[RU]

Настоящее изобретение относится к антителам, связывающим и нейтрализующим вирус чикунгунья (CHIKV) и к способам их применения.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к антителам, связывающим и нейтрализующим вирус чикунгунья (CHIKV) и к способам их применения.

---

Евразийское (21) 201792220 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2018.03.30
(22) Дата подачи заявки 2016.04.14
(51) Int. Cl.
A61K 39/00 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) C07K16/10 (2006.01) C12N 5/12 (2006.01) C12N15/13 (2006.01)
(54) ОПОСРЕДУЕМАЯ АНТИТЕЛОМ НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ ВИРУСА ЧИКУНГУНЬЯ
(31) 62/147,354
(32) 2015.04.14
(33) US
(86) PCT/US2016/027466
(87) WO 2016/168417 2016.10.20
(88) 2017.01.05
(71) Заявитель:
ВАНДЕРБИЛТ ЮНИВЕРСИТИ (US)
(72) Изобретатель:
Кроу Джеймс Э., Смит Скотт А., Дермоди Теренс, Силва Лори (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к антителам, связывающим и нейтрализующим вирус чи-кунгунья (CHIKV) и к способам их применения.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-545583ЕА/025 ОПОСРЕДУЕМАЯ АНТИТЕЛОМ НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ ВИРУСА ЧИКУНГУНЬЯ
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявке США с серийным номером № 62/147354, поданной 14 апреля 2015 года, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение было осуществлено при поддержке правительства в форме грантов с номерами К08 AI103038, F32 AI096833 и U54 AI057157, выданных National Institutes of Health. Правительство имеет определенные права на изобретение.
1. Область изобретения
Настоящее изобретение относится, главным образом, к областям медицины, инфекционных заболеваний и иммунологии. Более конкретно, изобретение относится к антителам, которые нейтрализуют вирус чикунгунья.
2. Уровень техники
Вирус чикунгунья (CHIKV) представляет собой оболочечный вирус с положительной смысловой РНК рода альфавирусов семейства Togaviridae, и он передается комарами Aedes. Зрелый вирион CHIKV содержит два гликопротеина: Е1 и Е2, которые образуются из белка-предшественника рб2-Е1 посредством протеолитического расщепления. Е2 функционирует при прикреплении вируса, в то время как Е1 опосредует слияние мембран для обеспечения вхождения вируса (Kielian et al., 2010). У человека инфекция CHIKV вызывает лихорадку и боль в суставах, которая может быть тяжелой и в некоторых случаях длится годами (Schilte et al., 2013; Sissoko et al., 2009; Staples et al., 2009). CHIKV вызывал вспышки в большинстве регионов Африки южнее Сахары, а также в частях Азии, Европы и Индийского и Тихого океанов. В декабре 2 013 года произошла первая передача CHIKV в Западном полушарии, причем аутохтонные случаи были идентифицированы на острове Святого Мартина (CDC 2 013). Вирус быстро распространился практически на все острова Карибского моря, а также на Центральную, Южную и Северную Америку. Сообщалось о более
миллиона предполагаемых случаев CHIKV в Западном полушарии менее чем за год, и была документально подтверждена эндемическая передача более чем в 40 странах, в том числе в США (CDC 2014). В настоящее время не существует лицензированной вакцины или противовирусной терапии для предупреждения или лечения инфекции CHIKV.
Хотя механизмы защитного иммунитета против инфекции CHIKV понятны не до конца, гуморальный ответ контролирует инфекцию и ограничивает повреждение тканей (Chu et al., 2013; Hallengard et al. , 2 014; Hawman et al. , 2 013; Kam et al. , 2 012b; Lum et al. , 2 013; Pal et al. , 2 013) . Иммунный у-глобулин человека нейтрализует инфекционность в культивируемых клетках и препятствует заболеваемости у мышей при введении через вплоть до 24 часов после инокуляции вируса (Couderc et al., 2009). Описано несколько моноклональных антител (mAb) мыши, которые нейтрализуют инфекцию CHIKV (Brehin et al., 2008; Goh et al. , 2013; Masrinoul et al. , 2014; Pal et al. , 2013; Pal et al. , 2 014), причем некоторые обладали эффективностью при использовании в комбинации для лечения мышей или не являющихся человеком приматов после заражения CHIKV (Pal et al. , 2013; Pal et al. , 2014) . Для сравнения, было описано ограниченное количество mAb человека против CHIKV, широкое большинство из которых демонстрируют умеренную нейтрализующую активность (Fong et al. , 2014; Fric et al., 2013; Lee et al., 2011; Selvarajah et al., 2013; Warter et al., 2011).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предусматривается способ обнаружения инфекции вирусом чикунгунья у субъекта, включающий (а) приведение в контакт образца от указанного субъекта с антителом или фрагментом антитела, имеющим последовательности CDR парных тяжелой и легкой цепей клонов из таблиц 3 и 4, соответственно; и (Ь) обнаружение гликопротеина Е2 вируса чикунгунья в указанном образце по связыванию указанного антитела или фрагмента антитела с Е2 в указанном образце. Образец может представлять собой жидкость организма, такую как
кровь, мокрота, слезная жидкость, слюна, слизь или сыворотка, моча или кал. Выявление может включать ELISA, RIA или вестерн-блоттинг. Кроме того, способ может включать выполнение стадий (а) и (Ь) второй раз и определение изменения уровней Е2 по сравнению с первым анализом. Антитело может кодироваться парными вариабельными последовательностями клонов, как указано в таблице
1, или может кодироваться вариабельными последовательностями
легкой и тяжелой цепей, обладающими 7 0%, 8 0%, 90% или 95%
идентичностью с парными вариабельными последовательностями
клонов, как указано в таблице 1, или может иметь вариабельные
последовательности легкой и тяжелой цепей, характеризующиеся
парными последовательностями клонов, как указано в таблице 2,
или обладающие 7 0%, 8 0%, 90% или 95% идентичностью с парными
последовательностями клонов из таблицы 2. Фрагмент антитела
может представлять собой рекомбинантное антитело ScFv
(одноцепочечный вариабельный фрагмент), Fab-фрагмент, F(ab')2_
фрагмент или Fv-фрагмент. Антитело может представлять собой IgG-
антитело и/или химерное антитело.
В другом варианте осуществления предусматривается способ
лечения субъекта, инфицированного вирусом чикунгунья, или
уменьшения вероятности инфицирования субъекта, имеющего риск
контактирования с вирусом чикунгунья, включающий доставку
указанному индивидууму антитела или фрагмента антитела, имеющих
последовательности CDR парных тяжелой и легкой цепей клонов из
таблиц 3 и 4, соответственно. Антитело может кодироваться
парными вариабельными последовательностями клонов, как указано в
таблице 1, или может кодироваться вариабельными
последовательностями легкой и тяжелой цепей, обладающими 7 0%, 8 0%, 90% или 95% идентичностью с парными вариабельными последовательностями клонов, как указано в таблице 1, или может иметь вариабельные последовательности легкой и тяжелой цепей, характеризующиеся парными последовательностями клонов, как указано в таблице 2, или обладающие 7 0%, 8 0%, 90% или 95% идентичностью с парными последовательностями клонов из таблицы
2. Фрагмент антитела может представлять собой рекомбинантное
антитело ScFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент), Fab-фрагмент, F(ab') 2_фрагмент или Fv-фрагмент. Антитело может представлять собой IgG-антитело и/или химерное антитело. Антитело или фрагмент антитела можно вводить до инфицирования или после инфицирования. Доставка может включать введение антитела или фрагмента антитела, или генетическую доставку посредством последовательности РНК или ДНК или вектора, кодирующих антитело или фрагмент антитела.
В следующем варианте осуществления предусматривается
моноклональное антитело, где антитело характеризуется
последовательностями CDR парных тяжелой и легкой цепей клонов из
таблиц 3 и 4, соответственно. Антитело может кодироваться
парными вариабельными последовательностями клонов, как указано в
таблице 1, или может кодироваться вариабельными
последовательностями легкой и тяжелой цепей, обладающими 7 0%, 8 0%, 90% или 95% идентичностью с парными вариабельными последовательностями клонов, как указано в таблице 1, или может иметь вариабельные последовательности легкой и тяжелой цепей, характеризующиеся парными последовательностями клонов, как указано в таблице 2, или обладающие 7 0%, 8 0%, 90% или 95% идентичностью с парными последовательностями клонов из таблицы 2. Фрагмент антитела может представлять собой рекомбинантное антитело ScFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент), Fab-фрагмент, F(ab') 2_фрагмент или Fv-фрагмент. Антитело может представлять собой химерное антитело или биспецифическое антитело, которое нацелено на антиген вируса чикунгунья, отличный от гликопротеина. Антитело может представлять собой IgG. Кроме того, антитело или фрагмент антитела содержит проникающий в клетку пептид и/или представляет собой интраантитело.
Также предусматривается гибридома или сконструированная клетка, кодирующая антитело или фрагмент антитела, где антитело или фрагмент антитела характеризуется последовательностями CDR парных тяжелой и легкой цепей клонов из таблиц 3 и 4, соответственно. Антитело или фрагмент антитела может
кодироваться парными вариабельными последовательностями клонов, как указано в таблице 1, или может кодироваться вариабельными последовательностями легкой и тяжелой цепей, обладающими 7 0%, 8 0%, 90% или 95% идентичностью с парными вариабельными последовательностями клонов, как указано в таблице 1, или может иметь вариабельные последовательности легкой и тяжелой цепей, характеризующиеся парными последовательностями клонов, как указано в таблице 2, или обладающие 7 0%, 8 0%, 90% или 95% идентичностью с парными последовательностями клонов из таблицы 2. Фрагмент антитела может представлять собой рекомбинантное антитело ScFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент), Fab-фрагмент, F(ab') 2_фрагмент или Fv-фрагмент. Антитело может представлять собой химерное антитело и/или IgG. Кроме того, антитело или фрагмент антитела может содержать проникающий в клетку пептид и/или представлять собой интраантитело.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит пары вариабельных последовательностей тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 53/54, 55/56, 57/58, 59/60, 61/62, 63/64, 65/66, 67/68, 70/71, 72/73, 74/75, 76/77, 81/82, 83/84, 85/86, 87/88, 89/90, 91/92, 93/94, 95/96 и 97/98.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID NO: 103, 104 и 105, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID NO: 187, 188 и 189, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID NO: 106, 107 и 108, соответственно, и аминокислотные
последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 190, 191 и 192, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 109, 110 и 111, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 193, 194 и 195, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 112, 113 и 114, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 196, 197 и 198, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 115, 116 и 117, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 199, 200 и 201, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 118, 119 и 120, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 202, 203 и 204, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 121, 122 и 123, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 205, 206 и
207, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID NO: 124, 125 и 126, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID NO: 208, 209 и 210, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID NO: 130, 131 и 132, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID NO: 211, 212 и 213, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID NO: 133, 134 и 135, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID NO: 214, 215 и 216, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID NO: 136, 137 и 138, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID NO: 217, 218 и 219, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID NO: 139, 140 и 141, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID NO: 220, 221 и 222, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 151, 152 и 153, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 223, 224 и 225, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 154, 155 и 156, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 226, 227 и 228, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 157, 158 и 159, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 229, 230 и 231, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 160, 161 и 162, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 232, 233 и 234, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 163, 164 и 165, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 235, 236 и 237, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное
антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 166, 167 и 168, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 238, 239 и 240, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 169, 170 и 171, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 241, 242 и 243, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 172, 173 и 174, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 244, 245 и 246, соответственно.
В одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с гликопротеином Е2 вируса чикунгунья, содержит аминокислотные последовательности CDRH1, CDRH2 и CDRH3 SEQ ID N0: 175, 176 и 177, соответственно, и аминокислотные последовательности CDRL1, CDRL2 и CDRL3 SEQ ID N0: 247, 248 и 249, соответственно.
Использование формы единственного числа совместно с термином "содержащий" в формуле изобретения и/или описании может означать "один", но также оно соответствует значению "один или несколько", "по меньшей мере один" и "один или более одного". Слово "приблизительно" означает плюс или минус 5% от указанной величины.
Предусматривается, что любой способ или композиция, описанные в настоящем описании, могут быть осуществлены с помощью любого другого способа или композиции, описанных в
настоящем описании. Другие задачи, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и указывают на конкретные варианты осуществления изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации, являющиеся частью сущности и объема изобретения, станут понятны специалистам в данной области из настоящего подробного описания. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Следующие чертежи являются частью настоящего описания и включены для дальнейшей демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение может стать более понятным с помощью одного или нескольких из этих чертежей в комбинации с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, описанных в настоящем описании.
Фиг.1А-С. Структурный анализ остатков Е2, важных для
связывания mAb. (Фиг.1А) Выравнивание последовательностей Е2 из
штаммов CHIKV, использованных в этом исследовании. Название
штамма указано слева (S27, SEQ ID NO: 1, номер доступа
AF369024.2; SL15649, номер доступа GU189061; LR2006_OPY1, номер
доступа DQ443544.2; 99659, номер доступа KJ451624; RSU1, номер
доступа НМ045797.1; N1 64 1ЬН35, номер доступа НМ045786.1).
Номера над последовательностями соответствуют положению
аминокислот в зрелом белке Е2. Аминокислоты, идентичные
аминокислотам штамма S2 7, указаны пунктирной линией. Домены Е2,
определенные из кристаллической структуры гетеродимера Е2/Е1
CHIKV (Voss et al., 2010), представлены на диаграмме над
выравниванием последовательностей и кодируются цветом (синий:
домен А, фиолетовый: [3-ленточный соединительный элемент, зеленый:
домен В, розовый: домен С, темно-серый: области, не
присутствующие в кристаллической структуре). Положение остатков,
в которых замена на аланин нарушает связывание mAb, как
определяют посредством аланин-сканирующего мутагенеза,
обозначены кодируемыми цветом точками над выравниванием для каждого конкретного антитела. Остатки, которые влияют на
связывание множества антител, указаны квадратами, затененными серым цветом, причем чем более темной является тень серого цвета, тем на большее количество антител влияет замена на аланин данного остатка. (Фиг.1В) Положение остатков, требуемых для связывания mAb, картированных на кристаллической структуре зрелого гликопротеинового комплекса оболочки (PDB ID 3N41). Показан вид сбоку ленточного чертежа одного гетеродимера Е1/Е2, причем Е1 окрашен голубым цветом, а домены Е2 окрашены так, как на панели А. Боковые цепи аминокислот, требуемых для связывания антитела, показаны в качестве заполняющих пространство форм и кодируются цветом для каждого из 2 0 индивидуальных антител согласно легенде на панели А. Остатки, которые влияют на связывание множества антител, представлены в виде теней серого цвета, причем чем более темной является тень, тем на большее количество антител влияет замена на аланин в данном остатке
(легенда, показанная слева). (Фиг.1С) Вид сверху гетеродимера Е1/Е2, повернутого на 90° относительно структуры на фиг.1В.
Фиг.2А-В. Механизм нейтрализации посредством mAb человека против CHIKV. (Фиг.2А) Анализы нейтрализации до и после прикрепления. VRP SL15 64 9 (i) инкубировали с указанными mAb
(включая СНК-152, положительное контрольное mAb) при 4°С в течение 1 часа перед добавлением к предварительно охлажденным клеткам Vero, а затем не связавшийся вирус удаляли посредством трех промываний (до прикрепления; закрашенный круг), или (ii) им позволяли адсорбироваться на предварительно охлажденные клетки Vero при 4°С в течение 1 часа, а затем добавляли указанные mAb при 4°С в течение 1 часа (после прикрепления; незакрашенные круги). (Фиг.2В) Анализ FFWO. VRP SL15649 адсорбировали на предварительно охлажденные клетки Vero при 4°С в течение 1 часа, а затем добавляли указанные mAb (включая СНК-152, положительное контрольное mAb мыши) на 1 час. Не связавшийся вирус удаляли и клетки подвергали воздействию среды с низким содержанием рН (рН 5,5; закрашенные круги) при 37°С в течение 2 мин для запуска слияния вируса с плазматической мембраной. В качестве отрицательного контроля клетки подвергали воздействию среды с
нейтральным значением рН (рН 7,4; незакрашенные круги) при 37°С в течение 2 мин. Как для фиг.2А, так и для фиг.2В, клетки инкубировали при 37°С до 18 часов после инфицирования и GFP-положительные клетки количественно определяли с использованием флуоресцентной микроскопии. Данные объединены для двух независимых экспериментов, каждый из которых проводился в трех экземплярах.
Фиг.3A-D. Терапия посредством mAb человека против летальной инфекции CHIKV у мышей Ifnar'1'. (Фиг. ЗА) Мышам вводили 50 мкг указанного специфичного к CHIKV или контрольного mAb посредством внутрибрюшинной инъекции за 2 4 часа до летального заражения CHIKV (л=3-б мышей на исследуемое mAb) . (Фиг.ЗВ) Мышам вводили 50 мкг указанного специфичного к CHIKV или контрольного mAb посредством внутрибрюшинной инъекции через 2 4 часа после летального заражения CHIKV (л=4-б мышей на исследуемое mAb) . (Фиг.ЗС) Мышам вводили 250 мкг указанного специфичного к CHIKV или контрольного mAb посредством внутрибрюшинной инъекции через 48 часов после летального заражения CHIKV (л=7-10 мышей на исследуемое mAb) . (Фиг.3D) Мышам вводили 250 мкг указанной пары специфичных к CHIKV mAb или контрольное mAb посредством внутрибрюшинной инъекции через 60 часов после летального заражения CHIKV (л=8 мышей на исследуемую комбинацию mAb, за исключением 4J21 + 2H1, для которой л=3) . Для монотерапии посредством 4J21 или 4N12, вводили однократную дозу 500 мкг (л=4-5 мышей на исследуемое mAb).
Фиг.4. Папулезная сыпь в период острого проявления. Индивидуум поступил к участковому терапевту с лихорадкой (102°F) длительностью трое суток с одновременным развитием билатеральной боли в суставах локтей и пальцев и сыпью. Врач отметил выступающую, незудящую, угасающую папулезную сыпь (фотография представлена на фиг.) на спине, груди и животе.
Фиг.5. Идентификация групп конкурирующих mAb. Для отнесения mAb к группам конкуренции использовали количественное конкурентное связывание с использованием биослойной инферометрии на основе Octet. Наконечники биосенсора с антителами против
пента-His, покрытые иммобилизованным эктодоменом Е2 CHIKV-LR2006 погружали в лунки, содержавшие первичное mAb, а затем погружали в лунки, содержавшие конкурирующие mAb. Показанные величины представляют собой процентное связывание конкурирующего mAb в присутствии первого mAb (определенное посредством сравнения максимального сигнала конкурирующего mAb, внесенного после первого комплекса mAb, с максимальным сигналом конкурирующего mAb отдельно). MAb считали высоко конкурирующим за связывание с одним участком, если максимальное связывание конкурирующего mAb снижалось до <30% от его связывания без конкуренции (черные квадраты) или демонстрирующим частичную конкуренцию, если связывание конкурирующего mAb снижалось до <7 0% от его связывания без конкуренции (серые квадраты). Mab считали неконкурирующими, если максимальное связывание конкурирующего mAb составляло > 7 0% от его связывания без конкуренции (белые квадраты). Было идентифицировано четыре группы конкурентного связывания, указанных цветными рамками. Соответствующие основные антигенные участки для mAb, обнаруженные посредством аланин-сканирующего мутагенеза (таблица 1 и фиг.1А-С), обобщенно представлены в столбцах справа от матрицы конкуренции. DA указывает на домен A; DB указывает домен В, е указывает как на дугу 1, так и на дугу 2; NT означает, что тестирование не проводили; "не реагирует" указывает на то, что mAb не реагировало с белками оболочки дикого типа; "без снижения" указывает на то, что mAb связывалось с белками Е дикого типа, однако ни для какого мутанта не было отмечено воспроизводимого снижения. Данные объединены для одного эксперимента, причем для каждого mAb отдельно было несколько результатов считывания и для mAb в комбинации с каждым конкурирующим антителом был один результат считывания.
Фиг.бА-F. Картирование эпитопов mAb против CHIKV высокого разрешения. (А) Конструировали библиотеку аланин-сканирующих мутаций для белка оболочки CHIKV, охватывающую 910 мутаций Е2/Е1, где каждую аминокислоту индивидуально подвергали мутации на аланин. Каждая лунка каждого планшета, являющегося матрицей мутаций, содержит один мутант с определенной заменой.
Представлены репрезентативные результаты реактивности в 384-луночном планшете. В каждый планшет было включено восемь положительных (Е2/Е1 дикого типа) и восемь отрицательных
(имитирующая трансфекция) контрольных лунок. (В) Для картирования эпитопов клетки НЕК-2 93Т человека, экспрессирующие библиотеку мутаций оболочки CHIKV, исследовали в отношении иммунореактивности с использованием представляющего интерес MAb
(MAb 4G2 0, представленное в настоящем описании) и количественно определяли с использованием высокопроизводительного проточного цитометра Intellicyt. Первоначально идентифицировали клоны с реактивностью <30% относительно Е2/Е1 CHIKV дикого типа, но в то же время с > 7 0% реактивностью в отношении отличающегося MAb против Е2/ El CHIKV в качестве ключевых для связывания MAb. (С) Мутация четырех индивидуальных остатков снижала связывание 4G2 0
(красные столбики), но не влияла в значительной степени на связывание других зависимых от конформации MAb (серые столбики) или поликлонального антитела кролика (гРАЬ, подарок от IBT Bioservices). Столбики соответствуют среднему значению и диапазону для по меньшей мере двух повторяющихся точек данных.
(D) Эпитопы нейтрализующих MAb с PRNT50 <1000 нг/мл картированы на трехмерных кристаллических структурах Е2/Е1 (PDB Entry 2XFC). Все нейтрализуемые эпитопы картируются на открытых дистальных относительно мембраны доменах Е2/Е1. Для ясности каждая индивидуальная гетеродимерная субъединица Е2/Е1 показана отличающимся цветом. Высокоиммуногенные области в доменах А и В Е2, которые содержат ключевые остатки эпитопов для множества MAb, изображены красным цветом на единичной субъединице Е2.
Фиг.7. Структурный анализ остатков Е2, важных для связывания mAb, для антител, картированных на группах конкуренции. Положение остатков, требуемых для связывания mAb человека или мыши из различных групп конкуренции (фиг.1А-С), картированное на кристаллической структуре Е1/Е2 (PDB ID 2XFB). Пространственная модель тримера Е1/Е2, в которой Е1 окрашен белым цветом и каждый мономер Е2 окрашен светло-серым, темно-серым или черным. Остатки, требуемые для связывания антитела, кодируются цветом в соответствии с группой(ами) конкуренции, к
которой они относятся. Красным цветом указаны остатки D117 и 1121, которые требуются для связывания 5N2 3 и принадлежат к группе конкуренции 1. Синим цветом указаны остатки R80 и G253, которые требуются для связывания посредством 106 или 5М16, и принадлежат к группе конкуренции 2. Зеленым цветом указаны Q184, S185, 1190, V197, R198, Y199, G209, L210, Т212, и 1217, которые требуются для связывания посредством СНК-2 85, СНК-8 8 или ЗА2, и принадлежат к группе конкуренции 3. Оранжевым цветом указан остаток Н18, который требуется для связывания 5F19, и принадлежит к группе конкуренции 4. Фиолетовым цветом указаны остатки Е24, АЗЗ, L34, R36, V50, D63, F100, Т155, которые требуются для связывания посредством 5N2 3, СНК-8 4 или СНК-141, и принадлежат к группам конкуренции 1 и 2. Сине-зеленым цветом указаны остатки Т58, D59, D60, R68, 174, D77, Т191, N193 и К234, которые требуются для связывания посредством 1Н12 и принадлежат к группам конкуренции 2 и 3. Коричневым цветом указаны остатки D71, которые требуются для связывания посредством СНК-84 и 1Н12, и принадлежат к группам конкуренции 1, 2 и 3. Желтым цветом указаны остатки (Т58, D71, N72, 174, Р75, А76, D77, S118 и R119) которые составляют предполагаемый связывающий рецептор домен (RBD), за исключением остатка D71, который принадлежит к группам конкуренции 1, 2 и 3. На верхней панели показан общий вид тримера, на средней панели показан вид сбоку тримера под углом 4 5 градусов по оси х относительно структуры на верхней панели, и на нижней панели показан вид сбоку тримера под углом 4 5 градусов по оси х относительно структуры на средней панели.
Фиг.8. Механизм нейтрализации посредством двух mAb человека против CHIKV, 2Н1 или 4N12. Анализы нейтрализации до и после связывания. Репликонные частицы вируса (VRP) CHIKV штамма SL15649 (1) инкубировали с указанными mAb (2Н1 или 4N12) перед добавлением к предварительно охлажденным клеткам Vero, а затем не связавшийся вирус удаляли посредством трех промываний (до прикрепления; закрашенный круг), или (2) им позволяли адсорбироваться на предварительно охлажденные клетки Vero, а затем добавляли указанные mAb (после прикрепления; незакрашенные круги). Эти mAb осуществляли нейтрализацию при добавлении до или
после прикрепления.
Фиг.9. Модель острого заболевания на мышах В6.
Продуцированные СНО рекомбинантный антитела, введенные на 1 сутки, снижают уровень вируса в голеностопном суставе по сравнению с введением контрольного антитела на D+3. Эксперименты проводили на мышах WT в возрасте 4 недель после подкожной инокуляции 103 ФОЕ CHIKV-LR. Антитела вводили на D+1 и ткани собирали на D+3 для титрования посредством анализа подавления фокусообразования.
Фиг.10. Модель острого заболевания на мышах В6. mAb 4N12 против CHKV, продуцированное в клетках СНО, введенное системно на 3 сутки, снижает титр вируса в голеностопных суставах. Эксперименты проводили у мышей WT в возрасте 4 недель после подкожной инокуляции ЮеЗ ФОЕ CHIKV-LR. Антитела вводили на D+3 и ткани собирали на D+5 для титрования посредством анализа подавления фокусообразования.
Фиг.11. Модель хронического заболевания на мышах В6. mAb против CHKV, продуцированные в СНО, введенные системно на 3 сутки, снижают уровень геномных эквивалентов вируса на 2 8 сутки в голеностопных суставах. Эксперименты проводили у мышей WT в возрасте 4 недель после инокуляции ЮеЗ ФОЕ CHIKV-LR. Антитела (300 мкг) вводили D+3 и ткани собирали на D+28 для анализа посредством кОТ-ПЦР.
Фиг.12. Модель летального заболевания на мышах с нокаутом INFNAR. mAb против CHKV, продуцированные в клетках СНО, введенные системно через 60 часов после инфицирования, усиливают выживаемость. Эксперименты проводили у мышей IFNAR-/- в возрасте 4-5 недель после подкожной инокуляции ЮеЗ ФОЕ CHIKV-LR. Антитела вводили через 60 часов после инфицирования и наблюдали за смертностью в течение 21 суток.
Фиг.13. Кривые нейтрализации для продуцированных гибридомой ("старых") или рекомбинантных ("новых") специфичных к CHIKV mAb. Кривые нейтрализации строили для клеток ВНК21. 100 ФОЕ CHIKV-LR смешивали с указанными mAb в течение 1 ч при 37°С, а затем добавляли к клеткам ВНК21. Инфицирование определяли посредством
анализа подавления фокусообразования.
Фиг.14. Полумаксимальная эффективная ингибиторная
концентрация (ЕС50; нг/мл) для продуцированных гибридомой против продуцированных рекомбинантными клетками СНО антител. Данные являются сходными для продуцированных гибридомой относительно рекомбинантных антител.
Фиг.15. Выравнивание аминокислот и нуклеотидов для генов, которые кодируют белки как Е1, так и Е2. Номер доступа Genbank для белков приведен с штаммом вируса. Представлены три штамма для вирусов из прототипных групп: Восточной, Центральной, Южной Африки (ECSA), два для Азии и один западно-африканский штамм. Эти антитела перекрестно-реагируют со всеми штаммами.
ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Авторы изобретения выделили большую панель mAb человека, которые нейтрализуют инфекционность CHIKV в клеточной культуре и успешно лечили мышей Ifnar~/~ (лишенных рецепторов интерферона типа I), которым была инокулирована летальная доза CHIKV, даже при введении только через 60 часов после инфицирования. Они идентифицировали домен А Е2 в качестве основного антигенного центра для распознавания посредством mAb, которые широко нейтрализуют инфекцию CHIKV со сверхвысокой активностью, и продемонстрировали, что основным механизмом ингибирования является предотвращение слияния. Эти и другие аспекты изобретения описаны более подробно.
I. Чикунгунья и вирус чикунгунья
Болезнь чикунгунья представляет собой инфекцию, вызываемую вирусом чикунгунья. Она характеризуется внезапной лихорадкой, обычно длящейся от двух до семи суток, и болью в суставах, обычно длящейся недели или месяцы, но иногда годы. Уровень смертности составляет немного меньше 1 на 1000, причем пожилые люди имеют большую вероятность погибнуть. Вирус передается людям двумя видами комаров рода Aedes: A. albopictus и A. aegypti. Животные, являющиеся резервуаром вируса, включают обезьян, птиц, крупный рогатый скот и грызунов. Это отличает его от денге, для которого хозяевами являются только приматы.
Наилучшим средством предупреждения является общий контроль комаров и избегание укусов какими-либо инфицированными комарами. Отсутствует известное специфическое лечение, однако можно использовать медикаментозную терапию для уменьшения симптомов. Также могут быть полезны покой и введение жидкостей.
Инкубационный период заболевания чикунгунья составляет от двух до двенадцати суток, обычно от трех до семи. Симптомы развиваются у от 72 до 97% инфицированных индивидуумов. Симптомы включают внезапное начало, иногда двухфазную лихорадку, обычно длящуюся от нескольких суток до недели, иногда вплоть до десяти суток, обычно выше 39°С (102°F) и иногда достигающую 41°С (104°F), и выраженную боль или скованность в суставах, обычно длящуюся недели или месяца, но иногда длящуюся годы. Также могут присутствовать сыпь (обычно макулопапулезная), мышечная боль, головная боль, усталость, тошнота или рвота. Может присутствовать воспаление глаз в форме иридоциклита или увеита, и могут встречаться очаги повреждения в сетчатке. Как правило, лихорадка длится в течение двух суток, а затем резко внезапно прекращается. Однако головная боль, бессонница и чрезвычайная степень слабости длятся в течение варьирующего периода, обычно приблизительно от пяти до семи суток.
Наблюдения последних эпидемий показали, что чикунгунья может вызывать длительные симптомы после острой инфекции. В ходе вспышки La Reunion в 2006 году более 50% индивидуумов в возрасте выше 4 5 лет сообщали о длительной боли в скелетных мышцах, причем вплоть до 60% человек описывали длительную боль в суставах через три года после первоначального инфицирования. В исследовании привезенных случаев во Франции сообщалось, что 59% людей все еще страдали артралгией через два года после острой инфекции. После локальной эпидемии чикунгунья в Италии 66% человек сообщали о мышечной боли, боли в суставах или астении через один год после острой инфекции. Длительные симптомы не являются полностью новым наблюдением; длительный артрит наблюдали после вспышки в 197 9 году. Обычными прогностическими факторами длительных симптомов является более высокий возраст и
предшествующее ревматологическое заболевание. Причина этих хронических симптомов в настоящее время не полностью известна. Маркеры аутоиммунного или ревматоидного заболевания не были обнаружены у людей, сообщавших о хронических симптомах. Однако, некоторые данные, полученные для человека и из моделей на животных, указывают на то, что вирус чикунгунья может быть способен вызывать хронические инфекции у хозяина. Вирусный антиген был обнаружен в биоптате мышц людей, страдавших рецидивирующим эпизодом заболевания через три месяца после первоначального возникновения. Кроме того, вирусный антиген и РНК были обнаружены в синовиальных макрофагах одного человека в ходе рецидива скелетно-мышечного заболевания через 18 месяцев после первоначального инфицирования. Несколько моделей на животных также показали, что вирус чикунгунья может приводить к персистирующим инфекциям. В модели на мышах вирусная РНК обнаруживалась специфически в ассоциированной с суставами ткани в течение по меньшей мере 16 недель после инокуляции и ассоциировалась с хроническим синовитом. Аналогично, в другом исследовании сообщалось об обнаружении репортерного гена вируса в суставной ткани мышей в течение недель после инокуляции. В модели на не являющихся человеком приматах было обнаружено, что вирус чикунгунья персистирует в селезенке в течение по меньшей мере шести недель.
Вирус чикунгунья представляет собой альфавирус с геномом в
виде положительной одноцепочечной РНК размером приблизительно
11,6 т.п.н. Он является представителем комплекса вирусов леса
Семлики и является близкородственным вирусу реки Росс, вирусу
о'Нъонг-нъонг и вирусу леса Семлики. В США он классифицируется
как патоген с категорией приоритета С и работа с ним требует мер
предосторожности, соответствующих уровню биологической
безопасности III. Эпителиальные и эндотелиальные клетки человека, первичные фибробласты и происходящие из моноцитов макрофаги являются пермиссивными для вируса чикунгунья in vitro, и репликация вируса является высоко цитопатической, однако чувствительной к интерферону типа I и II. In vivo вирус чикунгунья по-видимому реплицируется в фибробластах, клетках
предшественниках скелетных мышц и мышечных волокнах.
Вирус чикунгунья представляет собой альфавирус, как и вирусы, которые вызывают восточный энцефалит лошадей и западный энцефалит лошадей. Чикунгунья обычно распространяется через укусы комаров A. aegypti, однако недавнее исследование в Pasteur Institute в Париже показало, что штаммы вируса чикунгунья при вспышке Reunion Island 2005-2006 года приобрели мутацию, которая способствовала передаче азиатскими тигровыми комарами {А. albopictus) .
Инфекция вирусом чикунгунья A. albopictus была вызвана точковой мутацией в генах оболочки вируса (Е1) . Усиленная передача вируса чикунгунья посредством A. albopictus могла означать увеличенный риск вспышек в других областях, где присутствует азиатский тигровый комар. Недавняя эпидемия в Италии, вероятно, передавалась A. albopictus. В Африке чикунгунья распространяется посредством лесного цикла, в котором вирус по большей части находится в других приматах между вспышками у человека.
При инфицировании вирусом чикунгунья фибробласты хозяина продуцируют интерферон 1 типа (альфа и бета). Мыши, которые лишены рецептора интерферона альфа, погибают в течение от двух до трех суток при воздействии 102 БОЕ вируса чикунгунья, в то время как мыши дикого типа выживают даже при воздействии 106 БОЕ вируса. В то же время мыши, которые имеют частичный дефицит интерферона 1 типа (IFN а/|3 +/-), имеют мягкое поражение и имеют такие симптомы, как мышечная слабость и летаргия. Partidos et al. (2011) увидели сходные результаты для живого ослабленного штамма CHIKV181/25. Однако вместо гибели, мыши с дефицитом интерферона 1 типа (IFN а/|3 -/-) временно инвалидизировались, и мыши с частичным дефицитом интерферона 1 типа не имели никаких проблем.
Было проведено несколько исследований для поиска вышележащих компонентов каскада интерферона 1 типа, вовлеченных в ответ хозяина на инфекцию чикунгунья. До настоящего времени никому не известен специфический для чикунгунья ассоциированный
с патогеном молекулярный паттерн. Тем не менее, было обнаружено, что важным фактором является IPS-1 - также известный как Cardif, MAVS и VISA. В 2011 году White et al. обнаружили, что ингибирование IPS-1 снижало фосфорилирование регулирующего интерферон фактора 3 (IRF3) и продукцию IFN-|3. В других исследованиях было обнаружено, что IRF3 и IRF7 являются важными в зависимости от возраста. Взрослые мыши, которые лишены оба из этих регуляторных факторов, погибают при инфицировании вирусом чикунгунья. Новорожденные, с другой стороны, погибают от вируса, если они имеют дефицит одного из этих факторов.
Чикунгунья противодействует ответу интерферона типа I посредством продуцирования NS2, неструктурного белка, который осуществляет деградацию RBP1 и выключает способность клетки-хозяина транскрибировать ДНК. NS2 препятствует каскаду передачи сигнала JAK-STAT и препятствует фосфорилированию STAT.
Стандартные лабораторные тесты на чикунгунья включают ОТ-ПЦР, выделение вируса и серологические тесты. Выделение вируса обеспечивает наиболее точный диагноз, однако его проведение отнимает от одной до двух недель и должно проводиться в лабораториях с уровнем III биологической безопасности. Способ вовлекает воздействие на конкретные клеточные линии образцов из цельной крови и идентификацию специфических для вируса чикунгунья ответов. ОТ-ПЦР с использованием гнездовых пар праймеров используют для амплификации нескольких специфических для чикунгунья генов из цельной крови. Результаты можно получить в течение от одних до двух суток.
Серологическая диагностика требует большего количества крови, чем другие способы, и в ней используется анализ ELISA для количественного определения уровней специфических для чикунгунья IgM. Для получения результатов требуется от двух до трех суток, и могут появляться ложноположительные результаты при инфицировании другими родственными вирусами, такими как вирус о'Нъонг-нъонг и вирус леса Семлики.
Дифференциальная диагностика может включать диагностику инфекций другими переносимыми комарами вирусами, таким как вирус
денге и гриппа. Хроническая рецидивирующая полиартралгия возникает по меньшей мере у 2 0% пациентов с чикунгунья через один год после инфицирования, в то время как при денге такие симптомы являются нечастыми.
В настоящее время специфическое лечение не доступно. Попытки смягчить симптомы включают применение NSAID, таких как напроксен или парацетамол (ацетаминофен), и жидкостей. Аспирин не рекомендуется. У индивидуумов с артритом в течение более чем двух недель может использоваться рибавирин. Эффект хлороквина неочевиден. По-видимому, он не помогает при остром заболевании, однако предварительные данные указывают на то, что он может помочь при хроническом артрите. Стероиды, по-видимому, тоже не являются полезными.
Чикунгунья по большей части присутствует в развивающихся странах. Эпидемиология чикунгунья связана с комарами, их средой и поведением человека. Адаптация комаров к изменяющемуся климату Северной Африки приблизительно 5000 лет назад вынудила их искать среду, где люди хранили воду. Впоследствии поселения человека и среда обитания комаров очень близко связаны. В периоды эпидемии люди являются резервуарами вируса. В другое время резервуарами служат обезьяны, птицы и другие позвоночные.
Описано три генотипа этого вируса: западно-африканский, восточно/центрально/южно-африканский и азиатский генотипы. Взрывная эпидемия в Индийском океане в 2005 году и на островах Тихого океана в 2011 году, а также в настоящее время в Америке, продолжают изменять распределение генотипов.
2 8 мая 2 009 года в Changwat Trang в Таиланде, где вирус является эндемичным, в местной больнице решили провести кесарево сечение инфицированной чикунгунья беременной мальчиком женщине, Khwanruethai Sutmueang, 28 лет, местной жительнице Trang, для предотвращения передачи от матери к плоду. Однако после рождения ребенка врачи обнаружили, что ребенок уже инфицирован вирусом и поместили его в отделение интенсивной терапии, поскольку инфекция оставила ребенка неспособным самостоятельно дышать или пить молоко. Врачи предположили, что вирус может быть способен передаваться от матери к плоду, но без лабораторного
подтверждения.
В декабре 2013 года чикунгунья была подтверждена на Карибском острове Святого Мартина с 6 6 подтвержденными случаями и приблизительно 181 предполагаемым случаем. Эта вспышка является первой в Западном полушарии, когда заболевание распространилось к человеку от популяции инфицированных комаров. К январю 2014 года, Public Health Agency of Canada сообщило, что случаи были подтверждены на британских Виргинских островах, Saint-Barthelemy, Guadeloupe, Dominica, Martinique, и французской Гайане. В апреле 2014 года Centers for Disease Control and Prevention (CDC) также подтвердили чикунгунья в Доминиканской республике. К концу апреля она распространилась всего на 14 стран, включая Ямайку, Сент-Люсию, Сент-Китс и Невис, и Гаити, где была объявлена эпидемия.
К концу мая 2 014 года в США было описано свыше десяти привезенных случаев вируса от людей, путешествующих во Флориду из регионов, где вирус является эндемичным. Штамм чикунгунья, распространившийся в США из Карибского бассейна, легче всего распространяется A. aegypti. Существует опасение, что этот штамм чикунгунья может мутировать, чтобы вектор A. albopictus стал более эффективным. Если эта мутация произойдет, чикунгунья может стать более опасным для здравоохранения США, поскольку А. albopictus или азиатский тигровый комар более широко распространен в США и является более агрессивным, чем А. aegypti.
В июне 2 014 года шесть случаев вируса было подтверждено в Бразилии: два в городе Кампинас штата Сан-Паулу. Эти шесть случаев представляли собой солдат бразильской армии, которые недавно вернулись с Гаити, где они участвовали в попытках преобразования в качестве членов United Nations Stabilisation Mission in Haiti. Информация была официально выпущена муниципалитетом Кампинаса, который считает, что предпринял соответствующие действия.
На 16 июня 2014 года, во Флориде всего было 42 случая. К 11 сентября 2 014 года количество описанных случаев в Пуэрто-Рико для этого года составило 1636. К 28 октября это количество
возросло до 2 97 4 подтвержденных случаев с более чем 10000 предполагаемых. 17 июня 2014 года Department of Health officials of the U.S. штата Миссисипи подтвердил, что они исследуют первый потенциальный случай у жителя Миссисипи, который недавно путешествовал на Гаити. 19 июня 2014 года вирус распространился в Джорджию, США. 2 4 июня 2 014 года был описан случай в Poinciana, Polk County, Флорида, США. 25 июня 2014 года Health Department of the U.S. штата Арканзас подтвердил, что один индивидуум в штате является носителем чикунгунья. 26 июня 2014 года случай был описан в мексиканском штате Халиско.
17 июля 2 014 года первый случай чикунгунья, приобретенный в США, был описан Centers for Disease Control and Prevention во Флориде. С 2 00 6 года, свыше 2 00 случаев было описано в США, но только у людей, которые путешествовали в другие страны. Это является первым случаем, когда вирус был передан комарами индивидууму на материке в США. 2 сентября 2014 года, Centers for Disease Control and Prevention сообщили, что произошло семь подтвержденных случаев чикунгунья в США у людей, которые приобретенный заболевание на местном уровне.
25 сентября 2014 года официальные представители Сальвадора сообщили о более чем 30000 подтвержденных случаях этой новой эпидемии. Эта новая эпидемия также усиливается на Ямайке и Барбадосе. Существует риск, что туристы в этих странах могут привезти вирус в их собственные страны. В ноябре 2 014 года Бразилия описала локальную передачу отличающегося штамма (генотипа) чикунгунья, который никогда не документировался в Америке. Он представляет собой африканский генотип, но, как ни странно, не было объяснено, является ли он южно-африканским или западно-африканским. Новый генотип (в Америке) является более тяжелым, чем азиатский генотип, который в настоящее время распространяется в Америке, и иммунитет к одному генотипу не сообщает иммунитета к другим. Французская Полинезия входит в число других регионов, в которых продолжается вспышка.
7 ноября 2 014 года было сообщено о вспышке чикунгунья в Мексике, приобретенной посредством локальной передачи, в южном штате Чьяпас. Вспышка распространяется по побережью от границы с
Гватемалой до соседнего штата Оахака. Органы здравоохранения сообщили о совокупной заболеваемости, составлявшей 39 лабораторно подтвержденных случаев (к концу недели 48). Не было описано случаев подозрения. В январе 2015 в Колумбии произошел 904 81 описанный случай чикунгунья.
II. Моноклональные антитела и их получение
А. Общие способы
Будет понятно, что моноклональные антитела, связывающиеся с вирусом чикунгунья, имеют несколько применений. Они включают изготовление диагностических наборов для применения для обнаружения и диагностики инфекции вирусом чикунгунья, а также для ее лечения. В этом контексте можно связывать такие антитела с диагностическими или терапевтическими средствами, использовать их в качестве средств для улавливания или конкурирующих агентов в конкурентном анализе, или использовать их индивидуально без добавления дополнительных связанных с ними средств. Антитела могут быть мутантными или модифицированными, как дополнительно рассмотрено ниже. Способы получения и охарактеризации антител хорошо известны в данной области (см., например, Antibodies: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; патент США 4196265).
Способы получения моноклональных антител (MAb), как правило, начинаются аналогично получению поликлональных антител. Первой стадией обоих из этих способов является иммунизация соответствующего хозяина или идентификация индивидуумов, которые являются иммунными вследствие предшествующей естественной инфекции. Как хорошо известно в данной области, данная композиция для иммунизации может варьироваться по ее иммуногенности. Таким образом, часто является необходимым усиление иммунной системы хозяина, что может быть достигнуто путем связывания пептидного или полипептидного иммуногена с носителем. Иллюстративными и предпочтительными носителями являются гемоцианин лимфы улитки (KLH) и бычий сывороточный альбумин (BSA). Также в качестве носителей можно использовать другие альбумины, такие как овальбумин, сывороточный альбумин мыши или сывороточный альбумин кролика. Средства для конъюгации
полипептида с белком-носителем хорошо известны в данной области
и включают глутаральдегид, м-малеимидобенкоил-N-
гидроксисукцинимидный эфир, карбодиимид и бис-биазотированный бензидин. Как также хорошо известно в данной области, иммуногенность конкретной иммуногенной композиции может быть усилена с использованием неспецифических иммуностимуляторов иммунного ответа, известных как адъюванты. Иллюстративные и предпочтительные адъюванты включают полный адъювант Фрейнда (неспецифический стимулятор иммунного ответа, содержащий убитые Mycobacterium tuberculosis), неполный адъювант Фрейнда и адъювант на основе гидроксида алюминия.
Количество иммуногенной композиции, используемой для получения поликлональных антител, варьируется в зависимости от природы иммуногена, а также от животного, используемого для иммунизации. Для доставки иммуногена можно использовать различные пути (подкожный, внутримышечный, внутрикожный, внутривенный и внутрибрюшинный). Мониторинг продукции поликлональных антител можно осуществлять путем взятия образца крови иммунизированного животного в различные моменты времени после иммунизации. Также можно проводить вторую усиливающую инъекцию. Процесс усиления и титрования повторяют до тех пор, пока не достигнут подходящего титра. Когда достигают желаемого уровня иммуногенности, у иммунизированного животного можно проводить взятие крови и сыворотку выделять и хранить, и/или животное можно использовать для получения MAb.
После иммунизации соматические клетки, обладающие потенциалом к продукции антител, в частности В-лимфоциты (В-клетки), отбирают для применения в протоколе получения MAb. Эти клетки можно получать путем биопсии из селезенки или лимфатических узлов, или из циркулирующей крови. Затем продуцирующие антитела В-лимфоциты иммунизированного животного подвергают слиянию с клетками бессмертной линии миеломы, как правило, того же вида животных, что и животное, что иммунизировали, или клетками человека или химерными клетками человека/мыши. Миеломные клеточные линии, пригодные для применения в методиках слияния для получения гибридом,
предпочтительно являются не продуцирующими антитела, обладающими высокой эффективностью слияния и имеющими дефицит ферментов, который делает их неспособными расти в определенных селективных средах, которые поддерживают рост только желаемых слитых клеток
(гибридомы). Можно использовать любые из ряда миеломных клеток, как известно специалистам в данной области (Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp. 75-83, 1984) .
Способы получения гибридов продуцирующих антитела клеток селезенки или клеток лимфатических узлов и миеломных клеток обычно включают смешение соматических клеток с миеломными клетками в соотношении 2:1, хотя это соотношение может варьироваться от приблизительно 20:1 до приблизительно 1:1, соответственно, в присутствии средства или средств (химических или электрических), которые стимулируют слияние клеточных мембран. Способы слияния с использованием вируса Сендай описаны Kohler and Milstein (1975; 1976), и способы слияния с использованием полиэтиленгликоля (PEG), такого как 37% (об./об.) PEG, описаны Gefter et al. (1977) . Также является пригодным использование способов электрически индуцируемого слияния
(Goding, pp. 71-74, 1986) . Методики слияния обычно продуцируют жизнеспособные гибрид с низкой частотой приблизительно от 1x10-6 до 1х10~8. Однако это не является проблемой, поскольку жизнеспособные слитые гибриды отделяют от родительских неслитых клеток (в частности, неслитых клеток миеломы, которые обычно продолжают делиться неопределенно долго) путем культивирования в селективной среде. Селективная среда обычно представляет собой среду, которая содержит средство, которое блокирует синтез нуклеотидов de novo в среде для культивирования тканей. Иллюстративными и предпочтительными средствами являются аминоптерин, метотрексат и азасерин. Аминоптерин и метотрексат блокируют синтез de novo как пуринов, так и пиримидинов, в то время как азасерин блокирует только синтез пуринов. Когда используют аминоптерин или метотрексат, среду дополняют гипоксантином и тимидином в качестве источника нуклеотидов
(среда HAT) . Когда используют азасерин, среду дополняют
гипоксантином. Уабаин добавляют, если источником В-клеток является трансформированная вирусом Эпштейна-Барр (EBV) линия В-клеток человека, для устранения трансформированных EBV линий, которые не слились с миеломой.
