(57) Реферат / Формула:
Представленное раскрытие предусматривает вакцинные композиции для профилактики и лечения вирусных инфекций Зика, содержащих антигены вируса Зика в иммуногенных композициях, и в комбинации антигенов Зика с одним или несколькими антигенами арбовируса, такими как антигены вируса Чикунгунья и вируса японского энцефалита, способы получения и производства таких композиций для применения в качестве вакцины для индуцирования иммунного ответа у млекопитающих против указанных выше патогенов.
Евразийское (21) 201800108 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A61K39/12 (2006.01)
2018.08.31 C12N 7/06 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2016.07.15
(54) ВАКЦИННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АБРОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
(31) 3652/CHE/2015
(32) 2015.07.16
(33) IN
(86) PCT/IN2016/050241
(87) WO 2017/009873 2017.01.19
(71) Заявитель:
БХАРАТ БАЙОТЕК ИНТЕРНЭШНЛ ЛИМИТЕД (IN)
(72) Изобретатель:
Суматхи Кандасвами, Элла Кришна Муртхи (IN)
(74) Представитель:
Вахнин А.М. (RU) (57) Представленное раскрытие предусматривает вакцинные композиции для профилактики и лечения вирусных инфекций Зика, содержащих антигены вируса Зика в иммуногенных композициях, и в комбинации антигенов Зика с одним или несколькими антигенами арбовируса, такими как антигены вируса Чикунгунья и вируса японского энцефалита, способы получения и производства таких композиций для применения в качестве вакцины для индуцирования иммунного ответа у млекопитающих против указанных выше патогенов.
ВАКЦИННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АБРОВИРУСНЫХ
ИНФЕКЦИЙ
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Представленное изобретение раскрывает вакцинные композиции содержащие антигены вируса Зика для профилактики и лечения вирусных инфекций Зика у млекопитающих. Изобретение также раскрывает стабильные вакцинные композиции, содержащие антигены вируса Зика с одним или несколькими антигенами арбовируса, такими как вирусные агенты Чикунгунья и/или Японского энцефалита. Настоящее изобретение также касается способов получения, формулирования и применения данного средства для одновременного вызывания иммунного ответа к каждому из указанных выше патогенов у млекопитающих и приемлемого для иммунизации субъектов-людей.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время в мире не существует доступной вакцины для профилактики или лечения против вирусных инфекций Зика. Таким образом, не существует никаких данных из предыдущего уровня техники, релевантных изобретению, раскрытому в данной заявке. Однако, для общего понимания предпосылки и задачи, лежащие в основе данного изобретения, обсуждаются далее в данном документе в параграфах ниже.
Авторы изобретения данной патентной заявки предусматривали эпидемический потенциал вируса Зика в регионах с высокой распространенностью комаров Aedes, в частности Aedes aegypti, передающие вирус. Интерес к инициированию проекта вакцины "Зика" на ранней стадии, за несколько месяцев до того, как причинная связь вирусной инфекции Зика с синдромом Гиелла Берра и микроцефалией стала общедоступной в декабре 2015 года, заключалась в том, что ни в одной стране мира не было ни готовности, ни мероприятий, инициированных кем-либо в то время для разработки вакцины, чтобы остановить продолжающуюся передачу вируса в таких странах, как Бразилия, и предотвратить дальнейшую передачу в странах, находящихся под угрозой вируса Зика. Увеличение международных поездок в регионы и из регионов из которых продолжается передача вируса, создает серьезный риск начала вспышки заболевания в странах с высокой распространенностью комаров Aedes, в частности Ae.eguypti, и тех, которые имеют большое наивное население, которое не подвергалось воздействию вируса. Клиническая картина вирусной инфекции Зика на ранних стадиях с характерной высокой температурой, макулопапулярной сыпью и артралгией удивительно похожа на ранние симптомы вирусных инфекций Чикунгунья и денге, что делает дифференциальную диагностику особенно сложной.
Проект вакцины против вируса Зика был инициирован в то время, когда было, очень мало или не было никакой информации о вирусном патогенезе, генетическом разнообразие, передаче, диагностике, серологических коррелятах для защиты или модели животных для исследования концепций вакцины. С точки зрения вакцины, отсутствовали сведения о возможности культивирования вирусу in vitro на клеточных субстратах, и если возможно, то какие клеточные субстраты наиболее приемлемы, механизм адаптации к клеткам, потенциальные титры вирусов и возможность осуществления производства вакцинного продукта для введения человеку, так как опубликованная информация в то время касалась прохождения вируса в мозг мыши, что не приемлемо для производства вакцины. В конце 2014 года Bharat Biotech сделал шаги, для запуска проекта вакцины Зика, и в скорее после
этого начал экспериментальную работу, которая в результате привела к заявленной патентной заявке.
Инфекции арбовируса (распространяющиеся членистоногими) вызваны вирусами, которые распространяются членистоногими, такими как комары. Они вызывают значительные заболевания человека, начиная от мягкой, бессимптомной инфекции до острого энцефалита или геморрагической лихорадки, которые могут оказаться фатальными. Наиболее значимые арбовирусы, вызывающие заболевание человека, принадлежат к трем вирусным семействам, Togaviridae, Flaviviridae, и Bunyaviridae. Арбовирусные инфекции являются "буйными" в развивающихся странах, и вызывают серьезную заболеваемость, особенно у пожилых людей. Общей характерной особенностью арбовирусных инфекций, вызванной вирусами Денге, Чикунгунья, Зикой, японским энцефалитом и Западного Нила, среди других: лихорадка, головная боль, миалгия, боли в суставах с отеком и макулопапулярная сыпь во время острой фазы вирусной инфекции. Артралгия является особенно характерным признаком для лихорадки вируса Чикунгунья, денге и Зика. Co-инфекции являются общими, поскольку арбовирусы в основном распространяются одинаковыми комарами-переносчиками, такие как, например, вирусы денге, Чикунгунья и Зика, которые передаются комарами Aedes. Вирус японского энцефалита и вирусы Западного Нила передаются преимущественно комарами Culex. Проблема остро стоит в развивающих странах, где программы борьбы с комарами-переносчиками были неэффективными и в основном неудачными. Проблема осложняется тем, что не существует надежных способов диагностики для диагностики заболевания, вызываемого вирусами с уверенностью. Международные путешествия способствовали широкому распространению данных инфекционных агентов, и заболевания, такие как денге и Чикунгунья, которые до сих пор ограничивались только тропическими странами, теперь распространяются географически на новые районы и в регион с умеренным климатом. Как сообщается, вирус Зика распространился на более чем 65 стран за последние два года. Профилактика аутохтонных эпидемий, о которых сообщают в нескольких странах в данных регионах, поддерживается местной популяцией комаров-переносчиков.
Вирус Зика (ZIKV) представляет собой возникающий зоонозный арбовирус, который относится к семейству Flaviviridae. Подобно вирусам Денге и Чикунгунья, вирус Зика также может передаваться комарами Aedes, в частности A. furcifer, A. taylori, А. luteocephalus, A. africanus, A. albopictus и преимущественно A. aegypti. Туристические поездки в страны, где сообщалось о недавних эпидемиях, такие как Полинезия, способствовали географическому распространению вирусной инфекции в Бразилию, Колумбию, Италию и другие страны. Сообщалось о аутохтонных вспышка вируса в Италии, вызванных из-за локализованных комаров Aedes. В Азии вирусная инфекция Зика наблюдалась эпизодически в Камбодже, Таиланде, Индонезии, Малайзии и Бангладеш, хотя в данных регионах не сообщалось о больших эпидемических вспышках.
Вирус Чикунгунья (CHIKV) представляет собой Alphaeupyc семейства Togaviridae. Вирус вызывает самоограничивающую фебрильную инфекцию, которая характеризируется острым началом с высокой температурой, головной болью, миалгией, артралгией, отеками суставов и макулопапулярной сыпью. Сильные симптомы, такие как геморрагия, фульминантный гепатит и неврологические симптомы, были зарегистрированы в последних эпидемиях. Вирус Чикунгунья передается как комарами Aedesaegypti, так и Aedes albopictus. Вирус японского энцефалита (JEV) также представляет собой флавивирус семейства Flaviviridae и передается преимущественно комарами Culex. JEV связан с Денге, вирусом желтой лихорадки, вирусами Зика и Западного Нила. Инфекция JEV является очень бессимптомной, но в целом она вызывает недомогание с лихорадкой,
головной болью и другими гриппоподобными симптомами. Редко клиническая инфекция развивается до энцефалита с приступами, спастическим параличом, комой и смертью. Дети особенно чувствительны. В странах, эндемических для JEV, большинство взрослых имеют естественный иммунитет после детской инфекции. Взрослые, которые не подвергались инфекции в детстве, чувствительны в любом возрасте. Частота смертности от JEV, вызванная энцефалитом, может составлять до 30%. Неврологические осложнения или психиатрические симптомы возникают в большинстве случаев с энцефалитом. Во всем мире примерно 3 миллиарда населения находится под угрозой заражения JEV. Несколько вакцин для профилактики инфекции JEV были успешно проданы. Вирус денге (DENV) является членом семейства Flaviviridae. Арбовирусная инфекция больше не может рассматриваться как специфическая для региона, поскольку сейчас она широко географически распространена и является значительной проблемой общественного здоровья во многих частях мира. Заболеваемость, вызванная упомянутыми выше арбовирусными инфекциями, обычно высокая, и артралгия, в частности, неблагоприятно влияет на физическую мобильность пациентов. Вирус Зика вызывает более серьезные врожденные деформации при рождении, во время инфицирования, во время беременности, и Зика, связанные с синдромом Гиелла Берра, были подтверждены в текущих эпидемиях. Как и любые другие вирусные инфекции, не существует специальных терапевтических средств. Профилактическая вакцинация может эффективно прерывать передачу вируса Зика, и вакцина будет фронтом защиты от вирусного заболевания Зика.
Учитывая это, была разработана эффективная стратегия предотвращения дальнейшей передачи вируса Зика для защиты наивного населения, в странах, где наблюдается эпидемия, и в странах, где еще не было сообщено об активной передаче вируса Зика. Комбинированная вакцина для арбовирусных инфекций представляет собой хорошую стратегию защиты уязвимых групп населения от изнурительных заболеваний, вызванных Денге, Чикунгунья, Зика, японским энцефалитом, вирусами Западного Нила и желтой лихорадки. Вакцины для JEV, желтой лихорадки и одного из серотипов денге есть в продаже, и вакцины для Западного Нила и CHIKV находятся в клинической разработке. Пока не существует вакцины для вирусной инфекции Зика, и в данном изобретении раскрываются способы разработки первой вакцины кандидата Зика.
Однако выбор антигенов для включения в такой комплект вакцины, зависит от нескольких факторов. Зависящее от антитела усиление вируса, вызванное серотипами лихорадки Денге, хорошо исследуемо и опубликовано, и также кросс-реактивность флавивирусных антител. Но непонятно то, как бы такая интерференция или перекрестная реактивность распространенности антител Чикунгунья в одной и той же популяции, подверглась экспозиции вируса Зика. Аналогичным образом не было известно, могут ли антитела к вирусу японского энцефалита вызвать антигенные вмешательства в развитие иммунитета к вирусу Зика, и было интересно думать о том, что они так же изучаются. Предлагаемая работа также дает представление о любой возможной иммунной интерференции, вызванной распространенными антителами JE и CHIKV к вакцине кандидату Зика.
В данном изобретении вакцины с вирусом кандидата Зика были разработаны и испытаны относительно эффективности с использованием различных композиций для обнаружения соответствующего уровня иммунного ответа для защиты от вирусного заболевания Зика. Поскольку отсутствие значительной антигенной интерференции к Зика вызванной иммунной реакцией вакцины против вируса японского энцефалита и вакцины против вируса Чикунгуньи при одновременном введении или в комбинации в качестве комбинированной вакцины, препараты были эффективными для выявления высокого
уровня нейтрализующих антител, способных обеспечить защиту против каждого из вирусов.
ЗАДАЧИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одна из задач изобретения заключается в обеспечении стабильных иммуногенных композиций для профилактики и лечения вирусных инфекций Зика.
Другая задача изобретения заключается в обеспечении способов адаптации и роста вируса Зика в клетках Vero.
Иная задача изобретения заключается в обеспечении способов получения инактивированной вакцины против вируса Зика и очистки вирусного объемного антигена Зика.
Еще одна задача изобретения заключается в обеспечении способов инактивации вируса Зика химическими средствами с формалином, бета-пропиолактоном и пероксидом водорода.
Еще одна задача изобретения заключается в обеспечении способов инактивации вируса Зика физическими средствами, такими как нагревание, гамма-излучение и ультрафиолетовое излучение.
Еще одна задача изобретения заключается в обеспечении способов получения и формулирования рекомбинантных вирусных антигенов Зика, включающих протеин ргМЕ, и исследования относительно иммуногенности у животных.
Еще одна задача изобретения заключается в обеспечении способов формулирования антигенов вируса Зика с различными адъювантами и оценке иммунного ответа на композиции у животных.
Еще одна задача изобретения заключается в обеспечении кинетики иммунного ответа на однократную дозу, две и три дозы формалина и BPL инактивированной вакцины против вируса Зика у животных.
Еще одна задача изобретения заключается в обеспечении иммуногенных композиций для профилактики вирусных инфекций Зика и Чикунгунья.
Другая задача изобретения заключается в обеспечении иммуногенных композиций для профилактики вирусных инфекций Зика, Чикунгунья и японского энцефалита.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
• Представленное изобретение касается композиций и способов изготовления вакцинных композиций для профилактики и лечения вирусных инфекций Зика, а также инфекций вызванных другими арбовирусами, такими как вирус Чикунгунья и вирус японского энцефалита.
• В одном аспекте, изобретение касается вакцинных композиций для профилактики и лечения вирусных инфекций Зика, где указанные композиции содержат антигены вируса Зика в иммуногенных композициях и также могут содержать один или
более антигенов арбовируса, такого как вирус Чикунгунья и антигены вируса японского энцефалита, вместе с приемлемыми адъювантами и эксципиентами.
• В другом аспекте, изобретение касается способа получения вакцинных композиций согласно процессу, который включает:
(a) Применение клеточной линии Vero в качестве клеточного субстрата для культивирования вируса Зика
(b) Масштабирование культивирования вируса Зика вплоть до объема сбора клеток 10 л
(c) Инактивирование вирусной культуры
(d) Очистка вирусной культуры
(e) В другом аспекте, рекомбинантное клонирование и экспрессирование протеина pRME вируса Зика.
• В одном варианте осуществления изобретения, клеточную линию Vero использовали в качестве клеточного субстрата для культивирования вируса Зика и выращивали в культуральной среде с или без применения сыворотки.
• В другом варианте осуществления изобретения, вирус Зика был адаптирован путем повторного серийного пассажа в клетках Vero для получения более высоких титров.
• В другом варианте осуществления изобретения, вирус Зика был пассирован в клетки С6/36 Ае. Albopictus с последующим ростом в клетках Vero для увеличения титра.
• В другом варианте осуществления изобретения, раскрыты способы масштабирования вирусной культуры и последующей очистки масштабируемых вирусных культур, причем объем сбора клеток составлял примерно 8-10 л. Собранные вирусные клетки были инактивированы с использованием различных способов. Вирус затем чистили.
• В другом варианте осуществления изобретения, способ инактивации выбирают из группы инактивации формалином, инактивации бета-пропиолактоном (BPL), инактивации нагреванием, инактивации УФ, гамма-инактивации, в присутствии или при отсутствии стабилизирующих агентов и аминокислот.
• В предпочтительном варианте осуществления изобретения, аминокислоты были отобраны индивидуально или в комбинации из группы L-гистидина, L-глутаминовой кислоты, L-глицина и L-аспарагиновой кислоты и L-глютамина и альбумина сыворотки человека.
• В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, способ очистки выбирают с помощью использования целюфинсульфата, DEAE-сефадекса СМ-сефадекса с градиентом соли, с использованием гель-фильтрации на Captocore-700, Sepharose CL-4B, керамической гидроксиапатитной колонки с градиентом от 0,2М до 0,8М фосфата, с последующей диафильтрацией и ультрацентрифугированием на 20-60% градиента сахарозы, наиболее предпочтительно с использованием колонки Capto core 700.
• Другой вариант осуществления изобретения касается рекомбинантного клонирования, и предполагается экспрессия протеина pRME вируса Зика. Способ рекомбинантного клонирования использует сайт-специфическую транспозицию экспрессионной кассеты с клонированными вставками в бакуловирусный шаттл-вектор, который распространяется в E.coli и экспрессируется в клетках насекомых.
• В другом варианте осуществления изобретения, предусмотрены вакцинные композиции. Вакцина может содержать один или несколько антигенов арбовируса, выбранных из вируса Зика, вируса Чикунгунья и вирусов японского энцефалита.
• В другом варианте осуществления адъюванты могут быть выбраны из группы из алюминиевых солей, инулина, альгамулина, комбинации из инулина и гидроксида
алюминия, монофосфориллипида A (MPL), резиквимоида, мурамилдипептида (MDP), N-гликолилдипептида (GMDP), поли 1С, CpG олигонуклеотида, резиквимода, гидроксида алюминия с MPL, любой эмульсии вода-в-масле, любой эмульсии масло-в-воде, содержащей один или несколько из следующих компонентов: сквален или его аналоги, или любое фармацевтически приемлемое масло, твин-80, сорбитана триолеат, альфа-токоферол, холекальциферол или любой из аналогов и производных их молекул, или фосфата кальция или любой комбинации адъювантов.
• В другом варианте осуществления изобретения, композиции получают с эксципиентами и консервантами.
• В другом варианте осуществления изобретения, стабилизирующие агенты в вакцинных препаратах использовались индивидуально или в комбинациях с сорбитом, L-глицином, маннитом, L-глутаминовой кислотой и альбумином сыворотки человека, в различных концентрациях использовались для исследования вакцинного препарата.
• В другом варианте осуществления изобретения, эффективность вакцинных композиций исследовалась в моделях на животных, для демострации полной защиты от вирусемии в широком диапазоне дозирования.
• В другом варианте осуществления изобретения, комбинированные вакцинные композиции были также эффективными для обеспечения адекватной защиты против японского энцефалита, а также вирусов Чикунгунья.
• В другом варианте осуществления изобретения, антисыворотка предоставляет пассивный иммунитет у кролика против инфекции вируса Зика, для обеспечения полной защиты от вирусемии, тогда как вирусемия была детектирована у контролируемых животных, которая персистировала вплоть до 6 дней после обнаружения вируса.
• В другом варианте осуществления изобретения, вакцина с кандидатным инактивированным вирусом Зика может вводиться или однократно, или двумя или более дозами внутримышечным способом.
• В другом варианте осуществления изобретения, анализы по нейтрализации титров антител проводили для проверки уровней антитела по отношению к вакцинным композициям по представленному изобретению, которые, как показано, вызывают высокий уровень нейтрализующих антител.
• В другом варианте осуществления изобретения, исследования кросс-нейтрализации демонстрировали, что инактивированные вакцинные композиции по представленному изобретению были бы одинаково защитными и эффективными против любого штамма вируса Зика.
• В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, титры антител как для BPL инактивированных, так и инактивированных формалином Зика вакцинных композиций были выше с гидроксидом алюминия, чем с антигеном самостоятельно.
• В другом варианте осуществления изобретения, качество ответа антител к вакцинной композиции по представленному изобретению с помощью анализов авидности антител, показало, что антитела с высокой аффинностью были разработаны в течение времени с повторными иммунизациями.
Соответственно, изобретение обеспечивает стабильную вакцинную композицию, содержащую один или несколько антигенов арбовируса, выбранных из вируса Зика, вируса Чикунгунья и вируса японского энцефалита, причем указанные антигены формулируются с или без адъюванта в фармацевтически приемлемом буфере, где вакцинная композиция вызывает защитный иммунный ответ к каждому из вирусов у
млекопитающих. Вирусный антиген Зика композиции является эффективным для лечения, диагностики и профилактики по отношению к любому генотипу/генотипным вариантам/штаммам вируса Зика, причем композиция является эффективной против любого генотипа/генотипных вариантов/штаммов/синтетических вирусов Зика, которые распространяются где-либо от 50% до 100% идентичности на аминокислотном уровне в любом участке генома. Композиция по изобретению содержит антигены вируса Зика любого генотипа/генотипического варианта/штаммов/синтетического вируса Зика, причем антитела против любого из указанных выше типов вируса Зика перекрестно нейтрализуют гомологический вирус или любой гетерологичный штамм вируса Зика, которые распространяются по меньшей мере по 50%-100% аминокислотной идентичностью в любой области всего его генома, в частности протеина оболочки Е.
Антигены вируса Зика, вируса Чикунгунья и вируса японского энцефалита композиции инактивированы целыми вирионными (вирусными) антигенами. В свою очередь, антигены вируса Зика и Чикунгунья представляют собой очищенные рекомбинантные антигены.
Вирусный антиген Зика по изобретению получают с использованием клеток Vero, в качестве клеточного субстрата путем адаптации вируса к клеткам Vero.
Вирусный антиген Зика композиции по изобретению представляет собой очищенный и концентрированный антиген, полученный по одному или нескольким способам, выбранными из:
a. ультрацентрифугирования;
b. центрифугирования по градиенту плотности;
c. осветления собранных вирусных клеток с использованием мембранной фильтрации, с последующей очисткой с использованием колоночной хроматографии; и
d. тангенциальной текущей фильтрации с использованием мембран с отсечением от 100 кДа до 300 кДа, причем тангенциальную фильтрацию осуществляют или перед, или после инактивации вируса.
При этом очистка с использованием колоночной хроматографии включает гель-фильтрацию, колоночную хроматографию со смешанным режимом смолы, ионообменную колоночную хроматографию, аффинную матричную хроматографию и хроматографию с гидрофобными взаимодействиями. Колоночная хроматография элюирует предпочтительное большинство вирусного антигена в потоке, таком как Capto Core 700, наиболее предпочтительно Capto Core 700, где образец вируса очищен на Capto Core 700 колонке и является элюированным в потоке.
Вирус Зика композиции инактивирован, по меньшей мере, одним или несколькими из химического инактивирующего агента, физического инактивирующего агента и облучающего агента, где инактивацию вируса Зика осуществляют перед или после очистки вируса. В иллюстративном варианте осуществления вирус Зика инактивирован с использованием химического инактивирующего агента, выбранного из формалина (формальдегида), бета-пропиолактона (BPL) и пероксида водорода.
В одном предпочтительном варианте осуществления вирус Зика инактивирован каким-либо одним из следующих способов, выбранных из:
а. Обработки формалином при любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1: 500 вплоть до 1: 4000 об./об. формалин: вирус, при от 8°С до 37°С, предпочтительно 25 ± 3°С, в течение, по меньшей мере, от 1 до 7 дней;
b. Обработки формалином при любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1:500 вплоть до 1: 4000 об./об. формалин : вирус, при от 2°С до 8°С в течение, по меньшей мере, от 10 до 30 дней;
c. Бета-пропиолактона (далее BPL) при любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1:500 вплоть до 1: 4000 об./об. BPL : вируса, в течение, по меньшей мере, от 24 до 48 часов при температурах, которые находятся в диапазоне от 8°С до 30°С, предпочтительно 25±3°С, в течение 48 часов;
d. Бета-пропиолактона при любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1: 500 вплоть до 1:4000 (BPL : вируса, об./об.), при от 2°С до 8°С в течение, по меньшей мере, 3-7 дней;
e. Комбинации из BPL и формалина при любых из указанных выше условий, предпочтительно инактивация BPL при 1:3000 (BPL : вируса, об./об.) в течение 24 часов с последующей инактивацией формалином при 1: 3000 (формалин : вирус, об./об.) в течение от 24 до 48 часов при от 15°С до 30°С, предпочтительно 25±3°С;
f. Пероксида водорода при любой концентрации, от 0,1 до 3%, предпочтительно от 0,1 до 1% при любой температуре от 20 до 30°С в течение от 5 минут до 120 минут.
В одном варианте осуществления, инактивация вируса Зика с использованием облучающего агента включает инактивацию гамма-облучением путем экспозиции от 20 кГр (Кило Грей) вплоть до 35 кГр, предпочтительно от 25 кГр до 30 кГр из 60Со источника.
В другом варианте осуществления инактивация вируса Зика с использованием облучающего агента включает инактивацию облучением УФ путем экспозиции до 254 нм в течение 30 -60 минут.
В следующем варианте осуществления, вирус инактивирован путем термической обработки при температуре от 50 °С до 65 °С в течение от 30 минут до 2 часов.
Буфер, используемый в данном изобретении, может быть выбран из списка, включающего фосфатный буфер, цитратный буфер, фосфатно-цитратный буфер, боратный буфер, буфер, содержащий три(гидроксиметил)аминометан (Tris), сукцинатный буфер, буферы, содержащие глицин или гистидин, в качестве одного из буферирующих агентов, где фосфатный буфер представляет собой натрий-фосфатный буфер при концентрации от 5 мМ вплоть до 200 мМ фосфатных ионов с любым рН от 6,50 до рН 9, и необязательно содержащие натрия хлорид при концентрации от 50 до 200 мМ. Буфер поддерживает рН в жидкой композиции выше рН 6,5, предпочтительно выше рН 7,0 в течение всего биологического процесса от вирусной культуры до получения очищенного инактивированного вируса.
В одном варианте осуществления инактивацию вируса Зика осуществляют в присутствии стабилизирующего агента, выбранного из лактозы, сахарозы, трегалозы, мальтозы, не ограничивается этим, изо-мальтозы, рафинозы, стахиозы, лактобиозы, сорбита, маннита, лактобионовой кислоты, декстрана, L-глицина, L -гистидина, L-глутаминовой кислоты, L-аспарагиновой кислоты и альбумина сыворотки человека или их комбинаций. Однако, в одном предпочтительном варианте осуществления, стабилизирующий агент может быть выбран из:
a. 2% сорбита и 1% L-глицина;
b. 1% сорбита и 0,5 % L-глицина;
c. 1% маннита и 0,5% L-глицина;
d. 1% маннита и 0,5% L-глутаминовой кислоты; и
e. 1% сорбита и 0,5% L-глицина, 1% альбумина сыворотки человека.
В иллюстративном варианте осуществления инактивация вируса Зика включает инактивацию любого генотипа/штамма, живого ослабленного вируса Зика, дезактивированного вируса, вирусоподобных частиц, химерных вирусных частиц, несущих любые антигены вируса Зика, в частности, протеин Е в любом гетерологическом вирусном скелете, в векторных вакцинах и инфекционных синтетических вирусных частицах, полученных in vitro или in vivo, используя последовательность любого генома вируса Зика.
Очищенный рекомбинантный вирус Зика по изобретению содержит антигены вируса Зика, содержащие протеин оболочки (Е), мембранный (М) протеин и необязательно неструктурный 1 (NS1) протеин в качестве вакцинных антигенов для индуцирования иммунного ответа для профилактики вирусных инфекций Зика, причем вирус Зика имеет структурные протеиновые последовательности, как раскрыто в SEQ. Ш No. 3 и SEQ. Ш No. 4, что соответствует нуклеотидной последовательности SEQ Ш. No. 1 и SEQ Ш No. 2 соответственно, для применения в качестве вакцинных антигенов против вирусных инфекций Зика, вызванных генотипами или их вариантами. Рекомбинантные ДНК конструкты содержат (i) вектор, (ii) по меньшей мере один фрагмент нуклеиновой кислоты, соответствующей SEQ Ш NO. 1 или SEQ Ш N0. 2, кодирующий аминокислотную последовательность протеинов SEQ Ш N0.3, SEQ Ш N0. 4, соответственно, который является применяемым к любой протеиновой последовательности вируса Зика, которая имеет по меньшей мере 70% аминокислотную идентичность с указанными выше SEQ Ш N0. 3 и SEQ Ш N0. 4. Композиция по изобретению содержит рекомбинантный ДНК конструкт, причем вектор представляет собой эукариотический плазмидный вектор, который является клонированным в эукариотическом хозяине, таком как бакуловирус для экспрессии в клетках насекомых как вирусоподобных частицах (VLP).
Рекомбинантный протеин вируса Зика получают способом, включающем следующие стадии:
a. трансфекция рекомбинантной плазмидной ДНК в клетках насекомых;
b. сбор клеток и выделение рекомбинантного протеина из них;
c. очистка протеина способом, выбранном из ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, аффинной хроматографии, гидрофобной колоночной хроматографии, хроматографии со смешанным режимом смол, диафильтрации, ультрацентрифугирования, центрифугирования по градиенту плотности и фракционирования с солью.
Структурные антигены вируса Зика экспрессируются в любой прокариотической или эукариотической системе экспрессирования, включающей экспрессию, опосредованную бакуловирусом в клетках насекомых.
Вакцинная композиция по изобретению получается способом, в котором нейтрализующие антитела в значительной степени индуцированы против протеина оболочки, такого как оптимально инактивированный вирус, живой ослабленный вирус, дезактивированный вирус, ДНК вакцина, вирусоподобные частицы, химерные вирусные частицы, показывающие протеин Е вируса Зика в любом гетерологичном вирусном скелете, такую как в векторных вакцинах и синтетических вирусных частицах, полученных из любой геномной РНК последовательности вируса Зика.
Вакцинная композиция по изобретению может дополнительно содержать адъювант, причем адъювант выбранный из группы, состоящей из а) солей алюминия, содержащих гидроксид алюминия, алюминия фосфат, алюминия сульфатфосфат; Ь) инулина; с) альгамулина, представляющего собой комбинацию инулина и алюминия гидроксида; d) монофосфориллипида A (MPL) е) резиквимода; f) мурамилдипептида (MDP) g) N-гликолилдипептида (GMDP) h) поли-IC; i) CpG олигонуклеотида; j) алюминия гидроксида с MPL; к) любой эмульсии вода-в-масле; 1) любой эмульсии масло-в-воде, содержащей один или несколько из следующих компонентов: сквален, или его аналоги, или любое фармацевтически приемлемое масло, твин-80, сорбиантриолеат, альфа-токоферол, холекальциферол и водный буфер, или любой из аналогов и производных их молекул i) двух или более комбинаций любого из указанных выше адъювантов, когда они формулируются с антигенами вируса Зика, вызывает иммунный ответ против вируса. В одном предпочтительном варианте осуществления композиция содержит гидроксид алюминия в концентрации в диапазоне от 0,1 мг до 1,5 мг алюминия на дозу вакцины, предпочтительно от 0,25 до 0,5 мг алюминия на дозу вакцины.
Адъювант композиции по изобретению обеспечивает мукозный иммунитет и системный иммунитет при введении млекопитающим.
Вакцинная композиция с антигеном вируса Зика вводится в любой дозе, которая находится в диапазоне от 0,125 мкг до 100 мкг на дозу с или без адъюванта, либо в виде однократной дозы или двух или более доз для индуцирования иммунного ответа у млекопитающего.
