[RU]

Изобретение относится к области селекции растений, в частности, к разработке новых растений Brassica с устойчивостью к растрескиванию стручков. В частности, изобретением предусмотрены растения Brassica, содержащие в своем геноме геномный фрагмент Raphanus, причем данный фрагмент придает фенотип устойчивости к растрескиванию стручков POSH ⁺ , а также характеризуется отсутствием по меньшей мере одного SNP по меньшей мере в одном из следующих маркеров Raphanus: SEQ ID NOs 4-18.

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к области селекции растений, в частности, к разработке новых растений Brassica с устойчивостью к растрескиванию стручков. В частности, изобретением предусмотрены растения Brassica, содержащие в своем геноме геномный фрагмент Raphanus, причем данный фрагмент придает фенотип устойчивости к растрескиванию стручков POSH ⁺ , а также характеризуется отсутствием по меньшей мере одного SNP по меньшей мере в одном из следующих маркеров Raphanus: SEQ ID NOs 4-18.

---

Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201890462 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2018.07.31
(22) Дата подачи заявки 2016.08.04
(51) Int. Cl.
A01H1/04 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) C12N15/82 (2006.01)
(54) РАСТЕНИЯ BRASSICA С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К РАСТРЕСКИВАНИЮ СТРУЧКОВ
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
15306287.2
2015.08.11
PCT/EP2016/068612
WO 2017/025420 2017.02.16
Заявитель:
ЛИМАГРЕН ЭРОП (FR)
Изобретатель:
Абель Стефан (DE), Аннетон Лоран (FR), Гегас Василис (GB), Комадран Хорди, Мартинан Жан-Пьер (FR)
Представитель:
Саломатина И.С., Фелицына С.Б.
(RU)
(57) Изобретение относится к области селекции растений, в частности, к разработке новых растений Brassica с устойчивостью к растрескиванию стручков. В частности, изобретением предусмотрены растения Brassica, содержащие в своем геноме геномный фрагмент Raphanus, причем данный фрагмент придает фенотип устойчивости к растрескиванию стручков POSH+, а также характеризуется отсутствием по меньшей мере одного SNP по меньшей мере в одном из следующих маркеров Raphanus: SEQ ID NOs 4-18.
1810041
РАСТЕНИЯ BRASSICA С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К РАСТРЕСКИВАНИЮ
СТРУЧКОВ
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области селекции растений, в частности, к разработке новых растений Brassica с устойчивостью к растрескиванию стручков. Уровень техники
Культура рапса, который также называют "canola" по ту сторону Атлантического океана, широко распространена на всех континентах из-за ее многочисленных достоинств как в пищевом, так и индустриальном секторе. Так, из семян рапса получают много масла, которое широко применяется в качестве пищевого продукта, а также и биотоплива, особенно в автомобильной промышленности и т.п. Из рапса также получают жмых, который является хорошим источником белка в кормах для животных (крупного рогатого скота, свиней и домашней птицы).
Несмотря на эти достоинства, пищевое применение рапсового масла долгое время было ограниченным из-за чрезмерного содержания эруковой кислоты. Так, у различных разновидностей рапса уровень эруковой кислоты может составлять до 50% от общего содержания жирных кислот этого растения, что оказывает пагубное воздействие на здоровье человека.
Точно так же применению рапса для производства кормов тоже долгое время мешало высокое содержание глюкозинолатов в семенах. При получении жмыха из размолотых семян высвобождается фермент мирозиназа, который превращает глюкозинолаты семян в различные побочные продукты типа глюкозы, тиоцианатов, изотиоцианатов и нитрилов, которые могут вызывать метаболические нарушения у млекопитающих. Широкое развитие культуры рапса в основном связано с двумя главными техническими достижениями: снижением уровня эруковой кислоты в масле и снижением уровня глюкозинолатов в семенах. Так, сейчас селекционные станции выпускают коммерческие сорта, у которых уровень эруковой кислоты составляет менее 2% от общего содержания жирных кислот у растений рапса. Более того, в Европе декретом 2294/92 установлено максимальное приемлемое содержание глюкозинолатов в семенах 25 мкмоль на 1 грамм семян при влажности 9%. Поскольку при получении продуктов из семян рапса представляют интерес два параметра: содержание глюкозинолатов и уровень эруковой кислоты, то селекционеры стремились вывести разновидности, называемые "два ноля", то есть разновидности рапса с очень низким уровнем эруковой кислоты в масле и низким содержанием глюкозинолатов в семенах.
Хотя для работ по селекции Brassica важное значение имеют признаки масличных семян, однако для создания более конкурентоспособных новых сортов также проводится селекция и по другим агрономическим признакам. Например, по устойчивости к болезням, урожайности, морфологическим признакам типа длины стручков или физиологическим признакам типа мужской стерильности и восстановления фертильности или устойчивости к растрескиванию. Растрескивание стручков имеет агрономическое значение, так как оно может приводить к преждевременному выпадению семян до сбора урожая. Неблагоприятные погодные условия могут усугублять этот процесс, вызывая потерю более 50% семян. Эта потеря семян не только оказывает сильное влияние на урожайность, но и приводит к тому, что культура превращается в сорняк в следующий вегетационный период.
Для лучшего понимания генетического детерминизма растрескивания стручков использовались мутанты Arabidopsis. Было установлено, что в регуляции устойчивости к растрескиванию стручков участвуют различные гены, кодирующие факторы транскрипции. Например, в развитии краев створки участвуют Shaterproof 1 (SHP1) и 2 (SPH2), NAC, Indehiscent (IND), Alcatraz (ALC). В подавлении экспрессии генов идентичности краев створки участвуют Replumless (RPL) и Fruitfull (FUL). Функции FUL и IND проверялись методом эктопической экспрессии.
У масличных культур типа Brassica napus была выявлена естественная генетическая вариабельность по устойчивости к растрескиванию. Один из главных локусов был идентифицирован из популяции F2, происходящей из китайских родительских линий В. napus, и картирован на хромосоме А09 (Ни Z et al, 2012. Discovery of pod shatter-resistant associated SNPs by deep sequencing of a representative library followed by bulk segregant analysis in rapeseed. PLoS ONE 7:e34253). Проведенные недавно эксперименты на бипарентальной популяции и различных наборах зародышевой плазмы из Brassica napus позволили идентифицировать несколько QTL для устойчивости к растрескиванию стручков. Они были картированы на разных хромосомах в геноме Brassica napus (Raman et al, 2014. Genome-wide delineation of natural variation for pod shatter resistance in Brassica napus. PLoS ONE 9, 7, el01673). Интересно, что авторы делают вывод о трудностях при выявлении функции аллельной вариации в придании устойчивости к растрескиванию стручков, в особенности из-за ожидаемого высокого уровня числа копий различных генов, участвующих в растрескивании стручков, и сложности их организации в геноме.
Рапс является самоопыляющимся видом, причем его разновидности уже давно являются лишь популяционными разновидностями, а не гибридами. Однако разработка гибридных растений рапса представляет большой интерес как для фермеров, так и для
селекционеров, так как она позволяет получить лучшие растения, проявляющие свойства гетерозиса (или гибридной силы), гомеостаза (устойчивости растений в разных средах), возможности введения и комбинирования генов устойчивости к насекомым, грибкам, бактериям или вирусам либо адаптации к абиотическому стрессу. Но такое выведение гибридов рапса требует эффективных средств контроля за опылением. Для этого были разработаны системы цитоплазматической мужской стерильности (CMS, cytoplasmic male sterility) типа Polima и особенно системы Kosena и Ogura.
Система цитоплазматической мужской стерильности Ogura основывается на использовании детерминанты мужской стерильности, полученной из цитоплазмы редиса (Raphanus sativus), которая была перенесена из редиса в Brassica napus посредством межвидовых скрещиваний, спасения зародышей и обратного скрещивания (Bannerot et al, 1974). Для получения гибридов с цитоплазматической мужской стерильностью потребовалось слияние протопластов (Pelletier et al, 1983). Но в CMS Ogura цитоплазматическая мужская стерильность является доминантной, гибридные растения рапса не производят пыльцы, а без пыльцы у растений не образуются семена. Чтобы исправить эту ситуацию и получить урожай, необходимо, чтобы у мужского исходного растения гибрида был ген, восстанавливающий мужскую фертильность. Такой ген, восстанавливающий мужскую фертильность в системе Ogura, был идентифицирован у редиса Raphanus sativus и перенесен в растения Brassica, носители цитоплазматической мужской стерильности, в Национальном институте агрономических исследований в 1987 г. (Pelletier et al, 1987, Proc 7th Int. Rapeseed Conf. Poznan, Poland, 113/119). Восстанавливающий ген Rf описан в патентной заявке WO 92/05251 и в Delourme et al, 1991, Proc 8th Int. Rapeseed Conf. Saskatoon, Canada, 1506/1510. Однако полученные растения, несущие этот ген Rf, восстанавливающий мужскую фертильность, имеют два основных недостатка: значительное повышение уровня глюкозинолатов в семенах и значительное ухудшение агрономических характеристик растений, как-то уменьшение количества произведенных семян, снижение устойчивости к болезням и усиление подверженности к полеганию. Эти недостатки, по-видимому, напрямую связаны с несущим интрогрессию фрагментом, включающим восстанавливающий цитоплазматическую мужскую фертильность ген Rf, перенесенный из Raphanus sativus. Тот участок хромосомы, который не содержит восстанавливающего гена Rf, содержит один или несколько генов, ведущих к вышеуказанным недостаткам. Чтобы исправить эту ситуацию, различные исследовательские программы были направлены на поиск рекомбинационных событий в этом участке хромосомы, разрушающих при рекомбинации существующие связи между сегментами ДНК, кодирующими различные признаки. Хотя
исследованиям мешал тот факт, что участок хромосомы, окружающий восстанавливающий ген Rf, с большим трудом поддается рекомбинации, но в различных патентных заявках описано получение такие рекомбинационных событий во фрагменте из Raphanus, которые дают новые рекомбинантные линии, несущие ген Rf, а также приводят к снижению уровня глюкозинолатов и улучшению размера стручков (см. WO 97/02737, WO 98/27806, WO 2005/002324, WO 2005/074671 и WO2011020698). В каждом из этих документов описано получение специфических событий рекомбинации между геном Rf, восстанавливающим мужскую фертильность, и генами, связанными с высоким уровнем глюкозинолатов в семенах, или генами, связанными с небольшим размером стручков, причем каждое событие характеризуется при помощи определенных маркеров.
Для коммерциализации растений необходим низкий уровень глюкозинолатов в семенах и хороший размер стручков. Одним из эффективных способов снижения уровня глюкозинолатов и улучшения размера стручков в растениях Ogura с восстанавливающим геном является уменьшение интрогрессии Raphanus. С другой стороны, снижение размера фрагмента Raphanus может привести к устранению нужных агрономических признаков. Одним из этих агрономических признаков, пропадающих после уменьшения размера фрагмента Raphanus, является устойчивость к растрескиванию стручков, которая имеет большое значение для уменьшения потери семян перед сбором урожая и является главным преимуществом гибридов Ogura. Поэтому необходимы новые разработки в этой области, но они сильно затруднены из-за очень низкого уровня рекомбинации во фрагменте Raphanus, отсутствия картирования или секвенирования генома Raphanus, а тем самым отсутствия каких-либо маркеров, специфичных для этого фрагмента, наконец, из-за сложности генома Brassica.
В этом контексте одной из основных целей изобретения является получение растений Brassica, преодолевающих все недостатки, приведенные выше. В частности, одной из целей является получение растений Brassica, содержащих укороченный фрагмент Raphanus, включающий аллели устойчивости к растрескиванию стручков. Такие растения Brassica преимущественно могут применяться для селекции, чтобы легко переносить такие аллели устойчивости к растрескиванию стручков в другие растения Brassica с другим генетическим фоном. В частности, одной из целей настоящего изобретения является получение растений Brassica, содержащих укороченный фрагмент Raphanus, включающий аллели устойчивости к растрескиванию стручков и восстанавливающий мужскую фертильность ген RfO.
Другая цель изобретения заключается в том, чтобы идентифицировать новые растения Raphanus с устойчивостью к растрескиванию стручков, которые можно
использовать при работе по селекции Brassica.
Следующая цель изобретения состоит в том, чтобы получить растения Brassica, включающие устойчивость к растрескиванию стручков из Raphanus, и использовать эти растения для интрогрессии устойчивости к растрескиванию стручков в растения Brassica, несущие фенотип устойчивости к растрескиванию стручков.
Другой целью изобретения является получение семян, гибридных растений и потомства указанных растений Brassica.
Изобретение также касается способов идентификации наличия данных аллелей устойчивости к растрескиванию стручков в растениях Brassica, в частности, подходящих маркеров, связанных (или не связанных) с указанным новым признаком устойчивости к растрескиванию стручков.
Сущность изобретения
Итак, здесь раскрыты растения Brassica, содержащие в своем геноме геномный фрагмент Raphanus, причем данный фрагмент придает фенотип устойчивости к растрескиванию стручков POSH+, а также характеризуется отсутствием по меньшей мере одного SNP Raphanus по меньшей мере в одном из следующих маркеров: SEQ ID NOs 418.
В одном конкретном воплощении данных растений Brassica геномный фрагмент Raphanus дополнительно определяется наличием по меньшей мере одного SNP Raphanus в маркерах SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21. Например, указанные SNP Raphanus отсутствуют в маркерах SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 12-18. Например, указанные SNP Raphanus отсутствуют во всех маркерах SEQ ID NOs 4-18.
В другом конкретном воплощении приведенные здесь растения Brassica дополнительно содержат аллель Fruitfull из Raphanus. Как правило, данный аллель Fruitfull из Raphanus содержит SNP Raphanus в маркере SEQ ID NO: 22.
В определенных воплощениях приведенные выше растения Brassica также содержат локус восстановления мужской фертильности RfO внутри фрагмента из Raphanus.
В других конкретных воплощениях приведенные выше растения Brassica содержат цитоплазму CMS Ogura.
Также здесь раскрыты гибридные растения Brassica, полученные при скрещивании растений Brassica, содержащих фрагмент из Raphanus, придающий фенотип POSH+, как описано выше, с другими растениями Brassica, не содержащими данного фрагмента из Raphanus, придающего фенотип POSH+, причем данные гибридные растения содержат геномный фрагмент из Raphanus, придающий фенотип устойчивости к растрескиванию
стручков POSH+.
Также раскрыты семена или части растений либо потомство данных растений Brassica.
Другой приведенный здесь аспект касается способов идентификации растений Brassica POSH+, как описано выше, причем данные растения Brassica идентифицируются по наличию одного или нескольких SNP Raphanus по меньшей мере в одном из следующих маркеров SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и/или отсутствию SNP Raphanus по меньшей мере в одном из следующих маркеров: SEQ ID NOs 4-18.
В определенных воплощениях такого способа растения Brassica POSH+ идентифицируют по наличию аллеля Fruitfull из Raphanus, а более предпочтительно маркера Raphanus SEQ ID NO: 22.
Другой приведенный здесь аспект касается новых средств для выявления одного или нескольких SNP Raphanus в одном или нескольких из следующих маркеров: SEQ ID NO: 4-22.
Такими средствами, как правило, могут быть зонды или праймеры из нуклеиновых кислот или наборы праймеров либо их комбинации, к примеру, один или несколько праймеров, включающих в себя любые из SEQ ID NO: 64-99, 106-108, 112-114 и 52-54.
