|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Изобретение относится к вакцине для защиты поросят от болезней, связанных с новым пестивирусом. Вакцина обычно включает пестивирусное средство и, необязательно, адъювант. Изобретение также относится к способам защиты свиней от болезней, связанных с пестивирусом, включая, но не ограничиваясь ими, врожденный тремор, и к способам получения пестивирусной вакцины. 
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Изобретение относится к вакцине для защиты поросят от болезней, связанных с новым пестивирусом. Вакцина обычно включает пестивирусное средство и, необязательно, адъювант. Изобретение также относится к способам защиты свиней от болезней, связанных с пестивирусом, включая, но не ограничиваясь ими, врожденный тремор, и к способам получения пестивирусной вакцины.
Евразийское (21) 201792593 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A61K39/12 (2006.01)
2018.08.31 A61P 31/00 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2016.08.31
(54) ПЕСТИВИРУСНЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВРОЖДЕННОГО ТРЕМОРА
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
62/212,124 2015.08.31
PCT/US2016/049709
WO 2017/040672 2017.03.09
Заявитель:
БЕРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ВЕТМЕДИКА ГМБХ (DE); АЙОВА СТЕЙТ ЮНИВЕРСИТИ РИСЕРЧ ФАУНДЕЙШН, ИНК. (US)
Изобретатель:
Виктория Джозеф Гилберт, Паттерсон Эбби Рэй, Вайзек Кэлли Энн, Айер Арун В., Хоббс Леа Энн, Арруда Бэйли Лорен, Арруда Пауло Энрике Элиас, Магстадт Дрю Роберт, Швартц Кент
Джей (US)
Представитель: Медведев В.Н. (RU)
(57) Изобретение относится к вакцине для защиты поросят от болезней, связанных с новым пестиви-русом. Вакцина обычно включает пестивирусное средство и, необязательно, адъювант. Изобретение также относится к способам защиты свиней от болезней, связанных с пестивирусом, включая, но не ограничиваясь ими, врожденный тремор, и к способам получения пестивирусной вакцины.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-545502ЕА/045 ПЕСТИВИРУСНЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВРОЖДЕННОГО ТРЕМОРА
СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки на патент США № 62/212124, поданной 31 августа 2015, которая включена в настоящее описание в полном объеме в виде ссылки.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
А. Уровень техники
Настоящее изобретение относится к пестивирусной вакцине, которая способна снижать клинические симптомы врожденного тремора (СТ) или врожденной миоклонии. Состояние, известное также как "трясущиеся поросята".
Pestivirus является родом вирусов семейства Flaviviridae. Вирусы рода Pestivirus инфицируют млекопитающих, включая представителей семейства Suidae (который включает различные виды свиней).
СТ является спорадическим заболеванием, наблюдаемым у новорожденных поросят. Обычно в приплоде поражается более одного поросенка. Если тремор у поросят настолько сильный, что не дает доступа к соскам и сосанию, тогда смертность может быть высокой. Смертность в пораженном приплоде или при вспышке в стаде может возрастать на 3-10% выше нормы. По мере роста пораженных поросят это состояние ослабевает.
СТ подразделяется на пять типов. Типы AI, AIII, AIV и AV связаны с действием вируса классической чумы свиней, генетической особенностью или воздействием трихлорфона. Поскольку указанные причины известны и, следовательно, их стараются избегать, тип АН считается наиболее частой причиной. Полагают, что тип АН связан с вирусной инфекцией. Каузальный вирус группы 2 широко распространен в большинстве, если не во всех популяциях свиней, однако в большинстве стад наблюдается легкое течение заболевания, по-видимому, из-за того, что у свиноматки был приобретен иммунитет. Тем не менее, в новых стадах молодых свиней могут возникать крупные вспышки, при которых во время первых родов поражается до 8 0% всего помета.
Это не поддающийся количественному определению риск для любого нового стада молодых свиней.
Причина, по которой поросята рождаются с тремором, является вторичной по отношению к первичному поражению, заключающемуся в гипомиелинизации или демиелинизации мозга и спинного мозга. Специального лечения этого состояния не существует. Тем не менее, помощь при сосании и обеспечение условий содержания, при которых можно избежать охлаждения и задавливания, может позволить со временем восстановить большую часть свиней, хотя вес при отъеме может быть пониженным на 1 кг или более.
В. Описание предшествующего уровня техники
Несмотря на имеющиеся ранее сообщения о том, что цирковирусные инфекции свиней типа 1 и типа 2 (см., Burnborg et al., "Association of myocarditis with high viral load of porcine circovirus type 2 in several tissues in cases of fetal death and high mortality in piglets. A case study". J Vet Diagn Invest. 19(4):368-375, 2007) или астровируса (см. Blomstrom et al., "Astrovirus as a possible cause of congenital tremor type AH in piglets?" Acta Vet Scand. 56(1):82, 2014) являются причиной СТ, позднее они были опровергнуты (см., На et al., "Lack of evidence of porcine circovirus type 1 and type 2 infection in piglets with congenital tremors in Когеа", Vet Rec. (2005) 156:383-384; Kennedy et al., "Absence of evidence of porcine circovirus infection in piglets with congenital tremors" J Vet Diagn Invest. 2003 Mar; 15(2) :151-156) . Таким образом, не имеется явного патогенного источника СТ типа АН у поросят и, следовательно, нет эффективного лечения этого состояния.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Решение вышеуказанной технической проблемы достигается описанием и вариантами осуществления, определенными в формуле изобретения. Таким образом, изобретение в его различных аспектах реализовано в соответствии с формулой изобретения.
Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, вакцинам и связанным с ними способам, которые устраняют пробелы в данной области. Композиции и способы обеспечивают лечение врожденного тремора у поросят.
В одном из аспектов композиции по настоящему изобретению
могут включать инактивированный пестивирус, содержащий
последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере
приблизительно на 95% идентична SEQ ID N0:1, например, по
меньшей мере приблизительно на 96%, 97%, 98% или по меньшей мере
приблизительно на 99%, например, на 100%. В другом аспекте
настоящее описание относится к композициям, которые включают
инактивированный пестивирус, содержащий аминокислотную
последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 95% идентична SEQ ID N0:2, например, по меньшей мере приблизительно на 96%, 97%, 98% или по меньшей мере приблизительно на 99%, например, на 100%.
В некоторых вариантах осуществления композиций по
настоящему изобретению пестивирус представляет собой химически
инактивированный пестивирус, например, пестивирус,
инактивированный обработкой инактивирующим средством, таким как бинарный этиленимин, этиленимин, ацетилметиленимин, бета-этиленимин, бета-пропиолактон, глутаровый альдегид, озон и/или формальдегид.
В некоторых вариантах осуществления пестивирус представляет
собой физически инактивированный пестивирус, например,
пестивирус, инактивированный обработкой УФ-излучением,
рентгеновским излучением, гамма-излучением, замораживанием-оттаиванием и/или нагреванием.
В другом аспекте композиции по настоящему изобретению могут
включать аттенуированный пестивирус, содержащий
последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере
приблизительно на 95% идентична SEQ ID N0:1, например, по
меньшей мере приблизительно на 96%, 97%, 98% или по меньшей мере
приблизительно на 99%, например, на 100%. В еще одном аспекте
композиции могут включать композиции, которые включат
аттенуированный пестивирус, содержащий аминокислотную
последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 95% идентична SEQ ID N0:2, например, по меньшей мере приблизительно на 96%, 97%, 98% или по меньшей мере приблизительно на 99%, например, на 100%.
В некоторых вариантах осуществления описанный в настоящему документе пестивирус может находиться в лиофилизованной форме. В одном из вариантов осуществления композиция имеет по меньшей мере приблизительно 104 вирусных частиц, например, по меньшей мере приблизительно 104, 105, 106, 107, 108, 109, или по меньшей мере приблизительно 1010 вирусных частиц.
В некоторых вариантах осуществления композиции, описанные в настоящем документе, могут включать фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент, например, адъювант, например, адъювант на основе эмульсии типа масло-в-воде.
В некоторых вариантах осуществления композиция может включать смесь инактивированных и аттенуированных пестивирусов, описанных в настоящем изобретении. В настоящем описании также раскрыты композиции, которые включают смесь инактивированных пестивирусов, аттенуированных пестивирусов и векторов, описанных в настоящем документе.
В еще одном аспекте в настоящем описании представлены
композиции, которые включают вектор, например вектор экспрессии
бакуловируса или вектор аденовируса собаки, который содержит по
меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты,
которая по меньшей мере приблизительно на 95% (например, по
меньшей мере приблизительно на 96%, 97%, 98% или 99%) идентична
SEQ ID N0:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или 21, например, по
меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты,
которая на 100% идентична SEQ ID N0:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,
19 или 21. В другом аспекте в настоящем описании раскрыты
композиции, которые включают вектор, содержащий по меньшей мере
одну последовательность, кодирующую аминокислотную
последовательно, которая по меньшей мере приблизительно на 95% (например, по меньшей мере приблизительно на 96%, 97%, 98% или 99%) идентична SEQ ID N0:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22, например, по меньшей мере одну последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая на 100% идентична SEQ ID N0:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22. В некоторых вариантах осуществления композиции могут включать смесь векторов, описанных выше.
Также описаны способы защиты поросят от заболевания, связанного с пестивирусом, например, от врожденного тремора. Способы могут включать введение беременной свиноматке или молодой свинье, либо свиноматке или молодой свинье перед случкой, либо новорожденному поросенку любой из описанных в настоящем документе композиций в количестве, достаточном для защиты поросят.
В некоторых вариантах осуществления способы включают
введение композиции свиноматке или молодой свинье внутримышечно,
подкожно, внутривенно, перорально, внутриартериально,
интраназально (например, ингаляцией или без нее) ,
внутрисердечно, интраспинально, интраторакально, внутрибрюшинно, внутрижелудочно, сублингвально, чрезкожно и/или путем ингаляции. В одном их вариантов осуществления введение представляет собой первое введение, а способы предусматривают второе введение через одну-три недели после первого введения.
В некоторых аспектах настоящее изобретение касается описанных в настоящем документе композиций, например, композиций, которые включают инактивированный пестивирус, аттенуированный пестивирус и/или векторы, для применения в качестве лекарственного средства или для применения при получении лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления композиции, описанные в настоящем документе, предназначены для защиты поросят от заболевания, связанного с пестивирусом, например, от врожденного тремора.
Настоящее изобретение относится к инактивированным или модифицированным живым пестивирусным вакцинам по настоящему изобретению, которые филогенетически ближе всего к пестивирусу китайских летучих мышей. На фиг.1 и фиг.2 представлено филогенетическое дерево пестивируса по настоящему изобретению. Филогенетическое дерево по алгоритму ближайших соседей основано на 212 аминокислотах NS3, которые перекрываются между частичными и полными геномными последовательностями у пестивирусов. Уровень генетической изменчивости соответствует новому виду пестивируса. Пестивирусы на уровне нуклеотидов консервативны в пределах 83-98 процентов у идентифицированных изолятов, как показано на фиг.3.
Пестивирусы по настоящему изобретению могут использоваться для получения таких вакцин. В частности, изобретение относится к улучшенным изолятам пествируса, которые определены ниже, или к любому потомку или потомству одного из вышеуказанных изолятов.
Пестивирусы по настоящему изобретению могут быть описаны следующим образом: вирус может быть аттенуирован путем пассирования по меньшей мере четыре раза в клеточной культуре, так что, когда модифицированный вирус вводят свинье или другому млекопитающему, подверженному СТ, он не вызывает клинических симптомов СТ, а способен индуцировать иммунный ответ, который иммунизирует млекопитающее против патогенных форм пестивируса.
Изоляты пестивируса по настоящему изобретению можно пассировать более 10, предпочтительно по меньшей мере 20, еще более предпочтительно по меньшей мере 30, еще более предпочтительно по меньшей мере 40, еще более предпочтительно по меньшей мере 50, еще более предпочтительно по меньшей мере 55, еще более предпочтительно по меньшей мере, 60, еще более предпочтительно по меньшей мере 70, еще более предпочтительно по меньшей мере 80, еще более предпочтительно по меньшей мере 90, еще более предпочтительно по меньшей мере 95 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 100 раз в культуре клеток in vi tro.
Предполагается, что вакцина может содержать носитель, который подходит для внутрикожного или внутримышечного применения. В некоторых вариантах осуществления вакцина находится в лиофилизованной форме. В конкретных вариантах осуществления вакцина содержит по меньшей мере приблизительно 104 вирусных частиц.Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, вакцинам и связанным с ними способам, которые устраняют пробелы в данной области. Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, которые включают инактивированный или модифицированный живой аттенуированный пестивирус. Дополнительные иммуногенные композиции включают вакцину, состоящую из субгеномного антигена, либо экспрессированного рекомбинантно, либо доставленного как часть векторной платформы. В частности, в заявке предложена вакцина
для защиты свиней и особенно поросят от болезней, связанных с изолятами пестивируса по настоящему изобретению.
В другом аспекте изобретение относится к пестивирусу, содержащему нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 95%, например, по меньшей мере на 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID N0:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или 21.
В другом аспекте изобретение относится к пестивирусу, содержащему аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 95%, например, по меньшей мере на 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID N0:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22.
Другой аспект изобретения относится к способу получения инактивированной или живой аттенуированной вакцины для борьбы с врожденным тремором, включающему смешивание инактивированного или живого аттенуированного пестивируса, описанного в настоящем документе, с фармацевтически приемлемым носителем.
Иммуногенные композиции и вакцины по изобретению содержат инактивированные или модифицированные живые пестивирусы и могут также включать адъювант. Вакцина может также включать другие компоненты, такие как консервант(ы), стабилизатор(ы) и антигены против других патогенов свиней.
Специалистам в данной области будет понятно, что
используемые в настоящем документе композиции могут включать
известные инъекционные физиологически приемлемые стерильные
растворы. Для получения готового к употреблению раствора для
парентеральной инъекции или инфузии доступны водные
изотонические растворы, например, солевые или плазменные
белковые растворы. Кроме того, иммуногенные и вакцинные
композиции по настоящему изобретению могут включать
фармацевтически- или ветеринарно-приемлемые носители,
разбавители, изотонические средства, стабилизаторы или адъюванты.
Способы по изобретению могут также включать смешивание композиции по изобретению с ветеринарно-приемлемым носителем, адъювантом или их комбинацией. Специалистам в данной области
будет понятно, что выбор носителя, адъюванта или комбинации будет определяться, кроме прочего, путем введения, личными предпочтениями и видом животных.
В другом аспекте изобретения относится к вакцине для защиты свиней против инфекции пестивирусом, включающей инактивированный или живой аттенуированный пестивирус по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Такая вакцина может предпочтительно дополнительно содержать один или несколько непестивирусов или пестивирусов, которые отличаются от пестивируса по настоящему изобретению, аттенуированных или инактивированных патогенов или их антигенного материала. Например, непестивирусные патогены могут быть выбраны из вируса псевдобешенства, вируса свиного гриппа, парвовируса свиней, вируса трансмиссивного гастроэнтерита, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae, цирковируса свиней, включая, но этим не ограничиваясь, цирковирус свиньей типа 2 (PCV2), вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS) и Actinobacillus pleuropneumoniae.
Также описаны способы лечения или профилактики инфекций, вызванных пестивирусом. Способ включает введение эффективного количества иммуногенной композиции по настоящему изобретению животному, в частности, беременной свиноматке или молодой свинье, при этом указанное лечение или профилактика, таким образом, обеспечивается поросятам. Лечение или профилактика выбраны из группы, состоящей из уменьшения симптомов инфекции СТ, уменьшения тяжести или частоты клинических симптомов инфекции СТ, уменьшения смертности животных от инфекции СТ и их комбинаций.
При этом подходящими особями и особями, нуждающимися во введении композиции по изобретению, могут быть животные, нуждающиеся в профилактике или лечении вирусной, микробной, паразитарной, бактериальной или грибковой инфекции, заболевания или состояния, или инфекции, заболевания или состояния,
вызванных простейшими. Животные, у которых иммунный ответ индуцирован за счет применения композиций или способов по изобретению, включают домашний скот, такой как свиньи, быки, козы и овцы. Предпочтительные животные включают свиней, быков, представителей семейства мышиных, лошадиных и зайцеобразных. Наиболее предпочтительно иммунный ответ индуцирован у свиней и особенно у свиноматок, молодых свиней и поросят.
Изобретение относится к способу снижения частоты или тяжести одного или нескольких клинических симптомов, связанных или вызванных пестивирусной инфекцией, включающему стадию введения иммуногенной композиции по изобретению, как указано в настоящем документе, так что частота или тяжесть клинического симптома пестивирусной инфекции снижается, по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 2 0%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 7 0%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 100% по сравнению с особями, которые не получали иммуногенную композицию, как указано в настоящем изобретении. Такие клинические симптомы включают трясение и дрожание всего тела в различной степени. Поросята, как правило, рождаются дрожащими, трясущимися и качающимися, и активная стимуляция часто усиливает дрожание. Дрожание имеет тенденцию прекращаться, когда поросята засыпают. Кроме того, могут наблюдаться мышечный тремор при хождении поросят, нервные симптомы, отсутствие координации, поза сидячей собаки и повышенная смертность. В некоторых случаях трясение может отсутствовать 24-48 часов. Такое воздействие на поросенка включает влияние на сосание, когда в тяжелых случаях требуется физическое удерживание поросенка на соске. В зависимости от тяжести вспышки заболевания уровень смертности может составлять 15-20% и вплоть до 30-40% при более тяжелых вспышках. Другие критерии клинической тяжести включают снижение среднего дневного прироста веса и неврологическое повреждение.
Предпочтительные пути введения включают интраназальный, пероральный, внутрикожный и внутримышечный. Предпочтительным
является внутримышечное или интравагинальное введение, наиболее
предпочтительно, единичной дозой. Специалисту в данной области
будет понятно, что композиции по изобретению также можно вводить
многократными (например, двукратными или более) дозами, а также
другими или несколькими путями введения. Например, такие другие
пути включают подкожное, внутрикожное, внутривенное,
внутрисосудистое, внутриартериальное, внутрибрюшинное,
интратекальное, внутритрахеальное, внутрикожное,
внутрисердечное, внутрь легочной доли, внутримедуллярное или внутрилегочное введение. В зависимости от желаемой продолжительности и эффективности лечения композиции по изобретению можно вводить один или несколько раз, а также периодически, например, ежедневно в течение нескольких дней, недель или месяцев, и в разных дозах.
Также изобретение относится к способу получения живых аттенуированных пестивирусов в клетках, исключая клетки млекопитающих.
Новые вакцины по настоящему изобретению не ограничены каким-либо конкретным типом или способом получения. Эти вакцины получают стандартными способами, известными в данной области. Наиболее предпочтительной доставкой пестивирусной вакцины является прививка молодых свиней или беременных свиноматок против вирулентного пестивируса с передачей материнского иммунитета поросятам.
Другие объекты, особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания. Следует, однако, понимать, что подробное описание и конкретные примеры с указанием предпочтительных вариантов осуществления изобретения приведены только для иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в рамках сущности и объема изобретения будут очевидны для специалистов в данной области из подробного описания.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Приведенные ниже фигуры являются частью настоящего описания и включены для дополнительной иллюстрации некоторых аспектов данного изобретения. Изобретение может быть лучше понято
посредством ссылки на одну или несколько этих фигур в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных в настоящем документе.
На фигурах 1 и 2 проиллюстрированы филогенетические деревья, идентифицирующие новые пестивирусы по изобретению.
На фигуре 3 представлено сравнение аминокислотной
идентичности (процент идентичности) последовательностей
пестивирусов по изобретению.
На фигуре 4 показан цикл виремии у поросят, исследованный в примере 1.
На фигурах 5А и 5В показана филогенетическая связь пестивирусов. Филогенетическое дерево по алгоритму ближайших соседей получено по 1000 выборке, сформированной по методу бутстрепа (MEGA 6.0) для аминокислот пестивируса NS3 (5А) и Npro (5В), выровненных с помощью множественного выравнивания ClustalW. Номера доступа в GenBank для каждого образца указаны в названии. Круги указывают последовательности, описанные в этом исследовании, а треугольник указывает последовательность вируса, описанного в этом исследовании, используемого для инокуляции.
На фиг. б показана гистограмма, демонстрирующая процент положительных и средних значений ОТ-кПЦР Cq по типу образца. РНК пестивируса, обнаруженная с помощью ОТ-кПЦР, нацеленной на ген NS3. Вирусная РНК не была обнаружена у PBS-инокулированных поросят.
На фиг. 7 представлен график, который показывает, что
инактивированный пестивирус индуцирует специфический
серологический ответ на пестивирус у привитых поросят.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к инактивированному пестивирусу, аттенуированному пестивирусу и субъединичным вакцинам или иммуногенным композициям, которые можно вводить свиноматкам или молодым свиньям для уменьшения клинических проявлений врожденного тремора у их поросят. Кроме того, описаны способы введения, способы получения вакцины, анализы и другие аспекты настоящего изобретения.
Предпочтительно, пестивирус по изобретению представляет
собой инактивированный пестивирус и/или модифицированный живой
пестивирус и/или аттенуированный пестивирус с
последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере приблизительно на 95% идентична SEQ ID N0:1, например, по меньшей мере приблизительно на 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID N0:1 или имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0:2, например, по меньшей мере приблизительно на 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID N0:2.
CATAATGCTTTAATTGGCCGCATTATGTGTGGGACATCCTAAATATTTATGAGCCCTGC G G Т GAG Т G G G G GAAAGAG G Т ТААС СAG G С С Т С TAG ТАС СACAG G САС СААТ G GACAG GG СААС Т САААС С Т GAGAGAGAG G ТАС С GAAC Т С Т ТAAG С С С С GAG ТAC G G G G СAGAC G Т САС С GAG TAG Т ACACCCAAAGACCACCACTTCTAGGTGTAGGGTCTACTGAGGCTCGGGTGGACGTGGGCGCGCC CAAAGAGAAATCGGTGGTGGACCTGGGGGTCGGGGCCACCATGCCCCTTTACGGGGTAGACCTT ACTGCTTGATAGAGTGCCGGCGGATGCCTCAGGTAAGAGTATAAAATCCGTTGTTCATTAACAT G GAAAAACAGAT Т G СATAT ТAC Т ТAAAAAAAGAAAAACAAAGAAAT G G G Т G GAC G GAAC Т G G Т G G TAG GAGAAAG Т СATАСАААААТААС СAC GCTTTCTG GAAAGAC С ТAT С GAG G САС С Т G G GAAA TGGAGAAACGGCCAAATCCTTATGGAACCTATCTCCCCAGACCTAGTCCCCAACAGCTTACAGC С С ТАСАС С С С САС С СAG Т G G Т GAAT Т G ТAAG G Т G G Т Т GAG ТACAAG GAGAT G GAC С С ТААТ ТAT GGTGATTGCCCAAATACGAACGGGGTGTTTGTTGACGAAAAGGGTAGAAGGCTGAGCAGCCCTC CAT TAG G CAT T T G GAAGATAAGAT T G GAC TATAG T GAC T T G G TAAACATAAG СAGAC CAAC С С С CGCTAGTGGGAAAAACTCTTACCAAGTTGAGACCTGCAGTGGGGAGCTGGCTACAGTGACACTG GTACACAATAGGGTGCTCGTGGAAGATTGCAGGGGGCTATACCAATGGAAACCCAACTGTGAAG GAAT T GT GC T С TAT GT GAAAAC T T GT T С T GAC T GGGCAGAT CAGGTAGAAAAACAGGAGAAAGA AAG С С С С С СААААС СACAG С G G С САС СAAG G С GAGAC С СAC GAAAAG G G Т ТАСААС СACAAG Т С С С СAAAGAGAC Т GAG G Т СACAGAAAAGAAGAGACААС С TAG Т G Т САС С Т TAG TATCGGGGGGGC AGAAG G С С СAAG Т CAT С ТACAAAG G СAG GAC СAAAAACAAAAAGAC С С С G GAT G GAG T С TATAG АТАС С СAG GAG С ТAAAGAAG G G GAC G TAG TAAAG G T СAG GAAGAT G С T GAAGAAT T G GCATATA GCCTTAGTGATGTACCTGATACATATCATAACTCCAGGCCTTGCCAAGGTCCAGTGGTTCTTAA AAGAT GAAAAC T CGACGGGGAT CAAC СAGATACT GT GGСAAAGACAGATCAACAGAT CC T TACA T G GAGAAT G G С С TААС СAGAT С Т G С СAC GGTATGCC СААТ GAAAC ТAT СAC G GAT GAGGAAT ТА С G СAG Т С Т G G GAAT G G ТAGATACAAG С С С ТAGAACАААС ТАСАС С Т G Т Т G С СAG Т Т G СААТAT С AT GAG Т G GAAGAAACAT GGTTGGTG CAAC TAT С СACAAAAACAG G С G T G GAT СAC GAGGATAAC GGCCCTACAAGCTAACCTTACCGGGCCTTATGAGGGACCTGAGTGCGCCGTCATCTGCCGATTT AAC G G СAG С TACAACAT С G TAAAACAG G С СAGAGAT GAG G T GAG T С СAC T GACAG G G T G СAAG G AAGGGCATCCTTTTCTATTCTCTGGTGAAAGATCCGACACCTCATGCCTAAGGCCCCCTTCCAC
TAGTTGGGTAAGACCAGTGAAAATGGACGAGGCATCAATGGCCGATGGCTTTGCCCATGGGGTT GATAAG G С GATААТAC TААТ СAG GAAG G G G G CAT СAG GAATААТ СААТ T T С С TAGACAC TAT T G G GAG G T G G С TAC С G G TAG С T GAAG CAAC TATAG TAC СATAT T G T GATAC T TACAC T G T GACAG G GATGTATGTССATGTAAAGAATTGССTСССТAGAGGGТТАССТAAGСATТСАААААТААТСТСС С С GACААТ GATATAT С Т G G GAGAAG GAGAC С С G G С С СATААТAT С СAG СAC TTATTTGGCT СAG GTATAGCAAAGTGGGTCCTAGTTCTACTCGGGATTCTGGGTGAGTGGTATGGAGAATTGGCTTC САСААТATAC Т ТAC ТAC ТAGAATAC G G G Т С Т GAG Т G G Т Т G GAACAT GAAAG С С Т G G Т САС G GAA GGGTTGATTCCTGGCATTAATATTACAATAGAACTCCCAGCTAGTCATACAGTGCCTGGTTGGG TGTGGGTCGCAGGCCAGTGGGTATGCGTGAAGCCAGACTGGTGGCCTACACAGATTTGGATTGA AACCGTGGTGGCAGAGACCTGGCATATACTAAAAATATTGGCGTCAGCCCTGGTGAACATAGTT GCAGCGTTCGTAAACCTGGAATTGGTTTATCTGGTCATAATACTAGTCAAAATATCAAAAGGGA ACCTGATAGGTGCCATATTATGGTGCTTGTTACTGTCAGGCGCTGAAGGCTCGTGCTACAAAAG ACAAGACТAT ТАСААСАСССААС ТAGТ СGТ СGAAGAAAAAACAGGCGТAGAAAAACGAT С ТATА AT G G G СAAG Т G GAC С G Т GATААС СAG G GAAG G Т С G G GAG С СAAGAT ТААТ G GAG САААТАААТА Т G G ТAT Т GAAT GATAG С С Т G Т СAGAAAC С ТAC Т G С ТATААТAG G С ТАААСАС СAG САС Т Т G G G G GCGGCAACCGGCAAGACAAAGAGGGTGTGGTCAAACCGTGCCCTATTGGCCTGGTGACAATGTT С ТAGAAGAACААТAC ТACAG СACAG G Т ТAC Т G G G Т GAAT G ТААСAG GCGGTTGC СAG С Т GAGAG AAGGCGTATGGCTATCAAGAAAGGGTAACGTACAGTGTCAGCGTAACGGCTCATCCTTGATGCT G СААТ Т G G С GATAAAAGAAGAGAAT GACAC ТAT G GAAATAC CAT G Т GAC С СAG Т G GAAAC Т GAA AGTATGGGTCCAGTTGCACAGGGCACTTGTGTGTACAGCTGGGCATTCGCCCCAAGAGGGTGGT AC ТATААСAG GAAG GAT GGTTATTGGCTC СAG TACATAAAGAAAAAC GAC TAC СAG TAT T G GAC AAAAATGCCTACTGCCTCGTCCGCCGCAACCATGTACCGCCACTTGCTCCCCTTACTGGTGGCC TGCCTCATGGGCGGTAGGATATCGGTGTGGTTTGTGGCAATGCTCCTGTCTCTACAGGTGGAAG CTAGTGAAGTAGGCACTAAACAACTGGCTGTCACGCTAACCCTGTGGAAAATGGACTGGACAGA ACTACTTTTСTATATTGTСTTGATGСTAGССGTTAAGGAAGAACTTATAAAAAAAATTGTGACС GCTAGCCTTGTGGCCTTAAAAAATAGTCCAGTAGCCTTGAGTTTTCTTATTGTACTCAGACTTG T G G G G G G СAG T GAAG СAC T С С СAG TAG GTTTATTAT TAGAAAAAAT G T G СATAGAC CAAC С G GA GTTTGGAACTCCTTTCCTGATCTACCTATGGGACAACTGGAAGTGGACTGTGTTAGTCAGCTTC T С С G САС T GAAC CAT GAAAAAAC TATAAAAC T G G СAAGAAAAC TGTTGTTGG СAACACATATAA CAGCGCTCACAT T GAC T GGC T T GAGT GAT T CAAT С T T С TATAT GAT GC T TATAACAACAAAT T T G T TAATAAAGACAT T СATATAC TTGCTGGGGGC TAG TAT GAAT T G G G T С GAGAGAGAAAAAAAG АААТ T G С TAG T GAAGAG GAGAC TAATATACAAGAAAG С С G T TAC T T G СAG T СAG GAT GAGAAT G TAT T G GAGAATАААТ T СAACAAGATAAC T G TAAAC GCG GAT T T СAC С С CAT G СAAG С T T GAAC T TCTACAATTACTTAGGGCTTTTTTAGTCTCTTTGTGTTTTTCCTACTACAAACCTCTCCTGTAT G СAGAGAC TAC С T TAAC T G TAATAG TAAT T G G С G TACAAGAG TACAAC G TAG С CAT GGCCCGCG GGCGAAGTGTGGTCCACAGGCTACTAGCCATGGCCTATTACATATACGGCCGCATACAGGGTGA
