[RU]

В настоящем изобретении предлагаются полипептиды и рекомбинантные молекулы ДНК, полезные для придания устойчивости к гербицидам на основе АОФП, гербицидам на основе феноксикислот и гербицидам на основе пиридинилоксикислот, и также устойчивые к гербицидам трансгенные растения, семена, клетки и части растений, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, а также способы их применения.

(57) Реферат / Формула:

В настоящем изобретении предлагаются полипептиды и рекомбинантные молекулы ДНК, полезные для придания устойчивости к гербицидам на основе АОФП, гербицидам на основе феноксикислот и гербицидам на основе пиридинилоксикислот, и также устойчивые к гербицидам трансгенные растения, семена, клетки и части растений, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, а также способы их применения.

---

Евразийское (21) 201790841 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A01H5/00 (2006.01)
2017.08.31 C12N15/82 (2006.01)
C07K14/195 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2015.09.30
(54) ГЕНЫ УСТОЙЧИВОСТИ К ГЕРБИЦИДАМ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
(31) 62/064,343
(32) 2014.10.15
(33) US
(86) PCT/US2015/053123
(87) WO 2016/060843 2016.04.21
(71) Заявитель:
МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖИ ЛЛС
(US)
(72) Изобретатель:
Эллис Кристин М., Евдокимов Артем Дж., Фэн Пол К.К., Фу Сяожань, Лару Клейтон Т., Наджеотт Джеффри Р., Рид Эндрю К., Ши Лэй, Уоллекотт Эндрю М. (US)
(57) В настоящем изобретении предлагаются полипептиды и рекомбинантные молекулы ДНК, полезные для придания устойчивости к гербицидам на основе АОФП, гербицидам на основе фенок-сикислот и гербицидам на основе пиридинилокси-кислот, и также устойчивые к гербицидам трансгенные растения, семена, клетки и части растений, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, а также способы их применения.
(74)
Представитель: Медведев В.Н. (RU)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-541492ЕА/061 ГЕНЫ УСТОЙЧИВОСТИ К ГЕРБИЦИДАМ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США №62/064343, поданной 15 октября 2014 года, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Перечень последовательностей, который содержится в файле под названием "MONS378WO_ST25", который имеет размер 118,364 байт (измерено в MS-WINDOWS) и который был создан 25 сентября 2015 года, подается в данном документе в электронной форме и включен в данный документ посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область изобретения
[0003] Настоящее изобретение в целом относится к области биотехнологии. Более конкретно, изобретение относится к рекомбинантным молекулам ДНК, кодирующим ферменты, которые вызывают разрушение гербицидов. Изобретение также относится к трансгенным растениям, частям, семенам, клеткам и частям растений, содержащим рекомбинантные молекулы ДНК, а также способам их применения.
Описание уровня техники
[0004] В производстве сельскохозяйственных культур часто используется трансгенные признаки, созданные с помощью способов биотехнологии. Гетерологичный ген, также известный как трансген, вводится в растение для получения трансгенного признака. Экспрессия трансгена в растении дает желаемый признак, такой как устойчивость к гербициду, по всему растению. Примеры трансгенных признаков устойчивости к гербицидам включают устойчивость к глифосату, устойчивость к глюфосинату, и устойчивость к дикамба. С увеличением количества видов сорняков, резистентных к наиболее часто применяемым гербицидам, в поле необходимы новые признаки устойчивости к гербицидам. Гербициды, представляющие особый
интерес, являют собой гербициды на основе
арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербициды на основе феноксикислот и гербициды на основе пиридинилоксикислот. Гербициды на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербициды на основе феноксикислот и гербициды на основе пиридинилоксикислот обеспечивают контроль над спектром устойчивых к глифосату сорняков, тем самым делая признак, придающий устойчивость к этим гербицидам, особенно полезным в системе растениеводства в сочетании с другим признаком(-ами) устойчивости к гербициду(-дам).
[0005] Штамм МН Sphingobium herbicidovorans, выделенный из образца грунта, разрушающего дихлоропроп, был идентифицирован как способный расщеплять эфирные связи различных фиеноксиалкановых кислот и гербицидов, используя их в качестве единственного источника углерода и энергии для роста (НРЕ Kohler, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology
(1999) 23:336-340). Катаболизм гербицидов осуществляют две
различные энантиоселективные альфа-кетоглутаратзависимые
диоксигеназы, RdpA (R-дихлорпропдиоксигеназа) и SdpA (S-дихлорпропдиоксигеназа) . (A Westendorf, et al., Microbiological Research (2002) 157:317-322; Westendorf, et al., Acta Biotechnologica (2003) 23(1):3-17). RdpA был изолирован из Sphingobium herbicidovorans (номер доступа ГенБанка AF516752
(ДНК) и ААМ90965 (белок)) и Delftia acidovorans (номер доступа ГенБанка NG_036924 (ДНК) и YP_009083283 (белок)) (ТА Mueller, et al. , Applied and Environmental Microbiology (2004) 70 (10) :6066-6075.) Чтобы придать культурам устойчивость к гербицидам для трансформации растений были использованы гены RdpA и SdpA (TR Wright, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, (2010) 107(47) :20240-5) . Повышение активности фермента RdpA с применением технологий белковой инженерии с целью создания белка для использования в трансгенных растениях, позволило бы повысить нормы применения гербицидов, таким образом улучшив безопасность трансгенных культур и меры борьбы с сорняками. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] В изобретении предложен полипептид, который имеет по меньшей мере около 92% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52. В одном варианте реализации изобретения, полипептид имеет оксигеназную активность против по меньшей мере одного гербицида, выбранного из группы, состоящей из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП) , гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
[0007] В изобретении предложена рекомбинантная молекула
ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую
полипептид, который имеет по меньшей мере около 92% идентичности
последовательности с аминокислотной последовательностью,
выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14,
18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, и 46-52. В одном варианте
реализации изобретения, рекомбинантная молекула ДНК содержит
нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей
из SEQ ID N0:2, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44,
45, и 53-59. В другом варианте реализации изобретения,
рекомбинантная молекула ДНК кодирует полипептид с оксигеназной
активностью против по меньшей мере одного гербицида, выбранного
из группы, состоящей из гербицидов на основе
арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе
феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот. В
другом варианте реализации изобретения, рекомбинантная молекула
ДНК функционально связанна с гетерологичным промотором, который
функционирует в растительной клетке. В другом варианте
реализации изобретения, рекомбинантная молекула ДНК
функционально связана с молекулой ДНК, кодирующей транзитный пептид хлоропласта, функция которого заключается в локализации функционально связанного полипептида внутри клетки.
[0008] В изобретении предложена ДНК-конструкция, содержащая гетерологичный промотор, который функционирует в растительной клетке и функционально связан с рекомбинантной молекулой ДНК, кодирующей полипептид, который имеет по меньшей мере около 92%
идентичности последовательности с аминокислотной
последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, и 4652. В одном варианте реализации изобретения, рекомбинантная молекула ДНК функционально связана с молекулой ДНК, кодирующей транзитный пептид хлоропласта, функция которого заключается в локализации функционально связанного полипептида внутри клетки. В другом варианте реализации изобретения, рекомбинантная молекула ДНК кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, и 4652, и экспрессия полипептида в трансгенном растении придает растению устойчивость к гербицидам. В другом варианте реализации изобретения, ДНК-конструкция присутствуют в геноме трансгенного растения.
[0009] В изобретении предложено трансгенное растение, семя, клетка, или часть растения, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который имеет по меньшей мере около 92% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, и 46-52. В одном варианте реализации изобретения, трансгенное растение, семя, клетка или часть растения содержит трансгенный признак устойчивости к по меньшей мере одному гербициду, выбранному из группы, состоящей из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот. В другом варианте реализации изобретения, трансгенное растение, семя, клетка или часть растения содержит ДНК-конструкцию согласно данному изобретению. В другом варианте реализации изобретения, трансгенное растение, семя, клетка или часть растения содержит полипептид согласно данному изобретению.
[0010] В изобретении предложен способ придания растению, семени, клетке, или части растения устойчивости к гербицидам, включающий экспрессию полипептида согласного изобретению в растении, семени, клетке или части растения. В одном варианте
реализации изобретения, способ придания устойчивости к гербицидам применяется к трансгенному растению, семени, клетке или части растения, что содержат трансгенный признак, содержащие рекомбинантную молекулу ДНК согласно изобретению. В одном варианте реализации изобретения, способ придания устойчивости к гербицидам применяется с гербицидом, выбранным из группы, состоящей из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
[ООН] В изобретении предложен способ трансформации
растения, включающий введение ДНК-конструкции согласно
изобретению в растительную клетку и регенерацию из нее растения,
которое содержит ДНК-конструкцию и которое устойчиво к по
меньшей мере одному гербициду, выбранному из группы, состоящей
из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП),
гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе
пиридинилоксикислот. В одном варианте реализации изобретения,
способ трансформации растения включает скрещивание
регенерированного растения с самим собой или со вторым растением, и сбор семян гибрида.
[0012] В изобретении предложен способ контроля сорняков в области произрастания растений путем воздействия на область произрастания растений, содержащую трансгенное растение или семя согласно изобретению, по меньшей мере одним гербицидом, выбранным из группы, состоящей из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот, при этом трансгенное растение или семя устойчиво к гербициду.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0013] Фиг. 1. Контрольные и MON-HT55 (SEQ ID N0:11) трансгенные растения кукурузы после обработки квизалофопом-П. На Фиг. 1А проиллюстрированы контрольные и трансгенные растения кукурузы, которые либо необработанны, либо обработанны IX квизалофопом-П (0,08 фунта д.в./акр). На Фиг. 1Б проиллюстрированы гибридные контрольные растения кукурузы Fl, а на Фиг. 1В проиллюстрированы гибридные трансгенные растения
кукурузы MON-HT55 Fl. Растения выращивали при дневных/ночных температурах равных (1) 20 °С/20 °С, (2) 28 °С/20 °С, или (3) 38 °С/3 0 °С перед опрыскиванием 2Х квизалофопом-П.
[0014] Фиг. 2. Графики, показывающие зависимость активности сконструированных белков от температуры. На Фиг. 2А проиллюстрирована активность фермента RdpA MON-HT55 (SEQ ID NO: 11) и фермента RdpA дикого типа при тестировании с применением квизалофопа-П в качестве субстрата. На Фиг. 2Б проиллюстрирована активность RdpA MON-HT1 (SEQ ID NO: 14), MON-HT2 (SEQ ID NO: 18), MON-HT7 (SEQ ID NO: 34), MON-HT8 (SEQ ID NO: 37) и RdpA дикого типа при тестировании с применением квизалофопа-П в качестве субстрата. На Фиг. 2В проиллюстрирована активность RdpA MON-HT1, MON-HT2, MON-HT7, MON-HT8 и RdpA дикого типа при тестировании с применением 2,4-D в качестве субстрата. Данные нормированы к активности каждого белка при 2 5°С.
[0015] Фиг. 3. Белковая последовательность RdpA дикого типа (SEQ ID N0:60) с иллюстративными положениями аминокислот, пригодными для белковой инженерии, которые обозначены квадратами.
[0016] Фиг.4. Средняя оценка травматизма после применения 2Х квизалофопа-П (0,16 фунта д.в./акр) (4А, 4Б и 4В) или 4Х 2,4-D (4 фунта д.в./акр) (4Г и 4Д) к F1 гибридным растениям кукурузы (инбредные гомозиготные R1 экспрессирующие MON-HT х MON89034), экспрессирующим MON-HT55 (SEQ ID N0:11), MON-HT1 (SEQ ID N0:14), M0N-HT2 (SEQ ID N0:18), M0N-HT3 N0:22), M0N-HT4 (SEQ ID N0:25), M0N-HT7 (SEQ ID N0:34) или к Fl гибридному контролю (NK603 x MON8 9034). Данные полученные на растениях, адаптированных к дневным и ночным температурам, установленным на уровне 2 0 °С (20 °С/20 °С) перед нанесением 2Х квизалофопа-П (Фиг. 4А) или 4Х 2,4-D (Фиг.4Г); на Фиг. 4Б проиллюстрированы данные, полученные на растениях, адаптированных при дневной температуре 2 8 °С и ночной
температуре 20 С (28 ° С/20 °С) перед нанесением 2Х квизалофопа-П; на Фиг. 4В проиллюстрированы данные, полученные на растениях, акклиматизированных при дневной температуре 3 8 °С и ночной
температуре 30 °С (38 °С/30 °С) перед нанесением 2Х квизалофопа-П (Фиг. 4В) или 4Х 2,4-D (Фиг. 4Д).
[0017] Фиг. 5. 5А и 5Б: Контрольные и трансгенные растения кукурузы, содержащие M0N-HT2 (SEQ ID N0:20, кодирующая SEQ ID N0:18), с ТПХ или без ТПХ, где растения получали квизалофоп-П в 16Х нормах (1,28 фунта д.в./акр), примененных на V2, после чего следовало применение на V4, и фотографии, сделанные через 10-14 дней после применения квизалофопа-П.
[0018] Фиг. 6А - Фиг. 6Д. Множественное выравнивание белковых последовательностей для RdpA дикого типа из S.herbicidovorans (SEQ ID N0:60) и SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52 с консенсусной последовательностью (представленной в виде SEQ ID N0:61), представленной в нижней части каждой из Фиг. 6А, 6Б, 6В, 6Г, 6Д.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0019] SEQ ID N0:1-3 представляют собой последовательности M0N-HT51: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
[0020] SEQ ID N0:4-6 представляют собой последовательности MON-HT52: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
[0021] SEQ ID N0:7-8 представляют собой последовательности MON-HT53: аминокислотную последовательность и полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами.
[0022] SEQ ID N0:9-10 представляют собой последовательности MON-HT54: аминокислотную последовательность и полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами.
[0023] SEQ ID N0:11-13 представляют собой
последовательности MON-HT55: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
[0024] SEQ ID N0:14-17 представляют собой
последовательности M0N-HT1: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами двудольных.
[0025] SEQ ID N0:18-21 представляют собой
последовательности M0N-HT2: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами двудольных.
[0026] SEQ ID N0:22-24 представляют собой
последовательности M0N-HT3: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
[0027] SEQ ID N0:25-27 представляют собой
последовательности M0N-HT4: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
[0028] SEQ ID N0:28-30 представляют собой
последовательности M0N-HT5: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
[0029] SEQ ID N0:31-33 представляют собой
последовательности M0N-HT6: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
[0030] SEQ ID N0:34-36 представляют собой
последовательности M0N-HT7: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
[0031] SEQ ID N0:37-39 представляют собой
последовательности M0N-HT8: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
[0032] SEQ ID N0:40-42 представляют собой
последовательности M0N-HT9: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
[0033] SEQ ID N0:43-45 представляют собой
последовательности MON-HT10: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
[0034] SEQ ID N0:4 6-52 представляют собой аминокислотные последовательности M0N-HT11, M0N-HT13, M0N-HT14, M0N-HT15, M0N-НТ16, M0N-HT17 и M0N-HT18.
[0035] SEQ ID N0:53-59 представляют собой полинуклеотидные последовательности M0N-HT11, M0N-HT13, M0N-HT14, M0N-HT15, MON-HT 16, MON-HT17 и MON-HT18 с оптимизированным кодонами двудольных.
[0036] SEQ ID N0:60 представляет собой аминокислотную последовательность для RdpA дикого типа из Sphingobium herbicidovorans.
[0037] SEQ ID N0:61 представляет собой консенсусную последовательность Фиг. 6А - Фиг. 6Д.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0038] Следующие определения и способы предложены для того, чтобы лучше определить настоящее изобретение и направить среднего специалиста в данной области техники в практическом подходе по настоящему изобретению. Если не указано иное, термины следует понимать в соответствии с обычным применением средними специалистами в данной области техники.
[0039] Изобретение устраняет ограничения предшествующего уровня техники путем предоставления новых, сконструированных
белков, называемых в данном документе белками MON-HT, и
рекомбинантных молекул ДНК, которые их кодируют, а также
композиций и способов их применения. Белки MON-HT представляют
собой оксигеназы, которые могут инактивировать гербициды на
основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербициды на основе
феноксикислот и гербициды на основе пиридинилоксикислот.
Применяемый в данном документе термин "инактивация гербицида"
означает, что гербицид больше не обладает гербицидной
активностью против растения. Белки MON-HT проявляют новую
субстратную селективность, полезную ферментативную кинетику и
большую стабильность фермента при повышенной температуре.
Трансгенные растения, экспрессирующие белок MON-HT,
демонстрируют более высокую устойчивость к воздействию гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
Сконструированные белки и рекомбинантные молекулы ДНК
[0040] В изобретении предложены новые, сконструированные
белки и рекомбинантные молекулы ДНК, которые их кодируют.
Применяемый в данном документе термин "сконструированный"
относится к искусственным ДНК, белку или организму, которые
обычно не встречаются в природе и которые были созданы путем
человеческого вмешательства. "Сконструированный белок"
представляет собой белок, полипептидная последовательность которого была задумана и создана в лаборатории с применением одного или нескольких методов белковой инженерии, таких как дизайн белка с использованием сайт-направленного мутагенеза и направленной эволюции с применением случайного мутагенеза и перетасовки ДНК. Например, сконструированный белок может иметь одну или более делеций, вставок или замещений относительно кодирующей последовательности белка дикого типа, и каждая делеция, инсерция или замена может состоять из одной или более аминокислот. Примеры сконструированных белков представлены в данном документе как SEQ ID N0: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52.
[0041] Сконструированные белки, предложенные в настоящем изобретении, представляют собой ферменты, которые обладают оксигеназной активностью. Как применяется в данном документе, термин "оксигеназная активность" означает способность окислять субстрат путем переноса оксигена из молекулярного кислорода на субстрат, побочный продукт или промежуточный продукт. Оксигеназная активность сконструированных белков, предложенных в изобретении, может инактивировать один или более из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
[0042] Как применяется в настоящем документе, термин "дикий тип" означает естественно встречающийся. Как применяется в настоящем документе, "молекула ДНК дикого типа", "полипептид дикого типа" или "белок дикого типа" представляет собой естественно встречающуюся молекулу ДНК, полипептид или белок, то есть молекулу ДНК, полипептид или белок, ранее существовавший в природе. Вариант полипептида, белка или молекулы ДНК дикого типа может быть полезным для сравнения с сконструированным белком или геном. Примером белка дикого типа, пригодного для сравнения с сконструированными белками, предложенными в настоящем изобретении, является фермент RdpA из штамма МН Sphingobium herbicidovorans. Примером молекулы ДНК дикого типа, пригодной для сравнения с рекомбинантными молекулами ДНК, предложенными в настоящем изобретением, является ген RdpA из штамма МН Sphingobium herbicidovorans. Вариант белка или молекулы ДНК дикого типа может быть полезным в качестве контроля в эксперименте.
[0043] Как применяется в данном документе, термин
"контроль" означает экспериментальный контроль, предназначенный
для целей сравнения. Например, контрольное растение в анализе
трансгенных растений представляет собой растение того же типа,
что и экспериментальное растение (тестируемое растение), но не
содержит трансгенной вставки, рекомбинантной молекулы ДНК или
ДНК-конструкции экспериментального растения. Примером
контрольного растения, пригодного для сравнения с трансгенными растениями кукурузы, является нетрансгенная кукуруза LH2 4 4
(патент США № 6252148), и с трансгенными растениями сои является нетрансгенная соя А3555 (патент США № 7700846).
[0044] Как применяется в настоящем документе, термин "рекомбинантный" относится к искусственным ДНК, полипептиду или белку, который(-ая) является результатом генной инженерии и как таковой(-ая) обычно не встречается в природе, и который(-ая) был создан в результате вмешательства человека. "Рекомбинантная молекула ДНК" представляет собой молекулу ДНК, содержащую последовательность ДНК, которая не встречается в естественной среде, и как таковая является результатом вмешательства человека, например, молекула ДНК, которая кодирует сконструированный белок. Другим примером является молекула ДНК, состоящая из комбинации, по меньшей мере двух молекул ДНК, гетерологичных друг другу, таких как кодирующая белок молекула ДНК и функционально связанный гетерологичный промотор. Примером рекомбинантной молекулы ДНК является молекула ДНК, содержащая по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID N0:2, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45 и 53-59. "Рекомбинантный полипептид" или "рекомбинантный белок" представляет собой полипептид или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая не встречается в естественной среде, и как таковая является результатом вмешательства человека, например, сконструированный белок.
[0045] Термин "трансген" относится к молекуле ДНК, искусственно встраиваемой в геном организма в результате вмешательства человека, например, способами трансформации растений. Как применяется в настоящем документе, термин "трансгенный" означает содержащий трансген, например, "трансгенное растение" относится к растению, содержащему трансген в его геноме, а "трансгенный признак" относится к характеристике или фенотипу, который(-ая) передается или обеспечивается наличием трансгена, что встроен в геном растения. В результате такого геномного изменения трансгенное растение является чем-то, сильно отличающимся от родственного растения дикого типа, а трансгенный признак является признаком, не
встречающимся в естественной среде в растении дикого типа. Трансгенные растения, согласно данному изобретению, содержат рекомбинантную молекулу ДНК и сконструированные белки, предложенные в изобретении.
[004 6] Как применяется в настоящем документе, термин "гетерологичный" относится к взаимосвязи между двумя или более вещами, которые получены из разных источников и, таким образом, обычно не связанны в природе. Например, белок-кодирующая рекомбинантная молекула ДНК является гетерологичной по отношению к функционально связанному промотору, если такая комбинация обычно не встречается в природе. Кроме того, конкретная рекомбинантная молекула ДНК может быть гетерологичной по отношению к клетке или организму, в который она вставлена, когда она не будет встречаться в естественной среде в этой конкретной клетке или организме.
[0047] Как применяется в настоящем документе, термин
"молекула ДНК, кодирующая белок" или "молекула ДНК, кодирующая
полипептид" относится к молекуле ДНК, содержащей нуклеотидную
последовательность, которая кодирует белок или полипептид.
"Белок-кодирующая последовательность" или "полипептид-кодирующая
последовательность" означает последовательность ДНК, которая
кодирует белок или полипептид. "Последовательность" означает
последовательное расположение нуклеотидов или аминокислот.
Границы белок-кодирующей последовательности или полипептид-
кодирующей последовательности обычно определяются стартовым
кодоном трансляции на 5'-конце и стоп-кодоном трансляции на 3'-
конце. Белок-кодирующая молекула или полипептид-кодирующая
молекула может содержать последовательность ДНК, кодирующую
белковую или полипептидную последовательность. Как применяется в
настоящем документе, термин "экспрессия трансгена",
"экспрессирование трансгена", "экспрессия белка", "экспрессия полипептида", "экспрессирование белка" и "экспрессирование полипептида" означает продуцирование белка или полипептида в процессе транскрипции молекулы ДНК в матричную РНК (мРНК) и трансляции мРНК в полипептидные цепи, которые могут быть в конечном счете свернуты в белки. Белок-кодирующая молекула ДНК
или полипептид-кодирующая молекула ДНК, может быть функционально связана с гетерологичным промотором в ДНК-конструкции, для применения в экспрессии белка или полипептида в клетке, трансформированной рекомбинантной молекулой ДНК. Как применяется в настоящем документе, термин "функционально связанный" означает две молекулы ДНК, связанные таким образом, что одна молекула может влиять на функцию другой. Функционально-связанные молекулы ДНК могут быть частью одной непрерывной молекулы и могут быть или не быть смежными. Например, промотор функционально связан с белок-кодирующей молекулой ДНК или полипептид-кодирующей молекулой ДНК в ДНК-конструкции, где две молекулы ДНК расположены таким образом, что промотор может влиять на экспрессию трансгена.
[0048] Как применяется в настоящем документе, "ДНК-
конструкция" представляет собой рекомбинантную молекулу ДНК,
содержащую две или более гетерологичных последовательности ДНК.
Конструкции ДНК полезны для экспрессии трансгена и могут быть
включены в векторы и плазмиды. Конструкции ДНК могут быть
применены в векторах с целью трансформации, что представляет
собой введение гетерологичной ДНК в клетку-хозяина для получения
трансгенных растений и клеток, и как таковые могут также
содержаться в пластидной ДНК или геномной ДНК трансгенных
растения, семени, клетки или части растения. Как применяется в
настоящем документе, термин "вектор" означает любую
рекомбинантную молекулу ДНК, которая может быть применена для
трансформации растения. Рекомбинантные молекулы ДНК, как указано
в перечне последовательностей, могут быть, например, вставлены в
вектор как часть конструкции, имеющей рекомбинантную молекулу
ДНК, функционально связанную с промотором, который функционирует
в растении для управления экспрессией сконструированного белка,
кодируемого рекомбинантной молекулой ДНК. Способы
конструирования ДНК-конструкций и векторов хорошо известны в данной области техники. Компоненты ДНК-конструкции или вектора, содержащего ДНК-конструкцию, обычно включают, но не ограничиваются ими, одно или несколько из следующих: подходящий промотор для экспрессии функционально связанной ДНК,
функционально связанную белок-кодирующую молекулу ДНК и 3'-
нетранслируемый участок (З'-UTR). Промоторы, пригодные для
осуществления настоящего изобретения, включают промоторы,
которые функционируют в растении для экспрессии функционально
связанного полинуклеотида. Такие промоторы разнообразны и хорошо
известны в данной области, и включают те, которые являются
индуцибельными, вирусными, синтетическими, конститутивными,
временно регулируемыми, пространственно-регулируемыми и/или
пространственно-временно регулируемыми. Дополнительные
необязательные компоненты включают, но не ограничиваются ими, один или несколько следующих элементов: 5'-UTR, энхансер, лидер, цис-действующий элемент, интрон, транзитные пептиды хлоропласта (ТПХ) и один или несколько маркерных трансгенов для селекции.
[004 9] ДНК-конструкции согласно данному изобретению могут содержать молекулу ТПХ, функционально связанную с белок-кодирующими молекулами ДНК, предложенными в данном изобретении. ТПХ, пригодный для осуществления настоящего изобретения, включает тот, функционирование которого способствует локализации сконструированной белковой молекулы внутри клетки. Способствуя локализации белка внутри клетки, ТПХ может увеличить накопление сконструированного белка, защитить его от протеолитической деградации, повысить уровень устойчивости к гербицидам и тем самым снизить степень повреждений после применения гербицидов. Молекулы ТПХ для применения в настоящем изобретении известны в данной области техники и включают, но не ограничиваются ими: Arabidopsis thaliana EPSPS ТХП (Klee et al. , 1987), Petunia hybrida EPSPS ТПХ (della-Cioppa et al., 1986), сигнальную последовательность cab-m7 кукурузы (Becker et al. , 1992; PCT WO 97/41228) и сигнальную последовательность глутатионредуктазы гороха (Creissen et al., 1991; PCT WO 97/41228).
