(57) Реферат / Формула:
Новый амфифильный пептид, пептидные амфифильные липидные мицеллы, способы получения пептидных амфифильных липидных мицелл, содержащих амфифильный пептид и фосфолипид и необязательно содержащий молекулу груза, и способы их применения.
Евразийское (21) 201890271 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.01.31
(22) Дата подачи заявки 2016.07.08
(51) Int. Cl.
C07K14/00 (2006.01) A61K 9/107 (2006.01) A61K9/127 (2006.01) C12Q 1/48 (2006.01)
(54) СОСТАВЫ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГИДРОФОБНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
(31) 62/190,909
(32) 2015.07.10
(33) US
(86) PCT/US2016/041544
(87) WO 2017/011312 2017.01.19
(71) Заявитель: ПЕПТИНОВО БАЙОФАРМА,
ЭлЭлСи (US)
(72) Изобретатель:
Хомэн Рейнолд, Эллиотт Уильям Л.
(US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Новый амфифильный пептид, пептидные ам-фифильные липидные мицеллы, способы получения пептидных амфифильных липидных мицелл, содержащих амфифильный пептид и фосфолипид и необязательно содержащий молекулу груза, и способы их применения.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-547204ЕА/055 СОСТАВЫ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГИДРОФОБНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ
СРЕДСТВ
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка РСТ испрашивает приоритет по предварительной заявке США № 62/190909, поданной в 10 июля 2015. Раскрытие изобретения включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Данная заявка включает в себя путем ссылки во всей полноте список последовательностей, озаглавленный "236603-
371638_Sequence_Listing_ST25.txt" созданный 1 июля 2015 года, в 13:17, размером 2 9 KB, и поданный в электронном виде в данном документе.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Данное изобретение относится к транспортировке и доставке терапевтических молекул в их сайты действия посредством парентерального введения. Более конкретно, данное изобретение относится к технологии состава, позволяющей вводить лекарственные средства в наночастицы, которые можно легко вводить парентерально для безопасной и эффективной доставки включенных лекарственных средств в их терапевтические мишени.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Многие терапевтические вещества, которые действуют
системно, не подходят для относительной простоты перорального
введения и должны вводиться парентерально. Однако часто те же
факторы, которые усложняют пероральное дозирование, препятствуют
процессу парентерального дозирования. К таким факторам относятся
плохая растворимость в воде из-за гидрофобности или других
свойств, нестабильность лекарственного средства в
пищеварительном тракте, недостаточная абсорбция или повышенный клиренс после абсорбции, что приводит к неадекватной концентрации в плазме и/или времени воздействия.
[0005] Варианты для работы с гидрофобными лекарственными
средствами, требующими парентерального дозирования, обычно включают добавление различных эксципиентов для получения стабильных суспензий, дисперсий или растворов, пригодных для инъекций. Типы используемых эксципиентов включают детергенты, полимеры различных типов, масляные эмульсии, фосфолипиды и альбумин. Во многих случаях эксципиенты, используемые для получения необходимой лекарственной солюбилизации, представляют собой детергент-подобные вещества. К ним относятся дезоксихолат, Cremophore EL(r) - полиэтилоксированное производное касторового масла и полисорбат 80. Последние два обычно используются совместно с этанолом. Эти агенты решают проблему солюбилизации, но у них есть вредные свойства, которые приводят к высокому риску реакций гиперчувствительности. Общим требованием является то, что пациенты, которым вводили растворы, содержащие Cremophore EL(r) или полисорбат 80, предварительно получали противовоспалительные препараты для подавления воспаления, зависящего от состава. Наиболее серьезными последствиями реакций гиперчувствительности являются снижение толерантности к лечению и увеличение риска смерти.
[0006] Примеры одобренных лекарственных препаратов, содержащих Cremophore EL(r) или полисорбат 8 0 для солюбилизации, включают гидрофобные противораковые лекарственные средства паклитаксел (Taxol(r)) , доцетаксел (Taxotere(r)) , кабазитаксел
(Jevtana(r)) и иксабепилон (Ixempra(r)) . Иммуносупрессанты циклоспорин (Sandimmune(r)) , такролимус (Prograf(r)) и темсиролимус
(Torisel(r)) также зависят от этих агентов для препаратов. В случае паклитаксела определенный прогресс был достигнут путем замещения Cremophore EL(r) и этанола в качестве диспергирующего агента на альбумин (т.е. Abraxane(r)) . Противогрибковый агент амфотерицин В также является довольно гидрофобным и требует мер для получения стабильной суспензии для инфузии.
[0007] Другие дозирующие препятствия, с которыми сталкиваются многие лица, включают быстрый клиренс и инактивацию метаболическими путями. Например, противораковый агент
гемцитабин необходимо вводить в высоких дозах для преодоления его распада, катализируемого цитидиндезаминазой, для получения терапевтических уровней. Еще одной проблемой, ограничивающей введение лекарственного средства, является непреднамеренное воздействие на нецелевые ткани эффектов этих лекарственных средств. Это особенно важно для цитотоксических противораковых лекарственных средств.
[0008] Описания попыток обнаружить превосходные
парентеральные препараты, включая эмульсии, мицеллы, липосомальные составы, полимеры и твердые липидные наночастицы многочисленны, но многим усилиям препятствуют проблемы низкой эффективности захвата, нестабильности лекарственного средства, утечки полезной нагрузки и плохой стабильности при хранении. Некоторый успех был достигнут с липосомальными препаратами. Примеры включают цитарабин в липосомах (DepoCyt(r)) для снижения скорости клиренса, доксорубицин в липосомах (Doxil(r), Myocet(r)) для снижения кардиотоксичности и амфотерицин-В в липосомах (например, AmBisome(r)) для улучшения солюбилизации.
[0009] Учитывая ограниченное количество современных методов лечения и неадекватность вариантов, существует явная необходимость в разработке альтернатив препаратов для парентерального введения лекарств с улучшенными профилями безопасности и терапевтическими показателями; и/или терапий, которые, по меньшей мере, предоставляют общественности полезный выбор.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] Данное раскрытие относится к данной необходимости путем предоставления новых препаратов наночастиц липидов и пептидов, и способов их образования, которые позволяют включать молекулы, например, лекарственные средства, и являются стабильными в инфузионных или инъекционных растворах. Составы по изобретению обеспечивают одно или более улучшений, включая, но не ограничиваясь ими, улучшенные фармакокинетические параметры, увеличенный период полувыведения, целенаправленную доставку, уменьшенную токсичность или улучшенный терапевтический индекс
для парентерально вводимых лекарственных средств, в частности противораковых лекарственных средств.
В данном раскрытии предложены амфифильные альфа-спиральные пептиды, которые содержат аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 1, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 59.
[ООН] Кроме того, в данном описании предложены пептидные амфифильные липидные мицеллы (PALM), которые содержат пептид, содержащий аминокислотную последовательность раскрытия, сфингомиелин и один или более дополнительных фосфолипидов. PALM по данному раскрытии необязательно содержит одну или более молекул груза, таких как визуализирующие агенты и лекарственные средства.
[0012] В данном раскрытии также предложены способы получения PALM и композиции PALM, объединенной с молекулами груза.
[0013] Кроме того, в данном раскрытии предложены конъюгаты соединений и способы получения конъюгатов соединений, пригодных для использования с PALM.
[0014] Кроме того, в данном раскрытии предложены способы лечения расстройств путем введения конъюгатов PALM-лекарственное средство.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0015] На фиг. 1А и 1В представлены изображения кольца
Эдмундсона пептидов SEQ ID N0: 3 и 25 соответственно,
демонстрирующие их амфифильную конформацию. На фигурах 1А и 1В
дополнительно представлены осевые положения составляющих
аминокислот (обозначенных стандартными однобуквенными
аббревиатурами) вокруг длинной оси альфа-спирали. Буква "В" представляет собой 2-аминоизомасляную кислоту. Пунктирные линии указывают приблизительные границы между гидрофильными аминокислотами (заштрихованными), образующими полярные грани пептидов, и гидрофобными аминокислотами, образующими неполярные грани. На фигурах 1С и 1D представлены спиральные сетчатые изображения пептидов SEQ ID N0: 3 и 25, соответственно.
[0016] Фигура 2. Эксклюзионная хроматограмма PALM, содержащей мириплатин (сплошная линия) по сравнению с HDL
человека (пунктирная линия). PALM состояла из пептида SEQ ID N0: 2 5 и РОРС, SM и мириплатина в мольном отношении 2,5:3:7:0,75.
[0017] Фигура 3. Показана эксклюзионная хроматография PALM, содержащих ХС, и приготовленных с пептидом SEQ ID N0: 25 при мольном отношении пептид: фосфолипид:ХС, равном 1:4:0,4. Отмечены положения элюирования белковых стандартов различных диаметров Стокса.
[0018] Фигура 4. Сравнение эксклюзионных хроматограмм PALM, содержащих ХТЗ, и приготовленных с пептидом SEQ ID N0: 2 5 (пунктирная линия) или с пептидом R4F (сплошная линия). Состав обоих был следующим, пептид:РОРС:SM:ХТЗ в мольном эквивалентном соотношении 1:2,8:1,2:0,4.
[0019] Фигура 5. Показана эксклюзионная хроматография PALM, приготовленных с пептидом SEQ ID N0: 2 5 и содержащий фенретинид. Состав был следующим, пептид:РОРС:SM:фенретинид в мольном эквивалентном соотношении 2,5:3:7:2.
[0020] Фигура б. Ингибирование роста клеток рака простаты РСЗ с помощью PALM (MP) по сравнению с ингибированием цисплатином
[0021] Фигура 7. Эффект антитела SR-BI на ингибирование роста клеток рака простаты РСЗ PALM (MP). Линии указывают приближение данных к логистическому уравнению.
[0022] Фигура 8. Ингибирование роста клеток рака яичника SK0V3 с помощью PALM/(ХС) (квадрат, пунктирная линия) или PALM (ХТЗ) (ромб, сплошная линия) по сравнению с ингибированием паклитакселом (круг, пунктирная линия). Линии указывают приближение данных к логистическому уравнению.
[0023] Фигура 9. PALM, приготовленные с различными пептидами, как указано, и содержащие Dil, инкубировали с клетками ВНК (SR-BI), которые стабильно трансфицировали геном SR-BI человека, индуцируемым мифепристоном. Инкубации проводили с помощью неиндуцированных (контрольных) или индуцированных клеток. HDL человека, помеченный Dil, был протестирован для сравнения. Количество Dil, поглощаемое клетками в течение 4 часов после инкубации, регистрировалось с помощью флуоресценции.
[0024] Фигура 10. Клетки ВНК (SR-BI) с геном SR-BI
человека, индуцируемым мифепристоном, которые являлись либо индуцированными (SR-BI +), либо неиндуцированными (контроль), инкубировали с указанными концентрациями РТХ или PALM (ХТЗ) в течение 12 ч. Клетки инкубировали далее в отсутствие тестовых агентов в течение дополнительных 3 6 часов перед обнаружением % роста по методу МТТ.
[0025] Фигура 11. SR-BI-антитело блокирует поглощение ХТЗ от PALM (ХТЗ) (стрелка).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0026] Определения
[0027] "Наночастица" означает частицу, размер которой не превышает 100 нм.
[0028] Используемые в данном документе формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное.
[0029] Следует отметить, что в данном раскрытии термины, такие как "включает", "состоящий", "включающий", "содержит" и "содержащий" и т.п., имеют значение, указанное в патентном праве Соединенных Штатов; они являются инклюзивными или открытыми и не исключают дополнительных, неперечисленных элементов или стадий способа. Такие термины, как "состоящие в основном из" и "состоит в основном из", имеют значение, указанное в патентном праве Соединенных Штатов; они допускают включение дополнительных ингредиентов или стадий, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые характеристики заявленного изобретения. Термины "состоит из" и "состоящий из" имеют значение, приписываемое им в патентном праве Соединенных Штатов; а именно, что эти термины являются закрытыми.
[0030] Слово "около" указывает, что значения являются приблизительными. Например, диапазон "от около 1 мг до около 50 мг" указывает, что значения являются приблизительными. Диапазон "от около 1 мг до около 50 мг" включает приблизительные и конкретные значения, например, диапазон включает около 1 мг, 1 мг, около 50 мг и 50 мг.
[0031] Когда диапазон описан, диапазон включает как конечные точки диапазона, так и все числа между ними. Например,
"1-10 мг" включает 1 мг, 10 мг и все количества от 1 мг до 10 мг. Аналогично, "от 1 мг до 10 мг" включает 1 мг, 10 мг и все количества от 1 мг до 10 мг.
[0032] Используемый в данном документе термин "алкил" относится к насыщенной алифатической углеводородной группе, содержащей от 7-21 атомов углерода. Используемый в данном документе термин (Ci-Cn) алкил относится к алкильной группе, содержащей 1-п атомов углерода. Например, (C8-Ci2) алкил относится к алкильной группе, содержащей 8, 9, 10, 11 или 12 атомов углерода. Алкильная группа может быть разветвленной или неразветвленной.
[0033] Используемый в данном документе термин "алкенил" относится к алифатической группе углерода, которая содержит от 7-21 атомов углерода и по меньшей мере одну двойную связь. Используемый в данном документе термин (Ci-Cn) алкенил относится к алкенильной группе, содержащей 1-п атомов углерода. Алкенильная группа может быть разветвленной или неразветвленной.
[0034] "Состоит в основном из", когда используется для описания липидного компонента, означает, что липидный компонент содержит менее 0,1% мол. любого дополнительного липида, отличного от указанного.
[0035] "ХС" представляет собой аббревиатуру для паклитаксел 2'-холестерилкарбоната.
[0036] ХТЗ представляет собой аббревиатуру для паклитаксел 2'-8-токотриенилкарбоната.
[0037] "MP" представляет собой аббревиатуру для мириплатина.
[0038] "РТХ" представляет собой аббревиатуру для паклитаксела.
[0039] "РОРС" представляет собой аббревиатуру для 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолина
[0040] "SM" представляет собой аббревиатуру для сфингомиелина
[0041] "HDL" представляет собой аббревиатуру для липопротеина высокой плотности.
[0042] "SR-BI" представляет собой аббревиатуру для
фагоцитарного рецептора класса В, типа 1.
[0043] "ВНК" представляет собой аббревиатуру для почки детеныша хомяка.
[0044] "Dil" представляет собой аббревиатуру для 1,1'-диоктадецил- 3,3,3", 3"-тетраметилиндокарбоцианина
[0045] "PALM" представляет собой акронимом, используемым для идентификации пептидных амфифильных липидных мицелл, образованных из комбинации амфифильного пептида с фосфолипидами и необязательно другими гидрофобными молекулами в водной суспензии.
[004 6] "Амфифильный" описывает молекулу или полимер
(например, пептид) с аффинностью как для липидной, так и для
водной фаз из-за конформации, в которой гидрофильные
(стремящиеся к воде) заместители и гидрофобные
(водоотталкивающие) заместители в молекуле или полимере структурно отделены друг от друга.
[0047] "Липофильный" описывает вещество, которое преимущественно распределяется по липидным доменам богатых липидами частиц в водной суспензии. Богатые липидами частицы включают липидные мицеллы, липосомы, липопротеины, клеточные мембраны и липидные эмульсии.