CATGTTCCAGCTCGCCACTATCCAGTGCCTGCTGTCGAGTCCGAGGAAAATTATGAAACACATG G TAGAGAAT С CAAC T С T СAAGAAG С T С T G G СAAG G С GАААСAGAAC T С T T CAAC CAGGGTGTTA G T СAAT С СAAGATAG T GAAT С СAAAGAAAAT T G G G С T G GAAGAAT TACACAAG G G CAT G T G T G G С С T С ССААСAGТAGТ GСААААТ TTGGTCATATATGСAAAGAAGAAT GAC TCTCTTATTTTAGGA GAGCTGGGTTACCCCCCTGGGGATCTCACCAGTGATGGGTGGGAAATTTTAGGTCCTGGCAGAA TCCCAAAGATCACTAACGTCGAGTCTGCTAAGATGGACTTACTCTCCAAACTTATGACCTTTCT G G G GAT Т GAAAG С Т С GAG G G Т С С С СAG GAC С С СAG Т С САС Т СААСAAG GAAAT ТAT Т GAAGATА GTAAGGGGCTTGGAAACAGGATGGGGGTACACTCACGCAGGGGGGATAAGTAGCGCAAAACACG Т ТACAG G Т GAAAAGAAC Т ТААТ GAC С СACAT G GAG G G TAG GAAG G GAAAATATAT С С TACAAT С T СAAGAACAT G G T G С T GAC GAG G TAGAG TAC G GAG TAAAAAC T GAT СAAAAAG С T С С С GACAAT GCCTTATGC TAC T G T T T TAAC С С T GAAG С TACАААСATAAAAG GAGAGAC G G GAG С CAT G G T G T T CAT GAAGAAGATAG GAAAAAAG T G GAC T С T С G TAACAT СAGAC G G СAATAAAG С С TAT TATAA TGTAAACAATTTGAAAGGGTGGTCTGGACTACCAATAATGCTGCACTCCACCGGGGCCATAGTG G G GAG GAT TАААТ СAG С G TAT T СAGAT GAAAAC GAC С T G G T G GAG GAAC T TAT T GAC T С TAGAA С TAT TAG TAAGAG СAAT GAGACАААС С T G GAC СAC С T TAT СAAG GAAT T G G СAGACAT GCG GAG GGGGGAGTTCCGCTCAATTACCCTTGGAACGGGAGCCGGGAAAACCACAGAACTGCCTAGGCAA TACCTCACAACAGTAGGTGCCCATAAATCCGTGCTGGTCTTAGTCCCCTTAAAAGCACCTGCTG AAAGTGTTTGCCGCTTTATGAGGTCTAAATACCCTACCATCAACTTTTCCTTAAGAGTGGGGGA ACGGAAAGAGGGAGATGTGAGCAGCGGCATCACCTACGCTACTTACGGATTTTGCTGCCAGCTA AAC С TAG T С CAAC T TAAAGAAT G GATAT С СAG G TAC T СAAT GGTTTTTTTTGAT GAATAT СACA CAGCAAC T С СAGAACАААТAG С СATAATAAG СAAGATT CAT GCAC T GAAAGT TAAGACСAGGAT AGTGGCTATGTCAGCAACCCCCCCGGGTACCGTGACGACTGAAGGCAGGAAGTTTGACATTGAA GAGGTAGGGGTTGCTACCATAGAGAAAGGAGAGGAACCAAAAAGGGGGCGCATAGCGGTCGCTG GTATGCAGGTCCCATTAGAAGACTTAACAGGAAAGAACTGCCTGGTGTTCGTGGCAACCAAAGA AG С С G С G GAGAC G GAG G С TAAAGAAC T G С G СAC СAGAG GAAT TAAC G С САС С TAC ТAC ТAT Т СА G G ТATAGAC С С ТAAGAC Т С Т G GAACAT G G GAT GAC СAAT СAG С СATAC T G TAT T G TAGC TAC СA AT G С CAT T GAAT СAG G TATAAC С T G T С С T GAC T T G GAT G T G G T СATAGACAC CAT G СAGAAG ТА СGAAAAAGTAGTGAATTTСTСGGСAAAGATGСССTTGATTGTСACTTСATTAGTAAAGAAAAAA AT СAC СAG G GAAGAACAG G G С СAGAG GAAAG G T С GAG T G G G СAG G СAAAAGAAAG GAAAATAC T ACTACCCCTCGGGGGTGGTACCGAATGGGTCAAAAGACCTAAGCTATTTAATCCTACAGGCCCA AGAATAT GGTGTCTTG GAACAAG T СAATATAACAGAG TAC T T СAT СATAAT GAAT GAGGAC T G G GGTCTCTAT GAC G TAGAT GAAG TAGAAG T GAGAATAC T T GAGAGAAT GAACAAG GAAAT С T T G С TAC СAC TAG GTATTGTG GAGAAG САААТ С T T G GAAAGAAG TAC T СAC С С G GAAAAAG T G G СAC T G T T G TATAACАААТ TAG T G СAGAAAAAT С С TATAG TATAC С СTAGAGTACAGGAAGGTGAGGT С AG СAAG GAATACAATAC С TATAAT CTGGCCGTATAT GACAAG С TAAAAGAT G T CAAC С СACAAG С CAT TTATGTTC TAG СAGAAGAG GAGAGAG С СACAGAAAT GAT G G G T С T С GAG T T T GAACAAGA
С С CAT С T GAC Т ТACAG GATTCGGTAGTT СAG С Т Т Т G Т GAAGATAT СAAGAG G ТATACAAAAC T С TCTGGGATCACTGAGAAACTGCTAGTAGGTACGATGGTGGGGTATATTGGATACAAAGCCTTAA С СAGAAAC САС GTGCCCTGGGT СAG СAAAGAG TATTGTTAT GAG С T GAC С GAT T СAC С G GATAC TTACGAAAACTСATTСGСACСTTTGGACGTСGACGTССAAAACTССGGTGAAGGAAAACACССA GAG CAAC T G G СAGAC CAT СAAT T GAG G CAAC TAC T G GAGAC T G G GAGAGACAAG G СAAT T GAT T T С С TAAAAG GAAT С С G С GAG T T САС TAG Т G G G G С СATАААСAG T С СAAAG G САС ТAAG TATAT G G GAGAAAATATAT СAG TAT T T GAAGAAG CAT СAG G G С GAGAT CAT С T CAT СAG СAG CGTGGGGC AG T G С GAC G G С С С T T САС GACAG TAT TАААТ С TAGAC TAG GAGAT GAG G T С G С TAC T GCAG TAA TAATCCTCAAGTATTTAGCATTTGGTGAAAGAGAACTGTCTGGGCTAACTAGGCAAGTTCTAAT T GACAT СATAG TATAT TATATAG TTAACAAGCCCCGGTTCGAAGGAGACGAC TACGСAAAGAGA AAAGGAAGAAGGCTAGTCATCGAAGTCCTGATGGGGGCACTGGCGACTTATGCGGTGTCCAATT TTTGGGGTGTGTCCATTAATAAGATACTGCAACCAATTTCTGATTATCTACCCTATGCCACCGC CACTTTGGCTTTTCTTCGCCCAACCTTCATGGAATCAGCAGTGGTGGTCGCTTCCTCTATCTAT AGAGCTTTTCTCTCCATTAAGCATGCGGAAAACAGGAGTCTTGTCACGCAGGTCGCTTCTGCCG CCCTCGAAGTCATGGGCCTGACCCCAGTATCGGCTGGCCTAGGCGTCTTGCTGGGGCTTGGGTT GTGTGTGCTCCATAT GAACAT T GACAAGAAT GAG GAGAAAAG GACAC T TATAC T GAAAAT G T T T G T СAAAAAC T T TATAGAC СAG G С G G СAC TAGAC GAG T T G GATАААС T G GAG С СAGAAAAAATAA TCCTCTCATTGTTGGAGGGTATCCAAACCTGCACAAACCCGATTAGAGCAATCATGATTTTGTA CAGGGTGTACTACAAGGGAGAAACTTTCACAGAAGCTTTGTCTAAGATGGCCGGCAAGTCTCTC AT T G T GAT G G T СATAG T С GAG T T С С T G GAAT T GACAG G С САААС С СAAG GAG G G TATATAGAT С TTAGTGCTAATTTGCTGACCTTTCTCCTCGAGAAACTAAAAAAAATGACTAACCTCGCCATCGG GGAAGCTAGAAAGGTCTTGCTCCCCATCCCATACTTGTACTGTGAAACCTGGCAGTCTGACGCC AGAATCAAGGCCCCTGAATCCTACGACCAAGTGGTAGTGGAATGCAAATGTGGCGCTTCAGCGA GGTATTCCTTCCGC GAT G GAG T T CAT GAGATAT T G GAAGAAAAAAG GAC TAAT T G G T GCAAGAA CTTCTTCTTATGGG GAC С CAAC T T С СACAAT С С G GAT С СAAAAAG GAT GACAT T С TAT GAATAC GGCCAAGCAAAAAAGTGTCCTGTTATCATAATTGGTGAAGACATAACCTTCGGCAAATATGGCA TATATAT САААТ T T G G С СATAG G С С T GAT G GAG G GAG G T TAATAAG G G G TAC СAC С САС G С TAC TATCAGTAGGGAGGAATTGCTGGAAATCCTAACAGCCCCAAGCCAAGTGGCCATAGGCAAGGTC AAG С TAAC С GAT TAC T G TAAT СAAAAAG GAATAATAGACAG GAAAT T G G С С G TAC T T GAAG G T G ACAAAATACAT T T T T G GAAAG СACAC С G T G GAT С CAAAATСACAGACCAAC T СAC TAT T GAGAA T С T GACAGAT GAT T T G G G G T СAGAAAT СAG G GACAT СACAT G G GAG С T G TACACAG G T G GAAC G TGCACCGTAAAAGGGGTGTCCCTTAGATCATGCGCACCAGGTCATAGAACTAAGGCTATGGTCT TGTGTGATTGCACTGATGTGCTTAGCCCCTGTTACCTAATAAACGGCAGGAGACCATCCCCATT TGACGTCGCGGAAGGTTATGAATGTCACCACCGGAAGCCCCGAGCGACGTATGAAGACCTAGAA ATGGAGGAAATACTAAAGAGACGAGTCCCTGTCTACGATCCTCTGTGTTTGTTTGACACTGATA G TAAACTGCTACCTCCCGACACС TAC TAC T T GGAAGAAGAT СAAGAGGAC T T T GAGTACGСAT T
GAGATGCTGGGGCCTCGGGGTTTATGTAGCAGACGGGCCTGTCACTTCCCCCCCGGACATAAGA ATACAC СATAG TTCGGTAT TAC TAC T G С TGACACС T GGAGTAAAC T СAGAGT T GССС TТACAGТ ACATAC G T T G T TAC С С T CAT СAG G СAGAG G T G GACAT С TACAT TAG GAG T СAG С T T T T G GAG GA GGAAGACACTGCTACGGAGGTGGAAGGCTCCCAGGAAGATGGTGATGAAGGGATGGGCGATGCG G TAATAGAG GAT GAG GATACAT С G T С СACAACAGAAT СAATAC С С С САС ТAGAAGAG GAG GAAG G G G G С GAAGAG С СAAT САС CTATGTGGT СATAAG G G GAT TACAAGAAGAAAGATAC G С СAG С СA T С T TAAAC ТАААТ GAC TGGATСAGТ GAAAACAT Т Т СAGAGССACACAGAGТ ССАААТ ТAT GС ТА GAT G G GACAG Т GAGAG Т СACААТAAAAGAG G G СAAAG Т GAAACAT TTGTTTGGGGTC ТATAGAA TAGAAAACTCCCTGGAAGCAATGTTTAAAGAGACCATAGCTGACCTCCCCGTAGCTACCCAACC GCCCCAGGGGCCAGTCTATACGGCTAAAGAGCTGGCCCAAGGGAACATCGCCCCGGTCCAACCT G С AG С GAAT TAT Т AC G GAAT GAT AGAG G G GAGAG G С GAC С С AAT GAC G G CAT T С GAAGC С T T AT CAGTCTTGCGGTCACAAAAAGTCTTAGCCAAGGACGTGAAGGTGAACACCCGCAGGGCGCAGGT T T T T T TAAATAAAG T СAG GAGAAT T G С T GAG G T СAGAG С G T С G GAAC T GACAT TAAAAT G С T TA С С GATAC T T G G СAAAG TAAAT G G GAG GAAAT T GAT TAGAGAG GAAAC СAACAT С С С CAAC СAAA G G T T G G CAT СAATAAT GAC С T СAATAG GAAT TAGAC TAGAAAAAC T G С СAG T G G T TAGAG СAAA СAC TTCCGGCTC TAAG T T СAGACAG T СAAT С T TAGAAAAAAT G GATAAG TAT GAAAAT GAACAA GTCCCAGGGTTACATGAAAAGATGTGGGCAGCGTTCCTGGCAACTGCCAGGCAAGATTTAAGAA ATAC С TAT GAG GAAG TAAC T TAT С T T GAAT TAGAG G С С G GAAT СAAT С G GAAAG GAG С С С СAG G T T T С T T T GAAAAAGAAAG С ТСААТAGGAGAAGТ GС Т GGAAAAAAAAGAAAAAATТ GACGT САСА AT С CAAGAGAT Т GAAAAAG G CAACСАС Т ТATAC ТAT GAAACAGСCAT GССAAAAAATGAGAAAA GAGAT GTGCTTGATGATTGGTTGT СAGAG GAT T T С G T СAC T TATAAGAAAC СAC G T G T GATACA GTACCCTGAGGCAGTCACCCGGTTGGCCATCACCAAAATAATGTATAAGTGGGTGAAGCAAAAG С С T AT AG T GAT T С С С G G T T AT GAG G GAAAAAC С С С GAT С T T T GAAAT AT T T GAAAAAG T С AG T G CAGATTGGGCTCAGTTCAAAAATCCGGTAGCCGTCAGCTTCGACACCAGAGCCTGGGACACTCA AG TAACAAGAGAAGAC С T СAG G С T G G TAG G G С G GATACAGAAATAC TAT TACAAAAAAAAATAT T G GAAG T T CAT T GACAAT T T GACAG С CAT GAT G GAG GAAG T G С С T G TAAT СAC T G TAGAAG GAG ATATGTTCCTCAGAGTTGGACAGCGCGGATCCGGACAGCCTGATACCTCAGCAGGCAATTCCAT GCTAAATGTGCTGACTATGTTGGTAGCTTTCTCTGAATCCACAAATCTGCCCATAGCGGCTGCC TGGAAGGCCTGTCGGATCCACGTCTGTGGTGACGACGGTTTCTTAATCACAGAATCGGAATTAG GGAGGAAGTTTGCTGAAAAAGGTGTTCCTCTGTTAGCTGCATTTGGCAAACCCCAAAAAATTAC AGAG G GAG С GAG С С TAAAG G TAAC СAG CAAC T T T GAC G GAATAGAG T T T T G TAG T СATAC С С С T AT СAGAG T С САААСAC САААСAT СAG G Т G GAT G С СAG С GAGAC СAACAG СAACAAT С С TAG G СA AAATGAGTACCAGGCTGGGTGAGGGTGCCACCAGGTCGGGAGAAGAATACGAAAAACAGGTGGC ATTCGCATATCTACTGATGTACCCCTGGAACCCGCTGGTCAGGAGAATCAGCCTCCTATTGTTA TCGACTACTGACCCAATGGGGAAAGAGGAAACCCCATGCTCCGATGAGGGGGTGAAGTATGTTG GGGACCCTATCGCTGCATACAGGGATGTATGGGGGCACAAATTAGAGGATGTAGGCCATGTTGA
T CAAC С G СAG TTATCCCG GAT GAAC TATAG CAT GAC T TAC T TAG G GAT T T G GAAAC СAAAGACA AGTCAGCGGCTAGTCGAACAGTGTTGTCGTCTGGCCGAGAAAAGCAATTGTGTGGTACGTGCTG ACTCCCTGATAAAGAAAAAGGTCAAGATCACTTATGACCCGGGGATAGGAGTGGCTCAGGTCAT T С G TAG G T G G GAAGAG С T T GAG T G GAC СAGAAG GAAAC С T GAAC T СAC СAAT G TAAT T G TAGAA GATGATATСTTССTAGTССTGTGGAAGAGATTTTСAAAGTACATTTTTСAGAAAATGAAGTTСA TGCAGAGAATGTTCGCCCCTTATTAAGTGGGGGGCACTCATTTAAATTATAACCAGTATCTGGT AAGTATAAGATTTGTGTAAATAAAGTATATAACTGAAAGGGGCAAGTGGCCGTATAGGCTGGGG TGATCGCCGCACCCCCCCCTTCACTAGGCGCCTCAACCCCATGTACCATGGGGTTGTTGTAAAT ACTTGAATGAATGGAGTAATACGGGTAACAAACTTATAGGCCAGTATTGCCCCATTTGCTTTAT AGTGGTGACGACCTGTATAGGTCCGATCTGATATC (SEQ ID N0:1)
MEKQIAYYLKKEKQRNGWTELWGESHTKITTLSGKTYRGTWEMEKRPNPYGTYLPRPS PQQLTALHPHPWNCKWEYKEMDPNYGDCPNTNGVFVDEKGRRLSSPPLGIWKIRLDYSDLVN ISRPTPASGKNSYQVETCSGELATVTLVHNRVLVEDCRGLYQWKPNCEGIVLYVKTCSDWADQV EKQEKESPPKPQRPPRRDPRKGLQPQVPKETEVTEKKRQPSVTLVSGGQKAQVIYKGRTKNKKT PDGVYRYPGAKEGDVVKVRKMLKNWHIALVMYLIHIITPGLAKVQWFLKDENSTGINQILWQRQ INRSLHGEWPNQICHGMPNETITDEELRSLGMVDTSPRTNYTCCQLQYHEWKKHGWCNYPQKQA WITRITALQANLTGPYEGPECAVICRFNGSYNIVKQARDEVSPLTGCKEGHPFLFSGERSDTSC LRPPSTSWVRPVKMDEASMADGFAHGVDKAIILIRKGASGIINFLDTIGRWLPVAEATIVPYCD TYTVTGMYVHVKNCLPRGLPKHSKIISPTMIYLGEGDPAHNIQHLFGSGIAKWVLVLLGILGEW YGELASTIYLLLEYGSEWLEHESLVTEGLIPGINITIELPASHTVPGWVWVAGQWVCVKPDWWP TQIWIETVVAETWHILKILASALVNIVAAFVNLELVYLVIILVKISKGNLIGAILWCLLLSGAE GSCYKRQDYYNTQLWEEKTGVEKRSIMGKWTVITREGREPRLMEQINMVLNDSLSETYCYNRL NTSTWGRQPARQRGCGQTVPYWPGDNVLEEQYYSTGYWVNVTGGCQLREGVWLSRKGNVQCQRN GSSLMLQLAIKEENDTMEIPCDPVETESMGPVAQGTCVYSWAFAPRGWYYNRKDGYWLQYIKKN DYQYWTKMPTASSAATMYRHLLPLLVACLMGGRISVWFVAMLLSLQVEASEVGTKQLAVTLTLW KMDWTELLFYIVLMLAVKEELIKKIVTASLVALKNSPVALSFLIVLRLVGGSEALPVGLLLEKM CIDQPEFGTPFLIYLWDNWKWTVLVSFSALNHEKTIKLARKLLLATHITALTLTGLSDSIFYMM LITTNLLIKTFIYLLGASMNWVEREKKKLLVKRRLIYKKAVTCSQDENVLENKFNKITVNADFT PCKLELLQLLRAFLVSLCFSYYKPLLYAETTLTVIVIGVQEYNVAMARGRSWHRLLAMAYYIY GRIQGDMFQLATIQCLLSSPRKIMKHMVENPTLKKLWQGETELFNQGVSQSKIVNPKKIGLEEL HKGMCGLPTVVQNLVIYAKKNDSLILGELGYPPGDLTSDGWEILGPGRIPKITNVESAKMDLLS KLMTFLGIESSRVPRTPVHSTRKLLKIVRGLETGWGYTHAGGISSAKHVTGEKNLMTHMEGRKG KYILQSQEHGADEVEYGVKTDQKAPDNALCYCFNPEATNIKGETGAMVFMKKIGKKWTLVTSDG NKAYYNVNNLKGWSGLPIMLHSTGAIVGRIKSAYSDENDLVEELIDSRTISKSNETNLDHLIKE LADMRRGEFRSITLGTGAGKTTELPRQYLTTVGAHKSVLVLVPLKAPAESVCRFMRSKYPTINF SLRVGERKEGDVSSGITYATYGFCCQLNLVQLKEWISRYSMVFFDEYHTATPEQIAIISKIHAL
KVKTRIVAMSATPPGTVTTEGRKFDIEEVGVATIEKGEEPKRGRIAVAGMQVPLEDLTGKNCLV
FVATKEAAETEAKELRTRGINATYYYSGIDPKTLEHGMTNQPYCIVATNAIESGITCPDLDWI
DTMQKYEKWNFSAKMPLIVTSLVKKKITREEQGQRKGRVGRQKKGKYYYPSGWPNGSKDLSY
LILQAQEYGVLEQVNITEYFIIMNEDWGLYDVDEVEVRILERMNKEILLPLGIVEKQILERSTH
PEKVALLYNKLVQKNPIVYPRVQEGEVSKEYNTYNLAVYDKLKDVNPQAIYVLAEEERATEMMG
LEFEQDPSDLQDSWQLCEDIKRYTKLSGITEKLLVGTMVGYIGYKALTRNHVPWVSKEYCYEL
TDSPDTYENSFAPLDVDVQNSGEGKHPEQLADHQLRQLLETGRDKAIDFLKGIREFTSGAINSP
KALSIWEKIYQYLKKHQGEIISSAAWGSATALHDSIKSRLGDEVATAVIILKYLAFGERELSGL
TRQVLIDIIVYYIVNKPRFEGDDYAKRKGRRLVIEVLMGALATYAVSNFWGVSINKILQPISDY
LPYATATLAFLRPTFMESAWVASSIYRAFLSIKHAENRSLVTQVASAALEVMGLTPVSAGLGV
LLGLGLCVLHMNIDKNEEKRTLILKMFVKNFIDQAALDELDKLEPEKIILSLLEGIQTCTNPIR
AIMILYRVYYKGETFTEALSKMAGKSLIVMVIVEFLELTGQTQGGYIDLSANLLTFLLEKLKKM
TNLAIGEARKVLLPIPYLYCETWQSDARIKAPESYDQWVECKCGASARYSFRDGVHEILEEKR
TNWCKNFFLWGPNFHNPDPKRMTFYEYGQAKKCPVIIIGEDITFGKYGIYIKFGHRPDGGRLIR
GTTHATISREELLEILTAPSQVAIGKVKLTDYCNQKGIIDRKLAVLEGDKIHFWKAHRGSKITD
QLTIENLTDDLGSEIRDITWELYTGGTCTVKGVSLRSCAPGHRTKAMVLCDCTDVLSPCYLING
RRPSPFDVAEGYECHHRKPRATYEDLEMEEILKRRVPVYDPLCLFDTDSKLLPPDTYYLEEDQE
DFEYALRCWGLGVYVADGPVTSPPDIRIHHSSVLLLLTPGVNSELPLQYIRCYPHQAEVDIYIR
SQLLEEEDTATEVEGSQEDGDEGMGDAVIEDEDTSSTTESIPPLEEEEGGEEPITYWIRGLQE
ERYASHLKLNDWISENISEPHRVQIMLDGTVRVTIKEGKVKHLFGVYRIENSLEAMFKETIADL
PVATQPPQGPVYTAKELAQGNIAPVQPAANYYGMIEGRGDPMTAFEALSVLRSQKVLAKDVKVN
TRRAQVFLNKVRRIAEVRASELTLKCLPILGKVNGRKLIREETNIPNQRLASIMTSIGIRLEKL
PWRANTSGSKFRQSILEKMDKYENEQVPGLHEKMWAAFLATARQDLRNTYEEVTYLELEAGIN
RKGAPGFFEKESSIGEVLEKKEKIDVTIQEIEKGNHLYYETAMPKNEKRDVLDDWLSEDFVTYK
KPRVIQYPEAVTRLAITKIMYKWVKQKPIVIPGYEGKTPIFEIFEKVSADWAQFKNPVAVS FDT
RAWDTQVTREDLRLVGRIQKYYYKKKYWKFIDNLTAMMEEVPVITVEGDMFLRVGQRGSGQPDT
SAGNSMLNVLTMLVAFSESTNLPIAAAWKACRIHVCGDDGFLITESELGRKFAEKGVPLLAAFG
KPQKITEGASLKVTSNFDGIEFCSHTPIRVQTPNIRWMPARPTATILGKMSTRLGEGATRSGEE
YEKQVAFAYLLMYPWNPLVRRISLLLLSTTDPMGKEETPCSDEGVKYVGDPIAAYRDVWGHKLE
DVGHVDQPQLSRMNYSMTYLGIWKPKTSQRLVEQCCRLAEKSNCWRADSLIKKKVKITYDPGI
GVAQVIRRWEELEWTRRKPELTNVIVEDDIFLVLWKRFSKYIFQKMKFMQRMFAPY (SEQ ID
N0:2)
В настоящем описании также раскрыты векторы и инфекционные молекулярные клоны, кодирующие белки пестивирусов Npro, капсида, Erns, El, Е2, NS2-3, геликазы, NS4B, NS5A или РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp).
Npro: ген, кодирующий белок N-концевой протеазы (Npro), состоящий из 180 аминокислот, находится в положениях с 378 по 917 последовательности SEQ ID N0:1.
AT GGAAAAACAGAT Т GCATAT ТАС Т TAAAAAAAGAAAAACAAAGAAAT GGGT GGACGGA AC Т G G Т G G TAG GAGAAAG Т СATАСАААААТААС САС GCTTTCTG GAAAGAC С ТAT С GAG G САС С TGGGAAATGGAGAAACGGCCAAATCCTTATGGAACCTATCTCCCCAGACCTAGTCCCCAACAGC TTACAGCCCTACACCCCCACCCAGTGGTGAATTGTAAGGTGGTTGAGTACAAGGAGATGGACCC TAATTATGGTGATTGCCCAAATACGAACGGGGTGTTTGTTGACGAAAAGGGTAGAAGGCTGAGC AG С С С Т С CAT TAG G CAT T T G GAAGATAAGAT T G GAC TATAG T GAC T T G G TAAACATAAG СAGAC CAACCCCCGCTAGTGGGAAAAACTCTTACCAAGTTGAGACCTGCAGTGGGGAGCTGGCTACAGT GACAC T G G TACACAATAG GGTGCTCGTG GAAGAT T G СAG G G G G С TATAC СAAT G GAAAC С CAAC TGTGAAGGAATTGTGCTCTATGTGAAAACTTGT (SEQ ID N0:3)
MEKQIAYYLKKEKQRNGWTELWGESHTKITTLSGKTYRGTWEMEKRPNPYGTYLPRPS PQQLTALHPHPWNCKWEYKEMDPNYGDCPNTNGVFVDEKGRRLSSPPLGIWKIRLDYSDLVN ISRPTPASGKNSYQVETCSGELATVTLVHNRVLVEDCRGLYQWKPNCEGIVLYVKTC (SEQ ID N0:4)
Капсид: Ген, кодирующий капсидный белок, состоящий из 111 аминокислот, находится в положениях с 918 по 1250 последовательности SEQ ID N0:1.
Т С Т GAC Т G G G С AGAT С AG G Т AGAAAAAC AG GAGAAAGAAAG С С С С С С ААААС САС AG С G G С САС СAAG G С GAGAC С СAC GAAAAG G G Т ТАСААС СACAAG Т С С С СAAAGAGAC Т GAG G Т САСА GAAAAGAAGAGACААС С TAG Т G Т САС С Т TAG TATCGGGGGGG СAGAAG G С С СAAG Т CAT С ТАСА AAG G СAG GAC СAAAAACAAAAAGAC С С С G GAT G GAG T С TATAGATАС С СAG GAG С TAAAGAAG G G GAC G TAG TAAAG G T СAG GAAGAT G С T GAAGAAT T G G СATATAG С С T TAG T GAT G TAC С T GATA СATAT СATAAC T С СAG G С (SEQ ID N0:5)
SDWADQVEKQEKESPPKPQRPPRRDPRKGLQPQVPKETEVTEKKRQPSVTLVSGGQKAQ VIYKGRTKNKKTPDGVYRYPGAKEGDWKVRKMLKNWHIALVMYLIHIITPG (SEQ ID N0:6)
Erns: Ген, кодирующий белок оболочки Erns, состоящий из 209 аминокислот, находится в положениях от 1251 до 1877 последовательности SEQ ID N0:1.
CTTGCCAAGGTCCAGTGGTTCTTAAAAGATGAAAACTCGACGGGGATCAACCAGATACT G Т G G СAAAGACAGAT СААСAGAT С С Т ТАСAT G GAGAAT G G С С ТААС СAGAT С Т G С САС G G ТAT G С С С ААТ GAAAC TAT САС G GAT GAG GAAT ТАС G С AG T С T G G GAAT G G T AGAT AC AAG С С С T AGAA САААС ТАСАС С Т G Т Т G С СAG Т Т G СААТAT CAT GAG Т G GAAGAAACAT GGTTGGTG CAAC TAT С С ACAAAAACAGGCGTGGATCACGAGGATAACGGCCCTACAAGCTAACCTTACCGGGCCTTATGAG
GGACCTGAGTGCGCCGTCATCTGCCGATTTAACGGCAGCTACAACATCGTAAAACAGGCCAGAG
ATGAGGTGAGTCCACTGACAGGGTGCAAGGAAGGGCATCCTTTTCTATTCTCTGGTGAAAGATC
CGACACCTCATGCCTAAGGCCCCCTTCCACTAGTTGGGTAAGACCAGTGAAAATGGACGAGGCA
TCAATGGCCGATGGCTTTGCCCATGGGGTTGATAAGGCGATAATACTAATCAGGAAGGGGGCAT
СAG GAATAAT СAAT T T С С TAGACAC TAT T G G GAG G T G G С ТАС С G G TAG С T GAAG СA (SEQ ID
N0:7)
LAKVQWFLKDENSTGINQILWQRQINRSLHGEWPNQICHGMPNETITDEELRSLGMVDT SPRTNYTCCQLQYHEWKKHGWCNYPQKQAWITRITALQANLTGPYEGPECAVICRFNGSYNIVK QARDEVSPLTGCKEGHPFLFSGERSDTSCLRPPSTSWVRPVKMDEASMADGFAHGVDKAIILIR KGASGIINFLDTIGRWLPVAEA (SEQ ID N0:8)
El: Ген, кодирующий белок оболочки El, состоящий из 200 аминокислот, находится в положениях с 1878 по 2477 последовательности SEQ ID N0:1.
AC TATAG ТАС СATAT Т G Т GATАС Т ТАСAC Т G Т GACAG GGATGTATGTCCATG TAAAGAA TTGCCTCCCTAGAGGGTTACCTAAGCATTCAAAAATAATCTCCCCGACAATGATATATCTGGGA GAAG GAGAC С С G G С С СATААТAT С СAG САС TTATTTGGCT СAG G TATAG СAAAG Т G G G Т С С TAG TTCTACTCGGGATTCTGGGTGAGTGGTATGGAGAATTGGCTTCCACAATATACTTACTACTAGA ATACGGGTCTGAGTGGTTGGAACATGAAAGCCTGGTCACGGAAGGGTTGATTCCTGGCATTAAT ATTACAATAGAACTCCCAGCTAGTCATACAGTGCCTGGTTGGGTGTGGGTCGCAGGCCAGTGGG TATGCGTGAAGCCAGACTGGTGGCCTACACAGATTTGGATTGAAACCGTGGTGGCAGAGACCTG GCATATACTAAAAATATTGGCGTCAGCCCTGGTGAACATAGTTGCAGCGTTCGTAAACCTGGAA TTGGTTTATCTGGTCATAATACTAGTCAAAATATCAAAAGGGAACCTGATAGGTGCCATATTAT GGTGCTTGTTACTGTCAGGCGCTGAAGGC (SEQ ID N0:9)
TIVPYCDTYTVTGMYVHVKNCLPRGLPKHSKIISPTMIYLGEGDPAHNIQHLFGSGIAK WVLVLLGILGEWYGELASTIYLLLEYGSEWLEHESLVTEGLIPGINITIELPASHTVPGWVWVA GQWVCVKPDWWPTQIWIETWAETWHILKILASALVNIVAAFVNLELVYLVIILVKISKGNLIG AILWCLLLSGAEG (SEQ ID N0:10)
E2: Ген, кодирующий белок оболочки Е2, состоящий из 372 аминокислот, находится в положениях с 2478 по 3593 последовательности SEQ ID N0:1.
Т С G Т G С ТАСAAAAGACAAGAC TAT ТАСААСАС С СААС ТAG Т С G Т С GAAGAAAAAACAG G С G ТAGAAAAAC GAT С ТATААТ G G G СAAG Т G GAC С G Т GATААС СAG G GAAG G Т С G G GAGC СAAGA T TAAT GGAGCAAATAAATAT GGTAT T GAAT GATAG С С T G T СAGAAAC С ТАСT GC TATAATAGGC TAAACACCAGCACTTGGGGGCGGCAACCGGCAAGACAAAGAGGGTGTGGTCAAACCGTGCCCTA TTGGCCTGGT GACAAT G T T С TAGAAGAACAATAC TACAG СACAG G T TAC T G G G T GAAT G TAACA GGCGGTTGCCAGCTGAGAGAAGGCGTATGGCTATCAAGAAAGGGTAACGTACAGTGTCAGCGTA
AC G G С T CAT С С T T GAT G С T G СAAT T G G С GATAAAAGAAGAGAAT GACAC TAT G GAAATAC CAT G TGACCCAGTGGAAACTGAAAGTATGGGTCCAGTTGCACAGGGCACTTGTGTGTACAGCTGGGCA T T С G С С С СAAGAG G G Т G G TAC TATAACAG GAAG GAT GGTTATTGGCTC СAG TACATAAAGAAAA ACGACTACCAGTATTGGACAAAAATGCCTACTGCCTCGTCCGCCGCAACCATGTACCGCCACTT GCTCCCCTTACTGGTGGCCTGCCTCATGGGCGGTAGGATATCGGTGTGGTTTGTGGCAATGCTC CTGTCTCTACAGGTGGAAGCTAGTGAAGTAGGCACTAAACAACTGGCTGTCACGCTAACCCTGT GGAAAATGGACTGGACAGAACТАСTTTTСTATATTGTСTTGATGCTAGCCGTTAAGGAAGAACT TATAAAAAAAATTGTGACCGCTAGCCTTGTGGCCTTAAAAAATAGTCCAGTAGCCTTGAGTTTT CTTATTGTACTCAGACTTGTGGGGGGCAGTGAAGCACTCCCAGTAGGTTTATTATTAGAAAAAA TGTGCATAGACCAACCGGAGTTTGGAACTCCTTTCCTGATCTACCTATGGGACAACTGGAAGTG GACTGTGTTAGTСAGСTTСTССGСACTGAACСATGAAAAAACTATAAAACTGGСAAGAAAACTG T T G T T G G СAACACATATAACAG С G С T СACAT T G (SEQ ID N0:11)
SCYKRQDYYNTQLWEEKTGVEKRSIMGKWTVITREGREPRLMEQINMVLNDSLSETYC YNRLNTSTWGRQPARQRGCGQTVPYWPGDNVLEEQYYSTGYWVNVTGGCQLREGVWLSRKGNVQ CQRNGSSLMLQLAIKEENDTMEIPCDPVETESMGPVAQGTCVYSWAFAPRGWYYNRKDGYWLQY IKKNDYQYWTKMPTASSAATMYRHLLPLLVACLMGGRISVWFVAMLLSLQVEASEVGTKQLAVT LTLWKMDWTELLFYIVLMLAVKEELIKKIVTASLVALKNSPVALSFLIVLRLVGGSEALPVGLL LEKMCIDQPEFGTPFLIYLWDNWKWTVLVSFSALNHEKTIKLARKLLLATHITALTL (SEQ ID N0:12)
NS2-3: Ген, кодирующий неструктурный белок NS2-3, состоящий из 934 аминокислот, находится в положениях 3594-6959 последовательности SEQ ID N0:1.
AC Т GGC Т ТGAGTGATТ СААТ С Т Т С TATAT GATGCTТАТААСААСАААТ Т Т GT ТААТААА GACATТCATАТАСТТGCТGGGGGCTAGTATGAATТGGGTCGAGAGAGAAAAAAAGAAATTGCТА G T GAAGAG GAGAC TAATATACAAGAAAG С С G T TAC T T G СAG T СAG GAT GAGAAT G TAT T G GAGA ATAAAT T СAACAAGATAAC T G TAAAC G С G GAT T T СAC С С CAT G СAAG С T T GAAC T T С ТАСAAT T ACTTAGGGCTTTTTTAGTCTCTTTGTGTTTTTCCTACTACAAACCTCTCCTGTATGCAGAGACT ACCTTAACTGTAATAGTAATTGGCGTACAAGAGTACAACGTAGCCATGGCCCGCGGGCGAAGTG T G G T С СACAG G С ТАС TAG С CAT G G С С TAT TACATATAC G G С С G СATACAG G G T GACAT G T T С СA GCTCGCCACTATCCAGTGCCTGCTGTCGAGTCCGAGGAAAATTATGAAACACATGGTAGAGAAT CCAACTCTCAAGAAGCTCTGGCAAGGCGAAACAGAACTCTTCAACCAGGGTGTTAGTCAATCCA AGATAGTGAATCCAAAGAAAATTGGGCTGGAAGAATTACACAAGGGCATGTGTGGCCTCCCAAC AGTAGTGCAAAATTTGGTCATATATGCAAAGAAGAATGACTСTСTTATTTTAGGAGAGCTGGGT TACCCCCCTGGGGATCTCACCAGTGATGGGTGGGAAATTTTAGGTCCTGGCAGAATCCCAAAGA TCACTAACGTCGAGTCTGCTAAGATGGACTTACTCTCCAAACTTATGACCTTTCTGGGGATTGA AAG С T С GAG G G T С С С СAG GAC С С СAG Т С САС Т СААСAAG GAAAT ТAT Т GAAGATAG ТAAG G G G С
T T G GAAAC AG GAT G G G G G T AC AC T С AC G С AG G G G G GAT AAG TAG С G С AAAAC AC G T T AC AG G T G AAAAGAAC T TAAT GAC С СACAT G GAG G G TAG GAAG G GAAAATATAT С С ТАСAATС T CAAGAACA TGGTGCTGACGAGGTAGAGTACGGAGTAAAAACTGATCAAAAAGCTCCCGACAATGCCTTATGC ТАС T G T T T ТААС С С Т GAAG С ТАСАААСATAAAAG GAGAGAC G G GAG С CAT G G Т G Т Т CAT GAAGA AGATAG GAAAAAAG T G GAC T С T С G TAACAT СAGAC G G СAATAAAG С С TAT TATAAT G TAAACAA TTTGAAAGGGTGGTCTGGACTACCAATAATGCTGCACTCCACCGGGGCCATAGTGGGGAGGATT AAAT СAG С G TAT T СAGAT GAAAAC GAC С T G G T G GAG GAAC T TAT T GAC T С TAGAAC TAT TAG ТА AGAG СAAT GAGACАААС С T G GAC СAC С T TAT СAAG GAAT T G G СAGACAT GCG GAG G G GG GAG T T CCGCTCAATTACCCTTGGAACGGGAGCCGGGAAAACCACAGAACTGCCTAGGCAATACCTCACA ACAGTAGGTGCCCATAAATCCGTGCTGGTCTTAGTCCCCTTAAAAGCACCTGCTGAAAGTGTTT GCCGCTTTATGAGGTCTAAATACCCTACCATCAACTTTTCCTTAAGAGTGGGGGAACGGAAAGA GGGAGATGTGAGCAGCGGCATCACCTACGCTACTTACGGATTTTGCTGCCAGCTAAACCTAGTC CAAC T TAAAGAAT GGATATСCAGGTAC T СAAT GGTT T T T T T TGAT GAATAT CACACAGCAAC T С СAGAACAAATAG С СATAATAAG СAAGAT T CAT G СAC T GAAAG T TAAGAC СAG GATAG T G G С TAT GTCAGCAACCCCCCCGGGTACCGTGACGACTGAAGGCAGGAAGTTTGACATTGAAGAGGTAGGG GTTGCTACCATAGAGAAAGGAGAGGAACCAAAAAGGGGGCGCATAGCGGTCGCTGGTATGCAGG TCCCATTAGAAGACTTAACAGGAAAGAACTGCCTGGTGTTCGTGGCAACCAAAGAAGCCGCGGA GAC G GAG G С TAAAGAAC T G С G СAC СAGAG GAAT TAAC G С САС С ТАС ТАС ТAT Т СAG G TATAGAC С С ТAAGAC Т С Т G GAACAT G G GAT GAC СAAT СAG С СATAC T G TAT T G TAG С ТАС СAAT GC СAT T G AAT СAG G TATAAC С T G T С С T GAC TTGGATGTGGT СATAGACAC СAT G СAGAAG TAC GAAAAAG T AGTGAATTTСTСGGСAAAGATGСССTTGATTGTСACTTСATTAGTAAAGAAAAAAATСАССAGG GAAGAACAG G G С СAGAG GAAAG G T С GAG T G G G СAG G СAAAAGAAAG GAAAATAC TAC TAC С С С T CGGGGGTGGTACCGAATGGGTCAAAAGACCTAAGCTATTTAATCCTACAGGCCCAAGAATATGG T G T С T T G GAACAAG T СAATATAACAGAG TAC T T CAT СATAAT GAAT GAG GAC TGGGGTCTCTAT GAC G TAGAT GAAG TAGAAG T GAGAATAC T T GAGAGAAT GAACAAG GAAAT С T T G С TAC СAC TAG GTATTGTGGAGAAGCAAATCTTGGAAAGAAGTACTCACCCGGAAAAAGTGGCACTGTTGTATAA СAAAT TAG T G СAGAAAAAT С С TATAG TATAC С С TAGAG ТАСAG GAAG G T GAG G T СAG CAAG GAA TACAATAC CTATAATCTGGCCGTATAT GACAAG С TAAAAGAT G T CAAC С СACAAG СCATTTATG T T С TAG СAGAAGAG GAGAGAG С СACAGAAAT GAT G G G T С T С GAG T T T GAACAAGAC С CAT С T GA С T TACAG GAT T С G G TAG T T СAG С T T T G T GAAGATAT СAAGAG G TATACAAAAC T С (SEQ ID N0:13)
TGLSDSIFYMMLITTNLLIKTFIYLLGASMNWVEREKKKLLVKRRLIYKKAVTCSQDEN VLENKFNKITVNADFTPCKLELLQLLRAFLVSLCFSYYKPLLYAETTLTVIVIGVQEYNVAMAR GRSWHRLLAMAYYIYGRIQGDMFQLATIQCLLSSPRKIMKHMVENPTLKKLWQGETELFNQGV SQSKIVNPKKIGLEELHKGMCGLPTVVQNLVIYAKKNDSLILGELGYPPGDLTSDGWEILGPGR IPKITNVESAKMDLLSKLMTFLGIESSRVPRTPVHSTRKLLKIVRGLETGWGYTHAGGISSAKH
VTGEKNLMTHMEGRKGKYILQSQEHGADEVEYGVKTDQKAPDNALCYCFNPEATNIKGETGAMV FMKKIGKKWTLVTSDGNKAYYNVNNLKGWSGLPIMLHSTGAIVGRIKSAYSDENDLVEELIDSR TISKSNETNLDHLIKELADMRRGEFRSITLGTGAGKTTELPRQYLTTVGAHKSVLVLVPLKAPA ESVCRFMRSKYPTINFSLRVGERKEGDVSSGITYATYGFCCQLNLVQLKEWISRYSMVFFDEYH TATPEQIAIISKIHALKVKTRIVAMSATPPGTVTTEGRKFDIEEVGVATIEKGEEPKRGRIAVA GMQVPLEDLTGKNCLVFVATKEAAETEAKELRTRGINATYYYSGIDPKTLEHGMTNQPYCIVAT NAIESGITCPDLDWIDTMQKYEKWNFSAKMPLIVTSLVKKKITREEQGQRKGRVGRQKKGKY YYPSGWPNGSKDLSYLILQAQEYGVLEQVNITEYFIIMNEDWGLYDVDEVEVRILERMNKEIL LPLGIVEKQILERSTHPEKVALLYNKLVQKNPIVYPRVQEGEVSKEYNTYNLAVYDKLKDVNPQ AIYVLAEEERATEMMGLEFEQDPSDLQDSWQLCEDIKRYTKL (SEQ ID N0:14)
Геликаза: Ген, кодирующий белок геликазы, состоящий из 687 аминокислот, находится в положениях с 4335 по 6395 последовательности SEQ ID N0:1.
GGTCCTGGCAGAATCCCAAAGATCACTAACGTCGAGTCTGCTAAGATGGACTTACTCTC CAAACTTATGACCTTTCTGGGGATTGAAAGCTCGAGGGTCCCCAGGACCCCAGTCCACTCAACA AG GAAAT ТAT Т GAAGATAG TAAG G G G С T T G GAAACAG GAT G G G G G TACAC T СAC G СAGG G G G GA TAAG TAG С G СAAAACAC G T TACAG G T GAAAAGAAC T TAAT GAC С СACAT G GAG G G TAGGAAG G G AAAATATAT С С ТАСAAT С T СAAGAACAT G G Т G С Т GAC GAG G TAGAG TAC G GAG TAAAAAC T GAT С AAAAAG С T С С С GAC AAT GCCTTATGC T AC T G T T T T AAC С С T GAAG С T AC АААС AT AAAAG GAG AGAC G G GAG С CAT G G T G T T CAT GAAGAAGATAG GAAAAAAG T G GAC T С T С G TAACAT CAGAC G G CAATAAAGCCTATTATAATGTAAACAATTTGAAAGGGTGGTCTGGACTACCAATAATGCTGCAC TCCACCGGGGCCATAGTGGGGAGGATTAAATCAGCGTATTCAGATGAAAACGACCTGGTGGAGG AAC T TAT T GAC T С TAGAACTAT TAGTAAGAGСAAT GAGACАААСС T GGACСACС T TATСAAGGA ATTGGCAGACATGCGGAGGGGGGAGTTCCGCTCAATTACCCTTGGAACGGGAGCCGGGAAAACC ACAGAACTGCCTAGGCAATACCTCACAACAGTAGGTGCCCATAAATCCGTGCTGGTCTTAGTCC CCTTAAAAGCACCTGCTGAAAGTGTTTGCCGCTTTATGAGGTCTAAATACCCTACCATCAACTT T T С С T TAAGAG T G G G G GAAC G GAAAGAG G GAGAT G T GAG СAG С G G CAT СAC С ТАС G С ТАС T ТАС GGATTTTGCTGCCAGCTAAACCTAGTCCAACTTAAAGAATGGATATCCAGGTACTCAATGGTTT Т Т Т Т Т GAT GAATAT CACACAGCAAC Т ССAGAACАААТAGССATААТAAGСAAGATТ CAT GCAC Т GAAAGTTAAGACCAGGATAGTGGCTATGTCAGCAACCCCCCCGGGTACCGTGACGACTGAAGGC AG GAAG Т Т Т GACAT Т GAAGAG G TAG G G G Т Т G С ТАС СATAGAGAAAG GAGAG GAAC СAAAAAG G G GGCGCATAGCGGTCGCTGGTATGCAGGTCCCATTAGAAGACTTAACAGGAAAGAACTGCCTGGT GTTCGTGG CAAC СAAAGAAG С С G С G GAGAC G GAG G С TAAAGAAC T G С G СAC СAGAG GAAT TAAC G С САС С ТАС ТАС Т AT Т С AG G TAT AGAC С С Т AAGAC Т С Т G GAAC AT G G GAT GAC С AAT CAG С CAT ACTGTATTGTAGCTACCAATGCCATTGAATCAGGTATAACCTGTCCTGACTTGGATGTGGTCAT AGACAC СAT G СAGAAG TAC GAAAAAG TAG T GAAT T T С T С G G CAAAGATGCCCTTGATTGT СAC T
T CAT TAG TAAAGAAAAAAAT САС С AG G GAAGAACAG G G С С AGAG GAAAG G T С GAG T G GG С AG G С AAAAGAAAGGAAAATACTACTACCCCTCGGGGGTGGTACCGAATGGGTCAAAAGACCTAAGCTA T T TAAT С С ТАСAG G С С СAAGAATAT GGTGTCTTG GAACAAG T СAATATAACAGAG TAC T T СAT С ATAAT GAAT GAG GAC TGGGGTCTCTAT GAC G TAGAT GAAG TAGAAG T GAGAATAC T T GAGAGAA TGAACAAGGAAATСTTGCTACCACTAGGTATTGTGGAGAAGCAAATСTTGGAAAGAAGTACTCA С С С G GAAAAAG T G G СAC T G T T G TATAACAAAT TAG T G СAGAAAAAT С С TATAG TATAC С С TAGA G ТАСAG GAAG G T GAG G T СAG СAAG GAATACAATAC С TATAAT CTGGCCGTATAT GACAAG С TAA AAGAT G T CAAC С СACAAG С CAT TTATGTTC TAG СAGAAGAG GAGAGAG С СACAGAAAT GAT G G G TCTCGAGTTTGAACAAGACCCATCTGACTTACAGGATTCGGTAGTTCAGCTTTGTGAAGATATC AAGAGGTATACAAAACTС (SEQ ID N0:15)
GPGRIPKITNVESAKMDLLSKLMTFLGIESSRVPRTPVHSTRKLLKIVRGLETGWGYTH AGGISSAKHVTGEKNLMTHMEGRKGKYILQSQEHGADEVEYGVKTDQKAPDNALCYCFNPEATN IKGETGAMVFMKKIGKKWTLVTSDGNKAYYNVNNLKGWSGLPIMLHSTGAIVGRIKSAYSDEND LVEELIDSRTISKSNETNLDHLIKELADMRRGEFRSITLGTGAGKTTELPRQYLTTVGAHKSVL VLVPLKAPAESVCRFMRSKYPTINFSLRVGERKEGDVSSGITYATYGFCCQLNLVQLKEWISRY SMVFFDEYHTATPEQIAIISKIHALKVKTRIVAMSATPPGTVTTEGRKFDIEEVGVATIEKGEE PKRGRIAVAGMQVPLEDLTGKNCLVFVATKEAAETEAKELRTRGINATYYYSGIDPKTLEHGMT NQPYCIVATNAIESGITCPDLDWIDTMQKYEKWNFSAKMPLIVTSLVKKKITREEQGQRKGR VGRQKKGKYYYPSGWPNGSKDLSYLILQAQEYGVLEQVNITEYFIIMNEDWGLYDVDEVEVRI LERMNKEILLPLGIVEKQILERSTHPEKVALLYNKLVQKNPIVYPRVQEGEVSKEYNTYNLAVY DKLKDVNPQAIYVLAEEERATEMMGLEFEQDPSDLQDSWQLCEDIKRYTKL (SEQ ID N0:16)
NS4B: Ген, кодирующий неструктурный белок NS4B, состоящий из 67 аминокислот, находится в положениях с 6396 по 6596 последовательности SEQ ID N0:1.
TCTGGGATCACTGAGAAACTGCTAGTAGGTACGATGGTGGGGTATATTGGATACAAAGC CTTAACCAGAAACCACGTGCCCTGGGTCAGCAAAGAGTATTGTTATGAGCTGACCGATTCACCG GATACТТACGAAAACТСATТСGСАССТТТGGACGТСGACGТССAAAACТССGGТGAAGGAAAAC АС С СAGAG CAAC Т G (SEQ ID N0:17)
SGITEKLLVGTMVGYIGYKALTRNHVPWVSKEYCYELTDSPDTYENSFAPLDVDVQNSG EGKHPEQL (SEQ ID N0:18)
NS5A: Ген, кодирующий неструктурный белок NS5A, состоящий из 811 аминокислот, находится в положениях с 6597 по 9029 последовательности SEQ ID N0:1.
