[RU]

Настоящее изобретение относится к примесям нуклеиновой кислоты в композиции, содержащей парвовирусный вектор. В частности, настоящее изобретение показывает, что ДНК-примеси инкапсулируются в парвовирусном вирионе не случайным образом. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу идентификации и количественного определения примеси нуклеиновой кислоты в композиции, содержащей парвовирусный вектор. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу определения того, является ли композиция, содержащая парвовирусный вектор, клинически чистой.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к примесям нуклеиновой кислоты в композиции, содержащей парвовирусный вектор. В частности, настоящее изобретение показывает, что ДНК-примеси инкапсулируются в парвовирусном вирионе не случайным образом. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу идентификации и количественного определения примеси нуклеиновой кислоты в композиции, содержащей парвовирусный вектор. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу определения того, является ли композиция, содержащая парвовирусный вектор, клинически чистой.

---

Евразийское (21) 201791184 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C12Q1/68 (2006.01)
20170929 C12N 7/00 (2006.01)
C12N15/864 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки C12N15/866 (2006.0l)
2015.11.27
(54) ДНК-ПРИМЕСИ В КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ПАРВОВИРУСНЫЙ ВИРИОН
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
14195464.4
2014.11.28
PCT/EP2015/077882
WO 2016/083560 2016.06.02
Заявитель:
ЮНИКЬЮРЕ АйПи Б.В. (NL) Изобретатель:
Лубельский Яцек, Херменс Вильхельмус Теодорус Йоханнес Мария Кристиан (NL)
Представитель: Медведев В.Н. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к примесям нуклеиновой кислоты в композиции, содержащей парвовирусный вектор. В частности, настоящее изобретение показывает, что ДНК-примеси инкапсулируются в парвовирусном вирионе не случайным образом. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу идентификации и количественного определения примеси нуклеиновой кислоты в композиции, содержащей парво-вирусный вектор. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу определения того, является ли композиция, содержащая парвовирусный вектор, клинически чистой.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-542722ЕА/011 ДНК-ПРИМЕСИ В КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ПАРВОВИРУСНЫЙ ВИРИОН
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ Настоящее изобретение относится к области вирусологии и генной терапии. В частности, изобретение относится к способу идентификации и/или количественного определения избыточной примеси нуклеиновой кислоты в композиции. Уровень техники изобретения
Рекомбинантные векторы на основе аденоассоциированного вируса (ААВ) применялись в многочисленных клинических испытаниях и имеют большие перспективы для генной терапии человека. Основными характеристиками, обеспечивающими широкий успех ААВ, являются его способность устанавливать постоянную экспрессию трансгена в сочетании с хорошими характеристиками безопасности. Получение ААВ для клинического применения помимо прочего направлено на минимизацию ДНК-примесей, которые потенциально могут кодировать онкогены, маркеры антибиотиков или иммуногенные пептиды, снижающие безопасность вектора (Wright et al. , 2008, Gene Ther. 15, 840-848) .
Несмотря на то, что был достигнут значительный прогресс, как в предварительной, так и в последующей обработке ААВ с целью обеспечения чистоты конечного продукта, полное удаление нежелательной ДНК не кажется возможным. Упаковка клеточной ДНК или ДНК хелперного вектора, по-видимому, является побочным продуктом биологии ААВ, и таким образом неотъемлемо связана с капсидированием целевой трансгенной ДНК. После того как посторонняя ДНК инкапсулируется в преформированные капсиды, эти частицы становятся неотличимыми от капсидов, содержащих только желаемую экспрессионную кассету, и их фактически невозможно отделить.
Поэтому, для того чтобы поддержать клиническое развитие и понять риски, связанные с присутствием нежелательной ДНК в рААВ векторах, необходимо оценить потенциал экспрессии белка с этих генетических элементов в диапазоне клеточных линий, которые отражают профиль биораспределения используемого рААВ, чтобы
исключить теоретическую возможность того, что нежелательная экспрессия белков может привести к нежелательным эффектам, таким как, например, клеточные перестройки, туморогенность или нежелательные иммунные реакции, потенциально снижающие безопасность и/или эффективность этого вектора.
На сегодняшний день в научной литературе имеются сообщения о наличии и концентрации ДНК-примесей, контаминирующих препараты рААВ (Blouin et al. , 2004, J. Gene Med. 6 Suppl 1, S223-S228; Nony et al., 2003, J. Virol. 77, 776-781; Chadeuf et al. , 2005, Mol. Ther. 12, 744-753; Wright et al., 2008, выше). Удалось проследить, что источником этих примесей является или плазмида-помощник или ДНК клетки-хозяина (Wright et al. , 2 008, выше) . Только в ограниченном числе исследований рассматривался вопрос о предполагаемой экспрессии, происходящей с этой совместно упакованной остаточной ДНК. Wright с соавторами проанализировали экспрессию генов cap, amp(г) и двух аденовирусных генов Е2А и Е4 при помощи количественной ПЦР в реальном времени после инфекции человеческих гепатоцитов или мышей рААВ, и не выявили никакой обнаруживаемой транскрипции (Hauck et al., 2009, Mol Ther. 17(1) 144-152) . С другой стороны, Miller et al. обнаружили опосредованную ДНК-примесями экспрессию гена cap при помощи анализа комплементации (Halbert et al., 2011, Gene Ther. 18(4) : 411-417).
В настоящее время предпочтительным методом для анализа примесей ДНК в биофармацевтических препаратах вириона является количественная ПЦР. При помощи этого метода определяют наличие и количество конкретных ДНК-примесей. Важно отметить, что специалист в данной области техники при этом заранее выбирает ДНК-примесь, подлежащую обнаружению, т.е. перед проведением количественной ПЦР, так как в данной области техники существует общее мнение, что ДНК-примеси упаковываются в вирион случайным образом. Такая (предварительно выбранная) ДНК-примесь может, например, включать в себя ДНК клетки-хозяина, нуклеотидные последовательности Rep, Сар или плазмиды. Например, как указано в Thorne et al (2009, Hum. Gene Ther. 20: 707-714) ДНК-примеси клетки-хозяина определяют с использованием двух мишеней:
трансформирующие гены Е6/Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) в качестве релевантной последовательности для оценки безопасности продуцирующей системы на основе клеток HeLa, и сильно экспресирующийся, высококопийный ген для рибосомальной РНК (рРНК) в качестве чувствительного общего маркера. Согласно Thorne et al. (см. выше), наиболее распространенные совместно пакующиеся последовательности происходят из упаковочной плазмиды, включая гены rep и cap ААВ и селективные маркерные гены клеток бактерий и млекопитающих. Кроме того, в работе Ye et al. (2011, Gene Ther. 18, 135-144) показано, что последовательности ДНК из упаковочной плазмиды ВПЧ упаковываются случайным образом во время образования рААВ в линии клеток млекопитающих. Согласно Ye et al., вирион ААВ содержит случайные фрагменты, расположенные по всему геному ВПЧ. Кроме того, Chadeuf et al. (см. выше) показали, что в случае более мелкой ДНК-плазмиды в вирион инкапсулируются полноразмерная плазмида и вирусные ITRs, включая ген селективного маркера. Таким образом, по-видимому, отсутствует необходимость в обнаружении конкретных нуклеотидных последовательностей, так как ДНК-примеси, по всей видимости, упаковываются в парвовирусный вирион случайным образом.
В отличие от общепринятой теории о том, что ДНК-примеси упаковываются в вирион случайным образом, в настоящем изобретении показано, что некоторые ДНК-примеси на самом деле являются избыточными. Как следствие, используемые в настоящее время способы обнаружения ДНК-примесей в биофармацевтической композиции могут приводить значительной недооценке ДНК-примесей, присутствующих в композиции. Такая недооценка ДНК-примесей в фармацевтической композиции может приводить к введению композиций, которые являются недостаточно клинически чистыми, что в свою очередь приводит потенциальному риску для здоровья пациентов.
Поэтому в данной области техники существует потребность в средствах и способах идентификации и количественного определения избыточных ДНК-примесей в биологических композициях, таких как, например, биофармацевтические препараты. Целью настоящего
изобретения является разработка таких средств и способов. Сущность изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации и количественного определения избыточной примеси нуклеиновой кислоты в композиции, содержащей парвовирусный вектор, и где этот способ включает в себя этапы:
a) секвенирование композиции нуклеиновой кислоты для
получения случайных прочтений нуклеотидных последовательностей;
b) сравнение случайных последовательностей из этапа а) с
нуклеотидной последовательностью биологического компонента,
используемого в способе получения композиции, при котором
совпадение между случайным прочтением и нуклеотидной
последовательностью биологического компонента идентифицирует
примесь нуклеиновой кислоты;
c) определение среднего количества прочтений на
парвовирусный вектор; и
d) определение количества прочтений на нуклеотид избыточной
примеси нуклеиновой кислоты, где примесь нуклеиновой кислоты
идентифицируется как избыточная примесь, когда распределение
прочтений не является случайным, и избыточная примесь в 2, 3, 4,
5, б, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз превышает среднее
количество прочтений биологического компонента, или когда
количество прочтений на нуклеотид примеси нуклеиновой кислоты
составляет, по меньшей мере, 0,001, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4,
0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2,0, 3,0, 5,0, 7,0 или 10% от
среднего количества прочтений на парвовирусный вектор.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения секвенирование нуклеиновой кислоты на этапе (а) включает в себя высокопроизводительное секвенирование.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения парвовирусный вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (рААВ).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность биологического компонента выбрана из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей клетки-хозяина, плазмиды, вектора, отличного от рекомбинантного
парвовирусного вектора, и хелперного вируса, где предпочтительно вектор представляет собой бакуловирусный вектор.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения хелперный вирус представляет собой рекомбинантный аденовирус и/или рекомбинантный вирус простого герпеса.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность биологического компонента содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую Rep, Сар и/или трансген, где, предпочтительно, биологический компонент содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, где, более предпочтительно, биологический компонент содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, которая фланкирована, по меньшей мере, одним парвовирусным ITR, и где, наиболее предпочтительно, биологический компонент содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, которая фланкирована, по меньшей мере, одним парвовирусным ITR с каждой стороны.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения избыточную примесь нуклеиновой кислоты количественно определяют во второй или последующей композиции.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу количественного определения примеси нуклеиновой кислоты в композиции, содержащей парвовирусный вектор, где этот способ включает в себя этап определения относительного содержания примеси нуклеиновой кислоты, где эта примесь нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая расположена между 1 и 8000 п.н., 1 и 5000 п.н., 1 и 3000 п.н., 1 и 1000 п.н., 1 и 500 п.н., 1 и 250 п.н. или 1 и 10 0 п.н., непосредственно примыкающими к последовательности парвовирусного ITR, где последовательность ITR присутствует в биологическом компоненте, используемом в способе получения композиции, и где биологический компонент содержит трансген, фланкированный, по меньшей мере, одной копией последовательности парвовирусного ITR.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения биологический компонент выбран из группы, состоящей из клетки-
хозяина, плазмиды, вектора, отличного от рекомбинантного парвовирусного вектора, и хелперного вируса, где предпочтительно вектор представляет собой бакуловирусный вектор.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения парвовирусный вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (рААВ).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность примеси нуклеиновой кислоты непосредственно примыкает к каждому концу последовательности парвовирусного ITR, где последовательность ITR присутствует в биологическом компоненте, используемом в способе получения композиции.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения относительное содержание определяют по сравнению с нуклеотидной последовательностью парвовирусного вектора и/или референсной последовательностью композиции.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения относительное содержание определяется:
a) средним количеством прочтений на нуклеиновую кислоту
примеси нуклеиновой кислоты, как определено выше; и
i) средним количеством прочтений на нуклеиновую кислоту референсной последовательности; и/или
ii) средним количеством прочтений на парвовирусный вектор в композиции;
где количество прочтений определяется вышеописанным способом; и/или
b) амплификацией примеси нуклеиновой кислоты, как
определено выше; и
i) референсной последовательностью; и/или
ii) нуклеотидной последовательностью парвовирусного
вектора.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения относительное содержание определяют при помощи количественной ПЦР и/или при помощи высокопроизводительного секвенирования.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает в себя этап селективной
гибридизации олигонуклеотидного праймера с примесью нуклеиновой кислоты, как определено выше, или ее комплементом.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения
олигонуклеотидный праймер селективно гибридизуется с примесью
нуклеиновой кислоты, содержащей часть бакуловирусной
последовательности, или ее комплементом.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу определения того, может ли композиция, содержащая парвовирусный вектор, считаться клинически чистой, где этот способ включает в себя этапы:
i) количественного определения примеси нуклеиновой кислоты
в композиции парвовирусного вектора, как определено выше; и
ii) определение того, что композиция является клинически
чистой, если примесь нуклеиновой кислоты, как определено выше,
присутствует, по меньшей мере, в 10, 100, 250, 1000 раз меньшем
количестве, по сравнению с референсной последовательностью и/или
трансгеном, как определено по относительному содержанию примеси
нуклеиновой кислоты.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция, содержащая парвовирусный вектор, представляет собой фармацевтическую композицию. В альтернативном варианте или в комбинации с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая парвовирусный вектор, содержит парвовирусный капсид, в который упакован парвовирусный вектор. В альтернативном варианте или в комбинации с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая парвовирусный вектор, не содержит образец, полученный или получаемый от млекопитающего, где это млекопитающее предпочтительно является не человекообразным приматом.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к открытию, что ДНК-примеси упаковываются в парвовирусный вирион не случайным образом. В действительности, существуют примеси нуклеиновой кислоты,
которые являются избыточными в составе вириона. Таким образом, в
первом аспекте настоящее изобретение относится к способу
идентификации примеси нуклеиновой кислоты в композиции.
Предпочтительно, эта композиция содержит парвовирусный вектор.
Способ предпочтительно включает в себя этапы: а) секвенирования
композиции нуклеиновой кислоты для получения случайных прочтений
нуклеотидных последовательностей; Ь) сравнения случайных
последовательностей из этапа а) с нуклеотидной
последовательностью биологического компонента, используемого в способе получения композиции, при котором совпадение между случайным прочтением и нуклеотидной последовательностью биологического компонента идентифицирует примесь нуклеиновой кислоты. Для количественного определения идентифицированной примеси нуклеиновой кислоты способ предпочтительно дополнительно включает в себя этапы: с) определения среднего количества прочтений на парвовирусный вектор; и d) определения количества прочтений на нуклеотид идентифицированной примеси нуклеиновой кислоты, где примесь нуклеиновой кислоты идентифицируется как избыточная примесь, когда распределение прочтений не является случайным, и избыточная примесь в 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз превышает среднее количество прочтений биологического компонента, или когда количество прочтений на нуклеотид примеси нуклеиновой кислоты составляет, по меньшей мере, 0,001, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2,0, 3,0, 5,0, 7,0 или 10% от среднего количества прочтений на парвовирусный вектор.
Таким образом, способ настоящего изобретения относится к
идентификации и количественному определению примеси нуклеиновой
кислоты в композиции. Примесь нуклеиновой кислоты может
представлять собой ДНК-примесь и/или РНК-примесь,
предпочтительно, примесь нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК-примесь.
Подразумевается, что термин "примесь нуклеиновой кислоты" включает в себя любую последовательность нуклеиновой кислоты, которая не предназначена для упаковки в парвовирусный вирион, такая как, например, нуклеотидные последовательности
биологического компонента, используемого в способе получения композиции. В частности последовательность, которая не фланкировна одним парвовирусным ITR с каждой стороны, может образовывать примесь нуклеиновой кислоты.
Используемый здесь термин "парвовирусный вектор" относится к рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей одну или несколько представляющих интерес полинуклеотидных последовательностей (например, экспрессионную конструкцию для гена, кодирующего целевой продукт, т.е. "трансген"), которые фланкированы, по меньшей мере, одной (и обычно двумя) парвовирусной последовательностью (ми) инвертированного концевого повтора (ITRs).
