|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине и может быть использовано для производства гормона роста человека. Предложена плазмидная ДНК для синтеза гормона роста человека в клетках Escherichia coli, представленная вектором pET-21a(+), последовательность с T7 промотора по lac оператор модифицирована и охарактеризована SEQ ID NO:3, содержащим вставку гена, кодирующего белок, охарактеризованный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, оптимизированного по кодонному составу для экспрессии в клетках Escherichia coli. Также предложен штамм - продуцент гормона роста человека, на основе клеток Escherichia coli BL21 (DE3), трансформированных описанной плазмидной ДНК. Использование предложенных изобретений позволяет достичь значительного увеличения выхода мономерной формы соматотропина - до 80%.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине и может быть использовано для производства гормона роста человека. Предложена плазмидная ДНК для синтеза гормона роста человека в клетках Escherichia coli, представленная вектором pET-21a(+), последовательность с T7 промотора по lac оператор модифицирована и охарактеризована SEQ ID NO:3, содержащим вставку гена, кодирующего белок, охарактеризованный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, оптимизированного по кодонному составу для экспрессии в клетках Escherichia coli. Также предложен штамм - продуцент гормона роста человека, на основе клеток Escherichia coli BL21 (DE3), трансформированных описанной плазмидной ДНК. Использование предложенных изобретений позволяет достичь значительного увеличения выхода мономерной формы соматотропина - до 80%.
Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201791989 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2019.04.30
(22) Дата подачи заявки 2017.10.08
(51) Int. Cl.
C12N15/12 (2006.01) C07K14/61 (2006.01)
C12N 1/21 (2006.01)
C12N15/70 (2006.01) C12R 1/19 (2006.01)
(54)
ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ СОМАТОТРОПИНА ПРЕИМУЩЕСТВЕННО МОНОМЕРНОЙ ФОРМЫ
(96) 2017000100 (RU) 2017.10.08
(71) Заявитель: ДУХОВЛИНОВ ИЛЬЯ ВЛАДИМИРОВИЧ (RU)
(72) Изобретатель:
Духовлинов Илья Владимирович, Федорова Екатерина Алексеевна (RU) (57) Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине и может быть использовано для производства гормона роста человека. Предложена плазмидная ДНК для синтеза гормона роста человека в клетках Escherichia coli, представленная вектором pET-21a(+), последовательность с T7 промотора по lac оператор модифицирована и охарактеризована SEQ ID NO:3, содержащим вставку гена, кодирующего белок, охарактеризованный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, оптимизированного по кодон-ному составу для экспрессии в клетках Escherichia coli. Также предложен штамм - продуцент гормона роста человека, на основе клеток Escherichia coli BL21 (DE3), трансформированных описанной плазмидной ДНК. Использование предложенных изобретений позволяет достичь значительного увеличения выхода мономерной формы соматотропи-на - до 80%.
Штамм-продуцент соматотропина преимущественно мономерной формы
Описание
Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине и может быть использовано для производства гормона роста человека.
Гормон роста человека (соматотропин, соматропин, соматотропный гормон) - один из гормонов передней доли гипофиза. Вызывает выраженное ускорение линейного (в длину) роста, в основном за счет роста длинных трубчатых костей конечностей. Соматотропин оказывает мощное анаболическое и анти-катаболическое действие, усиливает синтез белка и тормозит его распад, а также способствует снижению отложения подкожного жира, усилению сгорания жира и увеличению соотношения мышечной массы к жировой. Кроме того, соматотропин принимает участие в регуляции углеводного обмена - он вызывает выраженное повышение уровня глюкозы в крови и является одним из антагонистов инсулина по действию на углеводный обмен. Описано также его действие на островковые клетки поджелудочной железы, иммуностимулирующий эффект, усиление поглощения кальция костной тканью и др.
Терапевтическое применение соматотропина:
1. Для лечения нарушений роста у детей.
2. Для лечения нервных расстройств. В некоторых работах показано, что
соматотропин улучшает память и познавательные функции, особенно у больных с
недостаточностью соматотропной функции гипофиза, и что введение соматотропина может
улучшать настроение и самочувствие больных с низким уровнем соматотропина в крови.
