(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к применению гемопексина, свободного не связанного с клетками гемоглобина и альфа-1-микроглобулина в качестве маркеров преэклампсии.
Евразийское (21) 201791978 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. G01N33/68 (2006.01)
2018.01.31
(22) Дата подачи заявки 2016.03.16
(54) БИОМАРКЕРЫ ПРЕЭКЛАМПСИИ
(31) PA 2015 70146; PA 2015 70794
(32) 2015.03.16; 2015.12.03
(33) DK
(86) PCT/EP2016/055619
(87) WO 2016/146647 2016.09.22
(71) Заявитель:
А1М ФАРМА АБ (SE)
(72) Изобретатель:
Ханссон Стефан, Акерстром Бо, Грам Магнус Горан (SE)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Настоящее изобретение относится к применению гемопексина, свободного не связанного с клетками гемоглобина и альфа-1-микроглобулина в качестве маркеров преэклампсии.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-544518ЕА/022
БИОМАРКЕРЫ ПРЕЭКЛАМПСИИ Область изобретения
Настоящее изобретение относится к биомаркерам преэклампсии, преэклампсии с ранним началом (до 34 недели беременности) и преэклампсии с поздним началом. Более того, идентифицированы биомаркеры для прогнозирования исходов для плода и матери у женщин, страдающих преэклампсией. Этими биомаркерами являются i) гемопексин (Нрх), Нрх в комбинации с альфа-1-микроглобулином (AIM), или iii) НрХ в комбинации с AIM и свободным циркулирующим фетальным гемоглобином (свободный HbF) . Панель маркеров может быть дополнена другими маркерами, выбранными из комплекса гаптоглобин-фетальный гемоглобин (Hp-HbF), гаптоглобина (Hp), гемоксигеназы-1 (НО-1) и тема. Маркерами исхода для плода могут быть CD163 и CD163 в комбинации с Нрх. Можно использовать как уровни, так и активность Нрх (последняя обозначается как Нрх-а).
Уровень техники, к которому относится изобретение
Преэклампсия (РЕ) осложняет 3-8% всех беременностей1 и клинически проявляется во второй половине беременности. Клиническими характеристиками, которые определяют РЕ, являются гипертензия и протеинурия, возникающие после 2 0 недель беременности. РЕ является потенциально серьезным состоянием, которое без лечения может привести к эклампсии, характеризующейся генерализованными приступами. Родственное заболевание, синдром HELLP (гемолиз, повышенный уровень ферментов печени и низкое количество тромбоцитов) развивается более быстро и сопровождается гемолизом у матери. Единообразная классификация различных форм гипертензивных состояний в ходе беременности является важной для возможности единообразной постановки диагноза. На сегодняшний день предложено несколько биомаркеров для скрининга в первом и втором триместре, однако ни один из них еще не используется в клинической практике. Более того, некоторые биомаркеры были предложены для облегчения постановки диагноза клиницистами и для контроля пациентов.
Патогенез РЕ понятен не до конца, однако последние
исследования показали, что вовлечен внеклеточный фетальный гемоглобин (HbF). С использованием технологий микрочипов экспрессии генов и протеомики Centlow et al10 продемонстрировали активацию гена HbF и накопление свободного HbF в просвете сосудов зрелой плаценты при РЕ. Позднее Olsson et al11 продемонстрировали, что женщины, у которых диагностирована РЕ, имеют повышенные уровни в плазме свободного HbF и взрослого гемоглобина (НЬА), и Anderson et al12 продемонстрировали, что сывороточные уровни HbF и AIM были повышены уже на 10 неделе беременности, при которой впоследствии развивалась РЕ. Было предположено, что HbF запускает образование активных форм кислорода (ROS) и, тем самым, индуцирует окислительное повреждение плаценты и последующую проницаемость фето-материнского барьера (включая HbF) . Эта сверхпродукция и просачивание HbF приводят к повышенной концентрации HbF в материнской плазме и дальнейшей индукции ROS и воспаления. Впоследствии общее эндотелиальное повреждение приводит к гипертензии и протеинурии, которые являются признаками РЕ. Описание изобретения
Одним из основных компонентов крови является белок гемоглобин (НЬ), транспортирующий кислород белок, который упакован в эритроциты с высокой плотностью. НЬ представляет собой тетрамер, состоящий из четырех субъединиц глобина, каждая из которых содержит группу тема в активном центре. У взрослых наиболее распространенной изоформой НЬ является НЬА - тетрамер, который состоит из двух а- и двух р-субъединиц ((Х2Р2) • В плоде преобладает HbF, и он состоит из двух а-цепей и двух у-цепей
(0C2Y2) • Более того, гем состоит из органического протопорфирина IX с кольцевой структурой, который содержит двухвалентный атом железа (Fe2+) с высокой аффинностью к свободному кислороду (Ог) • НЬ с двухвалентным железом, связанный с Ог, обозначают как окси-НЬ. Аутоокисление окси-НЬ представляет собой самопроизвольную реакцию окисления-восстановления, в конечном итоге приводящую к образованию НЬ с трехвалентным железом (Fe3+) (metHb), НЬ с четырехвалентным железом, свободного тема и различных ROS,
включающих свободные радикалы. Эти соединения являются химически в высокой степени реакционноспособными и обладают потенциалом к индукции повреждения тканей и разрушения клеток посредством одноэлектронных реакций с биомолекулами.
НЬ обычно расположен в мембранах эритроцитов. Аутоокислению внутриклеточного окси-Hb и последующему образованию свободных радикалов в основном препятствует супероксиддисмутаза (SOD), каталаза и глутатионпероксидаза (GPx). Однако значительные количества НЬ выходят из эритроцитов в нормальных условиях и массивные количества могут высвобождаться при патологических состояниях, вовлекающих гемолиз. Таким образом, развился ряд защитных механизмов, как в плазме, так и вне сосудов, для противодействия химической угрозе от свободного НЬ экспонированным тканям.
Гаптоглобин (Hp), возможно, является наиболее хорошо исследованной системой выведения НЬ. Он связывает свободный НЬ в плазме19,20 и связывание с рецептором макрофагов CD16321 выводит образовавшийся комплекс Нр-Hb из крови. Молекула Hp состоит из двух цепей, а и |3, и существует два аллельных варианта а-цепей: а.1 и а.2. В результате, в человеческой популяции встречается три фенотипических варианта: Hp 1-1, 1-2 и 2-2. Свободный гем в крови секвестрируется гемопексином (Нрх), и комплекс Нрх-гем выводится из кровотока посредством рецептора гепатоцитов CD9125. Во внутриклеточном компартменте гемоксигеназа (НО) является наиболее важным белком катаболизма тема, конвертирующим гем в свободное железо, биливердин и монооксид углерода (СО) . Плазменный и внесосудистый белок альфа-1-микроглобулин (AIM) связывает и деградирует гем и восстанавливает metHb. AIM также действует в качестве антиоксиданта путем восстановления и ковалентного связывания последующих ROS и радикалов, образовавшихся посредством свободного НЬ и из других источников.
В плацентах при РЕ был продемонстрирован увеличенный синтез и накопление свобдного HbF. Более того, увеличенные концентрации HbF были показаны в материнской плазме/сыворотке как при ранней, так и поздней беременности, осложненной РЕ, что указывает на то,
что он является важным фактором, этиологически связывающим первую и вторую стадии. Было показано, что HbF вызывает повреждение ткани плаценты и окислительный стресс, что в результате приводит к его просачиванию через барьер кровь-плацента в материнский кровоток. Для предотвращения токсичности НЬ и метаболитов его деградации: тема и свободного железа, несколько защитных выводящих систем защищает организм человека. Hp является наиболее хорош описанную систему выведения НЬ, которая связывает свободный НЬ и транспортирует его в макрофаги и гепатоциты, где его захват облегчается посредством опосредуемого рецептором CD163 эндоцитоза. Во внутреклеточном компартменте первичных макрофагов НЬ деградируется в гем посредством лизосом, и гем, более того, катаболизируется посредством НО-1 в биливердин, СО и свободное железо. Затем биливердин восстанавливается в билирубин, который экскретируется желчной системой. СО обладают эффектами расширения сосудистой сети, поскольку он расслабляет гладкомышечный слой сосудов и, следовательно, снижает кровяное давление.
Нрх представляет собой циркулирующий гликопротеин плазмы, в основном синтезируемый в печени. Он действует в качестве реагента острой фазы и связывает свободный гем с высокой аффинностью. На аффинность тема к Нрх влияет несколько факторов, таких как сниженное значение рН, восстановленное состояние атома железа тема, связывание оксида азота (N0) с атомом железа тема или присутствие хлоридных анионов и двухвалентных ионов металлов. Катионы натрия повышают аффинность тема к Нрх. Комплекс Нрх-гем транспортируется в макрофаги и гепатоциты, экспрессирующие родственный рецептору LDL белок 1 (LRP1, также известный как CD91), что облегчает захват комплекса Нрх-гем. Действительно, было показано, что Нрх препятствует повреждению эндотелия в модели на мышах. Помимо связывания тема, Нрх также обладает другими видами активности в плазме (активность Нрх) . Они включают ферментативную активность сериновой протеазы, ингибирование клеточной адгезии, ослабление воспаления и ингибирование рецептора ангиотензина II в моноцитах, эндотелиальных клетках и аортальных кольцах крысы.
Исходя из результатов, полученных в экспериментах, описанных в настоящем описании, настоящее изобретение относится к:
i) гемопексину и альфа-1-микроглобулину в качестве маркеров
преэклампсии для преэклампсии как с ранним, так и с поздним
началом,
ii) гемопексину, альфа-1-микроглобулину и свободному не связанному с клетками фетальному гемоглобину в качестве маркеров преэклампсии для преэклампсии как с ранним, так и с поздним началом.
iii) гемопексину или AIM в качестве маркеров преэклампсии для преэклампсии как с ранним, так и с поздним началом,
iv) гаптоглобину в качестве маркера преэклампсии и преэклампсии с поздним началом,
v) комплексу гаптоглобин-фетальный гемоглобин в качестве маркера преэклампсии,
vi) гемопексину и НО-1 (гемоксигеназа) в качестве маркеров пр е э кл амп сии,
vii) комбинации гемопексина, гаптоглобина, свободного фетального гемоглобина и гемоксигеназы в качестве маркеров пр е э кл амп сии,
viii) комбинации гемопексина, гаптоглобина, свободного фетального гемоглобина, гемоксигеназы и альфа-1-микроглобулина в качестве маркеров преэклампсии,
IX) применению комбинации гемопексина и гаптоглобина в качестве маркеров преэклампсии
х) применению комбинации гемопексина, гаптоглобина и комплекса гаптоглобин-фетальный гемоглобин в качестве маркеров пр е э кл амп сии,
XI) применению комбинации гемопексина и гемоксигеназы в качестве маркеров преэклампсии,
XIi) применению комбинации гемопексина, гаптоглобина, свободного фетального гемоглобина и гемоксигеназы в качестве маркеров преэклампсии,
xiii) применению комбинации гемопексина, гаптоглобина, свободного фетального гемоглобина, гемоксигеназы и альфа-1
микроглобулина в качестве маркеров преэклампсии,
xiv) применению комбинации активности гемопексина, уровней гемопексина, гаптоглобина, свободного фетального гемоглобина, гемоксигеназы и альфа-1-микроглобулина в качестве маркеров пр е э кл амп сии,
xv) применению любого из i)- v) вместе со свободным циркулирующим фетальным гемоглобином и/или вместе с альфа-1-микроглобулином в качестве маркеров преэклампсии,
xvi) способу диагностики преэклампсии, преэклампсии ранней стадии или преэклампсии с поздним началом,
xvii) способу оценки прогрессирования или регрессии преэклампсии, и
xviii) способу оценки эффективности лечения преэклампсии,
xix) применению любого из описанных выше вместе с а)
фетальным гемоглобином и/или Ь) альфа-1-микроглобулином для
оценки эффективности лечения преэклампсии;
в любое из вышеупомянутых положений также может быть включен гем.
Вышеупомянутые маркеры и комбинацию маркеров можно использовать в качестве предиктивных, прогностических и/или диагностических маркеров.
Настоящее изобретение также относится к предиктивным биомаркерам ряда исходов для матери и плода:
i) свободный фетальный гемоглобин, и/или гаптоглобин, и/или
гемопексин в качестве предиктивных маркеров для прогнозирования
поступления в отделение интенсивной терапии новорожденных (NICU)
ii) гемопексин в качестве предиктивного маркера недоношенности.
iii) применение любого из i)-ii) вместе с альфа-1-микроглобулином в качестве предиктивных маркеров для прогнозирования поступления в NICU или недоношенности.
Определение
В настоящем описании, если нет иных указаний, форма единственного числа означает "один или несколько".
Гемоглобин А (НЬА) . Существует несколько форм НЬ. Взрослый НЬ (НЬА) состоит из двух полипептидных альфа- и двух бета-цепей
(Hba, Hb|3) , каждая из которых содержит непептидную группу тема, которая обратимо связывает одну молекулу кислорода. Hb А2, другой компонент взрослого НЬ, состоит из двух альфа-цепей и двух дельта-цепей (Hba, Hb8) .
Фетальный гемоглобин (HbF). HbF, фетальный гемоглобин, состоит из двух альфа-цепей и двух гамма-цепей. Термин "фетальный НЬ" относится к свободному HbF или любой субъединице HbF и включает структуры HbF в полипептидной (белковой) или нуклеотидной (РНК) форме, за исключением случаев, когда его используют в качестве мишени для лечения. "HbF", "fHbF" или "свободный HbF" относится к свободному фетальному гемоглобину, как определено ниже.
Термин "свободный НЬ" в настоящем описании относится к свободному НЬ в целом и включает общий свободный НЬ, свободный НЬА, свободный НЬА2, свободный HbF, любую свободную субъединицу
НЬ (например, цепь Hba, HbP, НЬ8 или НЬу) или любую их комбинацию. Кроме того, он включает эти структуры НЬ либо в полипептидной (белковой), либо в нуклеотидной (РНК) форме, за исключением случаев, когда его используют в качестве мишени для лечения. Термин "свободный" относится к любому НЬ в жидкой фазе кровеносной системы (такой как плазма, сыворотка и т.д.), т.е. снаружи, но не внутри, эритроцитов, и, таким образом, он также включает связанный с белком НЬ в кровотоке, т.е. не связанный с клетками; примером связанного с белком НЬ является НЬ, связанный с Hp или Нрх. Более того, термин также охватывает НЬ, содержащийся в STMB. Как правило, термин охватывает НЬ, который не содержится в интактных эритроцитах. Таким образом, термин "свободный НЬ" охватывает все формы НЬ, которые не содержатся в интактных эритроцитах.
В настоящем описании термин "свободный", как используют, среди прочих, в выражениях "свободный НЬ", "свободный фетальный НЬ" или "свободные субъединицы НЬ (например, цепи Hba, HbP, НЬб или НЬу) " относится к НЬ, фетальному НЬ или субъединицам НЬ, свободно циркулирующим в биологической жидкости, в противоположность клеточному НЬ, который относится к молекулам,
находящимся внутри клеток. Термин "свободный" в этом значении, таким образом, в основном используется для отличения свободного НЬ от НЬ, который присутствует в интактных эритроцитах. Термин не исключает НЬ, содержащийся в STMB, и не исключает НЬ, связанный, например, с белками, но, тем не менее, находящийся вне эритроцитов. То же самое обозначение применимо к HbF, который в контексте настоящего изобретения относится к свободному HbF, который в контексте настоящего изобретения используется для отличения свободного HbF от HbF, который присутствует в интактных эритроцитах. Термин не исключает HbF, содержащийся в STMB, и не исключает HbF, связанный, например, с белками, но, тем не менее, находящийся вне эритроцитов.
Термины "маркер" или "биомаркер" в настоящем описании относятся к биомолекуле, предпочтительно, полипептиду или белку, которая дифференциально присутствует в образце, взятом от беременной самки млекопитающего, предпочтительно женщины.
Термин "панель биомаркеров" используют в настоящем описании для комбинации двух или более биомаркеров, которые должны количественно определяться с получением как надежных, так и воспроизводимых результатов. Таким образом, панель биомаркеров для прогнозирования, диагностики или оценки риска развития РЕ, может представлять собой комбинацию Нрх и AIM, или она может представлять собой комбинацию Нрх, AIM и свободного HbF. Предусматривается, что следующие биомаркеры, которые могут быть включены в такую панель биомаркеров, должны быть выбраны из группы, состоящей из Hp-HbF, Hp, НО-1 и тема.
Термин "биологический образец от беременной самки млекопитающего", термин "объект" или его эквиваленты означает образец непосредственно с материнской стороны; таким образом, образец не получают, например, от плода или из амниотической жидкости. Термин "образец из плода или фетоплацентарного кровотока" относится к образцу, взятому из плода, как например, из амниотической жидкости, кровеносной системы плода, в том числе из пуповинной вены и кровеносных сосудов плаценты.
Как используют в рамках изобретения фетальный НЬ, сокращенно обозначаемый как HbF, относится к типу НЬ, который
является основным компонентом НЬ в плоде. Фетальный НЬ имеет две полипептидных альфа-цепи и две полипептидных гамма-цепи (Hba, НЬу) . В контексте настоящего изобретения HbF представляет собой свободный циркулирующий HbF, т.е. вне клеток, однако он может быть связан с другими веществами, такими как белок, связанный с Hp, хотя связывание с другими белками не исключается.
Как используют в рамках изобретения, альфа-1-микроглобулин (AIM) относится к представителю семейства липокалинов, называемому альфа-1-микроглобулином. Альфа-1-микроглобулин может упоминаться в литературе как AIM, aim, HI30, белок НС и альфа-1-микрогликопротеин.
Ниже обсуждаются различные способы по изобретению. В отдельных абзацах приведены многие различные детали, касающиеся, например, характера образцов, эталонных или контрольных величин, времени взятия образцов, предпочтительной панели маркеров и т.д. Описание, приведенное под одним заголовком, также касается других заголовков, но не обязательно повторяется. Это означает, что даже если под некоторыми из заголовков нет упоминания, например, о характере образцов и т.д., очевидно, что объект, охватываемый аспектом диагностики, также применим к ситуациям, упоминаемым в других аспектах.
Биомаркер(ы) преэклампсии и способ диагностики преэклампсии
В соответствии с настоящим изобретением, предусматривается способ диагностики или облегчения диагностики РЕ, включающий следующие стадии:
(a) получение биологического образца от беременной женщины (например, образец крови, плазмы, мочи, цереброспинальной жидкости (CSF), биоптат плаценты (CVS), образец внутриматочной жидкости и/или амниотической жидкости и слюны));
(b) количественное определение уровня одного или нескольких биомаркеров, выбранных из Hp-HbF, Hp, Нрх, НО-1 и уровня биомаркера(ов): свободного HbF и/или AIM; или
количественное определение уровня Нрх и НО-1; или
количественное определение уровня одного или нескольких
биомаркеров, выбранных из Hp-HbF, Hp, и уровня биомаркера(ов), выбранного из i) свободного HbF и/или AIM и/или ii) Нрх и НО-1;
и определение активности Нрх,
(с) сравнение уровня количественно определенного биомаркера(ов) в образце с эталонной величиной,
для определения того, имеет ли беременная женщина РЕ, или имеет ли она повышенный риск развития РЕ.
Более конкретно, изобретение относится к способу диагностики или облегчения диагностики РЕ, включающему следующие стадии:
(a) получение биологического образца от беременной женщины (например, образца крови, плазмы, сыворотки, мочи, цереброспинальной жидкости (CSF), биоптата плаценты (CVS), образца внутриматочной жидкости и/или амниотической жидкости и слюны));
(b) количественное определение уровня i) Нрх, ii) Нрх и AIM, или iii) Нрх, AIM и свободного HbF, и необязательно одного или нескольких из Hp, НО-1 и Hp-HbF,
(c) сравнение уровня количественно определенного
биомаркера(ов) в образце с эталонной величиной,
для определения того, имеет ли беременная женщина РЕ, или имеет ли она увеличенный риск развития РЕ.
В некоторых случаях (Ь) может быть расширен включением также AIM и необязательно одного или нескольких из Hp, НО-1 и Hp-HbF (т.е. без использования Нрх или свободного HbF).
Как упоминалось выше, предпочтительная панель маркеров в соответствии с настоящим изобретением и для применения в прогнозировании или диагностике или оценке риска развития РЕ представляет собой: Нрх и AIM, необязательно дополненные одним или несколькими из следующих: свободный HbF, Hp-HbF, Hp, НО-1.
Контрольные данные или эталонную величину получают путем количественного определения уровня вышеупомянутых маркеров у беременной женщины, у которой не развилась РЕ. Поскольку уровень индивидуального маркера может изменяться в зависимости от срока
беременности, предпочтительно, чтобы контрольная или эталонная величина была получена от беременной женщины, имеющей тот же срок беременности (±1 неделя). Как видно из фиг.11 настоящего описания, нормальный уровень, а также уровень, указывающий на риск развития РЕ, изменяется в зависимости от срока беременности, на котором взяты образцы. Однако, даже если такие данные для эталонной величины не доступны, из фиг.11 понятно, что различие между контрольным уровнем и уровнем риска возрастает с течением времени, так что если исследуемый образец, взятый на 2 0 неделе, сравнивают с эталонной величиной, полученной на 15 неделе, должны быть получены те же результаты.
Понятно, что в способах, упомянутых в настоящем описании, эталонная величина относится к фактическому рассматриваемому маркеру.
Образец может быть взят на любом сроке беременности. Приведенные примеры показывают, что образец может быть получен с б недели по 2 0 неделю или с 34 недели по 4 0 неделю беременности. Преимуществом наличия надежных маркеров или панели маркеров уже на низком сроке беременности является то, что можно рано спрогнозировать риск развития РЕ и что для снижения или предотвращения симптомов РЕ может быть начато профилактическое лечение. Более того, как видно из примеров, панель маркеров по изобретению может обеспечить оценку того, ожидается ли раннее или позднее начало РЕ.
Предпочтительно биологический образец представляет собой образец крови, такой как образец плазмы или сыворотки, поскольку такие образцы наиболее легко получить.
Также изобретение относится к получению данных, способствующих прогнозированию, диагностике, оценке или риску развития РЕ или облегчающих оценку конкретного терапевтического или профилактического лечения РЕ.
Если желательно, образец можно подготавливать для повышения способности к обнаружению одного или нескольких биомаркеров. Как правило, подготовка образца включает фракционирование образца и сбор фракций, для которых определено, что они содержат
биомаркер(ы). Способы предварительного фракционирования включают, например, центрифугирование, экстракцию РНК/ДНК, эксклюзионную хроматографию, ионообменную хроматографию, гель-электрофорез, жидкостную хроматографию, фрагментацию белков и денатурацию белков.
Стадию количественного определения уровня биомаркера(ов)
можно проводить, например, посредством иммунологического анализа
(например, ELISA или другого твердофазного иммуноанализа, такого
как SPRIA или усиленный ELISA, так называемый IMRAMP), анализа
на белковых чипах, амплификации способом количественной ПЦР в
реальном времени, усиленной поверхностью лазерной
десорбции/ионизации (SELDI), высокоэффективной жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии, гибридизации in situ, иммуногистохимии, хемилюминесценции, нефелометрии/тербометрии, флоресценции в латеральном потоке или чистой или поляризованной флуоресценции или электрофореза. Однако специалисту в данной области будет понятно, что этот перечень способов является неполным и не только эти способы являются подходящими способами, которые можно использовать в рамках настоящего изобретения для количественного определения уровня биомаркера(ов).
