[RU]

Настоящее изобретение относится к композициям антител, включающим, например, антитела, сконструированные антитела и фрагменты антител, которые связывают член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (т.е., 18). Представленные композиции можно использовать для усиления ответа CD4+ и CD8+ Т-клеток и для лечения, облегчения и предотвращения заболеваний, которым можно противостоять с помощью усиленного иммунного ответа, например, злокачественных опухолей. Изобретение относится также к полинуклеотидам и векторам, кодирующим такие молекулы, и к клеткам-хозяевам, несущим полинуклеотиды или векторы; так же как к фармацевтическим композициям, содержащим такие молекулы, и к способам их применения.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к композициям антител, включающим, например, антитела, сконструированные антитела и фрагменты антител, которые связывают член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (т.е., 18). Представленные композиции можно использовать для усиления ответа CD4+ и CD8+ Т-клеток и для лечения, облегчения и предотвращения заболеваний, которым можно противостоять с помощью усиленного иммунного ответа, например, злокачественных опухолей. Изобретение относится также к полинуклеотидам и векторам, кодирующим такие молекулы, и к клеткам-хозяевам, несущим полинуклеотиды или векторы; так же как к фармацевтическим композициям, содержащим такие молекулы, и к способам их применения.

---

Евразийское (21) 201790799 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K16/28 (2006.01)
2017.08.31 A61K 39/00 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2015.10.08
(54) КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА И ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ
(31) 62/061,644; 62/198,673; 62/220,764
(32) 2014.10.08; 2015.07.29; 2015.09.18
(33) US
(86) PCT/US2015/054775
(87) WO 2016/057846 2016.04.14
(71) Заявитель: НОВАРТИС АГ (CH)
(72) Изобретатель:
Брогдон Дженнифер, Чиполлетта Даниэла, Дранофф Гленн, Ни Дебора А., Ван Фэй (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к композициям антител, включающим, например, антитела, сконструированные антитела и фрагменты антител, которые связывают член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (т.е., 18). Представленные композиции можно использовать для усиления ответа CD4+ и CD8+ Т-клеток и для лечения, облегчения и предотвращения заболеваний, которым можно противостоять с помощью усиленного иммунного ответа, например, злокачественных опухолей. Изобретение относится также к полинуклеотидам и векторам, кодирующим такие молекулы, и к клеткам-хозяевам, несущим по-линуклеотиды или векторы; так же как к фармацевтическим композициям, содержащим такие молекулы, и к способам их применения.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-541764ЕА/045
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА И ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ
РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет и преимущества Предварительной заявки США No. 62/061644, поданной 8 октября 2014 г., Предварительной заявки США No. 62/198673, поданной 2 9 июля 2 015 г., и Предварительной заявки США No. 62/220764, поданной 18 сентября 2015 г., полное содержание каждой из которых, таким образом, приведено в качестве ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0002] Настоящее изобретение относится к антителам, фрагментам антител и антигенсвязывающим молекулам, которые связывают член 18 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей/индуцируемый глюкокортикоидами родственный TNFR белок ("GITR"), и более конкретно, которые являются агонистами, стимулируют передачу сигнала через рецептор и/или модулируют иммунный ответ.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ДЛЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Индуцируемый глюкокортикоидами родственный TNFR белок ("GITR") является членом суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNFRSF), которое включает в себя более 2 0 трансмембранных белков типа I, несколько вариантов сплайсинга и несколько вирусных белков, все из которых обладают богатым цистеином доменом в качестве общего структурного признака. Внеклеточный домен (ECD) GITR состоит из 3 богатых цистеином доменов (CRD), за ним следует трансмембранный домен (ТМ) и внутриклеточный домен (ICD).
[0004] В CD4+CD25+ регуляторных Т-клетках мыши и человека детектирована конститутивная экспрессия GITR, которая может быть дополнительно увеличена после активации. В отличие от этого, эффекторные CD4+CD25- Т-клетки и CD8+CD25- Т-клетки экспрессируют от низких до не поддающихся детекции уровней GITR, которые повергаются быстрой повышающей регуляции после активации Т-клеточного рецептора. Экспрессия GITR детектирована также на
активированных клетках NK, дендритных клетках и макрофагах. Показано, что путь передачи сигнала ниже GITR включает в себя пути МАРК и канонические пути NFKB. Различные члены семейства TRAF вовлечены в качестве промежуточных элементов передачи сигнала ниже GITR (Nocentini et al. (2005) Eur. J. Immunol., 35:1016-1022).
[0005] Считают, что активация клеток посредством GITR выполняет несколько функций в зависимости от типа и микроокружения клеток, включая, но без ограничения, костимуляцию для усиления пролиферации и эффекторных функций, ингибирование супрессии регуляторными Т-клетками, и защиту от индуцированной активацией клеточной смерти (Shevach and Stephens (2006) Nat. Rev. Immunol., 6:613-618). Ко et al. ((2005) J. Exp. Med., 202:885-891) впервые показали, что агонистическое моноклональное антитело против GITR мыши эффективно индуцировало специфический для опухолей иммунный ответ и уничтожало развившиеся опухоли в модели сингенных опухолей на мышах. Дополнительно и/или альтернативно, показано, что антитело против mGITR, обладающее функциональной эффекторной активностью Fc, в некоторых доклинических моделях истощает регуляторные Т-клетки, так же как усиливает пролиферацию и секрецию цитокинов в эффекторных Т-клетках в избранном окружении опухолей. Эти обнаружения позволяют предполагать, что агонистическое антитело против mGITR может нарушать равновесие иммунной толерантности, что в свою очередь позволяет Т-клеткам бороться с опухолями и персистирующими вирусными инфекциями. Однако, исследования до настоящего времени были сфокусированы главным образом на применении суррогатных антител в системах грызунов. Из-за расхождения структуры между GITR мыши и человека, неизвестно, можно ли переносить наблюдения, полученные в суррогатных исследованиях на мышах, на модификацию функции GITR человека.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] Авторы настоящего изобретения идентифицировали
антитела, специфически связывающиеся с индуцируемым
глюкокортикоидами членом суперсемейства рецепторов фактора
некроза опухолей 18 человека ("GITR"), где антитела обладают
активностью агониста hGITR in vitro при перекрестном сшивании in
vitro, и где антитела обеспечивают активность hGITR in vivo и
индуцируют повышение соотношения Тэфф:Трег в участках опухолей,
что приводит к ингибированию прогрессирования опухолей. Таким
образом, настоящее изобретение относится к агонистическим
антителам, фрагментам антител и антигенсвязывающим молекулам,
которые осуществляют специфическое связывание и стимулируют
внутриклеточную передачу сигналов и/или модулируют иммунный
ответ посредством нацеливания на клетки, экспрессирующие GITR
человека. В одном аспекте изобретение относится к выделенным
антителам, фрагментам антител и антигенсвязывающим молекулам,
которые специфически связывают GITR человека, где антитело,
фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула связывается с
эпитопом, содержащим богатый цистеином домен 1 ("CRD1", SEQ ID
N0:4: CGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDC) и богатый
цистеином домен 2 ("CRD2", SEQ ID N0:5:
MCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQC), и где антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула является агонистом GITR, и где антитело, фрагмент антитела, или антигенсвязывающая молекула, необязательно, обладает интактной или усиленной эффекторной функцией по отношению к FcR.
[0007] В некоторых вариантах осуществления, антитело,
фрагмент антитела, или антигенсвязывающая молекула связывается с
эпитопом, содержащим SEQ ID N0:88, из GITR человека. В некоторых
вариантах осуществления, антитело, фрагмент антитела или
антигенсвязывающая молекула конкурирует с антителом или
фрагментом антитела, которые связываются с эпитопом, содержащим
SEQ ID N0:88, из GITR человека. В некоторых вариантах
осуществления, антитело, фрагмент антитела или
антигенсвязывающая молекула связывается по меньшей мере с одним аминокислотным остатком внутри SEQ ID N0:88 из GITR человека, например, антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула связывается с эпитопом, который перекрывается с SEQ ID N0:88 из GITR человека.
[0008] В некоторых вариантах осуществления, антитело,
фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула связывается с
эпитопом, содержащим CRD1 (остатки 34-72, SEQ ID N0:4) и остаток
7 8 из GITR человека. В некоторых вариантах осуществления,
антитело, фрагмент антитела, или антигенсвязывающая молекула
конкурирует с антителом или фрагментом антитела, которые
связываются с эпитопом внутри CRD1 (остатки 34-72, SEQ ID N0:4)
и остатком 7 8 из GITR человека. В некоторых вариантах
осуществления, антитело, фрагмент антитела или
антигенсвязывающая молекула связывается по меньшей мере с одним аминокислотным остатком внутри CRD1 (остатки 34-72, SEQ ID N0:4) и остатком 78 из GITR человека, например, антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула связывается с эпитопом, который перекрывается с CRD1 (остатки 34-72, SEQ ID N0:4) и остатком 78 из GITR человека.
[0009] В некоторых вариантах осуществления, антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула связывается с SEQ ID N0:1 и содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую человеческую тяжелую цепь, где: i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22, и ii) CDR2 тяжелой цепи содержит последовательность, выбранную из любой из SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 и SEQ ID N0:27, и iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29 или SEQ ID N0:109; и (b) a вариабельную область легкой цепи, где i) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30 или SEQ ID N0:31, и ii) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и iii) the CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
[0010] В некоторых вариантах осуществления, антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула связывается с SEQ ID N0:88 и содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую человеческую тяжелую цепь, где: i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22, и ii) CDR2 тяжелой цепи содержит последовательность, выбранную из любой из SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 и SEQ ID N0:27, и iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29 или SEQ ID N0:109; и (b) вариабельную область легкой цепи, где i) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30 или SEQ ID N0:31, и ii) CDR2 легкой цепи
содержит SEQ ID N0:33, и iii) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
[ООН] По отношению к дополнительным вариантам
осуществления антител, фрагментов антител или антигенсвязывающих
молекул, в некоторых вариантах осуществления вариабельная
область тяжелой цепи обладает по меньшей мере 95%, 96%, 97%,
98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной
последовательности с вариабельной областью из SEQ ID N0:16, и вариабельная область легкой цепи обладает по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью из SEQ ID N0:17. В конкретных вариантах осуществления, антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула содержит тяжелую цепь, содержащую SEQ ID N0:16 и легкую цепь, содержащую SEQ ID N0:17. В некоторых вариантах осуществления, антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула конкурирует с антителом, содержащим тяжелую цепь, содержащую SEQ ID N0:16, и легкую цепь, содержащую SEQ ID N0:17.
[0012] В некоторых вариантах осуществления, FR4 тяжелой цепи представляет собой человеческую зародышевую FR4. В конкретных вариантах осуществления, FR4 тяжелой цепи представляет собой SEQ ID N0:42.
[0013] В некоторых вариантах осуществления, FR4 легкой цепи представляет собой человеческую зародышевую FR4. В конкретных вариантах осуществления, FR4 легкой цепи представляет собой SEQ ID N0:50.
[0014] В некоторых вариантах осуществления представлено антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула, где: i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22 или SEQ ID N0:84; ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:28 или SEQ ID N0:80; iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29 или SEQ ID N0:109; iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30 или SEQ ID N0:85; v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33 или SEQ ID N0:82, и vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34 или SEQ ID N0:83.
[0015] В некоторых вариантах осуществления, представлено
антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула, где: i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22; ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:23; iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29; iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30; v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33 и vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
[0016] В некоторых вариантах осуществления представлено антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула, где: i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22; ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:24; iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29; iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:31; v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
[0017] В некоторых вариантах осуществления, представлено антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула, где: i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22; ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:25; iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29; iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30; v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и vi) the CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
[0018] В некоторых вариантах осуществления, представлено антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула, где: i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22; ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:2 6; iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29; iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30; v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
[0019] В некоторых вариантах осуществления, представлено антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула, где: i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22; ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:27; iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29; iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30; v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
[0020] В некоторых вариантах осуществления, представлено антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула,
где: i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22; ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:25; iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:109; iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30; v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
[0021] В следующем аспекте, изобретение относится к антителам, фрагментам антител или антигенсвязывающим молекулам, которые специфически связываются с GITR, где антитело или фрагмент антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где: i) CDR1 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:22, SEQ ID N0: 79 или SEQ ID N0:84; ii) CDR2 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26, SEQ ID N0:27, SEQ ID N0:62 и SEQ ID N0:80; iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29 или SEQ ID N0:109; iv) CDR1 легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:63, SEQ ID N0:81, SEQ ID N0:85, и SEQ ID N0:86; v) CDR2 легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:33, SEQ ID N0:64, и SEQ ID N0:82; и CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34 или SEQ ID N0:83.
[0022] В других вариантах осуществления антител, фрагментов
антител или антигенсвязывающих молекул, вариабельная область
тяжелой цепи обладает по меньшей мере 90%, 93%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной
последовательности с вариабельной областью из
последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:99 и SEQ ID N0:105, и вариабельная область легкой цепи обладает по меньшей мере 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:9 и SEQ ID N0:7. В конкретных вариантах осуществления, выделенное антитело, фрагмент антитела или
антигенсвязывающая молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность, выбранную из любой из SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:99 и SEQ ID N0:105; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID N0:7 или SEQ ID N0:9. В некоторых вариантах осуществления, выделенное антитело, фрагмент антитела, или антигенсвязывающая молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи из SEQ ID N0:6 и вариабельный домен легкой цепи из SEQ ID N0:7. В некоторых вариантах осуществления, выделенное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий SEQ ID N0:8, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID N0:9. В других вариантах осуществления, выделенное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий SEQ ID N0:10, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID N0:7. В других вариантах осуществления, выделенное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий SEQ ID N0:12, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID N0:7. В других вариантах осуществления, выделенное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий SEQ ID N0:14, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID N0:7.
[0023] По отношению к дополнительным вариантам осуществления антител, фрагментов антител или антигенсвязывающих молекул, в некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи обладает по меньшей мере 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью из SEQ ID N0:99, и вариабельная область легкой цепи обладает по меньшей мере 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью из SEQ ID N0:7. В некоторых вариантах осуществления, выделенное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий SEQ ID N0:99 и вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID N0:7.
[0024] По отношению к дополнительным вариантам
осуществления антител, фрагментов антител или антигенсвязывающих молекул, в некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи обладает по меньшей мере 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью из SEQ ID N0:105, и вариабельная область легкой цепи обладает по меньшей мере 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью из SEQ ID N0:7. В некоторых вариантах осуществления, выделенное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий SEQ ID N0:105, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID N0:7.
[0025] В некоторых вариантах осуществления, антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула, которые связываются с GITR, являются гуманизированными. В конкретных вариантах осуществления, антитело или фрагмент антитела содержит человеческую константную область.
[0026] В некоторых вариантах осуществления, фрагмент
антитела представляет собой фрагмент Fab'. В некоторых вариантах
осуществления, фрагмент антитела представляет собой
одноцепочечное антитело (scFv) . В некоторых вариантах осуществления, фрагмент антитела представляет собой однодоменное антитело или наноантитело.
[0027] В некоторых вариантах осуществления, антитело или фрагмент антитела является перекрестно сшитым с вторым антителом или фрагментом антитела. В некоторых вариантах осуществления, антитело является гликозилированным.
[0028] В некоторых вариантах осуществления, антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула представляет собой IgG. В конкретных вариантах осуществления антитело, фрагмент антитела, или антигенсвязывающая молекула содержит область Fc антитела изотипа IgG. В конкретных вариантах осуществления антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула содержит область Fc антитела изотипа IgGl или IgG2. В конкретных вариантах осуществления антитело, фрагмент антитела,
или антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело IgGl или IgG2. В некоторых вариантах осуществления, антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула содержит по меньшей мере одну мутацию, модулирующую (т.е., увеличивающую или уменьшающую) связывание антитела или фрагмента антитела с рецептором Fc. В некоторых вариантах осуществления, антитело, фрагмент антитела, или антигенсвязывающая молекула содержит по меньшей мере одну мутацию, модулирующую (т.е., увеличивающую или уменьшающую) способность антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы активировать рецептор Fc. В конкретных вариантах осуществления, антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула содержит по меньшей мере одну мутацию, увеличивающую связывание антитела или фрагмента антитела с рецептором Fc. В конкретных вариантах осуществления, антитело, фрагмент антитела, или антигенсвязывающая молекула содержит по меньшей мере одну мутацию, увеличивающую способность антитела, фрагмента антитела, или антигенсвязывающей молекулы активировать рецептор Fc.
[0029] В некоторых вариантах осуществления, антитело,
фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула обладает
перекрестной реактивностью по отношению к GITR человека и не
относящегося к человеку примата. В некоторых вариантах
осуществления, антитело, фрагмент антитела или
антигенсвязывающая молекула не обладает перекрестной реактивностью по отношению к GITR грызунов, например, GITR крысы или GITR мыши.
[0030] В родственном аспекте, изобретение, кроме того, относится к полинуклеотидам, кодирующим антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу по изобретению, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, обладает по меньшей мере 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID N0:52, SEQ ID N0:54 и SEQ ID N0:102. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий вариабельную
область тяжелой цепи, обладает по меньшей мере 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID N0:51, SEQ ID N0:53, SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:56, SEQ ID N0:57, SEQ ID N0:101 и SEQ ID N0:107. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, обладает последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID N0:52, SEQ ID N0:54 и SEQ ID N0:102. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, обладает последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID N0:51, SEQ ID N0:53, SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:56, SEQ ID N0:57, SEQ ID N0:101 и SEQ ID N0:107.
[0031] В родственном аспекте, изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу по изобретению, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу по изобретению для введения индивидууму.
[0032] В некоторых вариантах осуществления, композиция дополнительно содержит антиген-мишень, например, ассоциированный со злокачественной опухолью антиген или опухолеассоциированный антиген. В некоторых вариантах осуществления, антиген-мишень представляет собой вирусный антиген, бактериальный антиген грибковый антиген или паразитический антиген.
[0033] В некоторых вариантах осуществления, композиция дополнительно содержит антагонист CTLA4. В некоторых вариантах осуществления, композиция дополнительно содержит антагонист LAG3. В некоторых вариантах осуществления, композиция дополнительно содержит антагонист TIM3. В некоторых вариантах осуществления, композиция дополнительно содержит ингибитор взаимодействия PD-1/PD-L1 (например, В7-Н1 или его аналог, антитело против PD-1) . В конкретных вариантах осуществления композиция дополнительно содержит антагонист PD-1. В конкретных
вариантах осуществления композиция дополнительно содержит антагонист PD-L1.
[0034] В следующем аспекте, изобретение, кроме того, относится к наборам, содержащим антитело или фрагмент антитела по изобретению, как описано в настоящем документе.
[0035] В некоторых вариантах осуществления, наборы дополнительно содержат второе средство для совместного введения с антителом. В некоторых вариантах осуществления, второе средство представляет собой антиген-мишень, например, ассоциированный со злокачественной опухолью антиген или опухолеассоциированный антиген. В некоторых вариантах осуществления, антиген-мишень представляет собой вирусный антиген, бактериальный антиген, грибковый антиген или паразитический антиген.
[0036] В некоторых вариантах осуществления, второе средство представляет собой антагонист CTLA4. В некоторых вариантах осуществления, второе средство представляет собой антагонист TIM3. В некоторых вариантах осуществления, второе средство представляет собой антагонист LAG3. В некоторых вариантах осуществления, второе средство представляет собой ингибитор взаимодействия PD-1/PD-L1 (например, В7-Н1 или его аналог, антитело против PD-1). В конкретных вариантах осуществления второе средство представляет собой антагонист PD-1. В конкретных вариантах осуществления второе средство представляет собой антагонист PD-L1.
[0037] Необязательно, антитело или фрагмент антитела и второе средство представлены в форме смеси. Необязательно, антитело или фрагмент антитела и второе средство представлены в отдельных составах.
[0038] В другом аспекте изобретение относится к способам усиления ответа Т-клеток у нуждающегося в этом индивидуума, включающим в себя введение индивидууму терапевтически эффективного количества агонистического антитела или фрагмента антитела против GITR по изобретению, как описано в настоящем документе. В следующем аспекте, изобретение относится к агонистическому антителу или фрагменту антитела против GITR по
изобретению для применения для усиления ответа Т-клеток у индивидуума. В следующем аспекте, изобретение относится к композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела по изобретению для применения для усиления ответа Т-клеток у индивидуума.
[0039] В следующем аспекте, изобретение относится к способам лечения роста злокачественной опухоли, экспрессирующей опухолеассоциированный антиген, у нуждающегося в этом индивидуума, включающим в себя введение индивидууму терапевтически эффективного количества агонистического антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы против GITR по изобретению, как описано в настоящем документе. Изобретение, кроме того, относится к агонистическому антителу или фрагменту антитела против GITR по изобретению для применения для лечения роста злокачественной опухоли у индивидуума. Изобретение, кроме того, относится к композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела по изобретению для применения для уменьшения, ингибирования или предотвращения роста злокачественной опухоли, экспрессирующей опухолеассоциированный антиген, у индивидуума.
[0040] По отношению к вариантам осуществления способов и
применений в медицине, в некоторых вариантах осуществления,
агонистическое антитело, фрагмент антитела или
антигенсвязывающую молекулу против GITR вводят совместно с антигеном. В некоторых вариантах осуществления, антиген представляет собой ассоциированный со злокачественной опухолью антиген или а опухолеассоциированный антиген. В некоторых вариантах осуществления, агонистическое антитело или фрагмент антитела против GITR вводят совместно с клетками злокачественных опухолей от пациента, т.е., аутологичными клетками злокачественных опухолей.
[0041] В некоторых вариантах осуществления, агонистическое антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу против GITR вводят совместно с антагонистом CTLA4. В некоторых вариантах осуществления, агонистическое антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу против GITR вводят совместно с антагонистом LAG3. В некоторых вариантах
осуществления, агонистическое антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу против GITR вводят совместно с антагонистом TIM3. В некоторых вариантах осуществления, агонистическое антитело или фрагмент антитела против GITR вводят совместно с ингибитором взаимодействия PD-1/PD-L1 (например, В7-Н1). В конкретных вариантах осуществления, агонистическое антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу против GITR вводят совместно с антагонистом PD-1. В конкретных вариантах осуществления, агонистическое антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу против GITR вводят совместно с антагонистом PD-L1.
[0042] В некоторых вариантах осуществления, агонистическое антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу против GITR вводят совместно с химиотерапевтическим средством или цитотоксином.
[0043] В некоторых вариантах осуществления, ответ Т-клеток представляет собой ответ Т-клеток CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). В некоторых вариантах осуществления, ответ Т-клеток представляет собой ответ CD4+ Т-клеток-помощников (Th).
[0044] В некоторых вариантах осуществления, пациент имеет
злокачественную опухоль, экспрессирующую опухолеассоциированный
антиген. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная
опухоль выбрана из группы, состоящей из меланомы, рака яичника,
колоректального рака, рака предстательной железы,
немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) и рака молочной железы. В одном варианте осуществления, тип злокачественной опухоли выбран из группы, состоящей из: рака поджелудочной железы, меланом, рака молочной железы, рака легкого, рака бронхов, колоректального рака, рака предстательной железы, рака желудка, рака яичника, рака мочевого пузыря, злокачественной опухоли головного мозга или центральной нервной системы, злокачественной опухоли периферической нервной системы, рака пищевода, рака шейки матки, злокачественной опухоли тела или эндометрия матки, злокачественной опухоли полости рта или глотки, плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC) , рака печени, рака почки, рака яичка, рака желчных протоков, злокачественной опухоли тонкого
кишечника или аппендикса, злокачественной опухоли слюнных желез,
злокачественной опухоли щитовидной железы, злокачественной
опухоли надпочечника, остеосаркомы, хондросаркомы и
злокачественной опухоли кроветворных тканей.
[0045] В некоторых вариантах осуществления, пациент имеет инфекционное заболевание, например, вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, грибковый антиген или паразитический антиген. В некоторых вариантах осуществления, агонистическое антитело против GITR вводят совместно с вирусным антигеном (например, из HCV, HSV или HIV) . В некоторых вариантах осуществления, агонистическое антитело против GITR вводят совместно с бактериальным антигеном. В некоторых вариантах осуществления, агонистическое антитело против GITR вводят совместно с грибковым антигеном. В некоторых вариантах осуществления, агонистическое антитело против GITR вводят совместно с паразитическим антигеном (например, при филяриозе).
[0046] В других вариантах осуществления, представлено выделенное антитело, фрагмент антитела, или антигенсвязывающая молекула для применения в терапии. В конкретных вариантах осуществления представлены антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула для применения для усиления ответа Т-клеток у нуждающегося в этом индивидуума. В конкретных вариантах осуществления представлены антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула для применения в лечении роста опухоли у нуждающегося в этом индивидуума.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0047] "Антитело" относится к полипептиду из семейства иммуноглобулинов, способному нековалентно, обратимо и специфически связывать соответствующий антиген. Иллюстративная структурная единица антитела содержит тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, где каждая пара обладает одной "легкой" цепью (приблизительно 25 кДа) и одной "тяжелой" цепью (приблизительно 50-70 кДа), соединенными посредством дисульфидной связи. Известные гены иммуноглобулинов включают в себя гены константной области к, X, а, у, 8, s и \х,
так же как огромное количество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируют как к или X. Тяжелые цепи классифицируют как у, \х, а, 8 или s, которые, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулинов, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Антитела по изобретению могут принадлежать к любому изотипу/классу (например, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE) или любому подклассу (например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область из приблизительно от 100 до 110 или более аминокислот, в первую очередь ответственных за узнавание антигена. Термины вариабельная область легкой цепи (VL) и вариабельная область тяжелой цепи (VH) относятся к этим областям легкой и тяжелой цепей, соответственно. В дополнение к V-областям, как тяжелые цепи, так и легкие цепи содержат константную (С) область или домен. Секретируемая область иммуноглобулина С состоит из трех доменов С, CHI, СН2, СНЗ, необязательно, СН4 (Сд) , и шарнирной области. Связанная с мембраной форма области С иммуноглобулина имеет также мембранный и внутриклеточный домены. Каждая легкая цепь имеет VL на N-конце, затем константный домен (С) на другом конце. VL соединена с VH, и CL соединена с первым константным доменом тяжелой цепи. Спаривание VH и VL вместе формирует один антигенсвязывающий участок. Иммуноглобулин IgG "общепринятого антитела", как применяют в настоящем документе, относится к антителу в конфигурации, которая встречается в природе. Как правило, общепринятое антитело IgG имеет четыре цепи, две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи, соединенные вместе посредством дисульфидных связей. Как применяют в настоящем документе, "антитело" включают в себя также варианты антител и общепринятые структуры антител, которые обладают конкретной специфичностью связывания, т.е., для GITR. Таким образом, в объем этой концепции входят полноразмерные антитела, химерные антитела и гуманизированные антитела, которые обладают конкретной специфичностью связывания для GITR.