Предпочтительной селективной средой является HAT или HAT с уабаином. В среде HAT могут выжить только клетки, способные задействовать пути реутилизации нуклеотидов. Миеломные клетки имеют дефект ключевых ферментов реутилизационного пути, например, гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), и они не могут выжить. В-клетки могут задействовать этот путь, однако они имеют ограниченную продолжительность жизни в культуре и обычно погибают в течение приблизительно двух недель. Таким образом, единственными клетками, которые могут выжить в селективной среде, являются гибриды, образованные из клеток миеломы и В-клеток. Когда источником В-клеток, используемых для слияния, является линия трансформированных EBV В-клеток, как в данном случае, также для лекарственной селекции гибридов можно использовать уабаин, поскольку трансформированные EBV В-клетки являются подвержены уничтожению этим лекарственным средством, в то время как используемый миеломный партнер выбирают так, чтобы он был резистентным к уабаину.
Культивирование обеспечивает популяцию гибридом, из которых
отбирают специфические гибридомы. Как правило, селекцию гибридом
проводят путем культивирования клеток посредством разбавления до
единичных клонов в микропланшетах для титрования с последующим
исследованием супернатантов индивидуальных клонов
(приблизительно через от двух до трех недель) в отношении желаемой реактивности. Анализ должен быть чувствительным, простым и быстрым, такой как радиоиммунный анализ, ферментный иммуноанализ, анализ цитотоксичности, анализ бляшкообразования, дот-блоттинг и т.п. Затем отобранные гибридомы подвергают серийному разведению и единичные клетки сортируют посредством проточно-цитометрической сортировки и клонируют в индивидуальные продуцирующие антитела клеточные линии, и эти клоны затем можно неограниченно увеличивать в количестве с получением mAb. Клеточные линии можно исследовать в отношении продукции MAb
двумя основными путями. Образец гибридомы можно инъецировать (часто в брюшную полость) животному (например, мыши). Необязательно, животным предварительно вводят углеводород, особенно масла, такие как пристан (тетраметилпентадекан) перед инъекцией. Когда таким образом используют гибридомы человека, является оптимальным инъецирование мышам с иммунодефицитом, таким как мыши SCID, для предотвращения отторжения опухоли. У животных после инъекции развиваются опухоли, секретирующие специфическое моноклональное антитело, продуцируемое гибридом слитых клеток. Затем жидкости организма животного, такие как сыворотка или асцитная жидкость, можно отбирать для получения MAb в высокой концентрации. Индивидуальные клеточные линии также можно культивировать in vitro, где Mab естественным образом секретируются в культуральную среду, из которых их можно получать без труда в высоких концентрациях. Альтернативно гибридомные клеточные линии человека можно использовать in vitro для получения иммуноглобулинов в клеточном супернатанте. Клеточные линии могут быть адаптированы для роста в бессывороточной среде для оптимизации возможности выделения моноклональных иммуноглобулинов человека, имеющих высокую чистоту.
MAb, продуцированные любым из способом, можно очищать далее, если желательно, с использованием фильтрации, центрифугирования и различных хроматографических способов, таких как FPLC или аффинная хроматография. Фрагменты моноклональных антител по изобретению можно получать из очищенных моноклональных антител способами, которые включают расщепление ферментами, такими как пепсин или папаин, и/или расщепление дисульфидных связей посредством химического восстановления. Альтернативно фрагменты моноклональных антител, охватываемые настоящим изобретением, можно синтезировать с использованием автоматизированного устройства для синтеза пептидов.
Также предусматривается, что для получения моноклональных антител можно использовать подход молекулярного клонирования. Для этого РНК можно выделять из гибридомной линии и гены антител получать посредством ОТ-ПЦР и клонировать в экспрессирующий
вектор для иммуноглобулинов. Альтернативно из РНК, выделенной из клеточных линий, получают комбинаторные фагмидные библиотеки иммуноглобулинов, и фагмиды, экспрессирующие антитела, отбирают посредством сортировки с использованием вирусных антигенов. Преимущества этого подхода над общепринятыми способами гибридом состоят в том, что приблизительно 104 антител можно продуцировать и подвергать скринингу за один раунд и что новой специфичности достигают посредством комбинирования Н- и L-цепей, что далее повышает вероятность нахождения подходящих антител.
Другие патенты США, каждый из которых включен в качестве ссылки, в которых описано получение антител, пригодных в рамках настоящего изобретения, включают патент США 5565332, в котором описано получение химерных антител с использованием комбинаторного подхода; патент США 48165 67, в котором описаны рекомбинантные препараты иммуноглобулинов; и патент США 4 8 67973, в котором описаны конъюгаты антитело-лекарственное средство.
В. Антитела по настоящему изобретению
Антитела согласно настоящему изобретению могут определяться, в первом случае, их специфичностью связывания, которая в данном случае направлена на гликопротеин вируса чикунгунья (GP). Специалисты в данной области, посредством оценки специфичности/аффинности связывания данного антитела с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области, могут определить, входят ли такие антитела в объем настоящей формулы изобретения. В одном аспекте предусматриваются моноклональные антитела, имеющие парные CDR клонов из тяжелых и легких цепей, проиллюстрированных в таблицах 3 и 4, соответственно. Такие антитела можно получать с использованием клонов, описанных ниже в разделе "Примеры", с использованием способов, описанных в настоящем описании.
Во втором аспекте антитела могут определяться их
вариабельной последовательностью, которая включает
дополнительные "каркасные" области. Они предоставлены в таблицах 1 и 2, в которых представлены или отображены полные вариабельные области. Более того, последовательности антител можно изменять относительно этих последовательностей, необязательно с
использованием способов, более подробно описанных ниже.
Например, последовательности нуклеиновых кислот могут отличаться
от последовательностей, указанных выше, тем, что (а)
вариабельные области могут быть отделены от константных доменов
легкой и тяжелой цепей, (Ь) нуклеиновые кислоты могут отличаться
от нуклеиновых кислот, описанных выше, без влияния на остатки,
кодируемые ими, (с) нуклеиновые кислоты могут отличаться от
нуклеиновых кислот, описанных выше, с данным процентом
гомологии, например, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%,
94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, (d) нуклеиновые кислоты могут
отличаться от нуклеиновых кислот, описанных выше, способностью
гибридизоваться в условиях высокой жесткости, иллюстрируемых
условиями низкого содержания соли и/или высокой температуры,
обеспечиваемых от приблизительно 0,02 М до приблизительно 0,15 М
NaCl при температурах от приблизительно 50°С до приблизительно
70°С, (е) аминокислоты могут отличаться от аминокислот, указанных
выше, с данным процентом гомологии, например, 80%, 85%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, или (f)
аминокислоты могут отличаться от аминокислот, указанных выше,
вследствие допущения консервативных замен (рассмотренных ниже).
Каждое из вышеуказанных положений применимо к
последовательностям нуклеиновых кислот, указанным в таблице 1, и аминокислотным последовательности, приведенным в таблице 2.
С. Модификация способами инженерии последовательностей антител
В различных вариантах осуществления можно выбирать
модификацию способами инженерии последовательностей
идентифицированных антител по различным причинам, таким как повышенная экспрессия, повышенная перекрестная реактивность или сниженное неспецифическое связывание. Ниже приводится общее обсуждение соответствующих способов модификации антител способами инженерии.
Гибридомы можно культивировать, затем клетки можно подвергать лизису и экстрагировать тотальную РНК. Случайные гексамеры можно использовать с RT для получения кДНК-копий РНК,
а затем можно проводить ПЦР с использованием мультиплексной смеси праймеров ПЦР, которые предположительно будут амплифицировать все последовательности генов вариабельных областей человека. Продукт ПЦР можно клонировать в вектор pGEM-T Easy, а затем секвенировать посредством автоматизированного ДНК-секвенирования с использованием стандартных праймеров для вектора. Анализ связывания и нейтрализации можно проводить с использованием антител, собранных из супернатантов гибридом, и очищать посредством FPLC с использованием колонок с белком G.
Рекомбинантные полноразмерные IgG-антитела можно получать путем субклонирования ДНК Fv тяжелой и легкой цепей из клонирующего вектора в плазмидный вектор для IgG, трансфицировать в клетки 2 93 Freestyle или клетки СНО, и антитела собирать и очищать из супернатанта клеток 2 93 или СНО.
Быстрая доступность антитела, продуцируемого в той же клетке-хозяине и в том же процессе культивирования клеток, что и конечный процесс производства cGMP, имеет потенциал к снижению длительности программ разработки процесса. Lonza разработали общий способ с использованием объединенных трансфектантов, выращенных в среде CDACF, для быстрого продуцирования небольших количеств (вплоть до 50 г) антител в клетках СНО. Хотя это является несколько более медленным, чем истинная временная система, преимущества включают более высокую концентрацию продукта и использование того же хозяина и процесса, что и в случае клеточной линии для продукции. Пример роста и продуктивности совокупностей GS-CHO, экспрессирующих модельное антитело, в одноразовом биореакторе: в культуре в одноразовом биореакторе в виде мешка (рабочий объем 5 л) , работающем в режиме периодического культивирования с подпиткой, была достигнута концентрация антитела 2 г/л в пределах 9 недель после трансфекции.
Молекулы антител включают фрагменты (такие как F(ab'), F(ab')2)/ которые продуцируются, например, посредством протеолитического расщепления mAb, или одноцепочечные иммуноглобулины, продуцируемые, например, рекомбинантными
способами. Такие производные антител являются одновалентными. В одном варианте осуществления такие фрагменты можно комбинировать друг с другом или с другими фрагментами антител или лигандами рецепторов с получением "химерных" связывающих молекул. Важно, что такие химерные молекулы могут содержать заместители, способные связываться с различными эпитопами одной молекулы.
В родственных вариантах осуществления антитело представляет
собой производное описанных антител, например, антитело,
содержащее последовательности CDR, идентичные
последовательностям CDR описанных антител (например, химерного антитела или антитела с пересаженными CDR) . Альтернативно может быть желательным внесение модификаций, такое как внесение консервативных изменений в молекулу антитела. При внесении таких изменений можно учитывать гидропатический индекс аминокислот. Важность гидропатического индекса аминокислот для сообщения белку биологической функции взаимодействия в общем понятна в данной области (Kyte and Doolittle, 1982). Является общепризнанным, что относительный гидропатический характер аминокислоты вносит вклад во вторичную структуру конечного белка, что в свою очередь определяет взаимодействие белка с другими молекулами, например, ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антителами, антигенами и т.п.
Также в данной области понятно, что замену сходных аминокислот можно проводить эффективно на основе гидрофильности. В патенте США 4554101, включенном в настоящем описании в качестве ссылки, утверждается, что наибольшая локальная средняя гидрофильность белка, определяемая гидрофильностью его соседних аминокислот, коррелирует с биологическим свойством белка. Как подробно описано в патенте США 4554101, аминокислотным остаткам были приписаны следующие значения гидрофильности: основные аминокислоты: аргинин (+3,0), лизин (+3,0) и гистидин (-0,5); кислотные аминокислоты: аспартат (+3,0 ± 1), глутамат (+3,0 ± 1), аспарагин (+0,2) и глутамин (+0,2); гидрофильные неионные аминокислоты: серии (+0,3), аспарагин (+0,2), глутамин (+0,2) и треонин (-0,4), содержащие серу саминокислоты: цистеин (-1,0) и
метионин (-1,3); гидрофобные неароматические аминокислоты: валин (-1,5), лейцин (-1,8), изолейцин (-1,8), пролин (-0,5 ± 1), аланин (-0,5) и глицин (0); гидрофобные ароматические аминокислоты: триптофан (-3,4), фенилаланин (-2,5) и тирозин (2,3) .
Понятно, что аминокислота может быть заменена другой аминокислотой, имеющей сходную гидрофобность, и может быть получен биологически или иммунологически модифицированный белок. При таких изменениях предпочтительной является замена аминокислот, у которых величины гидрофильности находятся в пределах ±2, особенно предпочтительной является замена аминокислот с величиной в пределах ±1 и еще более предпочтительной является замена аминокислот с величиной в пределах ±0,5.
Как описано выше, аминокислотные замены обычно основаны на относительном сходстве заместителей боковых цепей аминокислот, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и т.п. Иллюстративные замены, учитывающие различные вышеуказанные характеристики, хорошо известны специалистам в данной области и включают: аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серии и треонин; глутамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин.
Настоящее изобретение также относится к модификации изотипов. Посредством модификации Fc-области для того, чтобы она имела отличающийся изотип, можно обеспечивать различную функциональность. Например, изменение в IgGi может повышать антителозависимую клеточную цитотоксичность, переключение на класс А может улучшить распределение в тканях и переключение на класс М может повысить валентность.
Модифицированные антитела можно получать любым способом, известным специалистам в данной области, включая экспрессию стандартными молекулярно-биологическими способами или химический синтез полипептидов. Способы рекомбинантной экспрессии описаны в настоящем описании.
D. Одноцепочечные антитела
Одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) представляет
собой слитую конструкцию вариабельных областей тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, связанных коротким (обычно серии, глицин) линкером. Эта химерная молекула сохраняет специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на удаление константных областей и внесение линкерного пептида. Эта модификация обычно оставляет специфичность неизмененной. Эти молекулы исторически создавали для облегчения фагового дисплея, когда является в высокой степени удобной экспрессия антигенсвязывающего домена в качестве единого пептида. Альтернативно scFv можно создавать непосредственно из субклонированных тяжелых и легких цепей, происходящих из гибридомы. Одноцепочечные вариабельные фрагменты лишены константной Fc-области, присутствующей в полных молекулах антител и, таким образом, для очистки антител используются распространенные участки связывания (например, белок A/G) . Эти фрагменты часто можно очищать/иммобилизовывать с использованием белка L, поскольку белок L взаимодействует с вариабельной областью легких цепей каппа.
Гибкие линкеры, как правило, состоят из обеспечивающих спираль и поворот аминокислотных остатков, таких как аланин, серии и глицин. Однако также могут функционировать другие остатки. Tang et al. (1996) использовали фаговый дисплей в качестве средства быстрой селекции оптимизированных линкеров для одноцепочечных антител (scFv) из библиотек белковых линкеров. Была сконструирована случайная библиотека линкеров, в которой гены для вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей были связаны сегментом, кодирующим пептид из 18 аминокислот с переменным составом. Репертуар scFv (приблизительно 5x106 различных представителей) был экспонирован на нитчатом фаге и подвергнут аффинной селекции с использованием гаптена. Популяция отобранных вариантов демонстрировала значительное повышение активности связывания, но сохраняла значительное разнообразие последовательностей. Скрининг 1054 индивидуальных вариантов впоследствии обеспечил каталитически активный scFv, который эффективно продуцировался в растворимой форме. Анализ последовательности выявил консервативный пролин в линкере через
два остатка после С-конца VH и множество остатков аргинина и пролина в других положениях в качестве единственных общих признаков отобранных связывающих структур.
Рекомбинантные антитела по настоящему изобретению также могут вовлекать последовательности или части, которые обеспечивают димеризацию или мультимеризацию рецепторов. Такие последовательности включают последовательности, происходящие из IgA, которые позволяют образование мультимеров совместно с J-цепью. Другим доменом мультимеризации является домен димеризации Gal4. В других вариантах осуществления цепи могут быть модифицированы такими средствами, как биотин/авидин, которые позволяют комбинирование двух антител.
В отдельных вариантах осуществления одноцепочечное антитело можно получать путем связывания легких и тяжелых цепей рецептора с использованием непептидного линкера или химической структуры. Как правило, легкие и тяжелые цепи продуцируют в различных клетках, очищают, а затем связывают вместе соответствующим образом (т.е. N-конец тяжелой цепи связан с С-концом легкой цепи через соответствующий химический мостик).
Сшивающие реагенты используют для формирования молекулярных мостиков, которые связывают функциональные группы двух различных молекул, например, стабилизирующего и коагулирующего средства. Однако предусматривается, что можно создавать димеры или мультимеры одного аналога или гетеромерные комплексы, состоящие из различных аналогов. Для связывания двух различных соединений пошаговым образом можно использовать гетеробифункциональные линкеры, которые устраняют нежелательное образование гомополимера.
Иллюстративный гетеробифункциональный сшивающий линкер содержит две реакционноспособных группы: одна реагирует с группой первичного амина (например, N-гидроксисукцинимид), а другая реагирует с тиольной группой (например, пиридилдисульфид, малеинимиды, галогены и т.д.). Через реакционноспособную группу первичного амина сшивающий линкер может реагировать с остатком(ами) лизина на белке (например, выбранное антитело или фрагмент) и через тиольную реакционноспособную группу сшивающий
линкер, уже связанный с первым белком, реагирует с остатком цистеина (свободная сульфгидрильная группа) другого белка (например, селективный агент).
Предпочтительно использование сшивающего линкера,
обладающего приемлемой стабильностью в крови. Известны многочисленные типы содержащих дисульфидную связь линкеров, которые можно успешно использовать для конъюгации нацеливающих и терапевтических/профилактических средств. Линкеры, которые содержат дисульфидную связь, доступ к которой пространственно затруднен, могут оказаться обеспечивающими более высокую стабильность in vivo, препятствуя высвобождению нацеливающего пептида до достижения области действия. Таким образом, линкеры являются одной группой связывающих агентов.
Другим сшивающим реагентом является SMPT, который представляет собой бифункциональный сшивающий линкер, содержащий дисульфидную связь, доступ к которой "пространственно затрудняет" соседнее бензольной кольцо и метильные группы. Полагают, что пространственное препятствие доступа к дисульфидной связи выполняет функцию защиты связи от атаки тиолатными анионами, такими как глутатион, которые могут присутствовать в тканях и крови, и, тем самым, помогает препятствовать расщеплению конъюгата до доставки связанного средства в заданную область.
Сшивающий реагент SMPT, также как и многие другие сшивающие реагенты, обладает способностью сшивать функциональные группы, такие как SH цистеина или первичные амины (например, эпсилон аминогруппа лизина). Другой возможный тип сшивающего линкера включает гетеробифункциональные фотореактивные фенилазиды, содержащие расщепляемую дисульфидную связь, такие как сульфосукцинимидил-2-(п-азидосалициламидо)этил-1,3'-дитиопропионат. N-гидроксисукцинимидильная группа реагирует с первичными аминогруппами и фенилазид (при фотолизе) неселективно реагирует с любым аминокислотным остатком.
В дополнение к сшивающим линкерам, доступ к которым затруднен, также можно использовать линкеры в соответствии с настоящим изобретением можно использовать линкеры, доступ к
которым не затруднен. Другие пригодные сшивающие линкеры, не считающиеся содержащими или образующими дисульфид, доступ к которому затруднен, включают SATA, SPDP и 2-иминотиолан (Wawrzynczak & Thorpe, 1987) . Использование таких сшивающих линкеров хорошо понятно в данной области. Другой вариант осуществления вовлекает использование гибких линкеров.
В патенте США 4 68 033 8 описаны бифункциональные линкеры, пригодные для получения конъюгатов лигандов с аминосодержащими полимерами и/или белками, особенно для получения конъюгатов антител с хелаторами, лекарственными средствами, ферментами, поддающимися обнаружению метками и т.п. В патентах США 5141648 и 5563250 описаны расщепляемые конъюгаты, содержащие неустойчивую связь, расщепляемую в различных мягких условиях. Этот линкер является особенно пригодным, поскольку представляющее интерес средством может быть связано непосредственно с линкером, причем расщепление приводит к высвобождению активного средства. Конкретные применения включают добавление свободной амино или свободной сульфгидрильной группы к белку, такому как антитело или лекарственное средство.
В патенте США 5856456 описаны пептидные линкеры для применения для связывания полипептидных компонентов для получения слитых белков, например, одноцепочечных антител. Линкер имеет длину вплоть до приблизительно 50 аминокислот, содержит по меньшей мере одну заряженную аминокислоту (предпочтительно аргинин или лизин), за которой следует пролин, и характеризуется более высокой стабильностью и сниженной агрегацией. В патенте США 5880270 описаны аминоокси-содержащие линкеры, пригодные для различных иммунодиагностических способов и способов разделения.
Е. Интраантитела
В конкретном варианте осуществления антитело представляет собой рекомбинантное антитело, которое является пригодным для действия внутри клетки - такие антитела известны как "интраантитела". Эти антитела могут препятствовать функции мишени посредством различных механизмов, например, посредством изменения внутриклеточного транспорта белков, препятствования
ферментативной функции и блокирования взаимодействий белок-белок или белок-ДНК. Во многом их структуры имитируют или сходны со структурами одноцепочечных и однодоменных антител, описанных выше. Действительно, единый транскрипт/единая цепь является важным признаком, который позволяет внутриклеточную экспрессию в клетке-мишени, а также делает транспорт белка через клеточные мембраны более осуществимым. Однако требуются дополнительные признаки.
Двумя основными ограничениями, влияющими на реализацию
терапевтического средства на основе интраантитела, являются
доставка, включая нацеливание в клетку/ткань и стабильность. Что
касается доставки, используют различные подходы, такие как
направленная на ткань доставка, использование специфических для
типа клеток промоторов, доставка на вирусной основе и
использование обеспечивающих клеточную
проницаемость/транслокацию через мембрану пептидов. Что касается
стабильности, подход обычно состоит либо в скрининге посредством
перебора, включая способы, которые вовлекают фаговый дисплей и
могут включать созревание последовательностей или разработку
консенсусных последовательностей, или более направленные
модификации, такие как встраивание стабилизирующих
последовательностей (например, Fc-областей, последовательностей белков-шаперонов, лейциновых молний) и замену/модификацию дисульфида.
Дополнительным признаком, который может потребоваться для интраантител, является сигнал для внутриклеточного нацеливания. Векторы, которые могут нацеливать интраантитела (или другие белки) в субклеточные области, такие как цитоплазма, ядро, митохондрии и ER, были сконструированы и являются коммерчески доступными (Invitrogen Corp.; Persic et al., 1997).
Вследствие их способности входить в клетки, интраантитела имеют дополнительные применения, которые не могут быть достигнуты с помощью других типов антител. В случае антител по настоящему изобретению, способность к взаимодействию с цитоплазматическим доменом MUC1 в живой клетке может препятствовать функциям, ассоциированным с CD MUC1, таким как
функции передачи сигнала (связывание с другими молекулами) или образование олигомера. В частности, предусматривается, что такие антитела можно использовать для ингибирования образования димера MUC1.
F. Очистка
В определенных вариантах осуществления антитела по
настоящему изобретению могут быть очищенными. Термин
"очищенный", как используют в рамках изобретения, относится к
композиции, изолированной от других компонентов, где белок
очищен до любой степени относительно его природного состояния.
Таким образом, очищенный белок также относится к белку,
свободному от среды, в которой он может встречаться в природе.
Когда используют термин "по существу очищенный" это обозначение
относится к композиции, в которой белок или пептид образует
основной компонент композиции, например, составляет
приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 7 0%, приблизительно 8 0%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или более от белков в композиции.
Способы очистки белков хорошо известны специалистам в
данной области. Эти способы вовлекают, на одном уровне,
предварительное фракционирование клеточной среды на
полипептидные и неполипептидные фракции. После отделения
полипептида от других белков представляющий интерес полипептид
можно далее очищать с использованием хроматографических и
электрофоретических способов для достижения частичной или полной
очистки (или очистки до однородности). Аналитическими способами,
особенно пригодными для получения чистого пептида, являются
ионообменная хроматография, эксклюзионная хроматография;
полиакриламидный гель-электрофорез; изоэлектрическое
фокусирование. Другие способы очистки белков включают преципитацию с сульфатом аммония, PEG, антитела и т.п. или тепловую денатурацию, а затем центрифугирование; гель-фильтрацию, обращено-фазовую хроматографию, хроматографию с гидроксилапатитом и аффинную хроматографию; и комбинации таких и других способов.
При очистке антитела по настоящему изобретению может быть
желательной экспрессия полипептида в прокариотической или эукариотической экспрессирующей системе и экстракция белка с использованием денатурирующих условий. Полипептид можно очищать от других клеточных компонентов с использованием аффинной колонки, с которой связывается меченая часть полипептида. Как общеизвестно в данной области, предполагается, что порядок проведения различных стадий очистки можно изменять или что определенные стадии можно исключать и все еще достигать подходящего способа получения по существу очищенного белка или пептида.
Часто полные антитела фракционируют с использованием средств (т.е. белка А), которые связывают Fc-часть антитела. Альтернативно антигены можно использовать для одновременной очистки и селекции соответствующих антител. В таких способах часто используется селективное средство, связанное с подложкой, такой как колонка, фильтр или гранулы. Антитела связываются с подложкой, примеси удаляют (например, смывают) и антитела высвобождают путем применения определенных условий (соль, нагревание и т.д.).
Различные способы количественного определения степени очистки белка или пептида будут известны специалистам в данной области с учетом настоящего изобретения. Они включают, например, определение удельной активности активной фракции или оценку количества полипептидов во фракции посредством анализа SDS/PAGE. Другим способом оценки чистоты фракции является вычисление удельной активности фракции, сравнения ее с удельной активностью первоначального экстракта и, таким образом, вычисление степени чистоты. Фактические единицы, используемые для обозначения величины активности, безусловно, зависят от конкретного способа анализа, выбранного для отслеживания очистки и того, демонстрирует ли экспрессируемый белок или пептид поддающуюся обнаружению активность.
Известно, что миграция полипептида может варьироваться, иногда значительно, в зависимости от условий SDS/PAGE (Capaldi et al. , 1977) . Таким образом, будет понятно, что в различных условиях электрофореза кажущаяся молекулярная масса очищенных
или частично очищенных продуктов экспрессии может варьироваться.
III. Активная/пассивная иммунизация и
лечение/предупреждение инфекции чикунгунья
А. Составление и введение
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитела против вируса чикунгунья и антигены для их получения. Такие композиции содержат профилактически или терапевтически эффективное количество антитела или его фрагмента, или пептидного иммуногена, и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретном варианте осуществления термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или приведенный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и более конкретно у человека. Термин "носитель" относится к разбавителю, эксципиенту или наполнителю, с которыми вводят терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. В частности, вода является носителем, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Также в качестве жидких носителей можно использовать солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, в частности, для инъекционных растворов. Другие подходящие фармацевтические эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерин моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п.
Если желательно, композиция также может содержать небольшие количества смачивающих средств или эмульгаторов или рН-буферных средств. Эти композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и т.п. Пероральные составы могут включать стандартные носители, такие как маннит, лактоза,
крахмал, стеарат магния, сахаринат натрия, целлюлоза, магний
карбонат, и т.д. фармацевтической категории. Примеры подходящих
фармацевтических средств описаны в "Remington's Pharmaceutical
Sciences". Такие композиции содержат профилактически или
терапевтически эффективное количество антитела или его
фрагмента, предпочтительно в очищенной форме, вместе с
подходящим количеством носителя, чтобы обеспечить форму для
надлежащего введения пациенту. Состав должен быть пригодным для
пути введения, который может быть пероральным, внутривенным,
внутриартериальным, интрабуккальным, интраназальным,
осуществляемого через небулайзер, бронхиальную ингаляцию, или доставляемый посредством механической вентиляции.
Также предусматриваются активные вакцины, где антитела, подобные антителам, которые описаны, продуцируются in vivo у субъекта, имеющего риск инфекции чикунгунья. Последовательности для Е1 и Е2 приведены в качестве SEQ ID N0: 253-276 в прилагаемом списке последовательностей. Такие вакцины можно составлять для парентерального введения, например, составлять для инъекции внутрикожным, внутривенным, внутримышечным, подкожным или даже внутрибрюшинным путями. Предусматривается введение внутрикожным и внутримышечным путями. Альтернативно вакцину можно вводить местным путем непосредственно на слизистую оболочку, например, посредством назальных капель, ингаляции или через небулайзер. Фармацевтически приемлемые соли включают кислые соли и соли, которые образованы с неорганическими кислотами, например, такими как хлористоводородная или фосфорная кислота, или с органическими кислотами, такие как уксусная, щавелевая, виннокаменная, миндальная и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильный группами, также могут происходить из неорганических оснований, например, таких как гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т.п.
Пассивный перенос антител, известный как искусственно приобретенный пассивный иммунитет, обычно вовлекает применение внутривенных или внутримышечных инъекций. Формы антитела могут
представлять собой плазму или сыворотку крови человека или животного, объединенный иммуноглобулин для внутривенного (IVIG) или внутримышечного (IG) применения, IVIG или IG человека с высоким титром от иммунизированных доноров или доноров, выздоравливающих от заболевания, и моноклональные антитела (MAb). Такой иммунитет обычно длится только короткий период времени, а также существует потенциальный риск реакций гиперчувствительности и сывороточной болезни, особенно вследствие гамма-глобулина, происходящего не из человека. Однако пассивный иммунитет обеспечивает немедленную защиту. Антитела можно составлять в носителе, подходящем для инъекции, т.е. стерильном и проходимом через иглу шприца.
Как правило, ингредиенты композиций по изобретению предоставляют либо по отдельности, либо смешанными вместе в единичной дозированной форме, например, в качестве сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, на которых указано количество активного вещества. Когда композицию вводят посредством инфузии, ее можно распределять с использованием бутылки для инфузии, содержащей стерильную воду или солевой раствор фармацевтической категории. Когда композицию вводят посредством инъекции, может быть предоставлена ампула стерильной воды для инъекций или солевой раствор, так чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.
Композиции по изобретению можно составлять в качестве
нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли
включают соли, образованные с анионами, такими как анионы
хлористоводородной, фосфорной, уксусной, щавелевой,
виннокаменной кислот и т.д., и соли, образованные с катионами, такими как катионы, образованные из гидроксида натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.
IV. Конгьюгаты антител
Антитела по настоящему изобретению могут быть связаны по меньшей мере с одним средством с образованием конъюгата антител. Для повышения эффективности молекул антител в качестве
диагностических или лекарственных средств, является общепринятым
сшивание или ковалентное связывание или образования комплекса по
меньшей мере с одной желаемой молекулой или частью. Такая
молекула или часть может представлять собой, но не
ограничивается ими, по меньшей мере одну эффекторную или
репортерную молекулу. Эффекторные молекулы включают молекулы,
обладающие желаемой активностью, например, цитотоксической
активностью. Неограничивающие примеры эффекторных молекул,
которые связаны с антителами, включают токсины,
противоопухолевые средства, терапевтические ферменты,
радионуклиды, противовирусные средства, хелатирующие агенты, цитокины, факторы роста, и олиго- или полинуклеотиды. Напротив, репортерную молекулу определяют как любую часть, которая может быть обнаружена с использованием анализа. Неограничивающие примеры репортерных молекул, которые конъюгируют с антителами, включают ферменты, радиоактивные метки, гаптены, флуоресцентные метки, фосфоресцентные молекулы, хемилюминесцентные молекулы, хромофоры, фотоаффинные молекулы, окрашенные частицы или лиганды, такие как биотин.
Конъюгаты антител, как правило, являются предпочтительными для применения в качестве диагностических средств. Антительные диагностические средства, как правило, относятся к двум классам: для применения в диагностике in vitro, такой как различные иммуноанализы, и для применения в протоколах диагностики in vivo, обычно известные как "визуализация с помощью антител". В данной области известны многие подходящие визуализирующие средства, также как и способы их связывания с антителами (см., например, патенты США 5021236, 4938948 и 4472509). Используемые визуализирующие части могут представлять собой парамагнитные ионы, радиоактивные изотопы, флуорохромы, обнаруживаемые посредством ЯМР вещества и средства рентгенографии.
В случае парамагнитных ионов в качестве примера могут быть упомянуты ионы, такие как хром (III), марганец (II), железо (III), железо (II), кобальт (II), никель (II), медь (II), неодимий (III), самарий (III), иттербий (III), гадолиний (III), ванадий (II), тербий (III), диспрозий (III), гольмий (III) и/или
эрбий (III), причем особенно предпочтительным является гадолиний. Ионы, пригодные в других контекстах, таких как рентгенография, включают, но не ограничиваются ими, лантан (III), золото (III), свиней (II) и особенно висмут (III).
В случае радиоактивных изотопов для терапевтического и/или диагностического применения, могут быть упомянуты астат211, 14углерод, 51хром, 36хлор, 57кобальт, 58кобальт, медь67, 152Еи, галлий67, 3водород, йод123, йод125, йод131, индий111, 59железо, 32фосфор, рений186, рений188 , 75селен, 35сера, технеций99т и/или иттрий90. Часто 1251 является предпочтительным для применения в определенных вариантах осуществления и технеций99т и/или индий111 также часто являются предпочтительными вследствие их низкой энергии и пригодности для дальнего обнаружения. Радиоактивно меченные моноклональные антитела по настоящему изобретению можно получать способами, хорошо известными в данной области. Например, моноклональные антитела можно йодировать посредством контакта с йодидом натрия и/или калия и химическим окислителем, таким как гипохлорит натрия или ферментативный окислитель, такой как лактопероксидаза. Моноклональные антитела по изобретению могут быть меченными технецием99т посредством процесса обмена лигандами, например, посредством восстановления пертехната раствором олова, хелатирования восстановленного технеция на колонке Sephadex и внесения антитела в эту колонку. Альтернативно можно использовать прямое мечение, например, посредством инкубации пертехната, восстановителя, такого как SNC12, буферного раствора, такого как раствор фталата натрия-калия и антитела. Промежуточные функциональные группы, которые часто используют для связывания радиоизотопов, которые существуют в качестве ионов металлов, с антителом, представляют собой диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) или этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).
Флуоресцентные метки, предусматриваемые для применения в качестве конъюгатов, включают Alexa 350, Alexa 430, АМСА, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, СуЗ, Cy5,6-FAM, флуоресцеин изотиоцианат, HEX, б-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500,
Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Renographin, ROX, TAMRA, TET, тетраметилродамин и/или Texas Red.
Другим типом конъюгатов антител, предусматриваемых в рамках
настоящего изобретения, являются конъюгаты антител,
предназначенные в основном для применения in vitro, где антитело связано со вторичным связывающим лигандом и/или с ферментом (ферментной меткой) , который будет образовывать окрашенный продукт при контакте с хромогенным субстратом. Примеры подходящих ферментов включают уреазу, щелочную фосфатазу, пероксидазу (хрена) или глюкозооксидазу. Предпочтительными вторичными связывающими лигандами являются соединения биотина, и авидина и стрептавидина. Применение таких меток хорошо известно специалистам в данной области и описано, например, в патентах США 3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 и 4366241.
Другой известный способ сайт-специфического связывания молекул с антителами включает рекацию антител с аффинными метками на основе гаптенов. По существу, аффинные метки на основе гаптенов реагируют с аминокислотами в антигенсвязывающем центре, тем самым разрушая этот участок и блокируя специфическую реакцию антигена. Однако это может не быть преимущественным, поскольку это приводит к утрате связывания антигена конъюгатом антитела.
Молекулы, содержащие азидогруппы, также можно использовать для образования ковалентных связей с белками через реактивные нитреновые промежуточные соединения, которые образуются под действием низкоинтенсивного ультрафиолетового света (Potter and Haley, 1983). В частности, 2- и 8-азидоаналоги пуриновых нуклеотидов используют в качестве сайт-направленных фотозондов для идентификации связывающих нуклеотиды белков в неочищенных клеточных экстрактах (Owens & Haley, 1987; Atherton et al. , 1985) . 2- и 8-азидонуклеотиды также используют для картирования нуклеотидсвязывающих доменов очищенных белков (Khatoon et al., 1989; King et al. , 1989; Dholakia et al. , 1989), и их можно использовать в качестве соединений для связывания с антителами.
В данной области известно несколько способов присоединения
или конъюгации антитела с конъюгируемой с ним частью. Некоторые
способы присоединения вовлекают применение хелатирующего металл
комплекса с использованием, например, органического
хелатирующего агента, такого как ангидрид
диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA);
этилентриаминтетрауксусная кислота; N-хлор-п-толуолсульфонамид;
и/или тетрахлор-За-ба-дифенилгликоурил-3, связанного с антителом
(патенты США 4472509 и 4938948). Моноклональные антитела также
можно подвергать реакции с ферментом в присутствии агента
реакции сочетания, такого как глутаральдегид или перйодат.
Конъюгаты с флуоресцеиновыми маркерами получают в присутствии
этих агентов реакции сочетания или посредством реакции с
изотиоцианатом. В патенте США 4938948, визуализацию опухолей
молочной железы осуществляют с использованием моноклональных
антител и поддающиеся обнаружению визуализирующие части
связывают с антителом с использованием линкеров, таких как
метил-п-гидроксибензимидат или N-сукцинимидил-З-(4-
гидроксифенил)пропионат.
В других вариантах осуществления предусматривается
дериватизация иммуноглобулинов посредством селективного внесения
сульфгидрильных групп в Fc-область иммуноглобулина с
использованием условий реакции, которые не изменяют
антигенсвязывающего центра антитела. Описано, что конъюгаты
антител, полученные по этой методологии, демонстрируют
улучшенную длительность действия, специфичность и
чувствительность (патент США 5196066, включенный в настоящее описание в качестве ссылки). Сайт-специфическое присоединение эффекторных или репортерных молекул, где репортерная или эффекторная молекула конъюгирована с углеводным остатком Fc-области, также описано в литературе (O'Shannessy et al. , 1987) . Описано, что этот подход обеспечивает диагностически и терапевтически перспективные антитела, которые в настоящее время проходят клиническую оценку.
V. Способы иммунодетекции
В следующих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам иммунодетекции для связывания, очистки, удаления, количественного определения или иного обнаружения в целом вируса чикунгунья и ассоциированных с ним антигенов. В то время как такие способы можно использовать традиционным образом, другим применением является контроль качества и мониторинг вакцин и других содержащих вирус материалов, где антитела по настоящему изобретению можно использовать для оценки количества или целостности (т.е долговременной стабильности) антигенов HI в вирусах. Альтернативно способы можно использовать для скрининга различных антител в отношении профилей подходящей/желаемой реактивности.
Некоторые способы иммунодетекции включают твердофазный
иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунный анализ (RIA),
иммунорадиометрический анализ, флуороиммуноанализ,
хемилюминесцентный анализ, биолюминесцентный анализ и вестерн-блоттинг, среди прочих. В частности, предусматривается конкурентный анализ для обнаружения и количественного определения антител против вируса чикунгунья, направленных на конкретные эпитопы паразитов в образцах. Стадии различных пригодных способов иммунодетекции описаны в научной литературе, например, такой как Doolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand J.1993), De Jager et al. (1993) и Nakamura et al. (1987). Как правило, способы иммуноблоттинга включают получение образца, предположительно содержащего вирус чикунгунья, и приведение в контакт образца с первым антителом в соответствии с настоящим изобретением, в соответствующих случаях, в условиях, эффективных для обеспечения образования иммунокомплексов.
Эти способы включают способы очистки вируса чикунгунья или родственных антигенов из образца. Антитело предпочтительно связывают с твердой подложкой, например, в форме матрикса колонки, и образец, предположительно содержащий вирус чикунгунья или антигенный компонент, наносят на иммобилизованное антитело. Нежелательные компоненты смывают с колонки, оставляя антиген вируса чикунгунья в иммунном комплексе с иммобилизованным антителом, которое затем собирают путем удаления организма или
антигена из колонки.
Способы иммунного связывания также включают способы обнаружения и количественного определения вируса чикунгунья или родственных компонентов в образце и обнаружение и количественное определение каких-либо иммунных комплексов, образовавшихся в процессе связывания. В этом случае можно получить образец, предположительно содержащий вирус чикунгунья или его антигены, и привести образец в контакт с антителом, которое связывает вирус чикунгунья или его компоненты, а затем провести обнаружение и количественное определение иммунных комплексов, образовавшихся в конкретных условиях. С точки зрения обнаружения антигена анализируемый биологический образец может представлять собой любой образец, который предположительно содержит вирус чикунгунья или антиген вируса чикунгунья, такой как срез или образец ткани, экстракт гомогенизированной ткани, биологическая жидкость, включая кровь и сыворотку, или секрет, такой как кал или моча.
Приведение в контакт выбранного биологического образца с антителом в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для обеспечения образования иммунных комплексов (первичных иммунных комплексов) , обычно является вопросом простого добавления композиции антитела к образцу и инкубации смеси в течение периода времени, достаточного длительного, чтобы антитела образовывали иммунные комплексы, т.е. связывались с вирусом чикунгунья или присутствующими антигенами. После этого композицию образец-антитело, такую как срез ткани, планшет для ELISA, дот-блот или вестерн-блот, обычно промывают для удаления любых неспецифически связанных типов антител, обеспечивая обнаружение только тех антител, которые специфически связались с первичными иммунными комплексами.
Как правило, обнаружение образования иммунного комплекса хорошо известно в данной области и может быть достигнуто с использованием многочисленных подходов. Эти способы обычно основаны на обнаружении метки или маркера, такого как радиоактивные, флуоресцентные, биологические и ферментные метки. Патенты, касающиеся применения таких меток, включают патенты США
3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 и 4366241. Безусловно, могут быть найдены дополнительные преимущества в использовании вторичного связывающего лиганда, такого как вторичное антитело и/или лиганд-связывающая система на основе биотина/авидина, как известно в данной области.
Антитело, используемое для обнаружения, может быть само по себе связано с поддающейся обнаружению меткой, где впоследствии можно просто обнаруживать эту метку, тем самым, позволяя определять количество первичных иммунных комплексов в композиции. Альтернативно первое антитело, которое становится связанным в первичных иммунных комплексах, можно обнаруживать посредством второго связывающего лиганда, который обладает аффинностью связывания с антителом. В этих случаях второй связывающий лиганд может быть связан с поддающейся обнаружению меткой. Второй связывающий лиганд сам по себе часто представляет собой антитело, которое, таким образом, может быть названо "вторичным" антителом. Первичные иммунные комплексы приводят в контакт с меченым вторичным связывающим лигандом или антителом в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для обеспечения образования вторичных иммунных комплексов. Затем вторичные иммунные комплексы обычно промывают для удаления каких-либо неспецифически связанных меченых вторичных антител или лигандов, а затем выявляют оставшуюся метку во вторичных иммунных комплексах.
Следующие способы включают обнаружение первичных иммунных комплексов посредством двухстадийного подхода. Второй связывающий лиганд, такой как антитело, которое обладает аффинностью связывания с антителом, используют для формирования вторичных иммунных комплексов, как описано выше. После промывания вторичные иммунные комплексы приводят в контакт с третьим связывающим лигандом или антителом, которые обладают аффинностью связывания со вторичным антителом, вновь в эффективных условиях и в течение периода времени, достаточного для обеспечения образования иммунных комплексов (третичные иммунные комплексы). Третий лиганд или антитело связаны с поддающейся обнаружению меткой, позволяя обнаружение третичных
иммунных комплексов, образовавшихся таким образом. Эта система может обеспечить усиление сигнала, если это желательно.
В одном способе иммунодетекции используется два различных
антитела. Первое биотинилированное антитело используют для
обнаружения антигена-мишени, а затем используют второе антитело
для обнаружения биотина, находящегося в комплексе. В этом
способе образец, подлежащий исследованию, сначала инкубируют в
растворе, содержащем антитело первой стадии. Если антиген-мишень
присутствует, часть антитела связывается с антигеном с
образованием комплекса биотинилированное антитело/антиген. Затем
комплекс антитело/антиген амплифицируют посредством инкубации в
последовательных растворах стрептавидина (или авидина),
биотинированной ДНК и/или комплементарной биотинилированной ДНК,
причем на каждой стадии к комплексу антитело/антиген добавляют
дополнительные участки биотина. Стадии амплификации повторяют до
тех пор, пока не достигнут подходящего уровня амплификации, и в
этот момент времени образец инкубируют в растворе, содержащем
антитело второй стадии против биотина. Это антитело второй
стадии является меченным, например, ферментом, который можно
использовать для обнаружения присутствия комплекса
антитело/антиген посредством гистоензимологии с использованием хромогенного субстрата. С использованием подходящей амплификации можно получать конъюгат, который является макроскопически видимым.
В другом известном способе иммунодетекции используется
методология иммуно-ПЦР (полимеразная цепная реакция). Способ ПЦР
является сходным со способом Cantor вплоть до инкубации с
биотинилированной ДНК, однако вместо использования множества
раундов инкубации стрептавидина и биотинилированной ДНК,
комплекс ДНК/биотин/стрептавидин/антитело смывают с
использованием буфера с низким значением рН или высоким содержанием соли, который высвобождает антитело. Затем полученный раствор для промывания используют для проведения реакции ПЦР с подходящими праймерами с соответствующими контролями. По меньшей мере теоретически, невероятную способность к амплификации и специфичность ПЦР можно
использовать для обнаружения одной молекулы антигена. A. ELISA
Способы иммуноанализа, в их наиболее простом и прямом значении, представляют собой анализы связывания. Определенными предпочтительными способами иммуноанализа являются различные типы твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и радиоиммунного анализа (RIA), известные в данной области. Также, в частности, является пригодным иммуногистохимическое обнаружение с использованием срезов тканей. Однако будет хорошо понятно, что обнаружение не ограничивается такими способами, и также можно использовать вестрн-блоттинг, дот-блоттинг, FACS-анализ и т.п.
В одном иллюстративном ELISA, антитела по изобретению иммобилизуют на выбранной поверхности, обладающей аффинностью к белку, такой как полистироловый микропланшет для титрования. Затем в лунки добавляют исследуемую композицию, предположительно содержащую вирус чикунгунья или антиген вируса чикунгунья. После связывания и промывания для удаления неспецифически связавшихся иммунных комплексов можно выявлять связанный антиген. Выявление можно осуществлять путем добавления другого антитела против вируса чикунгунья, которое связано с поддающейся обнаружению меткой. Этот тип ELISA представляет собой простой "сэндвич-ELISA". Обнаружение также можно осуществлять посредством добавления второго антитела против вируса чикунгунья, а затем добавления третьего антитела, которое обладает аффинностью связывания в отношении второго антитела, причем третье антитело связано с поддающейся обнаружению меткой.
В другом иллюстративном ELISA образцы, предположительно содержащие вирус чикунгунья или антиген вируса чикунгунья, иммобилизуют на поверхности лунки, а затем приводят в контакт с антителами против вируса чикунгунья по изобретению. После связывания и промывания для удаления неспецифически связанных иммунных комплексов, проводят выявление связанных антител против вируса чикунгунья. Когда первоначальные антитела против вируса чикунгунья связаны с поддающейся обнаружению меткой, иммунные комплексы можно выявлять прямо. Вновь, иммунные комплексы можно
выявлять с использованием второго антитела, которое обладает аффинностью связывания с первым антителом против вируса чикунгунья, причем второе антитело связано с поддающейся обнаружению меткой.
Независимо от используемого формата, ELISA обладают определенными общими признаками, такими как нанесение, инкубация и связывание, промывание для удаления неспецифически связавшихся компонентов и обнаружение связанных иммунных комплексов. Они описаны ниже.
При нанесении на планшет либо антигена, либо антитела, как правило, лунки планшета инкубируют с раствором антигена или антитела либо в течение ночи, либо в течение периода, составляющего определенное количество часов. Затем лунки планшета промывают для удаления неполностью адсорбированного материала. На любые оставшиеся доступные поверхности лунок затем "наносят" неспецифический белок, который является антигенно нейтральным для исследуемой антисыворотки. Они включают бычий сывороточный альбумин (BSA), казеин или растворы молочного порошка. Покрытие позволяет блокировать участки неспецифической адсорбции на поверхности для иммобилизации, и, таким образом, снижает фоновый сигнал, вызываемый неспецифическим связыванием антисыворотки с поверхностью.
В ELISA, вероятно, более традиционным является использование вторичных или третичных средств для обнаружения вместо прямой процедуры. Таким образом, после связывания белка или антитела с лункой, покрытия нереактивным материалом для уменьшения фонового сигнала и промывания для удаления несвязанного материала, иммобилизующую поверхность приводят в контакт с биологическим образцом, подлежащим исследованию, в условиях, эффективных для обеспечения образования иммунного комплекса (антиген/антитело). Затем обнаружение иммунного комплекса требует меченого вторичного связывающего лиганда, или антитела и вторичного связывающего лиганда, или антитела совместно с меченым третичным антителом или третьим связывающим лигандом.
"В условиях, эффективных для обеспечения образования
иммунного комплекса (антиген/антитело)" означает, что условия предпочтительно включают разбавление антигенов и/или антител растворами, такими как BSA, бычий гамма-глобулин (BGG) или фосфатно-солевой буфер (PBS)/Tween. Эти добавляемые средства также имеют тенденцию к способствованию снижению неспецифического фонового сигнала.
"Подходящие" условия также означают, что инкубацию проводят при температуре или в течение периода времени, достаточных для обеспечения эффективного связывания. Стадии инкубации, как правило, длятся приблизительно от 1 до 2 до 4 часов или около того, при температурах предпочтительно порядка от 25°С до 27°С, или они могут продолжаться в течение ночи при приблизительно 4°С или около того.