HbF, обнаруживаемый и/или количественно определяемый способами по изобретению, включает любую из цепей Hb (Hba, НЬ(3, Hb8 и НЬу) или любую их комбинацию. Гамма-цепь указывает на HbF, в то время как, например, бета- и дельта-цепи указывают на НЬА. Исходя из настоящего описания, специалисту в данной области будет известно, какую цепь(и) НЬ следует количественно определять. Молекула Hp состоит из двух цепей: а и |3, и существует два аллельных варианта a-цепи: al и а2. В результате, в человеческой популяции встречается три фенотипических варианта: Hpl-1, Нр1-2 и Нр2-2. Термин Hp включает все три варианта. AIM существует в свободной форме и в форме комплекса, связанный с другими белками, такими как IgA, альбумин, протромбин и т.д., и низкомолекулярными соединениями и веществами, включая, например, гем или радикалы. Исходя из настоящего описания, специалисту в данной области будет
известно, какую форму(ы) AIM следует количественно определять.
Для количественного определения уровня биомаркера в
соответствии с настоящим изобретением можно использовать
иммунологический анализ (иммуноанализ). Иммуноанализ
представляет собой анализ, в котором используется антитело для специфического связывания антигена (например, Нрх). Иммуноанализ характеризуется использованием конкретных связывающих свойств конкретного антитела для выделения, нацеливания на и/или количественного определения антигена. Таким образом, в предусматриваемых условиях иммуноанализа конкретные антитела связываются с конкретным белком по меньшей мере в два раза выше фонового уровня и по существу не связываются на значительном уровне с другими белками, присутствующими в образце. С использованием очищенных маркеров и их последовательностей нуклеиновых кислот можно получать антитела, которые специфически связываются с маркером (например, Нрх) любым из подходящих способов, известных в данной области [см., например, Coligan35] .
Уровень(и) биомаркеров можно количественно определять, например, с использованием иммунологического анализа. В частности, иммунологический анализ представляет собой ELISA. Однако, как описано выше, также можно использовать другие иммунологические принципы.
Уровень свободного HbF (или другого биомаркера) можно определять путем количественного определения РНК свободного HbF (или другого биомаркера). В частности, матричную РНК (мРНК) свободного HbF количественно определяют с использованием ПЦР в реальном времени. В случаях, где также определяют общий уровень НЬ, этот уровень также можно определять путем количественного определения мРНК альфа-цепи НЬ, например, с использованием ПЦР в реальном времени.
Как правило, образец, полученный от индивидуума, можно приводить в контакт с антителом, которое специфически связывает маркер. Необязательно, антитело можно фиксировать на твердой подложке (однако это не исключает другую не являющуюся твердой подложку) для облегчения промывания и последующего выделения комплекса перед приведением в контакт антитела с образцом.
Примеры твердых подложек включают стекло или пластмассу в форме, например, микропланшета для титрования, палочки, гранулы или микрогранулы.
После инкубации образца с антителами смесь промывают, и можно обнаруживать образовавшийся комплекс антитело-маркер. Это можно осуществлять посредством инкубации промытой смеси с реагентом для обнаружения. Этот реагент для обнаружения может представлять собой, например, второе антитело, которое является меченным поддающейся обнаружению меткой. Иллюстративные поддающиеся обнаружению метки включают магнитные гранулы, флуоресцентные красители, радиоактивные метки, ферменты и наборы для амплификации с тирамидом (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие широко используемые в ELISA), и калориметрические метки, такие как коллоидное золото или цветное стекло или пластмассовые гранулы.
Альтернативно маркер в образце можно обнаруживать с использованием непрямого анализа, где, например, второе меченое антитело используют для обнаружения связанного специфичного к маркеру антитела, и/или в конкурентном анализе или анализе ингибирования, где, например, со смесью инкубируют одновременно моноклональное антитело, которое связывается с определенным эпитопом маркера.
Способы определения количества или присутствия комплекса антитело-маркер включают, например, обнаружение флуоресценции, люминесценции, хемилюминесценции, поглощения, отражения, пропускающей способности, индекса рефракции (например, поверхностный плазмонный резонанс, эллипсометрия, способ резонансного зеркала, способ волновода-решеточного светоделителя или интерферометрия) или радиоактивности. Оптические способы включают микроскопию (конфокальную и неконфокальную), способы с визуализацией и без визуализации. Электрохимические способы включают способы вольтаметрии и амперометрии. Радиочастотные способы включают мультиполярную резонансную спектроскопию.
Пригодные способы анализа включают типы анализа, хорошо известные в данной области, включая, например, ферментный иммуноанализ (EIA), такой как твердофазный иммуноферментный
анализ (ELISA), способы радиоиммунного анализа, такие как RIA и SPRIA; анализ с использованием вестерн-блоттинга; или анализ с использованием слот-блоттинга, однако не исключаются другие форматы, которые идентифицирует специалист в данной области.
Стадию количественного определения уровня биомаркера(ов) также можно проводить посредством обнаружения и количественного определения свободной мРНК, кодирующей полипептиды НЬ в образце, например, обнаружения последовательностей мРНК, кодирующих биомаркер, или их фрагментов, в упомянутых жидкостях организма.
На стадии сравнения уровня биомаркера в образце с эталонной величиной термин "эталонная величина" в отношении настоящего изобретения относится к определенному исходному или среднему уровню биомаркера, т.е. тот же тип биомаркера количественно определяется на стадии (Ь) в образцах из контрольной группы. Предпочтительно, контрольная группа включает беременных самок млекопитающих (предпочтительно женщин), у которых не диагностирована или которые не страдают РЕ или любым другим связанным с беременностью осложнением, например, связанной с беременностью гипертензией.
Поскольку нормальный уровень биоаркеров изменяется в зависимости от срока беременности беременной женщины, является важным, чтобы используемый контрольный образец(ы) или контрольная величина(ы) были репрезентативными для данного анализируемого образца пациента. Контроль представляет собой образец, полученный от беременной женщины, которая не имеет РЕ или не имеет риска ее развития, и взятый на том же сроке беременности (т.е. при том же количестве недель беременности). Более того, величины могут зависеть от используемого анализа. Таким образом, отличающиеся величины могут быть получены, если используют анализ ELISA, по сравнению с величинами, получаемыми, когда используют, например, радиоиммунный способ анализа. Специалисту в данной области не будет трудно выбрать один и тот же способ анализа для исследуемого и контрольного образца и не составит труда знать, как идентифицировать правильный срок беременности для исследуемого и контрольного образца.
Как видно из примеров в настоящем описании, надежные и
воспроизводимые результаты получают, как когда образцы получают на сроке беременности 34-4 0 недель, так и когда образцы получают на сроке беременности 6-20 недель. Наиболее важно, настоящее изобретение, таким образом, относится к надежному биомаркеру(ам), который можно использовать очень рано при беременности для прогнозирования риска развития РЕ и/или для диагностики РЕ. Как видно из исследования II, описанного в настоящем описании, надежные и воспроизводимые результаты получают, когда образцы получают на сроке беременности от б до 20 недель, особенно от 12 до 14 недель. Результаты, в частности, касающиеся AIM, Нрх и HbF, согласуются с результатами, описанными в исследовании I, где образцы получают на сроке беременности 34-40 недель. Таким образом, настоящее изобретение относится к надежным маркерам РЕ с 12 недели (или ранее) и до родов.
В качестве примера следующие величины считаются нормальными величинами, когда образцы исследуют на сроке беременности 34-4 0 недель и когда анализом, используемым для исследования Hp, Нрх, является ELISA, и анализом, используемым для исследования не связанного с белком AIM, является радиоиммунный анализ. Следует отметить, что по сравнению с нормальным диапазоном, приведенным для AIM в предшествующей патентной заявке WO 2011116958 А1, величины, приведенные ниже, являются более высокими, что не означает, что величины, приведенные в W0 2011116958 А1, являются ошибочными, но связано с тем фактом, что AIM в WO 2011116958 А1 и величины, описанные в настоящем описании, получены с использованием двух различных способов радиоиммунного анализа, и получены для образцов, полученных на различных сроках беременности. Это иллюстрирует важность использованием одного и того же способа, чтобы сделать правильное заключение. Что касается HbF, также может существовать отличие от величин, описанных в WO 2008098734. В контексте исследования I, описанного ниже, измеряли только не связанный с белком HbF, в то время как в исследовании II и WO 2008098734 измеряли общий HbF (т.е. включая связанную с белком часть).
При использовании контрольной группы определение эталонной
величины для биомаркера проводят с использованием стандартных способов анализа, хорошо известных в данной области. Эта величина, безусловно, варьируется, в зависимости, например, от используемого типа анализа, измеряемой формы биомаркера, типа биологического образца и группы индивидуумов. Например, нормальные средние уровни в плазме у беременной женщины, у которой не диагностирована РЕ, и измеренные способом ELISA или способом радиоиммунного анализа, как описано выше, и где контрольные образцы получены на сроке беременности 34-4 0 недель (соответствующие величины, когда образцы получены на сроке беременности 12-14 недель приведены в скобках), представляют собой
i) диапазон от 2 до 5 нг/мл со срединным уровнем 3,85 нг/мл
(4,2-7,4 со срединной величиной 5,6 мкг/мл) для свободного не
связанного с белком HbF,
ii) диапазон от 0,003 до 1,18 мкг/мл со срединным уровнем
0,59 мкг/мл для Hp-HbF,
iii) диапазон от 1,04 до 1,30 мг/мл со срединным уровнем 1,17 мг/мл (0,915-1,028 со срединным уровнем 0,971 мг/мл) для Hp,
iv) диапазон от 0,88 до 0,98 мг/мл со срединным уровнем 0,93 мг/мл (1,111-1,175 со срединным уровнем 1,143 мг/мл) для Нрх
v) диапазон от 27,89 до 31,97 мкг/мл со срединным уровнем 29,93 мкг/мл (14,9-16,1 со срединным уровнем 15,5 мкг/мл) для AIM,
vi) диапазон от 4,69 до 5,9 ng/мл со срединным уровнем 5,29 нг/мл для НО-1,
vii) диапазон от 52,34 до 67,38 мкг/мл со срединным уровнем
59,86 мкг/мл для тема.
Однако, как упоминалось выше, другие нормальные величины ожидаются, когда образцы получают на другом сроке беременности. Таким образом, является предпочтительным использование контрольной величины с внесением поправки на срок беременности при сравнении величин, полученных для исследуемого образца, с "нормальными" величинами.
Как проиллюстрировано в исследовании II в настоящем описании и с использованием способов анализа, описанных в этом исследовании, беременная женщина имеет РЕ или имеет увеличенный риск ее развития, если уровень Нрх в образце плазмы/сыворотки от беременной женщины, полученном на сроке беременности 6-2 0 недель, составляет 1,1 мг/мл или менее, уровень свободного HbF составляет 5,6 мкг/мл или более и уровень AIM составляет 15,5 мкг/мл или более. Когда используют срединные значения, беременная женщина имеет РЕ или увеличенный риск ее развития, если уровень Нрх в образце плазмы/сыворотки от беременной женщины, полученном на сроке беременности 6-2 0 недель, составляет 1,06 мг/мл или менее, уровень свободного HbF составляет 10,8 мкг/мл или более и уровень AIM составляет 17,3 мкг/мл или более.
В случае, когда указанная эталонная (или нормальная) величина представляет собой уровень Hp-HbF, HbF, тема и/или AIM в образцах контрольной группы, более высокий уровень Hp-HbF, HbF, тема и/или AIM в образце относительно эталонной величины указывает на то, что беременная женщина имеет РЕ или увеличенный риск развития РЕ.
В случае, когда указанная эталонная величина представляет собой уровень Hp, НО-1 и/или Нрх в образцах контрольной группы, более низкий уровень Hp, НО-1 и/или Нрх в образце относительно эталонной величины указывает на то, что указанная беременная женщина имеет РЕ или увеличенный риск развития РЕ.
Как видно из результатов, представленных в настоящем описании, маркеры также можно использовать для определения риска развития РЕ с ранним или поздним началом. В частности, в этом случае важными по-видимому являются активность Нрх и/или свободный HbF. Таким образом, комбинация более низкой активности Нрх с более высокой концентрацией свободного HbF в образце по сравнению с контролем указывает на позднее начало, в то время как комбинация более высокой концентрации свободного HbF с неизмененной активностью Нрх, необязательно в комбинации с более высоким уровнем Hp, указывает на РЕ с ранним началом (см. таблицу 3).
Затем можно наблюдать за прогрессированием (или регрессией) заболевания посредством частого измерения уровня одного или нескольких биомаркеров в биологическом образце одного и того же типа одной и той же беременной женщины.
Другим способом определения точного уровня биомаркера в плазме для определения того, имеет ли женщина риск РЕ или имеет ли она уже признаки РЕ, является определение стандартного отклонения для теста, проведенного при определении уровня в плазме/сыворотке. Соответствующим параметром, рассматриваемым в этом случае, является повышение/снижение от нормального уровня (например, в плазме) на величину, в 1,1 раза превышающую стандартное отклонение, или более. Альтернативно изменение уровня должно составлять по меньшей мере 5% от нормальной величины.
Также настоящее изобретение относится к применению способов, описанных в настоящем описании, в комбинации с другими способами диагностики. Диагностические способы, которые можно использовать в комбинации со способами по изобретению, включают современные способы диагностики или облегчения диагностики преэклампсии, известные специалистам в данной области, примеры таких способов описаны в настоящем описании выше. Биологический образец сначала можно анализировать способами, описанными в настоящем описании. Затем биологический образец можно исследовать другими способами для подтверждения полученных результатов. Таким образом, точность диагностического способа по настоящему изобретению можно повышать путем комбинирования его с другими способами диагностики.
Как упоминалось выше, все детали, упомянутые в аспекте диагностики, также применимы к способам, описанным в других аспектах.
Оценка прогрессирования/регрессии преэклампсии
В следующих вариантах осуществления изобретения биомаркеры можно использовать для определения статуса РЕ (например, прогрессирование или регрессия). Некоторые из биомаркеров можно использовать для прогнозирования, т.е. предсказания исхода заболевания, у пациента. Например, концентрация HbF, Hp и/или
Нрх коррелирует с клиническим исходом, таким как необходимость в лечении в NICU, недоношенность и кесарево сечение, хотя не исключаются и другие клинические показания.
Таким образом, согласно одному аспекту настоящего
изобретения, предусматривается способ мониторинга
прогрессирования или регрессии преэклампсии, включающий:
(a) в первом биологическом образце, таком как кровь, плазма/сыворотка, моча, CSF, биоптаты плаценты, внутриматочная жидкость или амниотическая жидкость, полученном от беременной самки млекопитающего, количественное определение уровня одного или нескольких биомаркеров, выбранных из Hp-HbF, Hp, Нрх, НО-1, и уровня биомаркера(ов): свободного HbF и/или AIM; или
количественное определение Нрх и НО-1; или
количественное определение уровня одного или нескольких биомаркеров, выбранных из Hp-HbF, Hp, и уровня биомаркера(ов), выбранного из i) свободного HbF и/или AIM и/или ii) Нрх и НО-1;
(b) во втором биологическом образце, таком как образцы, упомянутые в настоящем описании, полученные от указанной беременной самки млекопитающего в более поздний момент времени, измерение уровня тех же маркеров, которые были выбраны в (а) , выше; и
(c) сравнение величин, определенных на стадиях (а) и (Ь),
где
i) увеличение уровня(ей) HbF, Hp-HbF и/или AIM во втором образце относительно уровня(ей) HbF, Hp-HbF и/или AIM в первом образце, и/ или
ii) снижение уровня(ей) Hp НО-1 и/или Нрх во втором образце относительно уровня(ей) Hp, НО-1 и/или Нрх в первом образце
указывает на прогрессирование РЕ; и снижение i) и/или увеличение ii), описанных выше, указывает на регрессию РЕ.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу мониторинга прогрессирования или регрессии РЕ, включающему:
(а) в первом биологическом образце, таком как кровь, плазма, моча, CSF, биоптаты плаценты, внутриматочная жидкость или амниотическая жидкость, полученном от беременной самки млекопитающего, количественное определение уровня i) Нрх, ii)
Нрх и AIM, и/или iii) Нрх, и необязательно уровня одного или нескольких из Hp-HbF, Hp, НО-1,
(b) во втором биологическом образце, таком как
биологические образцы, упоминаемые в настоящем описании,
полученном от указанной беременной самки млекопитающего в более
поздний момент времени, количественное определение уровня тех же
маркеров, которые выбраны в (а), выше; и
(c) сравнение величин, измеренных на стадии (а) и (Ь), где
i) повышение уровня(ей) свободного HbF и/или AIM, и, если
измеряли, Hp-HbF, во втором образце относительно их уровня в
первом образце, и/ или
ii) снижение уровня Нрх, и, если измеряли, уровня(ей) Hp
и/или НО-1 во втором образце относительно уровня в первом
образце,
указывает на прогрессирование РЕ; и снижение i) и/или увеличение ii), описанных выше, указывает на регрессию РЕ.
В некоторых случаях, (а) может быть расширен также включением AIM и необязательно одного или нескольких из Hp, НО-1 и Hp-HbF (т.е. без использования Нрх или свободного HbF).
Как упоминалось выше, предпочтительная панель маркеров в соответствии с настоящим изобретением и для применения в прогнозировании, или диагностике, или оценке риска развития РЕ, представляет собой: Нрх и AIM, необязательно дополненные одним или несколькими из следующих: свободный HbF, Hp-HbF, Hp, НО-1.
Предусматривается, что повышение уровня(ей) HbF, Hp-HbF, тема и/или AIM или снижение уровня (ей) Hp, НО-1 и/или Нрх, соответствующее 1,1 стандартного отклонения или более указывает на увеличенный риск развития преэклампсии и/или прогрессирования заболевания. Альтернативвно, отклонение на 5% от нормальных величин считается увеличением (или снижением, в соответствующих случаях). Аналогично, снижение уровня(ей) HbF, Hp-HbF, тема и/или AIM или повышение уровня (ей) Hp, НО-1 и/или Нрх, соответствующее 1,1 стандартного отклонения или более (или 5% отклонение, как упоминалось выше) указывает на сниженный риск развития РЕ и/или регрессии заболевания.
Детали, упоминаемые для первого аспекта, также применимы
для этого и следующих аспектов.
Способ оценки эффективности конкретного способа лечения преэклампсии
Биомаркер(ы) и способ, описанные выше, также можно использовать для оценки эффективности лечения РЕ. Единственным отличием является то, что первый образец получают либо до лечения (обозначается как время to) или в ходе лечения (обозначается как ti) , в то время как второй образец получают в момент времени позднее to или ti, в зависимости от ситуации. Способ включает следующие стадии:
(a) количественное определение в первом биологическом образце, выделенном, например, из крови, плазмы или мочи беременной самки млекопитающего либо до, либо в ходе лечения, уровня одного или нескольких биомаркеров, выбранных из Hp-HbF, Hp, Нрх, НО-1 и уровня биомаркера(ов) : свободного HbF и/или AIM; или
количественное определение уровня Нрх и НО-1; или количественное определение уровня одного или нескольких биомаркеров, выбранных из Hp-HbF, Hp, и уровня биомаркера(ов), выбранного из i) свободного HbF и/или AIM, и/или ii) Нрх и НО-1;
(b) количественное определение во втором биологическом образце, выделенном, например, из крови, плазмы/сыворотки или мочи указанной беременной самки млекопитающего в более поздний момент времени, чем для указанного первого образца, уровня одного или нескольких биомаркеров, выбранных согласно (а) ;
(c) сравнение величин, измеренных на стадиях (а) и (Ь), где
i) повышение уровня(ей) Hp-HbF, HbF и/или AIM и/или
снижение уровня(ей) Hp, НО-1 и/или Нрх во втором образце относительно уровня(ей) Hp-HbF, Hp, НО-1, Нрх, свободного HbF и/или AIM в первом образце
указывает на то, что лечение не является эффективным, поскольку РЕ прогрессирует; и снижение уровня(ей) Hp-HbF, HbF и/или AIM и/или повышение уровня(ей) Hp, НО-1 и/или Нрх, описанных выше, указывает на то, что лечение является эффективным, поскольку РЕ регрессирует.
Более конкретно, такой способ включает следующие стадии:
(a) количественное определение в первом биологическом образце, выделенном, например, из крови, плазмы/сыворотки или мочи беременной самки млекопитающего, либо до, либо в ходе лечения уровня одного или нескольких биомаркеров, выбранных из i) Нрх, ii) Нрх и AIM, и iii) Нрх, AIM и свободного HbF, и необязательно одного или нескольких из Hp-HbF, Hp, НО-1.
(b) количественное определение во втором биологическом образце, выделенном, например, из крови, плазмы/сыворотки или мочи указанной беременной самки млекопитающего в более поздний момент времени, чем для указанного первого образца, уровня одного или нескольких биомаркеров, выбранных согласно (а) ;
(c) сравнение величин, измеренных на стадии (а) и (Ь), где
i) увеличение уровня(ей) свободного HbF и/или AIM, и в
соответствующих случаях Hp-HbF, и/или снижение уровня Нрх и в соответствующих случаях уровня(ей) Hp, НО-1 во втором образце относительно уровня(ей) в первом образце указывает на то, что лечение не является эффективным, поскольку РЕ прогрессирует; и снижение уровня(ей) свободного HbF и/или AIM и в соответствующих случаях уровня Hp-HbF; и/или повышение уровня Нрх и в соответствующих случаях уровня(ей) Hp, НО-1 и/или Нрх, описанных выше, указывает на то, что лечение является эффективным, поскольку РЕ регрессирует.
В любом из описанных выше способов i)-ix) также может быть включен маркер гем.
Как упоминалось выше, предпочтительная панель маркеров в соответствии с настоящим изобретением и для применения в прогнозировании, или диагностике, или оценке риска развития РЕ представляет собой: Нрх и AIM, необязательно дополненные одним или несколькими из следующих: свободный HbF, Hp-HbF, Hp, НО-1.
В конкретных вариантах осуществления предусматривается, что эффективность лечения можно оценивать посредством определения того, соответствует ли снижение или увеличение 1,1 стандартного отклонения или более или варьированию на 5% от нормальных величин, как описано выше.
Изобретение также относится к наборам, содержащим подходящие реагенты для определения индивидуальных маркеров в
биологическом образце. Таким образом, наборы могут содержать антитела к индивидуальным маркерам, средства для проведения ELISA или любых других способов, упомянутых в настоящем описании.
Вещества и композиции для применения для предупреждения и/или лечения преэклампсии
В соответствии с данными, описанными в настоящем описании,
является вероятным, что любое вещество, которое обладает i)
способностью ингибировать образование свободного НЬ (свободный
HbF или любой другой НЬ) , ii) способностью связывать свободный
НЬ (свободный HbF или любой другой НЬ) , или iii) способностью
уменьшать концентрацию циркулирующего свободного НЬ (свободный
HbF или любой НЬ) для уменьшения какого-либо прогрессирования
заболевания является потенциальным средством для эффективного
лечения и/или предупреждения РЕ. Таким образом,
предусматривается применение по меньшей мере одного представителя, выбранного из группы, состоящей из связывающихся с НЬ средств; связывающих/деградирующих гем средств: связывающих железо средств; средств, которые стимулируют деградацию гемоглобина, деградацию тема и/или секвестрацию железа, и/или средств, которые ингибируют плацентарный гемопоэз, для лечения РЕ.
Таким образом, в одном аспекте изобретения, в тех случаях, когда беременная женщина, которую исследуют с помощью способов, имеет РЕ или имеет риск развития РЕ, каждый из вышеупомянутых аспектов, касающихся прогнозирования РЕ, диагностики РЕ, оценки риска наличия РЕ, может быть дополнен режимом лечения, вовлекающим введение беременной женщине одного или нескольких веществ, упомянутых ниже.
