[RU]

В изобретении предложены антитела, которые специфически связывают транстиретин (TTR). Антитела могут быть использованы для лечения или осуществления профилактики заболеваний или расстройств, связанных с накоплением TTR или накоплением отложений TTR (например, TTR амилоидоза). Антитела также могут быть использованы для диагностики TTR амилоидоза и ингибирования или уменьшения агрегации TTR среди других применений.

(57) Реферат / Формула:

В изобретении предложены антитела, которые специфически связывают транстиретин (TTR). Антитела могут быть использованы для лечения или осуществления профилактики заболеваний или расстройств, связанных с накоплением TTR или накоплением отложений TTR (например, TTR амилоидоза). Антитела также могут быть использованы для диагностики TTR амилоидоза и ингибирования или уменьшения агрегации TTR среди других применений.

---

Евразийское (2D 201791712 <13> А1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K16/18 (2006.01)
2017.12.29
(54) АНТИТЕЛА К ТРАНСТИРЕТИНУ
(22) Дата подачи заявки 2016.01.28
(31) 62/109,002; 62/266,556
(32) 2015.01.28; 2015.12.11
(33) US
(вв) PCT/IB2016/050415
(87) WO 2016/120810 2016.08.04
(71) Заявитель:
ПРОТЕНА БИОСАЙЕНСИС ЛИМИТЕД (IE); ЮНИВЕРСИТИ ХЭЛС НЕТУОРК (CA)
(72) Изобретатель:
Лю Юэ, Ниджджар Тарлохан С. (US), Чакрабартти Авиджит (CA), Хигаки Джеффри Н. (US)
(74) Представитель:
Харин А.В., Котов И.О., Стойко Г.В., Буре Н.Н. (RU) (57) В изобретении предложены антитела, которые специфически связывают транстиретин (TTR). Антитела могут быть использованы для лечения или осуществления профилактики заболеваний или расстройств, связанных с накоплением TTR или накоплением отложений TTR (например, TTR амилоидоза). Антитела также могут быть использованы для диагностики TTR амилоидоза и ингибирования или уменьшения агрегации TTR среди других применений.
B9D5VL DIVMTQAAPSVPV] IHGtfTYLl W 40
DrVMTQSPLSLPVTPCEPASISC RS3KSLLHSNGNTH.V * 40 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC ^SSKSLLHSNGNTYL* * 40 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC 4SSKSU-HSNGNTYI,V К 40 DIVKTQSAPSLPUTPGEPVSISC4SSKSl.UlSNGWrYL5(l* 40
Mous* Model LHJU L DIVMTQAAPSVPVtPGESVSlSC RSSKSLLHSNGNTYLY if 40
Вшип Acceptor ABC66952 DIVMTCSPLELPVTPGBPASISC HSHOSLLҐSSGҐKlfLC W 40 Bu9D5VLvl Hu9D5VLv2 HU9D5VLV3 Bu9D5VLv4 H"9D5VLv5
IS9DSVL
Mouse Model 1MJU L
Burner) Acceptor ASC66952
Hu9D5VLvI
HU6CIVLV2
Hu9D5Vtv3
Hu9DSVI,v4
HV"9D5VLv5
DXVHTOSAPEr-PVTPGSSVSISC ^SSKSLLHSNGNTYL* A 40
(seoDNO is;
SEQIONO ti ffiEQDNEMl. SEQIDNOZOl SEQ(c)NO-21i SEQIDN0J2) (SEQDN0.23)
FLClAPGQSPQLLIttWSNLAi 3VPDRFSGSGSGTAJTLRI 80 FLQRP < &3P0LLI1iKMSNLAЈ 3VFDRFSGSGSGTAFTLRI 60 YH3KPGQSPQLI.IW;GSNRW 3VPDRFSGSGSGTDFTLKI 80 FZXJKPSQSPQLLIWSNtA" 3VPDRFSGSGSGTDFTLFT 80 YLOKPGQSPQLLI"e .VEAKDVCVY TdMOHlf Ypi,"]FG AGT KLELX
SRVEAEDVGVYYC KQHUEYPW rGQG7KLEIK 112
S RVEAEDVGVYt С4QHLEYPL1rGQGTKbeiK 112
SRVEAEDVGVYVC KQffiJSYPI/lFGQGTKLE1R 117
SRVBAKDVSVYtC (tOKLBYPLI PGOGTKLElR 112
SRVEJLEDVqVYYC KQHLRYPL? rC.QGTKLEIK
Kouae Model 1KJU t SRVEAEDVCVYY dl-QHLEYPFijFGAG? К LE L-K 112
Acceptor ABC66S52 SRVBAJSDVGVYIfC 4QAiiQ5PTI PG^JGTKIiEIK 112 ffii9D5Vr,vl Hu6Clvtv2 B"9D5VLv3 Bu9D5ҐLv4 Hu9D5VLv5
АНТИТЕЛА К ТРАНСТИРЕТИНУ
ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка относится к предварительной заявке США № 62/109002, поданной 28 января 2015 года, и предварительной заявке США № 62/266556, поданной 11 декабря 2015 года, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Данная заявка включает электронный вариант списка последовательностей в файле с именем 473373_SEQLST.TXT, созданном 28 января 2016 года, и содержащем 135083 байта, который полностью включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Считается, что некоторые заболевания вызваны аномальной сверткой и агрегацией специфических для болезни белков. Эти белки могут собираться в патологические диагностические скопления, известные как амилоиды, которые визуализируются некоторыми гистологическими красителями. Считается, что амилоиды вызывают воспалительные реакции и имеют множество негативных последствий для вовлеченных тканей. Кроме того, могут существовать и оказывать цитотоксическое действие меньшие агрегаты аномально свернутого белка.
[0004] Транстиретин (TTR) является одним из многих белков, которые, как известно, могут неправильно свёртываться и агрегировать (например, подвергаются амилоидогенезу). Связанный с транстиретином амилоидоз включает две формы заболевания: наследственное заболевание, возникающее из-за неправильного свертывания мутированного TTR или варианта TTR, а также спорадическое, негенетическое заболевание, вызванное неправильным агрегированием TTR дикого типа. Процесс TTR амилоидогенеза может вызвать патологию в нервной системе и/или сердце, а также в других тканях.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Изобретение относится к антителам, которые связываются с транстиретином и содержат три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи в основном из антитела 14G8.
Некоторые антитела содержат три CDR тяжелой цепи по Кабату и три CDR легкой цепи по Кабату антитела 14G8, за исключением того, что каждая позиция Н52 и L26 могут быть N или S. Некоторые антитела содержат три CDR тяжелой цепи по Кабату и три CDR легкой цепи по Кабату антитела 14G8. Необязательно, CDR-H1 представляет собой составной CDR по Кабату-Чотия антитела 14G8. Некоторые антитела содержат три CDR тяжелой цепи по Кабату антитела 9D5. Необязательно, CDR-H1 представляет собой составной CDR по Кабату-Чотия антитела 9D5.
[0006] Некоторые антитела связываются с тем же эпитопом на транстиретине, что и 9D5 или 14G8, и содержат три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, причем: а) каждая CDR имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с соответствующей последовательностью CDR из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей 9D5; или б) каждая CDR имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с соответствующей последовательностью CDR из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей 14G8, за исключением того, что в позиции L26 может быть N или S. Некоторые антитела содержат: а) три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи 9D5; или б) три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи антитела 14G8, за исключением того, что в позиции L26 может быть N или S. В некоторых антителах три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи 9D5 представляют собой SEQ ID NO: 13-15 и 24-26 соответственно. В некоторых антителах, три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи антитела 14G8 представляют собой SEQ ГО NO: 67-69 и 77-79 соответственно, за исключением того, что в позиции L26 может быть N или S.
[0007] Любое из вышеуказанных антител может быть моноклональным антителом. Любое из вышеуказанных антител может быть химерным, гуманизированным, венированным или человеческим антителом. Любое из вышеуказанных антител может иметь изотип IgGl человека, изотип IgG2 человека или изотип IgG4 человека.
[0008] Изобретение дополнительно относится к гуманизированным или химерным антителам антитела мыши, которые специфически связываются с транстиретином, причем антитело мыши характеризуется вариабельной областью зрелой тяжелой цепи SEQ ГО NO: 61 и вариабельной областью зрелой легкой цепи SEQ ГО NO: 70, за исключением того, что в позиции Н52 может быть S или N, в позиции Н69 может быть F или I, в позиции L26 может быть S или N, a R в позиции L107 является необязательным. Необязательно, антитела
представляют собой гуманизированное или химерное антитело 9D5 или 14G8, которое специфически связывается с транстиретином, причем 9D5 представляет собой мышиное антитело, характеризующееся вариабельной областью зрелой тяжелой цепи SEQ Ш NO: 1 и вариабельной областью зрелой легкой цепи SEQ Ш N0: 16, и 14G8 представляет собой мышиное антитело, характеризующееся вариабельной областью зрелой тяжелой цепи SEQ Ш N0: 61 и вариабельной областью зрелой легкой цепи SEQ Ш N0: 70. Необязательно, гуманизированные антитела содержат: а) вариабельную область гуманизированной зрелой тяжелой цепи, содержащую три CDR тяжелой цепи антитела 9D5 и вариабельную область гуманизированной зрелой легкой цепи, содержащую три CDR легкой цепи антитела 9D5; или б) вариабельную область гуманизированной зрелой тяжелой цепи, содержащую три CDR тяжелой цепи антитела 14G8 и вариабельную область гуманизированной зрелой легкой цепи, содержащую три CDR легкой цепи антитела 14G8, за исключением того, что в позиции L26 может быть N или S. Необязательно, три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи антитела 9D5 представляют собой SEQ Ш N0: 13-15 и 24-26 соответственно. Необязательно, три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи антитела 14G8 представляют собой SEQ Ш N0: 67-69 и 77-79 соответственно, за исключением того, что в положении L26 может быть N или S. Необязательно, любые различия в CDR вариабельной области зрелой тяжелой цепи и вариабельной области зрелой легкой цепи из SEQ Ш NO: 1 и 16, соответственно, находятся в позициях Н60-Н65. Необязательно, любые различия в CDR вариабельной области зрелой тяжелой цепи и вариабельной области зрелой легкой цепи из SEQ Ш N0: 61 и 70, соответственно, находятся в позициях Н60-Н65, за исключением того, что в позиции L26 может быть N или S.
[0009] Необязательно, гуманизированное антитело содержит вариабельную область гуманизированной зрелой тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 5-12, и вариабельную область гуманизированной зрелой легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90 % идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 19-23, за исключением того, что в позиции Н19 может быть R или К, в позиции Н40 может быть А или Т, в позиции Н44 может быть G или R, в позиции Н49 может быть S или А, в позиции Н77 может быть S или Т, в позиции Н82а может быть N или S, в позиции Н83 может быть R или К, в позиции Н84 может быть А или S, а в позиции Н89 может быть V или М. Необязательно по меньшей мере одна из следующих позиций занята аминокислотой
как указано далее: позиция Н42 занята Е, позиция Н47 занята L, позиция Н69 занята F, позиция Н82 занята S, позиция Н82Ь занята L, позиция HI08 занята L, позиция L8 занято А, позиция L9 занята Р, позиция L18 занята S, позиция L19 занята V, позиция L36 Занято F, позиция L39 занята R, позиция L60 занята S, позиция L70 занята А, а позиция L74 занята R. Необязательно, позиции Н47, Н69 и Н82 заняты L, F, и S соответственно. Необязательно, позиции Н47, Н69, Н82 и Н82Ь заняты L, F, S и L соответственно. Необязательно, позиции Н42, Н47 и HI08 заняты Е, L и L соответственно. Необязательно, позиции Н69, Н82 и Н82Ь заняты F, S и L соответственно. Необязательно, позиции Н47 и HI08 заняты L. Необязательно, позиции Н82 и Н82Ь заняты S и L соответственно. Необязательно, позиции Н42, Н47 и Н82Ь заняты Е, L и L соответственно. Необязательно, позиция L36 занята F. Необязательно, позиция L60 занята S. Необязательно, позиции L8, L9, L19, L36, L39, L60, L70 и L74 заняты А, Р, V, F, R, S, А и R соответственно. Необязательно, позиции L8, L9, L18, L19, L36, L39, L60, L70 и L74 заняты А, Р, S, V, F, R, S, А и R соответственно.
[0010] Необязательно, гуманизированное антитело содержит вариабельную область зрелой тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 95% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш NO: 5-12, и вариабельную область зрелой легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 95% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш NO: 19-23, за исключением того, что в позиции HI9 может быть R или К, в позиции Н40 может быть А или Т, в позиции Н44 может быть G или R, в позиции Н49 может быть S или А, в позиции Н77 может быть S или Т, в позиции Н82а может быть N или S, в позиции Н83 может быть R или К, в позиции Н84 может быть А или S, а в позиции Н89 может быть V или М. Необязательно, гуманизированное антитело содержит вариабельную область зрелой тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 98% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш NO: 5-12, и вариабельную область зрелой легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 98% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш NO: 19-23, за исключением того, что в позиции HI9 может быть R или К, в позиции Н40 может быть А или Т, в позиции Н44 может быть G или R, в позиции Н49 может быть S или А, в позиции Н77 может быть S или Т, в позиции Н82а может быть N или S, в позиции Н83 может быть R или К, в позиции Н84 может быть А или S, и в позиции Н89 может быть V или М. Необязательно, вариабельная область зрелой тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность любой из SEQ Ш NO: 5-12, и вариабельная
область зрелой легкой цепи имеет аминокислотную последовательность любой из SEQ Ш N0: 19-23. В некоторых антителах вариабельная область зрелой тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 11, а вариабельная область зрелой легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 19.
[ООН] Необязательно, гуманизированное антитело содержит вариабельную область гуманизированной зрелой тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 64-66, и вариабельную область гуманизированной зрелой легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90 % идентичную любой из SEQ Ш N0: 74-76, за исключением того, что в позиции Н82а может быть N или S, в позиции Н83 может быть R или К, в позиции Н84 может быть А или S, в позиции Н89 может быть V или М, и в позиции L18 может быть S или Р. Необязательно по меньшей мере одна из следующих позиций занята аминокислотой как указано далее: позиция HI занята Е, позиция Н47 занята L, а позиция L36 занята F. Необязательно, позиции HI и Н47 заняты Е и L соответственно. Необязательно, позиция L36 занята F. Необязательно по меньшей мере одна из следующих позиций занята аминокислотой как указано далее: позиция НЗ занята К, позиция HI05 занята Т, позиция L8 занята А, позиция L9 занята Р, позиция L19 занята V, позиция L26 занята S, позиция L60 занята S, а позиция L70 занята А. Необязательно, позиции НЗ и HI05 заняты К и Т соответственно. Необязательно, позиции L8, L9, L19 и L70 заняты А, Р, V и А соответственно. Необязательно, позиции L26 и L60 каждая заняты S.
[0012] Необязательно, гуманизированное антитело содержит вариабельную область зрелой тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 95% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 64-66, и вариабельную область зрелой легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 95% идентичную любой из SEQ Ш N0: 74-76, за исключением того, что в позиции Н82а может быть N или S, в позиции Н83 может быть R или К, в позиции Н84 может быть А или S, в позиции Н89 может быть V или М, а в позиции L18 может быть S или Р. Необязательно, гуманизированное антитело содержит вариабельную область зрелой тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 98% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 64-66, и вариабельную область зрелой легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 98% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 74-76, за исключением того, что в позиции Н82а может
быть N или S, в позиции Н83 может быть R или К, в позиции Н84 может быть А или S, в позиции Н89 может быть V или М, а в позиции L18 может быть S или Р. Необязательно, вариабельная область зрелой тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность любой из SEQ Ш N0: 64-66, и вариабельная область зрелой легкой цепи имеет аминокислотную последовательность любой из SEQ Ш N0: 74-76. В некоторых антителах вариабельная область зрелой тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 65, а вариабельная область зрелой легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 76.
[0013] Любое из вышеуказанных антител может быть интактным антителом, связывающим фрагментом, одноцепочечным антителом, фрагментом Fab или Fab'2. В любом из вышеуказанных антител вариабельная область зрелой легкой цепи может быть слита с константной областью легкой цепи, а вариабельная область зрелой тяжелой цепи может быть слита с константной областью тяжелой цепи. Необязательно, константная область тяжелой цепи представляет собой мутантную форму естественной константной области тяжелой цепи человека, которая имеет ослабленное связывание с рецептором Fey относительно естественной константной области тяжелой цепи человека. Необязательно, константная область тяжелой цепи является таковой изотипа IgGl. Необязательно, вариабельная область зрелой тяжелой цепи слита с константной областью тяжелой цепи, имеющей последовательность SEQ Ш N0: 103, и/или вариабельная область зрелой легкой цепи слита с константной областью легкой цепи, имеющей последовательность SEQ Ш N0: 104 или 105.
[0014] Изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям, содержащим любое из вышеуказанных антител, и фармацевтически приемлемый носитель.
[0015] Изобретение дополнительно относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим тяжелую цепь и/или легкую цепь любого из вышеуказанных антител, таким как любая из SEQ ID NO: 40, 42, 44-56, 87, 89, 91-96 и 106-108.
[0016] В изобретении дополнительно предложен рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, как описано выше, и предложена клетка-хозяин, трансформированная рекомбинантным вектором экспрессии.
[0017] В изобретении дополнительно предложен способ гуманизации антитела, включающий: а) выбор одного или нескольких акцепторных антител; б) идентификацию аминокислотных остатков мышиного антитела, подлежащих сохранению; в) синтез
нуклеиновой кислоты, кодирующей гуманизированную тяжелую цепь, содержащую CDR тяжелой цепи антитела мыши, и нуклеиновой кислоты, кодирующей гуманизированную легкую цепь, содержащую CDR легкой цепи антитела мыши; и г) экспрессию нуклеиновых кислот в клетке-хозяине чтобы продуцировать гуманизированное антитело; причем мышиное антитело представляет собой 9D5 или 14G8, при этом 9D5 характеризуется вариабельной областью зрелой тяжелой цепи SEQ Ш NO: 1 и вариабельной областью зрелой легкой цепи SEQ Ш N0: 16, a 14G8 характеризуется вариабельной областью зрелой тяжелой цепи SEQ Ш N0: 61 и вариабельной областью зрелой легкой цепи SEQ Ш N0: 70.
[0018] В изобретении дополнительно предложен способ продуцирования гуманизированного, химерного или венированного антитела, включающий: а) культивирование клеток, трансформированных нуклеиновыми кислотами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела, так что клетки секретируют антитело; и б) очистку антитела от клеточной культуральной среды; причем антитело представляет собой гуманизированную, химерную или венированную форму 9D5 или 14G8.
[0019] В изобретении дополнительно предложен способ получения клеточной линии, продуцирующей гуманизированное, химерное или венированное антитело, включающий: а) введение вектора, кодирующего тяжелую и легкую цепи антитела, и селективный маркер, в клетки; б) размножение клеток в условиях, позволяющих проводить отбор клеток, имеющих увеличенное количество копий вектора; в) выделение отдельных клеток из выбранных клеток; и г) создание банка клеток, клонированных из одной клетки, выбранной на основе выхода антитела; причем антитело представляет собой гуманизированную, химерную или венированную форму 9D5 или 14G8. Необязательно, способ дополнительно включает размножение клеток в селективных условиях и отбор линий клеток, естественно экспрессирующих и секретирующих по меньшей мере 100 мг/л/10й клеток/24 ч.
[0020] В изобретении дополнительно предложен способ ингибирования или снижения агрегации транстиретина у субъекта, имеющего транстиретин-опосредованний амилоидоз или находящегося под риском его развития, включающий введение субъекту любого из вышеуказанных антител эффективной схемой, тем самым ингибируя или уменьшая агрегацию транстиретина у субъекта.
[0021] В изобретении дополнительно предложен способ ингибирования или уменьшения формирования фибрил транстиретина у субъекта, имеющего транстиретин-опосредованний
амилоидоз или находящегося под риском его развития, включающий введение субъекту любого из вышеуказанных антител эффективной схемой, тем самым ингибируя или уменьшая накопление транстиретина у субъекта.
[0022] В изобретении дополнительно предложен способ уменьшения количества отложений транстиретина у субъекта, имеющего транстиретин-опосредованний амилоидоз или находящегося под риском его развития, включающий введение субъекту любого из вышеуказанных антител эффективной схемой, тем самым уменьшая количество отложений транстиретина у субъекта.
[0023] В изобретении дополнительно предложен способ устранения агрегатов транстиретина у субъекта, имеющего транстиретин-опосредованний амилоидоз или находящегося под риском его развития, включающий введение субъекту любого из вышеуказанных антител эффективной схемой, тем самым устраняя агрегаты транстиретина у субъекта по сравнению с субъектом, имеющим транстиретин-опосредованний амилоидоз или находящимся под риском его развития, который не получал антитела.
[0024] В изобретении дополнительно предложен способ стабилизации нетоксичной формы транстиретина у субъекта, имеющего транстиретин-опосредованний амилоидоз или находящегося под риском его развития, включающий введение субъекту любого из вышеуказанных антител эффективной схемой, тем самым стабилизирую нетоксичную форму транстиретина у субъекта.
[0025] В изобретении дополнительно предложен способ лечения или осуществления профилактики транстиретин-опосредованного амилоидоза у субъекта, включающий введение субъекту любого из вышеуказанных антител эффективной схемой.
[0026] В изобретении дополнительно предложен способ замедления начала проявления транстиретин-опосредованного амилоидоза у субъекта, включающий введение субъекту любого из вышеуказанных антител эффективной схемой.
[0027] В изобретении дополнительно предложен способ диагностирования транстиретин-опосредованного амилоидоза у субъекта, включающий приведение в контакт биологического образца из субъекта с эффективным количеством любого из вышеуказанных антител. Необязательно, способ дополнительно включает обнаружение связывания антитела с транстиретином, причем присутствие связанного антитела указывает на то, что субъект имеет транстиретин-опосредованный амилоидоз. Необязательно, способ дополнительно включает
сравнение связывания антитела с биологическим образцом со связыванием антитела с контрольным образцом, при этом повышенное связывание антитела с биологическим образцом относительно контрольного образца указывает на то, что субъект имеет транстиретин-опосредованный амилоидоз. Необязательно, биологический образец и контрольный образец содержат клетки того же самого тканевого происхождения. Необязательно, биологический образец и/или контрольный образец представляют собой кровь, сыворотку, плазму или твердую ткань. Необязательно, твердая ткань представляет собой ткань из сердца, периферической нервной системы, вегетативной нервной системы, почек, глаз или желудочно-кишечного тракта.
[0028] В любом из вышеуказанных способов транстиретин-опосредованный амилоидоз может необязательно быть семейным транстиретиновым амилоидозом или спорадическим транстиретиновым амилоидозом. Необязательно, семейный транстиретиновый амилоидоз является семейной амилоидной кардиомиопатией (FAC), семейной амилоидной полинейропатией (FAP) или селективным амилоидозом центральной нервной системы (CNSA). Необязательно, спорадический транстиретиновый амилоидоз является старческим системным амилоидозом (SSA) или старческим сердечным амилоидозом (SCA). В любом из вышеуказанных способов транстиретин-опосредованный амилоидоз может необязательно быть связан с накоплением амилоидов в сердце, периферической нервной системе, вегетативной нервной системе, почках, глазах или желудочно-кишечном тракте субъекта.
[0029] В изобретении дополнительно предложен способ выявления присутствия или отсутствия отложений транстиретина у субъекта, включающий приведение в контакт биологического образца из субъекта, подозреваемого в наличии амилоидного накопления, с эффективным количеством любого из вышеуказанных антител. Необязательно, способ дополнительно включает обнаружение связывания антитела с транстиретином, причем обнаружение связанного антитела указывает на наличие отложений транстиретина. Необязательно, способ дополнительно включает сравнение связывания антитела с биологическим образцом со связыванием антитела с контрольным образцом, при этом повышенное связывание антитела с биологическим образцом относительно контрольного образца указывает на то, что субъект имеет транстиретин-опосредованный амилоидоз. Необязательно, биологический образец и контрольный образец содержат клетки того же самого тканевого происхождения. Необязательно, биологический образец и/или контрольный образец представляют собой кровь, сыворотку, плазму или твердую ткань. Необязательно,
твердая ткань представляет собой ткань из сердца, периферической нервной системы, вегетативной нервной системы, почек, глаз или желудочно-кишечного тракта.
[0030] В изобретении дополнительно предложен способ выявления количества отложений транстиретина у субъекта, включающий введение любого из антител и обнаружения присутствия связанного антитела у субъекта. Необязательно, присутствие связанного антитела определяется позитронно-эмиссионной томографией (ПЭТ).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0031] На фиг. 1А изображено выравнивание вариабельных областей тяжелой цепи антитела 9D5 мыши, модельных антител мыши, акцепторных антител человека и гуманизированных вариантов антитела 9D5. Последовательности CDR, как определено по Кабату, заключены в рамки, за исключением того, что первая охватывающая рамка является совмещением CDR-H1 по Чотия и CDR-H1 по Кабату, с подчеркнутым и выделенным полужирным шрифтом CDR-H1 по Кабату.
[0032] На фиг. 1В изображено выравнивание вариабельных областей легкой цепи антитела 9D5 мыши, модельного антитела мыши, акцепторного антитела человека и гуманизированных вариантов антитела 9D5. Последовательности CDR, как определено по Кабату, заключены в рамки.
[0033] На фиг. 2А изображено выравнивание вариабельных областей тяжелой цепи антитела 14G8 мыши, модельного антитела мыши, акцепторных антител человека и гуманизированных вариантов антитела 14G8. Последовательности CDR, как определено по Кабату, заключены в рамки, за исключением того, что первая охватывающая рамка является совмещением CDR-H1 по Чотия и CDR-H1 по Кабату, с подчеркнутым и выделенным полужирным шрифтом CDR-H1 по Кабату.
[0034] На фиг. 2В изображено выравнивание вариабельных областей легкой цепи антитела 14G8 мыши, модельного антитела мыши, акцепторных антител человека и гуманизированных вариантов антитела 14G8. Последовательности CDR, как определено по Кабату, заключены в рамки.
[0035] Фиг. ЗА и ЗВ: на фиг. ЗА изображены кривые связывания антител 5А1, 6С1, 9D5 и 14G8 мыши с TTR, обработанным рН4. На фиг. ЗВ изображены кривые связывания антител 5А1, 6С1, 9D5 и 14G8 мыши с нативным TTR.
[0036] Фиг. 4А, 4В и 4С: На фиг. 4А изображено ингибирование образования фибрилл TTR-Y78F с помощью антител к mis-TTR. На фиг. 4В изображено ингибирование образования фибрилл TTR-V122I с помощью антитела 14G8. На фиг. 4С изображено ингибирование образования фибрилл TTR-V122I с помощью контрольного антитела.
[0037] Фиг. 5А и 5В: На фиг. 5А изображен анализ оптической плотности Вестерн-блот анализа образцов плазмы от пациентов, для которых подтвержден V30M ATTR (образец № 11, № 12, № 15, № 18, № 19, № 20), и образцов от субъектов с нормальным состоянием (образец № 21, 22, № 23, № 24, № 25, № 27), с применением антитела 9D5 mis-TTR. На фиг. 5В изображен анализ оптической плотности Вестерн-блот анализа тех же образцов с применением антитела 5А1 mis-TTR.
[0038] На фиг. 6 изображен плашечный анализ MesoScale Discovery (MSD) образцов плазмы от пациентов с подтвержденным V30M ATTR (образец № 11, № 12, № 15, № 18, № 19, № 20) и образцов от субъектов с нормальным состоянием (№ 21, № 22, № 23, № 24, № 25, № 27), с применением антитела 6С1.
[0039] Фиг. 7А и 7В: на фиг. 7А изображен эффект антитела 14G8 на поглощение TTR с F87M/L110M клетками ТНР-1. На фиг. 7В изображен эффект каждого антитела к mis-TTR на поглощение TTR с V30M клетками ТНР-1.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0040] SEQ Ш NO: 1 указана как аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 9D5 мыши.
[0041] SEQ Ш NO: 2 указана как аминокислотная последовательность 1SEQ H шаблона структуры мышиной вариабельной области тяжелой цепи.
[0042] SEQ Ш NO: 3 указана как аминокислотная последовательность вариабельного акцептора тяжелой цепи АСС № ВАС02114.
[0043] SEQ Ш NO: 4 указана как аминокислотная последовательность вариабельного акцептора тяжелой цепи АСС № ААХ82494.1.
[0044] SEQ Ш NO: 5 указана как аминокислотная последовательность варианта 1 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHvl).
[0045] SEQ Ш NO: 6 указана как аминокислотная последовательность варианта 2 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv2).
[0046] SEQ Ш NO: 7 указана как аминокислотная последовательность варианта 2Ь вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv2b).
[0047] SEQ Ш NO: 8 указана как аминокислотная последовательность варианта 3 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv3).
[0048] SEQ Ш NO: 9 указана как аминокислотная последовательность варианта ЗЬ вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv3b).
[0049] SEQ Ш NO: 10 указана как аминокислотная последовательность варианта 4 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv4).
[0050] SEQ Ш NO: 11 указана как аминокислотная последовательность варианта 4Ь вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv4b).
[0051] SEQ Ш NO: 12 указана как аминокислотная последовательность варианта 5 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv5).
[0052] SEQ Ш NO: 13 указана как аминокислотная последовательность CDR-H1 по Кабату антитела 9D5 мыши.
[0053] SEQ Ш NO: 14 указана как аминокислотная последовательность CDR-H2 по Кабату антитела 9D5 мыши.
[0054] SEQ Ш NO: 15 указана как аминокислотная последовательность CDR-H3 по Кабату антитела 9D5 мыши.
[0055] SEQ Ш NO: 16 указана как аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 9D5 мыши.
[0056] SEQ Ш NO: 17 указана как аминокислотная последовательность 1MJUL шаблона структуры вариабельной области легкой цепи мыши.
[0057] SEQ Ш NO: 18 указана как аминокислотная последовательность вариабельного акцептора легкой цепи АСС № АВС66952.
[0058] SEQ Ш NO: 19 указана как аминокислотная последовательность варианта 1 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VLvl).
[0059] SEQ Ш NO: 20 указана как аминокислотная последовательность варианта 2 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VLv2).
[0060] SEQ Ш NO: 21 указана как аминокислотная последовательность варианта 3 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VLv3).
[0061] SEQ Ш NO: 22 указана как аминокислотная последовательность варианта 4 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VLv4).
[0062] SEQ Ш NO: 23 указана как аминокислотная последовательность варианта 5 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VLv5).
[0063] SEQ Ш NO: 24 указана как аминокислотная последовательность CDR-L1 по Кабату антитела 9D5 мыши.
[0064] SEQ Ш NO: 25 указана как аминокислотная последовательность CDR-L2 по Кабату антитела 9D5 мыши.
[0065] SEQ Ш NO: 26 указана как аминокислотная последовательность CDR-L3 по Кабату антитела 9D5 мыши.
[0066] SEQ Ш NO: 27 указана как аминокислотная последовательность варианта 1 тяжелой цепи гуманизированного 9D5.
[0067] SEQ Ш NO: 28 указана как аминокислотная последовательность варианта 2 тяжелой цепи гуманизированного 9D5.
[0068] SEQ Ш NO: 29 указана как аминокислотная последовательность варианта 2Ь тяжелой цепи гуманизированного 9D5.
[0069] SEQ Ш NO: 30 указана как аминокислотная последовательность варианта 3 тяжелой цепи гуманизированного 9D5.
[0070] SEQ Ш NO: 31 указана как аминокислотная последовательность варианта ЗЬ тяжелой цепи гуманизированного 9D5.
[0071] SEQ Ш NO: 32 указана как аминокислотная последовательность варианта 4 тяжелой цепи гуманизированного 9D5.
[0072] SEQ Ш NO: 33 указана как аминокислотная последовательность варианта 4Ь тяжелой цепи гуманизированного 9D5.
[0073] SEQ Ш NO: 34 указана как аминокислотная последовательность варианта 5 тяжелой цепи гуманизированного 9D5.
[0074] SEQ Ш N0: 35 указана как аминокислотная последовательность варианта 1 легкой цепи гуманизированного 9D5.
[0075] SEQ Ш NO: 36 указана как аминокислотная последовательность варианта 2 легкой цепи гуманизированного 9D5.
[0076] SEQ Ш NO: 37 указана как аминокислотная последовательность варианта 3 легкой цепи гуманизированного 9D5.
[0077] SEQ Ш NO: 38 указана как аминокислотная последовательность варианта 4 легкой цепи гуманизированного 9D5.
[0078] SEQ Ш NO: 39 указана как аминокислотная последовательность варианта 5 легкой цепи гуманизированного 9D5.
[0079] SEQ Ш NO: 40 указана как нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 9D5 мыши с сигнальным пептидом.
[0080] SEQ Ш NO: 41 указана как аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 9D5 мыши с сигнальным пептидом.
[0081] SEQ Ш NO: 42 указана как нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 9D5 мыши с сигнальным пептидом.
[0082] SEQ Ш NO: 43 указана как аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 9D5 мыши с сигнальным пептидом.
[0083] SEQ Ш NO: 44 указана как нуклеотидная последовательность варианта 1 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHvl).
[0084] SEQ Ш NO: 45 указана как нуклеотидная последовательность варианта 2 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv2).
[0085] SEQ Ш NO: 46 указана как нуклеотидная последовательность варианта 2Ь вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv2b).
[0086] SEQ Ш NO: 47 указана как нуклеотидная последовательность варианта 3 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv3).
[0087] SEQ Ш NO: 48 указана как нуклеотидная последовательность варианта ЗЬ вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv3b).
[0088] SEQ Ш NO: 49 указана как нуклеотидная последовательность варианта 4 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv4).
[0089] SEQ Ш NO: 50 указана как нуклеотидная последовательность варианта 4Ь вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv4b).
[0090] SEQ Ш NO: 51 указана как нуклеотидная последовательность варианта 5 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VHv5).
[0091] SEQ Ш NO: 52 указана как нуклеотидная последовательность варианта 1 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VLvl).
[0092] SEQ Ш NO: 53 указана как нуклеотидная последовательность варианта 2 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VLv2).
[0093] SEQ Ш NO: 54 указана как нуклеотидная последовательность варианта 3 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VLv3).
[0094] SEQ Ш NO: 55 указана как нуклеотидная последовательность варианта 4 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VLv4).
[0095] SEQ Ш NO: 56 указана как нуклеотидная последовательность варианта 5 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 9D5 (Hu9D5VLv5).
[0096] SEQ Ш NO: 57 указана как аминокислотная последовательность сигнального пептида вариабельной области тяжелой цепи 9D5 мыши.
[0097] SEQ Ш NO: 58 указана как нуклеотидная последовательность сигнального пептида вариабельной области тяжелой цепи 9D5 мыши.
[0098] SEQ Ш NO: 59 указана как аминокислотная последовательность сигнального пептида вариабельной области легкой цепи 9D5 мыши.
[0099] SEQ Ш NO: 60 указана как нуклеотидная последовательность сигнального пептида вариабельной области легкой цепи 9D5 мыши.
[00100] SEQ Ш NO: 61 указана как аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 14G8 мыши.
[00101] SEQ Ш NO: 62 указана как аминокислотная последовательность 1MQK H шаблона структуры вариабельной области тяжелой цепи мыши.
[00102] SEQ Ш NO: 63 указана как аминокислотная последовательность вариабельного акцептора тяжелой цепи АСС№ AAD30410.1.
[00103] SEQ Ш NO: 64 указана как аминокислотная последовательность варианта 1 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 14G8 (Hul4G8VHvl).
[00104] SEQ Ш NO: 65 указана как аминокислотная последовательность варианта 2 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 14G8 (Hul4G8VHv2).
[00105] SEQ Ш NO: 66 указана как аминокислотная последовательность варианта 3 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 14G8 (Hul4G8VHv3).
[00106] SEQ Ш NO: 67 указана как аминокислотная последовательность CDR-H1 по Кабату антитела 14G8 мыши.
[00107] SEQ Ш NO: 68 указана как аминокислотная последовательность CDR-H2 по Кабату антитела 14G8 мыши.
[00108] SEQ Ш NO: 69 указана как аминокислотная последовательность CDR-H3 по Кабату антитела 14G8 мыши.
[00109] SEQ Ш NO: 70 указана как аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 14G8 мыши.
[00110] SEQ Ш NO: 71 указана как аминокислотная последовательность 1MJUL шаблона структуры вариабельной области легкой цепи мыши.
[00111] SEQ Ш NO: 72 указана как аминокислотная последовательность вариабельного акцептора легкой цепи АСС № АВА71374.1.
[00112] SEQ Ш NO: 73 указана как аминокислотная последовательность вариабельного акцептора легкой цепи АСС № АВС66952.1.
[00113] SEQ Ш NO: 74 указана как аминокислотная последовательность варианта 1 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 14G8 (Hul4G8VLvl).
[00114] SEQ Ш NO: 75 указана как аминокислотная последовательность варианта 2 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 14G8 (Hul4G8VLv2).
[00115] SEQ Ш NO: 76 указана как аминокислотная последовательность варианта 3 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 14G8 (Hul4G8VLv3).
[00116] SEQ Ш NO: 77 указана как аминокислотная последовательность CDR-L1 по Кабату антитела 14G8 мыши.
[00117] SEQ Ш NO: 78 указана как аминокислотная последовательность CDR-L2 по Кабату антитела 14G8 мыши.
[00118] SEQ Ш NO: 79 указана как аминокислотная последовательность CDR-L3 по Кабату антитела 14G8 мыши.
[00119] SEQ Ш NO: 80 указана как аминокислотная последовательность варианта 3 CDR-L1 по Кабату гуманизированного антитела 14G8 мыши (Hul4G8VLv3).
[00120] SEQ Ш NO: 81 указана как аминокислотная последовательность варианта 1 тяжелой цепи гуманизированного 14G8.
[00121] SEQ Ш NO: 82 указана как аминокислотная последовательность варианта 2 тяжелой цепи гуманизированного 14G8.
[00122] SEQ Ш NO: 83 указана как аминокислотная последовательность варианта 3 тяжелой цепи гуманизированного 14G8.
[00123] SEQ Ш NO: 84 указана как аминокислотная последовательность варианта 1 легкой цепи гуманизированного 14G8.
[00124] SEQ Ш NO: 85 указана как аминокислотная последовательность варианта 2 легкой цепи гуманизированного 14G8.
[00125] SEQ Ш NO: 86 указана как аминокислотная последовательность варианта 3 легкой цепи гуманизированного 14G8.
[00126] SEQ Ш NO: 87 указана как нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 14G8 мыши с сигнальным пептидом.
[00127] SEQ Ш NO: 88 указана как аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 14G8 мыши с сигнальным пептидом.
[00128] SEQ Ш NO: 89 указана как нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 14G8 мыши с сигнальным пептидом.
[00129] SEQ Ш NO: 90 указана как аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 14G8 мыши с сигнальным пептидом.
[00130] SEQ Ш NO: 91 указана как нуклеотидная последовательность варианта 1 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 14G8 (Hul4G8VHvl).
[00131] SEQ Ш NO: 92 указана как нуклеотидная последовательность варианта 2 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 14G8 (Hul4G8VHv2).
[00132] SEQ Ш NO: 93 указана как нуклеотидная последовательность варианта 3 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 14G8 (Hul4G8VHv3).
[00133] SEQ Ш NO: 94 указана как нуклеотидная последовательность варианта 1 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 14G8 (Hul4G8VLvl).
[00134] SEQ Ш NO: 95 указана как нуклеотидная последовательность варианта 2 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 14G8 (Hul4G8VLv2).
[00135] SEQ Ш NO: 96 указана как нуклеотидная последовательность варианта 3 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 14G8 (Hul4G8VLv3).
[00136] SEQ Ш NO: 97 указана как аминокислотная последовательность сигнального пептида вариабельной области тяжелой цепи антитела 14G8 мыши.
[00137] SEQ Ш NO: 98 указана как нуклеотидная последовательность сигнального пептида вариабельной области тяжелой цепи антитела 14G8 мыши.
[00138] SEQ Ш NO: 99 указана как аминокислотная последовательность сигнального пептида вариабельной области легкой цепи антитела 14G8 мыши.
[00139] SEQ Ш NO: 100 указана как нуклеотидная последовательность сигнального пептида вариабельной области легкой цепи антитела 14G8 мыши.
[00140] SEQ Ш NO: 101 указана как аминокислотная последовательность типичной константной области тяжелой цепи IgGl человека.
[00141] SEQ Ш NO: 102 указана как аминокислотная последовательность типичной константной области тяжелой цепи IgGl человека аллотипа Glm3 иммуноглобулина IgGl.
[00142] SEQ Ш NO: 103 указана как аминокислотная последовательность типичной константной области тяжелой цепи IgGl человека аллотипа Glm3 иммуноглобулина IgGl.
[00143] SEQ Ш NO: 104 изложена аминокислотная последовательность типичной константной области каппа легкой цепи человека, имеющей N-концевой аргинин.
[00144] SEQ Ш NO: 105 изложена аминокислотная последовательность типичной константной области каппа легкой цепи человека без N-концевого аргинина.
[00145] SEQ Ш NO: 106 указана как нуклеотидная последовательность типичной константной области тяжелой цепи аллотипа Glm3.
[00146] SEQ Ш NO: 107 указана как нуклеотидная последовательность типичной константной области легкой цепи, имеющей N-концевой аргинин.
[00147] SEQ Ш NO: 108 указана как нуклеотидная последовательность типичной константной области легкой цепи без N-концевого аргинина.
[00148] SEQ Ш NO: 109 указана как аминокислотная последовательность транстиретина человека, представленную под идентификационным номером Р02766.1 (UniProt).
[00149] SEQ Ш NO: 110 указана как аминокислотная последовательность транстиретина человека, представленная под идентификационным номером ААВ35639.1 (GenBank).
[00150] SEQ Ш NO: 111 указана как аминокислотная последовательность транстиретина человека, представленную под идентификационным номером ААВ35640.1 (GenBank).
[00151] SEQ Ш NO: 112 указана как аминокислотная последовательность транстиретина человека, представленную под идентификационным номером АВ163351.1 (GenBank).
[00152] SEQ Ш NO: 113 указана как аминокислотная последовательность остатков 89-97 транстиретина человека.
[00153] SEQ Ш NO: 114 указана как аминокислотная последовательность потенциального транстиретинового иммуногена.
[00154] SEQ Ш NO: 115 указана как аминокислотная последовательность потенциального транстиретинового иммуногена.
[00155] SEQ Ш NO: 116 указана как аминокислотная последовательность потенциального транстиретинового иммуногена.
[00156] SEQ Ш NO: 117 указана как аминокислотная последовательность составного CDR-Н1 по Чотия-Кабат антитела 9D5 мыши.
[00157] SEQ Ш NO: 118 указана как аминокислотная последовательность составного CDR-Н1 по Чотия- Кабат антитела 14G8 мыши.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[00158] Моноклональные антитела или другие биологические объекты обычно предоставляются в выделенной форме. Это означает, что антитело или другой биологический объект обычно является по меньшей мере на 50% мае./мае. чистым от мешающих белков и других загрязнителей, возникающих в результате его получения или очистки, но не исключает возможности смешивания моноклонального антитела с избыточным количеством фармацевтически приемлемого носителя(-лей) или другого переносчика, предназначенного для облегчения его применения. Иногда моноклональные антитела являются по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% мае./мае. чистыми от мешающих белков и загрязняющих веществ, возникающих в результате производства или очистки. Часто, выделенное моноклональное антитело или другой биологический объект является преобладающим макромолекулярным видом, оставшимся после его очистки.
[00159] Специфическое связывание антитела с его целевым антигеном означает аффинность, которая составляет по меньшей мере 106, 107, 108, 109, или 1010 М"1. Специфическое связывание является более обнаруживаемым по значению, и отличается от неспецифического связывания, случающегося по меньшей мере с одной посторонней мишенью. Специфическое связывание может быть результатом формирования связей между конкретными функциональными группами или конкретного пространственного соответствия (например, тип "замок и ключ"), тогда как неспецифическое связывание обычно является результатом Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий. Однако, специфическое связывание не обязательно означает, что антитело связывает одну и только одну мишень.