3. Для профилактики старческих заболеваний
4. Применение в спортивной медицине в качестве анаболического препарата.
Для получения соматотропина известно использование многих штаммов Escherichia coli - продуцентов на основе клеток W3110 (RU2287574C2, RU2433185C2, RU2337968C2, CN103173440 (A), AU731758 (В2), US5496713 (A), WO2005067601 (А2), US5932439 (А), ЕР0587427 (Al), CN104561020 (А)), К-12 (294, Х1776, ВЕ1201, RV308, MKD3207) (RU2337968C2, US4859600 (A), RU2287574C2, RU2433185C2, US4874703 (А), ЕР0089666 (А2), RU2031121CT), JM (83, 101, 105, 109) (ЕА200601793А1, WO2005067601 (А2), JPH0771495 (В2), AU731758 (В2)), В (RU2433185C2, ЕР0089666 (А2)), МТ (012, 1067510853) (AU731758 (В2), US5496713 (A), JPH09216832 (А)), НВ101 (JPS60234584 (А), ЕР0587427 (Al), US4518690 (А)), МС1061 (JPH0771495 (В2), US6010875 (А)), АТСС №39384, 39386 (ЕР0173215 (А2)), D1210 (ЕР0067540 (А2)), НМ10011-НМ10020 (KR20020080108 (A)), YK537 (CN103882015 (В)), chil776 (WO2005067601 (А2)), JA221 (WO2005067601 (А2)), С41 (DE3), С43 (De3) (CN103882015 (В)), К802 (RU1248280),
Rosetta, Rosetta (DE3) (CN103882015 (В)), BL21, BL21 (DE3) (RU2002133932A, WO2014046484 (Al), CN103882015 (В), WO2011103325 (Al), NZ555206 (A), WO2004005335 (A2), US2010041153 (Al), US2011237509 (Al), WO2009057622 (Al).
В ряде таких штаммов получаемый целевой белок - секретируемый, либо накапливаемый в периплазматическом пространстве, однако больший выход белка возможно получить, если белок накапливается в тельцах включения. Штаммы с таким типом накопления соматотропина составляют часть приведенных выше. Однако от качества получаемых телец включения зависит выход белка, пригодного для применения, -мономеров соматотропина, - при дальнейшей очистке. Задачей, на решение которой направлено создание настоящего изобретения, является создание штамма-продуцента соматотропина, позволяющего получить больший выход мономерной формы соматотропина, по сравнению с известными штаммами.
Известен штамм-продуцент соматотропина на основе клеток E.coli BL21 (DE3) и вектора рЕТ22Ь(+), белок синтезируется без His-тага, в тельцах включения (RU2002133932A). Данный штамм, а также содержащаяся в нем плазмида являются прототипом.
Авторами настоящего изобретения выявлено с использованием штамма на основе клеток Е.coli BL21 (DE3) и вектора рЕТ-21(+), белок синтезируется без His-тага, в тельцах включения, что специфичное изменение Т7 промотора и lac оператора позволяет достичь значительного увеличения выхода мономерной формы соматотропина, - на 34%, с 46% до 80%.
Технический результат от использования созданных плазмидной ДНК и штамма - в значительном увеличении выхода мономерной формы соматотропина. Данный технический эффект достигается благодаря изменению кинетики накопления целевого белка в клетке за счет внесения специфичных мутаций в Т7 промотор и lac оператор плазмидной ДНК.
Технический результат от использования группы изобретений выражается также в расширении спектра плазмид и штаммов-продуцентов для получения соматотропина, что немаловажно, учитывая широкое применение данного белка. Клинический опыт показал, что, оптимизируя лечение низкорослости, целесообразно иметь в арсенале несколько аналогичных фармацевтических препаратов, получаемых различными технологиями или даже методами. Длительное лечение (годами) одним препаратом соматотропина вызывает в организме уменьшение чувствительности к нему (Ошибка! Недопустимый объект гиперссылки.plai/poluchenie-gormona-rosta-v-biotehno).