Такие растения или семена Brassica, раскрытые здесь, пригодны для пищевого применения, предпочтительно для получения масла, и для кормового применения, предпочтительно для получения жмыха, или для селекционного применения, к примеру, для применения в качестве исходных растений при селекции для улучшения агрономической ценности растений, линий, гибридов или сортов Brassica.
Также раскрыт способ получения растений Brassica POSH+, причем способ включает следующие стадии:
a) скрещивание первого растения Brassica с фенотипом POSH+ по настоящему изобретению, как описано выше, со вторым растением Brassica POSH" или POSH+, получая при этом гибридное растение F1;
b) самоопыление или возвратное скрещивание гибридного растения F1 с указанным вторым растением Brassica POSH" или POSH+;
c) отбор растений Brassica POSH+ среди растений, полученных на стадии Ь), необязательно используя по меньшей мере один SNP Raphanus по меньшей мере в одном из маркеров SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21; и
d) необязательно дополнительный отбор данных растений Brassica POSH+ по отсутствию по меньшей мере одного из SNP Raphanus по меньшей мере в одном из маркеров SEQ ID NOs 4-18.
a)
В определенных воплощениях такого способа второе растение Brassica POSH-характеризуется отсутствием в своем геноме какого-либо фрагмента генома Raphanus.
В другом конкретном воплощении такого способа первым растением служит растение, полученное из репрезентативного образца семян, депонированных в коллекции NCIMB за номером 42444.
Также раскрыт способ получения растений Brassica POSH+ по настоящему изобретению, как описано выше, причем способ включает следующие стадии:
a) получение первого растения Brassica POSH+, содержащего интрогрессию из Raphanus, придающую признак POSH+, причем данная интрогрессия из Raphanus включает по меньшей мере один из SNP Raphanus в одном или нескольких из следующих маркеров: SEQ ID NOs 4-18;
b) скрещивание данного первого растения Brassica POSH+ со вторым растением Brassica POSH" или POSH+, получая при этом гибридное растение F1;
c) самоопыление или возвратное скрещивание гибридного растения F1 с указанным вторым растением POSH" или POSH+;
d) отбор растений Brassica POSH+ среди растений, полученных на стадии с), необязательно проводя отбор по наличию по меньшей мере одного SNP Raphanus по меньшей мере в одном из маркеров SEQ ID NO: 19, SEQ Ш NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и/или необязательно дополнительный отбор по отсутствию по меньшей мере одного SNP Raphanus по меньшей мере в одном из маркеров SEQ ID NOs 4-18.
В определенных воплощениях вышеприведенного способа указанное первое растение Brassica POSH+ содержит восстанавливающий фертильность Ogura ген RfO.
Изобретение также касается растений Brassica, получаемых или полученных вышеприведенными способами получения.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена стратегия неспецифичного для генома подхода, применявшегося для маркеров Fruitfull_Hl_04.
На фиг. 2 представлена стратегия специфичного для генома подхода, применявшегося для маркеров Fruitfull spe Ol при совмещении последовательностей Raphanus и Brassica.
Раскрытие сущности изобретения
Растения Brassica
В настоящем изобретении термин "растения Brassica" охватывает растения видов Brassica, включая В. napus, В. juncea и В. гара; предпочтительно В. napus.
В настоящем изобретении "растрескивание стручков", а также "растрескивание
плодов или стручков" относится к процессу, который имеет место в плодах после созревания семян, при котором от центральной перегородки отделяются створки, высвобождая семена. Участок разрыва (т.е. зона "растрескивания") проходит по всей длине плода между створками и наружной перегородкой (внешней перегородкой). При созревании "зона растрескивания" представляет собой практически неодревесневший слой клеток между участками одревесневших клеток в створке и наружной перегородке. Растрескивание происходит вследствие разрыхления клеточной стенки в зоне растрескивания в сочетании с растяжением, обусловленным дифференциальными механическими свойствами высыхающих клеток в стручке.
Признак растрескивания стручков обычно измеряется с помощью лабораторных испытаний, имитирующих силы, действующие на стручки в естественных условиях. Существуют различные методы, как описано в Kadkol et al, 1984. Evaluation of Brassica accessions for resistance to shatter. Euphytica, 33, 61-71; Liu et al, 1994. Pendulum test for evaluation of rupture strength of seed pods. Journal of Texture Studies, 25, 179-189; или же способ, описанный в примере 3 настоящего изобретения. В этом последнем способе стручки собирают на стадии полной зрелости (ВВСН97). Устойчивость к растрескиванию стручков соответствует напряжению, которое необходимо для отрыва двух створок стручка друг от друга.
В настоящем изобретении растения Brassica, у которых стручки имеют значения напряжения, большие или равные 2,3 ньютона (N), определяются как устойчивые к растрескиванию стручков. В настоящем описании они также определяются как POSH+, что означает присутствие участка POSH из Raphanus в геноме растений. В определенных воплощениях растения Brassica POSH+ должны иметь стручки с устойчивостью от 2,3 до 7N (единиц). Предпочтительно растения Brassica POSH+ должны иметь стручки с устойчивостью от 2,3 до 5N. В общем случае растения Brassica POSH+ могут представлять собой растения Brassica, содержащие в своем геноме длинную интрогрессию из генома Raphanus, или же это могут быть одни из растений Brassica по настоящему изобретению.
В настоящем изобретении растения Brassica со стручками, имеющими значения напряжения менее 2,3N, определяются как неустойчивые к растрескиванию стручков. В частности, напряжение у стручков должно быть выше 0,6N. В настоящем описании они также именуются как POSH", что означает отсутствие участка POSH из Raphanus в геноме растений. В более общем плане растения Brassica POSH" могут быть фертильными или нет, к примеру, они могут содержать или нет восстанавливающий фертильность ген RfO, а также могут быть стерильными или нет, к примеру, они могут содержать или нет цитоплазму Ogura с мужской стерильностью, а также могут быть самодостаточными или
нет. Более того, данные растения Brassica POSH" могут содержать интрогрессию из Raphanus или не содержать её.
В настоящем изобретении термин "аллель" означает одну из нескольких альтернативных форм гена в определенном локусе. У диплоидных (или амфидиплоидных) клеток организма аллели данного гена располагаются в определенном месте или локусе на хромосоме. В каждой хромосоме из пары гомологичных хромосом присутствует один аллель.
При упоминании "растения" или "растений" подразумевается, что это охватывает и части растений (клетки, ткани или органы, семенные стручки, семена, оторванные части типа корней, листьев, цветков, пыльцы и пр.), потомство растений, сохраняющее отличительные характеристики исходных растений (особенно устойчивость к растрескиванию стручков, связанную с фрагментом из Raphanus), как-то семена, полученные при самоопылении или скрещивании, напр., гибридные семена (полученные при скрещивании двух инбредных исходных растений), гибридные растения и происходящие из них части растений, если не указано иначе.
В настоящем изобретении "геномный фрагмент Raphanus" означает интрогрессию, предпочтительно исходную интрогрессию, а также любые возникающие при этом рекомбинантные фрагменты из генома Raphanus sativa в геноме Brassica napus, причем такая интрогрессия встречается во многих коммерческих сортах Brassica, включая, без ограничения, сорта Albatros или Artoga. Для удобства при чтении исходная интрогрессия будет определяться в дальнейшем как "длинная интрогрессия из генома Raphanus".
Такая длинная интрогрессия из генома Raphanus в геноме Brassica napus также включает ген RfO для восстановления фертильности в системе CMS Ogura. Эта длинная интрогрессия из Raphanus не может содержать фрагментов генома Brassica napus. Примеры коммерческих сортов Brassica, содержащих длинный интрогрессионный фрагмент из Raphanus, представлены на фиг. 5, как-то Albatros или Artoga.
Также была описана более короткая интрогрессия из генома Raphanus в геноме Brassica napus, причем данная интрогрессия включает ген RfO для восстановления фертильности в системе CMS Ogura, но теперь уже изобретатели установили, что такая более короткая интрогрессия не включает участок генома, называемый POSH+, придающий устойчивость к растрескиванию стручков. Примеры коммерческих сортов Brassica, содержащих такой более короткий интрогрессионный фрагмент из Raphanus, представлены на фиг. 5, к примеру, Anterra, а также описаны в патентных заявках WO 02011/020698, WO 97/02737, WO 98/27806, WO 2005/074671 или WO 2005/074671.
В настоящем изобретении термин "интрогрессия" относится к переносу фрагмента
ДНК из определенного вида, в данном случае из вида Raphanus sativus, в растения другого вида, в данном случае Brassica, более предпочтительно Brassica napus.
В настоящем изобретении "маркер" означает определенную последовательность ДНК, идентифицированную в геноме растения, которая может использоваться для определения того, унаследовало ли растение определенный фенотип или представляющий интерес аллель от исходного растения. Такой маркер может включать кодирующие или некодирующие последовательности. В частности, такой маркер может содержать один или несколько однонуклеотидных полиморфизмов или SNP, идентифицированных между геномами Raphanus и В. napus. Также можно идентифицировать полиморфизмы типа делеции/вставки последовательности (indel). В настоящем изобретении не рассматривается геном В. гара, поэтому будет подлежать идентификации геном В. napus, а также геном В. oleracea.
В настоящем изобретении "SNPs Raphanus" соответствуют нуклеотидам, представленным в геноме Raphanus в полиморфном положении по сравнению с геномом В. oleracea.
В настоящем изобретении представлены SNPs Raphanus в маркерах (идентифицированных по их нуклеотидной последовательности) для определения в растениях Brassica того, сохраняется ли в каком-либо рекомбинантном фрагменте от длинной интрогрессии из Raphanus аллель POSH+, придающий устойчивость к растрескиванию стручков. Соответственно, растения Brassica по настоящему изобретению содержат рекомбинантный фрагмент от такой длинной интрогрессии, который предпочтительно короче, чем при длинной интрогрессии, но сохраняет по крайней мере аллель POSH+.
В частности, некоторые SNPs Raphanus, встречающиеся при указанной длинной интрогрессии из Raphanus, характеризуются тем, что они не связаны с аллелем POSH+. Такие SNP входят в число следующих 15 маркеров: SEQ ID NOs 4-18.
Соответственно, растения Brassica по настоящему изобретению содержат в своем геноме геномный фрагмент Raphanus, причем данный фрагмент придает фенотип устойчивости к растрескиванию стручков (POSH+), а сам фрагмент характеризуется отсутствием хотя бы одного SNP Raphanus по меньшей мере в одном из следующих маркеров: SEQ ID NOs 4-18.
Для каждого из этих маркеров был идентифицирован SNP Raphanus (см. табл. 2). Предпочтительно в указанных растениях Brassica отсутствуют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или все эти SNP.
При указанной длинной интрогрессии Raphanus были обнаружены SNP и в других
маркерах, в частности, SNP Raphanus, которые характеризуются как связанные с аллелем POSH+. Такие SNP Raphanus идентифицированы в последовательностях следующих трех маркеров: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21.
В одном конкретном воплощении указанные растения Brassica содержат в своем геноме фрагмент генома Raphanus, но без участков, включающих в себя SNPs Raphanus в маркерах по SEQ ID NO: 12-18 и SEQ ID NO: 9.
В одном конкретном воплощении указанные растения Brassica содержат в своем геноме фрагмент генома Raphanus, но без участков, включающих в себя SNPs Raphanus в маркерах по SEQ ID NOs 4-18.
В другом конкретном воплощении, которое может комбинироваться с предыдущими воплощениями, указанные растения Brassica содержат по меньшей мере участки фрагмента генома Raphanus, включающие в себя 1, 2 или 3 SNPs Raphanus в следующих маркерах: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, причем данные SNPs приведены в табл. 1.
В качестве альтернативы, в другом конкретном воплощении, указанные растения Brassica содержат по меньшей мере участок фрагмента генома Raphanus, включающий аллель Fruitfull из Raphanus, который идентифицируется по следующим маркерам: SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 31.
В другом конкретном воплощении растения Brassica не являются трансгенными растениями. Трансгенными или "генетически модифицированными организмами" (ГМО) в настоящем изобретении являются организмы, у которых генетический материал был изменен с помощью методов, обычно известных как "технология рекомбинантной ДНК". Технология рекомбинантной ДНК - это способность комбинировать молекулы ДНК из разных источников в одной молекуле ex vivo (напр., в пробирке). Эта терминология вообще не охватывает организмы, генетический состав которых был изменен путем стандартного скрещивания или селекции при помощи "мутагенеза". Таким образом, "не трансгенными" являются растения и пищевые продукты, полученные из растений, не являющихся "трансгенными" или "генетически модифицированными организмами".
Изобретение также касается гибридных растений Brassica, которые могут быть получены при скрещивании растений Brassica, полученных выше, со вторым растением. Например, гибридные растения Brassica могут быть получены при скрещивании описанных здесь растений Brassica, содержащих фрагмент из Raphanus, придающий фенотип POSH+, с другими растениями Brassica, не содержащими указанного фрагмента Raphanus, придающего фенотип POSH+, причем указанные гибридные растения содержат геномный фрагмент из Raphanus, который придает фенотип устойчивости к
растрескиванию стручков POSH+.
Способы получения гибридных растений хорошо известны в данной области. Как правило, гибридные растения получают, предотвращая самоопыление исходных женских растений, что позволяет пыльце из исходных мужских растений оплодотворять такие женские растения и давать гибридные семена F1 на женских растениях. Самоопыление можно предотвратить путем эмаскуляции цветков на ранней стадии развития цветка. С другой, можно предотвратить образование пыльцы на исходных мужских растениях, используя какую-либо форму мужской стерильности. Гибридные растения можно получить с помощью различных генетических систем, хорошо известных специалистам в данной области, таких, к примеру, как системы CMS типа системы Ogura или системы Kosena (см. Yamagashi and Bhat, 2014, Breeding Science, 64: 38-47) либо системы MSL (Male Sterility Lembke) (Pinochet et al, 2000 OCL-Leagineux Corps Gras Lipides 7:11-16). Предпочтительно гибридные растения по изобретению получают с помощью системы Ogura.
Поэтому здесь также раскрыты растения или линии Brassica по настоящему изобретению, разработанные для получения таких гибридных растений. Такие растения или линии обычно содержат генетические и/или цито плазматические элементы, необходимые для реализации соответствующей гибридной системы. Предпочтительно эти растения или линии содержат восстанавливающий фертильность ген RfO и/или цитоплазму из системы Ogura.
Способ получения растений Brassica с фенотипом устойчивости к растрескиванию стручков (POSH+)
Настоящее изобретение также касается новых способов получения растений Brassica с фенотипом устойчивости к растрескиванию стручков (POSH+), которые описаны в предыдущем разделе.
В одном воплощении указанный способ включает следующие стадии:
a) получение первого растения Brassica POSH+, содержащего интрогрессию из Raphanus, придающую устойчивость к растрескиванию стручков POSH+, причем данная интрогрессия из Raphanus включает по меньшей мере один из SNP Raphanus в одном или нескольких из следующих маркеров: SEQ ID NOs 4-18;
b) скрещивание данного первого растения Brassica POSH+ со вторым растением Brassica POSH" или POSH+, получая при этом гибридное растение F1;
c) самоопыление или возвратное скрещивание гибридного растения F1 с указанным вторым растением POSH" или POSH+;
d) отбор растений Brassica POSH+ среди растений, полученных на стадии с),
необязательно проводя отбор по наличию по меньшей мере одного SNP Raphanus по меньшей мере в одном из маркеров SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и/или необязательно дополнительный отбор по отсутствию по меньшей мере одного SNP Raphanus по меньшей мере в одном из маркеров SEQ ID NOs 4-18.