[00160] Основная структурная единица антитела представляет собой тетрамер субъединиц. Каждый тетрамер содержит две идентичные пары полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну "легкую" (около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (около 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи содержит вариабельную область длинной примерно от 100 до 110 или более аминокислот, в основном отвечающих за распознавание антигена. Данная вариабельная область в первоначальном экспрессированном виде связана с отщепляемым сигнальным пептидом. Вариабельная область без сигнального пептида иногда упоминается как зрелая вариабельная область. Так, например, зрелая вариабельная область
легкой цепи обозначает вариабельную область легкой цепи без сигнального пептида легкой цепи. Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константную область, главным образом отвечающую за эффекторную функцию.
[00161] Легкие цепи делят на каппа и лямбда. Тяжелые цепи разделяют на гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, и выделяют такие изотипы антитела как: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. В пределах легкой и тяжелой цепей вариабельная и константная области соединяются областью "J", длинной около 12 или более аминокислот, причем тяжелая цепь также содержит область "D", включающая около 10 или более аминокислот. Смотрите в целом, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7 (включен в полном объеме посредством ссылки для всех целей).
[00162] Вариабельная область легкой или тяжелой цепей иммуноглобулина (также называемая в данном документе "вариабельный домен легкой цепи" ("домен VL") или "вариабельный домен тяжелой цепи" ("домен VH"), соответственно) состоит из "каркасной" области, прерывающейся тремя "областями, определяющими комплементарность" или "CDR". Каркасные области используют для выравнивания CDR по специфическому связыванию с эпитопом антигена. CDR содержат аминокислотные остатки антитела, которые в первую очередь ответственны за связывание антигена. От аминоконца до карбоксиконца как домены VL, так и VH содержат следующие каркасные (FR - framework) и CDR области: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR 1, 2 и 3 домена VL также упоминаются в данном документе соответственно как CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3; CDR 1, 2 и 3 домена VH также упоминаются в данном документе соответственно как CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3.
[00163] Обозначение аминокислот для каждого домена VL и VH соответствует любому обычному определению CDR. Обычные определения включают определение по Кабату Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), определения по Чотия (Chothia & Lesk, J. Mol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342: 878-883, 1989); совмещенное определение для CDR по Чотия- Kabat, в котором CDR-H1 является совмещенными CDR по Чотия и Kabat ; определение АЬМ, используемое программным обеспечением для моделирования антител Oxford Molecular; и контактное определение Мартина и соавторов (bioinfo.org.uk/abs) (см. Таблицу 1). Kabat предлагает широко используемое соглашение о нумерации (нумерация Kabat), в котором соответствующим остаткам между различными тяжелыми цепями или между различными
легкими цепями назначается одинаковое число. Когда указывается, что антитело содержит CDR по некоторым определением CDR (например, Kabat), это определение указывает минимальное количество остатков CDR, присутствующих в антителе (т. е. CDR по Кабату). Это не исключает того, что также присутствуют другие остатки, попадающие в другое общепринятое определение CDR, но они находятся вне указанного определения. Например, антитело, содержащее CDR, определенные по Кабату, включает среди других вариантов, антитело, в котором CDR содержат остатки CDR по Кабату и не содержат других остатков CDR, и антитело, в котором CDR HI представляет собой составной CDR HI по Чотия- Kabat и другие CDR содержат остатки CDR по Кабату, и никаких дополнительных остатков CDR на основе других определений.
[00164] Таблица 1
Общепринятые определения CDR с использованием нумерации Kabat
Петля
По Кабату
По Чотия
Составное по
Чотия
Kabat
АЬМ
По контакту
L24-L34
L24-L34
L24-L34
L24-L34
L30-L36
L50-L56
L50-L56
L50-L56
L50-L56
L46-L55
L89-L97
L89-L97
L89-L97
L89-L97
L89-L96
Н31-Н35В
Н26-Н32..Н34*
Н26-Н35В*
Н26-Н35В
Н30-Н35В
Н50-Н65
Н52-Н56
Н50-Н65
Н50-Н58
Н47-Н58
Н95-Н102
Н95-Н102
Н95-Н102
Н95-Н102
Н93--Н101
*CDR-H1 по Чотия может заканчиваться на Н32, НЗЗ или Н34 (в зависимости от длины петли). Это связано с тем, что в схеме нумерации Kabat размещают вставки дополнительных остатков в 35А и 35В, тогда как в нумерации Чотия их размещают в 31А и 31В. Если не представлено ни Н35А, ни Н35В (нумерация Kabat), петля CDR-H1 по Чотия заканчивается на Н32. Если есть только Н35А, она заканчивается на НЗЗ. Если присутствуют и Н35А и Н35В, она заканчивается на Н34.
[00165] Термин "антитело" включает интактные антитела и их связывающие фрагменты. Как правило, фрагменты конкурируют с интактным антителом, из которого они были получены, за специфическое связывание с мишенью, включая отдельные тяжелые цепи, легкие цепи Fab, Fab', F(ab')2, F (ab)c, Dabs, нанотела и Fv. Фрагменты могут быть продуцированы с помощью способов рекомбинантной ДНК, или путем ферментативного или химического разделения интактных иммуноглобулинов. Термин "антитело" также включает биспецифическое антитело и/или гуманизированное антитело. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две разные пары тяжелых/легких цепей и два разных сайта связывания (см., например, Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)). В некоторых биспецифических антителах две различные пары тяжелых/легких цепей включают пару тяжелая цепь/легкая цепь гуманизированного 9D5 и пару тяжелая цепь/легкая цепь, специфичную к другому эпитопу на транстиретине, чем тот, что связан антителом 9D5. В некоторых биспецифических антителах две различные пары тяжелых/легких цепей включают пару тяжелая цепь/легкая цепь гуманизированного 14G8 и пару тяжелая цепь/легкая цепь, специфичную к другому эпитопу на транстиретине, чем тот, что связан антителом 14G8.
[00166] В некоторых биспецифических антителах одна пара тяжелая цепь/легкая цепь представляет собой гуманизированное антитело 9D5 или 14G8, как дополнительно описано ниже, а другая пара тяжелая цепь/легкая цепь из антитела, которое связывается с рецептором, экспрессируемым на гематоэнцефалическом барьере, таким как рецептор инсулина, рецептор инсулин-подобного фактора (IGF - insulin-like growth factor), рецептор лептина или рецептор липопротеинов или рецептор трансферрина (Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:47714775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993). Такое биспецифическое антитело может быть перенесено через гематоэнцефалический барьер посредством рецептор-опосредованного трансцитоза. Поглощение мозгом биспецифического антитела может быть
дополнительно усилено путем проектирования биспецифического антитела для снижения его аффинности к рецептору гематоэнцефалического барьера. Сниженная аффинность к рецептору приводит к более широкому распространению в мозге (см., например, Atwal et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu etal, Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011).
[00167] Примерами биспецифических антител также могут быть: 1) антитело с двойным вариабельным доменом (DVD-Ig), в котором каждая легкая цепь и тяжелая цепь содержит два вариабельных домена в тандеме посредством короткого пептидного соединения (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig(tm)) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) тандаб (Tandab), которое представляет собой гибрид двух одноцепочечных диател, образующих четырехвалентное биспецифическое антитело, которое имеет два сайта связывания для каждого из целевых антигенов; 3) флекситело, которое представляет собой совмещение scFvs с диателом, приводящее к образованию многовалентной молекулы; 4) так называемая молекула "dock and lock", созданная на основе "домена димеризации и докинга" протеинкиназы А, применение которого с Fab приводит к получению биспецифического трехвалентного связывающего белка, состоящего из двух идентичных Fab-фрагментов, присоединённых к другому Fab-фрагменту; (5) так называемая молекула Scorpion, содержащая, например, два scFv, слитых с обоими концам Fc-области антитела человека. Примеры платформ, полезных для приготовления биспецифических антител, включают: BiTE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab и Mab2 (F-star), Fc-спроектированный IgGl (Xencor) или DuoBody (на основе обмена плечей Fab, Genmab).
[00168] Термин "эпитоп" относится к сайту на антигене, с которым связывается антитело. Эпитоп может быть сформирован из смежных аминокислот или несмежных аминокислот, сближающихся посредством третичного свертывания одного или нескольких белков. Эпитопы, сформированные из смежных аминокислот (также известные как линейные эпитопы), обычно сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, сформированные путем третичного свертывания (также известные как конформационные эпитопы), обычно утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3, а более обычно - по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и двумерный ядерный магнитный резонанс. Смотрите, например, Epitope
Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). Эпитоп может быть линейным, таким как эпитоп, например, 2-5, 3-5, 3-9 или 5-9 смежных аминокислот из SEQ Ш N0: 109. Эпитоп также может быть конформационным эпитопом, содержащим, например, два или более несмежных сегмента аминокислот в пределах остатков 89-97 SEQIDNO: 109.
[00169] Если говорят, что антитело связывается с эпитопом в пределах аминокислот 89-97 транстиретина (TTR), например, то подразумевается, что эпитоп находится в пределах описанного промежутка аминокислот, включая те, которые определяют внешние пределы промежутка. Это не обязательно означает, что каждая аминокислота в пределах промежутка составляет часть эпитопа. Так, например, эпитоп в пределах аминокислот 89-97 TTR может состоять из аминокислот 89-97, 89-96, 90-96, 91-96, 92-96, 93-96, 94-96, 89-96, 89-95, 89-94, 89-93, 89-92 или 89-93 среди других линейных сегментов SEQ Ш NO: 113, или в случае конформационных эпитопов, несмежных сегментов аминокислот SEQ Ш NO: 113.
[00170] Антитела, которые распознают одни и те же или перекрывающиеся эпитопы, могут быть идентифицированы обычным иммуноанализом, показывающем способность одного антитела конкурировать с другим антителом за связывание с целевым антигеном. Эпитоп антитела также может быть определен рентгеновской кристаллографией антитела, связанного с его антигеном, для идентификации контактирующих остатков. В альтернативном варианте, два антитела имеют один и тот же эпитоп, если все аминокислотные мутации в антигене, которые уменьшают или устраняют связывание одного антитела, также уменьшают или устраняют связывание другого антитела. Два антитела имеют перекрывающиеся эпитопы, если некоторые аминокислотные мутации, которые уменьшают или устраняют связывание одного антитела, также уменьшают или устраняют связывание другого антитела.
[00171] Конкуренция между антителами определяется анализом, в котором тестируемое антитело ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном (см., например, Junghans et al, Cancer Res. 50:1495, 1990). Тестируемое антитело конкурирует с эталонным антителом, если избыток тестируемого антитела (например по меньшей мере 2х, 5х, 10х, 20х или 100х) ингибирует связывание эталонного антитела по меньшей мере на 50%, как измерено при анализе конкурентного связывания. Некоторые тестируемые антитела ингибируют связывание эталонных антител по меньшей мере на 75%, 90% или 99%. Антитела, идентифицированные конкурентным анализом (конкурирующие антитела),
включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, и антитела, связывающиеся с соседним эпитопом, находящимся достаточно проксимально по отношению к эпитопу, связанному эталонным антителом для создания стерического препятствия.
[00172] Термин "нативный" по отношению к структуре транстиретина (TTR) относится к нормально свернутой структуре TTR в его правильно функционирующем состоянии (т. е. тетрамер TTR). Поскольку TTR является тетрамером в его изначально свернутой форме, неродные формы TTR включают, например, неправильно свернутые тетрамеры TTR, мономеры TTR, агрегированные формы TTR, и TTR в форме фибрилл. Неродные формы TTR могут включать молекулы, содержащие аминокислотные последовательности TTR дикого типа или мутации.
[00173] Термин "неправильно свернутый" по отношению к TTR относится к вторичной и третичной структуре полипептидного мономера или мультимера TTR и указывает на то, что полипептид принял конформацию, которая не является нормальной для этого белка в его правильно функционирующем состоянии. Хотя неправильное свертывание TTR может быть вызвано с мутациями в белке (например, делецией, заменой или добавлением), белки TTR дикого типа также могут быть неправильно свернуты при заболеваниях, экспонируя специфические эпитопы.
[00174] Термин "фармацевтически приемлемый" означает, что носитель, разбавитель, эксципиент или вспомогательное вещество совместимы с другими ингредиентами состава и не является по существу вредным для его реципиента.
[00175] Термин "пациент" включает людей и других субъектов-млекопитающих, которые получают либо профилактическое, либо терапевтическое лечение.
[00176] Человек подвержен повышенному риску заболевания, если у субъекта есть хотя бы один известный фактор риска (например, генетический, биохимический, семейный анамнез и ситуационный риск), в результате чего люди с этим фактором риска имеют статистически значимый больший риск развития заболевания чем люди без фактора риска.
[00177] Термин "биологический образец" относится к образцу биологического материала внутри биологического источника, или который может быть получен из источника, например человека или млекопитающего. Такие образцы могут быть органами, органеллами, тканями, срезами тканей, физиологическими жидкостями, периферической кровью, плазмой крови,
сывороткой крови, клетками, молекулами, такими как белки и пептиды, и любыми полученными из них частями или комбинациями. Термин биологический образец может также охватывать любой материал, полученный путем обработки образца. Производный материал может включать клетки или их потомство. Обработка биологического образца может включать одну или несколько из: фильтраций, дистилляций, экстракций, концентраций, фиксаций, инактиваций мешающих компонентов и тому подобного.
[00178] Термин "контрольный образец" относится к биологическому образцу, для которого не известно или не подозревается содержание мономерных, неправильно свернутых, агрегированных или фибрильных форм транстиретина (TTR), например, таких как в амилоидные отложения TTR. Контрольные образцы могут быть получены у лиц, не страдающих TTR амилоидозом или специфически выбранным типом TTR амилоидоза. Альтернативно, контрольные образцы могут быть получены у пациентов, страдающих TTR амилоидозом или специфически выбранным типом TTR амилоидоза. Такие образцы могут быть получены в то же время, что и биологический образец, который, как считается, содержит TTR амилоидоз, или в другом случае. Биологический образец и контрольный образец могут быть получены из одной и той же ткани (например, срез ткани, содержащий как отложения TTR амилоида, так и окружающие нормальные ткани). Предпочтительно контрольные образцы состоят в основном или полностью из ткани, свободной от амилоидных отложений TTR, и могут быть использованы для сравнения с биологическим образцом, который, как считается, содержит амилоидные отложения TTR. Предпочтительно ткань в контрольном образце имеет тот же самый тип, что и ткань в биологическом образце (например, кардиомиоциты в сердце).
[00179] Термин "болезнь" относится к любому аномальному состоянию, которое ухудшает физиологическую функцию. Этот термин широко используется для охвата любого расстройства, хвори, аномалии, патологии, недуга, состояния или синдрома, при которых нарушается физиологическая функция, независимо от характера этиологии.
[00180] Термин "симптом" относится к субъективным свидетельствам заболевания, таким как измененная походка, как это воспринимается субъектом. "Признак" относится к объективным свидетельствам болезни, наблюдаемым врачом.
[00181] Для классификации аминокислотных замен на консервативные или неконсервативные, аминокислоты сгруппированы следующим образом: группа I
(гидрофобные боковые цепи): met, ala, val, leu, ile; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): cys, ser, thr; группа III (кислотные боковые цепи): asp, glu; группа IV (основные боковые цепи): asn, gin, his, lys, arg; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепей): gly, pro; и группа VI (ароматические боковые цепи): tip, tyr, phe. Консервативные замены подразумевают замены между аминокислотами в одном классе. Неконсервативные замены заключаются в обмене члена одного из этих классов на член другого.
[00182] Идентичность последовательности в процентах определяется с помощью последовательностей антител, максимально выравненных согласно соглашению нумерации Kabat. После выравнивания, если область антитела субъекта (например, вся зрелая вариабельная область тяжелой или легкой цепи) сравнивают с той же областью эталонного антитела, то идентичность последовательности в процентах между областями субъекта и эталонного антитела представляет собой число позиций, занятых такой же аминокислотой как в области субъекта, так и в области эталонного антитела, разделенное на общее количество выровненных позиций двух областей, причем промежутки не учитываются, умноженное на 100 для преобразования в процентное соотношение.
[00183] Композиции или способы, "содержащие" или "включающие" один или несколько рассмотренных элементов, могут включать другие элементы, которые не были точно указаны. Например, композиция, которая "содержит" или "включает" антитело, может содержать антитело отдельно или в комбинации с другими составляющими.
[00184] Обозначение диапазона значений включает все целые числа в пределах диапазона или задающие диапазон, и все поддиапазоны, заданные целыми числами в пределах диапазона.
[00185] Если иное не вытекает из контекста, термин "около" охватывает значения в пределах стандартной погрешности измерения (например, SEM) указанного значения.
[00186] Статистическая значимость означает р < равное 0,05.
[00187] Формы существительных в единственном числе включат также формы в множественном числе, до тех пор, пока иное четкое не следует из контекста. Например, термин "соединение" или "по меньшей мере одно соединение" может включать в себя множество соединений, включая их смеси.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ I. Общие положения
[00188] В изобретении предложены антитела, которые специфически связываются с остатками 89-97 транстиретина (TTR). Антитела обладают способностью связываться с мономерными, неправильно свернутыми, агрегированными или фибрильными формами TTR. Антитела могут быть использованы для лечения, или осуществления профилактики заболеваний или расстройств, связанных с накоплением TTR или накоплением отложений TTR (например, TTR амилоидоза). Антитела также могут быть использованы для диагностики TTR амилоидоза и ингибирования, или уменьшения агрегации TTR, среди других применений.
П. Молекулы-мишени
[00189] Транстиретин (TTR) представляет собой сывороточный белок и транспортный белок спинномозговой жидкости, имеет длину 127 аминокислот, массу 55 кДа и синтезируется в основном печенью. Он также упоминается как преальбумин, тироксинсвязывающий преальбумин, ATTR (TTR amyloidosis) и ТВРА (thyroxine-binding prealbumin - тироксин-связывающий преальбумин). В своем нативном состоянии TTR существует как тетрамер. У гомозигот тетрамеры содержат идентичные 127-аминокислотные субъединицы, богатые на бета-слои. У гетерозигот тетрамеры TTR состоят из различных субъединиц и/или субъединиц дикого типа, которые обычно объединяются статистическим способом.
[00190] Установленная функция TTR в крови заключается в транспорте holo-ретинолсвязывающего белка. Хотя TTR является основным переносчиком тироксина (Т4) в крови грызунов, задействуя сайты связывания, которые ортогональны к сайтам, используемым для /го/о-ретинолсвязывающего белка, сайты связывания Т4 фактически незаняты у людей.
[00191] TTR является одним из по меньшей мере тридцати различных человеческих белков, чье внеклеточное неправильное свертывание и/или неправильная сборка (амилоидогенез) в многообразие агрегатных структур, как полагают, вызывает дегенеративные заболевания, называемые амилоидными заболеваниями. TTR должен претерпеть конформационные изменения, чтобы стать амилоидогенным. Частичное
разворачивание раскрывает участки почти незаряженных гидрофобных остатков в развернутой конформации, которые эффективно неправильно собираются в почти полностью неструктурированные сферические агрегаты, которые в конечном итоге претерпевают конформационное преобразование в амилоидные структуры с бета-листами.
[00192] Если иное не очевидно из контекста, отсылка к транстиретину (TTR) или его фрагментам или доменам включает природные аминокислотные последовательности человека, включая их изоформы, мутантные и аллельные варианты. Иллюстративные полипептидные последовательности TTR обозначаются идентификационными номерами Р02766.1 (UniProt), ААВ35639.1 (GenBank), ААВ35640.1 (GenBank) и ABI63351.1 (GenBank) (SEQ Ш NOS: 109-112, соответственно). Остатки нумеруются в соответствии с Р02766.1 Swiss Prot, с первой аминокислотой зрелого белка (то есть, не включая 20-аминокислотную сигнальную последовательность), обозначенной остатком 1. В любом другом белке TTR остатки нумеруются согласно соответствующим остаткам в Р02766.1 при максимальном выравнивании.
III. Транстиретиновый амилоидоз
[00193] Транстиретиновый (TTR) амилоидоз представляет собой системное расстройство, характеризующееся патогенным, неправильным свернутым TTR и внеклеточным отложением амилоидных фибрилл, состоящих из TTR. TTR амилоидоз обычно вызван дестабилизацией нативной тетрамерной формы TTR (из-за условий среды или генетических патологий), что приводит к диссоциации, неправильному свертыванию и агрегации TTR в амилоидные фибриллы, которые накапливаются в различных органах и тканях, вызывая прогрессирующую дисфункцию. Смотрите, например, Almeida and Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012); Ando etal, Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).
[00194] У людей, как тетрамеры TTR дикого типа, так и смешанные тетрамеры, состоящие из субъединиц мутантного и дикого типа, могут диссоциировать, неправильно свертыватся и агрегировать, причем процесс амилоидогенеза приводит к дегенерации постмитотической ткани. Таким образом, TTR амилоидозы включают заболевания, вызванные патогенным неправильно свернутым TTR, возникающим в результате мутаций в TTR, или возникающим из не мутированного, неправильно свернутого TTR.
[00195] Например, старческий системный амилоидоз (SSA - senile systemic amyloidosis) и старческий сердечный амилоидоз (SCA - senile cardiac amyloidosis) представляют собой
возрастные типы амилоидоза, которые возникают в результате отложения TTR амилоида дикого типа за пределами и внутри кардиомиоцитов сердца. TTR амилоидоз также является наиболее распространенной формой наследственного (семейного) амилоидоза, который вызван мутациями, которые дестабилизируют белок TTR. TTR амилоидозы, связанные с точечными мутациями в гене TTR, включают семейную амилоидную полиневропатию (FAP -familial amyloid polyneuropathy), семейную амилоидную кардиомиопатию (FAC - familial amyloid cardiomyopathy) и редкий избирательный амилоидоз центральной нервной системы (CNSA - central nervous system selective amyloidosis). Пациенты с наследственным (семейным) TTR амилоидозом почти всегда являются гетерозиготами, что означает, что тетрамеры TTR состоят из субъединиц TTR мутантного и/или дикого типа, в целом, как правило, статистически распределенных. Наследственные (семейные) формы TTR амилоидоза, как правило, являются аутосомно-доминантными и, как правило, имеют более раннее проявление первых симптомов, чем спорадические заболевания (SSA и SCA).
[00196] В гене, кодирующем TTR, более 100 мутаций которые связывают с аутосомно-доминантными расстройствами FAP и FAC. Смотрите, например, US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat. 17(6):493-503 (2001); Damas and Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwulet and Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 114:657-662 (1983). Эти мутации, вызывающие образование амилоида, распределены по всей молекуле TTR. Как правило, чем более дестабилизирующими для тетрамерной структуры TTR являются мутантные субъединицы, тем раньше проявляются первые симптомы амилоидного заболевания. Патогенный потенциал варианта TTR в целом, как правило, определяется комбинацией его нестабильности и эффективности его клеточной секреции. Первоначальная патология, вызванная некоторыми вариантами TTR, является результатом их избирательного разрушения сердечной ткани, тогда как другие варианты TTR приводят к нарушениям в периферической и вегетативной нервной системах. Повреждение ткани, вызванное TTR амилоидогенезом, по-видимому, обусловлено главным образом токсичностью небольших, диффундирующих агрегатов TTR, хотя накопление внеклеточного амилоида может способствовать и почти наверняка приводит к изменению структуры органа на поздних стадиях TTR амилоидоза.
[00197] TTR амилоидоз представлен многими различными формами, со значительными фенотипическими различиями между индивидами и географическими регионами. Например, TTR амилоидоз может представлять собой прогрессирующую, аксональную сенсорную
вегетативную и моторную невропатию. TTR амилоидоз может также представлять собой проникающую кардиомиопатию.
[00198] Возраст проявления первых симптомов, связанных с болезнью, колеблется между вторым и девятым десятилетиями жизни с большими вариациями в разных популяциях. Мультисистемное поражение TTR амилоидозом является ключом к его диагностике. Например, диагноз TTR амилоидоза рассматривается при наличии одного или нескольких следующих факторов: 1) семейный анамнез нейропатического заболевания, особенно связанного с сердечной недостаточностью; 2) невропатическая боль или прогрессирующие сенсорные нарушения неизвестной этиологии; 3) синдром кистевого туннеля без очевидной причины, особенно если он двусторонний и требует хирургического устранения; 4) нарушения моторики желудочно-кишечного тракта или дисфункция автономной нервной системы неизвестной этиологии (например, эректильная дисфункция, ортостатическая гипотензия, нейрогенный мочевой пузырь); 5) сердечная болезнь, характеризующаяся утолщенными стенками желудочков в отсутствие гипертонии; 6) расширенный по неизвестным причинам атрио-вентрикуляный блок, особенно когда он сопровождается утолщенным сердцем; и 6) включения в стекловидном теле по типу ваты. Смотрите Ando et al, Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Другие симптомы могут включать, например, полинейропатию, потерю чувствительности, боль, слабость нижних конечностей, дисгидроз, диарею, запор, потерю веса и недержание/удержание мочи.
[00199] Диагностика TTR амилоидоза обычно основывается на биопсии органов-мишеней с последующим гистологическим окрашиванием вырезанной ткани с помощью специфического к амилоиду красителя конго красный. Если наблюдается положительный результат на амилоид, впоследствии проводится иммуногистохимическое окрашивание для TTR, чтобы гарантировать, что белок-предшественник, ответственный за образование амилоида, действительно является TTR. Для наследственных форм заболеваний необходимо продемонстрировать мутацию в гене, кодирующем TTR, до постановки диагноза. Это можно достигнуть, например, посредством изоэлектрического фокусирующего электрофореза, полимеразной цепной реакции или лазерной диссекции/жидкостной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией. См., например, US 2014/0056904; Ruberg and Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012); Ando etal, Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013).
IV. Антитела
А. Специфичность связывания и функциональные свойства
[00200] В изобретении предложены моноклональные антитела, связывающиеся с белком транстиретином (TTR), более конкретно, с эпитопами в пределах аминокислотных остатков 89-97 (SEQ Ш N0: 113) белка TTR. Такие эпитопы являются скрытыми в нативном тетрамере TTR и экспонированы в мономерных, неправильно свернутых, агрегированных или фибрильных формах TTR.
[00201] Антитела, обозначенные как 9D5 и 14G8, представляют собой два таких иллюстративных антитела мыши. Если не очевидно из контекста, отсылку к 9D5 или 14G8 следует понимать, как относящуюся к любой из мышиных, химерных, венированных и гуманизированных форм этих антител. Эти антитела специфически связываются в пределах аминокислотных остатков 89-97 (SEQ Ш NO: 113) белка TTR. Эти антитела дополнительно характеризуются их способностью связываться с мономерными, неправильно свернутыми, агрегированными или фибрильными формами TTR, но не с нативными тетрамерными формами TTR. Кроме того, эти антитела характеризуются иммунореактивностью к сердечной ткани, подверженной TTR-опосредованному амилоидозу, но не к здоровой сердечной ткани. Способность связываться с конкретными белками или их фрагментами может быть продемонстрирована с использованием иллюстративных форматов анализа, представленных в примерах.
[00202] Некоторые антитела связываются с тем же или перекрывающимся эпитопом что и антитела, обозначенные как 9D5 или 14G8. Последовательности зрелых вариабельных областей тяжелой и легкой цепей этих антител обозначены как SEQ Ш NO: 1 и 16 (9D5), и, 61 и 70 (14G8) соответственно. Другие антитела, обладающие такой специфичностью связывания, могут быть получены путем иммунизации мышей с помощью TTR или его части, включая желаемый эпитоп (например, SEQ Ш NO: 113), и путем скрининга полученных антител на связывания с мономерным TTR или пептидом, содержащим SEQ Ш NO: 113, необязательно в конкуренции с антителом, имеющим вариабельные области антитела мыши 9D5 или 14G8 (IgGl каппа). Фрагменты TTR, включая желаемый эпитоп, могут быть связаны с носителем, который помогает вызывать гуморальный ответ на фрагмент, и/или смешаны с адъювантом, который помогает вызвать такой ответ. Такие антитела могут быть проверены на различие в связывании с мономерным вариантом TTR, вариантом дикого типа или
фрагментом TTR (например, SEQ Ш NO: 113) по сравнению с мутантами по указанным остаткам. Скрининг при сравнении с такими мутантами более точно определяет специфичность связывания, что позволяет идентифицировать антитела, связывание которых ингибируется мутагенезом определенных остатков и которые, вероятно, будут обладать функциональными свойствами других иллюстративных антител. Мутации могут быть систематической замещающей заменой аланином (или серином, если уже присутствует аланин), по одному остатку за раз, или заменой более широкими интервалами по всей мишени или по всему её участку, в котором, как известно, находится эпитоп. Если один и тот же набор мутаций значительно снижает связывание двух антител, оба антитела связывают один и тот же эпитоп.
[00203] Антитела, обладающие специфичностью связывания выбранного антитела мыши (например, 9D5 или 14G8), также могут быть получены с использованием варианта способа фагового дисплея. См. Winter, WO 92/20791. Этот способ особенно подходит для продуцирования человеческих антител. В этом способе в качестве исходного материала используют вариабельную область или тяжелой, или легкой цепи выбранного антитела мыши. Если, например, в качестве исходного материала выбрана вариабельная область легкой цепи, то создают библиотеку фагов, в которой элементы отображают одну и ту же вариабельную область легкой цепи (то есть исходный материал мыши) и другую вариабельную область тяжелой цепи. Вариабельные области тяжелой цепи можно, например, получить из библиотеки перегруппированных вариабельных областей тяжелой цепи человека. Отбирается фаг, демонстрирующий сильное специфическое связывание (например, по меньшей мере 108, а предпочтительно по меньшей мере 109 М"1) для мономера TTR или его фрагмента (например, аминокислотных остатков 89-97). Вариабельная область тяжелой цепи из этого фага затем служит в качестве исходного материала для конструирования дополнительной библиотеки фагов. В этой библиотеке каждый фаг отображает ту же самую вариабельную область тяжелой цепи (то есть область, идентифицированную из первой дисплей-библиотеки), и другую вариабельную область легкой цепи. Вариабельные области легкой цепи могут быть получены, например, из библиотеки перегруппированных вариабельных областей легкой цепи человека. Опять же, выбирают фаг, демонстрирующий сильное специфическое связывание для мономерного TTR или его фрагмента (например, аминокислотных остатков 89-97). Полученные антитела обычно имеют такую же или сходную специфичность к эпитопу, что и исходный материал мыши. CDR по Кабату тяжелой
цепи 9D5 обозначены SEQ Ш NO: 13-15 соответственно, a CDR по Кабату легкой цепи 9D5 обозначены SEQ Ш N0: 24-26, соответственно. Составной CDR-H1 по Чотия- Кабат антитела 9D5 обозначен как SEQ Ш N0: 117. CDR по Кабату тяжелой цепи 14G8 обозначены SEQ Ш N0: 67-69 соответственно, a CDR по Кабату легкой цепи 14G8 обозначены SEQ Ш N0: 77-79, соответственно. Составной CDR-H1 по Чотия- Кабат антитела 14G8 обозначен как SEQ Ш N0: 118. Вариант CDR-L1 антитела 14G8 обозначен как SEQ ID N0: 80.
[00204] Другие антитела могут быть получены путем мутагенеза кДНК, кодирующей тяжелую и легкую цепи иллюстративного антитела, такого как 9D5 или 14G8. В изобретение также включены моноклональные антитела, которые по меньшей мере на 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны антителу 9D5 или 14G8 по аминокислотной последовательности вариабельных областей зрелой тяжелой и/или легкой цепи, и сохраняют его функциональные свойства, и/или которые отличаются от соответствующего антитела небольшим числом функционально несущественных аминокислотных замен (например, консервативных замен), делеций или вставок. Также включены моноклональные антитела, имеющие по меньшей мере одну или все шесть CDR, как определено в соответствии с любым общепринятым соглашением, но предпочтительно по Кабату у, которые являются на 90%, 95%, 99% или 100% идентичными соответствующим CDR антитела 9D5 или 14G8.
[00205] В изобретении также предложены антитела, имеющие некоторые или все (например, 3, 4, 5 и 6) CDR полностью или практически полностью из 9D5 или 14G8. Такие антитела могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет по меньшей мере две и, как правило, все три CDR полностью или почти полностью из вариабельной области тяжелой цепи антитела 9D5 или 14G8, и/или вариабельную область легкой цепи, имеющая по меньшей мере две и, как правило, все три CDR полностью или почти полностью из вариабельной области легкой цепи антитела 9D5 или 14G8. Антитела могут также включать как тяжелые, так и легкие цепи. CDR является почти полностью взят из соответствующего CDR антитела 9D5 или 14G8, когда он содержит не более 4, 3, 2 или 1 замен, вставок или делеций, за исключением того, что CDR-H2 (когда определено по Кабату) может иметь не более 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замен, вставки или удаления. Такие антитела могут иметь по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с антителом 9D5 или 14G8 по аминокислотной последовательности вариабельных зрелой тяжелой и/или легкой цепи(-ей), и сохраняют его функциональные свойства, и/или которые
отличаются от антитела 9D5 или 14G8 небольшим числом функционально несущественных аминокислотных замен (например, консервативных замен), делеций или вставок.
[00206] Некоторые антитела, идентифицированные с помощью таких анализов, могут связываться с мономерными, неправильно свернутыми, агрегированными или фибрильными формами TTR, но не с нативными тетрамерными формами TTR, как описано в примерах или где-либо еще. Аналогично, некоторые антитела являются иммунореактивными к ткани, подверженной TTR-опосредованному амилоидозу, но не к здоровой ткани.
[00207] Некоторые антитела могут ингибировать или уменьшать агрегацию TTR, ингибировать или уменьшать образование фибрилл TTR, уменьшать или удалять отложения TTR либо агрегированный TTR, или стабилизировать нетоксичные конформации TTR в животной модели или клинических испытаниях. Некоторые антитела могут лечить, оказывать профилактическое действие или замедлять начало проявления первых симптомов TTR амилоидоза, как показано на животной модели или клинических испытаниях. Иллюстративные модели животных для тестирования активности против TTR амилоидоза включают те, которые описаны в Kohno et al, Am. J. Path. 150(4): 1497-1508 (1997); Teng et al, Laboratory Investigations 81:385-396 (2001); Wakasugi et al, Proc. Japan Acad. 63B:344-347 (1987); Shimada et al, Mol. Biol. Med. 6:333-343 (1989); Nagata et al, J. Biochem. 117:169-175 (1995); Sousa et al, Am. J. Path. 161:1935-1948 (2002); и Santos et al, Neurobiology of Aging 31:280-289 (2010).
В. Нечеловеческие антитела
[00208] Производство других нечеловеческих антител, например, антител мыши, морской свинки, приматов, кроликов или крыс, к мономерному TTR или его фрагменту (например, аминокислотных остатков 89-97) может быть осуществлено, например, путем иммунизации животного TTR или его фрагментом. Смотрите Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (включено посредством ссылки для всех целей). Такой иммуноген может быть получен из природного источника, путем пептидного синтеза или экспрессией рекомбинантного пептида. Необязательно, иммуноген можно вводить слитым или иным образом, совмещенным с белком-носителем. Необязательно, иммуноген можно вводить с адъювантом. Могут быть использованы несколько типов адъювантов, как описано ниже. Для иммунизации лабораторных животных предпочтительным является полный адъювант Фрейнда, после которого применяют неполный адъювант. Кролики или морские свинки
обычно используются для получения поликлональных антител. Мышей обычно используют для продуцирования моноклональных антител. Антитела скринируют на специфическое связывание с мономерным TTR или эпитопом в TTR (например, эпитопом, содержащим один или несколько аминокислотных остатков 89-97). Такой скрининг может быть осуществлен путем определения связывания антитела с набором мономерных вариантов TTR, таких как варианты TTR, содержащие аминокислотные остатки 89-97 или мутации в пределах этих остатков, и путем определения того, какие варианты TTR связываются с антителом. Связывание может быть оценено, например, Вестерн-блоттингом, FACS (Flow Cytometry Staining Protocol) или твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA).
С. Гуманизированные антитела
[00209] Гуманизированное антитело представляет собой генетически модифицированное антитело, в котором CDR из нечеловеческого "донорного" антитела переносят в последовательности "акцепторного" антитела человека (см., например, Queen, US 5530101 и 5585089; Winter, US 5225539; Carter, US 6407213; Adair, US 5859205; и Foote, US 6881557). Последовательности акцепторных антител могут представлять собой, например, зрелую последовательность антитела человека, составную последовательность из таких последовательностей, консенсусную последовательность последовательностей антитела человека, или последовательность из клеток зародышевой линии. Таким образом, гуманизированное антитело представляет собой антитело, имеющее по меньшей мере три, четыре, пять или все CDR полностью или почти полностью из донорных антител, и каркасные последовательности вариабельной области, и константные области, если они присутствуют, полностью или почти полностью из последовательностей антитела человека. Аналогично, гуманизированная тяжелая цепь имеет по меньшей мере одну, две и обычно все три CDR полностью или почти полностью из тяжелой цепи донорного антитела, и каркасную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, и константную область тяжелой цепи, если она присутствует, почти полностью из каркаса вариабельной области тяжелой цепи и последовательностей константной области человека. Схожим образом, гуманизированная легкая цепь имеет по меньшей мере одну, две и обычно все три CDR полностью или почти полностью из легкой цепи донорного антитела, и каркасную последовательность вариабельной области легкой цепи, и константную область легкой цепи, если она присутствует, почти полностью из каркаса вариабельной области легкой цепи и
последовательностей константной области человека. Помимо нанотел и dAbs, гуманизированное антитело содержит гуманизированную тяжелую цепь и гуманизированную легкую цепь. CDR в гуманизированном антителе является почти полностью из соответствующего CDR в нечеловеческом антителе, когда по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 100% соответствующих остатков (как определено согласно общепринятому соглашению, но предпочтительно определено по Кабату) являются идентичными между соответствующими CDR. Каркасные последовательности вариабельной области цепи антитела или константной области цепи антитела являются почти полностью из каркасной последовательности вариабельной области человека или константной области человека соответственно, когда по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 100% соответствующих остатков, определенных согласно общепринятому соглашению, но предпочтительно определенные по Кабату, являются идентичными.
[00210] Хотя гуманизированные антитела часто содержат все шесть CDR (определены согласно любому общепринятому соглашению, но предпочтительно определены по Кабату) из антитела мыши, они также могут быть сконструированы с меньшим, чем все CDR, количеством (например, по меньшей мере тремя, четырьмя или пятью CDR) из антитела мыши (например, Pascalis et al, J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., J. ofMol. Biol., 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al, Mol Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, J. Immunol, 164:1432-1441, 2000).
[00211] В некоторых антителах для сохранения связывания в гуманизированном антителе необходима только часть CDR, а именно подгруппа остатков CDR, необходимых для связывания, называемых SDR. Остатки CDR, не контактирующие с антигеном и не входящие в SDR, могут быть идентифицированы на основе предыдущих исследований (например, остатки Н60-Н65 в CDR Н2 часто не требуются), на основании областей CDR по Кабату, расположенных вне гипервариабельных петель по Чотия (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), с помощью молекулярного моделирования и/или эмпирически, или как описано в Gonzales et al, Mol. Immunol. 41: 863, 2004. В таких гуманизированных антителах в позициях, в которых отсутствует один или несколько донорных CDR-остатков, или в которых отсутствует весь донорный CDR, аминокислота, занимающая позицию, может быть аминокислотой, занимающей соответствующую позицию (по нумерации Kabat) в последовательности акцепторного антитела. Количество таких замен акцептора для донорных аминокислот в CDR что должны быть включены, отражают баланс конкурирующих предпочтений. Такие замены
потенциально выгодны для уменьшения количества аминокислот мыши в гуманизированном антителе и, как следствие, уменьшения потенциальной иммуногенности. Однако замены могут также вызывать изменения аффинности, и предпочтительно избегать значительного снижения аффинности. Также могут быть выбраны эмпирически заменяемые позиции в пределах CDR, и аминокислоты для замены.
[00212] Последовательности акцепторного антитела человека могут быть необязательно выбраны из многих известных последовательностей антител человека для того, чтобы обеспечить высокую степень идентичности последовательности (например, идентичность 6585%) между каркасами вариабельной области последовательности акцептора человека и соответствующими каркасами вариабельной области цепи донорного антитела.
[00213] Примерами последовательностей акцептора для тяжелой цепи являются вариабельные области зрелой тяжелой цепи человека с идентификационными номерами NCBI - ВАС02114 и ААХ82494.1 (SEQ ID NOS: 3 и 4), и вариабельные области тяжелой цепи человека подгруппы 3 по Кабату. ВАС02114 разделяет ту же традиционную форму, что и тяжелая цепь 9D5 мыши. Другими примерами последовательностей акцептора для тяжелой цепи являются вариабельные области зрелой тяжелой цепи человека с идентификационными номерами NCBI - AAD30410.1 и ААХ82494.1 (SEQ ГО NOS: 63 и 4), и вариабельные области тяжелой цепи человека подгруппы 1 по Кабату. AAD30410.1 и ААХ82494.1 включают два CDR, имеющих ту же традиционную форму, что и тяжелая цепь 14G8 мыши. Примерами последовательностей акцептора для легкой цепи являются вариабельная область зрелой легкой цепи человека с идентификационным номером NCBI - АВС66952 (SEQ ГО NO: 18) и вариабельные области легкой цепи человека подгруппы 3 по Кабату. АВС66952 включает два CDR, имеющих ту же традиционную форму, что и легкая цепь 9D5 мыши. Другими примерами последовательностей акцептора для легкой цепи являются вариабельные области зрелой легкой цепи человека с идентификационными номерами NCBI - АВА71374.1 и АВС66952.1 (SEQ ГО NOS: 72 и 73 соответственно), и вариабельные области легкой цепи человека подгруппы 2 по Кабату. АВА71374.1 и АВС66952.1 имеют ту же традиционную форму, что и легкая цепь 14G8 мыши.
[00214] Если выбрано более одной последовательности акцепторного антитела человека, может быть использован композит или гибрид этих акцепторов, и аминокислоты, используемые в разных позициях в вариабельных областях гуманизированной легкой цепи и
гуманизированной тяжелой цепи, могут быть взяты из любых используемых последовательностей акцепторного антитела человека. Например, вариабельные области зрелой тяжелой цепи человека, с идентификационными номерами NCBI - ВАС02114 и ААХ82494.1 (SEQ Ш NOS: 3 и 4), использовались в качестве последовательностей акцептора для гуманизации вариабельной области зрелой тяжелой цепи 9D5. Примеры позиций, в которых эти два акцептора различаются, включают позиции HI9 (R или К), Н40 (А или Т), Н44 (G или R), Н49 (S или А), Н77 (S или Т), Н82а (N или S), Н83 (R или К), Н84 (А или S) и Н89 (V или М). Гуманизированные варианты вариабельной области тяжелой цепи 9D5 могут содержать одну из двух таких аминокислот в любой из этих позиций. Аналогично, вариабельные области зрелой тяжелой цепи человека с идентификационными номерами NCBI - AAD30410.1 и ААХ82494.1 (SEQ ID NOS: 63 и 4 соответственно) использовали в качестве последовательностей акцептора для гуманизации вариабельной области зрелой тяжелой цепи 14G8. Примеры позиций, в которых эти два акцептора различаются, включают позиции Н82а (N или S), Н83 (R или К), Н84 (А или S) и Н89 (V или М). Гуманизированные варианты вариабельной области тяжелой цепи 14G8 могут содержать одну из двух таких аминокислот в любой из этих позиций. Аналогично, вариабельные области зрелой легкой цепи человека с идентификационными номерами NCBI - АВА71374.1 и АВС66952.1 (SEQ ГО NOS: 72 и 73 соответственно) использовали в качестве последовательностей акцептора для гуманизации вариабельной области зрелой легкой цепи 14G8. Примером позиции, в которой эти два акцептора отличаются, является позиция L18 (S или Р). Гуманизированные варианты вариабельной области легкой цепи 14G8 могут содержать одну из двух таких аминокислот в этой позиции.
[00215] Могут быть выбраны определенные аминокислоты из остатков в каркасе вариабельной области человека для замены, исходя из их возможного влияния на конформацию CDR и/или связывания с антигеном. Исследование таких возможных влияний заключается в моделировании, изучении характеристик аминокислот в определенных местах, или эмпирическом наблюдении эффектов замены или мутагенеза определенных аминокислот.