В одном варианте осуществления изобретение предусматривает способ индуцирования защитного иммунного ответа у млекопитающих, включая людей, включающий введение вакцинной композиции по пункту 1 любым способом, который включает внутримышечный, интрадермальный, подкожный, внутривенный, пероральный, интраназальный или транскутанный способы введения.
Композиция по изобретению может вводиться любым способом, включающим иглы и шприцы, включая предварительно заполненные шприцы, микроигольный пластырь, безигольный пластырь, ингаляционные и назальные спреи.
Изобретение также предусматривает способ in vitro или in vivo применения антител вируса Зика композиции для приготовления иммунодиагностических и иммунотерапевтических агентов для вирусных инфекций Зика.
В одном варианте осуществления вакцинная композиция содержит вирус Зика и антигены вируса японского энцефалита в комбинированной вакцине, вызывающей защитный иммунный ответ у млекопитающих против каждого из вирусов, причем вирусный антиген Зика и инактивированные антигены вируса японского энцефалита присутствуют в комбинированной вакцине при концентрациях, которые находятся в диапазоне от 5 мкг до 50 мкг каждого антигена в фармацевтически приемлемом препарате без адъюванта или с адъювантом.
Адъювант может быть выбран из группы, состоящей из а) солей алюминия, содержащих гидроксид алюминия, алюминия фосфат, алюминия сульфатфосфат; Ь) инулина; с) альгамулина, представляющего собой комбинацию инулина и гидроксида алюминия; d) монофосфориллипида A (MPL) е) резиквимода; f) мурамилдипептида (MDP) g) N-гликолилдипептида (GMDP) h) поли-IC; i) CpG олигонуклеотида; j) гидроксида алюминия с MPL; к) любой эмульсии вода-в-масле; 1) любой эмульсии масло-в-воде, содержащей
один или несколько из следующих компонентов: сквален или его аналоги или любое фармацевтически приемлемое масло, твин-80, сорбиантриолеат, альфа-токоферол, холекальциферол и водный буфер, или любой из аналогов и производных их молекул i) двух или более комбинаций любого из указанных выше адъювантов, когда они формулируются с антигенами вируса Зика, вызывает иммунный ответ против вируса. В одном предпочтительном варианте осуществления, адъювант представляет собой гидроксид алюминия с содержанием алюминия от 0,25 до 1,0 мг на вакцинную дозу.
В другом варианте осуществления вакцинная композиция содержит вирус Зика и антигены вируса Чикунгунья в комбинированной вакцине, вызывающей защитный иммунный ответ у млекопитающих против каждого из вирусов, причем антигены вируса Зика и Чикунгунья присутствуют в комбинированной вакцине в концентрациях, которые находятся в диапазоне от 5 мкг до 50 мкг каждого антигена в фармацевтически приемлемом препарате без адъюванта или с адъювантом.
Адъювант может быть выбран из группы, состоящей из а) солей алюминия, включающие гидроксид алюминия, алюминия фосфат, алюминия сульфатфосфат; Ь) инулина; с) альгамулина, представляющего собой комбинацию из инулина и гидроксида алюминия; d) монофосфориллипида A (MPL); е) резиквимода; f) мурамилдипептида (MDP); g) N-гликолилдипептида (GMDP); h) поли-IC; i) CpG олигонуклеотида; j) гидроксида алюминия с MPL; к) любой эмульсии вода-в-масле; 1) любой эмульсии масло-в-воде, содержащей один или несколько из следующих компонентов: сквален или его аналоги, или любое фармацевтически приемлемое масло, твин-80, сорбиантриолеат, альфа-токоферол, холекальциферол и водный буфер, или любой из аналогов и производных их молекул i) двух или более комбинаций из любого из указанных выше адъювантов, когда формулируются с антигенами вируса Зика, вызывает иммунный ответ против вируса. В одном предпочтительном варианте осуществления, адъювант представляет собой гидроксид алюминия с содержанием алюминия от 0,25 до 1,5 мг на вакцинную дозу.
В другом варианте осуществления вакцинная композиция содержит вирус Зика, вирус Чикунгунья и антигены вируса японского энцефалита в комбинированной вакцине, вызывающей защитный иммунный ответ у млекопитающих против каждого из вирусов, причем вирус Зика, вирус Чикунгунья и антигены вируса японского энцефалита присутствуют в комбинированной вакцине при концентрациях, которые находятся в диапазоне от 5 мкг до 50 мкг каждого антигена в фармацевтически приемлемом препарате без адъюванта или с адъювантом.
Адъювант может быть выбран из группы, состоящей из а) солей алюминия, включающие гидроксид алюминия, алюминия фосфат, алюминия сульфатфосфат; Ь) инулина; с) альгамулина, представляющего собой комбинацию из инулина и гидроксида алюминия; d) монофосфориллипида A (MPL); е) резиквимода; f) мурамилдипептида (MDP); g) N-гликолилдипептида (GMDP); h) поли-IC; i) CpG олигонуклеотида; j) гидроксида алюминия с MPL; к) любой эмульсии вода-в-масле; 1) любой эмульсии масло-в-воде, содержащей один или несколько из следующих компонентов: сквален или его аналоги, или любое фармацевтически приемлемое масло, твин-80, сорбиантриолеат, альфа-токоферол, холекальциферол и водный буфер, или любой из аналогов и производных их молекул i) двух или более комбинаций из любого из указанных выше адъювантов, когда формулируются с антигенами вируса Зика, вызывает иммунный ответ против вируса. Предпочтительно, адъювант представляет собой алюминия гидроксид с содержанием алюминия от 0,25 мг до 1,0 мг на вакцинную дозу.
Вакцинная композиция по изобретению необязательно содержит 2-феноксиэтанольный консервант в концентрации от 2,5 до 5 мг/мл.
Вакцинная композиция при введеннии в однократной дозе или двумя или более дозами у млекопитающих вызывает как ТЫ, так и Th2 иммунный ответ против любого из антигенов арбовируса, содержащий вирус Зика, вирус Чикунгунья и вирус японского энцефалита и являются приемлемыми для введения людям.
В одном варианте осуществления изобретение предусматривает способ получения вакцинной композиции, содержащей один или несколько антигенов арбовируса, выбранных из вируса Зика, вируса Чикунгунья и вируса японского энцефалита, где способ включает одну или несколько стадий инактивации, продуцирования рекомбинантного протеина, экспрессирования структурных антигенов, очистки и концентрации вирусного антигена, причем указанные очистка и концентрация вируса Зика включает одну или несколько стадий, выбранных из:
a. ультрацентрифугирования;
b. центрифугирования по градиенту плотности;
c. осветления собранных вирусных клеток с использованием мембранной фильтрации;
d. очистки с использованием колоночной хроматографии;
e. тангенциальной текущей фильтрации с использованием мембран с
отсечением от 100 кДа до 300 кДа, причем тангенциальную фильтрацию
осуществляют или перед, или после инактивации вируса.
Способ колоночной хроматографии включает гель-фильтрацию, колоночную хроматографию со смешанным режимом смолы, любую ионообменную колоночную хроматографию, аффинную матричную хроматографию и хроматографию с гидрофобными взаимодействиями, причем колоночный хроматографический способ элюирует большую часть вирусного антигена в потоке, таком как Capto Core 700, наиболее предпочтительно Capto Core 700, причем вирусный образец очищен на колонке Capto Core 700 и элюирован в потоке.
Вирус Зика инактивиров одним или несколькими инактивирующими агентами, выбранными из химического инактивирующего агента, физического инактивирующего агента и облучающего агента.
Способ получения включает инактивацию вируса Зика, которая может быть осуществлена до или после очистки вируса, причем вирус Зика может быть инактивирован химическим инактивирующим агентом, выбранным из формалина (формальдегида), бета-пропиолактоном (BPL) и пероксида водорода.
В одном варианте осуществления способ получения включает инактивацию объемного вируса Зика, который инактивирован каким-либо одним из следующих способов, выбранных из:
a. Обработки формалином при любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1: 500 вплоть до 1: 4000 об./об. формалин : вирус, при от 8°С до 37°С, предпочтительно 25±3°С, в течение по меньшей мере от 1 до 7 дней;
b. Обработки формалином при любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1:500 вплоть до 1: 4000 об./об. формалин : вирус, при от 2°С до 8°С в течение по меньшей мере от 10 до 30 дней;
c. Бета-пропиолактона (далее BPL) при любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1:500 вплоть до 1: 4000 об./об. BPL: вируса, в течение
по меньшей мере от 24 до 48 часов, если не более, при температурах, которые находятся в диапазоне от 8°С до 30°С, предпочтительно 25±3°С, в течение 48 часов;
d. Бета-пропиолактона при любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1: 500 вплоть до 1:4000 (BPL: вируса, об./об.), при от 2°С до 8°С в течение по меньшей мере от 3 до 7 дней;
e. Комбинации BPL и формалина при любых из указанных выше условий, предпочтительно BPL инактивация при 1:3000 (BPL : вируса, об./об.) в течение 24 часов с последующей инактивацией формалином при 1: 3000 (формалин : вирус, об./об.) в течение от 24 до 48 часов при от 15°С до 30°С, предпочтительно 25±3°С;
f. Пероксида водорода при любой концентрации, от 0,1 до 3%, предпочтительно
от 0,1 до 1% при любой температуре от 20 до 30°С в течение от 5 минут до 120
минут.
В варианте осуществления способа получения, вирус инактивирован гамма-облучением путем экспозиции от 20 кГр (Кило Грей) вплоть до 35 кГр, предпочтительно от 25 кГр до 30 кГр от источника 60Со.
В другом варианте осуществления способа получения, вирус Зика инактивирован облучением УФ путем экспозиции на 254 нм в течение 30 -60 минут.
В другом варианте осуществления способа получения, вирус Зика инактивирован путем термической обработки от 50 °С до 65 °С в течение от 30 мин. вплоть до 2 часов, предпочтительно, при 65 °С в течение 1 часа.
В одном варианте осуществления способа получения, инактивацию осуществляют в присутствии стабилизирующего агента, выбранного из лактозы, сахарозы, трегалозы, мальтозы, не ограничивается этим, изо-мальтозы, рафинозы, стахиозы, лактобиозы, сорбита, маннита, лактобионовой кислоты, декстрана, L-глицина, L -гистидина, L-глутаминовой кислоты, L-аспарагиновой кислоты и альбумина сыворотки человека или их комбинаций. В одном предпочтительном варианте осуществления стабилизирующий агент выбран из:
a. 2% сорбита и 1% L-глицина;
b. 1% сорбита и 0,5 % L-глицина;
c. 1% маннита и 0,5% L-глицина;
d. 1% маннита и 0,5% L-глутаминовой кислоты; и
e. 1% сорбита и 0,5% L-глицина, 1% альбумина сыворотки человека.
Способы инактивации, описанные выше в данном документе, применяются к вирусу Зика любого генотипа/штамма, живого ослабленного вируса Зика, дезактивированного вируса, вирусоподобных частиц, химерных вирусных частиц, несущих любые антигены вируса Зика, в частности, Е протеин в любом гетерологичном вирусном скелете, в векторных вакцинах и инфекционных синтетических вирусных частицах, полученных in vitro или in vivo с использованием последовательности любого генома вируса Зика.
В одном варианте осуществления изобретение раскрывает способ продуцирования рекомбинантного протеина, включающий стадии:
a. трансфекции рекомбинантной плазмидной ДНК в клетках насекомых;
b. сбор клеток и выделение рекомбинантного протеина из них;
c. очистку протеина по меньшей мере одним из способов, включающим ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, аффинную хроматографию,
гидрофобную колоночную хроматографию, хроматографию со смешанным режимом смол, диафильтрацию, ультрацентрифугирование, центрифугирование по градиенту плотности, фракционирование с солью.
В другом варианте осуществления изобретение раскрывает способ экспрессирования структурных антигенов вируса Зика, включающий систему экспрессирования, представляющую собой любую прокариотическую или эукариотическую систему экспрессирования, включающий экспрессию, опосредованную бакуловирусом, в клетках насекомых.
В другом варианте осуществления изобретение раскрывает способ, причем способ включает нейтрализующие антитела, предпочтительно индуцирующиеся против протеина оболочки, такого как в оптимально инактивированном вирусе, живом ослабленном вирусе, дезактивированном вирусе, ДНК вакцине, вирусоподобных частицах, химерных вирусных частицах, демонстрирующих протеин Е вируса Зика в любом гетерологичном вирусном скелете, таком как в векторных вакцинах и синтетических вирусных частицах, полученных из любой геномной РНК последовательности вируса Зика.
Вакцинная композиция по изобретению может вводиться в прайм-буст стратегии, причем первичной является кандидатная инактивированная вакцина, и вторичной является или такая же вакцина или любая другая вакцина, такая как ДНК вакцина, вакцина химерного вируса Зика, вирусоподобные частицы, дезактивированая вакцина Зика, вакцина с живым ослабленным вирусом, рекомбинантная субъединичная вакцина, векторная вакцина или любая вакцина, полученная из синтетического вируса Зика, причем нейтрализующие антитела в каждой из них индуцируются против протеина оболочки вируса Зика.
КОРОТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1: Фиг. Очищенный вирус Зика масса в 12,5% SDS-PAGE геле, обнаруженный с использованием окрашивания серебром. Протеин оболочки (Е) и мембранные (М) протеины являются основными протеинами, обнаруженными в очищенном антигене.
Фигура 2: Фиг. 2А - Кинетика инактивации вируса Зика формалином в концентрациях, которые находятся в диапазоне от 1:1000 об./об. формалин : вирус вплоть до 1:4000 об./об. формалин : вирус при 25±3°С. Фиг. 2В - кинетика инактивации вируса Зика бета-пропиолактоном в концентрациях, которые находятся в диапазоне от 1:1000 вплоть до 1:3500 об./об. BPL : вируса при 25±3°С. В обоих процедурах инактивации в качестве стабилизаторов добавляли 1% сорбита и 0,5% L-глицина (конечная концентрация), которые не имели экспозиции на кинетику инактивации. Инактивированные образцы серийно амплифицировали три раза in vitro в клетках Vero, и анализировали в конце трех пассажей с помощью ТСШ50.
Фигура 3: Фиг. ЗА: -2,1 т.п.н. гена ргМЕ вируса Зика SEQ Ш NO. 1 амплифицировали ген-специфическими праймерами для инициирования клонирования в pFastBac вектор для экспрессии в клетках насекомых. Фиг. ЗВ: образец Sf9 клеточный лизат исследовали вестерн-детектированием экспрессии протеина ргМЕ с использованием Зика кроличьей поликлональной антисыворотки по стандартным процедурам. Протеин оболочки ~ 55 кДа может быть обнаружен в качестве основной полосы.
Фигура 4: Оценка нейтрализующих титров антител, индуцированных вакцинными композициями Зика с различными адъювантами. Адъюванты сокращаются следующим
образом: pIC (поли-IC) С-холекальциферол; MPL (липид А; монофосфорил) RP (резиквимоид + поли-IC) RM (резиквимоид + OWEM2) I (инулин) OWEM2 (эмульсия масло-в-воде 2) AI (гидроксид алюминия + инулин) MDP (мурамилдипептид) OWEM1 (эмульсия масло-в-воде 1). Ни одни значимые титры антител не могут быть выявлены в соответствующих контрольных группах и поэтому не показаны на фигуре. Во всех случаях, 10 мкг двух доз вакцинного антигена Зика было сформулировано для введения мышам Balb/c в.м. способом.
Фигура 5: Фиг. 5А: Оценка нейтрализующих титров антител с использованием PRNT50 в исследовании дозой, находящейся в диапазоне от 0,125 мкг вплоть до 40 мкг на дозу адъювантного гидроксида алюминия инактивированного формалином вакцины вируса Зика, которую вводят в.м. способом мышам Balb/c в двух дозах. Фиг. 5В: вакцинированных животных подвергали контрольному заражению внутривенно 10е5 PFU/вируса Зика штамма на животное через 7 дней после бустерной дозы, и вирусемию контролировали каждые 24 часа в течение 7 дней (изображено на графике в течение 6 дней). Все животные продемонстрировали полную защиту от вирусемии, тогда как животные, которым вводили контрольное плацебо показали вирусемию, которая сохранялась вплоть до 6 дней. Инфекционный вирус оценивали в образцах крови с
ПОМОЩЬЮ ТСШ50.
Фигура 6: Вирусное контрольное заражение мышей Balb/c возрастом 4-6 недель после введения от 1 мкг до 40 мкг BPL инактивированной, алюмокалиевыми квасцами адсорбированной вакцины вируса Зика. Животные из всех групп вакцинной дозы и группы плацебо подвергались контрольному заражению 10е5 PFU вируса Зика штамма MR766 через 7 дней после введения бустерной дозы. Вирусемию контролировали каждые 24 часа после вирусного контрольного заражения, и титры инфекционных частиц в крови оценивали с помощью ТСШ50. Кандидатная вакцина Зика предоставляла полную защиту от вирусного контрольного заражения во всех группах дозы.
Фигура 7: Пассивная иммунизация, осуществляющая полную защиту против вирусемии и инфекционного вируса, не могла быть обнаруженной с использованием ТСШ50 у животных, получивших внутрибрюшинно кроличью поликлональную антисыворотку Зика и были контрольно заражены 24 часа спустя 10е5 PFU вируса Зика. Инфекционные вирусные частицы не могли быть выявлены с использованием ТСШ50 в крови, при контроле каждые 24 часа в течение 6 дней, тогда как контрольные животные, получающие одинаковый объем PBS показали устойчивую вирусемию вплоть до 6 дней, когда были контрольно заражены одинаковой дозой вируса.
Фигура 8: Инактивированные формалином, адсорбированные на алюмокалиевых квасцах антисыворотки вакцины вируса Зика из вакцинированных мышей, нейтрализованных гомологичным штаммом вируса Зика MR766 (фиг. 8В) и перекрестно нейтрализованных гетерологичным штаммом 13025 FSS азиатского генотипа (фиг. 8А) с одинаковой эффективностью с титрами PRNT50 18105 и 18325, соответственно. Значения для плацебо (только алюмокалиевые квасцы) также изображены на графике рядом.
Фигура 9: Титры антител, выраженные как log 10 обратных разбавлений сыворотки от дозы, которая находится в диапазоне исследований (фиг. 9А) с однократной дозой (фиг. 9В), двумя дозами (фиг. 9С), тремя дозами инактивированной формалином вакцины, которая вводится мышам Balb/c возрастом 4-6 недель, как описано в примере 7. фиг. 9D представляет собой титры антител с одной, двумя и тремя дозами 10 мкг вакцинного антигена без алюмокалиевых квасцов. Все значения выражаются как геометрические
средние титры с 95% ДИ. На 9A-9D, нанесены отдельные данные животных. Вирусный антиген Зика был иммуногенным даже без адъюванта. Данные из других диапазонов доз оценивались, но не были включены в график.
Фигура 10: Антитела высокой аффинности могут быть обнаружены с использованием однократной дозы инактивированной формалином адсорбированной на алюмокалиевых квасцах вакцины вируса Зика у мышей Balb/c даже при низких дозах вакцинного антигена вплоть до 1 мкг. Авидность антител выражается как индекс авидности и оценивается способами, описанными в примере 12.
Фигура 11: Оценка ТЫ цитокинов (фиг. ПА) IFN гамма и (фиг. 11В) ГЬ-2 у мышей, вакцинированных вакцинными композициями Зика с различными адъювантами. Во всех случаях она составляла 10 мкг вакцинного антигена на дозу. Адъюванты сокращаются следующим образом: pIC (поли-IC); С- холекальциферол; MPL (липид А; монофосфорил); RP (резиквимоид + поли-IC); RM (резиквимоид + OWEM2); I (инулин); OWEM2 (эмульсия масло-в-воде 2); AI (гидроксид алюминия + инулин); MDP (мумарилдипептид); OWEM1 (эмульсия масло-в-воде 1); как описано в примере 5. Адъювант на основе масла и поли-IC индуцировали сильный ТЫ ответ по сравнению с другими испытанными адъювантами.
Фигура 12: Оценка Th2 цитокинов (Фиг. 12A) IL-4, и (Фиг. 12В) IL-10, у мышей, вакцинированных вакцинными композициями Зика с различными адъювантами. Во всех случаях она составляла 10 мкг вакцинного антигена на дозу. Адъюванты сокращаются следующим образом: pIC (поли-IC); С- холекальциферол; MPL (липид А; монофосфорил); RP (резиквимоид + поли-IC); RM (резиквимоид + OWEM2); I (инулин); OWEM2 (эмульсия масло-в-воде 2); AI (алюминия гидроксид + инулин); MDP (мумарилдипептид); OWEM1 (эмульсия масло-в-воде 1), как описано в примере 5. Адъюванты на основе масло и поли-IC индуцировали сильный Th2 ответ в дополнение к ТЫ ответу.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное раскрытие касается формулирования иммуногенных композиций. Изобретение раскрывает, в частности, получение и формулирование вакцинных антигенов вируса Зика в моновалентных композициях и в комбинациях с другими арбовирусами, такими как вирусы Чикунгунья и/или японского энцефалита. В частности, изобретение раскрывает композиции для профилактики и лечения вирусных инфекций Зика.
Один из аспектов изобретения заключается в том, что способы получения, формулирования и применения антигенов Зика, в качестве вакцины для индуцирования иммунного ответа, применяют к любому генотипу, генотипным вариантам или любому штамму вируса Зика причем один генотип вируса Зика эффективно перекрестно нейтрализует гетерологичный штамм. Вирус Зика может быть выбран из азиатского, западноафриканского или восточноафриканского генотипа вируса. Поэтому способы, описанные в представленном изобретении в данном документе применяются к вирусу Зика любого генотипа/штамма, живому ослабленному вирусу Зика, дезактивированному вирусу, вирусоподобным частицам, химерным вирусным частицам, несущим любые антигены вируса Зика, в частности, Е протеин и М протеин в любом гетерологичном вирусном скелете, в векторных вакцинах и инфекционных синтетических вирусных частицах, полученных in vitro или in vivo с использованием последовательности любого генома вируса Зика. Химерный вирус имеет нуклеиновую кислоту гетерологичного вируса и нуклеиновую кислоту вируса Зика.
В контексте иммуногенных композиций, раскрытых в данном документе, в частности, основной антиген, используемый для получения иммуногенных композиций, способы получения, формулирования и применения вакцинных антигенов Зика применяються к любому из указанных выше типов вируса Зика, которые имеют по меньшей мере от 50% аминокислотной идентичности и вплоть до 100% аминокислотной идентичности в любом участке генома. В контексте иммуногенных композиций, раскрытых в данном документе, последовательность штамма MR766 вируса Зика африканского генотипа (SEQ Ш N0. 5 для геномной нуклеотидной последовательности и SEQ Ш N0. 6 для полного ORF) имеет более чем 96,5% аминокислотную идентичность по структурному протеину оболочки со штаммом FSS13025 азиатского генотипа, и чья последовательность раскрыта в SEQ Ш N0. 7 и SEQ Ш N0. 8 для нуклеотидных и протеиновых последовательностей соответственно. Вакцина антисыворотки штамма MR766 перекрестно нейтрализовала штамм FSS13025 со 100% эквивалентной эффективностью, как гомотипный штамм MR766. Кроме того, в контексте раскрытия в данном документе, антисыворотка вируса Зика ргМЕ (SEQ Ш N0. 3) эффективно перекрестно нейтрализовала штамм MR766, что подтверждает, что все вирусы Зика являются серотипно подобными. В контексте раскрытия в данном документе, способы получения вакцины, разработанные с использованием какого-либо одного штамма вируса Зика применимы к гомологичным и любым гетерологичным штаммам вируса Зика для использования в качестве кандидатной вакцины.
Клеточная линия, которая может быть распространена in vitro в культуре, может использоваться в качестве хозяина для вирусной культуры Зика. Для распространения штаммов вируса Зика, предпочтительно выбранными могут быть пермиссивные клетки, позволяющие вирусу хорошо расти. Например, могут использоваться диплоидные клеточные линии, такие как MRC-5 и WI-38, и серийно пассированные клеточные линии, такие как Vero, ВНК-21, СНО клетки и т.п. Например клетки Vero (АТСС No. CCL-81), ВНК-21 (АТСС No. CCL-10), С6/СЗ (АТСС No. CRL-1660) и т.п.
В предпочтительном варианте осуществления, одна такая клеточная линия, используемая в представленном изобретении, представляет собой клетки Vero (АТСС No. CCL-81), которые были валидированы для применения в качестве клетки-хозяина для получения вакцины. Валидированные клеточные линии Vero соответствуют требованиям для биологических веществ No. 50 относительно требований по использованию клеток для производства биологических препаратов, рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), тем самым подтверждая, что данные клеточные линии являются надлежащего качества для получения вакцины (WHO Technical report Series, No. 878, pp 19-52, 1998).
В одном аспекте изобретения, способ адаптации вируса Зика к клеткам Vero увеличивает титр вируса. Повторно пересеянный вирус Зика в клетках Vero увеличивает титр вируса. В контексте роста вируса в клетках Vero, раскрытых в данном документе, вирус Зика первоначально пассировали в мышиный мозг или клетки Ае.albopictus С6/36 (АТСС No. CRL-160) и затем адаптировали к клеткам Vero, что увеличивает титры вируса, приемлемые для получения вакцины.
Для поддержания клеточной культуры указанных выше клеточных линий, адаптированными могут быть клетки Vero, в частности, стационарная культура в монослоях, культура перфузионной системы, колбы для встряхивания, культура роллера для пробирок/флакона, суспензионная культура с и без микроносителей, клеточные фабрики и клеточные стеки, биореакторы и одноразовые биореакторы, волновые биореакторы и подобные. Например, различные типы микроносителей коммерчески
доступны. Коммерчески доступные устройства для животной клеточной культуры могут использоваться для облегчения роста клеток до высокой плотности клеток.
В одном аспекте изобретения и как раскрыто в данном документе, вирус Зика является очищенным для применения в качестве кандидатной вакцины. Очистка достигается комбинацией как физических, так и химических способов или перед или после инактивации вируса. Физические способы включают любую из следующих техник, но не ограничивается этим: ультрацентрифугирование, центрифугирование по градиенту плотности, ультрафильтрацию, диафильтрацию и концентрацию с использованием полупроницаемых мембран с приемлемыми размерами молекулярного отсека. Очистка химическими средствами использует способы, такие как адсорбция/десорбция за счет химических или физико-химических реакций, таких как ионообменная хроматография, аффинная хроматография, хроматография с гидрофобными взаимодействиями, гель-фильтрационная хроматография, такая как например Captocore700TM, гидроксиапатитная матрица, сольвация с неорганическими солями, одним из таких примеров является сульфат аммония.
В предпочтительном варианте осуществления, вирус очищают с использованием колоночной хроматографии на Capto core 700 (GE Healthcare Life Sciences). Инактивация вируса достигается или перед очисткой, или после очистки на колонке Capto core 700 Собранные вирусные клетки перед колонкой Capto core 700 могут быть осветленными с использованием мембранных фильтров с различными размерами пор, преимущественно не менее 0,45 мкМ для связывания на мембране низших протеинов. В предпочтительном варианте осуществления, собранные вирусные клетки могут быть осветленными с использованием двойных мембран с двумя различными размерами пор, например 1,2 мкМ с последующей 0,45 мкМ, или 0,8 мкМ с последующей 0,45 мкМ. Осветленные собранные вирусные клетки являются приемлемыми для очистки на колонке Capto Core 700. Буферы, используемые для очистки на Capto core 700, имеют оптимальный уровень рН и ионную силу, для максимизации связывания примесей на колонке и элюирования вируса в потоке. Вирусный образец дополнительно концентрируют с использованием диафильтрации перед или после инактивации вируса. Диафильтрационный образец вируса после инактивации удаляет вирус инактивирующего агента из основного антигена, и является приемлемым для формулирования.
В одном варианте осуществления изобретения вирус Зика является инактивированным (убит) для применения в качестве вакцинного антигена. Инактивацию могут осуществлять или перед, или после очистки вируса. В предпочтительном варианте осуществления, инактивацию вируса Зика осуществляют после очистки вируса.
Вирус Зика может быть инактивирован или с использованием нагревания, гамма-облучения, ультрафиолетового света или химических средств. В предпочтительном варианте осуществления, раскрытый в данном документе, вирус Зика химически инактивирован. Химические инактивированные агенты были выбраны из следующего перечня, который включает, но не ограничивается этим: формалин, бета-пропиолактон, глутаральдегид, N-ацетилэтиленимин, бинарный этиленимин, третичный этиленимин, аскорбиновую кислоту, каприловую кислоту, псоларены, детергенты, включающие неионные детергенты, и тому подобное, причем химический инактивирующий агент добавляется в вирусную суспензию для инактивации вируса.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, химический инактивирующий агент выбирают из формалина и/или бета-пропиолактона (BPL). Формалин используют в любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1:1000 до 1:4000 об./об. формалин
: вирус. Бета-пропиолактона используют в любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1:1000 до 1:4000 об./об. BPL : вирус. Температура и продолжительность инактивации оптимизированы для полной инактивации вируса с минимальным вредным воздействием на иммуногенность. Это может быть достигнуто при более короткой продолжительности экспозиции минимальным количеством инактивирующего агента. В контексте инактивации вируса, раскрытие в данном документе описывает концентрацию, температуру и время экспозиции на вирус Зика формалином и BPL. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, температура инактивации составляет 25±3°С, наиболее предпочтительно - 22иС в течение 7 дней. При более низких температурах от 2°С до 8°С, продолжительность экспозиции формалина дольше, чем 7 дней, для достижения полной инактивации вируса при указанных выше диапазонах концентрации. Продолжительность экспозиции на вирус формалином может быть уменьшена до менее 48 часов за счет повышения температуры экспозиции вплоть до 37°С. Следовательно, эффективная инактивация формалином вируса Зика может быть достигнута при любой концентрации, в диапазоне формалина от 1:1000 об./об. формалин : вирус вплоть до 1:4000 об./об. формалин : вирус за счет вибора любой температуры в диапазоне от 2°С до 37иС и варьируя время экспозиции от 24 часов до более, чем 10 дней при любой из указанных выше концентраций, времени и температуры экспозиции.
В одном варианте осуществления раскрытия, BPL используют в качестве вирусного инактивирующего агента для вируса Зика. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, BPL используют в концентрациях, которая находится в диапазоне от 1:1000 об./об. BPL : вирус вплоть до 1: 4000 об./об. BPL: вирус. При более низких температурах от 2 до 8 °С, продолжительность экспозиции BPL составляет преимущественно от 3 до 7 дней для достижения полной инактивации вируса при указанных выше диапазонах концентраций. Продолжительность экспозиции вируса BPL может быть уменьшена до 48 часов или менеее путем повышения температуры экспозиции вплоть до 25±3 °С или даже вплоть до 37°С. Следовательно, эффективная инактивация BPL вируса Зика может достигаться за счет какой-либо концентрации в диапазоне BPL от 1:1000 об./об. BPL : вирус до 1:4000 об./об. BPL : вирус за счет выбора любой температуры в диапазоне от 2 до 37 °С и варьируя временем экспозиции от 24 часов до более чем 10 дней при каких-либо указанных выше концентрациях, времени и температуры экспозиции.
