|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] В настоящем изобретении предложены фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3 ФВ, химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и гетерологичный компонент, или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф VIII, а также способы их применения. Полипептидная цепь, содержащая фрагмент ФВ, являющегося объектом изобретения, связывается или является соединенной с полипептидной цепью, содержащей белок Ф VIII, и полипептидная цепь, содержащая фрагмент ФВ, может предотвращать или подавлять связывание эндогенного ФВ с белком Ф VIII. Путем предотвращения или подавления связывания эндогенного ФВ с Ф VIII, которое является фактором, ограничивающим время полужизни связывание эндогенного ФВ с белком Ф VIII, фрагмент ФВ может индуцировать продление времени полужизни белка Ф VIII. Изобретение также включает в себя нуклеотиды, векторы, клетки-хозяев, способы применения фрагмента ФВ или химерные белки.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула: В настоящем изобретении предложены фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3 ФВ, химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и гетерологичный компонент, или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф VIII, а также способы их применения. Полипептидная цепь, содержащая фрагмент ФВ, являющегося объектом изобретения, связывается или является соединенной с полипептидной цепью, содержащей белок Ф VIII, и полипептидная цепь, содержащая фрагмент ФВ, может предотвращать или подавлять связывание эндогенного ФВ с белком Ф VIII. Путем предотвращения или подавления связывания эндогенного ФВ с Ф VIII, которое является фактором, ограничивающим время полужизни связывание эндогенного ФВ с белком Ф VIII, фрагмент ФВ может индуцировать продление времени полужизни белка Ф VIII. Изобретение также включает в себя нуклеотиды, векторы, клетки-хозяев, способы применения фрагмента ФВ или химерные белки. Евразийское (21) 201791134 (13) A1 патентное ведомство (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ (43) Дата публикации заявки 2018.02.28 (22) Дата подачи заявки 2013.01.12 (51) Int. Cl. A61K38/37 (2006.01) C07K14/755 (2006.01) C12N15/63 (2006.01) (54) ПОЛИПЕПТИДЫ ХИМЕРНОГО ФАКТОРА VIII И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ (31) 61/586,099; 61/586,654; 61/667,901; 61/734,954 (32) 2012.01.12; 2012.01.13; 2012.07.03; 2012.12.07 (33) US (62) 201491186; 2013.01.12 (71) Заявитель: БАЙОДЖЕН ЭМЭЙ ИНК. (US) (72) Изобретатель: Чабра Экта Сет, Лю Туняо, Питерс Роберт, Цзян Хайянь (US) (74) Представитель: Нилова М.И. (RU) (57) В настоящем изобретении предложены фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3 ФВ, химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и гетеро-логичный компонент, или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф VIII, а также способы их применения. Полипептидная цепь, содержащая фрагмент ФВ, являющегося объектом изобретения, связывается или является соединенной с полипептидной цепью, содержащей белок Ф VIII, и полипептидная цепь, содержащая фрагмент ФВ, может предотвращать или подавлять связывание эндогенного ФВ с белком Ф VIII. Путем предотвращения или подавления связывания эндогенного ФВ с Ф VIII, которое является фактором, ограничивающим время полужизни связывание эндогенного ФВ с белком Ф VIII, фрагмент ФВ может индуцировать продление времени полужизни белка Ф VIII. Изобретение также включает в себя нуклеоти-ды, векторы, клетки-хозяев, способы применения фрагмента ФВ или химерные белки. ПОЛИПЕПТИДЫ ХИМЕРНОГО ФАКТОРА VIII И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ [0001] Свертывание является сложным процессом образования кровью тромбов. Важной частью гемостаза является прекращение тока крови из поврежденного сосуда, при котором стенка поврежденного сосуда покрывается бляшками и содержащими фибрин тромбами для того, чтобы остановить кровотечение и начать восстановление поврежденного сосуда. Нарушения свертываемости крови могут привести к повышенному риску возникновения кровотечений (геморрагии) или образованию закупоривающих тромбов (тромбозу). [0002] Свертывание начинается практически сразу после того, как при повреждении кровеносного сосуда была повреждена эндотелиальная выстилка сосуда. Воздействие на кровь таких белков, как тканевой фактор, инициирует изменения в тромбоцитах и плазменном белке фибриногене - факторе свертывания крови. Тромбоциты мгновенно образуют пробку в месте повреждения; это называется первичным гемостазом. Одновременно происходит вторичный гемостаз: белки, находящиеся в плазме крови, которые называются факторами коагуляции или факторами свертывания крови, откликаются сложным каскадом реакций, образуя фибриновые нити, которые укрепляют тромбоцитарную пробку. Неограничивающие факторы коагуляции включают, но не ограничиваются этим, фактор I (фибриноген), фактор II (протромбин), тканевый фактор, фактор V (проакцелерин, лабильный фактор), фактор VII (стабильный фактор, проконвертин), фактор VIII (антигемофильный глобулин А), фактор ГХ (антигемофильный глобулин В или кристмас-фактор), фактор X (фактор Стюарта-Прауэра), фактор XI (плазменный предшественник тромбопластина), фактор XII (фактор Хагемана), фактор XIII (фибринстабилизирующий фактор), ФВ, прекалликреин (фактор Флетчера), высокомолекулярный кининоген (ВМК) (фактор Фитцджеральда), фибронектин, антитромбин III, кофактор гепарина II, протеин С, протеин S, протеин Z, плазминоген, альфа 2-антиплазмин, тканевой активатор плазминогена (ТАЛ), урокиназа, ингибитор активатора плазминогена-1 (ИАП-1) ингибитор активатора плазминогена-2 (ИАП-2). [0003] Гемофилия А является нарушением свертываемости крови, возникающим из- за дефектов в гене, кодирующем фактор коагуляции VIII (ФУШ), и проявляющимся у 1-2 из 10,000 младенцев мужского пола. Grawetal., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Пациентов, страдающих гемофилией А можно лечить путем вливаний очищенного или полученного с помощью рекомбинантных технологий OVIII. При этом все коммерчески доступные продукты, содержащие OVIII, как известно, имеют время полужизни, составляющее 8-12 часов, и требуют частых внутривенных введений пациентам. Смотрите Weiner М.А. and Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Suppl 4:S2-8 (2008). Помимо этого было предпринято большое количество попыток с целью продлить время полужизни OVIII. Например, подходы в разработках для продления времени полужизни факторов свертывания крови включают пэгилирование, гликопэгилирование и конъюгацию с альбумином. Смотрите Dumontetal., Blood. 119(13): 3024-3030 (Опубликовано онлайн 13 января 2012 г.) Независимо от используемой белковой инженерии, разрабатываемые в последнее время содержащие OVIII продукты длительного действия обладают продленными временами полужизни, но эти времена полужизни, как сообщается, ограничены - на доклинических животных моделях было получено продление -всего лишь в около 1,5-2 раза. Смотрите Id. Схожие результаты были продемонстрированы для людей, например, сообщалось, что для пациентов, страдающих гемофилией А, время полужизни rFVIIIFc продлено в ~ 1,7 раз по сравнению с ADVATE(r). Смотрите Id. Следовательно, продление времени полужизни, несмотря на небольшое увеличение, может указывать на присутствие других ограничивающих Т1/2 факторов. See Liu, Т. et al., 2007 ISTH meeting, abstract #P-M-035; Henrik, A. et al., 2011 ISTH meeting, abstract #P=MO-181; Liu, T. et al., 2011 ISTH meeting abstract #P-WE-131. [0004] Плазменный фактор Виллебранда (OB) имеет время полужизни, составляющее приблизительно 12 часов (в диапазоне от 9 до 15 часов). http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/vwd/2_scientificoverview.htm (последний визит 22 октября 2011 г.). На время полужизни ОВ может воздействовать большое количество факторов: профиль гликозилирования, ADAMTS-13 (дезинтегрин и металлопротеаза в сочетании с тромбоспондином мотив-13), а также различные мутации в ОВ. [0005] В плазме 95-98% OVIII циркулирует в тесном нековалентном комплексе с полноразмерным ОВ. Образование этого комплекса важно для поддержки соответствующих плазменных уровней OVIIIinvivo. Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). Полноразмерный OVIII дикого типа в основном находится в виде гетеродимера, содержащего тяжелую цепь (ММ 200 кДа) и легкую цепь (ММ 73 кДа). Когда OVIII активируется благодаря протеолизу на позициях 372 и 740 тяжелой цепи и на позиции 1689 легкой цепи, связанный с OVIII ОВ отделяется от активированного OVIII. Активированный OVIII вместе с активированным фактором IX, кальцием и фосфолипидом ("теназный комплекс") участвуют в активации фактора X, вырабатывая большие количества тромбина. Тромбин, в свою очередь, расщепляет фибриноген до образования растворимых мономеров фибрина, которые затем спонтанно полимеризуются до образования растворимого фибринового полимера. Тромбин также активирует фактор XIII, который, вместе с кальцием, служит для перекрестного связывания и стабилизации растворимого фибринового полимера, образуя перекрестно-связанный (нерастворимый) фибрин. Активированный OVIII быстро удаляется из циркуляции при помощи протеолиза. [0006] Из-за частого дозирования и неудобств, связанных с режимом дозирования, до сих пор существует потребность в разработке продуктов, содержащих OVIII, которые требуют менее частого применения, т.е., содержащего OVIII продукта, который имеет время полужизни, превышающее ограничение в 1,5-2-кратное увеличение времени полужизни. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ [0007] Настоящее изобретение относится к химерному белку, содержащему белок фактора VIII ("OVIII") и дополнительный компонент ("ДК"), причем дополнительный компонент подавляет или предотвращает связывание эндогенного ОВ с белком OVIII. Белок OVIII и дополнительная группа связаны между собой ковалентной связью для того, чтобы предотвратить диссоциацию дополнительного компонента в присутствии эндогенного ОВ. В одном варианте реализации изобретения ковалентная связь представляет собой пептидную связь, дисульфидную связь или линкер, который является достаточно сильным для того, чтобы предотвратить диссоциацию дополнительного компонента от белка OVIII в присутствии эндогенного ОВ. В другом варианте реализации изобретения дополнительный компонент предотвращает выведение белка OVIII в процессе очистки ОВ. В других вариантах реализации изобретения дополнительный компонент подавляет или предотвращает связывание эндогенного ОВ с белком OVIII путем экранирования или блокирования ОВ-связывающего участка белка OVIII. Например, ОВ-связывающий участок находится в домене A3 или домене С2 белка OVIII, или в обоих - домене A3 и домене С2. [0008] В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок включает конструкцию, содержащую белок OVIII и дополнительный компонент, которые связаны между собой ковалентной связью, при этом химерный белок не содержит фактор, ограничивающий время полужизни OVIII, который индуцирует ограничение времени полужизни белка OVIII, например, полноразмерный белок ОВ или зрелый белок ОВ. Следовательно, в некоторых вариантах реализации изобретения время полужизни белка OVIII химерного белка выходит за пределы ограничения по времени полужизни белка OVIII в присутствии эндогенного ОВ. [0009] В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент обладает по меньшей мере одним ОВ-подобным OVIII-защитным свойством. Примеры ОВ-подобного OVIII-защитного свойства включают, но не ограничиваются этим, защиту белка OVIII от одного или более расщеплений протеазой, защиту белка OVIII от активации, стабилизацию тяжелой цепи и/или легкой цепи белка OVIII или предотвращение выведения белка OVIII одним или более фагоцитарными рецепторами. В одном варианте реализации изобретения дополнительный компонент содержит полипептид, неполипептидный компонент или оба этих компонента. В другом варианте реализации изобретения дополнительный компонент может представлять собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность длиной в по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 110, по меньшей мере около 120, по меньшей мере около 130, по меньшей мере около 140, по меньшей мере около 150, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 250, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 350, по меньшей мере около 400, по меньшей мере около 450, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 550, по меньшей мере около 600, по меньшей мере около 650, по меньшей мере около 700, по меньшей мере около 750, по меньшей мере около 800, по меньшей мере около 850, по меньшей мере около 900, по меньшей мере около 950 или по меньшей мере около 1000 аминокислот. В определенных вариантах реализации изобретения дополнительный компонент содержит фрагмент ОВ, константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент или любые комбинации этих компонентов. В других вариантах реализации изобретения дополнительный компонент представляет собой неполипептидный компонент, содержащий полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов. [0010] В определенных вариантах реализации изобретения дополнительный компонент содержит фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3 ФВ, при этом фрагмент ФВ связан с белком ФУШ нековалентной связью в дополнение к ковалентной связи между белком ФУШ и дополнительным компонентом (фрагментом ФВ). В одном примере фрагмент ФВ является мономером. В другом примере фрагмент ФВ содержит два, три, четыре, пять или шесть фрагментов ФВ, связанных друг с другом одной или более связями. [ООН] В одном аспекте реализации изобретения химерный белок содержит дополнительный компонент, например, фрагмент ФВ, и по меньшей мере один гетерологичный компонент (HI) и произвольный линкер между дополнительным компонентом, например, фрагментом ФВ, и гетерологичным компонентом (HI). В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (HI) может содержать вещество, которое продлевает время полужизни белка ФУШ, например, полипептид, выбранный из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов, либо неполипептидный компонент, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (HI) содержит первую Fc-область. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (HI) содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере около 50 аминокислот, по меньшей мере около 100 аминокислот, по меньшей мере около 150 аминокислот, по меньшей мере около 200 аминокислот, по меньшей мере около 250 аминокислот, по меньшей мере около 300 аминокислот, по меньшей мере около 350 аминокислот, по меньшей мере около 400 аминокислот, по меньшей мере около 450 аминокислот, по меньшей мере около 500 аминокислот, по меньшей мере около 550 аминокислот, по меньшей мере около 600 аминокислот, по меньшей мере около 650 аминокислот, по меньшей мере около 700 аминокислот, по меньшей мере около 750 аминокислот, по меньшей мере около 800 аминокислот, по меньшей мере около 850 аминокислот, по меньшей мере около 900 аминокислот, по меньшей мере около 950 аминокислот или по меньшей мере около 1000 аминокислот. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит линкер между дополнительным компонентом, например, фрагментом ФВ, и гетерологичным компонентом (HI), который является отщепляемым линкером. [0012] В другом аспекте реализации изобретения белок ФУШ в химерном белке содержит ФУШ и по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н2). В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) способен продлевать время полужизни белка ФУШ, например, полипептида, выбранного из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов, либо неполипептидного компонента, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В конкретном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) содержит вторую Fc-область. [0013] В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую фрагмент ФВ, первый гетерологичный компонент и линкер, и вторую полипептидную цепь, содержащую белок ФУШ и второй гетерологичный компонент, при этом первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь связаны друг с другом ковалентной связью. В одном примере первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент связаны друг с другом ковалентной связью, например, дисульфидной связью, пептидной связью или линкером, при этом ковалентная связь препятствует замещению фрагмента ФВ в первой полипептидной цепи эндогенным ФВ invivo. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер между белком ФУШ и вторым гетерологичным компонентом является отщепляемым линкером. [0014] В определенных вариантах реализации изобретения первый гетерологичный компонент (HI), связанный с фрагментом ФВ, и второй гетерологичный компонент (Н2), связанный с белком ФУШ, связаны посредством линкера, например, линкера оцБс, который является процессируемым линкером. [0015] В других вариантах реализации изобретения белок ФУШ химерного белка дополнительно содержит третий гетерологичный компонент (НЗ), четвертый гетерологичный компонент (Н4), пятый гетерологичный компонент (Н5), шестой гетерологичный компонент (Н6) или любые их комбинации. В одном варианте реализации изобретения один или более из третьего гетерологичного компонента (НЗ), четвертого гетерологичного компонента (Н4), пятого гетерологичного компонента (Н5), шестого гетерологичного компонента (Н6) способны продлевать время полужизни белка OVIII. В других вариантах реализации изобретения третий гетерологичный компонент (НЗ), четвертый гетерологичный компонент (Н4), пятый гетерологичный компонент (Н5) и шестой гетерологичный компонент (Н6) связаны с С-концом или N-концом OVIII либо вставлены между двумя аминокислотами OVIII. В других вариантах реализации изобретения один или более из третьего гетерологичного компонента (НЗ), четвертого гетерологичного компонента (Н4), пятого гетерологичного компонента (Н5) или шестого гетерологичного компонента (Н6) содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере около 50 аминокислот, по меньшей мере около 100 аминокислот, по меньшей мере около 150 аминокислот, по меньшей мере около 200 аминокислот, по меньшей мере около 250 аминокислот, по меньшей мере около 300 аминокислот, по меньшей мере около 350 аминокислот, по меньшей мере около 400 аминокислот, по меньшей мере около 450 аминокислот, по меньшей мере около 500 аминокислот, по меньшей мере около 550 аминокислот, по меньшей мере около 600 аминокислот, по меньшей мере около 650 аминокислот, по меньшей мере около 700 аминокислот, по меньшей мере около 750 аминокислот, по меньшей мере около 800 аминокислот, по меньшей мере около 850 аминокислот, по меньшей мере около 900 аминокислот, по меньшей мере около 950 аминокислот или по меньшей мере около 1000 аминокислот. [0016] В некоторых вариантах реализации изобретения линкер между белком OVIII и вторым гетерологичным компонентом или линкер между фрагментом ОВ и первым гетерологичным компонентом дополнительно содержит первый сайт расщепления (Р1) HaN-концевом участке линкера, второй сайт расщепления (Р2) на С-концевом участке линкера, либо оба этих компонента. В других вариантах реализации изобретения один или более элементов из линкера между белком OVIII и дополнительным компонентом, линкера между белком OVIII и вторым гетерологичным компонентом и линкера между фрагментом ОВ и первым гетерологичным компонентом имеют длину от около 1 до около 2000 аминокислот. [0017] В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит белок OVIII и дополнительный компонент, которые связаны посредством линкера между белком OVIII и дополнительным компонентом, при этом линкер дополнительно содержит распознающий сортазу мотив, например, последовательность LPXTG (SEQTONO: 106 ). [0018] Настоящее изобретение относится к фрагменту фактора Виллебранда (ФВ), содержащему домен D' и домен D3 ФВ, причем фрагмент ФВ связывается с фактором VIII ^VIII) и препятствует связыванию эндогенного ФВ с белком ФVIII. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, являющийся объектом изобретения, не является аминокислотами от 764 до 1274 из SEQIDNO: 2. В одном варианте реализации изобретения белок ФVIII без фрагмента ФВ имеет время полужизни сравнимое с ФVIII дикого типа. В другом варианте реализации изобретения белок ФVIII является слитым белком, содержащим ФVIII и гетерологичный компонент, который способен продлевать время полужизни ФVIII. Гетерологичный компонент может являться полипептидом, неполипептидным компонентом или обоими этими компонентами. Гетерологичный полипептидный компонент может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любой комбинации этих компонентов. В других вариантах реализации изобретения гетерологичный полипептидный компонент является константной областью иммуноглобулина или ее частью, например, Fc-областью. В других вариантах реализации изобретения неполипептидный компонент выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения белок ФVIII содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом первая полипептидная цепь содержит ФVIII и первую Fc-область, а вторая полипептидная цепь содержит вторую Fc-область без ФVIII. [0019] В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ продлевает время полужизни ФVIII. Аминокислотная последовательность домена D' может быть по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотам от 764 до 866 из SEQIDNO: 2. Также аминокислотная последовательность домена D3 может быть по меньшей мере на 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотам от 867 до 1240 из SEQIDNO: 2. В определенных вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в остатке, соответствующем остатку 1099, остатку 1142 либо им обоим из SEQIDNO: 2. В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислот от 764 до 1240 из SEQIDNO: 2. Фрагмент ФВ может дополнительно содержать домен D1, домен D2 или домены Din D2, принадлежащие ФВ. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ дополнительно содержит домен ФВ, выбранный из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена A3, домена D4, домена В1, домена В2, домена ВЗ, домена С1, домена С2, домена СК, одного или более их фрагментов и любых комбинаций этих компонентов. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ является пэгилированным, гликопэгилированным, гэкилированным или полисиалилированным. [0020] Настоящее изобретение также относится к химерному белку, содержащему описанный в данном тексте фрагмент ФВ, гетерологичный компонент и произвольный линкер между фрагментом ФВ и гетерологичным компонентом. Гетерологичный компонент может являться полипептидом, неполипептидным компонентом или обоими этими компонентами. В одном варианте реализации изобретения гетерологичный полипептидный компонент выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любой комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный неполипептидный компонент выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В конкретном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент представляет собой первую Fc-область. Химерный белок может дополнительно содержать вторую Fc-область, при этом вторая Fc-область связана или соединена с первой Fc-областью либо связана или соединена с фрагментом ФВ. [0021] В одном аспекте химерный белок, являющийся объектом изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из: (аа) V-L1-H1-L2-H2, (бб) H2-L2-H1-L1-V, (вв) H1-L1-V-L2-H2, и (гг) H2-L2-V-L1-H1, где V является одним или более из описанных в данном тексте фрагментов ФВ, каждый из L1 и L2 является произвольным линкером; HI является первым гетерологичным компонентом; (-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот; и Н2 является произвольным вторым гетерологичным компонентом. [0022] В одном варианте реализации изобретения HI является первым гетерологичным компонентом, например, продлевающей время полужизни молекулой, известной в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент является полипептидом. Первый гетерологичный полипептидный компонент выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения HI является неполипептидным компонентом, выбранным из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. Н2 является произвольным вторым гетерологичным компонентом, например, продлевающей время полужизни молекулой, известной в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любой комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения Н2 является неполипептидным компонентом, который выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения HI является первой Fc-областью, а Н2 является второй Fc-областью. Первая Fc-область и вторая Fc-область могут быть одинаковыми или различными, и могут быть связаны друг с другом линкером или ковалентной связью, например, дисульфидной связью. В другом варианте реализации изобретения вторая Fc-область связана или соединена с белком фактора VIII. В некоторых случаях может присутствовать третий гетерологичный компонент НЗ, который продлевает время полужизни и который связан с фрагментом ФВ, первым гетерологичным компонентом или вторым гетерологичным компонентом. Неограничивающие примеры третьего гетерологичного компонента могут включать полипептидный или неполипептидный компоненты либо оба эти компонента. В одном варианте реализации изобретения третий гетерологичный компонент может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента или любых комбинаций этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения Н2 является неполипептидным компонентом, который может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения НЗ связан с фрагментом ФВ или первым либо вторым гетерологичным компонентом посредством отщепляемого линкера, например, тромбин- отщепляемым линкером. Неограничивающие примеры линкеров приведены в другом месте данного текста. [0023] В другом аспекте изобретения предложен химерный белок, содержащий описанный в данном тексте фрагмент ФВ, белок ФУШ и произвольный линкер между фрагментом ФВ и белком ФУШ. Фрагмент ФВ может быть связан с белком ФУШ. В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ, который связан с гетерологичным компонентом. Гетерологичный компонент может являться компонентом, который продлевает время жизни белка, который содержит полипептид, неполипептидный компонент или оба эти компонента. Примеры такого гетерологичного полипептида включают, например, константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент или любые комбинации этих компонентов. Примеры неполипептидного компонента включают, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент является первой Fc-областью, связанной с фрагментом ФВ. В других вариантах реализации изобретения химерный белок дополнительно содержит вторую Fc-область, связанную с белком ФУШ. Фрагмент ФВ или белок ФУШ могут быть связаны с первой Fc-областью или второй Fc-областью, соответственно, посредством линкера. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ, связанный с первым гетерологичным компонентом, например, с первой Fc-областью, и белок ФУШ, связанный со вторым гетерологичным компонентом, например, с второй Fc-областью, при этом фрагмент ФВ дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом (например, второй Fc-областью) или белком ФУШ посредством линкера или ковалентной связью либо первый гетерологичный компонент (например, Fc-область) дополнительно связан с белком ФУШ или вторым гетерологичным компонентом (например, второй Fc-областью) посредством линкера или ковалентной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФУШ химерного белка содержит частичный В-домен. В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФУШ с неполным В-доменом является ФУТШ98 (SEQIDNO: 105). В других вариантах реализации изобретения химерный белок дополнительно содержит распознающий сортазу мотив. [0024] В некоторых вариантах реализации результатом изобретения является продление времени полужизни белка ФУШ по сравнению с белком ФУШ без фрагмента ФВ или ФУШ дикого типа. Время полужизни белка ФУШ по меньшей мере в 1,5 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 2,5 раз, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 11 раз или по меньшей мере в 12 раз больше, чем время полужизни белка ФУШ без фрагмента ФВ. В одном варианте реализации изобретения время полужизни ФУШ приблизительно 1,5-20-кратно, приблизительно 1,5-15-кратно или приблизительно 1,5-10 кратно превышает время полужизни ФУШ дикого типа. В другом варианте реализации изобретения время полужизни ФУШ продлено в от около 2 раз до около 10 раз, от около 2 раз до около 9 раз, от около 2 раз до около 8 раз, от около 2 раз до около 7 раз, от около 2 раз до около 6 раз, от около 2 раз до около 5 раз, от около 2 раз до около 4 раз, от около 2 раз до около 3 раз, от около 2,5 раз до около 10 раз, от около 2,5 раз до около 9 раз, от около 2,5 раз до около 8 раз, от около 2,5 раз до около 7 раз, от около 2,5 раз до около 6 раз, от около 2,5 раз до около 5 раз, от около 2,5 раз до около 4 раз, от около 2,5 раз до околоЗ раз, от около 3 раз до около 10 раз, от около 3 раз до около 9 раз, от около 3 раз до около 8 раз, от около 3 раз до около 7 раз, от около 3 раз до около 6 раз, от около 3 раз до около 5 раз, от около 3 раз до около 4 раз, от около 4 раз до около 6 раз, от около 5 раз до около 7 раз или от около 6 раз до около 8 раз по сравнению с ФУШ дикого типа или белком ФУШ без фрагмента ФВ. В других вариантах реализации изобретения время полужизни ФУШ составляет по меньшей мере около 17 часов, по меньшей мере около 18 часов, по меньшей мере около 19 часов, по меньшей мере около 20 часов, по меньшей мере около 21 часа, по меньшей мере около 22 часов, по меньшей мере около 23 часов, по меньшей мере около 24 часов, по меньшей мере около 25 часов, по меньшей мере около 26 часов, по меньшей мере около 27 часов, по меньшей мере около 28 часов, по меньшей мере около 29 часов, по меньшей мере около 30 часов, по меньшей мере около 31 часа, по меньшей мере около 32 часов, по меньшей мере около 33 часов, по меньшей мере около 34 часов, по меньшей мере около 35 часов, по меньшей мере около 36 часов, по меньшей мере около 48 часов, по меньшей мере около 60 часов, по меньшей мере около 72 часов, по меньшей мере около 84 часов, по меньшей мере около 96 часов или по меньшей мере около 108 часов. В других вариантах реализации изобретения время полужизни OVIII составляет от около 15 часов до около двух недель, от около 16 часов до около одной недели, от около 17 часов до около одной недели, от около 18 часов до около одной недели, от около 19 часов до около одной недели, от около 20 часов до около одной недели, от около 21 часа до около одной недели, от около 22 часов до около одной недели, от около 23 часов до около одной недели, от около 24 часов до около одной недели, от около 36 часов до около одной недели, от около 48 часов до около одной недели, от около 60 часов до около одной недели, от около 24 часов до около шести дней, от около 24 часов до около пяти дней, от около 24 часов до около четырех дней, от около 24 часов до около трех дней или от около 24 часов до около двух дней. [0025] В некоторых вариантах реализации изобретения среднее время полужизни OVIII у пациента составляет около 15 часов, около 16 часов, около 17 часов, около 18 часов, около 19 часов, около 20 часов, около 21 часа, около 22 часов, около 23 часов, около 24 часов (1 дня), около 25 часов, около 26 часов, около 27 часов, около 28 часов, около 29 часов, около 30 часов, около 31 часа, около 32 часов, около 33 часов, около 34 часов, около 35 часов, около 36 часов, около 40 часов, около 44 часов, около 48 часов (2 дней), около 54 часов, около 60 часов, около 72 часов (3 дней), около 84 часов, около 96 часов (4 дней), около 108 часов, около 120 часов (5 дней), около шести дней, около семи дней (одной недели), около восьми дней, около девяти дней, около 10 дней, около 11 дней, около 12 дней, около 13 дней или около 14 дней. [0026] В другом аспекте химерный белок, являющийся объектом изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из: (a) V-L1-H1-L3-C-L2-H2, (b) H2-L2-C- L3 - Н1-L1 -V, (c) C-L2-H2-L3-V-L1-H1, (a) (d) H1-L1-V-L3-H2-L2-C, (e) H1-L1-V-L3-C-L2-H2, (f) H2-L2-C-L3- V-L1-H1, (g) V-L1-H1-L3-H2-L2-C, (h) C-L2-H2- L3 - H1 -L1 -V, (i) H2-L3-H1-L1-V-L2-C, 0) C-L2-V-L1-H1-L3-H2, (k) V-L2-C-L1-H1-L3-H2, и (1) H2-L3-H1-L1-C-L2-V, где V является описанным в данном тексте фрагментом ФВ; каждый из L1 или L2 является произвольным линкером, например, тромбин-отщепляемым линкером; L3 является произвольным линкером, например, OIIFC линкером, например, процессируемым линкером; каждый из HI или Н2 является произвольным гетерологичным компонентом; С является белком OVIII; и (-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот. [0027] В других аспектах химерный белок, являющийся объектом изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из: (m) V-L1-H1: H2-L2-C, (n) V-L1-H1:C-L2-H2, (о) H1-L1-V:H2-L2-C, (р) H1-L1-V:C-L2-H2, (q) V:C-L1-H1:H2, (г) V:H1-L1-C:H2, (s) H2:H1-L1-C:V, (t) C:V-L1-H1:H2, и (u) C:H1-L1-V:H2, где V является описанным в данном тексте фрагментом ФВ; каждый из L1 или L2 является произвольным линкером, например, тромбин-отщепляемым линкером; каждый из HI или Н2 является произвольным гетерологичным компонентом; С является белком OVIII; (-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот; и (:) представляет химическое или физическое соединение между HI и Н2, между V и С, и между V и HI и С и Н2. (:) представляет собой химическое соединение, например, по меньшей мере одну непептидную связь. В определенных вариантах реализации изобретения химическое соединение, т.е., (:), является ковалентной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение между HI и Н2 является ковалентной связью, например, дисульфидной связью. В других вариантах реализации изобретения соединение, т.е., (:), является нековалентным взаимодействием, например, ионным взаимодействием, гидрофобным взаимодействием, гидрофильным взаимодействием, Ван-дер-Ваальсовским взаимодействием, водородной связью. В определенных вариантах реализации изобретения соединение между белком OVIII и фрагментом ОВ является нековалентной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является не пептид ной ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является пептидной связью. В одном варианте реализации изобретения HI является первым гетерологичным компонентом. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент способен продлевать время полужизни активности OVIII. В другом варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент является полипептидом, неполипептидным компонентом или обеими этими компонентами. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения неполипептидный компонент выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения Н2 является вторым гетерологичным компонентом. Второй гетерологичный компонент также может являться известным в данной области техники веществом, продлевающим время полужизни, и являться полипептидным, неполипептидным компонентом или обеими этими компонентами. В одном варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения неполипептидный компонент выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В конкретном варианте реализации изобретения HI является первой Fc-областью. В некоторых вариантах реализации изобретения Н2 является второй Fc-областью. В некоторых случаях может присутствовать третий гетерологичный компонент НЗ, который продлевает время полужизни. НЗ может быть связан с одним или более элементом из V, С, HI или Н2 посредством произвольного линкера, например, отщепляемого линкера, например, тромбин-отщепляемого линкера. Неограничивающие примеры третьего гетерологичного компонента могут включать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, полиэтиленгликоль (ПЭГ), последовательность PAS, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК) или их производные. [0028] В определенных вариантах реализации изобретения один или более из линкеров, применяемых для соединения друг с другом фрагмента ФВ, белка OVIII, первого гетерологичного компонента и/или второго гетерологичного компонента, соответствующих формулам от (а) до (и), является отщепляемым линкером. Один или более из сайтов расщепления химерного белка могут отщепляться протеазой, выбранной из группы, состоящей из фактора Х1а, фактора ХПа, калликреина, фактора Vila, фактора ГХа, фактора Ха, фактора Па (тромбина), эластазы-2, гранзима В, ВГТ, энтерокиназы, протеазы ЗС, сортазы А, ММП-12, ММП-13, ММП-17 и ММП-20. В других вариантах реализации изобретения один или более линкеров, применяемых в формулах от (а) до (1) (например, L3), содержат процессируемый линкер. Процессируемые линкеры могут отщепляться внутриклеточным ферментом непосредственно после секреции. Процессируемый линкер может содержать первый сайт расщепления (Р1) на N-концевом участке линкера, второй сайт расщепления (Р2) на С-концевом участке линкера, либо оба этих компонента. [0029] В некоторых вариантах реализации изобретения один или более из линкеров, применяемых в изобретении, имею длину в по меньшей мере от около 1 до около 2000 аминокислот. В определенном варианте реализации изобретения один или более из линкеров, применяемых в изобретении, имею длину в по меньшей мере около 20, 35, 42, 48, 73, 98, 144, 288, 324, 576 или 864 аминокислот. В конкретном варианте реализации изобретения один или более из линкеров содержат пептид gly/ser. Пептид gly/ser может представлять собой (Gly4 Serb или (Gly4 Ser)4. [0030] В других аспектах реализации изобретения белок OVIII в химерном белке является функциональным белком фактора VIII. Белок OVIII может содержать один или более доменов OVIII, выбранных из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена В, домена A3, домена С1, домена С2, одного или более их фрагментов и любых их комбинаций. В одном варианте реализации изобретения белок OVIII содержит В-домен или его часть. В другом варианте реализации изобретения белок OVIII является OVIII-SQ с удаленным В-доменом. В других вариантах реализации изобретения белок OVIII содержит одиночную цепь OVIII. В других вариантах реализации изобретения белок OVIII содержит тяжелую цепь OVIII и легкую цепь фактора VIII, при этом тяжелая цепь и легкая цепь соединены между собой металлической связью. В определенных вариантах реализации изобретения белок OVIII обладает низкой аффинностью к либо не связывается с белком, родственным рецептору липопротеинов низкой плотности (БРР). Например, белок OVIII, применяемый в изобретении, может содержать по меньшей мере одну аминокислотную замену, которая снижает аффиность к или исключает связывание с БРР. Неограничивающими примерами по меньшей мере одной аминокислотной замены являются замены остатков полноразмерного зрелого OVIII, соответствующих остатку 471, остатку 484, остатку 487, остатку 490, остатку 497, остатку 2092, остатку 2093 либо двум или более их комбинациям. В некоторых вариантах реализации изобретения белок OVIII в химерном белке, являющемся объектом данного изобретения, содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, которая обуславливает стабильность белка OVIII большую, чем у белка OVIII без замены. В других вариантах реализации изобретения белок OVIII содержит по меньшей мере две аминокислотных замены в домене А2 и по меньшей мере одну аминокислотную замену в домене A3, при этом домен А2 и домен А2 соединены между собой ковалентной связью. Неограничивающими примерами аминокислотной замены в домене А2 являются замены остатков полноразмерного зрелого OVIII, соответствующих остатку 662 или 664. Вдобавок, неограничивающими примерами аминокислотной замены в домене A3 являются замены остатков полноразмерного зрелого полисиалилированного OVIII, соответствующих остатку 1826 или 1828. [0031] В дополнительных аспектах изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий описанный в данном тексте фрагмент ОВ или описанный в данном тексте химерный белок, либо группа полинуклеотидов, содержащая первую нуклеотидную цепь и вторую нуклеотидную цепь, при этом первая нуклеотидная цепь колирует фрагмент ФВ, а вторая нуклеотидная цепь кодирует вторую Fc-область, или фактор свертывания крови, или его фрагмент, принадлежащие химерному белку. В одном варианте реализации изобретения группа полинуклеотидов дополнительно содержит третью полипептидную цепь, которая кодирует пропротеин конвертазу, которая принадлежит семейству субтилизин-подобных пропротеин конвертаз. Неограничивающие примеры пробелка конвертазы включают пропротеин конвертазу субтилизин/кексин типа 3 (РАСЕ или PCSK3), пропротеин конвертазу субтилизин/кексин типа 5 (PCSK5 или РС5), пропротеин конвертазу субтилизин/кексин типа 7 (PCSK7 или РС7) или дрожжевую протеазу Кех 2. В других аспектах изобретение включает вектор, содержащий полинуклеотид или группу полинуклеотидов и один или более промоторов, функционально связанных с полинуклеотидом или группой полинуклеотидов, либо группу векторов, содержащую первый вектор и второй вектор, при этом первый вектор кодирует первую полинуклеотидную цепь группы полинуклеотидов, а второй вектор кодирует вторую полинуклеотидную цепь группы полинуклеотидов. Группа векторов может дополнительно содержать третий вектор, который содержит третью полинуклеотидную цепь, кодирующую PC 5 или РС7. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор дополнительно содержит РАСЕ. В некоторых вариантах реализации изобретения РАСЕ отщепляет домены D1D2 фрагмента ФВ. [0032] Некоторые аспекты изобретение относятся к фармацевтическому составу, содержащему фрагмент ФВ, химерный белок, полинуклеотид, группу полинуклеотидов, вектор или группу векторов и фармацевтически приемлемый носитель. Состав, являющийся объектом данного изобретения, может продлевать время полужизни фактора VIII. В других аспектах изобретение включает клетку-хозяина, содержащую полинуклеотид, группу полинуклеотидов, вектор или группы векторов. [0033] Другие аспекты настоящего изобретения относятся к химерному белку, содержащему белок ФVIII, дополнительный компонент и произвольный линкер, при этом дополнительный компонент подавляет или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком ФVIII и обладает по меньшей мере одним ФВ-подобным ФVIII-зaщитным свойством. ФВ-подобное ФVIII-зaщитнoe свойство включает защиту белка ФVIII от одного или более расцеплений протеазой, защиту белка ФVIII от активации, стабилизацию тяжелой цепи и/или легкой цепи белка OVIII или предотвращение выведения белка OVIII одним или более фагоцитарными рецепторами. [0034] Дополнительный компонент химерного белка может подавлять или предотвращать связывание эндогенного ОВ с белком OVIII путем защиты или блокирования ОВ-связывающего участка белка OVIII. В некоторых вариантах реализации изобретения ОВ-связывающий участок находится в домене A3 или домене С2 белка OVIII, или в обоих - домене A3 и домене С2 белка OVIII. В другом варианте реализации изобретения ОВ-связывающий участок представляет собой аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам от 1669 до 1689 и от 2303 до 2332 из SEQIDNO: 16. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент является полипептидным, неполипептидным компонентом или обоими этими компонентами. Полипептид, применяемый в качестве дополнительного компонента, может содержать аминокислотную последовательность длиной по меньшей мере в 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ПО, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 аминокислот. Например, полипептид, применяемый в качестве дополнительного компонента, может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, других продлевающих время полужизни соединений и любых комбинаций этих компонентов. Неполипептидный компонент, применяемый в качестве дополнительного компонента, может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК) или их производных и любых комбинаций этих компонентов. В одном варианте реализации изобретения дополнительный компонент является описанным в данном тексте фрагментом ОВ. Дополнительный компонент и белок OVIII могут быть связанными, например, посредством линкера, или соединенными друг с другом. Линкер может содержать отщепляемый линкер, например, тромбин-отщепляемый линкер. [0035] В одном аспекте изобретения предложен способ предотвращения или подавления связывания белка OVIII с эндогенным ОВ, включающий введение эффективного количества фрагмента ОВ, химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов в клетку, содержащую белок OVIII или полинуклеотид, кодирующий белок OVIII, при этом фрагмент ОВ связывается с белком OVIII. В другом аспекте изобретение включает способ предотвращения или подавления связывания белка OVIII с эндогенным ОВ, включающий введение эффективного количества химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов нуждающемуся в этом пациенту, при этом фрагмент ОВ связывается с белком OVIII и тем самым предотвращает или подавляет связывание белка OVIII. В некоторых аспектах изобретение включает способ продления или увеличения времени полужизни белка OVIII, при этом способ включает введение эффективного количества фрагмента ОВ, химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов в клетку, содержащую белок OVIII или полинуклеотид, кодирующий белок OVIII, или нуждающемуся в этом пациенту, при этом фрагмент ОВ связывается с белком OVIII. Другие аспекты изобретения относятся к способу предотвращения или подавления выведения белка OVIII из клетки, при этом способ включает введение эффективного количества фрагмента ОВ, химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов в клетку, содержащую белок OVIII или полинуклеотид, кодирующий белок OVIII, или нуждающемуся в этом пациенту, при этом фрагмент ОВ связывается с белком OVIII. [0036] Другой аспект изобретения относится к способу лечения заболевания или нарушения, связанного с кровотечением, у нуждающегося в этом пациента, включающему введение эффективного количества фрагмента ОВ, химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов, при этом заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. В других вариантах реализации изобретения лечение является профилактическим или осуществляется по требованию. В других вариантах реализации изобретения предложен способ лечения заболевания или нарушения, связанного с болезнью Виллебранда типа 2N, у нуждающегося в этом пациента, включающий введение эффективного количества фрагмента ОВ, химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов, при этом заболевание или нарушение излечивается. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ/ФИГУР [0037] Фигура 1А-Е. Схематические изображения белков ФВ. На Фиг. 1А показаны два фрагмента ФВ, содержащие аминокислоты от 1 до 276 из SEQIDNO: 73 (аминокислоты от 764 до 1039 из SEQIDNO: 2). ФВ-001 синтезирован без пре/пропептидных последовательностей ФВ, а ФВ-009 синтезирован с пре/пропептидными последовательностями (домены Din D2). Препептид ФВ-009 отщепляется во время синтеза, а ФВ-009 содержит пропептид с последовательностями доменов D' и D3. На Фиг. 1Б показаны три фрагмента ФВ, содержащие аминокислоты от 1 до 477 из SEQIDNO: 73 (аминокислоты от 764 до 1240 из SEQIDNO: 2). ФВ-002 синтезирован без пре/пропептидных последовательностей. ФВ-010 содержит домены D1D2 дополнительно к доменам D'D3. ФВ-013 содержит домены D1D2D'D3 дополнительно к остаткам аланина, замещающим цистеин в остатках 336 и 379 из SEQIDNO: 72. На Фиг. 1В показаны два фрагмента ФВ, содержащие домены D'D3 и часть домена А1. ФВ-003 содержит аминокислоты от 764 до 1274 из SEQIDNO: 2. ФВ-011 содержит домены D1D2 дополнительно к доменам D'D3. На Фиг. 1Г показаны две конструкции - ФВ-004 и ФВ-012. ФВ-004 содержит домены D'D3 и полную последовательность домена А1. ФВ-012 содержит домены D1D2D'D3 и полную последовательность домена А1. На Фиг. 1Д показаны три конструкции. ФВ-006 содержит домены D1D2D'D3 и домен СК ФВ (цистеиновый узловой домен - от англ. "cysteineknotdomain"). ФВ-008 является полноразмерным ФВ. ФВ-031 (ФВ-Fc) демонстрирует конструкцию, содержащую домены D1D2D'D3, связанные с одиночной Fc-областью посредством отщепляемого линкера. ФВ-053 представляет собой домены D1D2. На Фиг. 1Е показан полноразмерный белок ФВ, содержащий пропептид (домены D1 и D2) и зрелые субъединицы (домены D', D3, Al, А2, A3, D4, Bl-3, С1-2). Белок ФВ является белком в около 250 кДа и образует мультимеры (> 20 МДа) путем дисульфидного связывания. Белок ФВ объединяется с ФУШ (95-98%) в нековалентный комплекс и далее продлевает время полужизни ФУШ, защищая ФУШ от отщепления протеазой/активации, стабилизируя тяжелую и легкую цепь и предотвращая очищение от ФУШ фагоцитарными рецепторами. Белок ФВ также может ограничивать время полужизни ФУШ путем очищения комплекса ФУШ-ФВ при помощи рецепторов ФВ и предотвращая пиноцитоз и рециклинг рФУПТЕс. [0038] Фигура 2 Схематические изображения примеров конструкций гетеродимеров ФВ:ФУШ. Левая конструкция демонстрирует фрагмент ФВ, содержащий домены D'D3 полноразмерного ФВ (аминокислоты 1-477 из SEQIDNO: 73) и содержащий замены аланина в остатках 336 и 379 из SEQIDNO: 72. Конструкция химерного белка (ФУШ 064/065) содержит С-конец фрагмента ФВ, связанный с первой Fc-областью посредством линкера, а ФУШ связан со второй Fc-областью, при этом вторая Fc-область дополнительно связана с N-концом фрагмента ФВ посредством линкера (например, формула C-H1-L1-V-L2-H2, в которой V является фрагментом ФВ, С является ФУШ, HI и Н2 являются Fc-областями, a L1 и L2 являются отщепляемыми линкерами). Конструкция на Фигуре 26 является внутриклеточно процессированной конструкцией гетеродимера ФВ:ФУШ, в которой был отщеплен линкер между второй Fc-областью и N-концом фрагмента ФВ. ФУШ-064 содержит домены D'D3 ФВ (аминокислоты от 1 до 477 из SEQIDNO: 73 с заменами С336А и С379). ФУШ-065 содержит домены D'D3 ФВ (аминокислоты от 1 до 276 из SEQIDNO: 73). ФУШ-136 содержит ФУШЕс, связанную с Fc-фрагментом D'D3 посредством линкера, который может процессировать внутриклеточный протеазный фермент. Когда экспрессируется ФУШ-136, фермент отщепляет линкер между второй Fc-областью (соединенной с ФУШ-ЛЦ) и D'D3 фрагментом ФВ (соединенным с первой Fc-областью), в то время как Fc-область, соединенная с (или связанная с) ФУШ-ЛЦ, образует ковалентную связь (например, дисульфидную связь) с первой Fc-областью, соединенной с (или связанной с) фрагментом ФВ. ФУШ-148 является одноцепочечным ФУПГЕс с фрагментом D'D3 (одноцепочечный ФУШ, получен путем внесения мутацииглЛ645А/КЛ648А в ген ФУШ). [0039] Фигура 3. Схематические изображения примеров конструкций гетеродимеров ФВ:ФУШ, содержащие примеры переменных линкеров между ФВ и Fc-областью. Конструкции (ФУШ-064, ФУШ-159, ФУШ-160, ФУШ-178 и ФУШ-179) имеют общую структуру, представленную формулой C-H1-L1-V-L2-H2, но содержат в качестве примеров различные линкеры или аминокислотные замены. Показанные конструкции содержат одинаковый фрагмент ФВ, который представляет собой домены D' и D3 ФВ (т.е., аминокислоты от 1 до 477 из SEQIDNO: 73 с аминокислотными заменами С336А и С379). Конструкция ФУШ 64 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е., L2) между фрагментом ФВ и Fc-областью (т.е., Н2), который содержит 20 аминокислот. Конструкция ФУШ 159 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е., L2) между фрагментом ФВ и Fc-областью (т.е., Н2), который содержит 35 аминокислот. Конструкция ФУШ 160 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е., L2) между фрагментом ФВ и Fc областью (т.е., Н2), который содержит 48 аминокислот. Конструкции OVIII-180, OVIII-181 и OVIII-182 являются производными OVIII-160, содержащими мутацию К2092А в домене CI OVIII, мутацию К2093А в домене CI OVIII и мутации К2092А/К2093А в домене CI OVIII, соответственно. Конструкция OVIII-178 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е., L2) между фрагментом ОВ и Fc- областью (т.е., Н2), который содержит 73 аминокислоты. Конструкция OVIII-179 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е., L2) между фрагментом ОВ и Fc- областью (т.е., Н2), который содержит 98 аминокислот. [0040] Оигура 4. Схематические изображения примеров конструкций OVIII-OB, в которых ОВ является D1D2D'D3 фрагментом ОВ, линкер является линкером переменной длины, содержащим сайт расщепления, например, сайт расщепления тромбином, ОЦ OVIII является одноцепочечным OVIII, который содержит замены R1645A/R1648A, Н является гетерологичным компонентом, например, константной областью иммуноглобулина или ее частью, компонентом для конъюгации полиэтиленгликоля (ПЭГ) и/или ПЭГ, альбумином или фрагментом альбумина, альбумин связывающим веществом, последовательностью НАР, компонентом для полисиалирования и/или полисиаловой кислотой, компонентом для гидроксиэтилового крахмала (ГЭК) и/или ГЭК или последовательностью PAS и т.д., ТЦ OVIII является тяжелой цепью OVIII, ЛЦ OVIII является легкой цепью OVIII, а Fc является Fc-областью константной области иммуноглобулина. На Оигуре 4А приведена формула ОВ-линкер-ОЦ OVIII. На Оигуре 4Б приведена формула ОВ-линкер-Н-линкер-ОЦ OVIII. Линкеры (первый линкер между ОВ и Н и второй линкер между Н и ОЦ OVIII) могут быть одинаковыми или разными. На Оигуре 4В приведена формула ОВ-линкер-ОЦ OVIII-линкер-Н. Линкеры (первый линкер между ОВ и ОЦ OVIII и второй линкер между ОЦ OVIII и Н) могут быть одинаковыми или разными. На Оигуре 4Г приведена формула ОВ-линкер-ТЦ OVIII-H-линкер-ЛЦ OVIII. Линкеры (первый линкер между ОВ и ТЦ OVIII и второй линкер между Н и ЛЦ OVIII) могут быть одинаковыми или разными. На Оигуре 4Д приведена формула ТЦ OVIII-H-ЛЦ OVIII-линкер-первая Fc-линкер-ОВ-линкер-вторая Fc. Линкеры (первый линкер между ЛЦ OVIII и первой Fc-областью, второй линкер между первой Fc-областью и ОВ и третий линкер между ОВ и второй Fc-областью) могут быть одинаковыми или разными. Линкеры могут являться отщепляемыми линкерами. Например, линкер между первой Fc-областью и ОВ может являться отщепляемым линкером, содержащим сайт расщепления на N-конце и/или С-конце линкера. Первая Fc-область и вторая Fc-область могут быть одинаковыми или разными. На Фигуре 4Е приведена формула ТЦ OVIII-H-LC ФУШ-линкер-первая Fc-линкер-ФВ-линкер-вторая Fc. Линкеры (первый линкер между ЛЦ OVIII и первой Fc-областью, второй линкер между первой Fc-областью и ФВ и третий линкер между ФВ и второй Fc-областью) могут быть одинаковыми или разными. Один или более линкеров могут являться отщепляемыми линкерами. Например, линкер между первой Fc-областью и ФВ может являться отщепляемым линкером, содержащим сайт расщепления на N-конце и/или С-конце линкера. Первая Fc-область и вторая Fc-область могут быть одинаковыми или разными. На Фигуре 4Ж приведена формула ОЦ ФУШ-линкер-Рс-линкер-ФВ-Н-линкер-Рс. На Фигуре 43 приведена формула пэгилированной или гэкилированной ОЦ ФУШ- линкер-Рс-линкер-ФВ-Н-линкер-Рс. Линкеры (первый линкер между ОЦ ФУШ и первой Fc-областью, второй линкер между первой Fc-областью и ФВ и третий линкер между Н и второй Fc-областью) могут быть одинаковыми или разными. Один или более линкеров могут являться отщепляемыми линкерами. Например, линкер между первой Fc-областью и ФВ может являться отщепляемым линкером, содержащим сайт расщепления на N-конце и/или С-конце линкера. Первая Fc- область и вторая Fc-область могут быть одинаковыми или разными. [0041] Фигура 5. Схематические изображения системы совместной трансфекции гетеродимеров ФУШ-ФВ. Конструкция ФУШ-155 содержит полноразмерную последовательность ФУШ (с замещением остатком аланина остатков аргинина в позициях 1645 и 1648), связанную с Fc-областью. ФВ-031 содержит фрагмент D1D2D'D3 (с замещением остатком аланина остатков цистеина в позициях 336 и 379), который связан с другой Fc-областью посредством 48 тромбин-отщепляемым линкером. После внутриклеточного процессирования конструкция Ф\гШ-155 продуцирует полноразмерный одноцепочечный ФУШ (ОЦФУШ), соединенный с одним Fc-фрагментом, конструкция ФВ-031 продуцирует фрагмент D'D3 длиной в 477 аминокислот, связанный с другим Fc-фрагментом. Две ковалентные связи могут образовываться между Fc-фрагментами, которые связаны с ОЦ ФУШ или фрагментом D'D3, что, в свою очередь, делает возможной ковалентное соединение ФУШ и D'D3, которое является основной характеристикой требуемого конечного продукта. [0042] Фигура 6 иллюстрирует невосстановительный и восстановительный ДСН- ПААГ ФВ-009 (D1D2D'D3 аминокислоты 1-276 х 6 HIS), который показывает, что ФВ-009 существует в виде мономера. Непроцессированный обозначает ФВ-009 с пропептидом (домены D1D2). [0043] Фигура 7 иллюстрирует невосстановительный и восстановительный ДСН- ПААГ ФВ-002 (D'D3 аминокислоты 1-447 х 6 his) или ФВ-010 (D1D2D'D3 аминокислоты 1-447 х 6 his), который показывает, что ФВ-002 существует в виде мономера, а ФВ-010 существует в виде димера. [0044] На Фигуре 8 показано расщепление тромбином гетеродимера ФУШ-ФВ, приведенного на Фигуре 2(6). На дорожке 1 показан маркер. Дорожка 2 соответствует рФУШ-Бс без тромбина. Дорожка 3 соответствует рФУШ-Бс с тромбином. Дорожка 5 соответствует ФУШРс-ФВ. Дорожка 6 соответствует ФУПГГс-ФВ и тромбину. А1 обозначает домен А1 ФУШ, А2 обозначает домен А2 ФУШ, а АаЗ ЛЦ обозначает легкую цепь ФУШ. [0045] На Фигуре 9А-Б показана активность ФУШ, определенная при помощи хромогенного анализа ФУШ. На Фигуре 9А показан фармакокинетический профиль рФУШ и рФУПГГс для мышей с гемофилией А. На Фигуре 9Б показан ФК профиль рФУШ и рФУПГГс для мышей с двойным ФУШ/ФВ генным нокаутом (ДГН). На оси Y показана активность ФУШ в мМЕ/мЛ, а на оси X показано время. [0046] На Фигуре 10А-Б показана защита ФУШ фрагментами D'D3, что отражает уровень мФУШ в плазме (мМЕ/мЛ) и уровень экспрессии ФВ (нМ/мЛ) через 48 часов после плазмидной инъекции. Фрагментами ФВ, применяемыми для демонстрации защиты ФУШ, являются ФВ-001 (276ак, мономер), ФВ-009 (276ак, мономер), ФВ-002 (477ак, мономер), ФВ-010 (477ак, димер), ФВ-003 (5Пак, мономер), ФВ-011 (5Пак, димер), ФВ-004 (71 бак, мономер), ФВ-012 (71 бак, димер), ФВ-006 и ФВ-008. [0047] На Фигуре 11 показан фармакокинетический профиль рУВД-ФУШ для ФУШ-ФВ ДГН мышей при совместном применении с фрагментами D'D3. На Фигуре ПА показана активность ФУШ (мМЕ/мЛ), определенная при помощи хромогенного анализа ФУШ, после совместного применения рУВД-ФУШ и ФВ-002, или рУВД-ФУШ и ФВ-010, или одного рУВД-ФУШ к ФУШ/ФВ ДГН мышам. На Фигуре ПБ показан уровень ФВ-002 и ФВ-010 в плазме (нг/мЛ) после применения. Ось X отображает время в часах. [0048] На Фигуре 12 показан фармакокинетический профиль рФУПГГс для мышей, экспрессирующих D'D3 ФВ. На Фигуре 12А показана последовательность гидродинамической инъекции (ГДИ) плазмидной ДНК, кодирующей домен D'D3 (день -5), внутривенного дозирования рФУПГГс (день 0) и забора образца ФК (деньО - деньЗ) На Фигуре 12Б показана активность плазменного ФУШ (мМЕ/мЛ) после инфузии рФУПГГс, определенная при помощи хромогенного анализа для ФУШ/ФВ ДГН мышей, которым проводили ГДИ доменов D1D2D'D3 (477ак) (кружки) и доменов D1D2D'D3 (477ак) с цистеиновыми заменами (прямоугольники). Активность OVIII для контрольных мышей без ГДИ доменов D'D3 показана в виде треугольников. На Фигуре 12В показан уровень D'D3 в плазме (нг/мЛ) после применения ГДИ D1D2D'D3 димерной или D1D2D'D3 мономерной конструкции ДНК. Ось X отображает время в часах. [0049] На Фигуре 13 показана подборка линкеровБ'БЗ-Гс по ГДИ для ФУШ/ФВ ДГН мышей. Между доменами D'D3 и Fc-областью были вставлены линкеры различной длины (20ак (ФУШ-064), 35ак (ФУШ-159) или 48ак (ФУШ-160)). Активность ФУШ (мМЕ/мЛ) определяли при помощи хромогенного анализа после ГДИ для ФУШ/ФВ ДГН мышей. [0050] На Фигуре 14 показана ГДИ одноцепочечного гетеродимера ФУШГсЛЭ'БЗ ФУШ/ФВ ДГН мышам. Активности ФУШ процессированного (двухцепочечного) рФУШГс-О'БЗ (nSYN-OVm-136) и одноцепочечного рФУШГс-О'ВЗ (nSYN-ФУШ-148) определяли через 24 часа и 48 часов после ГДИ. [0051] На Фигуре 15 показана аффинность связывания гетеродимера ФУШ-155/ФВ- 031 с обездвиженным чФВ, определенная при помощи платформы Octet. ФУТНГс, ФУШ и IgG также использовали в качестве контроля. На оси х показано время в часах, а на оси у показано связывание в нанометрах (нм). [0052] На Фигуре 16 показана фармакокинетика ФУШ-155/ФВ-031 для мышей с дефицитом ФУШ/ФВ (ФУШ/ФВ ДГН). На оси х показано время в часах, а на оси у показано восстановление ФУШ относительно исходного уровня в процентах. [0053] Фигура 17: Схематические изображения примеров конструкций фрагментов ФВ, в которых ФВ является D1D2D'D3 фрагментом ФВ; линкер является линкером переменной длины, содержащим сайт расщепления, например, сайт расщепления тромбином; Н является гетерологичным компонентом, например, константной областью иммуноглобулина или ее частью, компонентом для конъюгации полиэтиленгликоля (ПЭГ) и/или ПЭГ, альбумином или фрагментом альбумина, альбумин связывающим веществом, последовательностью НАР, компонентом для полисиалирования и/или полисиаловой кислотой, компонентом для гидроксиэтилового крахмала (ГЭК) и/или ГЭК или последовательностью PAS и т.д.; и Fc является Fc-областью иммуноглобулина. На Фигуре 17А приведена формула D1D2-D'-составляющей БЗ-Н-составляющая БЗ-линкер-Рс. На Фигуре 17Б приведена формула БШ2-составляющей D'-H- составляющая БТ)3-линкер-Рс. На Фигуре 17В приведена формула ВШ2-пэгилированной или гэкилированной D'D3-линкер-Fc. В некоторых случаях линкер может быть отщеплен. [0054] Фигура 18: на А) показана потеря со временем ФУШ-активности ФУПГГс как в гемА-плазме (ромбы), так и в ДГН-плазме (квадраты). Активность ФУШ определена при помощи хромогенного анализа. На оси х показано время в часах, а на оси у показана относительная активность. На Б) показано, что потеря ФУШ-активности происходит из-за диссоциации или деградации тяжелой цепи (ТЦ). На левой панели показан иммунопреципитационный анализ, в котором использовалось овечье поликлональное антитело к ФУШ в Bio-rad 4-15% геле. Гель был гидрирован и визуализирован при помощи системы Bio-rad. На дорожке 1 показан неокрашенный маркер Bio-rad; на дорожке 2 показаны ФУПГГс и ФБР; на дорожке 3 показаны ФУПГГс и ДГН-плазма; и на дорожке 5 показано одно овечье поликлональное антитело к ФУШ. На правой панели показан вестерн-блоттинг геля, в котором использовалось антитело к тяжелой цепи ФУШ (GMA012). На дорожке 1 показан неокрашенный маркер Bio-rad; на дорожке 2 показаны ФУШРс и ФБР; на дорожке 3 показаны ФУПГГс и ДГН-плазма; и на дорожке 4 показано одно овечье поликлональное антитело к ФУШ. [0055] На Фигуре 19 показана ФУШ-активность как функция времени для ФУПГГс дикого типа (кружки), оцФУПГГс (одноцепочечного ФУШ) (закрашенные треугольники) или гетеродимеров ФУПГФВ (например, ФУШ155/ФВ031) (пустые треугольники), определенная при помощи хромогенного анализа в плазме ДГН мышей (левая панель) и плазме гемА мышей (правая панель). На оси Y показана относительная активность ФУШ. ФУПГГс дикого типа содержит двойную цепь ФУШ (т.е., тяжелую цепь ФУШ и легкую цепь ФУШ, которые удерживаются вместе нековалентной связью) и, таким образом, имеет три цепи - тяжелую цепь ФУШ, легкую цепь ФУШ, сшитую с Fc, и саму Fc-область. ОцФУПГГс содержит одиночную цепь ФУШ и, таким образом, имеет две цепи, одну, в которой одиночная цепь ФУШ сшита с Fc, и другую, содержащую только Fc. Гетеродимер ФУПГФВ (например, ФУШ155/ФВ031) содержит одиночную цепь ФУШ, сшитую с Fc, и фрагмент ФВ (D'D3), сшитый с Fc. [0056] На Фигуре 20 показан процессинг домена D1D2, принадлежащего фрагменту ФВ (например, ФВ-03 1(D1D2D'D3FC)), при помощи РС5 или РАСЕ (фурина) различных концентраций. Процессинг D1D2 показан в Bio-rad 4-15% геле в восстановительных условиях при помощи устройства для визуализации Bio-rad. На дорожке 1 показан один ФВ031; на дорожке 2 показан один РС5; на дорожке 3 показан один РАСЕ; на дорожке 4 показаны ФВ031 и РС5 при 2,5%; на дорожке 5 показаны ФВ031 и РС5 при 5%; на дорожке 6 показаны ФВ031 и РС5 при 7,5%; на дорожке 7 показаны ФВ031 и РС5 при 10%; на дорожке 8 показаны ФВ031 и РАСЕ при 2,5%; на дорожке 9 показаны ФВ031 и РАСЕ при 5%; на дорожке 10 показан ФВ031при 7,5%; и на дорожке 11 показаны ФВ031 и РАСЕ при 10%. [0057] Фигура 21: на А) приведен анализ связывания гетеродимера ФУПГФВ (например, Ф\гШ-155/ФВ-031), проведенный при помощи октетной установки ForteBio. Для анализа при помощи сенсора APS был снят полноразмерный ФВ. На нижней левой панели показано связывание ФУНТЕ с и ФУШ с полноразмерным ФВ. На нижней правой панели показано отсутствие связывания между ФУШ1680 (мутантом, не обладающим аффинностью к ФВ) и гетеродимером ФУПГФВ (ФУШ155/ФВ031). На Б) приведен другой связывания гетеродимера ФУШ:ФВ (например, ФУШ-155/ФВ-031). При проведении этого анализа конструкции (конструкция ФВ031, ФУШ155/ФВ031 или ФУШ) были обездвижены на G-белковом сенсоре. Было определено связывание конструкций с ФУШ. [0058] На Фигуре 22 показана аффинность связывания доменов D'D3 ФВ с молекулой ФУШ, определенная экспериментом по поверхностному плазмонному резонансу. Конструкция ФВ031 (100 КЕ) захватывалась античеловеческим IgG в 1000 КЕ. ФУШ с удаленным В-доменом применяли в одноцикловом кинетическом режиме в соотношении 1:1. Общее количество составляло 4. [0059] На Фигуре 23 показано влияние различной длины линкеров в гетеродимерных конструкциях ФУШГс/ФВ на фармакокинетику при применении на ФУШ/ФВ ДГН мышах. Между D'D3 и Fc были вставлены три различных линкера (в 48 ак, 73 ак или 98 ак), т.е., ФВ031, ФВ035 и ФВ036. Активность ФУШ, нормированная относительно 5-минутной, величины (%) показана на оси Y. [0060] На Фигуре 24 показаны примеры лигирования сортазой фрагмента ФВ с ФУШ. На А) показаны две конструкции лигирования, где (1) фрагмент ФВ в области С-конца сшит с распознающим сортазу мотивом (например, LPXTG), и (2) ФУШ содержит глицин (п) в области N-конца. После реакции с сортазой фрагмент ФВ и распознающий сортазу мотив оказываются лигированными к N-концу ФУШ. На Б) показаны две конструкции лигирования, где (1) ФУШ в области С-конца сшит с распознающим сортазу мотивом, и (2) фрагмент ФВ содержит глицин (п) в области N-конца. После реакции с сортазой ФУШ и распознающий сортазу мотив оказываются сшитыми с фрагментом ФВ в N-конце фрагмента ФВ. На В) показаны две конструкции лигирования, где (1) фрагмент ФВ сшит с распознающим сортазу мотивом при помощи линкера переменной длины, и (2) ФУШ в области N-конца сшит с глицином (п). После реакции с сортазой ФВ, сшитый при помощи линкера с распознающим сортазу мотивом, оказывается лигированным к N-концу ФУШ. На Г) показаны две конструкции лигирования, где (1) ФУШ сшит с распознающим сортазу мотивом при помощи линкера переменной длины, и (2) фрагмент ФВ в области N-конца сшит с глицином (п). После реакции с сортазой ФУШ, сшитый при помощи линкера с распознающим сортазу мотивом, оказывается лигированным к N-концу фрагмента ФВ. На Д) показана конструкция лигирования, содержащая фрагмент ФВ, сшитый с распознающим сортазу мотивом при помощи линкера переменной длины, который также сшит с сайтом расщепления протеазой (например, сайтом расщепления тромбином), сшитом с Fc при помощи линкера переменной длины. [0061] На Фигуре 25 показано схематическое сравнение ФУШ155 и ФУШ198. ФУШ155 кодирует одноцепочечный белок ФУПГГс. ФУШ198 является одноцепочечной молекулой-226№ ФУПГГс, содержащей частичный В-домен. 226 обозначает 226 N-концевых аминокислот В-домена ФУШ, а N6 обозначает шесть участков N-гликозилирования в В-домене. [0062] Фигура 26. На А) показан анализ стабильности, в котором определяется относительная активность ФУШ155 и ФУШ198 в ДГН-плазме как функция времени. Как видно из фигуры, наличие частичного В-домена в ФУШ198 повысило стабильность одноцепочечного ФУ1Шс по сравнению с ФУШ155; на Б) показано сравнение времен полужизни ФУШ155 и ФУШ198 и двухцепочечного (дцФУШРс) в ДГН мышах. Как видно из фигуры, для одноцепочечного ФУШ (ФУШ155) наблюдается увеличение времени полужизни в 1,5 раз по сравнению с двухцепочечным ФУШ. Одноцепочечный ФУШ с 266N6 В-доменом (ФУШ198) демонстрирует дополнительно увеличение времени полужизни в 1,5 раз. На графике показана зависимость восстановления ФУШ от 5-минутного значения (%) как функция времени. ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ [0063] Стоит отметить, что употребление единственного числа по отношению к какому-либо объекту относится к одному или более объектам, например, под выражением "нуклеотидная последовательность" подразумевается одна или более нуклеотидных последовательностей. Соответственно, фирма единственного числа К заявке, выделенной из заявки № 201491186 и термины "один или более" и "по меньшей мере один" могут взаимозаменяемо употребляться в данном тексте. [0064] Термин "полинуклеотид" или "нуклеотид" включает в себя как одиночную нуклеиновую кислоту, так и множественные нуклеиновые кислоты, и относится к выделенной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например, информационной РНК (иРНК) или плазмидной ДНК (пДНК). В определенных вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит обычную фосфодиэфирную связь или альтернативную связь {например, амидную связь, которую можно обнаружить в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термин "нуклеиновая кислота" к какому-либо одному или более сегментам нуклеиновой кислоты, например, фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде. Под "выделенными" нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была удалена из своей естественной среды. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора VIII, содержащийся в векторе, считается выделенным в контексте настоящего изобретения. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, содержащиеся в гетерологичной клетке-хозяине или очищенные (частично или в значительной степени) от других полинуклеотидов в растворе. Выделенные молекулы РНК включают invivo или invitro РНК транскрипты полинуклеотидов, являющихся объектами настоящего изобретения. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению дополнительно включают такие молекулы, полученные синтетическим способом. Вдобавок полинуклеотид или нуклеиновая кислота может содержать регуляторные элементы, такие как промоторы, энхансеры, участки связывания рибосом или сигналы терминации транскрипции. [0065] При употреблении в данном тексте "кодирующая область" или "кодирующая последовательность" представляют собой фрагмент полинуклеотида, который состоит из кодонов, которые могут транслироваться в аминокислоты. Хотя "стоп-кодон" (TAG, TGA или ТАА) обычно не транслируется в аминокислоту, он может считаться частью кодирующей области, но любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, участки связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и тому подобные элементы не являются частью кодирующей области. Границы кодирующей области обычно определяются стартовым код оном на 5'-конце, кодирующем аминоконец результирующего полипептида, и трансляционным стоп-код оном на 3'-конце, кодирующем карбоксильный конец результирующего полипептида. Две или более кодирующих областей согласно настоящему изобретению могут присутствовать в одиночной полинуклеотидной конструкции, например, в одиночном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например, в отдельных (различных) векторах. Следовательно, отсюда вытекает, что одиночный вектор может содержать только одиночную кодирующую область или содержать две или более кодирующих областей, например, одиночный вектор может отдельно кодировать связывающий домен-А и связывающий домен-В, как описано ниже. Вдобавок вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота, являющиеся объектами данного изобретения, могут кодировать гетерологичные кодирующие области, как сшитые, так и несшитые с нуклеиновой кислотой, кодирующей связывающий домен согласно изобретению. Гетерологичные кодирующие области без ограничений включают специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен. [0066] Определенные белки, секретируемые клетками млекопитающих, связаны с секреторным сигнальным пептидом, который отщепляется от зрелого белка, как только инициируется экспорт растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Специалистам в данной области техники известно, что сигнальные пептиды в общем случае сшиты с N-концом полипептида для того, чтобы вырабатывать секретируемую или "зрелую" форму полипептида. В определенных вариантах реализации изобретения применяется нативный сигнальный пептид, например, сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, либо функциональное производное такой последовательности, которое сохраняет способность управлять секрецией функционально связанного с ней полипептида. В альтернативном варианте может применяться гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего, например, человеческий тканевой активатор плазминогена (ТАЛ) или мышиный сигнальный пептид Р-глюкуронидазы, либо его функциональное производное. [0067] Термин "нижележащая" относится к нуклеотидной последовательности, которая расположена в направлении 3' от основной нуклеотидной последовательности. В определенных вариантах реализации изобретения нижележащие нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, которые следуют за точкой старта транскрипции. Например, кодон инициации трансляции гена расположен ниже сайта старта транскрипции. [0068] Термин "вышележащая" относится к нуклеотидной последовательности, которая расположена в направлении 5' от основной нуклеотидной последовательности. В определенных вариантах реализации изобретения вышележащие нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, которые расположены на 5' стороне кодирующей области или точки старта транскрипции. Например, большинство промоторов располагаются выше сайта старта транскрипции. [0069] При употреблении в данном тексте "регуляторная область" относится к нуклеотидным последовательностям, расположенным выше (в направлении 5' некодирующих последовательностей), в рамках или ниже (в направлении 3' некодирующих последовательностей) кодирующей области, и которые оказывают влияние на транскрипцию, процессинг РНК, стабильность или трансляцию связанной с ней кодирующей области. Регуляторные области могут включать промоторы, трансляционные лидерные последовательности, интроны, последовательности распознавания полиаденилирования, участки процессинга РНК, участки связывания эффекторов и структуры типа "стебель - петля". Если кодирующая область предназначена для экспрессии в эукариотической клетке, сигнальная последовательность полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции обычно расположены в направлении 3' относительно кодирующей последовательности. [0070] Полинуклеотид, который кодирует генный продукт, например, полипептид, может включать промотор и/или другие транскрипционные или трансляционные контрольные элементы, функционально связанные с одной или более кодирующими областями. Находящаяся в функциональной связи кодирующая область для генного продукта, например, полипептида, связана с одной или более регуляторными областями таким образом, чтобы экспрессия генного продукта оказалась под влиянием или контролем регуляторной области (областей). Например, кодирующая область и промотор являются функционально связанными, если индукция действия промотора приводит к транскрипции иРНК, кодирующей генный продукт, кодируемый кодирующей областью, и если природа связи между промотором и кодирующей областью не препятствует возможности промотора управлять экспрессией генного продукта или не препятствует возможности транскрибирования ДНК-матрицы. Другие транскрипционные контрольные элементы, кроме промотора, например, энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, также могут быть функционально связанными с кодирующей областью для того, чтобы управлять экспрессией генного продукта. [0071] Специалистам в данной области техники известно множество транскрипционных контрольных областей. Они включают без ограничения транскрипционные контрольные области, которые функционируют в клетках позвоночных, такие как промоторные и энхансерные сегменты цитомегаловирусов (предранний промотор в сочетании с интроном-А), вирус обезьян 40 (ранний промотор) и ретровирусы (такие как вирус саркомы Рауса). Другие транскрипционные контрольные области включают те, которые получены из генов позвоночных, такие как актин, белок теплового шока, бычий гормон роста и кроличий Р-глобин, а также другие последовательности, способные контролировать генную экспрессию в эукариотических клетках. Дополнительные подходящие транскрипционные контрольные области включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также лимфокин-индуцибельные промоторы {например, индуцибельные интерферонами или интерлейкинами промоторы). [0072] Аналогично, специалистам в данной области техники известно множество трансляционных контрольных элементов. Они включают без ограничения участки связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции и элементы, полученные из пикорнавирусов (в частности, участок внутренней посадки рибосомы или УВГТР, также называемый CITE-последовательностью). [0073] Употребляемый в данном тексте термин "экспрессия" относится к процессу, посредством которого полинуклеотид продуцирует генный продукт, например, РНК или полипептид. Он включает без ограничения транскрипцию полинуклеотида в информационную РНК (иРНК), транспортную РНК (тРНК), малую шпилечную РНК (мшРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК) или любой другой РНК-продукт, и трансляцию иРНК в полипептид. При помощи экспрессии получают "генный продукт". При употреблении в данном тексте генный продукт может представлять нуклеиновую кислоту, например, информационную РНК, полученную посредством транскрипции гена, или полипептид, который был транслирован с транскрипта. Описанные в данном тексте генные продукты дополнительно включают нуклеиновые кислоты, прошедшие пост-транскрипционные модификации, например, полиаденилирование или сплайсинг, или полипептиды, прошедшие посттранскрипционные модификации, например, метилирование, гликозилирование, добавление липидов, объединение с другими белковыми субъединицами или протеолитическое расщепление. [0074] "Вектор" относится к любому средству для клонирования и/или переноса нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Вектор может являться репликоном, к которому может быть присоединен сегмент другой нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы привести к репликации присоединенного сегмента. "Репликон" относится к любому генетическому элементу {например, плазмиде, фагу, космиде, хромосоме, вирусу), который функционирует как автономная единица репликации invivo, т.е., способен к самостоятельно управляемой репликации. Термин "вектор" включает как вирусной, так и невирусной природы средства для внесения нуклеиновой кислоты в клетку invitro, exvivo или invivo. В данной области техники известно и применяется большое количество векторов, включая, например, плазмиды, модифицированные эукариотические вирусы или модифицированные бактериальные вирусы. Вставку полинуклеотида в подходящий вектор можно осуществить путем лигирования соответствующих фрагментов полинуклеотида в выбранный вектор, который имеет комплементарные липкие концы. [0075] Векторы могут быть сконструированы таким образом, чтобы кодировать селектируемые маркеры или репортеры, которые обеспечивают отбор или идентификацию клеток, в которые был инкорпорирован вектор. Экспрессия селектируемых маркеров или репортеров позволяет осуществлять идентификацию и/или отбор клеток-хозяев, которые инкорпорируют и экспрессируют другие кодирующие области, содержащиеся в векторе. Примеры известных и применяемых в данной области техники генов селектируемых маркеров включают: гены, обеспечивающие устойчивость к ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, гигромицину, гербициду биалафос, сульфонамиду и тому подобным веществам; и гены, которые применяются в качестве фенотипических маркеров, т.