Более конкретно, предусматривается, что вещество выбрано из
i) антител к гемоглобину или их фрагментов,
ii) гаптоглобина,
iii) CD 163,
iv) альфа-1-микроглобулина,
v) гемопексина,
vi) гемоксигеназы,
vii) альбумина,
viii) трансферрина,
ix) ферритина.
Связывающие гемоглобин средства:
Антитела
Можно разрабатывать моноклональные антитела с высоким связыванием с НЬ и блокированием окислительно-восстановительной ферментативной активности НЬ. Антитела можно получать посредством иммунизации in vivo или in vitro, или они могут быть выбраны из существующих библиотек. Антитела можно подвергать селекции в отношении специфичности к альфа-, бета-, дельта- или гамма цепям глобина, или к общим частям этих цепей глобина. Антитела можно модифицировать, чтобы они были пригодными для терапии у человека, т.е. можно обеспечивать каркасную область иммуноглобулина человека. Можно использовать любую часть антител: Fv-, Fab-фрагменты или целый иммуноглобулин.
Гаптоглобин
Hp представляет собой гликопротеин, находящийся в плазме/сыворотки крови. Существует три формы Hp: Hpl-1, Нр2-1 и Нр2-2. Все формы связываются с НЬ и образуют комплекс Нр-НЬ. Комплекс Hb-Нр имеет более слабую окислительно-восстановительную ферментативную активность, чем свободный НЬ, и, таким образом, он вызывает меньшее окислительное повреждение. Связывание с НЬ препятствует, например, потере железа из группы тема.
CD1 63
CD163 представляет собой рецептор-ловушку, находящийся на макрофагах, моноцитах и ретикулоэндотелиальной системе, выстилающей кровеносные сосуды. Рецептор распознает комплекс Нр-НЬ и опосредует эндоцитоз и доставку его в лизосомы, деградацию посредством НО-1 (см. ниже) и секвестрацию свободного железа клеточным ферритином. Таким образом, CD163 вносит вклад в устранение индуцируемого НЬ окислительного стресса.
Средства, связывающие/деградирующие гем:
Гемопексин
Нрх представляет собой гликопротеин (60 кДа), находящийся в плазме/сыворотке крови, и он устраняет свободный гем из плазмы
крови посредством прочного его связывания (Ко! приблизительно 1 пмоль/л) и транспорта в печень для деградации в ретикулоэндотелиальной системе. Гемоксигеназа
Гемоксигеназа представляет собой клеточный связывающий и деградирующий гем ферментативный комплекс, который конвертирует гем в биливердин, монооксид углерода и свободное железо. Последнее секвестрируется клеточным ферритином, а биливердин восстанавливается биливердинредуктазой в билирубин, который в конечном итоге выводится с мочой. Описано три формы генов гемоксигеназы со значительно отличающимися структурами: НО-1, НО-2 и НО-3. Наиболее важной является НО-1. Этот ген активируется практически во всех клетках организма посредством НЬ, свободного тема, гипоксии, свободных радикалов, ROS и многих различных воспалительных сигналов. НО-1 является мощным антиоксидантом, поскольку он устраняет окислители гем и железо, но также поскольку он продуцирует билирубин, который обладает антиоксидантными эффектами против некоторых окислителей.
Аль бумин
Альбумин представляет собой белок массой 66 кДа в плазме крови человека, который может связывать гем. Отсутствуют данные о клеточном захвате и деградации комплекса альбумин-гем, и эффект альбумина, возможно, состоит в действии в качестве депо тема, таким образом, препятствуя вхождению тема в мембраны эндотелиальных клеток, базальные мембраны сосудов и т.д.
Альфа-1-микроглобулин
AIM синтезируется в печени на высоком уровне, секретируется в кровоток и транспортируется через стенки сосудов во внесосудистую часть всех органов. Этот белок также синтезируется в других тканях (клетки крови, головной мозг, почка, кожа), но на более низком уровне. Вследствие небольшого размера, свободный AIM быстро отфильтровывается из крови в почках. AIM имеет превосходные антиоксидантные свойства в общем, и в частности в отношении токсичных продуктов деградации свободного НЬ; эти свойства делают его пригодным для лечения или профилактики различных заболеваний, которые вовлекают окислительный стресс,
или где присутствие свободного НЬ индуцирует или усиливает заболевание или состояние.
AIM представляет собой эндогенный антиоксидант, который
имеет антиокислительное действие посредством нескольких путей.
Таким образом, настоящее изобретение относится к AIM, который,
как было обнаружено, сочетает в себе свойства фермента редуктазы
(категория 1), неферментативного восстановления (категория 2) и
удаления радикалов (категория 3) . Кроме того, механизм
неферментативного восстановления (категория 2) может
использоваться многократно с несколькими циклами донирования электронов. Более того, механизм удаления радикалов (категория 3) приводит к суммарному образованию электронов, которые далее повышают антиокислительную способность белка. Иными словами, белок имеет его собственный запас электронов, является независимым от клеточного метаболизма и может действовать как внутриклеточно, так и внеклеточно. Кроме того, AIM может репарировать окислительное повреждение, нанесенное тканевым компонентам (уникальное свойство, относящееся к категории 4) . Также см. ниже подробное описание механизма удаления радикалов.
AIM является представителем суперсемейства липокалинов, группы белков животных, растений и бактерий с консервативной трехмерной структурой, но в высокой степени разнообразными функциями. Каждый липокалин состоит из цепи из 160-190 аминокислот, которая сворачивается в р-бочонок в виде кармана с гидрофобной внутренней частью. Известно двенадцать генов липокалина человека. Среди липокалинов человека AIM представляет собой белок плазмы и тканей массой 2 6 кДа, который до настоящего времени был идентифицирован у млекопитающих, птиц, рыб и лягушек. AIM синтезируется в печени на высоком уровне, секретируется в кровоток и быстро (Т^=2-3 мин) транспортируется через стенки сосудов во внесосудистые компартменты всех органов. Белок также синтезируется в других тканях (клетки крови, головной мозг, почки, кожа), но на более низком уровне. AIM обнаруживается как в свободной, мономерной форме, так и в качестве ковалентных комплексов с более крупными молекулами
(IgA, альбумин, протромбин) в крови и в тканях кишечника. Вследствие небольшого размера свободный AIM быстро отфильтровывается из крови в почках. Затем основная часть повторно всасывается, однако значительные количества экскретируются в мочу.
Последовательность и структурные свойства AIM
Полная последовательность AIM человека впервые была описана
Kaumeyer et al. (5) . Было обнаружено, что белок состоит из 183
аминокислотных остатков. С тех пор по меньшей мере пятьдесят
дополнительных кДНК и/или белков AIM из других млекопитающих,
птиц, амфибий и рыб было обнаружено, выделено и/или
отсеквенировано. Длина пептидной цепи AIM несколько различается
среди видов, в основном вследствие варьирования на С-конце.
Сравнение выровненных последовательностей различных
установленных аминокислотных последовательностей демонстрирует, что процентная идентичность варьируется от приблизительно 75-80% между грызунами или ферунглятами и человеком до приблизительно 4 5% между рыбами и млекопитающими. Свободная боковая цепь цистеина в положении 34 является консервативной. Было показано, что эта группа вовлечена в окислительно-восстановительные реакции (см. ниже) в комплексе с другими белками плазмы и в связывание с желто-коричневым хромофором. Компьютерные ЗБ-модели на основе известных рентгенограмм других липокалинов указывает на то, что Cys34 экспонирован для растворителя и расположен вблизи отверстия кармана липокалина. Фактор комплемента С8у, другой липокалин, также содержит непарный Cys в положении 34, который вовлечен в образование активного комплекса С8.
В контексте настоящего изобретения термин "альфа-1-
микроглобулин" охватывает альфа-1-микроглобулин,
идентифицированный в SEQ ID NO: 1 (AIM человека), а также SEQ ID NO: 2 (рекомбинантный AIM человека), а также его гомологи, фрагменты или варианты, обладающие сходной терапевтической активностью. Таким образом, AIM, как используют в рамках изобретения, означает белок, обладающий по меньшей мере 8 0% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO:
2. Является предпочтительным, чтобы AIM, как используют в рамках
изобретения, обладал по меньшей мере 90% идентичностью
последовательности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Еще более
предпочтительным является, чтобы AIM, как используют в рамках
изобретения, имел по меньшей мере 95%, как например, 99% или
100% идентичность последовательности с SEQ ID N0:1 или SEQ ID
N0: 2. В предпочтительном аспекте альфа-1-микроглобулин
соответствует SEQ ID N0: 1 или 2, как идентифицировано в
настоящем описании. На фиг.10 приведен список
последовательностей для аминокислотной последовательности AIM
человека и рекомбинантного AIM человека (SEQ ID N0: 1 и 2,
соответственно) и соответствующей нуклеотидной
последовательности (SEQ ID N0: 3 и 4, соответственно) . Однако, как используют в рамках изобретения, также термин AIM включает гомологи, варианты и фрагменты AIM, имеющие важные части белков, идентифицированные ниже.
Как упоминалось выше, в соответствии с настоящим описанием также можно использовать гомологи AIM. Теоретически, можно использовать AIM из всех видов, включая наиболее примитивные из обнаруженных на настоящий момент, которые представляют собой AIM рыб (камбала). AIM также доступен в выделенной форме из человека, крысы, мыши, кролика, морской свинки, коровы и камбалы.
Важно отметить, что даже если AIM и бикунин имеют одного предшественника, они имеют различный аминокислотный состав и различные свойства. AIM относится к так называемому семейству липокалинов, в то время как бикунин (также обозначаемый как улинастатин) принадлежит суперсемейству ингибиторов протеаз.
С учетом гомологов, вариантов и фрагментов AIM, следующие аминокислоты были идентифицированы в качестве важных частей антиоксидантного эффекта белка:
Y22 (тирозин, положение 22, пары оснований 64-66), С34 (цистеин, положение 34, пары оснований 100-102), К69 (лизин, положение 69, пары оснований 205-207), К92 (лизин, положение 92, пары оснований 274-276), К118 (лизин, положение 118, пары оснований 352-354),
К130 (лизин, положение 130, пары оснований 388-390), Y132 (тирозин, положение 132, пары оснований 394-396), L180 (лейцин, положение 180, пары оснований 538-540), 1181 (изолейцин, положение 181, пары оснований 541-543), Р182 (пролин, положение 182, пары оснований 544-546), R183 (аргинин, положение 183, пары оснований 547-549), (нумерация аминокислот и нуклеотидов на протяжении документа относится к SEQ ID 1 и 3, если используют другой AIM из другого вида, аналоги AIM или его рекомбинантные последовательности, специалисту в данной области будет известно, как идентифицировать аминокислоты активного центра(ов) или участок(и), ответственный за ферментативную активность).
Таким образом, в случаях, когда AIM, например, имеет 8 0% (или 90% или 95%) идентичность последовательности с одной из SEQ ID NO: 1 или 2, является предпочтительным, чтобы аминокислоты, упомянутые выше, присутствовали в соответствующих участках молекулы.
AIM человека замещен олигосахаридами в трех положениях: два сиалированных комплексного типа, вероятно, диантеннарных углевода, связанных с Asnl7 и Asn96, и один более простой олигосахарид, связанный с Thr5. Между тем, содержание углеводов в белках AIM из различных видов значительно варьируется, находясь в диапазоне от полного отсутствия гликозилирования в Xenopus leavis до спектра различных профилей гликозилирования.
AIM имеет желто-коричневый цвет, когда его очищают из плазмы или мочи. Цвет обеспечивается гетерогенными соединениями, ковалентно связанными с различными боковыми группами аминокислот, расположенными на входе в карман. Эти модификации, возможно соответствуют окисленным продуктам деградации органических окислителей, которые ковалентно улавливаются AIM in vivo, например, тема, кинуренина и тирозильных радикалов (6-8, 10) .
AIM также является гетерогенным по заряду и размеру и более коричневые молекулы AIM более отрицательно заряжены. Возможным объяснением гетерогенности является то, что различные боковые группы модифицированы в различной степени различными радикалами,
и что эти модификации изменяют суммарный заряд белка. Положение ковалентно связанных цветных структур было определено на Cys34, и Lys92, Lysll8 и Lysl30, причем последняя имеет молекулярную массу от 100 до 300 Да. Было обнаружено, что метаболит триптофана кинуренин ковалентно связан с лизильными остатками в AIM из мочи пациентов на гемодиализе и, по-видимому, он является источником коричневого цвета белка в этом случае (б) . Окисленные фрагменты синтетического радикала ABTS (2,2'-азино-ди-(3-этилбензотиазолин)-б-сульфоновая кислота) были связаны с боковыми цепями Y22 и Y132 (10).
С34 представляет собой активный центр AIM (9). Он становится высоко электроотрицательным, что означает, что он обладает высоким потенциалом к тому, чтобы отдавать электроны, вследствие близости положительно заряженных боковых цепей К69, К92, К118 и К130, которые индуцируют депротонизацию тиольной группы С34, что является предпосылкой окисления атома серы. Предварительные данные показывают, что С34 является одной из наиболее электроотрицательных из известных групп.
Теоретически, аминокислоты, которые обеспечивают уникальные ферментативные и неферментативные окислительно-восстановительные свойства AIM (С34, Y22, К92, К118, К130, Y132, L180, 1181, Р182, R183), которые более подробно описаны ниже, могут располагаться в аналогичной трехмерной конфигурации на другом каркасе, например, белке с такой же укладкой глобулы (другой липокалин) или полностью искусственной органической или неорганической молекуле, такой как полимер пластмассы, наночастица или металлсодержащий полимер.
Таким образом, предпочтительными являются гомологи, фрагменты или варианты, содержащие структуру, включающую активный центр и его окружение, как описано выше.
Модификации и изменения можно вносить в структуру полипептидов по настоящему изобретению, и они все еще могут приводить к молекуле, имеющей сходные характеристики с полипептидом (например, консервативная аминокислотная замена). Например, определенные аминокислоты можно заменять другими аминокислотами в последовательности без заметной потери
активности. Поскольку биологическую функциональную активность
полипептида определяет способность к взаимодействию и природа
полипептида, определенные замены аминокислотной
последовательности можно вносить в полипептидную
последовательность и, тем не менее, получать полипептид со сходными свойствами.
При внесении таких изменений можно учитывать гидропатический индекс аминокислот. Важность гидропатического индекса аминокислот для сообщения биологической функции взаимодействия полипептиду в целом понятна в данной области. Известно, что определенные аминокислоты можно заменять другими аминокислотами, имеющими сходный гидропатический индекс или показатель, и все еще получать полипептид со сходной биологической активностью. Каждой аминокислоте присвоен гидропатический индекс, исходя из гидрофобности и зарядовых характеристик. Эти индексы представляют собой: изолейцин ( + 4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистеин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серии (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (- 1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (4,5) .
Полагают, что относительный гидропатический характер аминокислоты определяет вторичную структуру конечного полипептида, что в свою очередь определяет взаимодействие полипептида с другими молекулами, такими как ферменты, субстраты, рецепторы, антитела, антигены и т.п. В данной области известно, что аминокислота может быть заменена другой аминокислотой, имеющей сходный гидропатический индекс, и все еще может быть получен функционально эквивалентный пептид. При таких изменениях замена аминокислот, у которых гидропатический индекс находится в пределах ±2, является предпочтительной, замена аминокислот с гидропатическим индексом в пределах ±1 является особенно предпочтительной, и замена аминокислот с гидропатическим индексом ±0,5 является еще более
предпочтительной.
Замену сходных аминокислот также можно проводить на основе гидрофобности, в частности, где биологически функциональный эквивалентный полипептид или пептид, полученный таким образом, предназначен для применения в иммунологических вариантах осуществления. Следующие величины гидрофобности были присвоены аминокислотным остаткам: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0 ± 1); глутамат (+3,0 ± 1); серии (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); пролин (-0,5 ± 1); треонин (-0,4); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4) . Понятно, что аминокислоту можно заменять другой аминокислотой, имеющей сходную величину гидрофобности и все еще получать биологически эквивалентный, и, в частности, иммунологически эквивалентный полипептид. В таких изменениях замена аминокислот, величины гидрофобности которых находятся в пределах ±2, является предпочтительной, замена аминокислот с величинами гидрофобности в пределах ±1 является особенно предпочтительной, и замена аминокислот с величинами гидрофобности в пределах ±0,5 является еще более предпочтительной.
Как описано выше, аминокислотные замены, как правило, основаны на относительном сходстве заместителей боковых цепей, например, их гидрофобности, гидрофильности, размере и т.п. Иллюстративные замены, которые учитывают одну или несколько из вышеуказанных характеристик, хорошо известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваются ими (исходный остаток: иллюстративная замена): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Glni His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gin: Asn) , (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gin), (He: Leu, Val), (Leu: He, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Trp: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) и (Val: Lie, Leu). Варианты осуществления изобретения, таким образом, предусматривают функциональные или биологические эквиваленты полипептида, как указано выше. В частности, варианты осуществления полипептидов могут включать
варианты, обладающие приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 95% идентичностью последовательности с представляющим интерес полипептидом.
В контексте настоящего изобретения гомология между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя последовательностями нуклеиновых кислот описывается параметром "идентичность". Выравнивание последовательностей и вычисление показателей гомологии можно проводить с использованием полного выравнивания Smith-Waterman, пригодного для выравнивания как белков, так и ДНК. Для выравнивания белков и ДНК используют оценочные матрицы BLOSUM50 и матрицу идентичности, соответственно. Штраф за первый пропуск остатка составляет -12 для белков и -16 для ДНК, в то время как штраф за пропуск дополнительных остатков составляет -2 для белков и -4 для ДНК. Выравнивание можно проводить с использованием пакета FASTA версии v2 0u6.
Множественное выравнивание белковых последовательностей можно проводить с использованием "ClustalW". Множественные выравнивания последовательностей ДНК можно проводить с использованием выравнивания белков в качестве матрицы, заменив аминокислоты соответствующим кодоном из последовательности ДНК.
Альтернативно для выравнивания аминокислотных
последовательностей и последовательностей ДНК можно использовать различное программное обеспечение. Выравнивание двух аминокислотных последовательностей проводят, например, с использованием программы Needle из пакета программ EMBOSS (http://emboss.org) версии 2.8.0. Программа Needle выполняет алгоритм глобального выравнивания, описанный в литературе. Используемая матрица замен представляет собой BLOSUM62, штраф за внесение делеции составляет 10, и штраф за продолжение делеции составляет 0,5.
Степень идентичности между аминокислотными
последовательностями; например, SEQ ID N0: 1 и другой аминокислотной последовательностью (например, SEQ ID N0: 2) вычисляют в качестве количества точных совпадений при выравнивании двух последовательностей, деленного на длину "SEQ
ID NO: 1" или длину " SEQ ID NO: 2", в зависимости от того, которая из них является наиболее короткой. Результаты выражают в качестве процентной идентичности.
Точное соответствие существует, когда две
последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки в одинаковых положениях перекрывающихся участков.
В соответствующих случаях, степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определять способом Wilbur-Lipman с использованием программного обеспечения LASER-GENE(tm) MEGALIGN(tm) (DNASTAR, Inc., Madison, W1) с таблицей идентичности и следующими параметрами множественного выравнивания: штраф за внесение пропуска 10 и штраф за продолжение пропуска 10. Параметры попарного выравнивания представляют собой Ktuple=3, штраф за делецию=3 и окна=2 0.
В конкретном варианте осуществления процент идентичности аминокислотной последовательности полипептида с или в отношении аминокислот SEQ ID NO: 1 определяют посредством i) выравнивания двух аминокислотных последовательностей с использованием программы Needle с матрицей заменой BLOSUM62, штрафом за внесение пропуска 10 и штрафом за продолжение пропуска 0,5; ii) подсчета количества точных совпадений при выравнивании; iii) деления количества точных совпадений на длину наиболее короткой из двух аминокислотных последовательностей, и iv) конвертирования результата деления iii) в проценты. Процент идентичности с или в отношении другой последовательности по изобретению вычисляют аналогичным образом.
В качестве примера, полипептидная последовательность может быть идентична эталонной последовательности, т.е. быть на 100% идентичной, или она может включать вплоть до определенного целого количества аминокислотных изменений по сравнению с эталонной последовательностью, так что % идентичность составляет менее 10 0%. Такие изменения выбраны из: по меньшей мере одной аминокислотной делеции, замены (включая консервативную и неконсервативную замену) или инсерции, и где указанные изменения могут находиться в N- или С-концевых положениях эталонной полипептидной последовательности или где-либо между этими
концевыми положениями, рассеянные либо по отдельности среди аминокислот в эталонной последовательности, либо одной или несколькими группами в эталонной последовательности.
Консервативные варианты аминокислот также могут включать не
встречающиеся в природе аминокислотные остатки. Не встречающиеся
в природе аминокислоты включают, но не ограничиваются ими,
транс-3-метилпролин, 2,4-метанопролин, цис-4-гидроксипролин,
транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин,
метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин,
нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту,
тиазолидинкарбоновую кислоту, дегидропролин, 3- и 4-метилпролин, 3,3-диметилпролин, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. В данной области известно несколько способов включения не встречающихся в природе аминокислотных остатков в белки. Например, можно использовать систему in vitro, где нонсенс-мутации подавляются с использованием химически аминоацилированных супрессорных тРНК. Способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК известны в данной области. Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенс-мутации, проводят в бесклеточной системе, содержащей экстракт Е. coli S30 и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают посредством хроматографии. Во втором способе трансляцию проводят в ооцитах Xenopus посредством микроинъекции мутантной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК. В третьем способе клетки Е. coli культивируют в отсутствие природной аминокислоты, подлежащей замене (например, фенилаланина), и в присутствии желаемой не встречающейся в природе аминокислоты(аминокислот) (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Не встречающуюся в природе аминокислоту включают в белок вместо ее природного аналога. Встречающиеся в природе аминокислотные остатки можно конвертировать в не встречающиеся в природе типы посредством химической модификации in vitro. Химическую модификацию можно комбинировать с сайт-направленным мутагенезом для дальнейшего расширения диапазона замен. Альтернативные химические структуры, предоставляющие 3
мерную структуру, достаточную для поддержания антиоксидантных свойств AIM, могут быть предоставлены посредством других технологий, например, искусственных каркасов, аминокислотных замен и т.п. Более того, структуры, имитирующие активные центры AIM, как перечислено выше, рассматриваются как имеющие ту же функцию, что и AIM.
Связывающие железо агенты:
Трансферрин
Трансферрин представляет собой наиболее важный переносчик железа в крови. Комплекс трансферрин-железо распознается и связывается клеточными рецепторами, которые интернализуют и диссоциируют комплекс.
Ферритин
Этот мультимерный белок, состоящий из 24 субъединиц двух типов, является основным внутриклеточным депо свободного железа. Он обладает способностью запасать железо в количестве 4500 атомов железа/молекула ферритина. В связанном с ферритином состоянии железа по большей части предотвращаются его окислительные и восстановительные реакции и, таким образом, окислительное повреждение.
В следующем варианте осуществления связывающий НЬ агент представляет собой антитело, специфичное к НЬ и/или тему.
В конкретных вариантах осуществления фармацевтический препарат содержит комбинацию связывающих НЬ агентов, и/или связывающих гем агентов, и/или секвестрирующих железо агентов.
Агенты, которые стимулируют деградацию НЬ и/или деградацию тема, включают, но не ограничиваются ими, белки, такие как Hp, Нрх и НО.
Фармацевтический препарат, содержащий один или несколько агентов, упомянутых выше, можно вводить "плацентарному" животному, такому как человек, другой примат или млекопитающее животное, служащее источником пищи. Предпочтительным животным для введения является человек, или коммерчески ценное животное, или домашний скот.