После всех стадий инкубации в ELISA, подвергнутую контакту поверхность промывают для удаления не образовавшего комплекс материала. Предпочтительная методика промывания включает промывание раствором, таким как PBS/Tween или боратный буфер. После образования специфических иммунных комплексов между исследуемым образцом и первоначально связавшимся материалом и последующего промывания можно определять наличие даже малых количеств иммунных комплексов.
Для обеспечения средств обнаружения, второе или третье антитело имеет связанную с ним метку, позволяющую обнаружение. Предпочтительно, она представляет собой фермент, который будет обеспечивать развитие окраски при инкубации с соответствующим хромогенным субстратом. Таким образом, например, может быть желательным приведение в контакт или инкубация первого и второго иммунного комплекса с антителом, конъюгированным с уреазой, глюкозооксидазой, щелочной фосфатазой или пероксидазой, в течение периода времени и в условиях, которые способствуют проявлению дальнейшего образования иммунного комплекса (например, инкубация в течение 2 часов при комнатной температуре в содержащем PBS растворе, таком как PBS-Tween).
После инкубации с меченым антителом и после промывания для удаления не связавшегося материала проводят количественное
определение метки, например, посредством инкубации с хромогенным субстратом, таким как мочевина или бромкрезоловый фиолетовый, или 2,2'-азино-ди-(3-этил-бензтиазолин-б-сульфоновая кислота (ABTS), или Н20г, в случае пероксидазы в качестве ферментной метки. Затем проводят количественное определение посредством измерения степени развившейся окраски, например, с использованием спектрофотометра видимого спектра.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает использование конкурентных форматов. Это, в частности, является пригодным для обнаружения антител против вируса чикунгунья в образце. В конкурентных анализах неизвестное количество анализируемого соединения или антитела определяют по его способности вытеснять известное количество меченого антитела или анализируемого соединения. Таким образом, поддающаяся количественному определению потеря сигнала является признаком количества неизвестного антитела или анализируемого соединения в образце.
В рамках настоящего изобретения авторы изобретения предлагают использовать меченые моноклональные антитела против вируса чикунгунья для определения количества антител против вируса чикунгунья в образце. Основной формат включает приведение в контакт известного моноклонального антитела против вируса чикунгунья (связанного с поддающейся обнаружению меткой) с антигеном или частицей вируса чикунгунья. Антиген или организм вируса чикунгунья предпочтительно связывают с подложкой. После связывания меченого моноклонального антитела с подложкой добавляют образец и инкубируют в условиях, позволяющих какому-либо немеченому антителу в образце конкурировать с меченым моноклональным антителом и, таким образом, вытеснять его. Посредством измерения либо утраченной метки, либо оставшейся метки (и вычитания этого количества из исходного количества связанной метки), можно определить, сколько немеченого антитело связано с подложкой и, таким образом, сколько антитела присутствовало в образце.
В. Вестерн-блоттинг
Вестерн-блоттинг (альтернативно иммуноблоттинг белков)
представляет собой аналитический способ, используемый для обнаружения конкретных белков в данном образце гомогената или экстракта ткани. В нем используется гель-электрофорез для разделения нативных и денатурированных белков по длине полипептида (денатурирующие условия) или по 3-D структуре белка (нативные/не денатурирующие условия). Затем белки переносят на мембрану (как правило, нитроцеллюлоза или PVDF), где их исследуют (обнаруживают) с использованием антител, специфичных к белку-мишени.
Образцы могут быть получены из цельной ткани или из клеточной культуры. В большинстве случаев солидные ткани сначала разрушают механически с использованием измельчителя (для образцов более крупных объемов), с использованием гомогенизатора (меньшие объемы) или посредством обработки ультразвуком. Клетки также можно разрушать одним из описанных выше механических способов. Однако следует отметить, что бактерии, вирус или образцы окружающей среды могут быть источником белка и, таким образом, вестерн-блоттинг не ограничивается только клеточными исследованиями. Для способствования лизису клеток и солюбилизации белков можно использовать подходящие детергенты, соли и буферы. Часто добавляют ингибиторы протеаз и фосфатаз для предотвращения расщепления образца его собственными ферментами. Подготовку ткани часто проводят при холодных температурах во избежание денатурации белков.
Белки образца разделяют с использованием гель-электрофореза. Разделение белков может быть осуществлено по изоэлектрической точке (pi), молекулярной массе, электрическому заряду или комбинации этих факторов. Характер разделения зависит от обработки образца и природы геля. Это является в высокой степени пригодным способом определения белка. Также можно использовать двумерный (2-D) гель, который разделяет белки из одного образца в двух направлениях. Белки разделяются в соответствии с изоэлектрической точкой (значение рН, при котором они имеют нейтральный суммарный заряд) в первом направлении и в соответствии с их молекулярной массой во втором направлении.
Для получения белков, доступных для обнаружения антителом,
их перемещают из геля на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилидендифторида (PVDF). Мембрану помещают над гелем и на него помещают стопку фильтровальной бумаги. Всю стопку помещают в буферный раствор, который перемещается вверх бумаги посредством капиллярного действия, привлекая с собой белки. Другой способ переноса белков называют электроблоттином, и в нем используется электрический ток для извлечения белков из геля на PVDF или нитроцеллюлозную мембрану. Белки двигаются из геля в мембрану, сохраняя организацию, которую они имели в геле. В результате этого процесса блоттинга белки экспонируются на тонком поверхностном слое для обнаружения (см. ниже). Оба типа мембраны выбирают вследствие их свойств неспецифического связывания белков (т.е. связывают все белки в равной степени хорошо). Связывание белков основано на гидрофобном взаимодействии, а также на зарядовых взаимодействиях между мембраной и белком. Нитроцеллюлозные мембраны дешевле, чем PVDF, однако они значительно более хрупкие и плохо выдерживают повторное испытание. Единообразие и общую эффективность переноса белка из геля на мембрану можно проверять посредством окрашивания мембраны кумасси бриллиантовым синим или красителем Ponceau S. После переноса обнаружение белков проводят с использованием меченых первичных антител или немеченых первичных антител с последующим непрямым обнаружением с использованием меченого белка А или вторичных меченых антител, связывающихся с Fc-областью первичных антител. С. Иммуногистохимия
Антитела по настоящему изобретению также можно использовать совместно как со свежезамороженными, так и/или фиксированными формалином залитыми парафином блоками тканей для исследования посредством иммуногистохимии (IHC). Способ получения блоков тканей из конкретных образцов успешно использовался в предшествующих исследованиях посредством IHC различных прогностических факторов, и он хорошо известен специалистам в данной области (Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990).
В кратком изложении, замороженные срезы можно получать
посредством регидратации 50 нг замороженной "растертой" ткани при комнатной температуре в фосфатно-солевом буфере (PBS) в небольших пластмассовых капсулах; осаждения частиц посредством центрифугирования; ресуспендирования их в вязкой заливочной среде (ОСТ); переворачивания капсулы и/или вновь осаждения посредством центрифугирования; быстрого замораживания в изопентане, имеющем температуру -70°С; разрезания пластмассовой капсулы и/или удаления замороженного цилиндра ткани; закрепления тканевого цилиндра на патроне криостата-микротома; и/или проведения 25-50 последовательных срезов с капсулы. Альтернативно для серийного нарезания срезов можно использовать замороженные образцы тканей.
Долговечные срезы можно получать сходным способом, вовлекающим регидратацию 50 мг образца в пластмассовой микроцентрифужной пробирке; осаждение; ресуспендирование в 10% формалина для фиксации в течение 4 часов; промывание/осаждение; ресуспендирование в теплом 2,5% агаре; осаждение; охлаждение в ледяной воде для застывания агара; удаление блока ткани/агара из пробирки; пропитывание и/или заливку блока парафином и/или проведение вплоть до 50 последовательных долговечных срезов. Вновь, целые образцы ткани можно заменять.
D. Наборы для иммунодетекции
В следующих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к наборам для иммунодетекции для применения в способах иммунодетекции, описанных выше. Поскольку антитела можно использовать для обнаружения вируса чикунгунья или антигенов вируса чикунгунья, антитела могут быть включены в набор. Таким образом, наборы для иммунодетекции включают в подходящих контейнерах первое антитело, которое связывается с вирусом чикунгунья или антигеном вируса чикунгунья, и необязательно реагент для иммунодетекции.
В определенных вариантах осуществления антитело против вируса чикунгунья может быть предварительно связано с твердой подложкой, такой как матрица колонки и/или лунка планшета для микротитрования. Реагенты для иммунодетекции в наборе могут
иметь любую из множества форм, включая поддающиеся обнаружению метки, которые ассоциированы или связаны с данным антителом. Также предусматриваются поддающиеся обнаружению метки, которые ассоциированы или связаны со вторичным связывающим лигандом. Иллюстративные вторичные лиганды представляют собой вторичные антитела, которые обладают аффинностью связывания в отношении первого антитела.
Следующие подходящие реагенты иммунодетекции для применения в наборах по настоящему изобретению включают двухкомпонентный реагент, который содержит вторичное антитело, которое обладает аффинностью связывания с первым антителом, а также третье антитело, которое обладает аффинностью связывания со вторым антителом, причем третье антитело связано с поддающейся обнаружению меткой. Как отмечалось выше, в данной области известен ряд иллюстративных меток, и все такие метки можно использовать в рамках настоящего изобретения.
Кроме того, наборы могут содержать подходящим образом распределенную на аликвоты композицию вируса чикунгунья или антигена вируса чикунгунья, как меченых, так и немеченых, которые можно использовать для получения стандартной кривой для анализа обнаружения. Наборы могут содержать конъюгаты антитело-метка, либо в полностью конъюгированной форме, либо в форме промежуточных соединений, либо в качестве отдельных частей для конъюгации пользователем набора. Компоненты наборов могут быть упаковываны либо в водных средах, либо в лиофилизированной форме.
Контейнеры набора, как правило, включают по меньшей мере один флакон, тест-пробирку, колбу, бутылку, шприц или другие контейнеры, в которые антитело может быть помещено или предпочтительно подходящим образом распределено аликвотами. Наборы по настоящему изобретению, как правило, включают средства для содержания антитела, антигена и любые другие контейнеры, находящиеся вблизи друг от друга в ограниченном пространстве для коммерческой продажи. Такие контейнеры могут включать инжекционно формуемые или формуемые литьем с раздувом пластмассовые контейнеры, в которых удерживаются желаемые
флаконы.
VI. Примеры
Следующие примеры включены для демонстрации
предпочтительных вариантов осуществления. Специалистам в данной области должно быть понятно, что способы, описанные в примерах, которые следуют далее, отражают способы, разработанные авторами изобретения для надлежащего применения вариантов осуществления на практике, и, таким образом, их можно считать составляющими предпочтительные способы для его применения на практике. Однако специалисты в данной области должны, в свете настоящего изобретения, понять, что многие изменения можно вносить в конкретные варианты осуществления, которые описании, и все еще получать подобный или сходный результат без отклонения от сущности и объема изобретения.
Пример 1 - Материалы и способы
Выделение mAb человека. РВМС получали от человека через ~5 лет после документированной симптоматической инфекции CHKV в Шри-Ланке. В-клетки трансформировали в 384-луночных планшетах посредством EBV в присутствии CpG. Супернатанты полученных В-клеточных лимфобластных линий подвергали скринингу в отношении присутствия специфичных к CHKV человека связывающих антител посредством ELISA с использованием живого вируса CHIKV вакцинного штамма 181/25 в качестве антигена. Трансформированные В-клетки собирали и подвергали слиянию с миеломной клеточной линией, распределяли в планшеты для культивирования и увеличения в количестве, и подвергали селекции посредством выращивания в среде с гипоксантином-аминоптерином-тимидином, содержавшей уабаин. Гибридомы клонировали посредством сортировки единичных клеток. Супернатанты клонированных гибридом, выращенных в бессывороточной среде, собирали, очищали и концентрировали из очищенной среды посредством хроматографии с белком G.
Анализы нейтрализации. Очищенные белки mAb-IgG исследовали в отношении нейтрализующей активности с использованием репликонных частиц (VRP) вируса CHKV или каждого из 4 живых вирусов чикунгунья, соответствующих разнообразному генетическому и географическому профилю. VRP CHIKV, которые кодировали GFP,
получали путем разработки системы-помощника репликона CHIKV из трех плазмид на основе плазмиды, содержавшей полноразмерную кДНК геноной последовательности CHIKV штамма SL15649 (GenBank: GU189061.1), с использованием методологий клонирования на основе ПЦР. VRP инкубировали с разведениями mAb, а затем инокулировали в монослои клеток Vero 81 на 18 ч; инфицированные клетки и тотальные клетки (идентифицированные с использованием ядерного маркера) идентифицировали с использованием флуоресцентной визуализирующей системы. Для определения охвата и эффективности нейтрализации mAb авторы изобретения использовали четыре репрезентативных живых штамма вируса с по меньшей мере одним репрезентативным штаммом для каждого генотипа CHIKV, включая один прототипный вирус из каждого из трех генотипов, а также штамм текущей вспышки в Карибском бассейне. Нейтрализующую активность определяли с использованием теста нейтрализации по подавлению фокусообразования. Серийные разведения очищенных mAb человека инкубировали со 100 фокусобразующими единицами CHIKV при 37°С в течение 1 часа. Комплексы МАЬ-вирус добавляли к клеткам Vero в 9б-луночных планшетах, а затем выявляли бляшки после фиксации клеток с использованием выявления с иммунопероксидазой и количественно определяли с использованием анализатора ImmunoSpot 5.0.37 macroanalyzer (Cellular Technologies Ltd). Величины EC50 вычисляли с использованием нелинейного регрессионного анализа после сравнения с лунками, инокулированными CHIKV в отсутствие антитела.
ELISA Е2. Рекомбинантный белок эктодомена Е2 CHIKV (соответствующий штамму CHIKV-LR2006) получали в Е. coli и адсорбировали на микропланшеты для титрования. Наносили mAb человека, а затем проводили обнаружение связанных специфичных к CHKV mAb с использованием конъюгированного с биотином антитела козы против IgG человека.
Конкурентный анализ связывания. Авторы изобретения идентифицировали группы антител, связывающихся с одним и тем же основным антигенным участком, по конкуренции пар антител за связывание с белком эктодомена Е2 CHIKV-LR2 00 6, содержащим
полигистидиновую метку, связанную с наконечником биосенсора Anti-Penta-His biosensor tip (ForteBio #18-5077) в биосенсоре Octet Red biosensor (ForteBio).
Аланин-сканирующий мутагенез для картирования эпитопов.
Экспрессирующую конструкцию для белка оболочки CHIKV (штамм S2 7, Uniprot Reference #Q8JUX5) с С-концевой меткой V5 подвергали аланин-сканирующему мутагенезу для получения всесторонней библиотеки мутаций. Праймеры конструировали для мутации каждого остатка в областях Е2, 6К и Е1 белков оболочки (остатки Y326-Н12 4 8 в структурном полибелке) на аланин; кодоны аланина подвергали мутации на серии. Всего было получено 910 мутантов белка оболочки CHIKV. Снижение связывания mAb с каждой конструкцией исследовали с помощью иммунофлуоресцентного связывающего анализа с использованием клеточной флуоресценции, обнаруживаемой с использованием высокопроизводительного проточного цитометра.
Механизм нейтрализации. MAb подвергали взаимодействию с VRP до или после связывания с клетками Vero 81, а затем клетки окрашивали, визуализировали и анализировали, как описано для анализов нейтрализации VRP, для определения того, на какой стадии mAb демонстрировали противовирусный эффект. Анализы слияния изнутри и слияния снаружи проводили, как подробно описано в "Дополнительных экспериментальных методиках".
Исследования защиты in vivo у мышей. Мышей Ifnar'1' разводили в не имеющих патогенов вивариях и эксперименты по инфицированию проводили в помещениях A-BSL3. Инъекции в подушечки стоп проводили под анестезией. Для исследований профилактики mAb человека вводили посредством внутрибрюшинной инъекции мышам Ifnar'1' в возрасте б недель за 1 сутки до подкожной инокуляции в подушечку лапы посредством 10 ФОЕ CHIKV-LR. Для терапевтических исследований 10 ФОЕ CHIKV-LR доставляли за 24, 48 или 60 часов до введения однократной дозы индивидуальных mAb или комбинаций mAb человека в указанных дозах.
Индивидуум и выделение клеток периферической крови. В
остальном у здоровый индивидуум был предоставлен в октябре 2 00 6
года с инфекцией CHIKV. Симптомы инфекции CHIKV совпали с возвращением из Шри-Ланки, посещаемой в течение одного года, в ходе которого пациент проводил время на городских территориях (в основном Коломбо), и в сельской местности, включая тропический лес и прибрежные зоны. Пациент перенес множество укусов насекомых в ходе посещения, но у него сохранялось хорошее состояние здоровья на протяжении пребывания. По возвращении в США индивидуум поступил к врачу общей практики с лихорадкой (102°F (38,9°С)), длившейся трое суток. Пациент сообщил о сопутствующим развитии двухсторонней боли в суставах локтей и пальцев и выступающей незудящей сыпи на спине и животе, сопровождающейся общей "болью в теле" и головной болью. При поступлении он выглядел хорошо и у него не было острого нарушения. Мягкая, бледная, папулезная сыпь выступала на спине, груди и животе (см. фиг.4). Отмечался мягкий конъюнктивит. При обследовании скелета отмечались болезненные опухшие пальцы, колени и локти, на которых не было эритемы и выпота. Мышечная сила и амплитуда движений пораженных суставов были интактными, однако движение в суставах вызывало боль.
Была взята кровь на СВС, серологию и мазки на малярию, и пациент был отпущен. Количество лейкоцитов составляло 4,0х104 клеток/мм3, гематокрит составлял 41% и количество тромбоцитов составляло 180000/мм3. Общее количество лимфоцитов составляло 1,0х104 клеток/мм3. Мазки на малярию и серологические тесты были отрицательными, и пациенту ориентировочно поставили диагноз вирусного заболевания неизвестной этиологии.
Пациент вернулся в клинику через две недели, без лихорадки, но с персистирующей артралгией, наиболее выраженной в пальцах. Пациент описывал боль и скованность, не улучшившиеся и, возможно, ухудшившиеся относительно его предшествующего посещения. Пациент сообщил, что в регионе его предыдущего путешествия происходила вспышка чикунгунья. Была взята кровь и отделена сыворотка и отправлена в CDC для ПЦР и серологического тестирования, которые подтвердили диагноз инфекции чикунгунья.
В апреле 2012 года через пять с половиной лет после
указанной инфекции, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделили посредством разделения в градиенте плотности на Ficoll без известного воздействия CHIKV или других артритогенных альфавирусов в промежуточный период во время жизни в США. Клетки подвергали криосохранению и хранили и жидком азоте до исследования. Протокол набора индивидуумов и взятия образцов крови был одобрен комиссией по биомедицинской этике University of North Carolina at Chapel Hill и Vanderbilt University Medical Center.
Получение гибридом человека. Криосохраненные образцы РВМС размораживали быстро при 37°С и промывали перед трансформацией вирусом Эпштейна-Барр, как описано (Smith et al. , 2012) . Культуры инкубировали при 37°С с 5% С02 в течение 10 суток и подвергали скринингу в отношении присутствия клеток, секретирующих антитела, специфичные к CHIKV, в супернатанте с использованием анализов нейтрализации VRP и ELISA. Авторы изобретения провели две независимых трансформации с использованием отдельных аликвот одного и того же образца крови.
В первой трансформации авторы изобретения получили 384 0 культур (10x384-луночных планшетов), содержавших в среднем 42 трансформированных В-клеточных колонии на культуру с всего приблизительно 161000 индивидуальных В-клеточных колоний. Для скрининга антител, которые демонстрируют нейтрализующую активность против CHIKV в условиях BSL2, авторы изобретения разработали высокопроизводительный анализ нейтрализации по уменьшению флуоресценции с использованием репликонных частиц
(VRP) CHIKV, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок, в качестве репортера. VRP представляют собой вирионы, которые экспонируют нативные вирусные гликопротеины, но лишены полноразмерного вирусного генома и, таким образом, неспособны давать инфекционное потомство (Vander Veen et al., 2012). Авторы изобретения использовали VRP, полученные из штамма SL15649
(Morrison et al. r 2011), который был выделен в Шри-Ланке в 2006 году. SL15 64 9 является совпадающим по времени со штаммом, который инфицировал донора, и, вероятно, имеет очень сходную
последовательность. Из этого эксперимента авторы изобретения идентифицировали 160 В-клеточных культур, супернатанты которых опосредовали нейтрализацию с 90% ингибированием, что указывает на частоту 0,099% вирус-специфических В-клеток на все В-клетки (~1 на 1000). Всего 60 из этих линий осуществляли ингибирование на уровне > 98%, и при вторичном скрининге супернатанты 58 из 60 линий содержали антитела, которые связывались в ELISA с продуцированным клеточной культурой CHIKV (штамм 181/25), иммобилизованном на планшете для иммуноанализа. Авторы изобретения отобрали 35 из 58 линий с наиболее высокой активностью нейтрализации и связывания для слияния гибридом, идентифицировали 22 гибридомы со связывающими вирус супернатантами после слияния и посева, и успешно выделили 14 клонов для дальнейшего исследования. Во второй трансформации авторы изобретения получили 1536 культур (4x384-луночных планшета), содержащих в среднем 3 8 трансформированных В-клеточных колоний на культуру с предположительно всего приблизительно 58 000 протестированных индивидуальных В-клеточных колоний, что указывает на частоту вирус-специфических В-клеток 0,1% (вновь ~1 на 1000) . В этом эксперименте они использовали первичный скрининг связывания в ELISA со штаммом CHIKV 181/25 без предшествующего теста нейтрализации. Авторы изобретения идентифицировали 60 линий с сигналом оптической плотности в ELISA, более чем в четыре раза превышающим фоновый уровень, отобрали 3 0 линий В-клеток с наиболее высоким сигналом оптической плотности в ELISA для слияния, идентифицировали 18 гибридом со связывающими вирус супернатантами после слияния и посева, и успешно выделили 16 клонов для дальнейшего исследования.
Слияние с клетками миеломы. Клетки из лунок с супернатантами, способными нейтрализовывать инфекционность CHIKV, подвергали слиянию с несекретирующими клетками миеломы НММА2.5, как описано (Smith et al. , 2012) . Полученные гибридомы отбирали по росту в среде с гипоксантином-аминоптерином-тимидином (HAT), содержавшей уабаин, биологически клонировали
посредством FACS единичных клеток с использованием клеточного сортировщика FACSAria III (BD Biosciences) и увеличивали в количестве.
Продукция и очистка mAb человека. Лунки, содержавшие гибридомы, продуцирующие антитела, специфичные к CHIKV, клонировали посредством трех раундов лимитирующего разведения или с использованием устройства ClonePix (Molecular Devices) в соответствии с инструкциями изготовителя. После получения индивидуальных клонов каждую гибридому увеличивали в количестве до 50% смыкания монослоя в 75-см2 колбах. Для экспрессии антител клетки собирали с использованием клеточного скребка, промывали бессывороточной средой (GIBCO Hybridoma-SFM от Invitrogen, 12045084) и разделяли поровну на четыре колбы объемом 22 5 см2 (Corning, 431082), содержавшие 250 мл бессывороточной среды. Клетки инкубировали в течение 21 суток, а затем среду очищали центрифугированием и пропускали через 0,2-мкм стерильный фильтр. Антитела очищали из очищенной среды посредством хроматографии с белком G (GE Life Sciences, Protein G HP Columns).
Клетки. Клетки BHK-21 (ATCC CCL-10) поддерживали в минимальной поддерживающей среде альфа (аМЕМ; Gibco), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS) и 10% фосфатом триптозы (Sigma). Клетки Vero 81 (ATCC CCL-81) поддерживали в аМЕМ, дополненной 5% FBS. Среду всех клеток дополняли 0,29 мг/мл L-глутамина (Gibco), 100 Е/мл пенициллина (Gibco), 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco) и 500 нг/мл амфотерицина В. Клетки поддерживали при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% С02.
Получение плазмидных конструкций VRP CHIKV. Система-
помощник репликона CHIKV с тремя плазмидами была получена из
плазмиды, содержавшей полноразмерную кДНК геномной
последовательности CHIKV штамма SL15649 (GenBank: GU189061.1), с использованием методологий клонирования на основе ПЦР. Геном репликона CHIKV конструировали с использованием двухстадийного процесса, который вовлекал получение промежуточного клонирующего вектора, в котором полноразмерная структурная кассета CHIKV была
заменена участком множественного клонирования (MCS). Усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) субклонировали в участок множественного клонирования этой плазмиды с получением рМН41
(репликон CHIKV SL15 64 9 eGFP). Конструирование системы-помощника с двумя плазмидами включало многостадийный процесс клонирования, который вовлекал получение плазмиды-помощника с полноразмерным структурным геном посредством удаления основной части (68 91 нуклеотидов) неструктурной кассеты CHIKV. Полноразмерную структурную кассету далее подразделяли на две конструкции: рМН3 8
(капсидный помощник CHIKV SL15 64 9), которая содержала последовательность гена капсида, за которой следовал уникальный участок рестрикции Avrll, и рМН3 9 (гликопротеиновый помощник CHIKV SL15 64 9), которая содержала делецию в рамке считывания капсидного РНК-связывающего домена за которой следовала интактная кодирующая последовательность гликопротеина оболочки
(ЕЗ-Е1).
Продукция рекомбинантного р62-Е1 CHIKV. Плазмиду, содержавшую р62 CHIKV (т.е. ЕЗ [ а.к.S1-R64]-Е2 [ а.к.S1-E361]-линкер из 16 аминокислот-El [а.к.Y1-Q411], за которыми следовала His-метка) (Voss et al. r 2010) трансфицировали в клетки 293F с использованием реагента 293fectin (Invitrogen). После инкубации в течение 72 часов супернатант удаляли и клетки культивировали в течение дополнительных 72 часов. Объединенные супернатанты наносили на колонку с никель-агарозными гранулами (GoldBio) и элюировали имидазолом. Белок далее очищали с использованием колонки для гель-фильтрации Superdex S200 (GE Life Sciences). Фракции, содержавшие белок рб2-Е1 CHIKV, объединяли, замораживали и хранили при -8 0°С.
Получение исходного материала VRP, происходящих из CHIKV штамма SL15649. Исходный материал VRP выделяли из рекомбинантных плазмид CHIKV в сертифицированном помещении с 3 уровнем биологической безопасности (BSL3) в биологических ламинарных шкафах в соответствии с протоколами, одобренными Vanderbilt University Department of Environment, Health, and Safety и Vanderbilt Institutional Biosafety Committee. Три плазмиды
репликонной системы SL15 64 9 линеаризовывали расщеплением посредством Notl-HF, очищали посредством экстракции фенолом-хлороформом, и использовали в качестве матриц в реакциях транскрипции с использованием набора для транскрипции mMessage mMachine SP6 (Life Technologies) с получением кэппированных полноразмерных РНК-транскриптов in vitro. Транскрипты вирусной РНК вводили в клетки ВНК21 посредством электропорации с использованием устройства для электропорации GenePulser. Культуральные супернатанты, содержавшие VRP, собирали через 2 4 часа после электропорации; супернатанты очищали посредством центрифугирования при 855хд в течение 20 мин, разделяли на аликвоты и хранили при -8 0°С. Исходный материал VRP оценивали на компетентный в отношении увеличения в количестве рекомбинантный вирус посредством серийного пассирования 2 0% исходного материала и 10% культурального супернатанта пассажа 1 с использованием клеток Vero81, которые исследовали в отношении цитопатического эффекта (СРЕ) через 72 часа после инфицирования. Исходные материалы считали прошедшими этот тест на безопасность, когда СРЕ не обнаруживался в последнем пассаже. Затем исходный материал перемещали из лаборатории BSL3.
Анализ нейтрализации VRP и анализ с репортером GFP. Клетки Vero 81 (2,25х103 клеток/лунка) высевали в лунки 384-луночных планшетов и инкубировали при 37°С в течение 24 часов. Чистый супернатант гибридомы или серийные разведения очищенных mAb инкубировали с VRP при MOI ~5 инфекционных единиц/клетка в буфере для разведения вируса (VDB; среда RPMI, содержащая 2 0 мМ HEPES, дополненный 1% FBS) при 37°С в течение 1 часа, а затем адсорбировали на клетки. Клетки инкубировали при 37°С в течение 18 часов, окрашивали красителем Хехста для мечения ядер и визуализировали с использованием визуализирующей системы ImageXpress Micro XL (Molecular Devices) в Vanderbilt High-Throughput Screening Facility. Тотальные и инфицированные CHIKV клетки (маркированные экспрессией GFP) количественно определяли с использованием программного обеспечения MetaXpress (Molecular Devices) в двух полях зрения на лунку. Для каждого антитела
определяли величины ЕС50 с 95% доверительным интервалом с использованием нелинейной регрессии для аппроксимации отдельных логистических кривых роста с использованием программы R statistics (R.C. Team, 2014) .
Исходные материалы вируса, полученные в качестве антигена для ELISA. Плазмиду инфекционного клонов для вакцинного штамма CHIKV 181/25 (Levitt et al., 1986 и Mainou et al., 2013) линеаризовывали посредством Notl-HF и транскрибировали in vitro с использованием набора для транскрипции mMessage mMachine SP6 (Life Technologies). Вирусную РНК вводили в клетки ВНК21 посредством электропорации. Культуральные супернатанты собирали через 24 часа, очищали посредством центрифугирования при 855хд в течение 2 0 мин, разделяли на аликвоты и хранили при -8 0°С.
ELISA для улавливания вируса для скрининга гибридом. Связывание антитела с вирусными частицами проводили посредством покрытия планшетов для анализа очищенным mAb мыши СНК-187 (Pal et al. r 2013), приготовленном в концентрации 1 мкг/мл в буфере для связывания 0,1 М Na2C03 и 0,1 М NaHC03, рН 9,3, которое использовали для нанесения на планшеты для ELISA (Nunc 242757), и инкубировали при 4°С в течение ночи. После инкубации планшетов в течение 1 часа с блокирующим буфером (1% сухое молоко и 2% сыворотка козы в PBS с Tween 2 0 [PBS-T]), планшеты промывали пять раз посредством PBS-T и инкубировали с 25 мкл культурального супернатанта монослоев клеток ВНК21, инфицированных вакцинным штаммом CHIKV 181/25. После инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа планшеты промывали десять раз PBS, и добавляли 10 мкл культурального супернатанта В-клеток к 2 5 мкл/лунка блокирующего буфера. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем промывали пять раз посредством PBS-T. Вторичное антитело, конъюгированное с щелочной фосфатазой (антитело козы против Fc человека; Meridian Life Science, W99008A) применяли в разведении 1:5000 в 25 мкл/лунка блокирующего буфера и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После пяти промываний посредством PBS-T, добавляли раствор субстрата
фосфатазы (1 мг/мл субстрата фосфатазы в 1 М Tris аминометане [Sigma, S0942]) в количестве 25 мкл/лунка и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем определяли оптическую плотность при 4 05 нм с использованием устройства для считывания планшетов Biotek.
CHIKV-специфические контрольные mAb человека. В некоторых анализах в качестве положительных контролей использовали два ранее описанных CHIKV-специфических mAb человека, 5F10 и 8В10 (Warter et al. , 2011) . Эти mAb экспрессировали в клетках 293F (Invitrogen) после трансфекции экспрессирующей IgGl плазмидой (Lonza), содержавшей кДНК с оптимизированной последовательностью генов вариабельных областей антител 5F10 и 8В10 на основе последовательностей, предоставленных Cheng-I Wang и Alessandra Nardin (Singapore Immunology Network, A*STAR, Singapore).
ELISA для mAb, связывающегося с белком E2. Рекомбинантный белок эктодомена Е2 CHIKV (соответствующий штамму CHIKV-LR2006) продуцировали в Е. coll, как описано (Pal et al. r 2013), и адсорбировали на микропланшеты для титрования (100 мкл раствора белка Е2 2 мкг/мл в 0,1 М Na2C03, 0,1 М NaHC03, и 0,1% NaN3 [рН 9,3]) при 4°С в течение ночи. Планшеты ополаскивали три раза посредством PBS, содержавшего 0,05% Tween-20, и инкубировали при 37°С в течение 1 часа с блокирующим буфером (PBS, 0,05% Tween-20, и 2% [масс./об.] BSA). В лунки добавляли первичное mAb человека (разбавленное до 10 мкг/мл в блокирующем буфере) при комнатной температуре на 1 час. Планшеты ополаскивали три раза PBS, содержавшим 0,05% Tween-20, и последовательно добавляли вторичное антитело (конъюгированное с биотином антитело козы против IgG человека (Н- и L-цепи) с минимальной перекрестной реактивностью в отношении белков сыворотки мыши (Jackson ImmunoResearch Laboratories), разбавленное 1/20000 блокирующим буфером), и конъюгированную со стрептавидином пероксидазу хрена (разбавленную PBS с 0,05% Tween-20; Vector Laboratories), в каждом случае при комнатной температуре на 1 час с ополаскиванием планшета между стадиями. После ополаскивания четыре раза посредством PBS планшеты инкубировали при комнатной
температуре с 100 мкл раствора хромогенного субстрата ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) (Dako) в течение 5 мин и реакцию останавливали добавлением 2 Н H2SO4. Интенсивность окрашивания продукта определяли с использованием устройства для считывания планшетов для ELISA при оптической плотности 450 нм.
Измерение аффинности посредством поверхностного плазмонного резонанса. Взаимодействия очищенных mAb человека и белков CHIKV анализировали кинетически с использованием устройства Biacore Т100, как описано (Austin et al. , 2012) . Для интактного IgG с растворимым рб2-Е1 CHIKV, антитела против IgG человека (GE Life Sciences) иммобилизовывали на чипе Series S СМ5 и использовали для улавливания антител против CHIKV или контрольных антител (hu-WNV El б) . Р62-Е1 CHIKV инжектировали над поверхностью со скоростью 65 мкл/мин в течение 180 с и позволяли диссоциировать в течение 1000 с, а затем проводили регенерацию посредством 3 М МдС12 между циклами. Некоторые антитела не связывались с мономерным белком Е1, таким образом, авторы изобретения протестировали их в отношении связывания с VLP. Для кинетических измерений с VLP CHIKV, антитела против IgG мыши (GE Life Sciences) иммобилизовывали для улавливания группы антител мыши против CHIKV с субнаномолярной аффинностью, которые в свою очередь использовали для улавливания VLP CHIKV. IgG или Fab против CHIKV инжектировали над поверхностью чипа со скоростью 65 мкл/мин в течение 180 с и позволяли им диссоциировать в течение 1000 с, а затем колонку регенерировали посредством 10 мМ глицина, рН 1,7, между циклами. Все данные обрабатывали с использованием программного обеспечения Biacore Evaluation Software (версии 1.1.1) и глобальной аппроксимации Ленгмюра 1:1 для кривых. Результаты получали для по меньшей мере трех независимых экспериментов.
Штаммы вируса, использованные для тестов нейтрализации посредством подавления фокусообразования. Для определения охвата и эффективности нейтрализации mAb, авторы изобретения использовали четыре репрезентативных живых штамма вируса по меньшей мере с одним репрезентативным штаммом для каждого генотипа CHIKV, включая один прототипный вирус из каждого из
трех генотипов, а также штамм текущей вспышки в Карибском бассейне. Штамм LR2006_OPY1 (LR) (восточно/центрально/южноафриканский [ECSA] генотип CHIKV) был предоставлен Stephen Higgs (Manhattan, KS) . Штамм N1 64 IbH 35 (западно-африканский генотип) и штаммы RSU1 и 99659 (азиатский генотип; выделенные в 2014 году от субъекта на Британских Виргинских островах (Lanciotti & Valadere, 2014)) были предоставлены Robert Tesh (World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, Galveston, TX).
Тест нейтрализации посредством подавления фокусообразования (FRNT) с инфекционным CHIKV. Серийные разведения очищенных mAb человека инкубировали со 100 фокусобразующими единицами CHIKV (ФОЕ) при 37°С в течение 1 часа. Комплексы МАЬ-вирус добавляли к клеткам Vero в 9б-луночных планшетах. После инкубации в течение 90 мин на клетки наслаивали 1% (масс./об.) метилцеллюлозу в модифицированной среде Игла (MEM), дополненной 2% FBS. Клетки инкубировали в течение 18 часов и фиксировали 1% параформальдегидом в PBS. Клетки инкубировали последовательно с 500 нг/мл СНК-11 мыши (Pal et al. r 2013) и конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) антителом козы против IgG мыши в PBS, дополненном 0,1% сапонином и 0,1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) . Инфицированные CHIKV бляшки визуализировали с использованием субстрата пероксидазы TrueBlue (KPL) и количественно определяли с использованием анализатора ImmunoSpot 5.0.37 macroanalyzer (Cellular Technologies Ltd) . Величины EC50 вычисляли с использованием нелинейного регрессионного анализа после сравнения с лунками, инокулированными CHIKV в отсутствие антитела.
Конкурентный анализ связывания на основе интерферометрии биослоя. Белок эктодомена Е2 CHIKV-LR2 00 6, содержащий полигистидиновую метку (20 мкг/мл), иммобилизовывали на наконечниках биосенсора Anti-Penta-His (ForteBio #18-5077) в течение 2 мин. После определения исходного сигнала в кинетическом буфере (KB, IX PBS, 0,01% BSA и 0,002% Tween 20) в течение 1 мин, наконечники биосенсора погружали в лунки,
содержавшие первичное антитело, в концентрации 100 мкг/мл на 5 мин, а затем погружали в лунки, содержавшие конкурирующие mAb в концентрации 100 мкг/мл на 5 мин. Процентное связывание конкурирующего mAb в присутствии первого mAb определяли посредством сравнения максимального сигнала конкурирующего mAb, добавленного после первоначального комплекса mAb, к максимальному сигналу конкурирующего mAb отдельно. Антитела считали конкурирующими за связывание одного участка, если максимальное связывание конкурирующего mAb снижалось до <30% относительно аффинности связывания отдельно. Антитела считали не конкурирующими, если максимальное связывание конкурирующего mAb составляло > 70% от неконкурентного связывания. Уровень 30-70% неконкурентного связывания считался промежуточной конкуренцией.
Картирование эпитопов посредством мутагенеза.
Экспрессирующую конструкцию белка оболочки CHIKV (штамм S2 7, ссылочный номер Uniprot #Q8JUX5) с С-концевой меткой V5 подвергали аланин-сканирующему мутагенезу для получения всесторонней библиотеки мутаций. Праймеры конструировали для мутации каждого остатка в областях Е2, 6К и Е1 белков оболочки (остатки Y326-H1248 в структурном полибелке) на аланин; кодоны аланина подвергали мутации на серии (Fong et al. , 2 014) . Всего было получено 910 мутантов белка оболочки CHIKV (охват 98,5%), последовательность подтверждена, и их упорядочивали в 384-луночных планшетах. Клетки НЕК-2 93Т трансфицировали библиотекой мутаций CHIKV в 3 8 4-луночных планшетах и инкубировали в течение 22 часов. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом (Electron Microscopy Sciences) в PBS плюс кальций и магний (PBS+/+) и окрашивали очищенными mAb в концентрации 0,25-1,0 мкг/мл или очищенными Fab-фрагментами в концентрации 2,5 мкг/мл, разбавленными 10% нормальной сывороткой козы (NGS; Sigma). Концентрации первичных антител определяли с использованием независимой кривой титрования иммунофлуоресценции против белков оболочки CHIKV дикого типа, чтобы убедиться, что сигналы находятся в пределах линейного диапазона обнаружения. Антитела выявляли с использованием 3,75 мкг/мл конъюгированного с AlexaFluor488 вторичного антитела (Jackson ImmunoResearch
Laboratories) в 10% NGS . Клетки промывали два раза PBS без магния и кальция (PBS -/-) и ресуспендировали в Cellstripper (Cellgro) с 0,1% BSA (Sigma). Среднюю флуоресценцию клеток выявляли с использованием высокопроизводительного проточного цитометра (HTFC, Intellicyt). Реактивность антител против каждого мутантного клона вычисляли относительно реактивности белка дикого типа посредством вычитания сигнала из трансфицированных имитирующей конструкцией контролей и нормализации к сигналу контролей, трансфицированных конструкцией дикого типа. Аминокислоты идентифицировали как требующиеся для связывания mAb, если соответствующий аланиновый мутант не реагировал с исследуемым mAb, но реагировал с другими антителами против CHIKV. Эта стратегия контр-скрининга способствует исключению мутантов, которые неправильно свернуты или имеют дефект экспрессии (Christian et al. , 2013, Paes et al. , 2009 и Selvarajah et al., 2 013). Аминокислоты, требуемые для связывания антител, визуализировали на кристаллической структуре белка оболочки CHIKV (мономер PDB ID #3N41 и тример PDB ID #2XFB) с использованием программного обеспечения PyMol.
Анализы нейтрализации до и после прикрепления. Клетки Vero 81 (ATCC CCL-81; ~7,5х103 клеток/лунка) высевали в лунки 96-луночных планшетов и инкубировали при 37°С в течение ~24 часов. Для анализов до прикрепления приготавливали разведения mAb при 4°С в буфере для разведения вируса (VDB) и предварительно инкубировали с VRP при 4°С в течение 1 часа. К предварительно охлажденным клеткам Vero 81 добавляли комплексы антитело-вирус при 4°С в течение 1 часа. Неадсорбированный вирус удаляли посредством трех промываний VDB и клетки инкубировали в полной среде при 37°С в течение 18 часов. Анализ после прикрепления проводили аналогичным образом, за исключением того, что эквивалентную MOI VRP сначала адсорбировали на клетках Vero 81 при 4°С в течение 1 часа, не связавшиеся VRP удаляли посредством трех промываний буфером для разведения вируса и клетки инкубировали с предварительно охлажденным VDB, содержавшим серийные разведения mAb при 4°С в течение 1 часа. Не связавшиеся
mAb удаляли посредством трех промываний VDB и клетки инкубировали в полной среде при 37°С в течение 18 часов. Клетки окрашивали, визуализировали и анализировали, как описано для анализов нейтрализации VRP, с четырьмя полями зрения на лунку с получением всего -80 0-1000 клеток, проанализированных в отношении экспрессии GFP, на образец.
Анализы ингибирования слияния. Слияние вируса с плазматической мембраной оценивали с использованием анализа FFWO (Edwards & Brown, 1986). Клетки Vero 81 (~3,75х103 клеток/лунка) высевали в лунки 9б-луночных планшетов и инкубировали при 37°С в течение ~24 часов. Клетки промывали один раз средой для связывания (RPMI 1640, дополненная 1% FBS, 25 мМ HEPES [рН 7,4] и 2 0 мМ NH4C1, для предотвращения инфицирования посредством эндосомального слияния) и инкубировали в среде для связывания при 4°С в течение 15 мин. Инокулят, содержавший VRP, разбавляли в среде для связывания и инкубировали с клетками при 4°С в течение 1 часа. Не связавшиеся VRP удаляли посредством двух промываний средой для связывания. Серийные разведения mAb в VDB инкубировали с клетками при 4°С в течение 1 часа и не связавшиеся mAb удаляли посредством двух промываний VDB. FFWO индуцировали добавлением предварительно нагретой среды для слияния (RPMI 1640, 1% FBS, 25 мМ HEPES и 30 мМ янтарная кислота при рН 5,5) при 37°С в течение 2 мин. В параллельных лунках добавляли контрольную среду (RPMI 1640, 1% FBS, 25 мМ HEPES при рН 7,4) при 37°С в течение двух мин. Среду удаляли и клетки инкубировали в DMEM, дополненной 5% FBS, 2 0 мМ NH4C1 (чтобы убедиться, что инфекция происходила только посредством рН-зависимого слияния плазматических мембран) и 25 мМ HEPES [рН 7,4]) . Через 18 часов после инфицирования клетки окрашивали, визуализировали и анализировали, как описано, с двумя полями зрения на лунку с получением всего -80 0-1000 клеток, проанализированных в отношении экспрессии GFP, на образец.
Исследования защиты in vivo на мышах. Это исследование проводили в строгом соответствии с рекомендациями Guide for the Care anf Use of Laboratory Animals от National Institutes of
Health. Протоколы были одобрены Institutional Animal Care and Use Committee at Washington University School of Medicine (Assurance Number: A3381-01) . Мышей If пат'1' разводили в не имеющих патогенов вивариях в Washington University School of Medicine, и эксперименты по инфицированию проводили в помещениях A-BSL3 при одобрении Washington University Animal Studies Committee. Инъекции в подушечки лап проводили под анестезией, которую индуцировали и поддерживали гидрохлоридом кетамина и ксилазином. Для исследований профилактики mAb человека вводили посредством внутрибрюшинной инъекции мышам Ifnar'1' в возрасте б недель за 1 сутки до подкожной инокуляции в подушечку лапы 10 ФОЕ CHIKV-LR, разбавленного в HBSS с 1% инактивированной нагреванием FBS. Для терапевтических исследований 10 ФОЕ CHIKV-LR доставляли за 24, 48 или 60 часов до введения однократной дозы индивидуальных mAb человека или их комбинаций в определенных дозах.
Пример 2 - результаты
Выделение специфичных к CHIKV mAb человека. Авторы изобретения выделили панель mAb от одного субъекта, который приобрел инфекцию CHIKV в Шри-Ланке в 2 00 6 году и поступил с лихорадкой, артралгией и сыпью (фиг.4). Клиническое течение, и трансформация В-клеток, и методики скрининга представлены в Online Methods. Они трансформировали В-клетки в двух отдельных экспериментах из одного образца крови, взятого от донора через пять с половиной лет после естественной инфекции. Они наблюдали частоту вирус-специфических В-клеток приблизительно 1 на 1000 тотальных В-клеток и получили 3 0 стабильных гибридом из линий В-клеток, секретирующих антитела, которые связывались с вирусом. Панель mAb содержала IgG нескольких подклассов с 24 IgGl, тремя IgG2 и двумя IgG3; один не определялся вследствие плохого роста гибридомы (таблица 5).
Оценка нейтрализации mAb. Восемнадцать mAb
продемонстрировали активность нейтрализации против репортерных частиц (VRP) азиатского штамма вируса CHIKV SL15649-GFP со значениями ECso <4 0 нг/мл, причем одиннадцать продемонстрировали сверхвысокую ингибиторную активность (определенную как величины
ЕС5о <Ю нг/мл, таблица 5) . Четыре mAb обладали слабой ингибиторной активностью (значения ЕС50 в диапазоне от 0,1 до 5 мкг/мл), и восемь из mAb не обладали ингибиторной активностью при наиболее высоких протестированных концентрациях (значения ЕС5о> 10 мкг/мл) .
Охват нейтрализующей активности. Авторы изобретения
определили значения ЕС50 для каждого антитела против
репрезентативных инфекционных штаммов CHIKV
восточно/центрально/южно-африканского (ECSA) генотипа (штамм LR2006 OPY1 [LR]), западно-африканского генотипа (штамм N1 64 IbH 35) и азиатского генотипа (штаммы RSU1 и 99659 [2014, карибский]) с использованием высокопроизводительного теста нейтрализации посредством подавления фокусообразования (FRNT)
(Pal et al. , 2013) . Двадцать пять mAb продемонстрировали активность нейтрализации против по меньшей мере одного штамма CHIKV (значения ЕС50 <10 мкг/мл), причем восемь mAb продемонстрировали нейтрализацию в эффективном диапазоне
(значения ЕС50 10-99 нг/мл) и тринадцать mAb продемонстрировали нейтрализацию в сверхэффективном диапазоне (значения ЕС50 <10 нг/мл) (таблица 5). Для целей сравнения авторы изобретения также протестировали ранее описанные mAb человека 5F10 и 8В10 против вирусов всех трех генотипов, и в каждом случае величины ЕС50 составляли > 100 нг/мл (диапазон 161-1337). В большинстве случаев mAb, выделенные авторами изобретения, продемонстрировали относительно сходную нейтрализующую активность против вируса всех трех генотипов. Шесть mAb (2В4, 2Н1, 4J21, 4N12, 5М16 и 9D14) ингибировали вирусы всех трех генотипов со сверхвысокой активностью (значения ЕС5о <10 нг/мл). Эти данные указывают на то, что у одного субъекта может сформироваться множество CHIKV-специфических антител, которые являются сверхэффективными и обладающими широкой нейтрализующей способностью.
