu
400 405 410 415
ctt gtt tat ccc atg aac cgc aac aa gtaagttatg atcaatatag 2421 Leu Val Tyr Pro Met Asn Arg Asn Lys
420
ccacattatc tacagtttca aaattttcaa aatgcgaaat acttaaatct cgaggtttta 2481
attcag g tgg aat gat cga atg tcg acc gtt tta cct gag gaa gac gta 2530
Trp Asn Asp Arg Met Ser Thr Val Leu Pro Glu Glu Asp Val
425 430 435
ttt tat gct gtc ggg ttt tta cga tcg gcg agt ttt gac aat tgg gat 2578
Phe Tyr Ala Val Gly Phe Leu Arg Ser Ala Ser Phe Asp Asn Trp Asp
440 445 450
gat tat gaa aaa gaa aac atg gaa gta tta aag ttt tgc gag gat gct Asp Tyr Glu Lys Glu Asn Met Glu Val Leu Lys Phe Cys Glu Asp Ala
2626
455
460
465
470
aat atg agg gtc ata caa tat ctt cct tac tat gca tca caa gaa gga 2674
Asn Met Arg Val Ile Gln Tyr Leu Pro Tyr Tyr Ala Ser Gln Glu Gly
475 480 485
tgg gtt gga cat ttt ggt acg agg tgg aat att ttt ctc gaa aga aaa 2722
Trp Val Gly His Phe Gly Thr Arg Trp Asn Ile Phe Leu Glu Arg Lys
490 495 500
tat aga tat gat cct aga atg ata ttg tcc cct gga caa aat ata ttt 2770
Tyr Arg Tyr Asp Pro Arg Met Ile Leu Ser Pro Gly Gln Asn Ile Phe
505 510 515
cca taa 2776 Pro
<210> 14
<211> 1560
<212> ДНК
<213> Brassica napus
вариация
/ О П fZ \ 1С
<220> <221>
<222> (876)..(876)
<223> замещение G на A в YIIN521
<400> 14
atggtgagct ataattttcc atcacaaatt catcttctaa tgataacgat attagtaatc 60
atcacaactc ttttcactcc gatcacaacc aacacatcat cactaccatg gaatatcctt 120
tccaatgaca acttcgcccg aaaactcact actgcatcat cctccgtcga atcagctgcc 180
actgatttcg gccacatcac caaaatcttt ccctccgccg tcttaaaccc ttcctccgtc 240
caagacatca ccgatcttat aaaactttct ttcgattctc aatcttcttt tcctctagcc 300
gctcgtggcc acggacacag ccaccgtggt caagccgcgg ctaatgacgg agtcgtggtc 360
aacatgcggt caatggtaaa cagggaccga ggcatcaagg tgtctaggac aggtttatat 420
gctgacgtgg acagcgcgtg gctatggatc gaggtgttga ataaaacgtt ggagttaggg 480
ctgacgccgg tttcttggac ggattatttg catttaacgg tcggtggaac gttatctaac 540
ggcggtataa gcggacaaac ttttcggtat ggtccacaga tcagtaatgt tttagagatg 600
gatgttatta ctggaaaagg agagattgca acttgttcca aagacatgaa ctcagatctt 660
ttctatgccg cgttaggagg tttaggtcaa ttcggaatta taacgagagc aagaatcaaa 720
ctcgaattag ctccgaaaaa tgctaaatgg ttaaggtttc tatacactga tttctctgag 780
tttacaagag atcaagaacg attgatatca gaaacgaacg ggctacattt cctggaaggt 840
tctgttatgt tagaccatgg cccacctgat aactggcggt ccacttacta tccaccgtcc 900
gagcacatga ggatcgtctc aatggtcaaa caacatcgtg tcatctactg ccttgaagtc 960
gtcaagtatt acgacgaaac ttcccaacac tcagtcaacg aggaaatgga ggagttaagc 1020
gacagtttaa actatgaacg agggtttgtg tacgagaaag atgtgacgta tatggatttc 1080
ttaaaccggg ttcgaaccgg agagctaaaa ctgaaatcca aaggccagtg ggatgttcca 1140
catccatggc ttaatctttt cgtaccaaaa tctcagattt caagattcga gtatggcgtt 1200
tttaagggta ttatccttag aaataacatc actactggtc cccttcttgt ttatcccatg 1260
aaccgcaaca agtggaatga tcgaatgtcg accgttttac ctgaggaaga cgtattttat 1320
gctgtcgggt ttttacgatc ggcgagtttt gacaattggg atgattatga aaaagaaaac 1380
atggaagtat taaagttttg cgaggatgct aatatgaggg tcatacaata tcttccttac 1440
tatgcatcac aagaaggatg ggttggacat tttggtacga ggtggaatat ttttctcgaa 1500
agaaaatata gatatgatcc tagaatgata ttgtcccctg gacaaaatat atttccataa 1560
<210> 15
<211> 519
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 15
Met Val Ser Tyr Asn Phe Pro Ser Gln Ile His Leu Leu Met Ile Thr
1 5 10 15
Ile Leu Val Ile Ile Thr Thr Leu Phe Thr Pro Ile Thr Thr Asn Thr
20 25 30
Ser Ser Leu Pro Trp Asn Ile Leu Ser Asn Asp Asn Phe Ala Arg Lys
35 40 45
Leu Thr Thr Ala Ser Ser Ser Val Glu Ser Ala Ala Thr Asp Phe Gly
50 55 60
His Ile Thr Lys Ile Phe Pro Ser Ala Val Leu Asn Pro Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Asp Ile Thr Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Ser Ser
85 90 95
Phe Pro Leu Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser His Arg Gly Gln Ala
100 105 110
Ala Ala Asn Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Arg
115 120 125
Asp Arg Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Ala Asp Val Asp
130 135 140
Ser Ala Trp Leu Trp Ile Glu Val Leu Asn Lys Thr Leu Glu Leu Gly
145
150
155
160
Leu Thr Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu His Leu Thr Val Gly Gly
165 170 175
Thr Leu Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Phe Arg Tyr Gly Pro
180 185 190
Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu Met Asp Val Ile Thr Gly Lys Gly Glu
195 200 205
Ile Ala Thr Cys Ser Lys Asp Met Asn Ser Asp Leu Phe Tyr Ala Ala
210 215 220
Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Lys
225 230 235 240
Leu Glu Leu Ala Pro Lys Asn Ala Lys Trp Leu Arg Phe Leu Tyr Thr
245 250 255
Asp Phe Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Glu Thr
260 265 270
Asn Gly Leu His Phe Leu Glu Gly Ser Val Met Leu Asp His Gly Pro
275 280 285
Pro Asp Asn Trp Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Pro Ser Glu His Met Arg
290 295 300
Ile Val Ser Met Val Lys Gln His Arg Val Ile Tyr Cys Leu Glu Val
305 310 315 320
Val Lys Tyr Tyr Asp Glu Thr Ser Gln His Ser Val Asn Glu Glu Met
325 330 335
Glu Glu Leu Ser Asp Ser Leu Asn Tyr Glu Arg Gly Phe Val Tyr Glu
340 345 350
Lys Asp Val Thr Tyr Met Asp Phe Leu Asn Arg Val Arg Thr Gly Glu
355 360 365
Leu Lys Leu Lys Ser Lys Gly Gln Trp Asp Val Pro His Pro Trp Leu
370 375 380
Asn Leu Phe Val Pro Lys Ser Gln Ile Ser Arg Phe Glu Tyr Gly Val
385 390 395 400
Phe Lys Gly Ile Ile Leu Arg Asn Asn Ile Thr Thr Gly Pro Leu Leu
405
410
415
Val Tyr Pro Met Asn Arg Asn Lys Trp Asn Asp Arg Met Ser Thr Val
420 425 430
Leu Pro Glu Glu Asp Val Phe Tyr Ala Val Gly Phe Leu Arg Ser Ala
435 440 445
Ser Phe Asp Asn Trp Asp Asp Tyr Glu Lys Glu Asn Met Glu Val Leu
450 455 460
Lys Phe Cys Glu Asp Ala Asn Met Arg Val Ile Gln Tyr Leu Pro Tyr
465 470 475 480
Tyr Ala Ser Gln Glu Gly Trp Val Gly His Phe Gly Thr Arg Trp Asn
485 490 495
Ile Phe Leu Glu Arg Lys Tyr Arg Tyr Asp Pro Arg Met Ile Leu Ser
500 505 510
Pro Gly Gln Asn Ile Phe Pro 515
<210> 16
<211> 2964
<212> ДНК
<213> Brassica napus
экзон
(1)..(610)
<220> <221> <222>
<223> экзон1
экзон
(1699)..(1826)
<220> <221> <222>
<223> экзон2
экзон
(1928)..(2188)
<220> <221> <222>
<223> экзон3
<220> <221> <222> <223>
вариация
(2171)..(2171)
замещение C на T в YIIN531
экзон
(2283)..(2551)
<220> <221> <222>
<223> экзон4
<220> <221> экзон
<222> (2676)..(2964) <223> экзон5
<400> 16
atg gca agt aat aat ttt cca tca caa agt cat ctt cta gta ata ata 48
Met Ala Ser Asn Asn Phe Pro Ser Gln Ser His Leu Leu Val Ile Ile
1 5 10 15
ata ttt atc aca act ctt tta act ccg atc aca acc aac aac aca tca 96
Ile Phe Ile Thr Thr Leu Leu Thr Pro Ile Thr Thr Asn Asn Thr Ser
20 25 30
cca caa cca tgg aat atc ctt tcc aac gac aac ttc gcc gga aaa ctg 144 Pro Gln Pro Trp Asn Ile Leu Ser Asn Asp Asn Phe Ala Gly Lys Leu
35 40 45
acc tcc gca tcc tcc tcc gtc gaa gca gct gcc atc gat ttc ggc cac 192
Thr Ser Ala Ser Ser Ser Val Glu Ala Ala Ala Ile Asp Phe Gly His
50 55 60
gtc acc aaa att cta ccc tca gcc gtc tta aac cct tcc tcc gtc caa 240
Val Thr Lys Ile Leu Pro Ser Ala Val Leu Asn Pro Ser Ser Val Gln
65 70 75 80
gac atc atc gat ctc ata aaa ctt tct ttc gac tct caa tcc tct ttc 288 Asp Ile Ile Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Ser Ser Phe
85 90 95
cct ata gcc gct cgt ggc cac gga cac agc ttc cgt ggc caa gcc gct 336
Pro Ile Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser Phe Arg Gly Gln Ala Ala
100 105 110
gct aaa gac gga gtc gtg gtc aac atg cgg tca atg gta aac gag gac 384
Ala Lys Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Glu Asp
115 120 125
cga ggc ata aag gtg tct agg acc ggt tta tat gcg gat gtg gac act 432
Arg Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Ala Asp Val Asp Thr
130 135 140
gca tgg cta tgg att gag gtg ttg aat aaa acg ttg gag ttg ggg tta 480
Ala Trp Leu Trp Ile Glu Val Leu Asn Lys Thr Leu Glu Leu Gly Leu
145 150 155 160
acg cct gtt tct tgg acg gac tat ttg tat tta acg atc ggt gga acg 528
Thr Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Ile Gly Gly Thr
165 170 175
tta tcc aac ggc gga ata agc gga caa acg tct cgg tac ggt cca cag 576
Leu Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Ser Arg Tyr Gly Pro Gln
180 185 190
atc agt aat gtt cta gag ctg gat gtt att act g gtacgtacca 620 Ile Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Ile Thr 195 200
tgcttttaca tatattccaa atctatgcaa tatttacttc gtacgtttga cgacaaaaat 680 aaaatacaat aaaatcgtac gttttttaga tctgcgtggt cacttgtgtt tatgctcttg 740 ttttgtttat attgtttgtg tcttttgtac atatttctcg aactagcttt tcttgttttc 800
acacatctag ctaatcacat tatttttgtg tctaagagta gaaagaaaca cgggctatgt
860
ataaaatagg tggttgttag aaaagatttt tctttgttgt acgtagtgat agaagattta 920
gcattattgc tgtttttgca acaaaaattt caaattaaaa ttcgtgaaag atacgtgtaa 980
ttataatata ttgtctctac ttgaaagtgt tgcacaaaaa aagtgtctac ttgaaagttg 1040
aaacagaaca attttttttt gattttatgt ttttattacg attttgtact aacgctatat 1100
