|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] В заявке описан новый комплекс, содержащий а) проникающий в клетку пептид, б) по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп и в) по меньшей мере один пептидный агонист TLR, в котором компоненты а)-в) ковалентно связаны. Кроме того, в заявке описана также нуклеиновая кислота, кодирующая комплекс, где комплекс представляет собой пептид или белок. Указанная нуклеиновая кислота может содержаться в векторе, а такой вектор может содержаться в клетке-хозяине. В частности, в заявке описаны композиции, такие как фармацевтические композиции и вакцины, которые можно применять, например, для предупреждения и/или лечения заболеваний и/или нарушения, включая рак, гематологические нарушения, инфекционные заболевания, аутоиммунные нарушения и отторжения трансплантатов.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
В заявке описан новый комплекс, содержащий а) проникающий в клетку пептид, б) по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп и в) по меньшей мере один пептидный агонист TLR, в котором компоненты а)-в) ковалентно связаны. Кроме того, в заявке описана также нуклеиновая кислота, кодирующая комплекс, где комплекс представляет собой пептид или белок. Указанная нуклеиновая кислота может содержаться в векторе, а такой вектор может содержаться в клетке-хозяине. В частности, в заявке описаны композиции, такие как фармацевтические композиции и вакцины, которые можно применять, например, для предупреждения и/или лечения заболеваний и/или нарушения, включая рак, гематологические нарушения, инфекционные заболевания, аутоиммунные нарушения и отторжения трансплантатов.
(19)
Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201792045 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2018.03.30
(22) Дата подачи заявки 2016.03.16
(51) Int. Cl. A61K39/00 (2006.01)
(54) НОВЫЙ КОМПЛЕКС, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОНИКАЮЩИЙ В КЛЕТКУ ПЕПТИД, КАРГО-МОЛЕКУЛУ И ПЕПТИДНЫЙ АГОНИСТ TLR
(31) PCT/EP2015/000580; PCT/ EP2015/002244
(32) 2015.03.16; 2015.11.09
(33) EP
(86) PCT/EP2016/000471
(87) WO 2016/146260 2016.09.22
(71) Заявитель:
АМАЛЬ ТЕРАПЬЮТИКС СА (CH)
(72) Изобретатель:
Деруази Мадиха, Бельнуэ Элоди (CH)
(74) Представитель:
Веселицкая И.А., Веселицкий М.Б., Кузенкова Н.В., Каксис Р.А., Белоусов Ю.В., Куликов А.В., Кузнецова Е.В., Соколов Р.А., Кузнецова Т.В. (RU)
(57) В заявке описан новый комплекс, содержащий а) проникающий в клетку пептид, б) по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп и в) по меньшей мере один пептидный агонист TLR, в котором компоненты а)-в) ковалентно связаны. Кроме того, в заявке описана также нуклеиновая кислота, кодирующая комплекс, где комплекс представляет собой пептид или белок. Указанная нуклеиновая кислота может содержаться в векторе, а такой вектор может содержаться в клетке-хозяине. В частности, в заявке описаны композиции, такие как фармацевтические композиции и вакцины, которые можно применять, например, для предупреждения и/или лечения заболеваний и/или нарушения, включая рак, гематологические нарушения, инфекционные заболевания, аутоиммунные нарушения и отторжения трансплантатов.
129631
НОВЫЙ КОМПЛЕКС, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОНИКАЮЩИЙ В КЛЕТКУ ПЕПТИД, КАРГО-МОЛЕКУЛУ И ПЕПТИДНЫЙ АГОНИСТ TLR
Настоящее изобретение относится к области вакцинации, прежде всего к противораковым вакцинам.
Иммунная система может распознавать и в некоторой степени элиминировать опухолевые клетки, однако уровень противоопухолевого ответа
10 часто является низким и неэффективным. Усиление этого слабого
противоопухолевого ответа с помощью терапевтической вакцинации уже давно является целью противораковой терапии. Таким образом, модуляция иммунной системы с целью повышения иммунных ответов представляет собой перспективный терапевтический подход в онкологии, так ее можно объединять
15 со стандартными методами ухода за больными.
Многообещающие результаты доклинических исследований и успехи в клинических испытаниях, включая одобренную в настоящее время FDA вакцину Sipuleucel-T и антитело к CTLA-4, продемонстрировали, что активная иммунизация является безопасным и реальным путем лечения некоторых типов
20 рака. Опубликованы данные об индукции иммунных ответов, опосредуемых опухоль специфическими цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), с использованием различных подходов, включая вакцины на основе модифицированных опухолевых клеток, пептидные вакцины, рекомбинантные вирусные векторы, вакцины на основе ДНК, белка или дендритных клеток.
25 Однако противоопухолевый иммунитет, опосредуемый CTL, только в редких
случаях коррелирует с регрессом опухолей, и лишь несколько проектов достигли фазы III клинических испытаний.
В целом, к настоящему времени для противораковых вакцин продемонстрирована очень ограниченная клиническая эффективность. Так,
30 известно, что к концу 2011 г. из 30000 проводимых клинических испытаний противораковых вакцин только 19 достигли фазы III испытаний (Global Data, 2012). Среди них, NeuVax, пептидная вакцина для рака молочной железы, Stimuvax, вакцина на основе липосом для немелкоклеточной карциномы легкого
(NSCLC) и рака молочной железы, TG4010, вакцина на основе вируса коровьей оспы для NSCLC, и GSK1572932A, липосома с адъювантом для NSCLC. Эти четыре противораковые вакцины основаны на различных технологиях и общим для них является то, что каждая из них направлена на один единственный антиген.
Терапевтические противораковые вакцины можно разделять на две принципиальные категории: персонализированные (аутологичные) и стандартизированные вакцины, и их дополнительно классифицируют в зависимости от технологической платформы. Современные персонализированные вакцины включают вакцины на основе опухолевого лизата, а также вакцину на основе дендритных клеток (далее в контексте настоящего описания обозначена как вакцина на основе клеток). В последнем случае для загрузки антигена можно использовать либо введение в импульсном режиме опухолевых лизатов, либо трансфекцию с помощью РНК, экстрагированной из опухолей. В этом случае антигены являются специфическими для опухоли или ассоциированы с ней, но не являются строго определенными. Дендритные клетки можно вносить также с определенными антигенами либо с помощью обработки в импульсном режиме пептидом, либо с использованием белка, такого как простатическая кислая фосфатаза (РАР), который применяли для создания вакцины Provenge(r). Однако процесс производства этих терапевтических агентов на основе клеток требует больших временных затрат и является трудоемким, и при этом трудно обеспечивать и поддерживать стандарты качества. Иммуномониторинг создает дополнительные сложности. Кроме того, большая часть аутологичных противораковых вакцин не позволяют идентифицировать или количественно оценивать антигены, которые следует контролировать, в отличие от имеющих заданный состав и стандартизованных вакцин.
В отличие от терапии на основе клеток (АРС, Т-клетки, CAR, лизаты) субъединичные вакцины (белок или пептиды) позволяют разрабатывать стандартизованную вакцину с использованием более простого процесса получения и с улучшенной в значительной степени воспроизводимостью от партии к партии, которую можно вводить широкому кругу пациентов. Кроме того, антигены являются полностью определенными, что позволяет улучшать
иммуномониторинг и снижать риск нежелательных явлений, связанных с компонентом вакцины.
Различные подходы, которые оценивали в доклинических и клинических исследованиях, включают вакцины на основе коротких пептидов (Slingluff C.L., 5 Jr., The present and future of peptide vaccines for cancer: single or multiple, long or short, alone or in combination? Cancer journal 17(5), 2011, cc. 343-350), вакцины на основе длинных пептидов (Melief С. J., van der Burg SH., Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nature reviews Cancer 8(5), 2008, cc. 351-360) и на основе белков. В отличие от вакцин на
10 основе длинных пептидов и белков вакцины на основе коротких пептидов обладают очень коротким временем полужизни и могут оказывать отрицательное воздействие на иммунный ответ.
В случае вакцин на основе белков результаты таргетинга MAGE-АЗ с помощью вакцины на основе рекомбинантного слитого белка оказались очень
15 оптимистическими после многообещающих данных, полученных на фазе II, в отношении метастатической меланомы (Kruit W.H., Suciu S., Dreno В., Mortier L., Robert C, Chiarion-Sileni V. и др., Selection of immunostimulant AS 15 for active иммунизация with MAGE-АЗ protein: results of a randomized phase II study of the European Organisation for Research and Treatment of Cancer Melanoma Group
20 in Metastatic Melanoma. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 31(19), 2013, cc. 2413-2420) и немелкоклеточного рака легкого (NSLC) (Vansteenkiste J., Zielinski M., binder A., Dahabreh J., Gonzalez E.E., Malinowski W. и др., Adjuvant MAGE-АЗ immunotherapy in resected non-small-cell lung cancer: phase II randomized study
25 results. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 31(19), 2013, cc. 2396-2403). Однако в 2013 г. на фазе III исследования на коже (DERMA-исследование) в отношении меланомы (NCT00796445) не подтверждена первичная конечная точка, в затем в 2014 г. прекращена фаза III MAGRIT-опыта в отношении NSCL (NCT00480025).
30 Несмотря на указанные очень неутешительные результаты клинических исследований, вакцины на основе белков безусловно обладают многими преимуществами.
Терапевтическую противораковую вакцину вводят страдающим раком пациентам для усиления способности их иммунной системы распознавать и уничтожать раковые клетки. Основной целью подхода на основе терапевтической противораковой вакцины является создание Т-клеток-киллеров 5 (которые обозначат также как цитотоксические Т-лимфоциты), специфических для опухолевых клеток. Для этого, а также для достижения сильного иммунного ответа, вакцина должна содержать молекулы, называемые антигенами, которые также присутствуют в опухоли и которые требуется доставлять к антигенпрезентирующим клетками (АРС), прежде всего дендритным клеткам
10 (DC), для инициации противоракового иммунитета. DC процессируют эти опухолевые антигены в небольшие пептиды, которые презентируются на поверхности клеток, экспрессирующих молекулы ГКГС класса I или ГКГС класса II, Т-клеткам. Пептиды, которые затем распознаются Т-клетками и тем самым индуцируют их стимуляцию, называются эпитопами. Презентация
15 молекулами ГКГС класса I и ГКГС класса II обеспечивает активацию двух классов Т-клеток, цитотоксических С08+-Т-лимфоцитов (CTL) и хелперных С04+-Т-клеток (Т^) соответственно. Кроме того, для полной активации помимо распознающих антиген Т-клеток требуется второй сигнал, костимуляторный сигнал, который представлен неспецифическим антигеном и образуется в
20 результате взаимодействия между костимуляторными молекулами,
экспрессируемыми на поверхности АРС, и Т-клеткой. Таким образом, двумя основными требованиями, предъявляемыми к эффективной терапевтической противораковой вакцине, является специфичность опухолевых антигенов и способность эффективно доставлять их к DC.
25 Таким образом, в совокупности для индукции опухолеспецифического
иммунного ответа требуется три основные стадии: (I) антиген должен быть доставлен к дендритным клеткам, которые должны процессировать его до эпитопов, (II) дендритные клетки должны получать соответствующий активирующий сигнал и (III) активированные загруженные опухолевым
30 антигеном дендритные клетки должны генерировать опосредуемые Т-клетками иммунные ответы в лимфоидных органах.
Поскольку опухолевые клетки могут ускользать от надзора иммунной системы с помощью понижающей регуляции экспрессии индивидуальных
антигенов (пассивное ускользание от иммунологического надзора), то доставка имеющего несколько эпитопов антигена (полиэпитопный антиген) должна обеспечивать преимущество. Так, вакцины на основе белков позволяют полиэпитопному антигену доставляться к антигенпрезентирующим клеткам 5 (АРС), таким как дендритные клетки (DC), без ограничения, обусловленного единичным аллелем ГКГС. Другим путем усиления является долговременная презентация эпитопа, описанная в настоящее время для дендритных клеток, загруженных белками (van Montfoort N., Camps M.G., Khan S., Filippov D.V., Weterings J.J., Griffith J.M. и др., Antigen storage compartments in mature dendritic
10 cells facilitate prolonged cytotoxic T lymphocyte cross-priming capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106(16), 2009, cc. 6730-6735). Кроме того, белки, для которых требуется их поглощение и процессирование DC для достижения ГКГС, ограничено презентируют присутствующие в них эпитопы. Это снижает риск индукции периферической
15 толерантности, которая обнаружена после вакцинации короткими пептидами, которые не обладают такими строгими требованиями к процессированию (Toes R.E., Offringa R., Blom R.J., Melief С.J., Kast W.M., Peptide vaccination can lead to enhanced tumor growth through specific T-cell tolerance induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(15), 1996, cc.
20 7855-7860).
Однако большинство растворимых белков, как правило, расщепляются в эндолизосомах и слабо перекрестно презентируются на молекулах ГКГС класса I и поэтому обладают слабой иммуногенностью в отношении С08+-Т-клеточных ответов (Rosalia R.A., Quakkelaar E.D., Redeker A., Khan S., Camps M., Drijfhout
25 J.W. и др., Dendritic cells process synthetic long peptides better than whole protein, improving antigen presentation and T-cell activation. European journal of immunology 43(10), 2013, cc. 2554-2565). Кроме того, хотя зрелые DC являются более эффективными, чем незрелые DC, в отношении примирования и вызывания Т-клеточных ответов (Apetoh L., Locher С, Ghiringhelli F., Kroemer
30 G., Zitvogel L., Harnessing dendritic cells in cancer. Semin Immunol. 23, 2011, cc. 42-49), они утрачивают способность эффективно поглощать экзогенные антигены, в частности антигены, ограниченные (рестриктированные) по ГКГС класса II (Banchereau J., Steinman R.M., Dendritic cells and the control of immunity.
Nature. 392, 1998, cc. 245-252). В результате, на обработанные в импульсном режиме пептидами DC в качестве вакцины накладывается несколько ограничений. Например, расщепление пептидов, быстрый круговорот молекул ГКГС класса I и диссоциация пептида из молекул ГКГС класса I в процессе 5 получения, и инъекция DC/пептидов может приводить к короткому времени
полужизни комплексов ГКГС класса I/пептид на поверхности DC, что приводит к слабым Т-клеточным ответам.
Для повышения эффективности доставки вакцины на основе белка предложено применение проникающих в клетку пептидов для внутриклеточной
10 доставки раковых пептидов в DC (Wang R.F., Wang H.Y., Enhancement of antitumor immunity by prolonging antigen presentation on dendritic cells. Nat Biotechnol. 20, 2002, cc. 149-156). Проникающие в клетку пептиды (СРР) представляют собой пептиды, состоящие из 8-40 остатков, которые обладают способностью пересекать клеточную мембрану и проникать в большинство
15 типов клеток (Copolovici D.M., Langel К., Eriste Е., Langel U., Cell-penetrating peptides: design, synthesis, and applications. ACS nano 8(3), 2014, cc. 1972-1994, Milletti F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today, 2012). Альтернативно этому, их обозначают также как домен трансдукции белка (PTD), что отражает их источник в виде встречающихся в
20 естественных условиях белков. Несколько эффективных СРР идентифицировано из белков, включая белок Tat вируса иммунодефицита человека, белок VP22 вируса герпеса простого и фактор роста фибробластов (Berry С.С. Intracellular delivery of nanoparticles via the HIV-1 tat peptide. Nanomedicine. 3, 2008, cc. 357365; Deshayes S., Morris M.C., Divita G., Heitz F., Cell-penetrating peptides: Tools
25 for intracellular delivery of therapeutics. Cell Mol Life Sci. 62, 2005, cc. 1839-1849; Edenhofer F. Protein transduction revisited: Novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins. Curr Pharm Des. 14, 2008, cc. 36283636; Gupta В., Levchenko T.S., Torchilin V.P., Intracellular delivery of large molecules and small particles by cell-penetrating proteins and peptides. Adv Drug
30 Deliv Rev. 57, 2005, cc. 637-651; Torchilin V.P., Recent approaches to intracellular delivery of drugs and DNA and organelle targeting. Annu Rev Biomed Eng. 8, 2006, cc. 343-375). Установлено, что Т-клеточная активность, обусловленная DC/TAT-TRP2, оказалась в 3-10 раз выше, чем индуцированная DC/TRP2 (Wang H.Y., Fu
Т., Wang G., Gang Z., Donna MPL, Yang J.C., Restifo N.P., Hwu P., Wang R.F., Induction of CD4+ T cell-dependent antitumor immunity by TAT-mediated tumor antigen delivery into dendritic cells. J Clin Invest. 109, 2002a, cc. 1463-1470).
Кроме того, субъединичные вакцины (пептиды или белки) обладают слабой 5 иммуногенностью. Поэтому с точки зрения терапевтической противораковой вакцины для них обязательным требованием является добавление в вакцину эффективного адъюванта для повышения уровня костимуляторных молекул на DC и, следовательно, для усиления ответа иммунной системы на антигены-мишени. Адъюванты решают эту задачу, имитируя сохраненные микробные
10 компоненты, которые в естественных условиях распознаются иммунной системой. Они включают липополисахарид (LPS), компоненты оболочек бактериальных клеток и нуклеиновые кислоты, такие как двухцепочечная РНК (dsPHK) и одноцепочечная РНК (ssPHK), и ДНК, содержащую неметилированный CpG-динуклеотид. Их присутствие в сочетании с вакциной
15 может значительно повышать врожденный иммунный ответ на антиген. Кроме
того, указанный адъювант может усиливать скорее адаптивный иммунный ответ, связанный с CTL и типом поляризованных Thl, чем гуморальный иммунный ответ, приводящий к выработке антител. Изучены различные адъюванты, из них для применения на человеке одобрено лишь ограниченное количество. Они
20 включают квасцы, MPL (монофосфарил-липид А) и ASO4 (квасцы и MPL), применяемые в США, и MF59 (эмульсия масло-в-воде), ASO4 липосомы, применяемые в Европе (Lim Y.T., Vaccine adjuvant materials for cancer immunotherapy and control of infectious disease. Clin Exp Vaccine Res, 4(1), 2015, cc. 54-58).
25 В настоящее время в качестве многообещающего класса адъювантов
рассматриваются лиганды Толл-подобного рецептора (TLR) (Baxevanis C.N., IF. Voutsas и О.Е. Tsitsilonis, Toll-like receptor agonists: current status and future perspective on their utility as adjuvants in improving anticancer vaccination strategies. Immunotherapy, 5(5), 2013, cc. 497-511). Так, в важных исследованиях,
30 направленных на развитие противораковых вакцин, в композиции вакцин включали различные агонисты TLR, такие как TLR-3 (поли I:C), TLR-4 (монофосфорил-липид A; MPL), TLR-5 (флагеллин), TLR-7 (имиквимод) и TLR-9 (CpG) (Duthie M.S., Windish H.P., Fox СВ., Reed S.G., Use of defined TLR ligands
as adjuvants within human vaccines. Immunol Rev. 239, 2011, cc. 178-196). Типы сигналов и цитокинов, продуцируемых иммунными клетками после стимуляции TLR контролируют дифференцировку СБ4+-Т-клеток в Thl, Th2, Thl7 и Treg клетки. Стимуляция иммунных клеток, таких как DC и Т-клетки, большинством 5 адъювантов на основе TLR приводит к выработке провоспалительных цитокинов и усиливает ответы Thl СБ8+-Т-клеток (Manicassamy S., Pulendran В. Modulation of adaptive immunity with Toll-like receptors. Semin Immunol. 21, 2009, cc. 185- 193).
Конъюгация вакцин с лигандом TLR представляет собой привлекательный 10 подход, который обладает несколькими преимуществами по сравнению с
неконъюгированными вакцинами, включая (I) предпочтительное поглощение иммунными клетками, экспрессирующими TLR, (II) повышенный иммунный ответ и (III) пониженный риск индукции периферической толерантности. Фактически, все антигенпрезентирующие клетки, загруженные антигеном, 15 должны одновременно активироваться. Различные группы исследователей,
изучавшие этот подход с использованием различных лигандов TLR, главным
образом связывали их химическим путем с вакциной на основе пептида или
белка (Zom G.G., Khan S., Filippov D.V., Ossendorp F., TLR ligand-peptide
conjugate vaccines: toward clinical application. Adv Immunol. 114, 2012, cc. 177-
20 201). Поскольку химическое связывание с пептидом легко осуществлять, то
наиболее изученные лиганды TLR, предназначенные для конъюгации с
вакциной, представляли собой агонисты TLR2 Pam2Cys и Pam3Cys (Fujita Y. и
Н. Taguchi, Overview and outlook of Toll-like receptor ligand-antigen conjugate
vaccines. Ther Deliv, 3(6), 2012, cc.749-760).
25 Однако установлено, что большинство изученных к настоящему времени
противораковых вакцин обладают ограниченной эффективностью. Одним из объяснений этого является отсутствие терапии, с помощью которой можно одновременно (I) стимулировать опосредуемый цитотоксическими полиэпитопными Т-клетками иммунитет, (II) индуцировать Т^ -клетки и (III) 30 повышать иммунологическую память. Эти три параметра являются
существенными для создания эффективного длительного противоопухолевого иммунитета. Так, CTL, специфические в отношении различных эпитопов, могут обеспечивать деструкцию многих раковых клеток в гетерогенной опухолевой
массе и избегания увеличения вариантов без антигена (ускользание опухоли от иммунологического надзора). Т^-клетки участвуют в поддержании длительного клеточного иммунитета, и инфильтрация опухолей Т^-клетками также является важной стадией рекрутмента и функции CD8+-CTL. Иммунологическая память 5 является важной для защиты от рецидива опухоли.
В свете вышесказанного, в основу настоящего изобретения была положена задача преодолеть указанные выше недостатки современных противораковых вакцин и разработать для применения в противораковой иммунотерапии новый комплекс, представляющий собой более эффективную вакцину, прежде всего 10 противораковую вакцину, которая обладает улучшенной противоопухолевой активностью.
Эта цель достигается с помощью изложенного ниже объекта изобретения и прилагаемой формулы изобретения.
Хотя настоящее изобретение описано подробно ниже, должно быть
15 очевидно, что настоящее изобретение не ограничено конкретными
методологиями, протоколами и реагентами, указанными в настоящем описании, и они могут варьироваться. Также должно быть очевидно, что применяемая в контексте описания терминология не направлена на ограничение объема настоящего изобретения, который определяется только прилагаемой формулой
20 изобретения. Если не указано иное, то все технические и научные понятия,
применяемые в контексте настоящего описания, имеют значения, общепринятые и очевидные обычному специалисту в данной области.
Ниже описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы перечислены с помощью конкретных вариантов осуществления изобретения,
25 однако следует понимать, что их можно объединять любым образом и в любом количестве с созданием дополнительных вариантов осуществления изобретения. Различные описанные примеры и предпочтительные варианты осуществления изобретения не должны рассматриваться, как ограничивающие объем настоящего изобретения, они предназначены только для пояснения описанных
30 вариантов осуществления изобретения. Должно быть очевидно, что настоящее описание предназначено для подтверждения вариантов осуществления изобретения и включает варианты осуществления изобретения, которые поясняют описанные варианты осуществления изобретения с любым
количеством описанных и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые
перестановки и комбинации всех указанных элементов в настоящем описании,
должны рассматриваться как подпадающие под объем настоящего описания,
если из контекста не следует иное.
5 В настоящем описании и в представленной ниже формуле изобретения,
если из контекста не требуется иное, понятие "содержат" и его грамматические формы, такие как "содержит" и "содержащий", следует рассматривать, как включающие указанного представителя, указанное целое число или указанную стадию, но не исключающие любого другого не указанного представителя,
10 указанное целое число или указанную стадию. Понятие "состоят из" является конкретным вариантом понятия "содержат", при этом исключается любой другой неуказанный представитель, неуказанное целое число или неуказанная стадия. В контексте настоящего изобретения понятие "содержат" включает понятие "состоят из". Таким образом, под понятие "содержащий" подпадает
15 также "включающий", а также "состоящий", например, композиция,
"содержащая" X может содержать только X или может иногда включать дополнительный элемент, например, X + Y.
Упоминание в контексте настоящего описания понятия в единственном числе относится также и к множественному числу (особенно в контексте
20 формулы изобретения), если в настоящем описании не указано иное или это явно противоречит контексту. Упоминание диапазонов величин в контексте настоящего описания должно служить только в качестве метода сокращенной ссылки индивидуально на каждую отдельную величину, подпадающую под диапазон. Если специально не указано иное, то каждое индивидуальное значение
25 включено в описание как если бы оно было индивидуально указано в настоящем описании. Спецификация не ограничена никаким языком, применяемым для указания не заявляемого элемента, важного для воплощения изобретения на практике.
Понятие "практически" не исключает "полностью", например, композиция, 30 "практически свободная" от Y, может представлять собой композицию
полностью свободную от Y. При необходимости понятие "практически" можно опускать в описании изобретения.
Понятие "примерно" касательно численного значения х обозначает х ±
Комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении
Первым объектом настоящего изобретения является комплекс, содержащий:
а) проникающий в клетку пептид;
б) по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп; и
в) по меньшей мере один пептидный агонист TLR,
в котором компоненты а)-в), т.е. проникающий в клетку пептид, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп и по меньшей мере один пептидный агонист TLR, ковалентно связаны.
Указанный предлагаемый в настоящем изобретении комплекс одновременно обеспечивает (I) стимуляцию опосредуемого полиэпитопной цитотоксической Т-клеткой иммунитета, (II) индукцию Т^-клеток и (III) усиление иммунологической памяти. Таким образом, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой эффективную вакцину, в частности, с улучшенной противоопухолевой активностью.
Предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой полипептид или белок, в частности, рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок, предпочтительно рекомбинантный слитый белок или рекомбинантный слитый полипептид. Понятие "рекомбинантный" в контексте настоящего описания обозначает, что субстанция (в настоящем описания полипептид или белок) не встречается в естественных условиях. Таким образом, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, который представляет собой рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок, как правило, содержит компоненты а)-в), в котором компоненты а)-в) имеют различное происхождение, т.е. не встречаются в естественных условиях в такой комбинации.
В контексте настоящего изобретения, т.е. в контексте настоящего описания, понятия "пептид", "полипептид", "белок" и вариации этих понятий относятся к пептиду, олигопептиду, олигомеру или белку, включая слитый белок, соответственно, содержащему по меньшей мере две аминокислоты, сцепленные друг с другом предпочтительно с помощью обычной пептидной связи, или альтернативно этому, с помощью модифицированной пептидной связи, такой,
например, как связь в изостерических пептидах. Пептид, полипептид или белок может состоять из L-аминокислот и/или D-аминокислот. Предпочтительно пептид, полипептид или белок либо (полностью) состоит из L-аминокислот, либо (полностью) состоит из D-аминокислот, образуя тем самым "ретро-5 инвертированные пептидные последовательности". Понятие "ретро-
инвертированные (пептидные) последовательности" относится к изомеру линейной пептидной последовательности, в которой направление последовательности является обратным (реверсированным) и хиральность каждого аминокислотного остатка является изменена на противоположную
10 (инвертированной) (см., например, Jameson и др., Nature, 368, 1994, cc. 744-746; Brady др., Nature, 368, 1994, cc. 692-693). В частности, понятия "пептид", "полипептид", "белок" включают также "пептидомиметики", которые обозначают пептидные аналоги, содержащие непептидные структурные элементы, указанные пептиды обладают способностью имитировать или
15 антагонизировать биологическое(ие) действие(я) встречающегося в
естественных условиях родительского пептида. У пептидомиметика отсутствуют классические характеристики пептида, такие как расщепляемые ферментами пептидные связи. В частности, пептид, полипептид или белок может содержать аминокислоты, отличные от тех 20 аминокислот, которые определяются
20 генетическим кодом, в дополнение к указанным аминокислотам, или он может состоять из аминокислот, отличных от тех 20 аминокислот, которые определяются генетическим кодом. В частности, в контексте настоящего изобретения пептид, полипептид или белок может также состоять из аминокислот, модифицированных с помощью естественных процессов, таких как
25 процессы пост-трансляционного созревания, или с помощью химических
процессов, которые хорошо известны специалисту в данной области. Такие модификации подробно описаны в литературе. Эти модификации могут затрагивать любую область полипептида: пептидный скелет, аминокислотную цепь или даже карбокси- или аминоконцы. В частности, пептид или полипептид
30 может быть разветвлен в результате убиквитинизации или может быть
циклическим с разветвлением или без разветвления. Такой тип модификации может являться результатом естественных или синтетических посттрансляционных процессов, которые хорошо известны специалисту в данной
области. Понятия "пептид", "полипептид", "белок" в контексте настоящего изобретения включают, в частности, также модифицированные пептиды, полипептиды и белки. Например, модификации пептида, полипептида или белка могут включать ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, 5 амидирование, ковалентное связывание с нуклеотидом или нуклеотидным
производным, ковалентное связывание с липидом или липидным производным, ковалентное связывание с фосфатидилинозитом, ковалентное или нековалентное перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, гликозилирование, включая пэгилирование,
10 гидроксилирование, йодизацию, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитические процессы, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, сенелоилирование, сульфатирование, присоединение аминокислот, такое как аргинилирование, или убиквитинизацию. Указанные модификации подробно описаны в литературе (Proteins Structure and Molecular Properties, 2-ое изд., под
15 ред. Т. Е. Creighton, New York, 1993; Post-translational Covalent Modifications of Proteins, под ред. В. С. Johnson, изд-во Academic Press, New York, 1983; Seifter и др., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182, 1990, cc. 626-646, и Rattan и др., Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663, 1992, cc. 48-62).Таким образом,
20 понятия "пептид", "полипептид", "белок" предпочтительно включают,
например, липопептиды, липопротеинаы, гликопептиды, гликопротеины и т.п.
Однако в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой "классический" пептид, полипептид или белок, где "классический" пептид,
25 полипептид или белок, как правило, состоит из аминокислот, выбранных из 20 аминокислот, определяемых генетическим кодом, которые сцеплены друг с другом с помощью обычной пептидной связи.
Если комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой полипептид или белок, то предпочтительно он содержит по меньшей мере
30 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, более предпочтительно по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, еще более предпочтительно по меньшей мере 120, по меньшей мере 130,
наиболее предпочтительно по меньшей мере 140 или наиболее предпочтительно по меньшей мере 150 аминокислотных остатков.
Компонент а) - Проникающий в клетку пептид
СРР позволяет эффективно доставлять, т.е. транспортировать и загружать, в 5 частности, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп в
антигенпрезентирующие клетки (АРС), в частности, в дендритные клетки (DC), что в результате обеспечивает механизм процессирования дендритными клетками антигена.
Понятие "проникающие в клетку пептиды" ("СРР"), как правило,
10 применяют для обозначения коротких пептидов, которые обладают
способностью транспортировать различные типы карго-молекул ("полезный груз") через плазматическую мембрану и в результате облегчать поглощение клетками различных карго-молекул (от наночастиц до небольших химических молекул и крупных фрагментов ДНК). "Клеточная интернализация" карго-
15 молекул, связанных с проникающим в клетку пептидом, как правило, означает транспорт карго-молекулы через плазматическую мембрану и проникновение таким образом карго-молекулы в клетку. Затем в зависимости от конкретных обстоятельств карго-молекула может высвобождаться в цитоплазму, направляться к внутриклеточной органелле или также презентироваться на
20 клеточной поверхности. Способность проникать в клетку или интернализация проникающего в клетку пептида или комплекса, содержащего указанный проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, можно оценивать стандартными методами, известными специалисту в данной области, включая проточную цитометрию или флуоресцентную микроскопию живых и
25 фиксированных клеток, иммуноцитохимию клеток, трансдуцированных указанным пептидом или комплексом, и Вестерн-блоттинг.
Проникающие в клетку пептиды, как правило, имеют аминокислотную композицию, которая либо содержит в относительно высоком количестве положительно заряженные аминокислоты, такие как лизин или аргинин, либо
30 имеют последовательность, которая содержит чередующуюся схему
расположения полярных/заряженных аминокислот и неполярных, гидрофобных аминокислот. Указанные два типа структур обозначают как поликатионные или амфипатические соответственно. Проникающие в клетку пептиды имеют
различные размер, аминокислотные последовательности и заряды, но все СРР обладают общим свойством, представляющим собой способность к транслокации через плазматическую мембрану и облегчение доставки различных карго-молекул в цитоплазму или в органеллу клетки. В настоящее время теории 5 транслокации СРР основаны на трех основных механизмах проникновения: непосредственное прохождение через мембрану, опосредуемое эндоцитозом проникновение и транслокация посредством образования транзиторной структуры. Трансдукция СРР относится к области дальнейшего исследования. Известно, что проникающие в клетку пептиды нашли многочисленные
10 применения в медицине в качестве агентов, доставляющих лекарственные средства, при лечении различных заболеваний, включая рак, и ингибиторов вирусов, а также контрастных агентов для мечения и визуализации клеток.
Как правило, проникающие в клетку пептиды (СРР) представляют собой пептиды, состоящие из 8-50 остатков, которые обладают способностью
15 пересекать клеточную мембрану и проникать в большинство клеточных типов.
Альтернативно этому, их обозначают также как домен трансдукции белка (PTD), что отражает их источник в виде встречающихся в естественных условиях белков. Frankel и Pabo одновременно с Green и Lowenstein описали способность да/?анс-активирующего активатора транскрипции из вируса иммунодефицита
20 человека 1 (HIV-TAT) проникать в клетки (Frankel A.D. и CO. Pabo, Cellular
uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell, 55(6), 1988, cc. 1189-1193). В 1991 г. описана трансдукция в нервные клетки гомеодомена Antennapedia (ДНК-связывающий домен) из Drosophila melanogaster (Joliot А. и др., Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis. Proc Natl Acad
25 Sci USA, 88(5), 1991, cc. 1864-1868). В 1994 г. охарактеризован первый 16-мерный пептид СРР, обозначенный как пенетратин, который имеет аминокислотную последовательность RQIKIYFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1), из третьей спирали гомеодомена Antennapedia (Derossi D. и др., The third helix of the Antennapedia гомеодомен translocates through biological membranes. J Biol
30 Chem, 269(14), 1994, cc. 10444-10450), после чего в 1998 г. идентифицирован минимальный домен ТАТ, имеющий аминокислотную последовательность YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2), необходимый для трансдукции белков (Vives Е., P. Brodin и В. Lebleu, A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly
translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem, 272(25), 1997, cc. 16010-16017). В течение двух последних десятилетий описано множество пептидов различного происхождения, включая вирусные белки, например, VP22 (Elliott G. и P. O'Hare, Intercellular trafficking and protein 5 delivery by a herpesvirus structural protein. Cell, 88(2), 1997, cc. p. 223-233) и
белок ZEBRA (Rothe R. и др., Characterization of the cell-penetrating properties of the Epstein-Barr virus ZEBRA trans-activator. J Biol Chem, 285(26), 2010, cc. 20224-20233), или из ядов, например, мелиттин (Dempsey С.Е., The actions of melittin on membranes. Biochim Biophys Acta, 1031(2), 1990, cc. 143-161),
10 мастопоран (Konno К. и др., Structure and biological activities of eumenine
mastoparan-AF (EMP-AF), a new mast cell degranulating peptide in the venom of the solitary wasp (Anterhynchium flavomarginatum micado). Toxicon, 38(11), 2000, cc. 1505-1515), маурокальцин (Esteve E. и др., Transduction of the scorpion toxin maurocalcine into cells. Evidence that the toxin crosses the plasma membrane. J Biol
15 Chem, 280(13), 2005, cc. 12833-12839), кротамин (Nascimento F.D. и др.,
Crotamine mediates gene delivery into cells through the binding to heparan sulfate proteoglycans. J Biol Chem, 282(29), 2007, cc. 21349-21360) или буфорин (Kobayashi S. и др., Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry, 43(49), 2004, cc. 15610-15616). Созданы также
20 синтетические СРР, включая полиаргинин (R8, R9, R10 и R12) (Futaki S. и др., Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery. J Biol Chem, 276(8), 2001, cc. 5836-5840) или транспортан (Pooga M. и др., Cell penetration by transportan. FASEB J, 12(1), 1998, cc. 67-77). Любые из описанных выше СРР можно
25 применять в качестве проникающего в клетку пептида, т.е. компонента а), в
комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении. В частности, компонент а), т.е. СРР, в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, может содержать минимальный домен ТАТ, имеющий аминокислотную последовательность YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2). В частности, компонент а), т.е. СРР, в
30 комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, может содержать пенетратин, который имеет аминокислотную последовательность RQIKIYFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1).
Различные СРР, которые можно использовать в качестве проникающего в клетку пептида, т.е. компонента а), в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, описаны также в обзоре Milletti F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17, (15-16), 2012, cc. 850-860). 5 Другими словами, СРР, описанные у Milletti F., Cell-penetrating: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16), 2012, cc. 850-860, можно применять в качестве проникающего в клетку пептида, т.е. компонента а), в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении. Они включают, в частности, катионные СРР, амфипатические СРР и гидрофобные СРР, а также СРР,
10 полученные из гепаран-, РНК- и ДНК-связывающих белков, (см. таблицу 1 у Millett, F., Cell-penetrating peptides penetrating: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16), 2012, cc. 850-860), СРР, полученные из сигнальных пептидов (см. таблицу у Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16), 2012, cc. 850-860),
15 СРР, полученные из антимикробных пептидов (см. таблицу 3 у Millett, F., Cell-penetrating peptides penetrating: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16), 2012, cc. 850-860), СРР, полученные из вирусных белков (см. таблицу 4 у Millett, F., Cell-penetrating peptides penetrating: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16), 2012, cc. 850-860), CPP,
20 полученные из различных природных белков (см. таблицу 5 у Millett, F., Cell-penetrating peptides penetrating: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16), 2012, cc. 850-860), а также сконструированные СРР и СРР, полученные из пептидных библиотек (см. таблицу 6 у Millett, F., Cell-penetrating peptides penetrating: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17
25 (15-16), 2012, cc. 850-860).
Предпочтительно проникающий в клетку пептид, который содержится в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении,
I) имеет длину аминокислотной последовательности указанного пептида, составляющую в целом 5-50 аминокислот, предпочтительно в целом 10-45
30 аминокислот, более предпочтительно в целом 15-45 аминокислот; и/или
II) имеет аминокислотную последовательность, содержащую минимальный домен белка ZEBRA, где указанный минимальный домен простирается от остатка 170 до остатка 220 аминокислотной последовательности ZEBRA,
II)
представленной в SEQ ID NO: 3, в которой необязательно 1 , 2, 3, 4 или 5
аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без
аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку, или
вариант последовательности указанного фрагмента.
5 Таким образом, проникающий в клетку пептид, который входит в комплекс,
предлагаемый в настоящем изобретение, предпочтительно
I) имеет длину аминокислотной последовательности указанного пептида, составляющую в целом 5-50 аминокислот, предпочтительно в целом 10-45 аминокислот, более предпочтительно в целом 15-45 аминокислот; и
10 II) имеет аминокислотную последовательность, содержащую минимальный
домен белка ZEBRA, где указанный минимальный домен простирается от остатка 170 до остатка 220 аминокислотной последовательности ZEBRA, представленной в SEQ ID NO: 3, в которой необязательно 1 , 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без
15 аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку, или вариант последовательности указанного фрагмента.
Указанные предпочтительные СРР описаны в WO 2014/041505. Понятие "ZEBRA" (которое имеет также обозначения Zta, Z, ЕВ 1 или BZLF1), как правило, обозначает основанный на лейциновой молнии (bZIP)
20 активатор транскрипции вируса Эпштейна-Барра (EBV). Минимальный домен ZEBRA, который обладает способностью проникать в клетку, идентифицирован в виде домена, простирающегося от остатка 170 до остатка 220 ZEBRA. Аминокислотная последовательность ZEBRA представлена в NCBI, код доступа YP 401673, и содержит 245 аминокислотных остатков, указанных в SEQ ID NO:
25 3:
MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLW PVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQN QQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAP ARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSS 30 ENDRLRLLLKQMCP SLD VD SIIPRTPD VLHEDLLNF
(SEQ ID NO: 3 - аминокислотная последовательность ZEBRA (встречающаяся в естественных условиях последовательность из вируса Эпштейна-Барра (EBV)) (YP 401673)).
В настоящее время описано, что СРР из вирусного белка ZEBRA трансдуцирует карго-белки через биологические мембраны как путем (I) непосредственной транслокации, так и путем (II) опосредуемого липидным рафтом (плотом) эндоцитоза (Rothe R., Liguori L., Villegas-Mendez A., Marques 5 В., Grunwald D., Drouet E. и др. Characterization of the cell-penetrating properties of the Epstein-Barr virus ZEBRA trans-activator. The Journal of biological chemistry 285(26), 2010, cc. 20224-20233). При создании настоящего изобретения высказано предположение о том, что эти два механизма проникновения должны усиливать ограниченную по ГКГС класса I и II презентацию карго-антигенов как
10 CD8+-, так и СВ4+-Т-клеткам соответственно. Таким образом, указанный СРР
может доставлять полиэпитопные пептиды к дендритным клеткам (DC), и затем усиливать активацию CTL и Th-клеток и противоопухолевую функцию. Таким образом, указанный СРР может эффективно доставлять комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, к антигенпрезентирующим клеткам (АРС) и
15 приводить к ограниченной по ГКГС класса I и II презентации полиэпитопных антигенов.
В контексте настоящего изобретения понятие "ГКГС класса I" обозначает один из двух основных классов молекул главного комплекса гистосовместимости. Молекулы ГКГС класса I (которые обозначают также как
20 "ГКГС I") обнаружены на каждой имеющей ядро клетке организма. Функция ГКГС класса I состоит в презентации эпитопа цитотоксическим клеткам (CTL). У людей молекулы ГКГС класса I состоят из двух полипептидных цепей, а- и Р2-микроглобулина (Ь2т). Только а-цепь является полиморфной и кодируется геном HLA, а Ь2т-субъединица не является полиморфной и кодируется геном
25 бета-2 микроглобулина. В контексте настоящего изобретения понятие "ГКГС класса II" означает другой основной класс молекул главного комплекса гистосовместимости. Молекулы ГКГС класса II (которые обозначают также как ГКГС II") обнаружены только в небольшом количестве специализированных клеточных типов, включая макрофаги, дендритные клетки и В-клетки, которые
30 все относятся к антигенпрезентирующим клеткам (АРС).
Предпочтительно последовательности варианта фрагмента минимального домена ZEBRA, описанного выше, характеризуется, в частности по всей длине, идентичностью аминокислотной последовательности, составляющей по меньшей
мере 70%, по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, с аминокислотной последовательностью 5 фрагмента минимального домена ZEBRA, описанного выше, без аннулирования способности проникающего в клетку пептида проникать в клетку. В частности, под "фрагментом" минимального домена ZEBRA, описанного выше, предпочтительно подразумевается его укороченная последовательность, т.е. аминокислотная последовательность, укороченная на N-конце, С-конце и/или
10 внутри последовательности по сравнению с аминокислотной
последовательностью нативной последовательности. Кроме того, указанный "фрагмент" минимального домена ZEBRA предпочтительно в целом состоит из 5-50 аминокислот, предпочтительно в целом состоит из 10-45 аминокислот, более предпочтительно в целом состоит из 15-45 аминокислот.
15 Таким образом, понятие "вариант последовательности" в контексте
настоящего изобретения, т.е. в настоящем описании, относится к любому изменению в референс-последовательности. Понятие "вариант последовательности" включает варианты нуклеотидной последовательности и варианты аминокислотной последовательности. Предпочтительно референс-
20 последовательность представляет собой любую из последовательностей,
указанную в "Таблице последовательностей и номеров SEQ ГО" (Перечень последовательностей), т.е. SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 79. Предпочтительно вариант последовательности характеризуется, в частности по всей длине последовательности, идентичностью последовательности, составляющей по
25 меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере
80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, с референс-последовательностью, где идентичность последовательности рассчитывают указанным ниже методом. В
30 частности, вариант последовательности сохраняет специфическую функцию
референс-последовательности. Идентичность последовательности рассчитывают с помощью описанного ниже метода. В частности, вариант аминокислотной последовательности имеет измененную последовательность, в которой одна или
несколько аминокислот в референс-последовательности удалена или заменена, или одна или несколько аминокислот встроены в последовательность аминокислотной референс-последовательности. В результате изменений вариант аминокислотной последовательности имеет аминокислотную 5 последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99%, идентична референс-последовательности. Например,
10 варианты последовательностей, идентичные по меньшей мере на 90%, имеют не более 10 изменений, т.е. любую комбинацию делеций, инсерций или замен, на 100 аминокислот референс-последовательности.
В контексте настоящего изобретения подразумевается, что аминокислотная последовательность "характеризуется идентичностью последовательности",
15 составляющей по меньшей мере, например, 95% с запрашиваемой
аминокислотной последовательность, предлагаемой в настоящем изобретении, означает, что последовательность рассматриваемой аминокислотной последовательности идентична запрашиваемой последовательности за исключением того, что рассматриваемая аминокислотная последовательность
20 может включать вплоть до 5 аминокислотных изменений на каждые 100
аминокислот запрашиваемой аминокислотной последовательности. Другими словами, для получении аминокислотной последовательности, имеющей последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% запрашиваемой аминокислотной последовательности, вплоть до 5% (5 из 100) аминокислотных
25 остатков в рассматриваемой последовательности можно встраивать или заменять на другую аминокислоту или изымать путем делеции, предпочтительно в соответствии с приведенными выше определениями вариантов или фрагментов. Это же, естественно, применимо также к сходству нуклеотидных последовательностей.
30 Для (аминокислотных или нуклеотидных) последовательностей, не
имеющих точного соответствия, "% идентичности" первой последовательности можно определять относительно второй последовательности. В целом, эти две последовательности, подлежащие сравнению, выравнивают для получения
максимальной корреляции между последовательностями. Это может включать встраивание "брешей" в любую одну или обе последовательности для повышения степени выравнивания. Затем можно определять % идентичности по всей длине каждой из сравниваемых последовательностей (так называемое 5 глобальное выравнивание), что наиболее пригодно для последовательностей
одинаковой или сходной длины, или для более коротких определенных длин (так называемое локальное выравнивание), что наиболее пригодно для последовательностей неодинаковой длины.
Методы сравнения идентичности и гомологии двух или большего
10 количества последовательностей хорошо известны в данной области. Процент идентичности двух последовательностей можно определять, например, с помощью математического алгоритма. Предпочтительным примером математического алгоритма, который можно применять, является (но не ограничиваясь только ими) алгоритм, описанный у Karlin и др., PNAS USA, 90,
15 1993, cc. 5873-5877. Указанный алгоритм интегрирован в семейство программ BLAST, например, программу BLAST или NBLAST (см. также Altschul и др., J. Mol. Biol. 215, 1990, cc. 403-410 или Altschul и др., Nucleic Acids Res, 25, 1997, cc. 3389-3402), доступные через домашнюю страницу NCBI в Интернете ncbi.nlm.nih.gov), и FASTA (Pearson, Methods Enzymol. 183, 1990, cc. 63-98;
20 Pearson и Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 1988, cc. 2444-2448.). С
помощью указанных программ можно идентифицировать последовательности, идентичные в определенной степени другим последовательностям. Кроме того, программы доступны в Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 9.1 (Devereux и др., Nucleic Acids Res., 1984, cc. 387-395), например, программы
25 BESTFIT и GAP, которые можно применять для определения % идентичности между двумя полинуклеотидами и % идентичности и % гомологии или идентичности между двумя полипептидными последовательностями. В BESTFIT применяют алгоритм "локальной гомологии", предложенный Smith и Waterman, J. Mol. Biol. 147, 1981, cc. 195-197.), и этот алгоритм позволяет находить
30 наилучшую единичную область сходства между двумя последовательностями. Более предпочтительно фрагменты проникающего в клетку пептида, предлагаемого в изобретении, или их варианты, описанные выше, сохраняют также способность пептида презентировать карго-молекулу, такую как антигены
или антигенные эпитопы на поверхности клетки, такой как
антигенпрезентирующая клетка, в контексте молекул ГКГС класса I и/или ГКГС класса П. Способность проникающего в клетку пептида или комплекса, содержащего указанный проникающий в клетку пептид, презентировать карго-5 молекулу, такую как антигены или антигенные эпитопы на поверхности клетки, такой как антигенпрезентирующая клетка, в контексте молекул ГКГС класса I и/или ГКГС класса II можно оценивать стандартными методами, известными специалисту в данной области, включая способность стимулировать пролиферацию и/или функцию ограниченных по ГКГС CD4+- или CD8-T-
10 клеток со специфическими для них эпитопами.
Предпочтительный проникающий в клетку пептид, который I) имеет длину аминокислотной последовательности указанного пептида, составляющую в целом 5-50 аминокислот, предпочтительно в целом 10-45 аминокислот, более предпочтительно в целом 15-45 аминокислот; и/или
15 II) имеет аминокислотную последовательности, содержащую фрагмент
минимального домена ZEBRA, где указанный минимальный домен простирается от остатка 170 до остатка 220 аминокислотной последовательности ZEBRA, представленной в SEQ ID NO: 3, в которой необязательно 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без
20 аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку, или вариант указанного фрагмента,
предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну консервативную аминокислотную замену по сравнению с референс-последовательностью, это означает, что данный
25 аминокислотный остаток заменен на остаток, имеющий сходные физико-химические характеристики.
Как правило, замены одной или нескольких аминокислот, присутствующих в аминокислотной референс-последовательности, должны представлять собой консервативные замены. Примеры консервативных замен включают замену
30 одного алифатического остатка на другой, например, замену друг на друга Не, Val, Leu или Ala, или замены одного полярного остатка на другой, например, замены между Lys и Arg; Glu и Asp или Gin и Asn. Хорошо известны и другие указанные консервативные замены, например, замены полных областей,
имеющих сходные гидрофобные свойства (Kyte и Doolittle, 1J. Mol. Biol. 157(1), 1982, cc. 105-132). Замены одной или нескольких L-аминокислот на одну или несколько D-аминокислот могут рассматриваться в качестве консервативных замен в контексте настоящего изобретения. Примеры аминокислотных замен 5 представлены ниже в таблице 1:
Наиболее предпочтительно предпочтительный проникающий в клетку пептид, который
10 I) имеет длину аминокислотной последовательности указанного пептида,
составляющую в целом 5-50 аминокислот, предпочтительно в целом 10-45 аминокислот, более предпочтительно в целом 15-45 аминокислот; и/или
II) имеет аминокислотную последовательности, содержащую фрагмент минимального домена ZEBRA, где указанный минимальный домен простирается
15 от остатка 170 до остатка 220 аминокислотной последовательности ZEBRA, представленной в SEQ ID NO: 3, в которой необязательно 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без
аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку, или вариант указанного фрагмента,
содержит замену Cys (С) на Ser (S) в эквивалентном положении 189 в аминокислотной последовательности ZEBRA, представленной в SEQ ID NO: 3.
Таким образом, предпочтительно, чтобы указанный предпочтительный проникающий в клетку пептид имел аминокислотную последовательность, содержащую последовательность следующей общей формулы (I):
Х1Х2ХзХ4Х5Х6Х7Х8Х9Х1оХ118Х1зХ14Х15Х16Х17
в которой 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку, в которой
Xi обозначает К, R или Н, предпочтительно Xi обозначает К или R;
Х2 обозначает R, К или Н, предпочтительно Х2 обозначает R или К;
Х3 обозначает Y, W или F, предпочтительно Х3 обозначает Y, W или F;
Х4 обозначает К, R или Н, предпочтительно Х4 обозначает К или R;
Х5 обозначает N или Q;
Xg обозначает R, К или Н, предпочтительно Xg обозначает R или К; Х7 обозначает V, I, М, L, F или А, предпочтительно Х7 обозначает V, I, М или L;
Х8 обозначает А, V, L, I или G, предпочтительно Х8 обозначает А или G; Х9 обозначает S или Т;
Хю обозначает R, К или Н, предпочтительно Хю обозначает R или К; Хц обозначает К, R или Н, предпочтительно Хц обозначает К или R; Х13 обозначает R, К или Н, предпочтительно Х13 обозначает R или К; Х14 обозначает А, V, L, I или G, предпочтительно Х14 обозначает А или G; Х15 обозначает К, R или Н, предпочтительно Х15 обозначает К или R; Xi6 обозначает F, L, V, I, Y, W или М, предпочтительно Xi6 обозначает F, Y или W; и
Х17 обозначает К, R или Н, предпочтительно Х17 обозначает К или R.
Предпочтительно указанный пептид, полипептид или белок состоит либо (полностью) из L-аминокислот, либо (полностью) из D- аминокислот, образуя "ретро-инвертированные пептидные последовательности". Понятие "ретро-инвертированные (пептидные) последовательности относится к изомеру 5 линейной пептидной последовательности, в которой направление
последовательности является обратным и хиральность каждого аминокислотного остатка изменена на противоположную (см., например, Jameson и др., Nature, 368, 1994, cc. 744-746; Brady др., Nature, 368, 1994, cc. 692-693).
В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку 10 пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше общей формулой (I), в которой X! обозначает К.
В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку
пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше
общей формулой (I), в которой Х2 обозначает R.
15 В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку
пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше общей формулой (I), в которой Х3 обозначает Y.
В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше 20 общей формулой (I), в которой Х4 обозначает К.
В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше общей формулой (I), в которой Х5 обозначает N.
В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку 25 пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше общей формулой (I), в которой Х6 обозначает R.
В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку
пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше
общей формулой (I), в которой Х7 обозначает V.
30 В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку
пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше общей формулой (I), в которой Xg обозначает А.
В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше общей формулой (I), в которой Х9 обозначает S.
В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку 5 пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше общей формулой (I), в которой Х10 обозначает R.
В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку
пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше
общей формулой (I), в которой Хц обозначает К.
10 В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку
пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше общей формулой (I), в которой Х13 обозначает R.
В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше 15 общей формулой (I), в которой Х14 обозначает А.
В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше общей формулой (I), в которой Х15 обозначает К.
В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку 20 пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше общей формулой (I), в которой Х16 обозначает F.
В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку
пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше
общей формулой (I), в которой Х17 обозначает К.
25 В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку
пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше общей формулой (I), в которой аминокислотный остаток в положении, эквивалентном положению 12 в общей формуле (I), представляет собой Ser (S).
Предпочтительно также предпочтительный проникающий в клетку пептид, 30 который
I) имеет длину аминокислотной последовательности указанного пептида, составляющую в целом 5-50 аминокислот, предпочтительно в целом 10-45 аминокислот, более предпочтительно в целом 15-45 аминокислот; и/или
II) имеет аминокислотную последовательности, содержащую фрагмент
5 минимального домена ZEBRA, где указанный минимальный домен простирается от остатка 170 до остатка 220 аминокислотной последовательности ZEBRA, представленной в SEQ ID NO: 3, в которой необязательно 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку, или
10 вариант указанного фрагмента,
содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, которая состоит из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4-13 или вариантов указанных последовательностей, не аннулирующих способность указанного пептида проникать в клетку, предпочтительно
15 вариантов последовательности, в которой 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку.
СРР1 (Z11):
20 KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMC (SEQ ID NO: 4)
СРР2 (Z12):
KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK 25 (SEQ ID NO: 5)
CPP3 (Z13):
KR YKNR V A S RK S R AKFK Q LL QH YRE V A A AK S S ENDRLRL LLK (SEQ ID NO: 6)
CPP4 (Z14):
KR YKNR V A S RK S R AKFK Q LL QH YRE V A A AK (SEQ ID NO: 7)
СРР5 (Z15):
KR YKNR V A S RK S R AKFK (SEQ ID NO: 8)
CPP6 (Z16):
QHYRE V A A AK S SEND (SEQ ID NO: 9)
10 CPP7 (Z17):
QLLQHYREVAAAK (SEQ ID NO: 10)
CPP8 (Z18): 15 RE V A A AK S S END RLRLLLK (SEQ ID NO: 11)
CPP9 (Z19): KRYKNRVA 20 (SEQ ID NO: 12)
CPP10 (Z20): VASRKSRAKFK (SEQ ID NO: 13)
Таким образом, особенно предпочтительным является проникающий в клетку пептид, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13), SEQ ID NO: 7 (CPP4/Z14), SEQ ID NO: 8 (CPP5/Z15) или SEQ ID NO: 11 (CPP8/Z18), или варианты этой последовательности, не аннулирующие 30 способность указанного пептида проникать в клетку, предпочтительно варианты последовательности, в которой 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку. Кроме того, более предпочтительным является
проникающий в клетку пептид, который имеет аминокислотную последовательность, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13) или SEQ ID NO: 7 (CPP4/Z14) или вариантов указанной последовательности, не аннулирующих способность 5 указанного пептида проникать в клетку, предпочтительно вариантов
последовательности, в которой 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку. Кроме того, наиболее предпочтительным является проникающий в клетку пептид, который имеет аминокислотную
10 последовательность, содержащую или состоящую из аминокислотной
последовательности SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13) или вариантов указанной последовательности, не аннулирующих способность указанного пептида проникать в клетку, предпочтительно вариантов последовательности, в которой 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены
15 без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, имеет аминокислотную последовательность, которая содержит или состоит из SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13).
20 В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения
проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, имеет аминокислотную последовательность, которая содержит или состоит из SEQ ID NO: 7 (CPP4/Z14).
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения 25 проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, имеет
аминокислотную последовательность, которая содержит или состоит из SEQ ID NO: 8 (CPP5/Z15).
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, имеет 30 аминокислотную последовательность, которая содержит или состоит из SEQ ID NO: 11 (CPP8/Z18).
Как должно быть очевидно специалисту в данной области, первичная аминокислотная последовательность проникающего в клетку пептида,
предлагаемого в изобретении, может быть подвергнута дополнительной посттрансляционной модификации, такой как гликозилирование или фосфорилирование, без отклонения от объема изобретения.
В следующем варианте осуществления изобретения проникающий в клетку 5 пептид, предлагаемый в изобретении, необязательно дополнительно содержит помимо его аминокислотной последовательности, описанной выше, любой из следующих компонентов или любую комбинацию следующих компонентов:
(I) сигнал ядерной локализации (NLS). Такие сигналы хорошо известны специалисту в данной области и описаны у Nair и др., Nucleic Acids Res. 31(1),
10 2003, cc. 397-399),
(II) нацеливающий (таргетирующий) пептид, включая пептиды хоминга опухолей, такие как описанные у Кароог и др., PLoS ONE 7(4), 2012, е35187) и перечисленные в in-http://crdd.osdd.net/raghava/tumorhope/general.php?
Предпочтительно проникающий в клетку пептид, предлагаемый в 15 изобретении, связан с антигеном или антигенным эпитопом и облегчает
клеточную интернализацию указанного антигена или антигенного эпитопа.
Комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать только один проникающий в клетку пептид или несколько проникающих в клетку пептидов. Предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем 20 изобретении, содержит не более пяти проникающих в клетку пептидов, более предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит не более четырех проникающих в клетку пептидов, еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит не более трех проникающих в клетку пептидов, наиболее предпочтительно комплекс, 25 предлагаемый в настоящем изобретении, содержит не более двух проникающих в клетку пептидов, и наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит только один проникающий в клетку пептид. Компонент б) - Антиген/антигенный эпитоп
Комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит в качестве 30 компонента б) по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп.
В контексте настоящего описания "антиген" представляет собой субстанцию любой структуры, которая служит в качестве мишени для рецепторов, участвующих в адаптивном иммунном ответе, в частности, в
качестве мишени для антител, Т-клеточных рецепторов и/или В-клеточных рецепторов. "Эпитоп", который называют также "антигенной детерминантой", представляет собой часть (или фрагмент) антигена, которая распознается иммунной системой, в частности, антителами, Т-клеточными рецепторами и/или В-клеточными рецепторами. Так, один антиген имеет по меньшей мере один эпитоп, т.е. один антиген имеет один или несколько эпитопов. В контексте настоящего изобретения понятие "эпитоп" главным образом применяют для обозначения Т-клеточных эпитопов, которые презентируются на поверхности антигенпрезентирующей клетки, где они связаны с главным комплексом гистосовметистимости (ГКГС). Т-клеточные эпитопы, которые презентируются молекулами ГКГС класса I, как правило, но не всегда, представляют собой пептиды, состоящие из 8-11 аминокислот, в то время как молекулы ГКГС класса II презентируют более длинные пептиды, как правило, но не всегда, состоящие из 12-25 аминокислот.
Предпочтительно в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп выбран из группы, которая состоит из: (I) пептида, полипептида или белка, (II) полисахарида, (III) липида, (IV) липопротеина или липопептида, (V) гликолипида, (VI) нуклеиновой кислота и (VII) низкомолекулярного лекарственного средства или токсина. Таким образом, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп может представлять собой пептид, белок, полисахарид, липид, их комбинацию, включающую липопротеины и гликолипиды, нуклеиновую кислоту (например, ДНК, siPHK, shPHK, антисмысловые олигонуклеотиды, ДНК-ловушка, плазмида), или низкомолекулярное лекарственное средство (например, циклоспорин А, паклитаксел, доксорубицин, метотрексат, 5-аминолевулиновая кислота), или любую их комбинацию, в частности, если предлагаемый в изобретении комплекс содержит более одного антигена или антигенного эпитопа.
Очевидно, что по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп может содержать, например, по меньшей мере один, т.е. один или несколько пептидов, полипептидов или белков, связанных вместе, и/или по меньшей мере одну, т.е. одну или несколько нуклеиновых кислот, например, каждая из которых кодирует один пептид или полипептид. Кроме того, по меньшей мере
один антиген или антигенный эпитоп может представлять собой комбинацию белка, липида и/или полисахарида, включая липопротеины и гликолипиды. Так, в частности, если комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит более одного антигена или антигенного эпитопа, то он может содержать более одного пептида, полипептида или белка, более одного полисахарида, более одного липида, более одного липопротеина, более одного гликолипида, более одной нуклеиновой кислоты, более одного низкомолекулярного лекарственного средства или токсина, или их комбинацию.
Предпочтительно комплекс, предлагаемый в изобретении, содержит по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, содержащий один или несколько эпитоп(ов), выбранный(ых) из ассоциированного с раком/опухолью антигена, специфического для рака/опухоли антигена и/или антигенного белка из патогена, включая антигенный белок из вирусов, бактерий, грибов, простейших и многоклеточных паразитов.
Более предпочтительно по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп содержит или состоит из (I) по меньшей мере одного эпитопа патогена и/или (II) по меньшей мере из одного ракового/опухолевого эпитопа, в частности, по меньшей мере из одного опухолевого эпитопа. Наиболее предпочтительно по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп содержит или состоит по меньшей мере из одного ракового/опухолевого эпитопа, в частности, по меньшей мере из одного опухолевого эпитопа.
Наиболее предпочтительно, когда комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит только такой(ие) антиген(ы) или антигенный(ые) эпитоп(ы), который(ые) представляет(ют) собой ассоциированный(ые) с раком/опухолью антиген(ы), специфический(ие) для рака/опухоли антиген(ы) и/или раковый(ые)/опухолевый(ые) эпитоп(ы); в частности, представляющий(ие) собой ассоциированный(ые) с раком/опухолью антиген(ы), специфический(ие) для рака/опухоли антиген(ы) и/или раковый(ые)/опухолевый(ые) эпитоп(ы).
В контексте настоящего описания "раковый эпитоп" означает эпитоп из ассоциированного с раком антигена или из специфического для рака антигена. Соответственно "опухолевый эпитоп" означает эпитоп из ассоциированного с опухолью антигена или из специфического для опухоли антигена. Указанные эпитопы, как правило, являются специфическими (или ассоциированы) для
определенного типа рака/опухоли. Например, раковые/опухолевые эпитопы включают эпитопы глиомы. В частности, ассоциированные с раком/опухолью (также связанные с раком/опухолью) антигены представляют собой антигены, которые экспрессируются как на раковых/опухолевых клетках, так и на здоровых клетках. Соответственно такие антигены в норме присутствуют с рождения (или даже до рождения). Соответственно существует шанс, что у иммунной системы разовьется самотолерантность к таким антигенам. В отличие от этого, специфические для рака/опухоли антигены представляют собой антигены, которые экспрессируются специфически раковыми/опухолевыми клетками, но не здоровыми клетками. Специфические для рака/опухоли антигены включают, в частности, неоантигены. В целом, неоантигены представляют собой антигены, которые не присутствовали ранее и поэтому являются "новыми" для иммунной системы. Неоантигены, как правило, являются результатом соматических мутаций. Касательно раковых/опухолевых, специфических для рака/опухоли неоантигенов, то они, как правило, не присутствуют до развития рака/опухоли и специфические для рака/опухоли неоантигены, как правило, кодируются соматическими генными мутациями в раковых клетках/опухолевых клетках. Поскольку неоантигены являются новыми для иммунной системы, то считается, что риск самотолерантности к этим антигенам является более низким, чем к ассоциированным с раком/опухолью антигенам. Однако каждый набор опухолеспецифических мутаций, вероятно, является уникальным. Соответственно в контексте настоящего изобретения предпочтительно, чтобы указанные специфические для рака/опухоли антигены, в частности неоантигены, были идентифицированы у индивидуума с диагностированным раком с помощью методов, известных специалисту в данной области, например, путем секвенирования ракового генома. После идентификации соответствующие специфические для рака/опухоли неоантигены и/или специфические для рака/опухоли эпитопы неоантигенов применяют в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении.
Предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит один или несколько ассоциированных с раком/опухолью эпитопов и/или один или несколько ассоциированных с раком/опухолью антигенов (но предпочтительно не содержит специфические для рака/опухоли эпитопы).
Предпочтительно также, чтобы комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержал один или несколько специфических для рака/опухоли эпитопов и/или один или несколько специфических для рака/опухоли антигенов (но предпочтительно не содержал ассоциированные с раком/опухолью эпитопы). Комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, можно также предпочтительно содержать как (I) один или несколько ассоциированных с раком/опухолью эпитопов и/или один или несколько ассоциированных с раком/опухолью антигенов, так и (II) один или несколько специфических для рака/опухоли эпитопов и/или один или несколько специфических для рака/опухоли антигенов
Приемлемые раковые/опухолевые эпитопы можно найти, например, в базах данных раковых/опухолевых эпитопов, например, у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, в которых человеческие опухолевые антигены, распознаваемые CD4+- или CD8-T-клетками классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их экспрессии, или из базы данных "Tantigen" (ТANTIGEN , версия 1.0, 1 декабря 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/). Примеры раковых/опухолевых эпитопов включают, например, полученные из TRP2-эпитопы, эпитопы антигена гликопротеина 100 (gp 100), ассоциированного с меланомой, эпитопы антигена гликопротеина 70 (gp70), эпитопы сурвивина, 1Еа-эпитопы, IL13ra2, Epha2 (эфриновый рецептор 2 типа А), их иммуногенные фрагменты и слияния указанных антигенов и/или фрагментов. Кроме того, примеры раковых/опухолевых эпитопов включают эпитопы неоантигенов, таких, например, как неоантиген из опухолевых клеток линии МС-38, описанный у Yadav и др., Nature, 515(7528), 27 ноября 2014 г., сс. 572-576. Как описано выше, неоантигены представляют собой антигены, которые полностью отсутствуют в геноме здорового человека. По сравнению с немутантными аутоантигенами неоантигены актуальные для контроля опухоли, поскольку на качество Т-клеточного пула, доступного для этих антигенов, не влияет центральная Т-клеточная толерантность. В частности, основой неоантигенов могут быть индивидуальные опухолевые геномы. Потенциальные неоантигены можно
предсказывать методами, известными специалисту в данной области, такими как секвенирование ракового генома или технологии глубокого секвенирования, позволяющие идентифицировать мутации в кодирующей белок области (ракового) генома.
5 Конкретными примерами ассоциированных с раком/опухолью, в частности
связанных с опухолью или тканеспецифических антигенов, которые можно применять в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, являются (но, не ограничиваясь только ими) следующие антигены: предстательная железа: простат специфический антиген (PSA), простатспецифический мембранный
10 антиген (PSMA), PAP, PSCA (PNAS 95(4), 1998, сс. 1735-1740), антиген муцина простаты (РМА) (Beckett и Wright, Int. J. Cancer 62, 1995, cc. 703-710), простаза, Her-2neu, SPAS-1; меланома: TRP-2, тирозиназа, Melan A/Mart-1, gplOO, BAGE, GAGE, ганглиозид GM2; молочная железа: Her2-neu, кинезин 2, ТАТА-элемент модулирующего фактора 1, опухолевый белок D52, MAGE D, ING2, HIP-55,
15 TGF-1 антиапоптозный фактор, HOM-Mel-40/SSX2, эпителиальный антиген (LEA 135), антиген DF31MUC1 (Apostolopoulos и др., Immunol. Cell. Biol. 74,
1996, cc. 457-464; Pandey и др., Cancer Res. 55, 1995, cc. 4000-4003); яички: MAGE-1, HOM-Mel-40/SSX2, NY-ESO-1; ободочная кишка: EGFR, CEA; легкое: MAGE D, EGFR; яичник: Her-2neu; мочевой пузырь: переходно-клеточная
20 карцинома (ТСС) (Jones и др., Anticancer Res. 17, 1997, cc. 685-687), некоторые Формы рака: Epha2, Epha4, PCDGF, НААН, мезотелин; ЕРСАМ; NY-ESO-1, гликопротеин MUC1 и муцины NIUC10 р5 (особенно мутантные версии), EGFR; смешанная опухоль: ассоциированный с раком сывороточный антиген (CASA) и раковый антиген 125 (СА 125) (Kierkegaard и др., Gynecol. Oncol. 59, 1995, cc.
