|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Предлагаемая группа изобретений относится к области медицины, а именно к диагностике, и может быть использована для диагностики онкологических заболеваний. Биочип для мультиплексного анализа, содержит прозрачную подложку из стекла, на которую нанесено покрытие, создающее положительный заряд на поверхности стекла, в тестовые ячейки внесены антитела, конъюгированные с флуоресцентными метками Cy-3, и реагент, препятствующий высыханию. Рабочая поверхность биочипа покрыта воздухонепроницаемой стерильной пленкой. Предварительная подготовка клеток из серозной жидкости, клеток из геморрагической жидкости или клеток мочи с осадком включает центрифугирование, удаление надосадочной жидкости и ресуспензирование осадка с питательной средой, при исследовании взвеси клеток, полученных из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клеток, полученных из соскоба с резецированной опухоли до ее помещения в формалин, пунктат помещают в пробирку Эппендорфа объемом 0,8 мл с питательной средой, проводят центрифугирование в течение 5 мин при скорости 1500 об/мин и внесение осадка в тестовые ячейки биочипа, после этого биочип с внесенными клетками различного биоматериала помещают в шейкер на 2-3 мин, затем в термостат на 25 мин при температуре 37°C. После чего ополаскивают биочип в буферном растворе, высушивают на воздухе и проводят флуоресцентный анализ. Предлагаемая группа изобретений позволяет расширить возможности диагностики за счет возможности анализа большого перечня клеточного материала.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Предлагаемая группа изобретений относится к области медицины, а именно к диагностике, и может быть использована для диагностики онкологических заболеваний. Биочип для мультиплексного анализа, содержит прозрачную подложку из стекла, на которую нанесено покрытие, создающее положительный заряд на поверхности стекла, в тестовые ячейки внесены антитела, конъюгированные с флуоресцентными метками Cy-3, и реагент, препятствующий высыханию. Рабочая поверхность биочипа покрыта воздухонепроницаемой стерильной пленкой. Предварительная подготовка клеток из серозной жидкости, клеток из геморрагической жидкости или клеток мочи с осадком включает центрифугирование, удаление надосадочной жидкости и ресуспензирование осадка с питательной средой, при исследовании взвеси клеток, полученных из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клеток, полученных из соскоба с резецированной опухоли до ее помещения в формалин, пунктат помещают в пробирку Эппендорфа объемом 0,8 мл с питательной средой, проводят центрифугирование в течение 5 мин при скорости 1500 об/мин и внесение осадка в тестовые ячейки биочипа, после этого биочип с внесенными клетками различного биоматериала помещают в шейкер на 2-3 мин, затем в термостат на 25 мин при температуре 37°C. После чего ополаскивают биочип в буферном растворе, высушивают на воздухе и проводят флуоресцентный анализ. Предлагаемая группа изобретений позволяет расширить возможности диагностики за счет возможности анализа большого перечня клеточного материала.
(12) МЕЖДУНАРОДНАЯ ЗАЯВКА , ОПУБЛИКОВАННАЯ В СООТВЕТСТВИИ С ДОГОВОРОМ О ПАТЕНТНОЙ КООПЕРАЦИИ (РСТ )
(19) Всемирная Организация Интеллектуальной Собственности
Международное бюро (10) Номер международной публикации
Дата международной публикации WO 2017/204674 А1
30 ноября 2017 (30.11.2017) W IP О I РСТ
(51) Международная патентная классификация : Novgorod (RU). РАЧКОВ , Виктор Владимирович
G01N21/78 (2006.0 1) С12М 3/00 (2006.0 1) (RACHKOV, Victor Vladimir ovich); ул. Соревнования
(21) Номер международной заявки : PCT/RU2016/0003 17
1, к в .28, Нижний Новгород , 603000, Nizhny Novgorod
(RU). УТКИН , Олег Владимирович (UTKIN, Oleg
(22) Дата международной подачи : Vladimir ovich); ул. Вологдина ,5, к в .12, Нижний Нов -
26 мая 2016 (26.05.2016) город , 603009, Nizhniy Novgorod (RU). САВОСТИ -
(25) Язык подачи : Русский
КОВА , Марина Владимировна (SAVOSTIKOVA,
Marina Vladimirovna); Нагатинская наб 62/2, к в .15,
(26) Язык публикации : Русский Москва , 115407, Moscow (RU). ФУРМИНСКАЯ , Еле -
(71) Заявитель : ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕН -
НОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ НАУЧНО -ПРО -
ИЗВОДСТВЕННОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ "БИО -
ЧИП " (OBSHCHESTVO S OGRANICHENNOI (74) Агент : ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТ -
OTVETSTVENNOSTYU NAUCHNO- СТВЕННОСТЬЮ ПАТЕНТНО -ПРАВОВАЯ ФИР -
PROIZVODSTVENNOE PREDPRIYATIE М А "ПЕТУХОВ И ПАРТНЕРЫ " (OBSHCHESTVO
"BIOCHIP") [RU/RU]; ул. Соревнования ,1-2, Нижний S OGRANICHENNOI OTVETSTVENNOSTYU
Новгород , 603000, Nizhny Novgorod (RU). PATENTNO-PRAVOVAYA FIRMA "PETUKHOV I
PARTNERY"); а/я 15, Нижний Новгород , 603106,
(72) Изобретатели : ЗИНОВЬЕВ , Святослав Владимиро - Nizhniy Novgorod (RU).
вич (ZINOVIEV, Svyatoslav Vladimirovich); ул. М и-
нина , 5, кв. 13, Нижний Новгород , 603005, Nizhniy
(54) Title: A BIOCHIP FOR MULTIPLEX ANALYSIS AND A METHOD OF STUDYING CELLS IN THE DIAGNOSIS OF ONCOLOGICAL DISEASES
(54) Название изобретения : БИОЧИП ДЛЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА И СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
(57) Abstract: The proposed group of inventions relates to the field of medicine, and more particularly to diagnostics, and may be used for the diagnosis of oncological diseases. A biochip for multiplex analysis comprises a clear glass substrate, onto which a coating has been applied that creates a positive charge on the surface of the glass, and antibodies conjugated with Cy-3 fluorescent markers and an anti-drying reagent are inserted into the test wells. The working surface of the biochip is coated with an airtight sterile film. Cells from serous fluid, cells from hemorrhagic fluid, or cells from urine with a precipitate are pretreated by centrifuging, removing the supernatant, and resuspending the precipitate in a nutrient medium; when studying a suspension of cells obtained by fine needle aspiration biopsy or cells obtained from scrapings from a resected tumour before the tumour is placed in formalin, the biopsy specimen is placed in a 0.8-ml Eppendorf tube with a nutrient medium; the sample is centrifuged for 5 minutes at 1500 rpm, and the precipitate is inserted into the test wells of the biochip, after which the biochip with the inserted cells of heterogeneous biomaterial is placed in a shaker for 2-3 minutes and then in an incubator at 37 °C for 25 minutes, after which the biochip is rinsed in buffer solution, air-dried, and subjected to fluorescence analysis. The proposed group of inventions makes it possible to broaden the possibilities for diagnosis by making it possible to analyse an extensive list of cellular material.