Используемый здесь термин "случайное распределение
прочтений" определяется как распределение прочтений, которое
равномерно выравнивается по длине нуклеотидной
последовательности биологического компонента, используемого в
способе получения композиции. В частности, случайное
распределение прочтений определяется как распределение
прочтений, которое равномерно выравнивается по длине
нуклеотидной последовательности одного биологического
компонента, используемого в способе получения композиции. Более
предпочтительно, случайное распределение прочтений определяется
здесь как распределение прочтений, которое равномерно
выравнивается по длине нуклеотидной последовательности,
выбранной из группы, состоящей из нуклеотидных
последовательностей клетки-хозяина, плазмиды, вектора, отличного от рекомбинантного парвовирусного вектора, и хелперного вируса, где предпочтительно вектор представляет собой бакуловирусный вектор. Таким образом, наиболее предпочтительно, случайное распределение прочтений определяется в настоящем изобретении как распределение прочтений, которое равномерно выравнивается по длине нуклеотидной последовательности бакуловирусного вектора.
Равномерное выравнивание определяется здесь как равная вероятность того, что прочтение выравнивается с определенной областью нуклеотидной последовательности по сравнению с любой другой областью той же нуклеотидной последовательности.
Предпочтительно, при равномерном выравнивании число прочтений,
которые выравниваются с нуклеотидом, не отклоняется более чем на
0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10, 15 или 20% от среднего числа
прочтений, выравнивающихся с этой нуклеотидной
последовательностью.
Используемый здесь термин "неслучайное распределение
прочтений" определяется как распределение прочтений, которое
неравномерно выравнивается по длине нуклеотидной
последовательности биологического компонента, используемого в
способе получения композиции. В частности, неслучайное
распределение прочтений определяется как распределение
прочтений, которое неравномерно выравнивается по длине
нуклеотидной последовательности одного биологического
компонента, используемого в способе получения композиции. Более
предпочтительно, неслучайное распределение прочтений
определяется здесь как распределение прочтений, которое
неравномерно выравнивается по длине нуклеотидной
последовательности, выбранной из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей клетки-хозяина, плазмиды, вектора, отличного от рекомбинантного парвовирусного вектора, и хелперного вируса, где предпочтительно вектор представляет собой бакуловирусный вектор. Таким образом, наиболее предпочтительно, неслучайное распределение прочтений определяется в настоящем изобретении как распределение прочтений, которое неравномерно выравнивается по длине нуклеотидной последовательности бакуловирусного вектора, т.е. это означает, что большее число прочтений выравнивается с конкретными областями бакуловирусного вектора по сравнению с другими областями бакуловирусного вектора.
Предпочтительно композиция представляет собой композицию, содержащую (рекомбинантный) парвовирусный вирион, содержащий или состоящий (по поменьшей мере) парвовирусный капсид, в который упакован рекомбинантный парвовирусный вектор. Композиция и ее компоненты также являются предпочтительными, как определено здесь ниже.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего
изобретения способ предназначен для идентификации и/или количественного определения примесей нуклеиновых кислот, которые упаковываются в парвовирусный вирион, т.е. инкапсулирован в вирион. В частности, примесь нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением не разрушается после обработки композиции, содержащей парвовирусный вирион, нуклеазой (например, обработки РНКазой или ДНКазой). Композиции
В предпочтительном варианте осуществления изобретения парвовирусный вектор содержится в композиции. Предпочтительно композиция представляет собой фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция дополнительно предпочтительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. Любой подходящий фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество может использоваться в настоящих композициях (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, April 1997).
Предпочтительные фармацевтические формы будут находиться в комбинации со стерильным физиологическим раствором, раствором декстрозы или буферным раствором или другими фармацевтически приемлемыми стерильными жидкостями. В альтернативном варианте, может использоваться твердый носитель, такой как, например, гранулы микроносителя.
В альтернативном варианте или в комбинации с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая парвовирусный вектор, не содержит образец, такой как, например, образец печени или мышечной ткани, полученный или получаемый от млекопитающего. В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения, композиция не содержит образец, полученный или получаемый от не человекообразного примата. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция не содержит геномную ДНК из мышечной ткани или печени млекопитающего, такого как, например, не человекообразного примата.
Секвенирование нуклеиновой кислоты
В способе настоящего изобретения идентифицируют и количественно определяют избыточную примесь нуклеиновой кислоты в композиции. Способы идентификации и количественного определения избыточной примеси нуклеиновой кислоты включают в себя без ограничений секвенирование по Сэнгеру или высокопроизводительное секвенирование.
В первом варианте осуществления изобретения ДНК
парвовирусного вектора может быть клонирована в плазмиду с
последующим обычным секвенированием по Сэнгеру. Секвенирование
по Сэнгеру в настоящем изобретении означает способ
секвенирования ДНК, который основан на избирательном встраивании
прерывающих синтез цепи дидезоксинуклеотидов ДНК-полимеразой в
процессе репликации ДНК in vitro. В соответствии с настоящим
изобретением секвенирование по Сэнгеру включает в себя, так
называемое, секвенирование по Сэнгеру с обрывом цепи и/или
секвенирование по Сэнгеру с мечеными терминирующими
нуклеотидами. Предпочтительно, секвенирование по Сэнгеру
представляет собой секвенирование по Сэнгеру с мечеными
терминирующими нуклеотидами. В секвенировании по Сэнгеру с
мечеными терминирующими нуклеотидами используются меченые
прерывающие синтез цепи ddNTPs. В частности, при секвенировании
с мечеными терминирующими нуклеотидами каждый из четырех
прерывающих синтез цепи дидезоксинуклеотидов метят
флуоресцентными красителями, каждый из которых излучает свет при разных длинах волн, что позволяет осуществлять процесс секвенирования в ходе одной реакции. Другие способы секвенирования ДНК также могут быть использованы, например, нанопоровое секвенирование ДНК, секвенирование ДНК с туннельным потоком, секвенирование при помощи гибридизации, секвенирование при помощи масс-спектрометрии, микрофлюидное секвенирование по Сэнгеру, методы на основе микроскопии и секвенирование с РНК-полимеразой.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения секвенирование нуклеиновой кислоты включает в себя высокопроизводительное секвенирование. Высокопроизводительное секвенирование (также именуемое секвенированием следующего
поколения или глубоким секвенированием) относится к отличным от секвенирования по Сэнгеру технологиям секвенирования ДНК с высокой пропускной способностью. Тысячи, миллионы или даже миллиарды цепей ДНК могут быть секвенированы параллельно, что дает значительно большую пропускную способность и сводит к минимуму необходимость в методах клонирования фрагментов, которые часто используются в секвенировании геномов по Сэнгеру.
В предпочтительном способе настоящего изобретения
высокопроизводительное секвенирование включает в себя
одномолекулярное секвенирование Heliscope, одномолекулярное
секвенирование в реальном времени, секвенирование Ion Torrent
(ионное полупроводниковое секвенирование), секвенирование 454
(пиросеквенирование, Roche 454 Life Sciences(tm), Branford, CT) ,
Solexa (секвенирование синтезом, Illumina, Inc, San Diego, CA)
и/или секвенирование SOLiD (секвенирование лигированием, ABI,
Applied Biosystems, Indianapolis, IN) . В еще одном
предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения
секвенирование нуклеиновой кислоты включает в себя
секвенирование SOLiD, Solexa и/или 454. В наиболее
предпочтительном варианте осуществления изобретения
секвенирование нуклеиновой кислоты включает в себя секвенирование Solexa/Illumina или 454.
Способ настоящего изобретения не ограничивается известными в настоящее время способами высокопроизводительного секвенирования. В частности, следует понимать, что с течением времени будут разработаны новые способы высокопроизводительного секвенирования, которые в равной степени пригодны для использования в способе настоящего изобретения. В частности, любой способ секвенирования, который классифицируется как способ высокопроизводительного секвенирования, т.е. любой способ, который генерирует тысячи, миллионы или миллиарды прочтений за один цикл, может использоваться в способе настоящего изобретения.
В предпочтительном способе настоящего изобретения случайные прочтения получают путем секвенирования нуклеиновых кислот
композиции, содержащей парвовирусный вектор. "Прочтение" или
"подсчет" при секвенировании определяется здесь как отдельная
цепь оснований, получаемая способом секвенирования нуклеиновой
кислоты. Различные способы высокопроизводительного
секвенирования могут генерировать различное количество прочтений
за один цикл (реакцию), и это могут быть прочтения разной длины.
Например, Illumina генерирует до 3 миллиардов прочтений на один
цикл, и прочтение имеет среднюю длину от 50 до 300 п.н. С другой
стороны секвенирование 4 54 генерирует примерно 1 миллион
прочтений на цикл со средней длиной прочтения примерно 7 00 п.н.
Число прочтений (количество прочтений на цикл) и длина прочтения
(количество оснований на прочтение) могут меняться в каждом
цикле секвенирвания, и ожидается, что длина прочтения, а также
число прочтений, на цикл будут в дальнейшем увеличиваться после
разработки других способов высокопроизводительного
секвенирования.
Идентификация избыточной примеси нуклеиновой кислоты В одном варианте осуществления настоящего изобретения случайные прочтения, полученные, как описано выше, сравнивают с нуклеотидной последовательностью биологического компонента, используемого в способе получения композиции, где сравнение случайных прочтений с нуклеотидной последовательностью из биологического компонента приводит к идентификации избыточной примеси нуклеиновой кислоты. Эта нуклеотидная последовательность биологического компонента может быть предполагаемым или неожиданным источником нуклеотидных последовательностей.
Предполагаемый источник нуклеотидных последовательностей
может быть выбран из группы, состоящей из нуклеотидных
последовательностей клетки-хозяина, плазмиды, вектора и
хелперного вируса. Где предпочтительно хелперный вирус
представляет собой аденовирус и/или вирус простого герпеса,
и/или где вектор представляет собой бакуловирусный вектор. В
предпочтительном варианте осуществления изобретения
предполагаемый источник нуклеотидных последовательностей представляет собой бакуловирусный вектор. В способе настоящего изобретения случайные прочтения таким образом выравниваются или
сравниваются с предполагаемым источником нуклеотидных последовательностей, что это приводит к идентификации избыточной примеси нуклеиновой кислоты.
В альтернативном варианте или в комбинации с вышеописанными
вариантами осуществления изобретения источник нуклеотидных
последовательностей представляет собой неожиданный источник
нуклеотидных последовательностей, т.е. источник нуклеотидных
последовательностей не является заранее определенным.
Неожиданный источник нуклеотидных последовательностей может быть
восстановлен путем сборки de novo случайных прочтений,
полученных способом настоящего изобретения, и сравнения этих
собранных нуклеотидных последовательностей с базой данных
нуклеотидных последовательностей. Такая база данных нуклеотидных
последовательностей может быть частной или общедоступной базой
данных нуклеотидных последовательностей. Примеры общедоступной
базой данных нуклеотидных последовательностей включают в себя
без ограничений UCSC Genome Bioinformatics, GenBank, DDBJ, ENA и
т.д. Сравнение собранной последовательности с
последовательностью в частной или общедоступной базе данных может приводить к идентификации примеси нуклеиновой кислоты.
В предпочтительном способе настоящего изобретения
нуклеотидная последовательность биологического компонента,
используемого в способе получения композиции, является
подозреваемым источником нуклеотидных последовательностей. В
частности, в предпочтительном варианте осуществления изобретения
нуклеотидная последовательность биологического компонента
выбирана из группы, состоящей из нуклеотидных
последовательностей клетки-хозяина, плазмиды, вектора, отличного от рекомбинантного парвовирусного вектора, и хелперного вируса. В частности, нуклеотидная последовательность биологического компонента не содержит нуклеотидную последовательность парвовирусного вектора.
Клетка-хозяин в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой любую клетку, используемую в способе получения композиции. Клетка-хозяин может быть выбрана из группы, состоящей из растительной клетки, бактериальной клетки,
дрожжевой клетки и животной клетки. Предпочтительно, клетка-
хозяин представляет собой животную клетку, и более
предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяин
млекопитающего или клетку-хозяин насекомого. В наиболее
предпочтительном варианте осуществления изобретения клетка-
хозяин представляет собой клетку-хозяин насекомого. Нуклеотидная
последовательность клетки-хозяина, используемая в способе
получения композиции, содержит геномную ДНК и/или
митохондриальную ДНК. Предпочтительно, нуклеотидная
последовательность клетки-хозяина содержит геномную ДНК. Геномная ДНК может содержать ген, выбранный из группы генов, состоящей из трансгена, гена, кодирующего Rep, гена, кодирующего Сар, и гена, кодирующего белок или РНК с хелперной функцией для получения композиции. Такой ген, кодирующий белок или РНК с хелперной функцией для получения композиции, может быть получен из вируса животного, такого как аденовирус и/или вирус простого герпеса, или вируса насекомого, такого как бакуловирус. В альтернативном варианте или в комбинации, геномная ДНК может содержать последовательность ITR. В предпочтительном варианте осуществления изобретения геномная ДНК клетки-хозяина содержит трансген, фланкированный, по меньшей мере, одним ITR, и предпочтительно трансген, фланкированный ITR с каждой стороны.
Плазмида в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой любую плазмиду, используемую в способе получения композиции. Плазмида предпочтительно содержит ген, выбранный из группы генов, состоящей из гена устойчивости, трансгена, гена, кодирующего Rep, гена, кодирующего Сар, и гена, кодирующего белок или РНК с хелперной функцией для получения композиции. В альтернативном варианте или в комбинации, плазмида может содержать последовательность ITR. В предпочтительном варианте осуществления изобретения плазмида содержит трансген, фланкированный, по меньшей мере, одним ITR, и предпочтительно трансген, фланкированный ITR с каждой стороны.
Вектор в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой любой вектор, используемый в способе получения композиции. Вектор может быть выбран из группы,
состоящей из плазмиды, вирусного вектора, космиды и
искусственной хромосомы. В предпочтительном варианте
осуществления настоящего изобретения вектор представляет собой
вирусный вектор. В наиболее предпочтительном варианте
осуществления вектор представляет собой бакуловирусный вектор.
Бакуловирусный вектор, используемый в способе получения
композиции, может содержать ген, выбранный из группы генов,
состоящей из: трансгена, гена, кодирующего Rep, гена,
кодирующего Сар, и гена, кодирующего белок с хелперной функцией
для получения композиции. В альтернативном варианте или в
комбинации, бакуловирусный вектор может содержать
последовательность ITR. В предпочтительном варианте
осуществления изобретения бакуловирусный вектор содержит трансген, фланкированный, по меньшей мере, одним ITR, и предпочтительно трансген, фланкированный ITR с каждой стороны.
Хелперный вирус в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой любой вирус, используемый в способе получения композиции. В предпочтительном варианте осуществления изобретения хелперный вирус используется в способе получения парвовирусного вириона. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения хелперный вирус используется в способе получения рекомбинантного аденоассоциированного вириона (рААВ). В более предпочтительном варианте осуществления изобретения хелперный вирус представляет собой аденовирус и/или вирус простого герпеса. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения хелперный вирус представляет собой рекомбинантный аденовирус и/или рекомбинантный вирус простого герпеса. В еще одном варианте осуществления изобретения хелперный вирус содержит ген, выбранный из группы генов, состоящей из трансгена, гена, кодирующего Rep, гена, кодирующего Сар, и гена, кодирующего белок с хелперной функцией для получения композиции. В альтернативном варианте или в комбинации, хелперный вирус может содержать последовательность ITR. В предпочтительном варианте осуществления изобретения хелперный вирус содержит трансген, фланкированный, по меньшей мере, одним ITR, и предпочтительно трансген, фланкированный ITR
с каждой стороны.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность биологического компонента, используемого в способе получения композиции, получена из бакуловирусного вектора. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность из биологического компонента получена из бакуловирусного вектора, содержащего трансген, фланкированный, по меньшей мере, одним ITR, и предпочтительно трансген, фланкированный двумя ITRs.
В комбинации или в качестве альтернативы вышеуказанному, нуклеотидная последовательность биологического компонента содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую Rep, Сар и/или трансген, где предпочтительно биологический компонент содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, причем более предпочтительно биологический компонент содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, который фланкирован по меньшей мере одним парвовирусным ITR, и где наиболее предпочтительно биологический компонент содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, который фланкирован, по меньшей мере, одним парвовирусным ITR с каждой стороны.