[0048] Антитела существуют в форме интактных иммуноглобулинов или в форме ряда хорошо охарактеризованных
фрагментов, полученных посредством расщепления различными
пептидазами. Таким образом, например, пепсин расщепляет антитело
ниже дисульфидных связей в шарнирной области с получением
F(ab)'2, димера Fab', который сам представляет собой легкую цепь,
соединенную с VH-CH1 посредством дисульфидных связей. F(ab)'2
можно восстанавливать в мягких условиях для разрушения
дисульфидной связи в шарнирной области, таким образом, превращая
димер F(ab)'2 в мономер Fab'. Мономер Fab' представляет собой в
основном Fab с частью шарнирной области. Paul, Fundamental
Immunology 3d ed. (1993). В то время как различные фрагменты
антител определены в отношении расщепления интактного антитела,
специалисту в данной области понятно, что такие фрагменты можно
синтезировать de novo либо химически, либо с использованием
способа рекомбинантной ДНК. Как применяют в настоящем документе,
"фрагмент антитела" относится к одной или нескольким частям
антитела, либо полученным посредством модификации полноразмерных
антител, либо синтезированным de novo с использованием способов
рекомбинантной ДНК, которые сохраняют специфичность связывания и
агонистическую активность в отношении GITR. Примеры фрагментов
антител включают в себя фрагменты Fv, одноцепочечные антитела
(ScFv) , Fab, Fab', Fd (домены Vh и CHI), dAb (Vh и выделенная
CDR); и мультимерные варианты этих фрагментов (например,
F(ab')2,) с той же самой специфичностью связывания. Фрагменты
антител можно включать также в однодоменные антитела,
максиантитела, миниантитела, диатела, триатела, тетратела, vNAR,
бис-scFv, и другие варианты антителоподобных соединений для
обеспечения специфичности связывания и активности,
представленных по настоящему изобретению.
[0049] Домен "Fab", как применяют в контексте изобретения, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, константную область домена СН1, вариабельный домен легкой цепи и домен CL константной области легкой цепи. Взаимодействие доменов стабилизируют посредством дисульфидной связи между доменами СН1 и CL. В некоторых вариантах осуществления, домены тяжелой цепи Fab представляют собой, в порядке от N-конца до С-конца, VH-CH,
и домены легкой цепи Fab представляют собой, в порядке от N-конца до С-конца, VL-CL. В некоторых вариантах осуществления, домены тяжелой цепи Fab представляют собой, в порядке от N-конца до С-конца, CH-VH, и домены легкой цепи Fab расположены в порядке CL-VL. Несмотря на то, что Fab исторически идентифицированы посредством расщепления папаином интактного иммуноглобулина, в контексте этого изобретения, "Fab", как правило, получают любым рекомбинантным способом. Каждый фрагмент Fab является одновалентным по отношению к связыванию антигена, т.е., он обладает одним антигенсвязывающим участком.
[0050] С-концевая часть тяжелых цепей иммуноглобулинов, содержащая домены СН2 и СНЗ, представляет собой домен "Fc". "Область Fc", как применяют в настоящем документе, относится к константной области антитела, исключая первый домен константной области иммуноглобулина. Fc относится к двум последним доменам константной области иммуноглобулина из IgA, IgD и IgG, и к трем последним доменам константной области иммуноглобулина из IgE и IgM, и к гибкому шарниру ближе к N-концу от этих доменов. Для IgA и IgM Fc может включать в себя цепь J. Для IgG, Fc содержит домены иммуноглобулина Су2 и СуЗ, и шарнирную область между Cyl и Су. Специалисту в данной области понятно, что границы области Fc могут меняться, однако, область Fc тяжелой цепи IgG человека обычно определяют как содержащую остатки С22 6 или Р230 на ее карбокси-конце, с использованием нумерации в соответствии с индексом EU как в Rabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va. ) . "Область Fc" может относиться к этой выделенной области или к этой области в контексте антитела или фрагмента антитела. "Область Fc" включает в себя встречающиеся в природе аллельные варианты области Fc, например, в области СН2 и СНЗ, так же как модификации, модулирующие эффекторную функцию. Области Fc включают в себя также варианты, не приводящие к изменениям в биологической функции. Например, одну или несколько аминокислот можно делетировать с N-конца или С-конца области Fc иммуноглобулина без существенной потери биологической функции.
Например, в конкретных вариантах осуществления С-концевой лизин можно модифицировать, заменять или удалять. В конкретных вариантах осуществления один или несколько С-концевых остатков в области Fc изменены или удалены. В конкретных вариантах осуществления один или несколько С-концевых остатков в Fc (например, концевой лизин) делетирован. В других конкретных вариантах осуществления один или несколько С-концевых остатков в Fc заменены на альтернативную аминокислоту (например, концевой лизин заменен). Такие варианты можно выбирать в соответствии с общими правилами, известными в данной области, так чтобы оказывать минимальный эффект на активность (см., например, Bowie, et al. , Science 247:306-1310, 1990). Домен Fc представляет собой часть Ig, которую узнают рецепторы клеток, такие как FcR, и с которой связывается активирующий комплемент белок, CI q. Нижняя шарнирная область, кодируемая 5'-частью экзона СН2, обеспечивает гибкость антитела для связывания с рецепторами FcR.
[0051] "Определеляющие комплементарность домены" или "определяющие комплементарность области ("CDR") взаимозаменяемо относятся к гипервариабельным областям VL и VH. CDR представляют собой участок связывания белка-мишени на цепях антитела, несущий специфичность для такого белка-мишени. Существуют три CDR (CDR1-3, пронумерованные последовательно с N-конца) в каждой VL или VH человека, составляющих приблизительно 15-20% из вариабельных доменов. CDR являются структурно комплементарными эпитопу на белке-мишени, и таким образом, непосредственно отвечают за специфичность связывания. Для оставшихся участков VL или VH, так называемых каркасных областей, показана меньшая изменчивость в аминокислотной последовательности (Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000).
[0052] Положения CDR и каркасных областей можно определять с использованием различных хорошо известных в данной области определений, например, Rabat, Chothia, международная база данных ImMunoGeneTics (IMGT) (web-сайт imgt.cines.fr/), и АЬМ (см., например, Johnson et al. , Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia и Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et
al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al. , J.Mol.Biol., 273:927-748
(1997)). Определения антигенсвязывающих участков описаны также в следующих ссылках: Ruiz et al. , Nucleic Acids Res., 28:219-221
(2000); и Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); и Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); и Rees et al. , In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996).
[0053] По Rabat, аминокислотные остатки CDR в VH пронумерованы 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); и аминокислотные остатки CDR в VL пронумерованы 24-34 (LCDR1), 5056 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) . По Chothia, CDR аминокислоты в VH пронумерованы 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); и аминокислотные остатки в VL пронумерованы 26-32 (LCDR1), 50-52
(LCDR2) и 91-9 6 (LCDR3). При комбинации определений CDR как по Rabat, так и по Chothia, CDR состоят из аминокислотных остатков 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в VH человека и аминокислотных остатков 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97
(LCDR3) в VL человека.
[0054] Термин "детерминанта специфичности связывания" или "BSD" взаимозаменяемо относятся к минимальной смежной или несмежной аминокислотной последовательности внутри определяющей комплементарность области, необходимой для определения специфичности связывания антитела. Минимальная детерминанта специфичности связывания может находиться внутри одной или нескольких последовательностей CDR. В некоторых вариантах осуществления, минимальные детерминанты специфичности связывания находятся внутри части последовательностей или внутри полноразмерных последовательностей CDR3 тяжелой и легкой цепей антитела (т.е., определяются единственно ими).
[0055] "Легкая цепь антитела" или "тяжелая цепь антитела", как применяют в настоящем документе, относится к полипептиду, содержащему VL или VH, соответственно. Эндогенную VL кодируют сегменты генов V (вариабельный) и J (соединительный), и
эндогенную VH - V, D (обеспечивающий разнообразие), и J. Каждая из VL или VH включает CDR, так же как каркасные области. В этой заявке, легкие цепи антитела и/или тяжелые цепи антитела можно, время от времени, вместе обозначать как "цепи антитела". Эти термины включают в себя цепи антитела, содержащие мутации, которые не нарушают основную структуру VL или VH, как понятно специалисту в данной области.
[0056] Термин "валентность", как применяют в настоящем документе, относится к количеству потенциальных участков связывания мишени в полипептиде. Каждый участок связывания мишени специфически связывает одну молекулу-мишень или специфический участок на молекуле-мишени. Когда полипептид содержит более одного участка связывания мишени, каждый участок связывания мишени может специфически связывать одинаковые или различные молекулы (например, может связывать различные молекулы, например, различные антигены, или различные эпитопы на одной и той же молекуле). Общепринятое антитело, например, имеет два связывающих участка и является двухвалентным. Антитела, антигенсвязывающие молекулы и их фрагменты могут являться одновалентными (т.е., связывать одну молекулу-мишень), двухвалентными или мультивалентными (т.е., связывать более одной молекулы-мишени).
[0057] Для получения моноклональных или поликлональных антител, можно использовать любой способ, известный в данной области (см., например, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497
(1975); Kozbor et al. , Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985). Способы получения одноцепочечных антител
(Патент США No. 4946778) можно адаптировать для получения
антител против полипептидов по этому изобретению. А также,
трансгенных мышей или другие организмы, такие как другие
млекопитающие, можно использовать для экспрессии
приматизитрованных или гуманизированные антитела. Альтернативно, способ фагового дисплея можно использовать для идентификации антител и гетеромерных фрагментов Fab, которые специфически связываются с избранными антигенами (см., например, McCafferty
et al., выше; Marks et al., Biotechnology, 10:779-783, (1992)).
[0058] Способы приматизации или гуманизации не относящихся к человеческим антител хорошо известны в данной области. Как правило, приматизированное или гуманизированное антитело обладает одним или несколькими аминокислотными остатками, введенными в него из источника, не относящегося к приматам или не относящегося к человеку. Эти не относящиеся к приматам или не относящиеся к человеку аминокислотные остатки часто обозначают как импортированные остатки, которые как правило, взяты из импортированного вариабельного домена. Гуманизацию в основном можно проводить способом Winter и соавторов (см., например, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:15341536 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)), посредством замены на CDR или последовательности CDR грызунов соответствующих последовательностей человеческого антитела. Соответственно, такие гуманизированные антитела представляют собой химерные антитела (Патент США No. 4816567), где значительно меньше, чем интактный человеческий вариабельный домен, заменяют на соответствующую последовательность из не относящихся к человеку видов. На практике, приматизированные или гуманизированные антитела, как правило, представляют собой антитела приматов или человека, в которых некоторые остатки определяющей комплементарность области ("CDR") и, возможно, некоторые остатки каркасной области ("FR") заменены на остатки из аналогичных участков исходных видов (например, антител грызунов) для придания специфичности связывания.
[0059] "Химерное антитело" представляет собой молекулу антитела, в которой (а) константную область, или ее часть, изменяют, заменяют или подвергают обмену, так что антигенсвязывающий участок (вариабельная область) является связанным с константной областью отличного или измененного класса, эффекторной функции и/или вида, или с полностью отличной молекулой, придающей новые свойства химерному антителу, например, ферментом, токсином, гормоном, фактором роста и лекарственным средством; или (Ь) вариабельную область, или ее
часть, изменяют, заменяют или подвергают обмену на вариабельную область, обладающую отличной или измененной антигенной специфичностью.
[0060] Антитела или антигенсвязывающие молекулы по изобретению, кроме того, включают в себя одну или несколько цепей иммуноглобулинов, химически конъюгированные с другими белками, или экспрессированные в форме слитых белков с другими белками. Они включают в себя также биспецифическое антитело. Биспецифическое или бифункциональной антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, обладающее двумя различными парами тяжелая/легкая цепь и двумя различными участками связывания. Другие антигенсвязывающие фрагменты или части антитела по изобретению включают в себя двухвалентный scFv (диатело), биспецифические антитела scFv, где молекула антитела узнает два различных эпитопа, одиночные связывающие домены (dAb) и миниантитела.
[0061] Различные антитела или антигенсвязывающие фрагменты,
описанные в настоящем документе, можно получать посредством
ферментативной или химической модификации интактных антител, или
синтезировать de novo с использованием способов рекомбинантной
ДНК (например, одноцепочечный Fv) , или идентифицировать с
использованием библиотек фагового дисплея (см., например,
McCafferty et al. , Nature 348:552-554, 1990). Например,
миниантитела можно получать с использованием способов, описанных
в данной области, например, Vaughan and Sollazzo, Comb Chem High
Throughput Screen. 4:417-30 2001. Биспецифические антитела можно
получать множеством способов, включая слияние гибридом или
соединение фрагментов Fab'. См., например, Songsivilai &
Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et
al. , J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992) . Одноцепочечные антитела
можно идентифицировать с использованием библиотек фагового
дисплея или библиотек рибосомного дисплея, библиотек с
перетасовкой генов. Такие библиотеки можно конструировать из
синтетических, полусинтетических или нативных и
иммунокомпетентных источников.
[0062] Термин "антигенсвязывающая молекула" или "не
относящийся к антителу лиганд" относится к миметикам антител, в которых использованы каркасы не относящихся к иммуноглобулинам белков, включая, но без ограничения, аднектины, авимеры, одноцепочечные полипептидные связывающие молекулы, и антителоподобные связывающие пептидомиметики.
[0063] Термин "вариабельная область" или "V-область"
взаимозаменяемо относятся к области тяжелой или легкой цепи,
содержащей FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Эндогенная
вариабельная область кодирована генами V-D-J тяжелой цепи или генами V-J легкой цепи иммуноглобулина. V-область может являться природной, рекомбинантной или синтетической.
[0064] Как применяют в настоящем документе, термин "вариабельный сегмент" или "V-сегмент" взаимозаменяемо относятся к подпоследовательности вариабельной области, включающей в себя FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3. Эндогенный V-сегмент кодирован V-геном иммуноглобулина. V-сегмент может являться природным, рекомбинантным или синтетическим.
[0065] Как применяют в настоящем документе, термин "J-сегмент" относится к подпоследовательности кодируемой вариабельной области, содержащей С-концевую часть CDR3 и FR4. Эндогенный J-сегмент кодирован J-геном иммуноглобулина. J-сегмент может являться природным, рекомбинантным или синтетическим.
[0066] "Гуманизированное" антитело представляет собой
антитело, которое сохраняет реактивность (например,
специфичность связывания, активность) не относящегося к человеку антитела, в то же время являясь менее иммуногенным для человека. Этого можно достигать, например, посредством сохранения не относящихся к человеку областей CDR и замены оставшихся частей антитела на человеческие эквиваленты. См., например, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison и Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al. , Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31 (3) :169-217 (1994).
[0067] Термин "соответствующая человеческая зародышевая последовательность" относится к последовательности нуклеиновой
кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность или
подпоследовательность вариабельной области, разделяющую
наивысшую определенную идентичность аминокислотной
последовательности с эталонной аминокислотной
последовательностью или подпоследовательностью вариабельной
области по сравнению со всеми другими известными аминокислотными
последовательностями вариабельной области, кодируемыми
человеческими зародышевыми последовательностями вариабельных
областей иммуноглобулинов. Соответствующая человеческая
зародышевая последовательность может также относиться к
аминокислотной последовательности или подпоследовательности
человеческой вариабельной области с наивысшей идентичностью
аминокислотной последовательности с эталонной аминокислотной
последовательностью или подпоследовательностью вариабельной
области по сравнению со всеми другими оцененными аминокислотными
последовательностями вариабельной области. Соответствующая
человеческая зародышевая последовательность может представлять
собой только каркасные области, только определяющие
комплементарность области, каркасные и определяющие
комплементарность области, вариабельный сегмент (как определено
выше), или другие комбинации последовательностей или
подпоследовательностей, содержащих вариабельную область.
Идентичность последовательности можно определять с
использованием способов, описанных в настоящем документе, например, выравнивания двух последовательностей с использованием BLAST, ALIGN или другого алгоритма выравнивания, известного в данной области. Соответствующая человеческая зародышевая последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность может обладать по меньшей мере приблизительно 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательностью вариабельной области. Соответствующие человеческие зародышевые последовательности можно определять, например, посредством публично доступных международной базы данных ImMunoGeneTics (IMGT) (web-сайт imgt.cines.fr/) и V-base (web-сайт vbase.mrc
сре.cam.ас.uk).
[0068] Фраза "специфически связывает" или "избирательно связывает", при использовании в контексте описания взаимодействия между антигеном (например, белком) и антителом, фрагментом антитела или происходящим из антитела связывающим средством, относится к реакции связывания, определяющей присутствие антигена в гетерогенной популяции белков и других биологических веществ, например, в биологическом образце, например, образце крови, сыворотки, плазмы или ткани. Таким образом, в конкретных указанных условиях иммуноанализа, антитела или связывающие средства с конкретной специфичностью связывания связываются с конкретным антигеном по меньшей мере в два раза сильнее по сравнению с фоном и по существу не связываются в значительном количестве с другими антигенами, присутствующими в образце. В одном варианте осуществления, в обозначенных условиях иммуноанализа, антитело или связывающие средства с конкретной специфичностью связывания связываются с конкретным антигеном по меньшей мере в десять (10) раз сильнее по сравнению с фоном и по существу не связываются в значительном количестве с другими антигенами, присутствующими в образце. Специфическое связывание антитела или связывающего средства в таких условиях может требовать отбора антитела или средства по их специфичности для конкретного белка (например, GITR человека). Как применяют в настоящем документе, специфическое связывание включает в себя антитела, их фрагменты и связывающие молекулы, которые избирательно связываются с GITR человека, и не включает в себя антитела, обладающие перекрестной реактивностью по отношению, например, к молекулам GITR мыши или другим членам суперсемейства рецептора TNF. В некоторых вариантах осуществления, отбирают антитела или фрагменты антител, обладающие перекрестной реактиовностью по отношению к GITR не относящихся к человеку приматов (например, GITR яванского макака).
[0069] Множество форматов иммуноанализа можно использовать
для отбора антител, обладающих специфической
иммуннореактивностью по отношению к конкретному белку. Например, твердофазные иммуноанализы ELISA общепринятым образом используют
для отбора антител, обладающих специфической
иммуннореактивностью по отношению к белку (см., например, в Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998), описание форматов и условий иммуноанализа, которые можно использовать для определения специфической иммуннореактивности). Как правило, при специфической специфической или избирательной реакции связывания получают сигнал, по меньшей мере в два раза превышающий фоновый сигнал, и более конкретно, по меньшей мере в 10-100 раз превышающий фон.
[0070] Термин "равновесная константа диссоциации (KD, М) " относится к константе скорости диссоциации (kd, время-1) , деленной на константу скорости связывания (ка, время-1, М-1) . Равновесные константы диссоциации можно измерять с использованием любого известного в данной области способа. Антитела по настоящему изобретению, как правило, обладают равновесной константой диссоциации менее приблизительно 10~7 или 10~8 М, например, менее приблизительно 10~9 М или Ю-10 М, в некоторых вариантах осуществления, менее приблизительно Ю-11 М, Ю-12 М или Ю-13 М. В некоторых вариантах осуществления, выделенное антитело или фрагмент антитела связывается с GITR человека с равновесной константой диссоциации (KD) приблизительно 1 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления, антитело или фрагмент антитела связывается с GITR человека с KD менее 1 нМ. В некоторых вариантах осуществления, антитело или фрагмент антитела связывается с GITR человека с KD, лежащей в диапазоне от приблизительно 0,5 нМ до приблизительно 1,0 нМ.
[0071] Как применяют в настоящем документе, термин "антигенсвязывающая область" относится к домену связывающей GITR молекулы по этому изобретению, ответственному за специфическое связывание между молекулой и GITR. Антигенсвязывающая область включает в себя по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи антитела и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи антитела. Существует по меньшей мере одна такая антигенсвязывающая область, присутствующая в каждой связывающей GITR молекуле по этому изобретению, и каждая из антигенсвязывающих областей может являться идентичной или
отличной от других. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере одна из антигенсвязывающих областей связывающей GITR молекулы по этому изобретению действует как агонист GITR.
[0072] Термин "антитело-агонист" или "агонист"
взаимозаменяемо обозначают антитело, способное к активации рецептора для индукции полного или частичного опосредованного рецептором ответа. Например, агонист GITR связывается с GITR и индуцирует опосредованную GITR внутриклеточную передачу сигнала
(например, увеличенную активацию экспрессии NF-KB). Антитело-агонист стимулирует передачу сигнала посредством GITR подобно природному лиганду, GITR-L. Связывание GITR-L с GITR индуцирует активацию NFKB благодаря деградации 1кВ. В некоторых вариантах осуществления, антитело-агонист GITR можно идентифицировать по его способности связывать GITR и индуцировать Т-клетки
(например, CD8+ CTL или CD4+ Th-клетки) для пролиферации, выживаемости, цитолитической активности и/или продукции цитокинов (например, IFNy, IL-10, IL-13, TNFa), или иным образом, как описано в настоящем документе.
[0073] Термины "GITR" или "индуцируемый глюкокортикоидами рецептор фактора некроза опухолей" или "член 18 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей", или "TNFRSF18" взаимозаменяемо обозначают трансмембранный белок типа I, являющийся членом суперсемейства рецепторов TNF. GITR экспрессируется на высоких уровнях на CD4+ CD25+ и на активированных эффекторных CD4+ и CD8+ Т-клетках. Последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности GITR известны и опубликованы как No. доступа в GenBank Accession NM_004195.2 -> NP_004186.1 (предшественник изоформы 1), SEQ ID N0:1:
1 maqhgamgaf ralcglallc alslgqrptg gpgcgpgrll lgtgtdarcc rvhttrccrd
61 ypgeeccsew dcmcvqpefh cgdpccttcr hhpcppgqgv qsqgkfsfgf qcidcasgtf
121 sggheghckp wtdctqfgfl tvfpgnkthn avcvpgsppa eplgwltvvl lavaacvlll
181 tsaqlglhiw qlrsqcmwpr etqlllevpp stedarscqf peeergersa eekgrlgdlw 241 v;
NM_148901.1 -> NP_683699.1 (предшественник изоформы 2), SEQ ID N0:2:
1 maqhgamgaf ralcglallc alslgqrptg gpgcgpgrll lgtgtdarcc rvhttrccrd
61 ypgeeccsew dcmcvqpefh cgdpccttcr hhpcppgqgv qsqgkfsfgf qcidcasgtf
121 sggheghckp wtdccwrcrr rpktpeaass prksgasdrq rrrggwetcg cepgrppgpp
181 taaspspgap qaagalrsal grallpwqqk wvqeggsdqr pgpcssaaaa gpcrreretq
241 swppsslagp dgvgs;
и NM_148902.1 -> NP_683700.1 (предшественник изоформы 3), SEQ ID N0:3:
1 maqhgamgaf ralcglallc alslgqrptg gpgcgpgrll lgtgtdarcc rvhttrccrd
61 ypgeeccsew dcmcvqpefh cgdpccttcr hhpcppgqgv qsqgkfsfgf qcidcasgtf
121 sggheghckp wtdctqfgfl tvfpgnkthn avcvpgsppa eplgwltvvl lavaacvlll
181 tsaqlglhiw qlrktqllle vppstedars cqfpeeerge rsaeekgrlg
dlwv.
См. также No. доступа в GenBank NM_005092 -> NP_005083.2. Структурно, аминокислотная последовательность GITR представляет собой трансмембранный белок типа I, являющийся членом суперсемейства рецепторов TNF, который обладает сигнальным пептидом, внеклеточным доменом (ECD), содержащим три богатых цистеином домена (CRD), и обладает на протяжении всей длины по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью из номеров доступа в GenBank NP_004186.1 (SEQ ID N0:1), NP_683699.1 (SEQ ID N0:2), NP_683700.1 (SEQ ID N0:3) или NP_005083.2. Структурно, последовательность нуклеиновой кислоты GITR обладает на
протяжении всей длины по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью нуклеиновой кислоты из номеров доступа в GenBank NM_004195.2, NM_148901.1, NM_148902.1, NM_005092 или SEQ ID N0:1-4. Функционально, агонизм GITR грызунов ингибирует, по меньшей мере временно, супрессорную активность CD25+ регуляторных Т-клеток (Трег). Кроме того, агонизм GITR усиливает иммуноактивность, например, пролиферацию, выживаемость, продукцию цитокинов и цитолитическую активность активированных эффекторных CD4+ и CD8+ Т-клеток. См., например, Nocentini, et al. , Eur J Immunol (2007) 37:1165-1169; Expert Opin Ther Patents (2007) 17 (5):567-757; Shevach and Stephens, Nature Reviews Immunology (2006) 6:613-618.
[0074] "Активность" полипептида по изобретению относится к структурным, регуляторным или биохимическим функциям полипептида в его природной клетке или ткани. Примеры активности полипептида включают в себя как прямую активность, так и опосредованную активность. Иллюстративные виды активности агонизма GITR включают в себя внутриклеточную передачу сигнала, приводящую к увеличенной активации NF-кВ, увеличенной пролиферации, выживаемости, продукции цитокинов (например, IFNy, IL-10, IL-13, TNFa) и цитолитической активности активированных эффекторных CD4+ и CD8+ Т-клеток. Терапевтически, агонизм GITR усиливает противоопухолевые и противовирусные ответы Т-клеток in vivo.
[0075] Термин "выделенный", при применении для нуклеиновой кислоты или белка, обозначает, что нуклеиновая кислота или белок являются в основном свободными от других клеточных компонентов, с которыми они ассоциированы в естественном состоянии. Они предпочтительно находятся в гомогенном состоянии. Они могут либо являться сухими, либо представлять собой водный раствор. Чистоту и гомогенность, как правило, определяют с использованием способов аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или высокоэффективная жидкостная хроматография. Белок, представляющий собой преобладающую молекулу, присутствующую в препарате, является в основном
очищенным. В частности, выделенный ген является отделенным от открытых рамок считывания, которые фланкируют ген и кодируют белок, отличный от белка, кодируемого представляющим интерес геном. Термин "очищенный" обозначает, что нуклеиновая кислота или белок образует по существу одну полосу в геле для электрофореза. В частности, это означает, что нуклеиновая кислота или белок являются по меньшей мере на 85% чистыми, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% чистыми, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 99% чистыми.
[0076] Термин "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид"
относится к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или
рибонуклеиновым кислотам (РНК) и их полимерам либо в одно-, либо
в двухцепочечной форме. Если нет конкретных ограничений, термин
включает в себя нуклеиновые кислоты, содержащие известные
аналоги природных нуклеотидов, которые обладают сходными
свойствами с эталонной нуклеиновой кислотой и подвергаются
метаболизму сходным образом с природными нуклеотидами. Если не
указано иначе, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты
неявно включает в себя также ее консервативно модифицированные
варианты (например, вырожденные замены кодонов), аллели,
ортологи, SNP и комплементарные последовательности, так же как
явно указанную последовательность. Конкретно, вырожденные замены
кодонов можно осуществлять посредством получения
последовательностей, в которых третье положение одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов заменено на остатки смешанных оснований и/или остатки дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al. , J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994) ) .
[0077] Термины "полипептид", "пептид" и "белок" применяют в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины применяют для аминокислотных полимеров, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой химический миметик соответствующей природной аминокислоты, так же как для полимеров природных аминокислот и полимеров неприродных аминокислот.
[0078] Термин "аминокислота" относится к природным и
синтетическим аминокислотам, так же как к аналогам аминокислот и
миметикам аминокислот, функционирующим сходным образом с
природными аминокислотами. Природные аминокислоты представляют
собой аминокислоты, кодированные генетическим кодом, так же как
аминокислоты, модифицированные позднее, например,
гидроксипролин, у-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, обладающим такой же основной химической структурой, как природная аминокислота, т.е., а-атомом углерода, связанным с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и группой R, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные группы R (например, норлейцин) или модифицидные пептидные остовы, но сохраняют такую же основную химическую структуру, как у природных аминокислот. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, которые обладают структурой, отличной от основной химической структуры аминокислот, но которые функционируют сходным образом с природной аминокислотой.