(57) Реферат : Предлагаемая группа изобретений относится к области медицины , а именно к диагностике и может быть использована для диагностики онкологических заболеваний . Биочип для мультиплексного анализа , содержит прозрачную под -ложку из стекла , на которую нанесено покрытие , создающее положительный заряд на поверхности стекла , в тестовые ячей -к и внесены антитела , конъюгированные с флуоресцентными метками Су -3, и реагент , препятствующий высыханию . Рабочая
поверхность биочипа покрыта воздухонепроницаемой стерильной пленкой . Предварительная подготовка клеток из серозной
т-f в формалин , пунктат помещают в пробирку Эппендорфа объемом 0,8 мл с питательной средой , проводят центрифугирование в течение 5 минут при скорости 1500 об/мин и внесение осадка в тестовые ячейки биочипа , после этого биочип с внесенны -ми клетками различного биоматериала помещают в шейкер на 2-3 минуты , затем в термостат на 25 минут при температуре t 37 °С После чего ополаскивают биочип в буферном растворе , высушивают на воздухе и проводят флуоресцентный анализ о Предлагаемая группа изобретений позволяет расширить возможности диагностики за счет возможности анализа большого перечня клеточного материала .
жидкости , клеток и з геморрагической жидкости или клеток мочи с осадком включает центрифугирование , удаление надоса -дочной жидкости и ресуспензирование осадка с питательной средой , при исследовании взвеси клеток , полученных из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клеток , полученных из соскоба с резецированной опухоли до ее помещения
[продолжение на следующей странице J
WO 2017/204674 л 1||iii^|l^hll1fliilll|i^||1flii||lll|||N|Hi!^||ii|H|ii
(81) Указанные государства (если не указано иначе, для каждого вида национальной охраны) : АЕ ,AG, AL,AM, АО, AT,AU, AZ, BA,BB, BG, BH, BN, BR, BW,BY,BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IR, IS, JP, KE, KG, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, О М , PA, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS, RU, RW, SA, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW.
(84) Указанные государства (если не указано иначе, для каждого вида региональной охраны) : ARIPO (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, SD, SL, ST, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), евразийский (AM, AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM), европейский патент (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR), OAPI (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, KM, ML, MR, NE, SN, TD, TG).
Декларации в соответствии с правилом 4.17:
- касающаяся права заявителя надавать заявку на патент и получать его (правило 4.1 7 (г))
- об авторстве изобретения (правило 4.17 (iv))
Опубликована :
- с отчётом о международном поиске (статья 21.3)
НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ : БИОЧИП ДЛЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА И СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
5 ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Предлагаемая группа изобретений относится к области медицины , а именно к диагностике и может быть использована для диагностики онкологических заболеваний . Кроме того , предлагаемая группа изобретений может быть использована в ветеринарии , а также в области биологии , иммунологии и цитологии .
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Биочип - один из новейших инструментов биологии и медицины 21 века, используя минимум материала и минимум времени для исследования он позволяет определять множество различной и достоверной информации , например , о различных
генетических дефектах , онкогенах , аллергенах . Биочипы позволяют обнаружить в организме человека маркеры , соответствующие конкретным заболеваниям , определенным вирусам и раковым клеткам практически в любом анализируемом материале - кровь , слюна , пот .
Широкие диагностические возможности биочипов обуславливают актуальность
разработки и х новых видов .
Выпускаемые в настоящее время биочипы отличаются друг от друга п о методике изготовления , виду подложки и зонда , методу регистрации результата взаимодействия реагента с исследуемым образцом . Для считывания результатов реакции используются флуоресцентные метки , лазеры и оптические сканеры .
В настоящее время известны следующие виды биочипов :
- ДНК -биочипы , используемые для идентификации генов и их мутаций , связанных с различными заболеваниями , диагностики инфекционных болезней , скрининга микроорганизмов ;
- белковые чипы , которые используют для обнаружения белковых маркеров ,
характерных для различных заболеваний на разных стадиях их развития ;
- клеточные чипы , позволяющие избежать проблемы нестабильности белков в белковых чипах и проводить более точный анализ взаимодействия белков внутри клетки , визуализация самой клетки и ее органелл ;
-
- тканевые чипы , позволяющие проводить анализ тысяч образцов тканей на одном предметном стекле и использующиеся для определения содержания белков в здоровых и патологически измененных тканях и оценки потенциальных мишеней для лекарственных препаратов ;
- микрочипы на основе малых молекул , которые позволяют проводить одновременный скрининг тысяч потенциальных лекарственных средств ;
- микрофлюидальные чипы - многофункциональное устройство для обмена , между компонентами которого используются электроды и микрожидкости .
Известна группа биочипов , содержащих твердый носитель , на рабочей зоне
которого в форме кластеров иммобилизованы олигонуклеотидные зоны и идентификатор : патент РФ на полезную модель № 69866 (МПК C12Q1/68, дата публикации 10.01.2008), патент РФ на изобретение № 2270254 (МПК C12Q1/68, дата публикации 20.02.2006), патент РФ на изобретение № 2436843 (МПК C12Q1/00, дата публикации 27.12.2008).
Другая группа биочипов представляет собой твердую подложку , выполненную из
стекла (патент РФ на полезную модель № 141359, МПК G01N33/552, дата публикации 28.1 1.2013) с нанесенным н а его поверхность покрытием , например и з халькогенидного стекла (там же) или и з полилизина (патент РФ н а полезную модель N 142470, МПК G01N 33/53, дата публикации 27.06.2014) или полимерным рабочим слоем (патент РФ н а изобретение №> 2298797, МПК G01N33/531, дата публикации 10.05.2007). На покрытии
размещены тестовые участки подложки с иммобилизованными антителами , специфичными к поверхностным антигенам клеток .