25 251-254), эпителиальный гликопротеин 40 (EGP40) (Kievit и др., Int. J. Cancer 71,
1997, cc. 237-245), антиген плоскоклеточной карциномы (SCC) (Lozza и др., Anticancer Res. 17, 1997, cc. 525-529), катепсин Е (Mota и др., Am. J Pathol. 150, 1997, cc. 1223-1229), тирозиназа в меланоме (Fishman и др., Cancer 79, 1997, сс. 1461-1464), ядерный антиген клеток (PCNA) церебральных каверном (Notelet и
30 др., Surg. Neurol. 47, 1997, сс. 364-370), ассоциированный с опухолью
аутоантиген 35 kD в папиллярной тиреоидной карциноме (Lucas и др., Anticancer Res. 16, 1996, сс. 2493-2496), CDC27 (включая мутантную форму белка), антигены триозофосфатизомеразы, 707-АР, микобактериальный антиген А60
(Macs и др., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 122, 1996, cc. 296-300), аннексии II, AFP, ART-4, BAGE, р-катенин/m, BCL-2, bcr-abl, bcr-abl pl90, bcr-abl p210, BRCA-1, BRCA-2, CA 19-9 (Tolliver и O'Brien, South Med. J. 90, 1997, cc. 89-90; Tsuruta и др., Urol. Int. 58, 1997, cc. 20-24), CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK-4/m, 5 CEA (Huang и др., Exper Rev. Vaccines 1, 2002, cc. 49-63), CT9, CT10, Cyp-B, Dek-cain, DAM-6 (MAGE-B2), DAM-10 (MAGE-B1), EphA2 (Zantek и др., Cell Growth Differ. 10, 1999, cc. 629-638; Carles-Kinch и др., Cancer Res. 62, 2002, cc. 2840-2847), EphA4 (Cheng и др., Cytokine Growth Factor Rev. 13, 2002, cc. 75-85), ассоциированный с опухолью антиген Томсена-Фриденрайха (Dahlenborg и др.,
10 Int. J Cancer 70, 1997, сс. 63-71), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, GnT-V, gplOO (Zajac и др., Int. J Cancer 71, 1997, cc. 491-496), HAGE, HER2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, hTRT, iCE, ингибиторы апоптоза (например, сурвивин), антиген аденокарциномы КН-1 (Deshpande и Danishefsky, Nature 387,
15 1997, сс. 164-166), KIAA0205, K-ras, LAGE, LAGE-1, LDLR/FUT, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-6, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE D, MART-1, MART-l/Melan-A (Kawakami и Rosenberg, Int. Rev. Immunol. 14, 1997, cc. 173-192), MC1R, MDM-2, миозин/m, MUC1, MUC2, MUM-
20 1, MUM-2, MUM-3, нео-полиА-полимераза, NA88-A, NY-ESO-1, NY-ESO-la
(CAG-3), PAGE-4, PAP, протеиназа 3 (Molldrem и др., Blood 88, 1996, cc. 24502457; Molldrem и др., Blood 90, 1997, cc. 2529-2534), P15, pl90, Pml/RARa, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RAS, RCAS1, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SP17, SPAS-1, TEL/AML1, TPI/m, тирозиназа, TARP, TRP-1
25 (gp75), TRP-2, TRP-2/INT2, WT-1 и альтернативно транслируемые белки NY-ESO-ORF2 и CAMEL, полученные из генов NY-ESO-1 и LAGE-1. В данной области хорошо известны многочисленные другие раковые антигены.
Предпочтительно раковый/опухолевый антиген или раковый /опухолевый эпитоп представляет собой рекомбинантный раковый/опухолевый антиген или
30 рекомбинантный раковый/опухолевый эпитоп. Указанный рекомбинантный
раковый/опухолевый антиген или рекомбинантный раковый/опухолевый эпитоп можно создавать путем интродукции мутаций, который изменяют (добавление, делеция или замена) конкретные аминокислоты во всей аминокислотной
последовательности нативного ракового/опухолевого антигена или нативного ракового/опухолевого эпитопа. Интродукция мутаций не изменяет раковый/опухолевый антиген или раковый/опухолевый эпитоп столь сильно, чтобы его уже нельзя было применять в качестве универсального для видов млекопитающих и предпочтительно человека или собак, но изменяют его в достаточной степени, чтобы образовавшаяся аминокислотная последовательность нарушала толерантность или рассматривалась как чужеродный антиген для создания иммунного ответа. Другим путем может являться создание консенсусного рекомбинантного ракового/опухолевого антигена или ракового/опухолевого эпитопа, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере на 85% и вплоть до 99% последовательности соответствующего нативного ракового/опухолевого антигена или нативного ракового/опухолевого эпитопа; предпочтительно идентичность последовательности составляет по меньшей мере 90% и вплоть до 98% и; более предпочтительно идентичность последовательности составляет по меньшей мере 93% и вплоть до 98%; или еще более предпочтительно идентичность последовательности составляет по меньшей мере 95% и вплоть до 98%. В некоторых случаях аминокислотная последовательность рекомбинантного ракового/опухолевого антигена или рекомбинантного ракового/опухолевого эпитопа идентична на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности соответствующего нативного ракового/опухолевого антигена или нативного ракового/опухолевого эпитопа. Нативный раковый/опухолевый антиген представляет собой антиген, ассоциированный в норме с конкретным раком или конкретной раковой опухолью. В зависимости от ракового/опухолевого антигена консенсусная последовательность ракового/опухолевого антигена может присутствовать в видах млекопитающих или в подтипах видов или вирусных штаммах или серотипах. Некоторые раковые/опухолевые антигены не отличаются значительно от аминокислотной последовательности дикого типа ракового/опухолевого антигена. Вышеописанные подходы можно объединять так, чтобы конечный рекомбинантный раковый/опухолевый антиген или раковый/опухолевый эпитоп имел указанный выше процент сходства с аминокислотной последовательностью нативного ракового антигена. Однако предпочтительно аминокислотная
последовательность эпитопа ракового/опухолевого антигена, указанного в настоящем описании, не является мутантной и, следовательно, является идентичной референс-последовательности эпитопа.
В контексте настоящего описания понятие "эпитоп патогена" означает 5 эпитоп антигенного белка, антигенного полисахарида, антигенного липида,
антигенного липопротеина или антигенного гликолипида из патогена, включая вирусы, бактерии, грибы, простейших и многоклеточных паразитов. Антигенные белки, полисахариды, липиды, липопротеины или гликолипиды из патогенов включают в контексте настоящего описания белки, полисахариды, липиды,
10 липопротеины и гликолипиды соответственно из патогенов, ответственных за заболевания, которые могут являться мишенью для вакцинации, включая, например, амебиаз, сибирскую язву, язву Бурули {Mycobacterium ulcerans), ассоциированную с калицивирусом диарею, кампилобактериальную диарею, рак шейки матки (папилломатоз человека), ассоциированные с Chlamydia trachomatis
15 болезни половой системы, холеру, геморрагическую лихорадку Крым-Конго, лихорадку Денге, дифтерию, геморрагическую лихорадку Эбола, диарею, связанную с энтеропатогенной кишечной палочкой (ЕТЕС), рак желудка {Helicobacter pylori), гонорею, болезни, ассоциированные со стафилококком группы А, болезни, ассоциированные со стафилококком группы В, пневмонию и
20 инвазивное заболевание, связанное с Haemophilus influenzae В, диарею, связанную с вирусом гепатита А, гепатита В, гепатита С, гепатита Е, генитальные язвы, связанные с вирусом герпеса простого типа 2, ВИЧ/СПИД, болезнь, связанная с нематодами, грипп, Японский энцефалит, лихорадку Ласса, лейшманиоз, лептоспироз, рак печени (гепатит В), рак печени (гепатит С),
25 болезнь Лайма, малярию, геморрагическую лихорадку Марбург, корь,
эпидемический паротит, назофарингеальный рак (вирус Эпштейна-Барра), менингит, связанный с Neisseria meningitidis , пневмонию, связанную с вирусом парагриппа, коклюш, чуму, полиомиелит, бешенство, пневмонию, связанную с респираторно-синцитиальным вирусом (RSV), лихорадку Рифт-Валли, диарею,
30 связанную с ротавирусом, краснуху, шистосомоз, серьезный острый
респираторный синдром (SARS), шигеллез, оспу, болезни, ассоциированные с Staphylococcus aureus, рак желудка {Helicobacter pylori), стрептококковую пневмонию и инвазивное заболевание, столбняк, клещевой энцефалит, трахому,
туберкулез, туляремию, тифозную лихорадку, болезнь, ассоциированную с вирусом Западного Нила, желтую лихорадку.
Предпочтительно по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп должен презентироваться на клеточной поверхности в контексте ГКГС класса I 5 и/или ГКГС класса II, и/или в контексте CD1, при этом презентация на
клеточной поверхности в контексте ГКГС класса I и/или ГКГС класса II является предпочтительной. Понятие "презентация эпитопа в контексте ГКГС класса I" относится, в частности, СВ8+-эпитопу, расположенному в (пептид связывающей) бороздке молекулы ГКГС класса I на поверхности клетки. Понятие "презентация
10 эпитопа в контексте ГКГС класса II" относится, в частности, к СВ4+-эпитопу, расположенному в бороздке молекулы ГКГС класса II на поверхности клетки. Понятие "презентация эпитопа в контексте CD1" относится, в частности, к липидному эпитопу, расположенному в бороздке молекул кластера дифференцировки 1 на поверхности клетки.
15 Целесообразно, чтобы комплекс, предлагаемый в изобретении, содержал
проникающий в клетку пептид и по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп и обеспечивал транспорт и презентацию указанных эпитопов на клеточной поверхности антигенпрезентирующих клеток в контексте ГКГС класса I и ГКГС класса II, и поэтому его можно применять для вакцинации и
20 иммунотерапии.
Предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, который представляет собой по меньшей мере один СВ4+-эпитоп и/или по меньшей мере один С08+-эпитоп.
25 Понятия "CD4+-3nnTon" или "СВ4+-ограниченный эпитоп" в контексте
настоящего описания означают эпитоп, распознаваемый СВ4+-Т-клеткой, указанный эпитоп, в частности, состоит из фрагмента антигена, расположенного в бороздке молекулы ГКГС класса П. Единичный СВ4+-эпитоп, входящий в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, предпочтительно состоит
30 примерно из 12-25 аминокислот. Он может состоять, например, примерно из 825 аминокислот или примерно 6-100 аминокислот.
Понятия "CD8 -эпитоп" или "CD8 -ограниченный эпитоп" в контексте настоящего описания означают эпитоп, распознаваемый СВ8+-Т-клеткой, указанный эпитоп, в частности, состоит из фрагмента антигена, расположенного в бороздке молекулы ГКГС класса I. Единичный СВ8+-эпитоп, входящий в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, предпочтительно состоит примерно из 8-11 аминокислот. Он может состоять, например, примерно из 8-15 аминокислот или примерно 6-100 аминокислот.
Предпочтительно по меньшей мере один антиген может содержать или по меньшей мере один антигенный эпитоп может состоять из СВ4+-эпитопа и/или СВ8+-эпитопа, соответствующего антигенной(ым) детерминанте(ам) ассоциированного с раком /опухолью антигена, специфического для рака/опухоли антигена или антигенного белка из патогена. Более предпочтительно по меньшей мере один антиген может содержать или по меньшей мере один антигенный эпитоп может состоять из СВ4+-эпитопа и/или СВ8+-эпитопа, соответствующего антигенной(ым) детерминанте(ам) ассоциированного с раком/опухолью антигена или специфического для рака/опухоли антигена. Наиболее предпочтительно по меньшей мере один антиген может содержать или по меньшей мере один антигенный эпитоп может состоять из СВ4+-эпитопа и/или СВ8+-эпитопа, соответствующего антигенной(ым) детерминанте(ам) ассоциированного с опухолью антигена или специфического для опухоли антигена.
Предпочтительно также, чтобы комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержал по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопа, где по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп содержит или состоит из СВ4+-эпитопа и по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп содержит или состоит из СВ8+-эпитопа. В настоящее время установлено, что Т^-клетки (CD4+) играют основную роль в противоопухолевым иммунном ответе, как в активности ДНК, так и в рекрутменте и поддержании CTL (CD8+) в области опухоли. Таким образом, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержащий по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопа, где по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп содержит
или состоит из CD4 -эпитопа и по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп содержит или состоит из СВ8+-эпитопа, обеспечивает интегрированный иммунный ответ, позволяющий одновременно примировать CTL и Т^-клетки, и поэтому является предпочтительным для иммунитета против только одного СВ8+-эпитопа или только одного СВ4+-эпитопа. Например, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении может предпочтительно содержать Еальфа-СБ4+-эпитоп и gpl00-CD8+-3nnTon.
Предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопа, где по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопа содержат или состоят по меньшей мере из двух, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или большего количества С04+-эпитопов и/или по меньшей мере из двух, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или большего количества СВ8+-эпитопов. При этом, по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопа предпочтительно представляют собой различные антигены или антигенные эпитопы, более предпочтительно по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопа отличаются друг от друга, но относятся к одному типу опухоли. Полиантигенная вакцина должна (I) предотвращать избыточный рост вариантов без антигена, (II) нацеливаться на различные опухолевые клетки в гетерогенной опухолевой массе и (III) преодолевать вариабельность опухолей от пациента к пациенту. Таким образом, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, наиболее предпочтительно содержит по меньшей мере четыре антигена или антигенных эпитопа, в частности, по меньшей мере два СВ8+-эпитопа и по меньшей мере два СВ4+-эпитопа. Указанный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, индуцирует синергетическую функциональную активность полиэпитопных CD8-CTL и CD4-Т^-клеток в отношении опухолевых клеток и усиливает эффективность противоопухолевого иммунитета. Т^-клетки участвуют также в поддержании длительного клеточного иммунитета, который обнаружен после вакцинации. Указанный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, индуцирует поликлональные полиэпитопные иммунные ответы и полифункциональные CD8+- и СВ4+-Т-клетки, и поэтому обладает эффективной противоопухолевой активностью.
Предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопы, более предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере три антигена или антигенных эпитопа, еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере четыре антигена или антигенных эпитопа, более предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере пять антигенов или антигенных эпитопов и наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере шесть антигенов или антигенных эпитопов. Антигены или антигенные эпитопы, входящие в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, могут быть одинаковыми или различными, предпочтительно антигены или антигенные эпитопы, входящие в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, отличаются друг от друга. Предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере один CD4-эпитоп и по меньшей мере один СВ8+-эпитоп.
Предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит более одного СВ4+-эпитопа, например, два или большее количество С04+-эпитопов из одного и того же антигена или из различных антигенов, и предпочтительно не содержит СВ8+-эпитоп. Предпочтительно также комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит более одного СВ8+-эпитопа, например, два или большее количество СВ8+-эпитопов из одного и того же антигена или из различных антигенов, и предпочтительно не содержит CD4-эпитоп. Однако наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит (I) по меньшей мере один СВ4+-эпитоп, например, два или большее количество СВ4+-эпитопов из одного и того же антигена или из различных антигенов, и (II) по меньшей мере один СВ8+-эпитоп, например, два или большее количество СВ8+-эпитопов из одного и того же антигена или из различных антигенов.
Например, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может предпочтительно содержать gpl00-CD8+-3nnTon, Еальфа-СВ4+-эпитоп и
дополнительный CD4 -эпитоп и дополнительный CD8 -эпитоп. Еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать полипептид или белок, содержащий gpl00-CD8+-3nnTon и Еальфа-С04+-эпитоп. Например, указанный полипептид или белок, входящий в 5 комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14, или вариантов указанной последовательности, указанных выше: ESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGS
10 SEQ ID NO: 14 (МА05-карго-молекула, содержащая эпитопы OVA-CD4+,
gpl00-CD8+, Еальфа-СТ> 4+ и OVA-CD8+).
Например, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать также gp70-CD8+-3nnTon и/или gp70-CD4+-3nnTon. В частности, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать
15 полипептид или белок, содержащий gp70-CD8+-3nnTon и/или gp70-CD4+-3nnTon. Например, указанный полипептид или белок, входящий в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 43, или вариантов указанной последовательности, указанных выше:
20 VTYHSPSYAYHQFERRAILNRLVQFIKDRI
SEQ ID NO: 43 (Мас18-карго-молекула, содержащая эпитопы gp70-CD8+ и gp70-CD4+).
Например, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может предпочтительно содержать по меньшей мере один эпитоп сурвивина, такой как
25 С08+-эпитоп сурвивина и/или С04+-эпитоп сурвивина. Более предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать полипептид или белок, содержащий С08+-эпитоп сурвивина и/или С04+-эпитоп сурвивина. Более предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать полипептид или белок, содержащий более одного
30 СВ8+-эпитопа сурвивина и/или более одного СВ4+-эпитопа сурвивина,
например, два различных СВ8+-эпитопа сурвивина. Например, указанный
полипептид или белок, входящий в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 44, или вариантов указанной последовательности, указанных выше: 5 NYRIATFKNWPFLEDCAMEELTVSEFLKLDRQR
SEQ ID NO: 44 (Mad 11-карго-молекула, содержащая С08+-эпитоп 1 сурвивина и С08+-эпитоп 2 сурвивина).
Например, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может предпочтительно содержать эпитоп из неоантигена. Еще более предпочтительно
10 комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать полипептид или белок, содержащий эпитоп из неоантигена, такого как неоантиген из опухолевых клеток линии МС-38, идентифицированный Yadav и др. Nature.515(7528), 27 ноября 2014 г., сс. 572-576. Например, указанный полипептид или белок, входящий в комплекс, предлагаемый в настоящем
15 изобретении, содержит или состоит из аминокислотной последовательности,
представленной в SEQ ID NO: 42, или вариантов указанной последовательности,
указанных выше:
HLEL ASMTNMELMS SIV
SEQ ID NO: 42 (Mad9-кapгo-мoлeкyлa, содержащая эпитоп из неоантигена,
20 описанного у Yadav и др. Nature.515(7528), 27 ноября 2014 г., сс. 572-576.
Например, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может предпочтительно содержать более одного, например, два или три эпитопа из неоантигенов. Еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать полипептид или белок, содержащий более
25 одного, например, два или три эпитопа из неоантигенов, таких как неоантигены из опухолевых клеток линии МС-38, идентифицированные Yadav и др. Nature.515(7528), 27 ноября 2014 г., сс. 572-576. Например, указанный полипептид или белок, входящий в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит или состоит из аминокислотной последовательности,
30 представленной в SEQ ID NO: 63, или вариантов указанной последовательности, указанных выше:
LFRAAQLANDVVLQIMEHLELASMTNMELMSSIVVISASIIVFNLLELEG
SEQ ID NO: 63 (Mad 12-карго-молекула, содержащая эпитоп из неоантигена, описанного у Yadav и др. Nature.515(7528), 27 ноября 2014 г., сс. 572-576.
Предпочтительно по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, входящий в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет 5 собой пептид, полипептид или белок. Примеры антигена или антигенного эпитопа пептидной, полипептидной или белковой природы, которые можно применять в изобретении, включают раковые/опухолевые антигены или их антигенные эпитопы, аллергические антигены или их антигенные эпитопы, аутоиммунные аутоантигены или их антигенные эпитопы, антиогены патогенов
10 или их антигенные эпитопы, и антигены или их антигенные эпитопы из вирусов, предпочтительно из таких вирусов, как цитомегаловирус (CMV), ортопоксивирус натуральной оспы, ортопоксивирус белой оспы, парапоксивирус овец, вирус контагиозного моллюска, вирус герпеса простого 1, вирус герпеса простого 2, вирус герпеса В, варицелла-зостер вирус, вирус псевдобешенства,
15 человеческий цитомегаловирус, человеческий вирус герпеса 6, человеческий вирус герпеса 7, вирус Эпштейна-Барра, человеческий вирус герпеса 8, вирус гепатита В, вирус лихорадки Чикунгунья, вирус лихорадки О'Ньонг-Ньонг, рубивирус, вирус гепатита С, GB-вирус С, вирус Западного Нила, вирус Денге, вирус желтой лихорадки, вирус энцефаломиелита овец, вирус энцефалита Сент-
20 Луис, вирус японского энцефалита В, вирус Повассан, FSME-вирус, SARS, SARS-ассоциированный короновирус, человеческий короновирус 229Е, человеческий короновирус Ос43, торовирус, человеческий Т-клеточный лимфотропный вирус типа I, человеческий Т-клеточный лимфотропный вирус типа II, ВИЧ (СПИД), т.е. вирус иммунодефицита человека типа 1 или вирус
25 иммунодефицита человека типа 2, вирус гриппа, вирус Ласса, вирус
лимфоцитарного хориомененгита, вирус Такарибе, вирус Хунин, вирус Мачупо, вирус болезни Борна, вирус Буньямвера, вирус калифорнийского энцефалита, вирус лихорадки Рифт-Валли, вирус флеботомной лихорадки, вирус Тоскана, вирус геморрагической лихорадки Крым-Конго, вирус Хазара, вирус Хасан,
30 вирус Хантаан, вирус Сеул, вирус проспекта Хилл, вирус Пуумала, вирус Добрава-Белград, вирус Тула, вирус Син Номбре, Марбург-вирус озера Виктория, вирус Эбола Заир, вирус Эбола Судан, вирус Эбола Берег Слоновой Кости, вирус гриппа А, вирус гриппа В, вирус гриппа С, вирус парагриппа,
малярийный паразит {Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi), Марбург-вирус, вирус кори, вирус эпидемического паротита, респираторно-сцинтиляционный вирус, человеческий метапневмовирус, индийский вирус везикулярного стоматита, 5 вирус бешенства, вирус Мокола, вирус Дувенхаге, Европейский лисавирус
летучих мышей 1+2, Австралийский лисавирус летучих мышей, аденовирус А-F, вирус папилломы человека, вирус кондиломы 6, вирус кондиломы 11, вирус полиомы, аденоассоциированный вирус 2, ротавирус, орбивирус, вирус оспы, включая вирус ветряной оспы и т.д., или антигены или антигенные эпитопы из
10 лейшманий, трипаносом, амеб, бактерий и т.д., или можно выбирать из эпитопов или из вариантов указанных выше антигенов или антигенных эпитопов. Предпочтительно эпитопы, а также варианты антигенов, указанных выше, характеризуются гомологией или идентичностью последовательности, составляющей примерно 10%, в частности, по меньшей мере 10%, примерно
15 20%, в частности, по меньшей мере 20%, примерно 30%, в частности, по меньшей мере 30%, примерно 40%, в частности, по меньшей мере 40%, примерно 50%, в частности, по меньшей мере 50%, примерно 60%, в частности, по меньшей мере 60%, примерно 70%, в частности, по меньшей мере 70%, примерно 80%, в частности, по меньшей мере 80%, примерно 90%, в частности,
20 по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98%, с антигенами или последовательностями антигенов, представленными или описанными выше. В этом контексте определения эпитопов и вариантов соответствуют указанным выше.
Примеры антигенов или антигенных эпитопов, относящихся к категории
25 пептида, полипептида или белка, включают комбинацию нескольких эпитопов глиомы, например, описанных у Novellino и др., Cancer Immunol Immunother, 54(3), 2005, сс. 187-207, Vigneron и др. Cancer Immun.13, 2013, с. 15). Однако индивидуальный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать также только поднабор, т.е. один или несколько из всех указанных
30 эпитопов глиомы. В таком случае предпочтительно различные комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат различные поднаборы указанных эпитопов глиомы, так что, например, вакцина, предлагаемая в настоящем изобретении, содержащая различные комплексы, предлагаемые в
настоящем изобретении, содержит все указанные эпитопы глиомы, но распределенные в различные комплексы.
Кроме того, комплекс, предлагаемый в изобретении, может содержать также по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, где указанный антиген или антигенный эпитоп представляет собой полисахарид, липид, липопротеин и/или гликолипид, в частности, полисахаридный, липидный, липопротеиновый и/или гликолипидный эпитоп, который может, например, представлять собой эпитопы патогена, указанные в настоящем описании.
В частности, комплекс, предлагаемый в изобретении, может содержать по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, где указанный антиген или антигенный эпитоп представляет собой полисахаридный, липидный, липопротеиновый и/или гликолипидный эпитоп, включая антигены или антигенные эпитопы вирусов, бактерий, грибов, простейших и многоклеточных паразитов.
Предпочтительно указанные эпитопы должны презентироваться на клеточной поверхности в контексте ГКГС класса I и/или ГКГС класса П.
Предпочтительно указанные липидные эпитопы должны презентироваться на клеточной поверхности в контексте CD1 (кластер дифференцировки 1).
Комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, где антиген или антигенный эпитоп представляет собой низкомолекулярное лекарственное средство или токсин.
Примеры карго-молекул, относящихся к категории низкомолекулярных лекарственных средств или токсинов, которые можно применять согласно изобретению, включают циклоспорин А, паклитаксел, доксорубицин, метотрексат, 5-аминолевулиновую кислоту, дифтерийный токсин, сунитиниб и молекулы, сведения о которых обобщены у De wit Amer, Neuro Oncol, 12(3), 2010, cc. 304-316).
Комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит несколько антигенов или антигенных эптопов, в частности, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или большее количество антигенов или антигенных эпитопов, более предпочтительно комплекс,
предлагаемый в настоящем изобретении, содержит (по меньшей мере) два или три антигена или антигенных эпитопа, еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит (по меньшей мере) четыре или пять антигенов или антигенных эпитопов.
Если в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, входит более одного антигена или антигенного эпитопа, то очевидно, что указанный антиген или антигенный эпитоп, в частности, также ковалентно связан в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, например, с другим антигеном или антигенным эпитопом и/или с компонентом а), т.е. проникающим в клетку пептидом, и/или с компонентом в), т.е. пептидным агонистом TLR.
Различные антигены или антигенные эпитопы, входящие в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, могут быть одинаковыми или различными. Предпочтительно различные антигены или антигенные эпитопы, входящие в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, отличаются друг от друга, что приводит к образованию полиантигенного и/или полиэпитопного комплекса.
Кроме того, предпочтительно, чтобы несколько антигенов или антигенных эпитопов, в частности, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или большее количество антигенов или антигенных эпитопов, располагались последовательно в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении. Это означает, в частности, что все антигены и/или антигенные эпитопы, входящие в комплекс, располагаются в виде участка, который не прерывается ни компонентом а), т.е. проникающим в клетку пептидом, ни компонентом в), т.е. пептидным агонистом TLR. Предпочтительно, компонент а) и компонент в) расположены в комплексе, например, перед или после такого участка, состоящего из всех антигенов и/или антигенных эпитопов. Однако антигены и/или антигенные эпитопы, расположенные таким последовательным образом, могут соединяться друг с другом, например, с помощью спейсера или линкера, описанного ниже, который не является ни компонентом а), т.е. проникающим в клетку пептидом, ни компонентом в), т.е. пептидным агонистом TLR.
Однако в альтернативном варианте различные антигены и/или антигенные эпитопы могут располагаться любым иным образом в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, например, когда компонент а) и/или компонент в)
расположены между двумя или большим количеством антигенов и/или антигенных эпитопов, т.е. один или несколько антигенов и/или антигенных эпитопов расположены между компонентом а) и компонентом в) (или наоборот) и необязательно один или несколько антигенов и/или антигенных эпитопов 5 расположены соответственно на другом конце компонента а) и/или компонента в).
Очевидно, что несколько различных антигенов или антигенных эпитопов, связанных с одним и тем же типом болезни, в частности, одним и тем же типом опухоли, целесообразно объединять в одном комплексе, предлагаемом в
10 настоящем изобретении. Альтернативно этому, несколько различных антигенов или антигенных эпитопов, связанных с одним и тем же типом болезни, в частности, одним и тем же типом опухоли, можно подразделять на поднаборы различных антигенов или антигенных эпитопов, в частности, поднаборы, дополняющие друг друга в контексте определенного типа болезни, например,
15 опухоли, которые входят в различные комплексы, предлагаемые в настоящем
изобретении, при этом указанные различные комплексы, содержащие различные поднаборы, целесообразно вводить одновременно, например, в виде одной вакцины, индивидууму, который нуждается в этом.
Предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении,
20 содержит по меньшей мере один опухолевый эпитоп, представляющий собой эпитоп антигена, выбранного из группы, состоящей из ЕрСАМ, HER-2/neu, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, КОС1, VEGFR, phCG, сурвивина, СЕА, TGFpR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART, ПЛЗЯальфаг, CMV, EGFRvIII, EphA2, gplOO, hTert, TRP-2, YKL-40, бревикана, нейролигина 4 и PTPRzl. Более
25 предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере один опухолевый антиген, выбранный из группы, состоящей из ЕрСАМ, HER-2/neu, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, КОС1, VEGFR, phCG, сурвивина, СЕА, TGFpR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART, ПЛЗЯальфаг, CMV, EGFRvIII, EphA2, gplOO, hTert, TRP-2, YKL-40, бревикана,
30 нейролигина 4 и PTPRzl или его фрагмента, варианта последовательности опухолевого антигена или варианта последовательности его фрагмента. Предпочтительно также комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере один опухолевый эпитоп, который представляет
собой эпитоп антигена, выбранного из антигенов глиомы, описанных у Reardon D.A. и др., An update on vaccine therapy and other immunotherapeutic approaches for glioblastoma. Expert Rev Vaccines, 12(6), 2013, cc. 597-615.
В контексте настоящего описания "фрагмент" антигена содержит по 5 меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот антигена, предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот антигена, более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот антигена, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных
10 аминокислот антигена и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот антигена. "Вариант последовательности", указанный выше, означает вариант последовательности, имеющий (аминокислотную) последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более
15 предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична референс-последовательности. "Функциональный" вариант последовательности означает в контексте антигена/фрагмента антигена/эпитопа, что функция эпитопа(ов),
20 например, входящего(их) в антиген (фрагмент), не нарушена или утрачена. Однако предпочтительно аминокислотная последовательность эпитопа(ов), например, входящего(их) в антиген (фрагмент), указанный в настоящем описании, не изменена в результате мутации и поэтому идентична референс-последовательности эпитопа.
25 Как описано выше, приемлемые раковые/опухолевые эпитопы указанных
антигенов известны из литературы или их можно идентифицировать с использованием баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun, 2013; URL:
30 http://www.cancerimmunity.org/peptide/, в которых человеческие опухолевые
антигены, распознаваемые CD4+- или СВ8+-Т-клетками классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их экспрессии, или из базы данных "Tantigen" (TANTIGEN , версия 1.0, 1 декабря 2009 г., созданной Bioinformatics
Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/). EpCAM
EpCam представляет собой гликопротеин, который опосредует клеточную 5 адгезию. Аминокислотная последовательность ЕрСАМ представлена ниже:
MAPPQVLAFGLLLAAATATFAAAQEECVCENYKLAVNCFVNNNRQCQCT SVGAQNTVICSKLAAKCLVMKAEMNGSKLGRRAKPEGALQNNDGLYDPDCDE SGLFKAKQCNGTSMCWCVNTAGVRRTDKDTEITCSERVRTYWIIIELKHKAREK PYDSKSLRTALQKEITTRYQLDPKFITSILYENNVITIDLVQNSSQKTQNDVDIAD 10 VAYYFEKDVKGESLFHSKKMDLTVNGEQLDLDPGQTLIYYVDEKAPEFSMQGL KAGVIAVIVVVVIAVVAGIVVLVISRKKRMAKYEKAEIKEMGEMHRELNA [SEQ ID NO: 47]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую 15 SEQ ID NO: 47, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании.
Специалисту в данной области известно несколько эпитопов ЕрСАМ. Предпочтительный эпитоп ЕрСАМ, который предпочтительно входит в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, включает следующий эпитоп (представленная ниже последовательность эпитопа представляет собой фрагмент 20 вышеуказанной последовательности ЕрСАМ, и он подчеркнут в указанной выше последовательности ЕрСАМ; указанная ниже эпитопная последовательность может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам): GLKAGVIAV 25 [SEQ ID NO: 48]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержат аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 48.
HER-2/neu
30 Нег-2 принадлежит к семейству EGFR (рецептор эпидермального фактора
роста). Специалисту в данной области известно много эпитопов HLA-A. Аминокислотная последовательность HER2 представлена ниже:
MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHL YQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVR GTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQR NPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSED 5 CQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICE LHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHN QEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFG SLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNL QVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPW
10 DQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFL RGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACA HYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGC PAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVE PLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAI
15 KVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCL LDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNH VKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTV WELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRP RFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAE
20 EYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPL APSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVA PLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKD VFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTF KGTPTAENPEYLGLDVPV
25 [SEQ ID NO: 70]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 70, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании. Как описано выше, приемлемые раковые/опухолевые эпитопы Нег-2
30 известны из литературы или их можно идентифицировать с использованием баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun, 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/,
в которых человеческие опухолевые антигены, распознаваемые CD4 - или CD8 -Т-клетками классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их экспрессии, или из базы данных "Tantigen" (ТANTIGEN , версия 1.0, 1 декабря 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber 5 Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/). Муцин-1 (MUC-1)
MUC-1 представляет собой человеческий эпителиальный муцин, оказывающий воздействие на адгезию клеток. Аминокислотная последовательность MUC-1 представлена ниже:
10 MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKN AVSMTSSVLSSHSPGSGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATWGQDVTSVPVTRP ALGSTTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPA HGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS
15 TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTR PAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPA HGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTR
20 PAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPA HGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTR PAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS
25 APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPA HGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNVTSASGSASGSASTLVHNGTSARATTT PASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSSVPPLTSSNHSTSPQLSTGVS FFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGS
30 VVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSG AGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPM SEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL [SEQ ID NO: 49]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 49, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании.
Специалисту в данной области известно несколько эпитопов MUC-1. 5 Предпочтительные эпитопы MUC-1, которые предпочтительно входят в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, включает следующие эпитопы (представленные ниже последовательности эпитопов представляют собой фрагмент вышеуказанной последовательности MUC-1, и они подчеркнуты в указанной выше последовательности MUC-1; каждая из указанных ниже 10 эпитопных последовательностей может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам):
GSTAPPVHN [SEQ ID NO: 50]
TAPPAHGVTS 15 [SEQ ID NO: 51]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержат аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 50, и/или аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 51. 20 ТОММ34
ТОММ34 участвует в импорте белков-предшественников в митохондрии. Много его этипотов известно специалисту в данной области.
RNF 43
RNF43 представляет собой ЕЗ-убиквитинлигазу RING-типа и, вероятно, 25 содержит трансмембранный домен, ассоциированный с протеазой домен,
эктодомен и цитоплазматический RING-домен. Вероятно, RNF43 обеспечивает отрицательную регуляцию передачи сигналов Wnt, и экспрессия RNF43 приводит к повышению убиквитинизации рецепторов Фрайззлед, изменяет их субклеточное распределение, что приводит к пониженному уровню этих 30 рецепторов на поверхности. Многие его эпитопы известны специалисту в данной области.
К0С1
KOC1, также известный как мРНК-связывающий белок 3
инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2BP3), представляет собой мРНК
связывающий белок. Однако отсутствуют данные о его экспрессии.
5 Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF)/ рецептор сосудистого
эндотелиального фактора роста (VEGFR)
Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), который первоначального называли фактором сосудистой проницаемости (VPF), представляет собой сигнальный белок, продуцируемый клетками, которые
10 стимулируют васкулогенез и ангиогенез. Он является частью системы, которая восстанавливает поставку кислорода к тканям, когда нарушается циркуляция крови. Обычная функция VEGF состоит в создании новых кровеносных сосудов в процессе эмбрионального развития, новых кровеносных сосудов после повреждения, мышц после физической нагрузки и новых сосудов
15 (колоректальная циркуляция) для обхода блокированных сосудов. Известно три основных подтипа рецепторов для VEGF (VEGFR), а именно, VEGFR1, VEGFR2 и VEGFR3.
Бета-субъединица человеческого хорионического гонадотропина (phCG) Человеческий хорионический гонадотропин (hCG) представляет собой 20 гормон, продуцируемый эмбрионом после имплантации. Некоторые раковые
опухоли продуцируют этот гормон; поэтому обнаруженные повышенные уровни у пациента, который не является беременным, могут способствовать диагностике рака. hCG является гетердимером, у которого а- (альфа) -субъединица идентична субъединице лютеинизирующего гормона (LH), 25 фолликулостимулирующего гормона (FSH), тиреотропного гормона (TSH), а Р-(бета)-субъединица является уникальной для hCG. Р-субъединица hCG гонадотропина (бета-hCG) содержит 145 аминокислот и кодируется шестью высоко гомологичными генами. Сурвивин
30 Сурвивин, который называют также бакуловирусным ингибитором мотива
апоптозных повторов 5 или BIRC5, является представителем семейства ингибиторов апоптоза (IAP). Функции белка сурвивина состоят в ингибировании активации каспазы, что приводит к отрицательной регуляции апоптоза или
запрограммированной гибели клеток. Аминокислотная последовательность сурвивина представлена ниже:
MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENE PDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDR 5 ERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD [SEQ ID NO: 52]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании.
10 Специалисту в данной области известно несколько эпитопов сурвивина.
Предпочтительный эпитоп сурвивина, который предпочтительно входит в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, включает следующий эпитоп (представленная ниже последовательность эпитопа представляет собой фрагмент вышеуказанной последовательности сурвивина, и он подчеркнут в указанной
15 выше последовательности сурвивина; указанная ниже эпитопная
последовательность может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам): RISTFKNWPF [SEQ ID NO: 53]
20 Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем
изобретении, содержат аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 53.
Карциноэмбриональный антиген (СЕА)
СЕА представляет собой внутриклеточный адгезионный гликопротеин. 25 СЕА в норме продуцируется тканью желудочно-кишечной системы в процессе эмбрионального развития, но его производство прекращается перед рождением. Таким образом, СЕА, как правило, присутствует лишь в очень невысоких уровнях в крови здоровых взрослых. Аминокислотная последовательность СЕА представлена ниже:
30 MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEV LLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNAS LLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDA VAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKC
ETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYS WFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKP FITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLT LLSVTRNDVGPYECGIQNKLSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLS 5 LSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRT TVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPV SPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPII SPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYA CFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVAL 10 [SEQ ID NO: 54]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 54, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании. Специалисту в данной области известно несколько эпитопов СЕА. 15 Предпочтительные эпитопы СЕА, которые предпочтительно входят в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, включает следующие эпитопы (представленные ниже последовательности эпитопов представляют собой фрагмент вышеуказанной последовательности СЕА, и они подчеркнуты в указанной выше последовательности СЕА; каждая из указанных ниже эпитопных 20 последовательностей может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам):
YLSGANLNLS [SEQ ID NO: 55]
SWRINGIPQQ 25 [SEQ ID NO: 56
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержат аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 55, и/или аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 56.
30 Рецептор трансформирующего роста фактора бета 2 (TGFPR2)
TGFP-рецепторы представляют собой пересекающие клеточную мембрану единственный раз серин/треонинкиназные рецепторы. Они присутствуют в нескольких различных изоформах. TGFPR2 представляет собой
трансмембранный белок, который содержит протеинкиназный домен, образует гетеродимерный комплекс с другим рецепторным белком и связывается с TGF-бета. Указанный комплекс рецептор/лиганд фосфорилирует белки, которые затем проникают в ядро и регулируют транскрипцию поднабора генов, 5 связанных с клеточной пролиферацией. Р53
Р53 представляет собой белок-супрессор опухоли, который играет роль в предупреждении мутаций генома. Р53 обладает несколькими механизмами противоракового действия и играет роль в апоптозе, стабильности генома и
10 ингибировании ангиогенеза. Противораковую функцию р53 осуществляет посредством нескольких механизмов: он активирует белки репарации ДНК, когда ДНК существенно повреждена; он может прекращать рост путем удерживания клеточного цикла в точке регуляции G1/S при распознавании повреждения ДНК; и он может инициировать апоптоз.
15 Kirsten-подтип Ras (KRas)
ГТФаза KRas ,известная как вирусный онкогенный гомолог саркомы крыс V-Ki-ras2 Kirsten и KRAS, выполняет важную функцию в передаче сигналов в здоровой ткани, и мутация гена KRAS является важной стадией в развитии многих типов рака. Подобно другим представителям подсемейства ras, белок
20 KRAS представляет собой ГТФазу и является ранним участником многих путей трансдукции сигнала. KRAS, как правило, связан с клеточной мембраной благодаря присутствию изопреновой группы на его С-конце. Аминокислотная последовательность KRas представлена ниже:
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIOLIONHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGET
25 CLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVK DSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYT LVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM [SEQ ID NO: 57]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем 30 изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 57, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании.
Специалисту в данной области известно несколько эпитопов Kirsten Ras. Предпочтительный эпитоп Kirsten Ras, который предпочтительно входит в
комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, включает следующий эпитоп (представленная ниже последовательность эпитопа представляет собой фрагмент вышеуказанной последовательности Kirsten Ras, и он подчеркнут в указанной выше последовательности Kirsten Ras; указанная ниже эпитопная 5 последовательность может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам): VVVGAGGVG [SEQ ID NO: 58]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем 10 изобретении, содержат аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 58.
О-связанная N-ацетилглюкозамин (GlcNAc)-тpaнcфepaзa (OGT) OGT (О-связанная N-ацетилглюкозамин (GlcNAc)-тpaнcфepaзa, O-GlcNAc-трансфераза, OGTase, О-связанная N-ацетилглюкозаминилтрансфераза,
15 уридиндифосфо^-ацетилглюкозамин:полипептид бета-N-
ацетилглюкозаминилтрансферазы, белок О-связанной бета-N-ацетилглюкозаминтрансферазы) представляет собой фермент, имеющий систематическое (номенклатурное) название "УДФ^-ацетил-О-глюкозамин:белок-0-бета-^ацетил-0-глюкозаминил-трансфераза)". OGT
20 катализирует добавление одного N-ацетилглюкозамина в О-гликозидную связь к остаткам серина или треонина внутриклеточных белков. OGT является компонентом хозяйских биологических функций в организме человека. OGT участвует в устойчивости к инсулину в мышечных клетках и адипоцитах путем ингибирования фосфорилирования треонина 308 АКТ1, повышает скорость
25 IRS1-фосфорилирования (на серине 307 и серине 632/635), снижает трансдукцию инсулинового сигнала и гликозилирование компонентов пути трансдукции инсулинового сигнала. Кроме того, OGT катализирует внутриклеточное гликозилирование остатков серина и треонина путем добавления N-ацетилглюкозамина. Исследования продемонстрировали, что аллели OGT
30 являются жизненно важными для эмбриогенеза, и OGT необходима для
внутриклеточного гликозилирования и жизнеспособности эмбриональных стволовых клеток. OGT катализирует также пост-трансляционную
модификацию, которая изменяет факторы транскрипции и РНК-полимеразу II, однако конкретная функция этой модификации в целом неясна. Каспаза 5 (CASP5)
Каспаза 5 представляет собой фермент, который протеолитически
5 расщепляет другие белки в остатке аспарагиновой кислоты, и принадлежит к
семейству цистеиновых протеаз, которые называют каспазами. Она относится к
провоспалительным каспазам наряду с каспазой 1, каспазой 4 и мышиной
каспазой 4, гомологом каспазы 11, и играет роль в функции иммунной системы.
Колоректальный ассоциированный с опухолью антиген -1 (СОА-1)
10 СОА-1 идентифицирован в 2003 г. МассаШ с соавторами (Maccall, С. и др.,
Identification of a colorectal tumor-associated antigen (COA-1) recognized by CD4(+) T lymphocytes. Cancer Res, 63(20), 2003, cc. 6735-6743) в качестве белка с с высоким уровнем экспрессии в колоректальных клетках и клетках меланомы (данные не представлены). Его мутация может влиять на способность 15 дифференцированно распознавать опухолевые и здоровые клетки. Ассоциированный с меланомой антиген (MAGE)
Представители семейства генов MAGE (ассоциированный с меланомой антиген) из организма млекопитающих первоначально были описаны как полностью молчащие в тканях здоровых взрослых, за исключением мужских
20 зародышевых клеток, и иногда в плаценте. В противоположность этому,
указанные гены экспрессируются в различных видах опухолей. Таким образом, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, предпочтительно содержит антиген MAGE-семейства ("МАОЕ"-антиген) или его эпитоп. Из семейства MAGE предпочтительными являются, в частности, MAGE-АЗ и MAGE-D4, и
25 наиболее предпочтительным является MAGE-АЗ. Нормальная функция MAGE-АЗ в здоровых клетках неизвестна. MAGE-A3 представляет собой специфический для опухоли белок, и он идентифицирован на многих опухолях. Аминокислотная последовательность MAGE-A3 представлена ниже:
MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTL
30 GEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEF OAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKAFSSLQ LVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDC
APEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYE FLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHIS YPPLHEWVLREGEE [SEQ ID NO: 59]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем 5 изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 59, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании.
Специалисту в данной области известно несколько эпитопов MAGE-A3. Предпочтительный эпитоп MAGE-A3, который предпочтительно входит в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, включает следующий эпитоп 10 (представленная ниже последовательность эпитопа представляет собой фрагмент вышеуказанной последовательности MAGE-A3, и он подчеркнут в указанной выше последовательности MAGE-АЗ; указанная ниже эпитопная последовательность может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам): 15 KVAELVHFL
[SEQ ID NO: 60]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержат аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 60.
20 Антиген плоскоклеточной карциномы, распознаваемый Т-клетками (SART)
Среди семейства SART наиболее предпочтительным является SART-3. Таким образом, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, предпочтительно содержит антиген из SART-семейства (антиген "SART") или его эпитоп; комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, более
25 предпочтительно содержит SART-3 или его эпитоп. Антиген 3 плоскоклеточной карциномы, распознаваемый Т-клетками, несет опухолевые эпитопы, обладающие способностью индуцировать НЬА-А24-ограниченные и опухолеспецифические цитотоксические Т-лимфоциты у больных раком пациентов. SART-3, вероятно, участвует в регуляции сплайсинга мРНК.
30 ПЛЗЫальфаг
IL13Raльфa2 связывается с интерлейкином 13 (IL-13) с очень высокой аффинностью (и может поэтому секвестировать его), но не обусловливает связывание с IL-4. Он действует в качестве негативного регулятор и IL-13, и IL
4, однако его механизм действия пока не установлен. Аминокислотная последовательность 1ЫЗЯальфа2 представлена ниже:
MAFVCLAIGCLYTFLISTTFGCTSSSDTEIKVNPPQDFEIVDPGYLGYLYLQ WQPPLSLDHFKECTVEYELKYRNIGSETWKTIITKNLHYKDGFDLNKGIEAKIHT 5 LLPWQCTNGSEVQSSWAETTYWISPQGIPETKVQDMDCVYYNWQYLLCSWKP GIGVLLDTNYNLFYWYEGLDHALQCVDYIKADGQNIGCRFPYLEASDYKDFYIC VNGSSENKPIRSSYFTFQLQNIVKPLPPVYLTFTRESSCEIKLKWSIPLGPIPARCF DYEIEIREDDTTLVTATVENETYTLKTTNETRQLCFVVRSKVNIYCSDDGIWSEW SDKQCWEGEDLSKKTLLRFWLPFGFILILVIFVTG LLLRKPNTYPKMIPEFFCDT
10 [SEQIDNO:61]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 61, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании. Специалисту в данной области известно несколько эпитопов IL13Raльфa2.
15 Предпочтительный эпитоп IL13Raльфa2, который предпочтительно входит в
комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, включает следующий эпитоп (представленная ниже последовательность эпитопа представляет собой фрагмент вышеуказанной последовательности IL13Raльфa2, и он подчеркнут в указанной выше последовательности IL13Raльфa2; указанная ниже эпитопная
20 последовательность может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам): LPFGFIL [SEQ ID NO: 62]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем 25 изобретении, содержат аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 62. CMV
Человеческий цитомегаловирус (CMV), представитель семейства вирусов герпеса, пожизненно сохраняется в организме после, как правило, 30 нераспознанной инфекции. CMV является причиной наиболее часто
встречающейся условно-патогенной инфекции ЦНС у некоторых пациентов с ослабленным иммунитетом. После аутопсии нуклеиновую кислоту CMV можно обнаружить в ЦНС более 20% индивидуумов без заболеваний ЦНС, что
подтверждает тропизм CMV к клеткам ЦНС и свидетельствует о том, что CMV может пожизненно сохраняться в ЦНС, не оказывая (очевидного) вреда. Однако экспрессия белков и олигонуклеотидов CMV выявлена в большом проценте глиом (Cobbs C.S., Harkins L., Samanta M. и др., Human cytomegalovirus infection 5 and expression in human malignant glioma. Cancer Res. 62, 2002, cc. 3347-3350).
Предпочтительные антигены CMV описаны в WO 2009/155535, например, полипептид или его иммуногенный фрагмент, выбранный из группы, состоящей из капсидных полипептидов, относящихся к покровам полипептидов и оболочечных полипептидов; предпочтительно, выбранный из группы, состоящей
10 из уникально длинного фосфопротеина 83 (ppUL83; иначе называемый рр65), гликопротеина UL55 (gpUL55; иначе называемый gB), UL123 немедленно-раннего белка 1 (IE1), UL122 белка IE2, UL1 11А (иначе называемый mtrll), US28, ppUL32, ppUL65, ppUL80a, ppUL82, ppUL98a, ppUL99, gpUL4 (иначе называемый gp48), gpULip, gpUL18 (иначе называемый ГКГ), gpUL75 (иначе
15 называемый gH), gpULlOO, gpULHO (иначе называемый gM), gpUL115 (иначе называемый gL), pUL46, pUL48, pUL56, pUL86 (иначе называемый MCP), уникально короткого гликопротеина 10 (gpUSIO), gpUSl 1, гликопротеинового комплекса II (gcll), gp65 и gp93. Предпочтительно антиген CMV представляет собой полипептид или его иммуногенный фрагмент, который кодируется геном,
20 соответствующем штамму CMV , зарегистрированному в GENBANK, код
доступа ВК000394.2 или XI 7403.1. Кроме того, в WO 2009/155535 описаны также предпочтительные эпитопы CMV, такие как пептиды, которые содержат аминокислотные последовательности, описанные у Trivedi и др., Blood, 105, 2005, с. 2793 и в публикации заявки на патент США № 2005/0019344, и другие
25 эпитопы CMV, описанные в WO 2009/155535. EGFRvIII
Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR; ErbB-1; HER1 у людей) является представителем рецептора клеточной поверхности семейства внеклеточных белковых лигандов эпидермального фактора роста (EGF-30 семейство). EGFRvIII представляет собой мутантную форму EGFR, которая, как известно, играет важную роль в туморогенезе. Так, EGFRvIII представляет собой конститутивно активируемую тирозинкиназу, полученную в результате делеционной мутации в EGFR. Для EGFRvIII характерна выраженная
сверхэкспрессия клетками глиобластомы (Saikali S., и др., Expression of nine tumour antigens in a series of human glioblastoma multiforme: interest of EGFRvIII, IL-13Ralpha2, gplOO and TRP-2 for immunotherapy. J Neurooncol, 81(2), 2007, cc. 139-148), которые приобретают повышенную способность к отрицательной 5 регуляции роста, выживаемости, инвазии и рекрутменту новых кровеносных сосудов опухоли.
Специалисту в данной области известно несколько эпитопов EGFRvIII. Предпочтительный эпитоп EGFRvIII, который предпочтительно входит в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, включает следующий эпитоп 10 (представленная ниже эпитопная последовательность может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам):
LEEKKGNYVVTDHC [SEQ ID NO: 71]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем 15 изобретении, содержат аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 71. EphA2
Эфрины и их рецепторы (эфриновые рецепторы, "Eph") принадлежат к подсемейству белков, участвующих в имеющих решающее значение процессах
20 во время эмбрионального развития центральной нервной системы, включая аксональное наведение, клеточную миграцию и ангиогенез. Современные исследования позволили предположить, что Eph/эфрин сверхэкспрессируются клетками глиомы и передача ими сигналов влияет на рост, миграцию и инвацию клеток глиомы (Nakada М., Y. Hayashi и J. Hamada, Role of Eph/ephrin tyrosine
25 kinase in malignant glioma. Neuro Oncol, 13(11), 2011, cc. 1163-1170).
Идентифицировано 16 эфриновых рецепторов (Eph). Эфриновые рецепторы подразделяют на две группы на основе сходства последовательностей их внеклеточных доменов, их аффинности связывания с лигандами эфрином-А и эфрином-В. Eph-рецептор А2 (эфриновый рецептор типа-А 2) связывается с
30 лигандами в виде эфрина-А.
Аминокислотная последовательность EphA2 представлена ниже: MELQAARACFALLWGCALAAAAAAQGKEVVLLDFAAAGGELGWLTHPY GKGWDLMQNIMNDMPIYM Y S VCN VM S GD QDNWLRTNW V YRGE AERIFIELKF
TVRDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDF EARHVKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLA HFPETIAGSDAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLC QAGYEKVEDACQACSPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAP 5 QDPASMPCTRPPSAPHYLTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCW PESGECGPCEASVRYSEPPHGLTRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTS RSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTTSLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDS NSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGS GNLAVIGGVAVGVVLLLVLAGVGFFIHRRRKNQRARQSPEDVYFSKSEQLKPLK
10 TYVDPHTYEDPNQAVLKFTTEIHPSCVTRQKVIGAGEFGEVYKGMLKTSSGKKE VPVAIKTLKAGYTEKQRVDFLGEAGIMGQFSHHNIIRLEGVISKYKPMMIITEYM ENGALDKFLREKDGEFSVLQLVGMLRGIAAGMKYLANMNYVHRDLAARNILV NSNLVCKVSDFGLSRVLEDDPEATYTTSGGKIPIRWTAPEAISYRKFTSASDVWS FGIVMWEVMTYGERPYWELSNHEVMKAINDGFRLPTPMDCPSAIYQLMMQCW
15 QQERARRPKFADIVSILDKLIRAPDSLKTLADFDPRVSIRLPSTSGSEGVPFRTVSE WLESIKMQQYTEHFMAAGYTAIEKVVQMTNDDIKRIGVRLPGHQKRIAYSLLG LKDQVNTVGIPI [SEQ ID NO: 72]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем 20 изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 72, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании.
Как описано выше, приемлемые раковые/опухолевые эпитопы EphA2 известны из литературы или их можно идентифицировать с использованием баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen 25 P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined
tumor antigens. Cancer Immun, 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, в которых человеческие опухолевые антигены, распознаваемые CD4+- или CD8-Т-клетками классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их экспрессии, или из базы данных "Tantigen" (ТANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря 30 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/).
GplOO
Гликопротеин 100, gplOO или меланоцитный белок PMEL состоит из 661 аминокислоты и представляет собой трансмембранный гликопротеин типа I, которым обогащены меланосомы, представляющие собой продуцирующие 5 меланин органеллы в меланоцитах. GplOO участвует в созревании меланосом. Белок gp 100 представляет собой меланомный антиген, т.е. ассоциированный с опухолью антиген. Аминокислотная последовательность gp 100 представлена ниже:
MDLVLKRCLLHLAVIGALLAVGATKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQL 10 YPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQ VIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWK Т W GQ Y W Q VL GGP V S GL SIGT GR AML GTHTME VT V YHRRG S R S Y VP L АН S S S AF TITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQPLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWD FGDSSGTLISRALVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPGTTDGHRPT 15 AEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAES TGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAAQVTTTEWV ETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRY GSFSVTLDIVQGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPP AQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIMPGQE 20 AGLGQVPLIVGILLVLMAVVLASLIYRRRLMKQDFSVPQLPHSSSHWLRLPRIFC SCPIGENSPLLSGQQV [SEQ ID NO: 73]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую
25 SEQ ID NO: 73, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании. Как описано выше, приемлемые раковые/опухолевые эпитопы gp 100 известны из литературы или их можно идентифицировать с использованием баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor
30 antigens. Cancer Immun, 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, в
которых человеческие опухолевые антигены, распознаваемые CD4+- или CD8-Т-клетками классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их экспрессии, или из базы данных "Tantigen" (ТANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря
2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/). hTert
Теломеразная обратная транскриптаза (сокращенно TERT или hTERT у 5 людей) представляет собой каталитическую субъединицу фермента теломеразы, которая вместе с РНК-компонентом теломеразы (TERC) содержит наиболее важную единицу теломеразного комплекса. Теломеразы являются частью отдельной группы РНК-зависимых полимераз. Теломераза удлиняет теломеры в цепях ДНК, что позволяет стареющим клеткам, которые в ином случае
10 становятся постмитотическими и подвергаются апоптозу, превышать предел Хейфлика и становиться потенциально иммортализованными, что часто имеет место в случае раковых клеток. Аминокислотная последовательность hTert представлена ниже:
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRAL
15 VAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFAL LDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARC ALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVRE AGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTR GPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPW
20 DTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWM PGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGV CAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLW GSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPA AEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQ
25 SIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVV GARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFV LRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQ KAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEAS SGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGI
30 RRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVE DEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGF KAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVL QLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQ
WLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPS
DFKTILD
[SEQ ID NO: 74]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем 5 изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 74, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании. Как описано выше, приемлемые раковые/опухолевые эпитопы hTert известны из литературы или их можно идентифицировать с использованием баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen P., 10 Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun, 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, в которых человеческие опухолевые антигены, распознаваемые CD4+- или CD8-Т-клетками классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их экспрессии, или из базы данных "Tantigen" (ТANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря 15 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/). TRP-2
Родственный тирозиназе белок 2 (TRP-2, известный также как "L-DOPA-хром-таутомераза") является меланогенным ферментом. TRP-2 регулирует
20 переключение, которое контролирует долю карбоксилированных субъединиц в биополимере меланина. Таким образом, TRP-2 представляет собой меланосомный белок, участвующий в производстве меланина. Для него характерна также сверхэкпрессия в клетках глиобластомы. Аминокислотная последовательность TRP-2 представлена ниже:
25 MSPLWWGFLLSCLGCKILPGAQGQFPRVCMTVDSLVNKECCPRLGAESAN VCGSQQGRGQCTEVRADTRPWSGPYILRNQDDRELWPRKFFHRTCKCTGNFAG YNCGDCKFGWTGPNCERKKPPVIRQNIHSLSPQEREQFLGALDLAKKRVHPDY VITTQHWVGLLGPNGTQPQFANCSVYDFFVWLHYYSVRDTLLGGFFPWLKVYY YRFVIGLRVWQWEVISCKLIKRATTRQP
30 [SEQ ID NO: 75]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 75, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании.
Как описано выше, приемлемые раковые/опухолевые эпитопы TRP-2 известны из литературы или их можно идентифицировать с использованием баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor 5 antigens. Cancer Immun, 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, в
которых человеческие опухолевые антигены, распознаваемые CD4+- или CD8-Т-клетками классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их экспрессии, или из базы данных "Tantigen" (ТANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber 10 Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/). YKL-40
YKL-40 (известный также как гликопротеин-39 человеческих хрящей (НС gp-39) и хитиназа-3-подобный белок 1 (CHI3L1)) представляет собой секретируемый гликопротеин, и он является представителем 18 семейств
15 гликозилгидролаз. Название YKL-40 происходит от трех N-концевых аминокислот, которые присутствуют на секретируемой форме, и его молекулярной массы. YKL-40 секретируется различными типами клеток, включая хондроциты, синовиальные клетки, макрофаги и некоторые типы раковых клеток. Аминокислотная последовательность YKL-40 представлена
20 ниже:
MGVKASQTGFVVLVLLQCCSAYKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRF LCTHIIYSFANISNDHIDTWEWNDVTLYGMLNTLKNRNPNLKTLLSVGGWNFGS QRFSKIASNTQSRRTFIKSVPPFLRTHGFDGLDLAWLYPGRRDKQHFTTLIKEMK AEFIKEAQPGKKQLLLSAALSAGKVTIDSSYDIAKISQHLDFISIMTYDFHGAWR 25 GTTGHHSPLFRGQEDASPDRFSNTDYAVGYMLRLGAPASKLVMGIPTFGRSFTL ASSETGVGAPISGPGIPGRFTKEAGTLAYYEICDFLRGATVHRILGQQVPYATKG NQWVGYDDQESVKSKVQYLKDRQLAGAMVWALDLDDFQGSFCGQDLRFPLT NAIKDALAAT [SEQ ID NO: 76]
30 Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем
изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 76, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании. Как описано выше, приемлемые раковые/опухолевые эпитопы YKL-40 известны
из литературы или их можно идентифицировать с использованием баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun, 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, в 5 которых человеческие опухолевые антигены, распознаваемые CD4+- или CD8-Т-клетками классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их экспрессии, или из базы данных "Tantigen" (ТANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/).
10 Бревикан
Коровый белок бревикан представляет собой белок, который у людей кодируется геном BCAN. Бревикан является представителем семейства белков лектиканов. Бревикан локализован на поверхности нейронов в головном мозге. В меланоцитах экспрессия гена BCAN может регулироваться MITF (связанный с
15 микрофтальмией фактор транскрипции). Аминокислотная последовательность бревикана представлена ниже:
MAQLFLPLLAALVLAQAPAALADVLEGDSSEDRAFRVRIAGDAPLQGVLG GALTIPCHVHYLRPPPSRRAVLGSPRVKWTFLSRGREAEVLVARGVRVKVNEA YRFRVALPAYPASLTDVSLALSELRPNDSGIYRCEVQHGIDDSSDAVEVKVKGV
20 VFLYREGSARYAFSFSGAQEACARIGAHIATPEQLYAAYLGGYEQCDAGWLSD QTVRYPIQTPREACYGDMDGFPGVRNYGVVDPDDLYDVYCYAEDLNGELFLG DPPEKLTLEEARAYCQERGAEIATTGQLYAAWDGGLDHCSPGWLADGSVRYPI VTPSQRCGGGLPGVKTLFLFPNQTGFPNKHSRFNVYCFRDSAQPSAIPEASNPAS NPASDGLEAIVTVTETLEELQLPQEATESESRGAIYSIPIMEDGGGGSSTPEDPAE
25 APRTLLEFETQSMVPPTGFSEEEGKALEEEEKYEDEEEKEEEEEEEEVEDEALWA WPSELSSPGPEASLPTEPAAQEESLSQAPARAVLQPGASPLPDGESEASRPPRVH GPPTETLPTPRERNLASPSPSTLVEAREVGEATGGPELSGVPRGESEETGSSEGAP SLLPATRAPEGTRELEAPSEDNSGRTAPAGTSVQAQPVLPTDSASRGGVAVVPA SGDCVPSPCHNGGTCLEEEEGVRCLCLPGYGGDLCDVGLRFCNPGWDAFQGAC
30 YKHFSTRRSWEEAETQCRMYGAHLASISTPEEQDFINNRYREYQWIGLNDRTIE GDFLWSDGVPLLYENWNPGQPDSYFLSGENCVVMVWHDQGQWSDVPCNYHL SYTCKMGLVSCGPPPELPLAQVFGRPRLRYEVDTVLRYRCREGLAQRNLPLIRC QENGRWEAPQISCVPRRPARALHPEEDPEGRQGRLLGRWKALLIPPSSPMPGP
[SEQ ID NO: 77]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 77, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании. 5 Как описано выше, приемлемые раковые/опухолевые эпитопы бревикана
известны из литературы или их можно идентифицировать с использованием баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun, 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/,
10 в которых человеческие опухолевые антигены, распознаваемые CD4+- или CD8-Т-клетками классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их экспрессии, или из базы данных "Tantigen" (ТANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/).
15 Нейролигин 4
Нейролигин (NLGN), мембранный белок типа I, представляет собой белок клеточной адгезии на постсинаптической мембране, который обусловливает образование и поддержание синапсов между нейронами. Нейролигины действуют в качестве лигандов для Р-нейрексинов, которые представляют собой
20 белки клеточной адгезии, локализованные перед синапсами. Нейролигины также влияют на свойство нейронных сетей путем специфических синаптических функций, и они опосредуют передачу сигналов путем рекрутмента и стабилизации ключевых компонентов синапсов. Нейролигины взаимодействуют с другими постсинаптическими белками для локализации рецепторов
25 нейромедиаторов и каналов в постсинаптической плотности. Аминокислотная последовательность нейролигина 4 представлена ниже:
MSRPQGLLWLPLLFTPVCVMLNSNVLLWLTALAIKFTLIDSQAQYPVVNT NYGKIRGLRTPLPNEILGPVEQYLGVPYASPPTGERRFQPPEPPSSWTGIRNTTQF AAVCPQHLDERSLLHDMLPIWFTANLDTLMTYVQDQNEDCLYLNIYVPTEDDI
30 HDQNSKKPVMVYIHGGSYMEGTGNMIDGSILASYGNVIVITINYRLGILGFLSTG DQAAKGNYGLLDQIQALRWIEENVGAFGGDPKRVTIFGSGAGASCVSLLTLSHY SEGLFQKAIIQSGTALSSWAVNYQPAKYTRILADKVGCNMLDTTDMVECLRNK NYKELIQQTITPATYHIAFGPVIDGDVIPDDPQILMEQGEFLNYDIMLGVNQGEG
LKFVDGIVDNEDGVTPNDFDFSVSNFVDNLYGYPEGKDTLRETIKFMYTDWAD KENPETRRKTLVALFTDHQWVAPAVATADLHAQYGSPTYFYAFYHHCQSEMK PSWADSAHGDEVPYVFGIPMIGPTELFSCNFSKNDVMLSAVVMTYWTNFAKTG DPNQPVPQDTKFIHTKPNRFEEVAWSKYNPKDQLYLHIGLKPRVRDHYRATKV 5 AFWLELVPHLHNLNEIFQYVSTTTKVPPPDMTSFPYGTRRSPAKIWPTTKRPAIT PANNPKHSKDPHKTGPEDTTVLIETKRDYSTELSVTIAVGASLLFLNILAFAALY YKKDKRRHETHRRPSPQRNTTNDIAHIQNEEIMSLQMKQLEHDHECESLQAHDT LRLTCPPDYTLTLRRSPDDIPLMTPNTITMIPNTLTGMQPLHTFNTFSGGQNSTNL PHGHSTTRV
10 [SEQ ID NO: 78]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 78, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании. Как описано выше, приемлемые раковые/опухолевые эпитопы нейролигина 4
15 известны из литературы или их можно идентифицировать с использованием баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun, 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, в которых человеческие опухолевые антигены, распознаваемые CD4+- или CD8-
20 Т-клетками классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их
экспрессии, или из базы данных "Tantigen" (ТANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/). PTPRzl
25 Тирозинпротеинфосфатаза зета рецепторного типа, известная также как
фосфакан, представляет собой пересекающий клеточную мембрану единственный раз мембранный белок типа I с двумя цитоплазматическими тирозинпротеинфосфатазными доменами, доменом альфа-карбоангидразы и доменом фибронектина типа III, и принадлежит к семейству рецепторных
30 тирозинфосфатаз. Как для белка, так и для транскрипта характерна
сверхэкспрессия в клетках глиобластомы, усиливающая их гаптотактическую миграцию. Аминокислотная последовательность PTPRzl представлена ниже:
MRILKRFLACIQLLCVCRLDWANGYYRQQRKLVEEIGWSYTGALNQKNW GKKYPTCNSPKQSPINIDEDLTQVNVNLKKLKFQGWDKTSLENTFIHNTGKTVEI NLTNDYRVSGGVSEMVFKASKITFHWGKCNMSSDGSEHSLEGQKFPLEMQIYC FDADRFSSFEEAVKGKGKLRALSILFEVGTEENLDFKAIIDGVESVSRFGKQAAL 5 DPFILLNLLPNSTDKYYIYNGSLTSPPCTDTVDWIVFKDTVSISESQLAVFCEVLT MQQSGYVMLMDYLQNNFREQQYKFSRQVFSSYTGKEEIHEAVCSSEPENVQAD PENYTSLLVTWERPRVVYDTMIEKFAVLYQQLDGEDQTKHEFLTDGYQDLGAI LNNLLPNMSYVLQIVAICTNGLYGKYSDQLIVDMPTDNPELDLFPELIGTEEIIKE EEEGKDIEEGAIVNPGRDSATNQIRKKEPQISTTTHYNRIGTKYNEAKTNRSPTR
10 GSEFSGKGDVPNTSLNSTSQPVTKLATEKDISLTSQTVTELPPHTVEGTSASLND GSKTVLRSPHMNLSGTAESLNTVSITEYEEESLLTSFKLDTGAEDSSGS SPATS AI PFISENISQGYIFSSENPETITYDVLIPESARNASEDSTSSGSEESLKDPSMEGNVW FPSSTDITAQPDVGSGRESFLQTNYTEIRVDESEKTTKSFSAGPVMSQGPSVTDLE MPHYSTFAYFPTEVTPHAFTPSSRQQDLVSTVNVVYSQTTQPVYNGETPLQPSY
15 SSEVFPLVTPLLLDNQILNTTPAASSSDSALHATPVFPSVDVSFESILSSYDGAPLL PFSSASFSSELFRHLHTVSQILPQVTSATESDKVPLHASLPVAGGDLLLEPSLAQY SDVLSTTHAASETLEFGSESGVLYKTLMFSQVEPPSSDAMMHARSSGPEPSYAL SDNEGSQHIFTVSYSSAIPVHDSVGVTYQGSLFSGPSHIPIPKSSLITPTASLLQPTH ALSGDGEWSGASSDSEFLLPDTDGLTALNISSPVSVAEFTYTTSVFGDDNKALSK
20 SEIIYGNETELQIPSFNEMVYPSESTVMPNMYDNVNKLNASLQETSVSISSTKGM FPGSLAHTTTKVFDHEISQVPENNFSVQPTHTVSQASGDTSLKPVLSANSEPASS DPASSEMLSPSTQLLFYETSASFSTEVLLQPSFQASDVDTLLKTVLPAVPSDPILV ETPKVDKISSTMLHLIVSNSASSENMLHSTSVPVFDVSPTSHMHSASLQGLTISY ASEKYEPVLLKSESSHQVVPSLYSNDELFQTANLEINQAHPPKGRHVF ATP VLSI
25 DEPLNTLINKLIHSDEILTSTKSSVTGKVFAGIPTVASDTFVSTDHSVPIGNGHVAI TAVSPHRDGSVTSTKLLFPSKATSELSHSAKSDAGLVGGGEDGDTDDDGDDDD DDRGSDGLSIHKCMSCSSYRESQEKVMNDSDTHENSLMDQNNPISYSLSENSEE DNRVTSVSSDSQTGMDRSPGKSPSANGLSQKHNDGKEENDIQTGSALLPLSPES KAWAVLTSDEESGSGQGTSDSLNENETSTDFSFADTNEKDADGILAAGDSEITP
30 GFPQSPTSSVTSENSEVFHVSEAEASNSSHESRIGLAEGLESEKKAVIPLVIVSALT FICLVVLVGILIYWRKCFQTAHFYLEDSTSPRVISTPPTPIFPISDDVGAIPIKHFPK HVADLHASSGFTEEFETLKEFYQEVQSCTVDLGITADSSNHPDNKHKNRYINIVA YDHSRVKLAQLAEKDGKLTDYINANYVDGYNRPKAYIAAQGPLKSTAEDFWR
MIWEHNVEVIVMITNLVEKGRRKCDQYWPADGSEEYGNFLVTQKSVQVLAYY TVRNFTLRNTKIKKGSQKGRPSGRVVTQYHYTQWPDMGVPEYSLPVLTFVRKA AYAKRHAVGPVVVHCSAGVGRTGTYIVLDSMLQQIQHEGTVNIFGFLKHIRSQR NYLVQTEEQYVFIHDTLVEAILSKETEVLDSHIHAYVNALLIPGPAGKTKLEKQF 5 QLLSQSNIQQSDYSAALKQCNREKNRTSSIIPVERSRVGISSLSGEGTDYINASYM GYYQSNEFIITQHPLLHTIKDFWRMIWDHNAQLVVMIPDGQNMAEDEFVYWPN KDEPINCESFKVTLMAEEHKCLSNEEKLIIQDFILEATQDDYVLEVRHFQCPKWP NPDSPISKTFELISVIKEEAANRDGPMIVHDEHGGVTAGTFCALTTLMHQLEKEN SVDVYQVAKMINLMRPGVFADIEQYQFLYKVILSLVSTRQEENPSTSLDSNGAA 10 LPDGNIAESLESLV [SEQ ID NO: 79]
Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 79, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании.