Введение можно проводить различными способами, зависящими от животного, подвергаемого лечению, состояния животного,
нуждающегося в указанном лечении, и конкретного показания к лечению. Путь введения может быть пероральным, ректальным, парентеральным или через назогастральный зонд при условии, что активное средство может транспортироваться в окружение плода, как например, в фетоплацентарный кровоток, амниотическую жидкость и т.д. Предпочтительным является парентеральный путь. Примерами парентеральных путей введения являются внутривенная, внутрибрюшинная, внутримышечная или подкожная инъекция.
Состав фармацевтического препарата необходимо выбирать в зависимости не только от фармакологических свойств активного ингредиента, но также от его физико-химических свойств и пути введения. Различные способы составления фармацевтических препаратов хорошо известны специалистам в данной области.
Как правило, фармацевтическая композиция, содержащая AIM (или его аналог, фрагмент или вариант, как определено в настоящем описании) или любое из других веществ, упомянутых в настоящем описании, можно составлять для в/в введения. Таким образом, вещество можно составлять в жидкости, например, в растворе, дисперсии, эмульсии, суспензии, и т.д. Как видно из примеров настоящего описания, подходящий носитель для в/в введения может состоять из 10 мМ Tris-HCl, рН 8,0 и 9,125 М NaCl.
Для парентерального применения подходящие растворители включают воду, спирты, липиды, растительные масла, пропиленгликоль и органические растворители, как правило, одобренные для таких целей. Как правило, специалист в данной области может найти руководство в "Remington's Pharmaceutical Science" под редакцией Gennaro et al. (Mack Publishing Company), в "Handbook of Pharmaceutical Excipients" под редакцией Rowe et al. (PhP Press) и в официальных монографиях (например, Ph.Eur. или USP), касающихся соответствующих эксципиентов для конкретных типов составов и способов получения конкретного состава. Подходящие эксципиенты включают растворители (например, воду, водную среду, спирты, растительные масла, липиды, органические растворители, такие как пропиленгликоль и т.п.), средства для
коррекции осмотического давления (например, хлорид натрия, маннит и т.п.), солюбилизаторы, средства для коррекции рН, консерванты (в соответствующих случаях), средства для усиления всасывания и т.д.
Вещество можно вводить в одной или нескольких дозах совместно с дозой радионуклидной терапии. Предпочтительно, каждую дозу вводят в/в либо в качестве однократной дозы, либо в качестве однократной дозы с последующей медленной инфузией в ходе короткого периода времени вплоть до 60 минут, либо в качестве медленной инфузии в ходе короткого периода времени вплоть до 60 минут. Можно добавлять дополнительные дозы. Когда используют AIM, каждая доза содержит количество AIM, соответствующее массе тела пациента: 1-15 мг А1М/кг пациента.
Для пероральных композиций, композиции могут быть в твердой, полутвердой или жидкой форме. Подходящие композиции включают твердые дозированные формы (например, таблетки, включая все типы таблеток, саше и капсулы), порошки, гранулы, драже, шарики, сиропы, смеси, суспензии, эмульсии и т.п.
Подходящие эксципиенты включают, например, наполнители, связующие вещества, разрыхлители, смазывающие вещества и т.д. (для твердых дозированных форм или композиций в твердой форме), растворители, например, такие как вода, органические растворители, растительные масла и т.д. для жидких или полутвердых форм. Более того, можно добавлять добавки, такие как средства для коррекции рН, маскирующие вкус средства, вкусовые добавки, стабилизаторы и т.д.
Более того, могут быть включены конкретные носители для нацеливания активного вещества в конкретную часть организма. Примером может быть комплекс антитело-А1М, где антитело нацелено на плаценту ("хоминг") вследствие его специфичности к эпитопу плаценты; стволовая клетка или рекомбинантная клетка со свойствами хоминга в плаценте, например, рецепторы интегрина, специфичные к плаценте и обладающие искусственной или естественной способностью секретировать большие количества AIM. Такое лечение было бы более эффективным, поскольку лекарственное средство концентрировалось бы в плаценте.
Термин "эффективное количество" применительно к настоящему изобретению относится к количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект для данного состояния и режима лечения. Оно представляет собой заданное количество активного материала, вычисленное для достижения желаемого терапевтического эффекта совместно с требуемыми добавками и разбавителями; т.е. носителем или наполнителем. Кроме того, подразумевается, что оно означает количество, достаточное для снижения и наиболее предпочтительно предотвращения клинически значимого дефицита активности и ответа хозяина. Альтернативно терапевтически эффективное количество является достаточным для обеспечения улучшения клинически значимого состояния у хозяина. Как понятно специалистам в данной области, количество соединение может варьироваться в зависимости от его удельной активности. Подходящие дозировки могут содержать заданное количество композиции активного вещества, вычисленное для обеспечения желаемого терапевтического эффекта, совместно с требуемыми разбавителями; т.е. носителем или добавкой. Кроме того, вводимая дозировка варьируется в зависимости от используемого активного вещества или веществ, возраста, массы тела и т.д. пациента, подлежащего лечению, однако, как правило, она находится в диапазоне от 0,001 до 1000 мг/кг массы тела/сутки. Более того, доза зависит от пути введения.
Описание чертежей
Фигура 1. Корреляция между концентрациями свободного HbF и Hp - Образцы были получены при нормальной беременности (контроль) и от женщин, у которых была диагностирована РЕ. Концентрацию в плазме свободного HbF для образца каждой пациентки (контроль и РЕ) наносили на график против концентрации Hp в плазме (А) . Концентрацию свободного HbF в плазме контролей наносили на график против концентрации в плазме Hp (В) . Концентрацию свободного HbF в плазме женщин, у которых была диагностирована РЕ, наносили на график против концентрации Hp в плазме (С) . Ассоциации между переменными оценивали посредством линейного регрессионного анализа (Пирсона) (исследование I).
Фигура 2. Корреляция между концентрацией изоформы Hp, свободного HbF и Hp-HbF - Изоформы Hp (1-1, 1-2 или 2-2)
исследовали в плазме с использованием SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с антителами против Hp, как показано на трех примерах с пациентками (А), как описано в разделе "Материалы и способы", и распределение различных изоформ представлено в качестве среднего процента женщин с Hp 1-1, 1-2 и 2-2 для соответствующей группы (В) . Концентрации в плазме свободного HbF (С) и Hp-HbF
(D) представлены по отдельности в образцах пациентов с каждой изоформой Hp (Hp 1-1, 1-2 и 2-2). На В результаты представлены в качестве среднего процента соответствующей изоформы Hp (Hp 1-1, 1-2 и 2-2) . На С и D результаты представлены в качестве среднего значения концентрации в плазме+SEM для свободного HbF и Hp-HbF
(исследование I).
Фигура 3. Корреляция между концентрацией Нрх и систолическим/диастодическим кровяным давлением - Наиболее высокое систолическое (А) и диастолическое (В) кровяное давление
(BP) , измеренное за последние две недели до доставки, наносили на график против концентрации Нрх в плазме (исследование I).
Фигура 4. Кривые зависимости чувствительности от частоты ложно положительных заключений (ROC) - ROC-кривые, демонстрирующие чувствительность и специфичность для комбинации HbF, AIM и Нрх (А) , Нрх и AIM (В) и Нрх (С) . Площадь под кривой
(AUC) составляет 0,88 для комбинации HbF, AIM и Нрх, 0,92 для комбинации AIM и Нрх и 0,87 для Нрх (исследование I).
Фигура 5. Схематическое представление предположительной цепи событий, вовлекающих HbF, Hp, Нрх, AIM и ROS и ведущих к РЕ - На фиг. показана схематическая плацента с нарушением функции фето-материнского барьера, вызвавшим просачивание плацентарных факторов. 1: Ранние события в плаценте индуцируют активацию генов и белка HbF и ROS. 2: Окислительное повреждение и просачивание через фето-материнский барьер приводит к 3: увеличенной концентрации HbF в материнской плазме. Избыток окси-НЬ подвергается реакциям аутоокисления, что приводит к свободным группам тема и образованию ROS. 4: Комплексная сеть белков-ловушек, состоящая из Hp, Нрх и AIM, связывает, ингибирует и устраняет HbF, гем и ROS. Свободный HbF связывается посредством
Hp и выводится с помощью опосредуемого рецептором CD163 захвата в моноцитах и макрофагах. Свободные группы тема связываются посредством Нрх и гем выводится через CD91, рецептор Нрх, предпочтительно экспрессируемый на макрофагах и гепатоцитах. В этом исследовании наблюдали значительное снижение как Hp, так и Нрх, в материнской плазме женщин с РЕ по сравнению с нормальной беременностью. Это продемонстрировало длительное присутствие увеличенных уровней как внеклеточного НЬ, так и тема. Анализ уровней AIM в плазме в данном исследовании выявил значительное увеличение его уровня у женщин с РЕ по сравнению с нормальными беременностями, наиболее вероятно в результате индуцируемой окислительным стрессом активации экспрессии гена AIM.
Фигура б. Кривые зависимости чувствительности от частоты ложно положительных заключений (ROC) - кривые зависимости чувствительности от частоты ложно положительных заключений для HbF, AIM, гемопексина, гаптоглобина и комбинации этих биомаркеров в качестве прогностических маркеров всех типов РЕ. Конкретные величины представлены в таблице 10 (исследование II).
Фигура 7. Кривые зависимости чувствительности от частоты ложно положительных заключений (ROC) - кривые зависимости чувствительности от частоты ложно положительных заключений для материнских характеристик и комбинации биомаркеров и материнских характеристик в качестве маркеров всех типов РЕ. Конкретные величины представлены в таблице 10 (исследование II).
Фигура 8. Корреляция между НрхЗО и диастодическим кровяным давлением - Корреляция между НрхЗО и диастолическим кровяным давлением у всех пациентк. Конкретные величины представлены в таблице 5 (исследование I).
Фигура 9. Логистический регрессионный анализ - комбинация HbF, активности Нрх, концентрации Нрх, тема и НО-1 продемонстрировала DR 84% при частоте ложноположительных результатов 10% (FPR) и AUC 0,93.
Фигура 10. Список последовательностей
Фигура 11. Уровни AIM по сравнению с контролем на различных сроках беременности.
Обсуждение результатов
В исследовании авторы изобретения использовали РЕ в качестве модельного заболевания для исследования ответа защитной сети от свободного НЬ в патологической ситуации с длительным повышением гемолиза. Таким образом, для исследования физиологической значимости и возможной патофизиологической важности свободного HbF при прогрессировании заболевания РЕ авторы настоящего изобретения исследовали влияние сводного HbF (как свободный, обозначаемый как HbF, так и в комплексе с Hp, обозначаемый как Hp-HbF) на основные эндогенные системы человека выведения НЬ: Hp, Нрх, AIM и CD163. Это позволило авторам настоящего изобретения исследовать потенциал HbF, Hp-HbF, общего Hb, AIM, Hp, Нрх и CD163 в качестве биохимических маркеров, подтверждающих диагноз РЕ.
В этом исследовании авторы настоящего изобретения охарактеризовали свободный HbF и эндогенные системы выведения НЬ и тема у беременных женщин, у которых диагностирована РЕ и у женщин с нормальной беременностью (контролей) на этом сроке. В согласии с предшествующими результатами, авторы настоящего изобретения обнаружили значительное повышение уровня HbF у женщин с РЕ11. Более того, было обнаружено значительное изменение уровней систем выведения НЬ и тема в плазме, демонстрирующее значительно сниженные уровни ловушки Hb - Hp и ловушки тема -Нрх. Интересно и в соответствии с ранее опубликованными исследованиями, уровень внесосудистой ловушки тема и радикалов AIM был значительно увеличен в плазме женщин с РЕ.
В этом исследовании авторы настоящего изобретения также оценивали диагностическую и клиническую пользу исследуемых биомаркеров и обнаружили явный потенциал к их использованию в качестве клинических инструментов для диагностики у женщин РЕ и/или HELLP. Более того, биомаркеры обеспечивали клиническую применимость, дав возможность идентифицировать женщин и плоды с риском клинических осложнений.
Гемолиз и последующее высвобождение свободного НЬ и тема происходит при широком диапазоне клинических состояний и заболеваний, включая синдром HELLP, трансфузионные реакции, малярию, геморрагию, сепсис и серповидноклеточную анемию.
Высвобождение свободного Hb и тема вызывает ряд
патофизиологических эффектов, где гемодинамическая
нестабильность и повреждение ткани обеспечивает основное повреждение. Немедленные эффекты включают выведение мощного сосудорасширяющего фактора оксида азота (N0), что приводит к повышению кровяного давления. Более того, было описано, что свободный НЬ и свободный гем накапливаются и компартментализуются в сосудистой стенке и органах, вызывая последующую недостаточность органов. Важно, что было описано, что длительное воздействие бесклеточного НЬ и тема ассоциировано с истощением N0, воспалением и окислительным стрессом.
В серии недавних публикаций охарактеризовано этиологическое
вовлечение и важность свободного HbF и его последующих
метаболитов свободного тема и R0S для развития обусловленного РЕ
повреждения и симптомов. С использованием двойной перфузионной
системы плаценты May et al. продемонстрировали, что добавление
свободного НЬ в кровоток плода вызывало значительное повышение
перфузионного давления, фето-материнское просачивание
внеклеточного НЬ в материнский кровоток и морфологическое повреждение, сходное с тем, что наблюдается в плацентах женщин с РЕ. С использованием модели РЕ на беременной овце и беременной самке кролика, было показано, что голодание приводит к гемолизу и увеличенному количеству внеклеточного тема и билирубина в крови. Более того, в этих моделях также описано тяжелое повреждение плаценты и почек. Это повреждение было объяснено увеличенным гемолизом и последующим высвобождением НЬ и образованием тема и R0S.
В рамках настоящего изобретения авторы настоящего изобретения сообщают, что в соответствии с предшествующими исследованиями уровень свободного HbF (как HbF, так и Hp-HbF) значимо повышен у беременных женщин, у которых диагностирована РЕ. Таким образом, у этих женщин имеется увеличенное кровяное давление и просачивание белка в мочу, оба из которых являются признаками патофизиологического воздействия свободного НЬ и тема.
Для защиты от внеклеточного НЬ и свободного тема у людей
развилось несколько систем детоксикации НЬ и гема. Наиболее хорошо исследованной системой выведения НЬ является Hp. Hp очень эффективно связывает внеклеточный НЬ в крови и полученный комплекс Нр-НЬ выводится из крови посредством связывания с макрофагальным рецептором CD163. Если происходит истощение Hp в результате больших количеств или длительного воздействия НЬ, избыток охуНЬ будет подвергаться реакциям аутоокисления, которые приводят к свободным группам гема и ROS. Более того, избыточный и не связанный с белком НЬ будет накапливаться в почках и вызывать их повреждение, что впоследствии приводит к просачиванию белков в мочу. Истощение, исчерпывание или избыток Hp обеспечат деградацию охуНЬ в его последующие метаболиты metHb, свободный гем и ROS. Основной ловушкой гема в кровотоке является Нрх, высокоспецифичная и обширная система, которая защищает клетки, сосуды и ткани против индуцируемого гемом повреждения. После связывания Нрх доставляет гем через его рецептор CD91, предпочтительно экспрессируемый на макрофагах, гепатоцитах, нейронах и синцитиотрофобластах, где он интернализуется посредством рецептор-опосредуемого эндоцитоза, а затем гем деградируется.
В этом исследовании наблюдали значимое снижение уровней как Hp, так и Нрх, в материнской плазме у женщин с РЕ по сравнению с нормальными беременностями. Это продемонстрировало длительное присутствие повышенных уровней как внеклеточного НЬ, так и гема. Таким образом, хотя это и не было продемонстрировано для очень высоких уровней свободного HbF, авторы настоящего изобретения полагают, что непрерывное воздействие сниженного или умеренного уровня с ранних сроков беременности, например, как показано в исследовании Dolberg et al. для увеличенного уровня свободного HbF уже на 10-16 неделе беременности, истощит эндогенные внутрисосудистые системы защиты от НЬ и гема (т.е. Hp и Нрх) . Кроме того, у некоторых пациентов с РЕ авторы настоящего изобретения наблюдали значимое повышение уровня свободного HbF (не связанного с Hp) . Очень интересно, что было обнаружено, что все из этих пациентов имели изоформу Hp 2-2 (фиг.2С) . Таким образом, эта подгруппа пациентов с РЕ могла иметь сниженную
врожденную защиту против свободного НЬ и в действительности может представлять собой группу пациентов высокого риска.
Ранее авторы настоящего изобретения показали, что ловушка радикалов AIM связывает и деградирует гем и защищает клетки и ткани от окисления, повреждения структур митохондрий, клеток и тканей, и клеточной смерти. Более того, авторы настоящего изобретения показали, что концентрация AIM в плазме значимо возрастает у женщин с РЕ как при полносрочной, так и при ранней беременности. Анализ уровней AIM в плазме в настоящем исследовании подтвердил ранее опубликованные данные, демонстрирующие значимое повышение концентрации AIM в плазме у женщин с РЕ по сравнению с нормальными беременностями.
Почему уровни AIM возрастали, в то время как уровни Hp и Нрх снижались у пациенток с РЕ? В нескольких сообщениях было показано, что экспрессия гена AIM быстро активируется в печени, коже, плаценте и других органах в ответ на увеличенные уровни НЬ, гема и ROS. Это приводит к повышенной секреции этого белка, что приводит к увеличенным его концентрациям в плазме при патологических ситуациях с увеличенной нагрузкой НЬ и ROS. Более того, было показано, что в ходе гемолиза или окислительного стресса не запускается специфическая опосредуемая рецепторами система выведения AIM, в то время как Hp и Нрх выводятся из плазмы при связывании с НЬ и гемом. В результате, концентрации AIM в плазе и внесосудистых жидкостях будут возрастать, в то время как Hp и Нрх будут истощаться, и, таким образом, их концентрации в плазме будут снижаться.
Существует повышенное внимание к применению биомаркеров для клинического прогнозирования и диагностики РЕ. До настоящего времени было предложено несколько биомаркеров, однако ни в одном доступном руководстве не рекомендуется использовать биомаркеры в клинике. Недавно Американский конгресс акушеров и гинекологов
(ACOG) предложил определение тяжелой РЕ, где протеинурия заменена биомаркерами, в настоящее время включающими тромбоциты
( <100000/микролитр), сывороточный креатинин (> 1,1 мг/дл) и трансаминазы печени (в два раза превышающие нормальную концентрацию). В настоящем описании авторы настоящего
изобретения предоставляют данные, указывающие на то, что биомаркеры HbF, AIM и Нрх можно использовать клинически для подтверждения диагностики РЕ. Комбинация HbF, Нрх и AIM демонстрировала наиболее высокую корреляцию с диагнозом
(вероятность обнаружения 69% с 5% ложноположительных результатов, AUC=0,88, abu/4A) и комбинация Нрх и AIM также продемонстрировала высокую вероятность обнаружения (66% с 5% ложноположительных результатов, AUC=0,87, фиг.4В). Таким образом, HbF, Нрх и AIM представляют собой возможные маркеры, которые могут подтвердить диагноз РЕ в будущем.
Было показано, что концентрация Нрх имеет значительную отрицательную корреляцию с кровяным давлением (фиг.З), т.е. тяжестью заболевания. Предшествующие исследования показали, что активный Нрх может влиять на ренин-ангиотензиновую систему (RAS) in vitro путем подавления сосудистого рецептора ангиотензина II
(АТ(1)) и стимуляции расширения сосудистой сети53,54 . Может быть предположено, что увеличенные уровни свободного HbF у женщин с преэклампсией приводят к расходу Нрх и, следовательно, снижению активности Нрх, что приводит к повышенной экспрессии рецептора AT(1) и сокращению сосудистой сети. В действительности, Bakker et al54 продемонстрировали, что плазма женщин с преэклампсией имеет увеличенную экспрессию рецептора AT(1) на моноцитах по сравнению с плазмой при нормальных беременностях. Это вместе с расходом N0 может быть важными эффектами регуляции кровяного давления, обуславливаемыми повышенными уровнями внеклеточного HbF, наблюдаемыми при РЕ.
Способность прогнозировать исходы для плода и матери имеет высокую клиническую ценность, поскольку это позволяет клиницистам решить трудную задачу оптимизации времени родов. В этом исследовании исследовали корреляцию между исследуемыми биомаркерами и рядом исходов для матери и плода. Результаты показали, что HbF, Hp и Нрх коррелировали с поступлением в NICU. Более того, Нрх был в высокой степени ассоциирован с преждевременными родами. Однако, поскольку во всех случаях недоношенность в этой группе была ассоциирована с преэклампсией, эта высокая ассоциация могла быть результатом высокой корреляции
между Нрх и преэклампсией, а не самой недоношенностью.
Важно отметить, что группа, используемая в данном исследовании случай-контроль, не является группой с нормальным распределением, т.е. она имеет избыток женщин с РЕ. Следовательно, уровни обнаружения и прогнозирования, описанные в этом исследовании, таким образом, могут отличаться в группе с нормальным распределением, содержащей 3-8% случаев РЕ.
В этом исследовании авторы настоящего изобретения, среди
прочего, охарактеризовали свободный HbF и эндогенные системы
выведения НЬ и гема при беременности, осложненной преэклампсией.
Уровни HbF в плазме были значимо повышены, в то время как уровни
Hp и Нрх были значительно снижены у женщин с преэклампсией.
Уровень внесосудистой ловушки гема и радикалов и маркера
окислительного стресса AIM был значимо повышен в плазме при
преэклампсии. Более того, HbF и сходные белки-ловушки
демонстрировали потенциал к применению в качестве клинических
биомаркеров для более точной диагностики преэклампсии и в
качестве прогностических факторов, которые помогают
идентифицировать беременность с повышенным риском осложнений при родах.
В настоящем исследовании концентрация НО-1 была значимо сниженной, в частности, в группе РЕ с поздним началом. Низкая концентрация НО-1 может быть следствием непрерывной нагрузки на эту систему вследствие повышенных уровней гема и HbF на протяжении РЕ. Фермент НО-1 медленно все в большей степени истощается на протяжении беременности и, таким образом, его уровень является более низким при РЕ с поздним началом.
Концентрация гема в плазме была повышена при РЕ как с ранним, так и поздним началом, однако на значимом уровне она была повышена только при РЕ позднего начала. Концентрация гема явно высоко коррелировала с общей концентрацией НЬ. Ранее опубликованные исследования показали, что увеличенные уровни HbF на протяжении беременности при РЕ медленно увеличивают нагрузку на и истощают материнские системы выведения НЬ и гема, включая концентрацию AIM, гаптоглобина и гемопексина. Непрерывная сверхпродукция HbF в плаценте индуцирует повреждение плаценты и
материнского эндотелия. Мощность материнских систем ловушек и ферментных систем может быть важным общим фактором, который определяет, как и когда клинические симптомы присутствуют на второй стадии РЕ. Чем более эти системы являются нагруженными и/или истощенными, тем более тяжелыми являются клинические симптомы.
Корреляционный анализ продемонстрировал значимую обратную корреляцию между активностью Нрх и диастолическим кровяным давлением у всех пациентов с РЕ.
Уровень гемоксигеназы 1 также обратно коррелировал с систолическим и диастолическим кровяным давлением. Более высокая нагрузка гемом может объяснить, почему уровень НО-1 был ниже у пациентов с РЕ. Истощение НО-1 уменьшает противовоспалительные свойства, что в свою очередь может усилить материнский эндотелиоз и, таким образом, повысить кровяное давление. Более того, деградация гема посредством НО-1 продуцирует СО, который является мощным сосудорасширяющим фактором. Впоследствии сниженные уровни НО-1 приводят к снижению деградации гема и меньшей продукции СО. Это может способствовать сокращению сосудистой сети, наблюдаемому у пациентов с РЕ.