Преимущественно в качестве первого растения Brassica можно использовать один из известных сортов, включающий длинную или короткую интрогрессию. В конкретном воплощении второе (возвратное) растение Brassica, которое используется в приведенном выше способе, представляет собой растение Brassica, характеризующееся отсутствием какого-либо фрагмента генома Raphanus в своем геноме, т.е. это растение, в которое не попал фрагмент гена Raphanus при интрогрессии. В качестве альтернативы указанное второе растение Brassica не содержит по меньшей мере гена Rf для восстановления фертильности в системе CMS Ogura и не содержит участка устойчивости к растрескиванию стручков (POSH-). Этим вторым растением Brassica может быть, к примеру, растение Brassica napus дикого типа POSH" без гена Rf. С другой стороны, данное второе растение может содержать короткую интрогрессию, включающую восстанавливающий фертильность Ogura ген RfO. В другом конкретном воплощении первое растение Brassica дополнительно включает восстанавливающий фертильность Ogura ген RfO.
На стадии с возвратное скрещивание гибридного растения F1 с возвратным вторым растением имеет целью снижение содержания генома возвратного растения и снижение содержания генома родительского растения (содержащего интрогрессию Raphanus). Благодаря маркерам отбора, приведенным выше, можно отобрать/сохранить фенотип POSH+ в процессе отбора.
Заявитель депонировал образец семян раскрытого растения Brassica с указанной интрогрессией из Raphanus, придающей признак POSH+, в соответствии с Будапештским договором, в коллекции NCIMB за номером 42444.
Настоящее изобретение также включает в себя и предусматривает способы идентификации растений Brassica POSH+, как описано в предыдущем разделе, и в более общем плане способы отбора или селекции растений Brassica на присутствие или отсутствие аллеля POSH+, который содержится в интрогрессии из Raphanus, к примеру, в виде молекулярно-ориентированных программ. Такие способы идентификации, отбора или селекции растений Brassica включают получение одного или нескольких растений Brassica и оценку их ДНК для определения наличия или отсутствия аллеля POSH+, содержащегося в интрогрессии Raphanus, и/или наличия или отсутствия других аллелей или маркеров, к примеру, других маркеров интрогрессии Raphanus, не связанных с
аллелем POSH+. Такие способы могут применяться, к примеру, для определения того, какое потомство, полученное при скрещивании, содержит аллель POSH+, и в соответствии с этим направлять получение растений, имеющих аллель POSH+, в сочетании с наличием или отсутствием других желательных признаков.
В определенных воплощениях определение присутствия аллеля POSH+ или других маркеров включает определение наличия маркеров интрогрессии Raphanus, связанных с аллелем POSH+, и/или отсутствия маркеров интрогрессии Raphanus, не связанных с аллелем POSH+. Соответственно, растения можно идентифицировать или отбирать путем оценки их на наличие одного или нескольких индивидуальных SNP, представленных в табл. 1 для POSH+, и/или на отсутствие одного или нескольких индивидуальных SNP, представленных в табл. 2 для фрагментов Raphanus, не связанных с аллелем POSH+.
В одном конкретном воплощении также можно идентифицировать локус RfO.
маркеров в табл. 1 и табл. 2 выделены жирным шрифтом. Конечно, специалисты могут использовать и другие SNP Raphanus, идентифицированные в вышеуказанных маркерах, представленных в табл. 1 и табл. 2. Некоторые из этих SNPs в вышеприведенных последовательностях обозначены по кодировке IUPAC.
В более общем плане здесь раскрыты конкретные средства для выявления аллеля POSH+ при интрогрессии Raphanus в растениях, более конкретно в растениях Brassica.
Так, указанные средства включают любые средства, подходящие для выявления
следующих маркеров SNP Raphanus в одном или нескольких из следующих маркеров: SEQ ID NOs 4-22.
Для оценки наличия или отсутствия SNP можно использовать любые известные в данной области методы. Некоторые подходящие методы включают, без ограничения, секвенирование, гибридизационные методы, полимеразные цепные реакции (1ТЦР), лигазные цепные реакции (LCR) и генотипирование по последовательности (GBS) либо их комбинации.
Специалистам в данной области доступны различные методы на основе ПНР. Можно использовать метод RT-PCR или метод Kaspar фирмы KBioscience (LGC Group, Teddington, Middlesex, UK).
В системе генотипирования KASP(tm) используются три специфичных к мишени праймера: два праймера, каждый из которых специфичен для каждой аллельной формы SNP (однонуклеотидного полиморфизма), и еще один праймер для проведения обратной амплификации, который является общим для обеих аллельных форм. Каждый специфичный к мишени праймер также содержит хвостовую последовательность, которая соответствует одному из двух зондов для FRET: один помечен красителем FAM(r), а другой - красителем HEX(r).
Проводятся последовательные реакции ПЦР, причем последняя заключается в амплификации зондов. Характер излучаемой флуоресценции используется для идентификации аллельной формы или форм, присутствующих в смеси от исследуемой ДНК.
Для системы генотипирования KASP(tm) особенно подходят праймеры, приведенные в табл. 3. Конечно, специалисты могут использовать и другие варианты праймеров или зондов из нуклеиновых кислот, приведенных в табл. 3, причем данные варианты праймеров или зондов из нуклеиновых кислот должны быть по меньшей мере на 90%, а предпочтительно на 95% идентичны по последовательности каким-либо праймерам, приведенным в табл. 3, или геномным фрагментам ДНК, амплифицированным с помощью соответствующих наборов праймеров, приведенных в табл. 3.
Степень идентичности последовательностей в настоящем изобретении определяется путем вычисления количества совпадающих положений при совмещении последовательностей нуклеиновых кислот, деления числа совпадающих положений на общее количество совмещенных нуклеотидов и умножения на 100. Совпадающее положение означает такое положение, в котором при совмещении последовательностей нуклеиновых кислот в одном и том же положении находятся идентичные нуклеотиды. Например, совмещение последовательностей нуклеиновых кислот может проводиться с
помощью программы BLAST для 2 последовательностей (B12seq) с использованием алгоритмов BLASTN (www.ncbi.nlm.nih.gov).
В настоящем изобретении праймер означает такую нуклеиновую кислоту, которая способна направлять синтез образующейся нуклеиновой кислоты в зависящем от матрицы процессе типа П1 IP Как правило, праймеры представляют собой олигонуклеотиды из 1030 нуклеотидов, но можно использовать и более длинные последовательности. Праймеры могут быть представлены в двухцепочечной форме, хотя предпочтительна одноцепочечная форма. С другой стороны, можно использовать зонд из нуклеиновой кислоты. Зонд из нуклеиновой кислоты означает такую нуклеиновую кислоту по меньшей мере из 30 нуклеотидов, которая может специфически гибридизироваться в стандартных строгих условиях с заданной нуклеиновой кислотой. Стандартные строгие условия в настоящем изобретении относятся к условиям гибридизации, описанным, к примеру, в Sambrook et al. 1989, которые могут включать: 1) иммобилизацию фрагментов геномной ДНК растений или библиотечной ДНК на фильтре, 2) предварительную гибридизацию фильтра в течение 1-2 часов при 65°С в 6> В определенных воплощениях указанные праймеры для выявления SNP-маркеров по настоящему изобретению представлены в следующей таблице.
Растения Brassica настоящего изобретения могут применяться для селекционных работ. В настоящем изобретении работы по селекции охватывают селекцию семенного материала для улучшения агрономической ценности растений, линий, гибридов или сортов. В конкретном воплощении это относится к работам по возвратному скрещиванию с целью создания новых рекомбинантных линий в представляющем интерес участке генома или для интрогресии такого участка в другие растения, не содержащие такого участка. Как правило, в настоящем изобретении растения Brassica применяются для интрогрессии участка из Raphanus, придающего фенотип POSH+, в другие растения.
Соответственно, далее изложен способ получения растений Brassica POSH+, причем способ включает следующие стадии:
a) скрещивание первого растения Brassica, как описано в предыдущем разделе, со вторым растением Brassica POSH" или POSH+, получая при этом гибридное растение F1;
b) самоопыление или возвратное скрещивание данного гибридного растения F1 с
указанным вторым растением Brassica POSH" или POSH+;
c) отбор растений Brassica POSH+ среди растений, полученных на стадии Ь), необязательно используя по меньшей мере один SNP Raphanus по меньшей мере в одном из маркеров SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21; и
d) необязательно дополнительный отбор данных растений Brassica POSH+ по отсутствию по меньшей мере одного из SNP Raphanus по меньшей мере в одном из маркеров SEQ ID NOs 4-18.
В одном конкретном воплощении первым растением, которое используется в вышеизложенном способе, служит растение, полученное из репрезентативного образца семян, депонированных 27 июля 2015 г. в коллекции NCIMB под номером доступа 42444, полученных из Brassica napus R42141F, как описано ниже в примере 5.
Также частью настоящего изобретения являются растения Brassica, получаемые или полученные изложенными способами получения растений Brassica с фенотипом POSH+.
Раскрытые здесь растения Brassica также применимы, к примеру, для получения масла канола. Семена, собранные из описанных здесь растений, можно использовать для получения неочищенного масла канола или очищенного, отбеленного, дезодорированного (RBD) масла канола. Собранные семена канолы можно раздробить известными в данной области методами. Семена можно довести до кондиции, распыляя на них воду, чтобы повысить влажность, к примеру, до 8,5%. Доведенные до кондиции семена можно размельчить с помощью гладких вальцов с зазором, к примеру, от 0,23 до 0,27 мм. Мятка может быть подвергнута тепловой обработке для дезактивации ферментов, облегчения дальнейшего разрушения клеток, слипания масляных капель или агломерации белковых частиц с тем, чтобы облегчить процесс экстракции. Как правило, масло извлекают из нагретой мятки канолы с помощью шнекового пресса, отжимая из нее большую часть масла. Полученные выжимки содержат некоторое количество остаточного масла.
Неочищенное масло, полученное при операции прессования, обычно пропускают через осадительный резервуар с проволочной щелевой сливной крышкой, чтобы удалить твердые вещества, отжатые вместе с маслом при работе шнека. Осветленное масло можно пропустить через рамный фильтр-пресс для удаления мелких твердых частиц. Выжимки, полученные при операции шнекового прессования, можно экстрагировать коммерческим н-гексаном. Масло канолы, извлеченное при экстракции, объединяют с осветленным маслом от операции шнекового прессования, получая смешанное неочищенное масло.
Растения Brassica или их масло также применимы в качестве пищевых композиций для человека или животных. Масло также может применяться в биотопливе.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Создание новых рекомбинантных растений Brassica
Brassica napus - относительно молодая культура, которая все еще проявляет некоторые характеристики дикого вида. Одной из этих характеристик является тенденция к растрескиванию стручков во время сбора урожая. Было показано, что некоторые гибриды Ogura В. napus обладают гораздо лучшей устойчивостью к растрескиванию стручков. Для того, чтобы изучить этот признак и получить новые рекомбинантные линии, в январе 2011 г. было проведено 204 скрещивания. При этом мужские растения Ogura и гибридные с первоначальной интрогрессией Raphanus, несущей устойчивость к растрескиванию стручков, скрещивали с мужскими растениями Ogura с укороченными интрогрессиями Raphanus или с инбредными линиями, не содержащими интрогрессии Raphanus. Кроме того, мужские растения Ogura с укороченными интрогрессиями Raphanus скрещивали с инбредными линиями, не содержащими интрогрессии Raphanus. В ноябре 2011 г. полученные растения F2 подвергали генотипированию с помощью SNP-маркеров, располагающихся на С09 и фланкирующих интрогрессию Raphanus. Один SNP-маркер фланкирует интрогрессию Raphanus в теломерной области, а четыре других SNP-маркера фланкируют интрогрессию Raphanus в центромерной области.
Следовательно, все комбинации маркерных профилей теломерных и центромерных SNP-маркеров, которые отсутствовали у родителей при соответствующем скрещивании, указывают на рекомбинацию между этими маркерами, а тем самым, вероятно, в пределах интрогрессии Raphanus, располагающейся между этими маркерами. При таком подходе из 11770 растений F2 было идентифицировано 62 потенциальных рекомбинантных растения. Такой скрининг повторяли в 2013, 2014 и 2015 годах. Самоопыленные семена от всех 62 потенциальных рекомбинантов из 2012 г. высеивали в виде F3 для проверки результатов по растениям F2. Растения F3 снова подвергали анализу с помощью теломерных и центромерных SNP-маркеров, фланкирующих интрогрессию, а также SNP-маркеров BnRfo5 (представленных как SEQ ID NO: 1) и SSR-маркеров С08 и Boljon (представленных как SEQ ID NO: 2), расположенных на интрогрессии Raphanus. Линии F3, у которых была подтверждена рекомбинация, продолжали до F4.
Пример 2. Разработка новых маркеров
Изучение новых рекомбинантных растений с помощью молекулярных маркеров весьма затруднительно. Так, с одной стороны, интрогрессия заменила часть генома Brassica napus, и трудно найти маркеры, которые работают как у Raphanus, так и В. napus. Кроме того, из-за низкого уровня рекомбинации в этом участке невозможно картировать положение маркеров на участке интрогрессии по сцеплению. Поэтому возможности
описания интрогрессии были весьма ограничены. Чтобы решить проблему выявления SNP, мы использовали подход на основе секвенирования типа Next Generation Sequencing (NGS) на транскриптоме вегетативной ткани.
В частности, брали образцы из 118 фиксированных восстанавливающих линий и 27 фиксированных женских линий через 4 недели после стадии прорастания и быстро замораживали их при подготовке к экстракции РНК. В каждом комбинированном образце измеряли концентрацию РНК, используя по 1 мкл каждого образца РНК на флуорометре Qubit (Invitrogen). Для преобразования тотальной РНК в библиотеку матричных молекул, пригодных для высокопроизводительного секвенирования ДНК для последующего создания кластеров, использовали текущую версию набора mRNA-Seq фирмы Illumina в соответствии с протоколом изготовителя. Библиотеки готовили из 5 мкг тотальной РНК, при этом количественное определение и оценку качества проводили путем пропускания 1 мкл библиотеки на Agilent DNA 1000 LabChip (Bioanalyzer 2100, Agilent Technology). Библиотеки мультиплексировали по две на каждую дорожку, наносили на прибор Illumina HiSeq2000, следуя инструкциям производителя, и выполняли 100 циклов (одностороннее считывание), получая не менее 2,0 Гбит последовательности на 1 образец.
Для разработки маркеров по изобретению, применимых для идентификации новых рекомбинантных линий, проводили совмещение исходных последовательностей и выявление SNP по всему комплекту линий с помощью скриптов MAQ (Li et al, Genome Research 18: 1851-1858, 2008) и Perl (Trick et al, Plant Biotech J. 7:334, 2009; Bancroft et al, 2011).
По 143 линиям OSR, для которых были получены данные по последовательности, в среднем 1,59х 107 прочтений последовательностей по 100 оснований (1,59 Гб данных о последовательностях) сопоставляли с 50,4 Мб референтных последовательностей, что дает 31,5-кратный охват. В результате получили набор данных по маркерам, содержащий 84 022 простых SNP (28 402 после удаления таковых с небольшой частотой аллелей менее 5%) и 119 523 полу-SNP (80 100 после удаления таковых с небольшой частотой аллелей менее 5%). Преимущество простых SNP состоит в том, что эти маркеры с большей уверенностью можно отнести к одному из двух геномов масличного рапса, чем маркеры типа полу-SNP. Анализ проводился с целью идентификации SNP-маркеров, связанных с обозначением линий как мужские родительские (MP) или женские родительские (FP). Было идентифицировано 169 маркеров, которые полностью разграничивали эти типы. Все 169 маркеров имели общие характеристики аллеля, включающие неоднозначный код (то есть означающий наличие 2 оснований) для линий MP и определенное основание для линий FP, что согласуется с добавлением дополнительного геномного сегмента (то есть
того, который связан с восстанавливающим CMS локусом из редиса). Маркеры группировались преимущественно в двух парах гомологичных участков на группах сцепления А9 и С9, а несколько в участках, паралогичных этим.