В качестве ближайшего аналога предлагаемого биочипа выбран известный биочип для мультиплексного анализа , содержащий прозрачную подложку и з стекла , разделенную
н а функциональную и рабочую части , функциональная часть служит для фиксации
биочипа в руках , рабочая часть имеет покрытие и разделена н а тестовые ячейки
посредством решетки и з пластика , каждая тестовая ячейка снабжена иммобилизованными флуоресцентными антителами , специфичными к антигенам клеток , биочип содержит
пленку , закрепленную поверх решетки (патент РФ н а полезную модель N 142470, МПК G01N 33/53, дата публикации 27.06.2014).
Известный биочип содержит прозрачную подложку , выполненную и з стекла с нанесенным н а его рабочую поверхность полилизином , биочип разделен н а 9 равных ячеек посредством решетки и з пластика . В каждой ячейке содержатся флуоресцентные антитела (0,01 мкл ). Для исследований используют тестовые участки с антителами к рецепторам эстрогена , рецепторам прогестерона , рецепторам С А-125, рецепторам РЭА ,
рецепторам СК 7, рецепторам СК 20, рецепторам Вег-ЕР4, рецепторам TTF1 и рецепторам WT1. Для сохранения антител во влажной среде в каждую ячейку добавлен реагент PBS в количестве 0,1 мкл . Биочип покрыт сверху гидрофобной пленкой , фиксированной к верхнему краю пластиковой решетки , создающей герметичные ячейки , ограниченные
снизу подложкой с покрытием , сверху - пленкой , с остальных сторон - пластиковыми стенками решетки , которая также препятствует транзиту антител и з одной ячейки в другую . Биочип хранится в темном месте для исключения выцветания метки . Известный биочип работает следующим образом .
Биочип достают из непрозрачного контейнера . Готовят биоматериал для исследования . С рабочей поверхности биочипа снимают защитную гидрофобную пленку , после чего незамедлительно производят инсталляцию исследуемой биожидкости в тестовые ячейки . Затем биочип ставят на нагревательный столик при температуре 37 °С и закрывают непрозрачной крышкой , для исключения попадания света , н а 30 минут . Далее биочип помещают н а предметное стекло флуоресцентного микроскопа и проводят анализ 15 флуоресценции в каждой из ячеек . После проведения исследования производят фиксацию клеток . Далее производят окраску для последующего морфологического исследования клеток .
Известный биочип позволяет исследовать серозную жидкость , жидкость с менее богатым , чем кровь клеточным составом , и определить характер асцита (реактивный или
онкологический ).
Однако , известный биочип имеет следующие недостатки :
- известное устройство обеспечивает возможность исследования клеток , содержащихся в серозных жидкостях . Однако , на сегодняшний день известно , что не только серозные выпоты являются часто встречающимся симптомом заболеваний как воспалительного характера (острый панкреатит , цирроз печени , гепатиты и других ), так и онкологических (рак яичника , рак печени , рак поджелудочной железы , рак прямой кишки
и другие ) заболеваний . Уникальной диагностической информацией обладают клетки геморрагической жидкости , клетки мочи , клетки , полученные методом тонкоигольной
аспирационной пункционной биопсии , а также соскобы с резецированной солидной
30 опухоли до ее фиксации в формалине . Однако , известный биочип не обеспечивает возможности исследования вышеуказанных клеток ;
- полилизиновое покрытие подложки способствует сорбции как антител , так и клеток , что препятствует полноценному связыванию антител с клетками , также
-
невозможно провести анализ реакции в пятне куда были нанесены антитела , так как свечение вокруг клеток носит фоновый , а не специфический характер ;
- флуоресцентная метка FITC, используемая в известном устройстве , является не достаточно стабильной , что влияет на длительность хранения биочипа ;
5 - пластиковая решетка , прикрепленная к биочипу , не позволяет проводить анализ
на микроскопе при увеличении более 200 вследствие невозможности приближения
объектива максимально близко к дну ячейки . Кроме того , пластиковая решетка
прикреплена к подложке с помощью полиакрилатного клея , что может способствовать
преждевременной денатурации антител за счет токсических эффектов клея ;
10 - антитела находятся в ячейках в растворе PBS, что не дает возможности
длительного хранения по двум причинам : преждевременный рост микроорганизмов и естественная сорбция антител к дну и стенкам ячейки ;
- защитная пленка не является стерильной , что представляет дополнительный фактор риска роста микроорганизмов и порчи белковой составляющей (антител );
- известный биочип обеспечивает возможность исследования ограниченного
количества маркеров (9-ти), что не всегда достаточно для нужд медицинских
исследований .
Известен способ исследования клеток при диагностике онкологических заболеваний с помощью известного биочипа , включающий предварительную подготовку
клеток , полученных из серозной жидкости , помещение исследуемого материала в ячейки биочипа , проведение флуоресцентного анализа и последующее исследование наличия и детекции флуоресценции в каждой тестовой ячейке , при этом на этапе предварительной подготовки серозную жидкость центрифугируют в течение 5 минут при скорости 2000 об/мин , выбранный в качестве ближайшего аналога (патент РФ на полезную модель №
142470, МПК G01N 33/53, дата публикации 27.06.2014).
Известный способ с помощью известного биочипа осуществляют следующим
образом .
Забирают серозную жидкость несколькими рутинными способами (интраоперационно в стерильный шприц в количестве не менее 2 мл, при пункции
трансвагинально , трансабдоминально в стерильный шприц ). Затем материал помещают в пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при скорости 2000 оборотов в минуту .
Надосадочную жидкость удаляют , осадок микропипеткой вносят в ячейки биочипа в количестве 0,2 м л. Исследуют количество окрашенных клеток и яркость флуоресценции .
После чего производят фиксацию клеток и их последующую окраску гематоксилином Майера и проводят морфометрическое исследование .
Однако известный способ имеет следующие недостатки .
Известный способ не обеспечивает возможности исследовать другие
биологические клеточные материалы , такие как клетки геморрагической жидкости , клетки в моче , клетки из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клетки из соскобов резецированных солидных опухолей до фиксации опухоли в формалине , что сужает диагностические возможности способа .
10 РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей предлагаемой группы изобретений является создание биочипа для мультиплексного анализа и способа исследования клеток для диагностики онкологических заболеваний с помощью биочипа для мультиплексного анализа , которые лишены недостатков прототипа .
Технический результат от использования предлагаемого биочипа заключается в обеспечении возможности анализа клеток геморрагической жидкости , клеток мочи , клеток из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клеток , полученных из соскобов резецированной солидной опухоли , повышении надежности работы биочипа и увеличении срок его годности .