В этом настоящем исследовании авторы настоящего изобретения представили ряд потенциальных биомаркеров на основе HbF, и белков-ловушек гемоглобина и гема, и ферментов. Используемые в комбинации, эти биомаркеры достигают достаточного уровня обнаружения, приемлемого для клинического применения. Активность Нрх в качестве единственного маркера была способна обнаружить 3 0% случаев РЕ с 10% FPR. Гем и НО-1 продемонстрировали сходные DR. Однако вместе активность Нрх, концентрации Нрх, НО-1, гема и HbF были способны обнаружить 84% случаев РЕ с 10% FPR, что соответствует некоторым из наилучших биомаркеров РЕ. Более того, несколько биомаркеров, включенных в предложенную модель, коррелируют с кровяным давлением и, таким образом, с клинической тяжестью РЕ.
Посредством измерения компонентов метаболизма НЬ в качестве потенциальных диагностических биомаркеров можно проводить более точную диагностику РЕ.
Экспериментальная часть Материалы и способы
Исследование I - взятие образцов на сроке беременности 344 0 недель
Пациенты и демографические данные
Изначально в исследование было включено 150 беременных женщин. Пациенток случайным образом ретроспективно отбирали из когорты в настоящее время продолжающегося проспективного исследования. Критериями исключения были гестационная гипертензия, эссенциальная гипертензия и гестационный диабет. Всего 5 случаев было исключено вследствие прегестационного диабета и связанного с беременностью диабета и всего 145 пациентов включали 98 случаев развивающейся РЕ (случаи) и 4 7 случаев нормальной беременности (контроли). Демографические данные пациентов представлены в таблицах 1 и 2.
Сбор образцов
Это исследование было одобрено наблюдательной комиссией этического комитета для исследований на человеке в Lund University, Швеция. Пациенты подписывали информированное согласие после устного и письменного предоставления информации. Образец материнской венозной крови получали до родов от пациенток, поступивших в Департамент акушерства и гинекологии, Lund University Hospital, Швеция. Образцы собирали в качестве б мл крови в пробирки для плазмы EDTA Vacuette(r) (Greiner Bio-One GmbH, Kremsmiinster, Австрия) и центрифугировали при 2000xg в течение 2 0 минут. Затем плазму переносили в криопробирки и хранили при -8 0°С до анализа. Исход беременности каждой пациентки ретроспективно узнавали из их карт.
Преэклампсию определяли как гипертензию de novo после 2 0 недель беременности с 2 результатами с интервалом по меньшей мере 4 часа, представляющими собой кровяное давление > 140/90 мм.рт.ст. и протеинурию > 300 мг за 24 часа. Это согласуется с определением Международного сообщества по исследованию гипертензии при беременности50. Если отсутствовало количественное определение протеинурии допускали анализ с использованием тест
полосок. Более того, группу РЕ далее подразделяли на РЕ с ранним началом (диагноз <34+0 недель беременности) или РЕ с поздним началом (диагноз > 34+0 недель беременности). Было 3 случая РЕ неизвестным временим постановки диагноза и, таким образом, они не были включены в анализ, проводимый для подгрупп РЕ с ранним началом и РЕ с поздним началом. Реагенты и белки
HbF очищали, как описано ранее16, из свежей цельной крови, взятой из пуповинной крови. у-Цепи человека получали посредством диссоциации очищенного HbF с использованием п-ртутьбензоата
(Sigma-Aldrich, St-Louis, МО, США) и преципитации кислотой, как описано Kajita et al.55 с модификациями Noble56. Абсолютную чистоту HbF (от контаминации посредством НЬА) и у-цепей (от контаминации посредством а- и р-цепей) определяли, как описано ранее11. Антитела мыши к у-цепям человека и, таким образом, специфичные к HbF, получали и очищали в AgriSera АВ (Vannas, Швеция). Антитела против HbF конъюгировали с пероксидазой хрена
(Lightning-Link HRP, Innova Biosciences, Cambridge,
Великобритания) , как описано изготовителем. AIM человека очищали из мочи, как описано Akerstrom57. Поликлональные антитела кролика против AIM человека58, моноклональные антитела мыши против AIM человека59, антитела козы против AIM человека и антитела козы против иммуноглобулина кролика, получали, как описано ранее60. Концентрации фетального гемоглобина (HbF)
Для количественного определения не входящего в комплекс HbF
использовали сэндвич-ELISA. Девяносто шести-луночные
микропланшеты для титрования покрывали антителами против HbF (моноклональное антитело мыши, 4 мкг/мл, в PBS) в течение ночи при комнатной температуре (к.т.). На второй стадии лунки блокировали в течение 2 часов с использованием блокирующего буфера (1% BSA в PBS), а затем проводили инкубацию с калибровочным стандартом HbF или образцами пациенток в течение 2 часов при к. т. На третей стадии добавляли конъюгированные с HRP антитела против HbF (моноклональное антитело мыши; разбавленное 1:5000), и инкубировали в течение 2 часов при к.т. Наконец,
добавляли готовый для применения субстрат 3,3',5, 5'-тетраметилбензидин (ТМВ, Life Technologies, Stockholm, Швеция). Реакцию останавливали через 20 минут с использованием 1,0 М НС1 и считывание поглощения проводили при 4 50 нм с использованием Wallac 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer Life Sciences, Waltham, MA, США).
Концентрации комплекса гаптоглобин-фетальный гемоглобин (Hp-HbF)
Для количественного определения Hp-HbF использовали сэндвич-ELISA. Этот ELISA демонстрирует высокое предпочтение к Hp-HbF по сравнению с не входящим в комплекс HbF (> 10х выделение серии калибровочных стандартов Hp-HbF по сравнению с серией калибровочных стандартов HbF при одном и том же молярном содержании HbF). Девяносто шести-луночные микропланшеты для титрования покрывали антителами против Hp-HbF (подвергнутое аффинной очистке поликлональное антитело кролика против HbF; 4 мкг/мл в PBS) в течение ночи при к. т. На второй стадии лунки блокировали в течение 2 часов с использованием блокирующего буфера (1% BSA в PBS), а затем проводили инкубацию с калибровочным стандартом Hp-HbF или образцами пациенток в течение 2 часов при к. т. На третей стадии добавляли конъюгированные с HRP антитела против НЬ (подвергнутое аффинной очистке поликлональное антитело кролика против НЬА; разбавленное 1:5000), и инкубировали в течение 2 часов при к.т. Наконец, добавляли готовый для применения субстрат ТМВ (Life Technologies), реакцию останавливали через 30 минут с использованием 1,0 М НС1 и считывание поглощения проводили при 450 нм с использованием Wallac 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer Life Sciences).
Концентрации общего гемоглобина (общий Hb)
Концентрации тотального Hb в материнской плазме определяли с использованием набора для ELISA для количественного определения НЬ человека от Genway Biotech Inc. (San Diego, CA, США) . Анализ проводили в соответствии с инструкциями изготовителя и считывание поглощения проводили при 450 нм с
использованием Wallac 1420 Multilabel Counter. Концентрации альфа-1-микроглобулина (AIM)
Радиоактивное мечение AIM посредством 125I (Perkin Elmer Life Sciences) проводили с использованием способа с хлорамином Т. Связанный с белком йод отделяли от свободного йодида гель-хроматографией на колонке Sephadex G-25 (PD10, GE Healthcare, Стокгольм, Швеция). Достигали удельной активности приблизительно 0,1-0,2 МБк/мкг. Радиоиммунный анализ (RIA) проводили путем смешения антисыворотки козы против AIM человека (разбавленной 1:6000) с 1251-меченным AIM (приблизительно 0,05 пг/мл) и неизвестными образцами пациенток или концентрациями калибровочного стандарта AIM. После инкубации в течение ночи при к. т. связанный с антителом антиген преципитировали добавлением бычьей сыворотки и 15% полиэтиленгликоля, центрифугировали при 2500 об/мин в течение 40 минут, после чего измеряли активность 1251 в остатке на гамма-счетчике Wallac Wizard 1470 (Perkin Elmer Life Sciences).
Концентрации гаптоглобина (Hp)
Концентрации Hp в материнской плазме определяли с использованием набора для ELISA для количественного определения Hp человека от Genway Biotech Inc. Анализ проводили в соответствии с инструкциями изготовителя и считывание поглощения проводили при 450 нм с использованием Wallac 1420 Multilabel Counter.
Концентрации гемопексина (Нрх)
Концентрации Нрх в материнской плазме определяли с использованием набора ELISA для Нрх человека от Genway Biotech Inc. Анализ проводили в соответствии с инструкциями изготовителя и считывание поглощения проводили при 4 50 нм с использованием Wallac 1420 Multilabel Counter.
Активность Нрх
Активность Нрх в плазме количественно определяли в образцах плазмы с EDTA с использованием субстрата Нрх-МСА (синтезированного в Pepscan, Lelystad, Нидерланды). Образцы плазмы (40 мкл) разбавляли 1:4 раствором субстрата (0,2 М Tris+0,9% NaCl рН 7,6 (концентрация субстрата 80 мкМ/л) до
конечного объема 2 00 мкл. Испускание измеряли при 4 60 нм на спектрофотометре Varioskan (Thermo Fisher) при 37°С. Активность Нрх измеряли через 0 мин, 30 мин (НрхЗО), 60 мин (НрхбО) и 24 часа. Измеренная величина соответствовала общему количеству серина, катаболизированному посредством Нрх в данный момент времени. Если величина составляла <5 после инкубации в течение 24 часов, активность считалась очень низкой вследствие технических проблем либо с анализом, либо с образцами, и эти образцы исключали из дальнейшего анализа. Анализ площади под кривой был основан на измерении НрхЗО и НрхбО (HpxAUC). Показатели НрхЗО, НрхбО и HpxAUC были аналогичными и, таким образом, для анализа использовали только НрхЗО. Ниже НрхЗО упоминается в качестве активности Нрх.
Концентрации белка кластера дифференцировки 163 (CD163) Концентрации CD163 в материнской плазме определяли с использованием набора Human CD163 Duo Set от R &D Systems (Abingdon, Великобритания). Анализ проводили в соответствии с инструкциями изготовителя и считывание поглощения проводили при 450 нм с использованием Wallac 1420 Multilabel Counter. SDS-PAGE и вестерн-блоттинг
SDS-PAGE проводили с использованием предварительно залитых
4-20% гелей Mini-Protean TGX gels от Bio-Rad (Hercules, СА, США)
и разделяли в восстанавливающих условиях с использованием
стандарта молекулярной массы (Precision protein plus dual marker
Bio-Rad). Разделенные белки переносили на
поливинилидендифторидные (PVDF) или низкофлуоресцентные (LF) мембраны из PVDF (Bio-Rad). Затем мембраны инкубировали с антителами против Hp (поликлональное антитело кролика против Hp человека, 12 мкг/мл, DAKO, Glostrup, Дания). Вестерн-блоттинг проводили с использованием конъюгированных с HRP вторичных антител (DAKO) и хемилюминесцентного субстрата Clarity Western ECL (Bio-Rad). Детекцию полос проводили в устройстве ChemiDoc XRS (Bio-Rad). Относительное количественное определение полос AIM проводили посредством денситометрии с использованием программного обеспечения Image Lab (Bio-Rad).
Статистический анализ
Для анализа данных использовали статистическое компьютерное программное обеспечение Statistical Package for the Social Sciences (SPSS Inc., Chicago, IL) версии 21 для Apple computers (Apple Inc., Cupertino, CA) и программное обеспечение Origin 9.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, США).
Испытание ANOVA использовали для сравнения групп по клиническим параметрам, таким как возраст, BMI, количество родов, систолическое кровяное давление, диастолическое кровяное давление, протеинурия, срок беременности при родах, масса тела при рождении, срок беременности в момент взятия образцов и показатель APGAR через 10 минут.
Для сравнения активности Нрх, концентраций Нрх, НО-1, гема, HbF и общего НЬ между РЕ и контролями использовали критерий Манна-Уитни. Анализ подгрупп проводили для РЕ с ранним и поздним началом.
Критерий Хи-квадрат использовали для сравнения групп по полу плода, стимуляции родов, способу родоразрешения (например, вакуумная экстракция, кесарево сечение или роды через естественные родовые пути), необходимости в пребывании в отделении интенсивной терапии новорожденных (NICU) и преждевременным родам.
Среднюю концентрацию исследованных переменных (далее
называемых биомаркерами) оценивали у женщин с РЕ по сравнению с
контрольной группой с использованием непараметрической
статистики. Для оцениваемых биомаркеров разрабатывали одномерную
логистическую регрессионную модель. В логистической
регрессионной модели вносили поправку на срок беременности в момент взятия образцов. Биомаркеры, демонстрирующие значимое отличие, далее оценивали с использованием кривой зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC-кривой) посредством анализа площади под ROC-кривой (AUC), а также вычисления вероятностей обнаружения при различных уровнях ложноположительных результатов. Для каждого из исследованных биомаркеров, а также для различных их комбинаций проводили параллельный анализ. Более того, проводили анализ подгрупп
женщин с РЕ, т.е. РЕ с ранним и поздним началом, по сравнению с контрольной группой. Одновариантную логистическую регрессионную модель также использовали для дальнейшего вычисления исходов для плода (т.е. поступление в NICU, и недоношенность, и задержка внутриутробного развития (IUGR)) и способа родоразрешения. Корреляционный анализ
Проводили корреляционный анализ (коэффициент корреляции Пирсона) между биомаркерами и диастолическим и систолическим кровяным давлением. Во всех тестах считали значимым значение р <0,05.
Корреляцию между активностью Нрх и концентрацией Нрх вычисляли с использованием непараметрического коэффициента корреляции Кандалла. Более того, корреляционный анализ проводили между активностью Нрх и материнским кровяным давлением (определяемым как наиболее высокое измеренное кровяное давление за 24 часов до родов).
Корреляционный анализ также проводили между концентрациями свободного Hb (HbF и общий НЬ) , гема, НО-1 и гемопексина. Более того, как гем, так и НО-1 сопоставляли как с систолическим, так и с диастолическим кровяным давлением.
Логистический регрессионный анализ
Вероятность обнаружения определяли посредством анализа с использованием ROC-кривой для каждого из потенциальных биомаркеров: Нрх, НО-1 и гема. Вероятность обнаружения получали при 10% и 2 0% ложноположительных результатов. Объединенный потенциал к обнаружению для биомаркеров получали посредством пошагового логистического регрессионного анализа биомаркеров и анализа ROC-кривой.
Результаты
Характеристики пациентов
Характеристики включенных пациентов представлены в таблице
1 и 2. Существовало значимое отличие между женщинами, у которых
диагностирована РЕ, и неосложненными беременностями
(обозначаемыми как контроли) по возрасту, кровяному давлению, протеинурии, количеству родов в прошлом, сроку беременности в
момент взятия образцов, сроку беременности при родах и массе тела при рождении. Более того, для параметров, касающихся исхода для матери (например, способ родоразрешения, включая стимуляцию и инструментальное пособие), а также исхода для плода (например, поступление в NICU и недоношенность) наблюдали значимое отличие. Значимое отличие в показателе APGAR через 10 минут наблюдали между контролями и РЕ с ранним началом, но не РЕ с поздним началом. Отсутствовали значимые отличия между группами в отношении BMI и пола плода.
4, 02)
2,39)
Срок
282
256"
212"
269"
беременности
(279-2?
35) (250-262)
(199-
(265-
при родах
225)
273)
(сутки)
Беременность
8 (8%)
2 (9%)
6 (8%)
двумя плодами
(п)
Срок
281
253"
208"
266"
беременности
(278-2?
34) (247-260)
(196-
(262-
при взятии
220)
270)
образцов
(сутки)
Гестационный
2 (2%)
1 (1%)
диабет1 (п)
Эссенциальная
3 (3%)
1 (5%)
2 (3%)
гипертензия7 (п)
IVF (п)
1 (2%)
8 (8%)
1 (5%)
7 (10%
ICSI (=п)
1 (2%)
1 (1%)
1 (5%)
Реципиент
1 (1%)
1 (1%)
донорской
яйцеклетки (п)
Медикаментозная
2 (2%)
2 (3%)
терапия для
стимуляции
овуляции8 (п)
определению; Р-глюкоза натощак > 7,0 или OGTT с Р-глюкозой через 2 часа > 12,2 ммоль/л.
6 Время постановки диагноза РЕ не было известным для одной пациентки с гестационным диабетом.
7 Эссенциальную гипертензию определяли как кровяное давление > 140/90 до 20 недель беременности или состояние, известное до беременности.
8 В одном случае неизвестно, другой пациентке проводили медикаментозную терапию перготимом.
Таблица 2. Демографические данные пациенток со случаями РЕ и нормальными беременностями (контроли). Величины представлены в качестве среднего значения (95% доверительный интервал) или количества (%) . Статистическое сравнение против контролей. Значимом считалось значение р <0,05. NS: нет значимых отличий; *:р= <0,05; **:р= <0,001.
Исход
Нормальная беременность (контроль; п=47)
Преэклампсия (п=98)
РЕ с ранним началом2 (п=22)
РЕ с
ПОЗДНИМ
началом3 (п=74)
Масса тела при
283
4**
1434**
3213**
рождении
477-3726)
(26
121-3047)
(1105-
(3045-
(грамм)
1764)
3381)
Пол плода (М:Ж)
: 24
46:
4 9 NS
7:15 NS
37:34 NS
HELLP4
7 (
7%)
3 (14%)
4 (5%)
Эклампсия5
5 (
5%)
2 (9%)
3 (4%)
Стимуляция (п)
(21%)
58*
* (59%)
2** (9%)
55**
(75%)
Естественное
(75%)
46*
(47%)
3* (14%)
43* (59%)
родоразрешение (п)
Вакуумная
(17%)
(8%)
0**
8** (11%)
экстракция (п)
Кесарево
(26%)
47*
* (48%)
18**
27**
сечение (п)
(82%)
(37%)
SGA6
1 (
1%) 5а
1 (1%)
IUGR7 0 8 (8%) 5 (23%) 3 (4%)
Поступили в 2 (4%) 32" (36%) 14" 18"* (25%)
NICU8 (n) (82%)
Смерть 0 1 (1%) 1 (5%) О
новорожденного
Преждевременные 0 34** (35%) 20** 12** (16%)
роды9 (=п) (95%)
APGAR1010 9, 80 9, 75 NS 9, 30* 9, 90 NS
(9, 64-9, 96) (9, 62-9, 89) (8, 80- (9, 709,70) 10,0)
концентрации HbF (значение р 0,01) по сравнению с контролями. При подразделении группы РЕ на РЕ с ранним и поздним началом, наблюдали практически 5-кратное повышение концентрации HbF в группе РЕ с ранним началом по сравнению с контролями (значение р 0,006). В группе РЕ с поздним началом наблюдали практически 4-кратное повышение по сравнению с контролями, которое не было статистически значимым (значение р 0,17).
Статистически значимое повышение средних концентраций Hp-HbF наблюдали у женщин с РЕ по сравнению с контролями (значение р 0,018). Это отличие не было выявлено при сравнении РЕ с ранним и поздним началом, хотя в группе РЕ с ранним началом можно было наблюдать отчетливую тенденцию к повышению (значение р 0,15) .
Не было выявлено значимых отличий в концентрации общего НЬ при РЕ против контролей (значение р 0,53) или между РЕ с ранним началом (значение р 0,80) и РЕ с поздним началом (р 0,73) против контролей.
Таблица 3. Средние концентрации в плазме биомаркеров в группе РЕ и нормальной беременности (контроли). Статистическое сравнение против контролей. Значимость вычисляли с использованием непараметрической статистики (Манна-Уитни). Значения представляют собой средние значения с (95%С1). Значимым считали значение р <0,05.
Биомаркер
Нормальная
Преэклампсия
РЕ с
РЕ с
беременность
(п=98)
ранним
ПОЗДНИМ
(контроль;
началом1
началом2
п=47)
(п=22)
(п=74)
HbF
3, 85
15,26
18,72
14, 60
(нг/мл)
(2,51-5,20)
(7,0-23,6)
(1, 6-
(5,10-
р=0,01
39,05)
24, 0)
р=0,006
р=0,17
Hp-HbF
0,59
0, 61
1, 07
0,48
(мкг/мл)
(0,003-1,18)
(0,31-0,90)
(-0,10-
(0,29-
р=0,018
2,24)
0, 66)
р=0,15
р=0,02
Общий Hb (мкг/мл) 277
(232-321;
285
(238-331; р=0,53 290
(152-430) р=0,80 284 (237331) р=0,73
(мг/мл)
1, 17
(1,04-1,30)
0, 97
(0,75-1,19) р= <0,0001
1,34 (0,392,30) р=0,067
О, 89 (0,771, 02) р=0,001
CD 163 (мкг/мл)
Нрх
(мг/мл) 461
(408-512)
О, 93
(О, 88-0, 9i
485
(445-527) р=0,37
О, 69
(О,66-0,73) р= <0,0001 433
(324-543) р=0,35
О, 69 (О,610,77) р <0,0001 508
(465551) р=0,07 О, 69
(О,650,73) р <0,0001
активность 0,80
Нрх (0, 66-0, 93)
0,59
(0,49-0,69) р=0,019
О, 81 (0,541, 07) р=0,96
О, 54 (0,440, 65) Р=0,004
Гем 59,86
(мкг/мл) (52,34- 67,3!
75,03 69,54 77,55
(67,43-82,62) (55,07- (68,37-
р=0,01 84,02) 86,74)
р=0,26 р=0,02
НО-1 нг/мл
5,29
(4,69-5,9)
4, 48 4, 67
(4, 04-4, 93) (3, 37-
р=0, 03 5, 97)
4,42 (4,695, 89)
беременности.
2 РЕ с поздним началом определяли как диагноз на сроке > 34+0 недель беременности Hp и CD163
Анализ концентрации Hp в плазме продемонстрировал, что повышенная концентрация HbF у пациентов с РЕ сопровождалась более низкой концентрацией Hp (таблица 3). Результаты продемонстрировали высокозначимое снижение концентрации Hp в образцах плазмы женщин с РЕ по сравнению с контролем (значение р <0,0001). Кроме того, РЕ с поздним началом продемонстрировала значимое снижение по сравнению с контролями (значение р 0,001). Напротив, РЕ с ранним началом продемонстрировала небольшое, но статистически значимое повышение концентрации Hp по сравнению с контролями (значение р 0,0 67).
Растворимый, отделившийся рецептор макрофагов CD163, опосредующий выведение комплекса Нр-НЬ, анализировали в плазме61-63. Анализ продемонстрировал небольшое, но не значимое (значение р 0,37) повышение в группе РЕ по сравнению с контролями (таблица 3) . При подразделении группы РЕ на РЕ с ранним и поздним началом, наблюдали небольшое не значимое статистически повышение в группе РЕ с поздним началом (значение р 0,07 против контролей), в то время как небольшое не значимое статистически снижение наблюдали в группе РЕ с ранним началом (значение р 0,35 против контролей).
Нрх
Анализ внутрисосудистого выводящего гем белка Нрх продемонстрировал высокозначимое снижение концентрации Нрх в
плазме у женщин с РЕ (значение р <0,0001) по сравнению с
контролями (таблица 3) . Подразделение группы РЕ
продемонстрировало значимое снижение в группах РЕ как с ранним началом (значение р <0,0001), так и с поздним началом (значение р <0,0001) по сравнению с контролями.
Образцы крови также анализировали в отношении активности Нрх. Активность Нрх в плазме количественно определяли в образцах плазмы с EDTA с использованием субстрата Нрх-МСА (синтезированного в Pepscan, Lelystad, Нидерланды). Образцы плазмы (40 мкл) разбавляли 1:4 раствором субстрата (0,2 М Tris+0,9% NaCl, рН 7,6 (концентрация субстрата 80 мкМ/л)) до конечного объема 200 мкл при 37°С. Испускание количественно определяли при 4 60 нм на спектрофотометре Varioskan (Thermo Fisher) после инкубации в течение 30 мин (при 37°С) .