[0079] "Консервативно модифицированные варианты" относится
как к аминокислотным последовательностям, так и к
последовательностям нуклеиновой кислоты. По отношению к
конкретным последовательностям нуклеиновой кислоты,
консервативно модифицированные варианты относятся к тем
нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по
существу идентичные аминокислотные последовательности, или, если
нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную
последовательность, к по существу идентичным
последовательностям. Вследствие вырожденности генетического кода, большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой данный белок. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU все кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где кодоном определен аланин, кодон может быть изменен на любой из описанных соответствующих кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие варианты нуклеиновой
кислоты представляют собой "молчащие варианты", которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариантов. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты в настоящем документе, которая кодирует полипептид, также описывает молчащие варианты нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) можно модифицировать с получением функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждый молчащий вариант нуклеиновой кислоты, который кодирует полипептид, подразумевают в каждой описанной последовательности.
[0080] Что касается аминокислотных последовательностей, специалисту в данной области понятно, что индивидуальные замены, делеции и добавления в последовательности нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, которые изменяют, добавляют или удаляют единственную аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, представляют собой "консервативно модифицированный вариант", когда изменение приводит к замене аминокислоты на химически сходную аминокислоту. Таблицы консервативных замен, представляющие функционально сходные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты дополняют и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели по изобретению.
[0081] Каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, являющиеся консервативными заменами друг для друга: 1) аланин (А), глицин (G) ; 2) аспарагиновая кислота (D) , глутаминовая кислота (Е) ; 3) аспарагин (N) , глутамин (Q) ; 4) аргинин (R) , лизин (К); 5) изолейцин (I), лейцин (L) , метионин (М) , валин (V); б) фенилаланин (F), тирозин (Y) , триптофан (W) ; 7) серии (S), треонин (Т) ; и 8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, Creighton, Proteins (1984)).
[0082] "Процент идентичности последовательности" определяют
посредством сравнения двух оптимально выровненных
последовательностей на протяжении окна сравнения, где часть
полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е., пропуски) по сравнению с эталонной последовательностью (например, полипептидом по изобретению), которая не содержит добавлений или делеций, для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают посредством определения количества положений, в которых идентичные основания нуклеиновой кислоты или аминокислотные остатки встречаются в обеих последовательностях, для получения количества совпадающих положений, деления количества совпадающих положений на общее количество положений в окне сравнения и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательности.
[0083] Термины "идентичная" или процент "идентичности", в
контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот
или полипептидных последовательностей, относятся к двум или
более последовательностям или подпоследовательностям,
представляющим собой одинаковые последовательности. Две
последовательности являются "в основном идентичными", если две
последовательности обладают указанным процентом аминокислотных
остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (т.е., по
меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%
идентичностью последовательности на протяжении указанной
области, или, если не указано, на протяжении всей
последовательности эталонной последовательности), при сравнении
и выравнивании для максимального соответствия на протяжении окна
сравнения, или обозначенной области, как измерено с
использованием одного из следующих алгоритмов сравнения
последовательностей или посредством выравнивания вручную и
визуального контроля. Изобретение относится к полипептидам или
полинуклеотидам, которые являются в основном идентичными
полипептидам или полинуклеотидам, соответственно,
проиллюстрированным в настоящем документе (например, вариабельным областям, проиллюстрированным в любой из SEQ ID N0:6-10, 12, 14, 59 и 61; вариабельным сегментам, проиллюстрированным в любой из SEQ ID N0:16-17; CDR, проиллюстрированным в любой из SEQ ID N0:22-34; FR,
проиллюстрированным в любой из SEQ ID N0:35-50; и последовательностям нуклеиновой кислоты, проиллюстрированным в любой из SEQ ID N0:51-58 и 60) . Необязательно, идентичность существует на протяжении области, имеющей длину по меньшей мере приблизительно 15, 25 или 50 нуклеотидов, или более предпочтительно, на протяжении области, имеющей длину 100-500 или 1000 или более нуклеотидов, или на протяжении всей длины эталонной последовательности. По отношению к аминокислотным последовательностям, идентичность или значительная идентичность может существовать на протяжении области, имеющей длину по меньшей мере 5, 10, 15 или 20 аминокислот, необязательно, имеющей длину по меньшей мере приблизительно 25, 30, 35, 40, 50, 7 5 или 100 аминокислот, необязательно, имеющей длину по меньшей мере приблизительно 150, 2 00 или 2 50 аминокислот, или на протяжении всей длины эталонной последовательности. По отношению к более коротким аминокислотным последовательностям, например, аминокислотным последовательностям из 2 0 или менее аминокислот, значительная идентичность существует, когда один или два аминокислотных остатка консервативно заменены, в соответствии с консервативными заменами, определенными в настоящем документе.
[0084] Для сравнения последовательностей, как правило, одна
последовательность действует как эталонная последовательность, с
которой сравнивают тестируемые последовательности. При
использовании алгоритма сравнения последовательностей,
тестируемые и эталонные последовательности вводят в компьютер,
указывают координаты подпоследовательности, при необходимости, и
указывают параметры алгоритма программы сравнения
последовательностей. Можно использовать параметры программы по умолчанию, или указать альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей рассчитывает процент идентичности последовательностей для тестируемых последовательностей относительно эталонной последовательности, на основании параметров программы.
[0085] "Окно сравнения", как применяют в настоящем документе, включает в себя ссылку на фрагмент из любого количества смежных положений, выбранного из группы, состоящей из
от 20 до 600, как правило, от приблизительно 50 до
приблизительно 2 00, более обычно, от приблизительно 100 до
приблизительно 150, в котором последовательность можно
сравнивать с эталонной последовательностью из такого же
количества смежных положений после оптимального выравнивания
двух последовательностей. Способы выравнивания
последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, посредством алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, посредством алгоритма выравнивания гомологии Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, способом поиска сходства Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, с помощью компьютеризованных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASТА и Т FAS ТА в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), или посредством выравнивания вручную и визуального контроля (см., например, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)).
[0086] Двумя примерами алгоритмов, пригодных для определения процентной идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, описанные в Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:33893402, и Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, соответственно. Программное обеспечение для проведения анализов BLAST является публично доступным через Национальный центр биотехнологической информации. Этот алгоритм включает в себя сначала идентификацию пар последовательностей с высоким количеством баллов (HSP) посредством идентификации в исследуемой последовательности коротких слов длиной W, которые либо совпадают, либо удовлетворяют определенному числу баллов положительного порога Т при выравнивании со словом такой же длины из базы данных последовательностей. Т обозначает порог количества баллов для соседнего слова (Altschul et al. , выше) . Эти исходные совпадения соседних слов выполняют роль затравки
для начала поисков для выявления более длинных HSP, содержащих
их. Совпадения слов продлевают в обоих направлениях вдоль каждой
последовательности до тех пор, пока суммарное количество баллов
выравнивания продолжает увеличиваться. Суммарные баллы
рассчитывают с использованием, для нуклеотидных
последовательностей, параметров М (вознаграждение за совпадающую
пару остатков; всегда > 0) и N (штраф за несовпадающие остатки;
всегда < 0) . Для аминокислотных последовательностей, матрицу
баллов используют для расчета суммарного количества баллов.
Расширение для совпадения слов в каждом направлении прекращают,
когда: суммарное количество баллов выравнивания уменьшается на
количество X от своего максимального достигнутого значения;
суммарное количество баллов снижается до нуля или ниже,
вследствие накопления одного или нескольких отрицательно
оцениваемых выравниваний остатков; или достигнут конец любой из
последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X
определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе
BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) используют по
умолчанию длину слова (W) 11, ожидание (Е) 10, М=5, N=-4 и
сравнение по обеим цепям. Для аминокислотных
последовательностей, в программе BLASTP программа используют по умолчанию длину слова 3 и ожидание (Е) 10, и матрицу баллов BLOSUM62 (см. Henikoff и Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) количество выравниваний (В) 50, ожидание (Е) 10, М=5, N=-4, и сравнение в двух направлениях.
[0087] Алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Одним из измерений сходства, которое обеспечивает алгоритм BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая является показателем вероятности того, что совпадение двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей происходит случайно. Например, нуклеиновую кислоту считают сходной с эталонной последовательностью, если эта наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет менее приблизительно
0,2, более предпочтительно, менее приблизительно 0,01, и наиболее предпочтительно, менее приблизительно 0,001.
[0088] Показателем того, что две последовательности нуклеиновой кислоты или два полипептида являются в основном идентичными, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, обладает иммунологической перекрестной реактивностью с антителами, полученными против полипептида, кодируемого второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид, как правило, является в основном идентичным второму полипептиду, например, когда два пептида отличаются только консервативными заменами. Другим показателем того, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются в основном идентичными, является то, что эти две молекулы или комплементарные им молекулы гибридизуются друг с другом в строгих условиях, как описано ниже. Другим показателем того, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются в основном идентичными, является то, что одни и те же праймеры можно использовать для амплификации последовательности.
[0089] Термин "связь", при применении в контексте того, как
антигенсвязывающие области соединены внутри связывающей GITR
молекулы по этому изобретению, включает в себя все возможные
способы физического соединения областей. Множество
антигенсвязывающих областей часто соединяют химическими связями, такими как ковалентная связь (например, пептидная связь или дисульфидная связь) или нековалентная связь, которые могут представлять собой либо прямую связь (т.е., без линкера между двумя антигенсвязывающими областями), либо непрямую связь (т.е., с помощью по меньшей мере одной линкерной молекулы между двумя или более антигенсвязывающими областями).
[0090] Термины "субъект", "пациент" и "индивидуум" взаимозаменяемо относятся к млекопитающему, например, человеку или млекопитающему из не относящихся к человеку приматов. Млекопитающее может представлять собой также лабораторное млекопитающее, например, мышь, крысу, кролика, хомяка. В некоторых вариантах осуществления, млекопитающее может представлять собой сельскохозяйственное млекопитающее (например,
лошадиное, овечье, бычье, свиное, верблюдовое) или домашнее млекопитающее (например, собачье, кошачье).
[0091] Как применяют в настоящем документе, термины "лечить", "лечение" или "излечение" любого заболевания или нарушения в одном варианте осуществления относится к облегчению заболевания или нарушения (т.е., замедлению или аресту, или уменьшению развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом варианте осуществления, "лечить", "лечение", или "излечение" относится к смягчению или улучшению по меньшей мере одного физического параметра, включая те, которые могут являться неразличимыми пациентом. В другом варианте осуществления, "лечить", "лечение" или "излечение" относится к модуляции заболевания или нарушения, физически (например, стабилизации различимого симптома), физиологически (например, стабилизации физического параметра) или обоими способами. В другом варианте осуществления, "лечить", "лечение" или "излечение" относится к предотвращению или отсрочке начала или развития, или прогрессирования заболевания или нарушения.
[0092] Термин "терапевтически приемлемое количество" или
"терапевтически эффективная доза" взаимозаменяемо относятся к
количеству, достаточному для обеспечения желательного результата
(т.е., уменьшения размера опухоли, ингибирования роста опухоли,
предотвращения метастазирования, ингибирования или
предотвращения вирусной, бактериальной, грибковой или
паразитарной инфекции). В некоторых вариантах осуществления,
терапевтически приемлемое количество не индуцирует или не
вызывает нежелательных побочных эффектов. Терапевтически
приемлемое количество можно определять посредством введения
сначала низкой дозы, и затем постепенного увеличения этой дозы
до достижения желательного эффекта. "Профилактически эффективная
доза" и "терапевтически эффективная доза" агонистического
антитела против GITR по изобретению может предотвращать начало,
или приводить к уменьшению тяжести, соответственно, симптомов
заболевания, включая симптомы, ассоциированные со
злокачественной опухолью или инфекционным заболеванием.
[0093] Термин "совместное введение" относится к
одновременному присутствию двух действующих веществ в крови индивидуума. Действующие вещества, которые вводят совместно, можно вводить одновременно или последовательно.
[0094] Как применяют в настоящем документе, фраза "в основном состоящий из" относится к типам или видам активных лекарственных средств, включенных в способ или композицию, так же как к любым неактивным носителям или наполнителям для намеченного применения способов или композиций. В некоторых вариантах осуществления, фраза "в основном состоящий из" в явной форме исключает включение одного или нескольких дополнительных действующих веществ, отличных от агонистического антитела против GITR по изобретению. В некоторых вариантах осуществления, фраза "в основном состоящий из" в явной форме исключает включение одного или нескольких дополнительных действующих веществ, отличных от агонистического антитела против GITR по изобретению и второго совместно вводимого средства.
[0095] Термины "ассоциированный со злокачественной опухолью
антиген" или "опухолеассоциированный антиген" или
"опухолеспецифический маркер" или "маркер опухоли"
взаимозаменяемо относятся к молекуле (как правило, белку,
углеводу или липиду), которая предпочтительно экспрессируется на
поверхности клетки злокачественной опухоли по сравнению с
нормальной клеткой, и которую можно использовать для
предпочтительного нацеливания лекарственного средства на клетки
злокачественной опухоли. Часто, ассоциированный со
злокачественной опухолью антиген представляет собой молекулу поверхности клетки с увеличенной экспрессией в клетке злокачественной опухоли по сравнению с нормальной клеткой, например, с экспрессией, увеличенной в 1 раз, с экспрессией, увеличенной в 2 раза, с экспрессией, увеличенной в 3 раза или более, по сравнению с нормальной клеткой. Часто, ассоциированный со злокачественной опухолью антиген представляет собой молекулу клеточной поверхности, несоответствующим образом синтезируемую в клетке злокачественной опухоли, например, молекулу, содержащую делеции, добавления или мутации по сравнению с молекулой, экспрессированной на нормальной клетке. Часто, ассоциированный
со злокачественной опухолью антиген экспрессируется исключительно на клеточной поверхности клетки злокачественной опухоли и не синтезируется или не экспрессируется на поверхности нормальной клетки. Иллюстративные маркеры поверхности клеток опухоли включают в себя белки с-егЬВ-2 и рецептор эпидермального фактора роста человека (HER) для рака молочной железы, PSMA для рака предстательной железы, и углеводы муцинов для многих злокачественных опухолей, включая злокачественные опухоли молочной железы, яичников и колоректальные злокачественные опухоли.
[0096] Как применяют в настоящем документе, термины "первый", "второй", "третий" и "четвертый", по отношению к антигенсвязывающим группам, например, Fab, используют для удобства их различения, когда присутствует более одной из каждой группы. Применение этих терминов не предназначено для придания определенного порядка или ориентации антитела, если не указано иначе.
[0097] Неконкретизированные и конкретизированные термины в единственном числе включают в себя ссылки на множественное число, если контекст явно не требует иного. Агонистические антитела против GITR
[0098] Настоящее изобретение относится к антителам, фрагментам антител и антигенсвязывающим молекулам, которые связываются с GITR и стимулируют передачу сигнала посредством GITR, и/или индуцируют усиленный иммунный ответ in vivo. Антитела, фрагменты антител и антигенсвязывающие молекулы находят применение для усиления ответов CD4+ Т-помощников (Th) и/или CD8+ цитолитических Т-лимфоцитов (CTL) против антигена-мишени. Они находят применение также в лечении состояний заболевания, прогрессирование которых можно обращать или ингибировать посредством эффективного иммунного ответа, включая злокачественные опухоли и инфекционные заболевания.
[0099] Антитела, фрагменты антител и антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению обладают подходящими свойствами для применения для пациентов-людей, например, они обладают низким риском проблем с иммуногенностью при применении
для человека (они кодированы человеческими зародышевыми последовательностями нуклеиновой кислоты, за исключением определяющих специфичность связывания областей (BSD), в частности, по меньшей мере CDR3); обладают высокой аффинностью для GITR (например, KD составляет по меньшей мере менее 5 нМ); не вступают в перекрестную реакцию с другими членами суперсемейства TNFR; вступают в перекрестную реакцию с GITR человека и GITR не относящихся к человеку приматов; и проявляют агонизм к передаче сигналов посредством GITR в низких дозах (например, в концентрациях менее 5 нМ в анализах in vitro) . Другие виды активности и характеристики также указаны на протяжении описания.
[0100] Соответственно, настоящее изобретение относится к антителам, фрагментам антител и антигенсвязывающим молекулам, являющимся агонистами GITR. Представленные антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR содержат последовательность минимальной детерминанты специфичности связывания (BSD) внутри CDR3 тяжелых и легких цепей, полученные из исходного или эталонного моноклонального антитела, например, антител, описанных в таблице 1 и таблице 2 ниже. Оставшиеся последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи (CDR и FR) , например, V-сегмент и J-сегмент, происходят из соответствующих человеческих зародышевых и подвергнутых аффинному созреванию аминокислотных последовательностей. V-сегменты можно выбирать из библиотеки человеческих V-сегментов. Дальнейшее уточнение последовательности можно осуществлять посредством аффинного созревания или других способов, известных в данной области для оптимизации активности связывания или активности антител, фрагментов антител или антигенсвязывающих молекул по изобретению.
[0101] В другом варианте осуществления, тяжелые и легкие
цепи антител или фрагментов антител против GITR содержат
человеческий V-сегмент из соответствующей человеческой
зародышевой последовательности (FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3),
например, выбранный из библиотеки человеческих V-сегментов, и
фрагмент последовательности CDR3-FR4 из исходного
моноклонального антитела (например, антител, как описано в таблице 1 и таблице 2) . Фрагмент последовательности CDR3-FR4 можно далее уточнять посредством замены фрагментов последовательности на соответствующие человеческие зародышевые последовательности и/или посредством аффинного созревания. Например, последовательность FR4 и/или CDR3, окружающую BSD, можно заменять на соответствующую человеческую зародышевую последовательность, в то время как BSD из CDR3 исходного моноклонального антитела сохраняют.
[0102] В некоторых вариантах осуществления, соответствующая
человеческая зародышевая последовательность для V-сегмента
тяжелой цепи представляет собой VH3 3-13/30:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIRYDGSNKYYADSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK (SEQ ID N0:89). В одном
варианте осуществления, последняя аминокислота в SEQ ID N0:89,
лизин ("К"), заменена на аргинин ("R"). В некоторых вариантах
осуществления, соответствующая человеческая зародышевая
последовательность для J-сегмента тяжелой цепи представляет
собой JH4. В некоторых вариантах осуществления, J-сегмент
тяжелой цепи содержит частичную человеческую зародышевую
последовательность JH4 WGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:90).
Полноразмерный J-сегмент из человеческой зародышевой JH4 представляет собой YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:91). Гены вариабельной области обозначены в соответствии со стандартной номенклатурой генов вариабельной области иммуноглобулинов. Современная информация о генах иммуноглобулинов доступна во всемирной web-сети, например, в базах данных ImMunoGeneTics (IMGT), V-base и PubMed. См. также Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18 (2):100-16; Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(3):161-74; Exp Clin Immunogenet. 2001;18(4):242-54; и Giudicelli, et al., Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D256-61.
[0103] В некоторых вариантах осуществления, соответсвующая
человеческая зародышевая последовательность для V-сегмента
легкой цепи представляет собой VKIII L16/A27:
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPDRFSG
SGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP (SEQ ID N0:92). В некоторых
вариантах осуществления, соответствующая человеческая
зародышевая последовательность для J-сегмента легкой цепи представляет собой JK2. В некоторых вариантах осуществления, J-сегмент легкой цепи содержит частичную человеческую зародышевую последовательность Jk2 FGQGTKLEIK (SEQ ID N0:93). Полноразмерный J-сегмент из человеческой зародышевой Jk2 представляет собой YTFGQGTKLEIK (SEQ ID N0:94).
[0104] В некоторых вариантах осуществления, V-сегмент тяжелой цепи обладает по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью
(E/Q)VQLVESGGGLVQ(P/S)GGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEW(L/V)GVIW GGGGTYY(А/Т)(A/S)S(L/V)М(А/G)RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA(K/R )(H/N)AYGHDGGFAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:16).
[0105] В некоторых вариантах осуществления, V-сегмент легкой цепи обладает по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRAS(E/Q)SVSSN(L/V)AWYQQ(K/R)PGQAPRLLIYGAS NRATGIP(D/A)RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID N0:17).
[0106] В некоторых вариантах осуществления, i) CDR3 тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность HAYGHDGGFAMDY (SEQ ID N0:29) или NAYGHDGGFAMDY (SEQ ID N0:109); и ii) CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность GQSYSYPFT (SEQ ID N0:34) или SYSYPF (SEQ ID N0:83).
[0107] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител по изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SYGVD (SEQ ID N0:22) или GFSLSSY (SEQ ID N0:84); CDR2, содержащую аминокислотную последовательность VIWGGGGTYY(А/Т)(A/S)S(L/V)M(A/G) (SEQ ID N0:28) или WGGGG (SEQ ID N0:80); и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность HAYGHDGGFAMDY (SEQ ID N0:29) или NAYGHDGGFAMDY (SEQ ID N0:109).
[0108] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител по изобретению содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, содержащую аминокислотную последовательность RAS(E/Q)SVSSN(L/V)A (SEQ ID N0:32) или S(E/Q)SVSSN (SEQ ID N0:87); CDR2, содержащую аминокислотную последовательность GASNRAT (SEQ ID N0:33) или GAS (SEQ ID N0:82); и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность GQSYSYPFT (SEQ ID N0:34) или SYSYPF (SEQ ID N0:83).
[0109] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител по изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SYGVD (SEQ ID N0:22) или GFSLSSY (SEQ ID N0:84); CDR2, содержащую аминокислотную последовательность VIWGGGGTYY(А/Т)(A/S)S(L/V)M(A/G) (SEQ ID N0:28) или WGGGG (SEQ ID N0:80); и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность HAYGHDGGFAMDY (SEQ ID N0:29) или NAYGHDGGFAMDY (SEQ ID N0:109). Такие антитела или фрагменты антител по изобретению дополнительно содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, содержащую аминокислотную последовательность RAS(E/Q)SVSSN(L/V)A (SEQ ID N0:32) или S(E/Q)SVSSN (SEQ ID N0:87); CDR2, содержащую аминокислотную последовательность GASNRAT (SEQ ID N0:33), или GAS (SEQ ID N0:82); и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность GQSYSYPFT (SEQ ID N0:34) или SYSYPF (SEQ ID N0:83).
[ОНО] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител по изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SYGVD (SEQ ID N0:22) или GFSLRSY (SEQ ID N0:79); CDR2, содержащую аминокислотную последовательность VIWGGGGTNYNSALMA (SEQ ID N0:62) или WGGGG (SEQ ID N0:80); и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность HAYGHDGGFAMDY (SEQ ID N0:29) или NAYGHDGGFAMDY (SEQ ID N0:109). В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител являются гуманизированными.
[0111] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител по изобретению содержат вариабельную область
легкой цепи, содержащую CDR1, содержащую аминокислотную последовательность KASENVDTFVS (SEQ ID N0:63) или SENVDTF (SEQ ID N0:81); CDR2, содержащую аминокислотную последовательность GASNRYT (SEQ ID N0:64) или GAS (SEQ ID N0:82); и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность GQSYSYPFT (SEQ ID N0:34) или SYSYPF (SEQ ID N0:83). В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител являются гуманизированными.
[0112] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител по изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SYGVD (SEQ ID N0:22) или GFSLRSY (SEQ ID N0:79); CDR2, содержащую аминокислотную последовательность VIWGGGGTNYNSALMA (SEQ ID N0:62) или WGGGG (SEQ ID N0:80); и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность HAYGHDGGFAMDY (SEQ ID N0:29) или NAYGHDGGFAMDY (SEQ ID N0:109). Такие антитела или фрагменты антител дополнительно содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, содержащую аминокислотную последовательность KASENVDTFVS (SEQ ID N0:63) или SENVDTF (SEQ ID N0:81); CDR2, содержащую аминокислотную последовательность GASNRYT (SEQ ID N0:64) или GAS (SEQ ID N0:82); и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность GQSYSYPFT (SEQ ID N0:34) или SYSYPF (SEQ ID N0:83). В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител являются гуманизированными.
[0113] В некоторых вариантах осуществления, вариабельная
область тяжелой цепи содержит FR1, содержащую аминокислотную
последовательность (E/Q)VQLVESGGGLVQ(P/S)GGSLRLSCAASGFSLS (SEQ
ID N0:37); FR2, содержащую аминокислотную последовательность
WVRQAPGKGLEW(L/V)G (SEQ ID N0:40); FR3, содержащую
аминокислотную последовательность RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA(K/R) (SEQ ID N0:41); и FR4, содержащую аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:42). В некоторых вариантах осуществления, вариабельная область тяжелой цепи содержит FR1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLS
(SEQ ID N0:35) и QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLS (SEQ ID N0:36);
FR2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из
WVRQAPGKGLEWVG (SEQ ID N0:38) и WVRQAPGKGLEWLG (SEQ ID N0:39);
FR3, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID
N0:41; и FR4, содержащую аминокислотную последовательность из
SEQ ID N0:42. Идентифицированные аминокислотные
последовательности могут иметь одну или несколько замененных аминокислот (например, при аффинном созревании), или одну или две консервативно замененные аминокислоты.
[0114] В некоторых вариантах осуществления, вариабельная область легкой цепи содержит FR1, содержащую аминокислотную последовательность EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC (SEQ ID N0:43); FR2, содержащую аминокислотную последовательность WYQQ(K/R)PGQAPRLLIY
(SEQ ID N0:46); FR3, содержащую аминокислотную
последовательность GIP (A/D) RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC (SEQ ID N0:49); и FR4, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID N0:50. В некоторых вариантах осуществления, вариабельная область легкой цепи содержит FR1, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID N0:43; FR2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из WYQQRPGQAPRLLIY
(SEQ ID N0:44) и WYQQRPGQAPRLLIY (SEQ ID N0:45); FR3, содержащую
аминокислотную последовательность, выбранную из
GIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC (SEQ ID N0:47) и
GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC (SEQ ID N0:48); и FR4, содержащую аминокислотную последовательность FGQGTKLEIK (SEQ ID N0:50). Идентифицированные аминокислотные последовательности могут иметь одну или несколько замененных аминокислот (например, при аффинном созревании), или одну или две консервативно замененные аминокислоты.
[0115] На протяжении их полной длины, вариабельные области
антител против GITR по настоящему изобретению, как правило,
обладают суммарной идентичностью аминокислотной
последовательности вариабельной области (например, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4) по меньшей мере приблизительно 85%, например, по меньшей мере приблизительно 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% с соответствующей
человеческой зародышевой аминокислотной последовательностью
вариабельной области. Например, тяжелая цепь антител против GITR
может обладать по меньшей мере приблизительно 85%, 89%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентичностью аминокислотной последовательности с человеческой
зародышевой вариабельной областью
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIRYDGSNKYYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK-YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:89 и 91) (VH3 3-13/3 0 + CDR3 +JH4, где дефис представляет собой CDR3, которая может иметь разную длину). В одном варианте осуществления, последняя аминокислота в SEQ ID N0:89, лизин (К), заменена на аргинин (R) . Легкая цепь антител против GITR может обладать по меньшей мере приблизительно 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с человеческой зародышевой вариабельной областью EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPDRFSG SGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC-YTFGQGTKLEIK (SEQ ID NOS:98 и 94) (VKIII L16/A27+CDR3+JK2; где дефис представляет собой CDR3, которая может иметь разную длину). В некоторых вариантах осуществления, только аминокислоты внутри каркасных областей добавляют, делетируют или заменяют. В некоторых вариантах осуществления, из сравнения идентичности последовательностей исключают CDR3.