ataacaagtt caattactaa ctaaatagtt tttcaaattt tgaattttat aatttcttac 1160
atattatgga tgtttcgtcg aatctaagtt tgatctccgc gaaatttaca taatggtcac 1220
gccgcgcacg ttaatgttat gtaattgttc atataaaccg gtgacaaaca aatattcaac 1280
caaaaatggt cccacgcgta tgttttttca cgaggtttct tgtggcatag agacaaaact 1340
caaaagctta taacgtttgg tcataaccag gtgtaaattt tcttattaca gctaatagtt 1400
gtaccactat gtccacatat gcatccatat ataattccat atacaaacac tgttggtctc 1460
aagtttagtt cgtttacgaa gactttctag ttccaaagtt tggttaggag ataagatata 1520
ttaatgggac cgactttaac attttaggct taaaacaacg atagttttat ttgaaactcg 1580
ttgcatcttt tctataaact atgatattct ttgtatagtc ttacggtcca aatatgttga 1640
aatagtttaa gactgaactt tctaattggg tcagttattt ttccccggaa ctttatag 1698
ga aaa ggg gag att gca act tgt tcc aac gac acg aac tca gat ctt 1745
Gly Lys Gly Glu Ile Ala Thr Cys Ser Asn Asp Thr Asn Ser Asp Leu
205 210 215
ttc tac gcg gcg tta gga ggt ttg ggt caa ttc gga att ata aca aga 1793
Phe Tyr Ala Ala Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg
220 225 230 235
gcc agg att aaa ctc gaa tta gct cca aaa agg gtatgttaaa tatgtaaatt 1846 Ala Arg Ile Lys Leu Glu Leu Ala Pro Lys Arg
240 245
attcaatata tattttatac aagtaagaat atttaccgaa atttttgatt aaatatatct 1906
cttttgttgg aaacttttca g gct aaa tgg tta agg ttt cta tac act gat 1957
Ala Lys Trp Leu Arg Phe Leu Tyr Thr Asp
250 255
ttc tct gaa ttc aca aga gat caa gaa cga ttg ata tca gaa acg gac 2005
Phe Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Glu Thr Asp
260 265 270
ggt tta cat ttc ttg gaa ggt tcc gtt atg ctt gac cat ggc cca cct 2053
Gly Leu His Phe Leu Glu Gly Ser Val Met Leu Asp His Gly Pro Pro
275 280 285
gat aac tgg aga tct act tac tat cca ccg tcc gat cac ttg agg atc 2101 Asp Asn Trp Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Pro Ser Asp His Leu Arg Ile
290 295 300
gtc tca atg atc aaa cga tac cgt gtc atc tac tgt ctc gaa gtc gcc 2149
Val Ser Met Ile Lys Arg Tyr Arg Val Ile Tyr Cys Leu Glu Val Ala
305 310 315 320
aag tat tac gac gaa act tct caa cac tca gtc aac gag gtccgtacac
Lys Tyr Tyr Asp Glu Thr Ser Gln His Ser Val Asn Glu
2198
325
330
atatacacga tctctactca taattaaaca actctatctt atattatatg tttcttaatt 2258
ttctcaatta tttaaactat gcag gaa att gag aag tta agc gag agt ttg 2309
Glu Ile Glu Lys Leu Ser Glu Ser Leu
335 340
aac tat gta aga ggg ttt gtg tac gag aaa gat gtg acg tat ata gat 2357
Asn Tyr Val Arg Gly Phe Val Tyr Glu Lys Asp Val Thr Tyr Ile Asp
345 350 355
ttc ttg aac cgg gtt cga acg gga gag cta aac ctg aaa tcc aaa ggc 2405 Phe Leu Asn Arg Val Arg Thr Gly Glu Leu Asn Leu Lys Ser Lys Gly
360 365 370
caa tgg gat gtt cca cat cca tgg ctt aat ctc ttt gta cca aaa tct 2453 Gln Trp Asp Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Phe Val Pro Lys Ser
375 380 385 390
cag att tca aga ttt gat tat ggt gtc ttt aag ggt att atc ctt aga 2501
Gln Ile Ser Arg Phe Asp Tyr Gly Val Phe Lys Gly Ile Ile Leu Arg
395 400 405
aat aac atc act acc ggt cca ctt ctt gtt tat ccc atg aag cgc att 2549
Asn Asn Ile Thr Thr Gly Pro Leu Leu Val Tyr Pro Met Lys Arg Ile
410 415 420
at gtaagttaaa actatagagc gatcatccat tcaatttttt ttattaaagt 2601
Met
tcttactaaa tgtttatggc ctccaaaatt tcagctttgt gtttaaataa ctgactttta 2661
aggttttgct tcag g tgg aat gat caa atg tct acc gct ata ccc gaa gaa 2712
Trp Asn Asp Gln Met Ser Thr Ala Ile Pro Glu Glu
425 430 435
gat gta ttt tat gcg gta ggg ttc tta cga tct gcc gag ttt gac aat 2760
Asp Val Phe Tyr Ala Val Gly Phe Leu Arg Ser Ala Glu Phe Asp Asn
440 445 450
tgg gag gct tat gat aaa gaa aat atg gag gta tta aag ttt tgt gag 2808
Trp Glu Ala Tyr Asp Lys Glu Asn Met Glu Val Leu Lys Phe Cys Glu
455 460 465
gat gct aaa atg gat gtc ata cag tat ctt cct tat cat gca tca caa 2856
Asp Ala Lys Met Asp Val Ile Gln Tyr Leu Pro Tyr His Ala Ser Gln
470 475 480
gaa gga tgg gtt aga cat ttt ggt ccg atg tgg aat act ttt gta gag 2904
Glu Gly Trp Val Arg His Phe Gly Pro Met Trp Asn Thr Phe Val Glu
485 490 495
aga aaa tat aga tac gat cct aaa atg ata ttg tct cca gga caa aat 2952
Arg Lys Tyr Arg Tyr Asp Pro Lys Met Ile Leu Ser Pro Gly Gln Asn
500 505 510 515
ata ttt cga taa 2964 Ile Phe Arg
<210> 17
<211> 1557 <212> ДНК
<213> Brassica napus
<220>
<221> вариация
<222> (982)..(982)
<223> замещение C на T в YIIN531
<400> 17
atggcaagta ataattttcc atcacaaagt catcttctag taataataat atttatcaca 60
actcttttaa ctccgatcac aaccaacaac acatcaccac aaccatggaa tatcctttcc 120
aacgacaact tcgccggaaa actgacctcc gcatcctcct ccgtcgaagc agctgccatc 180
gatttcggcc acgtcaccaa aattctaccc tcagccgtct taaacccttc ctccgtccaa 240
gacatcatcg atctcataaa actttctttc gactctcaat cctctttccc tatagccgct 300
cgtggccacg gacacagctt ccgtggccaa gccgctgcta aagacggagt cgtggtcaac 360
atgcggtcaa tggtaaacga ggaccgaggc ataaaggtgt ctaggaccgg tttatatgcg 420
gatgtggaca ctgcatggct atggattgag gtgttgaata aaacgttgga gttggggtta 480
acgcctgttt cttggacgga ctatttgtat ttaacgatcg gtggaacgtt atccaacggc 540
ggaataagcg gacaaacgtc tcggtacggt ccacagatca gtaatgttct agagctggat 600
gttattactg gaaaagggga gattgcaact tgttccaacg acacgaactc agatcttttc 660
tacgcggcgt taggaggttt gggtcaattc ggaattataa caagagccag gattaaactc 720
gaattagctc caaaaagggc taaatggtta aggtttctat acactgattt ctctgaattc 780
acaagagatc aagaacgatt gatatcagaa acggacggtt tacatttctt ggaaggttcc 840
gttatgcttg accatggccc acctgataac tggagatcta cttactatcc accgtccgat 900
cacttgagga tcgtctcaat gatcaaacga taccgtgtca tctactgtct cgaagtcgcc 960
aagtattacg acgaaacttc tcaacactca gtcaacgagg aaattgagaa gttaagcgag 1020
agtttgaact atgtaagagg gtttgtgtac gagaaagatg tgacgtatat agatttcttg 1080
aaccgggttc gaacgggaga gctaaacctg aaatccaaag gccaatggga tgttccacat 1140
ccatggctta atctctttgt accaaaatct cagatttcaa gatttgatta tggtgtcttt 1200
aagggtatta tccttagaaa taacatcact accggtccac ttcttgttta tcccatgaag 1260
cgcattatgt ggaatgatca aatgtctacc gctatacccg aagaagatgt attttatgcg 1320
gtagggttct tacgatctgc cgagtttgac aattgggagg cttatgataa agaaaatatg 1380
gaggtattaa agttttgtga ggatgctaaa atggatgtca tacagtatct tccttatcat 1440
gcatcacaag aaggatgggt tagacatttt ggtccgatgt ggaatacttt tgtagagaga 1500
aaatatagat acgatcctaa aatgatattg tctccaggac aaaatatatt tcgataa 1557
<210> 18
<211> 518
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 18
Met Ala Ser Asn Asn Phe Pro Ser Gln Ser His Leu Leu Val Ile Ile
1 5 10 15
Ile Phe Ile Thr Thr Leu Leu Thr Pro Ile Thr Thr Asn Asn Thr Ser
20 25 30
Pro Gln Pro Trp Asn Ile Leu Ser Asn Asp Asn Phe Ala Gly Lys Leu
35 40 45
Thr Ser Ala Ser Ser Ser Val Glu Ala Ala Ala Ile Asp Phe Gly His
50 55 60
Val Thr Lys Ile Leu Pro Ser Ala Val Leu Asn Pro Ser Ser Val Gln
65 70 75 80
Asp Ile Ile Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Ser Ser Phe
85 90 95
Pro Ile Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser Phe Arg Gly Gln Ala Ala
100 105 110
Ala Lys Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Glu Asp
115 120 125
Arg Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Ala Asp Val Asp Thr
130 135 140
Ala Trp Leu Trp Ile Glu Val Leu Asn Lys Thr Leu Glu Leu Gly Leu
145 150 155 160
Thr Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Ile Gly Gly Thr
165 170 175
Leu Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Ser Arg Tyr Gly Pro Gln
180 185 190
Ile Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Ile Thr Gly Lys Gly Glu Ile
195 200 205
Ala Thr Cys Ser Asn Asp Thr Asn Ser Asp Leu Phe Tyr Ala Ala Leu
210 215 220
Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Lys Leu
225
230
235
240
Glu Leu Ala Pro Lys Arg Ala Lys Trp Leu Arg Phe Leu Tyr Thr Asp
245 250 255
Phe Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Glu Thr Asp
260 265 270
Gly Leu His Phe Leu Glu Gly Ser Val Met Leu Asp His Gly Pro Pro
275 280 285
Asp Asn Trp Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Pro Ser Asp His Leu Arg Ile
290 295 300
Val Ser Met Ile Lys Arg Tyr Arg Val Ile Tyr Cys Leu Glu Val Ala
305 310 315 320
Lys Tyr Tyr Asp Glu Thr Ser Gln His Ser Val Asn Glu Glu Ile Glu
325 330 335
Lys Leu Ser Glu Ser Leu Asn Tyr Val Arg Gly Phe Val Tyr Glu Lys
340 345 350
Asp Val Thr Tyr Ile Asp Phe Leu Asn Arg Val Arg Thr Gly Glu Leu
355 360 365
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Gln Trp Asp Val Pro His Pro Trp Leu Asn
370 375 380
Leu Phe Val Pro Lys Ser Gln Ile Ser Arg Phe Asp Tyr Gly Val Phe
385 390 395 400
Lys Gly Ile Ile Leu Arg Asn Asn Ile Thr Thr Gly Pro Leu Leu Val
405 410 415
Tyr Pro Met Lys Arg Ile Met Trp Asn Asp Gln Met Ser Thr Ala Ile
420 425 430
Pro Glu Glu Asp Val Phe Tyr Ala Val Gly Phe Leu Arg Ser Ala Glu
435 440 445
Phe Asp Asn Trp Glu Ala Tyr Asp Lys Glu Asn Met Glu Val Leu Lys
450 455 460
Phe Cys Glu Asp Ala Lys Met Asp Val Ile Gln Tyr Leu Pro Tyr His
465 470 475 480
Ala Ser Gln Glu Gly Trp Val Arg His Phe Gly Pro Met Trp Asn Thr
485
490
495