Активность Нрх измеряли спектрофотометрически в следующие моменты времени: 0 мин, 30 мин (НрхЗО), 60 мин (НрхбО) и 24 часов. Измеренная величина соответствовала общему количеству серина, отщепленного Нрх в данный момент времени. Если величина составляла <5 через 24 часа активность считали чрезвычайно низкой и образцы исключали из дальнейшего анализа вследствие возможного повреждения образца. Вычисляли площадь под кривой на основе НрхЗО и НрхбО.
Активность Нрх
11 образцов (8 контролей и 3 РЕ) продемонстрировали "чрезвычайно низкую величину" после инкубации в течение 2 4 часов и, таким образом, были исключены из анализа.
Активность Нрх была значимо более низкой в группах РЕ по сравнению с контрольной группой через 30 мин (р=0,02), 60 мин
(р=0,05) и при HpxAUC (р=0,02) (таблица 2) . Однако при разделении пациентов с РЕ на РЕ с ранним началом и поздним началом, стало очевидно, что в группе с ранним началом Нрх30=0,81 она была идентичной контрольной группе (Нрх30=0,80)
(таблица 4). В противоположность этому, группа с поздним началом продемонстрировала еще более выраженное снижение активности Нрх, чем группа РЕ в общем, в отношении всех видов активности Нрх
(Нрх30=0,54) (таблица 4).
Интересно, что соотношение между концентрацией Нрх и активностью Нрх можно использовать для оценки риска развития РЕ с ранним началом или поздним началом. Как видно из таблицы выше, соотношение для нормальной беременности составляет 1,16, в то время как для РЕ с ранним началом оно составляет 0,8 5 и для РЕ с поздним началом оно составляет 1,28. Таким образом, если соотношение является более низким чем у контроля, т.е. составляет 1 или менее, тогда существует повышенный риск развития РЕ с ранним началом, когда соотношение составляет 1,2 или более, существует повышенный риск развития РЕ с поздним началом, и активность Нрх измеряют, как описано в настоящем описании, в качестве НрхЗО.
Корреляционный анализ
Результаты для Нрх
Активность Нрх не коррелировала с концентрацией Нрх в плазме (р=0,74 для НрхЗО) . То же самое было справедливым для группы РЕ с ранним началом (р=0,17), но не для группы РЕ с поздним началом (р=0,24).
НрхЗО значимо коррелировала с диастолическим кровяным давлением у всех пациентов (р=0,04) и существовала явная тенденция к корреляции для НрхбО (р=0,1) и HpxAUC (р=0,0б) (таблица 4). Когда пациентов с ранним началом исключили из анализа, существовала явная корреляция между диастолическим кровяным давлением и каждой из НрхЗО, НрхбО и HpxAUC (таблица 5, фиг.8). Более того, существовали явные тенденции к корреляции между систолическим кровяным давлением и НрхЗО (р=0,07), НрхбО (р=0,17) и HpxAUC (р=0,11) (таблица 5). Результаты для кровяного давления: Таблица 5
Все пациенты НрхЗО НрхбО HpxAUC
Систолическое р=0,35 NS р=0,53 NS р=0,45 NS
кровяное
давление
Диастолическое CF= -0,18 р=0,10 NS CF =-0,17
кровяное р=0,04 р=0,0б NS
давление
CF: коэффициент корреляции Пирсона
РЕ с поздним НрхЗО НрхбО HpxAUC
началом и
контроли
Систолическое
CF=-
-0, 17
р=0,
. 17 NS
р=0,
. 11
кровяное
р=0,
. 07
давление
Диастолическое
CF=
-0,25
CF=-
-0,20
CF =
=-о,
. 23
кровяное
р=0,
. 009
р=0,
. 04
р=0,
. 02
давление
В соответствии с предшествующими данными, авторы настоящего изобретения обнаружили сниженную активность Нрх у пациентов проявлениями РЕ. Однако авторы настоящего изобретения обнаружили снижение активности Нрх только у пациентов с РЕ с поздним началом, но не у пациентов с РЕ с ранним началом. В противоположность этому и как описано в настоящем описании, было показано, что концентрация белка Нрх является сниженной на статистически значимом уровне при РЕ как с ранним, так и с поздним началом. Корреляционный анализ продемонстрировал статистически значимую обратную корреляцию между НрхЗО и диастолическим кровяным давлением у всех пациентов, и существовала тенденция к той же обратной корреляции для НрхбО и HpxAUC (таблица 5) . Когда анализировали только корреляцию в группах контролей и позднего начала вместе, существовала статистически значимая корреляция между всеми показателями активности Нрх и диастолическим кровяным давлением и тенденция к статистически значимой корреляции с систолическим кровяным давлением.
AIM
Анализ уровней в плазме ловушки гема и радикалов AIM выявил значимое повышение концентрации AIM у женщин с РЕ (значение р 0, 035) по сравнению с контролями (таблица 3) . При подразделении группы РЕ наблюдали статистически значимое повышение в группе РЕ с поздним началом (значение р 0,03) и явное, но не значимое статистически, повышение наблюдали в группе РЕ с ранним началом (значение р 0,2 6).
Корреляция свободного HbF и Hp
Оценивали корреляцию между уровнями свободного HbF и Hp в плазме. Была обнаружена отрицательная корреляция, т.е. повышенная концентрация свободного HbF с плазме коррелировала со сниженной концентрацией Hp в плазме, когда были включены все пациенты, контроли и женщины с РЕ (г=-0,335, значение р <0,0001, п=145)(фиг.1А). Неожиданно, при сравнении корреляции у контролей
(фиг.1В) и женщин с РЕ (фиг.1С) по отдельности, наблюдали повышенную отрицательную корреляцию для группы РЕ (г =-0,437, значение р <0,0001, п=98), в то время как в контрольной группе наблюдали слабоположительную корреляцию (г=0,142, значение р 0,33, п=47). Сходные корреляции наблюдали для Hp против Hp-HbF и Hp против общего НЬ, но ни одна из них не достигла статистической значимости (Hp против Hp-HbF г=-0,05, значение р 0,52; Hp против общего НЬ г=0,03, значение р 0,73).
Ассоциация между изоформами Hp и уровнем свободного HbF, Нрх и AIM
Авторы настоящего изобретения идентифицировали
преобладающую изоформу Hp (1-1, 1-2 или 2-2) в образцах плазмы пациентов с использованием вестерн-блоттинга (фиг.2А). Как видно на фиг.2В, сходное распределение различных изоформ наблюдали как в группе контролей, так и в группе РЕ, с преобладающим присутствием Hp 1-2 (С, 45%; РЕ, 41%) и 2-2 (С, 43%; РЕ, 44%) по сравнению с 1-1 (С, 12%; 15%) . Подразделение группы РЕ на РЕ с ранним и поздним началом также продемонстрировало сходное распределение: 1-1 (раннее начало, 13%; позднее начало, 15%), 12 (раннее начало, 45%; позднее начало, 40%) и 2-2 (раннее начало, 42%; позднее начало, 45%) . Более того, анализировали ассоциацию между изоформами Hp и уровнями в плазме свободного HbF, Hp-HbF, общего Hb, Hp, CD163, Нрх и AIM (фиг.2С-Б). Неожиданное повышение концентрации свободного HbF наблюдали в группе Hp 2-2 у женщин с РЕ (фиг.2С) . Меньшее, но сходное повышение концентрации Hp-HbF наблюдали в группе Hp 2-2 РЕ по сравнению с контролями (фиг.2D). Не наблюдали дополнительных значимых ассоциаций с изоформой Hp.
Корреляционный анализ между биомаркерами и тяжестью заболевания
Корреляционный анализ с использованием коэффициента корреляции Пирсона продемонстрировал высокозначимую обратную корреляцию между Нрх и кровяным давлением, как систолическим (г=-0,511, значение р <0,00001, п=145), так и диастолическим (г=-0,520, значение р <0,00001, п=145)(фиг.З). Не наблюдали
статистически значимой корреляции для любого из других биомаркеров и кровяного давления.
Оценка биомаркеров в качестве диагностических инструментов и клинических прогностических показателей
Логистические регрессионные модели использовали для оценки полезности описанных биомаркеров в качестве диагностических маркеров РЕ. При сравнении женщин с РЕ против контролей было обнаружено значимое отличие для HbF, AIM и Нрх (значение р <0,0001), но не для Hp и CD163. Каждый из значимо измененных биомаркеров был способен осуществлять диагностику РЕ (с поправкой на срок беременности), однако Нрх продемонстрировала высокий уровень значимости и диагностическую вероятность обнаружения 64% при частоте ложноположительных результатов 5% с AUC 0,87 (таблица б, фиг.4С) . Комбинация Нрх, AIM и HbF не была значимой (значение р для HbF 0,08), однако демонстрировала диагностическую вероятность обнаружения 69% при частоте ложноположительных результатов 5% с AUC 0,88 (таблица б, фиг.4А). Комбинация Нрх и AIM была значимой и продемонстрировала диагностическую вероятность обнаружения бб% с частотой ложноположительных результатов 5% и AUC 0,87 (таблица б, фиг.4В).
Таблица 6. Величины чувствительности и специфичности для
комбинации 1) HbF, AIM и Нрх, 2) AIM и Нрх и 3) Нрх отдельно.
Вероятности обнаружения для РЕ при различных частотах
ложноположительных результатов и AUC для ROC-кривой. Вычисления
проведены для всех случаев РЕ против контроля.
Частота HbF в комбинации AIM в Нрх
ложноположительных с AIM и Нрх1 комбинации с
результатов Нрх2
69%
66%
64%
10%
69%
67%
70%
20%
81%
81%
75%
30%
83%
85%
79%
AUC
0, 88
0, 87
0, 87
1 На основе логистической регрессии, включая все три параметра.
2 На основе логистической регрессии, включая оба параметра. Прогнозирование исходов для плода и матери
Помимо исследования биомаркеров для подтверждения диагноза РЕ, авторы настоящего изобретения исследовали, могут ли биомаркеры прогнозировать ряд исходов для плода и матери. Это проводили с использованием логистической регрессионной модели, сходной с моделью РЕ. Исследованные исходы для плода представляли собой: поступление NICU, IUGR и недоношенность. Исследуемые исходы для матери представляли собой: стимуляцию родов, кесарево сечение и вакуумную экстракцию. Каждый из биомаркеров HbF (значение р 0,001), Нрх (значение р 0,008) и Hp (значение р 0,03) продемонстрировал потенциал в качестве прогностических биомаркеров "поступления NICU". Однако в комбинированной логистической регрессионной модели они оказались незначимыми. Биомаркеры Нрх (значение р 0,0003, AUC=0,71) и CD163 (значение р 0,03, AUC=0,61) продемонстрировали потенциал в качестве биомаркеров недоношенности. В комбинации эти два биомаркера оказались значимыми с несколько более сильной ассоциацией с недоношенностью (значение р 0,001 и значение р 0,025, AUC 0,72).
Ни один из биомаркеров не продемонстрировал никакую прогностическую ценность в отношении стимуляции родов или вакуумной экстракции. Нрх продемонстрировал значимую ассоциацию с кесаревым сечением (значение р 0,009, AUC 0,62).
Таблица 7. Площадь под ROC-кривыми (AUC) для исходов для плода (поступление в отделение интенсивной терапии новорожденных (NICU) и недоношенность) и исходов для матери (риск кесарева сечения). Исход для плода и исходы для матери, стимуляция родов и вакуумная экстракция не были значимо ассоциированными с каким-либо из биомаркеров. Все вычисления были основаны на одномерном логистическом регрессионном анализе.
Поступление в Значимость NICU
AUC
Пациенты и образцы
Исследование было одобрено этическим комитетом в St Georges University Hospital, Лондон, Великобритания. Все участники подписали письменное информированное согласие перед включением в исследование. Женщин, имеющих стандартные посещения для дородового наблюдения в St. Georges Hospital Obstetric Unit, Лондон, привлекали в 2006 и 2007 годах.
Срок беременности вычисляли, исходя из последнего менструального цикла и подтверждали с помощью ультразвукового измерения копчиково-теменного размера. Образец материнской венозной крови собирали на сроке беременности 6-2 0 недель (среднее значение 13,7) в 5-мл пробирки vacutainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) без добавок. После свертывания образцы центрифугировали при 2 000хд при комнатной температуре в течение 10 минут и сыворотку отделяли и хранили при -8 0°С до дальнейшего анализа.
Все данные об исходе беременности получали из главной базы данных о родах и проверяли для каждого индивидуального пациента. РЕ определяли как в исследовании I, описанном в настоящем описании.
Как и в исследовании I, нормальную беременность определяли как роды на сроке 37 + 0 недель или более с нормальным кровяным
давлением. Образцы при неосложненной беременности (контроль) привлекали в качестве последовательных случаев в тот же период времени.
Количественное определение общего Hb, HbF, AIM, Hp и Нрх
Концентрацию HbF в образцах сыворотки (т.е. свободный HbF)
измеряли посредством сэндвич-ELISA с использованием
поликлональных антител, как описано в исследовании I. Концентрацию AIM определяли посредством радиоиммунного анализа, как описано в исследовании I. Концентрацию общего Hb, Hp и Нрх определяли в образцах сыворотки с использованием набора для ELISA с количественным определением соответствующего маркера, как описано в исследовании I. Статистический анализ
Статистику SPSS версии 21.0 для компьютеров Apple использовали вместе со статистическим программным обеспечением R studio Version (0.98.1062). Для всех анализов значимым считалось значение р <0,05. Значимые отличия между группами для биомаркеров HbF, общего Hb, Hp, Нрх и AIM вычисляли посредством одностороннего ANOVA. Вследствие отличий в сроке беременности при проведении допплеровского ультразвукового исследования в группах РЕ и контроля, UtAD преобразовывали в величины кратных медиан (МоМ) согласно средним значениям, приведенным Velauthar et al64.
Пошаговый регрессионный анализ представляет собой широко используемый способ для разработки прогнозирующих моделей, однако он был подвергнут критике65. Таким образом, авторы настоящего изобретения предприняли попытку подтвердить результаты также посредством разработки прогностических моделей с использованием двух позднее разработанных статистических способов, регрессии Лассо и усиленной регрессии с использованием дерева и сравнить эти способы с точки зрения их прогностической способности. Способы сравнивали посредством площади под ROC-кривой. Для подтверждения результатов прогнозирования набор данных случайным образом распределяли на пробную группу (2/3), которую использовали для разработки прогностических моделей, и
исследуемую группу (1/3), которую использовали для исследования их прогностической способности.
Конечные модели для биомаркеров и материнских характеристик строили на основе обратной пошаговой логистической регрессии. Отдельные анализы проводили для РЕ с ранним началом и РЕ с поздним началом. Для всех регрессионных параметров и параметров в комбинации строили ROC-кривые и вычисляли прогностические показатели (PR) при различных частотах ложноположительных результатов (FPR). Оптимальный прогностический уровень/FPR определяли как точку на ROC-кривой, наиболее близкую к левому верхнему углу.
Результаты
Демографические данные
Всего было включено 52 0 женщин, у 86 из которых развилась РЕ (случаи), 65 имели спонтанные преждевременные роды (SPTB), 7 имели осложнение IUGR, у 10 развилась индуцированная беременностью гипертензия (PIH), 1 пациентка имела IUGR и отслоение плаценты, 3 имели изолированное отслоение плаценты (без РЕ или IUGR), 2 имели эссенциальную гипертензию. В качестве контролей было включено 34 7 женщин с неосложненными беременности и полносрочными родами (> 37 недель беременности).
Материнские характеристики представлены в таблице 8. Из 8 6 женщин, у которых развилась РЕ, у 28 роды произошли до 37 + 0 недель беременности. Из них у 17 роды произошли до 34 + 0 недель беременности, продемонстрировав значимо более низкую массу тела при рождении по сравнению с контролями. Группы эссенциальной гипертензии без РЕ (п=2) и отслоения (п=3) были исключены из последующего анализа вследствие малого размера выборки.
Контроль Преэклампсия IUGR (n=347) (n=86) (n=7)
Индуцированная Эссенциальная Спонтанные Отслоение
беременностью гипертензия преждевременные (п=3)
гипертензия (без РЕ) роды
(п=10) (п=2) (п=64)
Этническая принадлежность Европиоиды (304) Южная Азия (70) Афро-Американцы (54) Восточные Азиаты (4) Смешанные (19) Не известно (38)
Беременные женщины
252 36 20 3
13 23
1,46 (1,361,56)
р <0,000001* 2,73
(2,32-3,14) р <0,0001
4 2 0 0 0 1
Р=0,5 1 NS
3, 33
(1, 157-82) р <0, 0
001
6 1 3
о о о
0,06 NS
3,44
(0,03-6,86) р <0,0001 1,0
(1,0-1,0) р=0,4 9 NS 34
р=0,004* 2,71
(2,2-3,21) р <0,0001 4, 67 (-3,3212,65) р <0,0001
Роды
(Среднее значение-95%С1)
Индекс массы тела
0,11 (0,060,16)
23,4 (22,9
1, 14
(0,78-1,14) р <0,0001
26, 9
(25,5-28,35)
0, 67 (0,191,52) Р=0, 0 03
27,4 (20,9
2,11
(-0,85-5,07) р <0,0001
28,2
(21,7-34,8) 0,0
1,0 (0,0-0,0) р=0,73 NS
20,5
(3, 3-37,6) 0,74
(0,45-1,03) р <0,0001
23,5
(21,9-25,1)
0, 67 (-2,23,5) р=0,04
21,1 (16,2-
23, 9)
р <0,0001
33, 8) р=0, 0
Р=0,001
р=0,36 NS
р=0,8 8 NS
25,9) р=0,37 NS
GA при ультразвуковом сканировании (среднее значение -95%С1)
GA при взятии образцов крови (среднее значение -95SCI)
12,5 18,5 (12,4- (17,5-19,5) 12,6) р <0,0001
13,5 13,9
(13,3- (13,3-14,6)
13,8) р=0,17 NS
20,4 16,3 (15,9 (12,4-20,3) р <0,0001
25,0) р <0, 0
001
13,6 13,8 (10,5 (12,3-15,4) Р=0,66 NS
16,7) р=0,9 4 NS
11,6
(7,9-15,2) р=0,10 NS
12, 0
(-24,3-48,3) 0,34 NS 20,4
(19,5-21,4) р <0,0001
14, 1
(13,4-14,8) р=0,09 NS 19,0 (5,832, 3) р <0,0001
13,2 (7,918, 6) р=0,83
Пол плода
Мужской
Женский
Масса тела при рождении
185 49 161 36
р=0,44 NS*
3467 2716 (3415- (2485-2947) 3520) р <0,0001
р <0,0 р=0,69 NS*
001 *
1791 2810
(1214 (2090-3531)
-2369 р <0,0001
1 1
NS*
3260
(3414-3518) р=0,56 NS 32 32
р=0,8 NS*
2324
(2160-2488) р <0,0001 2 1
NS*
1838
(47-3629) р <0,0001
р <0, 0
Недоношенность (%) 0% 28 (33%)
р <0,0001
Среднее значение GA при 4 0,4 3 6,7
родах (40,3- (35,7-37,
40,5) р <0,0001
Диабет
Да 0 3
Нет 346 83
7 4 (40%) 0 (0%) 60 (100%) 2 (100%)
(100% р <0,0001
р <0, о
39,4 34,6 32,8
(34,8-43,9) (33,8-35,3) (25,6-
р=0,25 NS р <0,0001 40,9)
р <0,0001
001
34,8 37,0
(32,6 (34,2-39,9)
р <0,0001
37,0) р <0, 0
001
0 1 о о о
7 9 2 65 2
Отсутствовали статистически значимые отличия между случаями и контрольными группами с точки зрения времени взятия образцов сыворотки.
Биомаркеры
Сывороточные уровни биомаркеров HbF, Hp, AIM, общего Hb, Hp и Нрх представлены в таблице 9.
В таблице 9 представлены средние концентрации с 95% доверительным интервалом биохимических маркеров свободного HbF, AIM, общего Hb, Hp, Нрх, и кратные медианы (МоМ) для индекса пульсации маточной артерии при допплеровском ультразвуковом исследовании (UtAD PI) . Значения р вычисляли посредством одностороннего ANOVA по сравнению с контрольной группой. Анализ индуцированной беременностью гипертензии в группах пациенток и IUGR не продемонстрировал никаких значимых отличий от контрольной группы.
Биомаркер
Контроли (п=346) (95%С1)
Преэклампсии
(п=86)
(95%С1)
Спонтанные преждевремен ные роды (п=65) (95%С1)
HbF (мкг/мл)
5, 6
(4,2-7,4!
10, 8
(5,2-16,5; р=0,02 3,5
(2,3-4,8) р=0,25 NS
AIM (мкг/мл)
15, 5
(14,9-16, i;
17,3
(15,5-19,2; р=0,03 14, 1
(12,7-15,5) р=0,08 NS
Общий (мкг/мл)
НЬ-Т 297
(257-337;
258
(160-358) р=0,47 NS 201
(158-244; р=0,05
(мкг/мл) 971
(915-1028)
1102
(991-1131) р=0,089 NS 998
(863-1133) р=0,73 NS
Нрх
1143
1062
1061
(мкг/мл)
(1111-1175)
(992-1132)
(992-1130)
р=0,05
р=0,05
UtAD PI МоМ
0, 98
1, 18
0, 94
(О,92-0,99)
(1,04-1,31)
(О,87-1,02)
р <0,0001
р=0,84 NS
Средняя концентрация HbF в группе РЕ (10,8 мкг/мл, р=0,02) была значимо более высокой, чем в контрольной группе (5,6 мкг/мл). HbF представляет собой общий HbF по сравнению с в основном не входящим в комплекс HbF, описанным в исследовании I. Средняя концентрация AIM также была значимо повышена (17,3 мкг/мл против 15,5 мкг/мл, р=0,03). Средняя концентрация Нрх в группе РЕ была значимо более низкой, составив 10 62 мкг/мл, по сравнению с 1143 мкг/мл в контрольной группе (р=0,05). Существовала тенденция к несколько более высокой концентрации Hp в группе РЕ (1102 мкг/мл) по сравнению с контрольной группой (971 мкг/мл), однако она не была значимой (р=0, 089) . PIH или IUGR продемонстрировали сравнимые уровни с контролями (данные не представлены). Группа SPTB имела значимо более низкие уровни общего НЬ (201 мкг/мл против 297 мкг/мл, р=0,05) и Нрх (1061 мкг/мл против 1143, р=0,05). Значения UtAD МоМ были значимо более высокими в группе РЕ, чем у контролей (1,18 против 0,95 р <0,0001).
Логистический регрессионный анализ
Способность биомаркеров прогнозировать РЕ исследовали в логистических регрессионных моделях. Соответствующие ROC-кривые получали для визуализации прогностической ценности. Исследовали все биомаркеры по отдельности, а также оценивали в комбинации для поиска оптимального прогностического значения. Значимые результаты приведены в таблице 10 и ROC-кривые представлены на фиг.6.
Таблица 10. Прогностический уровень (PR) при различных
5% 10% 20% 30% Оптимально
(PR/FPR)
частотах ложноположительных результатов (FPR) для каждого из различных биомаркеров, величины МоМ для пульсации UtAD (PI) и материнские характеристики. Все прогностические величины получены из ROC-кривых на основе пошаговых логистических регрессионных моделей. Модель AUC
(95% CI)
HbF* 0, 65 13% 15% 35% 50% 60%/ 35%
(0,580,71)
А1М^
0,58 (0,50, 66)
19^
22!
35^
57%/4 б?
Hp ?
