(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к фармацевтическому составу, содержащему комбинацию бензидамина и противогрибкового активного ингредиента, указанная комбинация имеет синергический эффект в лечении микоза.
Евразийское (21) 201791483 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.11.30
(22) Дата подачи заявки 2016.01.08
(51) Int. Cl.
A61K31/416 (2006.01) A61K31/4174 (2006.01) A61K45/06 (2006.01) A61P 31/10 (2006.01)
(54) ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МИКОЗА
(31) 15150904.9
(32) 2015.01.13
(33) EP
(86) PCT/EP2016/050272
(87) WO 2016/113194 2016.07.21
(71) Заявитель:
АЦЬЕНДЕ КИМИКЕ РЬЮНИТЕ АНДЖЕЛИНИ ФРАНЧЕСКО А.К.Р.А.Ф. С.П.А. (IT)
(72) Изобретатель:
Миланесе Клаудио, Капеццоне Де Йоаннон Алессандра, Тоньяни Серена, Донати Лука (IT)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-543264RU/081 ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МИКОЗА
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к фармацевтической
композиции, содержащей комбинацию бензидамина и
противогрибкового активного ингредиента, указанная комбинация имеет синергический эффект в лечении микоза.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Грибки, относящиеся к роду Candida , являются одной из наиболее частых причин грибковых инфекций в мире.
Многие разновидности Candida являются безопасными симбионтами или эндосимбионтами своих организмов-носителей, таких, как например человек.
Грибки, относящиеся к разновидностям Candida albicans и Candida tropicalis, в норме присутствуют на слизистой оболочке полости рта, желудочно-кишечного тракта и влагалища. Вместе с тем, когда микрофлора слизистой оболочки изменяется, например, вследствие продолжительного лечения антибиотиками или гормональных изменений, грибки могут чрезмерно размножиться и вызвать поверхностные инфекции, например, в полости рта или во влагалище, известные как кандидоз. У людей с ослабленным иммунитетом грибки могут даже вызвать тяжелые системные инфекции, известные как кандидемия, которые иногда смертельны.
Вульвовагинит, вызванный грибком, представляет в настоящее время около 30-35% вагинальных инфекций и чаще всего вызван грибком Candida albicans.
Вульвовагинит сопровождается изменением вагинального показателя рН, и основными симптомами являются сильный вагинальный и/или вульварный зуд, выделения, воспаление и боль.
В общем, лечение состоит в введении местнодействующих противогрибковых препаратов в виде кремов, вагинальных суппозиториев и растворов для наружного применения. В случае тяжелых и/или рецидивирующих инфекций, противогрибковые препараты вводят перорально.
Pevaryl(tm) является имеющимся в продаже кремом для лечения
вульвовагинального микоза, содержащим 1% масс/масс эконазола нитрата.
Эконазол является производным имидазола, обладающим широким спектром противогрибкового действия и широко применяемым для лечения микоза, вызванного Candida albicans.
Несколько патентных заявок раскрывают комбинации активных ингредиентов, пригодных для лечения микоза полости рта и вульвовагинального микоза.
Публикация W0 96/2 6724 раскрывает фармацевтическую
композицию, содержащую противовоспалительное количество
бензидамина или его соли, антибактериально эффективное количество антибактериального средства и фармацевтически приемлемого носителя или эксципиента.
US 2009/0208558 относится к применению противогрибкового средства и ингибитора адгезии эпителиальных клеток или эндотелиальных клеток для производства комбинированного препарата для местного лечения микоза, вызванного Candida.
Большинство лекарственных комбинаций показывают аддитивный
эффект. В некоторых случаях, вместе с тем, комбинации показывают
менее чем или более чем аддитивный эффект. Комбинации называют
антагонистическими или синергическими, соответственно.
Антагонистический или синергический эффекты непредсказуемы и являются неожиданными экспериментальными данными. Вместе с тем, актуален поиск высоко эффективных комбинаций, например, синергических смесей активных ингредиентов. Способность делать случайные открытия не является подходящим путем, так как число потенциальных комбинаций средств необычайно велико. Другая нормальная стратегия открытия, заключающаяся в анализе и поиске возможных потенциальных комбинаций на основе знания механизма, также имеет ограниченные возможности, поскольку многие биологические конечные точки живых организмов подвержены воздействию по многочисленным направлениям. Данные пути часто неизвестны, и даже при их существовании, механизмы взаимодействия путей для создания биологического конечного эффекта часто неизвестны.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Заявитель столкнулся с проблемой создания фармацевтической композиции для лечения микоза, имеющего улучшенное действие по сравнению с композициями, известными в данной области техники.
Заявитель обнаружил, что бензидамин можно применять совместно с противогрибковыми активными ингредиентами, полученными из имидазола.
В частности, заявитель неожиданно обнаружил, что комбинация бензидамина с противогрибковым активным ингредиентом, полученным из имидазола, имеет синергический эффект в ингибировании роста грибков, относящихся к роду Candida.
Таким образом, в первом аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей комбинацию бензидамина и имидазола-антимикотика или их соли, и по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого эксципиента для применения в лечении микоза, вызванного Candida.
Предпочтительно, бензидамин в композиции согласно настоящему изобретению приносит облегчение при вульвовагинальном зуде и боли.