Связывание с белком Е2. Белок Е2 CHIKV является преобладающей мишенью гуморальных ответов мыши (Goh et al. , 2013; Lum et al. , 2013), не являющегося человеком примата (Kam et al. , 2014) и человека (Fong et al. , 2014; Kam et al. , 2012a; Kam et al., 2012b; Selvarajah et al. , 2013) . Авторы изобретения
протестировали mAb человека в отношении связывания с мономерной формой эктодомена белка Е2, экспрессируемого в Е. coli (Pal et al., 2013) . Девять mAb прочно связывались с эктодоменом Е2, шесть продемонстрировали умеренное связывание, одно связывалось слабо и 14 не связывались выше фонового уровня (таблица 5) . Способность связывать очищенный белок Е2 in vitro не коррелировала непосредственно с эффективностью нейтрализации (таблица 5) . Подгруппу из 17 mAb человека исследовали с использованием анализа посредством поверхностного плазмонного резонанса в отношении связывания с белком рб2-Е1, происходящим из клеток млекопитающих (Voss et al., 2010). Все mAb связывались в нМ-диапазоне с величинами KD от 0,5 до 2 0 нМ. Отличия в кинетике связывания не коррелировали с антигенной специфичностью или функциональной активностью (таблица S1).
Исследования конкурентного связывания. Для идентификации не перекрывающихся антигенных областей в рекомбинантном белке Е2, распознаваемом различными нейтрализующими mAb, авторы изобретения использовали количественный анализ конкурентного связывания. Для сравнения они также оценивали четыре ранее описанных mAb мыши (СНК-84, СНК-8 8, СНК-141 и СНК-2 65) (Pal et al. , 2013) и ранее описанное mAb человека 5F10 (Warter et al. , 2 011) (фиг.5). Профиль конкуренции был комплексным, однако было очевидно три основных группы конкуренции, которые авторы настоящего изобретения обозначили как группа 1 (красная рамка), группа 2 (синие рамки) или группа 3 (зеленая рамка). Авторы изобретения также определили четвертую группу, содержащую одно mAb человека, 5F19 (оранжевая рамка). Эти конкурентные исследования указывают на то, что существует три основных антигенных области, распознаваемых CHIKV-специфическими антителами.
Картирование эпитопов с использованием аланин-сканирующего мутагенеза. Авторы изобретения использовали библиотеку аланин-сканирующего мутагенеза в сочетании с клеточной экспрессией и проточной цитометрией для идентификации аминокислот в белках Е2 и Е1 штамма CHIKV S27 (генотип ECSA), требуемых для связывания антител (Fong et al. , 2014) (фиг.бА-F) . Остатки, требуемые для
связывания антитела с гликопротеинами CHIKV для подгруппы из 2 0 mAb человека приведены в таблице б. Мутации, влияющие на связывание этих 2 0 mAb, указаны в выравнивании полноразмерных последовательностей Е2 штамма S27 и штаммов, соответствующих всем генотипам CHIKV, которые использовали в этом исследовании
(фиг.1А). Аминокислоты в Е2, которые влияют на связывание, расположены в основном в открытых для растворителя областях доменов А и В и дугах 1 и 2 [3-ленточного соединительного элемениа, который связывает домены А и В (Voss et al., 2010)
(фиг. 1А). Сравнение антигенных участков, идентифицированных посредством экспериментов по утрате связывания с использованием аланин-сканирующего мутагенеза с конкурентным анализом связывания (фиг.5) продемонстрировало, что группы конкуренции 1 и 2, главным образом, соответствовали участкам в домене домен А и дугах, в то время группа 3 соответствовала областям в домене В.
Структурный анализ антигенных областей. С большим и разнообразным количеством поверхностных остатков в доменах А и В и дугах контактирует по меньшей мере одно из mAb (фиг.1В-С). Две основных антигенных области в Е2 обуславливают связывание множества mAb. Первая область расположена в домене А между аминокислотами 58 и 8 0 и содержит предполагаемый связывающий рецептор домен (RBD) (Sun et al. , 2014; Voss et al. , 2010) . Вторая область расположена в домене В между аминокислотами 190 и 215. Обе области последовательности выступают в направлении от оболочки вируса и расположены вблизи вершины тримера Е2 (фиг.бА-F и 7) .
Механизм нейтрализации. Авторы изобретения провели анализы
нейтрализации до и после прикрепления с использованием mAb,
демонстрирующих диапазон ингибиторной активности. Как и
ожидалось, все пять исследованных mAb эффективно
нейтрализовывали инфекцию, когда их предварительно инкубировали с VRP (фиг.2А). Однако mAb 4В8 не нейтрализовывало VRP полностью даже при высоких концентрациях, что указывает на присутствие части вирионов CHIKV, резистентных к этому mAb; этот паттерн
также наблюдали в анализах с использованием жизнеспособных штаммов CHIKV, соответствующих трем различным генотипам CHIKV
(данные не представлены). Напротив, mAb ЗЕ23, 4J21, 5М16 и 9D14 полностью нейтрализовывали инфекцию при введении до прикрепления. Все пять mAb человека также нейтрализовывали инфекцию CHIKV при добавлении после прикрепления, однако авторы изобретения наблюдали три различных паттерна активности
(фиг.2А). MAb 4В8 было неспособно осуществить нейтрализацию при добавлении после прикрепления и доля резистентных вирионов была большей по сравнению с долей, наблюдаемой после нейтрализации до прикрепления. MAb 9D14 нейтрализовывало VRP со сравнимой эффективностью при добавлении как до, так и после прикрепления. MAb ЗЕ2 3, 4J21 и 5М16 продемонстрировали полную нейтрализацию VRP, однако эффективность нейтрализации после прикрепления была более низкой, чем до прикрепления. mAb 2Н1 и 4N12 также эффективно нейтрализовывали VRP при добавлении до или после прикрепления (фиг.8).
Тестирование в анализе слияния снаружи (FFWO) пяти сверхэффективно нейтрализующих mAb (ЗЕ2 3, 4В8, 4J21, 5М16 или 9D14) показало, что все они ингибировали слияние (Edwards and Brown, 1986). Как и ожидалось, когда вирионы, предварительно обработанные mAb, инкубировали непрерывно со средой, забуференной при нейтральном значении рН, наблюдали от незначительной инфекции до ее отсутствия (фиг.2В). В отсутствие обработки антителом короткая импульсная обработка кислотной рН-забуференной средой приводила к инфицированию клеток, что указывало на слияние между вирусной оболочкой и плазматической мембраной. Примечательно, что все пять mAb человека ингибировали слияние плазматических мембран и инфицирование, причем mAb 9D14 продемонстрировало наибольшую эффективность в этом анализе. Эти исследования указывают на то, что сверхэффективно нейтрализующие mAb блокируют слияние CHIKV.
Профилактика посредством MAb in vivo. Авторы изобретения протестировали подгруппу mAb, демонстрирующих разнообразные уровни активности нейтрализации (таблица 7) в модели летальной инфекции у мышей с высоким иммунодефицитом Ifnar^ в возрасте б
недель. Мышам предварительно вводили однократную дозу 50 мкг (~3 мг/кг) mAb человека против CHIKV или изотипического контрольного mAb, специфичного к вирусу лихорадки западного Нила (WNV пЕ1б), за 2 4 часа до подкожной инъекции летальной дозы CHIKV-LR2 00 6. Все мыши, которым вводили изотипическое контрольное mAb, погибли от инфекции к 4 суткам после инокуляции. Предварительная обработка посредством mAb 4В8, 4J21 или 5М16 полностью защищала мышей Ifnar^, в то время как обработка посредством mAb ЗЕ23 или 9D14 частично защищала инфицированных животных с показателями выживаемости 67% (фиг.ЗА). Неожиданно, mAb 2D12, которое имело слабую нейтрализацию in vitro, защитило 83% животных.
Терапия MAb после воздействия in vivo. Мышам Ifnar_/_ инокулировали летальную дозу CHIKV-LR2 00 6, а затем вводили однократную дозу 50 мкг (~3 мг/кг) репрезентативных mAb через 24 часа после инокуляции вируса. Терапевтическое введение этих mAb обеспечило полную защиту, в то время как изотипическое контрольное mAb не обеспечило защиту (фиг.ЗВ). Для дальнейшего определения терапевтического окна эффективности мышам Ifnar^ вводили однократную дозу 250 мкг (~14 мг/кг) репрезентативных mAb через 48 часов после заражения CHIKV-LR2006. Введение 5М16, 4J21 и 4В8 защитило 85%, 50% и 12,5% животных, соответственно (фиг.ЗС). Примечательно, что монотерапия 4N12 в последующий момент времени 60 часов защитила 10 0% животных при использовании в дозе 500 мкг (~28 мг/кг) (фиг. 3D) . Эти данные показывают, что mAb человека могут защищать от индуцируемой CHIKV гибели даже со значительными интервалами после развития инфекции.
Аналогично проводили исследования на мышах WT для оценки эффектов mAb человека на острый и хронический артрит CHIKV. Mab вводили на 1 или 3 сутки после инфекции и вирусную нагрузку или РНК анализировали на D3, 5 или 2 8 после инфекции. В зависимости от исследуемой ткани и времени как 1Н12, так 4J14 обеспечили наиболее значительную вирологическую защиту. 4N12 также обеспечило значительную защиту в этих анализах.
Комбинированная терапия mAb in vivo. Учитывая возможность селекции резистентности in vivo у животных, которым вводят одно mAb против CHIKV (Pal et al. , 2013), авторы изобретения
исследовали, может ли комбинация двух mAb человека против CHIKV защитить от летального заражения. Они выбрали пары нейтрализующих mAb на основе эффективности индивидуальных mAb in vitro. Мышам Ifnar_/_ вводили одну дозу комбинации (2 50 мкг каждого, всего ~28 мг/кг) наиболее эффективных mAb через 60 часов после инокуляции. Хотя некоторые комбинации mAb
([4J21+2H1] и [4J21+5M16]) обеспечили небольшую защиту или не обеспечили ее, другие ([4J21+4N12]) привели к показателю выживаемости 63% в этот очень поздний момент времени (фиг.3D). Таким образом, комбинированная терапия mAb защищала от летальной инфекции CHIKV у мышей с высоким иммунодефицитом даже при введении в пределах от 24 до 36 часов до момента, когда эти животные погибают. В этих условиях 4N12 действовало хуже в комбинации с 4J21, чем в качестве монотерапии, хотя дозирование 4N12 в экспериментах по монотерапии (500 мкг) в два раза превышало дозирование компонента 4N12 в комбинированной терапии
(2 50 мкг).
Таблица S1. Кинетика связывания антител человека против CHIKV с антигеном, измеренная посредством SPR
Величины ka, kd, KD представляют собой средние значения+стандартное отклонение. KD=kd/ka: ti/2= (In (2 )/kd) / 60 .
MAb против CHKV
Лиганд
(106M-ls-l)
kd (loVi)
KD(нМ)
tl/2(мин)
5M16
P62-E1
1,09+0,02
1,13+0,02
1,03+0,01
102+2
5M16Fab
VLP
1,19+0,01
0,84+0,13
7,07+1,06
137+21
4 J21
P62-E1
1,19+0,02
0,62+0,04
0,54+0,31
18 6+11
4J21Fab
VLP
1,58+0,03
14,2+0,29
9,00+0,03
8+0,2
3E23
P62-E1
3,18+2,4 3
2,67+0,87
6,11+1,41
43+19
3E23Fab
VLP
0,203+0,03
3,93+0,40
19,6+3,16
2 9+3
4B8
P62-E1
2,98+2,98
5,06+1,10
5,57+1,10
2 3+5
4B8Fab
VLP
0,60+0,04
3,33+0,30
5,60+0,46
35+3
5N2 3
P62-E1
2,98+0,75
2,40+0,66
0,87+0,37
48+17
1L1
P62-E1
0,88+0,44
2,73+0,36
3,7 9+2,10
42+6
2С2
рб2-Е1
1,54+0,65
6,08+1,45
4,59+2,32
19+6
2D12
рб2-Е1
17,5+1,64
5,41+4,97
0,4 9+0,0 8
13+4
4N12
Р62-Е1
1,24+0,02
1,18+0,01
0, 95+0,02
98+1
5014
рб2-Е1
0,79+0,02
9,11+0,19
1,15+0,01
13+0,3
SD14
рб2-Е1
2,70+0,90
2,82+0,14
1,13+0,40
41+2
8G18
рб2-Е1
3,90+0,21
1,88+0,11
0,48+0,02
62+3
4 J14
рб2-Е1
1,61+0,47
15,3+2,52
9, 94+2,64
8+1
Р62-Е1
2,61+0,04
50,9+0,75
19,5+0,2
2+0,03
ЗА2
рб2-Е1
2,12+0,02
10,1+0,12
4,78+0,08
11+0,1
1М9
рб2-Е1
1,86+0,99
3,98+0,26
2,48+0,99
2 9+2
ЗВ4
рб2-Е1
2,91+0,09
1,56+0, 11
0,54+0,02
74+5
рб2-Е1
0,99+0,03
2,74+0,10
2,77+0,18
42+2
8Е22
Р62-Е1
0,48+0,02
2,0+0,13
4,22+0,42
58+4
Пример 3 - Обсуждение
Авторы изобретения сообщили о выделении разнообразной панели встречающихся в природе mAb человека от одного субъекта, большинство из которых распознают белок Е2 CHIKV и демонстрируют выраженную активность нейтрализации in vitro и терапевтическую эффективность in vivo. Как класс, большинство ингибиторных антител также демонстрировали широкую активность, нейтрализующую вирусы всех трех генотипов CHIKV, включая штамм, в настоящее время циркулирующий в Карибском бассейне. Большинство mAb человека, специфичных к CHIKV, выделенных в этом исследовании, нейтрализовывали вирус в концентрациях менее 100 нг/мл, и многие из них продемонстрировали ингибиторную активность при менее чем 10 нг/мл. Эта активность является более высокой, чем наблюдалось авторами изобретения в предшествующих исследованиях mAb человека против других патогенных вирусов человека, включая вирусы гриппа HI, Н2, НЗ или Н5 (Hong et al. , 2013; Krause et al. , 2012; Krause et al., 2011a; Krause et al., 2011b; Krause et al., 2010; Thornburg et al. , 2013; Yu et al., 2008), вирусы денге (Messer et al., 2014; Smith et al. , 2013a; Smith et al. , 2014; Smith et al. , 2013b; Smith et al., 2012) и другие. Эффективность многих
mAb человека против CHIKV является сравнимой или превышает
эффективность лучших в своем классе нейтрализующих mAb мыши
против CHIKV (Fong et al. , 2014; Fric et al. , 2013; Pal et al. ,
2013; Warter et al. , 2011), которые были получены после
неоднократной вспомогательной иммунизации и созревания
аффинности. Большинство других нейтрализующих mAb человека
против CHIKV являются существенно менее эффективными (Fong et
al., 2014; Selvarajah et al. , 2013; Warter et al. , 2011). Одно
ранее описанное специфичное к CHIKV mAb человека (IM-CKV0 63)
демонстрирует активность, сравнимую с активностью
сверхэффективных нейтрализующих mAb, описанных в настоящем описании (Fong et al., 2 014).
Авторы изобретения выявили многообразие паттернов распознавания эпитопа в Е2 различными протестированными нейтрализующими mAb против CHIKV. Точное картирование эпитопа посредством замещенных аланином гликопротеинов CHIKV продемонстрировало, что распознавание этих структурных областей в Е2 ассоциировано с опосредуемой mAb нейтрализацией: домен А, который содержит предполагаемый RBD (Sun et al. , 2013; Voss et al. , 2010), домен В, который контактирует и экранирует петлю слияния в El (Voss et al. , 2010), и дуги 1 и 2 [3-ленточного соединительного элемента, который содержит чувствительную к кислотам область и связывает домены А и В (Voss et al. , 2010) . Среди антител, картированных на эпитопах Е2, основная часть (антитела в группах конкуренции 1 и 2) предпочтительно распознавала участки в домене А и дуги 1 и 2, в то время как меньшая группа (в группе конкуренции 3) распознавала участки в домене В. Эти данные указывают на то, что экспонированные на поверхности области в домене А и дуги являются преобладающими антигенными участками, которые индуцируют ответы нейтрализующих антител человека. Авторы изобретения сделали заключение, что высококонсервативная область в домене А и дуге 2 может индуцировать широко защищающий иммунный ответ и служить привлекательным кандидатом для сфокусированной на эпитопе разработки вакцины.
Примечательно, что практически четверть экспонированных на поверхности остатков в ключевых доменах Е2, как оказалось, связывается одним или несколькими mAb от одного субъекта. Существование функционально разнообразных способов связывания на основных антигенных центрах предполагается вследствие двух наблюдений: (а) некоторые mAb связывались со сходными эпитопами, но демонстрировали ингибиторную активность, которая варьировалась на несколько порядков величины, и (Ь) корреляция между нейтрализующей способностью и аффинностью связывания с белком Е2 была малой. Семь из наиболее эффективно нейтрализующих mAb человека (2Н1, ЗЕ23, 4В8, 4J21, 4N12, 5М16 и 9D14) ингибировали инфекцию CHIKV на стадии после прикрепления, вероятно, посредством предотвращения рН-зависимых структурных изменений, которые препятствуют проникновению нуклеокапсида в цитоплазму (Kielian et al. , 2010) .
Поскольку терапевтическая эффективность у мышей по-видимому прогнозирует исходы лечения при экспериментально индуцируемой инфекции и артрите у не являющихся человеком приматов (Pal et al., 2 013; Pal et al., 2 014), данные, представленные в настоящем описании, указывают на то, что профилактика людей посредством специфичных к CHIKV mAb человека может предотвратить инфекцию. Учитывая опасения, касающиеся селекции резистентных вариантов при монотерапии (Pal et al. , 2013), может быть желательной комбинированная терапия с использованием сверхэффективных нейтрализующих антител, которые нацелены на различные области Е2. Терапия может быть нацелена на популяции пациентов, имеющих значительно увеличенный риск тяжелого заболевания, в ходе вспышек, включая пациентов с имеющимися серьезными медицинскими состояниями (например, беременные женщины на поздних сроках, индивидуумы с иммунодефицитом и пожилые индивидуумы). Планируется дальнейшее клиническое тестирование для определения того, могут ли нейтрализующие mAb человека предупреждать или смягчать развившееся заболевание суставов у человека.
ТАБЛИЦА 1 - НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДЛЯ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ АНТИТЕЛ
Клон
Последовательность вариабельной области
SEQ
NO:
1Н12
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTC AGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCCTCTGGTTACAGCTTTACCAGCTACGGTA TCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGG AT СAGСACТ ТACAAAGGТ ТACACACAGТAT GСACAGAACТ Т CCAGGGCAG AG Т СAC CAT САС СACAGACАСАС С С G С GAC ТACAG TCTATATG GAG С Т GA GGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGCGCGAGAGTTCTT TCCGAGACTGGTTATTTCTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGG CCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
1Н12
легка
CAGGCTGTGGTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAG GGTCACCATCTCCTGTACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGATTATA ATGTACACTGGTACCAGCTGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATC TATGGTAACACCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTC CAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGG ATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGCTTCG GTATTCGGCGGAGGGACCAAACTGACCGTCCTAG
2В4
тяжел
caggtgcagctggtgcaatctgggtctgagttgaagaagcctgggGCCTC AGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACAGTTTCACTAGCTATTCTA TCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCCTGAGTGGATGGGATGG АТС GACAC СAACAC T G G GAAC С СAAC С TAT G С С СAG GAC T T С G СAG GAC G GTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCACCACGGCATATCTGCAGATCA G СAG С С TAAAG G С T G G G GACAC TGCCGTTTAT TAC T G T G СAACATAT TAT GTTGACCTTTGGGGGAGTTATCGCCAAGACTACTACGGTATGGACGTCTG GGGCCAC
2В4
легка
cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagag ggtcaecatCTCTTGTTCTGGAGGGAGCTCCAACATCGGGAGTAATCCTG TAAATTGGTACCAGATGGTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCCTCTAT ACTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAA GTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAATGGACTCCAGTCTGAGGATG AGGCTGATTATTACTGTGCAGTATGGGATGACAGCCTGAGTGGCCGTTGG GTGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGACCGTCCTA
2Н1 тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTC AGTGAGGGTCTCCTGCAAGGCGTCTGGTTACACCTTTACCAGTTATGGTA
TCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGG AT СAGСАСТ ТАСААТ GGT GACACAAAC ТAT GСACAGAAGТ Т ССAGGGСAG AG Т САС С Т Т GACAACAGAGACAT С СAC GAG СACAG С С ТACAT G GAG С Т GA GGCGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTACTACTGTGCGAGAGATTTT GAATTTCCCGGAGATTGTAGTGGTGGCAGCTGCTACTCCAGGTTCATCTA CCAGCACAACGACATGGACGTCTGGGGCCACGGGACCCTGGTCACCGTCT CCTCAGCAAGC
2Н1
легка
CAGGCTGTGGTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAA GGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATCATTATG TATCCTGGTACCAGCACCTCCCGGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATTTAT GACAATTATAAGCGACCCTCAGTGATTCCTGACCGATTCTCTGCCTCCAA GTCTGGCGCGTCAGCCACCCTGGGCATCATCGGACTCCAGACTGGGGACG AGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATAGCAGCCTGAGTGCTGTGGTA TTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
ЗЕ23
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACAC CCTGTCCCTCACCTGCAGTGTCTCAAGTGACGCCCTCCGCAGCAGGAGTT ATTACTGGGGCTGGGTCCGCCAGCCCCCCGGGAAGGGATTGGAGTGGATT GGGACTGTCTCTTATAGTGGGGGCACCTACTACAACCCGTCCCTCCAGAG TCGAGTCACCGTGTCGGTGGACACGTCCAAGAACCACTTCTCCCTGAGGT TGAACTCTGTGACCGCCGCAGACGCGGCTGTTTATTACTGTGCGAGATCT TATTTCTATGATGGCAGTGGTTACTACTACCTGAGCTACTTTGACTCCTG GGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
ЗЕ23
легка
CAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCCTCACTGACTGTGTCCCCAGGAGGGAC AGTCACTCTCACCTGTGCTTCCAGCACTGGAGCAGTCACCAGTGGTCACT ATCCAAACTGGTTCCAGCAGAAACCTGGACAACCACCCAGGGCCCTGATT TATAGCACAGACAACAAGCACTCCTGGACCCCTGCCCGGTTCTCAGGCTC CCTCCTAGGGGTCAAGGCTGCCCTGACACTGTCAGATGTACAGCCTGAGG ACGAGGCTGACTATTACTGCCTGCTCCATTTTGGTGGTGTCGTGGTCTTC GGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
3N2 3
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTC CCTGAGACTCTCCTGTGCAGTGTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCCA TGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGACTGGGTGGCAGTT ATATGGTAT GAT G GAAG TAATAAATAC TAT G СAGAC T С С G T GAAG G G С С G ATT СAC СAT С T С СAGAGACAAT T С СAAGAACACGCTGTATCTGCAAGT GA ACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGGGTGAC
TACGTTCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
3N2 3
легка
GACATTGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA СAGAG Т СAC CAT СAG TTGCCGGGC СAG Т СAGAG CAT ТСС СAG С ТAT Т ТАА ATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTATGCT ACATCCACTTTGGAAGCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGTGGCAGTGGATC TGGGACAGATТ Т САС Т С Т СACCAT САССAGТ С Т GСААСС Т GAAGAT Т Т Т G СААС Т ТАС ТАС Т G Т СAACAGAG Т ТACAATAC G G G GATATТ САС TTTCGGC CCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
4 J14
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTC GGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACTTCCAGCACTTATGCTA TCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGC AG CAT CCCTGTCTTTGC ТАСAG ТАААС ТАС G СACAGAAG Т Т С СAG G G СAG АС Т САС GAT ТАС С G С G GAC GAAT С САС GAG СACAG Т Т ТАСAT G GAAC Т GA GCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTTTATTTCTGTGCGAGCCCCTAT TGTAGTAGTATGAACTGCTATACGACCTTTТАСTACTTTGACTTCTGGGG CCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
4 J14
легка
CAGGCTGTGGTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTTTGGGTTTCCTGGACAGTC GAT САС CATCTCCTG САС Т G GAAC СAG СAG Т GAC TTTGGTACT ТATAAC Т ATGTCTCTTGGTACCAGCAACACCCAGGCCAAGCCCCCAAACTCATGATT TTTGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTC CAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGG ACGAGGCTTCTTATTACTGCAGCTCCTATACAAGCGGCAGCACTCTCTAC GGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTG
4 J21
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTC AGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACAGTTTCACTAGCTATTCTA TCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCCTGAGTGGATGGGATGG АТС GACАС СAACAC Т G G GAAC С СААС С ТAT G С С СAG GAC Т Т С G СAG GAC G GTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCACCACGGCATATCTGCAGATCA G СAG С С TAAAG G С Т G G G GACAC TGCCGTTTAT TAC T G T G СAACATAT TAT GTTGACCTTTGGGGGAGTTATCGCCAAGACTACTACGGTATGGACGTCTG GGGCCACGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
4 J21
легка
CAGTCTGTGGTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCTGGGACCCCCGGGCAGGG GGTCACCATCTCTTGTTCTGGAGGGAGCTCCAACATCGGGAGTAATCCTG TAAATTGGTACCAGATGGTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCCTCTAT ACTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAA
GTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAATGGACTCCAGTCTGAGGATG AGGCTGATTATTACTGTGCAGTATGGGATGACAGCCTGAGTGGCCGTTGG GTGTTCggcggagggaccaagctgaccgtccta
4N12
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTC AGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGATACATCCTCAGTAAATTATCCG TGCACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGACTTGAATGGATGGGAGGT Т С Т GAAC G Т GAAGAT G G С GAAACAG Т С ТАС G СACAGAAG Т Т С СAG G G СAG AAT CAGC Т Т GAC С GAG GACACATС TATAGAGACAGСС ТАСAT GGAGС TGA GCAGCCTGAGTTCTGAGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCAACAGGAGGC TTCTGGAGTATGATTGGGGGAAATGGAGTGGACTACTGGGGCCAGGGAAC CCTGGTCACCGTCTCCTCA
4N12
легка
CAGGCTGTGGTGACTCAGTCTCCATCGTCCCTGCCTGCATCTGTAGGAGA СAG G G T СAC CAT СAC TTGCCGGG СAAG T СAG GACAT TAGAAATAAT T TAG GCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTGAGCGCCTGATCTATGGA ACCTCCAATTTGCAGAGTGGGGTCCCGTCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATC T G G GACAGAAT T СAC T С T СACAAT СAG СAG С С T G СAG С С T GAAGAT T T T G СAAC TTATTACTGTC TACAG СATAATAG T TAC С С T С ССАСGTTCGGCCGC GGGACCAAGGTGGAAATCAAA
5М16
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTC AGTGAGAGTTTCCTGCAAGGCATCTGGGTACACCTTCACCAGTTACTTTA TGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGACTTGAGTGGATGGCGATA ACTTATCCTGGTGGTGGTAGCCCATCCTACGCACCGCAGTTCCAGGGCAG AC T СAC CAT GAC С GAC GACAC G T С С G С GAC СACAG T С ТАСAT G GAC С T GA GTGACCTGACTTCTAAAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGTGCC CACCGTTCCATTGGGACGACCCCCCTTGACTCGTGGGGCCAGGGAACCCT GGTCACCGTCTCCTCAGCAAGCTTCAAGGG
5014
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGACGCGTGGTCCAGGCTGGGAGGTC CCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTATGTATGGCG TCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTT ATAT G GAAT GAT G GAT С TAAAGAATAC TAT G GAGAC T С С G T GAAG G G С С G ATT СAC СAT С T С СAGAGACAAT T С СAG GAACAC GTTGTATCTG CAAATGA AC AG С С T GAGAG T С GAC GAC AC G G С AG TGTATTTTTGTGC GAGAGAT G GA ATTCCTGACCCTGAACGCGGTGACTACGGGGGCTTGGACTACTGGGGCCA GGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
5014
CAGACTGTGGTGACTCAGTTTCCATCCTCCCCGTTTGCATCTGTAGGAGA
легка я
С G GAG Т САС CAT САС TTGCCGGG С AAG G СAGAG CAT TAG СAG TTATGTTA ATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATTTACGCT ACATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATA T GGGACAGAT T T САС T С T CACCAT CAGCGGT С TGCAACCTGAAGAT T T T G СAACATAC TAC T G T СAACAGAG T TACAG TTTTCCTC GAAC G T T С G G С СAA G G GAC СAAG G T G GAAAT СAAAC
8G18
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTCAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTC GGTGAAGGTCTCCTGCAAGCCCTCTGGAGGCACCTTCAACAACAATGGGA TCAGTTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGC ATCGTCCCGAACTTTGGAACCCCAACCTATGGACAAGACTTCCAGGGCAG AGTCACGATCACCGCGGACGAATCTACGAGCACAGTCTTCTTGGAGCTGA CCAGACTGAGATCTGACGACACGGCCGTTTATTTCTGTGCGCGAGGTCGC ACGGCGGTGACTCCGATGCAATTGGGTTTACAGTTCTACTTTGACTTCTG GGGCCGGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
8G18
легка
cagactgtggtgactCAGGAGCCCTCACTGACTGTGTCCCCAGGAGGGAC AGTCACTCTCACCTGTTCTGCCAACAGTGGAGCAGTCACCAGTGATTACT АТС СAAAC TGGTTCCAG СAGAAAC С T G GACAAG CACCCAGGGCACT GAT T TATAGTGCAAGCAACAAATTCTCCTGGACGCCTGCCCGGTTCTCAGGCTC CCTCCTTGGGGGCAAAGCTGCCCTGACACTGTCAGGTGCGCAGCCTGAGG ACGAGGCTGAGTATTACTGCCTGGTCTACTCTGGTGATGGTGTGGTTTTC GGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCC
119
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGGGCCTC AGTGAAGGTCTCCTGCAAGACTTCTGGATATACGTTCACCGACAACTCTG TACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGTTTGAGTGGATGGGACGG ATCAACCCTAACACTGGTGTCTCAACTTCTGCCCAGAAGTTTCAGGGCAG G G T СAC CAT GAC СAG G GACAC G T С CAT СAG СACAAC С ТАСAT G GAG С T GA G С AG T T T GAGAT С T GAC GAC AC GGCCGTCTAT T AC T G T G С GAGAGAG GAG AACGATAGTAGTGGGTATTACCTTTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT CTCCTCA
119
легка
CAGATTGTGGTGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTTTGCATCTGTAGGAGA СAGAG T СAC CAT СAC TTGCCGGG СAAG T СAGAG CAT TAG СAC С TAT T TAA ATTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCT GCATCCAGTTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCGGTGGCAGTAGATC T GGGACAGAT T T САС T С T CACCAT CAGCAGT СTGCAACCTGAAGAT T T T G СAAC T TAC TAC T G T СAACAGAG T TACAG GAC С С С G T GGAC G T T С GGС СAA
GGGACCAAGGTGGACATCAAA
1L1
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAGAC CCTCACGCTGACCTGCACCTTCTCTGGGTTCTCACTCAGTATTAGTGGAG TGGGTGTGGGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGAAAGGCCCTGGAGTGGCTT G САС Т CAT Т ТAT Т G G GAT GAT GATAAG С G С ТАСAG С С CAT С Т С Т GAAGAG CAGGCTCACCATCAC СAAG GАСАС С Т С С GААААС CAGGTGGTCCT ТАСАА Т GAC СААС AT G GAC С С Т G Т G GAC AC AG С С AC AT AT Т AC Т G Т G С AC AC AG T ATGACTAAAGGCGGGGCTATCTATGGTCAGGCCTACTTTGAATACTGGGG CCAGGGAACCCTGGTC
1L1
легка
CCATCTCCTGCACTGGAACCAGACAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGT CTCCTGGTAC СAACAACAC С СAG G СAAAG С С С С СAAAC Т CAT CAT Т TAT G ATGTCACTGATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGCCTCCAAG TCTGCCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGA G G С T GAT TAT TAC T G СAG С T СATATACAAG СAG СAG СAC TCTGGTTTTCG GCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
1М9
тяжел
caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggGGCCTC AGTGAAGGTCTCCTGCAAGGTTTCCGGATACACCCTCACTGAATTATCCA TGCACTGGGTGCGACAGGCTCCTGGAAAAGGCCTAGAGTGGATGGGAGGT T T T GAG С С T GAAGAT G G T GAAACAAT С ТАС G СACAGAAG T T С СAG G G СAG AG T СAC CAT GAC С GAG GACACAT С TAGAGACACAG С С ТАСAT G GAG С T GA G TAG С С T GAGAT С T GAG GACAC GGCCGTCTATTACTG TACAACAGAT СAG GTCTACTATCGTTCGGGGAGTTATTCTGGATATGTTGACTACTGGGGCCA GGGAACCCTGGTC
105
тяжел
caggtccagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtCCTC AGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGACGCACCTTCAGCAGCTATGTTA TCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGG AT CAT CCCTCTGTTTGG TACAG СAAAC TAC G СACAGAAAT T С СAG G G СAG AG T СAC GAT TAC С G С G GAC GAAT С САС GAG СACAG С С ТАСAT G GAG С T GA GCAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGGGGCGCC CAGCTATATTACAATGATGGTAGTGGTTACATTTTTGACTACTGGGGCCA GGGAGCCCTGGTC
106
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGCCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGACCTC AGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATTCAGCTTTATTAGCTCTGCTG TGCAGTGGGTGCGACAGGCTCGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGATGG
ATCGTCGTTGCCAGTGC ТAACACAAAC ТAC G СACAGAAG Т Т С С G G GAAAG AG Т САС СAT ТАС TAG G GACAT G Т С СACAAACACAG CCTATATG GAAC T GA CCAGCCTGAGATCCGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGGCAGAGCAC CGGTCCCCTTGTAGTGGTGGTGATAGCTGCTACAGTCTCTACTACGGTAT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
2А2
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTTCCGCCTGGGGGGTC CCTGAGACTGTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACCGTTAGTAACTATGGCA TGAGCTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACT AT TAG TAC TAG TAG T G G TAGAACAT T С ТАС G СAGAC T С С G T G GAG G G С С G G T T СAC СAT С T С С G GAGACAAT T С СAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGA ACAGCCTGAGAGTCGAAGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGCCCG TTCGGGGGCGACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTC CTCA
2А2
легка
CAGGCTGTGGTGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGA AAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGCCATCTACTTAG CCTGGTATCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGAT GCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTC T GGGACAGAC T T САС T С T CACCAT СAG СAG С С TAGAG С С TGAAGAT Т Т Т G CAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTGG СААС TGGCAGTACACTTTTGGCCAG G G GAC СAAAC Т G GAGAT СAAA
2С2
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCTGGCAGGTC CCTGACACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGTTTATGCCA TGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCTTGGAGTGGGTCGCAGGT ATTAGTTGGAATAGTGGTAGCGTAGGCTATGCGGACTCTATGAAGGGCCG ATT САС СAT С Т С СAGAGACAACGССAAGAAC TCCCTGTATCTGCAAAT ТА ACAG T С T GAGAG С T GAG GACAC GGCCTTATAT TAC T G T G СAAAAG CAT T С TGGTTCGGGGAGTTATCGGGTTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGAC CCTGGTCACCGTCTCCTCA
2С2
легка
CAGGCTGTGGTGACTCAGCCTCCCTCCGCGTCCGGGTTTCCTGGACAGTC AGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTAGTTATAACT ATGTCTCCTGG TAC СAACAG СAC С СAG G СAAAG С С С С СAAAC Т СATAAT Т TATGCGGTCACTAGGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGAGCGCTTCTCTGGCTC CAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCGTCTCTGGGCTCCAGGCTGAGG AT GAG G С Т GAT TAT ТАС T G САС С Т СATAT G СAG G СAACAACAAG GAT G T С
TTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA
2D12
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTC AGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACAGCTTTAACATCTATGGTA TCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGG AT СAG С G С Т ТACAAT G G ТAACACAAAC ТAT G СACAGAAAC Т С СAG G G СAG AG Т САС CAT GAC СACAGACACAT С САС GAG СACAG С С ТАСAT G GAAC T GA GGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACCACTT TGGGGGGAATTTTACTATGATATCTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGT CTCCTCA
2D12
легка
CAGGCTGTGGTGACTCAGTCTCCAGGCACCCTGTCCTTGTCTCCAGGGGA AAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCGGGTACT CAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTAT GGTGCATCCAAAAGGGCCGCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG GT С T GGGACAGAC T T САС T С T CACCAT СAGСAGACTGGAGCCTGAAGAT T TTGCAGTGTATTACTGTCAGCTGTTTGCTACCTCACCTCCGCCCTTCGGC СAAG G GACAC GACTGGAGATTAAA
ЗА2
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTC CCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAATTATGTTA TGGAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTT ATAT СATAT GAT G GAAG СAATAAATAC TAT G СAGAC T С С G T GAAG G G С С G ATT СAC СAT С T С СAGAGACAAT T С СAAGAACAC GTTGTATCTG CAAAT GA AC AG С С T GAGAG С T GAG GAC AC GGCTGTGTAT T AC T G T G С GAGAT С AGAG TGGGAGTCT T CC TAT GGT T CGGGGAAT TAT TATACAGAT ТАС T T С ТАС ТА CTACGCTATGGACGTCTGGGGCCCAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
ЗА2
легка
CAGGCTGTGGTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGA GCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAATCAGAGCCTCCTGCGTGGTATTA GATACAAC TAT T T G GAT T G G TAC С T G СAGAAAC СAG G G СAG T С T С СACAG CTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTT CAGT GGCAGT GGAT СAG С СACAGATT T TACAC T GAAAAT СAGСAGAGT GG AGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCT AC СAC С T T С G G С СAAG G GACAC GAC T G GAGAT TAAA
ЗВ4 тяжел
CAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAGAC CCTCACGCTGACCTGTTCCTTCTCTGGGTTCTCACTCACCACTACTGGAG
TGACTGTGGGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGAAAGGCCTTGGAGTGGCTT G САС Т CAT Т ТAT Т G G GAT GAT GATAAG С G С ТАСAG С С CAT С Т С Т GAAGAG CAGGCTCACCATCAC СAAG GАСАС С Т С САААААС CAGGTGGTCCTTACCA TGACCAACATGGACCCTGTGGACACTGCCACATATTACTGTGCGCACTCC ACCGGCTACTATGATAGTAGTGGCTATCGAGGGGCCCTTGATGCTTTTGC TGTCTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
ЗВ4
легка
CAGATTGTGGTGACTCAGTTTCCAGACTCCCCGGCTGTGTCTTTGGGCGA GAG G G С САС CAT СААС Т G СAAG Т С СAG С СAGAG Т G Т Т Т ТATАС САС Т С СА АСААТАААААС ТАС Т TAG С Т Т G G ТАС СAG СAGAAAC СAG GACAG С С Т С С Т AACCTGCTCATTTACTGGGCATCTGCCCGACAATCCGGGGTCCCTGACCG ATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCC TGCAGGCTGAAGAT GT GGCAGT Т ТАТ ТАС Т GТ СAGСAATATTATAGТАС Т CCGTACACTTTTGGCCAGGG GAC СAAG С Т G GAGAT СAAA
ЗЕ23
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGACAC CCTGTCCCTCACCTGCAGTGTCTCAAGTGACGCCCTCCGCAGCAGGAGTT ATTACTGGGGCTGGGTCCGCCAGCCCCCCGGGAAGGGATTGGAGTGGATT GGGACTGTCTCTTATAGTGGGGGCACCTACTACAACCCGTCCCTCCAGAG TCGAGTCACCGTGTCGGTGGACACGTCCAAGAACCACTTCTCCCTGAGGT TGAACTCTGTGACCGCCGCAGACGCGGCTGTTTATTACTGTGCGAGATCT TATTTCTATGATGGCAGTGGTTACTACTACCTGAGCTACTTTGACTCCTG GGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
ЗЕ23
легка
CAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCCTCACTGACTGTGTCCCCAGGAGGGAC AGTCACTCTCACCTGTGCTTCCAGCACTGGAGCAGTCACCAGTGGTCACT ATCCAAACTGGTTCCAGCAGAAACCTGGACAACCACCCAGGGCCCTGATT TATAGCACAGACAACAAGCACTCCTGGACCCCTGCCCGGTTCTCAGGCTC CCTCCTAGGGGTCAAGGCTGCCCTGACACTGTCAGATGTACAGCCTGAGG ACGAGGCTGACTATTACTGCCTGCTCCATTTTGGTGGTGTCGTGGTCTTC GGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
ЗН5
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTC CCTGAGACTCTCCTGTTCAACGTCTGGATTCACCTTCAGGATGTATGGCA TGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCGTT AT T T T TAAC GAT G GAG T TAAGAAATAT TAT G GAGAC G С С G T GAAG G G С С G ATT СAC С G T С T С СAGAGACAAT T С СAG GAACAC CCTGTATCTG GAAAT GA AAAGCCTGAGAGTCGACGACACGGCTGCCTACTACTGTGCGAGAGACGGG ATTCCTGACCCCGAACGCGGTGACTACGGGGGCTTGGACTACTGGGGCCA
GGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
ЗН5
легка
CAGACTGTGGTGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA СACAG Т САС CAT САС TTGCCGGG СAAG Т СAGAG CAT ТАС СAG Т ТAT Т ТАА ACTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCAAAGCTCCTCATCTATGCT ACATCCAGTTTGCAAAGTGGGCTCCCCTCAAGGTTCAGTGGCAGTGGCTA TGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGTGGTCTGCAACCTGAAGATTTTG СААСATAC ТAC Т G Т СААСAGAG Т ТАСAG ТТТТССТС GAAC G Т Т С G G С САА G G GAC СAAG G Т G GAAAT G GATА
3121
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTC CCTGAGACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCATCTTTGATGATTATGCCA TGTACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGT ATTAGTTGGAATAGTGGAAACATAGCCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCG AT Т САС СAT С Т С СAGAGACAACGССAAGAAC TCCCTGTATTTGGAAAT GA ACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGTAAAAGATCTT TACGGGTACGATATTTTGACTGGTAATGGATATGATTACTGGGGCCAGGG AACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
3121
легка
CAGGCTGTGGTGACTCAGTCTTCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGA GCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCAAAGTAATG GATACAAC TAT T T G GAT T G G TAC С T G СAGAAG С СAG G G СAG T С T С СACAG CTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTT СAG T G G СAG T G GAT СAG G СACAGAT T T TACAC T GAAAAT СAG СAGAG T G G AGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCT CCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAA
ЗК11
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTC GGTGAAGGTCCCCTGCAAGGCTTCTGGAGACACCCTCAGTTACTACGGAA TCACTTGGGTGCGACGGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGACAG ATCATCCCTTTCTTTGCTACAACAATCTCCGCACAGAAGTTCCAGGGCAG AC T СAC CAT GAC С G С G GAAGAAT С САС GAG САС T G G С ТАСAT G GAG С G СA CAT T T TACAT G GAC T T GAG TAG С С T TAGAC С T GAG GACAC G G С С G TATAC TACTGTGCGGGGGGCTACTATGGTTCGGGGAGTTCGGGCGACTACGGTTT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
ЗК11
легка
CAGGCTGTGGTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAG GGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATG ATGTAAACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATC TATGGTAACAACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTC
CAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGG ATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGTTCG GGAGTCTTCGGAACTGGGACCGAGGTCACCGTCCTA
4В8
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGAC CCTGTCCCTGACGTGCGCTGTTTCTGGTGACTCCATCGGCAGTAGAAGTT TCTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATT G GAAG TAT С TAT TATAAT GGGAC СAC С TAC TACAAGCCGTCCCT CAAGAG TCGAGTCACCATATCCCTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAGGC TGAGCTCTCTGACCGCCACAGACACGGGTGTCTATTACTGTGCGCGGGCG CCAACCTACTGTAGTCCTTCCAGCTGCGCAGTTCACTGGTACTTCAATCT CTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
4В10
тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGCTGAAGAAGCCTGGGGCCTC AGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACATATTTACCAAATATGGTA TCAGTTGGCTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGGATGG AT CAGCGCTTACAAT GAAAACACAAAC TAT GСAGAGAAGT T ССAGGGСAG AG T СAC С T T GAC СACAGAT G CAT С САС GAG САС G G С С ТАСAT G GAG С T GA GGAACCTGAGATCTGACGACACGGCCGTATACTTCTGTGCGAGAGAAGTC TGGTTCGCGGAGTATATTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTC CTCA
8Е22
легка
CAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCCTCACTGACTGTGTCCCCAGGAGGGAC AGTCACTCTCACCTGTTCTGCCAACAGTGGAGCAGTCACCAGTGATTACT АТС СAAAC TGGTTCCAG СAGAAAC С T G GACAAG CACCCAGGGCACT GAT T TATAGTGCAAGCAACAAATTCTCCTGGACGCCTGCCCGGTTCTCAGGCTC CCTCCTTGGGGGCAAAGCTGCCCTGACACTGTCAGGTGCGCAGCCTGAGG ACGAGGCTGAGTATTACTGCCTGGTCTACTCTGGTGATGGTGTGGTTTTC GGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAA
9А11
легка
CAGTCTGTGGTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTC GATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGCTTATAACT ATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCGTGATT TATGATGTCGCTAATCGGCCCTCAGGGATTTCTGACCGCTTCTCTGGCTC CAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGG ACGAGGCTGATTATTACTGCGGCTCATATACCAGCGACGTCTCGCCGGTT TTCAGCGGGGGGACCAAGCTGACCGTCCTCA
9D14 тяжел
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTC AGTGAAGCTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACAAGTCATCCTA
TGAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGG
AT СAACAC СAAGAC T G G GAAC С TAAC T TAT G С С СAG G G С T T СACAG GAC G
GTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGGACGGCGTATCTGCAGATCA
G С G G С С TAAAG G С T GAG GACAC T G С CAT T TAT TAC T G T G С GAGAGAT GAG
TATAGTGGCTACGATTCGGTAGGGGTGTTCCGTGGTTCTTTTGACGACTT
CTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
3N2 3 тяжелая
QVQLVQSGGGWQPGRSLRLSCAVSGFTFSNYAMHWVRQAPGKGLDWVA VIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQVNSLRAEDTAVYYCAR GDYVLDYWGQGTLVTVSS
3N2 3 легкая
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQSIPSYLNWYQQKPGKAPKVLIY ATSTLEAGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPEDFATYYCQQSYNTGIFT FGPGTKVDIK
4 J14 тяжелая
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTSSTYAISWVRQAPGQGLEWMG GSIPVFATVNYAQKFQGRLTITADESTSTVYMELSSLRSEDTAVYFCAS PYCSSMNCYTTFYYFDFWGQGTLVTVSS
4 J14 легкая
QAWTQPASVFGFPGQSITISCTGTSSDFGTYNYVSWYQQHPGQAPKLM IFDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEASYYCSSYTSGST LYGGGTKLTVL
4 J21 тяжелая
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSFTSYSINWVRQAPGQGPEWMG WIDTNTGNPTYAQDFAGRFVFSLDTSVTTAYLQISSLKAGDTAVYYCAT YYVDLWGSYRQDYYGMDVWGHGTLVTVSS
4 J21 легкая
QSWTQPPSVSGTPGQGVTISCSGGSSNIGSNPVNWYQMVPGTAPKLLL YTNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAINGLQSEDEADYYCAVWDDSLSG RWVFGGGTKLTVL
4N12 тяжелая
QVQLVQS GAEVKKPGASVKVS CKVS GYILSKL SVHWVRQAPGKGLEWMG GSEREDGETVYAQKFQGRISLTEDTSIETAYMELSSLSSEDTAVYYCAT GGFWSMIGGNGVDYWGQGTLVTVSS
4N12 легкая
QAWT QS Р S S L PAS VGDRVTIТ CPAS QDIRNNLGW YQQKPGKAPERLIY GTSNLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPPTF GRGTKVEIK
5М16 тяжелая
QVQLVQSGAEVKKPGASVRVSCKASGYTFTSYFMHWVRQAPGQGLEWMA ITYPGGGSPSYAPQFQGRLTMTDDTSATTVYMDLSDLTSKDTAVYYCAR GAHRSIGTTPLDSWGQGTLVTVSSASFK
5014 тяжелая
QVQLVQS GGRWQAGRS LRLSCAAS G FTFSMYGVHWVRQAPGKGLEWVA VIWNDGSKEYYGDSVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRVDDTAVYFCAR DGIPDPERGDYGGLDYWGQGTLVTVSS
5014 легкая
QTWTQFPSSPFASVGDGVTITCRARQSISSYVNWYQQKPGKAPKLLIY ATSSLQSGVPSRFSGSGYGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQSYSFPRTF GQGTKVEIK
8G18 тяжелая
QVQLVQSGAQVKKPGSSVKVSCKPSGGTFNNNGISWVRQAPGQGLEWMG GIVPNFGTPTYGQDFQGRVTITADESTSTVFLELTRLRSDDTAVYFCAR
GRTAVTPMQLGLQFYFDFWGRGTLVTVSS
8G18 легкая
QTWTQEPSLTVSPGGTVTLTCSANSGAVTSDYYPNWFQQKPGQAPRAL IYSASNKFSWTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCLVYSGDGV VFGGGTKLTV
119
тяжелая
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDNSVHWVRQAPGQGFEWMG RINPNTGVSTSAQKFQGRVTMTRDTSISTTYMELSSLRSDDTAVYYCAR EENDSSGYYLWGQGTLVTVSS
119
легкая
QIWTQSPSSLFASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPKLLIY AASSLESGVPSRFGGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPWTF GQGTKVDIK
1L1
тяжелая
QVQLVQSGP.TLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSISGVGVGWIRQPPGKALE WLALIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSENQVVLTMTNMDPVDTATYYC AHSMTKGGAIYGQAYFEYWGQGTLV
1L1
легкая
PSPALEPDSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLIIYDVTDRPSGVSNRFSAS KSANTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSST
1М9
тяжелая
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMG GFEPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSRDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTT DQVYYRSGSYSGYVDYWGQGTLV
105
тяжелая
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGRTFSSYVISWVRQAPGQGLEWMG G11PL FGTANYAQKFQGRVTITADE S T S TAYME L S S LRS DDTAVYYCAR GAQLYYNDGSGYIF DYWGQGALV
106
тяжелая
QVQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFSFISSAVQWVRQARGQRLEWIG WIWASANTNYAQKFRERVTITRDMSTNTAYMELTSLRSEDTAVYYCAA EHRSPCSGGDSCYSLYYGMDVWGQGTLVTVSS
2А2
тяжелая
QVQLVQSGGGLVPPGGSLRLSCTASGFTVSNYGMSWVRQTPGKGLEWVS TISTSSGRTFYADSVEGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAK GPFGGDFDYWGQGTLVTVSS
2А2
легкая
QAWTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVAIYLAWYQQKPGQAPRLLIY DASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRGNWQYTF GQGTKLEIK
2С2
тяжелая
QVQLVQSGGGLVQPGRSLTLSCAASGFTFDVYAMHWVRQAPGKGLEWVA GISWNSGSVGYADSMKGRFTISRDNAKNSLYLQINSLRAEDTALYYCAK AFWFGELSGYGMDVWGQGTLVTVSS
2С2
QAWTQPPS.ASGFPGQSVTISCTGTSSDVGSYNYVSWYQQHPGKAPKL
легкая
IIYAVTRRPSGVPERFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCTSYAGNN KDVFGTGTKVTVL
2D12 тяжелая
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFNIYGISWVRQAPGQGLEWMG WISAYNGNTNYAQKLQGRVTMT TDTSTSTAYMELRSLRS DDTAVYYCAR PLWGEFYYDIWGQGTLVTVSS
2D12 легкая
QAWTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSGYSAWYQQKPGQAPRLLI YGASKRAAGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQLFATSPPP FGQGTRLEIK
ЗА2
тяжелая
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYVMEWVRQAPGKGLEWVA VISYDGSNKYYADSVK.GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA RSEWESSYGSGNYYTDYFYYYAMDVWGPGTLVTVSS
ЗА2
легкая
QAWTQSPLSLPVTPGEPASISCRSNQSLLRGIRYNYLDWYLQKPGQSP QLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSATDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQ ТРТТFGQGTRLEIK
ЗВ4
тяжелая
QVQLEESGPTLVKPTQTLTLTCSFSGFSLTTTGVTVGWIRQPPGKALEW LALIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQWLTMTNMDPVDTATYYCA HSTGYYDSSGYRGALDAFAVWGQGTLVTVS S
ЗВ4
легкая
QIWTQFPDSPAVSLGERATINCKSSQSVLYHSNNKNYLAWYQQKPGQP PNLLIYWASARQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYY STPYTFGQGTKLEIK
ЗЕ23 тяжелая
QVQLVQSGPGLVKPSDTLSLTCSVSSDALRSRSYYWGWVRQPPGKGLEW IGTVSYSGGTYYNPSLQSRVTVSVDTSKNHFSLRLNSVTAADAAVYYCA RSYFYDGSGYYYLSYFDSWGQGTLVTVSS
ЗЕ23 легкая
QAWTQEPS.LTVSPGGTVTLTCASSTGAVTSGHYPNWFQQKPGQPPRA LIYSTDNKHSWTPARFSGSLLGVKAALTLSDVQPEDEADYYCLLHFGGV WFGGGTKLTVL
ЗН5
тяжелая
QVQLVQS GGGWQPGRS LRLSCSTSGFT FRMYGMHWVRQAPGKGLEWVA VIFNDGVKKYYGDAVKGRFTVSRDNSRNTLYLEMKSLRVDDTAAYYCAR DGIPDPERGDYGGLDYWGQGTLVTVSS
ЗН5
легкая
QTWTQSPSSLSASVGDTVTITCRASQSITSYLNWYQQKPGKAPKLLIY ATSSLQSGLPSRFSGSGYGTEFTLTISGLQPEDFATYYCQQSYSFPRTF GQGTKVEMD
3121 тяжелая
QVQLVQS GGGLVQPGRS LRLSCAT S G FIFDDYAMYWVRQAPGKGLEWVS GISWNSGNIAYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLEMNSLRAEDTALYYCVK DLYGYDILTGNGYDYWGQGTLVTVSS
3121 легкая
QAWTQSSLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLQSNGYNYLDWYLQKPGQSP QLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQ TPPTFGQGTKVEIK
ЗК11 тяжелая
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVPCKASGDTLSYYGITWVRRAPGQGLEWMG QIIPFFATTISAQKFQGRLTMTAEESTSTGYMERTFYMDLSSLRPEDTA VYYCAGGYYGSGSSGDYGLDVWGQGTLVTVSS
ЗК11 легкая
QAWTQPPS.VSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVNWYQQLPGTAPKL LIYGNNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSL SGSGVFGTGTEVTVL
4В8
тяжелая
QVQLVQSGPGLVKPSETLSLTCAVSGDSIGSRSFYWGWIRQPPGKGLEW IGSIYYNGTTYYKPSLKSRVTISLDTSKNQFSLRLSSLTATDTGVYYCA RAPTYCSPSSCAVHWYFNLWGRGTLVTVSS
4В10 тяжелая
QVQLVQSGAELKKPGASVKVSCKASGYIFTKYGISWLRQAPGQGLEWVG WISAYNENTNYAEKFQGRVTLTTDASTSTAYMELRNLRSDDTAVYFCAR EVWFAEYIYWGQGTLVTVSS
100
9А11 легкая
QSWTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNYVSWYQQHPGKAPKLV IYDVANRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSDVS PVFSGGTKLTVL
101
9D14 тяжелая
QVQLVQSGSELKKPGASVKLSCKASGYTFTSHPMNWVRQAPGQGLEWMG WINTKTGNLTYAQGFTGRFVFSLDTSVRTAYLQISGLKAEDTAIYYCAR DEYSGYDSVGVFRGSFDDFYGMDVWGQGTLVTVSS
102
3N2 3
GFTFSNYA (115)
IWYDGSNK (116)
ARGDYVLDY (117)
4 J14
GGTSSTYA (118)
SIPVFATV (119)
ASPYCSSMNCYTTFYYFDF (120)
4 J21
GYSFTSYS (121)
IDTNTGNP (122)
ATYYVDLWGSYRQDYYGMDV (123)
4N12
GYILSKLS (124)
SEREDGET (125)
AT GG FWSMIGGNGVDY (126)
5М16
GYTFTSYF (127)
TYPGGGSP (128)
ARGAHRSIGTTPLDS (129)
5014
GFTFSMYG (130)
IWNDGSKE (131)
ARDGIPDPERGDYGGLDY (132)
8G18
GGTFNNNG (133)
IVPNFGTP (134)
ARGRTAVTPMQLGLQFYFDF (135)
119
GYTFTDNS (136)
INPNTGVS (137)
AREENDSSGYYL (138)
1L1
GFSLSISGVG (139)
IYWDDDK (140)
AHSMTKGGAIYGQAYFEY (141)
1M9
GYTLTELS (142)
FEPEDGET (143)
TTDQVYYRSGSYSGYVDY (144)
105
GRTFSSYV (145)
IIPLFGTA (146)
ARGAQLYYNDGSGYIFDY (147)
106
GFSFISSA (148)
IWASANT (149)
AAEHRSPCSGGDSCYSLYYGMDV (150)
2A2
GFTVSNYG (151)
ISTSSGRT (152)
AKGPFGGDFDY (153)
2C2
GFTFDVYA (154)
ISWNSGSV (155)
AKAFWFGELSGYGMDV (156)
2D12
GYSFNIYG (157)
ISAYNGNT (158)
ARPLWGEFYYDI (159)
3A2
GFTFSNYV (160)
ISYDGSNK (161)
ARSEWESSYGSGNYYTDYFYYYAMDV (162)
3B4
GFSLTTTGVT (163)
IYWDDDK (164)
AHS TGYYDS S GYRGALDAFAV (165)
ЗЕ23
SDALRSRSYY (166)
VSYSGGT (167)
ARSYFYDGSGYYYLSYFDS (168)
ЗН5
GFTFRMYG (169)
IFNDGVKK (170)
ARDGIPDPERGDYGGLDY (171)
3121
GFIFDDYA (172)
ISWNSGNI (173)
VKDLYGYDILTGNGYDY (174)
ЗК11
GDTLSYYG (175)
IIPFFATT (176)
TAVYYCAGGYYGSGSSGDYGLDV (177)
4В8
GDSIGSRSFY (178)
IYYNGTT (179)
ARAP T YC S P S S CAVHWYFNL (180)
4В10
GYIFTKYG (181)
ISAYNENT (182)
AREVW FAE YIY (183)
9D14
GYTFTSHP (184)
INTKTGNL (185)
ARDEYSGYDSVGVFRGSFDDFYGMDV (186)
(211)
(212)
(213)
8G18
SGAVTSDYY
SAS
LVYSGDGW
(214)
(215)
(216)
119
QSISTY
AAS
QQSYRTPWT
(217)
(218)
(219)
1L1
DSDVGGYNY
DVT
SSYTSSSTLV
(220)
(221)
(222)
2A2
QSVAIY
DAS
QQRGNWQYT
(223)
(224)
(225)
2C2
SSDVGSYNY
AVT
TSYAGNNKDV
(226)
(227)
(228)
2D12
QSVSSGY
GAS
QLFATSPPP
(229)
(230)
(231)
3A2
QSLLRGIRYNY
LGS
MQALQTPTT
(232)
(233)
(234)
3B4
QSVLYHSNNKNY
WAS
QQYYSTPYT
(235)
(236)
(237)
3E23
TGAVTSGHY
STD
LLHFGGVW
(238)
(239)
(240)
3H5
QSITSY
ATS
QQSYSFPRT
(241)
(242)
(243)
3121
QSLLQSNGYNY
LGS
MQALQTPPT
(244)
(245)
(246)
3K11
SSNIGAGYD
GNN
QSYDSSLSGSGV
(247)
(248)
(249)
9A11
SSDVGAYNY
DVA
GSYTSDVSPV
(250)
(251)
(252)
доверительный интервал]
2Н1
IgG2
8 [6-10]
4N12
IgG2
8 [7-10]
2В4
IgGl
14 [11-17]
4J21
IgGl
5 [4-6]
5М16
IgGl
+++
5 [4-6]
9D14
IgGl
+++
6 [5-7]
1Н12
IgGl
+++
17 [14-20]
8Е22
IgGl
17 [14-19]
8G18
IgGl
17 [14-19]
10N24
IgGl
21 [17-26]
814
IgGl
+++
8 [5-14]
3N23
IgGl
25 [21-30]
5014
IgGl
+++
38 [30-47]
4J14
IgGl
23 [20-26]
ЗЕ23
IgG2
11 [9-13]
1L1
IgGl
+ /-
18 [15-22]
3B4
IgG3
4B8
IgGl
+++
0,6 [0,4-0,8]
4G20
IgGl
95 [60-160]
105
IgGl
138 [110-170]
106
IgG3
5,200 [4,1006,600]
2L5
4,600 [2,4009,500]
3A2
IgGl
+++
1,300 [830-1,900]
5F19
IgGl
+++
1M9
IgGl
119
IgGl
4B10
IgGl
2C2
IgGl
2D12
IgGl
5N23
IgGl
+ + +
СНК-152 мыши
IgG2c
3 [2-4]
1Порядок антител отражает уровень степени и охвата эффективности антител в анализах нейтрализации против клинических изолятов CHIKV различных генотипов.