Сущность изобретения
Предложена плазмидная ДНК pET-21a(+)somat для синтеза гормона роста человека в клетках Escherichia coli, представленная вектором рЕТ-21а(+), последовательность с Т7 промотора по lac оператор охарактеризована SEQ Ш N0:3, содержащим вставку гена, кодирующего белок гормон роста человека, охарактеризованный аминокислотной последовательностью SEQ Ш N0:1, оптимизированного по кодонному составу для экспрессии в клетках Escherichia coli. Последовательность с Т7 промотора по lac оператор вектора рЕТ-21а(+), охарактеризованная SEQ Ш N0:3, является модифицированной: в Т7 промотор введена мутация A6G, в lac оператор - мутации T22G, T23G. Последовательность расположения элементов в плазмидной ДНК понятна среднему специалисту в данной области.
Оптимизация по кодонному составу для организма экспрессии целевого гена может быть осуществлена вручную, либо с использованием специализированного программного обеспечения, например, на сайте molbiol.ru, либо encorbio.com/protocols/Codon.htm, на основе аминокислотной последовательности белка.
Также предложен штамм Escherichia coli BL21 (DE3)/pET-21a(+) - продуцент гормона роста человека, на основе клеток Escherichia coli BL21 (DE3), трансформированных описанной плазмидной ДНК.
Изобретение проиллюстрировано следующими графическими материалами:
Фиг. 1. Графики, демонстрирующие кинетику накопления соматотропина при индукции экспрессии кодирующего его гена в клетках штамма-продуцента с вариантами строения Т7 промотора и lac оператора: ось абсцисс - время, часы, ось ординат - процент целевого белка от общего; график, построенный по "точкам", - кинетика накопления соматотропина при строении Т7 промотора и lac оператора как охарактеризовано SEQ Ш N0:4, построенный по "треугольникам", - как охарактеризовано SEQ Ш N0:2, построенный по "квадратам", - как охарактеризовано SEQ Ш N0:3.
Фиг.2. Электрофореграмма плазмидной ДНК pET-21a(+)somat, 0,8% агарозный гель: 1 - маркер молекулярного веса DNA ladder GeneRuler 1 kb; 2 - отрицательный контроль -данная плазмидная ДНК без обработки рестриктазами; 3-6 - данная плазмидная ДНК, обработанная рестриктазой: 3 - Hindlll; 4 - Bglll; 5 - Ndel; 6 - Xhol;
Фиг.З. Электрофореграмма плазмидной ДНК pET-21a(+)somat, 0,8% агарозный гель: 1 - маркер молекулярного веса DNA ladder GenRuler 1 kb; 2 - отрицательный контроль -данная плазмидная ДНК без обработки рестриктазами; 3 - 8 - данная плазмидная ДНК, обработанная рестриктазами: 3 - Hindlll+BglII; 4 - Hindlll+Ndel; 5 - Hindlll+Xhol; 6 -Bglll+Ndel; 7 - Bglll+Xhol; 8 -Ndel+Xhol.
Авторами настоящего изобретения проведены лабораторные исследования, подтверждающие возможность реализации охарактеризованных изобретений. Полученные результаты исследований проиллюстрированы следующими примерами.
Пример 1. Создание плазмидной ДНК pET-21a(+)somat - вариантов с различиями в Т7 промоторе и lac операторе
1.1. Создание нуклеотидной последовательности, кодирующей гормон роста человека, и вариантов фрагмента плазмидной ДНК рЕТ-21а(+) с Т7 промотора по lac оператор
Аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:1, характеризующую гормон роста человека, без сигнальной последовательности, переводили в нуклеотидную с одновременной кодонной оптимизацией для экспрессии в клетках E.coli с использованием программы на сайте molbiol.ru и добавлением старт- и стоп-кодона, в одном из вариантов двух стоп-кодонов, а также сайтов рестрикции, фланкирующих получаемый ген. Рассчитанную нуклеотидную последовательность синтезировали химическим методом с помощью синтезатора ДНК ASM-800 (БИОССЕТ, Россия).