Один из вариантов осуществления представленного изобретения, раскрытого в данном документе представляет собой применение комбинации BPL и формалина при каких-либо из указанных выше условий, предпочтительно BPL инактивация при 1:3000 об./об. BPL : вирус в течение 24 часов с последующей инактивацией формалином при 1: 3000 об./об. формалин : вирус в течение от 24 до 48 часов при от 15 °С до 30 °С, предпочтительно 25±3 °С. Применение комбинации BPL и формалина для инактивации вируса Зика заключается в том, что механизм инактивации разный для формалина и BPL, их комбинированное применение снижает их общую концентрацию и экспозицию как инактивирующими агентами, так и применение низких концентраций формалина, способствует стабильности основного вируса, способствуя перекрестному связыванию вирусных эпитопов. В другом варианте осуществления изобретения, пероксид водорода используют для инактивации вируса Зика в концентрациях, которые находятся в диапазоне от 0,1 до 3%, предпочтительно от 0,1 до 1% при любой температуре от 20 °С до 30 °С в течение от 5 до 120 минут, если не более.
Вариант осуществления представленного изобретения раскрывает применение антигена ргМЕ вируса Зика в качестве антигена кандидатной вакцины для индуцирования иммунного ответа против вируса Зика. Раскрытие применимо к любому способу разработки вакцины, причем ргМЕ или Е протеин экспрессируется таким образом, что
нейтрализующие антитела Зика направлены против указанных антигенов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, ргМЕ протеин экспрессируется как рекомбинантные вирусоподобные частицы (VLP) в экспрессии, опосредованной бакуловирусом в клетках насекомых. Каждый квалифицированный специалист в данной области будет получать дополнительные варианты осуществления с использованием описанного выше раскрытия, для разработки кандидатной вакцины с использованием протеина ргМЕ в качестве мишени антигена Зика, такого как ДНК вакцина, вирусоподобные частицы, содержащие протеины ргМЕ, субединичная вакцина, содержащая антиген оболочки (Е), живые векторные вакцины, химерные вакцины с использованием ргМЕ Зика на гетерологичном скелете нуклеиновой кислоты, причем все указанные выше анти-Зика антитела направлены против Е протеина.
В представленном изобретении, раскрытом в данном документе, представлены иммуногенные композиции, содержащие очищенные рекомбинантные антигены вируса Зика, содержащие протеин оболочки (Е), мембранный (М) протеин и необязательно неструктурный 1 (NS1) протеин в качестве вакцинных антигенов для индуцирования иммунного ответа для профилактики вирусных инфекций Зика. В предпочтительном варианте осуществления, применение вируса Зика, имеющего ген ргМЕ последовательности SEQ Ш NO. 1 и SEQ Ш N0. 2, кодирующего структурный протеин SEQ. Ш N0. 3 и SEQ. ID N0. 4 соответственно, причем экспрессированный и очищенный протеин ргМЕ может использоваться в качестве вакцинного антигена для профилактики вирусных инфекций Зика.
В предпочтительном варианте осуществления, ген ргМЕ вируса Зика используют для генерирования рекомбинантного генного конструкта, который может использоваться для экспрессирования протеина ргМЕ в прокариотической или эукариотической системах экспрессирования в качестве вирусоподобных частиц (VLPs), предпочтительно экспрессия, опосредованная бакуловирусом в клетках насекомых. Способы, раскрытые в данном документе применимы к любому штамму вируса Зика, имеющему по меньшей мере 70% аминокислотную идентичность к указанным выше SEQ Ш N0. 3 и SEQ Ш N0. 4
Вариант осуществления представленного раскрытия представляет собой выбор фармацевтически приемлемого буфера в течение биопроцесса, причем буферный агент выбирают из перечня, состоящего из какого-либо одного или нескольких из последующих, но не ограничивается этим: фосфатный буфер; цитратный буфер; фосфатно-цитратный буфер; боратный буфер; буфер, содержащий три(гидроксиметил)аминометан (Tris); сукцинатный буфер; буферы, содержащие глицин или гистидин в качестве одного из буферных агентов. В наиболее предпочтительном варианте осуществления используют фосфатный буфер, причем фосфатный буфер представляет собой натрий-фосфатный буфер в концентрации от 5 мМ вплоть до 200 мМ фосфатных ионов, предпочтительно от 10 мМ до 100 мМ фосфатный буфер, наиболее предпочтительно от 10 мМ до 50 мМ фосфатный буфер любого рН выше 6,50 до рН 9, предпочтительно от рН 6,8 до рН 7,8 используют для процессов в обратном направлении и в прямом направлении. В предпочтительном варианте осуществления, 10 мМ натрий-фосфатный буфер рН 7,4±0,2 используют в получении очищенной инактивированной вакцины основного вирусуного антигена Зика, и, необязательно содержащие натрия хлорид в концентрации от 50 до 200 мМ. В другом предпочтительном варианте осуществления, сорбит и L-глицин необязательно добавляют до конечной концентрации 1% и 0,5%, соответственно.
Вариант осуществления представленного изобретения также раскрывает выбор адъювантов, совместимых для формулирования с вирусным антигеном Зика.
Антигенные композиции вируса Зика как моновалентная вакцина, и с вирусом Чикунгунья и вирусами японского энцефалита в комбинированной вакцине были сформулированы в фармацевтически приемлемом носителе для иммунизации. Применение адъюванта(ов) может снизить количество антигена, необходимого для формуляции. Кроме того, для адъювантной вакцинной композиции, приемлемый(е) адъювант(ы) были выбраны из слудующего перечня, включающего, но не ограничиваются этим: алюмокалиевые квасцы, такие как гидроксид алюминия, алюминия фосфат, или аморфный алюминия сульфатфосфат; фосфат кальция; инулин какой-либо полиморфной формы, предпочтительно гамма инулин; адъюванты, содержащие инулин в комбинации с другими органическими и неорганическими соединениями, такие как алюминия гидроксид, алюминия фосфат, алюминия сульфатфосфат и фосфат кальция; липосомы, хитозан и сложные углеводы, такие как декстран, декстрины, крахмал, маннаны и глюкоманнаны, галактоманнаны, бета-глюканы, гепарин, целлюлоза, гемицеллюлоза, пектины и пектиниты, лектины и какие-либо другие углеводы или синтетические, или полученные из любого источника, какие-либо способные к биологическому разложению и биосовместимые полимеры, такие как полилактид и полилактид согликолиды, (PLG или PLGA); какие-либо эмульсии, включающие, но не ограничивается этим, эмульсии масло-в-воде, причем одним таким примером является сквален или аналоги сквалена, содержащие масло в воде адъюванты, эмульсии масло-в-воде, содержащие растительные масла; любые эмульсии вода-в-масле; липосомы, полученные из холекальциферола в качестве одного из ингредиентов вместе с другими липидными растворимыми соединениями; липосомы других композиций; RTBI адъювантные системы, сапонины, включающие, но не ограничиваются этим, QS-21, QuilA, томатин, ISCOM, ISCOMATRIX, и тому подобное, липопептиды, гликопептиды и их аналоги, резиквимоиды, липополисахариды, липид А, мурамилдипептиды или их аналоги и любые адъюванты на основе пептида, олигонуклеотиды, любые TLR лиганды и их аналоги в качестве адъювантов, любой цитокин, витамины и нетоксичные бактериальные токсины, практически любые аналоги всех указанных выше адъювантов и комбинация из двух или более из указанных выше адъювантов или их аналогов, которые совместимы в вакцинной композиции(ях) и исследованы относительно повышенной иммуногенности. В дополнение к указанному выше, какие-либо другие органические и неорганические вещества, обладающие хорошей имунопотенциальной активностью являются приемлемыми для применение в качестве адъюванта либо самостоятельно, либо в адъювантных комбинациях для повышения иммуногенности арбовирусных антигенов. Применение адъюванта в вакцинных композициях может уменьшить необходимое количество антигена.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, гидроксид алюминия использовали для исследования диапазона дозирования как формалина, так и BPL, инактивированных антигенов Зика, а также в вакцинных комбинациях вакцин Зика, CHIKV и JEV через их профиль безопасности для применения в целевой популяции. Эмульсии на основе масла и поли-IC давали хороший иммунопотенциальный эффект относительно антигена Зика, при использовании в качестве адъювантов. В одном варианте осуществления изобретения, поли-IC и другие адъюванты осуществляющие системный мукозный иммунитет, особенно предпочтительны для защиты против заболевания, вызванного вирусной инфекцией Зика. Поли-IC и эмульсии на масляной основе и адъювантные комбинации, раскрытые в изобретении индуцировали как ТЫ, так и Th2 ответы, оцененные путем измерения цитокинов ТЫ и Th2 после вакцинации.
В одном варианте осуществления представленного изобретения, вакцинный консервант используют в вакцинных композициях. Предпочтительный вариант осуществления представляет собо 2-феноксиэтанол в концентрации от 2,5 до 5 мг на дозу.
В одном аспекте представленного изобретения, раскрытого в данном документе, применяются стабилизирующие агенты, выбранные из одного или нескольких из следующих, но не ограничивается этим: лактозы, сахарозы, трегалозы, мальтозы, маннозы, изо-мальтозы, рафинозы, стахиозы, лактобиозы, сорбита, маннита, лактобионовой кислоты, декстрана, L-глицина, L-гистидина, L-глутаминовой кислоты, L-аспарагиновой кислоты, альбумина сыворотки человека и их комбинаций, в какой-либо приемлемой концентрации, которая используется для обеспечения стабильности во время инактивации вируса Зика каким-либо из указанных выше способов. В предпочтительном варианте осуществления, стабилизирующие агенты выбраны из любой из следующих комбинаций, но не ограничивается этим: 2% сорбита и 1% L-глицина; 1% сорбита и 0,5 % L-глицина; 1% маннита и 0,5% L-глицина; 1% маннита и 0,5% L-глутаминовой кислоты; 1% сорбита, 0,5% L-глицина, 1% альбумина сыворотки человека. В предпочтительном варианте осуществления, комбинация из 1% сорбита и 0,5% L-глициа и 1% маннита и 0,5% L-глицина представляют собой предпочтительные комбинации, наиболее предпочтительно, 1% сорбита и 0,5% L-глицина. Квалифицированный специалист в данной области будет принимать во внимание дополнительные варианты осуществления, основанные на указанных выше раскрытиях.
Лиофилизированные композиции являются одним из способов получения вакцинного продукта. Лиофилизированные препараты вакцины против вируса Зика, как правило, содержат очищенный инактивированный вирус Зика, сахарные полиолы, предпочтительно сорбит и маннит, наиболее предпочтительно сорбит в комбинации со стеклообразующим сахаром, который преимущественно представляет собой дисахариды или олигосахариды. Предпочтительные дисахариды выбраны из следующего перечня, но не ограничивается этим: сахарозы, трегалозы, мальтозы, маннозы, лактозы, рафинозы, изомальтозы, стахиозы, и тому подобное. Предпочтительный вариант осуществления раскрытия представляет собой комбинацию из 1% сорбита с 5% сахарозы, 1% маннита и 5% сахарозы, и 3% сахарозы и 2% трегалозы, 1% маннита с 1% L-глицина и или 2% трегалозы. Любой обычный специалист в данной области разработает дополнительные варианты осуществления, основываясь на раскрытиях, указанных выше.
Лиофилизированные композиции могут быть повторно суспендированы в воде для инъекций или в водном буфере, фармацевтически приемлемом для введения, например, в качестве инъекционной жидкости для субъекта человека. Лиофилизированная композиция также может использоватся в качестве ингаляционного порошка, который будет приемлемым для индуцирования мукозного иммунитета. Кроме того, лиофилизированная композиция вируса Зика может содержать адъювант, обеспечивающий мукозный иммунитет предпочтительно из перечня тех адъювантов, которые были исследованы в представленном изобретении для вируса Зика, такого как, например, поли-1С.
В представленном изобретении, раскрытие, представленное в данном документе, относительно оптимального использования вирусуного антигена Зика для индуцирования сильного иммунного ответа, вакцинный антиген может использоваться в количестве от 0,10 мкг вплоть до 100 мкг на дозу, причем предпочтительный вариант осуществления представляет собой любую концентрацию от 0,125 мкг вплоть до 40 мкг на дозу, таким образом, что введенные вакцинные дозы индуцируют титры антител, которые можно измерить с помощью анализов, таких как ELISA и PRNT50. Вакцина может вводиться с и
без адъюванта, поскольку как инактивированная вакцина, так и адъювантные композиции индуцируют хороший иммунный ответ.
В еще одном раскрытии изобретения, инактивированная кандидатная вакцина Зика, инактивирована по какому-либо из раскрытых способов, может вводиться в качестве одноразовой дозы или двумя или более дозами для индуцирования иммунного ответа. Способы, раскрытые в изобретении обеспечивают кинетику иммунного ответа после каждой дозы вакцины, в дозах в диапазоне от 0,125 мкг вплоть до 40 мкг на дозу, что обеспечивает гибкость в выборе дозы вакцины в диапазоне концентраций и количестве доз для соответствия целевой популяции для вакцинации.
Путь введения вакцины может быть каким-либо путем, выбранным из, но не ограничивается этим, внутримышечного, интрадермального, подкожного, внутривенного, перорального, интраназального и транскутанного способов введения. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, предпочтительным путем введения вакцины является внутримышечный (в.м.) путь.
Вакцинные композиции могут быть представлены в стеклянных флаконах и вводиться с помощью иглы и шприцев, представленные в заранее заполненных шприцах в виде готовой к использованию презентации или введенных путем электропорации, микроигольных пластырей безигольного пластыря, в виде ингаляционного или назального спреев.
Представленное изобретение раскрывает способы получения и применения композиций, содержащих один или несколько антигенов арбовируса, выбранных из перечня, включающий вирус Зика, вирус Чикунгунья (CHIKV), и вирус японского энцефалита (JEV). При применении в вакцинной комбинации, вакцина может индуцировать иммунный ответ против каждого из вирусов, присутствующего в комбинированной вакцине. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, включающем вакцинную композицию, причем антигены вируса Зика и антигены вируса японского энцефалита присутствуют в комбинированной вакцине в концентрациях, которые находятся в диапазоне от 5 мкг до 50 мкг каждого антигена в фармацевтически приемлемой композиции без адъюванта, или предпочтительно с адъювантом, выбранным из перечня адъювантов, раскрытых в представленном изобретении, предпочтительно гидроксида алюминия с содержанием алюминия от 0,25 мг до 1,5 мг на вакцинную дозу являются раскрытыми. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, раскрыта вакцинная композиция, содержащая антигены вируса Чикунгунья и Зика в композиции, содержащей от 5 мкг до 50 мкг каждого антигена в фармацевтически приемлемой композиции без адъюванта, или предпочтительно с адъювантом, выбранным из перечня адъювантов, раскрытых в представленном изобретении, предпочтительно гидроксида алюминия с содержанием алюминия от 0,25 мг до 1,5 мг на вакцинную дозу.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, раскрыта вакцинная композиция, содержащая антигены вируса Чикунгунья, Зика и JEV в композиции, содержащей от 5 мкг до 50 мкг каждого антигена в фармацевтически приемлемой композиции без адъюванта, или предпочтительно с адъювантом, выбранным из перечня адъювантов, раскрытых в представленном изобретении, предпочтительно гидроксида алюминия с содержанием алюминия от 0,25 мг до 1,5 мг на вакцинную дозу. Применение вакцинной комбинации обеспечивает исключительное экономическое преимущество для производства и распределения вакцин, при условии, что иммунный ответ индуцируется против каждого из антигенов в композиции и никакой антигенной
интерференции не наблюдается ни к одному из антигенов при наличии дополнительного антигена. Вакцинные антигены могут или вводится из одной композиции, или вводится отдельно в одно и то же время или в приемлемые временные интервалы, таким образом, чтобы индуцировать иммунный ответ на общий антиген.
Представленое изобретение также раскрывает применение антител к вирусу Зика для виявления вируса Зика с помощью ELISA или какими-либо иммунодиагностическими способами, где антитела находят применение для выявления или диагностики вирусных инфекций Зика.
Представленное изобретение также раскрывает в данном документе применение антител к вирусу Зика для профилактики и лечения вирусного заболевания Зика.
Сокращения, используемые в изобретение: в.м. - внутримышечный; мкг - микрограмм; ТСШ50 - 50% инфекционная доза культуры ткани; PFU - Бляшкообразующая единица.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Вирусная культура Зика в клетках Vero
Клеточная линия Vero (АТСС No. CCL-81) использовалась в качестве клеточного субстрата для культивирования вируса Зика. Широко охарактеризованные клетки Vero, полученные от BioReliance, USA, использовались в полупромышленых масштабах производства. Клетки Vero выращивали в DMEM (Среда Игла модифицированная способом Дульбекко; Sigma-Aldrich Catalog # D5523, и использовали в соответствии с инструкциями производителя) или ЕМЕМ (Минимальная питательная среда Игла), содержащие 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) или сыворотки новорожденного теленка (NBCS) и инкубировали при 35°С - 37°С до достижения 80 - 100 % слияния монослоя. После инфицирования, использовали такую же среду, содержащую 1% сыворотку, или альтернативно вирус культивировали в клетках Vero, адаптированных к свободной от сыворотки среде. Вирус Зика также может быть выращен в монослое клеток MRC-5, который получали в среде для роста, состоящей из ЕМЕМ, от буферного до нейтрального рН буфером Hepes с 5% сывороткой и статически инкубировали при от 35°С до 37°С в течение от 6 до 8 дней. Вирус Зика культивировали обычным образом в клетках Vero. Вирус Зика штамма MR766 (АТСС VR-84) был адаптирован к клеткам Vero с помощью непосредственной инокуляции в клетках Vero. Альтернативно, вирус был адаптирован в клетках С6/36 Ае. albopictus дважды за счет серийного пассажирования, и вирус Зика в супернатанте культуры по данным клеток использовался для инфицирования клеток Vero. Серийный пассаж вируса Зика в клетках С6/36 культивировали при от 25°С до 28°С, что увеличивало титр вируса выше, чем 10е8,0 ТСШ50/МЛ или 10е8,0 PFU/мл. Это также исключает необходимость следующих повторных пассажей в клетках Vero для получения высоких титров. Адаптация вируса данным способом полезна для достижения высоких титров и последующего более высокого выхода в производстве. Посля культивирования в С6/36 клетках, вирус был серийно дважды бляшко очищен от клеток Vero, и вирус из одной лунки, выделенной бляшки амплифицировали и широко характеризовали, в отношении отсутствия занесенного агента (все известные РНК и ДНК вирусы, бактерии, грибы, микоплазмы и тому подобное) с использованием NGS (Next Generation Sequencing) платформы. Вирусная геномная РНК была секвенирована с использованием NGS платформы, и полная нуклеотидная последовательность штамма MR766 представлена в SEQ Ш N0. 5 и соответствующая расшифрованная аминокислотная последовательность представлена в SEQ Ш NO. 6. Секвенирование показало сайт интактного гликозилирования в протеиновой оболочке, который в
противном случае теряется, если клетки экстенсивно пассированы в клетках млекопитающих. Вирус Зика продуцирует цитопатический эффект (СРЕ) в клетках Vero, и при оптимальной кратности инфекции (Mol), и условиях сбора клеток, могут быть достигнуты титры вирусов выше 10е8,5 ТСШ50/мл или 10е8,5 PFU/мл.
Пример 2: Очистка вируса Зика
Для вирусной культуры Зика в полупромышленном масштабе, вирусная культура была систематически масштабирована из колб Т-175 в CS1 (клеточный стек 1), CS10 (клеточный стек 10) и CS40 (клеточный стек 40). Количество CS40 одновременно инфицированных вирусом в стандартизированном Mol, использовали для масштабирования производства. Использование коэффициентов CS40 позволяет быстро и линейно масштабировать вплоть до желаемых объемов производства. Объем сбора клеток от каждого CS40 составлял приблизительно 8-10 л. Вирус собирали через 4-6 дней или когда было достигнуто более, чем 90% СРЕ. Альтернативно, одноразовые биореакторы в хорошо стандартизированных условиях температуры от 35 °С до 37 °С, рН не менее, чем 7,0, и оптимально при рН 7,4, при растворенном кислороде в количестве от 45 до 75 м.ч., предпочтительно 60 об./мин. и перемешивании от 240 до 280 об./мин. и оптимально контролируемой скорости входящего потока и исходящего потока, оптимизированной в соответствии со шкалой объема культуры от 1 л до 100 л использовались для увеличения плотности клеток и сбора вируса. Собранные вирусные клетки осветляли или применяя микрофильтрацию или с использованием двойных фильтров с отсечением 1,2 мкМ и 0,45 мкМ. Осветленные собраны вирусные клетки затем пропускали через колонку Capto Core700 (GE healthcare Life Sciences) в фосфатном буферном солевом растворе, рН 7,4. Фракции, содержащие вирус Зика в потоке необязательно концентрировали, применяя диафильтрацию с использованием или 100 кДа, или 300 кДа отсечения мембран. Концентрированную вирусную фракцию использовали для инактивации вируса. Альтернативным способом, осветленные собранные вирусные клетки были инактивированы или BPL или формалином согласно способов, описанных в следующих разделах, и затем загружали в колонку. Чистоту вируса проверяли на 12,5% SDS-PAGE. Отсутствие существенной разницы в выходе или в чистоте при инактивации вируса до и после очистки. Вирус также может быть очищен с использованием целюфинсульфата, DEAE-Сефадекс СМ-сефадекс с градиентом соли и с использованием гель-фильтрации на сефарозе CL-4B, керамической гидроксиапатитной колонки с градиентом от 0,2 М до 0,8 М фосфата и во всех случаях с последующей диафильтрацией с использованием мембран с отсечением 100 или 300 кДа. Чистоту препарата вируса проверяли с помощью окрашивания серебром образца вируса в 12,5% SDS-PAGE геле (смотрите фигуру 1). Вирус Зика с использованием указанных выше способов может быть очищен до высокой чистоты, приемлемой для использования в качестве вакцинного основного антигена. Вирус также может быть очищен путем ультрацентрифугирования на 20-60% градиенте сахарозы с использованием ротора P28S Hitachi HIMACultracentrifuge после центрифугирования при 100 000 х г в течение от 6 до 8 часов.
Пример 3: Инактивация вируса Зика
Образец вируса Зика был инактивирован (убит) различными способами для применения в качестве вакцинных антигенов. Инактивацию формалином исследовали при различных концентрациях, находящихся в диапазоне от 1:1000 (формалин : вирус, об./об.) до 1: 4000 (формалин : вирус, об./об.) при температуре 25±5 °С, более конкретно при 22 °С и кинетику инактивации вируса контролировали каждые 24 часа в течение вплоть до 10 дней, и обычным образом инактивацию вируса осуществляли при 25 ± 3 °С, предпочтительно при 22 иС в течение 7 дней. Инактивация вируса была эффективной при всех концентрациях от 1:1000 об./об. формалин : вирус, вплоть до 1:3500 об./об. формалин : вирус, при указанных выше температурах и временных интервалах. Соотношение 1:4000
об./об. формалин : вирус было эффективным при инактивации вируса при более высоких температурах вплоть до от 30 до 37°С в течение от 3 до 7 дней. Инактивация формалином была эффективной при всех указанных выше соотношениях формалина к вирусу при температурах, находящихся в диапазоне от 2 до 8 °С, при инкубировании в течение временных интервалов длиннее чем 10 дней. Следовательно, инактивация формалином обеспечивает гибкость инактивации вируса при любой температуре от 2 °С до 37 °С, в временных интервалах, находящихся в диапазоне от 24 часов до более, чем 10 дней в зависимости от условий, используемых для инактивации. Инактивация вируса Зика бета-пропиолактоном (BPL) исследовалась в различных условиях. Вирус Зика был полностью инактивирован при концентрациях BPL, находящихся в диапазоне от 1:1 ООО (BPL : вирус, об./об.) вплоть до 1: 3500 (BPL : вирус, об./об.) при температуре 25±5 °С в течение от 24 до 48 часов. При более высокой концентрации BPL или при более высоких температурах вплоть до 37 °С, полная инактивация достигалась через 24 часа или меньше, и может использоваться в качестве способа для быстрой инактивации вируса. Вирус Зика мог также быть инактивирован при указанных выше концентрациях BPL, при инкубировании при от 2 до 8 °С в течение от 3 до 7 дней. Инактивация комбинацией BPL при 1:3500 (BPL : вирус, об./об.) при 22-25 °С в течение 48 часов, с последующей обработкой с низкими концентрациями формалина от 1:3000 до 1: 4000 об./об. формалин : вирус в течение 24 часов была эффективной как при инактивации, так и стабилизации вируса. Любая концентрация BPL и формалина могла бы использоваться как для инактивации, так и стабилизации вируса, при условии, что инактивация является полной без негативного влияния на иммуногенность. Инактивацию исследовали от 0,005% вплоть до 3% конечной концентрации пероксида водорода при от 20 °С до 25°С в течение периода времени 2 часа. Не существовало никакого негативного влияния на иммуногенность вируса при более низких концентрациях пероксида водорода с очень коротким временем экспозиции в пределах минут, но негативное влияние существовало при длительной концентрации при более высоких дозах исследуемых диапазонов. Инактивированные вирусные образцы после экспозиции в течение разного времени, и концентрации дозы титровали в отношении инфекционных вирусных частиц, если такие были, по ТСШ50/мл от 5 минут вплоть до 6 часов с интервалами 5, 10, 20, 30 и 60 минут и при 2, 4 и 6 часов. При более высоких концентрациях, вирус был инактивирован в пределах секунд. В каждый момент времени реакция была остановлена путем добавления 10 ед./мл каталазы, которая быстро гидролизирует пероксид водорода. Оптимальная концентрация для инактивации составляла 0,01% конечной в течение продолжительности 60 минут или меньше, чем определялось титрованием для инфекционных частиц с использованием ТСШ50/мл и последующей иммуногенности. Инактивация вируса Зика пероксидом водорода обеспечивает гибкость продолжительности экспозиции в различных концентрациях в течение разных временных точек в соответствии с концентрацией вирусных частиц в образце.
Образец очищенного вируса Зика был инактивирован нагреванием при температурах от 50иС до 65иС в течение вплоть до 60 мин. Инактивацию вируса УФ осуществляли экспозицией УФ при 254 нм в течение вплоть до 120 минут.
Вирус Зика был инактивирован гамма-облучением путем экспозиции от 20 кГр (Кило Грей) вплоть до 35 кГр из 60Со источника в Gamma Agro Medical Processing Facility в Hyderabad. Все указанные выше способы инактивации осуществляли в присутствии и при отсутствии стабилизирующих вирус агентов, таких как различные концентрации Сахаров, таких как сахароза, лактоза, трегалоза, мальтоза, манноза среди прочего. Сахарные спирты, используемые для обеспечения стабилизирующего эффекта, представляли собой сорбит и маннит. Исследуемые аминокислоты были выбраны из L-гистидина, L-глутаминовой кислоты, L-глицина и L-аспарагиновой кислоты и L-глютамина и также
альбумина сыворотки человека и комбинации с одним или несколькими из указанных выше стабилизирующих агентов. Наиболее эффективные стабилизирующие агенты представляли собой сорбит при от 0,5% до 2%, предпочтительно 1,0% в комбинации с L-глицином от 0,5% до 2%, предпочтительно при 0,5%. Маннит и L-глицин в комбинации были эффективными относительно стабилизирующего вирусного образца во время инактивации в отличии от маннита и L-глицина самостоятельно.
Образцы вируса Зика, инактивированные всеми указанными выше способами для применения вакцинных антигенов, исследовали в отношении завершенности инактивации путем серийного пассирования инактивированных образцов три раза серийно в клетках Vero и исследование относительно инфекционного вируса в конце периода инактивации с помощью ТСШ50. Кроме того, образец инактивированного вируса после трех серийных пассажей in vitro вводили инъекционно внутричерепно мышам в возрасте 2 дня и наблюдали за смертностью или аномалиями роста в течение 21 дня и считались полностью инактивированными, в случае когда они не показывали никаких неблагоприятных эффектов в исследовании in vitro и in vivo. Никакая инфекционность не наблюдалась с инактивированными формалином и бета-пропиолактоном вирионами при указанных выше в диапазоне концентраций и в течение различных исследуемых периодов времени. Кинетика инактивации вируса Зика формалином и BPL как репрезентативный пример одного из способов, раскрытых выше, представлена на фигуре 2 (Фиг. 2А и Фиг. 2В).
Пример 4:Рекомбинантное клонирование и экспрессия протеина pRME вируса Зика
Синтетический ген нуклеотидной последовательности SEQ Ш NO. 1 кодирующей открытую рамку считывания (ORF) ргМЕ протеина SEQ Ш NO. 3 вируса Зика, был синтезирован в GenScript, NJ, USA. Ген ПНР амплифицировали с использованием праймеров, перечисленных ниже для получения ~ 2,1 т.п.н. фрагмента SEQ Ш NO. 1 кодирующего протеин ргМЕ SEQ Ш NO. 3. Смотрите фигуру ЗА.