G СAGAC CAT СААТ Т GAG G CAAC ТАС Т G GAGAC Т G G GAGAGACAAG G СААТ Т GAT Т Т С С Т AAAAG GAAT С С G С GAG Т Т САС TAG Т G G G G С СATАААСAG Т С СAAAG G САС ТAAG ТATAT G G GAG
AAAAT AT AT С AG T AT T T GAAGAAG CAT С AG G G С GAGAT CAT С T CAT С AG С AG С G T G G GG С AG T G С GAC G G С С С T T САС GAC AG TAT T AAAT С T AGAC TAG GAGAT GAG G T С G С ТАС T G С AG TAAT AAT CCTCAAGTATTTAGCATTTGGTGAAAGAGAACTGTCTGGGCTAACTAGGCAAGTTCTAATTGAC AT СATAG TATAT TATATAG TTAACAAGCCCCGGTTCGAAGGAGACGAC TACGСAAAGAGAAAAG GAAGAAGGCTAGTCATCGAAGTCCTGATGGGGGCACTGGCGACTTATGCGGTGTCCAATTTTTG GGGTGTGTCCATTAATAAGATACTGCAACCAATTTCTGATTATCTACCCTATGCCACCGCCACT TTGGCTTTTCTTCGCCCAACCTTCATGGAATCAGCAGTGGTGGTCGCTTCCTCTATCTATAGAG CTTTTCTCTCCATTAAGCATGCGGAAAACAGGAGTCTTGTCACGCAGGTCGCTTCTGCCGCCCT CGAAGTCATGGGCCTGACCCCAGTATCGGCTGGCCTAGGCGTCTTGCTGGGGCTTGGGTTGTGT GTGCTCCATAT GAACAT T GACAAGAAT GAG GAGAAAAG GACAC T TATAC T GAAAAT G T T T G T СA AAAAC T T TATAGAC СAG G С G G СAC TAGAC GAG T T G GATАААС T G GAG С СAGAAAAAATAAT С С T С T CAT T G T T G GAG G G TAT С САААС С T G САСАААС С С GAT ТAGAG СААТ CAT GAT Т Т Т G ТАСAG G GTGTACTACAAGGGAGAAACTTTCACAGAAGCTTTGTCTAAGATGGCCGGCAAGTCTCTCATTG Т GAT G G Т СATAG Т С GAG Т Т С С Т G GAAT Т GACAG G С САААС С СAAG GAG G G TATATAGAT С T TAG TGCTAATTTGCTGACCTTTCTCCTCGAGAAACTAAAAAAAATGACTAACCTCGCCATCGGGGAA GCTAGAAAGGTCTTGCTCCCCATCCCATACTTGTACTGTGAAACCTGGCAGTCTGACGCCAGAA TCAAGGCCCCTGAATCCTACGACCAAGTGGTAGTGGAATGCAAATGTGGCGCTTCAGCGAGGTA TTCCTTCCGCGATGGAGTTCATGAGATATTGGAAGAAAAAAGGACTAATTGGTGCAAGAACTTC TTCTTATGGG GAC С CAAC T T С СACAAT С С G GAT С СAAAAAG GAT GACAT T С TAT GAATAC G G С С AAGCAAAAAAGTGTCCTGTTATCATAATTGGTGAAGACATAACCTTCGGCAAATATGGCATATA TAT СAAAT T T G G С СATAG G С С T GAT G GAG G GAG G T TAATAAG G G G TAC СAC С САС G С ТАС TAT С AGTAGGGAGGAATTGCTGGAAATCCTAACAGCCCCAAGCCAAGTGGCCATAGGCAAGGTCAAGC TAAC С GAT ТАС T G TAAT СAAAAAG GAATAATAGACAG GAAAT T G G С С G ТАС T T GAAG G T GACAA AATACAT T T T T G GAAAG СACAC С G T G GAT С СAAAAT СACAGAC CAAC T СAC TAT T GAGAAT С T G ACAGAT GAT T T G G G G T СAGAAAT СAG G GACAT СACAT G G GAG С T G TACACAG G T G GAAC G T G СA CCGTAAAAGGGGTGTCCCTTAGATCATGCGCACCAGGTCATAGAACTAAGGCTATGGTCTTGTG TGATTGCACTGATGTGCTTAGCCCCTGTTACCTAATAAACGGCAGGAGACCATCCCCATTTGAC GTCGCGGAAGGTTATGAATGTCACCACCGGAAGCCCCGAGCGACGTATGAAGACCTAGAAATGG AGGAAATACTAAAGAGACGAGTCCCTGTCTACGATCCTCTGTGTTTGTTTGACACTGATAGTAA ACTGCTACCTCCC GACAC С TAC TAC T T G GAAGAAGAT СAAGAG GAC T T T GAG TAC G СAT T GAGA TGCTGGGGCCTCGGGGTTTATGTAGCAGACGGGCCTGTCACTTCCCCCCCGGACATAAGAATAC AC СATAG TTCGGTAT TAC TAC T G С TGACACС T GGAGTAAAC T СAGAGT T GССС TТАСAGТАСAT AC G Т Т G Т ТАС С С Т CAT СAG G СAGAG G Т G GACAT С ТАСAT TAG GAG Т СAG С Т Т Т Т G GAGGAG GAA GACACTGCTACGGAGGTGGAAGGCTCCCAGGAAGATGGTGATGAAGGGATGGGCGATGCGGTAA ТAGAG GAT GAG GATACAT С G T С СACAACAGAAT СAATAC С С С САС ТAGAAGAG GAG GAAG G G G G С GAAGAG С СAAT САС CTATGTGGT СATAAG G G GAT TACAAGAAGAAAGATAC G С СAG С CAT С T T
АААСТА (SEQ ID N0:19)
ADHQLRQLLETGRDKAIDFLKGIREFTSGAINSPKALSIWEKIYQYLKKHQGEIISSAA WGSATALHDSIKSRLGDEVATAVIILKYLAFGERELSGLTRQVLIDIIVYYIVNKPRFEGDDYA KRKGRRLVIEVLMGALATYAVSNFWGVSINKILQPISDYLPYATATLAFLRPTFMESAWVASS IYRAFLSIKHAENRSLVTQVASAALEVMGLTPVSAGLGVLLGLGLCVLHMNIDKNEEKRTLILK MFVKNFIDQAALDELDKLEPEKIILSLLEGIQTCTNPIRAIMILYRVYYKGETFTEALSKMAGK SLIVMVIVEFLELTGQTQGGYIDLSANLLTFLLEKLKKMTNLAIGEARKVLLPIPYLYCETWQS DARIKAPESYDQVWECKCGASARYSFRDGVHEILEEKRTNWCKNFFLWGPNFHNPDPKRMTFY EYGQAKKCPVIIIGEDITFGKYGIYIKFGHRPDGGRLIRGTTHATISREELLEILTAPSQVAIG KVKLTDYCNQKGIIDRKLAVLEGDKIHFWKAHRGSKITDQLTIENLTDDLGSEIRDITWELYTG GTCTVKGVSLRSCAPGHRTKAMVLCDCTDVLSPCYLINGRRPSPFDVAEGYECHHRKPRATYED LEMEEILKRRVPVYDPLCLFDTDSKLLPPDTYYLEEDQEDFEYALRCWGLGVYVADGPVTSPPD IRIHHSSVLLLLTPGVNSELPLQYIRCYPHQAEVDIYIRSQLLEEEDTATEVEGSQEDGDEGMG DAVIEDEDTSSTTESIPPLEEEEGGEEPITYWIRGLQEERYASHLKL (SEQ ID N0:20)
RdRp: Ген, кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу, состоящую из 751 аминокислоты, находится в положениях с 9030 по 11285 последовательности SEQ ID N0:1.
ААТ GAC TGGATCAGТ GAAAACAT Т Т СAGAGССACACAGAGТ ССАААТТAT GC TAGAT GG GACAG T GAGAG T СACAATAAAAGAG G G СAAAG T GAAACAT TTGTTTGGGGTC TATAGAATAGAA AACTCCCTGGAAGCAATGTTTAAAGAGACCATAGCTGACCTCCCCGTAGCTACCCAACCGCCCC AGGGGCCAGTCTATACGGCTAAAGAGCTGGCCCAAGGGAACATCGCCCCGGTCCAACCTGCAGC GAAT TAT TAC G GAAT GATAGAG G G GAGAG G С GAC С СAAT GAC G G CAT T С GAAG С С T TAT CAG T С TTGCGGTCACAAAAAGTCTTAGCCAAGGACGTGAAGGTGAACACCCGCAGGGCGCAGGTTTTTT T AAAT AAAG T CAG GAGAAT T G С T GAG G T С AGAG С G T С G GAAC T GACAT T AAAAT G С T T AC С GAT AC T T G G СAAAG TAAAT G G GAG GAAAT T GAT TAGAGAG GAAAC СAACAT С С С CAAC СAAAG G T T G GCAT CAATAAT GACCTСAATAGGAATTAGAC TAGAAAAAC T GCCAGT GGT TAGAGCAAACAC T T С С G G С T С TAAG T T СAGACAG T СAAT С T TAGAAAAAAT G GATAAG TAT GAAAAT GAACAAG T С С С AGGGTTACATGAAAAGATGTGGGCAGCGTTCCTGGCAACTGCCAGGCAAGATTTAAGAAATACC TAT GAG GAAG TAAC T TAT С T T GAAT TAGAG G С С G GAAT СAAT С G GAAAG GAG С С С СAGG T Т Т С Т Т Т GAAAAAGAAAG С Т СААТAG GAGAAG Т G С Т G GAAAAAAAAGAAAAAAT Т GAC G Т САСААТ С СА AGAGAT Т GAAAAAG G CAAC САСТ ТАТАС TAT GAAACAGСCAT GССААААААТGAGAAAAGAGAT GTGCTTGATGATTGGTTGTCAGAGGATTTCGTCACTTATAAGAAACCACGTGTGATACAGTACC CTGAGGCAGTCACCCGGTTGGCCATCACCAAAATAATGTATAAGTGGGTGAAGCAAAAGCCTAT AG Т GAT Т С С С G G Т Т AT GAG G GAAAAAC С С С GAT С Т Т Т GAAAT AT Т Т GAAAAAG Т С AG Т G С AGAT TGGGCTCAGTTCAAAAATCCGGTAGCCGTCAGCTTCGACACCAGAGCCTGGGACACTCAAGTAA СAAGAGAAGAC С Т СAG G С Т G G TAG G G С G GATACAGAAATAC ТAT ТАСАААААААААТAT Т G GAA
G T T CAT Т GAC ААТ Т Т GAC AG С CAT GAT G GAG GAAG T G С С T G TAAT С AC T G T AGAAG GAGAT AT G TTCCTCAGAGTTGGACAGCGCGGATCCGGACAGCCTGATACCTCAGCAGGCAATTCCATGCTAA ATGTGCTGACTATGTTGGTAGCTTTCTCTGAATCCACAAATCTGCCCATAGCGGCTGCCTGGAA GGCCTGTCGGATCCACGTCTGTGGTGACGACGGTTTCTTAATCACAGAATCGGAATTAGGGAGG AAGTTTGCTGAAAAAGGTGTTCCTCTGTTAGCTGCATTTGGCAAACCCCAAAAAATTACAGAGG GAG С GAG С С TAAAG G TAAC CAG CAAC T T T GAC G GAATAGAG T T T T G TAG T СATAC С С С TAT CAG AG T С САААСAC САААСAT CAG G T G GAT G С CAG С GAGAC СAACAG СAACAAT С С TAG G CAAAAT G AGTACCAGGCTGGGTGAGGGTGCCACCAGGTCGGGAGAAGAATACGAAAAACAGGTGGCATTCG CATATCTACTGATGTACCCCTGGAACCCGCTGGTCAGGAGAATCAGCCTCCTATTGTTATCGAC TACTGACCCAATGGGGAAAGAGGAAACCCCATGCTCCGATGAGGGGGTGAAGTATGTTGGGGAC CCTATCGCTG СATACAG G GAT GTATGGGGG СACAAAT TAGAG GAT G TAG G С CAT G T T GAT CAAC С G CAG TTATCCCG GAT GAAC TATAG CAT GAC T TAC T TAG G GAT T T G GAAAC СAAAGACAAG T СA GCGGCTAGTCGAACAGTGTTGTCGTCTGGCCGAGAAAAGCAATTGTGTGGTACGTGCTGACTCC С T GATAAAGAAAAAG G T СAAGAT СAC T TAT GAC С С G G G GATAG GAG T G G С T CAG G T CAT T С G TA G G T G G GAAGAG С T T GAG T G GAC СAGAAG GAAAC С T GAAC T СAC СAAT G TAAT T G TAGAAGAT GA TATСTTССTAGTССTGTGGAAGAGATTTTСAAAGTACATTTTTСAGAAAATGAAGTTCATGСAG AGAATGTTCGCCCCTTATTAA (SEQ ID N0:21)
NDWISENISEPHRVQIMLDGTVRVTIKEGKVKHLFGVYRIENSLEAMFKETIADLPVAT QPPQGPVYTAKELAQGNIAPVQPAANYYGMIEGRGDPMTAFEALSVLRSQKVLAKDVKVNTRRA QVFLNKVRRIAEVRASELTLKCLPILGKVNGRKLIREETNIPNQRLASIMTSIGIRLEKLPWR ANTSGSKFRQSILEKMDKYENEQVPGLHEKMWAAFLATARQDLRNTYEEVTYLELEAGINRKGA PGFFEKESSIGEVLEKKEKIDVTIQEIEKGNHLYYETAMPKNEKRDVLDDWLSEDFVTYKKPRV IQYPEAVTRLAITKIMYKWVKQKPIVIPGYEGKTPIFEIFEKVSADWAQFKNPVAVS FDTRAWD TQVTREDLRLVGRIQKYYYKKKYWKFIDNLTAMMEEVPVITVEGDMFLRVGQRGSGQPDTSAGN SMLNVLTMLVAFSESTNLPIAAAWKACRIHVCGDDGFLITESELGRKFAEKGVPLLAAFGKPQK ITEGASLKVTSNFDGIEFCSHTPIRVQTPNIRWMPARPTATILGKMSTRLGEGATRSGEEYEKQ VAFAYLLMYPWNPLVRRISLLLLSTTDPMGKEETPCSDEGVKYVGDPIAAYRDVWGHKLEDVGH VDQPQLSRMNYSMTYLGIWKPKTSQRLVEQCCRLAEKSNCWRADSLIKKKVKITYDPGIGVAQ VIRRWEELEWTRRKPELTNVIVEDDIFLVLWKRFSKYIFQKMKFMQRMFAPY (SEQ ID N0:22)
В одном из вариантов осуществления пестирус по изобретению представляет собой мутант пестивируса, в частности, содержащий по сравнению с геномом пествируса дикого типа мутацию в гене, кодирующем белок указанного вируса.
В предпочтительном варианте осуществления пестирус по изобретению содержит мутацию в гене, кодирующем белки Npro,
капсида, Erns, El, E2, NS2-3, геликазы, NS4B, NS5A или RdRp указанного вируса. Таким образом, изобретение предпочтительно относится к пестивирусу, который проявляет пониженную репликативную способность вируса в результате мутации в гене, кодирующем полипротеин пестивируса, где указанная мутация предпочтительно представляет собой мутацию, как указано ниже.
Предпочтительно, мутация, как описано в настоящем документе, включает или состоит из одной или более точечных мутаций и/или одной или нескольких геномных делеций и/или одной или нескольких вставок.
Используемая в настоящем документе иммуногенная композиция также относится к композиции, которая содержит любой описанный в настоящем документе полипротеин пестивируса. В соответствии с еще одним вариантом осуществления такая иммуногенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный полипротеин пестивируса и, в частности, белок Е2, предпочтительно, рекомбинантный бакуловирус. Кроме того, иммуногенная композиция может включать: i) любой из описанных выше белков пестивирусов, предпочтительно, в концентрациях, описанных выше, ii) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный полипротеин пестивируса обработанных белков в полипротеине, предпочтительно, рекомбинантного бакуловируса, и ill) часть супернатанта клеточной культуры.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления
настоящее изобретение также относится к вектору, который
содержит любую из таких молекул нуклеиновой кислоты, как описано
в настоящем документе. Другими словами, настоящее изобретение
относится к вектору, который включает кодирующую
последовательность любого такого полипептида пестивируса или его части. Предпочтительно, указанный вектор представляет собой вектор экспрессии, который позволяет экспрессировать любой такой полипротеин пестивируса или часть белка. Векторами по изобретению являются такие векторы, которые подходят для трансфекции или инфицирования бактериальных, дрожжевых или животных клеток, in vitro или in vivo.
Вакцины по настоящему изобретению обычно включают инактивированные или аттенуированные пестивирусы, включенные в состав вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, обычно включают стерильные водные растворы (водорастворимые) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий для немедленного используемых инъекций. Состав желательно должен был стерильным и жидким в той степени, при которой он легко проходит через иглу. Лекарственная форма должна быть стабильной в условиях производства и хранения, и она обычно защищена от загрязняющего воздействия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиспирты (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное), их подходящие смеси и растительные масла. Одним из возможных носителей является физиологический солевой раствор. Надлежащая текучесть раствора может поддерживаться, например, за счет использования агентов покрытия, таких как лецитин, поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсий и использования поверхностно-активных веществ. Предохранение от воздействия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, таких как парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновая кислота, тимеросал (натрий этилмеркурий-тиосалицилат), деомицин, гентамицин и тому подобное. Во многих случаях предпочтительным будет включение в композицию изотонических агентов, например, сахара или хлорида натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций, если желательно, может быть достигнута за счет использования в композициях агентов, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
Объем однократной дозы вакцины по настоящему изобретению может варьировать, но обычно находится в пределах диапазонов, используемых в обычных вакцинах. Объем одноразовой дозы, предпочтительно, составляет от примерно 0,1 мл до примерно 3 мл, предпочтительно, от примерно 0,2 мл до примерно 1,5 мл, более
предпочтительно, от примерно 0,2 мл до примерно 0,5 мл при концентрациях конъюгата и адъюванта, указанных выше.
Вакцинные композиции по изобретению могут вводиться любыми
удобными способами, известными в данной области, например,
внутримышечно, подкожно, внутривенно, перорально,
внутриартериально, интраназально (например, ингаляцией или без
нее) , внутрисердечно, интраспирально, интраторакально,
внутрибрюшинно, внутрижелудочно, сублингвально, чрезкожно и/или путем ингаляции.
Особью, которой вводят композицию, предпочтительно, является животное, включая, но не ограничиваясь ими, свиней, коров, лошадей, овец, птиц (например, цыплят), коз, кошек, собак, хомяков, мышей и крыс. Наиболее предпочтительно, млекопитающим является свинья, более предпочтительно, свиноматка, молодая свинья или поросенок. В некоторых вариантах осуществления свиноматка или молодая свинья могут быть беременными.
Составы по настоящему изобретению включают эффективное иммунизирующее количество одной или нескольких иммуногенных композиций и физиологически приемлемый носитель. Вакцины включают эффективное иммунизирующее количество одной или нескольких иммуногенных композиций и физиологически приемлемый носитель. Состав должен подходить для способа введения.
Иммуногенная композиция может также содержать
незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов, либо рН-буферных агентов. Иммуногенная композиция может представлять собой жидкий раствор, суспензию, эмульсию, таблетку, пилюлю, капсулу, композицию с замедленным высвобождением или порошок. Пероральный состав может включать стандартные носители фармацевтической степени чистоты, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и тому подобное.
Предпочтительные пути введения включают, но ими не ограничиваются, интраназальный, пероральный, внутрикожный и внутримышечный. Предпочтительным является внутримышечное или интравагинальное введение, наиболее предпочтительно, единичной
дозой, если желательно. Специалисту в данной области будет
понятно, что композицию по изобретению также можно вводить
одной, двумя или несколькими дозами, а также другими путями
введения. Например, такие другие пути включают подкожное,
внутрикожное, внутривенное, внутрисосудистое,
внутриартериальное, внутрибрюшинное, интратекальное,
внутритрахеальное, внутрикожное, внутрисердечное, внутрь легочной доли, внутримедуллярное или внутрилегочное введение. В зависимости от желаемой продолжительности и эффективности лечения композиции по изобретению можно вводить один или несколько раз, а также периодически, например, ежедневно в течение нескольких дней, недель или месяцев, и в разных дозах.
Варианты осуществления изобретения также включают способ защиты поросят от болезней, связанных с пестивирусом, включающий введение беременной свиноматке или молодой свинье любой из аттенуированных вакцин, описанных в настоящем документе. Например, введенная вакцина содержит один или несколько антигенов пестивируса.
Таким образом, в соответствии с одним из аспектов настоящее изобретение относится к способу снижения процента пестивирусных инфекций в стаде поросят, включающему стадию введения беременным свиноматкам или молодым свиньям эффективного количества инактивированного или аттенуированного пестивирусного агента или иммуногенной композиции, содержащей пестивирусный агент, где пестивирусный антиген представляет собой инактивированный пестивирус, аттенуированный пестивирус или субъединичную вакцину.
В одном из вариантов осуществления пестивирус по изобретению представляет собой любой пестивирус, кодируемый или содержащий последовательность SEQ ID N0:1 или 2; где последовательность по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID N0:1 или 2; и/или где пестивирус кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID N0:1 или 2.
В еще одном варианте осуществления способ включает введение вакцины, содержащей один или несколько иммуногенных компонентов,
выбранных из группы, состоящей из пестивируса, который кодируется или содержит последовательность SEQ ID N0:1; где последовательность по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID N0:2; где полипротеин кодируется последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID N0:1 или 2; и/или где полипротеин пестивируса кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID N0:1 или 2.
Соединения, описанные в настоящем описании, могут вводиться пациенту в терапевтически эффективных дозах для лечения заболеваний, связанных с пестивирусом. Доза зависит от хозяина, получающего вакцину, а также от таких факторов, как размер, масса тела и возраст хозяина.
Иммуногенность композиции может быть определена путем мониторинга иммунного ответа испытуемых особей после иммунизации композицией, используя любой иммуноанализ, известный в данной области. Индукция гуморального (антительного) ответа и/или клеточного иммунитета может быть воспринята как признак иммунного ответа. Среди испытуемых особей могут быть такие животные, как свиньи, мыши, хомяки, собаки, кошки, кролики, коровы, лошади, овцы и домашняя птица (например, цыплята, утки, гуси и индюки).
Иммунный ответ испытуемых особей может быть проанализирован с помощью различных подходов, таких как: реактивность полученной иммунной сыворотки в отношении иммуногенного конъюгата, которую осуществляют известными методами, например, иммуноферментным анализом с ферментным связыванием (ELISA), иммуноблоттингом, иммунопреципитацией и тому подобное; или путем защиты иммунизированных хозяев от инфекции патогеном и/или ослабления симптомов инфекции патогеном у иммунизированных хозяев, что осуществляют любым способом, известным в данной области, для анализа уровней возбудителя инфекционных заболеваний, например, бактериальных уровней (например, путем культивирования образца особи) или другими методиками, известными в данной области. Уровни возбудителя инфекционных заболеваний также могут быть определены путем измерения уровней антигена, на который
направлен иммуноглобулин. Снижение уровней возбудителя инфекционных заболеваний или улучшение симптомов инфекционного заболевания указывает на то, что композиция эффективна.
Терапевтические агенты по изобретению могут быть проанализированы in vitro на желаемую терапевтическую или профилактическую активность перед испытанием in vivo на животных или людях. Например, анализы in vitro, которые могут быть использованы для определения того, показано ли введение конкретного терапевтического средства, включают анализы на клеточных культурах in vitro, в которых соответствующие клетки из клеточной линии или клетки, культивируемые у особи с конкретным заболеванием или расстройством, подвергаются воздействию или иным образом получают эффект терапевтического средства, и наблюдается эффект терапевтического средства на клетки.
Альтернативно, терапевтическое средство может быть проанализировано путем приведения в контакт терапевтического средства с клетками (либо культивируемыми от особи, либо культивируемой клеточной линии), которые восприимчивы к инфекции, вызываемой возбудителем инфекционного заболевания, но которые не инфицированы возбудителем инфекционного заболевания, подвергая клетки действию возбудителя инфекционного заболевания, а затем определяя, был ли уровень инфицирования клеток, приведенных в контакт с терапевтическим средство, ниже, чем уровень инфицирования клеток, не находившихся в контакте с терапевтическим средством. Инфекция клеток возбудителем инфекционного заболевания может быть проанализирована любым способом, известным в данной области.
Кроме того, терапевтическое средство может быть оценено путем измерения уровня молекулы, на которую направлено антитело в модели животного или человека, в подходящих временных интервалах до, в процессе или после терапии. Любое изменение или отсутствие изменения количества молекулы можно идентифицировать и коррелировать с эффектом лечения этой особи. Уровень молекулы может быть определен любым способом, известным в данной области.
После вакцинации животного пестивирусной вакциной или
иммуногенной композицией с использованием способов и композиций по настоящему изобретению для оценки связывания полученного антитела и конкретного молекулы может быть использован любой анализ связывания, известный в данной области. Эти анализы также могут быть осуществлены для отбора антител, которые проявляют более высокую аффинность или специфичность в отношении конкретного антигена.
Обычно аттенуация вируса может быть получена из изолятов патогенных вирусов путем повторного пассажа в подходящих клетках-хозяевах, которые пермиссивны к вирусу до тех пор, пока вирус не проявит желаемые свойства (W0 92/21375, W0 93/06211, WO93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, ЕР 0 676 467, ЕР 0 732 340, ЕР 0 835 930) . Альтернативно, это может быть осуществлено путем генетического реинжиниринга посредством использования инфекционного клона, обычно полноразмерной комплементарной ДНК-транскрипцией вирусного генома (WO 98/18933, ЕР 1 018 557, WO 03/062407, Nielsen et al. , J Virol 2003, 77:3702-3711). Дополнительно, вирус может быть пассирован при неприродных физиологических условиях, которые включают, но ими не ограничиваются, модифицированную температуру, клетки из видов, не являющихся хозяевами, или в присутствии мутагенов.
Изобретение распространяется на штаммы пестивируса, которые получены из штаммов путем культивирования или размножения в идентичной или дивергентной форме, в частности, на потомков, которые обладают основными характеристиками депонированных штаммов. При продолжении размножения штаммы могут приобретать мутации, большинство из которых не будут существенно изменять свойства этих штаммов.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к получению и выделению потомства или потомка пестивируса SEQ ID N0:1 или 2. Изобретение также распространяется на штаммы пестивируса, которые получены из идентифицированных штаммов путем культивирования или размножения в идентичной или дивергентной форме, в частности, на потомков, которые обладают основными характеристиками идентифицированных штаммов. При продолжении размножения штаммы могут приобретать мутации,
большинство из которых не будут существенно изменять свойства этих штаммов.
Изоляты по изобретению также могут быть дополнительно модифицированы для придания им дополнительных желательных свойств. Это может быть достигнуто путем классических методов размножения и селекции, таких как непрерывная репродукция в подходящих клетках-хозяевах для расширения аттенуированного фенотипа. Альтернативно, изоляты могут быть генетически модифицированы путем направленной мутации последовательности нуклеиновой кислоты генома этих штаммов подходящими методами генной инженерии.
Рекомбинантные методы получения модифицированных
последовательностей хорошо известны специалистам в данной области, и они обычно используют конструкцию полноразмерных комплементарных копий ДНК (инфекционных клонов) вирусного генома, которые затем могут быть модифицированы методами рекомбинантной ДНК и обработки (например, сайт-направленный мутагенез и тому подобное). Так, например, можно модифицировать антигенные сайты или ферментативные свойства вирусных белков.
Предпочтительно, изобретение охватывает последовательности нуклеиновой кислоты пестивируса, которые имеют по меньшей мере 95% гомологию с последовательностью SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:2, поскольку такие вирусы могут быть эффективными для индукции иммунитета у животных, вакцинированных аттенуированными вирусами, содержащими такие гомологичные последовательности. Последовательность, показанная в SEQ ID N0:1 или 2, представляет собой полноразмерную последовательность аттенуированного пестивируса и имеет полную длину последовательности, равную приблизительно 11550 оснований.
Пестивирусные штаммы по настоящему изобретению, подходящие для вакцин по изобретению, можно выращивать и собирать способами, известными в данной области, например, путем репродукции в подходящих клетках-хозяевах.
В частности, вакцина, как указано в настоящем описании, представляет собой живую вакцину и/или модифицированную живую аттенуированную вакцину. Штаммы пестивируса по изобретению можно
выращивать и собирать способами, известными в данной области, например, путем репродукции в подходящих клетках. Модифицированные живые вакцины (MLV) обычно вводят в состав в количестве, обеспечивающем введение lC^-lO7 вирусных частиц на дозу, предпочтительно, 103-106 частиц на дозу и, более предпочтительно, 104-106 частиц на дозу (4,0-6,0 logio TCID50) .
Вариант осуществления изобретения включает способ получения
пестивирусной вакцины, включающий: (а) инокулирование клеток
пестивирусом; (Ь) инкубацию инокулированных клеток; (с) сбор
пестивируса из инкубированных клеток. В предпочтительном
варианте осуществления способ включает пестивирус, содержащий
последовательность, которая кодируется или содержит
последовательность SEQ ID N0:1 или 2; последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID N0:1 или 2; белок, который кодируется последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID N0:1; и/или полипротеин, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID N0:2. Способ может дополнительно включать добавление адъюванта к пестивирусной вакцине, предпочтительно, адъювант представляет собой адъювант
на основе эмульсии типа масло-в-воде EMULSIGEN(r).
Другой вариант осуществления изобретения включает способ получения рекомбинантной вакцины, включающий: экспрессию одного или более антигенов пестивируса в клетке-хозяине; и сбор одного или нескольких антигенов пестивирусных клеток. В одном из таких вариантов осуществления способ может включать один или несколько антигенов, содержащих выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген пестивирусного белка, где рекомбинантный пестивирусный полипептид по меньшей мере на 90% гомологичен SEQ ID N0:1 или 2; вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту а) ; рекомбинантный пестивирусный белок, кодируемый нуклеиновой кислотой а); и любую их комбинацию. В одном из примеров варианта осуществления один или несколько антигенов пестивируса экспрессированы рекомбинантным бакуловирусным вектором. Способ может включать один или несколько антигенов пестивируса,
экспрессируемых в клетках насекомых. Один из вариантов осуществления дополнительно включает добавление адъюванта к пестивирусной вакцине, предпочтительно, адъювант представляет собой адъювант на основе эмульсии типа масло-в-воде EMULSIGEN(r).
Антитела или их связывающие части, получающиеся в результате применения пестивирусных пептидов по настоящему изобретению, могут использоваться для обнаружения в образце наличия пестивируса. Этот метод обнаружения включает стадии предоставления выделенного антитела или его связывающей части, полученного против пестивирусного пептида по изобретению, добавления к выделенному антителу или его связывающей части образца, предположительно содержащего некоторое количество пестивируса, и обнаружение наличия комплекса, содержащего выделенное антитело или его связывающую часть, связанную с пестивирусом.
Антитела или их связывающие части по настоящему изобретению также можно использоваться для обнаружения наличия в образце пестивирусного пептида. Этот метод обнаружения включает стадии предоставления выделенного антитела или его связывающей части, полученного против пестивирусного пептида, добавления к выделенному антителу или его связывающей части образца, предположительно содержащего некоторое количество пестивирусного пептида, и обнаружение комплекса, содержащего выделенное антитело или его связывающую часть, связанную с пестивирусным пептидом.
Иммуноглобулины, в частности, антитела (и их функционально активные фрагменты), которые связывают специфическую молекулу, которая является членом пары связывания, могут быть использованы в качестве диагностических и прогностических агентов, как описано в настоящем описании. В различных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к исследованию члена пары связывания и применению таких исследований для клинического использования. Иммуноглобулины в настоящем изобретении могут быть использованы, например, при обнаружении антигена в биологическом образце, посредством чего испытуемые
могут быть исследованы на аберрантные уровни молекулы, с которой связывается иммуноглобулин, и/или на наличие патологических форм таких молекул. Под "патологическими уровнями" подразумевается увеличение или уменьшение относительно присутствующего уровня или стандартного уровня, представляющего присутствующий уровень, в аналогичном образце части организма или особи, не страдающей этим заболеванием. Антитела по настоящему изобретению также могут быть включены в качестве реагента в набор для использования в диагностическом или прогностическом методе.
В одном из аспектов антитело по изобретению, которое иммуноспецифически связывается с пестивирусным пептидом, может быть использовано для диагностики, прогнозирования или скрининга пестивирусной инфекции.
В другом аспекте изобретение относится к способу диагностики или скрининга на наличие пестивирусной инфекции или иммунитета к ней, включающему измерение у особи уровня иммуноспецифического связывания антитела с образцом, полученным от особи, у которой иммуноспецифическое антитело связывается с пестивирусным пептидом, где повышение уровня указанного иммуноспецифического связывания по сравнению с уровнем указанного иммуноспецифического связывания в аналогичном образце у особи без этого инфекционного агента заболевания, указывает на наличие пестивируса.
Примеры подходящих анализов для обнаружения пестивирусных пептидов или их антагонистов включают, но не ограничиваются ими, ELISA, радиоиммунологический анализ, гель-диффузионную реакцию преципитации, иммунодиффузионный анализ, анализ агглютинации, флуоресцентный иммуноанализ, иммуноанализ белка А или иммуноэлектрофоретический анализ.
Иммуноанализы для конкретной молекулы обычно включают инкубацию образца, такого как биологическая жидкость, тканевой экстракт, свежесобранные клетки или лизаты культивируемых клеток, в присутствии детектируемого меченого антитела и обнаружения связанного антитела любым из большого числа методик, хорошо известных в данной области.
Активность связывания заданного антитела может быть
определена в соответствии с известными способами. Специалисты в данной области смогут определить функциональные и оптимальные условия анализа для каждого определения, используя обычные эксперименты.
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к
диагностическим наборам для обнаружения или количественного
определения пестивируса. Представлены наборы для
диагностического применения, которые содержат один или несколько
контейнеров антител против пестивирусных пептидов и,
необязательно, меченый связывающий партнер антитела.
Альтернативно, антитело против пестивирусного пептида может быть
меченым (детектируемым маркером, например, хемилюминесцентным,
ферментативным, флуоресцентным или радиоактивным агентом).
Соответственно, настоящее изобретение относится к
диагностическому набору, содержащему антитело против пестивирусного пептида и контрольный иммуноглобулин. В конкретном варианте осуществления одно из вышеуказанных соединений контейнера может быть мечено с возможностью обнаружения. Набор может необязательно дополнительно содержать в контейнере заранее определенное количество пестивирусного пептида, распознаваемого антителом набора, для использования в качестве стандарта или контроля.
Еще один вариант осуществления изобретения включает набор для вакцинации беременной свиноматки или молодой свиньи против болезней, связанных с пестивирусом, включающий: дозатор, способный вводить вакцину беременной свиноматке или молодой свинье; и пестивирусную вакцину, как описано в настоящем описании.
Композиции могут, при желании, быть представлены в упаковке или дозаторном устройстве, которое может содержать одну или несколько лекарственных форм с однократной дозировкой, содержащих активный ингредиент. Упаковка может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такая как блистерная упаковка. Упаковка иди дозаторное устройство могут сопровождаться инструкциями для введения, предпочтительно, для введения млекопитающему, особенно для введения свинье. В таком
контейнере(ах) может находится указание в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, с информацией об одобрении этим агентом по производству, применению или продаже для введения людям.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой принадлежит это изобретение на момент подачи. Смысл и область применения терминов должен быть ясным; однако в случае любой скрытой двусмысленности, определения, приведенные в настоящем описании, важнее определений, приведенных в любом словаре или внешнем источнике. Кроме того, если иное не требуется в соответствии с контекстом, термины в единственном числе включают множественное число, а термины во множественном числе включают единственное число. В данном случае использование "или" означает "и/или", если не указано иное. Кроме того, использование термина "включая", а также других форм, таких как "включает" и "включено", не является ограничивающим. Все патенты и публикации, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылки.
При практическом осуществлении настоящего изобретения будут использованы, если не указано иное, общепринятые методы молекулярной биологии, микробиологии, методы рекомбинантной ДНК, химии белка и иммунологии, которые находятся в компетенции специалистов в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II и III, второе издание (1989); DNA Cloning, Vols. I и II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, В., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Protein purification methods - a practical approach
(E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press); и Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and С. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).
Следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретной ДНК, полипептидные последовательности или параметры способа, как таковые, могут, разумеется, изменяться. Кроме того, следует учитывать, что терминология, используемая в настоящем описании, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не предназначена для ограничения. Следует отметить, что использованное в настоящем описании и приложенной формуле изобретения, единственное число включает ссылку и на множественное число, если из контекста с очевидностью не следует обратное. Так, например, ссылка на "антиген" включает смесь двух или более антигенов, ссылка на "эксципиент" включает смеси двух или более эксципиентов и тому подобное.
"Иммуногенная или иммунологическая композиция или вакцина", используемые в настоящей заявке взаимозаменяемо, относятся к композиции вещества, которая содержит по меньшей мере один пестивирус по настоящему изобретению или его иммуногенную часть, которые вызывают иммунологический ответ в организме хозяина, клеточный или антитело-опосредованный иммунный ответ на композицию. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммуногенная композиция индуцирует иммунный ответ и, более предпочтительно, обеспечивает защитный иммунитет против одного или нескольких клинических симптомов инфекции СТ.
Используемый в настоящем описании "иммуногенный" или "антиген" относится к полипептиду или белку, которые вызывают иммунологический ответ, как описано в настоящем описании. К ним относятся клеточный и/или гуморальный иммунные ответы. В зависимости от предполагаемой функции композиции в нее могут быть введены один или несколько антигенов. "Иммуногенный" пестивирусный белок или полипептид включают полноразмерную последовательность любого из описанных в настоящем описании пестивирусов или аналогов или их иммуногенных фрагментов. Термин
"иммуногенным фрагмент" или "иммуногенная часть", используемые в настоящей заявке взаимозаменяемо, относится к фрагменту или усеченной и/или замещенной форме пестивируса, которые включают один или несколько эпитопов и, таким образом, вызывают описанный в настоящем описании иммунологический ответ. В целом, такие усеченные и/или замещенные формы или фрагменты будут содержать по меньшей мере шесть смежных аминокислот полноразмерного пестивирусного белка. Более предпочтительно, усеченные или замещенные формы, или фрагменты будут иметь по меньшей мере 10, более предпочтительно, по меньшей мере, 15 и, еще более предпочтительно, по меньшей мере 19 смежных аминокислот полноразмерного пестивирусного белка. Такие фрагменты могут быть идентифицированы с использованием любого количества методик картирования эпитопов, хорошо известных в данной области. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Например, линейные эпитопы могут быть определены путем параллельного синтеза большого числа пептидов на твердых носителях, пептидов, соответствующих частям белковой молекулы, и взаимодействия пептидов с антителами, в то время как пептиды по-прежнему присоединены к носителям. Такие методики известны и описаны в данной области, см. , например, патент США № 4708871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; и Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Аналогично, конформационные эпитопы можно легко идентифицировать путем определения пространственной конформации аминокислот, например, рентгеновской кристаллографией и двумерным ядерным магнитным резонансом. См. Epitope Mapping Protocols, выше. Синтетические антигены также включены в это определение, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие антигены, полученные рекомбинантными или синтетическими методами. См., например, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A.
(1997) , Immunol, and Cell Biol. 75:402-408; и Gardner et al. ,
(1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-
July 3, 1998. (Описание и содержание которых включены в
настоящее описание в качестве ссылки).
Используемый в настоящем описании термин "вакцина" относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один иммунологически активный компонент, который индуцирует иммунологический ответ у животного и возможно, но не обязательно, один или несколько дополнительных компонентов, которые усиливают иммунологическую активность активного компонента. Вакцина может дополнительно содержать дополнительные компоненты, характерные для фармацевтических композиций. Как отличие, иммунологически активный компонент вакцины может содержать полноразмерные вирусные частицы либо в их первоначальной форме, либо в виде аттенуированных частиц в так называемой модифицированной живой вакцине (MLV) или в виде частиц, инактивированных подходящими способами, в так называемой инактивированной вакцине (KV) . В другой форме иммунологически активный компонент вакцины может содержать соответствующие элементы организмов (субъединичные вакцины), где эти элементы образуются либо путем разрушения полноразмерной частицы или растущих культур, содержащих такие частицы, и, необязательно, путем последующих этапов очистки, дающих желаемую структуру(ы), либо путем синтетических процессов, включая соответствующие манипуляции с использованием подходящей системы, основанной, например, на бактериях, насекомых, млекопитающих или других видах, плюс, необязательно, путем последующих процедур выделения и очистки, или путем индукции синтетических процессов у животного, нуждающегося в вакцине, путем непосредственного введения генетического материала с использованием подходящих фармацевтических композиций (полинуклеотидная вакцинация). Вакцина может содержать один или одновременно более одного элементов, описанных выше. Используемый в настоящем описании термин "вакцина" представляет собой модифицированную живую аттенуированную вакцину для ветеринарного применения, включающую антигенные вещества, и она вводится с целью индукции специфического и активного иммунитета против заболевания, вызванного пестивирусной инфекцией. Инактивированный или аттенуированный пестивирус, в частности, инактивированный или
модифицированный аттенуированный пестивирус, как описано в настоящем описании, придает активный иммунитет, который может передаваться пассивно через материнские антитела против иммуногенов, которые содержит организм, а иногда и против антигенно-связанных организмов.
Используемые в настоящем описании термины
"инактивированные" или "убитые" используются как синонимы. В
данной области известны различные физические и химические
способы инактивации. Термин "инактивированный" относится к ранее
вирулентному или невирулентному вирусу, или бактерии, которые
были подвергнуты облучению (ультрафиолетовое (УФ) ,
рентгеновское, электронно-лучевое или гамма-излучение), нагреты или химически обработаны для инактивации, уничтожения, сохраняя при этом их иммуногенность. В одном из вариантов осуществления инактивированный вирус, описанный в настоящем описании, инактивирован путем обработки инактивирующим агентом. Подходящие инактивирующие агенты включают бета-пропиолактон, бинарный или бета- или ацетил-этиленимин, глутаровый альдегид, озон и формалин (формальдегид).
При инактивации формалином или формальдегидом формальдегид обычно смешивают с водой и метиловым спиртом для образования формалина. Добавление метилового спирта предотвращает деградацию или перекрестную реакцию во время процесса активации. В одном из вариантов осуществления используют 0,1-1% 37%-ного раствора формальдегида для инактивации вируса или бактерии. Крайне важно подобрать количество формалина, которое гарантировало бы инактивацию вещества, но, чтобы при этом не возникали побочные эффекты от высокой дозы.
