[RU]

Настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или ослабления тяжести глазного заболевания. Способы согласно изобретению включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтической композиции, содержащей ингибитор ангиопоэтина-2 (ang-2), такой как анти-ang-2 антитело, в комбинации с антагонистом васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF) (например, с афлиберцептом).

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или ослабления тяжести глазного заболевания. Способы согласно изобретению включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтической композиции, содержащей ингибитор ангиопоэтина-2 (ang-2), такой как анти-ang-2 антитело, в комбинации с антагонистом васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF) (например, с афлиберцептом).

---

Евразийское (21) 201791168 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.09.29
(22) Дата подачи заявки 2015.11.19
(51) Int. Cl.
C07K16/22 (2006.01) C07K14/47 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01)
(54) СПОСОБЫ И СОСТАВЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЛАЗ
(31) 62/084,003; 62/147,232; 14/943,490
(32) 2014.11.25; 2015.04.14; 2015.11.17
(33) US
(86) PCT/US2015/061543
(87) WO 2016/085750 2016.06.02
(71) Заявитель: РИДЖЕНЕРОН
ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Витти Роберт Л., Эриксон Кристин А., Чу Карен У., Уиганд Стэнли Дж., Цао Цзинтай, Лобов Иван Б., Вадхва Саурабх, Грэхем Кеннет С., Дикс
Дэниел (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или ослабления тяжести глазного заболевания. Способы согласно изобретению включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтической композиции, содержащей ингибитор ангиопоэтина-2 (ang-2), такой как анти-ang-2 антитело, в комбинации с антагонистом васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF) (например, с афлиберцептом).
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-542493ЕА/072 СПОСОБЫ И СОСТАВЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЛАЗ Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам лечения или
ослабления по меньшей мере одного симптома или признака
сосудистого заболевания глаз, где указанные способы включают
введение фармацевтического состава, содержащего ингибитор
ангиопоэтина-2 (Ang-2) и антагониста васкулярного
эндотелиального фактора роста (VEGF), индивидууму, нуждающемуся в этом.
Предшествующий уровень техники
В настоящее время сосудистые заболевания глаз являются главной причиной потери зрения у пожилых людей. Эти заболевания характеризуются аномальным "проникновением" разрастающихся кровеносных сосудов в сетчатку. Двумя главными факторами, вызывающими такие заболевания у пациентов этой группы, являются диабетическая ретинопатия и экссудативная возрастная дегенерация желтого пятна.
В Соединенных Штатах диабетическая ретинопатия (ДР) является главной причиной ухудшения зрения (Klein et al. 1984, Ophthalmology 91:14 64-1474; Moss et al. 1998, Ophthalmology 105:998-1003). Диабетическая ретинопатия возникает в результате микрососудистой декомпенсации, начинающейся с утолщения базальной мембраны (Ruggiero et al. 1997, Diabetes Metab. 23:3042) и, в конечном счете, приводящей к закупорке сосудов и к неоваскуляризации (Porta et al., 2002, Diabetologia, 45:16171634). По оценкам специалистов, приблизительно 28% пациентов в возрасте 40 лет и старше, страдающих диабетом, имеют ДР, а 4,4% имеют ДР, которая может приводить к потере зрения (Zhang et al. 2010, JAMA. 304: 649-656). Диабетический отек желтого пятна (ДОЖП) является симптомом ДР и чаще всего приводит к слепоте у молодых людей и людей среднего возраста (Klein et al. 1984, Ophthalmology 91:14 64-1474; Moss et al. , 1998, Ophthalmology 105:998-1003).
В развитых странах, возрастная дегенерация желтого пятна
(ВДЖП) является главной причиной серьезной потери зрения у людей в возрасте 50 лет или старше. В последние годы наблюдались значительные успехи в лечении ВДЖП благодаря введению антиангиогенных агентов, что дает надежду на возможное восстановление зрения у пациентов с неоваскулярной ВДЖП (Кеапе et al., 2012, Surv. Ophthalmol. 57: 389-414).
Терапия антагонистом васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF) (например, афлиберцептом) представляет собой стандартное лечение неоваскулярной ВДЖП и ДОЖП. Эффективность и безопасность афлиберцепта у пациентов этой группы хорошо охарактеризованы (Dixon et al. , 2009; Expert Opin. Investig. Drugs 18: 1573-80). Хотя при ВДЖП у -95% пациентов зрение сохраняется, однако, только приблизительно у 30% пациентов достигается способность различать на 15 или более букв больше при остроте зрения с наилучшей коррекцией (BCVA) за 1 год. При ДОЖП, также возможно улучшение результатов лечения, как это наблюдается в случае афлиберцепта и ранибизумаба, причем у менее чем 50% пациентов с потерей зрения, вызванной ДОЖП, достигается идентификация 15 или более букв за 1 и 2 года. Кроме того, в испытаниях с применением ранибизумаба клинические признаки пролиферативной ретинопатии развиваются у 7,2% пациентов, которые в течение 3 лет проходили ежемесячное лечение ранибизумабом, причем, 3,2 процентам пациентов потребовалась фотокоагуляция всех отделов сетчатки, которая представляет собой наиболее эффективный метод лечения потери зрения (Brown et al., 2013 Ophthalmology 10: 2013-22) .
Доставка анти-VEGF антител в стекловидное тело (IVT), таких как ранибизумаб и афлиберцепт, продемонстрировала эффективное и безопасное лечение хориоретинальных заболеваний. Однако, существует много дополнительных факторов, которые вызывают сосудистую проницаемость, неоваскуляризацию и другую сосудистую дисфункцию. Одним из наиболее изученных факторов, вызывающих сосудистую проницаемость, является ангиопоэтин-2 (Ang-2). Ang-2 экспрессируется васкулярными эндотелиальными клетками в процессе нормального развития сосудов, а также в процессе физиологического или патологического ангиогенеза у взрослых
(Maisonpierre et al. , 1997, Science 277: 55-60; Holash et al. ,
1999, Science 284: 1994-98). Связывание Ang-2 с его рецептором Tie-2 стимулирует ангиогенез в процессе нормального развития сосудов и при состояниях, характеризующихся патологической неоваскуляризацией. Генетическая делеция Ang-2 у мышей приводит к значительному ингибированию нормального развития сосудов сетчатки и к патологической неоваскуляризации (Hackett et al.
2000, J. Cell Physiol. 184: 275-83; Hackett et al. , 2002, J. Cell Physiol. 192: 182-7; Gale et al. 2002, Dev. Cell 3: 411423). Нацеливание на ангиопоэтин-2 (Ang2) будет поддерживать ингибирование любого из этих факторов, либо отдельно, либо в комбинации, и, возможно, будет приводить к улучшению состояния после успешного проведения терапии только одним антагонистом VEGF.
Краткое описание сущности изобретения
В соответствии с одним из своих аспектов, настоящее изобретение относится к способам лечения, предупреждения или ослабления по меньшей мере одного симптома или признака сосудистого заболевания или расстройства глаз у индивидуума. Способы согласно этому аспекту изобретения включают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ингибитор ангиопоэтина-2 (Ang-2), индивидууму, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения, ингибитор Ang-2 вводят в комбинации с антагонистом васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF).
В соответствии с другим своим аспектом, настоящее изобретение относится к способам ингибирования ангиогенеза сетчатки у индивидуума. Эти способы включают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2, в комбинации с антагонистом VEGF, индивидууму, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения комбинированное введение приводит к снижению площади сосудов сетчатки по меньшей мере на 65% по сравнению с введением только ингибитора Ang-2 или только антагониста VEGF. В некоторых вариантах осуществления изобретения ангиогенез сетчатки ассоциируется с сосудистым
заболеванием или с расстройством глаз.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способам ингибирования неоваскуляризации сетчатки у индивидуума с заболеванием или с расстройством глаз, ассоциированным с ангиогенезом, где указанные способы включают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2 в комбинации с антагонистом VEGF, индивидууму, нуждающемуся в этом.
В соответствии с другим своим аспектом, настоящее изобретение относится к способам ингибирования пролиферации сосудов у индивидуума с заболеванием или с расстройством глаз. Эти способы включают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2 в комбинации с антагонистом VEGF, индивидууму, нуждающемуся в этом.
В своем родственном аспекте, настоящее изобретение относится к способам подавления разрастания сосудов у индивидуума с заболеванием или с расстройством глаз, ассоциированного с ангиогенезом, где указанные способы включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, одной дозы антагониста VEGF с последующим введением одной или более доз фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения разрастание сосудов ингибируется в течение по меньшей мере 3 недель, более чем 3 недель, более чем 4 недель, более чем 8 недель или более чем 10 недель по сравнению с ингибированием у индивидуума, которому вводили только антагонист VEGF.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к
способам ингибирования хороидальной неоваскуляризации,
включающим введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2, индивидууму, нуждающемуся в этом.
В соответствии с другим своим аспектом, настоящее изобретение относится к способам снижения зависимости, связанной с необходимостью частых инъекций в стекловидное тело индивидуума, и тяжести последствий таких инъекций у индивидуума
с сосудистым заболеванием или с расстройством глаз. Эти способы включают введение начальной дозы, а затем одной или более вторых доз терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2 в комбинации с антагонистом VEGF, индивидууму, нуждающемуся в этом, где число введений фармацевтической композиции снижают до одного раза в каждые 9 недель по сравнению с числом введений индивидууму, которому вводят только антагонист VEGF.
В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способу лечения сосудистого заболевания глаз, где указанные способы включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, одной или более доз фармацевтической композиции, содержащей терапевтически активное количество ингибитора Ang-2 и терапевтически активное количество антагониста VEGF. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы включают введение начальной дозы фармацевтической композиции, а затем одной или более вторых доз. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждую вторую дозу вводят через 1-4 недели сразу после введения предшествующей дозы. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные способы также включают введение одной или более третьих доз индивидууму. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждую третью дозу вводят через 5-12 недель сразу после введения предшествующей дозы. В одном из вариантов осуществления изобретения каждую вторую дозу вводят через 4 недели сразу после введения предшествующей дозы. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждую третью дозу вводят через 8 недель или 12 недель сразу после введения предшествующей дозы. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция включает приблизительно от 10 мг/мл до 120 мг/мл ингибитора Ang-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция включает приблизительно 4 0 мг/мл антагониста VEGF. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция включает приблизительно от 10 мг/мл до 12 0 мг/мл ингибитора Ang-2 и приблизительно 4 0 мг/мл антагониста VEGF. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическую композицию вводят в
стекловидное тело индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждая доза фармацевтической композиции включает приблизительно от 0,5 мг до б мг ингибитора Ang-2 и приблизительно 2 мг антагониста VEGF. В одном из вариантов осуществления изобретения каждая доза фармацевтической композиции включает приблизительно 3 мг ингибитора Ang-2 и приблизительно 2 мг антагониста VEGF. В одном из вариантов осуществления изобретения каждая доза фармацевтической композиции включает приблизительно б мг ингибитора Ang-2 и приблизительно 2 мг антагониста VEGF.
В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание или расстройство глаз выбраны из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, неоваскуляризации сетчатки, закупорки центральной вены сетчатки, закупорки сосудистого сплетения вены сетчатки, полипоидной хороидальной васкулопатии и хороидальной неоваскуляризации.
В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор Ang-2 вводят в комбинации с антагонистом VEGF. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор Ang-2 вводят отдельно или в комбинации с антагонистом VEGF в стекловидное тело индивидуума, нуждающегося в этом. В альтернативных вариантах осуществления изобретения ингибитор Ang-2 вводят внутривенно или подкожно. В некоторых вариантах осуществления изобретения, ингибитор Ang-2 вводят внутривенно или подкожно в комбинации с антагонистом VEGF, где антагонист VEGF вводят в стекловидное тело. В некоторых вариантах осуществления изобретения, ингибитор Ang-2 и антагонист VEGF вводят в комбинации друг с другом местно или интраокулярно (например, в стекловидное тело).
В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор Ang-2 вводят в дозе от 0,05 мг до 10 мг индивидууму, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист VEGF вводят в дозе от 0,01 мг до 5 мг индивидууму, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор Ang-2 вводят в дозе
приблизительно 1-50 мг/кг массы тела индивидуума.
В некоторых вариантах осуществления изобретения одну или более вторых доз фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2, вводят индивидууму, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна или более доз включают по меньшей мере 2 вторых дозы фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждую вторую дозу вводят через 1-4 недели сразу после введения предшествующей дозы.
Репрезентативными ингибиторами Ang-2, которые могут быть использованы в способах согласно изобретению, являются, например, низкомолекулярные химические ингибиторы Ang-2 или биологические агенты, нацеленные на Ang-2. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, ингибитором Ang-2 является антитело или антигенсвязывающий белок, который связывается с лигандом Ang-2 и блокирует передачу сигнала Tie2. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-Апд-2 антитело или антигенсвязывающий белок содержит гипервариабельные области тяжелой цепи (HCDR) вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и CDR легкой цепи вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
Антагонистами VEGF, которые могут быть использованы в
комбинации с ингибитором Ang-2 в композициях и способах согласно
изобретению, являются анти-VEGF антитела (например,
ранибизумаб), низкомолекулярные ингибиторы VEGF (например, сунетиниб) и VEGF-ингибирующие гибридные белки ("VEGF-ловушки"). Примером антагониста VEGF, который может быть использован в комбинации с анти-Апд-2 антителами в способах лечения согласно изобретению, является афлиберцепт, VEGF-ингибирующий гибридный белок (см. патент США 7087411) .
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к
фармацевтической композиции, содержащей терапевтически
эффективное количество ингибитора Ang-2 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция также
содержит антагонист VEGF.
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к применению анти-Апд-2 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению в целях приготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения или ослабления по меньшей мере одного симптома или признака заболевания или расстройства глаз у индивидуума, включая человека.
В некоторых вариантах осуществления изобретения настоящее изобретение относится к применению ингибитора Ang-2 согласно изобретению в комбинации с антагонистом VEGF в целях приготовления лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства глаз у индивидуума, включая человека.
В соответствии с другим своим аспектом, настоящее изобретение относится к стабильному жидкому фармацевтическому составу, включающему: (i) антагонист VEGF; (ii) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с Ang-2; (iii) буфер; (iv) неионный детергент; (v) агент, придающий тоничность; и (vi) стабилизатор. В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к стабильному офтальмологическому составу, включающему: (i) антагонист VEGF; (ii) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с Ang-2; (iii) буфер; (iv) неионный детергент; (v) агент, придающий тоничность; и (vi) стабилизатор.
В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист VEGF имеет концентрацию от 5 мг/мл+0,75 мг/мл и до приблизительно 100 мг/мл+15 мг/мл, а анти-Апд-2 антитело имеет концентрацию от 10+1,5 мг/мл до 120+18,0 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист VEGF имеет концентрацию от 10 мг/мл+1,5 мг/мл до 80 мг/мл+12 мг/мл или от 20 мг/мл+3,0 мг/мл до 60 мг/мл+9, 0 мг/мл. В одном из вариантов осуществления изобретения антагонист VEGF имеет концентрацию 40 мг/мл+б,0 мг/мл или приблизительно 4 0 мг/мл. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело имеет концентрацию 10 мг/мл+1,5 мг/мл или приблизительно 10 мг/мл. В другом варианте осуществления
изобретения антитело имеет концентрацию 2 0 мг/мл+3,0 мг/мл или приблизительно 2 0 мг/мл. В другом варианте осуществления изобретения антитело имеет концентрацию 60 мг/мл+9,0 мг/мл или приблизительно 60 мг/мл. В другом варианте осуществления изобретения антитело имеет концентрацию 120 мг/мл+18,0 мг/мл или приблизительно 12 0 мг/мл.
В некоторых вариантах осуществления изобретения рН жидкого состава составляет приблизительно от рН 5,5 до рН 6,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения рН жидкого состава представляет собой рН 6,2+0,3, рН 6,2+0,25, рН 6,2+0,2, рН 6,2+0,15, рН 6,2+0,1, рН 6,2+0,05, рН 6,2+0,01 или рН 6,2. В одном из вариантов осуществления изобретения рН жидкого состава представляет собой рН 6,2+0,3 или приблизительно рН 6,2.
В одном из вариантов осуществления изобретения буфером является фосфат натрия. В некоторых вариантах осуществления изобретения фосфат натрия присутствует в концентрации от 5 мМ+0,75 мМ до 50 мМ+7,5 мМ, от 5 мМ+0,75 мМ до 40 мМ+6, 0 мМ или от 5 мМ+0,75 мМ до 25 мМ+3,75 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения фосфат натрия присутствует в концентрации 10 мМ+1,5 мМ или приблизительно 10 мМ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения неионным
детергентом является неионный полимер, содержащий
полиоксиэтиленовую группу. В некоторых вариантах осуществления изобретения неионным детергентом является любой один или более из таких детергентов, как полисорбат 20, полоксамер 188 и полиэтиленгликоль 3350. В одном из вариантов осуществления изобретения детергентом является полисорбат 20. В одном из вариантов осуществления изобретения детергентом является полисорбат 80.
В некоторых вариантах осуществления изобретения неионный детергент присутствует в концентрации от 0,005%+0,00075% до 1%+0,15% "масса/объем" или "масс./об.", где, например, 0,1 г/мл=10% и 0,01 г/мл=1%. В одном из вариантов осуществления изобретения, неионным детергентом является полисорбат 20,
который присутствует в концентрации приблизительно от 0,01%±0,0045% до 0,05%±0,0045% масс./об. В одном из вариантов осуществления изобретения неионным детергентом является полисорбат 20, который присутствует в концентрации 0,03%±0,0045% масс./об. или приблизительно 0,03% масс./об.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агентом для придания тоничности является хлорид натрия или хлорид калия. В одном из вариантов осуществления изобретения, агентом для придания тоничности является хлорид натрия. В некоторых вариантах осуществления изобретения агентом для придания тоничности является хлорид натрия в концентрации от 10 мМ+1,5 мМ до 75 мМ+11,25 мМ, от 20 мМ+3,0 мМ до 60 мМ+9,0 мМ или от 30 мМ+4,5 мМ до 50 мМ+7,5 мМ. В одном из вариантов осуществления изобретения хлорид натрия присутствует в концентрации 4 0 мМ+б,0 мМ или приблизительно 4 0 мМ.
В одном из вариантов осуществления изобретения стабилизатором является сахар. В одном из вариантов осуществления изобретения сахар выбран из группы, состоящей из сахарозы, маннита и трегалозы. В одном из вариантов осуществления изобретения стабилизатором является сахароза.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, стабилизатор присутствует в концентрации от 1%±0,15% масс./об. до 2 0%±3% масс./об. В некоторых вариантах осуществления изобретения, стабилизатором является сахароза в концентрации от 1%±0,15% масс./об. до 15%±2,25% масс./об. или от 1%±0,15% масс./об. до 10%±1,5% масс./об. В одном из вариантов осуществления изобретения стабилизатором является сахароза в концентрации 5%±0,15% масс./об. или приблизительно 5% масс./об. В другом варианте осуществления изобретения стабилизатором является сахароза в концентрации 7,5%±1,125% масс./об. или приблизительно 7,5% масс./об. В другом варианте осуществления изобретения стабилизатором является сахароза в концентрации 10%±1,5% масс./об. или приблизительно 10% масс./об. В другом варианте осуществления изобретения стабилизатором является сахароза в
концентрации 12,5%±1,875% масс./об. или приблизительно 12,5% масс./об. В другом варианте осуществления изобретения стабилизатором является сахароза в концентрации 15%±2,25% масс./об. или приблизительно 15% масс./об. В другом варианте осуществления изобретения стабилизатором является сахароза в
концентрации 2 0%±3% масс./об. или приблизительно 2 0% масс./об.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к стабильному жидкому фармацевтическому составу, включающему: (i) от 5+0,75 мг/мл до 100+15,0 мг/мл антагониста VEGF; (ii) от 5+0,75 мг/мл до 150+22,5 мг/мл человеческого антитела, которое специфически связывается с человеческим Ang-2; (iii) от 5 мМ+0,75 мМ до 50 мМ+7,5 мМ фосфата натрия; (iv) от 0, 01%+0, 0015% до 0,1%+0,015% (масс./об.) полисорбата 20; (v) от 10 мМ+1,5 мМ до 100 мМ+15 мМ хлорида натрия; и (vi) от 1%+0,15% до 20%+3%
(масс./об.) сахарозы при рН приблизительно от 5,5 до 6,5.
В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтический состав содержит: (i) 40 мг/мл+б,0 мг/мл афлиберцепта; (ii) 10+1,5 мг/мл анти-Апд-2 антитела; (iii) 10+1,5 мМ фосфата натрия; (iv) 0,03%+0,0045% (масс./об.) полисорбата 20;
(v) 40 мМ+6,0 мМ хлорида натрия; и (vi) 5%+0,75% (масс./об.) сахарозы при рН 6,2+0,3.
В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтический состав содержит: (i) 40 мг/мл+б, 0 мг/мл афлиберцепта; (ii) 20+3,0 мг/мл анти-Апд-2 антитела; (iii) 10+1,5 мМ фосфата натрия; (iv) 0,03%+0,0045% (масс./об.) полисорбата 20;
(v) 40 мМ+6,0 мМ хлорида натрия; и (vi) 5%+0,75% (масс./об.) сахарозы при рН 6,2+0,3.
В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтический состав содержит: (i) 40 мг/мл+б, 0 мг/мл афлиберцепта; (ii) 60+9,0 мг/мл анти-Апд-2 антитела; (iii) 10+1,5 мМ фосфата натрия; (iv) 0,03%+0,0045% (масс./об.) полисорбата 20;
(v) 40 мМ+6,0 мМ хлорида натрия; и (vi) 5%+0,75% (масс./об.)
сахарозы при рН 6,2+0,3.
одном
вариантов
осуществления
изобрете
ни я
фармацевтический
состав
сод
ержит:
(i)
40 мг/мл+б,0 мг
/мл
афлиберцепта; (ii) 120+18,0 мг/мл анти-Апд-2 антитела; (iii) 10+1,5 мМ фосфата натрия; (iv) 0,03%+0,0045% (масс./об.) полисорбата 20; (v) 40 мМ+б,0 мМ хлорида натрия; и (vi) 5%+0,75% (масс./об.) сахарозы при рН 6,2+0,3.
В одном из аспектов изобретения жидкий фармацевтический состав согласно изобретению содержится в контейнере. В одном из вариантов осуществления изобретения контейнером является поликарбонатный сосуд. В другом варианте осуществления изобретения контейнером является стеклянный сосуд. В одном из вариантов осуществления изобретения стеклянным сосудом является боросиликатный стеклянный сосуд типа 1, снабженный пробкой из бутилового каучука, покрытой фторуглеводородом. В другом варианте осуществления изобретения контейнером является микроинфузор. В другом варианте осуществления изобретения контейнером является шприц. В конкретном варианте осуществления изобретения шприц имеет поршень, покрытый фторуглеводородом. В одном из вариантов осуществления изобретения шприц представляет собой длинный стеклянный 2 мл-шприц, содержащий приблизительно менее чем 500 миллионных долей вольфрама и снабженный иглой калибром 30, пробкой из бутилового каучука, покрытой фторуглеводородом, и крышкой, не содержащей латекса и имеющей кончик, состоящий из нецитотоксического каучука. В одном из вариантов осуществления изобретения шприц представляет собой длинный стеклянный 2 мл-шприц NUOVA OMPI, снабженный иглой с тонкой стенкой калибром 30, пробкой 4432/50 GRY В2-40, покрытой FLUROTEC, и крышкой-наконечником FM 2 7 из каучука. В некоторых вариантах осуществления изобретения шприц представляет собой пластиковый 1 мл-, 2 мл- или 3 мл-шприц, снабженный иглой калибра 27. В одном из вариантов осуществления изобретения контейнер представляет собой пакет из поливинилхлорида для внутривенного введения (IV) . В другом варианте осуществления изобретения контейнер представляет собой IV-пакет из
полиолефина.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение включает предварительно заполненный шприц, содержащий фармацевтический состав согласно любому из предшествующих аспектов.
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к набору, включающему фармацевтическую композицию согласно любому из предшествующих аспектов, контейнер и инструкции. В одном из вариантов осуществления изобретения контейнером является предварительно заполненный шприц. В одном из вариантов осуществления изобретения контейнером является боросиликатный сосуд, снабженный каучуковой пробкой 4432/50, покрытой FLUROTEC.
Другие варианты осуществления изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 показан процент изменения площади разрастания сосудов у кроликов с неоваскуляризацией сетчатки, индуцированной DL-альфа-аминоадипиновой кислотой (DL-альфа-ААА), где кролики были обработаны анти-Апд-2 антителом, антагонистом VEGF или комбинацией анти-Апд-2 антитела и антагониста VEGF, как описано в примере 2 настоящей заявки.
На фигуре 2 показан процент изменения площади разрастания
сосудов у кроликов с DL-альфа-ААА-индуцированной
неоваскуляризацией сетчатки, где кролики были обработаны интравитреально (IVT) антагонистом VEGF (VGT) (или контролем) и внутривенно (IV) анти-Апд-2 антителом (или контролем) в соответствии с нижеследующей схемой проведения терапии, описанной в примере 3, где: (а) IVT-контроль и IV-контроль; (Ь), IVT-VGT и IV-контроль; (с) IVT-контроль и анти-Апд-2 антитело, IV; и (d) IVT-VGT и анти-Апд-2 антитело, IV.
На фигуре 3 показана количественная оценка размера поражения (А) , объема образования новых сосудов (В) и плотности сосудов (С) всей субретинальной области, у групп до начала обработки, у групп, обработанных контролем (hFc), и у групп, обработанных анти-Апд-2 антителом (тАЫ), как описано в примере 5. По сравнению с hFc-обработанным контролем, у тАЫ-обработанной группы наблюдалось статистически значимое снижение
общей площади поражения (t-критерий Стьюдента, р=0,0034), и тенденция (26,9%) к снижению объема новообразованных сосудов (t-критерий Стьюдента, р=0,1658). Величина ошибки означает стандартное отклонение.
Подробное описание изобретения
Перед описанием настоящего изобретения следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретно описанными методами и условиями проведения эксперимента, и такие методы и условия могут варьироваться. Следует также отметить, что используемая здесь терминология употребляется лишь в целях описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не рассматривается как ограничение объема настоящего изобретения, представленного в прилагаемой формуле изобретения.
Если это не оговорено особо, то все используемые здесь технические и научные термины имеют общепринятые значения, понятные специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение. Термин "приблизительно", если он относится к конкретной численной величине, означает, что эта величина может варьировать не более чем на 1% по сравнению с указанной величиной. Так, например, выражение "приблизительно 100" включает 99 и 101 и все величины между этими значениями (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.п.).
Хотя для осуществления настоящего изобретения могут быть применены любые методы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным здесь методам и материалам, однако, следует отдать предпочтение методам и материалам, описанным в настоящей заявке. Все упомянутые здесь публикации во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Способы лечения или ослабления симптомов сосудистых заболеваний или расстройств глаз
Настоящее изобретение включает способы лечения,
предупреждения или ослабления по меньшей мере одного симптома
или признака сосудистого заболевания или расстройства глаз у
индивидуума. Способы согласно этому аспекту изобретения включают
введение терапевтически эффективного количества фармацевтической
композиции, содержащей ингибитор Ang-2, индивидууму,
нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор Ang-2 вводят подкожно или внутривенно. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор Ang-2 вводят в комбинации с антагонистом VEGF. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор Ang-2 вводят интравитреально в комбинации с антагонистом VEGF. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор Ang-2 вводят в виде одного комбинированного дозированного состава вместе с антагонистом VEGF. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор Ang-2 вводят в комбинации с антагонистом VEGF, где ингибитор Ang-2 вводят внутривенно, а антагонист VEGF вводят интравитреально. Антагонист VEGF может быть введен до, во время или после введения ингибитора Ang-2.
Используемые здесь термины "лечить", "лечение" или т.п. означают ослабление симптомов, временное или полное устранение причин, вызывающих эти симптомы, или предупреждение или замедление появления симптомов неоваскулярного заболевания глаз. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы согласно изобретению применяются для лечения или ослабления по меньшей мере одного симптома или признака, включая, но не ограничиваясь ими, ангиогенез сетчатки, неоваскуляризацию, разрастание сосудов, утолщение сетчатки в пределах 500 мкм от центра ямки сетчатки, появление жесткого желтого экссудата в пределах 500 мкм от центра ямки сетчатки с одновременным утолщением соседних областей сетчатки, и утолщение по меньшей мере площади 1 диска сетчатки, любая часть которого находится в пределах диаметра 1 диска от центра ямки сетчатки, размытое зрение, "летающие мушки", потерю контрастности, двоение в глазах и полную потерю зрения. В описании способов лечения сосудистого заболевания глаз, такого как ВДЖП или ДОЖП, этот термин означает, что пациент после начала лечения способен различать на одну или более (например, на 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10 или более) букв по программе оценки остроты зрения при проведении испытания по лечению диабетической ретинопатии на ранней стадии (EDTRS). В некоторых вариантах осуществления изобретения, этот термин означает, что после начала лечения, потеря зрения у пациента
снижается благодаря улучшению его способности различать на 15 или более букв больше.
Используемые здесь термины "предупреждать",
"предупреждение" или т.п. означают предупреждение появления симптома, признака или осложнения сосудистого заболевания глаз. В описании способов лечения сосудистого заболевания глаз, такого как ВДЖП или ДОЖП, этот термин означает, что у пациента после начала лечения предотвращается умеренная или серьезная потеря зрения.
Используемый здесь термин "сосудистое заболевание или расстройство глаз" означает заболевание или расстройство глаз, которое поражает кровеносные сосуды глаза. Эти заболевания могут вызываться аномальным ангиогенезом (образованием новых кровеносных сосудов) или закупоркой или блокадой кровеносных сосудов. Используемый здесь термин включает заболевания или расстройства глаз, ассоциированные с ангиогенезом. Этот термин включает, но не ограничивается ими, заболевание или расстройство глаз, выбранные из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, неоваскуляризации сетчатки, закупорки центральной вены сетчатки, закупорки сосудистого сплетения вены сетчатки, полипоидной хороидальной васкулопатии и хороидальной неоваскуляризации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, термин "неоваскулярное заболевание или расстройство глаз" может быть синонимом термина "заболевание или расстройство глаз, ассоциированное с ангиогенезом".
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение включает способы лечения, предупреждения или ослабления по меньшей мере одного симптома или признака заболевания или расстройства глаз, ассоциированного с ангиогенезом у индивидуума, где указанное заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, неоваскуляризации сетчатки, закупорки центральной вены сетчатки, закупорки сосудистого сплетения вены сетчатки, полипоидной хороидальной васкулопатии и хороидальной неоваскуляризации.