Количественное определение избыточной примеси нуклеиновой кислоты при помощи секвенироания нуклеиновой кислоты
Настоящее изобретение относится к способу идентификации и количественного определения избыточной примеси нуклеиновой кислоты в композиции, где этот способ включает в себя этап осуществления секвенирования нуклеиновой кислоты композиции для получения случайных прочтений нуклеотидных последовательностей. Примесь нуклеиновой кислоты может быть идентифицирована как, указано выше. Затем идентифицированную примесь нуклеиновой кислоты можно подвергнуть количественному определению путем определения количества прочтений на нуклеиновую кислоту избыточной примеси нуклеиновой кислоты в композиции.
Число прочтений на нуклеиновую кислоту определяется здесь как число прочтений, которые выравниваются с конкретной нуклеиновой кислотой нуклеотидной последовательности. Таким
образом, число прочтений на нуклеиновую кислоту примеси нуклеиновой кислоты в композиции следует понимать как число прочтений, которые специфично выравниваются с нуклеиновой кислотой примеси нуклеиновой кислоты.
Число прочтений, выравнивающихся с конкретной нуклеиновой кислотой нуклеотидной последовательности, переводится в частоту, где эта конкретная нуклеиновая кислота присутствует в композиции. Таким образом, большое число прочтений, выравнивающихся с конкретной нуклеиновой кислотой, следует понимать как нуклеиновую кислоту, которая часто встречается в композиции. В альтернативном варианте, если только несколько прочтений выравниваются с конкретной нуклеиновой кислотой, следует понимать, что эта нуклеиновая кислота встречается в композиции редко.
В соответствии со способом настоящего изобретения примесь нуклеиновой кислоты является избыточной, когда распределение прочтений не является случайным, и избыточная примесь в 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз превышает среднее количество прочтений биологического компонента, или когда количество прочтений на нуклеотид примеси нуклеиновой кислоты составляет, по меньшей мере, 0,0005, 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0, 005, 0, 006, 0, 007, 0, 008, 0, 009, 0, 01, 0, 02, 0, 03, 0, 04, 0, 05, 0, 05, 0, 06, 0, 07, 0, 08, 0, 09, 0, 1, 0, 2, 0, 3, 0, 4, 0, 5, 0, 6, 0, 7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 или 10% от среднего количества прочтений на нуклеиновую кислоту парвовирусного вектора.
Среднее число прочтений на парвивирусный вектор определяется здесь как общее число прочтений, которые выравниваются с парвовирусным вектором, деленное на общее число нуклеотидов парвовирусного вектора. Предпочтительно, прочтения и нуклеотиды, расположенные за 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400 или 500 нуклеотидов перед парвовирусным вектором и/или прочтения и нуклеотиды, расположенные за 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400 или 500 нуклеотидов после парвовирусного вектора, не рассматриваются при определении среднего числа прочтений на парвовирусный вектор. Эти прочтения могут не быть репрезентативными для
среднего числа прочтений на парвивирусный вектор, так как существует искусственное уменьшение числа прочтений, которые выравниваются с нуклеотидами, находящимися максимально перед и/или максимально после парвовирусного вектора, то есть на концах вектора.
Среднее число прочтений биологического компонента
определяется здесь как общее число прочтений, которые
выравниваются с биологическим компонентом, деленное на общее
число нуклеотидов биологического компонента. Биологический
компонент может содержать один биологический компонент,
используемый в способе получения композиции. Более
предпочтительно, биологический компонент выбран из группы,
состоящей из нуклеотидных последовательностей клетки-хозяина,
плазмиды, вектора, отличного от рекомбинантного парвовирусного
вектора, и хелперного вируса, где предпочтительно вектор
представляет собой бакуловирусный вектор. Наиболее
предпочтительно, биологический компонент представляет собой бакуловирусный вектор.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения число нуклеотидов парвовирусного вектора может содержать полную нуклеотидную последовательность парвовирусного вектора, например, включая последовательности ITR, промоторные последовательности, последовательность трансгена и любые другие последовательности между левым ITR и правым ITR. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения часть нуклеотидной последовательности парвовирусного вектора выбрана для определения среднего числа прочтений парвовирусного вектора. Такая часть парвовирусного вектора может содержать нуклеотидную последовательность ITR, промоторную последовательность и/или последовательность трансгена. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность трансгена выбрана для определения среднего числа прочтений на нуклеотидную кислоту парвовирусного вектора, т.е. числа прочтений, выравнивающихся с трансгеном, деленного на число нуклеотидов нуклеотидной последовательности трасгена.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения
избыточную примесь нуклеиновой кислоты количественно определяют
во второй или последующей композиции. После идентификации и
количественного определения избыточной примеси нуклеиновой
кислоты в перовой композиции, избыточная примесь нуклеиновой
кислоты может быть затем количественно определена в последующей
композиции. Количественное определение избыточной примеси
нуклеиновой кислоты во второй и последующей композиции может
быть проведено так, как описано выше. В альтернативном варианте
количественное определение избыточной примеси нуклеиновой
кислоты во второй и последующей композиции может быть проведено
любым другим способом, подходящим для определения количества
примеси нуклеиновой кислоты. Способы количественного определения
конкретных фрагментов ДНК хорошо известны из уровня техники и
равно применимы для количественного определения избыточной
примеси нуклеиновой кислоты во второй и последующей композиции.
Эти способы включают в себя без ограничений
высокопроизводительное секвенирование, количественную ПЦР, ПЦР с ограниченным числом циклов, гибридизационный анализ, анализ с использованием микрочипа и электрофорез в агарозном геле. Парвовирусные вирионы
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция содержит парвовирусный вектор. В частности, в предпочтительном способе настоящего изобретения парвовирусный вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (рААВ). Вирусы семейства Parvoviridae представляют собой небольшие ДНК-вирусы животных. Семейство Parvoviridae может быть разделено на два подсемейства: Parvovirinae, которые заражают позвоночных, и Densovirinae, которые заражают насекомых. Члены подсемейства Parvovirinae именуются здесь парвовирусами и включают в себя род Dependovirus. Как можно заключить из названия этого рода, члены Dependovirus уникальны тем, что они для продуктивной инфекции в культуре клеток обычно требуют совместной инфекции с хелперным вирусом, таким как аденовирус или вирус герпеса. Род Dependovirus включает в себя ААВ, который обычно заражает людей (например, серотипы 1, 2, ЗА, ЗВ, 4, 5 и б) или приматов
(например, серотипы 1 и 4), и родственные вирусы, которые заражают других теплокровных животных (например, бычий, собачий, конский и овечий аденоассоциированные вирусы). Дополнительная информация о парвовирусах и других членах семейства Parvoviridae описана в Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication" Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996).
Геномная организация всех известных серотипов ААВ является в значительной степени сходной. Геном ААВ представляет собой линейную одноцепочечную молекулу ДНК, которая состоит из, менее чем, 50 0 0 нуклеотидов (нд). Инвертированные концевые повторы
(ITR) фланкируют уникальные кодирующие нуклеотидные
последовательности неструктурных белков репликации (Rep) и структурных белков (VP). Белки VP (VP1, -2 и -3) образуют капсид. Концевые 145 нуклеотидов является самокомплементарными и организован таким образом, что могут формировать энергетически стабильный внутримолекулярный дуплекс, образующий Т-образную шпильку. Эти шпилечные структуры функционируют как источник репликации вирусной ДНК, они служат в качестве праймеров для клеточного комплекса ДНК-полимеразы. После инфицирования ААВ дикого типа (wt) клеток млекопитающих, гены Rep (т.е. Rep78 и Rep52) экспрессируются с промотора Р5 и промотора Р19, соответственно, и обоим белкам Rep принадлежит своя функция в репликации вирусного генома. Событие сплайсинга в ОРС Rep приводит к экспрессии фактически четырех белков Rep (т.е. Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40). Однако было показано, что несплайсированная мРНК, кодирующая белки Rep7 8 и Rep52, в клетках млекопитающих достаточна для синтеза вектора ААВ. Также в клетках насекомых белки Rep7 8 и Rep52 достаточны для синтеза вектора ААВ.
Используемый здесь термин "парвовирусный или ААВ вектор" или "рААВ вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей одну или несколько представляющих интерес полинуклеотидных последовательностей (например, экспрессионную конструкцию для гена, кодирующего целевой продукт, т.е. "трансген"), которые фланкированы, по меньшей мере, одной парвовирусной или ААВ последовательностью инвертированного
концевого повтора (ITRs). Такие рААВ вектора могут реплицироваться и упаковываться в инфекционные вирионы, когда они находятся в клетке-хозяине, которая экспрессирует продукты генов rep и cap ААВ (т.е. белки Rep и Сар ААВ) . Парвовирусный или ААВ вектор предпочтительно представляет собой рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, т.е. молекулу нуклеиновой кислоты, которая не встречается в природе и получена путем комбинации элементов последовательности, которые не встречаются в природе в этой комбинации и/или порядке.
Когда рААВ вектор встроен в более крупную конструкцию нуклеиновой кислоты (например, в хромосому или в другой вектор, такой как плазмида или бакуловирус, используемый для клонирования или трансфекции), то этот рААВ вектор обычно называется "провектор", который может быть "спасен" путем репликации и инкапсидирования при наличии функций упаковки ААВ и необходимых хелперных функций.
Предпочтительно, целевой генный продукт с каждой стороны
фланкирован ITRs ААВ. Любой ITR ААВ может быть использован в
способе настоящего изобретения, включая ITRs из ААВ1, ААВ2,
ААВ4, ААВ5, ААВб, ААВ8, ААВ9 и/или AABrhl0. ITRs ААВ2 являются
наиболее предпочтительными. Примеры предпочтительных
последовательностей ITR для использования в предпочтительных конструкциях нуклеиновых кислот приведены в SEQ ID N0: 1 (левый или 5'-ITR) и SEQ ID N0: 2 (правый или З'-ITR) .
ААВ способен инфицировать ряд клеток млекопитающих. См., например, Tratschin et al. (1985, Mol. Cell Biol. 5: 3251-3260) и Grimm et al. (1999, Hum. Gene Ther. 10: 2445-2450) . Однако, трансдукция ААВ синовиальных фибробластов человека значительно эффективнее, чем аналогичных мышиных клеток, Jennings et al., Arthritis Res, 3:1 (2001), и клеточный тропизм ААВ различается у разных серотипов. См., например, Goncalves, 2005, Virol J. 2(1): 43, где обсуждаются подходы к модификации тропизма ААВ.
Вектор рААВ для использования в способе настоящего изобретения может быть получен или в клетках млекопитающих, или в клетках насекомых. Оба способа описаны в данной области
техники. Например, в работе Grimm et al. (2003 Molecular Therapy 7(6) : 839-850) раскрыта стратегия получения ААВ векторов визуально контролируемым способом без хелперного вируса, которая основана на трансфекции только двух плазмид в клетки 2 93Т. В этой работе описан способ получения гибридного вектора ААВ, содержащего Rep белки ААВ2, ITRs ААВ2 и капсидные белки ААВ5. Эта ссылка включена в настоящее изобретение полностью. Дополнительная информация также может быть получена из Blits et al. (2010) (Journal of Neuroscience methods 185(2) : 257-263) .
Термины "гибридный" и "псевдотипированный" используются здесь взаимозаменяемо и используются для обозначения векторов, в которых белки Rep, ITRs и/или капсидные белки получены из разных серотипов. Например, ITRs и белки Rep из ААВ2, а капсидные белки из ААВ5. Термин "химерный" используется здесь для описания того, что один ген, такой как, например, капсид, состоит из, по меньшей мере, двух последовательностей, полученных зз разных серотипов.
Способы получения ААВ
рААВ вектор в композиции настоящего изобретения может быть получен классическим способом получения рААВ. Такой классический способ получения основан на протоколах транзиентной трансфекции клеток-мишеней/продуцирующих клеток (Merten et al, Gene Ther, 2006,, 12: S51-S61). Это подход, основанный на транскомплементации и транзиентной трансфекции, требует следующих генетических элементов: (i) последовательность генома рААВ. Последовательность генома рААВ может быть клонирована в плазмиду (так называемую вирусную векторную плазмиду). Эта вирусная векторная плазмида как правило содержит, по меньшей мере, один ITR и экспрессионную кассету для экспрессии трансгена; (ii) последовательность, кодирующую гены rep и cap, и (iii) необходимые хелперные функции, кодируемые естественным вспомогательным вирусом, таким как аденовирус и/или вирус простого герпеса.
Например, рААВ может быть получен в клетках млекопитающего следующим способом, но без ограничений: векторный геном содержит трансгенную экспрессионную кассету, фланкированную двумя
инвертированными концевыми повторами (ITRs), полученными из ААВ серотипа 2. Общая длина генома вирусного вектора не может превышать размер генома дикого типа 4,7 т.п.н. для поддержания высокой эффективности упаковки. Один капсид состоит из 60 вирусных белков VP1 (62 кДа) , VP2 (73 кДа) или VP3 (87 кДа) в соотношении 1:1:10. Способ получения векторов ААВ основан на Са(Р04)г трансфекции двух плазмид в клетки-продуценты почки эмбриона человека (НЕК2 93) в роллерных флаконах (площадь поверхности 8 50 см2) с последующей очисткой капсидированных векторных геномов методами фильтрации и хроматографии. Первая плазмида представляет собой вирусную векторную плазмиду и содержит экспрессионную конструкцию, которая фланкирована ITRs ААВ2. Вторая плазмида представляет собой упаковочную плазмиду и кодирует гены ААВ rep типа 2 и cap типа 5 желаемого серотипа и ранние хелперные гены аденовируса Е2А, VA, Е4 (pDP5, нуклеотидная последовательность, раскрытая в SEQ ID NO: 3). Геном линии клеток-продуцентов содержит аденовирус Е1 для обеспечения хелперных функций. После котрансфекции двумя плазмидами в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков,
(IMDM), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС), клетки инкубировали в течение трех суток в бессывороточной модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), чтобы обеспечить образование вектора. Образование вектора в роллерных флаконах приводит к среднему выходу 3x103 векторных геномов на клетку или 4x1011 векторных геномов на роллерный флакон
(определяется при помощи количественной ПЦР) . Затем культуру клеток лизируют буфером, содержащим Тритон-Х-100, и клеточный дебрис удаляют при помощи низкоскоростного центрифугирования. Осветленную массу очищают с помощью аффинной хроматографии на AVB Sepharose и растворяют в ФСБ/5% сахарозу путем концентрирования и диафильтрации с использованием модуля полых волокон 400 кДа (например, от Spectrum Laboratories).
В альтернативном варианте, рААВ в композиции настоящего изобретения могут быть получены преимущественно независимым от трансфекции способом. Такие способы могут быть основаны или на
использовании упаковывающих/продуцирующих клеточных линий, которые продуцируют рААВ после индукции, или на использовании систем бакуловирус/клетка насекомого.
Упаковывающие клетки могут содержать часть всех необходимых
генетических элементов ААВ, такие как хелперные
последовательности rep и cap ААВ. Последующая индукция синтеза рААВ линией упаковывающих клеток может быть осуществлена путем трансфекции плазмиды, содержащей последовательность рААВ (вирусная векторная плазмида), с последующим введением последовательности, кодирующей необходимые хелперные функции, такие как, например, инфицирование (репликативно дефицитным) аденовирусом и/или вирусом простого герпеса. Линии клеток-продуцентов могут быть полными транс-комплементарными системами, которые содержат все необходимые полученные из ААВ компоненты, интегрированные в их геном, то есть хелперные последовательности ААВ (rep-cap) вместе с вирусной векторной последовательностью. Индукция синтеза рААВ может происходить после введения последовательности, кодирующей необходимые хелперные функции.
С другой стороны, последовательность генома рААВ, содержащая, по меньшей мере, один ITR и экспрессионную кассету для экспрессии трансгена, может быть встроена в геном хелперного вируса, такого как аденовирус или вирус простого герпеса, соответственно образуя гибридную систему рААВ/Ад (Thorne et al. , 2 009; Hum. Gene Ther. 20; 707-714) или гибридную систему рААВ/ВПГ (Clement et al., 2 009; Hum. Gene ther. 20; 7 9 6-806.; Ye et al., 2014; Hum. Gene Ther. 15; 1-6).