[00216] Например, когда аминокислота различается между каркасным остатком вариабельной области мыши и выбранным каркасным остатком вариабельной области человека, аминокислота в человеческом каркасе может быть замещена эквивалентной каркасной аминокислотой из мышиного антитела, если разумно ожидать, что аминокислота:
1) нековалентно прямо связывается с антигеном;
2) является смежной с областью CDR или находится внутри CDR, как определено по Чотия, но не по Кабату;
3) в противном случае взаимодействует с областью CDR (например, находится в пределах около 6 А области CDR) (например, идентифицируется путем моделирования легкой или тяжелой цепи на решенной структуре гомологичной известной цепи иммуноглобулина); или
4) представляет собой остаток, размещенный в интерфейсе VL-VH.
[00217] Аминокислотные остатки каркаса из классов 1) - 3), как определено Queen, US 5530101, иногда поочередно упоминаются как канонические и верниальные (vernier) остатки. Аминокислотные остатки каркаса, которые помогают определить конформацию петли CDR, иногда упоминаются как канонические остатки (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Thornton & Martin, J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). Аминокислотные остатки каркаса, которые поддерживают конформацию антигенсвязывающей петли и играют определенную роль в тонкой подгонке антитела к антигену, иногда упоминаются как верниальные остатки (vernier residues) (Foote & Winter, J. Mol. Biol 224:487-499 (1992)).
[00218] Другими остатками каркаса, которые представляют собой кандидаты на замену, являются остатки, создающие потенциальный сайт гликозилирования. Другими кандидатами на замещение являются каркасные аминокислоты акцептора человека, которые являются необычными для иммуноглобулина человека в этом положении. Эти аминокислоты могут быть заменены аминокислотами из эквивалентной позиции донорного антитела мыши, или из эквивалентных позиций более типичных человеческих иммуноглобулинов.
[00219] Иллюстративные гуманизированные антитела представляют собой гуманизированные формы мышиных антител 9D5 или 14G8, обозначенных соответственно Hu9D5 или Hul4G8. Антитело 9D5 мыши содержит вариабельные области зрелой тяжелой и легкой цепей, имеющие аминокислотные последовательности, включающие SEQ Ш NO: 1 и SEQ Ш NO: 16, соответственно. В изобретении предложены восемь иллюстративных вариабельных областей гуманизированной зрелой тяжелой цепи: Hu9D5VHvl, Hu9D5VHv2, Hu9D5VHv2b, Hu9D5VHv3, Hu9D5VHv3b, Hu9D5VHv4, Hu9D5VHv4b и Hu9D5VHv5 (SEQ Ш NOS: 5-12, соответственно). В изобретении дополнительно предложены пять иллюстративных вариабельных областей зрелой легкой цепи человека: Hu9D5VLvl,
Hu9D5VLv2, Hu9D5VLv3, Hu9D5VLv4 и Hu9D5VLv5 (SEQ Ш NOS: 19-23, соответственно). Фиг. 1 иллюстрирует выравнивания 9D5, модельных антител мыши, акцепторных антител человека и различных гуманизированных антител.
[00220] Антитело 14G8 мыши содержит вариабельные области тяжелой и легкой зрелых цепей, имеющие аминокислотные последовательности, включающие SEQ Ш N0: 61 и SEQ Ш N0: 70 соответственно. В изобретении предложены три иллюстративных вариабельных области гуманизированной зрелой тяжелой цепи: Hul4G8VHvl, Hul4G8VHv2 и Hul4G8VHv3 (SEQ Ш NO: 64-66, соответственно). В изобретении дополнительно предложены три иллюстративных вариабельных области зрелой легкой цепи человека: Hul4G8VLvl, Hul4G8VLv2 и Hul4G8VLv3 (SEQ Ш NO: 74-76, соответственно). Фиг. 2 иллюстрирует выравнивания 14G8, модельных антител мыши, акцепторных антител человека и различных гуманизированных антител.
[00221] По причинам, таким как: возможное влияние на конформацию CDR и/или связывание с антигеном, опосредование взаимодействия между тяжелыми и легкими цепями, взаимодействие с константной областью, является сайтом для желательной или нежелательной посттрансляционной модификации, является необычным остатком для своей позиции в последовательности вариабельной области человека и, следовательно, потенциально иммуногеннен, повышает потенциал к агрегированию, и другим причинам, следующие 15 позиций в каркасе вариабельной области были рассмотрены как кандидаты на замещения в восьми иллюстративных вариабельных областях зрелой тяжелой цепи Hu9D5, и в пяти иллюстративных вариабельных областях зрелой легкой цепи Hu9D5 как указано далее в примерах: Н42 (G42E), Н47 (W47L), Н69 (I69F), Н82 (M82S), H82b (S82(b)L), HI08 (T108L), L8 (Р8А), L9 (L9P), L18 (P18S), L19 (A19V), L36 (Y36F), L39 (K39R), L60 (D60S), L70 (D70A), и L74 (K74R). Аналогичным образом, следующие 11 позиций каркаса вариабельной области рассматривались как кандидаты на замену в трех иллюстративных вариабельных областях зрелой тяжелой цепи Hul4G8 и трех иллюстративных вариабельных областях зрелой легкой цепи Hul4G8, как дополнительно указано в примерах: HI (Q1E), НЗ (Q3K), Н47 (W47L), Н105 (Q105T), L8 (Р8А), L9 (L9P), L19 (A19V), L26 (N26S), L36 (Y36F), L60 (D60S) и L70 (D70A).
[00222] Здесь, как и в других местах, первый упомянутый остаток представляет собой остаток гуманизированного антитела, образованного путем вставки CDR по Кабату или
составного CDR по Чотия-Кабату в случае CDR-H1, в каркас акцептора человека (например, составной или гибридный каркас акцептора человека), а второй упомянутый остаток представляет собой остаток, который рассматривается как заменяющий такой остаток. Таким образом, в пределах каркасов вариабельной области, первый упомянутый остаток является человеческим, а в пределах CDR, первый упомянутый остаток является мышиным.
[00223] Иллюстративные антитела Hu9D5 включают любые перестановки или комбинации иллюстративных вариабельных областей тяжелой и легкой зрелых цепей (например, VHvl/VLvl или H1L1, VHvl/VLv2 или H1L2, VHvl/VLv3 или H1L3, VHvl/VLv4 или H1L4, VHvl/VLv5 или H1L5, VHv2/VLvl или H2L1, VHv2/VLv2 или H2L2, VHv2/VLv3 или H2L3, VHv2/VLv4 или H2L4, VHv2/VLv5 или H2L5, VHv2b/VLvl или Н2ЫЛ, VHv2b/VLv2 или H2bL2, VHv2b/VLv3 или H2bL3, VHv2b/VLv4 или H2bL4, VHv2b/VLv5 или H2bL5, VHv3/VLvl или H3L1, VHv3/VLv2 или H3L2, VHv3/VLv3 или H3L3, VHv3/VLv4 или H3L4, VHv3/VLv5 или H3L5, VHv3b/VLvl или НЗЬЫ, VHv3b/VLv2 или H3bL2, VHv3b/VLv3 или H3bL3, VHv3b/VLv4 или H3bL4, VHv3b/VLv5 или H3bL5, VHv4/VLvl или H4L1, VHv4/VLv2 или H4L2, VHv4/VLv3 или H4L3, VHv4/VLv4 или H4L4, VHv4/VLv5 или H4L5, VHv4b/VLvl или H4bLl, VHv4b/VLv2 или H4bL2, VHv4b/VLv3 или H4bL3, VHv4b/VLv4 или H4bL4, VHv4b/VLv5 или H4bL5, VHv5/VLvl или H5L1, VHv5/VLv2 или H5L2, VHv5/VLv3 или H5L3, VHv5/VLv4 или H5L4, и VHv5/VLv5 или H5L5).
[00224] В изобретении предложены варианты гуманизированных антител 9D5, в которых вариабельная область гуманизированной зрелой тяжелой цепи показывает по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с гуманизированной Hu9D5VHv4b (SEQ ID NO: 11), и вариабельная область гуманизированной зрелой легкой цепи показывает по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с Hu9D5VLvl (SEQ Ш NO: 19). В некоторых таких антителах сохраняются по меньшей мере 1, 2 или все 3 обратных мутаций или других мутаций в Hu9D5 H4bLl. В изобретении также предложены варианты других иллюстративных гуманизированных антител 9D5. Такие варианты имеют вариабельные области легкой и тяжелой зрелых цепей, показывающие по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательностей с вариабельными областями легкой и тяжелой зрелых цепей иллюстративных гуманизированных антител 9D5 H1L1, H1L2, H1L3, H1L4, H1L5, H2L1, H2L2, H2L3, H2L4, H2L5, H2bLl, H2bL2, H2bL3, H2bL4, H2bL5, H3L1, H3L2, H3L3, H3L4, H3L5, НЗЬЫ, Hb3L2, H3bL3, Hb3L4, H3bL5, H4L1,
H4L2, H4L3, H4L4, H4L5, H4bLl, H4bL2, H4bL3, H4bL4, H4bL5, H5L1, H5L2, H5L3, H5L4 или H5L5.
[00225] В некоторых антителах по меньшей мере одна из позиций Н42, Н47, Н69, Н82, Н82Ь и HI08 в области Vh занята Е, L, F, S, L и L, соответственно. В некоторых антителах позиции Н47, Н69 и Н82 в области Vh заняты соответственно L, F и S, как в Hu9D5VHvl. В некоторых антителах позиции Н47, Н69, Н82 и Н82Ь в области Vh заняты соответственно L, F, S и L, как в Hu9D5VHv2. В некоторых антителах позиции Н42, Н47 и HI08 в области Vh заняты Е, L и L соответственно, как в Hu9D5VHv2b. В некоторых антителах позиции Н69, Н82, и Н82Ь в области Vh заняты соответственно F, S и L, как в Hu9D5VHv3. В некоторых антителах позиции Н47 и HI08 в области Vh каждая занята L, как в Hu9D5VHv3b и Hu9D5Vhv4b. В некоторых антителах позиции Н82, и Н82Ь в области Vh заняты соответственно S и L, как в Hu9D5VHv4. В некоторых антителах позиции Н42, Н47 и Н82Ь в области Vh заняты Е, L и L соответственно, как в Hu9D5VHv5. В некоторых антителах по меньшей мере одна из позиций L8, L9, L18, L19, L36, L39, L60, L70 и L74 в области Vk занята А, Р, S, V, F, R, S, А, и R, соответственно. В некоторых антителах позиция L36 в области Vk занята F, как в Hu9D5VLvl. В некоторых антителах позиция L60 в области Vk занята S, как в Hu9D5VLv3. В некоторых антителах позиции L8, L9, L19, L36, L39, L60, L70 и L74 в области Vk заняты А, Р, V, F, R, S, А и R соответственно, как в Hu9D5VLv4. В некоторых антителах позиции L8, L9, L18, L19, L36, L39, L60, L70 и L74 в области Vk заняты А, Р, S, V, F, R, S, А и R соответственно, как в Hu9D5VLv5. Области CDR таких гуманизированных антител могут быть идентичными или почти полностью идентичными областям CDR мышиного донорного антитела 9D5 или любого из вышеуказанных гуманизированных антител 9D5. Области CDR могут быть определены согласно любому общепринятому соглашению (например, по Чотия, или составное по Чотия и Кабату), но предпочтительно, как определено по Кабату.
[00226] Каркасные позиции вариабельных областей соответствуют нумерации Kabat, если не указано иное. Другие такие варианты обычно отличаются от последовательностей иллюстративных тяжелой и легкой цепей Hu9D5 небольшим числом (например, обычно не более 1, 2, 3, 5, 10 или 15) замен, делеций или инсерций. Такие отличия обычно приходятся на каркас, но могут также встречаться в CDR.
[00227] Иллюстративные антитела Hul4G8 включают любые перестановки или комбинации иллюстративных вариабельных областей тяжелой и легкой зрелых цепей (например, VHvl/VLvl или H1L1, VHvl/VLv2 или H1L2, VHvl/VLv3 или H1L3, VHv2/VLvl или H2L1, VHv2/VLv2 или H2L2, VHv2/VLv3 или H2L3, VHv3/VLvl или H3L1, VHv3/VLv2 или H3L2, и VHv3/VLv3 или H3L3).
[00228] В изобретении предложены варианты гуманизированных антител 14G8, в которых вариабельная область гуманизированной зрелой тяжелой цепи показывает по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с Hul4G8VHv2 (Hul4G8 Н2) (SEQ Ш NO: 65), и вариабельная область гуманизированной зрелой легкой цепи показывает по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с Hul4G8VLv3 (Hul4G8 L3) (SEQ Ш NO: 76). В некоторых таких антителах сохраняются по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или все 5 обратных мутаций или других мутаций в Hul4G8 H2L3. В изобретении также предложены варианты других иллюстративных гуманизированных антител 14G8. Такие варианты имеют вариабельные области легкой и тяжелой зрелых цепей, показывающие по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательностей с вариабельными областями легкой и тяжелой зрелых цепей иллюстративных гуманизированных антител 14G8 H1L1, H1L2, H1L3, H2L1, H2L2, H2L3, H3L1, H3L2, или H3L3.
[00229] В некоторых антителах по меньшей мере одна из позиций HI, и Н47 в области Vh занята Е и L, соответственно. В некоторых антителах позиции HI и Н47 в области Vh заняты Е и L соответственно, как в Hul4G8VHv2 и Hul4G8VHv3. В некоторых антителах по меньшей мере одна из позиций НЗ и HI05 в области Vh занята соответственно К и Т. В некоторых антителах позиции НЗ и HI05 в области Vh заняты соответственно К и Т, как в Hul4G8VHvl. В некоторых антителах позиция L36 в области Vk занята F, как в Hul4G8VLv2. В некоторых антителах по меньшей мере одна из позиций L8, L9, L19, L26, L60 и L70 в области Vk занята соответственно А, Р, V, S, S и А. В некоторых антителах позиции L8, L9, L19 и L70 в области Vk заняты соответственно А, Р, V и А, как в Hul4G8VLvl. В некоторых антителах позиции L26 и L60 в области Vk заняты S, как в Hul4G8VLv3. Области CDR таких гуманизированных антител могут быть идентичными или почти полностью идентичными областям CDR мышиного донорного антитела 14G8. Области CDR могут быть определены согласно любому общепринятому соглашению (например, по Чотия, или составное по Чотия и Кабату), но предпочтительно, как определено по Кабату.
[00230] Каркасные позиции вариабельных областей соответствуют нумерации Kabat, если не указано иное. Другие такие варианты обычно отличаются от последовательностей иллюстративных тяжелой и легкой цепей Hul4G8 небольшим числом (например, обычно не более 1, 2, 3, 5, 10 или 15) замен, делеций или инсерций. Такие отличия обычно приходятся на каркас, но могут также встречаться в CDR.
[00231] Возможностью для дополнительных вариаций в гуманизированных вариантах 9D5 или 14G8 являются дополнительные обратные мутации в каркасах вариабельной области. Многие из остатков каркаса, не контактирующих с CDR в гуманизированном mAb, могут вмещать замены аминокислот из соответствующих позиций донорного mAb мыши, или других антител мыши или человека, и даже многие потенциальные контактные остатки в CDR также поддаются замене. Даже аминокислоты в CDR могут быть изменены, например, на остатки, обнаруженные в соответствующей позиции последовательности акцептора человека, используемой для предоставления каркасов вариабельной области. Кроме того, альтернативные последовательности акцептора человека могут быть использованы, например, для тяжелой и/или легкой цепей. Если применяются различные акцепторные последовательности, одна или несколько рекомендованных выше обратных мутаций могут не выполняться, поскольку соответствующие донорные и акцепторные остатки уже одинаковы без обратных мутаций.
[00232] Предпочтительно замены или обратные мутации в гуманизированных вариантах 9D5 или 14G8 (независимо от того, консервативны они или нет) не оказывают существенного влияния на аффинность связывания или активность гуманизированного mAb, то есть его способность связываться с мономерным TTR (например, активность в некоторых или всех анализах, описанных в настоящих примерах, варианта гуманизированного антитела 9D5 или 14G8, является по существу, такой же, то есть в пределах экспериментальной погрешности, как и у антитела 9D5 или 14G8 мыши).
D. Химерные и венированные антитела
[00233] В изобретении дополнительно предложены химерные и венированные формы нечеловеческих антител, в частности антитела примеров 9D5 или 14G8.
[00234] Химерное антитело представляет собой антитело, в котором вариабельные области легких и тяжелых зрелых цепей нечеловеческого антитела (например, мыши), объединены с константными областями легкой и тяжелой цепей человека. Такие антитела почти полностью
или полностью сохраняют специфичность связывания мышиного антитела, и составляют примерно две трети человеческой последовательности.
[00235] Венированное антитело является типом гуманизированного антитела, которое сохраняет некоторые и, как правило, все CDR, и некоторые остатки каркаса нечеловеческой вариабельной области нечеловеческого антитела, но в котором заменяют другие каркасные остатки вариабельной области, которые могут вносить вклад в В- или Т-клеточные эпитопы, например, экспонированные остатки (Padlan, Mol. Immunol. 28: 489, 1991) на остатки из соответствующих позиций последовательности человеческого антитела. Результатом является антитело, в котором CDR взяты полностью или почти полностью из нечеловеческого антитела, и каркасы вариабельной области нечеловеческого антитела делают более подобными таковым человека с помощью замен. Венированные формы антител 9D5 или 14G8 включены в изобретение.
Е. Антитела человека
[00236] Человеческие антитела к мономерному TTR или его фрагменту (например, аминокислотным остаткам 89-97 (SEQ Ш N0: 113) белка TTR) производят с помощью различных методов, описанных ниже. Некоторые антитела человека выбирают с помощью экспериментов по конкурентному связыванию, с помощью способа Винтера - фагового дисплея, описанного выше, или иным образом, что получить антитело с такой специфичностью к эпитопу, как и в конкретном антителе мыши, таком как одно из моноклональных антител мыши, описанные в примерах. Также для человеческих антител может быть проведен скрининг на специфичность к определенному эпитопу, используя только фрагмент TTR, такой как вариант TTR, содержащий только аминокислотные остатки 89-97 TTR, в качестве целевого антигена, и/или скрининг антител против набора вариантов TTR, таких как варианты TTR, содержащие различные мутации в аминокислотных остатках 89-97 TTR.
[00237] Способы получения человеческих антител включают: способ триомы Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, патент США № 4634664; и Engleman et al., патент США № 4634666, использование трансгенной мыши, содержащей гены иммуноглобулинов человека (см., например, Lonberg et al, W093/12227 (1993); US 5877397; US 5874299; US 5814318; US 5789650; US 5770429; US 5661016; US 5633425; US 5625126; US 5569825; US 5545806; Neuberger, Nat. Biotechnol. 14:826 (1996); и Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)) и
способы фагового дисплея {see, e.g., Dower et al, WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047; US 5877218; US 5871907; US 5858657; US 5837242; US 5733743; и US 5565332).
F. Выбор константной области
[00238] Вариабельные области тяжелой и легкой цепей химерных, венированных или гуманизированных антител могут быть соединены по меньшей мере с частью константной области антитела человека. Выбор константной области зависит от желаемого эффекта, будь то антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЗКЦ), антителозависимый клеточный фагоцитоз и/или зависимая от комплемента цитотоксичность. Например, изотипы IgGl и IgG3 человека могут вызывать зависимую от комплемента цитотоксичность, а изотипы IgG2 и IgG4 человека - нет могут. IgGl и IgG3 человека также индуцируют более сильные клеточно-опосредованные эффекторные функции, чем IgG2 и IgG4 человека. Константными областями легкой цепи могут быть лямбда или каппа.
[00239] Одна или несколько аминокислот на амино- или карбоксиконце легкой и/или тяжелой цепи, такая как С-концевой лизин тяжелой цепи, может отсутствовать или может образовать производное в пропорции, или быть во всех молекулах. Замены могут быть сконструированы в константных областях для снижения или усиления эффекторной функции, такой как комплемент-опосредованая цитотоксичность или АЗКЦ (см., например, Winter et al, патент США № 5624821, Tso et al, патент США № 5834597 и Lazar et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), или для увеличения периода полувыведения у человека (see, e.g., Hinton et al, J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). Типичные замены включают Gin в позиции 250 и/или Leu в позиции 428 (нумерация ЕС используется в этом параграфе для константной области) для увеличения периода полувыведения антитела. Замены в любой или во всех позициях 234, 235, 236 и/или 237 уменьшают сродство к рецепторам Fey, в частности рецептору FcyRI (см., например, US 6624821). Может быть использована аланиновая замена в позициях 234, 235 и 237 человеческого IgGl для снижения эффекторных функций. Некоторые антитела имеют замены на аланин в позициях 234, 235 и 237 IgGl человека для снижения эффекторных функций. Необязательно, аминокислоты в позициях 234, 236 и/или 237 в IgG2 человека заменены на аланин, а в позиции 235 - на глутамин (см., например, US 5624821). В некоторых антителах используется мутация в одной или нескольких позициях 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 и 331 по нумерации ЕС IgGl человека. В некоторых антителах используется мутация в одной или нескольких позициях 318, 320 и 322 по
нумерации ЕС IgGl человека. В некоторых антителах в позициях 234 и/или 235 аминокислота замещена аланином, и/или в позиции 329 замещена глицином. В некоторых антителах, в позициях 234 и 235 аминокислоты замещены на аланины, например, в SEQ Ш N0: 102. В некоторых антителах, изотипом является IgG2 или IgG4 человека.
[00240] Иллюстративная константная область каппа-легкой цепи человека имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш NO: 104. N-концевой аргинин SEQ Ш NO: 104 может быть опущен, и в этом случае константная область каппа-легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш NO: 105. Иллюстративная константная область тяжелой цепи IgGl человека имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш NO: 101 (с или без С-концевого лизина). Антитела могут быть экспрессированы в виде тетрамеров, содержащих две легкие и две тяжелые цепи, в виде отдельных тяжелых цепей, легких цепей, в виде Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, или в виде одноцепочечных антител, в которых зрелые вариабельные домены тяжелой и легкой цепей соединены через спейсер.
[00241] Константные области антитела человека показывают аллотипическую вариацию и изоалотипическую вариацию между различными индивидами, то есть константные области могут различаться у разных людей в одной или больше полиморфных позициях. Изоаллотипы отличаются от аллотипов тем, что сыворотки, распознающие изоаллотип, связываются с неполиморфной областью одного или нескольких других изотипов. Так, например, другая константная область тяжелой цепи относится к аллотипу Glm3 IgGl и имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш NO: 103. Другая константная область тяжелой цепи аллотипа Glm3 IgGl имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш NO: 102 (с или без С-концевого лизина). Отсылка к константной области антитела человека включает константную область с любым природным аллотипом или любой перестановкой остатков, занимающих позиции в природных аллотипах.
G. Экспрессиярекомбинантных антител
[00242] Известен ряд способов продуцирования химерных и гуманизированных антител с использованием клеточной линии, экспрессирующей антитела (например, гибридомы). Например, иммуноглобулиновые вариабельные области антител могут быть клонированы и секвенированы с использованием хорошо известных способов. В одном способе, вариабельную область VH тяжелой цепи клонируют с помощью RT-PCR, с использованием мРНК, полученной из клеток гибридомы. Консенсусные праймеры применяют к лидерному
пептиду VH-области, охватывая кодон инициации трансляции посредством 5-праймера, и константные области g2b посредством З'-праймера. Иллюстративные праймеры описаны в публикации патента США 2005/0009150 Шенком и соавторами (далее "Шенк"). Последовательности из нескольких независимо полученных клонов можно сравнить для того, чтобы гарантировать, что во время амплификации не будут внесены изменения. Последовательность области VH также может быть определена или подтверждена путем секвенирования фрагмента VH, полученного с помощью 5'-RACE RT-PCR-методики и 3'-g2b-специфического праймера.
[00243] Аналогичным образом можно клонировать вариабельную область VL легкой цепи. В одном подходе, набор консенсусных праймеров предназначен для амплификации областей VL используя 5'-праймер, предназначенный для гибридизации с областью VL, включающей кодон инициации трансляции, и З'-праймер, специфический к области Ск ниже от V-J объединяющей области. Во втором подходе, используется 5RACE RT-PCR методика для клонирования кодирующей кДНК VL. Иллюстративные праймеры описаны в Шенк, см. выше. Затем клонированные последовательности объединяют с последовательностями, кодирующими константные области человека (или других нечеловеческих видов). Иллюстративные последовательности, кодирующие константные области антитела человека, включают SEQ Ш NO: 106, которая кодирует константную область IgGl человека (SEQ Ш NO: 103) и SEQ Ш NO: 107 и 108, которые кодируют константные области каппа-легкой цепи человека (SEQ Ш NOS: 104 и 105 соответственно).
[00244] В одном из подходов, вариабельные области тяжелой и легкой цепей реконструируют для того, чтобы они кодировали соединённые донорные последовательности после соответствующих соединений VDJ или VJ, и клонируют в вектор для экспрессии в клетках млекопитающего, такой как pCMV-hyl для тяжелой цепи и pCMV-Mcl для легкой цепи. Эти векторы кодируют константные области yl и Ск человека как экзонные фрагменты после вставленной кассеты с вариабельной областью. После проверки последовательности, векторы экспрессии с тяжелой цепью и легкой цепью могут быть совместно трансфицированы в клетки СНО для того, чтобы продуцировать химерные антитела. Среду, частично использованную клетками, собирают через 48 часов после трансфекции и анализируют Вестерн-блот-анализом на продуцирование антител, или ELISA на связывание антигена. Химерные антитела гуманизированы, как описано выше.
[00245] Химерные, венированные, гуманизированные и человеческие антитела обычно продуцируются с помощью рекомбинантной экспрессии. Рекомбинантные полинуклеотидные конструкции обычно содержат последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с последовательностями, кодирующими цепи антитела, включая природные или гетерологичные элементы контроля экспрессии, такие как промотор. Последовательности контроля экспрессии могут быть промоторными системами в векторах, способных трансформировать или трансфицировать эукариотические или прокариотические клетки-хозяева. Как только вектор был внедрен в соответствующего хозяина, хозяина поддерживают в условиях, подходящих для экспрессии нуклеотидных последовательностей на высоком уровне, и сбора, и очистки перекрёстно-реактивных антител.
[00246] Эти векторы экспрессии обычно реплицируются в организмах-хозяевах или в виде эписом, или как неотъемлемая часть хромосомной ДНК хозяина. Обычно векторы экспрессии содержат маркеры селекции, например, резистентность к ампициллину или устойчивость к гигромицину для того, чтобы можно было обнаружить те клетки, что были трансформированы желаемыми последовательностями ДНК.
[00247] Е. coli представляет собой одного прокариотического хозяина, полезного для экспрессии антител, в частности фрагментов антител. Микробы, такие как дрожжи, также полезны для экспрессии. Saccharomyces представляет собой дрожжевого хозяина с подходящими векторами, имеющими последовательности контроля экспрессии, точку начала репликации, последовательности терминации транскрипции, и тому подобное по желанию. Типичные промоторы включают 3-фосфоглицераткиназу и другие гликолитические ферменты. Индуцируемые дрожжевые промоторы включают, среди прочего, промоторы из алкогольдегидрогеназы, изоцитохрома С и ферментов, ответственных за использование мальтозы и галактозы.
[00248] Клетки млекопитающих могут быть использованы для экспрессии нуклеотидных сегментов, кодирующих иммуноглобулины или их фрагменты. См. Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, Нью-Йорк, 1987). Был создан ряд подходящих линий клеток-хозяев, способных секретировать интактные гетерологичные белки, и они включают клеточные линии СНО, различные клеточные линии COS, клетки HeLa, клетки НЕК293, L-клетки и не продуцирующие антитела клетки миеломы, включая Sp2/0 и NS0. Клетки могут быть нечеловеческими. Экспрессирующие векторы для этих клеток могут содержать
последовательности контроля экспрессии, такие как точку начала репликации, промотор, энхансер (Queen et al, Immunol. Rev. 89:49 (1986)) и необходимые сайты обработки информации, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и терминирующие транскрипцию последовательности. Контролирующие экспрессию последовательности могут включать промоторы, полученные из: эндогенных генов, цитомегаловируса, SV40, аденовируса, бычьего папилломавируса и тому подобных. Смотрите Со et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).
[00249] Альтернативно, последовательности, кодирующие антитела, могут быть внесены в трансгены для введения в геном трансгенного животного и последующей экспрессии в молоке трансгенного животного (см., например, патент США № 5741957; США № 5304489; и США № 5849992). Подходящие трансгены содержат кодирующие последовательности легких и/или тяжелых цепей, функционально связанные с промотором и энхансером из специфического гена молочной железы, такого как казеин или бета-лактоглобулин.
[00250] Векторы, содержащие интересующие сегменты ДНК, могут быть перенесены в клетку-хозяина способами, зависящими от типа клеточного хозяина. Например, трансфекция с помощью хлорида кальция обычно используется для прокариотических клеток, тогда как обработка фосфатом кальция, электропорация, липофекция, биолистика или трансфекция на основе вирусов могут применятся к другим клеточным хозяевам. Другие способы, используемые для трансформации клеток млекопитающих, включают использование полибрена, слияние протопластов, липосомы, электропорацию и микроинъекцию. Для получения трансгенных животных, трансгены могут быть микроинъецированы в оплодотворенные ооциты или могут быть внесены в геном эмбриональных стволовых клеток, а ядра таких клеток перенесены в избавленные от ядра ооциты.
[00251] После введения вектора(-ов), кодирующего тяжелые и легкие цепи анитела, в культуру клеток, клеточные пулы можно проскринировать на рост продуктивности и качество продукта в бессывороточной среде. Ton-продуцирующие пулы клеток затем могут быть подвергнуты поклеточному клонированию на основе FACS для создания моноклональных линий. Могут использоваться специфические урожайности выше 50 пг или 100 пг на клетку в день, которые соответствуют титрам продукта более 7,5 г на л культуры. Антитела, продуцированые клонами одной клетки, также могут быть протестированы на мутность, фильтрационные свойства, проведены электрофорез в полиакриламидном геле
(ПААГ) (PAGE), изоэлектрическое фокусирование (IEF), УФ сканирование, HP-SEC, картирование углеводов-олигосахаридов, масс-спектрометрия и анализ связывания, такой как ELISA или Biacore. Выбранный клон затем может быть перенесен в несколько флаконов и сохранен в замороженном виде для последующего использования.
[00252] После экспрессии, антитела могут быть очищены в соответствии со стандартными процедурами в данной области техники, включая захват белком А, очистку ВЭЖХ, колоночную хроматографию, гель-электрофорез и тому подобное (см., в целом, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, Нью-Йорк, 1982)).
[00253] Может быть использована методика коммерческого производства антител, включая оптимизацию кодонов, подбор промоторов, выбор элементов транскрипции, выбор терминаторов, клонирование из одной клетки без сыворотки, создание стока клеток, использование маркеров отбора для амплификации количества копий, терминатора СНО, или улучшение титров белка (см., например, US 5786464, US 6114148, US 6063598, US 7569339, W02004/050884, W02008/012142, W02008/012142, W02005/019442, W02008/107388, W02009/027471 и US 5888809).
H. Скрининговые исследования антитела
[00254] Антитела могут подвергаться нескольким исследованиям, включая исследования связывания, исследования функциональности, исследования на животных моделях заболеваний, связанных с отложениями TTR, и клинические испытания. Исследования связывания тестируют специфическое связывание и, необязательно, аффинность и специфичность к эпитопу, с мономерным TTR или его фрагментом. Например, в анализах связывания могут подвергать скринингу антитела, которые связываются с аминокислотными остатками 89-97 (SEQ ID NO: 113) TTR, пердставляющими собой эпитоп, который погружен в нативном тетрамере TTR, и экспонирован в мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной формах TTR. Антитела также могут быть подвергнуты скринингу на способность связывать пре-фибриллярные, ненативные конформации TTR и амилоидные фибриллы TTR, но не нативные конформации TTR. Например, антитела могут быть подвергнуты скринингу на способность связываться с мономерными формами TTR, созданными путем диссоциации или дезагрегации нативного тетрамерного TTR, и могут быть в тоже время подвергнуты скринингу против нативного тетрамерного TTR, как описано в примерах, или иным образом. Аналогично, антитела также могут быть подвергнуты
скринингу на их иммунореактивность в отношении ткани, подверженной TTR-опосредованному амилоидозу, но не на здоровой ткани. Такие исследования иногда проводят вместе с конкурентным иллюстративным антителом, таким как антитело, имеющее вариабельные области 9D5 или 14G8 (изотип каппа IgGl). Необязательно, в таком анализе иммобилизуют или антитело, или TTR-мишень.
[00255] Исследования функциональности могут быть выполнены в клеточных моделях, включая клетки, естественно экспрессирующие TTR, или клетки трансфицированные ДНК, кодирующим TTR или его фрагмент. Подходящие клетки включают клетки, полученные из сердечной ткани или других тканей, пораженных TTR амилоидогенезом. Клетки могут быть подвергнуты скринингу на пониженные уровни мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR (например, путем Вестерн-блоттинга, или путем иммунопреципитации клеточных экстрактов или супернатантов) или на сниженную токсичность, приписываемую мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной формам TTR. Например, антитела могут быть протестированы на способность ингибировать или уменьшать агрегацию TTR, ингибировать или уменьшать образование фибрилл TTR, уменьшать отложение TTR, удалять агрегированный TTR или стабилизировать нетоксичные конформации TTR.
[00256] Могут быть выполнены в растворе другие функциональные анализы, такие как проверка того, способно ли антитело нарушать или уменьшать образование фибрилл TTR, когда мономерный TTR или промежуточные формы неправильно свернутого TTR в растворе контактируют с антителом. Степень образования фибрилл может быть исследована измерениями мутности, например, при 400 нм на спектрометре в УФ и видимой области спектра, оснащенном блоком управления температурой. Также может быть использован тиофлавин-Т для оценки степени формирования амилоидных фибрилл. Например, пятикратный молярный избыток тиофлавина-Т можно добавить к образцам TTR и оставить их при комнатной температуре на 30 минут перед проведением измерений. Флюоресценцию тиофлавина-Т можно наблюдать с помощью спектрофлуориметра. Смотрите US 2014/0056904.
[00257] Исследования с применением животных моделей тестируют способность антитела к терапевтическому или профилактическому лечению признаков или симптомов на животной модели, моделирующей болезнь человека, связанную с накоплением TTR или отложениями
TTR. К таким заболеваниям относятся типы TTR амилоидоза, такие как старческий системный амилоидоз (SSA - senile systemic amyloidosis), старческий сердечный амилоидоз (SCA - senile cardiac amyloidosis), семейная амилоидная полинейропатия (FAP - familial amyloid polyneuropathy), семейная амилоидная кардиомиопатия (FAC - familial amyloid cardiomyopathy) и селективный амилоидоз центральной нервной системы (CNSA - central nervous system selective amyloidosis). Подходящими признаками или симптомами, которые можно наблюдать, являются присутствие и количество амилоидных отложений в различных тканях, таких как желудочно-кишечный тракт или сердце. Степень снижения количества амилоидных отложений можно определить сравнением с соответствующим контролем, таким как уровень отложений TTR амилоидов у контрольных животных, которые получили контрольное антитело (например, контрольное антитело с подобранным изотипом), плацебо или вовсе не получали лечения. Иллюстративная животная модель для тестирования активности против TTR амилоидоза представляет собой мышиную модель, несущую нуль-мутацию в эндогенном локусе Ttr мыши и человеческий мутантный ген TTR, содержащий мутацию V30M, которая связана с семейной амилоидной полинейропатией. Смотрите, например, Kohno et al, Am. J. Path. 150(4): 1497-1508 (1997); Cardoso and Saraiva, FASEB J 20(2):234-239 (2006). Также существуют подобные модели, включающие другие модели семейных вариантов TTR амилоидоза и модели для спорадических вариантов TTR амилоидоза. См., например, Teng et al, Lab. Invest. 81(3): 385-396 (2001); Ito and Maeda, Mouse Models of Transthyretin Amyloidosis, in Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure, and Biological Functions, pp. 261-280 (2009) (Springer Berlin Heidelberg). Трансгенные животные могут содержать человеческий трансген TTR, такой как трансген TTR с мутацией, ассоциированной с TTR амилоидозом, или трансген TTR дикого типа. Чтобы облегчить тестирование на животных моделях, можно использовать химерные антитела, имеющие константную область, подходящую для животной модели (например, химерные антитела мыша-крыса можно использовать для тестирования антител на крысах). Можно сделать вывод, что гуманизированная версия антитела будет эффективной, если соответствующее антитело мыши или химерное антитело будет эффективным в соответствующей животной модели, и гуманизированное антитело имеет сходную аффинность связывания (например, в пределах экспериментальной ошибки, например, при коэффициенте 1,5, 2 или 3).
[00258] Клинические испытания исследуют безопасность и эффективность для человека, имеющего заболевание, связанное с TTR амилоидозом.
I. Нуклеиновые кислоты
[00259] В изобретении дополнительно предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие любую из тяжелых и легких цепей, описанных выше (например, SEQ Ю N0: 40, 42, 44-56, 87, 89, 91-96 и 106-108). Необязательно, такие нуклеиновые кислоты дополнительно кодируют сигнальный пептид и могут быть экспрессированы с сигнальным пептидом, соединенным с константной областью (например, сигнальные пептиды, имеющие аминокислотные последовательности SEQ Ш NO: 41 и 88 (тяжелая цепь) и SEQ Ш NO: 43 и 90 (легкая цепь), которые могут кодироваться соответственно SEQ Ш NOS: 40 и 87 (тяжелая цепь) и соответственно SEQ Ш NO: 42 и 89 (легкая цепь)). Кодирующие нуклеотидные последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями для обеспечения экспрессии кодирующих последовательностей, такими как промотор, энхансер, сайт связывания рибосом, сигнал терминации транскрипции и тому подобное. Нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелые и легкие цепи, могут быть в выделенной форме или могут быть клонированы в один или несколько векторов. Нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы, например, путем твердофазного синтеза или ПНР с перекрывающимися олигонуклеотидами. Нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелые и легкие цепи, могут быть соединены в виде одной сплошной нуклеиновой кислоты, например, внутри вектора экспрессии или могут быть раздельными, например, каждая клонирована в свой собственный вектор экспрессии.
J. Конъюгированные антитела
[00260] Конъюгированные антитела, специфически связывающиеся с антигенами, экспонироваными в патогенных формах TTR, но не в нативных тетрамерных формах TTR, такими как аминокислотные остатки 89-97 (SEQ Ш NO: 113) TTR, полезны для: обнаружения присутствия мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR; наблюдения и оценки эффективности терапевтических средств, используемых для лечения пациентов с диагнозом TTR амилоидоз; ингибирования или снижения агрегации TTR; ингибирования или уменьшения образования фибрилл TTR; уменьшения количества или удаления отложений TTR; стабилизации нетоксичных конформаций TTR; или лечения или осуществления профилактики TTR амилоидоза у пациента. Например, такие антитела могут быть конъюгированы с другими терапевтическими фрагментами, другими белками,
другими антителами и/или обнаруживаемыми метками. Смотрите WO 03/057838; US 8455622.
[00261] Конъюгированными терапевтическими фрагментами могут быть любые вещества, которые могут быть использованы для лечения, борьбы, улучшения, предотвращения или улучшения нежелательного состояния или течения заболевания у пациента, например, TTR амилоидоза. Терапевтические вещества могут включать, например, иммуномодуляторы или любые биологически активные вещества, которые стимулируют или усиливают активность антитела. Иммуномодулятором может быть любое вещество, которое стимулирует или ингибирует, развитие или поддержание иммунологического ответа. Если такие терапевтические фрагменты связаны с антителом, специфичным к мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной формам TTR, таким как описанные в данном документе антитела, то присоединённые терапевтические фрагменты будут иметь специфическую аффинность к чужеродным патогенным формам TTR по сравнению с нативными тетрамерными формами TTR. Следовательно, введение конъюгированных антител непосредственно воздействует на ткани, содержащие патогенные формы TTR, с минимальным повреждением окружающей нормальной здоровой ткани. Это может быть особенно полезно для терапевтических компонентов, которые слишком токсичны для введения самих по себе. Кроме того, можно использовать меньшее количество терапевтических веществ.
[00262] Примеры подходящих терапевтических фрагментов включают лекарственные средства, которые снижают уровни TTR, стабилизируют нативную тетрамерную структуру TTR, ингибируют агрегацию TTR, разрушают фибриллы TTR или мешают образованию амилоида, или противодействуют токсичности для клетки. Смотрите, например, Almeida and Saraiva, FEBS Letters 586:2891-2896 (2012); Saraiva, FEBS Letters 498:201-203 (2001); Ando et al, Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013); Ruberg and Berk, Circulation 126:1286-1300 (2012); и Johnson et al, J. Mol. Biol. 421(2-3): 185-203 (2012). Например, антитела могут быть конъюгированы с тафамидом, дифлуниазом, ALN-TTR01, ALNTTR02, ISIS-TTRRx, доксициклином (doxy), таурорсодезоксихолевой кислотой (TUDCA), Doxy-TUDCA, галлатом эпигаллокатехина (EGCG), куркумином или ресвератролом (3,5,4'-тригидроксистильбеном). Другие репрезентативные терапевтические фрагменты включают другие вещества, которые, как известно, полезны для лечения, контроля или улучшения TTR амилоидоза или симптомов TTR амилоидоза. См., например, Ando et al, Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013) для
общеизвестных клинических симптомов TTR амилоидоза и типичных веществ, используемых для лечения таких симптомов.
[00263] Антитела также могут быть соединены с другими белками. Например, антитела могут быть соединены с файномерами (Fynomers). Файномеры представляют собой небольшие связывающие белки (например, 7 кДа), полученные из человеческого домена Fyn SH3. Они могут быть стабильными и растворимыми, и они могут быть лишены цистеиновых остатков и дисульфидных связей. Файномеры могут быть сконструированы для связывания с молекулами-мишенями с той же аффинностью и специфичностью, что и антитела. Они подходят для создания мультиспецифических гибридных белков на основе антител. Например, файномеры могут быть слиты с N-концевыми и/или С-концевыми концами антител для создания би- и триспецифических файномерных антител (FynomAb) с различными структурами. Файномеры могут быть подобраны с использованием библиотек файномеров, с помощью технологии скрининга с применением FACS, Biacore и клеточных анализов, которые позволяют эффективно выбирать файномеры с оптимальными свойствами. Примеры файномеров описаны в Grabulovski et al, J. Biol. Chem. 282:3196-3204 (2007); Bertschinger et al, Protein Eng. Des. Sel. 20:57-68 (2007); Schlatter et al, MAbs. 4:497-508 (2011); Banner etal, Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69(Pt6): 1124-1137 (2013); и Brack et al,Mol Cancer Ther. 13:2030-2039(2014).
[00264] Указанные в данном документе антитела также могут быть связаны или конъюгированы с одним или несколькими другими антителами (например, для образования гетероконъюгатов антител). Такие другие антитела могут связываться с различными эпитопами в пределах TTR или его части, или могут связываться с другим целевым антигеном.
[00265] Антитела также могут быть соединены с детектируемой меткой. Такие антитела могут быть использованы, например, для диагностики TTR амилоидоза, для мониторинга прогрессирования TTR амилоидоза и/или для оценки эффективности лечения. Такие антитела особенно полезны для выполнения таких определений у субъектов, которые подвержены или могут быть подвержены TTR амилоидозу, или в соответствующих биологических образцах, полученных от таких субъектов. Типичные обнаруживаемые метки, которые могут быть присоединены или прицеплены к антителу, включают: различные ферменты, такие как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или ацетилхолинэстераза;
протезные группы, такие как стрептавидин/биотин и авидин/биотин; флуоресцентные материалы, такие как зонтиллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; люминесцентные материалы, такие как люминол; биолюминесцентные материалы, такие как люцифераза, люциферин и аэкорин; радиоактивные материалы, такие как иттрий90 (90Y), радиосеребро-111, радиосеребро-199, висмут213, йод (1311, 1251, 1231, 1211,), углерод (14С), сера (5S), тритий (3Н),
~ /115т 113т 112т 111т ч - /99гг. ч ~ ЛО^-ч ~ ^68^ 67^ ч
индии ( In, In, In, In,), технеции ( 1c), таллии ( li), галлии ( Ста, Ста), палладии (103Pd), молибден ("Мо), ксенон (133Хе), фтор (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn,
75 113 117
Se, Sn, и Tin; позитрон-излучающие металлы с использованием различных позитронно-эмиссионных томографий; нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов; и молекулы, которые радиоактивно мечены или конъюгированы с определенными радиоизотопами.