Используемый здесь термин "диабетический отек желтого
пятна" (ДОЖП) означает тяжелое заболевание глаз, которое
развивается у людей с диабетом (типа 1 или 2) . Отек желтого
пятна возникает в том случае, когда кровеносные сосуды сетчатки
проникают в желтое пятно, в результате чего происходит
накопление жидкости и отложение белка на поверхности желтого
пятна или под поверхностью желтого пятна глаза (желтой
центральной области сетчатки), что приводит к утолщению и
набуханию (отеку). Такой отек может искажать центральное зрение
у человека, поскольку желтое пятно находится рядом с центром
сетчатки у основания глазного яблока. Первичными симптомами ДОЖП
являются, но не ограничиваются ими, размытое зрение, "летающие
мушки", потеря контрастности, двоение в глазах и полная потеря
зрения. Патология ДОЖП характеризуется разрушением
гематоретинального барьера, обычно предотвращающего поступление воды в сетчатку и, тем самым, накопление жидкости в ткани сетчатки и ее утолщение. В настоящее время ДОЖП диагностируется во время обследования глаз, состоящего из теста на остроту зрения, в котором определяют способность индивидуума различать самые мелкие буквы по стандартизированной таблице; расширенного теста для определения признаков заболевания глаз; визуализирующих тестов, таких как оптическая когерентная томография (ОКТ), или флуоресцеиновая ангиография (ФА) и тонометрия, то есть, способ, который позволяет измерить внутриглазное давление. Для назначения лечения были также проведены нижеследующие исследования: оптическая когерентная томография (ОКТ), флуоресцеиновая ангиография (ФА) и исследование по цветной стереоскопической фотографии глазного дна. ДОЖП может быть более широко охарактеризован по двум главным категориям - фокальному и диффузному. Фокальный ДОЖП характеризуется наличием специфических областей отдельного и явного прорастания сосудов в желтое пятно с достаточным кровотоком в желтом пятне. Диффузный ДОЖП вызывается образованием общего капиллярного слоя вокруг желтого пятна, что обусловлено снижением внутреннего гематоретинального барьера глаза. Исходя из результатов клинической оценки, ДОЖП, помимо
фокального и диффузного, также подразделяется на другие категории, такие как клинически значимый отек желтого пятна (CSME), не-CSME и CSME с центральным поражением (CSME-CI) ямки сетчатки. Настоящее изобретение включает способы лечения ДОЖП вышеупомянутых категорий.
Используемый здесь термин "возрастная дегенерация желтого пятна" (ВДЖП) означает серьезное заболевание глаз, при котором наблюдается повреждение небольшой центральной части сетчатки, известной как желтое пятно. Мокрая форма ВДЖП характеризуется ростом аномальных кровеносных сосудов из хороидальной оболочки в область под желтым пятном. Это заболевание называется хороидальной неоваскуляризацией. Такие кровеносные сосуды направляют кровь и жидкость в сетчатку, что приводит к искажению зрения в виде волнистых линий, а также к появлению слепых пятен и к потере центрального зрения. Все эти аномальные кровеносные сосуды в конечном счете, рубцуются, что приводит к перманентной потере центрального зрения. Симптомами ВДЖП являются темные размытые участки в центре поля зрения и ослабленное или искаженное восприятие цвета. ВДЖП может быть детектирована путем рутинного обследования глаза. Одним из наиболее распространенных ранних признаков дегенерации желтого пятна является присутствие друз - небольших желтых отложений под сетчаткой - или скоплений пигмента.
Используемый здесь термин "индивидуум, нуждающийся в этом" относится к человеку или к млекопитающему, не являющемуся человеком, у которых наблюдаются один или более симптомов или признаков заболевания или расстройства глаз, ассоциированного с ангиогенезом, и/или у которых были диагностированы эти симптомы или признаки. Термин "индивидуум, нуждающийся в этом" может также включать, например, индивидуумов, у которых до проведения лечения наблюдались (или могли наблюдаться) один или более признаков неоваскулярного заболевания глаз, такого как, например, ангиогенез сетчатки, неоваскуляризация, разрастание сосудов, утолщение сетчатки в пределах 500 мкм от центра ямки сетчатки, появление жесткого желтого экссудата в пределах 500 мкм от центра ямки сетчатки с одновременным утолщением соседних
областей сетчатки, и утолщение по меньшей мере площади 1 диска сетчатки, любая часть которого находится в пределах диаметра 1 диска от центра ямки сетчатки, размытое зрение, "летающие мушки", потерю контрастности, двоение в глазах и полную потерю зрения.
В описании настоящего изобретения термин "индивидуум, нуждающийся в этом" также относится к человеку или к млекопитающему, не являющемуся человеком, у которых наблюдаются сосудистое заболевание или расстройство глаз, выбранное из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, неоваскуляризации сетчатки, закупорки центральной вены сетчатки, закупорки сосудистого сплетения вены сетчатки, полипоидной хороидальной васкулопатии и хороидальной неоваскуляризации.
В контексте описания настоящего изобретения, термин "индивидуум, нуждающийся в этом" может включать подгруппу индивидуумов, которые являются более восприимчивыми к ДОЖП или ВДЖП, или у которых может наблюдаться повышенный уровень ДОЖП-ассоциированного или ВДЖП-ассоциированного биомаркера. Так, например, термин "индивидуум, нуждающийся в этом" может включать индивидуума, страдающего диабетом более чем 10 лет; индивидуума, у которого часто повышается уровень сахара в крови или наблюдаются высокие уровни глюкозы в крови натощак. В некоторых вариантах осуществления изобретения, термин "индивидуум, нуждающийся в этом" включает индивидуума, который, до или во время введения ингибитора Ang-2 и/или антагониста VEGF, был болен диабетом, или у которого был диагностирован диабет. В некоторых вариантах осуществления изобретения, термин "индивидуум, нуждающийся в этом", включает индивидуума, который, до или во время введения ингибитора Ang-2 и/или антагониста VEGF, имел возраст выше 50 лет. В некоторых вариантах осуществления изобретения, термин "индивидуум, нуждающийся в этом", включает индивидуумов, которые являются курильщиками или имеют высокое кровяное давление или высокий уровень холестерина.
Настоящее изобретение включает способы лечения, предупреждения или ослабления тяжести сосудистого заболевания
глаз, где указанные способы включают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2 в комбинации с антагонистом VEGF индивидууму, нуждающемуся в этом, где фармацевтическую композицию вводят индивидууму в дробных дозах, например, при проведении конкретной схемы терапевтического введения доз. Так, например, терапевтическая схема введения доз может включать введение дробных доз фармацевтической композиции индивидууму с частотой приблизительно один раз в день, один раз в два дня, один раз в три дня, один раз в четыре дня, один раз в пять дней, один раз в шесть дней, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в месяц, один раз в два месяца, один раз в три месяца, один раз в четыре месяца или менее часто. В некоторых вариантах осуществления изобретения терапевтическая схема введения доз может включать введение дробных доз фармацевтической композиции индивидууму с частотой один раз в день или 2 раза в день или более.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления
изобретения, способы согласно изобретению включают введение
индивидууму терапевтически эффективного количества
фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2 в комбинации с антагонистом VEGF. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор Ang-2 согласно изобретению может быть введен в комбинации с терапией, включающей лазерную обработку для прекращения проникновения сосудов в желтое пятно. Используемый здесь термин "в комбинации с." означает, что фармацевтическую композицию, содержащую ингибитор Ang-2, вводят индивидууму одновременно с введением, непосредственно до или сразу после введения антагониста VEGF.
Настоящее изобретение также включает способы ингибирования или снижения или подавления разрастания сосудов у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы согласно этому аспекту изобретения включают введение индивидууму одной или более доз фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2, для снижения или ингибирования разрастания сосудов в глазах у индивидуума. В некоторых других вариантах осуществления
изобретения способы включают введение индивидууму одной или более доз фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2 в комбинации с антагонистом VEGF, для снижения или ингибирования разрастания сосудов в глазах у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения разрастание сосудов ингибируется более чем через 3 недели, более чем через 4 недели, более чем через 8 недель или более чем через 10 недель по сравнению с разрастанием сосудов у индивидуума, которому был введен только антагонист VEGF.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления
изобретения способы согласно изобретению включают введение
индивидууму терапевтически эффективного количества
фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2 в
комбинации с антагонистом VEGF. Используемый здесь термин "в
комбинации с." означает, что фармацевтическую композицию,
содержащую ингибитор Ang-2, вводят индивидууму одновременно с
введением, непосредственно до или сразу после введения
антагониста VEGF. В некоторых вариантах осуществления
изобретения антагонист VEGF вводят в одной композиции с
ингибитором Ang-2. В своем родственном варианте, настоящее
изобретение относится к способам, включающим введение
индивидууму терапевтически эффективного количества
фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2, для достижения большего терапевтического эффекта или синергического эффекта по сравнению с эффектом при введении только антагониста VEGF. Индивидууму может быть назначена терапевтическая схема интравитреального введения антагониста VEGF. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в эту терапевтическую схему добавляют ингибитор Ang-2, где дозы одной или более интравитреальных инъекций антагониста VEGF могут быть снижены или могут быть увеличены промежутки между последовательными интравитреальными инъекциями.
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к способам лечения сосудистого заболевания глаз, где указанные способы включают введение одной или более доз фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество
ингибитора Ang-2 и терапевтически эффективное количество антагониста VEGF, индивидууму, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретенияфармацевтическую композицию вводят индивидууму интравитреально. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция включает приблизительно от 10 мг/мл до 12 0 мг/мл ингибитора Ang-2 и приблизительно 4 0 мг/мл антагониста VEGF. В некоторых вариантах осуществления изобретения, указанные способы включают введение начальной дозы фармацевтической композиции, а затем одной или более вторых доз, где каждую вторую дозу вводят через 1-4 недели после непосредственного введения предшествующей дозы. В некоторых вариантах осуществления изобретения вводят одну или более третьих доз фармацевтической композиции, где каждую третью дозу вводят через 5-12 недель сразу после введения предшествующей дозы. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждая доза фармацевтической композиции содержит приблизительно от 0,5 мг до б мг ингибитора Ang-2 и приблизительно 2 мг антагониста VEGF.
В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к способам снижения числа интравитреальных инъекций индивидууму с сосудистым заболеванием глаз, где указанные способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2 и антагонист VEGF, где интравитреальное введение сокращают до 1 раза в 8 недель по сравнению с введением только ингибитора Ang-2 или только антагониста VEGF.
Способы согласно изобретению могут быть применены для лечения или предупреждения сосудистых заболеваний глаз у пациентов, у которых было диагностировано такое заболевание или у которых имеется риск развития таких заболеваний. В целом, способы согласно изобретению дают эффект через 3 6 недель после начала проведения схемы лечения (с введением начальной дозы на "неделю 0") , например, по окончании недели б, по окончании недели 12, по окончании недели 18, по окончании недели 24 и т.п. В контексте описания способов лечения ангиогенных расстройств зрения, таких как ВДЖП и ДОЖП, термин "эффективность" означает, что пациент, после начала лечения, не может различать 10 или
менее букв по Таблице оценки остроты зрения при проведении испытания по лечению диабетической ретинопатии на ранней стадии (EDTRS). В некоторых вариантах осуществления изобретения термин "эффективность" означает способность различать на одну или более букв больше (например, на 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11 или более букв) по таблице ETDRS после начала проведения лечения. Ингибиторы ангиопоэтина-2 (Ang-2)
Используемый здесь термин "Апд-2" или "ANG2" означает человеческий ангиопоэтин-2, который, главным образом, известен как аутокринный антагонист активации Tie2. Ang-2, как, в основном, известно специалистам, "сообщает" сосудистому эндотелию цитокиновую активность. Ang-2 в высокой степени экспрессируется в сосудистой системе опухолей, и обычно считается, что он действует синергически с другими цитокинами (то есть, с васкулярным эндотелиальным фактором роста) и стимулирует ангиогенез и прогрессирование роста опухоли.
Используемый здесь термин "ингибитор Ang-2" (также называемый здесь "антагонистом Ang-2", "блокатором Ang-2" и т.п.) означает любой агент, который связывается или взаимодействует с Ang-2 и ингибирует или ослабляет нормальную биологическую функцию передачи сигнала/активности Ang-2.
Неограничивающими примерами различных категорий ингибиторов Ang-2 являются низкомолекулярные ингибиторы Ang-2, анти-Апд-2 аптамеры, ингибиторы Апд-2 на основе пептидов (например, молекулы "пептидных телец"), "рецептор-тельца" (например, сконструированные молекулы, содержащие рецептор-связывающий домен компонента Ang-2) и антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, которые специфически связываются с человеческим Ang-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитором Ang-2 является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные, например, в публикации заявки на патент США No. US20110027286. В некоторых вариантах осуществления изобретения, анти-Апд-2 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
Способы согласно изобретению включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2.
Анти-Апд-2 антитела и их антигенсвязывающие фрагменты В соответствии с некоторыми репрезентативными вариантами осуществления изобретения, ингибитором Апд-2 является анти-Апд-2 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Используемый здесь термин "антитело" включает молекулы иммуноглобулина, содержащие четыре полипептидных цепи, то есть, две тяжелых (Н) и две легких цепей (L) цепи, соединенных дисульфидными связями, а также их мультимеры (например, IgM). В типичном антителе, каждая тяжелая цепь включает вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначаемую HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена Сн1, Сн2 и Сн3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи
(сокращенно обозначаемую LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен
(CL1) . Области VH и VL могут быть также подразделены на
гипервариабельные области, называемые определяющими
комплементарность областями (CDR), между которыми расположены более консервативные области, называемые каркасными областями
(FR) . Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в направлении от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В различных вариантах осуществления изобретения, FR анти-Апд-2 антитела (или его антигенсвязывающей части) могут быть идентичны человеческим последовательностям зародышевой линии, либо они могут быть природными или искусственно модифицированными. Аминокислотная консенсусная последовательность может быть определена с помощью постадийного анализа двух или более CDR.
Используемый здесь термин "антитело" также включает антигенсвязывающие фрагменты полноразмерных молекул антитела. Используемые здесь термины "антигенсвязывающая" часть антитела, "антигенсвязывающий фрагмент" антитела и т.п. включают любой природный, ферментативно продуцируемый, синтетический или
генетически сконструированный полипептид или гликопротеин, который специфически связывается с антигеном с образованием комплекса. Антигенсвязывающие фрагменты антитела могут быть получены, например, из полноразмерных молекул антитела с применением любых подходящих стандартных методов, таких как протеолитическое расщепление, или рекомбинантных методов генной инженерии, включающих модификацию и экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и необязательно константные домены антитела. Такая ДНК является известной и/или может быть легко получена, например, из коммерчески доступных источников и библиотек ДНК
(включая, например, фаговых библиотек антител), либо она может быть синтезирована. ДНК может быть секвенирована и химически модифицирована, либо она может быть получена с применением методов молекулярной биологии, например, для введения одного или более вариабельных и/или константных доменов в подходящей конфигурации или для введения кодонов, встраивания цистеиновых остатков, модификации, добавления или делеции аминокислот и т.п.
Неограничивающими примерами антигенсвязывающих фрагментов являются: (i) Fab-фрагменты; (ii) F(ab')2-фрагменты; (iii) Fd-фрагменты; (iv) Fv-фрагменты; (v) одноцепочечные молекулы Fv
(scFv); (vi) dAb-фрагменты; и (vii) минимальные единицы
распознавания, состоящие из аминокислотных остатков, имитирующих
гипервариабельную область антитела (например, выделенную
определяющую комплементарность область (CDR), такую как пептид
CDR3), или усеченный пептид FR3-CDR3-FR4. В объем используемого
здесь термина "антигенсвязывающий фрагмент" входят также и
другие сконструированные молекулы, такие как домен-специфические
антитела, однодоменные антитела, антитела с делетированными
доменами, химерные антитела, CDR-привитые антитела, диантитела,
триантитела, тетраантитела, миниантитела, наноантитела
(например, одновалентные наноантитела, двухвалентные антитела и т.п.), небольшие модульные ииммунофармацевтические средства
(SMIP) и вариабельные домены IgNAR акулы.
Антигенсвязывающий фрагмент антитела обычно содержит по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может иметь любой размер или любой аминокислотный состав и обычно
содержит по меньшей мере одну CDR, которая является смежной с одной или более каркасными последовательностями или находятся в одной рамке считывания с этими последовательностями. В антигенсвязывающих фрагментах, имеющих Ун-домен, ассоциированный с Уь-доменом, VH- и Уь-домены могут быть расположены в любом подходящем порядке по отношению друг к другу. Так, например, вариабельная область может быть димерной и может содержать димеры VH-VH, VH-VL или VL-VL. Альтернативно, антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный VH- или Уь-домен.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно связанный по меньшей мере с одним константным доменом. Неограничивающими репрезентативными конфигурациями вариабельных и константных доменов, которые могут присутствовать в антигенсвязывающем фрагменте антитела согласно изобретению, являются: (i) VH-CH1;
(ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-Ch2; (V) VH-CH1-CH2-Ch3 ; (vi) VH-Ch2-Ch3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3;
(xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; и (xiv) VL-CL. В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, включая любые репрезентативные конфигурации, перечисленные выше, вариабельные и константные домены могут быть либо связаны друг с другом непосредственно, либо они могут быть связаны посредством полноразмерной или частичной шарнирной или линкерной области. Шарнирная область может состоять по меньшей мере из 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или более) аминокислот, сообщающих гибкую или полугибкую связь между смежными вариабельными и/или константными доменами в одной полипептидой молекуле. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент антитела согласно изобретению может содержать гомодимер или гетеролимер (или другой мультимер) в любых конфигурациях вариабельных и константных доменов, перечисленных выше, которые связаны нековалентной связью друг с другом и/или с одним или более мономерными VH- или Уь-доменами
(например, посредством дисульфидной(ых) связи(ей)).
Используемый здесь термин "антитело" также включает мультиспецифические (например, биспецифические) антитела.
Мультиспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обычно включает по меньшей мере два различных вариабельных домена, где каждый вариабельный домен может специфически связываться с отдельным антигеном или другим эпитопом на одном и том же антигене. Мультиспецифическое антитело любого формата может быть адаптировано применительно к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту согласно изобретению рутинными методами, известными специалистам. Так, например, настоящее изобретение относится к способам, включающим применение биспецифических антител, где одна ветвь иммуноглобулина является специфичной к IL-4Ra или к его фрагменту, а другая ветвь иммуноглобулина является специфичной ко второй терапевтической мишени или конъюгирована с этой мишенью. Репрезентативными антителами в биспецифическом формате, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, например, биспецифические антитела на основе scFv или биспецифические диантитела, гибриды IgG-scFv, антитело с двумя вариабельными доменами (DVD)-Ig, квадрома, структуры "узлы в дырках", общая легкая цепь (например, общая легкая цепь с "узлами в дырках" и т.п.) CrossMab, CrossFab, тельце (SEED), "лейциновая молния", Duobody, IgGl/IgG2, Fab двойного действия
(DAF)-IgG и биспецифические Mab2 (см., например, публикацию Klein
et al. , 2 012, mAbs 4:6, 1-11, и цитируемые там работы, в которых
приводится обзор антител вышеуказанных форматов).
Биспецифические антитела могут быть также сконструированы посредством конъюгирования пептида/нуклеиновой кислоты, например, где неприродные аминокислоты с ортогональной химической реактивностью используются для получения сайт-специфических конъюгатов "антитело-олигонуклеотид", которые затем подвергаются самосборке в мультимерные комплексы, имеющие определенный состав, валентность и геометрическую структуру
(см., например, Kazane et al. r, J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4r 2012] ) .
Антитела, используемые в способах согласно изобретению, могут представлять собой человеческие антитела. Используемый
здесь термин "человеческое антитело" включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, происходящие от последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Тем не менее, человеческие антитела согласно изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые генами последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии (например, мутации, введенные посредством неспецифического или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo), например, в CDR, а в частности, в CDR3. Однако, используемый здесь термин "человеческое антитело" не включает антитела, в которых последовательности CDR, происходящие от последовательности зародышевой линии млекопитающих других видов, таких как мышь, были присоединены к человеческим каркасным последовательностям.
Антителами, используемыми в способах согласно изобретению,
могут быть рекомбинантные человеческие антитела. Используемый
здесь термин "рекомбинантное человеческое антитело" включает все
человеческие антитела, которые были получены, экспрессированы,
сконструированы или выделены рекомбинантными методами, например,
антитела, экспрессируемые посредством рекомбинантного
экспрессионного вектора, перенесенного в клетку-хозяина (как
более подробно описано ниже); антитела, выделенные из библиотеки
рекомбинантных комбинаторных человеческих антител (как более
подробно описано ниже); антитела, выделенные у животного
(например, у мыши), которое является трансгенным по человеческим
генам иммуноглобулина (см., например, Taylor et al., (1992)
Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) или антитела, которые были
получены, экспрессированы, сконструированы или выделены любыми
другими методами, включающими сплайсинг последовательностей
генов человеческого иммуноглобулина с другими
последовательностьями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области, происходящие от последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Однако, в некоторых вариантах осуществления изобретения, такие рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу in vitro (или если используются животные, трансгенные по
человеческим последовательностям Ig, то соматическому мутагенезу in vivo) , и таким образом, аминокислотные последовательности VH-и Уь-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и происходят от последовательностей VH и VL человеческой зародышевой линии и являются родственными этим последовательностям, все же могут не присутствовать в природе в репертуаре антител человеческой зародышевой линии in vivo.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, антитела, используемые в фармацевтических составах и способах согласно изобретению, специфически связываются с Ang-2. Термин "специфически связывается" или т.п. означает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент образуют комплекс с антигеном, который является относительно стабильным в физиологических условиях. Методы определения специфического связывания антитела с антигеном хорошо известны специалистам и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и т.п. Так, например, антитело, которое "специфически связывается" с Ang-2, и которое используется в настоящем изобретении, включает антитела, которые связываются с Ang-2 или с его частью с KD, составляющей менее чем приблизительно 500 нМ,
менее чем
приблизительно 300
нМ, менее чем приблизительно 2
нМ,
менее
чем
приблизительно
100
нМ,
менее
чем приблизительно
нМ,
менее
чем
приблизительно
нМ,
менее
чем приблизительно
нМ,
менее
чем
приблизительно
нМ,
менее
чем приблизительно
нМ,
менее
чем
приблизительно
нМ,
менее
чем приблизительно
нМ,
менее
чем
приблизительно
нМ,
менее
чем приблизительно
нМ,
менее
чем
приблизительно
нМ,
менее
чем приблизительно
нМ,
менее
чем
приблизительно
нМ,
менее
чем приблизительно
нМ,
менее
чем
приблизительно
или менее чем приблизитель
0,5
нМ, как 1
было определено
анализе методом поверхностно
плазмонного резонанса. Однако, выделенное антитело, которое специфически связывается с человеческим Ang-2, может перекрестно реагировать с другими антигенами, такими как молекулы Ang-2, происходящие от животных других видов (не являющихся человеком).
В соответствии с некоторыми репрезентативными вариантами
осуществления изобретения, ингибитором Ang-2 является анти-Апд-2 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), вариабельную область легкой цепи (LCVR) и/или гипервариабельные области (CDR), содержащие любые аминокислотные последовательности анти-Апд-2 антител, представленных в публикации заявки на патент США No. US20110027286.
В некоторых репрезентативных вариантах осуществления изобретения анти-Апд-2 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые могут быть использованы в способах согласно изобретению, содержат гипервариабельные области тяжелой цепи (HCDR) вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), включающие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и гипервариабельные области легкой цепи (CDR) вариабельной области легкой цепи (LCVR), включающие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, анти-Апд-2 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат три HCDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) и три LCDR (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) , где HCDR1 содержит
аминокислотную последовательность SEQ ID NO:
аминокислотную последовательность SEQ ID NO:
аминокислотную последовательность SEQ ID NO:
аминокислотную последовательность SEQ ID NO:
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; и LCDR3 содержит
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В других
вариантах осуществления изобретения анти-Апд-2 антитело или его
антигенсвязывающий фрагмент содержат HCVR, включающую SEQ ID NO:
1, и LCVR, включающую SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах
осуществления изобретения способы согласно изобретению включают
применение анти-Апд-2 антитела, где указанное антитело содержит
тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ
ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-
Апд-2 антитело содержит легкую цепь, включающую аминокислотную
последовательность SEQ ID NO: 10. Репрезентативное антитело,
содержащее тяжелую цепь, включающую аминокислотную
последовательность SEQ ID NO: 9 и легкую цепь, включающую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, представляют собой полностью человеческое анти-Апд-2 антитело, известное как несвакумаб. В соответствии с некоторыми репрезентативными вариантами осуществления изобретения способы согласно изобретению включают применение несвакумаба или его биоэквивалента. Используемый здесь термин "биоэквивалент" означает анти-Апд-2 антитела или Апд-2-связывающие белки или их фрагменты, которые представляют собой фармацевтические эквиваленты или их фармацевтические альтернативы, степень и/или скорость абсорбции которых значительно не отличаются от степени и/или скорости абсорбции несвакумаба при его введении в той же самой молярной дозе в аналогичных экспериментальных условиях, либо в одной дозе, либо в дробной дозе. В контексте настоящего изобретения этот термин означает антигенсвязывающие белки, связывающиеся с Ang-2, которые по своим клиническим свойствам, таким как безопасность, чистота и/или активность, не отличаются от несвакумаба.
Неограничивающее репрезентативное антитело, используемое в описанных здесь примерах, обозначается "Н1Н685Р" как в US 2011/0027286. Это антитело содержит пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, имеющих SEQ ID NN: 1/2 и домены HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3, представленные SEQ ID NN: 3-4-5/SEQ ID NN: 6-7-8.
Другие антитела против человеческого Ang-2 описаны в публикациях заявок на патенты США 2010/0166768, US 2011/0065902 и WO 2010/077854, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащегося в фармацевтических составах согласно изобретению, может варьировать в зависимости от конкретных свойств состава, а также от конкретных условий и целей применения этих составов. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическими составами являются жидкие составы, которые могут содержать от 5+0,75 мг/мл до 150+22,5 мг/мл антитела; от 7,5+1,125 мг/мл до 140+21 мг/мл антитела. Так, например, составы согласно
изобретению могут содержать приблизительно 10 мг/мл; приблизительно 20 мг/мл; приблизительно 30 мг/мл; приблизительно 50 мг/мл; приблизительно 60 мг/мл; приблизительно 8 0 мг/мл; приблизительно 100 мг/мл; приблизительно 120 мг/мл; или приблизительно 150 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с человеческим Ang-2 .
Антагонисты VEGF
Используемый здесь термин "антагонист VEGF" означает любой агент, который связывается или взаимодействует с VEGF и ингибирует связывание VEGF с его рецепторами (VEGFR1 и VEGFR2) и/или ингибирует биологическую передачу сигнала и активность VEGF. Антагонистами VEGF являются молекулы, которые препятствуют взаимодействию VEGF и природного рецептора VEGF, например, молекулы, которые связываются с VEGF или с рецептором VEGF и предотвращают или как-либо иначе блокируют взаимодействие между VEGF и рецептором VEGF. Конкретными репрезентативными антагонистами VEGF являются анти-VEGF антитела (например, ранибизумаб [LUCENTIS(r)] ) , антитела против рецептора VEGF
(например, анти-VEGFRl антитела, aHTH-VEGFR2 антитела и т.п.), низкомолекулярные ингибиторы VEGF (например, сунитиниб) и химерные молекулы на основе рецептора VEGF или VEGF-ингибирующие гибридные белки (также называемые здесь "VEGF-ловушками").
Химерными молекулами на основе рецептора VEGF являются химерные полипептиды, которые содержат два или более иммуноглобулина (Ig)-подобных доменов рецептора VEGF, такого как VEGFR1 (также обозначаемого Fltl) и/или VEGFR2 (также обозначаемого Fltl или KDR), и могут также содержать мультимеризующий домен (например, Fc-домен, который облегчает мультимеризацию [например, димеризацию] двух или более химерных полипептидов). Репрезентативной химерной молекулой на основе рецептора VEGF является молекула, обозначаемая VEGFRlR2-FcACl(а)
(также известная как афлиберцепт, имеющийся в продаже под торговым знаком EYLEA(r)) . В некоторых вариантах осуществления изобретения афлиберцепт имеет аминокислотную последовательность
SEQ ID NO: 11.
Количество антагониста VEGF, содержащегося в
фармацевтических составах согласно изобретению, может варьировать в зависимости от конкретных свойств составов, а также от конкретных условий и целей применения этих составов. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическими составами являются жидкие составы, которые могут содержать от 5+0,75 мг/мл до 150+22,5 мг/мл антагониста VEGF; от 10+1,5 мг/мл до 100+15,0 мг/мл антагониста VEGF; от 20+3 мг/мл до 80+12 мг/мл антагониста VEGF; от 30+4,5 мг/мл до 70+10,5 мг/мл антагониста VEGF или 40+6,0 мг/мл антагониста VEGF. Так, например, составы согласно изобретению могут содержать приблизительно 2 0 мг/мл; приблизительно 30 мг/мл; приблизительно 50 мг/мл или приблизительно 60 мг/мл антагониста VEGF.
Комбинированные терапии
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, способы согласно изобретению включают введение индивидууму антагониста VEGF в комбинации с анти-Апд-2 антителом. Используемый здесь термин "в комбинации с." означает, что антагонист VEGF вводят до, во время или после введения фармацевтической композиции, содержащей анти-Апд-2 антитело. Термин "в комбинации с." также включает последовательное или одновременное введение анти-Апд-2 антитела и антагониста VEGF. Так, например, термин "до введения" фармацевтической композиции, содержащей анти-Апд-2 антитело, означает, что антагонист VEGF может быть введен более чем за 72 часа, приблизительно за 72 часа, приблизительно за 60 часов, приблизительно за 48 часов, приблизительно за 36 часов, приблизительно за 24 часа, приблизительно за 12 часов, приблизительно за 10 часов, приблизительно за 8 часов, приблизительно за б часов, приблизительно за 4 часа, приблизительно за 2 часа, приблизительно за 1 час, приблизительно за 3 0 минут, приблизительно за 15 минут или приблизительно за 10 минут до введения фармацевтической композиции, содержащей анти-Апд-2 антитело. Термин "после
введения" фармацевтической композиции, содержащей анти-Апд-2 антитело, означает, что антагонист VEGF может быть введен приблизительно через 10 минут, приблизительно через 15 минут, приблизительно через 30 минут, приблизительно через 1 час, приблизительно через 2 часа, приблизительно через 4 часа, приблизительно через б часов, приблизительно через 8 часов, приблизительно через 10 часов, приблизительно через 12 часов, приблизительно через 24 часа, приблизительно через 36 часов, приблизительно через 48 часов, приблизительно через 60 часов, приблизительно через 72 часа, или более чем через 72 часа после введения фармацевтической композиции, содержащей анти-Апд-2 антитело. Введение "одновременно" с фармацевтической композицией, содержащей анти-Апд-2 антитело, означает, что антагонист VEGF вводят индивидууму в отдельной лекарственной форме в период времени менее чем за 5 минут (до введения) , через 5 минут (после введения) или одновременно с введением фармацевтической композиции, содержащей анти-Апд-2 антитело, или в виде одного комбинированного дозированного состава, содержащего антагонист VEGF и анти-Апд-2 антитело.