В альтернативном варианте, вектор ААВ для использования в способе настоящего изобретения может быть получен в клетках насекомых, как описано ранее Urabe et al. (Journal of Virology 2006 80 (4): 1874-1885). В этой системе последовательность генома рААВ может быть клонирована в рекомбинантный бакуловирус.
ДНК-примеси в композиции, содержащей парвовирусный вектор, могут иметь своим источником любой биологический компонент, используемый в способе получения композиции. Композиция может быть получена любым из описанных выше способов.
Предпочтительно, в способе настоящего изобретения
нуклеотидная последовательность биологического компонента
выбрана из группы, состоящей нуклеотидных последовательностей
клетки-хозяина, плазмиды, вектора и хелперного вируса. В
предпочтительном варианте осуществления изобретения
биологический компонент содержит, по меньшей мере, один из следующих генетических элементов: (i) последовательность генома рААВ, предпочтительно содержащая, по меньшей мере, один ITR и экспрессионную кассету для экспрессии трансгена; (ii) последовательность, кодирующую гены rep и/или cap, и/или (iii) последовательность, кодирующую необходимые хелперные функции, которые в природе кодируются вспомогательным вирусом, таким как аденовирус и/или вирус простого герпеса. Более предпочтительно, биологический компонент содержит, по меньшей мере, один ITR и экспрессионную кассету для экспрессии трансгена.
В предпочтительном способе настоящего изобретения вектор представляет собой бакуловирусный вектор. Baculoviridae представляет собой семейство крупных оболочечных ДНК-вирусов. Бакуловирусы инфицируют преимущественно членистоногих с огромным количеством восприимчивых видов, относящихся к порядку Lepidoptera. Несколько перевиваемых клеточных линий, таких как Sf9, Sf21 или High Five, позволяющих осуществлять размножение бакуловируса in vitro, являются коммерчески доступными и могут быть использованы для получения композиции настоящего изобретения.
Рекомбинантные бакуловирусы, полученные из вируса многоядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV), наиболее часто используются в биотехнологии, в частности для получения рекомбинантных белков или вирусоподобных частиц (ВПЧ, т.е. оболочек, лишенных вирусных нуклеиновых кислот).
Основные преимущества получения, основанного на бакуловирусной экспрессионной векторной системе (BEVS), могут быть суммированы следующим образом: (i) наличие очень сильных промоторов (полиэдрин или рЮ) позволяет получать большое количество гетерологичных белков без ограничения размера гена; (ii) клетки насекомых обладают способностью выполнять основные посттрансляционные модификации, что позволяет получать
биологически активные белки; и (iii) бакуловирусная технология может быть легко реализована, масштабирование легко достижимо, клетки выращиваются в суспензии, и различные бессывороточные среды являются коммерчески доступными.
Сборка вирусных частиц является более сложным процессом, чем экспрессия одного белка. Тем не менее, было показано, что ВПЧ на основе вируса гепатита В человека, парвовируса В19, ротавируса, вируса папилломы человека могут быть успешно получены с помощью BEVS. Кроме того, бакуловирусная экспрессионная векторная система может быть использована для получения рААВ (Merten et al, выше, Urabe et al., 2002) .
Таким обрзом, в способе настоящего изобретения парвовирусный вирион может быть получен с использованием бакуловирусной экспрессионной векторной системы в клетках млекопитающих или в клетках насекомых. Предпочтительно парвовирусный вирион получают с использованием бакуловирусной экспрессионной векторной системы в клетках насекомых.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения бакуловирусный вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую Rep, Сар и/или трансген, где предпочтительно бакуловирусный вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, где более предпочтительно бакуловирусный вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, который фланкирован по меньшей мере одним парвовирусным ITR, и где наиболее предпочтительно бакуловирусный вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, который фланкирован, по меньшей мере, одним парвовирусным ITR с каждой стороны.
Также в настоящем изобретении могут быть использованы модификации последовательностей Rep и VP1, VP2 и VP3, например, раскрытые в публикациях международных патентных заявок WO2007/046703, W02007/148971, WO2009/014445, WO2009/104964 и/или WO2011/112089.
Последовательности ITR и Rep ААВ, которые могут быть использованы в способе настоящего изобретения для получения векторов рААВ, могут быть получены из генома ААВ любого
серотипа. Как правило, серотипы ААВ имеют геномные последовательности, обладающие значительной гомологией на аминокислотном и нуклеотидном уровне. Это обеспечивает идентичный набор генетических функций для получения вирионов, которые в значительной степени являются физически и функционально эквивалентными. Геномные последовательности различных серотипов ААВ и обзор геномных сходств см. , например, в регистрационный номер в GenBank U8 97 90; регистрационный номер в GenBank JO1901; регистрационный номер в a GenBank AF04 33 03; регистрационный номер в GenBank AF085716; Chiorini et al. (1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava et al. (1983, J. Vir. 45:55564); Chiorini et al. (1999, J. Vir. 73:1309-1319); Rutledge et al. (1998, J. Vir. 72:309-319); и Wu et al. (2000, J. Vir. 74: 8635-47). рААВ серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12 могут быть использованы в качестве источника нуклеотидных последовательностей для применения в контексте настоящего изобретения. рААВ серотипов 1, 2, 3, 4 и 5 являются предпочтительным источником нуклеотидных последовательностей ААВ. Предпочтительно последовательности ITR ААВ в контексте настоящего изобретения получены из ААВ1, ААВ2 и/или ААВ 5. Более предпочтительно, последовательности ITR в способе настоящего изобретения представляют собой ITR ААВ2. Аналогично, кодирующие последовательности Rep (Rep78/68 и Rep52/40) предпочтительно получены из ААВ1, ААВ2 и/или ААВ5, более предпочтительно из ААВ 2 .
Последовательности Rep и ITR ААВ являются особенно
консервативными среди большинства серотипов. Белки Rep7 8
различных серотипов ААВ являются, например, более чем на 8 9%
идентичными, а общая идентичность нуклеотидной
последовательности на уровне генома между ААВ2, ААВЗА, ААВЗВ и ААВб составляет около 82% (Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virol., 73 (2): 939-947). Кроме того, известно, что последовательности Rep и ITR многих серотипов ААВ являются эффективными кросс-комплементами, т.е. они функционально заменяют соответствующие последовательности из других серотипов при получении частиц ААВ в клетках млекопитающих. В заявке на
Патент США US2003148506 сообщается, что последовательности Rep и ITR ААВ также являются эффективными кросс-комплементами других последовательностей Rep и ITR ААВ в клетках насекомых.
Известно, что белки VP ААВ определяют клеточный тропизм вириона ААВ. Последовательности, кодирующие белок VP, у различных серотипов ААВ значительно менее консервативны, чем белки и гены Rep. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вектор рААВ содержит белки VP1. Способность последовательностей Rep и ITR к кросс-комплементации с соответствующими последовательностями других серотипов позволяет получать псевдотипированные частицы рААВ, содержащие капсидные белки одного серотипа (например, ААВ5) и последовательности Rep и/или ITR ААВ другого серотипа (например, ААВ) . Такие псевдотипированные частицы рААВ являются частью способа настоящего изобретения. В данном случае псевдотипированная частица рААВ может быть обозначена типом "х/у", где "х" обозначает источник ITR, а "у" обозначает серотип капсида, например, частица рААВ 2/5 имеет ITR из ААВ2 и капсид из ААВ5.
Модифицированные последовательности ААВ также могут использоваться в контексте настоящего изобретения, например, для получения векторов рААВ в клетках насекомых. Такие модифицированные последовательности, например, включающие в себя последовательности, обладающие, по меньшей мере, примерно 70%, по меньшей мере, примерно 75%, по меньшей мере, примерно 80%, по меньшей мере, примерно 85%, по меньшей мере, примерно 90%, по меньшей мере, примерно 95% или более идентичности по нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности (например, последовательность, обладающая от примерно 75% до примерно 99% идентичности по нуклеотидной последовательности) с ITR, Rep или VP ААВ1, ААВ2, ААВЗ, ААВ4, ААВ5, ААВб, ААВ7, ААВ 8 или ААВ9, могут быть использованы вместо последовательностей ITR, Rep или VP ААВ дикого типа.
Последовательности ITR, Rep и Сар могут быть модифицированы желаемым образом для обеспечения эффективного образования рААВ или псевдотипированных векторов рААВ в клетках, таких как клетки насекомых. Например, старт-кодон последовательностей Rep может
быть модифицирован, сайты сплайсинга VP могут быть модифицированы или удалены, и/или старт кодон VP1 может быть модифицирован для улучшения образования векторов рААВ в клетках
(насекомых), как, например, описано в Международных патентных заявках WO2007/046703, WO2007/148971 и/или WO2009/014445. Также настоящее изобретение относится к химерным капсидам ААВ, где, например, VP1 ААВ5 частично или полностью заменен VP1, полученным из ААВ2, a VP2 и 3 получены из ААВ5 (Urabe et al. , 2006; WO2000/028004). Предпочтительные аденовирусные векторы модифицируют, чтобы уменьшить ответ хозяина, как описано в Russell (2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-2604), или как описано в заявке на Патент США US20080008690 и в Zaldumbide and Hoeben
(Gene Therapy 2008: 239-246).
Предпочтительно, белок Rep ААВ, содержащийся в векторе для
генной терапии настоящего изобретения, представляет собой белок
Rep ААВ серотипа 2. Еще более предпочтительно, в настоящем
изобретении используется белок Rep7 8, имеющий нуклеотидную
последовательность SEQ ID NO: 4 и/или аминокислотную
последовательность SEQ ID NO: 5, и в настоящем изобретении
используется белок Rep52, имеющий нуклеотидную
последовательность SEQ ID NO: 6.
Количественное определение избыточной примеси нуклеиновой кислоты
В альтернативном варианте или в комбинации с любым из описанных здесь вариантов осуществления изобретения, настоящее изобретение также относится к количественному определению избыточной примеси нуклеиновой кислоты. В частности, настоящее изобретение относится к открытию того, что конкретные ДНК-примеси представлены в избыточном количестве в композиции, содержащей парвовирусный вектор. Эти ДНК-примеси содержат нуклеотидные последовательности, которые непосредственно фланкируют ITRs парвовирусной нуклеотидной последовательности в процессе получения парвовирусного вириона. Так, например, последовательности, расположенные перед левым парвовирусным ITR и/или последовательности, расположенные после правого парвовирусного ITR, являются избыточными в парвовирусном
вирионе.
Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение
относится к способу количественного определения примеси
нуклеиновой кислоты в композиции, содержащей парвовирусный
вектор, где этот способ включает в себя этап определения
относительного содержания примеси нуклеиновой кислоты, где эта
примесь нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную
последовательность, которая расположена между 1 и 8000 п.н., 1 и 5000 п.н., 1 и 3000 п.н., 1 и 1000 п.н., 1 и 500 п.н., 1 и 250 п.н. или 1 и 100 п.н., непосредственно примыкающими к последовательности парвовирусного ITR, где последовательность ITR присутствует в биологическом компоненте, используемом в способе получения композиции, и где биологический компонент содержит трансген, фланкированный, по меньшей мере, одной копией последовательности парвовирусного ITR. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу количественного определения примеси нуклеиновой кислоты в композиции, содержащей парвовирусный вектор, где этот способ состоит из этапа определения относительного содержания примеси нуклеиновой кислоты, где эта примесь нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая расположена между 1 и 8000 п.н., 1 и 5000 п.н., 1 и 3000 п.н., 1 и 1000 п.н., 1 и 500 п.н., 1 и 250 п.н. или 1 и 10 0 п.н., непосредственно примыкающими к последовательности парвовирусного ITR, где последовательность ITR присутствует в биологическом компоненте, используемом в способе получения композиции, и где биологический компонент содержит трансген, фланкированный, по меньшей мере, одной копией последовательности парвовирусного ITR.
Как указано выше, во время процесса получения парвовирусных вирионов парвовирусная последовательность может присутствовать в клетке-хозяине, плазмиде, векторе и/или хелперном вирусе, где предпочтительный вектор представляет собой бакуловирусный вектор. Парвовирусная последовательность может содержать, по меньшей мере, одну копию ITR и экспрессионную кассету для экспрессии трансгена. Избыточные ДНК-примеси могут содержать
любую последовательность, которая непосредственно фланкирует
парвовирусный ITR или ITRs, такие как геномные
последовательности, плазмидные последовательности, векторные
последовательности или последовательности хелперного вируса.
Таким образом, тип ДНК-примеси зависит от последовательностей от
последовательностей, фланкирующих ITR при получении
парвовирусных вирионов. Например, если парвовирусная
последовательность, содержащая, по меньшей мере, одну копию ITR
и предпочтительно трансген, присутствует в бакуловирном векторе,
то бакуловирусные последовательности, непосредственно
фланкирующие ITR или ITRs, будут представлены в избыточном количестве в композиции, содержащей парвовирусный вектор.
В одном варианте осуществления изобретения примесь
нуклеиновой кислоты количественно определяют в композиции,
содержащей парвовирусный вектор. Способ количественного
определения примеси нуклеиновой кислоты может включать в себя
любой способ, известный из уровня техники для количественного
определения нуклеиновой кислоты. Такие способы включают в себя
без ограничений высокопроизводительное секвенирование,
количественную ПЦР, ПЦР с ограниченным числом циклов, гибридизационный анализ, анализ с использованием микрочипа и электрофорез в агарозном геле.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения
биологический компонент определяется, как указано выше. В
частности, биологический компонент выбран из группы, состоящей
из клетки-хозяина, плазмиды, вектора, отличного от
рекомбинантного парвовирусного вектора, и хелперного вируса.
Предпочтительно, биологический компонент содержит парвовирусную
последовательность, где предпочтительно парвовирусная
последовательность содержит, по меньшей мере, один ITR и нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген. Наиболее предпочтительно, биологический компонент содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, который фланкирован, по меньшей мере, одним парвовирусным ITR с каждой стороны.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения биологический компонент представляет собой вектор,
где этот вектор представляет собой бакуловирусный вектор. Бакуловирусный вектор предпочтительно содержит парвовирусную последовательность. Эта парвовирусная последовательность предпочтительно содержит, по меньшей мере, один ITR и нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген. Наиболее предпочтительно, бакуловирусный вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, которая фланкирована, по меньшей мере, одним парвовирусным ITR с каждой стороны.
В способе настоящего изобретения примесь нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая расположена между 1 и 10000 п.н., 1 и 9000 п.н., 1 и 8000 п.н., 1 и 7000 п.н., 1 и 6000 п.н., 1 и 5000 п.н., 1 и 4000 п.н., 1 и 3000 п.н., 1 и 2000 п.н., 1 и 1000 п.н., 1 и 800, 1 и 600 п.н. 1 и 500 п.н., 1 и 400 п.н., 1 и 250 п.н. или 1 и 10 0 п.н., непосредственно примыкающими к последовательности парвовирусного ITR, которая присутствует в биологическом компоненте, используемом в способе получения композиции. Длина ДНК-примеси может зависеть от присутствия других случайно упакованных ДНК-примесей и/или от размера трансгена, так как существует максимальная упаковочная емкость парвовирусного вириона. Однако известно, что парвовирусный вирион может включать более длинные последовательности ДНК, чем длина его собственного генома (Grieger et al, J Virol. 2005 79(15): 9933-44).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения парвовирусный вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (рААВ) , как описано выше. Кроме того, вирион рААВ может быть получен с использованием любого из способов получения, как описано ранее.
В другом варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность примеси нуклеиновой кислоты непосредственно примыкает к каждому концу последовательности парвовирусного ITR, где последовательность ITR присутствует в биологическом компоненте, используемом в способе получения композиции. Парвовирусная последовательность, присутствующая в биологическом компоненте, может содержать трансген, который фланкирован, по меньшей мере, одним ITR на каждой конце трансгена. В этом случае
примесь нуклеиновой кислоты может содержать нуклеотидные последовательности, которые присутствуют на одном конце ITR, т.е. только непосредственно примыкают к левыми ITRs или только непосредственно примыкают к правым ITRs. В альтернативном варианте, нуклеотидная последовательность примеси нуклеиновой кислоты может содержать нуклеотидные последовательности, которые присутствуют на обоих концах ITRs.