20 Технический результат предлагаемого способа заключается в повышении точности ,
специфичности и чувствительности исследования , а также в расширении диагностических
возможностей .
Указанный технический результат достигается тем, что в предлагаемом биочипе для мультиплексного анализа , содержащем прозрачную подложку из стекла , разделенную
25 на функциональную и рабочую части , функциональная часть служит для фиксации биочипа в руках , рабочая часть имеет покрытие и разделена на тестовые ячейки посредством решетки из пластика , каждая тестовая ячейка снабжена иммобилизованными флуоресцентными антителами , специфичными к антигенам клеток , биочип содержит пленку , закрепленную поверх решетки , на подложку рабочей части нанесено покрытие ,
30 создающее положительный заряд на поверхности стекла , в тестовые ячейки внесены антитела , конъюгированные с флуоресцентной меткой Су-3 и реагент , препятствующий высыханию внесенных антител , рабочая поверхность биочипа покрыта воздухонепроницаемой стерильной пленкой , функциональная часть биочипа снабжена информацией о локализации внесенных антитела .
Указанный технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе исследования клеток для диагностики онкологических заболеваний с помощью биочипа для мультиплексного анализа , включающим предварительную подготовку клеток , полученных из серозной жидкости , помещение исследуемого материала в ячейки биочипа , 5 проведение флуоресцентного анализа и последующее исследование наличия и детекции флуоресценции в каждой ячейке , при этом на этапе предварительной подготовки серозную жидкость центрифугируют в течение 5 минут при скорости 2000 об/мин , клетками исследования являются клетки геморрагической жидкости , клетки в моче , клетки , полученные из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клетки , 10 полученные из соскобов резецированной солидной опухоли до ее фиксации в формалине , при этом предварительная подготовка клеток из мутной серозной жидкости ,
геморрагической жидкости и клеток мочи с осадком включает центрифугирование в
объеме не более 20 мл, последующее удаление надосадочной жидкости и ресуспензирование осадка с питательной средой , при исследовании клеток из материала
15 тонкоигольной аспирационной биопсии и клеток , полученных из соскобов с резецированной опухоли до ее фиксации в формалине , пунктат помещают в пробирку Эппендорфа объемом 0,8 мл с питательной средой , проводят центрифугирование в течение 5 минут при скорости 1500 об/мин и внесение в тестовые ячейки биочипа , далее биочип с внесенными клетками помещают в шейкер на 2-3 минуты , затем помещают в
20 термостат на 25 минут при температуре 37 °С, после чего биочип ополаскивают в буферном растворе , высушивают и проводят флуоресцентный анализ .
Предлагаемая группа изобретений отвечает критерию "новизна ", так как проведенные патентно -информационные исследования н е выявили источников
информации , которые бы порочили новизну предлагаемого способа и устройства , равно
как и технических решений с существенными признаками предлагаемых технических решений , что позволяет сделать вывод о соответствии критерию "изобретательский уровень ".
Предлагаемый биочип представляет собой подложку размерами 25,4 х76,2 мм, толщиной 1 мм. До начала работы биочип хранят в непрозрачном контейнере . Время нахождения н а свету н е должно превышать 20 минут до начала постановки реакции .
Следует избегать попадания прямых солнечных лучей н а изделие вне контейнера . Перед
началом работы с поверхности биочипа снимают воздухонепроницаемую стерильную пленку .
Предлагаемый биочип обеспечивает возможность анализа клеток геморрагической жидкости , клеток мочи , клеток , полученных из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клеток , поученных из соскобов с солидных опухолей . Выполнение подложки с покрытием , создающим положительный заряд на поверхности стекла , позволяет 5 проводить селективную сорбцию клеток за счет отрицательного заряда мембраны последних , при этом препятствует сорбции антител за счет положительного заряда последних . В предлагаемые ячейки можно сорбировать антитела к любым антигенам опухоли . Возможность селективного связывания антитела с клеткой , а клетки с подложкой , исключающей неспецифическое осаждение антител на подложку , позволяет 10 сократить время на исполнение анализа и повысить специфичность и надежность работы
биочипа .
Внесение в тестовые ячейки антител , конъюгированных с флуоресцентной меткой , например СуЗ ,позволяет сохранить свечение ячеек до 2 месяцев .
Добавление реагента в каждую тестовую ячейку , содержащего , например , PBS, 15 БСА и 0,06% азида натрия позволяет продлить работоспособность биочипа (более 1 года), так как препятствует высыханию капель антител за счет формирования защитной оболочки н а молекулярном уровне , а также препятствует размножению микроорганизмов .
Покрытие биочипа воздухонепроницаемой стерильной пленкой также препятствует
размножению микроорганизмов .
Предлагаемый способ позволяет :
- Расширить диагностические возможности способа , за счет получения новой , диагностически значимой информацию о процессах , происходящих в организме в целом и
в конкретной области исследования .
- Обеспечить возможность исследования клеток геморрагических жидкостей ,
клеток мочи , клеток и з пунктата тонкоигольной аспирационной биопсии , клеток и з соскобов резецированной солидной опухоли до ее фиксации в формалине . - Помещение клеток , полученных и з материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клеток , полученных и з соскобов с резецированной солидной опухоли до ее помещения в
формалин в питательную среду , внесение клеток в тестовые ячейки биочипа , дополнительное перемешивание н а шейкере и последующее нагревание биочипа с внесенными в ячейки клетками в термостате позволяет повысить взаимодействие антигенов с антителами , что повышает чувствительность способа . Повышение чувствительности происходит также за счет возможности создания более яркого и
стойкого сигнала и длительного эффекта свечения маркеров , имеющих различную локализацию : ядерные , мембранные цитоплазматические в общем количестве до 30-ти.
- Проведение флуоресцентного анализа после ополаскивания биочипа в Трис -буфере позволяет отмыть несвязавшиеся антитела , что повышает точность диагностики .
Высокая специфичность способа обусловлена селективностью связи антител с антигенами клеток без фонового свечения .
В результате работы создано простое в использовании устройство , позволяющее одномоментно проводить анализ сразу 30 маркеров клеток , с возможностью оценки связи морфологии клетки и свечения , взаимосвязи антигена и клетки , его локализации , 10 качественной характеристики . Использование вышеуказанных реагентов для анализа обеспечивает возможность длительного ретроспективного исследования
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предлагаемая группа изобретений работает следующим образом .