[0048] "Пептид" представляет собой полимер, полученный из мономеров альфа-аминокислот, соединенных вместе амидными связями, образованными между карбоксильной группой одной аминокислоты и альфа-аминогруппой следующей аминокислоты в полимере. "Пептид" также включает полимер мономеров аминокислот, соединенных вместе. Можно использовать как L-оптические изомеры, так и D-оптические изомеры аминокислот. Аминокислоты, составляющие полимер, могут быть либо теми, которые находятся в природе (то есть естественными аминокислотами), либо неестественными аминокислотами. Термин "остаток" или "аминокислотный остаток" включает ссылку на аминокислоту, которая включена в пептид, полипептид или белок.
[0049] Пептидные последовательности в соответствии с правилами и, используемые в данном документе, записывают с N
конца к С-концу, слева направо.
[0050] "Мицелла" представляет собой многомолекулярную структуру, организованную нековалентными взаимодействиями в водной фазе. Мицелла состоит из амфифильных и гидрофобных молекул, которые объединяются таким образом, что гидрофобные домены молекул экранированы от воды, а гидрофильные компоненты находятся на границе раздела мицелла-вода.
[0051] "Молекулы груза" представляют собой гидрофобные или амфифильные молекулы с фармацевтическими, терапевтическими или диагностическими свойствами, которые стабильно включены в PALM и не нарушают стабильности PALM.
[0052] "миРНК" представляет собой малые, интерферирующие рибонуклеиновые кислоты, созданными для контроля клеточной экспрессии гена, как часть РНК-индуцированного комплекса сайленсинга.
[0053] "Aib" представляет собой трехбуквенный код аминокислоты альфа-аминоизомасляной кислоты.
[0054] "АЬа" представляет собой трехбуквенный код аминокислоты альфа-аминомасляной кислоты.
[0055] "Amv" представляет собой трехбуквенный код для неестественной аминокислоты альфа-метилвалина.
[0056] "Огп" представляет собой трехбуквенный код аминокислоты орнитина.
[0057] "SEC" представляет собой эксклюзионную хроматографию
[0058] "DLS" представляет собой динамическое рассеяние света
[0059] В первом аспекте данного раскрытия предложены "амфифильные пептиды". Амфифильные пептиды способны принимать альфа-спиральную конформацию, в которой спираль имеет противоположные полярные и неполярные грани, ориентированные вдоль длинной оси спирали. Методики синтеза пептидов хорошо известны в данной области техники. Пептиды по данному изобретению могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области техники.
[0060] В таблице 1 показано распределение заряда конкретных амфифильных пептидов по данному изобретению по сравнению с
несколькими последовательностями, известными из уровня техники. Распределение заряда пептидов по данному изобретению является новым с учетом известного уровня техники, показанного ниже. ТАБЛИЦА 1
Заряды остатков в аполипопротеиновых A-I пептидах-миметиках при
нейтральном рН
Аминокислотное положение
Заряд
Заряд
а SEQ ID NO: 1-23 ь SEQ ID NO: 24-35
c Anantharamaiah et al. (1990) Arteriosclerosis 10:95-105 d Homan et al. (2013) Anal. Biochem. 441:80-86 eAnantharamaiah et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:10248-10255 f Datta et al. (2001) J. Lipid Res. 42:1096-1104 g Zhang et al. (2009) Angew. Chem. Int. Ed. 48:9171-9175
h Uehara et al. (2013) J Am Heart Assoc. 2 (3) : e000048. doi: 10.1161/JAHA.113.000048
"о" указывает на нулевой заряд в указанном положении.
"+" указывает на положительный заряд в указанном положении.
"-" указывает на отрицательный заряд в указанном положении.
[0061] В одном варианте осуществления первого аспекта раскрытия предложен пептид, содержащий аминокислотную последовательность: Xi- Х2 -Х3- Х4 -Х5 -Х6 -Х7 -Х8 -Х9 -Х10 -Хц -Х12 -Х13 -Х14 -Х15 -Xi6 -Xiv -Xi8- Xig -X2o, где: Xi представляет собой аминокислоту D; X2 и X2o каждый представляет собой аминокислоту V; Х3, Х6г Хю и Х13 каждый представляет собой аминокислоту,
независимо выбранную из группы, состоящей из L и F; Х4, Х12 и Xi9 каждый представляет собой аминокислоту Q; Х5 представляет собой аминогруппу А или Aib; Xlr Х16 и Xi8 каждый представляет собой аминокислоту К; Х8 и Xi5 каждый представляет собой аминокислоту Е; Х9 и Х14 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, L, F и Aib; Хц представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, Aib и N; а Х17 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F и L, (SEQ ID N0: 1), при этом пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот.
[0062] В другом варианте осуществления первого аспекта предложен пептид, который состоит по существу из аминокислотной последовательности: Хг- Х2 -Х3- Х4 -Х5 -Х6 -Х7 -Х8 -Х9 -Х10 -Хц -Х12 -Х13 -Х14 -Х15 -Х16 -Х17 -Х18- Х19 -Х20/ где: Хг представляет собой аминокислоту D; Х2 и Х20 каждый представляет собой аминокислоту V; Х3, Х6/ Х10 и Х13 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из L и F; Х4, Х12 и Х19 каждый представляет собой аминокислоту Q; Х5 представляет собой аминогруппу А или Aib; Xlr Х16 и Х18 каждый представляет собой аминокислоту К; Х8 и Х15 каждый представляет собой аминокислоту Е; Х9 и Х14 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, L, F и Aib; Хц представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, Aib и N; а Х17 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F и L, (SEQ ID N0: 1), при этом пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот.
[0063] В еще одном варианте осуществления первого аспекта предложен пептид, который состоит из аминокислотной последовательности: Xi- Х2 -Х3- Х4 -Х5 -Х6 -Х7 -Х8 -Х9 -Х10 -Хц -Х12 -Х13 -Х14 -Х15 -Xi6 -X17 -Xi8- Xig -X20, где: Xi представляет собой аминокислоту D; X2 и X20 каждый представляет собой аминокислоту V; Х3, Х6г Хю и Х13 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из L и F; Х4, Х12 и Х19 каждый представляет собой аминокислоту Q; Х5 представляет собой аминогруппу А или Aib; Х7, Xi6 и Х18 каждый представляет собой аминокислоту К; Х8 и Х15 каждый представляет собой аминокислоту
Е; Х9 и Х14 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, L, F и Aib; Хц представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, Aib и N; а Х17 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F и L. (SEQ ID N0: 1)
[0064] В другом варианте осуществления первого аспекта
предложен пептид, который содержит аминокислотную
последовательность: Xi- Х2 -Х3- Х4 -Х5 -Х6 -Х7 -Х8 -Х9 -Хц -Хц -Хц -Х13 -Х14 -Х15 -Х16 -Х17 -Х18- Х19 -Х2о, где: Х1г Х8 и Х15 независимо выбраны из группы, состоящей из аминокислот D и Е; Х2 и Х20 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из V, Y и L; Х6/ Х10 и Х17 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L, I, V, W, Y и F; Х4, Хц, Х12 и Х19 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из Q и N; Х5, Х16 и Х18 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из К, R, Н и Огп; Х3, Х7, Х9, Х13 и Х14 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, L, F, V, Amv и Aib, (SEQ ID NO: 24), при этом пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот.
[0065] В другом варианте осуществления первого аспекта предложен пептид, который состоит по существу из аминокислотной последовательности: Xi- Х2 -Х3- Х4 -Х5 -Х6 -Х7 -Х8 -Х9 -Х10 -Хц -Хц -Хц -Х14 -Х15 -Xi6 -Х17 -Xi8- Xig -X20, где: Xi представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D и Е; Х2 и Х20 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из V, I и L; Х3, Х6г Х10 и Хц каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из L, I, V, W, Y и F; Х4, Хц и Хц каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из Q и N; Х5, Хц и Хц каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из К, R, Н и Огп; Х7 выбирают из группы, состоящей из A, G, S, V, Aib и Amv; Х8 и Хц независимо выбирают из группы, состоящей из аминокислот Е и D; Х9 и Х14 представляют собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, G, S L, F, V, Amv и Aib; Хц представляет
собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, S, Aib, Amv, V и N; а Хц представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F, Y, I, V и L, (SEQ ID N0: 24), и пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот.
[0066] В еще одном варианте осуществления первого аспекта предложен пептид, который состоит из аминокислотной последовательности: Xi- Х2 -Х3- Х4 -Х5 -Х6 -Х7 -Х8 -Х9 -Хц -Хц -Хц -Хц -Х14 -Хц -Хц -Хц -Хц- Хц -Х2о, где: Xi представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D и Е; Х2 и Х20 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из V, I и L; Х3, Х6/ Х10 и Х13 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из L, I, V, W, Y и F; Х4, Х12 и Х19 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из Q и N; Х5, Х16 и Х18 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из К, R, Н и Огп; Х7 выбирают из группы, состоящей из A, G, S, V, Aib и Amv; Х8 и Х15 независимо выбирают из группы, состоящей из аминокислот Е и D; Х9 и Х14 представляют собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, G, S L, F, V, Amv и Aib; Хц представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, S, Aib, Amv, V и N; а Х17 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F, Y, I, V и L. (SEQ ID N0: 24)
[0067] Предполагается, что любой из раскрытых вариантов осуществления пептидов в соответствии с первым аспектом необязательно является ацилированным в альфа-амине N-концевой аминокислоты пептида, необязательно является амидированным в концевой карбоксильной группе пептида или необязательно является ацилированным в альфа-амине N-концевой аминокислоты и амидированным в концевой карбоксильной группе пептида. Пептиды могут быть ацилированы или амидированы способами, известными в данной области техники.
[0068] Конкретные пептиды по данному изобретению представлены в таблице 2 ниже.
ТАБЛИЦА 2
SEQ ID NO:
Последовательность пептида
Средний гидрофобный момент a
Средняя гидрофобность ь
DVFQALKELFAQLLEKWKQV
0, 846
-1,043
DVFQ{AIB}LKELFNQLLEKWKQV
0, 908
-1,135
DVFQ{AIB}LKELLAQLLEKFKQV
0, 885
-0,995
DVFQ{AIB}LKELLNQLLEKFKQV
0, 948
-1,092
DVFQ{AIB}LKELLNQL{AIB}EKFKQV
0, 940
-1,120
DVFQ{AIB}LKELLNQL{AIB}EKWKQV
0, 910
-1,151
DVFQALKELLAQLLEKFKQV
0, 887
-1,000
DVFQALKELLNQLLEKFKQV
0, 950
-1,097
DVFQ{AIB}LKELFAQLLEKWKQV
0, 845
-1,038
DVFQ{AIB}LKELFNQLLEKWKQV
0, 908
-1,135
DVFQ{AIB}LKELFNQLLEKFKQV
0, 938
-1,104
DVFQALKELFAQL{AIB}EKWKQV
0, 836
-1,071
DVFQALKELFNQL{AIB}EKWKQV
0, 902
-1,168
DVFQALKELFNQL{AIB}EKFKQV
0, 932
-1,137
DVFQAFKEAFAQLFEKWKQV
0, 821
-1,099
DVFQAFKE{AIB}FAQLFEKWKQV
0, 822
-1,094
DVFQ{AIB}FKE{AIB}FAQLFEKWKQV
0, 820
-1,089
DVFQAFKEAF{AIB}QLFEKWKQV
0, 818
-1,094
DVFQAFKE{AIB}F{AIB}QLFEKWKQV
0, 819
-1,089
DVFQ{AIB}FKE{AIB}F{AIB}QLFEK WKQV
0, 817
-1,084
DVFQALKELFNQLLEKWKQV
0, 910
-1,140
DVFQ{AIB}LKELLNQLLEKLKQV
0, 959
-1,081
DVFQKL{AIB}ELFNQLLEKWKQV
0, 976
-1,135
DVFQKLVELFNQLLEKWKQV
0, 979
-1,119
DV{AIB}QKLFELFNQLLEKWKQV
0, 966
-1,135
DVFQKL{AIB}ELFNQLLEKFKQV
1, 007
-1,104
DVFQKLVELFNQLLEKFKQV
1, 010
-1,088
DV{AIB}QKLFELFNQLLEKFKQV
0, 997
-1,104
DVLQKF{AIB}ELFNQLLEKWKQV
0, 974
-1,135
DV{AIB}QKFLELFNQLLEKWKQV
0, 958
-1,135
DVFQKLLE{AIB}FNQLLEKWKQV
0, 979
-1,135
DVFQKL{AIB}ELFNQ{AIB}LEKWKQV
0, 955
¦1, 163
DVFQKL{AIB}ELFNQL{AIB}EKWKQV
0, 961
-1,163
a Вычисляется из гидрофобности аминокислот (Hessa et al. Nature 433:377-381 (2005)) согласно Pownall et al. (FEBS Lettersl59:17-23 (1983)).
b Рассчитывается как сумма гидрофобности аминокислот, деленная на количество остатков (Ккал/моль/остаток).
[0069] Одним вариант осуществления первого аспекта раскрытия представляет собой пептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-23, где пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот. Еще один вариант осуществления представляет собой пептид, состоящий по существу из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-23, где пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот. Еще один вариант осуществления представляет собой пептид, состоящий из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-23. В любом из вышеприведенных вариантов осуществления раскрытых пептидов, необязательно альфа-амин N-концевой аминокислоты пептида является ацилированным; концевая карбоксильная группа является амидированнной; или альфа-амин N-концевой аминокислоты является ацилированным, и концевая карбоксильная группа пептида является амидированнной.
[0070] Одним вариант осуществления первого аспекта раскрытия представляет собой пептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 25-35, где пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот. Еще один вариант осуществления представляет собой пептид, состоящий по существу из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 25-35, где пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот. Другой вариант осуществления представляет собой пептид, состоящий из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 25-35. В любом из вышеприведенных вариантов осуществления пептидов, необязательно альфа-амин N-концевой аминокислоты пептида является ацилированным; концевая карбоксильная группа является
амидированнной; или альфа-амин N-концевой аминокислоты является ацилированным, и концевая карбоксильная группа пептида является амидированнной.
[0071] Варианты осуществления данного раскрытия дополнительно включают пептиды, которые имеют обратную последовательность пептидов, в общем определенных посредством SEQ ID N0: 1 и 24.
[0072] В одном варианте осуществления первого аспекта раскрытия предложены пептиды, которые являются обратными SEQ ID N0: 1 и пептиды, содержащие аминокислотную последовательность: Х1-Х2-ХЗ- Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х2 0, где XI и XI9 каждый представляет собой аминокислоту V; Х2, Х9 и Х17 каждый представляет собой аминокислоту Q; ХЗ, Х5 и Х14 каждый представляет собой аминокислоту К; Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F и L; Хб и Х13 каждый представляет собой аминокислоту Е; Х7 и Х12 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, L, F и Aib; Х8, XII, Х15 и Х18 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из L и F; XI0 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, Aib и N; XIб представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из А и Aib; а Х2 0 представляет собой аминокислоту D. (SEQ ID N0: 36), где пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот.
[0073] В другом варианте осуществления первого аспекта раскрытия предложены пептиды, которые являются обратными SEQ ID N0: 1, и пептиды, содержащие аминокислотную последовательность Х1-Х2-ХЗ- Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х2 0, где XI и XI9 каждый представляет собой аминокислоту V; Х2, Х9 и Х17 каждый представляет собой аминокислоту Q; ХЗ, Х5 и Х14 каждый представляет собой аминокислоту К; Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F и L; Хб и Х13 каждый представляет собой аминокислоту Е; Х7 и Х12 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, L, F и Aib; Х8, XII, Х15 и Х18 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы,
состоящей из L и F; XI0 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, Aib и N; XIб представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из А и Aib; а Х2 0 представляет собой аминокислоту D. (SEQ ID N0: 36), где пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот.