0,58 (0,50, 66)
17!
30^
A9h
53%/3f
Нрх*
0,58 (0,50, 66)
17!
40%/2S
UtAD PI MoM 0,60 18% 25% 39% 49% 48%/27%
(0,520, 68)
HbF*+AlM*+Hp*+ 0, 73 22% 33% 43% 59% 66%/22^
Hpx* (0,660,8)
Материнские 0, 85 52% 60% 68% 79% 73%/23^
характеристики (0,8-
* 0, 9)
UtAD^+материнс 0, 82 51% 57% 69% 80% 78%/27;
кие (0,75-характеристики 0,89)
UtAD^+биомарке 0,76 23 40 51 63 61%/24^
ры* (0,68- 26% 42% 58% 67%
0, 83)
Биомаркеры+мат 0, 83 60% 62% 68% 81% 81 %/2
еринские (0,7 5-
характеристики 0,91)
Биомаркеры+мат 0, 79 47% 53% 71% 74% 71%/19%
еринские (0,71-характеристики 0,87) +UtAD
Несмотря на значимо повышенную сывороточную концентрацию HbF у пациенток, у которых впоследствии развилась РЕ, она продемонстрировала ограниченную прогностическую ценность при использовании отдельно (PR 15% при FPR 10%) . AIM продемонстрировал сходную прогностическую ценность (PR 19% при FPR 10%) . Нрх продемонстрировал наилучшие индивидуальные прогностические уровни для РЕ (PR 42% при FPR 10%) . Оптимальный прогностический уровень был достигнут путем комбинирования AIM, HbF и Нрх (PR 62% при FPR 10%).
Все величины материнских характеристик исследовали отдельно и в комбинации с использованием логистического регрессионного анализа для сравнения РЕ и контролей.
Комбинация материнских характеристик (количество родов, диабет, гипертензия до беременности) и биомаркеров (HbF, AIM и Нрх) увеличивала PR до 62% при FPR 10% (таблица 10, фиг. 7) и комбинация UtAD и материнских характеристик продемонстрировала сходный прогностический уровень (PR 57% при FPR 10%).
Преэклампсии с ранним началом против позднего начала
Авторы настоящего изобретения обнаружили повышенные уровни HbF в группах РЕ как с ранним началом, так и с поздним началом (таблица 11).
Таблица 11. Средние концентрации биомаркеров в подгруппах РЕ с ранним началом (определение: роды <34+0 недель беременности) и РЕ с поздним началом (определение: роды > 34+0 недель беременности). Значения р вычисляли посредством одностороннего ANOVA по сравнению с контрольной группой.
была более низкой в обеих группах, но значимой только в группе РЕ с ранним началом (р=0,04) (таблица 11) . UtAD PI МоМ были значимо повышены особенно в группе с ранним началом 1,63 против 0,95, р <0,00001), но только незначительно повышены в группе с поздним началом, и это отличие не было статистически значимым (1,06 против 0,95, р=0,06). Отсутствовали значимые отличия для общего НЬ или Hp во всех из исследуемых групп.
Логистические регрессионные модели для РЕ с ранним и поздним началом для исследуемых биомаркеров продемонстрировали прогностический уровень для HbF 23% при FPR 10% - но только в группе РЕ с поздним началом. Уровень AIM был статистически значимым только в группе с поздним началом (р=0,01) и уровень Нрх был статистически значимым только в группе с ранним началом и продемонстрировал PR 32% при FPR 10%.
UtAD имел наилучшую эффективность в группе с ранним началом с PR 57% при FPR 10%, но был статистически значимым даже в группе с поздним началом.
Ни один из биомаркеров не был статистически значимым в комбинации с друг с другом для материнских характеристик или UtAD в группах как с ранним началом, так и с поздним началом.
Обсуждение
Целью этого исследования было подтверждение предшествующих данных, указывающих на то, что сывороточные уровни свободного HbF и AIM являются повышенными уже в первом триместре беременности, и что они являются пригодными в качестве прогностических биомаркеров первого триместра для последующего развития РЕ. Размер когорты в этом исследовании является более крупным и лучше отражает нормальную встречаемость РЕ. Кроме того, исследование также оценивает влияние биологических родственных белков Hp и Нрх, выводящих гем и НЬ.
Основные данные в настоящем описании подтверждают, что как HbF, так и AIM значимо повышены в сыворотке беременных женщин, у которых впоследствии развивается РЕ (таблица 9) . Увеличенные сывороточные концентрации HbF, вероятно, обусловлены дефектным плацентарным гемопоэзом, отражающим плацентарный окислительный стресс. Данные указывают на то, что HbF и AIM обладают
потенциалом в качестве прогностических биомаркеров первого и второго триместров для РЕ. Более того, ловушка гема Нрх также продемонстрировала высокую прогностическую ценность и, таким образом, также предлагается в качестве дополнительного потенциального биомаркера для РЕ. Индексы UtAD в основном продемонстрировали более высокие величины PI МоМ в группе с ранним началом. Это полностью соответствует ранее опубликованным результатам нескольких исследовательских групп. Более высокое значение PI в группе с ранним началом отражает увеличенную резистентность в маточных артериях в результате поверхностного проникновения материнских децидуальных спиральных артерий признака РЕ с ранним началом, но реже при РЕ с поздним началом.
Интересно, что данные показали, что свободный общий НЬ и Нрх были значимо снижены у пациенток с преждевременными родами. Известно, что низкая ферментативная активность Нрх ослабляет эндотелиальное воспаление. Таким образом, более низкие уровни Нрх могут приводить к повышению материнского воспаления, наблюдаемому как при РЕ, так и при преждевременных родах. Необходимы дальнейшие исследования для более тщательного установления роли Нрх в недоношенности.
Специальный скрининг в первом триместре на неблагоприятный
исход беременности является очень важным, поскольку он дает
клиницистам инструмент для нацеливания и индивидуализации
надзора за пациентами вместо общих скрининговых программ на
более поздних сроках беременности. Посредством идентификации
беременностей высокого риска можно инициировать превентивные
стратегии и профилактическое лечение. На сегодняшний день
единственным профилактическим лечением является
ацетилсалициловая кислота (ASA) в низкой дозе. Если лечение начать до 16 недель беременности, происходит значительное снижение риска (RR=0,47), особенно для тяжелой РЕ с ранним началом. Число пролеченных больных на одного излеченного (NNT) может составлять только 7 для предупреждения тяжелой РЕ при идентифицированных беременностях высокого риска. Применение ASA является недорогим и имеет мало побочных эффектов при введении в рекомендованных низких дозах (75 мг). Профилактическое лечение
следует начинать в конце первого триместра для наличия оптимального эффекта. Ввиду этого, является предпочтительным, чтобы РЕ можно было прогнозировать в конце первого триместра или в начале второго триместра, возможно в комбинации с другими общепринятыми программами скрининга на синдром Дауна. Заключения:
HbF, AIM и Нрх, измеренные в материнской сыворотке в конце первого и начале второго триместра беременности, являются потенциальными прогностическими биомаркерами для последующего развития РЕ. Эти три белка являются физиологически значимыми, поскольку было описано, что увеличенные количества свободного HbF вовлечены в патогенез и потенциально расходуют физиологические выводящие гем белки. Более того, прогностическая мощность трех биомаркеров увеличивается при комбинировании с допплеровским ультразвуковым исследованием маточной артерии и/или материнскими характеристиками.
Ссылки
1. Duley L. The global impact of pre-eclampsia and eclampsia. Semin Perinatol. 2009;33 (3) : 130-137 .
2. Walker JJ. Pre-eclampsia. Lancet. 2000;356(9237):12601265.
3. Redman CW, Sargent IL. Latest advances in understanding preeclampsia. Science. 2005;308 (5728):1592-1594.
4. Roberts JM, Hubel CA. The two stage model of preeclampsia: variations on the theme. Placenta. 2009;30 Suppl A:S32-37 .
5. Anderson UD, Olsson MG, Kristensen KH, Akerstrom B, Hansson SR. Re-view: Biochemical markers to predict preeclampsia. Placenta. 2012;33 Suppl:S42-47 .
6. Rana S, Karumanchi SA, Lindheimer MD. Angiogenic factors in diagnosis, management, and research in preeclampsia. Hypertension. 2014;63(2):198-202.
7. Hawkins TL, Roberts JM, Mangos GJ, Davis GK, Roberts LM, Brown MA. Plasma uric acid remains a marker of poor outcome in hypertensive pregnancy: a ret-rospective cohort study. BJOG. 2012; 119(4) :484-492 .
6.
8. Muller-Deile J, Schiffer M. Preeclampsia from a renal point of view: Insides into disease models, biomarkers and therapy. World J Nephrol. 2014 ; 3(4 ): 169-181.
9. Hansson SR, Gram M, Akerstrom B. Fetal hemoglobin in preeclampsia: A new etiological factor, a tool for predicting/diagnosis, and a potential target for thera-py. Curr Opin Obstet Gynecol. 2013;Epub ahead of print.
10. Centlow M, Carninci P, Nemeth K, Mezey E, Brownstein M, Hansson SR. Placental expression profiling in preeclampsia: local overproduction of hemoglobin may drive pathological changes. Fertil Steril. 2008; 90 (5) :1834-1843.
11. Olsson MG, Centlow M, Rutardottir S, et al. Increased levels of cell-free he-moglobin, oxidation markers, and the antioxidative heme scavenger al-microglobulin in preeclampsia. Free Radic Biol Med. 2010; 48 (2) :284-291.
12. Anderson UD, Olsson MG, Rutardottir S, et al. Fetal hemoglobin and al-microglobulin as first- and early second-trimester predictive biomarkers for preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 2011;204 (6) :520 e521-525.
13. May K, Rosenlof L, Olsson MG, et al. Perfusion of human placenta with he-moglobin introduces preeclampsia-like injuries that are prevented by al-microglobulin. Placenta. 2011;32 (4) :323-332 .
14. Bunn HF. Hemoglobin. Vol. 1st Installment. Weinhem: VCH; 1992.
15. Faivre B, Menu P, Labrude P, Vigneron C. Hemoglobin autooxida-tion/oxidation mechanisms and methemoglobin prevention or reduction processes in the bloodstream. Literature review and outline of autooxidation reaction. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 1998;26 (1) :17-26.
16. Winterbourn CC. Oxidative reactions of hemoglobin. Methods Enzymol. 1990;186:265-272.
17. Cimen MY. Free radical metabolism in human
erythrocytes. Clin Chim Acta. 2008;390 (1-2) :1-11.
18. Jozwik M, Szczypka M, Gajewska J, Laskowska-Klita T.
Antioxidant defence of red blood cells and plasma in stored
human blood. Clin Chim Acta. 1997 ; 267(2 ) : 129-142.
19. Schaer DJ, Buehler PW, Alayash Al, Belcher JD, Vercellotti GM. Hemolysis and free hemoglobin revisited: exploring hemoglobin and hemin scavengers as a novel class of therapeutic proteins. Blood. 2013;121(8):1276-1284.
20. Alayash Al. Haptoglobin: Old protein with new functions. Clin Chim Acta. 2011; 412 (7-8) :493-498.
21. Kristiansen M, Graversen JH, Jacobsen C, et al. Identification of the haemo-globin scavenger receptor. Nature. 2001;409(6817):198-201.
22. Polticelli F, Bocedi A, Minervini G, Ascenzi P. Human haptoglobin structure and function--a molecular modelling study. FEBS J. 2008;275(22) : 5648-5656.
23. Ascenzi P, Bocedi A, Visca P, et al. Hemoglobin and heme scavenging. IUBMB Life. 2005;57 (11):749-759.
24. Delanghe JR, Langlois MR. Hemopexin: a review of biological aspects and the role in laboratory medicine. Clin Chim Acta. 2001;312 (1-2):13-23.
25. Hvidberg V, Maniecki MB, Jacobsen C, Hojrup P, Moller HJ, Moestrup SK. Identification of the receptor scavenging hemopexin-heme complexes. Blood. 2005;106(7):2572-2579.
26. Tenhunen R, Marver HS, Schmid R. The enzymatic conversion of heme to bilirubin by microsomal heme oxygenase. Proc Natl Acad Sci USA. 1968; 61 (2):748-755.
27. Wagener FA, Eggert A, Boerman ОС, et al. Heme is a potent inducer of in-flamination in mice and is counteracted by heme oxygenase. Blood. 2001; 98 ( 6) :1802-1811.
28. Allhorn M, Berggard T, Nordberg J, Olsson ML, Akerstrom B. Processing of the lipocalin al-microglobulin by hemoglobin induces heme-binding and heme-degradation properties. Blood. 2002; 99 (6) :1894-1901.
29. Larsson J, Allhorn M, Akerstrom B. The lipocalin al-microglobulin binds heme in different species. Arch Biochem Biophys. 2004; 432(2) :196-204.
30. Allhorn M, Klapyta A, Akerstrom B. Redox properties of the lipocalin al-microglobulin: reduction of cytochrome c,
28.
hemoglobin, and free iron. Free Radic Biol Med. 2005; 38 (5) :557-567 .
31. Akerstrom B, Maghzal GJ, Winterbourn CC, Kettle AJ. The lipocalin al-microglobulin has radical scavenging activity. J Biol Chem. 2007;282(43):31493-31503.
32. Olsson MG, Olofsson T, Tapper H, Akerstrom B. The lipocalin al-microglobulin protects erythroid K562 cells against oxidative damage induced by heme and reactive oxygen species. Free Radic Res. 2008;42(8):725-736.
33. Grubb AO, Lopez C, Tejler L, Mendez E. Isolation of
human complex-forming glycoprotein, heterogeneous in charge
(protein HC) , and its IgA complex from plas-ma. Physiochemical
and immunochemical properties, normal plasma concentration. J
Biol Chem. 1983;258(23):14698-14707.
34. Berggard T, Thelin N, Falkenberg C, Enghild JJ,
Akerstrom B. Prothrombin, albumin and immunoglobulin A form
covalent complexes with al-microglobulin in hu-man plasma. Eur J
Biochem. 1997;245(3):676-683.
35. Coligan JE. New York: Wiley-Interscience; 1991.
36. Schaer DJ, Vinchi F, Ingoglia G, Tolosano E, Buehler PW. Haptoglobin, hemopexin, and related defense pathways-basic science, clinical perspectives, and drug development. Front Physiol. 2014;5:415.
37. Baek JH, D'Agnillo F, Vallelian F, et al. Hemoglobin-driven pathophysiology is an in vivo consequence of the red blood cell storage lesion that can be attenuated in guinea pigs by haptoglobin therapy. J Clin Invest. 2012; 122 (4):1444-1458.
38. Reiter CD, Wang X, Tanus-Santos JE, et al. Cell-free hemoglobin limits nitric oxide bioavailability in sickle-cell disease. Nat Med. 2002; 8 (12):1383-1389.
39. Minneci PC, Deans KJ, Zhi H, et al. Hemolysis-associated endothelial dys-function mediated by accelerated NO inactivation by decompartmentalized oxyhemo-globin. J Clin Invest. 2005; 115 (12) :3409-3417.
40. Wester-Rosenlof L, Casslen V, Axelsson J, et al. AlM/alpha-l-microglobulin protects from heme-induced placental
35.
and renal damage in a pregnant sheep model of preeclampsia. PLoS One. 2014;9(1):e86353.
41. Sverrisson K, Axelsson J, Rippe A, et al. Extracellular fetal hemoglobin in-duces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha-l-microglobulin and tempol. Am J Physiol Renal Physiol. 2014;30б (4) :F442-448.
42. Di Santo S, Sager R, Andres AC, Guller S, Schneider H. Dual in vitro perfu-sion of an isolated cotyledon as a model to study the implication of changes in the third trimester placenta on preeclampsia. Placenta. 2007;28 Suppl A:S23-32.
43. Thatcher CD, Keith JC, Jr. Pregnancy-induced
hypertension: development of a model in the pregnant sheep. Am J
Obstet Gynecol. 198б; 155(1) :201-207.
44. Talosi G, Nemeth I, Nagy E, Pinter S. The pathogenetic role of heme in pregnancy-induced hypertension-like disease in ewes. Biochem Mol Med. 1997; 62 (1) :58-64 .
45. Laurell CB, Nyman M. Studies on the serum haptoglobin level in hemoglo-binemia and its influence on renal excretion of hemoglobin. Blood. 1957;12(6):493-506.
46. Olsson MG, Allhorn M, Bulow L, et al. Pathological conditions involving ex-tracellular hemoglobin: molecular mechanisms, clinical significance, and novel thera-peutic opportunities for alpha-l-microglobulin. Antioxid Redox Signal. 2012; 17 (5) :813-846.
47. Allhorn M, Lundqvist K, Schmidtchen A, Akerstrom B. Heme-scavenging role of al-microglobulin in chronic ulcers. J Invest Dermatol. 2003; 121 (3) :640-646.
48. Olsson MG, Rosenlof LW, Kotarsky H, et al. The radical-binding lipocalin AIM binds to a Complex I subunit and protects mitochondrial structure and function. Antioxid Redox Signal. 2013;18(16):2017-2028.
49. Olsson MG, Allhorn M, Larsson J, et al. Up-regulation of AlM/al-microglobulin in skin by heme and reactive oxygen species gives protection from oxi-dative damage. PLoS One. 2011;6 (11) :e27505.
50. Tranquilli AL, Dekker G, Magee L, et al. The
classification, diagnosis and managements of the hypertensive disordes of pregnancy: A revised statement from ISSHP. Pregnancy Hypertens. 2014;4:97-104.
51. Brown MA. Pre-eclampsia: proteinuria in pre-eclampsia-does it matter any more? Nat Rev Nephrol. 2012; 8 (10) :563-565.
52. Gynecologists A-ACoOa. Hypertension in pregnancy; 2013.
53. Krikken JA, Lely AT, Bakker SJ, et al. Hemopexin activity is associated with angiotensin II responsiveness in humans. J Hypertens. 2013;31 (3) :537-541; discussion 542.
54. Bakker WW, Spaans F, el Bakkali L, et al. Plasma hemopexin as a potential regulator of vascular responsiveness to angiotensin II. Reprod Sci. 2013;20 (3) :234-237 .
55. Kajita A, Taniguchi K, Shukuya R. Isolation and properties of the gamma chain from human fetal hemoglobin. Biochim Biophys Acta. 1969; 175 (1):41-48 .
56. Noble RW. The effect of p-hydroxymercuribenzoate on the reactions of the isolated gamma chains of human hemoglobin with ligands. J Biol Chem. 1971;246 ( 9) :2972-2976.
57. Akerstrom B, Bratt T, Enghild JJ. Formation of the alpha-l-microglobulin chromophore in mammalian and insect cells: a novel post-translational mechanism? FEBS Lett. 1995;362(1) :50-54 .
58. Berggard I, Beam AG. Isolation and properties of a low molecular weight be-ta-2-globulin occurring in human biological fluids. J Biol Chem. 1968;243(15):4095-4103.
59. Nilson B, Akerstrom B, Logdberg L. Cross-reacting monoclonal anti-al-microglobulin antibodies produced by multi-species immunization and using protein G for the screening assay. J Immunol Methods. 1987; 99 (1):39-45.
60. Bjorck L, Cigen R, Berggard B, Low B, Berggard I. Relationships between beta2-microglobulin and alloantigens coded for by the major histocompatibility com-plexes of the rabbit and the guinea pig. Scand J Immunol. 1977; 6 (10) :1063-1069.
61. Moller HJ, Peterslund NA, Graversen JH, Moestrup SK. Identification of the hemoglobin scavenger receptor/CDl63 as a natural soluble protein in plasma. Blood. 2002; 99 (1):378-380.
51.
62. Moestrup SK, Moller HJ. CD163: a regulated hemoglobin scavenger receptor with a role in the anti-inflammatory response. Ann Med. 2004;36(5):347-354.
63. Van Gorp H, Delputte PL, Nauwynck HJ. Scavenger receptor CD163, a Jack-of-all-trades and potential target for cell-directed therapy. Mol Immunol. 2010;47(7-8):1650-1660.
64. Velauthar L, Plana MN, Kalidindi M, et al. First-trimester uterine artery Dop-pler and adverse pregnancy outcome: a meta-analysis involving 55,974 women. Ul-trasound Obstet Gynecol. 2014;43 (5) :500-507 .
65. Malek MH, Berger DE, Coburn JW. On the
inappropriateness of stepwise re-gression analysis for model
building and testing. Eur J Appl Physiol. 2007; 101 (2) :263-264;
author reply 265-266.
SEQUENCE LISTING
<110> Hansson, Stefan Akerstrom, Bo Gram, Magnus
<120> Biomarkers for preeclampsia
<130> P014862PCT1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 183 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu Asn Phe
1 5 10 15
Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile Gly Ser
20 25 30
Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Met Thr Val Ser Thr
35 40 45
Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met Thr Ser
50 55 60
Thr Arg Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu
65 70 75 80
Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asn
85 90 95
Ile Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala
100 105 110
Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr Ile Thr
115 120 125
Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gln
130 135 140
Asp Phe Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp Ser Ile
145 150 155 160
Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln Glu Pro
165 170 175
Glu Pro Ile Leu Ile Pro Arg
180
<210> 2
<211> 201
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met His His His His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Ile Glu
1 5 10 15
Gly Arg Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn Ile Gln Val Gln Glu
20 25 30
Asn Phe Asn Ile Ser Arg Ile Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala Ile
35 40 45
Gly Ser Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys Ile Met Asp Arg Met Thr Val
50 55 60
Ser Thr Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu Ile Ser Met
65 70 75 80
Thr Ser Thr Arg Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala
85 90 95
Tyr Glu Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys
100 105 110
Trp Asn Ile Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu
115 120 125
Tyr Ala Ile Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr
130 135 140
Ile Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gln Leu Arg Glu Thr Leu
145 150 155 160
Leu Gln Asp Phe Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu Asp
165 170 175
Ser Ile Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gln
180 185 190
Glu Pro Glu Pro Ile Leu Ile Pro Arg 195 200
<210> 3 <211> 549 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ggccctgtgc caacgccgcc cgacaacatc caagtgcagg aaaacttcaa tatctctcgg 60
atctatggga agtggtacaa cctggccatc ggttccacct gcccctggct gaagaagatc 120
atggacagga tgacagtgag cacgctggtg ctgggagagg gcgctacaga ggcggagatc 180
agcatgacca gcactcgttg gcggaaaggt gtctgtgagg agacgtctgg agcttatgag 240
aaaacagata ctgatgggag gtttctctat cacaaatcca aatggaacat aaccatggag 300
tcctatgtgg tccacaccac ctatgatgag tatgccattt ttctgaccaa gaaattcagc 360
cgccatcatg gacccaccat tactgccaag ctctacgggc gggcgccgca gctgagggaa 420
actctcctgc aggacttcag agtggttgcc cagggtgtgg gcatccctga ggactccatc 480
ttcaccatgg ctgaccgagg tgaatgtgtc cctggggagc aggaaccaga gcccatctta 540
atcccgaga 549
<210> 4 <211> 603 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaggtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccacctatga tgagtatgcc atttttctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
aga 603
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Панель биомаркеров, содержащая биомаркеры преэклампсии, где биомаркеры выбраны из
i) гемопексина (Нрх) и альфа-1-микроглобулина (AIM),
ii) Нрх, AIM и свободного HbF, и необязательно
дополнительно содержащая один или несколько биомаркеров,
выбранных из Hp-HbF, Hp, НО-1, гема.
2. Панель биомаркеров по п.1, содержащая НО-1 и/или гем в качестве биомаркера(ов) преэклампсии.
3. Панель биомаркеров по п.1 или 2, дополнительно
содержащая Hp-HbF и/или гаптоглобин в качестве биомаркера(ов)
преэклампсии.