FVFP: 5'AACTGCTCGAGGAATTCGGATCCAAC 3' FVRP: 5' AATGGGCATGCCTGCAGGCGGCCGCTC 3'
Амплифицированные ПЦР фрагменты были расщеплены рестрикционными ферментами EcoRl и Notl и клонированы в сайтах EcoRl и Notl плазмидного вектора pFastBac (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) под контролем полиэдроидного промотора способами, описанными в руководстве пользователя Вас-Вас бакуловирусной системы экспрессирования ("An efficient site-specific transposition system to generate baculovirus for high-level expression of recombinant proteins, Life Technologies, USA). Коротко говоря, способ использует сайт-специфическую транспозицию экспрессионной кассеты, такой как рекомбинантный вектор pFastBac с клонированными вставками, как описано выше, в бакуловирусный шаттл-вектор (bacmid), который распространяется в E.coli. Рекомбинантный вектор pFastBac, содержащий одну из вставок SEQ Ш NO. 1 или SEQ Ш NO. 2, клонированных под контролем полиэдроидного промотора, трансформируется в компетентные клетки E.coli с максимальной эффективностью DHlOBac(tm), содержащий бакуловирусный шаттл-вектор (bMON14272) и хелперную плазмиду (pMON7124), облегчающую транспозицию, чтобы разрешить эффективное повторное получение рекомбинантной bacmid. Рекомбинантные bacmid были выбраны относительно ампициллина, гентамицина и канамицина, содержащие планшеты с использованием голубого/белого отбора с использованием bluo-gal или X-gal, и IPTG. Рекомбинантные bacmids после подтверждения с использованием ПЦР относительно присутствия генных вставок были выделены по стандартным протоколам, описанным в указанном выше руководстве пользователя. Приблизительно 1 мкг bacmid ДНК использовали для
трансфекции с липофектамином в Spodoptera frugiperda Sf9 клетках насекомых (Life Technologies, Carlsbad, USA), выращенных в сыворотке свободной от клеток насекомых среде. Способы, используемые для трансфекции, выделения и титрования Р1 вирусных исходных растворов точно описаны в руководстве пользователя относительно Вас-Вас бакуловирусной системы экспрессирования, как указано выше. Р1 исходные растворы серийно амплифицировали дважды, для получения РЗ исходных растворов с высоким титром для экспрессии рекомбинантных ргМЕ протеинов в Sf9 клетках. Бакуловирусные исходные растворы с высоким титром для экспрессии протеина ргМЕ SEQ Ш No. 3 экспрессировали в 25 мл суспензии культуры Sf9 клетки и затем систематически масштабировали вплоть до 125 мл на 500 мл колбу. Бакуловирусные инфицированные клетки из нескольких колб собирали через 72 часа после инфицирования, объединяли, промывали один раз 1 х PBS, рН 7,6 и лизировали буфером для лизиса клеток, содержащий 10 мМ фосфата, рН 7,6 с 50 мМ NaCl, 1 мМ PMSF и 5 мМ ЭДТУ. Клеточный лизат центрифугировали при 20 000 об./мин. в течение 30 минут, для удаления клеточного дебриса, и супернатант концентрировали с использованием протеиновых концентраторов с 10 кДа мембранным отсечением. Концентрированный образей наслаивали на предварительно уравновешенном градиенте сахарозы от 20% до 60% и центрифугировали при 100 000 х г в течение 6-8 часов. Фракции, содержащие рекомбинантный мембранный протеин и протеин оболочки выделяли и подтверждали, применяя вестерн-блоттинг (Фиг. ЗВ) с использованием кроличьей MR766 поликлональной антисыворотки. Очищенный рекомбинантный протеин представляет собой последовательность современного азиатского генотипа вируса Зика, экспрессирующего с использованием гена последовательности SEQ Ш NO. 1, кодирующего протеин SEQ Ш No. 3. Рекомбинантный ME протеин перекрестно взаимодействовал с MR766 антителами в Вестерн-блоттинге и в ELISA и был сформулирован, как вакцинный антиген для исследования на мышах Balb/c как описано в разделах ниже.
Пример 5: Вакцинные композиции
Антиген вакцины против вируса Зика любого из указанных выше способов в предыдущих примерах исследовался относительно иммуногенности на лабораторных животных с и без адъювантов. Наблюдался высокий уровень связывания (> 95%) с гидроксидом алюминия (Alhydrogel(r) 2%, Brenntag) как адъювантом, используемым в дозе в диапазоне от 0,1 мг до 1,5 мг алюминия (представлен в качестве гидроксида алюминия) на дозу даже в исследовании с высокой дозой антигена 40 мкг. Связывание было полным во всех концентрациях антигенов вируса Зика, а также вакцинных комбинациях с CHIKV и ТЕ антигенами, обсуждаемых в следующих разделах, которые использовались для исследования на мышах. Связывание с гидроксидом алюминия осуществляли в течение трех часов при температуре окружающей среды. Аликвоту композиции центрифугировали при 5000 х г в течение 5 мин., и супернатант исследовали относительно полноты связывания антигеном ELISA. Связывание антигена было полным, поскольку не был обнаружен в супернатанте с использованием ELISA. Буфер для адъювантных композиций представлял собой 10 мМ фосфатный буфер, содержащий 154 мМ NaCl, рН 7,40 ± 0,2 и необязательно содержащий 1% сорбита и 0,5% L-глицина. Другие буферы, используемые для специфических композиций приведены ниже. Адъюванты, представленные ниже исследовались относительно сравнительной иммуногенности и во всех случаях концентрации предусмотрены на дозу вакцины. Инактивированный вирусный антиген Зика исследовали при 10 мкг на дозу:
a) Инулин (Orafti-HPX, Beneo) исследовали при 0,5 мг на дозу; гамма инулина получали способами, описанными в (Cooper и Steele, 1988).
b) Комбинация гидроксида алюминия и инулина. Комбинация инулина и гидроксида алюминия, альгамулина получали в соотношении 10:1 (10мг /мл инулина : 1 мг/мл алюминия в виде гидроксида алюминия) исследовали при 0,5 мг на дозу.
c) Мумарилдипептид (L18-MDP) (tlrl-Imdp, Invivogen) при 10 мкг на дозу.
d) MPL (липид А, монофосфорил из Salmonella enterica, L-6895-1 МГ, Sigma Aldrich) при 25 мкг на дозу.
e) Комбинация с 0,25 мг алюминия (в виде гидроксида алюминия) и 25 мкг MPL на дозу.
f) Эмульсия масло-в-воде (OWEM1), содержащая 9,75 мг сквалена (S3626-100ML, Sigma Aldrich), 11,86 мг альфа-токоферола (T3251-5G, Sigma Aldrich), 4,58 мг Твин-80 (61771205001730, Merck) в 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,4±0,2.
g) Эмульсия масло-в-воде 3 (OWEM2), содержащая 9,75 мг сквалена, 1,175 мг твин-80, 1,175 мг Span-85 (S7135-250ML, Sigma Aldrich) в 10 мМ цитратном буфере, рН 7,0.
h) Поли-IC (полиинозиновая полицитидиловая кислота, калиевая соль, Cat. NO. Р9582-5МГ, Sigma Aldrich) при 25 мкг на дозу.
i) Холекальциферол (Arachitol, Abbot) при 0,75 мг на дозу.
j) Резиквимод (SMJI0196-10Mr, Sigma Aldrich) + Поли 1С, 25 мкг каждого.
к) Резиквимод (25 мкг) + Эмульсия масло-в-воде 2, содержащая 9.75 мг сквалена,
1,175 мг твин-80, 1,175 мг Span-85 (87135-250МЛ, Sigma Aldrich) в 10 мМ
цитратном буфере, рН 7,0. 1) Алюминия 0,25 мг и 0,5 мг на дозу, предоставленную в виде гидроксида алюминия.
Все указанные выше композиции индуцировали высокий уровень нейтрализующих антител, и результаты изображены на Фигуре 4. Отдельные компоненты указанных выше адъювантов и любого из их аналогов, производных, замещенных боковых цепей и каких-либо модификаций любого из указанных выше компонентов при варьировании концентраций могут использоваться в качестве нетоксичных вакцинных адъювантных компонентов при условии, что они имеют имунопотенциальный эффект. Инактивированные формалином и рекомбинантные вакцинные антигены Зика, как описано в указанных выше разделах, каждый в концентрации от 10 мкг на дозу были лиофилизированы в комбинации с одним из следующих эксципиентов: 1% маннит и 0,5% глицин, 5% сахароза и 1% трегалоза, 5% сахароза и 1% мальтоза и 2% маннит и 0,5% глицин. Сухая лиофилизированная композиция может быть легко восстановленна в водном растворе с водой, нормальным солевым раствором и 10 мМ фосфатным буферным солевым раствором, рН 7,4±0,2. Стабильность композиции исследовали при 37 °С в течение двух недель. Никаких изменений в характеристиках коржа не наблюдалось, что свидетельствует о стабильности композиций. Содержание влаги составляло ниже 1%.
Пример 6: Влияние стабилизирующих агентов
Стабильность инактивированной формалином вакцины, основной для применения в качестве неадъювантного вакцинного антигена исследовали относительно стабильности с последующей концентрацией стабилизирующих агентов: а) 2% сорбит и 1% L-глицин; Ь) 1% сорбит и 0,5 % L-глицин с) 1% маннит и 0,5% L-глицин; d) 1% маннит и 0,5% L-глутаминовая кислота; е) 1% сорбит и 0,5% L-глицин, 1% альбумин сыворотки человека. Исследования стабильности осуществляли при 37иС в течение 2 недель, и концентрацию антигена исследовали с использованием ELISA перед и после экспозиции при 37 °С. 1 мкг и 10 мкг неадъювантной композиции с 1% сорбита и 0,5% L-глицина исследовали относительно иммуногенности на мышах Balb/c, как обговоривалось в следующих разделах.
Пример 7: Исследование эффективности вакцинных композиций в моделях на животных
Вакцинный антиген Зика, инактивированный указанными выше способами, исследовали на мышах Balb/c с дозами в диапазоне от 0,125 мкг вплоть до 40 мкг антигена на дозу с 0,25 мг алюминия на дозу (в виде гидроксида алюминия) в объеме 100 мкл (инъекции в два места по 50 мкл на место) внутримышечным способом в дни 0, 14, 28. Первоначальное исследование относительно эффекта алюминия (представленного в виде гидроксида алюминия) показало, что адсорбированная на алюмокалиевых квасцах вакцина давала более высокий титр нейтрализующих антител, чем неадъювантная вакцина. Приблизительно 1 и 10 мкг инактивированного вакцинного антигена без алюмокалиевых квасцов содержал 1% сорбита и 0,5% L-глицина в качестве эксципиентов, для обеспечения стабильности вакцинных антигенов. Кровь была взята из ретро-орбитального синуса на 13, 21 и 35-ый день для оценки титров нейтрализующих антител с использованием PRNT50, общий АЬ титр с использованием ELISA, Ab авидность и профили цитокинов. Отбор крови и исследование после каждой дозы давало данные относительно эффективности и безопасности однократного введения, двух доз и трех доз вакцинных препаратов. Животные в каждом случае были контрольно заражены на 36-й день 10е5 PFU вирусом Зика внутривенным способом. Образцы крови контролировали в течение вплоть до 7 дней с 24 часовыми интервалами для группы формалина и в двух точках в 48 часов и 96 часов для группы инактивации BPL для защиты от вирусемии ТСШ50 (50% Доза инфекции культуры ткани) и вирусные титры, если какой-либо присутствует, были выражены как ТСШ50/МЛ. Исследование контрольного заражения животных показали полную защиту от вирусемии при от 1 мкг до 40 мкг дозы в исследуемых группах. Следовательно, инактивированные BPL и формалином вакцинные композиции дополнительно исследовали в количестве 0,5 мкг, и 0,25 мкг, 0,125 мкг на дозу в.м. способом мышам Balb/c и, как было обнаружено, является иммуногенным даже при малых разведениях. Для адъювантных алюмокалиевыми квасцами композиций, 0,25 мг алюминия (в виде гидроксида алюминия) на дозу использовалась в качестве контроль-плацебо и для неадъювантных композиций, 10 мМ фосфатный буфер, содержащий 154 мМ NaCl, 1% сорбита и 0,5% L-глицина, рН 7,40 использовался в качестве контроля носителем. Все инактивированные формалином и BPL композиций индуцировали высокий уровень нейтрализующих антител и защищали от вирусемии как показано на Фиг. 5А, Фиг. 5В и Фигуре 6. Только антигенные композиции также индуцировали высокий уровень нейтрализующих антител и защищали при вирусном контрольном заражении. Рекомбинантный протеин ргМЕ, экспрессированный в клетках насекомых, был сформулирован в двух дозах 10 и 20 мкг на дозу с 0,25 мг алюминия (в виде гидроксида алюминия) на дозу у Balb/c (8 мышей) и инъекционно вводили внутримышечно на 0-ой день и 21-ый день индуцировали нейтрализующие антитела и данные представлены в таблице 1. Гамма облученный и инактивированный пероксидом водорода вирусный антиген Зика в дозовой концентрации 10 мкг и сформулированы с 0,25 мг алюминия (в виде гидроксида алюминия) на дозу инъекционно вводили в.м. способом мышам Balb/c на 0-ой день и 21-ый день, и кровь брали на 28-ой день для оценки нейтрализующих антител с помощью PRNT50. Инактивированный формалином вирусный антиген в количестве 10 мкг был сформулирован с каждым из адъювантов, раскрытых в Примере 5 и инъекционно вводили внутримышечно мышам Balb/c в возрасте 4-6 недель (5 мышей на группу дозирования), и кровь брали через 21 день после введения вакцины для оценки нейтрализующих антител и цитокинов. Контрольные группы были включены для каждого из адъювантов, и никакие нейтрализующие антитела ( < 10 по PRNT50) не могли быть детектированы, и данные не отображаются. Нейтрализующие титры антител по PRNT50 различных адъювантных композиций, использованные сгруппированные сыворотки из каждой группы представлены на Фигуре 4. Высокий уровень нейтрализующих антител был индуцирован указанными выше адъювантными композициями.
Комбинированные вакцины антигенов арбовируса получали со следующими концентрациями и исследовали на мышах Balb/c: а) 10 мкг инактивированного формалином вирусного антигена Зика, 20 мкг инактивированного BPL антигена вируса Чикунгунья и 6 мкг инактивированного формалином антигена JE в трехвалентной вакцинной комбинации; Ь) 10 мкг инактивированного формалином вирусного антигена Зика и 20 мкг инактивированного BPL антигена вируса CHTKV; с) 10 мкг инактивированного формалином вирусного антигена Зика и 6 мкг антигена вируса JE. Все перечисленные выше вакцинные комбинации исследовали с 0,25 мг алюминия (в виде гидроксида алюминия) на дозу мышам Balb/c (8 мишей каждая) с соответствующими контролями, в которые включены или указанные выше антигены самостоятельно, и также контрольные животные, получающие эквивалентное количество алюмокалиевых квасцов. Животных повторно иммунизировали на 14-ый и 21-ый день после первой иммунизации. Кровь брали через 7 дней после последней инъекции. Образцы сыворотки использовали для оценки нейтрализующих антител с помощью PRNT50 для Зика, CHTKV и JEV. Буфер, используемый во всех композициях, представлял собой 10 мМ фосфатный буфер, рН от 7,2 до 7,6, содержащий 154 мМ NaCl. Все способы, раскрытые выше, применимы к любому генотипу/генотипных вариантов/серотипов и штаммов вируса Чикунгунья, вируса Зика и вирусов японского энцефалита. Смотрите таблицу 1 относительно результатов.
Таблица 1 Легенда: Очищеный рекомбинантный ргМЕ антиген вируса Зика и инактивированные пероксидом водорода и гамма ооблученные антигены вируса Зика, сформулированы с 0,25 мг алюминия на дозу, индуцировали нейтрализующие антитела у мышей Balb/c. Титры выражаются в виде значения Logl0PRNT50. Вакцинные комбинации индуцировали нейтрализующие антитела, когда два или более антигенов были введены в одну композицию, и никакой значительной антигенной интерференции не наблюдалось между вирусами JE, Зика и CHIKV.
Пример 8: Исследование пасивной иммунизации
Доказательство концепции, что нейтрализующие антитела являются важными иммунными коррелятами защиты против вирусной инфекции Зика, было продемонстрировано одноразовой инъекцией кроличьей поликлональной антисыворотки Зика с известным титром, приблизительно 200 мкл антисыворотки разбавленного 1:1 с PBS инъекционно внутрибрюшинно вводили мышам Balb/c и были контрольно заражены через 8-24 часов после 10е5 PFU вируса Зика внутривенным способом в объеме 100 мкл. Одинаковое количество контрольных животных получало PBS, рН 7,4 и получало инъекцию вируса в качестве исследуемых животных. Кровь брали через 24, 48, 72, 96 и 144 часов после вирусного контрольного заражения для обнаружения вирусемии в обеих группах животных. Пассивная иммунизация осуществляла полную защиту против вирусемии, и инфекционный вирус не мог быть обнаружен с использованием ТСШ50. Смотрите фигуру 7. Вирусемия была обнаружена у контрольных животных, которые сохранялись в течение вплоть до 6 дней после вирусного контрольного заражения. Антитела Зика могут использоваться в качестве терапевтических средств для смягчения, уничтожения или предотвращения вирусных инфекций Зика.
Пример 9: Анализы титров нейтрализующих антител
Сыворотки животных из всех указанных выше исследований вакцины у мышей, описанных в Примере 7, включающие все моновалентные вакцины Зика, инактивированные различными инактивирующими агентами и сформулированные с различными адъювантами, вакцинные антисыворотки из дозы, находящейся в диапазоне от исследований, а также комбинированные вакцины с CHIKV и JEV, описанные в предыдущих разделах, анализировали для нейтрализующих антител относительно 50% реакции нейтрализации бляшкообразования (PRNT50) по стандартизированным процедурам. Коротко говоря, за один день до анализа 6-луночные планшеты высевали с 2,5 х 103 клетками Vero (АТСС CCL-81) на лунку, и планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 инкубаторе. До 4-кратных разбавлений образцов сыворотки в MEM, содержащие одинаковый объем стандартизированного штамма вируса Зика (105 pfu/мл) добавляли и инкубировали при 37°С с 5% СО2 в течение 90 минут. Клетки промывали дважды 1 х PBS рН 7,4 (10 мМ фосфата с 150 мМ NaCl), и добавляли 0,30 мл каждого разбавления смеси сыворотка-вирус в соответствующие лунки и инкубировали в течение 90 минут при 37 °С в 5% СО2 инкубаторе. Каждый анализ осуществляли в трех повторах. Клетки были наложенными на 2 мл 0,85% метилцеллюлозы в MEM с 1% пенициллина-стрептомицина и 1% L- глютамина. Планшеты инкубировали при 37°С в 5% СО2 инкубаторе в течение 4 дней. В конце инкубирования, бляшки фиксировали 10% формалина, промывали 1 х PBS, рН 7,4 и визуализировали с 0,1% кристаллическим фиолетовым. Высшее разбавление сыворотки, что приводило к 50% уменьшению количества бляшек, сформированных контрольным образцом вируса оценивали как титр PRNT50. Анти-CHIKV и анти-JE антитела из вакцинных комбинаций также оценивали PRNT50. Все указанные выше вакцинные антигены индуцировали высокий уровень нейтрализующих антител как изображено на Фигурах 5 и 6.
Пример 10: Исследование перекрестной нейтрализации вируса Зика
Инактивированные формалином вакцинные антисыворотки перекрестно нейтрализованы гомологичным штаммом вируса MR766 африканского генотипа и штаммом FSS13025 вируса Зика (GenBank Асе No. JN860885) азиатского генотипа с одинаковой эффективностью титров PRNT50 18105 и 18325 против штаммов MR766 и FS13025, соответственно. (Исследование BS-3018 были предусмотрены контрактом ШТ Bioservices, Gaithersburg, MD, USA). Коротко говоря, как MR766, так и штаммы FS13025 вируса Зика разбавляли до ~ 250 PFU в среде без сыворотки. Как вакцинные антисыворотки, так и
контрольные сыворотки (плацебо) серийно разбавляли в двукратных разделениях. Вирусные образцы смешивали 1:1 с серийно разбавленными образцами сыворотки и инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Клетки Vero, высеянные в 24-луночные планшеты, инфицировали разбавлениями в течение 1 часа, и 0,85% метилцеллюлозы добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 3 дней. Клетки фиксировали и анализировали с использованием анализа бляшек. Планшеты сканировали, и количество бляшек использовали для расчета титров PRNT50 с использованием кривой 4PL. Следовательно, способ получения вакцинного антигена, формуляции и исследования вполне перекрестно применяемы к любому генотипу вируса Зика, как вакцины с одним генотипом 100% перекрестно нейтрализуют гетерологичный штамм, и это также доказывает, что никаких серотипов вируса Зика не существует и что инактивированная вакцина Зика с использованием любого штамма будет одинаково защитной и эффективной как вакцина, полученная с использованием любого генотипа, и генотипического варианта или, более того, любого штамма вируса Зика. Данный факт был дополнительно подтвержден, когда антитела, индуцированные против рекомбинантного протеина, экспрессированного как ргМЕ (протеин SEQ Ш No. 3) в клетках насекомых перекрестно нейтрализованых вирусом MR766 с высокой эффективностью. Протеин SEQ Ш No. 3 получен из ргМЕ африканского генотипа штамма вируса Зика H/PF/013, который является более современным штаммом азиатского генотипа. Перекрестная нейтрализация вакцинной антисыворотки гомологического штамма MR766 нуклеотидной SEQ Ш N0. 5, кодирующая полный ORF с SEQ Ш N0. 6 и гетерологичный FSS13025 с SEQ Ш No. 7, кодирующая полный ORF с SEQ Ш N0. 8 изображены на Фигуре 8А и Фиг. 8В.
Пример 11: ELISA для антител
Коротко говоря, вирусный антиген Зика был нанесен со стандартизированной концентрацией в буфере для покрытия в 96-луночных планшетах в течение ночи при от 2 до 8°С. Содержание планшета отбрасывали, и лунки блокировали блокирующим буфером и интенсивно промывали перед добавлением вакцинных антисывороток при серийных разбавлениях. Каждую вакцинную антисыворотку анализировали в трех повторах. Планшеты инкубировали в течение 90 мин. при 37°С, перед добавлением вторичного антитела (анти мышиный-IgG HRPO конъюгат) разбавленного 1: 2500 в буфере для разбавления антитела. Каждую из лунок промывали пять раз промывочным буфером (PBST, рН 7,4) и три раза PBS (рН 7,4), каждые 30 секунд. Добавляли приблизительно 100 мкл/лунку свежо полученного субстратного раствора и инкубировали при температуре окружающей среды в течение 10 минут для развития цвета. Развитие цвета останавливали добавлением 50 мкл/лунку раствора для остановки. Поглощение считывали на 492 нм, и результаты были записаны. Для каждого анализа были включены антигенный контроль, контроли первичного и вторичного антитела, в качестве контролей. Значение отсечения сероконверсии = средний титр перед экспозицией + (3 х стандартное отклонение). Идентифицированными были разбавления конечной точки положительно сероконвертированного образца, который показывает титр эквивалентный уровню перед экспозицией. Обратная зависимость предпоследнего разбавления конечной точки положительно сероконвертированного образца интерпретировали как титр конечной точки антитела. Титры антител как инактивированных BPL, так и инактивированных формалином вакцинных композиций Зика были более высокими с гидроксидом алюминия, чем с антигенами самостоятельно. Вакцинные композиции, инактивированная формалином вакцина во всех дозах (Фиг. 9А-9С) и все дозы инактивированной BPL вакцины (данные не показаны), индуцировали высокий уровень антитела, после введения каждой дозы вакцины, что подтверждает то, что вакцина может вводиться в качестве одноразовой дозы или двумя или более дозами для индуцирования надежного иммунного ответа против вируса Зика.
Пример 12: Авидности антител
Качество антительных ответов на вакцину оценивали с использованием анализов авидности антител. Авидности связывания антиген-антитело представляют собой степень созревания аффинности в В-клетках. Более высокие авидности антитела коррелируют с нейтрализующими антителами в нескольких вакцинных исследованиях. Перед определением индекса авидности, проводили титрование изотиоцианатом натрия (NaSCN) с концентрацией от О М до 6 М в 0,25 М ступени от 0 до 2,0 М. После добавления и инкубирования первичной антисыворотки в планшеты, покрытые антигеном, планшеты инкубировали с калиброванными концентрациями NaSCN в течение 15 мин. с периодическим перемешиванием, промывали и развивали как в обычном ELISA. Полученные оптические плотности для каждой из концентраций наносили на график. Самый высокий показатель OD (А) был нанесен на график и поделен пополам (А/2), и расстояние между кривыми OD при А/2 измерялось как значение смещения NaSCN. Смещение NaSCN было более высоким после первой бустерной дозы по сравнению с основной дозой и оставалось статичным или немного увеличивалось после введения второй бустерной дозы, что свидетельствует о том, что антитела с высокой аффинностью развиваются со временем и с инъекциями бустеров. Референтной точкой в титровании ELISA была взята для вычисления индекса авидности, (AI]), которая представляет собой соотношение концентрации антитела (измеряемого поглощением) в ELISA, детектировали образцы сыворотки, обрабатывали с и без агента, который вызывает диссоциацию комплексов NaSCN. Даже при низкой концентрации однократной дозы 1 мкг инактивированной формалином вакцины Зика, детектировали антитела с высокой аффинностью связывания с антигеном, что свидетельствует о том, что вакцина является сильной даже при низких концентрациях вакцинного антигена (Смотрите Фигуру 10).
Пример 13: Профилирование цитокинов
Как ТЫ, так и Th2 цитокины оценивали в мышиных сыворотках после введения двух доз инактивированного формалином антигена Зика, сформулированного с различными адъювантами, включающими гидроксид алюминия и только в антигенных контролях для сравнения. Мышиный набор ELISA - ТЫ / Th2 (Catalog No. 88-7711-44, eBioscience) использовали для оценки IL-2, IFN гамма, IL-4 и IL-10 способами точно такими же, как в протоколах к набору с использованием стандартов, предоставляемых в наборе. Концентрация цитокинов выражается в пг/мл. Результаты относительно уровней цитокина ТЫ изображены на Фигуре НА и Фиг. 11В и цитокинов Th2 на Фиг. 12А и Фиг. 12В.
Пример 14: Оценка титров вирусов
Количество инфекционных вирусных частиц в образцах биопроцесса в обратном направлении и в прямом направлении, титры вируса Зика для исследований контрольного заражения животных измеряли, применяя анализ ТСШ50 (50% доза инфекции культуры ткани). Данный анализ измеряет разбавление образца вируса, который генерирует цитопатический эффект (СРЕ) у 50% клеток. Клетки Vero высевали в 96-луночные микропланшеты и инкубировали в 5% С02 при 37°С в течение ночи. Клетки инфицировали 10-кратными серийними разбавлениями образца вируса, с последующим инкубированием в течение 5 дней в 5% С02 при 33°С. Клетки визуально обследовали по СРЕ, и титр ТСШ50 рассчитывался согласно способу Рида и Мюнча (ссылка). Результаты представлены как loglO титра (10хТСШ50 единицы/мл). Альтернативно использовали анализы бляшек, и титры выражали в качестве бляшкообразующих единиц, PFU/мл.
ССЫЛКИ
1. Cooper PD, Steele EJ. The adjuvanticity of gamma inulin. Immunol Cell Biol. 1988,
66:345-52.