Phe Val Glu Arg Lys Tyr Arg Tyr Asp Pro Lys Met Ile Leu Ser Pro
500 505 510
Gly Gln Asn Ile Phe Arg 515
<210> <211> <212> <213>
2863
ДНК
Brassica napus
экзон
(1)..(580)
<220> <221> <222>
<223> экзон1
вариация
(399)..(399)
<220> <221> <222>
<223> замещение G на A в YIIN805
вариация
(465)..(465)
<220> <221> <222>
<223> замещение G на A в YIIN801
экзон
(665)..(792)
<220> <221> <222>
<223> экзон2
экзон
(952)..(1218)
<220> <221> <222>
<223> экзон3
экзон
(1799)..(2061)
<220> <221> <222>
<223> экзон4
экзон
(2506)..(2863)
<220> <221> <222>
<223> экзон5
<400> 19
atg acg tca agc ttt ctt ctc atg aca ttc gcg att tgt aca ctg atc
Met Thr Ser Ser Phe Leu Leu Met Thr Phe Ala Ile Cys Thr Leu Ile
1 5 10 15
ata gcc gtt ggt ccc agc gag ctc ctc cgc atc gga gcc ata gac gtc
Ile Ala Val Gly Pro Ser Glu Leu Leu Arg Ile Gly Ala Ile Asp Val
20 25 30
gac ggc cac ttc acc ttc aag cct tcc gac tta gcc tcc gtc tcg tcg
Asp Gly His Phe Thr Phe Lys Pro Ser Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser
35 40 45
gac ttc ggt atg cta aag tcg ccg gag gag cca tta gcc gta ctt cat 192 Asp Phe Gly Met Leu Lys Ser Pro Glu Glu Pro Leu Ala Val Leu His
50 55 60
cca tcc tca gct gaa gac gtg gca cgg ctc atc aga aca gct tac ggc 240
Pro Ser Ser Ala Glu Asp Val Ala Arg Leu Ile Arg Thr Ala Tyr Gly
65 70 75 80
tca gcc acg gcc ttt ccg gtc tca gcc cgt ggc cac ggc cat tcc ata 288
Ser Ala Thr Ala Phe Pro Val Ser Ala Arg Gly His Gly His Ser Ile
85 90 95
aac gga cag gct tcg aca ggg agg aac ggt gtg gtg gtg gag atg agc 336
Asn Gly Gln Ala Ser Thr Gly Arg Asn Gly Val Val Val Glu Met Ser
100 105 110
cac cgc aac ata ggg acg ccg gag cca cta gtt gaa ccc gag gaa atg 384
His Arg Asn Ile Gly Thr Pro Glu Pro Leu Val Glu Pro Glu Glu Met
115 120 125
tat gtg gac gtt tgg ggt gga gag tta tgg gtt gat gtg ttg aaa aaa 432
Tyr Val Asp Val Trp Gly Gly Glu Leu Trp Val Asp Val Leu Lys Lys
130 135 140
acg ttg gag cat ggc tta gca cca aag tca tgg act gat tac ttg tat 480
Thr Leu Glu His Gly Leu Ala Pro Lys Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr
145 150 155 160
ctt tcc gtt ggt ggt aca ctc tct aat gca gga att agt ggt caa gct 528
Leu Ser Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala
165 170 175
ttt cac cat ggt cct caa att agt aac gtc ctt gag cta gac gtt gta 576
Phe His His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Val
180 185 190
act g gttagtataa aacgttcaag ttcatatatt tggttcttga attgattttc 630 Thr
aatatttata acaaacaaat tgaatcaaaa acag gg aga gga gag gtg atg aga 684
Gly Arg Gly Glu Val Met Arg 195 200
tgt tca gaa gaa gag aac aca agg tta ttc cat gga gtt ctt ggt ggg 732
Cys Ser Glu Glu Glu Asn Thr Arg Leu Phe His Gly Val Leu Gly Gly
205 210 215
tta ggt caa ttt ggg atc att aca cga gca cga atc tct ctc gaa cct 780
Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Ser Leu Glu Pro
220 225 230
gct ccc caa agg gtaaatgttt ttaaattttg attctatgtt gtcaagaaat 832 Ala Pro Gln Arg 235
aaaaactgcc aggcgggtcc atgagttaca ttaacatttt cactgttgtg gtgacatatt 892 ttgttttata aatttattaa atttagttaa tgaaacccta aataataatc gtctgacag 951
gta aga tgg ata aga gtg ttg tat tcg agc ttc gaa gtg ttt aca gag
Val Arg Trp Ile Arg Val Leu Tyr Ser Ser Phe Glu Val Phe Thr Glu
240 245 250
gac caa gaa tac tta ata tct atg cat ggt caa tca aag ttt gat tac 1047
Asp Gln Glu Tyr Leu Ile Ser Met His Gly Gln Ser Lys Phe Asp Tyr
255 260 265
gtg gaa ggg ttt gtg atc gtg gac gaa ggt ctc gtc aac aac tgg aga 1095
Val Glu Gly Phe Val Ile Val Asp Glu Gly Leu Val Asn Asn Trp Arg
270 275 280
tca tct ttc ttc tct cct cgt aac ccc gtt aaa att tct tcc gtt agc 1143
Ser Ser Phe Phe Ser Pro Arg Asn Pro Val Lys Ile Ser Ser Val Ser
285 290 295 300
tct aac ggc tcc gtt ctg tat tgc ctt gag atc acc aag aac tac cgc 1191
Ser Asn Gly Ser Val Leu Tyr Cys Leu Glu Ile Thr Lys Asn Tyr Arg
305 310 315
gag tcc gag tcc gac acc gtc gat cag gtaaaattta attaagaagt 1238
Glu Ser Glu Ser Asp Thr Val Asp Gln 320 325
tctcaatttt ttttctcaat tagataaaga gatattattc tttttataat gatgaatatc 1298
tggaacgatt taacgctatg cgattattga ggaaatcatg attaaaaaaa ttggttttct 1358
tttagtttat atgattgaaa gtggtctccc tagtattttt gttgtgtcgg ctttataata 1418
taattaaatt gtttattata atttaaatta ggaagaagac atgaaaaaga agccagagag 1478
gatctacaga gatctagctt ttccacctga actattatgt ttagtttatc actagcgaat 1538
taatcatggt tactaataaa gtagtggacg gggtcatgga ccactcacca aataatgatt 1598
cccctttact ctaattaagt tttaataaaa ccaactctac tggaatctta acttatcctt 1658
ggttttgata gactttaata gcaaaacagt tttttaattt tctcctttaa ctttaatttt 1718
tttttttttt gaaaaatcct ttaactttaa ttttcctagt ctggtttaaa taaattaaaa 1778
gtgggttttg tttgctccag gaa gta gag att ttg atg aag aaa tta aat ttt 1831
Glu Val Glu Ile Leu Met Lys Lys Leu Asn Phe 330 335
ata ccg aca tcg gta ttc acg acg gat ttg caa tat gtg gat ttc ttg 1879
Ile Pro Thr Ser Val Phe Thr Thr Asp Leu Gln Tyr Val Asp Phe Leu
340 345 350
gac cgg gtt cac aag gcg gag ctg aag ctc cgg tcg aag aat tta tgg 1927 Asp Arg Val His Lys Ala Glu Leu Lys Leu Arg Ser Lys Asn Leu Trp
355 360 365
gag gtt cca cac cca tgg ctc aac cta ttc gta cca aaa tcg aga atc 1975 Glu Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Phe Val Pro Lys Ser Arg Ile
370 375 380
tct gat ttt gac aaa ggc gtt ttc aag ggc att tta ggg aat aaa act 2023
Ser Asp Phe Asp Lys Gly Val Phe Lys Gly Ile Leu Gly Asn Lys Thr
385 390 395 400
agt ggc cct atc ctt atc tac cca atg aac aaa gac aa gtaagtctcg 2071 Ser Gly Pro Ile Leu Ile Tyr Pro Met Asn Lys Asp Lys
405 410
atcgatatta ccagcgttta cttagaaatt tcttttcaga aacaaaagaa taaaacgagt
2131
tttgcatgca tgcaaagtta cacttgtggg gattaaatta gtggtccaag aaaataaatg
2191
ttttgtcgaa actgtaaaga actactgaca cgtggtacat gggattgtcc gaaaaacttt 2251
gttcacatgt gcatcgaatc gaaccagcta agattgataa taacgcatca tcgtcggctc 2311
atctttctct tttggttcgt tgtccaatct ggacggtcca gattgggtct attgtttttt 2371
agttcctata actaatggtg gtgggtccca atcggattct actaaaccaa accgatctca 2431
acgaccctcc ctcacatcat ttattaacta taagattatg tcgtgctgac gtgacgtact 2491
ttttgtaatg ccag a tgg gac gaa aga agc tcg gcc gtt aca ccg gac gag 2542
Trp Asp Glu Arg Ser Ser Ala Val Thr Pro Asp Glu
415 420 425
gaa gtt ttc tac ctc gtg gct tta ctg aga tca gct tta tcg gac ggt 2590
Glu Val Phe Tyr Leu Val Ala Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ser Asp Gly
430 435 440
gag gaa acg cag aag cta gag tat ttg aaa gat cag aac cgt cgg atc 2638
Glu Glu Thr Gln Lys Leu Glu Tyr Leu Lys Asp Gln Asn Arg Arg Ile
445 450 455
ttg gag ttc tgt gaa caa gcc aag atc aat gtg aag cag tac ctt cct 2686
Leu Glu Phe Cys Glu Gln Ala Lys Ile Asn Val Lys Gln Tyr Leu Pro
460 465 470
cac cat gca acg caa gag gag tgg gtg gct cat tat gga gac aaa tgg 2734
His His Ala Thr Gln Glu Glu Trp Val Ala His Tyr Gly Asp Lys Trp
475 480 485
gat cag ttt aga agc atg aag gct gag ttc gat cca cgg cat ata ctc 2782
Asp Gln Phe Arg Ser Met Lys Ala Glu Phe Asp Pro Arg His Ile Leu
490 495 500 505
gct acc ggt cag aaa atc ttt cag aac cca tct ctg gct ttg ttt cgt 2830
Ala Thr Gly Gln Lys Ile Phe Gln Asn Pro Ser Leu Ala Leu Phe Arg
510 515 520
cca tcg tcg tct tcg tcg tca gct tca tgg taa 2863 Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Trp 525 530
<210> 20
<211> 1596
<212> ДНК
<213> Brassica napus
<220> <221> <222> <223>
вариация (399)..(399)
замещение G на A в YIIN805
<220> <221> <222> <223>
вариация
(465)..(465)
замещение G на A в YIIN801
<400> 20
atgacgtcaa gctttcttct catgacattc gcgatttgta cactgatcat agccgttggt
cccagcgagc tcctccgcat cggagccata gacgtcgacg gccacttcac cttcaagcct 120
tccgacttag cctccgtctc gtcggacttc ggtatgctaa agtcgccgga ggagccatta 180
gccgtacttc atccatcctc agctgaagac gtggcacggc tcatcagaac agcttacggc 240
tcagccacgg cctttccggt ctcagcccgt ggccacggcc attccataaa cggacaggct 300
tcgacaggga ggaacggtgt ggtggtggag atgagccacc gcaacatagg gacgccggag 360
ccactagttg aacccgagga aatgtatgtg gacgtttggg gtggagagtt atgggttgat 420
gtgttgaaaa aaacgttgga gcatggctta gcaccaaagt catggactga ttacttgtat 480
ctttccgttg gtggtacact ctctaatgca ggaattagtg gtcaagcttt tcaccatggt 540
cctcaaatta gtaacgtcct tgagctagac gttgtaactg ggagaggaga ggtgatgaga 600
tgttcagaag aagagaacac aaggttattc catggagttc ttggtgggtt aggtcaattt 660
gggatcatta cacgagcacg aatctctctc gaacctgctc cccaaagggt aagatggata 720
agagtgttgt attcgagctt cgaagtgttt acagaggacc aagaatactt aatatctatg 780
catggtcaat caaagtttga ttacgtggaa gggtttgtga tcgtggacga aggtctcgtc 840
aacaactgga gatcatcttt cttctctcct cgtaaccccg ttaaaatttc ttccgttagc 900
tctaacggct ccgttctgta ttgccttgag atcaccaaga actaccgcga gtccgagtcc 960
gacaccgtcg atcaggaagt agagattttg atgaagaaat taaattttat accgacatcg 1020
gtattcacga cggatttgca atatgtggat ttcttggacc gggttcacaa ggcggagctg 1080
aagctccggt cgaagaattt atgggaggtt ccacacccat ggctcaacct attcgtacca 1140
aaatcgagaa tctctgattt tgacaaaggc gttttcaagg gcattttagg gaataaaact 1200
agtggcccta tccttatcta cccaatgaac aaagacaaat gggacgaaag aagctcggcc 1260