[0050] Рекомбинантные молекулы ДНК, согласно настоящему изобретению, могут быть синтезированы и модифицированы способами, известными в данной области техники, полностью или частично, особенно там, где желательно предоставить последовательности, пригодные для манипуляций с ДНК (такие как сайты узнавания рестриктаз или сайты клонирования на основе
рекомбинации), предпочтительные по отношению к растению последовательности (использование кодонов растений или консенсусных последовательностей Козак) или последовательности, пригодные для конструирования ДНК-конструкции (такие как спейсерные или линкерные последовательности). Данное изобретение включает рекомбинантные молекулы ДНК и сконструированные белки, имеющие по меньшей мере около 8 0% (процент) идентичности последовательности, около 85% идентичности последовательности, около 90% идентичности последовательности, около 91% идентичности последовательности, около 92% идентичности последовательности, около 93% идентичности последовательности, около 94% идентичности последовательности, около 95% идентичности последовательности, около 96% идентичность последовательности, около 97% идентичность последовательности, около 98% идентичность последовательности и около 99% идентичность последовательности с любой из рекомбинантных молекул ДНК или сконструированных белковых последовательностей, предложенных в настоящем документе, например, с рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID N0:2, 3, 5, б, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45 и 53-59. Как применяется в настоящем документе, термин "процент идентичности последовательности" или "% идентичности последовательности" относится к проценту идентичных нуклеотидов или аминокислот в эталонной ("запрос") линейной полинуклеотидной или полипептидной последовательности (или ее комплементарной цепи) по сравнению с тестовой ("субъект") последовательностью (или ее комплементарной цепью), когда две последовательности оптимально выровнены (с соответствующими нуклеотидными или аминокислотными вставками, делециями или пробелами, составляющими менее 2 0 процентов эталонной последовательности в окне сравнения). Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения хорошо известно специалистам в данной области техники и может быть выполнено с помощью таких инструментов, как алгоритм локальной гомологии Смита и Уотермана, алгоритм выравнивания
гомологии Нидлмана и Вунша, способ поиска схожести Пирсона и Липмана, а также с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов, таких как GAP, BESTFIT, FASТА и TFASTA, которые доступны в составе пакета программного обеспечения Sequence Analysis GCG(r) Wisconsin Package(r) (Accelrys Inc., Сан-Диего, Калифорния), MEGAlign (DNAStar, Inc.,1228 S.Park St., Мэдисон, Висконсин 53715), и MUSCLE (версия 3.6) (RC Edgar, Nucleic Acids Research (2004) 32 (5) : 1792-1797) со стандартными параметрами. "Доля идентичности" для выровненных сегментов тестовой последовательности и эталонной последовательности представляет собой количество идентичных компонентов, которые являются общими для двух выровненных последовательностей, деленное на общее количество компонентов в сегменте эталонной последовательности, то есть всю эталонную последовательность или меньшую определенную часть эталонной последовательности. Процент идентичности последовательности представлен как доля идентичности, умноженная на 100. Сравнение одной или более последовательностей может производиться с полноразмерной последовательностью или ее частью, или более длинной последовательностью.
[0051] Сконструированные белки могут быть получены путем изменения (то есть модификации) белка дикого типа, чтобы продуцировать новый белок с новой комбинацией полезных белковых характеристик, таких как измененные Vmax, Km, субстратная специфичность, селективность по субстрату и стабильность белка. В белке, в определенных аминокислотных позициях, могут быть сделаны модификации, и может быть обнаружена аминокислотная замена на другую аминокислоту в этой позиции в природе (то есть в белке дикого типа). Иллюстративные аминокислотные позиции относительно последовательности белка RdpA дикого типа (SEQ ID N0:60), полезные для белковой инженерии, изображены на Фиг. 3. На Фиг. 6А, 6Б, 6В, 6Г, 6Д проиллюстрирвоано множественное выравнивание последовательности RdpA дикого типа и сконструированных белковых последовательностей SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52.
Сконструированный белок может быть сконструирован таким образом,
чтобы иметь по меньшей мере около 92% идентичности
последовательности с аминокислотной последовательностью,
выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14,
18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52, и содержать по
меньшей мере одну из этих аминокислотных мутаций. Таким образом,
сконструированные белки, предложенные в изобретении,
предусматривают новый белок с одной или несколькими измененными
белковыми характеристиками относительно белка дикого типа,
обнаруженного в природе. В одном варианте реализации
изобретения, сконструированный белок имеет измененные белковые
характеристики, такие как улучшенная или пониженная активность
по отношению к одному или нескольким гербицидам, или улучшенная
стабильность белка, по сравнению с аналогичным белком дикого
типа, или любую комбинацию таких характеристик. В одном варианте
реализации изобретения, в изобретении предложен
сконструированный белок и рекомбинантная молекула ДНК, которая кодирует этот белок, имеющий по меньшей мере около 8 0% идентичность последовательности, около 85% идентичности последовательности, около 90% идентичности последовательности, около 91% идентичности последовательности, около 92% идентичности последовательности, около 93% идентичности последовательности, около 94% идентичности последовательности, около 95% идентичности последовательности, около 96% идентичности последовательности, около 97% идентичности последовательности, около 98% идентичности последовательности и около 99% идентичности последовательности с любой сконструированной последовательностью белка, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, и 4 6-52. Аминокислотные мутации могут быть произведены в виде одиночной замены аминокислоты в белке или в сочетании с одной или несколькими другими мутациями, такими как одна или несколько других аминокислотных замен, делеций или вставок. Мутации могут быть произведены как описано здесь или любым другим способом, известным специалистам в данной области техники.
Трансгенные растения
[0052] Аспект изобретения включает трансгенные растительные клетки, трансгенные растительные ткани, трансгенные растения и трансгенные семена, которые содержат рекомбинантные молекулы ДНК и сконструированные белки, предложенные в изобретении. Эти клетки, ткани, растения и семена, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК и сконструированные белки, демонстрируют гербицидную устойчивость к одному или нескольким гербицидам на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП) , гербицидам на основе феноксикислот и гербицидам на основе пиридинилоксикислот.
[0053] Подходящие способы трансформации клеток растения-хозяина для применения с настоящим изобретением включают практически любой способ, с помощью которого ДНК может быть введена в клетку (например, когда конструкция рекомбинантной ДНК стабильно интегрируется в растительную хромосому) и который хорошо известен в данной области техники. Иллюстративным и широко применяемым способом введения рекомбинантной ДНК-конструкции в растения является агробактериальная система трансформации, которая хорошо известна специалистам в данной области техники. Трансгенные растения могут быть регенерированы из трансформированной растительной клетки с помощью способов растительной клеточной культуры. Трансгенное растение, гомозиготное по трансгену (т.е. имеет две аллельные копии трансгена), может быть получено путем самоопыления (самооплодотворение) трансгенного растения, которое содержит единственный аллель трансгена, например, путем самоопыления растение R0, для получения R1 семян. Одна четверть полученных R1 семян будет гомозиготной по трансгену. Растения, выращенные из прорастающих R1 семян, могут быть проверены на зиготность, как правило, с применением анализа SNP, секвенирования ДНК или анализа термической амплификации, который позволяет различать гетерозиготы и гомозиготы и называется анализом зиготности.
[0054] Растения, семена, части растений, растительные ткани и клетки, предложенные в изобретении, проявляют гербицидную устойчивость к одному или нескольким гербицидам на основе АОФП, гербицидам на основе феноксикислотным и гербицидам на основе
пиридинилоксильных кислот. Гербициды на основе АОФП воздействуют на ацетилкоэнзим А карбоксилазу растения (АККаза) , которая является частью биосинтетического пути жирных кислот. Травяные растения чувствительны к этим гербицидам, потому что они содержат гербицид-чувствительную АККазу в их пластидах и цитозоле. Гербициды на основе АОФП хорошо известны в данной области техники и коммерчески доступны. Примеры гербицидов на основе АОФП включают, но не ограничиваются ими: клодинафоп, цигалофоп, диклофоп, феноксапроп, феноксапроп-П, фентиапроп, флуазифоп, флуазифоп-П, галоксифоп, изоксапирифоп, метамифоп, пропаквизафоп, квизалофоп, квизалофоп-П и трифоп. Гербициды на основе феноксикислот и пиридинилоксикислот представляют собой синтетические ауксины, подобные растительному гормону индолуксусной кислоте (1УК). Широколиственные растения чувствительны к этим гербицидам, которые вызывают быстрый, неконтролируемый рост, в конечном счете убивая растение. Примеры гербицидов на основе феноксикислот включают, но не ограничиваются ими: 2,4-D; 2,4-DB; кломепроп; дихлорпроп; денопроп; MXФУ; МХФБ и мекопроп. Примеры гербицидов на основе пиридинилоксикислот включают, но не ограничиваются ими: триклопир; флуроксипир; аминопиралид, клопиралид и пиклорам.
[0055] Гербициды можно наносить на участок произрастания растений, содержащий растения и семена, предложенные в изобретении, в качестве способа борьбы с сорняками. Растения и семена, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат признак устойчивости к гербицидам и как таковые являются устойчивыми к применению одного или нескольких гербицидов на основе АОФП, или гербицидов на основе феноксикислот, или гербицидов на основе пиридинилоксиловых кислот. Может быть рекомендовано применение гербицида в коммерческой норме (IX), или в любой ее части, или в любой ее кратности, такой как в два разы больше чем рекомендуемая коммерческая норма (2Х) . Нормы гербицидов могут быть выражены в виде кислотного эквивалента на фунт на акр (фунт к.э./акр) или фунта действующего вещества на акр (фунта д.в./акр). Применение гербицида включает по меньшей мере один гербицид, выбранный из группы, состоящей из гербицидов на основе
АОФП и гербицидов на основе феноксикислот, и гербицидов на основе пиридинилоксикислот. Участок произрастания растений может содержать или не содержать сорняки во время применения гербицидов. Гербицидно-эффективная доза гербицидов на основе АОФП, применяемых в борьбе с сорняками, должна составлять от 0,01 фунта д.в./акр до 16 фунтов д.в./акр в течение вегетационного периода. Например, IX норма квизалофопа-П будет равна 0,08 фунта д.в./акр. Гербицидно-эффективная доза гербицидов на основе феноксикислот, применяемых в борьбе с сорняками, должна составлять от 0,01 фунта к.э./акр до 16 фунтов к.э./акр в течение вегетационного периода. Например, норма IX 2,4-D будет составлять примерно от 0,75 фунта к.э./акр до 1,0 фунта к.э./акр. Гербицидно-эффективная доза гербицидов на основе пиридинолоксикислот, применяемых в борьбе с сорняками, должна составлять от 0,01 фунта к.э./акр до 16 фунтов к.э./акр в течение вегетационного периода. Например, IX норма флуроксипира должна составлять от 0,13 до 0,48 фунта к.э./акр.
[0056] Применение гербицидов может быть последовательным или гербицид может быть смешан в цистерне с одним, двумя или комбинацией нескольких гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот, гербицидов на основе пиридинилоксикислот или любим другим совместимым гербицидом. Многократное применение одного гербицида, или двух или более гербицидов, в комбинации или отдельно, может быть использовано в течение вегетационного периода на участках, содержащих трансгенные растения согласно изобретению, для борьбы с широким спектром двудольных сорняков, однодольных сорняков или тех и тех, например, два применения (таких как применение перед посадкой растений и применение после появления всходов, или применение перед появлением всходов и применение после появления всходов), или три применения (такие как применения перед посадкой растений, применения перед появлением всходов и применение после появления всходов, или применение перед появлением всходов и два применения после появления всходов).
[0057] Как применяется в настоящем документе, "устойчивость" или "устойчивость к гербициду" означает
способность растения, семени, растительной ткани, части растения или клетки противостоять токсическому воздействию одного или нескольких гербицидов. Устойчивость к гербициду растения, семян, растительной ткани, части растения или клетки можно измерить, сравнивая растение, семена, растительную ткань, часть растения или клетку с подходящим контролем. Например, устойчивость к гербицидам может быть измерена или оценена путем применения гербицида к растению, содержащему рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую белок, способный придавать устойчивость к гербициду (тестируемое растение), и к растению, не содержащему рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую белок, способный придавать устойчивость к гербициду (контрольное растение), а затем сравнить повреждение двух растений, при этом на устойчивость к гербициду тестируемого растения указывает уменьшение количества повреждений по сравнению с количеством повреждений контрольного растения. Гербицидо-устойчивое растение, семя, растительная ткань, часть растения или клетка проявляет уменьшенный ответ на токсические эффекты гербицида по сравнению с контрольным растением, семенем, растительной тканью, частью растения или клеткой. Как применяется в настоящем документе, термин "признак устойчивости к гербициду" представляет собой трансгенный признак, придающий растению улучшенную устойчивость к гербициду по сравнению с растением дикого типа или контрольным растением.
[0058] Трансгенные растения, потомство, семена, растительные клетки и части растений согласно данному изобретению могут также содержать один или более дополнительных трансгенных признаков. Дополнительные трансгенные признаки могут быть внесены путем скрещивания растения, содержащего трансген, содержащий рекомбинантные молекулы ДНК, предложенные в изобретении, с другим растением, содержащим дополнительный трансгенный признак (признаки). Как применяется в данном документе, термин "скрещивание" означает размножение двух отдельных растений для получения потомства растений. Таким образом, два трансгенных растения могут быть скрещены для получения потомства, которое содержит трансгенные признаки. Как
применяется в настоящем документе, термин "потомство" означает
потомство любого поколения родительского растения, и трансгенное
потомство содержит ДНК-конструкцию, предложенную в данном
изобретении, унаследованную, по меньшей мере, от одного
родительского растения. В альтернативном варианте,
дополнительный трансгенный признак(-и) может быть введен путем
совместной трансформации ДНК-конструкции для этого
дополнительного трансгенного признака(-ов) с конструкцией ДНК,
содержащей рекомбинантные молекулы ДНК, предложенные в
изобретении (например, со всеми ДНК-конструкциями,
представленными как часть того же вектора, примененного для трансформации растений) или путем введения дополнительного признака (признаков) в трансгенное растение, содержащее ДНК-конструкцию, предложенную в изобретении, или наоборот (например, применяя любой из способов трансформации растений к трансгенному растению или растительной клетке). Такие дополнительные трансгенные признаки включают, но не ограничиваются ими: повышенную резистентность к насекомым, повышенную эффективность использования воды, повышенную урожайность, повышенную устойчивость к засухе, повышенное качество семян, улучшенные питательные качества, производство семян гибрида, и устойчивость к гербицидам, при этом признак измеряется относительно растения дикого типа или контрольного растения. Такие дополнительные трансгенные признаки известны специалистам в данной области техники; например, перечень таких признаков предоставляется Службой инспекции здоровья животных и растений (APHIS) Министерства сельского хозяйства США (USDA), и они могут быть найдены на их веб-сайте по адресу: www.aphis.usda.gov.
[0059] Трансгенные растения и потомство, которые содержат трансгенный признак, предложенный в данном изобретении, могут быть использованы с любыми способами скрещивания, которые широко известны в данной области техники. В линиях растений, содержащих два или более трансгенных признака, трансгенные признаки могут быть независимо сегрегирующими, сцепленными или комбинацией обоих в линиях растений, содержащих три или более трансгенных признака. Рассматривается также обратное скрещивание с
родительским растением и скрещивание с нетрансгенным растением, а также вегетативное размножение. Описания способов скрещивания, которые обычно применяются для различных признаков и культур, хорошо известны специалистам в данной области техники. Для подтверждения присутствия трансгена(-ов) в конкретном растении или семени может быть выполнено множество анализов. Такие анализы включают, например, молекулярно-биологические анализы, такие как Саузерн и Нозерн блотинги, ПЦР и секвенирование ДНК; биохимические анализы, такие как обнаружение присутствия белкового продукта, например, иммунологическими способами (ELISA и Вестерн-блоты) или с помощью ферментной функции; анализы части растения, такие как анализ листьев или корней; а также анализ фенотипа всего растения.
[0060] Интрогрессия трансгенного признака в генотип
растения достигается в результате процесса конверсии обратного
скрещивания. Растительный генотип, в который был
интрогрессирован трансгенный признак, можно назвать
преобразованным с помощью обратного скрещивания генотипом, линией, инбредом или гибридом. Подобным же образом генотип растения, лишенный желаемого трансгенного признака, может быть назван непреобразованным генотипом, линией, инбредом или гибридом.
[0061] Как применяется в настоящем документе, термин "содержащий" означает "включающий, но не ограничивающийся этим". ПРИМЕРЫ
[0062] Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов реализации изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что методы, раскрытые в следующих ниже примерах, представляют собой методы, обнаруженные изобретателями, которые хорошо функционируют при практической реализации изобретения, и поэтому могут рассматриваться как предпочтительные способы для его практической реализации. Однако, в контексте данного изобретения, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что в конкретных раскрытых вариантах реализации изобретения могут быть сделаны многие изменения, однако при этом
будет получен схожий или аналогичный результат, без отступления от концепции, сущности и объема изобретение. Более конкретно, будет очевидно, что некоторые вещества, которые являются как химически, так и физиологически родственными, могут быть заменены описанными здесь веществами с тем же или сходным результатом. Все подобные аналогичные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, считаются находящимися в пределах сущности, объема и концепции изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.
Пример 1: Первоначальное конструирование белков и анализ ферментов
[0063] Новые, сконструированные белки и рекомбинантные молекулы ДНК, кодирующие эти белки, были задуманы и созданы в лаборатории с применением технологий белковой инженерии. Сконструированные белки представляют собой ферменты, которые обладают оксигеназной активностью и сконструированы таким образом, чтобы они обладали измененными способностями к инактивации гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата АОФП, гербицидов на основе феноксикислот, или обоих по отношению к белку дикого типа.
[0064] Были отобраны шестнадцать известных белков с
оксигеназной активностью, и они были применены для создания
консенсусного выравнивания последовательностей гомологов. Это
было использовано в сочетании со структурно-ориентированными
анализами для формирования рациональных стратегий разработки. Из
этих анализов для мутагенеза были отобраны пять областей, каждая
длиной от 13 до 21 аминокислоты, называемые в данном документе
"островами". Мутации в каждом из этих регионов были созданы с
применением методов, известных специалистам в данной области
техники, таких как аланин-сканирующие мутирование;
гомологически-сканирующие мутирование; Pro/Gly сканирующие мутирование; обмен областями или мутирование; и комбинации этих различных методов (см., М Lehmann and М Wyss, Current Opinion in Biotechnology (2001) 12 (4) :371-375; В Van den Burg and VGH Eijsink, Current Opinion in Biotechnology (2002) 13(4):333-337; и Weiss et al. , Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97(16) :8950
8954). Применяя эти способы, было получено более 1200 уникальных сконструированных белков и рекомбинантных молекул ДНК, которые их кодируют, для дальнейшего анализа и характеристики. Из-за большого количества сконструированных белков, полученных для тестирования, и необходимости тестирования и сравнения ферментативной активности каждого белка, были разработаны высокопроизводительные бактериальная экспрессия белка и система анализа ферментов для быстрого анализа с использованием неочищенных бактериальных экстрактов.
[0065] Экспрессия бактериального белка с высокой производительностью была достигнута путем синтеза рекомбинантной молекулы ДНК, кодирующей каждый сконструированный белок, и ее клонирования в бактериальный вектор экспрессии с С-концевой гистидиновой меткой (His-меткой) , функционально связанной с рекомбинантной молекулой ДНК. Векторы применяли для трансформации Escherichia coli (Е. coli) и индуцировали бактериальную экспрессию сконструированных белков. Ночные культуры Е. coli выращивали в 9б-луночных планшетах, и культуры центрифугировали для осаждения бактерий. Бактериальный осадок лизировали добавлением 100 мкл лизирующей смеси (10 мл реагента для экстракции бактериальных белков (B-PER(r)) II (Pierce Biotechnology, Rockford, IL;78260); 10 мкл лизоцима (10 мкг/мл конечная концентрация; Lysozyme American Bioanalytical, Натик, Массачусетс; каталожный номер АВ011780-00005) ; и 40 мкл Benzonase(r) Nuclease (100 единиц/мл конечная концентрация, Novagen, Дармштадт, Германия; каталожный номер 71206-3)) в каждую лунку. Планшеты встряхивали, затем инкубировали в течение 3 0 мин при 4 °С. 4 00 мкл буфера MOPS (рН 6,57) добавляли в каждую лунку и дебрис осаждали центрифугированием. Супернатант лизата осторожно удаляли и применяли в качестве неочищенного бактериального экстракта для последующего ферментативного анализа.
[0066] Высокопроизводительный анализ ферментативного разложения гербицида(-ов) был разработан для анализа ферментативной активности сконструированных белков по отношению
к различным гербицидам с применением неочищенного бактериального экстракта. Оксигеназную активность сконструированного белка (то есть его ферментативную активность) измеряли с помощью колориметрического анализа конечной точки, применяя детектирование фенольных продуктов путем измерения оптического поглощения при 510 нм 4-аминоантипирина и феррицианида калия. Этот анализ был основан на анализе, описанном в Fukomori and Hausinger, Journal of Biological Chemistry (1993) 268 (32) : 2431124317. Ферментативные реакции анализировали в 9б-луночных планшетах с общим объемом 150 мкл, которые содержали: 20 мМ MOPS рН 6,75, 50-200 мкМ NH4FeS04, 50-200 мкМ аскорбата натрия, 1 мМ альфа-кетоглутарата (aKG), 10 мкл клеточного лизата Е. coli, содержащего экспрессированный сконструированный белок, и субстрат (либо гербицид на основе АОФП, или гербицид на основе феноксикислоты). После инициирования реакции с субстратом планшет инкубировали при различных температурах в течение различных периодов времени и "гасили" (останавливали) добавлением EDTA до конечной концентрации 6,2 5 мМ или добавлением 15 мкл буфера с рН 10 (50 мМ борной кислоты, 50 мМ КС1) с последующим добавлением 15 мкл 0,2% 4-аминоантипирина и 15 мкл 0,8% феррицианида калия. Измерения абсорбции проводили на стандартном лабораторном спектрометре. Анализы масштабировали по мере необходимости для увеличения производительности. Стандартные кривые были получены с применением очищенного белка или стандартов продукта.
[0067] Применяя эту высокопроизводительную систему бактериальной экспрессии белка и ферментативного анализа, была измерена активность приблизительно 1200 сконструированных белков относительно активности выбранного белка дикого типа, RdpA. В анализе с применением 9б-луночных планшетов, было 3 контроля (неочищенный бактериальный экстракт без сконструированного белка) и 3 положительных контроля (неочищенный бактериальный экстракт с белком дикого типа). Измеряли поглощение лунок и рассчитывали активность белка с применением следующей формулы:
? Абсорбция^ - Абсорбция^шг j
Активность^ = | 1x100
_у Абсорбцин^т - Абсорбцня^т )
где Активность^ - активность образца, Абсорбция± - поглощение образца, Абсорбцияит - поглощение ячеек, содержащих экстракт из Е. coli, экспрессирующих фермент дикого типа, и АбсорбциярЕТ представляет собой поглощение ячеек, содержащих экстракт из Е. coli без сконструированного белка. Активность для каждого уникального сконструированного белка измерена в двух повторениях и приводится как среднее из двух измерений.
[0068] Основываясь на результатах высокопроизводительной
системы ферментативного анализа, было отобрано около 545
уникальных сконструированных белков для дальнейшего анализа с
применением очищенного сконструированного белка. В
предварительном анализе сконструированного очищенного белка, неочищенные бактериальные экспрессирующие лизаты готовили с применением QUIAGEN(r) Ni-NTA Agarose (Qiagen, Валенсия, Калифорния, каталожный номер 30230), следуя протоколу производителя.
[0069] Очищенные сконструированные белки анализировали с применением анализа ферментативной деградации гербицидов, описанного в этом Примере 1, используя в качестве субстрата квизалофопа - гербицид на основе АОФП. Результаты анализа очищенных сконструированных белков в значительной степени подтвердили результаты высокопроизводительного ферментативного анализа. Результаты анализа для семи из около 545 сконструированных белков приведены в Таблице 1, при этом ферментативная активность выражается как активность образца относительно активности фермента RdpA дикого типа (рассчитанная, как описано в данном Примере 1) . Данные этих анализов предоставили удивительный результат, заключающийся в том, что комбинации специфических мутаций проявляли себя значительно лучше, чем другие варианты, и показали, что ферментативная активность сконструированных белков может быть значительно изменена.
[0070] Применяя информацию, полученную из первых анализов, затем была выполнена белковая инженерия, как описано ранее, для получения дополнительных сконструированных белков, которые были протестированы, как описано в данном Примере 1. Результаты высокопродуктивного ферментативного анализа с применением квизалофопа-П в качестве субстрата для пяти из этих дополнительно сконструированных белков приведены в Таблице 2.
