EA201890019A1 20180531 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2018\PDF/201890019 Полный текст описания [**] EA201890019 20160610 Регистрационный номер и дата заявки EP15171710.5 20150611 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2016/063264 Номер международной заявки (PCT) WO2016/198578 20161215 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21805 Номер бюллетеня [**] СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ТРАНСПЛАНТАТА У РЕЦИПИЕНТА Название документа [8] A61K 31/727, [8] A61P 37/06 Индексы МПК [NL] Хёрн ван Лодевейк Виллем Эрнест, [NL] Николас Герард Анна Франсискус, [NL] Рётелингспергер Христиан Петер Мария, [NL] Смален ван Тим Христиан Сведения об авторах [NL] ЮНИВЕРСИТЕЙТ МААСТРИХТ, [NL] АКАДЕМИС ЗИКЕНХЁЙС МААСТРИХТ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201890019a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Данное изобретение относится к области медицинского лечения, в частности изобретение обеспечивает способ профилактики, облегчения или уменьшения недостаточности трансплантата в организме реципиента. В частности, изобретение обеспечивает гепарин, обедненный пентасахаридами, для применения в профилактике, облегчении или уменьшении недостаточности трансплантата чужеродного органа или ткани организма человека или животного у реципиента.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Данное изобретение относится к области медицинского лечения, в частности изобретение обеспечивает способ профилактики, облегчения или уменьшения недостаточности трансплантата в организме реципиента. В частности, изобретение обеспечивает гепарин, обедненный пентасахаридами, для применения в профилактике, облегчении или уменьшении недостаточности трансплантата чужеродного органа или ткани организма человека или животного у реципиента.


Евразийское (21) 201890019 d3) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A61K31/727 (2006.01)
2018.05.31 A61P37/06 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2016.06.10
(54) СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ТРАНСПЛАНТАТА У РЕЦИПИЕНТА
(31) 15171710.5
(32) 2015.06.11
(33) EP
(86) PCT/EP2016/063264
(87) WO 2016/198578 2016.12.15
(71) Заявитель: ЮНИВЕРСИТЕЙТ МААСТРИХТ; АКАДЕМИС ЗИКЕНХЁЙС МААСТРИХТ (NL)
(72) Изобретатель:
Хёрн ван Лодевейк Виллем Эрнест, Николас Герард Анна Франсискус, Рётелингспергер Христиан Петер Мария, Смален ван Тим Христиан
(NL)
(74) Представитель:
Агуреев А.П., Фелицына С.Б. (RU)
(57) Данное изобретение относится к области медицинского лечения, в частности изобретение обеспечивает способ профилактики, облегчения или уменьшения недостаточности трансплантата в организме реципиента. В частности, изобретение обеспечивает гепарин, обедненный пентасаха-ридами, для применения в профилактике, облегчении или уменьшении недостаточности трансплантата чужеродного органа или ткани организма человека или животного у реципиента.
1711657
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ТРАНСПЛАНТАТА У
РЕЦИПИЕНТА Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицинского лечения, в частности, изобретение обеспечивает способ профилактики, облегчения или уменьшения недостаточности трансплантата после трансплантации у реципиента.
Предшествующий уровень техники
Трансплантация является сложной медицинской методикой, которая обеспечивает пересадку органов от донора реципиенту, чьи органы неспособны функционировать в достаточной степени, повышая качество жизни реципиента, увеличивая вероятную продолжительность жизни и спасая жизнь.
Недостаточность трансплантата является одной из наибольших проблем трансплантации. После трансплантации органа отмечается неизбежный ответ реципиента и трансплантата. Этот ответ может развиваться в результате травмы, связанной с взятием, перфузией, консервацией органа и с операцией. Этот ответ может также включать специфическое распознавание иммунной системой антигенных различий между донором и реципиентом (1). Взятые вместе, эти механизмы могут развиваться остро или спустя недели, месяцы или даже годы, и приводить к развитию деструктивного ответа, который в конечном итоге приводит к потере трансплантата. Этот процесс также часто называют отторжением трансплантата.
Отторжение трансплантата является результатом многообразия ответов, и начинается с процессов клеточной гибели, которые, если их не остановить, будут возрастать и приведут к недостаточности трансплантата. Травматическое повреждение, приводящее к гибели клеток и вызванное взятием, консервацией и ишемией/реперфузией органа, нельзя полностью предотвратить. Таким образом, необходимы подходящие стратегии лечения для устранения отрицательных эффектов. К сожалению, имеется мало вариантов.