SEQ ID NO: описание
Последовательность
аминокислотной
последовательно сти или
полинуклеотида (PN)
59: VL, МАВ1
NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVDTFVSWYQQKPDHSPKLLIYGAS NRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSYPFTFGSGTKL EIK
60: PN для VH МАВ1,
кодирующий SEQ ID N0: 61 (VH)
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCC TGTCCATCACTTGCACTGTCTCTGGGTTTTCATTAAGGAGCTATGGTGTAGA CTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTTATATGG GGTGGTGGAGGCACAAATTATAATTCAGCTCTCATGGCCAAACTGAGTATCA GCAAAGACAAGT CCAAGAGCCAAGTTTT CT TAAAAATGAACAGT CT GCAAAC TGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAAACATGCCTATGGTCACGACGGC GGTTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
58: PN для VL МАВ1,
кодирующий SEQ ID NO: 59 (VL)
AACATTGTAATGACCCAATCTCCCAAATCCATGTCCATGTCAGTAGGAGAGA GGGTCACCTTGAGCTGCAAGGCCAGTGAGAATGTGGATACTTTTGTATCCTG GTATCAACAGAAACCAGACCACTCTCCTAAACTACTGATATACGGGGCATCC AACCGGTACACTGGGGTCCCCGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGCAACAG AT TTCACTCT GAC СAT СAGCAG TGTGCAGGCT GAAGAC С T T G СAGAT T AT СA CTGTGGACAGAGTTACAGCTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTG GAAATAAAA
6: VH, MAB2
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWVGVIW GGGGTYYASSVMARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSS
7: VL, MAB2
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESVSSNVAWYQQRPGQAPRLLIYGAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIK
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
65: Тяжелая цепь, МАВ2
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWVGVIW GGGGTYYASSVMARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
66: Легкая цепь, МАВ2
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESVSSNVAWYQQRPGQAPRLLIYGAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC
51: PN для VH МАВ2,
кодирующий SEQ ID N0: 6
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGCAGCTATGGTGTGGA CTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGGTGGGAGTTATATGG GGTGGTGGAGGCACATATTATGCTTCTTCTGTCATGGCCAGATTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGCGCCAAACATGCCTATGGCCATGATGGC GGCTTTGCTATGGATTATTGGGGCCAGGGTACCCTTGTGACCGTGAGCTCA
52: PN для VL МАВ2,
кодирующий SEQ ID NO: 7
GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTTTCTCCAGGAGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTGAGAGTGTTAGCAGTAATGTAGCCTG GTACCAGCAGAGACCTGGCCAGGCACCCAGGCTCCTCATCTACGGGGCATCC AACCGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAG ACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTACTA CTGCGGCCAGAGCTATAGCTATCCATTTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTT GAAATTAAG
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
67 : PN для НС МАВ2,
кодирующий SEQ ID N0: 65
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGCAGCTATGGTGTGGA CTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGGTGGGAGTTATATGG GGTGGTGGAGGCACATATTATGCTTCTTCTGTCATGGCCAGATTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGCGCCAAACATGCCTATGGCCATGATGGC GGCTTTGCTATGGATTATTGGGGCCAGGGTACCCTTGTGACCGTGAGCTCAG CTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCAC CAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAG CCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCT TCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGTCCAGCGTGGTGAC AGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACA AGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCCCCAGAGCTGCTGGGCGGACCCTC CGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACC CCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCAGAGGTGA AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCC CAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTG CTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCC ACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGAGGAGATGACCAAG AACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC CCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAA G
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
68 : PN для LC МАВ2,
кодирующий SEQ ID N0: 66
GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTTTCTCCAGGAGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTGAGAGTGTTAGCAGTAATGTAGCCTG GTACCAGCAGAGACCTGGCCAGGCACCCAGGCTCCTCATCTACGGGGCATCC AACCGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAG ACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTACTA CTGCGGCCAGAGCTATAGCTATCCATTTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTT GAAATTAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCG ACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTT CTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGC GGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACA GCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGT GTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGC TTCAACAGGGGCGAGTGC
8: VH, МАВЗ
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWLGVIW GGGGTYYTASLMGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSS
9: VL, МАВЗ
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGAS NRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIK
69: Тяжелая цепь, МАВЗ
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWLGVIW GGGGTYYTASLMGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
70: Легкая цепь, МАВЗ
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGAS NRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC
53: PN для VH МАВЗ,
кодирующий SEQ ID N0: 8
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGCAGCTATGGTGTGGA CTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTTATATGG GGTGGTGGAGGCACATATTATACTGCTTCTCTCATGGGCAGATTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGCGCCAAACATGCCTATGGCCATGATGGC GGCTTTGCTATGGATTATTGGGGCCAGGGTACCCTTGTGACCGTGAGCTCA
54: PN для VL МАВЗ,
кодирующий SEQ ID N0: 9
GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTG GTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTACGGGGCATCC AACCGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAG ACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTACTA CTGCGGCCAGAGCTATAGCTATCCATTTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTT GAAATTAAA
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
71: PN для НС МАВЗ,
кодирующий SEQ ID N0: 69
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGCAGCTATGGTGTGGA CTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTTATATGG GGTGGTGGAGGCACATATTATACTGCTTCTCTCATGGGCAGATTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGCGCCAAACATGCCTATGGCCATGATGGC GGCTTTGCTATGGATTATTGGGGCCAGGGTACCCTTGTGACCGTGAGCTCAG CTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCAC CAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAG CCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCT TCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGTCCAGCGTGGTGAC AGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACA AGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCCCCAGAGCTGCTGGGCGGACCCTC CGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACC CCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCAGAGGTGA AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCC CAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTG CTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCC ACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGAGGAGATGACCAAG AACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC CCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAA G
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
72: PN для LC МАВЗ,
кодирующий SEQ ID N0: 7 0
GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTG GTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTACGGGGCATCC AACCGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAG ACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTACTA CTGCGGCCAGAGCTATAGCTATCCATTTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTT GAAATTAAACGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCG ACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTT CTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGC GGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACA GCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGT GTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGC TTCAACAGGGGCGAGTGC
10: VH, МАВ4
EVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWVGVIW GGGGTYYASSLMGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSS
7: VL, МАВ4
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESVSSNVAWYQQRPGQAPRLLIYGAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIK
73: Тяжелая цепь, МАВ4
EVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWVGVIW GGGGTYYASSLMGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
66: Легкая цепь, МАВ4
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESVSSNVAWYQQRPGQAPRLLIYGAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC
55: PN для VH МАВ4,
кодирующий SEQ ID N0: 10
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGTCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGCAGCTATGGTGTGGA CTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGGTGGGAGTTATATGG GGTGGTGGAGGCACATATTATGCTTCTTCTCTCATGGGCAGATTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGCGCCAAACATGCCTATGGCCATGATGGC GGCTTTGCTATGGATTATTGGGGCCAGGGTACCCTTGTGACCGTGAGCTCA
52: PN для VL МАВ4,
кодирующий SEQ ID NO: 7
GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTTTCTCCAGGAGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTGAGAGTGTTAGCAGTAATGTAGCCTG GTACCAGCAGAGACCTGGCCAGGCACCCAGGCTCCTCATCTACGGGGCATCC AACCGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAG ACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTACTA CTGCGGCCAGAGCTATAGCTATCCATTTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTT GAAATTAAG
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
74: PN для НС МАВ4,
кодирующий SEQ ID N0: 73
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGTCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGCAGCTATGGTGTGGA CTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGGTGGGAGTTATATGG GGTGGTGGAGGCACATATTATGCTTCTTCTCTCATGGGCAGATTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGCGCCAAACATGCCTATGGCCATGATGGC GGCTTTGCTATGGATTATTGGGGCCAGGGTACCCTTGTGACCGTGAGCTCAG CTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCAC CAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAG CCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCT TCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGTCCAGCGTGGTGAC AGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACA AGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCCCCAGAGCTGCTGGGCGGACCCTC CGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACC CCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCAGAGGTGA AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCC CAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTG CTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCC ACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGAGGAGATGACCAAG AACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC CCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAA G
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
68 : PN для LC МАВ4,
кодирующий SEQ ID N0: 66
GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTTTCTCCAGGAGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTGAGAGTGTTAGCAGTAATGTAGCCTG GTACCAGCAGAGACCTGGCCAGGCACCCAGGCTCCTCATCTACGGGGCATCC AACCGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAG ACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTACTA CTGCGGCCAGAGCTATAGCTATCCATTTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTT GAAATTAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCG ACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTT CTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGC GGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACA GCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGT GTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGC TTCAACAGGGGCGAGTGC
12: VH, МАВ5
EVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWLGVIW GGGGTYYTSSLMGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSS
7: VL, МАВ5
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESVSSNVAWYQQRPGQAPRLLIYGAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIK
75: Тяжелая цепь, МАВ5
EVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWLGVIW GGGGTYYTSSLMGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
66: Легкая цепь, МАВ5
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESVSSNVAWYQQRPGQAPRLLIYGAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVflHKLQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC
56: PN для VH МАВ5,
кодирующий SEQ ID N0: 12
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGTCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGCAGCTATGGTGTGGA CTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTTATATGG GGTGGTGGAGGCACATATTATACTTCTTCTCTCATGGGCAGATTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGCGCCAAACATGCCTATGGCCATGATGGC GGCTTTGCTATGGATTATTGGGGCCAGGGTACCCTTGTGACCGTGAGCTCA
52: PN для VL МАВ5,
кодирующий SEQ ID NO: 7
GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTTTCTCCAGGAGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTGAGAGTGTTAGCAGTAATGTAGCCTG GTACCAGCAGAGACCTGGCCAGGCACCCAGGCTCCTCATCTACGGGGCATCC AACCGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAG ACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTACTA CTGCGGCCAGAGCTATAGCTATCCATTTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTT GAAATTAAG
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
76: PN для НС МАВ5,
кодирующий SEQ ID NO: 75
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGTCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGCAGCTATGGTGTGGA CTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTTATATGG GGTGGTGGAGGCACATATTATACTTCTTCTCTCATGGGCAGATTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGCGCCAAACATGCCTATGGCCATGATGGC GGCTTTGCTATGGATTATTGGGGCCAGGGTACCCTTGTGACCGTGAGCTCAG CTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCAC CAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAG CCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCT TCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGTCCAGCGTGGTGAC AGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACA AGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCCCCAGAGCTGCTGGGCGGACCCTC CGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACC CCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCAGAGGTGA AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCC CAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTG CTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCC ACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGAGGAGATGACCAAG AACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC CCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAA G
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
68 : PN для LC МАВ5,
кодирующий SEQ ID N0: 66
GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTTTCTCCAGGAGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTGAGAGTGTTAGCAGTAATGTAGCCTG GTACCAGCAGAGACCTGGCCAGGCACCCAGGCTCCTCATCTACGGGGCATCC AACCGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAG ACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTACTA CTGCGGCCAGAGCTATAGCTATCCATTTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTT GAAATTAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCG ACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTT CTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGC GGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACA GCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGT GTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGC TTCAACAGGGGCGAGTGC
14: VH, МАВб
EVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWLGVIW GGGGTYYTSSLMARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSS
7: VL, МАВб
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESVSSNVAWYQQRPGQAPRLLIYGAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIK
77: Тяжелая цепь, МАВб
EVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWLGVIW GGGGTYYTSSLMARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
66: Легкая цепь, МАВб
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESVSSNVAWYQQRPGQAPRLLIYGAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC
57: PN для VH МАВб,
кодирующий SEQ ID N0: 14
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGTCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGCAGCTATGGTGTGGA CTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTTATATGG GGTGGTGGAGGCACATATTATACTTCTTCTCTCATGGCCAGATTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGCGCCAAACATGCCTATGGCCATGATGGC GGCTTTGCTATGGATTATTGGGGCCAGGGTACCCTTGTGACCGTGAGCTCA
52: PN для VL МАВб,
кодирующий SEQ ID N0: 7
GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTTTCTCCAGGAGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTGAGAGTGTTAGCAGTAATGTAGCCTG GTACCAGCAGAGACCTGGCCAGGCACCCAGGCTCCTCATCTACGGGGCATCC AACCGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAG ACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTACTA CTGCGGCCAGAGCTATAGCTATCCATTTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTT GAAATTAAG
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
78: PN для НС МАВб,
кодирующий SEQ ID N0: 77
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGTCTGGGGGGTCCC TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGCAGCTATGGTGTGGA CTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTTATATGG GGTGGTGGAGGCACATATTATACTTCTTCTCTCATGGCCAGATTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGCGCCAAACATGCCTATGGCCATGATGGC GGCTTTGCTATGGATTATTGGGGCCAGGGTACCCTTGTGACCGTGAGCTCAG CTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCAC CAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAG CCCGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCT TCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGTCCAGCGTGGTGAC AGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACA AGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCCCCAGAGCTGCTGGGCGGACCCTC CGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACC CCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCAGAGGTGA AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCC CAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTG CTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AGGCCCTGCCAGCCCCCATCGAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCC ACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCCGGGAGGAGATGACCAAG AACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC CCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGCAA G
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
68:PN для LC МАВб,
кодирующий SEQ ID N0: 66
GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTTTCTCCAGGAGAAA GAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTGAGAGTGTTAGCAGTAATGTAGCCTG GTACCAGCAGAGACCTGGCCAGGCACCCAGGCTCCTCATCTACGGGGCATCC AACCGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAG ACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTACTA CTGCGGCCAGAGCTATAGCTATCCATTTACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTT GAAATTAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCG ACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTT CTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGC GGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACA GCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGT GTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGC TTCAACAGGGGCGAGTGC
99: VH, МАВ7
EVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWVGVIW GGGGTYYASSLMGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSS
7: VL, МАВ7
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESVSSNVAWYQQRPGQAPRLLIYGAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIK
10 0: Тяжелая цепь, МАВ7
EVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWVGVIW GGGGTYYASSLMGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
66: Легкая цепь, МАВ7
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESVSSNVAWYQQRPGQAPRLLIYGAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC
101: PN для VH МАВ7,
кодирующий SEQ ID NO: 99
GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGTCCGGCGGCTCTC TGAGACTGTCTTGCGCTGCCTCCGGCTTCTCCCTGTCCTCTTACGGCGTGGA CTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTGG GGCGGAGGCGGCACCTACTACGCCTCTTCCCTGATGGGCCGGTTCACCATCT CCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGC CGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGACACGCCTACGGCCACGACGGC GGCTTCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCC
102: PN для VL МАВ7,
кодирующий SEQ ID NO: 7
GAGATCGTGATGACCCAGTCCCCCGCCACCCTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGA GAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGTCCTCCAACGTGGCCTG GTATCAGCAGAGACCTGGTCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACGGCGCCTCT AACCGGGCCACCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCG ACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTA CTGCGGCCAGTCCTACTCATACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTG GAAATCAAG
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
103: PN для НС МАВ7,
кодирующий SEQ ID NO: 100
GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGTCCGGCGGCTCTC TGAGACTGTCTTGCGCTGCCTCCGGCTTCTCCCTGTCCTCTTACGGCGTGGA CTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGGGAGTGATCTGG GGCGGAGGCGGCACCTACTACGCCTCTTCCCTGATGGGCCGGTTCACCATCT CCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGC CGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGACACGCCTACGGCCACGACGGC GGCTTCGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCG CTAGCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTAC TTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAG CCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCT TCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGAC AGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACA AGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTC CGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACC CCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGA AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCC CAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTG CTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACA AGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCC ACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAG AACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC CCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAA G
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
104: PN для LC МАВ7,
кодирующий SEQ ID N0: 66
GAGATCGTGATGACCCAGTCCCCCGCCACCCTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGA GAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGTCCTCCAACGTGGCCTG GTATCAGCAGAGACCTGGTCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACGGCGCCTCT AACCGGGCCACCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCG ACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTA CTGCGGCCAGTCCTACTCATACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTG GAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCG ACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTT CTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGC GGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACA GCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGT GTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGC TTCAACAGGGGCGAGTGC
105: VH, МАВ8
EVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWVGVIW GGGGTYYASSLMGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSS
7: VL, МАВ8
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESVSSNVAWYQQRPGQAPRLLIYGAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIK
10 6: Тяжелая цепь, МАВ8
EVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGFSLSSYGVDWVRQAPGKGLEWVGVIW GGGGTYYASSLMGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNAYGHDG GFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
66: Легкая цепь, МАВ8
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASESVSSNVAWYQQRPGQAPRLLIYGAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCGQSYSYPFTFGQGTKL EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC
107: PN для VH МАВ8,
кодирующий SEQ ID NO: 105
GAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGCGGCGGACTGGTGCAGTCAGGCGGTAGCC TGAGACTGAGCTGCGCCGCCTCCGGCTTTAGCCTGTCTAGCTACGGCGTGGA CTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTCGGAGTGATCTGG GGCGGAGGCGGAACCTACTACGCCTCTAGCCTGATGGGCCGGTTCACTATCT CTAGGGACAACTCTAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGAGAGC CGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCTAGAAACGCCTACGGTCACGACGGC GGCTTCGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTCACCGTGAGTTCA
102: PN для VL МАВ8,
кодирующий SEQ ID NO: 7
GAGATCGTGATGACCCAGTCCCCCGCCACCCTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGA GAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGTCCTCCAACGTGGCCTG GTATCAGCAGAGACCTGGTCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACGGCGCCTCT AACCGGGCCACCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCG ACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTA CTGCGGCCAGTCCTACTCATACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTG GAAATCAAG
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
108: PN для НС МАВ8,
кодирующий SEQ ID NO: 106
GAGGTGCAGCTGGTGGAATCAGGCGGCGGACTGGTGCAGTCAGGCGGTAGCC TGAGACTGAGCTGCGCCGCCTCCGGCTTTAGCCTGTCTAGCTACGGCGTGGA CTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTGGAGTGGGTCGGAGTGATCTGG GGCGGAGGCGGAACCTACTACGCCTCTAGCCTGATGGGCCGGTTCACTATCT CTAGGGACAACTCTAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGAGAGC CGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCTAGAAACGCCTACGGTCACGACGGC GGCTTCGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTCACCGTGAGTTCAG CTAGCACTAAGGGCCCAAGTGTGTTTCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGTCTAC TTCCGGCGGAACTGCTGCCCTGGGTTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAG CCCGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGGGCTCTGACTTCCGGCGTGCACACCT TCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGAC AGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACA AGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCAGCTCCAGAACTGCTGGGAGGGCCTTC CGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACC CCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGA AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCC CAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTG CTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACA AGGCCCTGCCAGCCCCAATCGAAAAGACAATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCC ACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAG AACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC CCCAGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTG GACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAA G
SEQ ID NO: описание аминокислотной последовательно сти или полинуклеотида (PN)
Последовательность
104: PN для LC МАВ8,
кодирующий SEQ ID NO: 66
GAGATCGTGATGACCCAGTCCCCCGCCACCCTGTCTGTGTCTCCCGGCGAGA GAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCTCCGAGTCCGTGTCCTCCAACGTGGCCTG GTATCAGCAGAGACCTGGTCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACGGCGCCTCT AACCGGGCCACCGGCATCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCG ACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTA CTGCGGCCAGTCCTACTCATACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTG GAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCG ACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTT CTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGC GGCAACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACA GCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAGGT GTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGC TTCAACAGGGGCGAGTGC
[0116] CDR антител, перечисленных в таблице 1, можно определять посредством хорошо известных систем нумерации, известны в данной области, включая системы, описанные в настоящем документе. В таблице 2 перечислены CDR, определенные
(1) с использованием системы нумерации, описанной в Rabat et al.
(1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (система нумерации "Kabat") , Публикация NIH No. 913242; и (2) Chothia, см. Al-Lazikani et al. , (1997) "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", J.Mol.Biol. 273:927-948.
CDR
SEQ ID NO: CDR no Kabat (Kabat et al., 1991)
SEQ ID NO: CDR no Chothia (Al-Laikani et al. , 1997)
MAB1 CDRH3
2 9: HAYGHDGGFAMDY
2 9: HAYGHDGGFAMDY
MAB1 CDRL1
63: KASENVDTFVS
81: SENVDTF
MAB1 CDRL2
64: GASNRYT
8 2: GAS
MAB1 CDRL3
34: GQSYSYPFT
83: SYSYPF
MAB2 CDRH1
22: SYGVD
84: GFSLSSY
MAB2 CDRH2
23: VIWGGGGTYYASSVMA
8 0: WGGGG
MAB2 CDRH3
2 9: HAYGHDGGFAMDY
2 9: HAYGHDGGFAMDY
MAB2 CDRL1
30: RASESVSSNVA
85: SESVSSN
MAB2 CDRL2
33: GASNRAT
8 2: GAS
MAB2 CDRL3
34: GQSYSYPFT
83: SYSYPF
МАВЗ CDRH1
22: SYGVD
84: GFSLSSY
МАВЗ CDRH2
24: VIWGGGGTYYTASLMG
8 0: WGGGG
МАВЗ CDRH3
2 9: HAYGHDGGFAMDY
2 9: HAYGHDGGFAMDY
МАВЗ CDRL1
31: RASQSVSSNLA
86: SQSVSSN
МАВЗ CDRL2
33: GASNRAT
8 2: GAS
МАВЗ CDRL3
34: GQSYSYPFT
83: SYSYPF
МАВ4 CDRH1
22: SYGVD
84: GFSLSSY
МАВ4 CDRH2
25: VIWGGGGTYYASSLMG
8 0: WGGGG
МАВ4 CDRH3
2 9: HAYGHDGGFAMDY
2 9: HAYGHDGGFAMDY
МАВ4 CDRL1
30: RASESVSSNVA
85: SESVSSN
MAB4 CDRL2
33: GASNRAT
8 2: GAS
MAB4 CDRL3
34: GQSYSYPFT
83: SYSYPF
MAB5 CDRH1
22: SYGVD
84: GFSLSSY
MAB5 CDRH2
26: VIWGGGGTYYTSSLMG
8 0: WGGGG
MAB5 CDRH3
2 9: HAYGHDGGFAMDY
2 9: HAYGHDGGFAMDY
MAB5 CDRL1
30: RASESVSSNVA
85: SESVSSN
MAB5 CDRL2
33: GASNRAT
8 2: GAS
MAB5 CDRL3
34: GQSYSYPFT
83: SYSYPF
МАВб CDRH1
22: SYGVD
84: GFSLSSY
МАВб CDRH2
27: VIWGGGGTYYTSSLMA
8 0: WGGGG
МАВб CDRH3
2 9: HAYGHDGGFAMDY
2 9: HAYGHDGGFAMDY
МАВб CDRL1
30: RASESVSSNVA
85: SESVSSN
МАВб CDRL2
33: GASNRAT
8 2: GAS
МАВб CDRL3
34: GQSYSYPFT
83: SYSYPF
CDR
SEQ ID NO: CDR no Kabat (Kabat et al., 1991)
SEQ ID NO: CDR no Chothia (Al-Laikani et al. , 1997)
MAB7 CDRH1
22: SYGVD
84: GFSLSSY
MAB7 CDRH2
25: VIWGGGGTYYASSLMG
8 0: WGGGG
MAB7 CDRH3
2 9: HAYGHDGGFAMDY
2 9: HAYGHDGGFAMDY
MAB7 CDRL1
30: RASESVSSNVA
85: SESVSSN
MAB7 CDRL2
33: GASNRAT
8 2: GAS
MAB7 CDRL3
34: GQSYSYPFT
83: SYSYPF
MAB8 CDRH1
22: SYGVD
84: GFSLSSY
MAB8 CDRH2
25: VIWGGGGTYYASSLMG
8 0: WGGGG
MAB8 CDRH3
10 9: NAYGHDGGFAMDY
10 9: NAYGHDGGFAMDY
MAB8 CDRL1
30: RASESVSSNVA
85: SESVSSN
MAB8 CDRL2
33: GASNRAT
8 2: GAS
MAB8 CDRL3
34: GQSYSYPFT
83: SYSYPF
[0117] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител против GITR по изобретению, связывающие GITR (например, SEQ ID N0:1, подвергнутый процессингу в клетке SEQ ID N0:1), выбраны из любого из: i) антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы, где: CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22, CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:23, CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29, CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30, CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33 и CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34; ii) антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы, где: CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22, CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:24, CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29, CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:31, CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33 и CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34; iii) антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы, где: CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22, CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:25, CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29, CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30, CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33 и CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34; iv) антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы, где: CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22, CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:2 6, CDR3 тяжелой
цепи содержит SEQ ID N0:29, CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30, CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34; v) антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы, где: CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22, CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:27, CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29, CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30, CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33 и CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34; и vi) антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы, где: CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22, CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:25, CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:109, CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30, CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34. В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител являются гуманизированными. В конкретных вариантах осуществления антитела или фрагменты антител содержат человеческую константную область. В некоторых вариантах осуществления антитела или фрагменты антител содержат область Fc IgG. В конкретных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент является гликозилированным. В некоторых вариантах осуществления антитела или фрагменты антител являются модифицированными или являются экспрессированными в модифицированной клетке, где такая модификация приводит к усиленной эффекторной функции по отношению к FcR антитела или фрагмента антитела. В конкретных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент индуцирует увеличенное соотношение Тэфф:Трег in vivo. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела индуцирует усиленный иммунный ответ in vivo. В некоторых вариантах осуществления, когда антитело или фрагмент антитела является перекрестно сшитым со вторым антителом или фрагментом антитела, оно представляет собой агонист SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2 или SEQ ID N03.
[0118] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител против GITR по изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью аминокислотной
последовательности с вариабельной областью тяжелой цепи из SEQ ID N0:16, и содержат вариабельную область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью легкой цепи из SEQ ID N0:17.
[0119] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител против GITR по изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью тяжелой цепи из SEQ ID N0:6, и содержат вариабельную область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью легкой цепи из SEQ ID N0:7.
[0120] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител против GITR по изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью тяжелой цепи из SEQ ID N0:8, и содержат вариабельную область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью легкой цепи из SEQ ID N0:9.
[0121] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител против GITR по изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью тяжелой цепи из SEQ ID N0:10, и содержат вариабельную область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью легкой цепи из SEQ ID N0:7.
[0122] В некоторых вариантах осуществления, антитела или
фрагменты антител против GITR по изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью тяжелой цепи из SEQ ID N0:12, и содержат вариабельную область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью легкой цепи из SEQ ID N0:7.
[0123] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител против GITR по изобретению содержат полипептид тяжелой цепи, обладающий по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью тяжелой цепи из SEQ ID N0:14, и содержат полипептид легкой цепи, обладающий по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью легкой цепи из SEQ ID N0:7.
[0124] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител против GITR по изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью тяжелой цепи из SEQ ID N0:99, и содержат вариабельную область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью легкой цепи из SEQ ID N0:7.
[0125] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител против GITR по изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью тяжелой цепи из SEQ ID N0:105, и содержат вариабельную область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 90%, 91%, 92%,
93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью легкой цепи из SEQ ID N0:7.