Был синтезирован также фрагмент плазмидной ДНК рЕТ-21а(+), ограниченный сайтами рестрикции Bgl II и Xba I, содержащий Т7 промотор и lac оператор, а именно три его варианта, содержащие, соответственно, нуклеотидные последовательности SEQ Ш N0:2 - SEQ ГО N0:4, характеризующие варианты фрагмента плазмидной ДНК рЕТ-21а(+) с Т7 промотора по lac оператор, - (1) без мутаций, (2) с мутацией A6G в Т7 промоторе и с мутациями T22G, T23G в lac операторе, (3) с мутацией C7G в Т7 промоторе и с мутацией Т16С в lac операторе.
1.2. Создание вариантов плазмидной ДНК pET-21a(+)somat
Полученные фрагменты ДНК, а также вектор рЕТ-21а(+) (Novagen, США) обрабатывали соответствующими рестриктазами по инструкции к данным ферментам. Далее полученные фрагменты очищались с использованием препаративного электрофореза и использовались в реакции лигирования.
Осуществлялась реакция лигирования очищенных рестрицированных фрагментов ДНК в очищенный рестрицированный вектор последовательно. Реакционная смесь содержала 2 мкл очищенного рестрицированного фрагмента ДНК, 3,5 мкл 10Х буфера для лигазы (IX буфер содержит 10 мМ Tris-HCl (рН 7,5 при 37°С), 10 мМ MgCh, 50 мМ NaCl, 0,1 мг/мл бычий сывороточный альбумин (БСА)) (Thermo Fisher Scientific Inc.), 3,5 мкл 50% полиэтиленгликоля 4000, 1 мкл рестрицированного вектора, 5 мкл Т4 лигазы (Thermo Fisher Scientific Inc.). Реакционная смесь доводилась до 35 мкл безнуклеазной водой и
инкубировалась при 22°С в течение 4 часов. Ферментативная реакция останавливалась инкубацией реакционной смеси при 65°С в течение 15 минут.
Смесь очищали от солей диализом на нитроцелюлозных фильтрах с диаметром пор 0,025 мкм (Millipore, США). Диализ проводили против раствора, содержащего 0,5 мМ ЭДТА в 10% глицерине, в течение 10 мин..
1.3.Создание штамма (вариантов) на основе клеток Escherichia coli DH10B/R для амплификации полученной плазмидной ДНК (вариантов)
Подготавливали компетентные клетки Escherichia coli штамма DH10B/R (Gibko BRL, США) с генотипом F-mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) cp80dlacZAM 15 А1асХ74 deoR recAl endAl araD139 A(ara,leu)769 galU galKX- rpsL nupG, и далее осуществляли их трансформацию полученной лигазной смесью.
Подготавливали клетки Е. coli для трансформации полученной плазмидной ДНК -получали компетентные клетки - следующим образом. Инкубировали клетки при +37°С в течение 16ч в 5 мл L-бульона, содержащего 1% триптон, 1% дрожжевой экстракт и 1% натрий хлористый. Разводили культуру свежим L-бульоном в 50-100 раз и выращивали на качалке при +37°С до оптической плотности 0,2-0,3 при длине волны 590 нм. При достижении оптической плотности более 0,3 культуру разводили свежим L-бульоном до оптической плотности 0,1 и растили 30 мин. Переносили 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осаждали клетки при +4°С на 5000g в течение 10 мин. Супернатант сливали, клетки ресуспендировали в 50 мл 0,1 М СаСЬ, охлажденного на льду. Инкубировали клетки 20 мин на льду. Осаждали клетки в течение 10 мин. при 5000 об./мин, +4°С. Супернатант сливали, клетки ресуспендировали в 3 мл 0,1 М СаСЬ, охлажденного на льду.
Трансформацию полученных компетентных клеток осуществляли методом электропорации. Использовали электропоратор Eporator (Eppendorf, Германия) и стерильные кюветы для электропорации (Eppendorf, Германия), объемом 100 мкл, щель 1 мм.