Авторы изобретения разработали около 550 новых SNP-маркеров, специфичных для интрогрессии Raphanus. При сопоставлении этих SNP с геномом В. oleracea при помощи BLAST был сделан вывод, что специфические маркеры для интрогрессии Raphanus охватывают около 24 М.п.о. (длина интрогрессии Raphanus), что составляет около 50% хромосомы С09.
Более того, мы идентифицировали большое количество маркеров, которые функциональны в исходном В. napus, но отсутствуют в восстанавливающих линиях Ogura. При сопоставлении их с геномом В. oleracea при помощи BLAST оказалось, что эти маркеры опять же охватывают около 24 М.п.о. (утерянный сегмент хромосомы В. napus). Это также подтверждается результатами по матрице Illumina 50k Chip, где маркеры также отсутствовали в материале с восстанавливающим геном, охватывающем фрагмент ок. 22 М.п.о.
Эти результаты четко показывают, что одно плечо хромосомы С09 было заменено одним плечом хромосомы Raphanus, когда возникла интрогрессия Ogura.
Пример 3. Характеристика фенотипа новых рекомбинантных линий
Стойкость стручков можно измерить с помощью теста, разработанного Dr. Schulz в
Institute LFA-Mecklenburg-Vorpommern, который описан в марте 2013 г. в Abschlussbericht
2013, Forschungsnummer 1/29, im Forschungskomplex: Verfahrensoptimierung zur
Verbesserung der Wirtschaftlichkeit (http://www.landwirtschaft-
mv.de/cms2/LF A_prod/LF A/content/de/F achinformationen/ Acker-
_und_Pflanzenbau/Winterraps/Produktionstechnik/AB_Platzfestigkeit_2013/Online_Forschungs bericht_Platzfestigkeit_l_29.pdf). Стручки отбирают на стадии полной зрелости (ВВСН 97) из средней части главного стебля. После отбора образцов стручки выдерживают в сухих условиях при комнатной температуре не менее 21 дня, чтобы обеспечить полную зрелость всех стручков. В этом тесте измеряемым параметром устойчивости к растрескиванию стручков служит напряжение, при котором две половины стручка отрываются друг от друга. Для измерения использовали прибор Sauter Digital Force Gauge FK 50. Измерения проводили на 20 отдельных стручках из каждого генотипа и рассчитывали среднее из 20 измерений.
Примеры результатов этих измерений, проведенных с различными линиями или гибридами, приведены в табл. 4 и 5. Из таблиц четко видно, что повышение устойчивости к растрескиванию стручков ограничивается некоторыми линиями Ogura с
восстанавливающим геном и гибридами с длинной интрогрессией из Raphanus sativus, поэтому можно сделать вывод, что повышение устойчивости к растрескиванию стручков кодируется из интрогрессии Raphanus.
Таблица 4. Результаты по устойчивости стручков и профилю генотипа у комплекта генотипов из урожая 2013 г.
Данные аллели представлены названиями аллелей из генома Raphanus и В. oleracea, не учитывая аллели из генома В. гара. Черный цвет означает присутствие генома Raphanus, белый цвет означает присутствие генома В. oleracea, а серый - присутствие обоих геномов.
CMS
Интрогрессия Raphanus
Область POSH
Генотип
Тип
R613 7251-DB
R613 7251-DA
R613 7063-DA
R613 7063-AA
R813 7003-BOAD
R813 7S69-DA
R13 4515B16-34
R813 76S7-AAAA
R813 7011-AAAA
R813 7569-DABA
R813 7050-CBAD
R813 7569-AACD
R913 7222-ABAD
R13 4513CAA-29
R513 7684-D
R813 7008-AA
R4136366
R913 7222-A6AO
R813 7008-AACD
RS13 7675-D
R513 7964^B
R613 721S-CM
FOCTD176A
R913 7222-ABAD
R4136363
R4136495
R513 7703-A
R4136493
R813 7297-BCCA
Arsenal
R613 7247-CA
R513 7236-D
FOCTD907
R513 7448-A
восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. Восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан, восстан. восстан. восстан. восстан.
6,1 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А ОС ОС А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
6.1 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т 6:G А:А СС G:G А:А
5.8 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А;А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А.-А С:С G:6 А:А
¦ 5,7 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А ArA Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
5,6 ТТ:ТТ А:А ОС А:А А:А С:С ОС А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
5,6 ТТЛТ А:А С:С А:А А:А ОС С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
5,6 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
5,5 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
S,4 ТТ:ТТ А;А С:С А:А А:А С:С С;С А:А ОС СС А:А А:А А:А Т:Т Т;Т G:G А;А С;С G:G А:А
5,4 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
5,4 ТТ:ТТ А:А ОС А;А А;А С:С СС А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
5,4 ТТПТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
5,3 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G;G А:А С:С G:G А:А
5,3 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т;Т G;G А:А С:С G:G А:А
5.2 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G;G А:А С:С G:G А;А
5,1 ТТ:ТТ А:А ОС А:А А:А С:С С:С А:А ОС ОС А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
5,1 ТТ:П А:А С:С А;А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А;А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А ОС G:G А:А
5.1 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
5.0 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
4.9 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С ОС А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
4,8 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
4,8 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
4.3 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А ЩЦ С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А ОС G:G А:А
4.2 ТТ:ТТ А;А С;С А;А А:А С:С С:С А:А С;С С:С А;А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
4,2 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G АА
4,2 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G G А:А
4,2 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
4.1 ТТ:ТТ А:А С:С А;А А:А ОС. С:С А:А _С:С С;С А:А А;А А:А Т:Т Т:Т G:G А;А С:С G:G А:А
4,0 ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А С:С G:G А:А
11:11 ДД С:С Щ А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т ^Q^Q^Q^Q
Ц^ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т ^Q^g^Q^Q
ЩтТ:ТТ А:А С:С А:А А:А Д С С А:А С;С С:С А;А А;А А:А Т;Т Т:Т ^Q^Q^Q^Q
ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А
R513 7439-В
RD165-112-21 (12)
R81340103-AACA
R513 7885-C
R613 7248-АВ
R513 7806-А
R913 7222-ABAA
R91340111-BABAA
R91340156-ACACB
R913 7074-BCBD
R81340100-BCBB
R91340156-AABBB
R613 7565-DA
RS13 41108B
R81340I00-BBCA
R81340103-AACC
восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан, восстан. восстан.
восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан. восстан
1,4 1,4
1,4
1,4
1,4
1,3
1,3 1,3
1,0 0,9 0,9
'G-CF
'C^G
ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А ОС С:С А:А ОС ОС А:А А:А А:А Т:Т Т:Т G:G А:А Г1:1|ЩЩЦ А:А С:С Q^^g^Q^Q^g^g^g^Q^g^Q
ТТ:ГТ А:А С:С А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т
,тттш а:а'; сс Башошшшшкавш
ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А ОС СС А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т ТТ:ТТ А:А ОС А:А А:А С:С СС А:А С:С СС А:А А:А А:А Т:Т Т:Т
G:G
ТТТТИВВЙ$ЗЙ А:А сс шшшшщыямАммга
ТТ:ТТ A:A С:С А:А A:A С:С С:С A:A С:С С:С A:A А:А А:А Т:Т Т:Т
T:T
A:A
G:G
G:G
G:G
A:A
C:C
A:A
G;G
A:A
G:G
G:G
G:6
A:A
G:G
A:A
G:G
Щ Ш
A:A
G:G
G:G
G T:T A:A A:A G:G T:T A:A G:G G:G G:G A:A C:C A:A
G T:T A:A A:A G:G T:T A:A G:G G:G G:G A:A C:C A:A
G:G
G:G
A:A
G:G
ТТПТ А:А ОС А:А А:А С:С С:С А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т
G:G
ТТ:ТТ А:А ОС А:А А:А С:С ОС А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т
ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А С:С ОС А:А С:С С:С А:А А:А А:А Т:Т Т:Т Щ
А:А G:G
А:А
С:С А:А
G:G
G:G
A:A
C:C
A:A
G:G
A:A
G:G
G:G
G:G
G:G
G:G
A:A
A:A
G:G
ТТ:ТТ А:А С:С А:А А:А ОС ОС А:А С:С ОС А:А А:А Т:Т Т:Т G;G А:А
A:A A:A
A:A
A:A
A:A
A:A
A;A
A:A
A:A
A:A
A:A
A:A
A:A
A:A
A:A
А:А
А:А
А:А АЛ
А:А
А:А А:А
A:A
A:A
A:A
A:A
A:A
A:A
A:A
A:A
A:A
A;A
A:A
A:A
A:A
A:A
A:A
A:A
A:A
А:А
А:А
А:А
А:А
А:А
A:A
A:A
C:C
C:C
C:C
C:C
C:C
C:C
C:C
C:C
C:C
C:C
C:C
C:C
C:C
C:C
C:C
C:C
C:C
С:С
С:С
С:С
C:C
Таблица 5. Результаты по устойчивости стручков и профилю генотипа у комплекта генотипов из урожая 2014 г.
Данные аллели представлены названиями аллелей из генома Raphanus и В. oleracea, не учитывая аллели из генома В. гара. Черный цвет означает присутствие генома Raphanus, белый цвет означает присутствие генома В. oleracea, а серый - присутствие обоих геномов.
ciyis
Интрогрессия Raphanus
А:А
Н1100324-131А 1,3 Н91440103-А7САА-^В^Н-1Д R9147546-AABAA ^^^М~~1^2 H12D0389-12 ^BBS-IJ R714 7249-DCA ^^^H~TX R714 7247-DDB ^03
Пример 3. Устойчивость к растрескиванию стручков, исходящая от Raphanus, является частично доминантной
Для получения гибридов со стерильной линией CMS используются восстанавливающие линии Ogura. У полученных гибридов интрогрессия Raphanus находится в гетерозиготном состоянии, поэтому эти гибриды подходят для проверки того, как наследуется устойчивость к растрескиванию стручков: доминантно, рецессивно или промежуточно.
Примеры результатов измерений у различных гибридов Ogura приведены на фиг. 5. Черный цвет означает присутствие генома Raphanus, белый цвет означает присутствие генома В. oleracea, а серый - присутствие обоих геномов. Для этих измерений в общей сложности использовали 100 стручков и рассчитывали среднее из 100 измерений. Из таблицы четко видно, что устойчивость к растрескиванию стручков наследуется по крайней мере частично доминантно от восстанавливающих линий Ogura с длинной интрогрессией к соответствующим гибридам (генотипы 1-7 и 11). Генотипы 7-10 также являются гибридами Ogura, но у них восстанавливающими являются соответствующие короткие интрогрессии, лишенные области растрескивания стручков из интрогрессии Raphanus. Поэтому эти гибриды не проявляют стойкости к растрескиванию стручков.
Пример 4. Идентификация других маркеров, тесно связанных с локусом POSH
Авторы изобретения показали, что вне ожидания локус Fruitfull локализован на интрогрессии Raphanus, так как все маркеры, разработанные из последовательности гена Fruitfull, который идентифицирован в геноме Raphanus, тесно связаны с маркерами локуса POSH, описанными выше (фиг. 5).
В частности, авторы изобретения также идентифицировали расчетную открытую рамку считывания (SEQ ID NO: 31) гена Fruitfull у Raphanus и соответствующий расчетный белок (SEQ ID NO: 32) или соответствующую расчетную кДНК (SEQ ID NO: 33). Такие последовательности можно дополнительно использовать для идентификации SNP Raphanus, связанных с локусом POSH+ в растениях Brassica.
Идентифицировали два разных типа маркеров. Первый тип не специфичен для генома. Он основывается на классическом подходе с SNP между В. napus и Raphanus и общими маркерами между В. oleracea, В. гара и редисом. Таким образом, один аллель
будет амплифицировать В. гара и В. oleracea, а другой аллель специфичен для генома редиса. В этом типе конструкции геном А всегда амплифицируется, поэтому он дает фоновый сигнал, который снижает разрешение наблюдений. Этот тип маркера не позволяет отличить АА/СС от АА/0.
Второй тип маркеров специфичен для генома. Поэтому отсутствует амплификация генома "А" В. гара. Такой подход реализуется при SNP между В. napus и Raphanus и общими HSV (гомологическими вариантами последовательностей) между В. oleracea и Raphanus.
Примеры последовательностей праймеров для идентификации не специфичных для генома маркеров Fruitfull_Hl_04 представлены Fruitfull_Hl_04_F_Al (SEQ ID NO: 40), Fruitfull_Hl_04_F_A2 (SEQ ID NO: 41) и Fruitfull_Hl_04_F_C (SEQ ID NO: 42), a праймеры для идентификации специфичных для генома маркеров Fruitfull spe O 1 представлены Fruitfull spe Ol R Al (SEQ ID NO: 52), Fruitfull_spe_01_R_A2 (SEQ ID NO: 53) и Fruitfull spe Ol R C (SEQ ID NO: 54).
Эти маркеры использовались для идентификации и отслеживания участка POSH в селекционных программах, как показано в табл. 5.
Пример 5. Разработка новых устойчивых к растрескиванию стручков линий Brassica napus с укороченной интрогрессией Raphanus
Потомство F4 от линий, полученных в Примере 1, подвергали систематическому фенотипированию на устойчивость к растрескиванию стручков и проводили скрининг с помощью ко доминантных SNP-маркеров, разработанных в Примере 3.