Подготавливают биоматериала в виде взвеси клеток для исследования . Серозную жидкость забирают несколькими рутинными способами (интраоперационно в стерильный
шприц в количестве н е менее 2 м л, при пункции трансвагинально , трансабдоминально в
стерильный шприц ). Затем серозную жидкость помещают в пробирку и центрифугируют в
течение 5 минут при скорости 2000 об/мин . Удаляют надосадочную жидкость , взвесь
клеток в объеме не более 0,7-1 мл микропипеткой вносят в ячейки биочипа .
Мутную с осадком серозную жидкость , берут не более 20 мл (две центрифужные пробирки ) и , после центрифугирования , надосадочную жидкость аккуратно удаляют пипеткой , доводя до объема 0,7-1 м л и ресуспендируют , получая концентрированную
взвесь клеток . Полученную клеточную взвесь центрифугируют и осадок пипеткой вносят в ячейки биочипа .
Геморрагическую жидкость забирают с помощью пункции , центрифугируют в большом количестве (по 6-8) центрифужных пробирок емкостью 10 мл, далее над осадочные жидкости сливают , осадок ресуспензируют и объединяют в одну пробирку .
Если собранная взвесь клеток превышает объем более 1м л, еще раз центрифугируют и
пипеткой аккуратно удаляют лишнюю жидкость , доводя объем до 0,7-1 м л, ресуспензируют , получая концентрированную взвесь клеток в жидкости и вносят мерными микропипетками материал п о в ячейки биочипа .
Взвесь клеток и з материала тонкоигольной аспирационной биопсии помещают в
пробирку Эппендорфа с питательной средой объемом 0,8 мл. Накрывают пробирку
крышкой и тщательно перемешивают на шейкере , центрифугируют 5 минут при скорости 1500 об/мин , затем вносят мерными микропипетками материал в ячейки биочипа .
Для исследования солидных опухолей выполняют следующее . После получения
резецированной опухоли , до ее фиксации формальдегидом , опухолевое образование
рассекают и производят соскоб с его поверхности шпателем или краем стекла . Полученный соскоб помещают в пробирку Эппендорфа объемом 0,8 мл, содержащую питательную среду . Затем , закрыв пробирку крышечкой , взвесь тщательно перемешивают н а шейкере и центрифугируют 5 минут при скорости 1500 об/мин , после чего вносят мерными микропипетками материал в ячейки чипа .
Внесенный биоматериал , аккуратно ресуспензируют слегка касаясь пипеткой дна
для лучшего растворения антител и взаимодействия их с клетками опухоли . Затем биочип
накрывают воздухонепроницаемой стерильной пленкой и помещаю н а шейкер н а 2-3
минуты для лучшего растворения антител и взаимодействия и х с клетками опухоли . После чего помещают в термостат или в гибридайзер н а 25 минут при температуре 37 °С . П о истечении указанного времени , соблюдая режим темноты , легким движением чип ополаскивают в стаканчике с Трис -буфером и дают высохнуть . Проводят исследование
под флуоресцентным микроскопом . Проводят анализ флуоресценции в каждой и з ячеек п о
следующим параметрам : количество флуоресцентно окрашенных клеток и яркость
флуоресценции . После проведения флуоресцентного исследования выполняют фиксацию
20 клеток и окраску по Лейшману . Проводят морфологическое исследование клеток . Результаты флуоресцентного анализа и морфометрического сопоставляют . Если свечения н е отмечено , биочип окрашивают п о Лейшману и проводят цитологическое исследование , оценивают клеточность и морфологию клеток . После проведенного анализа , чип заворачивают в фольгу и помещают в холодильник при -2-8 °С .
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Примеры конкретного осуществления даны в виде протоколов исследования .
Протокол 1
Пациентка А . 57 лет, поступила в стационар с подозрение н а рак яичников , асцит . Пациентке в условиях поликлиники стерильным шприцом была выполнена пункция заднего свода влагалища . Было получено 20 м л светлой жидкости , соломенного цвета .
Исследуемую жидкость поместили в пробирку объемом 20 м л и центрифугировали в
течение 5 мин при 2000 об/мин . Затем серозную жидкость без осадка и каких -либо включений центрифугировали в большом количестве (по 4-5) центрифужных пробирок
емкостью 4 мл, далее надосадочную жидкость сливали , осадки ресуспензировали и объединяли в одну пробирку . Полученную клеточную взвесь тщательно перемешали на шейкере .
Для исследования был применен биочип для исследования серозных жидкостей . В 5 исследовании были использованы следующие виды антител : ячейка 1 маркер СА -125, ячейка 2-РЭА , ячейка 3-СК 7, ячейка 4-СК 20, ячейка 5- РЭ, ячейки 6 - TTF, ячейка 7-WT1, ячейка 8- Ерсаш 4, ячейка 9- виментин , ячейка 10- Cdx2.
С поверхности сняли воздухонепроницаемую стерильную пленку и внесли биоматериал взвеси клеток в каждую ячейку мерной пипеткой . Затем биочип вновь 10 накрыли пленкой и поставили нашейкер , инкубировали в термостате в полной темноте 30 минут при температуре 37 °С. Далее проводили отмывку биочипа в буферном растворе . Лишнюю влагу удалили фильтровальной бумагой . Затем решетку снимали и проводили исследование под флуоресцентным микроскопом . Выявлено свечение в комплексах клеток расположенных в ячейках : 1 - ярко выраженное свечение , 8 - ярко выраженное свечение , 3 - умеренно выраженное свечение . В остальных ячейках свечение н е выявлено .
Результат исследования : н а биочипе - иммунофенотип соответствует раку яичников .
Заключение исследователя : асцитическая жидкость содержит комплексы аденокарциномы
яичника .
После оценки флуоресценции биочип окрасили п о Лейшману , проведена
морфологическая оценка клеток в каждой ячейке .
Протокол окраски по Лейшману : Мазок высушен на воздухе . Зафиксирован в
фиксаторе -красителе Лейшмана в течение 3 минут , промыт водой . Произведена окраска
40 мл 0,1 % красителя азур II, 30 мл 0,1 % воднорастворимого эозина , 70 мл дистиллированной воды . Смесь красителей готовят перед работой (extempore).
Морфологическое заключение : во всех ячейках комплексы клеток
аденокарциномы .
Пациентка госпитализирована , выполнена операция экстирпации матки с придатками . Оментэктомия . Биопсия брюшины . Результат нистологического исследования :серозная аденокарцинома яичника . Диагноз - рак яичника Ш с стадии
Протокол 2
Пациентка И .38 лет. Выявлено новообразование молочной железы . Выполнена пункция . Цитологическое исследование : аденогенный рак. Выполнено оперативное
вмешательство в объеме секторальной резекции с подмышечной лимфоаденэктомией .