Комбинированные терапии могут включать введение анти-Апд-2 антитела согласно изобретению и антагониста VEGF (например, афлиберцепта, VEGF-ловушек, см., например, US7087411 (также называемой здесь "VEGF-ингибирующим гибридным белком"), анти-VEGF антитела (например, ранибизумаба), низкомолекулярного киназного ингибитора рецептора VEGF (например, сунитиниба, сорафениба или пазопаниба) и т.п.
Способы согласно изобретению включают введение анти-Апд-2 антитела в комбинации с антагонистом VEGF в целях достижения аддитивной или синергической активности для лечения или ослабления по меньшей мере одного симптома или признака заболевания или расстройства глаз, выбранного из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, неоваскуляризации сетчатки, закупорки центральной вены сетчатки, закупорки сосудистого сплетения вены сетчатки, полипоидной хороидальной васкулопатии и хороидальной неоваскуляризации.
Фармацевтические композиции и составы
Настоящее изобретение включает способы введения ингибитора Ang-2 индивидууму, где ингибитор Ang-2 содержится в фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция также содержит антагонист VEGF. В альтернативных вариантах осуществления изобретения, ингибитор Ang-2 и антагонист VEGF могут присутствовать в отдельном фармацевтическом дозированном составе. Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть приготовлены с использованием подходящих носителей, наполнителей и других агентов, обеспечивающих соответствующий перенос, доставку, устойчивость и т.п. Описание множества составов можно найти в реестре, известном всем химикам-фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Такими составами являются, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, везикулы, содержащие липид (катионный или анионный)(такие как LIPOFECTIN(tm)) , ДНК-конъюгаты, безводные абсорбирующие пасты, эмульсии типа "масло в воде" и "вода в масле", эмульсии Карбовакс (полиэтиленгликоли с различными молекулярными массами), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие Карбовакс. См. также Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J. Pharm. Sci. Technol. 52 : 238-311.
Используемое здесь выражение "фармацевтический состав" означает комбинацию по меньшей мере одного активного ингредиента (например, небольшой молекулы, макромолекулы, соединения и т.п.), способных сообщать биологический эффект у человека или у животного, не являющегося человеком) и по меньшей мере одного неактивного ингредиента, который, при его объединении с активным ингредиентом или с одним или более дополнительными неактивными ингредиентами, являются подходящим для терапевтического введения человеку или животному, не являющемуся человеком. Используемый здесь термин "состав" означает "фармацевтический состав", если это не оговорено особо. Настоящее изобретение относится к
фармацевтическим составам, содержащим по меньшей мере один
терапевтический полипептид. В соответствии с некоторыми
вариантами осуществления изобретения терапевтическим
полипептидом является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с человеческим белком ангиопоэтином-2 (Ang-2). В соответствии с некоторыми другими своими вариантами настоящее изобретение относится к фармацевтическим составам, содержащим более чем один терапевтический полипептид. Более конкретно, настоящее изобретение включает фармацевтические составы, содержащие: (i) человеческое антитело, которое специфически связывается с человеческим Ang-2; (ii) антагонист VEGF; (iii) натрийфосфатный буфер; (iv) органический сорастворитель, который представляет собой неионное поверхностно-активное вещество; (v) агент, придающий тоничность, такой как хлорид натрия; и (vi) термостабилизатор, который представляет собой углевод. Конкретные репрезентативные компоненты и составы, входящие в объем настоящего изобретения, подробно описаны ниже.
Количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащегося в фармацевтических составах согласно изобретению, может варьировать в зависимости от конкретных свойств состава, а также от конкретных условий и целей применения этих составов. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическими составами являются жидкие составы, которые могут содержать от 5+0,75 мг/мл до 150+22,5 мг/мл антитела; от 7,5+1,125 мг/мл до 140+21 мг/мл антитела; от 10+1,5 мг/мл до 130+19,5 мг/мл антитела; 10±1,5 мг/мл антитела; 20+3 мг/мл антитела; 60+9 мг/мл антитела; или 120+18 мг/мл антитела. Так, например, составы согласно изобретению могут содержать приблизительно 10 мг/мл; приблизительно 2 0 мг/мл; приблизительно 4 0 мг/мл; приблизительно 60 мг/мл; приблизительно 80 мг/мл; приблизительно 100 мг/мл; приблизительно 120 мг/мл; или приблизительно 140 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с человеческим Ang-2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения
фармацевтическими составами являются жидкие составы, которые могут содержать от 5+0,75 мг/мл до 100+15 мг/мл антагониста VEGF. Так, например, составы согласно изобретению могут содержать приблизительно 5 мг/мл; приблизительно 10 мг/мл; приблизительно 15 мг/мл; приблизительно 20 мг/мл; приблизительно 25 мг/мл; приблизительно 30 мг/мл; приблизительно 35 мг/мл; приблизительно 4 0 мг/мл; приблизительно 50 мг/мл; приблизительно 60 мг/мл; приблизительно 7 0 мг/мл; приблизительно 8 0 мг/мл; приблизительно 90 мг/мл; или приблизительно 100 мг/мл антагониста VEGF, такого как афлиберцепт.
В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическими составами являются стабильные жидкие комбинированные составы, содержащие приблизительно от 5 мг/мл до 150 мг/мл анти-Апд-2 антитела и приблизительно 5-100 мг/мл антагониста VEGF.
Фармацевтические составы согласно изобретению содержат один или более наполнителей. Используемый здесь термин "наполнитель" означает любой нетерапевтический агент, добавляемый в состав для достижения желаемой консистенции, вязкости или стабилизирующего эффекта.
В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтические составы согласно изобретению содержат по меньшей мере один органический сорастворитель определенного типа и в определенном количестве для стабилизации человеческого анти-Апд-2 антитела при транспортировке в неблагоприятных условиях или при резких движениях, таких как, например, тряска. В некоторых вариантах осуществления изобретения "стабилизировать" означает предупреждать образование более чем 4% агрегированного антитела от общего количества антитела (на молярной основе) при транспортировке в неблагоприятных условиях. В некоторых вариантах осуществления изобретения транспортировка в неблагоприятных условиях означает встряхивание раствора, содержащего антитело и органический сорастворитель, в течение приблизительно 60 минут или приблизительно 12 0 минут.
В некоторых вариантах осуществления изобретения
органический сорастворитель представляет собой неионное
поверхностно-активное вещество, такое как алкилполиэтиленоксид.
Конкретными неионными поверхностно-активными веществами, которые
могут присутствовать в составах согласно изобретению, являются,
например, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 28,
полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65, полисорбат 80,
полисорбат 81 и полисорбат 8 5; полоксамеры, такие как полоксамер
181, полоксамер 188, полоксамер 4 07; или полиэтиленгликоль
(ПЭГ) . Полисорбат 20 также известен как TWEEN 20,
сорбитанмонолаурат и полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат.
Полоксамер 188 также известен как PLURONIC F68.
Количество неионного поверхностно-активного вещества,
содержащегося в фармацевтических составах согласно изобретению,
может варьировать в зависимости от конкретных свойств состава, а
также от конкретных условий и целей применения этих составов. В
некоторых вариантах осуществления изобретения составы могут
содержать от 0,01%±0,0015% до 1%±0,15% поверхностно-активного
вещества. Так, например, составы согласно изобретению могут
содержать приблизительно 0,0085%; приблизительно 0,01%;
приблизительно 0,02%; приблизительно 0,03%; приблизительно
0,04%; приблизительно 0,05%; приблизительно 0,06%;
приблизительно 0,07%; приблизительно 0,08%; приблизительно
0,09%; приблизительно 0,1%; приблизительно 0,11%; приблизительно
0,12%; приблизительно 0,13%; приблизительно 0,14%;
приблизительно 0,15%; приблизительно 0,16%; приблизительно
0,17%; приблизительно 0,18%; приблизительно 0,19%;
приблизительно 0,2 0%; приблизительно 0,21%; приблизительно
0,22%; приблизительно 0,2 3%; приблизительно 0,24%;
приблизительно 0,25%; приблизительно 0,3%; приблизительно 0,4%; приблизительно 0,5%; приблизительно 0,6%; приблизительно 0,7%; приблизительно 0,8%; приблизительно 0,9%; приблизительно 1%; приблизительно 1,1%; приблизительно 1,15%; или приблизительно 1,2% полисорбата 20, полисорбата 80 или полоксамера 188.
Фармацевтические составы согласно изобретению могут также содержать один или более стабилизаторов определенного типа и в
определенном количестве для стабилизации человеческого анти-Ang-
2 антитела в условиях теплового стресса. В некоторых вариантах
осуществления изобретения "стабилизировать" означает сохранять
более чем приблизительно 93% антитела в нативной конформации при
хранении раствора, содержащего антитело и термостабилизатор,
приблизительно при 4 5°С в течение периода времени приблизительно
до 2 8 дней. В некоторых вариантах осуществления изобретения
"стабилизировать" означает создать условия, где при хранении
раствора, содержащего антитело и термостабилизатор
приблизительно при 4 5°С в течение периода времени приблизительно до 28 дней, агрегируется менее чем приблизительно 4% антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения "стабилизировать" означает сохранять более чем приблизительно 96% антитела в нативной конформации при хранении раствора, содержащего антитело
и термостабилизатор, приблизительно при 45°С в течение периода времени приблизительно до 2 8 дней. В некоторых вариантах осуществления изобретения "стабилизировать" означает создать условия, где при хранении раствора, содержащего антитело и термостабилизатор приблизительно при 37°С в течение периода времени приблизительно до 2 8 дней, агрегируется менее чем приблизительно 2% антитела. Используемый здесь термин "нативный" относится к антителу, которое в его основной форме определенного размера, по существу, представляет собой интактный мономер антитела.
В некоторых вариантах осуществления изобретения термостабилизатором является сахар или спирт ряда Сахаров, выбранные из сахарозы, сорбита, глицерина, трегалозы и маннита или любой их комбинации, количество которых в указанном составе может варьировать в зависимости от конкретных условий и целей применения состава. В некоторых вариантах осуществления изобретения составы могут содержать приблизительно от 1% до приблизительно 2 0% сахара или спирта ряда Сахаров; приблизительно от 2% до приблизительно 18% сахара или спирта ряда Сахаров; приблизительно от 3% до приблизительно 15% сахара или спирта ряда Сахаров; приблизительно от 4% до приблизительно
10% сахара или спирта ряда Сахаров; или приблизительно 5% сахара или спирта ряда Сахаров. Так, например, фармацевтические составы согласно изобретению могут содержать 4%±0,б%; 5%±0,75%; б%±0,9%; 7%±1,05%; 8%±1,2%; 9%±1,35%; 10%±1,5%; 11%±1,б5%; 12%±1,8%;
13%±1,95%; или приблизительно 14%±2,1% сахара или спирта ряда Сахаров (например, сахарозы, трегалозы или маннита).
В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтические составы согласно изобретению содержат агент, придающий тоничность, такой как хлорид натрия или хлорид калия. В некоторых вариантах осуществления изобретения агентом, придающим тоничность, является хлорид натрия. В некоторых вариантах осуществления изобретения хлорид натрия присутствует в концентрации от 5 мМ+0,75 мМ до 100 мМ+15, 0 мМ; от 10 мМ+1,5 мМ до 50 мМ+7,5 мМ; 40 мМ+б,0 мМ; или приблизительно 40 мМ.
Фармацевтические составы согласно изобретению могут также содержать буфер или буферную систему, которые служат для поддержания стабильного рН и для стабилизации человеческого анти-Апд-2 антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения "стабилизировать" означает создать условия, где при хранении раствора, содержащего антитело и буфер, приблизительно при 4 5°С в течение периода времени приблизительно до 2 8 дней, агрегируется менее чем 5%±0,5% или не более чем приблизительно 4,3% антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения "стабилизировать" означает сохранять по меньшей мере 92%±0,5% антитела в нативной конформации как было определено с помощью эксклюзионной хроматографии при хранении раствора, содержащего
антитело и буфер, приблизительно при 45°С в течение периода времени приблизительно до 2 8 дней. Термин "нативный" или "нативная конформация" относится к фракции антитела, которая не является агрегированной или расщепленной. Это обычно определяют с помощью анализа, позволяющего измерить относительный размер молекулы антитела, например, анализа методом эксклюзионной хроматографии. Неагрегированное и нерасщепленное антитело элюируется во фракции, относящейся к нативному антителу, а
обычно, в главной элюирующейся фракции. Агрегированное антитело элюируется во фракции, размер которой превышает размер нативного антитела. Расщепленное антитело элюируется во фракции, размер которой меньше размера нативного антитела.
В некоторых вариантах осуществления изобретения "стабилизировать" означает сохранять по меньшей мере 52%±0,5% антитела в его главной заряженной форме как было определено с помощью катионообменной хроматографии при хранении раствора,
содержащего антитело и буфер, приблизительно при 45°С в течение периода времени приблизительно до 2 8 дней. Термин "главный заряд" или "главная заряженная форма" относится к фракции антитела, которая элюируется из ионообменной смолы в главном пике, который обычно фланкируется более "основными" пиками на одной стороне и более "кислотными" пиками на другой стороне.
Фармацевтические составы согласно изобретению могут иметь рН приблизительно от 5,5 до 6,5. Так, например, составы согласно изобретению могут иметь рН приблизительно 5,5; приблизительно 5,6; приблизительно 5,7; приблизительно 5,8; приблизительно 5,9; приблизительно 6,0; приблизительно 6,1; приблизительно 6,2; приблизительно 6,3; приблизительно 6,4; или приблизительно 6,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения, рН составляет 6,2+0,3; б,2±0,2; 6,2+0,1; приблизительно 6,2 или 6,2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения буфер или буферная система содержит по меньшей мере один буфер, забуферивающее действие которого полностью или частично обеспечивается рН 5,5-7,4. В одном из вариантов осуществления изобретения буфер имеет рКа приблизительно 6,2+0,5. В некоторых
вариантах осуществления изобретения
буфер включает
фосф
> ат
натрия.
В некоторых вариантах осуществления изобретения
фосф
> ат
натрия
присутствует в концентрации от 5
мМ+0,7 5 мМ до 15
мМ+2,
мМ; от
6 мМ+0,9 мМ до 14 мМ+2,1 мМ; от 7
мМ+1,05 мМ до 13
мМ+1,
мМ; от
8 мМ+1,2 мМ до 12 мМ+1,8 мМ; от 9
мМ+1,35 мМ до 11
мМ+1,
мМ; 10 мМ+1,5 мМ; или приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения буферная система включает фосфат
натрия в концентрации 10 мМ+1,5 мМ, при рН 6,2+0,3 или 6,1+0,3.
Репрезентативные составы, содержащие антагонист VEGF, который может быть использован в настоящем изобретении, описаны, например, в патентах США 7531173 и 7608261. Репрезентативные фармацевтические композиции, содержащие анти-Апд-2 антитело, которое может быть использовано в настоящем изобретении, описаны, например, в публикации заявки на патент США No. 20130186797.
Стабильность фармацевтических составов
Фармацевтические составы согласно изобретению обычно имеют высокие уровни стабильности. Используемый здесь термин "стабильный", если он относится к фармацевтическим составам, означает, что антитела, присутствующие в фармацевтических составах, сохраняют приемлемую химическую структуру или биологическую функцию после хранения в определенных условиях. Состав может сохранять стабильность даже в том случае, когда содержащееся в нем антитело не будет на 100% сохранять свою химическую структуру или биологическую функцию после хранения в течение определенного периода времени. В некоторых случаях, под словом "стабильный" подразумевается сохранение приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98% или приблизительно 99% структуры или функции антитела после хранения в течение определенного периода времени.
Стабильность может быть оценена, inter alia, путем
определения процента нативного антитела, оставшегося в составе
после хранения в течение определенного периода времени и при
определенной температуре. Процент нативного антитела может быть
определен inter alia, с помощью эксклюзионной хроматографии
(например, эксклюзионной высокоэффективной или
ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии [ЭХ-ВЭЖХ или ЭХ-УВЭЖХ]), где термин "нативный" означает неагрегированный и нерасщепленный. Используемое здесь выражение "приемлемая степень стабильности" означает, что по меньшей мере 90% антитела в нативной форме может быть детектировано в составе после его хранения в течение определенного периода времени и при
определенной температуре. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% антитела в нативной форме может быть детектировано в составе после хранения в течение определенного периода времени и при определенной температуре. Определенный период времени, после которого оценивают стабильность, может составлять по меньшей мере 14 дней, по меньшей мере 2 8 дней, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере б месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяца или более. Определенная температура, при которой фармацевтический состав может храниться при оценке стабильности, может представлять собой любую температуру приблизительно от -80°С до приблизительно 45°С, например, приблизительно -80°С, приблизительно -30°С, приблизительно -20°С, приблизительно 0°С, приблизительно 4°-8°С, приблизительно 5°С, приблизительно 25°С, приблизительно 35°С, приблизительно 37°С или приблизительно 45°С. Так, например, фармацевтический состав может считаться стабильным, если после его хранения в течение девяти месяцев при 5°С, более чем приблизительно 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% или 99,5% нативного антитела было детектировано с помощью ЭХ-ВЭЖХ или ЭХ-УВЭЖХ. Фармацевтический состав может считаться стабильным, если после его хранения в течение шести месяцев при 25°С, более чем приблизительно 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% или 99,5% нативного антитела было детектировано с помощью ЭХ-ВЭЖХ или ЭХ-УВЭЖХ. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если после его хранения в течение 28 дней месяцев при 37°С, более чем приблизительно 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% или 99,5% нативного антитела было детектировано с помощью ЭХ-ВЭЖХ или ЭХ-УВЭЖХ. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если
после его хранения в течение 2 8 дней при 45°С, более чем приблизительно 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% или 99,5% нативного антитела было детектировано с помощью ЭХ-ВЭЖХ или ЭХ-УВЭЖХ. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если после его хранения в течение шести месяцев при -2 0°С, более чем приблизительно 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% или 99,5% нативного антитела было детектировано с помощью ЭХ-ВЭЖХ. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если после его хранения в течение шести месяцев при -30°С, более чем приблизительно 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% или 99,5% нативного антитела было детектировано с помощью ЭХ-ВЭЖХ или ЭХ-УВЭЖХ. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если после его хранения в течение шести месяцев при -80°С, более чем приблизительно 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% или 99,5% нативного антитела было детектировано с помощью ЭХ-ВЭЖХ или ЭХ-УВЭЖХ.
Стабильность может быть оценена, inter alia, путем
определения процента антитела, которое образует агрегат в
составе после хранения в течение определенного периода времени и
при определенной температуре, где стабильность обратно
пропорциональна проценту образующегося агрегата. Процент
агрегированного антитела может быть опеделен, inter alia, с
помощью эксклюзионной хроматографии (например, эксклюзионной
высокоэффективной жидкостной хроматографии [ЭХ-ВЭЖХ]).
Используемый здесь термин "приемлемая степень стабильности" означает, что максимум 6% антитела в агрегированной форме может быть детектировано в составе после хранения в течение определенного периода времени и при определенной температуре. В некоторых вариантах осуществления изобретения, термин "приемлемая степень стабильности" означает, что приблизительно максимум 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, или 0,1% антитела в агрегированной форме может быть детектировано в составе после хранения в течение определенного периода времени и при определенной температуре. Определенный период времени, после которого оценивают стабильность, может составлять по меньшей
мере 2 недели, по меньшей мере 2 8 дней, по меньшей мере 1 месяц,
по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей
мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере б
месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев,
по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по
меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей
мере 18 месяцев, по меньшей мере 2 4 месяца или более.
Температура, при которой фармацевтический состав может храниться
при оценке стабильности, может представлять собой любую
температуру приблизительно от -80°С до приблизительно 45°С,
например, приблизительно -80°С, приблизительно -30°С,
приблизительно -20°С, приблизительно 0°С, приблизительно 4°-8°С, приблизительно 5°С, приблизительно 25°С, приблизительно 35°С, приблизительно 37°С или приблизительно 45°С. Так, например, фармацевтический состав может считаться стабильным, если после его хранения в течение девяти месяцев при 5°С, менее чем приблизительно 2%, 1,75%, 1,5%, 1,25%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% или 0,1% антитела детектируется в агрегированной форме. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если после его хранения в течение шести месяцев при 25°С, менее чем приблизительно 2%, 1,75%, 1,5%, 1,25%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% или 0,1% антитела детектируется в агрегированной форме. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если после его хранения в течение 2 8 дней при 45°С, менее чем приблизительно 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1%, 0,5% или 0,1% антитела детектируется в агрегированной форме. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если после его хранения в течение трех месяцев при -20°С, -30°С или -80°С менее чем приблизительно 2%, 1,9%, 1,8%, 1,7%, 1,6%, 1,5%, 1%, 0,5% или 0,1% антитела детектируется в агрегированной форме.
Стабильность может быть оценена, inter alia, путем определения процента антитела, которое в процессе ионного обмена мигрирует в виде более кислотной фракции ("кислотной форме") , чем в своей главной фракции ("главной заряженной форме"), где
стабильность обратно пропорциональна фракции антитела в
кислотной форме. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией,
авторы лишь отмечают, что дезамидирование антитела может
сообщать антителу более отрицательный заряд и, таким образом,
антитело становится более кислотным по сравнению с не-
дезамидированным антителом (см., например, Robinson, N., Protein
Deamidation, PNAS, April 16, 2002, 99 (8):5283-5288) . Процент
"подкисленного" антитела может быть определен с помощью
ионообменной хроматографии (например, катионообменной
высокоэффективной жидкостной хроматографии [КО-ВЭЖХ]).
Используемый здесь термин "приемлемая степень стабильности" означает, что максимум 52% антитела в более кислотной форме может быть детектировано в составе после его хранения в течение определенного периода времени и при определенной температуре. В некоторых вариантах осуществления изобретения термин "приемлемая степень стабильности" означает, что приблизительно максимум 52%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% антитела может детектироваться в кислотной форме в составе после его хранения в течение определенного периода времени и при определенной температуре. Определенный период времени, после которого оценивают стабильность, может составлять по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 2 8 дней, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере б месяцев, по меньшей мере 7 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 11 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 24 месяца или более. Температура, при которой фармацевтический состав может храниться при оценке стабильности, может представлять собой любую температуру приблизительно от -80°С до приблизительно 45°С, например, приблизительно -80°С, приблизительно -30°С, приблизительно -20°С, приблизительно 0°С, приблизительно 4°-8°С, приблизительно 5°С, приблизительно 25°С, приблизительно 35°С, приблизительно 37°С или приблизительно 45°С.
Так, например, фармацевтический состав может считаться стабильным, если после его хранения в течение трех месяцев при -80°С, -30°С или -20°С менее чем приблизительно 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% антитела присутствует в более кислотной форме. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если после его хранения
в течение девяти месяцев при 5°С, менее чем приблизительно 28%, 2 7 ts, 2 6 ts, 25t:^ 2 4 ts, 2 3 ts, 2 2 ts, 21 ts, 2 0 ts, 19 ts, 18 ts, 17 ts, 1 6 ts, 15 ts, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% антитела присутствует в более кислотной форме. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если после его хранения в течение 28 дней при 25°С, менее чем приблизительно 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% антитела присутствует в более кислотной форме. Фармацевтический состав может также считаться стабильным, если после его хранения в течение 2 8 дней
при 37°С,
менее чем приблизительно 37%, 36%,
3 5 ts,
34%,
3 3 -б f
3 2 ts,
31 ts, 3 0 ts,
29'б, 28t5, 27t5, 26t5, 2 5 ts, 2 4 ts, 2 3 ts,
2 2 ts,
21%,
20%,
19%,
18%, 17%,
16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%,
8 %,
7%, 6%
, о
, 4%,
О о on О о , Z о ,
1%, 0,5% или 0,1% антитела присутствует
более
КИСЛОТНОЙ
форме. Фармацевтический состав может
также
считаться
стабильным, если после его хранения в течение 2 8
дней
при
45°C,
менее чем
приблизительно 52%, 51%, 50%, 49%,
48%,
47%,
46%,
45%,
44%, 43%,
42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%,
3 5 -б f
34%,
3 3 -б f
32^,
31 ts, 3 0 ts,
29'б, 28t5, 27t5, 26t5, 2 5 ts, 2 4 ts, 2 3 ts,
22^,
21%,
20%,
19%,
18%, 17%,
16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%,
8 %,
7%, 6%
, о
, Ч о ,
о а QQ.
О о f Z о /
1%, 0,5% или 0,1% антитело присутствует
более
кислотной форме.
Измерение аффинности связывания антитела с его мишенью может быть также проведено для оценки стабильности. Так, например, состав согласно изобретению может рассматриваться как стабильный, если после его хранения, например, при -80°С, -30°С, -20°С, 5°С, 25°С, 37°С, 45°С и т.п. в течение определенного
периода времени (например, от 14 дней до б месяцев) , анти-Апд-2
антитело, содержащееся в составе, связывается с Апд-2 с
аффинностью, которая составляет по меньшей мере 84%, 90%, 95%
или более от аффинности связывания антитела до его хранения.
Аффинность связывания может быть определена любым методом, таким
как, например, ELISA или плазмонный резонанс. Биологическая
активность может быть определена с помощью анализа на активность
Ang-2, например, посредством контактирования клетки, которая
экспрессирует Ang-2, с составом, содержащим анти-Апд-2 антитело.
Связывание антитела с такой клеткой может быть оценено
непосредственно, например, с помощью FACS-анализа.
Альтернативно, последующая активность системы Ang-2 может быть оценена в присутствии антитела, а затем ее сравнивают с активностью системы Ang-2 в отсутствии антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения Ang-2 может быть эндогенным для клетки. В других вариантах осуществления изобретения Ang-2 может эктопически экспрессироваться (то есть, посредством гетерологичной экспрессии) в клетке.
Другие способы оценки стабильности антитела в составе продемонстрированы ниже в примерах.
Контейнеры и способы введения
Известны различные системы доставки, которые могут быть применены для введения фармацевтической композиции согласно изобретению, например, инкапсуляция в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, экспрессирующие мутантные вирусы, и опосредуемый рецептором эндоцитоз (см., например, Wu et al. , 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432) . Способами введения являются, но не ограничиваются ими, интрадермальное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, подкожное, интраназальное, эпидуральное и пероральное введение. Композиция может быть введена любым стандартным способом, например, путем вливания или инъекции ударной дозы, посредством абсорбции через эпителиальный или кожно-слизистый выстилающий слой (например, через слизистую ротовой полости, прямой кишки и тонкой кишки и т.п.), и может быть введена вместе с другими биологически активными агентами.
Для лечения расстройств зрения фармацевтические составы согласно изобретению могут быть введены, например, в виде глазных капель, инъекции в область под конъюнктивой, имплантата в область под конъюнктивой, инъекции в стекловидное тело, имплантата в стекловидное тело, инъекции в субтенонову оболочку или имплантата в субтенонову оболочку.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть введена подкожно или внутривенно с помощью стандартной иглы и стандартного шприца. Кроме того, при подкожной доставке, введение фармацевтической композиции согласно изобретению может быть легко осуществлено с помощью устройства для доставки в виде пера. Такое устройство для доставки в виде пера может быть многоразовым или одноразовым. В многоразовом устройстве для доставки в виде пера обычно используется сменная кассета, содержащая фармацевтическую композицию. После введения всей фармацевтической композиции с помощью кассеты, эту кассету опустошают, а затем пустую кассету либо выбрасывают, либо заменяют новой кассетой, содержащей фармацевтическую композицию. Устройство для доставки в виде пера может быть затем использовано повторно. В одноразовом устройстве для доставки в виде пера сменную кассету не используют. В этом случае одноразовое устройство для доставки в виде пера предварительно заполняют фармацевтической композицией, содержащейся в резервуаре в самом устройстве. После удаления фармацевтической композиции из резервуара все устройство выбрасывают.
В некоторых ситуациях фармацевтическая композиция может быть доставлена с помощью системы регулируемого высвобождения. В одном из вариантов осуществления изобретения может быть применен насос. В другом варианте осуществления изобретения могут быть применены полимерные материалы, см. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. В другом варианте осуществления изобретения система регулируемого высвобождения может быть помещена поблизости от мишени для данной композиции, и, таким образом, может потребоваться только часть системной дозы (см., например, Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release,
supra, vol. 2, pp. 115-138). Другие системы регулируемого высвобождения обсуждаются в публикации Langer, 1990, Science 249:1527-1533.
Препараты для инъекций могут включать дозированные формы
для внутривенных, подкожных, чрезкожных и внутримышечных
инъекций; капельницы и т.п. Эти препараты для инъекций могут
быть получены известными методами. Так, например, препараты для
инъекций могут быть получены, например, путем растворения,
суспендирования или эмульгирования антитела или его соли,
описанной выше, в стерильной водной среде или в масляной среде,
обычно применяемой для инъекций. В качестве водной среды для
инъекций служит, например, физиологический раствор;
изотонический раствор, содержащей глюкозу и другие вспомогательные агенты и т.п., которые могут быть использованы в комбинации с соответствующим солюбилизирующим агентом, таким как спирт (например, этанол), многоатомный спирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионное поверхностно-активное вещество [например, полисорбат 80, НСО-50 (продукт присоединения полиоксиэтилена (50 моль) и гидрогенизированного касторового масла)] и т.п. В качестве масляной среды может служить, например, кунжутное масло, соевое масло и т.п., которые могут быть использованы в комбинации с солюбилизирующим агентом, таким как бензилбензоват, бензиловый спирт и т.п. Таким образом, полученной инъекцией предпочтительно заполняют соответствующую ампулу.
Предпочтительно, фармацевтические композиции для
перорального или парентерального введения, описанные выше, приготавливают в виде дозированных форм в стандартной дозе, подходящей для дозирования активных ингредиентов. Такими дозированными формами в стандартной дозе являются, например, таблетки, драже, капсулы, инъекции (ампулы), суппозитории и т.п.
Фармацевтические составы согласно изобретению могут содержаться в любом контейнере, подходящем для хранения или введения лекарственных средств и других терапевтических композиций. Так, например, фармацевтические составы могут содержаться в герметично закрытых и стерилизованных пластиковых
или стеклянных контейнерах определенного объема, таких как флаконы, ампулы, шприцы, кассеты, бутыли или пакеты для IV-введения. Составы согласно изобретению могут содержаться и в сосудах другого типа, включая, например, прозрачные и непрозрачные стеклянные сосуды (например, из янтарного стекла) или пластиковые сосуды. Аналогичным образом, для хранения или введения фармацевтических составов согласно изобретению могут быть применены шприцы любого типа.
Фармацевтические составы согласно изобретению могут содержаться в шприцах "с нормальным количеством вольфрама" или в шприцах "с низким количеством вольфрама". Как известно специалистам в данной области, способ изготовления стеклянных шприцов обычно включает применение горячего вольфрамого стержня, протыкающего стекло и создающего отверстие, через которое жидкость может подаваться и выталкиваться из шприца. Этот процесс приводит к осаждению следовых количеств вольфрама на внутренней поверхности шприца. Последующая промывка и другие стадии обработки могут быть проведены для снижения количества вольфрама в шприце. Используемый здесь термин "нормальное количество вольфрама" означает, что шприц содержит 500 миллионных долей (м.д.) вольфрама. Термин "нормальное количество вольфрама" означает, что шприц содержит менее чем 500 м.д. вольфрама. Так, например, в соответствии с настоящим изобретением, шприц с низким количеством вольфрама может содержать приблизительно менее чем 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 390, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 м.д. вольфрама или менее.