[0071] Определение дополнительных белковых характеристик, таких как Km, Vmax и анализ структуры кристаллов, выполняли с применением пяти сконструированных белков из Таблицы 2. Для этого подробного анализа очищенный белок подготавливали следующим образом: 2 мл ночных культур Е. coli, экспрессирующей трансген, который кодирует данный белок MON-HT, применяли для инокуляции 50 0 мл среды и выращивали при 37 °С в течение 4 часов с последующим культивированием при 15 °С в течение около 3 6 часов. Затем 250 мл из 500 мл бактериальной культуры осаждали
центрифугированием и ресуспендировали в 2 5 мл буфера для экстракции (20 мМ Трис, рН 7,8, 300 мМ NaCl, 5 мМ бета-меркаптоэтанол (БМЕ), 20 мМ имидазола (Fluka/Sigma- Aldrich, Сент-Луис, Миссури), 125 единиц/мл бензоназы и 10К единиц/мл лизоцима (Novagen, Дармштадт, Германия). Суспензию клеток пропускали через дезинтегратор клеток один раз при 20000 psi, а затем этот клеточный лизат очищали центрифугированием при 35000 х д в течение 2 0 мин при 4 °С. Надосадочную жидкость, содержащую растворимые His-меченые белки, применяли для очистки белка. Для этой очистки супернатант вносили в 1 мл колонку HisTrap(tm) FF (Nickel Sepharose) (GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси) с применением системы AKTaxpress(tm) (GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси) в соответствии со стандартным протоколом производителя. Буфер для промывки состоял из: 20 мМ Tris рН 7, 8, 300 мМ NaCl, 2 0 мМ имидазола и 5 мМ БМЕ. Состав элюирующего буфера был таким же, как и промывочного буфера, за исключением 500 мМ имидазола. Элюат из никелевой колонки обессоливали на тонкой колонке Quick Spin Protein Sephadex G-25 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), следуя протоколу производителя. Элюированный белок был в буфере, состоящем из: 20 мМ Tris рН 7,8, 50 мМ NaCl и 5 мМ БМЕ. Чистоту экстракта белка оценивали с помощью анализа SDS-PAGE. Концентрацию белка определяли с помощью анализа Брэдфорда с применением красителя-реагента Bio-Rad Protein Assay (Biorad, Геркулес, Калифорния, каталожный номер 500-0006).
[0072] Очищенный белок для пяти сконструированных белков анализировали с применением ферментативного анализа, описанного в данном Примере 1, но с четырьмя различными гербицидами на основе АОФП в качестве субстратов: квизалофоп-П, галоксифоп, феноксапроп и флуазифоп. Стандартные кривые получали с применением 2,4-дихлорфенола (2,4-DCP), который использовали для получения общей стандартной фенольной кривой. Количество фенола, производимого при анализе сконструированными белками, рассчитывали на основе этой стандартной кривой. Контрольные образцы представляли собой образцы с очищенным ферментом дикого типа, образцы без фермента и образцы без субстрата. Измерения
ферментативной кинетики пяти сконструированных белков проводили с применением 0, 20, 40, 80, 160, 32 0, 64 0 или 12 8 0 мкМ гербицидов квизалофопа-П, галоксифопа, феноксапропа или флюозифопа. В Таблице 3 показаны Km и Vmax (выраженные как относительные величины), измеренные для пяти белков с четырьмя субстратами - гербицидами на основе АОФП. Белковые характеристики этих пяти сконструированных белков с каждым из четырех гербицидов на основе АОФП в качестве субстратов продемонстрировали, что ферментативная активность, а именно Km и Vmax, сконструированных белков может быть значительно изменена с помощью белковой инженерии.
[0073] Были сконструированы векторы для трансформации
растений, каждый из которых содержал рекомбинантную молекулу
ДНК, кодирующую один из трех сконструированных белков, с белок-
кодирующей последовательностью, оптимизированной для экспрессии
в однодольных, MON-HT51 (SEQ ID N0:3), MON-HT52 (SEQ ID N0:6), и
MON-HT55 (SEQ ID N0:13). Векторы были созданы с применением
различных комбинаций промотора, лидера, интрона и 3'UTR, с и без
ТПХ, функционально связанного с белок-кодирующей
последовательностью. Также в векторы была включена вторая кассета ДНК, содержащая кодирующую последовательность cp4-EPSPS, которая должна применяться в трансгенных растениях для устойчивости к глифосату. Незрелые кукурузные (LH244) эмбрионы трансформировали этими векторами с применением Agrobacterium tumifaciens и стандартных способов, известных в данной области техники. Регенерированные R0 трансгенные проростки выращивали в
теплице и опрыскивали примерно на стадии роста V2-V4 квизалофопом-П в объеме 0,04 или 0,08 фунта д.в./акр (Assure(tm) II, E.I. DuPont), представляющие 0,5Х и IX нормы, соответственно. Образцы листьев применяли для идентификации трансгенных растений с единственной копией трансгенной ДНК-вставки (то есть единичные трансформанты). Растения R0, которые содержали только одну копию и прошли тестирование опрыскиванием либо 0,5Х, либо IX квизалофопа-П, были самоопылены для получения семян R1. С помощью конструкций, содержащих MON-HT52, не были получены трансформанты. Был регенерирован только один единичный трансформант, после трансформации конструкцией, содержащей MON-НТ51 с ТПХ, и конструкцией, содержащей MON-HT51 без ТПХ. Трансформирование проводили двумя парами векторов, которые содержали MON-HT55, причем каждая пара отличалась только тем, что содержала ТПХ или не содержала ТПХ.
[0074] Растения R1, экспрессирующие MON-HT55 с функционально связанным ТПХ и без него, выращивали в теплице, а гербицид квизалофоп-П применяли на стадии роста V2 в норме 0,0 8 фунта к.э./акр (IX) . Растения оценивали на наличие повреждений через одиннадцать дней после обработки. Растения R1 сегрегировали по признаку в типичном соотношении по Менделю, и было замечено ожидаемое количество (~2 5%) нулевых сегрегантов (растений-потомков, не содержащих трансгенных признаков), которые не выжили после гербицидной обработки. Все трансгенные растения R1, экспрессирующие MON-HT55 с функционально связанным ТПХ, за исключением тех, которые представляли собой единичные трансформанты, показали только незначительное хлоротическое пятнышко на самых молодых открытых листьях после применения квизалофопа-П. Для этих растений после применения гербицида не было зарегистрировано никаких повреждений, превышающих 5%. Также, необработанные трансгенные растения не отличались фенотипически от необработанных контрольных растений. Фиг. 1А иллюстрирует контрольные растения LH244 и трансгенные растения, содержащие MON-HT55 (SEQ ID N0:13) через 18 дней после нанесения квизалофопа-П.
[0075] Для оценки эффекта применения ТХП, которые
использовали для направления сконструированного белока к
хлоропласту растительных клеток, сравнивали трансгенные
растения, содержащие трансгенную вставку с ТПХ и без ТПХ,
функционально связанную с белок-кодирующей последовательностью.
Растения, содержащие ТПХ, функционально связанные с белок-
кодирующей последовательностью, продемонстрировали лучшую
переносимость по отношению к квизалофоп-П по сравнению с
растениями без ТПХ. При тестировании R1 в теплице, описанном в
данном Примере 2, большинство трансгенных растений, содержащих
ТПХ, функционально связанных с белок-кодирующей
последовательностью, продемонстрировали полную устойчивость к
квизалофопу-П. Растения, не содержащие ТПХ, функционально
связанные с белок-кодирующей последовательностью,
продемонстрировали устойчивость к квизалофопу-П, но имели
фенотипы с некоторыми умеренными повреждениями. Данные
результаты продемонстрировали, что использование ТПХ, что бы
направить сконструированный белок к хлоропласту растительных
клеток, усиливает устойчивость трансформированного растения к
квизалофопу-П. Данный неожиданный результат был перепроверен в
полевых испытаниях эффективности признака у растений R1,
содержащих либо M0N-HT51 с или без ТПХ, функционально связанных
с белок-кодирующей последовательностью, либо MON-HT55 с или без
ТПХ, функционально связанных с белок-кодирующей
последовательностью. Данные растения R1 были единичными трансформантами, но все еще сегригировали. В данном полевом испытании семена высевали в поле и обрабатывали следующим образом: 2Х (0,16 фунта д.в./акр) квизалофопа-П перед посевом, 2Х (0,14 фунта д.в./акр) галоксифопа на стадии роста V4, затем 2Х квизалофопа-П на стадии роста V8. Более высокий процент растений, содержащих ТПХ, функционально связанных с белок-кодирующей последовательностью, выживал при обработках квизалофопом-П и галоксифопом, и такие растения имели более низкие оценки повреждений по сравнению с растениями, не содержащими ТПХ, функционально связанными с белок-кодирующей последовательностью. Данные приведены в Таблице 4. Это
подтвердило неожиданный вывод о том, что ТПХ, функционально связанные с белок-кодирующей последовательностью, обеспечивают более высокую устойчивость растений к применению гербицидов для сконструированных белков.
[0076] Полевые испытания эффективности инбредных признаков проводились для оценки устойчивости к гербицидам на основе АОФП и чувствительности к гербицидам на основе циклогександионов (ЦГД) на инбредном фоне. Инбредные растения R2 получали путем самоопыления гомозиготного трансгенного растения R1 и сбора семян. Инбредные растения R2, содержащие MON-HT55 с или без ТПХ, или M0N-HT51 с ТПХ, оценивали в двух полевых локациях. Гербицидная обработка представляла собой обработку 2Х квизалофопом-П в 0,16 фунта д.в./акр, примененного ППП (после посадки, но до прорастания) , после чего применяли квизалофоп-П в 0,16 фунта д.в./акр на стадии роста V4, затем применяли квизалофоп-П в 0,16 фунта д.в./акр на стадии роста V8. Опытные участки оценивали по повреждению посевов через 7-10 дней после применения гербицидов, по шкале 0-100, при этом нулевое значение обозначало отсутствие травм, а 100 обозначало полную гибель посевов. Все данные были подвергнуты дисперсионному анализу дисперсии и среднего, разделенных при НДР (наименьшая достоверная разница) (0,05) . Большинство инбредных растений R1 не имели повреждений, подтверждая то, что и MON-HT55 и MON-HT51, с или без ТПХ, обеспечивают устойчивость кукурузе к квизалофопу-П. Для проверки чувствительности к гербицидам на основе ЦГД,
которые желательны для применения к самосевному контролю, растения обрабатывали IX нормой клефодиума (0,25 фунта д.в./акр) на стадии роста V8. Самосевный контроль с применением нормы IX клефодиума был на 100% эффективен для всех трансгенных растений, прошедших тестирование. Полевые испытания эффективности признаков гибридов проводились для оценки устойчивости к гербицидам на основе АОФП и чувствительности к гербицидам на основе циклогександионов (ЦГД) на гибридном фоне. F1 гибридные растения получали путем скрещивания инбредного растения R1 с нетрансгенным растением и сбором семян. Полученные в результате растения F1, содержащие MON-HT55 (SEQ ID N0:13) с или без ТПХ, или M0N-HT51 (SEQ ID N0: 3) без ТПХ, оценивали в шести полевых локациях. Полевые испытания эффективности гибридных признаков проводились в шести местах при различных условиях окружающей среды, включая условия высокой температуры и засухи во время полевого сезона. Это позволило оценить сконструированный белок в кукурузе в условиях высокой температуры и водного стресса. Данные представлены в Таблице 5. Первоначальное повреждение от применений 2Х квизалофопа-П было выше желаемого (> 10% повреждений) через 7-10 дней после применения. Растения в конечном итоге смогли преодолеть повреждения путем дальнейшего роста, при этом, как правило, наблюдалось меньше травм от применения гербицида на стадии роста V8 по сравнению с применением на стадии роста V4. Также отмечалось чрезмерное повреждение, когда квизалофоп-П применялся очень рано (например, на стадии роста VE-V2).
были чувствительными к применению квизалофопа-П при выращивании в полевых условиях при высокой температуре, было подтверждено с применением анализа на основе растений. Анализ на основе растений был разработан для проверки устойчивости гибридов F1 к квизалофопу-П в климатических камерах перед полевым тестированием. Анализ был разработан с применением гибридов F1, содержащих события трансформации кукурузы NK603 (патент США №8273959) х MON89034 (патент США №8581047) и гибридов F1, содержащих MON-HT55 х MON89034. Семена гибридов F1 проращивали в климатической камере в течение 1 недели, и затем перемещали в одну из трех различных климатических камер для акклиматизации в течение двух дней при дневных/ночных температурах 2 0 °С/2 0 °С, 2 8 °С/20 °С и 38°С/30 °С до применения 2Х (0,16 фунта д.в./акр) квизалофопа-П. Как и ожидалось, растения, не содержащие MON-HT55 при всех режимах температур, были серьезно повреждены обработкой 2Х квизалофопом-П (Фиг. 1Б) . Трансгенные растения, содержащие MON-HT55, показали хорошую устойчивость к обработке 2Х квизалофопом-П при акклиматизации к дневным/ночным температурам 2 0 °С/2 0 °С или 2 8 °С/2 0 °С, но проявили значительную чувствительность при акклиматизации к дневным/ночным температурам 38 °С/30 °С (Фиг. 1В) . Это подтвердило, что анализ на основе растений может быть применен для скрининга белков в растениях в климатической камере по температуро-чувствительной активности.
[0078] Данные демонстрируют, что сконструированные белки могут быть экспрессированы в трансгенных растениях для сообщения устойчивости к гербицидам, и что необработанные трансгенные растения не отличаются фенотипически от необработанных контрольных растений. Эти данные также подтвердили, что экспрессия сконструированных белков в растениях позволила применять гербициды на основе ЦГД для самосевных контрольных растений. Неожиданно, данные показали, что применение ТПХ для направления к хлоропластам сконструированного белка усиливает признак устойчивости к гербицидам, и что устойчивость к гербицидам, обеспечиваемая сконструированными белками, является
чувствительной к температуре, уменьшаясь в условиях высокой температуры.
Пример 3: Оптимизация сконструированных белков
[0079] Открытие того, что гибридные растения, экспрессирующие сконструированные белки MON-HT55 или M0N-HT51, были чувствительны к обработке квизалофопом-П при выращивании в полевых условиях при высокой температуре, было неожиданным и предоставило дополнительные белковые характеристики, которые можно было изменять в процессе конструирования белка. Была разработана новая серия ферментативных анализов in vitro и анализ ферментативной активности на основе растений для тестирования белков на чувствительность к высоким температурам.
[0080] Для создания сконструированных белков,
оптимизированных для работы при более высоких температурах, анализ белковых мотивов, использованный в первых двух циклах конструирования белка, был объединен с данными кристаллической структуры для нескольких сконструированных белков. Это использовалось, чтобы инициировать дополнительные раунды мутагенеза, выполненные, как описано ранее, и таким образом было получено около 14 00 дополнительных сконструированных белков. Они были объединены с примерно 1200 сконструированными белками, описанными в Примере 1, в общей сложности составив около 2 600 сконструированных белков для скрининга с помощью нового теста чувствительности к температуре для идентификации белков, оптимизированных для работы при более высоких температурах.
[0081] Чтобы проанализировать активность этих
сконструированных белков при более высоких температурах, ферментативный анализ in vitro в Примере 1 был модифицирован для того, чтобы точно определить условия предварительного нагревания всех компонентов анализа до желаемой температуры в течение 5 минут перед объединением компонентов, и затем поддерживать реакцию при желаемой температуре во время прохождения реакции. Для нормирования результатов анализа, в качестве субстрата для реакции применяли квизалофоп-П, и активность фермента была нормирована на основании 2 5 °С считываний. Применяя эти
параметры, рассчитывали температуру, при которой активность фермента составляла половину от максимальной (Ti/2) . Было рассчитано, что Ti/2 для MON-HT55 составляет 29 °С, а для RdpA дикого типа Т±/2 составляет 38°С (Фиг. 2А) .
[0082] Из-за большого количества вариантов тестирования применялся пятиступенчатый процесс скрининга. Таблица б показывает примерное количество вариантов, протестированных в различных скринингах.
[0083] Первый скрининг проводили с применением примерно 2 60 0 сконструированных белков и применяли высокопродуктивную систему бактериальной экспрессии белка и анализа ферментов с неочищенными бактериальными лизатами, как описано в Примере 1, но модифицировали для проведения при желаемых температурах 2 5 °С и 4 0°С с развитием окрашивания после гашения при 2 5 °С. После данного скрининга было отобрано и допущено к следующему этапу около 1250 сконструированных белков. Второй скрининг был аналогичным, но включал белковое нормирование по образцам. После данного скрининга было отобрано и пропущено к следующему этапу 94 сконструированных белка. В третьем скрининге применяли очищенный белок с анализом ферментативной деградации гербицида, как описано в Примере 1, но он был модифицирован для проведения при желаемых температурах 2 5°С и 4 0°С с развитием окраски после
гашения, выполненной при 2 5 °С. После данного скрининга было отобрано и пропущено к следующему этапу 4 7 сконструированных белков. Четвертый скрининг проводили с применением очищенного белка, нормировали концентрации белка, а скрининг включал квизалофоп-П и (для подмножества вариантов белков) 2,4-D в качестве субстратов с анализом конечной точки при 23 °С и 40 °С.
После данного скрининга было отобрано и пропущено к следующему этапу 13 сконструированных белков.
[0084] Для пятого скрининга для каждого из одиннадцати сконструированных белков получали и очищали рекомбинантный белок для углубленного биохимического анализа. Данный биохимический анализ включал: (1) кинетический анализ (Vmax и Km), (2) анализ активности в диапазоне температур, (3) анализ плавления белка, (4) активность на дополнительных гербицидах на основе АОФП и (5) масс-спектрометрический анализ на пептидах для подтверждения идентичности. Биохимические анализы также проводили с очищенным рекомбинантным белком дикого типа и белком MON-HT55 для сравнения. Для кинетического анализа проводили анализ без конечных точек при 2 3 °С с применением либо квизалофопа-П, либо 2,4-D в качестве субстрата. Рекомбинантные белки для данных анализов получали в бактериях и очищали с применением метки 6-His, прицепленной к С-концу белка. Результаты кинетического анализа с применением либо квизалофопа-П, либо 2,4-D в качестве субстрата представлены для десяти сконструированных белков, белка дикого типа и белка MON-HT55 в Таблице 7 (стандартная ошибка показана в скобках). Vmax выражается как удельная активность, мкМ гербицидный продукт мг фермент-1 мин-1; Km, выраженная в мМ гербицидного субстрата. NDB указывает на то, что ферментативная активность может проявляться при более высоких концентрациях гербицида, но активность при тестируемых концентрациях была недостаточно сильной, чтобы обеспечить надлежащую кинетическую характеристику. Для MON-HT55 низкие уровни активности (Vmax) с 2,4-D в качестве субстрата приводили к низкой достоверности предоставляемого значения. M0N-HT7 имеет Vmax с квизалофопом-П, которое на 40% больше, чем для фермента дикого типа, и Vmax для 2,4-D, которое составляет лишь половину от такового фермента дикого типа. M0N-HT1 имеет Vmax для квизалофопа-П, которое составляет половину от такового фермента дикого типа, и Vmax для 2,4-D, которое в 9,5 раз выше, чем таковое фермента дикого типа. Дифференциация белковой кинетики для M0N-HT1 и M0N-HT7 была неожиданной, поскольку между M0N-HT1
и MON-HT7 было всего четыре аминокислотных различия. В частности, MON-HT1 имеет следующие аминокислоты в указанной позиции: 182; F105; Т112; и V273, и MON-HT7 имеет следующие аминокислоты в указанной позиции: L82; V105; S112; и А273.
2,4-D, и активность была нормирована на основе активности фермента дикого типа при 2 5°С. Полученные кривые активности представлены на Фиг. 2Б (с квизалофопом-П в качестве субстрата), и на Фиг. 2В (с 2,4-D в качестве субстрата). В случае применяя квизалофоп-П в качестве субстрата, MON-HT55 оказался наиболее чувствительным к температуре, с Т±/2 2 9 °С. Фермент дикого типа имел Т1/2 3 8 °С. MON-HT 1 и MON-HT 8 были менее чувствительны к температуре, чем фермент дикого типа с Ti/2 42 °С и 41 °С, соответственно, тогда как фермент дикого типа при этих температурах был на 90% неактивен. MON-HT2 и MON-HT7 были
значительно менее чувствительны к температуре с Т±/2 4б°С и 47°С, соответственно, тогда как фермент дикого типа при этих температурах был полностью неактивен. Когда в качестве субстрата применяли 2,4-D, фермент дикого типа имел Ti/2 36 °С. MON-HT2, MON-HT7 и MON-HT8 были немного более чувствительны к температуре с более низким Т^, чем фермент дикого типа. MON-HT1 был немного менее чувствителен к температуре, при Ti/2 примерно на 1°С выше, чем фермент дикого типа.
[0086] Был также проведен анализ плавления белка. Для определения плавления белка очищенный фермент добавляли в 9 6-луночные планшеты для микротитрования в стандартном буфере для хранения (30 мМ Tris рН 7,5, 150 мМ NaCl) с или без 50 мкМ Fe2 + и 1,0 мМ aKG. Протеиновое развертывание затем детектировали с помощью оранжевого красителя белкового геля SYPRO(r) (Invitrogen(tm) каталожный номер S6651, Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк) на приборе Real time-PCR BioRad СFX9 б (tm) (BioRad, Геркулес, Калифорния) со считываниями, выполненными от 10°С до 95°С с шагом 0,5 °С. ^1/2 (здесь температура, при которой разворачивалось 50% белка) показаны в Таблице 8. Фермент дикого типа продемонстрировал стабилизацию с помощью 50 мкМ Fe2+ и 1,0 мМ aKG. Напротив, 50 мкМ Fe2+ и 1,0 мМ aKG мало влияли на стабильность любого из сконструированных белков. MON-HT55, MON-НТЗ, MON-HT4, MON-HT б, и MON-HT10 имели температуры плавления в диапазоне от 41°С до 4 8°С, которые были ниже температуры
плавления фермента дикого типа. MON-HT1, M0N-HT2, M0N-HT5, MON-HT? , M0N-HT8, и M0N-HT9 имели температуры плавления между 58°С и 67°С, которые от 8°С до 17°С выше чем фермента дикого типа. Для M0N-HT7 и M0N-HT1 разница в точке плавления составляла 11°С в буфере без Fe2+ и aKG и 8°С в буфере с Fe2+ и aKG. Это было неожиданно, поскольку между этими двумя ферментами было всего четыре аминокислотных различия. Эти данные по точке плавления ферментов подтверждают, что для сконструированных белков была оптимизирована белковая стабильность при более высоких температурах. Эти данные также соответствуют результатам анализа ферментативной активности белков, проводимого при разных температурах.
[0087] Ферментативную активность вариантов белка MON-HT с галоксифопом, феноксапропом, флуазифопом и дихлорпропом в качестве субстратов определяли с применением анализа ферментативной активности, проводимого при 2 3 °С с очищенным ферментом. Активность регистрировали как максимальную активность в процентах от активности фермента дикого типа, которая была установлена на уровне 100%. Данные представлены в Таблице 9.
MON-HT55, M0N-HT3, M0N-HT4, M0N-HT5, и MON-HT9 имел максимальные активности для всех четырех субстратов, которые были меньше или равны максимальной активности фермента дикого типа с тем же самым субстратом. При использовании галоксифопа в качестве субстрата, MON-HT1, M0N-HT2, M0N-HT7 и MON-HT10 имели максимальную активность, которая была выше, чем активность фермента дикого типа. При применении фенаксопропа в качестве субстрата, MON-HT1, M0N-HT2, M0N-HT6, M0N-HT7, MON-HT8 и MON-HT 10 имели максимальную активность, которая была выше, чем активность фермента дикого типа. При использовании флюзифопа в качестве субстрата, MON-HT2 и MON-HT7 имели максимальную активность, которая была выше, чем активность фермента дикого типа. При применении дихлорпопа в качестве субстрата, MON-HT1, MON-HT7, и MON-HT8 имели максимальную активность, которая была выше, чем активность фермента дикого типа.
MON-HT9 (SEQ ID N0:40)
MON-HT10 (SEQ ID N0:43)
124
233
RdpA дикого типа
100
100
100
100
[0088] Ферментативная идентичность была подтверждена с помощью масс-спектроскопии. Для этого анализа очищенный белок разделяли на геле PAGE и окрашивали. Затем окрашенные полоски вырезали, сушили и расщепляли с помощью трипсина согласно стандартным протоколам. Расщепленные трипсином белковые препараты разделяли на Dionox UltiMat(r) 3000 RSLCnano LC System (Thermo Scientific, Саннивейл, Калифорния) с применением колонки Thermo Scientific(tm) AQUASIL(tm) C-18 Javelin(tm) Guard в стандартных условиях и впрыскивали для анализа MS-MS с применением масс-спектрометра Thermo Scientific(tm) Q Exactive(tm) Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Thermo Scientific, Саннивейл, Калифорния).
[0089] Чтобы оптимизировать белки для повышения активности в присутствии гербицидов на основе феноксикислот, было выполнено вычислительное белковое конструирование на кристаллической структуре для нескольких сконструированных белков. Это использовали для инициации дополнительных циклов мутагенеза, выполняемых, как описано ранее, но с применением бактериальной последовательности SEQ ID N0:15, кодирующей белковую последовательность MON-HT1 (SEQ ID N0:14), в качестве начальной последовательности. Было произведено около 472 дополнительных сконструированных белков. Они были объединены с примерно 2600 сконструированными белками, описанными в Примере 1 и Таблице б, всего около 3072 сконструированных белков для идентификации белков, оптимизированных для работы в присутствии 2,4-D. Первый скрининг новых вариантов проводили с применением высокопроизводительной (ВПС) системы бактериальной экспрессии белка и анализа ферментов с неочищенными бактериальными лизатами, как описано в Примере 1, но модифицировали для проведения при желаемых температурах 2 5 °С и 4 0 °С с развитием
окрашивания после гашения при 25°С. После этого
высокопроизводительного скрининга было отобрано 34
сконструированных белка и допущено к следующему этапу скрининга
с белковым нормированием по всем образцам. После данного
скрининга 12 сконструированных белков были отобраны и допущены к
следующему этапу скрининга с очищенным белком,
проанализированные с применением анализа ферментативной деградации гербицидов, как описано в Примере 1. Ферментативную термостабильность анализировали с помощью анализа ограниченного плавления белков. После данного скрининга было отобрано и допущено к следующему этапу растительного тестирования 7 сконструированных белков. Были отобраны три варианта ферментов для детальной характеристики с применением очищенного белка, при этом концентрации белка были нормированы, и скрининг включал субстраты квизалофоп-П и 2,4-D, а также дополнительные гербициды, представленные в Таблице 10 и Таблице 12, а также характеристики плавление белков.
[0090] Кинетический анализ с применением анализа без конечных точек проводили при 2 3 °С с применением либо квизалофопа-П, либо 2,4-D в качестве субстрата, как описано выше для очищенного белка фермента дикого типа, M0N-HT1, MON- НТ13, M0N-HT15 и M0N-HT17. Данные демонстрируют значительное и неожиданное повышение ферментативной активности M0N-HT13, MON-HT 15 и MON-HT17 по отношению как к ферменту RdpA дикого типа, так и к ферменту M0N-HT1 при тестировании с применением 2,4-D в качестве субстрата. В частности, все три варианта показали примерно 2,5-3-кратное увеличение активности (Vmax) относительно M0N-HT1. Ферментативная активность вариантов M0N-HT13, M0N-HT15 и M0N-HT17 с квизалофопом в качестве субстрата была примерно аналогична активности M0N-HT1. См. Таблицу 10.