Отторжение является итогом естественного ответа иммунной системы на чужеродную субстанцию, или антиген. Этот сложный процесс опосредован главным образом Т-лимфоцитами, хотя он включает последовательные взаимодействия между чужеродными антигенами, антителами, Т-лимфоцитами, макрофагами, цитокинами (также известными как лимфокины или интерлейкины), молекулами адгезии (т.е. ко-стимулирующими молекулами), и мембранными белками, которые усиливают связывание Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов.
Иммуносупрессивную терапию часто проводят для профилактики и лечения отторжения трансплантата, а также для продления выживания трансплантата и пациента. Однако, из-за активности иммуносупрессивных агентов и интер-индивидуальной и интра-индивидуальной вариабельности фармакокинетики, необходима индивидуализация дозы для поддержки адекватной иммуносупрессии при минимизации побочных реакций. Плохая растворимость в воде и биодоступность усложняют применение таких иммуносупрессивных агентов, как циклоспорин и сиролимус. Отторжение трансплантата может быть сверхострым (в течение первых часов после трансплантации или первых дней), вызванным предварительно образованными антителами, острым (в первые дни или месяцы), вызванным Т-лимфоцитами, или хроническим (спустя месяцы или даже годы), вызванным главным образом антителами.
Отмечается постоянный дефицит донорских органов. Это вызывает серьезные проблемы для здоровья, поскольку пациенты из листа ожидания трансплантации органов могут умереть без трансплантации органа. Они представляют тяжелую финансовую нагрузку для системы здравоохранения из-за больших затрат на их лечение (2-10).
Таким образом, необходимы способы повышения уровня эффективности трансплантаций.
Изложение сущности изобретения
Мы установили, что гепарин со сниженной антикоагулянтной активностью, в частности, гепарин, обедненный пентасахаридами, можно применять для уменьшения, облегчения или профилактики недостаточности трансплантата чужеродного органа у реципиента. Гепарин, обедненный пентасахаридами, обладает значительно сниженной антикоагулянтной активностью. Далее, показана значительная способность к нейтрализации цитотоксичности, опосредованной гистонами. Эта цитотоксичность, опосредованная гистонами, отвечает за недостаточность трансплантата при трансплантации. Таким образом, изобретение относится к гепарину, обедненному пентасахаридами, для применения в лечении или профилактике недостаточности трансплантата в организме человека или животного.
Подробное описание изобретение
Гепарин является смесью полисахаридных цепей (Casu, В. (1989) "Structure of heparin and heparin fragments)). Ann. N. Y. Acad. Sci. 556: 1-17 "Структура гепарина и фрагменты гепарина"). Состав полисахаридных цепей и их длина варьирует. Цепи с так называемым пентасахаридным доменом прочно связываются с антитромбином (AT), который является одним из главных циркулирующих антикоагулянтных белков (Casu, В. et al. Biochem J 197(3) (1981) 599-609).
Гепарин со сниженной антикоагулянтной активностью известен в данной области техники, и имеется несколько способов его получения. Во-первых, из гепарина могут быть удалены его пентасахариды посредством аффинной хроматографии, с получением не-антикоагулянтного гепарина, или гепарина с пониженной антикоагулянтной активностью. Гепарин может также быть подвергнут химической обработке для получения гепарина со сниженной антикоагулянтной активностью.
Гепарин, обедненный пентасахаридами, может быть получен из нефракционированного гепарина (НФГ) с помощью способов, известных в данной области техники. В предпочтительном способе гепарин, обедненный пентасахаридами, получают посредством аффинной хроматографии. При этом НФГ пропускают через колонку, содержащую иммобилизованный AT. Молекулы, которые содержат пентасахаридную последовательность, связываются с колонкой, в то время как остальной материал проходит. Несвязанный материал называют низкоаффинным материалом (НАМ), в то время как связавшийся материал называют высокоаффинным материалом (ВАМ). НАМ имеет существенно сниженное содержание пентасахаридов, и следовательно, сниженную антикоагулянтную активность, в то время как ВАМ обладает полной антикоагулянтной активностью.
НАМ может также быть описан как фракция натурального гепарина, обедненная пентасахаридами.
Термин "гепарин, обедненный пентасахаридами" в контексте настоящего изобретения применяется для обозначения фракции гепарина, в которой содержание пентасахаридов существенно снижено, по сравнению с коммерческим гепарином.