[0126] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител против GITR по изобретению содержат полипептид тяжелой цепи, обладающий по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью тяжелой цепи из SEQ ID N0:61, и содержат полипептид легкой цепи, обладающий по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с вариабельной областью легкой цепи из SEQ ID N0:59.
[0127] На протяжении их полной длины, антитела против GITR
по настоящему изобретению, как правило, обладают суммарной
идентичностью аминокислотной последовательности константной
области (например, IgGl) по меньшей мере приблизительно 85%,
например, по меньшей мере приблизительно 85%, 89%, 90%, 91%,
92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% с
аминокислотными последовательностями константной области
IgGl/kappa человека. Например, тяжелая цепь антител против GITR
может обладать по меньшей мере приблизительно 85%, 89%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентичностью аминокислотной последовательности с константной
областью IgGl человека
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID N0:20). В одном варианте осуществления, обозначенные жирным шрифтом остатки лейцин/лейцин заменены на аланин/аланин. В одном варианте осуществления, последняя аминокислота, лизин (К) , заменена на аргинин (R) . Легкая цепь антител против GITR может обладать по меньшей мере приблизительно 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной
последовательности с константной областью человеческой легкой цепи каппа RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:21). В некоторых вариантах осуществления, аминокислоты внутри константных областей добавлены, делетированы или заменены.
[0128] В некоторых вариантах осуществления, такое антитело представляет собой человеческое или гуманизированное антитело. Последовательности VH, VL, полноразмерной легкой цепи и полноразмерной тяжелой цепи (аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности) можно "смешивать и комбинировать" для получения других связывающих GITR антител по изобретению. Такие "смешанные и комбинированные" связывающие GITR антитела можно тестировать с использованием анализов связывания, известных в данной области (например, ELISA и других анализов, описанных в разделе примеры), для подтверждения активности. Когда цепи смешивают и комбинируют, последовательность VH из конкретной пары VH/VL следует заменять на структурно сходную последовательность VH. Подобным образом, полноразмерную последовательность тяжелой цепи из конкретной пары полноразмерная тяжелая цепь/полноразмерная легкая цепь следует заменять на структурно сходную полноразмерную последовательность тяжелой цепи. Подобным образом, последовательность VL из конкретной пары VH/VL следует заменять на структурно сходную последовательность VL. Подобным образом, полноразмерную последовательность легкой цепи из конкретной пары полноразмерная тяжелая цепь/полноразмерная легкая цепь следует заменять на структурно сходную полноразмерную последовательность легкой цепи. Соответственно, в одном аспекте изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или фрагменту антитела, обладающему: вариабельной областью тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:6, 8, 10, 12, 14, 99 и 105; и вариабельной областью легкой цепи, содержащей аминокислотную
последовательность выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:7 и 9; где антитело специфически связывается с GITR.
[0129] В некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител против GITR по изобретению содержат полипептид тяжелой цепи, обладающий по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с последовательностью тяжелой цепи, выбранной из любой из SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:73, SEQ ID N0:75, SEQ ID N0:77, SEQ ID N0:100 и SEQ ID N0:106; и содержат полипептид легкой цепи, обладающий по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью аминокислотной последовательности с легкой цепью из SEQ ID N0:66 или SEQ ID N0:70. В конкретных вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител против GITR по изобретению содержат полипептид тяжелой цепи, выбранный из любой из SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:73, SEQ ID N0:75, SEQ ID N0:77, SEQ ID N0:100 и SEQ ID N0:106; и содержат полипептид легкой цепи из SEQ ID N0:66 или SEQ ID N0:70.
[0130] В случае идентифицированных аминокислотных последовательностей длиной менее 20 аминокислот, они могут являться устойчивыми к одной или двум консервативным заменам аминокислот, в то же время сохраняя желательные специфическое связывание и/или агонистическую активность.
[0131] Антитела и фрагменты антител против GITR по настоящему изобретению, как правило, связывают GITR, включая 1 (SEQ ID N0:1), изоформу 2 (SEQ ID N0:2) и изоформу 3(SEQ ID N0:3), с равновесной константой диссоциации (KD) менее приблизительно 10~8 М или 10~9 М, например, или менее приблизительно 10~10 М или 10 11 М, ив некоторых вариантах осуществления, менее приблизительно 10~12 М или 10~13 М.
Антителаг которые связываются с одним и тем же эпитопом
[0132] Настоящее изобретение относится к антителам и
фрагментам антител, которые связываются с эпитопом, содержащим
богатый цистеином домен 1 ("CRD1", SEQ ID N0:4:
CGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDC) и богатый цистеином
домен 2 ("CRD2", SEQ ID N0:5:
MCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQC) из GITR человека, и где антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула представляет собой агонист hGITR, и где антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула, необязательно, обладают интактной или усиленной эффекторной функцией по отношению к FcR. В некоторых вариантах осуществления, антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула связывается с эпитопом, содержащим SEQ ID N0:88) из GITR человека. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит остатки в пределах SEQ ID N0:88. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит аминокислотные остатки в пределах остатков 34-72 и 78 из GITR человека, где такие антитела и фрагменты антител являются агонистами hGITR.
[0133] Настоящее изобретение также относится к антителам и фрагментам антител, которые связываются с тем же эпитопом, что и связывающие GITR антитела, описанные в таблице 1. Дополнительные антитела и фрагменты антител можно, таким образом, идентифицировать на основании их способности проявлять перекрестную конкуренцию (например, конкурентно ингибировать связывание, статистически значимым образом) с другими антителами по изобретению в анализах связывания GITR. Способность тестируемого антитела ингибировать связывание антител и фрагментов антител по настоящему изобретению с белком GITR (например, GITR человека) показывает, что тестируемое антитело может конкурировать с этим антителом или фрагментом антитела за связывание с hGITR; такое антитело может, согласно неограничивающей теории, связываться с тем же самым или родственным (например, структурно сходным или пространственно близким) эпитопом на белке GITR, что и антитело или фрагмент антитела, с которыми оно конкурирует. В конкретном варианте осуществления, антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом на hGITR, что и антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению, представляет собой человеческое или гуманизированное моноклональное антитело. Такие человеческие или гуманизированные моноклональные антитела можно получать и выделять, как описано в настоящем документе.
Сконструированные и модифицированные антитела
[0134] Антитело или фрагмент антитела по изобретению, кроме
того, можно получать с использованием антитела, обладающего
одной или несколькими из последовательностей CDR и/или VH, и/или
VL, показанных в настоящем документе (например, таблица 1) в
качестве исходного материала для конструирования
модифицированного антитела или фрагмента антитела, где модифицированное антитело может обладать измененными свойствами по сравнению с исходным антителом. Антитело или фрагмент антитела можно конструировать посредством модификации одного или нескольких остатков внутри одной или обеих вариабельных областей (т.е., VH и/или VL), например, внутри одной или нескольких областей CDR и/или внутри одной или нескольких каркасных областей. Дополнительно или альтернативно, антитело или фрагмент антитела можно конструировать посредством модификации остатков внутри константной области(областей), например, для изменения эффекторной функции(функций) антитела.
[0135] Одним из типов конструирования вариабельной области, который можно осуществлять, является прививка CDR. Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями преимущественно через аминокислотные остатки, локализованные в шести определяющих комплементарность областях тяжелой и легкой цепи (CDR). По этой причине, аминокислотные последовательности внутри CDR обладают большим разнообразием между индивидуальными антителами, чем последовательности вне CDR. Поскольку последовательности CDR являются ответственными за большинство взаимодействий антитело-антиген, является возможным экспрессировать рекомбинантные антитела, имитирующие свойства специфического антитела, посредством конструирования экспрессирующих векторов, включающих последовательности CDR из специфического антитела, привитые в каркасные последовательности из другого антитела с отличными свойствами (см., например, Riechmann, L. et al. , 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al. , 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033; Патент США No. 5225539 от Winter и Патенты США No. 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 от Queen et al.).
[0136] Соответственно, другой вариант осуществления
изобретения относится к выделенному моноклональному антителу или
его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему вариабельную
область тяжелой цепи, содержащую последовательность CDR1,
обладающую аминокислотной последовательностью, выбранной из
группы, состоящей из SEQ ID N0:22, 79, и 84; последовательности
CDR2, обладающие аминокислотной последовательностью, выбранной
из группы, состоящей из SEQ ID N0:23, 24, 25, 26, 27, 62, и 80;
последовательности CDR3, обладающие аминокислотной
последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID
N0:29, 34 и 109, соответственно; и вариабельную область легкой
цепи, содержащую последовательности CDR1, обладающие
аминокислотной последовательностью, выбранной из группы,
состоящей из SEQ ID N0:30, 31, 63, 81, 85 и 86;
последовательности CDR2, обладающие аминокислотной
последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:33, 64, и 82; и последовательности CDR3, состоящие из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:34 и 83; соответственно. Таким образом, такие антитела содержат последовательности CDR VH и VL из моноклональных антител, но все еще могут содержать каркасные последовательности, отличные от этих антител. В конкретных вариантах осуществления, выделенные антитела или фрагменты антител содержат последовательности, обладающие идентичностью аминокислотной последовательности по меньшей мере приблизительно 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% с соответствующими последовательностями в этом разделе.
[0137] Такие каркасные последовательности можно получать из публично доступных баз данных ДНК или опубликованных ссылок, включающих в себя зародышевые последовательности генов антител. Например, зародышевые последовательности ДНК для генов вариабельной области человеческих тяжелых и легких цепей можно обнаружить в базе данных человеческих зародышевых последовательностей "VBase" (доступной в Internet на www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), так же как в Kabat, Е. A., et al. , 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,
U.S. Department of Health и Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. , 1992 J. fol. Biol. 227:776798; и Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836.
[0138] Примерами каркасных последовательностей для
применения в антителах по изобретению являются
последовательности, структурно сходные с каркасными
последовательностями, используемыми в избранных антителах по
изобретению, например, консенсусные последовательности и/или
каркасные последовательности, используемые в моноклональных
антителах по изобретению. Последовательности CDR1, 2 и 3 VH, и
последовательности CDR1, 2 и 3 VL, можно прививать в каркасные
области, обладающие последовательностью, идентичной с
обнаруженной в зародышевом гене иммуноглобулина, из которого
происходит каркасная последовательность, или последовательности
CDR можно прививать в каркасные области, содержащие одну или
несколько мутаций по сравнению с зародышевыми
последовательностями. Например, обнаружено, что в конкретных случаях является преимущественным подвергать мутации остатки внутри каркасных областей для сохранения или усиления антигенсвязывающей способности антитела (см., например, Патенты США No. 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 от Queen et al).
[0139] Другим типом модификации вариабельной области является мутагенез аминокислотных остатков внутри областей CDR1, CDR2, и/или CDR3 VH и/или VL, чтобы таким образом улучшить одно или несколько свойств связывания (например, аффинность) представляющего интерес антитела, известный как "аффинное созревание". Можно выполнять сайт-специфический мутагенез или опосредованный ПЦР мутагенез для введения мутации(мутаций), и воздействие на связывание антитела, или другое представляющее интерес функциональное свойство, можно оценивать в анализах in vitro или in vivo, как описано в настоящем документе и представлено в примерах и/или в альтернативных или дополнительных анализах, известных в данной области. Можно вводить консервативные модификации. Мутации могут представлять собой замены, добавления или делеции аминокислот. Более того, как правило, изменяют не более одного, двух, трех, четырех или
пяти остатков внутри области CDR.
[0140] Сконструированные антитела или фрагменты антител по
изобретению включают в себя те, в которых модификации выполнены
в каркасных остатках внутри VH и/или VL, например, для улучшения
свойств антитела. Как правило, такие модификации каркаса
выполняют для уменьшения иммуногенности антитела. Например,
одним из способов является "обратный мутагенез" одного или
нескольких каркасных остатков до соответствующей зародышевой
последовательности. Более конкретно, антитело, подвергшееся
соматической мутации, может содержать каркасные остатки,
отличающиеся от зародышевой последовательности, из которой
происходит антитело. Такие остатки можно идентифицировать
посредством сравнения каркасных последовательностей антитела с
зародышевыми последовательностями, из которых происходит
антитело. Для возвращения последовательностей каркасной области
к их зародышевой конфигурации, можно проводить "обратный
мутагенез" соматических мутаций до зародышевой
последовательности, например, посредством сайт-специфического мутагенеза. Такие "подвергнутые обратному мутагенезу" антитела также предназначены для включения в изобретение.
[0141] Другой тип модификации каркасной области включает в себя мутагенез одного или нескольких остатков внутри каркасной области, или даже внутри одной или нескольких областей CDR, для удаления Т-клеточных эпитопов, чтобы таким образом уменьшать потенциальную иммуногенность антитела. Этот способ обозначен также как "деиммунизация" и более подробно описан в Публикации патента США No. 20030153043 от Carr et al.
[0142] Если присутствуют, константные области антител или
фрагментов антител против GITR могут относиться к любому типу
или подтипу, подходящим образом, и могут быть выбраны из вида
субъекта, подлежащего лечению настоящими способами (например,
человека, не относящегося к человеку примата или другого
млекопитающего, например, сельскохозяйственного млекопитающего
(например, лошадиного, овечьего, бычьего, свиного,
верблюдового), домашнего млекопитающего (например, собачьего, кошачьего) или грызуна (например, крысы, мыши, хомяка, кролика).
В некоторых вариантах осуществления антитела против GITR конструируют для получения гуманизированных антител или антител Humaneered(r). В некоторых вариантах осуществления, изотип константной области представляет собой IgG, например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4. В конкретных вариантах осуществления изотип константной области представляет собой IgGi.
[0143] Дополнительно или альтернативно к модификациям, выполненным внутри каркасных областей или областей CDR, антитела или фрагменты антител по изобретению можно конструировать для включения модификаций в область Fc, как правило, для изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела, таких как время полужизни в сыворотке, связывание комплемента, связывание рецептора Fc и/или антигензависимая клеточная цитотоксичность. Более того, антитело или фрагмент антитела по изобретению можно химически модифицировать (например, одну или несколько химических групп можно присоединять к антителу) или можно модифицировать для изменения его гликозилирования, снова для изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела или фрагмента антитела.
[0144] В одном варианте осуществления, шарнирная область СН1 является модифицированной, так что количество остатков цистеина в шарнирной области изменено, например, увеличено или уменьшено. Этот способ дополнительно описан в Патенте США No. 5677425 от Bodmer et al. Количество остатков цистеина в шарнирной области СН1 можно изменять, например, для облегчения сборки легких и тяжелых цепей или для увеличения или уменьшения стабильности антитела или фрагмента антитела.
[0145] В другом варианте осуществления, шарнирную область Fc антитела подвергают мутагенезу для изменения биологического времени полужизни антитела. Более конкретно, одну или несколько мутаций аминокислот вводят в поверхность контакта домена СН2-СНЗ Fc-шарнирного фрагмента, так что антитело обладает нарушенным связыванием стафилококкового белка A (SpA) относительно связывания SpA нативным Fc-шарнирным доменом. Этот способ более подробно описан в Патенте США No. 6165745 от Ward et al.
[0146] В другом варианте осуществления, антитело модифицируют для увеличения его биологического времени полужизни. Возможны различные способы. Например, можно вводить одну или несколько из следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, как описано в Патенте США No. 6277375 от Ward. Альтернативно, для увеличения биологического времени полужизни, антитело можно изменять внутри области СН1 или CL, чтобы оно содержало эпитоп связывания рецептора спасения, полученный из двух петель домена СН2 области Fc IgG, как описано в Патентах США No. 58 6904 6 и 6121022 от Presta et al.
[0147] В других вариантах осуществления, область Fc изменяют посредством замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток для изменения эффекторных функций антитела. Например, одну или несколько аминокислот можно заменять на другой аминокислотный остаток, так чтобы антитело обладало измененной аффинностью для эффекторного лиганда, но сохраняло антигенсвязывающую способность исходного антитела. Эффекторный лиганд, аффинность для которого изменяют, может представлять собой, например, рецептор Fc (FcR) или компонент комплемента С1. Этот способ более подробно описан в Патентах США No. 5624821 и 5648260, оба от Winter et al.
[0148] В другом варианте осуществления, одну или несколько аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков, можно заменять на другой аминокислотный остаток, так чтобы антитело обладало измененным связыванием Clq и/или уменьшенной или утраченной комплементзависимой цитотоксичностью (CDC). Этот способ более подробно описан в Патенте США No. 6194551 от Idusogie et al.
[0149] Антитела, содержащие такие мутации, опосредуют уменьшенную или не опосредуют антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) или комплементзависимую цитотоксичность (CDC) . В некоторых вариантах осуществления, аминокислотные остатки L234 и L235 из константной области IgGl заменены на А1а234 и А1а235. В некоторых вариантах осуществления, аминокислотный остаток N2 67 из константной области IgGl заменен
на А1а267.
[0150] В другом варианте осуществления, один или несколько аминокислотных остатков изменяют, чтобы таким образом изменить способность антитела связывать комплемент. Этот способ дополнительно описан в публикации РСТ W0 94/29351 от Bodmer et al.
[0151] В другом варианте осуществления, область Fc модифицируют для увеличения способности антитела опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или для увеличения аффинности антитела для рецептора Fey посредством модификации одной или нескольких аминокислот. Этот способ дополнительно описан в публикации РСТ W0 00/42072 от Presta. Более того, картированы участки связывания на IgGl человека для FcyRl, FcyRII, FcyRIII и FcRn, и описаны варианты с улучшенным связыванием (см. Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604).
[0152] В другом варианте осуществления, гликозилирование антитела является модифицированным. Например, можно получать агликозилированное антитело (т.е., антитело, лишенное гликозилирования). Гликозилирование можно изменять, например, для увеличения аффинности антитела для "антигена". Такие модификации углеводов можно осуществлять, например, посредством изменения одного или нескольких участков гликозилирования в последовательности антитела. Например, можно осуществлять одну или несколько аминокислотных замен, которые приводят к удалению одного или нескольких участков гликозилирования из каркаса вариабельной области, чтобы таким образом исключить гликозилирование в этом участке. Такое агликозилирование может увеличивать аффинность антитела для антигена. Такой способ более подробно описан в Патентах США No. 5714350 и 6350861 от Со et al.
[0153] Дополнительно или альтернативно, можно получать антитело, обладающего измененным типом гликозилирования, такое как гипофукозилированное антитело, обладающее уменьшенным количеством остатков фукозила, или антитело, обладающее
увеличенным количеством разделенных надвое структур GlcNac.
Показано, что такие измененные паттерны гликозилирования
увеличивают способность ADCC антител. Такие модификации
углеводов можно осуществлять, например, посредством экспрессии
антитела в клетке-хозяине с измененным аппаратом
гликозилирования. Клетки с измененным аппаратом гликозилирования
описаны в данной области, и их можно использовать в качестве
клеток-хозяев, в которых следует экспрессиировать рекомбинантные
антитела по изобретению, чтобы таким образом получать антитело с
измененным гликозилированием. Например, в ЕР 1176195 by Hang et
al. описана линия клеток с функционально поврежденным геном
FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, так что антитела,
экспрессированные в такой линии клеток, обладают
гипофукозилированием. В публикации РСТ W0 03/035835 от Presta
описан вариант линии клеток СНО, клетки Lecl3, с уменьшенной
способностью присоединять фукозу к Asn (297)-связанным углеводам,
что также приводит к гипофукозилированию антител,
экспрессируемых в этих клетках-хозяевах (см. также Shields, R.L.
et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). В публикации РСТ
WO 99/54342 от Umana et al. описаны линии клеток,
сконструированные для экспрессии гликопротеин-модифицирующих
гликозилтрансфераз (например, бета-(1,4)-N-
ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII)), так что что антитела, экспрессируемые в этих сконструированных клеточных линиях, обладают увеличенным количеством разделенных надвое структур GlcNac, что приводит к увеличенной активности ADCC этих антител (см. также Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).
Прививка антигенсвязывающих доменов в алвтернативные каркасы или остовы
[0154] Можно использовать широкое множество каркасов или
остовов антител/иммуноглобулинов, при условии, что полученный
полипептид содержит по меньшей мере одну связывающую область,
которая специфически связывается с GITR. Такие каркасы или
остовы включают в себя 5 основных идиотипов иммуноглобулинов
человека или их фрагменты, и включают в себя иммуноглобулины
других видов животных, предпочтительно, обладающие
гуманизированными аспектами. Антитела из одиночной тяжелой цепи, такие как идентифицированные у верблюдовых, представляют особенный интерес в этом отношении. Специалисты в данной области продолжают открывать и разрабатывать новые каркасы, остовы и фрагменты.
[0155] В одном аспекте изобретение относится к получению антител на неиммуноглобулиновой основе с использованием не относящихся к иммуноглобулинам остовов, на которые можно прививать CDR по изобретению. Можно использовать известные или не обнаруженные до настоящего времени не относящиеся к иммуноглобулинам каркасы и остовы, при условии, что они содержат связывающую область, специфическую для белка-мишени GITR
(например, GITR человека и/или яванского макака). Известные не относящиеся к иммуноглобулинам каркасы или остовы включают в себя, но без ограничения, фибронектин (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), анкирин (Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland), доменные антитела (Domantis, Ltd., Cambridge, MA, и Ablynx nv, Zwijnaarde, Belgium), липокалин (Pieris Proteolab AG, Freising, Germany), иммунофармацевтические средства на основе модульных белков малого размера (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA) , максиантитела (Avidia, Inc., Mountain View, CA) , белок A (Affibody AG, Sweden) и аффилин (гамма-крисТаллин или убиквитин) (Scil Proteins GmbH, Halle, Germany).
[0156] Фибронектиновые остовы основаны на домене фибронектина типа III (например, десятом модуле фибронектина типа III (домене 10 Fn3) ) . Домен фибронектина типа III имеет 7 или 8 бета-цепей, которые распределены между двумя бета-складками, которые, в свою очередь, упакованы друг против друга с формированием сердцевины белка, и, кроме того, включают петли
(аналогичные CDR), которые связывают бета-цепи друг с другом и экспонированы для воздействия растворителя. Существует по меньшей мере три таких петли на каждом краю сэндвича бета-складки, где край представляет собой границу белка, перпендикулярную направлению бета-цепей (см. US 6818418) . Эти остовы на основе фибронектина не являются иммуноглобулином, хотя общая складка является близко родственной складке наименьшего
функционального фрагмента антитела, вариабельной области тяжелой цепи, которая включает полный элемент распознавания антигена в IgG верблюда и ламы. Вследствие этой структуры, неиммуноглобулиновое антитело имитирует свойства связывания антигена, сходные по природе и аффинности с этими свойствами антител. Эти остовы можно использовать в способе рандомизации и перетасовки петель in vitro, сходном с процессом аффинного созревания антител in vivo. Эти молекулы на основе фибронектина можно использовать в качестве остовов, где области петель молекулы можно заменять на CDR по изобретению с использованием стандартных способов клонирования.
[0157] Способ анкиринов основан на использовании белков с происходящими из анкирина модулями повторов в качестве остовов, чтобы нести вариабельные области, которые можно использовать для связывания различных мишеней. Модуль анкиринового повтора представляет собой полипептид из 33 аминокислот, состоящий из двух антипараллельных а-спиралей и [3-поворота. Связывание вариабельных областей оптимизируют главным образом с использованием рибосомного дисплея.
[0158] Авимеры происходят из белка, содержащего природный А-домен, такого как LRP-1. Эти домены используются в природе для белок-белковых взаимодействий, и у человека более 250 белков структурно основаны на А-доменах. Авимеры состоят из ряда различных мономеров "А-домена" (2-10), связанных посредством аминокислотных линкеров. Можно получать авимеры, которые могут связывать антиген-мишень, с использованием способа, описанного, например, в Публикациях патентных заявок США No. 20040175756; 20050053973; 20050048512; и 20060008844.
[0159] Аффинные лиганды аффитела представляют собой небольшие, простые белки, состоящие из трехспирального пучка, основанные на остове одного из связывающих IgG доменов белка А. Белок А представляет собой поверхностный белок из бактерии Staphylococcus aureus. Этот домен остова состоит из 58 аминокислот, 13 из которых рандомизируют для получения библиотек аффител с большим количеством вариантов лиганда (См., например,
US 5831012) . Молекулы аффител имитируют антитела, они обладают молекулярной массой б кДа, по сравнению с молекулярной массой антител, которая составляет 150 кДа. Несмотря на небольшой размер, связывающий участок молекул аффитела является сходным с участком антитела.
[0160] Антикалины представляют собой продукты,
разработанные компанией Pieris ProteoLab AG. Они происходят из
липокалинов, широко распространенной группы небольших и
устойчивых белков, которые, как правило, вовлечены в
физиологический транспорт или накопление химически
чувствительных или нерастворимых соединений. Несколько природных липокалинов встречается в тканях или жидкостях организма человека. Структура белка напоминает иммуноглобулины, с гипервариабельными петлями в верхней части жесткого каркаса. Однако, в отличие от антител или их рекомбинантных фрагментов, липокалины состоят из одной полипептидной цепи со 160-180 аминокислотными остатками, являясь только незначительно большими, чем один домен иммуноглобулина. Группа из четырех петель, которая создает связывающий карман, обладает выраженной структурной пластичностью и допускает множество боковых цепей. Таким образом, форму связывающего участка можно изменять запатентованным способом для узнавания предназначенных молекул-мишеней различной формы с высокой аффинностью и специфичностью. Один из белков из семейства липокалинов, связывающий билин белок (ВВР) из Pieris Brassicae, использовали для разработки антикалинов посредством мутагенеза группы из четырех петель. Одним из примеров патентных заявок, описывающих антикалины, является Публикация РСТ No. WO 199916873.
[0161] Молекулы аффилины представляют собой небольшие не относящиеся к иммуноглобулинам белки, которые разрабатывают для получения специфической аффинности по отношению к белкам и небольшим молекулам. Новые молекулы аффилины можно очень быстро отбирать из двух библиотек, каждая из которых основана на отличном остове человеческого белка. Молекулы аффилины не обладают никакой структурной гомологией с белками иммуноглобулинов. В настоящее время, используют два остова
аффилина, один из которых представляет собой гамма-кристаллин, структурный белок хрусталика глаза человека, а другой представляет собой белки из суперсемейства "убиквитина". Оба человеческих остова являются очень небольшими, обладают высокой термостабильностью и являются почти устойчивыми к изменениям рН и денатурирующим агентам. Эта высокая стабильность в основном обусловлена расширенной структурой бета-складки этих белков. Примеры происходящих из гамма-крисТаллина белков описаны в WO2 00104144 и примеры "подобных убиквитину" белков описаны в WO2004106368.
[0162] Миметики белковых эпитопов (РЕМ) представляют собой циклические, пептидоподобные молекулы среднего размера (MW 1-2 кДа) , имитирующие вторичные структуры бета-шпильки белков, основную вторичную структуру, вовлеченную в белок-белковые взаимодействия.
Человеческие или гуманизированные антитела
[0163] Настоящее изобретение относится к сконструированным
человеческим антителам, специфически связывающим белок GITR
(например, GITR человека). По сравнению с химерными,
приматизированными или гуманизированными антителами,
человеческие связывающие GITR антитела по изобретению обладают дополнительно уменьшенной антигенностью при введении субъектам-людям.
[0164] Человеческие связывающие GITR антитела можно получать с использованием способов, известных в данной области.