[0074] В одном варианте осуществления первого аспекта
раскрытия предложены пептиды, которые являются обратными SEQ ID
N0: 1, и пептиды, состоящие из аминокислотной
последовательности: Х1-Х2-ХЗ- Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20, где XI и Х19 каждый представляет собой аминокислоту V; Х2, Х9 и XI7 каждый представляет собой аминокислоту Q; ХЗ, Х5 и Х14 каждый представляет собой аминокислоту К; Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F и L; Хб и Х13 каждый представляет собой аминокислоту Е; Х7 и Х12 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, L, F и Aib; Х8, XII, Х15 и Х18 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из L и F; XI0 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, Aib и N; XI б представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из А и Aib; а Х2 0 представляет собой аминокислоту D. (SEQ ID N0: 36).
[0075] В другом варианте осуществления первого аспекта раскрытия предложены пептиды, которые являются обратными SEQ ID N0: 2 4 и обратные пептиды, содержащие аминокислотную последовательность: Х1-Х2-ХЗ- Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20, где XI и Х19 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из V, I и L; Х2, Х9 и XI7 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из Q и N; ХЗ, Х5 и XIб каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из К, R, Н и Orn; Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F, Y, I, V и L; Хб, Х13 и Х20 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из Е и D; Х7 и Х12 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из
группы, состоящей из A, G, S, L, F, V, Amv и Aib; Х8, XII, Х15 и XI8 независимо выбирают из группы, состоящей из аминокислот L, I, V, W и F; XI0 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, S, Aib, Amv, V и N; а Х14 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, S, V, Aib и Amv. (SEQ ID NO: 59) , где пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот.
[0076] В другом варианте осуществления первого аспекта раскрытия предложены пептиды, которые являются обратными SEQ ID N0: 24, и обратные пептиды, состоящие по существу из аминокислотной последовательности: Х1-Х2-ХЗ- Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20, где XI и Х19 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из V, I и L; Х2, Х9 и Х17 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из Q и N; ХЗ, Х5 и XI б каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из К, R, Н и Orn; Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F, Y, I, V и L; Хб, Х13 и Х20 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из Е и D; Х7 и Х12 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, G, S, L, F, V, Amv и Aib; Х8, XII, XI5 и XI8 независимо выбирают из группы, состоящей из аминокислот L, I, V, W и F; XI0 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, S, Aib, Amv, V и N; а XI4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, S, V, Aib и Amv. (SEQ ID NO: 59), где пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот.
[0077] В другом варианте осуществления первого аспекта раскрытия предложены пептиды, которые являются обратными SEQ ID N0: 24, и обратные пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности: Х1-Х2-ХЗ- Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20, где XI и Х19 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из V, I и L; Х2, Х9 и XI7 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из Q и N; ХЗ, Х5 и XIб
каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из К, R, Н и Orn; Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F, Y, I, V и L; Хб, Х13 и Х20 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из Е и D; Х7 и Х12 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, G, S, L, F, V, Amv и Aib; Х8, XII, Х15 и XI8 независимо выбирают из группы, состоящей из аминокислот L, I, V, W и F; XI0 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, S, Aib, Amv, V и N; а Х14 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, S, V, Aib и Amv. (SEQ ID NO: 59).
[0078] В таблице 3 представлены дополнительные пептиды по данному изобретению. Последовательности аминокислот в этих пептидах являются обратными аминокислотными последовательностями SEQ ID N0: 2-23 и 25-35.
ТАБЛИЦА 3
SEQ ID N0:
Последовательность пептида
VQKWKELLQAFLEKLAQFVD
VQKWKELLQNFLEKL{AIB}QFVD
VQKFKELLQALLEKL{AIB}QFVD
VQKFKELLQNLLEKL{AIB}QFVD
VQKFKE{AIB}LQNLLEKL{AIB}QFVD
VQKWKE{AIB}LQNLLEKL{AIB}QFVD
VQK FKE L L QALLEKLAQFVD
VQKFKELLQNLLEKLAQFVD
VQKWKELLQAFLEKL{AIB}QFVD
VQKWKELLQNFLEKL{AIB}QFVD
VQKFKELLQNFLEKL{AIB}QFVD
VQKWKE{AIB}LQAFLEKLAQFVD
VQKWKE{AIB}LQNFLEKLAQFVD
VQKFKE{AIB}LQNFLEKLAQFVD
VQKWKEFLQAFAEКFAQFVD
VQKWKE FLQAF{AIB}EКFAQFVD
VQKWKEFLQAF{AIB}EKF{AIB}QFVD
VQKWKEFLQ{AIB}FAEKFAQFVD
VQKWKEFLQ{AIB}F{AIB}EKFAQFVD
VQKWKEFLQ{AIB}F{AIB}EKF{AIB}QFVD
VQKWKELLQNFLEKLAQFVD
VQKLKELLQNLLEKL{AIB}QFVD
VQKWKELLQNFLE{AIB}LKQFVD
VQKWKELLQNFLEVLKQFVD
VQKWKELLQNFLE FLKQ{AlВ}VD
VQKFKELLQNFLE{AIB}LKQFVD
VQKFKELLQNFLEVLKQFVD
VQKFKELLQNFLE FLKQ{AlВ}VD
VQKWKELLQNFLE{AIB}FKQLVD
VQKWKELLQNFLELFKQ{AIB}VD
VQKWKELLQNF{AIB}ELLKQFVD
VQKWKEL{AIB}QNFLE{AIB}LKQFVD
VQKWKE{AIB}LQNFLE{AIB}LKQFVD
[0079] Одним вариант осуществления первого аспекта раскрытия представляет собой пептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3 6-58, где пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот. Еще один вариант осуществления представляет собой пептид, состоящий по существу из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 36-58. Еще один вариант осуществления представляет собой пептид, состоящий из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 36-58. В любом из вышеприведенных вариантов осуществления пептидов, необязательно альфа-амин N-концевой аминокислоты пептида является ацилированным; концевая карбоксильная группа является амидированнной; или альфа-амин N-концевой аминокислоты является ацилированным, и концевая карбоксильная группа пептида является амидированнной.
[0080] Одним вариант осуществления первого аспекта раскрытия представляет собой пептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 59-7 0, где пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот. Еще один вариант
осуществления представляет собой пептид, состоящий по существу из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID N0: 59-7 0. Еще один вариант осуществления представляет собой пептид, состоящий из любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID N0: 59-7 0. В любом из вышеприведенных вариантов осуществления пептидов, необязательно альфа-амин N-концевой аминокислоты пептида является ацилированным; концевая карбоксильная группа является амидированнной; или альфа-амин N-концевой аминокислоты является ацилированным, и концевая карбоксильная группа пептида является амидированнной.
[0081] Если пептид раскрытия содержит аминокислотную последовательность по любому из SEQ ID N0: 1-70, и 1-4 дополнительных аминогрупп, независимо добавлены к N-концу или С-концу аминокислотной последовательности, то дополнительные аминокислоты выбраны так, что добавление аминокислот не оказывает отрицательного влияния на амфифильность пептида.
[0082] Во втором аспекте раскрытия предложены пептидные
амфифильные липидные мицеллы (PALM), образованные из комбинации
амфифильного пептида с фосфолипидами. PALM по второму аспекту
раскрытия содержит один или более пептидов по первому аспекту
изобретения, образующих комплекс с липидным компонентом, причем
липидный компонент содержит сфингомиелин и один или более
дополнительных фосфолипидов. PALM согласно данному раскрытию,
могут пассивно или активно доставляться в популяцию клеток-
мишеней. В одном варианте осуществления второго аспекта
изобретения PALM содержит один или более пептидов по данному
раскрытию, причем липидный компонент состоит по существу из
сфингомиелина и одного или более дополнительных фосфолипидов. В
одном варианте осуществления PALM содержит пептид по данному
изобретению и липидный компонент, причем липидный компонент
содержит сфингомиелин и один или более дополнительных
фосфолипидов, при этом дополнительный фосфолипид выбирают из
группы, состоящей из фосфатидилхолина,
полиэтиленгликольфосфатидилэтаноламина (PEG-РЕ),
фосфатидилэтаноламина, фосфатидилглицерина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола, кардиолипина и любой их комбинации. В
другом варианте осуществления PALM содержит пептид по раскрытию, а липидный компонент содержит сфингомиелин и фосфатидилхолин. В другом варианте осуществления PALM содержит пептид по раскрытию, сфингомиелин и 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолин (РОРС). В еще одном варианте осуществления PALM содержит пептид по раскрытию, а липидный компонент содержит сфингомиелин и фосфатидилэтаноламин. В еще одном варианте осуществления PALM содержит пептид по раскрытию, а липидный компонент содержит сфингомиелин и поли(этиленгликоль)фосфатидилэтаноламин. В еще одном другом варианте осуществления PALM содержит пептид по раскрытию, а липидный компонент содержит сфингомиелин и фосфатидилсерин. В другом варианте осуществления PALM содержит пептид по раскрытию, а липидный компонент содержит сфингомиелин и кардиолипин.
[0083] В еще одном варианте осуществления второго аспекта
изобретения PALM содержит пептид по раскрытию, а липидный
компонент состоит по существу из сфингомиелина и одного или
более дополнительных фосфолипидов, причем один или более
дополнительных фосфолипидов выбраны из группы, состоящей из
фосфатидилхолина, полиэтиленгликольфосфатидилэтаноламина (ПЭГ-
ГО) , фосфатидилэтаноламина, фосфатидилглицерина,
фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола, кардиолипина и любой их
комбинации. В еще одном другом варианте осуществления PALM
содержит пептид по раскрытию, а липидный компонент состоит по
существу из сфингомиелина и фосфатидилсерина. В еще одном другом
варианте осуществления PALM содержит пептид по раскрытию, а
липидный компонент состоит по существу из сфингомиелина и 1-
пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолина (РОРС).
[0084] В некоторых вариантах осуществления второго аспекта
изобретения PALM содержит пептид по раскрытию, а липидный
компонент состоит по существу из сфингомиелина и одного или
более дополнительных фосфолипидов, причем один или более
дополнительных фосфолипидов выбраны из группы, состоящей из
фосфатидилхолина, полиэтиленгликольфосфатидилэтаноламина (ПЭГ-
ПЭ) , фосфатидилэтаноламина, фосфатидилглицерина,
фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола, кардиолипина и любой их
комбинации, при этом молярное отношение фосфолипида к сфингомиелину составляет от около 95:5 до около 10:90. В другом варианте осуществления молярное отношение фосфолипида к сфингомиелину составляет от около 90:10 до около 20:80. В еще одном варианте осуществления молярное отношение фосфолипида к сфингомиелину составляет от около 25:75 до около 35:65. В другом варианте осуществления молярное отношение фосфолипида к сфингомиелину составляет около 30:70. В другом варианте осуществления молярное отношение фосфолипида к сфингомиелину составляет от около 80:20 до около 60:40. В еще одном варианте осуществления молярное отношение фосфолипида к сфингомиелину составляет от около 75:25 до около 65:35. В еще одном варианте осуществления молярное отношение фосфолипида к сфингомиелину составляет около 70:30.
[0085] Состав жирных кислот фосфолипидов включает жирные кислоты по формуле: R СООН, где R представляет собой алкильную группу (С7-С21) или алкенильную группу (C7-C2i) , причем алкенильная группа может иметь от одной до шести двойных связей. Примеры подходящих жирных кислот включают, но не ограничиваются ими, фитановую кислоту, линоленовую кислоту, линолевую кислоту, докосатетраеновую кислоту, олеиновую кислоту, каприловую кислоту, лауриновую кислоту, арахидиновую кислоту, миристиновую кислоту и пальмитиновую кислоту. Пара жирных кислот, этерифицированных в глицериновую цепь конкретного фосфолипида, может быть одинаковой или каждая может представлять собой другой тип жирной кислоты.
[0086] Молярное отношение липидного компонента к пептиду составляет от около 10:1 до около 2:1. В одном варианте осуществления соотношение составляет от около 9:1 до около 2:1. В одном варианте осуществления молярное отношение липидного компонента к пептиду составляет от около 8:1 до около 2:1. В еще одном варианте осуществления молярное отношение липидного компонента к пептиду составляет от около 7:1 до около 3:1. В другом варианте осуществления молярное отношение липидного компонента к пептиду составляет от около 6:1 до около 4:1.
[0087] Известны комплексы фосфатидилхолина с амфифильными
пептидами. Один из способов получения этих комплексов заключается в начальной совместной лиофилизации из общей фазы растворителя с последующей регидратацией сухого лиофилизата с образованием комплексов в водной суспензии.
[0088] Размер частиц измеряют при помощи DLS и выражают как средний гидродинамический диаметр ("средний диаметр"). PALM согласно второму аспекту раскрытия представляют собой частицы нанометрового размера со средним диаметром 3 0 нм или менее. В одном варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 5 нм до около 30 нм. В еще одном варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 7,5 нм до около 30 нм. В еще одном варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 10 нм до около 30 нм. В другом варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 5 нм до около 25 нм. В другом варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 7,5 нм до около 25 нм. В еще одном варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 10 нм до около 25 нм. В другом варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 5 нм до около 2 0 нм. В другом варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 7,5 нм до около 20 нм. В еще одном варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 10 нм до около 2 0 нм. В еще одном варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 5 нм до около 15 нм. В другом варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 7,5 нм до около 15 нм. В еще одном варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 10 нм до около 15 нм. В еще одном варианте осуществления средний диаметр частиц составляет от около 7,5 нм до около 10 нм.
[0089] В третьем аспекте раскрытия предложены композиции
PALM-молекула груза, которые содержат любой из вариантов PALM
второго аспекта раскрытия и молекулу груза. Молекулы груза
включают, но не ограничиваются ими, молекулы, обладающие
фармацевтическими или терапевтическими свойствами.
Неограничивающие примеры молекул груза включают противораковые соединения, такие как полностью транс-ретиноевая кислота,
спиртовые эфиры полностью транс-ретиноевой кислоты, включая метиловые, этиловые и имеющие и более длинные алкильные цепи спиртовые сложные эфиры ретиноевой кислоты и холестериновые сложные эфиры ретиноевой кислоты; амиды ретиноевой кислоты, такие как фенретинид; ретинол и сложные эфиры карбоновой кислоты ретинола, включая метиловые, этиловые и имеющие и более длинные алкильные цепи спиртовые сложные эфиры ретиноевой кислоты; липофильные противогрибковые агенты, такие как амфотерицин В или нистатин; стероиды, такие как прогестерон, тестостерон, преднизолон, гидрокортизон, дексаметазон и эстрадиолы; анальгетики, такие как пропофол и галоперидол; антипсихотические средства, такие как флуфеназин деканоат и арипипразол; аналоги витамина D холекальциферол и эргокальциферол; и изомеры витамина Е, как вместе, так и индивидуально.
[0090] Молекулы груза также включают молекулы, обеспечивающие диагностические или визуальные процедуры, такие как флуоресцентные средства визуализации, радиоактивно меченые средства визуализации и агенты, используемые для МРТ, ПЭТ, КТ, ОФЭКТ/КТ и рентгеновских исследований. Средства визуализации МРТ включают, но не ограничиваются ими, контрастирующие агенты, такие как фосфатидилэтаноламин с фрагментом диэтилентриамин пентауксусной кислоты, который хелатируется ионом гадолиния или аналогичным ионом лантанида, или индия-111, или галлия-67, или лютеция-177, или самария-153.