2. Reed LJ. Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol. (1938) 27 (3): 493-497
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> BHARAT BIOTECH INTERNATIONAL LIMITED
<120> ВАКЦИННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ АБРОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
<130> P 15-309-IN
<140> 3652/CHE/2015 <141> 2015-07-16
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2121
<212> ДНК
<213> prME, Зика Азиатский генотип
<400> 1
ctcgaggaat tcggatccaa ctcctaaaaa accgccacca tggcagatac cagcgtcggc 60
atcgtcggac tcttgttgat taccacggca atggcagcag aagtgacccg caggggcagc 120
gcctactaca tgtacctcga caggaacgat gcgggagagg ctatcagctt ccctaccact 180
ttgggcatga acaagtgtta catccagatt atggacctgg gtcacatgtg cgatgctacc 240
atgtcttacg aatgtcctat gctggacgag ggcgtggaac ccgacgatgt cgattgctgg 300
tgtaacacaa cgagtacttg ggtggtgtac ggtacatgtc accataagaa aggtgaagct 360
aggcgttcga ggagagctgt gacgctcccc agtcactcga ccaggaagtt gcagactaga 420
agtcaaacat ggctggagtc gcgcgaatac acaaaacatc tgatcagggt cgaaaactgg 480
attttcagaa accctggatt cgctctcgct gccgcagcga tcgcttggct gctcggttcc 540
agcacctccc aaaaggttat ttacctggtc atgatcttgc tgattgctcc cgcctactcc 600
atccgctgca ttggcgttag caaccgtgac ttcgtggagg gaatgagcgg tggcacttgg 660
gtggatgttg tgttggaaca cggaggttgt gtcacggtta tggctcagga caagccaacc 720
gttgatatcg agctggtcac cactacagtt tctaacatgg ctgaggtcag gtcatactgc 780
tacgaagcct ccatcagcga catggcatct gattcaagat gtccgaccca aggtgaagct 840
tacctcgaca agcagtcaga tactcaatac gtctgcaaac gcacattggt tgaccgtggc 900
tggggaaacg gttgtggcct cttcggaaag ggtagtttgg tcacgtgcgc caaattcgca 960
tgtagtaaga aaatgaccgg caagtcgatc cagccagaga acctggaata ccgcattatg 1020
ctctctgtgc acggaagtca acattcgggt atgatcgtca acgacacggg ccacgagacc 1080
gatgaaaacc gcgccaaggt ggagatcacg cctaactctc cccgtgcaga agctaccctc 1140
ggcggattcg gatcactggg tctcgactgc gagccccgta ctggcttgga cttctcagat 1200
ttgtactacc tgacaatgaa caacaagcac tggctcgtcc ataaagaatg gttccacgac 1260
atcccactgc cttggcacgc tggagctgat actggcaccc ctcactggaa caacaaggag 1320
gccctggtgg agttcaagga cgcacatgcg aaacgccaga cagtcgttgt gctcggctcc 1380
caagaaggag ctgtgcacac tgctctggcc ggtgctctgg aggccgaaat ggacggcgca 1440
aagggacgtc tgtcttcagg ccatttgaaa tgcaggctga agatggacaa attgagactg 1500
aagggagtga gttactcgtt gtgtacggct gccttcactt tcacaaaaat ccctgctgag 1560
actctgcacg gcacggtgac cgtcgaagtt cagtacgccg gtactgacgg accatgcaag 1620
gtgccggctc agatggctgt cgatatgcaa actttgacac cagtcggcag gctgatcaca 1680
gctaacccgg ttattacgga gtctaccgaa aactcaaaga tgatgctgga gctggaccct 1740
cctttcggag attcctacat cgtgattggc gtcggagaaa agaaaatcac ccaccattgg 1800
cacagatccg gtagcactat tggcaaggcc ttcgaggcaa cagttcgcgg tgcgaaacgt 1860
atggctgtgc tgggagacac tgcctgggat ttcggttccg tgggtggtgc tctgaactcc 1920
ctgggcaagg gcatccacca gattttcgga gcagcgttca aaagcctgtt cggaggtatg 1980
tcctggttca gccaaatcct cattggtact ctcttgatgt ggctgggcct caacacaaag 2040
aacggatcta tctcactgat gtgcttggct ttgggaggtg ttttgatctt cttgtctact 2100
gctgtgagcg ccgatgtggg a 2121
<210> 2 <211> 2079 <212> ДНК
<213> prME, Зика MR766 <400> 2
atggcagaca ccagcatcgg aatcattggc ctcctgctga ctacagccat ggcagcagag 60
atcactagac gcgggagtgc atactacatg tacttggata ggagcgatgc cgggaaggcc 120
atttcgtttg ctaccacatt gggagtgaac aagtgccacg tacagatcat ggacctcggg 180
cacatgtgtg acgccaccat gagttatgag tgccctatgc tggatgaggg agtggaacca 240
gatgatgtcg attgctggtg caacacgaca tcaacttggg ttgtgtacgg aacctgtcat 300
cacaaaaaag gtgaggcacg gcgatctaga agagccgtga cgctcccttc tcactctaca 360
aggaagttgc aaacgcggtc gcagacctgg ttagaatcaa gagaatacac gaagcacttg 420
atcaaggttg aaaactggat attcaggaac cccgggtttg cgctagtggc cgttgccatt 480
gcctggcttt tgggaagctc gacgagccaa aaagtcatat acttggtcat gatactgctg 540
attgccccgg catacagtat caggtgcatt ggagtcagca atagagactt cgtggagggc 600
atgtcaggtg ggacctgggt tgatgttgtc ttggaacatg gaggctgcgt taccgtgatg 660
gcacaggaca agccaacagt tgacatagag ttggtcacga cgacggttag taacatggcc 720
gaggtaagat cctattgcta cgaggcatcg atatcggaca tggcttcgga cagtcgttgc 780
ccaacacaag gtgaagccta ccttgacaag caatcagaca ctcaatatgt ctgcaaaaga 840
acattagtgg acagaggttg gggaaacggt tgtggacttt ttggcaaagg gagcttggtg 900
acatgtgcca agtttacgtg ttctaagaag atgaccggga agagcattca accggaaaat 960
ctggagtatc ggataatgct atcagtgcat ggctcccagc atagcgggat gattgtcaat 1020
gatacaggat atgaaactga cgaaaataga gcgaaagtcg aggttacgcc taattcacca 1080
agagcggaag caaccttggg aggctttgga agcttaggac ttgactgtga accaaggaca 1140
ggccttgact tttcagatct gtattacctg accatgaaca ataagcattg gttggtgcac 1200
aaagagtggt ttcatgacat cccattgcct tggcatgctg gggcagacac cggaactcca 1260
cactggaaca acaaagaggc attggtagaa ttcaaggatg cccacgccaa gaggcaaacc 1320
gtcgtcgttc tggggagcca ggaaggagcc gttcacacgg ctctcgctgg agctctagag 1380
gctgagatgg atggtgcaaa gggaaagctg ttctctggcc atttgaaatg ccgcctaaaa 1440
atggacaagc ttagattgaa gggcgtgtca tattccttgt gcactgcggc attcacattc 1500
accaaggtcc cagctgaaac actgcatgga acagtcacag tggaggtgca gtatgcaggg 1560
acagatggac cctgcaagat cccagtccag atggcggtgg acatgcagac cctgacccca 1620
gttggaaggc tgataaccgc caaccccgtg attactgaaa gcactgagaa ctcaaagatg 1680
atgttggagc ttgacccacc atttggggat tcttacattg tcataggagt tggggacaag 1740
aaaatcaccc accactggca taggagtggt agcaccatcg gaaaggcatt tgaggccact 1800
gtgagaggcg ccaagagaat ggcagtcctg ggggatacag cctgggactt cggatcagtc 1860
gggggtgtgt tcaactcact gggtaagggc attcaccaga tttttggagc agccttcaaa 1920
tcactgtttg gaggaatgtc ctggttctca cagatcctca taggcacgct gctagtgtgg 1980
ttaggtttga acacaaagaa tggatctatc tccctcacat gcttggccct ggggggagtg 2040
atgatcttcc tctccacggc tgtttctgct gacgtgggg 2079
<210> 3 <211> 694 <212> PRT
<213> prME, Зика Азиатский генотип
<400> 3
Met Ala Asp Thr Ser Val Gly Ile Val Gly Leu Leu Leu Ile Thr Thr
1 5 10 15
Ala Met Ala Ala Glu Val Thr Arg Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr
20 25 30
Leu Asp Arg Asn Asp Ala Gly Glu Ala Ile Ser Phe Pro Thr Thr Leu
35 40 45
Gly Met Asn Lys Cys Tyr Ile Gln Ile Met Asp Leu Gly His Met Cys
50 55 60
Asp Ala Thr Met Ser Tyr Glu Cys Pro Met Leu Asp Glu Gly Val Glu
65 70 75 80
Pro Asp Asp Val Asp Cys Trp Cys Asn Thr Thr Ser Thr Trp Val Val
85 90 95
Tyr Gly Thr Cys His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg
100 105 110
Ala Val Thr Leu Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser
115 120 125
Gln Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Leu Ile Arg Val
130 135 140
Glu Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu Ala Ala Ala Ala
145 150 155 160
Ile Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu
165 170 175
Val Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro Ala Tyr Ser Ile Arg Cys Ile Gly
180 185 190
Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser Gly Gly Thr Trp Val
195 200 205
Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr Val Met Ala Gln Asp
210 215 220
Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr Thr Val Ser Asn Met
225 230 235 240
Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser Ile Ser Asp Met Ala
245 250 255
Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Tyr Leu Asp Lys Gln
260 265 270
Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu Val Asp Arg Gly Trp
275 280 285
Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala
290 295 300
Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys Ser Ile Gln Pro Glu
305 310 315 320
Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His Gly Ser Gln His Ser
325 330 335
Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr Asp Glu Asn Arg Ala
340 345 350
Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala Glu Ala Thr Leu Gly
355 360 365
Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro Arg Thr Gly Leu Asp
370 375 380
Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn Lys His Trp Leu Val
385 390 395 400
His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro Trp His Ala Gly Ala
405 410 415
Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu Ala Leu Val Glu Phe
420 425 430
Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val Val Leu Gly Ser Gln
435 440 445
Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala Leu Glu Ala Glu Met
450 455 460
Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu
465 470 475 480
Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr
485 490 495
Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr
500 505 510
Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val
515 520 525
Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg
530 535 540
Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys
545 550 555 560
Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile
565 570 575
Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp His Arg Ser Gly Ser
580 585 590
Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg Gly Ala Lys Arg Met
595 600 605
Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Ala
610 615 620
Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe
625 630 635 640
Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe Ser Gln Ile Leu Ile Gly
645 650 655
Thr Leu Leu Met Trp Leu Gly Leu Asn Thr Lys Asn Gly Ser Ile Ser
660 665 670
Leu Met Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val Leu Ile Phe Leu Ser Thr Ala
675 680 685
Val Ser Ala Asp Val Gly 690
<210> 4
<211> 693
<212> PRT
<213> prME, Зика штамм MR766
<400> 4
Met Ala Asp Thr Ser Ile Gly Ile Ile Gly Leu Leu Leu Thr Thr Ala
1 5 10 15
Met Ala Ala Glu Ile Thr Arg Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu
20 25 30
Asp Arg Ser Asp Ala Gly Lys Ala Ile Ser Phe Ala Thr Thr Leu Gly
35 40 45
Val Asn Lys Cys His Val Gln Ile Met Asp Leu Gly His Met Cys Asp
50 55 60
Ala Thr Met Ser Tyr Glu Cys Pro Met Leu Asp Glu Gly Val Glu Pro
65 70 75 80
Asp Asp Val Asp Cys Trp Cys Asn Thr Thr Ser Thr Trp Val Val Tyr
85 90 95
Gly Thr Cys His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala
100 105 110
Val Thr Leu Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln
115 120 125
Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Leu Ile Lys Val Glu
130 135 140
Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu Val Ala Val Ala Ile
145 150 155 160
Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu Val
165 170 175
Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro Ala Tyr Ser Ile Arg Cys Ile Gly Val
180 185 190
Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser Gly Gly Thr Trp Val Asp
195 200 205
Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr Val Met Ala Gln Asp Lys
210 215 220
Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr Thr Val Ser Asn Met Ala
225 230 235 240
Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser Ile Ser Asp Met Ala Ser
245 250 255
Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Tyr Leu Asp Lys Gln Ser
260 265 270
Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu Val Asp Arg Gly Trp Gly
275 280 285
Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys
290 295 300
Phe Thr Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys Ser Ile Gln Pro Glu Asn
305 310 315 320
Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His Gly Ser Gln His Ser Gly
325 330 335
Met Ile Val Asn Asp Thr Gly Tyr Glu Thr Asp Glu Asn Arg Ala Lys
340 345 350
Val Glu Val Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala Glu Ala Thr Leu Gly Gly
355 360 365
Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe
370 375 380
Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn Lys His Trp Leu Val His
385 390 395 400
Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro Trp His Ala Gly Ala Asp
405 410 415
Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu Ala Leu Val Glu Phe Lys
420 425 430
Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu
435 440 445
Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala Leu Glu Ala Glu Met Asp
450 455 460
Gly Ala Lys Gly Lys Leu Phe Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys
465 470 475 480
Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala
485 490 495
Ala Phe Thr Phe Thr Lys Val Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val
500 505 510
Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro
515 520 525
Val Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu
530 535 540
Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met
545 550 555 560
Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly
565 570 575
Val Gly Asp Lys Lys Ile Thr His His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr
580 585 590
Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala
595 600 605
Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Val Phe
610 615 620
Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe Lys
625 630 635 640
Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe Ser Gln Ile Leu Ile Gly Thr
645 650 655
Leu Leu Val Trp Leu Gly Leu Asn Thr Lys Asn Gly Ser Ile Ser Leu
660 665 670
Thr Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val Met Ile Phe Leu Ser Thr Ala Val
675 680 685
Ser Ala Asp Val Gly 690
<210> 5 <211> 10269
<212> ДНК
<213> Зика штамм MR766 <400> 5
atgaaaaacc caaagaagaa atccggagga ttccggattg tcaatatgct aaaacgcgga 60
gtagcccgtg taaacccctt gggaggtttg aagaggttgc cagccggact tctgctgggt 120
catggaccca tcagaatggt tttggcgata ctagcctttt tgagatttac agcaatcaag 180
ccatcactgg gccttatcaa cagatggggt tccgtgggga aaaaagaggc tatggaaata 240
ataaagaagt tcaagaaaga tcttgctgcc atgttgagaa taatcaatgc taggaaagag 300
aggaagagac gtggcgcaga caccagcatc ggaatcattg gcctcctgct gactacagcc 360
atggcagcag agatcactag acgcgggagt gcatactaca tgtacttgga taggagcgat 420
gccgggaagg ccatttcgtt tgctaccaca ttgggagtga acaagtgcca cgtacagatc 480
atggacctcg ggcacatgtg tgacgccacc atgagttatg agtgccctat gctggatgag 540
ggagtggaac cagatgatgt cgattgctgg tgcaacacga catcaacttg ggttgtgtac 600
ggaacctgtc atcacaaaaa aggtgaggca cggcgatcta gaagagccgt gacgctccct 660
tctcactcta caaggaagtt gcaaacgcgg tcgcagacct ggttagaatc aagagaatac 720
acgaagcact tgatcaaggt tgaaaactgg atattcagga accccgggtt tgcgctagtg 780
gccgttgcca ttgcctggct tttgggaagc tcgacgagcc aaaaagtcat atacttggtc 840
atgatactgc tgattgcccc ggcatacagt atcaggtgca ttggagtcag caatagagac 900
ttcgtggagg gcatgtcagg tgggacctgg gttgatgttg tcttggaaca tggaggctgc 960
gttaccgtga tggcacagga caagccaaca gttgacatag agttggtcac gacgacggtt 1020
agtaacatgg ccgaggtaag atcctattgc tacgaggcat cgatatcgga catggcttcg 1080
gacagtcgtt gcccaacaca aggtgaagcc taccttgaca agcaatcaga cactcaatat 1140
gtctgcaaaa gaacattagt ggacagaggt tggggaaacg gttgtggact ttttggcaaa 1200
gggagcttgg tgacatgtgc caagtttacg tgttctaaga agatgaccgg gaagagcatt 1260
caaccggaaa atctggagta tcggataatg ctatcagtgc atggctccca gcatagcggg 1320
atgattgtca atgatacagg atatgaaact gacgaaaata gagcgaaagt cgaggttacg 1380
cctaattcac caagagcgga agcaaccttg ggaggctttg gaagcttagg acttgactgt 1440
gaaccaagga caggccttga cttttcagat ctgtattacc tgaccatgaa caataagcat 1500
tggttggtgc acaaagagtg gtttcatgac atcccattgc cttggcatgc tggggcagac 1560
accggaactc cacactggaa caacaaagag gcattggtag aattcaagga tgcccacgcc 1620
aagaggcaaa ccgtcgtcgt tctggggagc caggaaggag ccgttcacac ggctctcgct 1680
ggagctctag aggctgagat ggatggtgca aagggaaagc tgttctctgg ccatttgaaa 1740
tgccgcctaa aaatggacaa gcttagattg aagggcgtgt catattcctt gtgcactgcg 1800
gcattcacat tcaccaaggt cccagctgaa acactgcatg gaacagtcac agtggaggtg 1860
cagtatgcag ggacagatgg accctgcaag atcccagtcc agatggcggt ggacatgcag 1920
accctgaccc cagttggaag gctgataacc gccaaccccg tgattactga aagcactgag 1980
aactcaaaga tgatgttgga gcttgaccca ccatttgggg attcttacat tgtcatagga 2040
gttggggaca agaaaatcac ccaccactgg cataggagtg gtagcaccat cggaaaggca 2100
tttgaggcca ctgtgagagg cgccaagaga atggcagtcc tgggggatac agcctgggac 2160
ttcggatcag tcgggggtgt gttcaactca ctgggtaagg gcattcacca gatttttgga 2220
gcagccttca aatcactgtt tggaggaatg tcctggttct cacagatcct cataggcacg 2280
ctgctagtgt ggttaggttt gaacacaaag aatggatcta tctccctcac atgcttggcc 2340
ctggggggag tgatgatctt cctctccacg gctgtttctg ctgacgtggg gtgctcagtg 2400
gacttctcaa aaaaggaaac gagatgtggc acgggggtat tcatctataa tgatgttgaa 2460
gcctggaggg accggtacaa gtaccatcct gactcccccc gcagattggc agcagcagtc 2520
aagcaggcct gggaagaggg gatctgtggg atctcatccg tttcaagaat ggaaaacatc 2580
atgtggaaat cagtagaagg ggagctcaat gctatcctag aggagaatgg agttcaactg 2640
acagttgttg tgggatctgt aaaaaacccc atgtggagag gtccacaaag attgccagtg 2700
cctgtgaatg agctgcccca tggctggaaa gcctggggga aatcgtattt tgttagggcg 2760
gcaaagacca acaacagttt tgttgtcgac ggtgacacac tgaaggaatg tccgcttgag 2820
cacagagcat ggaatagttt tcttgtggag gatcacgggt ttggagtctt ccacaccagt 2880
gtctggctta aggtcagaga agattactca ttagaatgtg acccagccgt cataggaaca 2940
gctgttaagg gaagggaggc cgcgcacagt gatctgggct attggattga aagtgaaaag 3000
aatgacacat ggaggctgaa gagggcccac ctgattgaga tgaaaacatg tgaatggcca 3060
aagtctcaca cattgtggac agatggagta gaagaaagtg atcttatcat acccaagtct 3120
ttagctggtc cactcagcca ccacaacacc agagagggtt acagaaccca agtgaaaggg 3180
ccatggcaca gtgaagagct tgaaatccgg tttgaggaat gtccaggcac caaggtttac 3240
gtggaggaga catgcggaac tagaggacca tctctgagat caactactgc aagtggaagg 3300
gtcattgagg aatggtgctg tagggaatgc acaatgcccc cactatcgtt tcgagcaaaa 3360
gacggctgct ggtatggaat ggagataagg cccaggaaag aaccagagag caacttagtg 3420
aggtcaatgg tgacagcggg gtcaaccgat catatggacc acttctctct tggagtgctt 3480
gtgattctac tcatggtgca ggaggggttg aagaagagaa tgaccacaaa gatcatcatg 3540
agcacatcaa tggcagtgct ggtagtcatg atcttgggag gattttcaat gagtgacctg 3600
gccaagcttg tgatcctgat gggtgctact ttcgcagaaa tgaacactgg aggagatgta 3660
gctcacttgg cattggtagc ggcatttaaa gtcagaccag ccttgctggt ctccttcatt 3720
ttcagagcca attggacacc ccgtgagagc atgctgctag ccctggcttc gtgtcttctg 3780
caaactgcga tctctgctct tgaaggtgac ttgatggtcc tcattaatgg atttgctttg 3840
gcctggttgg caattcgagc aatggccgtg ccacgcactg acaacatcgc tctaccaatc 3900
ttggctgctc taacaccact agctcgaggc acactgctcg tggcatggag agcgggcctg 3960
gctacttgtg gagggatcat gctcctctcc ctgaaaggga aaggtagtgt gaagaagaac 4020
ctgccatttg tcatggccct gggattgaca gctgtgaggg tagtagaccc tattaatgtg 4080
gtaggactac tgttactcac aaggagtggg aagcggagct ggccccctag tgaagttctc 4140
acagccgttg gcctgatatg tgcactggcc ggagggtttg ccaaggcaga cattgagatg 4200
gctggaccca tggctgcagt aggcttgcta attgtcagct atgtggtctc gggaaagagt 4260
gtggacatgt acattgaaag agcaggtgac atcacatggg aaaaggacgc ggaagtcact 4320
ggaaacagtc ctcggcttga cgtggcactg gatgagagtg gtgatttctc cttggtagag 4380
gaagatggtc cacccatgag agagatcata ctcaaggtgg tcctgatggc catctgtggc 4440
atgaacccaa tagctatacc ttttgctgca ggagcgtggt atgtgtatgt gaagactggg 4500
aaaaggagtg gcgccctctg ggacgtgcct gctcccaaag aagtgaagaa aggagagacc 4560
acagatggag tgtacagagt gatgactcgc agactgctag gttcaacaca ggttggagtg 4620
ggagtcatgc aagagggagt cttccacacc atgtggcacg ttacaaaagg agccgcactg 4680
aggagcggtg agggaagact tgatccatac tggggggatg tcaagcagga cttggtgtca 4740
tactgtgggc cttggaagtt ggatgcagct tgggatggac tcagcgaggt acagcttttg 4800
gccgtacctc ccggagagag ggccagaaac attcagaccc tgcctggaat attcaagaca 4860
aaggacgggg acatcggagc agttgctctg gactaccctg cagggacctc aggatctccg 4920
atcctagaca aatgtggaag agtgatagga ctctatggca atggggttgt gatcaagaat 4980
ggaagctatg ttagtgctat aacccaggga aagagggagg aggagactcc ggttgaatgt 5040
ttcgaaccct cgatgctgaa gaagaagcag ctaactgtct tggatctgca tccaggagcc 5100
ggaaaaacca ggagagttct tcctgaaata gtccgtgaag ccataaaaaa gagactccgg 5160
acagtgatct tggcaccaac tagggttgtc gctgctgaga tggaggaggc cttgagagga 5220
cttccggtgc gttacatgac aacagcagtc aacgtcaccc attctgggac agaaatcgtt 5280
gatttgatgt gccatgccac tttcacttca cgcttactac aacccatcag agtccctaat 5340
tacaatctct acatcatgga tgaagcccac ttcacagacc cctcaagtat agctgcaaga 5400
ggatacatat caacaagggt tgaaatgggc gaggcggctg ccatttttat gactgccaca 5460
ccaccaggaa cccgtgatgc gtttcctgac tctaactcac caatcatgga cacagaagtg 5520
gaagtcccag agagagcctg gagctcaggc tttgattggg tgacagacca ttctgggaaa 5580
acagtttggt tcgttccaag cgtgagaaac ggaaatgaaa tcgcagcctg tctgacaaag 5640
gctggaaagc gggtcataca gctcagcagg aagacttttg agacagaatt tcagaaaaca 5700
aaaaatcaag agtgggactt tgtcataaca actgacatct cagagatggg cgccaacttc 5760
aaggctgacc gggtcataga ctctaggaga tgcctaaaac cagtcatact tgatggtgag 5820
agagtcatct tggctgggcc catgcctgtc acgcatgcta gtgctgctca gaggagagga 5880
cgtataggca ggaaccctaa caaacctgga gatgagtaca tgtatggagg tgggtgtgca 5940
gagactgatg aaggccatgc acactggctt gaagcaagaa tgcttcttga caacatctac 6000
ctccaggatg gcctcatagc ctcgctctat cggcctgagg ccgataaggt agccgccatt 6060
gagggagagt ttaagctgag gacagagcaa aggaagacct tcgtggaact catgaagaga 6120
ggagaccttc ccgtctggct agcctatcag gttgcatctg ccggaataac ttacacagac 6180
agaagatggt gctttgatgg cacaaccaac aacaccataa tggaagacag cgtaccagca 6240
gaggtgtgga caaagtatgg agagaagaga gtgctcaaac cgagatggat ggatgctagg 6300
gtctgttcag accatgcggc cctgaagtcg ttcaaagaat tcgccgctgg aaaaagagga 6360
gcggctttgg gagtaatgga ggccctggga acactgccag gacacatgac agagaggttt 6420
caggaagcca ttgacaacct cgccgtgctc atgcgagcag agactggaag caggccttat 6480
aaggcagcgg cagcccaact gccggagacc ctagagacca ttatgctctt aggtttgctg 6540
ggaacagttt cactggggat cttcttcgtc ttgatgcgga ataagggcat cgggaagatg 6600
ggctttggaa tggtaaccct tggggccagt gcatggctca tgtggctttc ggaaattgaa 6660
ccagccagaa ttgcatgtgt cctcattgtt gtgtttttat tactggtggt gctcataccc 6720
gagccagaga agcaaagatc tccccaagat aaccagatgg caattatcat catggtggca 6780
gtgggccttc taggtttgat aactgcaaac gaacttggat ggctggaaag aacaaaaaat 6840
gacatagctc atctaatggg aaggagagaa gaaggagcaa ccatgggatt ctcaatggac 6900
attgatctgc ggccagcctc cgcctgggct atctatgccg cattgacaac tctcatcacc 6960
ccagctgtcc aacatgcggt aaccacttca tacaacaact actccttaat ggcgatggcc 7020
acacaagctg gagtgctgtt tggcatgggc aaagggatgc cattttatgc atgggacctt 7080
ggagtcccgc tgctaatgat gggttgctat tcacaattaa cacccctgac tctgatagta 7140
gctatcattc tgcttgtggc gcactacatg tacttgatcc caggcctaca agcggcagca 7200
gcgcgtgctg cccagaaaag gacagcagct ggcatcatga agaatcccgt tgtggatgga 7260
atagtggtaa ctgacattga cacaatgaca atagaccccc aggtggagaa gaagatggga 7320
caagtgttac tcatagcagt agccatctcc agtgctgtgc tgctgcggac cgcctgggga 7380
tggggggagg ctggagctct gatcacagca gcgacctcca ccttgtggga aggctctcca 7440
aacaaatact ggaactcctc tacagccacc tcactgtgca acatcttcag aggaagctat 7500
ctggcaggag cttcccttat ctatacagtg acgagaaacg ctggcctggt taagagacgt 7560
ggaggtggga cgggagagac tctgggagag aagtggaaag ctcgtctgaa tcagatgtcg 7620
gccctggagt tctactctta taaaaagtca ggtatcactg aagtgtgtag agaggaggct 7680
cgccgtgccc tcaaggatgg agtggccaca ggaggacatg ccgtatcccg gggaagtgca 7740
aagctcagat ggttggtgga gagaggatat ctgcagccct atgggaaggt tgttgacctc 7800
ggatgtggca gagggggctg gagctattat gccgccacca tccgcaaagt gcaggaggtg 7860
agaggataca caaagggagg tcccggtcat gaagaaccca tgctggtgca aagctatggg 7920
tggaacatag ttcgtctcaa gagtggagtg gacgtcttcc acatggcggc tgagccgtgt 7980
gacactctgc tgtgtgacat aggtgagtca tcatctagtc ctgaagtgga agagacacga 8040
acactcagag tgctctctat ggtgggggac tggcttgaaa aaagaccagg ggccttctgt 8100
ataaaggtgc tgtgcccata caccagcact atgatggaaa ccatggagcg actgcaacgt 8160
aggcatgggg gaggattagt cagagtgcca ttgtctcgca actccacaca tgagatgtac 8220
tgggtctctg gggcaaagag caacatcata aaaagtgtgt ccaccacaag tcagctcctc 8280
ctgggacgca tggatggccc caggaggcca gtgaaatatg aggaggatgt gaacctcggc 8340
tcgggtacac gagctgtggc aagctgtgct gaggctccta acatgaaaat catcggcagg 8400
cgcattgaga gaatccgcaa tgaacatgca gaaacatggt ttcttgatga aaaccaccca 8460
tacaggacat gggcctacca tgggagctac gaagccccca cgcaaggatc agcgtcttcc 8520
ctcgtgaacg gggttgttag actcctgtca aagccttggg acgtggtgac tggagttaca 8580
ggaatagcca tgactgacac cacaccatac ggccaacaaa gagtcttcaa agaaaaagtg 8640
gacaccaggg tgccagatcc ccaagaaggc actcgccagg taatgaacat agtctcttcc 8700
tggctgtgga aggagctggg gaaacgcaag cggccacgcg tctgcaccaa agaagagttt 8760
atcaacaagg tgcgcagcaa tgcagcactg ggagcaatat ttgaagagga aaaagaatgg 8820
aagacggctg tggaagctgt gaatgatcca aggttttggg ccctagtgga tagggagaga 8880
gaacaccacc tgagaggaga gtgtcacagc tgtgtgtaca acatgatggg aaaaagagaa 8940
aagaagcaag gagagttcgg gaaagcaaaa ggtagccgcg ccatctggta catgtggttg 9000
ggagccagat tcttggagtt tgaagccctt ggattcttga acgaggacca ttggatggga 9060
agagaaaact caggaggtgg agtcgaaggg ttaggattgc aaagacttgg atacattcta 9120
gaagaaatga atcgggcacc aggaggaaag atgtacgcag atgacactgc tggctgggac 9180
acccgcatta gtaagtttga tctggagaat gaagctctga ttaccaacca aatggaggaa 9240
gggcacagaa ctctggcgtt ggccgtgatt aaatacacat accaaaacaa agtggtgaag 9300
gttctcagac cagctgaagg aggaaaaaca gttatggaca tcatttcaag acaagaccag 9360
agagggagtg gacaagttgt cacttatgct ctcaacacat tcaccaactt ggtggtgcag 9420
cttatccgga acatggaagc tgaggaagtg ttagagatgc aagacttatg gttgttgagg 9480
aagccagaga aagtgaccag atggttgcag agcaatggat gggatagact caaacgaatg 9540
gcggtcagtg gagatgactg cgttgtgaag ccaatcgatg ataggtttgc acatgccctc 9600
aggttcttga atgacatggg aaaagttagg aaagacacac aggagtggaa accctcgact 9660