Например, технологическую платформу Humaneered(r) (KaloBios, Sout San Francisco, CA) использовали для перевода не относящихся к человеку антител в сконструированные человеческие антитела. В Публикации патента США No. 20050008625 описан способ in vivo для замены не относящейся к человеку вариабельной области антитела на человеческую вариабельную область в антителе с сохранением в то же время таких же характеристик связывания или с обеспечением лучших характеристик связывания относительно характеристик не относящегося к человеку антитела. Способ основан на направляемой эпитопом замене вариабельных областей не относящегося к человеку
эталонного антитела на полностью человеческое антитело. Полученное человеческое антитело, как правило, не является структурно родственным эталонному не относящемуся к человеку антителу, однако, связывает тот же самый эпитоп на том же самом антигене, что и эталонное антитело.
[0165] Антитела против GITR по изобретению основаны на
сконструированных человеческих антителах с последовательностями
V-области, обладающими значительной идентичностью аминокислотной
последовательности с человеческими зародышевыми
последовательностями V-области, в то же время сохраняющими
специфичность и аффинность эталонного антитела. См., Публикацию
патента США No. 2005/0255552 и Публикацию патента США No.
2006/0134098, полное содержание обеих из которых, таким образом,
приведено в настоящем документе в качестве ссылки. В способе
улучшения идентифицируют информацию о минимальной
последовательности, необходимой для определения специфичности связывания антигена, из вариабельной области эталонного антитела, и переводят эту информацию в библиотеку частичных последовательностей человеческих генов V-области для получения сфокусированной на эпитопах библиотеки V-областей человеческого антитела. Систему секреции на основе микроорганизмов можно использовать для экспрессии членов библиотеки в форме фрагментов Fab антитела, и проводить скрининг библиотеки по антигенсвязывающим Fab, например, с использованием анализа связывания с отпечатком колоний. См., например, Публикацию патента США No. 2007/0020685. Положительные клоны можно подвергать дальнейшей характеризации для идентификации клонов с наивысшей аффинностью. Полученные сконструированные человеческие Fab сохраняют специфичность связывания исходного, эталонного антитела против GITR, как правило, обладают эквивалентной или более высокой аффинностью для антигена по сравнению с исходным антителом, и обладают V-областями с высокой степенью идентичности последовательности по сравнению с V-областями человеческого зародышевого антитела.
[0166] Минимальная детерминанта специфичности связывания (BSD), необходимая для получения сфокусированной на эпитопе
библиотеки, как правило, представлена последовательностью внутри CDR3 тяжелой цепи ("CDRH3") и последовательностью внутри CDR3 легкой цепи ("CDRL3"). BSD может содержать часть или полноразмерную CDR3. BSD может состоять из смежных или не смежных аминокислотных остатков. В некоторых случаях, сфокусированную на эпитопе библиотеку конструируют из человеческих последовательностей V-сегмента, связанных с уникальной областью CDR3-FR4 из эталонного антитела, содержащей последовательности BSD и человеческого зародышевого J-сегмента
(см. Публикацию патента США No. 2005/0255552). Альтернативно, можно получать библиотеки человеческих V-сегментов посредством последовательной замены кассет, в которых только часть V-сегмента эталонного антитела первоначально заменена на библиотеку человеческих последовательностей. Идентифицированные человеческие "кассеты", поддерживающие связывание в контексте остальных аминокислотных последовательностей эталонного антитела, затем подвергают рекомбинации во втором скрининге библиотеки для получения полностью человеческих V-сегментов
(см., Публикацию патента США No. 2006/0134098).
[0167] В каждом случае, спаренные сегменты CDR3 тяжелой и легкой цепи, сегменты CDR3-FR4 или J-сегменты, содержащие детерминанты специфичности из эталонного антитела, используют для ограничения специфичности связывания, так что связывающие антиген члены, полученные из библиотеки, сохраняют эпитопную специфичность эталонного антитела. Дополнительные изменения с целью созревания можно вводить в области CDR3 каждой цепи в ходе конструирования библиотеки для идентификации антител с оптимальной кинетикой связывания. Полученные сконструированные человеческие антитела обладают последовательностями V-сегмента, происходящими из человеческих зародышевых библиотек, сохраняют короткую последовательность BSD внутри областей CDR3 и обладают человеческими зародышевыми каркасными областями 4 (FR4). Антитела верблюдовых
[0168] Белки антитела, полученные из членов семейства верблюда и дромадера (Camelus bactrianus и Calelus dromaderius) , включая членов семейства из Нового Света, таких как виды лам
(например, Lama paccos, Lama glama, и Lama vicugna), охарактеризованы в отношении размера, структурной сложности и антигенности для субъектов-людей. В конкретных антителах IgG из этого семейства млекопитающих, как обнаружено в природе, отсутствуют легкие цепи, и они, таким образом, отличаются по структуре от типичной для антител из других животных четверичной структуры с четырьмя цепями, обладающей двумя тяжелыми и двумя легкими цепями. См. РСТ/ЕР93/02214 (W0 94/04678, опубликованную 3 марта 1994 г. ) .
[0169] Область антитела верблюдовых, представляющую собой небольшой одиночный вариабельный домен, обозначенную как VHH, можно получать посредством генной инженерии для получения небольшого белка, обладающего высокой аффинностью для мишени, с получением в результате происходящего из антитела белка с низкой молекулярной массой, известного как "наноантитело верблюдовых". См. Патент США номер 5759808, выданный 2 июня 1998 г.; см. также Stijlemans, В. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al. , 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; и Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520. Сконструированные библиотеки антител и фрагментов антител верблюдовых являются коммерчески доступными, например, из Ablynx, Ghent, Belgium. Как и для других антител не относящегося к человеку происхождения, аминокислотную последовательность антитела верблюдовых можно изменять рекомбинантным способом для получения последовательности, более близко сходной с человеческой последовательностью, т.е., наноантитело может являться "гуманизированным". Таким образом, природную низкую антигенность антител верблюдовых для человека можно дополнительно уменьшать.
[0170] Наноантитело верблюдовых обладает молекулярной массой приблизительно в одну десятую массы молекулы IgG человека, и белок обладает физическим диаметром только в несколько нанометров. Одним из следствий небольшого размера является способность наноантител верблюдовых связывать антигенные участки, которые являются функционально невидимыми
для более крупных белков антител, т.е., наноантитела верблюдовых можно использовать в качестве реагентов для детекции антигенов, которые в ином случае являются скрытыми, с использованием общепринятых иммунологических способов, и в качестве возможных лекарственных средств. Таким образом, другим следствием небольшого размера является то, что наноантитело верблюдовых может осуществлять ингибирование в результате связывания со специфическим участком в бороздке или узкой щели белка-мишени, и таким образом, может действовать с активностью, более близко сходной с функцией классического низкомолекулярного лекарственного средства, чем с функцией классического антитела.
[0171] Низкая молекулярная масса и компактный размер дополнительно приводят к тому, что наноантитела верблюдовых являются исключительно термостабильными, стабильными к экстремальному рН и к протеолитическому расщеплению, и слабо антигенными. Другим следствием является то, что наноантитела верблюдовых легко продвигаются из системы кровообращения в ткани, и даже пересекают гематоэнцефалический барьер и могут лечить нарушения, поражающие нервную ткань. Наноантитела могут дополнительно облегчать транспорт лекарственного средства через гематоэнцефалический барьер. См. Патентную заявку США 20040161738, опубликованную 19 августа 2004 г. Эти свойства в сочетании с низкой антигенностью для человека указывают на большой терапевтический потенциал. Кроме того, эти молекулы можно экспрессировать в прокариотических клетках, таких как Е. coli, и их экспрессируют в форме слитых белков с помощью бактериофагов, и они являются функциональными.
[0172] Соответственно, признаком настоящего изобретения является антитело или наноантитело верблюдовых, обладающее высокой аффинностью для GITR. В конкретных вариантах осуществления в настоящем документе, антитело или наноантитело верблюдовых продуцировано естественным образом в верблюдовом животном, т.е., продуцировано верблюдовым после иммунизации GITR или его пептидным фрагментом, с использованием способов, описанных в настоящем документе для других антител. Альтернативно связывающее GITR наноантитело верблюдовых является
сконструированным, т.е., полученным посредством отбора,
например, из библиотеки экспонированных на фагах подвергнутых
подходящему мутагенезу белков наноантител верблюдовых с
использованием способов пэннинга с помощью GITR в качестве
мишени, как описано в примерах в настоящем документе.
Сконструированные наноантитела можно дополнительно
модифицировать по заказу посредством генетической инженерии для получения времени полужизни у субъекта-реципиента от 4 5 минут до двух недель. В конкретном варианте осуществления, антитело или наноантитело верблюдовых получают посредством прививки последовательностей CDR тяжелой или легкой цепи человеческих антител по изобретению в каркасные последовательности нанотела или однодоменного антитела, как описано, например, в РСТ/ЕР93/02214. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к мультивалентному антителу или наноантителу верблюдовых, в соответствии со способами, описанными ниже.
Мультивалентные антитела
[0173] В другом аспекте представлены мультивалентные
молекулы (моноспецифические, биспецифические или
мультиспецифические), содержащие связывающее GITR антитело или ее фрагмент, по изобретению. Антитело по изобретению или его антигенсвязывающие области можно дериватизировать или присоединять к другой функциональной молекуле, например, другому пептиду или белку (например, к другому антителу или лиганду для рецептора) для получения мультивалентной молекулы, связывающей по меньшей мере два различных участка связывания (которые могут представлять собой одинаковые или различные участки-мишени или молекулы-мишени). В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению дериватизируют или функционально связывают (например, посредством химического присоединения, генетического слияния, нековалентной ассоциации или другим способом) с более, чем одной отличной функциональной молекулой для получения мультивалентной молекулы, связывающей по меньшей мере два различных участка связывания, представляющие собой одинаковые или различные участки связывания на одной и той же молекуле
мишени. В конкретных вариантах осуществления, участки мультивалентного связывания являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению дериватизируют или связывают с более, чем одной отличной функциональной молекулой для получения мультиспецифических молекул, связывающих два или более различных участка связывания по меньшей мере на двух молекулах-мишенях; такие мультиспецифические молекулы также предназначены для включения в термин "биспецифическая молекула" или "мультиспецифическая молекула", как применяют в настоящем документе. Для получения биспецифической молекулы по изобретению, антитело по изобретению можно функционально связывать (например, посредством химического присоединения, генетического слияния, нековалентной ассоциации или другим способом) с одной или несколькими другими связывающими молекулами, такими как другое антитело, фрагмент антитела, пептидный миметик или миметик связывания, с получением в результате мультивалентной молекулы. Настоящее изобретение относится к биспецифическим молекулам, обладающим по меньшей мере одной первой специфичностью связывания для GITR и второй специфичностью связывания для второго эпитопа-мишени. Например, второй эпитоп-мишень представляет собой другой эпитоп из GITR, отличный от первого эпитопа-мишени. Кроме того, в случае изобретения, в котором молекула является мультиспецифической, в некоторых вариантах осуществления молекула дополнительно включает в себя третью специфичность связывания, в дополнение к первому и второму эпитопам-мишеням.
[0174] В одном варианте осуществления, биспецифические молекулы по изобретению содержат, в качестве специфичности связывания, по меньшей мере одно антитело, или фрагмент антитела, включая, например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv или одноцепочечное Fv. Антитело может также представлять собой димер легкой цепи или тяжелой цепи, или любой его минимальный фрагмент, такой как конструкция Fv или одноцепочечная конструкция, как описано в Ladner et al. Патент США No. 4946778.
[0175] Диатела представляют собой двухвалентные, биспецифические молекулы, в которых домены VH и VL
экспрессированы на одной полипептидной цепи, соединенные линкером, который является слишком коротким, чтобы позволять спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи. Домены VH и VL спариваются с комплементарными доменами другой цепи, таким образом, создавая два антигенсвязывающих участка (см., например, Holliger et al. , 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123). Диатела можно получать посредством экспрессии двух полипептидных цепей со структурой либо VHA-VLB и VHB-VLA (конфигурация VH-VL), либо VLA-VHB и VLB-VHA (конфигурация VL-VH) в одной и той же клетке. Большинство из них можно экспрессировать в растворимой форме в бактериях. Одноцепочечные диатела (scDb) получают посредством соединения двух образующих диатело полипептидных цепей с линкером из приблизительно 15 аминокислотных остатков (см. Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4) : 128-30; Wu et al. , 1996 Immunotechnology, 2(l):21-36). scDb можно экспрессировать в бактериях в растворимой, активной мономерной форме (см. Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34) : 128-30; Wu et al. , 1996 Immunotechnology, 2(1) : 21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2) : 83105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9 (7) : 617-21) . Диатело можно сливать с Fc для получения "ди-диател" (см. Lu et al. , 2004 J. Biol. Chem., 279 (4) :2856-65) .
[0176] Другие антитела, которые можно использовать в биспецифических молекулах по изобретению, представляют собой мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела.
[0177] Биспецифические и/или мультивалентные молекулы по
настоящему изобретению можно получать посредством конъюгации
составляющих специфичностей связывания, с использованием
способов, известных в данной области. Например, каждую
специфичность связывания из биспецифической и/или
мультивалентной молекулы можно получать по отдельности и затем конъюгировать друг с другом. Когда специфичности связывания представляют собой белки или пептиды, множество средств для присоединения или перекрестного сшивания можно использовать для ковалентной конъюгации. Примеры средств для перекрестного
сшивания включают в себя белок А, карбодиимид, Ы-сукцинимидил-Б-
ацетил-тиоацетат (SATA), 5,5'-дитиобис(2-нитробензойную кислоту)
(DTNB), о-фенилендималеинимид (oPDM), N-сукцинимидил-З-(2-
пиридилдитио)пропионат (SPDP) и сульфосукцинимидил-4-(N-
малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) (см., например, Karpovsky et al. , 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Другие способы включают в себя способы, описанные в Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), и Glennie et al. , 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375) . Средства для конъюгации представляют собой SATA и сульфо-SMCC, оба доступные из Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
[0178] Когда специфичности связывания представляют собой антитела, их можно конъюгировать посредством сульфгидрильного связывания шарнирных областей константных доменов двух тяжелых цепей. В конкретном варианте осуществления, шарнирную область модифицируют для содержания нечетного количества сульфгидрильных остатков, например, одного, перед конъюгацией.
[0179] Альтернативно, специфичности связывания можно кодировать в одном и том же векторе и экспрессировать и собирать в одной и той же клетке-хозяине. Этот способ является особенно полезным, когда биспецифическая и/или мультивалентная молекула представляет собой слитый белок mAb х mAb, mAb х Fab, Fab х F(ab')2 или лиганд х Fab. Биспецифическая и/или мультивалентная молекула по изобретению может представлять собой одноцепочечную молекулу, содержащую одно одноцепочечное антитело и связывающую детерминанту, или одноцепочечную биспецифическую молекулу, содержащую две связывающих детерминанты. Биспецифические молекулы могут содержать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Способы получения биспецифических молекул описаны, например, в Патенте США номер 52 602 03; Патенте США номер 5455030; Патенте США номер 4881175; Патенте США номер 5132405; Патенте США номер 5091513; Патенте США номер 5476786; Патенте США номер 5013653; Патенте США номер 5258498; и Патенте США номер 5482858.
[0180] Связывание биспецифических и/или мультивалентных
молекул с их специфическими мишенями можно подтверждать, например, посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммунного анализа (REA), анализа FACS, биологического анализа (например, ингибирования роста) или анализа Вестерн-блоттингом. В каждом из этих анализов, как правило, детектируют присутствие комплексов белок-антитело, представляющих особенный интерес, посредством использования меченного реагента (например, антитела), специфического для представляющего интерес комплекса.
Антитела с увеличенным временем полужизни
[0181] Настоящее изобретение относится к антителам и фрагментам антител, специфически связывающим белок GITR, обладающим увеличенным временем полужизни in vivo.
[0182] Множество факторов может влиять на время полужизни белка in vivo. Например, фильтрация в почках, метаболизм в печени, деградация посредством протеолитических ферментов (протеаз) и иммуногенные ответы (например, нейтрализация белка посредством антител и поглощение макрофагами и дентритными клетками). Множество способов можно использовать для продления времени полужизни антител по настоящему изобретению. Например, посредством химического связывания с полиэтиленгликолем (ПЭГ), reCODE ПЭГ, остовом антитела, полисиаловой кислотой (PSA), гидроксиэтилкрахмалом (ГЭК), альбуминсвязывающими лигандами и углеводными оболочками; посредством генетического слияния с белками, связывающимися с сывороточными белками, такими как альбумин, IgG, FcRn и трансферрин; посредством соединения (генетически или химически) с другими связывающими группами, которые связываются с сывороточными белками, такими как наноантитела, Fab, белки DARPin, авимеры, аффитела и антикалины; посредством генетического слияния с гПЭГ, альбумином, доменом альбумина, альбуминсвязывающими белками и Fc; или посредством включения в наноносители, составы с замедленным высвобождением или медицинские устройства.
[0183] Для продления времени циркуляции антител в сыворотке in vivo, инертные полимерные молекулы, такие как высокомолекулярный ПЭГ, можно присоединять к антителам или их
фрагментам в присутствии или в отсутствие мультифункционального линкера, либо посредством сайт-специфической конъюгации ПЭГ с N-или С-концом антител, либо посредством эпсилон-аминогрупп, присутствующих на остатках лизина. Для пэгилирования антитела, как правило, проводят реакцию антитела или его фрагмента с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как реакционноспособное сложноэфирное или альдегидное производное ПЭГ, в условиях, в которых одна или несколько групп ПЭГ присоединяются к антителу или фрагменту антитела. Пэгилирование можно осуществлять посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой ПЭГ (или с аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). Как применяют в настоящем документе, термин "полиэтиленгликоль" предназначен, чтобы включать в себя любую из форм ПЭГ, которую используют для дериватизации других белков, таких как моно(С1-С10)алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеинимид. В конкретных вариантах осуществления, антитело, подлежащее пэгилированию, представляет собой агликозилированое антитело. Используют дериватизацию линейным или разветвленным полимером, приводящую к минимальной потере биологической активности. Степень конъюгации можно тщательно мониторировать посредством SDS-PAGE и масс-спектрометрии для обеспечения надлежащей конъюгации молекул ПЭГ с антителами. Не вступивший в реакцию ПЭГ можно отделять от конъюгатов антитело-ПЭГ посредством эксклюзионной или посредством ионообменной хроматографии. Дериватизированные посредством ПЭГ антитела можно тестировать по активности связывания, так же как по эффективности in vivo efficacy с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области, например, посредством иммуноанализов, описанных в настоящем документе. Способы пэгилирования белков известны в данной области, и их можно применять для антител по изобретению. См., например, ЕР 0 154 316 от Nishimura et al. и ЕР 0 401 384 от Ishikawa et al.
[0184] Другие модифицированные способы пэгилирования включают в себя реконструированный способ направляемого вне зависимости от химического состава конструирования (ReCODE ПЭГ) ,
включающий в себя включение химически определенных боковых цепей в биосинтетические белки посредством реконструированной системы, включающей в себя тРНК-синтетазу и тРНК. Этот способ позволяет включение более 3 0 новых аминокислот в биосинтетические белки в клетках E.coli, дрожжи и млекопитающих. ТРНК включает неприродную аминокислоту в любое место, где расположен янтарный кодон, превращая янтарный кодон из стоп-кодона в кодон, подающий сигнал включения химически определенной аминокислоты.
[0185] Рекомбинантный способ пэгилирования (рПЭГ) также можно использовать для продления времени полужизни в сыворотке. Этот способ включает в себя генетическое слияние неструктурированного белкового хвоста из 300-600 аминокислот с существующим фармацевтическим белком. Поскольку кажущаяся молекулярная масса такой неструктурированной белковой цепи приблизительно в 15 раз превышает ее фактическую молекулярную массу, время полужизни белка в сыворотке намного увеличивается. В отличие от общепринятого пэгилирования, требующего химической конъюгации и повторной очистки, процесс изготовления намного упрощается и продукт является гомогенным.
[0186] Полисиалирование представляет собой другой способ, в
котором используют природный полимер полисиаловую кислоту (PSA)
для продления времени активности и улучшения стабильности
терапевтических пептидов и белков. PSA представляет собой
полимер сиаловой кислоты (сахар). При использовании для доставки
лекарственного средства на основе белка и терапевтического
пептида, полисиаловая кислота обеспечивает защитное
микроокружение при конъюгации. Это увеличивает время активности терапевтического белка в кровотоке и предотвращает его узнавание иммунной системой. Полимер PSA обнаружен в природе в организме человека. За миллионы лет эволюции его заимствовали определенные бактерии для покрытия своей клеточной стенки. Затем эти естественным образом полисиалированные бактерии приобрели способность, посредством молекулярной мимикрии, скрываться от системы защиты организма. PSA, по природной технологии малой заметности, можно получать из таких бактерий в больших количествах и с предопределенными физическими характеристиками.
Бактериальная PSA является совершенно неиммуногенной, даже при присоединении к белкам, поскольку является химически идентичной PSA в организме человека.
[0187] Другой способ включает в себя использование производных гидроксиэтилкрахмала ("ГЭК"), связанных с антителами. ГЭК представляет собой модифицированный природный полимер, который происходит из крахмала из восковой кукурузы и может подвергаться метаболизму посредством ферментов организма. Растворы ГЭК, как правило, вводят для замещения недостатка объема крови и для улучшения реологических свойств крови. Гэкилирование антитела позволяет продление времени полужизни в кровотоке посредством увеличения стабильности молекулы, так же как посредством уменьшения почечного клиренса, что приводит к увеличенной биологической активности. Посредством изменения различных параметров, таких как молекулярная масса ГЭК, можно получать широкий диапазон конъюгатов ГЭК-антитело по индивидуальному заказу.
[0188] Антитела, обладающие увеличенным временем полужизни in vivo, можно также получать посредством введения одной или нескольких модификаций аминокислот (т.е., замен, вставок или делеций) в константный домен IgG, или в его связывающий FcRn фрагмент (предпочтительно, фрагмент Fc или фрагмент шарнирного домена Fc). См., например, Международную публикацию No. WO 98/23289; Международную публикацию No. WO 97/34631; и Патент США No. 6277375.
[0189] Кроме того, антитела можно конъюгировать с альбумином для получения антитела или фрагмента антитела, которые являются более стабильными in vivo или обладают более длительным временем полужизни in vivo. Эти способы хорошо известны в данной области, см., например, Международные публикации No. WO 93/15199, WO 93/15200 и WO 01/77137; и Европейский патент No. ЕР 413622.
[0190] Способы увеличения времени полужизни являются особенно полезными для наноантител, связывающих средств на основе фибронектина и других антител или белков, для которых увеличенное время полужизни in vivo является желательным.
Конъюгаты антител
[0191] Настоящее изобретение относится к антителам или их фрагментам, специфически связывающимся с белком GITR, слитым рекомбинантным способом или химически конъюгированным (включая как ковалентную, так и нековалентную конъюгацию) с гетерологичным белком или полипептидом (или с его фрагментом, предпочтительно, с полипептидом из по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90 или по меньшей мере 100 аминокислот) для получения слитых белков. В частности, изобретение относится к слитым белкам, содержащим антигенсвязывающий фрагмент антитела, описанного в настоящем документе (например, фрагмент Fab, фрагмент Fd, фрагмент Fv, фрагмент F(ab)2, домен VH, CDR VH, домен VL или CDR VL) , и гетерологичный белок, полипептид или пептид. Способы слияния или конъюгации белков, полипептидов или пептидов с антителом или фрагментом антитела известны в данной области. См., например, Патенты США No. 5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851, и 5112946; Европейские патенты No. ЕР 307434 и ЕР 367166; Международные публикации No. WO 96/04388 и WO 91/06570; Ashkenazi et al. , 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1053510539; Zheng et al. , 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; и Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341.
[0192] Дополнительные слитые белки можно получать посредством способов перетасовки генов, перетасовки мотивов, перетасовки экзонов и/или перетасовки кодонов (вместе обозначенными как "перетасовка ДНК"). Перетасовку ДНК можно использовать для изменения активности антител по изобретению или их фрагментов (например, антитела или их фрагменты с более высокой аффинностью и более низкой скоростью диссоциации) . См., в общем, Патенты США No. 5605793, 5811238, 5830721, 5834252 и 5837458; Patten et al. , 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:72433; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; и Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313 (полное содержание каждого из этих
патентов и публикаций, таким образом, приведено в качестве ссылки). Антитела или их фрагменты, или кодированные антитела или их фрагменты, можно изменять посредством подвергания случайному мутагенезу посредством ПЦР с пониженной точностью, вставки случайных нуклеотидов или других способов, до рекомбинации. Полинуклеотид, кодирующий антитело или его фрагмент, специфически связывающие белок GITR, можно подвергать рекомбинации с одним или несколькими компонентами, мотивами, секциями, частями, доменами, фрагментами и т.д. одной или нескольких гетерологичных молекул.
[0193] Кроме того, антитела или их фрагменты можно сливать с маркерными последовательностями, такими как пептид, для облегчения очистки. В предпочтительных вариантах осуществления, маркерная аминокислотная последовательность представляет собой гексагистидиновый (НННННН SEQ ID N0:11) пептид, такой как метка, представленная в векторе pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), среди прочих, многие из которых являются коммерчески доступными. Как описано, например, в Gentz et al. , 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 гексагистидин (SEQ ID N0:11) обеспечивает удобную очистку слитого белка. Другие пептидные метки, которые можно использовать для очистки, включают в себя, но без ограничения, гемагглютининовую ("НА") метку, соответствующую эпитопу, полученному из белка гемагглютинина вируса гриппа (Wilson et al. , 1984, Cell 37:767), и метку "flag".
[0194] В других вариантах осуществления, антитела по настоящему изобретению или их фрагменты конъюгируют с диагностическим или поддающимся детекции средством. Такие антитела можно использовать для мониторирования или прогнозирования начала, развития, прогрессирования и/или тяжести заболевания или нарушения в качестве части способа клинического тестирования, такого как определение эффективности конкретного способа терапии. Такую диагностику и детекцию можно осуществлять посредством присоединения антитела к поддающимся детекции веществам, включая, но без ограничения, различные ферменты, такие как, но без ограничения, пероксидаза хрена, щелочная
фосфатаза,
бета-галактозидаза
или
ацетилхолинэстераза;
простетические
группы,
такие
как,
без
ограничения,
стрептавидин/биотин и авидин/биотин; флуоресцентные материалы, такие как, но без ограничения, умбеллиферон, флуоресцеин,
изотиоцианат
флуоресцеина,
родамин,
дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; люминесцентные материалы, такие как, но без ограничения, люминол; биолюминесцентные материалы, такие как, но без ограничения, люцифераза, люциферин и экворин; радиоактивные материалы, такие как, но без ограничения, иод (1311, 1251, 1231 и 1211), углерод (14С), сера (35S), тритий (ЗН), индий (1151п, 113In, 1121п и lllln), технеций (99Тс), таллий (201Ti), галлий (68Ga, 67Ga), палладий (103Pd), молибден (99Мо), ксенон (133Хе), фтор (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re,142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn и 117Tin; и позитронно-активные металлы, используемые в различных позитронно-эмиссионных томографах, и ионы нерадиоактивного парамагнитного металла.