В нижеследующей табл. 6 представлены кодоминантные SNP-маркеры, которые
TCAAGAAGACTTACCCAACAGTCCAGCTTACAGCATGGACATTTTTCCCCATTG TGGGATGGGTAAAYTAC AAGTATGTGCC ACTGC ACTTCCGGGTC AT [C/A] TTGC ACAGCCTCGTYGCATTCTTCTGGGGAATCTTCCTGACCCTGCGAGCAAGGTCAA
TGACACTAGCTTTGGCAAAGGCTAAGTGATCAGGGAAACACA
AGTATGAAGAAGAGGGYGAGTATGAGAGAGGTGGGTCGAAGCAGAGGAGAGG
AGAGTCAGAGGAAGGKCATGGRTACTACGAAGGGCGTAGTAGACGTTC[A/G]A
GCCATTATGAGCGTGAGGAGGAACAAGGAGGTGASCAAGACCGKTACGAYGAC
CGTTATGGGAGAGTGGAGGAAGAAGAATACCGTTATGATGATCGTG
CTCCTCCKCCGAATCCGTTTGGGGAYGCGTTCAAGGGGCCMGAGATGTGGGCS AAGCTGACGGCGGATCCGTCGACGAGGGGGTTCTTGAAGCAGCCTGA[C/T]TTC GTCAACATGATGCAGGAGATCCAGAGGAACCCTAGCAGTCTCAATCTCTACTTG
AAGGACCAGAGGGTGATGCAGTCTCTYGGGGTTTTGTTGAATG
TCAAGGACTTTGGTGATAGTATTCCAGGACATGGTGGAATCACTGATAGAATGG
ACTGCCAGATGGTAATGGCAGTATTTGCTTACATATATCTCCAGTC[C/A]TTTAT
CGTCTCCCAAAGCGTTTCGGTTGACAAAATCCTGGACCAGATATTGACGAACCT
TAGCTTCGAGGAACAACAAGCTCTCTTCACTAGATTAGGGC
TTGGCCCTGAAGGTTCTACAGTGCTTCATTATAGACAATCTTCAACTTCTGCTTC TATTGGGAAAATCAGTTGCAAGGTGTACTATTGCAAAGAAGACGA[A/G]GTTTG CTTGTACCAGTCTGTTCAGTTTGAGGTACCTTTCAAGRTGGAATCAGAAKCRTCT
YCTTCYCAGGTGATCGCATTCACCGTTAAACCTAGAGCAT
CTAAGGCAATGAAGTACCTGTCAATAGGTGAAGAAGACGATATATCATGGTCA CTTATCAAAGCTGCCTTCTCTTCAGTAGCTCAAACCGCAATCATACC[A/G]ATGC AAGACATTCTCGGWCTYGGAAGTTCTGCCAGGATGAACACTCCAGCCACTGAG GTGGGGAACTGGGGTTGGAGGATTCCGAGTTCAACGAACTTTG
CTTTTGCTGGTTTTGGTGAAATAGTATCTGTCAAGATACCAGTTGGGAAAGGAT GTGGATTC ATTC AGTTTGTC AAC AGAGAAAACGC AGAGGAGGCTTT [A/G] GAGA AACTAAATGGTTCTGTAATTGGAAAACAAACCGTTCGCCTTTCMTGGGGTCGTA
AYCAAGGCAAYAAACAGCCTCGAGGTGGGTATGG
GTCCATGTTTGATGCAATTGTATCAGCAGACGCATTTGAGAACTTGAAACCAGC TCCAGATATTTTCTTGGCTGCTTCCAAKATCTTGGGTGTGCCCACA[T/A]GCGAG TGTATTGTTATTGAAGATGCACTTGCTGGAGTCCAGGCTGCTCAAGCTGCAAAC ATGAGATGCATAGCTGTGAAAACTACTTTATCTGAAGCAAT
ACTTTGTTGAYAGYCTTACMGGAGTAGGACTTGTTGATCAAATGGGAAACTTCT TCTGC AAAACGCTCTTGTTTGTGGCTGTAGCTGGAGTTCTTTTC AT [T/C] CGC AA GAACGAAGATTTAGATAAGCTCAAGGGTCTRWTYGAAGAGACGACGYTRTATG ACAAGCARTGGCAAGCGGCTTGGAAAGAGCCGGAAATAATCA
CACAACATGCCGGTGATTGGTATCCAGCTGACCTTGGATCCAACGATTTCAAAG GTCTCTATGGATATAAGGTCTTTATTGCCATTGCCATTATCCTTGG[G/A]GACGG TCTCTACAATCTTGTCAAGATCATTGCTGTCACTGTGAAGGAATTATGCAGCAA TAGCTCTAGACACCTCAATCTACCCGTTGTTRCCAACGTTG
AGAAGATGGAGTTCTTGATGTTTGATCTYGATCGGGTTTTGAARCCCGGTGGGT TGTTCTGGTTGGATAACTTCTACTGCGCTAGTGACGTGAAGAAGAA [A/G] GAGC TGACGCGTTTGATYGAGAGGTTTGGGTATAAGAAGCTGAAATGGGTTATTGGA
GAGAAGGCTGATGGGCAAGTGWATCTCTCTGCTGTTCTKCAAA
TAGAGCTGAAGCTAGGTATAGGAGGCACATCATAYAAAGATTTCATTCAAAGC CTTCATCTACCTATGCAATTGAGTCAAGTAGACCCAATAGTAGCGTC[C/A]TTCT CYGGAGGAGCTGTTGGTGTGATCTCRGCKYTGATGGTWGTWGAAGTCAACAAC GTGAAGCAGCAAGAGCACAAGAGATGCAAATACTGTCTAGGAA
TTAAGAACTGTGTCACTGACATTGACCCTGAGAGGGAGAAGGAGAAGAGAGAA AGGATGGAAAGCCAAAACCTCAAGGCTAGTACAAAGCTGAGTCAAGC[G/A]AG GGAGAAAATCAAGCGCAAGTATCCACTTCCTGTTGCAAGGAGRCAACTYTCCA CTGGRTACNTGGAAGATGCTCTCGAAGAGGATGAAGAGACAGACC
GCTCAGGTAGATCTCCCACGGGTTGGGGAAGAGGATCCGGATATGGGTATGGG TCTGGATCTGGATCAGGTAGCGGATATGGGTACGGTTCCGGAGGTGG[A/C]GGA GSACGTGGTGGTGGGTATGGTTATGGAAGCGGAAATGGTCGGTCTGGAGGWGG TGGTGGTGGCTCTAATGGTGAAGTTGCCGCTTTGGGCCACGGTG
TCAGACTCATCCAGATAAAGAAGAACAAAATCTCATCTTCTGTGCACTCTATGG TACAAACTCCTTCAGGTACAGCWCGAACGCACAGGTTTGCCACTGA[A/G]ACAG CCGAGCTCCCTGCGCAAGAAGGAGAAAGAGTGACAATTGCATCTGCTGCTCCA
I TCAGATGTTTACAGACAAGTGGGACCTTTCAAGTTTACCCCCA
В вышеприведенных последовательностях маркеров SNP приведены в скобках,
причем первый нуклеотид представляет SNP Raphanus, а второй нуклеотид представляет
SNP В. oleracea.
Эта систематическая проверка привела к идентификации одного рекомбинантного растения с укороченной интрогрессией Raphanus, в которой все еще присутствовал участок, кодирующий растрескивание стручков. Потомство F5 этого растения имеет генотип R42141F с генеалогией FOCTD909 х NSL09/196. Эта рекомбинантная линия устойчива к растрескиванию стручков и имеет хорошие размеры стручков.
На фиг. 6 представлены результаты фенотипирования и генотипирования потомства F5 в сравнении с другими линиями и гибридами. Линии Amalie и Arabella не являются восстанавливающими. R7011-AB - восстанавливающая линия с длинной интрогрессией, включающей ген RfO (маркер BnRFO, как описано в SEQ ID NO: 1) и маркеры области POSH. Arsenal - гибридная разновидность с длинной интрогрессией, включающей ген RfO (маркер BnRFO, как описано в SEQ ID NO: 1) и маркеры области POSH. Линия RD153-101 - восстанавливающая, но не устойчивая к растрескиванию стручков, с короткой интрогрессией, описанной в патентной заявке WO 2011/020698. R101540103-AACCBA - восстанавливающая линия, но не устойчивая к растрескиванию стручков, с короткой интрогрессией.
Эти результаты показывают, что участок POSH локализуется в области, тесно связанной с маркерами локуса POSH по SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21.
Результаты по устойчивости стручков и профилю генотипа у устойчивой к растрескиванию стручков рекомбинантной линии R51542141F (также именуется R42141F) и комплекта эталонных генотипов представлены на фиг. 6. Приведенные аллели представлены названиями аллелей из генома Raphanus и В. oleracea, не учитывая аллели из генома В. гара. Черный цвет означает присутствие генома Raphanus, белый цвет означает присутствие генома В. oleracea, а серый - присутствие обоих геномов.
Пример 6. Идентификация новых устойчивых к растрескиванию стручков линий Brassica napus без области RfO Raphanus и получение устойчивых к растрескиванию стручков женских растений и инбредных линий не типа Ogura
Для того, чтобы получить новые рекомбинантные восстанавливающие линии с более короткой интрогрессией Raphanus, в январе 2012 г. проводили 128 скрещиваний. При этом мужские растения Ogura и гибриды с исходной длинной интрогрессией Raphanus, несущие устойчивость к растрескиванию стручков POSH+, скрещивали с
мужскими растениями Ogura POSH" с укороченной интрогрессией Raphanus или с инбредными линиями, не содержащими интрогрессии геномного фрагмента Raphanus. В ноябре 2012 г. 6421 растение F2, полученных при этих скрещиваниях, генотипировали по 4 SNP-маркерам, локализованным на С09, как описано в примере 1. Самоопыленные семена от всех 353 потенциальных рекомбинантов высеивали в виде F3 для проверки результатов по растениям F2. Растения F3 анализировали в ноябре 2013 г. с помощью набора кодоминантных SNP-маркеров, разработанных в примере 3.
Те же самые кодоминантные SNP-маркеры использовали для анализа всех новых рекомбинантных растений, полученных при посеве в виде F3 в ноябре 2013 г. (см. предыдущую табл. 7).
Среди этих растений F3 были идентифицированы растения, обозначенные как FR-13С-3-03137-2 и FR-13C-3-03137-5. Эти растения были отобраны потому, что они несут только благоприятные аллели Raphanus по маркерам SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, связанные с устойчивостью к растрескиванию стручков, без каких-либо других аллелей Raphanus из интрогрессии. Поскольку эти растения были со стерильной цитоплазмой Ogura и не содержали гена RfO, то они были стерильными и поэтому не могли самоопыляться. Для поддержания явления рекомбинации были отобраны 4 другие рекомбинантные фертильные линии с укороченной интрогрессией Raphanus, но несущие ген RfO, для скрещивания со стерильными, но устойчивыми к растрескиванию стручков рекомбинантами (генотипические профили приведены на фиг. 7, на которой представлена молекулярная характеристика рекомбинантных линий F3 при интрогрессии Raphanus. Черный цвет означает присутствие генома Raphanus, белый цвет означает присутствие генома В. oleracea, а серый - присутствие обоих геномов).
Полученное при этом потомство F1 является фертильным, несет укороченный фрагмент Raphanus и устойчивость к растрескиванию стручков. С этим F1, с одной стороны, можно получать инбредные линии с укороченной интрогрессией Raphanus, несущие устойчивость к растрескиванию стручков, путем инбридинга и отбора с помощью маркеров, а с другой стороны - скрещивать F1 в качестве мужского растения и тем самым переносить устойчивость к растрескиванию стручков в любые другие растения Brassica. В этом отношении особый интерес представляет скрещивание F1 с растениями Brassica napus с фертильной цитоплазмой с тем, чтобы перенести устойчивость к растрескиванию стручков за пределы стерильной цитоплазмы Ogura и получить инбредные линии с устойчивостью к растрескиванию стручков, но без гена RfO. Эти инбредные линии можно впоследствии использовать в качестве мужских/женских растений в других гибридных системах (напр., GMS) или же после преобразования в CMS
в качестве женских растений в гибридной системе Ogura.
Пример 7. Корреляция между уменьшением интрогрессионного фрагмента Raphanus и увеличением размера стручков
Измеряли размер стручков у различных линий или гибридов, несущих признак POSH. Растения выращивали в поле, а стручки отбирали на стадии полной зрелости. Измерение размера стручков соответствует измерению (в см) верхней половины стручка, которая не включает носика и ножки. Результаты представлены на фиг. ЗА и ЗВ.
R51542141F - рекомбинантная линия, R4513-CA- линия с длинной интрогрессией. Adriana - контрольный невосстанавливающий гибрид, который не содержит интрогрессии генома Raphanus.
Arsenal - гибридная разновидность с длинной интрогрессией, включающей ген RfO и маркеры области POSH. RD153-101 - восстанавливающая линия с короткой интрогрессией, которая не устойчива к растрескиванию стручков.
Результаты показывают, что существует корреляция между уменьшением интрогрессионного фрагмента Raphanus и увеличением размера стручков.
Пример 8. Сегрегация POSH в популяции двойных гибридов
Гибриды, содержащие короткую интрогрессию, скрещивали с гибридами, содержащими длинную интрогрессию. Получали сегрегирующие популяции двойных гибридов и выращивали растения в поле. Измеряли устойчивость стручков в соответствии с Примером 3.
Приведенные на фиг. 4А-4Н результаты свидетельствуют о сегрегацию POSH в популяции двойных гибридов.