е., регуляторные гены антоцианов, ген изолентенил трансферазы и тому подобные. Примеры известных и применяемых в данной области техники репортеров включают: люциферазу (Люц), зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ), хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (ХАТ), -галактозидазу (ЛакЗ), -глюкуронидазу (Гуз) и тому подобные вещества. Селектируемые маркеры также могут считаться репортерами. [0076] Термин "плазмида" относится к внехромосомному элементу, часто несущему ген, который не является частью центрального метаболизма клетки, и обычно находящемуся в форме кольцевых двухцепочечных молекул ДНК. Такие элементы могут являться автономно реплицирующимися последовательностями, интергирующимися в геном последовательностями, фагом или нуклеотидными последовательностями, линейными, кольцевыми или сверхспиральными одно- или двухцепочечных ДНК или РНК, полученными из произвольного источника, в которых определенное число нуклеотидных последовательностей было соединено или рекомбинировано в уникальную конструкцию, которая способна внести в клетку фрагмент промотора и последовательность ДНК для выбранного генного продукта вместе с соответствующей 3' нетранслируемой последовательностью. [0077] Эукариотические вирусные векторы, которые могут применяться, включают, но не ограничиваются этим, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы, адено-ассоциированные вирусные векторы, поксвирус, например, векторы на основе вируса осповакцины, векторы на основе бакуловирусов или векторы на основе вируса герпеса. Невирусные векторы включают плазмиды, липосомы, электрически заряженные липиды (цитофектины), ДНК-белковый комплексы и биополимеры. [0078] "Клонирующий вектор" относится к "репликону", который является единицей длины нуклеиновой кислоты, которая последовательно реплицируется и которая содержит точку начала репликации, такую как плазмида, фаг или космида, к которой может быть присоединен сегмент другой нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы привести к репликации присоединенного сегмента. Определенные клонирующие векторы способны к репликации в одном типе клеток, например, в бактериальных клетках, и экспрессии в другом, например, в эукариотических клетках. Клонирующие векторы обычно содержат одну или более последовательностей, которые могут применяться для отбора клеток, содержащих вектор, и/или один или более множественных клонирующих участков для вставки представляющих интерес нуклеотидных последовательностей. [0079] Термин "экспрессионный вектор" относится к элементу, сконструированному для того, чтобы сделать возможной экспрессию вставленной нуклеотидной последовательности после внесение в клетку-хозяина. Вставленная нуклеотидная последовательность размещается в функциональной связи с регуляторными областями, как описано выше. [0080] Векторы вносят в клетки-хозяев способами, хорошо известными в данной области техники, например, путем трансфекции, электропорации, микроинъекции, трансдукции, клеточного слияния, при помощи диэтиламиноэтилдекстрана, осаждения фосфата кальция, липофекции (слияния лизосом), применения генной пушки или транспортера ДНК-вектора. [0081] При употреблении в данном тексте "культивировать", "культивирование" и "культивация" обозначают инкубацию клеток в таких invitro условиях, которые способствуют росту клеток или делению, или поддержанию клеток в живом состоянии. При употреблении в данном тексте "культивированные клетки" обозначают клетки, которые были размножены invitro. [0082] При употреблении в данном тексте термин "полипептид" включает в себя как одиночный "полипептид", так и множественные "полипептиды", и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин "полипептид" относится к любой цепи или цепям двух или более аминокислот и не относится к специфичной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, "белок", "аминокислотная цепь" либо любой другой термин, применяемый для обозначения цепи или цепей двух или более аминокислот, включены в определение "полипептида", а термин "полипептид" может применяться вместо либо взаимозаменяемо с любым из этих терминов. Термин "полипептид" также относится к продуктам пост-экспрессионной модификации полипептида, включая без ограничений гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление или модификацию аминокислотами неприродного происхождения. Полипептид может быть получен из природного биологического ресурса или при помощи рекомбинатной технологии, но не обязательно являться транслированным из определенной нуклеотидной последовательности. Он может быть получен любым способом, включая химический синтез. [0083] "Выделенный" полипептид или его фрагмент, вариант или производное обозначает полипептид, который не находится в своем естественном окружении. Никакой конкретный уровень очистки не требуется. Например, выделенный полипептид может быть просто удален из своего природного или естественного окружения. Полученные при помощи рекомбинантных технологий полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках-хозяевах, считаются выделенными в контексте данного изобретения, как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были отделены, фракционированы либо частично или в значительной степени очищены любым подходящим способом. [0084] Также в настоящее изобретение включены фрагменты или варианты полипептидов и любые их комбинации. Термин "фрагмент" или "вариант" в отношении связывающих доменов полипептидов или связывающих молекул, являющихся объектами настоящего изобретения, включают любые полипептиды, которые сохраняют по меньшей мере некоторые свойства {например, аффинность связывания с FcRn в случае FcRn-связывающего домена или Fc-варианта, активность коагуляции в случае ФУШ-варианта или ФУШ-связывающую активность в случае фрагмента ФВ) основного полипептида. Фрагменты полипептидов включают протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты дополнительно к специфическим фрагментам антител, обсуждаемым в другом месте данного текста, но не включают полноразмерный полипептид природного происхождения (или зрелый полипептид). Варианты связывающих доменов полипептидов или связывающих молекул, являющихся объектами настоящего изобретения, включают фрагменты, как описано выше, а также полипептиды с аминокислотными последовательностями, измененными вследствие аминокислотных замен, делеций или инсерций. Варианты могут быть природного и неприродного происхождения. Варианты неприродного происхождения могут быть получены путем известных в данной области техники методов мутагенеза. Вариантные полипептиды могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеций или добавки. [0085] Употребляемый в данном тексте термин "фрагмент ФВ" или "фрагменты ФВ" обозначает любые фрагменты ФВ, которые взаимодействуют с ФУШ и сохраняют по меньшей мере одно или более свойств, которые обычно обеспечивает ФУШ полноразмерный ФВ, например, предотвращение преждевременной активации ФУШа, предотвращение преждевременного протеолиза, предотвращение связывания с фосфолипидными мембранами, которое может привести к преждевременному клиренсу, предотвращение связывания с клиренс-рецепторами ФУШ, которые могут связывать незащищенный ФУШ, но не ФВ-связанный ФУШ, и/или стабилизацию взаимодействий тяжелой цепи и легкой цепи ФУШ. Употребляемый в данном тексте термин "фрагмент ФВ" не включает полноразмерный или зрелый белок ФВ. В конкретном варианте реализации изобретения упоминаемый в данном тексте "фрагмент ФВ" содержит домен D' и домен D3 белка ФВ, но не содержит домен А1, домен А2, домен A3, домен D4, домен В1, домен В2, домен ВЗ, домен С1, домен С2 и домен СК белка ФВ. [0086] Употребляемый в данном тексте термин "фактор, ограничивающий время полужизни" или "фактор, ограничивающий время полужизни ФУШ" определяет фактор, который предупреждает продление времени полужизни белка ФУШ более чем в 1,5 раз или 2 раза по сравнению с ФУШ дикого типа (например, ADVATE(r) или REFACTO(r)). Например, полноразмерный или зрелый ФВ может действовать как фактор, ограничивающий время полужизни ФУШ, индуцируя выведение комплекса OVIII и ФВ из системы в процессе одного или более каскадов очистки ФВ. В одном примере эндогенный ФВ является фактором, ограничивающим время полужизни ФVIII. В другом примере полноразмерная рекомбинантная молекула ФВ, нековалентно связанная с белком ФVIII, является фактором, ограничивающим время полужизни ФVIII. [0087] Употребляемый в данном тексте термин "эндогенный ФВ" определяет молекулы ФВ, присутствующие в плазме в природном состоянии. Эндогенная молекула ФВ может являться мультимером, но может быть и мономером или димером. Эндогенный ФВ в плазме связывается с ФУШ и образует с ФУШ не ковале нтный комплекс. [0088] "Консервативной аминокислотной заменой" является такая, при которой аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, были определены в данной области техники, включая основные боковые цепи {например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи {например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи {например, глицин, аспарагин, глутами, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи {например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи {например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи {например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, если аминокислота в полипептиде замещается другой аминокислотой, принадлежащей тому же семейству боковых цепей, такая замена считается консервативной. В другом варианте реализации изобретения ряд аминокислот может быть консервативно заменен структурно подобным рядом, который отличается порядком и/или составом представителей семейства боковых цепей. [0089] Как известно в данной области техники "идентичность последовательностей" между двумя полипептидами определяется путем сравнения аминокислотной последовательности одного полипептида с последовательностью второго полипептида. При обсуждении в данном тексте определение того, является ли любой конкретный полипептид идентичным по меньшей мере на около 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% другому полипептиду, осуществляется при помощи известных в данной области техники методов и компьютерных программ/программного обеспечения, включающих, но не ограничивающихся этим, программу BESTFIT (WisconsinSequenceAnalysisPackage, Версия 8 для Unix, GeneticsComputerGroup, UniversityResearchPark, 575 ScienceDrive, Madison, WI 53711). BESTFIT использует алгоритм локальной гомологии Смита и Уотермана, AdvancesinAppliedMathematics 2:482-489 (1981), для того, чтобы найти сегмент наибольшей гомологии между двумя последовательностями. При применении BESTFIT или любой другой программы для выравнивания последовательностей для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной основной последовательности согласно настоящему изобретению, параметры устанавливают, конечно, таким образом, что процент идентичности рассчитывается относительно полной длины основной полипептидной последовательности и допускаются расхождения в гомологии до 5% относительно общего числа аминокислот в основной последовательности. [0090] При употреблении данном тексте "аминокислота, соответствующая чему- либо" или "эквивалентная аминокислота" в последовательности ФВ или последовательности белка ФУШ определяются по выравниванию с целью максимизировать идентичность или сходство между первой последовательностью ФВ или ФУШ и второй последовательностью ФВ или ФУШ. Число, применяемое для определения эквивалентной аминокислоты во второй последовательности ФВ или ФУШ, зависит от числа, применяемого для определения соответствующей аминокислоты в первой последовательности ФВ или ФУШ. [0091] "Слитый" или "химерный" белок содержит первую аминокислотную последовательность, связанную со второй аминокислотной последовательностью, с которой она не связана в естественном состоянии. Аминокислотные последовательности, которые обычно присутствуют в разных белках, могут быть соединены вместе в слитом полипептиде, либо аминокислотные последовательности, которые обычно присутствуют в одном белке, могут быть размещены в новом порядке в слитом полипептиде, примером чего является слияние домена фактора VIII, являющегося объектом данного изобретения, с Fc-доменом иммуноглобулина. Слитый белок создают, например, путем химического синтеза или путем создания и трансляции полинуклеотида, в котором пептидные области кодируются в необходимом взаиморасположении. Химерный белок может дополнительно содержать вторую аминокислотную последовательность, связанную с первой аминокислотной последовательностью ковалентной, непептидной связью или нековалентной связью. [0092] Употребляемый в данном тексте термин "время полужизни" относится к биологическому времени полужизни конкретного полипептида invivo. Время полужизни может обозначать время, необходимое для того, чтобы половина количества введенного испытуемому объекту препарата была выведена из кровообращения и/или других тканей животного. При построении кривой выведения данного полипептида как функции времени кривая обычно является двухфазной с быстрой а-фазой и более длинной Р-фазой. а-фаза обычно отображает равновесное распределение введенного Fc полипептида между внутрисосудистым и внесосудистым пространством и частично определяется размером полипептида. Р-фаза обычно отображает катаболизм полипептида во внутрисосудистом пространстве. В некоторых вариантах реализации изобретения ФУШ и содержащие ФУШхимерные белки являются монофазными и, таким образом, не имеют альфа-фазы, а только бета-фазу. Следовательно, в определенных вариантах реализации изобретения употребляемый в данном тексте термин время полужизни относится ко времени полужизни полипептида в Р-фазе. Обычное время полужизни Р-фазы человеческого антитела у человека составляет 21 день. [0093] При применении к полинуклеотиду или полипептиду термин "гетерологичный" означает, что полинуклеотид или полипептид получены из объекта, отличного от того объекта, с которым проводится сравнение. Следовательно, гетерологичный полипептид, связанный с фрагментом ФВ, обозначает полипептидную цепь, которая связана с фрагментом ФВ и не является частью фрагмента ФВ природного происхождения. Например, гетерологичный полипептид или антиген может быть получен от различных видов, из различных типов клеток особи либо одинаковых или различных типов клеток различных особей. [0094] Употребляемый в данном тексте термин "связанный" относится к первой аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, ковалентно или нековалентно соединенной со второй аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью соответственно. Термин "ковалентно связанный" или "ковалентная связь" относится к ковалентной связи, например, дисульфидной связи, пептидной связи или одной или более аминокислотам, например, линкеру, между двумя связанными между собой компонентами. Первая аминокислотная или нуклеотидная последовательность может быть прямым образом связана или соединена со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью, или в другом варианте промежуточная последовательность может ковалентно связывать первую последовательность со второй последовательностью. Термин "связанный" обозначает не только сшивание первой аминокислотной последовательности со второй аминокислотной последовательностью в области С-конца или N-конца, но также включает вставку полной первой аминокислотной последовательности (или второй аминокислотной последовательности) между любыми двумя аминокислотами второй аминокислотной последовательности (или первой аминокислотной последовательности соответственно). В одном варианте реализации изобретения первая аминокислотная последовательность может быть соединена со второй аминокислотной последовательностью посредством пептидной связи или линкера. Первая аминокислотная последовательность может быть соединена со второй аминокислотной последовательностью посредством фосфодиэфирной связи или линкера. Линкер может представлять собой пептид или полипептид (для полипептидных цепей) или нуклеотид или нуклеотидную цепь (для нуклеотидных цепей) либо любое химическое соединение (как для полипептидных, так и для полинуклеотидных цепей). Ковалентную связь иногда обозначают как (-) или дефис. [0095] Употребляемый в данном тексте термин "связанный с" относится к ковалентной или нековалентной связи, образованной между первой аминокислотной цепью и второй аминокислотной цепью. В одном варианте реализации изобретения термин "связанный с" обозначает ковалентную, непептидную связь или нековалентную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения такую связь обозначают двоеточием, т.е., (:).В другом варианте реализации изобретения он обозначает ковалентную связь за исключением пептидной связи. В других вариантах реализации изобретения употребляемый в данном тексте термин "ковалентно связанный" обозначает связь между двумя компонентами посредством ковалентной связи, например, дисульфидной связи, пептидной связи или одной или более аминокислот (например, линкера). Например, аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик с тиольной группой второго остатка цистеина. В большинстве молекул IgG природного происхождения области СН1 и CL связаны дисульфидной связью, а две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в позициях, соответствующих 239 и 242 согласно системе нумерации Кабата (позиции 226 и 229 в Европейской системе нумерации). Примеры ковалентных связей включают, но не ограничиваются этим, пептидную связь, металлическую связь, водородную связь, дисульфидную связь, сигма-связь, пи-связь, дельта-связь, гликозидную связь, агностическую связь, изогнутую связь, диполярную связь, пи-обратную связь, двойную связь, тройную связь, четвертную связь, пятерную связь, шестерную связь, конъюгацию, гиперконъюгацию, ароматичность, гаптичность или антисвязывание. Неограничивающие примеры нековалентной связи включают ионную связь (например, катионную пи-связь или соляную связь), металлическую связь, водородную связь (например, диводородную связь, диводородный комплекс, низкобарьерную водородную связь или симметричную водородную связь), Ван-дер-Ваальсовы силы, лондоновские дисперсионные силы, механическую связь, галогенную связь, аурофильность, интеркаляцию, стэкинг, энтропийные силы или химическую полярность. [0096] Употребляемый в данном тексте термин "мономерно-димерный гибрид" относится к химерному белку, содержащему первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, которые связаны друг с другом дисульфидной связью, при этом первая цепь содержит фактор свертывания крови, например, фактор VIII, и Fc-область, а вторая цепь содержит, состоит преимущественно из или состоит из Fc-области без фактора свертывания крови. Мономерно-димерная гибридная конструкция, таким образом, является гибридом, содержащим мономерную часть, содержащую только один фактор свертывания крови, и димерную часть, содержащую две Fc-области. [0097] Употребляемый в данном тексте термин "сайт расщепления" или "сайт ферментного расщепления" относится к сайту, распознаваемому ферментом. Определенные сайты ферментного расщепления содержат сайт внутриклеточного процессинга. В одном варианте реализации изобретения полипептид содержит сайт ферментного расщепления, расщепляемый ферментом, который активируется во время каскада свертывания таким образом, что расщепление таких сайтов происходит на участке образования тромба. Примеры таких сайтов включают, например, те, которые распознаются тромбином, фактор Х1а или фактор Ха. Примеры сайтов расщепления ФХ1а включают, например, TQSFNDFTR (SEQIDNO: 47) и SVSQTSKLTR (SEQIDNO: 48). Примеры сайтов расщепления тромбином включают, например, DFLAEGGGVR (SEQIDNO: 49), TTKIKPR (SEQIDNO: 50), LVPRG (SEQIDNO: 55) и ALRPR (аминокислоты от 1 до 5 из SEQIDNO: 51). Другие сайты ферментного расщепления известны в данной области техники. [0098] Употребляемый в данном тексте термин "сайт процессинга" или "сайт внутриклеточного процессинга" относится к такому типу сайтов ферментного расщепления в полипептиде, являющемся целью для ферментов, которые действуют после трансляции полипептида. В одном варианте реализации изобретения такие ферменты действуют во время переноса из полости аппарата Гольджи в транс-Гольджи компартмент. Ферменты внутриклеточного процессинга расщепляют полипептиды перед секрецией белка из клетки. Примеры таких сайтов процессинга включают, например, те, на которые нацелены представители семейства РАСЕ/фурин (где РАСЕ является акронимом от англ. "PairedbasicAminoacidCleavingEnzyme" - фермент, расщепляющий спаренные основные аминокислоты) эндопептидаз. Эти ферменты находятся в мембране Гольджи и расщепляют белки со стороны карбоксильного конца мотива последовательности А^-[любой остаток]-(Ьуз или Arg)-Arg. Упоминаемые в данном тексте представители "фуринового" семейства ферментов включают, например, PCSK1 (также известный как PCl/РсЗ), PCSK2 (также известный как РС2), PCSK3 (также известный как фурин или РАСЕ), PCSK4 (также известный как РС4), PCSK5 (также известный как PC 5 или РС6), PCSK6 (также известный как РАСЕ4) или PCSK7 (также известный как PC7/LPC, РС8 или SPC7). Другие сайты процессинга известны в данной области техники. [0099] Термин "фурин" относится к ферментам, соответствующим ECNo. 3.4.21.75. Фурин является субтилизин-подобной пробелковой конвертазой, которая также известна под названием РАСЕ (PairedbasicAminoacidCleavingEnzyme). Фурин удаляет секции неактивных белков-предшественников для того, чтобы конвертировать их в биологически активные белки. Во время своего внутриклеточного перемещения пропептид отщепляется от зрелой молекулы ФВ ферментом фурином в аппарате Гольджи. [0100] Понятно, что в конструкциях, содержащих более одного сайта процессинга или расщепления, данные сайты могут быть одинаковыми либо разными. [0101] При употреблении в данном тексте гемостатическое нарушение означает генетически унаследованное или приобретенное заболевание, которое характеризуется склонностью к кровоизлияниям, как к спонтанным, так и в результате травмы, из-за нарушения способности или неспособности образовывать фибриновые сгустки. Примеры таких нарушений включают разные виды гемофилии. Тремя основными формами являются гемофилия А (дефицит фактора VIII), гемофилия В (дефицит фактора IX или "болезнь Кристмаса") и гемофилия С (дефицит фактора XI, склонность к умеренным кровотечениям). Другие гемостатические нарушения включают, например, болезнь Виллебранда, дефицит фактора XI (дефицит ПТП), дефицит фактора XII, дефицит или структурные аномалии фибриногена, протромбина, фактора V, фактора VII, фактора X или фактора XIII, синдром Бернара-Сулье, который является дефектом или дефицитом К заявке, выделенной из заявки № 201491186 GPIb. GPIb - рецептор для ФВ - может быть дефективным и приводить к недостатку первичного тромбообразования (первичного гемостаза) и повышенной склонности к кровотечениям, и тромбастении Гланцманна и Негели (тромбастении Гланцманна). При печеночной недостаточности (острой и хронической формах) наблюдается недостаточная выработка факторов свертывания крови печенью, что может привести к повышенному риску кровотечений. [0102] Химерные молекулы, являющиеся объектом данного изобретения, можно применять в профилактических целях. Употребляемый в данном тексте термин "профилактическое лечение" относится к применению данной молекулы до случая кровотечения. В одном варианте реализации изобретения пациенту, нуждающемуся в общем гемостатическом средстве, проводят или собираются проводить хирургическую операцию. Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, можно применять до или после хирургической операции в качестве профилактики. Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, можно применять во время или после хирургической операции для контролирования острых случаев кровотечения. Хирургическая операция может включать, но не ограничивается этим, трансплантацию печение, резекцию печени, стоматологические процедуры или трансплантацию стволовых клеток. [0103] Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, также применяется для лечения по требованию (также называемому "эпизодическим"). Термин "лечение по требованию" или "эпизодическое лечение" относится к применению химерной молекулы в ответ на проявление симптомов случая кровотечения или перед действием, которое может вызвать кровотечение. В одном аспекте реализации лечение пациента по требованию (эпизодическое лечение) может проводиться тогда, когда кровотечение началось, например, после травмы, или тогда, когда кровотечение ожидается, например, перед хирургической операцией. В другом аспекте реализации лечение пациента по требованию может проводиться до действий, которые повышают риск кровотечения, например, в случае контактного спорта. [0104] Употребляемый в данном тексте термин "острое кровотечение" относится к случаю кровотечения вне зависимости от его причин. Например, пациент может получить травму, страдать уремией, наследственным нарушением, связанным с кровотечением (например, дефицитом фактора VII), нарушением тромбоцитарного звена гемостаза или обладать сопротивлением благодаря выработке антител к факторам свертывания крови. [0105] При употреблении в данном тексте лечение, проведение лечения, осуществление лечения относится к, например, снижению степени тяжести заболевания или болезненного состояния; снижению продолжительности заболевания; уменьшению интенсивности одного или более симптомов, связанных с заболеванием или болезненным состоянием, без обязательного излечения заболевания или болезненного состояния или предупреждения одного или более симптомов, связанных с заболеванием или болезненным состоянием. В одном варианте реализации изобретения термин "лечение" или "проведение лечения" означает поддержание у пациента минимального уровня OVIII, составляющего по меньшей мере 1 МЕ/дЛ, 2 МЕ/дЛ, 3 МЕ/дЛ, 4 МЕ/дЛ, 5 МЕ/дЛ, 6 МЕ/дЛ, 7 МЕ/дЛ, 8 МЕ/дЛ, 9 МЕ/дЛ, 10 МЕ/дЛ, 11 МЕ/дЛ, 12 МЕ/дЛ, 13 МЕ/дЛ, 14 МЕ/дЛ, 15 МЕ/дЛ, 16 МЕ/дЛ, 17 МЕ/дЛ, 18 МЕ/дЛ, 19 МЕ/дЛ или 20 МЕ/дЛ, путем введения химерного белка или фрагмента ФВ, которые являются объектами данного изобретения. В другом варианте реализации изобретения лечение или проведение лечения означает поддержание минимального уровня OVIII между около 1 и около 20 МЕ/дЛ, около 2 и около 20 МЕ/дЛ, около 3 и около 20 МЕ/дЛ, около 4 и около 20 МЕ/дЛ, около 5 и около 20 МЕ/дЛ, около 6 и около 20 МЕ/дЛ, около 7 и около 20 МЕ/дЛ, около 8 и около 20 МЕ/дЛ, около 9 и около 20 МЕ/дЛ или около 10 и около 20 МЕ/дЛ. Лечение или проведение лечения заболевания или болезенного состояния также может включать поддержание активности OVIII у пациента на уровне, сравнимом по меньшей мере приблизительно с 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% активности OVIII у пациента, не страдающего гемофилией. Минимальный уровень, необходимый для проведения лечения может быть определен при помощи одного или более известных способов и может быть подобран (увеличен или уменьшен) для каждого отдельного пациента. Химерные белки [0106] Настоящее изобретение относится к продлению времени полужизни белка фактора VIII путем предотвращения или подавления in vivo связывания фактора, ограничивающего время полужизни OVIII (например, эндогенного ОВ) с белком OVIII. Эндогенный ОВ связывает от около 95% до около 98% OVIII в нековалентные комплексы. Известно, что связывание эндогенного ОВ с белком OVIII защищает OVIII разными способами. Например, полноразмерный ОВ (в виде мультимера размером в около 250 кДа) может защитить OVIII от протеазного расщепления и активации OVIII, стабилизировать тяжелую цепь и/или легкую цепь OVIII и предотвратить выведение OVIII фагоцитарными рецепторами. При этом в то же время эндогенный ОВ ограничивает время полужизни OVIII, путем предотвращения пиноцитоза и путем выделения комплекса OVIII-OB из системы в процессе очищения ОВ. Считается, как показано в примерах, что эндогенный ОВ является ограничивающим время полужизни фактором, который препятствует продлению времени полужизни белка OVIII, слитого с компонентом, продлевающим время полужизни, более чем приблизительно в два раза по отношению к OVIII дикого типа. Следовательно, в настоящем изобретение предотвращается или подавляется взаимодействие между эндогенным ОВ и белком OVIII при помощи дополнительного компонента, и, тем самым, предотвращается выведение белка OVIII в процессе очищения ОВ и/или индукция пиноцитоза. В одном варианте реализации изобретения дополнительный компонент способен предотвращать или подавлять связывание белка OVIII с эндогенным ОВ и обладает по меньшей мере одним ОВ-подобным OVIII-защитным свойством. Вдобавок дополнительный компонент снижает выведение OVIII из системы, предотвращая или подавляя взаимодействие с эндогенным ОВ. Дополнительные компоненты, являющиеся объектами настоящего изобретения, связываются или ассоциируют с (например, путем нековалентного связывания) белком OVIII и/или физически или химически блокируют ОВ-связывающий участок белка OVIII. Таким образом, белок OVIII, связанный с дополнительным компонентом, выводится из кровообращения клиренс-рецепторами ОВ более медленно по сравнению с OVIII дикого типа или несвязанным с дополнительным компонентом OVIII. [0107] Примеры дополнительных компонентов, являющихся объектами настоящего изобретения, включают, например, полипептиды либо химические или физические модификации, добавления, делеций или вариации белка OVIII. Дополнительный компонент, применяемый в настоящем изобретении, может содержать полипептид, неполипептидный компонент или оба эти компонента. Неограничивающие примеры полипептида, применяемого в качестве дополнительного компонента, включают, например, описанный в данном тексте фрагмент ОВ, константную область иммуноглобулина или ее часть, трансферрин или его фрагмент, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность НАР, последовательность PAS, или любые комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любую комбинацию этих компонентов. Другие подобные компоненты, применяемые в настоящем изобретении, известны в данной области техники. [0108] В одном варианте реализации изобретения дополнительный компонент соединен (или связан) с белком OVIII ковалентной или нековалентной связью. При этом, в некоторых случаях, физическое блокирование или химическая связь (например, нековалентное связывание) между дополнительным компонентом и белком OVIII могут быть недостаточно сильными для того, чтобы обеспечить существование устойчивого комплекса, содержащего белок OVIII и дополнительный компонент, в присутствии эндогенного ОВ. Например, фрагмент ОВ, образующий нековалентную связь с белком OVIII без каких-либо дополнительных соединений, может легко быть отделен in vivo от белка OVIII в присутствии эндогенного ОВ, при этом фрагмент ОВ (например, рекомбинантного ОВ, т.е., рОВ) замещается эндогенным ОВ. Следовательно, нековалентно связанный с эндогенным ОВ белок OVIII будет подвержен процессу очистки ОВ и будет выведен из системы. С целью предотвращения отделения дополнительного компонента от белка OVIII в некоторых вариантах реализации изобретения связь между белком OVIII и дополнительным компонентом является ковалентной связью, например, пептидной связью, одной или более аминокислотами либо дисульфидной связью.В определенных вариантах реализации изобретения соединение (т.е., связь) между дополнительным компонентом и белком OVIII является пептидной связью или линкером между белком OVIII и дополнительным компонентом ("линкер OVIII/ДК"). Неограничивающие примеры линкеров описаны в другом месте данного текста. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент является полипептидом, содержащим, состоящим преимущественно из или состоящим из по меньшей мере 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000 или 4000 аминокислот. В других вариантах реализации изобретения дополнительный компонент является полипептидом, содержащим, состоящим преимущественно из или состоящим из от около 100 до около 200 аминокислот, от около 200 до около 300 аминокислот, от около 300 до около 400 аминокислот, от около 400 до около 500 аминокислот, от около 500 до около 600 аминокислот, от около 600 до около 700 аминокислот, от около 700 до около 800 аминокислот, от около 800 до около 900 аминокислот или от около 900 до около 1000 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент, ковалентно связанный с белком OVIII, является фрагментом ОВ, описанным в другом месте данного текста. [0109] В определенных вариантах реализации изобретения дополнительный компонент химически (например, нековалентно) связывается с или физически блокирует один или более ФВ-связывающих участков белка OVIII. ФВ-связывающий участок белка OVIII расположен в пределах домена A3 или домена С2 белка OVIII. В других вариантах реализации изобретения ОВ-связывающий участок белка OVIII расположен в пределах домена A3 и домена С2. Например, ОВ-связывающий участок белка OVIII может соответствовать аминокислотам от 1669 до 1689 и/или от 2303 до 2332 из SEQ Ш N0: 16 [полноразмерный зрелый OVIII]. [ОНО] В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит белок OVIII, связанный с дополнительным компонентом, при этом дополнительный компонент является молекулой ОВ, например, фрагментом ОВ, содержащим домен D' и домен D3, но не содержащим участок связывания клиренс-рецептора ОВ, и экранирует или защищает ОВ-связывающий участок белка OVIII, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка OVIII с эндогенным ОВ. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент является фрагментом ОВ. Орагмент ОВ, применяемый в настоящем изобретении, содержит домен D' и домен D3, обеспечивая белку OVIII одно или более преимуществ ОВ-подобных свойств, но при этом фрагмент ОВ не подвергается процессу очистки ОВ. Белок OVIII и дополнительный компонент могут быть ковалентно связанными посредством линкера (например, линкера OVIII/ДК). В одном варианте реализации изобретения линкер может являться отщепляемым линкером. Неограничивающие примеры линкеров приведены в другом месте данного текста. [0111] В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит белок OVIII и константную область иммуноглобулина или ее часть (т.е., дополнительный компонент), при этом константная область иммуноглобулина или ее часть экранирует или защищает ОВ-связывающий участок белка OVIII, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка OVIII с эндогенным ОВ. В других вариантах реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть является Fc-областью. [0112] Один аспект реализации настоящего изобретения относится к химерному или слитому белку либо гибриду, содержащему один или более из описанных в данном тексте фрагментов ОВ, и его применению. Химерный или слиты белок может быть сшит или связан с одним или более гетерологичным компонентом (иногда обозначаемом в данном тексте как Н или HI). В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (HI) является гетерологичным пептидом или гетерологичным полипептидом, который в естественных условиях не встречается с и/или связан с фрагментом ФВ. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (HI) является неполипептидным компонентом, например, химической модификацией или комбинацией пептида или полипептида и неполипептидного компонента. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты ФВ связаны или соединены с гетерологичным компонентом (HI) посредством линкера (также называемым в данном тексте "ФВ-линкером"). В одном варианте реализации изобретения ФВ-линкер является отщепляемым линкером. Неограничивающие примеры линкеров между фрагментом ФВ и гетерологичным компонентом (HI) раскрыты в другом месте данного текста. [0113] В одном варианте реализации гетерологичный компонент (HI), применяемый в данном изобретении, улучшает одно или более из фармакокинетических свойств фрагментов ФВ без заметного влияния на биологическую активность или функционирование фрагментов ФВ (например, их связывание или соединение с белком ФУШ). В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (HI), связанный с фрагментом ФВ, может продлевать время полужизни фрагментов ФВ. Неограничивающие примеры гетерологичного полипептидного компонента включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры гетерологичного неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов. [0114] В некоторых вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (HI) может применяться для соединения фрагмента ФВ и белка ФУШ ковалентной связью. Примеры гетерологичного компонента, который может обеспечить ковалентное связывание, включают, но не ограничиваются этим, константную область иммуноглобулина или ее часть, содержащую шарнирный участок, например, Fc-область или партнера по связыванию FcRn. В отдельном примере белок ФУШ связан с первой Fc-областью, а фрагмент ФВ связан со второй Fc-областью, при этом первая Fc-область и вторая Fc-область образуют одну или более дисульфидную связь. [0115] В некоторых вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как "Н" или "HI") является константной областью иммуноглобулина или ее частью. Неограничивающие примеры константной области иммуноглобулина или ее части могут быть выбраны из группы, состоящей из домена СН1, домена СН2, домена СНЗ, домена СН4, шарнирного домена и двух или более комбинаций этих компонентов. В одном варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит по меньшей мене один домен СН1, по меньшей мене один домен СН2, по меньшей мене один домен СНЗ, по меньшей мене один домен СН4 или их функциональные фрагменты. В другом варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит по меньшей мене один шарнирный домен или его часть и по меньшей мене один домен СН2 или его часть (например, в ориентации шарнир-СН2). В других вариантах реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит по меньшей мене один домен СН2 или его часть и по меньшей мене один домен СНЗ или его часть (например, в ориентации СН2-СНЗ). Примеры комбинаций включают, но не ограничиваются этим, домен СН2, домен СНЗ и шарнирный домен, которые также известны как Fc-область (или Fc-домен), например, первая Fc-область. В других вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (HI) связан с фрагментом ФВ посредством линкера. В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (HI) является партнером по связыванию FcRn, как описано в другом месте данного текста. В других вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (HI) является шарнирным участком. [0116] В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок дополнительно содержит второй (или дополнительный) гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как "Н2"). Стоит отметить, что первый гетерологичный компонент (HI) и второй гетерологичный компонент (Н2) могут применяться взаимозаменяемо и быть одинаковыми либо разными. Второй гетерологичный компонент (Н2) может быть связанным с белком ФУШ или с любым участком химерного белка пептидной связью, одной или более аминокислотами или посредством линкера (например, линкера ФУШ в случае связывания с ФУШ). Такие конструкции иногда могут называться гетеродимерами ФУШ/ФВ. В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) содержит гетерологичный полипептид. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) содержит неполипептидный компонент. В других вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) содержит комбинацию гетерологичного компонента и неполипептидного компонента. Второй гетерологичный компонент (Н2) может являться компонентом, продлевающим время полужизни. Неограничивающие примеры второго гетерологичного полипептидного компонента (Н2) включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры гетерологичного неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения первый гетерологичный компонент (HI) и второй гетерологичный компонент являются одинаковыми или разными. Каждый или оба компонента - первый гетерологичный компонент (HI) и второй гетерологичный компонент (Н2) могут обеспечить продление времени полужизни белка ФУШ в химерном белке, обеспечить соединение, более сильное, чем не ковале нтная связь, т.е., одну или более ковале нтных связей между белком ФУШ и фрагментом ФВ в химерном белке, либо и то и другое. После того как фрагмент ФВ, сшитый или связанный с гетерологичным компонентом (HI) снимает ограничение по времени полужизни путем предотвращения или подавления взаимодействия между белком ФУШ и эндогенным белком ФВ, связанный с гетерологичными компонентами белок ФУШ может достичь своего полного потенциала и может иметь время полужизни, более чем двукратно превышающее таковое у ФУШ дикого типа. [0117] В определенных вариантах реализации изобретения первый гетерологичный компонент (например, первая Fc-область), связанный с фрагментом ФВ, и второй гетерологичный компонент (например, вторая Fc-область), связанный с белком ФУШ, соединены друг с другом таким образом, что это соединение препятствует замещению фрагмента ФВ эндогенным ФВ in vivo. В одном варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент является второй Fc-областью, при этом вторая Fc-область связана или соединена с первым гетерологичным компонентом, например, первой Fc-областью, ковалентной связью, например, дисульфидной связью, пептидной связью или посредством линкера (одной или более аминокислотами). Например, второй гетерологичный компонент (например, вторая Fc-область), связанный с белком ФУШ со стороны одного конца, может быть дополнительно связанным с первым гетерологичным компонентом (например, первой Fc-областью), связанным с фрагментом ФВ посредством линкера (например, OITFC линкером), или соединенным с первым гетерологичным компонентом ковалентной или нековалентной связью. В другом варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент (например, вторая Fc-область) связан с фрагментом ФВ, который уже связан с первым гетерологичным компонентом. В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую фрагмент ФВ и первый гетерологичный компонент, и вторую полипептидную цепь, содержащую белок ФУШ и второй гетерологичный компонент, при этом первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь соединены, причем соединение между первой полипептидной цепью, содержащей первый гетерологичный компонент, и второй полипептидной цепью, содержащей второй гетерологичный компонент, является ковалентной связью, тем самым создавая возможность фрагменту ФВ и белку ФУШ поддерживать взаимодействие друг с другом. В то же время эндогенный ФВ, который может образовывать нековалентную связь с белком ФУШ, не может заместить ковалентно связанную полипептидную цепь, содержащую фрагмент ФВ. [0118] Линкер между первым гетерологичным компонентом (HI) и фрагментом ФВ (например, ФВ-линкер) может являться отщепляемым линкером, например, тромбин-отщепляемым линкером. Отщепляемые линкеры могут отщепляться протеазой, выбранной из группы, состоящей из фактора Х1а, фактора ХПа, калликреина, фактора Vila, фактора ГХа, фактора Ха, фактора Па (тромбина), эластазы-2, гранзима В, ВГТ, энтерокиназы, протеазы ЗС, сортазы А, ММП-12, ММП-13, ММП-17 и ММП-20 и их комбинаций. Эти отщепляемые линкеры обеспечивают возможность отщепления и отделения фрагмента ФВ от белка ФУШ после активации каскада реакций свертывания, что приводит к получению белка ФУШ с полным потенциалом действия. [0119] В других вариантах реализации изобретения химерный белок получают в виде одиночной полипептидной цепи, содержащей фрагмент ФВ, отщепляемый линкер, первый гетерологичный компонент (HI), процессируемый линкер, белок ФУШ и второй гетерологичный компонент (Н2) в любом порядке. После синтеза процессируемый линкер может перед секрецией отщепляться внутриклеточным протеазным ферментом, образуя, таким образом, две полипептидные цепи, как описано выше. В случае конструкции, содержащей одиночную цепь, перед секрецией второй гетерологичный компонент (например, вторая Fc-область) может связываться с фрагментом ФВ посредством процессируемого линкера. В определенных других вариантах реализации изобретения один или более линкеров могут содержать один или более сайтов расщепления. [0120] В некоторых вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, дополнительно содержит третий гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как "НЗ"). Третий гетерологичный компонент (НЗ) может продлевать время полужизни. Гетерологичный компонент (НЗ) может содержать гетерологичный полипептид, неполипептидный компонент либо оба эти компонента. Неограничивающие примеры третьего гетерологичного компонента (НЗ) включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, любые производные или варианты, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или любые комбинации этих компонентов. Первый гетерологичный компонент (HI), связанный с фрагментом ФВ, второй гетерологичный компонент (Н2), связанный с белком ФУШ, и третий гетерологичный компонент (НЗ) могут быть одинаковыми либо разными. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент (HI) идентичен второму гетерологичному компоненту (Н2), но отличается от третьего гетерологичного компонента (НЗ). В другом варианте реализации изобретения третий гетерологичный компонент (НЗ) сшит или связан с белком ФУШ или фрагментом ФВ химерного белка. В некоторых вариантах реализации третий гетерологичный компонент вставлен в один или более доменов белка ФУШ или между двумя доменами белка ФУШ. [0121] В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом первая цепь содержит белок ФУШ, связанный с первым гетерологичным компонентом (HI), например, первой Fc-областью, посредством произвольного линкера (например, ФУШ-линкера), а вторая цепь содержит фрагмент ФВ, связанный со вторым гетерологичным компонентом (Н2), например, второй Fc-областью, посредством произвольного линкера (например, ФВ-линкера). Белок ФУШ может дополнительно содержать третий гетерологичный компонент (НЗ), например, любой продлевающий время полужизни компонент, например, альбумин или последовательность PAS, между тяжелой цепью ФУШ и легкой цепью ФУШ (т.е., аминокислотный остаток 1648 из SEQ Ш N0: 16), являясь, таким образом, одноцепочечным белком ФУШ. В альтернативном варианте белок ФУШ может являться двухцепочечным белком, т.е., содержащим тяжелую цепь ФУШ и легкую цепь ФУШ, которые соединены друг с другом ковалентной или нековалентной связью (например, металлической связью), при этом тяжелая цепь дополнительно связана с третьим гетерологичным компонентом (НЗ), например, неструктурным полипептидом, продлевающим время полужизни, альбумином или его фрагментом или последовательностью PAS. В другом варианте реализации изобретения химерный белок содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом первая цепь содержит белок ФУШ, связанный с первым гетерологичным компонентом (HI), например, первой Fc-областью, посредством произвольного линкера (например, ФУШ-линкера), а вторая цепь содержит фрагмент ФВ, связанный с третьим гетерологичным компонентом (НЗ), например, неструктурным полипептидом, продлевающим время полужизни, альбумином или последовательностью PAS, который связан со вторым гетерологичным компонентом (Н2), например, второй Fc-областью, посредством произвольного линкера. В некоторых вариантах реализации изобретения третий гетерологичный компонент (НЗ) (например, полипептид, продлевающий время полужизни) может быть связан с С-концом или N-концом белка ФУШ или вставлен между двумя доменами белка ФУШ или между двумя аминокислотами в домене белка ФУШ. [0122] В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, дополнительно содержит четвертый гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как "Н4") и/или пятый гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как "Н5"). Четвертый и пятый гетерологичные компоненты также можгут продлевать время полужизни. Четвертый гетерологичный компонент и/или пятый гетерологичный компонент могут быть одинаковыми или разными с третьим гетерологичным компонентом. Гетерологичный компонент может содержать гетерологичный полипептид, неполипептидный компонент либо комбинациию этих компонента. Неограничивающие примеры четвертого или пятого гетерологичного компонента включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, любые производные или варианты, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или любые комбинации этих компонентов. Первый гетерологичный компонент, второй гетерологичный компонент, третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент и пятый гетерологичный компонент могут быть одинаковыми либо разными. В некоторых вариантах реализации изобретения четвертый гетерологичный компонент (например, полипептид, продлевающий время полужизни) может быть связан с С-концом или N-концом белка ФУШ или вставлен между двумя доменами белка ФУШ или между двумя аминокислотами в домене белка ФУШ. В других вариантах реализации изобретения пятый гетерологичный компонент (например, полипептид, продлевающий время полужизни) также может быть связан с С-концом или N-концом белка ФУШ или вставлен между двумя доменами белка ФУШ или между двумя аминокислотами в домене белка ФУШ. [0123] В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок содержит белок ФУШ, фрагмент ФВ, первый гетерологичный компонент, второй гетерологичный компонент, третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент и пятый гетерологичный компонент, при этом первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент образуют связь (например, ковалентную связь) между цепью, содержащей белок ФУШ, и цепью, содержащей фрагментФВ, а третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент и пятый гетерологичный компонент являются продлевающими время полужизни компонентами, и при этом связь между цепью, содержащей белок ФУШ, и цепью, содержащей фрагментФВ, является более сильной, чем нековалентное взаимодействие между ФУШ и фрагментом ФВ, и, тем самым, предотвращается связывание эндогенного ФВ с белком ФУШ in vivo, in vitro или ex vivo. [0124] В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит белок ФУШ, фрагмент ФВ, первый гетерологичный компонент, второй гетерологичный компонент, третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент, пятый гетерологичный компонент и шестой гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как "Н6"), при этом первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент образуют связь между цепью, содержащей белок ФУШ, и цепью, содержащей фрагментФВ, а третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент, пятый гетерологичный компонент и шестой гетерологичный компонент являются продлевающими время полужизни компонентами, и при этом связь между цепью, содержащей белок ФУШ, и цепью, содержащей фрагментФВ, является более сильной, чем взаимодействие между ФУШ и фрагментом ФВ, и, тем самым, предотвращается связывание эндогенного ФВ с белком ФУШ in vivo, in vitro шшех vivo. [0125] В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из: (аа) V-L1-H1-L2-H2, (bb) H2-L2-H1-L1-V, (сс) H1-L1-V-L2-H2, и (dd) H2-L2-V-L1-H1, где V содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ; каждый из L1 или L2 является произвольным линкером; и HI содержит первый гетерологичный компонент; и Н2 содержит произвольный второй гетерологичный компонент. Первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент либо оба могут являться компонентом, продлевающим время полужизни. В одном варианте реализации изобретения HI содержит полипептид, неполипептидный компонент либо оба эти компонента. Полипептид, применяемый в качестве HI, может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, любые производные или варианты, либо любые комбинации этих компонентов. Неполипептидный компонент может содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту и гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или вариант или любые комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения Н2 содержит полипептид, неполипептидный компонент либо оба эти компонента. Полипептид, применяемый в качестве Н2, может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, любые производные или варианты, либо любые комбинации этих компонентов. Неполипептидный компонент может содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или вариант или любые комбинации этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения линкер между HI и Н2 в формулах (аа) и (бб) является процессируемым линкером. В других вариантах реализации изобретения линкер между фрагментом ФВ и HI в формулах (аа) и (бб) является отщепляемым линкером, например, тромбин-отщепляемым линкером, который может отщепляться тромбином. [0126] Ориентация приведенных в данном тексте формул полипептидов идет от N- конца (слева) до С-конца (справа). Например, формула H-L-V означает формулу NH2-H-L-V-COOH. В одном варианте реализации изобретения описанные в данном тексте формулы могут содержать дополнительные последовательности между двумя компонентами. Например, формула V-L1-H1-L2-H2 может дополнительно содержать последовательностина N-конце V, между V и L1, между L1 и HI, между HI или L2, между L2 или Н2, или на С-конце Н2, если не указано иное. В другом варианте реализации изобретения дефис (-) указывает на наличие пептидной связи либо одной или более аминокислот. [0127] В конкретных вариантах реализации изобретения химерный белок содержит, состоит преимущественно из или состоит из одной или более формул, выбранных из группы, состоящей из (al) V-H, (а2) H-V, (аЗ) V-L-H, (а4) H-L-V, (а5) V-L1-H1-H2, (аб) H2-H1-L1-V, (а7) V-L1-H1:H2, (а8) H2:H1-L1-V, (а9) V-H1:H2, (61) H2:H1-V, (62) V-L1-H1-L2-H2, (63) H2-L2-H1-L1-V, (64) H1-V-H2, (65) H1-L1-V-L2-H2 и (66) H2-L2-V-L1-H1, где V один или более из описанных в данном тексте фрагментов ФВ, L, L1 или L2 содержит линкер, Н или HI содержит первый гетерологичный компонент. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент (HI) может являться полипептидом, неполипептидным компонентом либо и тем и другим. Гетерологичный полипептидный компонент может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР или любые комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента, применяемого в качестве HI, включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или любые комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения Н2 содержит второй гетерологичный компонент. Второй гетерологичный компонент может являться полипептидом, неполипептидным компонентом либо и тем и другим. Гетерологичный полипептидный компонент может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР или любые комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента, применяемого в качестве HI, включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или любые комбинации этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения линкер между первым гетерологичным компонентом и вторым гетерологичным компонентом является процессируемым линкером. В других вариантах реализации изобретения линкер между фрагментом ФВ и первым гетерологичным компонентом или вторым гетерологичным компонентом является отщепляемым линкером, который содержит один или более сайтов расщепления, например, тромбин-отщепляемым линкером. [0128] Химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из (аа), (бб), (вв), (гг), (al), (а2), (аЗ), (а4), (а5), (аб), (а7), (а8), (а9), (61), (62), (63), (64), (65) и (66), и белок ФУШ, который ковалентно связан или ковалентно соединен с фрагментом ФВ, первым гетерологичным компонентом (например, первой Fc-областью) или вторым гетерологичным компонентом (например, второй Fc-областью) из формулы. В одном варианте реализации изобретения белок ФУШ связан или соединен с фрагментом ФВ ковалентной или нековалентной связью либо посредством линкера. В другом варианте реализации изобретениям белок ФУШ может быть связан с первым гетерологичным компонентом или вторым гетерологичным компонентом ковалентной или нековалентной связью либо посредством линкера. [0129] В одном варианте реализации химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ, ковалентно связанный или ковалентно соединенный с белком ФУШ. Например, химерный белок может содержать фрагмент ФВ и белок ФУШ, при этом фрагмент ФВ и белок ФУШ связаны ковалентной непептидной связью, пептидной связью, нековалентной связью или посредством линкера, например, отщепляемого линкера. В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ и белок ФУШ связаны или взаимодействуют друг с другом посредством одной или более дисульфидных связей. В другом конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ связан или взаимодействует с белком ФУШ в области домена A3 ФУШ, домена С2 ФУШ или обоих - домена A3 и домена С2 ФУШ - посредством нековалентной связи. В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный или взаимодействующий с белком ФУШ, связан или сшит с первым гетерологичным компонентом. В других вариантах реализации изобретения белок ФУШ, связанный или взаимодействующий с фрагментом ФВ, дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный или взаимодействующий с белком ФУШ, дополнительно связан с первым гетерологичным компонентом, а белок ФУШ дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом. В определенных вариантах реализации изобретения первая полипептидная цепь, содержащая фрагмент ФВ и первый гетерологичный компонент, и вторая полипептидная цепь, содержащая белок ФУШ и второй гетерологичный компонент, соединены друг с другом таким образом, что это соединение не дает возможности белку ФУШ взаимодействовать с другими компонентами, например, эндогенным ФВ. В одном варианте реализации изобретения соединение представляет собой ковалентную связь, например, дисульфидную связь. [0130] Как фрагмент ФВ, так и белок ФУШ могут быть соединены или связаны с первым или вторым гетерологичным компонентом посредством линкера, например, отщепляемого линкера, например, тромбин-отщепляемого линкера. Линкер между фрагментом ФВ и первым гетерологичным компонентом может обозначаться в данном тексте как ФВ-линкер. Линкер между белком ФУШ и вторым гетерологичным компонентом может обозначаться в данном тексте как ФУШ-линкер. Либо оба компонента - фрагмент ФВ и белок ФУШ могут быть соединены или связаны с первым или вторым гетерологичным компонентом посредством линкера, например, отщепляемого линкера, например, тромбин-отщепляемого линкера. В определенных вариантах реализации изобретения первый гетерологичный компонент, связанный с фрагментом ФВ, содержит полипептидный, неполипептидный компонент либо оба. Неограничивающие примеры первого гетерологичного полипептидного компонента включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или вариант, или любые комбинации этих компонентов. В других вариантах реализации изобретения второй гетерологичный компонент, связанный с белком ФУШ, содержит полипептидный, неполипептидный компонент либо оба. Неограничивающие примеры второго гетерологичного компонента включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или вариант, или любые комбинации этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ присоединен к ФУШ при помощи опосредованного сортазой in vitro лигирования белка. В некоторых вариантах реализации изобретения применяется распознающий сортазу мотив. [0131] В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент является константной областью иммуноглобулина или ее частью. В конкретном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент является первой Fc-областью. В некоторых вариантах реализации изобретения второй гетерологичный компонент является константной областью иммуноглобулина или ее частью. В конкретном варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент является второй Fc-областью. В конкретном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и белок ФУШ, при этом фрагмент ФВ связан с константной областью иммуноглобулина или ее частью, которая является Fc-областью. В другом варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и белок ФУШ, при этом белок ФУШ связан с константной областью иммуноглобулина или ее частью, которая является Fc-областью. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и белок ФУШ, при этом фрагмент ФВ связан с первой с константной областью иммуноглобулина, которая является первой Fc-областью, а белок ФУШ связан со второй константной областью иммуноглобулина, которая является второй Fc-областью, и при этом фрагмент ФВ и белок ФУШ связаны или взаимодействуют друг с другом посредством нековалентной связи, либо первая Fc-область и вторая Fc-область соединены друг с другом посредством ковалентной связи. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный с первым гетерологичным компонентом, дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом, например, второй Fc-областью, посредством линкера, например, процессируемого линкера. В одном аспекте реализации фрагмент ФВ связан с первым гетерологичным компонентом посредством линкера, например, ФВ-линкера, например, отщепляемого линкера. В другом аспекте реализации белок OVIII связан со вторым гетерологичным компонентом посредством линкера, например, ФУШ-линкера, например, отщепляемого линкера. Неограничивающие примеры гетерологичных компонентов раскрыты в другом месте данного текста, например, константная область иммуноглобулина или ее часть в параграфах [0165] - [0193], альбумин, его фрагмент или вариант в параграфах [0194] - [0198], последовательность НАР в параграфе [0293], трансферрин, его фрагмент или вариант в параграфах [0204] - [0205], полимер, например, полиэтиленгликоль, в параграфах [0206] - [0213], ГЭК в параграфах [0214]-[0219] или последовательности PSA в параграфе [0220] и PAS в параграфах [0199]-[0202]. [0132] В некоторых вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит, в значительной степени описывается из или описывается формулой, выбранной из группы, состоящей из:и (a) V-L1-H1-L3-C-L2-H2, (b) H2-L2-C- L3 - Н1-L1 -V, (c) C-L2-H2-L3-V-LI-HI, (d) H1-L1-V-L3-H2-L2-C, (e) H1-L1-V-L3-C-L2-H2, (g) H2-L2-C-L3- V-L1-H1, (g) V-L1-H1-L3-H2-L2-C, (g) C-L2-H2- L3 - Н1 -L1 -V, (i) H2-L3-H1-L1-V-L2-C, (j) C-L2-V-L1-H1-L3-H2, (k) V-L2-C-L1 -H1-L3 -H2, и (1) H2-L3-H1-L1-C-L2-V, где V является описанным в данном тексте фрагментом ФВ; каждый из L1 или L2 является произвольным линкером, например, отщепляемым линкером, например, тромбин-отщепляемым линкером; L3 является произвольным линкером, например, оцГс линкером, например, процессируемым линкером; каждый из HI или Н2 является произвольным гетерологичным компонентом; С является белком OVIII; и (-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот. [0133] В других аспектах химерный белок, являющийся объектом изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из: (m) V-L1-H1: H2-L2-C, (n) V-L1-H1:C-L2-H2; (o) H1-L1-V:H2-L2-C; (p) H1-L1-V:C-L2-H2; (q) V:C-L1-H1:H2; (r) V:H1-L1-C:H2; (s) H2:H1-L1-C:V, (t) C:V-L1-H1:H2, и (u) C:H1-L1-V:H2. где V является описанным в данном тексте фрагментом ФВ; каждый из L1 или L2 является произвольным линкером, например, тромбин-отщепляемым линкером; каждый из HI или Н2 является произвольным гетерологичным компонентом; (-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот; и С является белком OVIII; и (:) представляет химическое или физическое соединение между HI и Н2. [0134] В одном варианте реализации изобретения один или более гетерологичных компонентов являются соединениями, продлевающими время полужизни. Соединения, продлевающие время полужизни, известны в данной области техники, а неограничивающие примеры таких продлевающих время полужизни соединений включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, производное либо вариант или две или более комбинации этих компонентов. Неполипептидный компонент может содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), производное или любые комбинации этих компонентов. [0135] В одном варианте реализации изобретения (:) в формулах от (н) до (х) представляет химическое соединение, например, по меньшей мере одну непептидную связь. В определенных вариантах реализации изобретения химическое соединение, т.е., (:), является ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения соединение, т.е., (:), является нековалентным взаимодействием, например, ионным взаимодействием, гидрофобным взаимодействием, гидрофильным взаимодействием, Ван-дер-Ваальсовским взаимодействием, водородной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является непептидной ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является пептидной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) в формулах формулах от (н) до (х) представляет физическое соединение между двумя последовательностями, при этом часть первой последовательности находится в непосредственной близости ко второй последовательности так, что первая последовательность защищает или блокирует часть второй последовательности от взаимодействия с другим компонентом, и, дополнительно к этому, данное физическое соединение поддерживается таким образом, что не дает возможности второй последовательности взаимодействовать с другими компонентами. [0136] Формулы (а) - (х) включены в данный текст в качестве неограничивающих примеров конструкций, являющихся объектами настоящего изобретения. Ориентация формул полипептидов идет от N-конца (слева) до С-конца (справа). Например, формула V-L1-H1-L3-C-L2-H2 означает формулу NH2-V-L1-H1-L3-C-L2-H2-COOH. Дополнительно (:) может являться соединением или взаимодействием между двумя полипептидными цепями посредством ковалентной связи или нековалентной связи между любой частью первой цепи и любой частью второй цепи, если не указано иное. Например, формула V-H1:H2-C содержит две полипептидные цепи, первую цепь представляет V-H1, а вторую цепь представляет С-Н2, при этом V из первой цепи взаимодействует или соединено с С из второй цепи и/или HI из первой цепи взаимодействует или соединено с Н2 С из второй цепи. В других некоторых реализации изобретения (:) обозначает ковалентную, непептидную связь или нековалентную связь. [0137] В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок содержит, в значительной степени описывается из или описывается формулой, выбранной из группы, состоящей из: (1) V:C, (2) H-V:C or C:V-H, (3) V:C-Hor H-C:V, (4) V-H1:H2-C orHl-V:C-H2, (5) V:C-H1:H2 orH2:Hl-C:V, (6) H2:H1-V:C orC:V-Hl:H2, (7) H-L-V:C or C:V-L-H, (8) V:C-L-H or H-L-C:V, (9) V-C or C-V, (10) H-V-C or C-V-H, (П) V-H-C or C-H-V, (12) V-C-H or H-C-V, (13) V-H1-C-H2 or H2-C-H1-V, (14) H1-V-C-H2 orH2-C-V-Hl, (15) H1-V-H2-C or C-H2-V-H1, (16) V-H1-H2-C or C-H2-H1-V, (17) V-L-C or C-L-V, (18) H-L-V-C or C-V-L-H, (19) H-V-L-C or C-L-V-H, (20) V-L-H-C or C-H-L-V, (21) V-H-L-C or C-L-H-V, (22) V-L-C-H or H-C-L-V, (23) V-C-L-H or H-L-C-V, (24) H-L1-V-L2-C or C-L2-V-L1-H, (25) V-L-Hl :H2-C or C-H2:H1-L-V, (26) V-Hl :H2-L-C or C-L-H2:H1-V, (27) V:C-H1-H2 orH2-Hl-C:V, (28) H2-H1-V:C or C:V-H1-H2, (29) V:C-L-Hl:H2orH2:Hl-L-C:V, (30) H2:H1-L-V:C or C:V-L-Hl :H2, (31) V-L1-H1:H2-L2-C or L-L2-H2:H1-L1-V, (32) V:C-L-H1-H2 or H2-H1-L-C:V, (33) V:C-H1-L-H2 or H2-L-H1-C:V, (34) V:C-L1-H1-L2-H2 or H2-L2-H1-L1-C:V, (35) H2-H1-V:C or C:V-H1-H2, (36) H2-H1-L-V:C or C:V-L-H1-H2, (37) H2-L-H1-V:C or C:V-H1-L-H2, (38) H2-L2-H1-L1-V:C or C:V-L1-H1-L2-H2, (3 9) V-L1-H-L2-C or C-L2-H-L1 -V, (40) V-L 1-C-L2-H or H-L2-C-L1 -V, (41) V-L-Hl-C-H2 or H2-C-H1-L-V, (42) V-H1-C-L-H2 orH2-L-C-Hl-V, (43) V-H1-L-C-H2 orH2-C-L-Hl-V, (44) H1-L-V-C-H2 or H2-C-V-L-Hl, (45) H1-V-L-C-H2 orH2-C-L-V-Hl, (46) Hl-V-C-L-H or H-L-C-V-Hl, (47) H1-L-V-H2-C or C-H2-V-L-H1, (48) H1-V-L-H2-C or C-H2-L-V-H1, (49) H1-V-H2-L-C or C-L-H2-V-H1, (50) V-L-Hl-H2-C or C-H2-H1-L-V, (51) V-H1-L-H2-C or C-H2-L-H1-V, (52) V-H1-H2-L-C or C-L-H2-H1-V, (53) V-L1-H1-L2-C-H2 or H2-C-L2-H1-L1-V, (54) V-L1-H1-C-L2-H2 or H2-L2-C-H1-L1-V, (55) V-L1-H1-L2-C-L3-H2 or H2-L3-C-L2-H1-L1-V, (40) (56) V-H1-L1 -C-L2-H2 orH2-L2-C-Ll-Hl-V, (57) Hl-Ll-V -L2-C-H2 orH2-C-L2-V-Ll-Hl, (58) Hl-Ll-V -C-L2-H2 orH2-L2-C-V-Ll-Hl, (59) Hl-Ll-V -L2-C-L3-H2 or H2-L3-C-L2-V-L1-H1, (60) Hl-V-Ll -C-L2-H2 orH2-L2-C-Ll-V-Hl, (61) Hl-Ll-V -L2-H2-C or C-H2-L2-V-L1-H1, (62) Hl-Ll-V -H2-L2-C or C-L2-H2-V-L1-H1, (63) Hl-Ll-V -L2-H2-L3-C or C-L3-H2-L2-V-L1-H1, (64) Hl-V-Ll -H2-L2-C or C-L2-H2-L1-V-H1, (65) V-L1-H1 -L2-H2-C or C-H2-L2-H1-L1-V, (66) V-L1-H1 -H2-L2-C or C-L2-H2-H1-L1-V, (67) V-L1-H1 -L2-H2-L3-C or C-L3-H2-L2-H1-L1-V, и (68) V-H1-L1 -H2-L2-C or C-L2-H2-L1-H1-V, V является описанным в данном тексте фрагментом ФВ; С является белком ФVIII; HI или Н2 является гетерологичным компонентом или первым гетерологичным компонентом; Н2 является вторым гетерологичным компонентом; первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент могут быть одинаковыми или разными; каждый roL,Ll или L2 является произвольным линкером; (-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот; и (:) представляет химическое или физическое соединение. Линкеры могут быть одинаковыми или разными и каждый может являться отщепляемым линкером, содержащим один или более сайтов расщепления ферментами. Гетерологичные компоненты могут представлять известную в данной области техники технологию и являться полипептидом, неполипептидными компонентами или обоими этими компонентами. Полипептидный компонент может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, любые их производные либо варианты или любые комбинации этих компонентов (например, Fc-область). Неполипептидный компонент может содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное либо вариант или любые комбинации этих компонентов. Каждый из Н, HI или Н2 может быть выбран отдельно на основе своих характеристик, и эти компоненты могут все быть одинаковыми или разными. Неограничивающие примеры гетерологичных компонентов раскрыты в другом месте данного текста, например, константная область иммуноглобулина или ее часть - в параграфах [0126] - [0153], альбумин или его фрагмент либо вариант - в параграфах [0154]-[0157], полимер, например, полиэтиленгликоль, - в параграфах [0166] - [0173], и последовательность PAS - в параграфах [0159]-[0162]. Формулы (1) - (68) включены в данный текст в качестве неограничивающих примеров конструкций, являющихся объектами настоящего изобретения. [0138] В одном варианте реализации изобретения (:) представляет химическое соединение, например, по меньшей мере одну непептидную связь. В определенных вариантах реализации изобретения химическое соединение, т.е., (:), является ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения соединение, т.е., (:), является нековалентным взаимодействием, например, ионным взаимодействием, гидрофобным взаимодействием, гидрофильным взаимодействием, Ван-дер-Ваальсовским взаимодействием, водородной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является не пептид ной ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является пептидной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) представляет физическое соединение между двумя последовательностями, при этом часть первой последовательности находится в непосредственной близости ко второй последовательности так, что первая последовательность защищает или блокирует часть второй последовательности от взаимодействия с другим компонентом, и, дополнительно к этому, данное физическое соединение поддерживается таким образом, что не дает возможности второй последовательности взаимодействовать с другими компонентами. [0139] В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент (Н или HI), связанный с фрагментом ФВ в химерном белке, является первой Fc-областью. В другом варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент (или Н2), связанный с белком ФУШ в химерном белке, является второй Fc-областью. [0140] В определенных вариантах изобретения химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит две полипептидные цепи, с первой цепью, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из аминокислотной последовательности, кодирующей ФУШ (например, одноцепочечный ФУШ), и первого гетерологичного компонента (например, первой Fc-области) и второй цепью, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из аминокислотной последовательности, кодирующей фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3, второго гетерологичного компонента (например, второй Fc-области) и линкера между фрагментом ФВ и вторым Fc-доменом (например, ФВ-линкера). Линкер между фрагментом ФВ и вторым Fc-доменом может являться тромбин-отщепляемым линкером. В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный белок ФУШ содержит третий гетерологичный компонент, например, продлевающий время полужизни компонент, который связан с N-концом, С-концом или одним или более участками в составе последовательности ФУШ. [0141] В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит три полипептидные цепи, при этом первая цепь содержит, состоит преимущественно из или состоит из тяжелой цепи ФУШ, вторая цепь, содержит, состоит преимущественно из или состоит из легкой цепи ФУШ, сшитой с первым гетерологичным компонентом (например, первой Fc-областью), и третья полипептидная цепь содержит, состоит преимущественно из или состоит из фрагмента ФВ, содержащего домен D' и домен D3, второго гетерологичного компонента (например, второй Fc-области) и линкера. Линкер между фрагментом ФВ и вторым гетерологичным компонентом может являться тромбин-отщепляемым линкером. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь ФУШ связана с третьим гетерологичным компонентом, например, продлевающим время полужизни компонентом, который может быть связан с N-концом, С-концом или одним или более участками в составе последовательности ФУШ. [0142] В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит две полипептидные цепи с первой цепью, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из тяжелой цепи ФУШ, и второй цепью, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из легкой цепи ФУШ, первого гетерологичного компонента (например, первой Fc-области), первого линкера (например, сайта расщепления протеазой, содержащего один или более сайтов внутриклеточного процессинга), фрагмента ФВ, второго линкера (например, тромбин-отщепляемого линкера) и второго гетерологичного компонента (например, второй Fc-области), при этом легкая цепь ФУШ связана с первым гетерологичным компонентом (например, первой Fc-областью), который дополнительно связан с фрагментом ФВ посредством первого линкера (например, процессируемого линкера, содержащего сайт расщепления протеазой, содержащего один или более сайтов внутриклеточного процессинга), а фрагмент ФВ связан со второй Fc-областью посредством второго линкера (например, тромбин-отщепляемого линкера). В определенных вариантах реализации изобретения первый линкер и второй линкер являются идентичными либо разными. [0143] В определенных вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит одну полипептидную цепь, которая содержит одноцепочечный белок ФУШ, первый гетерологичный компонент (например, первую Fc-область), первый линкер (например, тромбин-отщепляемый линкер), фрагмент ФВ, второй линкер (например, тромбин-отщепляемый линкер) и второй гетерологичный компонент (например, вторую Fc-область), при этом одноцепочечный белок ФУШ связан с первым гетерологичным компонентом, который дополнительно связан с фрагментом ФВ посредством первого линкера, а фрагмент ФВ связан со второй Fc-областью посредством второго линкера. В одном варианте реализации изобретения первый линкер является отщепляемым линкером, содержащим первый сайт расщепления и второй сайт расщепления. В другом варианте реализации изобретения второй линкер является отщепляемым линкером, содержащим один или два сайта расщепления. В конкретном варианте реализации изобретения второй линкер является тромбин-отщепляемым линкером. Линкер, применяемый в данном изобретении, может иметь любую длину, например, по меньшей мере 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 или 700 аминокислот. Например, линкер может состоять из 20 аминокислот, 35 аминокислот, 42 аминокислот, 73 аминокислот или 98 аминокислот. [0144] В определенных вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ напрямую связан с белком ФУШ посредством пептидной связи или линкера. В качестве одного из способов связывания фрагмента ФВ и белка ФУШ напрямую или посредством линкера может применяться ферментативное лигирование (например, с участием сортазы). Например, сортаза относится к группе прокариотических ферментов, которые модифицируют поверхностные белки путем распознавания и расщепления карбоксил-терминального сортировочного сигнала. Для большинства субстратов ферментов сортазы распознающий сигнал состоит из мотива LPXTG (Leu-Pro-любая аминокислота-Thr-Gly) (SEQ Ш NO: 106), затем идет высокогидрофобная трансмембранная последовательность, затем - кластер из основных остатков, таких как аргинин. Расщепление происходит между Thr и Gly с временным присоединением через остаток Thr к Cys остатку активного участка лигационного партнера, за чем следует транспептидация, во время которой белок ковалентно присоединяется к стенке клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения лигационный партнер содержит Gly(n). [0145] В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный с распознающим сортазу мотивом посредством произвольного линкера, может быть сшит с белком ФУШ, связанным сортазой с Gly(n), при этом п может иметь любое численное значение. Лигационная конструкция содержит фрагмент ФВ (N-концевая часть конструкции) и белок ФУШ (С-концевая часть конструкции), при этом между ними вставлен распознающий сортазу мотив. Пример конструкции показан на Фигуре 24(A). Другая лигационная конструкция содержит фрагмент ФВ (N-концевая часть конструкции), линкер, распознающий сортазу мотив и белок ФУШ (С-концевая часть конструкции) (например, Фигура 24(B)). В другом варианте реализации изобретения белок ФУШ, связанный с распознающим сортазу мотивом посредством произвольного линкера, может быть сшит с фрагментом ФВ, связанным сортазой с Gly(n), при этом п может иметь любое численное значение. Полученная лигационная конструкция содержит белок ФУШ (N-концевая часть конструкции) и фрагмент ФВ (С-концевая часть конструкции), при этом между ними вставлен распознающий сортазу мотив. Пример конструкции показан на Фигуре 24(Б). Другая лигационная конструкция содержит белок ФУШ (N-концевая часть конструкции), линкер, распознающий сортазу мотив и фрагмент ФВ (С-концевая часть конструкции) (например, Фигура 24(Г)). В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный с распознающим сортазу мотивом посредством первого произвольного линкера, может быть сшит с гетерологичным компонентом, например, константной областью иммуноглобулина или ее частью, например, Fc-областью, связанной с сайтом расщепления тромбином посредством второго произвольного линкера. Полученная конструкция может содержать фрагмент ФВ (N-концевая часть), первый линкер, распознающий сортазу мотив, сайт расщепления протеазой, второй произвольный линкер и гетерологичный компонент (например, Фигура 24(Д)). В определенных вариантах реализации изобретения эта полученная конструкция является частью химерного белка, содержащего белок ФУШ и второй гетерологичный компонент, например, константную область иммуноглобулина или ее часть, например, Fc-область. В одном примере, В другом примере химерный белок содержит три полипептидные цепи, с первой цепью, содержащей фрагмент ФВ, первый линкер, распознающий сортазу мотив, сайт расщепления протеазой, второй произвольный линкер, первый гетерологичный компонент, второй цепью, содержащей легкую цепь белка ФУШ и второй гетерологичный компонент, и третьей цепью, содержащей тяжелую цепь белка ФУШ. [0146] В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержащий фрагмент ФВ и белок ФУШ, причем фрагмент ФВ и белок ФУШ ковалентно соединены друг с другом либо ковалентно связаны друг с другом, обладает меньшей иммуногенностью чем белок ФУШ без фрагмента ФВ. Сниженная иммуногенность включает, но не ограничивается этим, более слабый гуморальный иммунный ответ, например, более низкий титр нейтрализующих антител, или более слабый клеточно-опосредованный иммунный ответ на ФУШ, например, меньшую выработку различных цитокинов. [0147] В других вариантах реализации результатом данного изобретения было продление времени полужизни белка ФУШ (либо химерного белка) по сравнению с белком ФУШ без фрагмента ФВ или ФУШ дикого типа. Время полужизни белка ФУШ по меньшей мере в 1,5 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 2,5 раз, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 11 раз или по меньшей мере в 12 раз больше, чем время полужизни белка ФУШ без фрагмента ФВ. В одном варианте реализации изобретения время полужизни ФУШ приблизительно 1,5-20-кратно, приблизительно 1,5-15-кратно или приблизительно 1,5-10 кратно превышает время полужизни ФУШ дикого типа. В другом варианте реализации изобретения время полужизни ФУШ продлено в от около 2 раз до около 10 раз, от около 2 раз до около 9 раз, от около 2 раз до около 8 раз, от около 2 раз до около 7 раз, от около 2 раз до около 6 раз, от около 2 раз до около 5 раз, от около 2 раз до около 4 раз, от около 2 раз до около 3 раз, от около 2,5 раз до около 10 раз, от около 2,5 раз до около 9 раз, от около 2,5 раз до около 8 раз, от около 2,5 раз до около 7 раз, от около 2,5 раз до около 6 раз, от около 2,5 раз до около 5 раз, от около 2,5 раз до около 4 раз, от около 2,5 раз до околоЗ раз, от около 3 раз до около 10 раз, от около 3 раз до около 9 раз, от около 3 раз до около 8 раз, от около 3 раз до около 7 раз, от около 3 раз до около 6 раз, от около 3 раз до около 5 раз, от около 3 раз до около 4 раз, от около 4 раз до около 6 раз, от около 5 раз до около 7 раз или от около 6 раз до около 8 раз по сравнению с ФУШ дикого типа или белком ФУШ без фрагмента ФВ. В других вариантах реализации изобретения время полужизни ФУШ составляет по меньшей мере около 17 часов, по меньшей мере около 18 часов, по меньшей мере около 19 часов, по меньшей мере около 20 часов, по меньшей мере около 21 часа, по меньшей мере около 22 часов, по меньшей мере около 23 часов, по меньшей мере около 24 часов, по меньшей мере около 25 часов, по меньшей мере около 26 часов, по меньшей мере около 27 часов, по меньшей мере около 28 часов, по меньшей мере около 29 часов, по меньшей мере около 30 часов, по меньшей мере около 31 часа, по меньшей мере около 32 часов, по меньшей мере около 33 часов, по меньшей мере около 34 часов, по меньшей мере около 35 часов, по меньшей мере около 36 часов, по меньшей мере около 48 часов, по меньшей мере около 60 часов, по меньшей мере около 72 часов, по меньшей мере около 84 часов, по меньшей мере около 96 часов или по меньшей мере около 108 часов. В других вариантах реализации изобретения время полужизни ФУШ составляет от около 15 часов до около двух недель, от около 16 часов до около одной недели, от около 17 часов до около одной недели, от около 18 часов до около одной недели, от около 19 часов до около одной недели, от около 20 часов до около одной недели, от около 21 часов до около одной недели, от около 22 часов до около одной недели, от около 23 часов до около одной недели, от около 24 часов до около одной недели, от около 36 часов до около одной недели, от около 48 часов до около одной недели, от около 60 часов до около одной недели, от около 24 часов до около шести дней, от около 24 часов до около пяти дней, от около 24 часов до около четырех дней, от около 24 часов до около трех дней или от около 24 часов до около двух дней. [0148] В некоторых вариантах реализации изобретения среднее время полужизни ФУШ у пациента составляет около 15 часов, около 16 часов, около 17 часов, около 18 часов, около 19 часов, около 20 часов, около 21 часа, около 22 часов, около 23 часов, около 24 часов (1 дня), около 25 часов, около 26 часов, около 27 часов, около 28 часов, около 29 часов, около 30 часов, около 31 часа, около 32 часов, около 33 часов, около 34 часов, около 35 часов, около 36 часов, около 40 часов, около 44 часов, около 48 часов (2 дней), около 54 часов, около 60 часов, около 72 часов (3 дней), около 84 часов, около 96 часов (4 дней), около 108 часов, около 120 часов (5 дней), около шести дней, около семи дней (одной недели), около восьми дней, около девяти дней, около 10 дней, около 11 дней, около 12 дней, около 13 дней или около 14 дней. [0149] В определенных вариантах реализации изобретения время полужизни белка ФУШ, ковалентно связанного с фрагментом ФВ, было продлено в случае мышей с двойным ФУШ/ФВ генным нокатутом ("ДГН") по сравнению с полипептидом, состоящим из ФУШ или мономер-димерного гибрида ФУШ. А) Фрагменты фактора Виллебранда (ФВ) [0150] ФВ (также известный как Ф8ФВ) является крупным мультимерным гликопротеином, который находится в плазме крови и постоянно вырабатывается в эндотелии (в тельцах Вейбеля-Палада), мегакариоцитах (а-гранулах тромбоцитов) и субэндотелиальной соединительной ткани. Основной мономер ФВ представляет собой белок из 2813 аминокислот. Каждый мономер содержит определенное количество специфических доменов со специфическими функциями, домены D' и D3 (которые совместно связываются с фактором VIII), домен А1 (который связывается с тромбоцитарным GPIb-рецептором, гепарином и/или, возможно, коллагеном), домен A3 (который связывается с коллагеном), домен С1 (в котором домен RGD связывается с тромбоцитарным интегрином аПЬрЗ, когда он находится в активированном состоянии) и "цистеин-узловой" домен у С-терминального конце белка (который ФВ делит с тромбоцитарным фактором роста (PDGF), трансформирующим фактором роста Р (TGFP) и Р человеческим хорионическим гонадотропином (РХГЧ)). [0151] Состоящая из 2813 аминокислот последовательность человеческого ФВ представлена в Genbank как Accession Number _NP_000543.2 . Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий ФВ, представлена в Genbank как Accession Number NM 000552.3 . Нуклеотидная последовательность человеческого ФВ обозначена как SEQ Ш NO: 1. SEQ Ш NO: 2 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ Ш NO: 1. Каждый из доменов ФВ перечислен в Таблице 1. 