[00266] Связывание радиоизотопов с антителами может быть выполнено с использованием обычных бифункциональных хелатов. Для присоединения радиосеребра-111 и радиосеребра-199 можно использовать линкеры на основе серы. Смотрите Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:17 (1994). Присоединение радиоизотопов серебра может включать восстановление иммуноглобулина с помощью аскорбиновой кислоты. Для радиоизотопов, таких как lllln и 90Y, можно использовать иритримомаб-тиуксетан, и оно будет реагировать с такими изотопами с образованием lllln-иритримомаб-тиуксетана и 90У-иритримомаб-тиуксетана, соответственно. Смотрите Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1:S91-S95 (2001).
[00267] Терапевтические фрагменты, другие белки, другие антитела и/или детектируемые метки могут быть соединены или конъюгированы, прямо или косвенно через посредника (например, линкер), с антителом по данному изобретению. Смотрите, например, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985); и Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982). Подходящие линкеры включают, например,
отщепляемые и неотщепляемые линкеры. Можно применять различные линкеры, которые высвобождают присоединенные терапевтические фрагменты, белки, антитела и/или детектируемые метки в кислотных или восстановительных условиях, при воздействии специфических протеаз или в других определенных условиях.
V. Терапевтические применения
[00268] Вышеуказанные антитела могут быть использованы для лечения или осуществления профилактики заболевания у пациента, имеющего или подверженного риску заболевания, опосредованного, по меньшей мере частично, транстиретином (TTR) и, в частности, мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной формами TTR. Хотя понимание механизмов не требуется для практики, считается, что любой или все из следующих механизмов могут способствовать лечению TTR амилоидоза с использованием вышеуказанных антител: опосредованное антителом ингибирование агрегации и образования фибрилл TTR, опосредованная антителом стабилизация нетоксичных конформаций TTR (например, тетрамерных форм), или опосредованный антителом клиренс агрегированного TTR, олигомерного TTR или мономерного TTR. Антитело-лекарственные конъюгаты могут иметь дополнительные механизмы действия, обусловленные конъюгированным фрагментом.
[00269] Антитела вводят эффективной схемой, что обозначает дозировку, способ введения и частоту введения, которая задерживает начало проявления симптомов, уменьшает тяжесть заболевания, замедляет дальнейшее ухудшение и/или улучшает по меньшей мере один признак или симптом расстройства, что подвергается лечению. Если пациент уже страдает от расстройства, схему можно обозначить как терапевтически эффективная схема. Если пациент подвергается повышенному риску заболевания по сравнению с общей популяцией, но еще не испытывает симптомов, схему можно назвать профилактически эффективной схемой. В некоторых случаях можно наблюдать терапевтическую или профилактическую эффективность у отдельного пациента по сравнению с историческими контролями или прошлым опытом у того же пациента. В других случаях терапевтическая или профилактическая эффективность может быть продемонстрирована в доклиническом или клиническом исследовании на популяции пациентов, получавших лечение, по сравнению с контрольной популяцией необработанных пациентов.
[00270] Частота введения зависит от периода полувыведения антитела из кровообращения, состояния пациента и пути введения среди прочих факторов. Частота может быть
ежедневной, еженедельной, ежемесячной, ежеквартальной или с нерегулярными интервалами в ответ на изменения состояния пациента или прогрессирования расстройства, которое лечится. Иллюстративная частота внутривенного введения находится между еженедельной и ежеквартальной при непрерывном курсе лечения, хотя также возможно более или менее частое дозирование. Для подкожного введения иллюстративная частота дозирования составляет от ежедневной до ежемесячной, хотя возможно более или менее частое дозирование.
[00271] Количество вводимых доз зависит от того, является ли заболевание острым или хроническим, а также от ответа расстройства на лечение. При острых расстройствах или острых обострениях хронического расстройства часто бывает достаточно от 1 до 10 доз. Иногда одной болюсной дозы, необязательно в виде разделенной дозы, достаточно для острого расстройства или острого обострения хронического расстройства. Лечение может повторяться для рецидивов острого расстройства или острого обострения. При хронических заболеваниях антитело можно вводить через регулярные промежутки времени, например, еженедельно, раз в две недели, ежемесячно, ежеквартально, каждые шесть месяцев в течение по меньшей мере 1, 5 или 10 лет, или в течение жизни пациента.
VI. Фармацевтические композиции и способы их применения
[00272] В данном документе приведены несколько способов диагностики, мониторинга, лечения или осуществления профилактики заболеваний или состояний, опосредованных, по меньшей мере частично, транстиретином (TTR) и, в частности, мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной формами TTR (например, TTR амилоидоз). Примеры таких заболеваний включают наследственные TTR амилоидозы, такие как наследственная амилоидная кардиомиопатия (FAC), наследственная амилоидная полинейропатия (FAP), или селективный амилоидоз центральной нервной системы (CNSA), и спорадические амилоидозы TTR, такие как старческий системный амилоидоз (SSA) или старческий сердечный амилоидоз (SCA). Антитела, описанные выше, могут быть включены в фармацевтическую композицию для использования в таких способах. В целом, как правило, антитело или фармацевтическую композицию, содержащую антитело, вводят субъекту, нуждающемуся в этом. Пациенты, поддающиеся лечению, включают индивидов с риском TTR амилоидоза, но не проявляющих симптомов, а также пациентов, которые в настоящее
время проявляют симптомы. Некоторых пациентов можно лечить во время продромальной стадии TTR амилоидоза.
[00273] Фармацевтические композиции можно вводить профилактически лицам, имеющим известный генетический риск TTR амилоидоза. К таким лицам относятся те, у кого есть родственники, которые подверглись такому заболеванию, и те, чей риск определяется анализом генетических или биохимических маркеров (например, мутаций в TTR, связанных с TTR амилоидозом), включая использование диагностических способов, представленных в данном документе. Например, в гене, кодирующем TTR, более 100 мутаций, которые вовлечены в TTR амилоидоз. Смотрите, например, US 2014/0056904; Saraiva, Hum. Mutat. 17(6):493-503 (2001); Damas and Saraiva, J. Struct. Biol. 130:290-299; Dwulet and Benson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 114:657-662 (1983).
[00274] Индивиды, страдающие от TTR амилоидоза могут иногда быть распознаны по клиническим проявлениям TTR амилоидоза, включая одно или несколько из следующих: 1) семейный анамнез нейропатического заболевания, особенно связанного с сердечной недостаточностью; 2) невропатическая боль или прогрессирующие сенсорные нарушения неизвестной этиологии; 3) синдром кистевого туннеля без очевидной причины, особенно если он двусторонний и требует хирургического устранения; 4) нарушения моторики желудочно-кишечного тракта или дисфункция автономной нервной системы неизвестной этиологии (например, эректильная дисфункция, ортостатическая гипотензия, нейрогенный мочевой пузырь); 5) сердечная болезнь, характеризующаяся утолщенными стенками желудочков в отсутствие гипертонии; 6) расширенный по неизвестным причинам атрио-вентрикуляный блок, особенно когда он сопровождается утолщенным сердцем; и 6) включения в стекловидном теле по типу ваты. Смотрите Ando et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Окончательный диагноз TTR амилоидоза обычно основывается на биопсии органов-мишеней с последующим гистологическим окрашиванием вырезанной ткани с помощью специфического к амилоиду красителя Congo red. Если наблюдается положительный результат на амилоид, впоследствии проводится иммуногистохимическое окрашивание для TTR, чтобы гарантировать, что белок-предшественник, ответственный за образование амилоида, действительно является TTR. Для наследственных форм заболеваний, необходимо продемонстрировать мутацию в гене, кодирующем TTR, до постановки окончательного диагноза.
[00275] Идентификация субъекта может происходить в клинической обстановке или в другом месте, таком как дом субъекта, например, посредством использования субъектом собственного набора для самопроверки. Например, субъект может быть идентифицирован на основе различных симптомов, таких как периферическая невропатия (сенсорная и моторная), вегетативная нейропатия, желудочно-кишечные нарушения, кардиомиопатия, нефропатия или отложения в глазах. Смотрите Ando et al, Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31 (2013). Субъект также может быть идентифицирован по повышенным уровням ненативных форм TTR в образцах плазмы, полученных от субъекта, по сравнению с контрольными образцами, как описано в примерах.
[00276] В соответствии с семейной историей, генетическим тестированием или медицинским скринингом на TTR амилоидоз, лечение может быть начато в любом возрасте (например, 20, 30, 40, 50, 60 или 70 лет). Лечение обычно влечет за собой многократное дозирование в течение определенного периода времени и может контролироваться путем анализа антител или активированных ответов Т-клеток или В-клеток на терапевтическое вещество (например, усеченную форму TTR, содержащую аминокислотные остатки 89-97) со временем. Если ответ снижается, требуется усиливающая его доза.
[00277] В профилактических применениях антитело или его фармацевтическую композицию вводят субъекту, восприимчивому к заболеванию или подверженному риску заболевания (например, TTR амилоидозу), схемой (доза, частота и способ введения), эффективной для того, чтобы уменьшить риск, снизить тяжесть или задержать начало проявления по крайней мере одного признака или симптома заболевания. В терапевтических применениях антитело, или иммуноген для индукции антитела, вводят субъекту, который подозревается в наличии болезни или уже страдает от болезни (например, TTR амилоидоза), схемой (доза, частота и способ введения), эффективной чтобы улучшить или по меньшей мере воспрепятствовать дальнейшему ухудшению по меньшей мере одного признака или симптома заболевания.
[00278] Схема считается терапевтически или профилактически эффективной, если отдельный субъект, прошедший лечение, достигает более благоприятного исхода, чем средний исход в контрольной популяции сопоставимых субъектов, не прошедших лечение описанными в данном документе способами, или если демонстрируется более благоприятный исход для схемы у прошедших лечение субъектов по сравнению с контрольными субъектами
в контролируемом клиническом исследовании (например, фаза II, фаза II/III или фазы III исследования), или на животной модели на уровне р <0,05 или 0,01 или даже 0,001.
[00279] Эффективная схема лечения антителом может быть использована, например, для: ингибирования или уменьшения агрегации TTR у субъекта, имеющего или подверженого риску приобретения состояния, связанного с накоплением TTR; ингибирования или уменьшения образования фибрилл TTR у субъекта, имеющего или подверженого риску приобретения состояния, связанного с накоплением TTR; уменьшения количества или удаления отложений TTR, или агрегированного TTR у субъекта, имеющего или подверженого риску приобретения состояния, связанного с накоплением TTR; стабилизации нетоксичных конформаций TTR у субъекта, имеющего или подверженого риску приобретения состояния, связанного с накоплением TTR; ингибирования токсических эффектов агрегатов, фибрилл или отложений TTR у субъекта, имеющего или подверженого риску приобретения состояния, связанного с накоплением TTR; диагностирования наличия или отсутствия накопления TTR амилоидов в ткани, предположительно содержащей накопление амилоида; определения количества отложений TTR у субъекта путем обнаружения наличия связанного антитела у субъекта после введения антитела; обнаружения присутствия мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR у субъекта; мониторинга и оценки эффективности терапевтических средств, используемых для лечения пациентов с диагнозом TTR амилоидоз; индуцирования иммунного ответа, включающего антитела к TTR у субъекта; задержки начала состояния, связанного с накоплением TTR амилоида у субъекта; или лечения, или осуществления профилактики TTR амилоидоза у пациента.
[00280] Эффективные дозы варьируют в зависимости от многих различных факторов, таких как способ введения, целевая локализация, физиологическое состояние субъекта, независимо от того, является ли субъект человеком или животным, других вводимых лекарств и является ли лечение профилактическим или терапевтическим.
[00281] Иллюстративный диапазон доз для антител может составлять около 0,1-20, или 0,55 мг/кг массы тела (например, 0,5, 1, 2, 3, 4 или 5 мг/кг) или 10-1500 мг в виде фиксированной дозы. Дозирование зависит от состояния пациента и реакции на предшествующий курс лечения, если таковой имеется, является ли лечение профилактическим или терапевтическим и является ли заболевание острым или хроническим, среди прочих факторов.
[00282] Антитело можно вводить в таких дозах ежедневно, в чередующиеся дни, еженедельно, раз в две недели, ежемесячно, ежеквартально или в соответствии с любым другим графиком, определяемым эмпирическим анализом. Иллюстративное лечение влечет за собой введение несколькими дозами в течение длительного периода, например по меньшей мере в течение шести месяцев. Дополнительные иллюстративные схемы лечения сопряжены с введением один раз в две недели или один раз в месяц или один раз каждые 3-6 месяцев.
[00283] Антитела могут вводиться через периферический путь. Пути введения включают местный, внутривенный, оральный, подкожный, внутриартериальный, внутричерепный, интратекальный, внутрибрюшинный, интраназальный или внутримышечный. Пути для введения антител могут быть внутривенными или подкожными. Внутривенное введение может быть реализовано, например, путем инфузии в течение периода, такого как 30-90 мин. Этот тип инъекций чаще всего выполняется в мышцы рук или ног. В некоторых способах вещества вводят непосредственно в определенную ткань, где накапливаются отложения, например, путем внутричерепной инъекции.
[00284] Фармацевтические композиции для парентерального введения могут быть стерильными и, по существу, изотоническими (250-350 мОсм/кг воды) и изготавливаться в условиях GMP (надлежащей производственной практики). Фармацевтические композиции могут быть представлены в виде единичной дозированной формы (то есть дозе для одного введения). Фармацевтические композиции могут быть составлены с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, разбавителей, эксципиентов или вспомогательных веществ. Состав зависит от выбранного пути введения. Для инъекций, антитела могут быть приготовлены в виде водных растворов, например, в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера, или физиологическом солевом растворе, или ацетатном буфере (чтобы уменьшить дискомфорт в месте инъекции). Раствор может содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества. Альтернативно, антитела могут быть в лиофилизированной форме для разбавления перед использованием подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой.
[00285] Схемы введения могут быть скомбинированы со схемами приема других средств, эффективных при лечении или профилактике заболевания, подлежащего лечению. Такие
вещества могут включать siRNA для ингибирования экспрессии TTR, или Vyndaqel, стабилизатора TTR в тетрамерной форме.
[00286] После лечения, состояние субъекта может быть оценено для определения прогресса или эффективности такого лечения. Такие способы предпочтительно проверяют изменение количества TTR амилоида или количества ненативных форм TTR. Например, количества TTR амилоида могут быть оценены для определения улучшения по сравнению с количествами TTR амилоида у субъекта при сравнимых обстоятельствах до лечения. Количества TTR амилоида субъекта также могут сравниваться с контрольными популяциями в сопоставимых условиях. Контрольные популяции могут состоять из одинаково пораженных, не подвергавшихся лечению субъектов или обычных, не подвергавшихся лечению субъектов (среди других контрольных субъектов). Улучшение по сравнению с одинаково пораженными, не подвергавшимся лечению субъектами, или уровнями, достигающими или приближающимися к таковым у обычных, не подвергавшихся лечению субъектов, указывает на положительный ответ на лечение.
[00287] Количества TTR амилоида могут быть измерены с помощью ряда способов, включая методы визуализации. Примеры подходящих методов визуализации включают ПЭТ-сканирование с помощью радиоактивно меченого TTR или его фрагментов, антител к TTR или их фрагментов, визуализирующих амилоид основанных на красителе Congo-red веществах, таких как, например, РГВ (US 2011/0008255), амилоид-визуализирующий пептид рЗ 1 (биораспределение амилоид-визуализирующего пептида р31, коррелирует с количественной оценкой амилоида на основе окрашивания ткани Congo-red, Wall et al, Abstract No. 1573, 2011 ISNM Annual Meeting) и других меток ПЭТ. Уровни ненативных форм TTR могут быть измерены, например, путем анализа ДСН-ПААГ-электрофореза/Вестерн-блоттинг или плашковым анализом Meso Scale Discovery с антителами, описанными в данном документе, на образцах плазмы или образцах биопсии из субъекта, при сравнении с контрольными образцами, как описано в примерах.
А. Способы диагностики и мониторинга
[00288] Также предложены способы обнаружения иммунного ответа против TTR у пациента, страдающего или подверженного заболеваниям, связанным с отложениями TTR или патогенными формами TTR (например, мономерными, неправильно свернутыми, агрегированными или фибрильными формами TTR). Способы могут использоваться для
контроля курса терапевтического и профилактического лечения с помощью предлагаемых здесь веществ. Профиль антител после пассивной иммунизации обычно показывает непосредственный пик концентрации антител с последующим экспоненциальным разрушением. Без дополнительной дозы распад приближается к предшествующим лечению уровням в период от нескольких дней до нескольких месяцев в зависимости от периода полувыведения вводимого антитела. Например, период полувыведения некоторых антител человека составляет порядка 20 дней.
[00289] В некоторых способах перед введением проводят измерение исходного уровня антитела к TTR у субъекта, вскоре после этого проводится второе измерение для определения пикового уровня антитела, и проводят одно или несколько дополнительных измерений с интервалами, для мониторинга уменьшения количества антител. Когда уровень антитела снизился до исходного уровня или заданного процента от пика меньше базового уровня (например, 50%, 25% или 10%), предписывают введение дополнительной дозы антитела. В некоторых способах, пиковые уровни или измеренные после них уровни меньше базового, сравнивают с эталонными уровнями, определенными до этого, чтобы составить целесообразную профилактическую или терапевтическую схему лечения для других пациентов. Если измеренный уровень антител значительно меньше эталонного уровня (например, меньше среднего минус одно или, предпочтительно, два стандартных отклонения эталонного значения в популяции субъектов, получающих пользу от лечения), предписывают введение дополнительной дозы антитела.
[00290] Также предложены способы обнаружения мономерной, неправильно свернутой, агрегированной, или фибрильной форм TTR у субъекта, например, путем измерения TTR амилоида или патогенных форм TTR (например, мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR). Такие способы полезны для диагностики или подтверждения диагноза заболеваний, связанных с такими патогенными формами TTR (например, TTR амилоидоза) или восприимчивостью к ним. Также могут быть использованы способы для бессимптомных субъектов. Наличие мономерных, неправильно свернутых, агрегированных или фибрильных форм TTR указывает на восприимчивость к будущему симптоматическому заболеванию. Эти способы также полезны для наблюдения за прогрессированием заболевания и/или ответом на лечение у пациентов, которым ранее был диагностирован TTR амилоидоз.
[00291] Биологические образцы, полученные от субъекта, подозреваемого в наличии или находящимся под риском наличия TTR амилоидоза, могут быть приведенными в контакт с антителами, раскрытыми в данном документе, для оценки присутствия мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR. Например, уровни мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR у таких субъектов можно сравнить с уровнями, характерными для здоровых людей. Альтернативно, уровни TTR амилоида или патогенных форм TTR (например, мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR) у таких субъектов, получающих лечение по заболеванию, можно сравнить с таковыми пациентов, которые не лечились от TTR амилоидоза. Некоторые такие тесты включают биопсию ткани, полученную от таких субъектов. Анализы ELISA также могут быть полезными способами, например, для оценки уровней мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR в образцах жидкости. Некоторые такие анализы ELISA включают применение антител против TTR, предпочтительно связывающих мономерную, неправильно свернутую, агрегированную или фибрильную формы TTR относительно нормальных тетрамерных форм TTR.
[00292] Способы визуализации in vivo могут работать путем введения реагента, такого как антитело, которое связывается с мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной формами TTR в субъекте, а затем обнаружения реагента после того, как он связался. Такие антитела обычно связываются с эпитопом в пределах остатков 89-97 TTR. При желании, реакции устранения можно избежать с использованием фрагментов антител, не имеющих полноразмерной константной области, таких как Fabs. В некоторых способах, одно и то же антитело может служить как лечебным, так и диагностическим реагентом.
[00293] Диагностические реагенты могут быть введены в организм субъекта путем внутривенной инъекцией, или другими путями, которые считаются разумными. Доза реагента должна быть в тех же пределах, что и для способов лечения. Как правило, реагент метят, хотя в некоторых способах первичный реагент с аффинностью к мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной формам TTR является немеченым, а вторичный меченный реагент используется для связывания с первичным реагентом. Выбор метки зависит от способа обнаружения. Например, флуоресцентная метка подходит для оптического обнаружения. Использование парамагнитных меток подходит для томографического обнаружения без хирургического вмешательства. Радиоактивные метки
также могут быть обнаружены с использованием ПЭТ или ОФЭКТ (однофотонной эмиссионной компьютерной томографии).
[00294] Диагностика выполняется путем сравнения количества, размера и/или интенсивности помеченных локусов с соответствующими значениями базовой линии. Значения базовой линии могут представлять собой средние уровни в популяции неподверженных заболеванию индивидов. Значения базовой линии также могут представлять предыдущие уровни, определенные в одном и том же субъекте. Например, значения базовой линии могут быть определены у субъекта до начала лечения, а затем измеренные значения сравнивают с значениями базовой линии. Снижение значений относительно базовой линии обычно сигнализирует о положительном ответе на лечение.
IX. Наборы
[00295] В изобретении дополнительно предложены наборы (например, контейнеры), содержащие антитело, раскрытое в данном документе, и связанные с ним материалы, такие как инструкции для использования (например, вкладыш в упаковке). Инструкции по применению могут содержать, например, инструкции для введения антитела, и, необязательно, одно или несколько дополнительных веществ. Контейнеры с антителом могут быть в форме одиночных доз, многоразовых упаковок (например, упаковок с несколькими дозами) или суб-единичных доз.
[00296] Вкладыш упаковки относится к инструкциям, обычно включаемым в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, использовании, дозировке, назначении, противопоказаниях и/или предупреждениях относительно использования таких терапевтических продуктов.
[00297] Наборы могут также содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI - bacteriostatic water for injection), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он также может содержать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точек зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
[00298] Антитела могут быть использованы для обнаружения мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм транстиретина (TTR) или их фрагментов в контексте клинической диагностики или лечения, или в исследованиях. Например, антитела могут быть использованы для обнаружения присутствия мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR в биологическом образце в качестве индикатора того, что биологический образец содержит отложения TTR амилоида. Связывание антител с биологическим образцом можно сравнить со связыванием антител с контрольным образцом. Контрольный образец и биологический образец могут содержать клетки того же самого тканевого происхождения. Контрольные образцы и биологические образцы могут быть получены от тех же или разных лиц, и в том же отборе проб или в разных отборах проб. При желании множество биологических образцов и множество контрольных образцов оценивают при многочисленных отборах проб, чтобы избежать случайного отклонения, независимого от различий между образцами. Затем может быть проведено прямое сравнение между биологическим образцом(-ами) и контрольным образцом (-ами), чтобы определить, увеличивается ли, уменьшается ли, или остается таким же связывание антитела (т. е. присутствие мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR) с биологическим образцом(-ами) относительно связывания антитела с контрольным образцом(-ами). Повышенное связывания антитела с биологическим образцом(-ами) по сравнению с контрольным образцом(-ами) указывает на присутствие мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR в биологическом образце(-ах). В некоторых случаях повышенное связывания антитела является статистически значимым. Необязательно, связывание антитела с биологическим образцом является по меньшей мере в 1,5 раза, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 20 раз или в 100 раз более сильным, чем связывание антитела с контрольным образцом.
[00299] Кроме того, антитела могут быть использованы для обнаружения присутствия мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR в биологическом образце для наблюдения и оценки эффективности лекарственного средства, что применяется для лечения пациента с диагностированным TTR амилоидозом. Оценивают биологический образец от пациента с диагнозом TTR амилоидоз, чтобы установить исходный уровень связывания антител с образцом (т. е. исходный уровень наличия мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR в образце) перед
началом терапии лекарственным препаратом. В некоторых случаях, множество биологических образцов от пациента оцениваются при множестве отборов проб, чтобы установить как исходное значение, так и меру случайного отклонения, не зависящего от лечения. Затем лекарственный препарат вводят согласно схеме приема лекарства. Схема может включать множество введений вещества в течение определенного периода времени. Необязательно, связывание антител (т. е. наличие мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR) оценивается при множественном отборе проб по множеству биологических образцов из пациента, как для определения меры случайного отклонения, так и для демонстрации тенденции в ответ на иммунотерапию. Затем сравнивают различные оценки связывания антитела с биологическими образцами. Если будут сделаны только два оценивания, можно провести прямое сравнение между двумя оцениваниями, чтобы определить, увеличилось ли, уменьшилось ли или оставалось неизменным связывание антитела между двумя оцениваниями (т.е. наличие мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR). Если проведено более двух измерений, измерения могут быть проанализированы как временной курс, начинающийся до лечения лекарственным препаратом, и длящийся все время терапии. Для пациентов, у которых уменьшилось связывание антител с биологическими образцами (т. е. наличие мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR), можно сделать вывод, что лекарственный препарат был эффективным при лечении TTR амилоидоза у пациента. Снижение связывания антител может быть статистически значимым. Необязательно, связывание уменьшается по меньшей мере на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 % или 100%. Оценка связывания антитела может быть проведена в сочетании с оценкой других признаков и симптомов TTR амилоидоза.
[00300] Антитела также могут быть использованы в качестве исследовательских реагентов для лабораторных исследований, для обнаружения мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR или их фрагментов. В таких применениях антитела могут быть помечены флуоресцентными молекулами, спин-мечеными молекулами, ферментами или радиоизотопами, и могут быть предоставлены в виде набора со всеми необходимыми реагентами для проведения детектирующего анализа. Антитела также могут быть использованы для очистки мономерной, неправильно свернутой, агрегированной или фибрильной форм TTR, или партнеров по связыванию мономерной, неправильно свернутой,
агрегированной или фибрильной форм TTR, например, с помощью аффинной хроматографии.
[00301] Антитела также могут быть использованы для ингибирования или уменьшения агрегации TTR, ингибирования или уменьшения формирования фибрилл TTR, уменьшения или устранения отложений TTR или агрегатов TTR, или стабилизации нетоксичных конформаций TTR в биологическом образце. Биологический образец может содержать, например, кровь, сыворотку, плазму или ткань (например, ткань из сердца, периферической нервной системы, вегетативной нервной системы, почки, глаза или желудочно-кишечного тракта). В некоторых случаях агрегация TTR, образование фибрилл TTR, или отложения TTR ограничиваются или снижаются по меньшей мере на 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или 75% (например, 10%-75 % или 30% -70%). Анализы для обнаружения образования фибрилл описаны в другом месте в данном документе. См. также US 2014/0056904.
[00302] Все патентные заявки, веб-сайты, другие публикации, идентификационные номера и тому подобное, упомянутые выше или ниже, включены посредством ссылки в полном объеме для всех целей в той же степени, как если бы каждый отдельный элемент был специально и индивидуально указан, чтобы быть включенным посредством ссылки. Если в разное время с идентификационным номером ассоциированы разные варианты последовательности, то под этим идентификационным номером подразумевается вариант, ассоциированный с ним на момент действительной даты подачи настоящей заявки. Действительная дата подачи означат наиболее раннюю действительную дату подачи или дату подачи приоритетной заявки со ссылкой на идентификационный номер при необходимости. Подобным образом, если разные варианты публикации, веб-сайта и тому подобного опубликованы в разное время, подразумевается вариант, опубликованный раньше всего на действительную дату подачи, если не указано иное. Любое свойство, этап, элемент, вариант осуществления изобретения, или аспект изобретения могут использоваться в сочетании с любым другим, если специально не указано иное. Хотя настоящее изобретение было описано более подробно с помощью иллюстрации и примера для ясности и понимания, будет очевидно, что определенные изменения и модификации могут быть реализованы в рамках прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1. Идентификация моноклональных антител к mis-TTR
[00303] Конформационно-специфичные моноклональные антитела против мономерной, неправильно свернутой, фибриллярной или агрегированной форм TTR (mis-TTR) создавали, подвергали скринингу, экспрессировали и очищали, как описано в "Материалы и способы" (a-d). Для создания моноклональных антител к mis-TTR была исследована кристаллическая структура тетрамерного TTR человека, чтобы найти области белка, которые погружены в тетрамере, но становятся экспонированными при диссоциации тетрамера на его мономерные субъединицы. В идентифицированной области были остатки 89-97 (EHAEVVFTA) (SEQ Ш N0: 113), расположенные в пределах F-цепи TTR и разделенные на границе раздела димера тетрамерного белка. Поиск BLAST в белковой базе данных не выявил каких-либо других человеческих белков, обладающих этой последовательностью.
[00304] Был синтезирован пептид, содержащий эту последовательность (ggEHAEVVFTAggkg) (SEQ Ш NO: 114). Заглавные буквы представляют собой остатки 89-97 TTR. Буквы нижнего регистра представляют собой дополнительные линкерные остатки, добавляемые для увеличения растворимости антигенного пептида, и для создания 9 аминокислотного фрагмента в качестве внутренней последовательности. Этот пептид был присоединён к полилизиновому разветвлённому ядру, образуя многосоставной антигенный пептидный иммуноген (TTR-MAP), содержащий ядро из лизиновых остатков с несколькими ответвлениями, присоединённое к пептиду 89-97 TTR. Антитела, перечисленные в Таблице 2, были получены против TTR-MAP.
[00305] В дополнение к этому многосоставному антигенному пептиду, два других иммуногена, содержащих один и тот же фрагмент TTR, были получены путем ковалентного присоединения аналогичных пептидов 89-97 TTR (Ac-cggEHAEVVFTA-амид (SEQ Ш NO: 115) и Ac-EHAEVVFTAcgg-амид (SEQ Ш NO: 116)) через N- и С-концевые цистеиновые остатки к гемоцианину фиссуреллы (TTR89-97-N-KLH и TTR89-97-C-KLH).
[00306] После создания, скрининга, экспрессии и очистки антител были определены подробные кинетические параметры связывания (скорость ассоциации (ка), скорость диссоциации (кд) и константа аффинности связывания (KD)) ДЛЯ "лидирующих" mis-TTR антител посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR - surface plasmon resonance) в паре с рекомбинантным человеческим TTR F87M/L110M, как показано в
Таблице 2. Антимышиный IgG (GE Healthcare) был иммобилизован на сенсорном чипе С5 (без цепей декстрана) через аминовое соединение в соответствии с инструкциями, представленными в антимышинном наборе GE Healthcare, a mis-TTR mAb (мышиные антитела к ненативным формам TTR) были захвачены до уровня, чтобы обеспечить максимальное связывание аналита до 30-50 RU (resonance units - резонансных единиц). Различные концентрации аналита (рекомбинантный человеческий TTR F87M/L110M) пропускали через захваченный лиганд при 30 мкл/мин в подвижном буфере (HBS + 0,05% Р-20, 1 мг/мл БСА) в 3-кратных разведениях. Для каждой концентрации реакция протекала в течение времени, позволяющем более высоким концентрациям аналита достичь равновесия во время ассоциации, а также по меньшей мере 10% сигнала до распада во время диссоциации. По меньшей мере одна концентрация (не самая высокая или самая низкая) была проанализирована с дублирующей пробой. Диапазоны концентрации аналита были выбраны на основе предварительных экспериментов, чтобы охватить пределы измерений по меньшей мере от в 10 раз выше KD до в 10 раз ниже KD.
[00307] Результаты анализа SPR "лидирующих" mis-TTR mAb приведены в Таблице 2 ниже.
Таблица 2
SPR анализ связывания антител к mis-TTR с человеческим TTR (F87M/L1 ЮМ)
mAb
ka(l/Ms)
kd(l/s)
KD(M)
Rmax
9D5
2,715Е+4
4,93 ОЕ-4
1,816Е-8
31,55
14G8
2,880Е+4
5,358Е-4
1,861Е-8
27,13
5А1
6Д07Е + 4
4,693Е-4
7,684Е-9
30,98
6С1
4,607Е+4
4Д51Е-4
9,010Е-9
26,32
Пример 2. Связывание антител к mis-TTR с антигеном TTR
[00308] Четыре "лидирующих" mis-TTR mAb (9D5, 14G8, 6С1 и 5А1) анализировали с помощью ELISA в концентрациях от 0,31 до 2,5 мкг/мл, используя как рН 4,0-обработанный TTR (pH4-TTR), так и нативный TTR в качестве покрывающего антигена. Подготовка антигена TTR и протоколы ELISA описаны в других местах, в разделе "Материалы и способы" (и т.п.).
[00309] Полученные кривые связывания и сведенные значения Kd и Вшах показаны на Фиг. 3 и в Таблице 3 ниже. Результаты на Фиг. 3 представлены в произвольных единицах (п. е.) по оси у. Все mAb показали значительное связывание с pH4-TTR с величинами Кд в диапазоне от 16 нМ (6С1) до 282 нМ (9D5). Значения Вшах для связывания с pH4-TTR варьировали от минимума 0,65 п. е. (14G8) до максимума 2,02 (9D5). В отличие от связывания с pH4-TTR, ни одно из антител не показало значительного связывания с нативным TTR, что указывает на то, что все полученные антитела против TTR были специфическими к негативным формам TTR.
Таблица 3
Анализ ELISA связывания "лидирующих" антител к mis-TTR с pH4-TTR
mAb
Кс(пМ)
Вшах (п. е.)
9D5
282
2,02
14G8
108
0,65
6С1
1,07
5А1
1,61
Пример 3. Анализ антител к mis-TTR с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза и нативного ПААГ-электрофореза
[00310] 9D5 и 14G8 были проанализированы с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза/Вестерн-блоттинга, чтобы продемонстрировать специфичность связывания с мономерными/денатурированными формами TTR по сравнению с нативным, неденатурированным TTR. Протоколы ДСН-ПААГ-электрофореза, нативного ПААГ-электрофореза и Вестерн блоттинга описаны в других местах, в "Материлы и способы" (h-j).
[00311] Неденатурированный TTR или pH4-TTR подвергали электрофорезу в геле ДСН-ПААГ наряду с термически денатурированным TTR, и термически денатурированным рН4-TTR. После электрофореза с гелем проводили Вестерн-блоттинг, перенося белки на нитроцеллюлозу и окрашивая mAb 9D5 и 14G8 к TTR. Оба антитела распознавали только TTR, когда он был обработан при рН4, или, когда TTR или pH4-TTR сначала подвергали термическому денатурированию до ДСН-ПААГ-электрофореза. Эти 9D5 и 14G8, таким образом, демонстрируют специфичность к конформерам TTR, полученным или денатурацией TTR, или обработкой TTR при рН 4.
[00312] 6С1 и 5А1 вместе с общими mAb (7G7, 8СЗ) к TTR и коммерчески доступным поликлональным антителом Sigma также анализировали с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза/Вестерн-блоттинга. Каждый блот содержал окрашенные маркеры молекулярной массы, неденатурированный TTR и pH4-TTR.
[00313] Окрашенный гель ДСН-ПААГ показал, что основными видами, присутствующими в неденатурированном образце TTR, был димер примерно 38 кДа. Напротив, основной компонент, присутствующий в образце pH4-TTR, был димером примерно 35 кДа, с небольшой частью димера мономера примерно 15 кДа. Этот димер проходил через гель как немного меньший белок, чем димер, присутствующий в неденатурированном образце TTR, что указывает на конформационную разницу между этими двумя видами димеров TTR.
[00314] Вестерн-блоттинг образцов TTR и pH4-TTR с использованием четырех антител к mis-TTR показал, что эти mAb не распознают неденатурированный TTR, но связывают как денатурированный мономер, так и димер, присутствующие в образце pH4-TTR. Таким образом, четыре mAb к mis-TTR (9D5, 14G8, 6С1 и 5А1) показывают сходную специфичность для ненативных конформаций TTR при анализе ДСН-ПААГ-электрофорезом/Вестерн-блоттингом.
[00315] В отличие от четырех mAb к mis-TTR, два контрольных TTR mAb, 7G7 и 8СЗ, полученные путем иммунизации мышей с интактным TTR, распознавали все виды TTR, присутствующие в образцах TTR и pH4-TTR, включая виды тетрамерного TTR. Таким образом, в отличие от mAb к mis-TTR, эти контрольные mAb связывают TTR, но без конформационной специфичности. Поликлональные антитела Sigma ведут себя аналогично контрольным mAb - 7G7 и 8СЗ.
[00316] TTR и pH4-TTR также подвергали электрофорезу в нативном геле для того, чтобы увидеть, способны ли четыре mAb к mis-TTR проявлять конформационную специфичность в условиях неденатурирующего геля. На окрашенном нативном геле ПААГ после электрофореза, TTR выглядел как нативный димер примерно 35 кДа с небольшим количеством тетрамера. В отличие от этого, pH4-TTR выглядел в основном как высокомолекулярное размазанное пятно с небольшим количеством димера примерно 35 кДа. Неспецифическое поликлональное антитело Sigma распознавало все формы TTR, присутствующие как в TTR, так и в образце pH4-TTR. В противоположность этому, 9D5 распознает только высокомолекулярные виды TTR, присутствующие в образце pH4-TTR. Как
отмечалось в исследовании ДСН-ПААГ-электрофорез/Вестерн-блоттинг, 9D5 не распознает ни одного из нативных видов TTR.
[00317] Все четыре mAb к mis-TTR впоследствии анализировали с помощью нативного ДСН-ПААГ-электрофореза/Вестерн-блоттинга. Как и ожидалось, и аналогично 9D5, другие mAb к mis-TTR, 14G8, 6С1 и 5А1, специфически связываются с высокомолекулярными ненативными формами TTR, присутствующими в образце pH4-TTR. Ни одно из этих антител не распознавало нативный димер TTR размером 3 5 кДа. Эти результаты указывают на то, что четыре mAb к mis-TTR ведут себя одинаково и распознают только ненативные виды TTR, которые конформационно отличаются от нативного TTR.
Пример 4. Ингибирование образования фибрилл TTR с помощью антител к mis-TTR
[00318] TTR-Y78F представляет собой вариант TTR, содержащий точечную мутацию в позиции 78, которая дестабилизирует тетрамер TTR. Со временем и в мягких кислотных условиях этот вариант TTR диссоциирует на его мономерные субъединицы, которые затем могут сближаться и образовывать фибриллы, способные связываться с тиофлавином-Т. Таким образом, масштаб формирования фибрилл может наблюдаться путем измерения флуоресценции тиофлавина-Т при 480 нм. Введение антитела к mis-TTR, специфичного к диссоциированным мономерам или агрегатам TTR, предотвращает объединение фибрилл TTR, что приводит к уменьшению флуоресценции тиофлавина-Т относительно реакции контроля при отсутствии антитела. Протоколы для оценивания ингибирования формирования фибрилл TTR описаны в других местах, в "Материалы и способы" (к).
[00319] Все четыре антитела к mis-TTR сильно ингибировали формирование тиофлавин-Т-реакционноспособных ТТК-У78Т-фибрилл по сравнению с изотопическим контролем. Результаты показаны на Фиг. 4А и представлены в произвольных единицах (п. е.) на оси у. Антитело 5А1 к mis-TTR почти полностью ингибирует образование фибрилл. Эти результаты согласуются с мнением о том, что антитела к mis-TTR связывают мономерные и/или агрегированные формы TTR, тем самым предотвращая образование фибрилл TTR.
[00320] В Таблице 4 приведены характеристики, полученные для набора из 4 антител к mis-TTR (9D5, 14G8, 6С1 и 5А1), которые показали хорошую конформационную селективность к ненативным формам TTR. Эти антитела имели аффинности (KD) К pH4-TTR в диапазоне от 14,5 нМ (6С1) до 257 нМ (9D5) и значения Вшах от 0,65 п. е. (14G8) до 2,02 (9D5). Ни одно из этих антител не распознавало нативный TTR, но на самом деле они
связывались с pH4-TTR при ДСН-ПААГ-электрофорезе/Вестерн-блоттинге, и с высокомолекулярными агрегатами TTR при нативном ПААГ-электрофорезе/Вестерн-блоттинге. Эти антитела также ингибировали формирование фибрилл TTR в анализе формирования фибрилл с использованием Thio-T для считывания данных.
[00321] TTR-V122I представляет собой вариант TTR, содержащий в позиции 122 одноточечную мутацию, которая дестабилизирует тетрамер. Формирование фибрилл связано с увеличением флуоресценции тиофлавина-Т. Увеличение концентраций mAb 14G8 вызывало монотонное снижение флуоресценции тиофлавина-Т, указывающее на субстехиометрическое ингибирование формирования фибрилл TTR (IC50 = 0,028 ± 0,009 мг/мл, п = 3, Фиг. 4В и Таблица 4а). Изотипное контрольное mAb не вызывал ингибирования формирования фибрилл TTR (Фиг. 4С), тем самым демонстрируя специфичность опосредованного 14G8 ингибирования.
[00322] Сопоставимые субстехиометрические значения IC50, определенные для 5А1 и 6С1 (Таблица 4а), предполагали аналогичные механизмы ингибирования формирования фибрилл для каждого из этих mAb к mis-TTR. В противоположность этому, 9D5 неожиданно не смог
ингибировать формирование фибрилл TTR-V122I, несмотря на то, что проявлял сходную специфичность и сродство к ненативному TTR. Остается изучить, является ли 9D5 более чувствительным к используемым условиям анализа.
Таблица 4а
Таблица результатов анализа характеристик mAb к mis-TTR-V122I
Антитело
IC50 ± средне-квадратическое отклонение (мг/мл)
9D5
Нет ингибирования
14G8
0,028 ± 0,009
6С1
0,048 ± 0,059
5А1
0,015 ±0,02
EG 27/1
Нет ингибирования
Пример 5. Иммуногистохимическое определение характеристик ткани, подверженной ATTR, с использованием mAb к mis-TTR
[00323] "Лидирующие" mAb к mis-TTR, созданные к фрагменту белка транстиретина 89-97 TTR, были иммуногистохимически протестированы на свежезамороженной и обработанной парафином ткани, взятой у пациентов с подтвержденным сердечным TTR амилоидозом. Протоколы для получения и подготовки образцов сердечной ткани, иммуногистохимии (ШС - immunohistochemistry) и анализа изображений приведены в других местах,, в "Материалах и способах" (1-о). Антитела, используемые для ШС, описаны в Таблице 5.
[00324] Образцы сердечной ткани были получены у пациентов с подтвержденными диагнозами мутаций ATTR. Демография для исследуемых иммуногистохимически случаев была следующей и представлена в Таблице 6: FAC = семейная амилоидная кардиомиопатия; FAP = семейная амилоидная полинейропатия; 1° AL = амилоидоз легкой цепи; ATTR = транстирентин-опосредованный амилоидоз; Unk = Неизвестно
Таблица 6
Иммуногистохимическое окрашивание образцов сердечной ткани с помощью антител к mis-TTR
Пациент
Диагноз
Мутации TTR
Форма
Окрашивалось ли антителами KTTR?
Пациент 1
FAC
lieu 122
Замороженный
Пациент 2
FAP
Дикий тип
Замороженный
Пациент 3
FAP
84Ser
Замороженный
Пациент 4
FAP
84Ser
Замороженный
Пациент 5
1° AL
Замороженный
Нет
Пациент 6
1° AL
Замороженный
Нет
Пациент 7
ATTR
lOArg
Замороженный
Пациент 8
ATTR
V122I
Замороженный
Пациент HI
ATTR
Vall22Ile
FFPE
Пациент Н2
ATTR
Thr60Ala
FFPE
Пациент НЗ
ATTR
Thr49Ala
FFPE
Пациент Н4
ATTR
Ile84Ser
FFPE
Пациент Н5
Unk.
Senile Cardiac
FFPE
Пациент Н6
ATTR
Ile84Ser
FFPE
[00325] Мышиные моноклональные антитела (mAb к mis-TTR), полученные к фрагменту белка транстиретина 89-97 TTR, были иммуногистохимически протестированы на свежезамороженной и обработанной парафином ткани, взятой у пациентов с подтвержденным сердечным TTR амилоидозом. Каждое антитело к mis-TTR проявляло сильную иммунореактивность на сердечной ткани с ATTR. Темное окрашивание наблюдалось в отложениях во всем миокарде и сосудистой сети. Когда иммунореактивность
сравнивали по окрашиванию Congo Red и тиофлавином-Т, большая часть иммунореактивности на ткани показало высокое соответствие между двулучепреломлением Congo red и Т-положительным окрашиванием тиофлавином. Это подтверждает бета-складчатая природа листа TTR амилоида, отложенного в этой ткани. 14G8, 9D5, 6С1 и 5А1 также обнаруживали пред-амилоидный TTR, присутствующий в областях миокарда, которые были TTR-иммуноположительными, но Congo red или тиофлавин-Т отрицательными. Секции как с применением контрольного антитела изотипа IgG, так и с недобавлением первичных антител были отрицательными для окрашивания во всех тестируемых тканях. Антитела, реакционноспособные по отношению к другим амилоидогенным белкам (легкие цепи лямбда и каппа, или амилоид А), были нереакционноспособными на сердечной ткани с ATTR, использованой в этом анализе, что указывает на то, что отложения были специфически характерными для TTR.