На резиновые поршни, применяемые в шприцах, и на резиновые
пробки, применяемые для закрытия отверстий в сосудах, может быть
нанесено покрытие для предупреждения загрязнения медицинских
препаратов, содержащихся в шприце или в сосуде, или для
сохранения их стабильности. Таким образом, в соответствии с
некоторыми вариантами осуществления изобретения,
фармацевтические составы согласно изобретению могут содержаться в шприце, который имеет поршень с покрытием, или в сосуде, герметично закрытом пробкой, имеющей резиновое покрытие. Так,
например, поршень или пробка могут иметь покрытие в виде
фторуглеродной пленки. Примеры пробок или поршней с покрытием,
подходящих для их применения в сосудах и шприцах, содержащих
фармацевтические составы согласно изобретению, упомянуты,
например, в патентах США NN. 4997423; 5908686; 6286699; 6645635
и 722 6554, содержание которых во всей своей полноте вводится в
настоящее описание посредством ссылки. Конкретные
репрезентативные пробки и поршни с резиновым покрытием, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются коммерчески доступными и поставляются под торговым знаком "FluroTec(r)", компанией West Pharmaceutical Services, Inc. (Lionville, PA) . FluroTec(r) представляет собой пример фторуглеродного покрытия, применяемого для минимизации или предупреждения адгезии лекарственного продукта на резиновых поверхностях.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения фармацевтические составы могут содержаться в шприце с низком количеством вольфрама, имеющем поршень с фторуглеродным покрытием.
Фармацевтические составы могут быть введены пациенту парентерально, например, путем инъекции (например, подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно и т.п.) или путем подкожного введения, введения через слизистую, интраназального введения, пульмонального введения или перорального введения. Для подкожной доставки фармацевтических составов согласно изобретению могут быть применены различные многоразовые устройства для доставки в виде пера или аутоинжектора. Примерами являются, но не ограничиваются ими, AUTOPEN(tm) (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), перо DISETRONIC(tm) (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), перо HUMALOG MIX 75/25(tm), перо HUMALOG(tm), перо HUMALIN 70/30(tm) (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN(tm) I, II и III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR(tm) (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), перо BD(tm) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN(tm), OPTIPEN PRO(tm),
OPTIPEN STARLET(tm) и OPTICLIK(tm) (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany). Примерами одноразовых устройств для доставки в виде пера или аутоинжектора, имеющих приспособление для подкожной доставки фармацевтической композиции согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, перо SOLOSTAR(tm) (sanofi-aventis), FLEXPEN(tm) (Novo Nordisk), и KWIKPEN(tm) (Eli Lilly), SURECLICK(tm) Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA) , PENLET(tm) (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), и перо HUMIRA(tm) (Abbott Labs, Abbott Park, IL).
В настоящем изобретении также рассматривается применение микроинфузора для доставки фармацевтических составов согласно изобретению. Используемый здесь термин "микроинфузор" означает устройство для подкожной доставки, изготовленное для медленного введения больших объемов (например, приблизительно до 2,5 мл или более) терапевтического состава в течение длительного периода времени (например, приблизительно 10, 15, 20, 25, 30 минут или более). См., например, патенты США 6629949, 6659982 и Meehan et al., J. Controlled Release 46:101-116 (1996) . Микроинфузоры являются особенно подходящими для доставки больших доз терапевтических белков в высокой концентрации (например, приблизительно 100, 125, 150, 175, 200 мг/мл или более) или вязких растворов.
В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтический состав вводят посредством капельного IV-вливания, а для этого состав разводят в пакете IV-вливания, содержащем физиологически приемлемый раствор. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция представляет собой компаундированный стерильный состав, находящийся в пакете для внутривенного вливания, где одну дозу лекарственного продукта разводят в 100 мл, 250 мл (или в другом подходящем количестве для внутривенной капельной доставки) физиологического буфера (например, 0,9% физиологического раствора). В некоторых вариантах осуществления изобретения пакет для вливания изготовлен из поливинилхлорида (например, VIAFLEX, Baxter, Deerfield, Illinois). В некоторых вариантах
осуществления изобретения пакет для вливания изготовлен из полиолефина (EXCEL IV Bags, Braun Medical Inc., Bethlehem, Pennsylvania).
В некоторых вариантах осуществления изобретения жидкий состав, включающий от 10 мг/мл до 120 мг/мл анти-Апд-2 антитела, содержится в предварительно заполненном шприце и вводится интравитреально в объеме приблизительно до 100 мкл. В некоторых вариантах осуществления изобретения жидкий состав, включающий от 10 мг/мл до 120 мг/мл анти-Апд-2 антитела и от 10 мг/мл до 100 мг/мл афлиберцепта, содержится в предварительно заполненном шприце и вводится интравитреально в объеме приблизительно до 100 мкл. В некоторых вариантах осуществления изобретения жидкий состав, включающий от 10 мг/мл до 120 мг/мл анти-Апд-2 антитела и от 10 мг/мл до 100 мг/мл афлиберцепта, содержится в предварительно заполненном шприце и вводится интравитреально в объеме приблизительно до 500 мкл. В некоторых вариантах осуществления изобретения жидкий состав, включающий от 60 мг/мл до 12 0 мг/мл анти-Апд-2 антитела и приблизительно 4 0 мг/мл афлиберцепта, содержится в предварительно заполненном шприце и вводится интравитреально в объеме приблизительно до 500 мкл. В одном из вариантов осуществления изобретения шприц представляет собой длинный стеклянный 2 мл-шприц, снабженный иглой с тонкой стенкой калибром 30, резиновым поршнем, покрытым фторуглеродом, и резиновым защитным экраном для иглы. В одном из вариантов осуществления изобретения шприц представляет собой длинный стеклянный 1 мл-шприц, снабженный иглой с тонкой стенкой калибром 30, резиновым поршнем, покрытым фторуглеродом, и резиновым защитным экраном для иглы.
Схемы введения
Настоящее изобретение включает способы введения индивидууму фармацевтической композиции, содержащей анти-Апд-2 антитело, с частотой введения доз приблизительно четыре раза в неделю, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в пять недель, один раз в шесть недель, один раз в восемь недель, один раз в двенадцать недель или менее часто при условии, что будет
достигаться терапевтический ответ. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей анти-Апд-2 антитело в комбинации с антагонистом VEGF, с частотой введения доз приблизительно четыре раза в неделю, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в пять недель, один раз в шесть недель, один раз в восемь недель, один раз в девять недель, один раз в двенадцать недель или менее часто при условии, что будет достигаться терапевтический ответ.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения дробные дозы анти-Апд-2 антитела могут быть введены индивидууму в течение определенного периода времени. Способы согласно этому аспекту изобретения включают последовательное введение индивидууму дробных доз анти-Апд-2 антитела. Используемый здесь термин "последовательное введение" означает, что каждую дозу анти-Апд-2 антитела вводят индивидууму в различные периоды времени, например, в различные дни с предварительно определенным интервалом (например, через часы, дни, недели или месяцы). Настоящее изобретение включает способы последовательного введения пациенту одной исходной дозы анти-Апд-2 антитела, а затем одной или более вторых доз анти-Апд-2 антитела, и, необязательно, одной или более третьих доз анти-Апд-2 антитела.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения дробные дозы комбинированного состава, содержащего анти-Апд-2 антитело и антагонист VEGF, могут быть введены индивидууму в течение определенного периода времени. Способы согласно этому аспекту изобретения включают последовательное введение индивидууму дробных доз комбинированного состава, содержащего анти-Апд-2 антитело и антагонист VEGF. Используемый здесь термин "последовательное введение" означает, что каждую дозу анти-Апд-2 антитела в комбинации с антагонистом VEGF вводят индивидууму в различные периоды времени, например, в различные дни с предварительно определенным интервалом (например, через часы, дни, недели или месяцы). Настоящее изобретение включает
способы последовательного введения пациенту одной исходной дозы комбинированного состава, содержащего анти-Апд-2 антитело и антагонист VEGF, а затем одной или более вторых доз комбинированного состава, содержащего анти-Апд-2 антитело и антагонист VEGF, и, необязательно, одной или более третьих доз комбинированного состава, содержащего анти-Апд-2 антитело и антагонист VEGF.
Термины "исходная доза", "вторые дозы" и "третьи дозы" относятся к временной последовательности введения доз. Таким образом, "исходная доза" представляет собой дозу, которую вводят в начале проведения схемы лечения (также называемую "базовой дозой"); "вторые дозы" представляют собой дозы, которые вводят после исходной дозы, а "третьи дозы" представляют собой дозы, которые вводят после вторых доз. Исходная доза, вторые и третьи дозы могут содержать одинаковое количество анти-Апд-2 антитела
(или комбинированного состава, содержащего анти-Апд-2 антитело и антагонист VEGF), но обычно эти дозы отличаются друг от друга по частоте их введения. Однако, в некоторых вариантах осуществления изобретения количество, содержащееся в исходной, вторых и/или третьих дозах, варьируют (например, при необходимости, они могут быть скорректированы в сторону их увеличения или уменьшения) в процессе проведения курса лечения. В некоторых вариантах осуществления изобретения одну или более (например, 1, 2, 3, 4, или 5) доз вводят в начале курса лечения как "нагрузочные дозы", а затем вводят другие дозы, но менее часто (например, "поддерживающие дозы"). Так, например, анти-Апд-2 антитело (или комбинированный состав, содержащий анти-Апд-2 антитело и антагонист VEGF) может быть введено пациенту, страдающему заболеванием или расстройством глаз, в нагрузочной дозе приблизительно б мг, а затем в одной или более поддерживающих дозах приблизительно от 0,5 мг до 10 мг.
В одном из репрезентативных вариантов осуществления изобретения, каждую вторую и/или третью дозу вводят через 1-14
(например, 1, 14, 2, 24, 3, 34, 4, 14, 5, Ъ4, 6, 64, 1, 14, 8, 84, 9, 94, 10, 104, 11, 114, 12, 124, 13, 134, 14, 144 или более) недель сразу после введения предшествующей дозы.
Используемое здесь выражение "сразу после введения предшествующей дозы" означает последовательное введение дробных доз, то есть, дозы анти-Апд-2 антитела (или комбинированного состава, содержащего анти-Апд-2 антитело и антагонист VEGF), которую вводят пациенту непосредственно до введения следующей дозы без введения промежуточных доз.
Способы согласно этому аспекту изобретения могут включать введение пациенту любого числа вторых и/или третьих доз анти-Апд-2 антитела (или комбинированного состава, содержащего анти-Апд-2 антитело и антагонист VEGF). Так, например, в некоторых вариантах осуществления изобретения пациенту вводят только одну вторую дозу. В других вариантах осуществления изобретения пациенту вводят две или более (например, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8 или более) вторых доз. Аналогичным образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения пациенту вводят только одну третью дозу. В других вариантах осуществления изобретения пациенту вводят две или более (например, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8 или более) третьих доз.
В вариантах, относящихся к множеству вторых доз, каждая вторая доза может быть введена с той же частотой, как и другие вторые дозы. Так, например, каждая вторая доза может быть введена пациенту через 1-2 недели сразу после введения предшествующей дозы. Аналогичным образом, в вариантах, относящихся к множеству третьих доз, каждая третья доза может быть введена с той же частотой, как и другие третьи дозы. Так, например, каждая третья доза может быть введена пациенту через 2-4 недели сразу после введения предшествующей дозы. Альтернативно, частота введения пациенту вторых и/или третьих доз может варьировать в зависимости от курса лечения. Частота введения может быть также скорректирована врачом во время проведения курса лечения в зависимости от индивидуальных особенностей пациента после клинической оценки.
Настоящее изобретение относится к способам, включающим последовательное введение анти-Апд-2 антитела в комбинации с антагонистом VEGF пациенту для лечения ДОЖП или ВДЖП. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы согласно
изобретению включают введение одной или более доз анти-Апд-2 антитела, а затем одной или более доз антагониста VEGF. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы согласно изобретению включают введение одной дозы антагониста VEGF, а затем одной или более доз анти-Апд-2 антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения сначала могут быть введены одна или более доз приблизительно от 0,05 мг до 2 мг антагониста VEGF, а затем одна или более доз приблизительно от 0,05 мг до 10 мг ингибитора Ang-2. В одном из вариантов осуществления изобретения сначала могут быть введены одна или более доз анти-Апд-2 антитела, составляющих приблизительно от 1 мг/кг до 15 мг/кг массы тела индивидуума, а затем могут быть введены одна или более доз антагониста VEGF для лечения, устранения, ослабления симптомов или снижения тяжести одного или более состояний, ассоциированных с ДОЖП или ВДЖП (например, для ингибирования ангиогенеза). В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-Апд-2 антитело вводят в одной или более дозах для улучшения одного или более параметров (например, утолщения сетчатки, остроты зрения), а затем вводят антагонист VEGF (например, афлиберцепт) для предупреждения рецидивов или аддитивной активности. В своих альтернативных вариантах настоящее изобретение относится к одновременному введению анти-Апд-2 антитела и антагониста VEGF, который вводят в отдельной дозе с одной и той же или с различной частотой по сравнению с частотой введения анти-Апд-2 антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антагонист VEGF вводят до, во время или после введения анти-Апд-2 антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антагонист VEGF вводят в виде одного лекарственного состава вместе с анти-Апд-2 антителом. Доза
Количество ингибитора Апд-2 (например, анти-Апд-2 антитела), вводимого индивидууму способами согласно изобретению, составляет, в основном, терапевтически эффективное количество. Используемое здесь выражение "терапевтически эффективное количество" означает количество ингибитора Ang-2, дающее один или более из следующих результатов: (а) снижение уровня
разрастания сосудов сетчатки; (Ь) уменьшение площади неоваскуляризации сетчатки или хороидальной неоваскуляризации; (с) изменение толщины центрального отдела сетчатки; (d) увеличение продолжительности ингибирования разрастания сосудов глаза; и (е) уменьшение числа интравитреальных инъекций индивидууму, страдающему заболеванием или расстройством глаз, ассоциированным с ангиогенезом.
В случае анти-Апд-2 антитела, терапевтически эффективное количество вводимого анти-Апд-2 антитела может составлять приблизительно от 0,05 мг до 100 мг, например, приблизительно 0,05 мг, приблизительно 0,1 мг, приблизительно 1,0 мг, приблизительно 1,5 мг, приблизительно 2,0 мг, приблизительно 10 мг, приблизительно 2 0 мг, приблизительно 3 0 мг, приблизительно 40 мг, приблизительно 50 мг, приблизительно 60 мг, приблизительно 70 мг, приблизительно 80 мг, приблизительно 90 мг или приблизительно 100 мг. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-Апд-2 антитело вводят в количестве 0,5 мг, 1,0 мг, 3,0 мг или б, 0 мг.
Количество ингибитора Апд-2, содержащегося в отдельных дозах, может быть выражено в миллиграммах антитела на килограмм массы тела пациента (то есть, мг/кг). Так, например, ингибитор Ang-2 может быть введен пациенту в дозе приблизительно от 0,0001 до 100 мг/кг массы тела пациента.
В некоторых вариантах осуществления изобретения 0,5 мг, 1,0 мг, 3,0 мг или 6,0 мг анти-Апд-2 антитела вводят в комбинации с 0,05 мг и приблизительно до 10 мг антагониста VEGF (например, афлиберцепта).
Примеры
Нижеследующие примеры изложены так, чтобы специалист в данной области мог лучше понять сущность изобретения и способы получения и применения композиций согласно изобретению, которые не рассматриваются как ограничение объема изобретения, поданного заявителем. Были предприняты попытки получить точные значения (например, количеств, температур и т.п.), но при этом, должны быть учтены некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если это не оговорено особо, то части представлены как части по
массе, молекулярные массы представлены как средняя молекулярная масса, температура приводится в градусах Цельсия, а давление является атмосферным или близким к атмосферному.
Пример 1: Влияние комбинированного ингибирования VEGF и Ang2 с использованием афлиберцепта (VEGF-ловушки) и анти-Апд-2 антитела на развитие ангиогенеза сетчатки у мышей
Введение: VEGF представляет собой ключевой модулятор ангиогенеза при нормальном и патологическом ангиогенезе. Однако, в ангиогенезе также участвуют и другие факторы роста, и эти факторы опосредуют резистентность кровеносных сосудов к терапии анти-VEGF антителами. Было показано, что ангиопоэтин-2 (Ang2) участвует в росте и регрессии кровеносных сосудов в различных случаях в зависимости от конкретной ситуации. В этом исследовании авторами было протестировано влияние блокады VEGF с использованием одного афлиберцепта и в комбинации с ингибированием Ang2 под действием анти-Апд-2 антитела на разрастание и регрессию кровеносных сосудов у модели с нормальным развитием сосудов сетчатки (RVD).
Человеческие анти-Апд-2 антитела были получены как описано в публикации заявки на патент США No. US20110027286. Репрезентативным анти-Апд-2 антителом, используемым в настоящем изобретении и в нижеследующих примерах, является человеческое анти-Апд-2 антитело, обозначенное как Н1Н685 с HCVR/LCVR SEQ ID NN: 1/2 (также обозначаемое здесь как "тАЫ") .
В первом эксперименте анти-Апд-2 антитело было введено интравитреально отдельно или в комбинации с афлиберцептом.
Методы: Детенышей нормальных мышей С57В1/6 обрабатывали афлиберцептом и анти-Апд-2 антителом отдельно или в комбинации на дни 4-6 после рождения (Р4)-(Рб) . Детенышам на день Р4 интравитреально (IVT) инъецировали 5 мкг контрольного белка (hFc) , 5 мкг тАЫ (анти-Апд-2 антитела) или 1,25 мкг афлиберцепта, как одного агента, или смеси афлиберцепта и тАЫ. Детенышей подвергали гуманной эвтаназии на день Рб, а затем глаза удаляли и фиксировали в 4% параформальдегиде. Затем сетчатки разрезали и окрашивали ФИТЦ-меченным лектином GS I (на сосудистые эндотелиальные клетки).
Результаты: день Р4 был выбран как исходная точка для проведения лечения с использованием тАЫ в целях определения влияния ингибирования Ang2 и/или VEGF на RVD. Введение тАЫ или афлиберцепта приводило к снижению разрастания сосудов на поверхности сетчатки по сравнению с разрастанием сосудов у hFc-обработанного контроля. В частности, тАЫ и афлиберцепт снижали среднюю площадь васкуляризации сетчатки на 17% и 3 6%, соответственно, по сравнению с hFc-контролем, а комбинированная обработка тАЫ и афлиберцептом снижала площадь сосудов на 72%, что указывало на полное прекращение развития сосудов сетчатки после проведения всего периода лечения (по сравнению с площадью сосудов сетчатки на день Р4). тАЫ и афлиберцепт также снижали среднюю длину сосудов на 23% и 22%, соответственно, по сравнению с hFc-контролем. Комбинированная обработка тАЫ и афлиберцептом давала значимый синергический эффект, приводящий к резкому снижению общей длины сосудов на 77%. Общая длина кровеносных сосудов, подвергнутых комбинированной обработке, была даже на 25% меньше, чем в сетчатке на день Р4.
Во втором эксперименте вводимые дозы тАЫ (25 мг/кг, подкожно [SC]) и афлиберцепта (25 мг/кг, SC) превышали минимальные дозы, необходимые для достижения максимального подавления ангиогенеза сетчатки, если каждое лекарственное средство использовалось в виде одного агента. Введение тАЫ или афлиберцепта на день РЗ приводило к значительному снижению средней площади васкуляризации сетчатки на день Рб на 36% и 42%, соответственно, по сравнению с hFc-контролем. Кроме того, средняя площадь васкуляризации сетчатки у животных, обработанных тАЫ и афлиберцептом, была значительно ниже по сравнению с животными, обработанными только одним агентом, где такое снижение составляло 68%, что указывало на почти полное прекращение развития сосудов сетчатки по окончании всего периода лечения.
Выводы: Комбинированное фармакологическое ингибирование Ang2 и VEGF-A оказывало большее влияние на развитие ангиогенеза сетчатки, чем введение только блокатора Ang2 или VEGF-A, и такое ингибирование Ang2 и VEGF-A приводило почти к полному
прекращению развития сосудов сетчатки во время проведения лечения и к частичной регрессии кровеносных сосудов по сравнению с ситуацией, наблюдаемой в начале лечения на день Р4.
Пример 2: Влияние IVT-инъекции комбинированного состава, содержащего тАЫ и афлиберцепт, на неоваскуляризацию сетчатки (RNV) в глазах кроликов, индуцированную DL-альфа-аминоадипиновой кислотой (DL-альфа-ААА)
Глиальный токсин DL-альфа-ААА является мишенью для мюллеровских клеток сетчатки и астроцитов и вызывает неоваскуляризацию и непрерывное разрастание сосудов, продолжающееся по меньшей мере 12 месяцев (Kato et al. 1993; Neuroscience 57: 473) . Целью этого исследования является оценка влияния IVT-инъекции комбинированного состава, содержащего анти-Апд-2 антитело и афлиберцепт, на RNV, индуцированную DL-альфа-ААА.
Методы: Самцов новозеландских белых кроликов (с массой тела > 2 кг) обрабатывали одной интравитреальной инъекцией DL-альфа-ААА для индуцирования RNV. Затем проводили мониторинг разрастания сосудов и проводили количественную оценку неинвазивности с помощью флуоресцеиновой ангиографии (ФА) . Патологическое образование сосудов и относительно не изменяющуюся площадь разрастания сосудов оценивали в течение 13 недель после инъекции. После подтверждения заболевания, индивидуумов распределяли на три группы обработки, как указано ниже:
Группа I: 125 мкг/50 мкл афлиберцепта, IVT Группа II: 500 мкг/50 мкл тАЫ, IVT
Группа III: Комбинированный состав, содержащий 125 мкг афлиберцепта и 500 мкг тАЫ/50 мкл, IVT
Перед первой обработкой проводили базовую оценку для создания равных условий для групп обработки. Катамнестическое обследование проводили на недели 1, 2, 3, 4, 5, б, 7 и 8 после IVT-обработки. После проведения анализа с помощью флуоресцеиновой ангиографии (ФА) проводили количественную оценку площади разрастания сосудов с использованием программы Adobe Photoshop. Для мониторинга разрастания сосудов внутривенно
вводили флуоресцентный агент, а для мониторинга структуры сетчатки проводили оптическую когерентную томографию на световых волнах.
Результаты: Как показано на фигуре 1, разрастание сосудов снова наблюдалось на неделе 3 у животных, обработанных афлиберцептом, тогда как у животных, обработанных комбинацией тАЫ и афлиберцепта, площадь разрастания не изменялась до 8-й недели. Комбинированная обработка афлиберцептом и тАЫ может значительно увеличивать продолжительность антипролиферирующих эффектов до 3-кратного уровня по сравнению с эффектами, наблюдаемым при введении одной IVT-инъекции только афлиберцепта.
Пример 3: Системное введение только тАЫ или совместное IVT-введение тАЫ с VEGF-ловушкой в глаза кроликов и влияние такого введения на DL-AAA-индуцированное разрастание новых сосудов сетчатки
Целью этого исследования является оценка влияния комбинированной обработки анти-Апд-2 антителом и афлиберцептом на RNV, индуцированную DL-альфа-ААА, где после введения афлиберцепта в стекловидное тело проводили системное введение тАЫ. Целью этого исследования была попытка подавления разрастания сосудов и его поддержания в течение более длительных периодов времени путем первоначальной IVT-инъекции афлиберцепта и последующих системных инъекций анти-Апд-2 антитела один раз в две недели (q2w).
Как описано в примере 2, неоваскуляризацию сетчатки у самцов новозеландских кроликов индуцировали путем введения одной интравитреальной инъекции DL-альфа-ААА. Через 10 недель после индуцирования наблюдалась стабильная неоваскуляризация и разрастание сосудов сетчатки. Через десять недель после установления заболевания, животных распределяли на четыре группы по оценке степени разрастания и проводили обработку как указано ниже:
Группа 1: Контроль 42 мкг/50 мкл, IVT, и контроль 5 мг/кг, IV, q2w
Группа 2: Контроль 42 мкг/50 мкл, IVT, и тАЫ (анти-Апд-2 антитело) 15 мг/кг, IV, q2w
Группа 3: Афлиберцепт 125 мкг/50 мкл, IVT, и контроль 5 мг/кг, IV, q2w
Группа 4: Афлиберцепт 125 мкг/50 мкл, IVT, и тАЫ (анти-Ang-2 антитело) 15 мг/кг, IV, q2w.
Анализ площади разрастания проводили с помощью флуоресцеиновой ангиографии (ФА); базовой флуоресцеиновой ангиографии (ФА) и оптической когерентной томографии (ОКТ) до 1-ой обработки; а на недели 1, 2, 3, 4, б, 8, 10, 12 и 14 после IV-обработки проводили ФА и ОКТ.
Как показано на фигуре 2, в глазах, обработанных афлиберцептом, на неделе 2 не наблюдалось какого-либо разрастания. Было показано, что разрастание возобновлялось на 4-ю неделю при обработке только афлиберцептом. Однако, у животных, обработанных комбинацией афлиберцепта и тАЫ, какого-либо разрастания не наблюдалось вплоть до 10-й недели. Было показано, что у животных, подвергнутых комбинированной обработке, на 12-ю неделю наблюдалось возвращение к исходным уровням разрастания.
Пример 4: Влияние IVT-инъекции афлиберцепта на DL-альфа-ААА-индуцированную RNV и на разрастание сосудов в глазах кроликов
Это исследование представляет собой исследование дозозависимого влияния IVT-монотерапии афлиберцептом на DL-альфа-ААА-индуцированную неоваскуляризацию сетчатки (RNV) и разрастание сосудов в глазах кроликов. Как описано в примере 2, DL-альфа-ААА использовали для индуцирования RNV в глазах кроликов. После выявления RNV и разрастания сосудов, животных лечили 4 дозами афлиберцепта: 50 мкг, 125 мкг, 250 мкг и 500 мкг. Затем проводили мониторинг разрастания сосудов сетчатки и проводили количественную оценку с помощью ФА (как описано в настоящей заявке) в последующие периоды времени на недели 1, 2, 3, 4, 5, б, 8, 10 и 12 после IVT.
В отсутствии лечения ФА указывала на то, что неоваскуляризация сетчатки и разрастание сосудов сетчатки оставались постоянными на недели 10-22. В таблица 1 указано среднее время рецидивов разрастания после лечения, где "первый рецидив разрастания"=время рецидива любого разрастания, но не
полного рецидива.
Таблица 1: Среднее время до первого рецидива разрастания
IVT-доза VTE
Среднее (недели)
ср. кв. откл.
(недели)
Интервал (недели)
500 мкг (п=4)
8-12
250 мкг (п=3)
6,3
1,5
5-8
125 мкг (п=2)
4,5
0,7
4-5
5 0 мкг (п=2)
2,5
0,7
2-3
500 мкг афлиберцепта блокировали неоваскуляризацию сетчатки через 1 неделю, и такое разрастание не возобновлялось вплоть до 12 недели после лечения. Таким образом, лечение афлиберцептом приводило к подавлению разрастания сосудов и к частичной регрессии неоваскуляризации. Разрастание сосудов возобновлялось, но длительность ингибирования зависела от дозы.
Пример 5: Системное введение анти-Апд-2 антитела
ингибировало индуцированную матригелем хороидальную
неоваскуляризацию (CNV) у крыс
Введение: Апд2 представляет собой лиганд для тирозин-киназного рецептора Tie-2 и широко экспрессируется в сосудистом эндотелии растущих кровеносных сосудов и в сосудах, которые обнаруживают активный рост и ремоделирование при различных физиологических и патофизиологических состояниях. тАЫ представляет собой человеческое моноклональное нейтрализующее антитело против Ang-2. В этом исследовании была использована крысиная модель хороидальной неоваскуляризации (CNV) для оценки подавляющего действия тАЫ-опосредованного фармакологического ингибирования Ang-2 на CNV.
Методы: У крыс Sprague Dawley (SD) индуцировали CNV путем субретинальной инъекции матригеля на день 0. Одну группу животных (животные: N=4-6; глаза: N=8-12) использовали для определения базовых уровней, и этим животным вливали краситель [перхлорат 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина (Dil)] для окрашивания сосудов через 10 дней после индуцирования CNV. Других животных подразделяли на две группы (животные: N=5-6, и глаза: N=10-12, в каждой группе) и лечили маскированными растворами путем подкожной инъекции 25 мг/кг тАЫ или 6,5 мг/кг
hFc в эквимолярном количестве по отношению к тАЫ, соответственно, на дни 10, 13 и 16, а затем вливали Dil для окрашивания сосудов на день 20. Субретинальное поражение и объем CNV сосудов количественно оценивали для 50 мкм-срезов по всей площади поражений по формуле:
V=T х I А4
где: V: Общий объем поражения; Т: Толщина среза;
А: Площадь поражения или сосудов на каждом срезе.
Результаты двух идентичных экспериментов были объединены для сравнения объема поражения, объема сосудов и плотности сосудов у трех групп. Для сравнения различий объемов поражения, объемов сосудов и плотности сосудов у групп, леченных тАЫ, по отношению к контролю применяли двусторонний t-критерий Стьюдента. Концентрации функционального тАЫ и уровни анти-тАЫ антител в крысиной сыворотке измеряли с помощью прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Результаты: Системное введение тАЫ (25 мг/кг) крысам SD приводило к ингибированию общего объема поражения и объема сосудов по сравнению с hFc-обработанным контролем (фигура 3) . В контрольной группе объем субретинального поражения, объем новообразованных сосудов и плотность новообразованных сосудов повышались на 28,2%, 62,5%, и 28,6%, соответственно, на день 20 по сравнению с базовыми значениями на день 10. У тАЫ-обработанной группы наблюдалось 26,5%-ное снижение общего объема поражения и 26,9%-ное снижение объема сосудов по сравнению с hFc-обработанной группой, а плотность сосудов оставалась такой же, как и у hFc-обработанной группы (фигура 3) . У тАЫ-обработанной группы по сравнению с hFc-обработанным контролем, наблюдалось статистически значимое снижение общего объема поражения (t-критерий Стьюдента, р=0,0034), и наблюдалась тенденция (26,9%) к снижению объема новообразованных сосудов, но такое снижение не было статистически значимым (t-критерий Стьюдента, р=0,1658), что может быть обусловлено различиями
между группами. Аналитический биоанализ функциональных антител тАЫ и анти-тАЫ антител в пробах крысиной сыворотки выявил высокие концентрации функционального тАЫ у тАЫ-обработанных животных с уровнями 504+107 мкг/мл на последний день (день 20) (таблица 2). Отдельные анти-тАЫ ответы были отрицательными.