15 Как описано выше, приемлемые раковые/опухолевые эпитопы PTPRzl известны из литературы или их можно идентифицировать с использованием баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun, 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, в
20 которых человеческие опухолевые антигены, распознаваемые CD4+- или CD8-Т-клетками классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их экспрессии, или из базы данных "Tantigen" (ТANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/).
25 Предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении,
содержит по меньшей мере один опухолевый эпитоп, который представляет собой эпитоп антигена, выбранного из группы, состоящей из ЕрСАМ, MUC-1, сурвивина, СЕА, KRas, MAGE-A3, 1Х^альфа2, EGFRvIII, EphA2, Her2/neu, TRP-2, бревикана, нейролигина 4 и PTPRzl, такой как эпитоп, имеющий любую
30 из SEQ ID NO: 48, 50, 51, 53, 55, 56, 58, 60, 62 и 71; более предпочтительно по меньшей мере один опухолевый эпитоп представляет собой эпитоп антигена, выбранного из группы, состоящей из ЕрСАМ, MUC-1, сурвивина, СЕА, KRas, MAGE-АЗ, EGFRvIII, EphA2, IL-13Ra2, TRP-2 и бревикана, такой как эпитоп,
имеющий любую из SEQ ID N0: 48, 50, 51, 53, 55, 56, 58, 60, 62 и 71; и еще более предпочтительно по меньшей мере один опухолевый эпитоп представляет собой эпитоп антигена, выбранного из группы, состоящей ЕрСАМ, MUC-1, сурвивина, СЕА, EGFRvIII, EphA2 и бревикана, такой как эпитоп, имеющий 5 любую из SEQ ID NO: 48, 50, 51, 53, 55, 56 и 71.
Предпочтительным является также комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, который содержит
- один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;
10 - один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ
ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей;
15 - один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID
NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов KRas (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 58) или функциональные варианты их последовательностей;
20 - один или несколько эпитопов MAGE-АЗ (например, эпитоп, имеющий
SEQ ID NO: 60) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их 25 последовательностей;
- один или несколько эпитопов Her2/neu или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей;
30 - один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их
последовательностей;
- один или несколько эпитопов бревикана или его функциональные варианты последовательности;
-
- один или несколько эпитопов нейролигина 4 или функциональные варианты их последовательностей; и/или
- один или несколько эпитопов PTPRzl или функциональные варианты их последовательностей.
5 Как описано выше, дополнительные эпитопы этих антигенов (в дополнение
к приведенным в качестве примера эпитопам) легко можно получить из баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun, 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/,
10 или из базы данных "Tantigen" (ТANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/).
"Вариант последовательности" представляет собой описанный выше вариант, а именно, вариант последовательности имеет (аминокислотную)
15 последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична референс-последовательности.
20 "Функциональный" вариант последовательности означает в контексте эпитопа, что функция в качестве эпитопа не нарушается или элиминируется. Однако предпочтительно аминокислотная последовательность эпитопа ракового/опухолевого антигена, указанного в настоящем описании, не изменена в результате мутации, и, следовательно, идентична референс-
25 последовательности эпитопа.
Предпочтительным является также комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, который содержит
- фрагмент ЕрСАМ, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;
30 - фрагмент MUC-1, содержащий один или несколько эпитопов или
функциональный вариант его последовательности;
- фрагмент СЕА, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;
-
- фрагмент KRas, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности; и/или
- фрагмент MAGE-АЗ, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;
5 - фрагмент EGFRvIII, содержащий один или несколько эпитопов или
функциональный вариант его последовательности;
- фрагмент EphA2 (например, фрагмент полипептида, имеющего SEQ ID NO: 72), содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;
10 - фрагмент Her2/neu (например, фрагмент полипептида, имеющего SEQ ID
NO: 70), содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;
- фрагмент IL-13Ra2 (например, фрагмент полипептида, имеющего SEQ ID NO: 61), содержащий один или несколько эпитопов или функциональный
15 вариант его последовательности;
- фрагмент сурвивина (например, фрагмент полипептида, имеющего SEQ ID NO: 52), содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;
- фрагмент TRP-2 (например, фрагмент полипептида, имеющего SEQ ID 20 NO: 75), содержащий один или несколько эпитопов или функциональный
вариант его последовательности;
- фрагмент бревикана (например, фрагмент полипептида, имеющего SEQ ID NO: 77), содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;
25 - фрагмент нейролигина 4 (например, фрагмент полипептида, имеющего
SEQ ID NO: 78), содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности; и/или
- фрагмент PTPRzl (например, фрагмент полипептида, имеющего SEQ ID NO: 79), содержащий один или несколько эпитопов или функциональный
30 вариант его последовательности.
В контексте настоящего описания "фрагмент" антигена содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот антигена, предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных
аминокислот антигена, более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот антигена, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот антигена и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 5 последовательно расположенных аминокислот антигена. Таким образом, фрагмент ЕрСАМ содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот ЕрСАМ (SEQ ID NO: 47), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот ЕрСАМ (SEQ ID NO: 47), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно
10 расположенных аминокислот ЕрСАМ (SEQ ID NO: 47), еще более
предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот ЕрСАМ (SEQ ID NO: 47) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот ЕрСАМ (SEQ ID NO: 47); фрагмент MUC-1 содержит по меньшей мере 10 последовательно
15 расположенных аминокислот MUC-1 (SEQ ID NO: 49), предпочтительно по
меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот MUC-1 (SEQ ID NO: 49), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот MUC-1 (SEQ ID NO: 49), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных
20 аминокислот MUC-1 (SEQ ID NO: 49) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот MUC-1 (SEQ ID NO: 49); фрагмент сурвивина содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот сурвивина (SEQ ID NO: 52), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот сурвивина (SEQ
25 ID NO: 52), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот сурвивина (SEQ ID NO: 52), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот сурвивина (SEQ ID NO: 52) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот сурвивина (SEQ
30 ID NO: 52); фрагмент СЕА содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот СЕА (SEQ ID NO: 54), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот СЕА (SEQ ID NO: 54), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно
расположенных аминокислот СЕА (SEQ ID NO: 54), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот СЕА (SEQ ID NO: 54) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот СЕА (SEQ ID NO: 54); фрагмент KRas содержит по 5 меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот KRas (SEQ ID NO: 57), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот KRas (SEQ ID NO: 57), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот KRas (SEQ ID NO: 57), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных
10 аминокислот KRas (SEQ ID NO: 57) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот KRas (SEQ ID NO: 57); фрагмент MAGE-АЗ содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот MAGE-АЗ (SEQ ID NO: 59), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот MAGE-A3 (SEQ
15 ID NO: 59), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот MAGE-АЗ (SEQ ID NO: 59), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот MAGE-АЗ (SEQ ID NO: 59) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот MAGE-A3 (SEQ
20 ID NO: 59); фрагмент EGFRvIII содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот EGFRvIII, предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот EGFRvIII, более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот EGFRvIII, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно
25 расположенных аминокислот EGFRvIII и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот EGFRvIII; фрагмент EphA2 содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот EphA2 (SEQ ID NO: 72), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот EphA2 (SEQ ID NO: 72), более
30 предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных
аминокислот EphA2 (SEQ ID NO: 72), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот EphA2 (SEQ ID NO: 72) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных
аминокислот EphA2 (SEQ ID NO: 72); фрагмент Her2/neu содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот Her2/neu (SEQ ID NO: 70), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот Her2/neu (SEQ ID NO: 70), более предпочтительно по меньшей 5 мере 20 последовательно расположенных аминокислот Her2/neu (SEQ ID NO: 70), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот Her2/neu (SEQ ID NO: 70) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот Her2/neu (SEQ ID NO: 70); фрагмент IL-13Ra2 содержит по
10 меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот IL-13Ra2 (SEQ ID NO: 61), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот IL-13Ra2 (SEQ ID NO: 61), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот IL-13Ra2 (SEQ ID NO: 61), еще более предпочтительно по меньшей мере 25
15 последовательно расположенных аминокислот IL-13Ra2 (SEQ ID NO: 61) и
наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот IL-13Ra2 (SEQ ID NO: 61); фрагмент TRP-2 содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот TRP-2 (SEQ ID NO: 75), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных
20 аминокислот TRP-2 (SEQ ID NO: 75), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот TRP-2 (SEQ ID NO: 75), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот TRP-2 (SEQ ID NO: 75) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот TRP-2 (SEQ ID NO: 75);
25 фрагмент бревикана содержит по меньшей мере 10 последовательно
расположенных аминокислот бревикана (SEQ ID NO: 77), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот бревикана (SEQ ID NO: 77), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот бревикана (SEQ ID NO: 77), еще более
30 предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот бревикана (SEQ ID NO: 77) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот бревикана (SEQ ID NO: 77); фрагмент нейролигина 4 содержит по меньшей мере 10
последовательно расположенных аминокислот нейролигин 4 (SEQ ID NO: 78), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот нейролигина 4 (SEQ ID NO: 78), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот нейролигина 4 5 (SEQ ID NO: 78), еще более предпочтительно по меньшей мере 25
последовательно расположенных аминокислот нейролигина 4 (SEQ ID NO: 78) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот нейролигина 4 (SEQ ID NO: 78); и фрагмент PTPRzl содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот PTPRzl (SEQ ID
10 NO: 79), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот PTPRzl (SEQ ID NO: 79), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот PTPRzl (SEQ ID NO: 79), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот PTPRzl (SEQ ID NO: 79) и наиболее предпочтительно по меньшей
15 мере 30 последовательно расположенных аминокислот PTPRzl (SEQ ID NO: 79).
Функциональный вариант последовательности указанного фрагмента имеет (аминокислотную) последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по
20 меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична референс-последовательности, и эпитопная функция по меньшей мере одного, предпочтительно всех, эпитопа(ов), входящих в фрагмент, сохраняется. Предпочтительно указанный комплекс содержит
25 - один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ
ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей; и
30 - один или несколько эпитопов MAGE-АЗ (например, эпитоп, имеющий
SEQ ID NO: 60) или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, КОС1, VEGFR, phCG, сурвивина, TGFpR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, SART или ПЛЗЯальфаг.
Предпочтительно указанный комплекс содержит
5 - один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ
ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей;
10 - один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID
NO: 55, и/или эпитоп, имеющий to SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов MAGE-АЗ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 60) или функциональные варианты их последовательностей.
15 Таким образом, комплекс предпочтительно не содержит эпитоп HER-2,
ТОММ34, RNF 43, КОС1, VEGFR, phCG, сурвивина, TGFpR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, SART или ПЛЗЯальфаг.
Предпочтительно также указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ 20 ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID 25 NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты
их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов KRas (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 58) или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп HER-2, 30 ТОММ34, RNF 43, КОС1, VEGFR, phCG, сурвивина, TGFpR2, р53, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или ПЛЗЯальфаг.
Предпочтительно также указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей;
5 - один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID
NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов MAGE-АЗ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 60) или функциональные варианты их последовательностей.
10 Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп HER-2, MUC-1,
ТОММ34, RNF 43, КОС1, VEGFR, phCG, TGFpR2, р53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART или ПЛЗЯальфаг.
Предпочтительно также указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ 15 ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные
варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов MAGE-АЗ (например, эпитоп, имеющий 20 SEQ ID NO: 60) или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп ЕрСАМ, HER-2, ТОММ34, RNF 43, КОС1, VEGFR, phCG, СЕА, TGFpR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, SART или ПЛЗЯальфаг.
Более предпочтительно указанный комплекс содержит
25 - один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ
ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей;
30 - один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий
SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей; и/или
- один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп HER-2, 5 ТОММ34, RNF 43, КОС1, VEGFR, phCG, TGFpR2, р53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART или ПЛЗЯальфаг.
Наиболее предпочтительно указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;
10 - один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ
ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей; и
15 - один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID
NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп HER-2, ТОММ34, RNF 43, КОС1, VEGFR, phCG, TGFpR2, р53, KRas, OGT, CASP5, 20 COA-1, MAGE, SART или ПЛЗЯальфаг.
Также особенно предпочтительно указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ 25 ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные
варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей.
30 Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп HER-2,
ТОММ34, RNF 43, КОС1, VEGFR, phCG, сурвивина, TGFpR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или ПЛЗЯальфаг.
Также особенно предпочтительно указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты
5 их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, КОС1, VEGFR, phCG, сурвивин, TGFpR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или ПЛЗЯальфаг.
Также особенно предпочтительно указанный комплекс содержит
10 - один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ
ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп HER-2, MUC-1,
ТОММ34, RNF 43, КОС1, VEGFR, phCG, сурвивина, СЕА, TGFpR2, р53, KRas,
OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или ПЛЗЯальфаг.
15 Также особенно предпочтительно указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп ЕрСАМ, HER-2, 20 MUC-1, ТОММ34, RNF 43, КОС1, VEGFR, phCG, сурвивина, TGFpR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или ПЛЗЯальфаг. Предпочтительно указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей;
25 - один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их
последовательностей;
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их 30 последовательностей; и/или
- один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты их последовательностей.
-
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп CMV, gp 100, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Более предпочтительно указанный комплекс содержит
5 - один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ
ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ 10 ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты их последовательностей.
15 Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп CMV, gp 100,
Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Более предпочтительно также указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их 20 последовательностей;
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их последовательностей; и
25 - один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты
их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
30 Также более предпочтительно указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей;
-
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их последовательностей; и
5 - один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты
их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EphA2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
10 Также более предпочтительно указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их последовательностей;
15 - один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их
последовательностей; и
- один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп IL-13Rальфа2, 20 CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей;
25 - один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их
последовательностей;
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты 30 их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп TRP-2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их 5 последовательностей;
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их последовательностей.
10 Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп бревикана,
CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ 15 ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей.
20 Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп TRP-2,
бревикана, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ 25 ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их последовательностей.
30 Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп бревикана, IL-
13Яальфа2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их последовательностей; и
5 - один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты
их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп IL-13Raльфa2,
TRP-2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40,
нейролигина 4 или PTPRzl.
10 Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей и
15 - один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их
последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EphA2, бревикана, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
20 Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей и
25 - один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты
их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EphA2, TRP-2,
CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40,
нейролигина 4 или PTPRzl.
30 Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей;
-
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их последовательностей и
- один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты их последовательностей.
5 Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EphA2, IL-
13Яальфа2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их 10 последовательностей;
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей и
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их последовательностей.
15 Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII,
бревикана, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их 20 последовательностей;
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей и
- один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты их последовательностей.
25 Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII, TRP-
2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их 30 последовательностей;
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их последовательностей и
-
- один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII, IL-13Яальфа2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, 5 YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей;
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их 10 последовательностей и
- один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII, EphA2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 15 нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их 20 последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп IL-13Rальфа2, бревикана, TRP-2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
25 - один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ
ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EphA2, 30 бревикана, TRP-2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их последовательностей.
5 Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EphA2, IL-
13Raльфa2, бревикана, CMV, gp 100, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ 10 ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EphA2, IL-13Яальфа2, TRP-2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-15 A3, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ 20 ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII, TRP-2, бревикана, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
25 - один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их
последовательностей; и
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII, IL-30 13Rальфа2, бревикана, CMV, gp 100, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII, IL-13Яальфа2, TRP-2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII, EphA2, бревикана, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII, EphA2, TRP-2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, нейролигин 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их последовательностей; и
- один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII, EphA2, 1Ь-13Кальфа2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
- один или несколько эпитопов EGFRvIII (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 71) или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EphA2, TRP-2, бревикана, IL-13Raльфa2, CMV, gp 100, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, 5 MAGE-A3, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов EphA2 или функциональные варианты их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII, IL-10 13Яальфа2, TRP-2, бревикана, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-Al, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов IL-13Ra2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 62) или функциональные варианты их последовательностей.
15 Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII,
EphA2, TRP-2, бревикана, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- один или несколько эпитопов TRP-2 или функциональные варианты их 20 последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII, EphA2, IL-13Rальфа2, бревикана, CMV, gp 100, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-A1, MAGE-АЗ, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
25 - один или несколько эпитопов бревикана или функциональные варианты
их последовательностей.
Указанный комплекс предпочтительно не содержит эпитоп EGFRvIII,
EphA2, 1Ь-13Кальфа2, TRP-2, CMV, gplOO, Her2/neu, сурвивина, hTert, MAGE-
Al, MAGE-A3, YKL-40, нейролигина 4 или PTPRzl.
30 Компонент в) - Пептидный агонист TLR
В комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, пептидный агонист TLR обеспечивает повышенный таргетинг вакцины к дендритным клеткам наряду с аутоиммуногенностью. Физическая связь пептидного агониста TLR с
СРР и по меньшей мере одним антигеном или антигенным эпитопом, предлагаемым в настоящем изобретении, в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, обеспечивает повышенный иммунный ответ путем одновременной стимуляции антигенпрезентирующих клеток, в частности 5 дендритных клеток, которые интернализируют, метаболизируют и экспонируют антиген(ы).
В контексте настоящего изобретения, "пептидный агонист TLR" представляет собой агонист Толл-подобного рецептора (TLR), т.е. он связывается с TLR и активирует TLR, в частности, приводя к биологическому
10 ответу. Кроме того, пептидный агонист TLR представляет собой пептид,
полипептид или белок, описанный выше. Предпочтительно пептидный агонист TLR содержит от 10 до 150 аминокислот, более предпочтительно от 15 до 130 аминокислот, еще более предпочтительно от 20 до 120 аминокислот, еще более предпочтительно от 25 до 110 аминокислот и наиболее предпочтительно от 30 до
15 100 аминокислот.
Толл-подобные рецепторы (TLR) представляют собой трансмембранные белки, характеризующиеся внеклеточным, трансмембранным и цитозольным доменами. Внеклеточные домены, содержащие богатые лейцином повторы (LRR) подковообразной формы, участвуют в распознавании стандартных
20 молекулярных структур (паттернов) из разнообразных микробов. Толл-подобные рецепторы включают TLR 1-10. Соединения, обладающие способностью активировать TLR-рецепторы, и их модификации и производные, хорошо известны в данной области. TLR1 может активироваться бактериальными липопротеинами и их ацетилированными формами, TLR2 может в дополнение к
25 указанному активироваться гликолипидами грамположительных бактерий, LPS, LPA, LTA, фимбриями, белками наружной мембраны, белками теплового шока из бактерий или из хозяина и липоарабиноманнанами микобактерий. TLR3 может актироваться dsPHK, в частности вирусного происхождения, или химическим соединением поли(ЕС). TLR4 может активироваться LPS, LTA
30 грамотрицательных бактерий, белками теплового шока из хозяина или
бактериального происхождения, белками покрытия или оболочки вирусов, таксолом или его производными, содержащими гиалурон олигосахаридами и фиброненктинами. TLR5 может активироваться бактериальными флагеллами или
флагеллином. TLR6 может активироваться липопротеинами микобактерий и чувствительным к тепловой обработке растворимым фактором стрептококков группы В (GBS- F) или модулинами стафилококков. TLR7 может активироваться имидазохинолинами. TLR9 может активироваться комплексами 5 неметилированный CpG-ДНК или хроматин-IgG.
Предпочтительно пептидный агонист TLR, входящий в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретения, является агонистом TLR1, 2, 4, 5, 6 и/или 10. TLR экспрессируются либо на клеточной поверхности (TLR1, 2, 4, 5, 6 и 10), либо на мембранах внутриклеточных органелл, таких как эндосомы
10 (TLR3, 4, 7, 8 и 9). Известные встречающиеся в естественных условиях лиганды для эндосомальных рецепторов представляют собой молекулы на основе нуклеиновых кислот (за исключением TLR4). Экспрессируемые на клеточной поверхности TLR1, 2, 4, 5, 6 и 10 распознают молекулярные паттерны внеклеточных микробов (Monie Т. P., Bryant С. Е. и др. Activating immunity:
15 Lessons from the TLRs and NLRs. Trends Biochem. Sci. 34(11), 2009, cc. 553-561). TLR экспрессируются на нескольких клеточных типах, но фактически все TLR экспрессируются на DC, обеспечивая этим специализированным клеткам чувствительность ко всем возможным патогенам и сигналам опасности.
При этом TLR2, 4 и 5 конститутивно экспрессируются на поверхности DC.
20 Таким образом, пептидный агонист TLR, входящий в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, более предпочтительно представляет собой пептидный агонист TLR2, TLR4 и/или TLR5. Еще более предпочтительно пептидный агонист TLR представляет собой пептидный агонист TLR2 и/или пептидный агонист TLR4. Наиболее предпочтительно пептидный агонист TLR представляет
25 собой пептидный агонист TLR4. Наиболее предпочтительно пептидный агонист TLR представляет собой пептидный агонист TLR, который является агонистом и TLR2, и TLR4. TLR2 может обнаруживать широкое разнообразие лигандов, полученных из бактерий, вирусов, паразитов и грибов. Специфичность лиганда часто определяют по взаимодействию TLR2 с другими TLR, такими как TLR1, 6
30 или 10, или не относящимися к TLR молекулами, такими как дектин-1, CD 14 или CD36. Образование гетеродимера с TLR1 позволят TLR2 идентифицировать триацильные липопротеины или липопептиды (мико)бактериального происхождения, такие как Pam3CSK4 и пептидогликан (PGA; Gay N. J. и
Gangloff M., Structure and function of Toll receptors and their ligands. Annu. Rev. Biochem. 76, 2007, cc. 141-165; Spohn R., Buwitt-Beckmann U. и др., Synthetic lipopeptide adjuvants and Toll-like receptor 2-Structure-activity relationships. Vaccine 22(19),2004, cc. 2494-2499). Гетеродимеризация TLR2 и 6 позволяет 5 обнаруживать диацильные липопептиды и зимозан. Липополисахарид (LPS) и его производные являются лигандами для TLR4, а флагеллин для TLR5 (Bryant С. Е., Spring D. R. и др., The molecular basis of the host response to lipopolysaccharide. Nat. Rev. Microbiol. 8(1), 2010, cc. 8-14).
TLR2 взаимодействует с широким спектром обладающих структурным
10 разнообразием лигандов, включая молекулы, экспрессируемые микробами и грибами. Идентифицировано множество агонистов TLR2, включая встречающиеся в естественных условиях и синтетические липопептиды (например, активирующий макрофаги липопептид Mycoplasma fermentas (MALP-2)), пептидогликаны (PG, например, из S. aureus), липополисахариды (LPS) из
15 различных штаммов бактерий, полисахариды (например, зимозан), заякоренные гликозидфосфофатидилинозитолом структуры из грамположительных бактерий (например, липотейхоевая кислота (LTA) и липоарабиноманнан из микобактерий и липоманнаны из М. tuberculosis). Некоторые вирусные детерминанты могут также "запускаться" через TLR2 (Barbalat R., Lau L., Locksley R.M., Barton G.M.
20 Toll-like receptor 2 on inflammatory monocytes induces type I interferon in response to viral but not bacterial ligands. Nat Immunol. 10(11), 2009, cc. 1200-1207). Бактериальные липопептиды являются структурными компонентами клеточных оболочек. Они состоят из ацилированного s-глицерилцистеинового остатка, с которым пептид может быть конъюгирован через цистеиновый остаток.
25 Примеры агонистов TLR2, представляющих собой бактериальные липопептиды, включают MALP-2 и его синтетический аналог дипальмитоил-S-глицерилцистеин (Pair^Cys) или трипалтмитоил-8-глицерилцистеин (Parr^Cys).
Множество лигандов взаимодействует с TLR4, включая монофосфорил-липид А из Salmonella minnesota R595 (MPLA), липополисахариды (LPS),
30 маннаны (Candida albicans), гликоинозитолфосфолипиды (Trypanosoma),
вирусные оболочечные белки (RSV и MMTV) и эндогенные антигены, включая фибриноген и белки теплового шока. Указанные агонисты TLR4 описаны, например, у Akira S., Uematsu S., Takeuchi О., Pathogen recognition and innate
immunity. Cell. 124(4), 24 февраля 2006 г., cc. 783-801 или у Kumar Н., Kawai Т., Akira S., Toll-like receptors and innate immunity. Biochem Biophys Res Commun. 388(4), 30 октября 2009 г., cc. 621-625. LPS, который обнаружен в наружных мембранах грамотрицательных бактерий, является наиболее широко изученным 5 из лигандов TLR4. Приемлемые полученные из LPS пептидные агонисты TLR4 описаны, например, в WO 2013/120073 (А1).
TLR5 "запускается" областью молекулы флагеллина, экспрессируемой практически всеми подвижными бактериями. Так, флагеллин или пептиды или белки, полученные из флагеллина и/или вариантов или фрагментов флагеллина,
10 также пригодны в качестве пептидных агонистов TLR, входящих в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении.
Таким образом, примеры пептидных агонистов TLR включают липопептидные агонисты TLR2 MALP-2, Pair^Cys и Pair^Cys или их модификации, различные формы LPS-агонистов TLR4, например, L3-LPS N.
15 meningitidis дикого типа и мутантный пентаацилированный LpxLl-LPS, и агонист TLR5 флагеллин.
Однако предпочтительно, чтобы пептидный агонист TLR, входящий в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, не представлял собой ни липопептид, ни липопротеин, ни гликопептид, ни гликопротеин, более
20 предпочтительно, пептидный агонист TLR, входящий в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой классический пептид, полипептид или белок, указанный в настоящем описании.
Предпочтительным агонистом TLR2 является аннексии II или его иммуномодуляторный фрагмент, который подробно описан в WO 2012/048190
25 А1 и заявке на патент США 13/0331546, в частности, предпочтительными являются пептидный агонист TLR2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 7, описанную в WO 2012/048190 А1, или его фрагменты или варианты.
Таким образом, пептидный агонист TLR2, содержащий или состоящий из
30 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 или варианта этой
последовательности, описанного выше, является наиболее предпочтительным в качестве компонента в), т.е. в качестве по меньшей мере одного пептидного агониста TLR, входящего в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении.
STVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE SEQ ID NO: 15 (пептидный агонист TLR2 Anaxa)
Касательно TLR4, то наиболее предпочтительными пептидными агонистами TLR, являются агонисты, которые соответствуют мотивам, которые 5 связываются с TLR4, в частности, (I) пептиды, имитирующие встречающийся в естественных условиях лиганд LPS (RS01: Gln-Glu-Ile-Asn-Ser-Ser-Tyr и RS09: Ala-Pro-Pro-His-Ala-Leu-Ser) и (II) полученные из фибронектина пептиды. Клеточный гликопротеин фибронектин (FN) имеет множество изоформ, созданных из одного гена в результате альтернативного сплайсинга трех 10 экзонов. Одна из этих изоформ представляет собой экстра-домен A (EDA), который взаимодействует с TLR4.
Другие приемлемые пептидные агонисты TLR содержат EDA-домен фибронектина или его фрагмент или вариант. Указанные приемлемые EDA-домены фибронектина или их фрагменты или варианты описаны в ЕР 15 1913954В1, ЕР 2476440 Al, US 2009/0220532 А1 и WO 2011/101332 А1. Таким образом, пептидный агонист TLR4, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45 или варианта этой последовательности, описанного выше, является наиболее предпочтительным в качестве компонента в), т.е. в качестве по меньшей мере одного пептидного 20 агониста TLR, входящего в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении.
NIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIRELFPAPDG EDDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGIQST SEQ ID NO: 45 (пептидный агонист TLR4 EDA)
Кроме того, белок 1 высокомобильной группы (белок из группы ядерных 25 негистоновых белков HMG) (HMGB1) и его пептидные фрагменты, как
предполагается, могут являться агонистами для TLR4.Указанные полученные из HMGB1 пептиды описаны, например, в US 2011/0236406 Al.
Комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере один пептидный агонист TLR, предпочтительно комплекс, предлагаемый в 30 настоящем изобретении, содержит более одного пептидного агониста TLR, в частности, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более пептидных агонистов TLR, более предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит (по меньшей мере) два или три пептидных агониста TLR, еще более
предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит (по меньшей мере) четыре или пять пептидных агонистов TLR. Если более одного пептидного агониста TLR содержится в комплексе, предлагаемом с настоящем изобретении, то, как должно быть очевидно, указанный пептидный 5 агонист TLR также, в частности, ковалентно связан в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, например, с другим пептидным агонистом TLR и/или с компонентом а), т.е. проникающим в клетку пептидом, и/или с компонентом б), т.е. антигеном или антигенным эпитопом.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения
10 комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит один
единственный пептидный агонист TLR. В частности, в указанном наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит один единственный пептидный агонист TLR и в нем не присутствует никакой дополнительный
15 компонент, обладающий свойствами ангониста TLR, за исключением одного единственного указанного пептидного агониста TLR.
Если несколько пептидных агонистов TLR входят в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, то они могут быть одинаковыми или различными. Предпочтительно, если несколько пептидных агонистов TLR
20 входят в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, то они отличаются друг от друга.
Кроме того, предпочтительно, чтобы более одного антигена или антигенного эпитопа, в частности, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 антигенов или антигенных эпитопов, или более одного пептидного агониста TLR, в частности,
25 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 агонистов TLR, располагались последовательно в
комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении. Это означает, в частности, что все пептидные агонисты TLR, входящие в комплекс, располагаются в виде участка, который не прерывается ни компонентом а), т.е. проникающим в клетку пептидом, ни компонентом б), т.е. по меньшей мере одним антигеном или
30 антигенным эпитопом. Предпочтительно компонент а) и компонент б)
располагаются в комплексе, например, до или после указанного участка из всех пептидных агонистов TLR. Однако пептидные агонисты TLR, расположенные таким последовательным образом, могут соединяться друг с другом, например, с
помощью спейсера или линкера, описанного ниже, который не является ни компонентом а), т.е. проникающим в клетку пептидом, ни компонентом б), т.е. по меньшей мере одним антигеном или антигенным эпитопом.
Однако альтернативно этому, различные пептидные агонисты TLR можно располагать также любым другим образом в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, например, с компонентом а) и/или компонентом б), расположенным между двумя или большим количеством пептидных агонистов TLR, т.е. с одним или большим количеством пептидных агонистов TLR, расположенных между компонентом а) и компонентом б) (или наоборот) и необязательно с одним или несколькими пептидными агонистами TLR, расположенными на соответствующем другом конце компонента а) и/или компонента б).
Должно быть очевидно, что может оказаться целесообразным, чтобы несколько различных пептидных агонистов TLR, активирующих одинаковые или различные TLR-рецепторы, входили в один комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении. Альтернативно этому, несколько различных пептидных агонистов TLR, активирующих одинаковые или различные TLR-рецепторы, можно подразделять на поднаборы различных пептидных агонистов TLR, активирующих одинаковые или различные TLR-рецепторы, которые входят в различные комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении, при этом, указанные различные комплексы, содержащие различные поднаборы, целесообразно вводить одновременно, например, в виде одной вакцины, индивидууму, который нуждается в этом.
Соединение компонентов а), б) и в) в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении
В комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, компоненты а), б) и в) ковалентно связаны, т.е. связь между двумя из трех компонентов а), б) и в) в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, представляет собой ковалентную связь. Предпочтительно два из трех компонентов а), б) и в) комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении (т.е. "первый" и "второй" компонент), ковалентно связаны друг с другом, а третий компонент из трех компонентов а), б) и в) ковалентно связан либо с первым компонентом из трех компонентов а), б) и в), либо со вторым компонентом из трех компонентов а), б)
и в). Тем самым предпочтительно образуется линейная молекула. Однако также возможно, чтобы каждый из трех компонентов а), б) и в) был ковалентно связан с обоими другими компонентами из трех компонентов а), б) и в).
Понятие "ковалентное соединение" (также ковалентная связь) в контексте настоящего изобретения относится к химической связи, которая включает перекрытие ("обобществление") электронных пар между атомами. "Ковалентное соединение" (также ковалентная связь) включает, в частности, стабильный баланс сил притяжения и отталкивания между атомами, когда они имеют общие электроны. Для многих молекул обобществление электронов позволяет каждому атому достигать состояния полной внешней оболочки, соответствующего стабильной электронной конфигурации. Ковалентное связывание включает много типов взаимодействий, включая, например, о-связывание, л> связывание, связывание по типу металл-с-металло, агонистические взаимодействия и трехцентровые связи двумя электронами. Таким образом, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, можно обозначать также как "соединение", в частности, его можно обозначать как "молекула".
Предпочтительно в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, компоненты а), б) и в) ковалентно связаны путем химического сочетания любым приемлемым путем, известным в данной области, например, методами перекрестного сшивания. Однако следует учитывать тот факт, что многие известные методы химического перекрестного сшивания являются неспецифическими, т.е. они не направляют точку сочетания к какому-либо конкретному положению на компонентах а), б) и в). Таким образом, применяемые неспецифические перекрестносшивающие агенты могут атаковать функциональные сайты или стерически блокировать активные сайты, делая слитые компоненты комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, биологически неактивными. Специалисту в данной области известно, как блокировать потенциально реактивные группы путем применения соответствующих защитных групп. Альтернативно этому, можно применять методики на основе сильного и универсального лигирования оксима и гидразона, которые представляют собой хемоселективные субстанции, пригодные для перекрестного сшивания компонентов а), б) и в). Указанная технология связывания описана, например, у Rose и др., JACS 116, 1994, с.30.
Специфичность сочетания можно повышать путем прямого химического связывания с функциональной группой, которая встречается только один раз или несколько раз в компонентах а), б) и/или в), при этом функциональную группу можно перекрестно связывать с другой, присутствующей в компонентах а), б) 5 или в). Так, например, можно применять тиольную группу цистеина, если только один остаток цистеина присутствует в конкретном компоненте а), б) или в) комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении. Так, например, если конкретный компонент а), б) или в) не содержит остатки лизина, то перекрестносшивающий реагент, специфический для первичных аминов, может
10 быть селективным для аминоконца соответствующего компонента.
Альтернативно этому, перекрестное сшивание можно осуществлять также через боковую цепь остатка глутаминовой кислоты, расположенного на N-конце пептида, в результате чего можно создавать амидную связь через ее боковую цепь. Таким образом, может оказаться целесообразным связывать остаток
15 глутаминовой кислоты с N-концом конкретного компонента а), б) или в). Однако, если цистеиновый остаток подлежит интродукции в конкретный компонент а), б) или в), то предпочтительной является интродукция на N- или С-конец или вблизи него. Известны общепринятые методы для таких изменений аминокислотных последовательностей, основанных на модификациях
20 конкретного компонента а), б) или в), либо путем добавления одной или нескольких аминокислот, например, среди прочего, остатка цистеина, для транслоцирования последовательности, либо путем замены по меньшей мере одного остатка транслоцированной(ых) последовательности(ей), входящей(их) в соответствующий компонент. В случае, когда боковую цепь цистеина
25 используют для целей сочетания, то конкретный компонент а), б) или в)
предпочтительно имеет один остаток цистеина. Любой второй остаток цистеина предпочтительно не требуется и его можно необязательно заменять, когда он присутствует в соответствующем компоненте, который входит в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении. Когда остаток цистеина заменяют в
30 исходной последовательности конкретного компонента а), б) или в), то, как правило, требуется минимизировать образовавшиеся изменения в укладке пептида соответствующего компонента. Изменения в укладке минимизируют,
когда замена представляет собой химическую замену и стерически сходную с цистеином. Так, серии является предпочтительной заменой для цистеина.
Сочетание двух из трех компонентов а), б) и в) можно осуществлять с помощью связывающего или конъюгирующего агента, используя стандартные 5 связывающие реагенты для синтеза пептидов, такие как HOBt, HBTU, DICI, TBTU. Известно несколько агентов, осуществляющих межмолекулярное перекрестное сшивание, которые можно использовать, см. например, Means и Feeney, Chemical Modification of Proteins, изд-во Holden-Day, 1974, cc 39-43. Среди этих реагентов следует отметить, например, Тч[-сукцинимидил-3-(2-
10 пиридилдитио)пропионат (SPDP) или ТчГ,№-(1,3-фенилен)бисмалеимид; N,N'-этилен-бис(йодацетамид) или другой такой реагент, имеющий метиленовые мостики, содержащие 6-11 атомов углерода; и 1,5-дифтор-2,4-динитробензол. Другие перекрестносшивающие агенты, которые можно применять для этой цели, включают: и,и'-дифтор-ж,ж'-динитродифенилсульфон;
15 диметиладипимидат; фенол-1,4-дисульфонилхлорид; гексаметилендиизоцианат или диизотиоцианат или азофенил-и-диизоцианат; глутаровый альдегид и дисдиазобензидин. Перекрестносшивающие агенты могут быть гомобифункциональными, т.е. иметь две функциональные группы, которые подвергаются одинаковой реакции. Предпочтительным гомобифункциональным
20 перекрестносшивающим агентом является бисмалеимидогексан (ВМН). ВМН
содержит две малеимидные функциональные группы, которые взаимодействуют специфически с содержащими сульфгидрил соединениями в мягких условиях (рН 6,5-7,7). Две малеимидные группы соединены углеводородной цепью. Таким образом, ВМН можно применять для необратимого перекрестного сшивания
25 белков (или полипептидов), которые содержат остатки цистеина.
Перекрестносшивающие агенты могут быть также гетеробифункциональными. Гетеробифункциональные перекрестносшивающие агенты имеют две различные функциональные группы, например, амино-реактивную группу и тиол-реактивную группу, которые могут перекрестно сшивать два белка, имеющие
30 свободные амины и тиолы соответственно. Примерами гетеробифункциональных перекрестеносшивающих агентов являются сукцинимидил-4-(1ч[-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), сложный м-малеимидобензоил-ТЧ-гидроксисукцинимидиловый эфир (MBS) и сукцинимид-4
(и-малеимидофенил)бутират (SMPB) и аналог с удлиненной цепью MBS. Сукцинимидильная группа указанных перекрестносшивающих агентов взаимодействует с первичным амином, тиол-реактивный малеимид образует ковалентную связь с тиолом остатка цистеина. Поскольку 5 перекрестносшивающие агенты часто обладают низкой растворимостью в воде, гидрофильный остаток, такой как сульфонатная группа, можно добавлять к перекрестносшивающему агенту для повышения его растворимости в воде. Сульфо-MBS и сульфо-SMCC являются примерами перекрестносшивающих агентов, модифицированных для растворимости в воде. Многие
10 перекрестносшивающие агенты образуют конъюгат, который практически не расщепляется в условиях клетки. Таким образом, некоторые перекрестносшивающие агенты содержат ковалентную связь, такую как дисульфид, которая может расщепляться в условиях клетки. Например, реагент Траута, дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP) и Тч[-сукцинимидил-3-(2-
15 пиридилдитио)пропионат (SPDP) являются хорошо известными расщепляемыми перекрестносшивающими агентами. Применение расщепляемого перекрестносшивающего агента позволяет проникающему в клетку пептиду, по меньшей мере одному антигену или антигенному эпитопу и по меньшей мере одному пептидному агонисту TLR, которые образуют комплекс, предлагаемый в
20 настоящем изобретении, отделяться друг от друга после их доставки в клетку-мишень. Для этой цели можно применять также прямую дисульфидную связь. Химическое перекрестное сшивание может включать также применение спейсерных плечей. Спейсерные плечи обеспечивают внутримолекулярную гибкость или позволяют регулировать внутримолекулярные расстояния между
25 конъюгированными фрагментами и поэтому могут способствовать сохранению биологической активности. Спейсерное плечо может находиться в форме белкового (или полипептидного) фрагмента, который включает спейсерные аминокислоты, например, пролин. Альтернативно этому, спейсерное плечо может являться частью перекрестносшивающего агента, такого как
30 "длинноцепочечный SPDP" (фирма Pierce Chem. Co., Рокфорд, шт. Иллинойс, каталожный № 21651 Н). Многочисленные перекрестносшивающие агенты, включая описанные выше, поступают в продажу. Подробные инструкции по их применению доступны от коммерческих поставщиков. Более подробную
информацию о перекрестном сшивании белков и получении конъюгатов, которые можно применять в контексте связывания компонентов а), б) и в), образующих комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, можно почерпнуть из: Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, изд-во 5 CRC Press, 1991.
Перекрестносшивающие агенты для перекрестного сшивания пептида или белка включают, например, (I) агенты, обеспечивающие перекрестное сшивание по типу амин-амин, например, гомобифункциональные амино-специфические белковые перекрестносшивающие реагенты на основе реактивных группы
10 сложного NHS-эфира и сложного имидоэфира для селективной конъюгации первичных аминов; доступны в виде коротких, длинных, расщепляемых, необратимых, проникающих через мембраны и находящихся на клеточной поверхности вариантов; (II) агенты, обеспечивающие перекрестное сшивание по типу сульфгидрил-углевод, например, перекрестносшивающие реагенты на
15 основе реактивных групп малеимида и гидразида для конъюгации и образования ковалентных перекрестных связей; (III) агенты, обеспечивающие перекрестное сшивание по типу сульфгидрил-сульфгидрил, например, гомобифункциональные сульфгидрил-специфические перекрестносшивающие реагенты на основе реактивных групп малеимида или пиридилдитиола для избирательной
20 ковалентной конъюгации тиолов белка и пептида (восстановленные цистеины) для образования стабильных тиоэфирных связей; (IV) фотореактивные перекрестносшивающие агенты, например, арилазид, диазирин и другие фотореактивные (активируемые светом) химические гетеробифункциональные перекрестносшивающие агенты для конъюгации белков, нуклеиновых кислот и
25 других молекулярных структур, участвующих в образовании комплексов рецептор-лиганд посредством двух стадийной активации; (V) агенты, обеспечивающие перекрестное сшивание по типу амин-сульфгидрил, например, гетеробифункциональные перекрестносшивающие агенты для белков для конъюгации между первичным амином (лизин) и сульфгидрильными (цистеин)
30 группами белков и других молекул; доступны со спейсерными плечами различной длины и типов; и (VI) агенты, обеспечивающие перекрестное сшивание по типу карбоксил-амин, например, перекрестносшивающие реагенты на основе карбодиимида, DCC и EDC (EDAC), для конъюгации карбоксильных
групп (глутамат, аспартат, С-концы) с первичными аминами (лизин, N-концы), а также N-гидроксисукцинимид (NHS) для стабильной активации карбоксилатов для конъюгации с амином.
В целом, примеры перекрестносшивающих агентов, которые можно 5 применять в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, включают сложный Тч[-(а-малеимидоацетокси)сукцинимидиловый эфир, Тч[-5-азидо-2-нитробензилоксисукцинимид, 1,4-бисмалеимидобутан, 1,4-бисмалеимидил-2,3 -дигидроксибутан, бисмалеимидогексан, бисмалеимидоэтан, гидразид N-(P-малеимидопропионовой кислоты)хТРА, сложный N-(P-10 малеимидопропилокси)сукцинимидиловый эфир, 1,8-
бисмалеимидодиэтиленгликоль, 1,11 -бисмалеимид отриэтиленгликоль, бис(сульфосукцинимидил)суберат, бис(сульфосукцинимидил)глутарат-с10, бис(сульфосукцинимидил)-2,2,4,4-глутарат-с14,
бис(сульфосукцинимидил)суберат-с10, бис(сульфосукцинимидил)-2,2,7,715 суберат-с14, бис(№Н8)ПЭГ5, бис(МШ)ПЭГ9, бис(2-
[сукцинимидоксикарбонилокси]этил)сульфон, Тч^ТЧ-дициклогексилкарбодиимид, 1-5-дифтор-2,4-динитробензол, диметиладипимидат> <НС1, диметилпимелимидатх 2HCI, диметилсуберимидат> <2НС1, дисукцинимидилглутарат, дитиобис(скуцимидилпропионат) (реагент Ломанта), дисукцинимидилсуберат, 20 дисукцинимидилтартрат, диметил-3,3'-дитиобиспропионимидатх2НС1,
дитиобисмалеимидоэтан, 3,3'-дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат), гидрохлорид 1 -этил-3 -(3 -диметиламинопропил)карбодиимида, этиленгликоль-бис(сукцинимидилсукцинат), N-s-малеимидокапроновую кислоту, гидразид N-(s-малеимидокапроновой кислоты), сложный N-(e-25 малеимидокапроилокси)сукцинимидиловый эфир, Тч[-(у-малеимидобутирилокси) сукцинимидиловый эфир, гидразид Тч[-(к-малеимидоундекановой кислоты), NHS-LC-диазирин, сукцинимидил-4-(М-малеимидометил)циклогексан-1-карбокси(6-амидокапроат), сукцинимидил-6-(3'-[2-пиридилтио]пропионамидо)гексаноат, L-фото-лейцин, L-фото-метионин, сложный ж-малеимидобензоил-N-30 гидроксисукцинимидиловый эфир, гидразид 4-(4-М-малеимидофенил)масляной кислотыХНС1, 2-[1ЧГ2-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоил)-М6-(6-биотинамидокапроил)-Ь-лизинил]этилметантиосульфат, 2-{N2-[N6-(4-a3Hflo-2,3,5,6-тетрафторбензоил)-М6-(6-биотинамидокапроил)-Ь
лизинил]}этилметантиосульфат, N-гидроксисукцинимид, сложный N-гидроксисукцинимидиловый эфир этаназида, сложный N-гидроксисукцинимидиловый эфир тетраоксапентадеканазида, сложный N-гидроксисукцинимидиловый эфир додекаоксанонатриаконтаназида, NHS-5 фосфин, 3-(2-пиридилтио)пропионилгидразид, 2-
пиридилдитиолтетраоксатетрадекан-ТЧ-гидроксисукцинимид, 2-пиридилдитиолтетраоксаоктатриаконтан-N-гидроксисукцинимид, N-(w-малеимидофенил)изоцианат, сукцинимидил-3-(бромацетамидо)пропионат, NHS-диазирин, NHS-SS-диазирин, N-сукцинимидилйодацетат, Тч[-сукцинимидил(4-
10 йодацетил)аминобензоат, сукцинимидил 4-(Тч[-малеимидометил)циклогексан-1-
карбоксилат, №18-ПЭГ2-малеимид, №18-ПЭГ4-малеимид, NHS-ПЭГб-малеимид, Ш18-ПЭГ8-малеимид, МШ-ПЭГ12-малеимид, Ш18-ПЭГ24-малеимид, сукцинимидил-4-(и-малеимидофенил)бутират, сукцинимидил-б-ф-малеимидопропионамидо)гексаноат, 4-сукцинимидилоксикарбонилметил-а-(2-
15 пиридилдитио)толуол, сукцинимидил-(4-псорален-8-илокси)бутират, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат, этиленгликоль-бис(сульфосукцинимидилсукцинат), сложный N-(e-
малеимидокапроилокси)сульфосукцинимидиловый эфир, сложный N-(y-малеимидобутилокси)сульфосукцинимидиловый эфир, сложный N-(K-20 малеимидоундеканоилокси)сульфосукцинимидиловый эфир, сульфо-NHS-LC-диазирин, сульфосукцинимидил-6-(3'-[2-
пиридилдитио]пропионамидо)гексаноат, сложный ж-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимидиловый эфир, N-гидроксисукцинимид, сульфо-NHS-фосфин, сульфосукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат,
25 сульфо-Ш18-(2-6-[биотинамидо]-2-(и-азидобензамид), сульфо-ТЧНЗ-диазирин, сульфо-ТЧНЗ-ЗЗ-диазирин, сульфосукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоат, сульфосукцинимидил-4-(1ч[-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, сульфосукцинимидил-4-(и-малеимидофенил)бутират, трис(2-малеимидоэтил)амин (трехфункциональный) и
30 трис(сукцинимидиламинотриацетат) (трехфункциональный).
Связь между двумя из трех компонентов а), б) и в) в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, может быть прямой или косвенной, т.е.
- по -
два компонента соединены, или они могут быть связаны с помощью дополнительного компонента комплекса, например, спейсера или линкера.
Предпочтительно реализацией прямой связи является амидный мостик, если подлежащие связыванию компоненты имеют реактивные аминогруппы или 5 карбоксильные группы. Более конкретно, если подлежащие связыванию компоненты представляют собой пептиды, полипептиды или белки, то предпочтительной является пептидная связь. Указанную пептидную связь, можно создавать с помощью химического синтеза, включающего оба подлежащих связыванию компонента (N-конец одного компонента и С-конец
10 другого компонента), или можно создавать непосредственно путем белкового
синтеза полной пептидной последовательности обоих компонентов, при этом оба (белок или пептид) компонента предпочтительно синтезируют на одной стадии. Указанные методы белкового синтеза включают (но не ограничиваясь только ими), например, методы жидкофазного пептидного синтеза или методы
15 твердофазного пептидного синтеза, например, методы твердофазного пептидного синтеза Меррифильда, твердофазной пептидный синтез с использованием ^-Вос, твердофазной пептидный синтез с использованием Fmoc, твердофазной пептидный синтез на основе ВОР (гексафторфосфат бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфония) и т.д. Альтернативно этому,
20 предпочтительными являются сложноэфирные или простые эфирные связи.
Кроме того, в частности, если подлежащие связыванию компоненты представляют собой пептиды, полипептиды или белки, то связь можно осуществлять через боковые цепи, например, с помощью дисульфидного мостика. Дополнительные компоненты другой химической природы, например,
25 по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, если он не имеет
пептидную природу, можно также присоединять к компонентам пептидной природы, к проникающему в клетку пептиду, по меньшей мере одному пептидному агонисту TLR и по меньшей мере одному антигену или антигенному эпитопу, если он имеет пептидную природу. Связь через боковую цепь
30 предпочтительно должна базироваться на аминогруппах, тиольных или
гидроксильных группах боковой цепи, например, представлять собой амидную или сложноэфирную или простую эфирную связь. Связь главной пептидной цепи с боковой пептидной цепью другого компонента может представлять собой
также изопептидную связь. Изопептидная связь представляет собой амидную
связь, которая не присутствует в главной цепи белка. Связь образуется между
карбоксильным концом одного пептида или белка и аминогруппой остатка
лизина на другом пептиде или белке (мишень).
5 Комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может необязательно
содержать спейсер или линкер, представляющие собой неиммунологические фрагменты, которые предпочтительно являются расщепляемыми и которые соединяют компонент а) и б) и/или компонент а) и в), и/или компонент б) и в), и/или соединяют последовательно расположенные антигены или антигенные
10 эпитопы, и/или соединяют последовательно расположенные пептидные агонисты TLR, и/или соединяют последовательно расположенные проникающие в клетку пептиды, и/или которые могут быть помещены в С-концевую область компонентов б) и/или в). Линкер или спейсер предпочтительно могут обладать дополнительными функциональностями помимо способности связывать
15 компоненты, предпочтительно являются расщепляемыми, более
предпочтительно расщепляемыми в естественных условиях внутри клетки-мишени, например, расщепляемыми ферментами. Однако указанные другие функциональности не должны, включать, в частности, иммунологические функциональности. Примеры дополнительных функциональностей, в частности,
20 касательно линкеров в слитых белках, представлены у Chen X. и др.: Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65(10), 2013, cc. 1357-1369, где описаны также, например, расщепляемые in vivo линкеры. Кроме того, у Chen X. и др., Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65(10), 2013, cc. 1357-1369 описаны также
25 различные линкеры, например, гибкие линкеры и жесткие линкеры, и
инструменты и базы данных для создания линкеров, которые можно применять в комплексах, предлагаемых в настоящем изобретении, или для создания линкера, который можно применять в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении. Указанный спейсер может быть пептидным или непептидным,
30 предпочтительно спейсер является пептидным. Предпочтительно пептидный спейсер состоит примерно из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, более предпочтительно примерно 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот. Аминокислотная последовательность пептидного спейсера может быть идентична
последовательности N-концевой или С-концевой фланкирующей области любого из компонентов а), б) или в). Альтернативно этому, пептидный спейсер может состоять из не встречающихся в естественных условиях аминокислотных последовательностей, таких как аминокислотная последовательность, 5 полученная в результате консервативных аминокислотных замен указанных встречающихся в естественных условиях фланкирующих областей, или последовательности известных расщепляемых протеазами сайтов, такие как сайт-мишень для энтерокиназы (аминокислотная последовательность: DDDK, SEQ ID NO: 16), сайт-мишень для фактора Ха (аминокислотная
10 последовательностье: IEDGR, SEQ ID NO: 17), сайт-мишень для тромбина
(аминокислотная последовательность: LVPRGS, SEQ ID NO: 18), сайт-мишень для протеазы TEV (аминокислотная последовательность: ENLYFQG, SEQ ID NO: 19), сайт-мишень для протеазы PreScission (аминокислотная последовательность LEVLFQGP, SEQ ID NO: 20), поликатионные аминокислоты,
15 например, сайт-мишень для полиК, фурина (аминокислотная
последовательность RX(R/K)R, SEQ ID NO: 21). В конкретном варианте осуществления изобретения пептидный спейсер не должен содержать никаких остатков Cys (С). В предпочтительном варианте осуществления изобретения линкерная последовательность содержит по меньшей мере 20%, более
20 предпочтительно по меньшей мере 40% и еще более предпочтительно по
меньшей мере 50% остатков Gly или Р-аланина, например, GlyGlyGlyGlyGly (SEQ ID NO: 22), GlyGlyGlyGly (SEQ ID NO: 23), GlyGlyGly, CysGlyGly или GlyGlyCys и т.д. Специалист в данной области легко может выбирать и получать приемлемые линкерные последовательности. Они могут состоять из D- и/или L-
25 аминокислот. Другие примеры пептидного спейсера включают аминокислотные последовательности EQLE (SEQ ID NO: 24) или TEWT (SEQ ID NO: 25), или любые их консервативные замены.
Непептидный спейсер может включать или может представлять собой сложный эфир, сложный тиоэфир и дисульфид.
30 В частности, комплекс, предлагаемый в изобретении, может содержать
спейсер или линкер, в частности, пептидный спейсер, расположенный между компонентом а) и б) и/или между компонентом а) и в), и/или между компонентом б) и в). Специалист в данной области может выбирать такой
пептидный спейсер, чтобы он мог отщепляться с помощью присущего клетке механизма после интернализации комплекса, содержащего проникающий в клетку пептид и карго-молекулу.
Когда комплекс содержит несколько антигенов или антигенных эпитопов или когда комплекс содержит несколько пептидных агонистов TLR, то, как должно быть очевидно специалисту в данной области, каждый из антигенов или антигенных эпитопов и/или каждый из пептидных агонистов TLR, входящих в комплекс, предлагаемый в изобретении, могут быть либо непосредственно соединены друг с другом, либо связаны через спейсеры или линкеры, такие, например, как пептидный спейсер, состоящий из нескольких аминокислот. Альтернативно этому, когда комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит несколько антигенов или антигенных эпитопов или когда комплекс содержит несколько пептидных агонистов TLR, то также является возможным, что некоторые антигены или антигенные эпитопы и/или некоторые пептидные агонисты TLR, входящие в комплекс, предлагаемый в изобретении, непосредственно связаны друг с другом, а некоторые другие антигены или антигенные эпитопы и/или некоторые другие пептидные агонисты TLR связаны через спейсеры или линкеры, такие, например, как пептидный спейсер, состоящий из нескольких аминокислот.
Например, два последовательно расположенных антигена или антигенных эпитопа или два последовательно расположенных пептидных агониста TLR, которые входят в комплекс, предлагаемый в изобретении, соединены друг с другом с помощью спейсера, состоящего из встречающихся в естественных условиях фланкирующих областей указанных антигенов или антигенных эпитопов или указанных пептидных агонистов TLR соответственно. Например, спейсер, применяемый для соединения первого антигена/антигенного эпитопа или первого пептидного агониста TLR со вторым антигеном /антигенным эпитопом или со вторым пептидным агонистом TLR соответственно, может состоять примерно из вплоть 8 аминокислот, соответствующих примерно вплоть до 4 аминокислотам N-концевой или С-концевой фланкирующей области первого антигена/антигенного эпитопа или первого пептидного агониста TLR, за которыми расположены примерно вплоть до 4 аминокислот N-концевой или С-концевой фланкирующей области второго антигена/антигенного эпитопа или
второго пептидного агониста TLR. В настоящем изобретении в качестве иллюстрации спейсер, применяемый для соединения первого антигена /антигенного эпитопа или первого пептидного агониста TLR ("антиген/эпитоп/пептидный агонист TLR 1") со вторым эпитопом 5 ("антиген/эпитоп/пептидный агонист TLR 2" состоит примерно из 8
аминокислот, соответствующих любой возможной следующей комбинации: от О фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 8 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, до 8 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и до
10 0 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, т.е. включая 1 фланкирующую аминокислоту антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 7 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, 2 фланкирующие аминокислоты антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 6 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного
15 агониста TLR 2, 3 фланкирующие аминокислоты антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 5 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, 4 фланкирующие аминокислоты антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 4 фланкирующие аминокислоты антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, 5 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного
20 агониста TLR 1 и 3 фланкирующие аминокислоты антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, 6 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 2 фланкирующие аминокислоты антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, 7 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 1 фланкирующая аминокислота антигена/эпитопа/пептидного
25 агониста TLR 2, 8 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 0 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2. Должно быть очевидно, что 8 аминокислот в целом, образующих спейсер, который соединяет два последовательно расположенных антигена/эпитопа/пептидных агониста TLR, не является абсолютной величиной,
30 и спейсер может состоять в целом, например, из 3 аминокислот, 4 аминокислот, 5 аминокислот, 6 аминокислот, 7 аминокислот, 9 аминокислот или 10 аминокислот. Аналогично этому, комбинации, эквивалентные указанным выше,
могут также служить иллюстрацией изобретения в ситуации, когда спейсер состоит из менее чем 8 аминокислот или более чем из 8 аминокислот.
Согласно другой конкретной иллюстрации настоящего изобретения спейсер, применяемый для соединения первого антигена/антигенного эпитопа 5 или первого пептидного агониста TLR ("антиген/эпитоп/пептидный агонист TLR 1") со вторым антигеном/антигенным эпитопом или со вторым пептидным агонистом TLR соответственно ("антиген/эпитоп/пептидный агонист TLR 2"), состоит, например, из 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот. Более конкретно, указанная спейсерная аминокислотная последовательность может соответствовать 4
10 аминокислотам N-концевой или С-концевой фланкирующей области
антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 или антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2. Спейсер, описанный выше, может также находиться в С-области последнего антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR, входящего в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении.
15 Методы соединения двух из трех компонентов а), б) и в) подробно описаны
в литературе, и они могут зависеть от природы по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа. Например, соединение двух из трех компонентов а), б) и в) можно достигать посредством расщепляемых дисульфидных связей, получаемых в целом с помощью постадийного
20 твердофазного синтеза или сочетания фрагментов в фазе раствора или на
твердой фазе, стабильной амидной, тиазолидиновой, оксимовой и гидразиновой связи, дисульфидной связи, стабильной тиомалеимидной связи, пептидной связи (включая пептидные связи между аминокислотами слитого белка), или электростатических или гидрофобных взаимодействий.
25 Предпочтительно по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп,
входящий в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, а также любой необязательный спейсер или линкер, входящий в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, имеют пептидную природу. Более предпочтительно все компоненты комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, например,
30 проникающий в клетку пептид, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, представляющий собой пептид, полипептид или белок, по меньшей мере один пептидный агонист TLR и необязательный пептидный линкер или спейсер, соединены в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, пептидной
связью. Таким образом, наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой пептид, полипептид или белок, такой как слитый белок, например, рекомбинантный слитый белок. В этом контексте комплекс, который содержит или состоит из 5 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 69, или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на
10 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO:
15 46 или SEQ ID NO: 69, является предпочтительным; комплекс, который
содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере
20 на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69,
25 является более предпочтительным; комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей
30 мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей
мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 28, SEQ ID N0:37, SEQ ID N0:39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, является еще
более предпочтительным; и комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей 5 мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 28, SEQ ID N0:39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, является особенно предпочтительным.
10 SEQ ID NO: 26:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGEDDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKSSE NDRLRLLLKE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA
15 QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS SEQ ID NO: 27:
MHHHHHHSTV HEILCKLSLE GDHSTPPSAY GSVKPYTNFD AEKRYKNRVA SRKSRAKFKQ LLQHYREVAA AKSSENDRLR LLLKESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA 20 NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGS SEQ ID NO: 28:
MHHHHHHKRYKNRVA SRKSRAKFKQ LLQHYREVAA AKSSENDRLR LLLKESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGSS TVHEILCKLS 25 LEGDHSTPPS AYGSVKPYTN FDAE SEQ ID NO: 33:
MHHHHHHKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESIINFEKLTEWT GSSTVHEILC KLSLEGDHST 30 PPSAYGSVKP YTNFDAE SEQ ID NO: 34:
MHHHHHHREV AAAKSSENDR LRLLLKESLK ISQAVHAAHA EINEAGREVV GVGALKVPRN QDWLGVPRFA KFASFEAQGA LANIAVDKAN
LDVEQLESII NFEKLTEWTG SSTVHEILCK LSLEGDHSTP PSAYGSVKPY
TNFDAE
SEQ ID NO: 37:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR 5 VTYSSPEDGI RELFPAPDGE DDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESIINFEKLTEWT GS SEQ ID NO: 38:
10 MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR
VTYSSPEDGI RELFPAPDGE DDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTREV AAAKSSENDR LRLLLKESLK ISQAVHAAHA EINEAGREVV GVGALKVPRN QDWLGVPRFA KFASFEAQGA LANIAVDKAN LDVEQLESII NFEKLTEWTG S
15 SEQ ID NO: 39:
KR YKNR VASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKS SEND RLRLLLKVTYHSPSY AYHQFERRAILNRLVQFIKDRISVVQALVLTSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGS VKPYTN FDAE
SEQ ID NO: 40:
20 KR YKNR VASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKS SEND RLRLLLKNYRIATFK
NWPFLEDCAMEELTVSEFLKLDRQRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYT NFDAE
SEQ ID NO: 41:
KR YKNR VASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKS SEND RLRLLLKHLEL ASM 25 TNMELMSSIVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE SEQ ID NO: 46:
RKKRRQRRRRVKRISQAVHAAHAEINEAGRRVKRKVPRNQDWLRVKRAS FEAQGALANIAVDKARVKRSIINFEKLRVKRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYG SVKPYTNFDAE 30 SEQ ID NO: 69:
KR YKNR VASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKS SEND RLRLLLKLFRAAQL ANDVVLQIMEHLELASMTNMELMSSIVVISASIIVFNLLELEGSTVHEILCKLSLE GDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
Расположение компонентов а), б) и в) в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении
Компоненты а), б) и в) могут располагаться в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, в любом порядке.
В частности, если более одного проникающего в клетку пептида и/или более одного антигена или антигенного эпитопа, и/или более одного пептидного агониста TLR содержатся в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, то несколько проникающих в клетку пептидов могут располагаться не последовательным образом, т.е. по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп (компонент б)) и/или по меньшей мере один пептидный агонист TLR (компонент в)) могут прерывать участок из последовательно расположенных проникающих в клетку пептидов и/или проникающие в клетку пептиды могут чередоваться с компонентом б) и/или компонентом в). Аналогично этому несколько антигенов или антигенных эпитопов могут располагаться не последовательным образом, т.е. по меньшей мере один проникающий в клетку пептид (компонент а)) и/или по меньшей мере один пептидный агонист TLR (компонент в)) могут прерывать участок из последовательно расположенных антигенов или антигенных эпитопов и/или антигены или антигенные эпитопы могут чередоваться с компонентом а) и/или компонентом в). Аналогично этому несколько пептидных агонистов TLR могут располагаться не обязательно последовательным образом, т.е. по меньшей мере один проникающий в клетку пептид (компонент а)) и/или по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп (компонент б)) могут прерывать участок из последовательно расположенных пептидных агонистов TLR и/или пептидные агонисты TLR могут чередоваться с компонентом а) и/или компонентом б).
Однако предпочтительно, чтобы несколько проникающих в клетку пептидов располагались в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, последовательным образом и/или несколько антигенов или антигенных эпитопов располагались в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, последовательным образом, и/или несколько пептидных агонистов TLR располагались в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, последовательным образом. Это означает, в частности, что все единичные элементы определенного компонента, т.е. все проникающие в клетку пептиды,
все антигены или антигенные эпитопы или все пептидные агонисты TLR, которые содержатся в комплексе, расположены в виде участка, который не прерывается любым из двух других компонентов. Предпочтительнее два других компонента располагаются в комплексе, например, до или после указанного 5 участка из всех единичных элементов указанного конкретного компонента. Однако последовательно расположенные единичные элементы указанного конкретного компонента могут быть связаны друг с другом, например с помощью указанного в настоящем описании спейсера или линкера, который не является частью двух других компонентов.
10 Наиболее предпочтительно, чтобы каждый из компонентов а), б) и в)
располагался последовательным образом.
Структурно каждый компонент а), б) и в), как правило, содержит одну главную цепь и по меньшей мере одну боковую цепь. Понятие "главная цепь" (синоним "каркасная цепь") в контексте настоящего изобретения относится к
15 главной непрерывной цепи ковалентно связанных атомов в молекуле. Например, в пептидах, полипептидах и белках главная цепь (каркас), как правило, содержит альфа-атомы углерода и атомы азота, образующие аминокислоты, сцепленные пептидной связью. Каркас не включает боковые цепи. Понятие "боковая цепь" (синоним "концевая (висящая) цепь") в контексте настоящего изобретения
20 относится к химической группе, присоединенной к коровой части молекулы, называемой "главной цепью" или каркасом. Например, в пептидах, полипептидах и белках боковые цепи, как правило, представляют собой (основные) части, образующие аминокислоты, которые присоединены к альфа-атомам углерода каркаса.
25 В комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, компоненты а), б) и
в) могут быть ковалентно связаны через линкер или спейсер, указанный в настоящем описании, или они могут быть непосредственно ковалентно связаны. Вне зависимости от того, применяют ли спейсер или линкер для ковалентного связывания, в принципе существует четыре возможных типа соединения друг с
30 другом двух из трех компонентов в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, а именно:
(I) посредством связи главная цепь/главная цепь,
(III) посредством связи боковая цепь/главная цепь или
(IV) посредством связи боковая цепь/боковая цепь.
Предпочтительно все три компонента а), б) и в) соединяют посредством связи главная цепь /главная цепь, что позволяет получать, в частности, главную цепь комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, которая содержит главную цепь одного или нескольких проникающего(их) в клетку пептида(ов), главную цепь одного или нескольких антигена(ов) или антигенного(ых) эпитопа(ов) и главную цепь одного или несколько пептидного(ых) агониста(ов) TLR. Другими словами, главная цепь одного или нескольких проникающего(их) в клетку пептида(ов), главная цепь одного или нескольких антигена(ов) или антигенного(ых) эпитопа(ов) и главная цепь одного или нескольких пептидного(ых) агониста(ов) TLR образуют главную цепь комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, необязательно в сочетании с дополнительными компонентами, например, линкером(ами), спейсером(ами) и т.д. Таки образом, предпочтительными являются следующие расположения компонентов а), б) и в), в частности, если по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп представляет собой пептид, полипептид или белок, где указанные предпочтительные расположения представлены ниже в направлении N-конец -" С-конец главной цепи комплекса и где все три компонента а), б) и в) связаны посредством связи главная цепь /главная цепь и могут необязательно соединены с помощью линкера, спейсера или другого дополнительного компонента:
(а) компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - компонент в) (по меньшей мере один пептидный агонист TLR);
(Р) компонент в) (по меньшей мере один пептидный агонист TLR) -компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп);
(у) компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент в) (по меньшей мере один пептидный агонист TLR) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп);
(8) компонент в) (по меньшей мере один пептидный агонист TLR) -компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) -компонент а) (проникающий в клетку пептид);
(s) компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп)
- компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент в) (по меньшей мере один пептидный агонист TLR); или
(Q компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп)
- компонент в) (по меньшей мере один пептидный агонист TLR) - компонент а) (проникающий в клетку пептид).