[00326] Шаблоны окрашивания антителами к mis-TTR сравнивали с окрашиванием, полученным с хорошо охарактеризованным коммерческим эталонным антителом к TTR (преальбумин, А0002; Dako; Карпинтерия, Калифорния). Контрольное антитело DAKO окрашивало подверженный заболеванию миокард в тех же областях, что и антитела к mis-TTR, но продуцировало более диффузный шаблон окрашивания. Контрольное антитело DAKO не окрашивало отложения амилоида TTR, окрашиваемые Congo Red, присутствующие в сосудистой сети, так же сильно, как антитела к mis-TTR.
[00327] Антитела к mis-TTR не окрашивали нормальную, не подверженную заболеванию ткань. Кроме того, как и ожидалось, окрашивание изотипным контрольным антителом, 6F10, также было отрицательным.
[00328] Чтобы определить, является ли реакционная способность антител к mis-TTR специфичной по отношению к отложениям TTR, была проанализирована кросс-реакционная способность этих антител к сердечной ткани, полученной от пациентов с диагнозом первичного амилоидоза AL (light-chain amyloidosis). Как и ожидалось, никакого окрашивания AL-амилоидной ткани не наблюдалось, подтверждая, что антитела к TTR специфически реагируют на подверженную ATTR ткань.
[00329] Сердечная ткань пациентов с подтвержденными диагнозами старческого системного амилоидоза или пациентов с подтвержденным FAC или FAP, вызванных точечными мутациями в гене TTR, также положительно окрашивается 14G8, 9D5, 6С1 и 5А1.
Эти результаты показывают, что антитела к TTR обладают способностью распознавать отложения TTR в сердечной ткани независимо от генотипа ATTR.
[00330] Другие несердечные ткани, которые, как известно, экспрессируют TTR, также исследовали на окрашивание антителами к mis-TTR, и сравнивали с окрашиванием, полученным с использованием эталонного антитела DAKO. Как и ожидалось, печень, поджелудочная железа и сосудистое сплетение окрашивались положительно на TTR с использованием эталонного антитела Dako. В противоположность этому, 14G8 окрашивало только альфа-клетки поджелудочной железы, расположенные в островках Лангерганса, и сосудистое сплетение, что указывает на то, что некоторые из TTR, локализованные в этих органах, конформационно отличаются от TTR, экспрессирующихся в печени. Отсутствие иммунореактивности у mAb к mis-TTR в печени свидетельствует о том, что большое количество TTR, эксрпессированного в ней, представляет собой, в основном, тетрамерный, нативный TTR, и не имеет экспонированного эпитопа mis-TTR. Аналогичные результаты были получены, когда одни и те же ткани окрашивались 9D5, 6С1 и 5А1.
Пример 6. Анализ ATTR в сравнении с плазмой обычного человека с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза/Вестерн-блоттинга и плашечного анализа Meso Scale Discovery (MSD)
[00331] Шесть образцов плазмы от пациентов, с подтвержденным V30M ATTR (образец № 11, № 12, № 15, № 18, № 19, № 20) и 6 образцов от нормальных субъектов (№ 21, № 22, № 23, № 24, № 25, № 27) были получены от М. Сарайва (Университет Порту, Португалия). Образец № С6 был нормальным образцом человеческой сыворотки, полученным из коммерческого источника (BioreclamationlVT). Образцы анализировали с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза и Вестерн-блоттинга или с помощью плашечного теста MesoScale Discovery (MSD). Протоколы для этих анализов описаны в других местах в "Материалах и способах" (р-r). Стандартная кривая была сгенерирована для плашечного анализа MSD с использованием 6С1.
[00332] В полученных Вестерн-блотах с использованием mAb к mis-TTR - 9D5 и 5А1, можно обнаружить различия в шаблонах полос между нормальными образцами плазмы и плазмой с TTR-V30M. Все образцы плазмы содержали полосу TTR примерно 14 кДа, которая двигалась вместе с ненативным TTR-мономером, присутствующим в эталонном образце рН4-TTR. В общем, образцы плазмы, полученные от пациентов с TTR-V30M (№ 21, 22, 23, 24, 25 и 27), имели больше видов этих мономерных mis-TTR. Кроте того, образцы плазмы,
полученные от пациентов с V30M, также содержали полосу примерно 30 кДа, которая двигалась вместе с ненативным димером TTR, присутствующим в эталонном образце рН4-TTR. За исключением образцов № 12 и № 18, образцы плазмы, полученные от нормальных особей, обладали меньшим количеством этих димерных видов.
[00333] Вышеуказанные Вестерн-блоты были отсканированы, а интенсивности комбинированного 9D5- или 5А1-реакционноспособного TTR-димера и полос мономеров были нанесены на график для каждого образца. Результаты показаны на Фиг. 5А (9D5) и 5В (5А1) и представлены в произвольных единицах (п. е.) по оси у. За исключением образцов плазмы № 15 и № 18, образцы плазмы, полученные от обычных индивидов (11, 12, 19 и 20), содержали меньше 9D5- и 5А1-реакционноспособных димерных и мономерных видов, чем образцы, полученные от пациентов с V30M (21-25 и 27).
[00334] 12 образцов сыворотки, проанализированных Вестерн-блоттингом с 9D5 и 5А1, также анализировали с помощью плашечного анализа MSD с использованием 6С1 в качестве антитела для захвата mis-TTR, и антитела Dako-SulfoTag в качестве антитела детектирования. Результаты этих MSD-анализов показаны на Фиг. 6 и представлены в произвольных единицах (п. е.) по оси у. Образцы 11, 12, 15, 18, 19 и 20 представляют собой обычную плазму. Образцы 21-25 и 27 представляют собой плазму больных с V30M.
[00335] За исключением образцов плазмы № 15 и № 18, количество 6С1-реакционноспособного TTR, присутствующего в образцах плазмы, полученных от обычных индивидов, было ниже, чем в плазме у индивидов с TTR-V30M. Уровни реакционной способности 6С1, измеренные с помощью анализа MSD, очень хорошо коррелировали с количеством 9В5-реакционноспособного димера и мономера, наблюдаемых выше с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза/Вестерн-блоттинга.
[00336] Чтобы определить концентрацию реакционноспособных видов TTR, присутствующих в образцах плазмы, те же образцы повторно анализировали с использованием 6С1 в качестве антитела захвата и 8C3-SulfoTag в качестве детектирующего антитела. Сигналы MSD преобразовывали в концентрации нг/мл реакционноспособных видов TTR, используя стандартную кривую TTR F87M/L110M, созданную выше. На основании этого анализа средняя концентрация 6С1-реакционноспособного TTR, присутствующего в контрольных образцах, составляла 271 ± 185 нг/мл. В противоположность этому, средняя концентрация реакционноспособного TTR, присутствующего в образцах плазмы V30M, была
выше, на уровне 331 +/- 95 нг/мл. Взятые вместе, эти результаты по анализу MSD показывают, что антитела к mis-TTR способны различать образы с ATTR и образы обычной плазмы. Это гарантирует дальнейшее улучшение антител к mis-TTR для использования в диагностических тестах болезни ATTR.
Пример 7. Дизайн гуманизированных антител 9D5
[00337] Отправной точкой или донорским антителом для гуманизации было мышиное антитело 9D5. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи зрелого m9D5 представлена как SEQ Ш NO: 1. Аминокислотная последовательность легкой цепи зрелого m9D5 представлена как SEQ Ш N0: 16. Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи представлены как SEQ Ш N0: 13-15 соответственно (как определено по Кабату). Составная CDR-H1 по Чотия-Кабат представлена как SEQ Ш N0: 117. Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи представлены как SEQ Ш N0: 24-26 соответственно (как определено по Кабату). В этом примере используется нумерация Kabat.
[00338] Вариабельная каппа (Vk) цепь анититела m9D5 относится к подгруппе 2 мыши по Кабату, что соответствует подгруппе 3 человека по Кабату. Вариабельная тяжелая (Vh) цепь антитела m9D5 относится к подгруппе 3d мыши по Кабату, что соответствует подгруппе 3 по Кабату. Смотрите Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NTH Publication No. 91-3242, 1991. CDR-L1 из 16 остатков относится к традиционному классу 4, CDR-L2 из 7 остатков относится к традиционному классу 1, a CDR-L3 из 9 остатков относится к традиционному классу 1 в Vk. Смотрите Martin & Thornton, J. Mol. Biol. 263:80015, 1996. Составная CDR-H1 из 10 остатков по Чотия- Кабат относится к традиционному классу 1, и CDR-H2 из 17 остатков относится к традиционному классу 1. Смотрите Martin & Thornton, J Mol. Biol. 263:800-15, 1996. CDR-H3 не имеет традиционных классов.
[00339] Остатки в зоне взаимодействия доменов Vk и Vh являются такими, какие обычно можно наблюдать, за исключением Leu в позиции 47 в тяжелой цепи, поскольку обычно в этой позиции встречается Туг. Эта позиция является кандидатом на обратное мутирование.
[00340] Был проведен поиск по белковым последовательностям в базе данных PDB (Deshpande et al., Nucleic Acids Res. 33: D233-7, 2005) чтобы найти структуры, которые бы предоставили грубую структурную модель для 9D5. Кристаллическая структура fab антитела (код pdb 1MJU) (Ruzheinikov et al., J. Mol. Biol. 332(2): 423-435, 2003) был использован для
структуры Vk, так как она имела хорошее разрешение (1,22 А) и общее сходство последовательностей с Vk антитела 9D5, сохраняя ту же традиционную структуру для петли как и в 9D5. Для структуры Vh использовали мономерное антитело с кодом pdb 1SEQ (Covaceuszach et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 57 (PT 9), 1307-1309, 2001), поскольку оно имело хорошее сходство последовательности и разрешение (2,0 А), и оно имеет те же традиционные структуры CDR-H1 и CDR-H2, как и таковые VH антитела 9D5. Мы моделировали цепь Vh антитела 9D5 также применяя структуру 1MQK, так как она имеет лучшее разрешение 1,28 A (Ostermeier et al., Proteins 21(l):74-77, 1995). Программное обеспечение BioLuminate (лицензия от Schrodinger Inc.) использовалось для моделирования грубой структуры 9D5.
[00341] Поиск базы данных из NCBI, не содержащей избыточных белковых последовательностей, позволил выбрать подходящие каркасы антитела человека для переноса CDR мыши. Для Vh была выбрана тяжелая цепь Ig человека ВАС02114 (GI: 21670209) (SEQ ID NO: 3) (Akahori et al., Construction and characterization of antibody libraries: isolation of therapeutic human antibodies and application to functional genomics, Direct Submission, July 25, 2001). Она имеет традиционную форму, как и в 9D5. Она является членом тяжелой подгруппы 1 человека по Кабату. Vh из 9D5 имеет некоторые уникальные остатки каркаса, и любой человеческий акцептор каркаса не показывал очень высокой гомологии. Поэтому мы также использовали второй каркас, ААХ82494 (GI: 62421461) (SEQ ГО NO: 4) (Lundquist et al., Infect. Immun. 74(6), 3222-3231, 2006) чтобы создать гибридный каркас акцептора. Для Vk была выбрана каппа-легкая цепь человека с идентификационным номером NCBI АВС66952 (GI: 84798006) (Shriner et al., Vaccine 24(49-50):7159-7166, 2006) (SEQ ID NO: 18). Традиционные классы ее CDR-L1 и L2 такие же как и в родительском Vk. Она является членом каппа-подгруппы 2 человека по Кабату.
[00342] Были сконструированы восемь вариантов вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи и пять вариантов вариабельной области гуманизированной легкой цепи, содержащие различные перестановки замен (Hu9D5VHvl, 2, 2b, 3, 3b, 4, 4b и 5 (SEQ ID NOS: 5-12 соответственно) и Hu9D5VLvl-5 (SEQ ID NOS: 19-23, соответственно)) (Таблицы 7 и 8). Иллюстративные гуманизированные конструкции Vh и Vk с обратными мутациями и другими мутациями, на основе выбранных человеческих каркасов показаны в Таблицах 7 и 8 соответственно. Заштрихованные серым области в первом столбце в Таблицах 7 и 8 обозначают CDR, как определено по Чотия, а заштрихованные серым в остальных столбцах в
Таблицах 7 и 8 обозначают CDR, как определено по Кабату. SEQ Ш NOS: 5-12 и 19-23 содержат обратные мутации и другие мутации, как показано в Таблице 9. Аминокислоты в позициях Н42, Н47, Н69, Н82, H82(b), Н108, L8, L9, L18, L19, L36, L39, L60, L70 и L74 в Hu9D5VHvl, 2, 2b, 3, 3b, 4, 4b и 5 и Hu9D5VLvl-5 приведены в Таблицах 10 и 11.
№ остатка по Чотия
№ остатка по Кабату
Линейний № остатка
FR или CDR
VH 9D5 мыши (SEQ ID NO: 1)
Hu VH Acceptor Fr Acc
№ BAC02114 (SEQ ID NO: 3)
Hu VH Acceptor Fr Acc
№ AAX82494 (SEQ ID NO: 4)
Hu9D5 VHvl (SEQ ID NO: 5)
Hu9D5 VHv2 (SEQ ID NO: 6)
Hu9D5 VHv2b (SEQ ID NO: 7)
Hu9D5 VHv3 (SEQ ID NO: 8)
Hu9D5 VHv3b (SEQ ID NO: 9)
Hu9D5 VHv4 (SEQ ID NO: 10)
Hu9D5 VHv4b (SEQ ID NO: 11)
Hu9D5 VHv5 (SEQ ID NO: 12)
Frl
Frl
Frl
CDR-H1
CDR-H1
CDR-H1
CDR-H1
CDR-H1
CDR-H1
CDR-H1
CDR-H1
CDR-H1
CDR-H1
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
№ остатка по Чотия
№ остатка по Кабату
Линейний № остатка
FR или CDR
VH 9D5 мыши (SEQ ID NO: 1)
Hu VH Acceptor Fr Acc
№ BAC02114 (SEQ ID NO: 3)
Hu VH Acceptor Fr Acc
№ AAX82494 (SEQ ID NO: 4)
Hu9D5 VHvl (SEQ ID NO: 5)
Hu9D5 VHv2 (SEQ ID NO: 6)
Hu9D5 VHv2b (SEQ ID NO: 7)
Hu9D5 VHv3 (SEQ ID NO: 8)
Hu9D5 VHv3b (SEQ ID NO: 9)
Hu9D5 VHv4 (SEQ ID NO: 10)
Hu9D5 VHv4b (SEQ ID NO: 11)
Hu9D5 VHv5 (SEQ ID NO: 12)
Fr2
CDR-H2
CDR-H2
CDR-H2
52А
52А
CDR-H2
CDR-H2
CDR-H2
CDR-H2
CDR-H2
CDR-H2
CDR-H2
CDR-H2
CDR-H2
CDR-H2
CDR-H2
CDR-H2
CDR-H2
CDR-H2
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
№ остатка по Чотия
№ остатка по Кабату
Линейний № остатка
FR или CDR
VH 9D5 мыши (SEQ ID NO: 1)
Hu VH Acceptor Fr Acc
№ BAC02114 (SEQ ID NO: 3)
Hu VH Acceptor Fr Acc
№ AAX82494 (SEQ ID NO: 4)
Hu9D5 VHvl (SEQ ID NO: 5)
Hu9D5 VHv2 (SEQ ID NO: 6)
Hu9D5 VHv2b (SEQ ID NO: 7)
Hu9D5 VHv3 (SEQ ID NO: 8)
Hu9D5 VHv3b (SEQ ID NO: 9)
Hu9D5 VHv4 (SEQ ID NO: 10)
Hu9D5 VHv4b (SEQ ID NO: 11)
Hu9D5 VHv5 (SEQ ID NO: 12)
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
82А
82А
Fr3
82В
82В
Fr3
82С
82С
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
CDR-H3
100
CDR-H3
№ остатка по Чотия
№ остатка по Кабату
Линейний № остатка
FR или CDR
VH 9D5 мыши (SEQ ID NO: 1)
Hu VH Acceptor Fr Acc
№ BAC02114 (SEQ ID NO: 3)
Hu VH Acceptor Fr Acc
№ AAX82494 (SEQ ID NO: 4)
Hu9D5 VHvl (SEQ ID NO: 5)
Hu9D5 VHv2 (SEQ ID NO: 6)
Hu9D5 VHv2b (SEQ ID NO: 7)
Hu9D5 VHv3 (SEQ ID NO: 8)
Hu9D5 VHv3b (SEQ ID NO: 9)
Hu9D5 VHv4 (SEQ ID NO: 10)
Hu9D5 VHv4b (SEQ ID NO: 11)
Hu9D5 VHv5 (SEQ ID NO: 12)
101
CDR-H3
102
CDR-H3
103
CDR-H3
100
100
104
CDR-H3
100А
100А
105
CDR-H3
100В
100В
106
CDR-H3
100С
100С
107
CDR-H3
100D
100D
108
CDR-H3
100Е
100Е
109
CDR-H3
100F
100F
CDR-H3
100G
100G
111
CDR-H3
101
101
112
CDR-H3
102
102
113
CDR-H3
103
103
114
Fr4
104
104
115
Fr4
105
105
116
Fr4
106
106
117
Fr4
107
107
118
Fr4
108
108
119
Fr4
109
109
120
Fr4
121
Fr4
111
111
122
Fr4
112
112
123
Fr4
113
113
124
Fr4
№ остатка по Чотия
о а
Й н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
Vb 9D5 мыши (SEQ ID NO: 16)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952 (SEQ ID NO: 18)
Hu9D5 VLvl (SEQ ID NO: 19)
Hu9D5 VLv2 (SEQ ID NO: 20)
Hu9D5 VLv3 (SEQ ID NO: 21)
Hu9D5 VLv4 (SEQ ID NO: 22)
Hu9D5 VLv5 (SEQ ID NO: 23)
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
№ остатка по Чотия
о в
Й н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
Vb 9D5 мыши (SEQ ID NO: 16)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952 (SEQ ID NO: 18)
Hu9D5 VLvl (SEQ ID NO: 19)
Hu9D5 VLv2 (SEQ ID NO: 20)
Hu9D5 VLv3 (SEQ ID NO: 21)
Hu9D5 VLv4 (SEQ ID NO: 22)
Hu9D5 VLv5 (SEQ ID NO: 23)
Frl
Frl
Frl
CDR-Ll
CDR-Ll
CDR-Ll
CDR-Ll
27А
27А
CDR-Ll
27В
27В
CDR-Ll
27С
27С
CDR-Ll
27D
27D
CDR-Ll
27Е
27Е
CDR-Ll
CDR-Ll
№ остатка по Чотия
о а
Й н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
Vb 9D5 мыши (SEQ ID NO: 16)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952 (SEQ ID NO: 18)
Hu9D5 VLvl (SEQ ID NO: 19)
Hu9D5 VLv2 (SEQ ID NO: 20)
Hu9D5 VLv3 (SEQ ID NO: 21)
Hu9D5 VLv4 (SEQ ID NO: 22)
Hu9D5 VLv5 (SEQ ID NO: 23)
CDR-L1
CDR-L1
CDR-L1
CDR-L1
CDR-L1
CDR-L1
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
№ остатка по Чотия
о в
Й н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
Vb 9D5 мыши (SEQ ID NO: 16)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952 (SEQ ID NO: 18)
Hu9D5 VLvl (SEQ ID NO: 19)
Hu9D5 VLv2 (SEQ ID NO: 20)
Hu9D5 VLv3 (SEQ ID NO: 21)
Hu9D5 VLv4 (SEQ ID NO: 22)
Hu9D5 VLv5 (SEQ ID NO: 23)
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
Fr3
Fr3
Fr3
№ остатка по Чотия
о в
Й н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
Vb 9D5 мыши (SEQ ID NO: 16)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952 (SEQ ID NO: 18)
Hu9D5 VLvl (SEQ ID NO: 19)
Hu9D5 VLv2 (SEQ ID NO: 20)
Hu9D5 VLv3 (SEQ ID NO: 21)
Hu9D5 VLv4 (SEQ ID NO: 22)
Hu9D5 VLv5 (SEQ ID NO: 23)
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
№ остатка по Чотия
о а
Й н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
VL 9D5 мыши (SEQ ID NO: 16)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952 (SEQ ID NO: 18)
Hu9D5 VLvl (SEQ ID NO: 19)
Hu9D5 VLv2 (SEQ ID NO: 20)
Hu9D5 VLv3 (SEQ ID NO: 21)
Hu9D5 VLv4 (SEQ ID NO: 22)
Hu9D5 VLv5 (SEQ ID NO: 23)
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
100
CDR-
№ остатка по Чотия
о а
Й н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
Vb 9D5 мыши (SEQ ID NO: 16)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952 (SEQ ID NO: 18)
Hu9D5 VLvl (SEQ ID NO: 19)
Hu9D5 VLv2 (SEQ ID NO: 20)
Hu9D5 VLv3 (SEQ ID NO: 21)
Hu9D5 VLv4 (SEQ ID NO: 22)
Hu9D5 VLv5 (SEQ ID NO: 23)
101
CDR-
102
CDR-
103
Fr4
104
Fr4
100
100
105
Fr4
101
101
106
Fr4
102
102
107
Fr4
103
103
108
Fr4
104
104
109
Fr4
105
105
Fr4
106
106
111
Fr4
107
107
112
Fr4
Обратные мутации и другие мутации VH, VL
Вариант VH или
Последовательность экзона акцептора VH или
Остатки каркаса донора
Hu9D5VHvl (SEQ ID NO: 5)
Идентификационные номера NCBI ВАС02114 и ААХ82494
(SEQ ID NOS: 3 и 4 соответственно)
Н47, Н69, Н82
Hu9D5VHv2 (SEQ ID NO: 6)
Идентификационные номера NCBI ВАС02114 и ААХ82494
(SEQ ID NOS: 3 и 4 соответственно)
Н47, Н69, Н82, H82b
Hu9D5VHv2b (SEQ ID NO: 7)
Идентификационные номера NCBI ВАС02114 и ААХ82494
(SEQ ID NOS: 3 и 4 соответственно)
Н42, Н47, Н108
Hu9D5VHv3 (SEQ ID NO: 8)
Идентификационные номера NCBI ВАС02114 и ААХ82494
(SEQ ID NOS: 3 и 4 соответственно)
Н69, Н82, H82b
Hu9D5VHv3b (SEQ ID NO: 9)
Идентификационные номера NCBI ВАС02114 и ААХ82494
(SEQ ID NOS: 3 и 4 соответственно)
Н47, Н108
Hu9D5VHv4 (SEQ ID NO: 10)
Идентификационные номера NCBI ВАС02114 и ААХ82494
(SEQ ID NOS: 3 и 4 соответственно)
Н82, H82b
Hu9D5VHv4b (SEQ ID NO: 11)
Идентификационные номера NCBI ВАС02114 и ААХ82494
(SEQ ID NOS: 3 и 4 соответственно)
H47, H108
Hu9D5VHv5 (SEQ ID NO: 12)
Идентификационные номера NCBI ВАС02114 и ААХ82494
(SEQ ID NOS: 3 и 4 соответственно)
H42, H47, H82b
Hu9D5VLvl (SEQ ID NO: 19)
Идентификационные номера NCBI АВС66952 (SEQ ID NO: 18)
L36
Нумерация остатков каркаса по Кабату для обратных мутаций и других мутаций в областях Vh гуманизированных антител 9D5
Остаток
Тяжелая цепь ВАС02114
Тяжелая цепь ААХ82494
9D5 мыши
Hu9D5 VHvl
Hu9D5 VHv2
Hu9D5 VHv2b
Hu9D5 VHv3
Hu9D5 VHv3b
Hu9D5 VHv4
Hu9D5 VHv4b
Hu9D5 VHv5
Н42
Н47
Н69
Н82
Н82Ь
Н108
[00343] Выравнивание последовательности Vh 9D5 мыши (SEQ Ш NO: 1) с модельными последовательностями мыши (1SEQ H и 1MQKH, SEQ Ш NOS: 2 и 62 соответственно), последовательностями акцептора человека (ВАС02114 и ААХ82494; SEQ Ш NOS: 3 и 4 соответственно), и последовательностями Hu9D5VHvl, Hu9D5VHv2, Hu9D5VHv2b, Hu9D5VHv3, Hu9D5VHv3b, Hu9D5VHv4, Hu9D5VHv4b и Hu9D5VHv5 (SEQ Ш NOS: 5-12 соответственно) показано на Фиг. 1А. Последовательности CDR, как определено по Кабату, заключены в рамки, за исключением того, что первая охватывающая рамка является совмещением CDR-H1 по Чотия и CDR-H1 по Кабату, с подчеркнутым и выделенным полужирным шрифтом CDR-H1 по Кабату. Позиции, в которых канонические, верниальные или интерфейсные остатки различаются между последовательностями акцепторов мыши и человека, являются кандидатами на замещение. Примеры верниальных/CDR-ocHOBHbrx остатков включают остатки 2, 49, 69, 71, 75, 80 и 94 по нумерации Kabat в Таблице 7. Примеры традиционныхЛ^ТЖ-взаимодействующих остатков включают остатки 24, 48 и 73 по
нумерации Kabat в Таблице 7. Примеры остатков интерфейса/упаковки (VH + VL) включают остатки 37, 39, 44, 47, 91, 93 и 103 по нумерации Kabat в Таблице 7.
[00344] Выравнивание последовательности Vk 9D5 мыши (SEQ Ш N0: 16) с модельной последовательностью мыши (1MJU L, SEQ Ш NO: 17), последовательностью акцептора человека (АВС66952, SEQ ГО NO: 18) и последовательностями Hu9D5VLvl, Hu9D5VLv2, Hu9D5VLv3, Hu9D5VLv4 и Hu9D5VLv5 (SEQ ID NOS: 19-23, соответственно) показаны на Фиг. 1В. Последовательности CDR, как определено по Кабату, заключены в рамки, за исключением того, что первая охватывающая рамка является совмещением CDR-H1 по Чотия и CDR-H1 по Кабату, с подчеркнутым и выделенным полужирным шрифтом CDR-H1 по Кабату. Позиции, в которых традиционные, верниальные или интерфейсные остатки различаются между последовательностями акцепторов мыши и человека, являются кандидатами на замещение. Примеры верниальных/CDR-ocHOBHbix остатков включают остатки 4, 35, 46, 49, 66, 68 и 69 по нумерации Kabat в Таблице 8. Примеры TpaflH4HOHHbrx/CDR-B3anMOfleftcTByiOLuHx остатков включают остатки 2, 48, 64 и 71 по нумерации Kabat в Таблице 8. Примеры остатков интерфейса/упаковки (VH + VL) включают остатки 36, 38, 44, 47, 87, и 98 по нумерации Kabat в Таблице 8.
[00345] Обоснования выбора позиций, указанных в Таблицах 9 и 11, в вариабельной области легкой цепи в качестве кандидатов для замены, следующие.
[00346] Р8А: модель показывает изгиб в петле в этой позиции, поэтому была опробована обратная мутация на А для смягчения этого.
[00347] L9P: модель показывает изгиб в петле в этой позиции, поэтому была опробована обратная мутация на Р для смягчения этого.
[00348] P18S: Р в этой позиции встречается реже. Была опробована мутация на S для того чтобы, снизить искривление петли.
[00349] A19V: А и V в этой позиции встречаются одинаково часто. Была опробована мутация на V для того чтобы, снизить искривление петли.
[00350] Y36F: Это остаток интерфейса, и обычно он представляет собой Y или F. Y имеет дополнительную гидроксильную группу, которая может потенциально влиять на упаковку LC + НС. Полярность Y36 может потенциально помешать размещению остатка Н95 тяжелой цепи CRD-H3. Гомологическая модель показывает, что Y в этом положении будет
формировать Н-связь с F 100(g) в НЗ de-novo, что может привести к ограничению подвижности НЗ. Как F, так и Y использовались в отдельных версиях.
[00351] K39R: R формирует Н-связи с соседними остатками в этой петле в отличие от К. Чтобы исключить какие-либо влияния на стабильность петли, была опробована мутация на R.
[00352] D60S: присутствие D в этом остатке показывает высокую степень риска протеолиза. В некоторых версиях он был заменен на S - остаток, наиболее часто встречающийся в этой позиции в клетках зародышевой линии человека. Это, как предсказано, повышает стабильность.
[00353] D70A: D подвержен риску протеолиза, поэтому была опробована мутация на А.
[00354] K74R: R, по-видимому, стабилизирует петлю по сравнению с К в этой позиции, поэтому была опробована обратная мутация на R.
[00355] Обоснования выбора позиций, указанных в Таблицах 9 и 10, в вариабельной области тяжелой цепи в качестве кандидатов для замены, следующие.
[00356] G42E: Е обладает ионными взаимодействиями с R в позиции 44. Чтобы исключить какое-либо влияние, которое могут иметь эти взаимодействия, в некоторых версиях была рассмотрена обратная мутация на Е.
[00357] W47L: Это остаток интерфейса, обычно W. В тяжелой цепи 9D5 мыши это L, тогда как в акцепторном каркасе антитела человека в этой позиции находится W. Хотя L и W являются неполярными, фенольное кольцо в W может потенциально воздействовать на упаковку легкая цепытяжелая цепь. W и L были включены в отдельные варианты.
[00358] I69F: Это остатки вернье, часть основания CDR-H2. В соответствии с гомологической моделью, ароматическое кольцо F в мышиных последовательностях представляет собой стек с ароматическим кольцом остатка Y59 CRD-H2. Остаток I в этой позиции нарушает эту укладку. I и F были включены в отдельные варианты.
[00359] M82S: М в этой позиции очень редко встречается в каркасе анититела человека. Более распространенными являются А или N. Изменение остатка на более распространенный S может уменьшить иммуногенность, которая может быть связана с редким М в этой позиции. Основываясь на модельных наблюдениях, существует вероятность того, что М взаимодействует с Leu80, который является остатком зоны вернье. М и S были включены в отдельные варианты.
[00360] S82(b)L: S присутствует в этой позиции как в мышиных, так и в человеческих каркасных последовательностях, но S в этой позиции является менее частым. Судя по тому, где этот остаток находится в модели, он, возможно, может вступить в контакт с антигеном. Известно, что остатки в каркасной области 3 тяжелой цепи изредка вносят вклад в связывание. S и L были включены в отдельные варианты.
[00361] T108L: L является наиболее частым остатком в человеческих каркасах в этой позиции, поэтому L был опробован в некоторых вариантах.
[00362] Поскольку для гуманизации вариабельной области тяжелой цепи 9D5 использовались два акцепторных каркаса человека (ВАС02114 и ААХ82494.1 (SEQ Ш NOS: 3 и 4)), существуют определенные позиции каркаса, которые имеют разные аминокислоты в двух акцепторных каркасах. Гуманизированные варинаты вариабельной области тяжелой цепи 9D5 могут содержать каждую из двух аминокислот в этих остатках. Примеры позиций, в которых эти два акцептора различаются, включают позиции HI9 (R или К), Н40 (А или Т), Н44 (G или R), Н49 (S или А), Н77 (S или Т), Н82а (N или S), Н83 (R или К), Н84 (А или S) и Н89 (V или М) по нумерации Kabat. Обоснования выбора одной аминокислоты или другой в этих позициях заключаются в следующем.
[00363] HI9 (R или К): R и К присутствуют в двух рассмотренных каркасах, поэтому каждый остаток был опробован в отдельных вариантах.
[00364] Н40 (А или Т): А и Т присутствуют в двух рассмотренных каркасах, поэтому каждый остаток был опробован в отдельных вариантах.
[00365] Н44 (G или R): G и R присутствуют в двух рассмотренных каркасах, поэтому каждый остаток был опробован в отдельных вариантах.
[00366] Н49 (S или А): это остаток вернье, который упаковывается под CDR-H2. В последовательности мыши это А. Небольшая разность размеров и гидрофильный характер S могут потенциально нарушить основу CDR. S и А были включены в отдельные версии.
[00367] Н77 (S или Т): S и Т присутствуют в двух рассмотренных каркасах акцептора человека, поэтому каждый остаток был опробован в отдельных вариантах.
[00368] Н82а (N или S): N в этой позиции встречается намного реже, чем S. Более того, S, по-видимому, способствует связыванию антигена. Мутация в S была опробована в некоторых вариантах.
[00369] Н83 (R или К): К в каркасной области 3 находиться близко к поверхности области связывания CDR. Замена его на R, который является более громоздким, чем К, может препятствовать размещению антигена. R встречается наиболее часто, и К является третьим по частоте встречаемости в человеческих каркасах в этой позиции. R и К были включены в отдельные варианты.
[00370] Н84 (А или S): S и А присутствуют в двух рассмотренных каркасах, поэтому каждый остаток был опробован в отдельных вариантах.
[00371] Н89 (V или М): V и М присутствуют в двух рассмотренных каркасах, поэтому каждый остаток был опробован в отдельных вариантах.
[00372] Пять вариантов вариабельной области гуманизированной легкой цепи и пять вариантов вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи:
[00373] Hu9D5VL вариант 1 (замена Y36F показана нижним регистром):
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGNTYLYWfLQKPGQSPQLLIYRVSNLASGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPLTFGQGTKLEIK (SEQ Ш NO: 19)
[00374] Hu9D5VL вариант 2 (без замен):
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGNTYLYWYLQKPGQSPQLLIYRVSNLASGV PDRF S GS GS GTDF TLKISRVE AED VGV Y YCMQHLE YPLTF GQGTKLEIK (SEQ Ш NO: 20)
[00375] Hu9D5VL вариант 3 (замена D60S показана нижним регистром):
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGNTYLYWYLQKPGQSPQLLIYRVSNLASGV PsRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPLTFGQGTKLEIK (SEQ Ш NO: 21)
[00376] Hu9D5VL вариант 4 (P8A, L9P, A19V, Y36F, K39R, D60S, D70A и K74R показаны нижним регистром):
DIVMTQSapSLPVTPGEPvSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWfLQrPGQSPQLLIYRVSNLASGVPs RFSGSGSGTaFTLrlSRVEAEDVGVYYCMQHLEYPLTFGQGTKLEIK (SEQ Ш NO: 22)
[00377] Hu9D5VL вариант 5 (P8A, L9P, P18S, A19V, Y36F, K39R, D60S, D70A, и K74R показаны нижним регистром):
DIVMTQSapSLPVTPGEsvSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWfLQrPGQSPQLLIYRVSNLASGVPs RFSGSGSGTaFTLrlSRVE AED VGVYYCMQHLEYPLTF GQGTKLEIK (SEQ Ш NO: 23)
[00378] Hu9D5VH вариант 1 (замены W47L, I69F и M82S показаны нижним регистром):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S S YTMSWVRQAPGKGLE1VAEISNSGDTT YYP DTVKGRFTfSRDNAKNSLYLQsNSLKAEDTAVYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQGTTV TVSS (SEQ Ш NO: 5)
[00379] Hu9D5VH вариант 2 (W47L, I69F, M82S и S82(b)L показаны нижним регистром):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S SYTMSWVRQAPGKGLE1 VAEISNSGDTT YYP DTVKGRFTfSRDNAKNSLYLQsNlLRAEDTAVYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQGTTV TVSS (SEQ Ш NO: 6)
[00380] Hu9D5VH вариант 2b (замены G42E, W47L и T108L показаны нижним регистром):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPeKRLElVAEISNSGDTTYYPD TVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQGT1VT VSS (SEQ Ш NO: 7)
[00381] Hu9D5VH вариант 3 (замены I69F, M82S, M82S и S82(b)L показаны нижним регистром):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S SYTMSWVRQAPGKGLEWVSEISNSGDTT YYP DTVKGRFTfSRDNAKNSLYLQsNlLRAEDTAVYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQGTTV TVSS (SEQ Ш NO: 8)
[00382] Hu9D5VH вариант 3b (замены W47L и T108L показаны нижним регистром):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPGKRLE1VAEISNSGDTTYYPD TVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQGT1VT VSS (SEQ Ш NO: 9)
[00383] Hu9D5VH вариант 4 (замены M82S и S82(b)L показаны нижним регистром):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S SYTMSWVRQAPGKGLEWVSEISNSGDTT YYP DTVKGRFTISRDNAKNSLYLQsNlLRAEDTAVYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQGTTV TVSS (SEQ Ш NO: 10)
[00384] Hu9D5VH вариант 4b (замены W47L и T108L показаны нижним регистром):
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKRLE1VAEISNSGDTTYYP DTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQGT1V TVSS (SEQ Ш NO: 11)
[00385] Hu9D5VH вариант 5 (замены G42E, W47L и S82(b)L показаны нижним регистром):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTF S SYTMSWVRQTPeKRLEl VAEISNSGDTT YYPD TVKGRFTISRDNAKNTLYLQMN1LRAEDTAVYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQGTTVT VSS (SEQ Ш NO: 12)
[00386] Анализ качества белка наряду с анализом потенциала к агрегации не выявил явных кластеров связанных с агрегацией остатков, представленных в каркасных областях легкой цепи или тяжелой цепи 9D5 или CDR (Wang et al., MAbsl(3): 254-267, 2009).
Пример 8. Кинетический анализ связывания гуманизированных антител 9D5
[00387] Кинетику связывания всех гуманизированных вариантов 9D5, 9D5 мыши и химерного 9D5 с рекомбинантным человеческим TTR F87M/L110M определяли с помощью Biacore, как показано в Таблице 12. Анти-человеческий (GE Healthcare) был иммобилизован на сенсорном чипе С5 (без цепей декстрана) через аминовое соединение в соответствии с инструкциями, представленными в анти-человеческом наборе GE Healthcare, a mAb были захвачены до уровня, чтобы обеспечить максимальное связывание аналита до 30-50 RU. Различные концентрации аналита (рекомбинантный человеческий TTR F87M/L110M) пропускали через захваченный лиганд при 50 мкл/мин в подвижном буфере (HBS + 0,05% Р-20, 1 мг/мл БСА) в 3-кратных разведениях. Для каждой концентрации реакция протекала в течение времени, позволяющем более высоким концентрациям аналита достичь равновесия во время ассоциации, а также по меньшей мере 10% сигнала до распада во время диссоциации. По меньшей мере одна концентрация (не самая высокая или самая низкая) была проанализирована с дублирующей пробой. Диапазоны концентрации аналита были выбраны на основе предварительных экспериментов, чтобы охватить пределы измерений по меньшей мере от в 10 раз выше KD до в 10 раз ниже KD.
[00388] В Таблице 12 приведены скорость ассоциации (ка), скорость диссоциации (к^) и константа аффинности связывания (KD) по Biacore мышиных, химерных и гуманизированных вариантов 9D5 для рекомбинантного человеческого TTR F87M/L1 ЮМ.
[00389] Эти результаты показывают, что аффинность 9D5 мыши к TTR-F87M/L1 ЮМ (KD = 1,82Е-08М) была слегка улучшена в химерном варианте 9D5 (KD = 1,35Е-09М). Кроме того, полностью гуманизированные варианты 9D5 имеют сходные значения аффинности в узком нМ диапазоне. Hu9D5 H4L1 обладает самой сильной аффинностю (Ко = 2,09Е-09) среди гуманизированных вариантов 9D5.
Пример 9. Дизайн гуманизированных антител 14G8
[00390] Отправной точкой или донорским антителом для гуманизации было мышиное антитело 14G8. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи зрелого ml4G8 представлена как SEQ Ш NO: 61. Аминокислотная последовательность легкой цепи зрелого ml4G8 представлена как SEQ Ш NO: 70. Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи представлены как SEQ Ш NO: 67-69 соответственно (как определено по Кабату). Составная CDR-H1 по Чотия- Кабат представлена как SEQ Ш NO: 118. Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи представлены как SEQ Ш NO: 77-79 соответственно (как определено по Кабату). Вариантная версия CDR1 предоставлена как SEQ Ш NO: 80. В этом примере используется нумерация Kabat.
[00391] Вариабельная каппа (Vk) анититела ml4G8 относится к подгруппе 2 мыши по Кабату, что соответствует подгруппе 2 человека по Кабату. Вариабельная тяжелая (Vh) антитела ml4G8 относится к подгруппе 3d мыши по Кабату, что соответствует подгруппе 1 по Кабату. Смотрите Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242, 1991. CDR-L1 из 16 остатков относится к традиционному классу 3, CDR-L2 из 7 остатков относится к традиционному классу 1, a CDR-L3 из 9 остатков
относится к традиционному классу 1 в Vk. Смотрите Martin & Thornton, J. Mol. Biol. 263:80015, 1996. Составная CDR-H1 из 10 остатков по Чотия- Кабат относится к традиционному классу 1, и CDR-H2 из 17 остатков относится к традиционному классу 1. Смотрите Martin & Thornton, J Mol. Biol. 263:800-15, 1996. CDR-H3 не имеет традиционных классов, но петля из 15 остатков, вероятно, имеет изогнутую основу в соответствии с правилами Shirai et al., FEBS Lett. 455:188-97(1999).
[00392] Остатки в зоне взаимодействия доменов Vk и Vh являются такими, какие обычно можно наблюдать, за исключением L47, поскольку обычно в этой позиции встречается W.
[00393] Был проведен поиск по белковым последовательностям в базе данных PDB (Deshpande et al., Nucleic Acids Res. 33: D233-7, 2005), чтобы найти структуры, которые предоставили бы грубую структурную модель 14G8. Кристаллическая структура Fab с активностью эстеразы (pdb 1MJU) использовалась в качестве модели для структуры Vk. Она была построена с разрешением 1,22 А, и содержит те же традиционные структуры для CDR-Н1 и CDR-H2, и также содержит CDR-H3 такой же длины, с изогнутым основанием. Для структуры Vh использовали Fv-фрагмент антитела 7Е2 - антитела к цитохром-С оксидазе (код pdb 1MQK H). Она имеет разрешение 1,28 А и сохраняет ту же традиционную структуру для петель, как и в 14G8. Программное обеспечение BioLuminate (лицензия от Schrodinger Inc.) использовалось для моделирования грубой структуры 14G8.
[00394] Поиск базы данных из NCBI, не содержащей избыточных белковых последовательностей, позволил выбрать подходящие каркасы антитела человека для переноса CDR мыши. Для Vh были выбраны тяжелые цепи человеческого Ig с идентификационными номерами NCBI AAD30410.1 и ААХ82494.1. Они имеют общие традиционные формы с доменами CDR-H1 и Н2 антитела 14G8, а НЗ AAD30410.1 имеет длину 15 остатков с предсказанным изогнутым основанием. Для Vk были выбраны две человеческие каппа-легкие цепи с идентификационными номерами NCBI АВА71374.1 и АВС66952.1. Они имеют одинаковые традиционные классы для LCDR.
[00395] Были сконструированы три гуманизированных варианта вариабельной области тяжелой цепи и три гуманизированных варианта вариабельной области легкой цепи, содержащие различные перестановки замен (Hul4G8VHvl-3 (SEQ Ш NO: 64-66 соответственно) и Hul4G8VLvl-3 (SEQ Ш NOS: 74-76, соответственно)) (Таблицы 13 и 14). Иллюстративные гуманизированные конструкции Vh и Vk с обратными мутациями и
Гуманизированные области Vh 14G8
другими мутациями, на основе выбранных человеческих каркасов показаны в Таблицах 13 и 14 соответственно. Заштрихованные серым области в первом столбце в Таблицах 13 и 14 обозначают CDR, как определено по Чотия, а заштрихованные серым в остальных столбцах в Таблицах 13 и 14 обозначают CDR, как определено по Кабату. SEQ Ш NOS: 64-66 и 74-76 содержат обратные мутации и другие мутации, как показано в Таблице 15. Аминокислоты в позициях HI, НЗ, Н47, Н105, L8, L9, L19, L26, L36, L60 и L70 в Hul4G8VHvl-3, и в Hul4G8VLvl-3 перечислены в Таблицах 16 и 17.