В одном варианте осуществления изобретения примеси нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая непосредственно примыкает к последовательности парвовирусного ITR, где последовательность ITR присутствует в биологическом компоненте, используемом в способе получения композиции. "Непосредственно примыкает" определяется здесь следующим образом: В случае ITR перед трансгеном "непосредственно примыкает" означает любую нуклеотидную последовательность, которая заканчивается, по меньшей мере, за О, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 или 50 п.н. перед ITR. В случае ITR, расположенного после трансгена, "непосредственно примыкает" означает любую нуклеотидную последовательность, которая начинается, по меньшей мере, через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 или 50 п.н. после ITR.
Относительное содержание
В одном варианте осуществления изобретения способ включает в себя этап определения относительного содержания примеси нуклеиновой кислоты. Используемый здесь термин "относительное содержание" относится к присутствию (части) первой молекулы нуклеиновой кислоты по сравнению с присутствием (части) второй молекулы нуклеиновой кислоты в той же самой или другой композиции. В случае если относительное содержание определяется между двумя или более композициями, вторая молекула нуклеиновой кислоты может содержать такую же или другую нуклеотидную последовательность, что и первая молекула нуклеиновой кислоты. В случае если относительное содержание определяется в одной композиции, первая и вторая молекулы нуклеиновой кислоты содержат, по меньшей мере, частично другую нуклеотидную последовательность.
В способе настоящего изобретения относительное содержание между примесью нуклеиновой кислоты и второй молекулой нуклеиновой кислоты предпочтительно определяют в той же композиции, хотя в другом варианте осуществления изобретения, относительное содержание примеси нуклеиновой кислоты определяют между разными композициями. В предпочтительном способе настоящего изобретения относительное содержание определяют по сравнению с нуклеотидной последовательностью парвовирусного вектора и/или референсной последовательностью в композиции. Предпочтительно, чтобы трансгенная и/или референсная последовательность присутствовали в той же композиции, что и примесь нуклеиновой кислоты.
Нуклеотидная последовательность парвовирусного вектора может содержать любую последовательность парвовирусного вектора, такую как полный парвовирусный вектор, или (часть) нуклеотидной последовательности трансгена, промотора или ITRs. Однако любая другая нуклеотидная последовательность парвовирусного вектора может быть одинаково пригодна для использования в способе настоящего изобретения.
Референсная последовательность может представлять собой любую подходящую нуклеотидную последовательность (или ее часть). Предпочтительно референсная последовательность представляет собой последовательность (или ее часть) гена домашнего хозяйства. Нуклеотидная последовательность биологического компонента и/или референсная последовательность представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая используется в качестве добавленного контроля композиции.
В случае если референсная последовательность представляет собой последовательность биологического компонента, то эта последовательность не является непосредственно фланкирующей парвовирусный ITR, и эта референсная последовательность предпочтительно получена из клетки-хозяина, плазмиды или вектора, используемого в способе получения композиции. Предпочтительно референсная последовательность получена из того же биологического компонента, содержащего трансген и, по меньшей мере, один ITR. Более предпочтительно, референсная
последовательность содержит последовательность из
бакуловирусного вектора, где этот бакуловирусный вектор используется в способе получения композиции, и содержит трансген и, по меньшей мере, один ITR, и эта референсная бакуловирусная последовательность не является непосредственно фланкирующей парвовирусный ITR.
В случае если референсная последовательность представляет собой нуклеиновую кислоту, которая используется в качестве добавленного контроля композиции, то предполагается, что эта нуклеиновая кислота отсутствует после получения композиции и добавляется в более поздний момент времени, но до определения относительного содержания примеси нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты, используемая в качестве добавленного контроля композиции, может представлять собой любую подходящую молекулу нуклеиновой кислоты, такую как небольшая линейная или кольцевая молекула РНК или ДНК размером, по меньшей мере, 10, 30, 50, 100, 150, 200, 500, 1000 или более пар оснований. Такая молекула нуклеиновой кислоты может содержать кодирующую и/или некодирующую область.
В еще одном варианте осуществления изобретения относительное содержание определяется:
a) средним количеством прочтений на нуклеиновую кислоту
примеси нуклеиновой кислоты, как определено выше; и
i) средним количеством прочтений на нуклеиновую кислоту референсной последовательности; и/или
ii) средним количеством прочтений на парвовирусный вектор в композиции;
где количество прочтений определяется любым вышеописанным способом; и/или
b) амплификацией примеси нуклеиновой кислоты, как
определено выше; и
i) референсной последовательностью; и/или
ii) нуклеотидной последовательностью парвовирусного
вектора.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения среднее количество прочтений определяется, как указано выше.
Кроме того, парвовирусный вектор может относиться к любой последовательности парвовирусного вектора, такой как полный парвовирусный вектор, или только нуклеотидная последовательность трансгена (ее часть), промотор или ITRs. Кроме того, любая другая нуклеотидная последовательность парвовирусного вектора может быть одинаково пригодна для использования в способе настоящего изобретения.
В еще одном варианте осуществления изобретения
относительное содержание примеси нуклеиновой кислоты может быть
определено любым способом, подходящим для определения количества
молекулы нуклеиновой кислоты, как указано выше. Более
предпочтительно, относительное содержание определяется при
помощи количественной ПЦР и/или при помощи
высокопроизводительного секвенирования. Любой способ
количественной ПЦР или способ высокопроизводительного
секвенирования, который приводит к количественному определению
нуклеиновой кислоты, является пригодным для использования в
способе настоящего изобретения. Способы количественной ПЦР
(полимеразной цепной реакции в режиме реального времени) хорошо
известны из уровня техники, и в этих способах могут
использоваться или неспецифичные флуорохромы, или
гибридизационные зонды. В предпочтительном варианте
осуществления настоящего изобретения количественную ПЦР проводят с использованием специфичных гибридизационных зондов.
Предпочтительно способ дополнительно включает в себя этап селективной гибридизации олигонуклеотидного праймера с примесью нуклеиновой кислоты, как определено выше.
Под селективной гибридизацией олигонуклеотидного праймера с примесью нуклеиновой кислоты понимается, что олигонуклеотид образует продуктивный или позитивный дуплекс с примесью нуклеиновой кислоты. Образование такого продуктивного или позитивного дуплекса следует понимать как образование дуплекса между олигонуклеотидом и примесью нуклеиновой кислоты, которое может быть обнаружено путем образования ампликона в анализе при помощи количественной ПЦР. На практике это будет означать, что конец олигонуклеотидного праймера будет образовывать дуплекс с
примесью нуклеиновой кислоты, так что олигонуклеотид может быть
удлинен полимеразой или лигирован с присоединенной к соседнему
основанию поли- или олигонуклеотидной молекулой. Используемый
здесь термин "ампликон" относится к двухцепочечному сегменту
нуклеиновой кислоты, имеющему определенный размер и
последовательность, который образуется в результате процедуры
амплификации, такой как процедура ПЦР. Размер ампликона
определяется сайтами на двух цепях дуплекса нуклеиновой кислоты,
с которыми связываются олигонуклеотидные праймеры. Как
объясняется в Патенте США No.4683195, этот сегмент нуклеиновой
кислоты продукта становится преобладающим продуктом процедуры
амплификации после небольшого числа циклов амплификации. Кроме
того, последовательность является "специфичной" или
"селективной" для примеси нуклеиновой кислоты, если она эффективно гибридизуется с целевой последовательностью, но не гибридизуется с любой последовательностью, которая не является примесью нуклеиновой кислоты, как определено выше, в условиях, используемых с учетом экспериментальных возможностей.
В предпочтительном варианте осуществления олигонуклеотидный
праймер избирательно гибридизуется с примесью нуклеиновой
кислоты, содержащей часть бакуловирусной последовательности или
ее комплемент. Используемый здесь термин "комплемент" или
"комплементарная последовательность" первой последовательности
означает вторую последовательность, которая может образовывать
двухцепочечную структуру или дуплекс с первой
последовательностью путем связывания пар оснований, например, комплементарной последовательностью для G-T-A-C является С-А-Т-G.
Таким образом, предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота
была получена из бакуловирусного вектора, используемого в
способе получения композиции. В частности, предпочтительно,
чтобы такой бакуловирусный вектор содержал трансген,
фланкированный, по меньшей мере, одним парвовирусным ITR. В
предпочтительном варианте осуществления изобретения
олигонуклеотидный праймер селективно гибридизуется с примесью нуклеиновой кислоты, где примесь нуклеиновой кислоты содержит
нуклеотидную последовательность, полученную из бакуловируса, которая расположена между 1 и 10000 п.н., 1 и 9000 п.н., 1 и 8000 п.н., 1 и 7000 п.н., 1 и 6000 п.н., 1 и 5000 п.н., 1 и 4000 п.н., 1 и 3000 п.н., 1 и 2000 п.н., 1 и 1000 п.н., 1 и 800, 1 и 600 п.н. 1 и 500 п.н., 1 и 400 п.н., 1 и 250 п.н. или 1 и 10 0 п.н., непосредственно примыкающими к последовательности парвовирусного ITR, когда эта последовательность парвовирусного ITR присутствует в бакуловирусном векторе. Клиническое применение
Композиция, содержащая парвовирусный вектор, не должна содержать высокую степень примесей нуклеиновых кислот, особенно если композиция должна использоваться при лечении. В частности, такие примеси нуклеиновой кислоты могут вызывать побочные реакции у обычно уже чувствительных пациентов, что может привести к тяжелым осложнениям. Настоящее изобретение относится к открытию, что ДНК-примеси что ДНК-примеси упаковываются в парвовирусный вирион не случайным образом. В действительности, последовательности, которые фланкируют ITR во время образования парвовирусных вирионов, являются избыточными. Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу определения того, является ли композиция, содержащая парвовирусный вектор, клинически чистой, где этот способ включает в себя этапы:
i) количественного определения примеси нуклеиновой кислоты
в композиции, содержащей парвовирусный вектор, как определено
выше; и
ii) определение того, что композиция является клинически
чистой, если примесь нуклеиновой кислоты, как определено выше,
присутствует, по меньшей мере, в 10, 100, 250, 1000 раз меньшем
количестве, по сравнению с референсной последовательностью и/или
трансгеном, как определено по относительному содержанию примеси
нуклеиновой кислоты.
Клинически чистый здесь определяется как фармацевтический продукт высокого качества, который представляет собой композицию, которая считается безопасной для введения животным, предпочтительно фармацевтический продукт высокого качества
представляет собой продукт, который считается безопасным для введения млекопитающим, наиболее предпочтительно композиция считается безопасной для введения людям.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения примесь нуклеиновой кислоты, как определено выше, присутствует, по меньшей мере, в 10, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 10000 или 100000 раз меньшем количестве, по сравнению с трансгеном или референсной последовательностью. Присутствие примеси нуклеиновой кислоты и трансгенной или эталонной последовательности может быть количественно определено любым стандартным способом количественного определения конкретной последовательности ДНК.
Под термином "клинически чистый" здесь подразумевается, что композиция, содержащая парвовирусный вектор, считается достаточно чистой для клинического применения. В частности, клинически чистая композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит низкую степень ДНК-примесей в соответствии с требованиями Руководства по качеству и безопасности Международной конференции по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных препаратов для медицинского применения (ICH). Предпочтительным является уровень ДНК-примеси ниже уровня, вызывающего любые неблагоприятные эффекты у пациентов.
В настоящем описании и формуле изобретения глагол "содержать" и его спряжения используется в его неограничивающем смысле, что означает, что предметы, следующие за этим словом, включены, но элементы, не указанные конкретно, не исключаются. Кроме того, упоминание элемента в единственном числе не исключает возможности наличия более одного элемента, если только контекст явно не требует наличия одного и только одного из элементов. Таким образом, упоминание элемента в единственном числе, как правило, означает "по меньшей мере, один".
Все патентные и литературные ссылки, приведенные в настоящем описании, включены в него полностью путем ссылки.
Следующие примеры предлагаются только для иллюстративных целей и никак не предназначены для ограничения объема настоящего
изобретения. Ссылки
1. Fujita, R., Matsuyama, Т., Yamagishi, J., Sahara, K.,
Asano, S., and Bando, H. (2006) Expression of Autographa
californica multiple nucleopolyhedrovirus genes in mammalian
cells and upregulation of the host beta-actin gene, J. Virol.
80, 2390-2395.
2. Liu, C. Y., Wang, С. H., Wang, J. C, and Chao, Y. C.
(2007) Stimulation of baculovirus transcriptome expression in
mammalian cells by baculoviral transcriptional activators, J. Gen. Virol. 88, 2176-2184.
3. Laakkonen, J. P., Kaikkonen, M. U., Ronkainen, P. H., Ihalainen, T. 0., Niskanen, E. A., Hakkinen, M., Salminen, M., Kulomaa, M. S., Yla-Herttuala, S., Airenne, K. J., and Vihinen-Ranta, M. (2008) Baculovirus-mediated immediate-early gene expression and nuclear reorganization in human cells, Cell Microbiol. 10, 667-681.
4. Blouin, V., Brument, N., Toublanc, E., Raimbaud, I., Moullier, P., and Salvetti, A. (2004) Improving rAAV production and purification: towards the definition of a scaleable process, J. Gene Med. 6 Suppl 1, S223-S228
5. Nony, P., Chadeuf, G., Tessier, J., Moullier, P., and Salvetti, A. (2003) Evidence for packaging of rep-cap sequences into adeno-associated virus (AAV) type 2 capsids in the absence of inverted terminal repeats: a model for generation of rep-positive AAV particles, J. Virol. 77, 776-781.
6. Chadeuf, G., Ciron, C, Moullier, P., and Salvetti, A. (2005) Evidence for encapsidation of prokaryotic sequences during recombinant adeno-associated virus production and their in vivo persistence after vector delivery, Mol. Ther. 12, 744753 .
7. Wright, J. F. (2008) Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies, Gene Ther. 15, 840-848.
8. Arsalan Haseeb Zaidi, Patrick J. Bakkes, Jacek Lubelski, Herfita Agustiandari, Oscar P. Kuipers, and Arnold J. M.
3.
Driessen (2008) The ABC-Type Multidrug Resistance Transporter LmrCD Is Responsible for an Extrusion-Based Mechanism of Bile Acid Resistance in Lactococcus lactis Journal of Bacteriology, 7357-7366
9. Jean - Marie Rouillard, Michael Zuker and Erdogan Gulari (2003) OligoArray 2.0: Design of oligonucleotide probes for DNA microarrays using a thermodynamic approach, Nucleic Acids Research, Vol. 31, No. 12 3057-3062
10. Van Hijum SA. , de la Nava GJ, Trelles О., Kok J., Kuipers OP., (2003) MicroPreP: a cDNA microarray data preprocessing framework. Appl Bioinformatics, 2(4):241-4
11. P. Baldi and A.D. Long, (2001) A Bayesian Framework for the Analysis of Microarray Expression Data: Regularized t-Test and Statistical Inferences of Gene Changes, Bioinformatics, 17, 6, 509-519.
12. Krappa, R., Roncarati, R., Knebel-Morsdorf, D., (1995) Expression of PE38 and IE2, Viral members of the C3HC4 finger family, during baculovirus infection: PE38 and IE2 localize to distint nuclear regions, J Virol, 5287-5293.
13. Gerhard Schwarz, Stefan BaEumler, Annette Block, Friedrich G. Felsenstein and Gerhard Wenzel (2004) Determination of detection and quantification limits for SNP allele frequency estimation in DNA pools using real time PCR Nucleic Acids Research, Vol. 32, No. 3 e24
14. Yaffe David, Saxel Ora, (1977) Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle, Nature 270, 725-727
15. Manno, CS, Pierce, GF, Arruda, VR, Glader, B, Ragni, M, Rasko, J et al. (2006).
Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-factor IX and limitations
imposed by the host immune response. Nat Med 12: 342-347.
16. Mingozzi, F, Maus, MV, Hui, DJ, Sabatino, DE, Murphy, SL, Rasko, JE et al. (2007).
CD8+ T-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat Med 13:
419-422.