gttacaccgg acgaggaagt tttctacctc gtggctttac tgagatcagc tttatcggac 1320
ggtgaggaaa cgcagaagct agagtatttg aaagatcaga accgtcggat cttggagttc 1380
tgtgaacaag ccaagatcaa tgtgaagcag taccttcctc accatgcaac gcaagaggag 1440
tgggtggctc attatggaga caaatgggat cagtttagaa gcatgaaggc tgagttcgat 1500
ccacggcata tactcgctac cggtcagaaa atctttcaga acccatctct ggctttgttt 1560
cgtccatcgt cgtcttcgtc gtcagcttca tggtaa 1596
<210> 21 <211> 531 <212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 21
Met Thr Ser Ser Phe Leu Leu Met Thr Phe Ala Ile Cys Thr Leu Ile
1 5 10 15
Ile Ala Val Gly Pro Ser Glu Leu Leu Arg Ile Gly Ala Ile Asp Val
20 25 30
Asp Gly His Phe Thr Phe Lys Pro Ser Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser
35 40 45
Asp Phe Gly Met Leu Lys Ser Pro Glu Glu Pro Leu Ala Val Leu His
50 55 60
Pro Ser Ser Ala Glu Asp Val Ala Arg Leu Ile Arg Thr Ala Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Thr Ala Phe Pro Val Ser Ala Arg Gly His Gly His Ser Ile
85 90 95
Asn Gly Gln Ala Ser Thr Gly Arg Asn Gly Val Val Val Glu Met Ser
100 105 110
His Arg Asn Ile Gly Thr Pro Glu Pro Leu Val Glu Pro Glu Glu Met
115 120 125
Tyr Val Asp Val Trp Gly Gly Glu Leu Trp Val Asp Val Leu Lys Lys
130 135 140
Thr Leu Glu His Gly Leu Ala Pro Lys Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr
145 150 155 160
Leu Ser Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala
165 170 175
Phe His His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Val
180 185 190
Thr Gly Arg Gly Glu Val Met Arg Cys Ser Glu Glu Glu Asn Thr Arg
195 200 205
Leu Phe His Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr
210 215 220
Arg Ala Arg Ile Ser Leu Glu Pro Ala Pro Gln Arg Val Arg Trp Ile
225 230 235 240
Arg Val Leu Tyr Ser Ser Phe Glu Val Phe Thr Glu Asp Gln Glu Tyr
245 250 255
Leu Ile Ser Met His Gly Gln Ser Lys Phe Asp Tyr Val Glu Gly Phe
260 265 270
Val Ile Val Asp Glu Gly Leu Val Asn Asn Trp Arg Ser Ser Phe Phe
275 280 285
Ser Pro Arg Asn Pro Val Lys Ile Ser Ser Val Ser Ser Asn Gly Ser
290 295 300
Val Leu Tyr Cys Leu Glu Ile Thr Lys Asn Tyr Arg Glu Ser Glu Ser
305 310 315 320
Asp Thr Val Asp Gln Glu Val Glu Ile Leu Met Lys Lys Leu Asn Phe
325 330 335
Ile Pro Thr Ser Val Phe Thr Thr Asp Leu Gln Tyr Val Asp Phe Leu
340 345 350
Asp Arg Val His Lys Ala Glu Leu Lys Leu Arg Ser Lys Asn Leu Trp
355 360 365
Glu Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Phe Val Pro Lys Ser Arg Ile
370 375 380
Ser Asp Phe Asp Lys Gly Val Phe Lys Gly Ile Leu Gly Asn Lys Thr
385 390 395 400
Ser Gly Pro Ile Leu Ile Tyr Pro Met Asn Lys Asp Lys Trp Asp Glu
405 410 415
Arg Ser Ser Ala Val Thr Pro Asp Glu Glu Val Phe Tyr Leu Val Ala
420 425 430
Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ser Asp Gly Glu Glu Thr Gln Lys Leu Glu
435 440 445
Tyr Leu Lys Asp Gln Asn Arg Arg Ile Leu Glu Phe Cys Glu Gln Ala
450 455 460
Lys Ile Asn Val Lys Gln Tyr Leu Pro His His Ala Thr Gln Glu Glu
465 470 475 480
Trp Val Ala His Tyr Gly Asp Lys Trp Asp Gln Phe Arg Ser Met Lys
485 490 495
Ala Glu Phe Asp Pro Arg His Ile Leu Ala Thr Gly Gln Lys Ile Phe
500 505 510
Gln Asn Pro Ser Leu Ala Leu Phe Arg Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser
515 520 525
Ala Ser Trp 530
<210> <211> <212> <213>
2804
ДНК
Brassica napus
экзон
(1)..(580)
<220> <221> <222>
<223> экзон1
<220> <221> <222> <223>
вариация (465)..(465)
замещение G на A в YIIN811
экзон
(664)..(791)
<220> <221> <222>
<223> экзон2
экзон
(950)..(1216)
<220> <221> <222>
<223> экзон3
экзон
(1765)..(2027)
<220> <221> <222>
<223> экзон4
экзон
(2447)..(2804)
<220> <221> <222>
<223> экзон5
<400> 22
atg acg tca agc ttt ctt ctc gtg aca ttc gcg att tgt aca ctg atc
Met Thr Ser Ser Phe Leu Leu Val Thr Phe Ala Ile Cys Thr Leu Ile
1 5 10 15
ata gcc gtt ggt ccc agc gag ctc ctc cgc atc gga gcc ata gac gtc
Ile Ala Val Gly Pro Ser Glu Leu Leu Arg Ile Gly Ala Ile Asp Val
20 25 30
gac ggc cac ttc acc ttc aag cct tcc gac tta gcc tcc gtc tcg tcg
Asp Gly His Phe Thr Phe Lys Pro Ser Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser
35 40 45
144
gac ttc ggt atg cta aag tcg ccg gag gag cca tta gcc gta ctt cat
Asp Phe Gly Met Leu Lys Ser Pro Glu Glu Pro Leu Ala Val Leu His
50 55 60
192
cca tcc tca gct gaa gac gtg gca cgg ctc atc aga aca gct tac ggc
Pro Ser Ser Ala Glu Asp Val Ala Arg Leu Ile Arg Thr Ala Tyr Gly
65 70 75 80
240
tca gcc acg gcc ttt ccg gtc tca gcc cgt ggc cac ggc cat tcc ata
Ser Ala Thr Ala Phe Pro Val Ser Ala Arg Gly His Gly His Ser Ile
aac gga cag gct tcg aca ggg agg aac ggt gtg gtg gtg gag atg agc 33 6
Asn Gly Gln Ala Ser Thr Gly Arg Asn Gly Val Val Val Glu Met Ser
100 105 110
cac cgc aac ata ggg acg ctg gag cca cta gtt gaa ccg gag gaa atg 384
His Arg Asn Ile Gly Thr Leu Glu Pro Leu Val Glu Pro Glu Glu Met
115 120 125
tat gtg gac gtt tgg ggt gga gag tta tgg gtt gat gtg ttg aaa aaa 432
Tyr Val Asp Val Trp Gly Gly Glu Leu Trp Val Asp Val Leu Lys Lys
130 135 140
acg ttg gag cat ggc tta gca cca aag tca tgg act gat tac ctg tat 480
Thr Leu Glu His Gly Leu Ala Pro Lys Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr
145 150 155 160
ctt tcc gtt ggt ggt aca ctc tcc aat gca gga att agt ggt caa gct 528
Leu Ser Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala
165 170 175
ttt cac cat ggt cct caa att agt aac gtc ctt gag cta gac gtt gta 576
Phe His His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Val
180 185 190
act g gttagtataa aacgttcaag ttcatatatt tggttcttga attgattttc 630 Thr
atattaataa caaacatatt gaatcaaaaa cag gg aga gga gag gtg atg aga 683
Gly Arg Gly Glu Val Met Arg 195 200
tgt tca gaa gaa gag aac aca agg ctt ttc cat gga gtt ctt ggt ggg 731
Cys Ser Glu Glu Glu Asn Thr Arg Leu Phe His Gly Val Leu Gly Gly
205 210 215
tta ggt caa ttt ggg atc att aca cga gca cga atc tct ctc gaa cct 779
Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Ser Leu Glu Pro
220 225 230
gct ccc caa agg gtaaatgttt ttaaattttg attctatgtt gtcacgatat 831
Ala Pro Gln Arg 235
aaaactgcca ggcgggtcca tgagttacat taaccttttc actattgtgg tgacatattt 891
tgttttataa atttattaaa tttagttaat gaaaccctaa atgataatct tgtgacag 949
gta aga tgg ata aga gtg ttg tat tcg agc ttc gaa gtg ttt aca gat 997
Val Arg Trp Ile Arg Val Leu Tyr Ser Ser Phe Glu Val Phe Thr Asp
240 245 250
gac caa gaa tac tta ata tct atg cat ggt cat tca aag ttt gat tac 1045
Asp Gln Glu Tyr Leu Ile Ser Met His Gly His Ser Lys Phe Asp Tyr
255 260 265
gtg gaa ggg ttt gtg atc gtg gac gaa ggt ctc gtc aac aac tgg aga 1093
Val Glu Gly Phe Val Ile Val Asp Glu Gly Leu Val Asn Asn Trp Arg
270 275 280
tcc tct ttc ttc tct cct cat aac ccc gtt aaa att tct tcc gtt agc 1141
Ser Ser Phe Phe Ser Pro His Asn Pro Val Lys Ile Ser Ser Val Ser
285
290
295
300
tct aac ggc tcc gtt ctg tat tgc ctt gag atc acc aag aac tac cac 1189
Ser Asn Gly Ser Val Leu Tyr Cys Leu Glu Ile Thr Lys Asn Tyr His
305 310 315
gag tcc gag tcc gac acc gtc gat cag gtaaaattta attaagaagt 1236
Glu Ser Glu Ser Asp Thr Val Asp Gln 320 325
tctcaatttt ttttcttctc aattagataa agagatatta ttctttttat aatgatgaat 1296
atctggaacg atttaacgct atgcgattat tgaggaaatc atgattaaaa aatttggttt 1356
tcttttagtt tatatgattg aaagtggtct ccatagtatt tttgttgtgt cggctttatt 1416
atataattaa aatagtttat tataatttaa attaggaaga aggcatgaaa aagaagcgag 1476
agaggatcta cagagatcta gcttttccac ctgaactatt atgtttagtt tatcactagc 1536
gaattaatca tggttactaa ttaagtagtg gacggggtca tggaccactc accaaataat 1596
gattcccctt tactctaatt aagttttaat aaaaccaact ctactggaat cttaacttat 1656
ccttggtttt ggtaggcttt aatagcaaaa cagtttttta attttctcct aactttaatt 1716
ttcctattct ggtttaaata aattaaaagt gggttttgtt tgctccag gaa gta gag 1773
Glu Val Glu
att ttg atg aag aaa tta aat ttt ata ccg aca tcg gta ttc acg aca 1821
Ile Leu Met Lys Lys Leu Asn Phe Ile Pro Thr Ser Val Phe Thr Thr
330 335 340
gat ttg caa tat gtg gat ttc ctg gac cgg gtt cac aag gcg gag ctg 1869
Asp Leu Gln Tyr Val Asp Phe Leu Asp Arg Val His Lys Ala Glu Leu
345 350 355 360
aag ctc cgg tcg aag aat tta tgg gag gtt cca cac cca tgg ctc aac 1917
Lys Leu Arg Ser Lys Asn Leu Trp Glu Val Pro His Pro Trp Leu Asn
365 370 375
cta ttc gta cca aaa tca aga atc tct gat ttt gac aaa ggc gtt ttc 1965
Leu Phe Val Pro Lys Ser Arg Ile Ser Asp Phe Asp Lys Gly Val Phe
380 385 390
aag ggc att ttg ggg aat aaa act agt ggc cct atc ctt atc tac cca 2013
Lys Gly Ile Leu Gly Asn Lys Thr Ser Gly Pro Ile Leu Ile Tyr Pro
395 400 405
atg aac aaa gac aa gtaagttccg atcgatatta ccaccgttta cttagaaatt 2067 Met Asn Lys Asp Lys
410
tcttttcaga aacaaaagaa taaaacgagt tttgcatgca tgcaaagtta cacttgtggt 2127
ccaaaaaaat aaatgttttg tcgaaactgt aaattagtgg tacatgggat tgtccgaaaa 2187
actttgttca catgtgcatc gaatcgaacc agctaagatt gataataacg catcatcgtc 2247
ggctcatctt tctcttttgg ttcattgtcc gatctggacg gtccagattg ggtctattgt 2307