Материал был отобран для исследования на биочипе ЕРН (рак молочной железы ). В
номерах ячеек 1, 6, 11 внесены антитела к рецепторам эстрогена , в номерах ячеек 2,7,12 антителя к рецепторам прогестерона , в номерах ячеек 3,8,13 внесены антитела Her2-neu, в номера ячеек 4,9,14 внесены антитела Ki67, в номера ячеек 5,10,15 внесены антитела EGFR. Для сохранения антител во влажной среде добавлен реагент PBS, азид натрия 0,06 5 %,БСА .
После получения резецированной опухоли до ее фиксации формальдегидом , опухолевый узел был рассечен и произведен соскоб шпателем с поверхности образования . Полученный соскоб помещен в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл с питательной средой . Затем, закрыв пробирку крышечкой , взвесь центрифугировали 5 минут при 1500 10 об/мин . С поверхности биочипа удалили защитную пленку и внесли материал взвеси клеток в каждую ячейку мерной пипеткой .
Так же выборочно взяты и рассечены 2 лимфоузла , произведены соскобы с поверхности каждого лимфоузла . Каждый соскоб был помещен в свою пробирку объемом
1,5 м л с питательной средой . Затем , закрыв пробирку крышечкой , взвесь
центрифугировали со скоростью 1500 об/мин в течение 5 минут . С поверхности биочипа удалили защитную пленку и внесли материал взвеси клеток в каждую ячейку мерной
пипеткой .
Материал опухоли в ячейки :1,2, 3,4, 5. Материал лимфоузла № 1 - 6,7,8,9,10 Материал лимфоузла 2 - 11,12,13,14,15
Затем биочип накрыт снятой пленкой и помещен н а шейкер н а 5 минут . Затем
помещен в термостат н а 30 минут при температуре 37° С . Проведена отмывка в буфере .
Лишнюю влагу удалили фильтровальной бумагой . Затем была снята решетка и проведено
исследование под флуоресцентным микроскопом .
25 Заключение на биочипе :
Опухоль имеет следующий фенотип :
Рецепторы эстрогена : отрицательные .
Рецепторы прогестерона : отрицательные .
Рецепторы Her2-neu : 3+ (выраженное )
30 Ki67 - более 30 % (2 балла)
Рецепторы EGFR: 1+ (слабо выраженное )
Лимфоузел №1 имеет следующий фенотип :
Рецепторы эстрогена : отрицательные .
Рецепторы прогестерона : отрицательные .
Рецепторы Her2-neu : 3+ (выраженное )
Ki67 - более 30 % (2 балла)
Рецепторы EGFR: 1+ (слабо выраженное )
Лимфоузел № 2 имеет следующий фенотип :
Рецепторы эстрогена : отрицательные . Рецепторы прогестерона : отрицательные .
Рецепторы Her2-neu : 3+ (выраженное )
Ю67 - более 30 % (2 балла ) Рецепторы EGFR: 0 (отрицательное )
Заключение исследователя : рак молочной железы Her2-neu: 3+, рецепторы эстрогена 0 баллов , рецепторы прогестерона 0 баллов , Ю67-более 30 % клеток , рецепторы EGFR-1 балл .
Протокол окраски по Лейшману .
Морфологическое заключение : в о всех ячейках комплексы клеток аденокарциномы
молочной железы
Результат планового гистологического исследования : инвазивная карцинома
молочной железы скирозного строения . В лимфоузлах метастазы аденокарциномы .
Результат иммуногистохимии : рак молочной железы Her2-neu : 3+, рецепторы
эстрогена 0 баллов , рецепторы прогестерона 0 баллов , К 67-более 30% клеток , рецепторы
EGFR-1 балл .
Пациентке выставлен диагноз рак молочной железы III стадии .
Протокол № 3
Пациент Д .69 лет . Взята моча на цитологический анализ . При цитологии выявлены
комплексы атипических клеток . Больной сдал анализ мочи повторно . В лабораторию
25 доставлена моча , соломенно -желтого цвета объемом 50 мл. Исследуемую жидкость
поместили в пробирки объемом 20 м л и центрифугировали в течение 5 минут при скорости 2000 об/мин . Затем мочу центрифугировали в большом количестве (п о 4-5)
центрифужных пробирок емкостью в 4 м л, после чего надосадочные жидкости слили ,
осадок ресуспензировали и объединили в одну пробирку .
30 Для исследования использован биочип NPV (урогенитальный тракт ). В тестовых
ячейках биочипа размещены антитела конъюгированные с СуЗ к рецепторам р 16 - ячейка 1, к рецепторам Ki67 - ячейка 2, к рецепторам р 63 - ячейка 3, к рецепторам цитокератины 5/6 - ячейка 4, цитокератин 7 - ячейка 5, цитокератин 20 - ячейка 6, СА 125 - ячейка 7,
WO 2017/204674 PCT/RU2016/000317
WT1 - ячейка 8, уроплакин - ячейка 9, CD 95 ячейка 10, Cdx2 - ячейка 11. Для сохранения антител во влажной среде добавлен реагент PBS, азид натрия 0,06 %, БСА .
С поверхности биочипа удалена воздухонепроницаемая стерильная пленка , в каждую ячейку мерной пипеткой внесен исследуемый материал - взвеси клеток мочи . 5 Затем биочип накрыли снятой пленкой . Обработали в течение 5 минут на шейкере . Инкубировали в термостате в полной темноте 30 минут при температуре 37 °С. Далее проведена отмывка в буфере. Лишнюю влагу удалили фильтровальной бумагой . Затем сняли решетку и провели исследование под флуоресцентным микроскопом . При оценки под флуоресцентным микроскопом выявлено свечение в комплексах клеток расположенных в ячейках : 1- ярко выраженная , 8 - умеренное выраженная , 9 - ярко выраженная . Ячейки 10 и 4 - слабовыраженная . Остальные ячейки отрицательные .
Заключение , полученное на биочипе : иммунофенотип соответствует раку мочевого пузыря высокой степени злокачественности .
Заключение исследователя : в моче присутствую клетки плоскоклеточного рака мочевого пузыря высокой степени злокачественности
После оценки флуоресценции биочип окрашен п о Лейшману и проведена морфологическая оценку клеток в каждой ячейке .
Морфологическое заключение : во всех ячейках комплексы атипичных клеток .
Пациентка госпитализирована в стационар . Выполнена цистоскопия с биопсией .
20 Результат гистологического исследования : плоскоклеточный рак. Диагноз рак мочевого
пузыря I стадии .