К 12 мкл компетентных клеток добавляли 1 мкл десятикратно разведенной лигазной смеси, осуществляли перемешивание и перенос в кювету, которую помещали в электропоратор. Трансформацию проводили при электрическом импульсе напряженностью 1,7 кВ длительностью 5 мсек. После трансформации клетки помещали в 1 мл SOC-среды (2% бактотриптон; 0,5% дрожжевой экстракт; 10 мМ NaCl; 2,5 мМ КС1; 10 мМ MgCh, 10 мМ MgS04; 20 мМ глюкоза) и инкубировали в течение 40 минут при 37°С, после чего вмазывали в LB-arap с антибиотиком на чашке Петри и инкубировали 16 ч при 37°С.
Выросшие на чашке Петри с ампициллином клоны E.coli анализировали на наличие используемой в настоящем эксперименте плазмидной ДНК, с одновременным переносом анализируемых клонов клеток E.coli на отдельные чашки Петри с селективной средой. Из таких клонов выделяли плазмидную ДНК и анализировали секвенированием с использованием специфичных праймеров. Это позволило отобрать клоны-продуценты разработанных плазмидных ДНК (вариантов). Данные штаммы использовали для получения вариантов плазмидной ДНК pET-21a(+)somat. 1.4.Получение вариантов плазмидной ДНК pET-21a(+)somat
Наработку и выделение плазмидной ДНК осуществляли следующим образом. Единичную колонию клеток продуцента плазмид E.coli, выращенную на LB-arape в чашке Петри с добавлением ампициллина, инокулировали в стандартную жидкую среду LB (Gibko BRL, США), 2-10 мл, содержащую ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, и осуществляли ферментацию при 37°С в термостатированном шейкере роторного типа в течение 16 ч при 250 об./мин. Полученную культуру бактериальных клеток осаждали центрифугированием при 4000g в течение 10 мин. при +4°С. Удаляли супернатант и из осадка клеток выделяли плазмидную ДНК с помощью набора для выделения плазмидной ДНК (Цитокин, Россия), по инструкции к набору. Выделенную плазмидную ДНК анализировали электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле.
Пример 2. Создание штамма-продуцента соматотропина преимущественно мономерной формы
2.1. Создание штамма-продуцента гормона роста человека на основе клеток Escherichia coli BL21 (DE3) (вариантов)
Выделенными согласно описанной в Примере 1 методике вариантами плазмидной ДНК pET-21a(+)somat, с различиями в строении Т7 промотора и lac оператора трансформировали клетки E.coli штамма BL21 (DE3) (Invitrogen, USA), с генотипом F-ompT hsdSB (гВ-mB-) gal dcm rnel31 (DE3), содержащие в геноме ШеЗ лизоген и мутацию гпе131. Мутированный ген гпе (гпе13Г) кодирует усеченную форму РНКазы Е, что уменьшает внутриклеточное разрушение мРНК, приводя к увеличению ее ферментативной стабильности. Ion- и ompT-мутации по генам протеаз позволяют получать непротеолизированные рекомбинантные белки в больших количествах.
Получали компетентные клетки E.coli BL21(DE3) и трансформировали их полученной плазмидной ДНК (вариантами) как описано в Примере 1, вместо десятикратно разведенной лигазной смеси использовали раствор плазмиды в воде. Выросшие клоны проверяли на наличие целевой плазмидной ДНК с использованием секвенирования
выделенной плазмидной ДНК. В итоге выбрали клон клеток E.coli, который далее использовали для получения гормона роста человека (штамм-продуцент), варианты.
2.2. Выявление штамма-продуцента соматотропина преимущественно мономерной формы из созданных вариантов
2.2.1. Индукция синтеза соматотропина в штамме-продуценте (вариантах) Индукцию экспрессии получали и с использованием ИПТГ, и 0,2% лактозы.
2.2.1.1. при индукции синтеза соматотропина 0.2% лактозой по методу Штудиера Для культивирования полученных штаммов-продуцентов использовали
стандартную агаризованную LB-среду, содержащую ампициллин в концентрации 50 мкг/мл и глюкозу в концентрации 1% для блокирования неспецифической экспрессии.