№ остатка по Чотия
о в
н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
VH 14G8 мыши (SEQ ID NO: 61)
Hu VH Acceptor Fr Acc № AAD30410.1 (SEQ ID NO: 63)
Hu VH Acceptor Fr Acc № AAX82494.1 (SEQ ID NO: 4)
Hul4G8 VHvl (SEQ ID NO: 64)
Hul4G8 VHv2 (SEQ ID NO: 65)
Hul4G8 VHv3 (SEQ ID NO: 66)
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
CDR-Hl
CDR-Hl
CDR-Hl
CDR-
№ остатка по Чотия
о а
1 н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
VH 14G8 мыши (SEQ ID NO: 61)
Hu VH Acceptor Fr Acc № AAD30410.1 (SEQ ID NO: 63)
Hu VH Acceptor Fr Acc № AAX82494.1 (SEQ ID NO: 4)
Hul4G8 VHvl (SEQ ID NO: 64)
Hul4G8 VHv2 (SEQ ID NO: 65)
Hul4G8 VHv3 (SEQ ID NO: 66)
CDR-Н1
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
CDR-H2
CDR-H2
CDR-
№ остатка по Чотия
о а
н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
VH 14G8 мыши (SEQIDNO: 61)
Hu VH Acceptor Fr Асе № AAD30410.1 (SEQ ID NO: 63)
Hu VH Acceptor Fr Acc № AAX82494.1 (SEQ ID NO: 4)
Hul4G8 VHvl (SEQ ID NO: 64)
Hul4G8 VHv2 (SEQ ID NO: 65)
Hul4G8 VHv3 (SEQ ID NO: 66)
52А
52А
CDR-
CDR-Н2
CDR-Н2
CDR-Н2
CDR-Н2
CDR-Н2
CDR-Н2
CDR-Н2
CDR-Н2
CDR-Н2
CDR-Н2
CDR-
№ остатка по Чотия
о в
н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
VH 14G8 мыши (SEQ ID NO: 61)
Hu VH Acceptor Fr Acc № AAD30410.1 (SEQ ID NO: 63)
Hu VH Acceptor Fr Acc № AAX82494.1 (SEQ ID NO: 4)
Hul4G8 VHvl (SEQ ID NO: 64)
Hul4G8 VHv2 (SEQ ID NO: 65)
Hul4G8 VHv3 (SEQ ID NO: 66)
CDR-
CDR-Н2
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
№ остатка по Чотия
о а
н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
VH 14G8 мыши (SEQ ID NO: 61)
Hu VH Acceptor Fr Acc № AAD30410.1 (SEQ ID NO: 63)
Hu VH Acceptor Fr Acc № AAX82494.1 (SEQ ID NO: 4)
Hul4G8 VHvl (SEQ ID NO: 64)
Hul4G8 VHv2 (SEQ ID NO: 65)
Hul4G8 VHv3 (SEQ ID NO: 66)
Fr3
82А
82А
Fr3
82В
82В
Fr3
82С
82С
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
CDR-
100
CDR-
101
CDR-
№ остатка по Чотия
о а
н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
VH 14G8 мыши (SEQIDNO: 61)
Hu VH Acceptor Fr Асе № AAD30410.1 (SEQ ID NO: 63)
Hu VH Acceptor Fr Acc № AAX82494.1 (SEQ ID NO: 4)
Hul4G8 VHvl (SEQ ID NO: 64)
Hul4G8 VHv2 (SEQ ID NO: 65)
Hul4G8 VHv3 (SEQ ID NO: 66)
102
CDR-
103
CDR-
100
100
104
CDR-
100 А
100 А
105
CDR-
100 В
100 В
106
CDR-
100 С
100 С
107
CDR-
100 D
100 D
108
CDR-
100 Е
100 Е
109
CDR-
100F
100F
CDR-
100 G
100 G
111
CDR-
101
101
112
CDR-
102
102
113
CDR-
№ остатка по Чотия
о а
1 н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
Vb 14G8 мыши (SEQ ID NO: 70)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABA71374.1 (SEQ ID NO: 72)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952.1 (SEQ ID NO: 73)
Hul4G8 VLvl (SEQ ID NO: 74)
Hul4G8 VLv2 (SEQ ID NO: 75)
Hul4G8 VLv3 (SEQ ID NO: 76)
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
Frl
№ остатка по Чотия
о в
н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
Vb 14G8 мыши (SEQ ID NO: 70)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABA71374.1 (SEQ ID NO: 72)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952.1 (SEQ ID NO: 73)
Hul4G8 VLvl (SEQ ID NO: 74)
Hul4G8 VLv2 (SEQ ID NO: 75)
Hul4G8 VLv3 (SEQ ID NO: 76)
CDR-L1
CDR-L1
CDR-L1
CDR-L1
27А
27А
CDR-L1
27В
27В
CDR-L1
27С
27С
CDR-L1
27D
27D
CDR-L1
27Е
27Е
CDR-L1
27F
27F
CDR-L1
CDR-L1
CDR-L1
№ остатка по Чотия
о а
н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
Vb 14G8 мыши (SEQ ID NO: 70)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABA71374.1 (SEQ ID NO: 72)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952.1 (SEQ ID NO: 73)
Hul4G8 VLvl (SEQ ID NO: 74)
Hul4G8 VLv2 (SEQ ID NO: 75)
Hul4G8 VLv3 (SEQ ID NO: 76)
CDR-L1
CDR-L1
CDR-L1
CDR-L1
CDR-L1
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
Fr2
№ остатка по Чотия
о в
н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
Vb 14G8 мыши (SEQ ID NO: 70)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABA71374.1 (SEQ ID NO: 72)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952.1 (SEQ ID NO: 73)
Hul4G8 VLvl (SEQ ID NO: 74)
Hul4G8 VLv2 (SEQ ID NO: 75)
Hul4G8 VLv3 (SEQ ID NO: 76)
Fr2
Fr2
Fr2
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
№ остатка по Чотия
о а
н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
Vb 14G8 мыши (SEQ ID NO: 70)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABA71374.1 (SEQ ID NO: 72)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952.1 (SEQ ID NO: 73)
Hul4G8 VLvl (SEQ ID NO: 74)
Hul4G8 VLv2 (SEQ ID NO: 75)
Hul4G8 VLv3 (SEQ ID NO: 76)
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
№ остатка по Чотия
о а
н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
Vb 14G8 мыши (SEQ ID NO: 70)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABA71374.1 (SEQ ID NO: 72)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952.1 (SEQ ID NO: 73)
Hul4G8 VLvl (SEQ ID NO: 74)
Hul4G8 VLv2 (SEQ ID NO: 75)
Hul4G8 VLv3 (SEQ ID NO: 76)
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
Fr3
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
CDR-
100
CDR-
101
CDR-
102
CDR-
№ остатка по Чотия
о а
н о о
Линейний № остатка
FR или CDR
Vb 14G8 мыши (SEQ ID NO: 70)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABA71374.1 (SEQ ID NO: 72)
Hu VL Acceptor Fr Acc № ABC66952.1 (SEQ ID NO: 73)
Hul4G8 VLvl (SEQ ID NO: 74)
Hul4G8 VLv2 (SEQ ID NO: 75)
Hul4G8 VLv3 (SEQ ID NO: 76)
103
Fr4
104
Fr4
100
100
105
Fr4
101
101
106
Fr4
102
102
107
Fr4
103
103
108
Fr4
104
104
109
Fr4
105
105
Fr4
106
106
111
Fr4
106 А
106 А
112
Fr4
107
107
113
Fr4
Обратные мутации и другие мутации VH, VL
Вариант VH или VL
Последовательность экзона акцептора VH или VL
Остатки каркаса донора
Остатки CDR по Кабату
Hul4G8VHvl (SEQ ID NO: 64)
Идентификационные номера NCBI AAD30410.1 и ААХ82494.1
(SEQ ID NO: 63 и 4 соответственно)
Н1,НЗ,Н47,Н105
Hul4G8VHv2 (SEQ ID NO: 65)
Идентификационные номера NCBI AAD30410.1 и ААХ82494.1
(SEQ ID NO: 63 и 4 соответственно)
HI, Н47
Hul4G8VHv3 (SEQ ID NO: 66)
Идентификационные номера NCBI AAD30410.1 и ААХ82494.1
(SEQ ID NO: 63 и 4 соответственно)
HI, Н47
Hul4G8VLvl (SEQ ID NO: 74)
Идентификационные номера NCBI АВА71374.1 и АВС66952.1
(SEQ ID NO: 72 и 73 соответственно)
L8, L9, L19, L36, L70
Hul4G8VLv2 (SEQ ID NO: 75)
Идентификационные номера NCBI АВА71374.1 и АВС66952.1
(SEQ ID NO: 72 и 73 соответственно)
L36
Hul4G8VLv3 (SEQ ID NO: 76)
Идентификационные номера NCBI АВА71374.1 и АВС66952.1
(SEQ ID NO: 72 и 73 соответственно)
L36, L60
L26
Таблица 16
Нумерация остатков каркаса и CDR по Кабату для обратных мутации и других мутаций в гуманизированных областях VH антитела 14G8
Нумерация остатков каркаса и CDR по Кабату для обратных мутации и других мутаций в гуманизированных областях VL антитела 14G8
Оста-ток
АВА71374.1 Легкая цепь
АВС66952.1 Легкая цепь
14G8 мыши
Hul4G8 VLvl
Hul4G8 VLv2
Hul4G8 VLv3
L19
L26
L36
L60
L70
[00396] Выравнивание последовательности Vh 14G8 мыши (SEQ Ш N0: 61) с модельной последовательностью мыши (1MJU L, SEQ Ш N0: 62), последовательностями акцептора человека (AAD30410.1 и ААХ82494.1; SEQ ID N0: 63 и 4, соответственно) и последовательностями Hul4G8VHvl, Hul4G8VHv2, и Hul4G8VHv3 (SEQ ГО NO: 64-66, соответственно) показаны на Фиг. 2А. Последовательности CDR, как определено по Кабату, заключены в рамки, за исключением того, что первая охватывающая рамка является совмещением CDR-H1 по Чотия и CDR-H1 по Кабату, с подчеркнутым и выделенным
полужирным шрифтом CDR-H1 по Кабату. Позиции, в которых канонические, верниальные или интерфейсные остатки различаются между последовательностями акцепторов мыши и человека, являются кандидатами на замещение. Примеры верниальных/CDR-ocHOBHbix остатков включают остатки 2, 49, 69, 71, 75, 80 и 94 по нумерации Kabat в Таблице 13. Примеры традиционных/СТЖ-взаимодействующих остатков включают остатки 24, 48 и 73 по нумерации Kabat в Таблице 13. Примеры остатков интерфейса/упаковки (VH + VL) включают остатки 37, 39, 44, 47, 91, 93 и 103 по нумерации Kabat в Таблице 13.
[00397] Выравнивание мышиного 9D5 Vk 14G8 (SEQ Ш NO: 70) с модельной последовательностью мыши (1MJU L, SEQ Ш NO: 71), последовательностями акцептора человека (АВА71374.1 и АВС66952.1; SEQ ID NOS: 72 и 73, соответственно), и последовательностями Hul4G8VLvl, Hul4G8VLv2, Hul4G8VLv3 (SEQ ID NOS: 74-76, соответственно) показаны на Фиг. 2В. Последовательности CDR, как определено по Кабату, заключены в рамки, за исключением того, что первая охватывающая рамка является совмещением CDR-H1 по Чотия и CDR-H1 по Кабату, с подчеркнутым и выделенным полужирным шрифтом CDR-H1 по Кабату. Позиции, в которых канонические, верниальные или интерфейсные остатки различаются между последовательностями акцепторов мыши и человека, являются кандидатами на замещение. Примеры верниальных/CDR-ocHOBHbix остатков включают остатки 4, 35, 46, 49, 66, 68 и 69 по нумерации Kabat в Таблице 14. Примеры традиционных/СТЖ-взаимодействующих остатков включают остатки 2, 48, 64 и 71 по нумерации Kabat в Таблице 14. Примеры остатков интерфейса/упаковки (VH + VL) включают остатки 36, 38, 44, 47, 87, и 98 по нумерации Kabat в Таблице 14.
[00398] Обоснования выбора позиций, указанных в Таблицах 15 и 17, в вариабельной области легкой цепи в качестве кандидатов для замены, следующие.
[00399] Р8А: пролин имеет решающее значение для формирования структуры, а потеря или добавление пролина может влиять на структуру. Были разработаны обратные мутации для того, чтобы избежать "добавления пролина". Однако, поскольку А в этой позиции редко встречается в каркасах IgG человека, Р был включен в некоторые варианты.
[00400] L9P: пролин имеет решающее значение для формирования структуры, а потеря или добавление пролина может влиять на структуру. Были разработаны обратные мутации для того, чтобы избежать "потери пролина". Однако, поскольку Р в этой позиции редко встречается в каркасах IgG человека, L был включен в некоторые варианты.
[00401] A19V: А и V имеют аналогичные частоты в каркасах человека. Оба остатка были включены в отдельные варианты.
[00402] N26S: L26 представляет собой сайт N-гликозилирования в CDR1 легкой цепи. Мутация в S уменьшает N-гликозилирование и дает более гетерогенный продукт.
[00403] Y36F: Это интерфейсный остаток. В некоторых вариантах была сделана замена для того, чтобы сохранить остаток мыши в этом остатке интерфейса.
[00404] D60S: D и S сходны по частоте в каркасах IgG человека. S применяется большинством коммерчески доступных терапевтических антител, поэтому D был заменен на S в некоторых вариантах.
[00405] D70A: D встречается гораздо чаще, чем А в каркасах IgG человека. Однако D образует ионную связь с R24 в CDR1 легкой цепи, поэтому как А, так и D включены в отдельные варианты.
[00406] Обоснования выбора позиций, указанных в Таблицах 15 и 16, в вариабельной области тяжелой цепи в качестве кандидатов для замены, следующие.
[00407] Q1E: Преобразование глутамата (Е) в пироглутамат (рЕ) происходит медленнее, чем из глютамина (Q). Антитела становятся более кислотными из-за потери первичного амина глютамином при преобразовании в рЕ. Неполное преобразование создает гетерогенность в антителе, которую можно наблюдать как множественные пики, используя аналитические способы на основе заряда. Различия в гетерогенности могут указывать на отсутствие контроля процесса.
[00408] Q3K: Q чаще встречается в каркасах IgG человека. К реже, но не является редким. Оба остатка были включены в отдельные варианты.
[00409] W47L: Это интерфейсный остаток. В некоторых вариантах была сделана замена для того, чтобы сохранить остаток мыши в этом остатке интерфейса.
[00410] Q105T: Т может образовывать водородную связь с КЗ, поэтому Т был включен в некоторые варианты для поддержания конформационной структуры VH.
[00411] Поскольку для гуманизации вариабельной области легкой цепи 14G8 использовались два акцепторных каркаса человека (АВА71374.1 и АВС66952.1 (SEQ Ш NOS: 72 и 73, соответственно)), существуют определенные позиции каркаса, которые имеют
разные аминокислоты в двух акцепторных каркасах. Гуманизированные варианты вариабельной области легкой цепи 14G8 могут содержать одну из двух таких аминокислот в этой позиции. Примером остатка, в котором эти два акцептора отличаются, является позиция L18 (S или Р) по нумерации Kabat. Обоснование выбора одной аминокислоты или другой в этой позиции заключается в следующем.
[00412] L18 (S или Р): Р в этой позиции встречается реже. Была опробована мутация на S для того чтобы, снизить искривление петли.
[00413] Поскольку для гуманизации вариабельной области зрелой тяжелой цепи 14G8 использовались два акцепторных каркаса человека (AAD30410.1 и ААХ82494.1 (SEQ Ш N0: 63 и 4, соответственно)), существуют определенные позиции каркаса, которые имеют разные аминокислоты в двух акцепторных каркасах. Гуманизированные варианты вариабельной области тяжелой цепи 14G8 могут содержать любую из таких аминокислот в этой позиции. Примеры остатков, в которых эти два акцептора различаются, включают позиции Н82а (N или S), Н83 (R или К), Н84 (А или S) и Н89 (V или М) по нумерации Kabat. Обоснования выбора одной аминокислоты или другой в этих позициях заключаются в следующем.
[00414] Н82а (N или S): N и S имеют аналогичную частоту в 82а. Они также являются человеческими остатками в двух шаблонах VH человека. S и N были включены в отдельные варианты.
[00415] Н83 (R или К): К в каркасной области 3 находиться близко к поверхности области связывания CDR. Замена его на R может препятствовать размещению антигена. R встречается наиболее часто, и К является третьим по частоте встречаемости в человеческих каркасах в этой позиции. R и К были включены в отдельные варианты.
[00416] Н84 (А или S): S и А присутствуют в двух рассмотренных каркасах, поэтому каждый остаток был опробован в отдельных вариантах.
[00417] Н89 (V или М): V и М присутствуют в двух рассмотренных каркасах, поэтому каждый остаток был опробован в отдельных вариантах.
[00418] Три варианта вариабельной области гуманизированной легкой цепи и три варианта вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи являются следующими:
[00419] Hul4G8VL вариант 1 (P8A, L9P, A19V, Y36F, D70A замены показаны нижним регистром):
DIVMTQSapSLPVTPGESvSISCRSNKSLLHSNGNTYLYWfLQKPGQSPQLLIYRVSNLASGVP DRFSGSGSGTaFTLKISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPLTFGQGTKLEIKR (SEQ Ш NO: 74)
[00420] Hul4G8VL вариант 2 (замена L36F показана нижним регистром):
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSNKSLLHSNGNTYLYWfLQKPGQSPQLLIYRVSNLASGV PDRF S GS GS GTDF TLKISRVE AED VGV Y YCMQHLE YPLTF GQGTKLEIKR (SEQ Ш NO: 75)
[00421] Hul4G8VL вариант 3 (замены N26S, L36F и D60S показаны нижним регистром):
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSsKSLLHSNGNTYLYWfLQKPGQSPQLLIYRVSNLASGVP sRFSGSGSGTDFTLKISRVE AED VGVYYCMQHLEYPLTF GQGTKLEIKR (SEQ Ш NO: 76)
[00422] Hul4G8VH вариант 1 (замены Q1E, Q3K, W47L и Q105T показаны нижним регистром):
eVkLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLElVAEINNSGDTTYYPD TVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGtGTLVT VSS (SEQ Ш NO: 64)
[00423] Hul4G8VH вариант 2 (замены Q1E и W47L показаны нижним регистром):
eVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLElVAEINNSGDTTYYPD TVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQGTLV TVSS (SEQ Ш NO: 65)
[00424] Hul4G8VH вариант 3 (замены Q1E и W47L показаны нижним регистром):
eVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLElVAEINNSGDTTYYPD TVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYYYGGGYGGWFFDVWGQGTLV TVSS (SEQ Ш NO: 66)
Пример 10. Кинетический анализ связывания гуманизированных антител 14G8
[00425] Кинетика связывания трех гуманизированных вариантов 14G8 и 14G8 мыши с рекомбинантным человеческим TTR F87M/L110M исследовали с помощью Biacore, как показано в Таблице 18. Анти-человеческий (GE Healthcare) был иммобилизован на сенсорном чипе С 5 (без цепей декстрана) через аминовое соединение в соответствии с инструкциями,
представленными в анти-человеческом наборе GE Healthcare, a mAb были захвачены до уровня, чтобы обеспечить максимальное связывание аналита до 30-50 RU. Различные концентрации аналита (рекомбинантный человеческий TTR F87M/L110M) пропускали через захваченный лиганд при 50мкл/мин в подвижном буфере (HBS + 0,05% Р-20, 1 мг/мл БСА) в 3-кратных разведениях. Для каждой концентрации реакция протекала в течение времени, позволяющем более высоким концентрациям аналита достичь равновесия во время ассоциации, а также по меньшей мере 10% сигнала до распада во время диссоциации. По меньшей мере одна концентрация (не самая высокая или самая низкая) была проанализирована с дублирующей пробой. Диапазоны концентрации аналита были выбраны на основе предварительных экспериментов, чтобы охватить пределы измерений по меньшей мере от в 10 раз выше KD до в 10 раз ниже KD.
Аффинность связывания антигена антителами 14G8 к TTR человека (F87M/L1 ЮМ)
[00426] В Таблице 18 приведены скорость ассоциации (ка), скорость диссоциации (к^) и константа аффинности связывания (KD) МЫШИНОГО 14G8, химерного- 14G8, Hul4G8 H2L1, Hul4G8 H2L2, Hul4G8H2L3, и Hul4G8 H3L1 с рекомбинантным TTRF87M/L110M человека. Как показано в Таблице 18, антитела Hul4G8 и 14G8 мыши имеют сходные аффинности связывания TTR.
[00427] 14G8 мыши, химерное 14G8 и другая гуманизированная версия 14G8 без изменений в LCDR1 показали наличие дополнительных легких цепей при ДСН-ПААГ электрофорезе при восстанавливающих условиях. Анализ последовательности показал, что в
LCDR1 имеется сайт N-гликозилирования в остатке 26 по нумерации Kabat. Этот сайт N-гликозилирования может вызывать потенциальные проблемы гетерогенности при производстве. Мутация N в остатке L26 в Hul4G8VLv2 давала Hul4G8VLv3. Гуманизированные антитела, имеющие Hul4G8VLv3, показывают только одну легкую цепь при ДСН-ПААГ электрофорезе в восстановительных условиях, тем самым устраняя потенциальную проблему гетерогенности. Аффинность связывания антигена антителом Hul4G8 H2L3 аналогична таковой родительского антитела мыши и химерного антитела.
Пример 11. Материалы и способы
a. Протокол создания антител
[00428] Мышей иммунизировали еженедельно антигенными пептидами TTR-MAP, TTR89-97-N-KLH или TTR89-97-C-KLH в адъюванте RIBI, или ежемесячно в адъюванте TiterMax. За три-четыре дня до гибридизации иммунитет выбранных мышей стимулировали четвертый раз иммуногеном в физиологическом растворе. Селезенку гомогенизировали для получения спленоцитов и их гибридизировали с клетками миеломы SP2/0 с использованием стандартного протокола электрогибридизации. Гибридные клетки в селективной среде высевали в 96-луночные плашки и подвергали скринингу через 7-10 дней.
b. Протокол скрининга антител
[00429] Отбор гибридомы основывался на следующем скрининге с помощью ELISA: 96-луночные плашки ELISA покрывали куриным анти-His, 1 мкг/мл ФСБ и инкубировали в течение 1 часа. Плашки блокировали 1% раствором БСА/ФСБ, 200 мкл/лунка в течение 15 минут, затем добавляли 0,5 мкг/мл pH4-TTR, 50 мкл/лунка и инкубировали в течение 1 часа. pH4-TTR представляет собой TTR который подвергли воздействию низкого рН (50 мМ ацетата натрия, рН 4,0) для того, чтобы диссоциировать/агрегировать TTR с целью экспонировать эпитоп TTR89-97. Плашки дважды промывали TBS-T. Добавляли супернатант из плашек гибридизации, 50 мкл/лунку и инкубировали в течение 1 часа. Плашки дважды промывали TBS-T. Добавляли антитело обнаружения, козье-антимышиное (IgGl, 2а, 2Ь, 3 специфичное)-1ЖР, разбавленное 1:5000 в 0,5% БС А/ФСБ/ТВ S-T, 50 мкл/лунка, и инкубировали в течение 1 часа. Наконец, плашки промывали пять раз субстратом TBS-T и ТМВ, добавляли 100 мкл/лунка. Через 15 минут проявление субстрата останавливали 2N серной кислотой, 50 мкл/лунка. Плашки считывали при 450 нм. Были выбраны лунки с OD> 1,0, и клетки переносили в 24-луночную плашку. Через 3 дня роста клоны подвергали
вторичному (counter) скринингу с помощью вышеуказанного анализа для подтверждения связывания, и заменяя нативный TTR на pH4-TTR в качестве отрицательного вторичного скрининга, что позволяет выбирать клоны, продуцирующие mAb к TTR, специфичные к ненативным формам TTR.
c. Протоколы экспрессии антител
[00430] Плазмиды с легкой цепью и тяжелой цепью, под контролем CMV, несущие гуманизированные последовательности моноклональных антител, трансфицировали в клетки CHO-S1 (Life Technology). Был применен двойной отбор, чтобы создать выборочный пул. Частично использованную клетками среду анализировали по титру, связывали и анализировали с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза/Вестерн-блоттинга. Выбранные пулы использовались для создания клонов с применением системы Clonepix (Molecular Devices). Клоны были ранжированы на основе титра антител. Выбранные клоны были размножены, и были созданы их стоки.
[00431] Самый высокопродуктивный клон размножали во встряхиваемых колбах, и культуру использовали для инокуляции 10-25-литровых одноразовых биореакторов (WAVE Biotech). Смесь сред экспрессии FreeStyle-CHO, CD OptiCHO и FreeStyle F17, дополненных Glutamax (среда и Glutamax от Life Technology), использовали в встряхиваемых колбах, а также для культур в одноразовых биореакторах. Одноразовую (batch) культуру получали с использованием волновогобиореактора (GE Healthcare) при 37°С, 7% СОг при постоянном перемешивании. Образцы периодически отбирали для контроля количества клеток, жизнеспособности и продуцирования антител. При необходимости вносили добавку Cell Boost (HyClone). Одноразовую культуру собирали, когда жизнеспособность клеток начинала становится ниже 90% (5-7 дней).
d. Протокол очистки антител
[00432] Культуру клеток собирали после того, как сперва позволяли клеткам в суспензии оседать на дно одноразового биореактора под действием силы тяжести при 4°С. Собранную среду очищали через поровый фильтр (Millistak Pod СОНС, Millipore), концентрировали 10-кратно с помощью фильтрования тангенциальным потоком (Pelicon 2PLC 30К, Millipore) и стерильно фильтровали через фильтр 0,2 мкм (Opticap XL, Millipore). Концентрированную частично использованную клетками среду затем загружали в колонку Protein G Sepharose Fast Flow (GE Lifesciences), предварительно уравновешенную в 1хФСБ, рН 7,4, используя FPLC
(Akta Avant, GE Lifesciences). Несвязанные белки смывали с колонки 5-10 объемами колонки 1хФСБ, рН 7,4 до достижения OD280 исходного уровня. Связанное антитело элюировали из колонки 2 объемами колонки буфером IgG Elution Buffer (Thermo Scientific). Фракции элюата собирали, и делали рН нейтральным с помощью 2М-ного Tris, рН 9,0 (60 мкл на 1 мл элюата).
[00433] Антителосодержащие фракции объединяли и диализовали в течение ночи при 4 °С против 1> <ФСБ, рН 7,4. Затем диализованный образец стерилизовали ультрафильтрацией через 0,2 мкм PES-фильтр и хранили при 4 °С. Конечную концентрацию белка определяли бицинхониновой кислотой (ВСА - bicinchoninic acid) с использованием бычьего гамма-глобулина в качестве стандарта белка (Thermo Scientific).
е. Протоколы экспрессии и очисткирекомбинантного TTR
[00434] Клетки Е. coli (BL21-A1) трансформировали плазмидой рЕТ21а(+), содержащей вставку TTR (Met-hTTR-(His)6 или вариант TTR, содержащий двойную мутацию F87M/L110M. Клетки выращивали в бульоне 2YT, содержащем 100 мкг/мл ампициллина. Экспрессию TTR индуцировали в течение ночи при 20 °С в присутствии 1 мМ IPTG и 005% арабинозы.
[00435] Клетки собирали центрифугированием при 4000xg в течение 10 мин. И хранили при -80 °С до использования. 10-15 г клеточного осадка оттаивали и лизировали в 50 мл буфера А (1хФСБ, содержащий 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазола) путем использования высокоскоростного прибора измельчения LV-1 (Microfluidics, Inc.). Лизированные клетки центрифугировали при 12,000 х g в течение 15 мин, фильтровали через 0,2 мкм PES-фильтр перед очисткой на колонке His-Trap HP (GE Lifesciences). После загрузки, колонку промывали 10 объемами колонки буфером А и элюировали буфером В (1> <ФСБ 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол). Пиковые фракции, соответствующие TTR, собирали, диализировали против 1хФСБ и хранили при -80°С до использования.
/ Приготовление антигена TTR
[00436] Нативный антиген TTR готовили путем разбавления концентрированного стока рекомбинантного TTR-6His до конечной концентрации 2,5 мкг/мл буфером 1хфСБ. Обработанный рН4 TTR получали путем инкубации рекомбинантного TTR в 50 мМ ацетате натрия в концентрации 0,2 мг/мл, рН 3,95, в течение 72 часов при комнатной температуре. В этих условиях TTR диссоциирует на смесь мономеров и агрегированных форм TTR, которые структурно отличаются от нативного TTR. pH4-TTR затем разбавляли до конечной
концентрации 2,5 мкг/мл в 1хФСБ непосредственно перед использованием в анализе. 96-луночные плашки (Costar № 3690) покрывали куриным анти-his поликлональным антителом при комнатной температуре 50 мкл на лунку 1,0 мкг/мл (Abeam № АЬ9107) в lxPBS в течение 1 часа. Раствор для покрытия отбрасывали и плашку блокировали 250 мкл на объем лунки 1* БСА-содержащего блок-буфера, разбавленного в 1хФСБ (G-Biosciences № 786-193) в течение 1 часа.
g. Протокол ELISA
[00437] Покрытые и блокированные 96-луночные плашки обрабатывали TTR-антигеном 50 мкл на лунку 2,5 мкг/мл (либо нативный TTR, либо pH4-TTR) в течение 1 часа при комнатной температуре. Плашки затем дважды промывали 250 мкл/лунка промывочного буфера (1хТрис-буферный солевой раствор, содержащий 0,05% Tween-20). Затем промытые плашки обрабатывали 50 мкл/лунка соответствующего моноклонального антитела против TTR в концентрациях от 0,31 до 2,5 мкг/мл в течение 1 часа.
[00438] Обработанные плашки промывали 3 раза 250 мкл/лунка промывочного буфера. После промывки, плашки обрабатывали в течение 1 часа 50 мкл/лунка детектирующего антитела, содержащего разведенное 1:5000 в 1хФСБ анти-мышиное пероксидаза-конъюгированное антитело козы (Jackson ImmunoResearch № 115-035-164). Затем плашки промывали 3 раза перед добавлением 100 мкл субстрата ТМВ/лунка (Rockland). Реакции HRP (пероксидаза хрена) разрешали продолжаться при комнатной температуре в течение 15 мин. до гашения (quenching) 50 мкл IN H2SO4 на объем лунки. Спектроскопическая абсорбция измерялась при длине волны равной 450 нм.
h. ДСН-ПААГ электрофорез
[00439] Электрофорез в ДСН-полиакриламидных гелях проводили следующим образом. 0,1-1 мкг TTR или рН 4,0-TTR в буфере для образцов lxLDS (Life Technologies) загружали на 10% -ный гель NusPage bis-tris и подвергали электрофорезу в буфере MES при постоянных 90 В в течение 105 минут. После электрофореза гель или окрашивали в Instant Blue (Expedeon), или переносили на нитроцеллюлозные фильтры для Вестерн-блоттинга.
/'. Нативный ПААГ электрофорез
[00440] Электрофорез на нативных Трис-глициновых гелях проводили следующим образом. 0,1-1 мкг TTR или рН 4,0 TTR в 1> <Триц-глициновом (Life Technologies) буфере для
образцов загружали в 10-20% Трис-глициновый-гель и подвергали электрофорезу в 1х нативном Трис-глициновом буфере пробега при постоянных 120В в течении 105 минут. После электрофореза гель или окрашивали в Instant Blue (Expedeon), или переносили на нитроцеллюлозные фильтры для Вестерн-блоттинга.
j. Вестерн-блоттинг
[00441] ДСН- или нативный ПААГ гели были блоттированы на нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу (iBlot, программу Р7) и заблокированы буфером для блокировки (Licor) в течение 30 минут. Затем фильтры инкубировали в 0,5 мкг/мл первичного антитела в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре (или в течение ночи при 4 ° С), а затем следовали три промывки lxTBS, каждая по 10 минут. Фильтры помещали в IRDye 800С\У-конъюгированное вторичное антитело козы против мыши, разбавленное 1:20000 в буфере для блокирования. После инкубации фильтров в растворе вторичных антител в течение 1 часа при комнатной температуре фильтры промывали и отображали на инфракрасном тепловизоре Odyssey CLx (Licor).
к. Протокол анализа формирования фибрилл TTR
[00442] Раствор 3,6 мкМ (0,2 мг/ мл) TTR-Y78F в 50 мМ ацетате натрия, рН 4,8, инкубировали при 37 °С в течение 72 часов в присутствии 1,4 мкМ (0,2 мг/мл) антитела к mis-TTR, или с изотипным контролем. После инкубации к смеси добавляли 5Х молярный избыток тиофлавина-Т и оставляли связываться в течение 30 минут. Флуорометрические измерения проводили при длине волны излучения равной 480 нм с длиной волны возбуждения, установленной на 440 нм. Ингибирование равное 0 % устанавливали, как интенсивность флуоресценции в присутствии изотипного контрольного антитела (83 п. е.) и точку 100%-ного ингибирования устанавливали, как флуоресценцию в отсутствие белка TTR-Y78F (38 п. е.).
[00443] Стоковый раствор TTR-V122I (примерно 5 мг/мл) разбавляли в буфере с конечными концентрациями TTR 0,2 мг/мл, 30 мМ ацетата натрия, 5 мМ фосфата натрия, 100 мМ КС1, 1 мМ ЭДТА, 0,02% азида натрия, и различными концентрациями моноклонального антитела при рН 7,2. Этот образец диализовали против того же буфера при рН 4,5 в течение 3 ч при комнатной температуре. Образцы затем инкубировали при 37 °С в течение 72 часов. После инкубации к смеси добавляли 5Х молярный избыток тиофлавина-Т и оставляли связываться в течение 30 минут. Наблюдение флуоресценции тиофлавина-Т осуществляли с
использованием спектрофлуориметра Photon Technology International C60. Варьировали коэффициент усиления фотоумножителя, а ширину входной щели возбуждения и излучения устанавливали в пределах 2-4 нм, чтобы максимизировать сигнал по отношению к шуму. Измерения флуоресценции проводились с использованием 430 нм и 480 нм в качестве длин волн возбуждения и излучения, соответственно.
[00444]
/. Образцы сердечной ткани
[00445] Свежезамороженные и обработанные парафином блоки сердечной ткани с подтвержденными диагнозами мутаций ATTR были получены от доктора Меррилл Бенсона в Университете Индианы. Образцы включали восемь свежих замороженных образцов и шесть образцов FFPE, и для каждого образца был поставлен диагноз ATTR или какой-либо другой сердечный амилоидоз. Диагноз для ткани был дополнительно подтвержден в Prothena с помощью окрашивания ШС антителами к каппа и лямбда-легким цепям и амилоиду А перед исследованием антител TTR.
т. Иммуногистохимия
[00446] Иммуногистохимия была выполнена на слегка закрепленных параформальдегидом, 10 мкм криосрезах и на 5 мкм парафиновых срезах. Способ с иммунопероксидазой был основной системой детектирования, которое было выполнено на Leica Bond Rx (Leica Biosystems, Буффало-Гроув, Иллинойс) с использованием набора для определения Refine Bond Polymer Refine Detection Kit (DS980, Leica Biosystems). Первичные антитела инкубировали в течение одного часа (в соответствии с концентрациями в Таблице 2) с последующей инкубацией с конъюгатами анти-мышиных и анти-кроличьих антител с полимерным HRP-линкером. Окрашивание визуализировали с помощью хромогена DAB, который продуцировал коричневый осадок. Микропрепараты докрашивали гематоксилином, обезвоживали в восходящей серии спиртов, очищали в ксилолах и накрывали покрывным стеклом CytoSeal 60 (Richard Allen Scientific, Каламазу, Мичиган). Отрицательный контроль заключался в проведении всей иммуногистохимической процедуры на срезах соседних участков ткани с неиммунным изотипным контролем IgG или в отсутствие первичного антитела.
п. Обнаружение амилоида: покраска Congo Red и тиофлавином-Т
[00447] Окрашивание Congo red проводили для обнаружения TTR амилоида в ткани применяя набор от American MasterTech (Л од и, Калифорния). Окрашивание проводили в соответствии с процедурой рекомендованной изготовителем. Микропрепараты окрашивали раствором Congo Red в течение 1 часа с последующей дифференциацией в 1%-ном гидроксиде натрия в течение примерно 15 секунд. Затем микропрепараты ополаскивали в проточной воде, обезвоживали с помощью серии спиртов с возрастающими концентрациями, и очищали с помощью трех смен ксилолов, и накрывали покрывным стеклом CytoSeal 60.
[00448] Для определения присутствия TTR амилоида в ткани использовали модифицированный протокол окрашивания тиофлавином-Т (Schmidt et al., 1995). Если коротко, микропрепараты докрашивали с помощью гематоксилина Маера, промывали проточной водой и окрашивали отфильтрованным 0,015% раствором тиофлавина-Т (Т3516-25G, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) в 50% этаноле в течение десяти минут. Затем микропрепараты промывали в проточной воде и дифференцировали в 1% (об./об.) уксусной кислоте в течение 10 минут и промывали три раза в воде. Микропрепаратам давали высохнуть на воздухе до того, как они были покрыты ProLong Gold (Life Technologies).
о. Анализ изображений
[00449] Микропрепараты визуализировали или с помощью микроскопа Olympus ВХ61, или с помощью цифрового сканера микропрепаратов Hamamatsu Nanozoomer 2.0НТ, либо спектральной конфокальной системы Leica SPE. Изображения собирали и сохраняли в виде файлов TIFF.
р. Анализ образцов плазмы человека с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза/Вестерн-блоттинга
[00450] Шесть образцов плазмы от пациентов, с подтвержденным V30M ATTR (образец № 11, № 12, № 15, № 18, № 19, № 20) и 6 образцов от обычных субъектов (№ 21, № 22, № 23, № 24, № 25, № 27) были получены от М. Сарайва (М. Saraiva) (Университет Порту, Португалия). Образец № С6 был обычным образцом человеческой сыворотки, полученным из коммерческого источника (BioreclamationlVT). Эти образцы плазмы разделяли с помощью ДСН-ПААГ электрофореза, и проводили Вестерн-блоттинг с 9D5 или 5А1 следующим образом. Объем плазмы равный 1,4 мкл разбавляли 1:8 в lxLDS буфер для образца в отсутствие восстановителя (Life Technologies). Образцы подвергали разделению с помощью
ДСН-ПААГ электрофореза, и Вестерн-блоттингу с использованием 0,5 мкг/мл 9D5 или 5А1, как описано ранее.
q. Анализ образцов плазмы человека с помощью плашечного анализа MesoScale Discovery (MSD)
[00451] 96-луночные плашки MSD покрывали моноклональным антителом 6С1 в концентрации 4 мкг/мл в ФСБ и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре со встряхиванием, или в течение ночи при 4 °С. Плашки промывали три раза lxTBST перед блокировкой 3% раствором MSD Blocker А, 150 мкл/лунка в течение 1 часа встряхивания. К заблокированным плашкам MSD добавляли 30 мкл на объем лунки образцов человеческой плазмы, разведенных 1:10 в буфере для образцов, состоящем из 0,6% бычьего сывороточного альбумина без глобулинов, 1,5 мМ одноосновного фосфата натрия, 8 мМ двухосновного фосфата натрия, 145 мМ хлорида натрия, 0,05% Triton Х- 405 и 0,05% тимеросала, на 1 час. Плашки промывали 3 раза lxTBST. На 1 час добавляли 50 мкл на объем лунки 1 мкг/мл сульфомеченного детектирующего антитела (или 8СЗ антитело к всем TTR, или поликлональное антитело Dako) в буфере для образцов при комнатной температуре со встряхиванием. Плашки промывали три раза lxTBST с последующим добавлением 150 мкл/лунка раствора IX Read Buffer Т (Meso Scale Discovery). Плашки затем считывали устройством визуализации MSD Sector.
г. Построение стандартной кривой MSD
[00452] Чтобы количественно определить количество ненативного 6С1-реакционноспособного TTR-белка, присутствующего в образцах плазмы человека, стандартную кривую MSD строили с использованием рекомбинантного TTR-F87M/L1 ЮМ в качестве 6С1-реакционноспособного стандарта TTR. Этот вариант TTR содержит две аминокислотные замены, которые препятствуют образованию тетрамеров и удерживают белок в мономерном состоянии (Jiang et al. (2001) Biochemistry 40, 11442-11452). Таким образом, этот вариант TTR распознается всеми mAb к mis-TTR и поэтому хорошо подходит для использования в качестве эталонного стандарта в анализе MSD.
[00453] Чтобы получить стандартную кривую 96-луночные плашки MSD покрывали моноклональным антителом 6С1 к mis-TTR в концентрации 4 мкг/мл в ФСБ и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре со встряхиванием, или в течение ночи при 4 ° С. Плашки промывали три раза lxTBST перед блокировкой 3% раствором MSD Blocker А,
150 мкл/лунка в течение 1 часа встряхивания. Заблокированные плашки затем обрабатывали в течение 1 часа 50 мкл/лунка 25 мкг/мл TTR-F87M/L1 ЮМ, серийно разведенного 1:5, причем последнее разбавление стало буферным контролем. Плашки промывали 3 раза lxTBST перед добавлением 50 мкл/объем лунки 1мкг/мл антитела SulfoTag-обнаружения (8C3-SulfoTag или Dako pAb-SulfoTag) в течение 1 часа при комнатной температуре при встряхивании. Как mAb 8СЗ, так и Dako были с присоединённым SulfoTag, и могли быть использованы в качестве детектирующего антитела, поскольку они связываются с любым TTR и не являются конформационно специфичными.
[00454] После обработки детектирующим антителом плашки трижды промывали 150 мкл lxTBST на объем лунки, с последующим добавлением 150 мкл/лунка lx Read Buffer Т (MSD). Плашки считывали в средстве визуализации изображений MSD, и строили калибровочную кривую TTR F87M/L1 ЮМ.
s. Анализ фагоцитоза
[00455] 1 мг/мл образца TTR-F87M/L1 ЮМ, нативного TTR или агрегированного низким рН TTR-V30M, связывали через амин с красителем pHrodo в течение 15 мин при 37 °С в соотношении белок: краситель примерно 15:4 в соответствии с спецификацией производителя (Thermo Scientific). Избыток pHrodo-метки удаляли диафильтрацией в спин-концентраторе с отсечением по молекулярной массе ЮК (Pierce Thermo), и pHrodo-TTR ресуспендировали в 1хФСБ.
[00456] Моноциты человека ТНР-1 культивировали в среде для культивирования клеток (RMPI, 10%-ная сыворотка IgG, пеницилин/стрептомицин). Аликвота 20-мкг/мл меченого pHrodo TTR была отдельно предварительно проинкубирована с 40 мкг/мл антитела при 37 °С в клеточной культуральной среде в течение 30 мин перед добавлением 5Е+04 ТНР-1 клеток в 1:1 объемном соотношении. После инкубации тканевой культуры (3 часа) клетки промывали средой для культивирования клеток три раза, инкубировали в среде в течение 10 мин, затем дважды промывали и ресуспендировали в FACS-буфере (1% ФБС (фетальная бычья сыворотка) в ФСБ). Интенсивность флуоресценции красного pHrodo детектировали с использованием фильтров красного канала Texas Red. Эпифлюоресцентная микроскопия была выполнена аналогичным образом. После анализа FACS, оставшиеся клетки переносили на предметное стекло с лунками, и визуализировали с помощью инвертированной микроскопии. Средняя интенсивность флуоресценции
автоматически рассчитывалась путем усреднения относительных интенсивностей флуоресценции каждой отдельной клетки.