В частности, если все три компонента а), б) и в) связаны посредством связи главная цепь/главная цепь, то предпочтительно, чтобы по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп располагались на С-конце проникающего в клетку пептида, а проникающий в клетку пептид и по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп необязательно были сцеплены с помощью дополнительного компонента, например, линкера, спейсера, или с помощью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR. Таким образом, это соответствует варианту расположения, указанному в (а), (Р) и (у), из описанных выше вариантов расположения, т.е. из описанных выше вариантов расположения более предпочтительными являются (а), (Р) и (у).
Еще более предпочтительно по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп располагаются на С-конце проникающего в клетку пептида, при этом проникающий в клетку пептид и по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп необязательно сцеплены с помощью дополнительного компонента, например, линкера, спейсера, но не с помощью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR. Таким образом, это соответствует варианту расположения, указанному в (а) и (Р), из описанных выше вариантов расположения, т.е. из описанных выше вариантов расположения еще более предпочтительными являются (а) и (Р). Особенно предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок и компоненты а)-в) располагаются в направлении N-конец -" С-конец главной цепи указанного комплекса в следующем порядке:
(Р) компонент в) - компонент а) - компонент б),
где компоненты могут быть сцеплены с помощью дополнительного компонента, например, линкера или спейсера.
Наиболее предпочтительным является вариант расположения (а), в котором по меньшей мере один агонист TLR содержит или состоит по меньшей мере из одного агониста TLR2, например:
(al) компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2;
(а2) компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2, один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4, и один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5;
(аЗ) компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2, и один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4; или
(а4) компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2, и один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5.
Альтернативно этому, в вариантах расположения, содержащих пептидный агонист TLR2, дополнительные пептидные агонисты TLR могут располагаться в комплексе в других положениях, например:
(а5) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп)
- один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2;
(аб) один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп)
- один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2; или
(а7) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4, и один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5 -компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2.
Наиболее предпочтительным является вариант расположения (Р), в котором по меньшей мере один агонист TLR содержит или состоит по меньшей мере из одного агониста TLR4, например:
(Р1) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп);
(Р2) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4, один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2 и один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп);
(РЗ) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4, и один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2 -компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп); или
(Р4) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4, и один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5
компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп).
Альтернативно этому, в вариантах расположения, содержащих пептидный агонист TLR4, дополнительные пептидные агонисты TLR могут располагаться в комплексе в других положениях, например:
(Р5) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп)
- один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2;
(Р6) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп)
- один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5; или
(Р7) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп)
- один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2, и один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5.
Альтернативно этому, только два из трех компонентов а), б) и в) соединяют посредством связи главная цепь/главная цепь в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении.
Например, компоненты а) и б) соединяют посредством связи главная цепь/главная цепь, получая тем самым следующее расположение компонентов а) и б) в комплексе, в направлении N-конец -" С-конец главной цепи комплекса, при этом компоненты а) и б) необязательно могут быть сцеплены с помощью дополнительного компонента, например, линкера, спейсера и т.д.:
(1) проникающий в клетку пептид (а) - антиген/антигенный эпитоп (б); или
(2) антиген/антигенный эпитоп (б) - проникающий в клетку пептид (а). В таком случае компонент в), т.е. по меньшей мере один пептидный
агонист TLR, затем можно соединять посредством связи главная цепь/боковая
цепь, посредством связи боковая цепь/главная цепь или посредством связи боковая цепь/боковая цепь либо с проникающим в клетку пептидом (а), либо с антигеном/антигенным эпитопом (б), либо, если он присутствует, с дополнительным компонентом типа спейсера или линкера, который может, 5 например, находиться между проникающим в клетку пептидом (а) и
антигеном/антигенным эпитопом (б). Это предусматривает следующие варианты расположения:
(I) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с компонентом а), т.е.
10 главная цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью проникающего в клетку пептида;
(II) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с компонентом а), т.е.
15 боковая цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью проникающего в клетку пептида;
(III) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с компонентом а), т.е.
20 боковая цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью проникающего в клетку пептида;
(IV) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с компонентом б), т.е.
25 главная цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа;
(V) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с компонентом б), т.е.
30 боковая цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа;
(VI) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с компонентом б), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа;
(VII) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом а) и компонентом б), т.е. главная цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью линкера или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом б);
(VIII) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер
или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с линкером или
спейсером, расположенным между компонентом а) и компонентом б), т.е.
боковая цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно
связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью линкера
или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом б); или
(IX) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или
линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с линкером или
спейсером, расположенным между компонентом а) и компонентом б), т.е.
боковая цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно
связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью линкера
или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом б).
Например, компоненты б) и в) соединяют посредством связи главная цепь/главная цепь, получая тем самым следующее расположение компонентов б) и в) в комплексе, в направлении N-конец -" С-конец главной цепи комплекса, при этом компоненты б) и в) необязательно могут быть сцеплены с помощью дополнительного компонента, например, линкера, спейсера и т.д.:
(3) антиген/антигенный эпитоп (б) - пептидный агонист TLR (в); или
(4) пептидный агонист TLR (в) - антиген/антигенный эпитоп (б).
В таком случае компонент а), т.е. проникающий в клетку пептид, затем можно соединять посредством связи главная цепь/главная цепь, посредством связи боковая цепь/главная цепь или посредством связи боковая цепь/боковая
цепь либо с антигеном/антигенным эпитопом (б), либо с пептидным агонистом TLR (в), либо, если он присутствует, с дополнительным компонентом типа спейсера или линкера, который может, например, находиться между антигеном/антигенным эпитопом (б) и пептидным агонистом TLR (в). Это 5 предусматривает следующие варианты расположения:
(X) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с компонентом б), т.е. главная цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана -необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере
10 одного антигена или антигенного эпитопа;
(XI) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с компонентом б), т.е. боковая цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана -необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью по меньшей мере
15 одного антигена или антигенного эпитопа;
(XII) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с компонентом б), т.е. боковая цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана -необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере
20 одного антигена или антигенного эпитопа;
(XIII) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с компонентом в), т.е. главная цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана -необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере
25 одного пептидного агониста TLR;
(XIV) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с компонентом в), т.е. боковая цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана -необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью по меньшей мере
30 одного пептидного агониста TLR;
(XV) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с компонентом в), т.е. боковая цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана
(XV)
необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR;
(XVI) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом б) и компонентом в), т.е. главная цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана -необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью линкера или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом б);
(XVII) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом б) и компонентом в), т.е. боковая цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана -необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью линкера или спейсера, расположенного между компонентом б) и компонентом в); или
(XVIII) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер
или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с линкером или
спейсером, расположенным между компонентом б) и компонентом в), т.е.
боковая цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана -
необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью линкера или
спейсера, расположенного между компонентом б) и компонентом в).
Например, компоненты а) и в) соединяют посредством связи главная цепь/главная цепь, получая тем самым следующее расположение компонентов б) и в) в комплексе, в направлении N-конец -" С-конец главной цепи комплекса, при этом компоненты а) и в) необязательно могут быть сцеплены с помощью дополнительного компонента, например, линкера, спейсера и т.д.:
(5) проникающий в клетку пептид (а) - пептидный агонист TLR (в); или
(6) пептидный агонист TLR (в) - проникающий в клетку пептид (а). В таком случае компонент б), т.е. по меньшей мере один антиген или
антигенный эпитоп, затем можно соединять посредством связи главная цепь/главная цепь, посредством связи боковая цепь /главная цепь или посредством связи боковая цепь/боковая цепь либо с проникающим в клетку пептидом (а), либо с пептидным агонистом TLR (в), либо, если он присутствует, с дополнительным компонентом типа спейсера или линкера, который может,
например, находиться между проникающим в клетку пептидом (а) и пептидным агонистом TLR (в). Это предусматривает следующие варианты расположения:
(XIX) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с компонентом а), т.е. главная цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью проникающего в клетку пептида;
(XX) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с компонентом а), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью проникающего в клетку пептида;
(XXI) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с компонентом а), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью проникающего в клетку пептида;
(XXII) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с компонентом в), т.е. главная цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR;
(XXIII) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с компонентом в), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR;
(XXIV) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с компонентом в), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR;
(XXIII)
(XXV) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом а) и компонентом в), т.е. главная цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью линкера или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом
в);
(XXVI) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом а) и компонентом в), т.е. боковая цепь по меньшей мере по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью линкера или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом в); или
(XXVII) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер
или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с линкером или
спейсером, расположенным между компонентом а) и компонентом в), т.е.
боковая цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа
ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью
с линкера или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом
в).
Альтернативно этому, также можно в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, все три компонента а), б) и в) располагать посредством связи главная цепь/боковая цепь, связи боковая цепь/главная цепь или связи боковая цепь/боковая цепь, необязательно сцепленных с помощью дополнительного компонента, например, спейсера или линкера.
Нуклеиновая кислота, кодирующая пептиды и белки комплексов, предлагаемых в изобретении
Другим объектом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, где комплекс представляет собой полипептид или белок. В частности, в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, кодирующие комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, который описан выше.
В этом контексте нуклеиновые кислоты предпочтительно содержат одноцепочечные, двухцпепочечные или частично двухцепочечные нуклеиновые кислоты, предпочтительно выбранные из геномной ДНК, кДНК, РНК, siPHK, антисмысловой ДНК, антисмысловой РНК, рибозима, комплементарных 5 последовательностей РНК/ДНК со способствующими экспрессии элементами или без них, минигена, генных фрагментов, регуляторных элементов, промоторов и их комбинаций.
Предпочтительно изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей комплекс, который представляет собой, в частности, полипептид
10 или белок, где комплекс, содержащий проникающий в клетку пептид, по
меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, который представляет собой полипепид или белок, и по меньшей мере один пептидный агонист TLR, где проникающий в клетку пептид, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп и по меньшей мере один пептидный агонист TLR связаны
15 ковалентно, необязательно с помощью пептидного(ых) спейсера(ов) или
линкера(ов), указанного(ых) в настоящем описании. Если более одного антигена или антигенного эпитопа, который представляет собой полипептид или белок, содержится в указанном комплексе, то несколько антигенов или антигенных эпитопов также ковалентно связаны необязательно с помощью пептидного(ых)
20 спейсера(ов) или линкера(ов), указанного(ых) в настоящем описании.
Аналогично этому, если более одного пептидного агониста TLR содержится в указанном комплексе, то несколько пептидных агонистов TLR также ковалентно связаны, необязательно с помощью пептидного(ых) спейсера(ов) или линкера(ов), указанного(ых) в настоящем описании.
25 Особенно предпочтительно, нуклеиновая кислота, предлагаемая в
настоящем изобретении, кодирует комплекс, представляющий собой (рекомбинантный) слитый белок, который содержит (а) проникающий в клетку пептид, описанный выше, (б) по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два, более предпочтительно по меньшей мере три, еще более
30 предпочтительно по меньшей мере четыре, особенно предпочтительно по меньшей мере пять, наиболее предпочтительно по меньшей мере шесть антигенов или антигенных эпитопов, описанных выше, предпочтительно
расположенных последовательным образом, описанным выше, и (а) по меньшей мере один агонист TLR, описанный выше.
Получение и очистка проникающих в клетку пептидов и комплексов,
предлагаемых в изобретении
5 Следующим объектом настоящего изобретения является вектор, в
частности, рекомбинантный вектор, который содержит нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем изобретении, описанную выше.
Понятие "вектор" в контексте настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, предпочтительно к искусственной молекуле
10 нуклеиновой кислоты, т.е. молекуле нуклеиновой кислоты, которая не встречается в естественных условиях. Вектор в контексте настоящего изобретения можно применять для включения или укрытия требуемой нуклеотидной последовательности. Указанные векторы могут представлять собой векторы для хранения, экспрессионные векторы, клонирующие векторы,
15 векторы для переноса и т.д. Вектор для хранения представляет собой вектор,
который обеспечивает удобное хранение молекулы нуклеиновой кислоты. Так, вектор может содержать последовательность, соответствующую, например, требуемому антителу или фрагменту антитела, предлагаемому в настоящем изобретении. Экспрессионный вектор можно применять для получения
20 продуктов экспрессии, таких как РНК, например, мРНК, или пептидов,
полипептидов или белков. Например, экспрессионный вектор может сдержать последовательности, необходимые для транскрипции участка последовательности вектора, такие как промоторная последовательность. Клонирующий вектор, как правило, представляет собой вектор, который
25 содержит сайт клонирования, который можно использовать для включения нуклеотидных последовательностей в вектор. Клонирующий вектор может представлять собой, например, плазмидный вектор или вектор на основе бактериофага. Вектор для переноса может представлять собой вектор, пригодный для переноса молекул нуклеиновых кислот в клетки или организмы,
30 например, вирусные векторы. Вектор в контексте настоящего изобретения может представлять собой, например, РНК-вектор или ДНК-вектор. Предпочтительно вектор представляет собой молекулу ДНК. Например, вектор в контексте настоящего описания содержит сайт клонирования, маркер для селекции, такой
как фактор, обусловливающий устойчивость к антибиотикам, и последовательность, пригодную для размножения вектора, такую как сайт инициации репликации. Предпочтительно в контексте настоящего описания вектор представляет собой плазмидный вектор. Предпочтительно в контексте 5 настоящего описания вектор представляет собой экспрессионный вектор.
Под объем изобретения подпадают также клетки трансформированные вектором, предлагаемым в настоящем изобретении. Примеры таких клеток включают (но не ограничиваясь только ими) бактериальные клетки, например, Е. coli, и эукариотические клетки, например, клетки дрожжей, клетки животных
10 или клетки растений. В одном из вариантов осуществления изобретения клетки представляют собой клетки млекопитающих, например, человека, СНО, НЕК293Т, PER.C6, NS0, клетки миеломы или клетки гибридомы. Таким образом, настоящее изобретение относится также к клетке, экспрессирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в
15 настоящем изобретении; или содержащей вектор, предлагаемый в настоящем изобретении.
В частности, клетку можно трансфектировать вектором, предлагаемым в настоящем изобретении, предпочтительно экспрессионным вектором. Понятие "трансфекция" относится к интродукции молекул нуклеиновых кислот, таких
20 как молекулы ДНК или РНК (например, мРНК), в клетки, предпочтительно в эукариотические клетки. В контексте настоящего изобретения под понятие "трансфекция" подпадает любой известный специалисту в данной области метод интродукции молекул нуклеиновых кислот в клетки, предпочтительно в эукариотические клетки, например, в клетки млекопитающих. Указанные
25 методы включают, например, электропорацию, липофекцию, например, на основе катионных липидов и/или липосом, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию на основе наночастиц, трансфекцию на основе вирусов или трансфецию на основе катионных полимеров, таких как ДЭАЭ-декстран или полиэтиленимин и т.д. Предпочтительно интродукцию осуществляют без
30 применения вирусов.
Можно использовать многочисленные экспрессионные системы, включая (но не ограничиваясь только ими) хромосомы, эписомы и производные вирусов. Более конкретно применяемый вектор, предлагаемый в настоящем изобретении,
в частности, рекомбинантный вектор, можно получать из бактериальных плазмид, транспозонов, эписом дрожжей, элементов-вставок, элементов хромосом дрожжей, вирусов, таких как бакуловирус, вирусы папилломы, такие как SV40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы ветряной оспы, вирусы 5 псевдобешенства, ретровирусы.
Например, указанные векторы, в частности рекомбинантные векторы, могут являться производными как космид, так и фагмид. Нуклеотидную последовательность, в частности, нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем изобретении, можно встраивать в рекомбинантный экспрессионный
10 вектор с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области, таких, например, как методы, описанные в MOLECULAR CLONING: А LABORATORY MANUAL, Sambrook и др., 4-ое изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001.
Вектор, в частности, рекомбинантный вектор, может включать также
15 нуклеотидные последовательности, которые контролируют регуляцию
экспрессии, в частности нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем изобретении, а также нуклеотидные последовательности, обеспечивающие экспрессию, транскрипцию и трансляцию, в частности, нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем изобретении. Как правило, эти последовательности
20 выбирают в зависимости от применяемых клеток-хозяев.
Так, например, соответствующий секреторный сигнал можно интегрировать в вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, в частности, в рекомбинантный вектор, так, чтобы полипептид или белок, кодируемый нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем изобретении, направлялся,
25 например, к полости эндоплазматического ретикулума, к периплазматическому пространству, к мембране или к внеклеточному окружению. Выбор соответствующего секторного сигнала может облегчать последующую очистку белка.
Еще одним объектом настоящего изобретения является клетка-хозяин, 30 содержащая вектор, в частности, рекомбинантный вектор, предлагаемый в настоящем изобретении.
Интродукцию вектора, в частности, рекомбинантного вектора, предлагаемого в настоящем изобретении, в клетку-хозяина можно осуществлять
методами, хорошо известными специалисту в данной области, такими как описанные в BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis и др., 2-ое изд., изд-во McGraw-Hill Professional Publishing, 1995, и MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, выше, включая, например описанную 5 выше трансфекцию, например, с помощью фосфата кальция, ДЭАЭ-дектрана или катионных липидов; микроинъекцию, электропорацию, трансдукцию или заражение.
Клетка-хозяин может представлять собой, например, бактериальные клетки, такие как Е. coli, клетки грибов, такие как клетки дрожжей и клетки Aspergillus,
10 Streptomyces, клетки насекомых и/или любые линии клеток, например, клетки яичника китайского хомячка (СНО), мышиную клеточную линию С127, клеточную линию ВНК или клетки сирийского хомяка, клетки почки человеческого эмбриона 293 (НЕК 293). Предпочтительно клетка-хозяин, предлагаемая в настоящем изобретении, представляет собой клетку
15 млекопитающего, например, человека, СНО, НЕК293Т, PER.C6, NS0, клетки миеломы или гибридомы. В качестве клетки-хозяина наиболее предпочтительными являются дендритные клетки и линии дендритных клеток. Как правило, выбор культуральной среды зависит, в частности, от выбора типа клеток и/или линии клеток, при этом, специалист в данной области обладает
20 информацией о приемлемых культуральных средах, пригодных для выбранного типа клеток и/или линии клеток.
Клетки-хозяева можно применять, например, для экспрессии полипептида или белка, в частности, комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, на основе вектора и/или нуклеиновой кислоты, предлагаемого/предлагаемой в
25 настоящем изобретении. После очистки стандартными методами полипептида
или белка, в частности, комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, его можно применять в способе, описанном ниже.
Таким образом, настоящее изобретение относится также к способу получения комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, в частности,
30 когда комплекс представляет полипептид или белок. Указанный способ содержит стадии, на которых:
(I) культивируют описанную выше клетку-хозяина в культуральной среде;
(II) отделяют комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, от культуральной среды или отделяют комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, от лизата клеток-хозяев после лизиса клеток-хозяев.
Таким образом, комплекс, полученный с помощью указанного способа, 5 предлагаемого в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, который представлен в настоящем описании.
Для экстракции белка можно применять поступающие в продажу наборы
и/или реагенты, например BugBuster(tm) фирмы Novagen.
10 Предпочтительно описанный выше способ получения комплекса,
предлагаемого в настоящем изобретении, дополнительно включает следующую стадию, на которой:
(III) солюбилизируют комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, например, путем ресуспендирования в растворах, содержащих мочевину или
15 гуанидина гидрохлорид (GuHCl),
при этом стадию (III) осуществляют после описанной выше стадии (II).
Кроме того, предпочтительно, чтобы описанный выше способ получения
комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, дополнительно содержал
следующую стадию, на которой:
20 (IV) очищают комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении,
предпочтительно с помощью одной стадии аффинной хроматографии, при этом стадию (IV) осуществляют после стадии (II) или, если она присутствует, стадии (III), которые описаны выше.
Кроме того, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, можно 25 получать также с помощью методов химического синтеза, например, с помощью твердофазного пептидного синтеза.
Очистку указанных пептидов или белков можно осуществлять посредством любого метода, известного в данной области для очистки белков/пептидов. Примеры методов включают ионообменную хроматографию, хроматографию 30 гидрофобного взаимодействия и методы, основанные на иммуноаффинности. Таким образом, в настоящем изобретении предложен также способ получения комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, содержащего стадии, на которых:
(I) химически синтезируют указанный комплекс; и
(II) очищают указанный комплекс.
Предпочтительно в способе получения комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, комплекс, химически синтезированный на стадии (I) и 5 очищенный на стадии (II), содержит указанные в настоящем описании аминокислотные последовательности проникающего в клетку пептида, указанную в настоящем описании аминокислотную последовательность пептидного агониста TLR и, необязательно, если по меньшей мере один антиген и/или антигенный эпитоп представляет собой пептид или белок, то указанную в 10 настоящем описании аминокислотную последовательность антигена или антигенного эпитопа.
Альтернативно этому, в настоящем изобретении предложен также способ получения комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, в котором
(I) проникающий в клетку пептид, по меньшей мере один антиген или
15 антигенный фрагмент и/или по меньшей мере один пептидный агонист TLR
синтезируют отдельно;
(II) необязательно проникающий в клетку пептид, по меньшей мере один
антиген или антигенный фрагмент и/или по меньшей мере один пептидный
агонист TLR очищают; и
20 (III) проникающий в клетку пептид, по меньшей мере один антиген или
антигенный фрагмент и/или по меньшей мере один пептидный агонист TLR ковалентно связывают, как описано выше, необязательно с помощью спейсера или линкера или с помощью описанного выше перекрестносшивающего агента. Клетки, загруженные комплексами, предлагаемыми в изобретении
25 Другим объектом настоящего изобретения являются клетки, загруженные
комплексом, предлагаемым в изобретении. Например, клетки, загруженные комплексом, предлагаемым в изобретении, представляют собой клетки индивидуума, подлежащего лечению, т.е. клетки, выделенные из индивидуума, подлежащего лечения.
30 В контексте настоящего изобретения понятие "индивидуум" относится, в
частности, к млекопитающим. Например, рассматриваемые в настоящем изобретении млекопитающие включают человека, приматов, одомашненных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, лошади,
лабораторные грызуны и т.п. Более предпочтительно понятие "индивидуум" относится к человеку.
В контексте настоящего изобретения понятия "лечение" и "лечить" и т.п., как правило, означают получение требуемого фармакологического и физиологического действия. Действие может быть профилактическим, относящимся к предупреждению или частичному предупреждению заболевания, симптома или состояния, и/или может быть терапевтическим, относящимся к частичному или полному излечиванию заболевания, состояния, симптома или нежелательного явления, связанного с заболеванием. Под понятие "лечение" в контексте настоящего описания подпадает любое лечение заболевания у млекопитающего, в частности у человека, и оно включает: (а) предупреждение возникновения заболевания у индивидуума, который предрасположен к заболеванию, но у которого заболевание еще не началось, и/или заболевание еще не диагностировано у этого индивидуума, например, профилактическое раннее асимптоматическое вмешательство; (б) ингибирование заболевания, т.е. прекращение или замедление его развития; или (в) ослабление заболевания, т.е. вызывание по меньшей мере частичного регресса заболевания и/или по меньшей мере одного из его симптомов или состояний, таких как улучшение или излечение повреждения. В частности, способы, варианты применения, препараты и композиции, предлагаемые в изобретении, пригодны для лечения различных видов рака или инфекционных заболеваний и/или для предупреждения развития различных видов рака до запущенной или метастатической стадии у индивидуумов с ранней стадией рака, улучшая тем самым стадию рака. При применении в случае разных видов рака предупреждение заболевания или нарушения включает предупреждение появления или развития рака у индивидуума, у которого идентифицирован риск развития указанного вида рака, например, связанный с известным наличием этого вида рака у родственников индивидуума, и предупреждение заражения стимулирующими опухоль патогенами, такими, например, как вирус Эпштейна-Барра (EBV), вирус папилломы человека (HPV), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирус герпеса человека типа 8 (HHV8), вирус человеческого Т-клеточного лейкоза типа 1 (HTLV-1), вирус полиомы из клеток Меркеля (MCV) и Helicobacter pylori. Под понятия "предупреждение/лечение" рака
подпадает также стабилизация или замедление уже диагностированного рака у индивидуума. По "стабилизацией" понимают предупреждение развития рака в запущенную или метастатическую стадию у индивидуумов с ранней стадией рака.
5 Предпочтительно клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в
изобретении, представляет собой антигенпрезентирующую клетку (АРС). Предпочтительно антигенпрезентирующие клетки выбирают из группы, состоящей из дендритной клетки (DC), макрофага и В-клетки. Дендритные клетки, в частности, дендритные клетки (обычные и/или плазмацитоидные),
10 выделенные из индивидуума, подлежащего лечению, являются более предпочтительными.
Методы выделения антигенпрезентирующих клеток, в частности дендритных клеток, из индивидуума известны специалистам в данной области. Они включают сбор моноцитов или гематопоэтических стволовых клеток из
15 костного мозга, пуповинной крови или периферической крови. Они включают также применения эмбриональных стволовых (ES) клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS). Антигенпрезентирующие клетки, в частности, дендритные клетки или их предшественники, можно обогащать методами, которые включают отмучивание и разделение на основе магнитных
20 гранул, которые можно применять для обогащения С014+-клеток-предшественников.
Методы загрузки комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, в клетки, предпочтительно в вышеуказанные антигенпрезентирующие клетки, более предпочтительно в дендритные клетки, а также методы получения таких
25 клеток перед введением индивидууму, известны специалисту в данной области. Например, получение дендритных клеток может включать их культивирование или дифференцировку с использованием цитокинов, которые могут включать, например, GM-CSF и IL-4. Можно применять также линии дендритных клеток. Загрузка комплекса, предлагаемого в изобретении, в клетки, предпочтительно в
30 АРС, более предпочтительно в дендритные клетки, может включать совместную инкубацию комплекса, предлагаемого в изобретении, с клетками в культуре, с использованием свойств, присущих проникающему в клетку пептиду, который содержится в комплексе, предлагаемом в изобретении (т.е. его способности к
интернализации). Дополнительное культивирование клеток, например, дендритных клеток, загруженных таким образом, может включать для индукции эффективного созревания добавление цитокинов, включая IL-ip, IL-6, TNFa, ПЭГ2, IFNa, и адъювантов, которые могут включать поли-1С, поли-ICLC (т.е. 5 синтетического комплекса карбоксиметилцеллюлозы, двухцепочечной РНК
полиинозиновой-полицитидиловой кислоты и поли-Ь-лизина), а также агонисты TLR и агонисты NLR (рецепторы, подобные олигонуклеотидсвязывающему домену олигомеризации).
Следующим объектом настоящего изобретения является также 10 визуализация клеток, применяемых для клеточной терапии, таких как стволовые клетки, дендритные клетки, Т-клетки или естественные клетки-киллеры, где клетки загружают комплексом, предлагаемым в изобретении, который может дополнительно содержать визуализирующий агент.
В настоящем изобретении предложен также способ получения клеток, в 15 частности, антигенпрезентирующих клеток, загруженных описанным выше комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении, где указанный способ, содержит стадии, на которых:
(I) трансдуцируют или трансфектируют указанные клетки комплексом,
предлагаемым в изобретении;
20 (II) культивируют указанные клетки в культуральной среде; и
(III) отделяют указанные клетки от культуральной среды.
Предпочтительно клетки загружают комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении, где комплекс представляет собой полипептид или белок.
25 Предпочтительно клетки, загруженные комплексом(ами), предлагаемым(и)
в настоящем изобретении, презентируют по меньшей мере один антиген или
антигенный эпитоп, содержащийся в указанном комплексе, на клеточной
поверхности в контексте ГКГС класса I и/или в контексте ГКГС класса П.
Композиции и наборы, предлагаемые в настоящем изобретении
30 Другим объектом изобретения является композиция, которая содержит по
меньшей мере один компонент, выбранный из:
(I) комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, который описан выше,
(II) нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем изобретении, которая описана выше,
(III) вектора, предлагаемого в настоящем изобретении, который описан выше,
5 (IV) клетки-хозяина, предлагаемой в настоящем изобретении, которая
описана выше, и
(V) клетки, загруженной комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении, которая описана выше.
Предпочтительно композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, 10 содержит комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, который описан выше.
Композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может также содержать более одного из вышеуказанных компонентов (I)-(V). Например, композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать по
15 меньшей мере два различных комплекса, указанных в подпункте (I), по меньшей мере две различные нуклеиновые кислоты, указанные в подпункте (II), по меньшей мере два различных вектора, указанных в подпункте (III), по меньшей мере две различные клетки-хозяева, указанные в подпункте (IV), и/или по меньшей мере две различные клетки, указанные в подпункте (V); например,
20 композиция, предлагаемая в изобретении, может содержать по меньшей мере два различных комплекса, указанных в подпункте (I), и/или по меньшей мере две различные нуклеиновые кислоты, указанные в подпункте (II).
Например, различные комплексы, указанные в подпункте (I), которые содержатся в описанной выше композиции, могут отличаться либо компонентом
25 а), т.е. проникающими в клетку пептидами, компонентом б), т.е. антигенами или антигенными эпитопами или поднаборами из нескольких антигенов или антигенных эпитопов, либо компонентом в), т.е. пептидным агонистом TLR или поднабором из нескольких пептидных агонистов TLR; или различные комплексы, указанные в подпункте (I), которые содержатся в описанной выше
30 композиции, могут отличаться двумя из трех компонентов а), б) и в); или различные комплексы, указанные в подпункте (I), которые содержатся в описанной выше композиции, могут отличаться всеми тремя компонентами а), б) и в) комплекса. Соответственно различные нуклеиновые кислоты, указанные в
подпункте (II), которые содержатся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они кодируют указанные различные комплексы; различные векторы, указанные в подпункте (III), которые содержатся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они содержат указанные различные 5 нуклеиновые кислоты; различные клетки-хозяева, указанные в подпункте (IV), которые содержатся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они содержат указанные различные векторы; и различные загруженные комплексом клетки, указанные в подпункте (V), которые содержатся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они загружены 10 указанными различными комплексами.
В настоящем изобретении предложен также комплекс или клетки, загруженные представленным в настоящем описании комплексом, для применения в качестве лекарственного средства, в частности, вакцины. В частности, композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, 15 предпочтительно представляет собой вакцину
Таким образом, в изобретении предложена также вакцина, которая содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из:
(I) комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, который описан выше,
20 (II) нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем изобретении, которая
описана выше,
(III) вектора, предлагаемого в настоящем изобретении, который описан
выше,
(IV) клетки-хозяина, предлагаемой в настоящем изобретении, которая
25 описана выше, и
(V) клетки, загруженной комплексом, предлагаемым в настоящем
изобретении, которая описана выше.
Предпочтительно вакцина, предлагаемая в настоящем изобретении,
содержит описанный выше комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении.
30 При этом описанные выше применительно к композиции, предлагаемой в
настоящем изобретении, которые касаются использования более одного компонента (I)-(V), применимы также и к вакцине, предлагаемой в настоящем изобретении.
В контексте настоящего изобретения понятие "вакцина" относится к биологическому препарату, обусловливающему врожденный и/или адаптивный иммунитет, как правило, к конкретному заболеванию, предпочтительно раку. Так, вакцина поддерживает врожденный и/или адаптивный иммунный ответ 5 иммунной системы индивидуума, подлежащего лечению. Например, антиген или антигенный эпитоп комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, как правило, обусловливает или поддерживает адаптивный иммунный ответ у пациента, подлежащего лечению, а пептидный агонист TLR комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, может обусловливать или
10 поддерживать врожденный иммунный ответ.
Предлагаемая в изобретении композиция, в частности предлагаемая в изобретении вакцина, может содержать также указанные ниже фармацевтически приемлемые носитель, адъювант и/или наполнитель для предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции. Согласно конкретному варианту
15 предлагаемой в изобретении композиции, в частности, предлагаемой в изобретении вакцины, выбор фармацевтически приемлемого носителя определяется в принципе тем путем, которым вводят предлагаемую в изобретении композицию, в частности, предлагаемую в изобретении вакцину. Предлагаемую в изобретении композицию, в частности, предлагаемую в
20 изобретении вакцину, можно применять, например, системно или местно. Пути системного введения, в целом, включают, например, чрескожный, оральный, парентеральный пути, включая подкожные, внутривенные, внутримышечные, внутриартериальные, внутрикожные и внутрибрюшинные инъекции и/или интраназальный путь введения. Пути местного применения, в целом, включают,
25 например, местное нанесение, но также и внутрикожные, чрескожные,
подкожные или внутримышечные инъекции или инъекции внутрь повреждения, внутричерепные, внутрилегочные, внутрисердечные, внутринодальные (внутрь лимфатических узлов) и подъязычные инъекции. Более предпочтительно предлагаемую в изобретении композицию, в частности, вакцины, можно вводить
30 внутрикожным, подкожным, внутринодальным или внутримышечным путем. Еще более предпочтительно предлагаемую в изобретении композицию, в частности, вакцины, можно вводить подкожным, внутринодальным или внутримышечным путем. Особенно предпочтительно предлагаемую в
изобретении композицию, в частности, вакцины, можно вводить подкожным или внутринодальным путем. Наиболее предпочтительно предлагаемую в изобретении композицию, в частности, вакцины, можно вводить внутрикожным путем. Таким образом, предлагаемую в изобретении композицию, в частности, 5 предлагаемые в изобретении вакцины, предпочтительно приготавливать в жидкой (или иногда твердой) форме.
Приемлемое количество предлагаемой в изобретении композиции, в частности, предлагаемой в изобретении вакцины, подлежащей введению, можно определять с помощью общепринятых экспериментов использованием животных
10 моделей. Такие модели включают (но не ограничиваясь только ими) модели, созданные с использованием кроликов, овец, мышей, крыс, собак и приматов кроме человека. Предпочтительные стандартные лекарственные формы для инъекции включают стерильные растворы воды, физиологического раствора или их смеси. рН таких растворов следует доводить примерно до 7,4. Приемлемые
15 носители для инъекции включают гидрогели, устройства для контролируемого или замеленного высвобождения, полимолочную кислоту и коллагеновые матриксы. Приемлемые фармацевтически приемлемые носители для местного применения включают носители, которые пригодны для применения в лосьонах, кремах, гелях и т.п. Если предлагаемая в изобретении композиция, в частности,
20 предлагаемая в изобретении вакцина, предназначена для орального введения, то таблетки, капсулы и т.п. являются предпочтительной стандартной лекарственной формой. Фармацевтически приемлемые носители для получения стандартных лекарственных форм, которые можно использовать для орального введения, известны из существующего уровня техники. Их выбор зависит от вторичных
25 параметров, таких как вкус, стоимость и стабильность при хранении, которые не имеют решающего значения для целей настоящего изобретения, и выбор легко может сделать специалист в данной области.
Предлагаемая в изобретении композиция, в частности, предлагаемая в изобретении вакцина, может содержать дополнительно одну или несколько
30 вспомогательных субстанций для дополнительного повышения иммуногенности. Тем самым предпочтительно достигается синергетическое действие предлагаемого в изобретении комплекса, указанного выше, и вспомогательной субстанции, которая необязательно может содержаться в предлагаемой в
изобретении вакцине, описанной выше. В этой связи в зависимости от различных типов вспомогательных субстанций можно рассматривать различные механизмы. Например, соединения, которые способствуют созреванию дендритных клеток (DC), например липополисахариды, TNF-альфа или лиганд 5 CD40, образуют первый класс приемлемых вспомогательных субстанций. В
целом, в качестве вспомогательной субстанции можно применять любой агент, который влияет на иммунную систему по типу "сигнал опасности" (LPS, GP96 и т.д.), или цитокины, такие как GM-CSF, способствующие усилению и/или воздействию на мишень иммунному ответу, который вырабатывается в ответ на
10 стимулирующий иммунитет адъювант, предлагаемый в изобретении. Наиболее
предпочтительными вспомогательными субстанциями являются цитокины, такие как монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, которые дополнительно способствуют врожденному иммунному ответу, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-
15 16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-бета или TNF-альфа, факторы роста, такие как hGH.
Следующими добавка, которые можно включать в предлагаемую в изобретении вакцину, являются эмульгаторы, такие, например, как Tween°;
20 смачивающие агенты, такие, например, как лаурилсульфат натрия; красители; придающие вкус агенты, фармацевтические носители; агент для формования таблеток; стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты.
Предлагаемая в изобретении композиция, в частности, предлагаемая в изобретении вакцина, может содержать любое дополнительное соединение, для
25 которого известно наличие иммуностимулирующих свойств благодаря
аффинности связывания (в качестве лигандов) с человеческими Толл-подобными рецепторами TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, или благодаря аффинности связывания (в качестве лигандов) с мышиными Толл-подобными рецепторами TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8,
30 TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 или TLR13.
Другим классом соединений, которые в этом контексте можно добавлять в предлагаемую в изобретении композицию, в частности, в предлагаемую в изобретении вакцину, могут являться нуклеиновые кислоты CpG, в частности
CpG-PHK или CpG-ДНК. CpG-PHK или CpG-ДНК могут представлять собой одноцепочечную CpG-ДНК (ssCpG-ДНК), двухцепочечную CpG-ДНК (dsflHK), одноцепочечную CpG-PHK (ssCpG-PHK) или двухцепочечную CpG-PHK (dsCpG-РНК). Нуклеиновая кислота CpG предпочтительно находится в форме CpG-PHK, 5 более предпочтительно в форме одноцепочечной CpG-PHK (ssCpG-PHK).
Нуклеиновая кислота CpG предпочтительно содержит по меньшей мере одну или несколько (митогенную(ых)) динуклеотидную(ых) цитозин/гуаниновую(ых) последовательность(ей) (СрО-мотив(ы)). Согласно первой предпочтительной альтернативе по меньшей мере один CpG-мотив в этих последовательностях, в
10 частности С (цитозин) и G (гуанин) CpG-мотива, является неметилированным. Все другие цитозины или гуанины, необязательно содержащиеся в этих последовательностях, могут быть метилированными, либо неметилированными. Однако согласно дополнительной предпочтительно альтернативе С (цитозин) и G (гуанин) CpG-мотива могут присутствовать также в метилированной форме.
15 Кроме того, в настоящем изобретении предложен также комплекс,
описанный выше, или клетка, загруженная указанным комплексом, или композиция или вакцина, описанная выше, для применения для предупреждения и/или лечения заболеваний или нарушений, включающих, например, разные виды рака, гематологические нарушения, инфекционные заболевания,
20 аутоиммунные нарушения и отторжения трансплантатов, предпочтительно рак. Кроме того, в настоящем изобретении предложен также комплекс, описанный выше, или клетка, загруженная указанным комплексом, или композиция, описанная выше, для применения в качестве визуализирующей или диагностической композиции.
25 В настоящем изобретении предложена также фармацевтическая
композиция, в частности, композиция вакцины, описанная выше, и способ лечения индивидуума, предпочтительно млекопитающего и наиболее предпочтительно человека, который страдает от заболевания или нарушения, в частности, от нарушения, которое можно лечить с помощью иммунотерапии,
30 такого как различные виды рака, инфекционные заболевания, аутоиммунные нарушения и отторжения трансплантатов.
В частности, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один комплекс, предлагаемый в
настоящем изобретении, или по меньшей мере одну клетку, загруженную комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель или любой эксципиент, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные 5 специалистам в данной области, в частности, фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, или по меньшей мере одну клетку, загруженную комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель.
10 В качестве дополнительного ингредиента предлагаемая в изобретении
фармацевтическая композиция может содержать, в частности, фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель. В контексте настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель, как правило, включает жидкую или нежидкую основу предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции.
15 Если предлагаемая в изобретении композиция находится в жидкой форме, то носитель должен, как правило, представлять собой свободную от пирогенов воду; изотонические соляные или забуференные (водные) растворы, например, забуференные фосфатом, цитратом и т.д. растворы. В частности, для инъекции предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно использовать
20 воду или предпочтительно буфер, более предпочтительно водный буфер, содержащий натриевую соль, предпочтительно по меньшей мере ЗОмМ натриевую соль, кальциевую соль, предпочтительно по меньшей мере 0,05мМ кальциевую соль, и необязательно калиевую соль, предпочтительно по меньшей мере 1мМ калиевую соль. Согласно предпочтительному варианту осуществления
25 изобретения натриевая, кальциевая и необязательно калиевая соль может находиться в форме их галогенидов, например, хлоридов, йодидов или бромидов, в форме их гидроксидов, карбонатов, бикарбонатов или сульфатов и т.д. Примеры натриевых солей включают (но не ограничиваясь только ими), в частности, NaCl, Nal, NaBr, Na2CC> 3, NaHC03, Na2SC> 4, примеры необязательных
30 калиевых солей включают, в частности, КС1, KI, KBr, К2СО3, КНСО3, K2SO4, а примеры кальциевых солей включают, в частности, СаС1г, Са1г, СаВгг, СаСОз, CaSC> 4, Са(ОН)2. Кроме того, в буфере могут содержаться органические анионы вышеуказанных катионов. Согласно более предпочтительному варианту
осуществления изобретения указанный выше буфер, который можно применять для целей инъекции, может содержать соль, выбранную из хлорида натрия (NaCl), хлорида кальция (СаОг) и необязательно хлорида калия (КС1), при этом, помимо хлоридов могут присутствовать дополнительные анионы. СаОг можно 5 заменять также другой солью типа КС1. Как правило, соли в буфере для инъекций присутствуют в концентрации по меньшей мере ЗОмМ в случае хлорида натрия (NaCl), по меньшей мере 1мМ в случае хлорида калия (КО) и по меньшей мере 0,05мМ в случае хлорида кальция (СаОг). Буфер для инъекций может быть гипертоническим, изотоническим или гипотоническим относительно
10 конкретной референс-среды, т.е. буфер может иметь более высокое, идентичное или более низкое содержание солей относительно конкретной референс-среды, при этом предпочтительно можно применять вышеуказанные соли в таких концентрациях, которые не приводят к повреждению клеток в результате осмоса или других зависящих от концентрации эффектов. Референс-среды представляют
15 собой, например, жидкости, присутствующие в методах "гп vivo", такие как кровь, лимфа, цитозольные жидкости или другие жидкости организма или, например, жидкости, которые можно использовать в качестве референс-сред в методах "гп vitro", такие как обычные буферы или жидкости. Такие обычные буферы или жидкости известны специалистам в данной области.
20 Предпочтительными в качестве жидкой основы являются соляной раствор (0,9% NaCl) и лактированный раствор Рингера.
Однако в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно применять также один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей или разбавителей, или капсулирующих соединений, которые
25 можно использовать для введения индивидууму, подлежащему лечению.
Понятие "совместимый" в контексте настоящего описания означает, что эти составляющие предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно смешивать с указанным выше комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении, таким образом, что отсутствует взаимодействие, которое могло бы
30 приводит к существенному снижению фармацевтической эффективности
предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции в обычных условиях применения. Фармацевтически приемлемые носители, наполнители и разбавители должны, естественно, иметь достаточно высокую степень чистоты и
достаточной низкую токсичность для того, чтобы их можно было бы применять для введения индивидууму, подлежащему лечению. Некоторыми примерами соединений, которые можно применять в качестве фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей или составляющих, являются сахара, такие, например, 5 как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие, например, как кукурузный крахмал или картофельный крахмал; целлюлоза и ее производные, такие, например, как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, этилцеллюлоза, ацетат целлюлозы; порошкообразный трагакант; солод, желатин; жир; твердые вещества, обеспечивающие скольжение, такие, например, как стеариновая
10 кислота, стеарат магния; сульфат кальция; растительные масла, такие, например, как арахисовое масло, масло из семян хлопчатника, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и масло из теобромы (шоколадное дерево); полиолы, такие, например, полипропиленгликоль, глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; альгиновая кислота.
15 Предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно
вводить орально, парентерально, путем ингаляции спрея, местно, ректально, назально, трансбуккально, вагинально или с помощью имплантированного резервуара. В контексте настоящего описания понятие парентерально включает подкожную, внутривенную, внутримышечную, внутрисуставную, в
20 синовиальную жидкость, надчревную, внутриоболочечную, внутрипеченочную, внутрь повреждения, внутричерепную, чрескожную, внутрикожную, внутрилегочную, внутрибрюшинную, внутрисердечную, внутриартериальную, внутринодальную и подъязычную инъекцию или инфузию. Предпочтительно предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить
25 внутрикожно, внутримышечно, внутринодально или подкожно. Более
предпочтительно предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить внутримышечно, внутринодально или подкожно. Еще более предпочтительно предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить внутринодально или подкожно. Наиболее предпочтительно
30 предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить подкожно.
Предпочтительно предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить с помощью парентеральной инъекции, более
предпочтительно подкожной, внутривенной, внутрисуставной, внутрь синовиальной жидкости, надчревной, внутриоболочечной, внутрипеченочной, внутрь повреждения, внутричерепной чрескожной, внутрикожной, внутрилегочной, внутрибрюшинной, внутрисердечной, внутриартериальной, 5 внутринодальной и подъязычной инъекции или инфузии. Стерильные инъецируемые формы предлагаемых в изобретении фармацевтических композиций могут представлять собой водную или маслянистую суспензию. Эти суспензии можно приготавливать с помощью методов, известных в данной области, с использованием приемлемых диспергирующих или смачивающих
10 агентов и суспендирующих агентов. Стерильный инъецируемый препарат может также представлять собой стерильный инъецируемый раствор или инъецируемую суспензию в нетоксичном приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе, таком, например, как раствор в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых наполнителей и растворителей, которые можно
15 применять, следует упомянуть воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды, как правило, применяют стерильные нелетучие масла. Для этой цели можно применять мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицериды
20 можно применять в препаратах для инъекции в виде встречающихся в естественных условиях фармацевтически приемлемых масел, таких как оливковое масло или касторовое масло, прежде всего в виде их полиоксиэтилированных производных. Эти масляные растворы или суспензии могут содержать также спирт с длинной цепью с качестве разбавителя или
25 диспергирующего агента, такой как карбоксиметилцеллюлоза или аналогичные диспергирующие агенты, которые обычно применяют для приготовления фармацевтически приемлемых лекарственных форм, включая эмульсии и суспензии. Для приготовления предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно применять также общепринятые поверхностно-активные
30 вещества, такие как Твины, Спаны и другие эмульгирующие агенты или биологически доступные энхансеры, которые обычно применяют для производства фармацевтически приемлемых твердых, жидких или других лекарственных форм.
Для внутривенной, кожной или подкожной инъекции или инъкции в область поражения действующее вещество должно предпочтительно находиться в форме приемлемого для парентерального введения водного раствора, свободного от пирогенов и имеющего приемлемую величину рН, изотоничность 5 и стабильность. Специалисты в данной области могут приготавливать приемлемые растворы, используя, например, придающие изотоничность наполнители, такие как хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, лактированный раствор Рингера для инъекций. Можно включать при необходимости консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или
10 другие добавки. Вне зависимости от того, применяют ли полипептид, пептид или молекулу нуклеиновой кислоты, другое фармацевтически приемлемое соединение, предлагаемое в изобретении, которое следует вводить индивидууму, введение предпочтительно осуществляют в "профилактически эффективном количестве" или "терапевтически эффективном количестве" (в зависимости от
15 ситуации), которое является достаточным для оказания благоприятного
воздействия на индивидуума. Фактически вводимое количество и скорость и продолжительность введения должны зависеть от природы и серьезности состояния, подлежащего лечению.
Предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию, указанную
20 выше, можно вводить также орально в виде любой приемлемой для орального введения лекарственной формы, включая (но не ограничиваясь только ими) капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для орального применения общепринятые носители представляют собой лактозу и кукурузный крахмал. Как правило, добавляют также замасливатели, такие как
25 стеарат магния. Для орального введения в форме капсулы приемлемыми
разбавителями являются лактоза и безводный кукурузный крахмал. Когда для орального введения требуются водные суспензии, то действующее вещество, т.е. указанный выше предлагаемый в изобретении, транспортер конъюгированной карго-молекулы, указанной выше, объединяют с эмульгирующими и
30 суспендирующими агентами. При необходимости можно добавлять
определенные подслащивающие вещества, корргиенты или красители.
Предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно применять также местно, прежде всего, если мишень обработки включает
области или органы, легко доступные для местного нанесения, например, включая заболевания кожи или любой другой доступной эпителиальной ткани. Приемлемые местные препаративные формы легко приготавливать для каждой/каждого из указанных областей или органов. Для местного применения 5 предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно приготавливать в виде приемлемой мази, содержащей предлагаемую в изобретении иммуностимулирующую композицию, в частности ее компоненты, описанные выше, суспендированные или растворенные в одном или нескольких носителях. Носители для местного применения включают (но не ограничиваясь
10 только ими) минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин,
пропиленгликоль, полиоксиэтилен, прлиоксипропилен, эмульгирующийся воск и воду. Альтернативно этому, предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно приготавливать в форме приемлемого лосьона или крема. В контексте настоящего изобретения приемлемые носители включают (но не
15 ограничиваясь только ими) минеральное масло, сорбитанмоностеарат,
полисорбат 60, сложные цетиловые эфиры воска, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду.
В этом контексте предписание лечения, например, выбор доз и т.д. при применении описанной выше фармацевтической композиции, находится в
20 компетенции обычных практикующих специалистов и других врачей, и, как правило, при этом учитываются нарушение, подлежащее лечению, состояние индивидуального пациента, место введения, метод обработки и другие факторы, известные практикующему специалисту. Примеры упомянутых выше методик и протоколов можно почерпнуть из REMINGTON'S PHARMACEUTICAL
25 SCIENCES, 160-е изд., под ред. Osol А., 1980.
Таким образом, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция, как правило, содержит в "безопасном и эффективном" количестве компоненты предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции, в частности указанного выше комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении,
30 и/или клеток, загруженных указанным комплексом. В контексте настоящего описания "безопасное и эффективное количество" означает количество комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, которое является достаточным для существенной индукции положительных изменений
заболевания или нарушения, т.е. количество комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, или клеток, загруженных указанным комплексом, которое вызывает биологический или медицинский ответ в рассматриваемой ткани, системе, у животного или человека. Эффективное количество может представлять собой "терапевтически эффективное количество" для облегчения симптомов заболевания или состояния, подлежащего лечению, и/или "профилактически эффективное количество" для профилактики симптомов заболевания или состояния, подлежащего предупреждению. Понятие включает также количество активного комплекса, достаточное для замедления развития заболевания, в частности, для снижения или ингибирования роста опухоли или инфекции, и тем самым вызывает ожидаемый ответ, в частности, указанный ответ может представлять собой иммунный ответ, направленный против антигенов или антигенных эпитопов, которые содержатся в комплексе (т.е. "ингибирующее эффективное количество"). Однако, в то же время "безопасное и эффективное количество" является достаточно небольшим, чтобы избегать серьезных побочных действий, т.е. обеспечивает разумное соотношение между пользой и риском. Указанные пределы, как правило, определяются разумными медицинскими решениями. "Безопасное и эффективное" количество компонентов предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции, в частности, указанного выше комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, должно также варьироваться в зависимости от конкретного состояния, подлежащего лечению, а также возраста и физического состояния пациента, подлежащего лечению, веса тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени обработки, скорости экскреции, комбинации лекарственных средств, активности конкретных компонентов а), б) и в) описанного выше комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, серьезности состояния, продолжительности лечения, природы сопутствующей терапии, конкретного применяемого фармацевтически приемлемого носителя и аналогичных факторов, которые являются известными и находятся в компетенции соответствующего врача. Предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно применять для человека, а также в ветеринарной медицине, предпочтительно в медицине человека, в качестве фармацевтической композиции в целом, или в качестве вакцины.
Фармацевтические композиции, в частности, композиции вакцины, или препаративные формы, предлагаемые в изобретении, можно вводить в виде фармацевтической препаративной формы, которая может содержать комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, в любой форме, указанной в настоящем 5 описании.
Понятия "фармацевтическая препаративная форма" и "фармацевтическая композиция" в контексте настоящего изобретения относится, в частности, к препаратам, которые находятся в форме, обеспечивающей биологическую активность действующего(их) вещества(в), таким образом, чтобы оно(и)
10 однозначно проявляло(и) эффективность, и которая не содержит
дополнительный компонент, который может обладать токсичностью для индивидуумов, которым должна вводиться указанная препаративная форма.
В контексте настоящего изобретения "эффективность" лечения можно измерять на основе изменений протекания заболевания в ответ на применение,
15 предлагаемое в настоящем изобретении, или на способ, предлагаемый в настоящем изобретении. Например, эффективность лечения рака можно измерять по снижению объема опухоли и/или удлинению времени жизни без прогрессирования, и/или снижению риска рецидива после резекции первичного рака. Более конкретно, при раке, который лечат с помощью иммунотерапии,
20 оценка эффективности может включать спектр клинических картин
противоопухолевого ответа на иммунотерапевтические агенты с использованием новых критериев ответа на иммунотерапию (irRC), которые являются адаптацией критериев оценки ответа солидных опухолей (RECIST), и критерии Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (J. Natl. Cancer Inst. 102(18),
25 2010, сс. 1388-1397). Эффективность предупреждения инфекционного
заболевания в конечном счете оценивают с помощью эпидемиологических исследований человеческих популяций, которые часто коррелируют с титрами нейтрализующих антител в сыворотке, и по индукции многофункциональных патогенспецифических Т-клеточных ответов. Доклиническая оценка может
30 включать устойчивость к инфекции после контрольного заражения
инфекционным патогеном. Лечение инфекционного заболевания можно оценивать по ингибированию роста патогена или элиминации патогена (и, как
следствие, отсутствию поддающегося обнаружению патогена), что коррелирует с патогенспефическими антителами и/или Т-клеточными иммунными ответами.
Фармацевтические композиции, в частности композиции вакцины, или препаративные формы, предлагаемые в изобретении, можно вводить также в 5 виде фармацевтической препаративной формы, которая может содержать антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, предлагаемым в изобретении, в любой указанной в настоящем описании форме.
Вакцину и/или композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно приготавливать также в виде фармацевтических композиций и их
10 стандартных доз, в частности, в сочетании с общепринятыми адъювантами,
иммуномодулирующим агентом, носителем, разбавителем или эксципиентом, которые описаны выше и будут описаны ниже, в такой форме их можно применять в виде твердых препаратов, таких как таблетки или заполненные капсулы, или в виде жидкостей, таких как растворы, суспензии, эмульсии,
15 эликсиры, или заполненные ими капсулы, все для орального применения, или в форме стерильных инъецируемых растворов для парентерального (включая подкожное и внутрикожное введение), которые вводят с помощью инъекции или непрерывной инфузии.
В контексте настоящего изобретения, в частности, в контексте
20 фармацевтической композиции и вакцин, предлагаемых в настоящем
изобретении, основой инъецируемых композиций, как правило, является инъецируемый стерильный физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор, или другие инъецируемые носители, известные в данной области. Указанные фармацевтические композиции и их
25 формы в виде стандартных доз могут содержать ингредиенты в общепринятых пропорциях, с добавлением дополнительных действующих веществ или ингредиентов или без них, и такие стандартные дозы могут содержать в любом пригодном эффективном количестве действующее вещество, в соответствии с предполагаемым диапазоном суточных доз при применении.
30 Примеры приемлемых адъювантов и/ или иммуномодулирующих агентов в
контексте настоящего изобретения включают MPL(r) (фирма Corixa), минералы на основе алюминия, включая производные алюминия (как правило, называемые квасцами), ASOl-4, MF59, фосфат кальция, липосомы, Iscom, полиинозиновую
полицитидиловую кислоту (полиГС), включая ее стабилизированную форму поли-ICLC (фирма Hiltonol), CpG-олигодезоксинуклеотиды, колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), липополисахарид (LPS), монтанид, сополимер полилактида-полигликолида 5 (PLG), флагеллин, сапонины коры мыльного дерева (QS21), аминоалкилглюкозамиды (например, RC529), два компонента антибактериальных пептидов с синтетическими олигодезоксинуклеотидами (например, IC31), имиквимод, резиквимод, иммуностимулирующие последовательности (ISS), монофосфорил-липид A (MPLA), фибробласт-
10 стимулирующий липопептид (FSL1) и антитела к CD40.
Композиции, в частности, фармацевтические композиции и вакцины, предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой жидкие препаративные формы, включая (но не ограничиваясь только ими) водные или масляные суспензии, растворы, эмульсии, сиропы и эликсиры. Композиции
15 можно приготавливать также в виде безводного продукта, предназначенного для восстановления водой или другим пригодным наполнителем перед применением. Указанные жидкие препараты могут содержать добавки, включая (но не ограничиваясь только ими) суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, неводные наполнители и консерванты. Суспендирующие агенты включают (но
20 не ограничиваясь только ими) сироп сорбита, метилцеллюлозу, сироп
глюкозы/сахара, желатин, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия и гидрогенизированные съедобные жиры. Эмульгирующие агенты включают (но не ограничиваясь только ими) лецитин, сорбитанмоноолеат и гуммиарабик. Консерванты включают (но не
25 ограничиваясь только ими) метил- или пропил-иара-гидроксибензоат и
сорбиновую кислоту. Диспергирующие или смачивающие агенты включают (но не ограничиваясь только ими) поли(этиленгликоль), глицерин, бычий сывороточный альбумин, Tween(r), Span(r).
Композиции, в частности, фармацевтические композиции и вакцины,
30 предлагаемые в настоящем изобретении, можно приготавливать также в виде препарата в форме депо, который можно вводить путем имплантации или внутримышечной инъекции.
Композиции, в частности, фармацевтические композиции и вакцины, предлагаемые в настоящем изобретении, могут находиться в форме твердых композиций, которые могут иметь форму таблеток или лепешек, которые приготавливают общепринятым образом. Например, таблетки и капсулы для 5 орального введения могут содержать общепринятые эксципиенты, включая (но не ограничиваясь только ими) связывающие агенты, наполнители, замасливатели, разрыхлители и смачивающие агенты. Связывающие агенты включают (но, не ограничиваясь только ими) сироп, гуммиарабик, желатин, сорбит, трагакант, клейкое вещество из крахмала и поливинилпирролидон.
10 Наполнители включают (но не ограничиваясь только ими) лактозу, сахар, микрокристаллическую целлюлозу, кукурузный крахмал, фосфат кальция и сорбит. Замасливатели включают (но не ограничиваясь только ими) стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, полиэтиленгликоль и кремнезем. Разрыхлители включают (но не ограничиваясь только ими) картофельный
15 крахмал и натрий гликолят крахмала. Смачивающие агенты включают (но не ограничиваясь только им) лаурилсульфат натрия. На таблетки можно наносить покрытие с помощью известных в данной области методов.
Композиции, в частности, фармацевтические композиции и вакцины, предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить также в виде форм с
20 замедленным высвобождением или систем для доставки лекарственных форм с замедленным высвобождением.
Кроме того, композиции, в частности, фармацевтические композиции и вакцины, предлагаемые в настоящем изобретении, можно адаптировать для доставки путем повторяющегося введения.
25 Дополнительные материалы, а также методы обработки препаративных
форм и т.п., которые можно применять в контексте композиций, в частности, фармацевтических композиций и вакцин, предлагаемых в настоящем изобретении, или в контексте их получения, изложены в "части 5 Remington's "The Science and Practice of Pharmacy", 22-ое изд., изд-во University of the
30 Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2012.
Следующим объектом настоящего изобретения является способ приготовления фармацевтической композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, включающий стадию смешения комплекса, предлагаемого в
настоящем изобретении, или клеток, в частности, антигенпрезентирующих клеток, загруженных комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемого носителя.
Таким образом, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, и 5 клетку, загруженную комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении,
можно применять (для приготовления фармацевтической композиции и/или для приготовления вакцины) для предупреждения, лечения и/или облегчения любого из заболеваний или нарушений, указанных в настоящем описании, в частности, тех, которые можно лечить или предупреждать с помощью иммунотерапии,
10 таких как разные виды рака и инфекционные заболевания.
Другим объектом изобретения являются композиции для визуализации или диагностирования ("диагностические композиции"). Еще одним объектом изобретения являются способы доставки визуализирующего агента и способы диагностирования заболевания или нарушения у индивидуума, предпочтительно
15 у млекопитающего и наиболее предпочтительно у человека, для которого
ожидается, что он может страдать от медицинского нарушения, в частности, рака, инфекционного заболевания, аутоиммунного нарушения и отторжения трансплантата.
Препаративные формы и пути введения, указанные в настоящем описании 20 для фармацевтических композиций, можно применять также и для
визуализирующих или диагностических композиций ("диагностические композиции"), предлагаемых в изобретении.
Следующим объектом настоящего изобретения являются также состоящие из частей наборы, которые содержат по меньшей мере один из следующих 25 компонентов:
(I) комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, который описан выше,
(II) нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем изобретении, которая описана выше,
30 (III) вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, который описан
выше,
(IV) клетку-хозяина, предлагаемую в настоящем изобретении, которая описана выше, и
(V) клетку, загруженную комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении, который описан выше.
В частности, состоящий из частей набор, предлагаемый в изобретении, может содержать более одного компонента (I)-(V). Например, состоящий из частей набор, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать по меньшей мере два различных комплекса, указанных в подпункте (I), по меньшей мере две различные нуклеиновые кислоты, указанные в подпункте (II), по меньшей мере два различных вектора, указанных в подпункте (III), по меньшей мере две различные клетки-хозяева, указанные в подпункте (IV), и/или по меньшей мере две различные клетки, указанные в подпункте (V); например, состоящей из частей набор, предлагаемый в изобретении, может содержать по меньшей мере два различных комплекса, указанных в подпункте (I), и/или по меньшей мере две различные нуклеиновые кислоты, указанные в подпункте (II).
Например, различные комплексы, указанные в подпункте (I), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться либо компонентом а), т.е. проникающими в клетку пептидами, либо компонентом б), т.е. антигенами или антигенными эпитопами или поднаборами из нескольких антигенов или антигенных эпитопов, либо компонентом в), т.е. пептидным агонистом TLR или поднаборами из нескольких пептидных агонистов TLR; или различные комплексы, указанные в подпункте (I), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться двумя из трех компонентов а), б) и в); различные комплексы, указанные в подпункте (I), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться всеми тремя компонентами а), б) и в) комплекса. Соответственно, различные нуклеиновые кислоты, указанные в подпункте (II), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться тем, что они кодируют указанные различные комплексы; различные векторы, указанные в подпункте (III), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться тем, что они содержат указанные различные нуклеиновые кислоты; различные клетки-хозяева, указанные в подпункте (IV), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться тем, что они содержат указанные различные векторы; и различные клетки, загруженные комплексом, указанные в
подпункте (V), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться тем, что они загружены указанными различными комплексами.
Различные компоненты состоящего из частей набора могут быть упакованы в один или несколько контейнеров. Указанные выше компоненты могут 5 находиться в лиофилизированной или безводной форме или могут быть растворены в приемлемом буфере. Набор может содержать также дополнительные реагенты, включая, например, консерванты, среды для роста и/или буферы для хранения и/или восстановления вышеуказанных компонентов, промывочные растворы и т.п. Кроме того, состоящий из частей набор,
10 предлагаемый в настоящем изобретении, необязательно может содержать инструкции по применению.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен также набор для вакцинации для лечения, предупреждения и/или стабилизации рака или инфекционного заболевания, который содержит фармацевтическую композицию,
15 предлагаемую в настоящем изобретении, или вакцину, предлагаемую в настоящем изобретении, и инструкции по применению указанной фармацевтической композиции или указанной вакцины.
Таким образом, в настоящем изобретении, предложен также набор, который содержит указанный в настоящем описании комплекс, предлагаемый в
20 настоящем изобретении, указанную в настоящем описании клетку,
предлагаемую в настоящем изобретении, указанную в настоящем описании композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, указанную в настоящем описании вакцину, предлагаемую в настоящем изобретении, и/или указанную в настоящем описании фармацевтическую композицию, предлагаемую в
25 настоящем изобретении.
Предпочтительно указанный набор содержит листовку-вкладыш в упаковку или листок с инструкцией по применению для лечения рака и/или гематологического нарушения, предпочтительно злокачественной неоплазмы головного мозга или злокачественной неоплазмы лимфоидной ткани,
30 гематопоэтической и родственной ткани, наиболее предпочтительно
глиобластомы, с помощью указанного в настоящем описании комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, указанной в настоящем описании клетки, предлагаемой в настоящем изобретении, указанной в настоящем
описании композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, указанной в
настоящем описании вакцины, предлагаемой в настоящем изобретении, и/или
указанной в настоящем описании фармацевтической композиции, предлагаемой
в настоящем изобретении.
5 Указанный набор можно применять, в частности, в медицине, для
предупреждения и/или лечения рака.
Кроме того, композиции и/или состоящие из частей наборы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в методах визуализации и/или для диагностирования заболевания или нарушения, указанного в настоящем 10 описании.
Применение и способы, предлагаемые в изобретении
Другим объектом настоящего изобретения является применение одного из следующих компонентов: (I) комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, и/или (II) клеток, таких как антигенпрезентирующие клетки,
15 загруженные комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении (для
приготовления лекарственного средства), для предупреждения, лечения или стабилизации заболевания или нарушения, такого, которое можно лечить с помощью иммунотерапии, включая различные виды рака, инфекционные заболевания, аутоиммунные нарушения, гематологические заболевания и
20 отторжения трансплантатов. Таким образом, в настоящем изобретении
предложен любой из следующих компонентов: (I) комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, и/или (II) клетки, такие как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении, для применения для предупреждения, лечения или стабилизации заболевания или
25 нарушения, такого, которое можно лечить с помощью иммунотерапии, включая различные виды рака, инфекционные заболевания, аутоиммунные нарушения, гематологические заболевания и отторжения трансплантатов.
В настоящем изобретение предложен также комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, который обеспечивает транспорт и презентацию по
30 меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа, содержащегося в комплексе, на клеточной поверхности антигенпрезентирующих клеток в контексте ГКГС класса I и/или ГКГС класса II, для применения для вакцинации и/или иммунотерапии.
Другим объектом настоящего изобретения является способ предупреждения, лечения или подавления заболевания или нарушения, которое можно лечить с помощью иммунотерапии, включая различные виды рака, инфекционные заболевания, аутоиммунные нарушения, гематологические 5 заболевания и отторжения трансплантатов, где указанный способ включает введение любого одного из следующих компонентов: (I) комплекс, предлагаемый в изобретении, (II) клетки, такие как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, предлагаемым в изобретении, или (III) фармацевтическая препаративная форма, содержащая компоненты, указанные в
10 (Г)-(П), указанному индивидууму.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ вызывания или повышения у индивидуума иммунного ответа против одного или нескольких эпитопов, который зависит от CD4+ -Т-клеток-хелперов и/или цитотоксических CD8+ -Т-клеток, где указанный способ включает введение любого одного из
15 следующих компонентов: (I) комплекс, предлагаемый в изобретении, (II) клетки, такие как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, или (III) фармацевтическая препаративная форма, содержащая компоненты, указанные в (Г)-(П), указанному индивидууму.
Иммунный ответ, который зависит от CD4+- и/или СВ8+-ответа, можно
20 определять по воспалительному ответу, ответу провоспалительных цитокинов, включающему увеличение экспрессии одного или нескольких из мРНК и белков IFN-y, TNF-a и IL-2 относительно уровня до введения соединений, предлагаемых в изобретении. Его можно измерять также по повышению частоты встречаемости или абсолютному количеству антигенспецифических Т-клеток
25 после введения соединений, предлагаемых в изобретении, измеренному по окрашиванию мультимера HLA-пептида, с помощью ELISPOT-анализов, и в опытах по оценке гиперчувствительности замедленного типа. Его можно косвенно оценивать по увеличению титров антигенспецифических антител в сыворотке, которые зависят от антигенспецифических Т-клеток-хелперов.
30 В настоящем изобретении предложен способ вызывания или повышения у
индивидуума иммунного ответа против одного или нескольких эпитопов, который ограничен несколькими молекулами ГКГС класса I и/или несколькими молекулами ГКГС класса II, где указанный способ включает введение любого
одного из следующих компонентов: (I) комплекс, предлагаемый в изобретении,
(II) клетки, такие как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом,
предлагаемым в изобретении, или (III) фармацевтическая препаративная форма,
содержащая компоненты, указанные в (1)-(П), указанному индивидууму.