Индукцию экспрессии проводили при достижении культурой клеток оптической плотности 0.6-0.8 оптических единиц при длине волны 600 нм.
Для автоиндукции экспрессии по методу Штудиера использовали среду PYP-5052, состоящую из 1% пептона (Gibco, США), 0.5% дрожжевого экстракта (Gibco, США), 50 мМ Na2HP04, 50 мМ К2НР04, 25 мМ (NH4)2S04, 2 мМ MgS04, 0.5% глицерола, 0.05% глюкозы и 0.2% лактозы, в качестве индуктора использовали 0.2% лактозу (Studier FW. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif. 2005 May;41(l):207-34).
В среду PYP-5052, содержащую ампициллин в концентрации 50 мкг/мл, инокулировали единичную колонию штамма-продуцента (варианта). Ферментацию проводили при +37°С в термостатированном шейкере роторного типа при 250 об. мин. в течение 14 часов до отсутствия существенного изменения ОШоо за 1 час. Отбирали аликвоту на анализ экспрессии гена, кодирующего соматотропин, методом электрофореза в ПААГ, каждый час, по окончании индукции биомассу осаждали центрифугированием при 9000g.
2.2.1.2. при индукции синтеза соматотропина ИПТГ
Индукцию экспрессии гена с использованием ИПТГ осуществляли следующим образом. Инкубировали клетки единичной колонии штамма-продуцента (вариантов) при +37°С в термостатированном шейкере роторного типа при 250 об./мин. в течение 16ч в LB среде (1% триптон, 1% дрожжевой экстракт и 1% натрий хлористый), содержащей ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Разводили культуру свежей LB средой в 50 раз и выращивали в термостатированном шейкере роторного типа при 250 об./мин. +37°С до достижения культурой клеток оптической плотности 0.6-0.8 оптических единиц при длине волны 600 нм. После этого осуществляли индукцию экспрессии рекомбинантного гена добавлением ИПТГ к культуре до конечной концентрации от 1 мМ до 2 мМ. Индукцию
проводили в течение 14 часов, отбирали пробу для анализа с использованием SDS-PAGE каждый час, по окончании индукции биомассу осаждали центрифугированием. 2.2.2. Анализ отобранных проб
Клетки ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторид, из расчета на 1 г клеток 5-7 мл буфера. Суспензию клеток обрабатывали ультразвуком 7 раз по 30 сек с интервалом в 30 сек (частота ультразвука составляет 22 кГц), отбирали пробу на анализ SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis with Sodium dodecyl sulfate). Процент содержания целевого белка от общего белка при использовании анализируемых трех штаммов-продуцентов соматотропина приведен на графиках Фиг. 1.
Лизат центрифугировали 10 мин. при +4°С, 5000 g. Отбирали пробу надосадочной жидкости (супернатанта) и осадка для анализа локализации белка и оценки его растворимости, с использованием SDS-PAGE. Анализ продемонстрировал нерастворимость полученного соматотропина.
2.2.1.3. Описание кинетики накопления соматотропина
Кинетика накопления соматотропина в клетках штамма-продуцента (вариантов) была выявлена с использованием дензитометрического сканирования электрофореграмм спектра белков, полученного из лизатов клеток E.coli штамма-продуцента (вариантов) после индукции экспрессии, с помощью программы ImageJ, и оказалась сходной при индукции экспрессии 0,2% лактозой и ИПТГ (от 1 мМ до 2 мМ) и приведена на Фиг. 1.
2.2.2. Рефолдинг
После окончания индукции осажденную биомассу лизировали с помощью 3 циклов соникации по 30 сек с перерывом в 2 мин на льду. Затем трехкратно отмывали тельца включения 0.2 М дезоксихолятом натрия, что позволяло получить препарат без примесей бактериальных эндотоксинов.