Пример 12. Антитело-зависимое поглощение TTR клетками ТНР-1
[00457] TTR-F87M/L1 ЮМ ковалентно маркировали флуоресцентным рН-чувствительным красителем pHrodo. Метка pHrodo имеет минимальную флуоресценцию при физиологическом рН, но флуоресценция усиливается при поглощении в средах с низким рН эндоцитарных везикул и, таким образом, обозначает клеточное поглощение меченых частиц. Моноциты ТНР-1 добавляли к pHrodo-меченому TTR (нативный или не нативный, TTR-F87M/L1 ЮМ) после обработки или 14G8, или изотопным контрольным антителом. Низкие уровни флуоресценции наблюдались с каждым антителом, инкубированным с нативным TTR, и после инкубации контрольного антитела с ненативным TTR. Тем не менее, флуоресценция была увеличена после инкубации 14G8 с ненативным TTR (Фиг. 7А), что указывает на то, что ненативный TTR не фагоцитируется эффективно в базовых условиях, однако добавление антител к mis-TTR специфически вызывает фагоцитоз ненативного TTR.
[00458] Также был продемонстрирован дозозависимый фагоцитоз крупных, меченых pHrodo, агрегированных фибриллярных частиц TTR для каждого из mAb к mis-TTR (Фиг. 7В). Максимальное антитело-зависимое поглощение различалось для каждого mAb к mis-TTR (6С1> 9D5~14G8> 5A1), достигая плато при концентрациях mAb между 5-10 мкг/мл. Различные возможности антител могут отражать изотопные различия и связанные с ними изменения в эффекторной функции между четырьмя mAb к mis-TTR. Контроли, включая необработанные клетки или те, которые были обработаны изотопным контрольным IgGl, не демонстрировали обнаруживаемой или усиленной флуоресценции, соответственно.
Пример 13. Оценка антител к mis-TTR в модели трансгенных мышей
[00459] Исследования in vivo проводятся на модельной гуманизированной трансгенной мыши V30M hTTR (Inoue et al., (2008) Specific pathogen free conditions prevent transthyretin amyloidosis in mouse models. Transgenic Research 17:817-826) для оценки эффективности связывания и удаления агрегированного hTTR aHTO-TTR-антителами.
[00460] Трансгенных мышей разводят с использованием стандартных процедур, и уровни их циркулирующего hTTR оценивают с помощью ELISA. Для последующих исследований
эффективности используют мышей с количеством hTTR в сыворотке равным 200-400 мкг/мл. В первом блоке исследований изучают естественное отложение hTTR у трансгенных мышей. Обнаружение отложений hTTR начинают в возрасте 12 месяцев и повторяют каждые 3-6 месяцев после этого. Исследования эффективности начинают когда у трансгенных мышей наблюдается приемлемое количество агрегатов. Животных делят на три группы лечения (п=10/группа) и обрабатывают еженедельно в течение четырех недель внутрибрюшинный дозой переносчика, контрольного антитела (изотипный контроль, 10 мг/кг тела) или антитела против hTRR (10 мг/кг тела). Через неделю после последней обработки мышей подвергают эвтаназии, ткани собирают и обрабатывают, а затем окрашивают для того, чтобы оценить количество и размер оставшихся отложений TTR. Используют количественные способы и статистику для определения уровня клиренса, наблюдаемого между группами.
[00461] В альтернативном подходе агрегаты hTTR готовят in vitro и затем вводят в почку трансгенных мышей для затравки отложения новых агрегатов. Заявитель определил, что инъекция этих препаратов может ускорить отложение новых агрегатов предсказуемым образом. Основываясь на этих выводах, животных усыпляют, оголяют левую почку, и вводят в корковое вещество почки предварительно агрегированный hTTR-материал. После соответствующего периода восстановления, мышей делят на три группы лечения (п=10/группа), и обрабатывают еженедельно в течение четырех-восьми недель внутрибрюшинный дозой переносчика, контрольного антитела (изотипный контроль, 10 мг/кг тела) или антитела против hTRR (10 мг/кг тела). Через неделю после последней обработки мышей подвергают эвтаназии, почки собирают и обрабатывают, а затем окрашивают для того, чтобы оценить количество и размер отложений TTR. Применяют количественные способы и статистику для определения уровня изменений, наблюдаемых между группами.
Пример 14. Оценивание антител к mis-TTR в модели имплантата Matrigel
Заявитель определил, что предварительно агрегированный hTTR может быть суспендирован в Matrigel (BD Bioscience, каталожный № 354263), которому дают возможность затвердеть, а затем можно поместить подкожно мышам. Через четыре недели после имплантации имплантат Matrigel сохранил свою структуру, и агрегированный hTTR все еще присутствовал в имплантате. Кроме того, имплантат хорошо переносился мышами, и антитела против hTTR были способны проникать и связываться с агрегатами, суспендированными в Matrigel.
Исходя из этих сведений, проводится исследование эффективности антител. Животных усыпляют, и имплантат, содержащий предварительно агрегированный hTTR, суспендированный в Matrigel, подкожно помещают мышам. После соответствующего периода восстановления, мышей делят на три группы лечения (п=10/группа), и обрабатывают еженедельно в течение от двух до четырех недель внутрибрюшинный дозой переносчика, контрольного антитела (изотипный контроль, 10 мг/кг тела) или антитела против hTRR (10 мг/кг тела). После последней обработки мышей подвергают эвтаназии, кожу, содержащую имплантат, собирают и обрабатывают, а затем количество оставшихся отложений TTR оценивают с помощью гистологических и/или биохимических способов. Используют количественный анализ и статистику для определения уровня клиренса, наблюдаемого между группами.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ЛЮ, Юэ
НИДЖДЖАР, Тарлохан ЧАКРАБАРТТИ, Авиджит
<12 0> АНТИТЕЛА К ТРАНСТИРЕТИНУ
<130> 057450/473373
<150> 62/109,002 <151> 2015-01-28
<150> 62/266,556 <151> 2015-12-11
<160> 118
<170> FastSEQ для Windows версии 4.0
<210> 1 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> m9D5VH
<400> 1
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
Arg
Phe
Thr
Phe 70
Ser
Arg
Asp
Asn
Met
Ser
Ser 85
Leu
Lys
Ser
Glu
Asp 90
His
Tyr 100 Thr
Tyr
Tyr
Gly
Gly
Gly 105 Thr
Tyr
Gly 115
Gly
Thr
Thr
Val 120
Val
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
y Gly Trp Phe Phe Asp 110
<210> 2 <211> 123 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1SEQ_H
Glu Val
Lys
Leu
Val
Glu
Ser
Gly
Gly
Gly
Gly
Leu
Val
Gln
Pro
Gly
Thr
Gly
Ser
Leu
Lys
Leu
Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Phe
Thr
Phe
Ser
Glu
Tyr
Thr
Met
Ser
Ile
Trp
Ala
Arg
Gln
Thr
Gly
Pro
Glu
Lys
Lys
Leu
45 Pro
Trp
Val
Ala
Tyr
Ser
Lys
Gly
Gly
Ser
Thr
Tyr
Tyr
Asp
Thr
Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Met Phe Gly Asn Asp Phe Lys Tyr Pro Met Asp Arg
100 105 110
115 120
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
lie; ion
<210> 3 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> BAC02114 <400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Gln Gly Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 4 <211> 120 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> AAX82494 <400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Tyr Gly Tyr Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 5 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VHv1
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Leu
Gln
Ser
Asn
Ser
Leu
Lys
Ala
Ala
Arg
His
Tyr 100
Gln
Tyr
Tyr
Gly
Gly
Val
Trp
Gly 115
Gly
Thr
Thr
Val
120
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ser Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95 Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp 105 110
<210> 6 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
Gly
Gly
Gly
Leu
Val
Gln
Ser 25
Phe
Thr
Phe
Pro
Gly
Lys
Gly
Leu
45 Pro
Thr
Thr
Tyr
Tyr 60
Asp
Asn
Ala
Thr
Lys
Asn
Glu
Asp
Tyr
Ala
Val
Gly 105 Thr
Gly
Gly
Trp
Val
Ser
Ser
<223> Hu9D5VHv2 <400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser G
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Se
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gl
35 40 Ala Glu Ile Ser Asn Ser Gly As
50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Ar
65 70 75 80
Leu Gln Ser Asn Leu Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 7 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VHv2b
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 8 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
Gly
Gly
Gly
Leu
Val
Gln
Ser 25
Phe
Thr
Phe
Pro
Gly
Lys
Gly
Leu
45 Pro
Thr
Thr
Tyr
Tyr 60
Asp
Asn
Ala
Thr
Lys
Asn
Glu
Asp
Tyr
Ala
Val
Gly 105 Thr
Gly
Gly
Trp
Val
Ser
Ser
<223> Hu9D5VHv3 <400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser G
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Se
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gl
35 40 Ser Glu Ile Ser Asn Ser Gly As
50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Ar
65 70 75 80
Leu Gln Ser Asn Leu Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 9 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VHv3b
85 90 95
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 100
Gly Gln Gly Thr Leu Val
115 120
<210> 11 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VHv4b <400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<211> 124
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VHv5
<210> 13 <211> 5 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 9D5 CDRH1 - Kabat
<400> 13
Ser Tyr Thr Met Ser 1 5
<210> 14 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 9D5 CDRH2 - Kabat <400> 14
Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 9D5 CDRH3 - Kabat
<400> 15
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 18 <211> 112 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ABC66952 <400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19 <211> 112 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VLv1
Val
Met
Thr
Gln
Ser
Pro
Leu
Ser
Ser
Leu
Pro
Val
Thr
Pro
His
Ala
Ser
Thr
Ile
Ser
Cys
Arg
Ser
Phe
Lys
Ser
Leu
Leu
30 Gly
Asn 35
Leu
Tyr
Leu
Tyr
Trp
Val
Leu
Gln
Lys
Pro
Ser
Gln
Leu
Ile
Tyr
Arg 55 Gly
Ser
Asn
Leu
Ala 60 Phe
Gly
Val
Phe
Ser
Gly
Ser 70 Glu
Ser
Gly
Thr
Asp 75 Tyr
Thr
Leu
Lys
Val
Glu
Ala 85
Leu
Asp
Val
Gly
Val 90 Gly
Tyr
Cys
Met
Gln 95 Ile
Tyr
Pro 100
Thr
Phe
Gly
Gln 105
Thr
Lys
Leu
Glu 110
<210> 20 <211> 112 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VLv2
Val
Met
Thr
Gln
Ser
Pro
Leu
Ser
Ser
Leu
Pro
Val
Thr
Pro
His
Ala
Ser
Thr
Ile
Ser
Cys
Arg
Ser
Tyr
Lys
Ser
Leu
Leu
30 Gly
Asn 35
Leu
Tyr
Leu
Tyr
Trp
Val
Leu
Gln
Lys
Pro
Ser
Gln
Leu
Ile
Tyr
Arg 55 Gly
Ser
Asn
Leu
Ala 60 Phe
Gly
Val
Phe
Ser
Gly
Ser 70 Glu
Ser
Gly
Thr
Asp 75 Tyr
Thr
Leu
Lys
Val
Glu
Ala 85
Leu
Asp
Val
Gly
Val 90 Gly
Tyr
Cys
Met
Gln 95 Ile
Tyr
Pro 100
Thr
Phe
Gly
Gln 105
Thr
Lys
Leu
Glu 110
<210> 21
<211> 112 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VLv3 <400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 22 <211> 112 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VLv4 <400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Pro Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 23 <211> 112 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VLv5 <400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Pro Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 24
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 9D5 CDRL1 - Кабат
<400> 24
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 25 <211> 7 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 9D5 CDRL2 - Kabat
<400> 25
Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser 1 5
<210> 26 <211> 9 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 9D5 CDRL3 - Kabat
<400> 26
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5
<210> 27 <211> 454 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5 H1 тяжелая цепь
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ser Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
<210> 28 <211> 454 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5 H2 тяжелая цепь
450
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Ala
Arg
His
Tyr 100 Gln
Tyr
Tyr
Gly
Val
Trp
Gly 115
Gly
Thr
Thr
Gly
Pro 130 Thr
Ser
Val
Phe
Pro
Leu
135
Gly 145 Val
Ala
Ala
Leu
Gly 150
Cys
Thr
Val
Ser
Trp 165
Asn
Ser
Phe
Pro
Ala
Val 180 Pro
Leu
Gln
Ser
Val
Thr
Val
Ser
Ser
Ser
Leu Gln Ser Asn Leu Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Thr
Leu
Met
Ile 260 Glu
Ser
Arg
Thr
Pro
Glu 265
Lys
Val
Val
Ser
His 275 Val
Asp
Pro
Glu
Val 280 Thr
Phe
Val
Glu 290 Thr
His
Asn
Ala
Lys
295 Ser
Lys
Pro
Ser 305
Leu
Tyr
Arg
Val
Val 310 Tyr
Val
Leu
Thr
Asn
Gly
Lys
Glu 325
Lys
Lys
Cys
Lys
Val 330 Ala
Ala
Pro
Ile
Glu 340 Tyr
Thr
Ile
Ser
Lys
345 Ser
Pro
Gln
Val 355 Ser
Thr
Leu
Pro
Pro 360 Val
Arg
Gln
Val 370 Val
Leu
Thr
Cys
Leu
375 Asn
Lys
Gly
Ala 385 Thr
Glu
Trp
Glu
Ser 390 Asp
Gly
Gln
Pro
Pro
Pro
Val
Leu
405
Lys
Ser
Asp
Gly
Ser 410 Gln
Leu
Thr
Val
Asp 420 His
Ser
Arg
Trp
Gln 425 Asn
Ser
Val
Met 435
Glu
Ala
Leu
His 440
His
Ser
Leu
450
Ser
Pro
Gly
Lys
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 300
Val Leu His Gln Asp Trp 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Pro
335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 445
<210> 29 <211> 454 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<223> Hu9D5 H2b тяжелая цепь
Leu
Val 5
Glu
Ser
Leu
20 Trp
Ser Val
Cys Arg
Ala Gln
Ser
Asn
Ser
Gly 55
Phe
Thr
Ile
Leu
Ser
Ser
Ser 85
Lys
Tyr 100 Gln
Tyr Gly
Tyr Thr
Gly
Leu
Val
Phe
Pro
Leu
135
Ala
Leu
Gly 150
Cys
Ser
Trp 165
Asn
Ser
Val 180 Pro
Leu
Ser
Gln Ser
Ser Ser
Leu
Val
Gln
Pro
Gly 15
Gly
Phe
Thr
Phe
Ser
Glu
Ser
Tyr
Lys
Arg
Leu
Leu
Val
Tyr
Tyr
Pro
Asp
Thr
Val
Ala
Thr
Lys
Ala
Asn Met
Thr Tyr
Leu
Tyr
Phe
Tyr
Cys
Gly
Gly
Trp
Phe 110 Ser
Asp
Ser
Ser
Ala 125
Thr
Lys
Ser
Lys
140
Ser
Thr
Ser
Gly
Asp 155 Thr
Tyr Ser
Phe Gly
Pro Val
Glu
His 175
Pro 160 Thr
Tyr
Ser
Leu
Ser 190 Ile
Ser
Val
Gln
Thr
Tyr
205
Cys
Asn
Asp
Lys
220
Arg
Val
Glu
Pro
<400> 29 Glu Val С
1 5 10
a Ser Gl 25
: Pro Gli
35 40
Ala He Ser Asn Ser Gly As-
Lys Gly 65
Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu
105
115 120
Gly Pro 130 Gly Thr 145
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
170
Gly 185
195 200 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
210 215
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
Ala
Pro
Ile
Glu 340 Tyr
Lys
Thr
Ile
Ser
Lys
345 Ser
Pro
Gln
Val 355 Ser
Thr
Leu
Pro
Pro 360 Val
Gln
Val 370 Val
Leu
Thr
Cys
Leu
375 Asn
Lys
Ala 385 Thr
Glu
Trp
Glu
Ser 390 Asp
Gly
Gln
Pro
Pro
Val
Leu
405
Ser
Asp
Gly
Leu
Thr
Val
Asp 420 His
Lys
Ser
Arg
Trp
Gln 425 Asn
Ser
Val
Met 435
Glu
Ala
Leu
His 440
Ser
Leu
450
Ser
Pro
Gly
Lys
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 445
<210> 30 <211> 454
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5 H3 тяжелая цепь
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gl
1 5 10
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gl
20 25 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gl
35 40 Ser Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Th
50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp As 65 70
Leu Gln Ser Asn Leu Leu Arg Ala Glu As
85 90 Gly Gly Ty
210 215
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 430
105 Val Thr Va 120
Ala
Pro
Ile
Glu 340 Tyr
Lys
Thr
Ile
Ser
Lys
345 Ser
Pro
Gln
Val 355 Ser
Thr
Leu
Pro
Pro 360 Val
Gln
Val 370 Val
Leu
Thr
Cys
Leu
375 Asn
Lys
Ala 385 Thr
Glu
Trp
Glu
Ser 390 Asp
Gly
Gln
Pro
Pro
Val
Leu
405
Ser
Asp
Gly
Leu
Thr
Val
Asp 420 His
Lys
Ser
Arg
Trp
Gln 425 Asn
Ser
Val
Met
Glu
Ala
Leu
His
435
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450
440
445
<210> 31 <211> 454 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5 H3b тяжелая цепь
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 32 <211> 454 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5 H4 тяжелая цепь
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ser Asn Leu Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
<210> 33
<211> 454
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5 H4b тяжелая цепь
Leu
Val 5
Glu
Ser
Leu
20 Trp
Ser Val
Cys Arg
Ala Gln
Ser
Asn
Ser
Gly 55
Phe
Thr
Ile
Leu
Ser
Ser
Ser 85
Lys
Tyr 100 Gln
Tyr Gly
Tyr Thr
Gly
Leu
Val
Phe
Pro
Leu
135
Ala
Leu
Gly 150
Cys
Ser
Trp 165
Asn
Ser
Val 180 Pro
Leu
Ser
Gln Ser
Ser Ser
<400> 33 Glu Val
1 5 10 15
er Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Se
25 30
Pro Gly Lys Arg Leu Gl
35 40 45
Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Ty
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Ly
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cy
90 95
Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe
105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu
Asn
Gly
Lys
Glu 325
Tyr
Lys
Cys
Lys
Ala
Pro
Ile
Glu 340 Tyr
Lys
Thr
Ile
Ser
Lys
345 Ser
Pro
Gln
Val 355 Ser
Thr
Leu
Pro
Pro 360 Val
Gln
Val 370 Val
Leu
Thr
Cys
Leu
375 Asn
Lys
Ala 385 Thr
Glu
Trp
Glu
Ser 390 Asp
Gly
Gln
Pro
Pro
Val
Leu
405
Ser
Asp
Gly
Leu
Thr
Val
Asp 420 His
Lys
Ser
Arg
Trp
Gln 425 Asn
Ser
Val
Met 435
Glu
Ala
Leu
His 440
Ser
Leu
450
Ser
Pro
Gly
Lys
330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 445
<210> 34 <211> 454 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5 H5 тяжелая цепь
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Ala
Arg
His
Tyr 100 Gln
Tyr
Tyr
Gly
Val
Trp
Gly 115
Gly
Thr
Thr
Gly
Pro 130 Thr
Ser
Val
Phe
Pro
Leu
135
Gly 145 Val
Ala
Ala
Leu
Gly 150
Cys
Thr
Val
Ser
Trp 165
Asn
Ser
Phe
Pro
Ala
Val 180 Pro
Leu
Gln
Ser
Val
Thr
Val
Ser
Ser
Ser
Leu Gln Met Asn Leu Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
Asn 210 Ser
His Cys
Lys Asp
Pro Lys
Ser
Thr 230 Ser
Asn 215 His
Leu
Gly
Gly
Pro 245
Val
Leu
Met
Ile 260 Glu
Ser
Arg
Thr
Ser
His
Asp
Pro
Glu
170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
e Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 250 255
0 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 265 270
1 Ттт^. TiU^ 7\^.-^ m т--^ mrTv i г-, 1 7\^.-^ г-'Ттт
<210> 35
<211> 219
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5 L1 легкая цепь
<400> 35
Glu
Pro
Ala
Ser
Thr
Ile
Ser
Asn
Gly
Asn 35
Tyr
Leu
Pro
Gln 50
Leu
Leu
Ile
Tyr
Asp
Ser
Arg Arg
Phe Val
Ser Glu
Gly
Ala 85
Ser
Glu
Leu
Glu
Tyr
Pro 100 Ala
Leu
Thr
Arg
Thr
Val 115
Ala
Pro
Gln
Leu
130
Lys
Ser
Gly
Thr
Tyr 145 Ser
Pro Gly
Arg Asn
Glu Ser
Ala
Gln 165
Lys
150 Glu
Thr
Tyr
Ser
Leu
180 Val
Ser
Ser
Lys
His
Lys
195 Thr
Tyr
Ala
Pro
Val 210
Lys
Ser
Phe
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gl
10 15
Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Se
25 30 Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Se
Thr
Lys
Leu
Glu 110 Ser
Ile
Lys
Phe
Pro
Pro 125
Asp
Glu
Cys
Leu
140
Leu
Asn
Asn
Phe
Val 155 Gln
Asp Asp
Asn Ser
Ala
Lys
Leu
Asp 175
Gln 160 Ser
Ser
Lys
Ala
Asp 190
Leu
Tyr
Glu
His
Gln
Gly
one;
Ser
Ser
40 45 Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pr 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Il 75 80 Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Hi 90
Phe Gly Gln Gly 105
Ser Val Phe Ile 120
Ala Ser Val Val 135
Val Gln Trp Lys
Ser Val Thr Glu 170
Thr Leu Thr Leu 185
Cys Glu Val Thr 200
Asn Arg Gly Glu 215
<210> 36 <211> 219 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5 L2 легкая цепь
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 37 <211> 219 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5 L3 легкая цепь
<400> 37
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser
Ser
Arg
Phe
Ser
Gly
Ser
Glu
Gly
Ser
Gly
Thr
Asp
Tyr
Phe
Thr
Leu
Lys
Ile
His
Arg
Val
Glu
Ala 85
Leu
Asp
Val
Gly
Val
Gly
Tyr
Cys
Met
Gln
Ile
Leu
Glu
Tyr
Pro 100 Ala
Thr
Phe
Gly
Gln 105 Phe
Thr
Lys
Leu
Glu 110 Ser
Lys
Arg
Thr
Val 115
Ala
Pro
Ser
Val 120
Ile
Phe
Pro
Pro 125
Asp
Glu
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 38
<211> 219
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5 L4 легкая цепь
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Pro Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
<210> 39 <211> 219 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5 L5 легкая цепь
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<400> 39
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Pro Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 35
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg
50 55 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 65 70
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp 85
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe 100
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 115
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 130 135 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 145 150 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 165
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 180
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 195
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 210 215
Arg
Ser
Phe
Ser
Lys
Ser
Leu
Leu
30 Gly
His
Ser
Trp
40 Val
Leu
Gln
Arg
Pro
Ser
Gln
Ser
Ser
Asn
Leu
Ala
Phe
Gly
Val
Pro
Ser
Gly
Thr
Ala
Tyr
Thr
Leu
Arg
Ile
His
Val
Gly
Val
Gly
Tyr
Cys
Met
Gln
Ile
Gly
Gln 105 Phe
Thr
Lys
Leu
Glu 110 Ser
Lys
Val 120 Ser
Ile
Phe
Pro
Pro 125
Leu
Asp
Glu
Val
Val
Cys
Leu
140
Asn
Asn
Phe
Gln
Trp
Lys
Val 155 Gln
Asp
Asn
Ala
Leu
Gln 160 Ser
Val
Thr
Glu 170
Asp
Ser
Lys
Asp 175
Leu
Thr 185 Val
Leu
Ser
Lys
Ala
Asp 190
Leu
Tyr
Glu
Glu 200
Thr
His
Gln
Gly 205
Ser
Ser
Arg
Gly
Glu
Cys
<210> 40 <211> 429
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> m9D5VH с сигнальным пептидом
<400> 40
atggactttg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt cctgtgtgaa 60 gtgaagctgg tggagtctgg gggaggttta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tataccatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gaaaagaggc tggagttggt cgcagaaatt agtaatagtg gtgataccac ctactatcca 240 gacactgtaa agggccgatt caccttctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag acattattac 360 tatggtggtg gctacggggg gtggttcttc gatgtctggg gcacagggac cacggtcacc 420 gtctcctcg 429
<210> 41 <211> 143 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> m9D5VH с сигнальным пептидом
<400> 41
Met Asp Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Leu Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Leu Val Ala Glu Ile Ser Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp
115 120 125
Phe Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 42
<211> 396 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> m9D5VL с сигнальным пептидом
<400> 42
atgaggtgcc tagctgagtt cctggggctg cttgtgctct ggatccctgg agccattggg 60 gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 120 atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 180 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcaa ctcctgatat atcgggtgtc caaccttgcc 240 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 300 agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacattt agaatatccg 360 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 396
<210> 43 <211> 132
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> m9D5VL с сигнальным пептидом
<400> 43
Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro
20 25 30
Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser
35 40 45
Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe
85 90 95
Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Leu Lys
<210> 44 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
130
<223> Hu9D5VHv1
<400> 44
gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcgcctg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcctacacca tgtcctgggt gcgccaggcc 120 cccggcaagg gcctggagct ggtggccgag atctccaact ccggcgacac cacctactac 180 cccgacaccg tgaagggccg cttcaccttc tcccgcgaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagtcca actccctgaa ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgccactac 300 tactacggcg gcggctacgg cggctggttc ttcgacgtgt ggggccaggg caccaccgtg 360 accgtgtcct ca 372
<210> 45 <211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VHv2
<400> 45
gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcgcctg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcctacacca tgtcctgggt gcgccaggcc 120 cccggcaagg gcctggagct ggtggccgag atctccaact ccggcgacac cacctactac 180 cccgacaccg tgaagggccg cttcaccttc tcccgcgaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagtcca acctgctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgccactac 300 tactacggcg gcggctacgg cggctggttc ttcgacgtgt ggggccaggg caccaccgtg 360 accgtgtcct ca 372
<210> 46 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VHv2b <400> 46
gaggtgcaac tggtggagtc tggcggcggc ttggtgcaac ctggcggctc cctgaagctg 60 tcctgtgccg cctccggctt caccttcagc agctatacca tgtcttgggt gcgccaaacc 120 cccgagaaga ggctggagtt ggtggctgag attagtaata gcggcgatac cacctactat 180 cccgataccg tgaagggccg cttcaccatt tccagagata atgctaagaa taccctgtat 240 ctgcaaatga gtagcctgaa gtctgaggat accgctatgt attattgtgc tagacattat 300 tattatggcg gcggctatgg cggctggttc ttcgatgtgt ggggccaagg caccctggtc 360 accgtgtcct ca 372
<210> 47 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VHv3 <400> 47
gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcgcctg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcctacacca tgtcctgggt gcgccaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtgtccgag atctccaact ccggcgacac cacctactac 180 cccgacaccg tgaagggccg cttcaccttc tcccgcgaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagtcca acctgctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgccactac 300 tactacggcg gcggctacgg cggctggttc ttcgacgtgt ggggccaggg caccaccgtg 360 accgtgtcct ca 372
<210> 48 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VHv3b <400> 48
gaggtgcaac tggtggagtc tggcggcggc ttggtgcaac ctggcggctc cctgaagctg 60 tcctgtgccg cctccggctt caccttcagc agctatacca tgtcttgggt gcgccaaacc 120 cccgggaaga ggctggagtt ggtggctgag attagtaata gcggcgatac cacctactat 180 cccgataccg tgaagggccg cttcaccatt tccagagata atgctaagaa taccctgtat 240 ctgcaaatga gtagcctgaa gtctgaggat accgctatgt attattgtgc tagacattat 300 tattatggcg gcggctatgg cggctggttc ttcgatgtgt ggggccaagg caccctggtc 360 accgtgtcct ca 372
<210> 49 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VHv4 <400> 49
gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcgcctg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcctacacca tgtcctgggt gcgccaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtgtccgag atctccaact ccggcgacac cacctactac 180 cccgacaccg tgaagggccg cttcaccatc tcccgcgaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctgcagtcca acctgctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgccactac 300 tactacggcg gcggctacgg cggctggttc ttcgacgtgt ggggccaggg caccaccgtg 360 accgtgtcct ca 372
<210> 50 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VHv4b <400> 50
gaggtgcaac tggtggagtc tggcggcggc ttggtgcaac ctggcggctc cctgaagctg 60 tcctgtgccg cctccggctt caccttcagc agctatacca tgtcttgggt gcgccaagcc 120 cccgggaaga ggctggagtt ggtggctgag attagtaata gcggcgatac cacctactat 180 cccgataccg tgaagggccg cttcaccatt tccagagata atgctaagaa taccctgtat 240 ctgcaaatga gtagcctgaa gtctgaggat accgctatgt attattgtgc tagacattat 300 tattatggcg gcggctatgg cggctggttc ttcgatgtgt ggggccaagg caccctggtc 360 accgtgtcct ca 372
<210> 51 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VHv5 <400> 51
gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcgcctg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcctacacca tgtcctgggt gcgccagacc 120 cccgagaagc gcctggagct ggtggccgag atctccaact ccggcgacac cacctactac 180 cccgacaccg tgaagggccg cttcaccatc tcccgcgaca acgccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acctgctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgccactac 300 tactacggcg gcggctacgg cggctggttc ttcgacgtgt ggggccaagg caccaccgtg 360 accgtgtcct ca 372
<210> 52 <211> 336 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VLv1 <400> 52
gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgcccgtga cccccggcga gcccgcctcc 60 atctcctgcc gctcctccaa gtccctgctg cactccaacg gcaacaccta cctgtactgg 120 ttcctgcaga agcccggcca gtccccccag ctgctgatct accgcgtgtc caacctggcc 180 tccggcgtgc ccgaccgctt ctccggctcc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcagcacct ggagtacccc 300 ctgaccttcg gccagggcac caagctggag atcaaa 336
<210> 53 <211> 336 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VLv2 <400> 53
gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgcccgtga cccccggcga gcccgcctcc 60 atctcctgcc gctcctccaa gtccctgctg cactccaacg gcaacaccta cctgtactgg 120 tacctgcaga agcccggcca gtccccccag ctgctgatct accgcgtgtc caacctggcc 180 tccggcgtgc ccgaccgctt ctccggctcc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcagcacct ggagtacccc 300 ctgaccttcg gccagggcac caagctggag atcaaa 336
<210> 54 <211> 336 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VLv3 <400> 54
gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgcccgtga cccccggcga gcccgcctcc 60 atctcctgcc gctcctccaa gtccctgctg cactccaacg gcaacaccta cctgtactgg 120 tacctgcaga agcccggcca gtccccccag ctgctgatct accgcgtgtc caacctggcc 180 tccggcgtgc cctcccgctt ctccggctcc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcagcacct ggagtacccc 300 ctgaccttcg gccagggcac caagctggag atcaaa 336
<210> 55 <211> 336 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VLv4 <400> 55
gacatcgtga tgacccagtc cgccccctcc ctgcccgtga cccccggcga gcccgtgtcc 60 atctcctgcc gctcctccaa gtccctgctg cactccaacg gcaacaccta cctgtactgg 120 ttcctgcagc gccccggcca gtccccccag ctgctgatct accgcgtgtc caacctggcc 180 tccggcgtgc cctcccgctt ctccggctcc ggctccggca ccgccttcac cctgcgcatc 240 tcccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcagcacct ggagtacccc 300 ctgaccttcg gccaaggcac caagctggag atcaaa 336
<210> 56 <211> 336 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu9D5VLv5 <400> 56
gacatcgtga tgacccagtc cgccccctcc ctgcccgtga cccccggcga gtccgtgtcc 60 atctcctgcc gctcctccaa gtccctgctg cactccaacg gcaacaccta cctgtactgg 120 ttcctgcagc gccccggcca gtccccccag ctgctgatct accgcgtgtc caacctggcc 180 tccggcgtgc cctcccgctt ctccggctcc ggctccggca ccgccttcac cctgcgcatc 240 tcccgcgtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcagcacct ggagtacccc 300 ctgaccttcg gccaaggcac caagctggag atcaaa 336
<210> 57
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 9D5VH Сигнальний пептид
<400> 57
Met Asp Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Leu Cys
<210> 58 <211> 57 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 9D5VH Сигнальний пептид
<400> 58
atggactttg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt cctgtgt 57
<210> 59 <211> 20 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 9D5VL Сигнальний пептид
<400> 59
Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ile Gly 20
<210> 60 <211> 60 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> 9D5VL Сигнальний пептид
<400> 60
atgaggtgcc tagctgagtt cctggggctg cttgtgctct ggatccctgg agccattggg 60
<210> 61 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> m14G8VH
<210> 62 <211> 118 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1MQK_H
<210> 63 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<223> AAD30410
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Thr Asp Gly Ser Phe Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Gly Ile Asp Ala Thr Ala Gln Val Gly Arg Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 64 <211> 124
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8VHv1 <400> 64
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Asn Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 65 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8VHv2 <400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gl
1 5 10
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gl
20 25
Leu
Val
Gln
Pro
Gly 15
Phe
Thr
Phe
Ser
Glu
Ser
Lys
Arg
Leu
Leu
35 40 45
Ala Glu Ile Asn Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp
100 105 110
115 120
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
lie ion
<210> 66
<211> 124
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8VHv3
<210> 67 <211> 5 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14G8 CDRH1 - Kabat
<400> 67
Ser Tyr Thr Met Ser 1 5
<210> 68 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14G8 CDRH2 - Kabat
<400> 68
Glu Ile Asn Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 69 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14G8 CDRH3 - Kabat <400> 69
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp Val
1 5 10 15
Arg
<210> 71 <211> 113 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MJU_L
<400> 71
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln His
85 90
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg
<210> 72 <211> 113 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ABA71374 <400> 72
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Arg His Tyr
20 25 30
Ser Gly Tyr Thr Tyr Ile Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Val Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 73 <211> 113 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ABC66952 <400> 73
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 74 <211> 113 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8VLv1
Arg
<210> 75 <211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8VLv2 <400> 75
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 76 <211> 113 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8VLv3 <400> 76
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 77
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14G8 CDRL1 (мышь, HuVLv1, HuVLv2) - Kabat
<400> 77
Arg Ser Asn Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 78 <211> 7 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14G8 CDRL2 - Kabat
<400> 78
Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser 1 5
<210> 79 <211> 9 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14G8 CDRL3 - Kabat
<400> 79
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5
<210> 80 <211> 16 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 14G8 CDRL1 (HuVLv3) - Kabat
<400> 80
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 81 <211> 454 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8 H1 тяжелая цепь
<400> 81
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Asn Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Pro 245 Ser
Ser
Val
Phe
Leu
Phe 250 Val
Pro
Pro
Lys
Arg
Thr
Pro
Glu 265
Thr
Cys
Val
Asp
Pro
Glu
Val 280 Thr
Lys
Phe
Asn
Trp
Tyr 285 Glu
Asn
Ala
Lys
295 Ser
Lys
Pro
Arg
Glu 300
Leu
Val
Val 310
Val
Leu
Thr
Val 315
His
Glu 325
Lys
Tyr
Lys
Cys
Lys
Val 330 Ala
Ser
Asn
Lys
Thr
Ile
Ser
Lys
345
Lys
Gly
Gln
Thr
Leu
Pro
Pro 360 Val
Ser
Arg
Glu
Glu
Met
365 Pro
Thr
Cys
Leu
375
Lys
Gly
Phe
Tyr 380
Glu
Ser 390 Asp
Asn
Gly
Gln
Pro
Glu 395 Phe
Asn
Asn
Leu
405
Lys
Ser
Asp
Gly
Ser 410 Gln
Phe
Leu
Ser
Arg
Trp
Gln
Gly
Asn
Val
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Lys
255 Val
260 265 270
Ser His
275 Glu Val 290
Thr Tyr
305 310 315 320
Leu
335
340 345 350
Gln Val
355
Val Ser
370
Val Glu
385 390 395 400
Ser
415
О ^
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 82
<211> 454
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8 H2 тяжелая цепь
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Asn Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 83 <211> 454 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8 H3 тяжелая цепь
<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Glu Ile Asn Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp Phe Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
<210> 84 <211> 219 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8 L1 легкая цепь
<400> 84
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Pro Ser Leu
1 5 10
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Lys
20 25 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln 35 40
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu
50 55
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala
65 70 75
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
85 90 Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr
100 105 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
115 120 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
130 135
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
145 150 155
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
165 170 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
180 185 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
195 200 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
Pro
Val
Thr
Pro
His
Gly
Ser
Leu
Leu
30 Gly
Ser
Lys
Pro 45
Gln
Ser
Ala
Phe
Ser
Gly
Val
Pro
Thr
Leu
Lys
Ile
His
Tyr
Cys
Met
Gln 95
Ile
Lys
Leu
Glu 110
Lys
Pro
Pro 125
Ser
Asp
Glu
Leu
140
Leu
Asn
Asn
Phe
Asp
Asn
Ala
Leu
Gln 160
Asp
Ser
Lys
Asp 175 Tyr
Ser
Lys
Ala
Asp 190
Glu
Gln
Gly 205
Leu
Ser
Ser
<210> 85 <211> 219 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<223> Hu14G8 L2 легкая цепь
<400> 85
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 86 <211> 219 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8 L3 легкая цепь
<400> 86
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
210
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
11 n О 1 с
215
<210> 87 <211> 429 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> m14G8VH с сигнальным пептидом
<400> 87
atgaatttcg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt cctgtgtgaa 60 gtgaagctgg tggagtctgg gggaggttta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ccggattcac tttcagtagc tataccatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gaaaagaggc tggagttggt cgcagaaatt aataatagtg gtgataccac ctactatcca 240 gacactgtaa agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag acattattac 360 tatggtggtg gctacggggg gtggttcttc gatgtctggg gcacagggac cacggtcacc 420 gtctcctca 429
<210> 88 <211> 143
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> m14G8VH с сигнальным пептидом
<400> 88
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Leu Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Leu Val Ala Glu Ile Asn Asn Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Trp
115 120 125
Phe Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 89 <211> 399 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> m14G8VL с сигнальным пептидом
<400> 89
atgaggtgcc tagctgagtt cctggggctg cttgtgctct ggatccctgg agccattggg 60 gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 120
atctcctgca ggtctaataa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 180 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcaa ctcctgatat atcgggtgtc caaccttgcc 240 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 300 agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacattt agaatatccg 360 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacgt 399
<210> 90 <211> 133 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> m14G8VL с сигнальным пептидом
Glu
Phe
Leu
Gly
Leu
10 Gln
Leu
Val
Leu
Trp
Ile
Val
Pro
Ile
Val
Met
Thr
Ile
Ala
Ala
Pro
Ser
Asn
Pro
Ser
Val
Ser
Thr
Ser
Cys
Arg
Ser
Phe
Lys
Ser
Gly
Asn 55
Leu
Phe
Tyr
Leu
Tyr
Trp
Val
Ser
Leu
Gln
Arg
Gln
Arg
Leu
Ser
Ile Gly
Tyr
Ser
Glu
Arg
Gly
Ser Gly
Asn Thr
Leu
Ala
Tyr
Ala
Phe
Arg
Val
Glu
Ala 105
Leu
Asp
Val
Gly
Val 110 Gly
Tyr
Glu
Tyr
Pro 120
Thr
Phe
Gly
Ala 125
Thr
Lys
<400> 90
Met Arg Cys Leu Ala 1 5 Gly Ala Ile Gly Asp 20
Val Thr Pro Gly Glu 35
Leu Leu His Ser Asn
Pro Gly Gln Ser Pro 65
Ser Gly Val Pro Asp 85
Thr Leu Arg Ile Ser 100
Cys Met Gln His Leu 115
Leu Glu Leu Lys Arg
130
<210> 91 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8VHv1
<400> 91
gaggtgaagc tggtggagtc tggcggcggc ttggtgcaac ctggcggctc cctgaagctg 60 tcctgtgccg cctccggctt caccttcagc agctatacca tgtcttgggt gcgccaaacc 120 cccgagaaga ggctggagtt ggtggctgag attaataata gcggcgatac cacctactat 180 cccgataccg tgaagggccg cttcaccatt tccagagata atgctaagaa taccctgtat 240 ctgcaaatga gtagcctgaa gtctgaggat accgctatgt attattgtgc tagacattat 300 tattatggcg gcggctatgg cggctggttc ttcgatgtgt ggggcaccgg caccctggtc 360 accgtgtcct ca 372
<210> 92 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8VHv2 <400> 92
gaggtgcaac tggtggagtc tggcggcggc ttggtgcaac ctggcggctc cctgaagctg 60 tcctgtgccg cctccggctt caccttcagc agctatacca tgtcttgggt gcgccaaacc 120 cccgagaaga ggctggagtt ggtggctgag attaataata gcggcgatac cacctactat 180
cccgataccg tgaagggccg cttcaccatt tccagagata atgctaagaa taccctgtat 240 ctgcaaatga gtagcctgaa gtctgaggat accgctatgt attattgtgc tagacattat 300 tattatggcg gcggctatgg cggctggttc ttcgatgtgt ggggccaagg caccctggtc 360 accgtgtcct ca 372
<210> 93 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8VHv3 <400> 93
gaggtgcaac tggtggagtc tggcggcggc ttggtgcaac ctggcggctc cctgaagctg 60 tcctgtgccg cctccggctt caccttcagc agctatacca tgtcttgggt gcgccaaacc 120 cccgagaaga ggctggagtt ggtggctgag attaataata gcggcgatac cacctactat 180 cccgataccg tgaagggccg cttcaccatt tccagagata atgctaagaa taccctgtat 240 ctgcaaatga atagcctgag ggctgaggat accgctgtgt attattgtgc tagacattat 300 tattatggcg gcggctatgg cggctggttc ttcgatgtgt ggggccaagg caccctggtc 360 accgtgtcct ca 372
<210> 94 <211> 339 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8VLv1 <400> 94
gatatcgtga tgacccagtc tgccccctcc ctgcctgtga cccctggcga gtccgtgtcc 60 atctcctgcc ggtccaacaa gagcctgctg cacagcaacg gcaacaccta cctgtactgg 120 ttcctgcaaa agcccggcca atcccctcaa ctgctgatct accgggtgtc caacctggcc 180 tccggcgtgc ccgataggtt ctccggaagc ggctccggca ccgccttcac cctgaagatt 240 agtagagtcg aggccgagga tgtgggcgtg tactactgta tgcaacactt ggagtacccc 300 ctgacgttcg gccaaggcac caagctggag atcaagcgt 339
<210> 95 <211> 339 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8VLv2 <400> 95
gatatcgtga tgacccagtc tcccctgtcc ctgcctgtga cccctggcga gcccgcctcc 60 atctcctgcc ggtccaacaa gagcctgctg cacagcaacg gcaacaccta cctgtactgg 120 ttcctgcaaa agcccggcca atcccctcaa ctgctgatct accgggtgtc caacctggcc 180 tccggcgtgc ccgataggtt ctccggaagc ggctccggca ccgatttcac cctgaagatt 240 agtagagtcg aggccgagga tgtgggcgtg tactactgta tgcaacactt ggagtacccc 300 ctgacgttcg gccaaggcac caagctggag atcaagcgt 339
<210> 96 <211> 339 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Hu14G8VLv3
gatatcgtga tgacccagtc tcccctgtcc ctgcctgtga cccctggcga gcccgcctcc 60
atctcctgcc ggtccagcaa gagcctgctg cacagcaacg gcaacaccta cctgtactgg 120 ttcctgcaaa agcccggcca atcccctcaa ctgctgatct accgggtgtc caacctggcc 180 tccggcgtgc ccagtaggtt ctccggaagc ggctccggca ccgatttcac cctgaagatt 240 agtagagtcg aggccgagga tgtgggcgtg tactactgta tgcaacactt ggagtacccc 300 ctgacgttcg gccaaggcac caagctggag atcaagcgt 339
<210> 97 <211> 19 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальний пептид 14G8VH
<400> 97
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Leu Cys
<210> 98 <211> 57
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальний пептид 14G8VH
<400> 98
atgaatttcg gcctgagctt gattttcctg gtgctggtgt tgaagggcgt gctgtgt 57
<210> 99 <211> 20 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальний пептид 14G8VL
<400> 99
Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ile Gly 20
<210> 100
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальний пептид 14G8VL
<400> 100
atgaggtgcc tggccgagtt cctgggcctg ctggtgctgt ggatccctgg cgccatcggc 60
<211> 330 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<223> Константная область тяжелой цепи IgGl человека
Ala
Pro
Ser
Ser l5
Lys
Leu
Val
Lys
Leu
Asp
Tyr
Gly
Ala
Gly
Thr
Ser
Ser 60
Leu
Tyr
Ser
Leu
Gly
Thr
Gln
Thr
Lys
Thr
Lys
Val
Asp 95
Thr
Cys
Pro ll0 Phe
Pro
Cys
Phe
Leu
1 9 c,
Pro
Pro
<400> l0l
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Le
l 5 l0
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cy
20 25 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Se
35 40 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Se
50 55 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Se
65 70 75
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser As
85 90 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hi
l00 l05 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Va
ll5 l20 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
l30 l35 l40
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
l45 l50 l55 l60
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Val Lys Thr Lys Pro Arg Glu
l65 l70 l75
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
l80 l85 l90
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
l95 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
Tyr
Thr
Leu
Pro 235
Leu
Pro
Ser
Arg
Glu
Glu 240 Tyr
Leu
Thr
Cys 250 Ser
Val
Lys
Gly
Phe 255 Glu
Trp
Glu 265
Leu
Asn
Gly
Gln
Pro 270 Ser
Asn
Val 280 Asp
Asp
Ser
Asp
Gly 285 Gln
Phe
Phe
Lys
Ser
Arg
Trp 300 His
Gln
Gly
Asn
His
Glu
Ala
Leu
3l5
Asn
His
Tyr
Thr 320
Pro
Gly
Lys
2l0 2l5 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 225 230 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 245
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 260
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 275
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 290 295 Val Phe Ser Cys Ser Val Met 305 3l0
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
325
<2l0> l02 <2ll> 330
<2l2> БЕЛОК
<2l3> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область тяжелой цепи IgGl человека аллотипа Glm3 IgGl
<400> l02
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
l 5 l0 l5
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
l00 l05 ll0
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
ll5 l20 l25
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
l30 l35 l40
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
l45 l50 l55 l60
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
l65 l70 l75
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
l80 l85 l90
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
l95 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
Tyr
Thr
Leu
Pro 235
Leu
Pro
Ser
Arg
Glu
Glu 240 Tyr
Leu
Thr
Cys 250 Ser
Val
Lys
Gly
Phe 255 Glu
Trp
Glu 265
Leu
Asn
Gly
Gln
Pro 270 Ser
Asn
Val 280 Asp
Asp
Ser
Asp
Gly 285 Gln
Phe
Phe
Lys
Ser
Arg
Trp 300 His
Gln
Gly
Asn
His
Glu
Ala
Leu
3l5
Asn
His
Tyr
Thr 320
Pro
Gly
Lys
2l0 2l5 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 225 230 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 245
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 260
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 275
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 290 295 Val Phe Ser Cys Ser Val Met 305 3l0
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
325
<2l0> l03 <2ll> 330 <2l2> БЕЛОК
<2l3> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область тяжелой цепи IgGl человека аллотипа Glm3 IgGl
Leu S 65
Ser
Val
Val
Thr 70
Val
Pro
Ser
Ser
Ser 75
Leu
Gly
Thr
Gln
Thr
Cys
Asn
Val 85
Lys
Asn
His
Lys
Pro
Ser
Thr
Asn
Thr
Lys
Val
Asp
Pro
Lys
Glu
Pro l00 Glu
Ser
Cys
Asp
Lys
l05 Pro
His
Thr
Cys
Pro ll0 Phe
Cys
Pro ll5
Lys
Leu
Leu
Gly
Gly l20 Ile
Ser
Val
Phe
Leu
l25 Glu
Pro
Pro
Asp
Thr
Leu
Met
Ser
Arg
Thr
Pro
Val
Thr
Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
325 330
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
<210> 104 <211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область каппа легкой цепи человека
<400> 104
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
О О С ООП
<210> 105 <211> 106 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область каппа легкой цепи человека
<400> 105
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
100 105
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
inn 1nс
<210> 106 <211> 990
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область тяжелой цепи IgG1 человека аллотипа G1m3 IgG1
<400> 106
gcctccacca agggtccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 990
<210> 107 <211> 321 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область каппа легкой цепи человека
<400> 107
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 108 <211> 318 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> Константная область каппа легкой цепи человека
<400> 108
actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgt 318
<210> 109
<211> 147
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
Leu
Ala
Gly
Leu
Val 15
Phe
Glu
Ser
Lys
Cys
Ile
Pro
Leu
Ser
Pro
Ala 45
Asn
Val
Asp
Thr
His
Glu
Trp
Glu
Pro
Phe
Leu
75 Val
Gly Ile
Leu Asp
Thr
Thr
Ala
Thr
Lys
Phe
His
Glu
His 110 Thr
Glu
Arg
Arg
Tyr 125 Val
Ile
Ala
Thr
Ala 140
Val
Thr
Asn
<400> 109
Met Ala Ser His Arg Leu Leu Leu Leu Cys
1 5 10
Val Ser Glu Ala Gly Pro Thr Gly Thr Gl\
20 25 Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gl
35 40 Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala As
50 55 Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Gl 65 70 Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Ly 85 90 Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pr
100 105 Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pr
115 120 Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Th 130 135
Pro Lys Glu
145
<210> 110 <211> 127 <212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 110
Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pr
1 5 10
Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile As
20 25 Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pr
35 40 Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Th
50 55
Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Th
65 70 75
Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Al
85 90 Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Il
100 105 Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Th 115 120
Leu
Met
Val
Lys
15 His
Val
Val
Ala
Val 30
Val
Phe
Ala
Glu
Ser
Gly
Lys
Thr 60
Glu
Gln
Phe
Lys
Ser
Tyr
Trp
Lys
80 Thr
Glu
Val
Val
Phe 95
Leu
Ala
Ala
Leu
110
Ser
Asn
Pro 125
Lys
Glu
<210> 111 <211> 127 <212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 111
Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val
1 5 10 15
Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val
20 25 30
Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys
35 40 45
Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Gln Phe
50 55 60
Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys
65 70 75 80
Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr
85 90 95
Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser
100 105 110
Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu
115 120 125
<210> 112 <211> 138 <212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 112
Met Ala Ser His Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu Ala Gly Leu Val Phe
1 5 10 15
Val Ser Glu Ala Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu
20 25 30
Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val
35 40 45
Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe
50 55 60
Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr
65 70 75 80
Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu
100 105 110
Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Ser Tyr Ser
115 120 125
Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu 130 135
<210> 113 <211> 9 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Остатки транстиретина 89-97
<400> 113
Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala
<211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Потенциальный иммуноген транстиретина
<400> 114
Gly Gly Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala Gly Gly Lys Gly
1 5 10 15
<210> 115 <211> 12 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Потенциальный иммуноген транстиретина
<400> 115
Cys Gly Gly Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala
1 5 10
<210> 116
<211> 12 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Потенциальный иммуноген транстиретина
<400> 116
Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala Cys Gly Gly
1 5 10
<210> 117 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Составной CDRH1 по Chothia-Kabat антитела 9D5
<400> 117
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser
1 5 10
<210> 118 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Составной CDRH1 по Chothia-Kabat антитела 14G8
<400> 118
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser
1 5 10
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело, которое связывается с транстиретином и содержит три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи в основном из антитела 14G8.