[0195] Настоящее изобретение, кроме того, относится к антителу или его фрагменту, конъюгированному с терапевтической группой или группой лекарственного средства, модифицирующим данный биологический эффект или ответ, и к применениям антител или их фрагментов, конъюгированных с терапевтической группой. Терапевтические группы или группы лекарственного средства не следует рассматривать как ограниченные классическими химическими лекарственными средствами. Например, группа лекарственного средства может представлять собой белок, пептид или полипептид, обладающий желательной биологической активностью. Такие белки могут включать в себя, например, токсин, такой как абрин, рицин А, экзотоксин pseudomonas, холерный токсин или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухолей, а-интерферон, Р-интерферон, фактор роста нервов, тромбоцитарный фактор роста, тканевой активатор плазминогена, апоптотическое средство, антиангиогенное средство; или модификатор биологического ответа
например, такой как лимфокин. Антитело или его фрагмент можно конъюгировать с терапевтической группой, такой как цитотоксин, например, цитостатическое или уничтожающее клетки средство, лекарственное средство или ион радиоактивного металла, например, источники альфа-излучения. Цитотоксин или цитотоксическое средство включает в себя любое средство, оказывающее неблагоприятное воздействие на клетки.
[0196] Например, антитело можно конъюгировать с терапевтическими группами, такими как ион радиоактивного металла, такой как источники альфа-излучения, такие как 213Bi или макроциклические хелаторы, которые можно использовать для конъюгации иона радиоактивного металла, включая, но без ограничения, 131In, 131LU, 131Y, 131Но, 131Sm, с полипептидами. В конкретных вариантах осуществления, макроциклический хелатор представляет собой 1, 4, 7, 10-тетраазациклододекан-N, N', N", N'"-тетрауксусную кислоту (D0TA), которую можно присоединять к антителу посредством линкерной молекулы. Такие линкерные молекулы включают в себя, например, глициновые линкеры, например, GGGGS (SEQ ID N0:15), которые, необязательно, могут повторяться, например, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N0:18), или другие линкеры являющиеся общеизвестными в данной области и описанные в Denardo et al. , 1998, Clin Cancer Res. 4(10):248390; Peterson et al. , 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; и Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 2 б(8) :943-50, полное содержание каждого из которых приведено в качестве ссылки.
[0197] Способы конъюгации терапевтических групп с антителами хорошо известны, см., например, Arnon et al. , "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.
(eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), и Thorpe et al. , 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.
[0198] Антитела можно также присоединять к твердым подложкам, которые являются особенно полезными для иммуноанализов или очистки антигена-мишени. Такие твердые подложки включают в себя, но без ограничения, стекло, целлюлозу, полиакриламид, нейлон, полистирол, поливинилхлорид или полипропилен.
Полинуклеотиды, кодирующие агонистические антитела против
GITR
[0199] Антитела, антигенсвязывающие молекулы против GITR и их фрагменты можно получать любыми способами, известными в данной области, включая, но без ограничения, рекомбинантную экспрессию, химический синтез и ферментативное расщепление тетрамеров антитела, в то время как полноразмерные моноклональные антитела можно получать, например, посредством гибридом или рекомбинантной продукции. Рекомбинантную экспрессию можно получать в любых пригодных клетках-хозяевах, известных в данной области, например, клетках-хозяевах млекопитающих, клетках-хозяевах бактерий, клетках-хозяевах дрожжей, клетках-хозяевах насекомых и т.д.
[0200] Изобретение, кроме того, относится к
полинуклеотидам, кодирующим антитела, описанные в настоящем документе, например, полинуклеотидам, кодирующим вариабельные области или сегменты тяжелых или легких цепей, содержащие определяющие комплементарность области, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий вариабельные области тяжелой цепи, содержит последовательность, обладающую по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательностей нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID N0:51, SEQ ID N0:53, SEQ ID N0:55, SEQ ID N0:56, SEQ ID N0:57, SEQ ID
N0:101 и SEQ ID N0:107. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий вариабельные области легкой цепи, содержит последовательность, обладающую по меньшей мере 8 5%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательностей нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID N0:52, SEQ ID N0:54 и SEQ ID N0:102.
[0201] В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:67. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:68.
[0202] В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:72. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом, выбранным из SEQ ID N0:73.
[0203] В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:74. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:68.
[0204] В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид,
кодирующий тяжелую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:76. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:68.
[0205] В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:78. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:68.
[0206] В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID N0:103. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:104.
[0207] В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:108. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:104.
[0208] В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:60. В некоторых вариантах осуществления, полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, обладает по меньшей мере 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты с полинуклеотидом из SEQ ID N0:58.
[0209] Полинуклеотиды по изобретению могут кодировать только последовательность вариабельной области антитела против GITR. Они могут также кодировать как вариабельную область, так и константную область антитела. Некоторые из полинуклеотидных последовательностей кодируют полипептид, содержащий вариабельные области как тяжелой цепи, так и легкой цепи одного из иллюстративных антител мыши против GITR. Некоторые другие полинуклеотиды кодируют два полипептидных сегмента, которые, соответственно, являются в основном идентичными вариабельным областям тяжелой цепи и легкой цепи одного из антител мыши.
[0210] Полинуклеотидные последовательности можно получать посредством твердофазного синтеза ДНК de novo или посредством ПЦР-мутагенеза существующей последовательности (например, последовательностей, как описано в настоящем документе), кодирующей антитело против GITR или его связывающий фрагмент. Прямой химический синтез нуклеиновых кислот можно осуществлять способами, известными в данной области, такими как фосфотриэфирный способ Narang et al. , Meth. Enzymol. 68:90, 1979; фосфодиэфирный способ Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; диэтилфосфорамидитный способ Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; и способ на твердой подложке из Патента США No. 4458066. Введение мутаций в полинуклеотидную последовательность посредством ПЦР можно проводить, как описано, например, в PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al. ,
Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; и Eckert et al. , PCR Methods and Applications 1:17, 1991.
[0211] Изобретение относится также к экспрессирующим
векторам и клеткам-хозяевам для продукции антител против GITR,
описанных выше. Различные экспрессирующие векторы можно
использовать для экспрессии полинуклеотидов, кодирующих цепи,
фрагменты или связывающие фрагменты антител против GITR. Как
основанные на вирусах, так и невирусные экспрессирующие векторы
моно использовать для продукции антител в клетке-хозяине
млекопитающего. Невирусные векторы и системы включают в себя
плазмиды, эписомные векторы, как правило, с экспрессирующей
кассетой для экспрессии белка или РНК, и человеческие
искусственные хромосомы (см., например, Harrington et al. , Nat
Genet 15:345, 1997). Например, невирусные векторы, пригодные для
экспрессии полинуклеотидов и полипептидов против GITR в клетках
млекопитающих (например, человека), включают в себя векторы
pThioHis А, В и С, рсГМАЗ.1/His, pEBVHis А, В и С (Invitrogen,
San Diego, СА) , векторы MPSV и многочисленные другие векторы,
известные в данной области для экспрессии других белков.
Вирусные векторы, которые можно использовать, включают в себя
векторы на основе ретровирусов, аденовирусов,
аденоассоциированных вирусов, вирусов герпеса, векторы на основе SV4 0, вируса папилломы, вируса Эпштейна-Барр НВР, векторы на основе вируса осповакцины и вируса леса Семлики (SFV). См., Brent et al., выше; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; и Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.
[0212] Выбор экспрессирующего вектора зависит от намеченных
клеток-хозяев, в которых вектор следует экспрессировать. Как
правило, экспрессирующие векторы содержат промотор и другие
регуляторные последовательности (например, энхансеры),
функционально связанные с полинуклеотидами, кодирующими цепь или фрагмент антитела против GITR. В некоторых вариантах осуществления, используют индуцибельный промотор для предотвращения экспрессии вставленных последовательностей в любых условиях, за исключением индуцирующих. Индуцибельные промоторы включают в себя, например, промотор арабинозы, lacZ,
промотор металлотионеина или промотор теплового шока. Культуры трансформированных организмов можно размножать в условиях отсутствия индукции без сдвига популяции в сторону кодирующих последовательностей, продукты экспрессии которых лучше переносимы клетками-хозяевами. В дополнение к промоторам, другие регуляторные элементы могут также являться необходимыми или желательными для эффективной экспрессии цепи или фрагмента антитела против GITR. Эти элементы, как правило, включают инициирующий кодон ATG и соседний участок связывания рибосомы или другие последовательности. Кроме того, эффективность экспрессии можно улучшать посредством включения энхансеров, подходящих для используемых клеточных систем (см., например, Scharf et al. , Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; и Bittner et al. , Meth. Enzymol., 153:516, 1987) . Например, энхансер SV4 0 или энхансер CMV можно использовать для увеличения экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих.
[0213] Экспрессирующие векторы могут также предоставлять
сигнальную последовательность для секреции, расположенную для
формирования слитого белка с полипептидами, кодируемыми
вставленными последовательностями антитела против GITR. Более
часто, вставленные последовательности антитела против GITR
присоединяют к сигнальным последовательностям перед включением в
вектор. Векторы для использования для получения
последовательностей, кодирующих вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела против GITR, иногда кодируют также константные области или их части. Такие векторы позволяют экспрессию вариабельных областей в форме слитых белков с константными областями, таким образом, приводя к продукции интактных антител или их фрагментов. Как правило, такие константные области являются человеческими.
[0214] Клетки-хозяева для переноса и экспрессии цепей антител против GITR могут являться либо прокариотическими, либо эукариотическими. Е. coli представляет собой одного из прокариотических хозяев, которого можно использовать для клонирования и экспрессии полинуклеотидов по настоящему изобретению. Другие микроорганизмы-хозяева, пригодные для
использования, включают в себя бациллы, такие как Bacillus subtilis, и другие энтеробактерии, такие как Salmonella, Serratia и различные виды Pseudomonas. В этих прокариотических хозяевах можно также получать экспрессирующие векторы, которые, как правило, содержат последовательности для контроля экспрессии, совместимые с клеткой-хозяином (например, точку начала репликации). Кроме того, может присутствовать любое количество из множества хорошо известных промоторов, таких как промоторная система лактозы, промоторная система триптофана (trp), промоторная система бета-лактамазы или промоторная система из фага лямбда. Промоторы, как правило, контролируют экспрессию, необязательно, с помощью последовательности оператора, и обладают последовательностями участка связывания рибосомы и т.п., для инициации и завершения транскрипции и трансляции. Другие микроорганизмы, такие как дрожжи, также можно использовать для экспрессии полипептидов против GITR по изобретению. Можно также использовать клетки насекомых в комбинации с бакуловирусными векторами.
[0215] В некоторых предпочтительных вариантах
осуществления, клетки-хозяева млекопитающих используют для
экспрессии и продукции полипептидов против GITR по настоящему
изобретению. Например, они могут представлять собой либо линию
клеток гибридомы, экспрессирующих эндогенные гены
иммуноглобулинов (например, клоны гибридомы миеломы, как описано
в примерах), либо линию клеток млекопитающих, несущих экзогенный
экспрессирующий вектор (например, клетки миеломы SP2/0,
проиллюстрированные ниже). Они включает в себя любые нормальные
смертные или нормальные или аномальные иммортализованные клетки
животных или человека. Например, разработан ряд пригодных линий
клеток-хозяев, способных секретировать интактные
иммуноглобулины, включая линии клеток СНО, различные линии
клеток Cos, клетки HeLa, линии клеток миеломы,
трансформированные В-клетки и гибридомы. Использование культуры клеток тканей млекопитающих для экспрессии полипептидов обсуждают в общем, например, в Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Экспрессирующие векторы для
клеток-хозяев млекопитающих могут включать в себя последовательности для контроля экспрессии, такие как точка начала репликации, промотор и энхансер (см., например, Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 198 6), и необходимые информационные участки для процессинга, такие как участки связывания рибосомы, участки сплайсинга РНК, участки полиаденилирования, и последовательности терминации транскрипции. Эти экспрессирующие векторы обычно содержат промоторы, полученные из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих. Пригодные промоторы могут являться конститутивными, специфическими для типа клеток, специфическими для стадии, и/или модулируемыми или регулируемыми. Промоторы, которые можно использовать, включают в себя, но без ограничения, промотор металлотионеина, конститутивный главный поздний промотор аденовируса, индуцируемый дексаметазоном промотор MMTV, промотор SV4 0, промотор MRP polIII, конститутивный промотор MPSV, индуцируемый тетрациклином промотор CMV (такой как немедленно-ранний промотор CMV человека), конститутивный промотор CMV и комбинации промотор-энхансер, известные в данной области.
[0216] Способы введения экспрессирующих векторов,
содержащих представляющие интерес полинуклеотидные
последовательности, меняют в зависимости от типа клеточного хозяина. Например, трансфекцию с помощью хлорида кальция обычно используют для прокариотических клеток, в то время как обработку фосфатом кальция или электропорацию можно использовать для других клеточных хозяев (см. в общем Sambrook et al., выше). Другие способы включают в себя, например, электропорацию, обработку фосфатом кальция, опосредованную липосомами трансформацию, инъекцию и микроинъекцию, баллистические способы, использование виросом, иммунолипосом, конъюгатов поликатион: нуклеиновая кислота, голой ДНК, искусственных вирионов, слияние со структурным белком вируса герпеса VP22 (Elliot and О'Hare, Cell 88:223, 1997), усиленное агентом поглощение ДНК и трансдукцию ex vivo. Для длительной продукции рекомбинантных белков с высоким выходом, стабильная экспрессия часто является желательной. Например, линии клеток, стабильно экспрессирующих
цепи или связывающие фрагменты антитела против GITR, можно получать с использованием экспрессирующих векторов по изобретению, содержащих вирусные точки начала репликации или эндогенные элементы экспрессии и ген селективного маркера. После введения вектора клеткам можно давать возможность расти в течение 1-2 суток в обогащенной среде перед тем, как их переведут на селективную среду. Целью селективного маркера является придание устойчивости к отбору, и его присутствие обеспечивает рост клеток, которые успешно экспрессируют введенные последовательности, в селективных средах. Можно обеспечивать пролиферацию устойчивых стабильно трансфицированных клеток с использованием способов культивирования клеток, подходящих для типа клеток.
Анализы для идентификации агонистических антител против
GITR
[0217] Анализы для идентификации агонистических антител против GITR известны в данной области и описаны в настоящем документе. Агонистические антитела против GITR связываются с GITR и активируют, индуцируют, стимулируют внутриклеточную передачу сигналов посредством GITR.
[0218] Связывание антител против GITR с GITR можно определять с использованием любого способа, известного в данной области. Например, связывание с GITR можно определять с использованием известных способов, включая, без ограничения, ELISA, Вестерн-блоттинг, поверхностный плазмонный резонанс (например, BIAcore) и проточную цитометрию.
[0219] Внутриклеточную передачу сигнала посредством GITR можно измерять с использованием любого способа, известного в данной области. Например, активация посредством GITR стимулирует передачу сигнала посредством NFKB И МАРК. Способы измерения активации NFKB И МАРК являются стандартными в данной области (например, использование анализов репортерных генов, ядерной транслокации белков посредством NFKB, статуса фосфорилирования белков МАРК). Активация посредством GITR представляет собой костимулирующий сигнал, усиливающий пролиферацию активированных
CD4+ и CD8+ Т-клеток в присутствии активации посредством Т-клеточного рецептора (например, в присутствии первичного антигена или антигена-мишени). Способы измерения пролиферации клеток являются стандартными в данной области (например, анализы включения 3Н-тимидина, мечение CFSE). Передача сигнала посредством GITR также костимулирует активированные CD4+ и CD8+ Т-клетки в присутствии активации посредством Т-клеточного рецептора для продукции цитокинов. Передача сигнала посредством GITR также костимулирует активированные клетки NK для продукции цитокинов. Цитокины могут относиться к любому типу или к обоим типам из цитокинов Thl-типа (например, интерферон-у, IL-2 и TNF) и цитокинов Тп2-типа (например, IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13). Способы измерения продукции цитокинов хорошо известны в данной области (например, анализы ELISA, анализы ELISpot). Активация посредством GITR может также индуцировать апоптоз. Способы измерения апоптоза клеток являются стандартными в данной области (например, окрашивание аннексина V) . При проведении анализов in vitro, тестируемые клетки или культуральный супернатант из тестируемых клеток после контакта с агонистическими антителами против GITR можно сравнивать с контрольными клетками или культуральными супернатантами из контрольных клеток, которые не приводили в контакт с агонистическими антителами против GITR.
[0220] Функциональные свойства агонистов GITR у антител по настоящему изобретению также можно измерять in vivo. Предпочтительные агонистические антитела против GITR обладают способностью к активации и увеличению количества CD4+ и CD8+ Т-клеток. Активацию и увеличение количества CD4+ и CD8+ Т-клеток in vivo можно измерять с использованием любого способа, известного в данной области, например, посредством проточной цитометрии. Предпочтительные агонистические антитела против GITR могут являться терапевтически полезными для ингибирования роста опухолей или стимуляции уменьшения размеров опухолей. Рост опухоли, или его ингибирование, можно измерять с использованием любого способа, известного в данной области (например, визуального обследования, штангенциркуля, определения массы,
способов визуализации, включая ЯМР). Предпочтительные
агонистические антитела против GITR могут являться
терапевтически полезными для предотвращения, уменьшения,
ингибирования или уничтожения этиологического фактора
инфекционного заболевания, например, бактериальной, грибковой,
вирусной или паразитической инфекции. Эффективность
агонистических антител против GITR для усиления ответа Т-клеток или уменьшения тяжести заболевания можно определять посредством введения терапевтически эффективного количества антитела субъекту и сравнения субъекта до и после введения антитела. Эффективность агонистических антител против GITR для усиления Т-клеточного ответа или уменьшения тяжести заболевания также можно определять посредством введения терапевтически эффективного количества антитела тестируемому субъекту и сравнения тестируемого субъекта с контрольным субъектом, которому не вводили антитело.
Композиции, содержащие агонистические антитела против GITR
[0221] Изобретение относится к фармацевтическим
композициям, содержащим антитела или антигенсвязывающие молекулы
против GITR по настоящему изобретению, составленные вместе с
фармацевтически приемлемым носителем. Необязательно,
фармацевтические композиции, кроме того, содержат одно или несколько других лекарственных средств(средства), пригодных для лечения или предотвращения данного нарушения. Фармацевтически приемлемые носители улучшают или стабилизируют композицию, или облегчают получение композиции. Фармацевтически приемлемые носители включают в себя растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие абсорбцию средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми.
[0222] Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить множеством способов, известных в данной области. Путь и/или способ введения меняют в зависимости от желательных результатов. Предпочтительно, чтобы введение являлось внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным или подкожным, или представляло собой введение поблизости от
участка-мишени. Фармацевтически приемлемый носитель должен являться пригодным для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, интраназального, ингаляционного, спинального или эпидермального введения (например, посредством инъекции или инфузии). В зависимости от способа введения, активное соединение, например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, или мультивалентную молекулу по изобретению (например, моноспецифическую, биспецифическую или мультиспецифическую молекулу), можно покрывать материалом для защиты соединения от действия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать соединение.
[0223] Антитело или его фрагмент, отдельно или в комбинации с другими пригодными компонентами, можно получать в форме аэрозольных составов (т.е., их можно "распылять") для введения посредством ингаляции. Аэрозольные составы можно помещать в пригодные сжатые пропелленты, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п.
[0224] В некоторых вариантах осуществления, композиция является стерильной и жидкой. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, посредством использования покрытий, таких как лецитин, посредством поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и посредством использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях, является предпочтительным включение в композицию изотонических средств, например, Сахаров, полиспиртов, таких как маннит или сорбит, и хлорида натрия. Длительную абсорбцию пригодных для инъекции композиций можно осуществлять посредством включения в композицию средства, замедляющего абсорбцию, например, моностеарата алюминия или желатина. В конкретных вариантах осуществления композиции можно получать для хранения в лиофилизированной форме с использованием пригодных наполнителей (например, сахарозы)
[0225] Фармацевтические композиции по изобретению можно получать в соответствии со способами, хорошо известными и общеупотребительными в данной области. Фармацевтически приемлемые носители частично определяются конкретной вводимой композицией, так же как конкретным способом, используемым для
введения композиции. Соответственно, существует широкое множество пригодных составов фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Пригодные способы для получения составов антител и определения подходящих дозировки и расписания можно найти, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippincott Williams & Wilkins (2005); и в Martindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press., и в Martindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition., 1996, Amer Pharmaceutical Assn, и в Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, содержание каждого из которых, таким образом, приведено в настоящем документе в качестве ссылки. Фармацевтические композиции предпочтительно изготавливают в условиях GMP. Как правило, терапевтически эффективную дозу или эффективную дозу антитела против GITR применяют в фармацевтических композициях по изобретению. Антитела против GITR составляют в фармацевтически приемлемые лекарственные формы посредством общепринятых способов, известных специалистам в данной области. Режимы дозирования корректируют для обеспечения желательного ответа (например, терапевтического ответа). При определении терапевтически или профилактически эффективной дозы, можно вводить низкую дозу, и затем постепенно увеличивать до достижения желательного ответа с минимальными нежелательными побочными эффектами или без нежелательных побочных эффектов. Например, можно вводить однократный болюс, можно вводить несколько разделенных доз с течением времени, или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать, как показано по необходимости в этой терапевтической ситуации. Является особенно преимущественным формулировать композиции для парентерального введения в единичной дозированной форме для простоты введения и равномерности дозирования. Единичная дозированная форма, как применяют в настоящем документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения,
рассчитанное для оказания желательного терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем.
[0226] Фактические уровни дозирования активных ингредиентов
в фармацевтических композициях по настоящему изобретению можно
изменять для получения количества активного ингредиента, которое
является эффективным для достижения желательного
терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, не являясь токсичным для пациента. Выбранный уровень дозирования зависит от множества фармакокинетических факторов, включая активность конкретной используемой композиции по настоящему изобретению, или ее эфира, соли или амида, способ введения, время введения, скорость выведения конкретного используемого соединения, длительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, используемые в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраст, пол, массу, состояние, общее состояние здоровья и предшествующий анамнез пациента, подвергаемого лечению, и подобные факторы.
Получение совместного состава с вторым средством
[0227] В некоторых вариантах осуществления,
фармакологические композиции содержат смесь антитела или антигенсвязывающей молекулы против GITR и второго фармакологического средства. Иллюстративные вторые средства для включения в смеси с агонистическим антителом или антигенсвязывающей молекулой против GITR по настоящему изобретению включают в себя, без ограничения, первичные антигены или антигены-мишени, средства, увеличивающие иммуногенность клеток опухоли, средства, ингибирующие или супрессирующие коингибирующие сигналы.
[0228] Антитела или антигенсвязывающие молекулы против GITR по изобретению можно составлять совместно (т.е., предоставлять в форме смеси или получать в смеси) с первичным антигеном или антигеном-мишенью. Антиген-мишень, или вакцина, зависит от состояния заболевания, подлежащего лечению. Например, антиген-мишень может происходить из клетки опухоли, клетки бактерии, гриба, вируса или паразита. Антиген-мишень может присутствовать в форме пептида, полипептида, клетки или полинуклеотида, по
необходимости.
[0229] В одном варианте осуществления, антиген-мишень
происходит из вируса, например, выбранного из группы, состоящей
из: вируса гепатита типа А, гепатита типа В, гепатита типа С,
гриппа, ветряной оспы, аденовируса, вируса простого герпеса типа
I (HSV I), вируса простого герпеса типа II (HSV II), вируса чумы
крупного рогатого скота, риновируса, эховируса, ротавируса,
респираторно-синцитиального вируса, вируса папилломы,
паповавируса, цитомегаловируса, эхиновируса, арбовируса,
хантавируса, вируса коксаки, вируса свинки, вируса кори, вируса
краснухи, вируса полиомиелита, вируса иммунодефицита человека
типа I (HIV I) и вируса иммунодефицита человека типа II (HIV
II), любых пикорнавирусов, энтеровирусов, калицивирусов, любого
из группы вирусов Норфолк, тогавирусов, таких как альфавирусы,
флавивирусы, коронавирусов, вируса бешенства, вируса марбургской
болезни, вирусов Эбола, вируса парагриппа, ортомиксовирусов,
буньявирусов, аренавирусов, реовирусов, ротавирусов,
орбивирусов, вируса типа I Т-клеточного лейкоза человека, вируса типа II Т-клеточного лейкоза человека, вируса иммунодефицита обезьян, лентивирусов, полиомавирусов, парвовирусов, вируса Эпштейна-Барр, вируса б герпеса человека, вируса 1 герпеса мартышковых (В-вируса) и поксвирусов.
[0230] В одном варианте осуществления, антиген-мишень происходит из бактерии, например, выбранной из группы, состоящей из: видов Neisseria, видов Streptococcus, видов S. mutans, видов Haemophilus, видов Moraxellaг видов Bordetellaг видов Mycobacteriumг видов Legionellaг видов Escherichiaг видов Vibrio, видов Yersiniaг видов Campylobacterг видов Salmonellaг видов Listeria г видов Helicobacter г видов Pseudomonasг Staphylococcus г видов Enterococcusг видов Clostridium г видов Bacillusг видов Corynebacteriumг видов Borrelia г видов Ehrlichia г видов Rickettsiaг видов Chlamydiaг видов Leptospira г видов Treponema.
[0231] В некоторых вариантах осуществления, антитела или антигенсвязывающие молекулы против GITR составляют совместно в смеси с опухолеассоциированным антигеном (ТАА). ТАА может
представлять собой выделенный полипептид или пептид, может
являться частью интактной клетки или частью лизата клеток
опухоли. ТАА может представлять собой полинуклеотид, например,
голый плазмидный или вирусный вектор, содержащий полинуклеотид,
кодирующий один или несколько ТАА. Примеры известных ТАА
включают в себя, без ограничения, ассоциированные с меланомой
антигены (MAGE-1, MAGE-3, TRP-2, гликопротеин мембраны меланосом
gplOO, gp75 и MUC-1 (муцин-1) ассоциированы с меланомой); СЕА
(карциноэмбриональный антиген), который может являться
ассоциированным, например, с раком яичников, меланомой или раком
толстого кишечника; рецептор фолата альфа, экспрессируемый
карциномой яичников; бета-субъединица (hCG|3) свободного
человеческого хорионического гонадотропина, экспрессируемая
множеством различных опухолей, включая, но без ограничения,
миелому; HER-2/neu, ассоциированный с раком молочной железы;
антиген вируса энцефаломиелита HuD, ассоциированный с
мелкоклеточным раком легкого; тирозингидроксилазу,
ассоциированную с нейробластомой; простатический специфический антиген (PSA), ассоциированный с раком предстательной железы; СА12 5, ассоциированный с раком яичника; и идиотипические детерминанты В-клеточной лимфомы могут стимулировать опухолеспецифический иммуннитет (приписываемый специфическому для идиотипа гуморальному иммунному ответу). Кроме того, показано, что антигены вируса типа 1 Т-клеточного лейкоза человека индуцируют специфические ответы CTL и противоопухолевый иммунитет против индуцированного вирусом Т-клеточного лейкоза человека у взрослых (ATL) . См., например, Haupt, et al. , Experimental Biology and Medicine (2002) 227:227-237; Ohashi, et al., Journal of Virology (2000) 74 (20) :9610-9616. Другие ТАА известны и находят применение в совместных составах с антителами против GITR.
[0232] В некоторых вариантах осуществления, антитела или антигенсвязывающие молекулы против GITR составляют совместно с аутологичными клетками опухолей от пациента, или аллогенными клетками опухолей того же самого типа ткани от другого пациента.