Термин "существенно сниженный или уменьшенный", как применяется в настоящей заявке, означает уменьшенный по меньшей мере на 10%, на такое количество, как 20% или 30%, более предпочтительно 40 или 50%, еще более предпочтительно больше чем на 60% или 70% или 80%, на такое количество, как 90%, или больше чем на 98%, на такое количество, как больше чем 99% или даже на 100%. Наиболее предпочтительно, фракция, обедненная пентасахаридами, не содержит каких-либо выявляемых пентасахаридов при анализе образования тромбина, как описано Hemker et al, (2003) ниже. В то же время, гепарин со сниженной антикоагулянтной активностью означает гепарин с антикоагулянтной активностью, уменьшенной по меньшей мере на 10%, на такое количество, как 20% или 30%, более предпочтительно на 40 или 50%, еще более предпочтительно больше чем на 60% или 70% или 80%, на такое количество, как 90%, или больше чем на 98%, на такое количество, как больше чем 99% или даже на 100%. Наиболее предпочтительно, гепарин с уменьшенной антикоагулянтной активностью не
содержит какой-либо выявляемой антикоагулянтной активности при анализе образования тромбина, как описано Hemker et al, (2003) ниже.
В разделе, посвященном экспериментам, подробно описано, как можно получить гепарин, обедненный пентасахаридами. В настоящей заявке он называется НАМ, сокращение от "низкоаффинный материал".
Мы установили, что удаление антикоагулянтной фракции гепарина из НФГ позволяет получить гепарин, обедненный пентасахаридами, который нейтрализует цитотоксичность, опосредованную гистонами, и который можно с пользой применять для профилактики недостаточности трансплантатов донорских органов и тканей, таких как сердце, легкие, печень, роговица, кожа, матка, почки, поджелудочная железа и тонкая кишка.
Термин "недостаточность трансплантата", как применяется в настоящей заявке, означает неспособность трансплантированного органа выполнять его нормальную функцию. Это может означать, что трансплантированный орган неспособен выполнять свою функцию полностью или только частично. Недостаточность трансплантата может также означать состояние трансплантированного органа, при котором его функция существенно уменьшена или снижена.
Краткое описание фигур
Фигура 1. Разделение НФГ на НАМ и ВАМ. Наносили 2 мг НФГ. Эта фигура демонстрирует оптическую плотность при 254 нм, где первый пик представляет собранный НАМ, а второй пик содержит собранный ВАМ. Второй график представляет электропроводность элюированного материала. НАМ элюировали со скоростью 1 мл/мин, а ВАМ - 4 мл/мин.
Фигура 2. Антикоагулянтная активность различных гепариновых препаратов. Диаграмма демонстрирует, что десульфирование и удаление пентасахаридов дает гепариновые фракции с уменьшенной антикоагулянтной активностью.
Фигура 3. Нейтрализация цитотоксичности гистона НЗ. Диаграмма демонстрирует, что влияние на цитотоксичность гистона НЗ снижается для десульфированной фракции гепарина, но полностью сохраняется для гепарина, обедненного пентасахаридами.
Примеры
Пример 1. Подготовка колонки с AT
Колонку с AT готовили в соответствии с упаковочным вкладышем для 5 мл колонки HiTrap (GE Healthcare(r)). После промывания изопропанолом на колонку наносили примерно 2,5 мг AT в 5 мл буфера для связывания. Затем применяли описанную процедуру для иммобилизации белка на материале колонки и промывания колонки (в
соответствии с упаковочным вкладышем). Наконец, колонку уравновешивали 140 мМ NaCl, 20 мМ Трис (рН 7,4).
Пример 2. Разделение НФГ на НАМ и ВАМ.
На колонку наносили 2 мг нефракционированного гепарина. НАМ элюировали с 140 мМ NaCl, 20 мМ Трис (рН 7,4), а ВАМ с 2 М NaCl, 20 мМ Трис (рН 7,4). Последний буфер наносили в ступенчатом градиенте. На Фигуре 1 показан пример характера элюции.
Для получения большего количества НАМ, процедуру, описанную на Фигуре 1, повторяли несколько раз.