17. Christine L. Halbert*, Michael J. Metzger*, Siu-Ling Lam, and A. Dusty Miller (2011) Capsid-expressing DNA in AAV vectors and its elimination by use of an oversize capsid gene for vector production. Gene Ther. 18(4): 411-417
18. Bernd Hauck, Samuel L Murphy, Peter H Smith, Guang Qu, Xingge Liu, Olga Zelenaia, Federico Mingozzi, Jtirg M Sommer, Katherine A High and J Fraser Wright (2009) Undetectable Transcription of cap in a Clinical AAV Vector: Implications for Preformed Capsid in Immune Responses. Mol Ther. 17(1) 144-152
Описание чертежей
Фигура 1. Устойчивость AABl-трансгена (верхние изображения) и бакуловирусной ДНК (средние и нижние изображения) к действию ДНКазы I. Количество ДНК определяли при помощи количественной ПЦР с использованием трех различных наборов праймеров, с обработкой ДНКазой или без нее. Для каждого набора прймеров проверяли две партии. А) и В) набор праймеров 59/60, С) и D) набор прймеров 180/181, Е) и F) набор прймеров 340/341.
Фигура 2. Карта последовательности бакуловирусной плазмиды Bac.VD. Показаны используемые наборы праймеров и ITRs.
Фигура 3. Относительное количество копий генома, обнаруженное различными наборами праймеров. На оси указывается местоположение ампликонов. Ампликон 5214-5284 представляет собой CMV-промотор ААВ-трансгенной кассеты. Ампликон 73555-73604 получен с набором праймеров 340/341 и расположен дальше всего от ААВ-трансгенной кассеты. Каждая точка представляет собой одно измерение.
Фигура 4. рААВ, содержащий трансген, анализировали путем глубокого секвенирования. Полученные прочтения выравнивали с трансгеном (А), кассетой cap (В) или кассетой rep (С).
Фигура 5_;_ рААВ анализировали путем глубокого
секвенирования. Полученные прочтения выравнивали с
бакуловирусным геномом. Показано распределение прочтений на нуклеотид бакуловирусной основы. Нуклеотид 1 представляет собой правый ITR, как показано на Фигуре 2.
Фигура 6. Пять различных партий векторов рААВ были
протестированы на ДНК-примеси с использованием количественной ПЦР или глубокого секвенирования при помощи технологии Illumina или Roche 4 54. Примеры
Пример 1: ДНК-примеси при получении векторов рААВ 1.1 Материалы и методы
Чтобы исследовать, была ли остаточная ДНК упакована в частицы ААВ1, проверяли, является ли остаточная ДНК устойчивой к действию ДНКазы. Образцы обрабатывали бензоназой (9Ед/мл) и количество ДНК анализировали при помощи количественной ПЦР.
ДНК выделяли из образцов с последующим проведением
количественной ПЦР, используя три разных набора праймеров
(59/60, 180/181, 340/341). Чтобы исследовать устойчивость
бакуловирусной ДНК к ДНКазе, для некоторых образцов этап
обработки ДНКазой был пропущен (обозначено как без ДНКазы).
Данные анализировали методом близкого лигирования, и для каждого
образца определяли соотношения количества ДНК,
амплифицированного различными наборами праймеров.
Количество ДНК AAV1 определяли при помощи количественной ПЦР с набором праймеров 59/90, специфичным по отношению к промотору CMV вектора AABl-трансген. Количественное определение остаточной бакуловирусной ДНК проводили при помощи количественной ПЦР с бакуловирус-специфичными праймерами. Эксперименты проводились с использованием двух разных наборов праймеров; набор праймеров 180/181, специфичный по отношению к ОРС 162 9 ДНК бакуловируса, рядом с ААВ-трансгенной кассетой, и набор праймеров 34 0/341, специфичный по отношению к последовательности hr3 бакуловируса, обнаруживая бакуловирусную ДНК, расположенную удаленно от ААВ-трансгенной кассетой. Для этих экспериментов были включены два стандарта: стандартная линия плазмиды (pVD) и очищенная бакуловирусная ДНК клона VD.
Для определения количества бакуловирусной ДНК с использованием набора праймеров 180/181 в качестве стандарта использовали pVD с набором праймеров 180/181. Концентрацию pVD определяли с помощью измерений ОП. Для определения количества бакуловирусной ДНК с использованием наборов праймеров 340/341 в
качестве стандарта использовали BacVD с набором праймеров 340/341. Количество BacVD для стандартной линии определяли при помощи количественной ПЦР с использованием набора праймеров 180/181 с pVD в качестве стандарта.
Количество ДНК (гк/мл) рассчитывали по формуле:
[ДНК] =S-D-C
где:
3=Среднее измеренное количество (геномные копии, гк) 0=Коэффициент разбавления вирусной ДНК (или в 500 раз или в 1000 раз)
С=Поправочный коэффициент для расчета от 10 мкл образца к 1 мл образца (100)
Для вычисления количества ДНК в мкг/мл, формула была расширена до:
где:
Х=Коэффициент пересчета для г в мкг (106) А=Число Авогадро (6, 022 х 1023)
]У^=Молекулярная масса ДНК. Бакуловирусный геном состоит из 135 т.п.н. двухцепочечной ДНК. Средняя молекулярная масса на п.н. составляет 64 9 Да. В качестве Mw для бакуловирусной ДНК (после определения с использованием наборов праймеров 180/181 или 340/341), использовали Mw 135000-649=8,76х107 Да.
Геном ААВ1 состоит из одноцепочечной ДНК длиной 3 63 0 п.н. Чтобы вычислить количество ДНК ААВ1, Mw 3630 п.н. • 340 Да=1,23х106 Да.
1.2 Результаты
Количество бакуловирусной ДНК определяли при помощи
количественной ПЦР с использованием двух разных наборов
праймеров. Набор праймеров 180/181 обнаруживает
последовательность в ОРС 1629, расположенную рядом с ААВ-трансгенной кассетой, в то время как последовательность для набора праймеров 340/341 расположена удаленно от кассеты. Результаты, приведенные в Таблице 1, показывают, что два набора
праймеров дают очень разные значения для количества гк/мл бакуловирусной ДНК (набор праймеров 180/181 дает в среднем в 2 0 раз более высокое значение, чем значение, полученное с помощью набора праймеров 340/341) .
Концентрация стандарта BacVD была скорректирована при помощи количественной ПЦР, поэтому можно исключить, что эта разница связана со стандартом. Таким образом, эти данные показывают, что бакуловирусная ДНК, близкая к ITR (обнаруженная при помощи набора праймеров 180/181), присутствует в гораздо большем количестве, чем ДНК, удаленная от ITR (обнаруженная при помощи набора праймеров 34 0/341).
Пример 2. Определение примеси нуклеиновой кислоты с использованием количественной ПЦР
2.1 Материалы и методы
Чтобы дополнительно исследовать, какие части
бакуловирусного генома присутствуют в образцах, и возможные различия в количестве различных последовательностей, провдили количественную ПЦР с различными наборами праймеров (см. Фигуру 2). Для каждого набора праймеров в эксперимент была включена стандартная линия. Количество копий трансгена определяли с использованием набора праймеров 59/60. Впоследствии было определено относительное количество копий генома по сравнению с копиями трансгена. Поскольку известно, что частица ААВ может включать в себя более длинные последовательности ДНК, чем длина собственного генома (Grieger et al., 2005, Allocca et al., 2 008), праймеры были выбраны в начале и конце ОРС, фланкирующих трансгенную кассету и на 10 т.п.н. перед и после ITR.
2.2 Результаты
Количество бакуловирусной ДНК определяли с использованием
набора праймеров 340/341, амплифицирующего ампликон 73555-73604,
который расположен рядом с последовательностью пгЗ бакуловируса.
Предполагалось, что количество копий генома, определенных этими
праймерами, является репрезентативным для всего бакуловирусного
генома. Однако аналогичные эксперименты с использованием разных
наборов праймеров, специфичных по отношению к
последовательностям, близким к ААВ-трансгенным кассетам,
показали, что большее количество копий генома было обнаружено,
когда ампликон находился ближе к ААВ-трансгенной кассете,
содержащей ITRs (Фигура 3) . Так как известно, что ААВ может
упаковывать большие последовательности ДНК (до 8,9 т.п.н.,
возможно даже больше (Allocca et al., 2008)), ожидалось, что эти
последовательности будут упакованы внутри частицы. Это
предполагает, что существуют два типа остаточных
последовательностей бакуловирусной ДНК; 1) случайные последовательности, определяемые с набором праймеров 340/341, которые находятся только в 0,1% от количества геномных копий трансгена и 2) бакуловирусные последовательности, расположенные
в пределах 10 т.п.н. от трансгенной кассеты (в диапазоне предела упаковки ААВ), которые составляют от 1 до 2,5% количества копий трансгенного генома. Обе последовательности, по-видимому, упакованы внутри частицы ААВ1 или связаны с капсидом.
Пример 3: Определение примесей нуклеиновой кислоты с использованием секвенирования следующего поколения
3.1 Материал и методы
Чтобы исследовать степень и происхождение примесей ДНК в полученных векторах рААВ, четыре различные партии векторов рААВ анализировали путем глубокого секвенирования. ДНК из этих векторов рААВ выделяли с использованием набора Nucleospin extract II (Macherey Nagel, Dtiren, Germany) .
Эту ДНК использовали для получения библиотек для глубокого секвенирования.
Для создания отдельных функций секвенирования проводили гибридизацию in situ. Кластеры выполняли путем ограничения разведений исходного материала. Фрагменты ДНК расплавляли, и одиночные цепи задерживали внутри проточной ячейки, которая покрыта плотным слоем праймеров. Последующая локальная амплификация (мост-ПЦР) приводит к образованию кластера примерно 1000 идентичных молекул на квадратный микрометр. Встраивание оснований начинается с добавления праймеров, полимеразы и четырех меченых флуофором дезоксинуклодитрифосфатов. dNTP действуют как обратимые терминаторы, т.е. только одно основание добавляется на молекулу в каждом цикле. Флуоресценцию кластера измеряели для определения того, какое основание было встроено. Зеленый лазер идентифицирует включение оснований G и Т, а красный лазер идентифицирует основания А и С. Для различения G/T и А/С используются два разных фильтра. После обнаружения сигнала удаляются флуорофор и конечная модификация нуклеотида (Dohm, JC, Lottaz, С, Borodina, Т., and Himmelbauer, Н. (2008), Nucleic Acids Res. 36, el05; Shendure, J and Ji, H. (2008), Nat. Biotechnol, 26, 1135-1145, Rothberg, JM and Leamon, JH (2008), Nat. Biotechnol., 26, 1117-1124, Kahvejian, A., Quackenbush, J., and Thompson, JF (2008), Nat. Biotechnol., 26, 1125-1133). Этот метод может быть особенно пригоден для определения того, какой
тип последовательности присутствует в качестве примеси, и каковы отношения между популяциями конкретной последовательности. Анализ проводился ServiceXS (Leiden).
Стандартный эксперимент секвенирования следующего поколения
приводит к образованию > 2 0 миллионов коротких прочтений,
которые должны быть выровнены с рефернсной последовательностью
или собраны de novo для создания контригов. Здесь, после
секвенирования всего содержимого, прочтения выравнивали с рядом
референсных последовательностей. Эти референсные
последовательности представляют собой молекулы ДНК, о которых известно, что они присутствуют в препаратах вектора рААВ. Это включает в себя предполагаемый геном и образование сопутствующих ДНК-примесей. Выравнивание выполняли при помощи программы CLC_bio aligner. Частота считывания каждого основания в эксперименте дает информацию об его относительном появлении по сравнению с другими измеренными последовательностями. Количество прочтений на нуклеотид были получены для каждой референсной последовательности (Фигура 4). Общепризнано, что когда нуклеотиды референсной последовательности считываются более 8-12 раз, информация о последовательности имеет высокий уровень достоверности (Schuster, S. С. (2008), Nat. Methods 5, 16-18).
3.2 Результаты
Для анализа состава ДНК различных партий ААВ использовали
полное секвенирование ДНК. Анализ проводился Baseclear (Leiden,
The Netherlands) на основе процедуры секвенирования одного
прочтения Ilumina GAI-II. Полученные качественные необработанные
отдельные данные были проанализированы с помощью пакета
биоинформтических программ CLI_bio. Прочтения представляй собой
справочную информацию, собранную на референсных
последовательностях, представляющих потенциально представленные молекулы ДНК в векторных препаратах рААВ, то есть бакуловирусную основу, сар-специфичные, rep-специфичные и трансген-специфичные ДНК. Как и ожидалось, большая часть> 99,7% из генерируемых ~ 20 млн. прочтений были собраны в целевую ДНК трансгенной кассеты и известные связанные с получением ДНК-примеси. Все остальные последовательности (менее 0,3%), которые не были собраны ни в
одну из упомянутых референсных последовательностей, могут представлять собой ошибки секвенирования, мультимеризацию линкера, низкое качество прочтений и другие последовательности ДНК.
Число прочтений на нуклеотид получали для трансгенной кассеты, cap кассеты, rep кассеты и бакуловирусного генома и наносили на график против числа нуклеотидов (см. Фигуры 4 и 5) . Распределение частот прочтений на нуклеотид в высокой степени совпадало у препаратов из различных партий. Кроме того, стало очевидно, что распределение бакуловирусного генома не является случайным. Сегменты генома, фланкирующие ITR.s были явно представлены в избыточном количестве (Фигура 5).
Авторы настоящего изобретения использовали среднее распределение прочтений, полученных из экспериментов по секвенированию, в качестве входных данных для расчета относительного появления различных последовательностей ДНК, обнаруженных в препаратах рААВ (Таблица 2).
В Таблице 2 приведены средние частоты (S), полученные в каждой последовательности. Эти частоты представлены по отношению к основной ДНК в образце, то есть к трансгенной кассете в Таблице 3. Процент данной примеси рассчитывается по отношению к трансгенной кассете в соответствии с приведенной ниже формулой и учитывает коэффициент поправки на размер.
у =с /с * р * 1 П П 9-
/Y6aK ибак' итрансген ^бак _l w w о
Где:
Хбак ~ процент ДНК-примесей бакуловируса по отношению к трансгенной кассете
Ббак ~ среднее количество прочтений, полученных для бакуловирусной основы
Этрансген ~ среднее количество прочтений, полученных для трансгенной кассеты
Сбак - Коэффициент поправки на длину молекулы, где С6ак=длина основной цепи бакуловируса (нд)/длина трансгенной кассеты (нт)
4.1 Материалы и методы
Следующим этапом было определение точное происхождение ДНК-примесей, полученных из бакуловируса. С этой целью различные партии векторов рААВ подвергали глубокому секвенированию на платформе Illumina, как описано выше. Выравнивание считываний в бакуловирусном геноме дало возможность изучить частоту каждого из нуклеотидов, полученных из бакуловируса, в библиотеке глубокого секвенирования. Кроме того, среднюю частоту рассчитывали путем деления общего числа считываний, принадлежащих бакуловирусному геному, на количество нуклеотидов.
4.2 Результаты
4.2
На Фигуре 5 показано выравнивание прочтений с бакуловирусным геномом после глубокого секвенирования. Если бы ДНК-примеси были бы случайным образом получены из генома бакуловируса, то должно было наблюдаться относительно равномерное распределение с примерно 1200 прочтениями на нуклеотид. Равномерное распределение действительно наблюдается в середине бакуловирусного генома. Однако в начале и в конце бакуловирусного генома наблюдается сильное увеличение числа прочтений. Это указывает на то, что эти области являются избыточными как ДНК-примеси в рААВ.
Пример 5: Оценка контроля качества с использованием количественной ПЦР или глубокого секвенирования
5.1 Материалы и методы
Чтобы исследовать количественные возможности различных методологий секвенирования следующего поколения, а именно Solexa и 454 Roche, полученное распределение прочтения секвенирования следующего поколения сравнивали с измерениями различных мишеней, расположенных в бакуловирусном гене при помощи количественной ПЦР (Фигура б). Мишени для количественной ПЦР представляли собой следующие области: представленные в сильно увеличенном количестве (180/181), соответствующие среднему распределению (426/427, 428/429; 1018/1019; 1020/1021; 1024/1025) и недопредставленные (340/341). Последнюю область использовали в качестве калибратора для всех других измерений.
5.2 Результаты
Были исследованы три разных метода для проверки уровня ДНК-примеси в векторах рААВ. Как показано на Фигуре б, эти три метода хорошо коррелируют друг с другом и поэтому могут использоваться параллельно для обнаружения ДНК-примесей в векторах рААВ.