[0091] Молекулы груза могут также представлять собой различные типы и длины РНК или ДНК, которые были связаны с холестерином или другими полициклическими жирными спиртами с помощью известных способов.
[0092] В одном варианте осуществления третьего аспекта молекула груза представляет собой мириплатин, который имеет химическое название: umc-[((1R, 2R)-1,2-циклогександиамин-N,N')бис(миристат)]платина(II).
[0093] Другие варианты осуществления третьего аспекта раскрытия представляет собой комплекс PALM-молекула-груза, в котором молекула груза представляет собой соединение-конъюгат формулы I
[0094] A-R-L-X (формула I)
где А представляет собой агент, имеющий гидроксильную группу или аминогруппу; R представляет собой гидроксильную группу или аминогруппу агента; L представляет собой линкер, а X представляет собой якорный фрагмент.
[0095] Другой вариант осуществления третьего аспекта раскрытия представляет собой комплекс PALM-молекула груза, в котором молекула груза представляет собой соединение-конъюгат формулы I:
[0096] A-R-L-X (формула I)
где А представляет собой агент, имеющий гидроксильную
группу или аминогруппу; R представляет собой гидроксильную
группу или аминогруппу агента; L представляет собой угольноую
кислоту, янтарную кислоту или дигликолевую кислоту; а X
представляет собой холестерин, а-токотриенол, р-токотриенол, у-
токотриенол, 8-токотриенол, холестерин, копростанол, растительные
стерины (Р-ситостерол, ситостанол, стигмастерол, стигмастанол,
кампестерол, брассикастерол), эргостерол, ретинол,
холекальциферол, эргокальциферол, токоферол или токотриенол.
[0097] Другой вариант осуществления третьего аспекта раскрытия представляет собой комплекс PALM-молекула груза, в котором молекула груза представляет собой соединение-конъюгат формулы I:
где А представляет собой агент, имеющий гидроксильную группу или аминогруппу; R представляет собой гидроксильную группу или аминогруппу агента; L выбирают из группы, состоящей из угольной кислоты, янтарной кислоты или дигликолевой кислоты; а X выбирают из группы, состоящей из холестерина, ос-токотриенола, р-токотриенола, у-токотриенола, 8-токотриенола, холестерина, копростанола, растительных стеринов (В-ситостерола, ситостанола, стигмастерола, стигмастанола, кампестерола,
брассикастерола) эргостерола, ретинола, холекальциферола, эргокальциферола, а-токоферола, р-токоферола, у-токоферола и 8-токоферола.
[0098] Другой вариант осуществления третьего аспекта раскрытия представляет собой комплекс PALM-молекула груза, в котором молекула груза представляет собой соединение-конъюгат формулы I:
где А представляет собой агент, имеющий гидроксильную группу или аминогруппу; R представляет собой гидроксильную группу или аминогруппу агента; L представляет собой линкер, а X представляет собой якорный фрагмент, выбранный из группы, состоящей из холестерина, холекальциферола и 8-токотриенола.
[0099] В одном варианте осуществления соединения-конъюгата формулы (1), R представляет собой гидроксильную группу агента, а якорный фрагмент ковалентно связан с агентом посредством карбонатной сложноэфирной связи. В другом варианте осуществления соединения-конъюгата формулы (1), R представляет собой аминогруппу агента, а якорный фрагмент ковалентно связан с агентом посредством карбаматной сложноэфирной связи.
[00100] В другом варианте осуществления конъюгата соединения формулы (1) якорный фрагмент представляет собой холестерин. В еще одном варианте осуществления соединения-конъюгата формулы (1) якорный фрагмент представляет собой холестерин, при условии, что если анкерный фрагмент представляет собой холестерин, то соединение не является паклитакселом.
[00101
] В еще одной варианте осуществления
конъюг
ата
соединения
формулы (1) якорный фрагмент представляет
собой
ос-
токотриенол
В другом варианте осуществления
конъюг
ата
соединения
формулы (1) якорный фрагмент представляет
собой
токотриенол
В другом варианте осуществления
конъюг
ата
соединения
формулы (1) якорный фрагмент представляет
собой
токотриенол
В еще одной варианте осуществления
конъюг
ата
соединения
формулы (1) якорный фрагмент представляет
собой
токотриенол
[00102
] В некоторых вариантах осуществления
конъюг
ата
соединения формулы (1) агент представляет собой лекарственное средство.
[00103] В некоторых вариантах осуществления конъюгата соединения формулы (1) агент представляет собой противораковое лекарственное средство. В одном варианте осуществления конъюгата соединения формулы (1) агент представляет собой противораковое лекарственное средство, а противораковое лекарственное средство ковалентно связано с якорем посредством карбонатной сложноэфирной связи.
В одном варианте осуществления конъюгата соединения формулы (1) агент представляет собой противораковое лекарственное средство, а противораковое лекарственное средство ковалентно связано с якорем посредством карбаматной сложноэфирной связи.
[00104] Неограничивающие примеры противораковых
лекарственных средств, имеющих гидроксильную группу, доступную для образования карбонатной сложноэфирной связи, включают AZD2811, гидроксикамптотецин, доксорубицин, трокацитабин, винкристин, сиролимус, тубулизин А, доцетаксел или паклитаксел.
[00105] Неограничивающие примеры противораковых
лекарственных средств, имеющих амин, доступный для образования карбаматной сложноэфирной связи, включают доксорубицин, даунорубицин, гемцитабин, цитарабин и трокацитабин.
[00106] В некоторых вариантах осуществления композиций PALM-молекула груза в третьем аспекте изобретения молекула груза представляет собой паклитаксел 2'-холестерилкарбонат. В другом варианте осуществления молекула груза представляет собой паклитаксел 2'-8-токотриенилкарбонат.
[00107] В других вариантах осуществления молекула груза
представляет собой доцетаксел 2'-холестерилкарбонат. В других
вариантах осуществления молекула груза представляет собой
сложный холестерилкарбонатный эфир 1О-гидроксикамптотецина. В
других вариантах осуществления молекула груза представляет собой
сложный холестерилкарбонатный эфир 7-этил-10-
гидроксикамптотецина, который является активным метаболитом иринотекана. В другом варианте осуществления молекула груза
представляет собой сложный холестерилкарбонатный эфир сиролимуса. В других вариантах осуществления молекула груза представляет собой сложный холестерилкарбонатный эфир гемцитабина. В других вариантах осуществления молекула груза представляет собой сложный холестерилкарбонатный эфир тубулизина А. В других вариантах осуществления молекула груза представляет собой сложный холестерилкарбонатный эфир морфина, сложный холестерилкарбонатный эфир гидроморфона или сложный эфир холестерина карбоната кодеина.
[00108] В других вариантах осуществления композиций PALM-молекула груза в третьем аспекте изобретения молекула груза представляет собой сложный холестерилкарбаматный эфир гемцитабина (холестерил (N4)-гемцитабинкарбамат) . В других вариантах осуществления молекула груза представляет собой сложный холестерилкарбаматный эфир аденозина. В других вариантах осуществления молекула груза представляет собой сложный холестерилкарбонатный эфир доксорубицина, структура которого представляет собой:
О ч-г N^
[00109] В других вариантах осуществления молекула груза представляет собой сложный холестерилкарбонатный эфир винкристина, структура которого представляет собой:
[00110] В еще одном варианте осуществления молекула груза
представляет собой дельта-токотриенилкарбаматный эфир
паклитаксела, структура которого представляет собой:
В еще одном варианте осуществления молекула груза представляет собой сложный дельта-токотриенлилкарбонатный эфир гемцитабина, структура которого представляет собой:
[00111] В еще одном варианте осуществления молекула груза представляет собой сложный дельта-токотриенлилкарбонатный эфир доксорубицина, структура которого представляет собой:
[00112] В таблице 4 предложена структура неограничивающих примеров агентов (А) , пригодных в данном изобретении, с гидроксильной группой или аминогруппой (R) , обозначенной стрелкой.
композиций PALM-молекула груза формулы A-R-L-X.
Гемцитабин
NH2
Угольная кислота
Холестерин
Гемцитабин
NH2
Угольная кислота
у-токотриенол
Гемцитабин
NH2
Угольная кислота
8-токотриенол
Гемцитабин
NH2
Угольная кислота
Холекальциферол
Гемцитабин
NH2
Угольная кислота
Эргокальциферол
Гемцитабин
NH2
Янтарная кислота
Холестерин
Гемцитабин
NH2
Янтарная кислота
у-токотриенол
Гемцитабин
NH2
Янтарная кислота
8-токотриенол
Гемцитабин
NH2
Янтарная кислота
Холекальциферол
Гемцитабин
NH2
Янтарная кислота
Эргокальциферол
Гемцитабин
NH2
Дигликолевая кислота
Холестерин
Гемцитабин
NH2
Дигликолевая кислота
у-токотриенол
Гемцитабин
NH2
Дигликолевая кислота
8-токотриенол
Гемцитабин
NH2
Дигликолевая кислота
Холекальциферол
Гемцитабин
NH2
Дигликолевая кислота
Эргокальциферол
AZD2811
Угольная кислота
Холестерин
AZD2811
Угольная кислота
у-токотриенол
AZD2811
Угольная кислота
8-токотриенол
AZD2811
Угольная кислота
Холекальциферол
AZD2811
Угольная кислота
Эргокальциферол
AZD2811
Янтарная кислота
Холестерин
AZD2811
Янтарная кислота
у-токотриенол
AZD2811
Янтарная кислота
8-токотриенол
AZD2811
Янтарная кислота
Холекальциферол
AZD2811
Янтарная кислота
Эргокальциферол
AZD2811
Дигликолевая кислота
Холестерин
AZD2811
Дигликолевая кислота
у-токотриенол
AZD2811
Дигликолевая кислота
8-токотриенол
AZD2811
Дигликолевая кислота
Холекальциферол
AZD2811
Дигликолевая кислота
Эргокальциферол
Даунорубицин
NH2
Угольная кислота
Холестерин
Даунорубицин
NH2
Янтарная кислота
у-токотриенол
Даунорубицин
NH2
Угольная кислота
8-токотриенол
Даунорубицин
NH2
Угольная кислота
Холекальциферол
Даунорубицин
NH2
Угольная кислота
Эргокальциферол
Даунорубицин
NH2
Янтарная кислота
Холестерин
Даунорубицин
NH2
Янтарная кислота
у-токотриенол
Даунорубицин
NH2
Янтарная кислота
8-токотриенол
Даунорубицин
NH2
Янтарная кислота
Холекальциферол
Даунорубицин
NH2
Янтарная кислота
Эргокальциферол
Даунорубицин
NH2
Дигликолевая кислота
Холестерин
Даунорубицин
NH2
Дигликолевая кислота
у-токотриенол
Даунорубицин
NH2
Дигликолевая кислота
8-токотриенол
Даунорубицин
NH2
Дигликолевая кислота
Холекальциферол
Даунорубицин
NH2
Дигликолевая кислота
Эргокальциферол
10-
Гидроксикампто тецин
Угольная кислота
Холестерин
10-
Гидроксикампто тецин
Угольная кислота
у-токотриенол
10-
Гидроксикампто тецин
Угольная кислота
8-токотриенол
10-
Гидроксикампто тецин
Угольная кислота
Холекальциферол
10-
Гидроксикампто
Угольная кислота
Эргокальциферол
тецин
10-
Гидроксикампто тецин
Янтарная кислота
Холестерин
10-
Гидроксикампто тецин
Янтарная кислота
у-токотриенол
10-
Гидроксикампто тецин
Янтарная кислота
8-токотриенол
10-
Гидроксикампто тецин
Янтарная кислота
Холекальциферол
10-
Гидроксикампто тецин
Янтарная кислота
Эргокальциферол
10-
Гидроксикампто тецин
Дигликолевая кислота
Холестерин
10-
Гидроксикампто тецин
Дигликолевая кислота
у-токотриенол
10-
Гидроксикампто тецин
Дигликолевая кислота
8-токотриенол
10-
Гидроксикампто тецин
Дигликолевая кислота
Холекальциферол
10-
Гидроксикампто тецин
Дигликолевая кислота
Эргокальциферол
Аденозин
NH2
Угольная кислота
Холестерин
Аденозин
NH2
Угольная кислота
у-токотриенол
Аденозин
NH2
Угольная кислота
8-токотриенол
Аденозин
NH2
Угольная кислота
Холекальциферол
Аденозин
NH2
Угольная кислота
Эргокальциферол
Аденозин
NH2
Янтарная кислота
Холестерин
Аденозин
NH2
Янтарная кислота
у-токотриенол
Аденозин
NH2
Янтарная кислота
8-токотриенол
Аденозин
NH2
Янтарная кислота
Холекальциферол
Аденозин
NH2
Янтарная кислота
Эргокальциферол
Аденозин
NH2
Дигликолевая
Холестерин
кислота
Аденозин
NH2
Дигликолевая кислота
у-токотриенол
Аденозин
NH2
Дигликолевая кислота
8-токотриенол
Аденозин
NH2
Дигликолевая кислота
Холекальциферол
Аденозин
NH2
Дигликолевая кислота
Эргокальциферол
Тубулизин А
Угольная кислота
Холестерин
Тубулизин А
Угольная кислота
у-токотриенол
Тубулизин А
Угольная кислота
8-токотриенол
Тубулизин А
Угольная кислота
Холекальциферол
Тубулизин А
Угольная кислота
Эргокальциферол
Тубулизин А
Янтарная кислота
Холестерин
Тубулизин А
Янтарная кислота
у-токотриенол
Тубулизин А
Янтарная кислота
8-токотриенол
Тубулизин А
Янтарная кислота
Холекальциферол
Тубулизин А
Янтарная кислота
Эргокальциферол
100
Тубулизин А
Дигликолевая кислота
Холестерин
101
Тубулизин А
Дигликолевая кислота
у-токотриенол
102
Тубулизин А
Дигликолевая кислота
8-токотриенол
103
Тубулизин А
Дигликолевая кислота
Холекальциферол
104
Тубулизин А
Дигликолевая кислота
Эргокальциферол
105
Доксорубицин
Угольная кислота
Холестерин
106
Доксорубицин
Угольная кислота
у-токотриенол
107
Доксорубицин
Угольная кислота
8-токотриенол
108
Доксорубицин
Угольная кислота
Холекальциферол
109
Доксорубицин
Угольная кислота
Эргокальциферол
110
Доксорубицин
Янтарная кислота
Холестерин
111
Доксорубицин
Янтарная
у-токотриенол
кислота
112
Доксорубицин
Янтарная кислота
8-токотриенол
113
Доксорубицин
Янтарная кислота
Холекальциферол
114
Доксорубицин
Янтарная кислота
Эргокальциферол
115
Доксорубицин
Дигликолевая кислота
Холестерин
116
Доксорубицин
Дигликолевая кислота
у-токотриенол
117
Доксорубицин
Дигликолевая кислота
8-токотриенол
118
Доксорубицин
Дигликолевая кислота
Холекальциферол
119
Доксорубицин
Дигликолевая кислота
Эргокальциферол
[00114] В четвертом аспекте раскрытия изобретения предложены неожиданно эффективные способы со-лиофилизации для получения композиций PALM или PALM-молекула груза из гомогенной фазы растворителя, состоящей из трет-бутилового спирта и воды. Преимущества такого подхода таковы: 1) все составляющие PALM, включая пептид, фосфолипид и необязательный липофильный груз (например, паклитаксел-2'-холестерилкарбонат), сорастворяются в одной фазе растворителя, 2) компоненты растворителя полностью смешиваются и хорошо подходят для удаления стандартной процедурой лиофилизации, 3) процедуры избегают потенциально токсичных веществ, поскольку трет-бутиловый спирт является низко токсичным, растворителем класса 3 и 4) полученный высушенный лиофилизат дает возможность для большей стабильности при хранении, чем это возможно с водными препаратами.