Таблица 2: Концентрация тАЫ и анти-тАЫ антител в пробах крысиной сыворотки
(-): Отрицательный ответ на антитело
Выводы: Эффекты тАЫ, нейтрализующего человеческое моноклональное антитело против Ang2, оценивали у крыс SD с CNV, индуцированной матригелем. Полученные результаты показали, что системная (подкожная) обработка антителом тАЫ может значительно ингибировать индуцированное матригелем CNV-поражение у крыс. Таким образом, в этом примере приводится дополнительное подтверждение целесообразности применения ингибиторов Ang-2 (таких как тАЫ) в качестве системной монотерапии для лечения сосудистых заболеваний глаз.
Пример 6: Состав, содержащий анти-Апд-2 антитело
Исследование по разработке состава включает скрининг буферов, органических сорастворителей и термостабилизаторов в жидких составах анти-Апд-2 антитела для идентификации наполнителей, повышающих стабильность белка. В целях определения оптимального рН для максимальной стабильности белка были также оценены буферные условия. Результаты, полученные в этих исследованиях, были применены для разработки стабильного жидкого состава, подходящего для клинического применения. Анти-Апд-2 антителом является человеческое анти-Апд-2 антитело с HCVR/LCVR SEQ ID NN: 1/2, обозначенное как Н1Н685 в публикации заявки на патент США US20110027286 (также обозначенное здесь как "тАЫ") .
Анти-Апд-2 антитело было сформулировано в четырех
концентрациях:
(i) 10 мг/мл+1,5 мг/мл,
(ii) 2 0 мг/мл+3,0 мг/мл,
(iii) 60 мг/мл+9,0 мг/мл, и
(iv) 120 мг/мл+18,0 мг/мл.
В различных вариантах осуществления изобретения, анти-Апд-2 антитело формулировали в 10+1,5 мМ фосфата натрия (рН 6,2+0,3), 0,03%+0,0045% полисорбата 20, 40 мМ+б,0 мМ хлорида натрия и 5%+0,75% сахарозы в воде.
Стабильность приготовленного сформулированной лекарственной субстанции и лекарственного продукта оценивали с помощью следующих анализов:
анализа цвета и внешнего вида путем визуального наблюдения; оценки рН; оценки мутности по увеличению оптической плотности на 4 05 нм; оценки размера визуально недетектируемых частиц путем визуализации микропотока (MFI); оценки концентрации белка с помощью ОФ-ВЭЖХ; оценки чистоты с помощью эксклюзионной ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии (ЭХ-УВЭЖХ); электрофореза в восстановленном и невосстановленном ПААГ с ДСН; анализа заряженного варианта с помощью катионнообменной УВЭЖХ; и оценки активности с помощью биоанализа. Более подробное описание приводится в примере 8.
Исследования на стабильность начинали с определения стабильности при хранении, стабильности при повышенных температурах (превышающих температуры в условиях хранения) и стабильности в условиях стресса (при встряхивании и при замораживании и оттаивании) исследуемых партий FDS, содержащих 10 мг/мл тАЫ и 120 мг/мл тАЫ. Эти условия были выбраны для точного определения концентраций белка в FDS, применяемых для приготовления клинического лекарственного продукта (DP) . Оценку исследуемых партий FDS в условиях повышенных температур и в условиях стресса осуществляли путем проведения серии тестов для FDS, разработанных для того, чтобы определить, как FDS в условиях повышенного стресса может влиять на процесс приготовления DP, и для идентификации путей разложения FDS,
содержащего тАЫ. Поликарбонатные 5 мл-сосуды заполняли FDS.
Исследования на стабильность лекарственной субстанции осуществляли как указано в таблицах 3 и 4:
Анализ
Анализируемые образцы
минут, 8Х замораживание/оттаивай ие
% Чистоты по ЭХ-УВЭЖХ
Все образцы
Анализ заряженного варианта методом КОХ-УВЭЖХ
Все образцы
Анализ заряженного варианта методом вКИЭФ
Все образцы
% Относительной активности тАЫ в биоанализе
t=0, 6, 12, 24 и 36 месяцев при -80°С и -20°С, 56 дней при 5°С, 28 дней при 25°С/60% RH и 40°С/75% RH встряхивание 120 минут, 8Х замораживание/оттаивай ие
Результаты испытаний на стабильность систематизированы ниже в таблицах 5-14:
Состав
10 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой,
Анализ
Время хранения (месяцы)
лекарственной субстанции 10 мг/мл тАЫ, после хранения при -20°С
Состав
10 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2 2
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой,
Анализ
Время хранения (месяцы)
Цвет и внешний вид
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Мутность (увеличение 0D на 405 нм)
0, 00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
6,2
6,2
6,2
6,2
6, 3
6,2
% общего тАЫ, выделенного с помощью ОФ-ВЭЖХ
100
104
103
106
105
100
Чистота в ПААГ с ДСН
Невосстановленн ый;
% главного пика
Восстановленный
о о
тяжелой+легкой цепи
100
100
Чистота по ЭХ-УВЭЖХ
% ВМП
2,3
2,1
2,0
1,9
1,8
1,9
% нативного продукта
96, 8
96, 7
96, 8
96, 8
97, 3
97, 3
% НМП
0,9
1,2
1,2
1,2
1,0
0,9
Анализ заряженного варианта с помощью КОХ-УВЭЖХ
% кислотного продукта
35, 9
35, 4
35, 5
34, 9
33, 5
34, 3
% главного продукта
56,2
56, 8
56, 9
57, 9
58,7
58,1
% основного продукта
7,8
7,7
7,6
7,3
7,9
7,6
Анализ заряженного варианта с помощью вКИЭФ
% кислотного продукта
33, 8
32, 7
34, 1
34,2
34, 1
34, 4
% главного продукта
59, 9
60, 6
59,5
60, 0
60, 1
59,5
% основного продукта
6, 3
6, 4
6, 3
5,8
5,7
6,2
12 0 мг
/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40
Состав
мМ хлорида натрия, 5% сахароза, 0,03% (масс./об. 20, рН 6,2
(масс./об . ) полисорбата
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой,
Время хранения (месяцы)
Анализ
Цвет и внешний вид
Проше л
Проше л
Проше л
Проше л
Проше л
Проше л
тест
тест
тест
тест
тест
тест
Мутность (увеличение OD на 405 нм)
0, 00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
6,2
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6,2
% общего тАЫ, выделенного с помощью ОФ-ВЭЖХ
100
101
105
101
103
Невосстановленн ый;
Чистота в
% главного пика
ПААГ с ДСН
Восстановленный
о о
100
100
тяжелой+легкой
цепи
Чистота по
% ВМП
2,6
2,7
2,6
2,7
2,6
2,7
Состав
120 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой,
Анализ
Время хранения (месяцы)
Цвет и внешний вид
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
лекарственной субстанции 120 мг/мл тАЫ, после хранения при -20°С
Состав
120 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2 20, рН 6,2
Полный объем
1,0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой, футерованной
Анализ
Время хранения (месяцы)
Цвет и внешний вид
Прошел тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Мутность (увеличение 0D на 4 05 нм)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
6,2
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
% общего тАЫ, выделенного с помощью 0Ф-ВЭЖХ
100
100
105
103
105
Чистота в ПААГ с ДСН
Невосстанов
ленный;
% главного
пика
Восстановле нный;
о о
тяжелой+лег кой цепи
100
100
100
Чистота по ЭХ-УВЭЖХ
% ВМП
2,6
2,6
2,5
2,7
2,6
2,7
% нативного продукта
96, 4
96, 3
96, 9
96,2
96, 5
96, 5
% НМП
1,0
1,1
0,7
1,1
0,9
0,8
Анализ заряженного варианта с помощью КОХ-УВЭЖХ
о о
кислотного продукта
35, 7
35, 4
35,2
34, 7
33, 1
34,2
% главного продукта
55, 8
56,2
56, 5
57,2
58,2
57, 5
% основного продукта
8,5
8,4
8,4
8,1
8,7
8,3
Состав
120 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2 20, рН 6,2
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой, футерованной
Анализ
Время хранения (месяцы)
Анализ заряженного варианта с помощью вКИЭФ
о о
КИСЛОТНОГО
продукта
33, 6
33, 5
32, 6
33,2
33, 7
33, 6
% главного продукта
59,9
60, 7
61, 8
60, 6
60,2
59,8
% основного продукта
6, 5
5,8
5,6
6,2
6,1
6, 5
% Относительной активности тАЫ в биоанализе
118
102
Состав
10 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой, футерованной силиконом
Анализ
Условия хранения/время хранения (дни)
хранили
5°С
25°C/60%RH
40°C/75%RH
% НМП
0,9
0,9
1,0
0,9
1,0
1,0
1,2
1,2
1,5
2,2
Анализ
заряженн
ого
варианта методом КОХ-УВЭЖХ
% КИСЛОТНОГО
продукта
35, 9
35, 9
35, 9
35, 4
36, 1
37, 0
38,6
41,0
46, 9
56, 0
% главного продукта
56,2
56, 5
56, 9
57, 1
55, 9
55, 4
54, 0
50,8
46, 1
37, 4
% основного продукта
7,8
7,7
7,2
7,5
8,0
7,6
7,5
8,2
7,0
6, 6
Анализ
заряженн
ого
варианта
методом
вКИЭФ
% кислотного продукта
33, 8
33, 9
33, 0
33, 9
33, 7
35, 3
37, 0
40,1
45,7
55, 1
% главного продукта
59,9
59,6
60, 7
59,5
59,6
57, 8
55, 6
52,5
46, 3
37,2
% основного продукта
6, 3
6, 4
6, 3
6, 6
6,7
6, 9
7,3
7,4
8,1
7,7
% Относительной активности тАЫ в биоанализе
101
136
Состав
120 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой, футерованной силиконом
Анализ
Условия хранения/время хранения (дни)
хранили
5°С
25°C/60%RH
40°C/75%RH
ЭХ-УВЭЖХ
% нативного продукта
96, 4
96, 5
96, 5
96, 4
96, 5
96, 3
95, 9
95, 0
93, 5
91,5
% НМП
1,0
0,9
0,9
0,9
0,8
0,8
1,1
1,2
1,7
1,9
Анали
заряж енног о
вариа
нта
метод
КОХ-
УВЭЖХ
% кислотного продукта
35, 7
35, 3
35, 6
34, 8
35, 9
36, 1
37, 5
39,7
44,9
53, 3
% главного продукта
55, 8
56,2
56,2
56, 6
55, 4
55, 0
53, 0
50,6
46,2
37, 8
% основного продукта
8,5
8,5
8,2
8,5
8,7
8,9
9,5
9,7
9,0
8,9
Анали
заряж енног
% кислотного продукта
33, 6
34, 4
32, 3
34,2
33,2
34,2
36, 1
38,4
44,8
54,2
% главного продукта
59,9
60, 0
61, 5
59,5
60, 3
58,9
56, 7
53, 9
46, 6
37, 4
Состав
120 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2
хлорида
натрия, 5% (масс.
/об.) сахароза,
Полный
объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд силиконом
с завинчивающейся полипропиленовой крышкой, футерованной
Условия хранения/вр
емя хранения (дни)
хранили
5°С
25°C/60%RH
40°C/75%RH
Анализ
вариа
нта метод
% основного продукта
5,5
6,1
вКИЭФ
6, 5
6, 3
6, 5
6, 9
7,2
7,8
8,6
8,4
о о
Относительной
активности тАЫ в
118
123
биоанализе
Состав
120 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой, футерованной силиконом
Анализ
Условия стресса/Продолжительность стресса
Без
стресса
Встряхивание (минуты)
Замораживание/отта ивание (циклы)
120
Цвет и внешний вид е
Прошел тест
Прошел тест
Прошел тест
Прошел тест
Прошел тест
Мутность (увеличение OD на
405 нм)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
6,2
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
% общего тАЫ, выделенного с помощью ОФ-ВЭЖХ
100
100
100
Состав
120 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой, футерованной силиконом
Анализ
Условия стресса/Продолжительность стресса
Без
стресса
Встряхивание (минуты)
Замораживание/отта ивание (циклы)
120
Чистота в ПААГ с ДСН
Невосстановле нный
% главного пика
Восстановленн ый;
о о
тяжелой+легко й цепи
100
100
100
Чистота по ЭХ-УВЭЖХ
% ВМП
2,6
2,7
2,8
2,8
3,0
% нативного продукта
96, 4
96, 4
96, 4
96, 3
96,2
% НМП
1,0
0,9
0,9
0,9
0,8
Анализ
заряженн
ого
варианта методом КОХ-УВЭЖХ
% кислотного продукта
35, 7
35, 8
35, 8
35, 8
35, 7
% главного продукта
55, 8
55, 9
56,2
56, 1
55, 8
% основного продукта
8,5
8,4
8,0
8,1
8,4
Анализ
заряженн
ого
варианта
методом
вКИЭФ
% кислотного продукта
33, 6
33,2
33,2
33, 9
33, 7
% главного продукта
59,9
60, 4
60, 3
59,5
60, 1
% основного продукта
6, 5
6, 4
6, 5
6, 6
6,2
% Относительной активности тАЫ в биоанализе
118
120
Экспериментальные испытания на стабильность т7АЫ-содержащих
лекарственных продуктов проводили как описано в таблицах 15 и 16:
Анализ
Анализируемые образцы
биоанализе
при 5°С; 6 месяцев при 25°С; 28 дней при 37°С, встряхивание 12 0 минут, 8Х замораживание/оттаивание
Результаты испытаний на стабильность лекарственных продуктов систематизированы в таблицах 17-22:
продукта, содержащего 120 мг/мл тАЫ, после хранения при 5°С
Состав
120 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2
Полный объем
0, 5 мл
Контейнер/Пробка
2 мл-сосуд из боросиликатного стекла типа I с пробкой West S2-F451 4432/50 GRY В2-40
Анализ
Время хранения (месяцы)
Цвет и внешний вид
Прошел тест
Прошел тест
Прошел тест
Прошел тест
Прошел тест
Мутность (увеличение OD на 405 нм)
0,00
0,00
0,00
0, 00
0,00
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
% тАЫ, выделенного с помощью ОФ-ВЭЖХ
100
101
продукта, содержащего 10 мг/мл тАЫ - Эффект в более жестких
условиях
Состав
10 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосафта натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2
Полный объем
0 ,5 мл
Контейнер/Пробка
2 мл-сосуд из боросилакитного стекла типа I с пробкой West S2-F451 4432/50 GRY В2-40
Анализ
Условия хранения/время хранения
храни ли
25°С (месяцы)
37°С (дни)
Цвет и внешний вид
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Мутность (увеличение 0D на 4 05 нм)
0,00
0,00
0,00
0, 00
0,00
0,00
0,00
6, 3
6,2
6,2
6,2
6, 3
6, 3
6, 3
% тАЫ, выделенного с помощью ОФ-ВЭЖХ
100
105
100
105
Чистота в ПААГ с ДСН
Невосстановлен ный; % главного пика
Восстановленны й;
о о
тяжелой+легкой цепи
100
100
Чистота по ЭХ-УВЭЖХ
% ВМП
1,4
1,3
1,4
1,3
1,2
1,3
1,3
% нативного продукта
97, 7
97, 4
96, 8
96, 5
97, 1
97, 0
96,2
% НМП
1,0
1,3
1,8
2,2
1,7
1,7
2,6
Анализ
заряженн
ого
варианта методом КОХ-УВЭЖХ
% кислотного продукта
39,3
41,4
48,1
53, 9
41,9
45,3
52, 1
% главного продукта
54, 6
52, 5
46, 1
40,6
52, 0
48,6
42, 1
% основного продукта
6,2
6,1
5,8
5, 5
6,1
6,1
5,8
Анализ
заряженн
ого
% кислотного продукта
37, 6
40,7
47,3
54, 7
40,1
44,2
51,7
% главного
57, 7
53, 4
47,5
39,2
54, 7
50,2
41,8
Состав
120 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2
Полный объем
0, 5 мл
Контейнер/Пробка
2 мл-сосуд из боросиликатного стекла типа I с пробкой West S2-F451 4432/50 GRY В2-40
Анализ
Условия хранения/время хранения
храни ли
25°С (месяцы)
37°С (дни)
Цвет и внешний вид
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Мутность (увеличение 0D на 4 05 нм)
0,00
0,00
0,00
0, 01
0,00
0,00
0,00
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
% тАЫ, выделенного с помощью 0Ф-ВЭЖХ
100
100
104
Чистота в ПААГ с ДСН
Невосстановлен ный; % главного пика
Восстановленны й;
о о
тяжелой+легкой цепи
100
100
100
Чистота
% ВМП
2,6
3,0
3,2
4,2
3,3
3,5
3,8
Состав
10 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2
Полный объем
0, 5 мл
Контейнер/Пробка
2 мл-сосуд из боросиликатного стекла типа I с пробкой West S2-F451 4432/50 GRY В2-40
Анализ
Условия стресса/время стресса
Без
стресс а
Перемешивание (минуты)
Замораживание/оттай вание (циклы)
120
Цвет и внешний вид
Прошел тест
Прошел тест
Прошел тест
Прошел тест
Прошел тест
Мутность (увеличение OD на 405 нм)
0,00
0,00
0,00
0,00
0, 00
Состав
120 мг/мл тАЫ, 10 мМ фосфата натрия, 40 мМ хлорида натрия, 5% (масс./об.) сахароза, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, рН 6,2
Полный объем
0, 5 мл
Контейнер/Пробка
2 мл-сосуд из боросиликатного стекла
типа I с
пробкой West S2-F451 4432/50
GRY В2-40
Анализ
Условия стресса/время стресса
Без
Перемешивание
Замораживание/отта
стресса
(минуты)
ивание (циклы)
120
Цвет и внешний вид
Прошел
Прошел
Прошел
Прошел
Прошел
тест
тест
тест
тест
тест
Мутность (увеличение 0D на 4 05 нм)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6,3
% тАЫ, выделенного с помощью ОФ-ВЭЖХ
100
Чистота
Невосстановле
в ПААГ с
нный; %
ДСН
главного пика
Восстановленн
ый;
о о
100
100
100
тяжелой+легко
й цепи
Чистота
% общего ВМП
2,6
2,6
2,6
3,0
3,0
по ЭХ-
% общего
УВЭЖХ
нативного
продукта
96, 5
96, 3
96, 3
96,2
96,2
% общего НМП
0,9
1,2
1,2
0,8
0,8
Анализ
% кислотного
заряженн
продукта
38,8
39,0
38,8
39,2
39,1
ого
% главного
варианта
продукта
54, 3
54, 5
54, 6
53, 6
53, 8
методом
% основного
КОХ-УВЭЖХ
продукта
6, 9
6, 5
6, 6
7,3
7,2
Анализ
% кислотного
заряженн
продукта
37, 7
37, 4
37,2
36, 8
37, 8
ого
% главного
варианта
продукта
58,0
58,5
58,2
58,5
57, 4
методом
% основного
вКИЭФ
продукта
4,3
4,1
4,5
4,7
4,8
Анализ
> 2 мкм
108
891
6365
частиц
> 10 мкм
175
Сформулированная лекарственная субстанция (FDS), 10 мг/мл тАЫ, является стабильной при его хранении при <-2 0°С по меньшей мере 12 месяцев.
FDS, содержащая 12 0 мг/мл тАЫ, является стабильной при его хранении при <-2 0°С по меньшей мере 12 месяцев.
FDS, содержащая 10 мг/мл тАЫ, была физически и химически стабильна после инкубирования в течение 5 6 дней при 5°С и сохранял свою активность при инкубировании при 5°С в течение 5 6 дней или при 25°С/относительной влажности 60% (RH) и при 40°С/75% RH в течение 2 8 дней.
FDS, содержащая 12 0 мг/мл тАЫ, была физически и химически стабильна после инкубирования в течение 5 6 дней при 5°С и сохраняла свою активность при инкубировании при 5°С в течение 5 6 дней или при 25°С/относительной влажности 60% (RH) и при 40°С/75% RH в течение 2 8 дней.
FDS, содержащая 10 мг/мл тАЫ, была физически и химически стабильна при перемешивании (встряхивании при температуре окружающей среды) в течение 12 0 минут или после проведения 8 циклов замораживания/оттаивания (замораживания при -3 0°С и оттаивания при комнатной температуре). При этом, мониторинг при любых условиях не выявил каких-либо явных изменений физической или химической стабильности. FDS, содержащая 10 мг/мл тАЫ, сохраняла активность при перемешивании (встряхивании при температуре окружающей среды) в течение 12 0 минут или после проведения 8 циклов замораживания/оттаивания (замораживания при -30°С и оттаивания при комнатной температуре).
FDS, содержащая 12 0 мг/мл тАЫ, была физически и химически стабильна при перемешивании (встряхивании при температуре окружающей среды) в течение 12 0 минут или после проведения 8
циклов замораживания/оттаивания (замораживания при -3 0°С и оттаивания при комнатной температуре). При этом, мониторинг при любых условиях не выявил каких-либо явных изменений физической или химической стабильности. FDS, содержащая 12 0 мг/мл тАЫ, сохраняла активность при перемешивании (встряхивании при температуре окружающей среды) в течение 12 0 минут или после проведения 8 циклов замораживания/оттаивания (замораживания при -30°С и оттаивания при комнатной температуре).
Лекарственный продукт (DP), содержащий 10 мг/мл тАЫ, является стабильным при его хранении при 2-8°С в течение по меньшей мере 9 месяцев.
DP, содержащий 12 0 мг/мл тАЫ, является стабильным при его хранении при 2-8°С в течение по меньшей мере 9 месяцев.
Пример 7: Комбинированный состав, содержащий анти-Апд-2 антитело и антагонист VEGF
Эксперименты по разработке комбинированного состава включали скрининг буферов, органических сорастворителей и термостабилизаторов в жидких составах, содержащих антагонист VEGF и анти-Апд-2 антитело, для идентификации наполнителей, повышающих стабильность белка. Была также проведена оценка буферных условий в целях определения рН, который является оптимальным для достижения максимальной стабильности белка. Результаты, полученные в этих испытаниях, были применены для разработки стабильного жидкого комбинированного состава, подходящего для его применения в клинических целях. Антагонист VEGF (также называемый здесь афлиберцептом) состоит из димера, включающего два полипептида, состоящих из аминокислот 27-457 SEQ ID NO: 11. Анти-Апд-2 антителом является человеческое анти-Апд-2 антитело (также называемое здесь "тАЫ"), содержащее HCVR/LCVR SEQ ID NN: 1/2 и обозначенное Н1Н685 в публикации заявки на патент США US20110027286. Антагонист VEGF был приготовлен в виде комбинированного состава с анти-Апд-2 антителом в четырех концентрациях:
(i) 40 мг/мл+б,0 мг/мл афлиберцепта с 10 мг/мл+1,5 мг/мл
тАЫ,
(ii) 40 мг/мл+б, 0 мг/мл афлиберцепта с 20 мг/мл+3, 0 мг/мл
тАЫ,
(iii) 40 мг/мл+б,0 мг/мл афлиберцепта с 60 мг/мл+9, 0 мг/мл тАЫ, и
(iv) 40 мг/мл+б,0 мг/мл афлиберцепта с 120 мг/мл+18,0 мг/мл
тАЫ .
В различных вариантах осуществления изобретения анти-Апд-2 антитело и антагонист VEGF были приготовлены в виде комбинированного состава, содержащего 10+1,5 мМ фосфата натрия (рН 6,2+0,3), 0,03%+0,0045% полисорбата 20, 40 мМ+б,0 мМ хлорида натрия и 5%+0,75% сахарозы в воде.
Стабильность сформулированной лекарственной субстанции и лекарственного продукта оценивали в анализах, описанных здесь в примере 8. Анализ заряженного варианта для сформулированной лекарственной субстанции и лекарственного продукта, проводили с помощью визуализирующего капиллярного изоэлектрического фокусирования (вКИЭФ).
Исследования на стабильность начинали с определения стабильности при хранении, стабильности при повышенных температурах (превышающих температуры в условиях хранения) и стабильности в условиях стресса (при встряхивании и при замораживании и оттаивании) исследуемых партий FDS, содержащих 10 мг/мл: 40 мг/мл и 120 мг/мл: 40 мг/мл FDS (тАЫ:афлиберцепта). Эти условия были выбраны для точного определения концентраций белка в FDS, применяемых для приготовления клинического DP. Оценку исследуемых партий FDS в условиях повышенных температур и в условиях стресса осуществляли путем проведения серии тестов для FDS, разработанных для того, чтобы определить, как FDS в условиях повышенного стресса может влиять на процесс приготовления DP, и для идентификации путей разложения FDS, содержащей тАЫ:афлиберцепт. Поликарбонатные 5 мл-сосуды заполняли FDS.
Исследования на стабильность комбинированной лекарственной субстанции осуществляли как указано в таблицах 2 3 и 24:
Таблица 23: Экспериментальное исследование на стабильность
стабильность сформулированной лекарственной субстанции,
содержащей тАЫ:афлиберцепт
Анализ
Анализируемые образцы
Цвет и внешний вид
Все образцы
Все образцы
Мутность (увеличение 0D на 405 нм)
Все образцы
% тАЫ, выделенного с помощью ОФ-ВЭЖХ
Все образцы
% афлиберцепта, выделенного с помощью ОФ-ВЭЖХ
Все образцы
Общая чистота (тАЫ+афлиберцепт) , определенная с помощью электрофореза в невосстановленном и восстановленном ПААГ с ДСН
t=0, 6, 12, 24 и 36 месяцев при -80°С, -30°С и -20°С 56 дней при 5°С, 28 дней при 25°С/60% RH и 40°С/75% RH, встряхивание 120 минут, 8Х замораживание/оттаивание
Анализ
Анализируемые образцы
Общая чистота (тАЫ+афлиберцепт) по ЭХ-УВЭЖХ
Все образцы
Анализ заряженного варианта REGN910 с помощью вКИЭФ
Все образцы
Анализ заряженного варианта афлиберцепта с помощью вКИЭФ
Все образцы
% Относительной активности тАЫ в биоанализе
t=0, 6, 12, 24 и 36 месяцев при -80°С и -20°С 56 дней при 5°С, 28 дней при 25°С/60% RH и 40°С/75% RH, встряхивание 120 минут, 8Х замораживание/оттаивание
% Относительной активности афлиберцепта в биоанализе
t=0, 6, 12, 24 и 36 месяцев при -80°С и -20°С 56 дней при 5°С, 28 дней при 25°С/60% RH и 40°С/75% RH встряхивание 120 минут, 8Х замораживание/оттаивание
Результаты испытаний на стабильность комбинированной лекарственной субстанции систематизированы ниже в таблицах 2 534 .
Таблица 25: Испытание на стабильность сформулированной лекарственной субстанции, содержащей тАЫ:афлиберцепт (10 мг/мл:
40 мг/мл) после хранения при -80°С
Состав
10 мг/мл тАЫ, 40 мг/мл афлиберцепта, 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 40 мМ хлорида натрия, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, 5% (масс./об.) сахарозы
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с
завинчивающейся полипропиленовой крышкой, футерованной силиконом
Анализ
Время хранения (месяцы)
Цвет и внешний вид
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Мутность (повышение OD на 405 нм)
0,00
0,01
0, 00
0,00
0,00
0,00
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
% общего состава, выделенного с помощью ОФ-ВЭЖХ
тАЫ
100
104
104
Афлиберцепт
100
102
101
103
102
Чистота в ПААГ с ДСН
Невосстановленный; % главного тАЫ+% главного афлиберцепта
Восстановленный; % тяжелой цепи тАЫ+% легкой цепи тАЫ+ % главного афлиберцепта
Чистота по ЭХ-УВЭЖХ
% общего ВМП
2,5
2,5
2,4
2,4
2,4
2,4
% общего нативного продукта
96, 8
97, 0
96, 9
97, 4
97, 0
97, 0
% общего НМП
0,7
0,6
0,7
0,2
0,6
0,6
Анализ заряженного варианта с помощью вКИЭФ
тАЫ
о о
КИСЛОТН ОГО
продукт а
33, 6
34, 3
33, 6
33, 8
35, 6
33, 9
о о
главног о
продукт а
59,9
60, 0
59, 7
59,7
57, 6
59,8
о о
ОСНОВНО ГО
продукт а
6, 5
5,8
6,7
6, 6
6, 8
6, 3
афлиберцеп
о о
КИСЛОТН
ого
продукт а
17, 4
17, 3
17, 1
16, 8
17, 9
16, 7
о о
главног о
78,4
78,6
78,6
78,9
77,8
79,2
Состав
10 мг/мл тАЫ, 40 мг/мл афлиберцепта, 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 40 мМ хлорида натрия, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, 5% (масс./об.) сахарозы
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой, футерованной силиконом
Анализ
Время хранения (месяцы)
Цвет и внешний вид
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Мутность (повышение 0D на 405 нм)
0,00
0,01
0, 00
0,00
0,00
0,00
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
% общего
состава,
выделенног
о с
помощью
ОФ-ВЭЖХ
тАЫ
100
105
104
102
Афлиберцепт
100
103
102
103
101
102
Чистота в ПААГ с ДСН
Невосстановленный; % главного тАЫ+% главного
афлиберцепта
Восстановленный;
% тяжелой цепи
тАЫ+ % цепи
легкой тАЫ+%
главного
афлиберцепта
Чистота по
% общего ВМП
2,5
2,5
2,4
2,5
2,4
2,4
ЭХ-УВЭЖХ
% общего продукта
нативного
96, 8
96, 9
96, 9
97, 3
97, 0
97,2
% общего НМП
0,7
0,6
0,7
0,2
0,6
0,5
Анализ
тАЫ
о о
заряженног
КИСЛОТН
о варианта
ОГО
с помощью вКИЭФ
продукт а
33, 6
34,2
34, 4
34, 3
33, 5
33, 6
о о
главног
продукт а
59,9
59,3
59, 1
60, 1
60, 0
60, 0
о о
ОСНОВНО
продукт а
6, 5
6, 5
6, 5
5,6
6, 5
6, 4
афлиберце
о о
КИСЛОТН
ого
17, 4
17, 0
17, 1
17, 5
17, 1
17, 1
продукт
о о
главног
78,4
78,7
78,8
78,5
78,7
78,8
продукт
о о
ОСНОВНО
4,2
4,3
4,2
4,1
4,2
4,1
продукт
о о
тАЫ
10 мг/мл mAb1, 4 0 мг
/мл афлиберцепта, 10
Состав
мМ фосфата натрия, рН 6,2, натрия, 0,03% (масс./об.)
4 0 мМ хлорида полисорбата
20, 5%
(масс./об.) сахарозы
Полный объем
1, 0 мл
Поликарбонатный
5 мл-сосуд
Контейнер/Пробка
завинчивающейся
полипропиленовой
крышкой, футерованной силиконом
Анализ
Время хранения (месяцы)
Цвет и внешний вид
Проше
Проше
Проше
Проше
Проше
Проше
тест
тест
тест
тест
тест
тест
Мутность (повышение 0D на 405 нм)
0,00
0,01
0, 00
0,00
0,00
0,00
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
% общего
тАЫ
100
105
101
101
108
состава,
Афлиберцепт
выделенног
о с
100
103
100
100
103
105
помощью
ОФ-ВЭЖХ
Чистота в
Невосстановленный;
ПААГ с ДСН
% главного тАЫ+ %
главного
афлиберцепта
Восстановленный;
% тяжелой цепи
тАЫ+ % легкой цепи тАЫ+%
главного
афлиберцепта
Чистота по
% общего ВМП
2,5
2,5
2,6
2,6
2,6
2,7
12 0 мг
/мл тАЫ, 4 0
мг/мл
афлиберцепта,
Состав
10 мМ
фосфата натрия, рН
6,2,
40 мМ
хлорида натрия,
0, 03%
(масс
./об.)