Как показано на Фигуре б, анализ при помощи секвенирования следующего поколения наглядно демонстрирует, что случайный выбор ДНК-ампликона для количественной ПЦР может приводить к неточному измерению конкретной ДНК-примеси в препарате вектора. Присутствие данной ДНК-примеси рассчитывали на основе измерения ампликона, предполагая, что все части исследуемой молекулы ДНК
(которые иногда составляют 136000 п.н. в длину, например бакуловирусная основа) распределены с одинаковой частотой. Приведенный анализ ясно показывает, что различные сегменты длинных молекул ДНК, например, бакуловирусного генома, могут контаминировать препарат вектора с различными частотами из-за неравномерной упаковки различных последовательностей ДНК.
тпн слева
135403
pr404
CAAACGTGGTTTC GTGTGCCAA
Бакуловирусн ая ДНК слева ОРС603
смысловой
35013603
pr405
GATGCATGACTTC АСССАСАСАСТТ
Бакуловирусн ая ДНК слева ОРС603
антисмысл овой
35013603
рг406
ACAGCCATTGTAA TGAGACGCACAA
Бакуловирусн ая ДНК справа ОРС603
смысловой
43574438
рг407
CCTAGCGCCCGAT CAGCAACTATAT
Бакуловирусн ая ДНК справа ОРС603
антисмысл овой
43574438
рг408
TACCGACTCTGCT GAAGAGGAGGAA
Бакуловирусн ая ДНК слева ОРС1629
смысловой
84218499
рг409
TGCGTCTGGTGCA ААСТССТТТА
Бакуловирусн ая ДНК слева ОРС1629
антисмысл овой
84218499
рг410
GATTCGTCATGGC САССACAAA
Бакуловирусн ая ДНК справа ОРС 1629
смысловой
1017810261
рг411
CCAAAGCGCCCGT TGATTATTTT
Бакуловирусн ая ДНК справа ОРС 1629
антисмысл овой
1017810261
рг412
GCGTACTTGCGGC TGTCGTTGTA
Бакуловирусн ая ДНК 10 тпн справа
смысловой
1450314605
рг413
CGAGGTCAAGTTC AAAGGGCAACAT
Бакуловирусн ая ДНК 10
антисмысл овой
1450314605
тпн справа
Pr426
GCATTTCGCAGCT CTCCTTCAATT
Вас геном
смысловой
3283732935
Pr427
CTTCAAGCGAGAA CGCAGCAATT
Вас геном
антисмысл овой
3283732935
Рг428
GTGGCGTTTGCCG TGGAAAA
Вас геном
смысловой
116615 116699
Рг429
TGCAGCTGTGCGT TTTGAATGAA
Вас геном
антисмысл овой
116615 116699
PrlOl 8
TTGTTATGTCAAT TTGTAGCGC
Вас геном
смысловой
1823018296
PrlOl 9
T G С AT AAAGAC AC AGTACAACG
Вас геном
антисмысл овой
1823018296
Prl02 0
GACATAGTTCGTT TGAAAATTATCCC
Вас геном
смысловой
2596326024
Prl02 1
AACGATCAAGCTG TTAATAAACG
Вас геном
антисмысл овой
2596326024
Prl02 4
CGCTTCGGCGTAG TTTACC
Вас геном
смысловой
109100 109151
Prl02 5
CGCTATAAGCGCG GGTTAC
Вас геном
антисмысл овой
109100 109151
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> uniQure IP B.V.
<120> ДНК-примеси в композиции, содержащей парвовирусный вирион
<130> p6042305pct
<160> 34
<170> Патентная версия 3.3
<210> 1
<211> 145
<212> ДНК
<213> аденоассоциированный вирус 2
<220>
<221> Прочий признак <223> левый ITR
<400> 1
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 2
<211> 183
<212> ДНК
<213> аденоассоциированный вирус 2
<220>
<221> Прочий признак <223> правый ITR
<400> 2
gcgcggtacc ccatggagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct 60
cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg 120
gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca agatatccca tggggtaccg 180
cgc 183
<210> 3
<211> 2203
<212> ДНК
<213> аденоассоциированный вирус 5
<220>
<221> Прочий признак
<223> pDP5 <400> 3
atgtcttttg ttgatcaccc tccagattgg ttggaagaag ttggtgaagg tcttcgcgag 60 tttttgggcc ttgaagcggg cccaccgaaa ccaaaaccca atcagcagca tcaagatcaa 120
gcccgtggtc ttgtgctgcc tggttataac tatctcggac ccggaaacgg tctcgatcga 180
ggagagcctg tcaacagggc agacgaggtc gcgcgagagc acgacatctc gtacaacgag 240
cagcttgagg cgggagacaa cccctacctc aagtacaacc acgcggacgc cgagtttcag 300
gagaagctcg ccgacgacac atccttcggg ggaaacctcg gaaaggcagt ctttcaggcc 360
aagaaaaggg ttctcgaacc ttttggcctg gttgaagagg gtgctaagac ggcccctacc 420
ggaaagcgga tagacgacca ctttccaaaa agaaagaagg ctcggaccga agaggactcc 480
aagccttcca cctcgtcaga cgccgaagct ggacccagcg gatcccagca gctgcaaatc 540
ccagcccaac cagcctcaag tttgggagct gatacaatgt ctgcgggagg tggcggccca 600
ttgggcgaca ataaccaagg tgccgatgga gtgggcaatg cctcgggaga ttggcattgc 660
gattccacgt ggatggggga cagagtcgtc accaagtcca cccgaacctg ggtgctgccc 720
agctacaaca accaccagta ccgagagatc aaaagcggct ccgtcgacgg aagcaacgcc 780
aacgcctact ttggatacag caccccctgg gggtactttg actttaaccg cttccacagc 840
cactggagcc cccgagactg gcaaagactc atcaacaact actggggctt cagaccccgg 900
tccctcagag tcaaaatctt caacattcaa gtcaaagagg tcacggtgca ggactccacc 9 60
accaccatcg ccaacaacct cacctccacc gtccaagtgt ttacggacga cgactaccag 1020
ctgccctacg tcgtcggcaa cgggaccgag ggatgcctgc cggccttccc tccgcaggtc 1080
tttacgctgc cgcagtacgg ttacgcgacg ctgaaccgcg acaacacaga aaatcccacc 1140
gagaggagca gcttcttctg cctagagtac tttcccagca agatgctgag aacgggcaac 1200
aactttgagt ttacctacaa ctttgaggag gtgcccttcc actccagctt cgctcccagt 1260
cagaacctgt tcaagctggc caacccgctg gtggaccagt acttgtaccg cttcgtgagc 1320
acaaataaca ctggcggagt ccagttcaac aagaacctgg ccgggagata cgccaacacc 1380
tacaaaaact ggttcccggg gcccatgggc cgaacccagg gctggaacct gggctccggg 1440
gtcaaccgcg ccagtgtcag cgccttcgcc acgaccaata ggatggagct cgagggcgcg 1500
agttaccagg tgcccccgca gccgaacggc atgaccaaca acctccaggg cagcaacacc 1560
tatgccctgg agaacactat gatcttcaac agccagccgg cgaacccggg caccaccgcc 1620
acgtacctcg agggcaacat gctcatcacc agcgagagcg agacgcagcc ggtgaaccgc 1680
gtggcgtaca acgtcggcgg gcagatggcc accaacaacc agagctccac cactgccccc 1740
gcgaccggca cgtacaacct ccaggaaatc gtgcccggca gcgtgtggat ggagagggac 1800
gtgtacctcc aaggacccat ctgggccaag atcccagaga cgggggcgca ctttcacccc 1860
tctccggcca tgggcggatt cggactcaaa cacccaccgc ccatgatgct catcaagaac 1920
acgcctgtgc ccggaaatat caccagcttc tcggacgtgc ccgtcagcag cttcatcacc 1980
cagtacagca ccgggcaggt caccgtggag atggagtggg agctcaagaa ggaaaactcc 2040
aagaggtgga acccagagat ccagtacaca aacaactaca acgaccccca gtttgtggac 2100 tttgccccgg acagcaccgg ggaatacaga accaccagac ctatcggaac ccgatacctt 2160 acccgacccc tttaacccat tcatgtcgca taccctcaat aaa 2203
<210> 4
<211> 1876
<212> ДНК
<213> аденоассоциированный вирус 2
<220>
<221> Кодирующая последовательность <222> (11)..(1876)
<400> 4
cgcagccgcc atg ccg ggg ttt tac gag att gtg att aag gtc ccc agc Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser
1 5 10
gac ctt gac gag cat ctg ccc ggc att tct gac agc ttt gtg aac tgg
Asp Leu Asp Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp
15 20 25
gtg gcc gag aag gaa tgg gag ttg ccg cca gat tct gac atg gat ctg
Val Ala Glu Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu
30 35 40 45
145
aat ctg att gag cag gca ccc ctg acc gtg gcc gag aag ctg cag cgc
Asn Leu Ile Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg
50 55 60
193
gac ttt ctg acg gaa tgg cgc cgt gtg agt aag gcc ccg gag gcc ctt
Asp Phe Leu Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu
65 70 75
241
ttc ttt gtg caa ttt gag aag gga gag agc tac ttc cac atg cac gtg
Phe Phe Val Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val
80 85 90
289
ctc gtg gaa acc acc ggg gtg aaa tcc atg gtt ttg gga cgt ttc ctg
Leu Val Glu Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu
95 100 105
337
agt cag att cgc gaa aaa ctg att cag aga att tac cgc ggg atc gag
Ser Gln Ile Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu
110 115 120 125
385
ccg act ttg cca aac tgg ttc gcg gtc aca aag acc aga aat ggc gcc
Pro Thr Leu Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala
130 135 140
433
gga ggc ggg aac aag gtg gtg gat gag tgc tac atc ccc aat tac ttg
Gly Gly Gly Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu
145 150 155
481
ctc ccc aaa acc cag cct gag ctc cag tgg gcg tgg act aat atg gaa
Leu Pro Lys Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu
160 165 170
529
cag tat tta agc gcc tgt ttg aat ctc acg gag cgt aaa cgg ttg gtg
577
Gln Tyr Leu Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val
175 180 185
gcg cag cat ctg acg cac gtg tcg cag acg cag gag cag aac aaa gag 625
Ala Gln His Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu
190 195 200 205
aat cag aat ccc aat tct gat gcg ccg gtg atc aga tca aaa act tca 673
Asn Gln Asn Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser
210 215 220
gcc agg tac atg gag ctg gtc ggg tgg ctc gtg gac aag ggg att acc 721
Ala Arg Tyr Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr
225 230 235
tcg gag aag cag tgg atc cag gag gac cag gcc tca tac atc tcc ttc 769
Ser Glu Lys Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe
240 245 250
aat gcg gcc tcc aac tcg cgg tcc caa atc aag gct gcc ttg gac aat 817
Asn Ala Ala Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn
255 260 265
gcg gga aag att atg agc ctg act aaa acc gcc ccc gac tac ctg gtg 865
Ala Gly Lys Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val
270 275 280 285
ggc cag cag ccc gtg gag gac att tcc agc aat cgg att tat aaa att 913
Gly Gln Gln Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile
290 295 300
ttg gaa cta aac ggg tac gat ccc caa tat gcg gct tcc gtc ttt ctg 961
Leu Glu Leu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu
305 310 315
gga tgg gcc acg aaa aag ttc ggc aag agg aac acc atc tgg ctg ttt 1009
Gly Trp Ala Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe
320 325 330
ggg cct gca act acc ggg aag acc aac atc gcg gag gcc ata gcc cac 1057
Gly Pro Ala Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His
335 340 345
act gtg ccc ttc tac ggg tgc gta aac tgg acc aat gag aac ttt ccc 1105
Thr Val Pro Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro
350 355 360 365
ttc aac gac tgt gtc gac aag atg gtg atc tgg tgg gag gag ggg aag 1153
Phe Asn Asp Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys
370 375 380
atg acc gcc aag gtc gtg gag tcg gcc aaa gcc att ctc gga gga agc 1201
Met Thr Ala Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser
385 390 395
aag gtg cgc gtg gac cag aaa tgc aag tcc tcg gcc cag ata gac ccg 1249 Lys Val Arg Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro
400 405 410
act ccc gtg atc gtc acc tcc aac acc aac atg tgc gcc gtg att gac 1297
Thr Pro Val Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp
415 420 425
ggg aac tca acg acc ttc gaa cac cag cag ccg ttg caa gac cgg atg
1345
Gly Asn Ser Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met
430 435 440 445
ttc aaa ttt gaa ctc acc cgc cgt ctg gat cat gac ttt ggg aag gtc 1393
Phe Lys Phe Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val
450 455 460
acc aag cag gaa gtc aaa gac ttt ttc cgg tgg gca aag gat cac gtg 1441
Thr Lys Gln Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val
465 470 475
gtt gag gtg gag cat gaa ttc tac gtc aaa aag ggt gga gcc aag aaa 1489
Val Glu Val Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys
480 485 490
aga ccc gcc ccc agt gac gca gat ata agt gag ccc aaa cgg gtg cgc 1537
Arg Pro Ala Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg
495 500 505
gag tca gtt gcg cag cca tcg acg tca gac gcg gaa gct tcg atc aac 1585
Glu Ser Val Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn
510 515 520 525
tac gca gac agg tac caa aac aaa tgt tct cgt cac gtg ggc atg aat 1633
Tyr Ala Asp Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn
530 535 540
ctg atg ctg ttt ccc tgc aga caa tgc gag aga atg aat cag aat tca 1681
Leu Met Leu Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser
545 550 555
aat atc tgc ttc act cac gga cag aaa gac tgt tta gag tgc ttt ccc 1729
Asn Ile Cys Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro
560 565 570
gtg tca gaa tct caa ccc gtt tct gtc gtc aaa aag gcg tat cag aaa 1777
Val Ser Glu Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys
575 580 585
ctg tgc tac att cat cat atc atg gga aag gtg cca gac gct tgc act 1825
Leu Cys Tyr Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr
590 595 600 605
gcc tgc gat ctg gtc aat gtg gat ttg gat gac tgc atc ttt gaa caa 1873 Ala Cys Asp Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln
610 615 620
taa 1876
<210> 5
<211> 621
<212> Белок
<213> аденоассоциированный вирус 2
<400> 5
Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile
35 40 45
Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu
50 55 60
Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu
85 90 95
Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile
100 105 110
Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu
115 120 125
Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly
130 135 140
Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys
145 150 155 160
Thr Gln Pro Glu Leu Gln Trp Ala Trp Thr Asn Met Glu Gln Tyr Leu
165 170 175
Ser Ala Cys Leu Asn Leu Thr Glu Arg Lys Arg Leu Val Ala Gln His
180 185 190
Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn
195 200 205
Pro Asn Ser Asp Ala Pro Val Ile Arg Ser Lys Thr Ser Ala Arg Tyr
210 215 220
Met Glu Leu Val Gly Trp Leu Val Asp Lys Gly Ile Thr Ser Glu Lys
225 230 235 240
Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala
245 250 255
Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys
260 265 270
Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln
275 280 285
Pro Val Glu Asp Ile Ser Ser Asn Arg Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Leu
290 295 300
Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Tyr Ala Ala Ser Val Phe Leu Gly Trp Ala
305 310 315 320
Thr Lys Lys Phe Gly Lys Arg Asn Thr Ile Trp Leu Phe Gly Pro Ala
325 330 335
Thr Thr Gly Lys Thr Asn Ile Ala Glu Ala Ile Ala His Thr Val Pro
340 345 350
Phe Tyr Gly Cys Val Asn Trp Thr Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp
355 360 365
Cys Val Asp Lys Met Val Ile Trp Trp Glu Glu Gly Lys Met Thr Ala
370 375 380
Lys Val Val Glu Ser Ala Lys Ala Ile Leu Gly Gly Ser Lys Val Arg
385 390 395 400
Val Asp Gln Lys Cys Lys Ser Ser Ala Gln Ile Asp Pro Thr Pro Val
405 410 415
Ile Val Thr Ser Asn Thr Asn Met Cys Ala Val Ile Asp Gly Asn Ser
420 425 430
Thr Thr Phe Glu His Gln Gln Pro Leu Gln Asp Arg Met Phe Lys Phe
435 440 445
Glu Leu Thr Arg Arg Leu Asp His Asp Phe Gly Lys Val Thr Lys Gln
450 455 460
Glu Val Lys Asp Phe Phe Arg Trp Ala Lys Asp His Val Val Glu Val
465 470 475 480
Glu His Glu Phe Tyr Val Lys Lys Gly Gly Ala Lys Lys Arg Pro Ala
485 490 495
Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val
500 505 510
Ala Gln Pro Ser Thr Ser Asp Ala Glu Ala Ser Ile Asn Tyr Ala Asp
515 520 525