Предпочтительно, имидазол-антимикотик выбран из группы, содержащей бифоназол, бутоконазол, хлормидазол, клотримазол, кроконазол, эконазол, фентиконазол, кетоконазол, изоконазол, миконазол, нетиконазол, омоконазол, оксиконазол, сертаконазол, сулконазол, тиоконазол или их соли.
Более предпочтительно, имидазол-антимикотик выбран из группы, содержащей бифоназол, бутоконазол, клотримазол, эконазол, фентиконазол, кетоконазол, изоконазол, миконазол, омоконазол, сертаконазол, сулконазол, тиоконазол или их соли.
Еще более предпочтительно, имидазол-антимикотик выбран из группы, содержащей бутоконазол, эконазол, фентиконазол, изоконазол, миконазол, сулконазол или их соли.
Предпочтительно, имидазол-антимикотик является эконазолом, миконазолом или их солью.
Предпочтительно, микоз, вызываемый Candidaг вызван Candida Albicansr Candida lusitaniae, Candida tropicalis, Candida qlabrata, Candida. rugosa, Candida parapsilosisr Candida tropicalis или Candida dubliniensis. Более предпочтительно,
микоз, вызываемый Candida, вызван Candida Albicansr Candida lusitaniae или Candida tropicalis.
Более предпочтительно, микоз, вызываемый Candida, является кандидозом слизистых оболочек, кандидозом кожи, онихомикозом, системным кандидозом, ятрогенным кандидозом, пеленочным кандидозом, кандидозом желудочно-кишечного тракта или кандидозным баланитом.
Еще более предпочтительно, кандидоз слизистых оболочек является кандидозом полости рта или вульвовагинальным.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 визуально показаны результаты действия кремов от А до С примера 7, протестированных на чашке Петри, содержащей Candida albicans, штамм АТСС 10231, способом разведения в агаре, применяя от 1% до 0,03% масс/об крема.
На фиг. 2 графически показаны результаты
денситометрического анализа, выполненного на чашке Петри фиг. 1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем описании выражение "синергический эффект" означает, что комбинация бензидамина и имидазола-антимикотика ингибирует рост штамма грибков, относящихся к роду Candida в концентрации ниже, чем сумма концентраций бензидамина и антимикотика-имидазола, применяемого отдельно для того же штамма для получения аналогичного ингибирования. Другими словами, синергический эффект означает, что комбинация бензидамина и имидазола-антимикотика является эффективной в оказании более чем аддитивного эффекта каждого компонента одного и того же штамма.
Синергизм определен в данном документе в форме индекса фракционной ингибирующей концентрации (FIC), которая является суммой FIC отдельных препаратов, применяемых в каждой комбинации, как описано в Meletiadis J. et al., Antibacterial Agents and Chemotherapy, Feb. 2010, p. 602-609. В строго научном и предпочтительном определении, термин синергизм определяется индексом FIC меньше 0,5, например, когда 50% ингибирование получают от комбинации одной четвертой или меньше концентрации каждого препарата, необходимой для достижения того же эффекта, что при отдельном применении (например, минимальной ингибирующей
концентрации (MIC) каждого препарата). Индекс FIC, равный 0,5, в данном узком смысле, означает аддитивную реакцию. В более широком смысле, применяемые для целей, определенных в данном документе, синергически эффективные количества определены индексом FIC меньше 1,0, например, когда 50% ингибирование получается от комбинации половины или меньше MIC каждого препарата. Индекс FIC, равный 1,0, в данном узком смысле, означает аддитивную реакцию. В рамках данного теста, можно составить изоболограммы из кривых зависимости доза-эффект для различных комбинаций бензидамина и антимикотика-имидазола в каждом штамме, с синергизмом, отмеченным точками ниже линии, где линия соединяет индекс FIC, равный 1 для бензидамина с индексом FIC, равным 1 для антимикотика-имидазола. Данный стандарт позволяет определить MIC для тестируемых комбинаций, чтобы определить MIC каждого компонента, которому необходимо получить синергическую смесь. Точное количество зависит, например, от конкретного штамма.
В настоящем описании и в следующей формуле изобретения, определение "имидазол-антимикотик" означает противогрибковые активные ингредиенты, содержащие кольцо имидазола в их химической структуре.
Предпочтительно, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит бензидамин в количестве по массе от 0,001 масс.% до 1 масс.%, более предпочтительно от 0,05 масс.% до 0,5 масс.%, и еще более предпочтительно от 0,08 масс.% до 0,2 масс.%.
Предпочтительно, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит имидазол-антимикотик, или его соль в количестве от 0,01 масс.% до 4 масс.%, более предпочтительно от 0,1 масс.% до 2 масс.% и еще более предпочтительно от 0,5 масс.% до 1,5 масс.%.
Предпочтительно, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению предназначена для местного применения.
Предпочтительно, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению приготовлена в виде подходящих дозированных форм, таких как кремы, мази, лосьоны, гели, пены,
суппозитории, суппозитории пролонгированного высвобождения, препараты для вагинального спринцевания или растворы для наружного применения.
Более предпочтительно, указанной дозированной формой является крем, мазь, лосьон, препарат для вагинального спринцевания или раствор для наружного применения.
Еще более предпочтительно, указанной дозированной формой является крем или препарат для вагинального спринцевания.
Фармацевтически приемлемый эксципиент может быть выбран их группы, содержащей: смягчающие средства, загустители, консерванты, стабилизаторы, поверхностно-активные вещества, буферные растворы, соли для регулирования осмотического давления, эмульгаторы и т.п.