tttttagttc ctataactaa tggtggtggg tcccaatcgg attctacgac acggaaccga 2367
tctcaacgac cctcccccac atcatttatt aactataaga ttatgtcgtg ctgacgtgtc
2427
ggattttttg taatgtcag a tgg gac gaa aga agc tcg gcc gtt aca ccg 2477
Trp Asp Glu Arg Ser Ser Ala Val Thr Pro 415 420
gac gag gaa gtt ttc tac ctg gtg gct cta ttg aga tca gct tta tcg 2525
Asp Glu Glu Val Phe Tyr Leu Val Ala Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ser
425 430 435
gat ggt gag gaa acg cag aag cta gag tat ttg aaa gat cag aac cgt 2573
Asp Gly Glu Glu Thr Gln Lys Leu Glu Tyr Leu Lys Asp Gln Asn Arg
440 445 450 455
cgg atc ttg gag ttc tgt gaa caa gcc aag atc aat gtg aag cag tac 2621
Arg Ile Leu Glu Phe Cys Glu Gln Ala Lys Ile Asn Val Lys Gln Tyr
460 465 470
ctt cct cac cat gca acg caa gag gag tgg gtg gat cat tat gga gac 2669
Leu Pro His His Ala Thr Gln Glu Glu Trp Val Asp His Tyr Gly Asp
475 480 485
aga tgg gat cag ttt aga agc atg aag act gag ttc gat cca cgg cat 2717
Arg Trp Asp Gln Phe Arg Ser Met Lys Thr Glu Phe Asp Pro Arg His
490 495 500
ata ctc gct acc ggt cag aaa atc ttt cag aac cca tct ctg gct ttg 2765
Ile Leu Ala Thr Gly Gln Lys Ile Phe Gln Asn Pro Ser Leu Ala Leu
505 510 515
ttt cct cca tcg ccg tct tca tcg tca gct tca tgg tga 2804
Phe Pro Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ala Ser Trp
520 525 530
<210> <211> <212> <213>
1596
ДНК
Brassica napus
<220> <221> <222> <223>
вариация (465)..(465)
замещение G на A в YIIN811
<400> 23
atgacgtcaa gctttcttct cgtgacattc gcgatttgta cactgatcat agccgttggt 60
cccagcgagc tcctccgcat cggagccata gacgtcgacg gccacttcac cttcaagcct 120
tccgacttag cctccgtctc gtcggacttc ggtatgctaa agtcgccgga ggagccatta 180
gccgtacttc atccatcctc agctgaagac gtggcacggc tcatcagaac agcttacggc 240
tcagccacgg cctttccggt ctcagcccgt ggccacggcc attccataaa cggacaggct 300
tcgacaggga ggaacggtgt ggtggtggag atgagccacc gcaacatagg gacgctggag 360
ccactagttg aaccggagga aatgtatgtg gacgtttggg gtggagagtt atgggttgat 420
gtgttgaaaa aaacgttgga gcatggctta gcaccaaagt catggactga ttacctgtat 480
ctttccgttg gtggtacact ctccaatgca ggaattagtg gtcaagcttt tcaccatggt 540
cctcaaatta gtaacgtcct tgagctagac gttgtaactg ggagaggaga ggtgatgaga 600
tgttcagaag aagagaacac aaggcttttc catggagttc ttggtgggtt aggtcaattt 660
gggatcatta cacgagcacg aatctctctc gaacctgctc cccaaagggt aagatggata 720
agagtgttgt attcgagctt cgaagtgttt acagatgacc aagaatactt aatatctatg 780
catggtcatt caaagtttga ttacgtggaa gggtttgtga tcgtggacga aggtctcgtc 840
aacaactgga gatcctcttt cttctctcct cataaccccg ttaaaatttc ttccgttagc 900
tctaacggct ccgttctgta ttgccttgag atcaccaaga actaccacga gtccgagtcc 960
gacaccgtcg atcaggaagt agagattttg atgaagaaat taaattttat accgacatcg 1020
gtattcacga cagatttgca atatgtggat ttcctggacc gggttcacaa ggcggagctg 1080
aagctccggt cgaagaattt atgggaggtt ccacacccat ggctcaacct attcgtacca 1140
aaatcaagaa tctctgattt tgacaaaggc gttttcaagg gcattttggg gaataaaact 1200
agtggcccta tccttatcta cccaatgaac aaagacaaat gggacgaaag aagctcggcc 1260
gttacaccgg acgaggaagt tttctacctg gtggctctat tgagatcagc tttatcggat 1320
ggtgaggaaa cgcagaagct agagtatttg aaagatcaga accgtcggat cttggagttc 1380
tgtgaacaag ccaagatcaa tgtgaagcag taccttcctc accatgcaac gcaagaggag 1440
tgggtggatc attatggaga cagatgggat cagtttagaa gcatgaagac tgagttcgat 1500
ccacggcata tactcgctac cggtcagaaa atctttcaga acccatctct ggctttgttt 1560
cctccatcgc cgtcttcatc gtcagcttca tggtga 1596
<210> 24 <211> 531 <212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 24
Met Thr Ser Ser Phe Leu Leu Val Thr Phe Ala Ile Cys Thr Leu Ile
1 5 10 15
Ile Ala Val Gly Pro Ser Glu Leu Leu Arg Ile Gly Ala Ile Asp Val
20 25 30
Asp Gly His Phe Thr Phe Lys Pro Ser Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser
35 40 45
Asp Phe Gly Met Leu Lys Ser Pro Glu Glu Pro Leu Ala Val Leu His
50 55 60
Pro Ser Ser Ala Glu Asp Val Ala Arg Leu Ile Arg Thr Ala Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Thr Ala Phe Pro Val Ser Ala Arg Gly His Gly His Ser Ile
85 90 95
Asn Gly Gln Ala Ser Thr Gly Arg Asn Gly Val Val Val Glu Met Ser
100 105 110
His Arg Asn Ile Gly Thr Leu Glu Pro Leu Val Glu Pro Glu Glu Met
115 120 125
Tyr Val Asp Val Trp Gly Gly Glu Leu Trp Val Asp Val Leu Lys Lys
130 135 140
Thr Leu Glu His Gly Leu Ala Pro Lys Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr
145 150 155 160
Leu Ser Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln Ala
165 170 175
Phe His His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Val
180 185 190
Thr Gly Arg Gly Glu Val Met Arg Cys Ser Glu Glu Glu Asn Thr Arg
195 200 205
Leu Phe His Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr
210 215 220
Arg Ala Arg Ile Ser Leu Glu Pro Ala Pro Gln Arg Val Arg Trp Ile
225 230 235 240
Arg Val Leu Tyr Ser Ser Phe Glu Val Phe Thr Asp Asp Gln Glu Tyr
245 250 255
Leu Ile Ser Met His Gly His Ser Lys Phe Asp Tyr Val Glu Gly Phe
260 265 270
Val Ile Val Asp Glu Gly Leu Val Asn Asn Trp Arg Ser Ser Phe Phe
275 280 285
Ser Pro His Asn Pro Val Lys Ile Ser Ser Val Ser Ser Asn Gly Ser
290 295 300
Val Leu Tyr Cys Leu Glu Ile Thr Lys Asn Tyr His Glu Ser Glu Ser
305 310 315 320
Asp Thr Val Asp Gln Glu Val Glu Ile Leu Met Lys Lys Leu Asn Phe
325 330 335
Ile Pro Thr Ser Val Phe Thr Thr Asp Leu Gln Tyr Val Asp Phe Leu
340 345 350
Asp Arg Val His Lys Ala Glu Leu Lys Leu Arg Ser Lys Asn Leu Trp
355 360 365
Glu Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Phe Val Pro Lys Ser Arg Ile
370 375 380
Ser Asp Phe Asp Lys Gly Val Phe Lys Gly Ile Leu Gly Asn Lys Thr
385 390 395 400
Ser Gly Pro Ile Leu Ile Tyr Pro Met Asn Lys Asp Lys Trp Asp Glu
405 410 415
Arg Ser Ser Ala Val Thr Pro Asp Glu Glu Val Phe Tyr Leu Val Ala
420 425 430
Leu Leu Arg Ser Ala Leu Ser Asp Gly Glu Glu Thr Gln Lys Leu Glu
435 440 445
Tyr Leu Lys Asp Gln Asn Arg Arg Ile Leu Glu Phe Cys Glu Gln Ala
450 455 460
Lys Ile Asn Val Lys Gln Tyr Leu Pro His His Ala Thr Gln Glu Glu
465 470 475 480
Trp Val Asp His Tyr Gly Asp Arg Trp Asp Gln Phe Arg Ser Met Lys
485 490 495
Thr Glu Phe Asp Pro Arg His Ile Leu Ala Thr Gly Gln Lys Ile Phe
500 505 510
Gln Asn Pro Ser Leu Ala Leu Phe Pro Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ser
515 520 525
Ala Ser Trp 530
<210> 25
<211> 364
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 25
Met Val Ser Tyr Asn Phe Pro Ser Gln Ile His Leu Leu Met Ile Thr
1 5 10 15
Ile Leu Val Ile Ile Thr Thr Leu Leu Thr Pro Ile Thr Thr Asn Thr
20 25 30
Ser Ser Leu Pro Trp Asn Ile Leu Ser Asn Asp Asn Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Leu Thr Thr Ala Ser Ser Ser Val Glu Ser Ala Ala Thr Asp Phe Gly
50 55 60
His Ile Thr Lys Ile Phe Pro Ser Ala Val Leu Asn Pro Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Asp Ile Thr Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Ser Ser
85 90 95
Phe Pro Leu Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser His Arg Gly Gln Ala
100 105 110
Ala Ala Lys Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Arg
115 120 125
Asp Arg Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Ala Asp Val Asp
130 135 140
Ser Ala Trp Leu Trp Ile Glu Val Leu Asn Lys Thr Leu Glu Leu Gly
145 150 155 160
Leu Thr Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly
165 170 175
Thr Leu Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Phe Arg Tyr Gly Pro
180 185 190
Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu Met Asp Val Ile Thr Gly Lys Gly Glu
195 200 205
Ile Ala Thr Cys Ser Lys Asp Met Asn Ser Asp Leu Phe Tyr Ala Ala
210 215 220
Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Lys
225 230 235 240
Leu Glu Leu Ala Pro Lys Lys Ala Lys Trp Leu Arg Phe Leu Tyr Thr
245 250 255
Asp Phe Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Glu Thr
260 265 270
Asn Gly Pro His Phe Leu Glu Gly Ser Val Met Leu Asp His Gly Pro
275 280 285
Pro Asp Asn Trp Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Pro Ser Glu His Met Arg
290 295 300
Ile Val Ser Met Val Lys Gln His Arg Val Ile Tyr Cys Leu Glu Val
305 310 315 320
Val Lys Tyr Tyr Asp Glu Thr Ser Gln His Ser Val Asn Glu Glu Met
325 330 335
Glu Glu Leu Ser Asp Ser Leu Asn Tyr Glu Arg Gly Phe Val Tyr Glu
340 345 350
Lys Asp Val Thr Tyr Met Asp Phe Leu Asn Arg Val 355 360
<210> 26
<211> 389
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 26
Met Ala Ser Asn Asn Phe Pro Ser Gln Ser His Leu Leu Val Ile Ile
1 5 10 15
Ile Phe Ile Thr Thr Leu Leu Thr Pro Ile Thr Thr Asn Thr Ser Pro
20 25 30
Gln Pro Trp Asn Ile Leu Ser Asn Asp Asn Phe Ala Gly Lys Leu Thr
35 40 45
Ser Ala Ser Ser Ser Val Glu Ala Ala Ser Ile Asp Phe Gly His Val
50 55 60
Thr Lys Ile Leu Pro Ser Ala Val Leu Asn Pro Ser Ser Val Gln Asp
65 70 75 80
Ile Ile Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Ser Ser Phe Pro
85 90 95
Ile Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser Phe Arg Gly Gln Ala Ala Ala