Растворяли тельца включения в 8 М растворе мочевины, затем осуществляли рефолдинг белка в буфере для рефолдинга (0.1М Tris рН 8.0, 0.2 тМ ЭДТА) с 0.5 М L-аргинином.
Проводили хроматографическую очистку полученного раствора белка. Около 1200 мл обессоленного супернатанта помещали на 20 мл S-Sepharose колонку, уравновешенную 20 мМ Tris-HCl рН 8.0. Колонку отмывали 200 мл 50 мМ Tris рН 8.0, белок элюировали 160 мл линейного градиента 50 мМ Tris рН 8.0 1М NaCl. Фракция очищенного на S-Sepharose гормона роста человека была помещена на S-100 колонку (2.5*80 см), предварительно уравновешенную фосфатным буфером. Собирали фракции по 1 мл, анализировали электрофоретически в 20% ПААГ-ДДс-Na, фракции с целевым белком объединяли,
концентрацию белка в них определяли по методу Бред форд. Колонку откалибровывали с использованием 10 мг бычьего сывороточного альбумина, овальбумина и соевого трипсинового ингибитора.
Формы соматотропина анализировали с использованием электрофореза в ПААГ при нанесении препаратов рефолдированного соматотропина, полученных с использованием трех штаммов и двух типов индукторов.
Удалось получить наибольший процент мономерной формы соматотропина, 80%, при использовании штамма-продуцента со строением Т7 промотора и lac оператора как охарактеризовано SEQ ГО N0:3. 46% Мономерной формы соматотропина получили с использованием штамма-продуцента со строением Т7 промотора и lac оператора как охарактеризовано SEQ ГО N0:2, т.е. оригинального для вектора рЕТ-21а(+). При внесении же мутаций в данные элементы как охарактеризовано SEQ ГО N0:4 получили значительное уменьшение выхода мономерной формы соматотропина при рефолдинге, до 21%. Полученные данные подтверждают нетривиальность предложенного решения.
Таким образом, оптимальным для получения высокого процента мономерной формы соматотропина является использование штамма Escherichia coli BL21 (DE3)/pET-21a(+), со строением Т7 промотора и lac оператора плазмидной ДНК рЕТ-21а(+) как охарактеризовано SEQ ГО N0:3.
Пример 3. Характеристика штамма-продуцента соматотропина преимущественно мономерной формы
3.1. Рестрикционный анализ
Из полученного штамма-продуцента мономерной формы соматотропина выделяли плазмидную ДНК как описано выше.
При обработке выделенной плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции наблюдали картину, приведенную на Фиг. 2 и 3, которая характеризует созданный штамм-продуцент соматотропина преимущественно мономерной формы. Соответствие полученных результатов ожидаемым было подтверждено.
3.2. Культуральные характеристики
Культуральные свойства Грам-отрицательные прямые палочки, размером 1,1-1,52,0-3,0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы. Интервал рН 5-7. Катализируют D-глюкозу и некоторые другие углеводы с образованием кислоты и газа, не сбраживают лактозу, арабинозу и галактозу. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, не образуют H2S, но гидролизуют мочевину.
Ростовые характеристики Клетки растут в интервале температур от 8°С до 43°С, интервал для культивирования - 28-38°С, оптимум роста при 37°С.
Описание визуальных и цитологических наблюдений при стандартных условиях культивирования Клетки хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих ампициллин. На агаризованной среде - колонии гладкие, круглые, слабо выпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную светорассеивающую суспензию, при хранении без перемешивания оседают на дно.
Штамм-продуцент соматотропина преимущественно мономерной формы Перечень последовательностей
<110> Духовлинов И.В.