Более предпочтительным способом инактивации является использование этиленимина и соответствующих производных, таких как бинарный этиленимин (BEI) и ацетилэтиленимин, которые являются примерами подходящих химических инактивирующих агентов для использования при инактивации пестивируса. Другие химические инактивирующие агенты, например, бета-пропиолактон, альдегиды (такие как формальдегид) и/или детергенты (например, детергент
TWEEN(r), TRITON(r) X или алкилтриметиламмониевые соли), также можно использовать для инактивации вируса. Инактивация может быть выполнена с помощью стандартных способов, известных специалистам в данной области. Образцы могут быть взяты с периодическим временным интервалом и проанализированы на наличие остаточного живого вируса. Мониторинг цитопатического эффекта на соответствующей клеточной линии и/или флуоресцентное окрашивание подходящим специфическим моноклональным или поликлональным антителом можно использовать для обнаружения остаточного живого вируса. Альтернативно, рост, контролируемый количественной ПЦР в реальном времени в сериях пассажей, может быть использован для определения наличия остаточного инфекционного вируса.
Инактивация с помощью BEI может быть осуществлена путем объединения маточного раствора BEI (например, раствора, образованного добавлением 0,1-0,2 М раствора гидробромида 2-бромэтиламина к 0,1-0,2 н водному раствору NaOH) с растворами вируса до конечной концентрации, равной приблизительно 1-5 мМ BEI. Инактивацию обычно проводят путем выдерживания смеси BEI-вирус при 35-40°С (например, при 37°С) при постоянном перемешивании в течение приблизительно 24-72 часов. Инактивацию вируса можно остановить путем добавления раствора тиосульфата натрия до конечной концентрации, превышающей концентрацию BEI (например, добавление тиосульфата натрия в объеме 17% от объема BEI для нейтрализации избытка BEI) с последующим перемешиванием.
Более конкретно, термин "инактивированный" в контексте вируса означает, что вирус неспособен к репликации in vivo или in vitro и, соответственно, термин "инактивированный" в контексте вируса означает, что вирус неспособен к размножению in vivo или in vitro. Например, термин "инактивированный" может относиться к вирусу, который был реплицирован in vitro, например, in vitro, а затем дезактивирован с помощью химических или физических средств так, что он больше не может реплицироваться. В другом примере термин "инактивированный" может относиться к вирусу, который был реплицирован, а затем дезактивирован с помощью химических или физических средств с
получением суспензии вируса, фрагментов или компонентов вируса, например, с получением раствора, который может использоваться в качестве компонента вакцины.
Термин "живая вакцина" относится к вакцине, содержащей живой, в частности, живой вирусный активный компонент.
"Субъединичная вакцина" может включать антигены, которые лучше всего стимулируют иммунную систему. В некоторых случаях в таких вакцинах используются белки Npro, капсида, Erns, El, Е2, NS2-3, геликазу, NS4B, NS5A и /или белок РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) пестивируса или эпитопы этих белков. Поскольку субъединичные вакцины содержат только существенные антигены, и не содержат все другие молекулы, которые составляют пестивирус, шансы неблагоприятных реакций на вакцину снижаются.
Субъединичные вакцины могут содержать от одного до 10 или более антигенов, например, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8 или 9 антигенов. Специалистам в данной области будет понятно, как получить субъединичные вакцины. Например, молекулы антигена могут быть экспрессированы с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Вакцины, полученные таким образом, называются "рекомбинантными субъединичными вакцинами".
"Фармацевтическая композиция" по существу состоит из одного или нескольких ингредиентов, способных модифицировать физиологические, например, иммунологические, функции организма, в который ее вводят, или организмов, обитающих в организме или на организме. Термин включает, но этим не ограничивается, антибиотики или противопаразитарные средства, а также другие компоненты, обычно используемые для достижения некоторых других показателей, таких как, но не ограничиваясь ими, характеристики обработки, стерильность, стабильность, возможность введения композиции энтеральным или парентеральным путями, такими как пероральный, интраназальный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрикожный или другой подходящий путь, толерантность после введения или свойства контролируемого высвобождения. Один из неограничивающих примеров такой фармацевтической композиции, исключительно для демонстрационных целей, может быть получен следующим образом: супернатант
клеточной культуры инфицированной клеточной культуры смешивают со стабилизатором (например, спермидином и/или бычьим сывороточным альбумином (BSA)), и смесь затем лиофилизируют или обезвоживают другими способами. Перед вакцинацией смесь затем регидратируют в водном (например, физиологическом растворе, забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS)) или неводном растворах (например, масляная эмульсия, адъювант на основе алюминия).
Используемый в настоящем описании термин "фармацевтический
или ветеринарно приемлемый носитель" включает любые и все
растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты,
стабилизирующие агенты, разбавители, консерванты,
антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, замедляющие адсорбцию, и тому подобное. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления и особенно в тех, которые включают лиофилизованные иммуногенные композиции, стабилизирующие агенты для использования в настоящем изобретении включают стабилизаторы для лиофилизации или сушки вымораживанием.
В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция
по настоящему изобретению содержит адъювант. "Адъюванты",
используемые в настоящем описании, могут включать гидроксид
алюминия и фосфат алюминия, сапонины, например, Quil A, QS-21
(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica
Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), эмульсию "масло-в-воде",
эмульсию "вода-в-масле", эмульсию "вода-в-масле-в-воде".
Эмульсия может быть основана, в частности, на легком жидком
парафиновом масле (типа приведенном в Европейской Фармакопее) ;
на изопреноидном масле, таком как сквалан или сквален; на масле,
полученном в результате олигомеризации алкенов, в частности,
изобутена или децена; на сложных эфирах кислот или спиртов,
содержащих линейную алкильную группу, более конкретно, на
растительных маслах, этилолеате, ди-(каприлат/капрат)
пропиленгликоля, три-(каприлат/капрат)глицериле или диолеате пропиленгликоля; на сложных эфирах разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности, сложных эфирах изостеариновой кислоты.
Масло используют в сочетании с эмульгаторами с образованием
эмульсии. Предпочтительными эмульгаторами являются неионные
поверхностно-активные вещества, в частности, сложные эфиры
сорбитана, маннида (например, олеат ангидроманнитола) , гликоля,
полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой кислоты,
изостеариновой, рицинолевой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными, и полиоксипропилен-полиоксиэтиленовых сополимерных блоков, в частности, продуктов плюроника, особенно L121. См., Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp. 51-94 (1995), и Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997). Типичными адъювантами являются эмульсия SPT, описанная на стр. 147 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Арргоасп" под редакцией M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995, и эмульсия MF59, описанная на стр. 183 этой же книги.
Другим примером адъюванта является соединение, выбранное из
полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров
малеинового ангидрида и алкенильного производного.
Преимущественными адъювантными соединениями являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, которые являются перекрестно-связанными, особенно с полиалкенильными эфирами Сахаров или полиспиртов. Эти соединения известны под термином карбомер (Phameuropa, том 8, № 2, июнь 1996) . Специалисты в данной области также могут ссылаться на патент США №2909462, в котором описаны такие акриловые полимеры, перекрестно-связанные с полигидроксилированным соединением, имеющим по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно, не более 8, причем атомы водорода по меньшей мере трех гидроксилов заменены на ненасыщенные алифатические радикалы, имеющие по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными радикалами являются радикалы, содержащие от 2 до 4 атомов углерода, например, винильные, аллильные и другие группы с этиленовыми двойными связями. Ненасыщенные радикалы могут сами содержать другие заместители, такие как метил. Особенно подходят продукты, продаваемые под названием карбопол (BF Goodrich, Огайо, США). Они являются
перекрестно-связанными с аллилсахарозой или с
аллилпентаэритритом. Среди них можно упомянуть карбопол 974Р, 934Р и 971Р. Наиболее предпочтительным является использование карбопола 971Р. Среди сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного представлены сополимеры ЕМА (Monsanto), которые являются сополимерами малеинового ангидрида и этилена. Растворение этих полимеров в воде дает раствор кислоты, который будет нейтрализован, предпочтительно, до физиологического рН, с получением адъювантного раствора, в который будет включена сама иммуногенная, иммунологическая или вакцинная композиция.
Другие подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются ими, адъювантную систему RIBI (Ribi Inc.), блок-сополимер (CytRx, Atlanta GA) , SAF-M (Chiron, Emeryville CA) , монофосфорильный липид А, адъювант авридин липид-амин, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или полученный другим образом), холерный токсин, IMS 1314 или мурамилдипептид, или природные или рекомбинантные цитокины, или их аналоги или стимуляторы высвобождения эндогенных цитокинов, среди многих других.
Предполагается, что адъювант может быть добавлен в количестве от приблизительно 100 мкг до приблизительно 10 мг на дозу, предпочтительно, в количестве от приблизительно 100 мкг до приблизительно 10 мг на дозу, более предпочтительно, в количестве от приблизительно 500 мкг до приблизительно 5 мг на дозу, еще более предпочтительно, в количестве от приблизительно 750 мкг до приблизительно 2,5 мг на дозу и, наиболее предпочтительно, в количестве приблизительно 1 мг на дозу. Альтернативно, адъювант может быть в концентрации от около 0,01 до 50%, предпочтительно, в концентрации от около 2% до 30%, более предпочтительно, в концентрации от около 5% до 25%, еще более предпочтительно, в концентрации от около 7% до 22% и, наиболее предпочтительно, в концентрации от 10% до 20% по объему конечного продукта.
"Разбавители" могут включать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические
агенты могут включать, среди прочих, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают альбумин и щелочные соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и другие.
"Выделенный" означает преобразованный "рукой человека" из его природного состояния, т.е.., если вещество является природным, то оно изменено или удалено из своей первоначальной среды или и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, естественно присутствующий в живом организме, не "выделен", но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от сосуществующих веществ своего природного состояния является "выделенным", как этот термин используется в настоящем описании.
"Аттенуация" означает снижение вирулентности патогена. В
настоящем изобретении аттенуированным вирусом является вирус, у
которого вирулентность снижена так, что не вызывает клинических
симптомов пестивирусной инфекции, но он способен индуцировать
иммунный ответ у мишеневого млекопитающего, а также может
означать, что клинические симптомы снижены при первичной
заболеваемости или снижена тяжесть заболевания у животных,
инфицированных инактивированным или аттенуированным
пестивирусом, по сравнению с "контрольной группой" животных,
инфицированных неаттенуированным пестивирусом дикого типа и не
получающих инактивированный или аттенуированный вирус. В этом
контексте термин "уменьшение/уменьшенный" означает уменьшение по
меньшей мере на 10%, предпочтительно, на 25%, еще более
предпочтительно, на 50%, еще более предпочтительно, на 60%, еще
более предпочтительно, на 70%, еще более предпочтительно, на
80%, еще больше предпочтительно, на 90% и, наиболее
предпочтительно, на 100% по сравнению с контрольной группой, как
определено выше. Таким образом, инактивированный,
аттенуированный и /или авирулентный пестивирусный изолят является изолятом, подходящим для включения в иммуногенную композицию, содержащую инактивированный или модифицированный живой пестивирус.
"Аттенуированный вирус" является жизнеспособным ("живым") вирусом, в котором вирулентность инфекционного агента снижена, например, при пассировании вируса в определенной клеточной линии
или при генетической манипуляции вирусным геномом. Аттенуация вируса имеет отношение к его вирулентности (патогенности), но не обязательно влияет на репликативную способность вируса. Аттенуированный вирус по-прежнему может быть способен к репликации. Таким образом, это может быть штамм вируса, патогенность которого снижена, так что он будет индуцировать иммунный ответ, не вызывая конкретного заболевания. В контексте настоящего изобретения аттенуированным вирусом может быть пестивирус, патогенность которого была уничтожена или уменьшена путем инактивации по меньшей мере одного гена или белка, вовлеченного в вирулентность. В настоящем изобретении "аттенуация" является синонимом "авирулентности". В этом контексте термин "уменьшение/уменьшенный" означает уменьшение патогенности по меньшей мере на 10%, предпочтительно, на 25%, еще более предпочтительно, на 50%, еще более предпочтительно, на 60%, еще более предпочтительно, на 70%, еще более предпочтительно, на 80%, еще более предпочтительно, на 90% и наиболее предпочтительно, на 100% по сравнению с контрольной группой.
"Модифицированный живой" означает, что вирулентность вируса была уменьшена любым из нескольких известных в данной области способов, таких как, но ими не ограничиваясь, повторный пассаж в клеточной культуре; принудительная адаптация к росту при нормальных ограниченных температурах; лечение химическими мутагенами для обеспечения большого количества мутаций и отбора по желаемым характеристикам; и делеция или вставка генов, используя технологию рДНК. Под термином "невирулентный" или "авирулентный" подразумевается, что модифицированный живой вирус демонстрирует снижение или отсутствие клинических симптомов инфекции при введении.
"Вирулентный" относится к способности пестивирусного изолята вызывать заболевание, связанное с пестивирусом. Вирулентность можно оценить, наблюдая прогрессирование болезни у животного. Примером "вирулентного" штамма пестивируса является пример штамма для экспериментального заражения, как описано и используется в настоящем изобретении.
"Авирулентый" относится к изолятам пестивируса, которые лишены вирулентности. То есть, авирулентные штаммы, изоляты или конструкции являются непатогенными и не способны вызвать заболевание. Используемый здесь термин "авирулентный" используется как синоним термина "невирулентный".
Используемые в данном описании термины "штамм" или "изолят" используются взаимозаменяемо.
Термин "пестивирус дикого типа", как используется в настоящем описании, в частности, относится к инфекционному патогенному пестивирусу, который, в частности, способен вызывать СТ у свиней и особенно у поросят. В одном из конкретных предпочтительных вариантов осуществления термин "вирус дикого типа" относится к пестивирусу, геном которого содержит последовательность РНК или состоит из полинуклеотида РНК, где указанная последовательность РНК или полинуклеотида РНК представляет собой РНК-копию полинуклеотида, содержащего SEQ ID N0:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или 21. В некоторых вариантах осуществления пестивирус дикого типа содержит аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID N0:2, 4, б, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22.
В настоящем описании "эффективная доза" означает, но не ограничивается этим, количество антигена, которое вызывает или способно вызывать иммунный ответ, приводящий к уменьшению клинических симптомов у животного, которому вводится антиген.
Используемый в настоящем описании термин "эффективное количество" означает, в контексте композиции, количество иммуногенной композиции, способной индуцировать иммунный ответ, который уменьшает заболеваемость или уменьшает тяжесть инфекции или частоту заболевания у животного. В частности, эффективное количество относится к титру, измеренному в культуре ткани при инфекционной дозе 50, или к единицам образования бляшек на дозу. Альтернативно, в контексте терапии термин "эффективное количество" относится к количеству терапевтического средства, которое является достаточным для снижения тяжести или облегчения течения или продолжительности заболевания или расстройства или одного или нескольких симптомов, препятствуя распространению
заболевания или расстройства, вызывая регрессию заболевания или расстройства, предотвращая повторение, развитие, начало или прогрессирование одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием или расстройством, или улучшает или усиливает профилактику или лечение с помощью другой терапии или терапевтического агента.
Используемый в настоящем описании термин "иммунореактивный к пестивирусу" означает, что пептид или фрагмент вызывает иммунологический ответ против пестивируса.
Термины "идентичность последовательности" или "процент
идентичности" используются в настоящем описании взаимозаменяемо.
Для целей настоящего изобретения в настоящем описании
определено, что для установления процентной идентичности двух
аминокислотных последовательностей или двух последовательностей
нуклеиновой кислоты с целью оптимального сравнения
последовательности выравнивают (например, пропуски могут быть
введены в последовательности первой аминокислоты или нуклеиновой
кислоты для оптимального выравнивания с последовательностью
второй аминокислоты или нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают
аминокислотные или нуклеотидные остатки в соответствующих
положениях аминокислот или нуклеотидов. Если положение в первой
последовательности занято теми же аминокислотой или нуклеотидным
остатком, что и соответствующее положение во второй
последовательности, то молекулы в этом положении являются
идентичными. Процент идентичности двух последовательностей
является функцией количества идентичных положений, общих для
последовательностей (то есть, % идентичности=количество
одинаковых положений/общее количество положений (т.е.
перекрывающиеся положения)xl00). Предпочтительно, две
последовательности имеют одинаковую длину.
"Гомология последовательности", как используется в
настоящем описании, относится к способу определения родства двух
последовательностей. Для определения гомологии
последовательностей, две или более последовательности оптимально выравнивают, и при необходимости в них вводят пробелы. Однако, в
отличие от "идентичности последовательности", консервативные аминокислотные замены считаются совпадением при определении гомологии последовательностей. Другими словами, для получения полипептида или полинуклеотида, имеющего 95%-ную гомологию последовательности с эталонной последовательностью, 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно, 95% аминокислотных остатков или нуклеотидов в эталонной последовательности должны соответствовать или содержать консервативную замену на другую аминокислоту или нуклеотид, или некоторое количество аминокислот или нуклеотидов до 15%, предпочтительно, до 10%, еще более предпочтительно, до 5% от общего количества аминокислотных остатков или нуклеотидов, не включая консервативные замены, в эталонной последовательности, может быть встроено в эталонную последовательность. Предпочтительно, гомологичная последовательность содержит участок по меньшей мере с 50, еще более предпочтительно, со 100, еще более предпочтительно, с 250, еще более предпочтительно, с 50 0 нуклеотидами.
"Консервативная замена" относится к замене аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим сходные характеристики или свойства, включая размер, гидрофобность и тому подобное, так что общая функциональность существенно не изменяется.
Специалисту в данной области известно, что для определения
гомологии между двумя последовательностями доступно несколько
различных компьютерных программ. Например, сравнение
последовательностей и определение процентной идентичности между
двумя последовательностями может быть выполнено с использованием
математического алгоритма. В предпочтительном варианте
осуществления процент идентичности между двумя аминокислотными
или нуклеотидными последовательностями определяют с
использованием алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol.
(48) : 444-453 (1970)), который был включен в программу GAP в
программном пакете Accelrys GCG (см.
www.accelrys.com/products/gcg), используя либо матрицу Blosum 62, либо матрицу РАМ250, и штраф за пропуск 16, 14, 12, 10, 8, б
или 4, и штраф за продолжение пропуска 1, 2, 3, 4, 5 или б. Специалисту в данной области будет понятно, что все эти различные параметры дадут несколько отличные результаты, но общая процентная идентичность двух последовательностей существенно не изменится при использовании разных алгоритмов.
Сравнение последовательностей может проводиться по всей длине двух последовательностей, которые сравниваются, или по длине фрагмента двух последовательностей. Как правило, сравнение будет проводиться по всей длине двух сравниваемых последовательностей. Однако идентичность последовательности может быть проведена в области, например, двадцать, пятьдесят, сто или более смежных аминокислотных остатков.
"Идентичность последовательности", как известно в данной области, относится к взаимосвязи между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, а именно: ссылочной последовательности и заданной последовательности, которая должна сравниваться со ссылочной последовательностью. Идентичность последовательности определяется путем сравнения данной последовательности со ссылочной последовательностью после того, как последовательности были оптимально выровнены, чтобы обеспечить наивысшую степень сходства последовательностей, как определено совпадением строк таких последовательностей. При таком выравнивании идентичность последовательности определяется на основании "положения по отношению к положению", например, последовательности "идентичны" в конкретном положении, если в этом положении нуклеотиды или аминокислотные остатки идентичны. Общее число таких идентичных положений затем делится на общее число нуклеотидов или остатков в ссылочной последовательности для получения % идентичности последовательностей. Идентичность последовательностей может быть легко рассчитана известными способами, включая, но не ограничиваясь, такими, которые описаны в Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin,
A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994);
Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic
Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and
Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); и
Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073
(1988), описания которых включены в настоящий документ в
качестве ссылки. Предпочтительные способы определения
идентичности последовательностей предназначены для обеспечения
наибольшего соответствия между исследованными
последовательностями. Способы определения идентичности
последовательностей зашифрованы в общедоступных компьютерных
программах, которые определяют идентичность последовательностей
между заданными последовательностями. Примеры таких программ
включают, но этим не ограничиваются, пакет программ GCG
(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1) :387
(1984)), В LAS TP, BLASTN and FASTA (Altschul, S. F. et al. , J.
Molec. Biol., 215:403-410 (1990). Программа BLASTX общедоступна
от NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul, S. et al. ,
NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al. , J.
Molec. Biol., 215: 403-410 (1990), содержание которых включено в
настоящее описание в качестве ссылки). Эти программы оптимально
выравнивают последовательности, используя штрафы за делецию по
умолчанию для того, чтобы получить высокий уровень идентичности
последовательностей между заданной и эталонной
последовательностями. В качестве иллюстрации полинуклеотида,
имеющего нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей
мере, 95%, например, по меньшей мере 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
"идентичность последовательности" со ссылочной нуклеотидной
последовательностью, предполагается, что нуклеотидная
последовательность заданного полинуклеотида идентична ссылочной
последовательности, за исключением того, что заданная
полинуклеотидная последовательность может включать до 5, 4, 3,
2, 1 или 0 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов ссылочной
нуклеотидной последовательности. Другими словами, в
полинуклеотиде, имеющем нуклеотидную последовательность по меньшей мере с 95%-ной, например, по меньшей мере с 96%, 97%,
98%, 99% или 100%-ной идентичностью последовательности
относительно эталонной нуклеотидной последовательности, до 5%,
4%, 3%, 2%, 1% или 0% нуклеотидов в эталонной последовательности
могут быть удалены или заменены другим нуклеотидом, или
некоторое количество нуклеотидов до 5%, 4%, 3%, 2% 1% или 0% от
общего количества нуклеотидов в эталонной последовательности
могут быть встроены в эталонную последовательность. Эти мутации
ссылочной последовательности могут встречаться в 5'- или 3'-
концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности
или в любом месте между этими конечными положениями,
расположенные либо индивидуально среди нуклеотидов в эталонной
последовательности, либо в одной или нескольких соседних группах
в эталонной последовательности. Аналогично, касательно
полипептида, имеющего заданную аминокислотную
последовательность, которая по меньшей мере, например, на 95%,
например, по меньшей мере на 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентична эталонной аминокислотной последовательности,
предполагается, что заданная аминокислотная последовательность полипептида идентична эталонной последовательности, за исключением того, что заданная полипептидная последовательность может включать до 5, 4, 3, 2, 1 или 0 аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот эталонной аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения заданной полипептидной последовательности, которая по меньшей мере на 95%, например, по меньшей мере на 96%, 97%, 98%, 99% или 10 0% идентична по последовательности ссылочной аминокислотной последовательности, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или 0%, включительно, аминокислотных остатков в ссылочной последовательности могут быть удалены или замещены другой аминокислотой или количество аминокислот, равное 5%, 4%, 3% 2%, 1% или 0%, включительно, от общего числа аминокислотных остатков в ссылочной последовательности может быть встроены в ссылочную последовательность. Эти изменения эталонной последовательности могут происходить в аминокислотных или карбокси концевых положениях эталонной аминокислотной последовательности или где-нибудь между этими конечными положениями, расположенными либо по
отдельности среди остатков в эталонной последовательности, либо в одной или более соседних группах в эталонной последовательности. Предпочтительно, положения остатков, которые не идентичны, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Однако консервативные замены не включаются как соответствие при определении идентичности последовательности.
Термин "мутация" в контексте изобретения понимается как
изменение геномной последовательности, в частности, в
последовательности РНК пестивируса. Поскольку вирусы, которые
используют РНК в качестве своего генетического материала,
обладают быстрой скоростью мутаций, термин "мутация", как
указано в настоящем описании, в частности, относится к
генетически модифицированному изменению геномной
последовательности, такому как клонирование, принудительная рекомбинация, рост в присутствии мутагенов или другие способы, используемые для экспериментального изменения генома, которые, в частности, приводят к тому, что вирус, растущий до титров, значительно ниже, чем пестивирус дикого типа в инфицированном хозяине, при распространении в тех же условиях. Кроме того, в другом предпочтительном варианте осуществления мутация, описанная в настоящем описании, также может быть природной мутацией и вызвана последующим выделением пестивируса по изобретению, где указанный выделенный вирус включает описанную в настоящем описании мутацию.
Последовательности белка или последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут быть дополнительно использованы как "искомая последовательность" для выполнения поиска в публичных базах данных, например, для идентификации других членов семейства или связанных последовательностей. Такой поиск может быть выполнен с использованием программ BLASTN и ВLASTP (версия 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Поиск белка BLAST может быть выполнен программой BLASTP, штраф=50, длина слова=3 с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белка по изобретению. Для получения выравнивания с пробелами для целей сравнения, можно использоваться Gapped BLAST, как описано в
Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST можно использовать параметры по умолчанию для соответствующих программ (например, BLASTP и BLASTN). См. домашнюю страницу National Center for Biotechnology Information at www.ncbi.nlm.nih.gov.
Термин "вектор", как известно в данной области, относится к полинуклеотидной конструкции, обычно к плазмиде или вирусу, которая используется для передачи генетического материала в клетку-хозяина. Векторами могут быть, например, вирусы, плазмиды, космиды или фаг. Используемый в настоящем описании вектор может состоять либо из ДНК, либо из РНК. В некоторых вариантах осуществления вектор состоит из ДНК. "Вектор экспрессии" представляет собой вектор, который способен направлять экспрессию белка, кодируемого одним или несколькими генами, переносимыми этим вектором, если он находится в соответствующем окружении. Предпочтительно, векторы способны к автономной репликации. Обычно вектор экспрессии содержит промотор транскрипции, ген и терминатор транскрипции. Экспрессия гена обычно находится под контролем промотора, а ген, как говорят, "функционально связан с" этим промотором.
Как используется в настоящем описании термин "функционально связанный" используется для описания связи между регуляторными элементами и геном или его кодирующей областью. Как правило, экспрессия гена находится под контролем одного или нескольких регуляторных элементов, например, но ими не ограничиваясь, конститутивных или индуцируемых промоторов, ткане-специфических регуляторных элементов и энхансеров. Говорят, что ген или кодирующая область "функционально связаны с" регуляторными элементами, что означает, что ген или кодирующая область контролируется или зависит от регуляторного элемента. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор осуществляет транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности.
Как используется в настоящем описании, термин "конструкция"
относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, которая была
создана для экспрессии специфической нуклеотидной
последовательности(ей), или которая должна использоваться при
конструировании других рекомбинантных нуклеотидных
последовательностей.
Векторы и способы получения и/или использования векторов (или рекомбинантных вариантов) для экспрессии могут быть или аналогичны способам, раскрытым в следующих патентах: патенты США №№ 4603112, 4769330, 5174993, 5505941, 5338683, 5494807, 4722848, 5942235, 5364773, 5762938, 5770212, 5942235, 382425, публикациях WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018; Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11349-11353, October 1996; Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11341-11348, October 1996; Smith et al. , U.S. Patent No. 4,745,051 (recombinant baculovirus); Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.); Smith et al. , "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock et al. , "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406; EPA0 370 573; заявка США № 920197, поданная 16 октября 1986; европейская патентная заявка № 265785; патент США № 4769331 (рекомбинантные вирус герпеса); Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11307-11312, октябрь 1996; Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11313-11318, октябрь 1996; Robertson et al. , "Epstein-Вагг virus vectors for gene delivery to В lymphocytes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11334-11340, октябрь 1996; Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11371-11377, 1996;
Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; патенты США 5593939, 5552143; WO 98/00166; принятые заявки США №№ 08/675556 и 08/675566, обе поданы 3 июля 1996 (рекомбинантный аденовирус); Grunhaus et al. , 1992, "Adenovirus as cloning vectors)), Seminars in Virology 3:237-52, 1993; Ballay et al. EMBO Journal 4:386165, Graham, Tibtech 8:85-87, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70:429-34; PCT WO 91/11525; Feigner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science 259:1745-49, 1993; и McClements et al., immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11414-11420, 1996; и патенты №№ 5591639, 5589466 и 5580859, а также WO 90/11092, W093/19183, W094/21797, WO95/11307, WO95/20660; Tang et al. , Nature, and Furth et al. , Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors, помимо прочих. См. также WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (лентивирусная экспрессионная система); Sanford et al. , патент США № 4945050; Fischbachet al. (Intracel); WO 90/01543; Robinson et al. , Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (векторные системы на основе ДНК); Szoka et al. , патент США № 4394448 (способ введения ДНК в живые клетки); McCormick et al. , патент США № 567717 8 (применение цитопатических вирусов); и патент США № 5928913 (векторы для доставки генов); а также другие документы, цитированные в настоящем описании.
Используемые в настоящем описании термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" взаимозаменяемы и относятся к любой нуклеиновой кислоте. Термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" также конкретно включают нуклеиновые кислоты, состоящие из оснований, отличных от пяти биологически встречающихся оснований (аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил).
Термины "регуляторный элемент" и "элемент контроля экспрессии" используются взаимозаменяемо и относятся к молекулам нуклеиновой кислоты, которые могут влиять на экспрессию функционально связанной кодирующей последовательности в
конкретном организме-хозяине. Эти термины широко используются и охватывают все элементы, которые способствуют или регулируют транскрипцию, включая промоторы, основные элементы, необходимые для основного взаимодействия РНК-полимеразы и факторов транскрипции, расположенных в направлении 3'- 5' элементов, энхансеров и элементов ответа. Характерные регуляторные элементы в прокариотах включают промоторы, последовательности операторов и сайты связывания рибосом. Регуляторные элементы, которые используются в эукариотических клетках, могут включать, но ими не ограничиваются, транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности, такие как промоторы, энхансеры, сигналы сплайсинга, сигналы полиаденилирования, терминаторы, сигналы деградации белка, участок внутренней посадки рибосомы (IRES), последовательности 2А и тому подобное, которые обеспечивают и/или регулируют экспрессию кодирующей последовательности и/или продукцию кодированного полипептида в клетке-хозяине.
Используемый в настоящем описании термин "промотор" представляет собой нуклеотидную последовательность, которая обеспечивает связывание РНК-полимеразу и направляет транскрипцию гена. Как правило, промотор расположен в 5'-некодирующей области гена, проксимальной к месту начала транскрипции гена. Элементы последовательности внутри промоторов, которые функционируют при инициировании транскрипции, часто характеризуются консенсус-нуклеотидными последовательностями. Примеры промоторов включают, но не ограничиваются ими, промоторы из бактерий, дрожжей, растений, вирусов и млекопитающих (включая людей). Промотор может быть индуцибельным, репрессируемым и/или конститутивным. Индуцируемые промоторы инициируют повышенные уровни транскрипции из ДНК под их контролем в ответ на некоторое изменение культуральных условий, такое как изменение температуры.
Как используется в настоящем описании, термин "энхансер" относится к типу регуляторного элемента, который может повысить эффективность транскрипции, независимо от расстояния или ориентации энхансера относительно исходного сайта транскрипции.
Получение вирусного вектора может быть осуществлено с использованием любых подходящих способов генной инженерии,
хорошо известных в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, стандартные методы рестрикционного расщепления эндонуклеазой, лигирование, трансформацию, плазмидную очистку и секвенирование ДНК, например, как описано в Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)).
Вирусный вектор может включать последовательности генома любого известного организма. Последовательности могут быть включены в их нативной форме или могут быть любым образом модифицированы для получения желаемой активности. Например, последовательности могут содержать вставки, делеции или замены.
Вирусный вектор может включать кодирующие области для двух или более представляющих интерес белков. Например, вирусный вектор может включать кодирующую область для первого представляющего интерес белка и кодирующую область для второго представляющего интерес белка. Первый представляющий интерес белок и второй представляющий интерес белок могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор может включать кодирующую(ие) область(и) для третьего или четвертого представляющего интерес белка. Третий и четвертый представляющие интерес белки могут быть одинаковыми или разными. Общая длина двух или более представляющих интерес белков, кодируемых одним вирусным вектором, может изменяться. Например, общая длина двух или более белков может составлять по меньшей мере около 400 аминокислот, по меньшей мере около 450 аминокислот, по меньшей мере около 500 аминокислот, по меньшей мере около 550 аминокислот, по меньшей мере около 600 аминокислот, по меньшей мере около 650 аминокислот, по меньшей мере около 7 00 аминокислот, по меньшей мере около 7 50 аминокислот, по меньшей мере около 8 00 аминокислот или более.
Предпочтительные вирусные векторы включают бакуловирус, такой как BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) , в частности, при условии, что продуцирующими клетками являются клетки насекомых. Хотя бакуловирусная система экспрессии является предпочтительной, специалистам в данной области будет понятно, что другие системы экспрессии будут эффективны для
целей настоящего изобретения, а именно экспрессия Е или Erns в супернатанте клеточной культуры. Для таких других систем экспрессии могут потребоваться сигнальная последовательность для индукции экспрессии Е или Erns в среду.
Термин "геногруппа", как известно в данной области,
относится к связанным вирусам в пределах рода; которые могут
быть дополнительно подразделены на генетические кластеры.
Идентифицированные геногруппы рода пестивируса включают вирус
пограничной болезни овец, вирус бычьей диареи 1 (BVD-1), BVD-2,
вирус классической свиной лихорадки и другие
неклассифицированные пестивирусы.
Термин "филогенетическая ветвь" или "клада", как известно в данной области, относится к группе, состоящей из предка и всех его потомков, единственной "ветви" в филогенетическом дереве. Предком может быть, например, особь, популяция или вид. Геногруппа может включать несколько клад.
"Иммунный ответ" или "иммунологический ответ" означает, но не ограничивается этим, развитие клеточного и/или антитело-опосредованного иммунного ответа на представляющую интерес композицию или вакцину. Обычно иммунный или иммунологический ответ включает (но не ограничивается этим) один или несколько следующих эффектов: продукцию или активацию антител, В-клеток, хелперных Т-клеток, супрессорных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, включенные в композицию или интересующую вакцину. Предпочтительно, хозяин будет проявлять либо терапевтический, либо защитный иммунологический (память) ответ, благодаря чему повышается устойчивость к новой инфекции и/или уменьшается клиническая тяжесть заболевания. Такая защита будет продемонстрирована либо снижением числа симптомов, тяжести симптомов, либо отсутствием одного или нескольких симптомов, связанных с инфекцией, вызываемой патогеном, задержкой начала виремии, снижением вирусной персистенции, снижением общей вирусной нагрузки и/или снижением экскреции вируса.
В настоящем описании "специфически иммунореактивный" относится к иммунореактивному белку или полипептиду, которые
распознают антиген, характерный для пестивируса или инфекции СТ, но не взаимодействуют с антигеном, характерным для строго контроля заражения.
"Защита от болезней", "защитный иммунитет", "функциональный иммунитет" и аналогичные фразы означает ответ на заболевание или состояние, вызванное введением одной или нескольких терапевтических композиций по изобретению, или их сочетания, что приводит к меньшему количеству побочных эффектов, чем могло бы ожидаться у неиммунизированной особи, которая подвержена болезни или инфекции. То есть, тяжесть побочных эффектов инфекции уменьшается у вакцинированной особи. У вакцинированной особи инфекция может быть уменьшена, замедлена или, возможно, полностью предотвращена. В настоящем описании, если подразумевается полная профилактика инфекции, то это конкретно указано. Если полная профилактика не указана, то термин включает частичную профилактику.
При этом "снижение частоты и/или тяжести клинических признаков" или "снижение клинических симптомов" означает, но этим не ограничивается, уменьшение числа инфицированных особей в группе, уменьшение количества особей, проявляющих клинические симптомы инфекции, или их исчезновение, или уменьшение тяжести любых клинических симптомов, которые присутствуют у одной или нескольких особей, по сравнению с инфекцией дикого типа. Например, это должно касаться любого уменьшения патогенной нагрузки, уменьшения количества патогенов, снижения передачи патогенов или уменьшения любого клинического симптома, характерного для СТ. Предпочтительно, эти клинические симптомы уменьшаются у одной или более особей, получающих терапевтическую композицию по настоящему изобретению, по меньшей мере на 10% по сравнению с особями, не получающими композицию, и которые становятся инфицированными. Более предпочтительно, клинические симптомы снижаются у особей, получающих композицию по настоящему изобретению, по меньшей мере на 20%, предпочтительно, по меньшей мере на 30%, более предпочтительно, по меньшей мере на 40% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 50%.
Термин "повышенная защита" в настоящем описании означает,
но не ограничивается этим, статистически значимое уменьшение одного или нескольких клинических симптомов, которые связаны с инфекцией инфекционным агентом, предпочтительно, пестивирусом, вызываемым СТ, соответственно, в вакцинированной группе особей по сравнению с невакцинированной контрольной группой особей. Термин "статистически значимое снижение клинических симптомов" означает, но не ограничивается этим, что частота распространенности по меньшей мере одного клинического симптома в вакцинированной группе особей по меньшей мере на 10%, предпочтительно, на 20%, более предпочтительно, на 30%, еще более предпочтительно, на 50% и, даже более предпочтительно, на 70% ниже, чем в невакцинированной контрольной группе после заражения инфекционным агентом.
"Долгосрочная защита" должна относиться к "улучшенной эффективности", которая сохраняется в течение по меньшей мере 3 недель, но, более предпочтительно, по меньшей мере 3 месяца, еще более предпочтительно, по меньшей мере б месяцев. В случае домашнего скота наиболее предпочтительно, чтобы длительная защита сохранялась до среднего возраста, при котором животных реализуют на рынке в пищу.
Как используется в настоящем описании, термин "виремия", в частности, понимают как состояние, при котором частицы пестивируса воспроизводятся и циркулируют в кровотоке животного, в частности, поросят.
Термин "снижение виремии", индуцированной пестивирусом, означает, но не ограничивается этим, сокращение пестивируса, проникающего в кровоток животного, где уровень виремии, то есть количество копий пестивирусов на мл сыворотки крови или количество колоний, образующих бляшки, на децилитр сыворотки снижается в сыворотке особей, получающих композицию по настоящему изобретению, по меньшей мере на 50% по сравнению с особями, не получающими такую композицию, и которые становятся инфицированными. Более предпочтительно, уровень виремии снижается у особей, получающих композицию по настоящему изобретению, по меньшей мере, на 90%, предпочтительно, по меньшей мере на 99,9%, более предпочтительно, по меньшей мере на
99,99% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 99,999%.
"Безопасность" относится к отсутствию неблагоприятных последствий у вакцинированного животного после вакцинации, включая, но этим не ограничиваясь: возможную реверсию вакцины на основе бактерий к вирулентности, клинически значимые побочные эффекты, такие как постоянная, системная болезнь или нежелательное воспаление на месте введения вакцины.
Термины "вакцинация" или "вакцинирование" или их варианты, используемые в настоящем описании, означают, но не ограничиваются ими, способ, который включает введение иммуногенной композиции по изобретению, которая при введении животному вызывает или способна вызывать, напрямую или косвенно, иммунный ответ у животного против пестивируса или СТ.
"Смертность" в контексте настоящего изобретения относится к смерти, вызванной пестивирусной инфекцией или СТ, и включает ситуацию, когда инфекция настолько сильная, что животное подвергают эвтаназии, чтобы предотвратить страдания и дать ему умереть.
Следующие примеры включены для демонстрации
предпочтительных вариантов осуществления изобретения.
Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что
способы, описанные в следующих ниже примерах, представляют собой
методы, обнаруженные изобретателями, которые хорошо
функционируют при практическом осуществлении изобретения и, таким образом, могут считаться предпочтительными при его практическом осуществлении. Однако специалистам в данной области будет, в свете настоящего описания, понятно, что может быть сделано большое число изменений в конкретных раскрытых вариантах осуществления и могут быть получены аналогичные или сходные результаты без отхода от сущности и объема изобретения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Цель исследования состояла в том, чтобы определить, можно ли воспроизвести клиническое заболевание у свиней, рожденных с помощью кесарева сечения (CDCD), используя гомогенат ткани, содержащий новый пестивирус по настоящему изобретению. В
частности, цель заключалась в воспроизведении виремии и колонизации тканей (как обнаружено с помощью кПЦР в реальном времени) у поросят CDCD после заражения сывороткой, содержащей новый пестивирус.
Уход за животными
Свиньей размещали в вивариях при VRI в Кембридже, IA, на протяжении всего исследования. Свиней вскармливали на коммерческом рационе (UltraCare Medicated, лот № 4Junl6), который соответствовал их размеру, возрасту и состоянию в соответствии с приемлемыми методами животноводства в данном регионе (были включены антибиотики). Вода была доступна ad libitum. Пол и место для корма удовлетворяли требованиям, изложенным в соглашении "Guide for the Care and Use of Agricultural Animals in Agricultural Research and Teaching", третье издание, январь 2010.
Любое умирающее животное и животные, отказывающиеся от еды или питья, подвергались эвтаназии до даты вскрытия по усмотрению исследователя. Любое животное, которое погибло или было подвергнуто эвтаназии в течение всего периода исследования, вскрывалось ветеринаром. Все животные подвергались эвтаназии по завершению исследования, учитывались и утилизировались путем сжигания.
Организация эксперимента
Для данного биоанализа использовалось в общей сложности десять свиней CDCD. Свиньи были рандомизированы на две группы. Животным группы 1 (п=б) вводили посредством трех путей введения (интракраниально, интраназально и внутривенно) сыворотку, содержащую пестивирусы. Животных группы 2 (п=4) инокулировали аналогичным образом веществом плацебо, и они служили отрицательным контролем. Животные в каждой группе находились в отдельных комнатах. После заражения проводили ежедневный мониторинг клинических симптомов у свиней со дня заражения (DO) до D2 8. На протяжении всего исследования дважды в неделю определяли ректальную температуру. На протяжении всего исследования дважды в неделю собирали образцы сыворотки, фекалий и образцы из носа. Образцы подвергали скринингу на пестивирусную
РНК. Вес животных измеряли в DO и во время вскрытия для оценки воздействия заражения на среднесуточный прирост. На D10, 14, 17, 21, 2 4 и 2 8 вскрывали одно животное из группы заражения. Решение о том, какое животное будет вскрыто, основывалось на обнаружении РНК пестивируса в сыворотке. На D17, 21, 24 и 28 эвтаназии подвергали одно животное из группы плацебо. Ткани и терминальную сыворотку, собранные во время вскрытия, подвергали скринингу на наличие РНК пестивируса посредством кПЦР в реальном времени (фиг.4).