Предпочтительно, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит один или несколько эмульгаторов, имеющих показатель HLB в диапазоне от б до 9 и один или несколько эмульгаторов, имеющих показатель HLB в диапазоне от больше 9 до 12.
Эмульгаторами, имеющими показатель HLB в диапазоне от б до 9, пригодными для настоящего изобретения, являются, например, цетеариловый спирт, цетеарет-20, полиглицерил-3-диизостеарат, смесь сорбитана стеарата и кокоата сахарозы, ПЭГ-4 дилаурат, метилглюкозы сесквистеарат, лаурил-2, лаурил-3, ПЭГ-8 диолеат, полиглицерил-5-диолеат, натрия стеароиллактилат, сорбитана лаурат, лауроил макрогол-б глицериды, ПЭГ-40 сорбитана перолеат, полиглицерил-3 стеарат, полиглицерил-2 лаурат.
Эмульгаторами, имеющими показатель HLB в диапазоне от
больше 9 до 12, пригодными для настоящего изобретения, являются,
например лаурил-4, ПЭГ-7 глицерилкокоат, ПЭГ-20 миндальные
глицериды, полиглицерил-3 пальмитат, ПЭГ-25 гидрогенизированное
касторовое масло, стеарамид, смесь глицерилстеарата и ПЭГ-100
стеарата, полисорбат 85, ПЭГ-7 оливат, цетеарилгликозид,
цетеарилоливат, глицерилмоностеарат, полиглицерил-10
диизостеарат, полисорбат 85, полиглицерил-5 олеат, ПЭГ-8 олеат, глицерилстеарата цитрат, ПЭГ-7 глицерилкокоат, полиглицерил-3 метилглюкозы дистеарат.
Конкретно, предпочтительными эмульгаторами, имеющими показатель HLB в диапазоне от больше 9 до 12, являются Tefose 63, смесь ПЭГ-б и ПЭГ-32 пальмитостеарата и гликоля стеарата, и Gelot 64, смесь глицеролмоностеарата и ПЭГ-75 стеарата, оба производства Gattefosse SAS, France.
Конкретно, предпочтительными эмульгаторами, имеющими показатель HLB в диапазоне от б до 9, являются Labrafil M2130CS, смесь лауроил макрогол-б глицеридов, и Labrafil M1944CS, смесь олеоил полиоксил-б глицеридов, оба производства Gattefosse SAS, France.
Приведенные далее примеры предназначены для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения, в то же время не ограничивают его.
ПРИМЕРЫ
Целью тестов, описанных в примерах 1-5, является оценка фунгицидной активности in vitro комбинации бензидамина и имидазола-антимикотика против штаммов грибков, относящихся к роду Candida.
Пример 1
1.1 Приготовление грибковых штаммов
Штаммы Candidaг хранящиеся при температуре -8 0°С, разморозили и посеяли на питательную среду СДА, и далее использовали вторую субкультуру. Затем приготовили суспензии штаммов Candida следующим образом.
10 мл раствора хлорида натрия поместили в 50 мл пробирку фирмы Falcon с 5 г стеклянных шариков. Петлю для посева клеток колоний второй субкультуры переместили в раствор хлорида натрия и суспендировали растиранием петли о влажную стенку пробирки для отделения клеток. Пробирку затем встряхивали в течение 3 минут, применяя механический встряхиватель.
Число клеток в суспензии довели с 1,5х106 до 5,0х106 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл, применяя раствор хлорида натрия, согласно стандарту Мс Farland standard No.0.5 и считывая оптическую плотность при 550 нм.
Для подсчета приготовили серию разведений 1:10, применяя
раствор хлорида натрия для получения 10 4 и 10 5 разведений суспензии. Образец в 100 мкл каждого разведения посеяли поверхностным методом и инкубировали при 37°С в течение 4 8 часов. Число колоний подсчитали при визуальном осмотре и установили, что плотность клеток соответствует необходимому диапазону. 1.2 Способ разведения в агаре
Методика была та же, что в R. Moody et al., "Тл Vitro Activities of Miconazoler Miconazole Nitrate, and Ketokonazole Alone и Combined with Rifampin against Candida spp. and Torulopsis glabrata Recovered from Cancer Patients.", Antimicrobial Agents and Chemotherapy: 1980, 17, 871-875.
1.2.1 Приготовление растворов активных ингредиентов
Были применены стандартные чашки Петри (диаметр 92 мм х высота 16 мм). После налива агара чашкам дали остыть и затем сразу применили.
(А) Растворы, примененные для вычисления MIC активных ингредиентов, приготовили, как описано далее в документе.
Эконазола нитрат и миконазола нитрат каждый растворили в 100% диметилсульфоксиде (DMSO) до концентраций в 5,0 активного препарата на мл. Затем, приготовили серию разведений 1:2 в DMSO, до концентраций от 5,0 мг/мл до 0,078 мг/мл. 0,250 мл каждого раствора эконазола или миконазола нитрата добавили к 24,75 мл (1:100 разведение) жидкого агара Сабуро (Difco Laboratoires, Detroit, Mich), перемешали, и налили в стандартные чашки Петри, до окончательной концентрации от 50 мкг/мл до 0,78 мкг/мл.