[00115] Смесь растворителей, используемая для получения PALM, предпочтительно представляет собой смесь трет-бутилового спирта (ТВА) и воды. В одном варианте осуществления процентное соотношение ТВА к воде составляет от около 70%:30% до около 90%:10%. В другом варианте осуществления соотношение составляет от около 75%:25% до около 85%:15%. В еще одном варианте осуществления соотношение составляет 80%:20%.
[00116] В одном варианте осуществления четвертого аспекта предложен способ получения PALM, который включает этапы:
i) солюбилизации амфифильного пептида в первой смеси
растворителей для получения раствора пептида;
ii) солюбилизации сфингомиелина во второй смеси растворителей для получения раствора сфингомиелина;
iii) солюбилизации дополнительного фосфолипида в третьей смеси растворителей для получения раствора фосфолипида;
iv) объединение раствора пептида, раствора сфингомиелина и
раствора фосфолипида с образованием раствора
пептида/сфингомиелина/фосфолипида; и
v) лиофилизации раствора пептида/сфингомиелина/фосфолипида,
в котором этапы i), ii) и iii) выполняются в любом порядке;
при этом первая, вторая и третья смеси растворителей содержат трет-бутиловый спирт и воду.
[00117] В другом варианте осуществления четвертого аспекта раскрытия предложен способ получения PALM, который включает этапы:
i) объединения амфифильного пептида, сфингомиелина и
дополнительного фосфолипида с образованием смеси
пептида/сфингомиелина/фосфолипида;
ii) солюбилизации смеси пептида/сфингомиелина/фосфолипида в
смеси растворителей с образованием раствора
пептида/сфингомиелина/фосфолипида; и
iii) лиофилизации раствора пептида/фосфолипида,
причем смесь растворителей содержит трет-бутиловый спирт и
воду.
[00118] В четвертом аспекте данного изобретения дополнительно предложен способ получения PALM, включающий молекулу груза для образования комплекса PALM-молекула груза. Для получения комплекса PALM-молекула груза, пептид, сфингомиелин, один или более дополнительных фосфолипидов и вещество груза каждый отдельно готовят в смеси растворителей и, в зависимости от желаемой композиции, объединяют в определенных молярных соотношениях. Альтернативно, пептид, сфингомиелин, один или более дополнительных фосфолипидов и вещество груза могут быть объединены непосредственно без предварительной солюбилизации и затем растворены с помощью желаемой смеси растворителей до лиофилизации.
[00119] В одном варианте осуществления четвертого аспекта раскрытия представлен способ получения комплекса PALM-молекула груза, включающий этапы:
i) солюбилизации амфифильного пептида в первой смеси
растворителей для получения раствора пептида;
ii) солюбилизации сфингомиелина во второй смеси растворителей для получения раствора сфингомиелина;
iii) солюбилизации дополнительного фосфолипида в третьей смеси растворителей для получения раствора фосфолипида;
iv) солюбилизации вещества груза в четвертой смеси растворителей для обеспечения раствора вещества груза;
v) объединения раствора пептида, раствора сфингомиелина,
раствора фосфолипида и раствора вещества груза для образования
раствора пептида/сфингомиелина/фосфолипида/вещества груза; и
vi) лиофилизации раствора
пептида/сфингомиелина/фосфолипида/вещества груза,
причем этапы i) ii), iii) и iv) выполняются в любом порядке; при этом первая, вторая, третья и четвертая смеси растворителей содержат трет-бутиловый спирт и воду.
[00120] Другой вариант осуществления способа получения комплекса PALM-молекула груза включает этапы:
i) объединения амфифильного пептида, сфингомиелина,
дополнительного фосфолипида и вещества груза с образованием
смеси пептида/сфингомиелина/фосфолипида/вещества груза;
ii) солюбилизации смеси пептида/сфингомиелина/фосфолипида/вещества груза в смеси растворителей с образованием раствора пептида/фосфолипида; и
iii) лиофилизации раствора пептида/сфингомиелина/фосфолипида/вещества груза,
причем смесь растворителей содержит трет-бутиловый спирт и
воду.
[00121] Полученный лиофилизированный осадок можно хранить в течение длительного периода времени, и он будет оставаться стабильным. Лиофилизированный продукт регидратируют путем добавления любого пригодного водного раствора, например, воды или солевого раствора, с последующим осторожным размешиванием
содержимого. Восстановление лиофилизатов PALM можно повысить путем инкубирования раствора PALM при 50°С в течение 5-30 минут. Затем раствор стерилизуют фильтрованием (0,2 мкм) и хранят при 4 °С. Альтернативно смесь растворителей, содержащую пептид, фосфолипид и вещество груза, стерилизуют путем фильтрования перед лиофилизацией.
[00122] В пятом аспекте данного раскрытия предложены способы лечения расстройства, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции PALM-молекула груза в соответствии с любым вариантом осуществления третьего аспекта раскрытия.
[00123] Фагоцитарный рецептор В-1 (SR-B1) представляет собой мембранный рецептор, который связывает аполипопротеин A-I, основной белковый компонент HDL, для облегчения клеточного транспорта холестерина. Холестерин является важным питательным веществом для пролиферирующих клеток, подобных тем, которые обнаружены в злокачественных опухолях. SR-B1 высоко экспрессируется во многих опухолевых клетках, включая, но не ограничиваясь ими, клетках рака молочной железы, предстательной железы, колоректального рака, рака поджелудочной железы, надпочечников, кожи, носоглотки и яичника. Некоторые амфифильные пептиды также распознаются и связываются SR-BI. PALM образуются из комбинаций фосфолипидных и амфифильных пептидов, разработанных для связывания с SR-BI и, тем самым, для выборочной доставки молекул груза в SR-BI-позитивные клетки.
[00124] Соответственно, в одном из вариантов осуществления пятого аспекта данного раскрытия предложены способы лечения расстройств, связанных с избыточной экспрессией рецепторов SR-BI, включающие введение PALM-лекарственное средство субъекту, нуждающемуся в этом. В одном варианте осуществления способ представляет собой способ лечения рака путем введения композиции PALM-молекула груза субъекту, нуждающемуся в этом.
[00125] Для фармацевтического применения лиофилизированный PALM может быть предложен в однодозовых или многодозовых контейнерах, которые могут быть удобно восстановлены в месте
использования, например, в больнице или в офисе врача, с
применением стандартных разбавителей, таких как стерильная вода
для инъекций, нормальный стерильный физиологический раствор или
стерильный 5% раствор декстрозы. Пригодные контейнеры затем
асептически заполняют стерилизованной смесью, лиофилизируют и
герметизируют, чтобы поддерживать стерильность
лиофилизированного материала. Пригодные контейнеры включают, без ограничения, флакон, содержащий резиновое уплотнение или эквивалент, который позволяет вводить разбавитель для восстановления, например, при помощи шприца. Такие препараты PALM подходят для парентерального введения, включая внутривенную, подкожную, внутримышечную, внутрибрюшинную инъекцию.
ПРИМЕРЫ
[00126] Пример 1 Синтез и очистка пептида
[00127] Пептиды были получены при помощи стандартных методик твердофазного синтеза Fmoc в GenScript USA, Inc. (Пискатауэй, штат Нью-Джерси). Некоторые пептиды модифицировали на концевых аминокислотах путем ацетилирования N-конца и амидирования С-конца стандартными способами. Пептиды хроматографически очищали до чистоты более 90% стандартным методом высокоэффективной жидкостной хроматографии для очистки пептидов. Чистоту подтверждают при помощи ВЭЖХ и масс-спектроскопического анализа.
[00128] Пример 2 Синтез паклитаксел 2'-холестерилкарбоната
(ХС)
[00129] Пятьдесят миллиграммов паклитаксела растворяли в 2 мл хлороформа и затем объединяли с 1,5 молярным избытком хлорформиата холестерина в 2 мл хлороформа плюс 4 мл N, N-диизопропилэтиламина и 2 мл ацетонитрила. Смесь перемешивали в течение ночи при температуре окружающей среды и затем сушили на роторном испарителе. Полученный грязно-белый осадок затем растворяли в этилацетате/гексане (3:1) и экстрагировали водой, сушили, и затем повторно растворяли в хлороформе. Образование продукта подтверждали при помощи тонкослойной хроматографии с использованием смеси этилацетат/гексан (3:1) в качестве
подвижной фазы (Rf паклитаксела 0,4, Rf Tax-Choi 0,92). Дальнейшую очистку продукта затем проводили на колонке с
в качестве подвижной фазы смесь с получением указанного в заголовке соединения (1) . Структуру подтвердили методом масс-спектрометрии и ЯМР-анализа.
2'-5-
паклитаксел
[00130] Пример 3
токотриенилкарбоната (ХТЗ)
[00131] Этап 1. Синтез п-нитрофенилкарбоната дельта-токотриенола
[00132] К раствору дельта-токотриенола (25 мг, 0,0629
ммоль) в безводном метиленхлориде (1,5 мл) добавляли 4-
нитрофенилхлорформиат (51 мг, 0,25 ммоль) и триэтиламин (35 мкл,
0,2 5 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь
перемешивали при комнатной температуре в течение 2 4 ч и затем
концентрировали, а затем целевой продукт (2) получали с
использованием препаративной ТСХ с использованием
этилацетата/гептанов (10:90) в качестве элюента. Искомый продукт получали в виде желтого порошка (18 мг) . гН ЯМР (CDC13) : 8 8,3 0
Id, 2Н) , 7,45 (d, 2Н) , 6,80 (дд, 2Н) , 5,05-5,20
ЗН), 2,72-
2,78 (т, 2Н) , 2,18 (с, 4Н) , 1,95-2,15 (м, 4Н) , 1, 72-1,85 (м, 4Н), 1,68 (с, ЗН), 1,55-1,62 (уш. с, 12 Н), 1,30 (уш. с, 5Н).
[00133] Этап 2. Синтез дельта-токотриенолкарбонат
(3)
[00134] Раствор соединения (2) (18 мг, продукт этапа 1) в метиленхлориде (2 мл), паклитакселе (28 мг) и DMAP (10 мг) объединяли при комнатной температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 4 часов. Смесь концентрировали и очищали с использованием препаративной ТСХ, используя этилацетат/гептаны (50:50) в качестве элюента. Искомый продукт
(3) (17 мг) получали в виде бесцветного твердого вещества. Анализ ТСХ (Rf 0,25, ЕА/гексаны: 1:1). гЕ ЯМР (CDC13) : 5 8, 20 (д, 2Н) , 7,75 (д, 2Н) , 7, 60-7, 62 (м, 1Н) , 7, 30-7, 52 (м, 9Н) , 6,906,95 (д, 1Н) , 6, 60-6, 75 (дд, 2Н) , 6, 20-6, 30 (м, 2Н) , 6,00-6,05
(м, 1Н) , 5, 70 -5, 75 (д, 1Н) , 5,50 (с, 1Н) , 5,10-5,20 (уш. с, 2Н) , 4, 95-5, 00 (д, 1Н) , 4, 30-4, 35 (уш. с, 1Н) , 4, 20-4, 30 (дд, 2Н) , 3, 75-3, 80 (д, 1Н) , 2, 70-2, 75 (м, 2Н) , 2, 30-2, 60 (м, 7Н) , 2, 23-2, 27 (м, 11Н) , 1, 50-2, 20 (м, 26Н), 1,25 (м, 9Н) , 1,15 (с, ЗН)
[00135] Пример 4 Препарат пептидной амфифильной липидной мицеллы (PALM).
[00136] Отдельные исходные растворы пептида и фосфолипидов
были приготовлены в смеси растворителей, состоящей из 8 0% трет-
бутилового спирта (ТБА) и 2 0% воды для получения отдельных
растворов 10 мМ пептида, 20 мМ 1,2-диолеоил-зп-глицеро-З-
фосфохолина (DOPC) или 20 мМ 1-пальмитоил-2-
олеоилфосфатидилхолина (РОРС) и 2 0 мМ яичного SM (сфингомиелина). Аликвоты исходного раствора объединяли для получения конечного раствора, содержащего 10 мольных эквивалентов пептида, 42 мольных эквивалента фосфатидилхолина и
18 мольных эквивалентов SM. Растворы объединяли в стеклянном флаконе объемом 1,5 мл, замораживали (-70 °С) и лиофилизировали при от -5 до -10 °С в течение ночи. Полученные лиофилизированные осадки были повторно гидратированы путем добавления забуференного фосфатом солевого раствора Дульбеко с последующим осторожным перемешиванием содержимого. Образование PALM
завершали путем инкубации раствора PALM при 50°С в течение 10 минут. Некоторые пептидные комплексы оставались мутными при нагревании и также подвергались одному циклу замораживания до -8 0 °С с последующим размораживанием до комнатной температуры с целью получения прозрачного раствора. Качества препаратов PALM были очевидны по своему внешнему виду. Визуально прозрачный препарат продемонстрировал, что любые наночастицы, которые образовались, имеют диаметр, равный менее приблизительно 2 0 нм. Результаты представлены в таблице 5.
ТАБЛИЦА 5
Стабильность комплексов пептид/фосфолипид путем визуальной
инспекции
диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), яичный сфингомиелин (SM) , фосфатидилхолин (PC), фосфолипиды (PL), паклитаксел 2'-пальмитат (СцРТХ)
ь Мольное отношение пептида к фосфолипидам составляло 1/4.
[00137] Пример 5 Получение PALM, содержащей флуоресцентный краситель Dil
[00138] 4 0 мкл аликвоты 10 мМ или пептида объединяли с 5 6 мкл 2 0 мМ РОРС, 2 4 мкл 2 0 мМ SM (яичный) и 16 мкл 2,5 мМ Dil в небольшом стеклянном флаконе. Пептидные и липидные растворы готовили в 80% ТВА/20% воды. Стоковый раствор Dil готовили в 92% ТВА/8% воды. Раствор лиофилизировали, а полученный осадок регидратировали путем добавления 0,2 мл забуференного фосфатом солевого раствора Дульбеко. Раствор кратковременно перемешивали, водяную баню обрабатывали ультразвуком (приблизительно 15 секунд) и помещали в нагревательный блок 50°С в течение 20 минут. [00139] Пример 6. Получение PALM, содержащей мираплатин [00140] 50 мкл аликвоты 10 мМ SEQ ID NO: 25 в 80% ТВА/20% воды, соответствующей 2,5 моль-эквивалентам пептида, объединяли
с 3 мольными эквивалентами РОРС и 7 мольных эквивалентов яичного SM из 40 мМ и 20 мМ исходных растворов, соответственно, из той же смеси растворителей. К этому добавляли 0,7 5 мольных эквивалента мириплатина (MedKoo Biosciences, Роли, штат Северная Каролина) из 1 мМ исходного раствора, полученного со 100% ТВА. Раствор лиофилизировали, а полученный осадок регидратировали путем добавления 0,4 мл 5% декстрозы в воде. Раствор кратковременно перемешивали, водяную баню обрабатывали ультразвуком (приблизительно 15 секунд) и помещали в
нагревательный блок 50°С в течение 2 0 минут. Полученный прозрачный раствор пропускали через полиэфирсульфоновый, стерилизационный фильтр с размером пор 0,2 мкм, и хранили при 4 °С. Анализ размера частиц (пример 11) DLS показал средний гидродинамический диаметр, равный 8 нм. SEC подтвердила популяцию частиц, сравнимую с размером HDL. Хроматограмма SEC представлена на фиг. 2 (мириплатин (сплошная линия), HDL человека (пунктирная линия)).