2Изотип, подтип иммуноглобулина и использование легкой цепи определяли посредством ELISA. NT означает не исследовали вследствие плохого роста В-клеточной линии.
3(-) обозначает не поддающееся обнаружению связывание [OD <0,1]; (+/-) обозначает слабое связывание [OD 0,31-0,499]; (++) обозначает умеренное связывание [OD 0,5-0,99]; (+++) обозначает сильное связывание [OD > 1,0] .
4Показанные величины соответствуют объединенным данным двух или более независимых экспериментов.
концентрация (нг/мл), при которой 50% нейтрализовывалось (ЕС50) • (> ) указывает на то, что величина ЕС50 превышает наиболее высокую исследованную концентрацию mAb (10 мкг/мл). N.D.=He проводили.
ТАБЛИЦА 6 - ОСНОВНЫЕ АНТИГЕННЫЕ УЧАСТКИ СПЕЦИФИЧНЫХ К ВИРУСУ ЧИКУНГУНЬЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА
mAb1
Группа
конкурентного
связывания
для
очищенного белка Е22
Картирование посредством мутагенеза
Домен Е23
Остатки Е2, для которых было отмечено сниженное связывание при замене на аланин
2Н1
Низкое связывание
E2-DA
R80, Т116
4N12
Дуга
D250
2В4
Низкое связывание
Без снижения ##
4J21
Низкое
Без снижения
связывание
5М16
Дуга
G253
9D14
Без снижения
1Н12
DA/B, Дуга
Т58, D59, D60, R68, D71, 174, D77, Т191, N193,
К234
8Е22
Низкое связывание
DA, Дуга
Н62, W64, R68, Н99, D117, 1255
8G18
Низкое связывание
Н62, W64, D117
10N24
DA, В
W64, D71, R80, Т116, D117, 1121, N187, 1190
814
NSF Ab
DB, Дуга
М171, Q184, 1190, N193, V197, R198, Y199, G209, L210, К215, К234, V242, 1255
3N23
DA, Дуга
D60, R68, G98, Н170, М171, К233, К234
5014
Без снижения
4J14
Низкое связывание
DA/B
D63, W64, Т65, R80, 1121, А162, N193
ЗЕ23
W64
1L1
Низкое связывание
Дуга
G253
3B4
V192, Q195
4B8
Без снижения
4G20
D174, R198, Y199, К215
105
W64, Т65
2Показанные величины соответствуют объединенным данным для двух независимых экспериментов. Низкое связывание указывает на неполное связывание mAb с Е2 на биосенсоре для оценки конкуренции. NT указывает не тестировали, поскольку Ab не связывало эктодомен Е2 в ELISA; NSF Ab указывает на недостаточное предоставление mAb.
3Не реагирует указывает на то, что mAb не реагировало против белков оболочки дикого типа и не могло тестироваться в этой системе. Без снижения указывает на то, что mAb связывалось с белками Е дикого типа, однако не отмечалось воспроизводимого снижения для какого-либо мутанта. DA указывает на домен A; DB указывает на домен В; Дуга указывает либо на дугу 1, либо на дугу 2, либо на обе из них.
40статки, идентифицировали посредством контактов с mAb при
предшествующем восстановлении крио-ЕМ.
ТАБЛИЦА 7 - ЭФФЕКТИВНОСЬ И ОХВАТ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ IN VITRO
7,2)
11,5)
17, 1)
10, 9)
5014
6,7 (5,58,3)
12,1 (10,913,5)
17,3 (14,221,1)
6,2 (5,37,2)
4J14
12,9 (11,215, 0)
17,7 (16,119,4)
23, 1 (2027)
23, 0 (18,528,4)
3E23
19,4 (15,225, 0)
18,7 (16,321,5)
36, 0 (30, 342, 9)
38, 0 (30,347,5)
1L1
18,6 (15,522,4)
24,2 (21,327,5)
34, 3 (2940,7)
N.D.
3B4
18,7 (10,732, 8)
29,6 (18,746, 8)
271 (144511)
N.D.
4B8
22,8 (12,441,8)
28,1 (19,839, 9)
234 (142386)
N.D.
4G20
22,3 (17,329, 0)
34, 9 (28, 243, 8)
131,4
(88,5-195)
N.D.
105
30, 1 (22, 635,3)
37, 6 (32, 643,4)
48, 9 (37, 863, 2)
N.D.
106
61,7 (50,874, 8)
57,5 (48,868, 1)
N.D.
N.D.
2L5
1,076 (7481,548)
2,361 (1,4603,819)
5, 632 (3,9048,128)
N.D.
3A2
1,566 (1,1112,207)
1,396 (9522, 046)
N.D.
5F19
9, 064 (2,91128,249)
N.D.
1M9
6, 187 (2,79513,709)
N.D.
119
N.D.
4B10
N.D.
концентрация (нг/мл) при которой 50% вируса
нейтрализовывалось (ЕС50) . (> ) указывает на то, что величина ЕС50 превышает наиболее высокую исследованную концентрацию mAb (10 мкг/мл). N.D.=He проводилось.
Все композиции и способы, описанные и заявленные в настоящем описании, можно получать и проводить без излишнего экспериментирования ввиду настоящего изобретения. В то время как композиции и способы по настоящему изобретению описаны с точки зрения предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области будет понятно, что можно вносить изменения в композиции и способы и в стадии или последовательность стадий способа, описанного в настоящем описании, без отклонения от идеи, сущности и объема изобретения. Более конкретно, будет понятно, что определенные средства, которые являются как химически, так и физиологически родственными, могут заменять средства, описанные в настоящем описании, достигая таких же или сходных результатов. Все такие сходные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области считаются являющимися частью сущности, объема и идеи изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
VII. ССЫЛКИ
Следующие ссылки прямо включены в настоящее описание в качестве ссылок в том объеме, в котором они обеспечивают иллюстративные детали методик или прочие детали, дополнительные к деталям, описанным в настоящем описании.
"Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988.
Abbondanzo et al. , Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol., 12(4), 480-489, 1990.
Allred et al., Arch. Surg., 125(1), 107-113, 1990. Atherton et al. , Biol, of Reproduction, 32, 155-171, 1985. Austin et al., PLoS Pathog 8, el002930, 2012. Brehin, et al., Virology 371:185-195, 2008.
Brown et al., J. Immunol. Meth., 12;130 (1),:111-121, 1990.
Campbell, In: Monoclonal Antibody Technology, laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burden and Von Knippenberg, Eds. pp. 75-83, Amsterdam, Elsevier, 1984 .
Capaldi et al. , Biochem. Biophys. Res. Comm., 74(2) :425-433, 1977.
CDC, Chikungunya in the Americas. (Atlanta, GA: US Department of Health and Human Services). world-wide-web at cdc.gov/chikungunya/geo/americas.html, 2014.
CDC, Chikungunya virus (Atlanta, GA: US Department of
Health and Human Services). world-wide-web at
cdc.gov/media/releases/2 013/pl218-chikungunyas.html, 2 013.
Christian et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 110:1866218667, 2013.
Chu et al. , Deciphering the protective role of adaptive immunity to CHIKV/IRES a novel candidate vaccine against Chikungunya in the A129 mouse model. Vaccine 31:3353-3360, 2013.
Couderc et al., J. Infect. Dis. 200, 516-523, 2009.
De Jager et al., Semin. Nucl. Med. 23(2), 165-179, 1993.
Dholakia et al., J. Biol. Chem., 264, 20638-20642, 1989.
Doolittle and Ben-Zeev, Methods Mol. Biol., 109, : 215-237,
1999.
Edwards & Brown, J. Gen. Virol. 67 ( Pt 2), 377-380, 1986.
Edwards et al., J. Gen. Virol. 67 ( Pt 2), 377-380, 1986.
Fong et al., J. Virol. 88:14364-14379, 2014.
Fric et al., J. Infect. Dis. 207:319-322, 2013.
Gefter et al., Somatic Cell Genet., 3:231-236, 1977.
Goh et al., Clin. Immunol. 149:487-497, 2013.
Gulbis and Galand, Hum. Pathol. 24(12), 1271-1285, 1993.
Guo et al., Sci. Transl. Med. 3:99 ra85, 2001. Hallengard, et al., J. Virol. 88:13333-13343, 2014. Hawman et al., J. Virol. 87, 13878-13888, 2013. Hong et al., J. Virol. 87:12471-12480, 2013. Kam et al., EMBO Mol. Med. 4, 330-343, 2012b. Kam et al., J. Virol. 86, 13005-13015, 2012a. Kam et al., PLoS One 9, e95647, 2014.
Khatoon et al., Ann. of Neurology, 26, 210-219, 1989.
Kielian et al., Viruses 2:796-825, 2010.
King et al. r J. Biol. Chem., 269, 10210-10218, 1989.
Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976.
Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975.
Krause et al., J. Immunol. 187:3704-3711, 2011b.
Krause et al. r J. Virol. 84:3127-3130, 2010.
Krause et al., J. Virol. 85:10905-10908, 2011a.
Krause et al., J. Virol. 8 6:6334-634 0, 2012.
Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157 (1):105-132, 1982.
Lanciotti & Valadere, Emerg Infect Dis 20, 2014.
Lee et al., PLoS Pathog. 7:el002390, 2011.
Levitt et al., Vaccine 4, 157-162, 1986.
Lum et al., J. Immunol. 190:62 95-6302, 2013.
Mainou et al., MBio 4, 2013.
Masrinoul et al., Virology 464-465, 111-117, 2014. Messer et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111:19391944, 2014.
Morrison et al., Am J Pathol, 178:32-40, 2011. Nakamura et al. , Тл: Enzyme Immunoassays: Heterogeneous and Homogeneous Systems, Chapter 27, 1987.
O'Shannessy et al., J. Immun. Meth., 99, 153-161, 1987. Paes et al. r J. Am. Chem. Soc, 131:6952-6954, 2009. Pal et al. r J. Virol. 88:8213-8226, 2014. Pal et al., PLoS Pathog 9, el003312, 2013. Persic et al., Селе 187:1, 1997
Potter and Haley, Meth. Enzymol., 91, 613-633, 1983. Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., 3:624-652,
R.C. Team, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2014.
Schilte et al., PLoS Negl. Trop. Dis. 7:e2137, 2013.
Selvarajah et al., PLoS Negl. Trop. Dis. 7:e2423, 2013.
Sissoko et al., PLoS Negl. Trop. Dis. 3:e389, 2009.
Smith et al., J. Virol. 86, 2665-2675, 2012.
Smith et al., J. Virol. 88, 12233-12241, 2014.
Smith et al., J. Virol., 8 6:2 665-2 675, 2012.
Smith et al., MBio 4, e00873-00813, 2013a.
Smith et al.,, J. Infect. Dis. 207, 1898-1908, 2013b.
Staples et al. , Clin. Infect. Dis., 49, 942-948, 2009.
Sun et al., Elife, 2:e00435, 2013.
Sun et al., J. Steroid Biochem., 26(l):83-92, 1987. Sun et al., J. Virol., 8 8:2 035-2 04 6, 2014. Tang et al., J. Biol. Chem., 271:28324-28330, 1996. Thornburg et al., J. Clin. Invest., 123:4405-4409, 2013.
Патент
США
3817837
Патент
США
3850752
Патент
США
3939350
Патент
США
3996345
Патент
США
4196265
Патент
США
4275149
Патент
США
4277437
Патент
США
4366241
Патент
США
4472509
Патент
США
4554101
Патент
США
4680338
Патент
США
4816567
Патент
США
4867973
Патент
США
4938948
Патент
США
5021236
Патент
США
5141648
Патент
США
5196066
Патент
США
5563250
Патент
США
5565332
Патент США 5856456 Патент США 5880270
Vander Veen et al. , Anim Health Res Rev, 13:1-9, 2012.
Voss et al., Nature, 468:709-712, 2010.
Voss et al., Nature, 468:709-712, 2010.
Warter et al., J. Immunol., 186:3258-3264, 2011.
Warter et al., J. Immunol., 186:3258-3264, 2011.
Wawrzynczak & Thorpe, In: Immunoconjugates, Antibody Conuugates In Radioimaging And Therapy Of Cancer, Vogel (Ed.), NY, Oxford University Press, 28, 1987.
Yu et al., Nature 455:532-536, 2008.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:
<110> Vanderbilt University
<120> ОПОСРЕДУЕМАЯ АНТИТЕЛОМ НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ ВИРУСА ЧИКУНГУНЬЯ
<130> VBLT.P0246WO
<150> US 62/147,354
<151> 2015-04-14
<160> 276
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 423
<212> БЕЛОК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 1
Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala Thr Arg Pro Tyr Leu
1 5 10 15
Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser Cys His Ser Pro Val
20 25 30
Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Gly Thr Asp Asp Ser His Asp Trp
50 55 60
Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Ile Pro Ala Asp Ala Gly Arg
65 70 75 80
Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr Gly Thr
85 90 95
Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr
100 105 110
Val Gly Phe Thr Asp Ser Arg Lys Ile Ser His Ser Cys Thr His Pro
115 120 125
Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu Lys Phe His Ser Arg
130 135 140
Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr Tyr Val Gln Ser Asn
145 150 155 160
Ala Ala Thr Ala Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp Thr Pro
165 170 175
Asp Arg Thr Leu Leu Ser Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile Thr Val
180 185 190
Asn Ser Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Gly Ser Asn Glu
195 200 205
Gly Leu Ile Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Val Asp Gln
210 215 220
Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp Gln Tyr Asn Ser Pro
225 230 235 240
Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg Lys Gly Lys Ile His
245 250 255
Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Met Val Pro Lys Ala Arg
260 265 270
Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Ile Met Leu Leu Tyr
275 280 285
Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Ser Met Gly Glu Glu Pro
290 295 300
Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Thr His Lys Lys Glu Val Val Leu Thr
305 310 315 320
Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr
325 330 335
Lys Tyr Trp Pro Gln Leu Ser Ala Asn Gly Thr Ala His Gly His Pro
340 345 350
His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr Pro Thr Met Thr Val
355 360 365
Val Val Val Ser Val Ala Ser Phe Ile Leu Leu Ser Met Val Gly Met
370 375 380
Ala Val Gly Met Cys Met Cys Ala Arg Arg Arg Cys Ile Thr Pro Tyr
385 390 395 400
Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ile Cys
405 410 415
Cys Ile Arg Thr Ala Lys Ala 420
<210> 2
<211> 378
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 2
caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctctggtta cagctttacc agctacggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcactt acaaaggtta cacacagtat 180
gcacagaact tccagggcag agtcaccatc accacagaca cacccgcgac tacagtctat 240
atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgcgc gagagttctt 300
tccgagactg gttatttcta ctactactac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360
ctggtcaccg tctcctca 378
<210> 3
<211> 334
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 3
caggctgtgg tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgtactg ggagcagctc caacatcggg gcagattata atgtacactg gtaccagctg 120
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca ccaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtgcttcg 300
gtattcggcg gagggaccaa actgaccgtc ctag 334
<210> 4
<211> 312
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 4
gcctcagtga aggtctcctg caaggcttct ggatacagtt tcactagcta ttctatcaac 60
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggcct gagtggatgg gatggatcga caccaacact 120
gggaacccaa cctatgccca ggacttcgca ggacggtttg tcttctcctt ggacacctct 180
gtcaccacgg catatctgca gatcagcagc ctaaaggctg gggacactgc cgtttattac 240
tgtgcaacat attatgttga cctttggggg agttatcgcc aagactacta cggtatggac 300 gtctggggcc ac 312
<210> 5
<211> 333
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 5
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gagggagctc caacatcggg agtaatcctg taaattggta ccagatggtc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcctctat actaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcaa tggactccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtatgggatg acagcctgag tggccgttgg 300
gtgttcggcg gagggaccaa ggtgaccgtc cta 333
<210> 6
<211> 411
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 6
caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgagggtc 60
tcctgcaagg cgtctggtta cacctttacc agttatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcactt acaatggtga cacaaactat 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccttg acaacagaga catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggcgcctgag atctgacgac acggccgttt actactgtgc gagagatttt 300
gaatttcccg gagattgtag tggtggcagc tgctactcca ggttcatcta ccagcacaac 360
gacatggacg tctggggcca cgggaccctg gtcaccgtct cctcagcaag c 411
<210> 7
<211> 330
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 7
caggctgtgg tgactcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aatcattatg tatcctggta ccagcacctc 120
ccgggaacag cccccaaact cctcatttat gacaattata agcgaccctc agtgattcct 180
gaccgattct ctgcctccaa gtctggcgcg tcagccaccc tgggcatcat cggactccag 240
actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgctgtggta 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 8
<211> 381
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 8
caggtgcagc tggtgcagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggacac cctgtccctc 60
acctgcagtg tctcaagtga cgccctccgc agcaggagtt attactgggg ctgggtccgc 120
cagccccccg ggaagggatt ggagtggatt gggactgtct cttatagtgg gggcacctac 180
tacaacccgt ccctccagag tcgagtcacc gtgtcggtgg acacgtccaa gaaccacttc 240
tccctgaggt tgaactctgt gaccgccgca gacgcggctg tttattactg tgcgagatct 300
tatttctatg atggcagtgg ttactactac ctgagctact ttgactcctg gggccaggga 360
accctggtca ccgtctcctc a 381
<210> 9
<211> 327
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 9
caggctgtgg tgactcagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60
acctgtgctt ccagcactgg agcagtcacc agtggtcact atccaaactg gttccagcag 120
aaacctggac aaccacccag ggccctgatt tatagcacag acaacaagca ctcctggacc 180
cctgcccggt tctcaggctc cctcctaggg gtcaaggctg ccctgacact gtcagatgta 240
cagcctgagg acgaggctga ctattactgc ctgctccatt ttggtggtgt cgtggtcttc 300
ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327
<210> 10
<211> 348
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 10
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag tgtctggatt caccttcagt aactatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggactg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaagtga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggggtgac 300
tacgttcttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348
<210> 11
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 11
gacattgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcagttgcc gggccagtca gagcattccc agctatttaa attggtatca acagaaacca 120
gggaaagccc ctaaggtcct gatctatgct acatccactt tggaagctgg ggtcccatca 180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaccag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacaata cggggatatt cactttcggc 300
cctgggacca aagtggatat caaa 324
<210> 12
<211> 378
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 12
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg cacttccagc acttatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggc agcatccctg tctttgctac agtaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag actcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagtttac 240
atggaactga gcagcctgag atctgaggac acggccgttt atttctgtgc gagcccctat 300
tgtagtagta tgaactgcta tacgaccttt tactactttg acttctgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcctca 378
<210> 13
<211> 327
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 13
caggctgtgg tgactcagcc tgcctccgtg tttgggtttc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgactttggt acttataact atgtctcttg gtaccagcaa 120
cacccaggcc aagcccccaa actcatgatt tttgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggcttc ttattactgc agctcctata caagcggcag cactctctac 300
ggcggaggga ccaagctgac cgtcctg 327
<210> 14
<211> 381
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 14
caggtgcagc tggtgcagtc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg cttctggata cagtttcact agctattcta tcaactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcctgagtg gatgggatgg atcgacacca acactgggaa cccaacctat 180
gcccaggact tcgcaggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcac cacggcatat 240
ctgcagatca gcagcctaaa ggctggggac actgccgttt attactgtgc aacatattat 300
gttgaccttt gggggagtta tcgccaagac tactacggta tggacgtctg gggccacggg 360
accctggtca ccgtctcctc a 381
<210> 15
<211> 333
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 15
cagtctgtgg tgactcagcc accctcagtg tctgggaccc ccgggcaggg ggtcaccatc 60
tcttgttctg gagggagctc caacatcggg agtaatcctg taaattggta ccagatggtc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcctctat actaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcaa tggactccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gtatgggatg acagcctgag tggccgttgg 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 16
<211> 369
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 16
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg tttccggata catcctcagt aaattatccg tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag gacttgaatg gatgggaggt tctgaacgtg aagatggcga aacagtctac 180
gcacagaagt tccagggcag aatcagcttg accgaggaca catctataga gacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag ttctgaggac acggccgtgt attattgtgc aacaggaggc 300
ttctggagta tgattggggg aaatggagtg gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 17
<211> 321 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 17
caggctgtgg tgactcagtc tccatcgtcc ctgcctgcat ctgtaggaga cagggtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca ggacattaga aataatttag gctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctgagcgcct gatctatgga acctccaatt tgcagagtgg ggtcccgtca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt accctcccac gttcggccgc 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 18
<211> 380
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 18
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgagagtt 60
tcctgcaagg catctgggta caccttcacc agttacttta tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gacttgagtg gatggcgata acttatcctg gtggtggtag cccatcctac 180
gcaccgcagt tccagggcag actcaccatg accgacgaca cgtccgcgac cacagtctac 240
atggacctga gtgacctgac ttctaaagac acggccgtgt attactgtgc gagaggtgcc 300
caccgttcca ttgggacgac cccccttgac tcgtggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctcagcaa gcttcaaggg 380
<210> 19
<211> 375
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 19
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggacgc gtggtccagg ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt atgtatggcg tccactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggaatg atggatctaa agaatactat 180
ggagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaggaa cacgttgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agtcgacgac acggcagtgt atttttgtgc gagagatgga 300
attcctgacc ctgaacgcgg tgactacggg ggcttggact actggggcca gggaaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 20
<211> 322
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 20
cagactgtgg tgactcagtt tccatcctcc ccgtttgcat ctgtaggaga cggagtcacc 60
atcacttgcc gggcaaggca gagcattagc agttatgtta attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatttacgct acatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggata tgggacagat ttcactctca ccatcagcgg tctgcaacct 240
gaagattttg caacatacta ctgtcaacag agttacagtt ttcctcgaac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa ac 322
<210> 21
<211> 381
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 21
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctcag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagc cctctggagg caccttcaac aacaatggga tcagttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggc atcgtcccga actttggaac cccaacctat 180
ggacaagact tccagggcag agtcacgatc accgcggacg aatctacgag cacagtcttc 240
ttggagctga ccagactgag atctgacgac acggccgttt atttctgtgc gcgaggtcgc 300
acggcggtga ctccgatgca attgggttta cagttctact ttgacttctg gggccgggga 360
accctggtca ccgtctcctc a 381
<210> 22
<211> 325
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 22
cagactgtgg tgactcagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60
acctgttctg ccaacagtgg agcagtcacc agtgattact atccaaactg gttccagcag 120
aaacctggac aagcacccag ggcactgatt tatagtgcaa gcaacaaatt ctcctggacg 180
cctgcccggt tctcaggctc cctccttggg ggcaaagctg ccctgacact gtcaggtgcg 240
cagcctgagg acgaggctga gtattactgc ctggtctact ctggtgatgg tgtggttttc 300
ggcggaggga ccaagctgac cgtcc 325
<210> 23
<211> 357
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 23
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ccggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaaga cttctggata tacgttcacc gacaactctg tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggtttgagtg gatgggacgg atcaacccta acactggtgt ctcaacttct 180
gcccagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacaacctac 240
atggagctga gcagtttgag atctgacgac acggccgtct attactgtgc gagagaggag 300
aacgatagta gtgggtatta cctttggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 24
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 24
cagattgtgg tgactcagtc tccatcctcc ctgtttgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc acctatttaa attggtatca gcaaaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tggagagtgg ggtcccatca 180
aggttcggtg gcagtagatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagga ccccgtggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggacatcaa a 321
<210> 25
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 25
caggtgcagc tggtgcagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60
acctgcacct tctctgggtt ctcactcagt attagtggag tgggtgtggg ctggatccgt 120
cagcccccag gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt attgggatga tgataagcgc 180
tacagcccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccga aaaccaggtg 240
gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacacagt 300
atgactaaag gcggggctat ctatggtcag gcctactttg aatactgggg ccagggaacc 360
ctggtc 366
<210> 26
<211> 276
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 26
ccatctcctg cactggaacc agacagtgac gttggtggtt ataactatgt ctcctggtac 60
caacaacacc caggcaaagc ccccaaactc atcatttatg atgtcactga tcggccctca 120
ggggtttcta atcgcttctc tgcctccaag tctgccaaca cggcctccct gaccatctct 180
gggctccagg ctgaggacga ggctgattat tactgcagct catatacaag cagcagcact 240
ctggttttcg gcggagggac caagctgacc gtccta 276
<210> 27
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 27
caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg tttccggata caccctcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120
cctggaaaag gcctagagtg gatgggaggt tttgagcctg aagatggtga aacaatctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctagaga cacagcctac 240
atggagctga gtagcctgag atctgaggac acggccgtct attactgtac aacagatcag 300
gtctactatc gttcggggag ttattctgga tatgttgact actggggcca gggaaccctg 360
gtc 363
<210> 28
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 28
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggacg caccttcagc agctatgtta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatccctc tgtttggtac agcaaactac 180
gcacagaaat tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgacgac acggccgtct attactgtgc gaggggcgcc 300
cagctatatt acaatgatgg tagtggttac atttttgact actggggcca gggagccctg 360
gtc 363
<210> 29
<211> 390
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 29
caggtgcagc tggtgcagtc tgggcctgag gtgaagaagc ctgggacctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggatt cagctttatt agctctgctg tgcagtgggt gcgacaggct 120
cgtggacaac gccttgagtg gataggatgg atcgtcgttg ccagtgctaa cacaaactac 180
gcacagaagt tccgggaaag agtcaccatt actagggaca tgtccacaaa cacagcctat 240
atggaactga ccagcctgag atccgaggac acggccgttt attactgtgc ggcagagcac 300
cggtcccctt gtagtggtgg tgatagctgc tacagtctct actacggtat ggacgtctgg 360
ggccaaggga ccctggtcac cgtctcctca 390
<210> 30
<211> 354
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 30
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggttccgc ctggggggtc cctgagactg 60
tcctgtacag cctctggatt caccgttagt aactatggca tgagctgggt ccgccagact 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaact attagtacta gtagtggtag aacattctac 180
gcagactccg tggagggccg gttcaccatc tccggagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agtcgaagac acggccgtat attactgtgc gaaaggcccg 300
ttcgggggcg actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 31
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 31
caggctgtgg tgactcagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttgcc atctacttag cctggtatca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtggcaact ggcagtacac ttttggccag 300
gggaccaaac tggagatcaa a 321
<210> 32
<211> 369
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 32
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ctggtacagc ctggcaggtc cctgacactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gtttatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcttggagtg ggtcgcaggt attagttgga atagtggtag cgtaggctat 180
gcggactcta tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatta acagtctgag agctgaggac acggccttat attactgtgc aaaagcattc 300
tggttcgggg agttatcggg ttacggtatg gacgtctggg gccaagggac cctggtcacc 360 gtctcctca 369
<210> 33
<211> 330
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 33
caggctgtgg tgactcagcc tccctccgcg tccgggtttc ctggacagtc agtcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt agttataact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcataatt tatgcggtca ctaggcggcc ctcaggggtc 180
cctgagcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccgt ctctgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc acctcatatg caggcaacaa caaggatgtc 300
ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta 330
<210> 34
<211> 357
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 34
caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggtta cagctttaac atctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180
gcacagaaac tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggaactga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaccactt 300
tggggggaat tttactatga tatctggggc caagggaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 35
<211> 324
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 35
caggctgtgg tgactcagtc tccaggcacc ctgtccttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcgggtact cagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca aaagggccgc tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag ctgtttgcta cctcacctcc gcccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 36
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 36
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aattatgtta tggagtgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgttgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagatcagag 300
tgggagtctt cctatggttc ggggaattat tatacagatt acttctacta ctacgctatg 360
gacgtctggg gcccagggac cctggtcacc gtctcctca 399
<210> 37
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 37
caggctgtgg tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctaatca gagcctcctg cgtggtatta gatacaacta tttggattgg 120
tacctgcaga aaccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcagcca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactcct 300
accaccttcg gccaagggac acgactggag attaaa 336
<210> 38
<211> 387
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 38
caggtgcagc tggaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac
ccacacagac
cctcacgctg
acctgttcct tctctgggtt ctcactcacc actactggag tgactgtggg ctggatccgt 120
cagcccccag gaaaggcctt ggagtggctt gcactcattt attgggatga tgataagcgc 180
tacagcccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240
gtccttacca tgaccaacat ggaccctgtg gacactgcca catattactg tgcgcactcc 300
accggctact atgatagtag tggctatcga ggggcccttg atgcttttgc tgtctggggc 360
caagggaccc tggtcaccgt ctcctca 387
<210> 39
<211> 339
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 39
cagattgtgg tgactcagtt tccagactcc ccggctgtgt ctttgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta taccactcca acaataaaaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aacctgctca tttactgggc atctgcccga 180
caatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300
ccgtacactt ttggccaggg gaccaagctg gagatcaaa 339
<210> 40
<211> 381
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 40
caggtgcagc tggtgcagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggacac cctgtccctc 60
acctgcagtg tctcaagtga cgccctccgc agcaggagtt attactgggg ctgggtccgc 120
cagccccccg ggaagggatt ggagtggatt gggactgtct cttatagtgg gggcacctac 180
tacaacccgt ccctccagag tcgagtcacc gtgtcggtgg acacgtccaa gaaccacttc 240
tccctgaggt tgaactctgt gaccgccgca gacgcggctg tttattactg tgcgagatct 300
tatttctatg atggcagtgg ttactactac ctgagctact ttgactcctg gggccaggga 360
accctggtca ccgtctcctc a 381
<210> 41
<211> 327
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 41
caggctgtgg tgactcagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60
acctgtgctt ccagcactgg agcagtcacc agtggtcact atccaaactg gttccagcag 120
aaacctggac aaccacccag ggccctgatt tatagcacag acaacaagca ctcctggacc 180
cctgcccggt tctcaggctc cctcctaggg gtcaaggctg ccctgacact gtcagatgta 240
cagcctgagg acgaggctga ctattactgc ctgctccatt ttggtggtgt cgtggtcttc 300
ggcggaggga ccaagctgac cgtccta 327
<210> 42
<211> 375
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 42
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgttcaa cgtctggatt caccttcagg atgtatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggccgtt atttttaacg atggagttaa gaaatattat 180
ggagacgccg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca attccaggaa caccctgtat 240
ctggaaatga aaagcctgag agtcgacgac acggctgcct actactgtgc gagagacggg 300
attcctgacc ccgaacgcgg tgactacggg ggcttggact actggggcca gggaaccctg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 43
<211> 322
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 43
cagactgtgg tgactcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cacagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattacc agttatttaa actggtatca gcagaaacca 120
ggaaaagccc caaagctcct catctatgct acatccagtt tgcaaagtgg gctcccctca 180
aggttcagtg gcagtggcta tgggacagaa ttcactctca ccatcagtgg tctgcaacct 240
gaagattttg caacatacta ctgtcaacag agttacagtt ttcctcgaac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatgga ta 322
<210> 44
<211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 44
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcaa cctctggatt catctttgat gattatgcca tgtactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggaaa catagcctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ttggaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgt aaaagatctt 300
tacgggtacg atattttgac tggtaatgga tatgattact ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 45
<211> 337
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 45
caggctgtgg tgactcagtc ttcactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg caaagtaatg gatacaacta tttggattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactcct 300
ccgacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaaa 337
<210> 46
<211> 390
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 46
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
ccctgcaagg cttctggaga caccctcagt tactacggaa tcacttgggt gcgacgggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggacag atcatccctt tctttgctac aacaatctcc 180
gcacagaagt tccagggcag actcaccatg accgcggaag aatccacgag cactggctac 240
atggagcgca cattttacat ggacttgagt agccttagac ctgaggacac ggccgtatac 300
tactgtgcgg ggggctacta tggttcgggg agttcgggcg actacggttt ggacgtctgg 360 ggccaaggga ccctggtcac cgtctcctca 390
<210> 47
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 47
caggctgtgg tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtaaactg gtaccagcag 120
cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca acaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300
ggagtcttcg gaactgggac cgaggtcacc gtccta 336
<210> 48
<211> 384
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 48
caggtgcagc tggtgcagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctg 60
acgtgcgctg tttctggtga ctccatcggc agtagaagtt tctactgggg ctggatccgc 120
cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt ggaagtatct attataatgg gaccacctac 180
tacaagccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccctag acacgtccaa gaaccagttc 240
tccctgaggc tgagctctct gaccgccaca gacacgggtg tctattactg tgcgcgggcg 300
ccaacctact gtagtccttc cagctgcgca gttcactggt acttcaatct ctggggccgt 360
ggcaccctgg tcaccgtctc ctca 384
<210> 49
<211> 354
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 49
caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag ctgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta catatttacc aaatatggta tcagttggct gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg ggtgggatgg atcagcgctt acaatgaaaa cacaaactat 180
gcagagaagt tccagggcag agtcaccttg accacagatg catccacgag cacggcctac 240
atggagctga ggaacctgag atctgacgac acggccgtat acttctgtgc gagagaagtc 300
tggttcgcgg agtatattta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 50
<211> 300
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 50
caggctgtgg tgactcagga gccctcactg actgtgtccc caggagggac agtcactctc 60
acctgttctg ccaacagtgg agcagtcacc agtgattact atccaaactg gttccagcag 120
aaacctggac aagcacccag ggcactgatt tatagtgcaa gcaacaaatt ctcctggacg 180
cctgcccggt tctcaggctc cctccttggg ggcaaagctg ccctgacact gtcaggtgcg 240
cagcctgagg acgaggctga gtattactgc ctggtctact ctggtgatgg tgtggttttc 300
<210> 51
<211> 331
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 51
cagtctgtgg tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt gcttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagcccccaa actcgtgatt tatgatgtcg ctaatcggcc ctcagggatt 180
tctgaccgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc ggctcatata ccagcgacgt ctcgccggtt 300
ttcagcgggg ggaccaagct gaccgtcctc a 331
<210> 52
<211> 399
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 52
caggtgcagc tggtgcagtc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaagctt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcaca agtcatccta tgaattgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacacca agactgggaa cctaacttat 180
gcccagggct tcacaggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag gacggcgtat 240
ctgcagatca gcggcctaaa ggctgaggac actgccattt attactgtgc gagagatgag 300
tatagtggct acgattcggt aggggtgttc cgtggttctt ttgacgactt ctacggtatg 360
gacgtctggg gccaagggac cctggtcacc gtctcctca 399
<210> 53
<211> 126
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Lys Gly Tyr Thr Gln Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Thr Pro Ala Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Leu Ser Glu Thr Gly Tyr Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 54
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
Gln Ala Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp
20 25 30
Tyr Asn Val His Trp Tyr Gln Leu Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Ala Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 55
<211> 119
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe
50 55 60
Ala Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Tyr Tyr Val Asp Leu Trp Gly Ser Tyr Arg Gln Asp Tyr Tyr
100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly His 115
<210> 56
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 56
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gln Met Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Leu Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 57
<211> 137
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Glu Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Phe Glu Phe Pro Gly Asp Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr
100 105 110
Ser Arg Phe Ile Tyr Gln His Asn Asp Met Asp Val Trp Gly His Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 130 135
<210> 58
<211> 110
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 58
Gln Ala Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Tyr Lys Arg Pro Ser Val Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ala Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala Thr Leu Gly Ile Ile Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 59
<211> 127
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Ser Asp Ala Leu Arg Ser Arg
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Thr Val Ser Tyr Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Gln Ser Arg Val Thr Val Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe
65 70 75 80
Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Ala Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Tyr Phe Tyr Asp Gly Ser Gly Tyr Tyr Tyr Leu Ser
100 105 110
Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 60
<211> 109
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 60
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
His Tyr Pro Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Ala
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Thr Asp Asn Lys His Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Val Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Asp Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Leu His Phe Gly Gly
85 90 95
Val Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105
<210> 61
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Val Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 62
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 62
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Pro Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Gly Ile
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105
<210> 63
<211> 126
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Ser Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ser Ile Pro Val Phe Ala Thr Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Tyr Cys Ser Ser Met Asn Cys Tyr Thr Thr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 64
<211> 109
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 64
Gln Ala Val Val Thr Gln Pro Ala Ser Val Phe Gly Phe Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Phe Gly Thr Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Phe Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Ser Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Gly
85 90 95
Ser Thr Leu Tyr Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 65
<211> 127
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe
50 55 60
Ala Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Tyr Tyr Val Asp Leu Trp Gly Ser Tyr Arg Gln Asp Tyr Tyr
100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly His Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 66
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 66
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Gly Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gln Met Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Leu Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Arg Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 67
<211> 123
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ile Leu Ser Lys Leu
20 25 30
Ser Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ser Glu Arg Glu Asp Gly Glu Thr Val Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ile Ser Leu Thr Glu Asp Thr Ser Ile Glu Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Gly Phe Trp Ser Met Ile Gly Gly Asn Gly Val Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 68
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 68
Gln Ala Val Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Asn
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 69
<211> 126
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Ile Thr Tyr Pro Gly Gly Gly Ser Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Met Thr Asp Asp Thr Ser Ala Thr Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Asp Leu Thr Ser Lys Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala His Arg Ser Ile Gly Thr Thr Pro Leu Asp Ser Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Phe Lys
115 120 125
<210> 70
<211> 125
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Arg Val Val Gln Ala Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asn Asp Gly Ser Lys Glu Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Ile Pro Asp Pro Glu Arg Gly Asp Tyr Gly Gly Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 71
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 71
Gln Thr Val Val Thr Gln Phe Pro Ser Ser Pro Phe Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Gly Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Arg Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 72
<211> 127
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Gln Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Pro Ser Gly Gly Thr Phe Asn Asn Asn
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Val Pro Asn Phe Gly Thr Pro Thr Tyr Gly Gln Asp Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Phe
65 70 75 80
Leu Glu Leu Thr Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Thr Ala Val Thr Pro Met Gln Leu Gly Leu Gln Phe
100 105 110
Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 73
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 73
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Asn Ser Gly Ala Val Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Tyr Pro Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Lys Phe Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu Val Tyr Ser Gly Asp
85 90 95
Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105
<210> 74
<211> 119
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20 25 30
Ser Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Phe Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Thr Gly Val Ser Thr Ser Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Asn Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 75
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 75
Gln Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Phe Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Gly Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Arg Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105
<210> 76
<211> 122
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Glu Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Ser Met Thr Lys Gly Gly Ala Ile Tyr Gly Gln Ala Tyr
100 105 110
Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120
<210> 77
<211> 80
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 77
Pro Ser Pro Ala Leu Glu Pro Asp Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
1 5 10 15
Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile
20 25 30
Tyr Asp Val Thr Asp Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Ala
35 40 45
Ser Lys Ser Ala Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala
50 55 60
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr
65 70 75 80
<210> 78
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 78
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Glu Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Arg Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Asp Gln Val Tyr Tyr Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Tyr Val
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120
<210> 79
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 79
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Leu Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Gln Leu Tyr Tyr Asn Asp Gly Ser Gly Tyr Ile Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val 115 120
<210> 80
<211> 130
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 80
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ile Ser Ser
20 25 30
Ala Val Gln Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Val Val Ala Ser Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu His Arg Ser Pro Cys Ser Gly Gly Asp Ser Cys Tyr Ser
100 105 110
Leu Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser 130
<210> 81
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Thr Ser Ser Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Pro Phe Gly Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 82
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 82
Gln Ala Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ala Ile Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Asn Trp Gln Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 83
<211> 123
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 83
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Val Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Phe Trp Phe Gly Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 84
<211> 110
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 84
Gln Ala Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Phe Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Tyr Ala Val Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Ala Gly Asn
85 90 95
Asn Lys Asp Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 85
<211> 119
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 85
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Asn Ile Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Leu Trp Gly Glu Phe Tyr Tyr Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 86 <211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 86
Gln Ala Val Val Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Arg Ala Ala Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Ala Thr Ser Pro
85 90 95
Pro Pro Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 87
<211> 133
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 87
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Val Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Trp Glu Ser Ser Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Tyr Thr
100 105 110
Asp Tyr Phe Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Pro Gly Thr Leu
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser 130
<210> 88
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 88
Gln Ala Val Val Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Leu Leu Arg Gly
20 25 30
Ile Arg Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 89
<211> 129
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Thr
20 25 30
Gly Val Thr Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Ser Thr Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Arg Gly Ala
100 105 110
Leu Asp Ala Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 90
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 90
Gln Ile Val Val Thr Gln Phe Pro Asp Ser Pro Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr His
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ala Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 91
<211> 127
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Ser Asp Ala Leu Arg Ser Arg
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Thr Val Ser Tyr Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Gln Ser Arg Val Thr Val Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn His Phe
65 70 75 80
Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Ala Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Tyr Phe Tyr Asp Gly Ser Gly Tyr Tyr Tyr Leu Ser
100 105 110
Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 92
<211> 109
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 92
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
His Tyr Pro Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Ala
35 40 45
Leu Ile Tyr Ser Thr Asp Asn Lys His Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Val Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Asp Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Leu His Phe Gly Gly
85 90 95
Val Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105
<210> 93
<211> 125
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Met Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Phe Asn Asp Gly Val Lys Lys Tyr Tyr Gly Asp Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Lys Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Ile Pro Asp Pro Glu Arg Gly Asp Tyr Gly Gly Leu
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 94
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 94
Gln Thr Val Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Leu Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Met Asp 100 105
<210> 95
<211> 124
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 95
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Asn Ile Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Asp Leu Tyr Gly Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Asn Gly Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 96
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 96
Gln Ala Val Val Thr Gln Ser Ser Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 97
<211> 130
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Pro Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Leu Ser Tyr Tyr
20 25 30
Gly Ile Thr Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Ile Pro Phe Phe Ala Thr Thr Ile Ser Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Met Thr Ala Glu Glu Ser Thr Ser Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Met Glu Arg Thr Phe Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp
85 90 95
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Ser
100 105 110
Gly Asp Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser 130
<210> 98
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 98
Gln Ala Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly Thr Gly Thr Glu Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 99
<211> 128
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 99
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Gly Ser Arg
20 25 30
Ser Phe Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Asn Gly Thr Thr Tyr Tyr Lys Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ala Thr Asp Thr Gly Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ala Pro Thr Tyr Cys Ser Pro Ser Ser Cys Ala Val His
100 105 110
Trp Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 100 <211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 100
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Glu Asn Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ala Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Val Trp Phe Ala Glu Tyr Ile Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 101
<211> 110
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 101
Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Val Ile Tyr Asp Val Ala Asn Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Thr Ser Asp
85 90 95
Val Ser Pro Val Phe Ser Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 102
<211> 133
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 102
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His
20 25 30
Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Asn Leu Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Arg Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Gly Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser Val Gly Val Phe Arg Gly
100 105 110
Ser Phe Asp Asp Phe Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser 130
<210> 103
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид <400> 103
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Gly 1 5
<210> 104
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 104
Ile Ser Thr Tyr Lys Gly Tyr Thr 1 5
<210> 105
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 105
Ala Arg Val Leu Ser Glu Thr Gly Tyr Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 106
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 106
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Ser 1 5
<210> <211> <212> <213>
107
БЕЛОК
Искусственная последовательность
Ile Asp Thr Asn Thr Gly Asn Pro 1 5
<210> 108
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 108
Ala Thr Tyr Tyr Val Asp Leu Trp Gly Ser Tyr Arg Gln Asp Tyr Tyr
1 5 10 15
Gly Met Asp Val
<210> 109
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 109
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly 1 5
<210> 110
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 110
Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr 1 5
<210> 111
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 111
Ala Arg Asp Phe Glu Phe Pro Gly Asp Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr
1 5 10 15
Ser Arg Phe Ile Tyr Gln His Asn Asp Met Asp Val 20 25
<210> 112
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 112
Ser Asp Ala Leu Arg Ser Arg Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 113
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 113
Val Ser Tyr Ser Gly Gly Thr
1 5
<210> 114
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 114
Ala Arg Ser Tyr Phe Tyr Asp Gly Ser Gly Tyr Tyr Tyr Leu Ser Tyr
1 5 10 15
Phe Asp Ser
<210> 115
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 115
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala 1 5
<210> 116
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 116
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5
<210> 117
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 117
Ala Arg Gly Asp Tyr Val Leu Asp Tyr 1 5
<210> 118
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 118
Gly Gly Thr Ser Ser Thr Tyr Ala 1 5
<210> 119
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 119
Ser Ile Pro Val Phe Ala Thr Val 1 5
<210> 120
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 120
Ala Ser Pro Tyr Cys Ser Ser Met Asn Cys Tyr Thr Thr Phe Tyr Tyr
1 5 10 15
Phe Asp Phe
<210> 121
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 121
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Ser 1 5
<210> 122
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 122
Ile Asp Thr Asn Thr Gly Asn Pro 1 5
<210> 123
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 123
Ala Thr Tyr Tyr Val Asp Leu Trp Gly Ser Tyr Arg Gln Asp Tyr Tyr
1 5 10 15
Gly Met Asp Val 20
<210> 124
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 124
Gly Tyr Ile Leu Ser Lys Leu Ser 1 5
<210> 125
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 125
Ser Glu Arg Glu Asp Gly Glu Thr
1 5
<210> 126
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 126
Ala Thr Gly Gly Phe Trp Ser Met Ile Gly Gly Asn Gly Val Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 127
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 127
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Phe 1 5
<210> 128
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 128
Thr Tyr Pro Gly Gly Gly Ser Pro 1 5
<210> 129
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 129
Ala Arg Gly Ala His Arg Ser Ile Gly Thr Thr Pro Leu Asp Ser
1 5 10 15
<210> 130
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 130
Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr Gly 1 5
<210> 131
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 131
Ile Trp Asn Asp Gly Ser Lys Glu 1 5
<210> 132
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 132
Ala Arg Asp Gly Ile Pro Asp Pro Glu Arg Gly Asp Tyr Gly Gly Leu
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 133
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид <400> 133
Gly Gly Thr Phe Asn Asn Asn Gly 1 5
<210> 134
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 134
Ile Val Pro Asn Phe Gly Thr Pro 1 5
<210> 135
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 135
Ala Arg Gly Arg Thr Ala Val Thr Pro Met Gln Leu Gly Leu Gln Phe
1 5 10 15
Tyr Phe Asp Phe 20
<210> 136
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 136
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn Ser 1 5
<210> <211> <212> <213>
137 8
БЕЛОК
Искусственная последовательность
Ile Asn Pro Asn Thr Gly Val Ser 1 5
<210> 138
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 138
Ala Arg Glu Glu Asn Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Leu
1 5 10
<210> 139
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 139
Gly Phe Ser Leu Ser Ile Ser Gly Val Gly
1 5 10
<210> 140
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 140
Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210> 141
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 141
Ala His Ser Met Thr Lys Gly Gly Ala Ile Tyr Gly Gln Ala Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 142
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 142
Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu Ser 1 5
<210> 143
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 143
Phe Glu Pro Glu Asp Gly Glu Thr
1 5
<210> 144
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 144
Thr Thr Asp Gln Val Tyr Tyr Arg Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Tyr Val
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 145
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 145
Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Val 1 5
<210> 146
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 146
Ile Ile Pro Leu Phe Gly Thr Ala 1 5
<210> 147
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 147
Ala Arg Gly Ala Gln Leu Tyr Tyr Asn Asp Gly Ser Gly Tyr Ile Phe
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 148
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 148
Gly Phe Ser Phe Ile Ser Ser Ala
1 5
<210> 149
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 149
Ile Val Val Ala Ser Ala Asn Thr
1 5
<210> 150
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 150
Ala Ala Glu His Arg Ser Pro Cys Ser Gly Gly Asp Ser Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Tyr Tyr Gly Met Asp Val 20
<210> 151
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 151
Gly Phe Thr Val Ser Asn Tyr Gly 1 5
<210> 152
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 152
Ile Ser Thr Ser Ser Gly Arg Thr 1 5
<210> 153
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 153
Ala Lys Gly Pro Phe Gly Gly Asp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 154
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
Gly Phe Thr Phe Asp Val Tyr Ala 1 5
<210> 155
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 155
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Val 1 5
<210> 156
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 156
Ala Lys Ala Phe Trp Phe Gly Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 157
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 157
Gly Tyr Ser Phe Asn Ile Tyr Gly 1 5
<210> 158
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 158
Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr 1 5
<210> 159
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 159
Ala Arg Pro Leu Trp Gly Glu Phe Tyr Tyr Asp Ile
<210> 160
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 160
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Val
<210> 161
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 161
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5
<210> 162
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 162
Ala Arg Ser Glu Trp Glu Ser Ser Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Tyr Thr
1 5 10 15
Asp Tyr Phe Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Val 20 25
<210> 163
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
Gly Phe Ser Leu Thr Thr Thr Gly Val Thr
1 5 10
<210> 164
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 164
Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210> 165
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 165
Ala His Ser Thr Gly Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Arg Gly Ala Leu
1 5 10 15
Asp Ala Phe Ala Val 20
<210> 166
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 166
Ser Asp Ala Leu Arg Ser Arg Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 167
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 167
Val Ser Tyr Ser Gly Gly Thr
1 5
<210> 168
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 168
Ala Arg Ser Tyr Phe Tyr Asp Gly Ser Gly Tyr Tyr Tyr Leu Ser Tyr
1 5 10 15
Phe Asp Ser
<210> 169
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 169
Gly Phe Thr Phe Arg Met Tyr Gly 1 5
<210> 170
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 170
Ile Phe Asn Asp Gly Val Lys Lys 1 5
<210> 171
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 171
Ala Arg Asp Gly Ile Pro Asp Pro Glu Arg Gly Asp Tyr Gly Gly Leu
1 5 10 15
<210> 172
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 172
Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5
<210> 173
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 173
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Asn Ile 1 5
<210> 174
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 174
Val Lys Asp Leu Tyr Gly Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Asn Gly Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 175
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 175
Gly Asp Thr Leu Ser Tyr Tyr Gly 1 5
<210> 176 <211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид <400> 176
Ile Ile Pro Phe Phe Ala Thr Thr 1 5
<210> 177
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 177
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Gly Asp Tyr Gly Leu Asp Val 20
<210> 178
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 178
Gly Asp Ser Ile Gly Ser Arg Ser Phe Tyr
1 5 10
<210> 179
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 179
Ile Tyr Tyr Asn Gly Thr Thr 1 5
<210> 180
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 180
Ala Arg Ala Pro Thr Tyr Cys Ser Pro Ser Ser Cys Ala Val His Trp
1 5 10 15
Tyr Phe Asn Leu
<210> 181
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 181
Gly Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Gly 1 5
<210> 182
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 182
Ile Ser Ala Tyr Asn Glu Asn Thr 1 5
<210> 183
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 183
Ala Arg Glu Val Trp Phe Ala Glu Tyr Ile Tyr
1 5 10
<210> 184
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His Pro 1 5
<210> 185
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 185
Ile Asn Thr Lys Thr Gly Asn Leu 1 5
<210> 186
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 186
Ala Arg Asp Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser Val Gly Val Phe Arg Gly
1 5 10 15
Ser Phe Asp Asp Phe Tyr Gly Met Asp Val 20 25
<210> 187
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 187
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asn
<210> 188
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 188
Gly Asn Thr 1
<210> 189
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 189
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10
<210> 190
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 190
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro 1 5
<210> 191
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 191
Thr Asn Asn 1
<210> 192
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 192
Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Arg Trp Val
1 5 10
<210> <211> <212> <213>
193 8
БЕЛОК
Искусственная последовательность
Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr 1 5
<210> 194
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 194
Asp Asn Tyr
<210> 195
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 195
Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Val Val
1 5 10
<210> 196
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 196
Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly His Tyr
1 5
<210> 197
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 197
Ser Thr Asp 1
<210> 198
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 198
Leu Leu His Phe Gly Gly Val Val Val 1 5
<210> 199
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 199
Gln Ser Ile Pro Ser Tyr 1 5
<210> 200
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 200
Ala Thr Ser 1
<210> 201
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 201
Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Gly Ile Phe Thr
1 5 10
<210> 202
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
Ser Ser Asp Phe Gly Thr Tyr Asn Tyr 1 5
<210> 203
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 203
Asp Val Ser 1
<210> 204
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 204
Ser Ser Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Leu Tyr Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 205
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 205
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro 1 5
<210> 206
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 206
Thr Asn Asn 1
<210> 207
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 207
Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Arg Trp Val
1 5 10
<210> 208
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 208
Gln Asp Ile Arg Asn Asn 1 5
<210> 209
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 209
Gly Thr Ser 1
<210> 210
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 210
Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5
<210> 211
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 211
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5
<210> 212
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 212
Ala Thr Ser 1
<210> 213
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 213
Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Thr 1 5
<210> 214
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 214
Ser Gly Ala Val Thr Ser Asp Tyr Tyr 1 5
<210> 215
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 215
Ser Ala Ser 1
<210> 216
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 216
Leu Val Tyr Ser Gly Asp Gly Val Val 1 5
<210> 217
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 217
Gln Ser Ile Ser Thr Tyr 1 5
<210> 218
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 218
Ala Ala Ser 1
<210> 219
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 219
Gln Gln Ser Tyr Arg Thr Pro Trp Thr 1 5
<210> 220
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 220
Asp Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr 1 5
<210> 221
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 221
Asp Val Thr 1
<210> 222
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 222
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Val
1 5 10
<210> 223
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 223
Gln Ser Val Ala Ile Tyr
1 5
<210> 224
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 224
Asp Ala Ser 1
<210> 225
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
Gln Gln Arg Gly Asn Trp Gln Tyr Thr 1 5
<210> 226
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 226
Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Tyr 1 5
<210> 227
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 227
Ala Val Thr 1
<210> 228
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 228
Thr Ser Tyr Ala Gly Asn Asn Lys Asp Val
1 5 10
<210> 229
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 229
Gln Ser Val Ser Ser Gly Tyr
1 5
<210> 230 <211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид <400> 230 Gly Ala Ser
<210> 231
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 231
Gln Leu Phe Ala Thr Ser Pro Pro Pro 1 5
<210> 232
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 232
Gln Ser Leu Leu Arg Gly Ile Arg Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 233
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 233
Leu Gly Ser
<210> 234
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Thr Thr 1 5
<210> 235
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 235
Gln Ser Val Leu Tyr His Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 236
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 236
Trp Ala Ser 1
<210> 237
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 237
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 238
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 238
Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly His Tyr
1 5
<210> 239
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 239
Ser Thr Asp 1
<210> 240
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 240
Leu Leu His Phe Gly Gly Val Val Val
1 5
<210> 241
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 241
Gln Ser Ile Thr Ser Tyr 1 5
<210> 242
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 242
Ala Thr Ser 1
<210> 243
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 243
Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Thr 1 5
<210> 244
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 244
Gln Ser Leu Leu Gln Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 245
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 245
Leu Gly Ser
<210> 246
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 246
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Pro Thr 1 5
<210> 247
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 247
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 1 5
<210> 248
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 248 Gly Asn Asn
<210> 249
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 249
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Gly Val
1 5 10
<210> 250
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 250
Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asn Tyr 1 5
<210> 251
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 251
Asp Val Ala 1
<210> 252
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 252
Gly Ser Tyr Thr Ser Asp Val Ser Pro Val
1 5 10
<210> 253
<211> 1317 <212> ДНК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 253
tacgaacacg taacagtgat cccgaacacg gtgggagtac cgtataagac tctagtcaac 60
agaccgggct acagccccat ggtactggag atggagctac tgtcagtcac tttggagcca 120
acgctatcgc ttgattacat cacgtgcgaa tacaaaaccg tcatcccgtc tccgtacgtg 180
aaatgctgcg gtacagcaga gtgcaaggac aaaaacctac ctgactacag ctgtaaggtc 240
ttcaccggcg tctacccatt tatgtggggc ggcgcctact gcttctgcga cgctgaaaac 300
acgcaattga gcgaagcaca tgtggagaag tccgaatcat gcaaaacaga atttgcatca 360
gcatacaggg ctcataccgc atccgcatca gctaagctcc gcgtccttta ccaaggaaat 420
aacatcactg taactgccta tgcaaacggc gaccatgccg tcacagttaa ggacgccaaa 480
ttcattgtgg ggccaatgtc ttcagcctgg acaccttttg acaacaaaat cgtggtgtac 540
aaaggtgacg tttacaacat ggactacccg ccctttggcg caggaagacc aggacaattt 600
ggcgatatcc aaagtcgcac gcctgagagc aaagacgtct atgctaacac acaactggta 660
ctgcagagac cggctgcggg tacggtacac gtgccatact ctcaggcacc atctggcttt 720
aagtattggt taaaagaacg aggggcgtcg ctacagcaca cagcaccatt tggctgccaa 780
atagcaacaa acccggtaag agcgatgaac tgcgccgtag ggaacatgcc catctccatc 840
gacataccgg atgcggcctt cactagggtc gtcgacgcgc cctctttaac ggacatgtca 900
tgcgaggtac cagcctgcac ccattcctca gactttgggg gcgtcgccat tattaaatat 960
gcagtcagca agaaaggcaa gtgtgcggtg cattcgatga ccaacgccgt cactatccgg 1020
gaagctgaga tagaagttga agggaattct cagctgcaaa tctctttctc gacggccttg 1080
gccagcgccg aattccgcgt acaagtctgt tctacacaag tacactgtgc agccgagtgc 1140
caccctccga aggaccacat agtcaactac ccggcgtcac ataccaccct cggggtccag 1200
gacatttccg ctacggcgat gtcatgggtg cagaagatca cgggaggtgt gggactggtt 1260
gtcgctgttg cagcactgat tctaatcgtg gtgctatgcg tgtcgttcag caggcac 1317
<210> 254 <211> 1317 <212> ДНК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 254
tacgaacacg taacagtgat cccgaacacg gtgggagtac cgtataagac tctagtcaat 60
agacctggct acagccccat ggtattggag atggaactac tgtcagtcac tttggagcca 120
acactatcgc ttgattacat cacgtgcgag tacaaaaccg tcatcccgtc tccgtacgtg 180
aagtgctgcg gtacagcaga gtgcaaggac aaaaacctac ctgactacag ctgtaaggtc 240
ttcaccggcg tctacccatt tatgtggggc ggcgcctact gcttctgcga cgctgaaaac 300
acgcagttga gcgaagcaca tgtggagaag tccgaatcat gcaaaacaga atttgcatca 360
gcatacaggg ctcataccgc atctgcatca gctaagctcc gcgtccttta ccaaggaaat 420
aacatcactg taactgccta tgcaaacggc gaccatgccg tcacagttaa ggacgccaaa 480
ttcattgtgg ggccaatgtc ttcagcctgg acacctttcg acaacaaaat tgtggtgtac 540
aaaggtgacg tctataacat ggactacccg ccctttggcg caggaagacc aggacaattt 600
ggcgatatcc aaagtcgcac acctgagagt aaagacgtct atgctaatac acaactggta 660
ctgcagagac cggctgcggg tacggtacac gtgccatact ctcaggcacc atctggcttt 720
aagtattggc taaaagaacg cggggcgtca ctgcagcaca cagcaccatt tggctgccaa 780
atagcaacaa acccggtaag agcggtgaac tgcgccgtag ggaacatgcc catctccatc 840
gacataccgg aagcggcctt cactagggtc gtcgacgcgc cctctttaac ggacatgtcg 900
tgcgaggtac tagcctgcac ccattcctca gactttgggg gcgtcgccat tattaaatat 960
gcagccagca agaaaggcaa gtgtgcggtg cattcgatga ctaacgccgt cactattcgg 1020
gaagctgaga tagaagttga agggaattct cagctgcaaa tctctttctc gacggcctta 1080
gccagcgccg aattccgcgt acaagtctgt tctacacaag tacactgtgc agctgagtgc 1140
caccccccga aggaccacat agtcaactac ccggcgtcac ataccaccct cggggtccag 1200
gacatctccg ctacggcgat gtcatgggtg cagaagatca cgggaggtgt gggactggtt 1260
gttgctgttg ccgcactgat tctaatcgtg gtgctatgcg tgtcgttcag caggcac 1317
<210> 255 <211> 1317 <212> ДНК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 255
tacgaacacg taacagtgat cccgaacacg gtgggagtac cgtataagac tctagtcaat 60
agacctggct acagccccat ggtattggag atggaactac tgtcagtcac tttggagcca 120
acactatcgc ttgattacat cacgtgcgag tacaaaaccg tcatcccgtc tccgtacgtg 180
aagtgctgcg gtacagcaga gtgcaaggac aaaaacctac ctgactacag ctgtaaggtc 240
ttcaccggcg tctacccatt tatgtggggc ggcgcctact gcttctgcga cgctgaaaac 300
acgcagttga gcgaagcaca cgtggagaag tccgaatcat gcaaaacaga atttgcatca 360
gcatacaggg ctcataccgc atctgcatca gctaagctcc gcgtccttta ccaaggaaat 420
aacatcactg taactgccta tgcaaacggc gaccatgccg tcacagttaa ggacgccaaa 480
ttcattgtgg ggccaatgtc ttcagcctgg acacctttcg acaacaaaat tgtggtgtac 540
aaaggtgacg tctataacat ggactacccg ccctttggcg caggaagacc aggacaattt 600
ggcgatatcc aaagtcgcac acctgagagt ctgcagagac cggctgtggg tacggtacac aagtattggc taaaagaacg cggggcgtcg atagcaacaa acccggtaag agcggtgaac gacataccgg aagcggcctt cactagggtc tgcgaggtac cagcctgcac ccattcctca gcagccagca agaaaggcaa gtgtgcggtg gaagctgaga tagaagttga agggaattct gccagcgccg aattccgcgt acaagtctgt caccccccga aggaccacat agtcaactac gacatctccg ctacggcgat gtcatgggtg gttgctgttg ccgcactgat tctaatcgtg
<210> 256
<211> 1317
<212> ДНК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 256
tacgaacacg taacagtgat cccgaacacg agaccgggct acagccccat ggtactggag acgctatcgc ttgattacat cacgtgcgag aaatgctgcg gtacagcaga gtgcaaggac ttcaccggcg tctacccatt catgtggggc acgcaattga gcgaagcaca tgtggagaag gcatataggg ctcataccgc atccgcatca aatgttactg tatctgctta tgcaaacggc ttcattgtgg ggccaatgtc ttcagcctgg aaaggcgacg tctacaacat ggactacccg ggcgacatcc aaagtcgcac gcctgagagc ctgcagagac cgtccgcggg tacggtgcac aagtattggc taaaagaacg aggggcgtcg atagcaacaa acccggtaag agcgatgaac gacataccgg acgcggcctt cactagggtc tgtgaggtac cagcctgcac ccactcctca gcagccagca agaaaggcaa gtgtgcggtg aaagacgtct atgctaatac acaactggta 660
gtgccatact ctcaggcacc atctggcttt 720
ctgcagcaca cagcaccatt tggctgccaa 780
tgcgccgtag ggaacatgcc catctccatc 840
gtcgacgcgc cctctttaac ggacatgtcg 900
gactttgggg gcgtcgccat tattaaatat 960
cattcgatga ctaacgccgt cactattcgg 1020
cagctgcaaa tctctttctc gacggcctta 1080
tctacacaag tacactgtgc agccgagtgc 1140
ccggcgtcac ataccaccct cggggtccag 1200
cagaagatca cgggaggtgt gggactggtt 1260
gtgctatgcg tgtcgttcag caggcac 1317
gtgggagtac cgtataagac tctagtcaac 60
atggagcttc tgtcagtcac tttggagcca 120
tataaaaccg tcatcccgtc tccgtacgtg 180
aagagcctac ctgattacag ctgtaaggtc 240
ggcgcctact gcttctgcga cactgaaaat 300
tccgaatcat gcaaaacaga atttgcatca 360
gctaagctcc gcgtccttta ccaaggaaat 420
gatcatgccg tcacagttaa ggacgctaaa 480
acaccttttg acaataaaat cgtggtgtac 540
cccttcggcg caggaagacc aggacaattt 600
gaagacgtct atgctaacac acaactggta 660
gtgccgtact ctcaggcacc atctggcttc 720
ctgcagcaca cagcaccatt tggctgtcaa 780
tgcgccgtag ggaacatgcc tatctccatc 840
gtcgacgcgc catctttaac ggacatgtcg 900
gactttgggg gcgtagccat cattaaatat 960
cattcgatga ctaacgccgt cactattcgg 1020
gaagctgaaa tagaagtaga agggaactct cagttgcaaa tctctttttc gacggcccta 1080
gccagcgccg aattccgcgt acaagtctgt tctacacaag tacactgtgc agccgagtgc 1140
catccaccga aagaccatat agtcaattac ccggcgtcac acaccaccct cggggtccaa 1200
gacatttccg ttacggcgat gtcatgggtg cagaagatca cgggaggtgt gggactggtt 1260
gtcgctgttg cagcactgat cctaatcgtg gtgctatgcg tgtcgtttag caggcac 1317
<210> 257 <211> 1317 <212> ДНК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 257
tacgaacacg taacagtgat cccgaacacg gtgggagtac cgtataagac tctagtcaac 60
agaccgggct acagccccat ggtattggag atggagcttc tgtctgtcac cttggaacca 120
acgctatcgc ttgattacat cacgtgcgag tataaaaccg ttatcccgtc tccgtacgtg 180
aaatgctgcg gtacagcaga gtgtaaggac aagagcctac ctgattacag ctgtaaggtc 240
ttcaccggcg tctacccatt catgtggggc ggcgcctact gcttctgcga caccgaaaat 300
acgcaattga gcgaagcaca tgtggagaag tccgaatcat gcaaaacaga atttgcatca 360
gcatacaggg ctcataccgc atccgcatca gctaagctcc gcgtccttta ccaaggaaat 420
aatatcactg tggctgctta tgcaaacggc gaccatgccg tcacagttaa ggacgctaaa 480
ttcatagtgg ggccaatgtc ttcagcctgg acacctttcg acaataaaat cgtggtgtac 540
aaaggcgacg tctacaacat ggactacccg cccttcggcg caggaagacc aggacaattt 600
ggcgacatcc aaagtcgcac gcctgagagc gaagacgtct atgctaatac acaactggta 660
ctgcagagac cgtccgcggg tacggtgcac gtgccgtact ctcaggcacc atctggcttc 720
aagtattggc taaaagaacg aggggcgtcg ctgcagcaca cagcaccatt tggctgtcaa 780
atagcaacaa acccggtaag agcgatgaac tgcgccgtag ggaacatgcc tatctccatc 840
gacataccgg acgcggcctt taccagggtc gtcgacgcgc catctttaac ggacatgtcg 900
tgtgaggtat cagcctgcac ccattcctca gactttgggg gcgtagccat cattaaatat 960
gcagccagta agaaaggcaa gtgtgcagtg cactcgatga ctaacgccgt cactattcgg 1020
gaagctgaaa tagaagtaga agggaactct cagttgcaaa tctctttttc gacggcccta 1080
gccagcgccg aatttcgcgt acaagtctgt tctacacaag tacactgtgc agccgagtgc 1140
catccaccga aagaccatat agtcaattac ccggcgtcac acaccaccct cggggtccaa 1200
gacatttccg ctacggcgat gtcatgggtg cagaagatca cgggaggtgt gggactggtt 1260
gtcgctgttg cagcactgat cctaatcgtg gtgctatgcg tgtcgtttag caggcac 1317
<210> 258
<211> 1317 <212> ДНК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 258
tacgaacacg taacagtgat cccgaacacg gtgggagtac cgtataagac tcttgtcaac 60
agaccgggtt acagccccat ggtattggag atggagctac aatcggtcac cttggaacca 120
acactgtcac ttgactacat cacgtgcgag tacaaaactg tcatcccctc cccgtacgtg 180
aagtgctgtg gtacagcaga gtgcaaggac aagagcctac cagactacag ctgcaaggtc 240
tttactggag tctacccatt tatgtggggc ggcgcctact gcttttgcga cgccgaaaat 300
acgcaattga gcgaggcaca tgtagagaaa tctgaatctt gcaaaacaga gtttgcatcg 360
gcctacagag cccacaccgc atcggcgtcg gcgaagctcc gcgtccttta ccaaggaaac 420
aacattactg tagctgccta cgctaacggc gaccatgccg tcacagtaaa ggacgccaag 480
tttgtcgtgg gaccaatgtc ctccgcctgg acaccttttg acaacaaaat cgtggtgtac 540
aaaggcgacg tctacaacat ggactaccca ccttttggcg caggaagacc aggacaattt 600
ggtgacattc aaagtcgtac accggaaagt aaagacgttt atgccaacac tcagttggta 660
ctacagaggc cagcagcagg cacggtacat gtaccatact ctcaggcacc atctggcttc 720
aagtattggc tgaaggaacg aggagcatcg ctacagcaca cggcaccgtt cggttgccag 780
attgcgacaa acccggtaag agctgtaaat tgcgctgtgg ggaacatacc aatttccatc 840
gacataccgg atgcggcctt tactagggtt gtcgatgcac cctctgtaac ggacatgtca 900
tgcgaagtac cagcctgcac tcactcctcc gactttgggg gcgtcgccat catcaaatat 960
acagctagca agaaaggtaa atgtgcagta cattcgatga ccaacgccgt taccattcga 1020
gaagccgacg tagaagtaga ggggaattcc cagctgcaaa tatccttctc aacagccttg 1080
gcaagcgccg agtttcgcgt gcaagtgtgc tccacacaag tacactgcgc agccgcatgc 1140
caccctccaa aggaccacat agtcaattac ccagcatcac acaccaccct tggggtccag 1200
gatatatcca caacggcaat gtcttgggtg cagaagatta cgggaggagt aggattaatt 1260
gttgctgttg ctgccttaat tttaattgtg gtgctatgcg tgtcgtttag caggcac 1317
<210> 259 <211> 439 <212> БЕЛОК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 259
Tyr Glu His Val Thr Val Ile Pro Asn Thr Val Gly Val Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly Tyr Ser Pro Met Val Leu Glu Met Glu
20 25 30
Leu Gln Ser Val Thr Leu Glu Pro Thr Leu Ser Leu Asp Tyr Ile Thr
35 40 45
Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys Gly
50 55 60
Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys Ser Leu Pro Asp Tyr Ser Cys Lys Val
65 70 75 80
Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe Cys
85 90 95
Asp Ala Glu Asn Thr Gln Leu Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser Glu
100 105 110
Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala Ser Ala Tyr Arg Ala His Thr Ala Ser
115 120 125
Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val Leu Tyr Gln Gly Asn Asn Ile Thr Val
130 135 140
Ala Ala Tyr Ala Asn Gly Asp His Ala Val Thr Val Lys Asp Ala Lys
145 150 155 160
Phe Val Val Gly Pro Met Ser Ser Ala Trp Thr Pro Phe Asp Asn Lys
165 170 175
Ile Val Val Tyr Lys Gly Asp Val Tyr Asn Met Asp Tyr Pro Pro Phe
180 185 190
Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln Phe Gly Asp Ile Gln Ser Arg Thr Pro
195 200 205
Glu Ser Lys Asp Val Tyr Ala Asn Thr Gln Leu Val Leu Gln Arg Pro
210 215 220
Ala Ala Gly Thr Val His Val Pro Tyr Ser Gln Ala Pro Ser Gly Phe
225 230 235 240
Lys Tyr Trp Leu Lys Glu Arg Gly Ala Ser Leu Gln His Thr Ala Pro
245 250 255
Phe Gly Cys Gln Ile Ala Thr Asn Pro Val Arg Ala Val Asn Cys Ala
260 265 270
Val Gly Asn Ile Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Asp Ala Ala Phe Thr
275 280 285
Arg Val Val Asp Ala Pro Ser Val Thr Asp Met Ser Cys Glu Val Pro
290 295 300
Ala Cys Thr His Ser Ser Asp Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys Tyr
305 310 315 320
Thr Ala Ser Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr Asn Ala
325 330 335
Val Thr Ile Arg Glu Ala Asp Val Glu Val Glu Gly Asn Ser Gln Leu
340 345 350
Gln Ile Ser Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu Phe Arg Val Gln
355 360 365
Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Ala Cys His Pro Pro Lys
370 375 380
Asp His Ile Val Asn Tyr Pro Ala Ser His Thr Thr Leu Gly Val Gln
385 390 395 400
Asp Ile Ser Thr Thr Ala Met Ser Trp Val Gln Lys Ile Thr Gly Gly
405 410 415
Val Gly Leu Ile Val Ala Val Ala Ala Leu Ile Leu Ile Val Val Leu
420 425 430
Cys Val Ser Phe Ser Arg His 435
<210> 260
<211> 439
<212> БЕЛОК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 260
Tyr Glu His Val Thr Val Ile Pro Asn Thr Val Gly Val Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly Tyr Ser Pro Met Val Leu Glu Met Glu
20 25 30
Leu Leu Ser Val Thr Leu Glu Pro Thr Leu Ser Leu Asp Tyr Ile Thr
35 40 45
Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys Gly
50 55 60
Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys Asn Leu Pro Asp Tyr Ser Cys Lys Val
65 70 75 80
Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe Cys
85 90 95
Asp Ala Glu Asn Thr Gln Leu Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser Glu
100 105 110
Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala Ser Ala Tyr Arg Ala His Thr Ala Ser
115 120 125
Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val Leu Tyr Gln Gly Asn Asn Ile Thr Val
130 135 140
Thr Ala Tyr Ala Asn Gly Asp His Ala Val Thr Val Lys Asp Ala Lys
145 150 155 160
Phe Ile Val Gly Pro Met Ser Ser Ala Trp Thr Pro Phe Asp Asn Lys
165 170 175
Ile Val Val Tyr Lys Gly Asp Val Tyr Asn Met Asp Tyr Pro Pro Phe
180 185 190
Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln Phe Gly Asp Ile Gln Ser Arg Thr Pro
195 200 205
Glu Ser Lys Asp Val Tyr Ala Asn Thr Gln Leu Val Leu Gln Arg Pro
210 215 220
Ala Ala Gly Thr Val His Val Pro Tyr Ser Gln Ala Pro Ser Gly Phe
225 230 235 240
Lys Tyr Trp Leu Lys Glu Arg Gly Ala Ser Leu Gln His Thr Ala Pro
245 250 255
Phe Gly Cys Gln Ile Ala Thr Asn Pro Val Arg Ala Met Asn Cys Ala
260 265 270
Val Gly Asn Met Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Asp Ala Ala Phe Thr
275 280 285
Arg Val Val Asp Ala Pro Ser Leu Thr Asp Met Ser Cys Glu Val Pro
290 295 300
Ala Cys Thr His Ser Ser Asp Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys Tyr
305 310 315 320
Ala Val Ser Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr Asn Ala
325 330 335
Val Thr Ile Arg Glu Ala Glu Ile Glu Val Glu Gly Asn Ser Gln Leu
340 345 350
Gln Ile Ser Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu Phe Arg Val Gln
355 360 365
Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Glu Cys His Pro Pro Lys
370 375 380
Asp His Ile Val Asn Tyr Pro Ala Ser His Thr Thr Leu Gly Val Gln
385 390 395 400
Asp Ile Ser Ala Thr Ala Met Ser Trp Val Gln Lys Ile Thr Gly Gly
405 410 415
Val Gly Leu Val Val Ala Val Ala Ala Leu Ile Leu Ile Val Val Leu
420 425 430
Cys Val Ser Phe Ser Arg His 435
<210> 261
<211> 439
<212> БЕЛОК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 261
Tyr Glu His Val Thr Val Ile Pro Asn Thr Val Gly Val Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly Tyr Ser Pro Met Val Leu Glu Met Glu
20 25 30
Leu Leu Ser Val Thr Leu Glu Pro Thr Leu Ser Leu Asp Tyr Ile Thr
35 40 45
Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys Gly
50 55 60
Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys Asn Leu Pro Asp Tyr Ser Cys Lys Val
65 70 75 80
Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe Cys
85 90 95
Asp Ala Glu Asn Thr Gln Leu Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser Glu
100
105
110
Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala Ser Ala Tyr Arg Ala His Thr Ala Ser
115 120 125
Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val Leu Tyr Gln Gly Asn Asn Ile Thr Val
130 135 140
Thr Ala Tyr Ala Asn Gly Asp His Ala Val Thr Val Lys Asp Ala Lys
145 150 155 160
Phe Ile Val Gly Pro Met Ser Ser Ala Trp Thr Pro Phe Asp Asn Lys
165 170 175
Ile Val Val Tyr Lys Gly Asp Val Tyr Asn Met Asp Tyr Pro Pro Phe
180 185 190
Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln Phe Gly Asp Ile Gln Ser Arg Thr Pro
195 200 205
Glu Ser Lys Asp Val Tyr Ala Asn Thr Gln Leu Val Leu Gln Arg Pro
210 215 220
Ala Ala Gly Thr Val His Val Pro Tyr Ser Gln Ala Pro Ser Gly Phe
225 230 235 240
Lys Tyr Trp Leu Lys Glu Arg Gly Ala Ser Leu Gln His Thr Ala Pro
245 250 255
Phe Gly Cys Gln Ile Ala Thr Asn Pro Val Arg Ala Val Asn Cys Ala
260 265 270
Val Gly Asn Met Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Glu Ala Ala Phe Thr
275 280 285
Arg Val Val Asp Ala Pro Ser Leu Thr Asp Met Ser Cys Glu Val Leu
290 295 300
Ala Cys Thr His Ser Ser Asp Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys Tyr
305 310 315 320
Ala Ala Ser Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr Asn Ala
325 330 335
Val Thr Ile Arg Glu Ala Glu Ile Glu Val Glu Gly Asn Ser Gln Leu
340 345 350
Gln Ile Ser Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu Phe Arg Val Gln
355
360
365
Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Glu Cys His Pro Pro Lys
370 375 380
Asp His Ile Val Asn Tyr Pro Ala Ser His Thr Thr Leu Gly Val Gln
385 390 395 400
Asp Ile Ser Ala Thr Ala Met Ser Trp Val Gln Lys Ile Thr Gly Gly
405 410 415
Val Gly Leu Val Val Ala Val Ala Ala Leu Ile Leu Ile Val Val Leu
420 425 430
Cys Val Ser Phe Ser Arg His 435
<210> 262
<211> 439
<212> БЕЛОК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 262
Tyr Glu His Val Thr Val Ile Pro Asn Thr Val Gly Val Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly Tyr Ser Pro Met Val Leu Glu Met Glu
20 25 30
Leu Leu Ser Val Thr Leu Glu Pro Thr Leu Ser Leu Asp Tyr Ile Thr
35 40 45
Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys Gly
50 55 60
Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys Asn Leu Pro Asp Tyr Ser Cys Lys Val
65 70 75 80
Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe Cys
85 90 95
Asp Ala Glu Asn Thr Gln Leu Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser Glu
100 105 110
Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala Ser Ala Tyr Arg Ala His Thr Ala Ser
115 120 125
Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val Leu Tyr Gln Gly Asn Asn Ile Thr Val
130 135 140
Thr Ala Tyr Ala Asn Gly Asp His Ala Val Thr Val Lys Asp Ala Lys
145 150 155 160
Phe Ile Val Gly Pro Met Ser Ser Ala Trp Thr Pro Phe Asp Asn Lys
165 170 175
Ile Val Val Tyr Lys Gly Asp Val Tyr Asn Met Asp Tyr Pro Pro Phe
180 185 190
Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln Phe Gly Asp Ile Gln Ser Arg Thr Pro
195 200 205
Glu Ser Lys Asp Val Tyr Ala Asn Thr Gln Leu Val Leu Gln Arg Pro
210 215 220
Ala Val Gly Thr Val His Val Pro Tyr Ser Gln Ala Pro Ser Gly Phe
225 230 235 240
Lys Tyr Trp Leu Lys Glu Arg Gly Ala Ser Leu Gln His Thr Ala Pro
245 250 255
Phe Gly Cys Gln Ile Ala Thr Asn Pro Val Arg Ala Val Asn Cys Ala
260 265 270
Val Gly Asn Met Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Glu Ala Ala Phe Thr
275 280 285
Arg Val Val Asp Ala Pro Ser Leu Thr Asp Met Ser Cys Glu Val Pro
290 295 300
Ala Cys Thr His Ser Ser Asp Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys Tyr
305 310 315 320
Ala Ala Ser Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr Asn Ala
325 330 335
Val Thr Ile Arg Glu Ala Glu Ile Glu Val Glu Gly Asn Ser Gln Leu
340 345 350
Gln Ile Ser Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu Phe Arg Val Gln
355 360 365
Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Glu Cys His Pro Pro Lys
370 375 380
Asp His Ile Val Asn Tyr Pro Ala Ser His Thr Thr Leu Gly Val Gln
385 390 395 400
Asp Ile Ser Ala Thr Ala Met Ser Trp Val Gln Lys Ile Thr Gly Gly
405 410 415
Val Gly Leu Val Val Ala Val Ala Ala Leu Ile Leu Ile Val Val Leu
420 425 430
Cys Val Ser Phe Ser Arg His 435
<210> 263
<211> 439
<212> БЕЛОК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 263
Tyr Glu His Val Thr Val Ile Pro Asn Thr Val Gly Val Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly Tyr Ser Pro Met Val Leu Glu Met Glu
20 25 30
Leu Leu Ser Val Thr Leu Glu Pro Thr Leu Ser Leu Asp Tyr Ile Thr
35 40 45
Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys Gly
50 55 60
Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys Ser Leu Pro Asp Tyr Ser Cys Lys Val
65 70 75 80
Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe Cys
85 90 95
Asp Thr Glu Asn Thr Gln Leu Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser Glu
100 105 110
Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala Ser Ala Tyr Arg Ala His Thr Ala Ser
115 120 125
Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val Leu Tyr Gln Gly Asn Asn Ile Thr Val
130 135 140
Ala Ala Tyr Ala Asn Gly Asp His Ala Val Thr Val Lys Asp Ala Lys
145 150 155 160
Phe Ile Val Gly Pro Met Ser Ser Ala Trp Thr Pro Phe Asp Asn Lys
165 170 175
Ile Val Val Tyr Lys Gly Asp Val Tyr Asn Met Asp Tyr Pro Pro Phe
180 185 190
Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln Phe Gly Asp Ile Gln Ser Arg Thr Pro
195 200 205
Glu Ser Glu Asp Val Tyr Ala Asn Thr Gln Leu Val Leu Gln Arg Pro
210 215 220
Ser Ala Gly Thr Val His Val Pro Tyr Ser Gln Ala Pro Ser Gly Phe
225 230 235 240
Lys Tyr Trp Leu Lys Glu Arg Gly Ala Ser Leu Gln His Thr Ala Pro
245 250 255
Phe Gly Cys Gln Ile Ala Thr Asn Pro Val Arg Ala Met Asn Cys Ala
260 265 270
Val Gly Asn Met Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Asp Ala Ala Phe Thr
275 280 285
Arg Val Val Asp Ala Pro Ser Leu Thr Asp Met Ser Cys Glu Val Ser
290 295 300
Ala Cys Thr His Ser Ser Asp Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys Tyr
305 310 315 320
Ala Ala Ser Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr Asn Ala
325 330 335
Val Thr Ile Arg Glu Ala Glu Ile Glu Val Glu Gly Asn Ser Gln Leu
340 345 350
Gln Ile Ser Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu Phe Arg Val Gln
355 360 365
Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Glu Cys His Pro Pro Lys
370 375 380
Asp His Ile Val Asn Tyr Pro Ala Ser His Thr Thr Leu Gly Val Gln
385 390 395 400
Asp Ile Ser Ala Thr Ala Met Ser Trp Val Gln Lys Ile Thr Gly Gly
405 410 415
Val Gly Leu Val Val Ala Val Ala Ala Leu Ile Leu Ile Val Val Leu
420 425 430
Cys Val Ser Phe Ser Arg His
435
<210> 264
<211> 439
<212> БЕЛОК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 264
Tyr Glu His Val Thr Val Ile Pro Asn Thr Val Gly Val Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly Tyr Ser Pro Met Val Leu Glu Met Glu
20 25 30
Leu Leu Ser Val Thr Leu Glu Pro Thr Leu Ser Leu Asp Tyr Ile Thr
35 40 45
Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile Pro Ser Pro Tyr Val Lys Cys Cys Gly
50 55 60
Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys Ser Leu Pro Asp Tyr Ser Cys Lys Val
65 70 75 80
Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Tyr Cys Phe Cys
85 90 95
Asp Thr Glu Asn Thr Gln Leu Ser Glu Ala His Val Glu Lys Ser Glu
100 105 110
Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala Ser Ala Tyr Arg Ala His Thr Ala Ser
115 120 125
Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val Leu Tyr Gln Gly Asn Asn Val Thr Val
130 135 140
Ser Ala Tyr Ala Asn Gly Asp His Ala Val Thr Val Lys Asp Ala Lys
145 150 155 160
Phe Ile Val Gly Pro Met Ser Ser Ala Trp Thr Pro Phe Asp Asn Lys
165 170 175
Ile Val Val Tyr Lys Gly Asp Val Tyr Asn Met Asp Tyr Pro Pro Phe
180 185 190
Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln Phe Gly Asp Ile Gln Ser Arg Thr Pro
195 200 205
Glu Ser Glu Asp Val Tyr Ala Asn Thr Gln Leu Val Leu Gln Arg Pro
210 215 220
Ser Ala Gly Thr Val His Val Pro Tyr Ser Gln Ala Pro Ser Gly Phe
225 230 235 240
Lys Tyr Trp Leu Lys Glu Arg Gly Ala Ser Leu Gln His Thr Ala Pro
245 250 255
Phe Gly Cys Gln Ile Ala Thr Asn Pro Val Arg Ala Met Asn Cys Ala
260 265 270
Val Gly Asn Met Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Asp Ala Ala Phe Thr
275 280 285
Arg Val Val Asp Ala Pro Ser Leu Thr Asp Met Ser Cys Glu Val Pro
290 295 300
Ala Cys Thr His Ser Ser Asp Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys Tyr
305 310 315 320
Ala Ala Ser Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr Asn Ala
325 330 335
Val Thr Ile Arg Glu Ala Glu Ile Glu Val Glu Gly Asn Ser Gln Leu
340 345 350
Gln Ile Ser Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu Phe Arg Val Gln
355 360 365
Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Glu Cys His Pro Pro Lys
370 375 380
Asp His Ile Val Asn Tyr Pro Ala Ser His Thr Thr Leu Gly Val Gln
385 390 395 400
Asp Ile Ser Val Thr Ala Met Ser Trp Val Gln Lys Ile Thr Gly Gly
405 410 415
Val Gly Leu Val Val Ala Val Ala Ala Leu Ile Leu Ile Val Val Leu
420 425 430
Cys Val Ser Phe Ser Arg His 435
<213> Вирус чикунгунья
<400> 265
agtattaagg acaacttcaa tgtctataaa gccataagac cgtacctagc tcactgtccc 60
gactgtggag aagggcactc gtgccatagt cccgtagcgc tagaacgcat cagaaacgaa 120
gcgacagacg ggacgctgaa aatccaggtt tccttgcaaa tcggaataaa gacggatgat 180
agccatgatt ggaccaagct gcgttacatg gacaatcata tgccagcaga cgcagagagg 240
gccaggctat ttgtaagaac gtcagcaccg tgcacgatta ctggaacaat gggacacttc 300
atcctggccc gatgtccgaa aggagaaact ctgacggtgg gattcactga cggtaggaag 360
atcagtcact catgtacgca cccatttcac cacgaccctc ctgtgatagg ccgggaaaaa 420
tttcattccc gaccgcagca cggtagagaa ctaccttgca gcacgtacgc gcagagcacc 480
gctgcaactg ccgaggagat agaggtacat atgcccccag acaccccaga tcgcacattg 540
atgtcacaac agtccggtaa tgtaaagatc acagtcaata gtcagacggt gcggtacaag 600
tgtaattgcg gtgactcaaa tgaaggacta accactacag acaaagtgat taataactgc 660
aaggttgatc aatgccatgc cgcggtcacc aatcacaaaa aatggcagta taattcccct 720
ctggtcccgc gtaatgctga actcggggac cgaaaaggaa aagttcacat tccgtttcct 780
ctggcaaatg tgacatgcag ggtgcctaag gcaaggaacc ccaccgtgac gtacggaaaa 840
aaccaagtca tcatgctgct gtatcctgac cacccaacgc tcctgtccta ccggaatatg 900
ggagaagaac caaactatca agaagagtgg gtgacgcata agaaggagat caggttaacc 960
gtgccgactg aagggctcga ggtcacgtgg ggcaacaacg agccgtacaa gtattggccg 1020
cagttatcca caaacggtac agcccacggc cacccgcatg agataatttt gtattattat 1080
gagctgtacc ctactatgac tgtggtagtt gtgtcagtgg cctcgttcgt actcctgtcg 1140
atggtgggtg tggcagtggg gatgtgcatg tgtgcacgac gcagatgcat tacaccgtac 1200
gaactgacac caggagctac cgtccctttc ctgcttagcc taatatgctg cattagaaca 1260
gctaaagcg 1269
<210> 266 <211> 1269 <212> ДНК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 266
agtactaagg acaattttaa tgtctataaa gctacaagac catatctagc tcattgtcct 60
gactgcggag aagggcattc gtgccacagc cctatcgcat tggagcgcat cagaaatgaa 120
gcaacggacg gaacgctgaa aatccaggtc tctttgcaga tcgggataaa gacagatgac 180
agccacgatt ggaccaagct gcgctatatg gatagccata cgccagcgga cgcggagcga 240
gccggattgc ttgtaaggac ttcagcaccg tgcacgatca ccgggaccat gggacacttt 300
attctcgccc gatgcccgaa aggagagacg ctgacagtgg gatttacgga cagcagaaag 360
atcagccaca catgcacaca cccgttccat catgaaccac ctgtgatagg tagggagagg 420
ttccactctc gaccacaaca tggtaaagag ttaccttgca gcacgtacgt gcagagcacc 480
gctgccactg ccgaggagat agaggtgcat atgcccccag atactcctga ccgcacgctg 540
atgacgcagc agtctggcaa cgtgaagatc acagttaatg ggcagacggt gcggtacaag 600
tgcaactgcg gcggctcaaa cgagggactg acaaccacag acaaagtgat caataactgc 660
aaaattgatc agtgccatgc tgcagtcact aatcacaaga agtggcaata caactcccct 720
ttagtcccgc gtaacgctga actcggggac cgtaaaggaa agattcacat cccattccca 780
ttggcaaacg tgacttgcag agtgccaaaa gcaagaaacc ccacagtaac gtacggaaaa 840
aaccaagtca ccatgctgct gtatcctgac catccgacac tcttgtctta tcgtaacatg 900
ggacaggaac caaattacca cgaggagtgg gtgacacaca agaaggaggt taccttgacc 960
gtgcctactg agggtctgga ggtcacttgg ggcaacaacg aaccatacaa gtactggccg 1020
cagatgtcta cgaacggtac tgctcatggt cacccacatg agataatctt gtactattat 1080
gagctgtacc ccactatgac tgtaatcatt gtgtcggtgg cctcgttcgt gcttctgtcg 1140
atggtgggca cagcagtggg gatgtgtgtg tgcgcacggc gcagatgcat tacaccatat 1200
gaattaacac caggagccac cgttcccttt ctgctcagcc tgctatgttg cgtcagaacg 1260
accaaggcg 1269
<210> 267 <211> 1269 <212> ДНК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 267
agcaccaagg acaacttcaa tgtctataaa gccacaagac catacttagc tcactgtccc 60
gactgtggag aagggcactc gtgccatagt cccgtagcac tagaacgcat cagaaatgaa 120
gcgacagacg ggacgctgaa aatccaggtc tccttgcaaa tcggaataaa gacggatgac 180
agccacgatt ggaccaagct gcgttatatg gacaaccaca tgccagcaga cgcagagagg 240
gcggggctat ttgtaagaac atcagcaccg tgtacgatta ctggaacaat gggacacttc 300
atcctggccc gatgtccaaa aggggaaact ctgacggtgg gattcactga cagtaggaag 360
attagtcact catgtacgca cccatttcac cacgaccctc ctgtgatagg tcgggaaaaa 420
ttccattccc gaccgcagca cggtaaagag ctaccttgca gcacgtacgt gcagagcacc 480
gccgcaacta ccgaggagat agaggtacac atgcccccag acacccctga tcgcacatta 540
atgtcacaac agtccggcaa cgtaaagatc acagtcaatg gccagacggt gcggtacaag 600
tgtaattgcg gtggctcaaa tgaaggacta acaactacag acaaagtgat taataactgc 660
aaggttgatc aatgtcatgc cgcggtcacc aatcacaaaa agtggcagta taactcccct 720
ctggtcccgc gtaatgctga acttggggac cgaaaaggaa aaattcacat cccgtttccg 780
ctggcaaatg taacatgcag ggtgcctaaa gcaaggaacc ccaccgtgac gtacgggaaa 840
aaccaagtca tcatgctact gtatcctgac cacccaacac tcctgtccta ccggaatatg 900
ggagaagaac caaactatca agaagagtgg gtgatgcata agaaggaagt cgtgctaacc 960
gtgccgactg aagggctcga ggtcacgtgg ggcaacaacg agccgtataa gtattggccg 1020
cagttatcta caaacggtac agcccatggc cacccgcatg agataattct gtattattat 1080
gagctgtacc ccactatgac tgtagtagtt gtgtcagtgg ccacgttcat actcctgtcg 1140
atggtgggta tggcagcggg gatgtgcatg tgtgcacgac gcagatgcat cacaccgtat 1200
gaactgacac caggagctac cgtccctttc ctgcttagcc taatatgctg catcagaaca 1260
gctaaagcg 1269
<210> 268 <211> 1269 <212> ДНК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 268
agcaccaagg acaacttcaa tgtctataaa gccacaagac catacttagc tcactgtccc 60
gactgtggag aagggcactc gtgccatagt cccgtagcac tagaacgcat cagaaatgaa 120
gcgacagacg ggacgctgaa aatccaggtc tccttgcaaa tcggaataaa gacggacgac 180
agccacgatt ggaccaagct gcgttatatg gacaaccaca tgccagcaga cgcagagagg 240
gcggggctat ttgtaagaac atcagcaccg tgtacgatta ctggaacaat gggacacttc 300
atcctggccc gatgtccaaa aggggaaact ctgacggtgg gattcactga cagtaggaag 360
attagtcatt catgtacgca cccatttcac cacgaccctc ctgtgatagg tcgggaaaaa 420
ttccattccc gaccgcagca cggtaaagag ctaccttgca gcacgtacgt gcagagcacc 480
gccgcaacta ccgaggagat agaggtacac atgcccccag acacccctga tcgcacatta 540
atgtcacaac agtccggcaa cgtaaagatc acagtcaatg gccagacggt gcggtacaag 600
tgtaattgcg gtggctcaaa tgaaggacta acaactacag acaaagtgat taataactgc 660
aaggttgatc aatgtcatgc cgcggtcacc aatcacaaaa agtggcagta taactcccct 720
ctggtcccgc gtaatgctga acttggggac cgaaaaggaa aaattcacat cccgtttccg 780
ctggcaaatg taacatgcag ggtgcctaaa gcaaggaacc ccaccgtgac gtacgggaaa 840
aaccaagtca tcatgctact gtatcctgac cacccaacac tcctgtccta ccggaatatg 900
ggagaagaac caaactatca agaagagtgg gtgatgcata agaaggaagt cgtgctaacc 960
gtgccgactg aagggctcga ggtcacgtgg ggcaacaacg agccgtataa gtattggccg 1020
cagttatcta caaacggtac agcccatggc cacccgcatg agataattct gtattattat 1080
gagctgtacc ctactatgac tgtagtagtt gtgtcagtgg ccacgttcat actcctgtcg 1140
atggtgggta tggcagtggg gatgtgcatg gaactgacac caggagctac cgtccctttc gctaaagcg
<210> 269
<211> 1269
<212> ДНК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 269
agcaccaagg acaacttcaa tgtctataaa gactgtggag aagggcactc gtgccatagt gcgacagacg ggacgctgaa aatccaggtc agccatgatt ggaccaagct gcgttacatg gccgggctat ttgtaagaac atcagcacca atcctggccc gatgtccgaa aggagaaact attagtcact catgtacgca cccatttcac ttccattccc gaccgcagca cggtaaagag gccgcaactg ccgaggagat agaggtacac ctgtcacaac agtccggcaa cgtaaagatc tgtaattgcg gtggctcaaa tgaaggacta aaggttgatc aatgtcatgc cgcggtcacc ctggtcccgc gtaacgctga actcggggac ctggcaaatg taacatgcat ggtgcctaaa aaccaagtca tcatgctact gtatcctgac ggagaagaac caaactatca agaagagtgg gtgccgactg aagggctcga ggttacgtgg cagttatctg caaacggtac agcccacggc gagctgtacc ctactatgac tgtagtagtt atggtgggta tggcagtggg gatgtgcatg gaactgacac caggagctac cgtccctttc gctaaagcg
<210> 270
<211> 1269
<212> ДНК
<213> Вирус чикунгунья
tgtgcacgac gcagatgcat cacaccgtat 1200 ctgcttagcc taatatgctg catcagaaca 1260
1269
gccacaagac catacctagc tcactgtccc 60
cccgtagcac tagaacgcat cagaaatgaa 120
tccttgcaaa ttggaatagg gacggatgat 180
gacaatcaca taccagcaga cgcagggagg 240
tgcacgatta ctggaacaat gggacacttc 300
ctgacggtgg gattcactga cagtaggaag 360
cacgaccctc ctgtgatagg ccgggaaaaa 420
ctaccttgca gcacgtacgt gcagagcaac 480
atgcccccag acacccctga tcgcacattg 540
acagtcaata gtcagacggt gcggtataag 600
ataactacag ataaagtgat taataactgc 660
aatcacaaaa agtggcagta taactcccct 720
cgaaaaggaa aaattcacat cccgtttccg 780
gcaaggaacc ccaccgtgac gtacgggaaa 840
cacccaacac tcctgtccta ccggagtatg 900
gtgacgcaca agaaggaggt cgtgctaacc 960
ggcaacaacg agccgtataa gtattggccg 1020
cacccgcatg agataatctt gtactattat 1080
gtgtcagtgg cctcgttcat actcctgtcg 1140
tgtgcacgac gcagatgcat cacaccatac 1200
ctgcttagcc taatatgctg catcagaaca 1260
<400> 270
agtattaagg accacttcaa tgtctataaa gccacaagac cgtacctagc tcactgtccc 60
gactgtggag aagggcactc gtgccatagt cccgtagcgc tagaacgcat cagaaacgaa 120
gcgacagacg ggacgttgaa aatccaggtt tccttgcaaa tcggaataaa gacggatgat 180
agccatgatt ggaccaagct gcgttatatg gacaatcaca tgccagcaga cgcagagcgg 240
gccgggctat ttgtaagaac gtcagcaccg tgcacgatta ctggaacaat gggacacttc 300
attctggccc gatgtccgaa aggagaaact ctgacggcgg ggttcactga cggtaggaag 3 60
atcagtcact catgtacgca cccatttcac catgaccctc ctgtgatagg ccgggaaaaa 420
ttccattccc gaccgcagca cggtagggaa ctaccttgca gcacgtacgc gcagagcacc 480
gctgcaactg ccgaggagat agaggtacac atgcccccag acaccccaga tcgcacatta 540
atgtcacaac agtccggcaa tgtaaagatc acagtcaata gtcagacggt gcggtacaag 600
tgcaattgtg gtgactcaag tgaaggatta accactacag ataaagtgat taataactgc 660
aaggtcgatc aatgccatgc cgcggtcacc aatcacaaaa aatggcagta taattcccct 720
ctggtcccgc gtaatgctga attcggggac cggaaaggaa aagttcacat tccatttcct 780
ctggcaaatg tgacatgcag ggtgcctaaa gcaagaaacc ccaccgtgac gtacggaaaa 840
aaccaagtca tcatgttgct gtatcctgac cacccaacgc tcctgtccta caggaatatg 900
ggagaagaac caaactatca agaagagtgg gtgacgcata agaaggagat caggttaacc 9 60
gtgccgactg aggggctcga ggtcacgtgg ggtaacaatg agccgtacaa gtattggccg 1020
cagttatcca caaacggtac agcccacggc cacccgcatg agataattct gtattattat 1080
gagctgtacc caactatgac tgcggtagtt ttgtcagtgg cctcgttcat actcctgtcg 1140
atggtgggtg tggcagtggg gatgtgcatg tgtgcacgac gcagatgcat tacaccgtac 1200
gaactgacac caggagctac cgtccctttc ctgcttagcc taatatgctg cattagaaca 1260
gctaaagcg 1269
<210> 271 <211> 423 <212> БЕЛОК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 271
Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala Thr Arg Pro Tyr Leu
1 5 10 15
Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser Cys His Ser Pro Ile
20 25 30
Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp Asp Ser His Asp Trp
50 55 60
Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Ser His Thr Pro Ala Asp Ala Glu Arg
65 70 75 80
Ala Gly Leu Leu Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr Gly Thr
85 90 95
Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr
100 105 110
Val Gly Phe Thr Asp Ser Arg Lys Ile Ser His Thr Cys Thr His Pro
115 120 125
Phe His His Glu Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu Arg Phe His Ser Arg
130 135 140
Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr Tyr Val Gln Ser Thr
145 150 155 160
Ala Ala Thr Ala Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp Thr Pro
165 170 175
Asp Arg Thr Leu Met Thr Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile Thr Val
180 185 190
Asn Gly Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Gly Ser Asn Glu
195 200 205
Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Ile Asp Gln
210 215 220
Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp Gln Tyr Asn Ser Pro
225 230 235 240
Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg Lys Gly Lys Ile His
245 250 255
Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg Val Pro Lys Ala Arg
260 265 270
Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Thr Met Leu Leu Tyr
275 280 285
Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Gln Glu Pro
290 295 300
Asn Tyr His Glu Glu Trp Val Thr His Lys Lys Glu Val Thr Leu Thr
305 310 315 320
Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr
325 330 335
Lys Tyr Trp Pro Gln Met Ser Thr Asn Gly Thr Ala His Gly His Pro
340 345 350
His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr Pro Thr Met Thr Val
355 360 365
Ile Ile Val Ser Val Ala Ser Phe Val Leu Leu Ser Met Val Gly Thr
370 375 380
Ala Val Gly Met Cys Val Cys Ala Arg Arg Arg Cys Ile Thr Pro Tyr
385 390 395 400
Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu Leu Ser Leu Leu Cys
405 410 415
Cys Val Arg Thr Thr Lys Ala 420
<210> 272
<211> 423
<212> БЕЛОК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 272
Ser Ile Lys Asp His Phe Asn Val Tyr Lys Ala Thr Arg Pro Tyr Leu
1 5 10 15
Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser Cys His Ser Pro Val
20 25 30
Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp Asp Ser His Asp Trp
50 55 60
Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Met Pro Ala Asp Ala Glu Arg
65 70 75 80
Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr Gly Thr
85 90 95
Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr
100 105 110
Ala Gly Phe Thr Asp Gly Arg Lys Ile Ser His Ser Cys Thr His Pro
115 120 125
Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu Lys Phe His Ser Arg
130 135 140
Pro Gln His Gly Arg Glu Leu Pro Cys Ser Thr Tyr Ala Gln Ser Thr
145 150 155 160
Ala Ala Thr Ala Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp Thr Pro
165 170 175
Asp Arg Thr Leu Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile Thr Val
180 185 190
Asn Ser Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Asp Ser Ser Glu
195 200 205
Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Val Asp Gln
210 215 220
Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp Gln Tyr Asn Ser Pro
225 230 235 240
Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Phe Gly Asp Arg Lys Gly Lys Val His
245 250 255
Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg Val Pro Lys Ala Arg
260 265 270
Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Ile Met Leu Leu Tyr
275 280 285
Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Glu Glu Pro
290 295 300
Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Thr His Lys Lys Glu Ile Arg Leu Thr
305 310 315 320
Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr
325 330 335
Lys Tyr Trp Pro Gln Leu Ser Thr Asn Gly Thr Ala His Gly His Pro
340 345 350
His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr Pro Thr Met Thr Ala
355 360 365
Val Val Leu Ser Val Ala Ser Phe Ile Leu Leu Ser Met Val Gly Val
370 375 380
Ala Val Gly Met Cys Met Cys Ala Arg Arg Arg Cys Ile Thr Pro Tyr
385 390 395 400
Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ile Cys
405 410 415
Cys Ile Arg Thr Ala Lys Ala 420
<210> 273
<211> 423
<212> БЕЛОК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 273
Ser Ile Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala Ile Arg Pro Tyr Leu
1 5 10 15
Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser Cys His Ser Pro Val
20 25 30
Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp Asp Ser His Asp Trp
50 55 60
Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Met Pro Ala Asp Ala Glu Arg
65 70 75 80
Ala Arg Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr Gly Thr
85 90 95
Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr
100 105 110
Val Gly Phe Thr Asp Gly Arg Lys Ile Ser His Ser Cys Thr His Pro
115 120 125
Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu Lys Phe His Ser Arg
130 135 140
Pro Gln His Gly Arg Glu Leu Pro Cys Ser Thr Tyr Ala Gln Ser Thr
145
150
155
160
Ala Ala Thr Ala Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp Thr Pro
165 170 175
Asp Arg Thr Leu Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile Thr Val
180 185 190
Asn Ser Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Asp Ser Asn Glu
195 200 205
Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Val Asp Gln
210 215 220
Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp Gln Tyr Asn Ser Pro
225 230 235 240
Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg Lys Gly Lys Val His
245 250 255
Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg Val Pro Lys Ala Arg
260 265 270
Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Ile Met Leu Leu Tyr
275 280 285
Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Glu Glu Pro
290 295 300
Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Thr His Lys Lys Glu Ile Arg Leu Thr
305 310 315 320
Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr
325 330 335
Lys Tyr Trp Pro Gln Leu Ser Thr Asn Gly Thr Ala His Gly His Pro
340 345 350
His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr Pro Thr Met Thr Val
355 360 365
Val Val Val Ser Val Ala Ser Phe Val Leu Leu Ser Met Val Gly Val
370 375 380
Ala Val Gly Met Cys Met Cys Ala Arg Arg Arg Cys Ile Thr Pro Tyr
385 390 395 400
Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ile Cys
405 410 415
Cys Ile Arg Thr Ala Lys Ala 420
<210> 274
<211> 423
<212> БЕЛОК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 274
Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala Thr Arg Pro Tyr Leu
1 5 10 15
Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser Cys His Ser Pro Val
20 25 30
Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Gly Thr Asp Asp Ser His Asp Trp
50 55 60
Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Ile Pro Ala Asp Ala Gly Arg
65 70 75 80
Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr Gly Thr
85 90 95
Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr
100 105 110
Val Gly Phe Thr Asp Ser Arg Lys Ile Ser His Ser Cys Thr His Pro
115 120 125
Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu Lys Phe His Ser Arg
130 135 140
Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr Tyr Val Gln Ser Asn
145 150 155 160
Ala Ala Thr Ala Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp Thr Pro
165 170 175
Asp Arg Thr Leu Leu Ser Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile Thr Val
180 185 190
Asn Ser Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Gly Ser Asn Glu
195 200 205
Gly Leu Ile Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Val Asp Gln
210 215 220
Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp Gln Tyr Asn Ser Pro
225 230 235 240
Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg Lys Gly Lys Ile His
245 250 255
Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Met Val Pro Lys Ala Arg
260 265 270
Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Ile Met Leu Leu Tyr
275 280 285
Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Ser Met Gly Glu Glu Pro
290 295 300
Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Thr His Lys Lys Glu Val Val Leu Thr
305 310 315 320
Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr
325 330 335
Lys Tyr Trp Pro Gln Leu Ser Ala Asn Gly Thr Ala His Gly His Pro
340 345 350
His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr Pro Thr Met Thr Val
355 360 365
Val Val Val Ser Val Ala Ser Phe Ile Leu Leu Ser Met Val Gly Met
370 375 380
Ala Val Gly Met Cys Met Cys Ala Arg Arg Arg Cys Ile Thr Pro Tyr
385 390 395 400
Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ile Cys
405 410 415
Cys Ile Arg Thr Ala Lys Ala 420
<210> 275
<211> 423
<212> БЕЛОК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 275
Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala Thr Arg Pro Tyr Leu
1 5 10 15
Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser Cys His Ser Pro Val
20 25 30
Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp Asp Ser His Asp Trp
50 55 60
Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Met Pro Ala Asp Ala Glu Arg
65 70 75 80
Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr Gly Thr
85 90 95
Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr
100 105 110
Val Gly Phe Thr Asp Ser Arg Lys Ile Ser His Ser Cys Thr His Pro
115 120 125
Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu Lys Phe His Ser Arg
130 135 140
Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr Tyr Val Gln Ser Thr
145 150 155 160
Ala Ala Thr Thr Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp Thr Pro
165 170 175
Asp Arg Thr Leu Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile Thr Val
180 185 190
Asn Gly Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Gly Ser Asn Glu
195 200 205
Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Val Asp Gln
210 215 220
Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp Gln Tyr Asn Ser Pro
225 230 235 240
Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg Lys Gly Lys Ile His
245 250 255
Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg Val Pro Lys Ala Arg
260 265 270
Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Ile Met Leu Leu Tyr
275 280 285
Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Glu Glu Pro
290 295 300
Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Met His Lys Lys Glu Val Val Leu Thr
305 310 315 320
Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr
325 330 335
Lys Tyr Trp Pro Gln Leu Ser Thr Asn Gly Thr Ala His Gly His Pro
340 345 350
His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr Pro Thr Met Thr Val
355 360 365
Val Val Val Ser Val Ala Thr Phe Ile Leu Leu Ser Met Val Gly Met
370 375 380
Ala Val Gly Met Cys Met Cys Ala Arg Arg Arg Cys Ile Thr Pro Tyr
385 390 395 400
Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ile Cys
405 410 415
Cys Ile Arg Thr Ala Lys Ala 420
<210> 276
<211> 423
<212> БЕЛОК
<213> Вирус чикунгунья
<400> 276
Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala Thr Arg Pro Tyr Leu
1 5 10 15
Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser Cys His Ser Pro Val
20 25 30
Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu Lys Ile
35 40 45
Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp Asp Ser His Asp Trp
50 55 60
Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Met Pro Ala Asp Ala Glu Arg
65 70 75 80
Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr Gly Thr
85 90 95
Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr
100 105 110
Val Gly Phe Thr Asp Ser Arg Lys Ile Ser His Ser Cys Thr His Pro
115 120 125
Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu Lys Phe His Ser Arg
130 135 140
Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr Tyr Val Gln Ser Thr
145 150 155 160
Ala Ala Thr Thr Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp Thr Pro
165 170 175
Asp Arg Thr Leu Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile Thr Val
180 185 190
Asn Gly Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Gly Ser Asn Glu
195 200 205
Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Val Asp Gln
210 215 220
Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp Gln Tyr Asn Ser Pro
225 230 235 240
Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg Lys Gly Lys Ile His
245 250 255
Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg Val Pro Lys Ala Arg
260 265 270
Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Ile Met Leu Leu Tyr
275 280 285
Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Glu Glu Pro
290 295 300
Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Met His Lys Lys Glu Val Val Leu Thr
305 310 315 320
Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr
325 330 335
Lys Tyr Trp Pro Gln Leu Ser Thr Asn Gly Thr Ala His Gly His Pro
340 345 350
His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr Pro Thr Met Thr Val
355 360 365
Val Val Val Ser Val Ala Thr Phe Ile Leu Leu Ser Met Val Gly Met
370 375 380
Ala Ala Gly Met Cys Met Cys Ala Arg Arg Arg Cys Ile Thr Pro Tyr
385 390 395 400
Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ile Cys
405 410 415
Cys Ile Arg Thr Ala Lys Ala 420
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ обнаружения инфекции вирусом чикунгунья у
субъекта, включающий:
(a) приведение в контакт образца от указанного субъекта с антителом или фрагментом антитела, имеющим парные последовательности CDR тяжелой и легкой цепи клонов из таблиц 3 и 4, соответственно; и
(b) обнаружение гликопротеина Е2 вируса чикунгунья в указанном образце посредством связывания указанного антитела или фрагмента антитела с Е2 в указанном образце.
2. Способ по п.1, где указанный образец представляет собой жидкость организма.
3. Способ по п.п.1-2, где указанный образец представляет собой кровь, мокроту, слезную жидкость, слюну, слизь или сыворотку, мочу или кал.
4. Способ по п.п.1-3, где обнаружение включает ELISA, RIA или вестерн-блоттинг.
5. Способ по п.п.1-4, дополнительно включающий проведение стадий (а) и (Ь) второй раз и определение изменения уровней Е2 по сравнению с первым анализом.
6. Способ по п.п.1-5, где антитело или фрагмент антитела кодируется парными вариабельными последовательностями клонов, как указано в таблице 1.
7. Способ по п.п.1-5, где указанное антитело или фрагмент антитела кодируется вариабельными последовательностями легкой и тяжелой цепей, обладающими 7 0%, 8 0% или 90% идентичностью с парными вариабельными последовательностями клонов, как указано в таблице 1.
8. Способ по п.п.1-5, где указанное антитело или фрагмент антитела кодируется вариабельными последовательностями легкой и тяжелой цепей, обладающими 95% идентичностью с парными последовательностями клонов, как указано в таблице 1.
9. Способ по п.п.1-5, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельные последовательности легкой и тяжелой цепей в соответствии с парными последовательностями клонов из таблицы 2.
2.
10. Способ по п.п.1-5, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельные последовательности легкой и тяжелой цепей, обладающие 7 0%, 8 0% или 90% идентичностью с парными последовательностями клонов из таблицы 2.
11. Способ по п.п.1-5, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельные последовательности легкой и тяжелой цепей, обладающие 95% идентичностью с парными последовательностями клонов из таблицы 2.
12. Способ по п.п.1-11, где фрагмент антитела представляет собой рекомбинантное антитело ScFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент), Fab-фрагмент, F(ab') 2~Фрагмент или Fv-фрагмент.
13. Способ лечения субъекта, инфицированного вирусом
чикунгунья или уменьшения вероятности инфицирования субъекта,
имеющего риск контакта с вирусом чикунгунья, включающий доставку
указанному индивидууму антитела или фрагмента антитела, имеющего
парные последовательности CDR тяжелой и легкой цепей клонов,
указанные в таблице 3 и 4, соответственно.
14. Способ по п.13, где антитело или фрагмент антитела кодируется парными последовательностями вариабельных областей легкой и тяжелой цепей клонов, указанными в таблице 1.
15. Способ по п.13-14, где антитело или фрагмент антитела кодируется парными последовательностями вариабельных областей легкой и тяжелой цепи клонов, обладающими 95% идентичностью с последовательностями, как указано в таблице 1.
16. Способ по п.13-14, где указанное антитело или фрагмент антитела кодируются вариабельными последовательностями легкой и тяжелой цепей, обладающими 7 0%, 8 0% или 90% идентичностью с парными последовательностями клонов из таблицы 1.
17. Способ по п.13, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей в соответствии с парными последовательностями клонов из таблицы 2.
18. Способ по п.13, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, обладающие 7 0%, 8 0% или 90%
14.
идентичностью с парными последовательностями клонов из таблицы 2 .
19. Способ по п.13, кодируемый последовательностями
вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, обладающими 95%
идентичностью с парными последовательностями клонов из таблицы
2 .
20. Способ по п.п.13-19, где фрагмент антитела представляет
собой рекомбинантное антитело ScFv (одноцепочечный вариабельный
фрагмент), Fab-фрагмент, F(ab') 2~Фрагмент или Fv-фрагмент.
21. Способ по п.п.13-20, где указанное антитело представляет собой IgG.
22. Способ по п.п.13-19, где указанное антитело представляет собой химерное антитело.
23. Способ по п.13-22, где указанное антитело или фрагмент антитела вводят до инфицирования.
24. Способ по п.13-22, где указанное антитело или фрагмент антитела вводят после инфицирования.
25. Способ по п.13-24, где доставка включает введение антитела или фрагмента антитела, или генетическую доставку последовательности РНК или ДНК, или вектора, кодирующих антитело или фрагмент антитела.
26. Моноклональное антитело, где антитело или фрагмент антитела характеризуются парными последовательностями CDR тяжелой и легкой цепей клонов из таблиц 3 и 4, соответственно.
27. Моноклональное антитело по п.2 6, где указанное антитело или фрагмент антитела кодируется последовательностями вариабельных областей легкой и тяжелой цепей в соответствии с парными последовательностями клонов из таблицы 1.
28. Моноклональное антитело по п.26, где указанное антитело
или фрагмент антитела кодируется вариабельными
последовательностями легкой и тяжелой цепей, обладающими по
меньшей мере 7 0%, 8 0% или 90% идентичностью с парными
последовательностями клонов из таблицы 1.
29. Моноклональное антитело по п.26, где указанное антитело
или фрагмент антитела кодируется вариабельными
23.
последовательностями легкой и тяжелой цепей, обладающими по меньшей мере 95% идентичностью с парными последовательностями клонов из таблицы 1.
30. Моноклональное антитело по п.2 6, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей в соответствии с парными последовательностями клонов из таблицы 2.
31. Моноклональное антитело по п.2 6, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, обладающие 95% идентичностью с парными последовательностями клонов из таблицы 2.
32. Моноклональное антитело по п.п.2 6-31, где фрагмент антитела представляет собой рекомбинантное антитело ScFv (одноцепочечный вариабельный), Fab-фрагмент, F(ab') 2~Фрагмент или Fv-фрагмент.
33. Моноклональное антитело по п.п.2 6-31, где указанное антитело представляет собой химерное антитело или биспецифическое антитело, которое нацелено на антиген вируса чикунгунья, отличный от гликопротеина.
34. Моноклональное антитело по п.26-33, где указанное антитело представляет собой IgG.
35. Моноклональное антитело по п.2 6-34, где указанное антитело или фрагмент антитела дополнительно содержит проникающий в клетку пептид и/или представляет собой интраантитело.
36. Гибридома или сконструированная клетка, кодирующая антитело или фрагмент антитела, где антитело или фрагмент антитела характеризуется парными последовательностями CDR тяжелой и легкой цепей клонов из таблиц 3 и 4, соответственно.
37. Гибридома или сконструированная клетка по п.36, где указанное антитело или фрагмент антитела кодируются вариабельными последовательностями легкой и тяжелой цепей в соответствии с парными последовательностями клонов из таблицы 1.
38. Гибридома или сконструированная клетка по п.3 6, где указанное антитело или фрагмент антитела кодируется
30.
вариабельными последовательностями легкой и тяжелой цепей, обладающими по меньшей мере 7 0%, 8 0% или 90% идентичностью с парными последовательностями вариабельных областей клонов из таблицы 1.
39. Гибридома или сконструированная клетка по п.3 6, где указанное антитело или фрагмент антитела кодируется вариабельными последовательностями легкой и тяжелой цепей, обладающими 95% идентичностью с парными последовательностями вариабельных областей клонов из таблицы 1.
40. Гибридома или сконструированная клетка по п.3 6, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей в соответствии с парными последовательностями клонов из таблицы 2 .
41. Гибридома или сконструированная клетка по п.3 6, где указанное антитело или фрагмент антитела кодируется вариабельными последовательностями легкой и тяжелой цепей, обладающими по меньшей мере 7 0%, 8 0% или 90% идентичностью с парными последовательностями вариабельной области клонов из таблицы 2.
42. Гибридома или сконструированная клетка по п.36, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, обладающие 95% идентичностью с парными последовательностями клонов из таблицы 2.
43. Гибридома или сконструированная клетка по п.п.36-42, где фрагмент антитела представляет собой рекомбинантное антитело ScFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент), Fab-фрагмент, F (ab') 2~Фрагмент или Fv-фрагмент.
44. Гибридома или сконструированная клетка по п.36-43, где указанное антитело представляет собой химерное антитело.
45. Гибридома или сконструированная клетка по п.36-43, где указанное антитело представляет собой IgG.
46. Гибридома или сконструированная клетка по п.36-45, где указанное антитело или фрагмент антитела дополнительно содержит
39.
проникающий в клетку интраантитело.
По доверенности
пептид и/или представляет собой
о (c)
? о ? о (c)? о о (r)о
ООО OQOO
ООО
70 80
100
S2J
SL15649 LR2006 0PY1 99659 ~ RSU1 1ЬН35
STKDNFNVYKATRPY
LAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEATDGTLKIQVSLQIGIGTDDSHDWTKLRYMDNHIPADAGRAGLFVRTSAPCTITGTMGHF
-I-H-
¦I-
-S-T-
110
ое о(c)
? (c)
120
130
140
150
? о
(c) О(c) ОО
160 170
(c) о (c)
180
? ? ?? о о (c)О
§(c)(c)§ (c) О^В
190 200
S2J
SU5649 LR2006 0PY1 99659 ~ RSU1 1ЬН35
-мт-
S2J
SU5649 LR2006 0PY1 99659 ~ RSU1 IhHM
?? ? оо о оо (c) (c)
? ? ?
-N--N--N--N-
-R--R--R--R--R-
(c) (c) о о (c) оо
210 220 230
240 250 260 270
280 290 300
домен о
^S^B Домен С ЩШШШШ
CNCGGSNEGLITTDKVINNCKVDQCHAAVTNHKKWQYNSPLVPRNAELGDRKGKIHIPFPLANVTCMVPKA
RNPTVTYGKNQVIMLLYPDHPTLLSYRSM
-V--V-
т-
т-
-D-S-Т-
-D Т-
Т-
310
320
330
340
350
360
370
380
390
S2J
SL15649 LR2006 0PY1 99659 ~ RSU1 1ЬН35
S2J
SU5649 LR2006 OPY1 99659 ~ RSU1 1ЬН35
Домен С Ш^^^^^Ш!
Домен Ш
GEEPNYQEEWVTHKKEWLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYWPQLSANGTAHGHPHEIILYYYELYPTMTWWSVASFILLSMVGMAVGMCMCARRRCITPY
1 т
т а
IR
__т
1 А
V
-V--V-
-V--Т-
-Т-
-м-т-
-IR---Т-
-V-
-A--L--II-
ELTPGATVPFLLSLICCIRTAKA
-L-V-Т-
120
Положения, в i
о1Н12
которых заме
°1L1
на на аланин t
(r)1М9
шрушаетсвяз!
(r)105
жние указан
о 106
ноготАЬ
°2Н1
оЗА2
(r)3?23
оЗН23
(c)4G20
о4Л4
о4Ш2
(r)5F19
(r)5М16
°5Л/23
(r)SЈ22
о 8G18
о 814
о ют
ФИГ. 1А (Продолжение)
ФИГ. -IB
ФИГ. 1С
-3 -2 -1 0 Ьод10мкг/т
Ьод10мкг/мл
5M16
2-10 1 Ьд10мкг/ш
-3 -2 -1 0 Ьд10мкг/мл
ФИГ. 2A
(Продолжение)
• i • t
-2-10 1
Ьд10мкг/мл
(Продолжение)
Добавление MAb в момент -24 часа (50 мкг)
Добавление MAb в момент +24 часа (50 мкг)
Добавление MAb в момент +48 часов (250мкг)
Добавление MAb в момент +60 часов (всего 500мкг)
700-1
80-
60-
оса
40-
20-
0 3 6 9 12151821
Сутки после инокуляции
-^4В8 ^5М16 ^4J21 + 2D12 ^9D14 + ЗЕ23 - WNV-E16
ФИГ. ЗА
S3 SK
/оо-
80 6040200
0 3 6 9 12151821
Сутки после инокуляции
^4В8 ^5М16 ^4J21 + 4N12 -¦- WNV-E16
ФИГ. зв
/OO-i
80-
60-
¦за
40-
20-
t I 1 I 1 1
0 3 6 9 12151821
Сутки после инокуляции
-^4B8
-*г5М16 ^4J21 + 4N12 -¦- WNV-E16
ФИГ. зс
11 •
1 п
1 1
ш ш
-1-1-1
0 3 6 9 12151821
Сутки после инокуляции
- 4J21 + 5М16 ¦*- 4J21 + 4N12
- 4J21 + 2Н1 ^4J21
ФИГ. 3D
ФИГ. 4
Конкурирующее антитело
СШ4
СШ41
5014
5Ш6
106
468
1W12
5F10
СГО8
8Л2
5F19
111
108
108
108
102
100
101
5Ш6
¦10
106
¦20
¦12
110
105
118
105
116
114
112
103
//////
¦10
101
100
100
101
101
108
103
Домен(ы), идентифицированный посредством исследований с мутатенезом
М, Дуга
ФИГ.