5 Способ вызывания или повышения у индивидуума иммунного ответа
против одного или нескольких эпитопов, который ограничен несколькими молекулами ГКГС класса I и/или несколькими молекулами ГКГС класса II, можно оценивать по цитокиновому ответу, включающему увеличение экспрессии одного или нескольких из мРНК и белков IFN-y, TNF-a и IL-2
10 относительно уровня до введения соединений, предлагаемых в изобретении, после стимуляции in vitro Т-клеток индивидуальными пептидами, связывающимися дискретно с молекулами ГКГС класса I и класса II на антигенпрезентирующих клетках. Рестрикцию различными молекулами ГКГС можно подтверждать с помощью антигенпрезентирующих клеток, которые
15 экспрессируют различные молекулы ГКГС, или с помощью блокирующих ГКГС антител. Это можно измерять также по повышению частоты встречаемости или абсолютному количеству антигенспецифических Т-клеток после введения соединений, предлагаемых в изобретении, измеренному по окрашиванию мультимера HLA-пептида, в которых используют мультимеры, объединенные с
20 отдельными молекулами ГКГС.
Предпочтительно в способах вызывания или повышения иммунного ответа против одного или нескольких эпитопов, предлагаемых в настоящем изобретении, иммунный ответ направлен против одного или нескольких эпитопов ассоциированного с опухолью антигена или опухолеспецифического
25 антигена, такого, например, как комбинация эпитопов глиомы, которые описаны у Novellino и др., Cancer Immunol Immunother, 54(3), 2005, сс. 187-207 и у Vigneron и др,. Cancer Immun.13, 2013, с. 15.
В альтернативном или дополнительном варианте иммунный ответ может быть направлен против нескольких эпитопов антигенного белка патогена.
30 Представленные в настоящем описании способы, предлагаемые в
настоящем изобретении, можно применять для вызывания или повышения у индивидуума иммунного ответа против одного или нескольких эпитопов,
которые ограничены молекулами ГКГС класса I и/или молекулами ГКГС класса П.
В частности, в настоящем изобретении предложен способ лечения рака или инициации, повышения или пролонгирования противоопухолевого ответа у 5 индивидуума, нуждающегося в этом, который включает введение индивидууму комплекса, содержащего:
проникающий в клетку пептид;
по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп; и
по меньшей мере один пептидный агонист TLR,
10 в котором компоненты а) - в) ковалентно связаны.
В указанном способе индивидууму предпочтительно вводят указанный в настоящем описании комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, указанную в настоящем описании клетку, предлагаемую в настоящем изобретении, указанную в настоящем описании композицию, предлагаемую в 15 настоящем изобретении, указанную в настоящем описании вакцину
предлагаемую в настоящем изобретении, и/или указанную в настоящем описании фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении.
Предпочтительно индивидуум имеет рак и/или у него диагностирован рак.
20 Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения рака
и/или гематологического нарушения, предпочтительно злокачественной неоплазмы головного мозга или злокачественной неоплазмы лимфоидной, гематопоэтической и родственной ткани, у индивидуума, который нуждается в этом, наиболее предпочтительно глиобластомы, включающий введение 25 индивидууму комплекса, содержащего: проникающий в клетку пептид;
по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп; и
по меньшей мере один пептидный агонист TLR,
в котором компоненты а) - в) ковалентно связаны.
30 Таким образом, предпочтительно указанный в настоящем описании
комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, указанную в настоящем описании клетку, предлагаемую в настоящем изобретении, указанную в настоящем описании композицию, предлагаемую в настоящем изобретении,
указанную в настоящем описании вакцину предлагаемую в настоящем изобретении, и/или указанную в настоящем описании фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, вводят индивидууму.
Другим объектом настоящего изобретения является применение любого из 5 следующих компонентов: (I) комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, и/или (II) клетки, такие как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении, для приготовления визуализирующей композиции, предназначенной для применения в методах визуализации, или для получения диагностической композиции
10 ("диагностические композиции"), предназначенной для диагностирования заболевания или нарушения соответственно. Заболевания или нарушения, которые можно диагностировать согласно изобретению, включают те, которые можно лечить в использованием иммунотерапии, например, различные виды рака, инфекционные заболевания, аутоиммунные нарушения и отторжения
15 трансплантатов. В частности, заболевания, которые можно диагностировать с
помощью диагностической композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, представляют собой заболевания, которые можно лечить и/или предупреждать с использованием указанного в настоящем описании комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении. Диагностическая композиция, предлагаемая в
20 настоящем изобретении, содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из:
(I) комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, который описан
выше,
(II) нуклеиновой кислоты, предлагаемой в настоящем изобретении, которая
25 описана выше,
(III) вектора, предлагаемого в настоящем изобретении, который описан выше,
(IV) клетки-хозяина, предлагаемой в настоящем изобретении, которая описана выше, и
30 (V) клетки, загруженной комплексом, предлагаемой в настоящем
изобретении, которая описана выше.
Предпочтительно диагностическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит описанный выше комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении.
В частности, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, клетку, 5 такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении, предлагаемую в изобретении композицию, предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину, или наиболее предпочтительно предлагаемую в изобретении диагностическую композицию можно использовать
10 в диагностике в качестве диагностического инструмента, например в анализах (in vivo или in vitro), например, в иммуноанализах, для обнаружения, прогнозирования, диагностирования или мониторинга упомянутых различных состояний и болезненных состояний, нарушений или заболеваний.
Например, анализы (in vitro) можно осуществлять путем доставки
15 комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, клетки, такой как
антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении, предлагаемой в изобретении композиции, предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или предлагаемой в изобретении вакцины или наиболее предпочтительно предлагаемой в изобретении
20 диагностической композиции, к клеткам-мишеням, как правило, выбранным, например, из культивируемых клеток животных, человеческих клеток или микроорганизмов, и мониторинга клеточного ответа с помощью биофизических методов, как правило, известных специалистам в данной области. Применяемые для этого клетки, как правило, могут представлять собой культивируемые
25 клетки (in vitro), например, клетки, выделенные из организма человека или животного, например, клетки крови, выделенные из организма человека или животного, или клетки in vivo, т.е. клетки, содержащиеся в органах или тканях живых животных или людей, или микроорганизмы, присутствующие в живых животных или людях. Особенно предпочтительными в этом контексте являются
30 так называемые маркеры или метки, которые могут входить в комплекс,
предлагаемый в настоящем изобретении, и, в частности, в диагностическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении.
Следующим объектом изобретения является способ диагностирования заболевания или нарушения у индивидуума, где способ включает введение любого из компонентов: (I) комплекс, предлагаемый в изобретении, (II) клетки, такие как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, предлагаемым в изобретении, или (III) фармацевтическая препаративная форма, содержащая компоненты, указанные в (1)-(П), указанному индивидууму или в образец из указанного индивидуума ex vivo.
Другим объектом настоящего изобретения является способ визуализации, где способ включает использование in vitro, ex vivo или in vivo, любого из следующих компонентов: (I) комплекса, предлагаемый в изобретении, (II) клеток, таких как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, предлагаемым в изобретении, или (III) фармацевтической препаративной формы, содержащей компоненты, указанные в (Г)-(П).
Предпочтительно варианты применения и способы, предлагаемые в настоящем изобретении, включают введение комплекса, предлагаемого в изобретении.
Кроме того, варианты применения и способы, предлагаемые в настоящем изобретении, включают введение нескольких комплексов, клеток или фармацевтических препаративных форм, предлагаемых в изобретении. Например, в вариантах применения и способах, предлагаемых в настоящем изобретении, применяют или вводят по меньшей мере два различных комплекса, при этом каждый комплекс содержит по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, и указанный антиген или антигенный эпитоп или (если в указанном комплексе содержатся несколько антигенов или антигенных эпитопов) указанный поднабор антигенов или антигенных эпитопов различаются между двумя комплексами.
Например, различные комплексы (I), содержащиеся в описанной выше композиции, могут отличаться либо компонентом а), т.е. проникающими в клетку пептидами, либо компонентом б), т.е. антигенами или антигенными эпитопами, либо поднаборами из нескольких антигенов или антигенных эпитопов, либо компонентом в), т.е. пептидным агонистом TLR или поднабором из нескольких пептидных агонистов TLR; или различные комплексы (I), содержащиеся в композиции описанной выше, могут отличаться двумя из трех
компонентов а), б) и в); или различные комплексы (I), содержащиеся в композиции описанной выше, могут отличаться всеми тремя компонентами а), б) и в) комплекса. Соответственно различные нуклеиновые кислоты (II), содержащиеся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они кодируют указанные различные комплексы; различные векторы (III), содержащиеся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они содержат указанные различные нуклеиновые кислоты; различные клетки-хозяева (IV), содержащиеся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они содержат указанные различные векторы; и различные клетки, загруженные комплексом (V), содержащиеся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они загружены указанными различными комплексами.
Кроме того, в вариантах применения и способах, предлагаемых в настоящем изобретении, клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой антигенпрезентирующие клетки, в частности, дендритные клетки, более предпочтительно дендритные клетки из индивидуума, подлежащего лечению.
Заболевания, подлежащие лечению или предупреждению
Подразумевается, что понятие "заболевание" в контексте настоящего изобретения, как правило, является синонимом и его применяют взаимозаменяемо с понятиями "нарушение" и "состояние" (в случае медицинского состояния), и во всех случаях отражает аномальное состояния организма человека или животного или одной из его частей, которое нарушает нормальное функционирование, оно, как правило, характеризуется различными признаками или симптомами, и приводит к тому, что человек или животное имеет пониженную продолжительность жизни или пониженное качество жизни.
Заболевания, подлежащие лечению и/или предупреждению, посредством применения комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении; клетки, такой как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемой в изобретении композиции; предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или предлагаемой в изобретении вакцины, включают рак, гематологические нарушения, инфекционные заболевания, аутоиммунные нарушения и отторжения трансплантатов. При этом лечение и/или предупреждение рака и инфекционных заболеваний является
предпочтительным, а лечение и/или предупреждение рака является более предпочтительным. В случае рака, предпочтительными являются злокачественная неоплазма головного мозга или злокачественная неоплазма лимфоидной ткани, гематопоэтической и родственной ткани, и более предпочтительной является глиобластома.
Предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно применять для (приготовления лекарственного средства, предназначенного для) профилактики, лечения и/или облегчения рака или опухолевых заболеваний, включая заболевания, вызываемые нарушенным апоптозом, предпочтительно выбранные из акустической невриномы, рака анального канала, астроцитомы, базалиомы, синдрома Бехчета, рака мочевого пузыря, бластом, рака кости, метастазов в головной мозг, опухолей головного мозга, рака головного мозга (глиобластом), рака молочной железы (карциномы молочной железы (carcinoma mamma)), лимфомы Беркитта, карциноидов, рака шейки матки, карциномы ободочной кишки, колоректального рака, карциномы тела матки, краниофарингеом, CUP-синдрома (синдром рака с невыявленным очагом), карциномы эндометрия, рака желчного пузыря, опухолей половых органов, включая различные виды рака мочеполового тракта, глиобластом, глиом, различных видов опухолей головы и шеи, гепатом, гистиоцитарной лимфомы, синдромов или лимфом Ходжкина и некоджкинских лимфом, опухолей гипофиза, рака кишечника, включая опухоли тонкой кишки и желудочно-кишечные опухоли, саркомы Капоши, рака почки, карцином почки, ларингеального рака или рака гортани, лейкозов, включая острый миелолейкоз (AML), эритролейкоз, острый лимфоидный лейкоз (ALL), хронический миелолейкоз (CML) и хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), опухоли века, рака печени, метастазов в печень, карцином легкого (= рак легкого = бронхиальная карцинома), мелкоклеточных карцином легкого и немелкоклеточных карцином легкого и аденокарцином легкого, лимфом, рака лимфатической системы, злокачественных меланом, карцином молочной железы (= рак молочной железы), медуллобластом, меланом, менингитом, грибовидного
микоза, невриномы, обусловленной неопластическими заболеваниями, рака пищевода, карциномы пищевода (= рак пищевода), олигодендроглиомы, рака яичника (= карцинома яичника), карциномы яичника, карциномы поджелудочной железы (= рак поджелудочной железы), рака пениса, рака полового члена, фарингального рака, опухоли гипофиза, плазмоцитомы, рака предстательной железы (= опухоли предстательной железы), ректальной карциномы, ректальных опухолей, рака почки, карцином почки, ретинобластомы, сарком, болезни Шнеебергера, рака кожи, например, меланомы или немеланомного рака кожи, включая базальноклеточные и плоскоклеточные карциномы, а также псориаз, пузырчатки обыкновенной, опухолей мягких тканей, спиналиомы, рака желудка, тестикулярного рака, рака глотки, тимомы, карциномы щитовидной железы, рака языка, рака мочеиспускательного канала, рака матки, вагинального рака, различных индуцируемых вирусом опухолей, таких, например, как индуцируемые вирусом папилломы карциномы (например, карциномы шейки матки = рак шейки матки), аденокарциномы, индуцируемые вирусом герпеса опухоли (например, лимфома Беркитта, индуцируемая EBV В-клеточная лимфома, карцинома шейки матки), индуцируемые вирусом гепатита В опухоли (печеночноклеточные карциномы), индуцируемые HTLV-1 и HTLV-2 лимфомы, рак вульвы, состояния, связанные с бородавками, или обусловленные ими, и т.д. В контексте настоящего описания понятия "терапия" и "терапевтический" предпочтительно относятся к достижению по меньшей мере определенного минимального физиологического воздействия на живой организм. Например, физиологическое воздействие после введения "терапевтического" противоопухолевого соединения может заключаться в ингибировании роста опухоли или уменьшении размера опухоли, или предупреждении рецидива опухоли. Предпочтительно при лечении рака или неопластического заболевания следует рассматривать соединение, которое ингибирует рост опухоли или уменьшает размер опухоли, или предупреждает рецидив опухоли, как обладающее терапевтической эффективностью. Таким образом, понятие "противоопухолевое лекарственное средство" предпочтительно обозначает любое терапевтическое средство, обладающее терапевтическим действием в отношении опухоли, неоплстического заболевания или рака.
Примеры различных видов рака включают рак головного мозга, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак пищевода, рак легкого, рак печени, рак почки, меланому, рак кишечника, карциному легкого, плоскоклеточную карциному головы и шеи, хронический миелолейкоз, 5 колоректальную карциному, карциному желудка, карциному эндометрия, миелолейкоз, плоскоклеточную карциному легкого, острый лимфобластный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, опухоль мочевого пузыря, промиелоцитарный лейкоз, немелкоклеточную карциному легкого, саркому.
Рак может представлять собой солидную опухоль, рак крови или рак 10 лимфатической системы. Рак может быть неметастатическим или метастатическим.
Предпочтительно рак, который требуется предупреждать и/или лечить, представляет собой глиому, более предпочтительно высоко инвазивную мультиформную глиобластому (GBM). Глиомы наиболее часто образуют
15 первичные опухоли головного мозга у взрослых, при этом мультиформная глиобластома (GBM) сопряжена с наиболее плохим прогнозом. Эта опухоль печально известна своей высокой инвазивностью и агрессивностью. В частности, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в
20 настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию;
предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно применять в сочетании с существующими подходами к лечению глиомы, более конкретно высоко инвазивной GBM. Т-лимфоциты могут активно выявлять неоплстические клетки в головном мозге и
25 они обладают потенциалом для безопасной элиминации конкретных опухолевых клеток без повреждения окружающих здоровых тканей.
Кроме того, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении
30 композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно применять для (приготовления лекарственного средства, предназначенного для) профилактики, лечения и/или облегчения инфекционных заболеваний, предпочтительно вирусных,
ретровирусных, бактериальных или протозойных инфекционных заболеваний. Такие инфекционные заболевания, как правило, выбирают из таких заболеваний, как СПИД, сибирская язва, японский энцефалит, бактериальные инфекционные заболевания, такие как выкидыш (воспаление предстательной железы), сибирская язва, аппендицит, боррелиоз, ботулизм, кампилобактериоз, вызываемый бактерией Camphylobacter, хламидиоз, вызываемый бактерией Chlamydia trachomatis (воспаление мочеиспускательного канала, конъюнктивит), холера, дифтерия, дованоз, эпиглоттит, тифозная лихорадка, газовая гангрена, гонорея, кроличья лихорадка, заболевание, вызываемое Heliobacter pylori, коклюш, паховый лимфогранулематоз, остеомиелит, болезнь легионеров, ветряная оспа, остроконечная кондилома, заболевание, вызываемое цитомегаловирусом (CMV), лихорадка Денге, весенний менингоэнцефалит (ESME), заболевание, вызываемое вирусом Эбола, простуда, инфекционная эритема (пятая болезнь), ящур, герпес простой типа I, герпес простой типа II, опоясывающий лишай, HSV, инфекционные заболевания, вызываемые паразитами, простейшими или грибами, такие как амебиаз, бильгарциоз, болезнь Шагаса, эхинококкоз, вызываемый цепнем Echinococcus, ботриоцефалёз (рыбий солитер), отравление рыбой (сигуатера), лисий солитер, эпидермофития стопы, собачий цепень, кандидоз, дрожжевые грибковые пятна, чесотка, кожный лейшманиоз, лямблиоз (гиаргиаз), педикулез, онхоцеркоз (речная слепота), грибковые заболевания, бычий цепень, шистосомоз, свиной цепень, токсоплазмоз, трихомониаз, трипаносомиаз (сонная болезнь), висцеральный лейшманиоз, пеленочный (памперсный) дерматит или карликовый цепень, инфекционная эритема, грипп, саркома Капоши, лихорадка Ласса, лейшманиоз, проказа, листериоз, боррелиоз Лайма, малярия, инфекция, вызываемая вирусом Марбург, корь, менингит, включая бактериальный менингит, контагиозный моллюск, мононуклеоз, свинка, урогенитальный микоплазмоз, неонатальный сепсис (хориоамнионит), нома, инфекция, вызываемая вирусом Норволк, отит среднего уха, паратиф, железистая лихорадка Пфейффера, чума, пневмония, полно (полиомиелит, детская хромота), псевдокруп, бешенство, синдром Рейтера, пятнистая лихорадка Скалистых Гор, вызываемый сальмонеллой паратиф, вызываемый сальмонеллой тиф, SARS (тяжелый острый респираторный синдром), скарлатина, опоясывающий лишай, гепатит, оспа,
мягкий шанкр, сифилис, столбняк, трехдневная лихорадка, триппер, болезнь цуцугамуши, туберкулез, тиф, вагинит (кольпит), вирусные заболевания, вызываемые цитомегаловирусом (CMV), ортопоксивирусом натуральной оспы, ортопоксивирусом белой оспы, парапоксивирусом овец, вирусом контагиозного 5 моллюска, вирусом герпеса простого 1, вирусом герпеса простого 2, вирусом герпеса В, варицелла-зостер вирусом, вирусом псевдобешенства, человеческим цитомегаловирусом, человеческим вирусом герпеса 6, человеческим вирусом герпеса 7, вирусом Эпштейна-Барра, человеческим вирусом герпеса 8, вирусом гепатита В, вирусом лихорадки Чикунгунья, вирусом лихорадки О'Ньонг-Ньонг,
10 рубивирусом, вирусом гепатита С, GB-вирусом С, вирусом Западного Нила, вирусом Денге, вирусом желтой лихорадки, вирусом энцефаломиелита овец, вирусом энцефалита Сент-Луис, вирусом японского энцефалита В, вирусом Повассан, FSME-вирусом, SARS, SARS-ассоциированным короновирусом, человеческим короновирусом 229Е, человеческим короновирусом Ос43,
15 торовирусом, человеческим Т-клеточным лимфотропным вирусом типа I,
человеческим Т-клеточным лимфотропным вирусом типа II, ВИЧ (СПИД), т.е. вирусом иммунодефицита человека типа 1 или вирусом иммунодефицита человека типа 2, вирусом гриппа, вирусом Ласса, вирусом лимфоцитарного хориоменингита, вирусом Такарибе, вирусом Хунин, вирусом Мачупо, вирусом
20 болезни Борна, вирусом Буньямвера, вирусом калифорнийского энцефалита, вирусом лихорадки Рифт-Валли, вирусом флеботомной лихорадки, вирусом Тоскана, вирусом геморрагической лихорадки Крым-Конго, вирусом Хазара, вирусом Хасан, вирусом Хантаан, вирусом Сеул, вирусом проспекта Хилл, вирусом Пуумала, вирусом Добрава-Белград, вирусом Тула, вирусом Син
25 Номбре, Марбург-вирусом озера Виктория, вирусом Эбола Заир, вирусом Эбола Судан, вирусом Эбола Берег Слоновой Кости, вирусом гриппа А, вирусом гриппа В, вирусом гриппа С, вирусом парагриппа, вирусом кори, вирусом эпидемического паротита, респираторно-синцитиальным вирусом, человеческим метапневмовирусом, индийским вирусом везикулярного стоматита, вирусом
30 бешенства, вирусом Мокола, вирусом Дувенхаге, Европейским лиссавирусом летучих мышей 1+2, Австралийским лиссавирусом летучих мышей, аденовирусами A-F, вирусом папилломы человека, вирусом кондиломы 6, вирусом кондиломы 11, вирусами полиомы, аденоассоциированным вирусом 2,
ротавирусами или орбивирусами, вирусом оспы, включая вирус ветряной оспы (варицелла-зостер), и малярийными паразитами (Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi), вирусные инфекционные заболевания, такие как СПИД, инфекционные 5 заболевания, такие как остроконечная кондилома, полые бородавки, лихорадка Денге, трехдневная лихорадка, вызываемые вирусом Эбола заболевания, простуда, весенний менингоэнцефалит (FSME), грипп, опоясывающий лишай, гепатит, герпес простой типа I, герпес простой типа II, опоясывающий герпес, грипп, японский энцефалит, лихорадка Ласса, вызываемые вирусом Марбург
10 заболевания, бородавки, лихорадка Западного Нила, желтая лихорадка и т.д.
Примеры инфекционных заболеваний включают заболевания, вызываемые вирусами, бактериями, грибами, простейшими и многоклеточными паразитами. К ним относятся, например, амебиаз, сибирская язва, язва Бурули (Mycobacterium ulcerans), ассоциированная с калицивирусами диарея,
15 вызываемая бактерией Campylobacter диарея, рак шейки матки (человеческий вирус папиломы), ассоциированные с Chlamydia trachomatis заболевания половых органов, холера, геморрагическая лихорадка Крым-Конго, лихорадка Денге, дифтерия, геморрагическая лихорадка Эбола, энтеротоксигенная диарея, вызываемая Escherichia coli (ЕТЕС), рак желудка (Helicobacter pylori), гонорея,
20 заболевания, ассоциированные со стрептококками группы А, заболевания, ассоциированные со стрептококками группы В, вызываемые палочкой Haemophilus influenzae типа В пневмония и инвазивное заболевание, диарея при гепатите А, гепатите В, гепатите С, гепатите Е, вызываемые вирусом герпеса простого типа 2 язвы половых органов, ВИЧ/СПИД, анкилостомидоз, грипп,
25 японский энцефалит, лихорадка Ласса, лейшманиоз, лептоспироз, рак печени (гепатит В), рак печени (гепатит С), болезнь Лайма, малярия, геморрагическая лихорадка Марбург, корь, свинка, рак носоглотки (вирус Эпштейна-Барра), вызываемый Neisseria meningitidis менингит, ассоциированная с парагриппом пневмония, коклюш, чума, полиомиелит, бешенство, вызываемая респираторным
30 синцитиальным вирусом (RSV) пневмония, лихорадка Рифт-Валли, вызываемая ротавирусом диарея, краснуха, шистосомоз, тяжелый острый респираторный синдром (SARS), шигеллез, оспа, ассоциированные с Staphylococcus aureus заболевания, рак желудка (Helicobacter pylori), вызываемая стрептококками
пневмония и инвазивное заболевание, столбняк, клещевой энцефалит, трахома, туберкулёз, туляремия, тифозная лихорадка, ассоциированное с вирусом Западного Нила заболевание, желтая лихорадка.
Кроме того, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку, 5 такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно применять для (приготовления лекарственного средства, предназначенного для) профилактики, лечения и/или
10 облегчения аутоиммунных нарушений, например, аутоиммунных заболеваний ЦНС, аутовоспалительных заболеваний, глютеновой болезни; синдрома Шегрена, системной красной волчанки и т.д. Как правило, аутоиммунные заболевания возникают вследствие аномального иммунного ответа организма на субстанции и ткани, которые в норме присутствуют в организме
15 (аутоиммунитет). Заболевание может быть ограничено определенными органами (как, например, в случае аутоиммунного тиреоидита) или может затрагивать конкретную ткань в различных местах (как, например, в случае болезни Гудпасчера, которая может поражать базальную мембрану как в легком, так и в почках). Аутоиммунные заболевания можно классифицировать по
20 соответствующему типу гиперчувствительности: тип I (а именно, крапивница, индуцируемая аутологичной сывороткой), тип II, тип III или тип IV.
Примерами аутоиммунных заболеваний являются синдром Блау, буллезный пемфигоид, рак, болезнь Кастлемена, глютеновая болезнь, болезнь Шагаса, хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия, хронический
25 рекуррентный многоочаговый остеомиелит, хроническая обструктивная болезнь легких, синдром Черджа-Стросса, рубцевой пемфигоид, синдром Когана, болезнь холодовых агглютининов, дефицит компонента 2 комплемента, контактный дерматит, черепной артериит, синдром CREST, болезнь Крона, синдром Кушинга, болезнь Деркума, герпетиформный дерматит, дерматомиозит,
30 сахарный диабет типа 1, диффузный кожный системный склероз, синдром Дресслера, волчанка, дискоидная красная волчанка, экзема, острый диссеминированный энцефаломиелит (ADEM), болезнь Аддисона, агаммаглобулинемия, амиотрофический боковой склероз (обозначаемый также
как болезнь Лу Герига; болезнь моторных нейронов), антифосфолипидный синдром анкилоизирующего спондилита, антисинтетазный синдром, атопический дерматит, аутоиммунная апластическая анемия, аутоиммунная кардиомиопатия, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, 5 аутоиммунная болезнь внутреннего уха, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунная периферическая невропатия, аутоиммунный панкреатит, аутоиммунный полиэндокринный синдром, аутоиммунный прогестероновый дерматит, аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура, аутоиммунная крапивница, аутоиммунный увеит, болезнь Бало/концентрический склероз Бало,
10 болезнь Бехчета, болезнь Берже, энцефалит Бикерстаффа, эндометриоз, энтезит-ассоциированный артрит, эозинофильный гастроэнтерит, приобретенный буллезный эпидермолиз, эритробластомоз плода, синдром Эванса, фибродисплазия оссифицирующая, фиброзный альвеолит (или идиопатический легочный фиброз), гастрит, гломерулонефрит, синдром Гудпасчера, болезнь
15 Грейвса, синдром Гийена-Барре, энцефалопатия Хашимото, тиреоидит Хашимото, пемфигоид беременных, гнойный гидраденит, гипогаммаглобулинемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура), IgA-нефропатия, глазной рубцовый пемфигоид, миозит с тельцами включения, ревматоидный артрит,
20 хроническая воспалительная ревматическая лихорадка, демиелинизирующая полиневропатия, саркоидоз, палиндромный ревматизм, интерстициальный цистит, ювенильная идиопатическая шизофрения, PANDAS (педиатрический артрит, также известный как ювенильный аутоиммунный ревматоидный артрит), синдром Шмидта, нейропсихиатрическая болезнь Кавасаки, другая форма APS
25 (антифосфолипидный синдром), синдром Шнитцлера, паранеопластический
мозжечковый миастенический синдром, лейкоцитокластическая сывороточная болезнь, плоский лишай, синдром Шегрена, склерозирующий лишай, синдром Персонэйджа-Тэйнера, IgA-линейная болезнь, болезнь Стилла, пемфигоид обыкновенный (пузырчатка обыкновенная), люпоидный гепатит, аутоиммунный
30 гепатит, синдром негнущегося человека, пернициозная анемия, подострый
бактериальный эндокардит (SBE), синдром POEMS, красная волчанка, синдром Свита, симпатическая офтальмия, болезнь Меньера, системная волчанка, первичный билиарный цирроз, синдром Миллера-Фишера, артериит Такаясу,
холангит, прогрессирующая воспалительная невропатия, болезнь Муха-Габермана, псориаз, псориатический артрит, гангренозная пиодермия, рассеянный склероз, чистая эритроцитарная аплазия, энцефалит Расмуссена, тяжелая миастения, поперечный миелит, феномен Рейно, микроскопический 5 колит, язвенный колит, миозит, идиопатическое воспалительное заболевание кишечника (IBD), оптический нейромиелит, болезнь Девика и нейромиотония.
Кроме того, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении
10 композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно применять для (приготовления лекарственного средства, предназначенного для) профилактики, лечения и/или облегчения гематологических нарушений, которые, как правило, представляют собой нарушения, влияющие главным образом на кровь. При этом
15 предпочтительными являются гематологические злокачественные заболевания. Примерами гематологических заболеваний являются миелоидные нарушения, включая гемоглобинопатии (врожденная анамалия молекулы гемоглобина или скорости синтеза гемоглобина), такие, например, как серповидно-клеточная болезнь, талассемия, метемоглобинемия; анемии
20 (нехватка эритроцитов или гемоглобина), такие, например, как
железодефицитная анемия, мегалобластная анемия, включая дефицит витамина В12, пернициозная анемия и фолатный дефицит, гемолитические анемии (разрушение эритроцитов), включая генетические нарушения мембраны RBC, такие, например, как наследственный сфероцитоз, наследственный эллиптоцитоз
25 и врожденная дисэритропоэтическая анемия, генетические нарушения
метаболизма RBC, такие как дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD) и дефицит пируваткиназы, иммуноопосредованная гемолитическая анемия (положительный результат прямого теста Кумба), такая как аутоиммунная гемолитическая анемия, включая аутоиммунную гемолитическую анемию с
30 тепловыми антителами (такую как идиопатическая системная красная волчанка (SLE) и синдром Эванса (антитела к тромбоцитам и гемолитические антитела (антитела к антигенам эритроцитов))) и аутоиммунную гемолитическую анемию с Холодовыми антителами (такую как идиопатический синдром Холодовых
гемагглютининов, инфекционный мононуклеоз и пароксизмальная холодовая гемоглобинурия), аллоиммунная гемолитическая анемия, включая гемолитическую болезнь новорожденных (HDN) (такую как Rh болезнь (Rh D), гемолитическая болезнь новорожденных АВО, гемолитическая болезнь 5 новорожденных с анти-Kell антителами, Резус С гемолитическая болезнь новорожденных, Резус Е гемолитическая болезнь новорожденных, и заболевания, связанные с несовместимостью других групп крови (RhC, Rhe, Kid, Duffy, MN, P и др.)), лекарственно-индуцированная иммуноопосредованная гемолитическая анемия, включая индуцированную пенициллином (в высокой
10 дозе) и метилдопой анемию, гемоглобинопатии (а именно, с нестабильным или кристаллическим гемоглобином), пароксизмальная ночная гемоглобинурия (редкое приобретенное клональное нарушение белков поверхности эритроцитов), прямое физическое повреждение RBC, включая микроангиопатическую гемолитическую анемию и вторичную, обусловленную
15 искусственным(и) сердечным(и) клапаном(амии), апластическая анемия, такая как анемия Фанкони, анемия Даймонда-Блэкфена (наследственная чистая аплазия эритроцитов) и приобретенная чистая аплазия эритроцитов; снижение числа клеток, например, миелодиспластический синдром, миелофиброз, нейтропения (снижение числа нейтрофилов), агранулоцитоз, тромбастения
20 Гланцманна и тромбоцитопения (снижение числа тромбоцитов), включая идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТР) и индуцируемую гепарином тромбоцитопению (HIT); миелопролиферативные нарушения (повышенное количество клеток), такие, например, как истинная полицитемия (повышение
25 количества клеток в целом), эритроцитоз (увеличение количества эритроцитов), лейкоцитоз (увеличение количества лейкоцитов), тромбоцитоз (увеличение количества тромбоцитов), и миелопролиферативное нарушение; коагулопатии (нарушения кровообращения и свертываемости крови), такие, например, как тромбоцитоз, рекуррентный тромбоз, диссеминированная внутрисосудистая
30 коагуляция, нарушения свёртывающих белков, включая гемофилию, такую как гемофилия А, гемофилия В (известная также как рождественская болезнь) и гемофилия С, болезнь фон Виллебранда, диссеминированная внутрисосудистая коагуляция, дефицит белка S и антифосфолипидный синдром, и нарушения
тромбоцитов, включая тромбоцитопению, тромбастению Гланцманна и синдром Вискотта-Олдрича. Кроме того, примерами гематологических заболеваний являются также гематологические злокачественные нарушения, включая такие гематологические злокачественные нарушения, как, например, лимфомы, включая болезнь Ходжкина и неходжкинскую лимфому, такую как лимфома Беркитта, анапластическую крупноклеточную лимфому, лимфому из клеток маргинальной зоны селезенки, гепатоселезеночную Т-клеточную лимфому и ангиоиммунобластную Т-клеточную лимфому (AILT), миеломы, такие как множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрёма и плазмацитома, лейкозы, такие как острый лимоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический идиопатический миелофиброз (MF), хронический миелогенный лейкоз (CML), Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз (T-PLL), В- клеточный пролимфоцитарный лейкоз (B-PLL), хронический нейтрофильный лейкоз (CNL), волосатоклеточный лейкоз (HCL), Т-клеточный лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов (T-LGL) и агрессивный NK-клеточный лейкоз. Кроме того, примерами гематологических заболеваний являются также гематологические заболевания смешанного типа, включая гемохроматоз, асплению, гиперспленизм, такой как болезнь Гоше, моноклональную гаммопатию неясного генеза, гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз и синдром Темпи. Кроме того, примерами гематологических заболеваний являются также гематологические нарушения, вторичные относительно негематологических нарушений, включая анемию при хроническом заболевании, инфекционный мононуклеоз, сприд, малярию и лейшманиоз.
Кроме того, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину, можно применять для (получения лекарственного средства, предназначенного для) профилактики, лечения и/или облегчения отторжения трансплантата, включая, например, реакцию трансплантат-против хозяина. Отторжение трансплантата включает гиперострое отторжение, острое отторжение и хроническое отторжение трансплантата.
Примеры отторжения трансплантата включают реакцию отторжения трансплантата кожи, почки, сердца, легкого, поджелудочной железы, печени, кровяной клетки, костного мозга, роговицы, оторванной в результате несчастного случая конечности, в частности пальцев, руки, ноги; лица, носа, 5 кости, сердечного клапана, кровеносного сосуда или кишечника. Путь введения
Комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию;
10 предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить любым описанным выше путем, в том числе, орально, парентерально, внутривенно, ректально или с помощью комбинации указанных путей введения. Парентеральное введение включает (но не ограничиваясь только ими) внутривенное, внутриартериальное,
15 внутрибрюшинное, подкожное, внутрикожное и внутримышечное введение. Комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую
20 в изобретении вакцину предпочтительно можно применять также местным, внутрь опухоли, внутрикожным, подкожным, внутримышечным, интраназальным или внутринодальным путем. Комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении;
25 предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении
фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно применять также в форме импланта, который обеспечивает медленное высвобождение композиций, а также с помощью медленной контролируемой i.v.-инфузии. Например, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении;
30 клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить подкожно.
При введении комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении; клетки, такой как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемой в изобретении композиции; предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или 5 предлагаемой в изобретении вакцины может требоваться несколько
последовательных инъекций. Так, введение можно повторять по меньшей мере два раза, например один раз в качестве инъекций для первичной иммунизации, а затем в качестве бустерных инъекций.
В частности, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку,
10 такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить многократно или постоянно. Комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку, такую
15 как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить многократно или постоянно в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1, 2, 3 или 4 недели; 2, 3, 4,
20 5, 6, 8, 10 или 12 месяцев; или 2, 3, 4 или 5 лет.
Кроме того, проникающий в клетку пептид, компоненты а), б) и в), т.е. по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп и по меньшей мере один пептидный агонист TLR, входящие в комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, могут содержаться в различных композициях, которые смешивают
25 перед введением или которые вводят одновременно индивидууму, нуждающемуся в этом.
Согласно одному из подходов комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в
30 изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую
композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить пациенту непосредственно, используя описанные выше пути введения, в частности, для фармацевтических композиций. Альтернативно этому, комплекс, предлагаемый
в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину 5 можно вводить пациенту с использованием подхода ex vivo, например, путем интродукции фармацевтической композиции, вакцины или предлагаемого в изобретении транспортера конъюгированной карго-молекулы, указанного выше, в клетки, предпочтительно аутологичные клетки, т.е. клетки, полученные из организма пациента, подлежащего лечению, и трансплантации этих клеток в
10 подлежащую лечению область у пациента, необязательно, осуществляя сортировку и/или культивирование этих клеток до обработки.
Вводимая индивидууму доза в виде однократной дозы или нескольких доз должна значительно варьироваться в зависимости от различных факторов, включая фармакокинетические свойства, состояния и характеристики
15 индивидуума (пол, возраст, вес тела, состояние здоровья, конституция), степени проявления симптомов, сопутствующей терапии, частоты обработок и требуемого действия.
Как правило, для лечения рака терапевтически эффективная доза комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, составляет от примерно
20 0,01 до 5 мг на инъекцию, в частности от примерно 0,1 до 2 мг на инъекцию или от примерно 0,01 нмоля до 1 ммоля на инъекцию, в частности, от 1 нмоля до 1 ммоля на инъекцию, предпочтительно от 1 мкмоля до 1 ммоля на инъекцию.
Как правило, для лечения рака терапевтически эффективная доза антигенпрезентирующей клетки, загруженной комплексом, предлагаемым в
25 настоящем изобретении, составляют от примерно 0,2 млн клеток до 2 млн клеток на инъекцию.
Комбинированная терапия
Введение комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении; клетки, такой как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, 30 предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемой в изобретении
композиции; предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или предлагаемой в изобретении вакцины согласно способам и вариантам применения, предлагаемым в изобретении, можно осуществлять индивидуально
или в комбинации с соагентом, пригодным для лечения и/или стабилизации заболевания или нарушения, подлежащего лечению или подавлению.
Например, в случае лечения, предупреждения или стабилизации рака, введение фармацевтических композиций согласно способам и вариантам 5 применения, предлагаемым в изобретении, можно осуществлять в комбинации с субстанциями, применяемыми для общепринятой химиотерапии, которые направлены против солидных опухолей, и для контроля возникновения метастазов, или любой другой молекулой, действие которой заключается в запуске запрограммированной гибели клеток, например, с соагентом,
10 выбранным из представителей семейства факторов некроза опухоли, включая (но не ограничиваясь только ими) Fas-лиганд и родственный фактору некроза опухоли (TNF) апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAIL). Согласно другому варианту осуществления изобретения введение комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении; клетки, такой как антигенпрезентирующая клетка,
15 загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении;
предлагаемой в изобретении композиции; предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или предлагаемой в изобретении вакцины согласно способам и вариантам применения, предлагаемым в изобретении, можно осуществлять параллельно с лучевой терапией.
20 Под объем изобретения подпадает введение комплекса, предлагаемого в
настоящем изобретении; клетки, такой как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемой в изобретении композиции; предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или предлагаемой в изобретении вакцины, где
25 введение индивидууму осуществляют до, одновременно или последовательно с другими терапевтическими режимами или соагентами, пригодными для лечения и/или стабилизации рака и/или предупреждения рецидива рака (например, режимы с применением нескольких лекарственных средств), в терапевтически эффективном количестве. Указанный комплекс, указанную клетку, композицию,
30 вакцину или фармацевтическую композицию, который/которую вводят
одновременно с соагентом, можно вводить в одной и той же или в различных композициях и с помощью одинакового или различных путей введения.
Указанные другие терапевтические режимы или соагенты можно выбирать из группы, состоящей из лучевой терапии, химиотерапии, хирургии, таргетной терапии (включающей применение малых молекул, пептидов и моноклональных антител) и антиангиогенной терапии. В контексте настоящего описания под 5 антиангиогенной терапией подразумевается введение агента, который прямо или косвенно целенаправленно воздействует на ассоциированную с опухолью сосудистую сеть.
Таким образом, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая препаративная форма, содержащая комплекс, предлагаемый в изобретении, или
10 клетку, предлагаемую в изобретении, в частности, антигенпрезентирующую
клетку, предлагаемую в изобретении, объединенная по меньшей мере с одним соагентом, пригодным для лечения и/или стабилизации рака и/или предупреждения рецидива рака, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
15 Кроме того, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку,
такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить после хирургического
20 вмешательства, при котором удаляют солидные опухоли, в качестве профилактики рецидива и/или метастазов.
Кроме того, введение визуализирующей или диагностической композиции согласно способам и вариантам применения, предлагаемым в изобретении, можно осуществлять индивидуально или в комбинации с соагентом, пригодным
25 для визуализации и/или диагностирования возможного заболевания или нарушения.
Индивидуумы
Настоящее изобретение можно применять для любого индивидуума, страдающего от любого заболевания или нарушения, в зависимости от 30 специфичности, в частности, по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа, содержащегося в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении. В частности, терапевтический эффект указанного комплекса может проявляться в виде иммунного ответа, направленного против указанных антигенов или
антигенных эпитопов, в частности, ответа, зависящего от CD4 -Т-клеток-хелперов и/или цитотоксических СВ8+-Т-клеток и/или ограниченного молекулами ГКГС класса I и/или молекулами ГКГС класса П.
Предпочтительно согласно настоящему изобретению индивидуумы 5 представляют собой индивидуумов, которые страдают от рака, например, рака головного мозга, ободочной кишки, головы или шеи или рака шейки матки. Более предпочтительно согласно настоящему изобретению индивидуумы представляют собой индивидуумов, которые страдают от рака головного мозга, включая глиому.
10 Согласно настоящему изобретению индивидуумы предпочтительно
подвергались хирургическому удалению опухоли.
Альтернативно этому, согласно настоящему изобретению индивидуумы представляют собой индивидуумов, которые страдают от инфекционного заболевания.
15 Объем настоящего изобретения не ограничен конкретными вариантами
осуществления изобретения, представленными в настоящем описании. Фактически специалистам в данной области после ознакомления с приведенным выше описанием и приведенными ниже чертежами должны стать очевидными различные модификации изобретения, которые можно осуществлять в
20 дополнение к указанным в настоящем описании. Указанные модификации подпадают по объем прилагаемой формулы изобретения.
Все процитированные в настоящем описании ссылки включены в него в качестве ссылок.
Если не указано иное, то все технические и научные понятия, примененные 25 в настоящем описании, имеют общепринятое значение, известное обычному
специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при воплощении изобретения на практике или тестировании настоящего изобретения можно применять методы и материалы, сходные или эквивалентные указанным в настоящем описании, ниже описаны приемлемые методы и материалы. Все 30 публикации, заявки на патент, патенты и другие упомянутые в настоящем описании ссылки полностью включены в него в качестве ссылки. В случае разногласия следует руководствоваться настоящим описанием, включая
определения. Кроме того, материалы, методы и примеры представлены только с целью иллюстрации и не направлены на ограничение объема изобретения. Краткое описание чертежей
Ниже представлено краткое описание прилагаемых чертежей. Чертежи 5 предназначены для более подробной иллюстрации настоящего изобретения. Однако они никоим образом не предназначены для ограничения объема изобретения.
На чертежах показано:
на фиг. 1 - полученные в примере 1 данные об экспрессии маркера
10 активации CD40 в полученных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали ЗООнМ EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 или 25 нг/мл LPS в течение 48 ч. Осуществляли также окрашивание изотипа для каждого из условий (данные, полученные для изотипа не представлены на фиг. 1) (один эксперимент);
15 на фиг. 2 - полученные в примере 1 данные об экспрессии маркера
активации CD86 в полученных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали ЗООнМ EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 или нг/мл LPS в течение 48 ч. Осуществляли также окрашивание изотипа для каждого из условий (данные, полученные для
20 изотипа не представлены на фиг. 1) (один эксперимент);
на фиг. 3 - полученные в примере 1 данные об экспрессии маркера активации HLADR в полученных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали ЗООнМ EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 или нг/мл LPS в течение 48 ч. Осуществляли
25 также окрашивание изотипа для каждого из условий (данные, полученные для изотипа не представлены на фиг. 1) (один эксперимент);
на фиг. 4 - полученные в примере 1 данные об экспрессии маркера активации CD83 в полученных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали ЗООнМ
30 EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 или нг/мл LPS в течение 48 ч. Осуществляли
также окрашивание изотипа для каждого из условий (данные, полученные для изотипа не представлены на фиг. 1) (один эксперимент);
на фиг. 5 - полученные в примере 2 данные о функциональной ограниченной ГКГС класса I кросс-презентации в мышиной системе in vitro с использованием полученных из костного мозга дендритных клеток (BMDC) и спленоцитов из различных трансгенных по TCR мышей. Для этой цели BMDC 5 загружали в течение ночи ЗООнМ EDAZ13Mad5, EDAMad5 или Mad5. Осуществляли мониторинг эффективности ограниченной ГКГС класса I презентации эпитопа OVACD8 и эпитопа gp 100 через 4 дня с помощью меченных CFSE ОТ 1-клеток и P-Mel-клеток соответственно. Осуществляли мониторинг эффективности ограниченной ГКГС класса II эпитопа OVACD4
10 через 4 дня с помощью меченных CFSE ОТ2-клеток. В качестве контроля BMDC импульсно обрабатывали в течение 1 ч 5мкМ пептидом (один эксперимент, репрезентативный для 2 отдельных экспериментов);
на фиг. 6 - полученные в примере 3 результаты для групп, обработанных соединениями в дозе 2 нмоля. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды
15 (WkO и Wk2), используя в дозе 2 нмоля EDAMad5 или EDAZ13Mad5. Группу, применяемую в качестве положительного контроля, вакцинировали Mad5 и MPLA (доза, эквимолярная EDA). У мышей брали кровь через 7 дней после последней вакцинации и осуществляли окрашивание пентамером (3-4 мыши на группу, один эксперимент);
20 на фиг. 7 - полученные в примере 3 результаты для групп, обработанных
соединениями в дозе 10 нмолей. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (WkO и Wk2) EDAMad5 или EDAZ13Mad5 в дозе 10 нмолей. Группу, применяемую в качестве положительного контроля, вакцинировали Mad5 и MPLA (доза, эквимолярная EDA). У мышей брали кровь через 7 дней после
25 последней вакцинации и осуществляли окрашивание пентамером (3-4 мыши на группу, один эксперимент);
на фиг. 8 - полученные в примере 3 данные о проценте позитивных по пентамеру С08+-Т-клеток во всех протестированных группах. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (WkO и Wk2), используя в дозе 10 нмолей
30 EDAMad5 или EDAZ13Mad5. Группу, применяемую в качестве положительного контроля, вакцинировали Mad5 и MPLA (доза, эквимолярная EDA). У мышей брали кровь через 7 дней после последней вакцинации и осуществляли окрашивание пентамером (3-4 мыши на группу, один эксперимент);
на фиг. 9 - полученные в примере 4 данные о росте опухолей у 7 мышей на группу (среднее ± СКО); *, р <0,05 EDAZ13Mad5 относительно контрольной группы (2-сторонний дисперсионный анализ). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3> <105 опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую 5 область и вакцинировали дважды (d5 и d 13) путем подкожной инъекции EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5 или Mad5 и MPLA в дозе 10 нмолей (доза, эквимолярная EDA) s.c. в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля;
на фиг. 10 - полученные в примере 4 кривые роста индивидуальных
10 опухолей (у каждой из 7 мышей на группу). Мышам линии C57BL/6
имплантировали s.c. ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d 13) путем подкожной (s.c.) инъекции в дозе 10 нмолей EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5 или Mad5 и MPLA (доза, эквимолярная EDA) в правую боковую область. Размер опухоли определяли с
15 помощью кронциркуля;
на фиг. 11 - полученная в примере 4 (А) кривая выживаемости для 7 мышей на группу; *, р <0,05 EDAZ13Mad5 относительно контрольной группы (логранговый критерий) и (Б) кривая периода без развития опухоли для 7 мышей на группу; *, р <0,05 EDAZ13Mad5 относительно контрольной группы
20 (логранговый критерий);
на фиг. 12- полученные в примере 5 данные о количестве метастазов в каждой экспериментальной группе. Мышам линии C57BL/6 имплантировали i.v. 1 х 105 опухолевых клеток меланомы линии B16-OVA и вакцинировали дважды (d0 и d9) путем подкожной (s.c.) инъекции в дозе 2 нмоля EDAZ13Mad5,
25 EDAMad5 или Z13Mad5 + MPLA (доза, эквимолярная EDA) или только MPLA в правую боковую область. Мышей умерщвляли в день 13 и изымали легкие. Количество метастатических очагов подсчитывали в каждом легком. **, р <0,01; ****, р <0,0001 (непарный Т-критерий);
на фиг. 13 - полученные в примере 6 данные о количестве метастазов в
30 каждой экспериментальной группе. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (d-21 и d-7) путем подкожной (s.c.) инъекции в дозе 2 нмоля EDAZ13Mad5, EDAMad5 или Z13Mad5 + MPLA (доза, эквимолярная EDA) в правую боковую область. В день 0 мышам имплантировали i.v. 1хЮ5
опухолевых клеток меланомы линии B16-OVA. Мышей умерщвляли в день 14 и изымали легкие. Количество метастатических очагов подсчитывали в каждом легком. *, р <0,05. ***, р <0,001 (непарный Т-критерий);
на фиг. 14 - результаты, полученные в примере 8. Линии клеток НЕК-5 hTLR2 высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулированную 0,ЗмкМ, 1мкМ или ЗмкМ AnaxaZ13Mad5 или Z13Mad5Anaxa, и инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Для получения положительного контроля использовали 500 нг/мл Pam3CSK4. (А) Добавляли 20 мкл супернатанта в среду для детекции QuantiBlue(r) и инкубировали при 37°С в
10 течение 1 ч перед определением ОП (620 нм). (Б) Оценивали секрецию IL-8 (с помощью ELISA) в супернатанте;
на фиг. 15 - результаты, полученные в примере 9. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (WkO и Wk2) в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или AnaxaZ13Mad5. У мышей брали кровь через 7 дней после последней вакцинации
15 и осуществляли окрашивание пентамером (один эксперимент);
на фиг. 16 - результаты, полученные в примере 9. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (WkO и Wk2) в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или AnaxaZ13Mad5. У мышей брали кровь через 7 дней после последней вакцинации и осуществляли окрашивание пентамером (один эксперимент с 4 мышами на
20 группу). *, р <0,05;
на фиг. 17 - полученные в примере 10 данные о росте опухолей у 7 мышей на группу (среднее ± СКО). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3> <105 опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d 13) путем подкожной инъекции в дозе 10 нмолей AnaxZ13Mad5,
25 Z13Mad5Anaxa, либо путем совместной s.c.-инъекции Z13Mad5 + Pam3CSK4 (доза, эквимолярная Апаха), в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля. *, р <0,05; ***, р <0,001, ****, р <0,0001;
на фиг. 18 - полученные в примере 10 кривые роста индивидуальных опухолей (7 мышей на группу). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c.
30 ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d 13) путем подкожной инъекции в дозе 10 нмолей AnaxZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa, либо путем совместной s.c.-инъекции Z13Mad5 + Pam3CSK4
(доза, эквимолярная Апаха) в правую боковую область. Размер опухоли
определяли с помощью кронциркуля;
на фиг. 19 - полученные в примере 10 кривые выживаемости для 7 мышей
на группу. Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. ЗхЮ5 опухолевых 5 клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и dl3)
путем подкожной инъекции в дозе 10 нмолей AnaxZ13Mad5, Z13Mad5Апаха,
либо путем совместной s.c.-инъекции Z13Mad5 + Pam3CSK4 (доза, эквимолярная
Апаха) в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью
кронциркуля. *, р <0,05, **, р <0,01, ****, р <0,0001 (логранговый критерий);
10 на фиг. 20 - полученные в примере 11 кривые роста опухолей у 7 мышей на
группу (среднее ± СКО). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. ЗхЮ5
опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды
(d5 и d 13) в дозе 2 нмоля путем подкожной инъекции Hp91Z13Mad5,
EDAZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa, Z13Mad5EDA или Z13Mad5 и MPLA (доза, 15 эквимолярная EDA) в правую боковую область. *, р <0,05; **, р <0,01; ***,
р <0,001; р <0,0001 (2-сторонний дисперсионный анализ в день 23);
на фиг. 21 - полученные в примере 11 индивидуальные кривые роста
опухолей (7 мышей на группу). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c.
ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали 20 дважды (d5 и dl3) в дозе 2 нмоля путем подкожной инъекции Hp91Z13Mad5,
EDAZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa, Z13Mad5EDA или Z13Mad5 и MPLA (доза,
эквимолярная EDA) в правую боковую область;
на фиг. 22 - полученные в примере 11 кривые выживаемости всех 7 мышей
на группу. На графике показаны медианы выживаемости (m.s.). *, р <0,05; **, 25 р <0,01 (логранговый критерий);
на фиг. 23 - полученные в примере 12 данные о росте опухолей у 7 мышей
на группу (среднее значение ± СКО); ****, р <0,0001 (логранговый критерий).
Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-OVA
в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d 13) путем подкожной 30 инъекции в правую боковую область Z13Mad5Anaxa в дозе либо 0,5 нмоля, либо
2 нмоля, либо 10 нмолей. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля; на фиг. 24 - полученные в примере 13 данные о SIINFEKL-специфических
С08-Т-клеточных ответах, обнаруженных в крови мышей линии C57BL/6,
вакцинированных три раза (один раз в WkO, один раз в Wk2 и один раз в Wk4) s.c, i.d. или i.m. с использованием Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля (А) или 2 нмоля (Б). Кровь брали у мышей через 7 дней после 2-ой и 3-ей вакцинации и осуществляли окрашиванием мультимером (один эксперимент с 4 мышами на 5 группу). *, р <0,05;
на фиг. 25 - полученные в пример 13 данные об экспрессии KLRG1 (А) и экспрессии PD-1 (Б), для анализа которых использовали позитивные по мультимеру CDS-T-клетки (один эксперимент с 4 мышами на группу). В целом, метод состоял в следующем: мышей линии C57BL/6 вакцинировали три раза
10 (один раз в WkO, один раз в Wk2 и один раз в Wk4) s.c, i.d. или i.m. с
использованием Z13Mad5Апаха в дозе 2 нмоля. Кровь брали у мышей через 7 дней после 2-ой и 3-ей вакцинации и осуществляли FACS-окрашивание;
на фиг. 26 - полученные в примере 14 данные о SIINFEKL-специфических CDS-T-клеточных ответах, обнаруженных у мышей линии C57BL/6,
15 вакцинированных два раза (один раз в WkO и один раз в Wk2) внутринодально с использованием Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля. Кровь брали у мышей через 7 дней после 2-ой вакцинации и осуществляли окрашиванием мультимером (3 мыши на группу);
на фиг. 27 - полученные в примере 15 данные о проценте позитивных по 20 пентамеру клеток среди СБ8-Т-клеток (А и Б; *, р <0,05) и средние
геометрические значения для (экспрессии) KLRG1 у позитивных по пентамеру CDS-T-клеток (В и Г). В целом, метод состоял в следующем: мышей линии C57BL/6 вакцинировали 3 раза (А и В: WkO, Wk2 и Wk4; Б и Г: WkO, Wk2 и Wk8) s.c. с использованием Z13Mad5Апаха в дозе 2 нмоля. У мышей брали кровь 25 через 7 дней после последней вакцинации и осуществляли окрашиванием пентамером (один эксперимент, 4 мыши на группу);
на фиг. 28 - полученные в примере 15 данные о проценте позитивных по мультимеру клеток среди CDS-T-клеток (А и Г); средние геометрические значения для KLRG1 у позитивных по мультимеру CDS-T-клеток (Б и Д) и 30 средние геометрические значения для PD1 у позитивных по мультимеру CD8-T-клеток (В и Е). А-В: мышей линии C57BL/6 вакцинировали 3 раза в день 0, день 3 и день 7 и кровь брали в день 7 и день 14. Г-Е, мышей линии C57BL/6 вакцинировали 3 раза в день 0, день 7 и день 14 и кровь брали в день 14 и день
21. Вакцинацию осуществляли s.c. с использованием Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля. Окрашивание мультимером осуществляли в образцах крови (один эксперимент, 4 мыши на группу);
на фиг. 29 - полученные в примере 16 данные о секреции IL-6, 5 свидетельствующей об активации АРС после инкубации BMDC с различными конструкциями, которые указаны на чертеже. В целом, метод состоял в следующем: BMDC высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулированную 1мкМ Z13Mad5 Апаха, Mad5 Апаха, Z13Mad5, EDAZ13Mad5 или EDAMad5, и инкубировали в течение 24 ч при 37°С.
10 Секрецию IL-6 количественно оценивали в супернатанте с помощью ELISA. Представлены средние ± СКО для 2-3 отдельных экспериментов;
на фиг. 30 - полученные в примере 16 данные о секреции TNF-a, свидетельствующей об активации АРС после инкубации клеток Raw 264.7 с различными конструкциями, указанными на чертеже. В целом, метод состоял в
15 следующем: клетки Raw 264.7 высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулированную 1мкМ Z13Mad5Апаха, Mad5Апаха или Z13Mad5, и инкубировали в течение 24 ч при 37°С. Секрецию TNF-a количественно оценивали в супернатанте с помощью ELISA. Представлены средние ± СКО для 2-3 отдельных экспериментов;
20 на фиг. 31 - полученные в примере 17 данные о секреции IL-8,
свидетельствующей о связывании TLR4 после инкубации клеток HEK-hTLR4 с различными конструкциями, указанными на чертеже. В целом, метод состоял в следующем: клетки HEK-hTLR4 высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулированную 1мкМ Z13Mad5 Апаха,
25 Mad5Anaxa, Z13Mad5, EDAZ13Mad5 или EDAMad5, и инкубировали в течение 24 ч при 37°С. Секрецию IL-8 количественно оценивали в супернатанте с помощью ELISA. Представлены средние ± СКО для 2 отдельных экспериментов;
на фиг. 32 - полученные в примере 18 данные о количестве метастазов на модели метастазирования легкого с использованием полутерапевтического
30 режима. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6
имплантировали i.v. 1 х 105 опухолевых клеток меланомы линии B16-OVA и вакцинировали дважды (d0 и d9) путем подкожной инъекции в дозе 2 нмоля EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (доза, эквимолярная EDA) или только MPLA в
правую боковую область. Мышей умерщвляли в день 13 и изымали легкие. Количество метастатических очагов подсчитывали в каждом легком. **, р <0,01 (односторонний дисперсионный анализ с критерием Тьюки для множественных сравнений);
5 на фиг. 33 - полученные в примере 19 данные о количестве метастазов на
модели метастазирования легкого с использованием полутерапевтического режима. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.v. 1 х 105 опухолевых клеток меланомы линии B16-OVA и вакцинировали дважды (dO и d9) путем подкожной инъекции (s.c.) в дозе 0,5
10 нмоля Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa или Z13Mad5 + Pam3CSK4 (доза,
эквимолярная Апаха) в правую боковую область. Мышей умерщвляли в день 21 и изымали легкие. Количество метастатических очагов подсчитывали в каждом легком. *, р <0,05; **, р <0,01 (непарный t-критерий);
на фиг. 34 - полученные в примере 20 данные количественной оценки
15 SIINFEKL-специфических СБ8-Т-клеток на модели глиобластомы Quad-G1261. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5х105 опухолевых клеток G1261-Quad и вакцинировали дважды (d7 и 21) путем s.с.-инъекции в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или 2 нмоля Z13Mad5 и 2 нмоля Апаха. SIINFEKL-специфические CDS-T-клетки количественно определяли в
20 крови и в BIL (инфильтрующие головной мозг лейкоциты) в d28 путем окрашивания мультимером (5-8 мышей на группу);
на фиг. 35 - полученные в примере 20 данные о секреции цитокинов. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5хЮ5 опухолевых клеток G1261-Quad и вакцинировали дважды (d7 и 21) путем
25 s.с.-инъекции в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или 2 нмоля Z13Mad5 и 2 нмоля Апаха. Выделяли BIL и культивировали в течение 6 ч со зрелыми BMDC, загруженными или не загруженными пептидом S11NFEKL, в присутствии брефелдина А перед внутриклеточным окрашиванием цитокинов. Данные представлены в виде % CDS-T-клеток, секретирующих цитокин (5-8 мышей на
30 группу);
на фиг. 36 - полученные в примере 21 данные о воздействии Z13Mad5Апаха на выживаемость на модели глиобластомы Quad-G1261. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5хЮ5 опухолевых
клеток G1261-Quad и вакцинировали трижды (d7, d21 и d35) путем s.c.-инъекции Z13Mad5Апаха в дозе 2 нмоля. Мышей ежедневно взвешивали и умерщвляли, когда потеря веса достигала более 15%;
на фиг. 37 - полученные в примере 22 данные о воздействии Z13Mad5Anaxa 5 на рост опухолей и на выживаемость на подкожной модели опухоли EG7-OVA с использованием профилактического режима. В целом, метод состоял в следующем: мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (d-21 и d-7) путем s.с.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля в правую боковую область, а затем имплантировали в день 0 s.c. ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-OVA в левую
10 боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля. (А) Рост опухолей у 7 мышей на группу (среднее ± СКО); ****, р <0,0001 (2-сторонний дисперсионный анализ в день 30). (Б) Кривая выживаемости для 7 мышей на группу. На графике показаны медианы выживаемости (m.s.). ***, р <0,001 (логранговый критерий);
15 на фиг. 38 - полученные в примере 23 данные о воздействии Z13Mad5Anaxa
на рост опухолей и на выживаемость на подкожной модели опухоли B16-OVA с использованием терапевтического режима на развитых опухолях. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 1хЮ5 опухолевых клеток B16-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды
20 (dl4 и d21) путем s.c.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля в правую
боковую область. (А) Рост опухолей у 7 мышей на группу (среднее ± СКО); *, р <0,05 (2-сторонний дисперсионный анализ в день 32). (Б) Кривая выживаемости для 7 мышей на группу. На графике показаны медианы выживаемости (m.s.);
25 на фиг. 39 - полученные в пример 24 данные о воздействии СРР в составе
конструкции Z13Mad5 Апаха на рост опухолей и на выживаемость на подкожной модели опухоли EG7-OVA. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали в день 0 s.c. ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область, а затем вакцинировали дважды (d5 и d 13) путем s.c-
30 инъекции Z13Mad5 Апаха или Mad5 Апаха в дозе 0,5 нмоля в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля. (А) Рост опухолей у 7 мышей на группу (среднее ± СКО); ****, р <0,0001. (Б) Кривая
выживаемости для 7 мышей на группу. На графике показаны медианы выживаемости (m.s.). **, р <0,01; ***, р <0,001;
на фиг. 40 - полученные в примере 25 данные о воздействии комплексов, имеющих различные СРР, на иммунный ответ. (А), либо 0,5 нмоля (Б) 5 Z13Mad5 Апаха, Z14Mad5 Апаха или Z18Mad5 Апаха. У мышей брали кровь в дни 7 после 2-ой, 3-ей, 4-ой и 5-ой вакцинации и осуществляли окрашивание мультимером (один эксперимент, 4 мыши на группу). *, р <0,05 при сравнении вакцинированных и наивных мышей в каждый момент времени за исключением Vac2 для вакцинированных Z18Mad5 Апаха мышей;
10 на фиг. 41- полученные в примере 26 данные о воздействии комплексов,
имеющих различные СРР, на CDS-T-клетки в селезенке (А), дренирующие лимфатические узлы (Б) и костный мозг (В). Мышей линии C57BL/6 вакцинировали пять раз (WkO, Wk2, Wk4, Wk6 и Wk8) s.c, используя в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa. Через 9 дней после 5-ой вакцинации
15 мышей умерщвляли, изымали органы и осуществляли окрашивание мультимером;
на фиг. 42 - полученные в примере 26 данные о воздействии комплексов, имеющих различные СРР, на Т-клетки в селезенке ( CDS-T-клеточный ответ (А) и СВ4-Т-клеточный ответ (Б)). Мышей линии C57BL/6 вакцинировали пять раз
20 (WkO, Wk2, Wk4, Wk6 и Wk8) s.c, используя в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa. (А) Через 9 дней после 5-ой вакцинации осуществляли Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидом SIINFEKL OVACD8. (Б) Через 9 дней после 5-ой вакцинации осуществляли Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидом OVACD4;
25 на фиг. 43 - полученные в примере 26 данные о воздействии комплексов,
имеющих различные СРР, на эффекторную функцию Т-клеток. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали пять раз (WkO, Wk2, Wk4, Wk6 и Wk8) s.c, используя в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa. Через 9 дней после 5-ой вакцинации осуществляли внутриклеточное окрашивание клеток селезенки,
30 стимулированных пептидом SIINFEKL OVACD8;
на фиг. 44 - полученные в примере 27 данные о воздействии комплексов, имеющих различные СРР, на рост опухолей (А) и на уровни выживаемости (Б). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-OVA
в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d 13) с помощью s.c-
инъекции Z13Mad5Апаха или Z14Mad5Апаха в дозе 0,5 нмоля в правую боковую
область. (А) Рост опухолей у 7 мышей на группу (среднее значение ± СКО); *,
р <0,05; р <0,0001 (2-сторонний дисперсионный анализ, тестирование в день
5 28). (Б) Кривая выживаемости для 7 мышей на группу. На графике показаны медианы выживаемости (m.s.). *, р <0,05; **, р <0,01; ***,р <0,001 (логранговый критерий);
на фиг. 45 - полученные в примере 28 данные о воздействии комплексов, имеющих различные СРР, на иммунный ответ. Мышей линии C57BL/6
10 вакцинировали три раза (WkO, Wk2 и Wk4) s.c, используя в дозе 2 нмоля (А) или 0,5 нмоля (Б) EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 или EDAZ18Mad5. У мышей брали кровь через 7 дней после 3-ей вакцинации и осуществляли окрашивание мультимером (один эксперимент, 4 мыши на группу). *, р <0,05;
на фиг. 46 - полученные в примере 29 данные о воздействии EDAZ14Mad5
15 на рост опухолей (А) и уровни выживаемости (Б). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d 13) с помощью s.c.-инъекции EDAZ14Mad5 в дозе 2 нмоля в правую боковую область. Левая панель: Рост опухолей у 7 мышей на группу (среднее ±СКО); **, р <0,01 (2-сторонний
20 дисперсионный анализ, тестирование в день 27). Правая панель: Кривая выживаемости для 7 мышей на группу. На графике показаны медианы выживаемости (m.s.);
на фиг. 47 - полученные в примере 30 результаты количественной оценки SIINFEKL-специфических СБ8-Т-клеток на модели глиобластомы Quad-G1261. В
25 целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5хЮ5 опухолевых клеток G1261-Quad и вакцинировали дважды (d7 и 21) путем s.с.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля или Z13Mad5 в дозе 2 нмоля и Апаха в дозе 2 нмоля. SIINFEKL-специфические CDS-T-клетки количественно определяли в крови и в BIL в d28 путем окрашивания мультимером (7-16 мышей
30 на группу);
на фиг. 48 - полученные в примере 30 данные о секреции цитокинов. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5хЮ5 опухолевых клеток G1261-Quad и вакцинировали дважды (d7 и 21) путем
s.c.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля или Z13Mad5 в дозе 2 нмоля и Апаха в дозе 2 нмоля. BIL выделяли и культивировали в течение 6 ч с созревшими BMDC, загруженными или не загруженными пептидом SIINFEKL, в присутствии брефелдина А перед внутриклеточным окрашиванием цитокинов. 5 Данные представлены в виде % CDS-T-клеток, секретирующих цитокин (7-16 мышей на группу);
на фиг. 49 - полученные в пример 31 данные о воздействии Z13Mad8Апаха на Т-клетки в селезенке (CDS-T-клеточный ответ (А) и СВ4-Т-клеточный ответ (Б)). Мышей линии C57BL/6 вакцинировали четыре раза (WkO, Wk2, Wk4 и Wk6)
10 s.c. с использованием Z13Mad8Апаха в дозе 2 нмоля. (А) Через одну неделю после 4-ой вакцинации осуществляли Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидом gp70CD8. (Б) Через одну неделю после 4-ой вакцинации осуществляли Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидом gp70CD4;
15 на фиг. 50 - полученные в пример 32 данные о воздействии Z13Madl 1 Апаха
на количество метастазов на модели метастазов в легком В16 (А) и на Т-клеточный ответ в селезенке (Б). Мышей линии C57BL/6 вакцинировали два раза (день 0, день 10) s.c. с использованием Z13Madl 1 Апаха в дозе 1 нмоль;
на фиг. 51 - полученные в пример 33 данные о воздействии Z13Mad9Anaxa
20 на Т-клетки в селезенке (CDS-T-клеточный ответ). Мышей линии C57BL/6 вакцинировали четыре раза (WkO, Wk2, Wk4 и Wk6) s.c. с использованием Z13Mad9Апаха в дозе 2 нмоля. Через одну неделю после 4-ой вакцинации осуществляли Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидом adpgk;
25 на фиг. 52 - полученные в примере 34 данные о воздействии комплексов,
имеющих различные СРР, на иммунный ответ. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали два раза (WkO и Wk2) s.c. с использованием в дозе 2 нмоля либо Z13Mad5Апаха, либо TatFMad5Апаха. У мышей брали кровь через 7 дней после 2-ой вакцинации и осуществляли окрашивание мультимером (один эксперимент,
30 8 мышей на группу):
на фиг. 53 - полученные в пример 35 результаты количественной оценки SIINFEKL-специфических CDS-T-клеток у наивных мышей. В целом, метод состоял в следующем: мышей линии C57BL/6 вакцинировали однократно (день
0) путем s.c.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля (группа "Z13Mad5Апаха"), либо Z13Mad5 в дозе 2 нмоля и Апаха в дозе 2 нмоля (группа "Z13Mad5+Anaxa"). SIINFEKL-специфические СБ8-Т-клетки количественно определяли в крови в d7 путем окрашивания мультимером (4-8 мышей на 5 группу);
на фиг. 54 - полученные в примере 36 данные о воздействии Z13Madl2Anaxa на Т-клетки в крови (С08-Т-клеточный ответ). Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (WkO и Wk2) s.c. с использованием Z13Madl2Anaxa в дозе 2 нмоля. Через 1 неделю после 2-ой вакцинации 10 осуществляли окрашивание мультимером в отношении неоантигена repsl на клетках крови;
на фиг. 55 - полученные в примере 37 данные об экспрессии маркеров активации HLA-DR, CD83, CD80 и CD86 (слева направо), выделенных из моноцитов человеческой крови дендритными клетками (DC) из одной 15 лейкоцитарной пленки. DC стимулировали с использованием в дозе ЗООнМ
Z13Mad5Апаха (нижние панели) или Z13Mad5 (верхние панели) в течение 48 ч. Для каждого состояния осуществляли также окрашивание указанного изотипа.