[00141] Пример 7 Получение PALM, содержащей паклитаксел-холестерилкарбонат (ХС)
[00142] Получение PALM, содержащей ХС, было по существу таким же, как описано в примере б, за исключением следующих случаев. В общей сложности 1,5 мольных эквивалента ХС из 10 мМ исходного раствора в 92% ТВА/8% воды объединяли с другими компонентами PALM. Раствор лиофилизировали, а полученный осадок регидратировали с 0,4 мл забуференного фосфатом солевого раствора Дульбеко. Гидродинамический средний диаметр данного препарата, определяемый DLS, составлял 9 нм (пример 11) . Анализ размера по SEC показал, что одна популяция частиц имеет диаметр 10 нм (фиг. 3).
[00143] Пример 8 Получение PALM, содержащей паклитаксел 8-токотриенилкарбонат (ХТЗ)
[00144] 50 мкл аликвоты 10 мМ пептида SEQ ID NO: 25 в 80% ТВА/20% воды, соответствующей 2,5 моль-эквивалентам пептида, объединяли с 7 мольными эквивалентами РОРС и 3 мольных эквивалентов яичного SM из 2 0 мМ исходного раствора из той же
смеси растворителей. К этому добавляли 1 мольный эквивалент ХТЗ из 10 мМ исходного раствора в 92% ТВА/8% воды. Лиофилизированный осадок регидратировали с помощью 0,4 мл забуференного фосфатом солевого раствора Дульбеко.
[00145] Пример 9 R4F непригоден для получение PALM, содержащей паклитаксел 8-токотриенилкарбонат (ХТЗ)
[00146] Препарат PALM готовили, как в примере 9, с SEQ ID N0: 2 5 и с R4F (таблица 1) . В отличие от PALM, полученной с пептидом SEQ ID N0: 25, которая оставалась прозрачным раствором при комнатной температуре и 4 °С, PALM, содержащая R4F, была прозрачным раствором при комнатной температуре, но становилась мутным гелем при 4 °С. Гель возвращался к прозрачной жидкости при нагревании до комнатной температуры. Препараты PALM анализировали на размер (пример 11). Динамическое рассеяние света показало, что PALM с пептидом SEQ ID N0: 2 5 имела средний гидродинамический диаметр, равный 8 нм (объемная интенсивность). Тот же анализ для PALM с R4F показал, что 94% популяции частиц имеют средний гидродинамический диаметр 11 нм, а остальные - 32 нм. SEC подтвердила единообразное распределение размера PALM с пептидом SEQ ID N0: 2 5 (фиг. 4) . Напротив, PALM с R4F продемонстрировала диапазон пиков, элюирующих при размерах, больших, чем SEQ ID N0: 25 PALM до размеров, меньших 8 нм. Отсутствие меньшего обнаружения частиц с помощью DLS неудивительно, так как чувствительность к частицам менее 7 нм довольно слаба. Эти результаты указывают на то, что R4F не пригоден для получения PALM.
[00147] Пример 10 Фенретинид загружают в PALM, полученную с пептидом SEQ ID N0: 25
[00148] 35 мкл аликвоты 10 мМ пептида SEQ ID N0: 25 в 80% ТВА/20% воды, соответствующей 2,5 моль-эквивалентам пептида, объединяли с 3 мольными эквивалентами РОРС и 7 мольных эквивалентов яичного SM из 40 мМ и 20 мМ исходных растворов, соответственно, из той же смеси растворителей. Также добавляли два мольных эквивалента 2 0 мМ фенретинида в той же смеси растворителей. Раствор лиофилизировали, а полученный осадок
регидратировали 0,325 мл забуференного фосфатом солевого раствора. Раствор становился прозрачным в течение 2 0 мин при 50 °С. Анализ SEC (пример 11) продемонстрировал, что все компоненты элюированы как один пик в диапазоне диаметра 8 нм - 10 нм (фиг. 5) .
[0014 9] Пример 11 Определение размера PALM
[00150] Размер и однородность размеров препаратов PALM определяли при помощи DLS и SEC. Размеры, основанные на гидродинамических средних диаметрах, определяли DLS с помощью анализатора размера Nicomp 370. Анализатор был откалиброван с использованием латексных стандартов. Размеры частиц, указанные в данном документе и в формуле изобретения, вычисляются с помощью DLS, как описано выше, если явно не указано иное.
[00151] Относительный гидродинамический размер частиц PALM также определялся при помощи SEC с использованием колонки GE Superose б Increase (10x300 мм), подключенной к насосу Beckman/Coulter Model 12 6 и детектору диодной матрицы модели 128. Скорость подвижной фазы (150 мМ NaCl, б мМ NaP04 (рН 7,4)) составляла 0,5 мл/мин. Элюент оценивали на длинах волн 215 и 280 нм. Производительность системы была подтверждена путем инъекции стандартов молекулярной массы белка (фиг. 3).
[00152] Пример 12 Селективность SR-BI PALM в клетках ВНК (SR-BI)
[00153] Исследования взаимодействия SR-BI выполняются с клетками ВНК (SR-BI), полученными из NIH (Национальные институты здравоохранения США) . Клетки стабильно трансфицировали индуцибельным геном SR-BI человека с помощью системы GeneSwitch (tm) (Invitrogen). Клетки высевали (9б-луночный планшет) (8000 клеток/лунка) в культуральной среде (модифицированная по Дульбеко среда Игла, содержащая 10% фетальную бычью сыворотку), содержащую 2 00 мкг/мл каждого из зеоцина и гигромицина. После 24-часовой инкубации культуральную среду удаляли и заменяли 0,2% бычьим сывороточным альбумином в модифицированной Дульбеко среде Игла. Среда клеток, которые должны быть индуцированы для экспрессии SR-BI, также содержала 10 нМ мифепристона,
добавленного из исходного раствора ДМСО. ДМСО отдельно добавляли к среде неиндуцированных клеток. Индукционную среду удаляли через 24 часа и заменяли средой, содержащей Dil-меченый PALM (32 мкг пептида/мл) или Dil-меченый HDL (19 мкг белка/мл) (Kalen Biomedical, Монтгомери Виллидж, штат Мэриленд). Среду для испытаний готовили путем разбавления аликвоты Dil-меченого PALM
(пример 5) или Dil-меченого HDL в 0,2% бычьего сывороточного
альбумина в модифицированной Дульбеко среде Игла. Растворы перед
использованием пропускали через полиэфирсульфоновые
стерилизующие фильтры с размером пор 0,2 мкм. Клетки инкубировали в течение 4 часов. Затем клетки промывали 3 раза 0,1% альбумина в забуференном фосфатом солевом растворе Дульбеко
(с кальцием и магнием). Последняя промывка была заменена 2 00 мкл/лунка трет-бутанол/вода (95%/5%). Закрытый планшет оставляли стоять при КОМНАТНОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ в течение 3 0 мин со случайным встряхиванием. Флуоресценция в каждой лунке была обнаружена при возбуждении 52 0 нм и эмиссии 58 0 нм с отсекающим фильтром 550 нм на флуоресцентном ридере планшетов Molecular Dynamics Gemini
(фиг. 9) .
Таблица б
Поглощение Dil из HDL и от PALM созданных с использованием
различных пептидов клетками ВНК (SR-BI) в зависимости от
экспрессии SR-BI
Неиндуцирова иные
Поглощение
Dil а (пмоль/мкг/м л)
Индуцированн ые
Поглощение Dil
(пмоль/мкг/м л)
Увеличение no
сравнению с неиндуцированн ыми
HDL
О,13 ± 0,02
SEQ ID N0: 3 0,16+0,01
SEQ ID NO: 5 0, 54 + 0, 03
SEQ ID NO:
SEQ ID NO:
SEQ ID NO:
SEQ ID NO:
SEQ ID NO:
0,86 + 0,03
0,29 + 0, 03
0,93 + 0,03
0,83 + 0,02
0,81 + 0,04
0,66 + 0,02
0,90 + 0,03
1,26 + 0,06
5615
735
245^
655
90s
2215
2645
а Количество Dil, поглощаемое клетками относительно концентрации белка (HDL) или пептида (PALM). Показаны средние значения (п=4) и стандартная ошибка среднего.
ь Содержание HDL Dil составляло 21 пмоль/мкг белка. Содержание PALM Dil составляло 4 0 пмоль/мкг пептида. Концентрация HDL составляла 19 мкг/мл. Концентрация пептида PALM составляла 32 мкг/мл.
[00154] Пример 13 Количественная оценка паклитаксела
[00155] Паклитаксел, ХТЗ и ХС экстрагируют из водных
образцов путем смешивания 1 объема водного образца с 4 объемами
этилацетата/ацетона/метанола (70/30/5 об./об.). Верхний
органический слой, полученный после встряхивания и центрифугирования, собирают, сушат выпариванием растворителя и вакуумом и повторно растворяют в подвижной фазе ВЭЖХ
(метанол/вода (65/35 об./об.)) . Аликвоту 20 мкл восстановленного образца вводили в ВЭЖХ со скоростью потока 1,2 мл/мин через колонку Macherey-Nagel (4x250 мм с нуклеозилом 10-5 С18) и детектируют с помощью УФ-детектора с длиной волны 230 нм.
[00156] Пример 14 PALM, содержащий мириплатин, ингибирует рост клеток РС-3 также, как цисплатин
[00157] Клетки РС-3 (Американская коллекция типовых культур, CRL-14 35) высевали в 9б-луночные планшеты с плотностью 5x103 клеток на лунку (100 мкл) и выращивали до приблизительно 70% конфлуентности (24 часа) в культуральной среде F-12K с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Затем культуральную среду заменяли либо 100 мкл свежей культуральной среды
(контроль), либо культуральной среды, дополненной различными концентрациями цисплатина (например, 0 мкМ и от 0,1до конечной концентрации 100 мкМ в среде), добавленной из 10 0-кратных концентрированных исходных растворов, полученных в 5% декстрозы или с эквивалентными количествами MP в PALM, как описано в примере 6. Каждое условие тестировали в трех повторностях. Планшеты инкубировали в течение 4 8 часов. Жизнеспособность клеток анализировали анализом тиазолил-синего тетразолия бромида
(МТТ) путем добавления 2 0 мкл 5 мг/мл МТТ в забуференном фосфатом солевом растворе Дульбеко (с кальцием и магнием) и инкубации в течение 3 часов. Затем среду осторожно удаляли и заменяли 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Планшеты осторожно перемешивали в течение 15 минут на круговом шейкере. Поглощение каждой лунки считывали при 57 0 нм. Концентрацию, приводящую к ингибированию роста 50% (IC50), определяли путем нелинейной регрессионной подгонки данных в логистическом уравнении. Среднее поглощение контрольных лунок представляло 100% рост (фиг. 6).
[00158] Пример 15 Антитело SR-BI ослабляет ингибирование
роста клеток РС-3 с помощью PALM, содержащей мириплатин
[00159] Клетки РС-3 выращивали, как в примере 14. Клетки, подлежащие тестированию в присутствии антитела SR-BI (Novus Biologies, NB400-113), предварительно инкубировали в течение 1 часа в культуральной среде, содержащей 1/400 разведения раствора целевого антитела. Затем все среды удаляли и заменяли культуральной средой, содержащей указанные количества соединений платины, полученных, как в примере 13. Ростовая среда с PALM (MP) для клеток, обработанных антителом содержала антитело в разведении 1/400 от стокового раствора антител. Клетки инкубировали в течение 5 ч. Затем все среды удаляли, клетки промывали один раз средой и затем инкубировали в течение еще 4 3 часов в культуральной среде. Выживаемость клеток определяли методом МТТ, как в примере 14 (фиг. 7).
[00160] Пример 16 ХТЗ в PALM более активен, чем ХС в PALM при блокировке роста клеток SK0V-3 ХС
[00161] Клетки SK0V-3 рака яичника (Американская коллекция типовых культур, НТВ-7 7) высевали в 9б-луночные планшеты с плотностью 5х103 клеток на лунку (100 мкл) и выращивали до приблизительно 70% конфлуентности (24 часа) в культуральной среде МакКоя с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Затем культуральную среду заменяли либо 100 мкл свежей культуральной среды (контроль), либо культуральной среды, дополненной различными концентрациями паклитаксела, PALM(XC) или PALM(ХТЗ). Испытуемый раствор 2 0 мкМ паклитаксела готовили путем разбавления 5 мМ исходного раствора паклитаксела в ДМСО в культуральной среде с последующей стерилизацией фильтрацией (фильтр 0,2 мкм) . Аликвоту 20 мкМ раствора разбавляли 5 раз в культуральной среде с получением 4 мкМ паклитаксела. Процесс 5-кратного разбавления продолжали с 4 мкМ, чтобы получить 8 00 нМ раствор паклитаксела. Этот процесс продолжали до тех пор, пока не была достигнута концентрация, равная 0,051 нМ паклитаксела в культуральной среде. Четыре аликвоты по 100 мкл каждого из полученных таким образом 9 растворов вносили в отдельные ячейки, содержащие клетки. Аналогичный, но модифицированный способ был
использован для подготовки тестовых растворов PALM (ХС) и PALM (ХТЗ) . Наибольшая концентрация составляла 50 мкМ, и была получена путем разбавления 1 мМ препаратов (примеры 7, 8) PALM (ХС) и PALM (ХТЗ) в культуральной среде с последующей стерилизацией фильтрацией. Наименьшая концентрация, полученная в процессе 5-кратного разведения каждого нового разведения, повторявшегося 8 раз, составляла 0,13 нМ. Клетки инкубировали с тестовыми растворами в течение 72 часов. В конце этого периода жизнеспособность клеток определяли методом МТТ, как в примере 14. (Фиг. 8).
[00162] Пример 17 Ингибирование роста клеток ВНК (SR-BI) PALM (ХТЗ) является SR-BI-зависимым
[00163] Клетки ВНК (SR-BI) высевали (3000 клеток/лунку) в 9б-луночные планшеты с культуральной средой (модифицированная по Дульбеко среда Игла, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки и 2 00 мкг/мл каждого из зеоцина и гигромицина) и инкубировали 2 4 часа. Культуральную среду заменяли на 0,2% бычьего сывороточного альбумина в модифицированной по Дульбеко среде Игла, содержащей либо 10 нМ мифепристона (индуцированного) , добавленного из исходного раствора ДМСО, либо эквивалентного количества только ДМСО (контроль). Планшеты инкубировали в течение 2 4 часов. Затем среды заменяли РТХ или PALM (ХТЗ) в 0,2% бычьего сывороточного альбумина в модифицированной по Дульбеко среде Игла при указанных концентрациях и клетки инкубировали в течение 12 часов. Затем эти среды заменяли нормальной культуральной средой и клетки инкубировали еще 3 6 часов. Процент роста клеток по сравнению с клетками без тестируемого агента определяли методом МТТ (фиг. 10).