полисорбата 20, 5% (масс./об.) сахарозы
Полный объем
1, 0 мл
Поликарбонатный
5 мл-сосуд
Контейнер/Пробка
завинчивающейся
полипропиленовой
крышкой, футерованной силиконом
Анализ
Время хранения (месяцы)
Цвет и внешний вид
Проше
Проше
Проше
Проше
Проше
Проше
тест
тест
тест
тест
тест
тест
Мутность (повышение OD на 405
0,00
0,01
0, 01
0,00
0,00
0,00
нм)
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
% общего
тАЫ
100
103
100
105
104
состава,
Афлиберцепт
выделенног
о с
100
помощью
ОФ-ВЭЖХ
Чистота в
Невосстановленный;
ПААГ с ДСН
% главного тАЫ+%
главного
афлиберцепта
Восстановленный;
% тяжелой цепи
тАЫ+ % цепи
легкой тАЫ+%
главного
афлиберцепта
Чистота по
% общего ВМП
2,8
2,7
2,7
2,7
2,7
2,6
ЭХ-УВЭЖХ
% общего продукта
нативного
96, 4
96, 6
96, 4
96, 9
96, 3
96, 9
% общего НМП
0,8
0,7
1,0
0,4
1,0
0,6
Анализ
тАЫ
о о
заряженног
КИСЛОТН
о варианта
ОГО
33, 3
33, 4
33, 6
33,2
33, 3
33, 6
с помощью
продукт
вКИЭФ
о о
60, 4
60, 4
60, 0
60, 5
60, 3
60, 1
Состав
120 мг/мл тАЫ, 40 мг/мл афлиберцепта, 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 40 мМ хлорида натрия, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, 5% (масс./об.) сахарозы
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой, футерованной силиконом
Анализ
Время
хранения (месяцы)
Цвет и внешний вид
Проше л
Проше л
Проше л
Проше л
Проше л
Проше л
тест
тест
тест
тест
тест
тест
Мутность (повышение OD на 405 нм)
0,00
0,01
0, 00
0,00
0,00
0,00
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
% общего
тАЫ
100
105
101
104
104
105
состава, выделенног о с
Афлиберцепт
100
101
помощью ОФ-ВЭЖХ
Чистота в ПААГ с ДСН
Невосстановленный; % главного тАЫ+% главного афлиберцепта
Восстановленный;
% тяжелой цепи тАЫ+ % легкой цепи тАЫ+% главного афлиберцепта
Чистота по
% общего ВМП
2,8
2,7
2,7
2,8
2,8
2,7
ЭХ-УВЭЖХ
% общего продукта
нативного
96, 4
96, 6
96, 8
96, 7
96, 3
96, 8
% общего НМП
0,8
0,7
0, 6
0,6
1,0
0,6
Анализ
тАЫ
о о
заряженног о варианта с помощью
КИСЛОТНО ГО
продукта
33, 3
33, 5
33, 5
33, 4
33,2
33, 5
вКИЭФ
о о
главного продукта
60, 4
60, 3
60, 1
60, 3
60, 4
60, 3
о о
ОСНОВНОГ
продукта
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 4
6,2
афлиберце
о о
КИСЛОТНО
продукта
15, 9
16,2
16, 1
17, 3
16, 8
14, 9
Состав
120 мг/мл тАЫ, 40 мг/мл афлиберцепта, 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 40 мМ хлорида натрия, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, 5% (масс./об.) сахарозы
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой, футерованной силиконом
Анализ
Время хранения (месяцы)
Цвет и внешний вид
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Проше л
тест
Мутность (повышение OD на 405 нм)
0,00
0,01
0, 00
0,00
0,00
0,00
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
% общего
состава,
выделенног
о с
помощью
ОФ-ВЭЖХ
тАЫ
100
104
103
103
106
107
Афлиберцепт
100
101
Чистота в ПААГ с ДСН
Невосстановленный; % главного тАЫ+% главного
афлиберцепта
Восстановленный;
% тяжелой цепи
тАЫ+ % легкой
цепи тАЫ+%
главного
афлиберцепта
Чистота по ЭХ-УВЭЖХ
% общего ВМП
2,8
2,7
2,7
2,8
2,9
2,8
% общего нативного продукта
96, 4
96, 7
96, 6
96, 7
96,2
96, 7
% общего НМП
0,8
0,6
0, 8
0,6
0,9
0,6
Анализ заряженног о варианта с помощью вКИЭФ
тАЫ
о о
КИСЛОТН ОГО
продукт а
33, 3
34,2
34, 1
33, 9
34, 7
33, 3
о о
главног о
продукт а
60, 4
59,6
59, 6
59,8
59,1
60, 4
о о
ОСНОВНО ГО
продукт а
6, 3
6,2
6, 4
6, 3
6,2
6, 3
афлиберце
о о
КИСЛОТН
ого
продукт а
15, 9
16, 4
14, 3
17,2
15, 5
16, 7
о о
главног о
продукт а
80,7
80,0
81,3
78,0
79,5
79,1
о о
ОСНОВНО ГО
продукт а
3,4
3,7
4,4
4,8
5,1
4,2
о о
тАЫ
110
Относитель
Афлиберцепт
ной
активности
109
133
140
биоанализе
помо
щью
ОФ-
ВЭЖХ
Чист
Невосстановленный;
ота
% главного тАЫ+%
главного афлиберцепта
ПААГ
Восстановленный;
ДСН
% тяжелой цепи тАЫ + % легкой цепи тАЫ+% главного афлиберцепта
Чист
% общего ВМП
2,5
2,2
2,3
2,3
2,2
2,6
2,8
4,8
9,5
11,2
ота по
% общего продукта
нативного
96, 8
96, 6
97, 1
97, 6
96, 8
96, 3
96, 6
94,2
88,8
87,9
ЭХ-
% общего НМП
УВЭЖ
0,7
1,2
0,6
0,2
1,0
1,2
0,7
1,0
1,7
0,9
Анал
тАЫ
о о
заря
КИСЛОТНО ГО
33, 6
34,2
34,2
34, 3
34, 3
36, 3
36, 3
38,7
49,6
53, 5
женн
продукта
ого
о о
вари
главного
59,9
59,3
59,3
59,5
59,8
56, 9
56, 7
53, 6
42, 0
38,3
анта
продукта
мето
о о
дом вКИЭ
ОСНОВНОГ О
6, 5
6, 5
6, 5
6,2
6, 0
6, 8
7,0
7,7
8,4
8,2
продукта
афлиберцеп т
о о
кислотно го
продукта
17, 4
17, 6
17, 6
16, 9
17,2
17, 3
18,1
18,3
21,9
23,4
о о
главного продукта
78,4
78,0
78,0
78,8
78,6
78,5
77,8
77,8
75,5
73,8
о о
ОСНОВНОГ О
продукта
4,2
4,4
4,4
4,3
4,2
4,2
4,2
3,9
2,7
2,8
о о
Отно сите льно й
акти
внос
ти в
биоа
нали
тАЫ
113
136
афлиберцепт
118
109
112
щью ОФ-ВЭЖХ
Чист
ота
ПААГ
Невосстановленный;
% главного тАЫ+%
главного
афлиберцепта
ДСН
Восстановленный;
% тяжелой цепи тАЫ +
% легкой цепи тАЫ +
% главного
афлиберцепта
Чист
% общего ВМП
2,8
2,8
2,9
3,0
3,0
3,4
3,5
5,1
8,6
10, 7
ота по
% общего продукта
нативного
96, 4
96, 0
96, 4
96, 4
96, 1
95, 3
95, 5
93, 8
89,2
87, 0
ЭХ-
УВЭЖ
% общего НМП
0,8
1,1
0,7
0,6
0,9
1,3
0,9
1,1
2,3
2,3
Анал из
заря женн
REGN 910
о о
КИСЛОТНО ГО
продукта
33, 3
33, 5
33, 6
33, 5
34,2
35, 8
36,2
38,7
48,9
51, 9
ого
вари
анта
о о
главного продукта
60, 4
60, 1
60, 1
60, 0
59,1
57, 4
56, 8
53, 4
42, 0
38, 7
помо щью
о о
основног о
6, 3
6, 4
6, 3
6, 4
6,7
6, 9
7,0
7,9
9,1
9,4
вКИЭ
продукта
афлиберцеп
о о
кислотно го
продукта
15, 9
15, 8
15, 7
15, 8
15, 9
16, 4
16, 9
14, 4
19,8
22, 8
о о
главного
80,7
80,3
79,9
80,0
79,6
79,4
78,9
81,7
77,1
75,0
продукта
о о
ОСНОВНОГ О
3,4
3,9
4,3
4,2
4,5
4,2
4,2
3,9
3,1
2,2
продукта
о о
Отно
тАЫ
141
143
сите
афлиберцепт
льно
акти
внос
109
121
107
104
ти в
биоа
нали
Состав
120 мг/мл тАЫ, 40 мг/мл афлиберцепта, 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 40 мМ хлорида натрия, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, 5% (масс./об.) сахарозы
Полный объем
1, 0 мл
Контейнер/Пробка
Поликарбонатный 5 мл-сосуд с завинчивающейся полипропиленовой крышкой, футерованной силиконом
Анализ
Условия стресса/время стресса
Без
стресс
Встряхивание (минуты)
Замораживание/отт аивание (циклы)
120
Цвет и внешний вид
Прошел тест
Прошел тест
Прошел тест
Прошел тест
Прошел тест
Мутность (повышение OD на 405 нм)
0,00
0,01
0,00
0,00
0,00
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
% общего состава, выделенного с помощью ОФ-ВЭЖХ
тАЫ
100
101
104
103
Афлиберцепт
100
101
Чистота в ПААГ с ДСН
Невосстановленный; % главного тАЫ+ % главного афлиберцепта
Восстановленный; % тяжелой цепи тАЫ+ % легкой цепи тАЫ+ % главного афлиберцепта
Чистота по ЭХ-УВЭЖХ
% общего ВМП
2,8
3,2
3,7
2,7
2,8
% общего нативного продукта
96, 4
96, 3
95, 7
96, 5
96, 4
% общего НМП
0,8
0,6
0,6
0,8
0,8
Анализ заряженного варианта с помощью вКИЭФ
тАЫ
о о
кислотно го
продукта
33, 3
34, 3
34,2
33, 9
34, 0
о о
главного продукта
60, 4
59,4
59,4
59,8
59,6
о о
ОСНОВНОГ О
продукта
6, 3
6,2
6, 4
6, 4
6, 3
афлиберце
о о
кислотно го
продукта
15, 9
16, 8
16, 3
15, 8
16, 6
о о
главного
80,7
78,3
79,0
79,9
79,3
продукта
о о
ОСНОВНОГ
продукта
3,4
4,9
4,7
4,3
4,2
о о
Относительн ой
активности в
биоанализе
тАЫ
афлиберцепт
109
143
тАЫ:афлиберцепт
Исследования на стабильность комбинированных лекарственных продуктов осуществляли как указано в таблицах 35 и 36:
Анализ
Анализируемые образцы
% афлиберцепта, выделенного с помощью ОФ-ВЭЖХ
Все образцы
Общая чистота (тАЫ+афлиберцепт) , определенная с помощью электрофореза в невосстановленном и восстановленном ПААГ с ДСН
t=0, 6, 12, 24 и 36 месяцев при 5°С ; 6 месяцев при 25°С, 28 дней при 37°С, встряхивание 12 0 минут, 8Х замораживание/оттаивание
Общая чистота (тАЫ+афлиберцепт) по ЭХ-УВЭЖХ
Все образцы
Анализ заряженного варианта тАЫ с помощью вКИЭФ
Все образцы
Анализ заряженного варианта афлиберцепта с помощью вКИЭФ
Все образцы
Анализ частиц по MFI
t=0, 6, 12, 24 и 36 месяцев при 5°С ; 6 месяцев при 25°С, 28 дней при 37°С, встряхивание 12 0 минут, 8Х замораживание/оттаивание
% Относительной активности тАЫ в биоанализе
t=0, 6, 12, 24 и 36 месяцев при 5°С ; 6 месяцев при 25°С, 28 дней при 37°С, встряхивание 12 0 минут, 8Х замораживание/оттаивание
% Относительной активности афлиберцепта в биоанализе
t=0, 6, 12, 24 и 36 месяцев при 5°С ; 6 месяцев при 25°С, 28 дней при 37°С, встряхивание 12 0 минут, 8Х замораживание/оттаивание
Результаты испытаний на стабильность комбинированных
5°С
лекарственных продуктов систематизированы ниже в таблицах 37-42.
I с пробкой West S2-F451 4432/50 GRY В2-40
Анализ
Время хранения (месяцы)
Цвет и внешний вид
Прошел тест
Прошел тест
Проше л
тест
Прошел тест
Прошел тест
Мутность (повышение 0D на 405 нм)
0,00
0, 00
0,00
0,00
0,00
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
% общего
состава,
выделенног
о с
помощью
ОФ-ВЭЖХ
тАЫ
100
100
104
афлиберцепт
100
102
101
Чистота в ПААГ с ДСН
Невосстановленный; % главного тАЫ+ % главного афлиберцепта
Восстановленный; % тяжелой цепи тАЫ+ % легкой цепи тАЫ+ % главного афлиберцепта
Чистота по ЭХ-УВЭЖХ
% общего ВМП
1,6
1,7
1,8
1,9
2,0
% общего нативного продукта
97, 6
97, 8
97, 8
97, 4
97, 5
% общего НМП
0,8
0, 6
0,4
0,7
0,5
Анализ заряженног о варианта с помощью вКИЭФ
тАЫ
о о
КИСЛОТН ОГО
продукт а
37, 1
37, 6
37, 5
37, 5
37, 6
о о
главног о
продукт а
58,1
58, 0
57, 8
58,2
57, 8
о о
ОСНОВНО
4,8
4,4
4,7
4,3
4,7
при 5°С
Состав
120 мг/мл тАЫ, 40 мг/мл афлиберцепта, 10 мМ фосфата натрия, рН 6,2, 40 мМ хлорида натрия, 0,03% (масс./об.) полисорбата 20, 5% (масс./об.) сахарозы
Полный объем
0, 5 мл
Контейнер/пробка
2 мл-сосуд из боросиликатного стекла типа I с пробкой West S2-F451 4432/50 GRY В2-40
Анализ
Время хранения (месяцы)
Цвет и внешний вид
Прошел тест
Прошел тест
Проше л
тест
Прошел тест
Прошел тест
Мутность (повышение 0D на 405 нм)
0,00
0, 00
0,00
0,00
0,00
6, 3
6, 4
6, 3
6, 3
6, 3
% общего
состава,
выделенног
о с
помощью
ОФ-ВЭЖХ
тАЫ
100
102
101
103
102
афлиберцепт
100
103
104
Чистота в ПААГ с ДСН
Невосстановленный; % главного тАЫ+ % главного афлиберцепта
Восстановленный; % тяжелой цепи тАЫ+ % легкой цепи тАЫ+ % главного афлиберцепта
Чистота по ЭХ-УВЭЖХ
% общего ВМП
2,4
2,8
3,0
3,2
3,4
% общего нативного продукта
96, 6
96, 5
96, 3
96, 1
96, 0
% общего НМП
1,1
0,7
0,6
0,8
0,7
Анализ заряженног о варианта методом вКИЭФ
тАЫ
о о
КИСЛОТН ОГО
продукт а
37, 7
37, 6
37, 5
37, 7
37, 5
о о
главног о
продукт а
57, 8
57, 9
57, 8
57, 6
57, 7
о о
ОСНОВНО ГО
продукт
4,5
4,5
4,7
4,7
4,8
афлиберц епт
о о
КИСЛОТН ОГО
продукт а
19,5
18, 0
18,2
18,8
18,1
о о
главног о
продукт а
77,9
80,0
79,1
77,5
77,8
о о
ОСНОВНО ГО
продукт а
2,6
2,0
2,7
3,7
4,0
Анализ
> 2 мкм
3276
2400
частиц по MFI
(частицы/м л)
> 10 мкм
145
> 2 5 мкм
о о
тАЫ
Относитель ной
активности (в
биоанализе
афлиберцепт
109
130
Восстановленный;
% тяжелой цепи тАЫ+ % легкой цепи тАЫ+ %
главного афлиберцепта
Чистота по
% общего ВМП
1,6
2,3
2,8
3,5
2,8
3,7
5,3
ЭХ-УВЭЖХ
% общего продукта
нативного
97, 6
97, 1
96, 5
95, 0
95, 9
95, 6
93, 7
% общего НМП
0,8
0,7
0,7
1,5
1,3
0,8
1,0
Анализ
тАЫ
о о
заряженног
кислотного
о варианта
продукта
37, 1
39,3
45,9
53,2
40,6
43,7
50,3
с помощью
% главного
вКИЭФ
продукта
58,1
54, 9
48,2
40,5
53, 7
50,2
42, 7
% основного
продукта
4,8
5,8
5,9
6,2
5,7
6,1
7,0
афлиберцепт
о о
кислотного
продукта
19,5
21,3
22,2
26, 1
20,9
22, 3
24,2
% главного
продукта
77,5
75,5
74,7
71,4
76, 0
74,7
72, 8
% основного
продукта
3,0
3,2
3,1
2,6
3,1
3,0
2,9
Анализ
> 2 мкм
4137
3628
1593
частиц по MFI
(частицы/м
> 10 мкм
103
105
> 2 5 мкм
о о
Относитель ной
активности в
биоанализе
тАЫ
124
123
афлиберцепт
125
146
139
с ДСН
афлиберцепта
Восстановленный; % тяжелой цепи тАЫ+% легкой цепи тАЫ+ % главного афлиберцепта
Чистота по ЭХ-УВЭЖХ
% общего ВМП
2,4
3,7
4,5
5,2
4,2
5,0
6, 5
% общего нативного продукта
96, 6
95, 5
94, 5
93, 1
94, 5
93, 8
92, 0
% общего НМП
1,1
0,8
1,1
1,7
1,4
1,2
1,6
Анализ
заряжен
ного
вариант
методом вКИЭФ
тАЫ
% кислотного продукта
37, 7
40,2
46, 4
53, 7
41,2
44,5
50,3
% главного продукта
57, 8
54,2
47,5
39,2
52, 9
49,2
42, 5
% основного продукта
4,5
5,6
6,2
7,1
5,9
6, 3
7,2
афлиберцепт
% кислотного продукта
19, 5
18,8
20,5
23,1
20,2
20,4
22, 5
% главного продукта
77, 9
79,0
77,7
75,0
77,7
77,1
75,5
% основного продукта
2,6
2,2
1,8
1,9
2,1
2,6
2,0
Анализ частиц по MFI (частиц ы/мл)
> 2 мкм
3276
2701
953
> 10 мкм
145
> 2 5 мкм
о о
ОТНОСИТ
тАЫ
116
афлиберцепт
109
108
ельной активно сти в биоанал изе
12 0 мг / мл mAb 1, 4 0 мг / мл
афлиберцепта, 10 мМ фосфата натрия,
Состав
рН 6,2, 40 мМ хлорида натрия, 0,03%
(масс./об.) полисорбата 20, 5%
(масс./об.) сахарозы
Полный объем
0, 5 мл
Контейнер/пробка
2 мл-сосуд из боросиликатного стекла типа I с пробкой West S2-F451 4432/50 GRY В2-40
Анализ
Условия стресса/время стресса
Без
стресс а
Встряхивание (минуты)
Замораживание /оттаивание (циклы)
120
Цвет и внешний вид
Прошел тест
Прошел тест
Проше л
тест
Прошел тест
Проше л
тест
Мутность (повышение 0D на 405 нм)
0,00
0,01
0,00
0,00
0,00
6, 3
6, 3
6, 3
6, 3
6, 4
% общего состава, выделенного с помощью ОФ-ВЭЖХ
тАЫ
100
102
101
101
101
афлиберцепт
100
100
100
103
103
Чистота в ПААГ с ДСН
Невосстановленный; % главного тАЫ+ % главного афлиберцепта
Восстановленный; % тяжелой цепи тАЫ+ % легкой цепи тАЫ+ % главного афлиберцепта
Чистота по ЭХ-УВЭЖХ
% общего ВМП
2,4
2,3
2,3
2,5
2,6
% общего нативного продукта
96, 6
96, 9
97, 0
96, 7
96, 7
% общего НМП
1,1
0,8
0,7
0,8
0,8
Анализ
заряженного
варианта
методом
вКИЭФ
тАЫ
о о
КИСЛОТНО
продукта
37, 7
37,3
37, 5
37, 5
37, 6
о о
главного продукта
57, 8
58,2
57, 9
57, 9
57, 9
о о
ОСНОВНОГ
4,5
4,5
4,5
4,6
4,6
Сформулированная лекарственная субстанция (FDS), 10:40 мг/мл т7АЫ: афлиберцепта, является стабильной при его хранении при <-2 0°С по меньшей мере 12 месяцев;
FDS, содержащая 120:40 мг/мл тАЫ:афлиберцепта, является стабильной при его хранении при <-2 0°С по меньшей мере 12 месяцев.
FDS, содержащая 10 мг/мл:40 мг/мл тАЫ:афлиберцепта, была физически и химически стабильна после инкубирования в течение 5 6 дней при 5°С или 2 8 дней при 25°С/60% RH. Мониторинг при любых условиях не выявил каких-либо явных изменений физической или химической стабильности. тАЫ и афлиберцепт сохраняли свою активность при инкубировании 10 мг/мл:40 мг/мл FDS при 5°С в течение 56 дней или при 25°С/60% RH в течение 28 дней.
FDS, содержащая 12 0 мг/мл:40 мг/мл тАЫ:афлиберцепта, была физически и химически стабильна после инкубирования в течение 5 6
дней при 5°С. Мониторинг при любых условиях не выявил каких-либо явных изменений физической или химической стабильности. 12 0 мг/мл:40 мг/мл FDS сохраняла свою физическую стабильность после инкубирования в течение 28 дней при 25°C/60% RH. Мониторинг при любых условиях не выявил каких-либо явных изменений физической или химической стабильности. тАЫ и афлиберцепт сохраняли свою активность при инкубировании 10 мг/мл:40 мг/мл FDS при 5°С в течение 56 дней или при 25°С/60% RH в течение 28 дней.
FDS, содержащая 10 мг/мл:40 мг/мл тАЫ:афлиберцепта, сохраняла свою физическую и химическую стабильность при перемешивании (встряхивании при температуре окружающей среды) в течение 12 0 минут или после проведения 8 циклов замораживания/оттаивания (замораживания при -30°С и оттаивания при комнатной температуре). Мониторинг при любых условиях не выявил каких-либо явных изменений физической или химической стабильности. тАЫ и афлиберцепт сохраняли свою активность при перемешивании 10 мг/мл:40 мг/мл FDS (при встряхивании при температуре окружающей среды) в течение 12 0 минут или после проведения 8 циклов замораживания/оттаивания (замораживания при -30°С и оттаивания при комнатной температуре).
FDS, содержащая 10 мг/мл:40 мг/мл тАЫ:афлиберцепта, сохраняла свою физическую и химическую стабильность при перемешивании (при встряхивании при температуре окружающей среды) в течение 60 минут или после проведения 8 циклов замораживания/оттаивания (замораживания при -30°С и оттаивания при комнатной температуре). Мониторинг при любых условиях не выявил каких-либо явных изменений физической или химической стабильности. Хотя при перемешивании FDS (встряхивании при температуре окружающей среды) в течение 12 0 минут наблюдалось 0,9% увеличение количества высокомолекулярного продукта (ЭХ-УВЭЖХ) , однако, мониторинг при любых других условиях не выявил каких-либо явных изменений. Перемешивание путем встряхивания в течение 12 0 минут представляет собой условия экстремального стресса, а поэтому, при получении FDS, содержащей 12 0 мг/мл: 4 0 мг/мл тАЫ:афлиберцепта, встряхивание было минимизировано. тАЫ
и афлиберцепт сохраняли свою активность при перемешивании 10 мг/мл:40 мг/мл FDS (встряхивании при температуре окружающей среды) в течение 12 0 минут или после проведения 8 циклов замораживания/оттаивания (замораживания при -30°С и оттаивания при комнатной температуре).
Лекарственный продукт (DP), содержащий 10:40 мг/мл тАЫ:афлиберцепта, был стабильным при хранении при 2-8°С в течение по меньшей мере 9 месяцев.
DP, содержащий 120:40 мг/мл тАЫ:афлиберцепта, был стабильным при хранении при 2-8°С в течение по меньшей мере 9 месяцев.
Пример 8: Методы, применяемые для оценки стабильности составов
Испытания на стабильность FDS и DP, содержащих тАЫ и тАЫ:афлиберцепт, проводили с помощью нижеследующих анализов: оценки цвета и внешнего вида путем визуального наблюдения; оценки рН; оценки мутности по увеличению оптической плотности (OD) на 405 нм; анализа визуально недетектируемых частиц на DP в визуализирующем микропотоке (MFI); и определения концентрации белка с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ).
Чистоту оценивали путем проведения следующих анализов:
анализа с помощью эксклюзионной ультравысокоэффективной
жидкостной хроматографии (ЭХ-УВЭЖХ; электрофореза в
восстановленном и невосстановленном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН).
Анализ заряженного варианта проводили с помощью следующих анализов: катионообменной УВЭЖХ (КОХ-УВЭЖХ) на FDS и DP тАЫ; визуализирующего капиллярного изоэлектрического фокусирования (вКИЭФ) на FDS и DP, содержащие тАЫ и тАЫ:афлиберцепт.
Активность оценивали с помощью биоанализов на тАЫ в тАЫ-содержащем составе и на тАЫ и афлиберцепт в составе, содержащем тАЫ:афлиберцепт. Относительную активность каждого образца определяли с помощью биоанализа и вычисляли по формуле: (IC50 эталонного образца/1С50 образца) х 100%. Измеренная активность
образцов, обладающих стабильностью при хранении, должна составлять в пределах 50-150% от измеренной активности эталонного стандарта.
Физическую стабильность состава оценивают по таким свойствам, как цвет, внешний вид, рН, мутность и концентрация белка. Присутствие визуально обнаруживаемых частиц в растворе может быть детектировано путем визуального наблюдения. Считается, что раствор прошел визуальный тест, если он был прозрачным или слегка мутноватым; в основном, не содержал визуально детектируемых частиц и был бесцветным или имел бледно-желтую окраску. Для детектирования частиц в растворе может быть также осуществлена оценка на мутность, проводимая по увеличению OD на 4 05 нм. Увеличение OD на 4 05 нм может указывать на присутствие частиц, повышение мутности или изменение цвета тестируемых изделий. MFI применяют для оценки визуально не
детектируемых частиц размером> 2 мкм. Концентрацию белка определяют с помощью ОФ-ВЭЖХ-анализа и выражают как процент выделенного белка по отношению к исходному веществу. В ОФ-ВЭЖХ-анализе, один пик тАЫ отделяют от одного пика афлиберцепта после элюирования с обращенно-фазовой колонки. Концентрацию тАЫ определяют путем сравнения площади пика тАЫ с площадью пика стандартного тАЫ по калибровочной кривой, а концентрацию афлиберцепта определяют путем сравнения площади пика афлиберцепта с площадью пика стандартного афлиберцепта по калибровочной кривой. Процент выхода вычисляют исходя из измеренной концентрации тАЫ или афлиберцепта по отношению к концентрации исходного тАЫ или афлиберцепта, соответственно.
Химическая стабильность означает образование ковалентно модифицированных форм (например, ковалентных агрегатов, продуктов расщепления и форм заряженных вариантов) и нековалентно модифицированных форм (например, нековалентных агрегатов) белка. Высокомолекулярные и низкомолекулярные продукты разложения могут быть отделены от продукта с нативной молекулярной массой с применением ЭХ-УВЭЖХ- и ДСН ПААГ-методов. Процент расщепленного тАЫ в ЭХ-УВЭЖХ-методе вычисляют как
отношение площади всех не-нативных пиков к общей площади всех пиков тАЫ. Чистоту тАЫ, оцениваемую в невосстановленном и восстановленном ПААГ с ДСН, вычисляют как отношение интенсивности главной полосы к общей интенсивности всех полос. Варианты заряженных форм тАЫ разделяют с помощью вКИЭФ и КОХ-УВЭЖХ. В этих методах, пики, у которых pi смещается в сторону более низких значений, чем у главного пика, называют "кислотными" пиками, а пики, у которых значения pi выше, чем у главного пика, называют "основными" пиками.
Составы, содержащие тАЫ:афлиберцепт, охарактеризовывают по
чистоте продукта с общей молекулярной массой (нативного
тАЫ+нативного афлиберцепта) с помощью ЭХ-УВЭЖХ (то есть,
чистоту молекулярной массы тАЫ и афлиберцепта не определяют
отдельно), поскольку нативные молекулы тАЫ и афлиберцепта не
могут быть полностью отделены друг от друга. Аналогичным
образом, составы, содержащие тАЫ:афлиберцепт,
охарактеризовывают с использованием общих высокомолекулярных
продуктов (высокомолекулярное тАЫ+высокомолекулярный
афлиберцепт) и общих низкомолекулярных продуктов
(низкомолекулярное тАЫ+низкомолекулярный афлиберцепт LMW), поскольку высокомолекулярное тАЫ не может быть отделено от высокомолекулярного афлиберцепта, а низкокомолекулярное тАЫ не может быть отделено от низкокомолекулярного афлиберцепта.
Процент общих высокомолекулярных продуктов или общих низкомолекулярных продуктов в тАЫ:афлиберцепте, определяемый с применением ЭХ-УВЭЖХ-метода, вычисляют как отношение площади общих высокомолекулярных продуктов или общих низкомолекулярных продуктов к общей площади всех пиков тАЫ:афлиберцепт, соответственно. Чистоту, оцениваемую в невосстановленном и восстановленном ПААГ с ДСН, вычисляют как отношение интенсивности (главной полосы афлиберцепта+главной полосы тАЫ) к общей интенсивности всех полос. Афлиберцепт представляет собой в высокой степени гликозилированный белок, имеющий высокий уровень сиаловой кислоты. Из-за сложного распределения зарядов на афлиберцепте, КОХ-УВЭЖХ-метод не позволяет в достаточной степени разделить все формы заряженного варианта, а поэтому,
этот метод не применяется для анализа изменений профиля заряженных вариантов для образцов тАЫ:афлиберцепт. Формы заряженного варианта тАЫ и афлиберцепта, которые представляют собой комбинированный состав, содержащий тАЫ:афлиберцепт, разделяют только посредством вКИЭФ.