4. Панель биомаркеров по любому из предшествующих п.п. для применения для прогнозирования или диагностики преэклампсии или для оценки риска развития преэклампсии.
5. Биомаркер по п. 4 для применения в качестве маркера преэклампсии с ранним или поздним началом.
6. Панель биомаркеров по любому из предшествующих п.п., где указанный маркер(ы) количественно определяют в образце крови, плазмы, сыворотки, CSF, мочи, биоптатах плаценты, образце внутриматочной жидкости или амниотической жидкости беременной женщины.
7. Панель биомаркеров по п.б, где указанная беременная женщина имеет преэклампсию или имеет увеличенный риск ее развития, если уровень гемопексина и, в соответствующих случаях, НО-1 и/или гаптоглобина в образце плазмы от беременной женщины по меньшей мере в 1,1 раза меньше, чем эталонная величина, уровень альфа-1-микроглобулина, и, в соответствующих случаях, уровень свободного не связанного с белком фетального гемоглобина и уровень гема по меньшей мере в 1,1 раза больше, чем эталонная величина, и эталонные величины определяют у беременной женщины, которая не страдает преэклампсией или не имеет повышенного риска ее развития, на том же сроке беременности, что и в случае исследуемого образца, или в эталонные величины вносят поправки для коррелирования со сроком беременности для исследуемого образца.
4.
8. Панель биомаркеров по любому из предшествующих п.п., где образец получен от беременной женщины на сроке беременности 6-2 0 недель.
9. Панель биомаркеров по любому из п.п.6-8, где указанная беременная женщина имеет преэклампсию или имеет повышенный риск ее развития, если уровень гемопексина в образце плазмы от беременной женщины, полученном на сроке беременности 6-2 0 недель, составляет 1,0 мг/мл или менее, уровень альфа-1-микроглобулина составляет 15,5 мкг/мл или более, и, в соответствующих случаях, уровень свободного общего фетального гемоглобина составляет 5,6 нг/мл или более.
10. Панель биомаркеров по любому из п.п.3-9, где указанная беременная женщина имеет преэклампсию или имеет риск ее развития, если уровень Hp-HbF в образце плазмы беременной женщины, взятой на сроке беременности 6-2 0 недель, составляет 0,7 мкг/мл или более, уровень НО-1 составляет 5,0 нг/мл или менее, и/или уровень гема составляет 60 мкМ или более.
11. Панель биомаркеров по п.п.1-7, где образец получают от беременной женщины на сроке беременности 34-40 недель.
12. Панель биомаркеров по п.11, где указанная беременная женщина имеет преэклампсию или имеет риск ее развития, если уровень гемопексина в образце плазмы от беременной женщины, полученном на сроке беременности 34-40 недель, составляет 0,85 мг/мл или менее, уровень альфа-1-микроглобулина составляет 30 мкг/мл или более, и, в соответствующих случаях, уровень свободного не связанного с белком фетального гемоглобина составляет 6,5 нг/мл или более.
13. Панель биомаркеров по п. 11 или 12, где Hp-HbF и НО-1 включены в качестве биомаркеров, и где указанная беременная женщина имеет преэклампсию или имеет риск ее развития, если уровень Hp-HbF в образце плазмы от беременной женщины, полученном на сроке беременности 34-40 недель, составляет 0,5 мкг/мл или менее, уровень свободного не связанного с белком фетального НО-1 составляет 5, 0 нг/мл или менее и уровень гема составляет 68 мкМ или более.
14. Способ диагностики или облегчения диагностики
преэклампсии, включающий следующие стадии:
(a) получение биологического образца от беременной женщины;
(b) количественное определение уровня биомаркеров, выбранных
из панелей биомаркеров i) и ii), где i) представляет собой: Нрх
и AIM; и ii) представляет собой: Нрх, AIM и свободный HbF, и где
i) или ii) необязательно дополнительно содержат один или
несколько из следующих биомаркеров: Hp-HbF, Hp, НО-1, гем,
(c) сравнение уровня количественно определенного
биомаркера(ов) в образце с эталонной величиной,
для определения, того, имеет ли указанная беременная женщина преэклампсию, или имеет ли она повышенный риск развития преэклампсии.
15. Способ мониторинга прогрессирования или регрессии пр е э кл амп сии, в ключ ающий:
(a) в первом биологическом образце, таком как образец крови, мочи или плазмы, взятый от беременной самки млекопитающего, количественное определение уровня биомаркеров, выбранных из панелей биомаркеров i) и ii), где i) представляет собой: Нрх и AIM; и ii) представляет собой: Нрх, AIM и свободный HbF, и где i) или ii) необязательно дополнительно содержит один или несколько из следующих биомаркеров: Hp-HbF, Hp, НО-1, гем;
(b) во втором биологическом образце, таком как образец крови, мочи, сыворотки или плазмы, взятый от указанной беременной самки млекопитающего в последующий момент времени, количественное определение уровня биомаркеров, выбранных согласно (а); и
(c) сравнение величин, количественно определенных на стадиях (а) и (Ь), где
i) повышение уровня AIM и, в соответствующих случаях, HbF,
Hp-HbF, гема во втором образце относительно уровня(ей) в первом
образце, и/ или
ii) снижение уровня Нрх и, в соответствующих случаях,
уровня(ей) Hp, НО-1 во втором образце относительно уровня(ей) в
первом образце
указывает на прогрессирование преэклампсии; и снижение i)
и/или повышение ii), описанных выше, указывает на регрессию преэклампсии.
16. Способ по п. 14 или 15, где Hp включен в качестве биомаркера.
17. Способ по любому из п.п.14-16, где комбинация биомаркеров дополнительно содержит свободный HbF.
18. Способ по любому из п.п. 14-17, где образец (по п. 14) или первый образец (по п.14) взят на сроке беременности по меньшей мере б недель.
19. Способ по п. 18, где образцы взяты на сроке от б до 2 0 недель или 12-14 недель.
20. Способ по п.18, где образец взят на сроке 34-40 недель.
21. Гемопексин, гаптоглобин и/или свободный не связанный с белком фетальный гемоглобин в качестве прогностического маркера(ов) преждевременных родов и/или родов посредством кесарева сечения.
22. Гемопексин, гаптоглобин и/или свободный не связанный с белком фетальный гемоглобин в качестве фетального прогностического маркера(ов) поступления в NICU.
23. Гемопексин для применения в качестве маркера или прогностического маркера преэклампсии.
24. Способ диагностики или облегчения диагностики
преэклампсии, включающий следующие стадии:
(a) получение биологического образца от беременной женщины;
(b) количественное определение уровня Нрх в указанном
образце; и
(c) сравнение уровня Нрх в образце с эталонной величиной,
для определения того, имеет ли указанная беременная женщина
преэклампсию, или имеет ли она повышенный риск развития преэклампсии.
25. Способ по п.24, где образец получен от беременной
женщины на сроке беременности 6-2 0 недель.
26. Способ диагностики или облегчения диагностики
преэклампсии, включающий следующие стадии:
(а) получение биологического образца от беременной женщины на сроке беременности 6-2 0 недель;
(b) количественное определение уровня Нрх и необязательно
уровня биомаркера(ов): общего HbF и/или AIM; и
(c) сравнение уровня количественно определенного
биомаркера(ов) в образце с эталонной величиной,
для определения того, имеет ли указанная беременная женщина преэклампсию, или имеет ли она повышенный риск развития преэклампсии.
27. Способ мониторинга прогрессирования или регрессии пр е э кл амп сии, в ключ ающий:
(a) в первом биологическом образце, таком как образец крови, мочи или плазмы, полученный от беременной самки млекопитающего на сроке беременности 6-2 0 недель, количественное определение уровня Нрх и необязательно уровня биомаркера(ов): общего HbF и/или AIM;
(b) во втором биологическом образце, таком как образец крови, мочи или плазмы, полученный от указанной беременной самки млекопитающего в более поздний момент времени, количественное определение уровня Нрх и необязательно уровня биомаркера(ов): общего HbF и/или AIM; и
(c) сравнение величин, измеренных на стадиях (а) и (Ь), где
i) повышение уровня(ей) общего HbF и/или AIM во втором образце относительно уровня(ей) общего HbF и/или AIM в первом образце, и/ или
ii) снижение уровня(ей) Нрх во втором образце относительно уровня(ей) Нрх в первом образце,
указывает на прогрессирование преэклампсии; и снижение i) и/или повышение ii), описанных выше, указывает на регрессию преэклампсии.
28. Способ по любому из п.п.23-27, где Нрх используют в качестве маркера вместе с НО-1.
29. Способ диагностики или облегчения диагностики преэклампсии, включающий следующие стадии:
(a) получение биологического образца от беременной женщины;
(b) количественное определение уровня AIM в указанном
образце; и
(c) сравнение уровня AIM в образце с эталонной величиной,
для определения того, имеет ли указанная беременная женщина преэклампсию, или имеет ли она повышенный риск развития преэклампсии.
30. Способ по п.29, где образец получен от беременной
женщины на сроке беременности 6-20 недель или 34-40 недель.
31. Способ диагностики или облегчения диагностики преэклампсии, включающий следующие стадии:
(a) получение биологического образца от беременной женщины
на сроке беременности 6-2 0 недель;
(b) количественное определение уровня AIM и необязательно
уровня биомаркера(ов): тотального HbF и/или Нрх; и
(c) сравнение уровня измеренного биомаркера(ов) в образце с
эталонной величиной,
для определения того, имеет ли указанная женщина преэклампсию, или имеет ли она повышенный риск развития преэклампсии.
32. Способ мониторинга прогрессирования или регрессии пр е э кл амп сии, в ключ ающий:
(a) в первом биологическом образце, таком как образец крови, мочи или плазмы, полученный от беременной самки млекопитающего на сроке беременности 6-2 0 недель или 34-4 0 недель, количественное определение уровня AIM и необязательно уровня биомаркера(ов): общего HbF и/или Нрх;
(b) во втором биологическом образце, таком как образец крови, мочи или плазмы, полученный от указанной беременной самки млекопитающего в более поздний момент времени, количественное определение уровня AIM и необязательно уровня биомаркера(ов) : общего HbF и/или Нрх; и
(c) сравнение величин, количественно определенных на стадиях (а) и (Ь), где
i) повышение уровня(ей) общего HbF и/или AIM во втором образце относительно уровня(ей) общего HbF и/или AIM в первом образце, и/ или
ii) снижение уровня(ей) Нрх во втором образце относительно уровня(ей) Нрх в первом образце
указывает на прогрессирование преэклампсии; и снижение i)
и/или повышение ii), описанных выше, указывает на регрессию преэклампсии.
По доверенности
ИЗМЕНЕННАЯ ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ (ПО СТАТЬЕ 34 РСТ)
1. Применение гемопексина (Нрх) и альфа-1-микроглобулина (AIM) в качестве биомаркеров преэклампсии.
2. Применение по п.1 для прогнозирования или диагностики преэклампсии или для оценки риска развития преэклампсии.
3. Применение в качестве биомаркеров для раннего или позднего начала преэклампсии.
4. Применение по любому из предшествующих п.п., где указанные маркеры количественно определяют в образце крови, плазмы, сыворотки, цереброспинальной жидкости, мочи, биоптатах плаценты, образце внутриматочной жидкости или амниотической жидкости беременной женщины.
5. Применение по п.4, где указанная беременная женщина имеет преэклампсию или имеет увеличенный риск ее развития, если уровень гемопексина в образце плазмы от беременной женщины по меньшей мере в 1,1 раза меньше, чем эталонная величина, уровень альфа-1-микроглобулина по меньшей мере в 1,1 раза больше, чем эталонная величина, и эталонные величины определяют у беременной женщины, которая не страдает преэклампсией или не имеет повышенного риска ее развития на том же сроке беременности, что и для исследуемого образца или в эталонные величины внесены поправки для коррелирования со сроком беременности для исследуемого образца.
6. Применение по любому из предшествующих п.п., где образец получен от беременной женщины на сроке беременности 6-2 0 недель.
7. Применение по любому из п.п.4-6, где указанная беременная женщина имеет преэклампсию или имеет риск ее развития, если уровень гемопексина в образце плазмы от беременной женщины, полученном на сроке беременности 6-20 недель, составляет 1,0 мг/мл или менее, и уровень альфа-1-микроглобулина составляет 15,5 мкг/мл или более.
8. Применение по п.п.1-5, где образец получен от беременной женщины на сроке беременности 34-40 недель.
9. Применение по п.8, где указанная беременная женщина имеет преэклампсию или имеет повышенный риск ее развития, если уровень гемопексина в образце плазмы от беременной женщины, полученном на сроке беременности 34-40 недель, составляет 0,85 мг/мл или менее,
1.
и уровень альфа-1-микроглобулина составляет 30 мкг/мл или более.
10. Способ диагностики или облегчения диагностики преэклампсии, включающий следующие стадии:
(a) получение биологического образца от беременной женщины;
(b) количественное определение уровня биомаркеров Нрх и AIM; и
(c) сравнение уровня измеренных биомаркеров в образце с
эталонной величиной для определения, того, имеет ли указанная
беременная женщина преэклампсию, или имеет ли она повышенный риск
развития преэклампсии.
11. Способ мониторинга прогрессирования или регрессии пр е э кл амп сии, в ключ ающий:
(a) в первом биологическом образце, таком как образец крови, мочи или плазмы, взятый от беременной самки млекопитающего, количественное определение уровня биомаркеров Нрх и AIM;
(b) во втором биологическом образце, таком как образец крови, мочи, сыворотки или плазмы, взятый от указанной беременной самки млекопитающего в последующий момент времени, количественное определение уровня Нрх и AIM;
(c) сравнение величин, количественно определенных на стадии (а) и (Ь), где
i) повышение уровня AIM во втором образце относительно его уровня в первом образце, и
снижение уровня Нрх во втором образце относительно уровня в первом образце,
указывает на прогрессирование преэклампсии; и
ii) снижение уровня AIM во втором образце относительно уровня в первом образце, и
повышение уровня Нрх во втором образце относительно его уровня в первом образце,
указывает на регрессию преэклампсии.
12. Способ по любому из п.п.10-11, где образец (по п.10), или
первый образец (по п.11), получены на сроке беременности по меньшей
мере б недель.
13. Способ по п.12, где образцы получены на сроке беременности от б до 20 недель или 12-14 недель.
14. Способ по п.12, где образец получен на сроке от 34 до 40 недель.
По доверенности
Ю О
О I-
с= со
[НЬН(нг/мл)
ю о
о I- с= со
ю о
о I- с= со
[НЬН(нг/мл)
50 37
20 15 10
1-2 2-2 1-1
Контроль Преэклампсия
Hp 1-1 Hp 1-2 Hp 2-2
Hp 1-1 Hp 1-2 Hp 2-2
230 210 180 150 120 90
о Контроль (c)Преэклампсия
0.25 0.5 0.75 1.0 1.25
Гемопексин (мг/мл)
Гемопексин (мг/мл)
9- о.о
1.0
Комбинация HbF-A1M-Hpx
0.0
0.2 0.4 0.6 0.8
Частота ложноположительных результатов
о о. со m
Комбинация А1М-Нрх
1.0
0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Частота ложноположительных результатов
о о.
Частота ложноположительных результатов
Все типы преэклампсии
1 t
^ г
^ -J-"
J : г
t ¦ 1 a*
i ... - i,........;
j ,"..'
1 J
Источник кривой
HbF A1M
Гаптоглобин Гемопексин - Комбинация
0,0 0.2 0,4 0,6 0.8 1,0
Частота ложноположительных результатов
0,2-
Материнские характеристики и биомаркеры
Материнские характеристики в комбинации
0,0-
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Частота ложноположительных результатов
з.оо-
Диагноз
Контроль Преэклампсия
R2 линейный = 0.032
о 2.00" со
о о
<
1.00-
.00^
-1.00-^-1 1 1 1 1 1 г-1
60 70 80 90 100 110 120
Диастолическое кровяное давление
Частота ложноположительных результатов
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Hansson, Stefan Akerstrom, Во Gram, Magnus
<120> Биомаркеры преэклампсии
<130> P014862PCT1 <160> 4
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 183
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn lie Gin Val Gin Glu Asn Phe
15 10 15
Asn lie Ser Arg lie Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala lie Gly Ser
20 25 30
Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys lie Met Asp Arg Met Thr Val Ser Thr
35 40 45
Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu He Ser Met Thr Ser
50 55 60
Thr Arg Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala Tyr Glu
65 70 75 80
Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys Trp Asn
85 90 95
He Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu Tyr Ala
100 105 110
He Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr He Thr
115 120 125
Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gin Leu Arg Glu Thr Leu Leu Gin
130 135 140
Asp Phe Arg Val Val Ala Gin Gly Val Gly He Pro Glu Asp Ser He
145 150 155 160
Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gin Glu Pro
165 170 175
Glu Pro He Leu He Pro Arg 180
<210> 2
<211> 201
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met His His His His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly He Glu
15 10 15
Gly Arg Gly Pro Val Pro Thr Pro Pro Asp Asn He Gin Val Gin Glu
20 25 30
Asn Phe Asn He Ser Arg He Tyr Gly Lys Trp Tyr Asn Leu Ala He
35 40 45
Gly Ser Thr Cys Pro Trp Leu Lys Lys He Met Asp Arg Met Thr Val
50 55 60
Ser Thr Leu Val Leu Gly Glu Gly Ala Thr Glu Ala Glu He Ser Met
65 70 75 80
Thr Ser Thr Arg Trp Arg Lys Gly Val Cys Glu Glu Thr Ser Gly Ala
85 90 95
Tyr Glu Lys Thr Asp Thr Asp Gly Lys Phe Leu Tyr His Lys Ser Lys
100 105 110
Trp Asn He Thr Met Glu Ser Tyr Val Val His Thr Asn Tyr Asp Glu
115 120 125
Tyr Ala He Phe Leu Thr Lys Lys Phe Ser Arg His His Gly Pro Thr
130 135 140
He Thr Ala Lys Leu Tyr Gly Arg Ala Pro Gin Leu Arg Glu Thr Leu
145 150 155 160
Leu Gin Asp Phe Arg Val Val Ala Gin Gly Val Gly He Pro Glu Asp
165 170 175
Ser He Phe Thr Met Ala Asp Arg Gly Glu Cys Val Pro Gly Glu Gin
180 185 190
Glu Pro Glu Pro He Leu He Pro Arg 195 200
<210> 3
<211> 549
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 3
ggccctgtgc caacgccgcc cgacaacatc caagtgcagg aaaacttcaa tatctctcgg 60
atctatggga agtggtacaa cctggccatc ggttccacct gcccctggct gaagaagatc 120
atggacagga tgacagtgag cacgctggtg ctgggagagg gcgctacaga ggcggagatc 180
agcatgacca gcactcgttg gcggaaaggt gtctgtgagg agacgtctgg agcttatgag 240
aaaacagata ctgatgggag gtttctctat cacaaatcca aatggaacat aaccatggag 300
tcctatgtgg tccacaccac ctatgatgag tatgccattt ttctgaccaa gaaattcagc 360
cgccatcatg gacccaccat tactgccaag ctctacgggc gggcgccgca gctgagggaa 420
actctcctgc aggacttcag agtggttgcc cagggtgtgg gcatccctga ggactccatc 480
ttcaccatgg ctgaccgagg tgaatgtgtc cctggggagc aggaaccaga gcccatctta 540
atcccgaga 549
<210> 4
<211> 603
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 4
atgcatcacc atcaccatca ccatcacggt ggaggagggg gtatcgaggg ccgcggccct 60
gtgccaacgc cgcccgacaa catccaagtg caggaaaact tcaatatctc tcggatctat 120
gggaagtggt acaacctggc catcggttcc acctgcccct ggctgaagaa gatcatggac 180
aggatgacag tgagcacgct ggtgctggga gagggcgcta cagaggcgga gatcagcatg 240
accagcactc gttggcggaa aggtgtctgt gaggagacgt ctggagctta tgagaaaaca 300
gatactgatg ggaggtttct ctatcacaaa tccaaatgga acataaccat ggagtcctat 360
gtggtccaca ccacctatga tgagtatgcc atttttctga ccaagaaatt cagccgccat 420
catggaccca ccattactgc caagctctac gggcgggcgc cgcagctgag ggaaactctc 480
ctgcaggact tcagagtggt tgcccagggt gtgggcatcc ctgaggactc catcttcacc 540
atggctgacc gaggtgaatg tgtccctggg gagcaggaac cagagcccat cttaatcccg 600
aga 603
] Случай
А1М - GA 15 недель - Когорта SCOPE - 21016-02-19 II-I Контпопь~
? С "
А1М - GA20 недель - Когорта SCOPE - 21016-02-19
Контроль Случай
40-
30-
20-
090500
гООО
°°8°
о ЗсРо оЛ
40-
30-
¦20
р = 3.3x10
1 Qrco 1
10'
50-
А1М - Срок родов - Когорта SCOPE - 21016-02-19
Контроль Случай
р = 6.7x10
40-
1 •
-^~~о 1
30-
о о о о о о
г-оо
оп°о°
(r) #
ФИГ. 11
20-
О ОпООп
° ко
OqJ_
Односторонний ANOVA, апостериорный Бонферрони
1 Гестационный диабет, определенный согласно шведскому
2 РЕ с ранним началом определяли как диагноз до 34+0 недель беременности.
3 РЕ с поздним началом определяли как срок беременности > 34+0 недель.
4 Синдром HELLP (гемолиз, повышенный уровень ферментов печени, низкий уровень тромбоцитов), диагностированный согласно классификации Миссисипи.
5 Эклампсию определяли как приступы во время беременности и после родов при наличии РЕ.
6 SGA (низкая масса для данного гестационного возраста), определяемая по кривой роста в качестве константы ультрасонографии ниже кривой.
5а Пациентка, определенная как SGA и как IUGR.
7 IUGR (внутриутробная задержка роста) определяли как -2 стандартных отклонения (-22%) на ультрасонографии или ниже 3-го процентиля.
8 NICU (отделение интенсивной терапии новорожденных).
9 Преждевременные роды определяли ка роды до 3 6+б недель беременности (258 суток).
10 Показатель APGAR (внешний вид, пульс, гримасничанье, активность, дыхание) через 10 минут.
Свободный НЬ
Концентрацию свободного HbF, Hp-HbF и общего НЬ анализировали во всех образцах плазмы женщин с РЕ и контролей (таблица 3) . У пациенток с РЕ наблюдали 4-кратное повышение
001
001
001
001
1/14
1/14
0 -
100
0 -
100
1/14
1/14
0 -
100
0 -
100
1/14
1/14
0 -
100
0 -
100
1/14
1/14
0 -
100
0 -
100
2/14
ФИГ. 2
2/14
ФИГ. 2
2/14
ФИГ. 2
2/14
ФИГ. 2
2/14
ФИГ. 2
2/14
ФИГ. 2
2/14
ФИГ. 2
2/14
ФИГ. 2
4/14
ФИГ. 4
4/14
ФИГ. 4
4/14
ФИГ. 4
4/14
ФИГ. 4
4/14
ФИГ. 4
4/14
ФИГ. 4
6/14
ФИГ. 6
6/14
ФИГ. 6
6/14
ФИГ. 6
6/14
ФИГ. 6
7/14
ФИГ. 7
7/14
ФИГ. 7
7/14
ФИГ. 7
7/14
ФИГ. 7
7/14
ФИГ. 7
7/14
ФИГ. 7
8/14
ФИГ. 8
8/14
ФИГ. 8
8/14
ФИГ. 8
8/14
ФИГ. 8
8/14
ФИГ. 8
8/14
ФИГ. 8
8/14
ФИГ. 8
8/14
ФИГ. 8
9/14
ФИГ. 9
9/14
ФИГ. 9
11/14
11/14
10-
10-
10-
10-
10-
10-
10-
10-
10-
10-
10-
10-