[00164] Пример 18 Подавление ксенотрансплантата клеток яичников SKOV-3 у голых мышей
[00165] Максимальная переносимая доза определяется у самцов мышей (Foxnlnu), полученных от коммерческих поставщиков. Эффективность PALM (ХТЗ) тестировали по сравнению с Taxol(r), который состоит из паклитаксела, приготовленного с использованием кремофора EL и этанола. Каждый агент тестировали
на уровне 3 доз с использованием 8 мышей на уровень. Уровни Taxol(r) составляли 9, 15, 25 мг/кг. Мышам вводили агент один раз в два дня х 4 (Q2Dx4) внутривенно. Отдельные контрольные группы плацебо обрабатывали соответствующим объемом солевого раствора или кремофор EL/этанола. Всех мышей ежедневно взвешивали и наблюдали на наличие клинических признаков. Все мыши удерживались в течение 14 суток после последней дозы, чтобы обнаружить любую отложенную токсичность
[00166] Для исследований эффективности мышам имплантировали подкожно от 3 0 до 60 мг опухолевых фрагментов, собранных у донорских животных. Мышей с опухолями, превышающими 1 г, или с изъязвленными опухолями, подвергали эвтаназии, как и те, у которых обнаруживали в явном плохом или в смертельно опасном состоянии. Дозирование (Q2Dx4) начинали, когда средняя оценочная масса опухоли для всех групп в эксперименте составляла 100-150 мг. Существовало 10 групп лечения (8 мышей на группу), включающих контрольную группу для каждого из 2-х плацебо, 3 обработанных группы для Taxol(r) 0,6Х, IX и 1,67Х от максимально допустимой дозы и 5 групп для PALM (ХТЗ) при 0,ЗХ, 0, 6Х, IX, 1,7Х и 2,8Х от максимально допустимой дозы. Всех мышей наблюдали по клиническим признакам не реже одного раза в сутки. Массу тела и измерения опухоли регистрировали три раза в неделю. Оценку мышей продолжали в течение 60 суток после последней дозы для получения данных о задержке роста опухоли.
[00167] Массу опухоли (мг) оценивали по формуле для объема вытянутого эллипсоида, предполагая плотность, равную единице: Масса опухоли (мг) = (Ь х W2)/2, где L и W являются соответствующими ортогональными измерениями длины и ширины опухоли с помощью штангенциркуля (мм) . Основными конечными точками, используемыми для оценки эффективности, являются: 1) %Т/С, которая определяется как медианная масса опухоли обработанной группы, деленная на медианную массу опухоли контрольной группы х 100, 2) полный и частичный ответ опухоли, 3) задержка роста опухоли и 4) количество выживших без опухолей в конце исследования. Медианное время до размера оценки для всех
исследовательских групп анализируется с помощью логарифмического рангового критерия (Каплана-Мейера), чтобы определить, существуют ли какие-либо существенные различия между группами. [00168] Пример 19 8-токотриенил (N4) -гемцитабинкарбамат [00169] Гидроксильные группы в гемцитабине защищены путем превращения в трет-бутоксикарбонильные (ВОС) эфиры с ди-трет-бутилдикарбонатом в соответствии с процедурой Guo and Gallo (J. Org. Chem. 1999, 64, 8319) для получения (1) F p О
вос-п \sF \\ _N
V-N \)-NH;
вос-0-^^0 N-' (4)
[00170] Соединение 4 растворяли в безводном дихлорметане до конечной концентрации 0,2 М соединения (4) . Для каждого моля соединения (4) в растворе объединяли 1,2 моль эквивалента соединения (2) при концентрации 0,5 М в метиленхлориде и 3 мольных эквивалента DMAP при комнатной температуре. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 4 часов. С полученного продукта снимали защиту с помощью трифторуксусной кислоты, как указано. Чистое соединение получают при помощи колоночной флэш-хроматографии с использованием элюента на основе дихлорметана и метанола, начиная с 100% дихлорметана и постепенно увеличивая концентрацию до 10% метанола с получением указанного в заголовке соединения (5).
F рОч
\ о
ОН (5)
[00171] Пример 20 Синтез карбаматов (N4)-гемцитабина с изомерами а, (3 или у-токотриенола проводят аналогично примеру 19. [00172] Пример 21 Холестерин (N4) -гемцитабинкарбамат [00173] Синтез холестерин (N4) -гемцитабинкарбамата (6) проводили таким же образом, как описано в примере 19, за исключением того, что соединение (4) подвергали взаимодействию с хлорформиатом холестерина (коммерчески доступным) и снимали защиту, как в примере 19, с получением (6).
НО-% \
г-о
F F .
(6)
[00174] Пример 22 Паклитаксел, связанный с жирными спиртами через янтарную и дигликолевую кислоты
[00175] Синтез паклитаксела, связанного с жирным спиртом,
через сукцинатную или дигликолятную диэфирную связь,
осуществляют путем взаимодействия жирного спирта с 4-
(диметиламино)пиридином и янтарным ангидридом или дигликолевым
ангидридом в безводном пиридине с постоянным перемешиванием в
течение 2 4 ч при комнатной температуре. Реакцию гасили 0,1 Н НС1
в дихлорметане. Продукт получали с помощью препаративной ТСХ или
флэш-хроматографии на колонке с этилацетатом в петролейном
эфире. Конъюгат спирто-янтарной кислоты или дигликолевой кислоты
объединяли с 4-(диметиламино)пиридином и N- (3-
диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимидом в сухом дихлорметане. Паклитаксел добавляли в реакционную смесь. Через 2 4 часа реакцию гасили водой и проводили экстракцию дихлорметаном. Продукт получали при помощи препаративной ТСХ с использованием этилацетата/гептанов (50:50) в качестве элюента.
[00176] Пример 23 Влияние антитела SR-BI на цитотоксичность PALM (ХТЗ) в клетках SK0V-3
[00177] SK0V-3 высевали и инкубировали в течение 24 часов, как в примере 16. Затем культуральную среду заменяли бессывороточной средой, содержащей 0,5% альбумина и указанные концентрации тестируемых агентов, с или без анти-SRBI (разбавление 1/250) (NB400-113, Novus Biologicals). Клетки инкубировали 12 ч. Затем клетки промывали бессывороточной средой, содержащей 0,5% альбумина, и выращивали еще 60 ч в культуральной среде. Рост клеток определяли методом МТТ (фиг. 11) .
[00178] Хотя описаны несколько вариантов осуществления данного раскрытия, очевидно, что основные примеры могут быть изменены для обеспечения других вариантов осуществления, которые
используют или охватывают способы и процессы данного изобретения. Варианты осуществления и примеры приведены в иллюстративных целях и не должны интерпретироваться как ограничивающие раскрытие, но, скорее, прилагаемая формула изобретения определяет объем данного изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Peptinovo Biopharma, LLC
<120> СОТАВЫ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГИДРОФОБНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
<130> 236603-397087
<150> PCT/US2016/041544
<151> 2016-07-08
<150> 62/190909
<151> 2015-07-10
<160> 70
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> L или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> A или Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> L или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> A, L, F или Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> L или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> A, Aib или N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> L или F
<222> (14)..(14) <223> A, L, F или Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> W, F или L
<400> 1
Asp Val Xaa Gln Xaa Xaa Lys Glu Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Glu Lys
1 5 10 15
Xaa Lys Gln Val 20
<210> 2
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 2
Asp Val Phe Gln Ala Leu Lys Glu Leu Phe Ala Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val
<210> 3
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Aib
<400> 3
Asp Val Phe Gln Xaa Leu Lys Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 4
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Aib
<400> 4
Asp Val Phe Gln Xaa Leu Lys Glu Leu Leu Ala Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Phe Lys Gln Val 20
<210> 5
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Aib
<400> 5
Asp Val Phe Gln Xaa Leu Lys Glu Leu Leu Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Phe Lys Gln Val 20
<210> 6
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Aib
Asp Val Phe Gln Xaa Leu Lys Glu Leu Leu Asn Gln Leu Xaa Glu Lys
1 5 10 15
Phe Lys Gln Val 20
<210> 7
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Aib
<400> 7
Asp Val Phe Gln Xaa Leu Lys Glu Leu Leu Asn Gln Leu Xaa Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 8
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 8
Asp Val Phe Gln Ala Leu Lys Glu Leu Leu Ala Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Phe Lys Gln Val 20
<210> <211> <212> <213>
Белок
Искусственная последовательность
<400> 9
Asp Val Phe Gln Ala Leu Lys Glu Leu Leu Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Phe Lys Gln Val
<210> 10
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Aib
<400> 10
Asp Val Phe Gln Xaa Leu Lys Glu Leu Phe Ala Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 11
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Aib
<400> 11
Asp Val Phe Gln Xaa Leu Lys Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 12
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Aib
<400> 12
Asp Val Phe Gln Xaa Leu Lys Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Phe Lys Gln Val 20
<210> 13
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Aib
<400> 13
Asp Val Phe Gln Ala Leu Lys Glu Leu Phe Ala Gln Leu Xaa Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 14
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Aib
<400> 14
Trp Lys Gln Val 20
<210> 15
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Aib
<400> 15
Asp Val Phe Gln Ala Leu Lys Glu Leu Phe Asn Gln Leu Xaa Glu Lys
1 5 10 15
Phe Lys Gln Val 20
<210> 16
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 16
Asp Val Phe Gln Ala Phe Lys Glu Ala Phe Ala Gln Leu Phe Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 17
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Aib
<400> 17
Trp Lys Gln Val 20
<210> 18
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Aib
<400> 18
Asp Val Phe Gln Xaa Phe Lys Glu Xaa Phe Ala Gln Leu Phe Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 19
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Aib
<400> 19
Asp Val Phe Gln Ala Phe Lys Glu Ala Phe Xaa Gln Leu Phe Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 20
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220> <221> <222> <223>
MISC_FEATURE
(9)..(9)
Aib
<220> <221> <222> <223>
MISC_FEATURE (11)..(11) Aib
<400> 20
Asp Val Phe Gln Ala Phe Lys Glu Xaa Phe Xaa Gln Leu Phe Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 21
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Aib
<400> 21
Asp Val Phe Gln Xaa Phe Lys Glu Xaa Phe Xaa Gln Leu Phe Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> <211> <212> <213>
22 20
Белок
Искусственная последовательность
<400> 22
Asp Val Phe Gln Ala Leu Lys Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 23
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Aib
<400> 23
Asp Val Phe Gln Xaa Leu Lys Glu Leu Leu Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Leu Lys Gln Val
<210> 24
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> D или E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> V, I или L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> L, I, V, W, Y, Aib, Amv или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Q или N
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> K, R, H или Orn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> L, I, V, W, Y, Aib, Amv или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> A, G, S, V, Aib или Amv
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> E или D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> A, G, S L, F, V, Amv или Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> L, I, V, W, Y, Aib, Amv или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> A, G, S, Aib, Amv, V или N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Q или N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> L, I, V, W, Y, Aib, Amv или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> A, G, S L, F, V, Amv или Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> E или D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> K, R, H или Orn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> W, F, Y, I, V или L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> K, R, H или Orn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> Q или N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> V, I или L
<400> 24
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210> 25
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Aib
<400> 25
Asp Val Phe Gln Lys Leu Xaa Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 26
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 26
<210> 27
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Aib
<400> 27
Asp Val Xaa Gln Lys Leu Phe Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 28
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Aib
<400> 28
Asp Val Phe Gln Lys Leu Xaa Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Phe Lys Gln Val 20
<210> 29
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 29
<210> 30
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Aib
<400> 30
Asp Val Xaa Gln Lys Leu Phe Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Phe Lys Gln Val 20
<210> 31
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Aib
<400> 31
Asp Val Leu Gln Lys Phe Xaa Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 32
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<222> (3)..(3) <223> Aib
<400> 32
Asp Val Xaa Gln Lys Phe Leu Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 33
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Aib
<400> 33
Asp Val Phe Gln Lys Leu Leu Glu Xaa Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 34
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Aib
<400> 34
<210> 35
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Aib
<400> 35
Asp Val Phe Gln Lys Leu Xaa Glu Leu Phe Asn Gln Leu Xaa Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<210> 36
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> W, F или L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> A, L, F или Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> L или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> A, Aib или N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> L или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> A, L, F или Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> L или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> A или Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> L или F
<400> 36
Val Gln Lys Xaa Lys Glu Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Glu Lys Xaa Xaa
1 5 10 15
Gln Xaa Val Asp 20
<210> 37
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 37
Val Gln Lys Trp Lys Glu Leu Leu Gln Ala Phe Leu Glu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 38
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Aib
Val Gln Lys Trp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu Lys Leu Xaa
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 39
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Aib
<400> 39
Val Gln Lys Phe Lys Glu Leu Leu Gln Ala Leu Leu Glu Lys Leu Xaa
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 40
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Aib
<400> 40
Val Gln Lys Phe Lys Glu Leu Leu Gln Asn Leu Leu Glu Lys Leu Xaa
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 41
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220> <221> <222> <223>
MISC_FEATURE
m..m
Aib
<220> <221> <222> <223>
MISC_FEATURE (16)..(16) Aib
<400> 41
Val Gln Lys Phe Lys Glu Xaa Leu Gln Asn Leu Leu Glu Lys Leu Xaa
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 42
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Aib
<400> 42
Val Gln Lys Trp Lys Glu Xaa Leu Gln Asn Leu Leu Glu Lys Leu Xaa
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 43
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 43
<210> 44
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 44
Val Gln Lys Phe Lys Glu Leu Leu Gln Asn Leu Leu Glu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 45
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Aib
<400> 45
Val Gln Lys Trp Lys Glu Leu Leu Gln Ala Phe Leu Glu Lys Leu Xaa
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 46
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Aib
<400> 46
Val Gln Lys Trp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu Lys Leu Xaa
<210> 47
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Aib
<400> 47
Val Gln Lys Phe Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu Lys Leu Xaa
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 48
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Aib
<400> 48
Val Gln Lys Trp Lys Glu Xaa Leu Gln Ala Phe Leu Glu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> <211> <212> <213>
49 20
Белок
Искусственная последовательность
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Aib
<400> 49
Val Gln Lys Trp Lys Glu Xaa Leu Gln Asn Phe Leu Glu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 50
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Aib
<400> 50
Val Gln Lys Phe Lys Glu Xaa Leu Gln Asn Phe Leu Glu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 51
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 51
Val Gln Lys Trp Lys Glu Phe Leu Gln Ala Phe Ala Glu Lys Phe Ala
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 52
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Aib
<400> 52
Val Gln Lys Trp Lys Glu Phe Leu Gln Ala Phe Xaa Glu Lys Phe Ala
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 53
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Aib
<400> 53
Val Gln Lys Trp Lys Glu Phe Leu Gln Ala Phe Xaa Glu Lys Phe Xaa
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 54
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Aib
<400> 54
Val Gln Lys Trp Lys Glu Phe Leu Gln Xaa Phe Ala Glu Lys Phe Ala
1 5 10 15
<210> 55
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Aib
<400> 55
Val Gln Lys Trp Lys Glu Phe Leu Gln Xaa Phe Xaa Glu Lys Phe Ala
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 56
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Aib
<400> 56
<210> 57
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 57
Val Gln Lys Trp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 58
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Aib
<400> 58
Val Gln Lys Leu Lys Glu Leu Leu Gln Asn Leu Leu Glu Lys Leu Xaa
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 59
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> V, I или L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Q или N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> K, R, H или Orn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> W, F, Y, I, V или L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> K, R, H или Orn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> E или D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> A, G, S, L, F, V, Amv или Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> L, I, V, W, Aib, Amv или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Q или N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> A, G, S, Aib, Amv, V или N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> L, I, V, W, Aib, Amv или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> A, G, S, L, F, V, Amv или Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> E или D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> A, G, S, V, Aib или Amv
<222> (15)..(15)
<223> L, I, V, W, Aib, Amv или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> K, R, H или Orn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Q или N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> L, I, V, W, Aib, Amv или F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> V, I или L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> E или D
<400> 59
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
<210> 60
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Aib
<400> 60
Val Gln Lys Trp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu Xaa Leu Lys
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 61
Val Gln Lys Trp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu Val Leu Lys
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 62
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> Aib
<400> 62
Val Gln Lys Trp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu Phe Leu Lys
1 5 10 15
Gln Xaa Val Asp 20
<210> 63
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Aib
<400> 63
Val Gln Lys Phe Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu Xaa Leu Lys
1 5 10 15
<210> 64
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 64
Val Gln Lys Phe Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu Val Leu Lys
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 65
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> Aib
<400> 65
Val Gln Lys Phe Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu Phe Leu Lys
1 5 10 15
Gln Xaa Val Asp 20
<210> 66
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Aib
<400> 66
<210> 67
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> Aib
<400> 67
Val Gln Lys Trp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu Leu Phe Lys
1 5 10 15
Gln Xaa Val Asp 20
<210> 68
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Aib
<400> 68
Val Gln Lys Trp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Xaa Glu Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 69
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Aib
<400> 69
Val Gln Lys Trp Lys Glu Leu Xaa Gln Asn Phe Leu Glu Xaa Leu Lys
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
<210> 70
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Aib
<400> 70
Val Gln Lys Trp Lys Glu Xaa Leu Gln Asn Phe Leu Glu Xaa Leu Lys
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Пептид, содержащий аминокислотную последовательность: XI- Х2 -ХЗ- Х4 -Х5 -Хб -Х7 -Х8 -Х9 -Х10 -XII -Х12 -Х13 -Х14 -Х15 -Х1б -Х17 -Х18- Х19 -Х20, где: XI представляет собой аминокислоту D; Х2 и Х2 0 каждый представляет собой аминокислоту V; ХЗ, Хб, Х10 и Х13 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из L и F; Х4, Х12 и XI9 каждый представляет собой аминокислоту Q; Х5 представляет собой аминогруппу А или Aib; Х7, XIб и XI8 каждый представляет собой аминокислоту К; Х8 и XI5 каждый представляет собой аминокислоту Е; Х9 и XI4 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, L, F и Aib; XII представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, Aib и N; а XI7 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F и L. (SEQ ID N0: 1) , причем пептид необязательно ацилируют на N-конце, амидируют на С-конце или и ацилируют на N-конце, и амидируют на С-конце, и пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот.