ggatggagca attgggaaga agtcccgttc tgctcccacc acttcaacaa gctgtacctc 9720
aaggatggga gatccattgt ggtcccttgc cgccaccaag atgaactgat tggccgagct 9780
cgcgtctcac caggggcagg atggagcatc cgggagactg cctgtcttgc aaaatcatat 9840
gcgcagatgt ggcagctcct ttatttccac agaagagacc ttcgactgat ggctaatgcc 9900
atttgctcgg ctgtgccagt tgactgggta ccaactggga gaaccacctg gtcaatccat 9960
ggaaagggag aatggatgac cactgaggac atgctcatgg tgtggaatag agtgtggatt 10020
gaggagaacg accatatgga ggacaagact cctgtaacaa aatggacaga cattccctat 10080
ctaggaaaaa gggaggactt atggtgtgga tcccttatag ggcacagacc ccgcaccact 10140
tgggctgaaa acatcaaaga cacagtcaac atggtgcgca ggatcatagg tgatgaagaa 10200
aagtacatgg actatctatc cacccaagtc cgctacttgg gtgaggaagg gtccacaccc 10260
ggagtgttg 10269
<210> 6
<211> 3423
<212> PRT
<213> Полный ORF, Зика штамм MR766
<400> 6
Met Lys Asn Pro Lys Lys Lys Ser Gly Gly Phe Arg Ile Val Asn Met
Leu Lys Arg Gly Val Ala Arg Val Asn Pro Leu Gly Gly Leu Lys Arg
20 25 30
Leu Pro Ala Gly Leu Leu Leu Gly His Gly Pro Ile Arg Met Val Leu
35 40 45
Ala Ile Leu Ala Phe Leu Arg Phe Thr Ala Ile Lys Pro Ser Leu Gly
50 55 60
Leu Ile Asn Arg Trp Gly Ser Val Gly Lys Lys Glu Ala Met Glu Ile
65 70 75 80
Ile Lys Lys Phe Lys Lys Asp Leu Ala Ala Met Leu Arg Ile Ile Asn
85 90 95
Ala Arg Lys Glu Arg Lys Arg Arg Gly Ala Asp Thr Ser Ile Gly Ile
100 105 110
Ile Gly Leu Leu Leu Thr Thr Ala Met Ala Ala Glu Ile Thr Arg Arg
115 120 125
Gly Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Asp Arg Ser Asp Ala Gly Lys Ala
130 135 140
Ile Ser Phe Ala Thr Thr Leu Gly Val Asn Lys Cys His Val Gln Ile
145 150 155 160
Met Asp Leu Gly His Met Cys Asp Ala Thr Met Ser Tyr Glu Cys Pro
165 170 175
Met Leu Asp Glu Gly Val Glu Pro Asp Asp Val Asp Cys Trp Cys Asn
180 185 190
Thr Thr Ser Thr Trp Val Val Tyr Gly Thr Cys His His Lys Lys Gly
195 200 205
Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr Leu Pro Ser His Ser Thr
210 215 220
Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu Tyr
225 230 235 240
Thr Lys His Leu Ile Lys Val Glu Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro Gly
245 250 255
Phe Ala Leu Val Ala Val Ala Ile Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser Thr
260
265
270
Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu Val Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro Ala
275 280 285
Tyr Ser Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly
290 295 300
Met Ser Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys
305 310 315 320
Val Thr Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val
325 330 335
Thr Thr Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu
340 345 350
Ala Ser Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly
355 360 365
Glu Ala Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg
370 375 380
Thr Leu Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys
385 390 395 400
Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Thr Cys Ser Lys Lys Met Thr
405 410 415
Gly Lys Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser
420 425 430
Val His Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly Tyr
435 440 445
Glu Thr Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Val Thr Pro Asn Ser Pro
450 455 460
Arg Ala Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys
465 470 475 480
Glu Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met
485 490 495
Asn Asn Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro
500 505 510
Leu Pro Trp His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn
515
520
525
Lys Glu Ala Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr
530 535 540
Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala
545 550 555 560
Gly Ala Leu Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Lys Leu Phe Ser
565 570 575
Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly
580 585 590
Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Val Pro
595 600 605
Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly
610 615 620
Thr Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Val Gln Met Ala Val Asp Met Gln
625 630 635 640
Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr
645 650 655
Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe
660 665 670
Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asp Lys Lys Ile Thr His
675 680 685
His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr
690 695 700
Val Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp
705 710 715 720
Phe Gly Ser Val Gly Gly Val Phe Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His
725 730 735
Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp
740 745 750
Phe Ser Gln Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Val Trp Leu Gly Leu Asn
755 760 765
Thr Lys Asn Gly Ser Ile Ser Leu Thr Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val
770 775 780
Met Ile Phe Leu Ser Thr Ala Val Ser Ala Asp Val Gly Cys Ser Val
785 790 795 800
Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly Thr Gly Val Phe Ile Tyr
805 810 815
Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys Tyr His Pro Asp Ser
820 825 830
Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala Trp Glu Glu Gly Ile
835 840 845
Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu Asn Ile Met Trp Lys Ser
850 855 860
Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu Glu Asn Gly Val Gln Leu
865 870 875 880
Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln
885 890 895
Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp
900 905 910
Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr Asn Asn Ser Phe Val
915 920 925
Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro Leu Glu His Arg Ala Trp
930 935 940
Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe Gly Val Phe His Thr Ser
945 950 955 960
Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu Glu Cys Asp Pro Ala
965 970 975
Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Arg Glu Ala Ala His Ser Asp Leu
980 985 990
Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr Trp Arg Leu Lys Arg
995 1000 1005
Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu Trp Pro Lys Ser His
1010 1015 1020
Thr Leu Trp Thr Asp Gly Val Glu Glu Ser Asp Leu Ile Ile Pro
1025
1030
1035
Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr Arg Glu Gly
1040 1045 1050
Tyr Arg Thr Gln Val Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu Leu Glu
1055 1060 1065
Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val Tyr Val Glu Glu
1070 1075 1080
Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser
1085 1090 1095
Gly Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro
1100 1105 1110
Pro Leu Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu
1115 1120 1125
Ile Arg Pro Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met
1130 1135 1140
Val Thr Ala Gly Ser Thr Asp His Met Asp His Phe Ser Leu Gly
1145 1150 1155
Val Leu Val Ile Leu Leu Met Val Gln Glu Gly Leu Lys Lys Arg
1160 1165 1170
Met Thr Thr Lys Ile Ile Met Ser Thr Ser Met Ala Val Leu Val
1175 1180 1185
Val Met Ile Leu Gly Gly Phe Ser Met Ser Asp Leu Ala Lys Leu
1190 1195 1200
Val Ile Leu Met Gly Ala Thr Phe Ala Glu Met Asn Thr Gly Gly
1205 1210 1215
Asp Val Ala His Leu Ala Leu Val Ala Ala Phe Lys Val Arg Pro
1220 1225 1230
Ala Leu Leu Val Ser Phe Ile Phe Arg Ala Asn Trp Thr Pro Arg
1235 1240 1245
Glu Ser Met Leu Leu Ala Leu Ala Ser Cys Leu Leu Gln Thr Ala
1250 1255 1260
Ile Ser Ala Leu Glu Gly Asp Leu Met Val Leu Ile Asn Gly Phe
1265
1270
1275
Ala Leu Ala Trp Leu Ala Ile Arg Ala Met Ala Val Pro Arg Thr
1280 1285 1290
Asp Asn Ile Ala Leu Pro Ile Leu Ala Ala Leu Thr Pro Leu Ala
1295 1300 1305
Arg Gly Thr Leu Leu Val Ala Trp Arg Ala Gly Leu Ala Thr Cys
1310 1315 1320
Gly Gly Ile Met Leu Leu Ser Leu Lys Gly Lys Gly Ser Val Lys
1325 1330 1335
Lys Asn Leu Pro Phe Val Met Ala Leu Gly Leu Thr Ala Val Arg
1340 1345 1350
Val Val Asp Pro Ile Asn Val Val Gly Leu Leu Leu Leu Thr Arg
1355 1360 1365
Ser Gly Lys Arg Ser Trp Pro Pro Ser Glu Val Leu Thr Ala Val
1370 1375 1380
Gly Leu Ile Cys Ala Leu Ala Gly Gly Phe Ala Lys Ala Asp Ile
1385 1390 1395
Glu Met Ala Gly Pro Met Ala Ala Val Gly Leu Leu Ile Val Ser
1400 1405 1410
Tyr Val Val Ser Gly Lys Ser Val Asp Met Tyr Ile Glu Arg Ala
1415 1420 1425
Gly Asp Ile Thr Trp Glu Lys Asp Ala Glu Val Thr Gly Asn Ser
1430 1435 1440
Pro Arg Leu Asp Val Ala Leu Asp Glu Ser Gly Asp Phe Ser Leu
1445 1450 1455
Val Glu Glu Asp Gly Pro Pro Met Arg Glu Ile Ile Leu Lys Val
1460 1465 1470
Val Leu Met Ala Ile Cys Gly Met Asn Pro Ile Ala Ile Pro Phe
1475 1480 1485
Ala Ala Gly Ala Trp Tyr Val Tyr Val Lys Thr Gly Lys Arg Ser
1490 1495 1500
Gly Ala Leu Trp Asp Val Pro Ala Pro Lys Glu Val Lys Lys Gly
1505
1510
1515
Glu Thr Thr Asp Gly Val Tyr Arg Val Met Thr Arg Arg Leu Leu
1520 1525 1530
Gly Ser Thr Gln Val Gly Val Gly Val Met Gln Glu Gly Val Phe
1535 1540 1545
His Thr Met Trp His Val Thr Lys Gly Ala Ala Leu Arg Ser Gly
1550 1555 1560
Glu Gly Arg Leu Asp Pro Tyr Trp Gly Asp Val Lys Gln Asp Leu
1565 1570 1575
Val Ser Tyr Cys Gly Pro Trp Lys Leu Asp Ala Ala Trp Asp Gly
1580 1585 1590
Leu Ser Glu Val Gln Leu Leu Ala Val Pro Pro Gly Glu Arg Ala
1595 1600 1605
Arg Asn Ile Gln Thr Leu Pro Gly Ile Phe Lys Thr Lys Asp Gly
1610 1615 1620
Asp Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Ser Gly
1625 1630 1635
Ser Pro Ile Leu Asp Lys Cys Gly Arg Val Ile Gly Leu Tyr Gly
1640 1645 1650
Asn Gly Val Val Ile Lys Asn Gly Ser Tyr Val Ser Ala Ile Thr
1655 1660 1665
Gln Gly Lys Arg Glu Glu Glu Thr Pro Val Glu Cys Phe Glu Pro
1670 1675 1680
Ser Met Leu Lys Lys Lys Gln Leu Thr Val Leu Asp Leu His Pro
1685 1690 1695
Gly Ala Gly Lys Thr Arg Arg Val Leu Pro Glu Ile Val Arg Glu
1700 1705 1710
Ala Ile Lys Lys Arg Leu Arg Thr Val Ile Leu Ala Pro Thr Arg
1715 1720 1725
Val Val Ala Ala Glu Met Glu Glu Ala Leu Arg Gly Leu Pro Val
1730 1735 1740
Arg Tyr Met Thr Thr Ala Val Asn Val Thr His Ser Gly Thr Glu
1745
1750
1755
Ile Val Asp Leu Met Cys His Ala Thr Phe Thr Ser Arg Leu Leu
1760 1765 1770
Gln Pro Ile Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu Tyr Ile Met Asp Glu
1775 1780 1785
Ala His Phe Thr Asp Pro Ser Ser Ile Ala Ala Arg Gly Tyr Ile
1790 1795 1800
Ser Thr Arg Val Glu Met Gly Glu Ala Ala Ala Ile Phe Met Thr
1805 1810 1815
Ala Thr Pro Pro Gly Thr Arg Asp Ala Phe Pro Asp Ser Asn Ser
1820 1825 1830
Pro Ile Met Asp Thr Glu Val Glu Val Pro Glu Arg Ala Trp Ser
1835 1840 1845
Ser Gly Phe Asp Trp Val Thr Asp His Ser Gly Lys Thr Val Trp
1850 1855 1860
Phe Val Pro Ser Val Arg Asn Gly Asn Glu Ile Ala Ala Cys Leu
1865 1870 1875
Thr Lys Ala Gly Lys Arg Val Ile Gln Leu Ser Arg Lys Thr Phe
1880 1885 1890
Glu Thr Glu Phe Gln Lys Thr Lys Asn Gln Glu Trp Asp Phe Val
1895 1900 1905
Ile Thr Thr Asp Ile Ser Glu Met Gly Ala Asn Phe Lys Ala Asp
1910 1915 1920
Arg Val Ile Asp Ser Arg Arg Cys Leu Lys Pro Val Ile Leu Asp
1925 1930 1935
Gly Glu Arg Val Ile Leu Ala Gly Pro Met Pro Val Thr His Ala
1940 1945 1950
Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly Arg Asn Pro Asn Lys
1955 1960 1965
Pro Gly Asp Glu Tyr Met Tyr Gly Gly Gly Cys Ala Glu Thr Asp
1970 1975 1980
Glu Gly His Ala His Trp Leu Glu Ala Arg Met Leu Leu Asp Asn
1985
1990
1995
Ile Tyr Leu Gln Asp Gly Leu Ile Ala Ser Leu Tyr Arg Pro Glu
2000 2005 2010
Ala Asp Lys Val Ala Ala Ile Glu Gly Glu Phe Lys Leu Arg Thr
2015 2020 2025
Glu Gln Arg Lys Thr Phe Val Glu Leu Met Lys Arg Gly Asp Leu
2030 2035 2040
Pro Val Trp Leu Ala Tyr Gln Val Ala Ser Ala Gly Ile Thr Tyr
2045 2050 2055
Thr Asp Arg Arg Trp Cys Phe Asp Gly Thr Thr Asn Asn Thr Ile
2060 2065 2070
Met Glu Asp Ser Val Pro Ala Glu Val Trp Thr Lys Tyr Gly Glu
2075 2080 2085
Lys Arg Val Leu Lys Pro Arg Trp Met Asp Ala Arg Val Cys Ser
2090 2095 2100
Asp His Ala Ala Leu Lys Ser Phe Lys Glu Phe Ala Ala Gly Lys
2105 2110 2115
Arg Gly Ala Ala Leu Gly Val Met Glu Ala Leu Gly Thr Leu Pro
2120 2125 2130
Gly His Met Thr Glu Arg Phe Gln Glu Ala Ile Asp Asn Leu Ala
2135 2140 2145
Val Leu Met Arg Ala Glu Thr Gly Ser Arg Pro Tyr Lys Ala Ala
2150 2155 2160
Ala Ala Gln Leu Pro Glu Thr Leu Glu Thr Ile Met Leu Leu Gly
2165 2170 2175
Leu Leu Gly Thr Val Ser Leu Gly Ile Phe Phe Val Leu Met Arg
2180 2185 2190
Asn Lys Gly Ile Gly Lys Met Gly Phe Gly Met Val Thr Leu Gly
2195 2200 2205
Ala Ser Ala Trp Leu Met Trp Leu Ser Glu Ile Glu Pro Ala Arg
2210 2215 2220
Ile Ala Cys Val Leu Ile Val Val Phe Leu Leu Leu Val Val Leu
2225
2230
2235
Ile Pro Glu Pro Glu Lys Gln Arg Ser Pro Gln Asp Asn Gln Met
2240 2245 2250
Ala Ile Ile Ile Met Val Ala Val Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr
2255 2260 2265
Ala Asn Glu Leu Gly Trp Leu Glu Arg Thr Lys Asn Asp Ile Ala
2270 2275 2280
His Leu Met Gly Arg Arg Glu Glu Gly Ala Thr Met Gly Phe Ser
2285 2290 2295
Met Asp Ile Asp Leu Arg Pro Ala Ser Ala Trp Ala Ile Tyr Ala
2300 2305 2310
Ala Leu Thr Thr Leu Ile Thr Pro Ala Val Gln His Ala Val Thr
2315 2320 2325
Thr Ser Tyr Asn Asn Tyr Ser Leu Met Ala Met Ala Thr Gln Ala
2330 2335 2340
Gly Val Leu Phe Gly Met Gly Lys Gly Met Pro Phe Tyr Ala Trp
2345 2350 2355
Asp Leu Gly Val Pro Leu Leu Met Met Gly Cys Tyr Ser Gln Leu
2360 2365 2370
Thr Pro Leu Thr Leu Ile Val Ala Ile Ile Leu Leu Val Ala His
2375 2380 2385
Tyr Met Tyr Leu Ile Pro Gly Leu Gln Ala Ala Ala Ala Arg Ala
2390 2395 2400
Ala Gln Lys Arg Thr Ala Ala Gly Ile Met Lys Asn Pro Val Val
2405 2410 2415
Asp Gly Ile Val Val Thr Asp Ile Asp Thr Met Thr Ile Asp Pro
2420 2425 2430
Gln Val Glu Lys Lys Met Gly Gln Val Leu Leu Ile Ala Val Ala
2435 2440 2445
Ile Ser Ser Ala Val Leu Leu Arg Thr Ala Trp Gly Trp Gly Glu
2450 2455 2460
Ala Gly Ala Leu Ile Thr Ala Ala Thr Ser Thr Leu Trp Glu Gly
2465
2470
2475
Ser Pro Asn Lys Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Ala Thr Ser Leu Cys
2480 2485 2490
Asn Ile Phe Arg Gly Ser Tyr Leu Ala Gly Ala Ser Leu Ile Tyr
2495 2500 2505
Thr Val Thr Arg Asn Ala Gly Leu Val Lys Arg Arg Gly Gly Gly
2510 2515 2520
Thr Gly Glu Thr Leu Gly Glu Lys Trp Lys Ala Arg Leu Asn Gln
2525 2530 2535
Met Ser Ala Leu Glu Phe Tyr Ser Tyr Lys Lys Ser Gly Ile Thr
2540 2545 2550
Glu Val Cys Arg Glu Glu Ala Arg Arg Ala Leu Lys Asp Gly Val
2555 2560 2565
Ala Thr Gly Gly His Ala Val Ser Arg Gly Ser Ala Lys Leu Arg
2570 2575 2580
Trp Leu Val Glu Arg Gly Tyr Leu Gln Pro Tyr Gly Lys Val Val
2585 2590 2595
Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly Trp Ser Tyr Tyr Ala Ala Thr
2600 2605 2610
Ile Arg Lys Val Gln Glu Val Arg Gly Tyr Thr Lys Gly Gly Pro
2615 2620 2625
Gly His Glu Glu Pro Met Leu Val Gln Ser Tyr Gly Trp Asn Ile
2630 2635 2640
Val Arg Leu Lys Ser Gly Val Asp Val Phe His Met Ala Ala Glu
2645 2650 2655
Pro Cys Asp Thr Leu Leu Cys Asp Ile Gly Glu Ser Ser Ser Ser
2660 2665 2670
Pro Glu Val Glu Glu Thr Arg Thr Leu Arg Val Leu Ser Met Val
2675 2680 2685
Gly Asp Trp Leu Glu Lys Arg Pro Gly Ala Phe Cys Ile Lys Val
2690 2695 2700
Leu Cys Pro Tyr Thr Ser Thr Met Met Glu Thr Met Glu Arg Leu
2705
2710
2715
Gln Arg Arg His Gly Gly Gly Leu Val Arg Val Pro Leu Ser Arg
2720 2725 2730
Asn Ser Thr His Glu Met Tyr Trp Val Ser Gly Ala Lys Ser Asn
2735 2740 2745
Ile Ile Lys Ser Val Ser Thr Thr Ser Gln Leu Leu Leu Gly Arg
2750 2755 2760
Met Asp Gly Pro Arg Arg Pro Val Lys Tyr Glu Glu Asp Val Asn
2765 2770 2775
Leu Gly Ser Gly Thr Arg Ala Val Ala Ser Cys Ala Glu Ala Pro
2780 2785 2790
Asn Met Lys Ile Ile Gly Arg Arg Ile Glu Arg Ile Arg Asn Glu
2795 2800 2805
His Ala Glu Thr Trp Phe Leu Asp Glu Asn His Pro Tyr Arg Thr
2810 2815 2820
Trp Ala Tyr His Gly Ser Tyr Glu Ala Pro Thr Gln Gly Ser Ala
2825 2830 2835
Ser Ser Leu Val Asn Gly Val Val Arg Leu Leu Ser Lys Pro Trp
2840 2845 2850
Asp Val Val Thr Gly Val Thr Gly Ile Ala Met Thr Asp Thr Thr
2855 2860 2865
Pro Tyr Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr Arg
2870 2875 2880
Val Pro Asp Pro Gln Glu Gly Thr Arg Gln Val Met Asn Ile Val
2885 2890 2895
Ser Ser Trp Leu Trp Lys Glu Leu Gly Lys Arg Lys Arg Pro Arg
2900 2905 2910
Val Cys Thr Lys Glu Glu Phe Ile Asn Lys Val Arg Ser Asn Ala
2915 2920 2925
Ala Leu Gly Ala Ile Phe Glu Glu Glu Lys Glu Trp Lys Thr Ala
2930 2935 2940
Val Glu Ala Val Asn Asp Pro Arg Phe Trp Ala Leu Val Asp Arg
2945
2950
2955
Glu Arg Glu His His Leu Arg Gly Glu Cys His Ser Cys Val Tyr
2960 2965 2970
Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Gln Gly Glu Phe Gly Lys
2975 2980 2985
Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala Arg
2990 2995 3000
Phe Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu Asp His Trp
3005 3010 3015
Met Gly Arg Glu Asn Ser Gly Gly Gly Val Glu Gly Leu Gly Leu
3020 3025 3030
Gln Arg Leu Gly Tyr Ile Leu Glu Glu Met Asn Arg Ala Pro Gly
3035 3040 3045
Gly Lys Met Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg Ile
3050 3055 3060
Ser Lys Phe Asp Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Thr Asn Gln Met
3065 3070 3075
Glu Glu Gly His Arg Thr Leu Ala Leu Ala Val Ile Lys Tyr Thr
3080 3085 3090
Tyr Gln Asn Lys Val Val Lys Val Leu Arg Pro Ala Glu Gly Gly
3095 3100 3105
Lys Thr Val Met Asp Ile Ile Ser Arg Gln Asp Gln Arg Gly Ser
3110 3115 3120
Gly Gln Val Val Thr Tyr Ala Leu Asn Thr Phe Thr Asn Leu Val
3125 3130 3135
Val Gln Leu Ile Arg Asn Met Glu Ala Glu Glu Val Leu Glu Met
3140 3145 3150
Gln Asp Leu Trp Leu Leu Arg Lys Pro Glu Lys Val Thr Arg Trp
3155 3160 3165
Leu Gln Ser Asn Gly Trp Asp Arg Leu Lys Arg Met Ala Val Ser
3170 3175 3180
Gly Asp Asp Cys Val Val Lys Pro Ile Asp Asp Arg Phe Ala His
3185
3190
3195
Ala Leu Arg Phe Leu Asn Asp Met Gly Lys Val Arg Lys Asp Thr
3200 3205 3210
Gln Glu Trp Lys Pro Ser Thr Gly Trp Ser Asn Trp Glu Glu Val
3215 3220 3225
Pro Phe Cys Ser His His Phe Asn Lys Leu Tyr Leu Lys Asp Gly
3230 3235 3240
Arg Ser Ile Val Val Pro Cys Arg His Gln Asp Glu Leu Ile Gly
3245 3250 3255
Arg Ala Arg Val Ser Pro Gly Ala Gly Trp Ser Ile Arg Glu Thr
3260 3265 3270
Ala Cys Leu Ala Lys Ser Tyr Ala Gln Met Trp Gln Leu Leu Tyr
3275 3280 3285
Phe His Arg Arg Asp Leu Arg Leu Met Ala Asn Ala Ile Cys Ser
3290 3295 3300
Ala Val Pro Val Asp Trp Val Pro Thr Gly Arg Thr Thr Trp Ser
3305 3310 3315
Ile His Gly Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Met
3320 3325 3330
Val Trp Asn Arg Val Trp Ile Glu Glu Asn Asp His Met Glu Asp
3335 3340 3345
Lys Thr Pro Val Thr Lys Trp Thr Asp Ile Pro Tyr Leu Gly Lys
3350 3355 3360
Arg Glu Asp Leu Trp Cys Gly Ser Leu Ile Gly His Arg Pro Arg
3365 3370 3375
Thr Thr Trp Ala Glu Asn Ile Lys Asp Thr Val Asn Met Val Arg
3380 3385 3390
Arg Ile Ile Gly Asp Glu Glu Lys Tyr Met Asp Tyr Leu Ser Thr
3395 3400 3405
Gln Val Arg Tyr Leu Gly Glu Glu Gly Ser Thr Pro Gly Val Leu
3410 3415 3420
<210> 7
<211> 10269
<212> ДНК
<213> Зика штамм FSS13025
<220>
<221> иной признак
<222> (4429)..(4429)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> иной признак
<222> (6882)..(6882)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 7
atgaaaaacc caaagaagaa atccggagga ttccggattg tcaatatgct aaaacgcgga 60
gtagcccgtg tgagcccctt tgggggcttg aagaggctgc cagccggact tctgctgggt 120
catgggccca tcaggatggt cttggcgatt ctagcctttt tgagattcac ggcaatcaag 180
ccatcactgg gtctcatcaa tagatggggt tcagtgggga aaaaagaggc tatggaaata 240
ataaagaagt ttaagaaaga tctggctgcc atgctgagaa taatcaatgc taggaaggag 300
aagaagagac gaggcacaga tactagtgtc ggaattgttg gcctcctgct gaccacagcc 360
atggcagtgg aggtcactag acgtgggaat gcatactata tgtacttgga cagaagcgat 420
gctggggagg ccatatcttt tccaaccaca atggggatga ataagtgtta tatacagatc 480
atggatcttg gacacatgtg tgatgccacc atgagctatg aatgccctat gctggatgag 540
ggggtagaac cagatgacgt cgattgttgg tgcaacacga cgtcaacttg ggttgtgtac 600
ggaacctgcc accacaaaaa aggtgaagca cggagatcta gaagagctgt gacgctcccc 660
tcccattcca ctaggaagct gcaaacgcgg tcgcagacct ggttggaatc aagagaatac 720
acaaagcacc tgattagagt cgaaaattgg atattcagga accctggctt cgcgttagca 780
gcagctgcca tcgcttggct tttgggaagc tcaacgagcc aaaaagtcat atacttggtc 840
atgatactgc tgattgcccc ggcatacagc atcaggtgca taggagtcag caatagggac 900
tttgtggaag gtatgtcagg tgggacttgg gttgatgttg tcttggaaca tggaggttgt 960
gttaccgtaa tggcacagga caaaccgact gtcgacatag agctggttac aacaacagtc 1020
agcaacatgg cggaggtaag atcctactgc tatgaggcat caatatcgga catggcttcg 1080
gacagccgct gcccaacaca aggtgaagcc taccttgaca agcaatcaga cactcaatat 1140
gtctgcaaaa gaacgttagt ggacagaggc tggggaaatg gatgtggact ttttggcaaa 1200
gggagcctgg tgacatgcgc taagtttgct tgctctaaga aaatgaccgg gaagagcatc 1260
cagccagaga atctggagta ccggataatg ctgtcagttc atggctccca gcacagtggg 1320
atgatcgtta atgatacagg acatgaaact gatgagaata gagcgaaggt tgagataacg 1380
cccaattcac caagagccga agccaccctg gggggttttg gaagcctagg acttgattgt 1440
gaaccgagga caggccttga cttttcagat ttgtattact tgactatgaa taacaagcac 1500
tggttggttc acaaggagtg gttccacgac attccattac cttggcatgc tggggcagac 1560
accggaactc cacactggaa caacaaagaa gcactggtag agttcaagga cgcacatgcc 1620
aaaaggcaga ctgtcgtggt tctagggagt caagaaggag cagttcacac ggcccttgct 1680
ggagctctgg aggctgagat ggatggtgca aagggaaggc tgtcctctgg ccacttgaaa 1740
tgtcgcctga aaatggataa acttagattg aagggcgtgt catactcctt gtgtaccgca 1800
gcgttcacat tcactaagat cccggctgaa acactgcacg ggacagtcac agtggaggta 1860
cagtacgcag ggacagatgg accttgcaag gttccagctc agatggcggt ggacatgcaa 1920
actctgaccc cagttgggag gttgataacc gctaaccctg taatcactga aagcactgag 1980
aactccaaga tgatgctgga actggatcca ccatttgggg actcttacat tgtcatagga 2040
gtcggggaaa agaagatcac ccaccactgg cacaggagtg gcagcaccat tggaaaagca 2100
tttgaagcca ctgtgagagg tgccaagaga atggcagtct tgggagacac agcctgggac 2160
tttggatcag ttgggggtgc tctcaactca ctgggcaagg gcatccatca aatttttgga 2220
gcagctttca aatcattgtt tggaggaatg tcctggttct cacaaattct cattggaacg 2280
ttgctggtgt ggttgggtct gaatacaaag aatggatcta tttcccttat gtgcttggcc 2340
ttagggggag tgttgatctt cttatccaca gccgtctctg ctgatgtggg gtgctcggtg 2400
gacttctcaa agaaggaaac gagatgcggt acaggggtgt tcgtctataa cgacgttgaa 2460
gcttggaggg acaggtacaa gtaccatcct gactcccctc gtagattggc agcagcagtc 2520
aagcaagcct gggaagatgg gatctgtggg atctcctctg tttcaagaat ggaaaacatc 2580
atgtggagat cagtagaagg ggagctcaac gcaatcctgg aagagaatgg agttcaactg 2640
acggtcgttg tgggatctgt aaaaaacccc atgtggagag gtccacagag attgcccgtg 2700
cctgtgaacg agctgcccca tggctggaag gcttggggga aatcgtactt cgtcagggca 2760
gcaaagacaa ataacagctt tgtcgtggat ggtgacacac tgaaggaatg cccactcaaa 2820
catagagcat ggaacagctt tcttgtggag gatcatgggt tcggggtatt tcacactagt 2880
gtctggctca aggttagaga agattattca ttagagtgtg atccagccgt cattggaaca 2940
gccgctaagg gaaaggaggc tgtgcacagt gatctaggct actggattga gagtgagaag 3000
aacgacacat ggaggctgaa gagggcccac ctgatcgaga tgaaaacatg tgaatggcca 3060
aagtcccaca cattgtggac agatggaata gaagaaagtg atctgatcat acccaagtct 3120
ttagctgggc cactcagcca tcacaacacc agagagggct acaggaccca aatgaaaggg 3180
ccatggcata gtgaagagct tgaaattcgg tttgaggaat gcccaggcac taaggtccac 3240
gtggaggaaa catgtggaac aagaggacca tctctgagat caaccactgc aagcggaagg 3300
gtgatcgagg aatggtgctg cagggagtgc acaatgcccc cactgtcgtt ccgggctaaa 3360
gatggttgtt ggtatggaat ggagataagg cccaggaaag aaccagaaag taacttagta 3420
aggtcaatgg tgactgcagg atcaactgat cacatggatc acttctccct tggagtgctt 3480
gtgattctgc tcatggtaca ggaagggcta aagaagagaa tgaccacaaa gatcatcata 3540
agcacatcaa tggcagtgct ggtagctatg atcctgggag gattttcaat gagtgacctg 3600
gctaagcttg caattttgat gggtgccacc ttcgcggaaa tgaacactgg aggagatgtt 3660
gctcatctgg cgctgatagc ggcattcaaa gtcagacctg cgttgctggt atctttcatt 3720
ttcagagcta attggacacc ccgtgagagc atgctgctgg ccttggcctc gtgtcttctg 3780
caaactgcga tctccgcctt ggaaggcgac ctgatggttc ccatcaatgg ttttgctttg 3840
gcctggttgg caatacgagc gatggttgtt ccacgcactg acaacatcac cttggcaatc 3900
ctggctgctc tgacaccact ggcccggggc acactgcttg tggcgtggag agcaggcctt 3960
gctacttgcg gggggttcat gctcctttct ctgaagggga aaggcagtgt gaagaagaac 4020
ttaccatttg tcatggccct gggactaacc gctgtgaggc tggtcgaccc catcaacgtg 4080
gtgggactgc tgttgctcac aaggagtggg aagcggagct ggccccctag tgaagtactc 4140
acagctgttg gcctgatatg cgcattggct ggagggttcg ccaaggcgga tatagagatg 4200
gctgggccca tggccgcggt cggtctgcta attgtcagtt acgtggtctc aggaaagagt 4260
gtggacatgt acattgaaag agcaggtgac atcacatggg aaaaagatgc ggaagtcact 4320
ggaaacagtc cccggctcga tgtggcacta gatgagagtg gtgatttctc cctagtggag 4380
gatgatggtc cccccatgag agagatcata ctcaaagtgg tcctgatgnc catctgtggc 4440
atgaacccaa tagccatacc ctttgcagct ggagcgtggt acgtgtatgt gaagactgga 4500
aaaaggagtg gtgctctatg ggatgtgcct gctcccaagg aagtaaaaaa gggggagacc 4560
acagatggag tgtacagagt aatgactcgt agactgctag gttcaacaca agttggagtg 4620
ggagtcatgc aagagggggt cttccacact atgtggcacg tcacaaaagg atccgcgctg 4680
agaagcggtg aagggagact tgatccatac tggggagatg tcaagcagga tctggtgtca 4740
tactgtggtc catggaagct agatgccgcc tgggacgggc acagcgaggt gcagctcttg 4800
gccgtgcccc ccggagagag agcgaggaac atccagactc tgcccggaat atttaagaca 4860