Сыворотку NAC#20140530, животное номер 21-24, лот с 2815105-2 по 2815-105-5, оттаивали при 37°С и объединяли. Объединенные сыворотки фильтровали через фильтр 0,2 мкм и разбавляли добавлением б мл сыворотки к 29 мл 1хзабуференного фосфатом физиологического раствора (Gibco номер в каталоге 10010-023, лот номер 1535358). Полученное вещество обозначали лот 2815-171-А и хранили при -70°С±10°С перед использованием (FreezerWorks id#466528). В день испытания вещество размораживали и сохраняли на льду в течение периода заражения. Три аликвоты по 2 мл хранили в качестве контрольных образцов при -70°С±10°С (FreezerWorks id#466044). Объединенное вещество сохраняли, но дополнительно не тестировали.
Таблица 1. Схема основных событий, DPC означает день после
Интраназальное заражение: на DPC0 исследователь вводил 2 мл вещества для заражения, 1 мл в каждую ноздрю, используя стерильный шприц. Это введение проводили перед анестезией животного.
Интракраниальное введение: на DPC0 исследователь
анестезировал животных смесью кетамина, ксилазина и телазола. Свод черепа очищали и дезинфицировали. Для удаления участка кожи размером 4 мм из свода черепа использовали иглу для биопсии кожи (Miltex Instrument Company, Inc.). Через отверстие проводили
трепанацию свода черепа, используя ручную механическую дрель. Зараженное вещество вводили в головной мозг с помощью катетера калибром 20, длиной 1,88 дюймов (BD AngioCath, партия номер
Н3272). После инъекции инокулята в катетер вводили 0,5 мл lxPBS для доставки инокулята. Разрез кожи закрывали одним швом.
Внутривенное заражение: после того, как поросят
анестезировали, 2 мл вещества для заражения медленно вводили в ушную вену, используя стерильный катетер-бабочку и шприц.
Клинические наблюдения
После заражения проводили мониторинг поросят один раз в день на наличие клинических симптомов. Поскольку неизвестно, будут ли клинические признаки сходны с другими пестивирусами свиней (например, классическая чума свиней, вирус Bungowannah), то проводили монитор поросят на симптомы системной инфекции, а также на неврологические симптомы.
Сбор проб фекалий
Фекальный материал у поросят собирал исследователь. Образцы собирали на тампон (номер в каталоге Fisher 23-400-111), помещенный в пробирку фирмы Falcon. Образцы брали у животных, а не с пола. Материал переносили в день сбора, и образцы поддерживали при 2-8°С, если тестирование проводили в течение <24 часов после доставки, или поддерживали при -7 0°С ±10°С, если их проводили позднее.
Взятие мазков из носа
Мазки из носа у поросят собирал исследователь. Образцы собирали на тампон (номер в каталоге Fisher 23-400-111), помещенный в пробирку фирмы Falcon. Образцы собирали у животного, беря мазки из обоих ноздрей. Образцы помечали, указывая минимальный номер исследования, день исследования и идентификационный номер животного. Материал переносили в день сбора, и образцы поддерживали при 2-8°С, если тестирование проводили в течение <24 часов после доставки, или поддерживали при -7 0°С±10°С, если их проводили позднее.
Забор крови
В день сбора крови исследователь собирал от 4 до 15 мл
венозной цельной крови через переднюю полую вену у каждой свиньи, используя стерильную иглу VACCUTAINER(r) размером от 18-20дхот 1 дюйма (2,54 см) до 1,5 дюйма (3,81 см)(r), держатель иглы VACCUTAINER(r) и 9 или 13 мл-овые пробирки для отделения сыворотки (SST) . Сыворотку отделяли от тромба центрифугированием и декантировали в низкотемпературный флакон с завинчивающейся крышкой. Материал переносили в день сбора, и образцы поддерживали при 2-8°С, если тестирование проводили в течение <24 часов после доставки, или поддерживали при -7 0°С±10°С, если их проводили позднее. Вскрытие
Общий о стотр: У каждого умирающего животного забирали кровь, подвергали эвтаназии, а затем ветеринар проводил вскрытие. Свиней отбирали для вскрытия на основе данных о виремии (значение Ct <30), полученных за день до запланированного вскрытия. Поросят взвешивали во время вскрытия и регистрировали макроскопические повреждения.
Сбор крови у умирающего животного и обработка: Поросят глубоко анестезировали перед сбором крови. Кровь (приблизительно 5% массы тела) собирали в стерильные банки, бутылки или несколько пробирок SST и оставляли коагулироваться при комнатной температуре. Сыворотку отделяли от сгустка центрифугированием и декантировали в стерильные бутылки. Образцы сыворотки поддерживали при 2-8°С, если тестирование проводили в течение <24 часов после доставки, или поддерживали при -7 0°С, если их проводили позднее.
Сбор образцов: Исследователь собирал фиксированные в формалине образцы тканей головного мозга (1/2 органа), мозжечка (1/2 органа), ствола мозга (1/2 органа), спинного мозга (б секций), костного мозга (гистологический срез длинной кости), миндалины (1 срез), легких (1 срез добавочной доли легких или область с поражением), сердца (2 среза), селезенки (1 срез), почки (1 срез), печени (1 срез), лимфатического узла (трахеобронхиальный и брыжеечный), тонкой кишки (3 среза подвздошной кишки), толстой кишки (3 среза). Рекомендуется 1
дюймовый гистологический срез легкого и 1-2-дюймовый срез кишечника, так чтобы сохранялось постоянное соотношение фиксированной ткани и формалина 1:10. Все фиксированные ткани помещали в один контейнер, содержащий 10% буферный раствор формалина. У каждого поросенка собирали образец секций в повторе, как перечислено выше, в отдельные упаковочные пакеты для центрифугирования.
Обработка ткани: Образцы перевозили в день сбора, и образцы поддерживали при 2-8°С, если тестирование проводили в течение <24 часов после доставки, или поддерживали при -7 0°С, если их проводили позднее. Фиксированные ткани содержали при комнатной температуре.
Измерение веса
Измерение веса поросят проводили на DPC0 в день вскрытия. Вес наносили на калибровочную шкалу и записывали по соответствующей форме, предоставляемой виварием. Показатели веса использовали для расчета среднего дневного прироста.
Тестирование образцов
ПЦР пестивируса проводили во всех образцах. Отобранные образцы подвергали скринингу на энтеровирус, свиной калицивирус, трансмиссивный вирус гастроэнтерита, Escherichia coli, Salmonella и/или Clostridium sp. или другие инфекционные агенты.
ПРИМЕР 2
Цели этого проекта состояли в том, чтобы: 1) обнаружить потенциальный(ые) патоген(ы) в образцах от поросят с врожденным тремором и 2) разработать модель инфекции для воспроизведения болезни. Используя следующее поколение секвенирования, у поросят с врожденным тремором был обнаружен дивергентный родственный пестивирус. Первоначально вирус был близкородственным с пестивирусом летучих мышей, но теперь он является близкородственным с новым свиным пестивирусом, информация о котором недавно была опубликована, условно названным атипичным свиным вирусом. Количественная ПЦР в реальном времени обнаружила вирус в образцах новорожденных поросят с врожденным тремором на двух разных фермах, но не обнаружила в образцах не пораженных
поросят той же фермы. Для выполнения второй задачи беременным свиноматкам инокулировали либо сывороткой, содержащей пестивирус, либо PBS (контроль) внутривенным и интраназальным путем одновременно с прямой инокуляцией эмбриональных амниотических пузырей с помощью ультразвуковой хирургической методики. Прививки проводили на 4 5 или 62 день беременности. Все свиноматки, которым инокулировали новый пестивирус, поросились поросятами, пораженными врожденным тремором, тогда как те, которым в качестве контроля инокулировали PBS, не были поражены. Степень тяжести тремора у каждого поросенка оценивали по видеороликам, сделанным в 0, 1 и 2 дни после рождения. Степень тремора оставалась относительно постоянной в течение от 0 до 2 дня после рождения для большинства поросят. Распространенность врожденного тремора в помете, инокулированном пестивирусом, изменялась от 57% (4 из 7 пораженных поросят) до 100% (10 из 10 пораженных поросят) . Вирус последовательно обнаруживали с помощью ПЦР в тканях поросят с врожденным тремором, но он не был обнаружен у контрольных поросят. Образцы, положительные по данным ПЦР у более 90% поросят, включали ствол головного мозга
(37 из 41), брыжеечный лимфатический узел (37 из 41), трахеобронхиальный лимфатический узел (37 из 41) и цельную кровь
(19 из 20). Хотя первое описание врожденного тремора было сделано в 1922 году, это первый зарегистрированный помет с врожденным тремором после экспериментальной инокуляции дивергентным родственным свиным пестивирусом. Для лучшего понимания патофизиологии врожденного тремора, вызванного этим пестивирусом, необходимы исследования, изучающие механизм заболевания, эпидемиологию и диагностический анализ. Секвенирование следующего поколения
Были получены разнообразные ткани свиней (сыворотка, головной мозг, мозжечок, спинной мозг, цереброспинальная жидкость (CSF) и/или легкое) из трех диагностических исследований СТ: легочная ткань от одного поросенка (ID 20130103); либо объединили мозговую ткань, либо объединили легочную ткань от шести поросят (ID 20120705); и CSF (п=2, ферма В), сыворотка (п=2, ферма А и В) и легкие (п=2; ферма А и В) из
шести разных поросят, происходящих из двух разных ферм (ID 2014016573). За исключением ткани легких из образца ID 20120705, во всех испытуемых образцах была обнаружена по меньшей мере частичная геномная последовательность пестивируса. Сыворотка и тканевые гомогенаты ресуспендировали в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (Corning-Cellgro) и обогащали защищенными нуклеиновыми кислотами вирусных частиц путем ферментации комбинацией нуклеаз: РНКазой А (Invitrogen), ДНКазой Baseline Zero (Epicentre) и ДНКазой Turbo (Invitrogen). Вирусные нуклеиновые кислоты экстрагировали в соответствии с протоколом производителя, используя набор для крови Qiagen Viral RNA. После экстракции нуклеиновые кислоты затем обрабатывали ДНКазой Turbo для удаления ДНК хозяина или вероятной вирусной ДНК, таким образом дополнительно обогащая вирусной РНК. Двухцепочечную кДНК получали посредством обратной транскрипции и обработкой Кленова
(NEB), используя прайминг со случайными гексамерами.
Образцы обрабатывали для секвенирования на основе MiSeq посредством создания библиотеки с использованием набора для подготовки библиотеки NextEra XT (Illumina) в соответствии с предлагаемым протоколом изготовителя, заменяя колоночное элюирование (Qiagen, MinElute) на нормализацию бусами. Библиотеку пускали на MiSeq, используя набор с 500 циклами
(Illumina), и данные анализировали, используя комбинацию NextGene (версия 2.3.4.2) и программное обеспечение Sequencher
(версия 5.1) . Выбирали последовательности высокого качества как последовательности, которые содержат медианный критерием Q более 25, и обрезали с отсечением не более 3 непривлеченных оснований на 3'-конце или 3-последовательных оснований с критерием Q, с оценкой менее 16. Последовательности, собранные de novo, анализировали путем сравнения с последовательностью из GenBank с помощью BLASTn и BLASTx. Выравнивание ClustalW использовали для филогенетического анализа 215 аминокислотной последовательности гена NS3 и 170 аминокислотной последовательности гена Npro. Соседние филогенетические деревья были созданы из 1000 реплик с использованием программного обеспечения MEGA 6.0.
Количественная полимеразная цепная реакция в реальном
времени (ОТ-кПЦР)
Была разработана ОТ-кПЦР, нацеленная на область N3S генома дивергентного пестивируса. Образцы тканей (п=3 62) растущих свиней, которые были представлены в State University Veterinary Diagnostic Laboratory (ISU VDL) для рутинного диагностического тестирования, использовали для определения количества пестивируса в этом наборе образцов. Два набора образцов также собирали с ферм с врожденным тремором. Эти образцы включали сыворотку, головной мозг, мозжечок, ствол мозга и спинной мозг. Первый набор (ферма А) состоял из б пораженных и 2 непораженных вскормленных на грудном молоке поросят, сыворотки из пяти свиноматок, из которых были отобраны вскормленные на грудном молоке поросята, а также 5 пораженных и 2 непораженных поросят в возрасте от б до 14 дней. Второй набор (ферма В: ISUVDL2014016573) состоял из 5 пораженных свиней с неизвестным статусом вскармливания и сыворотки от пяти свиноматок с пораженными поросятами.
Набор для количественного одностадийного RT-PCR (набор One-Step Kit iTaq Universal, BioRad, № 172-5141) использовали в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл экстрагированной общей нуклеиновой кислоты, 1,0 мкл зонда (2 мкМ), 1 мкл каждого праймера (5 мкМ), 12,5 мкл смеси 2xRT-PCR, 0,5 мкл обратной транскриптазы iScript и 7,0 мкл воды, обработанной DEPC (таблица 2) . Реакцию проводили с использованием системы детекции PCR в режиме реального времени CFX96 (BioRad) при следующих условиях: начальная обратная транскрипция при 50°С в течение 10 минут с последующей начальной денатурацией при 95°С в течение 3 мин, 4 0 циклов денатурации при 95°С в течение 15 с и отжигом и удлинением при 57°С в течение 3 0 с. Для получения количественных показателей пестивирусный ультрамер включали в каждый прогон (Integrated DNA Technologies), включая область NS3, нацеленный на праймеры. Отсечение для положительных образцов было установлено при значениях количественного определения цикла (Cq) ниже 36.
Таблица 2. Праймер, зонд и ультрамерные последовательности для ПЦР в реальном времени
Животные
Все процедуры были одобрены the Institutional Animal Care and Use Committee of Iowa State University (Log Number: 1-147 907-S 2) . Восемь индивидуально идентифицированных кросс-бредных свиноматок на 3 8-й день беременности получали из коммерческого источника без СТ в анамнезе. Сыворотка от всех свиноматок была отрицательной на PCV2a, PCV2b, PRRSV, PPV1, PPV5 и новый пестивирус ОТ-кПЦР перед отгрузкой и инокуляцией (?). Индивидуальные свиноматки были случайным образом распределены по одной из трех групп, размещенных отдельно [ложные прививки делали на 45 день беременности (п=1) и на 62 день беременности (п=1), инокулировали пестивирусом на 45 день беременности (п=3) и инокулировали пестивирус на 62 день беременности (п=3)], и в течение всего периода исследования кормили полноценной диетой.
Инокуляция животных
У свиноматок забирали корм и воду за 12 часов до операции, чтобы снизить риск анестезирующей регургитации. Терминальную сыворотку свиньи с виремией (ISUVDL2014016573) оттаивали при 37°С. Общую нуклеиновую кислоту экстрагировали и подвергали скринингу ПЦР на присутствие PCV2a, PCV2b, PRRSV, PPV1, PPV5 и пестивируса; был обнаружен только пестивирус (Cq=27,47). Сыворотку в объеме 0,2 мкм фильтровали и разбавляли, добавляя б мл сыворотки до 35 мл lxPBS (Gibco) . В день инокуляции инокулят оттаивали и держали на льду во время процедуры инокуляции. Общую
анестезию начинали с внутримышечной инъекции комбинации тилетамина и золазепама (TELAZOL(r)) , кетамина и ксилазина. После начала анестезии каждую свиноматку помещали в левый бок, а правую часть живота подготавливали для асептической лапаротомии. Живот закрывали для операции, и место разреза блокировали 2% лидокаином перед рассечением. Делали парамедиальнный разрез размером приблизительно 3 0 см на 5 см сбоку от ткани молочной железы, чтобы получить доступ к брюшной полости. Матку временно выводили на поверхность тела, и использовали стерильный ручной векторный линейный ультразвуковой преобразователь для визуализации каждого зародыша и направляли иглу для инокуляции в эмбриональную амниотическую везикулу. В каждую везикулу инокулировали 0,2 5 мл инокулята (PBS или пестивирусную сыворотку), используя иглу малого калибра (22 g) (S2 МР4) . Брюшную стенку закрывали в трех слоях, используя шов полиглактина 910 размером 2. Инокулят также вводили непосредственно в свиноматку интраназальным (2 мл) и внутривенным (2 мл) путем сразу же после хирургической процедуры. Единичные дозы мелумина флуниксина (BANAMINE-S(r)) и кристаллической свободной цефтиофуровой кислоты (EXCEDE(r)) вводили внутримышечно сразу после закрытия и перед обезболиванием. Анастезия первой свиноматки начиналась в 8:30 утра в соответствующий день операции. Каждая процедура занимала приблизительно 1 час. Анастезию последней свиноматки начинали 11:30.
Клинические наблюдения, сбор образцов и вскрытие
После инокуляции проводили ежедневный мониторинг свиноматок, а ректальную температуру измеряли через 0-7 дней после инокуляции (DPI). Фекальный материал, кровь и мазки из носа собирали у свиноматок на 2, 7, 10 и 14 DPI, а затем еженедельно перед тем как они поросились. Во время их опороса поросят индивидуально идентифицировали, и брали сыворотку, мазки из носа и фекальные мазки. У субпопуляции поросят (п=7) собирали кровь из пуповины. Каждого поросенка снимали на видео ежедневно с 0 по 2 день после опороса (DPF). Четыре исследователя из
слепых групп просматривали видеоролики, и каждый поросенок получал оценку тяжести тремора: 0 - отсутствует, 1 - мелкая мускулатурная фасцикуляция, 2 - легкий тремор, 3 - умеренный тремор, 4 - сильный тремор с выраженным подпрыгиванием. Затем оценки усредняли, назначая каждому поросенку общий показатель тяжести тремора по DPF. Поросят, получивших оценку > 0,7 5 на DPF 2 считали пораженными. Наличие или отсутствие дисплазии тазобедренного сустава также записывали на каждом DPF для каждого поросенка. Свиноматок и поросят подвергали эвтаназии на DPF 2 с помощью пистолета с выдвигающимся ударным стержнем и инъекцией сверхдозы барбитурата, соответственно. При вскрытии берут образцы сыворотки поросят, головного мозга, мозжечка, ствола головного мозга, спинного мозга, почек, брыжеечного лимфатического узла, трахеобронхиального лимфатического узла, тимуса, сердца и селезенки. У субпопуляции поросят брали цельную кровь (пробирки ЭДТА, п=2 0) и CSF (п=2 9). Сыворотку свиноматок также собирали при вскрытии.
Идентификация пестивируса
Секвенирование следующего поколения
Благодаря использованию технологии секвинирования
следующего поколения вирус, близкородственный пестивирусу Китайских летучих мышей, а теперь, как известно, более близкородственный недавно описанному пестивирусу, предварительно обозначенным как атипичный вирус свиней, был обнаружен в трех независимых исследованиях врожденного тремора. Почти полный геном был получен из одного из трех исследований. Этот вирус в сыворотке от виремического животного впоследствии использовали для инокуляции животных в этом исследовании. Филогенетический анализ NS3 и Npro подтверждает классификацию вируса, идентифицированного в настоящем описании как представитель предположительного вида "атипичного свиного вируса" (фиг.5), с 88,0% и 94,6% нуклеотидами и аминокислотами, соответственно. Ретроспективный анализ ренивирусной РНК с помощью ОТ-кПЦР из случаев, представленных в ISU VDL, показал, что 21 из 362 образцов (6%) были положительными. Эти случаи были обычными
данными стад, испытывающих различные клинические признаки. ОТ-кПЦР
Образцы от поросят с врожденным тремором и от непораженных когорт собирали из двух ферм, ферма А и ферма В. Животные, у которых был диагностирован врожденный тремор, были положительными на пестивирус с помощью ОТ-кПЦР, но вирус не был обнаружен в центральной нервной ткани или сыворотке непораженных поросят (таблица 3) . Вирус был обнаружен в сыворотке из одной свиноматки из фермы А.
Таблица 3. Количественные результаты ПЦР в реальном времени для образцов от поросят из фермы А и фермы В.
Вид образца Ствол головного
Головной мозг Мозжечок мозга Спинной мозг Сыворотка
ID Состояни животн е
Ферма.
болезни*
Cqb
SQC
Р2а
34, 18
3,95Е+02
35, 93
1,36Е+02
33, 39
6,38Е+02
30, 64
1,14Е+05
Р2В
35, 92
1,37Е+02
35, 53
1,74Е+02
30, 14
1,47Е+05
Р4а
32, 44
1,13Е+03
36, 51
9,56Е+01
36, 44
6,62Е+03
Р4Ь
29, 37
2,14Е+05
35, 41
1,87Е+02
30, 97
9,71Е+04
Р5а
Рба
33, 65
4,76Е+02
33, 89
4,71Е+02
РбЬ
28,75
2,89Е+05
31, 37
8,00Е+04
32, 65
1,00Е+03
35, 65
1,61Е+02
30, 92
1,05Е+05
32, 31
1,23Е+05
35, 72
1,54Е+02
30,77
1,13Е+05
30,50
3,69Е+03
35, 90
1,38Е+02
33, 97
2,31Е+04
Н0е
29,40
2,23Е+05
32, 39
31,29
8,74Е+04
26, 59
8,36Е+05
24,04
2,92Е+06
24,56
2,27Е+06
25,50
1,42Е+06
26, 04
1,09Е+06
30, 92
9,96Е+04
26,25
9,89Е+05
27,41
5,58Е+05
26, 14
1,04Е+06
22,26
6,98Е+06
25,79
1,24Е+05
29, 32
2,19Е+05
27,31
5,85Е+05
26, 14
1,04Е+06
22,25
7,04Е+06
23 + 27,51 5,31Е+05 23,45 3,91Е+0б 26,43 9,05Е+05 24,46 2,38Е+06 22,47 6,31Е+06
24 + 27,93 4,34Е+05 24,13 2,79Е+06 27,25 6,05Е+05 24,10 2,38Е+06 22,25 7,04Е+06
Присутствие (+) или отсутствие (-) врожденного тремора. ьСд=значение цикла количественных показаний. сЗО_=начальное количество, ^^необнаруженный" после 4 0 циклов. еНО=Не определено.
Модель инокуляции свиноматок Наблюдения и образцы свиноматок
У одной ложно инокулированной свиньи на 4 5 день беременности развивалась умеренную лихорадка после операции и у нее был выкидыш на 3 и 4 DPI. Было обнаружено, что свиноматка из группы, которую нужно прививать через 4 5 дней беременности, не была беременна во время инокуляции; она была удалена из исследования. Ложно инокулированные и инокулированные пестивирусом свиноматки не проявляли клинических симптомов, и, кроме того, у них не развивалась обнаруживаемая виремия или вирус не распространялся до уровней, определяемых ОТ-кПЦР. Все свиноматки поросились естественным образом. Один поросенок был мертворожденным (свиноматка с идентификационным номером 3 6 61), а один плод был мацерированным (свиноматка с идентификационным номером 350 0).
Наблюдения за поросятами и образцы
У ложно инокулированных поросят не было клинических
признаков, согласующихся с СТ на DPF 0, 1 или 2 (S4 МР4) .
Большинство поросят, которым на эмбриональной стадии
инокулировали пестивирус на 4 5 или 62 день беременности, имели
клинические признаки, соответствующие СТ (S4 МР4) .
Распространенность врожденного тремора (S5 МР4) и дисплазии тазобедренного сустава (S6 МР4) в помете, инокулированном пестивирусом, варьировала от 57% до 100% и от 0% до 40% на DPF 2, соответственно (таблица 4). Тяжесть тремора изменялась в пометах поросенка, но оставалась относительно постоянной в течение двухдневного периода наблюдения у большинства поросят (таблица 5).
ьПоросят считали пораженными врожденным тремором, если показатель тяжести тремора составлял >
0,75.
Таблица 5. Оценка врожденного тремора по поросятам и дням после рождения
Средний показатель тяжести тремора
Идентификационный номер свиноматки/инокуляция/день ID
беременности^
животн.
DPF* 0
DPF 1
DPF 2
0,25
2427/PBS/62
0,50
124
0,25
0,5
125
2, 00
0,75
0,25
0,25
3,50
4, 00
4, 00
0,50
4 03б/пестивирус/4 5
3,75
4,0
4,0
3,75
4,0
4,0
1, 00
0,25
3,50
3,5
3,5
4, 00
3,25
3,25
0,25
3, 00
1,75
1,5
2, 00
0,25
0,25
3 992/пестивирус/45
2,50
1,50
1,75
3, 00
3,75
4, 00
3,25
2,50
2,75
2,25
1,25
1,25
3, 00
2, 00
2,50
1, 00
2,5
3, 0
3 661/пестивирус/62
2, 00
3, 00
3,25
bDPF=flHeii после опороса.
Вирусные нуклеиновые кислоты экстрагировали из тканей, сывороток и цельной крови, собирали и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Хотя ни в какой из тканей помета, инокулированных плацебо, не было обнаружено пестивируса, почти все животные из экспериментально инокулированной группы были положительными по меньшей мере в одной ткани. Тропизм ткани был широким, так как РНК пестивируса была обнаружена в сыворотке (26 из 41), мазке из носа (12 из 41), фекалиях (14 из 41), терминальной сыворотке (34 из 41), головном мозге (30 из 41 ), мозжечке (36 из 41), стволе головного мозга (37 из 41), спинном
мозге (33 из 41), почке (35 из 41), брыжеечном лимфатическом узле (37 из 41), трахеобронхиальном лимфатическом узле (36 из 41), тимусе (37 из 41), сердце (35 из 41) и селезенке (37 из 41) с помощью ОТ-кПЦР у поросят, рожденных живыми, инокулированных пестивирусом (фиг.6); вирусную РНК не обнаруживали в таких же образцах PBS-инокулированных поросят. Кроме того, РНК пестивируса была обнаружена в пуповинной крови (5 из 7), цельной крови (19 из 20) и цереброспинальной жидкости (26 из 29) субпопуляции поросят (фиг.6). Среднее значение Cq сыворотки, мазков из носа, цереброспинальной жидкости, брыжеечного лимфатического узла, трахеобронхиального лимфатического узла, селезенки и пуповинной крови было меньше 26. Среднее значение Cq фекалий, терминальной сыворотки, мозжечка, спинного мозга, почки, тимуса и сердца измерялось от 2 6 до 28. Мозжечок, ствол мозга и цельная кровь имели самые высокие средние значения Cq (> 28) . Наиболее часто РНК пестивируса обнаружилась (> 90% взятых образцов) в стволе головного мозга, брыжеечном лимфатическом узле, трахеобронхиальном лимфатическом узле и цельной крови; реже (от 80 до 90% взятых проб) в терминальной сыворотке, мозжечке, спинном мозге, цереброспинальной жидкости, почке, тимусе, сердце и селезенке; и реже всего (от 2 9 до 74% взятых проб) в сыворотке, назальных секретах, фекалиях, головном мозге и пуповинной крови. Сыворотка двух животных (35 и 90) была случайно выбрана для оценки геномной стабильности путем полного секвенирования генома. Оба животных имели идентичные 7 фиксированные изменения в 7 нуклеотидах родительского штамма, приводящие к четырем консервативным изменениям аминокислот. При анализе данных глубокого секвенирования исследуемого материала в каждом из этих положений наблюдалось доказательство полиморфизма.
Обсуждение
Синдром СТ был впервые зарегистрирован почти 100 лет назад; тем не менее, большинство современных вспышек заболевания были связаны с неидентифицированным вирусом. Используя секвенирование следующего поколения, новый возбудитель, первоначально идентифицированный как близкородственный с пестивирусом летучих
мышей, был обнаружен в образцах поросят с СТ.
Был разработан ОТ-кПЦР, нацеленный на ЫЗБ-часть генома дивергентного пестивируса, чтобы обнаружить вирусную РНК во множестве образцах различного типа. Ретроспективный анализ выявил РНК пестивируса с помощью OT-rGWH в 6% (21 из 3 62) образцов стада с различными клиническими симптомами, что свидетельствует о том, что вирус в тканях этого набора образцов слабо распространен. Образцы исследования с инокуляцией отбирали на основании клинических симптомов СТ и распределения тканей и сайтов репликации CSFV. Образцы тканей поросят с СТ двух неродственных ферм содержали вирусную РНК, которая была последовательно обнаружена в сыворотке и в ткани центральной нервной системы, что указывает на то, что вирус имеет системное распределение при клиническом влиянии на функцию центральной нервной системы. Это также подтверждается распределением в ткани вирусной РНК у поросят, инокулированных пестивирусом. Специфический сайт репликации определен не был, так как все тестируемые ткани имели одинаковые уровни обнаруживаемой РНК пестивируса. На этом основании можно предположить, что репликация вируса происходит системно и может включать мононуклеарные клетки периферической крови или эндотелиальные клетки, сходные с CSFV.
Пестивирус, используемый для этой модели инокуляции, был виремической сывороткой, поскольку попытки in vitro культивирование вируса не были успешными. Иммунный статус свиноматок в этом исследовании неизвестен из-за отсутствия серологического анализа нового вируса. Чтобы избежать возможного влияния антипестивирусных антител у свиноматкок, непосредственно инокулировали эмбриональные амниотические пузырьки, так как плацента свиньи не дает проникать антителам от матери к плоду.
Несмотря на то, что в результате хирургической процедуры у одной из PBS-инокулированных свиноматок был аборт, клинических различий между свиноматками и свиноматками, инокулированных пестивирусом, не наблюдалось. По имеющимся данным, мертворожденные, мумифицированные или мацерированные плоды отсутствуют при вспышках СТ. Один мертворожденный плод в одном
из помета и один мацерированный плод в другом помете свиноматок, инокулированных пестивирусом, считались случайными и, вероятно, не связанными с инфекцией плода. Несмотря на IN и IV инокуляции у свиноматок не развивалась обнаруживаемая виремия или вирус не распространялся до уровней, определяемых ОТ-кПЦР. Поэтому либо свиноматки не были заражены после заражения, либо доступные диагностические тесты были недостаточными для обнаружения инфекции.
Для того чтобы СТ проявился, вполне вероятно, что инфекция плода должна произойти до развития иммунокомпетентности плода, которая происходит у поросят в период приблизительно от 70 до 80 дней беременности. В этом исследовании плоды как на 45, так и на 62 день беременности были восприимчивы к инфекции дивергентным пестивирусом, что приводило к СТ у большинства инфицированных поросят. Выбор этих двух временных точек гестации был основан на приблизительной виремии этого пестивируса на основе CSFV, имевшего место до развития иммунитета плода (45 день беременности) и развития центральной нервной системы плода (62 день беременности). Утробные инфекции пестивируса у других видов в разные временные точки гестации имеют разные клинические результаты, включая репродуктивную недостаточность, врожденные пороки развития или иммунотолерантность, при которых хронически инфицированное животное может распространять вирус на протяжении всей жизни. В этом исследовании родилось несколько поросят, зараженных пестивирусом, с дисплазией тазобедренного сустава. Это состояние обычно наблюдается у свиней; однако патогенез и этиология в настоящее время активно обсуждаются. Роль, если таковая имеет место, пестивируса в развитии дисплазии тазобедренного сустава, репродуктивной недостаточности у свиноматок или способность утробной инфекции давать хроническую инфекцию у животных, требует дополнительного исследования.
В целом, клиническое заболевание, воспроизведенное в настоящем описании, имитирует естественные вспышки заболевания с изменением распространенности СТ среди пометов и тяжестью клинических симптомов в пометах. Вирусная РНК была обнаружена у всех поросят с СТ. Более того, вирусная РНК была обнаружена у 41
из 42 живых поросят, инокулированных пестивирусом. Из рожденных живыми поросят, инокулированных пестивирусом, у одиннадцати не было СТ на DPF 2 или DPF 0 (95), и вирусная РНК была обнаружена у всех зараженных пестивирусом непораженных поросят, кроме одной (95) . Тем не менее, механизм дисфункции центральной нервной системы у большинства поросят, но не у всех инфицированных поросят, в настоящее время неизвестен. Экология и патогенез взаимодействия с хозяином-вирусом на данный момент не определены, но озадачивают. Исследование роли хронической инфекции или дисфункционального иммунного ответа в клиническом выражении СТ и механизма дисфункции центральной нервной системы является оправданным. Литература, касающаяся механизмов треморных расстройств у людей и животных, ограничена, несмотря на высокую распространенность и важность такой симптоматики в медицине и ветеринарии.
В этом исследовании был идентифицирован недавно описанный дивергентный пестивирус свиньи у поросят с СТ и в непораженных когортах и использован этот вирус для воспроизведения СТ путем разработки инновационной методики инокуляции. Успешная разработка методик выделения вирусов, специфических анализов с антителами, методик детекции in situ и усовершенствованные молекулярные инструменты, несомненно, приведут к лучшему пониманию патогенеза и эпидемиологии этого вируса.
ПРИМЕР 3
Целью этого исследования является оценка эффективности пестивирусной вакцины при введении пестивируса наивным или серонегативным самкам.
План исследования
В этом эксперименте было использовано 10 самок. Самок
рандомизировали на три группы. Животных 1-ой группы (п=4)
вакцинировали на DO и D14 с помощью прототипные пестивирусной
вакцины непосредственно перед или вскоре после скрещивания.
Животные 2-ой группы (п=4), вакцинировали плацебо прототипной
вакциной. Животные 3-ей группы (п=2) оставались
невакцинированными (строгий контроль). Животные в каждой группе находились в отдельных комнатах. Примерно через 42 дня
беременности самок групп 1 и 2 заражали пестивирусом таким путем, как внутривенная, внутримышечная, интраназальная, внутривагинальная или внутриматочная инокуляция. Следуя задаче, у самок ежедневно контролировали клинические симптомы на протяжении всего исследования. Дважды в неделю на протяжении беременности собирали образцы сыворотки, фекалий и брали мазки из носа. Примерно через 8 0 дней беременности всем свиноматкам проводили ультразвуковую оценку. Во время опороса поросят визуально оценивали на наличие клинических симптомов. Для обнаружения пестивируса собирали сыворотку, пуповинную кровь и плаценту. Поросят обрабатывали и делали видеозаписи. Поросят оставляли со свиноматкой. Поросят, достигших возраста 24 часа, визуально оценивали на наличие клинических симптомов и фиксировали на видеозаписи. Поросят подвергали эвтаназии в возрасте 48 часов. Перед эвтаназией поросят визуально оценивали на наличие клинических симптомов и делали видеозапись. Отобранные ткани и кровь собирали во время вскрытия. Образцы подвергали скринингу на наличие РНК пестивируса и антитела против пестивируса.
Таблица б. Организация эксперимента
День исследования
День события
TBD
- Самок доставляют в ISU
- Оценка самок
DO- D14
- Кормовая основа для всех самок
- Ежедневные клинические наблюдения
вводящее вакцину по настоящему изобретению и осуществляющее контроль, не было одним и тем же лицом, ответственным за клиническое наблюдение и взятие образцов у исследуемых животных. Лабораторные испытания были такими же, как описано в примере 2. ПРИМЕР 4
Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы определить возможность индукции серологического ответа, специфичного для пестивируса, после введения инактивированной цельной вирусной вакцины. В частности, наивные животные
подвергались внутримышечной инъекции концентрированного инактивированного вируса и оценивались с помощью серологического ELISA до и после вакцинации.
Был обнаружен новый вирус наиболее близкородственный с пестивирусом летучих мышей с помощью технологии глубокого секвенирования в нескольких случаях исследования вспышек заболевания. Клинический анамнез этих случаев включал врожденный тремор (2 случая), анемичных поросят (1 случай) или поросята с прогибом в спине, что, как считается, связано с PCVAD (1 случай). На основании полученных данных был разработан кПЦР, а распространенность идентифицированного вируса была определена в двух наборах образцов, собранных в Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory (ISU VDL). Было обнаружено, что предполагаемая распространенность составляет 7,3% (8/110) в наборе гомогенатов легких и 5,2% (13/252) в наборе клинических образцов случаев с полисерозитом в анамнезе. Дополнительные образцы двух ферм с клиническим анамнезом врожденного тремора были собраны в сотрудничестве с преподавателем ISU VDL (д-р Паулу Арруда). Эти образцы были использованы для инокуляции свиней и была получена сыворотка, содержащая высокие уровни вируса (пример 1). В последующем исследовании было показано, что внутриматочная инокуляция сыворотки беременным самках привела к высокому проценту свиней, рожденных с врожденным тремором (пример 2) . Благодаря способности пестивируса вызывать клиническое заболевание, существует интерес в разработке вакцины. В это исследование была включена обычная инактивированная вакцина.
Обычная инактивированная вакцина включена в исследование. Кроме того, в исследование включен вирусный вектор. Поскольку использование живых вирусных векторов для экспрессии соответствующих антигенов является ключевым компонентом стратегии Lead2Grow, это исследование обеспечит оценку вектора у свиней. В этом исследовании использован аденовирусный вектор собак (CAV-2, лицензированный для использования в Solo-Jec CAV-2), экспрессирующий белок Е2 пестивируса. Вектор является репликационным компетентным вектором, и по-видимому, вызывает
обширный длительный иммунный ответ. В качестве контроля конструкции включена дополнительная конструкция CAV, экспрессирующая ген НА гриппа А. Критерии включения животных
Поскольку исследование проводилось на животных, родившихся в условиях BSL2, и серологические анализы в настоящее время недоступны для пестивируса, то предварительный скрининг образцов сыворотки не проводился. Только свиньи, здоровые во время вакцинации, были включены в исследование. Если во время вакцинации исследователь замечал нездоровое животное, то этих животных не вакцинировали и подвергали гуманной эвтаназии.
Уход за животными
Всех животных размещали в вивариях при Sioux Center, IA, на протяжении всего исследования. Животных вскармливали на коммерческом рационе, который соответствовал их размеру, возрасту и состоянию в соответствии с приемлемыми методами животноводства в данном регионе (могут быть включены антибиотики) . Вода была доступна ad libitum. Пол и место для корма удовлетворяли требованиям, изложенным в соглашении "Guide for the Care and Use of Agricultural Animals in Agricultural Research and Teaching", третье издание, январь 2010.
Никакие другие биологические или фармацевтические продукты не вводились испытуемым животным без предварительного одобрения с помощью монитора исследования.
Критерий удаления после включения
Любое умирающее животное подвергалось эвтаназии по усмотрению наблюдающего ветеринара/исследователя. Умирающее животное определяли как животное, которое отказывается от еды или питья или сильно обезвожено из-за тяжелых клинических симптомов. Любое животное, которое погибло или подвергалось эвтаназии в течение всего периода исследования, вскрывалось ветеринаром. Вскрытие проводили, как описано ниже. Наблюдатель и исследователь консультировались для определения того, были ли данные от удаленных исследуемых животных включены в анализ данных и окончательный отчет.
Уход за животными
Все животные были подвергались гуманной эвтаназии, учитывались и утилизировались путем сжигания в конце исследования. Все процедуры были выполнены, как описано для SOP.
Организация эксперимента
Общее описание
Этот эксперимент был разработан для оценки серологического ответа прототипных пестивирусных вакцин у обычных животных. См. таблицу 8 ниже для объяснения экспериментальных групп.
Во время отъемки шесть животных в возрасте б недель рандомизировали в 1-ую и 2-ую группу, и им вводили дозу 2 мл либо вакцины, либо плацебо в соответствии с таблицей 8. Животных рандомизировали и объединяли в отдельные клетки в одной комнате. Животные в 3-ей группе были соединены в отдельной комнате. Общие наблюдения за состоянием здоровья регистрировали на протяжении всего исследования, и никаких побочных реакций не наблюдали. Примерно через 14 дней после вакцинации сыворотку собирали и выдерживали при 4°С до завершения обработки для серологической оценки. Бустерную вакцинацию идентичных материалов вводили через 21 день после первичной вакцинации. Сыворотку животных собирали через 13 дней после бустерной инъекции (день 34).
Образцы сыворотки анализировали на наличие сероконверсии, когда анализы стали доступны. Пероральные образцы, мазки носа и фекальные мазки собирали у свиней ежедневно в группе 3 с DO по D7. Образцы анализировали на наличие живых CAV. Места инъекций наблюдали на реакции в течение минимум трех дней после введения вакцины. Животным проводили эвтаназцию в конце испытания. См. таблицу 9 ниже, чтобы ознакомиться с подробностями исследовательских мероприятий и конкретными деталями процедуры. Таблица 8. Организация эксперимента
Групп а
Комната
(поросята)
Вакцинотерапия (б и 9 недель после опороса)
Доза/спосо б введения
Вакцина с прототипом инактивированного пестивируса
2 мл/IM
Плацебо (забуференный фосфатом физиологический раствор+12,5% эмульсиген D)
2 мл/IM
Прототипная вакцина Pesti-CAV-2
2 мл/IM
Супернатант из инфицированных клеток SK6 концентрировали в 10 раз путем ультрацентрифугирования и инактивировали 5 мМ раствором BEI в течение б часов при 37°С. Вакцина была приготовлена с 12,5% эмульсигеном D, хранящимся при 4°С до времени введения. Свиньи в группе 2 получали плацебо-материал (забуференный фосфатом физиологический раствор+12,5% эмульсиген D) . Дозу 2 мл соответствующей вакцины вводили в мускулатуру шеи с использованием соответствующего размера стерильных иглы и шприца.
Вакцинация
Перед введением любого вакцинного материала исследователь или сотрудник изучали общее состояние всех животных и включение в исследование. На DO и D21 дозу подходящей вакцины в объеме 2 мл вводили либо в мускулатуру шеи, используя иглу и шприц подходящего размера, стерильную иглу и шприц, либо вводили в нос (1 мл в ноздрю), используя стерильный шприц и канюлю. Для инъекций IM использовали мышцы правой стороны шеи для инъекций на DO, а мышцы левой стороны шеи для инъекций на D21. Номер лота, количество дозы, идентификационные номера животных и сроки введения вакцинного материала были задокументированы в записи подтверждения вакцинации.