Для тАЫ, пики, у которых pi смещается в сторону более низких значений, чем у главного пика, называют "кислотными" пиками, а пики, у которых значения pi выше, чем у главного пика, называют "основными" пиками. Для афлиберцепта, пики 3-8 пики представляют пики, называемые "главными" пиками. Пики афлиберцепта, у которых pi смещается в сторону более низких значений, чем у пика 3, называют "кислотными" пиками, а пики, у которых значения pi выше, чем у пика 8, называют "основными" пиками.
Пример 9: Сравнение стабильности составов, содержащих тАЫ, тАЫ:афлиберцепт и афлиберцепт, после их хранения
Результаты ЭХ-УВЭЖХ, проводимой в исследованиях по оценке стабильности исследуемых составов, содержащих 10 мг/мл тАЫ, 120 мг/мл тАЫ и 4 0 мг/мл афлиберцепта, после их хранения, сравнивали с результатами, полученными для комбинированных составов тАЫ:афлиберцепт (10 мг/мл: 40 мг/мл) и (120 мг/мл: 40 мг/мл). Этот анализ проводили для того, чтобы определить, может ли комбинированный состав "тАЫ и афлиберцепт" иметь различные относительные количества высокомолекулярных продуктов при их сравнении с отдельно приготовленными растворами тАЫ и афлиберцепта (моносоставами). Результаты ЭХ-УВЭЖХ для моносоставов, инкубированных в условиях, эквивалентных условиям инкубирования комбинированных составов, были применены для вычисления теоретического увеличения процента высокомолекулярных продуктов комбинированного состава, содержащих одинаковые концентрации каждого белка. Теоретическое увеличение процента высокомолекулярных продуктов сравнивали с увеличением процента высокомолекулярных продуктов, наблюдаемым при инкубировании фактического комбинированного лекарственного продукта при 5°С. Партии DS, используемые в этих исследованиях, представляют собой
репрезентативные DS, изготавливаемые промышленностью в клинических целях.
Ниже представлены систематизированные результаты ЭХ-УВЭЖХ, полученные для составов, содержащих 10 мг/мл только тАЫ, 4 0 мг/мл только афлиберцепта и комбинацию тАЫ:афлиберцепт (10 мг/мл: 40 мг/мл), после их хранения при 5°С. После хранения в течение 9 месяцев при 5°С, содержание высокомолекулярного продукта в составе с 10 мг/мл тАЫ не увеличивалось. За аналогичный период проведения исследования, % высокомолекулярных продуктов в составе с 4 0 мг/мл афлиберцепта, увеличивался на 0,4%. Исходя из результатов, полученных для составов с 10 мг/мл тАЫ и 40 мг/мл афлиберцепта, было теоретически вычислено, что увеличение содержания высокомолекулярных продуктов на 0,4% происходит в течение 9-месячного периода исследования в комбинированном составе тАЫ:афлиберцепт (10 мг/мл: 4 0 мг/мл). 0,4% увеличение общего количества высокомолекулярных продуктов наблюдалось для DP "тАЫ:афлиберцепт" (10 мг/мл: 4 0 мг/мл) в течение 9-месячного периода исследования. Совпадение вычисленного увеличения с наблюдаемым увеличением % высокомолекулярных продуктов позволяет предположить, что хранение тАЫ и афлиберцепта как DP тАЫ:афлиберцепт (10 мг/мл: 4 0 мг/мл) в течение 9 месяцев при 5°С не приводит к увеличению уровня продуцирования высокомолекулярных форм по сравнению с увеличением, наблюдаемым для отдельно приготовленных лекарственных продуктов.
Ниже представлены систематизированные результаты ЭХ-УВЭЖХ, полученные для составов, содержащих 120 мг/мл только тАЫ, 40 мг/мл только афлиберцепта и комбинацию тАЫ:афлиберцепт (12 0 мг/мл: 40 мг/мл), после их хранения при 5°С. После хранения в течение 9 месяцев при 5°С, содержание высокомолекулярного продукта в составе со 120 мг/мл тАЫ и 40 мг/мл афлиберцепта увеличивалось на 0,5% и 0,4%, соответственно. Исходя из результатов, полученных для составов со 120 мг/мл тАЫ и 40 мг/мл афлиберцепта, было теоретически вычислено, что увеличение содержания высокомолекулярных продуктов на 0,9% происходит в
течение 9-месячного периода инкубирования в комбинированном составе тАЫ:афлиберцепт (120 мг/мл: 40 мг/мл) . Этот теоретический результат был сравним с увеличением общих высокомолекулярных продуктов на 1,0% для DP "тАЫ:афлиберцепт" (12 0 мг/мл: 4 0 мг/мл) в течение 9-месячного хранения при 5°С. Близкое соответствие вычисленного увеличения с фактическим увеличением % высокомолекулярных продуктов позволяет предположить, что хранение тАЫ и афлиберцепта как DP тАЫ:афлиберцепт (12 0 мг/мл: 4 0 мг/мл) в течение 9 месяцев при 5°С не приводит к увеличению уровня продуцирования высокомолекулярных форм по сравнению с увеличением, наблюдаемым для отдельно приготовленных лекарственных продуктов.
Пример 10: Клиническое испытание по интравитреальному (IVT) введению тАЫ в комбинации с афлиберцептом пациентам с неоваскулярными ВДЖП или ДОЖП
Это исследование представляет собой открытое клиническое испытание фазы I с увеличением доз, проводимое для оценки безопасности, переносимости и эффективности IVT-введения только тАЫ или тАЫ в комбинации с афлиберцептом пациентам с неоваскулярными ВДЖП или ДОЖП.
Главной целью такого испытания является исследование безопасности и переносимости IVT-введения тАЫ и афлиберцепта и IVT-введения только тАЫ пациентам с неоваскулярной ВДЖП и пациентам только с ДОЖП.
Другими целями этого испытания являются: (i) характеризация системной фармакокинетики (ФК) тАЫ и афлиберцепта после IVT-инъекции тАЫ и афлиберцепта; и (ii) анализ на присутствие анти-тАЫ антител и антител против афлиберцепта после IVT-инъекции.
Первичной конечной точкой является вероятность возникновения и тяжесть побочных эффектов, вызываемых офтальмическим и системным лечением (ТЕАЕ) в течение 2 4 недель у пациентов, которым интравитреально вводили только тАЫ или комбинированный состав с тАЫ и афлиберцептом.
Вторичными конечными точками являются: (i) фармакокинетика; и (ii) продуцирование антител против лекарственного средства
(ADA) после IVT-инъекции комбинированного состава.
Исследуемыми конечными точками являются: (1) изменение BCVA по сравнению с базовым значением; (2) изменение толщины центральной области сетчатки по сравнению с базовым значением (измеренным по ОКТ) на недели 12 и 24; и (3) число инъекций афлиберцепта PRN начиная с недели 12 и до недели 20.
Для пациентов только с ВДЖП: (i) изменение площади ХНВ по сравнению с базовым значением (измеренным с помощью ФА) на неделю 12 и неделю 24; (ii) изменение общей площади поражения по сравнению с базовым значением (измеренным с помощью ФА) на неделю 12 и неделю 24; (iii) изменение площади разрастания сосудов по сравнению с базовым значением (измеренным с помощью ФА) на неделю 12 и неделю 24.
Для пациентов только с ДОЖП: изменение DRSS (измеренное с помощью ФГД) по сравнению с базовым значением на неделю 12 и неделю 24.
Обоснование дизайна исследования
Терапия анти-VEGF антителом (например, афлиберцептом) представляет собой стандартное терапевтическое лечение неоваскулярных ВДЖП и ДОЖП. Нацеливание на пути VEGF и ангиопоэтина-2 (Ang-2) при неоваскулярном заболевании глаз может повышать эффективность лечения по сравнению с лечением только одним анти-VEGF антителом, а также обеспечивать их более длительное действие с более продолжительными интервалами между введениями. В преклинической модели неоваскуляризации сетчатки и хронического разрастания сосудов у кроликов, индуцированного DL-ААА, лечение путем внутривенного (IV) введения тАЫ (15 мг/кг) и IVT-введения афлиберцепта (125 мкг/50 мкг) приводило к ингибированию разрастания сосудов в течение 8 недель, тогда как при введении только афлиберцепта, такое ингибирование наблюдалось только в течение 3 недель (см. подробно в примере 2) .
В другом испытании влияние тАЫ на развитие сосудов сетчатки сравнивали с влиянием афлиберцепта или влиянием лечения тАЫ и афлиберцептом. Дозы тАЫ (25 мг/кг, подкожно [SC] ) и афлиберцепта (25 мг/кг, SC) , применяемые в этом эксперименте,
превышали минимальные дозы, необходимые для достижения максимального подавления ангиогенеза сетчатки, если каждое лекарственное средство было введено как одно средство. Введение тАЫ или афлиберцепта на РЗ приводило к значительному уменьшению средней площади васкуляризации сетчатки, измеренной на Рб, на 36% и 42%, соответственно, по сравнению с hFc-контролем. Кроме того, средняя площадь васкуляризации сетчатки была значительно меньше у животных, обработанных тАЫ и афлиберцептом, по сравнению с животными, обработанными только одним из этих агентов, и такое снижение составляло 68%, что указывает на почти полное прекращение развития сосудов сетчатки за данный период лечения (см. подробно в примере 3). Обоснование выбора доз
Исходная доза состояла из комбинированного состава 0,5 мг тАЫ : 2 мг афлиберцепта, вводимого посредством IVT-инъекции в исследуемый глаз. 2 мг-доза афлиберцепта была эквивалентна дозе, которая была апробирована и является коммерчески доступной для лечения "мокрой" ВДЖП и закупорки центральной вены сетчатки.
Доза комбинированного состава, 0,5 мг: 2 мг, представляет собой половину от наименьшей дозы, вводимой билатерально в стекловидное тело яванским макакам при проведении токсикологического исследования в соответствии с надлежащей лабораторной практикой (GLP). Дозы до б мг тАЫ в комбинации с 2 мг афлиберцепта и только б мг тАЫ хорошо переносились обезьянами.
Схема введения этой исходной дозы с биологической точки зрения основана на DL-AAA-модели неоваскуляризации глаз кроликов. В этой модели комбинированный состав для IVT-введения афлиберцепта (0,125 мг) и тАЫ (0,5 мг) давал значительное увеличение продолжительности антипролиферирующих эффектов с 3 недель до 8 недель по сравнению с эффектами, достигаемыми при монотерапии афлиберцептом. Предполагается, что при экстраполяции на человеческий глаз (который приблизительно в 4 раза больше глаза кролика), дозы, составляющие от 0,5 мг до 0,6 мг, будут биологически активными. Таким образом, исходная доза 0,5 мг является целесообразной с фармакологической точки зрения (см.
пример 2).
Безопасность предполагаемой исходной дозы была подтверждена в 13-недельном токсикологическом IVT-испытании на обезьянах, которым вводили дозы 1, 3 и б мг тАЫ в комбинации с 2 мг афлиберцепта билатерально и дозу б мг только тАЫ. Если учесть, что объем полости стекловидного тела человека приблизительно в 4 раза превышает объем полости стекловидного тела обезьяны, то исходная доза является в 8 раз менее эффективной, чем наименьшая доза в испытании на обезьянах, и приблизительно в 4 8 раз менее эффективной, чем наивысшая планируемая доза. Таким образом, самая низкая доза, применяемая в IVT-испытании на обезьянах, обеспечивает адекватный уровень безопасности для предлагаемой клинической исходной дозы.
Дизайн исследования
Это испытание состоит из периода скрининга (от дня -21 до дня -1), первого визита (день 1), периода лечения (от дня 1 до дня 57), периода наблюдения (от дня 85 до дня 141) и последнего визита в данном испытании [день 169 (неделя 24)]. На день 1/первый визит, пациенты, включенные в программу испытания, были обследованы на безопасность, а затем им была введена первая доза исследуемого лекарственного средства.
На день 1, день 2 9 и день 57, пациентам вводили инъекцию комбинированного состава (тАЫ и афлиберцепта) или только тАЫ всего 3 дозы. Исходная группа получала комбинированный состав в дозе 0,5 мг: 2 мг. План введения комбинированного состава и только тАЫ представлен в таблице 43. Если была определена предельно допустимая доза (ПДД), то доза только одного тАЫ будет соответствовать наивысшей дозе тАЫ, вводимой в комбинированном составе тАЫ и афлиберцепта.
Таблица 43: Планируемые уровни доз
Группа (п=4-8)
тАЫ: афлиберцепт, IVT
тАЫ, IVT
0,5 мг: 2 мг
1 мг: 2 мг
3 мг: 2 мг
6 мг: 2 мг
6 мг
Последнюю дозу исследуемого лекарственного средства вводили на неделю 8. Интравитреальную инъекцию афлиберцепта (2 мг) вводили всем пациентам, начиная с 12-ой недели до 2 0-й недели в течение всего исследования глаз. Пациенты, которым вводили афлиберцепт на неделю 12, продолжали лечение путем введения инъекций афлиберцепта по возможности в течение месяца.
Пациентов обследовали при их визитах во время испытания на офтальмологическую и системную безопасность (включая офтальмологическое обследование, лабораторные анализы и т.п.) и эффективность лечения (с помощью оптической когерентной томографии [ОКТ], флуоресцентной ангиографии [ФА]/фотографии глазного дна [ФГД], аутофлуоресценции глазного дна [АФГД] и BCVA в соответствии с 4-параметрическим протоколом испытания способа лечения диабетической ретинопатии на ранней стадии [ETDRS]), и продолжали до недели 2 4 (окончания испытания).
Выбор обследуемого глаза/второго глаза: В этом испытании обследовали только 1 глаз пациента. Глаз, включенный в программу испытаний, был назван обследуемым глазом. Другой глаз рассматривался как второй глаз.
Для пациентов, глаза которых удовлетворяли критерию включению пациентов в программу испытаний, глаз, имеющий самую низкую оценку BCVA, был выбран как обследуемый глаз. Если у пациента в обоих глазах наблюдались одинаковые оценки BCVA, то в качестве обследуемого глаза был выбран глаз с самыми прозрачными внутренними структурами. Если внутренние структуры обоих глаз имели одинаковую прозрачность, то в качестве обследуемого глаза был выбран недоминантный глаз пациента (если он был идентифицирован) . Если ни один глаз не был доминантным, то в качестве обследуемого глаза был выбран правый глаз.
Обследуемые группы
Приблизительно 2 0-4 0 пациентов были включены в эту программу испытания с увеличением доз. Четырем группам пациентов, которым вводили последовательно повышающиеся дозы,
было запланировано введение комбинированного состава тАЫ и афлиберцепта (0,5 мг: 2 мг, 1 мг: 2 мг, 3 мг: 2 мг, и б мг: 2 мг) , а 1 группе было запланировано введение только тАЫ (б мг) . Группа для каждой дозы первоначально состояла из 4 пациентов, 2 с ДОЖП и 2 с ВДЖП. Если у 1 пациента наблюдалась дозо-лимитирующая токсичность (ДЛТ), то эту группу расширяли путем включения 2 дополнительных пациентов с ДОЖП и/или 2 дополнительных пациентов с ВДЖП. В эксперименте могут параллельно участвовать Группы 4 и 5, если, при этом, участвует группа 4.
Увеличение доз и правила прекращения испытаний Решение о введении следующей более высокой дозы комбинированного состава тАЫ и афлиберцепта было принято исходя из информации о безопасности и переносимости этой дозы пациентами с ВДЖП и ДОЖП, обследуемыми в данной группе с последующей регистрацией данных. Решение об увеличении дозы может быть принято после наблюдения за последним пациентом в данной группе (с ВДЖП и с ДОЖП) по меньшей мере в течение 1 недели после введения ему первой дозы исследуемого лекарственного состава. Группа, получающая только тАЫ, будет включена в испытание в группу с введением ПДД или самой высокой дозы (б мг) , если ПДД не была идентифицирована. Если ПДД не была идентифицирована, то в эту группу включали группу, которой одновременно вводили комбинированный состав б мг: 2 мг тАЫ:афлиберцепт.
Если наблюдалась ДЛТ, то эта группа может быть расширена. Расширенная группа может включать 2 дополнительных пациента с ВДЖП и/или 2 дополнительных пациента с ДОЖП. Принятие решения об увеличении числа пациентов в каждой группе в количестве более 4-х после обнаружения ДЛТ позволяет повысить вероятность дифференциации некоторых побочных эффектов, которые, как известно, возникают спорадически при IVT-инъекциях (например, реакция гиперчувствительности или умеренное или тяжелое воспаление внутриглазных тканей), от истинной ДЛТ, ассоциированной с введением исследуемого лекарственного средства. Расширение группы не является автоматическим. Вместо
этого, по имеющимся данным может быть проведено обсуждение клинической значимости любой потенциальной ДЛТ для того, чтобы определить, следует ли расширить группу или вводить пациентам следующую более высокую дозу комбинированного состава.
Все пациенты наблюдались по меньшей мере через 7 дней после введения им комбинированного состава тАЫ и афлиберцепта и перед начальным включением в группу для введения следующей дозы (хотя скрининг группы для следующей дозы можно начать до подтверждения безопасности текущей дозы). Расширение группы со следующей дозой осуществляют сразу после того, как все первых 4 пациента, включенных в группу, завершат обследование на безопасность с регистрацией данных на день 8 (визит 7) . См. таблицу 44, в которой представлены правила увеличения доз и прекращения их введения.
Таблица 44: Правила увеличения доз и прекращения их введения
Число пациентов с ДЛТ на группу
Действие
0 из 4
Увеличение следующей дозы
1 из 4 пациентов с ВДЖП или ДОЖП
Рассматривается расширение группы с текущей дозой на 2 пациента с ВДЖП и/или 2 пациента с ДОЖП вплоть до 8 пациентов
1 из 6 или 8
Увеличение следующей дозы
> 2 в любой группе
Прекращение включения в группу с т е кущими доз ами.
Если наблюдалось 2 или более случаев ДЛТ, то введение доз приостанавливали до проведения анализа на безопасность. По результатам анализа на безопасность было принято решение продолжать планируемые испытания, расширить группу, которой вводили текущую дозу, или прекратить введение текущей дозы. В этом случае, наблюдаемая токсичность будет рассматриваться как дозолимитирующая, и доза, которая ниже наивысшей вводимой дозы, будет рассматриваться как ПДД. Если в любой группе (в исходной группе или в расширенной группе, которой вводили дозу) наблюдался 1 побочный эффект (ПЭ) 4-й степени или серьезный побочный эффект (СПЭ) 4-й степени, то введение дозы может быть
приостановлено, а перед введением последующей дозы может быть проведен тщательный анализ на безопасность. Дозолимитирующая токсичность
ДЛТ определяли как офтальмическую токсичность 2-й или 3-й степени, определенную по шкале оценки офтальмической токсичности, или токсичность 3-й или 4-й степени, оцененную специалистами Управления по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA), сентябрь 2007, Guidance for Industry, по шкале оценки степени токсичности для здоровых добровольцев, которыми являются взрослые и подростки, участвующие в программе клинических испытаний по предварительной вакцинации.
Предельно допустимая доза
ПДД определяют как дозу, уровень которой несколько ниже уровня дозы, при которой введение доз прекращали из-за наличия ДЛТ 2-й степени или более. Если испытание не прекращали из-за ДЛТ, то это означает, что ПДД не была определена.
Группы, участвующие в испытании
Участниками испытания были мужчины и женщины в возрасте 50 лет и старше, страдающие неоваскулярной ВДЖП, или мужчины и женщины в возрасте 18 лет и старше, страдающие клинически диагностированным ДОЖП с нарушением центрального зрения.
Критерии включения: Для включения в программу испытания,
пациент должен удовлетворять нижеследующим критериям: (1) для
пациентов с ВДЖП: (а) активная субфовеальная хороидальная
неоваскуляризация (ХНВ), вызываемая ВДЖП, включая
юкстафовеальные поражения, которые разрушают ямку сетчатки, как было оценено по ФА или ОКТ глаза, обследуемого экспериментатором, и (Ь) мужчины или женщины в возрасте> 50 лет и старше. Для пациентов с ДОЖП: (с) пациенты, страдающие клинически диагностированным ДОЖП с нарушением центрального зрения (> 300 мкм в центральной подобласти на спектральной доменной ОКТ) ; и (d) мужчины или женщины в возрасте> 50 лет и старше; (2) желание и возможность посещать клинику и точно соблюдать процедуры в соответствии с проводимыми испытаниями; и
(3) получение письменного информированного согласия.
Критерии исключения: Из испытания исключаются пациенты, удовлетворяющие любому из нижеследующих критериев: (1) (а) для пациентов с неоваскулярной ВДЖП: наличие ХНВ, вызываемой любыми поражениями, не относящимися к ВДЖП в любом глазе; наличие ДР или ДОЖП в любом глазе; (Ь) для пациентов с ДОЖП: наличие неоваскулярной ВДЖП или ХНВ, вызываемых любыми поражениями в любом глазе; (2) предварительное введение афлиберцепта в любой глаз; (3) IVT-введение бевацизумаба, ранибизумаба или натрий-содержащего пегаптаниба в обследуемый глаз в течение 8 недель, начиная со дня 1, или наличие побочных эффектов, ассоциированных с проведением какого-либо предварительного лечения и являющихся противопоказаниями к введению в этом испытании; (4) любое ранее проводимое лечения ингибиторами ангиопоэтина; (5) любое предварительное системное (IV) введение анти-VEGF антитела; (6) наличие в анамнезе хирургической операции на стекловидном теле сетчатки обследуемого глаза; (7) лазерная фотокоагуляция всех тканей сетчатки или лазерная фотокоагуляция желтого пятна обследуемого глаза в течение 3 месяцев после визита для обследования; (8) предварительное введение кортикостероидов интраокулярно или периокулярно в обследуемый глаз в течение 4 месяцев после начала обследования; (9) внутриглазное давление
(ВГД) > 25 мм рт. ст. обследуемого глаза при обследовании/при первом визите; (10) наличие инфекционного блефарита, кератита, склерита или конъюнктивита в любом глазе при обследовании/при первом визите; (11) любое внутриглазное воспаление/инфекция в любом глазе в течение 3 месяцев после визита для обследования;
(12) имеющаяся неоваскуляризация радужки, кровоизлияние в стекловидное тело или визуально детектируемое отслоение сетчатки в обследуемом глазу при визите для обследования; (13) невозможность сделать фотографии или пройти ФА или ОКТ для документального подтверждения ХНВ, например, из-за мутности центральных структур, аллергии на флуоресцеиновый краситель или отсутствие доступа к вене при обследовании/при первом визите;
(14) не поддающийся лечению сахарный диабет, по мнению
экспериментатора; (15) нерегулируемое кровяное давление
(определяемое как систолическое давление > 1б0 мм рт. ст. или
диастолическое давление > 95 мм рт. ст. у пациента в положении
сидя); (16) наличие в анамнезе нарушения мозгового
кровообращения или инфаркта миокарда в течение 180 дней со дня
1; (17) почечная недостаточность, диализ или пересадка почки в
анамнезе; (18) зарегистрированная чувствительность к
доксициклину или к аналогичному соединению (то есть, к
тетрациклинам); (19) зарегистрированная чувствительность к любым
соединениям исследуемого состава; (20) беременные или кормящие
женщины; и (21) сексуально активные мужчины или женщины,
способные к деторождению, но не желающие использовать адекватную
контрацепцию во время испытания (адекватными контрацептивными
мерами являются постоянное использование пероральных
контрацептивов или других назначенных врачом фармацевтических
контрацептивов в течение 2 или более менструальных циклов до
проведения обследования; использование внутриматочных
приспособлений; двусторонняя перевязка маточных труб; вазектомия; использование презервативов плюс контрацептивных губок, пен или гелей или мембран плюс контрацептивных губок, пен или гелей).
Экспериментальное лечение
Экспериментальное и стандартное лечение
Комбинированный состав "тАЫ и афлиберцепт" представляет собой лекарственный продукт, который состоит из тАЫ (анти-Апд-2 антитела) и афлиберцепта. В данном испытании этот состав поставляется в виде водного раствора в стерильных одноразовых стеклянных 2 мл-сосудах для IVT-введения в нижеследующих концентрациях (с прогрессирующим увеличением концентрации, применяемым в целях прогрессирующего повышения доз в испытании с увеличением доз) : 10:40 мг/мл, 20:40 мг/мл; 60:40 мг/мл; и 120:40 мг/мл (тАЫ:афлиберцепт).
Лекарственный продукт, содержащий лишь один тАЫ и используемый в данном испытании, также поставляется в виде водного раствора в стерильных одноразовых стеклянных 2 мл-сосудах для IVT-введения в концентрации 12 0 мг/мл.
Комбинированный состав и тАЫ вводят путем IVT-инъекции в объеме 50 мкл (0,05 см3) . Этот объем соответствует 0, 050 мл минимального откачиваемого содержимого. Каждый сосуд содержит откачиваемый объем 0,3 мл тАЫ.
Пациентам вводят 3 дозы исследуемого лекарственного средства. Лекарственное вещество вводят на день 1, день 29 и день 57 экспериментатором или другим квалифицированным специалистом. Пациентам, участвующим в испытании, назначали введение комбинированного состава или тАЫ по нижеследующей схеме лечения:
группа
5 мг:
2 мг (тАЫ:
афлиберцепт
группа
2 :
мг:
мг (тАЫ: ас
шиберцепт)
группа
мг:
мг (тАЫ: ас
шиберцепт)
группа
4 :
мг:
мг (тАЫ: ас
шиберцепт)
группа
мг (
только тАЫ)
Фоновая терапия
Лечение обследуемого глаза: Интравитреальные инъекции афлиберцепта поставлялись в стерильных герметично запаянных сосудах в объеме, достаточном для приготовления шприца, содержащего 50 мкл состава в концентрации 4 0 мг/мл. Начиная с недели 12 (и вплоть до недели 20), пациентам, участвующим в испытании, каждый месяц вводили афлиберцепт (2 мг) в обследуемый глаз, если перед проведением лечения удовлетворялся любой из перечисленных ниже критериев: (1) увеличение толщины центральной области сетчатки > 50 мкм по ОКТ по сравнению с меньшими величинами, измеренными ранее; (2) наличие новых или персистентных кистозных изменений сетчатки или субретинальной жидкости по ОКТ или персистентного диффузного отека в центральной подобласти по ОКТ; (3) потеря способности различать 5 или более букв по сравнению с предшествующим обследованием, в комбинации с любым увеличением толщины сетчатки в центральной подобласти по ОКТ; (4) улучшение BCVA при сравнении текущих данных и данных самого последнего визита на> 5 букв.
Лечение другого глаза: На неделе 4 афлиберцепт (2 мг) вводят пациентам, у которых в другом глазе, на момент
обследования, наблюдались ВДЖП или ДОЖП, или у которых были диагностированы ВДЖП или ДОЖП во время испытания. Другой глаз оценивали на безопасность во время испытания, но он не рассматривался как обследуемый глаз. Другой глаз пациента может быть, по усмотрению экспериментатора, подвергнут лечению в день проведения лечения обследуемого глаза. Все способы лечения другого глаза должны быть зарегистрированы в виде отчета в электронной форме (CRF) как процедура лечения другого глаза.
Пациенты, которые проходили лечение другого глаза, не должны быть исключены из программы испытаний. При этом, необходимо собрать информацию о результатах обследования и всех ПЭ для другого глаза.
Запрещенные лекарственные препараты
Обследуемый глаз: Пациентам в обследуемый глаз могут не вводить каких-либо стандартных или исследуемых агентов для лечения ВДЖП или ДОЖП помимо назначенного экспериментального лечения посредством IVT-введения комбинированного состава или IVT-введения тАЫ, и, если это необходимо, афлиберцепта, в соответствии с данным протоколом. Этот протокол включает местное введение лекарственных препаратов (например, IVT-введение, местное введение, введение в участки рядом со склерой или в периорбитальное пространство), а также системное введение для лечения неоваскулярных ВДЖП или ДОЖП обследуемого глаза.
Другой глаз: Начиная с недели 4, если в другом глазе наблюдался ДОЖП или наблюдалось поражение центра желтого пятна или неоваскулярная ВДЖП, то может быть введен афлиберцепт (2 мг) . Другие состояния в другом глазе могут быть подвергнуты лечению с применением апробированных терапевтических средств, однако, они должны быть введены местно.
Не-офтальмическое системное введение: Не-офтальмическое (системное) стандартное или экспериментальное лечение неоваскулярных ВДЖП и ДОЖП обследуемого глаза или другого глаза не разрешено. Во время проведения испытания не разрешается введение системных антиангиогенных средств.
Процедуры проведения испытаний
Безопасность и переносимость оценивают путем
мониторинга/анализа побочных эффектов, вызываемых лечением (ТЕАЕ), анализа физического состояния, анализа жизненно важных функций, анализа по электрокардиограммам (ЭКГ) и клинических анализов (гематологии, биохимического анализа крови и анализа мочи) . Офтальмологическую безопасность оценивают путем офтальмологических анализов (с применением щелевой лампы, посредством непрямой офтальмоскопии, путем измерения внутриглазного давления [ВГД], с помощью спектральной доменной ОКТ, BCVA, FAF и информации по ФГД и ФА) . Пробы сыворотки берут для оценки уровня тАЫ, а пробы плазмы берут для ФК-анализа на афлиберцепт. Для оценки ADA-ответов берут пробы сыворотки.
Острота зрения с наилучшей коррекцией (BCVA): Визуальную функцию обследуемого глаза и другого глаза оценивают в соответствии с протоколом 4М ETDRS (для обследуемой группы, подвергаемой лечению диабетической ретинопатии на ранней стадии, 1985) по 4 параметрам при каждом визите во время обследования, на день 1, и на недели 1, 4, б, 8, 12, 16, 20 и 24 после лечения.
Флуоресцеиновая ангиография/фотография глазного дна
(ФА/ФГД): Анатомическую структуру сосудов сетчатки обследуемого глаза и другого глаза оценивали путем исследования глазного дна, ФА и ФГД в определенные периоды времени при каждом визите во время обследования, на день 1 и на недели 1, 4, б, 8, 12, 16, 20 и 2 4 после лечения. Информацию собирали, как минимум, по нижеследующим параметрам:
Только для ВДЖП: общая площадь поражения, площадь ХНВ, площадь классической ХНВ и площадь распространения флуоресцеина.
Только для ДОЖП: Оценка тяжести диабетической ретинопатии (DRSS) .
Оба глаза оценивали с помощью ФА и ФГД, сделанными фотографами, имеющими лицензию, в моменты времени, перечисленные выше. Фотографии глазного дна и ангиографические изображения отправляли в независимый центр обработки информации. Обследуемый глаз может быть "транзитным" глазом. Все ФА и ФГД-данные были архивированы на сайте как часть исходной документации.
Спектральная доменная оптическая когерентная томография:
Характеристики сетчатки и поражения оценивали с помощью спектральной доменной ОКТ в определенные периоды времени при каждом визите во время обследования, на день 1, и на недели 1, 4, б, 8, 12, 16, 20 и 24 после лечения.