100 105 110
Lys Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Glu Asp Arg
115 120 125
Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Ala Asp Val Asp Thr Ala
130 135 140
Trp Leu Trp Ile Glu Val Leu Asn Lys Thr Leu Glu Leu Gly Leu Thr
145 150 155 160
Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu
165 170 175
Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Ser Arg Tyr Gly Pro Gln Ile
180 185 190
Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Ile Ile Thr Gly Lys Gly Glu Ile Ala
195 200 205
Thr Cys Ser Asn Asp Met Asn Ser Asp Leu Phe Tyr Ala Ala Leu Gly
210 215 220
Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Lys Leu Glu
225 230 235 240
Leu Ala Pro Lys Arg Ala Lys Trp Leu Arg Phe Leu Tyr Thr Asp Phe
245 250 255
Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Glu Ala Gly Gly
260 265 270
Leu His Phe Leu Glu Gly Ser Val Met Leu Asp His Gly Pro Pro Asp
275 280 285
Asn Trp Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Pro Ser Asp His Leu Arg Ile Val
290 295 300
Ser Met Ile Lys Arg His Arg Val Ile Tyr Cys Leu Glu Val Val Lys
305 310 315 320
Tyr Tyr Asp Glu Phe Ser Gln His Ser Val Asn Glu Glu Met Glu Glu
325 330 335
Leu Ser Glu Ser Leu Asn Phe Val Arg Gly Phe Val Tyr Glu Lys Asp
340 345 350
Val Thr Tyr Ile Asp Phe Leu Asn Arg Val Arg Thr Gly Glu Leu Asn
355 360 365
Leu Lys Ser Lys Gly Gln Trp Asp Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu
370 375 380
Phe Val Pro Lys Ser
<210> 27
<211> 291
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 27
Met Val Ser Tyr Asn Phe Pro Ser Gln Ile His Leu Leu Met Ile Thr
1 5 10 15
Ile Leu Val Ile Ile Thr Thr Leu Phe Thr Pro Ile Thr Thr Asn Thr
20 25 30
Ser Ser Leu Pro Trp Asn Ile Leu Ser Asn Asp Asn Phe Ala Arg Lys
35 40 45
Leu Thr Thr Ala Ser Ser Ser Val Glu Ser Ala Ala Thr Asp Phe Gly
50 55 60
His Ile Thr Lys Ile Phe Pro Ser Ala Val Leu Asn Pro Ser Ser Val
65 70 75 80
Gln Asp Ile Thr Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Ser Ser
85 90 95
Phe Pro Leu Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser His Arg Gly Gln Ala
100 105 110
Ala Ala Asn Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Arg
115 120 125
Asp Arg Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Ala Asp Val Asp
130 135 140
Ser Ala Trp Leu Trp Ile Glu Val Leu Asn Lys Thr Leu Glu Leu Gly
145 150 155 160
Leu Thr Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu His Leu Thr Val Gly Gly
165 170 175
Thr Leu Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Phe Arg Tyr Gly Pro
180 185 190
Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu Met Asp Val Ile Thr Gly Lys Gly Glu
195 200 205
Ile Ala Thr Cys Ser Lys Asp Met Asn Ser Asp Leu Phe Tyr Ala Ala
210 215 220
Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Lys
225 230 235 240
Leu Glu Leu Ala Pro Lys Asn Ala Lys Trp Leu Arg Phe Leu Tyr Thr
245 250 255
Asp Phe Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Glu Thr
260 265 270
Asn Gly Leu His Phe Leu Glu Gly Ser Val Met Leu Asp His Gly Pro
275 280 285
Pro Asp Asn
290
<210> 28
<211> 327
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 28
Met Ala Ser Asn Asn Phe Pro Ser Gln Ser His Leu Leu Val Ile Ile
1 5 10 15
Ile Phe Ile Thr Thr Leu Leu Thr Pro Ile Thr Thr Asn Asn Thr Ser
20 25 30
Pro Gln Pro Trp Asn Ile Leu Ser Asn Asp Asn Phe Ala Gly Lys Leu
35 40 45
Thr Ser Ala Ser Ser Ser Val Glu Ala Ala Ala Ile Asp Phe Gly His
50 55 60
Val Thr Lys Ile Leu Pro Ser Ala Val Leu Asn Pro Ser Ser Val Gln
65 70 75 80
Asp Ile Ile Asp Leu Ile Lys Leu Ser Phe Asp Ser Gln Ser Ser Phe
85 90 95
Pro Ile Ala Ala Arg Gly His Gly His Ser Phe Arg Gly Gln Ala Ala
100 105 110
Ala Lys Asp Gly Val Val Val Asn Met Arg Ser Met Val Asn Glu Asp
115 120 125
Arg Gly Ile Lys Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Ala Asp Val Asp Thr
130 135 140
Ala Trp Leu Trp Ile Glu Val Leu Asn Lys Thr Leu Glu Leu Gly Leu
145 150 155 160
Thr Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Ile Gly Gly Thr
165 170 175
Leu Ser Asn Gly Gly Ile Ser Gly Gln Thr Ser Arg Tyr Gly Pro Gln
180 185 190
Ile Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Val Ile Thr Gly Lys Gly Glu Ile
195 200 205
Ala Thr Cys Ser Asn Asp Thr Asn Ser Asp Leu Phe Tyr Ala Ala Leu
210 215 220
Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Lys Leu
225 230 235 240
Glu Leu Ala Pro Lys Arg Ala Lys Trp Leu Arg Phe Leu Tyr Thr Asp
245 250 255
Phe Ser Glu Phe Thr Arg Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ser Glu Thr Asp
260 265 270
Gly Leu His Phe Leu Glu Gly Ser Val Met Leu Asp His Gly Pro Pro
275 280 285
Asp Asn Trp Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Pro Ser Asp His Leu Arg Ile
290 295 300
Val Ser Met Ile Lys Arg Tyr Arg Val Ile Tyr Cys Leu Glu Val Ala
305 310 315 320
Lys Tyr Tyr Asp Glu Thr Ser 325
<210> 29
<211> 154
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 29
Met Thr Ser Ser Phe Leu Leu Met Thr Phe Ala Ile Cys Thr Leu Ile
1 5 10 15
Ile Ala Val Gly Pro Ser Glu Leu Leu Arg Ile Gly Ala Ile Asp Val
20 25 30
Asp Gly His Phe Thr Phe Lys Pro Ser Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser
35 40 45
Asp Phe Gly Met Leu Lys Ser Pro Glu Glu Pro Leu Ala Val Leu His
50 55 60
Pro Ser Ser Ala Glu Asp Val Ala Arg Leu Ile Arg Thr Ala Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Thr Ala Phe Pro Val Ser Ala Arg Gly His Gly His Ser Ile
85 90 95
Asn Gly Gln Ala Ser Thr Gly Arg Asn Gly Val Val Val Glu Met Ser
100 105 110
His Arg Asn Ile Gly Thr Pro Glu Pro Leu Val Glu Pro Glu Glu Met
115 120 125
Tyr Val Asp Val Trp Gly Gly Glu Leu Trp Val Asp Val Leu Lys Lys
130 135 140
Thr Leu Glu His Gly Leu Ala Pro Lys Ser 145 150
<210> 30
<211> 132
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 30
Met Thr Ser Ser Phe Leu Leu Met Thr Phe Ala Ile Cys Thr Leu Ile
1 5 10 15
Ile Ala Val Gly Pro Ser Glu Leu Leu Arg Ile Gly Ala Ile Asp Val
20 25 30
Asp Gly His Phe Thr Phe Lys Pro Ser Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser
35 40 45
Asp Phe Gly Met Leu Lys Ser Pro Glu Glu Pro Leu Ala Val Leu His
50 55 60
Pro Ser Ser Ala Glu Asp Val Ala Arg Leu Ile Arg Thr Ala Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Thr Ala Phe Pro Val Ser Ala Arg Gly His Gly His Ser Ile
85 90 95
Asn Gly Gln Ala Ser Thr Gly Arg Asn Gly Val Val Val Glu Met Ser
100
105
110
His Arg Asn Ile Gly Thr Pro Glu Pro Leu Val Glu Pro Glu Glu Met
115 120 125
Tyr Val Asp Val 130
<210> 31
<211> 154
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 31
Met Thr Ser Ser Phe Leu Leu Val Thr Phe Ala Ile Cys Thr Leu Ile
1 5 10 15
Ile Ala Val Gly Pro Ser Glu Leu Leu Arg Ile Gly Ala Ile Asp Val
20 25 30
Asp Gly His Phe Thr Phe Lys Pro Ser Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser
35 40 45
Asp Phe Gly Met Leu Lys Ser Pro Glu Glu Pro Leu Ala Val Leu His
50 55 60
Pro Ser Ser Ala Glu Asp Val Ala Arg Leu Ile Arg Thr Ala Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Thr Ala Phe Pro Val Ser Ala Arg Gly His Gly His Ser Ile
85 90 95
Asn Gly Gln Ala Ser Thr Gly Arg Asn Gly Val Val Val Glu Met Ser
100 105 110
His Arg Asn Ile Gly Thr Leu Glu Pro Leu Val Glu Pro Glu Glu Met
115 120 125
Tyr Val Asp Val Trp Gly Gly Glu Leu Trp Val Asp Val Leu Lys Lys
130 135 140
Thr Leu Glu His Gly Leu Ala Pro Lys Ser 145 150
<210> 32
<211> 47
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX3-A1 WT аллель
<400> 32
gaaggtgacc aagttcatgc tgtatatgga tttcttaaac cgggttc 47
<210> 33
<211> 48
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX3-A1 YIIN501 аллель
<400> 33
gaaggtcgga gtcaacggat tcgtatatgg atttcttaaa ccgggttt 48
<210> 34
<211> 48
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX3-A2 WT аллель
<400> 34
gaaggtgacc aagttcatgc tggcttaatc tctttgtacc aaaatctc 48
<210> 35
<211> 50
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX3-A2 YIIN512 аллель
<400> 35
gaaggtcgga gtcaacggat tatggcttaa tctctttgta ccaaaatctt 50
<210> 36
<211> 42
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX3-C1 WT аллель
<400> 36
gaaggtgacc aagttcatgc tggtggatag taagtggacc gc 42
<210> 37
<211> 43
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX3-C1 YIIN521 аллель
<400> 37
gaaggtcgga gtcaacggat tcggtggata gtaagtggac cgt
<210> 38
<211> 43
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX3-C2 WT аллель
<400> 38
gaaggtgacc aagttcatgc tggacctcgt tgactgagtg ttg 43
<210> 39
<211> 44
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX3-C2 YIIN531 аллель
<400> 39
gaaggtcgga gtcaacggat tcggacctcg ttgactgagt gtta 44
<210> 40
<211> 47
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX5-A1 WT аллель
<400> 40
gaaggtgacc aagttcatgc tcaacggaaa gatacaagta atcagtc 47
<210> 41
<211> 48