Бензидамин растворили в воде до концентрации 12,5 мг/мл. Затем, приготовили серию разведений 1:2 в воде, до концентраций от 12,5 мг/мл до 1,56 мг/мл. 1 мл каждого раствора бензидамина добавили к 24 мл (1:25 разведение) жидкого агара Сабуро, перемешали, и налили в стандартные чашки Петри, до окончательной концентрации от 0,5 мг/мл до 0,0625 мг/мл.
В качестве положительной контрольной пробы, Амфотерицин В из базового раствора в 1600 мкг/мл развели в DMSO до растворов, имеющих концентрации от 50 мкг/мл до 6,25 мкг/мл. Данные растворы развели в пропорции 1:100 в агаре Сабуро, перемешали и
налили в стандартную чашку Петри, до окончательной концентрации от 0,5 мкг/мл до 0,0625 мкг/мл.
Отрицательные контрольные пробы воды, DMSO и воды+DMSO включили в эксперимент.
(В) Для изучения синергизма, дополнительные растворы эконазола и миконазола нитрата, имеющие концентрации от 2,5 мг/мл до 0,098 мг/мл приготовили в DMSO, с серией разведений 1:2, как раскрыто в параграфе 1.2.1(A).
Также, дополнительные растворы бензидамина, имеющие концентрации от 6,25 мг/мл до 1,56 мг/мл приготовили в воде, с серией разведений 1:2, как раскрыто в параграфе 1.2.1(A). Кроме того, раствор бензидамина с концентрацией 6,25 мг/мл развели в пропорции 1:1,43 в воде, чтобы придать раствору бензидамина значение концентрации 4,37 мг/мл.
Затем, 0,250 мл каждого раствора эконазола или миконазола нитрата и 1 мл каждого раствора бензидамина добавили к 23,750 мл жидкого агара Сабуро (Difco Laboratoires, Detroit, Mich), перемешали и налили в стандартную чашку Петри, тем самым получив в результате концентрации эконазола или миконазола от 25 мкг/мл до 0,098 мкг/мл и бензидамина от 0,25 мг/мл до 0,0625 мг/мл и 0,175 мг/мл.
1.2.2 Тест на чувствительность
(A) Для вычисления MIC поверхность каждой стандартной чашки Петри, приготовленной, как описано в параграфе 1.2.1(A), засеяли четырьмя пятнами (20 мкл объема посевного материала) суспензий штаммов Candida, приготовленными, как описано в параграфе 1.1.
Тестируемые суспензии, посеянные в стандартную чашку Петри с амфотерицином В, применили в качестве положительной контрольной пробы.
Тестируемые суспензии, посеянные в стандартную чашку Петри без препаратов, но содержащую воду, DMSO и воду+DMSO, применили в качестве отрицательных контрольных проб.
Все чашки Петри инкубировали при 35°С в течение 4 8 часов.
(B) Для изучения синергизма, поверхность каждой чашки Петри, приготовленную, как описано в параграфе 1.2.1(B), засеяли
(B)
четырьмя пятнами (20 мкл объема посевного материала) суспензий штаммов Candida, приготовленными, как описано в параграфе 1.1, и инкубировали при 35°С в течение 4 8 часов.
1.3 Способ разведения в жидкой питательной среде Методика, применяемая для способа разведения в жидкой питательной среде, была похожа на раскрытую в "EUCAST Definitive Document EDef 7.1: method for the determination of broth dilution MICs of antifungal agents for fermentative yeasts"
(Clin Microbiol Infect 2008; 14: 398-408).
1.3.1 Приготовление растворов активных ингредиентов (А) Растворы, примененные для вычисления MIC активных ингредиентов, приготовили, как описано далее в документе.
Эконазола нитрат и миконазола нитрат, каждый растворили в 100% диметилсульфоксиде(DMSO) до концентраций 10,0 мг активного препарата на мл. Затем, приготовили серию разведений 1:2 в DMSO, до концентраций от 10,0 мг/мл до 0,078 мг/мл. Данные растворы дополнительные развели в пропорции 1:100 в RPMI-1640 (GiBCO(r), Life Technologies), содержащем 2% глюкозу, 3-(N-морфолино) пропансульфоновую кислоту (MOPS, SIGMA) без NaHC03, до окончательной концентрации от 100 мкг/мл до 0,78 мкг/мл.
Клотримазола нитрат растворили в 100% диметилсульфоксиде
(DMSO) до концентраций 1,250 мг активного препарата на мл. Затем приготовили серию разведений 1:2 в DMSO, до концентраций от 1,250 мг/мл до 0,0196 мг/мл. Данные растворы дополнительно развели в пропорции 1:100 в RPMI-1640 (GiBCO(r), Life Technologies), содержащем 2% глюкозу, 3-(N-морфолино) пропансульфоновую кислоту (MOPS, SIGMA) без NaHC03, до окончательной концентрации от 12,50 мкг/мл до 0,196 мкг/мл.
Флуконазола нитрат растворили в 100% диметилсульфоксиде
(DMSO) до концентраций 5,0 мг активного препарата на мл. Затем приготовили серию разведений 1:2 в DMSO, до концентраций от 5,0 мг/мл до 0,3125 мг/мл. Данные растворы дополнительно развели в пропорции 1:100 в RPMI-1640 (GiBCO(r), Life Technologies), содержащем 2% глюкозу, 3-(N-морфолино) пропансульфоновую кислоту
(MOPS, SIGMA) без NaHC03, до окончательной концентрации от 50
мкг/мл до 3,125 мкг/мл.