1951 TGSSTRHIVTFDGQNFKLTGSCSYVLFQNKEQDLEVILHNGACSPGARQG 2 001 CMKSIEVKHSALSVEXHSDMEVTVNGRLVSVPYVGGNMEWVYGAIMHEV 2 051 RFNHLGHIFTFTPQNNEFQLQLSPKTFASKTYGLCGICDENGANDFMLRD 2101 GTVTTDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILEEQCLVPDSSHCQVLLLPLFAEC 2151 HKVLAPATFYAICQQDSCHQEQVCEVIASYAHLCRTNGVCVDWRTPDFCA 22 01 MSCPPSLVYNHCEHGCPRHCDGNVSSCGDHPSEGCFCPPDKVMLEGSCVP 22 51 EEACTQCIGEDGVQHQFLEAWVPDHQPCQICTCLSGRKWCTTQPCPTAK 2301 APTCGLCEVARLRQNADQCCPEYECVCDPVSCDLPPVPHCERGLQPTLTN 2 351 PGECRPNFTCACRKEECKRVSPPSCPPHRLPTLRKTQCCDEYECACNCW 24 01 STVSCPLGYLASTATNDCGCTTTTCLPDKVCVHRSTIYPVGQFWEEGCDV 2451 CTCTDMEDAVMGLRVAQCSQKPCEDSCRSGFTYVLHEGECCGRCLPSACE 2501 WTGSPRGDSQSSWKSVGSQWASPENPCLINECVRVKEEVFIQQRNVSCP 2 551 QLEVPVCPSGFQLSCKTSACCPSCRCERMEACMLNGTVIGPGKTVMIDVC 2 601 TTCRCMVQVGVISGFKLECRKTTCNPCPLGYKEENNTGECCGRCLPTACT 2 651 IQLRGGQIMTLKRDETLQDGCDTHFCKWERGEYFWEKRVTGCPPFDEHK 27 01 CLAEGGKIMKIPGTCCDTCEEPECNDITARLQYVKVGSCKSEVEVDIHYC 2751 QGKCASKAMYSIDINDVQDQCSCCSPTRTEPMQVALHCTNGSWYHEVLN 2801 AMECKCSPRK CSK Нуклеотидная последовательность Полноразмерный ATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTCTGGCCCTCATTTTGCCAGGGACCCTTTGTGC AGAAGGAACTCGCGGCAGGTCATCCACGGCCC ФВ TACTAAGGACGGTCTAAACGGCCCCACGACGAACGAGACCGGGAGTAAAACGGTCCCTGGGAAACACG TCTTCCTTGAGCGCCGTCCAGTAGGTGCCGGG (SEQIDNO:1) GATGCAGCCTTTTCGGAAGTGACTTCGTCAACACCTTTGATGGGAGCATGTACAGCTTTGCGGGATAC TGCAGTTACCTCCTGGCAGGGGGCTGCCAGAA CTACGTCGGAAAAGCCTTCACTGAAGCAGTTGTGGAAACTACCCTCGTACATGTCGAAACGCCCTATG ACGTCAATGGAGGACCGTCCCCCGACGGTCTT ACGCTCCTTCTCGATTATTGGGGACTTCCAGAATGGCAAGAGAGTGAGCCTCTCCGTGTATCTTGGGG AATTTTTTGACATCCATTTGTTTGTCAATGGT TGCGAGGAAGAGCTAATAACCCCTGAAGGTCTTACCGTTCTCTCACTCGGAGAGGCACATAGAACCCC T TAAAAAACT GTAG GTAAACAAACAGTTAC CA ACCGTGACACAGGGGGACCAAAGAGTCTCCATGCCCTATGCCTCCAAAGGGCTGTATCTAGAAACTGA GGCTGGGTACTACAAGCTGTCCGGTGAGGCCT TGGCACTGTGTCCCCCTGGTTTCTCAGAGGTACGGGATACGGAGGTTTCCCGACATAGATCTTTGACT CCGACCCATGATGTTCGACAGGCCACTCCGGA ATGGCTTTGTGGCCAGGATCGATGGCAGCGGCAACTTTCAAGTCCTGCTGTCAGACAGATACTTCAAC AAGACCTGCGGGCTGTGTGGCAACTTTAACAT TACCGAAACACCGGTCCTAGCTACCGTCGCCGTTGAAAGTTCAGGACGACAGTCTGTCTATGAAGTTG TTCTGGACGCCCGACACACCGTTGAAATTGTA CTTTGCTGAAGATGACTTTATGACCCAAGAAGGGACCTTGACCTCGGACCCTTATGACTTTGCCAACT CATGGGCTCTGAGCAGTGGAGAACAGTGGTGT GAAACGACTTCTACTGAAATACTGGGTTCTTCCCTGGAACTGGAGCCTGGGAATACTGAAACGGTTGA GTACCCGAGACTCGTCACCTCTTGTCACCACA GAACGGGCATCTCCTCCCAGCAGCTCATGCAACATCTCCTCTGGGGAAATGCAGAAGGGCCTGTGGGA GCAGTGCCAGCTTCTGAAGAGCACCTCGGTGT CTTGCCCGTAGAGGAGGGTCGTCGAGTACGTTGTAGAGGAGACCCCTTTACGTCTTCCCGGACACCCT CGTCACGGTCGAAGACTTCTCGTGGAGCCACA TTGCCCGCTGCCACCCTCTGGTGGACCCCGAGCCTTTTGTGGCCCTGTGTGAGAAGACTTTGTGTGAG TGTGCTGGGGGGCTGGAGTGCGCCTGCCCTGC AACGGGCGACGGTGGGAGACCACCTGGGGCTCGGAAAACACCGGGACACACTCTTCTGAAACACACTC ACACGACCCCCCGACCTCACGCGGACGGGACG CCTCCTGGAGTACGCCCGGACCTGTGCCCAGGAGGGAATGGTGCTGTACGGCTGGACCGACCACAGCG CGTGCAGCCCAGTGTGCCCTGCTGGTATGGAG GGAGGACCTCATGCGGGCCTGGACACGGGTCCTCCCTTACCACGACATGCCGACCTGGCTGGTGTCGC GCACGTCGGGTCACACGGGACGACCATACCTC TATAGGCAGTGTGTGTCCCCTTGCGCCAGGACCTGCCAGAGCCTGCACATCAATGAAATGTGTCAGGA GCGATGCGTGGATGGCTGCAGCTGCCCTGAGG ATATCCGTCACACACAGGGGAACGCGGTCCTGGACGGTCTCGGACGTGTAGTTACTTTACACAGTCCT CGCTACGCACCTACCGACGTCGACGGGACTCC GACAGCTCCTGGATGAAGGCCTCTGCGTGGAGAGCACCGAGTGTCCCTGCGTGCATTCCGGAAAGCGC TACCCTCCCGGCACCTCCCTCTCTCGAGACTG CTGTCGAGGACCTACTTCCGGAGACGCACCTCTCGTGGCTCACAGGGACGCACGTAAGGCCTTTCGCG ATGGGAGGGCCGTGGAGGGAGAGAGCTCTGAC CAACACCTGCATTTGCCGAAACAGCCAGTGGATCTGCAGCAATGAAGAATGTCCAGGGGAGTGCCTTG TCACTGGTCAATCCCACTTCAAGAGCTTTGAC GTTGTGGACGTAAACGGCTTTGTCGGTCACCTAGACGTCGTTACTTCTTACAGGTCCCCTCACGGAAC AGTGACCAGTTAGGGTGAAGTTCTCGAAACTG AACAGATACTTCACCTTCAGTGGGATCTGCCAGTACCTGCTGGCCCGGGATTGCCAGGACCACTCCTT CTCCATTGTCATTGAGACTGTCCAGTGTGCTG TTGTCTATGAAGTGGAAGTCACCCTAGACGGTCATGGACGACCGGGCCCTAACGGTCCTGGTGAGGAA GAGGTAACAGTAACTCTGACAGGTCACACGAC ATGACCGCGACGCTGTGTGCACCCGCTCCGTCACCGTCCGGCTGCCTGGCCTGCACAACAGCCTTGTG AAACTGAAGCATGGGGCAGGAGTTGCCATGGA TACTGGCGCTGCGACACACGTGGGCGAGGCAGTGGCAGGCCGACGGACCGGACGTGTTGTCGGAACAC TTTGACTTCGTACCCCGTCCTCAACGGTACCT TGGCCAGGACATCCAGCTCCCCCTCCTGAAAGGTGACCTCCGCATCCAGCATACAGTGACGGCCTCCG TGCGCCTCAGCTACGGGGAGGACCTGCAGATG ACCGGTCCTGTAGGTCGAGGGGGAGGACTTTCCACTGGAGGCGTAGGTCGTATGTCACTGCCGGAGGC ACGCGGAGTCGATGCCCCTCCTGGACGTCTAC GACTGGGATGGCCGCGGGAGGCTGCTGGTGAAGCTGTCCCCCGTCTATGCCGGGAAGACCTGCGGCCT GTGTGGGAATTACAATGGCAACCAGGGCGACG CTGACCCTACCGGCGCCCTCCGACGACCACTTCGACAGGGGGCAGATACGGCCCTTCTGGACGCCGGA CACACCCTTAATGTTACCGTTGGTCCCGCTGC ACTTCCTTACCCCCTCTGGGCTGGCRGAGCCCCGGGTGGAGGACTTCGGGAACGCCTGGAAGCTGCAC GGGGACTGCCAGGACCTGCAGAAGCAGCACAG TGAAGGAATGGGGGAGACCCGACCGYCTCGGGGCCCACCTCCTGAAGCCCTTGCGGACCTTCGACGTG CCCCTGACGGTCCTGGACGTCTTCGTCGTGTC CGATCCCTGCGCCCTCAACCCGCGCATGACCAGGTTCTCCGAGGAGGCGTGCGCGGTCCTGACGTCCC CCACATTCGAGGCCTGCCATCGTGCCGTCAGC GCTAGGGACGCGGGAGTTGGGCGCGTACTGGTCCAAGAGGCTCCTCCGCACGCGCCAGGACTGCAGGG GGTGTAAGCTCCGGACGGTAGCACGGCAGTCG CCGCTGCCCTACCTGCGGAACTGCCGCTACGACGTGTGCTCCTGCTCGGACGGCCGCGAGTGCCTGTG CGGCGCCCTGGCCAGCTATGCCGCGGCCTGCG GGCGACGGGATGGACGCCTTGACGGCGATGCTGCACACGAGGACGAGCCTGCCGGCGCTCACGGACAC GCCGCGGGACCGGTCGATACGGCGCCGGACGC CGGGGAGAGGCGTGCGCGTCGCGTGGCGCGAGCCAGGCCGCTGTGAGCTGAACTGCCCGAAAGGCCAG GTGTACCTGCAGTGCGGGACCCCCTGCAACCT GCCCCTCTCCGCACGCGCAGCGCACCGCGCTCGGTCCGGCGACACTCGACTTGACGGGCTTTCCGGTC CACATGGACGTCACGCCCTGGGGGACGTTGGA GACCTGCCGCTCTCTCTCTTACCCGGATGAGGAATGCAATGAGGCCTGCCTGGAGGGCTGCTTCTGCC CCCCAGGGCTCTACATGGATGAGAGGGGGGAC CTGGACGGCGAGAGAGAGAATGGGCCTACTCCTTACGTTACTCCGGACGGACCTCCCGACGAAGACGG GGGGTCCCGAGATGTACCTACTCTCCCCCCTG TGCGTGCCCAAGGCCCAGTGCCCCTGTTACTATGACGGTGAGATCTTCCAGCCAGAAGACATCTTCTC AGACCATCACACCATGTGCTACTGTGAGGATG ACGCACGGGTTCCGGGTCACGGGGACAATGATACTGCCACTCTAGAAGGTCGGTCTTCTGTAGAAGAG TCTGGTAGTGTGGTACACGATGACACTCCTAC GCTTCATGCACTGTACCATGAGTGGAGTCCCCGGAAGCTTGCTGCCTGACGCTGTCCTCAGCAGTCCC CTGTCTCATCGCAGCAAAAGGAGCCTATCCTG CGAAGTACGTGACATGGTACTCACCTCAGGGGCCTTCGAACGACGGACTGCGACAGGAGTCGTCAGGG GACAGAGTAGCGTCGTTTTCCTCGGATAGGAC TCGGCCCCCCATGGTCAAGCTGGTGTGTCCCGCTGACAACCTGCGGGCTGAAGGGCTCGAGTGTACCA AAACGTGCCAGAACTATGACCTGGAGTGCATG AGCCGGGGGGTACCAGTTCGACCACACAGGGCGACTGTTGGACGCCCGACTTCCCGAGCTCACATGGT TTTGCACGGTCTTGATACTGGACCTCACGTAC AGCATGGGCTGTGTCTCTGGCTGCCTCTGCCCCCCGGGCATGGTCCGGCATGAGAACAGATGTGTGGC CCTGGAAAGGTGTCCCTGCTTCCATCAGGGCA TCGTACCCGACACAGAGACCGACGGAGACGGGGGGCCCGTACCAGGCCGTACTCTTGTCTACACACCG GGACCTTTCCACAGGGACGAAGGTAGTCCCGT AGGAGTATGCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCAACACTTGTGTCTGTCGGGACCGGAAGTGG AACTGCACAGACCATGTGTGTGATGCCACGTG TCCTCATACGGGGACCTCTTTGTCACTTCTAACCGACGTTGTGAACACAGACAGCCCTGGCCTTCACC TTGACGTGTCTGGTACACACACTACGGTGCAC CTCCACGATCGGCATGGCCCACTACCTCACCTTCGACGGGCTCAAATACCTGTTCCCCGGGGAGTGCC AGTACGTTCTGGTGCAGGATTACTGCGGCAGT GAGGTGCTAGCCGTACCGGGTGATGGAGTGGAAGCTGCCCGAGTTTATGGACAAGGGGCCCCTCACGG TCATGCAAGACCACGTCCTAATGACGCCGTCA AACCCTGGGACCTTTCGGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCCCTCAGTGAAATGCAAGAA ACGGGTCACCATCCTGGTGGAGGGAGGAGAGA TTGGGACCCTGGAAAGCCTAGGATCACCCCTTATTCCCTACGTCGGTGGGGAGTCACTTTACGTTCTT TGCCCAGTGGTAGGACCACCTCCCTCCTCTCT TTGAGCTGTTTGACGGGGAGGTGAATGTGAAGAGGCCCATGAAGGATGAGACTCACTTTGAGGTGGTG GAGTCTGGCCGGTACATCATTCTGCTGCTGGG AACTCGACAAACTGCCCCTCCACTTACACTTCTCCGGGTACTTCCTACTCTGAGTGAAACTCCACCAC С T CAGAC С G G С CAT GTAG TAAGAC GAC GAC С С CAAAGCCCTCTCCGTGGTCTGGGACCGCCACCTGAGCATCTCCGTGGTCCTGAAGCAGACATACCAGG AGAAAGTGTGTGGCCTGTGTGGGAATTTTGAT GTTTCGGGAGAGGCACCAGACCCTGGCGGTGGACTCGTAGAGGCACCAGGACTTCGTCTGTATGGTCC TCTTTCACACACCGGACACACCCTTAAAACTA GGCATCCAGAACAATGACCTCACCAGCAGCAACCTCCAAGTGGAGGAAGACCCTGTGGACTTTGGGAA CTCCTGGAAAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACA CCGTAGGTCTTGTTACTGGAGTGGTCGTCGTTGGAGGTTCACCTCCTTCTGGGACACCTGAAACCCTT GAGGACCTTTCACTCGAGCGTCACACGACTGT CCAGAAAAGTGCCTCTGGACTCATCCCCTGCCACCTGCCATAACAACATCATGAAGCAGACGATGGTG GATTCCTCCTGTAGAATCCTTACCAGTGACGT GGTCTTTTCACGGAGACCTGAGTAGGGGACGGTGGACGGTATTGTTGTAGTACTTCGTCTGCTACCAC С TAAG GAG GACAT С T TAG GAAT G G T CAC T G CA CTTCCAGGACTGCAACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCTGCATTTACGACACCTGCT CCTGTGAGTCCATTGGGGACTGCGCCTGCTTC GAAGGTCCTGACGTTGTTCGACCACCTGGGGCTCGGTATAGACCTACAGACGTAAATGCTGTGGACGA GGACACTCAGGTAACCCCTGACGCGGACGAAG TGCGACACCATTGCTGCCTATGCCCACGTGTGTGCCCAGCATGGCAAGGTGGTGACCTGGAGGACGGC CACAT TGTGCCCC CAGAG CT G С GAG GAGAG GA ACGCTGTGGTAACGACGGATACGGGTGCACACACGGGTCGTACCGTTCCACCACTGGACCTCCTGCCG GTGTAACACGGGGGTCTCGACGCTCCTCTCCT ATCTCCGGGAGAACGGGTATGAGTGTGAGTGGCGCTATAACAGCTGTGCACCTGCCTGTCAAGTCACG TGTCAGCACCCTGAGCCACTGGCCTGCCCTGT TAGAGGCCCTCTTGCCCATACTCACACTCACCGCGATATTGTCGACACGTGGACGGACAGTTCAGTGC ACAGTCGTGGGACTCGGTGACCGGACGGGACA GCAGTGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCCTGGATGAGCTTTTGCAGACCT GCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAG CGTCACACACCTCCCGACGGTACGGGTGACGGGAGGTCCCTTTTAGGACCTACTCGAAAACGTCTGGA CGCAACTGGGACTTCTGACAGGTCACACACTC GTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCAGGAAAGAAAGTCACCTTGAATCCCAGTGACCCTGAGCACTGCCA GATTTGCCACTGTGATGTTGTCAACCTCACCT CACCGACCGGCCGCAAAACGGAGTCCTTTCTTTCAGTGGAACTTAGGGTCACTGGGACTCGTGACGGT С TAAAC G G T GACAC TACAACAG T T G GAG T G GA GTGAAGCCTGCCAGGAGCCGGGAGGCCTGGTGGTGCCTCCCACAGATGCCCCGGTGAGCCCCACCACT CTGTATGTGGAGGACATCTCGGAACCGCCGTT CACTTCGGACGGTCCTCGGCCCTCCGGACCACCACGGAGGGTGTCTACGGGGCCACTCGGGGTGGTGA GACATACACCTCCTGTAGAGCCTTGGCGGCAA GCACGATTTCTACTGCAGCAGGCTACTGGACCTGGTCTTCCTGCTGGATGGCTCCTCCAGGCTGTCCG AGGCTGAGTTTGAAGTGCTGAAGGCCTTTGTG CGTGCTAAAGATGACGTCGTCCGATGACCTGGACCAGAAGGACGACCTACCGAGGAGGTCCGACAGGC TCCGACTCAAACTTCACGACTTCCGGAAACAC GTGGACATGATGGAGCGGCTGCGCATCTCCCAGAAGTGGGTCCGCGTGGCCGTGGTGGAGTACCACGA CGGCTCCCACGCCTACATCGGGCTCAAGGACC CACCTGTACTACCTCGCCGACGCGTAGAGGGTCTTCACCCAGGCGCACCGGCACCACCTCATGGTGCT GCCGAGGGTGCGGATGTAGCCCGAGTTCCTGG GGAAGCGACCGTCAGAGCTGCGGCGCATTGCCAGCCAGGTGAAGTATGCGGGCAGCCAGGTGGCCTCC ACCAGCGAGGTCTTGAAATACACACTGTTCCA CCTTCGCTGGCAGTCTCGACGCCGCGTAACGGTCGGTCCACTTCATACGCCCGTCGGTCCACCGGAGG TGGTCGCTCCAGAACTTTATGTGTGACAAGGT AATCTTCAGCAAGATCGACCGCCCTGAAGCCTCCCGCATCGCCCTGCTCCTGATGGCCAGCCAGGAGC CCCAACGGATGTCCCGGAACTTTGTCCGCTAC TTAGAAGTCGTTCTAGCTGGCGGGACTTCGGAGGGCGTAGCGGGACGAGGACTACCGGTCGGTCCTCG GGGTTGCCTACAGGGCCTTGAAACAGGCGATG GTCCAGGGCCTGAAGAAGAAGAAGGTCATTGTGATCCCGGTGGGCATTGGGCCCCATGCCAACCTCAA GCAGATCCGCCTCATCGAGAAGCAGGCCCCTG CAGGTCCCGGACTTCTTCTTCTTCCAGTAACACTAGGGCCACCCGTAACCCGGGGTACGGTTGGAGTT CGTCTAGGCGGAGTAGCTCTTCGTCCGGGGAC AGAACAAGGCCTTCGTGCTGAGCAGTGTGGATGAGCTGGAGCAGCAAAGGGACGAGATCGTTAGCTAC CTCTGTGACCTTGCCCCTGAAGCCCCTCCTCC TCTTGTTCCGGAAGCACGACTCGTCACACCTACTCGACCTCGTCGTTTCCCTGCTCTAGCAATCGATG GAGACACTGGAACGGGGACTTCGGGGAGGAGG TACTCTGCCCCCCGACATGGCACAAGTCACTGTGGGCCCGGGGCTCTTGGGGGTTTCGACCCTGGGGC CCAAGAGGAACTCCATGGTTCTGGATGTGGCG ATGAGACGGGGGGCTGTACCGTGTTCAGTGACACCCGGGCCCCGAGAACCCCCAAAGCTGGGACCCCG GGTTCTCCTTGAGGTACCAAGACCTACACCGC TTCGTCCTGGAAGGATCGGACAAAATTGGTGAAGCCGACTTCAACAGGAGCAAGGAGTTCATGGAGGA GGTGATTCAGCGGATGGATGTGGGCCAGGACA AAGCAGGACCTTCCTAGCCTGTTTTAACCACTTCGGCTGAAGTTGTCCTCGTTCCTCAAGTACCTCCT CCACTAAGTCGCCTACCTACACCCGGTCCTGT GCATCCACGTCACGGTGCTGCAGTACTCCTACATGGTGACCGTGGAGTACCCCTTCAGCGAGGCACAG TCCAAAGGGGACATCCTGCAGCGGGTGCGAGA CGTAGGTGCAGTGCCACGACGTCATGAGGATGTACCACTGGCACCTCATGGGGAAGTCGCTCCGTGTC AGGTTTCCCCTGTAGGACGTCGCCCACGCTCT GATCCGCTACCAGGGCGGCAACAGGACCAACACTGGGCTGGCCCTGCGGTACCTCTCTGACCACAGCT TCTTGGTCAGCCAGGGTGACCGGGAGCAGGCG CTAGGCGATGGTCCCGCCGTTGTCCTGGTTGTGACCCGACCGGGACGCCATGGAGAGACTGGTGTCGA AGAACCAGTCGGTCCCACTGGCCCTCGTCCGC CCCAACCTGGTCTACATGGTCACCGGAAATCCTGCCTCTGATGAGATCAAGAGGCTGCCTGGAGACAT CCAGGTGGTGCCCATTGGAGTGGGCCCTAATG GGGTTGGACCAGATGTACCAGTGGCCTTTAGGACGGAGACTACTCTAGTTCTCCGACGGACCTCTGTA GGTCCACCACGGGTAACCTCACCCGGGATTAC CCAACGTGCAGGAGCTGGAGAGGATTGGCTGGCCCAATGCCCCTATCCTCATCCAGGACTTTGAGACG CTCCCCCGAGAGGCTCCTGACCTGGTGCTGCA GGTTGCACGTCCTCGACCTCTCCTAACCGACCGGGTTACGGGGATAGGAGTAGGTCCTGAAACTCTGC GAGGGGGCTCTCCGAGGACTGGACCACGACGT GAGGTGCTGCTCCGGAGAGGGGCTGCAGATCCCCACCCTCTCCCCTGCACCTGACTGCAGCCAGCCCC TGGACGTGATCCTTCTCCTGGATGGCTCCTCC CTCCACGACGAGGCCTCTCCCCGACGTCTAGGGGTGGGAGAGGGGACGTGGACTGACGTCGGTCGGGG ACCTGCACTAGGAAGAGGACCTACCGAGGAGG AGTTTCCCAGCTTCTTATTTTGATGAAATGAAGAGTTTCGCCAAGGCTTTCATTTCAAAAGCCAATAT AGGGCCTCGTCTCACTCAGGTGTCAGTGCTGC TCAAAGGGTCGAAGAATAAAACTACTTTACTTCTCAAAGCGGTTCCGAAAGTAAAGTTTTCGGTTATA TCCCGGAGCAGAGTGAGTCCACAGTCACGACG AGTATGGAAGCATCACCACCATTGACGTGCCATGGAACGTGGTCCCGGAGAAAGCCCATTTGCTGAGC CTTGTGGACGTCATGCAGCGGGAGGGAGGCCC TCATACCTTCGTAGTGGTGGTAACTGCACGGTACCTTGCACCAGGGCCTCTTTCGGGTAAACGACTCG GAACACCTGCAGTACGTCGCCCTCCCTCCGGG CAGCCAAATCGGGGATGCCTTGGGCTTTGCTGTGCGATACTTGACTTCAGAAATGCATGGTGCCAGGC CGGGAGCCTCAAAGGCGGTGGTCATCCTGGTC GTCGGTTTAGCCCCTACGGAACCCGAAACGACACGCTATGAACTGAAGTCTTTACGTACCACGGTCCG GCCCTCGGAGTTTCCGCCACCAGTAGGACCAG ACGGACGTCTCTGTGGATTCAGTGGATGCAGCAGCTGATGCCGCCAGGTCCAACAGAGTGACAGTGTT CCCTATTGGAATTGGAGATCGCTACGATGCAG TGCCTGCAGAGACACCTAAGTCACCTACGTCGTCGACTACGGCGGTCCAGGTTGTCTCACTGTCACAA GGGATAACCTTAACCTCTAGCGATGCTACGTC CCCAGCTACGGATCTTGGCAGGCCCAGCAGGCGACTCCAACGTGGTGAAGCTCCAGCGAATCGAAGAC CTCCCTACCATGGTCACCTTGGGCAATTCCTT GGGTCGATGCCTAGAACCGTCCGGGTCGTCCGCTGAGGTTGCACCACTTCGAGGTCGCTTAGCTTCTG GAGGGATGGTACCAGTGGAACCCGTTAAGGAA CCTCCACAAACTGTGCTCTGGATTTGTTAGGATTTGCATGGATGAGGATGGGAATGAGAAGAGGCCCG GGGACGTCTGGACCTTGCCAGACCAGTGCCAC GGAGGTGTTTGACACGAGACCTAAACAATCCTAAACGTACCTACTCCTACCCTTACTCTTCTCCGGGC CCCTGCAGACCTGGAACGGTCTGGTCACGGTG ACCGTGACTTGCCAGCCAGATGGCCAGACCTTGCTGAAGAGTCATCGGGTCAACTGTGACCGGGGGCT GAGGCCTTCGTGCCCTAACAGCCAGTCCCCTG TGGCACTGAACGGTCGGTCTACCGGTCTGGAACGACTTCTCAGTAGCCCAGTTGACACTGGCCCCCGA CTCCGGAAGCACGGGATTGTCGGTCAGGGGAC TTAAAGTGGAAGAGACCTGTGGCTGCCGCTGGACCTGCCCCTGYGTGTGCACAGGCAGCTCCACTCGG CACATCGTGACCTTTGATGGGCAGAATTTCAA AATTTCACCTTCTCTGGACACCGACGGCGACCTGGACGGGGACRCACACGTGTCCGTCGAGGTGAGCC GTGTAGCACTGGAAACTACCCGTCTTAAAGTT GCTGACTGGCAGCTGTTCTTATGTCCTATTTCAAAACAAGGAGCAGGACCTGGAGGTGATTCTCCATA ATGGTGCCTGCAGCCCTGGAGCAAGGCAGGGC CGACTGACCGTCGACAAGAATACAGGATAAAGTTTTGTTCCTCGTCCTGGACCTCCACTAAGAGGTAT TACCACGGACGTCGGGACCTCGTTCCGTCCCG TGCATGAAATCCATCGAGGTGAAGCACAGTGCCCTCTCCGTCGAGSTGCACAGTGACATGGAGGTGAC GGTGAATGGGAGACTGGTCTCTGTTCCTTACG ACGTACTTTAGGTAGCTCCACTTCGTGTCACGGGAGAGGCAGCTCSACGTGTCACTGTACCTCCACTG CCACTTACCCTCTGACCAGAGACAAGGAATGC TGGGTGGGAACATGGAAGTCAACGTTTATGGTGCCATCATGCATGAGGTCAGATTCAATCACCTTGGT CACATCTT CACATT CACT CCACAAAACAAT GA ACCCACCCTTGTACCTTCAGTTGCAAATACCACGGTAGTACGTACTCCAGTCTAAGTTAGTGGAACCA GTGTAGAAGTGTAAGTGAGGTGTTTTGTTACT GTTCCAACTGCAGCTCAGCCCCAAGACTTTTGCTTCAAAGACGTATGGTCTGTGTGGGATCTGTGATG AGAACGGAGCCAATGACTTCATGCTGAGGGAT CAAGGTTGACGTCGAGTCGGGGTTCTGAAAACGAAGTTTCTGCATACCAGACACACCCTAGACACTAC TCTTGCCTCGGTTACTGAAGTACGACTCCCTA GGCACAGTCACCACAGACTGGAAAACACTTGTTCAGGAATGGACTGTGCAGCGGCCAGGGCAGACGTG CCAGCCCATCCTGGAGGAGCAGTGTCTTGTCC CCGTGTCAGTGGTGTCTGACCTTTTGTGAACAAGTCCTTACCTGACACGTCGCCGGTCCCGTCTGCAC GGTCGGGTAGGACCTCCTCGTCACAGAACAGG CCGACAGCTCCCACTGCCAGGTCCTCCTCTTACCACTGTTTGCTGAATGCCACAAGGTCCTGGCTCCA G С CACAT T CTAT G С CAT С T G С CAG CAG GACAG GGCTGTCGAGGGTGACGGTCCAGGAGGAGAATGGTGACAAACGACTTACGGTGTTCCAGGACCGAGGT CGGTGTAAGATACGGTAGACGGTCGTCCTGTC TTGCCACCAGGAGCAAGTGTGTGAGGTGATCGCCTCTTATGCCCACCTCTGTCGGACCAACGGGGTCT GCGTTGACTGGAGGACACCTGATTTCTGTGCT AACGGTGGTCCTCGTTCACACACTCCACTAGCGGAGAATACGGGTGGAGACAGCCTGGTTGCCCCAGA CGCAACTGACCTCCTGTGGACTAAAGACACGA ATGTCATGCCCACCATCTCTGGTCTACAACCACTGTGAGCATGGCTGTCCCCGGCACTGTGATGGCAA CGTGAGCTCCTGTGGGGACCATCCCTCCGAAG TACAGTACGGGTGGTAGAGACCAGATGTTGGTGACACTCGTACCGACAGGGGCCGTGACACTACCGTT GCACTCGAGGACACCCCTGGTAGGGAGGCTTC GCTGTTTCTGCCCTCCAGATAAAGTCATGTTGGAAGGCAGCTGTGTCCCTGAAGAGGCCTGCACTCAG TGCATTGGTGAGGATGGAGTCCAGCACCAGTT CGACAAAGACGGGAGGTCTATTTCAGTACAACCTTCCGTCGACACAGGGACTTCTCCGGACGTGAGTC ACGTAACCACTCCTACCTCAGGTCGTGGTCAA CCTGGAAGCCTGGGTCCCGGACCACCAGCCCTGTCAGATCTGCACATGCCTCAGCGGGCGGAAGGTCA ACTGCACAACGCAGCCCTGCCCCACGGCCAAA GGACCTTCGGACCCAGGGCCTGGTGGTCGGGACAGTCTAGACGTGTACGGAGTCGCCCGCCTTCCAGT TGACGTGTTGCGTCGGGACGGGGTGCCGGTTT GCTCCCACGTGTGGCCTGTGTGAAGTAGCCCGCCTCCGCCAGAATGCAGACCAGTGCTGCCCCGAGTA TGAGTGTGTGTGTGACCCAGTGAGCTGTGACC CGAGGGTGCACACCGGACACACTTCATCGGGCGGAGGCGGTCTTACGTCTGGTCACGACGGGGCTCAT ACTCACACACACACTGGGTCACTCGACACTGG TGCCCCCAGTGCCTCACTGTGAACGTGGCCTCCAGCCCACACTGACCAACCCTGGCGAGTGCAGACCC AACTTCACCTGCGCCTGCAGGAAGGAGGAGTG ACGGGGGTCACGGAGTGACACTTGCACCGGAGGTCGGGTGTGACTGGTTGGGACCGCTCACGTCTGGG TTGAAGTGGACGCGGACGTCCTTCCTCCTCAC CAAAAGAGTGTCCCCACCCTCCTGCCCCCCGCACCGTTTGCCCACCCTTCGGAAGACCCAGTGCTGTG AT GAGTAT GAGT GT GC CT GCAACT GT GT CAAC GTTTTCTCACAGGGGTGGGAGGACGGGGGGCGTGGCAAACGGGTGGGAAGCCTTCTGGGTCACGACAC TACTCATACTCACACGGACGTTGACACAGTTG TCCACAGTGAGCTGTCCCCTTGGGTACTTGGCCTCAACCGCCACCAATGACTGTGGCTGTACCACAAC CACCTGCCTTCCCGACAAGGTGTGTGTCCACC AGGTGTCACTCGACAGGGGAACCCATGAACCGGAGTTGGCGGTGGTTACTGACACCGACATGGTGTTG GTGGACGGAAGGGCTGTTCCACACACAGGTGG GAAGCACCATCTACCCTGTGGGCCAGTTCTGGGAGGAGGGCTGCGATGTGTGCACCTGCACCGACATG GAGGATGCCGTGATGGGCCTCCGCGTGGCCCA CTTCGTGGTAGATGGGACACCCGGTCAAGACCCTCCTCCCGACGCTACACACGTGGACGTGGCTGTAC CTCCTACGGCACTACCCGGAGGCGCACCGGGT GTGCTCCCAGAAGCCCTGTGAGGACAGCTGTCGGTCGGGCTTCACTTACGTTCTGCATGAAGGCGAGT GCTGTGGAAGGTGCCTGCCATCTGCCTGTGAG CACGAGGGTCTTCGGGACACTCCTGTCGACAGCCAGCCCGAAGTGAATGCAAGACGTACTTCCGCTCA CGACACCTTCCACGGACGGTAGACGGACACTC GTGGTGACTGGCTCACCGCGGGGGGACTCCCAGTCTTCCTGGAAGAGTGTCGGCTCCCAGTGGGCCTC CCCGGAGAACCCCTGCCTCATCAATGAGTGTG CACCACTGACCGAGTGGCGCCCCCCTGAGGGTCAGAAGGACCTTCTCACAGCCGAGGGTCACCCGGAG GGGCCTCTTGGGGACGGAGTAGTTACTCACAC TCCGAGTGAAGGAGGAGGTCTTTATACAACAAAGGAACGTCTCCTGCCCCCAGCTGGAGGTCCCTGTC TGCCCCTCGGGCTTTCAGCTGAGCTGTAAGAC AGGCTCACTTCCTCCTCCAGAAATATGTTGTTTCCTTGCAGAGGACGGGGGTCGACCTCCAGGGACAG ACGGGGAGCCCGAAAGTCGACTCGACATTCTG CTCAGCGTGCTGCCCAAGCTGTCGCTGTGAGCGCATGGAGGCCTGCATGCTCAATGGCACTGTCATTG GGCCCGGGAAGACTGTGATGATCGATGTGTGC GAGTCGCACGACGGGTTCGACAGCGACACTCGCGTACCTCCGGACGTACGAGTTACCGTGACAGTAAC CCGGGCCCTTCTGACACTACTAGCTACACACG ACGACCTGCCGCTGCATGGTGCAGGTGGGGGTCATCTCTGGATTCAAGCTGGAGTGCAGGAAGACCAC CTGCAACCCCTGCCCCCTGGGTTACAAGGAAG TGCTGGACGGCGACGTACCACGTCCACCCCCAGTAGAGACCTAAGTTCGACCTCACGTCCTTCTGGTG GACGTTGGGGACGGGGGACCCAATGTTCCTTC AAAATAACACAGGTGAATGTTGTGGGAGATGTTTGCCTACGGCTTGCACCATTCAGCTAAGAGGAGGA CAGAT CAT GACACT GAAG CGT GAT GAGACG CT TTTTATTGTGTCCACTTACAACACCCTCTACAAACGGATGCCGAACGTGGTAAGTCGATTCTCCTCCT GTCTAGTACTGTGACTTCGCACTACTCTGCGA CCAGGATGGCTGTGATACTCACTTCTGCAAGGTCAATGAGAGAGGAGAGTACTTCTGGGAGAAGAGGG TCACAGGCTGCCCACCCTTTGATGAACACAAG GGTCCTACCGACACTATGAGTGAAGACGTTCCAGTTACTCTCTCCTCTCATGAAGACCCTCTTCTCCC AGTGTCCGACGGGTGGGAAACTACTTGTGTTC TGTCTTGCTGAGGGAGGTAAAATTATGAAAATTCCAGGCACCTGCTGTGACACATGTGAGGAGCCTGA GTGCAACGACATCACTGCCAGGCTGCAGTATG ACAGAACGACTCCCTCCATTTTAATACTTTTAAGGTCCGTGGACGACACTGTGTACACTCCTCGGACT CACGTTGCTGTAGTGACGGTCCGACGTCATAC TCAAGGTGGGAAGCTGTAAGTCTGAAGTAGAGGTGGATATCCACTACTGCCAGGGCAAATGTGCCAGC AAAGCCATGTACTCCATTGACATCAACGATGT AGTTCCACCCTTCGACATTCAGACTTCATCTCCACCTATAGGTGATGACGGTCCCGTTTACACGGTCG TTTCGGTACATGAGGTAACTGTAGTTGCTACA GCAGGACCAGTGCTCCTGCTGCTCTCCGACACGGACGGAGCCCATGCAGGTGGCCCTGCACTGCACCA ATGGCTCTGTTGTGTACCATGAGGTTCTCAAT CGTCCTGGTCACGAGGACGACGAGAGGCTGTGCCTGCCTCGGGTACGTCCACCGGGACGTGACGTGGT TACCGAGACAACACATGGTACTCCAAGAGTTA GCCATGGAGTGCAAATGCTCCCCCAGGAAGTGCAGCAAGTGA [0152] Настоящее изобретение относится к фрагменту фактора Виллебранда (ФВ), содержащему домен D' и домен D3 ФВ, отличающемуся тем, что фрагмент ФВ препятствует связыванию эндогенного ФВ (полноразмерного ФВ) с белком ФУШ. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ связывается или соединяется с белком ФУШ. Путем связывания или соединения с белком ФУШ фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, защищает ФУШ от расщепления протеазой и активации ФУШ, стабилизирует тяжелую цепь и легкую цепь ФУШ и предотвращает выведение ФУШ фагоцитарными рецепторами. В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ связывается или соединяется с белком ФУШ и блокирует или предотвращает связывание белка ФУШ с фосфолипидом и активированным протеином С. Путем предотвращения или подавления связывания белка ФУШ с эндогенным полноразмерным ФВ фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения снижает выведение ФУШ клиренс-рецепторами ФВ и, таким образом, продлевает время полужизни ФУШ. Продление времени полужизни белка ФУШ происходит, следовательно, благодаря связыванию или соединению фрагмента ФВ, в котором отсутствует участок связывания с клиренс-рецептором ФВ, с белком ФУШ и экранированию или защите фрагментом ФВ белка ФУШ от эндогенного ФВ, который содержит участок связывания с клиренс-рецептором ФВ. Наличие белка ФУШ, связанного или защищенного фрагментом ФВ, также дает возможность рециклинга белка ФУШ. Следовательно, фрагмент ФВ не может являться полноразмерным зрелым ФВ. Из-за удаления участков связывания клиренс-рецепторов ФВ, содержащихся в полноразмерной молекуле ФВ, гетеродимеры ФУШ/ФВ, являющиеся объектами данного изобретения, выключаются из процесса выведения ФВ, что позволяет дополнительно продлить время полужизни ФУШ. [0153] Фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3, может дополнительно содержать домен ФВ, выбранный из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена A3, домена D1, домена D2, домена D4, домена В1, домена В2, домена ВЗ, домена С1, домена С2, домена СК, одного или более их фрагментов или любых их комбинаций. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ содержит, К заявке, выделенной из заявки № 201491186 состоит преимущественно из или состоит из: (1) принадлежащих ФВ доменов D' и D3 или их фрагментов; (2) принадлежащих ФВ доменов Dl, D' и D3 или их фрагментов; (3) принадлежащих ФВ доменов D2, D' и D3 или их фрагментов; (4) принадлежащих ФВ доменов Dl, D2, D' и D3 или их фрагментов; или (5) принадлежащих ФВ доменов Dl, D2, D', D3 и А1 или их фрагментов. Описанный в данном тексте фрагмент ФВ не содержит участок, связывающийся с клиренс- рецептором ФВ. В другом варианте реализации изобретения описанный в данном тексте фрагмент ФВ не является аминокислотами от 764 до 1274 из SEQ ID N0: 2. Фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, может содержать любые другие последовательности, связанные или сшитые с фрагментом ФВ, но не являться полноразмерным ФВ. Например, описанный в данном тексте фрагмент ФВ может дополнительно содержать сигнальный пептид. [0154] В одном варианте реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, содержит домен D' и домен D3 ФВ, при этом домен D' является по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичным аминокислотам от 764 до 866 из SEQ ГО NO: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с белком ФУШ, защищает, подавляет или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком ФУШ. В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ содержит домен D' и домен D3 ФВ, при этом домен D3 является по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичным аминокислотам от 867 до 1240 из SEQ ГО NO: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с белком ФУШ, или подавляет, или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком ФУШ. В некоторых вариантах реализации изобретения описанный в данном тексте фрагмент ФВ содержит, состоит преимущественно из или состоит из домена D' и домена D3 ФВ, которые являются по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичным аминокислотам от 764 до 1240 из SEQ ГО NO: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с белком ФУШ, или подавляет, или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком ФУШ. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ содержит, состоит преимущественно из или состоит из доменов Dl, D2, D', D3 и является по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичным аминокислотам от 23 до 1240 из SEQ ГО NO: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с белком ФУШ, или подавляет, или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком ФУШ. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ дополнительно содержит функционально связанный с ним сигнальный пептид. [0155] В некоторых вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, состоит преимущественно из или состоит из (1) домена D'D3, домена D1D'D3, домена D2D'D3 или домена D1D2D'D3 и (2) дополнительной последовательности ФВ, содержащей до около 10 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из SEQ ID N0: 2 до аминокислот от 764 до 1250 из SEQ ГО NO: 2), до около 15 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из SEQ ГО NO: 2 до аминокислот от 764 до 1255 из SEQ ГО NO: 2), до около 20 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из SEQ ГО NO: 2 до аминокислот от 764 до 1260 из SEQ ГО NO: 2), до около 25 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из SEQ ГО NO: 2 до аминокислот от 764 до 1265 из SEQ ГО NO: 2) или до около 30 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из SEQ ГО NO: 2 до аминокислот от 764 до 1260 из SEQ ГО NO: 2). В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, содержащий или состоящий преимущественно из домена D' и домена D3 не представляет собой как аминокислоты от 764 до 1274 из SEQ ГО NO: 2, так и полноразмерный зрелый ФВ. [0156] В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ, содержащий домены D'D3, связанные с доменами D1D2, дополнительно содержит внутриклеточный сайт расщепления (например, сайт расщепления РАСЕ или РС5), что делает возможным отщепление доменов D1D2 от доменов D'D3 после экспрессии. Неограничивающие примеры внутриклеточных сайтов расщепления раскрыты в другом месте данного текста. [0157] В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ содержит домен D' и домен D3, но не содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (1) аминокислот от 1241 до 2813 из SEQ ГО NO: 2, (2) аминокислот от 1270 до аминокислот 2813 из SEQ ГО NO: 2, (3) аминокислот от 1271 до аминокислот 2813 из SEQ ГО NO: 2, (4) аминокислот от 1272 до аминокислот 2813 из SEQ ГО NO: 2, (5) аминокислот от 1273 до аминокислот 2813 из SEQ ГО NO: 2 и (6) аминокислот от 1274 до аминокислот 2813 из SEQ ГО NO: 2. [0158] В других вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей домену D', домену D3 и домену Al, при этом аминокислотная последовательность является по меньшей мере на 60%, 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотам от 764 до 1479 из SEQ Ш NO: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с ФУШ. В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ не представляет собой аминокислоты от 764 до 1274 из SEQ Ш NO: 2. [0159] В некоторых вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, содержит домен D' и домен D3, но не содержит по меньшей мере один домен ФВ, выбранный из группы, состоящей из (1) домена А1, (2) домена А2, (3) домена A3, (4) домена D4, (5) домена В1, (6) домена В2, (7) домена ВЗ, (8) домена С1, (9) домена С2, (10) домена СК, (11) домена СК и домена С2, (12) домена СК, домена С2 и домена С1, (13) домена СК, домена С2, домена С1, домена ВЗ, (14) домена СК, домена С2, домена С1, домена ВЗ, домена В2, (15) домена СК, домена С2, домена С1, домена ВЗ, домена В2 и домена В1, (16) домена СК, домена С2, домена С1, домена ВЗ, домена В2, домена В1 и домена D4 domain, (17) домена СК, домена С2, домена С1, домена ВЗ, домена В2, домена В1, домена D4 и домена A3, (18) домена СК, домена С2, домена С1, домена ВЗ, домена В2, домена В1, домена D4, домена A3 и домена А2, (19) домена СК, домена С2, домена С1, домена ВЗ, домена В2, домена В1, домена D4, домена A3, домена А2 и домена Al domain, и (20) любых комбинаций этих доменов. [0160] В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ содержит домены D'D3 и один или более доменов или модулей. Примеры таких доменов и модулей включают, но не ограничиваются этим, домены и модули, описанные в работе Zhour et al., Blood, опубликованной онлайн 6 апреля 2012 г.: DOI 10.1182/blood-2012-01-405134. Например, фрагмент ФВ может содержать домен D'D3 и один или более доменов или модулей, выбранных из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена A3, модуля D4N, модуля VWD4, модуля С8-4, модуля TIL-4, модуля С1, модуля С2, модуля СЗ, модуля С4, модуля С5, модуля С5, модуля С6 и любых комбинаций этих элементов. [0161] В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ связан с гетерологичным компонентом, при этом гетерологичный компонент связан с N-концом или С-концом фрагмента ФВ либо вставлен между двумя аминокислотами во фрагменте ФВ. Например, инсерционным участком для гетерологичного компонента во фрагменте ФВ может являться домен D', домен D3 либо они оба. Гетерологичный компонент может являться компонентом, продлевающим время полужизни. [0162] В определенных вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, образует мультимер, например, димер, тример, тетрамер, пентамер, гексамер, гептамер либо мультимеры высших порядков. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ является мономером, содержащим только один фрагмент ФВ. В некоторых вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, может одердать одну или более аминокислотных замен, делеций, присоединений или модификаций. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ может содержать аминокислотные замены, делеций, присоединения или модификации, которые приводят к тому, что фрагмент ФВ становится неспособным к образованию дисульфидной связи или образованию димера или мультимера. В другом варианте реализации изобретения аминокислотная замена находится в пределах домена D' и домена D3. В конкретном варианте реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену на месте остатка, соттветствующего остатку 1099, остатку 1142 или обоим остаткам 1099 и 1142 из SEQ Ш N0: 2. По меньшей мере одна аминокислотная замена может представлять собой любые аминокислоты, которые в естественном состоянии не встречаются в ФВ дикого типа. Например, аминокислотная замена может представлять собой любые аминокислоты, кроме цистеина, например, изолейцин, аланин, лейцин, аспарагин, лизин, аспарагиновую кислоту, метионин, фенилаланин, глутаминовую кислоту, треонин, глутамин, триптофан, глицин, валин, пролин, серии, тирозин, аргинин или гистидин. В другом примере аминокислотная замена содержит одну или более аминокислот, которые предотвращают или подавляют образование мультимеров фрагментами ФВ. [0163] В определенных вариантах реализации фрагмент ФВ, применяемый в данном изобретении, может быть дополнительно модифицирован с целью улучшения его взаимодействия с ФУШ, например, улучшения аффинности связывания с ФУШ. В качестве неограничивающего примера можно привести фрагмент ФВ, который содержит остаток серина на месте остатка, соответствующего аминокислоте 764 из SEQ Ш NO: 2, и остаток лизина на месте остатка, соответствующего аминокислоте 773 из SEQ ID NO: 2. Остатки 764 и/или 773 могут влиять на аффинность связывания фрагментов ФВ с ФУШ. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ может содержать другие модификации, например, фрагмент может пэгилированным, гликозилированным, гэкилированным или полисиалилированным. Б) Гетерологичные компоненты [0164] Гетерологичный компонент может являться гетерологичным полипептидным или неполипептидным компонентом. В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент является продлевающей время полужизни молекулой, которая известна в данной области техники, и содержит полипептидн, неполипептидный компонент либо комбинацию обоих этих компонентов. Гетерологичный полипептидный компонент может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, трансферрин или его фрагмент, последовательность PAS, последовательность НАР, их производные либо варианты или любые комбинации этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения неполипептидный связывающий компонент содержит полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), производное или любые комбинации этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения может быть один, два, три или более гетерологичных компонентов, которые могут являться одинаковыми либо разными молекулами. 1) Константная область иммуноглобулина или ее часть [0165] Константная область иммуноглобулина состоит из доменов, называемых СН (константными тяжелыми - от англ. "constant heavy") доменами (CHI, СН2 и т.д.). В зависимости от изотипа {т.е., IgG, IgM, IgA IgD или IgE) константная область может состоять из трех или четырех СН доменов. Некоторые изотипы {например, IgG) константных областей также содержат шарнирный участок. Смотрите Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y. [0166] Константную область иммуноглобулина или ее часть для получения химерного белка, являющегося объектом настоящего изобретения, можно получить из большого числа различных источников. В предпочтительных вариантах реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть получена из человеческого иммуноглобулина. При этом понятно, что константная область иммуноглобулина или ее часть может быть получена из иммуноглобулина других видов млекопитающих, включая, к примеру, виды грызунов (например, мышь, крысу, кролика, морскую свинку) или приматов за исключением человека (например, шимпанзе, макаку). Более того, константная область иммуноглобулина или ее часть может быть получена из иммуноглобулина любого класса, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и иммуноглобулина любого изотипа, включая IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4. В одном варианте реализации изобретения применяется человеческий изотип IgGl. [0167] Большое количество генетических последовательностей константной области иммуноглобулина (например, человеческих генетических последовательностей константной области) доступны в виде открытых баз данных. Можно выбрать последовательность доменов константной области, имеющую определенную эффекторную функцию (или с отсутствием определенной эффекторной функции), или с определенной модификацией для снижения иммуногенности. Было опубликовано большое количество данных последовательностей антител и кодирующих антитела генов, и подходящие последовательности константной области Ig (например, шарнирная, СН2 и/или СНЗ последовательности или их части) можно получить из этих последовательностей, используя общепринятые в данной области техники методы. Генетический материал, полученный любым из вышеописанных способов, может затем быть изменен либо синтезирован для того, чтобы получить полипептиды, являющиеся объектами настоящего изобретения. Следует также принять во внимание, что в объем данного изобретения включены аллели, варианты и мутации ДНК последовательностей константной области. [0168] Последовательности константной области иммуноглобулина или ее части можно клонировать, например, при помощи полимеразной цепной реакции и праймеров, которые выбраны таким образом, чтобы амплифицировать представляющий интерес домен. Для того, чтобы клонировать константную область иммуноглобулина или ее часть из антитела, можно выделить иРНК из клеток гибридомы, селезенки или лимфоцитов, обратно транскрибировать в ДНК, а гены антитела амплифицировать ПЦР Методы ПЦР-амплификации детально описаны в патентах US № 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; и в, например, "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270). ПЦР может инициироваться консенсусными праймерами константной области или более специфичными праймерами на основе опубликованных данных по ДНК- и аминокислотным последовательностям тяжелой и легкой цепи. Как обсуждалось выше, ПЦР также можно применять для выделения клонов ДНК, кодирующих легкую и тяжелую цепи антитела. В этом случае скрининг библиотек может проводиться по консенсусному праймеру или более крупным гомологичным зондам, таким как зонды мышиной константной области. В данной области техники известны многочисленные группы праймеров, подходящих для амплификации генов антител (например, 5'-концевые праймеры на основе N-концевой последовательности очищенных антител (Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); быстрая амплификация концов кДНК (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); лидерные последовательности антител (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). Клонирование последовательностей антител дополнительно описано в Newman et al., патент US № 5,658,570, зарегистрированного 25 января 1995 г., который включен в данный текст посредством ссылки. [0169] Применяемая в данном изобретении константная область иммуноглобулина может содержать все домены и шарнирный участок либо их части. В одном варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит домен СН2, домен СНЗ и шарнирный участок, например, Fc-область или FcRn партнера по связыванию. [0170] Употребляемый в данном тексте термин "Fc-область" определяется как часть полипептида, которая соответствует Fc-области нативного иммуноглобулина, т.е., как так, что образована путем димерной ассоциации соответствующих Fc-доменов своих двух тяжелых цепей. Нативная Fc-область образует гомодимер с другой Fc-областью. В противоположность этому, употребляемый в данном тексте термин "генетически-слитая Fc-область" или "одноцепочечная Fc-область" (оцРс-область) относится к синтетической димерной Fc-области, состоящей из Fc-доменов, генетически связанных в пределах одной полипептидной цепи (т.е., кодируемых одиночной непрерывной генетической последовательностью). [0171] В одном варианте реализации изобретения термин "Fc-область" относится к части одиночной тяжелой цепи иммуноглобулина, начиная с шарнирного участка выше сайта расщепления папаином (т.е., остатка 216 в IgG, принимая, что первый остаток тяжелой цепи константной области имеет номер 114) и заканчивая С-концом антитела.Соотвественно, полная Fc-область содержит по меньшей мере шарнирный участок, домен СН2 и домен СНЗ. [0172] Fc-область константной области иммуноглобулина в зависимости от изотипа иммуноглобулина может содержать домены СН2, СНЗ и СН4, а также шарнирный участок. Химерные белки, содержащие Fc-область иммуноглобулина, приобретают некоторое количество необходимых свойст химерного белка, включая повышенную стабильность, повышенное сывороточное время полужизни (смотрите Capon et al, 1989, Nature 337:525), а также связывание с Fc-рецепторами, такими как неонатальный Fc-рецептор (FcRn) (патенты US № 6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1), которые в полном объеме включены в данный текст посредством ссылки. [0173] Константная область иммуноглобулина или ее часть может являться партнером по связыванию FcRn. FcRn активен во взрослых эпителиальных тканях и экспрессируется в полости кишечника, в легочных дыхательных путях, на носовых поверхностях, на вагинальных поверхностях, поверхностях толстой и прямой кишок (патент US № 6,485,726). Партнер по связыванию FcRn представляет собой часть иммуноглобулина, которая связывается с FcRn. [0174] FcRn-рецептор выделяли из нескольких видов млекопитающих, включая человека. Известны последовательности человеческого FcRn, обезьяннего FcRn, крысиного FcRn и мышиного FcRn (Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). FcRn-рецептор связывает IgG (но не связывает другие классы иммуноглобулина, такие как IgA, IgM, IgD и IgE) при относительно низком уровне рН, активно транспортирует IgG трансцеллюлярно в направлении от люминального к серозному, а затем высвобождает IgG при относительно более высоком уровне рН, характерном для интерстициальных жидкостей. Он экспрессируется во взрослой эпителиальной ткани (патенты US № 6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536А1), включая легочный и кишечный эпителий (Israel et al. 1997, Immunology 92:69), почечный проксимальный тубулярный эпителий (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), а также эпителий носовой полости, вагинальные поверхности и поверхности желчных протоков. [0175] Партнеры по связыванию FcRn, применяемые в настоящем изобретении, включают молекулы, которые могут специфически связываться с FcRn-рецептором, всключая целый IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты, которые содержат полный связывающий участок FcRn-рецептора. Участок той части Fc-области IgG, которая связывается с FcRn-рецептором, был описан на основе рентгеноструктурной кристаллографии (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Основная контактная область Fc с FcRn находится в районе соединения доменов СН2 и СНЗ. Все контакты Fc-FcRn находятся в пределах одиночной тяжелой цепи Ig. Партнеры по связыванию FcRn включают целый IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты IgG, которые содержат полный связывающий участок FcRn. Основные контактные участки включают аминокислотные остатки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена СН2 и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 домена СНЗ. Все ссылки, приведенные на нумерацию иммуноглобулинов или фрагментов либо цчастков иммуноглобулина, основаны на Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md. [0176] Fc-области или партнеры по связыванию FcRn, связанные с FcRn, могут эффективно переноситься через эпителиальные барьеры посредством FcRn, что, таким образом, обеспечивает неинвазионные средства для систематического введения необходимой терапевтической молекулы. Вдобавок, слитые белки, содержащие Fc-области или партнеров по связыванию FcRn, эндоцитозируются клетками, экспрессирующими FcRn. Но, вместо того, чтобы помечаться для дальнейшей деградации, эти слитые белки снова возвращаются в циркуляцию, что, таким образом, увеличивает in vivo время полужизни этих белком. В определенных вариантах реализации изобретения части константных областей иммуноглобулина являются Fc-областью или партнером по связыванию FcRn, которые обычно объединяются при помощи дисульфидных связей и других неспецифических взаимодействий с другой Fc-областью или другим партнером по связыванию FcRn для того, чтобы образовать димер или мультимеры более высоких порядков. [0177] Два FcRn-рецептора могут связывать одиночную Fc-молекулу. Кристаллографические данные позволяют предположить, что каждая молекула FcRn связывает одиночный полипептид гомодимера Fc. В одном варианте реализации изобретения присоединение партнера по связыванию FcRn, например, Fc-фрагмента IgG, к биологически активной молекуле обеспечивает средства доставки биологически активной молекулы перорально, буккально, подъязычно, ректально, вагинально, в виде назально применяемого аэрозоля или через легочные дыхательные пути, либо через окулярные пути. В другом варианте реализации изобретения химерный белок можно вводить инвазионно, например, подкожно, внутривенно. [0178] Участок партнера по связыванию FcRn является такой молекулой или ее частью, которая может специфически связываться FcRn-рецептором с последующим активным транспортом посредством FcRn-рецептора Fc-области. Специфическое связываниет обозначает образование двумя молекулами комплекса, который является относительно стабильным в физиологических условиях. Специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью и емкостью от низкой до умеренной в отличие от неспецифического связывания, которое обычно обладает низкой аффинностью с емкостью от умеренной до высокой. Как правило, связывание считается специфическим, когда постоянная аффинности КА выше, чем 106 М"1, или выше, чем 108 М"1. В случае необходимости неспецифическое связывание може быть снижено без существенного влияния на специфическое связывание при помощи варьирования условий связывания. Соответствующие условия связывания, такие как концентрация молекул, ионная сила раствора, температура, время, отведенное на связывание, концентрация блокирующего вещества (например, сывороточного альбумина, молочного казеина) и т.д., могут быть оптимизированы специалистов в данной области техники при помощи стандартных методов. [0179] В определенных вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит один или более процессированных Fc-областей, которые, несмотря на это, способны обеспечивать Fc-области связывающие свойства Fc-рецептора (FcR). Например, часть Fc-области, которая связывается с FcRn (т.е., связывающая часть FcRn), содержит аминокислоты, приблизительно соответствующие 282-438 аминокислотам IgGl по европейской нумерации (с первичными контактными участками, соответстсующими аминокислотам 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314, принадлежащим домену СН2, и аминокислотным остаткам 385-387, 428 и 433-436, принадлежащим домену СНЗ). Таким образом, Fc-область, являющаяся объектом данного изобретения, может содержать или состоять из связывающей части FcRn. Связывающие части FcRn могут быть получены из тяжелых цепей любого изотипа, включая IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4. В одном варианте реализации изобретения используется связывающая часть FcRn из антитела человеческого изотипа IgGl. В другом варианте реализации изобретения используется связывающая часть FcRn из антитела человеческого изотипа IgG4. [0180] В другом варианте реализации изобретения "Fc-область" содержит аминокислотную последовательность Fc-домена или полученную из Fc-домена. В определенных вариантах реализации изобретения Fc-область содержит по меньшей мере один элемент из: шарнирного (например, верхнего, среднего и/или нижнего шарнирного участка) домена (приблизительно соответствующего аминокислотам 216-230 Fc-области антитела согласно европейской нумерации), домена СН2 (приблизительно соответствующего аминокислотам 231-340 Fc-области антитела согласно европейской нумерации), домена СНЗ (приблизительно соответствующего аминокислотам 341-438 Fc-области антитела согласно европейской нумерации), домена СН4 либо их варианта, части или фрагмента. В других вариантах реализации изобретения Fc-область содержит полный Fc-домен (т.е., шарнирный домен, домен СН2 и домен СНЗ). В некоторых вариантах реализации изобретения Fc-область содержит, состоит преимущественно из или состоит из шарнирного домена (или его части), сшитого с доменом СНЗ (или его частью), шарнирного домена (или его части), сшитого с доменом СН2 (или его частью), домена СН2 (или его части), сшитого с доменом СНЗ (или его частью), домена СН2 (или его части), сшитого с шарнирным доменом (или его частью) и доменом СНЗ (или его частью). В других вариантах реализации изобретения в Fc-области отсутствует по меньшей мере часть домена СН2 (например, весь домен СН2 или его часть). В конкретном варианте реализации изобретения Fc-область содержит или состоит из аминокислот, соответствующих номерам от 221 до 447 по европейской нумерации. [0181] Fc-области, обозначаемые в данном тексте как F, F1 или F2, могут быть получены из большого количества различных источников. В одном варианте реализации изобретения Fc-область полипептида получена из человеческого иммуноглобулина. При этом понятно, что Fc-область может быть получена из иммуноглобулина других видов млекопитающих, включая, к примеру, виды грызунов {например, мышь, крысу, кролика, морскую свинку) или приматов за исключением человека {например, шимпанзе, макаку). Более того, полипептид Fc-доменов или его части могут быть получены из иммуноглобулина любого класса, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и иммуноглобулина любого изотипа, включая IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4. В другом варианте реализации изобретения используется человеческий изотип IgGl. [0182] В определенных вариантах реализации изобретения Fc-вариант приводит к изменению по меньшей мере в одной эффекторной функции, обеспечиваемой Fc-областью, содержащей указанный Fc-домен дикого типа (например, улучшению или снижению способности Fc-области связываться с Fc-рецепторами (например, FcyRI, FcyRII или FcyRIII) или белками комплемента (например, Clq), либо к триггерной антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ), фагоцитозу или комплементзависимой клеточной цитотоксичности (КЗКЦ)). В других вариантах реализации изобретения Fc-вариант обкспечивает наличие сконструированного остатка цистеина. [0183] Fc-области, являющиеся объектами данного изобретения, могут включать принятые в данной области техники Fc-варианты, которые, как известно, приводят к изменению (например, усилению или снижению) в эффекторной функции и/или связывании FcR или FcRn. В частности, связывающая молекула, являющаяся объектом данного изобретения, может содержать, например, изменение (например, замену) в одной или более аминокислотных позициях, подобное описанным в международных публикациях согласно РСТ WO88/07089A1, W096/14339A1, WO98/05787A1, W098/23289A1, W099/51642A1, W099/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2 и WO06/085967A2; патентных публикациях US № US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; или патентах US 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 7,404,956 и 7,317,091, которые все включены в данный текст посредством ссылки. В одном варианте реализации изобретения может быть внесено конкретное изменение (например, конкретная замена одной или более аминокислот, описанная в данной области техники) в одну или более из описанных аминокислотных позиций. В другом варианте реализации изобретения может быть внесено отличное изменение в одну или более из описанных аминокислотных позиций (например, отличная замена одной или более аминокислот, описанная в данной области техники). [0184] Fc-область или партнер по связыванию FcRn, принадлежащие IgG, могут быть модифицированы в соответствии с общепринятыми процедурами, такими как сайтнаправленный мутагенез и тому подобное, для получения модифицированных фрагментов IgG или Fc или их частей, которые будут связываться FcRn. Такие модификации включают модификации удаленные от контактных участков FcRn, а также модификации. Находящиеся в пределах контактных участков FcRn, которые сохраняют или даже усиливают связывание с FcRn. Например, следующиеодиночныеаминокислотныеостаткив Fc человеческого IgGl (Fc yl) можнозаменитьбеззначительнойпотериаффинностисвязывания Fc к FcRn: Р238А, S239A, К246А, К248А, D249A, М252А, Т256А, Е258А, Т260А, D265A, S267A, Н268А, Е269А, D270A, Е272А, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, Е283А, Н285А, N286A, Т289А, К290А, R292A, Е293А, Е294А, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, Т307А, L309A, Q311A, D312A, N315A, К317А, Е318А, К320А, К322А, S324A, К326А, A327Q, Р329А, A330Q, Р331А, ЕЗЗЗА, К334А, Т335А, S337A, К338А, К340А, Q342A, R344A, Е345А, Q347A, R355A, Е356А, М358А, Т359А, К360А, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, Е380А, Е382А, S383A, N384A, Q386A, Е388А, N389A, N390A, Y391F, К392А, L398A, S400A, D401A, D413A, К414А, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, Е430А, N434A, Т437А, Q438A, К439А, S440A, S444A и К447А, где, например, Р23 8А представляетпролиндикоготипа, замещенныйаланиномвпозицииномер 238. В качестве примера конкретный вариант реализации изобретения включает мутацию N297A, при помощи которой удаляется высококонсервативный участок N-гликозилирования. Вдобавок к аланину другие аминокислоты могут замещать аминокислоты дикого типа в позициях, приведенных выше. Мутации могут одиночно вноситься в Fc, что приводит к получению более чем сотни Fc-областей, отличных от нативной Fc. Вдобавок, комбинации двух, трех или более из этих отдельных мутаций могут вноситься совместно, что приводит к получению сотен дополнительных Fc-областей. Более того, одна или более из Fc-областей конструкции, являющейся объектом данного изобретения, может быть мутированной, в то время как другая Fc-область конструкции не является мутированной, либо они обе могут быть мутированными но содержать различные мутации. [0185] Отдельные из вышеописынных мутаций могут приводить к новым функциональным возможностям Fc-области или партнера по связыванию FcRn. Например, один вариант реализации изобретения включает N297A, при помощи которой удаляется высококонсервативный участок N-гликозилирования. Действие этой мутации состоит в снижении иммуногенности, тем самым повышая время полужизни циркуляции Fc-области, и в приведении Fc-области в состояние, в котором она не способна связываться с FcyRI, FcyRIIA, FcyRUB и FcyRIIIA без потери аффинности к FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Дополнительным примером новых функциональных возможностей, обусловленных вышеописанными мутациями, является возможное в некоторых случаях повышение аффинности к FcRn по сравнению с таковой для дикого типа. Эта повышенная аффинность может отражаться на повышенной скорости ассоциации, сниженной скорости диссоциации либо как повышенной скорости ассоциации, так и сниженной скорости диссоциации. Примеры мутаций, которые, как считается, приводят к повышенной аффинности к FcRn, включают, но не ограничиваются этим, Т256А, Т307А, Е380А и N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591). [0186] Вдобавок, обнаружилось, что по меньшей мере три человеческих Fc гамма рецептора распознают связывающий участок IgG в пределах нижнего шарнирного участка, а именно, аминокислоты 234-237. Следовательно, другой пример новых функциональных возможностей и потенциально сниженной иммуногенности может обуславливаться мутациями в этой области, например, замещением аминокислот 233-236 человеческого IgGl "ELLG" соответствующей последовательностью из IgG2 "PVA" (с одной аминокислотной делецией). Было показано, что FcyRI, FcyRII и FcyRIII, которые опосредуют различные эффекторные функции, не будут связываться с IgGl в случае внесения таких мутаций. Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 и Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613. [0187] В одном варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть, например Fc-область, представляет собой полипептид, содержащий последовательность PKNSSMISNTP (SEQ Ш N0: 3) и в некоторых случаях дополнительно содержащий последовательность, выбранную из HQSLGTQ (SEQ ГО N0: 4), HQNLSDGK (SEQ ГО N0: 5), HQNISDGK (SEQ ГО N0: 6) или VISSHLGQ (SEQ ГО N0: 7) (Патент US № 5,739,277). [0188] В другом варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит аминокислотную последовательность в шарнирном участке или его части, который образует одну или более дисульфидных связей с другой константной областью иммуноглобулина или ее частью. Дисульфидная связь, образованная константной областью иммуноглобулина или ее частью, приводит к размещению вместе первого полипептида, содержащего ФУШ, и второго полипептида, содержащего фрагмент ФВ, таким образом, что эндогенный ФВ не замещает фрагмент ФВ и не связывается с ФУШ. Следовательно, дисульфидная связь между первой константной областью иммуноглобулина или ее частью и второй константной областью иммуноглобулина или ее частью предотвращает взаимодействие между эндогенным ФВ и белком ФУШ. Подавление взаимодействия между ФВ и белком ФУШ дает возможность выйти за пределы двукратного увеличения времени полужизни белка ФУШ. Шарнирный участок или его часть может быть дополнительно связан с одним или более доменами из СН1, СН2, СНЗ, их фрагментами или любыми их комбинациями. В конкретном примере константная область иммуноглобулина или ее часть содержит шарнирный участок и участок СН2 (например, аминокислоты 221-340 Fc-области). [0189] В определенных вариантах реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть является гемигликозилированной. Например, химерный белок, содержащий две Fc-области или двух партнеров по связыванию FcRn, может содержать первую гликозилированную Fc-область (например, гликозилированный участок СН2) или партнера по связыванию FcRn и вторую агликозилированную Fc-область (например, агликозилированный участок СН2) или партнера по связыванию FcRn. В одном варианте реализации изобретения между гликозилированной и агликозилированной областями может быть помещен линкер. В другом варианте реализации изобретения Fc-область или партнер по связыванию FcRn является полностью гликозилированным, т.е., все Fc-области гликозилированы. В других вариантах реализации изобретения Fc-область может быть агликозилированной, т.е., ни один из компонентов Fc не является гликозилированным. [0190] В определенных вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит аминокислотную замену в константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-варианты), которая изменяет антиген-независимые эффекторные функции константной области Ig, в частности, время полужизни циркуляции белка. [0191] Такие белки демонстрируют как повышенное, так и сниженное связывание с FcRn по сравнению с белками, у которых отсутствуют подобные замены, и, следовательно, характеризуются, соответственно, увеличенным или сниженным временем полужизни в сыворотке крови. Предполагается, что Fc-варианты с улучшенной аффинностью к FcRn характеризуются более продолжительным временем полужизни в сыворотке крови, и такие молекулы имеют полезные применения в способах лечения млекопитающих, в которых требуется продолжительное время полужизни применяемого полипептида, например, для лечения хронического заболевания или нарушения (смотрите, например, патенты US 7,348,004, 7,404,956 и 7,862,820). В противоположность этому считается, что Fc-варианты со сниженной аффинностью связывания FcRn характеризуются более короткими временами полужизни, и такие молекулы также применимы, например, для введения млекопитающим в случае, когда более короткое время циркуляции может быть более преимущественным, например, для in vivo диагностической визуализации или в ситуациях, когда исходный полипептид имеет токсические побочные эффекты при нахождении в циркуляции на протяжении продолжительных периодов. Также Fc-варианты со сниженной аффинностью связывания FcRn имеют меньшую вероятность прохождения через плаценту и, следовательно, применимы также для лечения заболеваний или нарушений у беременных женщин. Вдобавок, другие применения, в которых может требоваться сниженная аффинность связывания FcRn, включают такие применения, в которых требуется локализация мозга, почки и/или печени. В одном иллюстративном варианте реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, демонстрирует сниженный транспорт из сосудистой системы через эпителий почечных клубочков. В другом варианте реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, демонстрирует сниженный транспорт через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) из мозга в сосудистое пространство. В одном варианте реализации изобретения белок с измененным связыванием FcRn содержит по меньшей мере одну Fc-область или одного партнера по связыванию FcRn (например, одну или две Fc-области или партнеров по связыванию FcRn), содержащую одну или более аминокислотных замен в пределах "FcRn-связывающей петли" константной области Ig. FcRn-связывающая петля состоит из аминокислотных остатков 280-299 (согласно европейской нумерации) полноразмерной Fc-области дикого типа. В других вариантах реализации изобретения константная область Ig в химерном белке или ее часть, являющаяся объектом данного изобретения и имеющая измененную аффинность связывания FcRn, содержит по меньшей мере одну Fc-область или одного партнера по связыванию FcRn, содержащую одну или более аминокислотных замен в пределах 15 А -ой "контактной зоны" FcRn. Употребляемый в данном тексте термин 15 А-ая "контактная зона" FcRn включает в себя остатки в следующих позициях полноразмерного Fc-компонента дикого типа: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336- 348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (европейская нумерация). В других вариантах реализации изобретения константная область Ig или ее часть, являющаяся объектом данного изобретения и имеющая измененную аффинность связывания FcRn, содержит по меньшей мере одну Fc-область или одного партнера по связыванию FcRn, содержащую одну или более аминокислотных замен в аминокислотной позиции, соответствующей любой из следующих позиций согласно европейской нумерации: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (например, N434A или N434K) и 438. Примеры аминокислотных замен, которые изменяют активность связывания FcRn, раскрыты в международной публикации согласно РСТ № WO05/047327, которая включена в данный текст посредством ссылки. [0192] Fc-область или партнер по связыванию FcRn, применяемые в данном изобретении, могут также содержать общепринятую в данной области техники аминокислотную замену. Которая изменяет гликозилирование химерного белка. Например, Fc-область или партнер по связыванию FcRn химерного белка, связанные с фрагментом ФВ или белком ФУШ, могут содержать Fc-область, содержащую мутацию, которая приводит к сниженному гликозилированию {например, N- или О-связанному гликозилированию), либо могут содержать измененную гликоформу Fc-компонента дикого типа {например, гликан с низким содержанием или отсутствием фукозы). [0193] В одном варианте реализации непроцессированный химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, может содержать генетически сшитую Fc-область (т.е., оцРс-область), содержащую одну или более непрерывных константных областей или их частей, независимо выбранных из описанных в данном тексте константных областей или их частей. В одном варианте реализации изобретения Fc-области димерной Fc-области являются одинаковыми. В другом варианте реализации изобретения по меньшей мере две Fc-области являются разными. Например, Fc-области или партнеры по связыванию FcRn, принадлежащие белкам, являющимся объектами данного изобретения, содержат одинаковое количество аминокислотных остатков либо они могут отличаться по длине на один или более аминокислотных остатков (например, на около 5 аминокислотных остатков (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных остатков), около 10 остатков, около 15 остатков, около 20 остатков, около 30 остатков, около 40 остатков или около 50 остатков). В других вариантах реализации Fc-области или партнеры по связыванию FcRn, принадлежащие белку, являющемуся объектом данного изобретения, могут отличаться в последовательности по одной или более аминокислотным позициям. Например, по меньшей мере две Fc-области или два партнера по связыванию FcRn могут отличаться по около 5 аминокислотным позициям (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотным позициям), около 10 позициям, около 15 позициям, около 20 позициям, около 30 позициям, около 40 позициям или около 50 позициям). 2) Альбумин или его фрагмент или вариант [0194] В определенных вариантах реализации изобретения, гетерологичный компонент, связанный с фрагментом ФВ или связанный с белком ФУШ, является альбумином или его функциональным фрагментом. В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит белок ФУШ и альбумин или его фрагмент, при этом альбумин или его фрагмент экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка ФУШ, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка ФУШ с эндогенным ФВ. [0195] Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА или С А) - белок, имеющий полноразмерную форму из 609 аминокислот - отвечает за значительную часть осмотического давления сыворотки, а также действует как носитель эндогенных и экзогенных лигандов. Употребляемый в данном тексте термин "альбумин" включает в себя полноразмерный альбумин или его функциональный фрагмент, вариант, производное или аналог. [0196] В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и альбумин, его фрагмент или вариант, при этом фрагмент ФВ связан с альбумином или его фрагментом или вариантом. В другом варианте реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ и белок ФУШ, которые связаны друг с другом, при этом фрагмент ФВ связан с альбумином или его фрагментом или вариантом, белок, имеющий активность VIII, связан с альбумином или его фрагментом или вариантом, либо и фрагмент ФВ и белок, имеющий активность VIII, связаны с альбумином или его фрагментом или вариантом. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ, связанный с альбумином или его фрагментом или вариантом, и дополнительно связанный с гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК и ПЭГ. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ и белок ФУШ, которые связаны друг с другом, при этом белок ФУШ связан с альбумином или его фрагментом или вариантом и дополнительно связан с гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК и ПЭГ. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ, связанный с альбумином или его фрагментом или вариантом, и белок ФУШ, связанный с альбумином или его фрагментом или вариантом, которые связаны друг с другом, при этом фрагмент ФВ дополнительно связан с первым гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК и ПЭГ, а белок ФУШ дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК и ПЭГ. [0197] В других вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком ФУШ, является альбумин или его фрагмент или вариант, который продлевает (или способен продлевать) время полужизни фрагмента ФВ или белка ФУШ. Дополнительные примеры альбумина или его фрагментов или вариантов раскрыты в патентных публикациях US № 2008/0194481А1, 2008/0004206 Al, 2008/0161243 Al, 2008/0261877 Al, или 2008/0153751 Al или заявки на публикацию на патентную публикацию US № 2008/033413 А2, 2009/058322 Al или 2007/021494 А2. 3) Альбумин связывающее вещество [0198] В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком ФУШ, является альбумин связывающее вещество, которое содержит альбумин связывающий пептид, бактериальный альбумин связывающий домен, фрагмент альбумин-связывающего антитела или любые комбинации этих компонентов. Например, альбумин связывающий белок может являться бактериальным альбумин связывающим белком, антителом или фрагментом антитела, включая доменные антитела (смотрите патент US № 6,696,245). Альбумин связывающий белок, к примеру, может являться бактериальным альбумин связывающим доменом, таким как домен стрептококкового протеина G (Konig, Т. and Skerra, А. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). Другие примеры альбумин связывающих пептидов, которые могут применяться в качестве конъюгационных партнеров, включают, например, те, кторые содержат консенсусные последовательности Cys-Xaa i -Хаа 2 -Хаа з -Хаа 4 -Cys, где Хаа i является Asp, Asn, Ser, Thr или Tip; Хаа г является Asn, Gin, Н является, Не, Leu или Lys; Хаа з является Ala, Asp, Phe, Тгр или Туг; и Хаа 4 является Asp, Gly, Leu, Phe, Ser и Thr, как описано в патентной заявке US 2003/0069395 или в Dennis et al. (Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043). 4) Последовательность PAS [0199] В других вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком ФУШ, является последовательность PAS. В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и последовательность PAS, при этом фрагмент ФВ связан с последовательностью PAS. В другом варианте реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит белок ФУШ и последовательность PAS, при этом последовательность PAS экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка ФУШ, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка ФУШ с эндогенным ФВ. [0200] При употреблении в данном тексте выражение последовательность PAS обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, главным образом, остатки аланина и серина, или содержащую, главным образом, остатки аланина, серина и пролина, аминокислотную последовательность, образующую произвольную спиральную конформацию в физиологических условиях. Соотвественно, последовательность PAS является строительным блоком, аминокислотным полимером либо кассетой последовательности, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из аланина, серина и пролина, и которая может быть использована как часть гетерологичного компонента в химерном белке. При этом специалисту в данной области техники известно, что аминокислотный полимер также может образовывать произвольную спиральную конформацию в случае, когда отличные от аланина, серина и пролина остатки добавляют в последовательность PAS в качестве минорных компонентов. Употребляемый в данном тексте термин "минорный компонент" означает, что аминокислоты, отличные от аланина, серина и пролина, можно добавлять в последовательность PAS до определенной степени, например, до около 12%, т.е., около 12 из 100 аминокислот последовательности PAS, до около 10%, т.е., около 10 из 100 аминокислот последовательности PAS, до около 9%, т.е., около 9 из 100 аминокислот, до около 8%, т.е., около 8 из 100 аминокислот, около 6%, т.е., около 6 из 100 аминокислот, около 5%, т.е., около 5 из 100 аминокислот, около 4%, т.е., около 4 из 100 аминокислот, около 3%, т.е., около 3 из 100 аминокислот, около 2%, т.е., около 2 из 100 аминокислот, около 1%, т.е., около 1 из 100 из аминокислот. Аминокислоты, отличные от аланина, серина и пролина, могут быть выбраны из группы, состоящей из Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Туг и Val. [0201] В физиологических условиях участок последовательности PAS образует произвольную спиральную конформацию и, тем самым, может опосредовать повышенную in vivo и/или in vitro устойчивость к фактору ФВ или белку коагулирующей активности. Так как произвольная спиральная конформация сама по себе не образует устойчивой структуры или не функционирует, биологическая активность, опосредованная фрагментом ФВ или белком ФУШ, с которым она сшита, сохраняется в значительной степени. В других вариантах реализации изобретения последовательности PAS, которые образуют произвольную спиральную конформацию, являются биологически инертными, в особенности в отношении протеолиза в плазме крови, иммуногенности, изоэлектрической точки/изоэлектрического поведения, связывания с рецепторами клеточных поверхностей или интернализации, но в то же время являются биоразлагаемыми, что обеспечивает чистое преимущество перед синтетическими полимерами, такими как ПЭГ. [0202] Неограничивающие примеры последовательностей PAS, образующих произвольную спиральную конформацию, включают аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID N0: 8), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ГО NO: 9), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ГО NO: 10), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 11), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 12), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 13) и ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 14) или любых их комбинаций. Дополнительные примеры последовательностей PAS известны из, например, патентной публикации US № 2010/0292130 Al и заявки на публикацию на патентную публикацию US № WO 2008/155134 Al. 5) Последовательность НАР [0203] В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком ФУШ, является богатый глицином гомо-аминокислотный полимер (НАР - от англ. "homo-amino-acid polymer"). Последовательность НАР может содержать повторяющуюся последовательность глицина, которая составляет по меньшей мере 50 аминокислот, по меньшей мере 100 аминокислот, 120 аминокислот, 140 аминокислот, 160 аминокислот, 180 аминокислот, 200 аминокислот, 250 аминокислот, 300 аминокислот, 350 аминокислот, 400 аминокислот, 450 аминокислот или 500 аминокислот в длину. В одном варианте реализации изобретения последовательность НАР способна продлевать время полужизни компонента, сшитого или связанного с последовательностью НАР. Неограничивающие примеры последовательности НАР включают, но не ограничиваются этим, (Gly)n, (Gly4Ser)n или S(Gly4Ser)n, где п равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20. Ш одном варианте реализации изобретения, п равно 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40. В другом варианте реализации изобретения, п равно 50, 60, 70, 80, 90, 100, ПО, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200. Смотрите, например, Schlapschy М et al, Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007). 6) Трансферрин или его фрагмент [0204] В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком ФУШ, является трансферрин или его фрагмент. Для получения химерного белка, являющегося объектом данного изобретения, может быть использован любой трансферрин. Примером может служить человеческий Тф(Тф) дикого типа, который является белком из 679 аминокислот, примерно в 75 КДа (без учета гликозилирования), с двумя основными доменами - N (около 330 аминокислот) и С (около 340 аминокислот), происхождение которого связано с дупликацией гена. Смотрите учетные номера GenBank NM001063, ХМ002793, М12530, ХМ039845, ХМ 039847 и S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/), которые в полном объеме включены в данный текст посредством ссылки. Трансферрин содержит два домена - домен N и домен С. Домен N содержит два субдомена - домен N1 и домен N2, а домен С содержит два субдомена - домен С1 и домен С2. [0205] В одном варианте реализации изобретения часть трансферрина химерного белка содержит сплайс-вариант трансферрина. В одном примере сплайс-вариант трансферрина может являться сплайс-вариантом человеческого трансферрина, например, это номер Genbank ААА61140. В другом варианте реализации изобретения часть трансферрина химерного белка содержит один или более доменов последовательности трансферрина, например, домен N, домен С, домен N1, домен N2, домен С1, домен С2 или любые их комбинации. 7) Полимер, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ) [0206] В других вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, присоединенным к фрагменту ФВ или белку, характеризующемуся коагулирующей активностью, например ФУШ-активностью, является растворимый полимер, известный в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль, кополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, декстран или поливиниловый спирт. Гетерологичный компонент, такой как растворимый полимер, может быть присоединен в любой позиции в пределах фрагмента ФВ или белка ФУШ, либо к N- или С-концу. В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит белок ФУШ и ПЭГ, при этом ПЭГ экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка ФУШ, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка ФУШ с эндогенным ФВ. [0207] В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и ПЭГ, при этом фрагмент ФВ связан с ПЭГ. В другом варианте реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ и белок ФУШ, которые связаны друг с другом, при этом фрагмент ФВ связан с ПЭГ, белок ФУШ связан с ПЭГ либо и фрагмент ФВ и белок ФУШ связаны с ПЭГ. ГВ других вариантах реализации изобретения химерный белок, содержащий фрагмент ФВ, связанный с ПЭГ, дополнительно связан с гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК, альбумина, его фрагмента или варианта. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ и белок ФУШ, которые связаны друг с другом, при этом белок ФУШ дополнительно связан гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК, альбумина, его фрагмента или варианта. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ, связанный с ПЭГ, и белок ФУШ, связанный с ПЭГ, которые связаны друг с другом, при этом фрагмент ФВ дополнительно связан с первым гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК, альбумина, его фрагмента или варианта, а белок ФУШ дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК, альбумина, его фрагмента или варианта. [0208] Также в изобретении предложены химически модифицированные производные химерного белка, являющегося объектом данного изобретения, которые могут обеспечивать дополнительные преимущества, такие как повышенные растворимость, стабильность и время циркуляции полипептида либо сниженная иммуногенность (смотрите патент US № 4,179,337). Химические компоненты для модификации могут быть выбраны из группы, состоящей из водорастворимых полимеров, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль, кополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, декстран или поливиниловый спирт. Химерный белок может быть модифицирован в произвольных позициях в пределах молекулы или в N- или С-концах либо в заданных позициях в пределах молекулы, и может содержать один, два, три или более присоединенных химических компонентов. [0209] Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Для полиэтиленгликоля, в одном варианте реализации изобретения, молекулярная масса составляет величину между около 1 кДа и около 100 кДа для удобства в эксплуатации и производстве. Могут использоваться и другие размеры в зависимости от необходимого профиля (например, необходимой продолжительности пролонгированного высвобождения, воздействий в случае какой-либо биологической активности, удобства в эксплуатации, степени или отсутствия антигенности и других известных воздействий полиэтиленгликоля на белок или его аналог). Например, полиэтиленгликоль может имень среднюю молекулярную массу, составляющую около 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000 или 100,000 кДа. [0210] В некоторых вариантах реализации изобретения полиэтиленгликоль может иметь разветвленную структуру. Разветвленные полиэтиленгликоли описаны, например, в патенте US № 5,643,575; Morpurgo et al, Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Yovobjevetal.,NucleosidesNucleotides 18:2745-2750 (1999); nCalicetieto/., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999), которые все в полном объеме включены в данный текст посредством ссылки. [0211] Также может варьироваться количество (т.е., степень замещения) полиэтиленгликольных компонентов, присоединенных к каждому химерному белку, фрагменту ФВ или белку ФУШ, которые являются объектами данного изобретения. Например, пэгилированные белки, которые являются объектами данного изобретения, могут быть связаны в среднем с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20 или более молекулами полиэтиленгликоля. Аналогично, средняя степень замещения находится в пределах диапазонов, таких как 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19 или 18-20 полиэтиленгликольных компонентов на молекулу белка. Способы определения степени замещения обсуждаются, например, в Delgado et al, Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992). [0212] В некоторых вариантах реализации изобретения белок ФУШ может быть ПЭГилированным. ПЭГилированный фактор VIII может обозначать конъюгат, образованный между фактором VIII и по меньшей мере одной молекулой полиэтиленгликоля (ПЭГ). [0213] В других вариантах реализации применяемый в изобретении белок ФУШ конъюгирован с одним или более полимерами. Полимер может быть водораствомимым и ковалентно либо нековалентно присоединенным к фактору VIII или другим компонентам, конъюгированным с фактором VIII. Неограничивающими примерами могут быть поли(оксид алкилена), поли(винилпирролидон), поли(виниловый спирт), полиоксазолин или поли(акрилоилморфолин). Дополнительные типы полимер-конъюгированного ФУШ раскрыты в патенте US № 7,199,223. 8) Гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК) [0214] В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, присоединенным к фрагменту ФВ или белку ФУШ, является полимер, например, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК) или его производное. В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и ГЭК, при этом фрагмент ФВ связан с ГЭК. Ш других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит белок ФУШ, сшитый с гидроксиэтиловым крахмалом (ГЭК), при этом гидроксиэтиловый крахмал или его производное экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка ФУШ от эндогенного ФВ, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка ФУШ с эндогенным ФВ. [0215] Гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК) является производным амилопектина природного происхождения и в организме расщепляется альфа-амилазой. ГЭК является замещенным производным углеводного полимера амилопектина, который присутствует в кукурузном крахмале в концентрации до 95% по массе. ГЭК проявляет полезные биологические свойства и применяется клиниками в качестве вещества для замещения объема крови в гемодилюционной терапии (Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987); и Weidler et al., Arzneim.-Forschung/DrugRes., 41, 494-498 (1991)). [0216] Амилопектин содержит компоненты глюкозы, при этом в основной цепи находятся альфа-1,4-гликозидные связи, а в разветвляющихся участках находятся альфа-1,6-гликозидные связи. Физико-химические свойства этой молекулы определяются, главным образом, типом гликозидных связей. Благодаря разорванной альфа-1,4-гликозидной связи получают спиральные структуры, содержащие около шести мономеров глюкозы на виток. Физико-химические, а также биохимические свойства полимера могут быть модифицированы при помощи замещения. При помощи щелочного гидроксиэтилирования можно осуществлять введение гидроксиэтиловой группы. Подбирая условия реакции можно получить различную реактивность соответствующей гидрокси-группы в незамещенном мономере глюкозы по отношению к гидроксиэтилированию. Благодаря этому факту, специалист в данной области техники может в ограниченной степени влиять на схему замещения. [0217] ГЭК главным образом характеризуется распределением молекулярной массы и степенью замещения. Степень замещение, обозначаемая как СЗ, обозначает молярное замещение, известное специалистам в данной области. Смотрите Sommermeyer et al.,Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987), как указано выше, в частности, с. 273. [0218] В одном варианте реализации изобретения гидроксиэтиловый крахмал имеет среднюю молекулярную массу (среднюю массу), составляющую от 1 до 300 кД, от 2 до 200 кД, от 3 до 100 кД или от 4 до 70 кД. Гидроксиэтиловый крахмал может дополнительно иметь степень молярного замещения, составляющую от 0,1 до 3, предпочтительно, от 0,1 до 2, более предпочтительно, от 0,1 до 0,9, предпочтительно, от 0,1 до 0,8, и соотношение между С2:С6 заменой в диапазоне от 2 до 20 по отношению к гидроксиэтиловым группам. Неограничивающим примером ГЭК, имеющего среднюю молярную массу около 130 кД, является ГЭК со степенью замещения, составляющей от 0,2 до 0,8, например, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8, предпочтительно, от 0,4 до 0,7, например, 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7. В конкретном варианте реализации изобретения ГЭК со средней молярной массой около 130 кД является ВОЛЮВЕН(r) от Fresenius. ВОЛЮВЕН(r) является искусственным коллоидом, применяемым, например, для замещения объема, которое используется в показаниях к применению для лечения или профилактики гиповолемии. Характеристиками ВОЛЮВЕН(r)являются средняя молярная масса в 130,000+/-20,000 Д, молярное замещение 0,4 и соотношение С2:С6 около 9:1. В других вариантах реализации изобретения диапазоны средней молекулярной массы гидроксиэтилового крахмала составляют, например, от 4 до 70 кД, или от 10 до 70 кД, или от 12 до 70 кД, или от 18 до 70 кД, или от 50 до 70 кД, или от 4 до 50 кД, или от 10 до 50 кД, или от 12 до 50 кД, или от 18 до 50 кД, или от 4 до 18 кД, или от 10 до 18 кД, или от 12 до 18 кД, или от 4 до 12 кД, или от 10 до 12 кД, или от 4 до 10 кД. В других вариантах реализации изобретения средняя молекулярная масса применяемого гидроксиэтилового крахмала находится в диапазоне от более чем 4 кД и до 70 кД, например, около 10 кД, или в диапазоне от 9 до 10 кД, или от 10 до 11 кД, или от 9 до 11 кД, или около 12 кД, или в диапазоне от 11 до 12 кД, или от 12 до 13 кД, или от 11 до 13 кД, или около 18 кД, или в диапазоне от 17 до 18 кД, или от 18 до 19 кД, или от 17 до 19 кД, или окло 30 кД, или в диапазоне от 29 до 30 кД, или от 30 до 31 кД, или около 50 кД, или в диапазоне от 49 до 50 кД, или от 50 до 51 кД, или от 49 до 51 кД. [0219] В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом могут быть смеси гидроксиэтиловых крахмалов, имеющих различные средние молекулярные массы и/или различные степени замещения, и/или различные соотношения С2: С6 замещения. Следовательно, могут применяться смеси гидроксиэтиловых крахмалов, имеющие различные средние молекулярные массы и различные степени замещения, и различные соотношения С2: С6 замещения, или имеющие различные средние молекулярные массы и различные степени замещения, и одинаковые либо приблизительно одинаковые соотношения С2: С6 замещения, или имеющие различные средние молекулярные массы и одинаковые либо приблизительно одинаковые степени замещения, и различные соотношения С2: С6 замещения, или имеющие одинаковые либо приблизительно одинаковые средние молекулярные массы и различные степени замещения, и различные соотношения С2: С6 замещения, или имеющие различные средние молекулярные массы и одинаковые либо приблизительно одинаковые степени замещения, и одинаковые либо приблизительно одинаковые соотношения С2: С6 замещения, или имеющие одинаковые либо приблизительно одинаковые средние молекулярные массы и различные степени замещения, и одинаковые либо приблизительно одинаковые соотношения С2: С6 замещения, или имеющие одинаковые либо приблизительно одинаковые средние молекулярные массы и одинаковые либо приблизительно одинаковые степени замещения, и различные соотношения С2: С6 замещения, или имеющие одинаковые либо приблизительно одинаковые средние молекулярные массы и одинаковые либо приблизительно одинаковые степени замещения, и одинаковые либо приблизительно одинаковые соотношения С2: С6 замещения. 9) Полисиаловые кислоты (ПСК) [0220] В определенных вариантах реализации изобретения неполипептидным гетерологичным компонентом, присоединенным к фрагменту ФВ или белку ФУШ, является полимер, например, полисиаловые кислоты (ПСК) или их производные. Полисиаловые кислоты (ПСК) имеют природное происхождение и являются неразветвленными полимерами сиаловой кислоты, которые синтезируются определенными бактериальными штаммами или в определенных клетках млекопитающих Roth J., et al. (1993) in Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland), pp 335-348. Их можно синтезировать с различной степенью полимеризации от п=около 80 или более остатков сиаловой кислоты до п=2 при помощи ограниченного кислотного гидролиза или при помощи расщепления нейраминидазами, или при помощи фракционирования природных, полученных из бактерий форм полимера. Состав различных полисиаловых кислот также варьируется таким образом, что существуют гомополимерные формы, т.