Клинические наблюдения
Во время вакцинации животных ежедневно оценивали, используя обычную форму наблюдения за состоянием здоровья. Участки мест инъекции контролировались в течение как минимум трех дней после вакцинации. Если на участках в местах инъекции были обнаружены повреждения, то эти участки наблюдали до тех пор, пока повреждение не прекращалось или до окончания исследования.
Сбор крови
На даты взятия проб крови исследователь или назначенное
лицо собирали от трех до девяти мл венозной цельной крови через переднюю полую вену. Использовали стерильную иглу размером 18-20дхот 1 дюйма (2,54 см) до 1,5 дюймов (3,81 см) VACCUTAINER(r), держатель иглы VACCUTAINER(r) и пробирки сывороточного сепаратора соответствующего размера (SST). Кровь на льду отправляли в течение ночи в IVI Biological R &D в Ames, Iowa, в день сбора, если она была собрана с понедельника по четверг. Если сыворотку собирали в пятницу или субботу, то сыворотку отделяли от кровяного сгустка центрифугированием и выливали в криогенный флакон с закручивающейся крышкой, указывая по меньшей мере номер исследования, день исследования и идентификационный номер животного. Обработанные образцы сыворотки хранили при -7 0°С и отправляли на сухом льду в Ames на следующий день отправки. В BIVI-Ames образцы сыворотки отслеживали с помощью электронной системы управления FreezerWorks. Образцы сыворотки в BIVI-Ames поддерживали при 2-8°С, если тестирование проводили в течение <48 часов после доставки, или поддерживали при -7 0°С, если их проводили позднее. Образцы хранили в течение как минимум шесть месяцев после завершения этого исследования. Образцы мазков
Материалы на льду отправляли в течение ночи в BIVI Biological R &D in Ames, Iowa. Если сбор происходил в выходные дни, то образцы замораживали при -7 0°С и отправляли на сухом льду на следующий день после взятия проб. Образцы в BIVI-Ames поддерживали при 2-8°С, если тестирование проводили в течение <2 часов после доставки, или поддерживали при -7 0°С, если их проводили позднее. Образцы отслеживали с помощью электронной системы управления FreezerWorks. Образцы хранили в течение как минимум шесть месяцев после завершения этого исследования.
Вскрытие
Если во время исследования имелось агонизирующее животное, то животное подвергали эвтаназии и вскрывали по усмотрению наблюдающего ветеринара. Для определения причины смерти собирали соответствующие образцы. Образцы могли быть отправлены в диагностическую лабораторию для подтверждения.
Во время некондиционного испытания животных подвергали глубокой анестезии по одному SOP, и у каждого животного собирали кровь в 1x250 мл бутылочку для центрифугирования (свободный сбор). Животное подвергали эвтаназии после SOP, и место инъекции пальпировали. Если во время вскрытия четко пальпировались реакции в месте инъекции, то брали образец (свежий и фиксированный). Если во время исследования у животного присутствовали клинические симптомы или имелись доказательства клинического заболевания, то животное вскрывали. Для определения причины смерти собирали соответствующие образцы. Образцы могли быть отправлены в диагностическую лабораторию для подтверждения.
Дезинфекция помещений, процедуры входа и обслуживания
Прототипные вакцины не считаются инфекционными для людей. При работе с животными носили перчатки, маски и одноразовые комбинезоны TYVEK(r). Сапоги и средства индивидуальной защиты (РРЕ) были отдельными для каждого помещения. При смене работы с животными 3-ей группы на работу с животными в 1-ой и 2-ой группах требовалась обработка душем. Не допускался перенос предметов или РРЕ между комнатами. Дезинфекция оборудования подробно описывалась, и описание помещалось в отчет исследователя.
Серологический ответ
Центрифугированную сыворотку абсорбировали из первичных
клеток легких свиньи, чтобы уменьшить фон твердофазного
ферментного анализа (ELISA). Пластины ELISA покрывали 300 нг
концентрированного инактивированного пестивируса.
Абсорбированную тестируемую сыворотку вакцинированных животных, животных плацебо, сыворотки реконвалесцентого положительного контроля и сыворотки наивных животных оценивали в двух повторах, данные представлены на фиг.7. Все сыворотки, собранные во всех группах, по данным ELISA на 0-й день (0D <0,15) были отрицательными. Через 13 дней после бустерной инокуляции инактивированного пестивируса у всех четырех животных наблюдался сильный серологический ответ, в то время как ни у одного из плацебо контроля значение не превышало 0,7 0D пороговой величины
для анализа. Используя критерий суммы рангов Уилкоксона, статистически значимое увеличение OD в вакцинированной группе по сравнению с плацебо (р-значение=0,004) указывало на специфический серологический ответ на пестивирус. ПРИМЕР 5
Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы выделить и продуктивно реплицировать новый пестивирус ex vivo. В частности, вирусная репродукция была достигнута в клетках, полученных из природных хозяев (свиньи), и их мониторинг проводили с помощью молекулярно-биологических методов.
Получение инокулята
Ткани инфицированных поросят из примера 2 собирали и взвешивали индивидуально, и добавляли минимальную необходимую среду, модифицированную SAFC, (MEM) до конечного значения масса:объем, равного 10%. Ткани диспергировали путем высокоскоростного встряхивания с металлическими бусами, осветляли микроцентрифугированием и фильтровали через фильтр 0,2 мкм. Дополнительно, собирали кровь от каждого умирающего поросенка, зараженного пестивирусом. Каждый тканевой гомогенизат и образец сыворотки анализировали на наличие и относительную концентрацию пестивируса, используя кПЦР. Образцы с наивысшим титром объединяли по типу образца терминальной сыворотки, гомогенатов селезенки и почек. Затем эти объединенные образцы использовали в качестве инокулята.
Инокуляция первичных тканей свиней
Попытки вырастить вирус осуществляли, используя инокулят, как описано выше, как на первичных эмбриональных легких, так и на первичных эмбриональных культурах клеток почек свиньи. Культуры первичных клеток получали из тканей, собранных у свиней, перенесших кесарево сечение и не получавших молозиво (CDCD).
Инокулят разбавляли равным объемом MEM и стерилизовали, пропуская через фильтры 0,8 мкм/0,2 мкм. Образцы дополнительно разбавляли либо 1:2, либо 1:10 перед инокуляцией в попытке удалить сыворотку или клетки-хозяева, вызывающие токсичность.
Культуральный рост осуществляли на ростовых средах (MEM с
10% облученной фетальной бычьей сывороткой и 2,5% 1 М HEPES). Через семь дней после культивирования материалы подвергали 3-циклам замораживания/оттаивания, а затем инокулировали на свежие клетки, обеспечивая инфекцию вирусом, в течение 1 часа при 37°С, 5% СОг при покачивании. Через 1 час инокулят удаляли и заменяли растительной средой. Пассажи проводили в течение 11 раундов на первичных клетках легкого и в течение 4 раундов на первичных клетках почек. Пороговые значения цикла для первичных клеток почек изменялись от 21,3 до 22,5, что свидетельствовало о продуктивной репликации. Пороговые значения цикла для первичного легкого также указывали на продуктивную репликацию вируса, и они суммированы в таблице 8.
Подобно первоначальным условиям инокуляции первичных клеток, иммортализованные клетки почек свиней (SK6) инокулировали путем добавления супернатанта первичной культуры легких с 11 пассажами (замораживание/оттаивание в течение трех циклов) и инкубировали в течение 1 часа при 37°С, 5% СОг при покачивании. Через б дней инкубации при 37°С 5% СОг материал пассировали в свежие клетки SK6 таким же образом. Нуклеиновые кислоты каждого пассажа экстрагировали после 14 пассажей и контролировали с помощью кПЦР. При последовательных пассажах пороговая величина цикла уменьшалась (см. таблицу 8) до ~17, что свидетельствовало о приблизительно 10-кратном увеличении
вирусного титра.
Инактивация вирусного урожая
Супернатанты из 11 пассажа клеток SK6 объединяли и концентрировали ~10-кратно высокоскоростным центрифугированием до вирусного осадка. Вирусный осадок ресуспендировали в ~1/10ых исходного объема инертном буфере (1хзабуференный фосфатом физиологический раствор). Концентрированный вирус инактивировали с использованием циклического бинарного этиленимина (BEI) с конечной концентрацией 5 мМ в течение б часов и при постоянном перемешивании при 37°С. По завершении инактивации BEI инактивировали раствором тиосульфата натрия (17% по объему) при инкубации при 37°С в течение 15 минут. Инактивированный пестивирус готовили с 12,5% конечной концентрацией эмульгигена D и использовали в качестве предполагаемой кандидатной вакцины в примере 4.
Все композиции и способы, раскрытые и заявленные в настоящем описании, в свете настоящего описания могут быть получены и выполнены без излишнего экспериментирования. Хотя композиции и способы по настоящему изобретению были описаны с точки зрения предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области будет очевидно, что могут быть сделаны изменения в композициях и способах, а также в стадиях или последовательностях стадий, описанных в настоящем описании, без отхода от концепции, сущности и объема изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что некоторые агенты, которые являются как химически, так и физиологически близкими, могут быть заменены агентами, описанными в настоящем описании, и при этом будут достигнуты одинаковые или сходные результаты. Все такие сходные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области, считаются находящимися в пределах сущности, объема и концепции изобретения, как определено в следующей формуле изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> (как в заявлении!!!)
Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Iowa State University Research Foundation, Inc.
<120> ПЕСТИВИРУСНЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВРОЖДЕННОГО ТРЕМОРА <130> 24152-0041WO1
<140> PCT/US2016/049709 <141> 2016-08-31
<150> US 62/212,124 <151> 2015-08-31
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11550
<212> ДНК
<213> пестивирус типа 2
<400> 1
cataatgctt taattggccg cattatgtgt gggacatcct aaatatttat gagccctgcg 60
gtgagtgggg gaaagaggtt aaccaggcct ctagtaccac aggcaccaat ggacagggca 120
actcaaacct gagagagagg taccgaactc ttaagccccg agtacggggc agacgtcacc 180
gagtagtaca cccaaagacc accacttcta ggtgtagggt ctactgaggc tcgggtggac 240
gtgggcgcgc ccaaagagaa atcggtggtg gacctggggg tcggggccac catgcccctt 300
tacggggtag accttactgc ttgatagagt gccggcggat gcctcaggta agagtataaa 360
atccgttgtt cattaacatg gaaaaacaga ttgcatatta cttaaaaaaa gaaaaacaaa 420
gaaatgggtg gacggaactg gtggtaggag aaagtcatac aaaaataacc acgctttctg 480
gaaagaccta tcgaggcacc tgggaaatgg agaaacggcc aaatccttat ggaacctatc 540
tccccagacc tagtccccaa cagcttacag ccctacaccc ccacccagtg gtgaattgta 600
aggtggttga gtacaaggag atggacccta attatggtga ttgcccaaat acgaacgggg 660
tgtttgttga cgaaaagggt agaaggctga gcagccctcc attaggcatt tggaagataa 720
gattggacta tagtgacttg gtaaacataa gcagaccaac ccccgctagt gggaaaaact 780
cttaccaagt tgagacctgc agtggggagc tggctacagt gacactggta cacaataggg 840
tgctcgtgga agattgcagg gggctatacc aatggaaacc caactgtgaa ggaattgtgc 900
tctatgtgaa aacttgttct gactgggcag atcaggtaga aaaacaggag aaagaaagcc 960
ccccaaaacc acagcggcca ccaaggcgag acccacgaaa agggttacaa ccacaagtcc 1020
ccaaagagac tgaggtcaca gaaaagaaga gacaacctag tgtcacctta gtatcggggg 1080
ggcagaaggc ccaagtcatc tacaaaggca ggaccaaaaa caaaaagacc ccggatggag 1140
tctatagata cccaggagct aaagaagggg acgtagtaaa ggtcaggaag atgctgaaga 1200
attggcatat agccttagtg atgtacctga tacatatcat aactccaggc cttgccaagg 1260
tccagtggtt cttaaaagat gaaaactcga cggggatcaa ccagatactg tggcaaagac 1320
agatcaacag atccttacat ggagaatggc ctaaccagat ctgccacggt atgcccaatg 1380
aaactatcac ggatgaggaa ttacgcagtc tgggaatggt agatacaagc cctagaacaa 1440
actacacctg ttgccagttg caatatcatg agtggaagaa acatggttgg tgcaactatc 1500
cacaaaaaca ggcgtggatc acgaggataa cggccctaca agctaacctt accgggcctt 1560
atgagggacc tgagtgcgcc gtcatctgcc gatttaacgg cagctacaac atcgtaaaac 1620
aggccagaga tgaggtgagt ccactgacag ggtgcaagga agggcatcct tttctattct 1680
ctggtgaaag atccgacacc tcatgcctaa ggcccccttc cactagttgg gtaagaccag 1740
tgaaaatgga cgaggcatca atggccgatg gctttgccca tggggttgat aaggcgataa 1800
tactaatcag gaagggggca tcaggaataa tcaatttcct agacactatt gggaggtggc 1860
taccggtagc tgaagcaact atagtaccat attgtgatac ttacactgtg acagggatgt 1920
atgtccatgt aaagaattgc ctccctagag ggttacctaa gcattcaaaa ataatctccc 1980
cgacaatgat atatctggga gaaggagacc cggcccataa tatccagcac ttatttggct 2040
caggtatagc aaagtgggtc ctagttctac tcgggattct gggtgagtgg tatggagaat 2100
tggcttccac aatatactta ctactagaat acgggtctga gtggttggaa catgaaagcc 2160
tggtcacgga agggttgatt cctggcatta atattacaat agaactccca gctagtcata 2220
cagtgcctgg ttgggtgtgg gtcgcaggcc agtgggtatg cgtgaagcca gactggtggc 2280
ctacacagat ttggattgaa accgtggtgg cagagacctg gcatatacta aaaatattgg 2340
cgtcagccct ggtgaacata gttgcagcgt tcgtaaacct ggaattggtt tatctggtca 2400
taatactagt caaaatatca aaagggaacc tgataggtgc catattatgg tgcttgttac 2460
tgtcaggcgc tgaaggctcg tgctacaaaa gacaagacta ttacaacacc caactagtcg 2520
tcgaagaaaa aacaggcgta gaaaaacgat ctataatggg caagtggacc gtgataacca 2580
gggaaggtcg ggagccaaga ttaatggagc aaataaatat ggtattgaat gatagcctgt 2640
cagaaaccta ctgctataat aggctaaaca ccagcacttg ggggcggcaa ccggcaagac 2700
aaagagggtg tggtcaaacc gtgccctatt ggcctggtga caatgttcta gaagaacaat 2760
actacagcac aggttactgg gtgaatgtaa caggcggttg ccagctgaga gaaggcgtat 2820
ggctatcaag aaagggtaac gtacagtgtc agcgtaacgg ctcatccttg atgctgcaat 2880
tggcgataaa agaagagaat gacactatgg aaataccatg tgacccagtg gaaactgaaa 2940
gtatgggtcc agttgcacag ggcacttgtg tgtacagctg ggcattcgcc ccaagagggt 3000
ggtactataa caggaaggat ggttattggc tccagtacat aaagaaaaac gactaccagt 3060
attggacaaa aatgcctact gcctcgtccg ccgcaaccat gtaccgccac ttgctcccct 3120
tactggtggc ctgcctcatg ggcggtagga tatcggtgtg gtttgtggca atgctcctgt 3180
ctctacaggt ggaagctagt gaagtaggca ctaaacaact ggctgtcacg ctaaccctgt 3240
ggaaaatgga ctggacagaa ctacttttct atattgtctt gatgctagcc gttaaggaag 3300
aacttataaa aaaaattgtg accgctagcc ttgtggcctt aaaaaatagt ccagtagcct 3360
tgagttttct tattgtactc agacttgtgg ggggcagtga agcactccca gtaggtttat 3420
tattagaaaa aatgtgcata gaccaaccgg agtttggaac tcctttcctg atctacctat 3480
gggacaactg gaagtggact gtgttagtca gcttctccgc actgaaccat gaaaaaacta 3540
taaaactggc aagaaaactg ttgttggcaa cacatataac agcgctcaca ttgactggct 3600
tgagtgattc aatcttctat atgatgctta taacaacaaa tttgttaata aagacattca 3660
tatacttgct gggggctagt atgaattggg tcgagagaga aaaaaagaaa ttgctagtga 3720
agaggagact aatatacaag aaagccgtta cttgcagtca ggatgagaat gtattggaga 3780
ataaattcaa caagataact gtaaacgcgg atttcacccc atgcaagctt gaacttctac 3840
aattacttag ggctttttta gtctctttgt gtttttccta ctacaaacct ctcctgtatg 3900
cagagactac cttaactgta atagtaattg gcgtacaaga gtacaacgta gccatggccc 3960
gcgggcgaag tgtggtccac aggctactag ccatggccta ttacatatac ggccgcatac 4020
agggtgacat gttccagctc gccactatcc agtgcctgct gtcgagtccg aggaaaatta 4080
tgaaacacat ggtagagaat ccaactctca agaagctctg gcaaggcgaa acagaactct 4140
tcaaccaggg tgttagtcaa tccaagatag tgaatccaaa gaaaattggg ctggaagaat 4200
tacacaaggg catgtgtggc ctcccaacag tagtgcaaaa tttggtcata tatgcaaaga 4260
agaatgactc tcttatttta ggagagctgg gttacccccc tggggatctc accagtgatg 4320
ggtgggaaat tttaggtcct ggcagaatcc caaagatcac taacgtcgag tctgctaaga 4380
tggacttact ctccaaactt atgacctttc tggggattga aagctcgagg gtccccagga 4440
ccccagtcca ctcaacaagg aaattattga agatagtaag gggcttggaa acaggatggg 4500
ggtacactca cgcagggggg ataagtagcg caaaacacgt tacaggtgaa aagaacttaa 4560
tgacccacat ggagggtagg aagggaaaat atatcctaca atctcaagaa catggtgctg 4620
acgaggtaga gtacggagta aaaactgatc aaaaagctcc cgacaatgcc ttatgctact 4680
gttttaaccc tgaagctaca aacataaaag gagagacggg agccatggtg ttcatgaaga 4740
agataggaaa aaagtggact ctcgtaacat cagacggcaa taaagcctat tataatgtaa 4800
acaatttgaa agggtggtct ggactaccaa taatgctgca ctccaccggg gccatagtgg 4860
ggaggattaa atcagcgtat tcagatgaaa acgacctggt ggaggaactt attgactcta 4920
gaactattag taagagcaat gagacaaacc tggaccacct tatcaaggaa ttggcagaca 4980
tgcggagggg ggagttccgc tcaattaccc ttggaacggg agccgggaaa accacagaac 5040
tgcctaggca atacctcaca acagtaggtg cccataaatc cgtgctggtc ttagtcccct 5100
taaaagcacc tgctgaaagt gtttgccgct ttatgaggtc taaataccct accatcaact 5160
tttccttaag agtgggggaa cggaaagagg gagatgtgag cagcggcatc acctacgcta 5220
cttacggatt ttgctgccag ctaaacctag tccaacttaa agaatggata tccaggtact 5280
caatggtttt ttttgatgaa tatcacacag caactccaga acaaatagcc ataataagca 5340
agattcatgc actgaaagtt aagaccagga tagtggctat gtcagcaacc cccccgggta 5400
ccgtgacgac tgaaggcagg aagtttgaca ttgaagaggt aggggttgct accatagaga 5460
aaggagagga accaaaaagg gggcgcatag cggtcgctgg tatgcaggtc ccattagaag 5520
acttaacagg aaagaactgc ctggtgttcg tggcaaccaa agaagccgcg gagacggagg 5580
ctaaagaact gcgcaccaga ggaattaacg ccacctacta ctattcaggt atagacccta 5640
agactctgga acatgggatg accaatcagc catactgtat tgtagctacc aatgccattg 5700
aatcaggtat aacctgtcct gacttggatg tggtcataga caccatgcag aagtacgaaa 5760
aagtagtgaa tttctcggca aagatgccct tgattgtcac ttcattagta aagaaaaaaa 5820
tcaccaggga agaacagggc cagaggaaag gtcgagtggg caggcaaaag aaaggaaaat 5880
actactaccc ctcgggggtg gtaccgaatg ggtcaaaaga cctaagctat ttaatcctac 5940
aggcccaaga atatggtgtc ttggaacaag tcaatataac agagtacttc atcataatga 6000
atgaggactg gggtctctat gacgtagatg aagtagaagt gagaatactt gagagaatga 6060
acaaggaaat cttgctacca ctaggtattg tggagaagca aatcttggaa agaagtactc 6120
acccggaaaa agtggcactg ttgtataaca aattagtgca gaaaaatcct atagtatacc 6180
ctagagtaca ggaaggtgag gtcagcaagg aatacaatac ctataatctg gccgtatatg 6240
acaagctaaa agatgtcaac ccacaagcca tttatgttct agcagaagag gagagagcca 6300
cagaaatgat gggtctcgag tttgaacaag acccatctga cttacaggat tcggtagttc 6360
agctttgtga agatatcaag aggtatacaa aactctctgg gatcactgag aaactgctag 6420
taggtacgat ggtggggtat attggataca aagccttaac cagaaaccac gtgccctggg 6480
tcagcaaaga gtattgttat gagctgaccg attcaccgga tacttacgaa aactcattcg 6540
cacctttgga cgtcgacgtc caaaactccg gtgaaggaaa acacccagag caactggcag 6600
accatcaatt gaggcaacta ctggagactg ggagagacaa ggcaattgat ttcctaaaag 6660
gaatccgcga gttcactagt ggggccataa acagtccaaa ggcactaagt atatgggaga 6720
aaatatatca gtatttgaag aagcatcagg gcgagatcat ctcatcagca gcgtggggca 6780
gtgcgacggc ccttcacgac agtattaaat ctagactagg agatgaggtc gctactgcag 6840
taataatcct caagtattta gcatttggtg aaagagaact gtctgggcta actaggcaag 6900
ttctaattga catcatagta tattatatag ttaacaagcc ccggttcgaa ggagacgact 6960
acgcaaagag aaaaggaaga aggctagtca tcgaagtcct gatgggggca ctggcgactt 7020
atgcggtgtc caatttttgg ggtgtgtcca ttaataagat actgcaacca atttctgatt 7080
atctacccta tgccaccgcc actttggctt ttcttcgccc aaccttcatg gaatcagcag 7140
tggtggtcgc ttcctctatc tatagagctt ttctctccat taagcatgcg gaaaacagga 7200
gtcttgtcac gcaggtcgct tctgccgccc tcgaagtcat gggcctgacc ccagtatcgg 7260
ctggcctagg cgtcttgctg gggcttgggt tgtgtgtgct ccatatgaac attgacaaga 7320
atgaggagaa aaggacactt atactgaaaa tgtttgtcaa aaactttata gaccaggcgg 7380
cactagacga gttggataaa ctggagccag aaaaaataat cctctcattg ttggagggta 7440
tccaaacctg cacaaacccg attagagcaa tcatgatttt gtacagggtg tactacaagg 7500
gagaaacttt cacagaagct ttgtctaaga tggccggcaa gtctctcatt gtgatggtca 7560
tagtcgagtt cctggaattg acaggccaaa cccaaggagg gtatatagat cttagtgcta 7620
atttgctgac ctttctcctc gagaaactaa aaaaaatgac taacctcgcc atcggggaag 7680
ctagaaaggt cttgctcccc atcccatact tgtactgtga aacctggcag tctgacgcca 7740
gaatcaaggc ccctgaatcc tacgaccaag tggtagtgga atgcaaatgt ggcgcttcag 7800
cgaggtattc cttccgcgat ggagttcatg agatattgga agaaaaaagg actaattggt 7860
gcaagaactt cttcttatgg ggacccaact tccacaatcc ggatccaaaa aggatgacat 7920
tctatgaata cggccaagca aaaaagtgtc ctgttatcat aattggtgaa gacataacct 7980
tcggcaaata tggcatatat atcaaatttg gccataggcc tgatggaggg aggttaataa 8040
ggggtaccac ccacgctact atcagtaggg aggaattgct ggaaatccta acagccccaa 8100
gccaagtggc cataggcaag gtcaagctaa ccgattactg taatcaaaaa ggaataatag 8160
acaggaaatt ggccgtactt gaaggtgaca aaatacattt ttggaaagca caccgtggat 8220
ccaaaatcac agaccaactc actattgaga atctgacaga tgatttgggg tcagaaatca 8280
gggacatcac atgggagctg tacacaggtg gaacgtgcac cgtaaaaggg gtgtccctta 8340
gatcatgcgc accaggtcat agaactaagg ctatggtctt gtgtgattgc actgatgtgc 8400
ttagcccctg ttacctaata aacggcagga gaccatcccc atttgacgtc gcggaaggtt 8460
atgaatgtca ccaccggaag ccccgagcga cgtatgaaga cctagaaatg gaggaaatac 8520
taaagagacg agtccctgtc tacgatcctc tgtgtttgtt tgacactgat agtaaactgc 8580
tacctcccga cacctactac ttggaagaag atcaagagga ctttgagtac gcattgagat 8640
gctggggcct cggggtttat gtagcagacg ggcctgtcac ttcccccccg gacataagaa 8700
tacaccatag ttcggtatta ctactgctga cacctggagt aaactcagag ttgcccttac 8760
agtacatacg ttgttaccct catcaggcag aggtggacat ctacattagg agtcagcttt 8820
tggaggagga agacactgct acggaggtgg aaggctccca ggaagatggt gatgaaggga 8880
tgggcgatgc tagaagagga aagaaagata cacacagagt tgaaacattt ccatagctga agctggccca aggggagagg tcttagccaa ggagaattgc aagtaaatgg caataatgac ccggctctaa tcccagggtt gaaataccta ccccaggttt ttgacgtcac caaaaaatga agaaaccacg tgtataagtg tctttgaaat tcagcttcga ggcggataca ccatgatgga agcgcggatc tgttggtagc ggatccacgt ttgctgaaaa gagcgagcct tcagagtcca gcaaaatgag aggtggcatt ggtaatagag ggaagggggc cgccagccat ccaaattatg gtttggggtc cctccccgta agggaacatc cgacccaatg ggacgtgaag tgaggtcaga gaggaaattg ctcaatagga gttcagacag acatgaaaag tgaggaagta ctttgaaaaa aatccaagag gaaaagagat tgtgatacag ggtgaagcaa atttgaaaaa caccagagcc gaaatactat ggaagtgcct cggacagcct tttctctgaa ctgtggtgac aggtgttcct aaaggtaacc aacaccaaac taccaggctg cgcatatcta gatgaggata gaagagccaa cttaaactaa ctagatggga tatagaatag gctacccaac gccccggtcc acggcattcg gtgaacaccc gcgtcggaac attagagagg attagactag tcaatcttag atgtgggcag acttatcttg gaaagctcaa attgaaaaag gtgcttgatg taccctgagg aagcctatag gtcagtgcag tgggacactc tacaaaaaaa gtaatcactg gatacctcag tccacaaatc gacggtttct ctgttagctg agcaactttg atcaggtgga ggtgagggtg ctgatgtacc catcgtccac tcacctatgt atgactggat cagtgagagt aaaactccct cgccccaggg aacctgcagc aagccttatc gcagggcgca tgacattaaa aaaccaacat aaaaactgcc aaaaaatgga cgttcctggc aattagaggc taggagaagt gcaaccactt attggttgtc cagtcacccg tgattcccgg attgggctca aagtaacaag aatattggaa tagaaggaga caggcaattc tgcccatagc taatcacaga catttggcaa acggaataga tgccagcgag ccaccaggtc cctggaaccc aacagaatca ggtcataagg cagtgaaaac cacaataaaa ggaagcaatg gccagtctat gaattattac agtcttgcgg ggttttttta atgcttaccg ccccaaccaa agtggttaga taagtatgaa aactgccagg cggaatcaat gctggaaaaa atactatgaa agaggatttc gttggccatc ttatgaggga gttcaaaaat agaagacctc gttcattgac tatgttcctc catgctaaat ggctgcctgg atcggaatta accccaaaaa gttttgtagt accaacagca gggagaagaa gctggtcagg atacccccac ggattacaag atttcagagc gagggcaaag tttaaagaga acggctaaag ggaatgatag tcacaaaaag aataaagtca atacttggca aggttggcat gcaaacactt aatgaacaag caagatttaa cggaaaggag aaagaaaaaa acagccatgc gtcacttata accaaaataa aaaaccccga ccggtagccg aggctggtag aatttgacag agagttggac gtgctgacta aaggcctgtc gggaggaagt attacagagg cataccccta acaatcctag tacgaaaaac agaatcagcc
8940 9000 9060 9120 9180 9240 9300 9360 9420 9480 9540 9600 9660 9720 9780 9840 9900 9960 10020 10080 10140 10200 10260 10320 10380 10440 10500 10560 10620 10680 10740 10800
tcctattgtt gggtgaagta aggatgtagg tagggatttg agaaaagcaa atgacccggg gaaggaaacc agagattttc attaagtggg aaataaagta ccccccttca aatggagtaa tgacgacctg
<210> <211> <212> <213>
<400> 2
Met Glu Lys 1
Gly Trp Thr Leu Ser Gly
35 atcgactact tgttggggac ccatgttgat gaaaccaaag ttgtgtggta gataggagtg tgaactcacc aaagtacatt gggcactcat tataactgaa ctaggcgcct tacgggtaac tataggtccg gacccaatgg cctatcgctg caaccgcagt acaagtcagc cgtgctgact gctcaggtca aatgtaattg tttcagaaaa ttaaattata aggggcaagt caaccccatg aaacttatag atctgatatc ggaaagagga catacaggga tatcccggat ggctagtcga ccctgataaa ttcgtaggtg tagaagatga tgaagttcat accagtatct ggccgtatag taccatgggg gccagtattg aaccccatgc tgtatggggg gaactatagc acagtgttgt gaaaaaggtc ggaagagctt tatcttccta gcagagaatg ggtaagtata gctggggtga ttgttgtaaa ccccatttgc tccgatgagg cacaaattag atgacttact cgtctggccg aagatcactt gagtggacca gtcctgtgga ttcgcccctt agatttgtgt tcgccgcacc tacttgaatg tttatagtgg
10860 10920 10980 11040 11100 11160 11220 11280 11340 11400 11460 11520 11550
Asn Pro Tyr
Ala Leu His
Glu Met Asp
Gly Thr Tyr Leu Pro Arg Pro Ser Pro Gln Gln Leu Thr 55 60
Pro His Pro Val Val Asn Cys Lys Val Val Glu Tyr Lys
70 75 80
Pro Asn Tyr Gly Asp Cys Pro Asn Thr Asn Gly Val Phe
85 90 95
Val Asp Glu
Lys Gly Arg Arg Leu Ser Ser Pro Pro Leu Gly Ile Trp
100 105 110
Lys Ile Arg Leu Asp Tyr Ser Asp Leu Val Asn Ile Ser Arg Pro Thr
115
120
125
Pro Ala Ser Gly Lys Asn Ser Tyr Gln Val Glu Thr Cys Ser Gly Glu
130 135 140
Leu Ala Thr Val Thr Leu Val His Asn Arg Val Leu Val Glu Asp Cys
145 150 155 160
Arg Gly Leu Tyr Gln Trp Lys Pro Asn Cys Glu Gly Ile Val Leu Tyr
165 170 175
Val Lys Thr Cys Ser Asp Trp Ala Asp Gln Val Glu Lys Gln Glu Lys
180 185 190
Glu Ser Pro Pro Lys Pro Gln Arg Pro Pro Arg Arg Asp Pro Arg Lys
195 200 205
Gly Leu Gln Pro Gln Val Pro Lys Glu Thr Glu Val Thr Glu Lys Lys
210 215 220
Arg Gln Pro Ser Val Thr Leu Val Ser Gly Gly Gln Lys Ala Gln Val
225 230 235 240
Ile Tyr Lys Gly Arg Thr Lys Asn Lys Lys Thr Pro Asp Gly Val Tyr
245 250 255
Arg Tyr Pro Gly Ala Lys Glu Gly Asp Val Val Lys Val Arg Lys Met
260 265 270
Leu Lys Asn Trp His Ile Ala Leu Val Met Tyr Leu Ile His Ile Ile
275 280 285
Thr Pro Gly Leu Ala Lys Val Gln Trp Phe Leu Lys Asp Glu Asn Ser
290 295 300
Thr Gly Ile Asn Gln Ile Leu Trp Gln Arg Gln Ile Asn Arg Ser Leu
305 310 315 320
His Gly Glu Trp Pro Asn Gln Ile Cys His Gly Met Pro Asn Glu Thr
325 330 335
Ile Thr Asp Glu Glu Leu Arg Ser Leu Gly Met Val Asp Thr Ser Pro
340 345 350
Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Gln Leu Gln Tyr His Glu Trp Lys Lys
355 360 365
His Gly Trp Cys Asn Tyr Pro Gln Lys Gln Ala Trp Ile Thr Arg Ile
370
375
380
Thr Ala Leu Gln Ala Asn Leu Thr Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Glu Cys
385 390 395 400
Ala Val Ile Cys Arg Phe Asn Gly Ser Tyr Asn Ile Val Lys Gln Ala
405 410 415
Arg Asp Glu Val Ser Pro Leu Thr Gly Cys Lys Glu Gly His Pro Phe
420 425 430
Leu Phe Ser Gly Glu Arg Ser Asp Thr Ser Cys Leu Arg Pro Pro Ser
435 440 445
Thr Ser Trp Val Arg Pro Val Lys Met Asp Glu Ala Ser Met Ala Asp
450 455 460
Gly Phe Ala His Gly Val Asp Lys Ala Ile Ile Leu Ile Arg Lys Gly
465 470 475 480
Ala Ser Gly Ile Ile Asn Phe Leu Asp Thr Ile Gly Arg Trp Leu Pro
485 490 495
Val Ala Glu Ala Thr Ile Val Pro Tyr Cys Asp Thr Tyr Thr Val Thr
500 505 510
Gly Met Tyr Val His Val Lys Asn Cys Leu Pro Arg Gly Leu Pro Lys
515 520 525
His Ser Lys Ile Ile Ser Pro Thr Met Ile Tyr Leu Gly Glu Gly Asp
530 535 540
Pro Ala His Asn Ile Gln His Leu Phe Gly Ser Gly Ile Ala Lys Trp
545 550 555 560
Val Leu Val Leu Leu Gly Ile Leu Gly Glu Trp Tyr Gly Glu Leu Ala
565 570 575
Ser Thr Ile Tyr Leu Leu Leu Glu Tyr Gly Ser Glu Trp Leu Glu His
580 585 590
Glu Ser Leu Val Thr Glu Gly Leu Ile Pro Gly Ile Asn Ile Thr Ile
595 600 605
Glu Leu Pro Ala Ser His Thr Val Pro Gly Trp Val Trp Val Ala Gly
610 615 620
Gln Trp Val Cys Val Lys Pro Asp Trp Trp Pro Thr Gln Ile Trp Ile
625
630
635
640
Glu Thr Val Val Ala Glu Thr Trp His Ile Leu Lys Ile Leu Ala Ser
645 650 655
Ala Leu Val Asn Ile Val Ala Ala Phe Val Asn Leu Glu Leu Val Tyr
660 665 670
Leu Val Ile Ile Leu Val Lys Ile Ser Lys Gly Asn Leu Ile Gly Ala
675 680 685
Ile Leu Trp Cys Leu Leu Leu Ser Gly Ala Glu Gly Ser Cys Tyr Lys
690 695 700
Arg Gln Asp Tyr Tyr Asn Thr Gln Leu Val Val Glu Glu Lys Thr Gly
705 710 715 720
Val Glu Lys Arg Ser Ile Met Gly Lys Trp Thr Val Ile Thr Arg Glu
725 730 735
Gly Arg Glu Pro Arg Leu Met Glu Gln Ile Asn Met Val Leu Asn Asp
740 745 750
Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Asn Thr Ser Thr Trp
755 760 765
Gly Arg Gln Pro Ala Arg Gln Arg Gly Cys Gly Gln Thr Val Pro Tyr
770 775 780
Trp Pro Gly Asp Asn Val Leu Glu Glu Gln Tyr Tyr Ser Thr Gly Tyr
785 790 795 800
Trp Val Asn Val Thr Gly Gly Cys Gln Leu Arg Glu Gly Val Trp Leu
805 810 815
Ser Arg Lys Gly Asn Val Gln Cys Gln Arg Asn Gly Ser Ser Leu Met
820 825 830
Leu Gln Leu Ala Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr Met Glu Ile Pro Cys
835 840 845
Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val Ala Gln Gly Thr Cys
850 855 860
Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp Tyr Tyr Asn Arg Lys
865 870 875 880
Asp Gly Tyr Trp Leu Gln Tyr Ile Lys Lys Asn Asp Tyr Gln Tyr Trp
885
890
895
Thr Lys Met Pro Thr Ala Ser Ser Ala Ala Thr Met Tyr Arg His Leu
900 905 910
Leu Pro Leu Leu Val Ala Cys Leu Met Gly Gly Arg Ile Ser Val Trp
915 920 925
Phe Val Ala Met Leu Leu Ser Leu Gln Val Glu Ala Ser Glu Val Gly
930 935 940
Thr Lys Gln Leu Ala Val Thr Leu Thr Leu Trp Lys Met Asp Trp Thr
945 950 955 960
Glu Leu Leu Phe Tyr Ile Val Leu Met Leu Ala Val Lys Glu Glu Leu
965 970 975
Ile Lys Lys Ile Val Thr Ala Ser Leu Val Ala Leu Lys Asn Ser Pro
980 985 990