Изображения были фиксированы и занесены на сайт испытаний специалистами в спектральной доменной ОКТ для обследуемого глаза и другого глаза. Изображения, полученные с помощью оптической когерентной томографии, передавали в независимый центр по обработке информации, где считывали изображения обследуемого глаза. Все ОКТ-данные были архивированы в электронном виде на сайте как часть исходной документации. Специалисты в области оптической когерентной томографии должны иметь лицензию, выданную центром по обработке информации, для гарантии соответствия и качества получаемых изображений, и не должны иметь информацию об уровне доз комбинированного состава, вводимого пациентам.
Аутофлуоресценция глазного дна : Анатомические
характеристики сетчатки также оценивали с помощью аутофлуоресценции. АФГД осуществляется фотографами, имеющими лицензию, в определенные периоды времени при каждом визите во время обследования, на день 1, и на недели 1, 4, б, 8, 12, 16, 2 0 и 2 4 после лечения. Изображения передавали в независимый центр по обработке информации. Все изображения архивировали на сайте как часть исходной документации.
Внутриглазное давление: Внутриглазное давление обследуемого глаза измеряли при каждом визите во время испытания с помощью
аппланационного тонометра Гольдмана или Топо-pen(tm). Аналогичный метод измерения ВГД должен быть применен для каждого пациента в течение всего испытания. При визитах, когда проводили лечение афлиберцептом, ВГД должно быть измерено до лечения (двух глаз) и приблизительно через 30 минут после лечения (только обследуемого глаза).
Оценка с помощью щелевой лампы: Передний сегмент и передний отдел стекловидного тела оценивали с помощью щелевой лампы в определенные периоды времени при каждом визите во время
обследования, на день 1 и на недели 1, 4, б, 8, 12, 16, 20 и 24 после лечения. При этом обследовали оба глаза. Оценку глазного дна также осуществляли с помощью непрямой офтальмоскопии.
Затем оценивали воспаление передней камеры и присутствие в ней клеток. Интенсивность клеточной реакции в передней камере оценивали по числу воспалительных клеток, обнаруживаемых в 1x3-мм-щелях лучом высокой мощности под углом 4 5°-60° при полной интенсивности. Кроме того, была оценена степень воспалительного ответа в стекловидном теле.
Непрямая офтальмоскопия: Непрямую офтальмоскопию
осуществляли в определенные периоды времени при каждом визите во время обследования, на день 1, и на недели 1, 4, б, 8, 12, 16, 2 0 и 2 4 после лечения. Она может быть осуществлена для обоих глаз перед введением дозы и в обследуемом глазе сразу после введения исследуемого лекарственного средства в дни введения этого средства. Были применены соответствующие линзы и оптические приборы, то есть, офтальмоскоп, надеваемый на голову, или ручной офтальмоскоп для оценки периферических областей глаза, и щелевая лампа для оценки центрального глазного дна. Зрачок расширяли и проводили оценку глазного дна обоих глаз.
He-офтальмологическая безопасность: Перед введением дозы были получены данные жизненно важных функций, включая температуру, кровяное давление в положении сидя, пульс и дыхание; было проведено полное и тщательное физическое обследование; сделана стандартная ЭКГ с 12 отведениями, а также были проведены стандартные лабораторные анализы крови, биохимические анализы, анализы мочи и тест на беременность, в определенные периоды времени при каждом визите во время обследования, на день 1, и на недели 1, 4, б, 8, 12, 16, 20 и 24 после лечения.
Безопасность
Безопасность и переносимость оценивали путем
мониторинга/анализа побочных эффектов, вызываемых лечением (ТЕАЕ), анализа физического состояния, анализа жизненно важных функций, анализа по электрокардиограммам (ЭКГ) и клинических
анализов (гематологии, биохимического анализа крови и анализа мочи) .
Побочный эффект (ПЭ) представляет собой любое нежелательное клиническое состояние у пациента, которому вводят исследуемое лекарственное средство, и который может иметь, а может и не иметь, причинную взаимосвязь с исследуемым лекарственным средством. Следовательно, ПЭ представляет собой любой нежелательный и непредсказуемый признак (включая аномальные лабораторные показатели), симптом или заболевание, которое временно ассоциируется с применением исследуемого лекарственного средства, независимо от того, связаны ли указанные признаки, симптомы или заболевания с исследуемым лекарственным средством.
Серьезный побочный эффект (СПЭ) представляет собой любое
нежелательное клиническое состояние, которое, при любой дозе,
приводит к летальному исходу, представляет угрозу для жизни
пациента, требует госпитализации пациента, либо увеличения
времени госпитализации, если пациент уже госпитализирован;
приводит к персистентной или серьезной
инвалидности/нетрудоспособности, вызывает врожденную
аномалию/дефекты у новорожденных и/или дает неблагоприятный прогноз течения заболевания. Критериями серьезных глазных ПЭ с угрозой потери зрения являются нижеследующие критерии: (1) ПЭ, вызывающий снижение BCVA до > 3 0 букв (по сравнению с самыми последними оценками BCVA); (2) ПЭ, вызывающий снижение VA до уровня светоощущения или ниже; (3) ПЭ, требующий хирургического вмешательства (например, пункции в стекловидное тело или биопсии с IVT-инъекцией против противоинфекционных средств, лазерного облучения или криопексии сетчатки посредством воздействия газа) для предупреждения прогрессирующей потери зрения; (4) ПЭ, ассоциированный с тяжелым внутриглазным воспалением (то есть, наличие клеток/воспаления передней камеры 4-ой степени (4+) или витрита 4-ой степени (4+)); (5) по мнению экспериментатора, ПЭ, который может потребовать терапевтического лечения для предупреждения прогрессирующей потери зрения.
Результаты
Результаты предварительных анализов на безопасность
показали, что комбинированный состав хорошо переносится пациентами с ВДЖП и ДОЖП и имеет благоприятный профиль безопасности.
В таблицах 4 5 и 4 6 представлены основные демографические данные пациентов с ВДЖП и ДОЖП, соответственно.
ДОЖП
ВДЖП
Пол, п (%)
Женщины
(70%)
Мужчины
(30%)
Раса, п (%)
Индоевропейска я
(70%)
Негроидная
(20%)
Монголоидная
(10%)
Основные характеристики пациентов с ВДЖП и систематизированы в Таблицах 47 и 48, соответственно.
ДОЖП
Результаты, полученные на данный период времени (на неделю
12), продемонстрировали улучшение зрения (повышение остроты зрения до 2 0 букв) и морфологии сетчатки (снижения центральной толщины подобласти сетчатки) при всех уровнях доз. Продолжительность действия увеличивалась при более высоких дозах (при дозах 3 мг: 2 мг и б мг: 2 мг) .
После лечения в течение 24 недель ожидается, что у пациентов с ВДЖП или ДОЖП повышение остроты зрения будет сохраняться или продолжаться.
Объем настоящего изобретения не ограничивается описанными здесь конкретными вариантами его осуществления. Действительно, различные модификации согласно изобретению, внесенные в данное описание, будут более очевидны для специалиста из приведенного выше описания и прилагаемого графического материала. Такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Robert L. Vitti
Kristine A. Erickson Karen W. Chu
Stanley J. Weigand Jingtai Cao Ivan B. Lobov Saurabh Wadhwa Kenneth S. Graham Daniel Dix
<120> СПОСОБЫ И ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЛАЗ
<130> 10112WO01
<160> 11
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1 <211> 122 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Ile Thr Phe Gly Gly Leu Ile Ala Pro Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 2 <211> 107 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
1 5 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 20
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 35 40
Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
10 15 Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr 25 30 Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Ser Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 3 <211> 8 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая
<400> 3
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5
<210> 4 <211> 7 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая
<400> 4
Ile Gly Pro Ala Gly Asp Thr 1 5
<210> 5 <211> 16 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая
<400> 5
Ala Arg Gly Leu Ile Thr Phe Gly Gly Leu Ile Ala Pro Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 6 <211> 7 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая
<400> 6
Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr 1 5
<210> 7 <211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая
<400> 7
Gly Ala Ser 1
<210> 8 <211> 8 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая
<400> 8
Gln His Tyr Asp Asn Ser Gln Thr 1 5
<210> 9 <211> 452 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Ile Thr Phe Gly Gly Leu Ile Ala Pro Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 10 <211> 214 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая
<400> 10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Ser Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 11 <211> 458 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая
<400> 11
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro
20 25 30
Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu
35 40 45
Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr
50 55 60
Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys
65 70 75 80
Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr
85 90 95
Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His
100 105 110
Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile
115 120 125
Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu
130 135 140
Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile
145 150 155 160
Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu
165 170 175
Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe
180 185 190
Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu
195 200 205
Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr
210 215 220
Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245 250 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260 265 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275 280 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290 295 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325 330 335
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340 345 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
355 360 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
370 375 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385 390 395 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405 410 415
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420 425 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435 440 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения сосудистого заболевания или расстройства
глаз, включающий интравитреальное введение терапевтически
эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей
ингибитор ангиопоэтина-2 (Ang-2), индивидууму, нуждающемуся в
этом.
2. Способ по п. 1, где фармацевтическая композиция дополнительно включает антагонист васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF).
3. Способ по любому из п. п. 1-2, где фармацевтическая композиция включает приблизительно 10-12 0 мг/мл ингибитора Ang-2 .
4. Способ по п. 3, где фармацевтическая композиция включает 10 мг/мл, 20 мг/мл, 60 мг/мл или 120 мг/мл ингибитора Ang-2.
5. Способ по любому из п. п. 2-4, где фармацевтическая композиция включает приблизительно 4 0 мг/мл антагониста VEGF.
6. Способ по любому из п.п. 1-5, где ингибитор Ang-2 вводят индивидууму, нуждающемуся в этом, в дозе от 0,5 мг до 10 мг.
7. Способ по любому из п.п. 2-6, где антагонист VEGF вводят индивидууму, нуждающемуся в этом, в дозе от 50 мкг до 5 мг.
8. Способ по любому из п.п. 1-7, где заболевание или расстройство глаз выбраны из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, неоваскуляризации сетчатки, закупорки центральной вены сетчатки, закупорки сосудистого сплетения вены сетчатки, полипоидной хороидальной васкулопатии и хороидальной неоваскуляризации.
9. Способ по любому из п. п. 1-8, где заболеванием или расстройством глаз является возрастная дегенерация желтого пятна.
10. Способ по любому из п. п. 1-8, где заболеванием или расстройством глаз является диабетический отек желтого пятна.
11. Способ ингибирования ангиогенеза сетчатки, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2, в комбинации с антагонистом VEGF, индивидууму, нуждающемуся в этом.
10.
12. Способ по п. 11, где ингибитор Ang-2 вводят
интравитреально в комбинации с антагонистом VEGF.
13. Способ по любому из п.п. 11-12, где ингибитор Ang-2 вводят в дозе приблизительно 1-10 мкг.
14. Способ по любому из п.п. 11-13, где антагонист VEGF вводят в дозе приблизительно 1-10 мкг.
15. Способ по п. 11, где ингибитор Ang-2 вводят подкожно в комбинации с антагонистом VEGF.
16. Способ по п. 15, где ингибитор Ang-2 вводят в дозе 5-30 мг/кг массы тела индивидуума.
17. Способ по п.п. 15 или 16, где антагонист VEGF вводят в дозе 5-30 мг/кг массы тела индивидуума.
18. Способ по любому из п.п. 11-17, где комбинированное лечение снижает площадь сосудов по меньшей мере на 65% по сравнению с введением либо ингибитора Ang-2, либо антагониста VEGF, взятых отдельно.
19. Способ по любому из п.п. 11-18, где ангиогенез сетчатки ассоциируется с заболеванием или расстройством глаз, выбранными из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, неоваскуляризации сетчатки, закупорки центральной вены сетчатки, закупорки сосудистого сплетения вены сетчатки, полипоидной хороидальной васкулопатии и хороидальной неоваскуляризации.
20. Способ ингибирования неоваскуляризации сетчатки, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2, в комбинации с антагонистом VEGF, индивидууму, нуждающемуся в этом.
21. Способ по п. 20, где ингибитор Ang-2 вводят интравитреально в комбинации с антагонистом VEGF.
22. Способ по п. 21, где ингибитор Ang-2 вводят в дозе от 0,1 до 10,0 мг, а антагонист VEGF вводят в дозе приблизительно от 0,1 мг до 5 мг.
23. Способ по п. 20, где ингибитор Ang-2 вводят внутривенно один раз в 2 недели в дозе 15 мг/кг массы тела индивидуума.
22.
24. Способ по п. 23, где антагонист VEGF вводят
интравитреально в дозе от 0,1 до 5 мг.
25. Способ по любому из п.п. 20-24, где неоваскуляризация сетчатки ассоциируется с заболеванием или расстройством глаз, выбранными из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, закупорки центральной вены сетчатки и закупорки сосудистого сплетения вены сетчатки.
26. Способ ингибирования разрастания сосудов, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2, в комбинации с антагонистом VEGF, индивидууму, нуждающемуся в этом.
27. Способ по п. 26, где разрастание сосудов ингибируется по меньшей мере за 3 недели по сравнению с разрастанием сосудов у индивидуума, которому вводят только антагонист VEGF.
28. Способ по п. 27, где разрастание сосудов ингибируется более чем за 3 недели по сравнению с разрастанием сосудов у индивидуума, которому вводят только антагонист VEGF.
29. Способ по п. 2 6 или 28, где разрастание сосудов ингибируется по меньшей мере за 8 недель по сравнению с разрастанием сосудов у индивидуума, которому вводят только антагонист VEGF.
30. Способ по любому из п.п. 26-29, где разрастание сосудов ингибируется по меньшей мере за 10 недель по сравнению с разрастанием сосудов у индивидуума, которому вводят только антагонист VEGF.
31. Способ по любому из п.п. 26-30, где ингибитор Ang-2 вводят в дозе приблизительно 5-50 мг/кг массы тела индивидуума в комбинации с 0,05-2 мг антагониста VEGF.
32. Способ по п. 31, где ингибитор Ang-2 вводят в дозе приблизительно 15 мг/кг массы тела индивидуума в комбинации со 125 мкг антагониста VEGF.
33. Способ по любому из п.п. 26-30, где ингибитор Ang-2 вводят внутривенно или подкожно.
34. Способ по любому из п.п. 26-33, где антагонист VEGF вводят интравитреально.
25.
35. Способ по любому из п.п. 26-30, где ингибитор Ang-2 вводят интравитреально в комбинации с антагонистом VEGF.
36. Способ по п. 35, где ингибитор Ang-2 вводят в дозе приблизительно 50 0 мкг в комбинации приблизительно со 12 5 мкг антагониста VEGF.
37. Способ по любому из п.п. 26-36, где разрастание сосудов ассоциируется с заболеванием или расстройством глаз, выбранными из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, неоваскуляризации сетчатки, закупорки центральной вены сетчатки, закупорки сосудистого сплетения вены сетчатки, полипоидной хороидальной васкулопатии и хороидальной неоваскуляризации.
38. Способ по любому из п.п. 2 6-37, где разрастание сосудов ассоциируется с неоваскуляризацией сетчатки.
39. Способ подавления разрастания сосудов у индивидуума с заболеванием глаз, где указанный способ включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, одной дозы антагониста VEGF, а затем одной или более доз фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2.
40. Способ по п. 39, где антагонист VEGF вводят в дозе от 100 до 500 мкг.
41. Способ по любому из п.п. 3 9 или 40, где антагонист VEGF вводят интравитреально.
42. Способ по любому из п.п. 39-41, где ингибитор Ang-2 вводят внутривенно или подкожно.
43. Способ по любому из п.п. 39-42, где одну или более доз ингибитора Ang-2 вводят один раз в 2 недели.
44. Способ по любому из п. п. 3 9-4 3, где каждая одна или более доз содержат ингибитор Ang-2 в количестве 15 мг/кг массы тела индивидуума.
45. Способ по любому из п.п. 39-44, где разрастание сосудов ингибируется по меньшей мере за 4 недели по сравнению с разрастанием сосудов у индивидуума, которому вводят только антагонист VEGF.
46. Способ по п. 45, где разрастание сосудов ингибируется
более чем за 4 недели по сравнению с разрастанием сосудов у индивидуума, которому вводят только антагонист VEGF.
47. Способ по п. 45, где разрастание сосудов ингибируется по меньшей мере за 8 недель по сравнению с разрастанием сосудов у индивидуума, которому вводят только антагонист VEGF.
48. Способ по п. 47, где разрастание сосудов ингибируется по меньшей мере за 10 недель по сравнению с разрастанием сосудов у индивидуума, которому вводят только антагонист VEGF.
49. Способ по любому из п.п. 39-48, где разрастание сосудов ассоциируется с заболеванием или расстройством глаз, выбранными из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, неоваскуляризации сетчатки, закупорки центральной вены сетчатки, закупорки сосудистого сплетения вены сетчатки, полипоидной хороидальной васкулопатии и хороидальной неоваскуляризации.
50. Способ по любому из п.п. 39-49, где разрастание сосудов ассоциируется с неоваскуляризацией сетчатки.
51. Способ снижения числа интравитреальных инъекций,
вводимых индивидууму с заболеванием глаз, где указанный способ
включает последовательное введение первой исходной дозы, а затем
одной или более вторых доз фармацевтической композиции,
содержащей терапевтически эффективное количество ингибитора Ang-
2 в комбинации с антагонистом VEGF индивидууму, нуждающемуся в
этом, где число интравитреальных введений антагониста VEGF
снижают до одного раза в 9 недель по сравнению с числом введений
индивидууму, которому вводят только антагонист VEGF.
52. Способ по п. 51, где одна или более вторых доз составляют 2-10 доз фармацевтической композиции.
53. Способ по п. 52, где по меньшей мере 2 вторые дозы фармацевтической композиции вводят индивидууму, и где каждую вторую дозу вводят через 1-4 недели сразу после введения предшествующей дозы.
54. Способ по любому из п.п. 51-53, где начальная доза и одна или более вторых доз фармацевтической композиции составляют приблизительно 0,5-10 мг ингибитора Ang-2.
52.
55. Способ по любому из п. п. 51-54, где ингибитор Ang-2 вводят внутривенно или подкожно.
56. Способ по любому из п. п. 51-55, где антагонист VEGF вводят в дозе приблизительно 1-5 мг.
57. Способ по любому из п.п. 51-56, где глазное заболевание выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, неоваскуляризации сетчатки и хороидальной неоваскуляризации.
58. Способ ингибирования хороидальной неоваскуляризации, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей ингибитор Ang-2, индивидууму, нуждающемуся в этом.
59. Способ по п. 58, где ингибитор Ang-2 вводят подкожно в дозе приблизительно 10-50 мг/кг массы тела индивидуума.
60. Способ по п. 59, где ингибитор Ang-2 вводят в дозе 25 мг/кг массы тела индивидуума.
61. Способ по любому из п.п. 58-60, где хороидальная неоваскуляризация ассоциируется с заболеванием или расстройством глаз, выбранными из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, закупорки центральной вены сетчатки, закупорки сосудистого сплетения вены сетчатки и полипоидной хороидальной васкулопатии.
62. Способ по любому из п.п. 1-61, где ингибитором Ang-2 является анти-Апд-2 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
63. Способ по п. 62, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат гипервариабельные области (CDR) вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и CDR вариабельной области легкой цепи (LCVR), имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
64. Способ по п. 63, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; HCDR2,
63.
имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 4; HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 5; CDR1 легкой цепи (LCDR1), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: б, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 7, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 8.
65. Способ по п. 64, где антитело или его
антигенсвязывающий фрагмент включают HCVR, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 1, и LCVR, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 2.
66. Способ по любому из п. п. 2-57, где антагонист VEGF включает химерную молекулу на основе рецептора VEGF (VEGF-ловушки).
67. Способ по п. 66, где VEGF-ловушка включает один или более иммуноглобулин (Ig)-подобных доменов VEGFR1, один или более Ig-подобных доменов VEGFR2 и мультимеризующий домен.
68. Способ по п. 67, где VEGF-ловушка включает Ig-подобный домен 2 VEGFR1, Ig-подобный домен 3 VEGFR2 и мультимеризующий домен.
69. Способ по п. 66, где VEGF-ловушкой является
афлиберцепт.
70. Способ по любому из п. п. 2-57, где антагонист VEGF состоит из димера двух полипептидов, состоящих из аминокислот 27-457 SEQ ID N0: 11.
71. Стабильный жидкий состав, включающий: (i) антагонист васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF); (ii) антитело, которое специфически связывается с человеческим ангиопоэтином-2 (hAng-2); (iii) буфер при рН 6,2+0,3; (iv) неионный детергент; (v) агент, придающий тоничность; и (vi) стабилизатор, где антагонист VEGF состоит из димера двух полипептидов, состоящих из аминокислот 27-457 SEQ ID N0: 11.
72. Состав по п. 71, где антитело содержит три
гипервариабельные области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3),
где HCDR1 имеет SEQ ID N0: 3, HCDR2 имеет SEQ ID N0: 4, HCDR3
имеет SEQ ID N0: 5, и три CDR легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и
LCDR3), где LCDR1 имеет SEQ ID NO: 6, LCDR2 имеет SEQ ID NO: 7, a LCDR3 имеет SEQ ID NO: 8.
73. Состав по любому из п.п. 71 и 72, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) SEQ ID NO: 1 и вариабельную область легкой цепи (LCVR) SEQ ID NO: 2.
74. Состав по п. 73, где концентрация антагониста VEGF составляет приблизительно 4 0 мг/мл+1,5 мг/мл.
75. Состав по п.74, содержащий приблизительно 10-120 мг/мл антитела.
76. Состав по п. 75, содержащий антитело в концентрации, выбранной из группы, состоящей из 10 мг/мл, 2 0 мг/мл, 60 мг/мл и 12 0 мг/мл.
77. Состав по п. 71, содержащий приблизительно 5-100 мг/мл антагониста VEGF; приблизительно 10-120 мг/мл анти-Апд-2 антитела; приблизительно 5-50 мМ фосфата натрия, имеющего рН приблизительно 6,2; приблизительно 0,01-0,1% (масс./об.) полисорбата; приблизительно 10-50 мМ хлорида натрия; и приблизительно 1-20% (масс./об.) сахарозы.
78. Состав по п. 77, содержащий антитело в концентрации, выбранной из группы, состоящей из 10 мг/мл, 2 0 мг/мл, 60 мг/мл и 12 0 мг/мл.
79. Состав по п. 76, где буфером является фосфат натрия.
80. Состав по п. 79, где концентрация фосфата натрия составляет 10 мМ+1,5 мМ.
81. Состав по п. 76, где неионным детергентом является полисорбат 20.
82. Состав по п. 81, где концентрация полисорбата 20 составляет приблизительно 0,03% масс./об. +0,0045%.
83. Состав по п. 7 6, где агентом, придающим тоничность, является хлорид натрия.
84. Состав по п. 83, где концентрация хлорида натрия составляет приблизительно 40 мМ+б,0 мМ.
85. Состав по п. 76, где стабилизатором является сахароза.
86. Состав по п. 85, где концентрация сахарозы составляет приблизительно 5%+0,75% (масс./об.).
73.
87. Состав по п. 71, где концентрация антагониста VEGF составляет 40 мг/мл+б, 0 мг/мл, концентрация антитела составляет 10 мг/мл+1,5 мг/мл, буфером является 10 мМ+1,5 мМ фосфата натрия, рН 6,2+0,3, неионным детергентом является 0,03% масс./об. +0,0045% полисорбата 20, агентом, придающим тоничность, является 40 мМ хлорида натрия, а стабилизатором является 5% масс./об. +1,5% сахарозы.
88. Состав по п. 71, где концентрация антагониста VEGF составляет 40 мг/мл+б, 0 мг/мл, концентрация антитела составляет 20 мг/мл+3,0 мг/мл, буфером является 10 мМ+1,5 мМ фосфата натрия, рН 6,2+0,3, неионным детергентом является 0,03% масс./об. +0,0045% полисорбата 20, агентом, придающим тоничность, является 40 мМ хлорида натрия, а стабилизатором является 5% масс./об. +1,5% сахарозы.
89. Состав по п. 71, где концентрация антагониста VEGF составляет 40 мг/мл+б, 0 мг/мл, концентрация антитела составляет 60 мг/мл+9, 0 мг/мл, буфером является 10 мМ+1,5 мМ фосфата натрия, рН 6,2+0,3, неионным детергентом является 0,03% масс./об. +0,0045% полисорбата 20, агентом, придающим тоничность, является 40 мМ хлорида натрия, а стабилизатором является 5% масс./об. +1,5% сахарозы.
90. Состав по п. 71, где концентрация антагониста VEGF составляет 40 мг/мл+б, 0 мг/мл, концентрация антитела составляет 120 мг/мл+18,0 мг/мл, буфером является 10 мМ+1,5 мМ фосфата натрия, рН 6,2+0,3, неионным детергентом является 0,03% масс./об. +0,0045% полисорбата 20, агентом, придающим тоничность, является 40 мМ хлорида натрия, а стабилизатором является 5% масс./об. +1,5% сахарозы.
91. Способ лечения или ослабления сосудистого заболевания или расстройства глаз, где указанный способ включает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, состава по любому из п.п. 7190 .
92. Способ по п. 91, где заболевание или расстройство глаз
выбраны из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, неоваскуляризации сетчатки, закупорки центральной вены сетчатки, закупорки сосудистого сплетения вены сетчатки, полипоидной хороидальной васкулопатии и хороидальной неоваскуляризации.
93. Способ лечения сосудистого заболевания глаз, где указанный способ включает последовательное введение одной или более доз фармацевтической композиции, содержащей терапевтически активное количество ингибитора Ang-2 и антагониста VEGF индивидууму, нуждающемуся в этом.
94. Способ по п. 93, где фармацевтическая композиция включает приблизительно от 10 мг/мл до приблизительно 12 0 мг/мл ингибитора Ang-2.
95. Способ по любому из п.п. 93-94, где фармацевтическая композиция включает приблизительно 4 0 мг/мл антагониста VEGF.
96. Способ по п. 93, где фармацевтическая композиция включает приблизительно от 10 мг/мл до приблизительно 12 0 мг/мл ингибитора Ang-2 и приблизительно 4 0 мг/мл антагониста VEGF.
97. Способ по любому из п.п. 93-96, где фармацевтическая композиция включает 10 мг/мл ингибитора Ang-2 и 4 0 мг/мл антагониста VEGF.
98. Способ по любому из п.п. 93-96, где фармацевтическая композиция включает 2 0 мг/мл ингибитора Ang-2 и 4 0 мг/мл антагониста VEGF.
99. Способ по любому из п.п. 93-96, где фармацевтическая композиция включает 60 мг/мл ингибитора Ang-2 и 4 0 мг/мл антагониста VEGF
100. Способ по любому из п.п. 93-96, где фармацевтическая композиция включает 12 0 мг/мл ингибитора Ang-2 и 4 0 мг/мл антагониста VEGF
101. Способ по любому из п. п. 93-100, который включает введение исходной дозы фармацевтической композиции, а затем введение одной или более вторых доз фармацевтической композиции индивидууму, где каждую вторую дозу вводят через 1-4 недели сразу после введения предшествующей дозы.
93.
102. Способ по п. 101, где по меньшей мере 2 вторых дозы вводят индивидууму, и где каждую вторую дозу вводят через 4 недели сразу после введения предшествующей дозы.
103. Способ по п. 102, который также включает введение одной или более третьих доз фармацевтической композиции индивидууму, где каждую третью дозу вводят через 5-12 недель сразу после введения предшествующей дозы.
104. Способ по п. 103, где каждую третью дозу вводят через 8 недель сразу после введения предшествующей дозы.
105. Способ по любому из п.п. 101-104, где каждая доза фармацевтической композиции включает приблизительно от 0,5 мг до приблизительно 10 мг ингибитора Ang-2 и приблизительно 2 мг антагониста VEGF.
106. Способ по п. 105, где каждая доза фармацевтической композиции включает 10 мг/мл ингибитора Ang-2 и 4 0 мг/мл антагониста VEGF.
107. Способ по п. 105, где каждая доза фармацевтической композиции включает 2 0 мг/мл ингибитора Ang-2 и 4 0 мг/мл антагониста VEGF.
108. Способ по п. 105, где каждая доза фармацевтической композиции включает 60 мг/мл ингибитора Ang-2 и 4 0 мг/мл антагониста VEGF.
109. Способ по п. 105, где каждая доза фармацевтической композиции включает 12 0 мг/мл ингибитора Ang-2 и 4 0 мг/мл антагониста VEGF.
110. Способ по любому из п.п. 93-109, где каждую дозу фармацевтической композиции вводят интравитреально индивидууму.
111. Способ по любому из п.п. 93-110, где сосудистое заболевание глаз выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетического отека желтого пятна, возрастной дегенерации желтого пятна, закупорки центральной вены сетчатки, закупорки сосудистого сплетения вены сетчатки и полипоидной хороидальной васкулопатии.
112. Способ по п. 111, где сосудистым заболеванием глаз является возрастная дегенерация желтого пятна.
113. Способ по п. 111, где сосудистым заболеванием глаз
93.
является диабетический отек желтого пятна.
114. Способ по любому из п.п. 93-113, где ингибитором Ang-2
является анти-Апд-2 антитело или его антигенсвязывающий
фрагмент.
115. Способ по п. 114, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат гипервариабельные области (CDR) вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 1, и CDR вариабельной области легкой цепи (LCVR), имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 2.
116. Способ по п. 114 или 115, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 3; HCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 4; HCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 5; CDR1 легкой цепи (LCDR1), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: б, LCDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 7, и LCDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 8.
117. Способ по п. 116, где антитело или его
антигенсвязывающий фрагмент включают HCVR, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 1, и LCVR, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 2.
118. Способ по любому из п.п. 93-117, где антагонист VEGF включает химерную молекулу на основе рецептора VEGF (VEGF-ловушки).
119. Способ по п. 118, где VEGF-ловушка включает один или более иммуноглобулин (Ig)-подобных доменов VEGFR1, один или более Ig-подобных доменов VEGFR2 и мультимеризующий домен.
120. Способ по п. 119, где VEGF-ловушка включает Ig-подобный домен 2 VEGFR1, Ig-подобный домен 3 VEGFR2 и мультимеризующий домен.
121. Способ по п. 120, где VEGF-ловушкой является афлиберцепт.
122. Способ по любому из п.п. 93-121, где антагонист VEGF состоит из димера двух полипептидов, состоящих из аминокислот
118.
-457 SEQ ID No: 11.
По доверенности
Анти-Апд-2 антитело
Антагонист VEGF
анти-Апд-2 антите-ло+антагонист VEGF
^ Л /V > *> <^ <^ <^ <^ <^ <^ <^ <^
Время после лечения
ФИГ. 1
со I- о
mi-
/iv-крнтроль )т -VGT/ly-контроль
антитело,
\/Т-контооль/анти-Апа-2 антитело. VT-VGT/анти-Апд-:
3" о
m о ct > > о о о
CD о;
CD CD
* --*.ч
.о> jy .о? > .о*> .о?> > ч*
<$> Время лечения
ФИГ. 2
А. Объем поражения
В. Объем сосудов
С. Плотность сосудов (Объем сосудов/Объем поражения)%
'-'
п-14
день 20
ФИГ. 3 (продол.)
(19)
(19)
(19)
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
162
162