MON-HT1 (SEQ
1, 62
0, 12
1, 17
0, 03
N0:14)
(0,05)
(0,012)
(0,01)
(0,002)
M0N-HT13 (SEQ
1,51
0, 12
3,38
0, 08
N0:47)
(0,05)
(0,013)
(0,05)
(0,004)
M0N-HT15 (SEQ
1, 52
0, 12
3, 53
0, 07
N0:49)
(0,06)
(0,017)
(0,04)
(0,004)
M0N-HT17 (SEQ
1, 53
0, 14
2, 91
0, 07
N0:51)
(0,05)
(0,014)
(0,04)
(0,004)
[0091] Анализ плавления белка проводили, как описано выше. Температуры плавления MON-HT13, MON-HT15 и MON-HT17 были близки к температуре плавления MON-HT1 с Ti/2 в буфере в диапазоне 55-58°С, и с Т1/2 в буфере с Fe2+ и aKG в диапазоне 60-62°С. Эти данные показывают, что варианты MON-HT13, MON-HT15 и MON-HT17 имеют похожую ферментативную термостабильность по сравнению с MON-HT1. Эти данные по точке плавления ферментативных вариантов подтверждают, что для сконструированных белков была оптимизирована белковая стабильность при более высоких температурах. См. Таблицу 11.
[0092] Ферментативную активность вариантов белка MON-HT с триклопиром, флуроксипиром, МХФУ, МСРВ, мекопропом в качестве субстратов определяли с применением анализа ферментативной активности, проводимого при 23°С, с очищенным ферментом. Активность регистрировали как максимальную активность в процентах от активности фермента дикого типа RdpA, которая была установлена на уровне 100%. Данные представлены в Таблице 12. Для каждого из проанализированных белков (MON-HT1, MON-HT13, MON-HT15 и MON-HT17) с гербицидами триклопир и флуроксипир в
качестве субстрата обнаруживалась активность, особенно в сконструированных вариантах, но активность не была достаточно сильной для количественной оценки. Для каждого из протестированных белков (M0N-HT1, M0N-HT13, M0N-HT15 и M0N-HT17) не было обнаружено активности с гербицидом МСРВ в качестве субстрата. Ферментативная активность с мекопропом в качестве субстрата была сниженной для каждого из вариантов M0N-HT1, MON-НТ13, M0N-HT15 и M0N-HT17 по сравнению с ферментом дикого типа RdpA. Неожиданным результатом было то, что ферментативная активность с МХФУ в качестве субстрата была примерно в б раз выше для MON-HT1 и примерно в 10 раз выше для MON-HT13, MON-HT15 и MON-HT17 по сравнению с ферментом дикого типа RdpA. См. Таблицу 12.
[0093] Десять уникальных сконструированных белков, оптимизированных для работы при более высоких температурах, были отобраны для трансформации кукурузы и анализа в растениях. Были получены ДНК-конструкции для экспрессии этих сконструированных белков с применением кодонов, оптимизированных для экспрессии в злаках, с применением способов, известных специалистам в данной области техники. Энхансеры, промоторы, лидеры, интроны, ТПХ и 3'UTR испытывались в различных комбинациях с сконструированными белками в данных ДНК-конструкциях. ДНК-конструкции применяли для трансформации незрелых эмбрионов кукурузы (LH244) с помощью данных векторов, используя Agrobacterium tumifaciens и
стандартные способы, известные в данной области техники. Регенерированные R0 трансгенные проростки выращивали в теплице.
[0094] Трансгенные растения кукурузы R0 подвергали скринингу с обработкой квизалофопом-П (2Х) плюс 2,4-D (2Х) через 7-10 дней с последующей пересадкой в горшки (как правило, соответствует стадии роста V3-V4). На основе всех протестированных конструктов были получены растения, содержащие единичную копию трансгенной вставки, которые прошли R0 скрининг. Растения R0 были самоопылены для того, чтобы произвести гомозиготные семена R1, и также использовали R0 в качестве особей мужского пола для скрещивания с инбредными растениями, содержащими трансгенную вставку кукурузы MON8 9034, для получения семян сегрегирующего гибрида F1, для проведения полевых испытаний эффективности.
[0095] Полевое исследование эффективности проводилось с сегрегирующими F1 гибридными растениями, с 50% гемизигот и 50% нулевых по трансгену растений. Устойчивость к квизалофопу-П (2Х) плюс 2,4-D (2Х) оценивалась с применением двух схем обработки гербицидами: (1) квизалофоп-П (Assure II) при 0,16 фунта д.в./акр (2Х) плюс 0,25% об./об. неионного поверхностно-активного вещества (НИПАВ), наносимых на стадии роста VE-V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4, и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8, и 2) 2,4-D амин при 2 фунта к.э./акр (2Х) плюс квизалофоп-П при 0,04 фунта д.в./акр (0,5Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимых на стадии роста VE-V2, с последующей обработкой 2,4-D амина при 2 фунта к.э./акр (2Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимых на стадии роста V4, после чего следует такая же обработка на стадии роста V8. 50% растений, которые были нулевыми по трансгену, были удалены после первой обработки квизалофопом-П на стадии роста VE-V2. Участки были визуально оценены через 10-14 дней после обработки по уровню повреждений посевов в масштабе от 0 до 100, при этом "0" - отсутствие повреждений, а "100" являлось полным уничтожением посевов. Таблица 13 демонстрирует средний показатель повреждений на этапах роста V4 и V8 для обеих схем распыления. Оценка повреждений <10% рассматривалась как очень
хорошая устойчивость, а оценка повреждений <2 0% рассматривалась как хорошая устойчивость. Процентная оценка повреждений с применением 2Х 2,4-D на стадии роста V8 варьировала от 40% до минимума - 0. Аналогичным образом, процентная оценка повреждений с применением 2Х квизалофопа-Р на стадии роста V8 колебалась от 90% до минимума - 0. Различия в оценке повреждений между растениями, экспрессирующими один и тот же белок, вероятно, связаны с различиями в дизайне конструкции или местонахождении вставки трансгена. Эти данные подтвердили, что растения, экспрессирующие сконструированные белки, проявили устойчивость к обработке гербицидами 2,4-D и квизалофопом при 2Х нормах.
HT3+MON-НТ1
MON-HT 4+MON-HT8
А+нет
11, 25
11, 88
9,38
4,38
[0096] Был применен анализ ферментативной активности на основе растений для определения тепловой чувствительности, чтобы определить влияния повышенных ростовых температур на устойчивость к гербицидам трансгенных растений, содержащих оптимизированные сконструированные белки. Для проверки на устойчивость к квизалофопу-П при повышенных ростовых температурах, (полученного путем скрещивания гомозиготного растения R1, экспрессирующего один из белков MON-HT, с инбредным трансгенным растением кукурузы MON89034), семена F1 гибрида кукурузы проращивали в климатической камере в течение 10 дней при дневной температуре 2 8 °С и ночной температуре 2 0 °С при 50% влажности. Через 10 дней растения переносили для акклиматизации в течение 3 дней при одном из трех разных дневных и ночных температурных режимов: (1) дневная и ночная температуры установлены на 2 0 °С; (2) дневная температура 2 8 °С и ночная температура 2 0 °С; или (3) дневная температура 3 8 °С и ночная температура 3 0 °С. По окончании акклиматизационного периода растения обычно находились на стадии роста V4 и опрыскивались 2Х квизалофопом-П. Через 10 дней после обработки, повреждения растения оценивались по шкале от 1 до 5, в которой "0" - не наблюдалось видимых повреждений, "1" - хлоротическая пятнистость, "2" - хлоротические полосы, "3" - разрывы листьев, "4" - растения с чахлым ростом и/или скрученными листьями, а "5" мертвые растения или не наблюдалось роста. Результаты представлены на Фиг. 4. F1 гибридные растения кукурузы, экспрессирующие MON-HT55, показали хорошую устойчивость (оценка повреждений около 2) к обработке распылением, когда дневная/ночная температуры составляли 20°С/20°С (Фиг. 4А) или 28 °С/20 °С (Фиг. 4Б) относительно гибридных контрольных растений F1 (трансформанты кукурузы NK603 X MON8 9034) (оценка повреждений
5). Когда дневные/ночные температуры составляли 3 8 °С/3 0 °С оценка повреждений гибридных контрольных растений F1 равнялась пяти, гибридные растения F1, экспрессирующие MON-HT55, имели средний коэффициент повреждений три, и гибридные растения F1, экспрессирующие MON-HT1, M0N-HT2, M0N-HT3, M0N-HT4 или M0N-HT7 имели оценку повреждений < 1 (Фиг. 4В). Сконструированные белки, оптимизированные для работы при более высоких температурах, обеспечивали устойчивость к гербицидам на основе АОФП, когда растения, экспрессирующие данные сконструированные белки, подвергались воздействию высоких температур.
[0097] Для проверки на устойчивость к 2,4-D при повышенных ростовых температурах, гибридные растения F1 получали путем скрещивания растения R1, содержащего MON-HT1, M0N-HT2, M0N-HT3, M0N-HT4, M0N-HT7 или MON-HT55 с инбредным растением, содержащим трансгенную вставку кукурузы MON89034. Гибридные растения F1 выращивали в теплице в течение одной недели при минимальной температуре 2 0°С и максимальной температуре 2 8°С при влажности от 50 до 80%. Через 1 неделю растения переносили для акклиматизации в течение трех дней при одном из двух разных дневных и ночных температурных режимов: (1) дневная и ночная температуры установлены на 20°С, или (2) дневная температура 38°С и ночная
температура 3 0°С. По окончании акклиматизационного периода растения обычно находились на стадии роста V4 и опрыскивались 4Х 2,4-D амином. Через 10 дней после обработки повреждения растений оценивались с использованием шкалы повреждений от 0 до 100, при этом "0" - не было повреждений, а "100" - мертвое растение. Когда растения были акклиматизированы при дневных/ночных температурах 20°С/20°С до нанесения 4Х 2,4-D амина, растения F1, содержащие MON-HT1, MON-HT2, MON-HT3, MON-HT4, MON-HT7 или MON-НТ55 имели средние показатели повреждений <10%, а контрольные растения имели средние показатели повреждений менее 20% (Фиг. 4Г) . Когда растения были акклиматизированы при дневных/ночных температурах 38 °С/30 °С перед нанесением 4Х 2,4-D амина, растения F1, содержащие MON-HT4 или MON-HT7 имели средние оценки повреждений <2 0%, растения F1, содержащие MON-HT1, MON-HT2 или
M0N-HT3 имели средние оценки повреждений менее 10% (Фиг. 4Д) , а контрольные растения и растения, включающие MON-HT55 F1 растения, имели средние оценки повреждений равные 50% (Фиг. 4Д) . Эти результаты показали, что сконструированные белки, оптимизированные для работы при более высоких температурах, обеспечивали устойчивость к гербициду 2,4-D, когда растения, экспрессирующие эти сконструированные белки, подвергались воздействию высоких температур.
[0098] Отдельные полевые испытания эффективности признаков для квизалофопа-П и 2,4-D проводились в двух локациях, каждое с гибридными трансгенными растениями F1, полученными путем скрещивания инбредного растения, содержащего трансгенную вставку кукурузы MON89034, с растением R1, содержащим MON-HT55 (с ТПХ) MON-HT 1 (с или без ТПХ) , MON-HT2 (с или без ТПХ) , MON-HT3 (с ТПХ), MON-HT4 (с ТПХ), MON-HT5 (с ТПХ), MON -НТб (с ТПХ), или MON-HT7 (с ТПХ) . Трансгенные гибридные растения F1, содержащие единичные трансгенные вставки кукурузы, NK603 х MON8 9034, применяли для сравнения, в качестве контроля.
[0099] В полевом испытании эффективности устойчивости к квизалофопу-П и чувствительности к клефодиуму, применялась одна из четырех обработок гербицидом: (1) квизалофоп-П (Assure II) при 0,32 фунта д.в./акр (4Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадии роста VE-V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4, и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8; (2) квизалофоп-П при 0,64 фунта д.в./акр (8Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадиях роста от VE до V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4, и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8; (3) квизалофоп-П при 1,28 фунта д.в./акр (16Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадиях роста от VE до V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4, и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8; или (4) клефодиум при 0,25 фунта д.в./акр (IX) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадии роста V8. Участки были визуально оценены через 10-14 дней после обработки по уровню повреждений посевов в масштабе от 0 до 100, при этом "0" - отсутствие повреждений, а "100"
являлось полным уничтожением посевов. В Таблицах 14 и 15 показаны средние оценки повреждений после применения гербицидов на стадии роста V4 или V8, соответственно.
[00100] Растения, содержащие MON-HT1, M0N-HT2, M0N-HT3, M0N-HT4, M0N-HT5, MON-HTб или M0N-HT7 (все функционально связанные с ТПХ) показали очень хорошую устойчивость к квизалофопу-П с оценками повреждений менее 15% при всех нормах применения, и как на стадии роста V4, так на стадии V8. Растения, содержащие MON-HT55, функционально связанный с ТПХ, показали от умеренной до плохой устойчивости с оценками повреждений от 0,8% до 78,8%. Оценки повреждений для контрольных растений после применения квизалофопа-П составили 99,5%. Эти результаты показывают, что растения, содержащие M0N-HT1, M0N-НТ2, M0N-HT3, M0N-HT4, M0N-HT5, MON-HTб или M0N-HT7, функционально связанные с ТПХ, обладают очень хорошей устойчивостью к серийной обработке квизалофопом-П.
[00101] Растения, содержащие MON-HT1 или M0N-HT2 с функционально связанным ТПХ, имели лучшую устойчивость к квизалофопу-П, чем растения, содержащие M0N-HT1 или M0N-HT2 без функционально связанного ТПХ. Растения, содержащие M0N-HT1 с функционально связанным ТПХ, имели оценки повреждений от 0 до 5,5% при всех обработках квизалофопом-П, по сравнению с оценками повреждений от 3,3% до 18,8% растений, содержащих M0N-HT1 без функционально связанного ТПХ. Растения, содержащие M0N-HT2 с функционально связанным ТПХ, имели оценки повреждений от 1,5% до 10% при всех обработках квизалофопом-П, по сравнению оценками повреждений от 16,3% до 82,5% растений, содержащих M0N-HT2 без функционально связанного ТПХ. На Фиг. 5 показаны растения, содержащие M0N-HT2, функционально связанный с ТПХ (Фиг. 5А) и растения, содержащие M0N-HT2 без ТПХ (Фиг. 5Б) через 10-14 дней после применения квизалофопа-П (обработка 3) при 1,28 фунта д.в./акр (16Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на стадиях роста от VE до V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4, и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8. Контрольные растения не выживали, растения, содержащие M0N-HT2 без ТПХ, обладали устойчивостью от умеренной
до плохой, а растения, содержащие M0N-HT2, функционально связанный с ТПХ, показали сильную устойчивость к обработке квизалофопом-П. Данные результаты подтвердили, что применение функционально связанного ТПХ значительно улучшает устойчивость к квизалофопу-П.
[00102] Все трансгенные растения имели оценки повреждений выше 90% при обработке IX нормой клефодиума (0,25 фунта д.в./акр), применяемого на стадии роста V8, демонстрируя применение данного гербицида к самосевному контролю с трансгенными растениями, содержащими сконструированные белки.
[00103] В полевом испытании эффективности устойчивости к 2,4-D, применялась одна из четырех обработок гербицидом: (1) 2,4-0-амин при 2 фунтах к.э./акр (2Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на стадиях от VE до V2, и на затем на V4, и затем на V8; (2) 2,4-О-амин при 4 фунтах к.э./акр (4Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на стадиях от VE до V2, и на затем на V4, и затем на V8; (3) 2,4-О-амин при 8 фунтах к.э/акр 8Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на стадиях от VE до V2, и на затем на V4, и затем на V8 кукурузы; или (4) 2,4-Б-амин при 16 фунтах к.э./акр (16Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на стадиях от VE до V2, и на затем на V4, и затем на V8. Участки были визуально оценены, как указано выше. В Таблицах 14 и 15 показаны средние оценки повреждений после применения гербицидов на стадии роста V4 или V8, соответственно.
[00104] Растения, содержащие MON-HT1, M0N-HT2 или MON-HT б (все функционально связанные с ТПХ), показали очень хорошую устойчивость к 2,4-D, с оценками повреждений менее 10% и менее 17% при всех нормах обработки на стадиях роста V4 и V8, соответственно. Растения, содержащие M0N-HT3, M0N-HT4, M0N-HT5 или M0N-HT7 (все функционально связанные с ТПХ), показали хорошую устойчивость к 2,4-D, с оценками повреждений менее 20% и менее 22% при всех нормах обработки на стадиях роста V4 и V8, соответственно. Растения, содержащие MON-HT55, функционально связанный с ТПХ, показали от умеренной до плохой устойчивости с оценками повреждений от 7,5% до 66%. Оценки повреждений для контрольных растений после применения 2,4-D составляли от 40% до
82,2%. Данные результаты показывают, что растения, содержащие MON-HT1, M0N-HT2, M0N-HT3, M0N-HT4, M0N-HT5, M0N-HT6 или MON-HT? , хорошо переносят серийную обработку 2,4-D.
[00105] Растения, содержащие MON-HT1 или M0N-HT2 с функционально связанным ТПХ, в целом не показали заметных различий в устойчивости к 2,4-D по сравнению с растениями, содержащими M0N-HT1 или M0N-HT2, без функционально связанного ТПХ, как было видно из обработки квизалофопом-П. Растения, содержащие MON-HT1 с функционально связанным ТПХ, имели оценку повреждений от 0 до 16,3% при всех обработках 2,4-D по сравнению с оценками повреждений от 0 до 13,8% растений, содержащих M0N-НТ1, без функционально связанного ТПХ. Растения, содержащие M0N-НТ2 с функционально связанным ТПХ, имели оценку повреждений от 1,3% до 15% при всех обработках 2,4-D, по сравнению с оценками повреждений от 1,3% до 21,3% растений, содержащих M0N-HT2, без функционально связанного ТПХ. Однако, данная разница была заметна после обработки растений 2,4-D на стадии роста V4, содержащих M0N-HT2 с функционально связанным ТПХ (4,5%-ная оценка повреждений при 8Х, и 7,5% при 16Х) по сравнению с растениями без ТПХ (13,75% оценка повреждений при 8Х, и 21,25% при 16Х).
Стадия
1бх
1бх
роста
Клефоди
2,4-
2,4-
2,4-
2,4-
Квизало
Квизало
Квизало
фоп
фоп
фоп
Контрол ь
93, 6
40, 0
52, 8
64, 1
82,2
99, 5
99, 5
99, 5
MON-НТ55
93, 3
16, 3
28,8
36, 3
55, 0
25, 0
45, 0
78, 8
MON-НТ55
93, 3
14, 4
20,0
39, 4
56,9
10, 0
31, 3
41,3
MON-
93, 3
11,3
16,3
30, 0
47,5
3, 8
3,8
16, 3
[00106] Для оценки различных хлоропласт-нацеливающих пептидов (ТПХ), были сконструированы векторы для трансформации растений, каждый из которых содержал рекомбинантную молекулу ДНК, оптимизированную для экспрессии в однодольных, и кодирующую MON-HT1 (SEQ ID N0:16), MON-HT2 (SEQ ID N0:20), и MON-HT8 (SEQ ID N0:39), MON-HT9 (SEQ ID N0:42), или MON-HT10 (SEQ ID N0:45). Векторы были созданы с применением той же комбинации промотора, лидера, интрона и 3'-UTR, но с одним из трех отдельных ТПХ (А, В или С) или без ТПХ, функционально связанного с белок-кодирующей последовательностью. См. Таблицу 16. ДНК-конструкции применяли для трансформации незрелых эмбрионов кукурузы (LH244) с
использованием Agrobacterium tumifaciens и стандартных способов, известных в данной области техники. Регенерированные R0 трансгенные проростки выращивали в теплице. Растения R0 самоопыляли, чтобы получить R1 гомозиготные семена. Растения R0 также использовали в качестве особей мужского пола для скрещивания с инбредными растениями, содержащими трансгенную вставку кукурузы MON8 9034, чтобы получить семена сегрегирующего гибрида F1 для проведения полевых испытаний эффективности.
[00107] Полевые испытания эффективности отдельных признаков для квазилифопа-П и 2,4-D проводились в двух локациях, каждое с гомозиготными инбредными трансгенными растениями (поколения R2 или R4) . В этих полевых испытаниях применялась одна из двух обработок гербицидом: (1) квизалофоп-П (Assure II) при 0,16 фунта д.в./акр (2Х) плюс 0,25% об./об. неионного поверхностно-активного вещества (НИПАВ), наносимых на стадии роста V4, после чего следует такая же обработка на стадии роста V8; или (2) 2,4-D амин при 2 фунта к.э./акр (2Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимых на стадии роста V4, после чего следует такая же обработка на стадии роста V8. Оценки повреждений (процент повреждений посевов на стадии роста V4 (ПППУ4) или V8 (ППП8)) были проведены через 10-14 дней после обработок на стадиях V4 и V8. Ошибка была рассчитана с использованием НДР (0,05) . Результаты показали, что данные растения имели устойчивость к 2Х серийным обработкам либо квизалофопом-П, либо 2,4-D с оценкой повреждений ниже 10% после обработок на стадиях V4 и V8. См. Таблицу 16.
MON-HT1
нет ТПХ
1,25
1,25
MON-HT2
1, 875
0, 875
1,25
MON-HT2
2,5
MON-HT2
1,25
MON-HT2
нет ТПХ
1,25
3,5
2,5
MON-HT8
1,25
1,75
1,25
MON-HT8
0,75
2,5
1,25
MON-HT8
1,25
1,25
MON-HT9
3,75
1,25
MON-HT10
1,25
[00108] Образцы листьев собирали с растений, содержащих
трансгенные кассеты, кодирующие MON-HT1, MON-HT2 и MON-HT8 с
последовательностями ТПХ и без них, чтобы определить экспрессию
мРНК, транскрибированную из трансгенной кассеты, кодирующей
сконструированные белки. Анализ Quantigene(r) проводили на экстрактах листьев для определения экспрессии мРНК трансгенной кассеты. Для этих анализов зонд был к общей последовательности 3'-UTR, присутствующей в каждой экспрессирующей кассете, используемой для получения трансгенных растений. Относительную экспрессию рассчитывали с помощью нормирования по генам домашнего хозяйства кукурузы. Образцы листьев собирали с каждого из восьми растений для каждой конфигурации конструкции, применяемой для получения трансгенных растений, а данные относительной экспрессии мРНК представляли собой среднее по восьми образцам со стандартной ошибкой.
[00109] Растения, содержащие трансгенную конструкцию, кодирующую либо MON-HT1 (SEQ ID N0:14), либо M0N-HT2 (SEQ ID N0:18), имели более высокую относительную экспрессию трансгенной мРНК для конструкций, содержащих либо "А", либо "В" ТПХ, чем для конструкций без ТПХ или с "С" ТПХ. Растения, содержащие трансгенную конструкцию, кодирующую M0N-HT8 (SEQ ID N0:37), имели аналогичную высокую относительную экспрессию трансгенной мРНК для конструкций, содержащих любой из трех ТПХ (А, В или С). См. Таблицу 17.
[00110] Отдельные полевые испытания эффективности признака для скрининга под давлением квизалофопа-П и 2,4-D проводились в одной локации с трансгенными гибридными растениями F1, полученными путем скрещивания инбредного растения, содержащего трансгенную вставку кукурузы MON8 9034, с растением R1, содержащим MON-HT1, MON-HT2, MON-HT8, MON-HT9 и MON-HT10 с и без функционально связанных последовательностей ТПХ. Трансгенные гибридные растения F1, содержащие единичные трансгенные вставки кукурузы, NK603 х MON8 9034, применяли для сравнения в качестве контроля.
[00111] В полевом испытании эффективности устойчивости к квизалофопу-П, применялась одна из трех обработок гербицидом: (1) квизалофоп-П (Assure II) при 0,32 фунта д.в./акр (4Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадии роста VE-V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4, и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8; (2) квизалофоп-П при 0,64 фунта д.в./акр (8Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадиях роста VE-V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4, и после чего следует такая же обработка на
стадии роста V8; (3) квизалофоп-П при 1,28 фунта д.в./акр (16Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадии роста VE-V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4, и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8. Участки были визуально оценены, как указано выше. В таблице 18 приведены средние оценки повреждений после применения гербицидов на стадиях роста V4 (ПППВ4) или V8 (ПППВ8), соответственно. Оценки повреждений для контрольных растений после применения квизалофопа-П составили 100%. Ошибка была рассчитана с использованием НДР (0,05).
функционально связанным "А" ТПХ, имели оценку повреждений от О до 15% при всех применениях квизалофопа-П. Растения, содержащие MON-HT1 с функционально связанным "В" ТПХ, имели оценку повреждений от 2,5% до 20% при всех применениях квизалофопа-П. Растения, содержащие MON-HT1 с функционально связанным "С" ТПХ, имели оценку повреждений от 0% до 2 0% при всех применениях квизалофопа-П по сравнению с растениями, содержащими MON-HT1 без функционально связанного ТПХ, которые имели оценку повреждений от 2,5% до 37,5% при всех применениях квизалофопа-П.
[00113] Растения, содержащие MON-HT2 с любым из трех функционально связанных ТПХ (А, В или С), имели более высокую устойчивость к квизалофопу-П, чем растения, содержащие MON-HT2 без функционально связанного ТПХ. Растения, содержащие MON-HT2 с функционально связанным "А" ТПХ, имели оценку повреждений от 0 до 15% при всех применениях квизалофопа-П. Растения, содержащие MON-HT2 с функционально связанным "В" ТПХ, имели оценку повреждений от 0% до 2 0% при всех применениях квизалофопа-П. Растения, содержащие MON-HT2 с функционально связанным "С" ТПХ, имели оценку повреждений от 0% до 2 0% при всех применениях квизалофопа-П по сравнению с растениями, содержащими MON-HT2 без функционально связанного ТПХ, которые имели оценку повреждений от 35% до 7 0% при всех применениях квизалофопа-П.