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX5-YIIN801 WT аллель
<400> 41
gaaggtcgga gtcaacggat tccaacggaa agatacaagt aatcagtt 48
<210> 42
<211> 44
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX5-A1 WT аллель
<400> 42
gaaggtgacc aagttcatgc tcatcaaccc ataactctcc accc 44
<210> 43 <211> 45
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX5-A1 YIIN805 аллель <400> 43
gaaggtcgga gtcaacggat tacatcaacc cataactctc cacct 45
<210> 44
<211> 47
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX5C1 WT аллель
<400> 44
gaaggtgacc aagttcatgc tcaacggaaa gatacaggta atcagtc 47
<210> 45
<211> 47
<212> ДНК
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> KASP Праймер BnCKX5-C1 YIIN811 аллель
<400> 45
gaaggtcgga gtcaacggat tcaacggaaa gatacaggta atcagtt
Формула изобретения
1. Растение рода Brassica, содержащее, по меньшей мере, один ген СКХ5, включающий, по меньшей мере, один мутантный СКХ5 аллель в геноме, отличающееся тем, что указанный мутантный СКХ5 аллель является мутантным аллелем гена СКХ5, включающим нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих последовательностей:
(a) нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ Ш N0: 19 или SEQ ГО N0: 23;
(b) нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 20 или SEQ ГО N0: 23; и
(c) нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 21 или SEQ ГО N0: 24.
2. Растение по п. 1, представляющее собой растение рода Brassica, содержащее два гена СКХ5, при этом указанное растение рода Brassica выбрано из группы, состоящей из Brassica napus, Brassica juncea и Brassica carinata.
3. Растение по пп. 1 или 2, отличающееся тем, что указанный мутантный аллель СКХ5 выбран из группы, состоящей из следующих аллелей:
(a) мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении,
соответствующем положению 465 SEQ ГО N0: 19 или положению 465 SEQ ГО N0: 20;
(b) мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении,
соответствующем положению 399 SEQ ГО N0: 19 или положению 399 SEQ ГО N0: 20; и
(c) мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении,
соответствующем положению 465 SEQ ГО N0: 22 или положению 399 SEQIDNO: 23.
4. Растение по любому из пп. 1-3, дополнительно содержащее, по меньшей мере, два гена СКХЗ, также включающих, по меньшей мере, два мутантных СКХЗ аллеля в геноме, отличающееся тем, что указанный мутантный СКХЗ аллель является мутантным аллелем гена СКХЗ, включающим нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих последовательностей:
(a) нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ID N0: 7, SEQ ГО N0: 10; SEQ ГО N0: 13 или SEQ ГО N0: 16;
(b) нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 8, SEQ ГО N0: 11; SEQ ГО N0: 14 или SEQIDNO: 17; и
(c) нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 9, SEQ ГО N0: 12; SEQ ГО N0: 15 или SEQIDNO: 18.
5. Растение по п. 3 или 4, представляющее собой растение рода Brassica, содержащее четыре гена СКХЗ, при этом указанное растение рода Brassica выбрано из группы, состоящей из Brassica napus, Brassica juncea и Brassica carinata.
6. Растение по п. 5, отличающееся тем, что указанный мутантный аллель СКХЗ выбран из группы, состоящей из следующих аллелей:
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2244 SEQ ГО N0: 7 или положению 1093 SEQ ГО N0: 8;
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2482 SEQ ГО N0: 10 или положению 1168 SEQIDNO: 11;
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 1893 SEQ ГО N0: 13 или положению 876 SEQ ГО N0: 14;
мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2171 SEQ ID N0: 16 или положению 982 SEQIDNO: 17.
7. Растение по любому из пп. 1-6, имеющее увеличенное количество цветков на растение или имеющее увеличенное количество стручков на растение или увеличенное количество стручков на главном стебле или имеющее увеличенную массу тысячи семян.
8. Клетка растения, стручок, семя или потомство растения по любому из пп. 1 - 7.
9. Мутантный аллель гена Brassica СКХЗ или СКХ5, отличающийся тем, что указанный ген СКХ5 выбран из группы, состоящей из следующих последовательностей:
(a) нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 19 или SEQ ГО N0: 23;
(b) нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 20 или SEQ ГО N0: 23; и
(c) нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 21 или SEQ ГО N0: 24; при этом СКХЗ ген выбран из группы, состоящей из следующих последовательностей:
(d) нуклеотидная последовательность, включающая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 7, SEQ ГО N0: 10; SEQ ГО N0: 13 или SEQ ГО N0: 16;
(e) нуклеотидная последовательность, включающая кодирующую последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с SEQ ГО N0: 8, SEQ ГО N0: 11; SEQ ГО N0: 14 или SEQIDNO: 17; и
(f) нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную
последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности
последовательности с SEQ Ш NO: 9, SEQ Ш NO: 12; SEQ Ш NO: 15 или SEQ Ш NO: 18.
10. Мутантный аллель по п. 9, выбранный из группы, состоящей из следующих аллелей:
a. мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ Ш N0: 19 или положению 465 SEQ ID N0: 20;
b. мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 399 SEQ ГО N0: 19 или положению 399 SEQ ГО N0: 20; и
c. мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ ГО N0: 22 или положению 399 SEQ ГО N0: 23;
d. мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2244 SEQ ГО N0: 7 или положению 1093 SEQ IDNO: 8;
e. мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2482 SEQ ГО N0: 10 или положению 1168 SEQ IDNO: 11;
f. мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 1893 SEQ ГО N0: 13 или положению 876 SEQ ГО N0: 14;
g. мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2171 SEQ ГО N0: 16 или положению 982 SEQ ГО N0: 17.
11. Способ увеличения количества цветков на растении, увеличения массы тысячи семян или увеличения количества стручков на растении, включающий этап введения, по меньшей мере, одного мутантного СКХ5 аллеля или одного мутантного СКХ5 аллеля и одного мутантного СКХЗ аллеля в растение рода Brassica.
12. Растение рода Brassica, выбранное из группы, состоящей из следующих растений:
11.
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ ГО N0: 19 или положению 465 SEQ ГО N0: 20, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCFMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCFMB 42464;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 399 SEQ ГО N0: 19 или положению 399 SEQ ГО N0: 20, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCFMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCFMB 42465;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХ5 аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 465 SEQ ГО N0: 22 или положению 399 SEQ ГО N0: 23, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCFMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCFMB 42464;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2244 SEQ ГО N0: 7 или положению 1093 SEQ ГО N0: 8, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCFMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCFMB 42464;
растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2482 SEQ ГО N0: 10 или положению 1168 SEQ ГО N0: 11, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCFMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCIMB 42464; растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение G на А в положении, соответствующем положению 1893 SEQ ГО N0: 13 или положению 876 SEQ ГО N0: 14, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в
Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCIMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCIMB 42464; растение рода Brassica, содержащее мутантный СКХЗ аллель, содержащий замещение С на Т в положении, соответствующем положению 2171 SEQ ID N0: 16 или положению 982 SEQ ID N0: 17, при этом эталонные образцы семян, содержащих указанный аллель, зарегистрированы в Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (NCFMB) 5 октября 2015 г., номер доступа NCIMB 42464.
13. Применение мутантного аллеля СКХ5 или мутантных аллелей СКХ5 и СКХЗ по п. 9 или 10 для увеличения количества цветков на растении, количества стручков на растении или увеличения массы тысячи семян в растениях рода Brassica.
14. Применение растений рода Brassica по любому из пп. 1 - 6 и 12 или семян таких растений для получения рапсового масла или рапсового жмыха.
15. Способ получения пищевых продуктов, кормов или промышленной продукции, включающий следующие этапы:
a. получение растения или его части по любому из пп. 1-6 или 12, и
b. получение пищевых продуктов, кормов или промышленной продукции из растения или его части.