Val Ala Leu Ser Phe Leu Ile Val Leu Arg Leu Val Gly Gly Ser Glu
995 1000 1005
Ala Leu Pro Val Gly Leu Leu Leu Glu Lys Met Cys Ile Asp Gln
1010 1015 1020
Pro Glu Phe Gly Thr Pro Phe Leu Ile Tyr Leu Trp Asp Asn Trp
1025 1030 1035
Lys Trp Thr Val Leu Val Ser Phe Ser Ala Leu Asn His Glu Lys
1040 1045 1050
Thr Ile Lys Leu Ala Arg Lys Leu Leu Leu Ala Thr His Ile Thr
1055 1060 1065
Ala Leu Thr Leu Thr Gly Leu Ser Asp Ser Ile Phe Tyr Met Met
1070 1075 1080
Leu Ile Thr Thr Asn Leu Leu Ile Lys Thr Phe Ile Tyr Leu Leu
1085 1090 1095
Gly Ala Ser Met Asn Trp Val Glu Arg Glu Lys Lys Lys Leu Leu
1100 1105 1110
Val Lys Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Lys Ala Val Thr Cys Ser Gln
1115 1120 1125
Asp Glu Asn Val Leu Glu Asn Lys Phe Asn Lys Ile Thr Val Asn
1130
1135
1140
Ala Asp Phe Thr Pro Cys Lys Leu Glu Leu Leu Gln Leu Leu Arg
1145 1150 1155
Ala Phe Leu Val Ser Leu Cys Phe Ser Tyr Tyr Lys Pro Leu Leu
1160 1165 1170
Tyr Ala Glu Thr Thr Leu Thr Val Ile Val Ile Gly Val Gln Glu
1175 1180 1185
Tyr Asn Val Ala Met Ala Arg Gly Arg Ser Val Val His Arg Leu
1190 1195 1200
Leu Ala Met Ala Tyr Tyr Ile Tyr Gly Arg Ile Gln Gly Asp Met
1205 1210 1215
Phe Gln Leu Ala Thr Ile Gln Cys Leu Leu Ser Ser Pro Arg Lys
1220 1225 1230
Ile Met Lys His Met Val Glu Asn Pro Thr Leu Lys Lys Leu Trp
1235 1240 1245
Gln Gly Glu Thr Glu Leu Phe Asn Gln Gly Val Ser Gln Ser Lys
1250 1255 1260
Ile Val Asn Pro Lys Lys Ile Gly Leu Glu Glu Leu His Lys Gly
1265 1270 1275
Met Cys Gly Leu Pro Thr Val Val Gln Asn Leu Val Ile Tyr Ala
1280 1285 1290
Lys Lys Asn Asp Ser Leu Ile Leu Gly Glu Leu Gly Tyr Pro Pro
1295 1300 1305
Gly Asp Leu Thr Ser Asp Gly Trp Glu Ile Leu Gly Pro Gly Arg
1310 1315 1320
Ile Pro Lys Ile Thr Asn Val Glu Ser Ala Lys Met Asp Leu Leu
1325 1330 1335
Ser Lys Leu Met Thr Phe Leu Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val Pro
1340 1345 1350
Arg Thr Pro Val His Ser Thr Arg Lys Leu Leu Lys Ile Val Arg
1355 1360 1365
Gly Leu Glu Thr Gly Trp Gly Tyr Thr His Ala Gly Gly Ile Ser
1370
1375
1380
Ser Ala Lys His Val Thr Gly Glu Lys Asn Leu Met Thr His Met
1385 1390 1395
Glu Gly Arg Lys Gly Lys Tyr Ile Leu Gln Ser Gln Glu His Gly
1400 1405 1410
Ala Asp Glu Val Glu Tyr Gly Val Lys Thr Asp Gln Lys Ala Pro
1415 1420 1425
Asp Asn Ala Leu Cys Tyr Cys Phe Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ile
1430 1435 1440
Lys Gly Glu Thr Gly Ala Met Val Phe Met Lys Lys Ile Gly Lys
1445 1450 1455
Lys Trp Thr Leu Val Thr Ser Asp Gly Asn Lys Ala Tyr Tyr Asn
1460 1465 1470
Val Asn Asn Leu Lys Gly Trp Ser Gly Leu Pro Ile Met Leu His
1475 1480 1485
Ser Thr Gly Ala Ile Val Gly Arg Ile Lys Ser Ala Tyr Ser Asp
1490 1495 1500
Glu Asn Asp Leu Val Glu Glu Leu Ile Asp Ser Arg Thr Ile Ser
1505 1510 1515
Lys Ser Asn Glu Thr Asn Leu Asp His Leu Ile Lys Glu Leu Ala
1520 1525 1530
Asp Met Arg Arg Gly Glu Phe Arg Ser Ile Thr Leu Gly Thr Gly
1535 1540 1545
Ala Gly Lys Thr Thr Glu Leu Pro Arg Gln Tyr Leu Thr Thr Val
1550 1555 1560
Gly Ala His Lys Ser Val Leu Val Leu Val Pro Leu Lys Ala Pro
1565 1570 1575
Ala Glu Ser Val Cys Arg Phe Met Arg Ser Lys Tyr Pro Thr Ile
1580 1585 1590
Asn Phe Ser Leu Arg Val Gly Glu Arg Lys Glu Gly Asp Val Ser
1595 1600 1605
Ser Gly Ile Thr Tyr Ala Thr Tyr Gly Phe Cys Cys Gln Leu Asn
1610
1615
1620
Leu Val Gln Leu Lys Glu Trp Ile Ser Arg Tyr Ser Met Val Phe
1625 1630 1635
Phe Asp Glu Tyr His Thr Ala Thr Pro Glu Gln Ile Ala Ile Ile
1640 1645 1650
Ser Lys Ile His Ala Leu Lys Val Lys Thr Arg Ile Val Ala Met
1655 1660 1665
Ser Ala Thr Pro Pro Gly Thr Val Thr Thr Glu Gly Arg Lys Phe
1670 1675 1680
Asp Ile Glu Glu Val Gly Val Ala Thr Ile Glu Lys Gly Glu Glu
1685 1690 1695
Pro Lys Arg Gly Arg Ile Ala Val Ala Gly Met Gln Val Pro Leu
1700 1705 1710
Glu Asp Leu Thr Gly Lys Asn Cys Leu Val Phe Val Ala Thr Lys
1715 1720 1725
Glu Ala Ala Glu Thr Glu Ala Lys Glu Leu Arg Thr Arg Gly Ile
1730 1735 1740
Asn Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ile Asp Pro Lys Thr Leu Glu
1745 1750 1755
His Gly Met Thr Asn Gln Pro Tyr Cys Ile Val Ala Thr Asn Ala
1760 1765 1770
Ile Glu Ser Gly Ile Thr Cys Pro Asp Leu Asp Val Val Ile Asp
1775 1780 1785
Thr Met Gln Lys Tyr Glu Lys Val Val Asn Phe Ser Ala Lys Met
1790 1795 1800
Pro Leu Ile Val Thr Ser Leu Val Lys Lys Lys Ile Thr Arg Glu
1805 1810 1815
Glu Gln Gly Gln Arg Lys Gly Arg Val Gly Arg Gln Lys Lys Gly
1820 1825 1830
Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ser Gly Val Val Pro Asn Gly Ser Lys Asp
1835 1840 1845
Leu Ser Tyr Leu Ile Leu Gln Ala Gln Glu Tyr Gly Val Leu Glu
1850
1855
1860
Gln Val Asn Ile Thr Glu Tyr Phe Ile Ile Met Asn Glu Asp Trp
1865 1870 1875
Gly Leu Tyr Asp Val Asp Glu Val Glu Val Arg Ile Leu Glu Arg
1880 1885 1890
Met Asn Lys Glu Ile Leu Leu Pro Leu Gly Ile Val Glu Lys Gln
1895 1900 1905
Ile Leu Glu Arg Ser Thr His Pro Glu Lys Val Ala Leu Leu Tyr
1910 1915 1920
Asn Lys Leu Val Gln Lys Asn Pro Ile Val Tyr Pro Arg Val Gln
1925 1930 1935
Glu Gly Glu Val Ser Lys Glu Tyr Asn Thr Tyr Asn Leu Ala Val
1940 1945 1950
Tyr Asp Lys Leu Lys Asp Val Asn Pro Gln Ala Ile Tyr Val Leu
1955 1960 1965
Ala Glu Glu Glu Arg Ala Thr Glu Met Met Gly Leu Glu Phe Glu
1970 1975 1980
Gln Asp Pro Ser Asp Leu Gln Asp Ser Val Val Gln Leu Cys Glu
1985 1990 1995
Asp Ile Lys Arg Tyr Thr Lys Leu Ser Gly Ile Thr Glu Lys Leu
2000 2005 2010
Leu Val Gly Thr Met Val Gly Tyr Ile Gly Tyr Lys Ala Leu Thr
2015 2020 2025
Arg Asn His Val Pro Trp Val Ser Lys Glu Tyr Cys Tyr Glu Leu
2030 2035 2040
Thr Asp Ser Pro Asp Thr Tyr Glu Asn Ser Phe Ala Pro Leu Asp
2045 2050 2055
Val Asp Val Gln Asn Ser Gly Glu Gly Lys His Pro Glu Gln Leu
2060 2065 2070
Ala Asp His Gln Leu Arg Gln Leu Leu Glu Thr Gly Arg Asp Lys
2075 2080 2085
Ala Ile Asp Phe Leu Lys Gly Ile Arg Glu Phe Thr Ser Gly Ala
2090
2095
2100
Ile Asn Ser Pro Lys Ala Leu Ser Ile Trp Glu Lys Ile Tyr Gln
2105 2110 2115
Tyr Leu Lys Lys His Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ser Ala Ala Trp
2120 2125 2130
Gly Ser Ala Thr Ala Leu His Asp Ser Ile Lys Ser Arg Leu Gly
2135 2140 2145
Asp Glu Val Ala Thr Ala Val Ile Ile Leu Lys Tyr Leu Ala Phe
2150 2155 2160
Gly Glu Arg Glu Leu Ser Gly Leu Thr Arg Gln Val Leu Ile Asp
2165 2170 2175
Ile Ile Val Tyr Tyr Ile Val Asn Lys Pro Arg Phe Glu Gly Asp
2180 2185 2190
Asp Tyr Ala Lys Arg Lys Gly Arg Arg Leu Val Ile Glu Val Leu
2195 2200 2205
Met Gly Ala Leu Ala Thr Tyr Ala Val Ser Asn Phe Trp Gly Val
2210 2215 2220
Ser Ile Asn Lys Ile Leu Gln Pro Ile Ser Asp Tyr Leu Pro Tyr
2225 2230 2235
Ala Thr Ala Thr Leu Ala Phe Leu Arg Pro Thr Phe Met Glu Ser
2240 2245 2250
Ala Val Val Val Ala Ser Ser Ile Tyr Arg Ala Phe Leu Ser Ile
2255 2260 2265
Lys His Ala Glu Asn Arg Ser Leu Val Thr Gln Val Ala Ser Ala
2270 2275 2280
Ala Leu Glu Val Met Gly Leu Thr Pro Val Ser Ala Gly Leu Gly
2285 2290 2295
Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Cys Val Leu His Met Asn Ile Asp
2300 2305 2310
Lys Asn Glu Glu Lys Arg Thr Leu Ile Leu Lys Met Phe Val Lys
2315 2320 2325
Asn Phe Ile Asp Gln Ala Ala Leu Asp Glu Leu Asp Lys Leu Glu
2330
2335
2340
Pro Glu Lys Ile Ile Leu Ser Leu Leu Glu Gly Ile Gln Thr Cys
2345 2350 2355
Thr Asn Pro Ile Arg Ala Ile Met Ile Leu Tyr Arg Val Tyr Tyr
2360 2365 2370
Lys Gly Glu Thr Phe Thr Glu Ala Leu Ser Lys Met Ala Gly Lys
2375 2380 2385
Ser Leu Ile Val Met Val Ile Val Glu Phe Leu Glu Leu Thr Gly
2390 2395 2400
Gln Thr Gln Gly Gly Tyr Ile Asp Leu Ser Ala Asn Leu Leu Thr
2405 2410 2415
Phe Leu Leu Glu Lys Leu Lys Lys Met Thr Asn Leu Ala Ile Gly
2420 2425 2430
Glu Ala Arg Lys Val Leu Leu Pro Ile Pro Tyr Leu Tyr Cys Glu
2435 2440 2445
Thr Trp Gln Ser Asp Ala Arg Ile Lys Ala Pro Glu Ser Tyr Asp
2450 2455 2460
Gln Val Val Val Glu Cys Lys Cys Gly Ala Ser Ala Arg Tyr Ser
2465 2470 2475
Phe Arg Asp Gly Val His Glu Ile Leu Glu Glu Lys Arg Thr Asn
2480 2485 2490
Trp Cys Lys Asn Phe Phe Leu Trp Gly Pro Asn Phe His Asn Pro
2495 2500 2505
Asp Pro Lys Arg Met Thr Phe Tyr Glu Tyr Gly Gln Ala Lys Lys
2510 2515 2520
Cys Pro Val Ile Ile Ile Gly Glu Asp Ile Thr Phe Gly Lys Tyr
2525 2530 2535
Gly Ile Tyr Ile Lys Phe Gly His Arg Pro Asp Gly Gly Arg Leu
2540 2545 2550
Ile Arg Gly Thr Thr His Ala Thr Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu
2555 2560 2565
Glu Ile Leu Thr Ala Pro Ser Gln Val Ala Ile Gly Lys Val Lys
2570
2575
2580
Leu Thr Asp Tyr Cys Asn Gln Lys Gly Ile Ile Asp Arg Lys Leu
2585 2590 2595
Ala Val Leu Glu Gly Asp Lys Ile His Phe Trp Lys Ala His Arg
2600 2605 2610
Gly Ser Lys Ile Thr Asp Gln Leu Thr Ile Glu Asn Leu Thr Asp
2615 2620 2625
Asp Leu Gly Ser Glu Ile Arg Asp Ile Thr Trp Glu Leu Tyr Thr
2630 2635 2640
Gly Gly Thr Cys Thr Val Lys Gly Val Ser Leu Arg Ser Cys Ala
2645 2650 2655
Pro Gly His Arg Thr Lys Ala Met Val Leu Cys Asp Cys Thr Asp
2660 2665 2670
Val Leu Ser Pro Cys Tyr Leu Ile Asn Gly Arg Arg Pro Ser Pro
2675 2680 2685
Phe Asp Val Ala Glu Gly Tyr Glu Cys His His Arg Lys Pro Arg
2690 2695 2700
Ala Thr Tyr Glu Asp Leu Glu Met Glu Glu Ile Leu Lys Arg Arg
2705 2710 2715
Val Pro Val Tyr Asp Pro Leu Cys Leu Phe Asp Thr Asp Ser Lys
2720 2725 2730
Leu Leu Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Glu Glu Asp Gln Glu Asp
2735 2740 2745
Phe Glu Tyr Ala Leu Arg Cys Trp Gly Leu Gly Val Tyr Val Ala
2750 2755 2760
Asp Gly Pro Val Thr Ser Pro Pro Asp Ile Arg Ile His His Ser
2765 2770 2775
Ser Val Leu Leu Leu Leu Thr Pro Gly Val Asn Ser Glu Leu Pro
2780 2785 2790
Leu Gln Tyr Ile Arg Cys Tyr Pro His Gln Ala Glu Val Asp Ile
2795 2800 2805
Tyr Ile Arg Ser Gln Leu Leu Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Glu
2810
2815
2820
Val Glu Gly Ser Gln Glu Asp Gly Asp Glu Gly Met Gly Asp Ala
2825 2830 2835
Val Ile Glu Asp Glu Asp Thr Ser Ser Thr Thr Glu Ser Ile Pro
2840 2845 2850
Pro Leu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Pro Ile Thr Tyr Val
2855 2860 2865
Val Ile Arg Gly Leu Gln Glu Glu Arg Tyr Ala Ser His Leu Lys
2870 2875 2880
Leu Asn Asp Trp Ile Ser Glu Asn Ile Ser Glu Pro His Arg Val
2885 2890 2895
Gln Ile Met Leu Asp Gly Thr Val Arg Val Thr Ile Lys Glu Gly
2900 2905 2910
Lys Val Lys His Leu Phe Gly Val Tyr Arg Ile Glu Asn Ser Leu
2915 2920 2925
Glu Ala Met Phe Lys Glu Thr Ile Ala Asp Leu Pro Val Ala Thr
2930 2935 2940
Gln Pro Pro Gln Gly Pro Val Tyr Thr Ala Lys Glu Leu Ala Gln
2945 2950 2955
Gly Asn Ile Ala Pro Val Gln Pro Ala Ala Asn Tyr Tyr Gly Met
2960 2965 2970
Ile Glu Gly Arg Gly Asp Pro Met Thr Ala Phe Glu Ala Leu Ser
2975 2980 2985
Val Leu Arg Ser Gln Lys Val Leu Ala Lys Asp Val Lys Val Asn
2990 2995 3000
Thr Arg Arg Ala Gln Val Phe Leu Asn Lys Val Arg Arg Ile Ala
3005 3010 3015
Glu Val Arg Ala Ser Glu Leu Thr Leu Lys Cys Leu Pro Ile Leu
3020 3025 3030
Gly Lys Val Asn Gly Arg Lys Leu Ile Arg Glu Glu Thr Asn Ile
3035 3040 3045
Pro Asn Gln Arg Leu Ala Ser Ile Met Thr Ser Ile Gly Ile Arg
3050
3055
3060
Leu Glu Lys Leu Pro Val Val Arg Ala Asn Thr Ser Gly Ser Lys
3065 3070 3075
Phe Arg Gln Ser Ile Leu Glu Lys Met Asp Lys Tyr Glu Asn Glu
3080 3085 3090
Gln Val Pro Gly Leu His Glu Lys Met Trp Ala Ala Phe Leu Ala
3095 3100 3105
Thr Ala Arg Gln Asp Leu Arg Asn Thr Tyr Glu Glu Val Thr Tyr
3110 3115 3120
Leu Glu Leu Glu Ala Gly Ile Asn Arg Lys Gly Ala Pro Gly Phe
3125 3130 3135
Phe Glu Lys Glu Ser Ser Ile Gly Glu Val Leu Glu Lys Lys Glu
3140 3145 3150
Lys Ile Asp Val Thr Ile Gln Glu Ile Glu Lys Gly Asn His Leu
3155 3160 3165
Tyr Tyr Glu Thr Ala Met Pro Lys Asn Glu Lys Arg Asp Val Leu
3170 3175 3180
Asp Asp Trp Leu Ser Glu Asp Phe Val Thr Tyr Lys Lys Pro Arg
3185 3190 3195
Val Ile Gln Tyr Pro Glu Ala Val Thr Arg Leu Ala Ile Thr Lys
3200 3205 3210
Ile Met Tyr Lys Trp Val Lys Gln Lys Pro Ile Val Ile Pro Gly
3215 3220 3225
Tyr Glu Gly Lys Thr Pro Ile Phe Glu Ile Phe Glu Lys Val Ser
3230 3235 3240
Ala Asp Trp Ala Gln Phe Lys Asn Pro Val Ala Val Ser Phe Asp
3245 3250 3255
Thr Arg Ala Trp Asp Thr Gln Val Thr Arg Glu Asp Leu Arg Leu
3260 3265 3270
Val Gly Arg Ile Gln Lys Tyr Tyr Tyr Lys Lys Lys Tyr Trp Lys
3275 3280 3285
Phe Ile Asp Asn Leu Thr Ala Met Met Glu Glu Val Pro Val Ile
3290
3295
3300
Thr Val Glu Gly Asp Met Phe Leu Arg Val Gly Gln Arg Gly Ser
3305 3310 3315
Gly Gln Pro Asp Thr Ser Ala Gly Asn Ser Met Leu Asn Val Leu
3320 3325 3330
Thr Met Leu Val Ala Phe Ser Glu Ser Thr Asn Leu Pro Ile Ala
3335 3340 3345
Ala Ala Trp Lys Ala Cys Arg Ile His Val Cys Gly Asp Asp Gly
3350 3355 3360
Phe Leu Ile Thr Glu Ser Glu Leu Gly Arg Lys Phe Ala Glu Lys
3365 3370 3375
Gly Val Pro Leu Leu Ala Ala Phe Gly Lys Pro Gln Lys Ile Thr
3380 3385 3390
Glu Gly Ala Ser Leu Lys Val Thr Ser Asn Phe Asp Gly Ile Glu
3395 3400 3405
Phe Cys Ser His Thr Pro Ile Arg Val Gln Thr Pro Asn Ile Arg
3410 3415 3420
Trp Met Pro Ala Arg Pro Thr Ala Thr Ile Leu Gly Lys Met Ser
3425 3430 3435
Thr Arg Leu Gly Glu Gly Ala Thr Arg Ser Gly Glu Glu Tyr Glu
3440 3445 3450
Lys Gln Val Ala Phe Ala Tyr Leu Leu Met Tyr Pro Trp Asn Pro
3455 3460 3465
Leu Val Arg Arg Ile Ser Leu Leu Leu Leu Ser Thr Thr Asp Pro
3470 3475 3480
Met Gly Lys Glu Glu Thr Pro Cys Ser Asp Glu Gly Val Lys Tyr
3485 3490 3495
Val Gly Asp Pro Ile Ala Ala Tyr Arg Asp Val Trp Gly His Lys
3500 3505 3510
Leu Glu Asp Val Gly His Val Asp Gln Pro Gln Leu Ser Arg Met
3515 3520 3525
Asn Tyr Ser Met Thr Tyr Leu Gly Ile Trp Lys Pro Lys Thr Ser
3530 3535 3540
Gln Arg Leu Val Glu Gln Cys Cys Arg Leu Ala Glu Lys Ser Asn
3545 3550 3555
Cys Val Val Arg Ala Asp Ser Leu Ile Lys Lys Lys Val Lys Ile
3560 3565 3570
Thr Tyr Asp Pro Gly Ile Gly Val Ala Gln Val Ile Arg Arg Trp
3575 3580 3585
Glu Glu Leu Glu Trp Thr Arg Arg Lys Pro Glu Leu Thr Asn Val
3590 3595 3600
Ile Val Glu Asp Asp Ile Phe Leu Val Leu Trp Lys Arg Phe Ser
3605 3610 3615
Lys Tyr Ile Phe Gln Lys Met Lys Phe Met Gln Arg Met Phe Ala
3620 3625 3630
Pro Tyr
3635
<210> 3
<211> 540
<212> ДНК
<213> пестивирус типа 2
<400> 3
atggaaaaac agattgcata ttacttaaaa aaagaaaaac aaagaaatgg gtggacggaa 60
ctggtggtag gagaaagtca tacaaaaata accacgcttt ctggaaagac ctatcgaggc 120
acctgggaaa tggagaaacg gccaaatcct tatggaacct atctccccag acctagtccc 180
caacagctta cagccctaca cccccaccca gtggtgaatt gtaaggtggt tgagtacaag 240
gagatggacc ctaattatgg tgattgccca aatacgaacg gggtgtttgt tgacgaaaag 300
ggtagaaggc tgagcagccc tccattaggc atttggaaga taagattgga ctatagtgac 360
ttggtaaaca taagcagacc aacccccgct agtgggaaaa actcttacca agttgagacc 420
tgcagtgggg agctggctac agtgacactg gtacacaata gggtgctcgt ggaagattgc 480
agggggctat accaatggaa acccaactgt gaaggaattg tgctctatgt gaaaacttgt 540
<210> 4
<211> 180
<212> БЕЛОК
<213> пестивирус типа 2
<400> 4
Met Glu Lys Gln Ile Ala Tyr Tyr Leu Lys Lys Glu Lys Gln Arg Asn
10 15
Gly Trp Thr Glu Leu Val Val Gly Glu Ser His Thr Lys Ile Thr Thr
20 25 30
Leu Ser Gly Lys Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Glu Met Glu Lys Arg Pro
35 40 45
Asn Pro Tyr Gly Thr Tyr Leu Pro Arg Pro Ser Pro Gln Gln Leu Thr
50 55 60
Ala Leu His Pro His Pro Val Val Asn Cys Lys Val Val Glu Tyr Lys
65 70 75 80
Glu Met Asp Pro Asn Tyr Gly Asp Cys Pro Asn Thr Asn Gly Val Phe
85 90 95
Val Asp Glu Lys Gly Arg Arg Leu Ser Ser Pro Pro Leu Gly Ile Trp
100 105 110
Lys Ile Arg Leu Asp Tyr Ser Asp Leu Val Asn Ile Ser Arg Pro Thr
115 120 125
Pro Ala Ser Gly Lys Asn Ser Tyr Gln Val Glu Thr Cys Ser Gly Glu
130 135 140
Leu Ala Thr Val Thr Leu Val His Asn Arg Val Leu Val Glu Asp Cys
145 150 155 160
Arg Gly Leu Tyr Gln Trp Lys Pro Asn Cys Glu Gly Ile Val Leu Tyr
165 170 175
Val Lys Thr Cys 180
<210> 5
<211> 333
<212> ДНК
<213> пестивирус типа 2
<400> 5
tctgactggg cagatcaggt agaaaaacag gagaaagaaa gccccccaaa accacagcgg 60
ccaccaaggc gagacccacg aaaagggtta caaccacaag tccccaaaga gactgaggtc 120
acagaaaaga agagacaacc tagtgtcacc ttagtatcgg gggggcagaa ggcccaagtc 180
atctacaaag gcaggaccaa aaacaaaaag accccggatg gagtctatag atacccagga 240
gctaaagaag gggacgtagt aaaggtcagg aagatgctga agaattggca tatagcctta 300
gtgatgtacc tgatacatat cataactcca ggc 333
<210> 6 <211> 111 <212> БЕЛОК
<213> пестивирус типа 2
<400> 6
Ser Asp Trp Ala Asp Gln Val Glu Lys Gln Glu Lys Glu Ser Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Gln Arg Pro Pro Arg Arg Asp Pro Arg Lys Gly Leu Gln Pro
20 25 30
Gln Val Pro Lys Glu Thr Glu Val Thr Glu Lys Lys Arg Gln Pro Ser
35 40 45
Val Thr Leu Val Ser Gly Gly Gln Lys Ala Gln Val Ile Tyr Lys Gly
50 55 60
Arg Thr Lys Asn Lys Lys Thr Pro Asp Gly Val Tyr Arg Tyr Pro Gly
65 70 75 80
Ala Lys Glu Gly Asp Val Val Lys Val Arg Lys Met Leu Lys Asn Trp
85 90 95
His Ile Ala Leu Val Met Tyr Leu Ile His Ile Ile Thr Pro Gly
100 105 110
<210> 7 <211> 627 <212> ДНК
<213> пестивирус типа 2
<400> 7
cttgccaagg tccagtggtt cttaaaagat gaaaactcga cggggatcaa ccagatactg 60
tggcaaagac agatcaacag atccttacat ggagaatggc ctaaccagat ctgccacggt 120
atgcccaatg aaactatcac ggatgaggaa ttacgcagtc tgggaatggt agatacaagc 180
cctagaacaa actacacctg ttgccagttg caatatcatg agtggaagaa acatggttgg 240
tgcaactatc cacaaaaaca ggcgtggatc acgaggataa cggccctaca agctaacctt 300
accgggcctt atgagggacc tgagtgcgcc gtcatctgcc gatttaacgg cagctacaac 360
atcgtaaaac aggccagaga tgaggtgagt ccactgacag ggtgcaagga agggcatcct 420
tttctattct ctggtgaaag atccgacacc tcatgcctaa ggcccccttc cactagttgg 480
gtaagaccag tgaaaatgga cgaggcatca atggccgatg gctttgccca tggggttgat 540
aaggcgataa tactaatcag gaagggggca tcaggaataa tcaatttcct agacactatt 600
gggaggtggc taccggtagc tgaagca 627
<210> 8
<211> 209
<212> БЕЛОК
<213> пестивирус типа 2
<400> 8
Leu Ala Lys Val Gln Trp Phe Leu Lys Asp Glu Asn Ser Thr Gly Ile
1 5 10 15
Asn Gln Ile Leu Trp Gln Arg Gln Ile Asn Arg Ser Leu His Gly Glu
20 25 30
Trp Pro Asn Gln Ile Cys His Gly Met Pro Asn Glu Thr Ile Thr Asp
35 40 45
Glu Glu Leu Arg Ser Leu Gly Met Val Asp Thr Ser Pro Arg Thr Asn
50 55 60
Tyr Thr Cys Cys Gln Leu Gln Tyr His Glu Trp Lys Lys His Gly Trp
65 70 75 80
Cys Asn Tyr Pro Gln Lys Gln Ala Trp Ile Thr Arg Ile Thr Ala Leu
85 90 95
Gln Ala Asn Leu Thr Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Glu Cys Ala Val Ile
100 105 110
Cys Arg Phe Asn Gly Ser Tyr Asn Ile Val Lys Gln Ala Arg Asp Glu
115 120 125
Val Ser Pro Leu Thr Gly Cys Lys Glu Gly His Pro Phe Leu Phe Ser
130 135 140
Gly Glu Arg Ser Asp Thr Ser Cys Leu Arg Pro Pro Ser Thr Ser Trp
145 150 155 160
Val Arg Pro Val Lys Met Asp Glu Ala Ser Met Ala Asp Gly Phe Ala
165 170 175
His Gly Val Asp Lys Ala Ile Ile Leu Ile Arg Lys Gly Ala Ser Gly
180 185 190
Ile Ile Asn Phe Leu Asp Thr Ile Gly Arg Trp Leu Pro Val Ala Glu
195 200 205
Ala
<210> 9
<211> 600
<212> ДНК
<213> пестивирус типа 2
<400> 9
actatagtac catattgtga tacttacact gtgacaggga tgtatgtcca tgtaaagaat 60
tgcctcccta gagggttacc taagcattca aaaataatct ccccgacaat gatatatctg 120
ggagaaggag acccggccca taatatccag cacttatttg gctcaggtat agcaaagtgg 180
gtcctagttc tactcgggat tctgggtgag tggtatggag aattggcttc cacaatatac 240
ttactactag aatacgggtc tgagtggttg gaacatgaaa gcctggtcac ggaagggttg 300
attcctggca ttaatattac aatagaactc ccagctagtc atacagtgcc tggttgggtg 360
tgggtcgcag gccagtgggt atgcgtgaag ccagactggt ggcctacaca gatttggatt 420
gaaaccgtgg tggcagagac ctggcatata ctaaaaatat tggcgtcagc cctggtgaac 480
atagttgcag cgttcgtaaa cctggaattg gtttatctgg tcataatact agtcaaaata 540
tcaaaaggga acctgatagg tgccatatta tggtgcttgt tactgtcagg cgctgaaggc 600
<210> 10
<211> 200
<212> БЕЛОК
<213> пестивирус типа 2
<400> 10
Thr Ile Val Pro Tyr Cys Asp Thr Tyr Thr Val Thr Gly Met Tyr Val
1 5 10 15
His Val Lys Asn Cys Leu Pro Arg Gly Leu Pro Lys His Ser Lys Ile
20 25 30
Ile Ser Pro Thr Met Ile Tyr Leu Gly Glu Gly Asp Pro Ala His Asn
35 40 45
Ile Gln His Leu Phe Gly Ser Gly Ile Ala Lys Trp Val Leu Val Leu
50 55 60
Leu Gly Ile Leu Gly Glu Trp Tyr Gly Glu Leu Ala Ser Thr Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Leu Glu Tyr Gly Ser Glu Trp Leu Glu His Glu Ser Leu Val
85 90 95
Thr Glu Gly Leu Ile Pro Gly Ile Asn Ile Thr Ile Glu Leu Pro Ala
100 105 110
Ser His Thr Val Pro Gly Trp Val Trp Val Ala Gly Gln Trp Val Cys
115 120 125
Val Lys Pro Asp Trp Trp Pro Thr Gln Ile Trp Ile Glu Thr Val Val
130 135 140
Ala Glu Thr Trp His Ile Leu Lys Ile Leu Ala Ser Ala Leu Val Asn
145 150 155 160
Ile Val Ala Ala Phe Val Asn Leu Glu Leu Val Tyr Leu Val Ile Ile
165 170 175
Leu Val Lys Ile Ser Lys Gly Asn Leu Ile Gly Ala Ile Leu Trp Cys
180 185 190
Leu Leu Leu Ser Gly Ala Glu Gly 195 200
<210> 11 <211> 1116
<212> ДНК
<213> пестивирус типа 2
<400> 11
tcgtgctaca aaagacaaga ctattacaac acccaactag tcgtcgaaga aaaaacaggc 60
gtagaaaaac gatctataat gggcaagtgg accgtgataa ccagggaagg tcgggagcca 120
agattaatgg agcaaataaa tatggtattg aatgatagcc tgtcagaaac ctactgctat 180
aataggctaa acaccagcac ttgggggcgg caaccggcaa gacaaagagg gtgtggtcaa 240
accgtgccct attggcctgg tgacaatgtt ctagaagaac aatactacag cacaggttac 300
tgggtgaatg taacaggcgg ttgccagctg agagaaggcg tatggctatc aagaaagggt 360
aacgtacagt gtcagcgtaa cggctcatcc ttgatgctgc aattggcgat aaaagaagag 420
aatgacacta tggaaatacc atgtgaccca gtggaaactg aaagtatggg tccagttgca 480
cagggcactt gtgtgtacag ctgggcattc gccccaagag ggtggtacta taacaggaag 540
gatggttatt ggctccagta cataaagaaa aacgactacc agtattggac aaaaatgcct 600
actgcctcgt ccgccgcaac catgtaccgc cacttgctcc ccttactggt ggcctgcctc 660
atgggcggta ggatatcggt gtggtttgtg gcaatgctcc tgtctctaca ggtggaagct 720
agtgaagtag gcactaaaca actggctgtc acgctaaccc tgtggaaaat ggactggaca 780
gaactacttt tctatattgt cttgatgcta gccgttaagg aagaacttat aaaaaaaatt 840
gtgaccgcta gccttgtggc cttaaaaaat agtccagtag ccttgagttt tcttattgta 900
ctcagacttg tggggggcag tgaagcactc ccagtaggtt tattattaga aaaaatgtgc 960
atagaccaac cggagtttgg aactcctttc ctgatctacc tatgggacaa ctggaagtgg 1020
actgtgttag tcagcttctc cgcactgaac catgaaaaaa ctataaaact ggcaagaaaa 1080
ctgttgttgg caacacatat aacagcgctc acattg
1116
<210> 12
<211> 372
<212> БЕЛОК
<213> пестивирус типа 2
<400> 12
Ser Cys Tyr Lys Arg Gln Asp Tyr Tyr Asn Thr Gln Leu Val Val Glu
1 5 10 15
Glu Lys Thr Gly Val Glu Lys Arg Ser Ile Met Gly Lys Trp Thr Val
20 25 30
Ile Thr Arg Glu Gly Arg Glu Pro Arg Leu Met Glu Gln Ile Asn Met
35 40 45
Val Leu Asn Asp Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Asn
50 55 60
Thr Ser Thr Trp Gly Arg Gln Pro Ala Arg Gln Arg Gly Cys Gly Gln
65 70 75 80
Thr Val Pro Tyr Trp Pro Gly Asp Asn Val Leu Glu Glu Gln Tyr Tyr
85 90 95
Ser Thr Gly Tyr Trp Val Asn Val Thr Gly Gly Cys Gln Leu Arg Glu
100 105 110
Gly Val Trp Leu Ser Arg Lys Gly Asn Val Gln Cys Gln Arg Asn Gly
115 120 125
Ser Ser Leu Met Leu Gln Leu Ala Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr Met
130 135 140
Glu Ile Pro Cys Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val Ala
145 150 155 160
Gln Gly Thr Cys Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp Tyr
165 170 175
Tyr Asn Arg Lys Asp Gly Tyr Trp Leu Gln Tyr Ile Lys Lys Asn Asp
180 185 190
Tyr Gln Tyr Trp Thr Lys Met Pro Thr Ala Ser Ser Ala Ala Thr Met
195 200 205
Tyr Arg His Leu Leu Pro Leu Leu Val Ala Cys Leu Met Gly Gly Arg
210 215 220
Ile Ser Val Trp Phe Val Ala Met Leu Leu Ser Leu Gln Val Glu Ala
225 230 235 240
Ser Glu Val Gly Thr Lys Gln Leu Ala Val Thr Leu Thr Leu Trp Lys
245 250 255
Met Asp Trp Thr Glu Leu Leu Phe Tyr Ile Val Leu Met Leu Ala Val
260 265 270
Lys Glu Glu Leu Ile Lys Lys Ile Val Thr Ala Ser Leu Val Ala Leu
275 280 285
Lys Asn Ser Pro Val Ala Leu Ser Phe Leu Ile Val Leu Arg Leu Val
290 295 300
Gly Gly Ser Glu Ala Leu Pro Val Gly Leu Leu Leu Glu Lys Met Cys
305 310 315 320
Ile Asp Gln Pro Glu Phe Gly Thr Pro Phe Leu Ile Tyr Leu Trp Asp
325 330 335
Asn Trp Lys Trp Thr Val Leu Val Ser Phe Ser Ala Leu Asn His Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Lys Leu Ala Arg Lys Leu Leu Leu Ala Thr His Ile Thr
355 360 365
Ala Leu Thr Leu 370
<210> 13
<211> 2802
<212> ДНК
<213> пестивирус типа 2
<400> 13
actggcttga gtgattcaat cttctatatg atgcttataa caacaaattt gttaataaag 60
acattcatat acttgctggg ggctagtatg aattgggtcg agagagaaaa aaagaaattg 120
ctagtgaaga ggagactaat atacaagaaa gccgttactt gcagtcagga tgagaatgta 180
ttggagaata aattcaacaa gataactgta aacgcggatt tcaccccatg caagcttgaa 240
cttctacaat tacttagggc ttttttagtc tctttgtgtt tttcctacta caaacctctc 300
ctgtatgcag agactacctt aactgtaata gtaattggcg tacaagagta caacgtagcc 360
atggcccgcg ggcgaagtgt ggtccacagg ctactagcca tggcctatta catatacggc 420
cgcatacagg gtgacatgtt ccagctcgcc actatccagt gcctgctgtc gagtccgagg 480
aaaattatga aacacatggt agagaatcca actctcaaga agctctggca aggcgaaaca 540
gaactcttca accagggtgt tagtcaatcc aagatagtga atccaaagaa aattgggctg 600
gaagaattac acaagggcat gtgtggcctc ccaacagtag tgcaaaattt ggtcatatat 660
gcaaagaaga atgactctct tattttagga gagctgggtt acccccctgg ggatctcacc 720
agtgatgggt gggaaatttt aggtcctggc agaatcccaa agatcactaa cgtcgagtct 780
gctaagatgg acttactctc caaacttatg acctttctgg ggattgaaag ctcgagggtc 840
cccaggaccc cagtccactc aacaaggaaa ttattgaaga tagtaagggg cttggaaaca 900
ggatgggggt acactcacgc aggggggata agtagcgcaa aacacgttac aggtgaaaag 960
aacttaatga cccacatgga gggtaggaag ggaaaatata tcctacaatc tcaagaacat 1020
ggtgctgacg aggtagagta cggagtaaaa actgatcaaa aagctcccga caatgcctta 1080
tgctactgtt ttaaccctga agctacaaac ataaaaggag agacgggagc catggtgttc 1140
atgaagaaga taggaaaaaa gtggactctc gtaacatcag acggcaataa agcctattat 1200
aatgtaaaca atttgaaagg gtggtctgga ctaccaataa tgctgcactc caccggggcc 1260
atagtgggga ggattaaatc agcgtattca gatgaaaacg acctggtgga ggaacttatt 1320
gactctagaa ctattagtaa gagcaatgag acaaacctgg accaccttat caaggaattg 1380
gcagacatgc ggagggggga gttccgctca attacccttg gaacgggagc cgggaaaacc 1440
acagaactgc ctaggcaata cctcacaaca gtaggtgccc ataaatccgt gctggtctta 1500
gtccccttaa aagcacctgc tgaaagtgtt tgccgcttta tgaggtctaa ataccctacc 1560
atcaactttt ccttaagagt gggggaacgg aaagagggag atgtgagcag cggcatcacc 1620
tacgctactt acggattttg ctgccagcta aacctagtcc aacttaaaga atggatatcc 1680
aggtactcaa tggttttttt tgatgaatat cacacagcaa ctccagaaca aatagccata 1740
ataagcaaga ttcatgcact gaaagttaag accaggatag tggctatgtc agcaaccccc 1800
ccgggtaccg tgacgactga aggcaggaag tttgacattg aagaggtagg ggttgctacc 1860
atagagaaag gagaggaacc aaaaaggggg cgcatagcgg tcgctggtat gcaggtccca 1920
ttagaagact taacaggaaa gaactgcctg gtgttcgtgg caaccaaaga agccgcggag 1980
acggaggcta aagaactgcg caccagagga attaacgcca cctactacta ttcaggtata 2040
gaccctaaga ctctggaaca tgggatgacc aatcagccat actgtattgt agctaccaat 2100
gccattgaat caggtataac ctgtcctgac ttggatgtgg tcatagacac catgcagaag 2160
tacgaaaaag tagtgaattt ctcggcaaag atgcccttga ttgtcacttc attagtaaag 2220
aaaaaaatca ccagggaaga acagggccag aggaaaggtc gagtgggcag gcaaaagaaa 2280
ggaaaatact actacccctc gggggtggta ccgaatgggt caaaagacct aagctattta 2340
atcctacagg cccaagaata tggtgtcttg gaacaagtca atataacaga gtacttcatc 2400
ataatgaatg aggactgggg tctctatgac gtagatgaag tagaagtgag aatacttgag 2460
agaatgaaca aggaaatctt gctaccacta ggtattgtgg agaagcaaat cttggaaaga 2520
agtactcacc cggaaaaagt ggcactgttg tataacaaat tagtgcagaa aaatcctata 2580
gtatacccta gagtacagga aggtgaggtc agcaaggaat acaataccta taatctggcc 2640
gtatatgaca agctaaaaga tgtcaaccca caagccattt atgttctagc agaagaggag 2700
agagccacag aaatgatggg tctcgagttt gaacaagacc catctgactt acaggattcg 2760
gtagttcagc tttgtgaaga tatcaagagg tatacaaaac tc 2802
<210> 14
<211> 934
<212> БЕЛОК
<213> пестивирус типа 2
<400> 14
Thr Gly Leu Ser Asp Ser Ile Phe Tyr Met Met Leu Ile Thr Thr Asn
1 5 10 15
Leu Leu Ile Lys Thr Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Ala Ser Met Asn Trp
20 25 30
Val Glu Arg Glu Lys Lys Lys Leu Leu Val Lys Arg Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Lys Lys Ala Val Thr Cys Ser Gln Asp Glu Asn Val Leu Glu Asn Lys
50 55 60
Phe Asn Lys Ile Thr Val Asn Ala Asp Phe Thr Pro Cys Lys Leu Glu
65 70 75 80
Leu Leu Gln Leu Leu Arg Ala Phe Leu Val Ser Leu Cys Phe Ser Tyr
85 90 95
Tyr Lys Pro Leu Leu Tyr Ala Glu Thr Thr Leu Thr Val Ile Val Ile
100 105 110
Gly Val Gln Glu Tyr Asn Val Ala Met Ala Arg Gly Arg Ser Val Val
115 120 125
His Arg Leu Leu Ala Met Ala Tyr Tyr Ile Tyr Gly Arg Ile Gln Gly
130 135 140
Asp Met Phe Gln Leu Ala Thr Ile Gln Cys Leu Leu Ser Ser Pro Arg
145 150 155 160
Lys Ile Met Lys His Met Val Glu Asn Pro Thr Leu Lys Lys Leu Trp
165 170 175
Gln Gly Glu Thr Glu Leu Phe Asn Gln Gly Val Ser Gln Ser Lys Ile
180 185 190
Val Asn Pro Lys Lys Ile Gly Leu Glu Glu Leu His Lys Gly Met Cys
195 200 205
Gly Leu Pro Thr Val Val Gln Asn Leu Val Ile Tyr Ala Lys Lys Asn
210 215 220
Asp Ser Leu Ile Leu Gly Glu Leu Gly Tyr Pro Pro Gly Asp Leu Thr
225 230 235 240
Ser Asp Gly Trp Glu Ile Leu Gly Pro Gly Arg Ile Pro Lys Ile Thr
245 250 255
Asn Val Glu Ser Ala Lys Met Asp Leu Leu Ser Lys Leu Met Thr Phe
260 265 270
Leu Gly Ile Glu Ser Ser Arg Val Pro Arg Thr Pro Val His Ser Thr
275 280 285
Arg Lys Leu Leu Lys Ile Val Arg Gly Leu Glu Thr Gly Trp Gly Tyr
290 295 300
Thr His Ala Gly Gly Ile Ser Ser Ala Lys His Val Thr Gly Glu Lys
305 310 315 320
Asn Leu Met Thr His Met Glu Gly Arg Lys Gly Lys Tyr Ile Leu Gln
325 330 335
Ser Gln Glu His Gly Ala Asp Glu Val Glu Tyr Gly Val Lys Thr Asp
340 345 350
Gln Lys Ala Pro Asp Asn Ala Leu Cys Tyr Cys Phe Asn Pro Glu Ala
355 360 365
Thr Asn Ile Lys Gly Glu Thr Gly Ala Met Val Phe Met Lys Lys Ile