Бензидамин растворили в воде до концентрации 2 5 мг/мл. Затем приготовили серию разведений 1:2 в воде, до концентраций от 25 мг/мл до 3,125 мг/мл. 1 мл каждого раствора добавили к 24 мл (1:25 разведение) RPMI-1640 (GiBCO(r), Life Technologies) содержащего 2% глюкозу, 3-(N-морфолино) пропансульфоновую кислоту (MOPS, SIGMA) без NaHC03, до окончательной концентрации от 1 мг/мл до 0,125 мг/мл.
В качестве положительной контрольной пробы, Амфотерицин В из базового раствора в 1600 мкг/мл развели в DMSO до растворов, имеющих концентрации от 200 мкг/мл до 50 мкг/мл. Данные растворы развели в пропорции 1:100 в RPMI-1640 (GiBCO(r), Life Technology), содержащем 2% глюкозу, 3-(N-морфолино) пропансульфоновую кислоту (MOPS, SIGMA) без NaHC03, до концентраций от 2 мкг/мл до 0,5 мкг/мл.
Отрицательные контрольные пробы воды, DMSO и воды+DMSO включили в эксперимент.
(В) Для изучения синергизма, дополнительные растворы эконазола, миконазола, клотримазола и флуконазола нитрата, имеющие концентрации от 100 мкг/мл до 0,049 мкг/мл приготовили в RPMI-1640, как раскрыто в параграфе 1.3.1(A).
Также, дополнительные растворы бензидамина, имеющие концентрации от 1 мг/мл до 0,25 мг/мл приготовили в RPMI-1640, как раскрыто в параграфе 1.3.1(A). Кроме того, раствор бензидамина с концентрацией 1 мг/мл дополнительно развели в пропорции 1:1,43 с RPMI-1640 до концентрации 0,7 мг/мл.
1.3.2 Тест на чувствительность
Были применены чашки с микроразведением, содержащие лунки с номинальной емкостью около 300 мкл/лунку.
Суспензии штаммов Candidaг приготовленные, как описано в параграфе 1.1, вырастили на агаровой среде Сабуро SDA (Oxoid). Колонии развели в фосфатном буфере раствора хлорида натрия (PBS) и суспензии довели до приблизительно 1-5x105 КОЕ/мл, применяя Мс Farland 0.5 стандарт и считывая оптическую плотность при 550 нм.
Стандартный посевной материал приготовили суспендированием
отдельных колоний из второй субкультуры штаммов Candida, чтобы получить оптическую плотность, сходную со стандартом МакФарланда 0,5 (около 1-5х105 КОЕ/мл).
(A) Для вычисления MIC, приготовили чашки с микроразведением, содержащим в каждой лунке 100 мкл каждого раствора активных ингредиентов, полученных как описано в параграфе 1.3.1(A). Лунки затем засеяли 100 мкл суспензии штамма Candidaг полученной как раскрыто выше, содержащей 1-5х105 КОЕ/мл.
В каждой лунке, окончательная плотность посевного материала и окончательная концентрация активных ингредиентов была половиной примененной (например, окончательная плотность
посевного материала была 0,5-2,5х105 КОЕ/мл, концентрация эконазола и миконазола была от 50 мкг/мл до 0,39 мкг/мл, концентрация клотримазола была от 6,25 мкг/мл до 0,098 мкг/мл, концентрация флуконазола была от 50 мкг/мл до 3,125 мкг/мл и концентрация бензидамина была от 0,5 мг/мл до 0,0625 мг/мл).
Лунки, содержащие 100 мкл амфотерицина В, засеянного с 100 мкл той же суспензии Candidaг применили в качестве положительной контрольной пробы.
Лунки, содержащие 100 мкл воды, DMSO и воды+DMSO и стерильной, не содержащей лекарственных препаратов среды, засеяли с 100 мкл той же суспензии Candidaг применили в качестве отрицательной контрольной пробы.
Чашки с микроразведением инкубировали в течение 4 8 часов при 35°С.
(B) Для изучения синергизма, приготовили чашки с микроразведением, содержащие в каждой лунке 50 мкл каждого раствора эконазола и миконазола и 50 мкл каждого раствора бензидамина, полученного как раскрыто в параграфе 1.3.1(B). Затем, лунки засеяли с 100 мкл 1-5х105 КОЕ/мл суспензии Candida. В каждой лунке, окончательная плотность посевного материала была половиной использованной (например, 0,5-2,5х105 КОЕ/мл) и окончательная концентрация активных ингредиентов была четвертой частью примененной (например, концентрация эконазола и миконазола была от 25 мкг/мл до 0,098 мкг/мл, концентрация
(B)
клотримазола была от 0,78 мкг/мл до 0,049 мкг/мл, концентрация флуконазола была от 25 мкг/мл до 3,125 мкг/мл и концентрация бензидамина была от 0,25 мг/мл до 0,0625 мг/мл и 0,175 мг/мл).
Чашки с микроразведением инкубировали в течение 4 8 часов при 35°С.
1.4 Вычисление MIC
Самая низкая концентрация препарата, производящая полное ингибирование роста для определенных штаммов Candidaг считается минимальной ингибирующей концентрации (MIC) для штамма.