Что бы определить отсутствие примесей ВАМ в НАМ, проводили два анализа. Во-первых, собранную ВАМ повторно наносили на колонку с AT и проводили хроматографию, как описано выше. Не отмечалось пика ВАМ. Во-вторых, определяли влияние НАМ на генерацию тромбина. Реакционная смесь (120 мкл) содержала нормальную плазму из пула в разведении 1,5; 3 мкл НАМ или буфера, 4 мкл DOPL (60% DOPC, 20% DOPC и 20% DOPE), 5 пМ тканевого фактора (Innovin), 100 мМ СаСЬ и 417 мкМ ZGGR-AMC. Реакцию начинали с СаСЬ + ZGGR-AMC. Образование тромбина определяли, как описано Hemker, Н. С, P. Giesen, et al. (2003) "Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma" Pathophysiol Haemost Thromb 33(1): 415 ("Калиброванный автоматизированный анализ образования тромбина при коагуляции плазмы"). Генерация тромбина не ингибировалась добавлением 3 мкл ВАМ.
С колонки собирали фракции, содержащие НАМ. Буфер заменяли на аммония бикарбонат (рН 7,8) с помощью среды Сефадекс G-25, и фракции лиофилизировали. Сухой НАМ взвешивали и растворяли в фосфатно-солевом буфере для получения необходимой концентрации.
Пример 3. Профилактика недостаточности трансплантата.
Мы провели наблюдения на модели трансплантата почки, где мы трансплантировали почки мышам. Мы определили условия, при которых для трансплантируемых почек имелась повышенная вероятность недостаточности, а затем проводили эксперимент, где 30 мышам вводили от 0,1 до 10 мг НАМ на мышь на инъекцию. Подходящая контрольная группа мышей не получала какого-либо лечения, другая контрольная группа получала сопоставимые количества ВАМ или натурального гепарина.
Отмечалось, что группа, получавшая НАМ, имела сниженную частоту недостаточности трансплантата.
Пример 4. Антикоагулянтная активность различных гепариновых препаратов Нефракционированный гепарин (НФГ) был обеднен пентасахаридами посредством
аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным антитромбином. Не связавшаяся с колонкой фракция содержала гепарин, обедненный пентасахаридами (НАМ).
Нефракционированный гепарин десульфировали в соответствии со способом, описанным Yuko Inoue and Kinzo Nagasawa, Carbohydrate Research (1976) 46: 87-95.
Десульфированный гепарин (ДС), НФГ и НАМ тестировали в анализе эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП) для определения их антикоагулянтной активности (Фигура 2). Мы пришли к выводу, что десульфирование, так же как и удаление пентасахаридов, почти полностью устраняет антикоагулянтную активность НФГ, по меньшей мере до степени ниже 10% от исходной активности НФГ.
Пример 5. Нейтрализация цитотоксичности гистона НЗ.
ДС, НФГ и НАМ тестировали в анализе цитотоксичности гистона НЗ, как описано Wildhagen et al. (Blood 2014; 123:1098-1101), для определения их защитной активности против цитотоксичности гистона НЗ (Фигура 3). Отмечалось, что защитный эффект против цитотоксичности гистона НЗ сохранялся во фракции НАМ (100% от активности нефракционированного гепарина (Фигура 3), в то время как десульфированный гепарин показал значительное снижение (более 50%) защитного эффекта, по сравнению с нефракционированным гепарином. Мы пришли к выводу, что НФГ и НАМ нейтрализуют цитотоксическую активность гистона НЗ в одинаковой степени, в то время как десульфирование гепарина (ДС) приводит к потере способности к нейтрализации цитотоксической активности гистона НЗ.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Гепарин, обедненный пентасахаридами, для применения в профилактике, облегчении или уменьшении недостаточности трансплантата после трансплантации у реципиента.
2. Гепарин, обедненный пентасахаридами, по п.1, где трансплантат является органом или тканью.
3. Гепарин, обедненный пентасахаридами, по п.2, где орган является кожей, сердцем, печенью, легким, поджелудочной железой, тонкой кишкой или почкой.
4. Гепарин, обедненный пентасахаридами, по любому из п.п. 1-3, полученный посредством аффинной хроматографии.
5. Гепарин, обедненный пентасахаридами, по п.4, где аффинную хроматографию проводят с применением иммобилизованного антитромбина.
1.
1.
Контроль НФГ ДС НАМ
Фиг. 2
¦ <он~:эаль Ги-ггс-н/. Гисп> i-; Г;IC~OH Гцс-онм
- НФГ - ЛС ~ НАМ
Фиг. 3
(19)
1/3
2/3