370 375 380
Gly Lys Lys Trp Thr Leu Val Thr Ser Asp Gly Asn Lys Ala Tyr Tyr
385 390 395 400
Asn Val Asn Asn Leu Lys Gly Trp Ser Gly Leu Pro Ile Met Leu His
405 410 415
Ser Thr Gly Ala Ile Val Gly Arg Ile Lys Ser Ala Tyr Ser Asp Glu
420
425
430
Asn Asp Leu Val Glu Glu Leu Ile Asp Ser Arg Thr Ile Ser Lys Ser
435 440 445
Asn Glu Thr Asn Leu Asp His Leu Ile Lys Glu Leu Ala Asp Met Arg
450 455 460
Arg Gly Glu Phe Arg Ser Ile Thr Leu Gly Thr Gly Ala Gly Lys Thr
465 470 475 480
Thr Glu Leu Pro Arg Gln Tyr Leu Thr Thr Val Gly Ala His Lys Ser
485 490 495
Val Leu Val Leu Val Pro Leu Lys Ala Pro Ala Glu Ser Val Cys Arg
500 505 510
Phe Met Arg Ser Lys Tyr Pro Thr Ile Asn Phe Ser Leu Arg Val Gly
515 520 525
Glu Arg Lys Glu Gly Asp Val Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Ala Thr Tyr
530 535 540
Gly Phe Cys Cys Gln Leu Asn Leu Val Gln Leu Lys Glu Trp Ile Ser
545 550 555 560
Arg Tyr Ser Met Val Phe Phe Asp Glu Tyr His Thr Ala Thr Pro Glu
565 570 575
Gln Ile Ala Ile Ile Ser Lys Ile His Ala Leu Lys Val Lys Thr Arg
580 585 590
Ile Val Ala Met Ser Ala Thr Pro Pro Gly Thr Val Thr Thr Glu Gly
595 600 605
Arg Lys Phe Asp Ile Glu Glu Val Gly Val Ala Thr Ile Glu Lys Gly
610 615 620
Glu Glu Pro Lys Arg Gly Arg Ile Ala Val Ala Gly Met Gln Val Pro
625 630 635 640
Leu Glu Asp Leu Thr Gly Lys Asn Cys Leu Val Phe Val Ala Thr Lys
645 650 655
Glu Ala Ala Glu Thr Glu Ala Lys Glu Leu Arg Thr Arg Gly Ile Asn
660 665 670
Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ser Gly Ile Asp Pro Lys Thr Leu Glu His Gly
675
680
685
Met Thr Asn Gln Pro Tyr Cys Ile Val Ala Thr Asn Ala Ile Glu Ser
690 695 700
Gly Ile Thr Cys Pro Asp Leu Asp Val Val Ile Asp Thr Met Gln Lys
705 710 715 720
Tyr Glu Lys Val Val Asn Phe Ser Ala Lys Met Pro Leu Ile Val Thr
725 730 735
Ser Leu Val Lys Lys Lys Ile Thr Arg Glu Glu Gln Gly Gln Arg Lys
740 745 750
Gly Arg Val Gly Arg Gln Lys Lys Gly Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ser Gly
755 760 765
Val Val Pro Asn Gly Ser Lys Asp Leu Ser Tyr Leu Ile Leu Gln Ala
770 775 780
Gln Glu Tyr Gly Val Leu Glu Gln Val Asn Ile Thr Glu Tyr Phe Ile
785 790 795 800
Ile Met Asn Glu Asp Trp Gly Leu Tyr Asp Val Asp Glu Val Glu Val
805 810 815
Arg Ile Leu Glu Arg Met Asn Lys Glu Ile Leu Leu Pro Leu Gly Ile
820 825 830
Val Glu Lys Gln Ile Leu Glu Arg Ser Thr His Pro Glu Lys Val Ala
835 840 845
Leu Leu Tyr Asn Lys Leu Val Gln Lys Asn Pro Ile Val Tyr Pro Arg
850 855 860
Val Gln Glu Gly Glu Val Ser Lys Glu Tyr Asn Thr Tyr Asn Leu Ala
865 870 875 880
Val Tyr Asp Lys Leu Lys Asp Val Asn Pro Gln Ala Ile Tyr Val Leu
885 890 895
Ala Glu Glu Glu Arg Ala Thr Glu Met Met Gly Leu Glu Phe Glu Gln
900 905 910
Asp Pro Ser Asp Leu Gln Asp Ser Val Val Gln Leu Cys Glu Asp Ile
915 920 925
Lys Arg Tyr Thr Lys Leu
<210> 15
<211> 2061
<212> ДНК
<213> пестивирус типа 2
<400> 15
ggtcctggca gaatcccaaa gatcactaac gtcgagtctg ctaagatgga cttactctcc 60
aaacttatga cctttctggg gattgaaagc tcgagggtcc ccaggacccc agtccactca 120
acaaggaaat tattgaagat agtaaggggc ttggaaacag gatgggggta cactcacgca 180
ggggggataa gtagcgcaaa acacgttaca ggtgaaaaga acttaatgac ccacatggag 240
ggtaggaagg gaaaatatat cctacaatct caagaacatg gtgctgacga ggtagagtac 300
ggagtaaaaa ctgatcaaaa agctcccgac aatgccttat gctactgttt taaccctgaa 360
gctacaaaca taaaaggaga gacgggagcc atggtgttca tgaagaagat aggaaaaaag 420
tggactctcg taacatcaga cggcaataaa gcctattata atgtaaacaa tttgaaaggg 480
tggtctggac taccaataat gctgcactcc accggggcca tagtggggag gattaaatca 540
gcgtattcag atgaaaacga cctggtggag gaacttattg actctagaac tattagtaag 600
agcaatgaga caaacctgga ccaccttatc aaggaattgg cagacatgcg gaggggggag 660
ttccgctcaa ttacccttgg aacgggagcc gggaaaacca cagaactgcc taggcaatac 720
ctcacaacag taggtgccca taaatccgtg ctggtcttag tccccttaaa agcacctgct 780
gaaagtgttt gccgctttat gaggtctaaa taccctacca tcaacttttc cttaagagtg 840
ggggaacgga aagagggaga tgtgagcagc ggcatcacct acgctactta cggattttgc 900
tgccagctaa acctagtcca acttaaagaa tggatatcca ggtactcaat ggtttttttt 960
gatgaatatc acacagcaac tccagaacaa atagccataa taagcaagat tcatgcactg 1020
aaagttaaga ccaggatagt ggctatgtca gcaacccccc cgggtaccgt gacgactgaa 1080
ggcaggaagt ttgacattga agaggtaggg gttgctacca tagagaaagg agaggaacca 1140
aaaagggggc gcatagcggt cgctggtatg caggtcccat tagaagactt aacaggaaag 1200
aactgcctgg tgttcgtggc aaccaaagaa gccgcggaga cggaggctaa agaactgcgc 1260
accagaggaa ttaacgccac ctactactat tcaggtatag accctaagac tctggaacat 1320
gggatgacca atcagccata ctgtattgta gctaccaatg ccattgaatc aggtataacc 1380
tgtcctgact tggatgtggt catagacacc atgcagaagt acgaaaaagt agtgaatttc 1440
tcggcaaaga tgcccttgat tgtcacttca ttagtaaaga aaaaaatcac cagggaagaa 1500
cagggccaga ggaaaggtcg agtgggcagg caaaagaaag gaaaatacta ctacccctcg 1560
ggggtggtac cgaatgggtc aaaagaccta agctatttaa tcctacaggc ccaagaatat 1620
ggtgtcttgg aacaagtcaa tataacagag tacttcatca taatgaatga ggactggggt 1680
ctctatgacg tagatgaagt agaagtgaga atacttgaga gaatgaacaa ggaaatcttg 1740
ctaccactag gtattgtgga gaagcaaatc ttggaaagaa gtactcaccc ggaaaaagtg 1800
gcactgttgt ataacaaatt agtgcagaaa aatcctatag tataccctag agtacaggaa 1860
ggtgaggtca gcaaggaata caatacctat aatctggccg tatatgacaa gctaaaagat 1920
gtcaacccac aagccattta tgttctagca gaagaggaga gagccacaga aatgatgggt 1980
ctcgagtttg aacaagaccc atctgactta caggattcgg tagttcagct ttgtgaagat 2040
atcaagaggt atacaaaact c 2061
<210> 16
<211> 687
<212> БЕЛОК
<213> пестивирус типа 2
<400> 16
Gly Pro Gly Arg Ile Pro Lys Ile Thr Asn Val Glu Ser Ala Lys Met
1 5 10 15
Asp Leu Leu Ser Lys Leu Met Thr Phe Leu Gly Ile Glu Ser Ser Arg
20 25 30
Val Pro Arg Thr Pro Val His Ser Thr Arg Lys Leu Leu Lys Ile Val
35 40 45
Arg Gly Leu Glu Thr Gly Trp Gly Tyr Thr His Ala Gly Gly Ile Ser
50 55 60
Ser Ala Lys His Val Thr Gly Glu Lys Asn Leu Met Thr His Met Glu
65 70 75 80
Gly Arg Lys Gly Lys Tyr Ile Leu Gln Ser Gln Glu His Gly Ala Asp
85 90 95
Glu Val Glu Tyr Gly Val Lys Thr Asp Gln Lys Ala Pro Asp Asn Ala
100 105 110
Leu Cys Tyr Cys Phe Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ile Lys Gly Glu Thr
115 120 125
Gly Ala Met Val Phe Met Lys Lys Ile Gly Lys Lys Trp Thr Leu Val
130 135 140
Thr Ser Asp Gly Asn Lys Ala Tyr Tyr Asn Val Asn Asn Leu Lys Gly
145 150 155 160
Trp Ser Gly Leu Pro Ile Met Leu His Ser Thr Gly Ala Ile Val Gly
165 170 175
Arg Ile Lys Ser Ala Tyr Ser Asp Glu Asn Asp Leu Val Glu Glu Leu
180 185 190
Ile Asp Ser Arg Thr Ile Ser Lys Ser Asn Glu Thr Asn Leu Asp His
195 200 205
Leu Ile Lys Glu Leu Ala Asp Met Arg Arg Gly Glu Phe Arg Ser Ile
210 215 220
Thr Leu Gly Thr Gly Ala Gly Lys Thr Thr Glu Leu Pro Arg Gln Tyr
225 230 235 240
Leu Thr Thr Val Gly Ala His Lys Ser Val Leu Val Leu Val Pro Leu
245 250 255
Lys Ala Pro Ala Glu Ser Val Cys Arg Phe Met Arg Ser Lys Tyr Pro
260 265 270
Thr Ile Asn Phe Ser Leu Arg Val Gly Glu Arg Lys Glu Gly Asp Val
275 280 285
Ser Ser Gly Ile Thr Tyr Ala Thr Tyr Gly Phe Cys Cys Gln Leu Asn
290 295 300
Leu Val Gln Leu Lys Glu Trp Ile Ser Arg Tyr Ser Met Val Phe Phe
305 310 315 320
Asp Glu Tyr His Thr Ala Thr Pro Glu Gln Ile Ala Ile Ile Ser Lys
325 330 335
Ile His Ala Leu Lys Val Lys Thr Arg Ile Val Ala Met Ser Ala Thr
340 345 350
Pro Pro Gly Thr Val Thr Thr Glu Gly Arg Lys Phe Asp Ile Glu Glu
355 360 365
Val Gly Val Ala Thr Ile Glu Lys Gly Glu Glu Pro Lys Arg Gly Arg
370 375 380
Ile Ala Val Ala Gly Met Gln Val Pro Leu Glu Asp Leu Thr Gly Lys
385 390 395 400
Asn Cys Leu Val Phe Val Ala Thr Lys Glu Ala Ala Glu Thr Glu Ala
405 410 415
Lys Glu Leu Arg Thr Arg Gly Ile Asn Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ser Gly
420
425
430
Ile Asp Pro Lys Thr Leu Glu His Gly Met Thr Asn Gln Pro Tyr Cys
435 440 445
Ile Val Ala Thr Asn Ala Ile Glu Ser Gly Ile Thr Cys Pro Asp Leu
450 455 460
Asp Val Val Ile Asp Thr Met Gln Lys Tyr Glu Lys Val Val Asn Phe
465 470 475 480
Ser Ala Lys Met Pro Leu Ile Val Thr Ser Leu Val Lys Lys Lys Ile
485 490 495
Thr Arg Glu Glu Gln Gly Gln Arg Lys Gly Arg Val Gly Arg Gln Lys
500 505 510
Lys Gly Lys Tyr Tyr Tyr Pro Ser Gly Val Val Pro Asn Gly Ser Lys
515 520 525
Asp Leu Ser Tyr Leu Ile Leu Gln Ala Gln Glu Tyr Gly Val Leu Glu
530 535 540
Gln Val Asn Ile Thr Glu Tyr Phe Ile Ile Met Asn Glu Asp Trp Gly
545 550 555 560
Leu Tyr Asp Val Asp Glu Val Glu Val Arg Ile Leu Glu Arg Met Asn
565 570 575
Lys Glu Ile Leu Leu Pro Leu Gly Ile Val Glu Lys Gln Ile Leu Glu
580 585 590
Arg Ser Thr His Pro Glu Lys Val Ala Leu Leu Tyr Asn Lys Leu Val
595 600 605
Gln Lys Asn Pro Ile Val Tyr Pro Arg Val Gln Glu Gly Glu Val Ser
610 615 620
Lys Glu Tyr Asn Thr Tyr Asn Leu Ala Val Tyr Asp Lys Leu Lys Asp
625 630 635 640
Val Asn Pro Gln Ala Ile Tyr Val Leu Ala Glu Glu Glu Arg Ala Thr
645 650 655
Glu Met Met Gly Leu Glu Phe Glu Gln Asp Pro Ser Asp Leu Gln Asp
660 665 670
Ser Val Val Gln Leu Cys Glu Asp Ile Lys Arg Tyr Thr Lys Leu
675
680
685
<210> 17
<211> 201
<212> ДНК
<213> пестивирус типа 2
<400> 17
tctgggatca ctgagaaact gctagtaggt acgatggtgg ggtatattgg atacaaagcc 60
ttaaccagaa accacgtgcc ctgggtcagc aaagagtatt gttatgagct gaccgattca 120
ccggatactt acgaaaactc attcgcacct ttggacgtcg acgtccaaaa ctccggtgaa 180
ggaaaacacc cagagcaact g 201
<210> 18
<211> 67
<212> БЕЛОК
<213> пестивирус типа 2
<400> 18
Ser Gly Ile Thr Glu Lys Leu Leu Val Gly Thr Met Val Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Gly Tyr Lys Ala Leu Thr Arg Asn His Val Pro Trp Val Ser Lys Glu
20 25 30
Tyr Cys Tyr Glu Leu Thr Asp Ser Pro Asp Thr Tyr Glu Asn Ser Phe
35 40 45
Ala Pro Leu Asp Val Asp Val Gln Asn Ser Gly Glu Gly Lys His Pro
50 55 60
Glu Gln Leu 65
<210> 19
<211> 2433
<212> ДНК
<213> пестивирус типа 2
<400> 19
gcagaccatc aattgaggca actactggag actgggagag acaaggcaat tgatttccta 60
aaaggaatcc gcgagttcac tagtggggcc ataaacagtc caaaggcact aagtatatgg 120
gagaaaatat atcagtattt gaagaagcat cagggcgaga tcatctcatc agcagcgtgg 180
ggcagtgcga cggcccttca cgacagtatt aaatctagac taggagatga ggtcgctact 240
gcagtaataa tcctcaagta tttagcattt ggtgaaagag aactgtctgg gctaactagg 300
caagttctaa ttgacatcat agtatattat atagttaaca agccccggtt cgaaggagac 360
gactacgcaa agagaaaagg aagaaggcta gtcatcgaag tcctgatggg ggcactggcg 420
acttatgcgg tgtccaattt ttggggtgtg tccattaata agatactgca accaatttct 480
gattatctac cctatgccac cgccactttg gcttttcttc gcccaacctt catggaatca 540
gcagtggtgg tcgcttcctc tatctataga gcttttctct ccattaagca tgcggaaaac 600
aggagtcttg tcacgcaggt cgcttctgcc gccctcgaag tcatgggcct gaccccagta 660
tcggctggcc taggcgtctt gctggggctt gggttgtgtg tgctccatat gaacattgac 720
aagaatgagg agaaaaggac acttatactg aaaatgtttg tcaaaaactt tatagaccag 780
gcggcactag acgagttgga taaactggag ccagaaaaaa taatcctctc attgttggag 840
ggtatccaaa cctgcacaaa cccgattaga gcaatcatga ttttgtacag ggtgtactac 900
aagggagaaa ctttcacaga agctttgtct aagatggccg gcaagtctct cattgtgatg 960
gtcatagtcg agttcctgga attgacaggc caaacccaag gagggtatat agatcttagt 1020
gctaatttgc tgacctttct cctcgagaaa ctaaaaaaaa tgactaacct cgccatcggg 1080
gaagctagaa aggtcttgct ccccatccca tacttgtact gtgaaacctg gcagtctgac 1140
gccagaatca aggcccctga atcctacgac caagtggtag tggaatgcaa atgtggcgct 1200
tcagcgaggt attccttccg cgatggagtt catgagatat tggaagaaaa aaggactaat 1260
tggtgcaaga acttcttctt atggggaccc aacttccaca atccggatcc aaaaaggatg 1320
acattctatg aatacggcca agcaaaaaag tgtcctgtta tcataattgg tgaagacata 1380
accttcggca aatatggcat atatatcaaa tttggccata ggcctgatgg agggaggtta 1440
ataaggggta ccacccacgc tactatcagt agggaggaat tgctggaaat cctaacagcc 1500
ccaagccaag tggccatagg caaggtcaag ctaaccgatt actgtaatca aaaaggaata 1560
atagacagga aattggccgt acttgaaggt gacaaaatac atttttggaa agcacaccgt 1620
ggatccaaaa tcacagacca actcactatt gagaatctga cagatgattt ggggtcagaa 1680
atcagggaca tcacatggga gctgtacaca ggtggaacgt gcaccgtaaa aggggtgtcc 1740
cttagatcat gcgcaccagg tcatagaact aaggctatgg tcttgtgtga ttgcactgat 1800
gtgcttagcc cctgttacct aataaacggc aggagaccat ccccatttga cgtcgcggaa 1860
ggttatgaat gtcaccaccg gaagccccga gcgacgtatg aagacctaga aatggaggaa 1920
atactaaaga gacgagtccc tgtctacgat cctctgtgtt tgtttgacac tgatagtaaa 1980
ctgctacctc ccgacaccta ctacttggaa gaagatcaag aggactttga gtacgcattg 2040
agatgctggg gcctcggggt ttatgtagca gacgggcctg tcacttcccc cccggacata 2100
agaatacacc atagttcggt attactactg ctgacacctg gagtaaactc agagttgccc 2160
ttacagtaca tacgttgtta ccctcatcag gcagaggtgg acatctacat taggagtcag 2220
cttttggagg aggaagacac tgctacggag gtggaaggct cccaggaaga tggtgatgaa 2280
gggatgggcg atgcggtaat agaggatgag gatacatcgt ccacaacaga atcaataccc 2340
ccactagaag aggaggaagg gggcgaagag ccaatcacct atgtggtcat aaggggatta 2400
caagaagaaa gatacgccag ccatcttaaa cta 2433
<210> 20
<211> 811
<212> БЕЛОК
<213> пестивирус типа 2
<400> 20
Ala Asp His Gln Leu Arg Gln Leu Leu Glu Thr Gly Arg Asp Lys Ala
1 5 10 15
Ile Asp Phe Leu Lys Gly Ile Arg Glu Phe Thr Ser Gly Ala Ile Asn
20 25 30
Ser Pro Lys Ala Leu Ser Ile Trp Glu Lys Ile Tyr Gln Tyr Leu Lys
35 40 45
Lys His Gln Gly Glu Ile Ile Ser Ser Ala Ala Trp Gly Ser Ala Thr
50 55 60
Ala Leu His Asp Ser Ile Lys Ser Arg Leu Gly Asp Glu Val Ala Thr
65 70 75 80
Ala Val Ile Ile Leu Lys Tyr Leu Ala Phe Gly Glu Arg Glu Leu Ser
85 90 95
Gly Leu Thr Arg Gln Val Leu Ile Asp Ile Ile Val Tyr Tyr Ile Val
100 105 110
Asn Lys Pro Arg Phe Glu Gly Asp Asp Tyr Ala Lys Arg Lys Gly Arg
115 120 125
Arg Leu Val Ile Glu Val Leu Met Gly Ala Leu Ala Thr Tyr Ala Val
130 135 140
Ser Asn Phe Trp Gly Val Ser Ile Asn Lys Ile Leu Gln Pro Ile Ser
145 150 155 160
Asp Tyr Leu Pro Tyr Ala Thr Ala Thr Leu Ala Phe Leu Arg Pro Thr
165 170 175
Phe Met Glu Ser Ala Val Val Val Ala Ser Ser Ile Tyr Arg Ala Phe
180 185 190
Leu Ser Ile Lys His Ala Glu Asn Arg Ser Leu Val Thr Gln Val Ala
195 200 205
Ser Ala Ala Leu Glu Val Met Gly Leu Thr Pro Val Ser Ala Gly Leu
210 215 220
Gly Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Cys Val Leu His Met Asn Ile Asp
225 230 235 240
Lys Asn Glu Glu Lys Arg Thr Leu Ile Leu Lys Met Phe Val Lys Asn
245 250 255
Phe Ile Asp Gln Ala Ala Leu Asp Glu Leu Asp Lys Leu Glu Pro Glu
260 265 270
Lys Ile Ile Leu Ser Leu Leu Glu Gly Ile Gln Thr Cys Thr Asn Pro
275 280 285
Ile Arg Ala Ile Met Ile Leu Tyr Arg Val Tyr Tyr Lys Gly Glu Thr
290 295 300
Phe Thr Glu Ala Leu Ser Lys Met Ala Gly Lys Ser Leu Ile Val Met
305 310 315 320
Val Ile Val Glu Phe Leu Glu Leu Thr Gly Gln Thr Gln Gly Gly Tyr
325 330 335
Ile Asp Leu Ser Ala Asn Leu Leu Thr Phe Leu Leu Glu Lys Leu Lys
340 345 350
Lys Met Thr Asn Leu Ala Ile Gly Glu Ala Arg Lys Val Leu Leu Pro
355 360 365
Ile Pro Tyr Leu Tyr Cys Glu Thr Trp Gln Ser Asp Ala Arg Ile Lys
370 375 380
Ala Pro Glu Ser Tyr Asp Gln Val Val Val Glu Cys Lys Cys Gly Ala
385 390 395 400
Ser Ala Arg Tyr Ser Phe Arg Asp Gly Val His Glu Ile Leu Glu Glu
405 410 415
Lys Arg Thr Asn Trp Cys Lys Asn Phe Phe Leu Trp Gly Pro Asn Phe
420 425 430
His Asn Pro Asp Pro Lys Arg Met Thr Phe Tyr Glu Tyr Gly Gln Ala
435 440 445
Lys Lys Cys Pro Val Ile Ile Ile Gly Glu Asp Ile Thr Phe Gly Lys
450 455 460
Tyr Gly Ile Tyr Ile Lys Phe Gly His Arg Pro Asp Gly Gly Arg Leu
465 470 475 480
Ile Arg Gly Thr Thr His Ala Thr Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu
485 490 495
Ile Leu Thr Ala Pro Ser Gln Val Ala Ile Gly Lys Val Lys Leu Thr
500 505 510
Asp Tyr Cys Asn Gln Lys Gly Ile Ile Asp Arg Lys Leu Ala Val Leu
515 520 525
Glu Gly Asp Lys Ile His Phe Trp Lys Ala His Arg Gly Ser Lys Ile
530 535 540
Thr Asp Gln Leu Thr Ile Glu Asn Leu Thr Asp Asp Leu Gly Ser Glu
545 550 555 560
Ile Arg Asp Ile Thr Trp Glu Leu Tyr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Val
565 570 575
Lys Gly Val Ser Leu Arg Ser Cys Ala Pro Gly His Arg Thr Lys Ala
580 585 590
Met Val Leu Cys Asp Cys Thr Asp Val Leu Ser Pro Cys Tyr Leu Ile
595 600 605
Asn Gly Arg Arg Pro Ser Pro Phe Asp Val Ala Glu Gly Tyr Glu Cys
610 615 620
His His Arg Lys Pro Arg Ala Thr Tyr Glu Asp Leu Glu Met Glu Glu
625 630 635 640
Ile Leu Lys Arg Arg Val Pro Val Tyr Asp Pro Leu Cys Leu Phe Asp
645 650 655
Thr Asp Ser Lys Leu Leu Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr Leu Glu Glu Asp
660 665 670
Gln Glu Asp Phe Glu Tyr Ala Leu Arg Cys Trp Gly Leu Gly Val Tyr
675 680 685
Val Ala Asp Gly Pro Val Thr Ser Pro Pro Asp Ile Arg Ile His His
690 695 700
Ser Ser Val Leu Leu Leu Leu Thr Pro Gly Val Asn Ser Glu Leu Pro
705 710 715 720
Leu Gln Tyr Ile Arg Cys Tyr Pro His Gln Ala Glu Val Asp Ile Tyr
725 730 735
Ile Arg Ser Gln Leu Leu Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Glu Val Glu
740 745 750
Gly Ser Gln Glu Asp Gly Asp Glu Gly Met Gly Asp Ala Val Ile Glu
755 760 765
Asp Glu Asp Thr Ser Ser Thr Thr Glu Ser Ile Pro Pro Leu Glu Glu
770 775 780
Glu Glu Gly Gly Glu Glu Pro Ile Thr Tyr Val Val Ile Arg Gly Leu
785 790 795 800
Gln Glu Glu Arg Tyr Ala Ser His Leu Lys Leu 805 810
<210> 21 <211> 2256
<212> ДНК
<213> пестивирус типа 2
<400> 21
aatgactgga tcagtgaaaa catttcagag ccacacagag tccaaattat gctagatggg 60
acagtgagag tcacaataaa agagggcaaa gtgaaacatt tgtttggggt ctatagaata 120
gaaaactccc tggaagcaat gtttaaagag accatagctg acctccccgt agctacccaa 180
ccgccccagg ggccagtcta tacggctaaa gagctggccc aagggaacat cgccccggtc 240
caacctgcag cgaattatta cggaatgata gaggggagag gcgacccaat gacggcattc 300
gaagccttat cagtcttgcg gtcacaaaaa gtcttagcca aggacgtgaa ggtgaacacc 360
cgcagggcgc aggttttttt aaataaagtc aggagaattg ctgaggtcag agcgtcggaa 420
ctgacattaa aatgcttacc gatacttggc aaagtaaatg ggaggaaatt gattagagag 480
gaaaccaaca tccccaacca aaggttggca tcaataatga cctcaatagg aattagacta 540
gaaaaactgc cagtggttag agcaaacact tccggctcta agttcagaca gtcaatctta 600
gaaaaaatgg ataagtatga aaatgaacaa gtcccagggt tacatgaaaa gatgtgggca 660
gcgttcctgg caactgccag gcaagattta agaaatacct atgaggaagt aacttatctt 720
gaattagagg ccggaatcaa tcggaaagga gccccaggtt tctttgaaaa agaaagctca 780
ataggagaag tgctggaaaa aaaagaaaaa attgacgtca caatccaaga gattgaaaaa 840
ggcaaccact tatactatga aacagccatg ccaaaaaatg agaaaagaga tgtgcttgat 900
gattggttgt cagaggattt cgtcacttat aagaaaccac gtgtgataca gtaccctgag 960
gcagtcaccc ggttggccat caccaaaata atgtataagt gggtgaagca aaagcctata 1020
gtgattcccg gttatgaggg aaaaaccccg atctttgaaa tatttgaaaa agtcagtgca 1080
gattgggctc agttcaaaaa tccggtagcc gtcagcttcg acaccagagc ctgggacact 1140
caagtaacaa gagaagacct caggctggta gggcggatac agaaatacta ttacaaaaaa 1200
aaatattgga agttcattga caatttgaca gccatgatgg aggaagtgcc tgtaatcact 1260
gtagaaggag atatgttcct cagagttgga cagcgcggat ccggacagcc tgatacctca 1320
gcaggcaatt ccatgctaaa tgtgctgact atgttggtag ctttctctga atccacaaat 1380
ctgcccatag cggctgcctg gaaggcctgt cggatccacg tctgtggtga cgacggtttc 1440
ttaatcacag aatcggaatt agggaggaag tttgctgaaa aaggtgttcc tctgttagct 1500
gcatttggca aaccccaaaa aattacagag ggagcgagcc taaaggtaac cagcaacttt 1560
gacggaatag agttttgtag tcatacccct atcagagtcc aaacaccaaa catcaggtgg 1620
atgccagcga gaccaacagc aacaatccta ggcaaaatga gtaccaggct gggtgagggt 1680
gccaccaggt cgggagaaga atacgaaaaa caggtggcat tcgcatatct actgatgtac 1740
ccctggaacc cgctggtcag gagaatcagc ctcctattgt tatcgactac tgacccaatg 1800
gggaaagagg aaaccccatg ctccgatgag ggggtgaagt atgttgggga ccctatcgct 1860
gcatacaggg atgtatgggg gcacaaatta gaggatgtag gccatgttga tcaaccgcag 1920
ttatcccgga tgaactatag catgacttac ttagggattt ggaaaccaaa gacaagtcag 1980
cggctagtcg aacagtgttg tcgtctggcc gagaaaagca attgtgtggt acgtgctgac 2040
tccctgataa agaaaaaggt caagatcact tatgacccgg ggataggagt ggctcaggtc 2100
attcgtaggt gggaagagct tgagtggacc agaaggaaac ctgaactcac caatgtaatt 2160
gtagaagatg atatcttcct agtcctgtgg aagagatttt caaagtacat ttttcagaaa 2220
atgaagttca tgcagagaat gttcgcccct tattaa 2256
<210> 22 <211> 751
<212> БЕЛОК
<213> пестивирус типа 2
<400> 22
Asn Asp Trp Ile Ser Glu Asn Ile Ser Glu Pro His Arg Val Gln Ile
1 5 10 15
Met Leu Asp Gly Thr Val Arg Val Thr Ile Lys Glu Gly Lys Val Lys
20 25 30
His Leu Phe Gly Val Tyr Arg Ile Glu Asn Ser Leu Glu Ala Met Phe
35 40 45
Lys Glu Thr Ile Ala Asp Leu Pro Val Ala Thr Gln Pro Pro Gln Gly
50 55 60
Pro Val Tyr Thr Ala Lys Glu Leu Ala Gln Gly Asn Ile Ala Pro Val
65 70 75 80
Gln Pro Ala Ala Asn Tyr Tyr Gly Met Ile Glu Gly Arg Gly Asp Pro
85 90 95
Met Thr Ala Phe Glu Ala Leu Ser Val Leu Arg Ser Gln Lys Val Leu
100 105 110
Ala Lys Asp Val Lys Val Asn Thr Arg Arg Ala Gln Val Phe Leu Asn
115 120 125
Lys Val Arg Arg Ile Ala Glu Val Arg Ala Ser Glu Leu Thr Leu Lys
130 135 140
Cys Leu Pro Ile Leu Gly Lys Val Asn Gly Arg Lys Leu Ile Arg Glu
145 150 155 160
Glu Thr Asn Ile Pro Asn Gln Arg Leu Ala Ser Ile Met Thr Ser Ile
165 170 175
Gly Ile Arg Leu Glu Lys Leu Pro Val Val Arg Ala Asn Thr Ser Gly
180 185 190
Ser Lys Phe Arg Gln Ser Ile Leu Glu Lys Met Asp Lys Tyr Glu Asn
195 200 205
Glu Gln Val Pro Gly Leu His Glu Lys Met Trp Ala Ala Phe Leu Ala
210 215 220
Thr Ala Arg Gln Asp Leu Arg Asn Thr Tyr Glu Glu Val Thr Tyr Leu
225 230 235 240
Glu Leu Glu Ala Gly Ile Asn Arg Lys Gly Ala Pro Gly Phe Phe Glu
245 250 255
Lys Glu Ser Ser Ile Gly Glu Val Leu Glu Lys Lys Glu Lys Ile Asp
260 265 270
Val Thr Ile Gln Glu Ile Glu Lys Gly Asn His Leu Tyr Tyr Glu Thr
275 280 285
Ala Met Pro Lys Asn Glu Lys Arg Asp Val Leu Asp Asp Trp Leu Ser
290 295 300
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Lys Lys Pro Arg Val Ile Gln Tyr Pro Glu
305
310
315
320
Ala Val Thr Arg Leu Ala Ile Thr Lys Ile Met Tyr Lys Trp Val Lys
325 330 335
Gln Lys Pro Ile Val Ile Pro Gly Tyr Glu Gly Lys Thr Pro Ile Phe
340 345 350
Glu Ile Phe Glu Lys Val Ser Ala Asp Trp Ala Gln Phe Lys Asn Pro
355 360 365
Val Ala Val Ser Phe Asp Thr Arg Ala Trp Asp Thr Gln Val Thr Arg
370 375 380
Glu Asp Leu Arg Leu Val Gly Arg Ile Gln Lys Tyr Tyr Tyr Lys Lys
385 390 395 400
Lys Tyr Trp Lys Phe Ile Asp Asn Leu Thr Ala Met Met Glu Glu Val
405 410 415
Pro Val Ile Thr Val Glu Gly Asp Met Phe Leu Arg Val Gly Gln Arg
420 425 430
Gly Ser Gly Gln Pro Asp Thr Ser Ala Gly Asn Ser Met Leu Asn Val
435 440 445
Leu Thr Met Leu Val Ala Phe Ser Glu Ser Thr Asn Leu Pro Ile Ala
450 455 460
Ala Ala Trp Lys Ala Cys Arg Ile His Val Cys Gly Asp Asp Gly Phe
465 470 475 480
Leu Ile Thr Glu Ser Glu Leu Gly Arg Lys Phe Ala Glu Lys Gly Val
485 490 495
Pro Leu Leu Ala Ala Phe Gly Lys Pro Gln Lys Ile Thr Glu Gly Ala
500 505 510
Ser Leu Lys Val Thr Ser Asn Phe Asp Gly Ile Glu Phe Cys Ser His
515 520 525
Thr Pro Ile Arg Val Gln Thr Pro Asn Ile Arg Trp Met Pro Ala Arg
530 535 540
Pro Thr Ala Thr Ile Leu Gly Lys Met Ser Thr Arg Leu Gly Glu Gly
545 550 555 560
Ala Thr Arg Ser Gly Glu Glu Tyr Glu Lys Gln Val Ala Phe Ala Tyr
565
570
575
Leu Leu Met Tyr Pro Trp Asn Pro Leu Val Arg Arg Ile Ser Leu Leu
580 585 590
Leu Leu Ser Thr Thr Asp Pro Met Gly Lys Glu Glu Thr Pro Cys Ser
595 600 605
Asp Glu Gly Val Lys Tyr Val Gly Asp Pro Ile Ala Ala Tyr Arg Asp
610 615 620
Val Trp Gly His Lys Leu Glu Asp Val Gly His Val Asp Gln Pro Gln
625 630 635 640
Leu Ser Arg Met Asn Tyr Ser Met Thr Tyr Leu Gly Ile Trp Lys Pro
645 650 655
Lys Thr Ser Gln Arg Leu Val Glu Gln Cys Cys Arg Leu Ala Glu Lys
660 665 670
Ser Asn Cys Val Val Arg Ala Asp Ser Leu Ile Lys Lys Lys Val Lys
675 680 685
Ile Thr Tyr Asp Pro Gly Ile Gly Val Ala Gln Val Ile Arg Arg Trp
690 695 700
Glu Glu Leu Glu Trp Thr Arg Arg Lys Pro Glu Leu Thr Asn Val Ile
705 710 715 720
Val Glu Asp Asp Ile Phe Leu Val Leu Trp Lys Arg Phe Ser Lys Tyr
725 730 735
Ile Phe Gln Lys Met Lys Phe Met Gln Arg Met Phe Ala Pro Tyr
740 745 750
<210> 23
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> лабораторно-синтезированная последовательность ДНК
<400> 23
tgcctggtat tcgtggc 17
<210> 24
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> лабораторно-синтезированная последовательность ДНК
<400> 24
tcatcccatg ttccagagt
<210> 25
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> лабораторно-синтезированная последовательность ДНК
<400> 25
cctccgtctc cgcggctttg g 21
<210> 26
<211> 143
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> <223>
лабораторно-синтезированная последовательность ДНК
<400> 26
aacaggaaag aactgcctgg tattcgtggc aaccaaagaa gccgcggaga cggaggctaa
agaactgcgc accagaggaa ttaacgccac ctattcaggt atagacccta agactctgga
120
acatgggatg accaatcagc cat
143
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Композиция, содержащая инактивированный пестивирус, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0:1.
2. Композиция, содержащая инактивированный пестивирус, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0:2.
3. Композиция по п.1 или 2, где пестивирус представляет
собой химически инактивированный пестивирус, и где пестивирус
инактивирован обработкой инактивирующим средством, выбранным из
группы, состоящей из бинарного этиленимина, этиленимина,
ацетилметиленимина, бета-этиленимина, бета-пропиолактона,
глутарового альдегида, озона и формальдегида.
4. Композиция по п.1 или 2, где пестивирус является
физически инактивированным пестивирусом, и где пестивирус
инактивирован обработкой УФ-излучением, рентгеновским
излучением, гамма-излучением, замораживанием-оттаиванием и/или
нагреванием.
5. Композиция по п.1 или 2, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.
6. Композиция по п. 5, где фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом является адъювант.
7. Композиция по п.б, где адъювант представляет собой адъювант на основе эмульсии типа масло-в-воде.
8. Композиция, содержащая аттенуированный пестивирус, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0:1.
9. Композиция, содержащая аттенуированный пестивирус, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID N0:2.
10. Композиция по п.8 или 9, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.
11. Композиция по п.10, где фармацевтически приемлемым носителем и/или эксципиентом является адъювант.
12. Композиция по п.11, где адъювант представляет собой адъювант на основе эмульсии типа масло-в-воде.
1.
13. Композиция по п. 8 или 9, где пестивирус находится в лиофилизированной форме.
14. Композиция по п. 8 или 9, в которой композиция содержит по меньшей мере около 104 вирусных частиц.
15. Композиция, содержащая вектор, содержащий
последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере
на 95% идентична SEQ ID N0:3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 или
21.
16. Композиция, содержащая вектор, кодирующий
аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на
95% идентична SEQ ID N0:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22.
17. Композиция по п. 15 или 16, где вектор представляет собой вектор экспрессии бакуловируса или вектор аденовируса собак.
18. Способ защиты поросят от болезней, связанных с пестивирусом, включающий введение беременной свиноматке или молодой свинье, свиноматке или молодой свинье перед размножением композиции по п.1, 2, 8, 9, 14 и/или 15 в количестве, достаточном для защиты поросят.
19. Способ по п.18, где заболевание представляет собой врожденный тремор.
20. Способ по п.18, в котором способ включает введение композиции беременной свиноматке или молодой свинье.
21. Способ по п.18, где способ включает введение композиции свиноматке или молодой свинье до размножения.
22. Способ по п.18, где способ включает введение композиции свиноматке или молодой свинье внутримышечно.
23. Способ по п.18, где введение представляет собой первое введение, и где способ дополнительно включает второе введение через одну-три недели после первого введения.
По доверенности
545502
Пестивирус жирафа
BVD-3
i^jPestNP 620053 жирафа" "1 Pest AAF02523 жирафа.
: BVD-2 ¦
Вирус пограничной болезни : Вирус классической чумы свиней
| Stmgftwanrsah А8021120
A eivi ю us 1 геликаза
ФИГ. 2
ЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧ\\\\\*
S51 Г
Идентичность по аминокислотам
Вирус пограничной болезни NP 777541
Reindeer PesJf AAF02524
85|Вирус пограничной болезни NP 777540 Вирус пограничной болезни AHN 82188
Жирафаревймреговвз
BVD 3 AFU72300 BVD 3 AGHS8118
Вирус к
Жирафа Pest! NP 777527 ЖирафаРевйИР 777828 BVD 3 АЕМ44933
ВААЙШ6 ADD"2448 AD023G43
8VD 2 AHL96301 BVD 2 AGT17S59 "35' SVD2ANN0SS2S BVD 1 NP 778287 BUD 1 AAK6S175 89s- BVD 1 AGG54034
Bungowannah YP09SSS20S2 Летучей мыши AFKSSOW
&PPV AKS24377
CTV Pesti 2812070S CW Pesti 23130103 CTV ISUVDL2014016S73 HepC ABY27298
9Sr SVD 1 AF1453S5 jiST'- BVD 1 AABS4209
' BVD 1 AAF02511
Жирафа Pesti NP 777520 100L Жирафа Pesti AAB64218 BVD 2 A8DS7857 ggu BV0 2AHJ6146S 78^~BVD2AAF0250T
| зет Вирус классической чумы свиней ы р !р~§2р~ Вирус классической чумы свиней АКАШЙЗ | Вирус классической чумы свиней деютз
- Вирус пограничной болезни ABBSDJ^ Вирус пограничной болезни дршззв Вирус пограничной болезни АА047921
L-BVD3AC057513
8VD3AGJ01125 BVD 3 AKT2S153
Bungowannsh ABKS8633
APPV AKS24977
CTV SSUVDL281401§573
ФИГ. 6
100
90 80 70
I- 60 ?z
О 50 Q.
40 30 20 10
?Процент положительных *Ђq
2.5
8 1
3.5
С_5 CD
0.5
* наивные "положительные - плацебо
> вакцинирование
930
930
930
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
103
103
2/7
1/7
ФИГ. 1
2/7
1/7
ФИГ. 1
2/7
1/7
ФИГ. 1
2/7
3/7
ФИГ. 3
4/7
ФИГ. 4
4/7
ФИГ. 4
5/7
ФИГ. 5
5/7
ФИГ. 5
100 *
100 *
5/7
ФИГ. 5
5/7
ФИГ. 5
100 *
100 *
7/7
ФИГ. 7
7/7
ФИГ. 7
7/7
ФИГ. 7
7/7
ФИГ. 7
|