[00114] Растения, содержащие M0N-HT8 с функционально связанным "А" или "В" ТПХ, имели лучшую устойчивость к квизалофопу-П, чем растения, содержащие MON-HT8 с функционально связанным "С" ТПХ. Растения, содержащие MON-HT8 с функционально связанным "А" ТПХ, имели оценку повреждений от 15% до 60% при всех применениях квизалофопа-П. Растения, содержащие MON-HT8 с функционально связанным "В" ТПХ, имели оценку повреждений от 5% до 35% при всех применениях квизалофопа-П по сравнению с растениями, содержащими MON-HT8 с функционально связанным "С" ТПХ, которые имели оценку повреждений от 45% до 85% при всех применениях квизалофопа-П.
[00115] Растения, содержащие MON-HT1 или MON-HT2 с любым из трех функционально связанных ТПХ, и растения, содержащие MON-HT9 или MON0HT10 с функционально связанным "А" ТПХ, имели лучшую
устойчивость к квизалофопу-П, чем растения, содержащие M0N-HT8 с любым из трех функционально связанных ТПХ. Растения, содержащие MON-HT9 или MON-HT10 с функционально связанным "А" ТПХ, имели устойчивость к квизалофопу-П во всех обработках, что было сопоставимо с растениями, содержащими MON-HT1 или MON-HT2 с любым из трех функционально связанных ТПХ. При самой высокой норме обработке (16Х) квизалофопом, растения, содержащие MON-HT1 или MON-HT2 с функционально связанным "А" ТПХ, имели несколько более высокую устойчивость, чем растения, содержащие MON-HT1 или MON-HT2 с функционально связанным "В" или "С" ТПХ.
[00116] В полевом испытании эффективности признака на устойчивость к 2,4-D применяли три обработки гербицидом: (1) 2,4-О-амин при 4 фунтах к.э./акр (4Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на VE-V2, и затем на V4, и затем на V8; (2) 2,4-О-амин при 8 фунтах к.э./акр (8Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на VE-V2, и затем на V4, и затем на V8 кукурузы; (3) 2,4-О-амин при 16 фунтах к.э./акр (16Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на VE-V2, и на затем на V4, и затем на V8.Участки были визуально оценены, как указано выше.
[00117] В Таблице 19 приведены средние оценки повреждений кукурузы после применения гербицида 2,4-D на стадиях роста V4 (ПППВ4) или V8 (ПППВ8), соответственно. Оценка повреждений для контрольных растений после применений 2,4-D составляла от 80% до 96,25%. При самой высокой норме 2,4-D (1бх), применяемой в течении V8, растения, содержащие M0N-HT1 или M0N-HT2, функционально связанный с любым из трех ТПХ (А, В или С) , имели лучшую устойчивость по сравнению с растениями, содержащими M0N-НТ1 или M0N-HT2, без функционально связанного ТПХ. Растения, содержащие MON-HT1, M0N-HT2 или MON-HT8 с или без функционально связанного ТПХ, имели лучшую устойчивость к 2,4-D во всех применениях, чем растения, содержащие или MON-HT9 или MON-HT10 без функционально связанного ТПХ "А" . В диапазоне применений 2,4-D, относительный рейтинг устойчивости был следующим: растения, содержащие MON-HT1, имеют лучшую устойчивость, чем растения, содержащие M0N-HT2, которые, в свою очередь, имели лучшую устойчивость, чем растения, содержащие M0N-HT8. В
соответствии с данными испытания давления квизалофопа-П, растения содержащие M0N-HT1, M0N-HT2 или M0N-HT8, функционально связанные с "А" ТПХ, продемонстрировали небольшое математическое, но не статистически значимое преимущество над "В" и "С" транзитным пептидом. Ошибка была рассчитана с использованием НДР (0,05).
MON-HT8
7,5
17,5
17,5
MON-HT9
17,5
MON-T10
32, 5
87,5
Пример 6. Экспрессия оптимизированных сконструированных белков в сое
[00118] Два сконструированных белка были отобраны для анализа в трансгенной сое. Были получены ДНК-конструкции для экспрессии MON-HT1 (SEQ ID N0:14) и MON-HT2 (SEQ ID N0:18) с применением кодонов, оптимизированных для экспрессии в двудольных, с применением способов, известных специалистам в данной области техники. Энхансеры, промоторы, лидеры, интроны, ТПХ и 3'UTR в различных комбинациях были функционально связаны с сконструированными белками в данных ДНК-конструкциях. ДНК-конструкции применяли для трансформации сои с использованием Agrobacterium tumifaciens и стандартных способов, известных в данной области техники. Регенерированные R0 трансгенные проростки выращивали в теплице. Примерно через 9 недель после трансформации, на стадии 1-2 тройных листа были идентифицированы единичные RO-трансформанты, и их опрыскивали гербицидом 2,4-D в норме 0,5Х (0,37 5 фунта к.э./акр), 2Х (1,5 фунта к.э./акр) или 4Х (3,0 фунта к.э./акр). Примерно через 2 недели после применения гербицидов растения были оценены по степени повреждения гербицидом по шкале от 1 до 3, где 1=незначительное или полное отсутствие повреждений ( <20%), 2=умеренные повреждения (2 0-50%) и 3=тяжелые повреждения (> 50%).
[00119] Растения сои R0, содержащие каждую из конструкций, проявили устойчивость к 2,4-D с незначительными или отсутствующими повреждениями ( <20% повреждений), или умеренными повреждениями (2 0-50%) . Данные приведены в Таблице 20. Это указывает на то, что сконструированные белки MON-HT1 и MON-HT2 могут давать устойчивость к 2,4-D в растениях сои.
Таблица 20
Белок
ТПХ
норма 2,4-D
Трансфер манты с
единичной копией
трансгена
Трансфер манты с повреж дениями <2 0%
Трансфер
манты с повреж дениями 2 050%
Трансфер манты с повреж дениями
> 50%
MON-HT1
Нет
0, 5Х
130
120
MON-HT1
Нет
MON-HT1
136
101
MON-HT2
Нет
0, 5Х
MON-HT1
[00120] Дополнительные пять сконструированных белков, оптимизированных для расщепления 2,4-D затем были отобраны для анализа в трансгенной сое. Для экспрессии MON-HT13 (SEQ ID N0:47), MON-HT14 (SEQ ID N0:48), MON-HT15 (SEQ ID N0:49), MON-HT17 (SEQ ID N0:51) И MON-HT18 (SEQ ID N0:52) создавали ДНК-конструкции с кодонами, оптимизированными для экспрессии в двудольных. Функционально связанные элементы экспрессии (промотор, лидер, интрон, ТПХ и 3'UTR) были идентичны во всех конструкциях. Образцы листьев брали из ростков R0, и растения с одиночной копией трансгена идентифицировали с применением ПЦР-анализа. Когда растения R0 с единичной копией трансгена имели примерно 2-3 тройных листа, их обрабатывали либо 1,5 фунта к.э./акр (2Х), либо 3,0 фунта к.э./акр (4Х) 2,4-D. Через семь дней после нанесения гербицида растения оценивали по повреждениям гербицидом в зависимости от процентной площади растения, показывающей повреждение, как указано выше.
[00121] При норме нанесения 2Х растения сои, содержащие любой из шести вариантов MON-HT (M0N-HT1, M0N-HT13, M0N-HT14, M0N-HT15, MON-HT17 и M0N-HT18) продемонстрировали отличную устойчивость к обработке 2,4-D, о чем свидетельствуют все, кроме двух, растения с единственной копией трансгена, имеющие оценку повреждений менее 20%; эти два трансформанта (одно с M0N-HT13 и одно с M0N-HT18) имели оценку повреждений 20-30%. При 4Х норме из одиннадцати растений с единственной копией трансгена, содержащих M0N-HT1, у пяти растений оценка повреждений составила <20%, а у шести растений оценка повреждений составила 20-50%. Из одиннадцати растений с единственной копией трансгена, содержащих
M0N-HT13, десять растений имели оценку повреждений <20% и одно растение имело оценку повреждений 20-50%. Из восьми растений с единственной копией трансгена, содержащих MON-HT14, шесть растений имели оценку повреждений <2 0%, одно растение имело оценку повреждений 2 0-50%, и одно растение имело оценку повреждений > 50%. Из семи растений с единственной копией трансгена, содержащих MON-HT15, пять растений имели оценку повреждений <2 0%, одно растение имело оценку повреждений 2 0-50%, и одно растение имело оценку повреждений > 50%. Из одиннадцати растений с единственной копией трансгена, содержащих MON-HT17, все одиннадцать имели оценку повреждений <20%. Из двенадцати растений с единственной копией трансгена, содержащих MON-HT18, девять растений имели оценку повреждений <2 0% и три растения имели оценку повреждений 20-50%. Эти результаты показывают, что растения сои, содержащие MON-HT1 (SEQ ID N0:14), M0N-HT13 (SEQ ID N0:47), MON-HT14 (SEQ ID N0:48), MON-HT15 (SEQ ID N0:49), M0N-HT17 (SEQ ID N0:51), или M0N-HT18 (SEQ ID N0:52) обладают устойчивостью к 2,4-D при норме обработки 4Х. Кроме того, это демонстрирует, что растения сои, содержащие M0N-HT13 (SEQ ID N0:47), M0N-HT14 (SEQ ID N0:48), M0N-HT15 (SEQ ID N0:49), MON-HT17 (SEQ ID N0:51), или M0N-HT18 (SEQ ID N0:52) обладают улучшенной устойчивостью к 2,4-D при норме применения 4Х по сравнению с M0N-HT1 (SEQ ID N0:14). Исходя из процента растений с единственной копией трансгена с оценкой повреждений менее 2 0%, растения сои, содержащие либо M0N-HT13, либо M0N-HT17, имеют лучшую устойчивость к 2,4-D, применяемого в 4Х норме, по сравнению с растениями сои, содержащими M0N-HT1, M0N-HT14, M0N-НТ15 или M0N-HT18. См. Таблицу 21.
MON-HT14
MON-HT15
MON-HT17
MON-HT18
MON-HT1
MON-HT13
MON-HT14
MON-HT15
MON-HT17
MON-HT18
Пример 7. Устойчивость к синтетическим ауксинам-гербицидам флюроксипиру, трайклопиру и МХФУ
[00122] Определяли устойчивость кукурузы и растений сои, содержащих MON-HT1, к обработке 2,4-D, флюроксипиром, триклопиром и МХФУ. Семена F1 гибридов кукурузы трех уникальных трансформантов, содержащих MON-HT1 с "А" ТПХ, и семена сои R2 были посажены в горшки. Семена гибридной кукурузы, содержащие NK603 х MON8 9034, и ту же самую соевую зародышевую плазму, которая применялась для трансформации растений, использовали в качестве контроля. Растения выращивали в теплице, и для каждой обработки использовали четыре растения. Растения опрыскивали гербицидом в климатической камере, когда растения были высотой между 6-8 дюймами (соя) и 10-12 дюймами (кукуруза), затем переносили в теплицу, запрограммированную для поддержания оптимальных условий роста.
[00123] Для сои использовали норму применения гербицида 2Х каждого из последующих компонентов: (1) 2,4-D амин 4 (1680 талонов к.э./гектар) (2) триклопир (840 талонов к.э./гектар, GARLON(r)) ; (3) флуроксипир (840 талонов к.э./гектар, Starane(r)); или (4) МХФУ (талонов к.э./гектар 1680) . После применения триклопира, флуроксипира или МПКТ, основной симптоматикой на сое был тяжелый некроз и эпинастия. Оценки визуальных повреждений растений были сделаны для всех обработок по шкале оценки от 0% до 100%, где 0% представляли растения, эквивалентные необработанному контролю, и 100% представляли растения, которые были полностью мертвы. Все оценки были сделаны через семь дней после обработки. Все три трансформанта сои MON-HT1 показали
хорошую устойчивость к 2,4-D амину (2,4-D) в среднем с менее чем 7% повреждений посевов по сравнению с контрольной группой с 9097% повреждений посевов. Ни один трансформант сои не продемонстрировал устойчивости к триклопиру или флюроксипиру, при этом оценки повреждений во всех трех случаях в среднем составляли 81-97% посевов по сравнению с контрольной группой с 91% повреждений посевов. Один из трех трансформантов сои продемонстрировал низкий уровень устойчивости к МФХУ со средней оценкой повреждений 72%, тогда как два других трансформанты имели повреждения посевов равные 90% по сравнению с контрольной группой с 90% повреждений. См. Таблицу 22. Таблица 22.
Среднее повреждения % посевов сои для 4 образцов
Обработ ка
Гербицид
2Х норма (галлон к. э . /
гектар)
MON-HT1 Трансфер мант 1
MON-HT1 Трансфо рмант 2
MON-HT1 Трансфер мант 3
Контро ль
2,4-D амин
1680
4,5
6, 5
5,3
90,0
триклопир
840
81,3
90,0
90,0
91,3
флуроксипир
840
96, 3
93, 8
97, 5
91,3
МХФУ
1680
90,0
90,0
72, 5
90,0
Контроли
0,0
0,0
0,0
0,0
[00124] Для кукурузы использовали норму применения гербицида 4Х каждого из последующих компонентов: (1) 2,4-D амин 4 (3360 талонов к.э./гектар) (2) триклопир (1680 талонов к.э./гектар, GARLON(r)) ; (3) флуроксипир (1680 талонов к.э./гектар, Starane(r)); или (4) МХФУ (талонов к.э./гектар 3360). После обработки кукурузы триклопиром, флуроксипиром или МХФУ основной симптоматикой было полегание. Все три трансформанта кукурузы MON-HT1 показали хорошую устойчивость к 2,4-D амину (2,4-D) в среднем с менее чем 15% повреждений посевов по сравнению с контрольной группой с 43% повреждений посевов. Три трансформанта кукурузы MON-HT1, по-видимому, демонстрируют несколько низкую устойчивость к триклопиру с повреждениями посевов в среднем равными 2 6-37% по сравнению с контрольной группой с 47% повреждений посевов. Три трансформанта кукурузы
MON-HT1, по-видимому, демонстрируют несколько низкую
устойчивость к флуроксипиру с повреждениями посевов в среднем равными 2 0-21% по сравнению с контрольной группой с 55% повреждений посевов. Два трансформанта кукурузы MON-HT1 продемонстрировали хорошую устойчивость к МХФУ со средним повреждением посевов равным менее чем б% по сравнению с контрольной группой с 31% повреждением посевов. Третий трансформант кукурузы MON-HT1 имел среднюю оценку повреждений равную 20%. См. Таблицу 23. Эти результаты низкой устойчивости к триклопиру и флуроксипиру и хорошей устойчивости к МХФУ согласуются с ферментативными данными in vitro с очищенным ферментом MON-HT1.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Monsanto Technology LLC
<120> ГЕНЫ УСТОЙЧИВОСТИ К ГЕРБИЦИДАМ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> MONS:378WO
<150> US 62/064343
<151> 2014-10-15
<160> 61
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 1
Met His Ala Ala Leu Ser Pro Leu Ser Gln Arg Phe Glu Arg Ile Ala
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Ser Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Leu Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Val Ile Gly Asp Asp Trp His Thr
100 105 110
Asp Ser Ser Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Asp Val Pro Glu His Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Thr Ala Tyr Asp Ala Leu Ser Asp Gly Leu Lys Lys Leu Ile Ser Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Arg Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Gln Asn Arg Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Ala Asp Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Gly Ser Gly Arg Lys Gly Leu Tyr Val Asn Gln Val Tyr Cys Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Gly Met Ser Glu Lys Glu Ser Glu Pro Leu Leu Ser Phe Leu
225 230 235 240
Phe Ala His Ala Thr Lys Pro Glu Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Tyr Ala
260 265 270
Ile Asn Asp Tyr His Gly Gln Thr Arg Ile Leu His Arg Thr Thr Val
275 280 285
Gly Gly Val Arg Pro Ala Arg 290 295
<210> 2
<211> 906
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 2
atgcatgctg cactgtcccc cctctcccag cgctttgagc gcatcgcggt ccagccgctg 60
accggcgtcc tgggcgccga gatcaccggc gtcgacctgc gcgagccgct cagcgacagc 120
acctggaacg aaatcctcga cgcgttccac acttaccagg tcatctattt tcccggccag 180
gcgatcacca acgaacagca catcgccttc agccggcgct tcggccccgt cgatcccgtg 240
cccctgctca agagcatcga agggtatcca gaggtgcaga tgatccgccg cgaagccaac 300
gaaagcgggc gtgtgatcgg tgatgactgg cacaccgaca gcagcttcct ggacgcaccg 360
ccggccgccg tggtgatgcg cgcgatcgac gtgcccgagc atggcggcga caccggtttt 420
ctgagcatgt acaccgcgta tgatgcgctg tcggatggcc tgaagaaact gatcagcggg 480
ttgaacgtag tgcacagcgc cacgcgtgtg ttcggctcgc tctaccaggc ccagaaccgg 540
caccccctgg tggtgaccca tccgggcagc ggccgcaagg gcctgtacgt gaaccaggtc 660
tattgccagc gcatcgaggg catgagcgaa aaagaaagcg aaccgctgct gagcttcctg 720
tttgcgcatg cgacaaaacc ggaattcacc tgccgcgtgc gctggaagaa ggaccaggtc 780
ctggtctggg acaacctgtg cacgatgcac tatgccatta acgactacca tggccagacc 840
cgcattctgc atcgcaccac ggtcggtggc gtgcgcccgg cgcgccatca tcaccatcat 900
cactag 906
<210> 3 <211> 888 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 3
atgcacgccg ctctgagccc gcttagccag cgcttcgagc gcatcgccgt gcagccgctg 60
accggcgtgc taggcgctga gatcaccggc gttgacctga gggagccgct tagcgactcc 120
acctggaacg agatcctcga cgccttccac acttaccaag ttatctactt cccaggacag 180
gctatcacga acgaacagca catcgccttc tcgcggaggt tcgggccagt ggacccagtc 240
ccgctgctta agtctatcga aggctaccct gaggtgcaaa tgatccgccg cgaggcgaac 300
gaatccggga gggttattgg cgacgattgg cacactgact ccagcttcct cgatgctcct 360
ccagcagccg tcgtgatgcg ggccatcgac gtgccggagc acggcggcga tacgggtttc 420
ctgtccatgt acactgctta cgacgctctt tctgatggcc tcaagaaact catcagcgga 480
ctcaatgtgg tccactctgc gacccgtgtc tttggctcgc tctatcaggc gcagaatagg 540
cgcttcagca acacctccgt gaaggtcatg gacgtggcgg atggagacag ggagactgtc 600
cacccgctcg tcgttactca ccctgggtcc ggccgtaagg gtctgtacgt gaaccaggtg 660
tactgtcagc gaattgaggg tatgagtgag aaggagtccg agccgctgct cagtttcctc 720
ttcgcgcacg ccaccaagcc cgagttcacc tgccgcgtcc gctggaagaa ggatcaagtc 780
ctggtgtggg acaacctctg caccatgcac tacgccatca atgactatca tggtcaaacc 840
cggattcttc atcgcacaac ggttggcggc gtgagacctg cccggtga 888
<210> 4
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
Met His Ala Ala Leu Ser Pro Leu Ser Gln Arg Phe Glu Arg Ile Ala
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln Gln Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Leu Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Val Ile Gly Asp Asp Trp His Thr
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Asp Val Pro Glu His Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Thr Ala Tyr Asp Ala Leu Ser Asp Gly Leu Lys Lys Leu Ile Ser Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Arg Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Gln Asn Arg Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Gly Ser Gly Arg Lys Gly Leu Tyr Val Asn Gln Val Tyr Cys Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Gly Met Ser Glu Lys Glu Ser Glu Pro Leu Leu Ser Phe Leu
225 230 235 240
Phe Ala His Ala Thr Lys Pro Glu Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Tyr Ala
260 265 270
Ile Asn Asp Tyr His Gly Gln Thr Arg Ile Leu His Arg Thr Thr Val
275 280 285
Gly Gly Val Arg Pro Ala Arg 290 295
<210> 5 <211> 906 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 5
atgcatgctg cactgtcccc cctctcccag cgctttgagc gcatcgcggt ccagccgctg 60
accggcgtcc tgggcgccga gatcaccggc gtcgacctgc gcgagccgct cgacgacagc 120
acctggaacg aaatcctcga cgcgttccac acttaccagg tcatctattt tcccggccag 180
gcgatcacca acgaacagca gatcgccttc agccggcgct tcggccccgt cgatcccgtg 240
cccctgctca agagcatcga agggtatcca gaggtgcaga tgatccgccg cgaagccaac 300
gaaagcgggc gtgtgatcgg tgatgactgg cacaccgaca gcaccttcct ggacgcaccg 360
ccggccgccg tggtgatgcg cgcgatcgac gtgcccgagc atggcggcga caccggtttt 420
ctgagcatgt acaccgcgta tgatgcgctg tcggatggcc tgaagaaact gatcagcggg 480
ttgaacgtag tgcacagcgc cacgcgtgtg ttcggctcgc tctaccaggc ccagaaccgg 540
cgcttcagca acaccagcgt caaggtgatg gacgtcgacg cgggcgaccg tgaaaccgtg 600
caccccctgg tggtgaccca tccgggcagc ggccgcaagg gcctgtacgt gaaccaggtc 660
tattgccagc gcatcgaggg catgagcgaa aaagaaagcg aaccgctgct gagcttcctg 720
tttgcgcatg cgacaaaacc ggaattcacc tgccgcgtgc gctggaagaa ggaccaggtc 780
ctggtctggg acaacctgtg cacgatgcac tatgccatta acgactacca tggccagacc 840
cgcattctgc atcgcaccac ggtcggtggc gtgcgcccgg cgcgccatca tcaccatcat 900
cactag 906
<210> 6
<211> 888
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
accggcgtgc taggcgctga gatcaccggc gttgacctga gggagccgct tgacgactcc 120
acctggaacg agatcctcga cgccttccac acttaccaag ttatctactt cccaggacag 180
gctatcacga acgaacagca gatcgccttc tcgcggaggt tcgggccagt ggacccagtc 240
ccgctgctta agtctatcga aggctaccct gaggtgcaaa tgatccgccg cgaggcgaac 300
gaatccggga gggttattgg cgacgattgg cacactgact ccaccttcct cgatgctcct 360
ccagcagccg tcgtgatgcg ggccatcgac gtgccggagc acggcggcga tacgggtttc 420
ctgtccatgt acactgctta cgacgctctt tctgatggcc tcaagaaact catcagcgga 480
ctcaatgtgg tccactctgc gacccgtgtc tttggctcgc tctatcaggc gcagaatagg 540
cgcttcagca acacctccgt gaaggtcatg gacgtggacg cgggagacag ggagactgtc 600
cacccgctcg tcgttactca ccctgggtcc ggccgtaagg gtctgtacgt gaaccaggtg 660
tactgtcagc gaattgaggg tatgagtgag aaggagtccg agccgctgct cagtttcctc 720
ttcgcgcacg ccaccaagcc cgagttcacc tgccgcgtcc gctggaagaa ggatcaagtc 780
ctggtgtggg acaacctctg caccatgcac tacgccatca atgactatca tggtcaaacc 840
cggattcttc atcgcacaac ggttggcggc gtgagacctg cccggtga 888
<210> 7
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 7
Met His Ala Ala Leu Ser Pro Leu Ser Gln Arg Phe Glu Arg Ile Ala
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Ser Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Val Ile Gly Asp Asp Trp His Ser
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Asp Val Pro Glu His Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Thr Ala Tyr Asp Ala Leu Ser Asp Gly Leu Lys Lys Leu Ile Ser Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Arg Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Gln Asn Arg Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Gly Ser Gly Arg Lys Gly Leu Tyr Val Asn Gln Val Tyr Cys Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Gly Met Ser Glu Lys Glu Ser Glu Pro Leu Leu Ser Phe Leu
225 230 235 240
Phe Ala His Ala Thr Lys Pro Glu Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Tyr Ala
260 265 270
Ile Asn Asp Tyr His Gly Gln Thr Arg Ile Leu His Arg Thr Thr Val
275 280 285
Gly Gly Val Arg Pro Ala Arg 290 295
<210> 8
<211> 906
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
acctggaacg aaatcctcga cgcgttccac acttaccagg tcatctattt tcccggccag 180
gcgatcacca acgaacagca catcgccttc agccggcgct tcggccccgt cgatcccgtg 240
cccctgctca agagcatcga agggtatcca gaggtgcaga tgatccgccg cgaagccaac 300
gaaagcgggc gtgtgatcgg tgatgactgg cacagcgaca gcaccttcct ggacgcaccg 3 60
ccggccgccg tggtgatgcg cgcgatcgac gtgcccgagc atggcggcga caccggtttt 420
ctgagcatgt acaccgcgta tgatgcgctg tcggatggcc tgaagaaact gatcagcggg 480
ttgaacgtag tgcacagcgc cacgcgtgtg ttcggctcgc tctaccaggc ccagaaccgg 540
cgcttcagca acaccagcgt caaggtgatg gacgtcgacg cgggcgaccg tgaaaccgtg 600
caccccctgg tggtgaccca tccgggcagc ggccgcaagg gcctgtacgt gaaccaggtc 660
tattgccagc gcatcgaggg catgagcgaa aaagaaagcg aaccgctgct gagcttcctg 720
tttgcgcatg cgacaaaacc ggaattcacc tgccgcgtgc gctggaagaa ggaccaggtc 780
ctggtctggg acaacctgtg cacgatgcac tatgccatta acgactacca tggccagacc 840
cgcattctgc atcgcaccac ggtcggtggc gtgcgcccgg cgcgccatca tcaccatcat 900
cactag 906
<210> 9
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 9
Met His Ala Ala Leu Ser Pro Leu Ser Gln Arg Phe Glu Arg Ile Ala
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Val Leu Gly Asp Asp Trp His Thr
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Asp Val Pro Glu His Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Thr Ala Tyr Asp Ala Leu Ser Asp Gly Leu Lys Lys Leu Ile Ser Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Arg Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Gln Asn Arg Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Ala Asp Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Gly Ser Gly Arg Lys Gly Leu Tyr Val Asn Gln Val Tyr Cys Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Gly Met Ser Glu Lys Glu Ser Glu Pro Leu Leu Ser Phe Leu
225 230 235 240
Phe Ala His Ala Thr Lys Pro Glu Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Val Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Tyr Ala
260 265 270
Ile Asn Asp Tyr His Gly Gln Thr Arg Ile Leu His Arg Thr Thr Val
275 280 285
Gly Gly Val Arg Pro Ala Arg 290 295
<210> 10
<211> 906
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
acctggaacg aaatcctcga cgcgttccac acttaccagg tcatctattt tcccggccag 180
gcgatcacca acgaacagca catcgccttc agccggcgct tcggccccgt cgatcccgtg 240
cccctgctca agagcatcga agggtatcca gaggtgcaga tgatccgccg cgaagccaac 300
gaaagcgggc gtgtgctggg tgatgactgg cacaccgaca gcaccttcct ggacgcaccg 360
ccggccgccg tggtgatgcg cgcgatcgac gtgcccgagc atggcggcga caccggtttt 420
ctgagcatgt acaccgcgta tgatgcgctg tcggatggcc tgaagaaact gatcagcggg 480
ttgaacgtag tgcacagcgc cacgcgtgtg ttcggctcgc tctaccaggc ccagaaccgg 540