2. Антитело по п. 1, содержащее три CDR тяжелой цепи по Кабату и три CDR легкой цепи по Кабату антитела 14G8, за исключением того, что каждая позиция Н52 и L26 может быть N или S.
3. Антитело по п. 1 или п. 2, содержащее три CDR тяжелой цепи по Кабату и три CDR легкой цепи по Кабату антитела 14G8.
4. Антитело по п. 1, п. 2 или п. 3, отличающееся тем, что CDR-H1 представляет собой составную CDR по Кабату-Чотия антитела 14G8.
5. Антитело по п. 1 или п. 2, содержащее три CDR тяжелой цепи по Кабату
антитела 9D5.
6. Антитело по п. 1, п. 2 или п. 5, отличающееся тем, что CDR-H1 представляет собой составную CDR по Кабату-Чотия антитела 9D5.
7. Антитело по п. 1, которое связывается с тем же эпитопом на транстиретине что и 9D5 или 14G8 и содержит три CDR легкой цепи и три CDR тяжелой цепи, отличающееся тем, что:
а) каждая CDR имеет по меньшей мере 90% идентичности
последовательности с соответствующей последовательностью CDR из вариабельных
областей тяжелой и легкой цепей 9D5; или
б) каждая CDR имеет по меньшей мере 90% идентичности
последовательности с соответствующей последовательностью CDR из вариабельных
областей тяжелой и легкой цепей 14G8, за исключением того, что позиция L26 может
представлять собой N или S.
8. Антитело по п. 7, содержащее:
а) три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи 9D5; или
б) три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи 14G8, за исключением
того, что позиция L26 может представлять собой N или S.
9. Антитело по п. 7 или п. 8, отличающееся тем, что:
а) три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи 9D5 представляют собой
SEQ Ш N0: 13-15 и 24-26 соответственно, и
б) три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи 14G8 представляют
собой SEQ ID N0: 67-69 и 77-79 соответственно, за исключением того, что позиция L26
может представлять собой N или S.
10. Антитело по любому из предыдущих пунктов, которое представляет собой моноклональное антитело.
11. Антитело по любому из предыдущих пунктов, которое представляет собой химерное, гуманизированное, венированное или человеческое антитело.
12. Антитело по любому из предыдущих пунктов, которое имеет изотип IgGl человека.
13. Антитело по любому из пп. 1-11, которое имеет изотип IgG2 или IgG4
человека.
14. Антитело по п. 1, которое является гуманизированным или химерным антителом антитела мыши, которое специфически связывается с транстиретином, причем антитело мыши характеризуется вариабельной областью зрелой тяжелой цепи SEQ Ш N0: 61 и вариабельной областью зрелой легкой цепи SEQ Ш N0: 70, за исключением того, что позиция Н52 может представлять собой S или N, позиция Н69 может представлять собой F или I, позиция L26 может представлять собой S или N, a R в позиции L107 является необязательным.
15. Антитело по п. 14, которое представляет собой гуманизированное или химерное антитело 9D5 или 14G8, которое специфически связывается с транстиретином, причем 9D5 представляет собой мышиное антитело, характеризующееся вариабельной областью зрелой тяжелой цепи SEQ ID NO: 1 и вариабельной областью зрелой легкой цепи SEQ ID NO: 16, a 14G8 представляет собой мышиное антитело, характеризующееся вариабельной областью зрелой тяжелой цепи SEQ ID NO: 61 и вариабельной областью зрелой легкой цепи SEQ ID NO: 70.
16. Гуманизированное антитело по п. 15, содержащее:
14.
а) вариабельную область гуманизированной зрелой тяжелой цепи,
содержащую три CDR тяжелой цепи 9D5, и вариабельную область гуманизированной зрелой
легкой цепи, содержащую три CDR легкой цепи 9D5; или
б) вариабельную область гуманизированной зрелой тяжелой цепи,
содержащую три CDR тяжелой цепи 14G8, и вариабельную область гуманизированной
зрелой легкой цепи, содержащую три CDR легкой цепи 14G8, за исключением того, что
позиция L26 может представлять собой N или S.
17. Гуманизированное антитело по п. 16, отличающееся тем, что:
а) три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи 9D5 представляют собой
SEQ ID N0: 13-15 и 24-26 соответственно, и
б) три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи 14G8 представляют
собой SEQ ID N0: 67-69 и 77-79 соответственно, за исключением того, что позиция L26
может представлять собой N или S.
18. Гуманизированное антитело по любому из пп. 14-17, содержащее вариабельную область гуманизированной зрелой тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% идентичную любой из последовательностей SEQ ГО N0: 5-12, и вариабельную область гуманизированной зрелой легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90 % идентичную любой из последовательностей SEQ ГО N0: 19-23, за исключением того, что позиция HI9 может представлять собой R или К, позиция Н40 может представлять собой А или Т, позиция Н44 может представлять собой G или R, позиция Н49 может представлять собой S или А, позиция Н77 может представлять собой S или Т, позиция Н82а может представлять собой N или S, позиция Н83 может представлять собой R или К, позиция Н84 может представлять собой А или S, и позиция Н89 может представлять собой V или М.
19. Гуманизированное антитело по п. 18, отличающееся тем, что по меньшей мере, одна из следующих позиций занята аминокислотой, как указано: в позиции Н42 находится Е, в позиции Н47 находится L, в позиции Н69 находится F, в позиции Н82 находится S, в позиции Н82Ь находится L, в позиции Н108 находится L, в позиции L8 находится А, в позиции L9 находится Р, в позиции L18 находится S, в позиции L19 находится V, в позиции L36 находится F, в позиции L39 находится R, в позиции L60 находится S, в позиции L70 находится А, и в позиции L74 находится R.
18.
20. Гуманизированное антитело по п. 19, отличающееся тем, что в позициях Н47, Н69 и Н82 находиться соответственно L, F и S.
21. Гуманизированное антитело по п. 19, отличающееся тем, что в позициях Н47, Н69, Н82 и Н82Ь находятся соответственно L, F, S и L.
22. Гуманизированное антитело по п. 19, отличающееся тем, что в позициях Н42, Н47 и HI08 находятся соответственно Е, L и L.
23. Гуманизированное антитело по п. 19, отличающееся тем, что в позициях Н69, Н82, и Н82Ь находятся соответственно F, S, и L.
24. Гуманизированное антитело по п. 19, отличающееся тем, что в позициях Н47 и HI08 находится L.
25. Гуманизированное антитело по п. 19, отличающееся тем, что в позициях Н82 и Н82Ь находятся соответственно S и L.
26. Гуманизированное антитело по п. 19, отличающееся тем, что в позициях Н42, Н47 и Н82Ь находятся соответственно Е, L и L.
27. Гуманизированное антитело по п. 19, отличающееся тем, что в позиции L36 находится F.
28. Гуманизированное антитело по п. 19, отличающееся тем, что в позиции L60 находится S.
29. Гуманизированное антитело по п. 19, отличающееся тем, что в позициях L8, L9, L19, L36, L39, L60, L70 и L74 находятся соответственно А, Р, V, F, R, S, А и R.
30. Гуманизированное антитело по п. 19, отличающееся тем, что в позициях L8, L9, L18, L19, L36, L39, L60, L70 и L74 находятся соответственно А, Р, S, V, F, R, S, А, и R.
31. Гуманизированное антитело по п. 18 содержащее вариабельную область зрелой тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 95% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 5-12, и вариабельную область зрелой легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 95 % идентичную любой из последовательностей SEQ Ш NO: 19-23, за исключением того, что позиция Н19 может представлять собой R или К, позиция Н40 может представлять собой А
18.
или Т, позиция Н44 может представлять собой G или R, позиция Н49 может представлять собой S или А, позиция Н77 может представлять собой S или Т, позиция Н82а может представлять собой N или S, позиция Н83 может представлять собой R или К, позиция Н84 может представлять собой А или S, и позиция Н89 может представлять собой V или М.
32. Гуманизированное антитело по п. 31 содержащее вариабельную область зрелой тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 98% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 5-12, и вариабельную область зрелой легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 98 % идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 19-23, за исключением того, что позиция Н19 может представлять собой R или К, позиция Н40 может представлять собой А или Т, позиция Н44 может представлять собой G или R, позиция Н49 может представлять собой S или А, позиция Н77 может представлять собой S или Т, позиция Н82а может представлять собой N или S, позиция Н83 может представлять собой R или К, позиция Н84 может представлять собой А или S, и позиция Н89 может представлять собой V или М.
33. Гуманизированное антитело по п. 32, отличающееся тем, что вариабельная область зрелой тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность любой из SEQ Ш N0: 5-12, а вариабельная область зрелой легкой цепи имеет аминокислотную последовательность любой из SEQ Ш N0: 19-23.
34. Гуманизированное антитело по п. 33, отличающееся тем, что вариабельная область зрелой тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 11, а вариабельная область зрелой легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ 1DN0: 19.
35. Гуманизированное антитело по любому из пп. 14-17 содержащее вариабельную область гуманизированной зрелой тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 64-66, и вариабельную область гуманизированной зрелой легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90 % идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 74-76, за исключением того, что позиция Н82а может представлять собой N или S, позиция Н83 может представлять собой R или К, позиция Н84 может представлять собой А или S, позиция Н89 может представлять собой V или М, и позиция L18 может представлять собой S или Р.
32.
36. Гуманизированное антитело по п. 35, отличающееся тем, что по меньшей мере одна из следующих позиций занята указанной аминокислотой: в позиции HI находится Е, в позиции Н47 находится L, а в позиции L36 находится F.
37. Гуманизированное антитело по п. 36, отличающееся тем, что в позициях HI и Н47 находятся соответственно Е и L.
38. Гуманизированное антитело по п. 36, отличающееся тем, что в позиции L36 находится F.
39. Гуманизированное антитело по любому из пп. 35-38, отличающееся тем, что по меньшей мере одна из следующих позиций занята указанной аминокислотой: в позиции НЗ находится К, в позиции HI05 находится Т, в позиции L8 находится А, в позиции L9 находится Р, в позиции L19 находится V, в позиции L26 находится S, в позиции L60 находится S, а в позиции L70 находится А.
40. Гуманизированное антитело по п. 39, отличающееся тем, что в позициях НЗ и HI05 находятся соответственно К и Т.
41. Гуманизированное антитело по п. 39, отличающееся тем, что в позициях L8, L9, L19 и L70 находятся соответственно А, Р, V и А.
42. Гуманизированное антитело по п. 39, отличающееся тем, что в позициях L26 и L60 находится S.
43. Гуманизированное антитело по п. 35, содержащее вариабельную область зрелой тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 95% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 64-66, и вариабельную область зрелой легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 95 % идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 74-76, за исключением того, что позиция Н82а может представлять собой N или S, позиция Н83 может представлять собой R или К, позиция Н84 может представлять собой А или S, позиция Н89 может представлять собой V или М, и позиция L18 может представлять собой S или Р.
44. Гуманизированное антитело по п. 43, содержащее вариабельную область зрелой тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 98% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш NO: 64-66, и вариабельную область зрелой легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере на 98
32.
% идентичную любой из последовательностей SEQ Ш N0: 74-76, за исключением того, что позиция Н82а может представлять собой N или S, позиция Н83 может представлять собой R или К, позиция Н84 может представлять собой А или S, позиция Н89 может представлять собой V или М, и позиция L18 может представлять собой S или Р.
45. Гуманизированное антитело по п. 44, отличающееся тем, что вариабельная область зрелой тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность любой из SEQ ID N0: 64-66, а вариабельная область зрелой легкой цепи имеет аминокислотную последовательность любой из SEQ Ш N0: 74-76.
46. Гуманизированное антитело по п. 45, отличающееся тем, что вариабельная область зрелой тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 65, а вариабельная область зрелой легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 76.
47. Антитело по любому из пп. 1-46, которое представляет собой интактное
антитело.
48. Антитело по любому из пп. 1-46, которое представляет собой связывающий фрагмент.
49. Антитело по п. 48, отличающееся тем, что связывающий фрагмент представляет собой одноцепочечное антитело, Fab или Fab'2-фрагмент.
50. Гуманизированное антитело по любому из пп. 14-47, отличающееся тем, что вариабельная область зрелой легкой цепи слита с константной областью легкой цепи, а вариабельная область зрелой тяжелой цепи слита с константной областью тяжелой цепи.
51. Гуманизированное антитело по п. 50, отличающееся тем, что константная область тяжелой цепи представляет собой мутантную форму естественной константной области тяжелой цепи человека, которая имеет ослабленное связывание с рецептором Fey по сравнению с естественной константной областью тяжелой цепи человека.
52. Гуманизированное антитело по п. 50 или п. 51, отличающееся тем, что константная область тяжелой цепи является таковой изотипа IgGl.
53. Гуманизированное антитело по п. 50, отличающееся тем, что вариабельная область зрелой тяжелой цепи слита с константной областью тяжелой цепи, имеющей последовательность SEQ Ш N0: 103, и/или вариабельная область зрелой легкой
48.
цепи слита с константной областью легкой цепи, имеющей последовательность SEQ Ш N0: 104 или 105.
54. Гуманизированное антитело по любому из пп. 14-53, отличающееся тем,
что:
а) любые различия в CDR вариабельной области зрелой тяжелой цепи и
вариабельной области зрелой легкой цепи из SEQ Ш NO: 1 и 16, соответственно, находятся в
позициях Н60-Н65; или
б) любые различия в CDR вариабельной области зрелой тяжелой цепи и
вариабельной области зрелой легкой цепи из SEQ Ш N0: 61 и 70, соответственно, находятся
в позициях Н60-Н65; за исключением того, что в позиции L26 может быть N или S.
55. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из предыдущих пунктов и фармацевтически приемлемый носитель.
56. Нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь и/или легкую цепь антитела, как описано в любом из пп. 1 -54.
57. Нуклеиновая кислота по п. 56, имеющая последовательность, содержащую любую из SEQ ГО N0: 40, 42, 44-56, 87, 89, 91-96 и 106-108.
58. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 56 или п. 57.
59. Клетка-хозяин, трансформированная рекомбинантным вектором экспрессии по п. 58.
60. Способ гуманизации антитела, включающий:
а) выбор одного или больше акцепторных антител;
б) идентификацию аминокислотных остатков мышиного антитела,
подлежащих сохранению;
в) синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей гуманизированную
тяжелую цепь, содержащую CDR тяжелой цепи антитела мыши, и нуклеиновой кислоты,
кодирующей гуманизированную легкую цепь, содержащую CDR легкой цепи антитела
мыши; и
г) экспрессию нуклеиновых кислот в клетке-хозяине для продуцирования гуманизированного антитела;
причем антитело мыши представляет собой 9D5 или 14G8, при этом 9D5 характеризуется вариабельной областью зрелой тяжелой цепи SEQ Ш NO: 1 и вариабельной областью зрелой легкой цепи SEQ Ш N0: 16, a 14G8 характеризуется вариабельной областью зрелой тяжелой цепи SEQ ID N0: 61 и вариабельной областью зрелой легкой цепи SEQ ID N0: 70.
61. Способ продуцирования гуманизированного, химерного или венированного антитела, включающий:
а) культивирование клеток, трансформированных нуклеиновыми
кислотами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела, так что клетки секретируют
антитело;и
б) очистку антитела от клеточной культуральной среды;
при этом антитело представляет собой гуманизированную, химерную или венированную форму 9D5 или 14G8.
62. Способ создания клеточной линии, продуцирующей гуманизированное, химерное или венированное антитело, включающий:
а) введение вектора, кодирующего тяжелую и легкую цепи антитела и
маркер селекции в клетки;
б) размножение клеток в условиях, позволяющих отбирать клетки,
имеющие увеличенное количество копий вектора;
в) выделение отдельных клеток из выбранных клеток; и
б) создание банка клеток, клонированных из одной клетки, выбранной на основе выхода антитела;
при этом антитело представляет собой гуманизированную, химерную или венированную форму 9D5 или 14G8.
63. Способ по п. 62, дополнительно включающий размножение клеток в селективных условиях и скрининг для обнаружения линий клеток, естественно экспрессирующих и секретирующих по меньшей мере 100 мг/л/10ь клеток/24 ч.
63.
64. Способ ингибирования или снижения агрегации транстиретина у субъекта, имеющего транстиретин-опосредованний амилоидоз или подверженного риску его развития, включающий введение субъекту антитела по любому из пп. 1-54 эффективной схемой, тем самым ингибируя или уменьшая агрегацию транстиретина у субъекта.
65. Способ ингибирования или снижения формирования фибрилл транстиретина у субъекта, имеющего транстиретин-опосредованний амилоидоз или подверженного риску его развития , включающий введение субъекту антитела по любому из пп. 1-54 эффективной схемой, тем самым ингибируя или уменьшая накопление транстиретина у субъекта.
66. Способ уменьшения количества отложений транстиретина у субъекта, имеющего транстиретин-опосредованний амилоидоз или подверженного риску его развития , включающий введение субъекту антитела по любому из пп. 1-54 эффективной схемой, тем самым уменьшая количество отложений транстиретина у субъекта.
67. Способ устранения агрегатов транстиретина у субъекта, имеющего транстиретин-опосредованний амилоидоз или подверженного риску его развития, включающий введение субъекту антитела по любому из пп. 1-54 эффективной схемой, тем самым устраняя агрегаты транстиретина у субъекта по сравнению с субъектом, имеющим транстиретин-опосредованний амилоидоз или находящимся под риском его развития, который не получал антитела.
68. Способ стабилизации нетоксичной формы транстиретина у субъекта, имеющего транстиретин-опосредованний амилоидоз или подверженного риску его развития , включающий введение субъекту антитела по любому из пп. 1-54 эффективной схемой, тем самым стабилизирую нетоксичную форму транстиретина у субъекта.
69. Способ лечения или осуществления профилактики транстиретин-опосредованного амилоидоза у субъекта, включающий введение субъекту антитела по любому из пп. 1-54 эффективной схемой.
70. Способ замедления начала проявления транстиретин-опосредованного амилоидоза у субъекта, включающий введение субъекту антитела по любому из пп. 1-54 эффективной схемой.
63.
71. Способ диагностирования транстиретин-опосредованного амилоидоза у субъекта, включающий приведение в контакт биологического образца от субъекта с эффективным количеством антитела по любому из пп. 1-54.
72. Способ по п. 71, дополнительно включающий обнаружение связывания антитела с транстиретином, причем присутствие связанного антитела указывает на то, что субъект имеет транстиретин-опосредованный амилоидоз.
73. Способ по п. 71 или п. 72, дополнительно включающий сравнение связывания антитела с биологическим образцом с связыванием антитела с контрольным образцом, при этом повышенное связывание антитела с биологическим образцом относительно контрольного образца указывает на то, что субъект имеет транстиретин-опосредованный амилоидоз.
74. Способ по п. 73, отличающийся тем, что биологический образец и контрольный образец содержат клетки того же самого тканевого происхождения.
75. Способ по любому из пп. 71-74, отличающийся тем, что биологический образец и/или контрольный образец представляют собой кровь, сыворотку, плазму или твердую ткань.
76. Способ по п. 75, отличающийся тем, что твердая ткань представляет собой ткань из сердца, периферической нервной системы, вегетативной нервной системы, почек, глаз или желудочно-кишечного тракта.
77. Способ по любому из пп. 64-76, отличающийся тем, что транстиретин-опосредованный амилоидоз представляет собой наследственный транстиретиновый амилоидоз или спорадический транстиретиновый амилоидоз.
78. Способ по п. 77, отличающийся тем, что наследственный транстиретиновый амилоидоз представляет собой наследственную амилоидную кардиомиопатию (FAC), наследственную амилоидную полинейропатию (FAP) или селективный амилоидоз центральной нервной системы (CNSA).
79. Способ по п. 77, отличающийся тем, что спорадический транстиретиновый амилоидоз представляет собой старческий системный амилоидоз (SSA) или старческий сердечный амилоидоз (SCA).
63.
80. Способ по любому из пп. 64-76, отличающийся тем, что транстиретин-опосредованный амилоидоз связан с накоплением амилоида в сердце, периферической нервной системе, вегетативной нервной системе, почках, глазах или желудочно-кишечном тракте субъекта.
81. Способ выявления присутствия или отсутствия отложений транстиретина у субъекта, включающий приведение в контакт биологического образца от субъекта, подозреваемого в наличии амилоидного накопления, с эффективным количеством антитела по любому из пп. 1-54.
82. Способ по п. 81, дополнительно включающий обнаружение связывания антитела с транстиретином, причем обнаружение связанного антитела указывает на наличие отложений транстиретина.
83. Способ по п. 81 или п. 82, дополнительно включающий сравнение связывания антитела с биологическим образцом с связыванием антитела с контрольным образцом, при этом повышенное связывание антитела с биологическим образцом относительно контрольного образца указывает на то, что субъект имеет транстиретин-опосредованный амилоидоз.
84. Способ по п. 83, отличающийся тем, что биологический образец и контрольный образец содержат клетки того же самого тканевого происхождения.
85. Способ по любому из пп. 80-84, отличающийся тем, что биологический образец и/или контрольный образец представляют собой кровь, сыворотку, плазму или твердую ткань.
86. Способ по п. 85, отличающийся тем, что твердая ткань представляет собой ткань из сердца, периферической нервной системы, вегетативной нервной системы, почек, глаз или желудочно-кишечного тракта.
87. Способ определения количества отложений транстиретина у субъекта, включающий введение антитела по любому из пп. 1-54 и обнаружения присутствия связанного антитела у субъекта.
88. Способ по п. 87, отличающийся тем, что присутствие связанного антитела определяется с помощью позитронно-эмиссионной томографией (ПЭТ).
63.
4 0
aSBSVH
Mouse Model 1SEQ В
Яешяе Model '.HQK К
йшлап Acceptor &AC02H4
Hunan Acceptor ДАХ82494
HuStOSVHvl
HU &B5VH-/2
Hu*D5VHv Hu Hu5DSVBv3b
Ku?05VHv4b HuSDSVHvS
EyKI.OtSGGOl.VOPgSSLKLSCAASfaFrrSSymyvRO'rPE 42
EVQIAJESGGGr,V0PSGSLRb3CAASCF?f5SY"|iHmQllPG 4 2
EVQI.VESGGGf VCPGGSI.atSCAASeFTFSSffM^fraOAPS 4?
g^QlA^SGGGLVQPSGSiaLSCAaSCF?FSSf?M№VmQAPG -t 2
EVQLVESGiJGf.V0PGGSmi.SCA &St5F^FSfJ"^fVR0APG 4?
r.'QLVESGGGrVQPGGSI.KLSCAA^GF-rFSSrTMyVROrPG 42
50 63 ?3 40
raS &SVH
Mouse Model iSEQ_H Mouse Model ШОК И Human Acceptor BAC5?!I4 """ Acceptor AAX82494
uu^mmvi
Hu*05VHv2
Bu505VHv2b
Hu*D5VHv3
Hu9DSVHv3b
HuSD5VHv4
HuS05VHv4b
Ha9D5VHv5
K.Rt.EWV^JW.'GGGRT'yyPDTVKGf rTISBOKAfTNTLri^MS KGIJWVЈ" 1TSSSSTIYYADSVKGRFT ISRCWAKKSL.YI.QMK XRLEWVttTTSSGGSYrYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMS 84 KGI.El> VfljETSllSGDTrYYP07VKGBPT'FSBDHAKNSI"ҐLOSJ" 84 KGf.F.J.VAF I bf.4> GI5"TYYPnTV!4GKt*TKSHDNAKT"St,Yf.QSM 84 КЯЫгЬУД^IsNSutJTTYYPDTVKGKFT 1SBDt" АКТ)?t?I.QMS S4 КСГ.ГЛЧУ tSNUGCT'YYPDrVKGRFTF^RDNAKNSI.Vl.CSrJ 84 r.Rt.Er.VAF.rSNSr.BTTYYPDTVKGRFT I SRRNAKiJTT.YLQHS 84 KGI.EKV^ISKSGDt-tYYPOTVKeJfTlSRDHaKBSt.fLOSII 84 XP t.EIiVAF ISNSGD7TYYPDTVKGRF7 T SRONAKNT'.Yr.OMS 84 Kai.F-.t.V^:SSSGr)T?YVPDTVKGHFTTSRDSAKNrr.Yt.O> C-- 84
Фет. 1A 1
100
1?0
H9D5VH
Mouse Model ism н House Model ;чок н Human Acceptor BACO 2 I1\ йдаип Acceptor AAX8?4"4
HuSOSVKv!
Hu$D5VHv2
Hu905VHv2b
HuSDSVHvJ
HcSDbVHv.?b
Hu9DSVHv4
Hu9D'jVHv4b
Hu9D5VHv5
"Ек5?вТК"?С1шШ?\*€Ж J ?4 iSEQ О № *i
SLKSECTAI.YYCAR"-GAHFGN0FKYP4CI*HGQCTSV?VSS 1 2 3 |$E0 О "0 2}
SUtSEDTAMYYCVRHF.YY YAMDYHOCGTTVTVSS 1 18 ;S50 !0 N0 62,
SLSAED7 AVY YC ARjSGQCSRY YYYYGMD WG00T7 V?VSS 1 24 ;SrO Ю SO 3j
SI.KSrnTAMYYCARI-YYGyRYYF OYBGOSfMVTVSS 120 iSEQiONO*
SI.KAEC7AVYYCARHYYYGGGYGGKFFDVHSCST'TVTVSS 124 {SEO Ю HQ 5)
I. :Л.АЕОТAVYYC ARKY YYGGGYGJWf FOVWGCS rTVTVSS 124 (SЈQ!0H0 6.i
SI.KSEOTAK/YCAR^YYGGGYGGKFFDVleGOerr.VTVdlJ 1?4 ;SSQ '0 NO 7)
X .1 .RAF. D Г AVY Y С ARH Y Y YGGGYGGWFKOVfcGQGC Г VT VS S 124 SiO ID NO В i
SLKSED?AMYYCAI &YYYGSGYGGWrFDVWGOGTbVTVSS 124 iSEG Ю NO 9;
RAEOTAVYYCARHYY YGGGYGGb"FKr)Vi"'GQG~?V'"VЈ> t> l?4 ,S=Q О NO '0.
ST KKKDT AMY YCARWY Y YGGGYC.GWFPnVHCCGTI.VTVSS 124 -:S=0 ID MO
II. RAEС?AVYY С ARHY Y YGGG Y GG WFFDvWCQGTTVT VSS 124 .SiC !D N0 12;
Фиг. 1A.2
ra9D5VL
Jfeuse Model lMJU I,
Hume.t acceptor
Hu9D5VLvl
Hu9D5Vbv2
Hu9D5VI.v3
Hu9.')SVLv4
HoSObVLv*
Hi J.4t- > fcdej i M.7U L
Brari Acceptor АВС6695/ "u9D5VLvl
HU6CIVI.V;
Hu9Dt> "T.v.! H"9E> 5VLv4 Hu"D5VLvi>
DI4> (r0W^PSVVV~t> GESVS!SCRdSKS!J-Hbt;CNTYI-VV 40 DIVMTOAAPSVPVTPGESVli rSCRSSKSt.LHSKGHTYI.VW 4 0
DfVHT0SI"I,SI.prrPCEPAStSS3"SM0SU,YSKGYfiyrJt* 45 DlVMTOSPLSI.PVTPGEPASILLHSKGHTYШ 4 0 DIVM-OSVt.yt.VvTPGr.PASTSChSSXSLl.HStiGNTYLyv; 40 DT WT0SPUJbPVTPGEP AS I SOKSSKSU-HcSKGNT YLYV 4 0 DIVMTOiiAPSLPVTPGEPVS I SC$lSSX31.LHSNGNT-YLiV 4 0 DIV4TQSAP^!J> V?PGESVS:SC"_bJiKSrr.HbNGNTYr^V 40
5C 60 70 80
F!^RPG0SP0I.r-:V"Vit7LA*iVPDP"FSGS^ 80
Fl.CSPGOSP01.t.tY?i.".SHI,AdGVPDRFSGSGSGTAF^ri?r 90
У! ОКР GOSF0I .Г. T VSGUNRAJCVPDRFSCSGSGT DFTi "К I 00
PL0M"G05POIXI 1*RVSMlAStSVPDRFSGSGSGTDF?bKI 80
YlCKPGQSPOt^IYJM/SNIASiGVPDRFSGSGSGTDFTUa S3
Ґr^SPGCSP01.!.TY*VSHO"'J3V"PSRFSGSSSGTOFrLKI 80
FLORPG0SPCLII SЈVSNIA$GVPSRFSGSGSCTAFTLR I 83
FLQRPGCSP0tATYftVSMA3GVPSRFSGSGSGTAFTUtI 30
House Model 1MJ1J L Hunan Acceptor
Hu6ClVI.v? Ru90SVLv3
Hu9D8Vt,v4 B*J3BSVI,V5
9C 1C0 U0
SR~VEAESVGVY Y ClXgHl.r.YP!.7"Ffl AGIfIF 1.К liR'.TAmVJVYYai.CHI.FYPF^TiAGrKI.KI.K SR-.T.AFDVGVYYq> K?AI,OSPYrFCOGTKI.E : К SR VEAEDVGVY YCfftpHLE YP I.BFGQGTKT.E 1К SHVFAKDVGVY YCSXOHT.FYP'.T'l'GOGTKI.F Г К SRVEAEDҐGVҐYC"08LEYI"LtTGQGTKLCIK SRVF.AFDVGVY YCMOHt.ryFt.trFGOG?K!.r 7 К SWVFAF.OVGVYYCtMQHl.FYPLWGOGTKS.F. IК
112 .'SEQONO'v 112 iSrO 2 NCT * 112 'SEQ 'G N0 -e 112 iSr'Q NO
U2 fSЈOi0KC2*i 112 iSrQ 3 K'.; .7 U2 tSЈQ:CNC2V
Фиг. IB
ml4S8VH
.House Model 1M0K И
Йшвао Acceptor ЛАОЗйИС
Нияшп Acceptor аЯХ82494
Hul4G8VHvl
Ни!4CBVHV2
Hu!4G8VHv3
10 2C 30
FVK Г. vr S G GG :.VC PG С SI. К i'.S С AA: &F?FS6. EVKT^JFSGCOI VCPGG-SI.Kr.SCAAiJGFTf 0V0-V0SSS5I.VS?GGSSKI.SCAAffeFTF OVar ЛИС-ТРЕ
WRQTPE
AWT РЕ
WRGTPF
mt4GSVH
Моиее Model 1M0K И
Ногьап Acceptor AAD3G4 ! С
Human Acceptor AAXS ?•! V t
Hul4C8VKvi
HuMCfcVNV?
Hu!4GSVHV3
50 6 0 70 1С
KRLEWVAS I WiGCCR-YУ PD7VFSRF?ISROUAKNT Г.УГ-СМУ 84
KB^EWVAATSTOGSFT%'УАОТУкфгГ1 SG0"SK"^LҐI,O"i 84
KR;,EWVWTlSSSSS?Tt"> DS\?KGt*FTISHDiar.l",:,yt^KS 84
KRIJEbVAEISSSGDTTYYPD?VKG)ftFTtSRDHAFUTLYI^OMS 84
KRIJELVABI№JSGDTTYYPOTVKG|tFTTSRDNAKNTbYi^K!} 84
KRLFI.VAF,INtl^GDTTYYPDTVKGftFri:;RD:JArNTI.Y',CVJJ 84
"14G8VH
Meuse Model 1V.CC H
Ними Acceptor AAGK41С
Нилли Acceptor AAX82434
Mu!4G8VHv!
Hul4G8VHv?
Hul4G8VHv3
90 S5C 510 !?C
i 1 .KL: Г Г> AKY YCAJWYY YGC 4 Y G G WF Ft: VV G 7G T ~V 7 V3 5
SIJCSECfTAMYYCVRiHEY Y YAMDYVGOG7. 7VTVSS
SURAEO?AVY YC AKJ5RGI CATACV5RFOPtiGOC;tt,VTVSS
SMtSECTAMYYCARsLYYGYRYYF OAfSCGrMVTVSS
ST.KSEGT AHYYCAWVY YSSGYGGV"FFE* 124 1 18 124 ]" 1 ?i l?i 124
,S~0 DN0 6-
,3EO> Df*0 6i, ,'SEO !DN0". .S-QONC4': ¦St'QO КО 54. |ЗЕЭ !0 NO 66.-
ФИГ 2A
House ffedel IHJU J,
Human Acceptor ABA7;374
8мл Acceptor ABC66952
H"14G8VI,vJ
Hul4G8Vr.v2
Hu! 4G8V!.v3
reMG8Vt"
нг -3"" KctJel iM.ru i,
Hunan Acceptor ABA" J 374
Huron Acceptor ABC66§52 Ни 1 4 G8V1 V 1
HU!4C9V:.V:
Hu! 4G8V!.v3
10 20 1С 40
DI VM70AAPSVPVTPGE5VS I Scfe.SNK3f.LHSNGfiT YLVK 40 DIVMTGAAPSVPVTPGF.SVSISC^lLSKtn.r HbliGIiTYI.YW 40 DIVTOrQTPLSLPVTPGESASISCfcSSQSLRHYSGYTYItii 43 OIV^:0SP:-S!J'4'TPGEPASISCRStJO3l.LYSf*CYNYI.rji < 40 DtWrCSAPSI.FVTPGF.SVStS^SWKSU^SNCTJTYrAfc 40 DlVKTOSPr-SI.PVTPGEPASTSCiBSKKSf,LHaMGMTYbY^ 4 0 DIVM?0SP:,i> r.FVTPGF.PAbISCftbSKS7.I_4SHGNrYI.Y> < 43
?c бе тс e:
FLCRPGOSfQVL 1 YpV^HLASbVPDRJFSGSCSSTAFfLBf 80 R,CHPGQSP2I.f-IYfe4S"IASGV-|"DSrS6SGSGTAFTI*I 80 YbOKPGQSPgVLI Yf.GSURAaGVPORFSGiGSGTDFT'.Kr 8 0 YLOKPGOSPOI-ЬГYfeGSKRA^GVPORFSGSGSGTOFTLXI 80 F!"QXPGOSFQt.LI YhvSNIJkSjGVPDRFSGSGSGTAFTIJtl 80 F:.QKP CCS PQM. I YttVSNLAsbvpDRFS &SGSGTDFTIJC 180 FtOKPGOSfOJ.I.tit &'SNI-ASGVPSRFSCSCSGTDFtLKl 80
E14G8YL
Шизе Mode! 1K.TO h
Htusan Acceptor AHA 7 13 7 4
Human Acceptor АВ€в6952
Hul4G8Vivl
Hul4G8Vt.v?
HJ!4G8VLV.1
SO 100 П0
sRv^fcvaWycp^^p^^ из iSSOiONOTOi
liR VF AF.D VCVYYCt-vJHl.FYPFTFGAGTКl.FT.KR: 113 .SЈOtDN07")
SRVKAF3VGVYYCHvA:.v~ VCSFGCGT KI.F.TKR 113 "SЈQ О NO ?2,
SRVEAEf> VGVYYCHOAI.OSI-YTFGOGTKLETFR 113 {SEQ 10 NO 73)
SRVEAE0VGҐYYcllQHUiYPLTIFGQSTШЖIKR 1П sSrOlO NO 74;
SRVKAEDVGVY VCHCHI^YPbTFGOGTKbK IKR 11 3 iSSQ Ю N0-751
SRVEAEBVGVYYC^Hl.EYPI.Tf'GOGTKtEIKR 113 iSЈ0"0 NO 76j
Фиг. 2B
6/8
рЧ4 toMdTO
25, ¦
Фиг ЗА
20 I
-*> ¦ 14GI -•-ВС' - 5А'
ООО* О С" О О'ОС 1 10 ч*ю
;?rAS' fug- гг. I
Фиг. ЗВ
7/8
, 60 j
" ш I
" , Г"]
9D5 *4G8 6C1 5А'
••• з { I I ! if ;гГ- \ г; :i i'
Л 1 С • <
r '2 "5 *,8 *3 20 2' 22 P. 24 25 2Г Фиг. 5A
*! *2 "5 '.8 19 20 21 22 23 24 25 2?
-V'iZ "OZ;
Фиг. 5B
8/8
"j:i:*-:s-:
Of.ilf !i, 1'лгд -. 1' i, ?, J
•* 12 '5 !8 15 23 :i 22 23 24 25 2? Фиг 6
Фиг 7B
X. Другие применения
ПРИМЕРЫ
Таблица 5
Таблица 7
Гуманизированные области Vh 9D5
Таблица 7
Гуманизированные области Vh 9D5
Таблица 7
Гуманизированные области Vh 9D5
Таблица 7
Гуманизированные области Vh 9D5
Таблица 8
Гуманизированные области Vk 9D5
Таблица 8
Гуманизированные области Vk 9D5
Таблица 9
Таблица 9
101
101
Ill
Таблица 13
Гуманизированные области Vh 14G8
Ill
Таблица 13
Гуманизированные области Vh 14G8
Таблица 13
Гуманизированные области Vh 14G8
112
Таблица 13
Гуманизированные области Vh 14G8
115
Таблица 13
Гуманизированные области Vh 14G8
115
Таблица 13
Гуманизированные области Vh 14G8
Таблица 13
Гуманизированные области Vh 14G8
Таблица 13
Гуманизированные области Vh 14G8
117
117
118
Таблица 14
Гуманизированные области Vk 14G8
118
Таблица 14
Гуманизированные области Vk 14G8
Таблица 14
Гуманизированные области Vk 14G8
Таблица 14
Гуманизированные области Vk 14G8
Таблица 14
Гуманизированные области Vk 14G8
122
Таблица 14
Гуманизированные области Vk 14G8
125
Таблица 15
125
Таблица 15
126
126
<220>