AtCKX3
CKX3-A1-WT
CKX3-A1-YIIN501
CKX3-A2-WT
CKX3-A2-YIIN512
| (1) I I
1 masynlrsqvrliaitiviiit-lstpittntspqpwnilshnefagkltsssssvesaatdfghvtkifpsavlipssveditdlikls 1 mvsynfpsqihllmitilviittlltpittntsslpwnilsndnfagklttasssvesaatdfghitkifpsavlnpssvqditdlikls 1 mvsynfpsqihllmitilviittlltpittntsslpwnilsndnfagklttasssvesaatdfghitkifpsavlnpssvqditdlikls 1 masnnfpsqshllvi-iifitt-lltpittntspqpwnilsndnfagkltsasssveaasidfghvtkilpsavlnpssvqdiidlikls 1 masnnfpsqshllvi-iifitt-lltpittntspqpwnilsndnfagkltsasssveaasidfghvtkilpsavlnpssvqdiidlikls
(2)
AtCKX3
CKX3-A1-WT
CKX3-A1-YIIN501
CKX3-A2-WT
CKX3-A2-YIIN512
9 0 fdsqlsfplaarghghshrgqasakdgvvvnmrsmvnrdrgikvsrtclyvdvdaawlwievlnktlelgltpvswtdylyltvggtlsn
91 fdsqss fplaarghghshrgqaaakdgvvvnmrsmvnrdrgikvsrtglyadvdsawlwievlnktlelgltpvswtdylyltvggtlsn
91 fdsqss fplaarghghshrgqaaakdgvvvnmrsmvnrdrgikvsrtglyadvdsawlwievlnktlelgltpvswtdylyltvggtlsn
89 fdsqssfpiaarghghsfrgqaaakdgvvvnmrsmvnedrgikvsrtglyadvdtawlwievlnktlelgltpvswtdylyltvggtlsn
89 fdsqssfpiaarghghsfrgqaaakdgvvvnmrsmvnedrgikvsrtglyadvdtawlwievlnktlelgltpvswtdylyltvggtlsn
AAAAAAA ^ О A A AA
AtСКХЗ 18 0 ggisgqtfrygpqitnvlemdvitgkgeiatcskdmnsdlffavlgglgqfgiitrariklevapkrakwlrflyidfseftrdqervis
CKX3-A1-WT 181 ggisgqtfrygpqisnvlemdvitgkgeiatcskdmnsdlfyaalgglgqfgiitrariklelapkkakwlrflytdfseftrdqerlis
CKX3-A1-YIIN501 181 ggisgqtfrygpqisnvlemdvitgkgeiatcskdmnsdlfyaalgglgqfgiitrariklelapkkakwlrflytdfseftrdqerlis
CKX3-A2-WT 17 9 ggisgqtsrygpqisnvleldiitgkgeiatcsndmnsdlfyaalgglgqfgiitrariklelapkrakwlrflytdfseftrdqerlis
CKX3-A2-YIIN512 17 9 ggisgqtsrygpqisnvleldiitgkgeiatcsndmnsdlfyaalgglgqfgiitrariklelapkrakwlrflytdfseftrdqerlis
(3)
AtСКХЗ 27 0 ktdgvdflegsimvdhgppdnwrstyyppsdhlriasmvkrhrviyclevvkyydetsqytvneemeelsdslnhvrgfmyekdvtymdf
CKX3-A1-WT 271 etngphflegsvmldhgppdnwrstyyppsehmrivsmvkqhrviyclevvkyydetsqhsvneemeelsdslnyergfvyekdvtymdf
CKX3-A1-YIIN5 01 271 etngphflegsvmldhgppdnwrstyyppsehmrivsmvkqhrviyclevvkyydetsqhsvneemeelsdslnyergfvyekdvtymdf
CKX3-A2-WT 2 69 eagglhflegsvmldhgppdnwrstyyppsdhlrivsmikrhrviyclevvkyydefsqhsvneemeelseslnfvrgfvyekdvtyidf
CKX3-A2-YIIN512 2 69 eagglhflegsvmldhgppdnwrstyyppsdhlrivsmikrhrviyclevvkyydefsqhsvneemeelseslnfvrgfvyekdvtyidf
AtСКХЗ 3 60 lnrvrtgelnlkskgqwdvphpwlnlfvpktqiskfddgvfkgiilrnnitsgpvlvypmnrnkwndrmsaaipeedvfyavgflrsagf
CKX3-A1-WT 3 61 lnrvrtgelklkskgkwdvphpwlnlfvpksqisrfeygvfkgiilrnnittgpllvypmnrnkwndrmstvipeedvfyavgflrsas f
CKX3-A1-YIIN501 361 lnrv
CKX3-A2-WT 35 9 lnrvrtgelnlkskgqwdvphpwlnlfvpksqisrfdygvfkgiilrnnittgpllvypmkrimwndqmstaipeedvfyavgflrsaef
CKX3-A2-YIIN512 359 lnrvrtgelnlkskgqwdvphpwlnlfvpks
AtСКХЗ 450 dnweafdqenmeilkfcedanmgviqylpyhssqegwvrhfgprwnifverkykydpkmilspgqnifqkinss
CKX3-A1-WT 451 dnwddyekenmevlkfcedanmrviqylpyyasqegwvghfgprwniflerkyrydprmilspgqnifp
CKX3-A1-YIIN501
CKX3-A2-WT 44 9 dnweaydkenmevlmfcedakmdviqylpyhasqegwvrhfgprwntfverkykydpkmilspgqnifq
CKX3-A2-YIIN512
^ ---J ФИГ. 1
AtCKX3 1
CKX3-C1-WT 1
CKX3-C1-YIIN521 1
CKX3-C2-WT 1
CKX3-C2-YIIN531 1
I (1) I I
masynlrsqvrliaitiviiit-lstpittn-tspqpwnilshnefagkltsssssvesaatdfghvtkifpsavlipssveditdlikls mvsynfpsqihllmitilviittlftpittn-tsslpwnilsndnfarklttasssvesaatdfghitkifpsavlnpssvqditdlikls mvsynfpsqihllmitilviittlftpittn-tsslpwnilsndnfarklttasssvesaatdfghitkifpsavlnpssvqditdlikls masnnfpsqshllvi-iifitt-lltpittnntspqpwnilsndnfagkltsasssveaaaidfghvtkilpsavlnpssvqdiidlikls masnnfpsqshllvi-iifitt-lltpittnntspqpwnilsndnfagkltsasssveaaaidfghvtkilpsavlnpssvqdiidlikls
(2)
AtCKX3
CKX3-C1-WT
CKX3-C1-YIIN521
CKX3-C2-WT
CKX3-C2-YIIN531
9 0 fdsqlsfplaarghghshrgqasakdgvvvnmrsmvnrdrgikvsrtclyvdvdaawlwievlnktlelgltpvswtdylyltvggtlsn
91 fdsqss fplaarghghshrgqaaandgvvvnmrsmvnrdrgikvsrtglyadvdsawlwievlnktlelgltpvswtdylhltvggtlsn
91 fdsqss fplaarghghshrgqaaandgvvvnmrsmvnrdrgikvsrtglyadvdsawlwievlnktlelgltpvswtdylhltvggtlsn
9 0 fdsqssfpiaarghghsfrgqaaakdgvvvnmrsmvnedrgikvsrtglyadvdtawlwievlnktlelgltpvswtdylyltiggtlsn
9 0 fdsqssfpiaarghghsfrgqaaakdgvvvnmrsmvnedrgikvsrtglyadvdtawlwievlnktlelgltpvswtdylyltiggtlsn
AAAAAAA ^ 0 A A AA
AtCKX3
CKX3-C1-WT
CKX3-C1-YIIN521
CKX3-C2-WT
CKX3-C2-YIIN531
18 0 ggisgqtfrygpqitnvlemdvitgkgeiatcskdmnsdlffavlgglgqfgiitrariklevapkrakwlrflyidfseftrdqervis
181 ggisgqtfrygpqisnvlemdvitgkgeiatcskdmnsdlfyaalgglgqfgiitrariklelapknakwlrflytdfseftrdqerlis
181 ggisgqtfrygpqisnvlemdvitgkgeiatcskdmnsdlfyaalgglgqfgiitrariklelapknakwlrflytdfseftrdqerlis
18 0 ggisgqtsrygpqisnvleldvitgkgeiatcsndtnsdlfyaalgglgqfgiitrariklelapkrakwlrflytdfseftrdqerlis
18 0 ggisgqtsrygpqisnvleldvitgkgeiatcsndtnsdlfyaalgglgqfgiitrariklelapkrakwlrflytdfseftrdqerlis
(3)
AtCKX3
CKX3-C1-WT
CKX3-C1-YIIN521
CKX3-C2-WT
CKX3-C2-YIIN531
27 0 ktdgvdflegsimvdhgppdnwrstyyppsdhlriasmvkrhrviyclevvkyydetsqytvneemeelsdslnhvrgfmyekdvtymdf
271 etnglhflegsvmldhgppdnwrstyyppsehmrivsmvkqhrviyclevvkyydetsqhsvneemeelsdslnyergfvyekdvtymdf
271 etnglhflegsvmldhgppdn
27 0 etdglhflegsvmldhgppdnwrstyyppsdhlrivsmikryrviyclevakyydetsqhsvneeieklseslnyvrgfvyekdvtyidf
27 0 etdglhflegsvmldhgppdnwrstyyppsdhlrivsmikrуrviуclevakyydets
AtCKX3
CKX3-C1-WT
CKX3-C1-YIIN521
CKX3-C2-WT
CKX3-C2-YIIN531
3 60 lnrvrtgelnlkskgqwdvphpwlnlfvpktqiskfddgvfkgiilrnnitsgpvlvypmnrnkwndrmsaaipeedvfyavgflrsagf 3 61 lnrvrtgelklkskgqwdvphpwlnlfvpksqisrfeygvfkgiilrnnittgpllvypmnrnkwndrmstvlpeedvfyavgflrsas f
3 60 lnrvrtgelnlkskgqwdvphpwlnlfvpksqisrfdygvfkgiilrnnittgpllvypmkrimwndqmstaipeedvfyavgflrsaef
AtCKX3
CKX3-C1-WT
CKX3-C1-YIIN521
CKX3-C2-WT
CKX3-C2-YIIN531
450 dnweafdqenmeilkfcedanmgviqylpyhssqegwvrhfgprwnifverkykydpkmilspgqnifqkinss
451 dnwddyekenmevlkfcedanmrviqylpyyasqegwvghfgtrwniflerkyrydprmilspgqnifp
450 dnweaydkenmevlkfcedakmdviqylpyhasqegwvrhfgpmwntfverkyrydpkmilspgqnifr
ФИГ.
AtCKX5
CKX5-A1-WT
CKX5-A1-YIIN801
CKX5-A1-YIIN805
CKX5-C1-WT
CKX5-C1-YIIN811
221 vlgglgqfgiitrarislepapqrvrwirvlys s fkvftedqeylismhgqlkfdyvegfvivdeglvnnwrs s ffsprnpvkis svssngsvlycleitknyhdsdsei 213 vlgglgqfgiitrarislepapqrvrwirvlyssfevftedqeylismhgqskfdyvegfvivdeglvnnwrssffsprnpvkissvssngsvlycleitknyresesdt
213 vlgglgqfgiitrarislepapqrvrwirvlyssfevftddqeylismhghsкfdyvegfvivdeglvnnwrssffsphnpvkissvssngsvlycleitknyhesesdt
(3)
AtCKX5
CKX5-A1-WT
CKX5-A1-YIIN801
CKX5-A1-YIIN805
CKX5-C1-WT
CKX5-C1-YIIN811
331 vdqeveilmkklnfiptsvfttdlqyvdfldrvhkaelklrsknlwevphpwlnlfvpksrisdfdkgvfkgilgnktsgpiliypmnkdkwderssavtpdeevfylva 32 3 vdqeveilmkklnfiptsvfttdlqyvdfldrvhkaelklrsknlwevphpwlnlfvpksrisdfdkgvfkgilgnktsgpiliypmnkdkwderssavtpdeevfylva
32 3 vdqeveilmkklnfiptsvfttdlqyvdfldrvhkaelklrsknlwevphpwlnlfvpksrisdfdkgvfkgilgnktsgpiliypmnkdkwderssavtpdeevfylva
AtCKX5
CKX5-A1-WT
CKX5-A1-YIIN801
CKX5-A1-YIIN805
CKX5-C1-WT
CKX5-C1-YIIN811
441 llrsaltdgeetqkleylkdqnrrilefceqakinvkqylphhatqeewvahfgdkwdrfrslkaefdprhilatgqrifqnpslslfppssssssaasw 433 llrsalsdgeetqkleylkdqnrrilefceqakinvkqylphhatqeewvahygdkwdqfrsmkaefdprhilatgqkifqnpslalfrpssssss-asw
433 llrsalsdgeetqkleylkdqnrrilefceqakinvkqylphhatqeewvdhygdrwdqfrsmktefdprhilatgqkifqnpslalfppspssss-asw
(19)
(19)
(19)
109
112
112
129
129
132
132
2022
432
432
432
432
432
432
144
144
144
144
144
144
144
144
144
144
144
144
144
144
999
288
288
288
288
288
288
288
288
288
385
1/3
1/3
2/3
2/3
2/3
2/3
(1)
3/3
(1)
3/3
(1)
3/3
(1)
3/3
|