cgcttcagca acaccagcgt caaggtgatg gacgtcgcag atggcgaccg tgaaaccgtg 600
caccccctgg tggtgaccca tccgggcagc ggccgcaagg gcctgtacgt gaaccaggtc 660
tattgccagc gcatcgaggg catgagcgaa aaagaaagcg aaccgctgct gagcttcctg 720
tttgcgcatg cgacaaaacc ggaattcacc tgccgcgtgc gctggaagaa ggaccaggtc 780
gtggtctggg acaacctgtg cacgatgcac tatgccatta acgactacca tggccagacc 840
cgcattctgc atcgcaccac ggtcggtggc gtgcgcccgg cgcgccatca tcaccatcat 900
cactag 906
<210> 11
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 11
Met His Ala Ala Leu Ser Pro Leu Ser Gln Arg Phe Glu Arg Ile Ala
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Val Ile Gly Glu Asn Trp His Thr
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Tyr Ala
115 120 125
Lys Glu Ile Pro Pro Tyr Gly Gly Asp Thr Leu Phe Thr Ser Met Tyr
130 135 140
Thr Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Arg Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Gln Asn Arg Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Glu Thr Gly Arg Lys Gly Leu Tyr Val Asn Gln Val Tyr Cys Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Gly Met Ser Glu Lys Glu Ser Glu Pro Leu Leu Ser Phe Leu
225 230 235 240
Phe Ala His Ala Thr Lys Pro Glu Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Gln
245 250 255
Glu Gly Asp Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Gln His Tyr Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Gly Gly Val Arg Pro Ala Arg 290 295
<210> 12
<211> 906
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
acctggaacg aaatcctcga cgcgttccac acttaccagg tcatctattt tcccggccag 180
gcgatcacca acgaacagca catcgccttc agccggcgct tcggccccgt cgatcccgtg 240
cccctgctca agagcatcga agggtatcca gaggtgcaga tgatccgccg cgaagccaac 300
gaaagcgggc gtgtgatcgg tgaaaactgg cacaccgaca gcaccttcct ggacgcaccg 360
ccggccgccg tggtgatgta tgcgaaagaa attcccccgt atggcggcga caccctgttt 420
accagcatgt acaccgcgtg ggagacgctg tcgcccacca tgcaggccac catcgaaggg 480
ttgaacgtag tgcacagcgc cacgcgtgtg ttcggctcgc tctaccaggc ccagaaccgg 540
cgcttcagca acaccagcgt caaggtgatg gacgtcgacg cgggcgaccg tgaaaccgtg 600
caccccctgg tggtgaccca tccggaaacc ggccgcaagg gcctgtacgt gaaccaggtc 660
tattgccagc gcatcgaggg catgagcgaa aaagaaagcg aaccgctgct gagcttcctg 720
tttgcgcatg cgacaaaacc ggaattcacc tgccgcgtgc gctggcagga aggcgatgtc 780
ctggtctggg acaacctgtg cacgcagcac tatgccgtac ccgactacgc gggcaagttc 840
cgctacctga cgcgcaccac ggtcggtggc gtgcgcccgg cgcgccatca tcaccatcat 900
cactag 906
<210> 13 <211> 888 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 13
atgcacgccg ctctgagccc gcttagccag cgcttcgagc gcatcgccgt gcagccgctg 60
accggcgtgc taggcgctga gatcaccggc gttgacctga gggagccgct tgacgactcc 120
acctggaacg agatcctcga cgccttccac acttaccaag ttatctactt cccaggacag 180
gctatcacga acgaacagca catcgccttc tcgcggaggt tcgggccagt ggacccagtc 240
ccgctgctta agtctatcga aggctaccct gaggtgcaaa tgatccgccg cgaggcgaac 300
gaatccggga gggttattgg cgagaactgg cacactgact ccaccttcct cgatgctcct 360
ccagcagccg tcgtgatgta cgccaaggag atcccgccct acggcggcga tacgctcttc 420
acctccatgt acactgcttg ggagaccctt tctccgacca tgcaagccac catcgaggga 480
ctcaatgtgg tccactctgc gacccgtgtc tttggctcgc tctatcaggc gcagaatagg 540
cgcttcagca acacctccgt gaaggtcatg gacgtggacg ccggagacag ggagactgtc 600
cacccgctcg tcgttactca ccctgagacc ggccgtaagg gtctgtacgt gaaccaggtg 660
tactgtcagc gaattgaggg tatgagtgag aaggagtccg agccgctgct cagtttcctc 720
ctggtgtggg acaacctctg cacccagcac tacgccgtgc cggactatgc cgggaagttc 840 cgctacctta cccgcacaac ggttggcggc gtgagacctg cccggtga 888
<210> 14
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 14
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg Phe Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Ile Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Ser Arg Phe Ile Gly Asp Asp Trp His Thr
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Lys Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Thr Asn Trp Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Lys
210 215 220
Ile Gln Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Ser Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Lys Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> 15
<211> 906
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 15
atgcacgcgg ctctgacccc gcttaccaac aaataccgtt tcatcgacgt tcagccgctg 60
accggtgttt taggtgctga aatcaccggt gttgacctgc gtgaaccgct ggacgactct 120
acctggaacg aaatcctgga cgcgttccac acctaccagg ttatctactt cccgggtcag 180
gcgatcacca acgaacagca catcgcgttc tctcgtcgct tcggtccggt tgacccggtt 240
ccgattctca aatctatcga aggttacccg gaagttcaga tgatccgtcg cgaagcgaac 300
gaatctagcc gttttattgg tgacgattgg cacaccgact ccaccttcct ggacgcgccg 360
ccagctgcag ttgtgatgcg tgctattgaa gttccggaat acggtggcga caccggtttc 420
ctgtccatgt actctgcttg ggaaaccctg tccccgacca tgcaggctac cattgaaggt 480
ctgaacgttg tgcactccgc aaccaaagtg ttcggcagcc tgtaccaggc aaccaactgg 540
cgcttcagca acactagtgt gaaagtgatg gatgtggatg caggcgatcg tgagactgtg 600
cacccgctgg tggtaactca cccggttacc ggccgtcgtg cgctgtactg caaccaggta 660
tattgccaga aaattcaggg catgactgat gcagagtcaa aatctctgct ccaatttctg 720
tatgagcacg ccactaaatt tgattttact tgccgtgtcc gttggaaaaa ggatcaagta 780
ctggtatggg ataatctgtg tacgatgcac cgcgccgtac ctgattatgc cggcaaattt 840 cgctatttga cgcgcacgac agtcgcgggg gacaaacctt ctcgccatca ccatcatcat 900 cattag 906
<210> 16
<211> 888 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 16
atgcacgcgg cgctgactcc tctcaccaac aagtatcgct ttatcgacgt gcagccgctg 60
acaggcgtcc tcggtgcaga gattacaggc gtggatctgc gggagcctct cgatgacagc 120
acttggaatg agatcctgga cgcctttcac acctaccaag tgatctactt tccgggtcaa 180
gctatcacta acgagcagca catcgcgttc tcccgccggt tcggccctgt ggacccggtg 240
ccgatcttaa agagtatcga gggctatcca gaggtgcaga tgatacggcg cgaggcgaac 300
gagagcagcc ggttcatcgg agatgactgg cacaccgatt ccaccttcct ggacgctccg 360
cctgccgccg tggtgatgag agctatcgaa gtgccggagt atggaggtga cacaggcttc 420
ctctccatgt acagtgcctg ggagacactc tcgcctacga tgcaagctac catcgaaggc 480
ttaaacgtgg tccactcggc gacgaaggtc ttcgggtcat tgtaccaggc gactaattgg 540
cgcttctcga acaccagcgt gaaagtgatg gacgtggacg ccggagatag agagactgtg 600
cacccactcg tcgtgacgca tcctgttacg ggaaggcgcg cactctactg caaccaggtg 660
tactgccaga agatccaggg aatgacggac gcggagtcga agtccctgtt gcaattcctt 720
tacgagcacg ccaccaagtt cgacttcacc tgccgggtcc ggtggaagaa ggaccaagtc 780
ctggtgtggg acaacctgtg taccatgcac cgcgccgtcc cggactacgc tgggaaattc 840
agatacctga cccgcaccac cgtggcggga gacaagccgt cgcgttga 888
<210> 17
<211> 888
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 17
atgcacgcgg ctttgacacc tttgaccaac aagtatcggt tcatcgacgt tcaaccactc 60
acaggcgtgc tcggcgcaga gattaccgga gtggacctga gggagccctt agacgactcc 120
acttggaacg agatcctcga cgcctttcac acctaccaag ttatctactt tcctggacag 180
gcgatcacca acgagcagca cattgccttc tcaaggaggt tcggaccggt agatccagtt 240
gagtcctcac ggttcatagg cgacgattgg cacacagaca gcaccttcct tgacgctcct 360
ccggctgccg tggttatgcg cgcaatagag gtgccggagt acggcggcga taccggtttc 420
ctatcaatgt actctgcatg ggagacgctc tcaccaacga tgcaagccac cattgaaggt 480
ctaaacgtgg ttcactcagc tactaaggtc ttcggaagtc tttaccaggc gacgaattgg 540
aggttcagta acaccagtgt gaaggtgatg gatgtggacg ctggagacag ggagacggtg 600
catccactcg tagttacaca ccctgtaact ggacgcagag ccctttactg caaccaggtt 660
tactgccaga agatccaggg aatgactgat gcggagtcta agtccctgct tcaattcctc 720
tacgaacacg ccaccaaatt cgacttcact tgtcgtgttc ggtggaagaa ggaccaagtg 780
ctcgtgtggg ataacctttg caccatgcac cgagcagtac cagactacgc cgggaaattc 840
cgctatctca cccgcactac agtggccgga gacaagccta gccgctga 888
<210> 18
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 18
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg Phe Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Leu Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Ser Arg Val Ile Gly Asp Asp Trp His Ser
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Lys Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Thr Asn Trp Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Lys
210 215 220
Ile Gln Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Ser Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Lys Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Ala Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> 19 <211> 906
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 19
atgcacgcgg ctctgacccc gcttaccaac aaataccgtt tcatcgacgt tcagccgctg 60
accggtgttt taggtgctga aatcaccggt gttgacctgc gtgaaccgct ggacgactct 120
acctggaacg aaatcctgga cgcgttccac acctaccagg ttatctactt cccgggtcag 180
gcgatcacca acgaacagca catcgcgttc tctcgtcgct tcggtccggt tgacccggtt 240
ccgctgctca aatctatcga aggttacccg gaagttcaga tgatccgtcg cgaagcgaac 300
ccagctgcag ttgtgatgcg tgctattgaa gttccggaat acggtggcga caccggtttc 420
ctgtccatgt actctgcttg ggaaaccctg tccccgacca tgcaggctac cattgaaggt 480
ctgaacgttg tgcactccgc aaccaaagtg ttcggcagcc tgtaccaggc aaccaactgg 540
cgcttcagca acactagtgt gaaagtgatg gatgtggatg caggcgatcg tgagactgtg 600
cacccgctgg tggtaactca cccggttacc ggccgtcgtg cgctgtactg caaccaggta 660
tattgccaga aaattcaggg catgactgat gcagagtcaa aatctctgct ccaatttctg 720
tatgagcacg ccactaaatt tgattttact tgccgtgtcc gttggaaaaa ggatcaagta 780
ctggtatggg ataatctgtg tacgatgcac cgcgccgcgc ctgattatgc cggcaaattt 840
cgctatttga cgcgcacgac agtcgcgggg gacaaacctt ctcgccatca ccatcatcat 900
cattag 906
<210> 20 <211> 888 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 20
atgcacgcgg cgctgactcc tctcaccaac aagtatcgct ttatcgacgt gcagccgctg 60
acaggcgtcc tcggtgcaga gattacaggc gtggatctgc gggagcctct cgatgacagc 120
acttggaatg agatcctgga cgcctttcac acctaccaag tgatctactt tccgggtcaa 180
gctatcacta acgagcagca catcgcgttc tcccgccggt tcggccctgt ggacccggtg 240
ccgctgttaa agagtatcga gggctatcca gaggtgcaga tgatacggcg cgaggcgaac 300
gagagcagcc gggtgatcgg agatgactgg cactccgatt ccaccttcct ggacgctccg 360
cctgccgccg tggtgatgag agctatcgaa gtgccggagt atggaggtga cacaggcttc 420
ctctccatgt acagtgcctg ggagacactc tcgcctacga tgcaagctac catcgaaggc 480
ttaaacgtgg tccactcggc gacgaaggtc ttcgggtcat tgtaccaggc gactaattgg 540
cgcttctcga acaccagcgt gaaagtgatg gacgtggacg ccggagatag agagactgtg 600
cacccactcg tcgtgacgca tcctgttacg ggaaggcgcg cactctactg caaccaggtg 660
tactgccaga agatccaggg aatgacggac gcggagtcga agtccctgtt gcaattcctt 720
tacgagcacg ccaccaagtt cgacttcacc tgccgggtcc ggtggaagaa ggaccaagtc 780
ctggtgtggg acaacctgtg taccatgcac cgcgccgccc cggactacgc tgggaaattc 840
agatacctga cccgcaccac cgtggcggga gacaagccgt cgcgttga 888
<211> 888 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 21
atgcacgcag cccttactcc actgacgaac aagtatcgct tcatcgacgt gcagccactc 60
acgggtgtac tcggagccga gatcacggga gtggatctgc gcgagccgct cgatgactct 120
acatggaacg agatcctaga cgctttccac acttatcaag ttatctactt tccaggacaa 180
gccatcacta acgagcaaca catcgcgttc tcacgtcggt tcgggcctgt tgatcctgtg 240
ccgctcctca agtcaatcga gggttatcca gaagttcaga tgatccggcg cgaggctaat 300
gagtcatccc gtgttatcgg tgatgactgg cactcggaca gtacattcct cgacgcacca 360
ccggccgcag ttgtgatgag ggctatcgaa gtgccggaat acggtggtga cactgggttc 420
ctgtcaatgt actctgcatg ggagaccctt agtcccacta tgcaagcaac catcgaaggg 480
ctcaacgttg tgcattcagc tactaaagta ttcggttccc tttatcaggc gacaaactgg 540
cggttcagca ataccagtgt taaagttatg gatgtggatg ctggagacag ggaaacggtc 600
caccctcttg tcgtcacgca cccagttaca gggcgtcgag cgctttactg caatcaggtg 660
tactgtcaga agattcaagg aatgaccgat gcggagtcca aatcactgtt acaattcttg 720
tacgagcacg ccactaagtt cgatttcacg tgccgagtgc gctggaagaa ggatcaagtg 780
ctcgtttggg acaacttgtg caccatgcac cgggcagctc ccgactacgc gggcaagttc 840
cgttatctca ctcgcacaac tgtcgctgga gacaagccct cccgatga 888
<210> 22
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 22
Met His Ala Ala Leu Ser Pro Leu Ser Gln Arg Phe Glu Arg Ile Ala
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Leu Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Val Ile Gly Asp Asp Trp His Thr
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Tyr Ala
115 120 125
Lys Glu Val Pro Pro Tyr Gly Gly Asp Thr Leu Phe Ala Ser Met Tyr
130 135 140
Thr Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Arg Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Gln Asn Arg Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Glu Thr Gly Arg Lys Gly Leu Tyr Val Asn Gln Val Tyr Cys Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Gly Met Ser Glu Lys Glu Ser Glu Pro Leu Leu Ser Phe Leu
225 230 235 240
Phe Ala His Ala Thr Lys Pro Glu Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Gln
245 250 255
Glu Gly Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Gln His Phe Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Gly Gly Val Arg Pro Ala Arg 290 295
<210> <211> <212>
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 23
atgcacgcgg ctctgagccc gcttagccag cgtttcgaac gtatcgcggt tcagccgctg 60
accggtgttt taggtgctga aatcaccggt gttgacctgc gtgaaccgct ggacgactct 120
acctggaacg aaatcctgga cgcgttccac acctaccagg ttatctactt cccgggtcag 180
gcgatcacca acgaacagca catcgcgttc tctcgtcgct tcggtccggt tgacccggtt 240
ccgctgctca aatctatcga aggttacccg gaagttcaga tgatccgtcg cgaagcgaac 300
gaatctggtc gtgttattgg tgacgactgg cacaccgact ctaccttcct ggacgcgccg 360
ccagctgcag ttgtgatgta cgctaaagaa gtgccgccat acggtggcga caccctgttc 420
gcgtccatgt acaccgcttg ggaaaccctg tccccgacca tgcaggctac cattgaaggt 480
ctgaacgttg tgcactccgc aactcgtgtt ttcggctccc tgtaccaggc acagaaccgt 540
cgcttcagca acactagcgt taaagtgatg gatgtggatg caggcgatcg tgaaactgtg 600
cacccgctgg tggtaactca cccggaaact ggccgtaaag gcctgtacgt gaaccaggta 660
tattgccagc gtattgaagg catgagtgag aaagagtcgg agccgctgct ctcatttctg 720
tttgcacacg ccactaaacc agagtttact tgccgtgtcc gttggcaaga gggccaggta 780
ctggtatggg ataatctgtg tacgcaacac ttcgccgtac ctgattatgc cggcaagttt 840
cgctatttga cgcgcacgac agtcggcggg gtccgccctg cccgccatca ccatcaccat 900
cattag 906
<210> 24 <211> 888 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 24
atgcacgcgg ccctgtctcc tctgtcccag cggttcgagc gcatcgcggt ccagccgcta 60
acgggtgtcc tgggcgcgga aatcaccgga gttgatctga gagagccttt agacgacagc 120
acctggaacg agatcctcga tgcctttcac acataccaag ttatctactt tcccggccaa 180
gccatcacga acgagcagca catcgcgttt agccggaggt ttggcccggt tgatccggtt 240
cctctgctta agtcaattga gggttaccca gaggtgcaga tgatccgccg cgaggccaac 300
gaatctgggc gtgtcatagg cgacgattgg catacggaca gcacctttct cgacgctcct 360
ccggccgcag tcgtgatgta cgcgaaggag gtgccgcctt acggcggcga taccctgttc 420
gcgtcgatgt acacggcctg ggagacgctc agcccgacca tgcaagccac aatagagggt 480
cggttctcga acacatcagt caaggtgatg gacgtggatg ccggagatcg tgaaactgtt 600
cacccacttg tggtcaccca tccagagacg ggaaggaaag gactttacgt gaaccaggtg 660
tactgccagc ggatcgaggg catgtccgag aaggagagtg agccattgct gagctttcta 720
ttcgcgcacg caactaagcc cgagttcacg tgccgcgtcc gatggcaaga gggccaagtt 780
ctcgtctggg ataacttgtg cacacagcac ttcgcggttc ccgattacgc cggaaagttc 840
cgctatctca cacgcaccac tgtgggaggc gttcgtcccg cgcggtga 888
<210> 25
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 25
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg Phe Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Leu Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Val Ile Gly Asp Asp Trp His Thr
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Tyr Ala
115 120 125
Arg Glu Val Pro Pro Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Thr Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Arg Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Gln Asn Arg Arg Tyr Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Ser His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Ser Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Lys Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> 26
<211> 906
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 26
atgcacgcgg ctctgacccc gcttaccaac aaataccgtt tcatcgacgt tcagccgctg 60
accggtgttt taggtgctga aatcaccggt gttgacctgc gtgaaccgct ggacgactct 120
acctggaacg aaatcctgga cgcgttccac acctaccagg ttatctactt cccgggtcag 180
gcgatcacca acgaacagca catcgcgttc tctcgtcgct tcggtccggt tgacccggtt 240
ccgctgctca aatctatcga aggttacccg gaagttcaga tgatccgtcg cgaagcgaac 300
gaatctggtc gtgttattgg tgacgattgg cacaccgact ccaccttcct ggacgcgccg 360
ccagctgcag ttgtgatgta cgctcgtgaa gttccgccgt acggtggcga caccggtttc 420
ctgtccatgt acaccgcttg ggaaaccctg tccccgacca tgcaggctac cattgaaggt 480
ctgaacgttg tgcactccgc aacccgtgtg ttcggcagcc tgtaccaggc acagaaccgt 540
cacccgctgg tggtatctca cccggttacc ggccgtcgtg cgctgtactg caaccaggta 660
tattgccagc gtattgaggg catgactgat gcagagtcaa aatctctgct ccaatttctg 720
tatgagcacg ccactaaatt tgattttact tgccgtgtcc gttggaaaaa ggatcaagta 780
ctggtatggg ataatctgtg tacgatgcac cgcgccgtac ctgattatgc cggcaaattt 840
cgctatttga cgcgcacgac agtcgcgggg gacaaacctt ctcgccatca ccatcatcat 900
cattag 906
<210> 27 <211> 888
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 27
atgcacgctg ctctgactcc actcacaaac aagtaccggt tcatcgacgt gcaaccgctg 60
accggcgtct tgggtgcgga aatcaccggc gtggacttgc gggagccgct ggatgacagc 120
acatggaacg agatcctcga tgcgttccac acctaccaag tgatctattt cccaggccag 180
gccattacga acgagcagca catcgcgttc agtcgaaggt tcgggcctgt ggacccggtt 240
ccgctgctta agagtatcga gggctacccg gaagtacaga tgattcgccg cgaagcgaat 300
gagtccgggc gagtgatcgg cgatgactgg cacaccgaca gcacgttcct cgacgcgccg 360
cctgccgctg tcgtgatgta cgcacgggag gtgccaccct acggcggaga tacgggattc 420
ctttcaatgt acacggcatg ggagacactc tctccgacca tgcaagcaac gatagagggc 480
ttgaacgtgg tgcactccgc cacgagggtc ttcggcagcc tctaccaagc ccagaaccgc 540
cggtactcca acactagcgt gaaagtgatg gacgtggatg cgggcgaccg ggagaccgtg 600
catcctctag ttgtgagcca cccggtgact ggccgacggg cgctgtactg caaccaggtc 660
tattgccagc gcatcgaggg catgaccgac gcggagtcga aatctctgct ccaattcctg 720
tacgagcacg ccacgaagtt cgacttcacc tgccgggttc gctggaagaa ggatcaagtg 780
ctagtgtggg acaacctctg cactatgcac agggctgtgc cggactatgc tggcaaattc 840
cgttacctta cccggaccac tgtggcgggc gacaagccaa gcagatga 888
<210> 28
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg Phe Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Leu Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Val Ile Gly Asp Asp Trp His Thr
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Lys Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Thr Asn Trp Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Lys
210 215 220
Ile Gln Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Ser Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Lys Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> 29 <211> 906 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 29
atgcacgcgg ctctgacccc gcttaccaac aaataccgtt tcatcgacgt tcagccgctg 60
accggtgttt taggtgctga aatcaccggt gttgacctgc gtgaaccgct ggacgactct 120
acctggaacg aaatcctgga cgcgttccac acctaccagg ttatctactt cccgggtcag 180
gcgatcacca acgaacagca catcgcgttc tctcgtcgct tcggtccggt tgacccggtt 240
ccgctgctca aatctatcga aggttacccg gaagttcaga tgatccgtcg cgaagcgaac 300
gaatctggtc gtgttattgg tgacgattgg cacaccgact ccaccttcct ggacgcgccg 360
ccagctgcag ttgtgatgcg tgctattgaa gttccggaat acggtggcga caccggtttc 420
ctgtccatgt actctgcttg ggaaaccctg tccccgacca tgcaggctac cattgaaggt 480
ctgaacgttg tgcactccgc aaccaaagtg ttcggcagcc tgtaccaggc aaccaactgg 540
cgcttcagca acactagtgt gaaagtgatg gatgtggatg caggcgatcg tgagactgtg 600
cacccgctgg tggtaactca cccggttacc ggccgtcgtg cgctgtactg caaccaggta 660
tattgccaga aaattcaggg catgactgat gcagagtcaa aatctctgct ccaatttctg 720
tatgagcacg ccactaaatt tgattttact tgccgtgtcc gttggaaaaa ggatcaagta 780
ctggtatggg ataatctgtg tacgatgcac cgcgccgtac ctgattatgc cggcaaattt 840
cgctatttga cgcgcacgac agtcgcgggg gacaaacctt ctcgccatca ccatcatcat 900
cattag 906
<210> 30
<211> 888
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
acaggcgtcc tcggtgcaga gattacaggc gtggatctgc gggagcctct cgatgacagc 120
acttggaatg agatcctgga cgcctttcac acctaccaag tgatctactt tccgggtcaa 180
gctatcacta acgagcagca catcgcgttc tcccgccggt tcggccctgt ggacccggtg 240
ccgctgttaa agagtatcga gggctatcca gaggtgcaga tgatacggcg cgaggcgaac 300
gagagcggcc gggtgatcgg agatgactgg cacaccgatt ccaccttcct ggacgctccg 360
cctgccgccg tggtgatgag agctatcgaa gtgccggagt atggaggtga cacaggcttc 420
ctctccatgt acagtgcctg ggagacactc tcgcctacga tgcaagctac catcgaaggc 480
ttaaacgtgg tccactcggc gacgaaggtc ttcgggtcat tgtaccaggc gactaattgg 540
cgcttctcga acaccagcgt gaaagtgatg gacgtggacg ccggagatag agagactgtg 600
cacccactcg tcgtgacgca tcctgttacg ggaaggcgcg cactctactg caaccaggtg 660
tactgccaga agatccaggg aatgacggac gcggagtcga agtccctgtt gcaattcctt 720
tacgagcacg ccaccaagtt cgacttcacc tgccgggtcc ggtggaagaa ggaccaagtc 780
ctggtgtggg acaacctgtg taccatgcac cgcgccgtcc cggactacgc tgggaaattc 840
agatacctga cccgcaccac cgtggcggga gacaagccgt cgcgttga 888
<210> 31
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 31
Met His Ala Ala Leu Ser Pro Leu Ser Gln Lys Tyr Arg Phe Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Thr
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Asn Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Leu Leu
Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Val Ile Gly Asp Asp Trp His Thr
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Tyr Ala
115 120 125
Arg Glu Val Pro Pro Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Asp Thr Leu Ser Asp Thr Met Lys Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Arg Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Gln Asn Arg Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Ser His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Pro Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Arg Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> 32
<211> 906
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
acctggaacg aaatcctgga cgcgttccac acctaccagg ttatctactt cccgggtcag 180
gcgatcacca acgaacagca catcgcgttc tctcgtcgct tcggtccggt tgacccggtt 240
ccgctgctca aatctatcga aggttacccg gaagttcaga tgatccgtcg cgaagcgaac 300
gaatctggtc gtgttattgg tgacgattgg cacaccgact ccaccttcct ggacgcgccg 3 60
ccagctgcag ttgtgatgta cgctcgtgaa gttccgccgt acggtggcga caccggtttc 420
ctgtccatgt actctgcttg ggacaccctg tccgacacca tgaaagctac cattgaaggt 480
ctgaacgttg tgcactccgc aacccgtgtg ttcggcagcc tgtaccaggc acagaaccgt 540
cgcttcagca acactagtgt gaaagtgatg gatgtggatg caggcgatcg tgagactgtg 600
cacccgctgg tggtatctca cccggttacc ggccgtcgtg cgctgtactg caaccaggta 660
tattgccagc gtattgaggg catgactgat gcagagtcaa aaccactgct ccaatttctg 720
tatgagcacg ccactcgttt tgattttact tgccgtgtcc gttggaaaaa ggatcaagta 780
ctggtatggg ataatctgtg tacgatgcac cgcgccgtac ctgattatgc cggcaaattt 840
cgctatttga cgcgcacgac agtcgcgggg gacaaacctt ctcgccatca ccatcatcat 900
cattag 906
<210> 33 <211> 888 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 33
atgcacgccg ccctctctcc tcttagccag aagtaccgat tcatcgacgt ccagccgctc 60
actggcgtac tgggcgctga gataacgggt gtgaccctga gggagccgct ggacgacaac 120
acttggaacg agatccttga cgccttccat acttatcaag ttatctactt tcctggacaa 180
gcgattacga atgagcagca catcgcgttc tcccggaggt tcgggccagt cgatccggtg 240
ccgctactca agtccatcga aggataccca gaagtccaga tgatccgtcg tgaggcaaac 300
gagtccggcc gggtcatcgg cgacgattgg cacaccgact ctaccttcct tgacgcgcct 360
ccggccgcag tggtcatgta cgcccgcgag gtgcctccct acggcggcga tacgggcttc 420
ctcagtatgt actctgcatg ggacacccta agcgacacca tgaaggccac catcgaaggt 480
ctgaacgtcg tgcactcggc aacacgagtc ttcggatcac tctaccaagc acagaatcgc 540
cgcttctcga acacctcggt taaggtgatg gacgtggatg cgggtgacag ggaaaccgtt 600
catcctctgg tggtctcgca tccggttacg ggacgccgcg ctctctactg caaccaggtg 660
tactgtcaaa ggatcgaagg aatgacagat gctgagagca agccgttgct ccaattcctc 720
ctagtctggg acaacctctg caccatgcac cgggccgtgc cggactatgc tgggaaattc 840 cgttacctga cccgcacgac cgtcgcggga gacaagccgt cgagatga 888
<210> 34
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 34