Результаты показывают, что существует значительная корреляция между длинной интрогрессией, несущей маркеры POSH, представленные аллелями в черных клеточках, и высоким уровнем стабильности стручков.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> LIMAGRAIN EUROPE
<120> Brassica Plant with Pod Shattering Tolerance <130> LVH 003 EP <160> 125
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 100 <212> DNA
<213> Raphanus sativus <400> 1
ctctccataa gaagatggaa atgcggcgca ttccatgtga tgcatacagc ttcaatattc 60 tgataaagtg tttctgcagc tgctctaagc tgccctttgc 100
<210> 2
<211> 959
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 2
gatccgattc ttctcctgtt gagatcagct ccaaacatca aacaacttgt acacaaatat 60
ctttacttgc taaatggaac atgacaagag atagaaaatc ttgctcatag tattgtacaa 120
gggataacag tgtagaaaac aaaccgtctg taagattttc tccctgatcc tctcacttaa 180
ccagtaggcg tttttcacat tgaagcgcat atctactttg gtattcactg aataaaaaaa 240
gaaggctggt aacatgtgga ggatatacaa gcattgatac accaagtagt cacaaactac 300
attataaagg tcagaccttt gttcacattc tggcctccag gatcaccgct tctagcaaag 360
ttaagcgtaa catggtctgc acgtatacaa atgaaaatgt ttctatcaaa atcactataa 420
aatagagctc tataacattg tcgatacata gtttcactaa ctctgcaagt actaaacaca 480
tatacaaaca aaactatgcg aacagatcaa aactactaca gaacacagtt ctatgacact 540
gtcgatagta acatcctctg caagtaccaa agagatagca aatgaaacta tgtaaacaaa 600
tcaaaattct aaatttctcc atcacaagga cctacagaat agagttatca taacattttc 660
tgtaaatatt tccatcaaaa tgactagaga acagagttct tataacatta tctgtaaatg 720
ttccaacaaa accactacat agcagagttc ttataacatt gtctgtaaat gtccaatcaa 780
aaccactaca gaacaaagct cctataacat tgtttataca aagtttcact aaatctacaa 840
actttccccg taaatgagct taatatcacc caaagatgtt tcaatcagat aaagagtaac 900
gacatcgttt tgagattaga acaaactgaa acttacgtag agtgatttga ggagtaggc 959
<210> 3 <211> 603
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 3
caggttctga acctttctct cccttgcttt tgggcgatga ttcgattctt ctgggcttgc 60
ttgtggccac ttaagaaaga gttctgcctt ctagccaagc ctttgagttt gagaccaagt 120
aaagcttccc ggcagtcaac caagaaagac tctttctccc ctactgaaga aatggaagtc 180
agatcttttt ccataccata acgtatatag aatcgatttt cttttctgat cgctagcctg 240
ccgggccgcc cccgcgatca aactatcaat ctcataagag aagaaatctc tatgccccct 300
ttgttcttgg ttttctccca tgcttttgtt ggtcaacaac caaccacaac tttctatagt 360
tcttcactac tcctagaggc ttgacggagt gaagctgtct ggagggaatc attttgttga 420
aatcaattaa tctaatcatg cctcaactgg ataaattcac ttatttttca caattcttct 480
ggttatgcct tttcttcttt actttctata ttttcatatg caatgatgga gatggagtac 540
ttgggatcag cagaattcta aaactacgga accaactgct ttcacaccgg gggaagacca 600
tcc 603
<210> 4
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 4
tcagactcat ccagataaag aagaacaaaa tctcatcttc tgtgcactct atggtacaaa 60
ctccttcagg tacagcwcga acgcacaggt ttgccactga aacagccgag ctccctgcgc 120
aagaaggaga aagagtgaca attgcatctg ctgctccatc agatgtttac agacaagtgg 180
gacctttcaa gtttaccccc a 201
<210> 5
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 5
taaagtatac tcgaaatggc ccaaatctca ctctttcaag atcggcgact ccctcttgtt 60
cttgtaccca ccaagcgaag attcaatgat tcaagtgaca ccttccaact tcaagagctg 120
caacaccaaa gatccgatct tgtacatgaa cgacggcaac tctctcttca acctcaccca 180
aaacggaacc ttttacttca c 201
<210> 6
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 6
gaagtgttct ggacacagct gagaaagccc acgaagggga tatcacatgc atttcgtggg 60
cacccaaggc aatgacagtt ggggagagaa aggcgcaggt attagcgaca gcaggggttg 120 acaaraaagt gaagctgtgg gaagctccaa mgttgcagtc tgtgtagact tgctactgct 180 gctgcaatac aaagaaagtc t 201
<210> 7
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 7
ctagtttcag ggaatggttt rcagaaggtt gaattgatga agacgagagc ttcttcatca 60
gacgagacct caacgtccat tgacaccaac gaactcttta cwgacttgaa ggaaaagtgg 120
gatggtcttg agaacaarac racygtggtt atctayggag gaggagccat tgtwgctgtt 180
tggttatctt ccattcttgt t 201
<210> 8
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 8
tcaagaagac ttacccaaca gtccagctta cagcatggac atttttcccc attgtgggat 60
gggtaaayta caagtatgtg ccactgcact tccgggtcat cttgcacagc ctcgtygcat 120
tcttctgggg aatcttcctg accctgcgag caaggtcaat gacactagct ttggcaaagg 180
ctaagtgatc agggaaacac a 201
<210> 9
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 9
agtatgaaga agagggygag tatgagagag gtgggtcgaa gcagaggaga ggagagtcag 60
aggaaggkca tggrtactac gaagggcgta gtagacgttc aagccattat gagcgtgagg 120
aggaacaagg aggtgascaa gaccgktacg aygaccgtta tgggagagtg gaggaagaag 180
aataccgtta tgatgatcgt g 201
<210> 10
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 10
ctcctcckcc gaatccgttt ggggaygcgt tcaaggggcc mgagatgtgg gcsaagctga 60
cggcggatcc gtcgacgagg gggttcttga agcagcctga cttcgtcaac atgatgcagg 120
agatccagag gaaccctagc agtctcaatc tctacttgaa ggaccagagg gtgatgcagt 180
ctctyggggt tttgttgaat g
201
<210> 11
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 11
tcaaggactt tggtgatagt attccaggac atggtggaat cactgataga atggactgcc 60
agatggtaat ggcagtattt gcttacatat atctccagtc ctttatcgtc tcccaaagcg 120
tttcggttga caaaatcctg gaccagatat tgacgaacct tagcttcgag gaacaacaag 180
ctctcttcac tagattaggg c 201
<210> 12
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 12
ttggccctga aggttctaca gtgcttcatt atagacaatc ttcaacttct gcttctattg 60
ggaaaatcag ttgcaaggtg tactattgca aagaagacga agtttgcttg taccagtctg 120
ttcagtttga ggtacctttc aagrtggaat cagaakcrtc tycttcycag gtgatcgcat 180
tcaccgttaa acctagagca t 201
<210> 13
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 13
ctaaggcaat gaagtacctg tcaataggtg aagaagacga tatatcatgg tcacttatca 60
aagctgcctt ctcttcagta gctcaaaccg caatcatacc aatgcaagac attctcggwc 120
tyggaagttc tgccaggatg aacactccag ccactgaggt ggggaactgg ggttggagga 180
ttccgagttc aacgaacttt g 201
<210> 14
<211> 193
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 14
cttttgctgg ttttggtgaa atagtatctg tcaagatacc agttgggaaa ggatgtggat 60
tcattcagtt tgtcaacaga gaaaacgcag aggaggcttt agagaaacta aatggttctg 120
taattggaaa acaaaccgtt cgcctttcmt ggggtcgtaa ycaaggcaay aaacagcctc 180
gaggtgggta tgg 193
<210> 15
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 15
gtccatgttt gatgcaattg tatcagcaga cgcatttgag aacttgaaac cagctccaga 60
tattttcttg gctgcttcca akatcttggg tgtgcccaca tgcgagtgta ttgttattga 120
agatgcactt gctggagtcc aggctgctca agctgcaaac atgagatgca tagctgtgaa 180
aactacttta tctgaagcaa t 201
<210> 16
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 16
actttgttga yagycttacm ggagtaggac ttgttgatca aatgggaaac ttcttctgca 60
aaacgctctt gtttgtggct gtagctggag ttcttttcat tcgcaagaac gaagatttag 120
ataagctcaa gggtctrwty gaagagacga cgytrtatga caagcartgg caagcggctt 180
ggaaagagcc ggaaataatc a 201
<210> 17
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 17
cacaacatgc cggtgattgg tatccagctg accttggatc caacgatttc aaaggtctct 60
atggatataa ggtctttatt gccattgcca ttatccttgg ggacggtctc tacaatcttg 120
tcaagatcat tgctgtcact gtgaaggaat tatgcagcaa tagctctaga cacctcaatc 180
tacccgttgt trccaacgtt g 201
<210> 18
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 18
agaagatgga gttcttgatg tttgatctyg atcgggtttt gaarcccggt gggttgttct 60
ggttggataa cttctactgc gctagtgacg tgaagaagaa agagctgacg cgtttgatyg 120
agaggtttgg gtataagaag ctgaaatggg ttattggaga gaaggctgat gggcaagtgw 180
atctctctgc tgttctkcaa a 201
<210> 19
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 19
tagagctgaa gctaggtata ggaggcacat catayaaaga tttcattcaa agccttcatc 60
tacctatgca attgagtcaa gtagacccaa tagtagcgtc cttctcygga ggagctgttg 120 gtgtgatctc rgckytgatg gtwgtwgaag tcaacaacgt gaagcagcaa gagcacaaga 180 gatgcaaata ctgtctagga a 201
<210> 20
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<220>
<221> misc_feature
<222> (165)..(165)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 20
ttaagaactg tgtcactgac attgaccctg agagggagaa ggagaagaga gaaaggatgg 60
aaagccaaaa cctcaaggct agtacaaagc tgagtcaagc gagggagaaa atcaagcgca 120
agtatccact tcctgttgca aggagrcaac tytccactgg rtacntggaa gatgctctcg 180
aagaggatga agagacagac c 201
<210> 21
<211> 201
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 21
gctcaggtag atctcccacg ggttggggaa gaggatccgg atatgggtat gggtctggat 60
ctggatcagg tagcggatat gggtacggtt ccggaggtgg aggagsacgt ggtggtgggt 120
atggttatgg aagcggaaat ggtcggtctg gaggwggtgg tggtggctct aatggtgaag 180
ttgccgcttt gggccacggt g 201
<210> 22
<211> 107
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 22
gggagagaga ggaaacctgg aggatgttac gcagtactgg ggctgaagaa ctgaagaatt 60 gttggagcat tggattaatt gtccttcktg ctgacccgtg ttcttct 107
<210> 23
<211> 109
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 23
gggagagaga ggaaacctgg aggakgttac gcagtactgg ggctgaagaa ctgaagaatt
gttggagcat tggattaatt gtccttcgtg ctgacccgtg ttcttctcc 109
<210> 24
<211> 88
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 24
gagagagaaa ygacaaccct gaaataacca aagtatatmt ctctctcttt ctttcctatg 60 tctctctggg tatcttttgt gttaaatt 88
<210> 25
<211> 88
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 25
gagagagaaa ygacaaccct gaaatracca aagtatatct ctctctcttt ctttcctatg 60 tctctctggg tatcttttgt gttaaatt 88
<210> 26
<211> 84
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 26
gaaatgtctc ggccaacaag ttgtttgtct gaatataaat agcgatcrta kcgttcaagt 60 atcctttcca tgctatattt caga 84
<210> 27
<211> 101
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 27
tgcatttata tcagtacgaa cttacatata tgttgagcgt tatgttatta tccamtggat 60
tatagcayat ccttgtaaat gcttattcca ttgtttcaaa t 101
<210> 28
<211> 113
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 28
tgcatttata tcagtacgaa cttacatata tgttgagcgt tatgttatgc gttatgttat 60
tatccamtgg attatagcac atccttgtaa atgcttattc cattgtttca aat 113
<210> 29
<211> 156
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 29
tggaagagaa gacaacgaga gcaacctcag catcgcagag aacagagatc tcatgagctt 60
tcttgagcaa accagatctt ctcttkgaga aagtaacttg cctattgatc ttgttctcta 120
tcctcttcag ctgaacccta ccccttccca tctctc 156
<210> 30
<211> 726
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 30
atgggaaggg gtagggttca gctgaagagg atagagaaca agatcaatag gcaagttact 60
ttctccaaga gaagatctgg tttgctcaag aaagctcatg agatctctgt tctctgcgat 120
gctgaggttg ctctcgttgt cttctcttcc aaaggcaaac tcttcgaata ttccactgac 180
tctagcatgg aaaggatact tgaacgctac gatcgctatt tatattcaga caaacaactt 240
gttggccgag acatttcgca gagtgaaaat tgggttctag agcatgctaa gctcaaggca 300
agagttgagg tacttgagaa gaataaaagg aattttatgg gggaagatct tgattccttg 360
agcctaaagg agcttcaaag cttggagcat cagctcgacg ctgctatcaa gagcattagg 420
tcaagaaaga accaagctat gttcgaatcc atatcagcgc tccagaagaa ggataaggca 480
ttgcaagatc ataataatac gcttctcaaa aagattaagg agagggagaa gaacacgggt 540
cagcacgaag gacaattaat ccaatgctcc aacaattctt cagttcttca gccccagtac 600
tgcgtaacat cctccagaga tggtcttgtg gagagagttg ggggagagaa cggaggtgca 660
tcgtcattga ttgaaccaaa ctctcttctt ccagcttgga tgttacgtcc tactacgaat 720
gagtaa 726
<210> 31
<211> 726
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 31
atgggaaggg gtagggttca gctgaagagg atagagaaca agatcaatag gcaagttact 60
ttctccaaga gaagatctgg tttgctcaag aaagctcatg agatctctgt tctctgcgat 120
gctgaggttg ctctcgttgt cttctcttcc aaaggcaaac tcttcgaata ttccactgac 180
tctagcatgg aaaggatact tgaacgctac gatcgctatt tatattcaga caaacaactt 240
gttggccgag acatttcgca gagtgaaaat tgggttctag agcatgctaa gctcaaggca 300
agagttgagg tacttgagaa gaataaaagg aattttatgg gggaagatct tgattccttg 360
agcctaaagg agcttcaaag cttggagcat cagctcgacg ctgctatcaa gagcattagg 420
tcaagaaaga accaagctat gttcgaatcc atatcagcgc tccagaagaa ggataaggca 480
ttgcaagatc ataataatac gcttctcaaa aagattaagg agagggagaa gaacacgggt 540
cagcacgaag gacaattaat ccaatgctcc aacaattctt cagttcttca gccccagtac 600
tgcgtaacat cctccagaga tggtcttgtg gagagagttg ggggagagaa cggaggtgca 660
tcgtcattga ttgaaccaaa ctctcttctt ccagcttgga tgttacgtcc tactacgaat 720
gagtaa 726
<210> 32
<211> 241
<212> PRT
<213> Raphanus sativus
<400> 32
Met Gly Arg Gly Arg Val Gln Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Ser Gly Leu Leu Lys Lys Ala
20 25 30
His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Val Val Phe
35 40 45
Ser Ser Lys Gly Lys Leu Phe Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Met Glu
50 55 60
Arg Ile Leu Glu Arg Tyr Asp Arg Tyr Leu Tyr Ser Asp Lys Gln Leu
65 70 75 80
Val Gly Arg Asp Ile Ser Gln Ser Glu Asn Trp Val Leu Glu His Ala
85 90 95
Lys Leu Lys Ala Arg Val Glu Val Leu Glu Lys Asn Lys Arg Asn Phe
100 105 110
Met Gly Glu Asp Leu Asp Ser Leu Ser Leu Lys Glu Leu Gln Ser Leu
115 120 125
Glu His Gln Leu Asp Ala Ala Ile Lys Ser Ile Arg Ser Arg Lys Asn
130 135 140
Gln Ala Met Phe Glu Ser Ile Ser Ala Leu Gln Lys Lys Asp Lys Ala
145 150 155 160
Leu Gln Asp His Asn Asn Thr Leu Leu Lys Lys Ile Lys Glu Arg Glu
165 170 175
Lys Asn Thr Gly Gln His Glu Gly Gln Leu Ile Gln Cys Ser Asn Asn
180 185 190
Ser Ser Val Leu Gln Pro Gln Tyr Cys Val Thr Ser Ser Arg Asp Gly
195 200 205
Leu Val Glu Arg Val Gly Gly Glu Asn Gly Gly Ala Ser Ser Leu Ile
210 215 220
Glu Pro Asn Ser Leu Leu Pro Ala Trp Met Leu Arg Pro Thr Thr Asn
225 230 235 240
Glu
<210> 33 <211> 1067 <212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 33
gggagatata ctttggttat ttcagggttg tcgtttctct ctcttgttct tgaagtttta 60
aggggagaga gagagagaga gaaaagattg agagatggga aggggtaggg ttcagctgaa 120
gaggatagag aacaagatca ataggcaagt tactttctcc aagagaagat ctggtttgct 180
caagaaagct catgagatct ctgttctctg cgatgctgag gttgctctcg ttgtcttctc 240
ttccaaaggc aaactcttcg aatattccac tgactctagc atggaaagga tacttgaacg 300
ctacgatcgc tatttatatt cagacaaaca acttgttggc cgagacattt cgcagagtga 360
aaattgggtt ctagagcatg ctaagctcaa ggcaagagtt gaggtacttg agaagaataa 420
aaggaatttt atgggggaag atcttgattc cttgagccta aaggagcttc aaagcttgga 480
gcatcagctc gacgctgcta tcaagagcat taggtcaaga aagaaccaag ctatgttcga 540
atccatatca gcgctccaga agaaggataa ggcattgcaa gatcataata atacgcttct 600
caaaaagatt aaggagaggg agaagaacac gggtcagcac gaaggacaat taatccaatg 660
ctccaacaat tcttcagttc ttcagcccca gtactgcgta acatcctcca gagatggtct 720
tgtggagaga gttgggggag agaacggagg tgcatcgtca ttgattgaac caaactctct 780
tcttccagct tggatgttac gtcctactac gaatgagtaa aattatctaa gtatgataac 840
atcatcaatg cttaatattt tcataatata tatcagcatt tttggtgacc ttactcttca 900
ttaatactga tatatgtaat gacggaatta caatgtcaag aacgtacgta ctctatcact 960
ggattcactg cgtcttaagg acaaaggttc atgatatcgt tgtgatgatt tctgatgaat 1020
gatgtattga tacttttcct tttactgtgg catagatgcg tgaaatc 1067
<210> 34 <211> 42 <212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 34
gaaggtgacc aagttcatgc tcggcgcatt ccatgtgatg ca 42
<210> 35
<211> 43
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 35
gaaggtcgga gtcaacggat tgcggcggat tccgtgtaat atc 43
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 36
gcttagagca gctgcagaaa cactt 25
<210> 37
<211> 47
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 37
gaaggtgacc aagttcatgc tcaaaagcat gggagaaaac caagaac 47
<210> 38
<211> 48
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 38
gaaggtcgga gtcaacggat tacaaaagca tgggagaaaa ccaagaaa 48
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 39
cgcgatcaaa ctatcaatct cataagagaa 30
<210> 40
<211> 49
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 40
gaaggtgacc aagttcatgc tgaaatatag catggaaagg atacttgaa 49
<210> 41
<211> 49