aaggatgggg acattggagc agttgcgctg gactacccag caggaacttc aggatctcca 4920
atcctagata agtgtgggag agtgatagga ctctatggta atggggtcgt gatcaaaaat 4980
gggagttacg ttagtgccat cacccaaggg aggagggagg aagagactcc tgttgagtgc 5040
ttcgagcctt cgatgctgaa gaagaagcag ctaactgtct tagacttgca tcctggagct 5100
gggaaaacca ggagagttct tcctgaaata gtccgtgaag ccataaaaac aagactccgc 5160
actgtgatct tagctccaac cagggttgtc gctgctgaaa tggaggaagc ccttagaggg 5220
cttccagtgc gttatatgac aacagcagtc aatgtcaccc attctgggac agaaatcgtt 5280
gacttaatgt gccatgccac cttcacttca cgtctactac agccaatcag agtccccaac 5340
tataatctgt atattatgga tgaggcccac ttcacagatc cctcaagtat agcagcaaga 5400
ggatacattt caacaagggt tgagatgggc gaggcggctg ccatcttcat gactgccacg 5460
ccaccaggaa cccgtgacgc attcccggac tccaactcac caattatgga caccgaagtg 5520
gaagtcccag agagagcctg gagctcaggc tttgattggg tgacggatca ttctggaaaa 5580
acagtttggt ttgttccaag cgtgaggaat ggcaatgaga tcgcagcttg tctgacaaag 5640
gctggaaaac gggtcataca gctcagcaga aagacttttg agacagagtt ccagaaaaca 5700
aaacatcaag agtgggactt cgtcgtgaca actgacattt cagagatggg cgccaacttt 5760
aaagctgacc gtgtcataga ttccaggaga tgcctaaagc cggtcatact tgatggcgag 5820
agagtcattc tggctggacc catgcctgtc acacatgcca gcgctgccca gaggaggggg 5880
cgcataggca ggaaccccaa caaacctgga gatgagtatc tgtatggagg tgggtgcgca 5940
gagactgatg aagaccatgc acactggctt gaagcaagaa tgcttcttga caacatttac 6000
ctccaagatg gcctcatagc ctcgctctat cgacctgagg ccgacaaagt agcagctatt 6060
gagggagagt tcaagcttag gacggagcaa aggaagacct ttgtggaact catgaaaaga 6120
ggagatcttc ctgtttggct ggcctatcag gttgcatctg ccggaataac ctacacagat 6180
agaagatggt gctttgatgg cacgaccaac aacaccataa tggaagacag tgtgccggca 6240
gaggtgtgga ccagatacgg agagaaaaga gtgctcaaac cgaggtggat ggacgccaga 6300
gtttgttcag atcatgcggc cctgaagtca ttcaaagagt ttgccgctgg gaaaagagga 6360
gcggcctttg gagtgatgga agccctggga acactgccag gacatatgac agagagattc 6420
caggaggcca ttgacaacct cgctgtgctc atgcgggcag agactggaag caggccctac 6480
aaagccgcgg cggcccaatt accggagacc ctagagacta tcatgctttt ggggttgctg 6540
ggaacagtct cgctgggaat ctttttcgtc ttgatgcgga acaagggcat agggaagatg 6600
ggctttggaa tggtgactct tggggccagc gcatggctta tgtggctctc ggaaattgag 6660
ccagccagaa ttgcatgtgt cctcattgtt gtgttcctat tgctggtggt gctcatacct 6720
gagccagaaa agcaaagatc tccccaggac aaccaaatgg caatcatcat catggtagca 6780
gtgggtcttc tgggcttgat taccgccaat gaactcggat ggttggagag aacaaagagt 6840
gacctaagcc atctaatggg aaggagagag gagggggcaa cnataggatt ctcaatggac 6900
attgacctgc ggccagcctc agcttgggct atctatgctg ctctgacaac tttcattacc 6960
ccagccgtcc aacatgcagt gaccacttca tacaacaact actccttaat ggcgatggcc 7020
acgcaagctg gagtgttgtt cggtatgggt aaagggatgc cattctatgc atgggacttt 7080
ggagtcccgc tgctaatgat aggttgctac tcacaattaa cacccctgac cctaatagtg 7140
gccatcattt tgctcgtggc gcactacatg tacttgatcc cagggctgca ggcagcagct 7200
gcgcgtgctg cccagaagag aacggcagct ggcatcatga agaaccctgt tgtggatgga 7260
atagtggtga ctgacattga cacaatgaca attgaccccc aagtggagaa aaagatggga 7320
caggtgctac tcatagcagt agctgtctcc agcgccatac tgtcgcggac cgcctggggg 7380
tggggtgagg ctggggccct gatcacagct gcaacttcca ctttgtggga gggctctccg 7440
aacaagtact ggaactcctc cacagccacc tcactgtgta acatttttag gggaagctac 7500
ttggctggag cttctctaat ctacacagta acaagaaacg ctggcttggt caagagacgt 7560
gggggtggaa cgggagagac cctgggagag aaatggaagg cccgcctgaa ccagatgtcg 7620
gccctggagt tctactccta caaaaagtca ggcatcaccg aggtgtgcag agaagaggcc 7680
cgccgcgccc tcaaggacgg tgtggcaacg ggaggccacg ctgtgtcccg aggaagtgca 7740
aagctgagat ggttggtgga gaggggatac ctgcagccct atggaaaggt cattgatctt 7800
ggatgtggca gagggggctg gagttactat gccgccacca tccgcaaagt tcaagaagtg 7860
aaaggataca caaaaggagg ccctggtcat gaagaaccca tgttggtgca aagctatggg 7920
tggaacatag tccgtcttaa gagtggggtg gacgtctttc atatggcggc tgagccgtgt 7980
gacacgttgc tgtgtgatat aggtgagtca tcatctagtc ctgaagtgga agaagcacgg 8040
acgctcagag tcctctccat ggtgggggat tggcttgaaa aaagaccagg agccttttgt 8100
ataaaagtgt tgtgcccata caccagcact atgatggaaa ccctggagcg actgcagcgt 8160
aggtatgggg gaggactggt cagagtgcca ctctcccgca actctacaca tgagatgtac 8220
tgggtctctg gagcgaaaag caacaccata aaaagtgtgt ccaccacgag ccagctcctt 8280
ttggggcgca tggacgggcc caggaggcca gtgaaatatg aagaggatgt gaatctcggc 8340
tctggcacgc gggctgtggt aagctgcgct gaagctccca acatgaagat cattggtaac 8400
cgcattgaga ggatccgcag tgagcacgcg gaaacgtggt tctttgacga gaaccaccca 8460
tataggacat gggcttacca tggaagctac gaggccccca cacaagggtc agcgtcctct 8520
ctaataaacg gggttgtcag gctcctgtca aaaccctggg atgtggtgac tggagtcaca 8580
ggaatagcca tgaccgacac cacaccgtat ggtcagcaaa gagttttcaa ggaaaaagtg 8640
gacactaggg tgccagaccc ccaagaaggc actcgtcagg ttatgagcat ggtctcttcc 8700
tggttgtgga aagagttagg caaacacaaa cggccacgag tctgtaccaa agaagagttc 8760
atcaacaagg ttcgtagcaa cgcagcatta ggggcaatat ttgaagagga aaaagagtgg 8820
aagactgcag tggaagctgt gaacgatcca aggttctggg ctctagtgga caaggaaaga 8880
gagcaccacc tgagaggaga gtgccagagc tgtgtgtaca acatgatggg aaaaagagaa 8940
aagaaacaag gggaatttgg aaaggccaag ggcagccgcg ccatctggta catgtggcta 9000
ggggctagat ttctagagtt cgaagccctt ggattcttga acgaggatca ctggatgggg 9060
agagagaatt caggaggtgg tgttgaaggg ctaggattac aaagactcgg atatgtctta 9120
gaagagatga gtcgcatacc aggaggaagg atgtatgcag atgatactgc tggctgggac 9180
acccgcatca gcaggtttga tctggagaat gaagctctaa tcaccaacca aatggagaaa 9240
gggcacaggg ccttggcatt ggccataatc aagtacacat accaaaacaa agtggtaaag 9300
gtccttagac cagctgaaaa agggaagaca gttatggaca ttatttcaag acaagaccaa 93 60
agggggagcg gacaagttgt cacttacgct cttaatacat ttaccaacct agtggtgcag 9420
ctcattcgga atatggaggc tgaggaagtt ctagagatgc aagacttgtg gctgctgcgg 9480
aggtcagaga aagtgaccaa ctggttgcag agcaatggat gggataggct caaacgaatg 9540
gcagtcagtg gagatgattg cgttgtgaaa ccaattgatg ataggtttgc acatgctctc 9600
aggttcttga atgatatggg aaaagttagg aaggacacac aagagtggaa gccctcaact 9660
ggatgggaca actgggaaga agttccgttt tgctcccacc acttcaacaa gctccatctc 9720
aaggacggga ggtccattgt ggttccctgc cgccaccaag atgaactgat tggccgagct 9780
cgcgtctcac cgggggcggg atggagcatc cgggagactg cttgcctagc aaaatcatat 9840
gcgcaaatgt ggcagctcct ttatttccac agaagggacc tccgactgat ggccaatgcc 9900
atttgttcat ctgtgccagt tgactgggtt ccaactggga gaactacctg gtcaatccat 9960
ggaaagggag aatggatgac cactgaagac atgcttgtgg tgtggaacag agtgtggatt 10020
gaggagaacg accacatgga agacaagacc ccagttacga aatggacaga cattccctat 10080
ttgggaaaaa gggaagactt gtggtgtggg tctctcatag ggcacagacc gcgcaccacc 10140
tgggctgaga acattaaaaa cacagtcaac atgatgcgta ggatcatagg tgatgaagaa 10200
aagtacgtgg actacctatc cacccaagtt cgctacttgg gcgaagaagg gtccacacct 10260
ggagtgcta 10269
<210> 8 <211> 3423 <212> PRT
<213> Полный ORF, Зика штамм FSS13025
<400> 8
Met Lys Asn Pro Lys Lys Lys Ser Gly Gly Phe Arg Ile Val Asn Met
1 5 10 15
Leu Lys Arg Gly Val Ala Arg Val Ser Pro Phe Gly Gly Leu Lys Arg
20 25 30
Leu Pro Ala Gly Leu Leu Leu Gly His Gly Pro Ile Arg Met Val Leu
35 40 45
Ala Ile Leu Ala Phe Leu Arg Phe Thr Ala Ile Lys Pro Ser Leu Gly
50 55 60
Leu Ile Asn Arg Trp Gly Ser Val Gly Lys Lys Glu Ala Met Glu Ile
65 70 75 80
Ile Lys Lys Phe Lys Lys Asp Leu Ala Ala Met Leu Arg Ile Ile Asn
85 90 95
Ala Arg Lys Glu Lys Lys Arg Arg Gly Thr Asp Thr Ser Val Gly Ile
100 105 110
Val Gly Leu Leu Leu Thr Thr Ala Met Ala Val Glu Val Thr Arg Arg
115 120 125
Gly Asn Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Asp Arg Ser Asp Ala Gly Glu Ala
130 135 140
Ile Ser Phe Pro Thr Thr Met Gly Met Asn Lys Cys Tyr Ile Gln Ile
145 150 155 160
Met Asp Leu Gly His Met Cys Asp Ala Thr Met Ser Tyr Glu Cys Pro
165 170 175
Met Leu Asp Glu Gly Val Glu Pro Asp Asp Val Asp Cys Trp Cys Asn
180 185 190
Thr Thr Ser Thr Trp Val Val Tyr Gly Thr Cys His His Lys Lys Gly
195 200 205
Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr Leu Pro Ser His Ser Thr
210 215 220
Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu Tyr
225 230 235 240
Thr Lys His Leu Ile Arg Val Glu Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro Gly
245 250 255
Phe Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ile Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser Thr
260 265 270
Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu Val Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro Ala
275 280 285
Tyr Ser Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly
290 295 300
Met Ser Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys
305 310 315 320
Val Thr Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val
325 330 335
Thr Thr Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu
340 345 350
Ala Ser Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly
355 360 365
Glu Ala Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg
370 375 380
Thr Leu Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys
385 390 395 400
Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr
405 410 415
Gly Lys Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser
420 425 430
Val His Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His
435 440 445
Glu Thr Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro
450 455 460
Arg Ala Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys
465 470 475 480
Glu Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met
485 490 495
Asn Asn Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro
500 505 510
Leu Pro Trp His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn
515 520 525
Lys Glu Ala Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr
530 535 540
Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala
545 550 555 560
Gly Ala Leu Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly
580 585 590
Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro
595 600 605
Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly
610 615 620
Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln
625 630 635 640
Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr
645 650 655
Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe
660 665 670
Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His
675 680 685
His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr
690 695 700
Val Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp
705 710 715 720
Phe Gly Ser Val Gly Gly Ala Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His
725 730 735
Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp
740 745 750
Phe Ser Gln Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Val Trp Leu Gly Leu Asn
755 760 765
Thr Lys Asn Gly Ser Ile Ser Leu Met Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val
770 775 780
Leu Ile Phe Leu Ser Thr Ala Val Ser Ala Asp Val Gly Cys Ser Val
785 790 795 800
Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly Thr Gly Val Phe Val Tyr
805 810 815
Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys Tyr His Pro Asp Ser
820 825 830
Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala Trp Glu Asp Gly Ile
835 840 845
Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu Asn Ile Met Trp Arg Ser
850 855 860
Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu Glu Asn Gly Val Gln Leu
865 870 875 880
Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln
885 890 895
Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp
900 905 910
Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr Asn Asn Ser Phe Val
915 920 925
Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro Leu Lys His Arg Ala Trp
930 935 940
Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe Gly Val Phe His Thr Ser
945 950 955 960
Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu Glu Cys Asp Pro Ala
965 970 975
Val Ile Gly Thr Ala Ala Lys Gly Lys Glu Ala Val His Ser Asp Leu
980 985 990
Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr Trp Arg Leu Lys Arg
995 1000 1005
Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu Trp Pro Lys Ser His
1010 1015 1020
Thr Leu Trp Thr Asp Gly Ile Glu Glu Ser Asp Leu Ile Ile Pro
1025 1030 1035
Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr Arg Glu Gly
1040 1045 1050
Tyr Arg Thr Gln Met Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu Leu Glu
1055 1060 1065
Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu Glu
1070 1075 1080
Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser
1085 1090 1095
Gly Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro
1100 1105 1110
Pro Leu Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu
1115 1120 1125
Ile Arg Pro Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met
1130 1135 1140
Val Thr Ala Gly Ser Thr Asp His Met Asp His Phe Ser Leu Gly
1145 1150 1155
Val Leu Val Ile Leu Leu Met Val Gln Glu Gly Leu Lys Lys Arg
1160 1165 1170
Met Thr Thr Lys Ile Ile Ile Ser Thr Ser Met Ala Val Leu Val
1175 1180 1185
Ala Met Ile Leu Gly Gly Phe Ser Met Ser Asp Leu Ala Lys Leu
1190 1195 1200
Ala Ile Leu Met Gly Ala Thr Phe Ala Glu Met Asn Thr Gly Gly
1205 1210 1215
Asp Val Ala His Leu Ala Leu Ile Ala Ala Phe Lys Val Arg Pro
1220 1225 1230
Ala Leu Leu Val Ser Phe Ile Phe Arg Ala Asn Trp Thr Pro Arg
1235 1240 1245
Glu Ser Met Leu Leu Ala Leu Ala Ser Cys Leu Leu Gln Thr Ala
1250 1255 1260
Ile Ser Ala Leu Glu Gly Asp Leu Met Val Pro Ile Asn Gly Phe
1265 1270 1275
Ala Leu Ala Trp Leu Ala Ile Arg Ala Met Val Val Pro Arg Thr
1280 1285 1290
Asp Asn Ile Thr Leu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Thr Pro Leu Ala
1295 1300 1305
Arg Gly Thr Leu Leu Val Ala Trp Arg Ala Gly Leu Ala Thr Cys
1310 1315 1320
Gly Gly Phe Met Leu Leu Ser Leu Lys Gly Lys Gly Ser Val Lys
1325 1330 1335
Lys Asn Leu Pro Phe Val Met Ala Leu Gly Leu Thr Ala Val Arg
1340 1345 1350
Leu Val Asp Pro Ile Asn Val Val Gly Leu Leu Leu Leu Thr Arg
1355 1360 1365
Ser Gly Lys Arg Ser Trp Pro Pro Ser Glu Val Leu Thr Ala Val
1370 1375 1380
Gly Leu Ile Cys Ala Leu Ala Gly Gly Phe Ala Lys Ala Asp Ile
1385 1390 1395
Glu Met Ala Gly Pro Met Ala Ala Val Gly Leu Leu Ile Val Ser
1400 1405 1410
Tyr Val Val Ser Gly Lys Ser Val Asp Met Tyr Ile Glu Arg Ala
1415 1420 1425
Gly Asp Ile Thr Trp Glu Lys Asp Ala Glu Val Thr Gly Asn Ser
1430 1435 1440
Pro Arg Leu Asp Val Ala Leu Asp Glu Ser Gly Asp Phe Ser Leu
1445 1450 1455
Val Glu Asp Asp Gly Pro Pro Met Arg Glu Ile Ile Leu Lys Val
1460 1465 1470
Val Leu Met Ala Ile Cys Gly Met Asn Pro Ile Ala Ile Pro Phe
1475 1480 1485
Ala Ala Gly Ala Trp Tyr Val Tyr Val Lys Thr Gly Lys Arg Ser
1490 1495 1500
Gly Ala Leu Trp Asp Val Pro Ala Pro Lys Glu Val Lys Lys Gly
1505 1510 1515
Glu Thr Thr Asp Gly Val Tyr Arg Val Met Thr Arg Arg Leu Leu
1520 1525 1530
Gly Ser Thr Gln Val Gly Val Gly Val Met Gln Glu Gly Val Phe
1535 1540 1545
His Thr Met Trp His Val Thr Lys Gly Ser Ala Leu Arg Ser Gly
1550 1555 1560
Glu Gly Arg Leu Asp Pro Tyr Trp Gly Asp Val Lys Gln Asp Leu
1565 1570 1575
Val Ser Tyr Cys Gly Pro Trp Lys Leu Asp Ala Ala Trp Asp Gly
1580 1585 1590
His Ser Glu Val Gln Leu Leu Ala Val Pro Pro Gly Glu Arg Ala
1595 1600 1605
Arg Asn Ile Gln Thr Leu Pro Gly Ile Phe Lys Thr Lys Asp Gly
1610 1615 1620
Asp Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Ser Gly
1625 1630 1635
Ser Pro Ile Leu Asp Lys Cys Gly Arg Val Ile Gly Leu Tyr Gly
1640 1645 1650
Asn Gly Val Val Ile Lys Asn Gly Ser Tyr Val Ser Ala Ile Thr
1655 1660 1665
Gln Gly Arg Arg Glu Glu Glu Thr Pro Val Glu Cys Phe Glu Pro
1670 1675 1680
Ser Met Leu Lys Lys Lys Gln Leu Thr Val Leu Asp Leu His Pro
1685 1690 1695
Gly Ala Gly Lys Thr Arg Arg Val Leu Pro Glu Ile Val Arg Glu
1700 1705 1710
Ala Ile Lys Thr Arg Leu Arg Thr Val Ile Leu Ala Pro Thr Arg
1715 1720 1725
Val Val Ala Ala Glu Met Glu Glu Ala Leu Arg Gly Leu Pro Val
1730 1735 1740
Arg Tyr Met Thr Thr Ala Val Asn Val Thr His Ser Gly Thr Glu
1745 1750 1755
Ile Val Asp Leu Met Cys His Ala Thr Phe Thr Ser Arg Leu Leu
1760 1765 1770
Gln Pro Ile Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu Tyr Ile Met Asp Glu
1775 1780 1785
Ala His Phe Thr Asp Pro Ser Ser Ile Ala Ala Arg Gly Tyr Ile
1790 1795 1800
Ser Thr Arg Val Glu Met Gly Glu Ala Ala Ala Ile Phe Met Thr
1805 1810 1815
Ala Thr Pro Pro Gly Thr Arg Asp Ala Phe Pro Asp Ser Asn Ser
1820 1825 1830
Pro Ile Met Asp Thr Glu Val Glu Val Pro Glu Arg Ala Trp Ser
1835 1840 1845
Ser Gly Phe Asp Trp Val Thr Asp His Ser Gly Lys Thr Val Trp
1850 1855 1860
Phe Val Pro Ser Val Arg Asn Gly Asn Glu Ile Ala Ala Cys Leu
1865 1870 1875
Thr Lys Ala Gly Lys Arg Val Ile Gln Leu Ser Arg Lys Thr Phe
1880 1885 1890
Glu Thr Glu Phe Gln Lys Thr Lys His Gln Glu Trp Asp Phe Val
1895 1900 1905
Val Thr Thr Asp Ile Ser Glu Met Gly Ala Asn Phe Lys Ala Asp
1910 1915 1920
Arg Val Ile Asp Ser Arg Arg Cys Leu Lys Pro Val Ile Leu Asp
1925 1930 1935
Gly Glu Arg Val Ile Leu Ala Gly Pro Met Pro Val Thr His Ala
1940 1945 1950
Ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly Arg Asn Pro Asn Lys
1955 1960 1965
Pro Gly Asp Glu Tyr Leu Tyr Gly Gly Gly Cys Ala Glu Thr Asp
1970 1975 1980
Glu Asp His Ala His Trp Leu Glu Ala Arg Met Leu Leu Asp Asn
1985 1990 1995
Ile Tyr Leu Gln Asp Gly Leu Ile Ala Ser Leu Tyr Arg Pro Glu
2000 2005 2010
Ala Asp Lys Val Ala Ala Ile Glu Gly Glu Phe Lys Leu Arg Thr
2015 2020 2025
Glu Gln Arg Lys Thr Phe Val Glu Leu Met Lys Arg Gly Asp Leu
2030 2035 2040
Pro Val Trp Leu Ala Tyr Gln Val Ala Ser Ala Gly Ile Thr Tyr
2045 2050 2055
Thr Asp Arg Arg Trp Cys Phe Asp Gly Thr Thr Asn Asn Thr Ile
2060 2065 2070
Met Glu Asp Ser Val Pro Ala Glu Val Trp Thr Arg Tyr Gly Glu
2075 2080 2085
Lys Arg Val Leu Lys Pro Arg Trp Met Asp Ala Arg Val Cys Ser
2090 2095 2100
Asp His Ala Ala Leu Lys Ser Phe Lys Glu Phe Ala Ala Gly Lys
2105 2110 2115
Arg Gly Ala Ala Phe Gly Val Met Glu Ala Leu Gly Thr Leu Pro
2120 2125 2130
Gly His Met Thr Glu Arg Phe Gln Glu Ala Ile Asp Asn Leu Ala
2135 2140 2145
Val Leu Met Arg Ala Glu Thr Gly Ser Arg Pro Tyr Lys Ala Ala
2150 2155 2160
Ala Ala Gln Leu Pro Glu Thr Leu Glu Thr Ile Met Leu Leu Gly
2165 2170 2175
Leu Leu Gly Thr Val Ser Leu Gly Ile Phe Phe Val Leu Met Arg
2180 2185 2190
Asn Lys Gly Ile Gly Lys Met Gly Phe Gly Met Val Thr Leu Gly
2195 2200 2205
Ala Ser Ala Trp Leu Met Trp Leu Ser Glu Ile Glu Pro Ala Arg
2210 2215 2220
Ile Ala Cys Val Leu Ile Val Val Phe Leu Leu Leu Val Val Leu
2225 2230 2235
Ile Pro Glu Pro Glu Lys Gln Arg Ser Pro Gln Asp Asn Gln Met
2240 2245 2250
Ala Ile Ile Ile Met Val Ala Val Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr
2255 2260 2265
Ala Asn Glu Leu Gly Trp Leu Glu Arg Thr Lys Ser Asp Leu Ser
2270 2275 2280
His Leu Met Gly Arg Arg Glu Glu Gly Ala Thr Ile Gly Phe Ser
2285 2290 2295
Met Asp Ile Asp Leu Arg Pro Ala Ser Ala Trp Ala Ile Tyr Ala
2300 2305 2310
Ala Leu Thr Thr Phe Ile Thr Pro Ala Val Gln His Ala Val Thr
2315 2320 2325
Thr Ser Tyr Asn Asn Tyr Ser Leu Met Ala Met Ala Thr Gln Ala
2330 2335 2340
Gly Val Leu Phe Gly Met Gly Lys Gly Met Pro Phe Tyr Ala Trp
2345 2350 2355
Asp Phe Gly Val Pro Leu Leu Met Ile Gly Cys Tyr Ser Gln Leu
2360 2365 2370
Thr Pro Leu Thr Leu Ile Val Ala Ile Ile Leu Leu Val Ala His
2375 2380 2385
Tyr Met Tyr Leu Ile Pro Gly Leu Gln Ala Ala Ala Ala Arg Ala
2390 2395 2400
Ala Gln Lys Arg Thr Ala Ala Gly Ile Met Lys Asn Pro Val Val
2405 2410 2415
Asp Gly Ile Val Val Thr Asp Ile Asp Thr Met Thr Ile Asp Pro
2420 2425 2430
Gln Val Glu Lys Lys Met Gly Gln Val Leu Leu Ile Ala Val Ala
2435 2440 2445
Val Ser Ser Ala Ile Leu Ser Arg Thr Ala Trp Gly Trp Gly Glu
2450 2455 2460
Ala Gly Ala Leu Ile Thr Ala Ala Thr Ser Thr Leu Trp Glu Gly
2465 2470 2475
Ser Pro Asn Lys Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Ala Thr Ser Leu Cys
2480 2485 2490
Asn Ile Phe Arg Gly Ser Tyr Leu Ala Gly Ala Ser Leu Ile Tyr
2495 2500 2505
Thr Val Thr Arg Asn Ala Gly Leu Val Lys Arg Arg Gly Gly Gly
2510 2515 2520
Thr Gly Glu Thr Leu Gly Glu Lys Trp Lys Ala Arg Leu Asn Gln
2525 2530 2535
Met Ser Ala Leu Glu Phe Tyr Ser Tyr Lys Lys Ser Gly Ile Thr
2540 2545 2550
Glu Val Cys Arg Glu Glu Ala Arg Arg Ala Leu Lys Asp Gly Val
2555 2560 2565
Ala Thr Gly Gly His Ala Val Ser Arg Gly Ser Ala Lys Leu Arg
2570 2575 2580
Trp Leu Val Glu Arg Gly Tyr Leu Gln Pro Tyr Gly Lys Val Ile
2585 2590 2595
Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly Trp Ser Tyr Tyr Ala Ala Thr
2600 2605 2610
Ile Arg Lys Val Gln Glu Val Lys Gly Tyr Thr Lys Gly Gly Pro
2615 2620 2625
Gly His Glu Glu Pro Met Leu Val Gln Ser Tyr Gly Trp Asn Ile
2630 2635 2640
Val Arg Leu Lys Ser Gly Val Asp Val Phe His Met Ala Ala Glu
2645 2650 2655
Pro Cys Asp Thr Leu Leu Cys Asp Ile Gly Glu Ser Ser Ser Ser
2660 2665 2670
Pro Glu Val Glu Glu Ala Arg Thr Leu Arg Val Leu Ser Met Val
2675 2680 2685
Gly Asp Trp Leu Glu Lys Arg Pro Gly Ala Phe Cys Ile Lys Val
2690 2695 2700
Leu Cys Pro Tyr Thr Ser Thr Met Met Glu Thr Leu Glu Arg Leu
2705 2710 2715
Gln Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Leu Val Arg Val Pro Leu Ser Arg
2720 2725 2730
Asn Ser Thr His Glu Met Tyr Trp Val Ser Gly Ala Lys Ser Asn
2735 2740 2745
Thr Ile Lys Ser Val Ser Thr Thr Ser Gln Leu Leu Leu Gly Arg
2750 2755 2760
Met Asp Gly Pro Arg Arg Pro Val Lys Tyr Glu Glu Asp Val Asn
2765 2770 2775
Leu Gly Ser Gly Thr Arg Ala Val Val Ser Cys Ala Glu Ala Pro
2780 2785 2790
Asn Met Lys Ile Ile Gly Asn Arg Ile Glu Arg Ile Arg Ser Glu
2795 2800 2805
His Ala Glu Thr Trp Phe Phe Asp Glu Asn His Pro Tyr Arg Thr
2810 2815 2820
Trp Ala Tyr His Gly Ser Tyr Glu Ala Pro Thr Gln Gly Ser Ala
2825 2830 2835
Ser Ser Leu Ile Asn Gly Val Val Arg Leu Leu Ser Lys Pro Trp
2840 2845 2850
Asp Val Val Thr Gly Val Thr Gly Ile Ala Met Thr Asp Thr Thr
2855 2860 2865
Pro Tyr Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr Arg
2870 2875 2880
Val Pro Asp Pro Gln Glu Gly Thr Arg Gln Val Met Ser Met Val
2885 2890 2895
Ser Ser Trp Leu Trp Lys Glu Leu Gly Lys His Lys Arg Pro Arg
2900 2905 2910
Val Cys Thr Lys Glu Glu Phe Ile Asn Lys Val Arg Ser Asn Ala
2915 2920 2925
Ala Leu Gly Ala Ile Phe Glu Glu Glu Lys Glu Trp Lys Thr Ala
2930 2935 2940
Val Glu Ala Val Asn Asp Pro Arg Phe Trp Ala Leu Val Asp Lys
2945 2950 2955
Glu Arg Glu His His Leu Arg Gly Glu Cys Gln Ser Cys Val Tyr
2960 2965 2970
Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Gln Gly Glu Phe Gly Lys
2975 2980 2985
Ala Lys Gly Ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala Arg
2990 2995 3000
Phe Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu Asp His Trp
3005 3010 3015
Met Gly Arg Glu Asn Ser Gly Gly Gly Val Glu Gly Leu Gly Leu
3020 3025 3030
Gln Arg Leu Gly Tyr Val Leu Glu Glu Met Ser Arg Ile Pro Gly
3035 3040 3045
Gly Arg Met Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Arg Ile
3050 3055 3060
Ser Arg Phe Asp Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Thr Asn Gln Met
3065 3070 3075
Glu Lys Gly His Arg Ala Leu Ala Leu Ala Ile Ile Lys Tyr Thr
3080 3085 3090
Tyr Gln Asn Lys Val Val Lys Val Leu Arg Pro Ala Glu Lys Gly
3095 3100 3105
Lys Thr Val Met Asp Ile Ile Ser Arg Gln Asp Gln Arg Gly Ser
3110 3115 3120
Gly Gln Val Val Thr Tyr Ala Leu Asn Thr Phe Thr Asn Leu Val
3125 3130 3135
Val Gln Leu Ile Arg Asn Met Glu Ala Glu Glu Val Leu Glu Met
3140 3145 3150
Gln Asp Leu Trp Leu Leu Arg Arg Ser Glu Lys Val Thr Asn Trp
3155 3160 3165
Leu Gln Ser Asn Gly Trp Asp Arg Leu Lys Arg Met Ala Val Ser
3170 3175 3180
Gly Asp Asp Cys Val Val Lys Pro Ile Asp Asp Arg Phe Ala His
3185 3190 3195
Ala Leu Arg Phe Leu Asn Asp Met Gly Lys Val Arg Lys Asp Thr
3200 3205 3210
Gln Glu Trp Lys Pro Ser Thr Gly Trp Asp Asn Trp Glu Glu Val
3215 3220 3225
Pro Phe Cys Ser His His Phe Asn Lys Leu His Leu Lys Asp Gly
3230 3235 3240
Arg Ser Ile Val Val Pro Cys Arg His Gln Asp Glu Leu Ile Gly
3245 3250 3255
Arg Ala Arg Val Ser Pro Gly Ala Gly Trp Ser Ile Arg Glu Thr
3260 3265 3270
Ala Cys Leu Ala Lys Ser Tyr Ala Gln Met Trp Gln Leu Leu Tyr
3275 3280 3285
Phe His Arg Arg Asp Leu Arg Leu Met Ala Asn Ala Ile Cys Ser
3290 3295 3300
Ser Val Pro Val Asp Trp Val Pro Thr Gly Arg Thr Thr Trp Ser
3305 3310 3315
Ile His Gly Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Val
3320 3325 3330
Val Trp Asn Arg Val Trp Ile Glu Glu Asn Asp His Met Glu Asp
3335 3340 3345
Lys Thr Pro Val Thr Lys Trp Thr Asp Ile Pro Tyr Leu Gly Lys
3350 3355 3360
Arg Glu Asp Leu Trp Cys Gly Ser Leu Ile Gly His Arg Pro Arg
3365 3370 3375
Thr Thr Trp Ala Glu Asn Ile Lys Asn Thr Val Asn Met Met Arg
3380 3385 3390
Arg Ile Ile Gly Asp Glu Glu Lys Tyr Val Asp Tyr Leu Ser Thr
3395 3400 3405
Gln Val Arg Tyr Leu Gly Glu Glu Gly Ser Thr Pro Gly Val Leu
3410 3415 3420
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Стабильная вакцинная композиция, содержащая один или несколько антигенов арбовируса, выбранных из вируса Зика, вируса Чикунгунья и вируса японского энцефалита, где указанные антигены формулируются с или без адъюванта в фармацевтически приемлемом буфере, причем вакцинная композиция вызывает защитный иммунный ответ к каждому из вирусов у млекопитающих.