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg Phe Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Leu Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Val Ile Gly Asp Asp Trp His Ala
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Lys Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Thr Asn Trp Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Lys
210 215 220
Ile Gln Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Ser Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Lys Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ser
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> 35 <211> 906
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 35
atgcacgcgg ctctgacccc gcttaccaac aaataccgtt tcatcgacgt tcagccgctg 60
accggtgttt taggtgctga aatcaccggt gttgacctgc gtgaaccgct ggacgactct 120
acctggaacg aaatcctgga cgcgttccac acctaccagg ttatctactt cccgggtcag 180
gcgatcacca acgaacagca catcgcgttc tctcgtcgct tcggtccggt tgacccggtt 240
ccgctgctca aatctatcga aggttacccg gaagttcaga tgatccgtcg cgaagcgaac 300
gaatctggtc gtgttattgg tgacgattgg cacgcggact ccaccttcct ggacgcgccg 360
ccagctgcag ttgtgatgcg tgctattgaa gttccggaat acggtggcga caccggtttc 420
ctgtccatgt actctgcttg ggaaaccctg tccccgacca tgcaggctac cattgaaggt 480
ctgaacgttg tgcactccgc aaccaaagtg ttcggcagcc tgtaccaggc aaccaactgg 540
cgcttcagca acactagtgt gaaagtgatg gatgtggatg caggcgatcg tgagactgtg 600
cacccgctgg tggtaactca cccggttacc ggccgtcgtg cgctgtactg caaccaggta 660
tattgccaga aaattcaggg catgactgat gcagagtcaa aatctctgct ccaatttctg 720
tatgagcacg ccactaaatt tgattttact tgccgtgtcc gttggaaaaa ggatcaagta 780
cgctatttga cgcgcacgac agtcgcgggg gacaaacctt ctcgccatca ccatcatcat 900
cattag 906
<210> 36 <211> 888 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 36
atgcacgcgg cgctgactcc tctcaccaac aagtatcgct ttatcgacgt gcagccgctg 60
acaggcgtcc tcggtgcaga gattacaggc gtggatctgc gggagcctct cgatgacagc 120
acttggaatg agatcctgga cgcctttcac acctaccaag tgatctactt tccgggtcaa 180
gctatcacta acgagcagca catcgcgttc tcccgccggt tcggccctgt ggacccggtg 240
ccgctgttaa agagtatcga gggctatcca gaggtgcaga tgatacggcg cgaggcgaac 300
gagagcggcc gggtgatcgg agatgactgg cacgccgatt ccaccttcct ggacgctccg 360
cctgccgccg tggtgatgag agctatcgaa gtgccggagt atggaggtga cacaggcttc 420
ctctccatgt acagtgcctg ggagacactc tcgcctacga tgcaagctac catcgaaggc 480
ttaaacgtgg tccactcggc gacgaaggtc ttcgggtcat tgtaccaggc gactaattgg 540
cgcttctcga acaccagcgt gaaagtgatg gacgtggacg ccggagatag agagactgtg 600
cacccactcg tcgtgacgca tcctgttacg ggaaggcgcg cactctactg caaccaggtg 660
tactgccaga agatccaggg aatgacggac gcggagtcga agtccctgtt gcaattcctt 720
tacgagcacg ccaccaagtt cgacttcacc tgccgggtcc ggtggaagaa ggaccaagtc 780
ctggtgtggg acaacctgtg taccatgcac cgctccgtcc cggactacgc tgggaaattc 840
agatacctga cccgcaccac cgtggcggga gacaagccgt cgcgttga 888
<210> 37
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 37
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg Phe Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Ile Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Val Ile Gly Asp Asp Trp His Thr
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Lys Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Thr Asn Trp Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Lys
210 215 220
Ile Gln Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Ser Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Lys Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ser
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Gly Asn Ala Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> 38
<211> 906
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 38
atgcacgcgg ctctgacccc gcttaccaac aaataccgtt tcatcgacgt tcagccgctg 60
accggtgttt taggtgctga aatcaccggt gttgacctgc gtgaaccgct ggacgactct 120
acctggaacg aaatcctgga cgcgttccac acctaccagg ttatctactt cccgggtcag 180
gcgatcacca acgaacagca catcgcgttc tctcgtcgct tcggtccggt tgacccggtt 240
ccgattctca aatctatcga aggttacccg gaagttcaga tgatccgtcg cgaagcgaac 300
gaatctggtc gtgttattgg tgacgattgg cacaccgact ccaccttcct ggacgcgccg 360
ccagctgcag ttgtgatgcg tgctattgaa gttccggaat acggtggcga caccggtttc 420
ctgtccatgt actctgcttg ggaaaccctg tccccgacca tgcaggctac cattgaaggt 480
ctgaacgttg tgcactccgc aaccaaagtg ttcggcagcc tgtaccaggc aaccaactgg 540
cgcttcagca acactagtgt gaaagtgatg gatgtggatg caggcgatcg tgagactgtg 600
cacccgctgg tggtaactca cccggttacc ggccgtcgtg cgctgtactg caaccaggta 660
tattgccaga aaattcaggg catgactgat gcagagtcaa aatctctgct ccaatttctg 720
tatgagcacg ccactaaatt tgattttact tgccgtgtcc gttggaaaaa ggatcaagta 780
ctggtatggg ataatctgtg tacgatgcac cgcagcgtac ctgattatgg caatgcgttt 840
cgctatttga cgcgcacgac agtcgcgggg gacaaacctt ctcgccatca ccatcatcat 900
cattag 906
<210> 39
<211> 888
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 39
atgcacgcgg cgctgactcc tctcaccaac aagtatcgct ttatcgacgt gcagccgctg 60
acaggcgtcc tcggtgcaga gattacaggc gtggatctgc gggagcctct cgatgacagc 120
acttggaatg agatcctgga cgcctttcac acctaccaag tgatctactt tccgggtcaa 180
gctatcacta acgagcagca catcgcgttc tcccgccggt tcggccctgt ggacccggtg 240
gagagcggcc gggtgatcgg agatgactgg cacaccgatt ccaccttcct ggacgctccg 360
cctgccgccg tggtgatgag agctatcgaa gtgccggagt atggaggtga cacaggcttc 420
ctctccatgt acagtgcctg ggagacactc tcgcctacga tgcaagctac catcgaaggc 480
ttaaacgtgg tccactcggc gacgaaggtc ttcgggtcat tgtaccaggc gactaattgg 540
cgcttctcga acaccagcgt gaaagtgatg gacgtggacg ccggagatag agagactgtg 600
cacccactcg tcgtgacgca tcctgttacg ggaaggcgcg cactctactg caaccaggtg 660
tactgccaga agatccaggg aatgacggac gcggagtcga agtccctgtt gcaattcctt 720
tacgagcacg ccaccaagtt cgacttcacc tgccgggtcc ggtggaagaa ggaccaagtc 780
ctggtgtggg acaacctgtg taccatgcac cgctccgtcc cggactacgg caacgccttc 840
agatacctga cccgcaccac cgtggcggga gacaagccgt cgcgttga 888
<210> 40
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 40
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg Phe Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Ala Gln Gln Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ser Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Leu Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Ile Leu Gly Asp Asp Trp His Thr
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Asp Thr Leu Ser Asp Thr Met Lys Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Arg Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Gln Asn Trp Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Ser His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Cys Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Lys Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Arg Pro Ala Arg 290 295
<210> 41
<211> 906
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 41
atgcacgcgg ctctgacccc gcttaccaac aaataccgtt tcatcgacgt tcagccgctg 60
accggtgttt taggtgctga aatcaccggt gttgacctgc gtgaaccgct ggacgactct 120
acctggaacg aaatcctgga cgcgttccac acctaccagg ttatctactt cccggcgcag 180
cagatcacca acgaacagca catctctttc tctcgtcgct tcggtccggt tgacccggtt 240
ccgctgctca aatctatcga aggttacccg gaagttcaga tgatccgtcg cgaagcgaac 300
ccagctgcag ttgtgatgcg tgctattgaa gttccggaat acggtggcga caccggtttc 420
ctgtccatgt actctgcttg ggacaccctg tccgacacca tgaaagctac cattgaaggt 480
ctgaacgttg tgcactccgc aacccgtgtg ttcggcagcc tgtaccaggc acagaactgg 540
cgcttcagca acactagtgt gaaagtgatg gatgtggatg caggcgatcg tgagactgtg 600
cacccgctgg tggtatctca cccggttacc ggccgtcgtg cgctgtactg caaccaggta 660
tattgccagc gtattgaggg catgactgat gcagagtcaa aatgcctgct ccaatttctg 720
tatgagcacg ccactaaatt tgattttact tgccgtgtcc gttggaaaaa ggatcaagta 780
ctggtatggg ataatctgtg tacgatgcac cgcgccgtac ctgattatgc cggcaaattt 840
cgctatttga cgcgcacgac agtcgcgggg gaccgccctg cccgccatca ccatcatcat 900
cattag 906
<210> 42 <211> 888 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 42
atgcacgccg ccttaacgcc actcacgaac aagtatcgct tcatcgacgt ccagccgctc 60
actggcgtgc taggtgctga gatcaccggc gttgatctcc gcgagcctct tgacgactcg 120
acctggaacg agatcctgga tgccttccac acttaccaag tgatctactt cccggcccaa 180
cagatcacaa acgagcagca catctccttt agtaggcgat tcggtccagt cgatccggtg 240
ccgctcctca agtcgattga gggctacccg gaggtccaga tgattcgtag ggaagccaac 300
gagtcaggcc gtattctggg cgacgactgg catacggact ccactttcct agacgcacct 360
ccggctgccg tcgtcatgag ggctattgaa gtgccggagt acggcggcga taccggattc 420
ctctctatgt actccgcctg ggacacgctc tcagacacca tgaaggccac gatagagggc 480
ctgaacgttg tgcactccgc aacgagagta ttcggatctc tgtaccaggc acagaactgg 540
cggttcagta acacgagcgt gaaagtcatg gacgtggacg ctggcgacag ggaaactgtt 600
cacccgttgg tcgtttccca ccctgtcact ggtcgccggg cactttactg caaccaggtg 660
tactgtcagc gcattgaggg catgacggat gctgagtcga agtgccttct ccaattcttg 720
tacgagcacg cgacaaagtt cgatttcacg tgccgggtcc gatggaagaa ggaccaagtg 780
ctagtgtggg acaacctttg cacgatgcac cgcgctgtcc cggattacgc cggaaagttc 840
cgttacctca ccagaacaac agttgccggt gacagacccg cgagatga 888
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 43
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg Phe Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Cys Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Leu Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Ile Leu Gly Asp Asp Trp His Thr
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Asp Thr Leu Ser Asp Thr Met Lys Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Arg Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Gln Asn Trp Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Ser His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Cys
225 230 235
Leu Leu Gln Phe Leu
240
Tyr Glu His Ala Thr Lys Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Leu Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Asp Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> 44 <211> 906
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 44
atgcacgcgg ctctgacccc gcttaccaac aaataccgtt tcatcgacgt tcagccgctg 60
tgcggtgttt taggtgctga aatcaccggt gttgacctgc gtgaaccgct ggacgactct 120
acctggaacg aaatcctgga cgcgttccac acctaccagg ttatctactt cccgggtcag 180
gcgatcacca acgaacagca catcgcgttc tctcgtcgct tcggtccggt tgacccggtt 240
ccgctgctca aatctatcga aggttacccg gaagttcaga tgatccgtcg cgaagcgaac 300
gaatctggtc gtatcctggg tgacgattgg cacaccgact ccaccttcct ggacgcgccg 360
ccagctgcag ttgtgatgcg tgctattgaa gttccggaat acggtggcga caccggtttc 420
ctgtccatgt actctgcttg ggacaccctg tccgacacca tgaaagctac cattgaaggt 480
ctgaacgttg tgcactccgc aacccgtgtg ttcggcagcc tgtaccaggc acagaactgg 540
cgcttcagca acactagtgt gaaagtgatg gatgtggatg caggcgatcg tgagactgtg 600
cacccgctgg tggtatctca cccggttacc ggccgtcgtg cgctgtactg caaccaggta 660
tattgccagc gtattgaggg catgactgat gcagagtcaa aatgcctgct ccaatttctg 720
tatgagcacg ccactaaatt tgattttact tgccgtgtcc gttggaaaaa ggatcaagta 780
ctggtatggg ataatctgtg tacgatgcac ctggccgtac ctgattatga cggcaaattt 840
cgctatttga cgcgcacgac agtcgcgggg gacaaacctt ctcgccatca ccatcatcat 900
cattag 906
<211> 888 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 45
atgcacgcgg ctctcacacc gctcacaaac aagtaccgct tcattgacgt gcagccgctg 60
tgtggcgtcc tgggcgcaga aatcacgggc gtggatctcc gcgagcctct ggacgacagc 120
acctggaacg aaatcctgga tgctttccac acttaccaag tgatctactt tcccggacaa 180
gccatcacta acgagcagca catcgctttc tcacggcgct tcggcccggt agatccggtg 240
ccgctactca agtcaattga aggctatccg gaggtgcaaa tgattcgccg cgaagctaac 300
gagagcgggc gcatactggg cgacgactgg catactgact ccaccttcct cgatgctcca 360
ccagccgcag tggtgatgcg tgccatcgaa gttcccgagt atggtggcga cacgggtttc 420
ctgtctatgt actccgcttg ggatacactg tctgacacga tgaaggctac catcgagggc 480
ctgaatgtcg tccacagtgc tacgcgcgtg ttcggctcac tgtaccaggc gcagaactgg 540
aggttcagca acaccagtgt caaggtgatg gacgttgatg ctggagacag ggaaactgtg 600
catcctcttg tggtctccca tccagttacc gggaggagag cactctactg caaccaggtt 660
tactgccagc gcatcgaggg catgaccgat gcggagtcga agtgtctgtt acagttcttg 720
tacgagcacg cgacgaagtt cgacttcacg tgccgggtgc ggtggaagaa ggaccaagtt 780
ctcgtctggg acaatctctg cacgatgcac ctcgccgttc ccgactacga cggcaaattc 840
agatacttga cccgaacaac agtagcggga gataagcctt cccgttga 888
<210> 46
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 46
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg Phe Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Ile Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Ser Arg Tyr Ile Gly Asp Asp Trp His Ala
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Lys Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Thr Asn Trp Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Lys
210 215 220
Ile Gln Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Ser Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Lys Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> <211> <212>
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 47
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg Phe Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Ile Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Ser Arg Tyr Ile Gly Asp Asp Trp His Ala
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Lys Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Thr Asn Trp Arg Phe Ser Gly Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Lys
210 215 220
Ile Gln Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Ser Leu Leu Gln Phe Leu
Tyr Glu His Ala Thr Gln Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> 48
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 48
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg His Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Ile Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Ser Arg Tyr Ile Gly Asp Asp Trp His Ala
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Lys Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Thr Asn Trp Arg Phe Ser Gly Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Lys
210 215 220
Ile Gln Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Ser Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Gln Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> 49
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 49
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg His Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Ile Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Ser Arg Tyr Ile Gly Asp Asp Trp His Ala
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Ala Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Lys Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Thr Asn Trp Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Ile Tyr Cys Gln Lys
210 215 220
Ile Gln Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Ser Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Gln Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 50
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg Phe Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Ile Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Ser Arg Tyr Ile Gly Asp Asp Trp His Ala
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Lys Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Thr Asn Trp Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Ile Tyr Cys Gln Lys
210 215 220
Ile Gln Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Ser Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Gln Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> 51
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 51
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg Phe Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Ile Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Ser Arg Tyr Ile Gly Asp Asp Trp His Ala
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
Ser Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Lys Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Thr Asn Trp Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Lys
210 215 220
Ile Gln Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Ser Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Gln Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> 52
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 52
Met His Ala Ala Leu Thr Pro Leu Thr Asn Lys Tyr Arg His Ile Asp
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Ile Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Ser Arg Tyr Ile Gly Asp Asp Trp His Ala
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Ser Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Lys Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Thr Asn Trp Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Val Thr Gly Arg Arg Ala Leu Tyr Cys Asn Gln Val Tyr Cys Gln Lys
210 215 220
Ile Gln Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Ser Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Gln Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Ala Gly Asp Lys Pro Ser Arg 290 295
<210> 53
<211> 888
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная <400> 53
atgcacgcgg ctttgacacc tttgaccaac aagtatcggt tcatcgacgt tcaaccactc 60
acaggcgtgc tcggcgcaga gattaccgga gtggacctga gggagccctt agacgactcc 120
acttggaacg agatcctcga cgcctttcac acctaccaag ttatctactt tcctggacag 180
gcgatcacca acgagcagca cattgccttc tcaaggaggt tcggaccggt agatccagtt 240
ccaattctca aatccattga gggttatccc gaggtgcaga tgattagacg agaagccaac 300
gagtcctcac ggtacatagg cgacgattgg cacgcagaca gcaccttcct tgacgctcct 360
ccggctgccg tggttatgcg cgcaatagag gtgccggagt acggcggcga taccggtttc 420
ctatcaatgt actctgcatg ggagacgctc tcaccaacga tgcaagccac cattgaaggt 480
ctaaacgtgg ttcactcagc tactaaggtc ttcggaagtc tttaccaggc gacgaattgg 540
aggttcagta acaccagtgt gaaggtgatg gatgtggacg ctggagacag ggagacggtg 600
catccactcg tagttacaca ccctgtaact ggacgcagag ccctttactg caaccaggtt 660
tactgccaga agatccaggg aatgactgat gcggagtcta agtccctgct tcaattcctc 720
tacgaacacg ccaccaaatt cgacttcact tgtcgtgttc ggtggaagaa ggaccaagtg 780
ctcgtgtggg ataacctttg caccatgcac cgagcagtac cagactacgc cgggaaattc 840
cgctatctca cccgcactac agtggccgga gacaagccta gccgctga 888
<210> 54
<211> 888
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 54
atgcacgcgg ctttgacacc tttgaccaac aagtatcggt tcatcgacgt tcaaccactc 60
acaggcgtgc tcggcgcaga gattaccgga gtggacctga gggagccctt agacgactcc 120
acttggaacg agatcctcga cgcctttcac acctaccaag ttatctactt tcctggacag 180
gcgatcacca acgagcagca cattgccttc tcaaggaggt tcggaccggt agatccagtt 240
ccaattctca aatccattga gggttatccc gaggtgcaga tgattagacg agaagccaac 300
gagtcctcac ggtacatagg cgacgattgg cacgcagaca gcaccttcct tgacgctcct 360
ccggctgccg tggttatgcg cgcaatagag gtgccggagt acggcggcga taccggtttc 420
ctaaacgtgg ttcactcagc tactaaggtc ttcggaagtc tttaccaggc gacgaattgg 540
aggttcagtg gaaccagtgt gaaggtgatg gatgtggacg ctggagacag ggagacggtg 600
catccactcg tagttacaca ccctgtaact ggacgcagag ccctttactg caaccaggtt 660
tactgccaga agatccaggg aatgactgat gcggagtcta agtccctgct tcaattcctc 720
tacgaacacg ccacccaatt cgacttcact tgtcgtgttc ggtggaagaa ggaccaagtg 780
ctcgtgtggg ataacctttg caccatgcac cgagcagtac cagactacgc cgggaaattc 840
cgctatctca cccgcactac agtggccgga gacaagccta gccgctga 888
<210> 55 <211> 888 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 55
atgcacgcgg ctttgacacc tttgaccaac aagtatcggc atatcgacgt tcaaccactc 60
acaggcgtgc tcggcgcaga gattaccgga gtggacctga gggagccctt agacgactcc 120
acttggaacg agatcctcga cgcctttcac acctaccaag ttatctactt tcctggacag 180
gcgatcacca acgagcagca cattgccttc tcaaggaggt tcggaccggt agatccagtt 240
ccaattctca aatccattga gggttatccc gaggtgcaga tgattagacg agaagccaac 300
gagtcctcac ggtacatagg cgacgattgg cacgcagaca gcaccttcct tgacgctcct 360
ccggctgccg tggttatgcg cgcaatagag gtgccggagt acggcggcga taccggtttc 420
ctatcaatgt actctgcatg ggagacgctc tcaccaacga tgcaagccac cattgaaggt 480
ctaaacgtgg ttcactcagc tactaaggtc ttcggaagtc tttaccaggc gacgaattgg 540
aggttcagtg gaaccagtgt gaaggtgatg gatgtggacg ctggagacag ggagacggtg 600
catccactcg tagttacaca ccctgtaact ggacgcagag ccctttactg caaccaggtt 660
tactgccaga agatccaggg aatgactgat gcggagtcta agtccctgct tcaattcctc 720
tacgaacacg ccacccaatt cgacttcact tgtcgtgttc ggtggaagaa ggaccaagtg 780
ctcgtgtggg ataacctttg caccatgcac cgagcagtac cagactacgc cgggaaattc 840
cgctatctca cccgcactac agtggccgga gacaagccta gccgctga 888
<210> 56
<211> 888
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 56
atgcacgcgg ctttgacacc tttgaccaac aagtatcggc atatcgacgt tcaaccactc 60
acaggcgtgc tcggcgcaga gattaccgga gtggacctga gggagccctt agacgactcc 120
acttggaacg agatcctcga cgcctttcac acctaccaag ttatctactt tcctggacag 180
gcgatcacca acgagcagca cattgccttc tcaaggaggt tcggaccggt agatccagtt 240
ccaattctca aatccattga gggttatccc gaggtgcaga tgattagacg agaagccaac 300
gagtcctcac ggtacatagg cgacgattgg cacgcagaca gcaccttcct tgacgctcct 360
ccggctgccg tggttatgcg cgcaatagag gtgccggagt acggcggcga taccggtttc 420
ctatcaatgt actctgcatg ggagacgctc tcaccagcta tgcaagccac cattgaaggt 480
ctaaacgtgg ttcactcagc tactaaggtc ttcggaagtc tttaccaggc gacgaattgg 540
aggttcagta acaccagtgt gaaggtgatg gatgtggacg ctggagacag ggagacggtg 600
catccactcg tagttacaca ccctgtaact ggacgcagag ccctttactg caaccagatt 660
tactgccaga agatccaggg aatgactgat gcggagtcta agtccctgct tcaattcctc 720
tacgaacacg ccacccaatt cgacttcact tgtcgtgttc ggtggaagaa ggaccaagtg 780
ctcgtgtggg ataacctttg caccatgcac cgagcagtac cagactacgc cgggaaattc 840
cgctatctca cccgcactac agtggccgga gacaagccta gccgctga 888
<210> 57 <211> 888 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 57
atgcacgcgg ctttgacacc tttgaccaac aagtatcggt tcatcgacgt tcaaccactc 60
acaggcgtgc tcggcgcaga gattaccgga gtggacctga gggagccctt agacgactcc 120
acttggaacg agatcctcga cgcctttcac acctaccaag ttatctactt tcctggacag 180
gcgatcacca acgagcagca cattgccttc tcaaggaggt tcggaccggt agatccagtt 240
ccaattctca aatccattga gggttatccc gaggtgcaga tgattagacg agaagccaac 300
gagtcctcac ggtacatagg cgacgattgg cacgcagaca gcaccttcct tgacgctcct 360
ccggctgccg tggttatgcg cgcaatagag gtgccggagt acggcggcga taccggtttc 420
ctatcaatgt actctgcatg ggagacgctc tcaccaacga tgcaagccac cattgaaggt 480
ctaaacgtgg ttcactcagc tactaaggtc ttcggaagtc tttaccaggc gacgaattgg 540
aggttcagta acaccagtgt gaaggtgatg gatgtggacg ctggagacag ggagacggtg 600
catccactcg tagttacaca ccctgtaact ggacgcagag ccctttactg caaccagatt 660
tacgaacacg ccacccaatt cgacttcact tgtcgtgttc ggtggaagaa ggaccaagtg 780
ctcgtgtggg ataacctttg caccatgcac cgagcagtac cagactacgc cgggaaattc 840
cgctatctca cccgcactac agtggccgga gacaagccta gccgctga 888
<210> 58
<211> 888
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 58
atgcacgcgg ctttgacacc tttgaccaac aagtatcggt tcatcgacgt tcaaccactc 60
acaggcgtgc tcggcgcaga gattaccgga gtggacctga gggagccctt agacgactcc 120
acttggaacg agatcctcga cgcctttcac acctaccaag ttatctactt tcctggacag 180
gcgatcacca acgagcagca cattgccttc tcaaggaggt tcggaccggt agatccagtt 240
ccaattctca aatccattga gggttatccc gaggtgcaga tgattagacg agaagccaac 300
gagtcctcac ggtacatagg cgacgattgg cacgcagaca gcaccttcct tgacgctcct 360
ccggctgccg tggttatgcg cgcaatagag gtgccggagt acggcggcga taccggtttc 420
ctatcaatgt actctgcatg ggagacgctc tcaccaacga tgcaagccac cattgaaggt 480
ctaaacgtgg ttcactcagc tactaaggtc ttcggaagtc tttaccaggc gacgaattgg 540
aggttcagta acaccagtgt gaaggtgatg gatgtggacg ctggagacag ggagacggtg 600
catccactcg tagttacaca ccctgtaact ggacgcagag ccctttactg caaccaggtt 660
tactgccaga agatccaggg aatgactgat gcggagtcta agtccctgct tcaattcctc 720
tacgaacacg ccacccaatt cgacttcact tgtcgtgttc ggtggaagaa ggaccaagtg 780
ctcgtgtggg ataacctttg caccatgcac cgagcagtac cagactacgc cgggaaattc 840
cgctatctca cccgcactac agtggccgga gacaagccta gccgctga 888
<210> 59
<211> 888 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Рекомбинантная
<400> 59
atgcacgcgg ctttgacacc tttgaccaac aagtatcggc atatcgacgt tcaaccactc 60
acaggcgtgc tcggcgcaga gattaccgga gtggacctga gggagccctt agacgactcc 120
acttggaacg agatcctcga cgcctttcac acctaccaag ttatctactt tcctggacag 180