2. Пептид, содержащий аминокислотную последовательность: Х1-Х2-ХЗ-Х4 -Х5 -Хб -Х7 -Х8 -Х9 -Х10 -XII -Х12 -Х13 -Х14 -Х15-Х1б -Х17 -Х18- Х19 -Х20, где: XI представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D и Е; Х2 и Х2 0 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из V, I и L; ХЗ, Хб, Х10 и Х13 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из L, I, V, W, Y, Aib, Amv и F; Х4, Х12 и XI9 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из Q и N; Х5, Х1б и Х18 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из К, R, Н и Orn; Х7 выбирают из группы, состоящей из A, G, S, V, Aib и Amv; Х8 и XI5 независимо выбирают из группы, состоящей из аминокислот Е и D; Х9 и Х14 представляют собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, G, S L, F, V, Amv и Aib; XII представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, S, Aib, Amv, V и N; а Х17 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей
1.
из W, F, Y, I, V и L. (SEQ ID NO: 24), причем пептид необязательно ацилируют на N-конце, амидируют на С-конце или и ацилируют на N-конце, и амидируют на С-конце, и пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот.
3. Пептид, содержащий аминокислотную последовательность XI-Х2-ХЗ- Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х2 0, где XI и XI9 каждый представляет собой аминокислоту V; Х2, Х9 и Х17 каждый представляет собой аминокислоту Q; ХЗ, Х5 и Х14 каждый представляет собой аминокислоту К; Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F и L; Хб и Х13 каждый представляет собой аминокислоту Е; Х7 и Х12 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, L, F и Aib; Х8, XII, Х15 и Х18 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из L и F; XI0 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, Aib и N; XIб представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из А и Aib; а Х2 0 представляет собой аминокислоту D. (SEQ ID NO: 36), причем пептид необязательно ацилируют на N-конце, амидируют на С-конце или и ацилируют на N-конце, и амидируют на С-конце, и пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот.
4. Пептид, содержащий аминокислотную последовательность XI-Х2-ХЗ- Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9-Х10-Х11-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х2 0, где XI и XI9 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из V, I и L; Х2, Х9 и XI7 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из Q и N; ХЗ, Х5 и XIб каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из К, R, Н и Orn; Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из W, F, Y, I, V и L; Хб, Х13 и Х20 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из Е и D; Х7 и Х12 каждый представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из A, G, S, L, F, V, Amv и Aib; Х8, XII, Х15 и Х18 независимо выбирают из группы, состоящей из аминокислот L, I, V, W, Aib, Amv и F; XI0 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей
3.
из A, G, S, Aib, Amv, V и N; а Х14 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, S, V, Aib и Amv. (SEQ ID NO: 59), причем пептид необязательно ацилируют на N-конце, амидируют на С-конце или и ацилируют на N-конце, и амидируют на С-конце, и пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот.
5. Пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 70, причем пептид необязательно ацилируют на N-конце, амидируют на С-конце или и ацилируют на N-конце, и амидируют на С-конце, и пептид имеет длину от 2 0 до 2 4 аминокислот.
6. Пептид по п. 5, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, причем пептид необязательно ацилируют на N-конце, амидируют на С-конце или и ацилируют на N-конце, и амидируют на С-конце.
7. Пептид по п. 5, состоящий из аминокислотной
последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35, причем пептид необязательно ацилируют на N-конце, амидируют на С-конце или и ацилируют на N-конце, и амидируют на С-конце.
8. Пептид по п. 5, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, причем пептид необязательно ацилируют на N-конце, амидируют на С-конце или и ацилируют на N-конце, и амидируют на С-конце.
9. Пептид по п. 5, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 70, причем пептид необязательно ацилируют на N-конце, амидируют на С-конце или и ацилируют на N-конце, и амидируют на С-конце.
10. Пептидная амфифильная липидная мицелла (PALM), содержащая пептид по любому из пп. 1-9, и липидный компонент, содержащий сфингомиелин и один или более дополнительных фосфолипидов.
11. PALM по п. 10, отличающаяся тем, что липидный компонент состоит главным образом из сфингомиелина и одного или более дополнительных фосфолипидов.
12. PALM по п. 10 или п. 11, отличающаяся тем, что один или
более дополнительных фосфолипидов выбирают из группы, состоящей
из фосфатидилхолина, полиэтиленгликольфосфатидилэтаноламина
(PEG-РЕ), фосфатидилэтаноламина, фосфатидилглицерина,
фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола, кардиолипина или любой их
комбинации.
13. PALM по любому из пп. 10-12, отличающаяся тем, что один
или более дополнительных фосфолипидов содержат фосфатидилхолин.
14. PALM по п. 13, отличающаяся тем, что фосфатидилхолин представляет собой 1-пальмитоил-2-олеоилфосфатидилхолин (РОРС).
15. PALM по любому из пп. 10-14, отличающаяся тем, что молярное отношение фосфолипида к сфингомиелину составляет от около 90:10 до около 5:95.
16. PALM по п. 15, отличающаяся тем, что молярное отношение фосфолипида к сфингомиелину составляет 30:70.
17. PALM по п. 15, отличающаяся тем, что молярное отношение фосфолипида к сфингомиелину составляет от около 80:20 до около 60:40.
18. PALM по п. 17, отличающаяся тем, что молярное отношение фосфолипида к сфингомиелину составляет около 70:30.
19. PALM по любому из пп. 10-18, отличающаяся тем, что молярное отношение липидного компонента к пептиду составляет от около 10:1 до около 2:1.
20. PALM по любому из п. 19, отличающаяся тем, что молярное отношение липидного компонента к пептиду составляет от около 6:1 до около 4:1.
21. Композиция PALM-молекула груза, содержащая PALM по любому из пп. 10-2 0 и по меньшей мере одну молекулу груза.
22. Композиция PALM-молекула груза по п. 21, отличающаяся тем, что по меньшей мере, одна молекула груза представляет собой визуализирующий агент.
23. Композиция PALM-молекула груза по п. 22, отличающаяся тем, что визуализирующий агент представляет собой визуализирующий агент.
24. Композиция PALM-молекула груза по любому из пп. 21-23, отличающаяся тем, что по меньшей мере одна молекула груза представляет собой лекарственное средство.
25. Композиция PALM-молекула груза по п. 24, отличающаяся тем, что лекарственное средство представляет собой мириплатин или фенретинид.
26. Композиция PALM-молекула груза по п. 2 4 или п. 25, отличающаяся тем, что композиция PALM-молекула груза дополнительно содержит визуализирующий агент.
14.
27. Композиция PALM-молекула груза по п. 21, отличающаяся тем, что по меньшей мере одна молекула груза представляет собой соединение-конъюгат, имеющее формулу (I):
A-R-L-X (формула I)
где А представляет собой агент, имеющий гидроксильную группу или аминогруппу; R представляет собой гидроксильную группу или аминогруппу агента; L представляет собой линкер, а X представляет собой якорный фрагмент, выбранный из группы, состоящей из холестерина, а-токотриенола, р-токотриенола, у-токотриенола и 8-токотриенола.
28. Композиция PALM-молекула груза по п. 27, отличающаяся тем, что R представляет собой гидроксильную группу, а якорный фрагмент ковалентно связан с агентом посредством карбонатной сложноэфирной связи.
29. Композиция PALM-молекула груза по п. 27, отличающаяся тем, что R представляет собой аминогруппу, а якорный фрагмент ковалентно связан с агентом посредством карбаматной сложноэфирной связи.
30. Композиция PALM-молекула груза по любому из пп. 27-29, отличающаяся тем, что якорный фрагмент представляет собой холестерин.
31. Композиция PALM-молекула груза по любому из пп. 27-29, отличающаяся тем, что якорный фрагмент представляет собой 8-токотриенол.
32. Композиция PALM-молекула груза по любому из пп. 27-31, отличающаяся тем, что агент представляет собой лекарственное средство.
33. Композиция PALM-молекула груза по любому из пп. 21-32, отличающаяся тем, что композиция PALM-молекула груза дополнительно содержит визуализирующий агент.
34. Композиция PALM-молекула груза по п. 33, отличающаяся тем, что визуализирующий агент представляет собой 1,2-дипальмитоил зл-глицеро-З-фосфоэтаноламин-N-диэтилентриаминпентауксусную кислоту (соль гадолиния) (РЕ-DTPA(Gd)), 1,2- дипалмитоил -зл-глицеро-З-фосфоэтаноламин-N
28.
диэтилентриаминпентауксусную кислоту (соль марганца) (РЕ-DTPA(Mn)), 11:LIn-DTPA-A.
35. Композиция PALM-молекула груза по любому из пп. 32-34, отличающаяся тем, что лекарственное средство представляет собой противораковое лекарственное средство.
36. Композиция PALM-молекула груза по п. 35, отличающаяся тем, что противораковое лекарственное средство представляет собой гидроксикамптотецин, даунорубицин, или паклитаксел, доцетаксел.
37. Способ лечения расстройства, включающий введение
субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества
композиции PALM-молекула груза по любому из пп. 21-3 6.
38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что расстройство представляет собой рак.
39. Способ по любому из пп. 21-3 8, отличающийся тем, что пептид выбирают из группы, состоящей из SEQ ID N0: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35
По доверенности
ФИГ. 1А
SEQ ID NO; 3
0 SO 120 180' 240 300 3№D
Ориентация в спирали {градусы} ФИГ. 1С
D "О 120 ПВО 240 3 &0 360
Ориентация в спирали (градусъ~J ФИГ. 1D
20 30 40 50
Время удержания (мин)
ФИГ. 3
-г-
Время удержания (мин]
" m " -г- 1 г-
10 20 30 40 50
Время удержания (мим)
о а.
о о.
ФИГ. 7
0.1
1 10 [Платима] (мкМ)
5/6 ФИГ. 8
100
-Q- Паклитаксел контроль -0- PALM (XT 3.1 контроль ф Паклитаксел SR-BI* . --ф- PALM(XT3) SR-BI+
0,1
1 10
[Паклитаксм] мкМ
--. без At
г - -Kjmv-SKB
без. At
: " ^ +анти-5кБ
¦ "."без At
• " . < +aHTt.--SKB
0,0001
0,001
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<220>
<221> MISC_FEATURE
<400>
<400>
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<220>
Asp Val Phe Gln Ala Leu Lys Glu Leu Phe Asn Gln Leu Xaa Glu Lys
1 5 10 15
Asp Val Phe Gln Ala Leu Lys Glu Leu Phe Asn Gln Leu Xaa Glu Lys
1 5 10 15
Asp Val Phe Gln Ala Phe Lys Glu Xaa Phe Ala Gln Leu Phe Glu Lys
1 5 10 15
Asp Val Phe Gln Ala Phe Lys Glu Xaa Phe Ala Gln Leu Phe Glu Lys
1 5 10 15
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<220>
Asp Val Phe Gln Lys Leu Val Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val
Asp Val Phe Gln Lys Leu Val Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val
Asp Val Phe Gln Lys Leu Val Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Asp Val Phe Gln Lys Leu Val Glu Leu Phe Asn Gln Leu Leu Glu Lys
1 5 10 15
Phe Lys Gln Val 20
Phe Lys Gln Val 20
MISC_FEATURE
MISC_FEATURE
Asp Val Phe Gln Lys Leu Xaa Glu Leu Phe Asn Gln Xaa Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
Asp Val Phe Gln Lys Leu Xaa Glu Leu Phe Asn Gln Xaa Leu Glu Lys
1 5 10 15
Trp Lys Gln Val 20
<400>
<400>
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
Val Gln Lys Phe Lys Glu Leu Leu Gln Ala Leu Leu Glu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Val Gln Lys Phe Lys Glu Leu Leu Gln Ala Leu Leu Glu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Val Gln Lys Phe Lys Glu Leu Leu Gln Ala Leu Leu Glu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Val Gln Lys Phe Lys Glu Leu Leu Gln Ala Leu Leu Glu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
Gln Phe Val Asp 20
Gln Phe Val Asp 20
Gln Phe Val Asp 20
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
Gln Phe Val Asp 20
Gln Phe Val Asp 20
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
Gln Phe Val Asp 20
Gln Phe Val Asp 20
Val Gln Lys Trp Lys Glu Phe Leu Gln Xaa Phe Xaa Glu Lys Phe Xaa
1 5 10 15
Val Gln Lys Trp Lys Glu Phe Leu Gln Xaa Phe Xaa Glu Lys Phe Xaa
1 5 10 15
Gln Phe Val Asp 20
Gln Phe Val Asp 20
<220>
<221> MISC_FEATURE
<220>
<221> MISC_FEATURE
<210> 61 <211> 20
<210> 61 <211> 20
Gln Phe Val Asp 20
Gln Phe Val Asp 20
Val Gln Lys Trp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu Xaa Phe Lys
1 5 10 15
Gln Leu Val Asp
Val Gln Lys Trp Lys Glu Leu Leu Gln Asn Phe Leu Glu Xaa Phe Lys
1 5 10 15
Gln Leu Val Asp
1/6
1/6
2/6
ФИГ. 2
2/6
ФИГ. 2
3/6
ФИГ. 4
3/6
ФИГ. 4
4/6
ФИГ.
4/6
ФИГ.
4/6
ФИГ.
4/6
ФИГ.
4/6
ФИГ.
4/6
ФИГ.
6/6
ФИГ. 10
6/6
ФИГ. 10
6/6
ФИГ. 10
6/6
ФИГ. 10
6/6
ФИГ. 10
6/6
ФИГ. 10