Значение MIC для С. lusitaniae АТСС(r) 34449 получили способом разведения в агаре, раскрытым в параграфе 1.2.
Значения MIC для С.albicans АТСС(r) MYA-427,C. tropicalis АТСС(r) 750, С. albicans АТСС(r) 10231, и С. albicans АТСС(r) MYA-574 флуконазол резистентных, были получены способом разведения в жидкой питательной среде, раскрытым в параграфе 1.3.
Значения MIC эконазола нитрата, миконазола нитрата, клотримазола нитрата, флуконазола нитрата и бензидамина для тестируемых штаммов Candida приведены в следующей Таблице 1.
ингибирующего эффекта (не обнаружен (н/о).
1.5 Синергический эффект
Фунгицидную активность комбинации бензидамина и эконазола нитрата оценили, противопоставив С. lusitaniae АТСС(r) 34449 на агаре Сабуро, способом разведения в агаре, раскрытым в параграфе 1.2.
Синергический эффект комбинаций, содержащих бензидамин и эконазола нитрат оценили вычислением фракционной ингибирующей концентрации (FIC), согласно Meletiadis J. et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Feb. 2010, p. 602-609.
Значения FIC сравнили противогрибковую активность комбинации, содержащей бензидамин и эконазола нитрат с противогрибковой активностью каждого из активных ингредиентов, протестированных отдельно.
Значения FIC для комбинаций, содержащих бензидамин и эконазола нитрат (FIC[комбинация ь+е]) i вычислили для каждого штамма Candida, применив следующее уравнение:
F1 С [комбинация b+e] FIC[b] ~^fIC[e]
где:
FIC[b], является фракционной ингибирующей концентрацией бензидамина относительно конкретного штамма Candida, вычисленной как отношение MIC бензидамина в присутствии суб-MIC количества эконазола (М1С(Ь+е)) и отдельно MIC бензидамина (М1С(Ь)), следующим
образом:
М/С (е)
фракционной ингибирующей концентрацией эконазола в отношении конкретного штамма Candida, вычисленной, как отношение между MIC эконазола в присутствии суб-М1С количества бензидамина (М1С(е+Ь))и отдельно MIC эконазола (М1С(е)), следующим образом: MIC (е + Ь)
FIC(e) =
Синергизм определили как FIC ниже 0,5 согласно Meletiadis J. et al. , Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Feb. 2010, p. 602-609.
FIC комбинации бензидамина и эконазола нитрата (FIC[ком6инация ь+е]) вычислили с помощью уравнения, раскрытого выше:
FIC[b] = 0, 125/0, 5=0, 25
FIC[е] = 0, 098/1, 5 6=0, 0 62 8
FIC[ком6инация ь+е] = 0/ 0628 + 0, 25=0, 3128
Приведенные выше результаты показали, что когда активные ингредиенты бензидамина и эконазола нитрата были связаны с суб-MIC концентрациями, наблюдалась синергическая фунгицидная активность, противопоставленная С. lusitaniae АТСС(r) 34449.
Следующие примеры от 2 до 5 суммируют результаты, полученные для других штаммов Candida. Пример 2
Фунгицидная активность бензидамина и эконазола или миконазола нитрата были определены относительно С. Albicans АТСС(r) MYA-427 в RPMI-1640 способом разведения в питательной среде, раскрытым в параграфе 1.3.
Результаты приведены в Таблице 3.
Таблица 3
концентрация бензидамина (мг/мл)
0, 125
концентрац ия
эконазола нитрата (мкг/мл)
3, 12
нет роста
1,56
нет роста
0,78
концентрац ия
миконазола нитрата (мкг/мл)
3, 12
нет роста
1,56
нет роста
0,78
нет роста
0,39
Р=обнаружен рост
Приведенные выше данные ясно показывают, что комбинация с бензидамином позволила уменьшить MIC эконазола нитрата с 25 мкг/мл, как показано в Таблице 1, до 1,56 мкг/мл, и MIC миконазола нитрата с 25 мкг/мл, как показано в Таблице 1, до 0,78 мкг/мл.
Пример 3
Фунгицидная активность бензидамина и эконазола или миконазола нитрата, определили относительно С. Tropicalis АТСС(r) 750 в RPMI-1640, способом разведения в питательной среде, раскрытым в параграфе 1.3.
Результаты приведены в Таблице 4.
Таблица 4
концентрация бензидамина (мг/мл)
0, 175
концентрац ия
эконазола нитрата (мкг/мл)
1,56
нет роста
0,78
0,39
концентрац ия
миконазола нитрата (мкг/мл)
0,78
нет роста
0,39
0, 19
Р=обнаружен рост
Приведенные выше данные ясно показывают, что комбинация с бензидамином позволила уменьшить MIC эконазола нитрата с 12,5 мкг/мл, как показано в Таблице 1 до 1,56 мкг/мл, и MIC миконазола нитрата с 6,25 мкг/мл, как показано в Таблице 1 до 0,78 мкг/мл.
Пример За
Фунгицидная активность бензидамина и клотримазола или флуконазола нитрата была определена относительно С. Tropicalis АТСС(r) 750 в RPMI-1640, способом разведения в питательной среде, раскрытым в параграфе 1.3.
Результаты приведены в Таблице 4а.