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 41
gaaggtcgga gtcaacggat tgaaatatag catggaaagg atacttgag
<210> 42
<211> 29
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 42
cggccaacaa gttgtttgtc tgaatataa 29
<210> 43
<211> 53
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 43
gaaggtgacc aagttcatgc tatttatatc agtacgaact tacatatatg ttg 53
<210> 44
<211> 54
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 44
gaaggtcgga gtcaacggat tcatttatat cagtacgaac ttacatatat gtta 54
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 45
tgaaacaatg gaataagcat ttacaaggat 30
<210> 46
<211> 50
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 46
gaaggtgacc aagttcatgc taaacaatgg aataagcatt tacaaggatg 50
<210> 47
<211> 51
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 47
gaaggtcgga gtcaacggat tgaaacaatg gaataagcat ttacaaggat a 51
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 48
tgcatttata tcagtacgaa cttacatata
<210> 49
<211> 47
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 49
gaaggtgacc aagttcatgc tcatgagctt tcttgagcaa accagat 47
<210> 50
<211> 46
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 50
gaaggtcgga gtcaacggat tatgagcttt cttgagcaaa ccagac 46
<210> 51
<211> 29
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 51
ggatagagaa caagatcaat aggcaagtt 29
<210> 52
<211> 42
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 52
gaaggtgacc aagttcatgc tcagccccag tactgcgtaa ca 42
<210> 53
<211> 42
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 53
gaaggtcgga gtcaacggat tcagccccag tactgcgtaa cc 42
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 54
ggagagagag gaaacctgga gga 23
<210> 55
<211> 42
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 55
gaaggtgacc aagttcatgc tgagaagaac acgggtcagc ac
<210> 56
<211> 43
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 56
gaaggtcgga gtcaacggat tggagaagaa cacgggtcag caa 43
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 57
ggagagagag gaaacctgga gga 23
<210> 58
<211> 47
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 58
gaaggtgacc aagttcatgc tgagagagaa aygacaaccc tgaaata 47
<210> 59
<211> 46
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 59
gaaggtcgga gtcaacggat tagagagaaa ygacaaccct gaaatg 46
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 60
tttaacacaa aagataccca gagagac 27
<210> 61
<211> 49
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 61
gaaggtgacc aagttcatgc tgacaaccct gaaatracca aagtatatc 49
<210> 62
<211> 49
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 62
gaaggtcgga gtcaacggat tgacaaccct gaaatracca aagtatata
<210> 63 <211> 27
<212> DNA
<213> Raphanus sativus <400> 63
tttaacacaa aagataccca gagagac 27
<210> 64
<211> 43
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 64
gaaggtgacc aagttcatgc tcgaagggcg tagtagacgt tca 43
<210> 65
<211> 42 <212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 65
gaaggtcgga gtcaacggat tgaagggcgt agtagacgtt cg 42
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 66
ccttgttcct cctcacgctc ataat 25
<210> 67
<211> 42
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 67
gaaggtgacc aagttcatgc tccactgcac ttccgggtca ta 42
<210> 68
<211> 42 <212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 68
gaaggtcgga gtcaacggat tccactgcac ttccgggtca tc 42
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 69
gaagaatgcg acgaggctgt gcaa
<210> 70 <211> 45
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 70
gaaggtgacc aagttcatgc tagagaaaac gcagaggagg cttta 45
<210> 71
<211> 44
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 71
gaaggtcgga gtcaacggat tgagaaaacg cagaggaggc tttg 44
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 72
gcgaacggtt tgttttccaa ttacagaa 28
<210> 73
<211> 45
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 73
gaaggtgacc aagttcatgc tcaagtagac ccaatagtag cgtca 45
<210> 74
<211> 44
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 74
gaaggtcgga gtcaacggat taagtagacc caatagtagc gtcc 44
<210> 75
<211> 25
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 75
accatcaacg ctgagatcac accaa 25
<210> 76
<211> 41
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 76
gaaggtgacc aagttcatgc tggtacggtt ccggaggtgg a
<210> 77
<211> 40
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 77
gaaggtcgga gtcaacggat tgtacggttc cggaggtggc 40
<210> 78
<211> 25
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 78
cgaccatttc cgcttccata accat 25
<210> 79
<211> 42
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 79
gaaggtgacc aagttcatgc tagtacaaag ctgagtcaag ca 42
<210> 80
<211> 44
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 80
gaaggtcgga gtcaacggat tctagtacaa agctgagtca agcg 44
<210> 81
<211> 25
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 81
caggaagtgg atacttgcgc ttgat 25
<210> 82
<211> 47
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 82
gaaggtgacc aagttcatgc tttattgcca ttgccattat ccttgga 47
<210> 83
<211> 45
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 83
gaaggtcgga gtcaacggat tattgccatt gccattatcc ttggg 45
<210> 84
<211> 29 <212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 84
gtgacagcaa tgatcttgac aagattgta 29
<210> 85
<211> 48
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 85
gaaggtgacc aagttcatgc taaggtgtac tattgcaaag aagacgaa 48
<210> 86
<211> 46
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 86
gaaggtcgga gtcaacggat tggtgtacta ttgcaaagaa gacgag 46
<210> 87
<211> 28
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 87
tcaaactgaa cagactggta caagcaaa 28
<210> 88
<211> 41
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 88
gaaggtgacc aagttcatgc tgggagagaa aggcgcaggt a 41
<210> 89
<211> 41
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 89
gaaggtcgga gtcaacggat tgggagagaa aggcgcaggt t 41
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 90
ttttgtcaac ccctgctgtc gctaa 25
<210> 91 <211> 44
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 91
gaaggtgacc aagttcatgc tcaagatctt gggtgtgccc acaa 44
<210> 92
<211> 44
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 92
gaaggtcgga gtcaacggat tcaagatctt gggtgtgccc acat 44
<210> 93
<211> 29
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 93
ctccagcaag tgcatcttca ataacaata 29
<210> 94
<211> 47
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 94
gaaggtgacc aagttcatgc tcgaagattc aatgattcaa gtgacac 47
<210> 95
<211> 47
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 95
gaaggtcgga gtcaacggat tcgaagattc aatgattcaa gtgacag 47
<210> 96
<211> 25
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 96
ggtgttgcag ctcttgaagt tggaa 25
<210> 97
<211> 42
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 97
gaaggtgacc aagttcatgc tgtagctgga gttcttttca tc 42
<210> <211> <212>
98 46 DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 98
gaaggtcgga gtcaacggat tggctgtagc tggagttctt ttcatt 46
<210> 99
<211> 29
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 99
cccttgagct tatctaaatc ttcgttctt 29
<210> 100
<211> 46
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 100
gaaggtgacc aagttcatgc tagtagctca aaccgcaatc atacca 46
<210> 101
<211> 43
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 101
gaaggtcgga gtcaacggat tagctcaaac cgcaatcata ccg 43
<210> 102
<211> 25
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 102
ttccgagacc gagaatgtct tgcat 25
<210> 103
<211> 50
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 103
gaaggtgacc aagttcatgc tcagtatttg cttacatata tctccagtca 50
<210> 104
<211> 48
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 104
gaaggtcgga gtcaacggat tgtatttgct tacatatatc tccagtcc 48
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 105
ccgaaacgct ttgggagacg ataaa
<210> 106
<211> 42
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 106
gaaggtgacc aagttcatgc tgggttcttg aagcagcctg ac 42
<210> 107
<211> 43
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 107
gaaggtcgga gtcaacggat tggggttctt gaagcagcct gat 43
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 108
ggatctcctg catcatgttg acgaa 25
<210> 109
<211> 44
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 109
gaaggtgacc aagttcatgc tgaacgcaca ggtttgccac tgaa 44
<210> 110
<211> 43
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 110
gaaggtcgga gtcaacggat taacgcacag gtttgccact gag 43
<210> 111
<211> 29
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 111
agatgcaatt gtcactcttt ctccttctt 29
<210> 112
<211> 46
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 112
gaaggtgacc aagttcatgc tccattgaca ccaacgaact ctttaa
<210> 113
<211> 46 <212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 113
gaaggtcgga gtcaacggat tccattgaca ccaacgaact ctttac 46
<210> 114
<211> 26
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 114
gtcttgttct caagaccatc ccactt 26
<210> 115
<211> 44
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 115
gaaggtgacc aagttcatgc tgcgctagtg acgtgaagaa gaaa 44
<210> 116
<211> 44
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 116
gaaggtcgga gtcaacggat tgcgctagtg acgtgaagaa gaag 44
<210> 117 <211> 29
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 117
gcttcttata cccaaacctc tcaatcaaa 29
<210> 118
<211> 21 <212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 118
gatccgattc ttctcctgtt g 21
<210> 119
<211> 21
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
<400> 119
gcctactcct caaatcactc t
<210> 120
<211> 195 <212> DNA <213> Napus sativus
<400> 120
tatacataac tgagtaagac ttataaacat aaacatctag aagaaaaaca aagcttaaaa 60
cttacactct gcgaaatgtc tcggccaaca agttgtttgt ctgaatataa atagcgatcg 120
tagcgttcaa gtatcctttc catgctatat ttcagaaaaa taaaacaaaa tatacttcag 180
taatttgatc catgt 195
<210> 121
<211> 198
<212> DNA
<213> Brassica oleracea
<400> 121
tatacataac tgagcaagac ttatgagtac ataaacatct agaagaaaca aagcttaaaa 60
cttacacttt gtgaaatgtc tcggccaaca agttgtttgt ctgaatataa atagcgatca 120
tatcgctcaa gtatcctttc catgctatat ttcagagaaa aaaacaatca aaatatactt 180
cattaatttg atccatgt 198
<210> 122
<211> 195
<212> DNA
<213> Brassica rapa
<400> 122
tacacataac tgagcaagac ttatgaacat aaacatctag aagaaacaaa gcttaaaact 60
tacactttgt gaaatgtctc ggccaacaag ttgtttgtct gaatataaat agcgatcata 120
tcgctcaagt atcctttcca tgctatattt cagagaaaaa acaatcaaaa tatacttcat 180
taatttgatc catgt 195
<210> 123 <211> 194 <212> DNA
<213> Napus sativus
<400> 123
tcagaatctt tcatagctag agatgtatat tacacaatta atcatactct acatgtaatt 60
aagaatgcta ccgagaaagg gagagagagg aaacctggag gatgttacgc agtactgggg 120
ctgaagaact gaagaattgt tggagcattg gattaattgt ccttcgtgct gacccgtgtt 180
cttctccctc tcct 194
<210> 124
<211> <212> <213>
187 DNA
Brassica oleracea
<400> 124
tcagaatctt ccatagctag agatgtatta atcataatct aaatgtaatt tagaatgcta 60
ctgagaggga gagagaggaa acctggagga ggttacgcag tactggggct gaagaactga 120
agaattgttg gagcattgga ttaattgtcc ttcttgctga cccgtgttct tctccttttc 180
ctctcct 187
<210> 125
<211> 197
<212> DNA
<213> Brassica rapa
<400> 125
tcagaatctt ccatagctag agatgtatat tacacaatta atcataatct aaatgtaatt 60
aagaatgcta ctgagaggga gagagaggaa acctggaggc ggttacgcag tactggggct 120
gaagaactga agaattgttg gagcattgga ttaattgtcc ttcttgctga cccgtgttct 180
tctccttttc ctctcct
197
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Растение Brassica, содержащее в своем геноме геномный фрагмент Raphanus, который придает фенотип устойчивости к растрескиванию стручков POSH+ и характеризуется отсутствием по меньшей мере одного SNP Raphanus по меньшей мере в одном из следующих маркеров: SEQ ID NOs 4-18.
2. Растение Brassica по п. 1, в котором в геномном фрагменте Raphanus присутствует по меньшей мере один SNP Raphanus по меньшей мере в одном маркере SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21.
3. Растение Brassica по п. 1 или 2, в котором SNP Raphanus отсутствуют в маркерах SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 12-18.
4. Растение Brassica по любому из пп. 1-3, в котором SNP Raphanus отсутствуют во всех маркерах SEQ ID NOs 4-18.
5. Растение Brassica по любому из пп. 1-4, которые дополнительно содержат аллель Fruitfull из Raphanus.
6. Растение Brassica по п. 5, в котором аллель Fruitfull из Raphanus включает SNP Raphanus в маркере SEQ ID NO: 22.
7. Растение Brassica по любому из пп. 1-6, которое дополнительно содержит локус восстановления мужской фертильности RfO во фрагменте из Raphanus.
8. Растение Brassica по любому из пп. 1-6, которое содержит цитоплазму CMS
Ogura.
9. Гибридное растение Brassica, полученное путем скрещивания растения Brassica по любому из пп. 1-8, содержащего фрагмент из Raphanus, придающий фенотип POSH+, с другим растением Brassica, не содержащим данного фрагмента из Raphanus, придающего фенотип POSH+, причем данное гибридное растение содержит геномный фрагмент из Raphanus, который придает фенотип устойчивости к растрескиванию стручков POSH+.
10. Семена, части растения либо потомство растения Brassica по любому из пп. 1-9.
11. Способ идентификации растения Brassica POSH+ по любому из пп. 1-10, причем данное растение Brassica идентифицируют по наличию по меньшей мере одного SNP Raphanus по меньшей мере в одном из следующих маркеров SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и/или по отсутствию по меньшей мере одного SNP Raphanus no меньшей мере в одном из следующих маркеров: SEQ ID NOs 4-18.
12. Способ по п. 11, в котором локус POSH+ идентифицируют по наличию аллеля Fruitfull из Raphanus, более предпочтительно маркера Raphanus SEQ ID NO: 22.
13. Способ по п. 11 или 12, в котором дополнительно идентифицируют локус RfO.
14. Средство для выявления одного или нескольких SNP Raphanus в одном или
10.
нескольких из следующих маркеров: SEQ ID NO: 4-22.
15. Средство по п. 14, которое состоит из зонда из нуклеиновой кислоты, праймера или набора праймеров либо их комбинации.
16. Средство по п. 14 или 15, состоящее из одного или нескольких праймеров, включающих в себя любые из SEQ ID NO: 64-99, 106-108, 112-114 и 52-54.
17. Применение растений Brassica либо их семян по любому из пп. 1-10 для пищевого применения, предпочтительно для получения масла, или для кормового применения либо для селекционного применения, к примеру, для применения в качестве родительских растений при селекции для улучшения агрономической ценности растений, линий, гибридов или сортов Brassica.
18. Способ получения растений Brassica POSH+, который включает следующие
стадии:
a) скрещивание первого растения Brassica по любому из пп. 1-9 со вторым растением Brassica POSH" или POSH+, получая при этом гибридное растение F1;
b) самоопыление или возвратное скрещивание данного гибридного растения F1 с указанным вторым растением Brassica POSH" или POSH+;
c) отбор растений Brassica POSH+ среди растений, полученных на стадии Ь), необязательно используя по меньшей мере один SNP Raphanus по меньшей мере в одном из маркеров SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ Ш NO: 21; и
d) необязательно дополнительный отбор данных растений Brassica POSH+ по отсутствию по меньшей мере одного из SNP Raphanus по меньшей мере в одном из маркеров SEQ ID NOs 4-18.