2. Вакцинная композиция по пункту 1, причем указанный вирусный антиген Зика является эффективным для лечения, диагностики и профилактики против любого генотипа/генотипных вариантов/штаммов вируса Зика.
3. Вакцинная композиция по пункту 2, причем композиция является эффективной против любого генотипа/генотипных вариантов/штаммов/синтетических вирусов Зика, имеющих в любом случае от 50% до 100% идентичности на аминокислотном уровне в любом участке генома.
4. Вакцинная композиция по пункту 3, содержащая антигены вируса Зика любого генотипа/генотипного варианта/штаммов/синтетического вируса Зика, причем антитела против какого-либо из указанных выше типов вируса Зика перекрестно нейтрализуют гомологический вирус или любой гетерологичный штамм вируса Зика, который имеет по меньшей мере 50% -100% аминокислотную идентичность в любом участке всего своего генома, в частности протеина оболочки Е.
5. Вакцинная композиция по пункту 1, причем антигены вируса Зика, вируса Чикунгунья и вируса японского энцефалита представляют собой инактивированные целые антигены вирионов (вирусы).
6. Вакцинная композиция по пункту 1, причем антигены вируса Зика и Чикунгунья представляют собой очищенные рекомбинантные антигены.
7. Вакцинная композиция по пункту 1, причем вирусный антиген Зика получают с использованием клеток Vero в качестве клеточного субстрата путем адаптации вируса к клеткам Vero.
8. Вакцинная композиция по пункту 1, причем указанный вирусный антиген Зика представляет собой очищенный и концентрированный антиген, полученный одним или несколькими способами, выбранными из:
a. ультрацентрифугирования;
b. центрифугирования по градиенту плотности;
c. осветления собранных вирусных клеток с использованием мембранной фильтрации, с последующей очисткой с использованием колоночной хроматографии; и
d. тангенциальной текущей фильтрации с использованием мембран с отсечением от 100 кДа до 300 кДа, причем тангенциальную фильтрацию осуществляют или перед, или после инактивации вируса.
9. Вакцинная композиция по пункту 8, причем указанная очистка с использованием колоночной хроматографии включает гель-фильтрацию, колоночную хроматографию со смешанным режимом смолы, ионообменную колоночную хроматографию, афинную матричную хроматографию и хроматографию с гидрофобными взаимодействиями.
10. Вакцинная композиция по пункту 9, причем колоночная хроматография элюирует большинство антигена вируса в потоке, таком как Capto Core 700, наиболее предпочтительно Capto Core 700, причем вирусный образец очищен на колонке Capto Core 700 и элюирован в потоке.
11. Вакцинная композиция по пункту 5, причем вирус Зика инактивирован по меньшей мере одним или несколькими из химических инактивирующих агентов, физическими инактивирующими агентами и облучающими агентами.
12. Вакцинная композиция по пункту 11, причем инактивацию вируса Зика осуществляют перед или после очистки вируса.
13. Вакцинная композиция по пункту 12, причем вирус Зика инактивирован химическим инактивирующим агентом, выбранным из формалина (формальдегида), бета-пропиолактона (BPL) и пероксида водорода.
14. Вакцинная композиция по пункту 13, причем вирус Зика инактивирован каким-либо одним из следующих способов, выбранных из:
e. Обработки формалином при любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1 : 500 вплоть до 1 : 4000 об./об. формалин : вирус, при от 8°С до 37°С, предпочтительно 25±3°С, в течение по меньшей мере от 1 до 7 дней;
f. Обработки формалином при любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1 : 500 вплоть до 1 : 4000 об./об. формалин : вирус, при от 2°С до 8°С в течение по меньшей мере от 10 до 30 дней;
g. Бета-пропиолактона (далее BPL) при любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1 : 500 вплоть до 1 : 4000 об./об. BPL : вирус, в течение по меньшей мере 24 до 48 часов при температурах, которая находится в диапазоне от 8°С до 30°С, предпочтительно 25±3°С, в течение 48 часов;
h. Бета-пропиолактона при любой концентрации, которая находится в диапазоне от 1 : 500 вплоть до 1 : 4000 (BPL : вирус, об./об.), при от 2°С до 8°С в течение по меньшей мере 3-7 дней;
i. Комбинации с BPL и формалином при любой из указанных выше условий,
предпочтительно BPL инактивация при 1 : 3000 (BPL : вирус, об./об.) в
течение 24 часов с последующей инактивацией формалином при 1 : 3000
(формалин : вирус, об./об.) в течение от 24 до 48 часов при от 15°С до 30°С,
предпочтительно 25±3°С;
j. Пероксида водорода при любой концентрации, от 0,1 до 3%, предпочтительно от 0,1 до 1% при любой температуре от 20 до 30°С в течение от 5 минут до 120 минут.
15. Вакцинная композиция по пункту 11, причем инактивация вируса Зика облучающим агентом включает инактивацию гамма-облучением путем экспозиции от 20 кГр (Кило Грей) вплоть до 35 кГр, предпочтительно от 25 кГр до 30 кГр из
Со источника.
16. Вакцинная композиция по пункту 11, причем инактивация вируса Зика облучающим агентом включает инактивацию облучением УФ за счет экспозиции на 254 нм в течение 30-60 минут.
16.
17. Вакцинная композиция по пункту 11, причем вирус инактивирован путем термической обработки при температуре от 50°С до 65°С в течение от 30 мин. вплоть до 2 часов.
18. Вакцинная композиция по пункту 1, причем буфер выбран из перечня, включающего фосфатный буфер, цитратный буфер, фосфатно-цитратный буфер, боратный буфер, буфер, содержащий три(гидроксиметил)аминометан (Tris), сукцинатный буфер, буферы, содержащие глицин или гистидин, в качестве одного из буферных агентов.
19. Вакцинная композиция по пункту 18, причем фосфатный буфер представляет собой натрий-фосфатный буфер в концентрации от 5 мМ вплоть до 200 мМ фосфатных ионов при любом рН от 6,50 до рН 9, и необязательно, содержащий натрия хлорид в концентрации от 50 до 200 мМ.
20. Вакцинная композиция по пункту 1, причем буфер поддерживает рН в жидкой композиции выше рН 6,5, предпочтительно выше рН 7,0 по всему биопроцессу от вирусной культуры вплоть до получения очищенного инактивированного основного вируса.
21. Вакцинная композиция по пункту 11, причем инактивацию вируса Зика осуществляют в присутствии стабилизирующего агента, выбранного из лактозы, сахарозы, трегалозы, мальтозы, маннозы, изо-мальтозы, рафинозы, стахиозы, лактобиозы, сорбита, маннита, лактобионовой кислоты, декстрана, L-глицина, L-гистидина, L-глутаминовой кислоты, L-аспарагиновой кислоты и альбумина сыворотки человека или их комбинаций.
22. Вакцинная композиция по пункту 21, причем стабилизирующий агент выбран из:
a. 2% сорбита и 1% L-глицина;
b. 1% сорбита и 0,5 % L-глицина;
c. 1% маннита и 0,5% L-глицина;
d. 1% маннита и 0,5% L-глутаминовой кислоты; и
e. 1% сорбита и 0,5% L-глицина, 1% альбумина сыворотки человека.
23. Вакцинная композиция по пункту 11, причем инактивация вируса Зика включает инактивацию любого генотипа/штамма, живого ослабленного вируса Зика, дезактивированного вируса, вирусоподобных частиц, химерных вирусных частиц несущих любые антигены вируса Зика, в частности, Е протеин в каком-либо гетерологичном вирусном скелете, в векторных вакцинах и инфекционных синтетических вирусных частиц, полученных in vitro или in vivo с использованием последовательности генома любого вируса Зика.
24. Вакцинная композиция по пункту 6, причем очищенный рекомбинантный вирус Зика содержит антигены вируса Зика, содержащие протеин оболочки (Е), мембранный (М) протеин и необязательно неструктурный 1 (NS1) протеин в качестве вакцинных антигенов для индуцирования иммунного ответа для профилактики вирусных инфекций Зика.
25. Вакцинная композиция по пункту 24, причем вирус Зика имеет структурные протеиновые последовательности, как раскрыто в SEQ. Ш No. 3 и SEQ. Ш NO. 4, что соответствует нуклеотидным последовательностям SEQ Ш. No. 1 и SEQ Ш No.
23.
2, соответственно, для применения в качестве вакцинных антигенов против вирусуных инфекций Зика, вызванных генотипами или их вариантами.
26. Вакцинная композиция по пункту 6, причем рекомбинантные ДНК конструкты содержат (i) вектор, (ii) по меньшей мере один фрагмент нуклеиновой кислоты, который соответствует SEQ Ш NO. 1 или SEQ Ш N0. 2, кодирующей аминокислотную последовательность протеинов SEQ Ш N0. 3, SEQ Ш N0. 4, соответственно, который применим к какой-либо протеиновой последовательности вируса Зика, имеющий по меньшей мере 70% аминокислотную идентичность к указанным выше SEQ ID N0. 3 и SEQ ГО N0. 4.
27. Вакцинная композиция по пункту 26, содержащая рекомбинантный ДНК конструкт, причем вектор представляет собой эукариотический плазмидный вектор, клонированный в эукариотическом хозяине, таком как бакуловирус для экспрессии в клетках насекомых, как вирусоподобных частицах (VLP).
28. Вакцинная композиция по пункту 24, причем рекомбинантный протеин вируса Зика получен способом включающем стадии:
a. трансфекции рекомбинантной плазмидной ДНК в клетках насекомых;
b. сбора клеток и выделение рекомбинантного протеина из них;
c. очистки протеина способом, выбранным из ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, афинной хроматографии, гидрофобной колоночной хроматографии, хроматографии со смешанным режимом смол, диафильтрации, ультрацентрифугирования, центрифугирования по градиенту плотности и фракционирования с солью.
29. Вакцинная композиция по пункту 1, причем структурные антигены вируса Зика экспрессируются в каком-либо прокариотической или эукариотической системе экспрессирования, включающей экспрессию, опосредованную бакуловирусом в клетках насекомых.
30. Вакцинная композиция по пункту 1, причем композиция получена способом, причем нейтрализующие антитела в значительной степени индуцируются против протеина оболочки, например, в оптимально инактивированном вирусе, живом ослабленном вирусе, дезактивированном вирусе, ДНК вакцине, вирусоподобных частицах, химерных вирусных частицах, демонстрирующих протеин Е вируса Зика в любом гетерологичном вирусном скелете, такой как в векторных вакцинах и синтетических вирусных частицах, полученных из любой геномной РНК последовательности вируса Зика.
31. Вакцинная композиция по пункту 1, дополнительно содержащая адъювант.
32. Вакцинная композиция по пункту 31, причем адъювант выбран из группы, состоящей из а) солей алюминия, включающие гидроксид алюминия, алюминия фосфат, алюминия сульфатфосфат; Ь) инулина; с) альгамулина, представляющего собой комбинацию инулина и гидроксида алюминия; d) монофосфориллипида А (MPL); е) резиквимода; f) мурамилдипептида (MDP); g) N-гликолилдипептида (GMDP); h) поли-IC; i) CpG олигонуклеотида; j) гидроксида алюминия с MPL; k) любой эмульсии вода-в-масле; 1) любой эмульсии масло-в-воде, содержащая один или несколько из следующих компонентов: сквалена или его аналогов или любого фармацевтически приемлемого масла, твина-80, сорбиантриолеата, альфа-токоферола, холекальциферола и водного буфера, или любого из аналогов и
29.
производных их молекул i) двух или более комбинаций из любого из указанных выше адъювантов, когда формулируется с антигенами вируса Зика вызывает иммунный ответ против вируса.
33. Вакцинная композиция по пункту 32, причем композиция содержит гидроксид алюминия в концентрации, находящейся в диапазоне от 0,1 мг до 1,5 мг алюминия на вакцинную дозу, предпочтительно от 0,25 мг до 0,5 мг алюминия на вакцинную дозу.
34. Вакцинная композиция по пункту 32, причем адъювант обеспечивает мукозный иммунитет и системный иммунитет при введении млекопитающим.
35. Вакцинная композиция по пункту 1, причем композиция с антигеном вируса Зика вводится у какой-либо дозе, находящейся в диапазоне от 0,125 мкг до 100 мкг на дозу с или без адъюванта, или как одноразовая доза или двумя или более дозами для индуцирования иммунного ответа у млекопитающего.
36. Способ индуцирования защитного иммунного ответа у млекопитающих, в том числе людей, включающий введение вакцинной композиции по пункту 1 каким-либо путем, включающим внутримышечный, интрадермальный, подкожный, внутривенный, пероральный, интраназальный или транскутанный способы введения.
37. Способ введения вакцинной композиции по пункту 1, где какой-либо способ включает иголки и шприцы, включающий предварительно заполненные шприцы, микроигольный пластырь, безигольный пластырь, ингаляционные и назальные спреи.
38. Способ применения in vitro или in vivo антител к вирусу Зика композиции по пункту 1 для получения иммунодиагностических и иммунотерапевтических агентов для вирусных инфекций Зика.
39. Вакцинная композиция по пункту 1, содержащая антигены вируса Зика и вируса японского энцефалита в комбинированной вакцине, вызывающей защитный иммунный ответ у млекопитающих против каждого из вирусов.
40. Вакцинная композиция по пункту 39, причем антиген вируса Зика и инактивированные антигены вируса японского энцефалита присутствуют в комбинированной вакцине в концентрациях, находящихся в диапазоне от 5 мкг до 50 мкг каждого антигена в фармацевтически приемлемой композиции без адъюванта или с адъювантом.
41. Вакцинная композиция по пункту 40, причем адъювант выбран из группы, состоящей из а) солей алюминия, включающие гидроксид алюминия, алюминия фосфат, алюминия сульфатфосфат; Ь) инулина; с) альгамулина, который представляет собой комбинацию из инулина и гидроксида алюминия; d) монофосфориллипида A (MPL); е) резиквимода; f) мурамилдипептида (MDP); g) N-гликолилдипептида (GMDP); h) поли-IC; i) CpG олигонуклеотида; j) гидроксида алюминия с MPL; к) любой эмульсии вода-в-масле; 1) любой эмульсии масло-вводе, содержащая один или несколько из следующих компонентов: сквален или его аналоги или любое фармацевтически приемлемое масло, твин-80, сорбиантриолеат, альфа-токоферол, холекальциферол и водный буфер, или какой-либо из аналогов и
33.
производных их молекул i) двух или более комбинаций любого из указанных выше адъювантов, когда формулируются с антигенами вируса Зика, что вызывает иммунный ответ против вируса.
42. Вакцинная композиция по пункту 41, причем адъювант представляет собой гидроксид алюминия с содержанием алюминия от 0,25 мг до 1,0 мг на вакцинную дозу.
43. Вакцинная композиция по пункту 1, содержащая антигены вируса Зика и вируса Чикунгунья в комбинированной вакцине, вызывающей защитный иммунный ответ у млекопитающих против каждого из вирусов.
44. Вакцинная композиция по пункту 43, причем антигены вируса Зика и Чикунгунья присутствуют в комбинированной вакцине в концентрациях, находящихся в диапазоне от 5 мкг до 50 мкг каждого антигена в фармацевтически приемлемой композиции без адъюванта, или с адъювантом.
45. Вакцинная композиция по пункту 44, причем адъювант выбран из группы, состоящей из а) солей алюминия, включающих гидроксид алюминия, алюминия фосфат, алюминия сульфатфосфат; Ь) инулина; с) альгамулина, который представляет собой комбинацию из инулина и гидроксида алюминия; d) монофосфориллипида A (MPL); е) резиквимода; f) мурамилдипептида (MDP); g) N-гликолилдипептида (GMDP); h) поли-IC; i) CpG олигонуклеотида; j) гидроксида алюминия с MPL; к) любой эмульсии вода-в-масле; 1) любой эмульсии масло-вводе, содержащая один или несколько из следующих компонентов: сквален или его аналоги или любое фармацевтически приемлемое масло, твин-80, сорбиантриолеат, альфа-токоферол, холекальциферол и водный буфер, или какой-либо из аналогов и производных их молекул, i) двух или более комбинаций любого из указанных выше адъювантов, когда формулируются с антигенами вируса Зика, что вызывает иммунный ответ против вируса.
46. Вакцинная композиция по пункту 45, причем адъювант представляет собой гидроксид алюминия с содержанием алюминия от 0,25 мг до 1,5 мг на вакцинную дозу.
47. Вакцинная композиция по пункту 1, содержащая антигены вируса Зика, вируса Чикунгунья и вируса японского энцефалита в комбинированной вакцине, вызывающей защитный иммунный ответ у млекопитающих против каждого из вирусов.
48. Вакцинная композиция по пункту 47, причем антигены вируса Зика, вируса Чикунгунья и вируса японского энцефалита присутствуют в комбинированной вакцине в концентрациях, находящихся в диапазоне от 5 мкг до 50 мкг каждого антигена в фармацевтически приемлемой композиции без адъюванта, или с адъювантом.
49. Вакцинная композиция по пункту 48, причем адъювант выбран из группы, состоящей из а) солей алюминия, включающих гидроксид алюминия, алюминия фосфат, алюминия сульфатфосфат; Ь) инулина; с) альгамулина, который представляет собой комбинацию из инулина и гидроксида алюминия; d) монофосфориллипида A (MPL); е) резиквимода; f) мурамилдипептида (MDP); g) N-гликолилдипептида (GMDP); h) поли-IC; i) CpG олигонуклеотида; j) гидроксида
42.
алюминия с MPL; к) любой эмульсии вода-в-масле; 1) любой эмульсии масло-вводе, содержащей один или несколько из следующих компонентов: сквален или его аналоги или любое фармацевтически приемлемое масло, твин-80, сорбиантриолеат, альфа-токоферол, холекальциферол и водный буфер, или какой-либо из аналогов и производных их молекул i) двух или более комбинаций любого из указанных выше адъювантов, когда формулируются с антигенами вируса Зика, что вызвает иммунный ответ против вируса.
50. Вакцинная композиция по пункту 49, причем адъювант представляет собой гидроксид алюминия с содержанием алюминия от 0,25 мг до 1,0 мг на вакцинную дозу.
51. Вакцинная композиция по пункту 1, причем композиция необязательно содержит 2-феноксиэтанольный консервант в концентрации от 2,5 до 5 мг/мл.
52. Вакцинная композиция по пункту 1, при введении в одноразовой дозе или двумя или более дозами у млекопитающих вызывает как ТЫ, так и Th2 иммунный ответ против какого-либо из антигенов арбовируса, включающий вирус Зика, вирус Чикунгунья и вирус японского энцефалита и является приемлемым для введения людям.
53. Способ получения вакцинной композиции, содержащей один или несколько антигенов арбовируса, выбранных из вируса Зика, вируса Чикунгунья и вируса японского энцефалита, где способ включает одну или несколько стадий из инактивации, продуцирования рекомбинантного протеина, экспрессирования структурных антигенов, очистки и концентрации вирусного антигена, причем указанные очистка и концентрация вируса Зика включает одну или несколько стадий, выбранных из:
a. ультрацентрифугирования;
b. центрифугирования по градиенту плотности;
c. осветление собранных вирусных клеток с использованием мембранной фильтрации;
d. очистки с использованием колоночной хроматографии;
e. тангенциальной текущей фильтрации с использованием мембран с отсечением от 100 кДа до 300 кДа, причем тангенциальную фильтрацию осуществляют или перед или после инактивации вируса.
54. Способ по пункту 53, причем способ колоночной хроматографии включает гель-фильтрацию, колоночную хроматографию со смешанным режимом смолы, какую-либо ионообменную колоночную хроматографию, афинную матричную хроматографию и хроматографию с гидрофобными взаимодействиями.
55. Способ по пункту 53, причем очистка включает очистку способом колоночной хроматографии, которая элюирует большинство вирусного антигена в потоке, таком как Capto Core 700, наиболее предпочтительно Capto Core 700, причем вирусный образец очищен на колонке Capto Core 700 и элюирован в потоке.
56. Способ по пункту 53, причем вирус Зика инактивирован с использованием одного или нескольких инактивирующих агентов, выбранных из химического инактивирующего агента, физического инактивирующего агента и облучающего агента.
54.
57. Способ по пункту 53, причем инактивацию вируса Зика осуществляют перед или после очистки вируса.
58. Способ по пункту 57, причем вирус Зика инактивирован с помощью химического инактивирующего агента, выбранного из формалина (формальдегида), бета-пропиолактона (BPL) и пероксида водорода.
59. Способ по пункту 56, причем основной вирус Зика инактивирован каким-либо одним из следующих способов, выбранных из:
a. Обработки формалином при любой концентрации, находящейся в диапазоне от 1 : 500 вплоть до 1 : 4000 об./об. формалин : вирус, при от 8°С до 37°С, предпочтительно 25±3°С, в течение по меньшей мере от 1 до 7 дней;
b. Обработки формалином при любой концентрации, находящейся в диапазоне от 1 : 500 вплоть до 1 : 4000 об./об. формалин : вирус, при от 2°С до 8°С в течение по меньшей мере от 10 до 30 дней;
c. Бета-пропиолактона (далее BPL) при любой концентрации, находящейся в диапазоне от 1 : 500 вплоть до 1 : 4000 об./об. BPL : вирус, в течение по меньшей мере от 24 до 48 часов, если не более, при температурах, которые находятся в диапазоне от 8°С до 30°С, предпочтительно 25±3°С, в течение 48 часов;
d. Бета-пропиолактона при любой концентрации, находящейся в диапазоне от 1 : 500 вплоть до 1 : 4000 (BPL : вирус, об./об.), при от 2°С до 8°С в течение по меньшей мере от 3 до 7 дней;
e. Комбинации BPL и формалина по любым из указанных выше условий, предпочтительно BPL инактивация при 1:3000 (BPL :вирус, об./об.) в течение 24 часов с последующей инактивацией формалином при 1 : 3000 (формалин : вирус, об./об.) в течение от 24 до 48 часов при от 15°С до 30°С, предпочтительно 25±3°С;
f. Пероксида водорода при любой концентрации, от 0,1 до 3%, предпочтительно
от 0,1 до 1% при любой температуре от 20 до 30°С в течение от 5 минут до 120
минут.
60. Способ по пункту 56, причем вирус инактивирован гамма-облучением за счет экспозиции от 20 кГр (Кило Грей) вплоть до 35 кГр, предпочтительно от 25 кГр до 30 кГр из 60Со источника.
61. Способ по пункту 56, причем вирус Зика инактивирован облучением УФ за счет экспозиции при 254 нм в течение 30-60 минут.
62. Способ по пункту 56, причем вирус Зика инактивирован за счет термической обработки от 50°С до 65°С в течение от 30 мин. Вплоть до 2 часов, предпочтительно, 65°С в течение 1 часа.
63. Способ по пункту 56, причем инактивацию осуществляют в присутствии стабилизирующего агента, выбранного из лактозы, сахарозы, трегалозы, мальтозы, маннозы, изо-мальтозы, рафинозы, стахиозы, лактобиозы, сорбита, маннита, лактобионовой кислоты, декстрана, L-глицина, L-гистидина, L-глутаминовой кислоты, L-аспарагиновой кислоты и альбумина сыворотки человека или их комбинаций.
64. Способ по пункту 63, причем стабилизирующий агент выбран из:
а. 2% сорбита и 1% L-глицина;
b. 1% сорбита и 0,5 % L-глицина;
c. 1% маннита и 0,5% L-глицина;
d. 1% маннита и 0,5% L-глутаминовой кислоты; и
e. 1% сорбита и 0,5% L-глицина, 1% альбумина сыворотки человека.
65. Способ по пункту 56, причем способы инактивации применимы к вирусу Зика любого генотипа/штамма, живого ослабленого вируса Зика, дезактивированного вируса, вирусоподобных частиц, химерных вирусных частиц, несущих любые антигены вируса Зика, в частности, протеин Е в любом гетерологичном вирусном скелете, в векторных вакцинах и инфекционных синтетических вирусных частицах, полученных in vitro или in vivo с использованием последовательности генома любого вируса Зика.
66. Способ по пункту 53, причем способ продуцирования рекомбинантного протеина включает стадии:
a. трансфекции рекомбинантной плазмидной ДНК в клетках насекомых;
b. сбора клеток и выделения рекомбинантного протеина из них;
c. очистки протеина по меньшей мере одним из способов, включающих
ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, афинную хроматографию,
гидрофобную колоночную хроматографию, хроматографию со смешанным
режимом смол, диафильтрацию, ультрацентрифугирование, центрифугирование
по градиенту плотности, фракционирование с солью.
67. Способ по пункту 53, причем способ экспрессирования структурных антигенов вируса Зика включает системы экспрессирования, которые являются какими-либо прокариотическими или эукариотическими системами экспрессирования, включающей экспрессию, опосредованную бакуловирусом в клетках насекомых.
68. Способ по пункту 53, причем способ включает нейтрализующие антитела, которые предпочтительно индуцируются против протеина оболочки, такого как в оптимально инактивированном вирусе, живом ослабленном вирусе, дезактивированном вирусе, ДНК вакцине, вирусоподобных частицах, химерных вирусных частицах, демонстрирующих протеин Е вируса Зика в каком-либо гетерологичном вирусном скелете, например, в векторных вакцинах и синтетических вирусных частицах, полученных из любой геномной РНК последовательности вируса Зика.
69. Вакцинная композиция по пункту 1, причем композиция вводится прайм-буст стратегией, причем первичной является кандидатная инактивированная вакцина, и буст является или той же вакциной или какой-либо иной вакциной, такой как ДНК вакцина, вакцина химерного вируса Зика, вирусоподобная частица, дезактивированная вакцина Зика, живая ослабленная вирусная вакцина, рекомбинантная субединичная вакцина, векторная вакцина или какая-либо вакцина, полученная из синтетического вируса Зика, причем нейтрализующие антитела в каждом из них индуцируются против протеина оболочки вируса Зика.
67.
250 кДа-130 кДа^ 100 кДа
72кДа 55 кДа
Е протеин
35 кДа
25 кДа
10 кДа
Фигура 1
М протеин
\ 2А 1 в юоо
\ 1 в 1500 \ 1е 2000
18 ,
" 1
\ - 1 в 2500 " ч 1 в 3000 \ Is 3500
\ <| * * • в 4000
0 24 48 72 36 120 144 168
Часы после добавления формалина
1 в юоо
2В - " 1 в 1500
1в 2000 1 в 2500
- I в 3000 1 в 3500
0 24 46 72 96 120 144
Часы после добавления BPL
Фигура 2
Фигура 3
Квасцы о 5 мг Квасцы 0 25 мг pic
со ю
MPL+квасцы
MPL+квасцы
МОР OWEM1
LoglOPRNm
Фигура 4
4,5
о in
3,5
j i I
1-z
i j ¦ •
2,5
1,5
0,5
0 10 20 30 40
Доза в мкг
Ф плацебо
3,5
контроль
, 1 мкг
2,5 мкг
LoglOTCIDSO/Wi
5 мкг
1 о мкг
1,5
15 мкг
-==-20 мкг
-'--"40 мкг
__-,. г
24 4t- 72 13) 14-1
Часы после инфицирования
4,5 4
3,5 3
2,5 2
1,5
0,5 0
48 час. - 96 час.
1 Щ
До" (мкг)
Фигура 6
Часы после инфицирования
Фигура 7
контроль
исследования
я* с
Is-
g 4 3
1 3?
ё 211-
ЛЛ W
Iff
(D 5
О .-,
¦ 1 1 1 1 | 1 | 1
bbbbbbbb^
Log
1 1 1 1 1 1
kz kz kz kz kz kz 2 5 5 S S 5
Ш Ш т- LJ-~J Ш СЭ
? о" <м"
Доза в мкг
1 1 1
fcz *2 iz
2 2 2
г " 5
-jl V Jt. _l_ _l_ -*- -¦- -•-
ш kft T- urj uh сэ urt а О
Доза в мкг
g 43
1 2-
S 43
"и 15
X '1'
ё 291-
CL 1
I *
? kz kz kz kz kz
*2 tg kz
S 12 5 2 2
Ш Ш T- ^ft ^ D
? О (чГ
Доза в мкг
2 2 2
ш О сэ т- ем if
о 0
i i i
1 2 3 Количество доз
Фигура 9
I * I I
-г-
1 1
Доза в мкг
Фигура 10
НА INF Гамма
Квасцы
? с
Квасцы 1- MFL '
O'A'EMZ ' -
0WEM1
поли :С -
Концентрация в о г/ил
11В
IL-2
Квасцы
RI.1
Квасцы-MPL
О'Л'ЕМ 2
С'-,". E;.I_
Поли 1С
15 2: 25 35 АО
Кояцешрация в л г/мл
12A
fl-2
Квасцы
AI ¦¦¦¦¦¦НИИ
Квасцы - MPL
OWffel 2 eiillililll^Hll
поли 1С
0 s
10 IS 2" 25 30 35
Концентрация в nr/un
12В
IL-10
Квасцы
с иии^^и
квасцы - !-• PL
OWE Mi
пеги 1С
о г"
¦i ¦ i -• : i .. 1400
Концентрация в пг/ил
(19)
1/12
1/12
1/12
1/12
2/12
2/12
5/12
4/12
Фигура 5
5/12
4/12
Фигура 5
5/12
4/12
Фигура 5
5/12
6/12
Фигура 5
5/12
6/12
Фигура 5
5/12
6/12
Фигура 5
7/12
7/12
8/12
8/12
10/12
10/12
10/12
10/12
10/12
10/12
11/12
11/12
Фигура 11
Фигура 11
11/12
11/12
Фигура 11
Фигура 11
11/12
11/12
Фигура 11
Фигура 11
12/12
12/12
Фигура 12
Фигура 12