Таблица 4а
концентрация бензидамина (мг/мл)
0, 175
концентраци я
0,390
нет роста
0, 195
нет роста
клотримазол а нитрата (мкг/мл)
0, 098
нет роста
0, 049
концентраци я
флуконазола нитрата (мкг/мл)
нет роста
12,5
нет роста
6, 25
нет роста
3, 13
Р=обнаружен рост
Приведенные выше данные ясно показывают, что комбинация бензидамина позволила уменьшить MIC клотримазола нитрата от 6,25 мкг/мл, как показано Таблице 1 до 0,098 мкг/мл, и MIC флуконазола нитрата от 50мкг/мл, как показано в Таблице 1 до 6,25 мкг/мл.
Значение FIC для комбинации бензидамина и клотримазола нитрата (FIC [ком6инация ь+с]) , вычисленное с помощью уравнения, раскрытого выше, составило 0,37.
Значение FIC для комбинации бензидамина и флуконазола нитрата (FIC [ком6инация ь+?]) , вычисленное с помощью уравнения, раскрытого выше, составило 0,48.
Пример 4
Фунгицидная активность бензидамина и эконазола или миконазола нитрата, вычисленная относительно С. Albicans АТСС(r) 10231 в RPMI-1640, способом разведения в питательной среде, раскрыта в параграфе 1.3.
Результаты приведены в Таблице 5.
Таблица 5
концентрация бензидамина (мг/мл)
0, 125
концентрац ия
6, 25
нет роста
эконазола нитрата (мкг/мл)
3, 12
нет роста
1,56
концентрац ия
миконазола нитрата (мкг/мл)
3, 12
нет роста
1,56
нет роста
0,78
Р=обнаружен рост
Приведенные выше данные ясно показывают, что комбинация с бензидамином позволила уменьшить MIC эконазола нитрата с 25 мкг/мл, как показано в Таблице 1 до 3,125 мкг/мл, и MIC миконазола нитрата с 6,25 мкг/мл, как показано в Таблице 1 до 1,56 мкг/мл.
Пример 5
Фунгицидная активность бензидамина и эконазола или миконазола нитрата была определена относительно флуконазол-резистентного С. Albicans АТСС(r) MYA-574 в RPMI-1640, способом разведения в питательной среде, раскрытым в параграфе 1.3.
Результаты приведены в Таблице 6.
Таблица б
Приведенные выше данные ясно показывают, что комбинация с бензидамином позволила уменьшить MIC эконазола нитрата с 25 мкг/мл, как показано в Таблице 1 до 12,5 мкг/мл, и MIC миконазола нитрата от 50 мкг/мл, как показано в Таблице 1 до 12,5 мкг/мл.
Также, MIC бензидамина был уменьшен с 0,5 мг/мл, как показано в Таблице 1 до 0,125 мг/мл, в случае комбинации с эконазолом и до 0,0625 мг/мл, в случае комбинации с миконазолом.
Пример б
Следующая Таблица 7 показывает состав из трех фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению в форме крема для местного нанесения. Все значения были выражены в процентах по массе, относительно общего содержания препарата.
Таблица 7
Количество (% масс/масс)
Ингредиенты
Пропилгаллат
0,1
0,1
ЭДТА
0,1
0,1
Miglyol 812
Парафиновое масло
Compritol 888 АТО
Gelot 64
Tefose 63
Labrafil M1944CS
Labrafil M2130CS
Бензидамина гидрохлорид
0, 12
0, 12
0, 12
Эконазола нитрат
Вода дост. кол-во
100
100
100
Miglyol 812: Каприловый/Каприевый Триглицерид (Sasol Olefin & Surfactants GmbH, Germany
Compritol 888ATO: Глицерила бегенат (Gattefosse SAS, France)
Gelot 64: Смесь Глицеролмоностеарата и ПЭГ-75 стеарата -HLB 10 (Gattefosse SAS, France)
Tefose 63: ПЭГ-б и ПЭГ-32 пальмитостеарата/гликоля стеарат - HLB 10 (Gattefosse SAS, France)
Labrafil M1944CS: Олеоилполиоксил-б глицериды - HLB 9 (Gattefosse SAS, France)
Labrafil M2130CS: Лаурилмакрогол-б глицериды - HLB 9(Gattefosse SAS, France)
Состав крема Fl протестировали на определение высвобождения активных веществ через восемь часов после нанесения.
Эксперименты на диффузионных ячейках Франца были применены для анализа in vitro величин трансдермального поступления бензидамина гидрохлорида через мембрану субстрата. Диффузионные ячейки Франца являются стандартным и хорошо известным способом измерения величин трансдермального поступления. Основная методика с ячейками Франца описана в Franz, Т. J., Percutaneous absorption: on the relevance of in vitro data. J Invest Derm, 64:190-195 (1975). Приведенное ниже является методологией, примененной в настоящем примере.
Применили Мембрану регенерированной целлюлозы с пористостью 0,45 мкм. Перед применением, мембрану обработали с NaCl 0,9% масс/об раствора, с целью удаления воздуха из пор.
Контактная поверхность мембраны с продуктом составила 0, б см2. Полученную камеру термостатировали при 37°С. Один грамм состава крема 1 нанесли на мембрану донорской камеры. Каждый час в течение 8 часов, 0,3 мл NaCl 0,9% масс/об полученного раствора извлекали и заменяли свежим раствором.
Отобранные образцы протестировали с применением ВЭЖХ способа.