е., альфа-2,8-связанная полисиаловая кислота, содержащая капсульный полисахарид штамма Kl Е. coli и менингококки группы В, которую также можно обнаружить в эмбриональной форме адгезивных молекул нервных клеток (N-CAM - от англ. "neuronal cell adhesion molecule"). Также существуют гетерополимерные формы, такие как чередующаяся альфа-2,8 и альфа-2,9 полисиаловая кислота штамма К92 Е. coli и полисахариды группы С N. meningitidis. Сиаловую кислоту также можно обнаружить в чередующихся кополимерах с мономерами, отличающимися от сиаловой кислоты, таких как группа W135 или группа Y N. meningitidis. Полисиаловые кислоты обладают важными биологическими функциями, включая уклонение патогенных бактерий от иммунной системы и системы комплемента и регуляцию глиальной адгезионной способности незрелых нейронов во время фетального развития (при этом полимер имеет антиадгезионную функцию) Cho and Troy, P.N.A.S., USA, 91 (1994) 11427-11431, хотя рецепторы полисиаловых кислот у млекопитающих не известны. Альфа-2,8-связанная полисиаловая кислота штамма К1 Е. coli также известна как 'коломиновая кислота' и используется (с разными длинами) в качестве примера реализации настоящего изобретения. Были описаны различные способы присоединения или конъюгации полисиаловых кислот к полипептиду (например, смотрите патент US № 5,846,951; WO-A-0187922 и US 2007/0191597 Al, которые все в полном объеме включены в данный текст посредством ссылки. С) Белок OVIII [0221] Употребляемое в данном тексте выражение "белок OVIII" обозначает функциональный полипептид OVIII в своей обычной роли в коагуляции, если не указано иное. Термин белок OVIII включает в себя функциональный фрагмент, вариант, аналог или производное, которые сохраняют функцию полноразмерного фактора VIII дикого типа в процессе коагуляции. Выражение "белок OVIII" взаимозаменяемо употребляется с выражение полипептид (или белок) OVIII или просто OVIII. Примеры функций OVIII включают, но не ограничиваются этим, способность активировать коагуляцию, способность действовать как кофактор фактора ГХ или способность образовывать теназный комплекс с фактором IX в присутствии Са2+ и фосфолипидов, которые затем преобразует фактор X в активированную форму Ха. Белок OVIII может являться человеческим, свиным, собачьим, крысиным или мышиным белком OVIII. Вдобавок, при сравнении OVIII, полученного от людей и других видов, были обнаружены консервативные остатки, которые, вероятно, являются необходимыми для функционирования (Cameron et al, Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632). [0222] Существует большое количество тестов для оценки функции системы свертывания крови: тест на активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), хромогенный анализ, метод ротационной тромбоэластометрии (РОТЭМ), тест на протромбиновый индекс (ПИ) (также применяемый для определения MHO), фибриноген-тест (часто проводимый методом Клауса), количество тромбоцитов, тестирование тромбоцитарной функции (часто проводимый при помощи PFA-100), тромбиновое время, время кровотечения, тест смешивания (показывающий, исправляется ли нарушение при смешивании плазмы крови пациента с нормальной плазмой), анализ фактора свертывания крови, антифосфолипидные антитела, D-димер, генетические тесты (например, фактор V Ляйдена, мутация протромбина G20210A), время разбавленного яда гадюки Рассела (dRVVT-тест), различные тесты тромбоцитарной функции, тромбоэластография (ТЭГ или Соноклот), тромбоэластометрия (ТЭМ(r), например, РОТЭМ(r)) или время лизиса эуглобулина (ВЛЭ). [0223] АЧТВ-тест является показателем эффективности и определяет эффективность как "внутреннего" (также называемого механизмом активации свертывания крови), так и общего механизма коагуляции. Этот тест обычно применяется для определения коагулирующей активности коммерчески доступных рекомбинантных факторов свертывания крови, например, OVIII или OIX. Он К заявке, выделенной из заявки № 201491186 применяется совместно с тестом на протромбиновый индекс (ПИ), который определяет внешний механизм. [0224] РОТЭМ-анализ дает информацию о полной кинетике гемостаза: времени свертывания крови, образовании тромбов, стабильности тромбов и лизисе. Разные параметры в тромбоэластометрии зависят от активности плазматической коагулирующей системы, тромбоцитарной функции, фибринолиза или многих факторов, которые влияют на эти взаимодействия. Данный метод может дать полную информацию о вторичном гемостазе. [0225] Известны полипептидные и полинуклеотидные последовательности OVIII, как и последовательности большого количества функциональных фрагментов, мутантов и модифицированных версий. Примеры последовательностей (полноразмерных) человеческого OVIII приведены как подпоследовательности в SEQIDNO: 16 или 18. Таблица 2. Полноразмерный OVIII (сигнальный пептид OVIII выделен подчеркиванием; тяжелая цепь OVIII выделена двойным подчеркиванием; В-домен выделен курсивом; и легкая цепь OVIII показана обычным текстом)С Сигнальный пептид: (SEQIDNO: 15) MQIELSTCFFLCLLRFCFS Зрелый факторVIII (SEQIDNO: 16)* ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGL LGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYWQVLK ENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETK NSLMQDRDAASARAWPKMHTWGYWRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQA SLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEM DWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKV RFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKH LKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFWMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMS DKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYI LSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSS CDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQiVSPJfPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRТРМРК IQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPE SGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFG KKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVS ISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMS NKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEK SVEGQNFLSEKNKWVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQE NWLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLE GLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTP STLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAAS YRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGK VELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKNNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLL DPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTE PLCSQJVPPVLKRffQPEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVE RLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTF RNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKD VHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYR FHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEM LPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSI NAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNV DSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFA TWSPSKARLHLQGRSNAWRPQWNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWT LFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY Таблица 3. Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерный OVIII (SEQIDNO: 17)* 661 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTG 721 CTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGC 7 81 AGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAG 841 ATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGAC 9 01 TCTGTTTGTAGAATTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGAT 9 61 GGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACTTAA 1021 GAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTC 10 81 T GAG G GAG С T GAATAT GAT GAT СAGAC СAGT СAAAG G GAGAAAGAAGAT GATAAAGT С T T 1141 CCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTC 12 01 TGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAA 12 61 T T CAG G С С T CAT T G GAG С С С TAC TAGTAT GTAGAGAAG G GAG T С T GG С СAAG GAAAAGAC 1321 ACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCA 13 81 CTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCC 14 41 TAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCA 15 01 CAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAAT 15 61 ATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTC 1621 GCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTT 1681 T T GT СATAT С T С T T С С СAC СAACAT GAT G G CAT G GAAG С T TAT GT CAAAGTAGACAG С T G 17 41 T С СAGAG GAAC С С СAAC TAC GAAT GAAAAATAAT GAAGAAG С GGAAGAC TAT GAT GAT GA 18 01 TCTTACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTAT 18 61 CCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATTGCTGCTGA 1921 AGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAG 19 81 T СAATAT T T GAACAAT G G С С С T CAG С G GAT T G GTAG GAAGTACAAAAAAGT С С GAT T TAT 2 041 G G СATACACAGAT GAAAC С T T TAAGAC T С GT GAAG CTAT T СAGCAT GAAT CAG GAAT С T T 2101 G G GAC CTTTACTT TAT G G G GAAGT T G GAGACACAC T GT T GAT TATAT T TAAGAAT СAAG С 2161 AAG СAGAC СATATAACAT С TAC С С T СAC G GAAT СACT GAT GTCCGTCCTTT GTAT T СAAG 2221 GAGAT TAC СAAAAG GT GTAAAACAT T T GAAG GAT T T T С СAAT T С T GC CAG GAGAAATAT T 22 81 СAAATATAAAT G GACAGT GAC T GTAGAAGAT G G G С CAAC TAAAT СAGAT CCTCGGTGCCT 2 341 GACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGG 2 4 01 CCCTCTCCT CAT С T G С TACAAAGAAT С T GTAGAT СAAAGAG GAAAC СAGATAAT GT СAGA 2 4 61 CAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGA 2 521 GAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCA 2 5 81 AGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGT 2 641 TTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCT 27 01 TTCTGTCTTCTTCTCTG GATATAC С T T СAAACACAAAAT G GT CTAT GAAGACACAC T СAC 2 7 61 CCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGAT 2 821 TCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTC 2 8 81 TAGT T GT GACAAGAACAC T G GT GAT TAT TAC GAG GACAGT TAT GAAGATAT T T CAG СATA 2 941 CTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCCCAGAATTCAAGACACCC 3 0 01 TAG СAC TAG G СAAAAG СAAT T TAAT G С СAC СACAAT T С СAGAAAAT GACATAGAGAAGAC 3 0 61 TGACCCTTGGTTTGCACACAGAACACCTATGCCTAAAATACAAAATGTCTCCTCTAGTGA 3121 TTTGTTGATGCTCTTGCGACAGAGTCCTACTCCACATGGGCTATCCTTATCTGATCTCCA 3181 AGAAG С СAAATAT GAGAC T T T T T С T GAT GAT С CAT CAC С T G GAG СAATAGACAGTAATAA 32 41 CAG С С T GT С T GAAAT GACACAC T T CAG G С СACAG С T С CAT СACAGT GG G GACAT G GTAT T 33 01 TAC С С С T GAGT CAG G С С T С СAAT TAAGAT TAAAT GAGAAAC T GG G GACAAC T G CAG CAAC 3361 AGAGTT GAAGAAAC T T GAT T T CAAAGT T T С TAGTACAT СAAATAAT С T GAT T T СAACAAT 3421 TCCATCAGACAATTTGGCAGCAGGTACTGATAATACAAGTTCCTTAGGACCCCCAAGTAT 34 81 G С СAGT T CAT TAT GATAGT СAAT TAGATAC CAC T С TAT T T G G CAAAAAGT CAT С T С С С С T 3541 TACTGAGTCTGGTGGACCTCTGAGCTTGAGTGAAGAAAATAATGATTCAAAGTTGTTAGA 3 601 ATCAGGTTTAATGAATAGCCAAGAAAGTTCATGGGGAAAAAATGTATCGTCAACAGAGAG 3 661 TGGTAGGTTATTTAAAGGGAAAAGAGCTCATGGACCTGCTTTGTTGACTAAAGATAATGC 3721 С T TAT T CAAAGT TAG CAT CTCTTTGT TAAAGACAAACAAAAC T T С CAATAAT T CAG CAAC 37 81 TAATAGAAAGAC T СACAT T GAT G G С С CAT CAT TAT TAAT T GAGAATAGT С CAT СAGT С T G 3 8 41 G СAAAATATAT TAGAAAGT GACAC T GAGT T TAAAAAAGT GACAC С T T T GAT T CAT GACAG 3 9 01 AAT G С T TAT G GACAAAAAT G С TACAG С T T T GAG G С TAAAT СATAT GT СAAATAAAAC TAC 3 9 61 T T CAT СAAAAAACAT G GAAAT G GT С СAACAGAAAAAAGAG G G С С С CAT T С CAC СAGAT G С 4 021 ACAAAAT С СAGATAT GTCGTTCTT TAAGAT G С TAT T С T T G С СAGAAT CAG СAAG GT G GAT 4 0 81 ACAAAGGACTCATGGAAAGAACTCTCTGAACTCTGGGCAAGGCCCCAGTCCAAAGCAATT 4141 AGTAT С С T TAG GAC СAGAAAAAT С T GT G GAAG GT СAGAAT TTCTTGTCT GAGAAAAACAA 42 01 AGTGGTAGTAGGAAAGGGTGAATTTACAAAGGACGTAGGACTCAAAGAGATGGTTTTTCC 42 61 AAG CAG СAGAAAC С TAT T T С T TAC TAAC T T G GATAAT T TACAT GAAAATAATACACACAA 4 321 T СAAGAAAAAAAAAT T CAG GAAGAAATAGAAAAGAAG GAAACAT TAAT С СAAGAGAAT GT 4381 AGTTTTGCCT СAGATACATACAGT GAC T G G CAC TAAGAAT T T CAT GAAGAAC CTTTTCTT 4 4 41 ACT GAG CAC TAG G СAAAAT GTAGAAG GT T СATAT GAC G G G G СATAT G С T С СAGTAC T T СA 4 5 01 AGAT T T TAGGT CAT TAAAT GAT T CAACAAATAGAACAAAGAAACACACAGCT CAT T T CT С 4 5 61 AAAAAAAGGGGAGGAAGAAAACT T GGAAGGСT T GGGAAAT СAAAC CAAGСAAAT T GTAGA 4 621 GAAATAT G CAT G CAC СACAAG GATAT С T С С TAATACAAG С СAGCAGAAT T T T GT CAC G СA 4 681 AC GTAGTAAGAGAG С T T T GAAACAAT T СAGAC T С С CAC TAGAAGAAACAGAAC T T GAAAA 4741 AAG GATAAT T GT G GAT GACAC С T CAAC С СAGT G GT С СAAAAACAT GAAACAT T T GAC С С С 4 8 01 GAG CAC С С T СACACAGATAGAC TACAAT GAGAAG GAGAAAG G GG С CAT TACT СAGT С T С С 4 8 61 С T TAT СAGAT TGCCTTAC GAG GAGT СATAG CAT С С CT CAAG СAAATAGAT С T С CAT TAC С 4 921 CAT T G СAAAG GTAT CAT CAT T T С CAT С TAT TAGAC CTATATAT С T GAC CAG G GT С С TAT T 4 9 81 CCAAGACAACTCTTCTCATCTTCCAGCAGCATCTTATAGAAAGAAAGATTCTGGGGTCCA 5 041 AGAAAG СAGT CAT T T С T TACAAG GAG С СAAAAAAAATAAC CTTTCTTTAGC CAT T С TAAC 5101 CTTGGAGATGACTGGTGATCAAAGAGAGGTTGGCTCCCTGGGGACAAGTGCCACAAATTC 5161 AGT СACATACAAGAAAGT T GAGAACAC TGTTCTCCC GAAAC СAGAC T T G С С СAAAACAT С 5221 TGGCAAAGTTGAATTGCTTCCAAAAGTTCACATTTATCAGAAGGACCTATTCCCTACGGA 52 81 AACTAGCAATGGGTCTCCTGGCCATCTGGATCTCGTGGAAGGGAGCCTTCTTCAGGGAAC 5341 AGAG G GAG С GAT TAAGT G GAAT GAAG СAAACAGAC CT G GAAAAGT TCCCTTTCT GAGAGT 54 01 AGCAACAGAAAGCTCTGCAAAGACTCCCTCCAAGCTATTGGATCCTCTTGCTTGGGATAA 54 61 С CAC TAT G GTAC T СAGATAC СAAAAGAAGAGT G GAAAT С С СAAGAGAAGT CAC СAGAAAA 5521 AACAGCTTTTAAGAAAAAGGATACCATTTTGTCCCTGAACGCTTGTGAAAGCAATCATGC 55 81 AATAG CAG СAATAAAT GAG G GACAAAATAAG С С С GAAATAGAAGT CAC С T G G G СAAAG СA 5 641 AGGTAGGACTGAAAGGCTGTGCTCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCCATCAACGGGA 57 01 AATAAC TCGTACTACTCTT СAGT СAGAT СAAGAG GAAAT T GACTAT GAT GATAC СATAT С 57 61 AGT T GAAAT GAAGAAG GAAGAT T T T GACAT T TAT GAT GAG GAT GAAAAT СAGAG С С С С С G 5 821 CAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTA 5 8 81 TGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCA 5 941 GTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCG 60 01 T G GAGAAC TAAAT GAACAT T T G G GAC TCCTGGGGC CATATATAAGAG СAGAAGT T GAAGA 60 61 TAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCT 6121 TAT T T С T TAT GAG GAAGAT СAGAG G CAAG GAG СAGAAC С TAGAAAAAAC T T T GT CAAG С С 6181 TAAT GAAAC СAAAAC TTACTTTTG GAAAGT G СAACAT СATAT GG СAC С CAC TAAAGAT GA 62 41 GTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTC 63 01 AGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAG 63 61 ACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTG 6421 GTAC T T CAC T GAAAATAT G GAAAGAAAC T G CAG GGCTCCCTG CAATAT С СAGAT G GAAGA 64 81 T С С CAC T T T TAAAGAGAAT TAT С G С T T С CAT G CAAT CAAT G G С TACATAAT G GATACAC T 6541 ACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAG 6601 CAAT GAAAACAT С CAT T CTAT T CAT T T CAGT GGACAT GT GT T CAC T GTAC GAAAAAAAGA 6661 GGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTT 6721 ACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGG 67 81 GATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTC 68 41 T G GAC AC AT T AGAGAT T T T С AGAT T AC AG С T T CAG GAC AAT AT G GAC AGT G G G С С С С AAA 69 01 GCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTC 69 61 TTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGC 7 021 CCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAGTCTTGATGG 7 081 GAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAA 7141 T GT G GAT T CAT С T G G GATAAAACACAATAT T T T TAAC С С T С CAAT TAT T G С T С GATACAT 72 01 CCGTTTGCACCCAACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTG 72 61 T GAT T TAAATAGT T G CAG CAT G С CAT T G G GAAT G GAGAGTAAAG СAATAT СAGAT G СACA 7 321 GATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCG 7381 AC T T CAC С T С CAAG G GAG GAGTAAT G С С T G GAGAC CT СAG GT GAATAAT С СAAAAGAGT G 7 4 41 GCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAAGTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAA 7501 ATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCA 7 5 61 TCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTC 7 621 CTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCA 7 681 CCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACA 7741 GGACCTCTAC *Выделенные подчеркиванием нуклеиновые кислоты кодируют сигнальный пептид. [0226] Полипептиды OVIII включают полноразмерный OVIII, полноразмерный OVIII минус Met на N-конце, зрелый OVIII (минус сигнальная последовательность), зрелый OVIII с добавочным Met на N-конце и/или OVIII с полной или частичной делецией В-домена. В определенных вариантах реализации изобретения варианты OVIII включают делеций В-домена, как частичные, так и полные. [0227] Ген человеческого OVIII был выделен и экспрессирован в клетках млекопитающих (Toole, J. J., et al, Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al, Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., et al, Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al, Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; и Патент US № 4,757,006). Аминокислотная последовательность OVIII была получена с кДНК, как показано в патенте US № 4,965,199. OVIII с частично или полностью удаленным В-доменом дополнительно приведен в патентах US № 4,994,371 и 4,868,112. В некоторых вариантах реализации изобретения В-домен человеческого OVIII замещен В-доменом человеческого фактора V, как показано в патенте US № 5,004,803. Последовательность кДНК, кодирующая человеческий фактор VIII и аминокислотная последовательность приведены в SEQ Ш NOs: 17 и 16, соответственно, из заявки на патентную публикацию US № 2005/0100990. [0228] Данные о последовательности свиного OVIII были опубликованы в Toole, J. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986). В Healey, J. F., et al, Blood 88:4209-4214 (1996) дополнительно сообщалось о полной свиной последовательности кДНК, полученной при помощи ПЦР амплификации последовательностей OVIII из библиотеки кДНК из свиной селезенки. В патенте US № 5,364,771 авторства Lollar и Runge и в WO 93/20093 описаны гибридный человеческий/свиной OVIII, содержащий замены всех доменов, всех субъединиц, и и специфические аминокислотные последовательности. Недавно в WO 94/11503 были опубликованы нуклеотидная и соответствующай ей аминокислотная последовательности доменов А1 и А2 свиного OVIII и химерного OVIII, в котором свиные домены А1 и/или А2 замещают соответствующие человеческие домены. В патенте US № 5,859,204, Lollar, J. S., также описаны последовательность свиной кДНК и полученные аминокислотные последовательности. В патенте US №6,458,563 описан OVIII с удаленным В-доменом. [0229] В патенте US № 5,859,204 авторстава Lollar, J. S. сообщается о функциональных мутантах OVIII, обладающих сниженной антигенностью и сниженной иммунореактивностью. В патенте US № 6,376,463 авторстава Lollar, J. S. также сообщается о мутантах OVIII, обладающих сниженной иммунореактивностью. В заявке на патентную публикацию US № 2005/0100990 авторства Saenko et al. сообщается о функциональных мутациях в домене А2 OVIII. [0230] В одном варианте реализации изобретения OVIII (или часть OVIII в химерном белке) может быть по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичным аминокислотной последовательности OVIII из аминокислот от 1 до 1438 из SEQ Ш NO: 18 или аминокислот от 1 до 2332 из SEQ Ш NO: 15 и SEQ Ш NO: 16 (без сигнальной последовательности), или аминокислотной последовательности OVIII из аминокислот от 19 до 1438 из SEQ Ш NO: 15 и SEQ ID NO: 18 или аминокислот от 19 до 2332 из SEQ ГО NO: 15 и SEQ ГО NO: 16 (с сигнальной последовательностью), при этом OVIII обладает коагулирующей активностью, например, активирует как кофактор фактор ГХ для того, чтобы преобразовать фактор X в активированный фактор X. OVIII (или часть OVIII в химерном белке) может быть идентичным аминокислотной последовательности OVIII из аминокислот от 1 до 1438 из SEQ ID NO: 18 или аминокислот от 1 до 2332 из SEQ ГО NO: 16 (без сигнальной последовательности). OVIII может дополнительно содержать сигнальную последовательность. [0231] Употребляемое в данном тексте выражение "В-домен" OVIII означает то же самое, что и известный в данной области техники В-домен, который определяется внутренней идентичностью аминокислотной последовательности и сайтами протеолитического расщепления, например, это остатки Ser741-Argl648 полноразмерного человеческого OVIII. Другие домены человеческого OVIII определяются следующими аминокислотными остатками: А1, остатки Alal-Arg372; А2, остатки Ser373-Arg740; A3, остатки Serl690-Asn2019; С1, остатки Lys2020-Asn2172; С2, остатки Ser2173-Tyr2332. Последовательность АЗ-С1-С2 включает остатки Serl690-Tyr2332. Оставшуюся последовательность, включающую остатки Glul649-Argl689, обычно называют аЗ кислотным участком. Расположение границ для всех доменов, включая В-домены, для свиного, мышиного и собачьего OVIII также известны в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения В-домен OVIII удален ("фактор VIII с удаленным В-доменом" или "УВД"). Примером OVIII с удаленным В-доменом является РЕОАКТО(r) (рекомбинантный OVTII с удаленным В-доменом), который имеет ту же последовательность, что и часть последовательности фактора VIII в Таблице 4. (тяжелая цепь OVIII с удаленным В-доменом выделена двойным подчеркиванием; В-домен выделен курсивом; и легкая цепь OVIII с удаленным В-доменом показана обычным текстом). Таблица 4 OVIIIc удаленным В-доменом (SEQIDNO: 18) ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGL LGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYWQVLK ENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETK NSLMQDRDAASARAWPKMHTWGYWRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQA SLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEM DWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKV RFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKH LKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFWMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMS DKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYI LSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSS CDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQJVPPVIiKRHQPEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKE DFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQP LYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFW KVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKS WYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFS GHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASG HIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQF IIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLN SCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQWNPKEWLQVDFQKTMKVTGV TTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWV HQIALRMEVLGCEAQDLY Таблица5. Нуклеотидная последовательность, кодирующая OVIIIc удаленным В-доменом (SEQIDNO: 19)* 661 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTC 721 TGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAAC 7 81 TGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCTC 8 41 CTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTG 9 01 TAGAATTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGC 9 61 TAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACTTAAGAACATGG 1021 CTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAG 10 81 С Т GAATAT GAT GAT СAGAC СAGT СAAAG G GAGAAAGAAGAT GATAAAGT CTTCCCTGGTG 1141 GAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCAC 12 01 TGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCC 12 61 T CAT T G GAG С С С T AC T AGT AT GT AGAGAAG G GAGT CT G G С CAAG G AAAAGAC AC AGAC С T 1321 TGCACAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAA 13 81 CAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGC 14 41 ACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAAT 15 01 CAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCG 15 61 AAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAA 1621 CTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATA 1681 TCTCTTCC CAC СAACAT GAT G G CAT G GAAG С T TAT GT СAAAG TAGACAG С T GT С СAGAG G 17 41 AAC С С CAAC TAC GAAT GAAAAATAAT GAAGAAG С G GAAGAC TAT GAT GAT GAT С T TAC T G 18 01 ATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTC 18 61 GCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGG 1921 ACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATT 19 81 T GAACAAT G G С С С T CAG С G GAT T G GTAG GAAGTACAAAAAAG T С С GAT T TAT G G СATACA 2 041 СAGAT GAAAC С T T TAAGAC T С GT GAAG С TAT T CAG CAT GAAT CAG GAAT С T T G G GAC С T T 2101 T AC T T TAT G G G GAAGT T G GAGAC AC AC T GT T GAT TAT AT T T AAGAAT CAAG CAAG С AGAC 2161 СATATAACAT С TAC С С T CAC G GAAT CAC T GAT GTCCGTCCTTT GTAT T CAAG GAGAT TAC 2221 СAAAAG GT GTAAAACAT T T GAAG GAT T T T С CAAT T CT G С CAG GAGAAATAT T СAAATATA 22 81 AATGGACAGTGACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCT 2 341 ATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCC 2 4 01 T CAT С Т G С ТACAAAGAAT С Т GTAGAT СAAAGAG GAAAC СAGATAAT GT СAGACAAGAG GA 2 4 61 ATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATAC 2 521 AACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCA 2 5 81 ACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGC 2 641 ATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCTGTCT 27 01 TCTTCTCTG GATATAC С T T СAAACACAAAAT G GT С TAT GAAGACACAC T CAC С С TAT ТСС 2 7 61 CATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGT 2 821 GCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTG 2 8 81 ACAAGAACAC T G GT GAT TAT TAC GAG GACAGT TAT GAAGATAT T T CAG СATAC T T G С T GA 2 941 GTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCC 3 0 01 AT CAAC G G GAAAT AAC TCGTACTACTCTT С AGT С AGAT С AAG AG GAAAT T GAC TAT GAT G 3 0 61 AT AC С AT AT С AGT T GAAAT GAAGAAG GAAGAT T T T GAC AT T TAT GAT GAG GAT GAAAAT С 3121 AGAGCCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGC 3181 TCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCA 32 41 GTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGC 33 01 С С T TATAC С GT G GAGAAC TAAAT GAACAT T T G G GACT CCTGGGGC CATATATAAGAG CAG 33 61 AAGTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCT 3421 AT TCTAGCCT TAT T T С T TAT GAG GAAGAT СAGAG G CAAG GAG CAGAAC С TAGAAAAAAC T 34 81 T T GT CAAG С С TAAT GAAAC СAAAAC TTACTTTTG GAAAGT G СAACAT СATAT G G CAC С СA 3541 CTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAG 3 601 ATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTG 3 661 CTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGA 3721 CCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCC 37 81 AGAT G GAAGAT С С CAC T T T TAAAGAGAAT TAT С G С T T С CAT G CAAT CAAT G G С TACATAA 3 8 41 TGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCA 3901 G CAT G G G CAG CAAT GAAAACAT С CAT T С TAT T CAT T T СAGT G GACAT GT GT T CAC T GTAC 3 9 61 GAAAAAAAGAG GAGTATAAAAT G G CAC T GTACAAT CT С TAT С CAG GTGTTTTT GAGACAG 4 021 TGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATC 4 081 TACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGG 4141 GAAT GGCTTCTG GACACAT TAGAGAT T T T СAGAT TACAG С T T CAGGACAATAT G GACAGT 42 01 GGGCCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGG 42 61 AGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGA 4 321 CCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATA 4381 GTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCT 4441 TCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTG 4 5 01 CTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGT 4 5 61 T GAT G G G С T GT GAT T TAAATAGT T G CAG CAT G С CAT T G G GAAT G GAGAGTAAAG СAATAT 4 621 CAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTT 4 681 CAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAATC 4 7 41 СAAAAGAGT G G С T G СAAGT G GAC T T С СAGAAGACAAT GAAAG T СACAG GAGTAAC TAC T С 4 8 01 AGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTC 4 8 61 AAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAA 4 921 ATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACC 4 9 81 TTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCT 5 041 G С GAG G СACAG GAC С T С TAC *Выделенные подчеркиванием нуклеиновые кислоты кодируют сигнальный пептид. [0232] "OVIII с удаленным В-доменом" может содержать полные либо частичные делеций, описанные в патентах US № 6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112 и 6,458,563. В некоторых вариантах реализации последовательность OVIII с удаленным В-доменом, являющаяся объектом настоящего изобретения, содержит любую из делеций, приведенных в патенте US № 6,316,226 (также в патенте US 6,346,513) от кол. 4, строка 4 до кол. 5, строка 28, и в Примерах 1-5. В другом варианте реализации изобретения фактор VIII с удаленным В-доменом является фактором VIII с удаленным В-доменом S743/Q1638 (SQ УВД ФУШ) (например, фактором VIII, содержащим делецию от аминокислоты 744 до аминокислоты 1637, например, фактором VIII, содержащим аминокислоты 1-743 и аминокислоты 1638-2332 из SEQ ID N0: 16, т.е., SEQ ГО N0: 18). В некоторых вариантах реализации ФУШ с удаленным В-доменом, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит делецию, приведенную в кол. 2, строки 26-51 и примерах 5-8 патента US № 5,789,203 (а также в патентах US 6,060,447, 5,595,886 и 6,228,620). В некоторых вариантах реализации изобретения ФУШ с удаленным В-доменом содержит делецию, приведенную в патенте US № 5,972,885, от кол. 1, строка 25 до кол. 2, строка 40; в патенте US № 6,048,720, кол. 6, строки 1-22 и пример 1; в патенте US № 5,543,502, кол. 2, строки 17-46; в патенте US № 5,171,844, от кол. 4, строка 22 до кол. 5, строка 36; в патенте US № 5,112,950, кол. 2, строки 55-68, фигура 2 и пример 1; в патенте US № 4,868,112, от кол. 2, строка 2 до кол. 19, строка 21 и таблица 2; в патенте US № 7,041,635, от кол. 2, строка 1 до кол. 3, строка 19, от кол. 3, строка 40 до кол. 4, строка 67, от кол. 7, строка 43 до кол. 8, строка 26, и от кол. 11, строка 5 до кол. 13, строка 39; или в патенте US № 6,458,563, кол. 4, строки 25-53. [0233] В некоторых вариантах реализации изобретения ФУШ с удаленным В- доменом содержит делецию большей части В-домена, но при этом сохраняет аминотерминальные последовательности В-домена, которые выжны для in vivo протеолитического процессинга продукта первичной трансляции в двуполипептидную цепь, как описано в WO 91/09122. В некоторых вариантах реализации изобретения конструкция ФУШ с удаленным В-доменом содержит делецию аминокислот 747-1638, т.е., фактически полную делецию В-домена. HoebenR.C, etal. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Фактор VIII с удаленным В-доменом также может содержать делецию аминокислот 771-1666 или аминокислот 868-1562 ФУШ. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Дополнительные делеций В-домена, которые являются частью данного изобретения, включают: делецию аминокислот от 982 до 1562 или от 760 до 1639 (Toole et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), от 797 до 1562 (Eaton, etal. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), от 741 до 1646 (Kaufman Kaufman (заявка на публикацию согласно РСТ № WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, et al, DNA (1987) 6:553-564)), от 741 до 1648 (Pasek (заявка на публикацию согласно РСТ № 88/00831)) или от 816 до 1598 либо от 741 до 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) № 82:1625, ЕП 295597)). В других вариантах реализации изобретения ФУШ с удаленным В доменом содержит полипептид ФУШ, содержащий фрагменты В-домена, в которых сохранены один или более N-связанных участков гликозилирования, например, остатки 757, 784, 828, 900, 963 или, в некоторых случаях, 943, которые соответствуют аминокислотной последовательности полноразмерной последовательности ФУШ. Примеры фрагментов В-домена включают 226 аминокислот или 163 аминокислоты В-домена, как описано в Miao, H.Z., et al, Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, etal, J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008), и Pipe, S.W., etal, J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) (т.е., сохранены первые 226 аминокислот или 163 аминокислоты В-домена). В некоторых вариантах реализации изобретения ФУШ, содержащий частичный В-домен, является ФУШ198 (SEQ Ш NO: 105). ФУШ198 является одноцепочечной молекулой-226№ ФУПГТс, содержащей частичный В-домен. 226 обозначает 226 N-концевых аминокислот В- домена ФУШ, а N6 обозначает шесть участков N-гликозилирования в В-домене. В других вариантах реализации изобретения ФУШ с удаленным В-доменом дополнительно содержит точечную мутацию в остатке 309 (от Phe до Ser) для того, чтобы улучшить экспрессию белка ФУШ с удаленным В-доменом. CjuompumeMiao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004). В других вариантах реализации изобретения ФУШ с удаленным В-доменом содержит полипептид ФУШ, содержащий часть В-домена, но не содержащий один или более сайтов расщепления фурином (например, Argl313 и Arg 1648). СмотритеТЧре, S.W., et al, J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011). Каждую из вышеописанных делеций можно внести в любую последовательность ФУШ. [0234] Белок ФУШ, применяемый в настоящем изобретении, может включать ФУШ, содержащий одну или более гетерологичных последовательностей или их химических или физических модификаций, которые не оказывают влияния на коагулирующую активность ФУШ. Подобные гетерологичные последовательности или их химические или физические модификаций могут быть сшитыми с С-концом или N-концом белка ФУШ либо вставленными между одним или более из двух аминокислотных остатков в белке ФУШ. Такие вставки в белок ФУШ не оказывают влияния на коагулирующую активность ФУШ или функционирование ФУШ. В одном варианте реализации изобретения данные вставки улучшают фармакокинетические свойства белка ФУШ (например, время полужизни). В другом варианте реализации изобретения вставки могут быть сделаны на более чем двух, трех, четырех, пяти или шести участках. [0235] В одном варианте реализации изобретения белок ФУШ расщепляется сразу за аргинином при аминокислоте 1648 (в полноразмерном факторе VIII или SEQ Ш N0: 16), аминокислоте 754 (в факторе VIII с удаленным В-доменом S743/Q1638 или SEQ Ш N0: 16), или соответствующим аргинину остатком (в других вариантах), тем самым приводя к наличию тяжелой цепи и легкой цепи. В другом варианте реализации изобретения ФУШ содержит тяжелую цепь и легкую цепь, которые связаны или соединены посредством ион-опосредованной нековалентной связи. [0236] В других вариантах реализации изобретения ФУШ является одноцепочечным ФУШ, который не был расщеплен сразу за аргинином при аминокислоте 1648 (в полноразмерном факторе VIII или SEQ Ш N0: 16), аминокислоте 754 (в факторе VIII с удаленным В-доменом S743/Q1638 или SEQ Ш N0: 18), или соответствующим аргинину остатком (в других вариантах). Одноцепочечный ФУШ может содержать одну или более аминокислотных замен. В одном варианте реализации изобретения аминокислотная замена проведена в остатке, соответствующем остатку 1648, остатку 1645 или им обоим полипептида полноразмерного зрелого фактора VIII (SEQ Ш N0: 16), либо остатку 754, остатку 751 или им обоим фактора VIII с удаленным В-доменом (SEQ Ш N0: 18). Аминокислотная замена может представлять собой любые аминокислоты, кроме аргинина, например, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин, аланин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, пролин, селеноцистеин, серии, тирозин, гистидин, орнитин, пирролизин или таурин. [0237] ФУШ может дополнительно расщепляться тромбином, а затем активироваться как ФУШа, выполняя функцию кофактора для активированного фактора IX (ФГХа). Активированный ФГХ совместно с активированным ФУШ образует комплекс Х-азу и преобразует фактор X в активированный фактор X (ФХа). Для активации ФУШ расщепляется тромбином за тремя остатками аргинина в аминокислотах 372, 740 и 1689 (соответствующих аминокислотам 372, 740 и 795 в последовательности ФУШ с удаленным В-доменом), при этом расщепление приводит к образованию ФУШа, содержащего цепи А1 в 50 кДа, А2 в 43 кДа и АЗ-С1-С2 в 73 кДа. В одном варианте реализации белок ФУШ, применяемый в настоящем изобретении, является неактивированным ФУШ. В другом варианте реализации изобретения белок ФУШ является активированным ФУШ. [0238] Белок, содержащий полипептид ФУШ, связанный или соединенный с фрагментом ФВ, может содержать последовательность по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную SEQ Ш NO: 16 или 18, при этом последовательность обладает коагулирующей активностью ФУШ, например, активирует фактор IX как кофактор для преобразования фактора X в активированный фактор X (ФХа). [0239] Употребляемое в данном тексте выражение "гибридные" полипептиды и белки означает комбинацию первой полипептидной цепи, например фрагмента ФВ, в некоторых случаях связанной с первым гетерологичным компонентом, со второй полипептидной цепью, например, белком ФУШ, в некоторых случаях связанной со вторым гетерологичным компонентом, образующую, таким образом, гетеродимер. В одном варианте реализации изобретения первый полипептид и второй полипептид в гибриде связаны друг с другом посредством белок-белковых взаимодействий, таких как заряд-зарядное или гидрофобное взаимодействия. В другом варианте реализации изобретения первый полипептид и второй полипептид в гибриде связаны друг с другом посредством дисульфидной или другой ковалентной связи(ей). Гибриды описаны, к примеру, в патенте US 2004/101740 и патенте US 2006/074199. Второй полипептид может являться идентичной копией первого полипептида или быть неидентичным полипептидом. В одном варианте реализации изобретения первый полипептид является слитым белком из фрагмента ФВ и Fc, а второй полипептид является полипептидом, содержащим, состоящим преимущественно из или состоящим из FcRn-связывающего домена, при этом первый полипептид и второй полипептид связаны друг с другом. В другом варианте реализации изобретения первый полипептид содержит слитый белок из фрагмента ФВ и Fc, а второй полипептид содержит слитый белок из ФУШ и Fc, что превращает гибрид в гетеродимер. Первый полипептид и второй полипептид могут быть связаны посредством ковалентной связи, например, дисульфидной связи между первой Fc-областью и второй Fc-областью. Первый полипептид и второй полипептид могут быть дополнительно связаны друг с другом посредством связывания между фрагментом ФВ и белком ФУШ. Г) Линкеры [0240] Химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, дополнительно содержит линкер. Между двумя белками может находиться один или более линкеров, например, между дополнительным компонентом и белком ФУШ (иногда также называемый "ФУШ/ДК линкер"), между фрагментом ФВ и первым гетерологичным компонентом (иногда также называемый "ФВ линкер"), например, первая Fc-область, между белком ФУШ и вторым гетерологичным компонентом (иногда также называемый "ФУШ линкер"), например, вторая Fc-область, между фрагментом ФВ и белком ФУШ (например, ФУШ/ДК линкер), между фрагментом ФВ и вторым гетерологичным компонентом и/или между белком ФУШ и первым гетерологичным компонентом. Все линкеры могут иметь одинаковую или разную последовательность. В одном варианте реализации изобретения линкер является полипептидным линкером. В другом варианте реализации изобретения линкер является неполипептидным линкером. [0241] Линкер, применяемый в настоящем изобретении, может содержать любую органическую молекулу. В одном варианте реализации изобретения линкер является полимером, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ) или гидроксиэтиловым крахмалом (ГЭК). В другом варианте реализации изобретения линкер представляет собой аминокислотную последовательность (например, полипептидный линкер). Полипептидный линкер может содержать по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 аминокислот. Линкер может содержать 1-5 аминокислот, 1-10 аминокислот, 1-20 аминокислот, 10-50 аминокислот, 50-100 аминокислот, 100-200 аминокислот, 200-300 аминокислот, 300-400 аминокислот, 400-500 аминокислот, 500-600 аминокислот, 600-700 аминокислот, 700-800 аминокислот, 800-900 аминокислот или 900-1000 аминокислот. [0242] Примеры полипептидных линкеров хорошо известны в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения линкер содержит последовательность Gn. Линкер может содержать последовательность (GA)n. Линкер может содержать последовательность (GGS)n усиливает активность фрагмента ФВ или коагулирующую активность белка фактора VIII, например, дополнительно снижая эффекты стерического несоответствия и обеспечивая фрагменту ФВ или части фактора VIII больший доступ к их целевому связывающему участку. [0243] В одном варианте реализации изобретения длина линкера, применяемого в химерном белке, составляет 15-25 аминокислот. В другом варианте реализации изобретения длина линкера, применяемого в химерном белке, составляет 15-20 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения длина линкера, применяемого в химерном белке, составляет 10-25 аминокислот. В других вариантах реализации изобретения длина линкера, применяемого в химерном белке, составляет 15 аминокислот. В других вариантах реализации изобретения линкер, применяемый в химерном белке, представляет собой (GGGGS)n (SEQ Ш NO: 27), где G является глицином, S является серином, а п является целым числом в диапазоне 1-20. Д) Сайты расщепления [0244] Линкер также может содержать компонент, который может отщепляться химически {например, гидролиз или эфирная связь), ферментативно {т.е., включение последовательности расщепления протеазой) или фотолитически {например, хромофор, такой как 3-амино-(2-нитрофенил) проприоновая кислота (АНП)), с целью отделить одну молекулу от другой. [0245] В одном варианте реализации изобретения линкер является отщепляемым линкером. Отщепляемые линкеры могут содержать один или более сайтов расщепления на N-конце или С-конце, либо на обоих. В другом варианте реализации изобретения отщепляемый линкер состоит преимущественно из или состоит из одного или более отщепляемых участков. В других вариантах реализации изобретения отщепляемый линкер содержит описанные в данном тексте гетерологичные аминокислотные линкерные последовательности или полимеры и один или более отщепляемых участков. [0246] В определенных вариантах реализации изобретения отщепляемый линкер содержит один или более сайтов расщепления, которые могут расщепляться в клетке-хозяине (т.е., сайты внутриклеточного процессинга). Неограничивающие примеры сайтов расщепления включают RRRR (SEQ ID NO: 52), RKRRKR (SEQ ГО NO: 53) и RRRRS (SEQ ГО NO: 54). [0247] В других вариантах реализации изобретения отщепляемый линкер содержит один или более сайтов расщепления, которые расщепляются протеазой после введения пациенту химерного белка, содержащего отщепляемый линкер. В одном варианте реализации изобретения сайт расщепления расщепляется протеазой, выбранной из группы, состоящей из фактора Х1а, фактора ХПа, калликреина, фактора Vila, фактора ГХа, фактора Ха, фактора Па (тромбина), эластазы-2, ММП-12, ММП-13, ММП-17 и ММП-20. В другом варианте реализации изобретения сайт расщепления выбран из группы, состоящей из сайта расщепления ФХ1а (например, KLTR | AET (SEQ ID N0: 29)), сайта расщепления ФХ1а (например, DFTR | VVG (SEQ ГО N0: 30)), сайта расщепления ФХПа (например, TMTR | IVGG (SEQ ГО N0: 31)), сайта расщепления калликреином (например, SPFR | STGG (SEQ ГО N0: 32)), сайта расщепления ФУПа (например, LQVR I IVGG (SEQ ГО N0: 33)), сайта расщепления ФГХа (например, PLGR I IVGG (SEQ ГО N0: 34)), сайта расщепления ФХа (например, IEGR I TVGG (SEQ ГО N0: 35)), сайта расщепления ФПа (тромбином) (например, LTPR | SLLV (SEQ ГО N0: 36)), сайта расщепления эластазой-2 (например, LGPV I SGVP (SEQ ГО N0: 37)), сайта расщепления гранзимом В (например, VAGD | SLEE (SEQ ID N0: 38)), сайта расщепления ММР- 12 (например, GPAG I LGGA (SEQ ГО N0: 39)), сайта расщепления ММР-13 (например, GPAG I LRGA (SEQ ГО N0: 40)), сайта расщепления ММР-17 (например, APLG I LRLR (SEQ ГО N0: 41)), сайта расщепления ММР-20 (например, PALP | LVAQ (SEQ ГО N0: 42)), сайта расщепления ВГТ (например, ENLYFQ | G (SEQ ГО N0: 43)), сайта расщепления энтерокиназой (например, DDDK | IVGG (SEQ ГО N0: 44)), сайта расщепления протеазой ЗС (PRESCISSION(tm)) (например, LEVLFQ | GP (SEQ ГО N0: 45)) и сайта расщепления сортазой А (например, LPKT I GSES) (SEQ ГО N0: 46). В определенных вариантах реализации изобретения сайты расщепления ФХ1а включают, но не ограничиваются этим, например, TQSFNDFTR (SEQ ГО N0: 47) и SVSQTSKLTR (SEQ ID N0: 48). Неограничивающие примеры сайта расщепленияБ тромбином включают, например, DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 49), TTKIKPR (SEQ Ш NO: 50) или LVPRG (SEQ Ш NO: 55), и последовательность, содержащую, состоящую преимущественно из или состоящую из ALRPR (например, ALRPRVVGGA (SEQ Ш N0: 51)). [0248] В конкретном варианте реализации изобретения сайтом расщепления является TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ Ш N0: 56). Полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева и способы их получения [0249] Также в изобретении предложен полинуклеотид, кодирующий описанный в данном тексте фрагмент ФВ, химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и гетерологичный компонент, химерный белок, содержащий белок ФУШ и дополнительный компонент, или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок ФУШ. В случае, когда фрагмент ФВ в химерном белке связан с гетерологичным компонентом или белком ФУШ в виде одиночной полипептидной цепи, данное изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему фрагмент ФВ, связанный с гетерологичным компонентом или белком ФУШ. В случае, когда химерный белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, с первой полипептидной цепью, содержащей фрагмент ФВ и первый гетерологичный компонент (например, первую Fc-область), и второй полипептидной цепью, содержащей фрагмент ФВ и второй гетерологичный компонент (например, вторую Fc-область), причем первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь соединены друг с другом, полинуклеотид может содержать первую нуклеотидную последовательность и вторую нуклеотидную последовательность. В одном варианте реализации изобретения первая нуклеотидная последовательность и вторая нуклеотидная последовательность принадлежат одному и тому же полинуклеотиду. В другом варианте реализации изобретения первая нуклеотидная последовательность и вторая нуклеотидная последовательность принадлежат двум разным полинуклеотидам (например, разным векторам). В определенных вариантах реализации настоящее изобретение относится группе полинуклеотидов, содержащей первую нуклеотидную цепь и вторую нуклеотидную цепь, причем первая нуклеотидная цепь кодирует фрагмент ФВ химерного белка, а вторая нуклеотидная цепь кодирует белок ФУШ. [0250] В других вариантах реализации изобретения группа полинуклеотидов дополнительно содержит добавочную нуклеотидную цепь (например, вторую нуклеотидную цепь, если химерный белок кодируется одиночной полинуклеотидной цепью, или третью нуклеотидную цепь, если химерный белок кодируется двумя полинуклеотидными цепями), которая кодирует протеин-конвертазу. Протеин-конвертаза может быть выбрана из группы, состоящей из пропротеин конвертазы субтилизин/кексин типа 5 (PCSK5 или РС5), пропротеин конвертазы субтилизин/кексин типа 7 (PCSK7 или РС7), дрожжевой протеазы Кех 2, пропротеин конвертазы субтилизин/кексин типа 3 (РАСЕ или PCSK3) и двух или более комбинаций этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения протеин-конвертаза представляет собой РАСЕ, PC 5 или РС7. В конкретном варианте реализации изобретения протеин-конвертаза представляет собой РС5 или РС7. Смотрите международную заявку № PCT/US2011/043568, которая включена в данный текст посредством ссылки. В другом варианте реализации изобретения протеин-конвертаза представляет собой РАСЕ/фурин. [0251] В определенных вариантах реализации данное изобретение относится группе полинуклеотидов, содержащей первую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3 ФВ, вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ФУШ, и третью нуклеотидную последовательность, кодирующую домен Din домен D2 ФВ. В этом варианте реализации изобретения домен Din домен D2 экспрессируются отдельно (и не связаны с доменом D'D3 фрагмента ФВ) с целью образования подходящей дисульфидной связи и филдинга доменов D'D3. Экспрессия домена D1D2 может происходить как в цис-, так и в транс-форме. [0252] Употребляемое в данном тексте выражение экспрессионный вектор относится к любой нуклеотидной конструкции, которая содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей последовательности или, в случае вирусного РЕГК вектора, необходимые элементы для репликации и трансляции при внесении в соответствующую клетку-хозяина. Экспрессионные векторы могут включать плазмиды, фадмиды, вирусы и их производные. [0253] Экспрессионные векторы, являющиеся объектами данного изобретения, будут содержать полинуклеотиды, кодирующие фрагмент ФВ или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ. [0254] В одном варианте реализации изобретения последовательность, кодирующая фрагмент ФВ, второй гетерологичный компонент (например, вторую Fc-область) или белок ФУШ, функционально связанная с управляющей экспрессионной последовательностью. В данном контексте две нуклеотидные последовательности являются функционально связанными, когда они ковалентно связаны таким образом, чтобы обеспечить сохранение функциональности каждого компонента нуклеотидной последовательности. Считается, что кодирующая последовательность и управляющая генной экспрессией последовательность функционально связаны, когда они ковалентно связаны таким образом, чтобы экспрессия или транскрипция и/или трансляция кодирующей последовательности оказалась под влиянием или управлением последовательности, управляющей генной экспрессией. Считается, что две последовательности ДНК функционально связаны, если индукция промотора в 5' последовательности генной экспрессии приводит к транскрипции кодирующей последовательности и если природа связи между двумя последовательностями ДНК не (1) приводит к внесению мутации со сдвигом рамки, (2) препятствует возможности промоторной области управлять транскрипцией кодирующей последовательности или (3) препятствует возможности соответствующего РНК-транскрипта быть транслированным в белок. Таким образом, последовательность генной экспрессии будет функционально связана с кодирующей нуклеотидной последовательностью, если последовательность генной экспрессии способна осуществить транскрипцию данной кодирующей нуклеотидной последовательности так, что полученный транскрипт транслируется в необходимый белок или полипептид. [0255] В данном контексте управляющая генной экспрессией последовательность представляет собой любую регуляторную нуклеотидную последовательность, такую как промоторная последовательность или промоторно-энхансерная комбинация, которая способствует эффективной транскрипции и трансляции кодирующей нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана. Управляющая генной экспрессией последовательность может, к примеру, являться промотором млекопитающего или вируса, таким как конститутивный или индуцибельный промотор. Конститутивные промоторы млекопитающих включают, но не ограничиваются этим, промоторы для следующих генов: гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (ГГРТ), аденозиндеаминазы, пируваткиназы, промотор бета-актина и другие конститутивные промоторы. Примеры вирусных промоторов, которые конститутивно функционируют в эукариотических клетках, включают, например, промоторы из цитомегаловируса (ЦМВ), вируса обезьяны {например, SV40), вируса папилломы, аденовируса, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса саркомы Рауса, цитомегаловируса, длинные концевые повторы (ДКП) вируса лейкоза Молони и другие ретровирусы, а также тимидинкиназный промотор вируса простого герпеса. Другие конститутивные промоторы известны специалистам в данной области техники. Промоторы, применимые в качестве последовательностей генной экспрессии согласно изобретению, также включают индуцибельные промоторы. Индуцибельные промоторы экспрессируются в присутствии индуктора. Например, индукция промотора металлотионеина для стимуляции транскрипции или трансляции происходит в присутствии определенных ионов металлов. Другие индуцибельные промоторы известны специалистам в данной области техники. [0256] В общем случае управляющая генной экспрессией последовательность будет включать, при необходимости, 5' нетранскрибируемые и 5' нетранслируемые последовательности, участвующий в инициации, соответственно, транскрипции и трансляции, такие как ТАТА-бокс, кэпирующая последовательность, последовательность ЦААТ и им подобные. В частности, такие 5' нетранскрибируемые последовательности будут включать промоторную область, которая содержит промоторную последовательность для управления транскрипцией функционально присоединенной кодирующей нуклеиновой кислоты. Последовательности генной экспрессии в некоторых случаях содержат энхансерные последовательности или вышележащие активаторные последовательности, если они необходимы. [0257] Вирусные векторы включают, но не ограничиваются этим, нуклеотидные последовательности следующих вирусов: ретровируса, такого как вирус лейкоза мышей Молони, вирус саркомы мышей Харви, вирус опухоли молочной железы мышей и вирус саркомы Рауса; аденовируса, адено-ассоциированного вируса; вирусов типа SV40; полиомавирусов; вирусов Эпштейна-Барра; вирусов папилломы; вируса герпеса; вируса осповакцины; полиовируса; и РНК-вируса, такого как ретровирус. Также можно применять другие хорошо известные в данной области техники векторы. Определенные вирусные векторы происходят от нецитопатических эукариотических вирусов, в которых несущественные гены были заменены генами, представляющими интерес. Нецитопатические вирусы включают ретровирусы, жизненный цикл которых включает обратную транскрипцию геномной вирусной РНК в ДНК с последующим провирусным внедрением в клеточную ДНК хозяина. Ретровирусы были апробированы в экспериментах по генной терапии человека. Наиболее подходящими есть такие ретровирусы, которые являются дефектными по репликации {т.е., способными к прямому синтезу необходимых белков, но неспособными к созданию инфекционных частиц). Такие генетически измененные ретровирусны экспрессионные векторы в общем случае используются для высокоэффективной трансдукции генов in vivo. Стандартные протоколы по получению дефектных по репликации ретровирусов (включая этапы внесения экзогенного генетического материала в плазмиды, трансфекции пакующей клеточной линии плазмидами, получения рекомбинантных ретровирусов при помощи пакующей клеточной линии, забора вирусных частиц из тканевой культуральной среды и инфекцирования целевых клеток вирусными частицами) приведены в Kriegler, М., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) и Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991). [0258] В одном варианте реализации изобретения вирус является адено- ассоциированным вирусом, двухцепочечным ДНК-вирусом. Адено-ассициированный вирус может быть сконструирован так, чтобы быть дефектным по репликации, и способным инфицировать большое количество типов и видов клеток. Дополнительно он обладает такими преимуществами, как устойчивость к температуре и липидным растворителям; высокие частоты трансдукции в клетках из различных клеточных линий, включая гемопоэтические клетки; и отсутствие ингибирования суперинфекции, что дает возможность осуществления множественных серий трансдукций. Согласно имеющимся сведениям адено-ассоциированный вирус может интегрироваться в человеческую клеточную ДНК сайт-специфическим образом, тем самым минимизируя возможность инсерционного мутагенеза и вариабельность экспрессионных характеристик ретровирусной инфекции вставленного гена. Вдобавок, адено-ассоциированные вирусные инфекции дикого типа претерпели в тканевой культуре более чем 100 переносов в отсутствии селективного давления, что указывает на то, что геномная интеграция адено-ассоциированного вируса является относительно стабильным явлением. Адено-ассоциированный вирус также может функционировать внехромосомным способом. [0259] Другие векторы включают плазмидные векторы. Плазмидные векторы были подробно описаны в данной области техники и хорошо известны специалистам. Смотрите, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. В последние несколько лет было обнаружено, что плазмидные векторы являются исключительно удобными для доставки генов в клетки in vivo благодаря своей неспособности реплицироваться внутри клетки и интегрироваться в геном организма-хозяина. При этом плазмиды имеют промотор, совместимый с клеткой-хозяином, и могут экспрессировать пептид из гена, функционально кодируемого в пределах плазмиды. Некоторые широкоприменяемые плазмиды, предлагаемые частными поставщиками, включают pBR322, pUC18, pUC19, различные плазмиды pcDNA, pRC/CMV, различные плазмиды pCMV, pSV40 и pBlueScript. Дополнительные примеры отдельных плазмид включают pcDNA3.1, номер в каталоге V79020; pcDNA3.1/rnrpo, номер в каталоге V87020; pcDNA4/myc-His, номер в каталоге V86320; и pBudCE4.1, номер в каталоге V53220, предоставляемые все компанией Инвитроген (Карлсбад, Калифорния). Другие плазмиды известны специалистам в данной области техники. Вдобавок, плазмиды могут быть разработаны индивидуально при помощи стандартных методов молекулярной биологии для удаления и/или добавления отдельных фрагментов ДНК. [0260] В одной экспрессионной системе насекомого происхождения, которую можно применять для получения белков, являющихся объектами данного изобретения, для экспрессии чужеродных генов в качестве вектора используется вирус ядерного полигидроза Autographa californica (AcNPV). Вирус выращивается в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая последовательность может быть клонирована в несущественные области (например, ген в форме многогранника) вируса и помещена под управления промотора AcNPV (например, промотора в форме многогранника). Успешная вставка кодирующей последовательности приведет к инактивации гена в форме многогранника и получению невкрапленного рекомбинантного вируса {т.е., вируса с отсутствием белкового покрытия, кодируемого геном в форме многогранника). Эти рекомбинантные вирусы впоследствии применяются для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda, в которых экспрессируется вставленный ген. (смотрите, например, Smith et al. (1983) J Virol 46:584; патент US № 4,215,051). Дополнительные примеры подобной экспрессионной системы можно найти в Ausubel et al., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience. [0261] Другой системой, которую можно применять для получения белков, являющихся объектами данного изобретения, является система генной экспрессии глутамин синтетазы, также называемая "экспрессионной системой ГС" (Lonza Biologies PLC, Berkshire UK). Эта экспрессионная система детально описана в патенте US № 5981216. [0262] В клетках-хозяевах, принадлежащих млекопитающим, может применяться большое количество экспрессионных систем на вирусной основе. В случаях, когда в качестве экспрессионного вектора применяется аденовирус, кодирующая последовательность может быть лигирована к аденовирусному комплексу, управляющему транскрипцией/трансляцией, например, позднему промотору и трехкомпонентной лидерной последовательности. Затем этот химерный ген может быть вставлен в геном аденовируса путем in vitro или in vivo рекомбинации. Вставка несущественной области вирусного генома {например, области Е1 или ЕЗ) приведет к образованию рекомбинантного вируса, который является жизнеспособным и способным экспрессировать пептид в инфицированном организме-хозяине. Смотрите, например, Logan & Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655). В качестве альтернативного варианта может применяться промотор 7.5 К осповакцины. Смотрите, например, Macketteto/. (1982)ProcNatlAcadSciUSA 79:7415; Macketteto/. {\9M)JVirol 49:857; Panicali etal. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927. [0263] Для повышения эффективности производства полинуклеотиды могут быть сконструированы таким образом, чтобы кодировать множественные звенья белка, являющегося объектом данного изобретения, разделенные сайтами расщепления ферментами. Результирующий полипептид может быть расщеплен {например, путем обработки соответствующим ферментом) с целью восстановления звеньев полипептида. Это может увеличить выход полипептидов, управляемых одиночным промотором. При применении в соответствующих вирусных экспрессионных системах управление трансляцией каждого полипептида, кодируемого иРНК, происходит внутри транскрипта, например, осуществляется участком внутренней посадки рибосомы или УВПР. Таким образом, полицистронная конструкция управляет транскрипцией одиночной, крупной полицистронной иРНК, которая, в свою очередь, управляет трансляцией множественных отдельных полипептидов. В этом подходе не используется получение и ферментативный процессинг полипротеинов, что может значительно повысить выход полипептидов, управляемых одиночным промотором. [0264] Применяемые для трансформации векторы обычно будут содержать селектируемый маркер, который используется для идентификации трансформантов. В бактериальных системах они могут включать гены устойчивости к антибиотикам, таким как ампициллин и канамицин. Селектируемые маркеры для применения в культивируемых клетках млекопитающих включают гены, которые придают устойчивость к лекарственным препаратам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемый маркер может быть амплифицируемым селектируемым маркером. Одним из амплифицируемых селектируемых маркеров является ген дегидрофолатредуктазы (ДГФР). SimonsenCCeto/. (1983) ProcNatlAcadSciUSA 80:2495-9. Обзор по селектируемым маркерам сделан Thilly (1986) Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass., а выбор селектируемых маркеров не составит трудности для специалистов в данной области техники. [0265] Селектируемые маркеры могут быть внесены в клетку при помощи отдельной плазмиды одновременно с представляющим интерес геном, либо они могут быть внесены при помощи той же самой плазмиды. В случае применения одной плазмиды селектируемый маркер и представляющий интерес ген могут находиться под управлением разных промоторов или одного и того же промотора, при этом последняя конфигурация приводит к получению двухцистронной иРНК. Конструкции такого типа известны в данной области техники (например, патент US №4713339). [0266] Экспрессионные векторы могут кодировать метки, которые дают возможность легкого выведения рекомбинантно произведенного белка. Примеры включают, но не ограничиваются этим, вектор pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J 2:1791), в котором кодирующие последовательности для экспрессируемого белка могут быть лигированными в вектор в рамку с кодирующей областью lac z таким образом, что это приводит к получению меченного слитого белка; векторы pGEX можно применять для экспрессии белков, являющихся объектами данного изобретения, с глутатион-8-трансферазной (GST) меткой. Обычно эти белки растворимы и легко могут быть выведены из клеток путем адсорбции на глутатион-арагозных гранулах с последующей элюцией в присутствии свободного глутатиона. Векторы содержат сайты расщепления (тромбином или протеазой фактора Ха или PRESCISSION PROTEASE(tm) (Pharmacia, Peapack, N.J.)) для легкого удаления метки после выведения. [0267] Затем экспрессионные векторы трансфицируются или ко-трансфицируются в подходящую клетку-мишень, которая будет экспрессировать полипептиды. Известные в данной области техники трансфекционные методы включают, но не ограничиваются этим, осаждение фосфата кальция (Wigler et al. (1978) Cell 14:725), электропорацию (Neumann et al. (1982) EMBO J 1:841) и реагенты на основе липосом. Для экспрессии описанных в данном тексте белков можно применять большое количество систем хозяи-экспресионный вектор, включая как прокариотические, так и эукариотические клетки. Такие системы включают, но не ограничиваются этим, микроорганизмы, такие как бактерии {например, Е. coli), трансформированные при помощи рекомбинантной ДНК бактериофага или экспрессионных векторов плазмидной ДНК, содержащих соответствующую кодирующую последовательность; дрожжевые или мицелиальные грибы, трансформированные при помощи рекомбинантных дрожжевых или грибных экспрессионных векторов, содержащих соответствующую кодирующую последовательность; клеточные системы насекомого происхождения, инфицированные рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами {например, бакуловируса), содержащими соответствующую кодирующую последовательность; клеточные системы растительного происхождения, инфицированные рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами {например, вируса мозаики цветной капусты или вируса табачной мозаики) или трансформированные при помощи рекомбинантных плазмидных экспрессионных векторов {например, Ti-плазмиды), содержащих соответствующую кодирующую последовательность; или клеточные системы животного происхождения, включая клетки млекопитающих {например, клетки НЕК 293, СНО, Cos, HeLa, НКВП и ВНК). [0268] В одном варианте реализации изобретения клеткой-хозяином является эукариотическая клетка. При употреблении в данном тексте эукариотическая клетка относится к любой животной или растительной клетке, имеющей сформировавшееся ядро. Эукариотические клетки животных включают клетки позвоночных, например, млекопитающих, и клетки беспозвоночных, например, насекомых. Эукариотические клетки растений, в частности, могут без ограничений включать дрожжевые клетки. Эукариотическая клетка отличается от прокариотической клетки, например, бактерии. [0269] В некоторых вариантах реализации изобретения эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего. Клеткой млекопитающего является любая клетка, полученная от млекопитающего. Клетки млекопитающих включают, в частности, но не ограничиваются этим, клеточные линии млекопитающих. В одном варианте реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой человека. ГВ другом варианте реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой НЕК 293, которая принадлежит к клеточной линии из человеческих эмбриональных почек. Клетки НЕК 293 предоставляются под маркировкой CRL-1533 американской коллекцией типовых культур, Манассас, Вирджиния, и под маркировкой клетки 293-Н, Каталог № 11631-017, или клетки 293-F, Каталог № 11625-019 Инвитроген (Карлсбад, Калифорния). В некоторых вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой PER.C6(r), которая принадлежит к человеческой клеточной линии, полученной из сетчатки. Клетки PER.C6(r) предоставляются Crucell (Ляйден, Нидерланды). В других вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой яичников китайского хомячка (СНО - от англ. "Chinese hamster ovary"). Клетки СНО предоставляются американской коллекцией типовых культур, Манассас, Вирджиния, {например, СНО-К1; CCL-61). В других вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой почки новорожденного хомячка (ВНК - от англ. "baby hamster kidney"). Клетки ВНК предоставляются американской коллекцией типовых культур, Манассас, Вирджиния, {например, CRL-1632). В некоторых вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой НКВП, которая представляет гибридную клеточную линию из линий клеток НЕК293 и человеческих В-клеток. Mei et al, Mol.Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006). [0270] В одном варианте реализации плазмида, кодирующая фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, дополнительно содержит селектируемый маркер, например, отвечающий за устойчивость к зеоцину, и трансфицируется в клетки НЕК 293 для продуцирования фрагмента ФВ или химерного белка. [0271] В другом варианте реализации первая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок фактор VIII-Fc, и первый селектируемый маркер, например, ген, отвечающий за устойчивость к зеоцину, и вторая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую фрагмент ФВ-Fc, и второй селектируемый маркер, например, ген, отвечающий за устойчивость к неомицину, котрансфицируются в клетки НЕК 293 для создания гибрида фактор VIII-Fc - фрагмент ФВ-Fc. Первая и вторая плазмиды могут быть внесены в одинаковых количествах {т.е., в соотношении 1:1), либо они могут быть внесены в неодинаковых количествах. [0272] В некоторых вариантах реализации изобретения первая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок фактор VIII-Fc, и первый селектируемый маркер, например, ген, отвечающий за устойчивость к зеоцину, и вторая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую фрагмент ФВ-Fc, и второй селектируемый маркер, например, ген, отвечающий за устойчивость к неомицину, и третья плазмида, содержащая последовательность, кодирующую протеинконвертазу (например, РС5 или фурин), и третий селектируемый маркер, например, ген, отвечающий за устойчивость к гигромицину, котрансфицируются в клетки НЕК 293 для создания гибрида фактор VIII-фрагмент ФВ. Первая и вторая плазмиды могут быть внесены в одинаковых количествах {т.е., в молярном соотношении 1:1), либо они могут быть внесены в неодинаковых количествах. В определенных вариантах реализации изобретения первая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок фактор VIII-Fc, последовательность, кодирующую фрагмент ФВ-Fc, и первый селектируемый маркер, например, ген, отвечающий за устойчивость к зеоцину, и вторая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую протеинконвертазу (например, PC 5 или фурин), и второй селектируемый маркер, например, ген, отвечающий за устойчивость к гигромицину, котрансфицируются в клетки НЕК 293 для создания гибрида фактор VIII-фрагмент ФВ. В одном варианте реализации изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательность ФVIII-Fc и последовательность ФВ-Fc, могут быть соединены для того, чтобы кодировать один единственный полипептид. В другом варианте реализации изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательность ФVIII-Fc и последовательность ФВ-Fc, могут кодировать две полипептидные цепи. Промоторы последовательности, кодирующей слитый белок фактор VIII-Fc, и последовательности, кодирующей фрагмент ФВ-Fc, могут быть разными либо одинаковыми. [0273] В некоторых вариантах реализации изобретения плазмида, содержащая фурин, котрансфицируется с плазмидой, содержащей последовательность, кодирующую ФVIII-Fc, и/или последовательность, кодирующую ФВ-Fc. В некоторых вариантах реализации изобретения белок фурин находится на той же плазмиде, которая содержит последовательность, кодирующую слитый белок ФVIII-Fc. В некоторых вариантах реализации изобретения белок фурин находится на той же плазмиде, которая содержит последовательность, кодирующую фрагмент ФВ-Fc. В некоторых вариантах реализации изобретения белок фурин находится на отдельной плазмиде. [0274] В других вариантах реализации изобретения трансфицированные клетки являются стабильно трансфицированными. Эти клетки могут быть собраны и сохранены в качестве стабильной клеточной линии при помощи традиционных методов, известных специалисту в данной области техники. [0275] Клетки-хозяева, содержащие ДНК-конструкции белка, выращиваются в подходящей питательной среде. Употребляемый в данном тексте термин "подходящая питательная среда" обозначает среду, содержащую питательные вещества, необходимые для роста клеток. Питательные вещества, необходимые для роста клеток, могут включать источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины, минералы и факторы роста. В некоторых случаях среда может содержать один или более селективных факторов. В некоторых случаях среда может содержать телячью сыворотку или фетальную телячью сыворотку (ФТС). В одном варианте реализации изобретения среда практически не содержит IgG. В общем случае питательная среда рассчитана на клетки, содержащие ДНК- конструкцию, при помощи, например, отбора по чувствительности к лекарственному препарату или дефициту незаменимого питательного веществ, которая дополнена селектируемым маркером на ДНК-конструкции или котрансфицируется с ДНК-конструкцией. Культивируемые клетки млекопитающих в общем случае выращивают на коммерчески доступных содержащих сыворотку или бессывороточных средах {например, MEM, DMEM, DMEM/F12). В одном варианте реализации изобретения средой является CD293 (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния). В другом варианте реализации изобретения средой является CD 17 (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния). Выбор среды, подходящей для конкретной применяемой клеточной линии, является стандартным навыком для специалиста в данной области техники. [0276] Для того чтобы экспрессировать фрагмент ФВ и второй гетерологичный компонент или белок ФУШ, клетки-хозяева культивируются в условиях, которые обеспечивают возможность экспрессии фрагмента ФВ и второго гетерологичного компонента или белка ФУШ. Употребляемый в данном тексте термин культивирование относится к сохранению живых клеток in vitro на протяжении по меньшей мере определенного времени. Сохранение может, но не обязательно, включать рост популяции живых клеток. Например, сохраняемые в культуре клетки могут иметь статическую популяцию, но при этом жизнеспособными и способными к продуцированию необходимого продукта, например, рекомбинантного белка или рекомбинантного слитого белка. Условия, подходящие для культивирования эукариотических клеток, хорошо известны в данной области техники и включают подходящий выбор питательной среды, добавок к среде, температуры, уровня рН, насыщения кислородом и тому подобное. В коммерческих целях культивирование может включать использование любых из множества типов систем для расширения масштаба, включая шуттель-аппараты, роллерные флаконы, биореакторы с полыми волокнами, биореакторы с механическим перемешиванием, эрлифтные биореакторы, волновые биореакторы и другие. [0277] Условия культивирования клеток также выбираются таким образом, чтобы обеспечить возможность связывания фрагмента ФВ со вторым гетерологичным компонентом или белком ФУШ. Условия, которые обеспечивают возможность экспрессии фрагмента ФВ и/или белка ФУШ, могут включать наличие источника витамина К. Например, в одном варианте реализации изобретения стабильно трансфицированные клетки НЕК 293 культивируются в среде CD293 (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния) или в среде OptiCHO (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния), дополненной 4 мМ глутамина. [0278] В одном аспекте реализации настоящее изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения фрагмента ФВ, являющегося объектом изобретения, включающему а) трансфекцию клетки-хозяина полинуклеотидом, кодирующим фрагмент ФВ, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии фрагмента ФВ, при этом фрагмент ФВ экспрессируется. В одном варианте реализации изобретение относится к способу получения зрелого белка ФВ или его фрагмента, включающему, а) трансфекцию клетки-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим белок ФВ или его фрагмент, который сшит с пропептидом ФВ, и вторым полинуклеотидом, кодирующим протеинконвертазу, например, РС5, РС7 или фурин, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии зрелого белка ФВ или его фрагмента. Полинуклеотид, кодирующий белок ФВ или его фрагмент, также может быть сшит с препептидом ФВ. Последовательность препептида может отщепляться во время внесения в эндоплазматический ретикулум перед секрецией. [0279] В другом аспекте реализации данное изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, связанный или соединенный с гетерологичным компонентом белка ФУШ, включающему а) трансфекцию одной или более клеток-хозяев полинуклеотидом или группой полинуклеотидов, кодирующими химерный белок, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка. В одном варианте реализации изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения химерного белка, включающему а) трансфекцию клетки-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим фрагмент ФВ, связанный с гетерологичным компонентом, и вторым полинуклеотидом, кодирующим белок ФУШ, связанный с гетерологичным компонентом, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка. Первый полинуклеотид и второй полинуклеотид могут находиться в одном векторе или в двух векторах. В другом варианте реализации изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения химерного белка, включающему а) трансфекцию клетки-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим фрагмент ФВ, связанный с гетерологичным компонентом, вторым полинуклеотидом, кодирующим белок ФУШ, связанный с гетерологичным компонентом, и третьим полинуклеотидом, кодирующим протеинконвертазу, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка. В других вариантах реализации изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения химерного белка, включающему а) трансфекцию клетки-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3, связанный с гетерологичным компонентом, вторым полинуклеотидом, кодирующим белок ФУШ, связанный с гетерологичным компонентом, и третьим полинуклеотидом, кодирующим домен D1 и домен D2 ФВ, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка. В одном варианте реализации изобретения первый полинуклеотид, второй полинуклеотид и третий полинуклеотид могут находиться в одном векторе или в разных векторах. В другом варианте реализации изобретения первый полинуклеотид и второй полинуклеотид могут находиться в одном векторе, а третий полинуклеотид может находиться в другом векторе. В других вариантах реализации изобретения первый полинуклеотид и третий полинуклеотид могут находиться в одном векторе, а второй полинуклеотид может находиться в другом векторе. В некоторых вариантах реализации изобретения второй полинуклеотид и третий полинуклеотид могут находиться в одном векторе, а первый полинуклеотид может находиться в другом векторе. [0280] В дополнительных вариантах реализации изобретения белковый продукт, содержащий фрагмент ФВ или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ, секретируется в среду. Среду отделяют от клеток, концентрируют, фильтруют, а затем пропускают через две или три колонки для аффинной хроматографии, например, колонку протеина А и одну или более анионообменных колонок. [0281] В определенных аспектах реализации настоящее изобретение относится к полипептиду фрагмента ФВ или химерного белка, получаемому описанными в данном тексте способами. [0282] In vitro производство дает возможность для расширения масштаба для получения больших количеств необходимых измененных полипептидов, являющихся объектами данного изобретения. Методы культивирования клеток млекопитающих в условиях тканевого культивирования известны в данной области техники и включают гомогенное суспензионное культивирование, например, в эрлифтном реакторе или реакторе с механическим перемешиванием для непрерывного культивирования, или культивирование иммобилизованных или обездвиженных клеток, например, в полых волокнах, микрокапсулах, на арагозных микрогранулах или пьезокерамических головках. При необходимости и/или при желании растворы полипептидов могут быть очищены при помощи принятых хроматографических методов, например, гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием (ХГВ), хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе или аффинной хроматографии. Фармацевтический состав [0283] Составы, содержащие фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами настоящего изобретения, могут содержать подходящий фармацевтически приемлемый носитель. Например, они могут содержать наполнители и/или вспомогательные вещества, которые способствуют превращению активных компонентов в препараты, предназначенные для доставки в место действия. [0284] Фармацевтический состав может быть приготовленным для парентерального введения (т.е., внутривенного, подкожного или внутримышечного) при помощи болюсной инъекции. Лекарственная форма для инъекции может быть представлена в виде единичной дозировки, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с добавление консерванта. Составы могут иметь вид суспензий, растворов или эмульсий на основе масляных или водных растворителей, и содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества. В альтернативном варианте активный ингредиент может находиться в виде порошка для соединения с подходящим растворителем, например, апирогенной водой. [0285] Подходящие лекарственные формы для парентерального введения также включают водные растворы активных компонентов в водорастворимой форме, например, водорастворимые соли. Вдобавок, могут применяться суспензии активных компонентов в виде подходящих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или среды включают жирные масла, например, кунжутное масло, или эфиры синтетических жирных кислот, например, этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, натриевую карбоксиметилцеллюлозу, сорбитол и декстран. В некоторых случаях суспензия также может содержать стабилизаторы. Также могут использоваться липосомы для инкапсуляции молекул, являющихся объектами данного изобретения, для доставки их в клетки или интерстициальное пространство. Примерами фармацевтически приемлемых носителей являются физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые вещества, изотонические и замедляющие всасывание вещества, вода, солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор, декстроза, глицерол, этанол и тому подобное. В некоторых вариантах реализации изобретения состав содержит изотонические вещества, например, сахара, полиспирты, такие как маннитол, сорбитол, или хлорид натрия. В других вариантах реализации изобретения составы содержат фармацевтически приемлемые вещества, такие как смачивающие вещества, или небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие вещества, консерванты или буферы, которые повышают срок годности или эффективность активных ингредиентов. [0286] Составы, являющиеся объектами данного изобретения, могут находиться в различных формах, включая, например, жидкость (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии, суспензии, полутвердые и твердые дозировочные формы. Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтического применения. [0287] Состав может быть изготовлен в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомной или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного препарата. Стерильные растворы для инъекций можно изготовить путем внесения необходимого количества активного ингредиента в подходящий растворитель, в случае необходимости - с одним или комбинацией вышеперечисленных ингредиентов, с последующей фильтрующей стерилизацией. В общем случае дисперсии изготавливают путем внесения активного ингредиента в стерильный растворитель, который содержит базовую дисперсную среду и другие необходимые ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для изготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами изготовления являются вакуумная сушка и лиофильная сушка, которая на выходе дает порошок из активного ингредиента плюс любой дополнительный необходимый ингредиент из исходного стерильно-отфильтрованного раствора. Необходимую текучесть раствора можно сохранить, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем сохранения необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Пролонгированное всасывание составов для инъекций может быть достигнуто путем включения в состав вещества, которое замедляет всасывание, например, солей моностеарата или желатина. [0288] Активный ингредиент может быть изготовлен так, чтобы иметь форму приспособление для контролируемого высвобождения. Примеры таких лекарственных форм и приспособлений включают импланты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут применяться биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, например, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полилактидная кислота. Способы изготовления таких лекарственных форм и приспособлений известны в данной области техники. Смотрите, например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. [0289] Депо лекарственных препаратов для инъекций может быть создано путем образования микроинкапсулированных матриц препаратов в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения препарата и полимера и природы применяемого полимера можно контролировать скорость высвобождения препарата. Другими примерами биоразлагаемых полимеров являются полиортоэфиры и полиангидриды. Депо лекарственных препаратов для инъекций может быть изготовлено путем заключения препарата в липосомы или микроэмульсии. [0290] В составы могут включаться дополнительные активные соединения. В одном варианте реализации фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, изготавливается вместе с другим фактором свертывания крови или его вариантом, фрагментом, аналогом или производным. Например, факторы свертывания крови включают, но не ограничиваются этим, фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор ГХ, фактор X, фактор XI, фактор XII, фактор XIII, протромбин, фибриноген, фактор Виллебранда или рекомбинантный растворимый тканевой фактор (ррТФ) либо активированные формы любого из предыдущих веществ. Фактор свертывания крови гемостатического средства также может содержать антифибринолитические препараты, например, эпсилон-амино-капроновую кислоту, транексамовую кислоту. [0291] Схемы приема лекарственных препаратов можно подобрать таким образом, чтобы они обеспечивали оптимальные необходимый ответ. Например, можно вводить единичную болюсную дозу, можно вводить несколько отдельных доз в течение продолжительного периода или дозы можно пропорционально уменьшать или увеличивать как того требует терапевтическая ситуация. Парентеральные составы удобно изготавливать в виде единичной дозировки для облегчения введения и постоянства дозировки. Смотрите, например, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980). [0292] Дополнительно к активному соединению жидкая форма дозировки может содержать инертные ингредиенты, такие как вода, этиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бенз иловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, глицерол, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот или сорбитан. [0293] Неограничивающие примеры подходящих фармацевтических носителей также описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences авторства Е. W. Martin. Некоторые примеры наполнителей включают крохмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силиконовый гель, стеарат натрия, глицерол моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерол, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Состав также может содержать рН буферные реагенты и смачивающие или эмульгирующие вещества. [0294] Для перорального введения фармацевтический состав может иметь форму таблеток или капсул, изготовленных стандартными способами. Также состав может быть изготовлен в виде жидкости, например, сиропа или суспензии. Жидкость может содержать суспендирующие вещества {например, сорбитный сироп, производные целлюлозы или гидрогенезированные пищевые жиры), эмульгирующие вещества (лецитин или гуммиарабик), неводные растворители {например, миндальное масло, жирные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты {например, метил или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновую кислоту). Препараты также могут содержать ароматизирующие, окрашивающие вещества и подсластители. В альтернативном варианте состав может представлять собой сухой продукт для соединения с водой либо другим подходящим растворителем. [0295] Для буккального введения состав может иметь форму таблеток или леденцов в соответствии о стандартными протоколами. [0296] ля введения путем ингаляции соединения для применения согласно настоящему изобретению обычно доставляются в форме распыляемого аэрозоля с или без наполнителей или в форме спрей-аэрозоля из аэрозольной упаковки или ингалятора, в некоторых случаях с пропеллентом, например, дихлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафтрометаном, двуокисью углерода или другим подходящим газом. В случае аэрозольной упаковки единичная дозировка может быть определена, если нажатие клапана приводит к выделению дозированного количества вещества. Капсулы и картриджы из, к примеру, желатина, для использования в ингаляторе или инжекторе, можно изготовить с содержанием порошкообразной смеси из соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал. [0297] Также можно изготовить фармацевтический состав для ректального введения в виде суппозитория или микроклизмы с удержанием, например, с содержанием обычных основ для суппозитория, таких как кокосовое масло или другие глицериды. Генная терапия [0298] Фрагмент ФВ или содержащий его химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, могут продуцироваться in vivo в организме млекопитающего, например, пациента-человека, при применении терапевтически эффективных подходов генной терапии в лечении заболевания или нарушения, связанного с кровотечением, выбранного из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. В одном варианте реализации изобретения заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, является гемофилией. В другом варианте реализации изобретения заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, является гемофилией А. Лечение включает введение подходящего фрагмента ФВ или нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный белок, функционально связанной с подходящей управляющей экспрессией последовательностью. В определенном варианте реализации изобретения эти последовательности включены в вирусный вектор. Подходящие вирусные векторы для указанной генной терапии включают аденовирусные векторы, лентивирусные векторы, бакуловирусные векторы, векторы на основе вируса Эпштейна-Барра, паповавирусные векторы, векторы на основе вируса осповакцины, векторы на основе вируса простого герпеса и аденоассоциированные вирусные (ААВ) векторы. Вирусный вектор может являтьться дефектным по репликации вирусным вектором. В других вариантах реализации изобретения аденовирусный вектор содержит делецию в гене Е1 или в гене ЕЗ. При применении аденовирусного вектора организм млекопитающего можно не подвергать обработке нуклеиновой кислотой, кодирующей ген селектируемого маркера. В других вариантах реализации изобретения последовательности включены в невирусный вектр, известный специалистам в данной области техники. Способы применения фрагмента ФВ или химерного белка [0299] Один аспект реализации настоящего изобретения относится к предотвращению или подавлению взаимодействия ФУШ с эндогенным ФВ путем блокирования или экранирования ФВ-связывающего участка на ФУШ от эндогенного ФВ. В одном варианте реализации изобретение относится к способу создания белка ФУШ, который имеет время полужизни большее, чем ФУШ дикого типа, или мономерно-димерного гибрида ФУШ, при этом способ включает ковалентное соединение дополнительного компонента с белком ФУШ, тем самым создавая химерный белок, содержащий белок ФУШ и дополнительный компонент, причем дополнительный компонент экранирует или предотвращает взаимодействие белка ФУШ с эндогенным ФВ. Химерный белок, применяемый в данном способе, включает один или более описанных в данном тексте химерных белков. [0300] Другой аспект реализации изобретения включает способ введения нуждающемуся в этом пациенту белка ФУШ, который имеет время полужизни большее, чем ФУШ дикого типа, или мономерно-димерного гибрида ФУШ, который состоит из двух полипептидных цепей, с первой цепью, состоящей из аминокислотной последовательности, кодирующей ФУШ и Fc-область, и второй цепью, состоящей из Fc-области, при этом способ включает введение описанного в данном тексте фрагмента ФВ или описанного в данном тексте химерного белка пациенту. Аминокислотная последовательность ФУШ в мономерно-димерном гибриде может являться последовательностью ФУШ или ФУШ дикого типа. [0301] В одном варианте реализации изобретение относится к способу применения вспосогательного компонента, например, описанного в данном тексте фрагмента ФВ или химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, для того, чтобы предотвратить или подавить взаимодействие эндогенного ФВ с белком ФУШ. В другом варианте реализации изобретения белок ФУШ, который способен взаимодействовать с фрагментом ФВ, является эндогенным ФУШ. В других вариантах реализации изобретения белок ФУШ, который способен взаимодействовать с фрагментом ФВ, является составом ФУШ, который вводится пациенту отдельно, до или после либо одновременно с фрагментом ФВ или химерным белком, содержащим фрагмент ФВ. В других вариантах реализации изобретения белок ФУШ, который способен связываться с фрагментом ФВ, является составом ФУШ, который вводится пациенту вместе с фрагментом ФВ или химерным белком. В других вариантах реализации изобретения белок ФУШ, который способен связываться с фрагментом ФВ, является ФУШ, присутствующим с фрагментом ФВ или соединенным с фрагментом ФВ в химерном белке. Фрагмент ФВ или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ, связывается или соединен с белком ФУШ и, таким образом, продлевает время полужизни белка ФУШ, связанного с фрагментом ФВ или химерным белком. Белок ФУШ, связанный с фрагментом ФВ или химерным белком экранирован или защищен от процесса выведения ФВ и, таким образом, характерихуется сниженным выведением по сравнению с белком ФУШ, не связанным с фрагментом ФВ или химерным белком. Таким образом, экранированный белок ФУШ имеет большее время полужизни чем белок ФУШ, не связанный или не соединенный с фрагментом ФВ или химерным белком. В определенных вариантах реализации изобретения белок ФУШ, соединенный с или защищенный фрагментом ФВ или химерным белком, являющимися объектами данного изобретения, не выводится клиренс-рецепторами ФВ. В других вариантах реализации изобретения белок ФУШ, соединенный с или защищенный фрагментом ФВ или химерным белком, выводится из системы медленнее, чем белок ФУШ, не соединенный с или не защищенный фрагментом ФВ. [0302] В одном аспекте реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, или содержащий его химерный белок характеризуется сниженным выведение из циркуляции, так как данный фрагмент ФВ или химерный белок не содержит участка связывания клиренс-рецепторов ФВ. Фрагмент ФВ предотвращает или подавляет выведение из системы ФУШ, связанного или соединенного с фрагментом ФВ, в процессе очистки ФВ. Применяемые в настоящем изобретении фрагменты ФВ также могут обеспечивать по меньшей мере одно или более из ФВ-подобных ФУШ-защитных свойств, которые обеспечиваются эндогенным ФВ. В определенных вариантах реализации изобретения фрагменты ФВ также могут маскировать один или более из участков связывания клиренс-рецепторов ФУШ, тем самым предотвращая выведение ФУШ в процессе его собственной очистки. [0303] В другом аспекте реализации фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, можно применять для лечения или предотвращения заболевания или нарушения, связанного с болезнью Виллебранда (БВ) типа 2N. БВ типа 2N является качественным дефектом ФВ, который есть следствием нарушения связывания ФВ с ФУШ и в результате приводит к низким уровням циркулирующего ФУШ. Следовательно, фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, путем связывания с или будучи связанными с белком ФУШ, не только стабилизируют белок ФУШ, но также предотвращают выведение белка ФУШ из циркуляции. [0304] В некоторых вариантах реализации изобретения предотвращение или подавление связывания белка ФУШ с эндогенным ФВ фрагментом ФВ или химерным белком может происходить in vitro или in vivo. [0305] Также предложен способ увеличения времени полужизни белка ФУШ, включающий введение фрагмента ФВ или химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, и белка ФУШ нуждающемуся в этом пациенту. Время полужизни неактивированного ФУШ, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ, в плазме крови составляет от 12 до 14 часов. При БВ типа 3, когда в циркуляции практически отсутствует ФВ, время полужизни ФУШ составляет всего около шести часов, что приводит к появлению у таких пациентов симптомов легкой или умеренной формы гемофилии А по причине пониженных концентраций ФУШ. Время полужизни белка ФУШ, связанного или соединенного с фрагментом ФВ, являющимся объектом настоящего изобретения, может возрастать по меньшей мере приблизительно в 1,5 раз, 1,6 раз, 1,7 раз, 1,8 раз, 1,9 раз, 2,0 раз, 2,1 раз, 2,2 раз, 2,3 раз, 2,4 раз, 2,6 раз, 2,7, раз, 2,8 раз, 2,9 раз, 3,0 раз, 3,1 раз, 3,2 раз, 3,3 раз, 3,4 раз, 3,5 раз, 3,6 раз, 3,7 раз, 3,8 раз, 3,9 раз или 4,0 раз по сравнению со временем полужизни неактивированного ФУШ, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ. В одном варианте реализации изобретения время полужизни белка ФУШ, связанного или соединенного с фрагментом ФВ в химерном белке возрастает по меньшей мере приблизительно в 2 раза, 2,5 раз, 3,0 раз, 3,5 раз, 4,0 раз, 4,5 раз, 5,0 раз, 5,5 раз, 6,0 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз или 10 раз по сравнению со временем полужизни неактивированного ФУШ, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ. В другом варианте реализации изобретения время полужизни белка ФУШ, связанного или соединенного с фрагментом ФВ в химерном белке возрастает в от около 2 до около 5 раз, от около 3 до около 10 раз, от около 5 до около 15 раз, от около 10 до около 20 раз, от около 15 до около 25 раз, от около 20 до около 30 раз, от около 25 до около 35 раз, от около 30 до около 40 раз, от около 35 до около 45 раз по сравнению со временем полужизни неактивированного ФУШ, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ. В конкретном варианте реализации изобретения время полужизни белка ФУШ, связанного или соединенного с фрагментом ФВ в химерном белке возрастает по меньшей мере в около 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 раз по сравнению со временем полужизни ФУШ дикого типа у мышей с двойным ФУШ- и ФВ-генным нокаутом. В некоторых вариантах реализации изобретения время полужизни химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, сшитый с первым гетерологичным компонентом, например, первой Fc-областью, и белок ФУШ, связанный со вторым гетерологичным компонентом, например, второй Fc-областью, превышает время полужизни химерного белка, содержащего белок ФУШ и две Fc-области, где белок ФУШ связан с одной из двух Fc-областей (т.е., мономерно-димерный гибрид ФУШ). В других вариантах реализации изобретения время полужизни химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, сшитый с первым гетерологичным компонентом, например, первой Fc- областью, и белок ФУШ, связанный со вторым гетерологичным компонентом, например, второй Fc-областью, превышает по меньшей мере в около 1,5 раз, 2 раз, 2,5 раз, 3,5 раз, 3,6 раз, 3,7 раз, 3,8 раз, 3,9 раз, 4,0 раз, 4,5 раз или 5,0 раз время полужизни химерного белка, содержащего белок ФУШ и две Fc-области, где белок ФУШ связан с одной из двух Fc-областей (т.е., мономерно-димерный гибрид ФУШ). [0306] В некоторых вариантах реализации результатом изобретения является продление времени полужизни белка ФУШ по сравнению с белком ФУШ без фрагмента ФВ или ФУШ дикого типа. Время полужизни белка ФУШ по меньшей мере в 1,5 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 2,5 раз, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 11 раз или по меньшей мере в 12 раз больше, чем время полужизни белка ФУШ без фрагмента ФВ. В одном варианте реализации изобретения время полужизни ФУШ приблизительно 1,5-20-кратно, приблизительно 1,5-15-кратно или приблизительно 1,5-10 кратно превышает время полужизни ФУШ дикого типа. В другом варианте реализации изобретения время полужизни ФУШ продлено в от около 2 раз до около 10 раз, от около 2 раз до около 9 раз, от около 2 раз до около 8 раз, от около 2 раз до около 7 раз, от около 2 раз до около 6 раз, от около 2 раз до около 5 раз, от около 2 раз до около 4 раз, от около 2 раз до около 3 раз, от около 2,5 раз до около 10 раз, от около 2,5 раз до около 9 раз, от около 2,5 раз до около 8 раз, от около 2,5 раз до около 7 раз, от около 2,5 раз до около 6 раз, от около 2,5 раз до около 5 раз, от около 2,5 раз до около 4 раз, от около 2,5 раз до околоЗ раз, от около 3 раз до около 10 раз, от около 3 раз до около 9 раз, от около 3 раз до около 8 раз, от около 3 раз до около 7 раз, от около 3 раз до около 6 раз, от около 3 раз до около 5 раз, от около 3 раз до около 4 раз, от около 4 раз до около 6 раз, от около 5 раз до около 7 раз или от около 6 раз до около 8 раз по сравнению с ФУШ дикого типа или белком ФУШ без фрагмента ФВ. В других вариантах реализации изобретения время полужизни ФУШ составляет по меньшей мере около 17 часов, по меньшей мере около 18 часов, по меньшей мере около 19 часов, по меньшей мере около 20 часов, по меньшей мере около 21 часа, по меньшей мере около 22 часов, по меньшей мере около 23 часов, по меньшей мере около 24 часов, по меньшей мере около 25 часов, по меньшей мере около 26 часов, по меньшей мере около 27 часов, по меньшей мере около 28 часов, по меньшей мере около 29 часов, по меньшей мере около 30 часов, по меньшей мере около 31 часа, по меньшей мере около 32 часов, по меньшей мере около 33 часов, по меньшей мере около 34 часов, по меньшей мере около 35 часов, по меньшей мере около 36 часов, по меньшей мере около 48 часов, по меньшей мере около 60 часов, по меньшей мере около 72 часов, по меньшей мере около 84 часов, по меньшей мере около 96 часов или по меньшей мере около 108 часов. В других вариантах реализации изобретения время полужизни ФУШ составляет от около 15 часов до около двух недель, от около 16 часов до около одной недели, от около 17 часов до около одной недели, от около 18 часов до около одной недели, от около 19 часов до около одной недели, от около 20 часов до около одной недели, от около 21 часа до около одной недели, от около 22 часов до около одной недели, от около 23 часов до около одной недели, от около 24 часов до около одной недели, от около 36 часов до около одной недели, от около 48 часов до около одной недели, от около 60 часов до около одной недели, от около 24 часов до около шести дней, от около 24 часов до около пяти дней, от около 24 часов до около четырех дней, от около 24 часов до около трех дней или от около 24 часов до около двух дней. [0307] В некоторых вариантах реализации изобретения среднее время полужизни ФУШ у пациента составляет около 15 часов, около 16 часов, около 17 часов, около 18 часов, около 19 часов, около 20 часов, около 21 часа, около 22 часов, около 23 часов, около 24 часов (1 дня), около 25 часов, около 26 часов, около 27 часов, около 28 часов, около 29 часов, около 30 часов, около 31 часа, около 32 часов, около 33 часов, около 34 часов, около 35 часов, около 36 часов, около 40 часов, около 44 часов, около 48 часов (2 дней), около 54 часов, около 60 часов, около 72 часов (3 дней), около 84 часов, около 96 часов (4 дней), около 108 часов, около 120 часов (5 дней), около шести дней, около семи дней (одной недели), около восьми дней, около девяти дней, около 10 дней, около 11 дней, около 12 дней, около 13 дней или около 14 дней. [0308] В конкретном варианте реализации время полужизни химерного белка, являющегося объектом данного изобретения, примерно в два раза больше, чем время полужизни ФУШ дикого типа или ФУШ с удаленным В-доменом. В другом варианте реализации изобретения время полужизни химерного белка примерно в три раза больше, чем время полужизни ФУШ дикого типа или ФУШ с удаленным В-доменом. [0309] В изобретении дополнительно предложен способ лечения или предотвращения заболевания или нарушения, связанного с кровотечением, включающий введение эффективного количества фрагмента ФВ или химерного белка (например, химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, связанный с первым гетерологичным компонентом, например, первой Fc-областью, и белок ФУШ, связанный со вторым гетерологичным компонентом, например, второй Fc-областью, где фрагмент ФВ связан или соединен с белком ФУШ). В одном варианте реализации изобретения заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. В конкретном варианте реализации изобретения заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, является гемофилией А. [0310] Для специалиста в данной области техники будет очевидно, что фрагмент ФВ и химерный белок, содержащий дополнительный компонент, например, описанный в данном тексте фрагмент ФВ, и белок ФУШ, изготовленный согласно изобретению, имеют много применений, включая, но не ограничиваясь этим, способы лечения пациента с нарушением гемостатики и способы лечения нуждающегося в общем гемостатическом средстве пациента. В одном варианте реализации изобретение относится к способу лечения пациента с нарушением гемостатики, включающему введение пациенту терапевтически эффективного количества фрагмента ФВ или химерного белка. [0311] Часть белка ФУШ в составе химерного белка излечивает или предотвращается нарушение гемостатики, выполняя роль кофактора фактору IX на негативно заряженной фосфолипидной поверхности, образуя, тем самым, комплекс Хазы. Связывание активированных факторов свертывания крови с фосфолипидной поверхностью локализирует этот процесс на поврежденных участках сосуда. На фосфолипидной поверхности фактор Villa повышает максимальную скорость активации фактора X фактором 1ха приблизительно в 200,000 раз, что приводит к второй большой волне образования тромбина. [0312] Химерный белок, содержащий дополнительный компонент, например, фрагмент ФВ, и белок ФУШ, можно применять для лечения любого нарушения гемостатики. Нарушения гемостатики, которые могут лечиться введением химерного белка, являющегося объектом данного изобретения, включают, но не ограничиваются этим, гемофилию А, а также дефицит или структурные аномалии в отношении фактора VIII. В одном варианте реализации изобретения нарушение гемостатики является гемофилией А. [0313] Химерный белок, содержащий дополнительный компонент, например, фрагмент ФВ, и белок ФУШ, можно применять профилактически для лечения пациента с нарушением гемостатики. Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, можно применять для лечения острых случаев кровотечения у пациента с нарушением гемостатики. В другом варианте реализации изобретения нарушение гемостатики может быть результатом дефективности фактора свертывания крови, например, фактора Виллебранда. В одном варианте реализации изобретения нарушение гемостатики является наследственным нарушением. В другом варианте реализации изобретения нарушение гемостатики является приобретенным нарушением. Приобретенное нарушение может являться следствием первопричинного заболевания или состояния. Состоянием, не связанным с заболеванием, в качестве примера, но не ограничения, может являться рак, аутоиммунное заболевание или беременность. Приобретенное нарушение может являться следствием преклонного возраста или медикаментозного лечения первопричинного заболевания (например, химиотерапии при раке). [0314] Изобретение также относится к способам лечения пациента, который не имеет врожденного нарушения гемостатики, но имеет первопричинное заболевание или состояние, которое приводит к появлению нарушения гемостатики, например, вследствие выработки антител к ФУШ или хирургической операции. Таким образом, изобретение относится к способу лечения нуждающегося в общем гемостатическом средстве пациента, включающему введение пациенту терапевтически эффективного количества химерного белка, содержащего фрагмент ФВ и белок ФУШ, изготовленного согласно представленным способам. [0315] Настоящее изобретение также относится к способам снижения иммуногенности ФУШ или индуцирования меньшей иммуногенности против ФУШ, сключающим введение эффективного количества описанного в данном тексте фрагмента ФВ, описанных в данном тексте химерных белков или кодирующих их полинуклеотидов. [0316] В одном варианте реализации изобретения пациенту, нуждающемуся в общем гемостатическом средстве, проводят или собираются проводить хирургическую операцию. Химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок ФУШ, можно применять до, во время или после хирургической операции в качестве профилактики. Химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок ФУШ, можно применять до, во время или после хирургической операции для контролирования острых случаев кровотечения. [0317] Химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок ФУШ, можно применять для лечения острых случаев кровотечения у пациента без нарушениея гемостатики. Острые случаи кровотечения могут являться следствием тяжелой травмы, например, хирургической операции, автомобильной катастрофы, ранения, проникающего огнестрельного ранения или любого травматического происшествия, которое приводит к неконтролируемому кровотечению. Неограничивающие примеры случаев кровотечения включают нарушение свертываемости крови, гемартроз, мышечное кровотечение, кровотечение в полости рта, кровоизлияние, кровоизлияние в мышцы, кровоизлияние в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечное кровотечение, внутричерепное кровоизлияние, кровоизлияние в брюшную полость, внутригрудное кровоизлияние, переломы костей, кровотечение в центральной нервной системе, кровотечение в заглоточном пространстве, кровотечение в забрюшинном пространстве, кровотечение во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и любые их комбинации. [0318] При профилактических применениях один или более составов, содержащих химерный белок или фрагмент ФВ, являющиеся объектами данного изобретения, либо их смесь вводят пациенту, у которого еще не наблюдается болезненного состояния, для того, чтобы повысить устойчивость пациента или облегчить симптомы, связанные с заболеванием или нарушением. Такое количество препарата определяется как "эффективная профилактическая доза". При терапевтических применениях иногда требуется относительно высокая дозировка {например, от 1 до 400 мг/кг полипептида на дозу, при этом дозировки в диапазоне от 5 до 25 мг являются более общеупотребимыми для радиоиммуноконьюгатов и более высокие дозы - для полипептидов, модифицированных цитотоксичными препаратами) при относительно коротких интервалах до того времени, пока прогрессирование заболевания снизится или закончится, и пока у пациента не появятся признаки частичного либо полного уменьшения интенсивности симптомов заболевания. После этого пациент может быть переведен на профилактический режим. [0319] В некоторых вариантах реализации химерный белок, фрагмент ФВ или состав, являющиеся объектами данного изобретения, применяются для лечения по требованию, которое включает лечение случая кровотечения, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве или кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. Пациент может нуждаться в оперативной профилактике, периоперативной терапии или лечении для осуществления хирургической операции. Такие хирургические операции включают, например, малые хирургические операции, обширные хирургические операции, удаление зубов, тонзилэктомию, паховое грыжесечение, синовэктомию, полную замену коленного сустава, краниотомию, остеосинтез, травматическую хирургию, внутричерепную хирургию, внутрибрюшинную хирургию, внутригрудную хирургию или операции по протезированию суставов. [0320] В одном варианте реализации изобретения химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок ФУШ, вводится внутривенно, подкожно, внутримышечно или через любую слизистую поверхность, например, перорально, подъязычно, буккально, назально, ректально, вагинально или через легочные дыхательные пути. Химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок ФУШ, может быть находиться в составе или быть связанным с биополимерным твердофазным носителем, что дает возможность медленного высвобождения химерного белка в месте кровотечения, или находиться в составе пропитки бандажа/повязки. Дозировка химерного белка, содержащего фрагмент ФВ и белок ФУШ, будет варьироваться в зависимости от пациента и от конкретно применяемого способа введения. Дозировки могут находиться в диапазоне от 0,1 до 100000 мкг/кг массы тела. В одном варианте реализации изобретения диапазон дозировок составляет 0,1-1000 мкг/кг. В другом варианте реализации изобретения диапазон дозировок составляет 0,1-500 мкг/кг. Белок может вводиться в непрерывном режиме или через определенные временные интервалы. Для определения оптимальных диапазонов дозировок и/или графиков введения препаратов можно применять методы in vitro аналитики. Методы in vitro аналитики для измерения активности фактора свертывания крови известны в данной области техники, например, это анализ коагулирующей активности VIIa-rTF STA-CLOT или анализ коагулирующей активности РОТЭМ. Вдобавок, эффективные дозировки могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных при испытаниях на животных моделях, например, на собаках с гемофилией (Mount et al. 2002, Blood 99(8):2670). [0321] После детального описания настоящего изобретения его содержание станет более понятным с отсылкой на нижеприведенные примеры, которые включены в данный текст исключительно в иллюстративных целях и не ограничивают данное изобретение. Все патенты и публикации, упоминаемые в данном тексте, включены в прямой форме посредством ссылки. Примеры [0322] Во всех примерах, если не указано иное, применяли нижеприведенные материалы и способы. Материалы и способы [0323] В общем случае в осуществлении настоящего изобретения применяют, если не указано иное, общепринятые методы химии, биофизики, молекулярной биологии, рекомбинантной ДНК-технологии, иммунологии (в частности, например, технологии антител) и стандартных методов электрофореза. Смотрите, например, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub. (1999); и Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992). Пример 1: Клонирование различных доменов ФВ (Фигура 1) (а) Клонирование pSYN-ФВ-ОО!, 002, 003 и 004 [0324] pSYN-ФВ от 001 до 004 содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие фрагменты ФВ, которыми являются аминокислоты 1-276 (001), аминокислоты 1-477 (002), аминокислоты 1-511 (003) и аминокислоты 1-716 (004) белковой последовательности ФВ-ОГОЗА. Следующая нумерация аминокислот представляет последовательность зрелого ФВ без пропептида и соответствует аминокислотам 764-1039 (001), аминокислотам 764-1240 (002), аминокислотам 7641274 (003) и аминокислотам 764-1479 (004) из SEQ ID NO: 2, соответственно. Все четыре конструкции содержат сигнальный пептид ФУШ при N-конце, что делает возможной необходимую секрецию синтезированного белка, за которым следует метка 6xHis при С-конце, которая используется для очистки белка. Вышеприведенные конструкции синтезировали при помощи следующих комбинаций праймеров: pSYN <ЈB-001: ESC48- Прям. - ФВ-Б'БЗ с сигналом VIII и сайтом BsiWl TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGC CTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(SEQIDNO: 57) ESC50- Обрати.- ФВ- частичный D'D3 (аминокислоты 1-276) с сайтом 6 His и Notl TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCAGAGGCACTTTTCTGGTG Т С AG С AC AC Т G ( SEQIDNO: 58) pSYN ФВ- 002: ESC48- Прям. - ФВ-Б'БЗ с сигналом VIII и сайтом BsiWl TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGC CTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(SEQIDNO: 59) ESC51- Обрати.- ФВ D'D3 (аминокислоты 1-477) с сайтом 6 His и Notl TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCGGCTCCTGGCAGGCTTCA CAGGTGAGGTTGACAAC(SEQIDNO: 60) pSYNOB-003: ESC48- Прям. - ФВ-Б'БЗ с сигналом VIII и сайтом BsiWl TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGC CTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(SEQIDNO: 61) ESC52- Обратн.-ФВ-Б'БЗ PartialAl (аминокислоты 1-511) с сайтом 6 His и Notl TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCCTGCTGCAGTAGAAATCG TGCAACGGCGGTTC(SEQIDNO: 62) pSYN ФВ- 004: ESC48- Прям. - ФВ-Б'БЗ с сигналом VIII и сайтом BsiWl TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGC CTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(SEQIDNO:63) ESC53-Обрати.- ФВ-БТ)ЗА1 (аминокислоты 1-716) с сайтом 6 His и Notl TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGGCCCACAGTGACTTGTGCC AT GT GGGG(SEQIDNO: 64) Предполагается, что белки из конструкций ФВ-001, 002, 003 и 004 существуют в виде мономера. [0325] Реакцию ПЦР проводили в 50 мкл с комбинациями праймеров ESC 48/ESC50, ESC 48/ESC 51, ESC 48/ESC52, ESC48/ESC53 и полноразмерной ФВ-плазмидой в качестве матрицы, используя двухэтапный цикл ПЦР-амплификации: 94 °С 2 минуты; 21 цикл с (96 °С 30 секунд, 68 °С 2 минуты). Полосы правильного размера (-960 п.н.о. для ФВ 001; 1460 для ФВ 002, 1520 п.н.о. для ФВ 003; и 2150 п.н.о. для ФВ 004) очищали гелем при помощи Gel Extraction kit (Киаген (Qiagen), Валенсия, Калиф.) и клонировали в сайты рестрикции BsiWl и Notl пцДНК 4 для получения pSYN-ФВ 001,002,003 и 004, соответственно, (б) Клонирование pSYN-ФВ-ООб [0326] pSYN-ФВ-ООб содержит домен D1D2D'D3-CK (от англ. "cysteine knot") ФВ. Для клонирования этой конструкции использовали синтез фрагмента ДНК, содержащего часть домена D3 и домена СК (Genscript - идентификационный номер последовательности 122026, показано ниже). Фрагмент конструкции Genscript субклонировали в расщепленную BamHl/EcoRV pSYN-ФВ 008, т.е., вектор, кодирующий полноразмерный ФВ. Genscript-Номер последовательности - 122026 (SEQIDNO: 65) GGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCCCTCAGTGAAATGCAAGAAACGGGTCACCATCCTGGTG GAG G GAG GAGAGAT T GAG С T GT T T GAC G G G GAG GT GAAT GT GAAGAG G С С CAT GAAG GAT GAGAC T CAC T T TGAGGTGGTGGAGTCTGGCCGGTACATCATTCTGCTGCTGGGCAAAGCCCTCTCCGTGGTCTGGGACCGCC ACCTGAGCATCTCCGTGGTCCTGAAGCAGACATACCAGGAGAAAGTGTGTGGCCTGTGTGGGAATTTTGAT GGCATCCAGAACAATGACCTCACCAGCAGCAACCTCCAAGTGGAGGAAGACCCTGTGGACTTTGGGAACTC CTGGAAAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACACCAGAAAAGTGCCTCTGGACTCATCCCCTGCCACCTGCCATA ACAACATCATGAAGCAGACGATGGTGGATTCCTCCTGTAGAATCCTTACCAGTGACGTCTTCCAGGACTGC AACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCTGCATTTACGACACCTGCTCCTGTGAGTCCATTGG GGACTGCGCCTGCTTCTGCGACACCATTGCTGCCTATGCCCACGTGTGTGCCCAGCATGGCAAGGTGGTGA CCTGGAGGACGGCCACATTGTGCCCCCAGAGCTGCGAGGAGAGGAATCTCCGGGAGAACGGGTATGAGTGT GAGTGGCGCTATAACAGCTGTGCACCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCACCCTGAGCCACTGGCCTGCCC TGTGCAGTGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCCTGGATGAGCTTTTGCAGACCT GCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAGGTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCAGGAAAGAAAGTCACC TTGAATCCCAGTGACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGATGTTGTCAACCTCACCTGTGAAGCCTG CCAGGAGCCGGGAGGCCTGGTGGTGCCTCCCACAGATGCCCCGGTGAGCCCCACCACTCTGTATGTGGATG AGAC G С T С CAG GAT G G С T GT GATAC T CAC T T С T G СAAG GT CAAT GAGAGAG GAGAGTAC T T С T G G GAGAAG AGGGTCACAGGCTGCCCACCCTTTGATGAACACAAGTGTCTTGCTGAGGGAGGTAAAATTATGAAAATTCC AGGCACCTGCTGTGACACATGTGAGGAGCCTGAGTGCAACGACATCACTGCCAGGCTGCAGTATGTCAAGG TGGGAAGCTGTAAGTCTGAAGTAGAGGTGGATATС (в) Клонирование pSYN-O> B-009, 010, 011, 012 и 013 [0327] Конструкция pSYN ФВ 008 содержит последовательность полноразмерного ФВ в пцДНК 3.1 (аминокислоты 1-2813 из SEQ ID NO: 2). Она содержит пропептид длиной в 763 аминокислоты (т.е., домены D1D2), за которым следует остальная последовательность из 2050 аминокислот зрелого ФВ. р8УТ\Г-ФВ-009, 010, 011 и 012 содержат одинаковые кодирующие последовательности как и ФВ 001, 002, 003 и 004, соответственно, но дополнительно содержат домены D1D2 (пропептида ФВ) при N-конце вместо сигнального пептида ФУШ. pSYN ФВ 008 содержит сайт BamHl в Arg907 и сайт Notl в конце кодирующей области (после стоп-кодона). pSYN-ФВ-008, 001, 002, 003 и 004 расщепляли рестрикционными ферментами BamHl и Notl. Вставки из pSYN-ФВ-ОО! (423 п.н.о.), pSYN-O> B-002 (1026 п.н.о.), pSYN-ФВ-ООЗ (1128 п.н.о.) и р8УТ\Г-ФВ-004 (1743 п.н.о.) были лигированы в расщепленную bamHl/Notl pSYN-OB-008 (8242 п.н.о.), чтобы получить pSYN-O> B-009 (D1D2D'D3: аминокислоты 1-1039 из SEQ ГО NO: 2); pSYN-ФВ-ОЮ (D1D2D'D3: аминокислоты 1-1240 из SEQ ГО NO: 2); pSYN-ФВ-ОП (D1D2D'D3: аминокислоты 1-1274 из SEQ ГО NO: 2); pSYN-O> B-012 (D1D2D'D3: аминокислоты 1-1479). Все 4 конструкции содержат метку 6xHis при С-конце. В трансфицированных клетках р8УТ\Г-ФВ-009, 010, 011 и 012 синтезируются с пропептидом, но вследствие внутриклеточного процессинга секретируемые продукты не содержат пропептид (D1D2). Белок, экспрессируемый из конструкции ФВ-009, существует в виде мономера, а белки, экспрессируемые из конструкции ФВ-010, 011 и 012, как предполагается, существуют в виде димеров, как показано на фигуре 6 и фигуре 7, где в качестве приверов взяты соответственно ФВ-009 и ФВ-010. [0328] pSYN-ФВ-ОЮ использовали для получения pSYN^B-013, которая содержит две точечные мутации в С336А и С379А, соответствующие SEQ Ш N0: 73 (нумерация аминокислот представляет последовательность зрелого ФВ без ФВ последовательности 2 доменов D1D2). Эти мутации должны предотвращать димеризацию домена D'D3 ФВ. (г) Клонирование pSYN-O> B-025 и 029 [0329] pSYN^B-025 содержит D1D2D'D3 последовательности дикого типа полноразмерного ФВ в векторе pLIVE, в то время как pSYN^B-029 содержит домены D1D2D'D3 с мутациями С336А/С379А в векторе pLIVE. Для клонирования pSYN^B-025 и 029 использовали следующие комбинации праймеров: ESC 89-прям. с сайтом Nhe 1=С Т С AC Т AT AG G GAGAC С CAAG С T G G С TAG С С G( SEQIDNO: 66) ESC 91-обрати, с Sail= CTGGATCCCGGGAGTCGACTCGTCAGTGGTGATGGTGATGATG(SEQIDNO: 67) [0330] Реакцию ПЦР проводили в 50 мкл с комбинациями праймеров ESC 89/ESC91 и плазмидами pSYN-ФВ-ОЮ (для pSYN-O> B-025) или pSYN-0> B-013 (для pSYN-ФВ-029) в качестве матрицы, используя трехэтапный цикл ПЦР-амплификации: 94 °С -2 минуты; 21 цикл с (96 °С -30 секунд, 55 °С - 30 секунд, 68 °С - 4 минуты). Полосу с ожидаемым размером (-3800 п.н.о.) очищали гелем при помощи Gel Extraction kit (Киаген (Qiagen), Валенсия, Калиф.) и клонировали в рестрикционные сайты Nhel и Sail вектора pLIVE-Mirus (Инвитроген, Карлсбад, Калиф.) для получения pSYN-ФВ-025 и 029. (д) Клонирование pSYN-ФВ-ОЗ! [0331] pSYN-ФВ-ОЗ! является D1D2D'D3(C336A/C379A)-Fc конструкцией, котораясодержиттромбин-отщепляемыйлинкердлинойв 48 аминокислот (8х GGGGS (SEQ Ш NO: ПО) + тромбин-сайт) междупоследовательностямиФВ D1D2D'D3(C336A/C379A) и Fc. Для создания этой конструкции область ФВ-Fc амплифицировали из конструкции pSYN^VTII-064 (смотрите нижеприведенную конструкцию ФУТД-ФВ). рБУК-ФУШ-ФВ расщепляли Xbal и Nhel. Полученную область вставки в 4165 п.н.о., содержащую фрагмент ФВ и Fc-область, использовали в качестве матрицы для амплификации ФВ и Fc-области при помощи комбинаций праймеров LW 22/LW23. LW 22-ПРЯМ.-ФВ-0'ВЗ с сигнальными последовательностями ФУШ и сайтом BsiWl GCGCCGGCCGTACGATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGC GATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(SEQroNO: 68) LW 23-Обратн.- Fc со стоп-кодоном и сайтом Notl TCATCAATGTATCTTATCATGTCTGAATTCGCGGCCGCTCATTTACC(SEQIDNO: 69) Нуклеотидная последовательность ФВ 031 (SEQIDNO: 108) 1 ATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTCTGGCCCTCATTTT 51 GCCAGGGACCCTTTGTGCAGAAGGAACTCGCGGCAGGTCATCCACGGCCC 101 GATGCAGCCTTTTCGGAAGTGACTTCGTCAACACCTTTGATGGGAGCATG 151 TACAGCTTTGCGGGATACTGCAGTTACCTCCTGGCAGGGGGCTGCCAGAA 2 01 ACGCTCCTTCTCGATTATTGGGGACTTCCAGAATGGCAAGAGAGTGAGCC 2 51 TCTCCGTGTATCTTGGGGAATTTTTTGACATCCATTTGTTTGTCAATGGT 3 01 ACCGTGACACAGGGGGACCAAAGAGTCTCCATGCCCTATGCCTCCAAAGG 351 GCTGTATCTAGAAACTGAGGCTGGGTACTACAAGCTGTCCGGTGAGGCCT 4 01 ATGGCTTTGTGGCCAGGATCGATGGCAGCGGCAACTTTCAAGTCCTGCTG 4 51 Т СAGACAGATАС Т Т СAACAAGAC CTGCGGGCTGTGTGG СAAC Т Т ТAACAT 501 CTTTGCTGAAGATGACTTTATGACCCAAGAAGGGACCTTGACCTCGGACC 551 CTTATGACTTTGCCAACTCATGGGCTCTGAGCAGTGGAGAACAGTGGTGT 601 GAACGGGCATCTCCTCCCAGCAGCTCATGCAACATCTCCTCTGGGGAAAT 651 GCAGAAGGGCCTGTGGGAGCAGTGCCAGCTTCTGAAGAGCACCTCGGTGT 7 01 TTGCCCGCTGCCACCCTCTGGTGGACCCCGAGCCTTTTGTGGCCCTGTGT 7 51 GAGAAGACTTTGTGTGAGTGTGCTGGGGGGCTGGAGTGCGCCTGCCCTGC 8 01 CCTCCTGGAGTACGCCCGGACCTGTGCCCAGGAGGGAATGGTGCTGTACG 8 51 GCTGGACCGACCACAGCGCGTGCAGCCCAGTGTGCCCTGCTGGTATGGAG 9 01 TATAGGCAGTGTGTGTCCCCTTGCGCCAGGACCTGCCAGAGCCTGCACAT 951 CAATGAAATGTGTCAGGAGCGATGCGTGGATGGCTGCAGCTGCCCTGAGG 10 01 GACAGCTCCTGGATGAAGGCCTCTGCGTGGAGAGCACCGAGTGTCCCTGC 1051 GTGCATTCCGGAAAGCGCTACCCTCCCGGCACCTCCCTCTCTCGAGACTG 1101 СAACАС С Т G CAT Т Т G С С GAAACAG С СAGT G GAT С Т G CAG CAAT GAAGAAT 1151 GTCCAGGGGAGTGCCTTGTCACTGGTCAATCCCACTTCAAGAGCTTTGAC 12 01 AACAGATACTTCACCTTCAGTGGGATCTGCCAGTACCTGCTGGCCCGGGA 12 51 TTGCCAGGACCACTCCTTCTCCATTGTCATTGAGACTGTCCAGTGTGCTG 13 01 ATGACCGCGACGCTGTGTGCACCCGCTCCGTCACCGTCCGGCTGCCTGGC 1351 CTGCACAACAGCCTTGTGAAACTGAAGCATGGGGCAGGAGTTGCCATGGA 14 01 TGGCCAGGACATCCAGCTCCCCCTCCTGAAAGGTGACCTCCGCATCCAGC 14 51 ATACAGTGACGGCCTCCGTGCGCCTCAGCTACGGGGAGGACCTGCAGATG 15 01 GACTGGGATGGCCGCGGGAGGCTGCTGGTGAAGCTGTCCCCCGTCTATGC 1551 CGGGAAGACCTGCGGCCTGTGTGGGAATTACAATGGCAACCAGGGCGACG 1601 ACTTCCTTACCCCCTCTGGGCTGGCGGAGCCCCGGGTGGAGGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGAAGCTGCACGGGGACTGCCAGGACCTGCAGAAGCAGCACAG 17 01 CGATCCCTGCGCCCTCAACCCGCGCATGACCAGGTTCTCCGAGGAGGCGT 17 51 GCGCGGTCCTGACGTCCCCCACATTCGAGGCCTGCCATCGTGCCGTCAGC 18 01 CCGCTGCCCTACCTGCGGAACTGCCGCTACGACGTGTGCTCCTGCTCGGA 18 51 CGGCCGCGAGTGCCTGTGCGGCGCCCTGGCCAGCTATGCCGCGGCCTGCG 19 01 CGGGGAGAGGCGTGCGCGTCGCGTGGCGCGAGCCAGGCCGCTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGAAAGGCCAGGTGTACCTGCAGTGCGGGACCCCCTGCAACCT 2 0 01 GACCTGCCGCTCTCTCTCTTACCCGGATGAGGAATGCAATGAGGCCTGCC 2 051 TGGAGGGCTGCTTCTGCCCCCCAGGGCTCTACATGGATGAGAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCAAGGCCCAGTGCCCCTGTTACTATGACGGTGAGATCTTCCA 2151 G С СAGAAGACAT С T T С T СAGAC CATСАСАССАТ GT GCTACT GTGAGGAT G 22 01 GCTTCATGCACTGTACCATGAGTGGAGTCCCCGGAAGCTTGCTGCCTGAC 22 51 GCTGTCCTCAGCAGTCCCCTGTCTCATCGCAGCAAAAGGAGCCTATCCTG 2 3 01 TCGGCCCCCCATGGTCAAGCTGGTGTGTCCCGCTGACAACCTGCGGGCTG 2 351 AAGGGCTCGAGTGTACCAAAACGTGCCAGAACTATGACCTGGAGTGCATG 2 4 01 AGCATGGGCTGTGTCTCTGGCTGCCTCTGCCCCCCGGGCATGGTCCGGCA 2 4 51 TGAGAACAGATGTGTGGCCCTGGAAAGGTGTCCCTGCTTCCATCAGGGCA 2 5 01 AGGAGTATGCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCAACACTTGTGTC 2 551 TGTCGGGACCGGAAGTGGAACTGCACAGACCATGTGTGTGATGCCACGTG 2 601 CTCCACGATCGGCATGGCCCACTACCTCACCTTCGACGGGCTCAAATACC 2 651 TGTTCCCCGGGGAGTGCCAGTACGTTCTGGTGCAGGATTACTGCGGCAGT 2 7 01 AACCCTGGGACCTTTCGGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCC 2 7 51 С T СAGT GAAAT G СAAGAAAC G G GT CAC CAT С С T G GT G GAG G GAG GAGAGA 2 8 01 TTGAGCTGTTTGACGGGGAGGTGAATGTGAAGAGGCCCATGAAGGATGAG 2 8 51 ACTCACTTTGAGGTGGTGGAGTCTGGCCGGTACATCATTCTGCTGCTGGG 2 901 CAAAGCCCTCTCCGTGGTCTGGGACCGCCACCTGAGCATCTCCGTGGTCC 2 951 TGAAGCAGACATACCAGGAGAAAGTGTGTGGCCTGTGTGGGAATTTTGAT 3 0 01 G G CAT С СAGAACAAT GAC С T CAC CAG CAG CAAC С T С СAAGT G GAGGAAGA 3 051 CCCTGTGGACTTTGGGAACTCCTGGAAAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACA 3101 CCAGAAAAGTGCCTCTGGACTCATCCCCTGCCACCTGCCATAACAACATC 3151 AT GAAG СAGAC GAT G GT G GAT T С С T С С T GTAGAAT С С T TAC СAGT GAC GT 32 01 CTTCCAGGACTGCAACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCT 32 51 GCATTTACGACACCTGCTCCTGTGAGTCCATTGGGGACTGCGCCGCATTC 33 01 TGCGACACCATTGCTGCCTATGCCCACGTGTGTGCCCAGCATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGGAGGACGGCCACATTGTGCCCCCAGAGCTGCGAGGAGAGGA 34 01 ATCTCCGGGAGAACGGGTATGAGGCTGAGTGGCGCTATAACAGCTGTGCA 34 51 CCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCACCCTGAGCCACTGGCCTGCCCTGT 35 01 GCAGTGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCCTGG 3551 ATGAGCTTTTGCAGACCTGCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAG 3 601 GTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCAGGAAAGAAAGTCACCTTGAATCCCAG 3 651 TGACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGATGTTGTCAACCTCACCT 37 01 GTGAAGCCTGCCAGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGG 37 51 GGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATC 38 01 CGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGCGGTGGAGGTTCCG 3 8 51 GTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCA 3 9 01 GAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA 3 951 CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACG 4 0 01 TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG 4 051 GAG GT G СATAAT G С СAAGACAAAG С С G С G G GAG GAG СAGTACAACAG CAC 4101 GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATG 4151 G CAAG GAGTACAAGT G СAAG GT С T С СAACAAAG С С CT С С CAG С С С С CAT С 42 01 GAGAAAAC CAT С Т С СAAAG С СAAAG G G CAG С С С С GAGAAC СACAG GT GTА 42 51 CACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA 4 3 01 CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAG 4 351 AGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGA 4 4 01 CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA 4 4 51 GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG 4 5 01 CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Белковая последовательность ФВ 031 (SEQIDNO: 109) 1 MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSM 51 YSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIGDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWC 2 01 ERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALC 251 EKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCPAGME 301 YRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPC 351 VHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFD 4 01 NRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKHGAGVAMDGQDIQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGD 7 01 CVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECM 8 01 SMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDE 951 THFEWESGRYIILLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFD 10 01 GIQNNDLTS SNLQVEEDPVDFGNSWKVS SQCADTRKVPLDS S PATCHNNI 1051 MKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYEAEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCE 12 01 VAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVWLTCEACQEP IS GGGGS GGG 12 51 GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAP 13 01 ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGV 1351 EVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI 14 01 EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE 14 51 SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL 1501 HNHYTQKSLS LSPGK* Конструкция ДНК Линкер между ФВ Fc ФВ035 73 ак= IS{11X(GGGGS)}LVPRGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 96) ФВ036 98 ак= IS{16X(GGGGS)}LVPRGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 97) ФВ= D'D3 (ак 1-477 с С336А/С379А) [0332] Продукт ПЦР, полученный амплификацией LW22/LW23 (-2300 п.н.о.) клонировали в расщепляемую BsiWl/Notl pSYN-OB-002 для получения промежуточного продукта pSYN-OB-014. pSYN-OB-014 содержит 20-аминокислотный тромбин-отщепляемый линкер между сигнальным пептидом ФУШ и D'D3, за которым следует Fc-область. [0333] Для создания конструкции D1D2D'D3-Fc область D1D2D'D3 амплифицировали обычным ПЦР-методом из pSYN-OB-013, используя комбинацию праймеров LW24/LW27. LW24- Прям.- ФВ D1D2D'D3 клонирующий олиго с сайтом BsiWl GCGCCGGCCGTACGATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTG(SEQroNO: 70) LW27-06paTH.-OB D'D3 олигосЕсоЯУ CCACCGCCAGATATCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAG (SEQ Ш N0:71) [0334] Продукт ПЦР, полученный амплификацией LW22/LW23 (-3750 п.н.о.) клонировали в расщепляемую BsiWl/EcoRV pSYN-OB-014 для получения промежуточного продукта pSYN-OB-015. Длина линкера между фрагментом ФВ и Fc-областью изменили, чтобы получить pSYN-OB-031. [0335] Белковая последовательность полноразмерного ФВ приведена в Таблице 1. Белковая последовательность OB-DlD2D'D3 16 (SEQIDNO: 72) 1 MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFWTFDGSM 51 YSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIGDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWC 2 01 ERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALC 251 EKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCPAGME 301 YRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPC 351 VHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFD 4 01 NRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKHGAGVAMDGQDIQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGD 7 01 CVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECM 8 01 SMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDE 951 THFEWESGRYIILLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFD 10 01 GIQNNDLTS SNLQVEEDPVDFGNSWKVS SQCADTRKVPLDS S PATCHNNI 1051 MKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACF 1101 CDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCE 12 01 VAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEP* Белковая последовательность OB-D'D3 2 (SEQIDNO: 73) 1 SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPG 51 MVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCRDRKWNCTDHVC 101 DATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKG 151 CSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDETHFEWESGRYII 2 01 LLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQNNDLTSSNLQ 251 VEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRIL 301 TSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQ 351 HGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPL 4 01 ACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVT 451 LNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEP Пример 2: Гетеродимерные конструкции, содержащие OVIII-Fc и OB-D'D3 домен при аминоконце второй цепи Fc (гетеродимер OVIII-OB-Fc, Фигура 2) (а) Клонирование pSYN-OVIII-064 [0336] Плазмида OVIII-064 содержит одноцепочечный остов FC (scFc) с сайтами расщепления ферментами, которые процессируются во время синтеза в клетке. Конструкция содержит OVIII-связывающий домен полноразмерного ФВ (D'D3). [0337] Плазмида (pSYN-OVIII-064) была сконструирована для экспрессии гетеродимера OVIII-Fc и ФВ-Fc, в котором домены D'D3 предназначены для связывания OVIII и предотвращения взаимодействия OVIII с фосфолипидами и К заявке, выделенной из заявки № 201491186 активированным протеином С и/или предотвращения или подавления связывания с эндогенным ФВ. Белок из pSYN-OVIII-064 экспрессируется в клетке в виде одиночного полипептида, где С-конец субъединицы OVIII-Fc связан с N-концом субъединицы ФВ D'D3-Fc посредством полипептидного линкера 6х (GGGGS) (SEQ Ш NO: 74). Дополнительно в 5' и 3' концы полипептидного линкера были вставлены последовательности RRRRS (SEQ ID N0: 75) и RKRRKR (SEQ ГО N0: 76) соответственно, для внутриклеточного расщепления пропротеинконвертазами сразу после последнего Arg в каждой последовательности. Следовательно, клетки могут экспрессировать двухцепочечный гетеродимер OVIII-Fc/D'D3-Fc, в котором цепь OVIII-Fc содержит последовательность RRRRS (SEQ ГО N0: 75) в С-конце, но при это остаток последовательности линкера удален. Другой полипептидный линкер Зх (GGGGS) (SEQ ГО N0: 28) вместе с сайтом расщепления тромбином вставляли между доменами ФВ и Fc-областью для того, чтобы способствовать отделению фрагмента ФВ от ФVIII в случае активации гетеродимерного белка ФVIII-ФB тромбином, которая делает возможным взаимодействие ФУШ с другими факторами свертывания крови. [0338] Проводили синтез фрагментов ДНК, содержащих часть первой Fc-области, за которой следует 6х (GGGGS) (SEQ ГО NO: 74), домен ФВ-Б'БЗ domain (ак 1-477; мутация С336А/С379А), Зх (GGGGS) (SEQ ГО N0:28), сайт расщепления тромбином и часть второй Fc-области (Genscript-номер последовательности 103069, показана ниже). Фрагмент конструкции Genscript субклонировали в расщепляемую Sall/RsRII pSYN^VIII-049, которая являетсяконструкцией ФУШ-Рс с отщепляемым линкером между двумя Fc-доменами. Genscript-номер последовательности 103069 (SEQ ГО N0: 82): CCGTCGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAACGGCGCCGCCGGAGCGGTGGCGGCGGATCAGG TGGGGGTGGATCAGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGGGGTGGAT CAAGGAAGAGGAGGAAGAGAAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATGGTCAAGCTGGTGTGTCCCGCTGACAAC CTGCGGGCTGAAGGGCTCGAGTGTACCAAAACGTGCCAGAACTATGACCTGGAGTGCATGAGCATGGGCTG TGTCTCTGGCTGCCTCTGCCCCCCGGGCATGGTCCGGCATGAGAATCGATGTGTGGCCCTGGAAAGGTGTC CCTGCTTCCATCAGGGCAAGGAGTATGCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCAACACTTGTGTCTGT CGGGACCGGAAGTGGAACTGCACAGACCATGTGTGTGATGCCACGTGCTCCACGATCGGCATGGCCCACTA CCTCACCTTCGACGGGCTCAAATACCTGTTCCCCGGGGAGTGCCAGTACGTTCTGGTGCAGGATTACTGCG GCAGTAACCCTGGGACCTTTCGGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCCCTCAGTGAAATGCAAG AAACGGGTCACCATCCTGGTGGAGGGAGGAGAGATTGAGCTGTTTGACGGGGAGGTGAATGTGAAGAGGCC CATGAAGGATGAGACTCACTTTGAGGTGGTGGAGTCTGGCCGGTACATCATTCTGCTGCTGGGCAAAGCCC TCTCCGTGGTCTGGGACCGCCACCTGAGCATCTCCGTGGTCCTGAAGCAGACATACCAGGAGAAAGTGTGT GGCCTGTGTGGGAATTTTGATGGCATCCAGAACAATGACCTCACCAGCAGCAACCTCCAAGTGGAGGAAGA CCCTGTGGACTTTGGGAACTCCTGGAAAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACACCAGAAAAGTGCCTCTGGACT CATCCCCTGCCACCTGCCATAACAACATCATGAAGCAGACGATGGTGGATTCCTCCTGTAGAATCCTTACC AGTGACGTCTTCCAGGACTGCAACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCTGCATTTACGACAC CTGCTCCTGTGAGTCCATTGGGGACTGCGCCGCATTCTGCGACACCATTGCTGCCTATGCCCACGTGTGTG CCCAGCATGGCAAGGTGGTGACCTGGAGGACGGCCACATTGTGCCCCCAGAGCTGCGAGGAGAGGAATCTC CGGGAGAACGGGTATGAGGCTGAGTGGCGCTATAACAGCTGTGCACCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCA CCCTGAGCCACTGGCCTGCCCTGTGCAGTGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCC TGGATGAGCTTTTGCAGACCTGCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAGGTGGCTGGCCGGCGTTTT GCCTCAGGAAAGAAAGTCACCTTGAATCCCAGTGACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGATGTTGT CAACCTCACCTGTGAAGCCTGCCAGGAGCCGATCGATGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCCTGG TCCCCCGGGGCAGCGGAGGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGA CCGTCA (б) Клонирование pSYN-OVIII-065 [0339] Плазмида OVIII-065 содержит первые 276 аминокислот домена D'D3 ФВ, присоединенные ко второй Fc-области. Фрагмент ФВ амплифицировали при помощи ПЦР из полноразмерной плазмиды pSYN^B-008, используя комбинации праймеров ESC17 и ESC41. Е8С17-Прям.- ФВ клонирующий олиго с Clal GTCCGGCATGAGAATCGATGTGTG(SEQIDNO: 77) ESC41- Обрати.-ФВ с EcoRV С С Т С С АС С G С С AGAT AT С AGAG G CAC T T T T С (SEQIDNO: 78) [0340] Полосусожидаемымразмером (-692 п.н.о.) очищалигелемприпомощи Gel Extraction kit (Киаген (Qiagen), Валенсия, Калиф.) иклонироваливсайты Clal и EcoRV pSYN^VIII-064 дляполучения pSYN^VIII-065. Пример 3: Клонирование pSYN^VIII-159, 160, 178, 179 (Фигура 3) [0341] С целью изменения длины линкера между фрагментом ФВ и Fc-областью в месте соединения ФВ и начала 20-аминокислотного линкера в pSYN^VIII-064 вставляли сайт EcoRV, затем линкеры переменной длины использовали для замещения 20-ак линкера в pSYN^VIII-064. Новыми конструкциями ДНК являются: pSYN^VIII-159, 160, 178 и 179, которые содержат 35-ак, 48-ак, 73-ак и 98-ак линкеры соотвественно. [0342] Для того чтобы вставить 35-аминокислотный линкер в pSYN^VIII-159 были заказаны два олиго (ESC78- 105 п.н.о. и ESC79 -107 п.н.о.) от Integrated DNA Technologies, Inc (Коралвилль, Айова). Олиго ренатурировали и продлевали при помощи стандартного метода ПЦР. Праймеры: ESC78- Прям, с сайтом EcoRV AAAGTGCCTCTGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGG GGATCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGG (SEQ Ш NO: 79) ESC79- Обрати, с сайтом RsRII GAAGAGGAAGACTGACGGTCCGCCCAGGAGTTCTGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGT GTGAGTTTTGTCGCCTCCGCTGCCCCGGGGGACCAGGGATCCCCCGCCAC (SEQ Ш NO: 80) [0343] Реакцию ПЦР по ренатурированию и продлению олиго проводили в 50 мкл с комбинациями праймеров ESC78/ESC79, используя трехэтапный цикл ПЦР-амплификации: 25 циклов с (96° С 30 секунд, 55° С 30 секунд, 68° С 30 секунд). Полосу с ожидаемым размером (-186 п.н.о.) очищали гелем при помощи Gel Extraction kit (Киаген (Qiagen), Валенсия, Калиф.) и клонировали в рестрикционные сайты EcoRV и RsRII pSYN-OVIII-064 для получения pSYN-OVIII-159. (б) Клонирование pSYN-OVIII-160, 178 и 179 [0344] pSYN-VIII-160 содержит 48-аминокислотный линкер между фрагментом ФВ и Fc-областью. Проводили синтез фрагмента ДНК, кодирующего 48- аминокислотный линкер (ISGG GGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS LVPRGS GGGGS GGGGS) (SEQ Ш NO: 81) и часть Fc-области (Genscript-Последовательность номер-132601, показана ниже). Фрагмент конструкции Genscript субклонировали в расщепляемую EcoRV/RsRII pSYN^VIII-0159 (упомянуто выше). Genscript-Последовательность номер-132601 (SEQ Ш NO: 83) AAAGTGCCTCTGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGGTGG AGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGCGGTGGAGGTTCCG GTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCA GTCTTCC [0345] SYN-VIII-178 содержит 73-аминокислотный линкер между фрагментом ФВ и Fc-областью. Проводили синтез фрагмента ДНК, кодирующего 73-аминокислотный линкер {ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVP RGSGGGGSGGGGS) (SEQ Ш NO: 84) и часть Fc-области (Genscript-Последовательность номер-144849, показано ниже). Фрагмент конструкции Genscript субклонировали в расщепляемую EcoRV/RsRII pSYN^VIII-0159 (упомянуто выше). Genscript-Последовательность номер-144849 (SEQ Ш NO: 85) GCCTGCCAGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGG TGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCG GCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGCGGTGGA GGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCCCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGA CCGTCAGTCTTCCTC [0346] SYN-VIII-179 содержит 98-аминокислотный линкер между фрагментом ФВ и Fc-областью. Проводили синтез фрагмента ДНК, кодирующего 98-аминокислотный линкер (ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGS) (SEQ Ш N0 86) И часть Fc-области (Genscript-Последовательность номер-144849, показано ниже). Фрагмент конструкции Genscript субклонировали в расщепляемую EcoRV/RsRII pSYN^VIII-0159 (упомянуто выше). Genscript-Последовательность номер-144849 (SEQ Ш N0:87) GCCTGCCAGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGG TGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCG GCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGT TCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGCGG TGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGG GCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCC Клонирование pSYN^VIII-l80, 181 и 182 [0347] pSYN^VIII-180, 181 и 182 получали из pSYN^VIII-160. В pSYN^VIII- 160FVIII в домен С1 ФУШ вносили мутации К2093А или F2093A или K2093A/F2093A для создания соответственно pSYN^VIII-180, pSYN^VIII-181 и pSYN^VIII-182. Белковая последовательность гетеродимера ФУШ-ФВ-Рс (SEQIDNO: 88) [0348] (аминокислотные позиции 1-1457 последовательности ФУШ; область, выделенная подчеркиванием, представляет Fc-область; выделение подчеркиванием волнистой линией представляет отщепляемый линкер между первой Fc-областью и фрагментом ФВ; выделенная двойным подчеркиванием область представляет фрагмент ФВ; выделенная жирным шрифтом область представляет отщепляемый линкер переменной длины между фрагментом ФВ и Fc. Длина линкера отличается для конструкций ФУШ-064, 159, 160, 178 и 179). 1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP К заявке, выделенной из заявки № 201491186 51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY 101 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 4 01 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE 801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG 851 SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF 901 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP 951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE 1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI 1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL 1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL 1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL 1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV 1251 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS 1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQWN 1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF 1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG 14 51 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW 15 01 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW 1551 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV 1601 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 1651 KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGKRRRRSG JiGiiSGJ^GGSG 1701 ^iS^GGGSG^ JiGGSGGGGS^ KRRKRSLSCR PPMVKLVCPA DNLRAEGLEC 1751 TKTCONYDLE CMSMGCVSGC LCPPGMVRHE NRCVALERCP CFHOGKEYAP 1801 GETVKIGCNT CVCRDRKWNC TDHVCDATCS TIGMAHYLTF DGLKYLFPGE 1851 CQYVLVQDYC GSNPGTFRIL VGNKGCSHPS VKCKKRVTIL VEGGEIELFD 1901 GEVNVKRPMK DETHFEWES GRYIILLLGK ALSWWDRHL SISWLKQTY 1951 OEKVCGLCGN FDGIONNDLT SSNLOVEEDP VDFGNSWKVS SOCADTRKVP 2001 LDSSPATCHN NIMKOTMVDS SCRILTSDVF ODCNKLVDPE PYLDVCIYDT 2051 CSCESIGDCA AFCDTIAAYA HVCAQHGKW TWRTATLCPQ SCEERNLREN 2101 GYEAEWRYNS CAPACQVTCQ HPEPLACPVQ CVEGCHAHCP PGKILDELLQ 2151 TCVDPEDCPV CEVAGRRFAS GKKVTLNPSD PEHCQICHCD WNLTCEACQ 2201 EPIDGGGGSG GGGSLVPRGS GGDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK 2251 DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS 2301 TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV 2351 YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 2401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK Пример 4: ПримерДНК-конструкцийФУШ-ФВ (Фигура 4) [0349] Фрагмент ФВ и белок ФУШ могут быть связаны вместе посредством линкера или другого белка, или полипептида при помощи общепринятых рекомбинантных ДНК-технологий, как показано на Фигуре 4. На Фигуре 4А домен D1D2D'D3 ФВ связан с белком ФУШ посредством 48-ак линкера ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 89)и защищает ФУШ от преждевременного выведения. Для того, чтобы дополнительно увеличить ФУШ-защитную активность D'D3 в конструкцию можно включить другой белок или полипептид, который обладает свойством продления времени полужизни, такой как альбумин или последовательность PAS (гетерологичные компоненты). Гетерологичный компонент, например, белок альбумина или последовательность PAS можно вносить в различные позиции молекулы ФУШ; несколько примеров показано на Фигуре 4Б-4Г: в N-конце ФУШ (4Б), в С-конце ФУШ (4В) или в В-области (4Г). В этих конструкциях дополнительные белковые последовательности могут увеличить защитную активность D'D3 и дополнительно продлить время полужизни ФУШ. [0350] Вдобавок, гетерологичный компонент, например, альбумин или последовательность PAS также можно вносить в гетеродимерные конструкции ФУШ/ФВ как показано на фигуре 4Д-4Ж. На фигуре 4Д гетерологичный компонент, например, альбумин или последовательность PAS внесен в В-доменную область ФУШ, белка ФУШ-148; на фигуре 4Е гетерологичный компонент, например, альбумин или последовательность PAS внесен в В-доменную область ФУШ, белка ФУШ-136; на фигуре 4Ж гетерологичный компонент, например, альбумин или последовательность PAS используется в качестве линкера для соединения фрагмента D'D3 и Fc. Ожидается, что в этих конфигурациях общий эффект от D'D3, Fc и гетерологичного компонента, который является продлевающим время полужизни веществом (например, альбумин/последовательность PAS), отразится на продлении времени полужизни ФУШ. Пример 5: Плазмидное конструирование системы котрансфекции для гетеродимера ФУПГГс-ФВ (Фигура 5) [0351] Для получения гетеродимера ФУПГГс-ФВ создавали систему котрансфекции, которая содержит три конструкции ДНК. Первая конструкция ДНК - pSYN-ФУШ-155 - кодирует слитый белок ФУШ-Fc, в котором одноцепочечный белок ФУШ напрямую сшит с одиночным фрагментом Fc, а второй конструкцией ДНК является pSYN-ФВ-ОЗ!, которая кодирует слитый белок D'D3-Fc (упомянутый выше в примере 1). Клетки HEK293F трансфицировали двумя плазмидами совместно с третьей плазмидой (РС5) в соотношении 80:15:5. Котрансфекцию РС5 проводили для того, чтобы точно обеспечить полный пропептидный процессинг областей Din D2, чтобы в итоге получить зрелые домены D'D3. Синтезированные белки секретировались в виде гетеродимера ФУПГГс/В'БЗГс и гомодимера D'D3Fc, после чего гетеродимер ФУПГГс/В'БЗГс отделяли от гомодимера D'D3Fc при помощи очистки белка. Последовательность зрелого белка pSYN-OVIII-155 (SEQ Ш NO: 90): ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGL LGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLK ENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETK NSLMQDRDAASARAWPKMHTWGYWRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQA SLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEM DWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKV RFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKH LKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFWMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMS DKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYI LSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSS CDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKAHQAEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKE DFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQP LYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFW KVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKS WYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFS GHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASG HIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQF IIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLN SCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQWNPKEWLQVDFQKTMKVTGV TTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWV HQIALRMEVLGCEAQDLYDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Последовательность ДНК pSYN-OVIII-155 DNA (SEQ Ш NO: 91): ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCCACCAGAAGATA CTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAA GATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTGTA GAATTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCAT CCAGGCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATG CTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAA GAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAAT GGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAG GCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAA TTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCA GGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTC TGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAA GTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTC GCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCT CTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCCAACTACGA AT GAAAAATAAT GAAGAAG С G GAAGAC TAT GAT GAT GAT С T TAC T GAT T С T GAAAT G GAT GT G GT СAG GT T TGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTAC ATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTAT AAAAGT СAATAT T T GAACAAT G G С С С T CAG С G GAT T G GTAG GAAGTACAAAAAAG T С С GAT T TAT G G СATA CACAGAT GAAAC С T T TAAGAC T С GT GAAG С TAT T CAG CAT GAAT CAG GAAT С T T G GGAC С T T TAC T T TAT G GG GAAGT T G GAGACACAC T GT T GAT TATAT T TAAGAAT CAAG CAAG CAGAC СATATAACAT С TAC С С T CAC GGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCC AAT T С T G С CAG GAGAAATAT T СAAATATAAAT G GACAGTGACT GTAGAAGAT GGGCCAACTAAAT CAGAT С CTCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGC CCT CT CCT CAT CT GCTACAAAGAAT CT GTAGAT CAAAGAGGAAACCAGATAATGT CAGACAAGAGGAAT GT CATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCA AT С CAG С T G GAGT G CAG С T T GAG GAT С СAGAGT T С CAAG С С T С СAACAT CAT G CACAG CAT CAAT G G С TAT GTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGC ACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACAC TCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGG T G С С AC AAC T CAGAC T T T С G GAAC AGAG G CAT GAC CGCCTTACT GAAG GT TTCTAGTTGT GAC AAGAAC AC T G GT GAT TAT TAC GAG GACAGT TAT GAAGATAT T T CAG СATAC T T G С T GAGTAAAAACAAT G С CAT T GAAC CAAGAAGCTTCTCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAAGCCCATCAGGCGGAAATAACTCGTACTACTCTTCAG T CAGAT СAAGAG GAAAT T GAC TAT GAT GATAC СATAT СAGT T GAAAT GAAGAAG GAAGAT T T T GACAT T TA T GAT GAG GAT GAAAAT СAGAG С С С С С G CAG С Т Т Т СAAAAGAAAACAC GACAC ТAT Т Т ТAT Т G С Т G СAGT G G AGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTC CCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGA AC ТAAAT GAACAT Т Т G G GAC TCCTGGGGC СATATATAAGAG CAGAAGT T GAAGATAATAT CAT G GTAAC T T TCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGATCAGAGGCAA GGAG СAGAAC С TAGAAAAAAC T T T GT CAAG С С TAAT GAAAC CAAAAC TTACTTTT GGAAAGT G СAACAT СA TATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAG ATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGA CAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGA AAATAT G GAAAGAAAC T G CAG GGCTCCCTG СAATAT С CAGAT G GAAGAT С С CAC T T T TAAAGAGAAT TAT С GCTTCCATGCAATCAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATT CGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACATGTGTTCAC TGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAA TGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGC ACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTT T CAGAT TACAG С T T CAG GACAATAT G GACAGT G G G С С С СAAAG С Т G G С СAGACT Т CAT TAT Т С С G GAT САА TCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCAC GGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAG TCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAATG TGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCA ACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCC ATTGGGAATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTG CCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAAT ААТ С СAAAAGAGT G G С Т G СAAGT G GAC Т Т С СAGAAGACAAT GAAAGT СACAG GAG ТAAC TACT CAG G GAGT AAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGA CTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAAC TCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCT GAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTACGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG CTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTG TGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCT ATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG GAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT CTCCGGGTAAA [0352] Ниже перечислены дополнительные сконструированные фрагменты ФВ и гетеродимеры ФУ1ПТС-ФВ. pSYN-VWF-009 D1D2D'D3 -область (1-276 ак, 6xHis) pcDNA3.1 pSYN-VWF-010 D1D2D'D3-область (1-477 ак, 6xHis) pcDNA3.1 pSYN-VWF-011 D1D2D'D3-область частично Al (1-511 ак, 6xHis) pcDNA3.1 pSYN-VWF-012 D1D2DD3A1 -область (1-716 ак, 6xHis) pcDNA3.1 pSYN-VWF-013 D1D2D'D3 region (1-477 ак, C336A/C379A, 6x His) pcDNA3.1 pSYN-VWF-014 Сигнальный пептид <ЈVIII-D'D3 (1-477ак, C336A/C379A)-одиночная Fc с 20ак линкером, содержащим сайт тромбина pcDNA 4 pSYN-VWF-015 D1D2DD3 (1-477ак, С336А/С379А)- одиночная Fc с 20ак линкером, содержащим сайт тромбина pcDNA 4 pSYN-VWF-016 Сигнальный пептид ФУШ-О'БЗ (1-477ак, ДТ)-одиночная Fc с 20ак линкером, содержащим сайт тромбина pcDNA 4 pSYN-VWF-017 D1D2D'D3 (1-477ак, ДТ)-одиночная Fc с 20ак линкером, содержащим сайт тромбина pcDNA 4 pSYN-VWF-025 D1D2DD3 -область (1-477 ак, 6xHis) в pLIVE pLIVE pSYN-VWF-029 DlD2D'D3-o6nacTb (1-477 ак, С336А/С379А, 6xHis) в pLIVE pLIVE pSYN-VWF-030 Сигнальный пептид ФУШ-Б'БЗ (1-477ак, С336А/С379А)-одиночная Fc с 48ак линкером, содержащим сайт тромбина pcDNA 4 pSYN-VWF-031 D1D2DD3 (1-477ак, С336А/С379А)- одиночная Fc с 48ак линкером, содержащим сайт тромбина pcDNA 4 pSYN-VWF-032 Сигнальный пептид ФУШ-О'БЗ (1-477ак, ДТ)- одиночная Fc с 48ак линкером, содержащим сайт тромбина pcDNA 4 pSYN-VWF-033 Сигнальный пептид ФУШ-О'БЗ (1-477ак, ДТ)- одиночная Fc с 35ак линкером, содержащим сайт тромбина pcDNA 4 FVIII pSYN-FVIII-055 УВД-ФУШ ouFc с R336I и Y1680F pBUD pSYN-FVIII-056 УВД-ФУШ onFc с R336I, R562 и Y1680F pBUD pSYN-FVIII-057 УВД-ФУШ ouFc с Y1680F pBUD pSYN-FVIII-058 УВД-ФУШ onFc с S488A pBUD pSYN-FVIII-059 УВД-ФУШ onFc с R336I, R562K, S488A pBUD pSYN-FVIII-060 УВД-ФУШ onFc с R336I, R562K, Y1680F pBUD pSYN-FVIII-061 УВД-ФУШ onFc с R336I, R562K, S488A, Y1680F pBUD pSYN-FVIII-064 УВД-ФУШ отщепляемая onFc с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними pBUD pSYN-FVIII-065 УВД-ФУШ отщепляемая onFc с ФВ D'D3 (1-276ак) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними pBUD pSYN-FVIII-083 УВД-ФУШ onFc с R336I, S488A,R562K, Y1680F, E1984V pBUD pSYN-FVIII-086 УВД-ФУШоцРсс 6x(GGGGS) линкероммеждуС2 ФУШиРс pBUD pSYN-FVIII-095 УВД-ФУШ onFc с S104C, R562K,Y1680F, G1960C pBUD pSYN-FVIII-101 УВД-ФУШ onFc из ФУШ-041 в пцДНК 3.3. Торо pcDNA3.3 Topo pSYN-FVIII-102 УВД-ФУШ (M662C/D1828C для дисульфидной связи; АРС мутации расщепления R336I/R562K; вместе с мутацией Y1680F для связывания ФВ) pBUD pSYN-FVIII-103 УВД-ФУШ onFc (Y662C/T1828C) pBUD pSYN-FVIII-104 УВД-ФУШ onFc (G655C/ST1788C) pBUD pSYN-FVIII-113 УВД-ФУШ (R490A/H497A) отщепляемая onFc с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними pBUD pSYN-FVIII-114 УВД-ФУШ (R490A/H497A) отщепляемая onFc с ФВ D'D3 (1-276) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними pBUD pSYN-FVIII-126 УВД-ФУШ onFc (M662C/D1828C) pcDNA3.3 Topo pSYN-FVIII-127 УВД-ФУШ onFc (M662C/D1828C для дисульфидной связи; АРС мутации расщепления R336I/R562K; вместе с мутацией Y1680F для связывания ФВ) pcDNA 3.3 Topo pSYN-FVIII-128 УВД-ФУШ onFc (Y664C/T1826C) pcDNA3.3 Topo pSYN-FVIII-129 мутация R336I R562K R490A Н497А N1224A на фоне pSYN-VIII-64 pBUD pSYN-FVIII-130 мутация R336I R562K R490A Н497А N1224A на фоне pSYN-VIII-65 pBUD pSYN-FVIII-131 мутация R471A Y487A R490A Н497А N1224A на фоне pSYN-VIII-64 pBUD pSYN-FVIII-132 мутация R471A Y487A R490A Н497А N1224A на фоне pSYN-VIII-65 pBUD pSYN-FVIII-135 УВД-ФУШ onFc с R1645A/R1648A pcDNA3.3 Topo pSYN-FVIII-136 УВД-ФУШ отщепляемая onFc с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними pcDNA3.3 Topo pSYN-FVIII-137 УВД-ФУШ отщепляемая onFc с ФВ D'D3 (1-276ак) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними pcDNA3.3 Topo pSYN-FVIII-145 УВД-ФУШ onFc с R471A/Y487A, R490A/H497A pcDNA3.3 Topo pSYN-FVIII-146 УВД-ФУШ отщепляемая onFc (R471A/Y487A) с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером pcDNA3.3 Topo pSYN-FVIII-147 УВД- ФУШ отщепляемая onFc (R471A/Y487A) с ФВ DD3 (1-276ак) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними pcDNA3.3 Topo pSYN-FVIII-148 УВД-ФУШ отщепляемая onFc (R1645A/R1648A) с ФВ DD3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером pcDNA3.3 Topo pSYN-FVIII-149 УВД- ФУШ отщепляемая onFc (R1645A/R1648A) with ФВ D'D3 (1-276ак) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером pcDNA3.3 Topo pSYN-FVIII-155 УВД-ФУШ сшитый с одиночной Fc (R1645A/R1648A) pcDNA 4 pSYN-FVIII-159 УВД-ФУШ отщепляемая onFc с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 35ак тромбин-отщепляемым линкером между pBUD pSYN-FVIII-160 УВД-ФУШ отщепляемая onFc с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 48ак тромбин-отщепляемым линкером между ними pBUD pSYN-FVIII-164 УВД-ФУШ отщепляемая onFc (R490A/H497A, R1645A/R1648A) с ФВ D'D3 ( 1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером pcDNA3.3 Topo pSYN-FVIII-165 УВД-ФУШ отщепляемая onFc (R336I/R562K, R490A/H497A, R1645A/R1648A) с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером pcDNA3.3 Topo pSYN-FVIII-178 УВД-ФУШ отщепляемая onFc с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 73ак тромбин-отщепляемым линкером между ними pBUD pSYN-FVIII-179 УВД-ФУШ отщепляемая onFc с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 98ак тромбин-отщепляемым линкером между ними pBUD pSYN-FVIII-180 УВД-ФУШ (K2092A) отщепляемая onFc с ФВ D'D3 (1-477ак, C336A/C379A) на второй Fc и 48ак тромбин-отщепляемым линкером между ними pBUD pSYN-FVIII-181 УВД-ФУШ (F2093A) отщепляемая onFc с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 48ак тромбин-отщепляемым линкером между ними pBUD pSYN-FVIII-182 УВД-ФУШ (K2092A/F2093A) отщепляемая onFc с ФВ DD3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 48ак тромбин-отщепляемым линкером между ними pBUD Пример 6: Белковая очистка Белковая очистка фрагментов ФВ [0353] Фрагменты ФВ очищали с применением двухэтапного метода очистки. Для первичной очистки использовали заряженную колонку с сульфатом никеля для афинной хроматографии на иммобилизованном металле (АХИМ), а для окончательной очистки использовали ионообменную колонку с ДЭАЭ-фрактогелем. Ниже детально описан способ очистки. (а) Первичная очистка фрагмента ФВ на АХИМ никеле [0354] 14 мЛ никелевую АХИМ колонку с НР-сефарозой [ХК26/3] уравновешивали 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. Приблизительно 7.2 Л ФВ-кондиционированной среды доводили 100 мЛ 1М ГЭПЭС @ рН 7,5 и 600 мЛ 5М NaCl. Затем добавляли 80 мЛ 1М имидазола (@ рН 7.5) до достижения конечной концентрации в 10 мМ. Затем 7,8 L доведенной ФВ-кондиционированной среды загружали в колонку при 2-8°С при 10 мЬ/мин [113 см/час]. Этапы отмывки проводили при 13.3 мЛ/минуту [150 см/час]. Сначала проводили отмывку 2х объемов колонки (ОК) с 25 мМ ГЭПЭС, 500 MMNaCl, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5 в нормальном потоке {"нисходящем потоке"}. Затем проводили отмывку ЗхОК с 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и 0,05% ТВИН-20 @ рН 7,5 в обратном потоке {"восходящем потоке"}. И наконец, проводили отмывку ЗхОК с 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5 в нормальном потоке {"нисходящем потоке"}. Элюирование проводили как градиент ЮхОК до 50% В1 (25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазола и 0,05% ТВИН-20 @ рН 7,5). Объем фракции положили равным 10 мЛ. Затем колонку очищали 100% В1. После этого проводили отмывку с 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. Вторую очистку проводили с lHNaOH. Затем колонку промывали с 1М ТРИС, lMNaCl @ рН 7,8, и после этого - 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ К заявке, выделенной из заявки № 201491186 рН 7,5. В конце колонку промывали с 5 OK of ФСБД + 20% этанола и хранили при 4°С. (б) Вторичная очистка фрагмента ФВ на ДЭАЭ-фрактогеле [0355] Вторичную очистку фрагмента ФВ проводили на ДЭАЭ-фрактогеле @ рН 7,5. Сначала 20 мЛ элюата АХИМ никеля (что соответствует пику фрагмента ФВ) доводили 200 мг цвиттергента 3-14 цвиттерионного детергента, чтобы попытаться разделить агрегированные частицы без применения денатурации или восстановительных добавок. После растворения детергента белок оставляли при комнатной температуре приблизительно на 15 минут. Затем белок доводили 4 граммами трегалозы, 1 мЛ 10% Твин-20, 5 мЛ 1М ГЭПЭС @ рН 7,5 и 174 мЛ воды "Милли-Кью". Равновесный буфер "А12" содержал 25 мМ ГЭПЭС, 50 мМ NaCl, 1% трегалозы, 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. Элюирующий буфер "В1" содержал 25 мМ ГЭПЭС, 1000 мМ NaCl, 1% трегалозы, 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. Элюирование проводили как градиент 10 ОК до 50% В1 с удерживанием 5+ ОК после чего следовал этап доведения до 100% В1. Затем колонку очищали 0,85% ортофосфорной кислоты, и после этого - 1М ТРИС, 1М NaCl @ рН 7,5. Затем колонку очищали Ш NaOH, 2М NaCl и после этого - 1М TRIS, 1М NaCl @ рН 7,5. Затем колонку промывали с 25 мМ ГЭПЭС, 100 мМ NaCl + 20% этанола @ рН 7,5 для хранения. (с) Белковая очистка гетеродимера ФУШ-ФВ [0356] Сначала гетеродимер ФУШ-ФВ очищали на аффинной колонке (GE VHISelect), после чего проводили очистку на ионообменной колонке содержащей фрактогель ТМАЕ. (McCueJT. SelvitelliK. WalkerJ. JChromatogrA. 2009 Nov 6; 1216(45):7824-30. Epub 2009 Sep 23.) [0357] Для очистки Ф\гШ-155/ФВ-31 проводили этап тангенциальной поточной фильтрации (ТПФ) для замены буфера очищаемой кондиционированной среды. Затем при помощи аффинной хроматографии проводили захват целевых белков в фильтрате. После этого проводили этап слабой анионообменной хроматографии для уменьшения количества высокомолекулярных компонентов. Чистоту и размер молекул оценивали при помощи эксклюзионной ВЭЖХ и ДСН-ПААГ. Наличие разных доменов Ф\гШ-155/ФВ-31 дополнительно подтверждали Вестерн-блоттингом. Специфическая активность молекул была сравнима с ФУШ с удаленным В-доменом. (г) Расщепление тромбином гетеродимера ФУШ-ФВ (Фигура 8) [0358] Гетеродимер ФУШ-ФВ или ФУШ-Fc (контроль) смешивали с тромбином в соотношении 1:10 в тромбин-расщепляющем буфере (50 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 2 мМ СаС12, 5% глицерола). Реакцию инкубировали при 37 °С на протяжении 20 минут. Расщепленный продукт проводили в 4-12% восстановительном трис-глициновом геле. Нерасщепленный белок использовали в качестве контроля. Полосы визуализировали красителем кумасси. (д) Оценка ФВ-связывающей способности ФУШ-155/ФВ-31 при помощи октетного анализа [0359] ФВ-связывающую способность ФУШ-155/ФВ-31 определяли при помощи измерений на основе био-слоевой интерферометрии (БСИ) (октетный анализ) при 25 °С при помощи измерительной установки ForteBio Octet 384 с использованием буферного раствора Трис (50 мМ Tris, рН 7,2, 150 мМ NaCl, 5 мМ СаСЬ). Октетный анализ для определения связывания ФУШ основан на гидрофобной иммобилизации человеческого фактора Виллебранда (чФВ) (Haematologic Technologies, Каталог №. HCVWF-0191) на АФС-биосенсоре, за которой следует связывание 1,0% бычьего сывороточного альбумина (Jackson ImmunoResearch, Каталог №. 001-000-161). Вкратце, чФВ (38,5 нМ) растворяли в Трис-буфере и загружали на АФС-биосенсоры на 600 с, получая приблизительно 3,0 - 3,5 нм связывание на реакционных зондах. Контрольные АФС-зонды загружали 1,0% БСА в отсутствие чФВ для базового вычитания. После загрузки все зонды инкубировали в Трис-буфере на протяжении 300 с для установления новой базовой линии. После этого биосенсорные зонды инкубировали в растворах ФУШ-155/ФВ-031, лекарственного вещества с содержанием ФУПГГс или рФУШ (60 нМ) на протяжении 5 мин при комнатной температуре с последующим 5-минутным этапом диссоциации. При помощи программного обеспечения для октетного анализа данных связывающий отклик (нм) получали путем вычетания данных (реакционный зонд минус контрольный зонд). Как показано на Фигуре 15, по сравнению с ФВ-связывающей активностью рФУПГГс и рФУШ ФВ-связывающая активность ФУ1П-155/ФВ-031 является значительно более слабой. Это указывает на успешное экранирование ФУШ от полноразмерного ФВ фрагментом D'D3 гетеродимера ФУПГГс/ФВ. Пример 7. ФВ-ФУШ взаимодействие является ограничивающим фактором для продления времени полужизни ФУШ [0360] Большая часть циркулирующего ФУШ существует в виде комплекса ФУШ- ФВ (> 95% плазменного ФУШ). Это ФУШ-ФВ взаимодействие способствует выведению ФУШ в процессе выведения ФВ, тем самым делая время полужизни ФВ (Т1/2) ограничителем для продления времени полужизни ФУШ. Для оценки этой гипотезы при помощи Fc-технологий проводили испытания по ограничению продления времени полужизни ФУШ у мышей с дефицитом ФУШ (мышей с гемофилией А, которые имеют интактный ген ФВ) и у мышей с дефицитом ФУШ/ФВ (с двойным ФУШ-ФВ генным нокаутом (ДГН)). [0361] Мышей с гемофилией А или ФУШ-ФВ ДГН мышей лечили путем введения единичной внутривенной дозы рФУШ или рФУПГГс в рассчете 125 МЕ/кг в случае мышей с гемофилией А или 200 МЕ/кг в случае ДГН мышей. Образцы крови брали до 72 ч у мышей с гемофилией А или до 8 ч у ФУШ/ФВ ДГН мышей. Затем измеряли активность ФУШ в образцах плазмы крови при помощи хромогенного анализа ФУШ. Фармакокинетический (ФК) профиль двух вариаций рФУШ анализировали при помощи программы WinNonline. [0362] Как показано в Таблице 7 и на Фигуре 9, для ФУШ/ФВ ДГН мышей рФУПГГс продемонстрировал приблизительно в 4,8 раз большее Тш (т.