Arg Tyr Gln Asn Lys Cys Ser Arg His Val Gly Met Asn Leu Met Leu
530 535 540
Phe Pro Cys Arg Gln Cys Glu Arg Met Asn Gln Asn Ser Asn Ile Cys
545 550 555 560
Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu
565 570 575
Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Cys Tyr
580 585 590
Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala Cys Asp
595 600 605
Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln
610 615 620
<210> 6 <211> 1194
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ААВ2 Rep52 AcMNPV оптимизированный
<220>
<221> Прочий признак
<223> AcMNPV оптимизированная Rep52 кодирующая последовательность
<400> 6
atggaattgg tcggttggtt ggtggacaag ggtattacct cggagaagca atggatacaa 60
gaagatcaag cctcatacat ctcgtttaat gcggcatcca actcgcgtag ccaaatcaaa 120
gctgccttgg acaatgcggg caagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180
gtgggccagc aacccgtgga agacatttcc agcaatcgca tctataagat tttggagtta 240
aacggctacg atcctcaata tgcggcttcc gtatttttgg gctgggcgac gaaaaagttt 300
ggcaaaagaa acaccatttg gttgtttgga cctgcaacta cgggaaaaac aaacatagcg 360
gaggccatag cccacactgt acctttttat ggctgcgtta actggaccaa tgagaacttt 420
ccattcaacg actgtgtcga caagatggtt atttggtggg aggaaggcaa aatgaccgct 480
aaagtcgtgg agtcggccaa agcaatttta ggaggcagca aagtgcgcgt agaccagaaa 540
tgcaaaagct ctgcgcagat agacccgaca ccggtgatcg ttacaagcaa cacgaacatg 600
tgcgccgtga ttgacggtaa cagtacgaca ttcgaacacc aacaaccgtt gcaagaccga 660
atgttcaaat ttgaattgac gcgccgactg gatcatgatt ttggcaaggt aacaaaacaa 720
gaagtcaaag acttctttcg ttgggcaaag gatcacgttg ttgaagtgga acatgaattt 780
tacgtcaaaa aaggtggtgc taagaaaaga cccgccccga gtgatgcaga tataagtgag 840
cccaaacgag tgagagaatc ggttgcgcag ccaagcacgt cagatgcgga agcttcgata 900
aactacgcag accgctacca aaacaaatgt tctcgtcacg taggcatgaa cttaatgttg 960
tttccctgca gacaatgtga gagaatgaat cagaatagta atatctgttt cactcacggc 1020
cagaaagact gtttagaatg ctttccggtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtaaaa 1080
aaggcgtatc aaaaattatg ctatattcat catatcatgg gaaaagtgcc agacgcttgt 1140
actgcctgcg atctggttaa tgtggatttg gatgactgta tctttgaaca ataa 1194
<210> 7
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr59 <400> 7
aatgggcggt aggcgtgta 19
<210> 8
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr60 <400> 8
aggcgatctg acggttcact aa 22
<210> <211> <212> <213>
ДНК
Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr180 <400> 9
cgaaccgatg gctggactat c 21
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr181 <400> 10
tgctgctaca agatttggca agt 23
<210> 11
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr340 <400> 11
atacaaccgt tggttgcacg 20
<210> 12
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr341 <400> 12
cgggacacgc catgtatt 18
<210> 13
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr402
<400> 13
gggagtggcg gcgttgattt
<210> 14
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr403
<400> 14
gcacagttca agcctcacag ccta 24
<210> 15
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr404
<400> 15
caaacgtggt ttcgtgtgcc aa 22
<210> 16
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr405
<400> 16
gatgcatgac ttcacccaca cactt 25
<210> 17
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<221> Прочий признак
<223> pr406
<400> 17
acagccattg taatgagacg cacaa 25
<210> 18
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr407 <400> 18
cctagcgccc gatcagcaac tatat 25
<210> 19
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr408 <400> 19
taccgactct gctgaagagg aggaa 25
<210> <211> <212> <213>
20 23
ДНК
Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr409 <400> 20
tgcgtctggt gcaaactcct tta 23
<210> 21
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr410 <400> 21
gattcgtcat ggccaccaca aa 22
<210> <211> <212> <213>
22 23
ДНК
Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr411 <400> 22
ccaaagcgcc cgttgattat ttt 23
<210> 23
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr412 <400> 23
gcgtacttgc ggctgtcgtt gta 23
<210> <211> <212> <213>
24 25
ДНК
Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr413 <400> 24
cgaggtcaag ttcaaagggc aacat 25
<210> 25 <211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr426 <400> 25
gcatttcgca gctctccttc aatt 24
<210> <211> <212> <213>
26 23
ДНК
Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr427 <400> 26
cttcaagcga gaacgcagca att 23
<210> 27
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr428 <400> 27
gtggcgtttg ccgtggaaaa 20
<210> 28
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr429
<400> 28
tgcagctgtg cgttttgaat gaa
<210> 29
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак <223> pr1018
<400> 29
ttgttatgtc aatttgtagc gc 22
<210> 30
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак <223> pr1019
<400> 30
tgcataaaga cacagtacaa cg 22
<210> <211> <212> <213>
ДНК
Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак <223> pr1020
<400> 31
gacatagttc gtttgaaaat tatccc 26
<210> 32
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220> <221>
Прочий признак
<223> pr1021
<400> 32
aacgatcaag ctgttaataa acg
<210> <211>
33 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr1024
<400> 33
cgcttcggcg tagtttacc 19
<210> 34
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> праймер
<220>
<221> Прочий признак
<223> pr1025
<400> 34
cgctataagc gcgggttac
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ идентификации и количественного определения
избыточной примеси нуклеиновой кислоты в композиции, содержащей
парвовирусный вектор, и где этот способ включает в себя этапы:
a) секвенирование композиции нуклеиновой кислоты для
получения случайных прочтений нуклеотидных последовательностей;
b) сравнение случайных последовательностей из этапа а) с
нуклеотидной последовательностью биологического компонента,
используемого в способе получения композиции, при котором
совпадение между случайным прочтением и нуклеотидной
последовательностью биологического компонента идентифицирует
примесь нуклеиновой кислоты;
c) определение среднего количества прочтений на
парвовирусный вектор; и
d) определение количества прочтений на нуклеотид избыточной
примеси нуклеиновой кислоты, где примесь нуклеиновой кислоты
идентифицируется как избыточная примесь, когда распределение
прочтений не является случайным, и избыточная примесь в 2, 3, 4,
5, б, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 50 раз превышает среднее
количество прочтений биологического компонента, или когда
количество прочтений на нуклеотид примеси нуклеиновой кислоты
составляет, по меньшей мере, 0,001, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4,
0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2,0, 3,0, 5,0, 7,0 или 10% от
среднего количества прочтений на парвовирусный вектор.
2. Способ по п.1, где секвенирование нуклеиновой кислоты на
этапе (а) включает в себя высокопроизводительное секвенирование.
3. Способ по п.1 или п. 2, где парвовирусный вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (рААВ).
4. Способ по любому из п. п. 1-3, где нуклеотидная последовательность биологического компонента выбрана из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей клетки-хозяина, плазмиды, вектора, отличного от рекомбинантного парвовирусного вектора, и хелперного вируса, где предпочтительно вектор представляет собой бакуловирусный вектор.
5. Способ по п.4, где хелперный вирус представляет собой
рекомбинантный аденовирус и/или рекомбинантный вирус простого герпеса.
6. Способ по любому из п. п. 1-5, где нуклеотидная
последовательность биологического компонента содержит
нуклеотидную последовательность, кодирующую Rep, Сар и/или
трансген, где, предпочтительно, биологический компонент содержит
нуклеотидную последовательность, кодирующую трансген, где, более
предпочтительно, биологический компонент содержит нуклеотидную
последовательность, кодирующую трансген, которая фланкирована,
по меньшей мере, одним парвовирусным ITR, и где, наиболее
предпочтительно, биологический компонент содержит нуклеотидную
последовательность, кодирующую трансген, которая фланкирована,
по меньшей мере, одним парвовирусным ITR с каждой стороны.
7. Способ по любому из п. п. 1-6, где избыточную примесь нуклеиновой кислоты количественно определяют во второй или последующей композиции.
8. Способ количественного определения примеси нуклеиновой кислоты в композиции, содержащей парвовирусный вектор, где этот способ включает в себя этап определения относительного содержания примеси нуклеиновой кислоты, где эта примесь нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая расположена между 1 и 8000 п.н., 1 и 5000 п.н., 1 и 3000 п.н., 1 и 1000 п.н., 1 и 500 п.н., 1 и 250 п.н. или 1 и 10 0 п.н., непосредственно примыкающими к последовательности парвовирусного ITR, где последовательность ITR присутствует в биологическом компоненте, используемом в способе получения композиции, и где биологический компонент содержит трансген, фланкированный, по меньшей мере, одной копией последовательности парвовирусного ITR, где предпочтительно биологический компонент выбран из группы, состоящей из клетки-хозяина, плазмиды, вектора, отличного от рекомбинантного парвовирусного вектора, и хелперного вируса, где предпочтительно вектор представляет собой бакуловирусный вектор.
9. Способ по п. 8, где парвовирусный вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (рААВ).
6.
10. Способ по п. 8 или п. 9, где нуклеотидная
последовательность примеси нуклеиновой кислоты непосредственно
примыкает к каждому концу последовательности парвовирусного ITR,
где последовательность ITR присутствует в биологическом
компоненте, используемом в способе получения композиции.
11. Способ по любому из п.п. 8-10, где относительное содержание определяют по сравнению с нуклеотидной последовательностью парвовирусного вектора и/или референсной последовательностью композиции.
12. Способ по п.11, где относительное содержание определяется:
a) средним количеством прочтений на нуклеиновую кислоту
примеси нуклеиновой кислоты, как определено в п.8; и
i) средним количеством прочтений на нуклеиновую кислоту референсной последовательности;
и/или
ii) средним количеством прочтений на парвовирусный вектор в композиции;
где количество прочтений определяется способом по любому из п.п. 1-6; и/или
b) амплификацией примеси нуклеиновой кислоты, как
определено в п.8; и
i) референсной последовательностью; и/или
ii) нуклеотидной последовательностью парвовирусного
вектора.
13. Способ по любому из п.п. 8-12, где относительное содержание определяют при помощи количественной ПЦР и/или при помощи высокопроизводительного секвенирования.
14. Способ по любому из п.п. 8-13, где способ дополнительно включает в себя этап селективной гибридизации олигонуклеотидного праймера с примесью нуклеиновой кислоты, как определено в п.8, или ее комплементом, где предпочтительно этот олигонуклеотидный праймер селективно гибридизуется с примесью нуклеиновой кислоты, содержащей часть бакуловирусной последовательности, или ее комплементом.
15. Способ определения того, может ли композиция,
содержащая парвовирусный вектор, считаться клинически чистой, где этот способ включает в себя этапы:
i) количественного определения примеси нуклеиновой кислоты
в композиции парвовирусного вектора по любому из п.п. 8-14; и
ii) определение того, что композиция является клинически
чистой, если примесь нуклеиновой кислоты, как определено выше,
присутствует, по меньшей мере, в 10, 100, 250, 1000 раз меньшем
количестве, по сравнению с референсной последовательностью и/или
трансгеном, как определено по относительному содержанию примеси
нуклеиновой кислоты.
16. Способ по любому из п. п. 1-15, где композиция,
содержащая парвовирусный вектор, представляет собой
фармацевтическую композицию.
17. Способ по любому из п. п. 1-16, где композиция, содержащая парвовирусный вектор, содержит парвовирусный капсид, в который упакован парвовирусный вектор.
18. Способ по любому из п. п. 1-17, где композиция, содержащая парвовирусный вектор, не содержит образец, полученный или получаемый от млекопитающего, где это млекопитающее предпочтительно является не человекообразным приматом.
По доверенности
ФИГ 1А
4.5*101: 4.0хЮ1? 3.5x10" 3.0*101*
2.5*101:'-
2.0*10--
1.5ХЮ1--1.0x1012-5.0Х1011-
0.0-
ДНКаза
+ ДНКаза
ФИГ. 1В
4.5хЮ12 4.0хЮ12. 3.5x10".
3.0x1012. 2.5 х"! О ^ 1
2.0хЮ12. 1.5х1012' 1.0х1012. 5.0хЮ11-
0.0*
ФИГ. 1С
1.2*101N
1.0Х1011-8.0х1010 < 6.0хЮ1°.
4.0Х1010-
2.0x10".
0,0-
ДНКаза
+ ДНКаза
ФИГ 1D
1.2x10"-
1.0*1011-
8.0хЮ10-б.ОхЮ10-Д.ОхЮ10-2.0хЮ10-0.0-
ФИГ. 1Е
2.0*1010-1.5Х1010-1.0х1010-5.0хЮсэ-
0.0-
ДНКаза
+ ДНКаза
ФИГ 1F
1.5хЮ10
1,0x10",
5.0x10"--0.0-
80000
60000
\ .
см ю
(О о
10000-1 100010010-1 <
0.1
# J> А^ 3% # # <г
ампликон
ФИГ. 4А
10000000
ioooooo -
> ^3
? о
CD D~
100000
10000
1000
100
2500п
ш I-
2000
1500
ё 1000
500
mm mm Количество нуклеотидов
2500i
2000
ш I-
1500
о 10004
500
§00
1000
1500
2000
2500
ФИГ. 5
2500
О ОО
35-
30-
О Q-О VO
а: ю
^ Solexa 454
КОЛ. ПЦР
I^IIMKM
& ^ $ о/ ^ ^
Различные пары праймеров, использованные в исследовании
<210> 10
<210> 10
<210> 10
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
1/10
1/10
- ДНКаза
+ ДНКаза
- ДНКаза
+ ДНКаза
1/10
1/10
- ДНКаза
+ ДНКаза
- ДНКаза
+ ДНКаза
1/10
1/10
- ДНКаза
+ ДНКаза
- ДНКаза
+ ДНКаза
1/10
1/10
- ДНКаза
+ ДНКаза
- ДНКаза
+ ДНКаза
1/10
1/10
- ДНКаза
+ ДНКаза
- ДНКаза
+ ДНКаза
2/10
2/10
ДНКаза
+ ДНКаза
ДНКаза
+ ДНКаза
2/10
2/10
ДНКаза
+ ДНКаза
ДНКаза
+ ДНКаза
2/10
2/10
ДНКаза
+ ДНКаза
ДНКаза
+ ДНКаза
3/10
3/10
ДНКаза
+ ДНКаза
ДНКаза
+ ДНКаза
3/10
3/10
ДНКаза
+ ДНКаза
ДНКаза
+ ДНКаза
3/10
3/10
ДНКаза
+ ДНКаза
ДНКаза
+ ДНКаза
5/10
5/10
5/10
5/10
5/10
5/10
Количество нуклеотидов
Количество нуклеотидов
Количество нуклеотидов
Количество нуклеотидов
ФИГ. 4В
ФИГ. 4В
ФИГ. 4В
ФИГ. 4В
ФИГ. 4В
ФИГ. 4В
ФИГ. 4С
ФИГ. 4С
Количество нуклеотидов
Количество нуклеотидов
ФИГ. 4С
ФИГ. 4С
Количество нуклеотидов
Количество нуклеотидов
Количество нуклеотидов
Количество нуклеотидов
ФИГ. 6
ФИГ. 6
<5?
<5?
ФИГ. 6
ФИГ. 6
<5?
<5?
ФИГ. 6
ФИГ. 6
<5?
<5?
ФИГ. 6
ФИГ. 6
<5?
<5?
ФИГ. 6
ФИГ. 6
<5?
<5?
ФИГ. 6
ФИГ. 6
<5?
<5?