ccaattctca aatccattga gggttatccc gaggtgcaga tgattagacg agaagccaac 300
gagtcctcac ggtacatagg cgacgattgg cacgcagaca gcaccttcct tgacgctcct 360
ccggctgccg tggttatgcg cgcaatagag gtgccggagt acggcggcga taccggtttc 420
ctatcaatgt actctgcatg ggagacgctc tcaccaacga tgcaagccac cattgaaggt 480
ctaaacgtgg ttcactcagc tactaaggtc ttcggaagtc tttaccaggc gacgaattgg 540
aggttcagta acaccagtgt gaaggtgatg gatgtggacg ctggagacag ggagacggtg 600
catccactcg tagttacaca ccctgtaact ggacgcagag ccctttactg caaccaggtt 660
tactgccaga agatccaggg aatgactgat gcggagtcta agtccctgct tcaattcctc 720
tacgaacacg ccacccaatt cgacttcact tgtcgtgttc ggtggaagaa ggaccaagtg 780
ctcgtgtggg ataacctttg caccatgcac cgagcagtac cagactacgc cgggaaattc 840
cgctatctca cccgcactac agtggccgga gacaagccta gccgctga 888
<210> 60 <211> 295
<212> PRT
<213> Sphingobium herbicidovorans
<400> 60
Met His Ala Ala Leu Ser Pro Leu Ser Gln Arg Phe Glu Arg Ile Ala
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Leu Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Gly Arg Val Ile Gly Asp Asp Trp His Thr
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Asp Val Pro Glu His Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Thr Ala Trp Glu Thr Leu Ser Pro Thr Met Gln Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Arg Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Ala Gln Asn Arg Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Gly Ser Gly Arg Lys Gly Leu Tyr Val Asn Gln Val Tyr Cys Gln Arg
210 215 220
Ile Glu Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Pro Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Arg Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Arg Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Gly Gly Val Arg Pro Ala Arg 290 295
<210> 61
<211> 295
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная последовательность
<220>
<221> отличительная особенность
<222> (6)..(6)
<223> Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221> отличительная особенность
<222> (9)..(14)
<223> Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<221> <222> <223>
отличительная особенность
(16)..(16)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ (21)..(21)
Thr может быть Cys
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(32)..(32)
Asp может быть Thr
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(38)..(38)
Asp может быть Ser
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(40)..(40)
Ser может быть Asn
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(59)..(59)
Gly может быть Ala
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(61)..(61)
Ala может быть Gln
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(67)..(67)
His может быть Gln
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(69)..(69)
Ala может быть Ser
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(82)..(82)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(103)..(103)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(105)..(105)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220> <221> <222> <223>
<220> <221>
<222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(108)..(108)
Asp может быть Glu
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(109)..(109)
Asp может быть Asn
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(112)..(112)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(115)..(115)
Thr может быть Ser
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(127)..(127)
Arg может быть Tyr
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(129)..(129)
Ile может быть Arg or Lys
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(130)..(130)
Glu может быть Asp
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(131)..(131)
Val может быть Ile
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(133)..(133)
Glu может быть Pro
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(134)..(134)
Tyr может быть His
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(139)..(139)
Gly может быть Leu
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(141)..(141)
Leu может быть Thr or Ala
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(147)..(147)
Trp может быть Tyr
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(148)..(148)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(149)..(149)
Thr может быть Ala
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(152)..(152)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(153)..(153)
Thr может быть Gly or Ala
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(154)..(154)
Met может быть Leu
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(155)..(155)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(156)..(156)
Ala может быть Lys
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(157)..(157)
Thr может быть Leu
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(159)..(159)
Glu может быть Ser
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(169)..(169)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220> <221> <222>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(182)..(182)
Phe может быть Tyr
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(184)..(184)
Asn может быть Gly
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(193)..(193)
Asp может быть Ala
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(194)..(194)
Ala может быть Asp
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(206)..(206)
Thr может быть Ser
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(209)..(209)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(210)..(210)
Thr может быть Ser
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(213)..(214)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(217)..(217)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(220)..(220)
Val может быть Ile
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(224)..(224)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220> <221>
<222> <223>
(229)..(229)
Thr может быть Ser
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(230)..(230)
Asp может быть Glu
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(231)..(231)
Ala может быть Lys
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(234)..(234)
Lys может быть Glu
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(235)..(235)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(238)..(238)
Gln может быть Ser
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(241)..(241)
Tyr может быть Phe
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(242)..(242)
Glu может быть Ala
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(246)..(246)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(247)..(247)
Phe может быть Pro
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(248)..(248)
Asp может быть Glu
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(256)..(256)
Lys может быть Gln
<221> <222> <223>
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(258)..(258)
Asp может быть Gly
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
<220> <221> <222> <223>
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(259)..(259)
Gln может быть Asp
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(269)..(269)
Met может быть Gln
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(271)..(271)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(272)..(272)
Ala может быть Ser
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(273)..(273)
Val может быть Ala or Ile
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(274)..(274)
Pro может быть Asn
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(277)..(277)
Ala может быть Asp or Gly or His
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(278)..(278)
Gly может быть Asn
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(279)..(279)
Lys может быть Ala or Gln
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(280)..(280)
Phe может быть Thr
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(282)..(282)
Tyr может быть Ile
<220>
<221> ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
<222> (289)..(289)
<223> Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221> ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
<222> (291)..(292)
<223> Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<220>
<221> ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
<222> (294)..(294)
<223> Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<400> 61
Met His Ala Ala Leu Xaa Pro Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Xaa
1 5 10 15
Val Gln Pro Leu Thr Gly Val Leu Gly Ala Glu Ile Thr Gly Val Asp
20 25 30
Leu Arg Glu Pro Leu Asp Asp Ser Thr Trp Asn Glu Ile Leu Asp Ala
35 40 45
Phe His Thr Tyr Gln Val Ile Tyr Phe Pro Gly Gln Ala Ile Thr Asn
50 55 60
Glu Gln His Ile Ala Phe Ser Arg Arg Phe Gly Pro Val Asp Pro Val
65 70 75 80
Pro Xaa Leu Lys Ser Ile Glu Gly Tyr Pro Glu Val Gln Met Ile Arg
85 90 95
Arg Glu Ala Asn Glu Ser Xaa Arg Xaa Ile Gly Asp Asp Trp His Xaa
100 105 110
Asp Ser Thr Phe Leu Asp Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Met Arg Ala
115 120 125
Ile Glu Val Pro Glu Tyr Gly Gly Asp Thr Gly Phe Leu Ser Met Tyr
130 135 140
Xaa Ala Trp Xaa Thr Leu Ser Xaa Thr Met Xaa Ala Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
Leu Asn Val Val His Ser Ala Thr Xaa Val Phe Gly Ser Leu Tyr Gln
165 170 175
Asp Ala Gly Asp Arg Glu Thr Val His Pro Leu Val Val Thr His Pro
195 200 205
Xaa Thr Gly Arg Xaa Xaa Leu Tyr Xaa Asn Gln Val Tyr Cys Gln Xaa
210 215 220
Ile Xaa Gly Met Thr Asp Ala Glu Ser Lys Xaa Leu Leu Gln Phe Leu
225 230 235 240
Tyr Glu His Ala Thr Xaa Phe Asp Phe Thr Cys Arg Val Arg Trp Lys
245 250 255
Lys Asp Gln Val Leu Val Trp Asp Asn Leu Cys Thr Met His Xaa Ala
260 265 270
Val Pro Asp Tyr Ala Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Arg Thr Thr Val
275 280 285
Xaa Gly Xaa Xaa Pro Xaa Arg
290 295
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Рекомбинантная молекула ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который имеет по меньшей мере 92% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, и 46-52.
2. Рекомбинантная молекула ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что нуклеотидную последовательность выбирают из группы, состоящей из SEQ ID N0:2, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45, и 53-59.
3. Рекомбинантная молекула ДНК по п. 1, отличающаяся тем, что рекомбинантная молекула ДНК функционально связана с гетерологичным промотором, функциональным в растительной клетке.
4. Рекомбинантная молекула ДНК по п. 3, отличающаяся тем, что рекомбинантная молекула ДНК дополнительно функционально связана с молекулой ДНК, кодирующей транзитный пептид хлоропласта.
5. ДНК-конструкция, содержащая гетерологичный промотор функциональный в растительной клетке, функционально связанная с рекомбинантной молекулой ДНК по п. 1.
6. ДНК-конструкция по п. 5, дополнительно содержащая молекулу ДНК, кодирующую транзитный пептид хлоропласта, функционально связанная с рекомбинантной молекулой ДНК.
7. ДНК-конструкция по п. 5, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, и 46-52.
8. ДНК-конструкция по п. 5, отличающаяся тем, что ДНК-конструкция присутствует в геноме трансгенного растения.
9. Растение, семя, растительная ткань, часть растения или клетка, содержащие рекомбинантную молекулу ДНК по п. 1.
10. Растение, семя, растительная ткань, часть растения или клетка по п. 9, отличающиеся тем, что растение, семя,
1.
растительная ткань, часть растения или клетка содержат
устойчивость к по меньшей мере одному гербициду, выбранному из
группы, состоящей из гербицидов на основе
арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот, гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
11. Растение, семя, растительная ткань, часть растения или клетка, содержащие ДНК-конструкцию по п. 5.
12. Растение, семя, растительная ткань, часть растения или клетка, содержащие полипептид, который кодируется рекомбинантной молекулой ДНК по п. 1.
13. Полипептид, имеющий по меньшей мере 92% идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52.
14. Полипептид по п. 13, отличающийся тем, что полипептид имеет оксигеназную активность против по меньшей мере одного гербицида, выбранного из группы, состоящей из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП) , гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
15. Способ придания растению, семени, клетке или части растения устойчивости к гербициду, включающий стадию, на которой полипептид по п. 13 экспрессируют в указанном растении, семени, клетке или части растения.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанное растение, семя, клетка или часть растения содержит ДНК-конструкцию, содержащую гетерологичный промотор функциональный в растительной клетке, которая функционально связана с рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который имеет по меньшей мере 92% идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, и 46-52.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что растение, семя, клетка или часть растения содержат устойчивость к по меньшей мере одному гербициду, выбранному из группы, состоящей из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП),
11.
гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
18. Способ получения устойчивого к гербицидам трансгенного растения, включающий стадию, в которой трансформируют растительную клетку или ткань рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
а) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид,
содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из
группы, состоящей из SEQ ID N0:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25,
28, 31, 34, 37, 40, 43, и 46-52;
б) нуклеотидной последовательности, выбранной из группы,
состоящей из SEQ ID N0:2, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17,
18, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39,
41, 42, 44, 45 и 53-59; и
в) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид,
имеющий по меньшей мере около 92% идентичности с аминокислотной
последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID
N0:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, и 46-
52, и способный придать трансгенному растению устойчивость к
гербициду;
и стадию, в которой регенерируют трансгенное растение, устойчивое к гербицидам, из трансформированной растительной клетки или ткани.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанное
трансгенное растение, устойчивое к гербицидам, содержит
устойчивость по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из
группы, состоящей из гербицидов на основе
арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе
феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
20. Способ борьбы с сорняками на участке произрастания растений, включающий стадию, в которой воздействуют на участок произрастания растений, содержащую растение или семя, содержащее рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий по меньшей мере 92% идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной
19.
из группы, состоящей из SEQ ID N0: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52, по меньшей мере одним гербицидом, выбранным из группы, состоящей из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот, причем растение или семя устойчиво к по меньшей мере одному гербициду.
По доверенности
LH244
SEQ ID N0:11
Фиг. 1А
20°С/20°С 28°С/20°С 38 °С/30 °С
Фиг. 1Б
20°С/20°С 28°С/20°С 38°С/30°С
Фиг. 1В
Нативная SEQ ID N0:11
SEQ ID N0:18 SEQ ID N0:34 SEQ ID N0:14 SEQ ID N0:37 Нативная
SEQ ID N0:18 SEQ ID N0:34 SEQ ID N0:14 SEQ ID N0:37 Нативная
20 40 60
Температура реакции {"С)
Фиг. 2А
"l l l I I l 0 10 20 30 40 50 60 70 Температура реакции (°C)
Фиг. 2Б
о 4
cts
0 10 20 30 40 50 60 70 Температура реакции (°C)
Фиг. 2B
MHAALSPLSQRFERIAVQPLTGVLGAEITGV|LREPLDD|TWNEIL DAFHTYQVIYFPGQ0ITNEQH ijfSRRFGPVDPVPQ-KS IEGYPEV QMI RREANES§^0I GDDWbJjDS^ LDAPPAAWMRAIDVPEHGGDT GFpSMY^AWETLSPTMQAT I EGLNWHSAT§/FGSLYQA^iRRFSN
TSVKVMDVDAGDRETVHPL VVTHPg5RK|LYVNQVYCQR I EGMT@ AESK0LLQFLYEHATJ DFTCRVRWKKDQVLVWDNLCTgHRA^PDY AGKFRYLTRTTVGGVRP@R
Фиг. 3
4/11
Квизалофоп 20°С/20°С
1 5.00
| 4,00
И 3,00
2 2,00
| 1,00
f 0.00
28°С/20°С
^-1 п I ^. I ^, I _х. I _х. I " UT3 CNI ОО ""ф ""st" М
Tl csi CNJ
О О О О О О
о is:
z z Z Z Z Z
?3 О О О О О
о О О О О О
Ш ш Ш Ш Ш Ш
^ СЛ 00 СО СО СЛ
i Ф
ш о
х Ф zr О
5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00
Фиг. 4Б
38°С/30°С
ФИГ. 4В
2 i a>
100,0 80.0 60,0
40,0 20,0 0,0
2,4-D 20°C/20°C
1*1
Г*1
ю см
см см
. \
N0:
N0;
N0:
N0:
О i | j
111
i t i
Фиг. 4Г
100,0 80,0
60,0 40,0 20,0 0,0
38°С/30°С
Я га га
" ч
' <
ю см оо -^i- -^j-
7; м м т- ю 1-
Q о О О О О
z Z Z Z Z. Z
Q Q Q Q Q Q
о о о о о о
Ш LU Ш UJ Ш Ш
СО ОО со со со
Фиг. 4Д
Квизалофоп
Квизалофоп
Контроль F1
M0N-HT2
+ТПХ
M0N-HT2
без ТПХ
Контроль F1
Фиг. 5А
Фиг. 5Б
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
N0:60
N0:1
N0:4
N0:7
N0:9
N0:11
N0:14
N0:18
N0:22
N0:25
N0:28
N0:31
N0:34
N0:37
N0:40
N0:43
N0:46
N0:47
N0:48
N0:49
N0:50
N0:51
N0:52
Консенсус
• [!1 • fWL]t|GVLGAEI TGV|d|LREPLdDsTWNE ILDAFHTYQVIYFРдЩГГмЩпМ 70
Фиг. 6A
SEQ ID SEQ ID SEQ SEQ SEQ
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
N0:60
N0:1
N0:4
N0:7
N0:9
N0:11
N0:14
N0:18
N0:22
N0:25
N0:28
N0:31
N0:34
N0:37
N0:40
N0:43
N0:46
N0:47
N0:48
N0:49
N0:50
N0:51
N0:52
VPEHGG VPEH3G VlPEHSd VPEHXDTGF
:Y: :Y; 3Y: 3Y; •Y: 3Y: IK
Y3GI
fpPYGGDTLF
iGDTGF
mm ц ц ц
:Y; :Y:
Ц > GI ;G
iGI
;G №G
:Y: :Y: :Y: :Y:
Консенсус
jSRRFGPVDPVPj• LKSI EGYPEVQMIRREANES • Щ• i|ddg-
Фиг. 6Б
tFLDAPPAAVVMrfli ечЩеуЩЩ 140
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
N0:60
N0:1
N0:4
N0:7
N0:9
N0:11
N0:14
N0:18
N0:22
N0:25
N0:28
N0:31
N0:34
N0:37
N0:40
N0:43
N0:46
N0:47
N0:48
N0:49
N0:50
N0:51
N0:52
Консенсус
Щи- 1Щ- tm• at|l|e|GLNWHSATl*^FGSLYQA|*R -Rf^[rSVKVMDVMq^DRETVHPLV^tp^• t 210
Фиг. 6B
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
SEQ ID
N0:60
N0:1
N0:4
N0:7
N0:9
N0:11
N0:14
N0:18
N0:22
N0:25
N0:28
N0:31
N0:34
N0:37
N0:40
N0:43
N0:46
N0:47
N0:48
N0:49
N0:50
N0:51
N0:52
Консенсус
•LY-№v№l-C§tdaf§k-^ 280
Фиг. 6Г
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
N0:60
N0:1
N0:4
N0:7
N0:9
N0:11
N0:14
N0:18
N0:22
N0:25
N0:28
N0:31
N0:34
N0:37
N0:40
N0:43
N0:46
N0:47
N0:48
N0:49
N0:50
N0:51
N0:52
TTV33VI TTV3SVI TTVA3D WTWA3D RTTV33VI RYLTRTTVA3 RYLTRTTVAS YLTFTTVA3
RTTVA3 YLTRTTVA3
?YLTI
YLT;
TTVA3 TTVA3
YLT]
YiLTl YLT]
RTTjVAG)
ктшз кттшз
lYLTRTTVAGL
Консенсус PygtRTTVj-^- P R 295
Фиг. 6Д
cgcttcagca acaccagcgt caaggtgatg gacgtcgcag atggcgaccg tgaaaccgtg 600
<400> 4
cgcttcagca acaccagcgt caaggtgatg gacgtcgcag atggcgaccg tgaaaccgtg 600
<400> 4
<400> 6
<400> 6
atgcacgccg ctctgagccc gcttagccag cgcttcgagc gcatcgccgt gcagccgctg 60
atgcacgccg ctctgagccc gcttagccag cgcttcgagc gcatcgccgt gcagccgctg 60
Pro Leu Leu
Pro Leu Leu
accggcgtcc tgggcgccga gatcaccggc gtcgacctgc gcgagccgct cagcgacagc 120
<400> 8
atgcatgctg cactgtcccc cctctcccag cgctttgagc gcatcgcggt ccagccgctg
Pro Leu Leu
accggcgtcc tgggcgccga gatcaccggc gtcgacctgc gcgagccgct cgacgacagc 120
accggcgtcc tgggcgccga gatcaccggc gtcgacctgc gcgagccgct cgacgacagc 120
Pro Leu Leu
Pro Leu Leu
<400> 12
atgcatgctg cactgtcccc cctctcccag cgctttgagc gcatcgcggt ccagccgctg
<400> 12
atgcatgctg cactgtcccc cctctcccag cgctttgagc gcatcgcggt ccagccgctg
accggcgtcc tgggcgccga gatcaccggc gtcgacctgc gcgagccgct cgacgacagc 120
accggcgtcc tgggcgccga gatcaccggc gtcgacctgc gcgagccgct cgacgacagc 120
ttcgcgcacg ccaccaagcc cgagttcacc tgccgcgtcc gctggcaaga gggcgacgtc 780
ttcgcgcacg ccaccaagcc cgagttcacc tgccgcgtcc gctggcaaga gggcgacgtc 780
ccaattctca aatccattga gggttatccc gaggtgcaga tgattagacg agaagccaac 300
gaatctagcc gtgttattgg tgacgattgg cacagcgact ccaccttcct ggacgcgccg 360
gaatctagcc gtgttattgg tgacgattgg cacagcgact ccaccttcct ggacgcgccg 360
<210> 21
<210> 21
906
ДНК
906
ДНК
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
ctaaatgtgg tccactccgc gacgcgggtg ttcgggagcc tctaccaggc gcagaacaga 540
ctaaatgtgg tccactccgc gacgcgggtg ttcgggagcc tctaccaggc gcagaacaga 540
cgctacagca acactagtgt gaaagtgatg gatgtggatg caggcgatcg tgagactgtg 600
<400> 28
cgctacagca acactagtgt gaaagtgatg gatgtggatg caggcgatcg tgagactgtg 600
<400> 28
<400> 30
<400> 30
atgcacgcgg cgctgactcc tctcaccaac aagtatcgct ttatcgacgt gcagccgctg 60
atgcacgcgg cgctgactcc tctcaccaac aagtatcgct ttatcgacgt gcagccgctg 60
atgcacgcgg cgctgactcc tctcaccaac aagtatcgct ttatcgacgt gcagccgctg 60
atgcacgcgg cgctgactcc tctcaccaac aagtatcgct ttatcgacgt gcagccgctg 60
<400> 32
atgcacgcgg ctctgagccc gcttagccag aaataccgtt tcatcgacgt tcagccgctg
<400> 32
atgcacgcgg ctctgagccc gcttagccag aaataccgtt tcatcgacgt tcagccgctg
accggtgttt taggtgctga aatcaccggt gttaccctgc gtgaaccgct ggacgacaac 120
accggtgttt taggtgctga aatcaccggt gttaccctgc gtgaaccgct ggacgacaac 120
tatgaacacg caacaaggtt cgacttcacc tgccgggttc gatggaagaa ggatcaagtg 780
tatgaacacg caacaaggtt cgacttcacc tgccgggttc gatggaagaa ggatcaagtg 780
ctggtatggg ataatctgtg tacgatgcac cgcagcgtac ctgattatgc cggcaaattt 840
ctggtatggg ataatctgtg tacgatgcac cgcagcgtac ctgattatgc cggcaaattt 840
ccgatcttaa agagtatcga gggctatcca gaggtgcaga tgatacggcg cgaggcgaac 300
gaatctggtc gtatcctggg tgacgattgg cacaccgact ccaccttcct ggacgcgccg 360
gaatctggtc gtatcctggg tgacgattgg cacaccgact ccaccttcct ggacgcgccg 360
<210> 43
<210> 43
<210> 45
<210> 45
295
PRT
295
PRT
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
225
230
240
235
225
230
240
235
50 55 60
<210> 50
130 135 140
ctatcaatgt actctgcatg ggagacgctc tcaccaacga tgcaagccac cattgaaggt 480
tactgccaga agatccaggg aatgactgat gcggagtcta agtccctgct tcaattcctc 720
tactgccaga agatccaggg aatgactgat gcggagtcta agtccctgct tcaattcctc 720
gcgatcacca acgagcagca cattgccttc tcaaggaggt tcggaccggt agatccagtt 240
gcgatcacca acgagcagca cattgccttc tcaaggaggt tcggaccggt agatccagtt 240
<220>
<220>
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(106)..(106)
Ile может быть Leu
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(106)..(106)
Ile может быть Leu
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(145)..(145)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(145)..(145)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(178)..(178)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(180)..(180)
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(178)..(178)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(180)..(180)
<223>
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<223>
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(226)..(226)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(226)..(226)
Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(257)..(257)
<220>
Lys может быть Glu
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(257)..(257)
<220>
Lys может быть Glu
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(257)..(257)
<220>
Lys может быть Glu
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(257)..(257)
<220>
Lys может быть Glu
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(284)..(284)
Thr может быть His
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(284)..(284)
Thr может быть His
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(284)..(284)
Thr может быть His
ОТЛИЧИТЕЛЬНАЯ ОСОБЕННОСТЬ
(284)..(284)
Thr может быть His
Ala Xaa Asn Xaa Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
Ala Xaa Asn Xaa Arg Phe Ser Asn Thr Ser Val Lys Val Met Asp Val
180 185 190
1/11
1/11
1/11
1/11
1/11
3/11
3/11
3/11
3/11
3/11
6/11
6/11
6/11
6/11
6/11
6/11
6/11
6/11