Протокол 4
Пациентка С .45 лет. Узловое новообразовоание щитовидной железы Пациентке в условиях поликлиники стерильным шприцом была выполнена пункция новообразования . 25 Было получено 5 мл геморрагической жидкости . Жидкость направлена на исследование . Исследование проведено на биочипе TYR (щитовидная железа). Тестовые ячейки биочипа содержали следующие антитела с меткой СуЗ : тиреоглобулин - ячейка 1, кальцитонин -
ячейка 2, TTFI - ячейка 3, галектин - ячейка 4, мезотелиальный антиген HBMEI - ячейка
5, цитокератин 19 - ячейка 6, CD44v6 - ячейка 7, р 53 - ячейка 8. Для сохранения антител 30 во влажной среде добавлен реагент PBS, азид натрия 0,06 %, БСА .
Исследуемая жидкость перелита в пробирку объемом 10 мл, содержащую питательную среду . Проведено центрифугирование в течение 5 минут при скорости 2000
об/мин . в пробирке объемом 10 м л. Затем геморрагическую жидкость без осадка и каких -либо включений центрифугировали в большом количестве (п о 4-5) центрифужных
пробирок емкостью в 4 мл, после центрифугирования надосадочные жидкости слили , осадки ресуспензировали и объединили в одну пробирку . Полученную клеточную взвесь тщательно перемешали на шейкере . Затем с поверхности биочипа сняли воздухонепроницаемую стерильную пленку и внесли материал взвеси клеток в каждую 5 ячейку мерной пипеткой . Затем биочип накрыли снятой пленкой . Инкубировали в термостате в полной темноте 30 минут при температуре 37 °С. Далее поместили на шейкер . Далее проводили отмывку в буфере . Лишнюю влагу удаляли фильтровальной бумагой . Затем сняли решетку и провели исследование под флуоресцентном микроскопе . Выявлено свечение в комплексах клеток расположенных в ячейках : 1 - ярко 10 выраженная , 2 - ярко выраженная , 7 - умеренно выраженная , 8 - ярко выраженная . Остальные ячейки отрицательные .
Заключение п о результатам анализа н а биочипе : иммунофенотип соответствует раку щитовидной железы .
Заключение исследователя : пунктат содержит клетки рака щитовидной железы .
После оценки флуоресценции биочип окрасили п о Лейшману и провели морфологическую оценку клеток в каждой ячейке .
Морфологическое заключение : во всех ячейках комплексы клеток карциномы .
Пациентка госпитализирована в стационар . Выполнена операция
гемиструмэктомия . Результат гистологического исследования : фолликулярная карцинома
щитовидной железы . Пациентке выставлен диагноз рак щитовидной железы .
Формула изобретения
1. Биочип для мультиплексного анализа , содержащий прозрачную подложку из стекла , разделенную на функциональную и рабочую части , функциональная часть служит для
5 фиксации биочипа в руках , рабочая часть имеет покрытие и разделена на тестовые ячейки посредством решетки из пластика , каждая тестовая ячейка снабжена иммобилизованными
флуоресцентными антителами , специфичными к антигенам клеток , биочип содержит
пленку , закрепленную поверх решетки , отличающийся тем , что н а подложку рабочей части нанесено покрытие , создающее положительный заряд н а поверхности стекла , в 10 тестовые ячейки внесены антитела , конъюгированные с флуоресцентными метками Су-3 и
реагент , препятствующий высыханию внесенных антител , рабочая часть биочипа покрыта воздухонепроницаемой стерильной пленкой , функциональная часть биочипа снабжена информацией о локализации внесенных антител .
2. Способ исследования клеток для диагностики онкологических заболеваний с помощью биочипа для мультиплексного анализа , включающий предварительную подготовку клеток , полученных из серозной жидкости , помещение исследуемого материала в ячейки биочипа , проведение флуоресцентного анализа и последующее исследование наличия и детекции флуоресценции в каждой ячейке , при этом на этапе предварительной подготовки серозную жидкость центрифугируют в течение 5 минут при скорости 2000 об/мин ,
отличающийся тем , что биообъектами исследования являются клетки геморрагической
жидкости , клетки мочи , клетки , полученные и з материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клетки , полученные из соскобов с резецированной солидной опухоли до ее
фиксации в формалине , при этом предварительная подготовка клеток и з мутной серозной
жидкости , клеток и з геморрагической жидкости и клеток в моче с осадком включает
центрифугирование в объеме н е более 20 м л, последующее удаление над осадочной
жидкости и ресуспендирование осадка с питательной средой , при исследовании взвеси
клеток , полученных и з материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клеток ,
полученных из соскоба с резецированной опухоли до ее фиксации в формалине , пунктат помещают в пробирку Эппендорфа объемом 0,8 мл с питательной средой , проводят центрифугирование в течение 5 минут при скорости 1500 об/мин и внесение осадка в тестовые ячейки биочипа , далее биочип с внесенными клетками различного биоматериала помещают в шейкер н а 2-3 минуты , затем помещают в термостат н а 25 минут при температуре 37 °С , после чего биочип ополаскивают в буферном растворе , высушивают и проводят флуоресцентный анализ .
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
International application No.
PCT/RU 2016/0003 17
A .
CLASSIFICATION
OF SUBJECT MATTER
G01N21/78 (2006.01) CI2M3/00 (2006.01)
According to International Patent Classification (IPC) or to both national classification and IPC
FIELDS SEARCHED
Minimum documentation searched (classification system followed by classification symbols)
G01N 33/533, C12M 3/00
Documentation searched other than minimum documentation to the extent that such documents are included in the fields searched
Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practicable, search terms used)
DEPATISNET, EAPATIS, ESP@CENET, DWPI, PAJ, RUPTO, USPTO, WIPO, KIPRIS, PATSEARCH
C . DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Category*
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Relevmt to claim No.
Y Y
RU 142470 Ul (ZINOVEV SVIATOSLAV VLADIMIROVICH et al.) 27.06.2014, p. 4-5, the claims
US 6656697 Bl (LIFESCAN, INC.) 02.12.2003, the claims
GRIADUNOV D.A. et al. Tekhnologia gidrogelevykh biochipov i ее primenenie v meditsinskoi laboratomoi diagnostike. Meditsinsky alfavit. Laboratoria 3,2009, p. 10-14
RU 137188 Ul (GOSUDARSTVENNOE BIUDZHETNOE OBRAZOVATELNOE UCHREZHDENIE VYSSHEGO PROFESSIONALNOGO OBRAZOVANIA "NIZHEGORODSKAIA GOSUDARSTVENNAIA MEDITSINSKAIA AKADEMIA" MINESTERSTVA ZDRAVOOKHRANENIA ROSSYSKOI FEDERATSII) 10.02.2014, p. 3-4, the claims
1-2
Further documents are listed in the continuation of Box C.
| See patent family annex.