250-1
SS 200-
g 150-I
i 100-
¦ Критические концентрации
ФИГ. 6А контроли
§ 740-| 720^ ^.700-
80 60 40 A
S 204
0 50 100 150 200 250
Реактивность контрольного mAb ФИГ. 6B
Реактивность MAb
Ш 4G20
? 4ВЗ В ЗВ4
В 10N24
? sPAb
Q о: > -
Остаток жопа 4G20
ФИГ. 6С
шшшш
ДоменА
Тример-щ сверху
ФИГ. 6F
45°
45°
Lo§wm/m
-До --о-- После
87-
D+3-введение МаЬнзМ (50 мкг/мышь) @ 1Н12
о ** ** ? 2Н1
^ 6 *5
¦ АА ЎЎ Л A 4N12
п • **** . • ¦ 4Л4
f^yi А тт V ° Ад тТ ****т • Отрицательное
qp ^ ^ w о . А Т КОНТрОЛЬНОе со
J" ЗШШ со
т 1 1 1 1 1 1 1 1 1 г
на той же стороне на противоположной стороне
Критерий Крускала-Уоллисадля каждой ткани по сравнению с D1.3
ФИГ. 9
2\ 1
А А А А
лодыжка на противоположной стороне
лодыжка на той же стороне Контрольное антитело Продуцируемое клетками СНО рекомбинантное антитело 4N12
ФИГ. 10
РНК на D28
ста
4i 3 2\ 1 0 -1
О AA
о л
о ^ ^
C\| C\|
¦о
I I I I I I I I
00^1-C\|C\|C\|Oo^l-C\|
3: ^
^- 'si-
лодыжка на той же стороне лодыжка на противоположной стороне D1.3 представляет собой отрицательное контрольное антитело
ФИГ. 11
+60ЖОВ,№ШИ\НШ-/-
500 мкг/мышь
-(c)-
-ЕЗ- -А-
1Н12п=15
2Н1 п=11
3N23n=13
ЗЕ23п=11
4N12n=13
4J21 п=11
5014п=11
4J14n=11
D1.3n=16
hE16n=6
отрицательное контрольное антитело отрицательное контрольное антитело
О 5 10 15 20
Количество суток после инфицирования
ФИГ. 12
0 2 4
Log/ц [MAb] нг/мл
¦ тоновое * 1H12 старое
1.5
1.0
I °-5
^ O.Q]
0 2 4
Log JMAb] нг/мл
¦ 2H1 новое
* 2H1 старое
0 2 4
Log JMAb] нг/мл
¦ 4Л4 новое
* 4Л4 старое 0 2 4
Log JMAb] нг/мл
• 4J21'новое
* 4 J21 старое
ФИГ. 13
0 2 4
Log JMAb]нг/мл • 3E23 новое
*ЗЕ23СЩХЮ
150 125 100 75 50 25 О
3N23
¦¦¦¦¦¦
0 2 4
Log JMAb] нг/мл
• з N23 новое
*з N23 трое
4N12
5014
0 2 4
Log JMAb] нг/мл
¦ 5014 новое А 5014 трое
- i
-2 -1 0123468%
Log JMAb] нг/мл
*4N12 новое *4Ni2mpoe
ФИГ. 13
(Продолжение)
Клон
Продуцированное гиоридомой mAb ("старое")
Продуцируемое рекомбинантными клетками СНО mAb ("новое")
1H12
4.2
2.7
2H1
3.8
(3E)23
13.8
3N23
2.1
4.5
4J14
8.6
5.7
4J21
11.4
4.8
4N12
4.8
5M16
5.9
1,094
5(0)14
14.3
34.8
ФИГ. 14
Выравнивание Е1/Е2 вируса шнп/нья ИенотипыЕС$А: LR2006
S27
SL15649
Азиатские тенотипы: 181125
99659
шотш: /ьнз5
Выровненные последовательности показаны как Белок_штамм_номер доступа Genbank
ФИГ. 15
clustal 0(1.2.1) множественное выравнивание последовательностей
E1_S27_NC004162 .2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624 .1 El IbH35 HM045786.1
TACGAACACGTAACAGTGATCCCGAACACGGT TACGAACACGTAACAGTGATCCCGAACACGGT TACGAACACGTAACAGTGATCCCGAACACGGT TACGAACACGTAACAGTGATCCCGAACACGGT TACGAACACGTAACAGTGATCCCGAACACGGT TACGAACACGTAACAGTGATCCCGAACACGGT
GGGAGTACCGTATAAGACTCTAGTCAAC GGGAGTACCGTATAAGACTCTAGTCAAT GGGAGTACCGTATAAGACTCTAGTCAAT GGGAGTACCGTATAAGACTCTAGTCAAC GGGAGTACCGTATAAGACTCTAGTCAAC GGGAGTACCGTATAAGACTCTTGTCAAC
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624.1 El IbH35 HM045786.1
AGACCGGGCTACAGCCCCATGGTACTGGAGAT AGACCTGGCTACAGCCCCATGGTATTGGAGAT AGACCTGGCTACAGCCCCATGGTATTGGAGAT AGACCGGGCTACAGCCCCATGGTACTGGAGAT AGACCGGGCTACAGCCCCATGGTATTGGAGAT AGACCGGGTTACAGCCCCATGGTATTGGAGAT
GGAGCTACTGTCAGTCACTTTGGAGCCA GGAACTACTGTCAGTCACTTTGGAGCCA GGAACTACTGTCAGTCACTTTGGAGCCA GGAGCTTCTGTCAGTCACTTTGGAGCCA GGAGCTTCTGTCTGTCACCTTGGAACCA GGAGCTACAATCGGTCACCTTGGAACCA
CD GO
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624.1 El IbH35 HM045786.1
ACGCTATCGCT ACACTATCGCT ACACTATCGCT ACGCTATCGCT ACGCTATCGCT ACACTGTCACT
TGATTACATCACGTGCGAATACAAAACCGTCATCCCGTCTCCGTACGTG TGATTACATCACGTGCGAGTACAAAACCGTCATCCCGTCTCCGTACGTG TGATTACATCACGTGCGAGTACAAAACCGTCATCCCGTCTCCGTACGTG TGATTACATCACGTGCGAGTATAAAACCGTCATCCCGTCTCCGTACGTG TGATTACATCACGTGCGAGTATAAAACCGTTATCCCGTCTCCGTACGTG TGACTACATCACGTGCGAGTACAAAACTGTCATCCCGTCCCCGTACGTG
E1_S27_NC004162 .2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624 .1 El IbH35 HM045786.1
AAATGCTGCGGTACAGCAGAGT AAGTGCTGCGGTACAGCAGAGT AAGTGCTGCGGTACAGCAGAGT AAATGCTGCGGTACAGCAGAGT AAATGCTGCGGTACAGCAGAGT AAGTGCTGTGGTACAGCAGAGT
GCAAGGACAAAAACCTACCTGACTACAGCTGTAAGGTC GCAAGGACAAAAACCTACCTGACTACAGCTGTAAGGTC GCAAGGACAAAAACCTACCTGACTACAGCTGTAAGGTC GCAAGGACAAGAGCCTACCTGATTACAGCTGTAAGGTC GTAAGGACAAGAGCCTACCTGATTACAGCTGTAAGGTC GCAAGGACAAGAGCCTACCAGACTACAGCTGCAAGGTC
ФИГ. 15 (Продолжение)
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT4 4 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624.1 El IbH35 HM045786.1
TTCACCGGCGTCTACCCAT TTCACCGGCGTCTACCCAT TTCACCGGCGTCTACCCAT TTCACCGGCGTCTACCCAT TTCACCGGCGTCTACCCAT TTTACTGGAGTCTACCCAT
TTATGTGGGGCGGCGCCTACTGCT TTATGTGGGGCGGCGCCTACTGCT TTATGTGGGGCGGCGCCTACTGCT TCATGTGGGGCGGCGCCTACTGCT TCATGTGGGGCGGCGCCTACTGCT TTATGTGGGGCGGCGCCTACTGCT
TCTGCGACGCTGAAAAC TCTGCGACGCTGAAAAC TCTGCGACGCTGAAAAC TCTGCGACACTGAAAAT TСTGCGACACСGAAAAT TTTGCGACGCCGAAAAT
* * * * * * *********** *********************** ******
*****
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT4 4 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624.1 El IbH35 HM045786.1
E1_S27_NC004162 .2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT4 4 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624 .1 El IbH35 HM045786.1
ACGCAATTGAGCGAAGCACATGTGGAGAAGTCCGAATCATGCAAAACAGAATTTGCATCA ACGCAGTTGAGCGAAGCACATGTGGAGAAGTCCGAATCATGCAAAACAGAATTTGCATCA ACGCAGTTGAGCGAAGCACACGTGGAGAAGTCCGAATCATGCAAAACAGAATTTGCATCA ACGCAATTGAGCGAAGCACATGTGGAGAAGTCCGAATCATGCAAAACAGAATTTGCATCA ACGCAATTGAGCGAAGCACATGTGGAGAAGTCCGAATCATGCAAAACAGAATTTGCATCA ACGCAATTGAGCGAGGCACATGTAGAGAAATCTGAATCTTGCAAAACAGAGTTTGCATCG
***** ******** ***** ** ***** ** ***************** ********
GCATACAGGGCTCATACCGCATCCGCATCAGCTAAGCTCCGCGTCCTTTACCAAGGAAAT GCATACAGGGCTCATACCGCATCTGCATCAGCTAAGCTCCGCGTCCTTTACCAAGGAAAT GCATACAGGGCTCATACCGCATCTGCATCAGCTAAGCTCCGCGTCCTTTACCAAGGAAAT GCATATAGGGCTCATACCGCATCCGCATCAGCTAAGCTCCGCGTCCTTTACCAAGGAAAT GCATACAGGGCTCATACCGCATCCGCATCAGCTAAGCTCCGCGTCCTTTACCAAGGAAAT GCCTACAGAGCCCACACCGCATCCGCGTCGGCGAAGCTCCGCGTCCTTTACCAAGGAAAC
** ** ** ** ** ******** ** ** ** **************************
Ю О
El S27 NC004162.2
AACATCACTGTAACTGCCTATGCAAACGGCGACCATGCCGTCACAGTTAAGGACGCCAAA
ФИГ. 15 (Продолжение)
E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624 .1 El IbH35 HM045786.1
AACATCACTGTAACTGCCTATGCAAACGGCGACCATGCCGTCACAGTTAAGGACGCCAAA AACATCACTGTAACTGCCTATGCAAACGGCGACCATGCCGTCACAGTTAAGGACGCCAAA AATGTTACTGTATCTGCTTATGCAAACGGCGATCATGCCGTCACAGTTAAGGACGCTAAA AATATCACTGTGGCTGCTTATGCAAACGGCGACCATGCCGTCACAGTTAAGGACGCTAAA AACATTACTGTAGCTGCCTACGCTAACGGCGACCATGCCGTCACAGTAAAGGACGCCAAG
* * * ***** **** ** *********** *********************** **
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624.1 El IbH35 HM045786.1
TTCATTGTGGGGCCAATGTCTTCAGCCTGGACACCTT TTCATTGTGGGGCCAATGTCTTCAGCCTGGACACCTT TTCATTGTGGGGCCAATGTCTTCAGCCTGGACACCTT TTCATTGTGGGGCCAATGTCTTCAGCCTGGACACCTT TTCATAGTGGGGCCAATGTCTTCAGCCTGGACACCTT TTTGTCGTGGGACCAATGTCCTCCGCCTGGACACCTT
TTGACAACAAAATCGTGGTGTAC TCGACAACAAAATTGTGGTGTAC TCGACAACAAAATTGTGGTGTAC TTGACAATAAAATCGTGGTGTAC TCGACAATAAAATCGTGGTGTAC TTGACAACAAAATCGTGGTGTAC
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624.1 El IbH35 HM045786.1
AAAGGTGACGTTTACAACATGGACTACCCGCCCTTTGGCGCAGGAAGACCAGGACAATTT AAAGGTGACGTCTATAACATGGACTACCCGCCCTTTGGCGCAGGAAGACCAGGACAATTT AAAGGTGACGTCTATAACATGGACTACCCGCCCTTTGGCGCAGGAAGACCAGGACAATTT AAAGGCGACGTCTACAACATGGACTACCCGCCCTTCGGCGCAGGAAGACCAGGACAATTT AAAGGCGACGTCTACAACATGGACTACCCGCCCTTCGGCGCAGGAAGACCAGGACAATTT AAAGGCGACGTCTACAACATGGACTACCCACCTTTTGGCGCAGGAAGACCAGGACAATTT
***** ***** ** ************** ** ** ************************
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624.1 El IbH35 HM045786.1
GGCGATATCCAAAGTCGCACGCCTGAGAGCAAAGACGTCTATGCTAACACACAACTGGTA GGCGATATCCAAAGTCGCACACCTGAGAGTAAAGACGTCTATGCTAATACACAACTGGTA GGCGATATCCAAAGTCGCACACCTGAGAGTAAAGACGTCTATGCTAATACACAACTGGTA GGCGACATCCAAAGTCGCACGCCTGAGAGCGAAGACGTCTATGCTAACACACAACTGGTA GGCGACATCCAAAGTCGCACGCCTGAGAGCGAAGACGTCTATGCTAATACACAACTGGTA GGTGACATTCAAAGTCGTACACCGGAAAGTAAAGACGTTTATGCCAACACTCAGTTGGTA
** ** ** ******** ** ** ** ** ******* ***** ** ***** *****
ФИГ. 15 (Продолжение)
E1_S27_NC004162.2 E1_SL1564 9_GU18 90 61.1 E1_LR2 00 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624 .1 El IbH35 HM045786.1
CTGCAGAGACCGGCTGCGGGTACGGTACACGTGCCATACTCTCAGGCACCATCTGGCTTT CTGCAGAGACCGGCTGCGGGTACGGTACACGTGCCATACTCTCAGGCACCATCTGGCTTT CTGCAGAGACCGGCTGTGGGTACGGTACACGTGCCATACTCTCAGGCACCATCTGGCTTT CTGCAGAGACCGTCCGCGGGTACGGTGCACGTGCCGTACTCTCAGGCACCATCTGGCTTC CTGCAGAGACCGTCCGCGGGTACGGTGCACGTGCCGTACTCTCAGGCACCATCTGGCTTC CTACAGAGGCCAGCAGCAGGCACGGTACATGTACCATACTCTCAGGCACCATCTGGCTTC
* * ***** ** * * ** ***** ** ** ** ***********************
E1_S27_NC004162.2 E1_SL1564 9_GU18 90 61.1 E1_LR2 00 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624 .1 El IbH35 HM045786.1
E1_S27_NC004162 .2 E1_SL1564 9_GU18 90 61.1 E1_LR2 00 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661. 3 E1_99659_KJ451624.1 El IbH35 HM045786.1
AAGTATTGGTTAAAAGAACGAGGGGCGTCGCTACAGCACACAGCACCATTTGGCTGCCAA AAGTATTGGCTAAAAGAACGCGGGGCGTCACTGCAGCACACAGCACCATTTGGCTGCCAA AAGTATTGGCTAAAAGAACGCGGGGCGTCGCTGCAGCACACAGCACCATTTGGCTGCCAA AAGTATTGGCTAAAAGAACGAGGGGCGTCGCTGCAGCACACAGCACCATTTGGCTGTCAA AAGTATTGGCTAAAAGAACGAGGGGCGTCGCTGCAGCACACAGCACCATTTGGCTGTCAA AAGTATTGGCTGAAGGAACGAGGAGCATCGCTACAGCACACGGCACCGTTCGGTTGCCAG
********* * ** ***** ** ** ** ** ******** ***** ** ** ** **
ATAGCAACAAACCCGGTAAGAGCGATGAACTGCGCCGTAGGGAACATGCCCATCTCCATC ATAGCAACAAACCCGGTAAGAGCGGTGAACTGCGCCGTAGGGAACATGCCCATCTCCATC ATAGCAACAAACCCGGTAAGAGCGGTGAACTGCGCCGTAGGGAACATGCCCATCTCCATC ATAGCAACAAACCCGGTAAGAGCGATGAACTGCGCCGTAGGGAACATGCCTATCTCCATC ATAGCAACAAACCCGGTAAGAGCGATGAACTGCGCCGTAGGGAACATGCCTATCTCCATC ATTGCGACAAACCCGGTAAGAGCTGTAAATTGCGCTGTGGGGAACATACCAATTTCCATC
***** ***************** * ** ***** ** ******** ** ** ******
E1_S27_NC004162.2 E1_SL1564 9_GU18 90 61.1 E1_LR2 00 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624 .1 El IbH35 HM045786.1
GACATACCGGATGCGGCCTTCACTAGGGTCGTCGACGCGCCCTCT GACATACCGGAAGCGGCCTTCACTAGGGTCGTCGACGCGCCCTCT GACATACCGGAAGCGGCCTTCACTAGGGTCGTCGACGCGCCCTCT GACATACCGGACGCGGCCTTCACTAGGGTCGTCGACGCGCCATCT GACATACCGGACGCGGCCTTTACCAGGGTCGTCGACGCGCCATCT GACATACCGGATGCGGCCTTTACTAGGGTTGTCGATGCACCCTCT
TTAACGGACATGTCA TTAACGGACATGTCG TTAACGGACATGTCG TTAACGGACATGTCG TTAACGGACATGTCG GTAACGGACATGTCA
*********** ******** ** ***** ***** ** ** *** *************
ФИГ. 15 (Продолжение)
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624 .1 El IbH35 HM045786.1
TGCGAGGTACCAGCCTGCACCCATTCCTCAGACTT TGCGAGGTACTAGCCTGCACCCATTCCTCAGACTT TGCGAGGTACCAGCCTGCACCCATTCCTCAGACTT TGTGAGGTACCAGCCTGCACCCACTCCTCAGACTT TGTGAGGTATCAGCCTGCACCCATTCCTCAGACTT TGCGAAGTACCAGCCTGCACTCACTCCTCCGACTT
TGGGGGCGTCGCCATTATTAAATAT TGGGGGCGTCGCCATTATTAAATAT TGGGGGCGTCGCCATTATTAAATAT TGGGGGCGTAGCCATCATTAAATAT TGGGGGCGTAGCCATCATTAAATAT TGGGGGCGTCGCCATCATCAAATAT
* * * * * * * ********* ** ***** ************** ***** ** ******
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624 .1 El IbH35 HM045786.1
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624.1 El IbH35 HM045786.1
GCAGTCAGCAAGAAAGGCAAGT GCAGCCAGCAAGAAAGGCAAGT GCAGCCAGCAAGAAAGGCAAGT GCAGCCAGCAAGAAAGGCAAGT GCAGCCAGTAAGAAAGGCAAGT ACAGCTAGCAAGAAAGGTAAAT
* * *
GACCAACGCCGTCACTATCCGG GACTAACGCCGTCACTATTCGG GACTAACGCCGTCACTATTCGG GACTAACGCCGTCACTATTCGG GACTAACGCCGTCACTATTCGG GACCAACGCCGTTACCATTCGA
TCTCGACGGCCTTG TCTCGACGGCCTTA TCTCGACGGCCTTA TTTCGACGGCCCTA TTTCGACGGCCCTA TCTCAACAGCCTTG
Ю CO
***** * *
********** ***** ** *** ******* ** ** ** ** ***
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624 .1 El IbH35 HM045786.1
GCCAGCGCCGAATTCCGCGTACAAGTCTGTTCTACACAAGTACACT GCCAGCGCCGAATTCCGCGTACAAGTCTGTTCTACACAAGTACACT GCCAGCGCCGAATTCCGCGTACAAGTCTGTTCTACACAAGTACACT GCCAGCGCCGAATTCCGCGTACAAGTCTGTTCTACACAAGTACACT GCCAGCGCCGAATTTCGCGTACAAGTCTGTTCTACACAAGTACACT GCAAGCGCCGAGTTTCGCGTGCAAGTGTGCTCCACACAAGTACACT
GTGCAGCCGAGTGC GTGCAGCTGAGTGC GTGCAGCCGAGTGC GTGCAGCCGAGTGC GTGCAGCCGAGTGC GCGCAGCCGCATGC
** ******** ** ***** ***** ** ** ************** ***** *
* * *
ФИГ. 15 (Продолжение)
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624 .1 El IbH35 HM045786.1
CACCCTCCGAAGGACCACATAGTCAACTACCCGGCGTCACATACCACCCTCGGGGTCCAG CACCCCCCGAAGGACCACATAGTCAACTACCCGGCGTCACATACCACCCTCGGGGTCCAG CACCCCCCGAAGGACCACATAGTCAACTACCCGGCGTCACATACCACCCTCGGGGTCCAG CATCCACCGAAAGACCATATAGTCAATTACCCGGCGTCACACACCACCCTCGGGGTCCAA CATCCACCGAAAGACCATATAGTCAATTACCCGGCGTCACACACCACCCTCGGGGTCCAA CACCCTCCAAAGGACCACATAGTCAATTACCCAGCATCACACACCACCCTTGGGGTCCAG
* * * * * * * * ***** ******** ***** ** ***** ******** ********
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624 .1 El IbH35 HM045786.1
GACATTTCCGCTACGGCGATGTCAT GACATCTCCGCTACGGCGATGTCAT GACATCTCCGCTACGGCGATGTCAT GACATTTCCGTTACGGCGATGTCAT GACATTTCCGCTACGGCGATGTCAT GATATATCCACAACGGCAATGTCTT
GGGTGCAGAAGATCACGGGAGGTGTGGGACTGGTT GGGTGCAGAAGATCACGGGAGGTGTGGGACTGGTT GGGTGCAGAAGATCACGGGAGGTGTGGGACTGGTT GGGTGCAGAAGATCACGGGAGGTGTGGGACTGGTT GGGTGCAGAAGATCACGGGAGGTGTGGGACTGGTT GGGTGCAGAAGATTACGGGAGGAGTAGGATTAATT
• ~k ~k ~k ~k ~k •к'к'к'к'к.'к'к'к'к'к'к'к'к'к'к'к'к'к'к 'k'k'k'k'k'k'k'k"'k'k ~k ~k ~k
E1_S27_NC004162.2 E1_SL15 64 9_GU18 90 61.1 E1_LR20 0 6_KT44 9801.1 E1_181/25_L37661.3 E1_99659_KJ451624 .1 El IbH35 HM045786.1
GTCGCTGTTGCAGCACTGATTCTAATCGTGGTGCTATGCGTGTCGT GTTGCTGTTGCCGCACTGATTCTAATCGTGGTGCTATGCGTGTCGT GTTGCTGTTGCCGCACTGATTCTAATCGTGGTGCTATGCGTGTCGT GTCGCTGTTGCAGCACTGATCCTAATCGTGGTGCTATGCGTGTCGT GTCGCTGTTGCAGCACTGATCCTAATCGTGGTGCTATGCGTGTCGT GTTGCTGTTGCTGCCTTAATTTTAATTGTGGTGCTATGCGTGTCGT
TCAGCAGGCAC TCAGCAGGCAC TCAGCAGGCAC TTAGCAGGCAC TTAGCAGGCAC TTAGCAGGCAC
** ******** **
* *
**** ******************** *********
ФИГ. 15 (Продолжение)
CLUSTAL 0(1.2.1) множественное выравнивание последовательностей
IbH35 HM0457
86.1
El"
S27 NC004162
El"
SL15649 GUI8
9061.1
El"
LR2006 KT449
801.1
El"
99659 KJ4516
24 .1
El"
181/25 L3766
1.3
IbH35 HM0457
86.1
El"
S27 NC004162
El"
SL15649 GUI8
9061.1
El"
LR2006 KT449
801.1
El"
99659 KJ4516
24 .1
El"
181/25 L3766
1.3
PMVLEMELQSVTLE PMVLEMELLSVTLE PMVLEMELLSVTLE PMVLEMELLSVTLE PMVLEMELLSVTLE PMVLEMELLSVTLE
PTLSLDYI PTLSLDYI PTLSLDYI PTLSLDYI PTLSLDYI PTLSLDYI
TCEYKTVI TCEYKTVI TCEYKTVI TCEYKTVI TCEYKTVI TCEYKTVI
YEHVTVIPNTVGVPYKTLVNRPGYS YEHVTVIPNTVGVPYKTLVNRPGYS YEHVTVIPNTVGVPYKTLVNRPGYS YEHVTVIPNTVGVPYKTLVNRPGYS YEHVTVIPNTVGVPYKTLVNRPGYS YEHVTVIPNTVGVPYKTLVNRPGYS
********************************* **************************
KCCGTAECKDKSLPDYSCKVFTGVYPFMWGGAYCFCDAENTQLSEAHVEKSESCKTEFAS KCCGTAECKDKNLPDYSCKVFTGVYPFMWGGAYCFCDAENTQLSEAHVEKSESCKTEFAS KCCGTAECKDKNLPDYSCKVFTGVYPFMWGGAYCFCDAENTQLSEAHVEKSESCKTEFAS KCCGTAECKDKNLPDYSCKVFTGVYPFMWGGAYCFCDAENTQLSEAHVEKSESCKTEFAS KCCGTAECKDKSLPDYSCKVFTGVYPFMWGGAYCFCDTENTQLSEAHVEKSESCKTEFAS KCCGTAECKDKSLPDYSCKVFTGVYPFMWGGAYCFCDTENTQLSEAHVEKSE
1SCKTEFAS
*********** ************************* • **********************
ю сл
IbH35 HM0457
86.1
El"
S27 NC004162
El"
SL15649 GUI8
9061.1
El"
LR2006 KT449
801.1
El"
99659 KJ4516
24 .1
El"
181/25 L3766
1.3
IbH35 HM0457
86.1
El"
S27 NC004162
El"
SL15649 GUI8
9061.1
El"
LR2006 KT449
801.1
El"
99659 KJ4516
24 .1
El"
181/25 L3766
1.3
SAWTPFDNKIVVY SAWTPFDNKIVVY SAWTPFDNKIVVY SAWTPFDNKIVVY SAWTPFDNKIVVY SAWTPFDNKIVVY
AYRAHTASASAKLRVLYQGNNITVAAYANGDHAVTVKDAKFVVGPMS AYRAHTASASAKLRVLYQGNNITVTAYANGDHAVTVKDAKFIVGPMS AYRAHTASASAKLRVLYQGNNITVTAYANGDHAVTVKDAKFIVGPMS AYRAHTASASAKLRVLYQGNNITVTAYANGDHAVTVKDAKFIVGPMS AYRAHTASASAKLRVLYQGNNITVAAYANGDHAVTVKDAKFIVGPMS AYRAHTASASAKLRVLYQGNNVTVSAYANGDHAVTVKDAKFIVGPMS
PFGAGRPGQFGDIQSRT PFGAGRPGQFGDIQSRT PFGAGRPGQFGDIQSRT PFGAGRPGQFGDIQSRT PFGAGRPGQFGDIQSRT PFGAGRPGQFGDIQSRT
PESKDVYANTQLVLQRPAAGTVHVPYSQAPSGF PESKDVYANTQLVLQRPAAGTVHVPYSQAPSGF PESKDVYANTQLVLQRPAAGTVHVPYSQAPSGF PESKDVYANTQLVLQRPAVGTVHVPYSQAPSGF PESEDVYANTQLVLQRPSAGTVHVPYSQAPSGF PESEDVYANTQLVLQRPSAGTVHVPYSQAPSGF
********************* • ** • **************** • ******************
KGDVYNMDYP]
****************************** • ************* • **************
ФИГ. 15 (Продолжение)
IbH35 HM0457
86.1
El"
S27 NC004162
El"
SL15649 GUI8
9061.1
El"
LR2006 KT449
801.1
El"
99659 KJ4516
24 .1
El"
181/25 L3766
1.3
KYWLKERGAS KYWLKERGAS KYWLKERGAS KYWLKERGAS KYWLKERGAS KYWLKERGAS
LQHTAPFGCQ LQHTAPFGCQ LQHTAPFGCQ LQHTAPFGCQ LQHTAPFGCQ LQHTAPFGCQ
IATNPVRAVNCAVGNIP IATNPVRAMNCAVGNMP IATNPVRAVNCAVGNMP IATNPVRAVNCAVGNMP IATNPVRAMNCAVGNMP IATNPVRAMNCAVGNMP
ISIDIPDAAFTRVVDAPSVTDMS ISIDIPDAAFTRVVDAPSLTDMS ISIDIPEAAFTRVVDAPSLTDMS ISIDIPEAAFTRVVDAPSLTDMS ISIDIPDAAFTRVVDAPSLTDMS ISIDIPDAAFTRVVDAPSLTDMS
**************************** • ****** • ******* • *********** • ****
IbH35 HM0457
86.1
El"
S27 NC004162
El"
SL15649 GUI8
9061.1
El"
LR2006 KT449
801.1
El"
99659 KJ4516
24 .1
El"
181/25 L3766
1.3
IbH35 HM0457
86.
El"
S27 NC004162
El"
SL15649 GUI8
906
1.1
El"
LR2006 KT449
801
El"
99659 KJ4516
24.
El"
181/25 L3766
1.3
SDFGGVAIIKYTASKKGKCAVHSMTNAVT SDFGGVAIIKYAVSKKGKCAVHSMTNAVT SDFGGVAIIKYAASKKGKCAVHSMTNAVT SDFGGVAIIKYAASKKGKCAVHSMTNAVT SDFGGVAIIKYAASKKGKCAVHSMTNAVT SDFGGVAIIKYAASKKGKCAVHSMTNAVT
STTAMSWVQKI SATAMSWVQKI SATAMSWVQKI SATAMSWVQKI SATAMSWVQKI SVTAMSWVQKI
*** ***************** ********************* *****************
ASAEFRVQVCSTQVHCAAACHPPKDHIVNYPASHTTLGVQDI ASAEFRVQVCSTQVHCAAECHPPKDHIVNYPASHTTLGVQDI ASAEFRVQVCSTQVHCAAECHPPKDHIVNYPASHTTLGVQDI ASAEFRVQVCSTQVHCAAECHPPKDHIVNYPASHTTLGVQDI ASAEFRVQVCSTQVHCAAECHPPKDHIVNYPASHTTLGVQDI ASAEFRVQVCSTQVHCAAECHPPKDHIVNYPASHTTLGVQDI
****************** ************************ ***************•
IbH35 HM0457
86.1
El"
S27 NC004162
El"
SL15649 GUI8
9061.1
El"
LR2006 KT449
801.1
El"
99659 KJ4516
24 .1
El"
181/25 L3766
1.3
VAVAALI VAVAALI VAVAALI VAVAALI VAVAALI VAVAALI
LIVVLCVS LIVVLCVS LIVVLCVS LIVVLCVS LIVVLCVS LIVVLCVS
FSRH FSRH FSRH FSRH FSRH FSRH
*******************
ФИГ. 15 (Продолжение)
CLUSTAL 0(1.2.1) множественное выравнивание последовательностей
181/25 L37661
"lbH35 HM04578
6.1
"LR2006 КТ4498
01.1
"SL15649 GU189
061 л
"S27 NC004162.
"99659 KJ45162
4.1
181/25 L37661
"lbH35 HM04578
6.1
"LR2006 КТ4498
01.1
"SL15649 GU189
061 л
"S27 NC004162.
"99659 KJ45162
4.1
GTCTATAAAGCCATAAGACCGTACCTAGCTCACTGTCCC GTCTATAAAGCTACAAGACCATATCTAGCTCATTGTCCT GTCTATAAAGCCACAAGACCATACTTAGCTCACTGTCCC GTCTATAAAGCCACAAGACCATACTTAGCTCACTGTCCC GTCTATAAAGCCACAAGACCATACCTAGCTCACTGTCCC GTCTATAAAGCCACAAGACCGTACCTAGCTCACTGTCCC
* * * ****** * ** ************** * ****** ** ******* *****
GACTGTGGAGAAGGGCACTCGTGCCATAGTCCCGTAGCGCTAGAACGCATCAGAAACGAA GACTGCGGAGAAGGGCATTCGTGCCACAGCCCTATCGCATTGGAGCGCATCAGAAATGAA GACTGTGGAGAAGGGCACTCGTGCCATAGTCCCGTAGCACTAGAACGCATCAGAAATGAA GACTGTGGAGAAGGGCACTCGTGCCATAGTCCCGTAGCACTAGAACGCATCAGAAATGAA GACTGTGGAGAAGGGCACTCGTGCCATAGTCCCGTAGCACTAGAACGCATCAGAAATGAA GACTGTGGAGAAGGGCACTCGTGCCATAGTCCCGTAGCGCTAGAACGCATCAGAAACGAA
***** *********** ******** ** ** * ** * ** *********** ***
181/25 L37661
"lbH35 HM04578
6.1
"LR2006 КТ4498
01.1
"SL15649 GU189
061 л
"S27 NC004162.
"99659 KJ45162
4.1
GCGACAGACGGGACGCTGAAAATCCAGGTTTCCT GCAACGGACGGAACGCTGAAAATCCAGGTCTCTT GCGACAGACGGGACGCTGAAAATCCAGGTCTCCT GCGACAGACGGGACGCTGAAAATCCAGGTCTCCT GCGACAGACGGGACGCTGAAAATCCAGGTCTCCT GCGACAGACGGGACGTTGAAAATCCAGGTTTCCT
Т GCAAATС GGAATAAAGAC GGAT GAT Т GCAGATC GGGATAAAGACAGAT GAC Т GCAAAT С GGAATAAAGAC GGAT GAC T GCAAAT С GGAATAAAGAC GGAC GAC TGCAAATTGGAATAGGGACGGATGAT T GCAAAT С GGAATAAAGAC GGAT GAT
** ** ***** *** ************* ** ***** ** ** *** *** ** **
181/25 L37661
"lbH35 HM04578
6.1
"LR2006 KT4498
01.1
"SL15649 GU189
061.1
"S27 NC004162.
"99659 KJ45162
4.1
AGCCATGATTGGACCAAGCTGCGTTACATGGACAATCATATGCCAGCAGACGCAGAGAGG AGCCACGATTGGACCAAGCTGCGCTATATGGATAGCCATACGCCAGCGGACGCGGAGCGA AGCCACGATTGGACCAAGCTGCGTTATATGGACAACCACATGCCAGCAGACGCAGAGAGG AGCCACGATTGGACCAAGCTGCGTTATATGGACAACCACATGCCAGCAGACGCAGAGAGG AGCCATGATTGGACCAAGCTGCGTTACATGGACAATCACATACCAGCAGACGCAGGGAGG AGCCATGATTGGACCAAGCTGCGTTATATGGACAATCACATGCCAGCAGACGCAGAGCGG
***** ***************** ** ***** * ** * ***** ***** * * *
ФИГ. 15 (Продолжение)
E2_181/25_L37661.3 E2_IbH35_HM045786.1 E2_LR2006_KT449801.1 E2_SL15649_GU189061.1 E2_S27_NC004162 .2 E2 99659 KJ451624.1
GCCAGGCTATTTGTAAGAACGTCAGCACCGT GCCGGATTGCTTGTAAGGACTTCAGCACCGT GCCGGGCTATTTGTAAGAACATCAGCACCGT GCCGGGCTATTTGTAAGAACATCAGCACCGT GCCGGGCTATTTGTAAGAACATCAGCACCAT GCCGGGCTATTTGTAAGAACGTCAGCACCGT
GCACGATTACTGGAACAAT GCACGATCACCGGGACCAT GTACGATTACTGGAACAAT GTACGATTACTGGAACAAT GCACGATTACTGGAACAAT GCACGATTACTGGAACAAT
GGGACACTTC GGGACACTTT GGGACACTTC GGGACACTTC GGGACACTTC GGGACACTTC
•k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k 'k'k'k'k'k'k'k'k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k 'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k'k
E2_181/25_L37661.3 E2_IbH35_HM045786.1 E2_LR2006_KT449801.1 E2_SL15649_GU189061.1 E2_S27_NC004162 .2 E2 99659 KJ451624.1
ATCCTGGCCCGATGTCCGAAAGGAGAAACTCTGACGGTGGGATTCACTGACGGTAGGAAG ATTCTGGCCCGATGCCCGAAAGGAGAGACGCTGACAGTGGGATTTACGGACAGCAGAAAG ATCCTGGCCCGATGTCCAAAAGGGGAAACTCTGACGGTGGGATTCACTGACAGTAGGAAG ATCCTGGCCCGATGTCCAAAAGGGGAAACTCTGACGGTGGGATTCACTGACAGTAGGAAG ATCCTGGCCCGATGTCCGAAAGGAGAAACTCTGACGGTGGGATTCACTGACAGTAGGAAG ATTCTGGCCCGATGTCCGAAAGGAGAAACTCTGACGGCGGGGTTCACTGACGGTAGGAAG
* * * * ******** ** ***** ** ** *****
*** ** ** ***
* * * * *
E2_181/25_L37661.3 E2_IbH35_HM045786 .1 E2_LR2006_KT449801.1 E2_SL1564 9_GU18 90 61.1 E2_S27_NC004162 .2 E2 99659 KJ451624.1
ATCAGTCACTCAT ATCAGCCACACAT ATTAGTCACTCAT ATTAGTCATTCAT ATTAGTCACTCAT ATCAGTCACTCAT
GTACGCACCCATTTCACCACGACCCTCCT GCACACACCCGTTCCATCATGAACCACCT GTACGCACCCATTTCACCACGACCCTCCT GTACGCACCCATTTCACCACGACCCTCCT GTACGCACCCATTTCACCACGACCCTCCT GTACGCACCCATTTCACCATGACCCTCCT
GTGATAGGCCGGGAAAAA GTGATAGGTAGGGAGAGG GTGATAGGTCGGGAAAAA GTGATAGGTCGGGAAAAA GTGATAGGCCGGGAAAAA GTGATAGGCCGGGAAAAA
** ** ** ***** ** ***** ** ** ** ** **************
* * * *
E2_181/25_L37661.3 E2_IbH35_HM045786.1 E2_LR2006_KT449801.1 E2_SL15649_GU189061.1 E2_S27_NC004162 .2 E2 99659 KJ451624.1
TTTCATTCCCGACCGCAGCACGGTAGAGAACTACCTT TTCCACTCTCGACCACAACATGGTAAAGAGTTACCTT TTCCATTCCCGACCGCAGCACGGTAAAGAGCTACCTT TTCCATTCCCGACCGCAGCACGGTAAAGAGCTACCTT TTCCATTCCCGACCGCAGCACGGTAAAGAGCTACCTT TTCCATTCCCGACCGCAGCACGGTAGGGAACTACCTT
GCAGCACGTACGCGCAGAGCACC GCAGCACGTACGTGCAGAGCACC GCAGCACGTACGTGCAGAGCACC GCAGCACGTACGTGCAGAGCACC GCAGCACGTACGTGCAGAGCAAC GCAGCACGTACGCGCAGAGCACC
** ** ** ***** ** ** ****
* *
****************** ******** *
ФИГ. 15 (Продолжение)
E2_181/25_L37661.3 E2_IbH35_HM045786.1 E2_LR2006_KT449801.1 E2_SL15649_GU189061.1 E2_S27_NC004162 .2 E2 99659 KJ451624.1
GCTGCAACTGCCGAGGAGATAGAGGTACATATGCCCCCAGACACCCCAGATCGCACATTG GCTGCCACTGCCGAGGAGATAGAGGTGCATATGCCCCCAGATACTCCTGACCGCACGCTG GCCGCAACTACCGAGGAGATAGAGGTACACATGCCCCCAGACACCCCTGATCGCACATTA GCCGCAACTACCGAGGAGATAGAGGTACACATGCCCCCAGACACCCCTGATCGCACATTA GCCGCAACTGCCGAGGAGATAGAGGTACACATGCCCCCAGACACCCCTGATCGCACATTG GCTGCAACTGCCGAGGAGATAGAGGTACACATGCCCCCAGACACCCCAGATCGCACATTA
* * * * * * * **************** * * *********** ** ***** ***** *
E2_181/25_L37661.3 E2_IbH35_HM045786.1 E2_LR2006_KT449801.1 E2_SL15649_GU189061.1 E2_S27_NC004162 .2 E2 99659 KJ451624.1
ATGTCACAACAGTCCGGTAATGTAAAGATCACAGTCAATAGTCAGACGGT ATGACGCAGCAGTCTGGCAACGTGAAGATCACAGTTAATGGGCAGACGGT ATGTCACAACAGTCCGGCAACGTAAAGATCACAGTCAATGGCCAGACGGT ATGTCACAACAGTCCGGCAACGTAAAGATCACAGTCAATGGCCAGACGGT CTGTCACAACAGTCCGGCAACGTAAAGATCACAGTCAATAGTCAGACGGT ATGTCACAACAGTCCGGCAATGTAAAGATCACAGTCAATAGTCAGACGGT
GCGGTACAAG GCGGTACAAG GCGGTACAAG GCGGTACAAG GCGGTATAAG GCGGTACAAG
E2_181/25_L37661.3 E2_IbH35_HM045786 .1 E2_LR2006_KT449801.1 E2_SL1564 9_GU18 90 61.1 E2_S27_NC004162 .2 E2 99659 KJ451624.1
TGTAATTGCGGTGACTCAAATGAAGGACTAACCACTACAGACAAAGTGATTAATAACTGC TGCAACTGCGGCGGCTCAAACGAGGGACTGACAACCACAGACAAAGTGATCAATAACTGC TGTAATTGCGGTGGCTCAAATGAAGGACTAACAACTACAGACAAAGTGATTAATAACTGC TGTAATTGCGGTGGCTCAAATGAAGGACTAACAACTACAGACAAAGTGATTAATAACTGC TGTAATTGCGGTGGCTCAAATGAAGGACTAATAACTACAGATAAAGTGATTAATAACTGC TGCAATTGTGGTGACTCAAGTGAAGGATTAACCACTACAGATAAAGTGATTAATAACTGC
Ю CD
** ** ** **
*****
* * * * *
** ***** ******** *********
E2_181/25_L37661.3 E2_IbH35_HM045786.1 E2_LR2006_KT449801.1 E2_SL15649_GU189061.1 E2_S27_NC004162 .2 E2 99659 KJ451624.1
AAGGTTGATCAATGCCAT AAAATTGATСAGTGCСAT AAGGTTGATCAATGTCAT AAGGTTGATCAATGTCAT AAGGTTGATCAATGTCAT AAGGTCGATCAATGCCAT
GCCGCGGTCACCAATCACAAAAAATGGCAGTATAATTCCCCT GCTGCAGTCACTAATCACAAGAAGTGGCAATACAACTCCCCT GCCGCGGTCACCAATCACAAAAAGTGGCAGTATAACTCCCCT GCCGCGGTCACCAATCACAAAAAGTGGCAGTATAACTCCCCT GCCGCGGTCACCAATCACAAAAAGTGGCAGTATAACTCCCCT GCCGCGGTCACCAATCACAAAAAATGGCAGTATAATTCCCCT
•к ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k 'k'k'k'k'k'k'k'k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k ~k к ~k ~k
ФИГ. 15 (Продолжение)
E2_181/25_L37661.3 E2_IbH35_HM045786.1 E2_LR2006_KT449801.1 E2_SL15649_GU189061.1 E2_S27_NC004162 .2 E2 99659 KJ451624.1
CTGGTCCCGCGTAATGCT TTAGTCCCGCGTAACGCT CTGGTCCCGCGTAATGCT CTGGTCCCGCGTAATGCT CTGGTCCCGCGTAACGCT CTGGTCCCGCGTAATGCT
GAACTCGGGGACCGAAAAGGAAAAGTTCACATTCCGTTTCCT GAACTCGGGGACCGTAAAGGAAAGATTCACATCCCATTCCCA GAACTTGGGGACCGAAAAGGAAAAATTCACATCCCGTTTCCG GAACTTGGGGACCGAAAAGGAAAAATTCACATCCCGTTTCCG GAACTCGGGGACCGAAAAGGAAAAATTCACATCCCGTTTCCG GAATTCGGGGACCGGAAAGGAAAAGTTCACATTCCATTTCCT
* *********** ****** * ******** ******** ******* ** ** **
E2_181/25_L37661.3 E2_IbH35_HM045786.1 E2_LR2006_KT449801.1 E2_SL15649_GU189061.1 E2_S27_NC004162 .2 E2 99659 KJ451624.1
E2_181/25_L37661.3 E2_IbH35_HM045786 .1 E2_LR2006_KT449801.1 E2_SL1564 9_GU18 90 61.1 E2_S27_NC004162 .2 E2 99659 KJ451624.1
CTGGCAAATGTGACATGCAGGGT TTGGCAAACGTGACTTGCAGAGT CTGGCAAATGTAACATGCAGGGT CTGGCAAATGTAACATGCAGGGT CTGGCAAATGTAACATGCATGGT CTGGCAAATGTGACATGCAGGGT
******* ** *******
GCCTAAGGCAAGGAACCCCACCGTGACGTACGGAAAA GCCAAAAGCAAGAAACCCCACAGTAACGTACGGAAAA GCCTAAAGCAAGGAACCCCACCGTGACGTACGGGAAA GCCTAAAGCAAGGAACCCCACCGTGACGTACGGGAAA GCCTAAAGCAAGGAACCCCACCGTGACGTACGGGAAA GCCTAAAGCAAGAAACCCCACCGTGACGTACGGAAAA
E2_181/25_L37661.3 E2_IbH35_HM045786.1 E2_LR2006_KT449801.1 E2_SL15649_GU189061.1 E2_S27_NC004162 .2 E2 99659 KJ451624.1
GGAGAAGAACCAAACTATCAAGAAGAGTGGGTGACGCATAAGAAGGAGATCAGGTTAACC GGACAGGAACCAAATTACCACGAGGAGTGGGTGACACACAAGAAGGAGGTTACCTTGACC GGAGAAGAACCAAACTATCAAGAAGAGTGGGTGATGCATAAGAAGGAAGTCGTGCTAACC GGAGAAGAACCAAACTATCAAGAAGAGTGGGTGATGCATAAGAAGGAAGTCGTGCTAACC GGAGAAGAACCAAACTATCAAGAAGAGTGGGTGACGCACAAGAAGGAGGTCGTGCTAACC GGAGAAGAACCAAACTATCAAGAAGAGTGGGTGACGCATAAGAAGGAGATCAGGTTAACC
*** * ******** ** ** ** ********** ** ********
* * * *
ФИГ. 15 (Продолжение)
181/25 L37661
Е2"
IbH35 НМ04578
6.1
Е2"
LR2006 КТ4498
01.1
Е2"
SL15649 GU189
061 л
Е2"
S27 NC004162.
Е2"
99659 KJ45162
4.1
181/25 L37661
Е2"
IbH35 НМ04578
6.1
Е2"
LR2006 КТ4498
01.1
Е2"
SL15649 GU189
061 л
Е2"
S27 NC004162.
Е2"
99659 KJ45162
4.1
181/25 L37661
Е2"
IbH35 НМ04578
6.1
Е2"
LR2006 КТ4498
01.1
Е2"
SL15649 GU189
061 л
Е2"
S27 NC004162.
Е2"
99659 KJ45162
4.1
181/25 L37661
Е2"
IbH35 НМ04578
6.1
Е2"
LR2006 КТ4498
01.1
Е2"
SL15649 GU189
061 л
Е2"
S27 NC004162.
Е2"
99659 KJ45162
4.1
GTGCCGACTGAAGGGCTCGAGGTCACGTGGGGCAACAACGAGCCGTACAAGTATTGGCCG GTGCCTACTGAGGGTCTCGAGGTCACTTGGGGCAACAACGAACCATACAAGTACTGGCCG GTGCCGACTGAAGGGCTCGAGGTCACGTGGGGCAACAACGAGCCGTATAAGTATTGGCCG GTGCCGACTGAAGGGCTCGAGGTCACGTGGGGCAACAACGAGCCGTATAAGTATTGGCCG GTGCCGACTGAAGGGCTCGAGGTTACGTGGGGCAACAACGAGCCGTATAAGTATTGGCCG GTGCCGACTGAGGGGCTCGAGGTCACGTGGGGTAACAATGAGCCGTACAAGTATTGGCCG
GAGATААТТТТ GAGATААТ С Т Т GAGATААТ Т С Т GAGATААТ Т С Т GAGATААТ С Т Т GAGATААТ Т С Т
***** ***** ** ** ***** ** ***** ***** ** ** ** ***** ******
CAGTTATCCACAAACGGTACAGCCCACGGCCACCCGCAT CAGATGTCTACGAACGGTACTGCTCATGGTCACCCACAT CAGTTATCTACAAACGGTACAGCCCATGGCCACCCGCAT CAGTTATCTACAAACGGTACAGCCCATGGCCACCCGCAT CAGTTATCTGCAAACGGTACAGCCCACGGCCACCCGCAT CAGTTATCCACAAACGGTACAGCCCACGGCCACCCGCAT
*********** ** ** ***** ***********
GTGGTAGTTGTGTCAGTGGCCTCGTTCGTACTCCTGTCG GTAATCATTGTGTCGGTGGCCTCGTTCGTGCTTCTGTCG GTAGTAGTTGTGTCAGTGGCCACGTTCATACTCCTGTCG GTAGTAGTTGTGTCAGTGGCCACGTTCATACTCCTGTCG GTAGTAGTTGTGTCAGTGGCCTCGTTCATACTCCTGTCG GCGGTAGTTTTGTCAGTGGCCTCGTTCATACTCCTGTCG
** **** ************
**** *********
GTGCATGTGTGCACGACGCAGATGCATTACACCGTAC GTGTGTGTGCGCACGGCGCAGATGCATTACACCATAT GTGCATGTGTGCACGACGCAGATGCATCACACCGTAT GTGCATGTGTGCACGACGCAGATGCATCACACCGTAT GTGCATGTGTGCACGACGCAGATGCATCACACCATAC GTGCATGTGTGCACGACGCAGATGCATTACACCGTAC
**** ***** *********** ***** **
CO CO
ФИГ. 15 (Продолжение)
181/25 L37661
"1ЬН35 НМ04578
6.1
"LR2006 КТ4498
01.1
"SL15649 GU189
061 л
"S27 NC004162.
"99659 KJ45162
4.1
GAACTGACACCAGGAGCTACCGTCCCTTTCCTGCTTAGCCTAATATGCTGCATTAGAACA GAATTAACACCAGGAGCCACCGTTCCCTTTCTGCTCAGCCTGCTATGTTGCGTCAGAACG GAACTGACACCAGGAGCTACCGTCCCTTTCCTGCTTAGCCTAATATGCTGCATCAGAACA GAACTGACACCAGGAGCTACCGTCCCTTTCCTGCTTAGCCTAATATGCTGCATCAGAACA GAACTGACACCAGGAGCTACCGTCCCTTTCCTGCTTAGCCTAATATGCTGCATCAGAACA GAACTGACACCAGGAGCTACCGTCCCTTTCCTGCTTAGCCTAATATGCTGCATTAGAACA
* * * * *********** * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *****
181/25 L37661
GCTAAAGCG
"1ЬН35 НМ04578
6.1
ACCAAGGCG
"LR2006 КТ4498
01.1
GCTAAAGCG
"SL15649 GU189
061 л
GCTAAAGCG
"S27 NC004162.
GCTAAAGCG
"99659 KJ45162
4.1
GCTAAAGCG
* * * * * *
ФИГ. 15 (Продолжение)
CLUSTAL 0(1.2.1) множественное выравнивание последовательностей
E2_IbH35_HM045786.1 E2_99659_KJ451624 .1 E2_181/25_L37661.3 E2_S27_NC004162 .2 E2_SL1564 9_GU18 90 61.: E2 LR2006 KT449801.1
STKDNFNVYKATRPYLAHCPDCGEGHSCHSPIALERIRNEAT SIKDHFNVYKATRPYLAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEAT SIKDNFNVYKAIRPYLAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEAT STKDNFNVYKATRPYLAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEAT STKDNFNVYKATRPYLAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEAT STKDNFNVYKATRPYLAHCPDCGEGHSCHSPVALERIRNEAT
* * * ****** ******************************
DGTLKI DGTLKI DGTLKI DGTLKI DGTLKI DGTLKI
QVSLQI QVSLQI QVSLQI QVSLQI QVSLQI QVSLQI
GIKTDD GIKTDD GIKTDD GIGTDD GIKTDD GIKTDD
************** ***
E2_IbH35_HM045786.1 E2_99659_KJ451624.1 E2_181/25_L37661.3 E2_S27_NC004162 .2 E2_SL1564 9_GU18 90 61.: E2 LR2006 KT449801.1
E2_IbH35_HM045786 .1 E2_99659_KJ451624 .1 E2_181/25_L37661.3 E2_S27_NC004162 .2 E2_SL1564 9_GU18 90 61.: E2 LR2006 KT449801.1
SHDWTKLRYMDSHTPADAERAGLLVRTSAPCTITGTMGHFILARCPKGET SHDWTKLRYMDNHMPADAERAGLFVRTSAPCTITGTMGHFILARCPKGET SHDWTKLRYMDNHMPADAERARLFVRTSAPCTITGTMGHFILARCPKGET SHDWTKLRYMDNHIPADAGRAGLFVRTSAPCTITGTMGHFILARCPKGET SHDWTKLRYMDNHMPADAERAGLFVRTSAPCTITGTMGHFILARCPKGET SHDWTKLRYMDNHMPADAERAGLFVRTSAPCTITGTMGHFILARCPKGET
**** ** ****************************** **** **
TYVQS TAATAEE TYAQS TAATAEE TYAQSTAATAEE TYVQSNAATAEE TYVQSTAATTEE TYVQSTAATTEE
IEVHMPPDT IEVHMPPDT IEVHMPPDT IEVHMPPDT IEVHMPPDT IEVHMPPDT
PVIGRERFHSRPQHGKELPCS PVIGREKFHSRPQHGRELPCS PVIGREKFHSRPQHGRELPCS PVIGREKFHSRPQHGRELPCS PVIGREKFHSRPQHGRELPCS PVIGREKFHSRPQHGKELPCS
*********** *
ISHTCTHPFHHEP ISHSCTHPFHHDP ISHSCTHPFHHDP ISHSCTHPFHHDP ISHSCTHPFHHDP ISHSCTHPFHHDP
*** • ******* • ******* • ******** • ******* ** *** • ****************
CO CO
E2_IbH35_HM045786.1 E2_99659_KJ451624.1 E2_181/25_L37661.3 E2_S27_NC004162 .2 E2_SL1564 9_GU18 90 61 E2 LR2006 KT449801.:
MTQQSGNVKITVNGQTVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKIDQCHAAVTNHKKWQYNSP MSQQSGNVKITVNSQTVRYKCNCGGSSEGLTTTDKVINNCKVDQCHAAVTNHKKWQYNSP MSQQSGNVKITVNSQTVRYKCNCGDSNEGLTTTDKVINNCKVDQCHAAVTNHKKWQYNSP LSQQSGNVKITVNSQTVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKVDQCHAAVTNHKKWQYNSP MSQQSGNVKITVNGQTVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKVDQCHAAVTNHKKWQYNSP MSQQSGNVKITVNGQTVRYKCNCGGSNEGLTTTDKVINNCKVDQCHAAVTNHKKWQYNSP
• ************ **********
*** ********** • ******************
ФИГ. 15 (Продолжение)
IbH35 НМ04578
6.1
Е2"
99659 KJ45162
4.1
Е2"
181/25 L37661
Е2"
S27 NC004162.
Е2"
SL15649 GU189
061 Л
Е2"
LR2006 КТ4498
01.1
IbH35 НМ04578
6.1
Е2"
99659 KJ45162
4.1
Е2"
181/25 L37661
Е2"
S27 NC004162.
Е2"
SL15649 GU189
061 Л
Е2"
LR2006 КТ4498
01.1
IbH35 НМ04578
6.1
Е2"
99659 KJ45162
4.1
Е2"
181/25 L37661
Е2"
S27 NC004162.
Е2"
SL15649 GU189
061 Л
Е2"
LR2006 КТ4498
01.1
IbH35 НМ04578
6.1
Е2"
99659 KJ45162
4.1
Е2"
181/25 L37661
Е2"
S27 NC004162.
Е2"
SL15649 GU189
061 Л
Е2"
LR2006 КТ4498
01.1
LVPRNAELGDRKGKIHIPFPLANVTCRVPKARNPTVTYGKNQVTMLLYPDHPTLLSYRNM LVPRNAEFGDRKGKVHIPFPLANVTCRVPKARNPTVTYGKNQVIMLLYPDHPTLLSYRNM LVPRNAELGDRKGKVHIPFPLANVTCRVPKARNPTVTYGKNQVTMLLYPDHPTLLSYRNM LVPRNAELGDRKGKIHIPFPLANVTCMVPKARNPTVTYGKNQVTMLLYPDHPTLLSYRSM LVPRNAELGDRKGKIHIPFPLANVTCRVPKARNPTVTYGKNQVTMLLYPDHPTLLSYRNM LVPRNAELGDRKGKIHIPFPLANVTCRVPKARNPTVTYGKNQVTMLLYPDHPTLLSYRNM
************************** ~к~к~к~к~к~к~к~к~к~к~к~к~к~к~к~к ************** *
GQEPNYHEEWVTHKKEVTLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYWPQMSTNGTAHGHPHEIILYYY GEEPNYQEEWVTHKKEIRLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYWPQLSTNGTAHGHPHEIILYYY GEEPNYQEEWVTHKKEIRLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYWPQLSTNGTAHGHPHEIILYYY GEEPNYQEEWVTHKKEWLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYWPQLSANGTAHGHPHEIILYYY GEEPNYQEEWVMHKKEWLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYWPQLSTNGTAHGHPHEIILYYY GEEPNYQEEWVMHKKEWLTVPTEGLEVTWGNNEPYKYWPQLSTNGTAHGHPHEIILYYY СО
* • **** • **** **** • *********************** • * • ****************
ELYPTMTVIIVSVASFVLLSMVGTAVGMCVCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLLCCVRT ELYPTMTAWLSVASFILLSMVGVAVGMCMCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLICCIRT ELYPTMTVWVSVASFVLLSMVGVAVGMCMCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLICCIRT ELYPTMTVWVSVASFILLSMVGMAVGMCMCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLICCIRT ELYPTMTVWVSVATFILLSMVGMAVGMCMCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLICCIRT ELYPTMTVWVSVATFILLSMVGMAAGMCMCARRRCITPYELTPGATVPFLLSLICCIRT
******* • • •***•*•****** * **********************************
ТКА АКА АКА АКА АКА АКА
ФИГ. 15 (Продолжение)
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
Ill
Ill
112
112
115
1990 .
114
<220>
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 54
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 54
<220>
<220>
<223> Синтетический пептид
<223> Синтетический пептид
<220>
<220>
<223> Синтетический пептид
<223> Синтетический пептид
Синтетический пептид
Синтетический пептид
<400> 89
<400> 89
<220>
<220>
<223> Синтетический пептид
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 107
<400> 107
<220>
<220>
<223> Синтетический пептид
<223> Синтетический пептид
<220>
<220>
<223> Синтетический пептид
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 137
<400> 137
Glu Tyr
Glu Tyr
<220>
<220>
<223> Синтетический пептид
<223> Синтетический пептид
<220>
154
<223> Синтетический пептид
<400>
<220>
154
<223> Синтетический пептид
<400>
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 163
<400> 163
Asp Tyr
Asp Tyr
<220>
<220>
<223> Синтетический пептид
<223> Синтетический пептид
<220>
184
<223> Синтетический пептид
<400>
<220>
184
<223> Синтетический пептид
<400>
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 193
<400> 193
<220>
202
<223> Синтетический пептид
<400>
<220>
202
<223> Синтетический пептид
<400>
<220>
<220>
<223> Синтетический пептид
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<223> Синтетический пептид
<400> 225
<400> 225
<220>
234
<223> Синтетический пептид
<400>
<220>
234
<223> Синтетический пептид
<400>
<220>
<220>
<223> Синтетический пептид
<223> Синтетический пептид
1269
117
117
4/34
4/34
5/34
5/34
5/34
7/34
7/34
10/34
10/34
10/34
10/34
10/34
10/34
11/34
11/34
12/34
12/34
14/34
14/34
14/34
14/34
14/34
14/34
14/34
14/34
16/34
17/34
17/34
17/34
17/34
17/34
17/34
18/34
18/34
18/34
18/34