е., Тш в 1,2 ч) по сравнению с Тш рФУШ (т.е., Тш в 0,25 ч). В противоположность этому, при испытаниях на мышах с гемофилией А рФУПГГс имел только в 1,8 раз большее Тш по сравнению с рФУШ. Тш рФУПГГс составило 13,7 ч, что совпадает со временем полужизни эндогенного мышиного ФВ. Это указывает на то, что ФУШ-ФВ взаимодействие является ограничивающим фактором для продления времени полужизни ФУГГГ. Для того, чтобы достичь более чем двукратного увеличения времени полужизни ФУГГГ, ФУШ-ФВ взаимодействие должно быть устранено. Хромогенный аналих OVIII [0363] Активность OVIII определяли при помощи набора инструментов COATEST SP FVIII от DiaPharma (lot# N089019), а все инкубирования проводили на плоском нагревателе при 37 °С с встряхиванием. [0364] Диапазон калибровочной пробы pOVIII составлял от 100 мМЕ/мЛ до 0,78 мМЕ/мЛ. Смешанные образцы контрольной нормальной человеческой плазмы и плазмы (разведенные в IX буфере Coatest) добавляли в 96-луночные планшеты Immulon 2НВ в дубликате (25 мкЛ/лунку). Свежеприготовленную смесь ГХа/ОХ/Оосфолипид (50 мкЛ), 25 мкЛ 25мМ СаСЬ и 50 мкЛ субстрата ОХа последовательно добавляли в каждую лунку с 5 минутами инкубации между добавлениями. После инкубации с субстратом добавляли 25 мкЛ 20% уксусной кислоты для терминации цветной реакции и измеряли поглощение OD405 при помощи установки SpectraMAX plus (Molecular Devices). Данные анализировали при помощи программного обеспечения SoftMax Pro (версия 5.2). Нижний предел количественного определения (НПКО) равен 7,8 мМЕ/мЛ. Пример 8. Димер ОВ D'D3 защищает OVIII от OVIII-протеолиза и выведения (Оигура 10) [0365] OVIII-защитную активность фрагментов ОВ оценивали по их способности защищать эндогенный мышиный OVIII от выведения у мышей с дефицитом ОВ. В циркуляцию крови мышей с дефицитом ОВ вводили разные фрагменты ОВ, перечисленные в Таблице 8, колонка 1 (Оигура 1, Пример 1), при помощи гидродинамической инъекции соответствующих конструкций ДНК в расчете 100 мкг/мышь. Образцы плазмы крови брали через 48 часов после инъекции, а плазменную активность мышиного OVIII измеряли при помощи хромогенного анализа OVIII. Уровень экспрессии ОВ измеряли при помощи ELISA ОВ. [0366] Исследовали четыре фрагмента ОВ разной длины, составляющей 276, 477, 511 и 716 аминокислот. Диапазон аминокислот от 276 до 716 исследовали, чтобы определить длину фрагментов ОВ, которая требуется для связывания OVIII (276 ак) в отсутствие связывающего домена клиренс-рецептора ОВ (716 ак). Полноразмерный ОВ и мультимер D1D2D'D3CK использовали в качестве положительного контроля для защиты OVIII. В циркуляции крови фрагменты ОВ, синтезированные с доменом D1D2, существуют в виде димера и в виде мономеров, если они синтезированы без доменов D1D2. [0367] Повышение активности мышиного OVIII в плазме крови после гидродинамической инъекции определяет OVIII-защитное действие фрагментов ОВ. Как показано в Таблице 8 и на Оигуре 10А-Б, первые 276 ак фрагмента Б'БЗне проявляют OVIII-защитной активности, что демонстрируют одинаковые уровни OVIII в плазме крови до/после инъекции (Оигура 10А). При этом введение других фрагментов ОВ привело к значительному повышению уровня OVIII в плазме крови, что указывает на то, что эти фрагменты ОВ могут защищать OVIII от выведения. [0368] В Таблице 8 приведены значение активности плазменного OVIII и плазменный уровень антигена фрагментов ОВ, которые содержат домен D'D3 полноразмерного ОВ, после инъекции. Аналогичные послеинъекционные значения OVIII/OB наблюдали для полноразмерного ОВ и двух димерных форм фрагментов ОВ, что означает, что эти два димера фрагментов ОВ обеспечивают такую же защиту OVIII, что и полноразмерный ОВ. Вдобавок, трехкратно превышающее значение OVIII/OB наблюдали для димерных изоформ фрагмента ОВ по сравнению с соответствующими им мономерами: димер D'D3 (477 ак) характеризуется К заявке, выделенной из заявки № 201491186 значением OVIII/OB в 38,7 мМЕ/нмоль; мономер D'D3 (477 ак) характеризуется значением OVIII/OB в 11,6 мМЕ/нмоль: димер D'D3A1 (511 ак) характеризуется значением OVIII/OB в 32,9 мМЕ/нмоль; и мономер D'D3 (511 ак) характеризуется значением OVIII/OB в 13,8 мМЕ/нмоль, что указывает на то, что димерные изоформы фрагментов ОВ обеспечивают лучшую защиту OVIII по сравнению с соответствующими им мономерами. [0369] Гидродинамическая инъекция является эффективным и безопасным методом доставки генов в печень небольших животных, таких как мыши и крысы. Впервые он был описан как быстрая инъекция чистой плазмидной ДНК/солевого раствора без содержания эндотоксинов в размере десятой части от массы тела животного, проводимая за 5-7 секунд. Чистая плазмидная ДНК содержит представляющий интерес ген, а целевой белок, вырабатывающийся в печени из инъектированной ДНК, можно обнаружить в пределах 24 часов после инъекции. Затем образцы плазмы крови брали для изучения терапевтических свойств экспрессируемого белка. [0370] Во всех гидродинамических инъекциях, которые проводили в рамках данной патентной заявки, мышам массой 20-35 граммов в течении 4-7 секунд путем внутривенной инъекции в хвостовую вену доставляли 2 мл плазмидной ДНК в 0,9% стерильном солевом растворе. За мышами внимательно наблюдали на протяжении первых нескольких часов до тех пор, пока не восстанавливалась нормальная активность. После того, как при помощи метода отбора образцов крови из ретроорбитального синуса образцы крови были взяты, из них получали образцы плазмы крови и хранили при -80 °С для дальнейшего анализа. ELISA ФВ: [0371] Для ELISA ФВ использовали козлиное антитело к ФВ (аффинно очищенное, аффинно биологическое, КАФВ-АО) в качестве иммобилизованного антитела в количестве 0,5 мкг/лунку, а ФВ-ИФА-Д (Affinity Biologicals, ФВ-ИФА-Д, разведение 1:100) использовали в качестве детектирующего антитела. Анализ ELISA проводили согласно стандартной процедуре ELISA, в качестве субстрата ПХ использовали ТМБ, в качестве блокирующего и связывающего буфера использовали буфер ФСБТ/1,5% БСА/0,5М NaCl. Стандартный диапазин анализа составляет от 100 нг до 0,78 нг, а нижний предел количественного определения (НПКО) в анализе равен 7,8 нг/мЛ. Пример 9: Совместное введение полноразмерного D'D3 -фрагмента ФВ продлевает время полужизни рУВД-ФУШ у ФУШ-ФВ ДГН мышей [0372] Пример 8 продемонстрировал, что полноразмерный фрагмент D'D3 может защитить эндогенный ФУШ от процесса его выведения. Для того, чтобы дополнительно оценить ФУШ-защитную активность белка D'D3, ФУШ-ФВ ДГН мышам вводили совместно ФУШ с удаленным В-доменом (рУВД-ФУШ) и димер D'D3 (ФВ-010) или рУВД-ФУШ и мономер D'D3 (ФВ-002) при помощи внутривенной инъекции в расчете 200 МЕ/кг для рУВД-ФУШ, 770 мкг/кг для димера D'D3 и 590 мкг/кг для мономера D'D3. ФК профиль рУВД-ФУШ изучали по его плазменной активности после инъекции. Из-за короткого in vivo времени полужизни фрагментов D'D3 через три часа после первичной совместной инъекции вводили еще одну дозу D'D3 тем же самым путем для того, чтобы поддерживать необходимый уровень D'D3 в плазме крови. [0373] Для анализа ФК образцы плазмы крови получали при помощи метода отбора образцов крови из ретроорбитального синуса через 5 мин, 30 мин, 1 час, 2 часа, 4 часа и 6 часов после инъекции, активность плазменного ФУШ и уровень ангигена D'D3 анализировали при помощи хромогенного анализа ФУШ и ELISA ФВ. [0374] Как показано на Фигуре 11 и в Таблице 10, мономер D'D3 продлил время полужизни рУВД-ФУШ в 2,5 раз и улучшил его восстановление в 1,8 раз. Димер D'D3 продлил время полужизни рУВД-ФУШ в 4,1 раз и улучшил его восстановление в 3,5 раз. Также для обеих изоформ наблюдали улучшенные параметры среднего времени нахождения, выведения и ПИК. При этом димер D'D3 показывал лучшие результаты по всем ФК параметрам по сравнению со своей мономерной формой. [0375] Таким образом, совместное введение полноразмерного D'D3 защищает ФУШ от процесса выведения, что показывает улучшение профиля ФК рУВД-ФУШ. Потенциальное клиническое значение этого открытия нуждается в дополнительной оценке. Пример 10. Мономер D'D3, синтезированный с доменом D1D2, и его димерная изоформа обладают такой же ФУШ-защитной активностью и дополнительно продлевают время полужизни ФУШГс приблизительно в ~4 раза у ФУШ-ФВ ДГН мышей [0376] Для того чтобы количественно оценить ФУШ-защитную способность доменов D'D3 и выяснить, является ли димеризация D'D3 необходимой для ФУШ-защитной активности, каждую из двух конструкций ДНК (т.е., ФВ-025 (содержащую последовательность ДНК, кодирующую D1D2D'D3) и ФВ-029 (содержащую D1D2D'D3 кодон ДНК с мутациями С336А и С379А)) вводили ФУШ/ФВ ДГН мышам путем гидродинамической инъекции. Эта инъекция приводила к экспрессии димера D'D3 (ФВ-025) или экспрессии мономера (ФВ-029) у ФУШ/ФВ ДГН мышей. На 5 день после гидродинамической инъекциивводили единичную внутривенную дозу рФУШГс в расчете 200 МЕ/кг, а образцы плазмы крови брали через 5 мин, 4, 8, 16, 24, 31, 40, 55, 66 ч после инъекции рФУШГс IV. Исследование ФК рФУШГс, проводимое на ранее не подвергавшихся экспериментам ФУШ-ФВ ДГН мышах с аналогичными дозировками, использовалось в качестве базовой линии времени полужизни рФУШГс. Активность плазменного ФУШ анализировали при помощи хромогенного анализа ФУШ. Плазменный уровень D'D3 измеряли при помощи ELISA ФВ, а ФК профиль рФУШГс анализировали при помощи программы WinNonlin. [0377] Как показано в Таблице 11 и на Фигуре 12, при наличии в циркуляции D'D3- фрагментов ФВ исходное восстановление рФУПГГс возрастает от 42% до 75% для димера D'D3 и 60% для мономера D'D3. Тш для рФУПГГс также возросло от 2,5 ч до 9,3 ч и 9,2 ч соответственно. Вместе с Тш наблюдали улучшенные параметры среднего времени нахождения, выведения и объемного распределения у мышей, экспрессирующих мономеры и димеры D'D3. В целом, наблюдали приблизительно 8-кратное увеличение времени полужизни рФУПГГс и 6-кратное увеличение ППК у мышей, экспрессирующих и мономеры и димеры D'D3. Так же, как и его димерная изоформа, мономер D'D3 полноразмерного ФВ, который синтезировали с пропептидом (D1D2) ФВ, может обеспечивать полный ФУШ-защитный эффект, что и полноразмерная молекула ФВ. [0378] У ФУШ/ФВ ДГН мышей ФУГГГ дикого типа имеет 0,25 ч Т1/2.Метод слияния Fc повышает Тш ФУГГГ до 1,2 часа, что является приблизительно 4,8-кратным увеличением. Когда метод слияния Fc объединили с доменами D'D3, Т1/2 ФУШ возросло до 9,3 ч (димер D'D3) and 9,2 ч (мономер D'D3), что в целом является приблизительно 37-кратным увеличением. (Таблица 10) Этот результат демонстрирует синергетический эффект слияния Fc и В'ОЗ-фрагмента ФВ на продление времени полужизни ФУШ. [0379] На мышах с гемофилией А проводят исследование ФК профиля основных представителей гетеродимеров ФУШ-ФВ (таких как ФУ1П-155/ФВ-031) для того, чтобы оценить их способность экранировать ФУГГГ от эндогенного ФВ и их способность продлевать время полужизни ФУШ. [0380] Мышей с гемофилией А обрабатывают единичной внутривенной дозой основных представителей в расчете 200 МЕ/кг, затем берут образцы плазмы крови через 5 мин, 4 ч, 8 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 120 ч, исследуют активность плазменного К заявке, выделенной из заявки № 201491186 OVIII при помощи хромогенного анализа OVIII, а изменение времени полужизни OVIII рассчитывают при помощи программы WinNonlin. [0381] В оптимальной конфигурации гетеродимера OVIII/OB, связывание OVIII с эндогенным ОВ будет полностью подавляться, следовательно, базовая линия времени полужизни pOVIII снизится от 7,6 ч до 0,25 ч, как показано в примере 7. При нековалентном соединении фрагмента D'D3 с OVIII наблюдали приблизительно 8-кратное увеличение времени полужизни (пример 9). У основных представителей гетеродимеров OVIII/OB фрагмент ОВ ковалентно соединен с молекулой OVIII, соответственно, должна быть достигнута лучшая защита OVIII. Изобретение, описанное в данной заявке, открывает двери дальнейшему продлению времени полужизни OVIII за границу двукратного увеличения с применением доступных способов продления времени полужизни, пациенты с гемофилией А в ближайшем будущем могут надеяться на вариант OVIII более длительного действия. [0382] На мышах с гемофилией А и OVIII/OB ДГН мышах исследовали ОК профиль OVIII-155/OB-031 для того, чтобы оценить способность фрагмента D'D3 экранировать компонент OVIII от эндогенного ОВ. Мышей с гемофилией А и OVIII/OB ДГН мышей лечили единичной внутривенной дозой OVIII-155/OB-031 в расчете 200 МЕ/кг, затем брали образцы плазмы крови через 5 мин, 8 ч, 24 ч и 48 ч после дозирования. OVIII-активность образца плазмы исследовали при помощи хромогенного анализа OVIII, а время полужизни OVIII-155/OB-031 рассчитывали при помощи программы WinNonlin. [0383] Методом биослоевой интерферометрии для OVIII-155/OB-031 по сравнению с pOVIIIFc и pOVIII было зарегистрировано очень слабое связывание с иммобилизованным ОВ (Оигура 15, Октет; ForteBio Inc., Менло-Парк, Калифорния). Это показывает, что домен D'D3 в молекуле успешно блокирует связывание OVIII с нативными молекулами ОВ. Следовательно, ожидается, что для двух разных мышиных линий времена полужизни pOVIII-155/OB-031 будут сходными. Результаты исследования приведены на Оигуре 16 и в Таблице 12А. Как и предсказывалось, ОК профайл pOVIII-155/ОВ-031 сравним в обоих случаях -мышей с гемофилией А и OVIII/OB ДГН мышей, что указывает на то, что время полужизни гетеродимера OVIIIFc/OB не зависит от времени полужизни эндогенного ОВ. Результаты показывают, что подавление взаимодействия pOVIIIFc с эндогенным ОВ В'ОЗ-доменами ОВ дает возможность снять ограничение по времени полужизни OVIII и открывает возможность продления времени полужизни OVIII за границы времени полужизни, достигаемые в отсутствие В'ОЗ-доменов ОВ (приблизительно в два раз по сравнению с OVIII дикого типа). [0384] ФУШ-защитную способность доменов D'D3 оценивали путем сравнения tl/2 для ФУШ-155/ФВ-031 с ФУППх у ФУШ/ФВ ДГН мышей. После одноразового введения IV брали образцы крови через 5 мин, 8 ч, 24 ч и 48 ч для ФУШ-155/ФВ-031, и через 5 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч и 8 ч для ФУПГГс. Активность ФУШ образцов плазмы крови исследовали при помощи хромогенного анализа ФУШ, а время полужизни ФУШ-155/ФВ-031 рассчитывали при помощи программы WinNonlin. [0385] Фигура 16Б и Таблица 12Б демонстрируют значительно улучшенный ФК профиль для ФУШ-155/ФВ-031 по сравненю с рФУИШс для ДГН мышей: приблизительно 6-кратное увеличение для ti/г; и приблизительно 5-кратное увеличение для параметров выведения и ППК. Этот результат демонстрирует, что домен D'D3 гетеродимера ФУПТГс/ФВ защищает компонент ФУШ от некоторых процессов выведения, обеспечивая, таким образом, часть защиты, которую обычно обеспечивает полноразмерный ФВ. Этот вывод был также подтвержден в случае мышей с гемофилией А. По сравнению с рФУШГс у мышей с гемофилией А рФУШ-155/ФВ-031 имеет более короткое tm и меньшую ППК, что означает, что в такой конфигурации домены D'D3 (ФВ-031) успешно предотвращают связывание белка ФУШ (рФУШ-155) с эндогенным ФВ, который до определенной степени обладает свойствами продления времени полужизни, равно как и свойствами, ограничивающими время полужизни ФУШ. Полноразмерный ФВ имеет длину в 250 кДа и образует мультимеры так, что эндогенный ФВ может иметь длину до 2 МДа, и, таким образом, это согласуется с гипотезой о том, что в данном контексте D'D3-участок ФВ длиной в 55 кДа не обеспечивает защиту в той же степени, в какой ее предоставляет гораздо более крупный эндогенный ФВ. Так как фрагмент ФВ предотвращает связывание эндогенным ФВ рФУШ-155/ФВ-031, в этой конкретной К заявке, выделенной из заявки № 201491186 конструкции время полужизни у мышей с гемофилией А сокращается. Следовательно, результаты, приведенные в таблице 12Б, указывают на то, что молекула pOVIII-155/ФВ-031 способна предотвращать связывание pOVIII-155/ОВ-031 с компонентом, продлевающим время полужизни OVIII (эндогенным ОВ). При этом эксперименты показывают, что устранение фактора, ограничивающего время полужизни OVIII, открывает возможность продления времени полужизни белка OVIII за пределы ранее осуществляемого 1,5-кратного или 2-кратного увеличения. Комбинируя OVIII с другими продлевающими время полужизни элементами, можно выйти за ограничение на более чем 2-кратное продление времени полужизни. [0386] Для того чтобы обеспечить возможность pOVIIIFc избежать процесса выведения ОВ и устранить ограничение в виде 2-кратного увеличения времени полужизни OVIII, D'D3-фрагмент ОВ вносили в молекулу pOVIIIFc (Оигура 2), что приводило к образованию гетеродимера OVIIIFc/OB. Чтобы исключить взаимодействие междк pOVIIIFc и эндогенным ОВ и максимизировать OVIII- защитный потенциал D'D3, между доменом D'D3 и Fc-областью добавляли линкер, чтобы обеспечить возможность оптимального связывания OVIII/D'D3. Более оптимальный линкер обеспечит домену D'D3 возможность предоставлять большую защиту D'D3, чем это делает менее оптимальная конструкция линкера. Это К заявке, выделенной из заявки № 201491186 предположение можно проверить путем проведения гидродинамической инъекции конструкций ДНК OVIII/OB ДГН мышам. Более оптимальная конструкция приведет к более стабильной экспрессии гетеродимера OVIIIFc/D'D3. [0387] Для того чтобы выбрать оптимальный линкер было создано три разных гетеродимера OVIIIFc/D'D3 (Оигура 3, Пример 3). Возможные линкеры между доменами D'D3 и Fc-областью перечислены в Таблице 13. Данные конструкции ДНК вводили OVIII/OB ДГН мышам при помощи гидродинамической инъекции ("ГДИ") в расчете 100 мкг/мышь, образцы плазмы брали через 48 ч после ГДИ. Активность циркулирующего гетеродимера OVIIIFc/D'D3 анализировали при помощи хромогенного анализа OVIII. [0388] Результаты исследований показаны на Оигуре 13. Через 48 ч после ГДИ наблюдали одинаковый уровень экспрессии, достигаемый OVIII-064 и OVIII-159, что указывает на то, что 20 ак линкер и 35 ак линкер обеспечивают одинаковый уровень взаимодействия OVIII/D'D3. С другой стороны, OVIII-160 продемонстрировал значительно более высоку экспрессию, чем OVIII-064, что указывает на то, что 48 ак линкер обеспечивает возможность лучшего связывания OVIII/D'D3 по сравнению с 20 ак и 35 ак линкерами. [0389] Оптимальный линкер между фрагментом ОВ и Fc-областью является одним из ключевых элементов в гетеродимере OVIIIFc/OB. Нахождение лучшего линкера позволит получить оптимальное взаимодействие между OVIII и фрагментом ОВ, предотвратит связывание OVIII с эндогенным ОВ, даст возможность OVIII избежать процесса выведения ОВ и продлит время полужизни OVIII за пределы времени полужизни плазменного ОВ. Пример 13: Стабильность одноцепочечного OVIII [0390] Одноцепочечный белок OVIII должен быть более стабильным, чем его изоформа с двойной цепью. Для проверки этой гипотезы были созданы две конструкции ДНК: OVIII-136 (процессируемый OVIIIFc с доменом D'D3) и О VIII-148 (одноцепочечный (ОЦ) OVIIIFc с доменом D'D3, который содержит мутацию R1645A/R1648A, чтобы предотвратить расщепление между тяжелой цепью и легкой цепью OVIII). [0391] Обе плазмиды вводили OVIII/OB ДГН мышам при помощи гидродинамической инъекции. Образцы плазмы брали через 24 ч и 48 ч после инъекций для того, чтобы измерить уровень экспрессии двух изоформ OVIIIFc/D'D3. Как показано на Оигуре 14 для обеих временных точек лучшую экспрессию наблюдали для конструкции ОЦ-ОУПГГс/Б'БЗ (OVIII-148) (р=0,12, р=0,19), что указывает на то, что одноцепочечный OVIII может являться более стабильным или лучше экспрессируемым, чем его двухцепочечная изоформа (OVIII-13 6). ОК профиль двух изоформ OVIII и уровни их экспрессии в клеточной культуре будут дополнительно исследованы. Одноцепочечную изоформу OVIII потенциально можно использовать для замещения традиционной двухцепочечной изоформы для достижения лучшей выработки белка и лучшего in vivo времени полужизни OVIII. Пример 14. ПЭГилирование [0392] Одну или более молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ) можно присоединить к любой области белка OVIII, фрагмента ОВ или их обоих. Так как, согласно данным по кристаллической структуре OVIII не содержит на своей поверхности свободного цистеина (PDB:2R7E, Shen etal, Blood 111:1240 (2008); PDB:3CDZ, Ngo, Structure, 16:597-606 (2008)), одним из подходов является либо вставка цистеин-содержащего пептида {например, GGGSGCGGGS) (SEQ Ш NO: 107), либо его присоединение к белку OVIII, фрагменту ОВ или им обоим. Затем молекулы ПЭГ, содержащие малеимид, могут быть специфически конъюгированы с цистеином, внедренным в рекомбинантный белок OVIII. Вкратце, рекомбинантный белок OVIII, содержащий Cys-вставку, можно сконструировать при помощи стандартной молекулярной технологии, а экспрессируемый в экспрессионной системе млекопитающего рекомбинантный белок OVIII {например, в клетках НЕК293, СНО, ВНК21, PER.C6 и САР) можно очистить при помощи аффинной и ионообменной хроматографии. Очищенный рекомбинантный белок OVIII восстанавливают Трис(2 карбоксиэтил)фосфином (ТКЭФ) для того, чтобы открыть тиоловую группу внедренного цистеина, а затем проводят реакцию с содержащим малеимид ПЭГ. Полученный рекомбинантный белок ФУШ исследуют на предмет прокоагулирующей активности и продления времени полужизни. [0393] ПЭГ присоединяют в одной из позиций, раскрытых в патентной заявке US № 61/670,553, которая в полном объеме включена в данный текст посредством ссылки, либо в других подходящих для вставки позициях. Активность циркулирующего гетеродимера ФУШ-активность ПЭГилированного рекомбинантного белка ФУШ анализировали при помощи хромогенного анализа ФУШ. ФК ПЭГилированного рекомбинантного белка ФУШ анализировали для мышей с гемофилией А и ФУШ-ФВ ДГН мышей как описано выше. Пример 15: Стабильность ФУШ в плазме крови мышей с гемофилией А и мышей с двойным ФУШ/ФВ генным нокаутом (ДГН) [0394] Плазменную стабильность разных слитых белков OVIIIFc исследовали в плазме крови мышей с гемофилией А и мышей с двойным ФУШ/ФВ генным нокаутом (ДГН). Для анализа стабильности 5 МЕ/мл разных белков ФУШГс инкубировали вместе с с плазмой крови мышей с гемофилией А или ДГН мышей при 37°С. Аликвоты брали для разных временных точек, чтобы измерить активность при помощи хромогенного анализа ФУШ. Активность для каждой временной точки измеряли дважды, а среднюю активность наносили на график как функцию времени. [0395] Для анализа иммунопреципитации ФУШГс 5 мкг ФУШГс инкубировали с 250 мкл ФСБ или плазмой крови ДГН мыши на протяжении 24 ч при 37°С. ФУШГс иммунопреципитировали путем добавления 5 мкг овечьего поликлонального антитела к ФУШ (аЬ61370) на протяжении 1 ч при комнатной температуре и 100 мкл гранул протеина А. После 4x1 мл ФСБ отмывок гранулы пересуспендировали в 50 мл 1х восстановительного ДСН-ПААГ буфера. После кипячения 20 мкл {т.е., ~ 1мкг ФУНТЕ с) загружали в 4-15% не содержащий красителей Bio-Rad гель. Гель визуализировали при помощи установки Bio-Rad и после этого проводили вестерн-блоттинг с антителом к тяжелой цепи ФУШ (GMA012). [0396] Активность ФУШГс (двухцепочечной молекулы ФУШ, которая содержит отдельные тяжелую и легкую цепи ФУШ, удерживающиеся посредством нековалентных взаимодействий) уменьшается со временем в плазме крови как мышей с гемофилией А, так и ДГН мышей (Фигура 18А). Из-за отсутствия опосредованной ФВ защитыуменьшение активности ФУШГс более четко выражено в плазме крови ДГН мышей. Это уменьшение активности ФУШ происходит, главным образом, из-за диссоциации или деградации тяжелой цепи (ТЦ) ФУШ. После 24-часовой инкубации в плазме крови ДГН мышей наблюдали около 75% уменьшение тяжелой цепи ФУШГс (Фигура 18Б). Для легкой цепи (ЛЦ) (данные не приведены) или непроцессированного/одноцепочечного ФУШГс {т.е., молекулы ФУШ, в которой легкая цепь и тяжелая цепь удерживаются вместе посредством ковалентной связи - верхняя полоса в гель-изображении) не наблюдали значительного уменьшения (Фигура 18Б). [0397] Так как предполагается, что ФВ повышает стабильность ФУШ in vivo, проводили исследования, чтобы выяснить, будет ли химерный белок гетеродимера ФУШ-ФВ (ФУШ155:ФВ31, который содержит D'D3 ФВ, ковалентно присоединенный к ФУШ через Fc) более стабильным в плазме крови мышей с гемофилией А и ДГН мышей. Согласно приведенным на Фигуре 19 данным по плазменной стабильности, наличие D'D3 повышает стабильность ФУШГс в плазме крови как мышей с гемофилией А, так и ДГН мышей. Одноцепочечный ФУШГс без D'D3 использовали в этих экспериментах в качестве контроля (оцФУШ). Согласно Фигуре 19, одноцепочечный ФУШ оказался более стабильным, чем двухцепочечный ФУШГс; при этом наличие D'D3 значительно повышает плазменную стабильность одноцепочечной молекулы ФУШГс. На основе этого можно предположить, что D'D3 стабилизирует ФУШ не только путем удержания вместе тяжелой и легкой цепей, но также при помощи других неизвестных механизмов. Пример 16: Применение фурина/РАСЕ для процессинга ФВ [0398] ФВ является уникальным белком в том смысле, что он содержит очень большой пропептид (т.е., домен D1D2 ФВ, ~85 кДа). Пропептид ФВ исполняет роль внутреннего шаперона для правильного фолдинга молекулы ФВ. Два фермента -PC5 и фурин (РАСЕ) исследовали на предмет процессинга ФВ. Конструкцией ФВ031 (DlD2D'D3Fc) временно трансфицировали клетки НЕК293 у применение разных концентраций РС5 или РАСЕ. Через четыре дня культуральную тканевую среду собирали и подвергали понижению протеина А. Даже при более низкой концентрации (2,5%) фурин (РАСЕ) был более эффективным, чем 10% РС5, в удалении пропептида (D1D2) из D'D3Fc (Фигура 20). Удаление D1D2 является важным, так как известно, что D1D2 приводит к предотвращению взаимодействия D'D3 с ФУШ. Пример 17: Фрагмент ФВ в гетеродимере ФУШ-ФВ предотвращает взаимодействие ФУШ с полноразмерным ФВ [0399] Для исследования связывания гетеродимерной конструкции ФУШ 155/ФВ31 с полноразмерным ФВ использовали октетную установку ForteBio (Фигура 21 А). Для проведения анализа связывания полноразмерный ФВ иммобилизовали при помощи АФС-сенсора, после чего блокировали 1% БСА. После блокирования исследовали разные конструкции ФУШ на предмет связывания с ФВ. Как и предполагалось, ФУШ дикого типа и ФУНШс прочно связываются с сенсорами ФВ. ФУШ-мутант Y1680F, для которого, как известно, характерна низкая аффинность или отсутствие аффинности к ФВ, демонстрировал в значительной степени сниженное связывание ФВ. Гетеродимер ФУШ155/ФВ31 вообще не связывался с полноразмерным ФВ, что подтверждает экранирование ФУШ D'D3 в гетеродимере ФУШ-ФВ. [0400] Тот же самый эксперимент проводили наоборот, чтобы определить, может ли часть D'D3 гетеродимера ФУШ-ФВ взаимодействовать с другими молекулами ФУШ, которые не являются ковалентно присоединенными к D'D3. Как показано на Фигуре 21Б, конструкция ФВ31 (D'D3Fc), иммобилизованная на сенсоре из протеина G, сама может прочно связываться с ФУШ, при этом D'D3 в гетеродимере ФУШ155:ФВ31 не проявляет связывания с ФУШ. Протеин G вместе с ФУШ использовали в качестве контроля. Эти эксперименты по связыванию подтвердили, что D'D3 в гетеродимере может взаимодействовать только с молекулой ФУШ, которая ковалентно присоединена к нему, и предотвращать взаимодействие ФУШ с полноразмерными молекулами ФВ дикого типа. [0401] Для определения точного значения аффинности связывания D'D3 ФВ с молекулой ФУШ для ФВ031 проводили эксперимент по поверхностному плазмонному резонансу (Фигура 22). Конструкцию ФВ031 (D'D3Fc) иммобилидовали при помощи анти-человеческого IgG, а ФУШ с удаленным В-доменом проводили через чип, содержащий D'D3Fc. Для ФУШ наблюдали KD, составляющую около 10 нМ. Такая аффинность приблизительно в 25 раз ниже по сравнению молекулой ФВ дикого типа и соответствует той величине, о которой ранее сообщалось в литературе. Пример 18: Влияние разной длины линкеров между D'D3 и Fc на активность и ФК гетеродимера [0402] Чтобы проверить, оказывает ли влияние на ФК и активность гетеродимера ФУШ-ФВ изменение длины тромбин-отщепляемого линкера между D'D3 и Fc, разные конструкции ФВ экспрессировали совместно с ФУШ 155. Исследовали конструкции линкеров трех разных длин, перечисленных в Таблице 14А (ФВ031, ФВ035 и ФВ036). Каждую плазмиду смешивали с плазмидой ФУШ155 (Пример 5) и трансфицировали клетки НЕК293. На четвертый день после трансфекции культуральную клеточную среду собирали и концентрировали до 10 МЕ/мл хромогенной активности ФУШ. [0403] Затем концентрированную клеточную среду вводили 8-12 недельным ФУШ/ФВ ДГН мышам в дозировке 100 МЕ/10 мЛ/кг. Образцы плазмы крови брали через 5 мин, 8 ч, 16 ч, 24 ч, 32 ч и 48 ч после дозирования. ФУШ-активность образцов плазмы анализировали при помощи хромогенного анализа ФУШ, а время полужизни рассчитывали при помощи программы WinNonlin-Phoenix. [0404] Как показано на Фигуре 23, когда длину линкера между D'D3 и Fc- фрагментом увеличили от 48 ак до 73 ак или 98 ак, время полужизни соответствующего гетеродимера ФУПГГс/ФВ увеличилось и достигло 12,2 ч и 13,3 ч соответственно. Это отвечает от 1,5-1,6-кратному увеличению по сравнению с вариантом длиной в 48 ак. На сегодняшний день 98 ак линкер является наиболее оптимальным линкером при использовании ФУШ-защитной активности фрагмента D'D3, и именно его включают в состав гетеродимера ФУПГГс/ФВ для дополнительного увеличения его времени полужизни. [0405] Для сравнения влияния линкера на активность ФУШ проводили хромогенный анализ ФУШ и АЧТВ-анализ культуральной тканевой среды из клеток, экспрессирующих разные гетеродимеры ФУШ-ФВ. Хотя для гетеродимерных конструкций АЧТВ-активность оказалась в 2 раза меньшей по сравнению с хромогенной активностью, не наблюдали значительных различий между разными линкерами, за исключением случая, когда линкер содержит сайт PARI рядом с сайтом тромбина (Таблица 14Б). образца Описание образца Длина линкера между D'D3 и Fc (ак) Хромогенный МЕ/мЛ АЧТВ МЕ/мЛ Хромогенный/ АЧТВ FVIIIFc 155+VWF15 1,81 0,85 2,14 FVIIIFc 155+VWF31 2,32 1,05 2,21 FVIII Fc 155+VWF33 2,21 1,02 2,16 FVIII Fc 155+VWF35 2,65 1,24 2,14 FVIII Fc 155+VWF36 2,75 1,11 2,47 FVIII Fc 155+VWF39 (тромбин+PARl) 1,85 1,21 1,53 Пример 19: Связывание ФУШ с фрагментом ФВ при помощи фермента сортазы [0406] В другом аспекте реализации изобретения фрагмент ФВ (например, домен D1D2D'D3 или D'D3) присоединяют к ФУШ при помощи опосредованного сортазой метода in vitro белкового лигирования. В одном примере распознающий сортазу А (LPXTG) мотив Staphylococcus aureus вносили в С-конец фрагмента ФВ, а остаток Gly(n) - в N-конец ФУШ (где количество остатком глицина может меняться). Применяемая молекула ФУШ может являться как одноцепочечной, так и двухцепочечной. Катализированная сортазой реакция транспептидации ковалентно присоединяет фрагмент ФВ к ФУШ. Обратную ориентацию распознающего мотива также можно применять для того, чтобы связать эти два белка, при этом ФУШ будет находиться на N-конце с мотивом LPXTG, а фрагмент ФВ - на С-конце с Gly(n) (Смотрите Фигуру 24 - пример сортазного лигирования для ссылки). Мотив LPXTG и остатки глицина можно заменить другими распознающими сортазу последовательностями. [0407] Также создали фрагмент ФВ, содержащий распознающую сортазу А последовательность слитого Fc-белка. Для конструкций слияния Fc, D1D2D'D3-фрагмент ФВ сшивали с Fc-областью IgG посредством GS-линкера, который содержит распознающую сортазу последовательность и сайт расщепления тромбином (Таблицы 15 и 16). После того как белок экспрессируют и очищают на протеин А-колонке, Fc-область можно отделить при помощи расщепления тромбином. Полученный фрагмент ФВ с распознающим сортазу участком можно затем использовать для лигирования с молекулой ФУШ (Фигура 24 - пример сортазного лигирования для ссылки - ряд Д). [0408] pSYN^B-051 содержит 54-аминокислотный линкер с сортазным и тромбиновым сайтами между фрагментом ФВ и Fc-областью. Проводили синтез фрагмента ДНК, кодирующего 54-аминокислотный линкер (ISGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLPETGALR PRVVGGGGSG GGGS) (SEQ ГО NO: 98) и часть Fc-области (Genewiz - Последовательность №-10-210746313, показана ниже). Фрагмент конструкции Genewiz субклонировали в расщепляемый EcoRV/RsRII pSYN-ФВ-ОЗ 1. Genewiz - Последовательность №-10-210746313 (SEQ ГО NO: 99) [0409] AGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCG GTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCTTACCTGAAACTGGAGCCCTGCGGCCCC GGGTCGTCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG CTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTT [0410] Последовательность одноцепочечного ФУШ, содержащего N-концевой пентаглицин, приведена в Таблицах 17 и 18. Таблица-15: Нуклеотидная последовательность pSYN^B051 (DlD2D'D3Fc ФВ с распознающим сортазу А мотивом и тромбин-отщепляемым линкером между фрагментом ФВ и Fc) (SEQIDNO: 100) 1 ATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTCTGGCCCTCATTTT 51 GCCAGGGACCCTTTGTGCAGAAGGAACTCGCGGCAGGTCATCCACGGCCC 101 GATGCAGCCTTTTCGGAAGTGACTTCGTCAACACCTTTGATGGGAGCATG 151 TACAGCTTTGCGGGATACTGCAGTTACCTCCTGGCAGGGGGCTGCCAGAA 2 01 ACGCTCCTTCTCGATTATTGGGGACTTCCAGAATGGCAAGAGAGTGAGCC 2 51 TCTCCGTGTATCTTGGGGAATTTTTTGACATCCATTTGTTTGTCAATGGT 3 01 ACCGTGACACAGGGGGACCAAAGAGTCTCCATGCCCTATGCCTCCAAAGG 351 GCTGTATCTAGAAACTGAGGCTGGGTACTACAAGCTGTCCGGTGAGGCCT 4 01 ATGGCTTTGTGGCCAGGATCGATGGCAGCGGCAACTTTCAAGTCCTGCTG 4 51 T СAGACAGATAC T T СAACAAGAC CTGCGGGCTGTGTGG CAAC T T TAACAT 501 CTTTGCTGAAGATGACTTTATGACCCAAGAAGGGACCTTGACCTCGGACC 551 CTTATGACTTTGCCAACTCATGGGCTCTGAGCAGTGGAGAACAGTGGTGT 601 GAACGGGCATCTCCTCCCAGCAGCTCATGCAACATCTCCTCTGGGGAAAT 651 GCAGAAGGGCCTGTGGGAGCAGTGCCAGCTTCTGAAGAGCACCTCGGTGT 7 01 TTGCCCGCTGCCACCCTCTGGTGGACCCCGAGCCTTTTGTGGCCCTGTGT 7 51 GAGAAGACTTTGTGTGAGTGTGCTGGGGGGCTGGAGTGCGCCTGCCCTGC 8 01 CCTCCTGGAGTACGCCCGGACCTGTGCCCAGGAGGGAATGGTGCTGTACG 8 51 GCTGGACCGACCACAGCGCGTGCAGCCCAGTGTGCCCTGCTGGTATGGAG 9 01 TATAGGCAGTGTGTGTCCCCTTGCGCCAGGACCTGCCAGAGCCTGCACAT 951 CAATGAAATGTGTCAGGAGCGATGCGTGGATGGCTGCAGCTGCCCTGAGG 10 01 GACAGCTCCTGGATGAAGGCCTCTGCGTGGAGAGCACCGAGTGTCCCTGC 1051 GTGCATTCCGGAAAGCGCTACCCTCCCGGCACCTCCCTCTCTCGAGACTG 1101 СAACAC С T G CAT T T G С С GAAACAG С СAGT G GAT С T G CAG CAAT GAAGAAT 1151 GTCCAGGGGAGTGCCTTGTCACTGGTCAATCCCACTTCAAGAGCTTTGAC 12 01 AACAGATACTTCACCTTCAGTGGGATCTGCCAGTACCTGCTGGCCCGGGA 12 51 TTGCCAGGACCACTCCTTCTCCATTGTCATTGAGACTGTCCAGTGTGCTG 13 01 ATGACCGCGACGCTGTGTGCACCCGCTCCGTCACCGTCCGGCTGCCTGGC 1351 CTGCACAACAGCCTTGTGAAACTGAAGCATGGGGCAGGAGTTGCCATGGA 14 01 TGGCCAGGACATCCAGCTCCCCCTCCTGAAAGGTGACCTCCGCATCCAGC 14 51 ATACAGTGACGGCCTCCGTGCGCCTCAGCTACGGGGAGGACCTGCAGATG 15 01 GACTGGGATGGCCGCGGGAGGCTGCTGGTGAAGCTGTCCCCCGTCTATGC 1551 CGGGAAGACCTGCGGCCTGTGTGGGAATTACAATGGCAACCAGGGCGACG 1601 ACTTCCTTACCCCCTCTGGGCTGGCGGAGCCCCGGGTGGAGGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGAAGCTGCACGGGGACTGCCAGGACCTGCAGAAGCAGCACAG 17 01 CGATCCCTGCGCCCTCAACCCGCGCATGACCAGGTTCTCCGAGGAGGCGT 17 51 GCGCGGTCCTGACGTCCCCCACATTCGAGGCCTGCCATCGTGCCGTCAGC 18 01 CCGCTGCCCTACCTGCGGAACTGCCGCTACGACGTGTGCTCCTGCTCGGA 18 51 CGGCCGCGAGTGCCTGTGCGGCGCCCTGGCCAGCTATGCCGCGGCCTGCG 19 01 CGGGGAGAGGCGTGCGCGTCGCGTGGCGCGAGCCAGGCCGCTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGAAAGGCCAGGTGTACCTGCAGTGCGGGACCCCCTGCAACCT 2 0 01 GACCTGCCGCTCTCTCTCTTACCCGGATGAGGAATGCAATGAGGCCTGCC 2 051 TGGAGGGCTGCTTCTGCCCCCCAGGGCTCTACATGGATGAGAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCAAGGCCCAGTGCCCCTGTTACTATGACGGTGAGATCTTCCA 2151 G С СAGAAGACAT С T T С T CAGAC CAT СACAC CAT GTGCTACTGT GAGGAT G 22 01 GCTTCATGCACTGTACCATGAGTGGAGTCCCCGGAAGCTTGCTGCCTGAC 22 51 GCTGTCCTCAGCAGTCCCCTGTCTCATCGCAGCAAAAGGAGCCTATCCTG 2 3 01 TCGGCCCCCCATGGTCAAGCTGGTGTGTCCCGCTGACAACCTGCGGGCTG 2 351 AAGGGCTCGAGTGTACCAAAACGTGCCAGAACTATGACCTGGAGTGCATG 2 4 01 AGCATGGGCTGTGTCTCTGGCTGCCTCTGCCCCCCGGGCATGGTCCGGCA 2 4 51 TGAGAACAGATGTGTGGCCCTGGAAAGGTGTCCCTGCTTCCATCAGGGCA 2 5 01 AGGAGTATGCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCAACACTTGTGTC 2 551 TGTCGGGACCGGAAGTGGAACTGCACAGACCATGTGTGTGATGCCACGTG 2 601 CTCCACGATCGGCATGGCCCACTACCTCACCTTCGACGGGCTCAAATACC 2 651 TGTTCCCCGGGGAGTGCCAGTACGTTCTGGTGCAGGATTACTGCGGCAGT 2 7 01 AACCCTGGGACCTTTCGGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCC 2 7 51 С T СAGT GAAAT G СAAGAAAC G G GT CAC CAT С С T G GT G GAG G GAG GAGAGA 2 8 01 TTGAGCTGTTTGACGGGGAGGTGAATGTGAAGAGGCCCATGAAGGATGAG 2 8 51 ACTCACTTTGAGGTGGTGGAGTCTGGCCGGTACATCATTCTGCTGCTGGG 2 9 01 CAAAGCCCTCTCCGTGGTCTGGGACCGCCACCTGAGCATCTCCGTGGTCC 2 951 TGAAGCAGACATACCAGGAGAAAGTGTGTGGCCTGTGTGGGAATTTTGAT 3 0 01 G G CAT С СAGAACAAT GAC С T CAC CAG CAG CAAC С T С СAAGT G GAG GAAGA 3 051 CCCTGTGGACTTTGGGAACTCCTGGAAAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACA 3101 CCAGAAAAGTGCCTCTGGACTCATCCCCTGCCACCTGCCATAACAACATC 3151 AT GAAG CAGAC GAT G GT G GAT T С С T С С T GTAGAAT С С T TAC СAGT GAC GT 32 01 CTTCCAGGACTGCAACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCT 32 51 GCATTTACGACACCTGCTCCTGTGAGTCCATTGGGGACTGCGCCGCATTC 33 01 TGCGACACCATTGCTGCCTATGCCCACGTGTGTGCCCAGCATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGGAGGACGGCCACATTGTGCCCCCAGAGCTGCGAGGAGAGGA 34 01 ATCTCCGGGAGAACGGGTATGAGGCTGAGTGGCGCTATAACAGCTGTGCA 34 51 CCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCACCCTGAGCCACTGGCCTGCCCTGT 35 01 GCAGTGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCCTGG 3551 ATGAGCTTTTGCAGACCTGCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAG 3 601 GTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCAGGAAAGAAAGTCACCTTGAATCCCAG 3 651 TGACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGATGTTGTCAACCTCACCT 3701 3751 3801 GTGAAGCCTGCCAGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGG GGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATC CGGTGGCGGGGGATCCTTACCTGAAACTGGAGCCCTGCGGCCCCGGGTCG 3 8 51 TCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGC 3 9 01 CCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTTCCTCTT 3 951 CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA 4 0 01 CATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC 4 051 TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA 4101 GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC 4151 AC CAG GAC T G G С T GAAT G G CAAG GAGTACAAGT G СAAG GT С T С СAACAAA 42 01 GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC 42 51 CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCA 4 3 01 AGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAC 4 351 AT С G С С GT G GAGT G G GAGAG CAAT G G G CAG С С G GAGAACAAC TACAAGAC 4 4 01 CACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGC 4451 TCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC 4 5 01 GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT 4 551 GTCTCCGGGTAAATGA Таблица-16: Белковая последовательность ФВ051 ((DlD2D'D3Fc ФВ с распознающим сортазу А мотивом и тромбин-отщепляемым линкером между фрагментом ФВ и Fc; сайт сортазы А выделен жирным) (SEQIDNO: 101) 1 MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSM 51 YSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIGDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWC 2 01 ERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALC 2 51 Е КТ L С Е СAG G L Е СAC РAL L Е YART СAQ Е GMVL Y GWT DHSACSPVC РAGME 301 YRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPC 351 VHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFD 4 01 NRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKHGAGVAMDGQDIQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGD 7 01 CVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECM 8 01 SMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDE 951 THFEWESGRYIILLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFD 10 01 GIQNNDLTS SNLQVEEDPVDFGNSWKVS SQCADTRKVPLDS S PATCHNNI 1051 MKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYEAEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCE 12 01 VAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVWLTCEACQEP IS GGGGS GGG 12 51 GS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS LPETGALRPRWGGGGS GGGGS DKTHTC 13 01 PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFN 1351 WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK 14 01 ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD 14 51 IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS 1501 VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* Таблица 17: Нуклеотидная последовательность ФУШ 265 (одноцепочечной молекулы ФУШ с пентаглицином на N-конце) (SEQIDNO: 102) 1 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTG 51 CTTTAGTGGAGGAGGAGGAGGAGСCACСAGAAGATACTACCTGGGTGCAG 101 TGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTG 151 GACGCAAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTC 2 01 AGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTGTAGAATTCACGGATCACCTTTTCA 2 51 ACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATC 3 01 CAG G С T GAG GT T TAT GATACAGT G GT CAT TACAC T TAAGAACAT G GC T T С 351 CCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTG 4 01 AGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGAT 4 51 AAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGA 5 01 GAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTT 551 CTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTA 601 С TAGTAT GTAGAGAAG G GAGT С T G G С CAAG GAAAAGACACAGAC С T T G СA 651 CAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACT 7 01 CAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGG 751 GCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCC 8 01 AGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAA 8 51 TGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTT 9 01 CTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTT 951 CCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTT 10 01 GT СATAT С T С T T С С CAC СAACAT GAT G G CAT G GAAG С T TAT GT CAAAGTA 1051 GACAG С T GT С СAGAG GAAC С С CAAC TAC GAAT GAAAAATAAT GAAGAAG С 1101 GGAAGACTAT GAT GAT GAT CTTACT GATT CT GAAATGGAT GT GGT CAGGT 1151 TTGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAG 12 01 AAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTG 12 51 GGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTC 13 01 AATAT T T GAACAAT G G С С С T CAG С G GAT T G GTAG GAAGTACAAAAAAGT С 1351 С GAT T TAT G G СATACACAGAT GAAAC С T T TAAGAC T С GT GAAGC TAT T СA 14 01 GCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACA 14 51 CAC T GT T GAT TATAT T TAAGAAT CAAG CAAG CAGAC СATATAACAT С TAC 15 01 CCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAA 1551 AGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCA 1601 AATATAAAT GGACAGTGACT GTAGAAGAT GGGСCAACTAAATCAGAT CCT 1651 CGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCT 17 01 AGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAG 17 51 AT CAAAGAGGAAAC CAGATAAT GT СAGACAAGAGGAAT GT CAT С С T GT T T 18 01 T С T GTAT T T GAT GAGAAC С GAAG CTGGTACCT СACAGAGAATATACAAC G 18 51 CTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAG 19 01 С С T С СAACAT CAT G СACAG CAT CAAT G G С TAT GT T T T T GATAGT T T G CAG 1951 TTGTCAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGG 2 001 AGCACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAAC 2 051 ACAAAAT G GT С TAT GAAGACACAC T CAC С С TAT ТСС CAT T С T CAG GAGAA 2101 ACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCA 2151 CAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTA 22 01 GT T GT GACAAGAACACT GGT GAT TAT TAC GAGGACAGT TAT GAAGATAT T 22 51 T CAG СATAC T T G С T GAGTAAAAACAAT G С CAT T GAAC СAAGAAG CT T CT С 2 3 01 TCAAAACCCACCAGTCTTGAAGGCCCATCAGGCCGAAATAACTCGTACTA 2351 CTCTT CAGT CAGAT СAAGAG GAAATT GACTAT GAT GATACCATAT CAGTT 2 4 01 GAAAT GAAGAAG GAAGAT T T T GAC AT T TAT GAT GAG GAT GAAAAT CAGAG 2 4 51 CCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGG 2 5 01 AGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAAC 2 551 AGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGA 2 601 ATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATG 2 651 AACAT TTGGGCCTCCTCGGCC СATATATAAGAG СAGAAGT T GAAGATAAT 2 7 01 ATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTC 2 7 51 TAG С С T TAT T T С T TAT GAG GAAGAT CAGAG G CAAG GAG СAGAAC С TAGAA 2 8 01 AAAACTTTGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAA 2 8 51 CATCATATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTA 2 901 TTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGAC 2 951 CCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAA 3001 GT GACAGTACAGGAAT TTGCTCTGTTTTTCAC CAT CT T T GAT GAGAC СAA 3 051 AAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCA 3101 ATAT С CAGAT G GAAGAT С С CAC T T T TAAAGAGAAT TAT С G С T T С CAT G СA 3151 AT CAAT G G С TACATAAT G GATACAC TACCTGGCT TAGTAAT G GC T CAG GA 32 01 TCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCC 32 51 AT T С TAT T CAT T T CAGT G GACAT GT GT T CAC T GTAC GAAAAAAAGAG GAG 33 01 TATAAAAT G G CAC T GTACAAT С T С TAT С СAG GT GT T T T T GAGACAGT G GA 3351 AATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCG 34 01 AG CAT С TACAT G С T G G GAT GAG СACAC TTTTTCTGGT GTACAGCAATAAG 35 51 TGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGAT 36 01 TACAG С T T CAG GACAATAT G GACAGT G G G С С С СAAAG С Т G G С CAGAC Т Т С 3551 ATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGG 3 601 AT С AAG GT G GAT С T GT T G G CAC CAAT GAT TAT T CAC G G CAT С AAG AC С С A 3 651 GGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCA 37 01 T GTATAGT С T T GAT G G GAAGAAGT G G CAGAC T TAT С GAG GAAAT T С CAC T 37 51 GGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACA 38 01 CAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAA 3 8 51 CTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGAT 3 9 01 T TAAATAGT T G CAG CAT G С CAT T G G GAAT G GAGAGTAAAG СAATAT СAGA 3 951 TGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGT 4 001 CTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGA 4 051 CCT СAG GT GAATAAT С СAAAAGAGT G G С T G СAAGT G GAC T T С CAGAAGAC 4101 AAT GAAAGT СACAG GAGTAAC TACT CAG G GAGTAAAAT С T С T GC T TAC СA 4151 GCAT GTAT GT GAAGGAGTT CCT CAT CT CCAGCAGT CAAGAT GGCCAT CAG 42 01 TGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCA 42 51 AGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTC 4 3 01 GCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGG 4 351 ATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTACTGA Таблица 18: Белковая последовательность OVIII 265 (одноцепочечной молекулы OVIII с пентаглицином на N-конце; пентаглицин выделен жирным) (SEQIDNO: 103) 1 MQIELSTCFFLCLLRFCFSGGGGGATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPV 51 DARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTI 101 QAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDD 151 KVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGAL 201 LVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASAR 251 AWPKMHTWGYWRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTF 301 LVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKV 351 DSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAK 401 KHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKV 451 RFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIY 501 PHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDP 551 RCLTRYYSSFWMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILF 601 SVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQ 651 LSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGE 701 TVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDI 751 SAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKAHQAEITRTTLQSDQEEIDYDDTISV 801 EMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRN 851 RAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDN 901 IMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQ 951 HHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQ 10 01 VTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHA 1051 INGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEE 1101 YKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNK 1151 CQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSW 12 01 IKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNST 12 51 GTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCD 13 01 LNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWR 1351 PQWNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQ 14 01 WTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALR 14 51 MEVLGCEAQDLY* Пример 20: Плазменная стабильность и OK OVIII198 в плазме крови мышей с гемофилией А и мышей с двойным OVIII/OB генным нокаутом (ДГН) [0411] Плазменную стабильность OVIII198 (которая является одноцепочечной ОУПГГс-226№-молекулой, частично содержащей В-домен; где 226 представляет 226 N-концевых аминокислот В-домена OVIII, а N6 представляет шесть участков N- гликозилирования в В-домене) сравнивали с OVIIIFc (OVIII 155/Fc) в в плазме крови мышей с двойным OVIII/OB генным нокаутом (ДГН). Схематическое изображение OVIII155 и OVIII198 представлено на Оигуре 25. [0412] Для анализа стабильности 5 МЕ/мл белков OVIII 198 или OVIIIFc с мышиной или ДГН плазмой при 37°С. Аликвоты брали для разных временных точек, чтобы измерить активность при помощи хромогенного анализа OVIII. Активность для каждой временной точки измеряли дважды, а среднюю активность наносили на график как функцию времени. Анализ стабильности показал, что наличие частичного В-домена повышает стабильность одноцепочечного OVIIIFc (Оигура 26А). [0413] Время полужизни OVIII 198 (одноцепочечная B226N6) также сравнивали с OVIII155 (одноцепочечный OVIII с удаленным В-доменом) для ДГН мышей. OVIII 198 имеет по менбшей мере приблизительно в 1,5 раз большее время полужизни по сравнению с OVIII155 (Оигура 26Б). Эти эксперименты позволяют предположить, что возможно существование взаимосвязи между стабильностью OVIII и его in-vivo временем полужизни. Нуклеотидная последовательность белка ФУШ 198 (OVIIIFc с частичным В-доменом. 226N6XSEOIDNO: 104) 1 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTG 51 CTTTAGTGC САС СAGAAGATAC TACCTGGGTG CAGT G GAAC Т GT CAT G G G 101 ACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCT 151 CCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAA 2 01 GACTCTGTTTGTAGAATTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAA 2 51 GGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTAT 301 GATACAGT GGT CAT TACAC T TAAGAACAT G G С T T С С CAT С С T GT CAGT С T 351 TCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATG 4 01 AT GAT CAGACCAGT CAAAGGGAGAAAGAAGAT GATAAAGT CT TCC CT GGT 451 GGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGC 501 CTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGG 551 TAAAAGAC T T GAAT T CAG G С С T CAT T G GAG С С С TACTAGTAT GTAGAGAA 601 G G GAGT С T G G С CAAG GAAAAGACACAGAC С T T G СACAAAT T TATACTAC T 651 TTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACT 7 01 CCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATG 751 CACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATG 8 01 CCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTG 8 51 AAGT GCACT CAATAT T С CT С GAAGGT CACACAT T T CT T GT GAGGAAC CAT 901 CGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAAC 951 ACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCC 10 01 AC СAACAT GAT G G CAT G GAAG С T TAT GT CAAAGTAGACAG С T GT С CAGAG 1051 GAAC С С CAAC TAC GAAT GAAAAATAAT GAAGAAG С G GAAGAC TAT GAT GA 1101 T GAT CTTACT GATT CT GAAAT GGAT GT GGT CAGGTTT GAT GAT GACAACT 1151 CTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACT 12 01 TGGGTACATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTT 1251 AGTCCTCGCCCCC GAT GACAGAAGT TATAAAAGT CAATAT T T GAACAAT G 13 01 G С С С T CAG С G GAT T G GTAG GAAGTACAAAAAAGT С С GAT T TAT G GCATAC 1351 ACAGAT GAAAC С T T TAAGAC T С GT GAAG С TAT T CAG CAT GAAT СAGGAAT 14 01 CTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATAT 14 51 T TAAGAAT CAAG CAAG CAGAC СATATAACAT С TAC С С T CAC G GAAT CAC T 15 01 GAT GTCCGTCCTTT GTAT T CAAGGAGAT TAC CAAAAGGT GTAAAACAT TT 1551 GAAG GAT T T T С CAAT T С T G С С AG GAGAAAT AT T С AAAT AT AAAT G GAC AG 1601 TGACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGC 1651 TATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCAT 17 01 TGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACC 17 51 AGATAAT GT СAGACAAGAG GAAT GT CAT CCTGTTTTCTGTATTT GAT GAG 18 01 AAC С GAAG CTGGTACCT СACAGAGAATATACAAC GCTTTCTCCC CAAT С С 18 51 AGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGC 19 01 ACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTG 1951 CAT GAG GT G G СATAC T G GTACAT T С TAAG CAT T G GAG СACAGACT GAC T T 2 001 CCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATG 2 051 AAGACACACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCG 2101 ATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCG 2151 GAACAGAG G CAT GAC CGCCTTACT GAAG GT TTCTAGTTGT GACAAGAACA 22 01 С T G GT GAT TAT TAC GAG GACAGT TAT GAAGATAT T T CAG СATAC T T G С T G 22 51 AGTAAAAACAAT G С CAT T GAAC СAAGAAG С T T С T С T СAGAAT T СAAGACA 2 3 01 С С С TAG CAC TAG G СAAAAG CAAT T TAAT G С CAC СACAAT T С СAGAAAAT G 2 351 ACATAGAGAAGAC T GAC CCTTGGTTTG СACACAGAACAC С TAT G С CTAAA 24 01 ATACAAAATGTCTCCTCTAGTGATTTGTTGATGCTCTTGCGACAGAGTCC 2 4 51 TAC T С СACAT G G G С TAT CCT TAT С T GAT С T С СAAGAAG С СAAATAT GAGA 2 5 01 CTTTTTCT GAT GAT С CAT CAC С T G GAG СAATAGACAGTAATAACAGC С T G 2 551 T С T GAAAT GACACAC T T CAG G С СACAG С T С CAT СACAGT G G G GACAT GGT 2 601 AT TTACCCCT GAGT CAG G С С T С CAAT TAAGAT TAAAT GAGAAAC T GG G GA 2 651 CAAC T G CAG СAACAGAGT T GAAGAAAC T T GAT T T CAAAGT T T CTAGTACA 2 7 01 T CAAATAAT CT GAT T T CAACAAT T С CAT CAGACAATT T GGCAGCAGGTAC 2 7 51 T GATAATACAAGT T С С T TAG GAC С С С СAAGTAT G С CAGT T CAT TAT GATA 2 8 01 GT CAAT TAGATAC CAC T С TAT T T G G СAAAAAGT CAT CTCCCCTTACT GAG 2 851 TCTGGTGGACCTCTGAGCTTGAGTGAAGAAAATAATGATTCAAAGTTGTT 2 9 01 AGAAT СAG GT T TAAT GAATAG С СAAGAAAGT T CAT G G G GAAAAAAT GTAT 2 951 CGT CAGAAATAACT CGTACTACT CTT CAGT CAGAT CAAGAGGAAATT GAC 3 0 01 TAT GAT GATAC СATAT CAGT T GAAAT GAAGAAG GAAGAT T T T GACAT T TA 3 051 T GAT GAG GAT GAAAAT CAGAG С С С С С G CAG С Т Т Т СAAAAGAAAACAC GAC 3101 ACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGC 3151 TCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTT 32 01 CAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCT 32 51 ТATАС С GT G GAGAAC ТAAAT GAACAT Т Т G G GAC TCCTGGGGC CATATATA 33 01 AGAG СAGAAGT T GAAGATAATAT CAT GGTAACTTT CAGAAAT CAG GC С T С 3351 TCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGATCAGA 34 01 G G CAAG GAG СAGAAC С TAGAAAAAAC T T T GT CAAG С С TAAT GAAAC СAAA 34 51 ACTTACTTTTG GAAAGT G СAACAT СATAT G G CAC С CAC TAAAGAT GAGT T 35 01 TGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATG 3551 TGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTG 3 601 AACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTT 3 651 CAC CAT С T T T GAT GAGAC СAAAAG CTGGTACTT СACT GAAAATAT GGAAA 37 01 GAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCCACTTTTAAA 37 51 GAGAAT TAT С G С T T С CAT G CAAT CAAT G G С TACATAAT G GATACACTAC С 38 01 TGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCA 3851 T G G G CAG CAAT GAAAACAT С CAT T С TAT T CAT T T CAGT G GACAT GT GT T С 3 9 01 ACT GTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAAT GGCACT GTACAAT CT CTAT CC 3 951 AGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGC 4 0 01 GGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTT 4 051 TTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGG 4101 ACACAT TAGAGAT T T T CAGAT TACAG CTT CAG GACAATAT G GACAGT G G G 4151 CCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGC 42 01 ACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGAT 42 51 TATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCT 4 3 01 ACAT CT CT CAGTTTAT CAT CAT GTATAGT CTT GAT GGGAAGAAGT GGCAG 4 351 ACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAATGT 44 01 G GAT T CAT С T G G GATAAAACACAATAT T T T TAAC С CT С CAAT TAT T G С T С 4 4 51 GATACAT С С GT T T G CAC С CAAC T CAT TATAG CAT T С G CAG CAC T С T T С G С 4501 ATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCCATTGGGAAT 4 551 GGAGAGTAAAGCAATAT CAGAT GCACAGATTACT GCTT CAT С CTACTTTA 4 601 CCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAA 4 651 G G GAG GAGTAAT G С С T G GAGAC С T СAG GT GAATAAT С СAAAAGAGT G GC T 4 7 01 G СAAGT G GAC T T С СAGAAGACAAT GAAAGT СACAG GAGTAAC TAC T CAG G 4 7 51 GAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCC 4 8 01 AGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGT 4 851 AAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTC 4 9 01 TAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGG 4 951 GTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGA 5 0 01 CCTCTACGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCC 5 051 TGGGCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC 5101 ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA 5151 CGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC 52 01 ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT 52 51 GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGA 53 01 GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA 5351 CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG 54 01 CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT 54 51 GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG 55 01 GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGAC 5551 GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA 5 601 GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC 5 651 ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Последовательность белка ФУШ 198 (SEQIDNO: 105) 1 MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFP 51 PRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVY 101 DTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPG 151 GSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCRE 2 01 GSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKM 251 HTWGYWRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNH 301 RQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKT 4 01 WVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAY 451 TDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTR 551 YYSSFWMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDE 601 NRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMS 7 01 MENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPK 8 01 IQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSL 851 SEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSST 901 SNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTE 951 SGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSEITRTTLQSDQEEID 10 01 YDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQS PRS FQKKTRHYFIAAVERLWDYGMS S 1051 SPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYI 1101 RAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETK 1151 TYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTL 12 01 NPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFK 12 51 ENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVF 13 01 TVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTL 1351 FLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWS 14 01 TKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQ 14 51 TYRGNSTGTLMVFFGNVDS SGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLR 15 01 MELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQ 1551 GRSNAWRPQWNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLIS 1601 SSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSW 1651 VHQIALRMEVLGCEAQDLYDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL 1701 MISRTP E VT CWVDVS H E D P E VK FNWYVD GVE VHNAKT KPREEQYNSTYR 17 51 WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL 18 01 PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD 1851 GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* Пример 21. Экспрессия белка D1D2 ФВ [0414] Правильный фолдинг домена D'D3 важен для его связывания с ФУШ. Пропептид ФВ (D1D2 - аминокислоты 1-763) необходим для эффективного образования дисульфидной связи и фолдинга D'D3. Он действует как внутренний шаперон для фолдинга D'D3. Конструкции ФВ, создающие фрагменты ФВ, также могут экспрессироваться там, где пропептид ФВ (т.е., домен D1D2) напрямую связан с доменом D'D3, и удаляться во время регулярного внутриклеточного процессинга D'D3 (т.е., в цис-форме), или же, он может экспрессироваться с другой плазмиды, т.е. в транс-форме. Гетеродимер ФУШ-ФВ был сконструирован таким образом, чтобы D1D2 мог экспрессироваться как в цис-, так и в транс-форме. [0415] Клонирование ФВ 053: клон ФВ 053 экспрессирует пропептид ФВ (домен D1D2) для экспрессии D1D2 в транс-форме. Пропептид ФВ амплифицировали ПЦР из полноразмерной формы при помощи ESC 54 и ESC124. ESC54-cЈB прямая с сайтом BsiWl (SEQIDNO: 111) (CGCTTCGCGACGTACGGCCGCCACCATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTC) ESC 124 - D1D2 клонирующий олиго с сайтом Notl - обратная (SEQIDNO: 112) (CTAGACTCGAGCGGCCGCTCACCTTTTGCTGCGATGAGACAGGGGACTGCTGAGGACAGC) [0416] Продукт ПЦР расщепляли BsiWl и Notl лигировали в BsiWl/Notl- расщепленный пЦДНК 4. Нуклеотидная последовательность ФВ 053 (пропептид D1D2 ФВ) (SEQIDNO: 113) 1 ATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTCTGGCCCTCATTTT 51 GCCAGGGACCCTTTGTGCAGAAGGAACTCGCGGCAGGTCATCCACGGCCC 101 GATGCAGCCTTTTCGGAAGTGACTTCGTCAACACCTTTGATGGGAGCATG 151 TACAGCTTTGCGGGATACTGCAGTTACCTCCTGGCAGGGGGCTGCCAGAA 2 01 ACGCTCCTTCTCGATTATTGGGGACTTCCAGAATGGCAAGAGAGTGAGCC 2 51 TCTCCGTGTATCTTGGGGAATTTTTTGACATCCATTTGTTTGTCAATGGT 301 ACCGTGACACAGGGGGACCAAAGAGTCTCCATGCCCTATGCCTCCAAAGG 351 GCTGTATCTAGAAACTGAGGCTGGGTACTACAAGCTGTCCGGTGAGGCCT 4 01 ATGGCTTTGTGGCCAGGATCGATGGCAGCGGCAACTTTCAAGTCCTGCTG 4 51 Т СAGACAGATАС Т Т СAACAAGAC CTGCGGGCTGTGTGG СAAC Т Т ТAACAT 501 CTTTGCTGAAGATGACTTTATGACCCAAGAAGGGACCTTGACCTCGGACC 551 CTTATGACTTTGCCAACTCATGGGCTCTGAGCAGTGGAGAACAGTGGTGT 601 GAACGGGCATCTCCTCCCAGCAGCTCATGCAACATCTCCTCTGGGGAAAT 651 GCAGAAGGGCCTGTGGGAGCAGTGCCAGCTTCTGAAGAGCACCTCGGTGT 7 01 TTGCCCGCTGCCACCCTCTGGTGGACCCCGAGCCTTTTGTGGCCCTGTGT 7 51 GAGAAGACTTTGTGTGAGTGTGCTGGGGGGCTGGAGTGCGCCTGCCCTGC 8 01 CCTCCTGGAGTACGCCCGGACCTGTGCCCAGGAGGGAATGGTGCTGTACG 8 51 GCTGGACCGACCACAGCGCGTGCAGCCCAGTGTGCCCTGCTGGTATGGAG 9 01 TATAGGCAGTGTGTGTCCCCTTGCGCCAGGACCTGCCAGAGCCTGCACAT 951 CAATGAAATGTGTCAGGAGCGATGCGTGGATGGCTGCAGCTGCCCTGAGG 10 01 GACAGCTCCTGGATGAAGGCCTCTGCGTGGAGAGCACCGAGTGTCCCTGC 1051 GTGCATTCCGGAAAGCGCTACCCTCCCGGCACCTCCCTCTCTCGAGACTG 1101 СAACАС С Т G CAT Т Т G С С GAAACAG С CAGT G GAT С T G CAG CAAT GAAGAAT 1151 GTCCAGGGGAGTGCCTTGTCACTGGTCAATCCCACTTCAAGAGCTTTGAC 12 01 AACAGATACTTCACCTTCAGTGGGATCTGCCAGTACCTGCTGGCCCGGGA 12 51 TTGCCAGGACCACTCCTTCTCCATTGTCATTGAGACTGTCCAGTGTGCTG 13 01 ATGACCGCGACGCTGTGTGCACCCGCTCCGTCACCGTCCGGCTGCCTGGC 1351 CTGCACAACAGCCTTGTGAAACTGAAGCATGGGGCAGGAGTTGCCATGGA 14 01 TGGCCAGGACATCCAGCTCCCCCTCCTGAAAGGTGACCTCCGCATCCAGC 14 51 ATACAGTGACGGCCTCCGTGCGCCTCAGCTACGGGGAGGACCTGCAGATG 15 01 GACTGGGATGGCCGCGGGAGGCTGCTGGTGAAGCTGTCCCCCGTCTATGC 1551 CGGGAAGACCTGCGGCCTGTGTGGGAATTACAATGGCAACCAGGGCGACG 1601 ACTTCCTTACCCCCTCTGGGCTGGCGGAGCCCCGGGTGGAGGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGAAGCTGCACGGGGACTGCCAGGACCTGCAGAAGCAGCACAG 17 01 CGATCCCTGCGCCCTCAACCCGCGCATGACCAGGTTCTCCGAGGAGGCGT 17 51 GCGCGGTCCTGACGTCCCCCACATTCGAGGCCTGCCATCGTGCCGTCAGC 18 01 CCGCTGCCCTACCTGCGGAACTGCCGCTACGACGTGTGCTCCTGCTCGGA 18 51 CGGCCGCGAGTGCCTGTGCGGCGCCCTGGCCAGCTATGCCGCGGCCTGCG 19 01 CGGGGAGAGGCGTGCGCGTCGCGTGGCGCGAGCCAGGCCGCTGTGAGCTG 1951 AACTGCCCGAAAGGCCAGGTGTACCTGCAGTGCGGGACCCCCTGCAACCT 2 0 01 GACCTGCCGCTCTCTCTCTTACCCGGATGAGGAATGCAATGAGGCCTGCC 2 051 TGGAGGGCTGCTTCTGCCCCCCAGGGCTCTACATGGATGAGAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCAAGGCCCAGTGCCCCTGTTACTATGACGGTGAGATCTTCCA 2151 G С СAGAAGACAT С T T С T CAGAC CAT СACAC CAT GTGCTACTGT GAGGAT G 22 01 GCTTCATGCACTGTACCATGAGTGGAGTCCCCGGAAGCTTGCTGCCTGAC 22 51 GCTGTCCTCAGCAGTCCCCTGTCTCATCGCAGCAAAAGG Белковая последовательность ФВ 053 (пропептид D1D2 ФВ) (SEQIDNO: 114) 1 MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSM 51 YSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIGDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWC 2 01 ERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALC 251 EKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCPAGME 301 YRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPC 351 VHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFD 4 01 NRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKHGAGVAMDGQDIQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGD 7 01 CVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHRSKR [0417] Вышеприведенное описание характерных вариантов реализации раскрывает общий характер данного изобретения в настолько полном объеме, что другие специалисты могут, применяя знания в данной области техники, с легкостью модифицировать и/или адаптировать эти характерные варианты реализации для различных применений, без проведения лишних экспериментов и без отступления от общей концепции настоящего изобретения. Следовательно, такие адаптации и модификации находятся в пределах содержания и серии эквивалентов раскрытых вариантов реализации, на основе представленных в данном тексте идеи и методологических принципов. Стоит понимать, что употребляемая в данном тексте фразеология и терминология имеет цель описания, но не ограничения, поэтому специалистам в данной области техники следует интерпретировать терминологию или фразеологию описания настоящего изобретения в свете его идеи и методологических принципов. [0418] Существование других вариантов реализации изобретения будет очевидным для специалистов в данной области техники из приведенных в тексте обсуждения и реализации изобретения. Описание изобретения и примеры стоит рассматривать как иллюстративные, а подлинные суть и объем данного изобретения определены прилагающейся формулой изобретения. [0419] Все перечисленные в данном тексте патентные публикации в полном объеме включены в текст посредством ссылки. ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Biogen Idec MA Inc. CHHABRA, EKTA SETH LIU,TONGYAO PETERS, ROBERT <120> ПОЛИПЕПТИДЫ ХИМЕРНОГО ФАКТОРА VIII И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ <130> 2159.359PC04/EKS/C-K/E-H <140> На присвоение <141> 2013-01-11 <150> США 61/586,099 <151> 2012-01-12 <150> США 61/586,654 <151> 2012-01-13 <150> США 61/667,901 <151> 2012-07-03 <150> США 61/734,954 <151> 2012-12-07 <160> 114 <170> Патентная версия 3.5 <210> 1 <211> 16842 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 1 atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60 ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc tactaaggac ggtctaaacg 120 gccccacgac gaacgagacc gggagtaaaa cggtccctgg gaaacacgtc ttccttgagc 180 gccgtccagt aggtgccggg gatgcagcct tttcggaagt gacttcgtca acacctttga 240 tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc ctggcagggg gctgccagaa 300 ctacgtcgga aaagccttca ctgaagcagt tgtggaaact accctcgtac atgtcgaaac 360 gccctatgac gtcaatggag gaccgtcccc cgacggtctt acgctccttc tcgattattg 420 gggacttcca gaatggcaag agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca 480 tccatttgtt tgtcaatggt tgcgaggaag agctaataac ccctgaaggt cttaccgttc 540 tctcactcgg agaggcacat agaacccctt aaaaaactgt aggtaaacaa acagttacca 600 accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 660 gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct tggcactgtg tccccctggt 720 ttctcagagg tacgggatac ggaggtttcc cgacatagat ctttgactcc gacccatgat 780 gttcgacagg ccactccgga atggctttgt ggccaggatc gatggcagcg gcaactttca 840 agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg ctgtgtggca actttaacat 900 taccgaaaca ccggtcctag ctaccgtcgc cgttgaaagt tcaggacgac agtctgtcta 960 tgaagttgtt ctggacgccc gacacaccgt tgaaattgta ctttgctgaa gatgacttta 1020 tgacccaaga agggaccttg acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga 1080 gcagtggaga acagtggtgt gaaacgactt ctactgaaat actgggttct tccctggaac 1140 tggagcctgg gaatactgaa acggttgagt acccgagact cgtcacctct tgtcaccaca 1200 gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 1260 ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt cttgcccgta gaggagggtc 1320 gtcgagtacg ttgtagagga gaccccttta cgtcttcccg gacaccctcg tcacggtcga 1380 agacttctcg tggagccaca ttgcccgctg ccaccctctg gtggaccccg agccttttgt 1440 ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg ctggagtgcg cctgccctgc 1500 aacgggcgac ggtgggagac cacctggggc tcggaaaaca ccgggacaca ctcttctgaa 1560 acacactcac acgacccccc gacctcacgc ggacgggacg cctcctggag tacgcccgga 1620 cctgtgccca ggagggaatg gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag 1680 tgtgccctgc tggtatggag ggaggacctc atgcgggcct ggacacgggt cctcccttac 1740 cacgacatgc cgacctggct ggtgtcgcgc acgtcgggtc acacgggacg accatacctc 1800 tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 1860 tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg atatccgtca cacacagggg 1920 aacgcggtcc tggacggtct cggacgtgta gttactttac acagtcctcg ctacgcacct 1980 accgacgtcg acgggactcc gacagctcct ggatgaaggc ctctgcgtgg agagcaccga 2040 gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc acctccctct ctcgagactg 2100 ctgtcgagga cctacttccg gagacgcacc tctcgtggct cacagggacg cacgtaaggc 2160 ctttcgcgat gggagggccg tggagggaga gagctctgac caacacctgc atttgccgaa 2220 acagccagtg gatctgcagc aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat 2280 cccacttcaa gagctttgac gttgtggacg taaacggctt tgtcggtcac ctagacgtcg 2340 ttacttctta caggtcccct cacggaacag tgaccagtta gggtgaagtt ctcgaaactg 2400 aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 2460 cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg ttgtctatga agtggaagtc 2520 accctagacg gtcatggacg accgggccct aacggtcctg gtgaggaaga ggtaacagta 2580 actctgacag gtcacacgac atgaccgcga cgctgtgtgc acccgctccg tcaccgtccg 2640 gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat ggggcaggag ttgccatgga 2700 tactggcgct gcgacacacg tgggcgaggc agtggcaggc cgacggaccg gacgtgttgt 2760 cggaacactt tgacttcgta ccccgtcctc aacggtacct tggccaggac atccagctcc 2820 ccctcctgaa aggtgacctc cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct 2880 acggggagga cctgcagatg accggtcctg taggtcgagg gggaggactt tccactggag 2940 gcgtaggtcg tatgtcactg ccggaggcac gcggagtcga tgcccctcct ggacgtctac 3000 gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 3060 tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg ctgaccctac cggcgccctc 3120 cgacgaccac ttcgacaggg ggcagatacg gcccttctgg acgccggaca cacccttaat 3180 gttaccgttg gtcccgctgc acttccttac cccctctggg ctggcrgagc cccgggtgga 3240 ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag gacctgcaga agcagcacag 3300 tgaaggaatg ggggagaccc gaccgyctcg gggcccacct cctgaagccc ttgcggacct 3360 tcgacgtgcc cctgacggtc ctggacgtct tcgtcgtgtc cgatccctgc gccctcaacc 3420 cgcgcatgac caggttctcc gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg 3480 cctgccatcg tgccgtcagc gctagggacg cgggagttgg gcgcgtactg gtccaagagg 3540 ctcctccgca cgcgccagga ctgcaggggg tgtaagctcc ggacggtagc acggcagtcg 3600 ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 3660 tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg ggcgacggga tggacgcctt 3720 gacggcgatg ctgcacacga ggacgagcct gccggcgctc acggacacgc cgcgggaccg 3780 gtcgatacgg cgccggacgc cggggagagg cgtgcgcgtc gcgtggcgcg agccaggccg 3840 ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag tgcgggaccc cctgcaacct 3900 gcccctctcc gcacgcgcag cgcaccgcgc tcggtccggc gacactcgac ttgacgggct 3960 ttccggtcca catggacgtc acgccctggg ggacgttgga gacctgccgc tctctctctt 4020 acccggatga ggaatgcaat gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct 4080 acatggatga gaggggggac ctggacggcg agagagagaa tgggcctact ccttacgtta 4140 ctccggacgg acctcccgac gaagacgggg ggtcccgaga tgtacctact ctcccccctg 4200 tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 4260 atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg acgcacgggt tccgggtcac 4320 ggggacaatg atactgccac tctagaaggt cggtcttctg tagaagagtc tggtagtgtg 4380 gtacacgatg acactcctac gcttcatgca ctgtaccatg agtggagtcc ccggaagctt 4440 gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc agcaaaagga gcctatcctg 4500 cgaagtacgt gacatggtac tcacctcagg ggccttcgaa cgacggactg cgacaggagt 4560 cgtcagggga cagagtagcg tcgttttcct cggataggac tcggcccccc atggtcaagc 4620 tggtgtgtcc cgctgacaac ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga 4680 actatgacct ggagtgcatg agccgggggg taccagttcg accacacagg gcgactgttg 4740 gacgcccgac ttcccgagct cacatggttt tgcacggtct tgatactgga cctcacgtac 4800 agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 4860 tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca tcgtacccga cacagagacc 4920 gacggagacg gggggcccgt accaggccgt actcttgtct acacaccggg acctttccac 4980 agggacgaag gtagtcccgt aggagtatgc ccctggagaa acagtgaaga ttggctgcaa 5040 cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac catgtgtgtg atgccacgtg 5100 tcctcatacg gggacctctt tgtcacttct aaccgacgtt gtgaacacag acagccctgg 5160 ccttcacctt gacgtgtctg gtacacacac tacggtgcac ctccacgatc ggcatggccc 5220 actacctcac cttcgacggg ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg 5280 tgcaggatta ctgcggcagt gaggtgctag ccgtaccggg tgatggagtg gaagctgccc 5340 gagtttatgg acaaggggcc cctcacggtc atgcaagacc acgtcctaat gacgccgtca 5400 aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 5460 tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgggaccct ggaaagccta 5520 ggatcacccc ttattcccta cgtcggtggg gagtcacttt acgttctttg cccagtggta 5580 ggaccacctc cctcctctct ttgagctgtt tgacggggag gtgaatgtga agaggcccat 5640 gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg tacatcattc tgctgctggg 5700 aactcgacaa actgcccctc cacttacact tctccgggta cttcctactc tgagtgaaac 5760 tccaccacct cagaccggcc atgtagtaag acgacgaccc caaagccctc tccgtggtct 5820 gggaccgcca cctgagcatc tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg 5880 gcctgtgtgg gaattttgat gtttcgggag aggcaccaga ccctggcggt ggactcgtag 5940 aggcaccagg acttcgtctg tatggtcctc tttcacacac cggacacacc cttaaaacta 6000 ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 6060 tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccgtaggtct tgttactgga 6120 gtggtcgtcg ttggaggttc acctccttct gggacacctg aaacccttga ggacctttca 6180 ctcgagcgtc acacgactgt ccagaaaagt gcctctggac tcatcccctg ccacctgcca 6240 taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt agaatcctta ccagtgacgt 6300 ggtcttttca cggagacctg agtaggggac ggtggacggt attgttgtag tacttcgtct 6360 gctaccacct aaggaggaca tcttaggaat ggtcactgca cttccaggac tgcaacaagc 6420 tggtggaccc cgagccatat ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca 6480 ttggggactg cgcctgcttc gaaggtcctg acgttgttcg accacctggg gctcggtata 6540 gacctacaga cgtaaatgct gtggacgagg acactcaggt aacccctgac gcggacgaag 6600 tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 6660 aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga acgctgtggt aacgacggat 6720 acgggtgcac acacgggtcg taccgttcca ccactggacc tcctgccggt gtaacacggg 6780 ggtctcgacg ctcctctcct atctccggga gaacgggtat gagtgtgagt ggcgctataa 6840 cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct gagccactgg cctgccctgt 6900 tagaggccct cttgcccata ctcacactca ccgcgatatt gtcgacacgt ggacggacag 6960 ttcagtgcac agtcgtggga ctcggtgacc ggacgggaca gcagtgtgtg gagggctgcc 7020 atgcccactg ccctccaggg aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg 7080 aagactgtcc agtgtgtgag cgtcacacac ctcccgacgg tacgggtgac gggaggtccc 7140 ttttaggacc tactcgaaaa cgtctggacg caactgggac ttctgacagg tcacacactc 7200 gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 7260 cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct caccgaccgg ccgcaaaacg 7320 gagtcctttc tttcagtgga acttagggtc actgggactc gtgacggtct aaacggtgac 7380 actacaacag ttggagtgga gtgaagcctg ccaggagccg ggaggcctgg tggtgcctcc 7440 cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct gtatgtggag gacatctcgg aaccgccgtt 7500 cacttcggac ggtcctcggc cctccggacc accacggagg gtgtctacgg ggccactcgg 7560 ggtggtgaga catacacctc ctgtagagcc ttggcggcaa gcacgatttc tactgcagca 7620 ggctactgga cctggtcttc ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg 7680 aagtgctgaa ggcctttgtg cgtgctaaag atgacgtcgt ccgatgacct ggaccagaag 7740 gacgacctac cgaggaggtc cgacaggctc cgactcaaac ttcacgactt ccggaaacac 7800 gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc cgtggtggag 7860 taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc cacctgtact acctcgccga 7920 cgcgtagagg gtcttcaccc aggcgcaccg gcaccacctc atggtgctgc cgagggtgcg 7980 gatgtagccc gagttcctgg ggaagcgacc gtcagagctg cggcgcattg ccagccaggt 8040 gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac cagcgaggtc ttgaaataca cactgttcca 8100 ccttcgctgg cagtctcgac gccgcgtaac ggtcggtcca cttcatacgc ccgtcggtcc 8160 accggaggtg gtcgctccag aactttatgt gtgacaaggt aatcttcagc aagatcgacc 8220 gccctgaagc ctcccgcatc gccctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt 8280 cccggaactt tgtccgctac ttagaagtcg ttctagctgg cgggacttcg gagggcgtag 8340 cgggacgagg actaccggtc ggtcctcggg gttgcctaca gggccttgaa acaggcgatg 8400 gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg gccccatgcc 8460 aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg caggtcccgg acttcttctt 8520 cttccagtaa gtagctcttc gcagcaaagg tcttgttccg aatcgatgga cacaagtcac ccatggttct cccgagaacc ttcgtcctgg atggaggagg gttttaacca ctacctacac cgtggagtac cgtaggtgca tccgtgtcag acaggaccaa agggtgaccg cgggacgcca cccaacctgg ggagacatcc gtggccttta gtaacctcac ccctatcctc ggttgcacgt aactctgcga ggctgcagat ttctcctgga aggggacgtg agtttcccag gccaatatag actactttac gtgagtccac cactagggcc gtccggggac gacgagatcg gaagcacgac gacactggaa tgtgggcccg ggatgtggcg cccaaagctg aaggatcgga tgattcagcg cttcggctga ccggtcctgt cccttcagcg gtgccacgac gtttcccctg cactgggctg ggagcaggcg tggagagact tctacatggt aggtggtgcc ggacggagac ccgggattac atccaggact cctcgacctc gggggctctc ccccaccctc tggctcctcc gactgacgtc cttcttattt ggcctcgtct ttctcaaagc agtcacgacg acccgtaacc agaacaaggc ttagctacct tcgtcacacc cggggacttc gggctcttgg atgagacggg ggaccccggg caaaattggt gatggatgtg agttgtcctc gcatccacgt aggcacagtc gtcatgagga taggacgtcg gccctgcggt ctaggcgatg ggtgtcgaag caccggaaat cattggagtg tactctagtt ccaacgtgca ttgagacgct tcctaaccga cgaggactgg tcccctgcac ctccacgacg ggtcggggac tgatgaaatg cactcaggtg ggttccgaaa agtatggaag cggggtacgg cttcgtgctg ctgtgacctt tactcgacct ggggaggagg gggtttcgac gggctgtacc ttctccttga gaagccgact ggccaggaca gttcctcaag cacggtgctg caaaggggac tgtaccactg cccacgctct acctctctga gtcccgccgt aaccagtcgg cctgcctctg ggccctaatg ctccgacgga ggagctggag cccccgagag ccgggttacg accacgacgt ctgactgcag aggcctctcc ctgcactagg aagagtttcg tcagtgctgc gtaaagtttt catcaccacc ttggagttcg agcagtgtgg gcccctgaag cgtcgtttcc tactctgccc cctggggccc gtgttcagtg ggtaccaaga tcaacaggag aagcaggacc tacctcctcc cagtactcct atcctgcagc gcacctcatg gatccgctac ccacagcttc tgtcctggtt tcccactggc atgagatcaa gggttggacc cctctgtagg aggattggct gctcctgacc gggataggag gaggtgctgc ccagcccctg ccgacgtcta aagaggacct ccaaggcttt tcaaagggtc cggttatatc attgacgtgc tctaggcgga atgagctgga cccctcctcc ctgctctagc cccgacatgg aagaggaact acacccgggc cctacaccgc caaggagttc ttcctagcct actaagtcgc acatggtgac gggtgcgaga gggaagtcgc cagggcggca ttggtcagcc gtgacccgac cctcgtccgc gaggctgcct agatgtacca tccaccacgg ggcccaatgc tggtgctgca taggtcctga tccggagagg gacgtgatcc ggggtgggag accgaggagg catttcaaaa gaagaataaa ccggagcaga catggaacgt 8580 8640 8700 8760 8820 8880 8940 9000 9060 9120 9180 9240 9300 9360 9420 9480 9540 9600 9660 9720 9780 9840 9900 9960 10020 10080 10140 10200 10260 10320 10380 10440 ggtcccggag tcataccttc acgactcgga tgggctttgc aggcggtggt aactgaagtc acggacgtct acagtgttcc tcacctacgt acctctagcg cgtggtgaag gggtcgatgc agcttctgga gatttgttag ccttgccaga ctactcctac accgtgactt cgggggctga accggtctgg gggattgtcg ctgygtgtgc aatttcacct ggtgagccgt atgtcctatt gccctggagc ctcgtcctgg tgcatgaaat gaggtgacgg cttcgtgtca tgaccagaga gcatgaggtc acccaccctt aaagcccatt gtagtggtgg acacctgcag tgtgcgatac catcctggtc tttacgtacc ctgtggattc ctattggaat cgtcgactac atgctacgtc ctccagcgaa ctagaaccgt gggatggtac gatttgcatg ccagtgccac ccttactctt gccagccaga ggccttcgtg aacgacttct gtcaggggac acaggcagct tctctggaca gtagcactgg tcaaaacaag aaggcagggc acctccacta ccatcgaggt tgaatgggag cgggagaggc caaggaatgc agattcaatc gtaccttcag tgctgagcct taactgcacg tacgtcgccc ttgacttcag gtcggtttag acggtccggc agtggatgca tggagatcgc ggcggtccag cccagctacg tcgaagacct ccgggtcgtc cagtggaacc gatgaggatg ggaggtgttt ctccgggccc tggccagacc ccctaacagc cagtagccca ttaaagtgga ccactcggca ccgacggcga aaactacccg gagcaggacc cgactgaccg agaggtatta gaagcacagt actggtctct agctcsacgt tgggtgggaa accttggtca ttgcaaatac tgtggacgtc gtaccttgca tccctccggg aaatgcatgg cccctacgga cctcggagtt gcagctgatg tacgatgcag gttgtctcac gatcttggca ccctaccatg cgctgaggtt cgttaaggaa ggaatgagaa gacacgagac ctgcagacct ttgctgaaga cagtcccctg gttgacactg agagacctgt catcgtgacc cctggacggg tcttaaagtt tggaggtgat tcgacaagaa ccacggacgt gccctctccg gttccttacg gtcactgtac catggaagtc catcttcaca cacggtagta atgcagcggg ccagggcctc cagccaaatc tgccaggccg acccgaaacg tccgccacca ccgccaggtc tgcctgcaga tgtcacaagg ggcccagcag gtcaccttgg gcaccacttc cctccacaaa gaggcccggg ctaaacaatc ggaacggtct gtcatcgggt tggcactgaa gcccccgact ggctgccgct tttgatgggc gacrcacacg gctgactggc tctccataat tacaggataa cgggacctcg tcgagstgca acgtacttta ctccactgcc aacgtttatg ttcactccac cgtactccag agggaggccc tttcgggtaa ggggatgcct ggagcctcaa acacgctatg gtaggaccag caacagagtg gacacctaag gataacctta gcgactccaa gcaattcctt gaggtcgctt ctgtgctctg gacgtctgga ctaaacgtac ggtcacggtg caactgtgac cggtcggtct ccggaagcac ggacctgccc agaatttcaa tgtccgtcga agctgttctt ggtgcctgca agttttgttc ttccgtcccg cagtgacatg ggtagctcca acttaccctc gtgccatcat aaaacaatga tctaagttag 10500 10560 10620 10680 10740 10800 10860 10920 10980 11040 11100 11160 11220 11280 11340 11400 11460 11520 11580 11640 11700 11760 11820 11880 11940 12000 12060 12120 12180 12240 12300 12360 tggaaccagt ccaagacttt atgacttcat tgcataccag ggcacagtca cagacgtgcc cttttgtgaa cctcctcgtc tgctgaatgc ggctgtcgag accgaggtcg gtgaggtgat ggacacctga cgggtggaga atgtcatgcc gatggcaacg ccagatgttg acccctggta ctgtgtccct cgacaaagac cgtgagtcac accaccagcc agccctgccc acgtgtacgg gctcccacgt cccgagtatg acttcatcgg actgggtcac actgaccaac acgggggtca cgtctgggtt cctgcccccc gtagaagtgt tgcttcaaag gctgagggat acacacccta ccacagactg agcccatcct caagtcctta acagaacagg cacaaggtcc ggtgacggtc gtgtaagata cgcctcttat tttctgtgct cagcctggtt caccatctct tgagctcctg gtgacactcg gggaggcttc gaagaggcct gggaggtcta gtaaccactc ctgtcagatc cacggccaaa agtcgcccgc gtggcctgtg agtgtgtgtg gcggaggcgg tcgacactgg cctggcgagt cggagtgaca gaagtggacg gcaccgtttg aagtgaggtg acgtatggtc caaggttgac gacactactc gaaaacactt ggaggagcag cctgacacgt ccgacagctc tggctccagc caggaggaga cggtagacgg gcccacctct aacggtggtc gccccagacg ggtctacaac tggggaccat taccgacagg gctgtttctg gcactcagtg tttcagtaca ctacctcagg tgcacatgcc ggaccttcgg cttccagttg tgaagtagcc tgacccagtg tcttacgtct tgcccccagt gcagacccaa cttgcaccgg cggacgtcct cccacccttc ttttgttact tgtgtgggat gtcgagtcgg ttgcctcggt gttcaggaat tgtcttgtcc cgccggtccc ccactgccag cacattctat atggtgacaa tcgtcctgtc gtcggaccaa ctcgttcaca caactgacct cactgtgagc ccctccgaag ggccgtgaca ccctccagat cattggtgag accttccgtc tcgtggtcaa tcagcgggcg acccagggcc acgtgttgcg cgcctccgcc agctgtgacc ggtcacgacg gcctcactgt cttcacctgc aggtcgggtg tcctcctcac ggaagaccca gttccaactg ctgtgatgag ggttctgaaa tactgaagta ggactgtgca ccgtgtcagt gtctgcacgg gtcctcctct gccatctgcc acgacttacg ttgccaccag cggggtctgc cactccacta cctgtggact atggctgtcc tacagtacgg ctaccgttgc aaagtcatgt gatggagtcc gacacaggga cctggaagcc gaaggtcaac tggtggtcgg tcgggacggg agaatgcaga cgagggtgca gggctcatac gaacgtggcc gcctgcagga tgactggttg caaaagagtg gtgctgtgat cagctcagcc aacggagcca acgaagtttc cgactcccta gcggccaggg ggtgtctgac tcgggtagga taccactgtt agcaggacag gtgttccagg gagcaagtgt gttgactgga gcggagaata aaagacacga ccggcactgt gtggtagaga actcgaggac tggaaggcag agcaccagtt cttctccgga tgggtcccgg tgcacaacgc gacagtctag gtgccggttt ccagtgctgc caccggacac tcacacacac tccagcccac aggaggagtg ggaccgctca tccccaccct gagtatgagt 12420 12480 12540 12600 12660 12720 12780 12840 12900 12960 13020 13080 13140 13200 13260 13320 13380 13440 13500 13560 13620 13680 13740 13800 13860 13920 13980 14040 14100 14160 14220 14280 gtgcctgcaa gggtgggaag tccacagtga accacaacca acccatgaac gctgttccac ctgcgatgtg cttcgtggta ggctgtacct aggacagctg gcctgccatc aagtgaatgc gtggtgactg tgggcctccc ccccctgagg gacggagtag ctcctgcccc aggctcactt agggacagac gtcgctgtga ctgtgatgat cggacgtacg acgacctgcc aagaccacct cgtccacccc gggggaccca ggcttgcacc ttttattgtg ctcctcctgt acttctgcaa caccctttga tctcctctca ctgtgtcaac ccttctgggt gctgtcccct cctgccttcc cggagttggc acacaggtgg tgcacctgca gatgggacac cctacggcac tcggtcgggc tgcctgtgag aagacgtact gctcaccgcg cggagaaccc gtcagaagga ttactcacac cagctggagg cctcctccag ggggagcccg gcgcatggag cgatgtgtgc agttaccgtg gctgcatggt gcaacccctg cagtagagac atgttccttc attcagctaa tccacttaca ctagtactgt ggtcaatgag tgaacacaag tgaagaccct gttttctcac cacgacacta tgggtacttg cgacaaggtg ggtggttact gaagcaccat ccgacatgga ccggtcaaga tacccggagg ttcacttacg cacgagggtc tccgctcacg gggggactcc ctgcctcatc ccttctcaca tccgagtgaa tccctgtctg aaatatgttg aaagtcgact gcctgcatgc gagtcgcacg acagtaaccc gcaggtgggg ccccctgggt ctaagttcga aaaataacac gaggaggaca acaccctcta gacttcgcac agaggagagt ggtcctaccg cttctcccag aggggtggga ctcatactca gcctcaaccg tgtgtccacc gacaccgaca ctaccctgtg ggatgccgtg ccctcctccc cgcaccgggt ttctgcatga ttcgggacac acaccttcca cagtcttcct aatgagtgtg gccgagggtc ggaggaggtc cccctcgggc tttccttgca cgacattctg tcaatggcac acgggttcga gggcccttct gtcatctctg tacaaggaag cctcacgtcc aggtgaatgt gatcatgaca caaacggatg tactctgcga acttctggga acactatgag tgtccgacgg ggacgggggg cacggacgtt ccaccaatga aggtgtcact tggtgttggt ggccagttct atgggcctcc gacgctacac gtgctcccag aggcgagtgc tcctgtcgac cggacggtag ggaagagtgt caccactgac acccggaggg tttatacaac tttcagctga gaggacgggg ctcagcgtgc tgtcattggg cagcgacact gacactacta gattcaagct tgctggacgg ttctggtgga tgtgggagat ctgaagcgtg ccgaacgtgg ccaggatggc gaagagggtc tgaagacgtt gtgggaaact cgtggcaaac gacacagttg ctgtggctgt cgacagggga ggacggaagg gggaggaggg gcgtggccca acgtggacgt aagccctgtg tgtggaaggt agccagcccg acggacactc cggctcccag cgagtggcgc gcctcttggg aaaggaacgt gctgtaagac gtcgacctcc tgcccaagct cccgggaaga cgcgtacctc gctacacacg ggagtgcagg cgacgtacca cgttggggac gtttgcctac atgagacgct taagtcgatt tgtgatactc acaggctgcc ccagttactc acttgtgttc 14340 14400 14460 14520 14580 14640 14700 14760 14820 14880 14940 15000 15060 15120 15180 15240 15300 15360 15420 15480 15540 15600 15660 15720 15780 15840 15900 15960 16020 16080 16140 16200 tgtcttgctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga cacatgtgag 16260 gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg acagaacgac tccctccatt 16320 ttaatacttt taaggtccgt ggacgacact gtgtacactc ctcggactca cgttgctgta 16380 gtgacggtcc gacgtcatac tcaaggtggg aagctgtaag tctgaagtag aggtggatat 16440 ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa agccatgtac tccattgaca tcaacgatgt 16500 agttccaccc ttcgacattc agacttcatc tccacctata ggtgatgacg gtcccgttta 16560 cacggtcgtt tcggtacatg aggtaactgt agttgctaca gcaggaccag tgctcctgct 16620 gctctccgac acggacggag cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg 16680 tgtaccatga ggttctcaat cgtcctggtc acgaggacga cgagaggctg tgcctgcctc 16740 gggtacgtcc accgggacgt gacgtggtta ccgagacaac acatggtact ccaagagtta 16800 gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt ga 16842 <210> 2 <211> 2813 <212> Белок <213> Homo sapiens <220> <221> <222> <223> примечание (1)..