<120> Штамм-продуцент соматотропина преимущественно мономерной формы <160> 2
<210> 1
<211> 191 <212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<220>
<223> гормон роста человека без секреторной последовательности <400> 1
Phe
Pro
Thr
Ile
Pro
Leu
Ser
Arg
Leu
Phe
Asp
Asn
Ala
Met
Leu
Arg
Ala
His
Arg
Leu
His
Gln
Leu
Ala
Phe 25
Asp
Thr
Tyr
Gln
Glu 30
Phe
Glu
Glu
Ala
Tyr 35
Ile
Pro
Lys
Glu
Gln 40
Lys
Tyr
Ser
Phe
Leu
Gln
Asn
Pro
Gln
Thr
Ser
Leu
Cys
Phe
Ser 55
Glu
Ser
Ile
Pro
Thr 60
Pro
Ser
Asn
Arg
Glu
Glu
Thr
Gln
Gln
Lys
Ser
Asn
Leu
Glu
Leu
Leu
Arg
Ile
Ser
Leu
Leu
Leu
Ile
Gln
Ser 85
Trp
Leu
Glu
Pro
Val 90
Gln
Phe
Leu
Arg
Ser 95
Val
Phe
Ala
Asn
Ser 100
Leu
Val
Tyr
Gly
Ala 105
Ser
Asp
Ser
Asn
Val 110
Tyr
Asp
Leu
Leu
Lys
115
Asp
Leu
Glu
Glu
Arg 120
Ile
Gln
Thr
Leu
Met 125
Gly
Arg
Leu
Glu
Asp
130
Gly
Ser
Pro
Arg
Thr 135
Gly
Gln
Ile
Phe
Lys
140
Gln
Thr
Tyr
Ser
Lys
Phe
Asp
Thr
Asn
Ser
His
Asn
Asp
Asp
Ala
Leu
Leu
Lys
Asn
Tyr
145
150
155
160
Gly
Leu
Leu
Tyr
Cys 165
Phe
Arg
Lys
Asp
Met
170
Asp
Lys
Val
Glu
Thr 175
Phe
Leu
Arg
Ile
Val 180
Gln
Cys
Arg
Ser
Val 185
Glu
Gly
Ser
Cys
Gly 190
Phe
<210> 2 <211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> T7 промотор, GG, lac оператор
<400> 2
ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcc 45
<210> 3 <211> 45 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> T7 промотор с мутацией A6G, GG, lac оператор с мутациями T22G, T23G
<400> 3
ttaatgcgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca aggcc 45
<210> 4
<211> 45 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> T7 промотор с мутацией C7G, GG, lac оператор с мутацией T16C
<400> 4
ttaataggac tcactatagg ggaattgtga gcggacaaca attcc 45
Штамм-продуцент соматотропина преимущественно мономерной формы
Формула изобретения
1. Плазмидная ДНК pET-21a(+)somat для синтеза гормона роста человека в клетках Escherichia coli, представленная вектором рЕТ-21а(+), последовательность с Т7 промотора по lac оператор охарактеризована SEQ ГО N0:3, содержащим вставку гена, кодирующего белок гормон роста человека, охарактеризованный аминокислотной последовательностью SEQ ГО N0:1, оптимизированного по кодонному составу для экспрессии в клетках Escherichia coli.
2. Штамм Escherichia coli BL21 (DE3)/pET-21a(+) - продуцент гормона роста человека на основе клеток Escherichia coli BL21 (DE3), трансформированных плазмидной ДНК по п.1.
Штамм-продуцент соматотропина преимущественно мономерной формы
А. КЛАССИФИКАЦИЯ ПРЕДМЕТА ИЗОБРЕТЕНИЯ:
C12N15/12 С07К14/61 C12N1/21 C12N15/70
C12R 1/19 (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01)
Согласно Международной патентной классификации (МПК) или национальной классификации и МПК
Б. ОБЛАСТЬ ПОИСКА:
Минимум просмотренной документации (система классификации и индексы МПК)
C12N 15/12, 1/21, 15/70, С07К 14/61, C12R 1/19
Дата действительного завершения патентного поиска:
15 марта 2018 (15.03.2018)
Наименование и адрес Международного поискового органа: Федеральный институт промышленной собственности
РФ, 125993,Москва, Г-59, ГСП-3, Бережковская наб., д. 30-1.Факс: (499) 243-3337, телетайп: 114818 ПОДАЧА
Уполномоченное лицо :
fyz^? -- Е.И.Евграфова
Телефон № (495) 531-6481
|