* Special categories of cited documents:
"A" document deiining the general state ofthe art which is not considered to be of particular relevance
"E" earlier application or patent but published on or after the international filing date
"L" document which may throw doubts on priority claim(s) or which is cited to establish the publication date of another citation or other special reason (as specified)
"O" document referring to an oral disclosure, use, exhibition or other means
"P" document published priorto the iinternational filing date but laterthan the priority date claimed
"T" later document published afterthe international filing date or priority date and not in conflict with the application but cited to understand the principle or theory underlying the invention
"X" document of particular relevance; the claimed invention cannot be considered novel or cannot be considered to involve an inventive step when the document is taken alone
"Y" document of particular relevance; the claimed invention cannot be considered to involve an inventive step when the document is combined with one or more other such documents, such combination being obvious to a person skilled in the art
" &" document member ofthe same patent family
Date of the actual completion ofthe international search
02 Februaiy 2017 (02.02.2017)
mailing ofthe international search report
27 Februaiy 2017 (27.02.2017)
Name and mailing address ofthe ISA/
Authorized officer
Facsimile No.
Telephone No.
Form PCT7ISA/2 10 (second sheet) (January 2015)
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
International application No. PCT/RU 2016/0003 17
С (Continuation). DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Category"'
Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages
Relevant to claim No.
SHISHKIN A.V. et al. Otsenka vozmozhnosti ispolzovania tsentrifugirovania dlia uskorennogo provedenia analiza s ispolzovaniem immunologicheskikh biochipov dlia issledovania kletok krovi. Fundamentalnye issledovania v prakticheskoi meditsine na sovremennom etape. Onkogematologia, 2011, N° 3, p.76-81
ZUBTSOVA ZH.l. et al. Razrabotka mnogoparametricheskoi test-sistemy dlia diagnostiki onkologicheskikh zabolevany zhenskoi reproduktivnoi sistemy. Molekuliamaia fizika, biologia, meditsina, Trudy MFTI, 2010, Tom.2, N°2, p. 16-22
RU 2292 551 CI (GOSUDARSTVENNOE UCHREZHDENIE DALNEVOSTOCHNY NAUCHNY TSENTR FIZIOLOGII I PATOLOGII DYKHANIA SIBIRSKOGO OTDELENIA ROSSYSKOI AKADEMII MEDITSINSKII NAUK) 27.01.2007, p. 4
Form РСТЯ 8Л /210 (continuation of second sheet) (January 201 5)
ОТЧЕТ О МЕЖДУНАРОДНОМ
ПОИСКЕ
Номер меиадународной заявки
PCT/RU 2016/0003 17
КЛАССИФИКАЦИЯ
ПРЕДМЕТА ИЗОБРЕТЕНИЯ
ОБЛАСТЬ ПОИСКА
Проверенный минимум документации (система классификации с индексами классификации )
G01N 33/533, С 12М 3/00
Другая проверенная документация в той мере, в какой она включена в поисковые подборки
Электронная база данных , использовавшаяся при поиске (название базы и, если , возможно , используемые поисковые термины )
DEPATISNET, EAPATIS, ESP@CENET, DWPI, PAJ, RUPTO, USPTO, WIPO, KIPRIS, PATSEARCH
ДОКУМЕНТЫ , СЧИТАЮЩИЕСЯ РЕЛЕВАНТНЫМИ
Категория
Цитируемые документы с указанием , где это возможно , релевантных частей
Относится к пункту N
Y Y
ВЛАДИМИРОВИЧ
и др.)
RU 142470 U1 (ЗИНОВЬЕВ СВЯТОСЛАВ
27.06.2014, с . 4-5, формула
US 6656697 В 1 (LIFESCAN, INC.) 02. 12.2003, формула
ГРЯДУНОВ Д .А . и др . Технология гидрогелевых биочипов и ее применение в
медицинской лабораторной диагностике . Медицинский алфавит . Лаборатория 3, 2009, с.10-14
RU 137188 U1 (ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
"НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ
АКАДЕМИЯ "МИНЕСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ
ФЕДЕРАЦИИ ) 10.02.2014, с.3-4, формула
1-2
1 1
X последующие документы указаны в продолжении графы С .
Т~|
данные о патентах -аналогах указаны в приложении
Особые категории ссылочных документов : Т "А " документ , определяющий общий уровень техники и не считающийся особо релевантным
'Е " более ранняя заявка или патент, но опубликованная надату "X"
международной подачи или после нее "L" документ , подвергающий сомнению притязание(я) на приоритет, или
который приводится с целью установления даты публикации другого "Y"
ссылочного документа , а также в других целях (как указано) "О " документ , относящийся к устному раскрытию , использованию,
экспонированию и т.д.
"Р " документ , опубликованный до даты международной подачи, но после " &" даты испрашиваемого приоритета
более поздний документ , опубликованный после даты международной
подачи или приоритета, но приведенный для понимания принципа или теории, на которых основывается изобретение
документ , имеющий наиболее близкое отношение к предмету поиска ; заявленное изобретение не обладает новизной или изобретательским уровнем, в сравнении с документом , взятым в отдельности документ , имеющий наиболее близкое отношение к предмету поиска ; заявленное изобретение не обладает изобретательским уровнем, когда документ взят в сочетании с одним или несколькими документами той же категории , такая комбинация документе в очевидна для специалиста документ, являющийся патентом-аналогом
Дата действительного завершения международного поиска 02 февраля 2017 (02.02.2017)
Дата отправки настоящего отчета о международном поиске 27 февраля 2017 (27.02.2017)
Наименование и адрес ISA/RU:
Федеральный институт промышленной собственности
Бережковская наб .,30-1, Москва , Г-59,
ГСП -3, Россия , 125993
Факс : (8-495) 531-63-18, (8-499)243-33-37
Уполномоченное лицо :
Телефон №. 495 53 1 65 15
А . Силкин
Форма PCT/ISA/210 (второй лист ) (Январь 2015)
WO 2017/204674
PCT/RU2016/000317
WO 2017/204674
PCT/RU2016/000317
WO 2017/204674
PCT/RU2016/000317
WO 2017/204674
PCT/RU2016/000317
WO 2017/204674
PCT/RU2016/000317
|