(22) Сигнальный пептид ФВ <220> <221> <222> <223> примечание (23)..(763) D1D2-участок ФВ <220> <221> <222> <223> примечание (764)..(866) Домен D,ФВ <220> <221> <222> <223> примечание (867)..(1240) Домен D3 ФВ <220> <221> <222> <223> примечание (1241)..(1479) Домен A1 ФВ <220> <221> <222> <223> примечание (2016)..(2016) Xaa может являться аминокислотой природного происхождения <400> 2 Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr 20 25 30 Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly 35 40 45 Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly 50 55 60 Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys 65 70 75 80 Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu 85 90 95 Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro 100 105 110 Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys 115 120 125 Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly 130 135 140 Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly 145 150 155 160 Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln 165 170 175 Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala 180 185 190 Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln 210 215 220 Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu 225 230 235 240 Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu 245 250 255 Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala 260 265 270 Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His 275 280 285 Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys 290 295 300 Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met 305 310 315 320 Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu 325 330 335 Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His 340 345 350 Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn 355 360 365 Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys 370 375 380 Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp 385 390 395 400 Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg 405 410 415 Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys 420 425 430 Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu 435 440 445 Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val 450 455 460 Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu 465 470 475 480 Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu 485 490 495 Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu 500 505 510 Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn 515 520 525 Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro 530 535 540 Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln 545 550 555 560 Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met 565 570 575 Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe 580 585 590 Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys 595 600 605 Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly 610 615 620 Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val 625 630 635 640 Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln 645 650 655 Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu 660 665 670 Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe 675 680 685 Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys 690 695 700 Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp 705 710 715 720 Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met 725 730 735 His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val 740 745 750 Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg 755 760 765 Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu 770 775 780 Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met 785 790 795 800 Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg 805 810 815 His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln 820 825 830 Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr 835 840 845 Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp 850 855 860 Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly 865 870 875 880 Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp 885 890 895 Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys 900 905 910 Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu 915 920 925 Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys 930 935 940 Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg 945 950 955 960 Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg 965 970 975 His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val 980 985 990 Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr 995 1000 1005 Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn 1010 1015 1020 Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro 1025 1030 1035 Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln 1040 1045 1050 Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe 1055 1060 1065 Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 1070 1075 1080 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala 1085 1090 1095 Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln 1100 1105 1110 His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln 1115 1120 1125 Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu 1130 1135 1140 Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln 1145 1150 1155 His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys 1160 1165 1170 His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln 1175 1180 1185 Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly 1190 1195 1200 Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp 1205 1210 1215 Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr 1220 1225 1230 Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr 1235 1240 1245 Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser 1250 1255 1260 Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu 1265 1270 1275 Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe 1280 1285 1290 Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg 1295 1300 1305 Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp 1310 1315 1320 Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser 1325 1330 1335 Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln 1340 1345 1350 Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile 1355 1360 1365 Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu 1370 1375 1380 Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val 1385 1390 1395 Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro 1400 1405 1410 Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile 1415 1420 1425 Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val 1430 1435 1440 Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys 1445 1450 1455 Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met 1460 1465 1470 Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu 1475 1480 1485 Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu 1490 1495 1500 Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys 1505 1510 1515 Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp 1520 1525 1530 Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val 1535 1540 1545 Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln 1550 1555 1560 Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr 1565 1570 1575 Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser 1580 1585 1590 Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr 1595 1600 1605 Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile 1610 1615 1620 Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu 1625 1630 1635 Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp 1640 1645 1650 Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg 1655 1660 1665 Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala 1670 1675 1680 Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly 1685 1690 1695 Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe 1700 1705 1710 Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr 1715 1720 1725 Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val 1730 1735 1740 Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val 1745 1750 1755 Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala 1760 1765 1770 Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala 1775 1780 1785 Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val 1790 1795 1800 Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn 1805 1810 1815 Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala 1820 1825 1830 Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val 1835 1840 1845 Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu 1850 1855 1860 Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile 1865 1870 1875 Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp 1880 1885 1890 Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly 1895 1900 1905 Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu 1910 1915 1920 Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu 1925 1930 1935 Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser 1940 1945 1950 Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu 1955 1960 1965 Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp 1970 1975 1980 Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg 1985 1990 1995 Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser 2000 2005 2010 Val Glu Xaa His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu 2015 2020 2025 Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr 2030 2035 2040 Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile 2045 2050 2055 Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser 2060 2065 2070 Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys 2075 2080 2085 Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val 2090 2095 2100 Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg 2105 2110 2115 Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val 2120 2125 2130 Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala 2135 2140 2145 Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys 2150 2155 2160 Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala 2165 2170 2175 Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp 2180 2185 2190 Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val 2195 2200 2205 Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn 2210 2215 2220 Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro 2225 2230 2235 Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala 2240 2245 2250 Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu 2255 2260 2265 Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys 2270 2275 2280 Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr 2285 2290 2295 Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg 2300 2305 2310 Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp 2315 2320 2325 Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly 2330 2335 2340 Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe 2345 2350 2355 Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro 2360 2365 2370 Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys 2375 2380 2385 Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val 2390 2395 2400 Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys 2405 2410 2415 Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His 2420 2425 2430 Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys 2435 2440 2445 Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu 2450 2455 2460 Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg 2465 2470 2475 Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg 2480 2485 2490 Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly 2495 2500 2505 Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser 2510 2515 2520 Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu 2525 2530 2535 Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu 2540 2545 2550 Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser 2555 2560 2565 Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met 2570 2575 2580 Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp 2585 2590 2595 Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser 2600 2605 2610 Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro 2615 2620 2625 Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg 2630 2635 2640 Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile 2645 2650 2655 Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr 2660 2665 2670 His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys 2675 2680 2685 Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala 2690 2695 2700 Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr 2705 2710 2715 Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr 2720 2725 2730 Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His 2735 2740 2745 Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp 2750 2755 2760 Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg 2765 2770 2775 Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val 2780 2785 2790 Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro 2795 2800 2805 Arg Lys Cys Ser Lys 2810 <210> 3 <211> 11 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220> <223> полипептид <400> 3 Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> полипептид <400> 4 His Gln Ser Leu Gly Thr Gln 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> полипептид <400> 5 His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> полипептид <400> 6 His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys 1 5 <210> 7 Белок <211> 8 <212> <213> Искусственная <220> <223> полипептид <400> 7 Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln 1 5 <210> 8 <211> 20 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> Последовательность PAS <400> 8 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala 20 <210> 9 <211> 20 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> Последовательность PAS <400> 9 Ala Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ser <210> 10 <211> 20 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> Последовательность PAS <400> 10 Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala 1 5 10 15 Ser Pro Ser Ser <210> 11 <211> 19 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> Последовательность PAS <400> 11 Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala 1 5 10 15 Ser Pro Ser <210> 12 <211> 20 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> Последовательность PAS <400> 12 Ser Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro 1 5 10 15 Ser Ser Pro Ala 20 <210> <211> <212> 13 24 Белок <213> Искусственная <220> <223> Последовательность PAS <400> 13 Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Pro 1 5 10 15 Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala 20 <210> 14 <211> 20 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> Последовательность PAS <400> 14 Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala 20 <210> 15 <211> 19 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> Сигнальный пептид OVIII <400> 15 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser <210> 16 <211> 2332 <212> Белок <213> Homo sapiens <400> 16 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn 130 135 140 Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160 His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu 165 170 175 Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu 180 185 190 His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205 His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220 Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg 225 230 235 240 Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255 Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270 Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285 Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300 Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met 305 310 315 320 Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg 325 330 335 Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350 Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380 Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe 565 570 575 Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln 580 585 590 Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605 Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620 Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720 Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg 740 745 750 Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys 755 760 765 Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn 770 775 780 Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro 785 790 795 800 His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe 805 810 815 Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser 820 825 830 Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val 835 840 845 Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly 850 855 860 Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser 865 870 875 880 Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala 885 890 895 Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His 900 905 910 Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro 915 920 925 Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp 930 935 940 Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp 945 950 955 960 Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys 965 970 975 Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys 980 985 990 Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala 995 1000 1005 Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu 1010 1015 1020 Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu 1025 1030 1035 Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp 1040 1045 1050 Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr 1055 1060 1065 Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly 1070 1075 1080 Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys 1085 1090 1095 Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His 1100 1105 1110 Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln 1115 1120 1125 Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe 1130 1135 1140 Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr 1145 1150 1155 Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn 1160 1165 1170 Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His 1175 1180 1185 Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys Lys Glu Thr 1190 1195 1200 Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val Thr 1205 1210 1215 Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg 1220 1225 1230 Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu 1235 1240 1245 Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys 1250 1255 1260 His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu 1265 1270 1275 Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys 1280 1285 1290 Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr 1295 1300 1305 Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu 1310 1315 1320 Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr 1325 1330 1335 Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr 1340 1345 1350 Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser 1355 1360 1365 Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala 1370 1375 1380 Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser 1385 1390 1395 Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser 1400 1405 1410 Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val 1415 1420 1425 Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu 1430 1435 1440 Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu 1445 1450 1455 Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys 1460 1465 1470 Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr 1475 1480 1485 Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys 1490 1495 1500 Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu 1505 1510 1515 Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile 1520 1525 1530 Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg 1535 1540 1545 Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp 1550 1555 1560 Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu 1565 1570 1575 Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys 1580 1585 1590 Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His 1595 1600 1605 Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu 1610 1615 1620 Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln 1625 1630 1635 Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr 1640 1645 1650 Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile 1655 1660 1665 Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp 1670 1675 1680 Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr 1685 1690 1695 Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser 1700 1705 1710 Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro 1715 1720 1725 Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe 1730 1735 1740 Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu 1745 1750 1755 Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val 1760 1765 1770 Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser 1775 1780 1785 Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg 1790 1795 1800 Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys 1805 1810 1815 Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys 1820 1825 1830 Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His 1835 1840 1845 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu 1850 1855 1860 Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu 1865 1870 1875 Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu 1880 1885 1890 Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu 1895 1900 1905 Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly 1910 1915 1920 Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln 1925 1930 1935 Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile 1940 1945 1950 His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys 1955 1960 1965 Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe 1970 1975 1980 Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val 1985 1990 1995 Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu 2000 2005 2010 Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala 2015 2020 2025 Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr 2030 2035 2040 Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser 2045 2050 2055 Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val 2060 2065 2070 Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly 2075 2080 2085 Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile 2090 2095 2100 Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn 2105 2110 2115 Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser 2120 2125 2130 Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr 2135 2140 2145 Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg 2150 2155 2160 Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu 2165 2170 2175 Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser 2180 2185 2190 Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala 2195 2200 2205 Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val 2210 2215 2220 Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met 2225 2230 2235 Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr 2240 2245 2250 Ser Met 2255 Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly 2260 2265 His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe 2270 2275 2280 Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp 2285 2290 2295 Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp 2300 2305 2310 Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala 2315 2320 2325 Gln Asp Leu Tyr 2330 <210> 17 <211> 7053 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 17 atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60 accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120 ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180 acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240 gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300 gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360 ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420 gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540 gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600 gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660 tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720 gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780 ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840 accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900 cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960 gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020 gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080 gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140 gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200 tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260 cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320 aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380 attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440 ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500 gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560 ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620 actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680 gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740 agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800 aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860 cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920 tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980 attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040 atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160 atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220 agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280 ttctcccaga attcaagaca ccctagcact aggcaaaagc aatttaatgc caccacaatt 2340 ccagaaaatg acatagagaa gactgaccct tggtttgcac acagaacacc tatgcctaaa 2400 atacaaaatg tctcctctag tgatttgttg atgctcttgc gacagagtcc tactccacat 2460 gggctatcct tatctgatct ccaagaagcc aaatatgaga ctttttctga tgatccatca 2520 cctggagcaa tagacagtaa taacagcctg tctgaaatga cacacttcag gccacagctc 2580 catcacagtg gggacatggt atttacccct gagtcaggcc tccaattaag attaaatgag 2640 aaactgggga caactgcagc aacagagttg aagaaacttg atttcaaagt ttctagtaca 2700 tcaaataatc tgatttcaac aattccatca gacaatttgg cagcaggtac tgataataca 2760 agttccttag gacccccaag tatgccagtt cattatgata gtcaattaga taccactcta 2820 tttggcaaaa agtcatctcc ccttactgag tctggtggac ctctgagctt gagtgaagaa 2880 aataatgatt caaagttgtt agaatcaggt ttaatgaata gccaagaaag ttcatgggga 2940 aaaaatgtat cgtcaacaga gagtggtagg ttatttaaag ggaaaagagc tcatggacct 3000 gctttgttga ctaaagataa tgccttattc aaagttagca tctctttgtt aaagacaaac 3060 aaaacttcca ataattcagc aactaataga aagactcaca ttgatggccc atcattatta 3120 attgagaata gtccatcagt ctggcaaaat atattagaaa gtgacactga gtttaaaaaa 3180 gtgacacctt tgattcatga cagaatgctt atggacaaaa atgctacagc tttgaggcta 3240 aatcatatgt caaataaaac tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa 3300 gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat ccagatatgt cgttctttaa gatgctattc 3360 ttgccagaat cagcaaggtg gatacaaagg actcatggaa agaactctct gaactctggg 3420 caaggcccca gtccaaagca attagtatcc ttaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag 3480 aatttcttgt ctgagaaaaa caaagtggta gtaggaaagg gtgaatttac aaaggacgta 3540 ggactcaaag agatggtttt tccaagcagc agaaacctat ttcttactaa cttggataat 3600 ttacatgaaa ataatacaca caatcaagaa aaaaaaattc aggaagaaat agaaaagaag 3660 gaaacattaa tccaagagaa tgtagttttg cctcagatac atacagtgac tggcactaag 3720 aatttcatga agaacctttt cttactgagc actaggcaaa atgtagaagg ttcatatgac 3780 ggggcatatg ctccagtact tcaagatttt aggtcattaa atgattcaac aaatagaaca 3840 aagaaacaca cagctcattt ctcaaaaaaa ggggaggaag aaaacttgga aggcttggga 3900 aatcaaacca agcaaattgt agagaaatat gcatgcacca caaggatatc tcctaataca 3960 agccagcaga attttgtcac gcaacgtagt aagagagctt tgaaacaatt cagactccca 4020 ctagaagaaa cagaacttga aaaaaggata attgtggatg acacctcaac ccagtggtcc 4080 aaaaacatga aacatttgac cccgagcacc ctcacacaga tagactacaa tgagaaggag 4140 aaaggggcca ttactcagtc tcccttatca gattgcctta cgaggagtca tagcatccct 4200 caagcaaata gatctccatt acccattgca aaggtatcat catttccatc tattagacct 4260 atatatctga ccagggtcct attccaagac aactcttctc atcttccagc agcatcttat 4320 agaaagaaag attctggggt ccaagaaagc agtcatttct tacaaggagc caaaaaaaat 4380 aacctttctt tagccattct aaccttggag atgactggtg atcaaagaga ggttggctcc 4440 ctggggacaa gtgccacaaa ttcagtcaca tacaagaaag ttgagaacac tgttctcccg 4500 aaaccagact tgcccaaaac atctggcaaa gttgaattgc ttccaaaagt tcacatttat 4560 cagaaggacc tattccctac ggaaactagc aatgggtctc ctggccatct ggatctcgtg 4620 gaagggagcc ttcttcaggg aacagaggga gcgattaagt ggaatgaagc aaacagacct 4680 ggaaaagttc cctttctgag agtagcaaca gaaagctctg caaagactcc ctccaagcta 4740 ttggatcctc ttgcttggga taaccactat ggtactcaga taccaaaaga agagtggaaa 4800 tcccaagaga agtcaccaga aaaaacagct tttaagaaaa aggataccat tttgtccctg 4860 aacgcttgtg aaagcaatca tgcaatagca gcaataaatg agggacaaaa taagcccgaa 4920 atagaagtca cctgggcaaa gcaaggtagg actgaaaggc tgtgctctca aaacccacca 4980 gtcttgaaac gccatcaacg ggaaataact cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa 5040 attgactatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 5100 gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 5160 gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc cacatgttct aagaaacagg 5220 gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag aaagttgttt tccaggaatt tactgatggc 5280 tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 5340 tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 5400 ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 5460 cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 5520 catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 5580 gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg attggacccc ttctggtctg ccacactaac 5640 acactgaacc ctgctcatgg gagacaagtg acagtacagg aatttgctct gtttttcacc 5700 atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 5760 ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 5820 aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 5880 tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 5940 gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 6000 gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt 6060 attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 6120 cagactcccc tgggaatggc ttctggacac attagagatt ttcagattac agcttcagga 6180 caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 6240 tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 6300 cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 6360 atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 6420 accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 6480 cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 6540 cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 6600 agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 6660 acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct 6720 caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 6780 ggagtaacta ctcagggagt aaaatctctg cttaccagca tgtatgtgaa ggagttcctc 6840 atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 6900 gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga cccaccgtta 6960 ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 7020 gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tac 7053 <210> 18 <211> 1438 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> OVIII с удаленным В-доменом <400> 18 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn 130 135 140 Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160 His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu 165 170 175 Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu 180 185 190 His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205 His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220 Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg 225 230 235 240 Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255 Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270 Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285 Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300 Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met 305 310 315 320 Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg 325 330 335 Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350 Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380 Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe 565 570 575 Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln 580 585 590 Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605 Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620 Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720 Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His 740 745 750 Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile 755 760 765 Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp 770 775 780 Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys 785 790 795 800 Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly 805 810 815 Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser 820 825 830 Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser 835 840 845 Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu 850 855 860 Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr 865 870 875 880 Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile 885 890 895 Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe 900 905 910 Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His 915 920 925 Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe 930 935 940 Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro 945 950 955 960 Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln 965 970 975 Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr 980 985 990 Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro 995 1000 1005 Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg 1010 1015 1020 Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu 1025 1030 1035 Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met 1040 1045 1050 Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val 1055 1060 1065 Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn 1070 1075 1080 Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys 1085 1090 1095 Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His 1100 1105 1110 Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln 1115 1120 1125 Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile 1130 1135 1140 Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg 1145 1150 1155 Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro 1160 1165 1170 Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His 1175 1180 1185 Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr 1190 1195 1200 Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp 1205 1210 1215 Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe 1220 1225 1230 Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro 1235 1240 1245 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1250 1255 1260 Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn 1265 1270 1275 Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp 1280 1285 1290 Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr 1295 1300 1305 Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn 1310 1315 1320 Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val 1325 1330 1335 Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly 1340 1345 1350 Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile 1355 1360 1365 Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn 1370 1375 1380 Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro 1385 1390 1395 Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg 1400 1405 1410 Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu 1415 1420 1425 Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 1430 1435 <210> 19 <211> 4371 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> OVIII с удаленным В-доменом <400> 19 atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60 accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120 ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180 acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240 gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300 gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360 ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420 gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540 gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600 gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660 tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720 gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780 ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840 accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900 cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960 gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020 gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080 gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140 gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200 tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260 cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320 aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380 attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440 ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500 gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560 ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 162 0 actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680 gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740 agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800 aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860 cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920 tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980 attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040 atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160 atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220 agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280 ttctctcaaa acccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340 cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400 gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460 cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520 catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580 caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640 ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700 agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760 cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820 ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880 gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940 ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000 tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060 gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120 tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180 caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240 attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300 tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360 tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420 gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480 cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540 tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600 ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660 ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720 cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780 aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840 tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900 atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960 tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020 agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080 aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140 tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200 cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260 tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320 cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta c 4371 <210> 20 <211> 500 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> линкер <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 165 170 175 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 260 265 270 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 275 280 285 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 305 310 315 320 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 325 330 335 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 340 345 350 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 355 360 365 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 370 375 380 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 405 410 415 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 420 425 430 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 465 470 475 480 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 485 490 495 Gly Gly Gly Ser 500 <210> 21 <211> 800 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> линкер <220> <221> ПОВТОР <222> (1)..(300) <223> Gly-Gly-Ser повтор от 1 до 100 раз <220> <221> ПОВТОР <222> (301)..(800) <223> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser повтор от 1 до 100 раз <400> 21 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 65 70 75 80 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 85 90 95 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 145 150 155 160 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 165 170 175 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 180 185 190 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 225 230 235 240 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 245 250 255 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 260 265 270 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 305 310 315 320 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 325 330 335 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 340 345 350 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 355 360 365 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 370 375 380 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 405 410 415 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 420 425 430 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 465 470 475 480 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 485 490 495 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 500 505 510 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 515 520 525 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 530 535 540 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 545 550 555 560 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 565 570 575 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 580 585 590 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 595 600 605 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 610 615 620 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 625 630 635 640 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 645 650 655 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 660 665 670 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 675 680 685 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 690 695 700 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 705 710 715 720 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 725 730 735 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 740 745 750 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 755 760 765 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 770 775 780 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 785 790 795 800 <210> 22 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> линкер <400> 22 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser <210> <211> 23 15 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> линкер <400> 23 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> <211> <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> линкер <400> 24 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> <211> 25 18 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> линкер <400> 25 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 26 <211> 15 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> линкер <220> <221> ПОВТОР <222> (1)..(15) <223> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser повтор от 1 до 3 раз <400> 26 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 27 <211> 100 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> линкер <220> <221> ПОВТОР <222> (1)..(100) <223> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser повтор от 1 до 20 раз <400> 27 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Ser 100 <210> 28 <211> 15 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> линкер <220> <221> ПОВТОР <222> (1)..(15) <223> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser повтор от 1 до 3 раз <400> 28 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 29 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер примечание I Л \ I ZZ \ <220> <221> <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления OXIa <400> 29 Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr <210> 30 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер <220> <221> <222> <223> примечание (4)..(5) Сайт расщепления OXIa <400> 30 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер <220> <221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления OXIIa <400> 31 Thr Met Thr Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер примечание I Л \ I ZZ \ <220> <221> <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления калликреином <400> 32 Ser Pro Phe Arg Ser Thr Gly Gly <210> 33 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер примечание I Л \ I zz \ <220> <221> <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления OVIIa <400> 33 Leu Gln Val Arg Ile Val Gly Gly 1 5 <210> <211> <212> 34 8 Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер примечание (4)..(5) <220> <221> <222> <223> Сайт расщепления OIXa <400> 34 Pro Leu Gly Arg Ile Val Gly Gly <210> 35 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер <220> <221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления OXa <400> 35 Ile Glu Gly Arg Thr Val Gly Gly 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер примечание (4)..(5) <220> <221> <222> <223> Сайт расщепления OIIa (тромбином) <400> 36 Leu Thr Pro Arg Ser Leu Leu Val <210> 37 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер <220> <221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления эластазой-2 <400> 37 Leu Gly Pro Val Ser Gly Val Pro 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер примечание I Л \ I ZZ \ <220> <221> <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления гранзимом-В <400> 38 Val Ala Gly Asp Ser Leu Glu Glu <210> 39 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер примечание I Л \ I ZZ \ <220> <221> <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления MMP-12 <400> 39 Gly Pro Ala Gly Leu Gly Gly Ala 1 5 <210> 40 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер <220> <221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления MMP-13 <400> 40 Gly Pro Ala Gly Leu Arg Gly Ala 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер <220> <221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления MMP-17 <400> 41 Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Arg <210> 42 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер <220> <221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления MMP-20 <400> 42 Pro Ala Leu Pro Leu Val Ala Gln <210> 43 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер <220> <221> примечание <222> (6)..(7) <223> Сайт расщепления ВГТ <400> Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 44 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер <220> <221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сайт расщепления энтерокиназой <400> 44 Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly 1 5 <210> 45 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер <220> <221> примечание <222> (6)..(7) <223> Сайт расщепления протеазой С (PRESCISSION) <400> 45 Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5 <210> 46 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер <220> <221> примечание <222> (4)..(5) <223> Сортаза А <400> 46 Leu Pro Lys Thr Gly Ser Glu Ser 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> отщепляемый линкер <400> 47 Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg 1 5 <210> 48 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> сайт расщепления <400> 48 Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg <210> 49 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> сайт расщепления <400> 49 Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg 1 5 10 <210> 50 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> сайт расщепления <400> 50 Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg 1 5 <210> 51 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> сайт расщепления <400> 51 Ala Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Ala 1 5 10 <210> 52 <211> 4 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> сайт расщепления <400> 52 Arg Arg Arg Arg <210> 53 Белок <211> 6 <212> <213> Искусственная <220> <223> сайт расщепления <400> 53 Arg Lys Arg Arg Lys Arg <210> 54 <211> 5 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> сайт расщепления <400> 54 Arg Arg Arg Arg Ser <210> 55 <211> 5 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> сайт расщепления <400> 55 Leu Val Pro Arg Gly 1 5 <211> 25 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> сайт расщепления и линкера <400> 56 Thr Leu Asp Pro Arg Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr 1 5 10 15 Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys 20 25 <210> 57 <211> 99 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> ESC48-Прям-ФВ-D,D3 с сигналом VIII и сайтом BsiW1 для pSYN ФВ-001 <400> 57 tcgcgacgta cggccgccac catgcaaata gagctctcca cctgcttctt tctgtgcctt 60 ttgcgattct gctttagcct atcctgtcgg ccccccatg 99 <210> 58 <211> 68 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> ESC50- Обратн- ФВ- частичный D'D3 (аминокислоты 1-276) с сайтом 6 His Not1 для pSYN ФВ- 001 <400> 58 tgacctcgag cggccgctca gtggtgatgg tgatgatgca gaggcacttt tctggtgtca 60 gcacactg 68 <210> 59 <211> 99 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> ESC48- Прям - с сигналом VIII и сайтом BsiW1 для pSYN ФВ- 002 <400> 59 tcgcgacgta cggccgccac catgcaaata gagctctcca cctgcttctt tctgtgcctt 60 ttgcgattct gctttagcct atcctgtcgg ccccccatg 99 <210> 60 <211> 71 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> ESC51- Обратн- ФВ D'D3 ( аминокислоты 1-477) с сайтом 6His и Not 1 для pSYN ФВ- 002 <400> 60 tgacctcgag cggccgctca gtggtgatgg tgatgatgcc tgctgcagta gaaatcgtgc 60 aacggcggtt c 71 <210> 61 <211> 99 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> ESC48- Прям - с сигналом VIII и сайтом BsiW1 для pSYN ФВ- 003 <400> 61 tcgcgacgta cggccgccac catgcaaata gagctctcca cctgcttctt tctgtgcctt 60 ttgcgattct gctttagcct atcctgtcgg ccccccatg 99 <210> 62 <211> 65 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> ESC52- Обратн-ФВ^^3 Частичный A1 (аминокислоты 1-511) с сайтом 6His и Not1 для pSYN ФВ- 003 <400> 62 tgacctcgag cggccgctca gtggtgatgg tgatgatggc ccacagtgac ttgtgccatg 60 tgggg 65 <210> 63 <211> 99 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> ESC48- Прям - с сигналом VIII и сайтом BsiW1 для pSYN ФВ- 004 <400> 63 tcgcgacgta cggccgccac catgcaaata gagctctcca cctgcttctt tctgtgcctt 60 ttgcgattct gctttagcct atcctgtcgg ccccccatg 99 <210> 64 <211> 65 <212> ДНК <213> Искусственная <223> ESC53-Обратн- ФВ-D'D3A1 (аминокислоты 1-716) с сайтом 6His и Not1 для pSYN ФВ- 004 <400> 64 tgacctcgag cggccgctca gtggtgatgg tgatgatggc ccacagtgac ttgtgccatg tgggg 60 65 <210> 65 <211> 1313 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> клонированный вектор <400> 65 ggatcctagt ggggaataag ggatgcagcc acccctcagt gaaatgcaag aaacgggtca 60 ccatcctggt ggagggagga gagattgagc tgtttgacgg ggaggtgaat gtgaagaggc 120 ccatgaagga tgagactcac tttgaggtgg tggagtctgg ccggtacatc attctgctgc 180 tgggcaaagc cctctccgtg gtctgggacc gccacctgag catctccgtg gtcctgaagc 240 agacatacca ggagaaagtg tgtggcctgt gtgggaattt tgatggcatc cagaacaatg 300 acctcaccag cagcaacctc caagtggagg aagaccctgt ggactttggg aactcctgga 360 aagtgagctc gcagtgtgct gacaccagaa aagtgcctct ggactcatcc cctgccacct 420 gccataacaa catcatgaag cagacgatgg tggattcctc ctgtagaatc cttaccagtg 480 acgtcttcca ggactgcaac aagctggtgg accccgagcc atatctggat gtctgcattt 540 acgacacctg ctcctgtgag tccattgggg actgcgcctg cttctgcgac accattgctg 600 cctatgccca cgtgtgtgcc cagcatggca aggtggtgac ctggaggacg gccacattgt 660 gcccccagag ctgcgaggag aggaatctcc gggagaacgg gtatgagtgt gagtggcgct 720 ataacagctg tgcacctgcc tgtcaagtca cgtgtcagca ccctgagcca ctggcctgcc 780 ctgtgcagtg tgtggagggc tgccatgccc actgccctcc agggaaaatc ctggatgagc 840 ttttgcagac ctgcgttgac cctgaagact gtccagtgtg tgaggtggct ggccggcgtt 900 ttgcctcagg aaagaaagtc accttgaatc ccagtgaccc tgagcactgc cagatttgcc 960 actgtgatgt tgtcaacctc acctgtgaag cctgccagga gccgggaggc ctggtggtgc 1020 ctcccacaga tgccccggtg agccccacca ctctgtatgt ggatgagacg ctccaggatg 1080 gctgtgatac tcacttctgc aaggtcaatg agagaggaga gtacttctgg gagaagaggg 1140 tcacaggctg cccacccttt gatgaacaca agtgtcttgc tgagggaggt aaaattatga 1200 aaattccagg cacctgctgt gacacatgtg aggagcctga gtgcaacgac atcactgcca 1260 ggctgcagta tgtcaaggtg ggaagctgta agtctgaagt agaggtggat atc 1313 <210> 66 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> ESC 89-прям с сайтом Nhe1 <400> 66 ctcactatag ggagacccaa gctggctagc cg 32 <210> 67 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> ESC 91-обратн с Sal1 <400> 67 ctggatcccg ggagtcgact cgtcagtggt gatggtgatg atg 43 <210> 68 <211> 92 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> LW 22-ПРЯМ-ФВ-D'D3 с сигнальной последовательностью ФVIII и сайтом BsiW1 <400> 68 gcgccggccg tacgatgcaa atagagctct ccacctgctt ctttctgtgc cttttgcgat 60 tctgctttag cctatcctgt cggcccccca tg 92 <210> 69 <211> 47 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> LW 23-Обратн- Fc со стоп-кодоном и сайтом Not1 <400> 69 tcatcaatgt atcttatcat gtctgaattc gcggccgctc atttacc 47 <210> 70 <211> 41 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> LW24- Прям- ФВ D1D2D'D3 клонирующий олиго с сайтом BsiW1 <400> 70 gcgccggccg tacgatgatt cctgccagat ttgccggggt g 41 <210> <211> <212> 71 41 ДНК <213> Искусственная <220> <223> LW27-Обратн-ФВ D'D3 олиго с EcoRV <400> 71 ccaccgccag atatcggctc ctggcaggct tcacaggtga g 41 <210> 72 <211> 1240 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> ФВ-D1D2D,D3 <400> 72 Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr 20 25 30 Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly 35 40 45 Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly 50 55 60 Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys 65 70 75 80 Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu 85 90 95 Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro 100 105 110 Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys 115 120 125 Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly 130 135 140 Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly 145 150 155 160 Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln 165 170 175 Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala 180 185 190 Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln 210 215 220 Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu 225 230 235 240 Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu 245 250 255 Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala 260 265 270 Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His 275 280 285 Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys 290 295 300 Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met 305 310 315 320 Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu 325 330 335 Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His 340 345 350 Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn 355 360 365 Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys 370 375 380 Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp 385 390 395 400 Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg 405 410 415 Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys 420 425 430 Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu 435 440 445 Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val 450 455 460 Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu 465 470 475 480 Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu 485 490 495 Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu 500 505 510 Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn 515 520 525 Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro 530 535 540 Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln 545 550 555 560 Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met 565 570 575 Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe 580 585 590 Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys 595 600 605 Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly 610 615 620 Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val 625 630 635 640 Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln 645 650 655 Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu 660 665 670 Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe 675 680 685 Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys 690 695 700 Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp 705 710 715 720 Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met 725 730 735 His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val 740 745 750 Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg 755 760 765 Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu 770 775 780 Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met 785 790 795 800 Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg 805 810 815 His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln 820 825 830 Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr 835 840 845 Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp 850 855 860 Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly 865 870 875 880 Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp 885 890 895 Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys 900 905 910 Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu 915 920 925 Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys 930 935 940 Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg 945 950 955 960 Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg 965 970 975 His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val 980 985 990 Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr 995 1000 1005 Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn 1010 1015 1020 Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro 1025 1030 1035 Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln 1040 1045 1050 Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe 1055 1060 1065 Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 1070 1075 1080 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala 1085 1090 1095 Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln 1100 1105 1110 His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln 1115 1120 1125 Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu 1130 1135 1140 Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln 1145 1150 1155 His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys 1160 1165 1170 His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln 1175 1180 1185 Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly 1190 1195 1200 Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp 1205 1210 1215 Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr 1220 1225 1230 Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro 1235 1240 <210> 73 <211> 477 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> ФВ-D,D3 <400> 73 Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp 1 5 10 15 Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr 20 25 30 Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro 35 40 45 Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys 50 55 60 Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys 65 70 75 80 Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr 85 90 95 Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr 100 105 110 Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr 115 120 125 Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile 130 135 140 Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys 145 150 155 160 Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly 165 170 175 Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val 180 185 190 Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser 195 200 205 Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr 210 215 220 Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln 225 230 235 240 Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val 245 250 255 Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg 260 265 270 Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met 275 280 285 Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val 290 295 300 Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 305 310 315 320 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys 325 330 335 Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly 340 345 350 Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu 355 360 365 Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn 370 375 380 Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu 385 390 395 400 Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro 405 410 415 Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp 420 425 430 Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys 435 440 445 Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys 450 455 460 Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro 465 470 475 <210> 74 <211> 30 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> Домен ФВ-D,D3 (1-477 a^- мутация C336A/C379A) <220> <221> ПОВТОР <222> (1)..(30) <223> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser повтор 6 раз <400> 74 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 75 <211> 5 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> линкер <400> 75 Arg Arg Arg Arg Ser 1 5 <210> 76 <211> 6 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> линкер <400> Arg Lys Arg Arg Lys Arg 1 5 <210> <211> <212> <213> 77 24 ДНК Искусственная <220> <223> ESC^-Прям- ФВ клонирующий олиго с Cla1 <400> 77 gtccggcatg agaatcgatg tgtg <210> 78 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> ESC41- Обратн-ФВ с EcoRV <400> 78 cctccaccgc cagatatcag aggcactttt c 31 <210> 79 <211> 105 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> ESC78- Прям с сайтом EcoRV <400> 79 aaagtgcctc tgatatctgg cggtggaggt tccggtggcg ggggatccgg tggcggggga 60 tccggtggcg ggggatccgg tggcggggga tccctggtcc cccgg 105 <210> 80 <211> 107 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> ESC79- Обратн с сайтом RsRII <400> 80 gaagaggaag actgacggtc cgcccaggag ttctggagct gggcacggtg ggcatgtgtg 60 agttttgtcg cctccgctgc cccgggggac cagggatccc ccgccac 107 <210> 81 <211> 48 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> линкер <400> 81 Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 <210> 82 <211> 1781 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> pSYN^VIII-049, которая является конструкцией ФVIII-Fc с отщепляемым линкером между двумя Fc-доменами; Genscript-Номер последовательности 103069 <400> 82 ccgtcgacaa ctctgcacaa ggagcggtgg gatccggcgg cctgtcggcc tcgagtgtac ctggctgcct ggtgtccctg gcaacacttg cgtgctccac ccggggagtg ggatcctagt ccatcctggt ccatgaagga tgggcaaagc agacatacca acctcaccag aagtgagctc gccataacaa gagcaggtgg ccactacacg cggcggatca tggaggttcc ccccatggtc caaaacgtgc ctgccccccg cttccatcag tgtctgtcgg gatcggcatg ccagtacgtt ggggaataag ggagggagga tgagactcac cctctccgtg ggagaaagtg cagcaacctc gcagtgtgct catcatgaag cagcagggga cagaagagcc ggtgggggtg ggtgggggtg aagctggtgt cagaactatg ggcatggtcc ggcaaggagt gaccggaagt gcccactacc ctggtgcagg ggatgcagcc gagattgagc tttgaggtgg gtctgggacc tgtggcctgt caagtggagg gacaccagaa cagacgatgg acgtcttctc tctccctgtc gatcaggcgg gatcaaggaa gtcccgctga acctggagtg ggcatgagaa atgcccctgg ggaactgcac tcaccttcga attactgcgg acccctcagt tgtttgacgg tggagtctgg gccacctgag gtgggaattt aagaccctgt aagtgcctct tggattcctc atgctccgtg tccgggtaaa tggaggttcc gaggaggaag caacctgcgg catgagcatg tcgatgtgtg agaaacagtg agaccatgtg cgggctcaaa cagtaaccct gaaatgcaag ggaggtgaat ccggtacatc catctccgtg tgatggcatc ggactttggg ggactcatcc ctgtagaatc atgcatgagg cggcgccgcc ggtggcgggg agaagcctat gctgaagggc ggctgtgtct gccctggaaa aagattggct tgtgatgcca tacctgttcc gggacctttc aaacgggtca gtgaagaggc attctgctgc gtcctgaagc cagaacaatg aactcctgga cctgccacct cttaccagtg 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 <210> 83 <211> 220 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> Фрагмент конструкции Genscript был субклонирован в расщепляемую EcoRV/RsRII pSYN^VIII-0159; Genscript-Последовательность №-132601 <400> 83 aaagtgcctc tgatatctgg cggtggaggt tccggtggcg ggggatccgg cggtggaggt 60 tccggcggtg gaggttccgg tggcggggga tccggtggcg ggggatccct ggtcccccgg 120 ggcagcggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccgaca aaactcacac atgcccaccg 180 tgcccagctc cagaactcct gggcggaccg tcagtcttcc 220 <210> 84 <211> 73 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> pSYN-VIII-178 содержит 73-аминокислотный линкер между фрагментом ФВ и Fc-областью; синтез фрагмента ДНК, кодирующего 73-аминокислотный линкер <400> 84 Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 <210> 85 <211> 299 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> Genscript-Последовательность №-144849 <400> 85 gcctgccagg agccgatatc tggcggtgga ggttccggtg gcgggggatc cggcggtgga 60 ggttccggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccggcg gtggaggttc cggtggcggg 120 ggatccggcg gtggaggttc cggcggtgga ggttccggtg gcgggggatc cggtggcggg 180 ggatccctgg tcccccgggg cagcggcggt ggaggttccg gtggcggggg atccgacaaa 240 actcacacat gcccccgtgc ccagctccag aactcctggg cggaccgtca gtcttcctc 299 <210> 86 <211> 98 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> линкер <400> 86 Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Ser <210> 87 <211> 380 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> Genscript-Последовательность №-144849 <400> 87 gcctgccagg agccgatatc tggcggtgga ggttccggtg gcgggggatc cggcggtgga 60 ggttccggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccggcg gtggaggttc cggtggcggg 120 ggatccggcg gtggaggttc cggcggtgga ggttccggtg gcgggggatc cggcggtgga 180 ggttccggtg gcgggggatc cggcggtgga ggttccggcg gtggaggttc cggtggcggg 240 ggatccggtg gcgggggatc cctggtcccc cggggcagcg gcggtggagg ttccggtggc 300 gggggatccg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag ctccagaact cctgggcgga 3 60 ccgtcagtct tcctcttccc 380 <210> 88 <211> 2449 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> Гетеродимер ФVIII-ФВ-Fc <400> 88 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 180 185 190 Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 195 200 205 Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 210 215 220 Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp 225 230 235 240 Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr 245 250 255 Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 260 265 270 Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 275 280 285 Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser 290 295 300 Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met 305 310 315 320 Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His 325 330 335 Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 340 345 350 Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp 355 360 365 Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser 370 375 380 Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400 Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415 Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn 420 425 430 Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 435 440 445 Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu 450 455 460 Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 485 490 495 His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 500 505 510 Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 515 520 525 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 545 550 555 560 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 565 570 575 Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590 Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 595 600 605 Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp 610 615 620 Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640 Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655 Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720 Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 725 730 735 Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 740 745 750 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu 755 760 765 Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln 770 775 780 Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu 785 790 795 800 Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe 805 810 815 Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp 820 825 830 Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln 835 840 845 Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr 850 855 860 Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His 865 870 875 880 Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile 885 890 895 Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser 900 905 910 Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg 915 920 925 Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val 930 935 940 Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp 945 950 955 960 Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu 965 970 975 Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His 980 985 990 Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe 995 1000 1005 Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn 1010 1015 1020 Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 1025 1030 1035 Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr 1040 1045 1050 Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr 1055 1060 1065 Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe 1070 1075 1080 Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met 1085 1090 1095 Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met 1100 1105 1110 Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly 1115 1120 1125 Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser 1130 1135 1140 Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg 1145 1150 1155 Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro 1160 1165 1170 Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser 1175 1180 1185 Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro 1190 1195 1200 Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe 1205 1210 1215 Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp 1220 1225 1230 Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu 1235 1240 1245 Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn 1250 1255 1260 Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1265 1270 1275 Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly 1280 1285 1290 Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys 1295 1300 1305 Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn 1310 1315 1320 Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln 1325 1330 1335 Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu 1340 1345 1350 Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val 1355 1360 1365 Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys 1370 1375 1380 Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu 1385 1390 1395 Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp 1400 1405 1410 Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr 1415 1420 1425 Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala 1430 1435 1440 Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp 1445 1450 1455 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1460 1465 1470 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 1475 1480 1485 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 1490 1495 1500 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 1505 1510 1515 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 1520 1525 1530 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 1535 1540 1545 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 1550 1555 1560 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 1565 1570 1575 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1580 1585 1590 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 1595 1600 1605 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 1610 1615 1620 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 1625 1630 1635 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 1640 1645 1650 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 1655 1660 1665 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1670 1675 1680 Lys Arg Arg Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1685 1690 1695 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1700 1705 1710 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys Arg Arg Lys Arg Ser Leu Ser 1715 1720 1725 Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu 1730 1735 1740 Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp 1745 1750 1755 Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro 1760 1765 1770 Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg 1775 1780 1785 Cys Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr 1790 1795 1800 Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp 1805 1810 1815 Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly 1820 1825 1830 Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro 1835 1840 1845 Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn 1850 1855 1860 Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His 1865 1870 1875 Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly 1880 1885 1890 Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro 1895 1900 1905 Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr 1910 1915 1920 Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg 1925 1930 1935 His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys 1940 1945 1950 Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp 1955 1960 1965 Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe 1970 1975 1980 Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys 1985 1990 1995 Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met 2000 2005 2010 Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp 2015 2020 2025 Val Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu 2030 2035 2040 Asp Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp 2045 2050 2055 Cys Ala Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys 2060 2065 2070 Ala Gln His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys 2075 2080 2085 Pro Gln Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu 2090 2095 2100 Ala Glu Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr 2105 2110 2115 Cys Gln His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu 2120 2125 2130 Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu 2135 2140 2145 Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val 2150 2155 2160 Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro 2165 2170 2175 Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn 2180 2185 2190 Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Asp Gly Gly Gly Gly 2195 2200 2205 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Asp 2210 2215 2220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 2225 2230 2235 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 2240 2245 2250 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 2255 2260 2265 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 2270 2275 2280 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 2285 2290 2295 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 2300 2305 2310 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 2315 2320 2325 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 2330 2335 2340 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 2345 2350 2355 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 2360 2365 2370 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 2375 2380 2385 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 2390 2395 2400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 2405 2410 2415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 2420 2425 2430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 2435 2440 2445 Lys <210> 89 <211> 48 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> 48-аминокислотный линкер <400> 89 Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 <210> <211> <212> 90 1665 Белок <213> Искусственная <220> <223> зрелый белок pSYN-OVIII-155 <400> 90 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn 130 135 140 Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160 His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu 165 170 175 Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu 180 185 190 His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205 His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220 Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg 225 230 235 240 Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255 Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270 Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285 Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300 Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met 305 310 315 320 Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg 325 330 335 Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350 Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380 Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe 565 570 575 Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln 580 585 590 Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605 Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620 Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720 Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Ala His 740 745 750 Gln Ala Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile 755 760 765 Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp 770 775 780 Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys 785 790 795 800 Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly 805 810 815 Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser 820 825 830 Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser 835 840 845 Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu 850 855 860 Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr 865 870 875 880 Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile 885 890 895 Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe 900 905 910 Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His 915 920 925 Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe 930 935 940 Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro 945 950 955 960 Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln 965 970 975 Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr 980 985 990 Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro 995 1000 1005 Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg 1010 1015 1020 Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu 1025 1030 1035 Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met 1040 1045 1050 Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val 1055 1060 1065 Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn 1070 1075 1080 Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys 1085 1090 1095 Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His 1100 1105 1110 Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln 1115 1120 1125 Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile 1130 1135 1140 Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg 1145 1150 1155 Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro 1160 1165 1170 Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His 1175 1180 1185 Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr 1190 1195 1200 Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp 1205 1210 1215 Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe 1220 1225 1230 Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro 1235 1240 1245 Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser 1250 1255 1260 Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn 1265 1270 1275 Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp 1280 1285 1290 Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr 1295 1300 1305 Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn 1310 1315 1320 Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val 1325 1330 1335 Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly 1340 1345 1350 Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile 1355 1360 1365 Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn 1370 1375 1380 Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro 1385 1390 1395 Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg 1400 1405 1410 Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu 1415 1420 1425 Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr 1430 1435 1440 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1445 1450 1455 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 1460 1465 1470 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 1475 1480 1485 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 1490 1495 1500 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 1505 1510 1515 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 1520 1525 1530 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 1535 1540 1545 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 1550 1555 1560 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 1565 1570 1575 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 1580 1585 1590 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 1595 1600 1605 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 1610 1615 1620 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 1625 1630 1635 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 1640 1645 1650 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1655 1660 1665 <210> 91 <211> 5052 <212> ДНК <213> Искусственная <220> <223> pSYN-OVIII-155 <400> 91 atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60 accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120 ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180 acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240 gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300 gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360 ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420 gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540 gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600 gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660 tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720 gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780 ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840 accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900 cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960 gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020 gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080 gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140 gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200 tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260 cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320 aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380 attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440 ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500 gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560 ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620 actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680 gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740 agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800 aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860 cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920 tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980 attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040 atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160 atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220 agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280 ttctctcaaa acccaccagt cttgaaagcc catcaggcgg aaataactcg tactactctt 2340 cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400 gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460 cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520 catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580 caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640 ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700 agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760 cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820 ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880 gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940 ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000 tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060 gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120 tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180 caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240 attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300 tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360 tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420 gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480 cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540 tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600 ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660 ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720 cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780 aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840 tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900 atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960 tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020 agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080 aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140 tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200 cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260 tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320 cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta cgacaaaact 4380 cacacatgcc caccgtgccc agctccagaa ctcctgggcg gaccgtcagt cttcctcttc 4440 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 4500 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 4560 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 4620 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 4680 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 4740 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 4800 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 4860 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgttggactc cgacggctcc 4920 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 4980 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 5040 tctccgggta aa 5052 <210> 92 <211> 19 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> GOVIII-159 <400> 92 Ile Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg 1 5 10 15 Gly Ser Gly <210> 93 <211> 34 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> GOVIII-160 <400> 93 Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly 20 25 30 Ser Gly <210> 94 <211> 48 <212> Белок <213> Искусственная <220> <223> OVIII-064 <400> 94 Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 <210> 95 <211> 48 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220> <223> OB031 <400> 95 Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 <210> 96 <211> 73 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220> <223> OB035 <400> 96 Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 <210> 97 <211> 98 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220> <223> OB036 <400> 97 Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Ser <210> 98 <211> <212> <213> Белок Искусственная последовательность <220> <223> линкер pSYN-OB-051 <400> Ile Ser Gly Gly 1 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 5 10 15 Ser Gly Gly Gly 20 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 25 30 Leu Pro Glu Thr Gly Ala Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Gly Gly 40 45 Ser Gly Gly Gly Gly Ser 50 <210> 99 <211> 232 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> Genewiz-Последовательность №-10-210746313 <400> 99 aggagccgat atctggcggt ggaggttccg gtggcggggg atccggcggt ggaggttccg 60 gcggtggagg ttccggtggc gggggatccg gtggcggggg atccttacct gaaactggag 120 ccctgcggcc ccgggtcgtc ggcggtggag gttccggtgg cgggggatcc gacaaaactc 180 acacatgccc accgtgccca gctccagaac tcctgggcgg accgtcagtc tt 232 <210> 100 <211> 4566 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> pSYN-OB051 <400> 100 atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60 ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120 gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180 ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240 agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300 accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360 gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420 gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480 ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540 acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600 gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660 ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720 gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780 ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840 gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900 tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960 tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020 ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080 acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140 aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200 aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260 cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320 acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380 ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440 cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500 gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560 tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620 ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680 gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740 gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800 ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860 tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920 gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980 tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040 gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100 tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160 atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220 agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280 agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340 ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400 agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460 tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520 acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580 catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640 ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700 aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760 tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820 gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880 tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940 tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000 ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060 tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120 tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180 agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240 ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgccgcattc 3300 tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360 aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420 gaggctgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480 gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540 aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600 gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660 cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720 atatctggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccggcg gtggaggttc cggcggtgga 3780 ggttccggtg gcgggggatc cggtggcggg ggatccttac ctgaaactgg agccctgcgg 3840 ccccgggtcg tcggcggtgg aggttccggt ggcgggggat ccgacaaaac tcacacatgc 3900 ccaccgtgcc cagctccaga actcctgggc ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 3960 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 4020 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 4080 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 4140 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 4200 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 4260 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 4320 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 4380 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgttggact ccgacggctc cttcttcctc 4440 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 4500 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 4560 aaatga 4566 <210> 101 <211> 1521 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220> <223> OB051 <400> 101 Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr 20 25 30 Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly 35 40 45 Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly 50 55 60 Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys 65 70 75 80 Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu 85 90 95 Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro 100 105 110 Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys 115 120 125 Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly 130 135 140 Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly 145 150 155 160 Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln 165 170 175 Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala 180 185 190 Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln 210 215 220 Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu 225 230 235 240 Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu 245 250 255 Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala 260 265 270 Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His 275 280 285 Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys 290 295 300 Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met 305 310 315 320 Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu 325 330 335 Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His 340 345 350 Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn 355 360 365 Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys 370 375 380 Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp 385 390 395 400 Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg 405 410 415 Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys 420 425 430 Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu 435 440 445 Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val 450 455 460 Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu 465 470 475 480 Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu 485 490 495 Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu 500 505 510 Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn 515 520 525 Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro 530 535 540 Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln 545 550 555 560 Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met 565 570 575 Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe 580 585 590 Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys 595 600 605 Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly 610 615 620 Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val 625 630 635 640 Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln 645 650 655 Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu 660 665 670 Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe 675 680 685 Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys 690 695 700 Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp 705 710 715 720 Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met 725 730 735 His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val 740 745 750 Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg 755 760 765 Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu 770 775 780 Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met 785 790 795 800 Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg 805 810 815 His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln 820 825 830 Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr 835 840 845 Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp 850 855 860 Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly 865 870 875 880 Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp 885 890 895 Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys 900 905 910 Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu 915 920 925 Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys 930 935 940 Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg 945 950 955 960 Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg 965 970 975 His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val 980 985 990 Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr 995 1000 1005 Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn 1010 1015 1020 Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro 1025 1030 1035 Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln 1040 1045 1050 Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe 1055 1060 1065 Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 1070 1075 1080 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala 1085 1090 1095 Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln 1100 1105 1110 His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln 1115 1120 1125 Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu 1130 1135 1140 Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln 1145 1150 1155 His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys 1160 1165 1170 His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln 1175 1180 1185 Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly 1190 1195 1200 Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp 1205 1210 1215 Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr 1220 1225 1230 Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1235 1240 1245 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1250 1255 1260 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Ala 1265 1270 1275 Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1280 1285 1290 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 1295 1300 1305 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 1310 1315 1320 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 1325 1330 1335 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 1340 1345 1350 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 1355 1360 1365 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 1370 1375 1380 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 1385 1390 1395 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 1400 1405 1410 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 1415 1420 1425 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 1430 1435 1440 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 1445 1450 1455 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 1460 1465 1470 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 1475 1480 1485 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 1490 1495 1500 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 1505 1510 1515 Pro Gly Lys 1520 <210> 102 <211> 4389 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> OVIII 265 <400> 102 atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgga 60 ggaggaggag gagccaccag aagatactac ctgggtgcag tggaactgtc atgggactat 120 atgcaaagtg atctcggtga gctgcctgtg gacgcaagat ttcctcctag agtgccaaaa 180 tcttttccat tcaacacctc agtcgtgtac aaaaagactc tgtttgtaga attcacggat 240 caccttttca acatcgctaa gccaaggcca ccctggatgg gtctgctagg tcctaccatc 300 caggctgagg tttatgatac agtggtcatt acacttaaga acatggcttc ccatcctgtc 360 agtcttcatg ctgttggtgt atcctactgg aaagcttctg agggagctga atatgatgat 420 cagaccagtc aaagggagaa agaagatgat aaagtcttcc ctggtggaag ccatacatat 480 gtctggcagg tcctgaaaga gaatggtcca atggcctctg acccactgtg ccttacctac 540 tcatatcttt ctcatgtgga cctggtaaaa gacttgaatt caggcctcat tggagcccta 600 ctagtatgta gagaagggag tctggccaag gaaaagacac agaccttgca caaatttata 660 ctactttttg ctgtatttga tgaagggaaa agttggcact cagaaacaaa gaactccttg 720 atgcaggata gggatgctgc atctgctcgg gcctggccta aaatgcacac agtcaatggt 780 tatgtaaaca ggtctctgcc aggtctgatt ggatgccaca ggaaatcagt ctattggcat 840 gtgattggaa tgggcaccac tcctgaagtg cactcaatat tcctcgaagg tcacacattt 900 cttgtgagga accatcgcca ggcgtccttg gaaatctcgc caataacttt ccttactgct 960 caaacactct tgatggacct tggacagttt ctactgtttt gtcatatctc ttcccaccaa 1020 catgatggca tggaagctta tgtcaaagta gacagctgtc cagaggaacc ccaactacga 1080 atgaaaaata atgaagaagc ggaagactat gatgatgatc ttactgattc tgaaatggat 1140 gtggtcaggt ttgatgatga caactctcct tcctttatcc aaattcgctc agttgccaag 1200 aagcatccta aaacttgggt acattacatt gctgctgaag aggaggactg ggactatgct 1260 cccttagtcc tcgcccccga tgacagaagt tataaaagtc aatatttgaa caatggccct 1320 cagcggattg gtaggaagta caaaaaagtc cgatttatgg catacacaga tgaaaccttt 1380 aagactcgtg aagctattca gcatgaatca ggaatcttgg gacctttact ttatggggaa 1440 gttggagaca cactgttgat tatatttaag aatcaagcaa gcagaccata taacatctac 1500 cctcacggaa tcactgatgt ccgtcctttg tattcaagga gattaccaaa aggtgtaaaa 1560 catttgaagg attttccaat tctgccagga gaaatattca aatataaatg gacagtgact 1620 gtagaagatg ggccaactaa atcagatcct cggtgcctga cccgctatta ctctagtttc 1680 gttaatatgg agagagatct agcttcagga ctcattggcc ctctcctcat ctgctacaaa 1740 gaatctgtag atcaaagagg aaaccagata atgtcagaca agaggaatgt catcctgttt 1800 tctgtatttg atgagaaccg aagctggtac ctcacagaga atatacaacg ctttctcccc 1860 aatccagctg gagtgcagct tgaggatcca gagttccaag cctccaacat catgcacagc 1920 atcaatggct atgtttttga tagtttgcag ttgtcagttt gtttgcatga ggtggcatac 1980 tggtacattc taagcattgg agcacagact gacttccttt ctgtcttctt ctctggatat 2040 accttcaaac acaaaatggt ctatgaagac acactcaccc tattcccatt ctcaggagaa 2100 actgtcttca tgtcgatgga aaacccaggt ctatggattc tggggtgcca caactcagac 2160 tttcggaaca gaggcatgac cgccttactg aaggtttcta gttgtgacaa gaacactggt 2220 gattattacg aggacagtta tgaagatatt tcagcatact tgctgagtaa aaacaatgcc 2280 attgaaccaa gaagcttctc tcaaaaccca ccagtcttga aggcccatca ggccgaaata 2340 actcgtacta ctcttcagtc agatcaagag gaaattgact atgatgatac catatcagtt 2400 gaaatgaaga aggaagattt tgacatttat gatgaggatg aaaatcagag cccccgcagc 2460 tttcaaaaga aaacacgaca ctattttatt gctgcagtgg agaggctctg ggattatggg 2520 atgagtagct ccccacatgt tctaagaaac agggctcaga gtggcagtgt ccctcagttc 2580 aagaaagttg ttttccagga atttactgat ggctccttta ctcagccctt ataccgtgga 2640 gaactaaatg aacatttggg cctcctcggc ccatatataa gagcagaagt tgaagataat 2700 atcatggtaa ctttcagaaa tcaggcctct cgtccctatt ccttctattc tagccttatt 2760 tcttatgagg aagatcagag gcaaggagca gaacctagaa aaaactttgt caagcctaat 2820 gaaaccaaaa cttacttttg gaaagtgcaa catcatatgg cacccactaa agatgagttt 2880 gactgcaaag cctgggctta tttctctgat gttgacctgg aaaaagatgt gcactcaggc 2940 ctgattggac cccttctggt ctgccacact aacacactga accctgctca tgggagacaa 3000 gtgacagtac aggaatttgc tctgtttttc accatctttg atgagaccaa aagctggtac 3060 ttcactgaaa atatggaaag aaactgcagg gctccctgca atatccagat ggaagatccc 3120 acttttaaag agaattatcg cttccatgca atcaatggct acataatgga tacactacct 3180 ggcttagtaa tggctcagga tcaaaggatt cgatggtatc tgctcagcat gggcagcaat 3240 gaaaacatcc attctattca tttcagtgga catgtgttca ctgtacgaaa aaaagaggag 3300 tataaaatgg cactgtacaa tctctatcca ggtgtttttg agacagtgga aatgttacca 3360 tccaaagctg gaatttggcg ggtggaatgc cttattggcg agcatctaca tgctgggatg 3420 agcacacttt ttctggtgta cagcaataag tgtcagactc ccctgggaat ggcttctgga 3480 cacattagag attttcagat tacagcttca ggacaatatg gacagtgggc cccaaagctg 3540 gccagacttc attattccgg atcaatcaat gcctggagca ccaaggagcc cttttcttgg 3600 atcaaggtgg atctgttggc accaatgatt attcacggca tcaagaccca gggtgcccgt 3660 cagaagttct ccagcctcta catctctcag tttatcatca tgtatagtct tgatgggaag 3720 aagtggcaga cttatcgagg aaattccact ggaaccttaa tggtcttctt tggcaatgtg 3780 gattcatctg ggataaaaca caatattttt aaccctccaa ttattgctcg atacatccgt 3840 ttgcacccaa ctcattatag cattcgcagc actcttcgca tggagttgat gggctgtgat 3900 ttaaatagtt gcagcatgcc attgggaatg gagagtaaag caatatcaga tgcacagatt 3960 actgcttcat cctactttac caatatgttt gccacctggt ctccttcaaa agctcgactt 4020 cacctccaag ggaggagtaa tgcctggaga cctcaggtga ataatccaaa agagtggctg 4080 caagtggact tccagaagac aatgaaagtc acaggagtaa ctactcaggg agtaaaatct 4140 ctgcttacca gcatgtatgt gaaggagttc ctcatctcca gcagtcaaga tggccatcag 4200 tggactctct tttttcagaa tggcaaagta aaggtttttc agggaaatca agactccttc 4260 acacctgtgg tgaactctct agacccaccg ttactgactc gctaccttcg aattcacccc 4320 cagagttggg tgcaccagat tgccctgagg atggaggttc tgggctgcga ggcacaggac 4380 ctctactga 4389 <210> 103 <211> <212> <213> 1462 Белок Искусственная последовательность <220> <223> OVIII 265 <400> 103 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly 20 25 30 Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu 35 40 45 Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe 50 55 60 Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp 65 70 75 80 His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu 85 90 95 Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu 100 105 110 Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser 115 120 125 Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln 130 135 140 Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr 145 150 155 160 Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu 165 170 175 Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu 180 185 190 Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu 195 200 205 Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala 210 215 220 Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu 225 230 235 240 Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His 245 250 255 Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys 260 265 270 His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro 275 280 285 Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn 290 295 300 His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala 305 310 315 320 Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile 325 330 335 Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser 340 345 350 Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu 355 360 365 Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe 370 375 380 Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys 385 390 395 400 Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp 405 410 415 Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys 420 425 430 Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys 435 440 445 Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu 450 455 460 Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu 465 470 475 480 Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro 485 490 495 Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser 500 505 510 Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu 515 520 525 Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly 530 535 540 Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe 545 550 555 560 Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu 565 570 575 Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser 580 585 590 Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser 595 600 605 Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly 610 615 620 Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser 625 630 635 640 Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His 645 650 655 Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe 660 665 670 Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr 675 680 685 Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met 690 695 700 Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp 705 710 715 720 Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp 725 730 735 Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala 740 745 750 Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln 755 760 765 Asn Pro Pro Val Leu Lys Ala His Gln Ala Glu Ile Thr Arg Thr Thr 770 775 780 Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val 785 790 795 800 Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln 805 810 815 Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala 820 825 830 Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu 835 840 845 Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val 850 855 860 Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly 865 870 875 880 Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu 885 890 895 Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro 900 905 910 Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln 915 920 925 Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr 930 935 940 Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe 945 950 955 960 Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp 965 970 975 Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr 980 985 990 Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu 995 1000 1005 Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu 1010 1015 1020 Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu 1025 1030 1035 Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly 1040 1045 1050 Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln 1055 1060 1065 Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile 1070 1075 1080 His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys 1085 1090 1095 Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe 1100 1105 1110 Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val 1115 1120 1125 Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu 1130 1135 1140 Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala 1145 1150 1155 Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr 1160 1165 1170 Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser 1175 1180 1185 Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val 1190 1195 1200 Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly 1205 1210 1215 Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile 1220 1225 1230 Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn 1235 1240 1245 Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser 1250 1255 1260 Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr 1265 1270 1275 Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg 1280 1285 1290 Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu 1295 1300 1305 Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser 1310 1315 1320 Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala 1325 1330 1335 Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val 1340 1345 1350 Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met 1355 1360 1365 Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr 1370 1375 1380 Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly 1385 1390 1395 His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe 1400 1405 1410 Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp 1415 1420 1425 Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp 1430 1435 1440 Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala 1445 1450 1455 Gln Asp Leu Tyr 1460 <210> 104 <211> 5691 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> OVIII198 <400> 104 atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60 accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120 ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180 acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240 gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300 gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360 ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420 gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540 gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600 gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660 tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720 gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780 ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840 accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900 cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960 gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020 gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080 gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140 gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200 tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260 cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320 aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380 attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440 ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500 gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560 ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620 actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680 gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740 agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800 aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860 cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920 tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980 attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040 atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160 atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220 agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280 ttctctcaga attcaagaca ccctagcact aggcaaaagc aatttaatgc caccacaatt 2340 ccagaaaatg acatagagaa gactgaccct tggtttgcac acagaacacc tatgcctaaa 2400 atacaaaatg tctcctctag tgatttgttg atgctcttgc gacagagtcc tactccacat 2460 gggctatcct tatctgatct ccaagaagcc aaatatgaga ctttttctga tgatccatca 2520 cctggagcaa tagacagtaa taacagcctg tctgaaatga cacacttcag gccacagctc 2580 catcacagtg gggacatggt atttacccct gagtcaggcc tccaattaag attaaatgag 2640 aaactgggga caactgcagc aacagagttg aagaaacttg atttcaaagt ttctagtaca 2700 tcaaataatc tgatttcaac aattccatca gacaatttgg cagcaggtac tgataataca 2760 agttccttag gacccccaag tatgccagtt cattatgata gtcaattaga taccactcta 2820 tttggcaaaa agtcatctcc ccttactgag tctggtggac ctctgagctt gagtgaagaa 2880 aataatgatt caaagttgtt agaatcaggt ttaatgaata gccaagaaag ttcatgggga 2940 aaaaatgtat cgtcagaaat aactcgtact actcttcagt cagatcaaga ggaaattgac 3000 tatgatgata ccatatcagt tgaaatgaag aaggaagatt ttgacattta tgatgaggat 3060 gaaaatcaga gcccccgcag ctttcaaaag aaaacacgac actattttat tgctgcagtg 3120 gagaggctct gggattatgg gatgagtagc tccccacatg ttctaagaaa cagggctcag 3180 agtggcagtg tccctcagtt caagaaagtt gttttccagg aatttactga tggctccttt 3240 actcagccct tataccgtgg agaactaaat gaacatttgg gactcctggg gccatatata 3300 agagcagaag ttgaagataa tatcatggta actttcagaa atcaggcctc tcgtccctat 3360 tccttctatt ctagccttat ttcttatgag gaagatcaga ggcaaggagc agaacctaga 3420 aaaaactttg tcaagcctaa tgaaaccaaa acttactttt ggaaagtgca acatcatatg 3480 gcacccacta aagatgagtt tgactgcaaa gcctgggctt atttctctga tgttgacctg 3540 gaaaaagatg tgcactcagg cctgattgga ccccttctgg tctgccacac taacacactg 3600 aaccctgctc atgggagaca agtgacagta caggaatttg ctctgttttt caccatcttt 3660 gatgagacca aaagctggta cttcactgaa aatatggaaa gaaactgcag ggctccctgc 3720 aatatccaga tggaagatcc cacttttaaa gagaattatc gcttccatgc aatcaatggc 3780 tacataatgg atacactacc tggcttagta atggctcagg atcaaaggat tcgatggtat 3840 ctgctcagca tgggcagcaa tgaaaacatc cattctattc atttcagtgg acatgtgttc 3900 actgtacgaa aaaaagagga gtataaaatg gcactgtaca atctctatcc aggtgttttt 3960 gagacagtgg aaatgttacc atccaaagct ggaatttggc gggtggaatg ccttattggc 4020 gagcatctac atgctgggat gagcacactt tttctggtgt acagcaataa gtgtcagact 4080 cccctgggaa tggcttctgg acacattaga gattttcaga ttacagcttc aggacaatat 4140 ggacagtggg ccccaaagct ggccagactt cattattccg gatcaatcaa tgcctggagc 4200 accaaggagc ccttttcttg gatcaaggtg gatctgttgg caccaatgat tattcacggc 4260 atcaagaccc agggtgcccg tcagaagttc tccagcctct acatctctca gtttatcatc 4320 atgtatagtc ttgatgggaa gaagtggcag acttatcgag gaaattccac tggaacctta 4380 atggtcttct ttggcaatgt ggattcatct gggataaaac acaatatttt taaccctcca 4440 attattgctc gatacatccg tttgcaccca actcattata gcattcgcag cactcttcgc 4500 atggagttga tgggctgtga tttaaatagt tgcagcatgc cattgggaat ggagagtaaa 4560 gcaatatcag atgcacagat tactgcttca tcctacttta ccaatatgtt tgccacctgg 4620 tctccttcaa aagctcgact tcacctccaa gggaggagta atgcctggag acctcaggtg 4680 aataatccaa aagagtggct gcaagtggac ttccagaaga caatgaaagt cacaggagta 4740 actactcagg gagtaaaatc tctgcttacc agcatgtatg tgaaggagtt cctcatctcc 4800 agcagtcaag atggccatca gtggactctc ttttttcaga atggcaaagt aaaggttttt 4860 cagggaaatc aagactcctt cacacctgtg gtgaactctc tagacccacc gttactgact 4920 cgctaccttc gaattcaccc ccagagttgg gtgcaccaga ttgccctgag gatggaggtt 4980 ctgggctgcg aggcacagga cctctacgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagct 5040 ccagaactcc tgggcggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 5100 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 5160 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 5220 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 5280 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 5340 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 5400 cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 5460 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 5520 aagaccacgc ctcccgtgtt ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 5580 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 5640 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 5691 <210> 105 <211> 1896 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220> <223> OVIII 198 <400> 105 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 180 185 190 Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 195 200 205 Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 210 215 220 Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp 225 230 235 240 Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr 245 250 255 Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 260 265 270 Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 275 280 285 Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser 290 295 300 Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met 305 310 315 320 Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His 325 330 335 Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 340 345 350 Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp 355 360 365 Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser 370 375 380 Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400 Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415 Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn 420 425 430 Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 435 440 445 Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu 450 455 460 Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 485 490 495 His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 500 505 510 Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 515 520 525 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 545 550 555 560 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 565 570 575 Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590 Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 595 600 605 Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp 610 615 620 Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640 Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655 Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720 Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 725 730 735 Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 740 745 750 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro 755 760 765 Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp 770 775 780 Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys 785 790 795 800 Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser 805 810 815 Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr 820 825 830 Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn 835 840 845 Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly 850 855 860 Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu 865 870 875 880 Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys 885 890 895 Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn 900 905 910 Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met 915 920 925 Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys 930 935 940 Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu 945 950 955 960 Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu 965 970 975 Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu 980 985 990 Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu 995 1000 1005 Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln 1010 1015 1020 Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala 1025 1030 1035 Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His 1040 1045 1050 Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys 1055 1060 1065 Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro 1070 1075 1080 Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro 1085 1090 1095 Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg 1100 1105 1110 Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser 1115 1120 1125 Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe 1130 1135 1140 Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His 1145 1150 1155 His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala 1160 1165 1170 Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu 1175 1180 1185 Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala 1190 1195 1200 His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr 1205 1210 1215 Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu 1220 1225 1230 Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr 1235 1240 1245 Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met 1250 1255 1260 Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg 1265 1270 1275 Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile 1280 1285 1290 His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr 1295 1300 1305 Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val 1310 1315 1320 Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu 1325 1330 1335 Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val 1340 1345 1350 Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His 1355 1360 1365 Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp 1370 1375 1380 Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala 1385 1390 1395 Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu 1400 1405 1410 Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln 1415 1420 1425 Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser 1430 1435 1440 Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly 1445 1450 1455 Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys 1460 1465 1470 His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu 1475 1480 1485 His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu 1490 1495 1500 Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu 1505 1510 1515 Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe 1520 1525 1530 Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His 1535 1540 1545 Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro 1550 1555 1560 Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr 1565 1570 1575 Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr 1580 1585 1590 Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp 1595 1600 1605 Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn 1610 1615 1620 Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu 1625 1630 1635 Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln 1640 1645 1650 Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu 1655 1660 1665 Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 1670 1675 1680 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 1685 1690 1695 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 1700 1705 1710 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 1715 1720 1725 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 1730 1735 1740 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 1745 1750 1755 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 1760 1765 1770 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 1775 1780 1785 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 1790 1795 1800 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 1805 1810 1815 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 1820 1825 1830 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 1835 1840 1845 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 1850 1855 1860 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 1865 1870 1875 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 1880 1885 1890 Pro Gly Lys 1895 <210> 106 <211> <212> <213> Белок Искусственная последовательность <220> <223> распознающий сортазу мотив <220> <221> <222> <223> Xaa может являться любой аминокислотой природного происхождения <400> 106 Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5 <210> 107 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220> <223> цистеин-содержащий пептид <400> 107 Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 108 <211> 4548 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> ФВ 031 <400> 108 atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60 ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120 gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180 ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240 agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300 accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360 gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420 gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480 ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540 acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600 gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660 ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720 gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780 ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840 gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900 tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960 tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020 ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080 acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140 aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200 aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260 cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320 acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380 ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440 cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500 gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560 tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620 ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680 gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740 gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800 ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860 tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920 gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980 tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040 gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100 tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160 atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220 agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280 agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340 ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400 agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460 tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520 acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580 catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640 ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700 aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760 tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820 gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880 tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940 tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000 ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060 tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120 tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180 agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240 ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgccgcattc 3300 tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360 aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420 gaggctgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480 gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540 aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600 gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660 cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720 atatctggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccggcg gtggaggttc cggcggtgga 3780 ggttccggtg gcgggggatc cggtggcggg ggatccctgg tcccccgggg cagcggcggt 3840 ggaggttccg gtggcggggg atccgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagctcca 3900 gaactcctgg gcggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 3960 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 4020 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 4080 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 4140 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 4200 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 4260 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 4320 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 4380 accacgcctc ccgtgttgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 4440 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 4500 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 4548 <210> 109 <211> 1515 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220> <223> ФВ 031 <400> 109 Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr 20 25 30 Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly 35 40 45 Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly 50 55 60 Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys 65 70 75 80 Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu 85 90 95 Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro 100 105 110 Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys 115 120 125 Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly 130 135 140 Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly 145 150 155 160 Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln 165 170 175 Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala 180 185 190 Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln 210 215 220 Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu 225 230 235 240 Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu 245 250 255 Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala 260 265 270 Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His 275 280 285 Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys 290 295 300 Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met 305 310 315 320 Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu 325 330 335 Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His 340 345 350 Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn 355 360 365 Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys 370 375 380 Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp 385 390 395 400 Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg 405 410 415 Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys 420 425 430 Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu 435 440 445 Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val 450 455 460 Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu 465 470 475 480 Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu 485 490 495 Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu 500 505 510 Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn 515 520 525 Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro 530 535 540 Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln 545 550 555 560 Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met 565 570 575 Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe 580 585 590 Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys 595 600 605 Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly 610 615 620 Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val 625 630 635 640 Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln 645 650 655 Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu 660 665 670 Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe 675 680 685 Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys 690 695 700 Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp 705 710 715 720 Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met 725 730 735 His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val 740 745 750 Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg 755 760 765 Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu 770 775 780 Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met 785 790 795 800 Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg 805 810 815 His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln 820 825 830 Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr 835 840 845 Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp 850 855 860 Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly 865 870 875 880 Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp 885 890 895 Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys 900 905 910 Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu 915 920 925 Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys 930 935 940 Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg 945 950 955 960 Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg 965 970 975 His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val 980 985 990 Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr 995 1000 1005 Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn 1010 1015 1020 Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro 1025 1030 1035 Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln 1040 1045 1050 Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe 1055 1060 1065 Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val 1070 1075 1080 Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala 1085 1090 1095 Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln 1100 1105 1110 His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln 1115 1120 1125 Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu 1130 1135 1140 Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln 1145 1150 1155 His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys 1160 1165 1170 His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln 1175 1180 1185 Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly 1190 1195 1200 Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp 1205 1210 1215 Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr 1220 1225 1230 Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1235 1240 1245 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1250 1255 1260 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser 1265 1270 1275 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr 1280 1285 1290 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1295 1300 1305 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 1310 1315 1320 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 1325 1330 1335 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 1340 1345 1350 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 1355 1360 1365 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 1370 1375 1380 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 1385 1390 1395 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 1400 1405 1410 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 1415 1420 1425 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 1430 1435 1440 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 1445 1450 1455 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 1460 1465 1470 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 1475 1480 1485 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 1490 1495 1500 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1505 1510 1515 <210> 110 <211> 40 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220> <223> линкер <220> <221> ПОВТОР <222> (1)..(5) <223> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser повтор <400> 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 111 <211> 62 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> ESC54-OB в прямом направлении с сайтом BsiW1 <400> 111 cgcttcgcga cgtacggccg ccaccatgat tcctgccaga tttgccgggg tgctgcttgc 60 tc 62 <210> 112 <211> 60 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> ESC 124 - D1D2 клонирующий олиго с сайтом Not1 site-в обратном направлении <400> 112 ctagactcga gcggccgctc accttttgct gcgatgagac aggggactgc tgaggacagc 60 <210> 113 <211> 2289 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> <223> ФВ 053 №^2-пропептид ФВ) <400> 113 atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60 ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120 gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180 ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240 agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300 accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360 gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420 gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480 ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540 acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600 gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660 ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720 gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780 ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840 gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900 tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960 tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020 ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080 acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140 aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200 aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260 cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320 acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380 ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440 cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500 gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560 tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620 ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680 gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740 gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800 ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860 tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920 gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980 tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040 gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100 tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160 atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220 agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280 agcaaaagg 2289 <210> 114 <211> 763 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220> <223> ФВ 053 №^2-пропептид ФВ) <400> 114 Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr 20 25 30 Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly 35 40 45 Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly 50 55 60 Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys 65 70 75 80 Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu 85 90 95 Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro 100 105 110 Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys 115 120 125 Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly 130 135 140 Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly 145 150 155 160 Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln 165 170 175 Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala 180 185 190 Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln 210 215 220 Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu 225 230 235 240 Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu 245 250 255 Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala 260 265 270 Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His 275 280 285 Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys 290 295 300 Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met 305 310 315 320 Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu 325 330 335 Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His 340 345 350 Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn 355 360 365 Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys 370 375 380 Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp 385 390 395 400 Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg 405 410 415 Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys 420 425 430 Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu 435 440 445 Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val 450 455 460 Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu 465 470 475 480 Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu 485 490 495 Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu 500 505 510 Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn 515 520 525 Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro 530 535 540 Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln 545 550 555 560 Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met 565 570 575 Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe 580 585 590 Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys 595 600 605 Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly 610 615 620 Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val 625 630 635 640 Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln 645 650 655 Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu 660 665 670 Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe 675 680 685 Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys 690 695 700 Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp 705 710 715 720 Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met 725 730 735 His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val 740 745 750 Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg 755 760 К заявке №201791134 ИЗМЕНЕННАЯ ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ для вступления в региональную фазу в Евразии 1. Химерный белок, содержащий белок фактора VIII ("ФУШ") и фрагмент фактора Виллебранда (ФВ), содержащий домен D' и домен D3 ФВ, при этом указанный фрагмент ФВ и указанный белок ФУШ соединены друг с другом посредством взаимодействия, которое является достаточно сильным для предотвращения диссоциации указанного фрагмента ФВ от указанного белка ФУШ в присутствии эндогенного ФВ. 2. Химерный белок по п. 1, отличающийся тем, что домен D' содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной аминокислотам от 764 до 866 из SEQ ID NO: 2, и/или отличающийся тем, что домен D3 содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 90% идентичной аминокислотам от 867 до 1240 из SEQ ID NO: 2. 3. Химерный белок по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что указанный белок ФУШ содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 18, при этом указанный белок ФУШ обладает активностью ФУШ. 4. Химерный белок по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что указанный белок ФУШ содержит тяжелую цепь фактора VIII и легкую цепь фактора VIII, при этом указанная тяжелая цепь фактора VIII содержит аминокислоты от 1-740 последовательности SEQ ID NO: 16, и при этом указанная легкая цепь фактора VIII содержит аминокислоты 1649-2332. 5. Химерный белок по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что время полужизни белка ФУШ продлевается за пределы ограничения времени полужизни белка ФУШ в присутствии эндогенного ФВ. 6. Химерный белок по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанный фрагментФВ содержит по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н1) 7. Химерный белок по п. 6, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н1) содержит константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов. 8. Химерный белок по п. 6 или п. 7, отличающийся тем, что указанный химерный белок содержит линкер между фрагментом ФВ и гетерологичным компонентом (Н1), который является отщепляемым линкером. 9. Химерный белок по любому из пп. 1 - 8, отличающийся тем, что указанный белок ФУШ содержит ФУШ и по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н2). 10. Химерный белок по п. 9, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н2) содержит константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), его производное, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент или любые комбинации этих компонентов. 11. Химерный белок по п. 9 или 10, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н2) содержит Fc-область. 12. Химерный белок по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что указанный белок ФУШ содержит одноцепочеченый ФУШ. 13. Полинуклеотид или набор полинуклеотидов, кодирующих химерный белок по любому из пп. 1-12. 14. Вектор или набор векторов, содержащие полинуклеотид или набор полинуклеотидов по п. 13 и один или более промоторов, функционально связанных с полинуклеотидом или группой полинуклеотидов. 15. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид или набор полинуклеотидов по п. 14. 16. Фармацевтическая композиция, содержащая химерный белок по любому из пп. 1-12 и фармацевтически приемлемый носитель. 17. Способ лечения заболевания или болезненного состояния, связанного с кровотечением, у нуждающегося в этом пациента, включающий введение эффективного количества белка ФУШ и введение эффективного количества химерного белка, содержащего фрагмент фактора Виллебранда (ФВ), содержащий домен D' и домен D3 ФВ, при этом указанный фрагмент ФВ и указанный белок ФУШ соединены друг с другом посредством взаимодействия, которое является достаточно сильным для предотвращения диссоциации указанного фрагмента ФВ от указанного белка ФУШ в присутствии эндогенного ФВ. 18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что указанное заболевание или болезненное состояние, связанное с кровотечением, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и любых их комбинаций. 19. Способ по п. 17 или п. 18, отличающийся тем, что указанный фрагмент ФВ содержит по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н1). 20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н1) содержит константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов. 21. Способ по п. 19 или п. 20, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н1) содержит альбумин. 22. Способ по любому из пп. 17-21, отличающийся тем, что указанный белок ФУШ содержит ФУШ и по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н2). 23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н2) содержит константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), его производное, альбумин связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент или любые комбинации этих компонентов. 24. Способ по любому из пп. 19-22, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н1), указанный по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н2), или оба указанных компонента содержат партнер по связыванию FcRn. 25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что указанный партнер по связыванию FcRn содержит Fc-область. 26. Способ по любому из пп. 19-25, отличающийся тем, что указанный химерный белок содержит линкер между фрагментом ФВ и указанным гетерологичным компонентом (Н1), который является отщепляемым линкером. 27. Способ по любому из пп. 17-26, отличающийся тем, что указанный белок ФУШ содержит одноцепочеченый ФУШ. Фигура 1: Разные конструкции ФВ D D3 nnJ oi__i?2 ггоз rL ,... -.. "." i ^?3^010 D1 _02__Л' D3 ^.^^ ОЗлА.С.тл 003 D1 02 D; РЗ I> M ч i i*1.^ 011 " ФВ-006 ФВ-008 (FL-ФВ ) п ;> " ". их. w ФВ-031 ( ФВ -Fc) шшшшш В1 НГ ИЛ 48 ак отщепляемый линкер Фигура 1Е: Фактор Виллебранда Пропептид Зрелая субъединица "1С ADAMTS13 Коллаген Мультимер S- S D4 t^1-2 Димер > Белок - 250 кДа. образует мулынмеры (> 20 МДа) путем дисульфидного связывания > Объединяется с ФУШ (95-98%) в нековалептный комплекс Защищает Ф\''Ш от протеачного расщепленпя/активашш Стабилизирует тяжелую и легкую цепи ¦ Предотвращает выведение ФУШ фагоцитарными рецепторами Продлевает время полужизни Выведение комплекса ФУШ-ФВ посредством ФВ-рецепторов Предотвращает пппоцпточ и рециклпш рФУПИ'с? Ограничивает время полужизни Фигура 2: Конструкции ФУШ (гетеродимер ФУШ/ФВ) Внутриклеточный процессинг Дисульфидная снизь Произвольный линкер Отщепляемый линкер | переменной длины (с сайтом расщепления Х1а, тромбином. Ха и г д.) 20 ак тромбин- 'отщепляемый линкер 20 ак тромбин-отщепляемый линкер ФУШсвязывающий домен ФВ переменной длины Ф\Т 11-064/065 Коми рл кинм . 1Ш\ * Пр <НИ.ЧЧ'!1р> еЧЫЙ ,.11ШК1'р Ф\'Ш-064/(М> 5 IUMKOBMH продукт ФУ II1-064: ( одержит ФВ 1ГШ 1-477 ак С336Л/С379Л Ф\'111-065: С одержит ФВ 1)'D3 1-276 ак ФУШ-136: Ф\ 111-064 в остове пЦДНК ФУ 111-148: Двулцепочечнан молекула ФУШ в ФУ 11136 был" превращена в олноиепочсчнын ФУШ путем внесения м\т;шни К1645Л7К1648Л в ген ФУШ Фигура 3: Конструкции Ф\ЛН (разные линкеры) Конструкция ДНК Линкер между ФВ и Fc ФУШ-064 20зк = ID {2XiGGGGS)HVPRGSGG I ФУ! II-159 35 ак = IS{5X(GGGGS)1LVPRGSGG Ф\ЛН-160 и его производные ФУШ-178 ФУ111-160: 48 ак = IS{6X(GGGGS)}IVPRGSGGGGSG6GGS I ФУШ-180: ФУШ-160 с мутацией К2092А в С1-домене ФУШ ФУШ-181: ФУШ-160 с мутвцией К2093А в С1 -домене ФУШ \ ФУШ-182: ФУ11И60 с мутацией K2092A/F2093A в С1 домене ФУШ \ 73 ак - IST 1IX(GGGGS)} IVPRGSGGGGSGGGGS ФУШ-179 98 зк = IS{16X(GGGC5}} LVPRGSGGGGSGGGGS ФВ - D'D3 (1-477 ак с С336А/С379А) ф\1 п-064,ш). пк т щ- In \i\o iipoiu-cciip> c.Mbiii линкер Фигура 4: Конструкции ФУШ 4А 4Б 4В 4] Т..5 ФЧ(! 4Д 14 *y.iu ГС ..^.УУ.!!.. ...,"""^1. fg ^ ФВ-"> И> 2-"-03,|-47^,.-^.ША.-С37", П - I fSTJlO.IOI НЧПЫИ комшпн-м г . lit ИМ}) (li llfkdl 1"[1Ы\ 1.ИЧЛН\ lil Uil'll.fHt'Mblii) *¦ In \ho иротчтируемми тикер Фигура 4: Конструкции ФУШ (продолжение) ПЭГ или ГЭК ФВ^И"> 4)'И(М11и(1(1Мпт| И ^ гепфологн'нплн компонент . (нМкСр (В Щ'КОтрЫЧ СП ЧЯИА (I I ПЛМПНСНЫН) t In vivo иронсччируемын линкер Фигура 5: Конструкции ФУШ (система котрансфекции) 43 ак тромбин-опцетиммый линкер ФУШ-155 ФВ-031 ФУШ-155 Одноцепочечный (ОЦ) - ФУШ R1645A/R1648A. напрямую связанный с одиночной Fc Внутриклеточный процессинг ФВ-031 Фрагмент D1D2D'D3 (1-477 ак с С336А/С379А), связанный с одиночной Fc 48 ак тромбин отщепляемым линкером СО ГО 48 as трюмбйн-огщвплжмыи линкер Фигура 6: Очистка ФВ 009 (D1D2D'D3 "1Ь^ х б his) Невосстановительный 2SCKB" шкда Воссгзновтепьный СО Ы Очищенный ФВ 009 существует в виде мономера ¦Непроцвссиронанныи - Непроцессированныи DTJ3 Фигура 7: Очищенный ФВ 002 и 010 (D'D3 ,.д?;йч х в his) Невосс f аиови i смь н > и 2 3 4 5 Bocl i dtiOi.ni {г;пьный 7. 3.4 5 Непроцессированный ФВ010 . Димер D'03 D'D3 (477 ate) ГЧЭ Дублет в районе 60 кДа указывает на разную форму гликозилирования 1- ФВ -002 АХИМ Фракция 1АЗ 2- ФВ -002 АХИМ Фракция 1В1 3- ФВ -010 АХИМ Фракция 1ВЗ 4- ФВ -010 АХИМ Фракция 2А1 5- ФВ -010 АХИМ Фракция 2А2 Фигура 8: Расщепление тромбином гетеродимере ФУШ-ФВ Расщепление тромбином белка ФУШЖС-ФВ 1- Маркер 2- рФУШРс 3- pOVIIIFc + Тромбин 4- Пустой 5- ФУШРс-ФВ 6- OVIIIFc-ФВ + Тромбин А1 = домен А1 ФУШ А2 = домен А2 ФУШ ЛаЗ ЛЦ = Легкая цепь ФУИРе Фигура 9: Взаимодействие ФУШ-ФВ является ограничивающим фактором для продления времени полужизни ФУШ 3 <э <" & в 103л I 1? ФК pOVIIIFc у ФУШ/ФВ ДНГ мышей •л" • pOTIII Т1,2 = 0,25 ч FMDVMIFC Т1/2 * 1,2 ч "-f Фигура 10А: Полноразмерный димер D D3 обеспечивает такую же защиту ФУШ, как и полноразмерная молекула ФВ Плазменный уровень эндогенного Ф\ЛП юооз через 48 ч после инъекции плазмид "Т"~ ач> " л40" ' л4" 'Л |Л *у . |Л csNV с?"1-' с0> ч** сС> ъ ччЪ с^Л <^ ОТ ъч ЪЧ Уровень плазменного ФУШ до иньекции Фигура 10Б: Полноразмерный димер D'D3 обеспечивает такую же защиту ФУШ, как и полноразмерная молекула ФВ Ш 100 х Уровень экспрессии доменов ФВ через 48 ч после инъекции плазмид (c) со о <и 2 S К о о ф с: о ш ш о ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ # ^ ^ ^N ^ ч^л ^ ^ ^ СГ "Г "У СГ <У Фигура 11; ФК УВД-ФУШ у ФУШ-ФВ ДГН мышей .при совместной инъекции ФВ-010 или ФВ-002 Плазменная активность УВД-ФУШ Плазменный уровень ФВ 3 4 Время {часы) 2 3 4 Время (часы) Фигура 12: ФК рФУШРс у мышей, экспрессирующих D D3 ФВ ГДИ LTD3 JV дотирование нлазлшзной ДНК пФУШР'с ч " ^^^^^^^^^^^ День-5 День 0 ДеньЗ Б В Время (часы) Вромя (часы) * Димер D"D3 и его мономер, сише'шгюыниьш вмале с доменом DID2 айсслечивас! аналм нчнчю tauniгу ФУШ * Циркуляция фрш ченюв О'Ш ФВ обуславливает лошишнельное К-крашое продление времени полужимн * Восешшвлешк рФУШК- ширх-ло ш 40% до 70% Фигура 13: Отбор D'D3-Fc линкеров путем ГДИ у ФУШ/ФВ ДГН мышей ГДИ D D3-FC линкерных конструкций ФУШ/ФВ ДГН мышам {48 часов после инъекции} 1024- Ш 512- 5 0 <в и о < 256- 128 О О д д д д а а ФУШ-064: рФУШРс-ФВ с 22 ак линкером ФУПМ 69: рФУШРс-ФВ с 35 ак линкером ФУШ-160: рФУШРс-ФВ с 48 ак линкером Фигура 14: ГДИ одноцепочечного и двухцепочечиого гетеродимера ФУШРсЮ'ОЗ у ФУШ/ФВ ДГИ мышей ФУШ-136 лроцесированный (двухцопочечный) p0VniFc-D'D3 10(Ю-1 е юо " О X < JEb0JL2 • • 24 ч 48 ч ФУШ-148 ОЦ-рФУШРс-О'ОЗ * Процессируемый линкер Фигура 15: Октетный анализ Ф\/11М55/ФВ-031 связывания с иммобилизованным ФВ Выбранный этап: ассоциация {информация с сенсора) 040 0.10 i' t t i I i t " . I.' ft -0.10 > 440 460 480 50 ъ Время (с) 5m sm 5so его OVIII-155/AD-031 OVii! OVlilFc ^л, IgG Фигура 16: ФК ФУШ-155/ФВ-031 и ФШРс у ФУШ/ФВ ДГН мышей 100т 10i to со pOVIIIFc ti/2: 1,6 ч РФУНИ55/ФВ-31 tl/2: 9,9 ч 0,1 -Г" 40 "eo Время (часы) Фигура 17; Конструкции ФВ 17А. линкер 17Б. F ~Ш ... с I линкер 17В. линкер Линкер переменной дпины ^ (в некоторых случаях расщепляемый Х1а. тромбином, Ха и т.д.} Н - гетерологичный компонент "ПЭГ илиГЭК Фигура 185: Снижение активности ФУШ вследствие диссоциации/деградации тяжелой цепи (ТЦ) Oectepn -ОМАрЩантм-Щ) Дорожка I - нсокрашскннй маркер Bie-racI Дорожка 2 - ФЧ'ШК- • ФСЬ Дорожка 3 - Ф\1Ш\ - Л! II плаша Дорижка "- 11> сгая Дорожка 5 - только o*ciu. ri".'iiiK.iomtibmic атше.щ ШШ- 5 чк, Ф Villi с ннхуйирокали с 250 мкл ФСБ или плазмой ДГН мышей ira протяжении 24 ч при З"7 гряд. Ф\'1Ш-'с и м мут "прс им пи тирокал и. л№зкляя 5 чкг овечьего ноликлонального аитнлела к Ф\'Иi i jb6137|)) на пропащий I п при КТ и НЮ мкл гранул протеина А Носче отмывки 4x1 мл ФСБ гранулы рссуевендировади в вгохтяновитслышм ДСН-ПЛАГ буфере 2d мкл ."алружали в 4-15"" гель (т.е. 1 и кг Ф\'Ш1-'с) Фигура 19: Измерение активности ФУШРс хромогенным методом Мышиная ДГН плазма Мышиная гемА плазма Фигура 20: процессинг ФВ-031 {D1D2D*D3}=c} РС5 или РАСЕ РС5 РАСЕ ni02i"> r).UL D'D3Fc 1 4 - 7 8 9 Ю И Дорожка! - один ФВ031 Дорожка 2- смчн ?С5 Дррожы 3- один РАСЕ Дорожка 4- ФВОЗ f f PL 5-2.5% Дорезка 5-ФВ031 • РС.'5-5% Дорожка *-ФВ""Ч • Pt'5-7.^% Дорожка 7-ФВУЗ! ¦ РС5-!0% Дорожка 8- ФВО: I . РАСЕ-2 5% Дорожка "- ФВШ S - l'ACE-5% Дорожка 10- ФВОЗ 1 Р А <-'К-7,5% Дорожка 11-ФВУ31 • РА1Т,-10% Фигура 21 А: Отсутствие связывания ФУ1Н-155/ФВ-031 с ФВ 1 V л 'Л Блокирование 1% БСА -.У "; :? .4 .'.I л Зречя (с) вариант г '.Л ГЛ ^ ';" Сенсор: APS ФУ1Н - ? ,Ґ16|GF Jjti №. I'i? f}2 \" Время (с) v ~- ;a .IV.," к.?- .t-з- ¦ma ; 155,031 !gG Время (с) Фигура 21 Б: ФУНИ55/ФВ-031 не связывается с ФУШ Исходнь* данные (информации с сенсора! 155,031 : • . - ФУШ < ц у; г-а ли г & j.su т т як ".у м" Время (с) Сенсор- Протеин G Фигура 22: Взаимодействие ФУШ с ФВ-031 • 1000 КЕ иммобилизованного козлиного античеловеского IgG • 100 КЕ ФВ-031 • OVIII (с удаленным В-доменом) применяли в одноцикловом кинетическом режиме • 1:1 соотношение; п = 4 К0~ 10 ± 1нМ (В 25 раз слабее, чем с FL-ФВ в качестве лиганда) Фигура 23: влияние различной длины линкеров гетеродимеров ФУШРс/ФВ на ФК у ФУШ/ФВ ДГН мышей ФК гетеродимеров ФУШРс/ФВ у ФУШ.'ФВ ДГН мышей OVMMSfi Одноточечный {ОЦ) - OVIII К1в44А/В1"4вА. напрямую связанный с одиночной Fc ФВ-031 Фрагмент D1D20'D3 (1-477 ак с С336А/С379А), связанный с одиночной Fc посредством 48ак тромбин-отщепляемого линкер" ФВ-035 Фрагмент D1D2D'D3 (1-477 Ак С С338А/С379А), связанный с одиночной Fc посредством 7Sat громбми-отшеплнеыога линкера ФВ-036 Фрагмент D102DD3 (1-477 ак с CJ36A/CS7SA), связанный с одиночной Fc посредством 98вк тромбин-отщепляемого линкера Время (часы) Фигура 24: Пример лигирования сортазой i \ .-*;Г.Лу* | | - П'МЬк ги тй р;кгюnwiaiinm <;i> (•> )¦{ Ф\ III +¦ copi аза +сортаза Дополненный ФВ и ФУШ Фигура 24: Пример лигирования сортазой | Фрагмент ФН J I С.ЫиГ" Ф^Ш 1 JL + сортам Дополненный ФИ и ФУШ ф - сортата I гч/\гт~ Дололненный ФВ и ФУШ w о _ Сайг расщепления nporcamfi ) например, тромбином t - линкер перечеоной длины Фигура 25: Схематическое сравнение одноцепочечного Ф\/1НРс {OVUM 55) и частичного В-домена, содержащего одноцепочечный ФУШРс (ФУИ!198) (В-домен -226N6) I с оо hi ФУШ 155: Ре (одноцепочечный ФVI1 IFc) ФУШ 198:Fe (одноце! ючечный ФУ 111 Fc с 226N6) ОТЧЕТ О ПАТЕНТНОМ ПОИСКЕ (статья 15(3) ЕАПК и правило 42 Патентной инструкции к ЕАПК) Номер евразийской заявки: 201791134 Дата подачи: 12 января 2013 (12.01.2013) Дата испрашиваемого приоритета: 12 января 2012 (12.01.2012) 1азвание изобретения: Полипептиды химерного фактора VIII и их применение Заявитель: БАИОДЖЕН ЭМЭИ ИНК. | | Некоторые пункты формулы не подлежат поиску (см. раздел I дополнительного листа) ГП Единство изобретения не соблюдено (см. раздел II дополнительного листа) А. КЛАССИФИКАЦИЯ ПРЕДМЕТА ИЗОБРЕТЕНИЯ: Согласно международной патентной классификации (МПК) А61К38/37 (2006.01) С07К14/755 (2006.01) C12N15/63 (2006.01) Б. ОБЛАСТЬ ПОИСКА: Минимум просмотренной документации (система классификации и индексы МПК) А61К 38/37, С07К 14/755, C12N 15/63 Другая проверенная документация в той мере, в какой она включена в область поиска: В. ДОКУМЕНТЫ, СЧИТАЮЩИЕСЯ РЕЛЕВАНТНЫМИ Категория* Ссылки на документы с указанием, где это возможно, релевантных частей Относится к пункту Н" Y Y WO 2008/057683 А2 (NEOSE TECHNOLOGIES, INC. et al.) 15.05.2008, реферат, пп. 1, 12, 27, 32 формулы WO 2011/101284 Al (NOVO NORDISK et al.) 25.08.2011, c. 4, 5 WO 2011/060242 A2 (TALECRIS BIOTHERAPEUTICS, INC. et al.) 19.05.2011, реферат, формула, SEQ ID NO: 29, c. 8, фиг. 2 US 2008/0255040 Al (NEOSE TECHNOLOGIES, INC.) 16.10.2008, параграф [0034], SEQ ID NO: 255 US 2004/0235734 Al (MARY J. BOSSARD et al.) 25.11.2004, параграф [0066], SEQ ID NO: 2 WO 2009/156137 Al (CSL BEHRING GMBH et al.) 30.12.2009, формула, с. 10, 18,24-26 1-27 1-27 6-12, 14-27 последующие документы указаны в продолжении графы В [^jj данные о патентах-аналогах указаны в приложении Особые категории ссылочных документов: "А" документ, определяющий общий уровень техники "Е" более ранний документ, но опубликованный на дату подачи евразийской заявки или после нее О" документ, относящийся к устному раскрытию, экспонированию и т.д. Р" документ, опубликованный до даты подачи евразийской заявки, но после даты испрашиваемого приоритета "D" документ, приведенный в евразийской заявке "T" более поздний документ, опубликованный после даты приоритета и приведенный для понимания изобретения "X" документ, имеющий наиболее близкое отношение к предмету поиска, порочащий новизну или изобретательский уровень, взятый в отдельности "Y" документ, имеющий наиболее близкое отно поиска, порочащий изобретательский уровень в сочетании с другими документами той же категории " &" документ, являющийся патентом-аналогом "L" документ, приведенный в других целях Дата действительного завершения патентного поиска: 18 сентября 2017(18.09.2017) Наименование и адрес Международного поискового органа: Федеральный институт промышленной собственности > Ф, 125993,Москва, Г-59, ГСП-3, Бережковская наб., 30-1 Факс: 243-3337, телетайп: 114818 ПОДАЧА Уполномоченное лицо : Телефон № (495) 531-6481 О. Макарова К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 (19) К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 (19) К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 (19) К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 107 108 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 Ill Ill К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 159 158 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 161 161 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 163 162 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 165 165 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 169 170 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 172 172 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 175 174 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 177 177 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 179 178 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 182 182 183 183 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 192 192 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 192 192 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 К заявке, выделенной из заявки № 201491186 <210> 56 <210> 56 <210> 56 <210> 56 <210> 56 <210> 56 <220> <220> К заявке №201791134 К заявке №201791134 .13 .13 .13 .13 .13 .13 .13 .13
|