О результатах сообщили, как только накопившееся количество активного ингредиента высвободилось на единицу площади в
зависимости от времени. Результаты теста приведены в следующей Таблице 8.
Таблица 8
Время
Высвобождение
(час)
активного
ингредиента
(мкг/см2)
5,40
8, 00
10, 13
12, 04
13,41
14, 90
16, 50
17,40
Пример 7
Анти-Candida активность состава крема настоящего изобретения, содержащего те же ингредиенты крема F1 Таблицы 7 (крем А) , протестировали по сравнению с активностью Pevaryl(r) крема, имеющегося на рынке, содержащего 1% только эконазола нитрата (крем В) и плацебо (крем С).
Штамм Candida albicans АТСС 10231 применили для изучения противогрибковых свойств кремов от А до С и, в частности, чтобы дополнительно подтвердить, что присутствие бензидамина влияет на фунгицидную активность эконазола.
По этой причине способ разведения в агаре составили согласно Asterholm et al (Acta Derm Venereol 2010; 90: 239-245), таким образом, что состав крема можно протестировать. Вследствие технической необходимости, кремы развели в агаре, таким образом, что окончательные концентрации кремов были в диапазоне от 0,03% до 1% (масс/об).
Как сообщается на фиг. 1 и 2, визуальное изучение и денситометрический анализ чашек подтвердил, что присутствие бензидамина увеличило фунгицидную активность эконазола.
Фактически, данные денситометрического анализа показали, что данная четырехкратная концентрация крема А была достаточна для получения снижения роста такого же, как для крема В.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Фармацевтическая композиция, содержащая синергическую комбинацию бензидамина и имидазола-антимикотика или их солей и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, для применения в лечении микоза, вызванного Candida.
2. Фармацевтическая композиция для применения по п. 1, где указанный имидазол-антимикотик выбран из группы, содержащей бифоназол, бутоконазол, хлормидазол, клотримазол, кроконазол, эконазол, фентиконазол, кетоконазол, изоконазол, миконазол, нетиконазол, омоконазол, оксиконазол, сертаконазол, сулконазол, тиоконазол или их соли.
3. Фармацевтическая композиция для применения по п. 2, где указанный имидазол-антимикотик выбран из группы, содержащей бифоназол, бутоконазол, клотримазол, эконазол, фентиконазол, кетоконазол, изоконазол, миконазол, омоконазол, сертаконазол, сулконазол, тиоконазол или их соли.
4. Фармацевтическая композиция для применения по п. 3, где указанный имидазол-антимикотик выбран из группы, содержащей бутоконазол, эконазол, фентиконазол, изоконазол, миконазол, сулконазол или их соли.
5. Фармацевтическая композиция для применения по п. 4, где указанный имидазол-антимикотик является эконазолом, миконазолом или их солью.
6. Фармацевтическая композиция для применения по п. 1, где указанный микоз, вызванный Candida, вызван видами Candida, выбранными из группы, состоящей из Candida Albicans, Candida lusitaniae, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida, rugosa, Candida parapsilosis, Candida tropicalis и Candida dubliniensis.
7. Фармацевтическая композиция для применения по п. б, где указанный микоз, вызванный Candida, является кандидозом слизистых оболочек, кандидозом кожи, онихомикозом, системным кандидозом, ятрогенным кандидозом, пеленочным кандидозом, кандидозом желудочно-кишечного тракта или кандидозным баланитом.
8. Фармацевтическая композиция для применения по п. 7, где указанный кандидоз слизистых оболочек является кандидозом
1.
полости рта или вульвовагинальным.
9. Фармацевтическая композиция для применения по любому из п. п. 1-8, где указанная композиция предназначена для наружного применения.
10. Фармацевтическая композиция для применения по любому из п. п. 1-9, где указанная композиция представлена в форме крема, мази, лосьона, геля, пены, суппозиториев, суппозиториев с замедленным высвобождением, препарата для вагинального спринцевания или раствора для наружного применения.
11. Фармацевтическая композиция для применения по п. 10, где указанная композиция представлена в форме крема, мази, лосьона, препарата для вагинального спринцевания или раствора для наружного применения.
12. Фармацевтическая композиция для применения по п. 11, где указанная композиция представлена кремом или препаратом для вагинального спринцевания.
13. Фармацевтическая композиция для применения по любому из п.п. 1-12, где бензидамин присутствует в количестве по массе от 0,001 масс.% до 1 масс.%, более предпочтительно от 0,05 масс.% до 0,5 масс.% и еще более предпочтительно от 0,08 масс.% до 0,2 масс.%.
14. Фармацевтическая композиция для применения по любому из п.п. 1-12, где имидазол-антимикотик или его соль присутствует в количестве от 0,01 масс.% до 4 масс.%, более предпочтительно от 0,1 масс.% до 2 масс.% и еще более предпочтительно от 0,5 масс.% до 1,5 масс.%.
15. Фармацевтическая композиция для применения по любому из предыдущих п.п., где указанная фармацевтическая композиция представлена в форме крема, содержащего один или несколько эмульгаторов, имеющих показатель HLB в диапазоне от б до 9, и один или несколько эмульгаторов, имеющих показатель HLB в диапазоне от больше 9 до 12.
По доверенности
i% 0,5%
0.259
Крем А
Крем В
Крем С
о. I-
О I-
CD -О
CD I- О
О CD
% растворение крема
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