Примеры
Ниже представлены конкретные примеры, иллюстрирующие различные 20 варианты осуществления и объекты изобретения. Однако объем настоящего изобретения не ограничен указанными в настоящем описании конкретными вариантами осуществления изобретения. Представленные ниже препараты и примеры даны с целью лучшего понимания изобретения специалистами в данной области и воплощения на практике настоящего изобретения. Однако объем 25 настоящего изобретения не ограничен приведенными в качестве примера
вариантами осуществления изобретения, которые представлены только с целью иллюстрации отдельных объектов изобретения, и под объем изобретения подпадают функционально эквивалентные методы. Так, различные модификации изобретения в дополнение к указанным в настоящем описании должны быть 30 очевидны специалистам в данной области из представленного выше описания, прилагаемых чертежей и описанных ниже примеров. Указанные модификации подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1: Созревание in vitro человеческих дендритных клеток
В основу настоящего исследования была положена задача изучить способность комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, индуцировать созревание дендритных клеток. В настоящем исследовании комплекс, 5 предлагаемый в настоящем изобретении, представлял собой слитый белок,
содержащий проникающий в клетку пептид "Z13", белок "MAD5", состоящий из различных CD8+- и СВ4+-эпитопов из различных антигенов, и пептидного агониста TLR4 "EDA". Таким образом, создавали слитый белок с EDA-пептидом в N-концевом положении и различными контрольными конъюгированными 10 белками без Z13 или EDA, или без них обоих.
Так, создавали следующие конструкции, в которых аминокислотная последовательность проникающего в клетку пептида "Z13" подчеркнута, а пептидного агониста TLR "EDA" обозначена курсивом:
ED AZ13 Mad 5 15 Последовательность:
МННННННЖ" RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGEDDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKSSE NDRLRLLLKE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA QGALANIAVD 20 KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS [SEQ ID NO: 26]
Молекулярная масса: 25057 Да.
Характеристики:
- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gpl00CD8, 25 ЕальфаСБ4 и OVACD8.
- Содержит агонист TLR EDA (Lasarte J.J. и др., The extra domain A from fibronectin targets antigens to TLR4-expressing cells and induces cytotoxic T cell responses in vivo. J Immunol, 178(2), 2007, cc. 748-756).
- Буфер для хранения: 50мМ Трис-HCl, 150мМ NaCl, 10% глицерина, 2мМ 30 ДТТ, 1М L-аргинин, рН 8.
- Уровень эндотоксинов: < 0,01 эндотоксиновых единиц (ЕИ)/мкг.
Z13Mad5
Последовательность:
MHHHHHHKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKSSE NDRLRLLLKE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP 5 RFAKFASFEA QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS [SEQ ID NO: 29]
Молекулярная масса: 15196 Да Характеристики:
- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gpl00CD8, 10 ЕальфаСБ4 и OVACD8.
- Буфер для хранения: 50мМ Трис-HCl, 150мМ NaCl, 10% глицерина, 2мМ ДТТ, 1М L-аргинин, рН 9.
- Уровень эндотоксинов:
- партия 1: 0,32 EU/мг
15 - партия 2: 0,44 EU/мг.
Mad5
Последовательность: МННННННЕ SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS 20 [SEQ ID NO: 30]
Молекулярная масса: 10154,6 Да
Характеристики:
- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gpl00CD8, ЕальфаС04 и OVACD8.
25 - Буфер для хранения: 50мМ Трис-HCl, 150мМ NaCl, 10% глицерина, 2мМ
ДТТ, 0,5М L-аргинин, рН 8.
- Уровень эндотоксинов: 0,069 EU/мг.
Исследовали белки EDAZ13Mad5, Z13Mad5 и Mad5 в отношении их способности индуцировать созревание человеческих дендритных клеток (DC). 30 После инкубации в течение 48 ч с ЗООнМ белком оценивали экспрессию
маркеров активации (CD86, CD40, CD83 и HLA-DR) на человеческих DC с помощью FACS (фиг. 1-4). В качестве отрицательного контроля использовали специфические для каждого белка буферы.
Результаты для CD40 представлены на фиг. 1, для CD86 на фиг. 2, для HLADR на фиг. 3 и для CD83 на фиг. 4. В то время как EDAZ13Mad5 индуцировал созревание человеческих DC, о чем свидетельствует повышающая регуляция CD86, HLADR и CD83, белки Z13Mad5 и Mad5 не обладали 5 способностью активировать человеческие DC. Эти результаты свидетельствуют о том, что EDA-компонент белка ответствен за повышающую регуляцию маркеров активации на человеческих DC.
Пример 2: Презентация эпитопов in vitro (ГКГС I)
В основу настоящего исследования была положена задача изучить 10 функциональную ограниченную ГКГС класса I кросс-презентацию в мышиной системе in vitro с использованием полученных из костного мозга дендритных клеток (BMDC) и спленоцитов из различных трансгенных по TCR мышей. Для этой цели использовали конструкции EDAZ13Mad5 и Mad5 (описанные выше в примере 1) и конструкцию EDAMad5: 15 EDAMad5
Последовательность MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGEDDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA 20 QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS [SEQ ID NO: 31]
Молекулярная масса: 20017 Да.
Характеристики:
- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gpl00CD8, 25 ЕальфаС04 и OVACD8.
- Содержит агонист TLR EDA.
- Буфер для хранения: 50мМ Трис-HCl, 150мМ NaCl, 10% глицерина, 2мМ ДТТ, 0,5М L-аргинин, рН 8.
- Уровень эндотоксинов: 1,8 EU/мг.
30 BMDC загружали в течение ночи ЗООнМ белками EDAMad5, EDAZ13Mad5
и Mad5, содержащими эпитопы OVACD8, OVACD4 и gp 100. Осуществляли мониторинг процессинга и презентации этих ограниченных ГКГС I эпитопов OVACD8 и gp 100, измеряя in vitro пролиферацию наивных OVA257-264
специфических CD8 -Т-клеток из трансгенных по ОТ-1 Т-клеточному рецептору (TCR) мышей и gplOO-специфических СВ8+-Т-клеток из трансгенных по P-mel Т-клеточному TCR мышей соответственно. Таким образом, осуществляли мониторинг эффективности ограниченной ГКГС класса I презентации эпитопа 5 OVACD8 и эпитопа gp 100 через 4 дня с использованием меченных CFSE ОТ1-клеток и P-Mel-клеток соответственно. Мониторинг процессинга и презентации ограниченного ГКГС II эпитопа OVACD4 осуществляли путем измерения in vitro пролиферации наивных ОУАз2з-зз9-специфических СВ4+-Т-клеток из трансгенных по ОТ-2 Т-клеточному рецептору (TCR) мышей. Таким образом,
10 осуществляли мониторинг эффективности ограниченной ГКГС класса II
презентации эпитопа OVACD4 через 4 дня с использованием меченных CFSE ОТ2-клеток. В качестве контроля BMDC подвергали в течение 1 ч обработке в импульсном режиме пептидом в дозе 5мкМ (один эксперимент, репрезентативный для 2 отдельных экспериментов).
15 Результаты представлены на фиг. 5. Обнаружены сходные кросс-
презентация и способность к процессингу всех изученных белков на основе Mad5.
Пример 3: СР8-Т-клеточный иммунный ответ
Для изучения эффективности конъюгированных с EDA белков в отношении 20 индукции С08+-Т-клеточного ответа мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (WkO и Wk2) путем подкожной инъекции конструкций EDAZ13Mad5 или EDAMad5 (описанных в примерах 1 и 2) в дозе либо 2 нмоля, либо 10 нмолей. Применяемую в качестве положительного контроля группу вакцинировали Mad5 и агонистом TLR4 MPLA (в дозе, эквимолярной EDA). 25 Изучали две дозы конструкций (2 нмоля) (фиг. 6) и (10 нмолей) (фиг. 7). В каждой группе использовали 3-4 мыши.
Через 7 дней после последней вакцинации у мышей брали кровь и осуществляли окрашивание пентамером для мониторинга OVA-специфического иммунного ответа в крови. На фиг. 8 представлен процент позитивных по 30 пентамеру СВ8+-Т-клеток во всех группах и для обеих тестированных доз.
Эти данные свидетельствуют о том, что указанный иммунный ответ оказался ниже при дозе 10 нмолей, чем при дозе 2 нмоля. При использовании
обеих доз, 2 нмоля и 10 нмолей, опосредуемый вакциной иммунный ответ
оказался более стойким в группе, обработанной EDAZ13Mad5, чем в группе,
обработанной EDAMad5. Кроме того, обнаружен повышенный иммунный ответ,
когда агонист TLR4 конъюгировали с вакциной.
5 Пример 4: Эффективность вакцины в отношении роста опухоли на
стандартной модели опухоли EG.7-OVA
Для оценки воздействия содержащих EDA конструкций белков на контроль роста опухоли, была выбрана s.c.-модель клеток тимомы EG.7-OVA. Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-OVA в левую
10 боковую область. После имплантации опухолей мышей вакцинировали в дни 5 и 13, используя в дозе 10 нмолей одну из следующих конструкций (описание конструкций см. в примерах 1 и 2): EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5 или Mad5 и MPLA (в дозе, эквимолярной EDA) s.c. в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля.
15 На фиг. 9 представлены данные о росте опухолей у 7 мышей на группу
(среднее значение ± СКО); *, р <0,05 EDAZ13Mad5 относительно контрольной группы (2-сторонний дисперсионный анализ). На фиг. 10 представлены кривые роста индивидуальных опухолей (для каждой из 7 мышей на группу). На фиг. ПА представлена кривая выживаемости 7 мышей на группу; *, р <0,05
20 EDAZ13Mad5 относительно контрольной группы (логранговый критерий). На фиг. ПБ представлена кривая периода без развития опухоли для 7 мышей на группу; *, р <0,05 EDAZ13Mad5 относительно контрольной группы (логранговый критерий).
Результаты продемонстрировали, что при использовании в терапевтическом 25 режиме конструкция EDAZ13Mad5 представляла собой единственную белковую вакцину, которая значительно контролировала рост опухолей по сравнению с контрольной группой, что приводило к существенному улучшению кривых периода без развития опухоли и кривых выживаемости.
Таким образом, результаты позволяют предположить, что конструкция 30 белка EDAZ13Mad5 представляет собой высокоэффективную вакцину для контроля роста опухолей при применении в терапевтическом режиме.
Пример 5: Эффективность вакцины в отношении роста опухолей на модели метастатической меланомы
Для оценки эффективности на модели метастазов в легкие с использованием опухолевых клеток B16-OVA в полутерапевтическом режиме 5 применяли различные конструкции белков: EDAMad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (см. в примерах 1 и 2 описание конструкций) и индивидуально MPLA. Мышам линии C57BL/6 имплантировали i.v. 1 х 105 опухолевых клеток меланомы B16-OVA и одновременно (d0) вводили путем подкожной инъекции в правую боковую область в дозе 2 нмоля вакцину (EDAMad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5 +
10 MPLA, MPLA индивидуально). Через 9 дней мышей вакцинировали второй раз такой же дозой. Дополнительно контрольные группы вакцинировали с использованием в дозе 2 нмоля Z13Mad5 и агониста TLR4 MPLA (в дозе, эквимолярной EDA) или только MPLA. Мышей умерщвляли в день 13 и изымали легкие. В каждом легком подсчитывали количество метастатических очагов.
15 Результаты представлены на фиг. 12.
Результаты продемонстрировали, что конъюгат EDAZ13Mad5 обладал такой же эффективностью, что и Z13Mad5 + MPLA в отношении ингибирования метастазов опухоли в легкое. Кроме того, установлено, что EDA-Mad5 обладал более низкой эффективностью, чем EDAZ13Mad5, что свидетельствует о
20 имеющей решающее значение роли Z13 в эффективности вакцины.
Пример 6: Эффективность вакцины в отношении роста опухолей на модели метастатической меланомы - профилактический режим
Кроме того, эффективность различных конструкций белков EDAMad5, EDAZ13Mad5 и Z13Mad5 + MPLA (см. в примерах 1 и 2 описание конструкций)
25 оценивали на модели метастазов в легкие в профилактическом режиме. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали за 21 и 7 дней до имплантации опухолевых клеток (d-21 и d-7) путем подкожной инъекции (s.c.) в дозе 2 нмоля EDAZ13Mad5, EDAMad5 или Z13Mad5 + MPLA (в дозе, эквимолярной EDA) в правую боковую область. В день 0 мышам имплантировали i.v. 1> <105
30 опухолевых клеток меланомы B16-OVA. Мышей умерщвляли в день 14 и изымали легкие. Результаты представлены на фиг. 13.
Пример 7: Создание дополнительных конструкций, содержащих пептидный агонист TLR2
В этом случае комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, представлял собой слитый белок, который содержал проникающий в клетку пептид "Z13", белок "MAD5", состоящий из различных CD8+- и СБ4+-эпитопов различных антигенов, и пептидный агонист TLR2 "Апаха". Таким образом, создавали слитые белки с пептидом Апаха в С-концевом или N-концевом положении.
Так, создавали следующие конструкции, в которых аминокислотная последовательность проникающего в клетку пептида "Z13" подчеркнута, а пептидного агониста TLR "Апаха" обозначена курсивом:
AnaxaZ13Mad5
Последовательность: MHHHHHHSTVHEILCKLSLE GDHSTPPSAY GSVKPYTNFD ^EKRYKNRVA SRKSRAKFKQ LLQHYREVAA AKSSENDRLR LLLKESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGS [SEQ ID NO: 27]
Молекулярная масса: 18973 Да.
Характеристики:
- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gpl00CD8, ЕальфаС04 и OVACD8.
- Содержит 35-мерный пептид аннексина.
- Буфер для хранения: 50мМ Трис-HCl, 150мМ NaCl, 10% глицерина, 2мМ ДТТ, 0,5М L-аргинин, рН 8.
- Уровень эндотоксинов: 5,17 EU/мг. Z13Mad5 Апаха Последовательность:
MHHHHHHKRYKNRVA SRKSRAKFKQ LLQHYREVAA AKSSENDRLR LLLKESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGS^ TVHEILCKLS LEGDHSTPPS A YGSVKPYTN FDAE [SEQ ID NO: 28]
Молекулярная масса: 18973 Да Характеристики:
- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gpl00CD8, ЕальфаСБ4 и OVACD8.
5 - Содержит 35-мерный пептид аннексина.
- Буфер для хранения: 50мМ Трис-HCl, 150мМ NaCl, 10% глицерина, 2мМ ДТТ, 0,5М L-аргинин, рН 8.
- Уровень эндотоксинов: 3,1 EU/мг.
Пример 8: Оценка ТЕЯ2-связывания (клеточные линии HEK-hTLR2)
10 В основу настоящего исследования была положена задача оценить, могут
ли конструкции белков Z13Mad5Апаха и AnaxaZ13Mad5 (см. в примере 7 описание конструкций этих белков) связываться с TLR2 в качестве агониста. Клетки HEK-Blue hTLR2 высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулированную 0,3, 1 или ЗмкМ AnaxaZ13Mad5 или 15 Z13Mad5Anaxa, и инкубировали при 37°С в течение 24 ч. В качестве положительного контроля использовали Pam3CSK4, агонист TLR2, в концентрации 500 нг/мл.
Для мониторинга активации NF-KB/API добавляли 20 мкл супернатанта в среду для детекции QuantiBlue(r) и инкубировали при 37°С за 1 ч до определения 20 ОП (620 нм). Результаты представлены на фиг. 14 А.
Секрецию IL-8 в супернатанте количественно оценивали с помощью ELISA. Результаты представлены на фиг. 14 Б.
Результаты (фиг. 14 А, Б) свидетельствуют о том, что Z13Mad5 Апаха и AnaxaZ13Mad5 обладали одинаковой способностью связываться с TLR2 в 25 зависимости от дозы.
Пример 9: Индукция in vivo специфических СР8+-Т-клеток Для изучения эффективности конъюгированных с Апаха белков, описанных в примере 7, в отношении индукции СВ8+-Т-клеточных ответов мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (WkO и Wk2) путем подкожной инъекции 30 AnaxaZ13Mad5 в дозе 2 нмоля или Z13Mad5 Апаха в дозе 2 нмоля. Через 7 дней после последней вакцинации у мышей брали кровь, и для мониторинга OVA-специфического иммунного ответа в крови осуществляли окрашивание
пентамером (один эксперимент с 4 мышами на группу). Результаты представлены на фиг. 15 и 16.
Эти данные свидетельствуют о том, что и вакцина Z13Mad5Апаха, и
конструкция AnaxaZ13Mad5 вызывали сильный иммунный ответ.
5 Пример 10: Терапевтическое воздействие на рост опухолей
Для оценки воздействия конъюгированных с Апаха конструкций белков, описанных в примере 7, на контроль роста опухолей применяли стандартную модель опухоли, а именно, созданную путем s.c.-имплантации клеток тимомы EG.7-OVA.
10 Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-
OVA в левую боковую область. После имплантации опухолей каждую из трех групп по 7 мышей в каждой вакцинировали s.c. в правую боковую область в дни 5 и 13 путем подкожной инъекция в дозе 10 нмолей либо AnaxZ13Mad5 (группа 1), либо Z13Mad5Апаха (группа 2), либо Z13Mad5 и Pam3CSK4 (в дозе,
15 эквимолярной Апаха; группа 3). Для сравнения воздействия белка, смешанного с другим адъювантом, контрольную группу вакцинировали Z13Mad5 и Pam3CSK4 (в дозе, эквимолярной Апаха). Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля. Результаты представлены на фиг. 17-19.
При применении в терапевтическом режиме белковые вакцины
20 Z13Mad5 Апаха и AnaxaZ13Mad5 обладали более высокой эффективностью в
отношении контроля роста опухолей по сравнению с контрольной группой, т.е. совместная инъекция Z13Mad5 и Pam3CSK обеспечивала существенно улучшенную кривую выживаемости. В частности, для Z13Mad5 Апаха и AnaxaZ13Mad5 была продемонстрирована существенно более высокая
25 эффективность, чем для Z13Mad5 при введении отдельно от Pam3CSK4. Таким образом, результаты позволяют предположить, что конструкции белков Z13Mad5Апаха и AnaxaZ13Mad5 являются многообещающими конъюгированными вакцинами для контроля роста опухолей при использовании в терапевтическом режиме.
30 Пример 11: Терапевтическое воздействие на рост опухолей - сравнение
конструкций, содержащих различные агонисты TLR
Задачей настоящего исследования было сравнение эффективности различных конструкций белковых вакцин, конъюгированных с различными
агонистами TLR, а именно: EDAZ13Mad5 и Z13Mad5 Апаха, которые описаны в примерах 1 и 7, в отношении контроля роста опухолей. Для этой цели мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. ЗхЮ5 клеток тимомы EG.7-OVA в левую боковую область согласно методу, описанному в примере 10. Мышей (каждую из 5 7 мышей в группе) вакцинировали s.c. в правую боковую область в дни 5 и 13, используя в дозе 2 нмоля либо EDAZ13Mad5, Z13Mad5Апаха, либо используя совместную инъекцию Z13Mad5+MPLA (в дозе, эквимолярной EDA).
Результаты представлены на фиг. 20, 21 и 22. В этой экспериментальной схеме Z13Mad5Апаха, EDAZ13Mad5 и Z13Mad5+MPLA обладали сходной
10 способностью обеспечивать существенный контроль роста опухолей. Кроме
того, эти данные свидетельствуют о том, что Z13Mad5Апаха является наиболее эффективной конструкцией в отношении уровня контроля роста опухолей, а эффективность EDAZ13Mad5 несколько превышала эффективность Z13Mad5+MPLA при изучении с использованием указанной экспериментальной
15 схемы.
Пример 12: Зависимость эффекта от дозы Z13Mad5Anaxa в отношении контроля роста опухолей
Для определения оптимальной дозы содержащей конъюгат вакцины оценивали способность Z13Mad5Апаха (см. пример 7) в трех различных дозах
20 (0,5, 2 и 10 нмолей) контролировать рост опухолей. Дозовую зависимость конструкции Z13Mad5Anaxa оценивали на s.c.-модели, созданной с использованием клеток тимомы EG.7-OVA, согласно методу, описанному выше в примере 10. После имплантации опухолей мышей вакцинировали дважды (в день 5 и в день 13 после имплантации опухолей) в терапевтическом режиме с
25 использованием Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5, 2 или 10 нмолей.
Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d 13) путем подкожной инъекция в дозе либо 0,5, либо 2, либо 10 нмолей Z13Mad5Апаха в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля.
30 Данные о росте опухолей в группе из 7 мышей представлены на фиг. 23.
Эти данные свидетельствуют о том, что дозы 0,5 и 2 нмоля обладали по меньшей мере такой же эффективностью, что и доза 10 нмолей в отношении контроля роста опухолей.
Пример 13: Влияние различных путей введения Z13Mad5Апаха Это исследование базировалось на полученных в описанных выше
примерах результатах, продемонстрировавших эффективность содержащей
конъюгат вакцины Z13Mad5Апаха (см. пример 7), которая обладала 5 способностью вызывать специфические иммунные ответы и оказалась
эффективной в отношении контроля роста опухолей на описанной выше
подкожной модели опухоли EG7.
Для изучения воздействия подкожного, внутримышечного и внутрикожного
путей введения сравнивали иммунные ответы, вызываемые подкожной,
10 внутримышечной и внутрикожной инъекциями. Внутрикожные инъекции
(r)
осуществляли, используя устройство PLEASE фирма Pantec Biosolutions.
Мышей вакцинировали три раза каждые две недели (WkO, Wk2 и Wk4), используя Z13Mad5Апаха в дозе 0,5 или 2 нмоля (см. пример 7). Для того, чтобы оказывать целенаправленное воздействие на несколько лимфатических узлов, 115 ую и 3-ую вакцинации осуществляли в правую боковую область, а 2-ую
осуществляли в левую боковую область. Ответ SIINFEKL-специфических CD8-Т-клеток анализировали через 1 неделю после 2-ой и 3-ей вакцинаций в крови. На фиг. 24 представлены данные об ответах SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток после каждой вакцинации, обнаруженные в крови мышей линии C57BL/6, 20 вакцинированных три раза (WkO, Wk2 и Wk4) s.c, i.d. или i.m. с использованием 0,5 нмоля (фиг. 24 А) или 2 нмоля (фиг. 24 Б) Z13Mad5Anaxa. Кровь брали у мышей через 7 дней после 2-ой и 3-ей вакцинаций и осуществляли окрашивание мультимером (один эксперимент с 4 мышами на группу).
Результаты продемонстрировали, что при использовании двух изученных 25 доз (0,5 и 2 нмоля) (I) введение всеми изученными путями приводило к SIINFEKL-специфическому СВ8-Т-клеточному иммунному ответу и (II) подкожная вакцинация приводила к самому сильному SIINFEKL-специфическому CDS-T-клеточному иммунному ответу. При подкожном введении максимальный ответ достигался после 3-ей вакцинации и все еще 30 поддерживался после 3-ей вакцинации. SIINFEKL-специфический CD8-T-клеточный иммунный ответ после 2-ой вакцинации, вызываемый при внутрикожной и внутримышечной вакцинациях, был ниже, чем при подкожной вакцинации, и не повышался после 3-ей вакцинации.
Далее оценивали эффекторную функцию и статус истощения SIINFEKL-специфических CDS-T-клеток, анализируя KLRG 1 (представитель 1 лектинподобного рецептора клеток-киллеров подсемейства G 1) и PD-1 соответственно.
5 Для этой цели мышей линии C57BL/6 вакцинировали три раза (WkO, Wk2 и
Wk4) s.c, i.d. или i.m. Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля (см. пример 7). Кровь брали у мышей через 7 дней после 2-ой и 3-ей вакцинаций и осуществляли FACS-окрашивание. Экспрессию KLRG1 и PD-1 анализировали по позитивным по мультимеру CDS-T-клеткам (один эксперимент с 4 мышами на группу).
10 Результаты представлены на фиг. 25.
Указанные данные свидетельствуют о том, что экспрессия KLRG 1 сильно повышалась на SIINFEKL-специфических CDS-T-клетках после подкожной вакцинации. После i.d.- или i.m.-вакцинации обнаруженное действие оказалось более низким. Процент KLRG 1-позитивных клеток среди SIINFEKL-
15 специфических CDS-T-клеток также повышался после s.c.-вакцинации (данные не представлены).
В противоположность KLRG 1, экспрессия PD-1 снижалась с течением времени и с количеством вакцинаций при подкожном и внутримышечном путях вакцинации. Это позволяет предположить, что истощение SIINFEKL-
20 специфических CDS-T-клеток не происходило. Процент PD1 -позитивных клеток среди SIINFEKL-специфических CDS-T-клеток также снижался после s.c- и i.m.-вакцинаций (данные не представлены). Важно отметить, что экспрессия PD-1 оказалась выше после 2-ой вакцинации, когда мышей вакцинировали подкожно, что отражает статус более ранней активации специфических Т-клеток (Keir М.Е.
25 и др., PD-1 and its ligands in tolerance and immunity. Annu Rev Immunol, 26, 2008, cc. 677-704).
Анализировали также маркер позднего истощения Tim-З. Во всех группах обнаружен очень низкий уровень его экспрессии.
В совокупности, результаты свидетельствуют о том, что подкожная 30 вакцинация вызывает наиболее сильный специфический СВ8-Т-клеточный иммунный ответ по сравнению с внутримышечными или внутрикожными инъекциями.
Пример 14: Внутринодальный путь введения
С учетом результатов предыдущих экспериментов (пример 13) проводили дополнительное изучение внутринодального пути введения. Для этого исследовали иммунный ответ, вызываемый внутринодальной инъекцией 5 Z13Mad5Апаха (см. пример 7).
Для этой цели мышам сначала инъецировали подкожно голубой Эванса, позволяющий легко визуализировать лимфатические узлы, в которые осуществляли инъекции, и осуществлять внутринодальную инъекцию без инвазивной хирургии, например, согласно методу, описанному у Jewell СМ.,
10 S.C. Lopez и D.J. Irvine, In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection adjuvant-releasing polymer particles. Proc Natl Acad Sci US A, 108(38), 2011, cc. 15745-15750.
Мышей линии C57BL/6 вакцинировали два раза каждые две недели (WkO и Wk2) внутринодально, используя в дозе 0,5 нмоля Z13Mad5Апаха (см. пример
15 7). Первую вакцинацию осуществляли в правый паховый лимфатический узел, а вторую вакцинацию осуществляли в левый паховый лимфатический узел. Кровь брали у мышей через 7 дней после 2-ой вакцинации и осуществляли окрашивание мультимером (3 мыши на группу.). Другими словами анализировали SIINFEKL-специфический ответ СВ8+-Т-клеток в крови через 1
20 неделю после 2-ой вакцинации. На фиг. 26 показаны SIINFEKL-специфические ответы CDS-T-клеток. Указанные данные свидетельствуют о том, что внутринодальная инъекция также может вызывать ответ SIINFEKL-специфических СВ8-Т-клеток.
Пример 15: Схема вакцинации
25 Работу по изучению схемы вакцинации начинали с выявления влияния
третьей вакцинации при применении описанной выше конструкции Z13Mad5Апаха (см. пример 7). С учетом предыдущих результатов был выбран подкожный путь введения.
В этом эксперименте первые две вакцинации осуществляли в wkO и wk2, а
30 3-ю вакцинацию осуществляли либо в wk4 (фиг. 27 А), либо в wk8 (фиг. 27Б). Таким образом, мышей линии C57BL/6 вакцинировали три раза (фиг. 27 А и В: WkO, Wk2 и Wk4 и фиг. 27 Б и Г: WkO, Wk2 и Wk8) s.c, используя Z13Mad5Апаха в дозе 2 нмоля. Брали кровь у мышей через 7 дней после
последней вакцинации и осуществляли окрашиванием пентамером (один эксперимент с 4 мышам на группу). Соответственно анализировали SIINFEKL-специфический СВ8+-Т-клеточный ответ через 1 неделю после 2-ой и 3-ей вакцинаций (фиг. 27 А и Б). Дополнительно оценивали эффекторную функцию 5 SIINFEKL-специфических Т-клеток, анализируя экспрессию KLRG 1 на специфических CDS-T-клетках (фиг. 27 В и Г).
Данные свидетельствуют о том, что по сравнению с контролем процент SIINFEKL-специфических CDS-T-клеток существенно повышался во все изученные моменты времени (Vac2 и Vac3), а также при использовании обеих 10 схем вакцинации (фиг. 27 А и Б).
Важно отметить, что третья вакцинация в Wk4 обеспечивала наиболее значительное повышение процента SIINFEKL-специфических СВ8-Т-клеток (фиг. 27 А). Для этих же клеток продемонстрировано повышение эффекторной функции благодаря более высокому уровню экспрессии KLRG 1 (фиг. 27 В). В 15 противоположность этому, при осуществлении третьей вакцинации в Wk8 не обнаружено улучшения после третьей вакцинации относительно второй вакцинации касательно SIINFEKL-специфического иммунного ответа и экспрессии KLRG 1.
В совокупности, эти результаты свидетельствуют о том, что CD8-T-20 клеточный иммунный ответ можно повышать путем укорачивания промежутка времени между второй и третьей вакцинацией.
С учетом того, что более ранняя третья вакцинация, вероятно, усиливала иммунный ответ, в следующем опыте исследовали две короткие схемы вакцинации:
25 I) три вакцинации в день 0, день 3 и день 7 и
II) три вакцинации в день 0, день 7 и день 14.
И в этом случае также использовали мышей линии C57BL/6 и вакцинацию осуществляли s.c. с применением Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля (см. пример 7). Осуществляли окрашивание мультимером образцов крови, полученных через 30 1 неделю после 2-ой и 3-ей вакцинаций (один эксперимент с 4 мышами на группу).
Таким образом, анализировали SIINFEKL-специфический CD8-T-клеточный ответ через 1 неделю после 2-ой и 3-ей вакцинаций (фиг. 28А и Г).
Кроме того, оценивали эффекторную функцию SIINFEKL-специфических Т-
клеток, анализируя экспрессию KLRG 1 на специфических CDS-T-клетках (фиг.
28Б и 28Д), и статус истощения путем анализа экспрессии PD-1 специфическими
Т-клетками (фиг. 28В и 28Е).
5 Данные свидетельствуют о том, что - аналогично результатам, полученным
в первом опыте, вне зависимости от описанной выше схемы вакцинации - по сравнению с контролем процент SIINFEKL-специфических СВ8-Т-клеток увеличивался во все изученные моменты времени (Vac2 и Vac3), а также в обеих схемах вакцинации (фиг. 28 А и Б).
10 Однако по сравнению со схемой wk0-wk2-wk4 схема с вакцинациями в день
0, день 3 и день 7 не вызывала столь же сильный SIINFEKL-специфический СВ8-Т-клеточный иммунный ответ. Касательно схемы с вакцинациями в день 0, день 7 и день 14, вызываемый SIINFEKL-специфический СВ8-Т-клеточный иммунный ответ оказался более сильным по сравнению с описанной ранее
15 схемой (d0-d3-d7), но он не поддерживался после 3-ей вакцинации.
В совокупности, результаты, полученные при применении указанных схем вакцинации, свидетельствуют о том, что схема вакцинации Wk0-Wk2-Wk4 представляет собой самую лучшую схему вакцинации для вызывания эффективного OVA-специфического CDS-T-клеточного иммунного ответа с
20 высокой эффекторной функцией.
Пример 16: Способность конъюгированных конструкций агонист TLR-CPP активировать мышиные антигенпрезентирующие клетки (АРС)
Для изучения воздействия как компонента, представляющего собой СРР, так и компонента, представляющего собой агонист TLR, в комплексе,
25 предлагаемом в настоящем изобретении, вновь применяли описанные выше слитые белки (см. примеры 1, 2 и 7).
Кроме того, создавали дополнительный "контрольный пептид", который также представлял собой слитый белок и который содержал белок "MAD5", состоящий из различных CD8+- и СВ4+-эпитопов из различных антигенов, и
30 пептидный агонист TLR2 "Апаха" (т.е. без проникающего в клетку пептида).
Таким образом, дополнительно создавали следующие контрольные конструкции:
Mad5Anaxa
Последовательность: MHHHHHHESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESIINFEKLTEWT GSSTVHEILC 5 KLSLEGDHST PPSAYGSVKP YTNFDAE [SEQ ID NO: 32]
Молекулярная масса: 13933 Да.
Характеристики:
- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gpl00CD8, 10 ЕальфаСБ4 и OVACD8.
- Содержит 35-мерный пептид аннексина в С-концевом положении.
- Буфер для хранения: 50мМ Трис-HCl, 150мМ NaCl, 10% глицерина, 2мМ ДТТ, 0,5М L-аргинин, рН 8.
- Уровень эндотоксинов: партия 1 - 12,15 EU/мг.
15 В основу этого исследования была положена задача оценить способность
двух взятых в качестве примера комплексов, предлагаемых в настоящем изобретении, а именно: EDAZ13Mad5 (см. пример 1) и Z13Mad5Anaxa (см. пример 7), повышать активацию антигенпрезентирующих клеток по сравнению с референс-комплексами, в которых отсутствовал либо компонент,
20 представляющий собой проникающий в клетку пептид Z13 (Mad5Апаха, см. выше; EDAMad5, см. пример 2), либо агонист TLR (Z13Mad5, см. пример 1).
Для этой цели оценивали способность указанных выше конструкций повышать активацию антигенпрезентирующих клеток (АРС) на дендритных клетках из костного мозга (BMDC), которые экспрессируют все TLR за
25 исключением TLR7.
BMDC высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулированную 1мкМ либо Z13Mad5Апаха (см. пример 7), Mad5Апаха (см. выше), Z13Mad5 (см. пример 1), EDAZ13Mad5 (см. пример 1), либо EDAMad5 (см. пример 2), и инкубировали в течение 24 ч при 37°С.
30 Активацию АРС изучали, осуществляя мониторинг секреции IL-6 в
супернатант культуры BMDC. Секрецию IL-6 количественно оценивали в супернатанте с помощью ELISA.
Результаты представлены на фиг. 29. Эти данные четко демонстрируют, что конструкция Z13Mad5Апаха обладала способностью активировать BMDC, однако не обнаружено никакой активации, когда клетки культивировали в присутствии Z13Mad5 или Mad5Апаха. Это позволяет предположить, что не 5 только агонист TLR (Апаха или EDA) имеет решающее значение для активации макрофагов и дендритных клеток, но необходим также и СРР. Кроме того, установлено, что присутствие СРР без агониста TLR не достаточно, таким образом, фактически оба, и СРР, и агонист TLR имеют решающее значение для активации макрофагов и дендритных клеток.
10 Указанные результаты подтверждали с использованием другой клеточной
линии, такой как клеточная линия мышиных макрофагов Raw 264.7, которая экспрессирует все TLR за исключением TLR5 (Applequist S.E., R.P. Wallin и H.G. Ljunggren, Variable expression of Toll-like receptor in murine innate and adaptive immune cell lines. Int Immunol, 14(9), 2002, cc. 1065-1074).
15 Клетки линии Raw 264.7 высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в
культуральную среду, стимулированную 1мкМ либо Z13Mad5Апаха (см. пример 7), Mad5Anaxa (см. выше), либо Z13Mad5 (см. пример 1), и инкубировали в течение 24 ч при 37°С.
Активацию АРС в клетках линии Raw 264.7 изучали, осуществляя
20 мониторинг секреции TNF-a в супернатанте культуры Raw 264.7. Секрецию
TNF-a количественно оценивали с помощью ELISA в супернатанте. Результаты представлены на фиг. 30.
Считается, что СРР может облегчать проникновение молекулы в клетки, что обеспечивает улучшенный таргетинг внутриклеточного TLR.
25 В совокупности, данные подтвердили решающее значение как СРР, так и
агониста TLR в конъюгированных конструкциях в отношении активации АРС. Это действие может быть результатом облегчения проникновения конструкции в клетку, что приводит к оптимальному таргетингу внутриклеточного TLR. Пример 17: Способность конъюгированных конструкций связываться с
30 человеческим TLR4
В настоящее время установлено, что пептид Апаха обладает адъювантной активностью благодаря передаче сигналов через TLR2 (WO 2012/048190 А1), в то время как пептид EDA является встречающимся в естественных условиях
лигандом для TLR4 (Okamura Y. и др., The extra domain A of fibronectin activates Toll-like receptor 4. J Biol Chem, 276(13), 2001, cc. 10229-10233).
Кроме того, как продемонстрировано выше в примере 8 и на фиг. 14, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, который содержит пептид 5 Апаха в качестве агониста TLR, например Z13Mad5Апаха, обладает
способностью связываться с человеческим TLR2 и усиливать секрецию IL-8 клетками линии HEK-hTLR2 (см. пример 8, фиг. 14).
При создании настоящего изобретения оценивали способность комплексов, предлагаемых в настоящем изобретении, которые содержали либо пептид Апаха,
10 в качестве агониста TLR, либо пептид EDA в качестве агониста TLR, связываться с человеческим TLR4. Для этой цели НЕК-клетки, трансфектированные человеческим TLR4 (HEK-hTLR4), высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулированную 1мкМ либо Z13Mad5 Апаха (см. пример 7), Mad5 Апаха (см выше), Z13Mad5 (см.
15 пример 1), EDAZ13Mad5 (см. пример 1), либо EDAMad5 (см. пример 2), и инкубировали в течение 24 ч при 37°С. Секрецию IL-8 в супернатанте количественно оценивали с помощью ELISA.
Результаты представлены на фиг. 31. Как и ожидалось, инкубация НЕК-hTLR4 с EDAZ13Mad5 приводила к выраженной секреции IL-8, что
20 свидетельствует о связывании EDAZ13Mad5 с TLR4. В соответствии с
результатами, полученными в примере 16, секреция IL-8 при использовании EDAMad5 (без СРР) оказалась существенно ниже по сравнению с EDAZ13Mad5, что демонстрирует эффект присутствия СРР. Установлено, что конструкция Z13Mad5, в которой отсутствует агонист TLR, не вызвала секрецию IL-8,
25 свидетельствуя - как и ожидалось - об отсутствии связывания с TLR4. Важно отметить, что инкубация HEK-hTLR4 с конструкцией Z13Mad5Апаха приводила к наиболее выраженной секреции IL-8, свидетельствующей о связывании Z13Mad5Апаха с TLR4. Это является неожиданным, поскольку согласно существовавшей ранее гипотезе Апаха
30 является агонистом TLR2. И в этом случае аналогичная конструкция, но без СРР (Mad5Anaxa) приводила к существенно более низкой секреции IL-8, что подтверждает результаты, полученные в примере 16.
В совокупности, эти данные (I) подтверждают результаты, полученные в пример 16, (II) подтверждают, что EDA действительно является агонистом TLR4, и (III) и свидетельствуют, что является неожиданным, о том, что пептид Апаха также является агонистом TLR4 (в дополнение к тому, что он является 5 агонистом TLR2, см. пример 8 и фиг. 14).
Пример 18: Эффективность вакцины в отношении роста опухоли на модели метастазов легкого - полутерапевтический режим: в качестве агониста TLR ЕРА
Это исследование базировалось на результатах, полученных в примере 6, демонстрирующих эффективность комплекса, предлагаемого в настоящем
10 изобретении, такого как EDAZ13Mad5, при изучении на модели метастазов меланомы в легкое в профилактическом режиме (см. фиг. 13).
В настоящем исследовании использовали такую же модель метастазов в легкое, а также конструкции белков EDAZ13Mad5 и Z13Mad5 + MPLA (см. в примерах 1 и 2 описание конструкций). Однако при использовании
15 полутерапевтического режима мышей линии C57BL/6 вакцинировали
одновременно с имплантацией опухолевых клеток (d0) и второй раз через 9 дней после имплантации (d9). Вакцинацию осуществляли путем подкожной инъекции (s.c.) в дозе 2 нмоля EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (в дозе, эквимолярной EDA) или MPLA в правую боковую область. В день 0 мышам имплантировали
20 i.v. 1 х 105 опухолевых клеток меланомы B16-OVA и вакцинировали дважды (d0 и d9) путем подкожной инъекции (s.c.) в дозе 2 нмоля EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (в дозе, эквимолярной EDA) или MPLA индивидуально в правую боковую область. Мышей умерщвляли в день 13 и легкое изымали. Результаты представлены на фиг. 32.
25 Результаты продемонстрировали, что конструкция EDAZ13Mad5 оказалась
несколько более эффективной, чем Z13Mad5 + MPLA в отношении ингибирования роста метастазов меланомы. Кроме того, никакого адъювантного действия не выявлено при инъекции мышам только MPLA.
Как EDAZ13Mad5, так и Z13Mad5 + MPLA существенно ингибировали
30 метастазы меланомы в легкое при их применении и в профилактическом, и в полутерапевтическом режимах.
Пример 19: Эффективность вакцины в отношении роста опухолей на модели метастазов в легкое - полутерапевтический режим: в качестве агониста TLR Апаха
Это исследование базировалось на результатах, полученных в примере 18, в 5 нем использовали такую же модель (в полутерапевтическом режиме) и схему эксперимента. Однако изучали воздействие комплексов, предлагаемых в настоящем изобретении, которые содержали пептид "Апаха" в качестве агониста TLR - вместо агониста TLR EDA, который применяли в примере 18.
Для этой цели мышам линии C57BL/6 имплантировали i.v. 1 х 105 10 опухолевых клеток меланомы B16-OVA и вакцинировали дважды (d0 и d9)
путем подкожной инъекции (s.c.) в дозе 0,5 нмоля Z13Mad5Апаха, Mad5Апаха или Z13Mad5 + Pam3CSK4 (в дозе, эквимолярной Апаха) в правую боковую область. Мышей умерщвляли в день 21 и легкое изымали. Количество метастатических очагов подсчитывали в каждом легком. Результаты 15 представлены на фиг. 33.
Результаты продемонстрировали, что конструкция Z13Mad5Апаха оказалась значительно более эффективной, чем Z13Mad5 + Pam3CSK4 в отношении ингибирования роста метастазов меланомы. В противоположность этому, Mad5Anaxa не обладала способностью контролировать рост метастазов в 20 легкое, что вновь подтверждает важность СРР.
В целом, эксперимент, проведенный на модели метастазов B16-OVA в легкое, продемонстрировал, что конструкция Z13Mad5Апаха обладала высокой эффективностью в отношении ингибирования роста метастазов меланомы в легкое.
25 Пример 20: Эффективность вакцины на модели глиобластомы
В этом исследовании использовали другую модель рака, а именно: модель глиобластомы. Глиома представляет собой наиболее часто встречающуюся форму первичной опухоли головного мозга у взрослых, при этом мультиформная глиобластома (GBM) является наиболее летальной. Эта опухоль является
30 печально известной с позиции ее высокой инвазивности и агрессивного
поведения. В настоящее время наилучшим путем лечения GBM является режим, включающий комбинацию хирургии, химиотерапии и лучевой терапии, который обеспечивает медианный период выживаемости, составляющий только 14,6
месяца. Существует неотложная неудовлетворенная к настоящему времени потребность в новых путях лечения, улучшающих прогноз для страдающих глиомой пациентов. Опосредуемая Т-клетками иммунотерапия умозрительно представляет собой привлекательный вариант лечения при применении в 5 сочетании с существующими путями лечения глиомы, в частности, высоко инвазивной GBM.
Глиома G1261 представляет собой индуцируемую карциногеном модель мышиной глиомы. Эта модель представляет собой одну из очень небольшого количества моделей опухолей головного мозга, созданную на животных с
10 нарушенным иммунитетом, которая имеет характеристики роста, сходные с человеческой GBM (Newcomb Е. и D. Zagzag, The murine GL261 glioma experimental model to assess novel brain tumor treatments, в: CNS Cancer Models, Markers, Prognostic, Factors, Targets, and Therapeutic Approaches под ред. E.G. Van Meir, изд-во Humana Press: Atlanta, 2009, cc. 227-241; Jacobs V.L. и др.,
15 Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model. ASN Neuro, 3(3): 2011, еОООбЗ). Небольшие количества трансплантированных внутрь черепа клеток G1261 образуют внутричерепные опухоли у мышей линии C57BL/6 (Zhu X. и др., Poly-/CLC promotes the infiltration of effector T cells into intracranial gliomas via induction of CXCL10 in IFN-alpha and IFN-gamma
20 dependent manners, Cancer Immunol lmmunother, 59(9), 2010, cc. 1401-1409; Zhu X. и др., Toll like receptor-3 ligand poly-/CLC promotes the efficacy of peripheral vaccinations with tumor antigen-derived peptide epitopes in murine CNS tumor models. J Transl Med, 5, 2007, c. 10). Клетки обладают умеренной иммуногенностью: они обладают способностью вызывать
25 опухолеспецифический иммунный ответ в области опухоли. Однако
опухолеспецифическое иммунные клетки не обеспечивают полный клиренс опухоли.
В настоящее время М. Ollin создал новую модель G1261 (Ohlfest J.R., и др., Vaccine injection site matters: qualitative and quantitative defects in CDB T cells 30 primed as a function of proximity to the tumor in a murine glioma model. J Immunol, 190(2), 2013, cc. 613-620) путем трансфекции клеток линии G1261 "Quad кассетой" ("четверной кассетой"), экспрессирующей четыре пептида, презентируемых молекулами Н-2Ь класса I или II: человеческий gp 1OO25-33,
куриный OVA257-264, куриный OVA323.339 и мышиный I-Ea52-68- Клеточная линия Quad-G1261 также стабильно экспрессирует люциферазу, что позволяет отслеживать рост опухоли с помощью биолюминесценции.
Целью настоящего исследования была оценка эффективности комплекса, 5 предлагаемого в настоящем изобретении, на модели глиобластомы Quad-G1261. Воздействие комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, а именно: Z13Mad5Апаха (см. пример 7) оценивали с использованием описанной выше модели глиобластомы. При этом анализировали Т-клеточный хоминг в области опухоли у мышей, несущих опухоль G1261-Quad, которых
10 вакцинировали дважды (Wkl и Wk3) вакциной Z13Mad5Апаха. Группу,
вакцинированную Z13Mad5 и Апаха (в дозе, эквимолярной Z13Mad5Апаха), которые вводили индивидуально, применяли в качестве контроля. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. (внутрь черепа) 5x105 опухолевых клеток G1261-Quad и вакцинировали дважды (в d7 и
15 d21 после имплантации) путем s.c.-инъекции в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa (группа 1) или 2 нмоля Z13Mad5 и 2 нмоля Апаха (группа 2). В Wk4 анализировали кровь и инфильтрующие головной мозг лейкоциты (BIL), при этом количественно оценивали SIINFEKL-специфические CDS-T-клетки в крови и в BIL в d28 путем окрашивания мультимером (5-8 мышей на группу).
20 Результаты представлены на фиг. 34.
В целом, в крови обнаружена низкая частота встречаемости SIINFEKL-специфических CDS-T-клеток. Однако более высокий процент SIINFEKL-специфических CDS-T-клеток обнаружен в крови вакцинированных Z13Mad5Апаха мышей. Во всех группах обнаружена существенно более сильная
25 аккумуляция SIINFEKL-специфических CDS-T-клеток в BIL.
После двух вакцинаций Z13Mad5 Апаха частота встречаемости SIINFEKL-специфических СВ8+-Т-клеток в BIL оказалась в 2 раза выше (24%), чем при применении Z13Mad5 + Апаха (12%).
Затем оценивали секрецию цитокинов. Для этого мышам линии C57BL/6
30 имплантировали i.e. 5> <105 опухолевых клеток G1261-Quad и вакцинировали
дважды (d7 и 21) путем s.c.-инъекции, используя в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или 2 нмоля Z13Mad5 и 2 нмоля Апаха. BIL выделяли и культивировали в течение 6 ч со зрелыми BMDC, загруженными или не загруженными пептидом
SIINFEKL, в присутствии брефелдина А перед внутриклеточным окрашиванием цитокинов. Результаты представлены на фиг. 35.
Несмотря на гетерогенность, обнаружен высокий уровень секреции цитокинов для инфильтрующих головной мозг CDS-T-клеток из мышей, 5 вакцинированных Z13Mad5Апаха. Эти результаты продемонстрировали, что вакцина Z13Mad5 Апаха обладала способностью вызывать более сильный SIINFEKL-специфический CDS-T-клеточный иммунный ответ в головном мозге несущих опухоли мышей с выраженной эффекторной функцией.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что Z13Mad5Апаха 10 обладает эффективностью в отношении вызывания иммунного ответа
инфильтрующих головной мозг SIINFEKL-специфических СВ8-Т-клеток. Z13Mad5Апаха обладает способностью усиливать секрецию цитокинов антигенспецифическими CDS-T-клетками в головном мозге.
Пример 21: Эффективность вакцины в отношении выживаемости на модели 15 глиобластомы G1261-Quad
В независимом эксперименте осуществляли мониторинг выживаемости
мышей, вакцинированных контролем и Z13Mad5Апаха. Терапевтический режим
включал три последовательные вакцинации с использованием в дозе 2 нмоля
Z13Mad5Anaxa в дни 7, 21 и 35 после i.e.-имплантации опухоли.
20 Мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5x105 опухолевых клеток
G1261-Quad и вакцинировали три раза (d7, d21 и d35) путем s.c.-инъекции Z13Mad5Апаха в дозе 2 нмоля. Мышей ежедневно взвешивали и умерщвляли, когда потеря веса достигала более чем 15%. Результаты представлены на фиг. 36.
25 Результаты продемонстрировали, что терапевтическая вакцинация
Z13Mad5 Апаха является более эффективной, чем в контрольной группе, удлиняя медиану выживаемости на 10 дней.
Пример 22: Эффективность вакцины на подкожной модели опухоли -
профилактический режим
30 Этот опыт базировался на результатах, полученных в примере 10, которые
представлены на фиг. 17-19.
Для оценки воздействия конъюгированных с Апаха конструкций белков, описанных в примере 7, на контроль роста опухолей использовали стандартную
модель опухоли, а именно: s.c.-имплантацию клеток тимомы EG.7-OVA. В
противоположность примеру 10, в котором вакцинацию осуществляли в дни 5 и
13, в настоящем исследовании использовали профилактический режим, при
котором мышей вакцинировали за 21 и 7 дней до имплантации опухоли.
5 Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (d-21 и d-7) путем s.c-
инъекции, используя в дозе 0,5 нмоля Z13Mad5Апаха, в правую боковую область, а затем имплантировали в день 0 s.c. ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля.
10 Результаты, представленные на фиг. 37, касаются объема опухолей (фиг. 37
А) и уровня выживаемости (фиг. 37 Б). Данные демонстрируют, что профилактическая вакцинация с использованием Z13Mad5Апаха обладала высокой эффективностью в отношении контроля роста опухолей и уровня выживаемости. Объем опухолей существенно снижался у мышей, обработанных
15 Z13Mad5Anaxa, по сравнению с контрольными мышами. Уровень выживаемости существенно повышался у мышей, обработанных Z13Mad5Апаха, по сравнению с контрольными мышами.
Пример 23: Эффективность вакцины на подкожной модели опухоли -терапевтический режим на развитых опухолях
20 Этот опыт базировался на результатах, полученных в примере 10, которые
представлены на фиг. 17-19, и на результатах, полученных в примере 22, которые представлены на фиг. 37. Целью настоящего исследования была оценка воздействия Z13Mad5Апаха (см. пример 7) на развитую опухоль.
Для этой цели применяли s.c.-модель, полученную с использованием клеток
25 меланомы B16-OVA. В этой модели опухолевые клетки размножались медленно, что позволяло создавать большее окно продолжительности вакцинации.
Первую вакцинацию с использованием Z13Mad5Апаха в низкой дозе 0,5 нмоля осуществляли при наличии развитой и видимой невооруженным глазом опухоли, т.е. в день 14 после имплантации опухолевых клеток. Вторую
30 вакцинацию осуществляли в день 21.
Таким образом, мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 1хЮ5 опухолевых клеток B16-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (dl4 и d21) путем s.c.-инъекции в дозе 0,5 нмоля Z13Mad5Anaxa в правую
боковую область. Осуществляли мониторинг роста опухолей и строили кривые
выживаемости. Результаты представлены на фиг. 38.
Результаты продемонстрировали, что Z13Mad5Апаха эффективно
контролировала рост развитых и видимых невооруженных глазом опухолей. 5 Кроме того, несмотря на присутствие развитых и видимых невооруженных
глазом опухолей уровни выживаемости повышались у мышей, обработанных
Z13Mad5Апаха, по сравнению с контролями.
Пример 24: Эффективность вакцины на подкожной модели опухоли -
терапевтический режим: роль СРР
10 Протокол этого исследования соответствовал протоколу опыта, описанного
в примере 10, только с тем различием, что оценивали дополнительную группу
"Mad5Апаха" (см. пример 16).
В целом, метод состоял в следующем: использовали стандартную модель
опухоли, а именно: полученную в результате s.c.-имплантации клеток тимомы 15 EG.7-OVA. Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. ЗхЮ5 опухолевых
клеток EG7-OVA в левую боковую область. После имплантации опухолей
группы по 7 мышей в каждой вакцинировали s.c. в правую боковую область в
день 5 и 13 путем подкожной инъекции, используя в дозе 0,5 нмоля либо
Z13Mad5Anaxa (группа 1), либо Mad5Anaxa (группа 2), и сравнивали с 20 контрольной группой. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля.
Результаты представлены на фиг. 39.
Результаты продемонстрировали, что у мышей, обработанных
Z13Mad5Апаха, обнаружено существенное снижение объема опухолей и
существенно повышение уровня выживаемости по сравнению как с 25 контрольными мышами, так и с мышами, обработанными Mad5Апаха, т.е.
конструкцией без СРР. Эти результаты свидетельствуют о том, что присутствие
СРР приводит к существенному уменьшению объема опухолей и существенному
повышению уровня выживаемости, т.е. повышенной эффективности вакцинация.
Таким образом, результаты продемонстрировали - в совокупности с 30 результатами, полученными в примере 10, - что присутствие СРР и агониста
TLR приводит к синергетическому действию в отношении роста опухолей и
уровня выживаемости.
Пример 25: Сравнение кинетики иммунных ответов при применении комплексов, содержащих различные проникающие в клетку пептиды
Для изучения воздействия различных СРР в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, применяли описанный выше слитый белок 5 Z13Mad5Апаха (см. пример 7).
Дополнительно конструировали слитые белки, содержащие СРР, отличные от Z13, а именно: Z14 (SEQ ID NO: 7) или Z18 (SEQ ID NO: 11). Указанные слитые белки содержали также белок "MAD5", который состоит из различных CD8+- и С04+-эпитопов из различных антигенов, и пептидный агонист TLR2 10 "Апаха". Таким образом, создавали следующие дополнительные конструкции:
Z14Mad5 Апаха
Последовательность: MHHHHHHKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA 15 NLDVEQLESIINFEKLTEWT GSSTVHEILC KLSLEGDHST PPSAYGSVKP YTNFDAE (SEQ ID NO: 33)
Z18Mad5Anaxa
Последовательность:
20 MHHHHHHREV AAAKSSENDR LRLLLKESLK ISQAVHAAHA EINEAGREVV GVGALKVPRN QDWLGVPRFA KFASFEAQGA LANIAVDKAN LDVEQLESII NFEKLTEWTG SSTVHEILCK LSLEGDHSTP PSAYGSVKPY TNFDAE (SEQ ID NO: 34)
Мышей линии C57BL/6 разделяли на 8 различных групп (по 4 мыши на 25 группу): три группы, обрабатываемые либо Z13Mad5Апаха, либо
Z14Mad5 Апаха, либо Z18Mad5 Апаха в дозе 2 нмоля, и соответствующий им контроль, и три группы, обрабатываемые Z13Mad5 Апаха, Z14Mad5 Апаха или Z18Mad5Апаха в дозе 0,05 нмоля, и соответствующий им контроль. Мышей вакцинировали пять раз (WeekO, Week2, Week4, Week6 и Week8) s.c. У мышей 30 брали кровь через 7 дней после 2-ой, 3-ей, 4-ой и 5-ой вакцинаций и
осуществляли окрашивание мультимером (один эксперимент, 4 мыши на группу).
Результаты представлены на фиг. 40. Во всех группах, вакцинированных Z13Mad5 Апаха, Z14Mad5 Апаха или Z18Mad5 Апаха, обнаружен повышенный процент позитивных по мультимеру клеток по сравнению с контрольной группой (за исключением второй вакцинации Z18Mad5 Апаха). Эти результаты 5 свидетельствуют о том, что комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении, которые содержат различные проникающие в клетку пептиды, обладают способностью вызывать иммунный ответ при их применении в различных дозах.
Пример 26: Сравнение Т-клеточных иммунных ответов при применении комплексов, содержащих различные проникающие в клетку пептиды
10 Для более детального изучения CDS-T-клеточных иммунных ответов
мышей линии C57BL/6 разделяли на три различные группы (по 3-4 мыши на группу): наивные Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa.
Мышей линии C57BL/6 из Z13Mad5Anaxa-rpynnbi и Z14Mad5Anaxa-rpynnbi вакцинировали 5 раз (WeekO, Week2, Week4, Week6 и Week8) s.c, используя в
15 дозе 2 нмоля либо Z13Mad5Anaxa (см. пример 7), либо Z14Mad5Anaxa (см.
пример 25). Через 9 дней после 5-ой вакцинации мышей умерщвляли, органы изымали и осуществляли окрашивание мультимером для определения процента SIINFEKL-специфических CDS-T-клеток в селезенке, костном мозге и дренирующих лимфатических узлах (паховых и подмышечных).
20 Результаты представлены на фиг. 41. У мышей, вакцинированных
Z13Mad5 Апаха или Z14Mad5 Апаха, обнаружено сходное увеличение позитивных по мультимеру клеток, в частности, в селезенке и костном мозге, а также небольшое увеличение дренирующих лимфатических узлов.
Для дополнительного изучения эффекторной функции CDS-T-клеток после
25 вакцинации комплексами с различными СРР, в те же группах мышей, которые
описаны выше, осуществляли Elispot-анализ клеток селезенки, стимулированных пептидом SIINFEKL-OVACD8 (SEQ ID NO: 35), через 9 дней после 5-ой вакцинации для количественного определения продуцирующих IFN-y клеток. Результаты представлены на фиг. 42А. У мышей, вакцинированных
30 Z13Mad5Апаха, обнаружено существенное увеличение продуцирующих IFN-y клеток по сравнению с наивными мышами. У мышей, вакцинированных Z14Mad5Апаха, также обнаружено увеличение продуцирующих IFN-y клеток по сравнению с наивными мышами, однако увеличение оказалось не значимым, что
может являться следствием небольшого количества мышей (3 мыши в обработанной Z14Mad5Anaxa группе).
Для изучения С04-Т-клеточных ответов после вакцинации комплексами, содержащими разные СРР, в тех же группах мышей, которые описаны выше, 5 осуществляли Elispot-анализ клеток селезенки, стимулированных пептидом
SIINFEKL-OVACD4 (SEQ ID NO: 36), через 9 дней после 5-ой вакцинации для количественного определения продуцирующих IFN-y клеток.
Результаты представлены на фиг. 42Б. У мышей, вакцинированных Z13Mad5Апаха, обнаружено очень существенно повышение количества
10 продуцирующих IFN-y клеток по сравнению с наивными мышами. У мышей, вакцинированных Z14Mad5Апаха, также обнаружено увеличение продуцирующих IFN-y клеток по сравнению с наивными мышами, однако увеличение оказалось не значимым, что может являться следствием небольшого количества мышей (3 мыши в обработанной Z14Mad5Апаха группе).
15 Кроме того, у описанных выше групп мышей осуществляли
внутриклеточное окрашивание клеток селезенки, стимулированных пептидом SIINFEKL OVACD8 (SEQ ID NO: 35), для идентификации CD107a+IFN-y+TNF-а+-клеток. Результаты представлены на фиг. 43. У мышей, вакцинированных Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa, обнаружено сходное увеличение
20 CD107a+IFN-y+TNF-a+-^eTOK.
Пример 27: Сравнение действия комплексов, содержащих различные проникающие в клетку пептиды, на рост опухолей и выживаемость на s.c-модели EG.7-OVA
Для изучения воздействий комплексов, содержащих различные
25 проникающие в клетку пептиды, на рост опухолей и выживаемость использовали s.с.-модель, созданную с использованием клеток EG.7-OVA. В dO мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и разделяли на три различные группы (наивные, Z13Mad5Апаха и Z14Mad5Апаха). Мышей вакцинировали дважды в d5 и d 13 после имплантации
30 опухолей путем s.c.-инъекции, используя в дозе 0,5 нмоля Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Апаха, в правую боковую область.
Результаты представлены на фиг. 44. Вакцинация Z13Mad5Апаха или Z14Mad5Апаха приводила к существенному снижению объемов опухолей по
сравнению с контрольными мышами (фиг. 44 А), а также к существенному повышению уровней выживаемости по сравнению с контрольными мышами (фиг. 44 Б). Эти результаты продемонстрировали, что оба комплекса, и Z13Mad5 Апаха и Z14Mad5 Апаха, обладали способностью существенно снижать 5 рост опухолей и существенно пролонгировать выживаемость.
Пример 28: Сравнение иммунных ответов после вакцинации комплексами, содержащими различные проникающие в клетку пептиды
В этом эксперименте изучали воздействие различных СРР в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, с использованием комплекса с 10 агонистом TLR "EDA". Для этого применяли описанный выше слитый белок EDAZ13Mad5 (см. пример 1).
Кроме того, дополнительно создавали слитые белки, которые содержали СРР, отличные от Z13, а именно: Z14 (SEQ ID NO: 7) или Z18 (SEQ ID NO: 11). Указанные слитые белки содержали также белок "MAD5", состоящий из 15 различных CD8+- и С04+-эпитопов из различных антигенов, и пептидный
агонист TLR4 "EDA". Таким образом, дополнительно создавали следующие конструкции:
EDAZ14Mad5
Последовательность:
20 MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGE DDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESI INFEKLTEWT GS
25 (SEQ ID N0:37)
EDAZ18Mad5 Последовательность: MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGE DDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTREV
30 AAAKSSENDR LRLLLKESLK ISQAVHAAHA EINEAGREVV GVGALKVPRN QDWLGVPRFA KFASFEAQGA LANIAVDKAN LDVEQLESII NFEKLTEWTG S (SEQ ID NO: 38)
Мышей линии C57BL/6 разделяли на 8 различных группы (по 4 мыши на группу): три группы, которые обрабатывали либо EDAZ13Mad5, либо EDAZ14Mad5, либо EDAZ18Mad5 в дозе 2 нмоля, и соответствующий им контроль, и три группы, которые обрабатывали либо EDAZ13Mad5, 5 EDAZ14Mad5, либо EDAZ18Mad5 в дозе 5 нмолей, и соответствующая им контрольная группа. Мышей вакцинировали три раза (неделя 0, неделя 2 и неделя 4) s.c. У мышей брали кровь через 7 дней после 2-ой и 3-ей вакцинаций и осуществляли окрашивание мультимером (один эксперимент с 4 мышами на группу).
10 Результаты представлены на фиг. 45. Во всех группах, вакцинированных
EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 или EDAZ18Mad5, обнаружен повышенный процент позитивных по мультимеру клеток по сравнению с контрольной группой. Эти результаты продемонстрировали, что комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении, которые содержали различные проникающие в клетку
15 пептиды, обладали способностью вызывать иммунный ответ в различных дозах.
Пример 29: Воздействие EDAZ14Mad5 на рост опухолей и выживаемость на s.с.-модели EG.7-OVA
Для изучения воздействия EDAZ14Mad5 на рост опухоли и выживаемость использовали s.c.-модель EG.7-OVA (см. в примере 4 и на фиг. 9-11 результаты
20 исследования EDAZ13Mad5 на такой же модели).
В dO мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. ЗхЮ5 опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и разделяли на 2 группы (наивные и EDAZ14Mad5). Мышей вакцинировали дважды в d5 и d 13 после имплантации опухолей путем s.c.-инъекции EDAZ14Mad5 в дозе 0,5 нмоля в правую боковую
25 область.
Результаты представлены на фиг. 46. Аналогично EDAZ13Mad5 (см. пример 4, фиг. 9-11) вакцинация EDAZ14Mad5 приводила к существенному снижению объемов опухолей по сравнению с контрольными мышами (фиг. 46 А), а также к существенному повышению уровней выживаемости (фиг. 46 Б). 30 Указанные результаты продемонстрировали, что конструкция EDAZ14Mad5 обладала способностью существенно снижать рост опухолей и существенно пролонгировать выживаемость - аналогично EDAZ13Mad5 (см. пример 4, фиг. 9-11).
Пример 30: Повышенная эффективность слитой конструкции Z13Mad5Апаха по сравнению с Z13Mad5 и Апаха на модели глиобластомы
Для изучения эффективности комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, была выбрана модель глиобластомы (см. пример 20). Так, 5 Z13Mad5Апаха (см. пример 7; SEQ ID NO: 28) вводили одной группе мышей, а Z13Mad5 (SEQ ID NO: 29) и Апаха (SEQ ID NO: 15) вводили (вместе) другой группе мышей.
Т-клеточный хоминг в области опухоли анализировали у несущих опухоль линии G1261-Quad мышей (7-16 мышей на группу), которых вакцинировали
10 дважды, а именно: день 7 и день 21 после имплантации опухолей (день 0),
используя вакцину Z13Mad5Апаха в дозе 2 нмоля. Группу, вакцинированную и Z13Mad5, и Апаха (в дозе, эквимолярной Z13Mad5Апаха), применяли в качестве контроля. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. (внутрь черепа) 5x105 опухолевых клеток G1261-Quad и
15 вакцинировали дважды (в d7 и d21 после имплантации) путем s.c.-инъекции
Z13Mad5 Апаха в дозе 2 нмоля (группа 1) или Z13Mad5 в дозе 2 нмоля и Апаха в дозе 2 нмоля (группа 2). В день 28 анализировали кровь и инфильтрующие головной мозг лейкоциты (BIL), при этом количественно оценивали SIINFEKL-специфические С08-Т-клетки в крови и BIL в d28 путем окрашивания
20 мультимером (7-16 мышей на группу).
Результаты представлены на фиг. 47. Обнаружен существенно более высокий процент SIINFEKL-специфических С08-Т-клеток в крови вакцинированных Z13Mad5Апаха мышей по сравнению с мышами, вакцинированными и Z13Mad5, и Апаха (фиг. 47А). Аналогично этому,
25 обнаружено более сильное накопление SIINFEKL-специфических С08-Т-клеток в BIL у вакцинированных Z13Mad5Апаха мышей по сравнению с мышами, вакцинированными по отдельности Z13Mad5 и Апаха (фиг. 47Б, р = 0,0539).
Далее оценивали секрецию цитокинов. Для этого мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5> <105 опухолевых клеток G1261-Quad и вакцинировали
30 дважды (d7 и 21) путем s.c.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля или
Z13Mad5 в дозе 2 нмоля и Апаха в дозе 2 нмоля. BIL выделяли и культивировали в течение 6 ч со зрелыми BMDC, загруженными или не загруженными пептидом
SIINFEKL (SEQ ID NO: 35), в присутствии брефелдинаА перед внутриклеточным окрашиванием цитокинов.
Результаты представлены на фиг. 48. В целом, более высокий уровень секреции цитокинов обнаружен для инфильтрующих головной мозг CD8-T-5 клеток из мышей, вакцинированных Z13Mad5Апаха. В частности, существенно более высокий уровень секреции общего IFN-y и IFN-y и TNF-a вместе обнаружен для инфильтрующих головной мозг С08-Т-клеток из мышей, вакцинированных Z13Mad5Апаха, по сравнению с мышами, вакцинированными по отдельности Z13Mad5 и Апаха.
10 В совокупности эти результаты продемонстрировали, что вакцина
Z13Mad5Апаха (по сравнению с введением по отдельности Z13Mad5 и Апаха) обладала способностью вызывать более сильный SIINFEKL-специфический CD8-T клеточный иммунный ответ в головном мозге несущих опухоли мышей с выраженной эффекторной функцией.
15 Полученные результаты свидетельствуют о том, что Z13Mad5Апаха
является эффективной в отношении вызывания высокого иммунного ответа инфильтрующих головной мозг SIINFEKL-специфических СВ8-Т-клеток. Z13Mad5 Апаха также обладает способностью усиливать секрецию цитокинов антигенспецифическими CDS-T-клетками в головном мозге.
20 Пример 31: Воздействие других антигенных карго-молекул в комплексе,
предлагаемом в настоящем изобретении
Для изучения воздействия различных антигенных карго-молекул ("Mad8") создавали другой комплекс, содержащий проникающий в клетку пептид, различные антигены и пептидный агонист TLR ("Z13Mad8Апаха").