19. Способ по п. 18, в котором растением служит растение, полученное из репрезентативного образца семян, депонированных в коллекции NCIMB за номером 42444.
20. Способ получения растений Brassica POSH+ по любому из пп. 1-9, который включает следующие стадии:
a) получение первого растения Brassica POSH+, содержащего интрогрессию из Raphanus, придающую признак POSH+, причем данная интрогрессия из Raphanus включает по меньшей мере один из SNP Raphanus в одном или нескольких из следующих маркеров: SEQ ID NOs 4-18;
b) скрещивание данного первого растения Brassica POSH+ со вторым растением Brassica POSH" или POSH+, получая при этом гибридное растение F1;
c) самоопыление или возвратное скрещивание гибридного растения F1 с указанным вторым растением POSH" или POSH+;
a)
d) отбор растений POSH+ среди растений, полученных на стадии с), необязательно проводя отбор по наличию по меньшей мере одного SNP Raphanus по меньшей мере в одном из маркеров SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21, и/или необязательно дополнительный отбор по отсутствию по меньшей мере одного SNP Raphanus по меньшей мере в одном из маркеров SEQ ID NOs 4-18.
21. Способ по любому из пп. 18-20, в котором указанное первое растение Brassica POSH+ содержит восстанавливающий фертильность Ogura ген RfO.
22. Растение Brassica, полученное способом по любому из пп. 18-21.
21.
Фиг. 1
i I • - *- "Л"'"' "А^АА" "i УМ ---JLPJ у^д -"Д-'АА Л" A'AAJ' ~\*" УЦи У",АААА" AAA' i -'AAAJU "* 'JM "А1~ ' ч а НАЛ* *¦ *~И =га """^"ДА'^ГЛГ*^
л$*л Н ^wifwA '¦¦ ¦ ¦ ¦ 1¦ *''
м\ ""а% (?ЬГ*ЖШМ &М &ЖМЖ*М *1 iUfi 1 ? ДА1 J i ^^^J^^Jt^lTV'S8^^ - ДА" ~AAAA'-.*A*?Ai. * * V Д| ?'ДЖ?~" *Л Л*Л > A"i7'v
!и !¦""*¦¦¦ чл;* pi sen* :( Д. *"" il ' .ИМ, Mi "'Я, *¦..*
.¦Sfwt | -г И АС"5*"! Л, V :1. ¦ I: .Д. Л "Л. 'Г
Фиг, 2
11 - < 1А"""> г-до з Др 111 JT_r 1 HUM * 1 АЧ" АА" ¦
¦ '-1.1- { , .if-, | 1Л
ifi 1 • - .р АОЧ о:
и г. 3/\
iKOB
POSH (N'
h s
° о ф
ЗосстанаЕ 1 вающий i
Интрогрессия Raphanus
- ¦
Ф Ф
днее
DN03
DN04
DN05
DN01
IDN06
IDN07
IDN08
IDN09
IDN10
IDN11
CL О
Ф о, О
SEQI
SEQI
SEQI
SEQI
SEQI
SEQI
SEQI
SEQI
SEQI
SEQI
Adrian а
0,6
6,7
G:G
G:G
G:G
С:С
Т:Т
А:А
А:А
G:G
T:T
A:A
R4513-CA
5,1
4,4
ТТ:ТТ
А:А
С: С
А:А
А:А
С: С
С:С
А:А
C:C
C:C
Arsenal
7,1
ТТ:ТТ
RD153-101
0,9
6,1
ТТ:ТТ
А:А
С: С
А:А
G:G
T:T
A:A
R51542141F
4,2
6,5
ТТ:ТТ
G:G
C:C
блас
POS
;ть H
Генотип
QID
QID
QID
QID
QID
QID
QID
QID
QID
QID
Lil
Adriana
G:G
G:G
G:G
A:A
C:C
A:A
G:G
A:A
A:A
C:C
R4513-CA
A:A
A:A
A:A
T:T
T:T
G:G
A:A
C:C
G:G
A:A
Arsenal
RD153-101
G:G
G:G
G:G
A:A
C:C
A:A
G:G
A:A
A:A
C:C
R51542141F
G:G
G:G
G:G
A:A
C:C
A:A
G:G
C:C
Фиг. 3B
о Q.
о. я х'1
Интрогрессия Raphanus
° °
о *
О !-" о
а I
ш Г
9 9 9
а а сг
ш ш ш
ьп ьп *л
О короткая,
ГИбрИД х
длинная,
гибрид
0,6
А:А
<*> _^ О "*
а **>
короткая, гибрид х
длинная, гибрид
0,6
из го
О (М
О со ем
короткая х длинная гибрид
ID en
о со
О СП
короткая,
ГИбрИД х
длинная, гибрид
С: А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: А:
C'ACCACCAAATTGAC ' А А
короткая, гибрид * длинная, гибрид
ТТ: С: А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: А:
ТТ ' C'ACCACCAAATTGAC А А
короткая, гибрид * длинная, гибрид
ТТ: С: А: С: С: А: С: С: A: A: A: T: Т: G: А: С: А:
ТТ : C'ACCACCAAATTGAC А А
О Я
короткая, гибрид х длинная, гибрид
л г ТТ: . , С: А: С: С: А: С: С: A: A: A: T: T: G: А: С: " " А:
4 6 А-А • G-G
ТТ ' C'ACCACCAAATTGAC ' А А
короткая, гибрид х длинная, гибрид
ТТ: С: А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: А:
ТТ Г C'ACCACCAAATTGAC : А А
о Q.
о. я t= СС
X | ш
СО g
о с? о (tm)
Интрогрессия Raphanus
° °
о *
О !-" о
ш 9 а
короткая, гибрид х длинная, гибрид
ТТ: С: А: С: С: А: С: С: A: A: A: T: Т: G: А: С: А:
тт : C;ACCACCAAATTGAC : А
А
короткая, гибрид х длинная, гибрид
ТТ: С: А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: А:
3,9 ТТ C'ACCACCAAATTGAC А
А
короткая, гибрид х длинная, гибрид
короткая, гибрид * длинная, гибрид
О (M О -I ем
длинная, гибрид х короткая, мужское
en со го
О > "
а ем
длинная, гибрид х короткая, мужское
ТТ: С: А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: А:
ТТ : C:ACCACCAAATTGAC : А А
в) со го
О > " а <М ем
длинная, гибрид х короткая, мужское
ТТ: С: А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: А:
ТТ : C'ACCACCAAATTGAC 1 А А
со го
о о о "" ем
длинная, гибрид х короткая, мужское
0,4
о. <о
О QJ Q- СО
X | ш
Интрогрессия Raphanus
о о.
о m
8 о
о а 3
ш 9 cf
9 I
Ш Г
en . о Ol О "* ем
ел со en
о о
О 1/1 ем
в) со en
о "*
о из ем
со en
о со О из ем
§ -ем
о о a
о ем
о ем О m ем
Интрогрессия Raphanus
9 а
9 а
А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: ACCACCAAATTGAC
А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: T: G: А: С: ACCACCAAATTGAC
КНЯ А:
Unu
QQ А
sed
А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: ACCACCAAATTGAC
А:А
|№НЯ А: Щ9 А
А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: ACCACCAAATTGAC
А:А
^Я9 А
А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: ACCACCAAATTGAC
Фиг. 4D
о Q. !z СС
Интрогрессия Raphanus
А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: ACCACCAAATTGAC
|ШН А:
А:А
А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: ACCACCAAATTGAC
А:А
|ЕЕ№| А: А
А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: ACCACCAAATTGAC
А:А
А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: ACCACCAAATTGAC
¦КЛЮЯ А: ЕЯ9Д
А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: ACCACCAAATTGAC
Р 5,
О н 5
9 а
о Ш
о з
1- -С
о C1J
Q- га
9 а
Интрогрессия Raphanus
длинная, гибрид * короткая, мужское
С: А: С: С: А: С: С: A: A: A: T: T: G: А: С: А:
C'ACCACCAAATTGAC : А А
§ *
О 1Л
а -I см
длинная, гибрид х короткая, мужское
длинная, гибрид х короткая, мужское
I I
А: С: А С
А: С: А С
длинная, гибрид х короткая, мужское
С: А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: T: G: А: С: А:
C'ACCACCAAATTGAC ' А А
о из О "" см
длинная, гибрид х короткая, мужское
С: _ А: С: С: А: С: С: A: A: A: T: Т: G: А: С: А:
C'ACCACCAAATTGAC ' А А
О 1Л Q U3
длинная, гибрид х короткая, мужское
" " ТТ- , С: А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: _ А:
4 4 А'А • G'G
ТТ ' C'ACCACCAAATTGAC ' А А
о о
О 00
длинная, гибрид х короткая, мужское
А: С: А С
о см О ел см
длинная, гибрид х короткая, мужское
О ТО
О- СС !? СС
I ф
m |-
св is
i I
° 2
о "
Интрогрессия Raphanus
о ш о
о о с
о п о
а а 3 z 9
СП О тН
i-i ем ем
z z z
ООО
(Л (Л (Л
о оо О en ем
длинная, гибрид х короткая, мужское
0,4
ем о
8 01
короткая, гибрид х длинная, гибрид
О) ем О
о о О "н го
короткая, гибрид х длинная, гибрид
ТТ: С: А: С: С: А: С: С: A: A: A: T: T: G: А: С: А:
ТТ : C^ACCACCAAATTGAC : А А
ем о
О О тН ео
короткая, гибрид х длинная, гибрид
С: А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: А:
: C^ACCACCAAATTGAC : А А
О) ем
§ и о <м
короткая,
ГИбрИД х
длинная, гибрид
А: С: А С
в) ем о
о lv а <м
короткая,
ГИбрИД х
длинная, гибрид
С: А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: А:
: C:ACCACCAAATTGAC : А А
в) ем о
о о О (О ео
короткая, гибрид х длинная, гибрид
С: А: С: С: А: С: С: А: А: А: Т: Т: G: А: С: А:
: C:ACCACCAAATTGAC : А А
О) ем о
о з О ео ео
короткая, гибрид х длинная, гибрид
0,7
А:А
о "я
о 2
ф с.
Q. ^
Й °i
р. Я
ь СС
СП ,s
X ^
S ЕГ
о о
° та
О m
0Q |
Интрогрессия Raphanus
3 z 9
9 а
А: С: С: А: С: С: A: A: A: T: T: G: А: С: ACCACCAAATTGAC
Фиг. 5
Интрогрессия
Raphanus
Интрогрессия Raphanus
Область POSH
CMS
Artoga (1) Albatros (2) Alabaster (3) Dobrava (4) Atenzo (5) Arsenal (6) NSA10/209 (7) Armstrong (8) NSA10/211 (9) Anterra (10) Mescal "(11)
кдроткайГ^тр%рй№ия, гибрид.. . .. короткая ивтшгрессия,
короткая интрогрессия; гибр"
длинная интрогрессия.
DN03
KOC
ОЙ;
стр;
0,8 1,0
0,9 0,9
3 ш
1Г:
3 ш
(Л 3
(Л з
(Л 3 ш
9 ш
(Г,
3 ш
3 ш
3 ш
3 ш •л
А:А G:G Т:Т А:А G:G, G:G1 G:G А:А С:С А:А G:G А:А А:А; С:С
А;А G;G " f:T А:А ¦ G:G7G:G . G:G А:А [ С;С " А:А \ G:G А:А А:А , С:С
А;А G:G Т;Т ] А:А G:G' G:G G:G~A;A С;С k.A Q:Q кА к.А С:С
А:А ¦ G:G "т":Т " А:А G:G" G:G 1 G:G " А:А С:С А:А G:G А:А А:А С:С
Фиг. 7
Интрогрессия Raphanus
Восстанавливающий ген
Интрогрессия Raphanus
Область POSH
Fruitfull
о IH tn
ГМ 4f in ID
о 2
о 2
о 2
a 2
о 2
о 2
о 2
ГМ ГМ ГМ PM PM
Генотип
¦ 11
z a
z a
z a
z a
z z z a a a
Sf Sf Sf
z z z z
О О О О
a a a a
(rt


LU LU LU LU (/)(/)(/)(/)
03137 2
тт/гт
G/G
G/G
C/C
T/T
A/A
A/A
G/G
T/T
A/A
G/G
G/G
G/G
A/A
C/C
A/A
G/G
G/G A/A C/C
T/T A/A C/C T/T
03137 5
тт/гт
G/G
G/G
C/C
т/т
A/A
A/A
G/G
т/т
A/A
G/G
G/G
G/G
A/A
C/C
A/A
G/G
G/G A/A C/C
T/T A/A C/C T/T
05627 2
тт/гг
G/G
G/G
C/C C/C C/C
C/C
A/A
G/G
т/т
A/A
G/G
G/G
G/G
A/A
C/C
A/A
G/G
05627 3
тт/гт
G/G
G/G
A/A
G/G
T/T
A/A
G/G
G/G
G/G
A/A
C/C
A/A
G/G
05627 12
тт/гт
G/G
G/G
A/A
G/G
т/т
A/A Й1
G/G
G/G
G/G
A/A
C/C
A/A
G/G
04013 22
тт/гг
A/A A/A
A/A
G/G
G/G
G/G
G/G
A/A
G/G ¦¦c/f
T/T A/A C/C T/T
F31420031-L-9
тт/гт
A/A
G/G
l/l
A/A
G/G
G/G
G/G
A/A
C/C
A/A
G/G
шшшшшашшшшшшша
2/14
2/14
4/14
4/14
Фиг. 4А
Фиг. 4А
4/14
4/14
Фиг. 4А
Фиг. 4А
4/14
4/14
Фиг. 4А
Фиг. 4А
4/14
4/14
Фиг. 4А
Фиг. 4А
4/14
4/14
Фиг. 4А
Фиг. 4А
4/14
4/14
Фиг. 4А
Фиг. 4А
5/14
5/14
Фиг. 4В
Фиг. 4В
5/14
5/14
Фиг. 4В
Фиг. 4В
5/14
5/14
Фиг. 4В
Фиг. 4В
5/14
5/14
Фиг. 4В
Фиг. 4В
5/14
5/14
Фиг. 4В
Фиг. 4В
5/14
5/14
Фиг. 4В
Фиг. 4В
6/14
6/14
Фиг. 4С
Фиг. 4С
6/14
6/14
Фиг. 4С
Фиг. 4С
6/14
6/14
Фиг. 4С
Фиг. 4С
7/14
7/14
8/14
8/14
Фиг. 4Е
Фиг. 4Е
9/14
9/14
Фиг. 4F
Фиг. 4F
9/14
9/14
Фиг. 4F
Фиг. 4F
9/14
9/14
Фиг. 4F
Фиг. 4F
9/14
9/14
Фиг. 4F
Фиг. 4F
9/14
9/14
Фиг. 4F
Фиг. 4F
9/14
9/14
Фиг. 4F
Фиг. 4F
10/14
10/14
Фиг. 4G
Фиг. 4G
10/14
10/14
Фиг. 4G
Фиг. 4G
10/14
10/14
Фиг. 4G
Фиг. 4G
10/14
10/14
Фиг. 4G
Фиг. 4G
10/14
10/14
Фиг. 4G
Фиг. 4G
10/14
10/14
Фиг. 4G
Фиг. 4G
10/14
10/14
Фиг. 4G
Фиг. 4G
11/14
11/14
11/14
11/14