25 Z13Mad8Апаха отличался от Z13Mad5 Апаха (описанного в примере 7)
антигенными карго-молекулами. В частности, "Z13Mad8Апаха" представляет собой слитый белок, содержащий проникающий в клетку пептид "Z13", антигенную карго-молекулу "MAD8", которая содержит CD8- и СВ4-эпитопы гликопротеина 70, и пептидный агонист TLR "Апаха". Ниже представлена
30 аминокислотная последовательность Z13Mad8Апаха, в которой проникающий в клетку пептид "Z 13" подчеркнут, а пептидный агонист TLR "Апаха" обозначен курсивом:
KR YKNR V A S R KSRAKFKQLL QHYREVAAAK SSENDRLRLLLK VTYHSPSYAY HQFERRAILN RLVQFIKDRI SVVQALVLTS TVHEILCKLS LEGDHSTPPS A YGSVKPYTN FDAE (SEQ ID N0:39)
5 Наивных мышей линии Balb/c (4 мыши на группу) вакцинировали 4 раза
s.c. (неделя 0, неделя 2, неделя 4 и неделя 6) Z13Mad8Апаха в дозе 2 нмоля.
Для изучения СВ4-Т-клеточных ответов после вакцинации через 1 неделю после 4-ой вакцинации мышей умерщвляли; изымали органы и осуществляли ех vivo Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидом gp70CD4
10 (SEQ ID NO: 64) или пептидом gp70CD8 (SEQ ID NO: 65), для количественной оценки продуцирующих IFN-y эпитопспецифических CD4- и С08-Т-клеток.
Результаты представлены на фиг. 49. У мышей, вакцинированных Z13Mad8Апаха, обнаружено существенное увеличение продуцирующих IFN-y клеток по сравнению с наивными мышами. Эти данные демонстрируют, что
15 вакцина Z13Mad8Апаха обладала способностью вызывать эффективный иммунный ответ эпитопспецифических CD8- и С04-Т-клеток, и поэтому комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может вызывать иммунный ответ на аутоантиген.
Пример 32: Воздействие других антигенных карго-молекул в комплексе,
20 предлагаемом в настоящем изобретении
Для изучения воздействия дополнительных других антигенных карго-молекул ("Madll") создавали другой комплекс, содержащий проникающий в клетку пептид, другие антигены и пептидный агонист TLR ("Z13Madl 1 Апаха"). Z13Madl 1 Апаха отличался от Z13Mad5Anaxa (описанного в примере 7)
25 антигенными карго-молекулами. В частности, "Z13Madl 1 Апаха" представляет собой слитый белок, содержащий проникающий в клетку пептид "Z13", антигенную карго-молекулу "MAD11", содержащую два СВ8-эпитопа сурвивина, подробно описанных у Derouazi М., Wang Y., Marlu R. и др. Optimal epitope composition after antigen screening using a live bacterial delivery vector:
30 Application to TRP-2. Bioengineered Bugs. 1(1), 2010, cc. 51-60,
doi: 10.4161/bbug. 1.1.9482, и пептидный агонист TLR "Апаха". Ниже представлена аминокислотная последовательность Z13Madl 1 Апаха, в которой
проникающий в клетку пептид "Z13" подчеркнут, а пептидный агонист TLR "Апаха" обозначен курсивом:
KR YKNR VASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKS SEND RLRLLLKNYRIAJTK NWPFLEDCAMEELTVSEFLKLDRQRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYT 5 NFDAE
(SEQ ID NO: 40)
Наивным мышам линии C57BL/6 (5 мышей на группу) имплантировали i.v. 1 х 105 опухолевых клеток меланомы В16 и вакцинировали дважды (d0 и dlO) путем подкожной инъекции Z13Madl 1 Апаха в дозе 1 нмоль. В день 18 мышей
10 умерщвляли, органы изымали и осуществляли ex vivo Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидами сурвивина сурвивин20-28 (SEQ ID NO: 67) и сурвивин97-104: (SEQ ID NO: 68) для количественной оценки продуцирующих IFN-y сурвивинспецифических Т-клеток.
Результаты представлены на фиг. 50. У мышей, вакцинированных
15 Z13Madl 1 Апаха, обнаружено меньшее количество метастазов по сравнению с наивными мышами (фиг. 50А). Кроме того, в селезенке мышей, вакцинированных Z13Madl 1 Апаха, существенно увеличено количество продуцирующих IFN-y сурвивинспецифических Т-клеток (фиг. 49Б).
Полученные результаты продемонстрировали, что Z13Madl 1 Апаха
20 обладает эффективностью в отношении уменьшения количества метастазов, и
Z13Madl 1 Апаха может усиливать секрецию цитокинов антигенспецифическими С08-Т-клетками в селезенке.
Пример 33: Воздействие других антигенных карго-молекул в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении
25 Для изучения воздействия дополнительных других антигенных карго-
молекул ("Mad9") создавали другой комплекс, содержащий проникающий в клетку пептид, другой антиген и пептидный агонист TLR ("Z13Mad9Anaxa"). Z13Mad9Апаха отличался от Z13Mad5 Апаха (описанного в примере 7) антигенной карго-молекулой. В частности, "Z13Mad9Anaxa" представляет собой
30 слитый белок, содержащий проникающий в клетку пептид "Z13", антигенную карго-молекулу "Mad9", содержащую неоантиген, описанный у Yadav и др. Nature. 515(7528), 27 ноября 2014 г., сс. 572-576, из линии опухолевых клеток МС-38, и пептидный агонист TLR "Апаха". Ниже представлена аминокислотная
последовательность Z13Mad9Апаха, в которой проникающий в клетку пептид "Z13" подчеркнут, а пептидный агонист TLR "Апаха" обозначен курсивом:
KR YKNR VASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKS SEND RLRLLLKHLELASM TNMELMSSIVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE 5 (SEQ ID NO: 41)
Наивных мышей линии C57BL/6 (4 мыши на группу) вакцинировали 4 раза s.c. (неделя 0, неделя 2, неделя 4 и неделя 6), используя Z13Mad9Апаха в дозе 2 нмоля. Для изучения С08-Т-клеточных ответов после вакцинации через 1 неделю после 4-ой вакцинации мышей умерщвляли, органы изымали и 10 осуществляли Elispot-анализ на клетках селезенки после рестимуляции in vitro на 7 день с использованием стимуляции пептидом adpgk (SEQ ID NO: 66) для количественной оценки продуцирующих IFN-y эпитопспецифических CD8-T-клеток.
Результаты представлены на фиг. 51. У мышей, вакцинированных 15 Z13Mad9Апаха, обнаружено существенное увеличение эффекторных
неоантигенспецифических С08-Т-клеток по сравнению с наивными мышами
Пример 34: Сравнение иммунных ответов после вакцинации комплексами, имеющими различные проникающие в клетку пептиды
В этом эксперименте изучали воздействие дополнительного другого СРР в 20 комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, используя комплекс, содержащий агонист TLR "Апаха". Для этого использовали слитый белок Z13Mad5Anaxa, описанный выше (см. пример 7, SEQ ID NO: 28).
Кроме того, создавали дополнительный слитый белок, который содержал ТАТ-СРР, объединенный с линкерами фурина, описанный у Lu и др., 25 Multiepitope trojan antigen peptide vaccines for the induction of antitumor CTL and Th immune responses J. Immunol., 172, 2004, cc. 4575-4582. Указанный слитый белок содержал также белок "MAD5", состоящий из различных CD8+- и CD4-эпитопов из различных антигенов, и пептидный агонист TLR4 "Апаха". Таким образом, дополнительно создавали следующую конструкцию:
TatFMad5 Апаха Последовательность: RKKRRQRRRRVKRISQAVHAAHAEINEAGRRVKRKVPRNQDWLRVKRASFEA QGALANIAVDKARVKRSIINFEKLRVKRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVK 5 PYTNFDAE
(SEQ ID NO: 46)
Мышей линии C57BL/6 разделяли на три различные группы (8 мышей на группу): одна группа, которую обрабатывали Z13Mad5Апаха в дозе 2 нмоля, одна группа, которую обрабатывали TatFMad5Anaxa в дозе 2 нмоля, и
10 соответствующий контроль. Мышей вакцинировали два раза (неделя 0 и неделя 2) s.c, используя либо Z13Mad5Апаха в дозе 2 нмоля, либо TatFMad5Апаха в дозе 2 нмоля. У мышей брали кровь через 7 дней после 2-ой вакцинации и осуществляли окрашивание мультимером (8 мышей на группу).
Результаты представлены на фиг. 52. У мышей, вакцинированных
15 Z13Mad5Апаха или TatFMad5Апаха, обнаружен повышенный процент
позитивных по мультимеру клеток по сравнению с контрольной группой. Эти результаты свидетельствуют о том, что комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении, которые имеют различные проникающие в клетку пептиды, могут вызывать иммунный ответ в различных дозах. Однако СРР, полученный из
20 ZEBRA (Z13), оказался лучше, чем ТАТ-СРР.
Пример 35: Повышенная эффективность слитой конструкции Z13Mad5Апаха по сравнению с Z13Mad5 и Апаха на наивных мышах
Далее эффективность комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, изучали на наивных мышах. Для этого Z13Mad5Апаха (см. пример 7; SEQ ID
25 NO: 28) вводили одной группе мышей, a Z13Mad5 (SEQ ID NO: 29) и Апаха (SEQ ID NO: 15) вводили (совместно) другой группе мышей.
Мышей линии C57BL/6 из Z13Mad5Anaxa-rpynnbi и Z13Mad5 + Апаха-группы вакцинировали однократно (неделя 0) путем s.c.-инъекции в дозе 2 нмоля Z13Mad5Апаха (группа 1) или 2 нмоля Z13Mad5 и 2 нмоля Апаха (группа
30 2). В день 14 анализировали кровь, оценивая количественно SIINFEKL-
специфические С08-Т-клетки в крови путем окрашивания мультимером (4-8 мышей на группу).
Результаты представлены на фиг. 53. Обнаружен существенно более
высокий процент SIINFEKL-специфических CDS-T-клеток в крови мышей,
вакцинированных Z13Mad5Апаха, по сравнению с мышами, вакцинированными
Z13Mad5 и Апаха по отдельности (фиг. 53).
5 В совокупности эти результаты продемонстрировали, что вакцина
Z13Mad5Апаха (по сравнению с введением Z13Mad5 и Апаха по отдельности) обладала способностью вызывать более сильный SIINFEKL-специфический CDS-T-клеточный периферический иммунный ответ.
Пример 36: Воздействие другой антигенной карго-молекулы в комплексе, 10 предлагаемом в настоящем изобретении
Для изучения воздействия дополнительной другой антигенной карго-молекулы ("Madl2") создавали другой комплекс, содержащий проникающий в клетку пептид, другой антиген и пептидный агонист TLR ("Z13Madl2Anaxa"). Z13Mad 12Апаха отличался от Z13Mad5 Апаха (описанного в примере 7) 15 антигенной карго-молекулой. В частности, "Z13Madl2Anaxa" представляет собой слитый белок Ю содержащий проникающий в клетку пептид "Z13", антигенную карго-молекулу "MAD12", которая содержит три неоантигена, описанные у Yadav и др. Nature. 515(7528), 27 ноября 2014 г., сс. 572-576, из линии опухолевых клеток МС-38, и пептидный агонист TLR "Апаха". Ниже 20 представлена аминокислотная последовательность Z13Mad 12Апаха:
KR YKNR VASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKS SEND RLRLLLKLFRAAQL ANDVVLQIMEHLELASMTNMELMSSIVVISASIIVFNLLELEGSTVHEILCKLSLE GDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE (SEQ ID NO: 69)
25 Наивных мышей линии C57BL/6 (4 мыши на группу) вакцинировали
дважды s.c. (неделя 0, неделя 2), используя Z13Madl2Anaxa в дозе 2 нмоля. Для изучения С08-Т-клеточных ответов после вакцинации через 1 неделю после 2-ой вакцинации анализировали кровь, при этом количественно оценивали специфические в отношении неоантигена repsl CDS-T-клетки в крови путем
30 окрашивания мультимером (4 мыши на группу).
Результаты представлены на фиг. 54. У мышей, вакцинированных Z13Mad 12Апаха, обнаружено существенное увеличение эффекторных неоантигенспецифических CDS-T-клеток по сравнению с наивными мышами.
Пример 37: Созревание in vitro человеческих дендритных клеток
В основу этого исследования была положена задача изучить способность комплекса, предназначенного для применения согласно настоящему изобретению ("Z13Mad5Апаха", SEQ ID NO: 28, см. пример 7), индуцировать 5 созревание дендритных клеток в сравнении с комплексом, в котором отсутствует пептидный агонист TLR ("Z13Mad5", SEQ ID NO: 29, см. пример 1).
Полипептид Z13Mad5Апаха и полипептид Z13Mad5 исследовали в отношении их способности индуцировать созревание человеческих дендритных клеток (DC). После инкубации в течение ночи с использованием ЗООнМ белка 10 оценивали экспрессию маркеров активации (CD86, CD80, CD83 и HLA-DR) на человеческих DC с помощью FACS (фиг. 55). В качестве отрицательного контроля для каждого белка применяли в таких же объемах буфер.
Результаты представлены на фиг. 55. В то время как комплекс Z13Mad5 Апаха индуцировал созревание человеческих DC, о чем 15 свидетельствует повышающая регуляция CD86, HLADR и CD83, Z13Mad5 не обладал способностью активировать человеческие DC. Эти результаты свидетельствуют о том, что компонент белка, представляющий собой Апаха, ответствен за повышающую регуляцию маркеров активации на человеческих DC.
20 Таблицы последовательностей и номера SEQ ID: (Перечень
SEQ ID
Последовательность
Примечания
SEQ ID
KRYKNRVASRKSRAKFK
CPP5 (Z15)
NO: 8
SEQ ID
QHYREVAAAKS SEND
CPP6 (Z16)
NO: 9
SEQ ID
QLLQHYREVAAAK
CPP7 (Z17)
NO: 10
SEQ ID
REVAAAKSSENDRLRLLLK
CPP8 (Z18)
NO: 11
SEQ ID
KRYKNRVA
CPP9 (Z19)
NO: 12
SEQ ID
VASRKSRAKFK
CPP10 (Z20)
NO: 13
SEQ ID
ESLKIS Q AVH AAH AEINE AGRE VVGV
карго-молекула MAD5
NO: 14
GALKVPRNQD WLGVPRFAKFASFEAQ GALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGS
SEQ ID
STVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFD
пептидный агонист TLR2 Апаха
NO: 15
SEQ ID
DDDK
сайт-мишень для энтерокиназы
NO: 16
SEQ ID
IEDGR
сайт-мишень для фактора Ха
NO: 17
SEQ ID
LVPRGS
сайт-мишень для тромбина
NO: 18
SEQ ID
ENLYFQG
сайт-мишень для протеазы TEV
NO: 19
SEQ ID
LEVLFQGP
сайт-мишень для протеазы PreScission
NO: 20
SEQ ID
RX(R/K)R
сайт-мишень для фурина
NO: 21
SEQ ID
GGGGG
пептидный линкер
NO: 22
SEQ ID
GGGG
пептидный линкер
NO: 23
SEQ ID
EQLE
пептидный линкер
NO: 24
SEQ ID
TEWT
пептидный линкер
NO: 25
SEQ ID
MHHHHHHNIDRPKGLAFTDVDVDSIK
EDAZ13Mad5
NO: 26
IAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIRELF PAPDGEDDTAELQGLRPGSEYTVSVVA LHDDMESQPLIGIQSTKRYKNRVASRK SRAKFKQLLQHYRE VAAAKS SENDRLR LLLKE SLKISQAVHA AH AE INE A GRE V VGVGALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASF EAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFE KLTEWTGS
SEQ ID
MHHHHHHSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVK
AnaxaZ13Mad5
NO: 27
PYTNFDAEKRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREV AAAKSSENDRLRLLLKESLKISQAVHAAHAEINEA GREVVGVGALKVPRNQDWLGVPRFAKFASFEAQG ALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGS
SEQ ID
MHHHHHHKRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYRE
Z13Mad5 Апаха
NO: 28
VAAAKSSENDRLRLLLKESLKISQAVHAAH AEINE AGREVVGVGALKVPRNQD WLGVPRFAKFASFEAQ GALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGSST VHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID
MHHHHHHKRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYRE
Z13Mad5
NO: 29
VAAAKSSENDRLRLLLKESLKISQAVHAAH AEINE A GRE V VGVGALKVPRNQD WL GVPRF AKF ASFE A
SEQ ID NO
Последовательность
Примечания
QGALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGS
SEQ ID NO: 30
MHHHHHHESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGV G ALK VPRNQD WL G VPRF AKF ASFE AQ G AL ANIAV DKANLD VEQLE SIINFEKLTE WT G S
Mad5
SEQ ID NO: 31
MHHHHHHNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQG Q VSRYR VT YS SPED GIRELFP APD GEDD T AELQ GLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQPLIGIQSTESLKISQAV HA AH AE INE A GRE V VGVGALKVPRNQD WL G VPR FAKFASFEAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFE KLTEWTGS
EdaMad5
SEQ ID NO: 32
MHHHHHHESLKISQAVHAAH AEINE AGREVVG VGALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFE AQGAL AN IAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGSSTVHEI LCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
Mad5Anaxa
SEQ ID NO: 33
MHHHHHHKRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYR EVAAAKESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKFASFEAQGAL ANI AVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGSSTVHEIL CKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
Z14 Mad5Anaxa
SEQ ID NO: 34
MHHHHHHRE VAAAKS SENDRLRLLLKESLKIS QAVHAAH AEINE AGREVVGVGALKVPRNQDW LGVPRF AKF ASFE AQGAL ANIAVDKANLDVEQ LE SIINFEKLTEWTGS ST VHEIL CKL SLE GD H STP PSAYGSVKPYTNFDAE
Z18Mad5Anaxa
SEQ ID NO: 35
SIINFEKL
SIINFEKL OVACD8
SEQ ID NO: 36
ISQAVHAAH AEINE AGR
пептид OVACD4
SEQ ID
NO: 37
MHHHHHHNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESP
QGQVSRYRVTYSSPEDGIRELFPAPDGEDDTAE
LQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGIQSTK
RYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKESL
KISQAVHAAH AEINE AGREVVGVGALKVPRNQ
DWLGVPRF AKF ASFE AQGAL ANIAVDKANLDV
EQLESIINFEKLTEWTGS
EDAZ14Mad5
SEQ ID NO: 38
MHHHHHHNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESP
QGQVSRYRVTYSSPEDGIRELFPAPDGEDDTAE
LQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGIQSTR
EVAAAKSSENDRLRLLLKESLKISQAVHAAHAE
INEAGREVVGVGALKVPRNQD WLGVPRFAKF A
SFE AQGAL ANI AVDKANLDVEQLESIINFEKLTE
WTGS
EDAZ18Mad5
SEQ ID NO: 39
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSS ENDRLRLLLK VTYH SP S Y AYHQFERR AILNRL V QFIKDRISVVQALVLTSTVHEILCKLSLEGDHST PPSAYGSVKPYTN FDAE
Z13Mad8Anaxa
SEQ ID NO: 40
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSS ENDRLRLLLKNYRIATFKNWPFLEDCAMEELT VSEFLKLDRQRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAY GSVKPYTNFDAE
Z13MadllAnaxa
SEQ ID NO: 41
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSS ENDRLRLLLKHLELASMTNMELMSSIVSTVHEI LCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
Z13Mad9Anaxa
SEQ ID NO: 42
HLELASMTNMELMSSIV
Mad9
SEQ ID NO: 43
VTYH SP SY AYHQFERR AILN RLVQFIKDRISVVQALVLT
Mad8
SEQ ID NO: 44
NYRIATFKNWPFLEDCAMEELTVSEFLKLDRQR
Madll
SEQ ID NO
Последовательность
Примечания
SEQ ID NO: 45
NIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYR VTYSSPEDGIRELFPAPDGEDDTAELQGLRPGSE YTVSVVALHDDMESQPLIGIQST
EDA
SEQ ID NO: 46
RKKRRQRRRRVKRISQAVHAAH AEINE AGRRV KRKVPRNQDWLRVKRASFE AQGAL ANI AVDK ARVKRSIINFEKLRVKRSTVHEILCKLSLEGDHS TPPSAYGSVKPYTNFDAE
TatFMad5Anaxa
SEQ ID NO: 47
MAPPQVLAFGLLLAAATATFAAAQEECVCENY
KLAVNCFVNNNRQCQCTSVGAQNTVICSKLAA
KCLVMKAEMNGSKLGRRAKPEGALQNNDGLY
DPDCDESGLFKAKQCNGTSMCWCVNTAGVRR
TDKDTEITCSERVRTYWIIIELKHKAREKPYDSK
SLRTALQKEITTRYQLDPKFITSILYENNVITIDL
VQN S S QKTQND VDI AD VAYYFEKD VKGESLFH
SKKMDLTVNGEQLDLDPGQTLIYYVDEKAPEF
SMQGLKAGVIAVIVVVVIAVVAGIVVLVISRKK
RMAKYEKAEIKEMGEMHRELNA
EpCAM
SEQ ID NO: 48
GLKAGVIAV
эпитоп EpCAM
SEQ ID NO: 49
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGG
EKETSATQRSSVPSSTEKNAVSMTSSVLSSHSPG
SGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATWGQDVT
SVPVTRPALGSTTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTA
PPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTR
PAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGV
TSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGST
APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDT
RPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHG
VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGS
TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPD
TRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAH
GVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPG
STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAP
DTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPA
HGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAP
GSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSA
PDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP
AHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPA
PGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS
APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAP
PAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRP
APGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVT
SAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTA
PPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTR
PAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGV
TSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGST
APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDT
RPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHN
VTSASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKST
PFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSSVPPL
TSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLED
PSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKF
RPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTE
AASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWG
IALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQ
LDIFP ARD T YHPM SE YP TYHTH GR Y VPP SSTDR
SPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL
MUC-1
SEQ ID NO: 50
GSTAPPVHN
эпитоп MUC-1
SEQ ID
TAPPAHGVTS
эпитоп MUC-1
SEQ ID NO
Последовательность
Примечания
NO: 51
SEQ ID NO: 52
MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCAC TPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEG WEPDDDPIEEHKKH S S GC AFL S VKKQFEELTL G EFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKV RRAIEQLAAMD
сурвивин
SEQ ID NO: 53
RISTFKNWPF
эпитоп сурвивина
SEQ ID NO: 54
MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTT
AKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYS
WYKGERVD GNRQIIGY VIGTQQ ATP GP AY S GR
EIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEE
ATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFT
CEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNR
TLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVIL
NVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASN
PPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYT
CQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSNNS
NPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLP
VSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQN
KLSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGV
NLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFIS
NITEKNS GL YTCQ ANNS AS GH SRTT VKTIT V S A
ELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTT
YLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTR
NDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDT
PIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRIN
GIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATG
RNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLV
GVAL
СЕА
SEQ ID NO: 55
YLSGANLNLS
эпитоп СЕА
SEQ ID NO: 56
SWRINGIPQQ
эпитоп СЕА
SEQ ID NO: 57
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEY
DPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSA
MRD QYMRTGE GFL С VF AINNTK SFEDIHH YRE
QIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQA
QDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIR
QYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
Kirsten-подтип Ras
SEQ ID NO: 58
VVVGAGGVG
эпитоп Kirsten-подтипа Ras
SEQ ID NO: 59
MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPA
TEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQ
GAS SLPTTMNYPLWSQS YEDS SNQEEEGP STFP
DLE SEFQ A AL SRK V AEL VHFLLLKYR AREP VTK
AEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKAFSSLQLVFGIE
LME VDPIGHL YIF ATCL GL S YD GLL GDNQIMPK
AGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEG
REDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDP
ACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPH
ISYPPLHEWVLREGEE
MAGE-АЗ
SEQ ID NO: 60
KVAELVHFL
эпитоп MAGE-A3
SEQ ID NO: 61
MAFVCL AIGCL YTFLISTTFGCTS S SDTEIKVNPP
QDFEIVDPGYLGYLYLQWQPPLSLDHFKECTVE
YELKYRNIGSETWKTIITKNLHYKDGFDLNKGI
EAKIHTLLPWQCTNGSEVQSSWAETTYWISPQG
IPETKVQDMDCVYYNWQYLLCSWKPGIGVLLD
TNYNLFYWYEGLDHALQCVDYIKADGQNIGCR
IL13Ralpha2
SEQ ID NO
Последовательность
Примечания
FPYLEASDYKDFYICVNGSSENKPIRSSYFTFQL
QNIVKPLPP VYLTFTRE S S CEIKLKWSIPL GPIPA
RCFDYEIEIREDDTTLVTATVENETYTLKTTNET
RQLCFVVRSKVNIYCSDDGIWSEWSDKQCWEG
EDLSKKTLLRFWLPFGFILILVIFVTGLLLRKPNT
YPKMIPEFFCDT
SEQ ID NO: 62
LPFGFIL
эпитоп IL13Ralpha2
SEQ ID NO: 63
LFRAAQLANDVVLQIMEHLELASMTNMELMSS IVVISASIIVFNLLELEG
Mad 12
SEQ ID NO: 64
LVQFIKDRISVVQA
пептид gp70CD4
SEQ ID NO: 65
SPSYVYHQF
пептид gp70CD8
SEQ ID NO: 66
ASMTNMELM
пептид adpgk
SEQ ID
NO: 67
ATKNWPFL
survivin20-28
SEQ ID NO: 68
TVSEFLKL
сурвивин97-104
SEQ ID NO: 69
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSS ENDRLRLLLKLFRAAQLANDVVLQIMEHLELA SMTNMELMSSIVVISASIIVFNLLELEGSTVHEIL CKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
Z13Madl2 Апаха
SEQ ID NO: 70
MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMK
LRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTY
LPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQ
RLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVT
GASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCY
QDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCS
PMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCK
GPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNH
SGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGA
SCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAE
DGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVT
SANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAP
LQPEQLQ VFETLEEITGYL YIS AWPD SLPDL S VF
QNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSL
RELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPH
QALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCW
GPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREY
VNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVA
С AH YKDPPFC V ARCP S GVKPDL S YMPIWKFPDE
EGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLT
SIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYT
MRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETE
LRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAI
KVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSR
LLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRL
GSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAA
RNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADG
GKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVW
ELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPIC
TIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMA
RDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDD
MGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVH
HRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPS
EGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQ
RYSEDPT VPLP SETD GY V APLTC SPQPE YVNQP
DVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPG
Her2/neu
SEQ ID NO
Последовательность
Примечания
KNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPH
PPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTP
TAENPEYLGLDVPV
SEQ ID NO: 71
LEEKKGNYVVTDHC
эпитоп EGFRvIII
SEQ ID NO: 72
MELQAARACFALLWGCALAAAAAAQGKEVVL
LDF A A AGGEL GWLTHP YGKGWDLMQNIMND
MPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEA
ERIFIELKFT VRD CNSFPGG AS S CKETFNL YY AE
SDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEAR
HVKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALL
SVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGSDAPSLAT
VAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPI
GQCLCQAGYEKVEDACQACSPGFFKFEASESPC
LECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMP
CTRPPSAPHYLTAVGMGAKVELRWTPPQDSGG
REDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPP
HGLTRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGL
VTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTTSLSVS
WSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRT
EGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQALTQEGQGAGS
KVHEFQTLSPEGSGNLAVIGGVAVGVVLLLVL
AGVGFFIHRRRKNQRARQSPEDVYFSKSEQLKP
LKTY VDPHTYEDPNQ A VLKFTTEIHP S CVTRQK
VIG AGEFGE V YKGMLKT S S GKKE VP V AIKTLK
AGYTEKQRVDFLGEAGIMGQFSHHNIIRLEGVI
SKYKPMMIITEYMENGALDKFLREKDGEFSVL
QLVGMLRGIAAGMKYLANMNYVHRDLAARNI
L VNSNL VCKVSDFGL SRVLEDDPE ATYTTS GGK
IPIRWTAPEAISYRKFTSASDVWSFGIVMWEVM
TYGERP YWEL SNHE VMK AIND GFRLPTPMD CP
SAIYQLMMQCWQQERARRPKFADIVSILDKLIR
APDSLKTLADFDPRVSIRLPSTSGSEGVPFRTVS
EWLESIKMQQYTEHFMAAGYTAIEKVVQMTN
DDIKRIGVRLPGHQKRIAYSLLGLKDQVNTVG
IPI
EphA2
SEQ ID
NO: 73
MDLVLKRCLLHLAVIGALLAVGATKVPRNQD
WL GVSRQLRTK AWNRQL YPEWTE AQRLD CWR
GGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQK
VLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETD
DACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQY
WQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHR
RGSRSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRAL
DGGNKHFLRNQPLTFALQLHDPSGYLAEADLS
YTWDFGDSSGTLISRALVVTHTYLEPGPVTAQV
VLQAAIPLTSCGSSPVPGTTDGHRPTAEAPNTT
AGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTT
EVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTL
AEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAAQVTTTE
WVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPL
LDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIV
QGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKE
ACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQ
ILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIMPGQ
EAGLGQVPLIVGILLVLMAVVLASLIYRRRLMK
QDFSVPQLPHSSSHWLRLPRIFCSCPIGENSPLLS
GQQV
GplOO
SEQ ID NO: 74
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGP QGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARP PPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVL AFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDA
hTert
SEQ ID NO
Последовательность
Примечания
LRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLV
AP S С AYQ VCGPPL YQL G A ATQ ARPPPH AS GPRR
RLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGS
ASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPG
RTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTR
HSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYA
ETKHFLYSS GDKEQLRP SFLL S SLRP SLTG ARRL
VETIFL GSRPWMP GTPRRLPRLPQRYWQMRPLF
LELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGV
CAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSP
WQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRN
TKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRR
SPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVV
ELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSI
GIRQHLKR VQLREL SE AE VRQHRE ARP ALLT SR
LRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAER
LTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDI
HRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYD
TIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAA
HGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQET
SPLRD AVVIEQS S SLNE AS SGLFD VFLRFMCHH
AVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDM
ENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKT
FLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEAL
GGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDY
SSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLR
LKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRF
HACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYS
ILKAKN AGMSL G AKG A AGPLP SE AVQWL CHQ
AFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPG
TTLT ALE AAANP ALP SDFKTILD
SEQ ID NO: 75
MSPL WWGFLL S CL GCKILP G AQ GQFPRVCMT V
DSLVNKECCPRLGAESANVCGSQQGRGQCTEV
RADTRPWSGPYILRNQDDRELWPRKFFHRTCK
CTGNFAGYNCGDCKFGWTGPNCERKKPPVIRQ
NIHSLSPQEREQFLGALDLAKKRVHPDYVITTQ
HWVGLLGPNGTQPQFANCSVYDFFVWLHYYS
VRDTLLGGFFPWLKVYYYRFVIGLRVWQWEVI
SCKLIKRATTRQP
TRP-2
SEQ ID
NO: 76
MGVKASQTGFVVLVLLQCCSAYKLVCYYTSW
SQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISNDH
IDTWEWNDVTLYGMLNTLKNRNPNLKTLLSVG
GWNFGSQRFSKIASNTQSRRTFIKSVPPFLRTHG
FDGLDLAWLYPGRRDKQHFTTLIKEMKAEFIKE
AQPGKKQLLLSAALSAGKVTIDSSYDIAKISQH
LDFISIMTYDFHGAWRGTTGHHSPLFRGQEDAS
PDRFSNTDYAVGYMLRLGAPASKLVMGIPTFG
RSFTLASSETGVGAPISGPGIPGRFTKEAGTLAY
YEICDFLRGATVHRILGQQVPYATKGNQWVGY
DDQESVKSKVQYLKDRQLAGAMVWALDLDDF
QGSFCGQDLRFPLTNAIKDALAAT
YKL-40
SEQ ID
NO: 77
MAQLFLPLLAALVLAQAPAALADVLEGDSSED
RAFRVRIAGDAPLQGVLGGALTIPCHVHYLRPP
P SRR A VL G SPR VKWTFL SR GRE AE VL V AR G VR
VKVNEAYRFRV AL P A YP ASLTDVSL AL S ELRPN
DSGIYRCEVQHGIDDSSDAVEVKVKGVVFLYR
EGSARYAFSFSGAQEACARIGAHIATPEQLYAA
YLGGYEQCDAGWLSDQTVRYPIQTPREACYGD
MDGFPGVRNYGVVDPDDLYDVYCYAEDLNGE
LFLGDPPEKLTLEEARAYCQERGAEIATTGQLY
AAWDGGLDHCSPGWLADGSVRYPIVTPSQRCG
бревикан
SEQ ID NO
Последовательность
Примечания
GGLP GVKTLFLFPNQTGFPNKH SRFN VYCFRD S
AQPSAIPEASNPASNPASDGLEAIVTVTETLEEL
QLPQEATESESRGAIYSIPIMEDGGGGSSTPEDP
AEAPRTLLEFETQSMVPPTGFSEEEGKALEEEE
KYEDEEEKEEEEEEEE VEDE AL W AWP SEL S SP G
PEASLPTEPAAQEESLSQAPARAVLQPGASPLPD
GESEASRPPRVHGPPTETLPTPRERNLASPSPSTL
VEAREVGEATGGPELSGVPRGESEETGSSEGAP
SLLPATRAPEGTRELEAPSEDNSGRTAPAGTSV
QAQPVLPTDSASRGGVAVVPASGDCVPSPCHN
GGTCLEEEEGVRCLCLPGYGGDLCDVGLRFCN
PGWDAFQGACYKHFSTRRSWEEAETQCRMYG
AHLASISTPEEQDFINNRYREYQWIGLNDRTIEG
DFL WSD GVPLL YENWNP GQPD SYFL S GENCVV
MVWHDQGQWSDVPCNYHLSYTCKMGLVSCG
PPPELPLAQVFGRPRLRYEVDTVLRYRCREGLA
QRNLPLIRCQENGRWEAPQISCVPRRPARALHP
EEDPEGRQGRLL GRWK ALLIPP S SPMP GP
SEQ ID NO: 78
MSRPQGLLWLPLLFTPVCVMLNSNVLLWLTAL
AIKFTLIDSQAQYPVVNTNYGKIRGLRTPLPNEI
LGPVEQYLGVPYASPPTGERRFQPPEPPSSWTGI
RNTTQFAAVCPQHLDERSLLHDMLPIWFTANL
DTLMTYVQDQNEDCLYLNIYVPTEDDIHDQNS
KKPVMVYIHGGSYMEGTGNMIDGSILASYGNV
IVITINYRLGILGFLSTGDQAAKGNYGLLDQIQA
LRWIEENVGAFGGDPKRVTIFGSGAGASCVSLL
TLSHYSEGLFQKAIIQSGTALSSWAVNYQPAKY
TRILADKVGCNMLDTTDMVECLRNKNYKELIQ
QTITPATYHIAFGPVIDGDVIPDDPQILMEQGEF
LNYDIMLGVNQGEGLKFVDGIVDNEDGVTPND
FDFSVSNFVDNLYGYPEGKDTLRETIKFMYTD
WADKENPETRRKTLVALFTDHQWVAPAVATA
DLHAQYGSPTYFYAFYHHCQSEMKPSWADSAH
GDEVPYVFGIPMIGPTELFSCNFSKNDVMLSAV
VMTYWTNFAKTGDPNQPVPQDTKFIHTKPNRF
EEVAWSKYNPKDQLYLHIGLKPRVRDHYRATK
VAFWLELVPHLHNLNEIFQYVSTTTKVPPPDMT
SFPYGTRRSPAKIWPTTKRPAITPANNPKHSKDP
HKTGPEDTTVLIETKRDYSTELSVTIAVGASLLF
LNILAFAALYYKKDKRRHETHRRPSPQRNTTND
IAHIQNEEIMSLQMKQLEHDHECESLQAHDTLR
LTCPPDYTLTLRRSPDDIPLMTPNTITMIPNTLTG
MQPLHTFNTFSGGQNSTNLPHGHSTTRV
нейрогилин 4
SEQ ID
NO: 79
MRILKRFLACIQLLCVCRLDWANGYYRQQRKL
VEEIGWSYTGALNQKNWGKKYPTCNSPKQSPI
NIDEDLTQVNVNLKKLKFQGWDKTSLENTFIH
NTGKTVEINLTNDYRVSGGVSEMVFKASKITFH
WGKCNMSSDGSEHSLEGQKFPLEMQIYCFDAD
RFSSFEEAVKGKGKLRALSILFEVGTEENLDFK
AIIDGVESVSRFGKQAALDPFILLNLLPNSTDKY
YIYNGSLTSPPCTDTVDWIVFKDTVSISESQLAV
FCEVLTMQQSGYVMLMDYLQNNFREQQYKFS
RQ VF S S YTGKEEIHE A VC S SEPENVQ ADPENYT
SLLVTWERPRVVYDTMIEKFAVLYQQLDGEDQ
TKHEFLTD GYQDL G AILNNLLPNMS YVLQIV Al
CTNGLYGKYSDQLIVDMPTDNPELDLFPELIGT
EEIIKEEEE GKDIEE G Al VNP GRD S ATNQIRKKEP
QISTTTHYNRIGTKYNE AK TNRSPTRGSEFSGK
GDVPNTSLNSTSQPVTKLATEKDISLTSQTVTEL
PPHTVEGTSASLNDGSKTVLRSPHMNLSGTAES
LNTVSITEYEEESLLTSFKLDTGAEDSSGS SPATS
PTPRzl
SEQ ID NO
Последовательность
Примечания
AIPFISENISQGYIFSSENPETITYDVLIPESARNA
SED STS SGSEESLKDP SMEGNVWFPS STDITAQP
DVGSGRESFLQTNYTEIRVDESEKTTKSFSAGP
VMSQGPSVTDLEMPHYSTFAYFPTEVTPHAFTP
SSRQQDLVSTVNVVYSQTTQPVYNGETPLQPSY
SSE VFPL VTPLLLDNQILNTTP AAS S SD S ALH AT
PVFPSVDVSFESILSSYDGAPLLPFSSASFSSELF
RHLHTVSQILPQVTSATESDKVPLHASLPVAGG
DLLLEPSLAQYSDVLSTTHAASETLEFGSESGVL
YKTLMFSQVEPPSSDAMMHARSSGPEPSYALSD
NEGSQHIFTVSYSSAIPVHDSVGVTYQGSLFSGP
SHIPIPKSSLITPTASLLQPTHALSGDGEWSGASS
DSEFLLPDTDGLTALNISSPVSVAEFTYTTSVFG
DDNK AL SKSEIIYGNETELQIP SFNEM V YP SE ST
VMPNM YDNVNKLN ASLQET S V SI S STKGMFP G
SLAHTTTKVFDHEISQVPENNFSVQPTHTVSQA
SGDTSLKPVLSANSEPASSDPASSEMLSPSTQLL
FYETSASFSTEVLLQPSFQASDVDTLLKTVLPAV
PSDPILVETPKVDKISSTMLHLIVSNSASSENML
HSTSVPVFDVSPTSHMHSASLQGLTISYASEKY
EPVLLKSESSHQVVPSLYSNDELFQTANLEINQ
AHPPKGRHVFATPVLSIDEPLNTLINKLIHSDEIL
TSTKSSVTGKVFAGIPTVASDTFVSTDHSVPIGN
GHVAITAVSPHRDGSVTSTKLLFPSKATSELSHS
AKSDAGLVGGGEDGDTDDDGDDDDDDRGSDG
LSIHKCMSCSSYRESQEKVMNDSDTHENSLMD
QNNPISYSLSENSEEDNRVTSVSSDSQTGMDRS
PGKSPSANGLSQKHNDGKEENDIQTGSALLPLS
PESKAWAVLTSDEESGSGQGTSDSLNENETSTD
FSFADTNEKDADGILAAGDSEITPGFPQSPTSSV
TSENSEVFHVSEAEASNSSHESRIGLAEGLESEK
KAVIPLVIVSALTFICLVVLVGILIYWRKCFQTA
HFYLEDSTSPRVISTPPTPIFP
ISDDVGAIPIKHFPKHVADLHASSGFTEEFETLK
EFYQEVQSCT VDLGIT AD S SNHPDNKHKNRYIN
IVAYDHSRVKLAQLAEKDGKLTDYINANYVDG
YNRPKAYIAAQGPLKSTAEDFWRMIWEHNVEV
IVMITNLVEKGRRKCDQYWPADGSEEYGNFLV
TQKSVQVLAYYTVRNFTLRNTKIKKGSQKGRP
SGRVVTQYHYTQWPDMGVPEYSLPVLTFVRKA
AYAKRHAVGPVVVHCSAGVGRTGTYIVLDSML
QQIQHEGTVNIFGFLKHIRSQRNYLVQTEEQYV
FIHDTLVEAILSKETEVLDSHIHAYVNALLIPGP
AGKTKLEKQFQLLSQSNIQQSDYSAALKQCNRE
KNRT S SUP VERSRVGIS SL S GE GTD YIN AS YMG
YYQSNEFIITQHPLLHTIKDFWRMIWDHNAQLV
VMIPD GQNM AEDEF V YWPNKDEPINCE SFKVT
LMAEEHKCLSNEEKLIIQDFILEATQDDYVLEV
RHFQCPKWPNPDSPISKTFELISVIKEEAANRDG
PMIVHDEHGGVTAGTFCALTTLMHQLEKENSV
DVYQVAKMINLMRPGVFADIEQYQFLYKVILSL
VSTRQEENPSTSLDSNGAALPDGNIAESLESLV
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> АМАЛЬ ТЕРАПЬЮТИКС СА
<120> НОВЫЙ КОМПЛЕКС, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОНИКАЮЩИЙ В КЛЕТКУ ПЕПТИД, КАРГО-МОЛЕКУЛУ И ПЕПТИДНЫЙ АГОНИСТ TLR
<130> AM05P002WO2
<150> PCT/EP2015/000580
<151> 2015-03-16
<150> PCT/EP2015/002244
<151> 2015-11-09
<160> 79
<170> PatentIn, версия 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CPP: пенетратин
<400> 1
Arg Gln Ile Lys Ile Tyr Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220> <223> <400>
CPP: минимальный домен TAT
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 245
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность ZEBRA (встречающаяся в естественных условиях последовательность из вируса Эпштейна-Барра (EBV)) (YP_401673)
<400> 3
Met Met Asp Pro Asn Ser Thr Ser Glu Asp Val Lys Phe Thr Pro Asp
1 5 10 15
Pro Tyr Gln Val Pro Phe Val Gln Ala Phe Asp Gln Ala Thr Arg Val
20 25 30
Tyr Gln Asp Leu Gly Gly Pro Ser Gln Ala Pro Leu Pro Cys Val Leu
35 40 45
Trp Pro Val Leu Pro Glu Pro Leu Pro Gln Gly Gln Leu Thr Ala Tyr
50 55 60
His Val Ser Thr Ala Pro Thr Gly Ser Trp Phe Ser Ala Pro Gln Pro
65 70 75 80
Ala Pro Glu Asn Ala Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Phe Pro
85 90 95
Val Ser Asp Ile Thr Gln Asn Gln Gln Thr Asn Gln Ala Gly Gly Glu
100 105 110
Ala Pro Gln Pro Gly Asp Asn Ser Thr Val Gln Thr Ala Ala Ala Val
115 120 125
Val Phe Ala Cys Pro Gly Ala Asn Gln Gly Gln Gln Leu Ala Asp Ile
130 135 140
Gly Val Pro Gln Pro Ala Pro Val Ala Ala Pro Ala Arg Arg Thr Arg
145 150 155 160
Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu
165 170 175
Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys
180 185 190
Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser
195 200 205
Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys Pro Ser
210 215 220
Leu Asp Val Asp Ser Ile Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val Leu His Glu
225 230 235 240
Asp Leu Leu Asn Phe
245
<210> 4
<211> 45
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CPP1 (Z11)
<400> 4
Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe
1 5 10 15
Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser
20 25 30
Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys
35 40 45
<210> 5
<211> 42
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CPP2 (Z12)
<400> 5
Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe
1 5 10 15
Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser
20 25 30
Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys
35 40
<210> 6
<211> 42
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CPP3 (Z13)
<400> 6
Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe
1 5 10 15
Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser
20 25 30
Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys
35 40
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CPP4 (Z14)
<400> 7
Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe
1 5 10 15
Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys
20 25 30
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CPP5 (Z15)
<400> 8
Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe
1 5 10 15
Lys
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CPP6 (Z16)
<400> 9
Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp
1 5 10 15
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CPP7 (Z17)
<400> 10
Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys
1 5 10
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CPP8 (Z18) <400> 11
Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu
1 5 10 15
Leu Leu Lys
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CPP9 (Z19)
<400> 12
Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala 1 5
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CPP10 (Z20)
<400> 13
Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe Lys
1 5 10
<210> 14
<211> 85
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> карго-молекула
<400> 14
MAD5
Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile
1 5 10 15
Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val Pro
20 25 30
Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala Ser
35 40 45
Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn
50 55 60
Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr
65 70 75 80
Glu Trp Thr Gly Ser 85
<210> 15
<211> 35
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Пептидный агонист TLR2 Anaxa
<400> 15
Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His
1 5 10 15
Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe
20 25 30
Asp Ala Glu 35
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> сайт-мишень для энтерокиназы
<400> 16
Asp Asp Asp Lys
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> сайт-мишень для фактора Xa
<400> 17
Ile Glu Asp Gly Arg 1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> сайт-мишень для тромбина <400> 18
Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> сайт-мишень для протеазы TEV
<400> 19
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> сайт-мишень
<400> 20 для протеазы PreScission
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
1 5
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> сайт-мишень для фирина
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X может обозначать любую аминокислоту
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X обозначает R или K
<400> 21
Arg Xaa Xaa Arg
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептидный линкер
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Gly
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептидный линкер
<400> 23
Gly Gly Gly Gly 1
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептидный линкер
<400> 24
Glu Gln Leu Glu 1
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептидный линкер
<400> 25
Thr Glu Trp Thr 1
<210> 26
<211> 224
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> EDAZ13Mad5 <400> 26
Met His His His His His His Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala
1 5 10 15
Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro
20 25 30
Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp
35 40 45
Gly Ile Arg Glu Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala
50 55 60
Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val
65 70 75 80
Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser
85 90 95
Thr Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys
100 105 110
Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser
115 120 125
Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Lys Ile
130 135 140
Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg
145 150 155 160
Glu Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp
165 170 175
Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly
180 185 190
Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln
195 200 205
Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser
210 215 220
<210> 27
<211> 169
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> AnaxaZ13Mad5
<400> 27
Met His His His His His His Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys
1 5 10 15
Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser
20 25 30
Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu Lys Arg Tyr Lys Asn Arg
35 40 45
Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His
50 55 60
Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg
65 70 75 80
Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala
85 90 95
His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala
100 105 110
Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala
115 120 125
Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val
130 135 140
Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe
145 150 155 160
Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser 165
<210> 28
<211> 169
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Z13Mad5Anaxa
<400> 28
Met His His His His His His Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser
1 5 10 15
Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu
20 25 30
Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu
50 55 60
Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val
65 70 75 80
Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala
85 90 95
Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala
100 105 110
Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
115 120 125
Thr Glu Trp Thr Gly Ser Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu
130 135 140
Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val
145 150 155 160
Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu 165
<210> 29
<211> 134
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Z13Mad5
<400> 29
Met His His His His His His Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser
1 5 10 15
Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu
20 25 30
Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu
50 55 60
Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val
65 70 75 80
Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala
85 90 95
Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala
100 105 110
Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
115 120 125
Thr Glu Trp Thr Gly Ser 130
<210> 30
<211> 92
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Mad5
<400> 30
Met His His His His His His Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val
1 5 10 15
His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly
20 25 30
Val Gly Ala Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro
35 40 45
Arg Phe Ala Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn
50 55 60
Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile
65 70 75 80
Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser 85 90
<210> 31
<211> 182
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> EdaMad5
<400> 31
Met His His His His His His Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala
1 5 10 15
Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro
20 25 30
Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp
35 40 45
Gly Ile Arg Glu Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala
50 55 60
Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val
65 70 75 80
Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser
85 90 95
Thr Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu
100 105 110
Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val
115 120 125
Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala
130 135 140
Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala
145 150 155 160
Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
165 170 175
Thr Glu Trp Thr Gly Ser 180
<210> 32
<211> 127
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Mad5Anaxa
<400> 32
Met His His His His His His Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val
1 5 10 15
His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly
20 25 30
Val Gly Ala Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro
35 40 45
Arg Phe Ala Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn
50 55 60
Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile
65 70 75 80
Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser Ser Thr Val His
85 90 95
Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro
100 105 110
Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu
115 120 125
<210> 33
<211> 157
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Z14Mad5Anaxa
<400> 33
Met His His His His His His Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser
1 5 10 15
Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu
20 25 30
Val Ala Ala Ala Lys Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala
35 40 45
Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly
50 55 60
Ala Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe
65 70 75 80
Ala Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala
85 90 95
Val Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn
100 105 110
Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser Ser Thr Val His Glu Ile
115 120 125
Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala
130 135 140
Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu
145 150 155
<210> 34
<211> 146
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Z18Mad5Anaxa <400> 34
Met His His His His His His Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser
1 5 10 15
Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Lys Ile Ser
20 25 30
Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu
35 40 45
Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu
50 55 60
Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala
65 70 75 80
Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu
85 90 95
Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser Ser
100 105 110
Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser
115 120 125
Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp
130 135 140
Ala Glu 145
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SIINFEKL OVACD8
<400>
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид OVACD4
<400> 36
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 37
<211> 212
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> EDAZ14Mad5 <400> 37
Met His His His His His His Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala
1 5 10 15
Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro
20 25 30
Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp
35 40 45
Gly Ile Arg Glu Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala
50 55 60
Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val
65 70 75 80
Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser
85 90 95
Thr Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys
100 105 110
Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Glu
115 120 125
Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn
130 135 140
Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val Pro Arg
145 150 155 160
Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala Ser Phe
165 170 175
Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu
180 185 190
Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu
195 200 205
Trp Thr Gly Ser 210
<210> 38
<211> 201
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> EDAZ18Mad5
<400> 38
Met His His His His His His Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala
1 5 10 15
Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro
20 25 30
Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp
35 40 45
Gly Ile Arg Glu Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala
50 55 60
Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val
65 70 75 80
Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser
85 90 95
Thr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg
100 105 110
Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala
115 120 125
His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala
130 135 140
Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala
145 150 155 160
Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val
165 170 175
Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe
180 185 190
Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser 195 200
<210> 39
<211> 116
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Z13Mad8Anaxa
<400> 39
Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe
1 5 10 15
Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser
20 25 30
Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Val Thr Tyr His Ser Pro
35 40 45
Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe Glu Arg Arg Ala Ile Leu Asn Arg Leu
50 55 60
Val Gln Phe Ile Lys Asp Arg Ile Ser Val Val Gln Ala Leu Val Leu
65 70 75 80
Thr Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp
85 90 95
His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn
100 105 110
Phe Asp Ala Glu 115
<210> 40
<211> 110
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Z13Mad11Anaxa
<400> 40
Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe
1 5 10 15
Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser
20 25 30
Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Asn Tyr Arg Ile Ala Thr
35 40 45
Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Asp Cys Ala Met Glu Glu Leu Thr
50 55 60
Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Gln Arg Ser Thr Val His Glu
65 70 75 80
Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser
85 90 95
Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu
100 105 110
<210> 41
<211> 94
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Z13Mad9Anaxa
<400> 41
Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe
1 5 10 15
Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser
20 25 30
Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys His Leu Glu Leu Ala Ser
35 40 45
Met Thr Asn Met Glu Leu Met Ser Ser Ile Val Ser Thr Val His Glu
50 55 60
Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu 85 90
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Mad9
<400> 42
His Leu Glu Leu Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Ser Ser Ile
1 5 10 15
Val
<210> 43
<211> 20
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Mad8
<400> 43
Val Thr Tyr His Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe Glu Arg Arg
1 5 10 15
Ala Ile Leu Asn
<210> 44
<211> 33
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Mad11 <400> 44
Asn Tyr Arg Ile Ala Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Asp Cys
1 5 10 15
Ala Met Glu Glu Leu Thr Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Gln
20 25 30
Arg
<210> 45
<211> 90
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> EDA
<400> 45
Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp
1 5 10 15
Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile Arg Glu Leu Phe Pro
35 40 45
Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro
50 55 60
Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met Glu
65 70 75 80
Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser Thr 85 90
<210> 46
<211> 115
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TatFMad5Anaxa
<400> 46
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Val Lys Arg Ile Ser Gln
1 5 10 15
Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Arg Val
20 25 30
Lys Arg Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Arg Val Lys Arg Ala
35 40 45
Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala
50 55 60
Arg Val Lys Arg Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Arg Val Lys Arg
65 70 75 80
Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His
85 90 95
Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe
100 105 110
Asp Ala Glu 115
<210> 47
<211> 314
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> EpCAM
<400> 47
Met Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gln Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr
20 25 30
Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gln Cys Gln Cys
35 40 45
Thr Ser Val Gly Ala Gln Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala
50 55 60
Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg
65 70 75 80
Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp
85 90 95
Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn Gly
100 105 110
Thr Ser Met Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp
115 120 125
Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile
130 135 140
Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys
145 150 155 160
Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gln Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gln Leu
165 170 175
Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr
180 185 190
Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Gln Lys Thr Gln Asn Asp Val Asp
195 200 205
Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser
210 215 220
Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gln Leu
225 230 235 240
Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala
245 250 255
Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val Ile
260 265 270
Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala Gly Ile Val Val Leu Val Ile
275 280 285
Ser Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu
290 295 300
Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala 305 310
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эпитоп EpCAM
<400> 48
Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val
1 5
<210> 49
<211> 1255
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MUC-1
<400> 49
Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr
Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly
20 25 30
Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser
35 40 45
Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His
50 55 60
Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu
65 70 75 80
Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln
85 90 95
Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr
100 105 110
Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
130 135 140
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
145 150 155 160
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
165 170 175
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
180 185 190
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
195 200 205
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
210 215 220
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
225 230 235 240
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
245 250 255
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
260
265
270
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
275 280 285
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
290 295 300
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
305 310 315 320
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
325 330 335
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
340 345 350
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
355 360 365
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
370 375 380
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
385 390 395 400
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
405 410 415
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
420 425 430
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
435 440 445
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
450 455 460
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
465 470 475 480
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
485 490 495
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
500 505 510
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
515
520
525
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
530 535 540
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
545 550 555 560
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
565 570 575
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
580 585 590
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
595 600 605
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
610 615 620
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
625 630 635 640
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
645 650 655
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
660 665 670
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
675 680 685
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
690 695 700
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
705 710 715 720
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
725 730 735
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
740 745 750
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
755 760 765
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
770 775 780
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
785 790 795 800
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
805 810 815
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
820 825 830
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
835 840 845
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
850 855 860
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
865 870 875 880
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His
885 890 895
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
900 905 910
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
915 920 925
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn
930 935 940
Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser
945 950 955 960
Ala Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly
965 970 975
Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe
980 985 990
Ser Ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His
995 1000 1005
Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Ser Val Pro
1010 1015 1020
Pro Leu Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr
1025
1030
1035
Gly Val Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln
1040 1045 1050
Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu
1055 1060 1065
Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln
1070 1075 1080
Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser
1085 1090 1095
Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn
1100 1105 1110
Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala
1115 1120 1125
Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp
1130 1135 1140
Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly
1145 1150 1155
Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu
1160 1165 1170
Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg
1175 1180 1185
Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr
1190 1195 1200
His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr
1205 1210 1215
Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser
1220 1225 1230
Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val
1235 1240 1245
Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu 1250 1255
<210> 50
<211> <212> <213>
PRT
Искусственная последовательность
<220>
<223> эпитоп MUC-1 <400> 50
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn 1 5
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эпитоп MUC-1 <400> 51
Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
<210> 52
<211> 142
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220> <223>
<400>
сурвивин
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His
65 70 75 80
Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
85 90 95
Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys
100 105 110
Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala
115 120 125
Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp
130 135 140
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эпитоп сурвивина
<400> 53
Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe
1 5 10
<210> 54
<211> 701
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CEA
<400> 54
Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr
20 25 30
Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly
35 40 45
Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly
50 55 60
Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile
65 70 75 80
Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser
85 90 95
Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile
100 105 110
Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp
115 120 125
Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu
130 135 140
Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys
145 150 155 160
Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr
165 170 175
Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln
180 185 190
Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn
195 200 205
Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg
210 215 220
Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro
225 230 235 240
Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn
245 250 255
Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn
275 280 285
Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser
290 295 300
Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu
325 330 335
Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr
340 345 350
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg
355 360 365
Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr
370 375 380
Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser
385 390 395 400
Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp
405 410 415
Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser
435 440 445
Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile
450 455 460
Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn
465 470 475 480
Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val
485 490 495
Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro
500 505 510
Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln
515 520 525
Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser
530 535 540
Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn
545 550 555 560
Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser
565 570 575
Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly
580 585 590
Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly
595 600 605
Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln
610 615 620
Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu
625 630 635 640
Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe
645 650 655
Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile
660 665 670
Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr
675 680 685
Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu
690 695 700
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эпитоп CEA
<400> 55
Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эпитоп CEA
<400> 56
Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln
1 5 10
<210> 57
<211> 189
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Kirsten-подтип Ras
<400> 57
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met 180 185
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эпитоп Kirsten-подтипа Ras
<400> 58
Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly
1 5
<210> 59
<211> 314
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MAGE-A3 <400> 59
Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu
1 5 10 15
Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val
35 40 45
Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser
50 55 60
Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp
65 70 75 80
Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser
85 90 95
Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys
100 105 110
Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu
115 120 125
Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln
130 135 140
Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Phe Ser Ser Leu Gln Leu
145 150 155 160
Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr
165 170 175
Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp
180 185 190
Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile
195 200 205
Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu
210 215 220
Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly
225 230 235 240
Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu
245 250 255
Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu
260 265 270
Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His
275 280 285
His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu
290 295 300
His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu 305 310
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эпитоп MAGE-A3 <400> 60
Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu 1 5
<210> 61
<211> 380
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IL13Rальфа2
<400> 61
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
1 5 10 15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
20 25 30
Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr
35 40 45
Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu
50 55 60
Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
65 70 75 80
Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp
85 90 95
Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln
100 105 110
Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr
115 120 125
Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp
130 135 140
Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly
145 150 155 160
Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu
165 170 175
Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly
180 185 190
Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
195 200 205
Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg
210 215 220
Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro
225 230 235 240
Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu
245 250 255
Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr
260 265 270
Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val
275 280 285
Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu
290 295 300
Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly
305 310 315 320
Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu
325 330 335
Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu
340 345 350
Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr
355 360 365
Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr
370 375 380
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эпитоп IL13Rальфа2
<400> 62
Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu 1 5
<210> 63
<211> 50
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Mad12
<400> 63
Leu Phe Arg Ala Ala Gln Leu Ala Asn Asp Val Val Leu Gln Ile Met
1 5 10 15
Glu His Leu Glu Leu Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Ser Ser
20 25 30
Ile Val Val Ile Ser Ala Ser Ile Ile Val Phe Asn Leu Leu Glu Leu
35 40 45
Glu Gly 50
<210> 64
<211> 14
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид gp70CD4 <400> 64
Leu Val Gln Phe Ile Lys Asp Arg Ile Ser Val Val Gln Ala
1 5 10
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид gp70CD8 <400> 65
Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe 1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> пептид adpgk
<400> 66
Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met 1 5
<210> <211> <212> <213>
<220> <223>
<400>
67 8
PRT
Искусственная последовательность
сурвивин2 0-2 8
Ala Thr Lys Asn Trp Pro Phe Leu 1 5
<210> <211> <212> <213>
<220> <223>
<400>
68 8
PRT
Искусственная последовательность
сурвивин97-104
Thr Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu 1 5
<210> 69
<211> 127
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Z13Mad12Anaxa
<400> 69
Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe
1 5 10 15
Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser
20 25 30
Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Leu Phe Arg Ala Ala Gln
35 40 45
Leu Ala Asn Asp Val Val Leu Gln Ile Met Glu His Leu Glu Leu Ala
50 55 60
Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Ser Ser Ile Val Val Ile Ser Ala
65 70 75 80
Ser Ile Ile Val Phe Asn Leu Leu Glu Leu Glu Gly Ser Thr Val His
85 90 95
Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro
100 105 110
Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu
115 120 125
<210> 70
<211> 1255
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Her2/neu
<400> 70
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
690 695 700
Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770 775 780
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu
785 790 795 800
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
805 810 815
Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly
820 825 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
835 840 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865 870 875 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900 905 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
915 920 925
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
930 935 940
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945 950 955 960
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
980 985 990
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu
995 1000 1005
Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr
1010 1015 1020
Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly
1025 1030 1035
Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg
1040 1045 1050
Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu
1055 1060 1065
Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser
1070 1075 1080
Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu
1085 1090 1095
Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser
1100 1105 1110
Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val
1115 1120 1125
Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro
1130 1135 1140
Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro
1145 1150 1155
Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu
1160 1165 1170
Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly
1175 1180 1185
Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala
1190 1195 1200
Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp
1205 1210 1215
Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro
1220 1225 1230
Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1235 1240 1245
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1250 1255
<210> 71
<211> 14
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> эпитоп EGFRvIII
<400> 71
Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Cys
1 5 10
<210> 72
<211> 976
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> EphA2 <400> 72
Met Glu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Cys Phe Ala Leu Leu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Lys Glu Val Val Leu Leu
20 25 30
Asp Phe Ala Ala Ala Gly Gly Glu Leu Gly Trp Leu Thr His Pro Tyr
35 40 45
Gly Lys Gly Trp Asp Leu Met Gln Asn Ile Met Asn Asp Met Pro Ile
50 55 60
Tyr Met Tyr Ser Val Cys Asn Val Met Ser Gly Asp Gln Asp Asn Trp
65 70 75 80
Leu Arg Thr Asn Trp Val Tyr Arg Gly Glu Ala Glu Arg Ile Phe Ile
85 90 95
Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp Cys Asn Ser Phe Pro Gly Gly Ala
100 105 110
Ser Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Ala Glu Ser Asp Leu
115 120 125
Asp Tyr Gly Thr Asn Phe Gln Lys Arg Leu Phe Thr Lys Ile Asp Thr
130 135 140
Ile Ala Pro Asp Glu Ile Thr Val Ser Ser Asp Phe Glu Ala Arg His
145 150 155 160
Val Lys Leu Asn Val Glu Glu Arg Ser Val Gly Pro Leu Thr Arg Lys
165 170 175
Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Ile Gly Ala Cys Val Ala Leu Leu
180 185 190
Ser Val Arg Val Tyr Tyr Lys Lys Cys Pro Glu Leu Leu Gln Gly Leu
195 200 205
Ala His Phe Pro Glu Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ala Pro Ser Leu Ala
210 215 220
Thr Val Ala Gly Thr Cys Val Asp His Ala Val Val Pro Pro Gly Gly
225 230 235 240
Glu Glu Pro Arg Met His Cys Ala Val Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro
245 250 255
Ile Gly Gln Cys Leu Cys Gln Ala Gly Tyr Glu Lys Val Glu Asp Ala
260 265 270
Cys Gln Ala Cys Ser Pro Gly Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser
275 280 285
Pro Cys Leu Glu Cys Pro Glu His Thr Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ala
290 295 300
Thr Ser Cys Glu Cys Glu Glu Gly Phe Phe Arg Ala Pro Gln Asp Pro
305 310 315 320
Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro His Tyr Leu Thr
325 330 335
Ala Val Gly Met Gly Ala Lys Val Glu Leu Arg Trp Thr Pro Pro Gln
340 345 350
Asp Ser Gly Gly Arg Glu Asp Ile Val Tyr Ser Val Thr Cys Glu Gln
355 360 365
Cys Trp Pro Glu Ser Gly Glu Cys Gly Pro Cys Glu Ala Ser Val Arg
370 375 380
Tyr Ser Glu Pro Pro His Gly Leu Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser
385 390 395 400
Asp Leu Glu Pro His Met Asn Tyr Thr Phe Thr Val Glu Ala Arg Asn
405 410 415
Gly Val Ser Gly Leu Val Thr Ser Arg Ser Phe Arg Thr Ala Ser Val
420 425 430
Ser Ile Asn Gln Thr Glu Pro Pro Lys Val Arg Leu Glu Gly Arg Ser
435 440 445
Thr Thr Ser Leu Ser Val Ser Trp Ser Ile Pro Pro Pro Gln Gln Ser
450 455 460
Arg Val Trp Lys Tyr Glu Val Thr Tyr Arg Lys Lys Gly Asp Ser Asn
465 470 475 480
Ser Tyr Asn Val Arg Arg Thr Glu Gly Phe Ser Val Thr Leu Asp Asp
485 490 495
Leu Ala Pro Asp Thr Thr Tyr Leu Val Gln Val Gln Ala Leu Thr Gln
500 505 510
Glu Gly Gln Gly Ala Gly Ser Lys Val His Glu Phe Gln Thr Leu Ser
515 520 525
Pro Glu Gly Ser Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Gly Val Ala Val Gly
530 535 540
Val Val Leu Leu Leu Val Leu Ala Gly Val Gly Phe Phe Ile His Arg
545 550 555 560
Arg Arg Lys Asn Gln Arg Ala Arg Gln Ser Pro Glu Asp Val Tyr Phe
565 570 575
Ser Lys Ser Glu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Thr Tyr Val Asp Pro His
580 585 590
Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala Val Leu Lys Phe Thr Thr Glu Ile
595 600 605
His Pro Ser Cys Val Thr Arg Gln Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Phe
610 615 620
Gly Glu Val Tyr Lys Gly Met Leu Lys Thr Ser Ser Gly Lys Lys Glu
625 630 635 640
Val Pro Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Gln
645 650 655
Arg Val Asp Phe Leu Gly Glu Ala Gly Ile Met Gly Gln Phe Ser His
660 665 670
His Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Ile Ser Lys Tyr Lys Pro Met
675 680 685
Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Lys Phe Leu
690 695 700
Arg Glu Lys Asp Gly Glu Phe Ser Val Leu Gln Leu Val Gly Met Leu
705 710 715 720
Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met Lys Tyr Leu Ala Asn Met Asn Tyr Val
725 730 735
His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu Val
740 745 750
Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro
755 760 765
Glu Ala Thr Tyr Thr Thr Ser Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr
770 775 780
Ala Pro Glu Ala Ile Ser Tyr Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val
785 790 795 800
Trp Ser Phe Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Thr Tyr Gly Glu Arg
805 810 815
Pro Tyr Trp Glu Leu Ser Asn His Glu Val Met Lys Ala Ile Asn Asp
820 825 830
Gly Phe Arg Leu Pro Thr Pro Met Asp Cys Pro Ser Ala Ile Tyr Gln
835 840 845
Leu Met Met Gln Cys Trp Gln Gln Glu Arg Ala Arg Arg Pro Lys Phe
850 855 860
Ala Asp Ile Val Ser Ile Leu Asp Lys Leu Ile Arg Ala Pro Asp Ser
865 870 875 880
Leu Lys Thr Leu Ala Asp Phe Asp Pro Arg Val Ser Ile Arg Leu Pro
885 890 895
Ser Thr Ser Gly Ser Glu Gly Val Pro Phe Arg Thr Val Ser Glu Trp
900 905 910
Leu Glu Ser Ile Lys Met Gln Gln Tyr Thr Glu His Phe Met Ala Ala
915 920 925
Gly Tyr Thr Ala Ile Glu Lys Val Val Gln Met Thr Asn Asp Asp Ile
930 935 940
Lys Arg Ile Gly Val Arg Leu Pro Gly His Gln Lys Arg Ile Ala Tyr
945 950 955 960
Ser Leu Leu Gly Leu Lys Asp Gln Val Asn Thr Val Gly Ile Pro Ile
965 970 975
<210> 73
<211> 661
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> gp100
<400> 73
Met Asp Leu Val Leu Lys Arg Cys Leu Leu His Leu Ala Val Ile Gly
1 5 10 15
Ala Leu Leu Ala Val Gly Ala Thr Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp
20 25 30
Leu Gly Val Ser Arg Gln Leu Arg Thr Lys Ala Trp Asn Arg Gln Leu
35 40 45
Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gln Arg Leu Asp Cys Trp Arg Gly Gly
50 55 60
Gln Val Ser Leu Lys Val Ser Asn Asp Gly Pro Thr Leu Ile Gly Ala
65 70 75 80
Asn Ala Ser Phe Ser Ile Ala Leu Asn Phe Pro Gly Ser Gln Lys Val
85 90 95
Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Trp Val Asn Asn Thr Ile Ile Asn Gly
100 105 110
Ser Gln Val Trp Gly Gly Gln Pro Val Tyr Pro Gln Glu Thr Asp Asp
115 120 125
Ala Cys Ile Phe Pro Asp Gly Gly Pro Cys Pro Ser Gly Ser Trp Ser
130 135 140
Gln Lys Arg Ser Phe Val Tyr Val Trp Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp
145 150 155 160
Gln Val Leu Gly Gly Pro Val Ser Gly Leu Ser Ile Gly Thr Gly Arg
165 170 175
Ala Met Leu Gly Thr His Thr Met Glu Val Thr Val Tyr His Arg Arg
180 185 190
Gly Ser Arg Ser Tyr Val Pro Leu Ala His Ser Ser Ser Ala Phe Thr
195 200 205
Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val Ser Val Ser Gln Leu Arg Ala
210 215 220
Leu Asp Gly Gly Asn Lys His Phe Leu Arg Asn Gln Pro Leu Thr Phe
225 230 235 240
Ala Leu Gln Leu His Asp Pro Ser Gly Tyr Leu Ala Glu Ala Asp Leu
245 250 255
Ser Tyr Thr Trp Asp Phe Gly Asp Ser Ser Gly Thr Leu Ile Ser Arg
260 265 270
Ala Leu Val Val Thr His Thr Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala
275 280 285
Gln Val Val Leu Gln Ala Ala Ile Pro Leu Thr Ser Cys Gly Ser Ser
290 295 300
Pro Val Pro Gly Thr Thr Asp Gly His Arg Pro Thr Ala Glu Ala Pro
305 310 315 320
Asn Thr Thr Ala Gly Gln Val Pro Thr Thr Glu Val Val Gly Thr Thr
325 330 335
Pro Gly Gln Ala Pro Thr Ala Glu Pro Ser Gly Thr Thr Ser Val Gln
340 345 350
Val Pro Thr Thr Glu Val Ile Ser Thr Ala Pro Val Gln Met Pro Thr
355 360 365
Ala Glu Ser Thr Gly Met Thr Pro Glu Lys Val Pro Val Ser Glu Val
370 375 380
Met Gly Thr Thr Leu Ala Glu Met Ser Thr Pro Glu Ala Thr Gly Met
385 390 395 400
Thr Pro Ala Glu Val Ser Ile Val Val Leu Ser Gly Thr Thr Ala Ala
405 410 415
Gln Val Thr Thr Thr Glu Trp Val Glu Thr Thr Ala Arg Glu Leu Pro
420 425 430
Ile Pro Glu Pro Glu Gly Pro Asp Ala Ser Ser Ile Met Ser Thr Glu
435 440 445
Ser Ile Thr Gly Ser Leu Gly Pro Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu
450 455 460
Arg Leu Val Lys Arg Gln Val Pro Leu Asp Cys Val Leu Tyr Arg Tyr
465 470 475 480
Gly Ser Phe Ser Val Thr Leu Asp Ile Val Gln Gly Ile Glu Ser Ala
485 490 495
Glu Ile Leu Gln Ala Val Pro Ser Gly Glu Gly Asp Ala Phe Glu Leu
500 505 510
Thr Val Ser Cys Gln Gly Gly Leu Pro Lys Glu Ala Cys Met Glu Ile
515 520 525
Ser Ser Pro Gly Cys Gln Pro Pro Ala Gln Arg Leu Cys Gln Pro Val
530 535 540
Leu Pro Ser Pro Ala Cys Gln Leu Val Leu His Gln Ile Leu Lys Gly
545 550 555 560
Gly Ser Gly Thr Tyr Cys Leu Asn Val Ser Leu Ala Asp Thr Asn Ser
565 570 575
Leu Ala Val Val Ser Thr Gln Leu Ile Met Pro Gly Gln Glu Ala Gly
580 585 590
Leu Gly Gln Val Pro Leu Ile Val Gly Ile Leu Leu Val Leu Met Ala
595 600 605
Val Val Leu Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Arg Arg Leu Met Lys Gln Asp
610 615 620
Phe Ser Val Pro Gln Leu Pro His Ser Ser Ser His Trp Leu Arg Leu
625 630 635 640
Pro Arg Ile Phe Cys Ser Cys Pro Ile Gly Glu Asn Ser Pro Leu Leu
645 650 655
Ser Gly Gln Gln Val 660
<210> 74
<211> 1132
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> hTert
<400> 74
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser
1 5 10 15
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20 25 30
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35 40 45
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50 55 60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu
65 70 75 80
Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val
85 90 95
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100 105 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115 120 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val
130 135 140
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr
165 170 175
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180 185 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195 200 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210 215 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg
225 230 235 240
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp
245 250 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260 265 270
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275 280 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290 295 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro
305 310 315 320
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly
325 330 335
Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro
340 345 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser
355 360 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His
385 390 395 400
Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg
405 410 415
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420 425 430
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435 440 445
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450 455 460
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser
465 470 475 480
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser
485 490 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500 505 510
Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515 520 525
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe
530 535 540
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe
545 550 555 560
Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr
565 570 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
580 585 590
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595 600 605
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
610 615 620
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
625 630 635 640
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser
645 650 655
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660 665 670
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg
675 680 685
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro
690 695 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705 710 715 720
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725 730 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740 745 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser
770 775 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785 790 795 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805 810 815
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820 825 830
Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835 840 845
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu
850 855 860
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865 870 875 880
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys
885 890 895
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
900 905 910
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
915 920 925
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser
930 935 940
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe
945 950 955 960
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
965 970 975
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn
980 985 990
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln
995 1000 1005
Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln
1010 1015 1020
Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp
1025 1030 1035
Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly
1040 1045 1050
Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu
1055 1060 1065
Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr
1070 1075 1080
Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr
1085 1090 1095
Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr
1100 1105 1110
Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys
1115 1120 1125
Thr Ile Leu Asp 1130
<210> 75
<211> 237
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TRP-2
<400> 75
Met Ser Pro Leu Trp Trp Gly Phe Leu Leu Ser Cys Leu Gly Cys Lys
1 5 10 15
Ile Leu Pro Gly Ala Gln Gly Gln Phe Pro Arg Val Cys Met Thr Val
20 25 30
Asp Ser Leu Val Asn Lys Glu Cys Cys Pro Arg Leu Gly Ala Glu Ser
35 40 45
Ala Asn Val Cys Gly Ser Gln Gln Gly Arg Gly Gln Cys Thr Glu Val
50 55 60
Arg Ala Asp Thr Arg Pro Trp Ser Gly Pro Tyr Ile Leu Arg Asn Gln
65 70 75 80
Asp Asp Arg Glu Leu Trp Pro Arg Lys Phe Phe His Arg Thr Cys Lys
85 90 95
Cys Thr Gly Asn Phe Ala Gly Tyr Asn Cys Gly Asp Cys Lys Phe Gly
100 105 110
Trp Thr Gly Pro Asn Cys Glu Arg Lys Lys Pro Pro Val Ile Arg Gln
115 120 125
Asn Ile His Ser Leu Ser Pro Gln Glu Arg Glu Gln Phe Leu Gly Ala
130 135 140
Leu Asp Leu Ala Lys Lys Arg Val His Pro Asp Tyr Val Ile Thr Thr
145 150 155 160
Gln His Trp Val Gly Leu Leu Gly Pro Asn Gly Thr Gln Pro Gln Phe
165 170 175
Ala Asn Cys Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu His Tyr Tyr Ser
180 185 190
Val Arg Asp Thr Leu Leu Gly Gly Phe Phe Pro Trp Leu Lys Val Tyr
195 200 205
Tyr Tyr Arg Phe Val Ile Gly Leu Arg Val Trp Gln Trp Glu Val Ile
210 215 220
Ser Cys Lys Leu Ile Lys Arg Ala Thr Thr Arg Gln Pro
225 230 235
<210> 76
<211> 383
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> YKL-40
<400> 76
Met Gly Val Lys Ala Ser Gln Thr Gly Phe Val Val Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Gln Cys Cys Ser Ala Tyr Lys Leu Val Cys Tyr Tyr Thr Ser Trp Ser
20 25 30
Gln Tyr Arg Glu Gly Asp Gly Ser Cys Phe Pro Asp Ala Leu Asp Arg
35 40 45
Phe Leu Cys Thr His Ile Ile Tyr Ser Phe Ala Asn Ile Ser Asn Asp
50 55 60
His Ile Asp Thr Trp Glu Trp Asn Asp Val Thr Leu Tyr Gly Met Leu
65 70 75 80
Asn Thr Leu Lys Asn Arg Asn Pro Asn Leu Lys Thr Leu Leu Ser Val
85 90 95
Gly Gly Trp Asn Phe Gly Ser Gln Arg Phe Ser Lys Ile Ala Ser Asn
100 105 110
Thr Gln Ser Arg Arg Thr Phe Ile Lys Ser Val Pro Pro Phe Leu Arg
115 120 125
Thr His Gly Phe Asp Gly Leu Asp Leu Ala Trp Leu Tyr Pro Gly Arg
130 135 140
Arg Asp Lys Gln His Phe Thr Thr Leu Ile Lys Glu Met Lys Ala Glu
145 150 155 160
Phe Ile Lys Glu Ala Gln Pro Gly Lys Lys Gln Leu Leu Leu Ser Ala
165 170 175
Ala Leu Ser Ala Gly Lys Val Thr Ile Asp Ser Ser Tyr Asp Ile Ala
180 185 190
Lys Ile Ser Gln His Leu Asp Phe Ile Ser Ile Met Thr Tyr Asp Phe
195 200 205
His Gly Ala Trp Arg Gly Thr Thr Gly His His Ser Pro Leu Phe Arg
210 215 220
Gly Gln Glu Asp Ala Ser Pro Asp Arg Phe Ser Asn Thr Asp Tyr Ala
225 230 235 240
Val Gly Tyr Met Leu Arg Leu Gly Ala Pro Ala Ser Lys Leu Val Met
245 250 255
Gly Ile Pro Thr Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr
260 265 270
Gly Val Gly Ala Pro Ile Ser Gly Pro Gly Ile Pro Gly Arg Phe Thr
275 280 285
Lys Glu Ala Gly Thr Leu Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Asp Phe Leu Arg
290 295 300
Gly Ala Thr Val His Arg Ile Leu Gly Gln Gln Val Pro Tyr Ala Thr
305 310 315 320
Lys Gly Asn Gln Trp Val Gly Tyr Asp Asp Gln Glu Ser Val Lys Ser
325 330 335
Lys Val Gln Tyr Leu Lys Asp Arg Gln Leu Ala Gly Ala Met Val Trp
340 345 350
Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Gln Gly Ser Phe Cys Gly Gln Asp Leu
355 360 365
Arg Phe Pro Leu Thr Asn Ala Ile Lys Asp Ala Leu Ala Ala Thr
370 375 380
<210> 77 <211> 911
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> бревикан
<400> 77
Met Ala Gln Leu Phe Leu Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Leu Ala Gln
1 5 10 15
Ala Pro Ala Ala Leu Ala Asp Val Leu Glu Gly Asp Ser Ser Glu Asp
20 25 30
Arg Ala Phe Arg Val Arg Ile Ala Gly Asp Ala Pro Leu Gln Gly Val
35 40 45
Leu Gly Gly Ala Leu Thr Ile Pro Cys His Val His Tyr Leu Arg Pro
50 55 60
Pro Pro Ser Arg Arg Ala Val Leu Gly Ser Pro Arg Val Lys Trp Thr
65 70 75 80
Phe Leu Ser Arg Gly Arg Glu Ala Glu Val Leu Val Ala Arg Gly Val
85 90 95
Arg Val Lys Val Asn Glu Ala Tyr Arg Phe Arg Val Ala Leu Pro Ala
100 105 110
Tyr Pro Ala Ser Leu Thr Asp Val Ser Leu Ala Leu Ser Glu Leu Arg
115 120 125
Pro Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Arg Cys Glu Val Gln His Gly Ile Asp
130 135 140
Asp Ser Ser Asp Ala Val Glu Val Lys Val Lys Gly Val Val Phe Leu
145 150 155 160
Tyr Arg Glu Gly Ser Ala Arg Tyr Ala Phe Ser Phe Ser Gly Ala Gln
165 170 175
Glu Ala Cys Ala Arg Ile Gly Ala His Ile Ala Thr Pro Glu Gln Leu
180 185 190
Tyr Ala Ala Tyr Leu Gly Gly Tyr Glu Gln Cys Asp Ala Gly Trp Leu
195 200 205
Ser Asp Gln Thr Val Arg Tyr Pro Ile Gln Thr Pro Arg Glu Ala Cys
210 215 220
Tyr Gly Asp Met Asp Gly Phe Pro Gly Val Arg Asn Tyr Gly Val Val
225 230 235 240
Asp Pro Asp Asp Leu Tyr Asp Val Tyr Cys Tyr Ala Glu Asp Leu Asn
245 250 255
Gly Glu Leu Phe Leu Gly Asp Pro Pro Glu Lys Leu Thr Leu Glu Glu
260 265 270
Ala Arg Ala Tyr Cys Gln Glu Arg Gly Ala Glu Ile Ala Thr Thr Gly
275 280 285
Gln Leu Tyr Ala Ala Trp Asp Gly Gly Leu Asp His Cys Ser Pro Gly
290 295 300
Trp Leu Ala Asp Gly Ser Val Arg Tyr Pro Ile Val Thr Pro Ser Gln
305 310 315 320
Arg Cys Gly Gly Gly Leu Pro Gly Val Lys Thr Leu Phe Leu Phe Pro
325 330 335
Asn Gln Thr Gly Phe Pro Asn Lys His Ser Arg Phe Asn Val Tyr Cys
340 345 350
Phe Arg Asp Ser Ala Gln Pro Ser Ala Ile Pro Glu Ala Ser Asn Pro
355 360 365
Ala Ser Asn Pro Ala Ser Asp Gly Leu Glu Ala Ile Val Thr Val Thr
370 375 380
Glu Thr Leu Glu Glu Leu Gln Leu Pro Gln Glu Ala Thr Glu Ser Glu
385 390 395 400
Ser Arg Gly Ala Ile Tyr Ser Ile Pro Ile Met Glu Asp Gly Gly Gly
405 410 415
Gly Ser Ser Thr Pro Glu Asp Pro Ala Glu Ala Pro Arg Thr Leu Leu
420 425 430
Glu Phe Glu Thr Gln Ser Met Val Pro Pro Thr Gly Phe Ser Glu Glu
435 440 445
Glu Gly Lys Ala Leu Glu Glu Glu Glu Lys Tyr Glu Asp Glu Glu Glu
450 455 460
Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val Glu Asp Glu Ala Leu Trp
465 470 475 480
Ala Trp Pro Ser Glu Leu Ser Ser Pro Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro
485 490 495
Thr Glu Pro Ala Ala Gln Glu Glu Ser Leu Ser Gln Ala Pro Ala Arg
500 505 510
Ala Val Leu Gln Pro Gly Ala Ser Pro Leu Pro Asp Gly Glu Ser Glu
515 520 525
Ala Ser Arg Pro Pro Arg Val His Gly Pro Pro Thr Glu Thr Leu Pro
530 535 540
Thr Pro Arg Glu Arg Asn Leu Ala Ser Pro Ser Pro Ser Thr Leu Val
545 550 555 560
Glu Ala Arg Glu Val Gly Glu Ala Thr Gly Gly Pro Glu Leu Ser Gly
565 570 575
Val Pro Arg Gly Glu Ser Glu Glu Thr Gly Ser Ser Glu Gly Ala Pro
580 585 590
Ser Leu Leu Pro Ala Thr Arg Ala Pro Glu Gly Thr Arg Glu Leu Glu
595 600 605
Ala Pro Ser Glu Asp Asn Ser Gly Arg Thr Ala Pro Ala Gly Thr Ser
610 615 620
Val Gln Ala Gln Pro Val Leu Pro Thr Asp Ser Ala Ser Arg Gly Gly
625 630 635 640
Val Ala Val Val Pro Ala Ser Gly Asp Cys Val Pro Ser Pro Cys His
645 650 655
Asn Gly Gly Thr Cys Leu Glu Glu Glu Glu Gly Val Arg Cys Leu Cys
660 665 670
Leu Pro Gly Tyr Gly Gly Asp Leu Cys Asp Val Gly Leu Arg Phe Cys
675 680 685
Asn Pro Gly Trp Asp Ala Phe Gln Gly Ala Cys Tyr Lys His Phe Ser
690 695 700
Thr Arg Arg Ser Trp Glu Glu Ala Glu Thr Gln Cys Arg Met Tyr Gly
705 710 715 720
Ala His Leu Ala Ser Ile Ser Thr Pro Glu Glu Gln Asp Phe Ile Asn
725 730 735
Asn Arg Tyr Arg Glu Tyr Gln Trp Ile Gly Leu Asn Asp Arg Thr Ile
740 745 750
Glu Gly Asp Phe Leu Trp Ser Asp Gly Val Pro Leu Leu Tyr Glu Asn
755 760 765
Trp Asn Pro Gly Gln Pro Asp Ser Tyr Phe Leu Ser Gly Glu Asn Cys
770 775 780
Val Val Met Val Trp His Asp Gln Gly Gln Trp Ser Asp Val Pro Cys
785 790 795 800
Asn Tyr His Leu Ser Tyr Thr Cys Lys Met Gly Leu Val Ser Cys Gly
805 810 815
Pro Pro Pro Glu Leu Pro Leu Ala Gln Val Phe Gly Arg Pro Arg Leu
820 825 830
Arg Tyr Glu Val Asp Thr Val Leu Arg Tyr Arg Cys Arg Glu Gly Leu
835 840 845
Ala Gln Arg Asn Leu Pro Leu Ile Arg Cys Gln Glu Asn Gly Arg Trp
850 855 860
Glu Ala Pro Gln Ile Ser Cys Val Pro Arg Arg Pro Ala Arg Ala Leu
865 870 875 880
His Pro Glu Glu Asp Pro Glu Gly Arg Gln Gly Arg Leu Leu Gly Arg
885 890 895
Trp Lys Ala Leu Leu Ile Pro Pro Ser Ser Pro Met Pro Gly Pro
900 905 910
<210> 78
<211> 816
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> нейролигин 4
<400> 78
Met Ser Arg Pro Gln Gly Leu Leu Trp Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro
1 5 10 15
Val Cys Val Met Leu Asn Ser Asn Val Leu Leu Trp Leu Thr Ala Leu
20 25 30
Ala Ile Lys Phe Thr Leu Ile Asp Ser Gln Ala Gln Tyr Pro Val Val
35 40 45
Asn Thr Asn Tyr Gly Lys Ile Arg Gly Leu Arg Thr Pro Leu Pro Asn
50 55 60
Glu Ile Leu Gly Pro Val Glu Gln Tyr Leu Gly Val Pro Tyr Ala Ser
65 70 75 80
Pro Pro Thr Gly Glu Arg Arg Phe Gln Pro Pro Glu Pro Pro Ser Ser
85 90 95
Trp Thr Gly Ile Arg Asn Thr Thr Gln Phe Ala Ala Val Cys Pro Gln
100 105 110
His Leu Asp Glu Arg Ser Leu Leu His Asp Met Leu Pro Ile Trp Phe
115 120 125
Thr Ala Asn Leu Asp Thr Leu Met Thr Tyr Val Gln Asp Gln Asn Glu
130 135 140
Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Tyr Val Pro Thr Glu Asp Asp Ile His
145 150 155 160
Asp Gln Asn Ser Lys Lys Pro Val Met Val Tyr Ile His Gly Gly Ser
165 170 175
Tyr Met Glu Gly Thr Gly Asn Met Ile Asp Gly Ser Ile Leu Ala Ser
180 185 190
Tyr Gly Asn Val Ile Val Ile Thr Ile Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Leu
195 200 205
Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Gln Ala Ala Lys Gly Asn Tyr Gly Leu
210 215 220
Leu Asp Gln Ile Gln Ala Leu Arg Trp Ile Glu Glu Asn Val Gly Ala
225 230 235 240
Phe Gly Gly Asp Pro Lys Arg Val Thr Ile Phe Gly Ser Gly Ala Gly
245 250 255
Ala Ser Cys Val Ser Leu Leu Thr Leu Ser His Tyr Ser Glu Gly Leu
260 265 270
Phe Gln Lys Ala Ile Ile Gln Ser Gly Thr Ala Leu Ser Ser Trp Ala
275 280 285
Val Asn Tyr Gln Pro Ala Lys Tyr Thr Arg Ile Leu Ala Asp Lys Val
290 295 300
Gly Cys Asn Met Leu Asp Thr Thr Asp Met Val Glu Cys Leu Arg Asn
305 310 315 320
Lys Asn Tyr Lys Glu Leu Ile Gln Gln Thr Ile Thr Pro Ala Thr Tyr
325 330 335
His Ile Ala Phe Gly Pro Val Ile Asp Gly Asp Val Ile Pro Asp Asp
340 345 350
Pro Gln Ile Leu Met Glu Gln Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Asp Ile Met
355 360 365
Leu Gly Val Asn Gln Gly Glu Gly Leu Lys Phe Val Asp Gly Ile Val
370 375 380
Asp Asn Glu Asp Gly Val Thr Pro Asn Asp Phe Asp Phe Ser Val Ser
385 390 395 400
Asn Phe Val Asp Asn Leu Tyr Gly Tyr Pro Glu Gly Lys Asp Thr Leu
405 410 415
Arg Glu Thr Ile Lys Phe Met Tyr Thr Asp Trp Ala Asp Lys Glu Asn
420 425 430
Pro Glu Thr Arg Arg Lys Thr Leu Val Ala Leu Phe Thr Asp His Gln
435 440 445
Trp Val Ala Pro Ala Val Ala Thr Ala Asp Leu His Ala Gln Tyr Gly
450 455 460
Ser Pro Thr Tyr Phe Tyr Ala Phe Tyr His His Cys Gln Ser Glu Met
465 470 475 480
Lys Pro Ser Trp Ala Asp Ser Ala His Gly Asp Glu Val Pro Tyr Val
485 490 495
Phe Gly Ile Pro Met Ile Gly Pro Thr Glu Leu Phe Ser Cys Asn Phe
500 505 510
Ser Lys Asn Asp Val Met Leu Ser Ala Val Val Met Thr Tyr Trp Thr
515 520 525
Asn Phe Ala Lys Thr Gly Asp Pro Asn Gln Pro Val Pro Gln Asp Thr
530 535 540
Lys Phe Ile His Thr Lys Pro Asn Arg Phe Glu Glu Val Ala Trp Ser
545 550 555 560
Lys Tyr Asn Pro Lys Asp Gln Leu Tyr Leu His Ile Gly Leu Lys Pro
565 570 575
Arg Val Arg Asp His Tyr Arg Ala Thr Lys Val Ala Phe Trp Leu Glu
580 585 590
Leu Val Pro His Leu His Asn Leu Asn Glu Ile Phe Gln Tyr Val Ser
595 600 605
Thr Thr Thr Lys Val Pro Pro Pro Asp Met Thr Ser Phe Pro Tyr Gly
610 615 620
Thr Arg Arg Ser Pro Ala Lys Ile Trp Pro Thr Thr Lys Arg Pro Ala
625 630 635 640
Ile Thr Pro Ala Asn Asn Pro Lys His Ser Lys Asp Pro His Lys Thr
645 650 655
Gly Pro Glu Asp Thr Thr Val Leu Ile Glu Thr Lys Arg Asp Tyr Ser
660 665 670
Thr Glu Leu Ser Val Thr Ile Ala Val Gly Ala Ser Leu Leu Phe Leu
675 680 685
Asn Ile Leu Ala Phe Ala Ala Leu Tyr Tyr Lys Lys Asp Lys Arg Arg
690 695 700
His Glu Thr His Arg Arg Pro Ser Pro Gln Arg Asn Thr Thr Asn Asp
705 710 715 720
Ile Ala His Ile Gln Asn Glu Glu Ile Met Ser Leu Gln Met Lys Gln
725 730 735
Leu Glu His Asp His Glu Cys Glu Ser Leu Gln Ala His Asp Thr Leu
740 745 750
Arg Leu Thr Cys Pro Pro Asp Tyr Thr Leu Thr Leu Arg Arg Ser Pro
755 760 765
Asp Asp Ile Pro Leu Met Thr Pro Asn Thr Ile Thr Met Ile Pro Asn
770 775 780
Thr Leu Thr Gly Met Gln Pro Leu His Thr Phe Asn Thr Phe Ser Gly
785 790 795 800
Gly Gln Asn Ser Thr Asn Leu Pro His Gly His Ser Thr Thr Arg Val
805 810 815
<210> 79
<211> 2314
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> PTPRz1
<400> 79
Met Arg Ile Leu Lys Arg Phe Leu Ala Cys Ile Gln Leu Leu Cys Val
1 5 10 15
Cys Arg Leu Asp Trp Ala Asn Gly Tyr Tyr Arg Gln Gln Arg Lys Leu
20 25 30
Val Glu Glu Ile Gly Trp Ser Tyr Thr Gly Ala Leu Asn Gln Lys Asn
35 40 45
Trp Gly Lys Lys Tyr Pro Thr Cys Asn Ser Pro Lys Gln Ser Pro Ile
50 55 60
Asn Ile Asp Glu Asp Leu Thr Gln Val Asn Val Asn Leu Lys Lys Leu
65 70 75 80
Lys Phe Gln Gly Trp Asp Lys Thr Ser Leu Glu Asn Thr Phe Ile His
85 90 95
Asn Thr Gly Lys Thr Val Glu Ile Asn Leu Thr Asn Asp Tyr Arg Val
100 105 110
Ser Gly Gly Val Ser Glu Met Val Phe Lys Ala Ser Lys Ile Thr Phe
115 120 125
His Trp Gly Lys Cys Asn Met Ser Ser Asp Gly Ser Glu His Ser Leu
130 135 140
Glu Gly Gln Lys Phe Pro Leu Glu Met Gln Ile Tyr Cys Phe Asp Ala
145 150 155 160
Asp Arg Phe Ser Ser Phe Glu Glu Ala Val Lys Gly Lys Gly Lys Leu
165 170 175
Arg Ala Leu Ser Ile Leu Phe Glu Val Gly Thr Glu Glu Asn Leu Asp
180 185 190
Phe Lys Ala Ile Ile Asp Gly Val Glu Ser Val Ser Arg Phe Gly Lys
195 200 205
Gln Ala Ala Leu Asp Pro Phe Ile Leu Leu Asn Leu Leu Pro Asn Ser
210 215 220
Thr Asp Lys Tyr Tyr Ile Tyr Asn Gly Ser Leu Thr Ser Pro Pro Cys
225 230 235 240
Thr Asp Thr Val Asp Trp Ile Val Phe Lys Asp Thr Val Ser Ile Ser
245 250 255
Glu Ser Gln Leu Ala Val Phe Cys Glu Val Leu Thr Met Gln Gln Ser
260 265 270
Gly Tyr Val Met Leu Met Asp Tyr Leu Gln Asn Asn Phe Arg Glu Gln
275 280 285
Gln Tyr Lys Phe Ser Arg Gln Val Phe Ser Ser Tyr Thr Gly Lys Glu
290 295 300
Glu Ile His Glu Ala Val Cys Ser Ser Glu Pro Glu Asn Val Gln Ala
305 310 315 320
Asp Pro Glu Asn Tyr Thr Ser Leu Leu Val Thr Trp Glu Arg Pro Arg
325 330 335
Val Val Tyr Asp Thr Met Ile Glu Lys Phe Ala Val Leu Tyr Gln Gln
340 345 350
Leu Asp Gly Glu Asp Gln Thr Lys His Glu Phe Leu Thr Asp Gly Tyr
355 360 365
Gln Asp Leu Gly Ala Ile Leu Asn Asn Leu Leu Pro Asn Met Ser Tyr
370 375 380
Val Leu Gln Ile Val Ala Ile Cys Thr Asn Gly Leu Tyr Gly Lys Tyr
385 390 395 400
Ser Asp Gln Leu Ile Val Asp Met Pro Thr Asp Asn Pro Glu Leu Asp
405 410 415
Leu Phe Pro Glu Leu Ile Gly Thr Glu Glu Ile Ile Lys Glu Glu Glu
420 425 430
Glu Gly Lys Asp Ile Glu Glu Gly Ala Ile Val Asn Pro Gly Arg Asp
435 440 445
Ser Ala Thr Asn Gln Ile Arg Lys Lys Glu Pro Gln Ile Ser Thr Thr
450 455 460
Thr His Tyr Asn Arg Ile Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Ala Lys Thr Asn
465 470 475 480
Arg Ser Pro Thr Arg Gly Ser Glu Phe Ser Gly Lys Gly Asp Val Pro
485 490 495
Asn Thr Ser Leu Asn Ser Thr Ser Gln Pro Val Thr Lys Leu Ala Thr
500 505 510
Glu Lys Asp Ile Ser Leu Thr Ser Gln Thr Val Thr Glu Leu Pro Pro
515 520 525
His Thr Val Glu Gly Thr Ser Ala Ser Leu Asn Asp Gly Ser Lys Thr
530 535 540
Val Leu Arg Ser Pro His Met Asn Leu Ser Gly Thr Ala Glu Ser Leu
545 550 555 560
Asn Thr Val Ser Ile Thr Glu Tyr Glu Glu Glu Ser Leu Leu Thr Ser
565 570 575
Phe Lys Leu Asp Thr Gly Ala Glu Asp Ser Ser Gly Ser Ser Pro Ala
580 585 590
Thr Ser Ala Ile Pro Phe Ile Ser Glu Asn Ile Ser Gln Gly Tyr Ile
595 600 605
Phe Ser Ser Glu Asn Pro Glu Thr Ile Thr Tyr Asp Val Leu Ile Pro
610 615 620
Glu Ser Ala Arg Asn Ala Ser Glu Asp Ser Thr Ser Ser Gly Ser Glu
625 630 635 640
Glu Ser Leu Lys Asp Pro Ser Met Glu Gly Asn Val Trp Phe Pro Ser
645 650 655
Ser Thr Asp Ile Thr Ala Gln Pro Asp Val Gly Ser Gly Arg Glu Ser
660 665 670
Phe Leu Gln Thr Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Val Asp Glu Ser Glu Lys
675 680 685
Thr Thr Lys Ser Phe Ser Ala Gly Pro Val Met Ser Gln Gly Pro Ser
690 695 700
Val Thr Asp Leu Glu Met Pro His Tyr Ser Thr Phe Ala Tyr Phe Pro
705 710 715 720
Thr Glu Val Thr Pro His Ala Phe Thr Pro Ser Ser Arg Gln Gln Asp
725 730 735
Leu Val Ser Thr Val Asn Val Val Tyr Ser Gln Thr Thr Gln Pro Val
740 745 750
Tyr Asn Gly Glu Thr Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Ser Ser Glu Val Phe
755 760 765
Pro Leu Val Thr Pro Leu Leu Leu Asp Asn Gln Ile Leu Asn Thr Thr
770 775 780
Pro Ala Ala Ser Ser Ser Asp Ser Ala Leu His Ala Thr Pro Val Phe
785 790 795 800
Pro Ser Val Asp Val Ser Phe Glu Ser Ile Leu Ser Ser Tyr Asp Gly
805 810 815
Ala Pro Leu Leu Pro Phe Ser Ser Ala Ser Phe Ser Ser Glu Leu Phe
820 825 830
Arg His Leu His Thr Val Ser Gln Ile Leu Pro Gln Val Thr Ser Ala
835 840 845
Thr Glu Ser Asp Lys Val Pro Leu His Ala Ser Leu Pro Val Ala Gly
850 855 860
Gly Asp Leu Leu Leu Glu Pro Ser Leu Ala Gln Tyr Ser Asp Val Leu
865 870 875 880
Ser Thr Thr His Ala Ala Ser Glu Thr Leu Glu Phe Gly Ser Glu Ser
885 890 895
Gly Val Leu Tyr Lys Thr Leu Met Phe Ser Gln Val Glu Pro Pro Ser
900 905 910
Ser Asp Ala Met Met His Ala Arg Ser Ser Gly Pro Glu Pro Ser Tyr
915 920 925
Ala Leu Ser Asp Asn Glu Gly Ser Gln His Ile Phe Thr Val Ser Tyr
930 935 940
Ser Ser Ala Ile Pro Val His Asp Ser Val Gly Val Thr Tyr Gln Gly
945 950 955 960
Ser Leu Phe Ser Gly Pro Ser His Ile Pro Ile Pro Lys Ser Ser Leu
965 970 975
Ile Thr Pro Thr Ala Ser Leu Leu Gln Pro Thr His Ala Leu Ser Gly
980 985 990
Asp Gly Glu Trp Ser Gly Ala Ser Ser Asp Ser Glu Phe Leu Leu Pro
995 1000 1005
Asp Thr Asp Gly Leu Thr Ala Leu Asn Ile Ser Ser Pro Val Ser
1010 1015 1020
Val Ala Glu Phe Thr Tyr Thr Thr Ser Val Phe Gly Asp Asp Asn
1025 1030 1035
Lys Ala Leu Ser Lys Ser Glu Ile Ile Tyr Gly Asn Glu Thr Glu
1040 1045 1050
Leu Gln Ile Pro Ser Phe Asn Glu Met Val Tyr Pro Ser Glu Ser
1055 1060 1065
Thr Val Met Pro Asn Met Tyr Asp Asn Val Asn Lys Leu Asn Ala
1070 1075 1080
Ser Leu Gln Glu Thr Ser Val Ser Ile Ser Ser Thr Lys Gly Met
1085 1090 1095
Phe Pro Gly Ser Leu Ala His Thr Thr Thr Lys Val Phe Asp His
1100 1105 1110
Glu Ile Ser Gln Val Pro Glu Asn Asn Phe Ser Val Gln Pro Thr
1115 1120 1125
His Thr Val Ser Gln Ala Ser Gly Asp Thr Ser Leu Lys Pro Val
1130 1135 1140
Leu Ser Ala Asn Ser Glu Pro Ala Ser Ser Asp Pro Ala Ser Ser
1145 1150 1155
Glu Met Leu Ser Pro Ser Thr Gln Leu Leu Phe Tyr Glu Thr Ser
1160 1165 1170
Ala Ser Phe Ser Thr Glu Val Leu Leu Gln Pro Ser Phe Gln Ala
1175 1180 1185
Ser Asp Val Asp Thr Leu Leu Lys Thr Val Leu Pro Ala Val Pro
1190 1195 1200
Ser Asp Pro Ile Leu Val Glu Thr Pro Lys Val Asp Lys Ile Ser
1205 1210 1215
Ser Thr Met Leu His Leu Ile Val Ser Asn Ser Ala Ser Ser Glu
1220 1225 1230
Asn Met Leu His Ser Thr Ser Val Pro Val Phe Asp Val Ser Pro
1235 1240 1245
Thr Ser His Met His Ser Ala Ser Leu Gln Gly Leu Thr Ile Ser
1250 1255 1260
Tyr Ala Ser Glu Lys Tyr Glu Pro Val Leu Leu Lys Ser Glu Ser
1265 1270 1275
Ser His Gln Val Val Pro Ser Leu Tyr Ser Asn Asp Glu Leu Phe
1280 1285 1290
Gln Thr Ala Asn Leu Glu Ile Asn Gln Ala His Pro Pro Lys Gly
1295 1300 1305
Arg His Val Phe Ala Thr Pro Val Leu Ser Ile Asp Glu Pro Leu
1310 1315 1320
Asn Thr Leu Ile Asn Lys Leu Ile His Ser Asp Glu Ile Leu Thr
1325 1330 1335
Ser Thr Lys Ser Ser Val Thr Gly Lys Val Phe Ala Gly Ile Pro
1340 1345 1350
Thr Val Ala Ser Asp Thr Phe Val Ser Thr Asp His Ser Val Pro
1355 1360 1365
Ile Gly Asn Gly His Val Ala Ile Thr Ala Val Ser Pro His Arg
1370 1375 1380
Asp Gly Ser Val Thr Ser Thr Lys Leu Leu Phe Pro Ser Lys Ala
1385 1390 1395
Thr Ser Glu Leu Ser His Ser Ala Lys Ser Asp Ala Gly Leu Val
1400 1405 1410
Gly Gly Gly Glu Asp Gly Asp Thr Asp Asp Asp Gly Asp Asp Asp
1415 1420 1425
Asp Asp Asp Arg Gly Ser Asp Gly Leu Ser Ile His Lys Cys Met
1430 1435 1440
Ser Cys Ser Ser Tyr Arg Glu Ser Gln Glu Lys Val Met Asn Asp
1445 1450 1455
Ser Asp Thr His Glu Asn Ser Leu Met Asp Gln Asn Asn Pro Ile
1460 1465 1470
Ser Tyr Ser Leu Ser Glu Asn Ser Glu Glu Asp Asn Arg Val Thr
1475 1480 1485
Ser Val Ser Ser Asp Ser Gln Thr Gly Met Asp Arg Ser Pro Gly
1490 1495 1500
Lys Ser Pro Ser Ala Asn Gly Leu Ser Gln Lys His Asn Asp Gly
1505 1510 1515
Lys Glu Glu Asn Asp Ile Gln Thr Gly Ser Ala Leu Leu Pro Leu
1520 1525 1530
Ser Pro Glu Ser Lys Ala Trp Ala Val Leu Thr Ser Asp Glu Glu
1535 1540 1545
Ser Gly Ser Gly Gln Gly Thr Ser Asp Ser Leu Asn Glu Asn Glu
1550 1555 1560
Thr Ser Thr Asp Phe Ser Phe Ala Asp Thr Asn Glu Lys Asp Ala
1565 1570 1575
Asp Gly Ile Leu Ala Ala Gly Asp Ser Glu Ile Thr Pro Gly Phe
1580 1585 1590
Pro Gln Ser Pro Thr Ser Ser Val Thr Ser Glu Asn Ser Glu Val
1595 1600 1605
Phe His Val Ser Glu Ala Glu Ala Ser Asn Ser Ser His Glu Ser
1610 1615 1620
Arg Ile Gly Leu Ala Glu Gly Leu Glu Ser Glu Lys Lys Ala Val
1625 1630 1635
Ile Pro Leu Val Ile Val Ser Ala Leu Thr Phe Ile Cys Leu Val
1640 1645 1650
Val Leu Val Gly Ile Leu Ile Tyr Trp Arg Lys Cys Phe Gln Thr
1655 1660 1665
Ala His Phe Tyr Leu Glu Asp Ser Thr Ser Pro Arg Val Ile Ser
1670 1675 1680
Thr Pro Pro Thr Pro Ile Phe Pro Ile Ser Asp Asp Val Gly Ala
1685 1690 1695
Ile Pro Ile Lys His Phe Pro Lys His Val Ala Asp Leu His Ala
1700 1705 1710
Ser Ser Gly Phe Thr Glu Glu Phe Glu Thr Leu Lys Glu Phe Tyr
1715 1720 1725
Gln Glu Val Gln Ser Cys Thr Val Asp Leu Gly Ile Thr Ala Asp
1730 1735 1740
Ser Ser Asn His Pro Asp Asn Lys His Lys Asn Arg Tyr Ile Asn
1745 1750 1755
Ile Val Ala Tyr Asp His Ser Arg Val Lys Leu Ala Gln Leu Ala
1760 1765 1770
Glu Lys Asp Gly Lys Leu Thr Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Val
1775 1780 1785
Asp Gly Tyr Asn Arg Pro Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Gln Gly Pro
1790 1795 1800
Leu Lys Ser Thr Ala Glu Asp Phe Trp Arg Met Ile Trp Glu His
1805 1810 1815
Asn Val Glu Val Ile Val Met Ile Thr Asn Leu Val Glu Lys Gly
1820 1825 1830
Arg Arg Lys Cys Asp Gln Tyr Trp Pro Ala Asp Gly Ser Glu Glu
1835 1840 1845
Tyr Gly Asn Phe Leu Val Thr Gln Lys Ser Val Gln Val Leu Ala
1850 1855 1860
Tyr Tyr Thr Val Arg Asn Phe Thr Leu Arg Asn Thr Lys Ile Lys
1865 1870 1875
Lys Gly Ser Gln Lys Gly Arg Pro Ser Gly Arg Val Val Thr Gln
1880 1885 1890
Tyr His Tyr Thr Gln Trp Pro Asp Met Gly Val Pro Glu Tyr Ser
1895 1900 1905
Leu Pro Val Leu Thr Phe Val Arg Lys Ala Ala Tyr Ala Lys Arg
1910 1915 1920
His Ala Val Gly Pro Val Val Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly
1925 1930 1935
Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Val Leu Asp Ser Met Leu Gln Gln Ile
1940 1945 1950
Gln His Glu Gly Thr Val Asn Ile Phe Gly Phe Leu Lys His Ile
1955 1960 1965
Arg Ser Gln Arg Asn Tyr Leu Val Gln Thr Glu Glu Gln Tyr Val
1970 1975 1980
Phe Ile His Asp Thr Leu Val Glu Ala Ile Leu Ser Lys Glu Thr
1985 1990 1995
Glu Val Leu Asp Ser His Ile His Ala Tyr Val Asn Ala Leu Leu
2000 2005 2010
Ile Pro Gly Pro Ala Gly Lys Thr Lys Leu Glu Lys Gln Phe Gln
2015 2020 2025
Leu Leu Ser Gln Ser Asn Ile Gln Gln Ser Asp Tyr Ser Ala Ala
2030 2035 2040
Leu Lys Gln Cys Asn Arg Glu Lys Asn Arg Thr Ser Ser Ile Ile
2045 2050 2055
Pro Val Glu Arg Ser Arg Val Gly Ile Ser Ser Leu Ser Gly Glu
2060 2065 2070
Gly Thr Asp Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Met Gly Tyr Tyr Gln Ser
2075 2080 2085
Asn Glu Phe Ile Ile Thr Gln His Pro Leu Leu His Thr Ile Lys
2090 2095 2100
Asp Phe Trp Arg Met Ile Trp Asp His Asn Ala Gln Leu Val Val
2105 2110 2115
Met Ile Pro Asp Gly Gln Asn Met Ala Glu Asp Glu Phe Val Tyr
2120 2125 2130
Trp Pro Asn Lys Asp Glu Pro Ile Asn Cys Glu Ser Phe Lys Val
2135 2140 2145
Thr Leu Met Ala Glu Glu His Lys Cys Leu Ser Asn Glu Glu Lys
2150 2155 2160
Leu Ile Ile Gln Asp Phe Ile Leu Glu Ala Thr Gln Asp Asp Tyr
2165 2170 2175
Val Leu Glu Val Arg His Phe Gln Cys Pro Lys Trp Pro Asn Pro
2180 2185 2190
Asp Ser Pro Ile Ser Lys Thr Phe Glu Leu Ile Ser Val Ile Lys
2195 2200 2205
Glu Glu Ala Ala Asn Arg Asp Gly Pro Met Ile Val His Asp Glu
2210 2215 2220
His Gly Gly Val Thr Ala Gly Thr Phe Cys Ala Leu Thr Thr Leu
2225 2230 2235
Met His Gln Leu Glu Lys Glu Asn Ser Val Asp Val Tyr Gln Val
2240 2245 2250
Ala Lys Met Ile Asn Leu Met Arg Pro Gly Val Phe Ala Asp Ile
2255 2260 2265
Glu Gln Tyr Gln Phe Leu Tyr Lys Val Ile Leu Ser Leu Val Ser
2270 2275 2280
Thr Arg Gln Glu Glu Asn Pro Ser Thr Ser Leu Asp Ser Asn Gly
2285 2290 2295
Ala Ala Leu Pro Asp Gly Asn Ile Ala Glu Ser Leu Glu Ser Leu
2300 2305 2310
Val
- 103 -
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Комплекс, содержащий:
а) проникающий в клетку пептид;
5 б) по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп; и
в) по меньшей мере один пептидный агонист TLR, в котором компоненты а)-в) ковалентно связаны.
2. Комплекс по п. 1, где комплекс представляет собой рекомбинантный 10 полипептид или рекомбинантный белок.
3. Комплекс по п. 1 или п. 2, в котором проникающий в клетку пептид
(I) имеет аминокислотную последовательность указанного пептида, состоящую в целом из 5-50 аминокислот, предпочтительно в целом из 10-45 аминокислот,
15 более предпочтительно в целом из 15-45 аминокислот; и/или
(II) имеет аминокислотную последовательность, содержащую фрагмент минимального домена ZEBRA, где указанный минимальный домен простирается от остатка 170 до остатка 220 аминокислотной последовательности ZEBRA, представленной в SEQ ID NO: 3, в которой необязательно 1, 2, 3, 4 или 5
20 аминокислот замены, удалены и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку, или ее вариант.
4. Комплекс по п. 3, в котором проникающий в клетку пептид имеет аминокислотную последовательность, содержащую Ser (S) в положении,
25 эквивалентном положению 189 аминокислотной последовательности ZEBRA, указанной в SEQ ID NO: 3.
5. Комплекс по п. 3 или п. 4, в котором проникающий в клетку пептид имеет аминокислотную последовательность, содержащую:
30 (I) последовательность общей формулы (I):
Х1Х2ХзХ4Х5Х6Х7Х8Х9Х1оХ118Х1зХ14Х15Х16Х17; в которой 0, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот замены, удалены и/или добавлены без аннулирования указанной способности пептида проникать в клетку, где
Xi обозначает К, R или Н, предпочтительно Xi обозначает К или R;
Х2 обозначает R, К или Н, предпочтительно Х2 обозначает R или К;
Х3 обозначает Y, W или F, предпочтительно Х3 обозначает Y, W или F;
Х4 обозначает К, R или Н, предпочтительно Х4 обозначает К или R;
5 Х5 обозначает N или Q;
Xg обозначает R, К или Н, предпочтительно Xg обозначает R или К; Х7 обозначает V, I, М, L, F или А, предпочтительно Х7 обозначает V, I, М или L;
Х8 обозначает А, V, L, I или G, предпочтительно Х8 обозначает А или G;
10 Х9 обозначает S или Т;
Хю обозначает R, К или Н, предпочтительно Хю обозначает R или К;
Хц обозначает К, R или Н, предпочтительно Хц обозначает К или R;
Х13 обозначает R, К или Н, предпочтительно Х13 обозначает R или К;
Х14 обозначает А, V, L, I или G, предпочтительно Х14 обозначает А или G;
15 Х15 обозначает К, R или Н, предпочтительно Х15 обозначает К или R;
Хю обозначает F, L, V, I, Y, W или М, предпочтительно Xi6 обозначает F, Y или W; и
Х17 обозначает К, R или Н, предпочтительно Х17 обозначает К или R.
20 6. Комплекс по п. 3 или п. 4, в котором проникающий в клетку пептид
имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4-13, или вариантов последовательностей, у которых не аннулирована способность указанного пептида проникать в клетку, в
25 частности, вариантов последовательностей, характеризующихся по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью последовательности и более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью последовательности, без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку.
7. Комплекс по п. 6, в котором проникающий в клетку пептид имеет аминокислотную последовательность, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13), SEQ ID NO: 7 (CPP4/Z14), SEQ ID NO: 8 (CPP5/Z15) или SEQ ID NO: 11 (CPP8/Z18), или
5 вариантов последовательностей, у которых не аннулирована способность указанного пептида проникать в клетку, в частности, вариантов последовательностей, характеризующихся по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью последовательности и более предпочтительно по меньшей мере по меньшей мере 10 90% идентичностью последовательности, без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку.
8. Комплекс по любому из п.п. 1-7, в котором по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп выбран из группы, состоящей из: (I) пептида,
15 полипептида или белка, (II) полисахарида, (III) липида, (IV) липопротеина, (V) гликолипида, (VI) нуклеиновой кислоты и (VII) низкомолекулярного лекарственного средства или токсина.
9. Комплекс по любому из п.п. 1-8, в котором по меньшей мере один
20 антиген или антигенный эпитоп содержит или состоит по меньшей мере из
одного эпитопа патогена и/или по меньшей мере одного опухолевого эпитопа, предпочтительно по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп содержит или состоит по меньшей мере из одного опухолевого эпитопа.
25 10. Комплекс по любому из п.п. 1-9, в котором по меньшей мере один
антиген или антигенный эпитоп представляет собой по меньшей мере один CD4+ -эпитоп и/или по меньшей мере один С08+-эпитоп.
11. Комплекс по любому из п.п. 1-10, в котором по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп представляет собой пептид, полипептид или белок.
12. Комплекс по любому из п.п. 1-11, где комплекс содержит более одного антигена или антигенного эпитопа, в частности 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более антигенов или антигенных эпитопов.
5 13. Комплекс по п. 12, в котором несколько антигенов или антигенных
эпитопов, в частности, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более антигенов или антигенных эпитопов располагаются последовательно в комплексе.
14. Комплекс по любому из п.п. 1-13, в котором по меньшей мере один 10 пептидный агонист TLR представляет собой пептидный агонист TLR2, TLR4
и/или TLR5, предпочтительно пептидный агонист TLR2 и/или пептидный агонист TLR4.
15. Комплекс по п. 14, в котором по меньшей мере один пептидный агонист 15 TLR содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:
15 или варианта последовательности, в частности, варианта последовательности, который характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью последовательности, предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью последовательности и более предпочтительно по меньшей мере 90% 20 идентичностью последовательности, без аннулирования способности указанного пептида быть агонистом TLR.
16. Комплекс по любому из п.п. 1-15, где комплекс содержит более одного пептидного агониста TLR, в частности 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более
25 пептидных агонистов TLR.
17. Комплекс по любому из п.п. 1-16, в котором по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп расположен на С-конце проникающего в клетку пептида, при этом проникающий в клетку пептид и по меньшей мере один
30 антиген или антигенный эпитоп необязательно связаны с помощью
дополнительного компонента, например, линкера, спейсера или по меньшей мере одного пептидного агониста TLR.
18. Комплекс по п. 17, в котором по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп расположен на С-конце проникающего в клетку пептида, при этом проникающий в клетку пептид и по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп необязательно связаны с помощью дополнительного компонента, например, линкера, спейсера, но не с помощью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR.
19. Комплекс по любому из п.п. 2-18, где указанный комплекс представляет собой рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок и компоненты а)-в) располагаются в направлении N-конец -" С-конец главной цепи указанного комплекса в следующем порядке:
(а) компонент а) - компонент б) - компонент в); или (Р) компонент в) - компонент а) - компонент б), где компоненты могут быть связаны с помощью дополнительного компонента, в частности, линкера или спейсера.
20. Нуклеиновая кислота, кодирующая комплекс по любому из п.п. 1-19, где комплекс представляет собой полипептид или белок.
21. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 20.
22. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п. 21.
23. Способ получения комплекса, в котором комплекс представляет собой полипептид или белок, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 22 в культуральной среде и отделение указанного комплекса от культуральной среды или лизата клетки-хозяина после лизиса клетки-хозяина.
24. Способ получения комплекса по п. 23, в котором получают комплекс по любому из п.п. 1-19.
20.
26. Клетка по п. 25, где указанная клетка представляет собой
антигенпрезентирующую клетку, предпочтительно дендритную клетку.
27. Композиция, содержащая по меньшей мере один из следующих
5 ингредиентов:
(I) комплекс по любому из п. п. 6-19;
(II) нуклеиновую кислоту по п. 20;
(III) вектор по п. 21;
(IV) клетку-хозяина по п. 22; или
10 (V) клетку, загруженную комплексом по п. 25 или п. 26.
28. Вакцина, содержащая по меньшей мере один из следующих
ингредиентов:
(I) комплекс по любому из п. п. 6-19;
15 (II) нуклеиновую кислоту по п. 20;
(III) вектор по п. 21;
(IV) клетку-хозяина по п. 22; или
(V) клетку, загруженную комплексом по п. 25 или п. 26.
20 29. Фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один
комплекс по любому из п.п. 1-19 или по меньшей мере одну клетку по п. 25 или п. 26 и фармацевтически приемлемый носитель.
30. Фармацевтическая композиция по п. 29, где указанная композиция
25 содержит по меньшей мере два различных комплекса.
31. Комплекс по любому из п.п. 1-19 для применения в качестве
лекарственного средства.
30 32. Комплекс по любому из п.п. 1-19 для применения для предупреждения
и/или лечения заболеваний и/или нарушения, включая рак, гематологические нарушения, инфекционный заболевания, аутоиммунные нарушения и отторжения трансплантатов.
33. Комплекс для применения по п. 32, где заболевание, подлежащие
предупреждению и/или лечению, представляет собой рак и/или
гематологическое нарушение, предпочтительно злокачественную неоплазму
5 головного мозга или злокачественную неоплазму лимфоидной,
гематопоэтической и родственной ткани, наиболее предпочтительно глиобластому.
34. Клетка по п. 25 или п. 26 для применения для предупреждения и/или 10 лечения заболеваний и/или нарушения, включая рак, гематологические
нарушения, инфекционные заболевания, аутоиммунные нарушения и отторжения трансплантатов.
35. Клетка для применения по п. 34, где заболевание, подлежащие 15 предупреждению и/или лечению, представляет собой рак и/или
гематологическое нарушение, предпочтительно злокачественную неоплазму головного мозга или злокачественную неоплазму лимфоидной, гематопоэтической и родственной ткани, наиболее предпочтительно глиобластому.
36. Диагностическая композиция, содержащая комплекс по любому из п.п.
1-19.
37. Набор, содержащий комплекс по любому из п.п. 1-19, клетку по п. 25 25 или п. 26, композицию по п. 27, вакцину по п. 28 и/или фармацевтическую
композицию по п. 29 или п. 30.
38. Набор по п. 37, где набор дополнительно содержит листовку-вкладыш в
упаковку или листок с инструкцией по применению для лечения рака и/или
30 гематологического нарушения, предпочтительно злокачественной неоплазмы головного мозга или злокачественной неоплазмы лимфоидной, гематопоэтической и родственной ткани, наиболее предпочтительно глиобластомы, путем применения комплекса по любому из п. п. 1-19, клетки по
п. 25 или п. 26, композиции по п. п. 27, вакцины по п. 28 и/или фармацевтической композиции по п. 29 или п. 30.
39. Набор по п. 37 или п. 38 для применения в медицине.
40. Набор по любому из п.п. 37-39 для применения для предупреждения и/или лечения рака.
41. Способ лечения рака или инициации, усиления или удлинения противоопухолевого ответа у индивидуума, который нуждается в этом, включающий введение индивидууму комплекса, который содержит:
а) проникающий в клетку пептид;
б) по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп; и
в) по меньшей мере один пептидный агонист TLR,
в котором компоненты а)-в) ковалентно связаны.
42. Способ по п. 41, в котором комплекс по любому из п.п. 1-19, клетку по п. 25 или п. 26, композицию по п. 27, вакцину по п. 28 и/или фармацевтическую композицию по п. 29 или п. 30 вводят индивидууму.
43. Способ по п. 41 или п. 42, где индивидуум имеет рак.
44. Способ лечения рака и/или гематологического нарушения, предпочтительно злокачественной неоплазмы головного мозга или злокачественной неоплазмы лимфоидной, гематопоэтической и родственной ткани у индивидуума, который нуждается в этом, наиболее предпочтительно глиобластомы, включающий введение индивидууму комплекса, который содержит:
а) проникающий в клетку пептид;
б) по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп; и
в) по меньшей мере один пептидный агонист TLR,
в котором компоненты а)-в) ковалентно связаны.
45. Способ по п. 44, в котором комплекс по любому из п.п. 1-19, клетку по п. 25 или п. 26, композицию по п. 27, вакцину по п. 28 и/или фармацевтическую композицию по п. 29 или п. 30 вводят индивидууму.
буфер - gMFI: 13.38
EDA Z13 Mad5 ЗООнМ - gMFI: 14.54
буфер - gMFI: 13,38
Z13 Mad5 ЗООнМ - gMFI: 16.06
буфер - gMFI: 13.38 Mad5 ЗООнМ - gMFI: 14.81
250^
¦jH
50-
j'Ul
среда - gMFI: 15.12 LPS - gMFI: 25.41
CD40
Фиг. 1
¦ буфер-gMFI: 9.66
¦ EDA Z13 Mad5 ЗООнМ - gMFI: 10.45
¦ буфер - gMFI: 9.66
¦ Z13 MadS ЗООнМ - gMFI: 9.58
Я буфер - gMFI: 9.66
¦ MadS ЗООнМ - gMFI: 8.76
¦ среда -gMFI: 7.65
¦ LPS-gMFI: 29.31
HLADR
Фиг. 3
буфер - gMFI: 2.08
EDA Z13 Mad5 ЗООнМ - gMFI: 4.02
буфер - gMFI: 2.08
Z13 MadS ЗООнМ - gMFI: 2.07
буфер - gMFI: 2.08
MadS ЗООнМ -gMFI: 1.85
среда -gMFI: 1.52 LPS-gMFI: 35.28
CD83
Фиг. 4
разведение CFSE
Инъекция белка в дозе 2 нмоля EDA-MAD5
MA05+MPLA
"'- 0.34%
ttf 11? V
наивные
-0.14%
Инъекция белка в дозе 10 нмолей
EDA-MAD5
0.37%
EDA-Z13-MAD5
MAD5+MPLA
наивные
' 0.22% 1
"-s-^-i
G СШ
Фиг. 8
1200-1 11001000 900800700600500 40030020010ОО
контроль EDA Z13 MadS EDA MadS Mad5
MadS + MPLA
Фиг. 9
Фиг. 10
100-r-9080706050403020100-
til
-i *т 1 1-I
контроль EDA Z13Mad5
EDA MadS MadS
MadS + MPLA
10 20 30 40 50 60
Дни
-i 1 "¦ i r 1 1
10 20 30 40 50 60
Дни
Фиг. 11
контроль EDAZ13 MadS EDA Mad5
MadS
MadS + MPLA
Фиг. 12
Фиг. 13
HEK-hTLR2
Anaxa-Z13-Mad5
Z13-Mad5-Anaxa
-1-
среда 0,ЗмкМ 1мкМ ЗмкМ 0,ЗмкМ 1мкМ ЗмкМ Pam3CSK4
Высвобождение IL-8 в НЕК hTLR2
1.00.8-
S 0.6-
оо 0.4-¦
0.24
0.0-
Anaxa-Z13-Mad5
Z13-Mad5-Anaxa HH
T I
1ГЯВ ^И^^! ilium i^^^^^i - ^^^^м-
среда 0,ЗмкМ IMKM ЗМКМ 0,3MKM IMKM ЗмкМРатЗСЭК4
Фиг. 14
н а
1 5
Я H
1> I
С ae
о в
в U
3 e
В vO
ffl ^
1.5-
1.0-
0.5-
0.0
a 2 я aa я ее
<
S со
<
Фиг. 16
лень 5 лень 13
дни после имплантации опухоли
Фиг. 17
Z13Mad5 Апах
1200-1 110010009008007006005004003002001000-
дни после имплантации опухоли
Фиг. 18
Дни
Фиг. 19
1200-1 1100
1000900 800700600500400 300200100-
контроль EDAZ13 Mad 5 Z13 Mad5 Anax . Z13 Mad5 + MPLA
Фиг. 20
Фиг. 21
Фиг. 22
1200-1 1100
дни после имплантации опухоли
Фиг. 23
0,5 нмоля
KLRG1
PD-1
" О
к "
о "
К И
7.5n
s.c.
i.d.
i.m.
2.01.51.00.5"*
о.си-
контроль
интранодальное введение
Фиг. 26
t-f-t-
Vac2
Ш W3 W4 W5
8 о
¦ a
f..
м Й й
в s
. н
о а
В S to К
Фиг. 27
Vac3/взятие Vacl Vac2 образцов крови
Ч Н
н 1-
день 0 день 3 день 7 2.0-1
взятие образцо! крови
день 14
УасЗ/взятие взятие образцо] образцов крови крови
и ш
b о н -.4-
оЗ-
-г~-
Vac2
I
Vac3
Vae2
Vac3
Фиг. 28
О 1000 15000 10000 15000
IL-6 (пг/мл)
Фиг. 29
MadSAnaxa
Z13Mad5
буфер.
среда
5000 10000
TNF-a (пг/мл)
Фиг. 30
Z13Mad5Anaxa
Mad5Anaxa
Z13Mad5
EDAZ13Mad5
EDAMad5
буфер
среда
О 2500 5000 7500
IL-8 (пг/мл)
Фиг. 31
Фиг. 32
Mad5Anaxa-
Z13Mad5 + Pam3CSK4
ШШШШШШт
Z13Mad5Anaxa'
Фиг. 33
0.1-
кровь
ИЗОТИП
T "
кровь
Z13Mad5 + Anaxa
I 1
кровь BIL
Z13Mad5Anaxa
+ ИЗОТИП
Фиг. 34
О изотип
¦ Z13Mad5 + Апаха
• Z13Mad5Anaxa + изотип
.W...J:.-5- т~~ &-
только IFNy только TNFa IFNy и TNFa общий IFNy
Фиг. 35
too
Vac1 Vac2 Vac3
контроль Z13Mad5Anaxa
m.s.: 40 m.s.: 49
-j ¦
I .
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90100
время после имплантации (дни)
Фиг. 36
1100л
100- -9080706050- -403020100-
контроль
Z13 Mad5 Апаха
т-I-1-I Г I Щ I-I-I-I-I-I
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
дни после имплантации опухоли
Фиг. 37
1200-1 11001000900800700600400300200100
1009080-70Н 6050- -403020100
т*27
m.s: 32
-i 1 г-
10 15 20
контроль Z13 Mad 5 Апаха
i h 1
ii *i i*i
25 30 35 40 45 50
дни после имплантации опухоли
Фиг. 38
100-
80706050- -
4030100-
-*""• контроль
-*- Z13 Mad 5 Апаха
-at- Mad 5 Апаха
........
5 10 15 20 25 30 3^ 40 45 50
дни после имплантации опухоли
Фиг. 39
2 нмоля
а н и
- о
а ч
g О
S и
4.5-1 4.03.53.0-
0,5 нмоля
Дренирующие лимфатические узлы
Селезенка
210.5- • 0.40.30.20.1-0.Q-L1 Ц
tj> ос
4.03,83,02.52.0-' 1.0-•
0,50.0'
-.-L
Z13
Z14
Z13
Костный мозг
наивные
Z13
Z14
Фиг. 41
к ~
Ч ^
+ н Ч
+. 90
z и
* t
1.0т
0.8-
0.6-
0.4-
0.2-
контроль
Фиг. 43
2 нмоля
1.5-
1.0-
0.0-
S СО
Q Ш -а
я S
Ш ю ¦и
Фиг. 45
к о
Е? о
из ю о
1200
" 1000
Vac1 Vac2
день 5 день 13
дни после имплантации опухоли
Фиг. 46
8-i
62-
100-
H 11
80-
+ '
60-
H A
40-
20-
p = 0.0539
5> +
Фиг. 47
Фиг. 48
200-1
150-
100-
50-
контроль
Z13Mad8Anaxa
150-
100-
50-
контроль
Z13Mad8 Апаха
Фиг. 49
контроль
20 40 60 80 100 120 140
количество метастазов
наивные контроль Z13Mad11 Апаха
Фиг. 50
Фиг. 51
- о
Ь 90 § О
g U
1.51.00.50.0--
контроль
Фиг. 52
н - о
S U
1,0т
D.5-
а ё
5.0
н S
контроль
Фиг. 53
н -
1.0т
$ н Ь ее 0.5-§ О
§ и
а ё
0.0-
Фиг. 54
HLA-DR CD83 CD80 CD86
ПЗ изотип - буфер в качестве контроля
ЕЭ окрашивание - буфер в качестве контроля
F~1 изотип - белок
I I окрашивание - белок
- 4 -
- 3 -
- 4 -
- 4 -
- 5 -
- 5 -
- 6 -
- 6 -
- 7 -
- 7 -
- 8 -
- 8 -
- 9 -
- 9 -
10%.
- 10 -
- 13 -
- 13 -
- 14 -
- 14 -
- 15 -
-16 -
- 15 -
-16 -
- 17 -
-16 -
- 18 -
- 18 -
- 19 -
- 19 -
- 20 -
- 20 -
- 21 -
- 21 -
- 22 -
- 22 -
- 23 -
- 23 -
- 24 -
- 24 -
- 27 -
- 27 -
- 28 -
- 28 -
- 29 -
- 29 -
-31 -
- 30 -
-31 -
- 30 -
-31 -
- 32 -
- 34 -
- 36 -
- 37 -
- 37 -
- 38 -
- 38 -
- 39 -
- 39 -
- 44 -
- 44 -
- 45 -
- 45 -
- 46 -
- 46 -
- 47 -
- 47 -
- 48 -
- 48 -
- 51 -
- 51 -
- 52 -
- 52 -
- 53 -
- 53 -
- 54 -
- 54 -
- 55 -
- 55 -
- 56 -
- 56 -
- 57 -
- 57 -
- 58 -
- 58 -
- 59 -
- 59 -
- 60 -
- 60 -
- 61 -
- 61 -
- 62 -
- 62 -
- 63 -
- 63 -
- 64 -
- 64 -
- 65 -
- 65 -
- 66 -
- 66 -
- 67 -
- 67 -
- 68 -
- 68 -
- 69 -
- 69 -
- 70 -
- 70 -
- 71 -
- 71 -
- 72 -
- 72 -
- 73 -
- 73 -
- 74 -
- 74 -
- 75 -
- 75 -
- 76 -
- 76 -
- 77 -
- 77 -
- 78 -
- 78 -
- 79 -
- 79 -
- 80 -
- 80 -
- 81 -
- 81 -
- 82 -
- 82 -
- 83 -
- 83 -
- 84 -
- 84 -
- 85 -
- 85 -
- 86 -
- 86 -
- 87 -
- 87 -
- 89 -
- 88 -
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- 89 -
- 88 -
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- 89 -
- 90 -
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- 91 -
- 91 -
- 92 -
- 92 -
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- 93 -
- 93 -
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- 94 -
- 94 -
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
Также более предпочтительный указанный комплекс содержит
- 95 -
- 95 -
- 96 -
- 96 -
- 99 -
- 99 -
- 100 -
- 100 -
- 101 -
- 101 -
- 102 -
- 102 -
- 105 -
- 105 -
- 106 -
- 106 -
- 107 -
- 107 -
- 108 -
- 108 -
- 109 -
- 109 -
- Ill -
- Ill -
- 112 -
- 112 -
-113-
-113-
-114-
-114-
-115-
-115-
-116-
-116-
-117-
-117-
-118-
-118-
- 120 -
- 120 -
(II) посредством связи главная цепь/боковая цепь,
(II) посредством связи главная цепь/боковая цепь,
- 121 -
- 122 -
(а) компонент а) - компонент б) - компонент в); или
- 124 -
- 124 -
- 133 -
- 133 -
- 134 -
- 134 -
- 135 -
- 135 -
- 136 -
- 136 -
- 137 -
- 137 -
- 138 -
- 138 -
- 141 -
- 141 -
- 142 -
- 142 -
- 143 -
- 143 -
- 144 -
- 144 -
- 145 -
- 145 -
- 146 -
- 146 -
- 147 -
- 147 -
- 148 -
- 148 -
- 149 -
- 149 -
- 154 -
- 154 -
- 155 -
- 155 -
- 156 -
- 156 -
- 157 -
- 157 -
- 158 -
- 158 -
- 159 -
- 159 -
-161 -
- 160 -
-161 -
- 160 -
-161 -
- 162 -
- 163 -
- 163 -
- 164 -
- 164 -
- 165 -
-166 -
- 165 -
-166 -
- 167 -
-166 -
- 168 -
- 168 -
- 175 -
- 175 -
- 176 -
- 176 -
- 177 -
- 177 -
- 178 -
- 178 -
- 179 -
- 179 -
- 180 -
- 180 -
- 181 -
- 181 -
- 182 -
- 182 -
- 183 -
- 183 -
- 184 -
- 184 -
- 185 -
- 185 -
- 186 -
- 186 -
- 187 -
- 187 -
- 188 -
- 188 -
- 189 -
- 189 -
- 190 -
- 190 -
- 193 -
- 193 -
- 194 -
- 194 -
- 199 -
- 199 -
- 200 -
- 200 -
- 201 -
- 201 -
- 202 -
- 202 -
- 203 -
- 203 -
- 206 -
- 206 -
- 207 -
- 207 -
- 208 -
- 208 -
- 209 -
- 209 -
- 210 -
- 210 -
- 211 -
- 211 -
- 212 -
- 212 -
- 213 -
- 213 -
- 214 -
- 214 -
- 215 -
- 215 -
- 216 -
- 216 -
- 217 -
- 217 -
- 218 -
- 218 -
- 219 -
- 219 -
- 220 -
- 220 -
- 221 -
- 221 -
- 222 -
- 222 -
- 223 -
- 223 -
- 224 -
- 224 -
- 225 -
- 225 -
- 226 -
- 226 -
- 231 -
- 231 -
- 232 -
- 232 -
- 233 -
- 233 -
- 234 -
- 234 -
- 235 -
- 235 -
- 247 -
- 247 -
- 248 -
- 248 -
- 249 -
- 249 -
- 251 -
- 250 -
25. Клетка, загруженная комплексом по любому из п.п. 1-19.
- 251 -
- 250 -
25. Клетка, загруженная комплексом по любому из п.п. 1-19.
- 251 -
- 252 -
25. Клетка, загруженная комплексом по любому из п.п. 1-19.
- 253 -
- 253 -
- 254 -
- 254 -
1/55
1/55
1/55
1/55
1/55
1/55
2/55
2/55
3/55
3/55
3/55
3/55
4/55
4/55
4/55
4/55
6/55
6/55
6/55
6/55
7/55
7/55
7/55
7/55
7/55
7/55
7/55
7/55
7/55
7/55
7/55
7/55
8/55
8/55
9/55
9/55
10/55
10/55
11/55
11/55
11/55
11/55
12/55
12/55
14/55
14/55
14/55
14/55
14/55
14/55
16/55
16/55
16/55
17/55
17/55
18/55
18/55
18/55
18/55
18/55
18/55
19/55
19/55
20/55
20/55
21/55
21/55
22/55
22/55
23/55
23/55
25/55
25/55
25/55
25/55
25/55
25/55
25/55
25/55
26/55
26/55
26/55
26/55
26/55
26/55
27/55
27/55
27/55
27/55
27/55
27/55
28/55
28/55
28/55
28/55
28/55
28/55
28/55
28/55
29/55
29/55
30/55
30/55
30/55
30/55
30/55
30/55
31/55
31/55
31/55
31/55
33/55
34/55
34/55
35/55
35/55
36/55
36/55
36/55
36/55
36/55
36/55
37/55
37/55
37/55
37/55
37/55
37/55
38/55
38/55
38/55
38/55
39/55
39/55
40/55
40/55
40/55
40/55
40/55
40/55
41/55
41/55
41/55
41/55
41/55
41/55
41/55
41/55
42/55
42/55
43/55
43/55
43/55
43/55
44/55
44/55
44/55
44/55
45/55
45/55
45/55
45/55
45/55
45/55
45/55
45/55
46/55
46/55
47/55
47/55
47/55
47/55
47/55
47/55
47/55
47/55
47/55
47/55
47/55
47/55
48/55
48/55
49/55
49/55
49/55
49/55
49/55
49/55
49/55
49/55
49/55
49/55
49/55
49/55
50/55
50/55
50/55
50/55
50/55
50/55
51/55
51/55
52/55
52/55
52/55
52/55
53/55
53/55
53/55
53/55
53/55
53/55
53/55
53/55
53/55
53/55
54/55
54/55
54/55
54/55
|