Клетки опухолей могут находиться в форме интактных клеток, лизата клеток опухолей, апоптотических клеток опухолей или тотальной мРНК клеток опухоли. Клетки опухолей можно подвергать трансфекции для экспрессии полипептида, улучшающего или усиливающего иммуногенность клеток опухоли для пациента, например, подвергать трансфекции для экспрессии гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GM-CSF). Клетки опухолей могут происходить из любой злокачественной ткани, включая, без ограничения, эпителиальные злокачественные опухоли или карциномы, так же как саркомы и лимфомы. В некоторых вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет собой меланому, рак яичника, рак почки, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак легкого, включая немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак молочной железы, глиому, фибросаркому, злокачественную опухоль кроветворных тканей или плоскоклеточную карциному головы и шеи (HNSCC) . См., например, Pardee, et al, Immunotherapy (2 009) 1(2) :24 9-2 64, и обсуждаемые в этом документе ссылки. В некоторых вариантах осуществления, клетка опухоли происходит, например, из рака поджелудочной железы, меланом, рака молочной железы, рака легкого, рака бронхов, колоректального рака, рака предстательной железы, рака желудка, рака яичника, рака мочевого пузыря, злокачественной опухоли головного мозга или центральной нервной системы, злокачественной опухоли периферической нервной системы, рака пищевода, рака шейки матки, злокачественной опухоли тела или эндометрия матки, злокачественной опухоли полости рта или глотки, рака печени, рака почки, рака яичка, рака желчных протоков, злокачественной опухоли тонкого кишечника или аппендикса, злокачественной опухоли слюнных желез, злокачественной опухоли щитовидной железы, злокачественной опухоли надпочечника, остеосаркомы, хондросаркомы и злокачественной опухоли кроветворных тканей.
[0233] В некоторых вариантах осуществления, антитела или
антигенсвязывающие молекулы против GITR составляют совместно с
цитотоксическим средством. Например, антитела или
антигенсвязывающие молекулы против GITR составляют совместно с агонистическим антителом или антигенсвязывающей молекулой,
которые связываются с CD4+ CD25+ регуляторными Т-клетками (Трег) и уменьшают их количество или истощают их. Иллюстративные истощающие Трег антитела или антигенсвязывающие молекулы связываются с CD25 или CCR4. См., Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5) :567-575 и обсуждаемые в этом документе ссылки.
[0234] В некоторых вариантах осуществления, антитела или
антигенсвязывающие молекулы против GITR составляют совместно с
ингибитором коингибирующего сигнала. Иллюстративные ингибиторы
включают в себя ингибиторы CTLA-4 и ингибиторы взаимодействия
PD-1/PD-L1 (например, В7-Н1). В некоторых вариантах
осуществления, антитела против GITR составляют совместно с
антителом, связывающим и ингибирующим CTLA-4. В некоторых
вариантах осуществления, антитела против GITR составляют
совместно с антителом, связывающим и ингибирующим TIM3. В
некоторых вариантах осуществления, антитела против GITR
составляют совместно с антителом, связывающим и ингибирующим
LAG3. В некоторых вариантах осуществления, антитела против GITR
составляют совместно с антителом, связывающим и ингибирующим PD-
1. В некоторых вариантах осуществления, антитела против GITR
составляют совместно с антителом, связывающим и ингибирующим В7-
Н1. См., например, Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-
575; и Melero, et al., Clin Cancer Res (2009) 15 (5) :1507-1509 и
обсуждаемыми в нем ссылками. В конкретных вариантах
осуществления, составы содержат биспецифическую молекулу,
включающую антитело или антигенсвязывающую молекулу против GITR
и ингибитор коингибирующего сигнала. В некоторых вариантах
осуществления, составы содержат биспецифическую молекулу,
включающую антитело или антигенсвязывающую молекулу против GITR
и ингибитор CTLA4. В некоторых вариантах осуществления, составы
содержат биспецифическую молекулу, включающую антитело или
антигенсвязывающую молекулу против GITR и ингибитор TIM3. В
некоторых вариантах осуществления, составы содержат
биспецифическую молекулу, включающую антитело или
антигенсвязывающую молекулу против GITR и ингибитор LAG3. В
некоторых вариантах осуществления, составы содержат
биспецифическую молекулу, включающую антитело или
антигенсвязывающую молекулу против GITR и ингибитор PD-1/PD-L1.
В некоторых вариантах осуществления, составы содержат
биспецифическую молекулу, включающую антитело или
антигенсвязывающую молекулу против GITR и ингибитор В7Н1. Ингибиторы PD-1
[0235] В одном варианте осуществления, агонист GITR используют в комбинации с ингибитором PD-1, например, как описано в WO2015/026684. В некоторых вариантах осуществления, ингибитор PD-1 представляет собой антитело против PD-1, выбранное из ниволумаба, пембролизумаба или пидилизумаба.
[0236] В некоторых вариантах осуществления, антитело против PD-1 представляет собой ниволумаб. Альтернативные наименования ниволумаба включают в себя MDX-1106, MDX-1106-04, ONO-4538 или BMS-936558. В некоторых вариантах осуществления, антитело против PD-1 представляет собой ниволумаб (регистрационный номер регистрационный номер CAS: 94 6414-94-4). Ниволумаб представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело IgG4, специфически блокирующее PD1. Ниволумаб (клон 5С4) и другие человеческие моноклональные антитела, специфически связывающие PD1, описаны в US 8008449 и WO2006/121168. В одном варианте осуществления, ингибитор PD-1 представляет собой ниволумаб и обладает последовательностью, описанной в этих документах (или последовательностью, в основном идентичной или сходной с ней, например, последовательностью, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или выше идентичной указанной последовательности).
[0237] В некоторых вариантах осуществления, антитело против PD-1 представляет собой пембролизумаб. Пембролизумаб (обозначаемый также как ламбролизумаб, МК-3475, МК03475, SCH-900475 или KEYTRUDA(r); Merck) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело IgG4, связывающее PD-1. Пембролизумаб и другие гуманизированные антитела против PD-1 описаны в Hamid, О. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2) : 134-44, US 8354509 и WO2009/114335.
[0238] В одном варианте осуществления, ингибитор PD-1 представляет собой пембролизумаб, описанный, например, в US
8354509 и WO 2009/114335, и обладает последовательностью, описанной в этих документах (или последовательностью, в основном идентичной или сходной с ней, например, последовательностью, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или выше идентичной указанной последовательности).
[0239] В некоторых вариантах осуществления, антитело против PD-1 представляет собой пидилизумаб. Пидилизумаб (СТ-011; Cure Tech) представляет собой гуманизированное моноклональные антитело IgGlk, связывающее PD1. Пидилизумаб и другие гуманизированные моноклональные антитела против PD-1 описаны в WO2009/101611. Другие антитела против PD1 включают в себя AMP 514 (Amplimmune), среди прочих, например, антитела против PD1, описанные в US 8609089, US 2010028330 и/или US 20120114649.
[0240] В некоторых вариантах осуществления, ингибитор PD-1 представляет собой иммуноадгезин (например, иммуноадгезин, содержащий внеклеточную или связывающую PD-1 часть PD-L1 или PD-L2, слитую с константной областью (например, областью Fc из последовательности иммуноглобулина). В некоторых вариантах осуществления, ингибитор PD-1 представляет собой АМР-224 (В7-DCIg; Amplimmune; например, описанный в WO2010/027827 и WO2011/066342), представляет собой слитый растворимый рецептор из PD-L2 и Fc, блокирующий взаимодействие между PD-1 и В7-Н1.
[0241] В одном варианте осуществления, комбинация включает в себя молекулу антитела против GITR, например, как описано в настоящем документе, и антитело против PD-1, описанное, например, в WO 2015/112900, и обладающее последовательностью, описанной в этом документе (или последовательностью, в основном идентичной или сходной с ней, например, последовательностью, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или выше идентичной указанной последовательности).
Ингибиторы PD-L1 или PD-L2
[0242] В некоторых вариантах осуществления, ингибитор PD-L1 представляет собой молекулу антитела. В некоторых вариантах осуществления, ингибитор против PD-L1 выбран из YW243,55.S70, MPDL3280A, MEDI-4736, MSB-0010718C или MDX-1105.
[0243] В некоторых вариантах осуществления, антитело против
PD-L1 представляет собой MSB0010718C. MSB0010718C (обозначаемое также как А09-246-2; Merck Serono) представляет собой моноклональное антитело, связывающее PD-L1. Пембролизумаб и другие гуманизированные антитела против PD-L1 описаны в WO2013/079174 и обладают последовательностью, описанной в этом документе (или последовательностью, в основном идентичной или сходной с ней, например, последовательностью, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или выше идентичной указанной последовательности).
[0244] В одном варианте осуществления, ингибитор PD-L1 представляет собой YW243.55.S70. Антитело YW243.55.S70 представляет собой антитело против PD-L1, описанное в W0 2010/077634 (последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи показаны в SEQ ID No. 20 и 21, соответственно), и обладает последовательностью, описанной в этом документе (или последовательностью, в основном идентичной или сходной с ней, например, последовательностью, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или выше идентичной указанной последовательности).
[0245] В одном варианте осуществления, ингибитор PD-L1 представляет собой MDX-1105. MDX-1105, известное также как BMS-936559, представляет собой антитело против PD-L1, описанное в WO2007/005874, и обладает последовательностью, описанной в этом документе (или последовательностью, в основном идентичной или сходной с ней, например, последовательностью, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или выше идентичной указанной последовательности).
[0246] В одном варианте осуществления, ингибитор PD-L1 представляет собой MDPL3280A (Genentech/Roche) . MDPL32 8 OA представляет собой человеческое моноклональное антитело IgGl с оптимизированным Fc, связывающее PD-L1. MDPL3280A и другие человеческие моноклональные антитела против PD-L1 описаны в Патенте США No.: 7943743 и Патентной публикации США No.: 20120039906.
[0247] В других вариантах осуществления, ингибитор PD-L2 представляет собой АМР-224. АМР-224 представляет собой слитый растворимый рецептор из PD-L2 и Fc, блокирующий взаимодействие между PD1 и В7-Н1 (B7-DCIg; Amplimmune; например, описанный в WO2010/027827 и WO2011/066342).
Ингибиторы LAG-3
[0248] В одном варианте осуществления, комбинация, описанная в настоящем документе, включает в себя ингибитор LAG-3. В некоторых вариантах осуществления, комбинацию используют для лечения злокачественной опухоли, например, злокачественной опухоли, описанной в настоящем документе, например, солидной опухоли или злокачественной опухоли кроветворных тканей. В некоторых вариантах осуществления, антитело против LAG-3 представляет собой BMS-986016. BMS-986016 (обозначаемое также как BMS986016; Bristol-Myers Squibb) представляет собой моноклональное антитело, связывающее LAG-3. BMS-98 6016 и другие гуманизированные антитела против LAG-3 описаны в US 2011/0150892, WO2010/019570 и WO2014/008218. В некоторых вариантах осуществления, антитело против LAG-3 представляет собой гуманизированное антитело против LAG3, описанное в WO2015/138920.
Ингибиторы TIM-3
[0249] В одном варианте осуществления, комбинация, описанная в настоящем документе, включает в себя ингибитор TIM-
3. В некоторых вариантах осуществления, комбинацию используют для лечения злокачественной опухоли, например, злокачественной опухоли, описанной в настоящем документе, например, солидной опухоли или злокачественной опухоли кроветворных тканей. Иллюстративные антитела против TIM-3 описаны в Патенте США No.: 8552156, WO 2011/155607, ЕР 2581113 и Патентной публикации США No.: 2014/044728. В некоторых вариантах осуществления антитело против TIM3 представляет собой гуманизированное mAb ABTIM3, описанное в WO2015/117002.
Ингибиторы CTLA-4
[0250] В одном варианте осуществления, комбинация, описанная в настоящем документе, включает в себя ингибитор CTLA-
4. В некоторых вариантах осуществления, комбинацию используют для лечения злокачественной опухоли, например, злокачественной опухоли, описанной в настоящем документе, например, солидной опухоли или злокачественной опухоли кроветворных тканей.
[0251] Иллюстративные антитела против CTLA4 включают в себя
тремелимумаб (моноклональное антитело IgG2, доступное из Pfizer, ранее известное как тицилимумаб, СР-675206); и ипилимумаб
(антитело против CTLA-4, известное также как MDX-010, CAS No. 477202-00-9). Другие иллюстративные антитела против CTLA-4 описаны, например, в Патенте США No. 5811097.
[0252] Антитела или антигенсвязывающие молекулы против GITR можно также составлять совместно с одним или несколькими иммуностимулирующими средствами. Например, в некоторых вариантах осуществления, антитела против GITR составляют совместно с иммуностимулирующим цитокином, например, IL-7, IL-12 или IL-15. Альтернативно, антитела или антигенсвязывающие молекулы против GITR можно составлять совместно с вторым иммуностимулирующим антителом. Например, антитела или антигенсвязывающие молекулы против GITR можно также составлять совместно с агонистическим антителом или антигенсвязывающей молекулой из числа других членов суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей. Иллюстративные вторые иммуностимулирующие мишени включают в себя, без ограничения, член 4 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей TNFRSF4 (известный также как 0X40) или член 9 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (известный также как TNFRSF9, 4-1ВВ или CD137) . См., например, Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-575; Pardee, et al, Immunotherapy
(2009) 1 (2) : 249-264; и Melero, et al. , Clin Cancer Res (2009) 15(5):1507-1509, и обсуждаемые в этих документах ссылки.
[0253] Антитела или антигенсвязывающие молекулы против GITR можно также составлять совместно с химиотерапевтическим средством. Выбранное средство зависит от состояния, подлежащего лечению, например, злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, такого как бактериальная инфекция, грибковая инфекция, вирусная инфекция или паразитическая инфекция. Антитела или антигенсвязывающие молекулы против GITR можно составлять совместно с химиотерапевтическим средством, известным специалисту в данной области для лечения состояния заболевания, подлежащего лечению. Химиотерапевтические средства, например, для лечения злокачественных опухолей и инфекционных заболеваний, известны в данной области, и описаны, например, в Goodman and
Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., Brunton, Lazo and Parker, Eds., McGraw-Hill (2006); 2010 Physicians' Desk Reference (PDR) , 64th Edition, Thomson PDR.
[0254] В некоторых вариантах осуществления, антитела или антигенсвязывающие молекулы против GITR можно составлять совместно с антинеопластическим средством. Иллюстративные антинеопластические средства, находящие применение для смешивания в композициях с антителами против GITR, включают в себя алкилирующие средства (например, азотистые иприты, этиленимины и метилмеламины, производное метилгидразина, алкилсульфонат, нитрозомочевину, триазены и координационные комплексы платины); антиметаболиты (например, аналоги фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина; природные продукты
(например, алкалоиды барвинка, таксаны, эпиподофиллотоксины,
камптотецины, антибиотики и антрацендион). В некоторых вариантах
осуществления, антитела или антигенсвязывающие молекулы против
GITR составляют совместно с антиметаболитным антинеопластическим
средством, например, аналогом фолиевой кислоты (например,
метотрексатом, пеметрекседом, триметрексатом), аналогом
пиримидина (например, 5-фторурацилом, капецитабином,
цитарабином, гемцитабином), аналогом пурина (например,
меркаптопурином, пентостатином, кладрибином, флударабином), или
их смесью. В некоторых вариантах осуществления, антитела или
антигенсвязывающие молекулы против GITR составляют совместно с
алкилирующим антинеопластическим средством, например, азотистыми
ипритами (например, мехлорэтамином, циклофосфамидом,
ифосфамидом, мелфаланом, хлорамбуцилом), этилениминами
(например, алтретамином) и метилмеламином (например, тиотепа),
производными метилгидразина (например, прокарбазином),
алкилсульфонатом (например, бусульфаном), нитрозомочевиной
(например, кармустином, стрептозоцином), триазенами (например, декарбазином, темозололмидом) и координационными комплексами платины (например, цисплатином, карбоплатином, оксалиплатином).
[0255] В некоторых вариантах осуществления, антитела или антигенсвязывающие молекулы против GITR можно составлять
совместно с противовирусным средством. Иллюстративные
противовирусные средства включают в себя, без ограничения,
средства против вируса герпеса (например, ацикловир, цидофовир,
фамицикловир, фоскарнет, тиовир, фомивирсен, ганцикловир,
идоксуридин, пенцикловир, трифлуридин, валацикловир,
валганцикловир, резиквимод); средства против гриппа (например, амантадин, озельтамивир, римантидин, занамивир, перамивир, Е-118958); средства против гепатита (например, адефовир дипивоксил, интерферон-альфа, ламивудин, энтекавир, клевудин, эмтрицитабин, телбувидин, тенофовир, вирамидин, BILN 2 0 61, NM283) и другие противовирусные средства (например, рибавирин, имиквимод, марибавир, sICAM-1, плеконарил). Противовирусное средство может представлять собой средство против ретровирусов. Иллюстративные средства против ретровирусов включают в себя, без ограничения, зидовудин, диданозин, ставудин, зальцитабин, ламивудин, абакавир, тенофавир, эмтрицитабин, невирапин, эфавиренц, делавирдин, саквинавир, индинавир, ритонавир, нельфинавир, ампренавир, лопинавир, атазанавир, фосампренавир и энфувиртид.
[0256] В некоторых вариантах осуществления, антитела или
антигенсвязывающие молекулы против GITR можно составлять
совместно с антибактериальным средством. Иллюстративные
антибактериальные средства включают в себя, без ограничения,
сульфонамиды (например, сульфаниламид, сульфадиазин,
сульфаметоксазол, сульфизоксазол, сульфацетамид), триметоприм,
хинолоны (например, налидиксовая кислота, циноксацин,
норфлоксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин, спарфлоксацин,
флероксацин, перлоксацин, левофлоксацин, гареноксацин и
гемифлоксацин), метенамин, нитрофурантоин, пенициллины
(например, пенициллин G, пенициллин V, метициллин, оксициллин,
клоксициллин, диклоксициллин, нафцилин, ампициллин,
амоксициллин, карбенициллин, тикарциллин, мезлоциллин и пиперациллин), цефалоспорины (например, цефазолин, цефалексин, цефадроксил, цефокситин, цефаклор, цефпрозил, цефуроксим, ацетил цефуроксима, лоракабеф, цефотетан, цефоранид, цефотаксим, цефподоксим проксетил, цефибутен, цефдинир, цефдиторен пивоксил,
цефтизоксим, цефтриаксон, цефоперазон, цефтазидим и цефепин), карбапенемы (например, имипенем, азтреонам) и аминогликозиды (например, неомицин, канамицин, стрептомицин, гентамицин, торамицин, нетилмицин и амикацин).
[0257] В некоторых вариантах осуществления, антитела или
антигенсвязывающие молекулы против GITR можно составлять
совместно с противопаразитическим средством. Иллюстративные
противопаразитические средства включают в себя, без ограничения,
противомалярийные средства (например, хинолины, включая
хлороквин, мефлоквин, хинин, квинидин и примаквин;
диаминопиримидины, включая пириметамин, сульфадоксин,
тетрациклины, атоваквон и прогуанил); антипротозойные средства,
включая амфотерицин, хлороквин, эфлорнитин, эметин, фумагиллин,
8-гидроксихинолины, меларсопрол, метронидазол, милтефосин,
нифуртимокс, нитазоксанид, паромомицин, пентамидин,
стибоглюконат натрия и сурамин.
[0258] В некоторых вариантах осуществления, антитела или
антигенсвязывающие молекулы против GITR можно составлять
совместно с противогрибковым средством. Иллюстративные
противогрибковые средства включают в себя, без ограничения,
полиены (например, натамицин, римоцидин, филипин, нистатин,
амфотерицин В, кандицин, и гамицин), имидазолы (например,
миконазол, кетоконазол, клотримазол, эконазол, бифоназол,
бутоконазол, фентиконазол, изоконазол, оксиконазол,
сертаконазол, сулконазол, тиоконазол) , триазолы (например, флуконазол, итраконазол, изавуконазол, равуконазол, позаконазол, вориконазол, терконазол), тиазолы (например, абафунгин), аллиламины (например, тербинафин, аморолфин, нафтифин, бутенафин), эхинокандины (например, анидулафунгин, каспофунгин, микафунгин), бензойную кислоту, циклопирокс, толнафтат, ундециленовую кислоту, флуцитозин или 5-фторцитозин, гризеофульвин и галопрогин.
Наборы
[0259] Композиции против GITR по настоящему изобретению можно предоставлять в наборе. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула против GITR, как правило, находится
во флаконе или контейнере. При необходимости, антитело может
находиться в жидкой или высушенной (например, лиофилизированной)
форме. Наборы могут содержать антитело, фрагмент антитела или
антигенсвязывающую молекулу против GITR по изобретению, как
описано в настоящем документе, и необязательно, содержит также
второе или третье средство. В некоторых вариантах осуществления,
наборы содержат антитело, фрагмент антитела или
антигенсвязывающую молекулу против GITR по изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель. Антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR можно предоставлять в наборах с вторым или третьим средствами в одном и том же или в отдельных составах (например, в форме смесей или в отдельных контейнерах). Наборы могут содержать аликвоты антител, фрагментов антител или антигенсвязывающих молекул против GITR, представленных для одной или нескольких доз. Если представлены аликвоты для множественных введений, дозы могут являться равномерными или меняющимися. Меняющиеся режимы дозирования могут являться увеличивающимися или уменьшающимися, при необходимости. Дозы антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы против GITR и второго средства могут независимо являться равномерными или меняющимися.
[0260] В некоторых вариантах осуществления, наборы
дополнительно содержат антиген-мишень. Антиген-мишень, или
вакцина, зависит от состояния заболевания, подлежащего лечению.
Например, антиген-мишень может происходить из клетки опухоли,
бактериальной клетки, гриба, паразита или вируса. Антиген-мишень
может находиться в форме пептида, полипептида, клетки,
полинуклеотида (например, голого плазмидного или вирусного
вектора), при необходимости. В некоторых вариантах
осуществления, антиген-мишень представляет собой
опухолеассоциированный антиген. Иллюстративные антигены-мишени обсуждают в настоящем документе; другие, известные в данной области, также находят применение.
[0261] В некоторых вариантах осуществления, наборы дополнительно содержат цитотоксическое средство. Например, наборы могут содержать агонистические антитело или
антигенсвязывающую молекулу, которые связываются с CD4+ CD2 5+ регуляторными Т-клетками (Трег) и уменьшают их количество или истощают их. Иллюстративные истощающие Трег антитела или антигенсвязывающие молекулы связываются с CD25 или CCR4. См., Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5) : 567-575 и обсуждаемые в этом документе ссылки.
[0262] В некоторых вариантах осуществления, наборы дополнительно содержат ингибитор коингибирующего сигнала. Иллюстративные ингибиторы включают в себя ингибиторы CTLA-4, LAG3, TIM3 и/или ингибиторы взаимодействия PD-1/PD-L1 (например, В7-Н1). В некоторых вариантах осуществления, наборы дополнительно содержат антитело, связывающее и ингибирующее CTLA-4. В некоторых вариантах осуществления, наборы дополнительно содержат антитело, связывающее и ингибирующее LAG3. В некоторых вариантах осуществления, наборы дополнительно содержат антитело, связывающее и ингибирующее TIM3. В некоторых вариантах осуществления, наборы дополнительно содержат антитело, связывающее и ингибирующее PD-1. В некоторых вариантах осуществления, наборы дополнительно содержат антитело, связывающее и ингибирующее В7-Н1. См., например, Expert Opin Ther Patents (2007) 17 (5) :567-575; и Melero, et al., Clin Cancer Res (2009) 15(5):1507-1509, и обсуждаемые в этих документах ссылки.
[0263] В некоторых вариантах осуществления, наборы дополнительно содержат одно или несколько иммуностимулирующих средств. Например, в некоторых вариантах осуществления, наборы содержат иммуностимулирующий цитокин, например, IL-7, IL-12 или IL-15. Альтернативно, наборы могут содержать второе иммуностимулирующее антитело. Например, наборы могут содержать агонистическое антитело или антигенсвязывающую молекулу другого члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей. Иллюстративные вторые иммуностимулирующие мишени включают в себя, без ограничения, член 4 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей TNFRSF4 (известный также как 0X40) или член 9 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (известный также как TNFRSF9, 4-1ВВ или CD137) . См., например, Expert Opin
Ther Patents (2007) 17(5):567-575; Pardee, et al, Immunotherapy (2009) 1 (2) : 249-264; и Melero, et al. , Clin Cancer Res (2009) 15(5) : 1507-1509, и обсуждаемые в этом документе ссылки.
[0264] В некоторых вариантах осуществления, наборы
дополнительно содержат химиотерапевтическое средство. Выбранное
средство зависит от состояния, подлежащего лечению, например,
злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, такого
как бактериальный инфекция, грибковая инфекция, вирусная
инфекция или паразитическая инфекция. Иллюстративные
химиотерапевтические средства включают в себя любые
антинеопластические, противовирусные, антибактериальные,
противопаразитические и противогрибковые средства, известные в данной области и описанные в настоящем документе. Способы усиления ответов Т-клеток
Состояния, подлежащие лечению или предотвращению [0265] Агонистические антитела и фрагменты антител против GITR по изобретению находят применение в усилении ответов CD4+ Т-помощников и CD8+ цитолитических Т-клеток у нуждающегося в этом пациента. Таким образом, антитела находят применение в улучшении или усилении ответа Т-клеток у пациента, например, для эффекта уменьшения, обращения, ингибирования или предотвращения заболевания, которому можно противостоять с помощью улучшенного или усиленного иммунного ответа. В одном аспекте изобретение относится к способам усиления ответа Т-клеток у нуждающегося в этом индивидуума, включающим в себя введение индивидууму терапевтически эффективного количества агонистического антитела или фрагмента антитела против GITR по изобретению, как описано в настоящем документе. В одном аспекте изобретение относится также к агонистическому антителу или фрагменту антитела против GITR для применения для усиления ответа Т-клеток у индивидуума. В следующем аспекте, изобретение относится к композиции, содержащей такое антитело или фрагмент антитела, для применения для усиления ответа Т-клеток у индивидуума.
[0266] Состояния субъекта, подлежащие лечению, включают в себя злокачественные опухоли и инфекционное заболевание. Для терапевтических целей, пациент может иметь злокачественную
опухоль или опухоль или инфекционное заболевание, например, бактериальную, вирусную, грибковую или паразитическую инфекцию. Для профилактических целей, пациент может находиться в ремиссии после злокачественной опухоли, или его может ожидать воздействие бактериальной, вирусной, грибковой или паразитической инфекции. Антитела могут также служить адъювантом для усиления или стимуляции, или быстрого развития иммунного ответа против первичного антигена или антигена-мишени, например, вакцины.
[0267] В некоторых вариантах осуществления, пациент имеет
злокачественную опухоль, как подозревают, имеет злокачественную
опухоль, или находится в ремиссии после злокачественной опухоли.
Злокачественные опухоли, подлежащие лечению с использованием
антитела против GITR, обычно экспрессируют
опухолеассоциированный антиген (ТАА), как описано в настоящем
документе. Злокачественные опухоли, подлежащие лечению, включают
в себя, без ограничения, эпителиальные злокачественные опухоли
или карциномы, так же как саркомы и лимфомы. В некоторых
вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет
собой меланому, рак яичника, рак почки, колоректальный рак, рак
предстательной железы, рак легкого, включая немелкоклеточный рак
легкого (NSCLC), рак молочной железы, глиому или фибросаркому.
См., например, Pardee, et al, Immunotherapy (2009) 1(2) : 249-264,
и обсуждаемые в этом документе ссылки. В некоторых вариантах
осуществления, тип злокачественной опухоли выбран из группы,
состоящей из: рака поджелудочной железы, меланом, рака молочной
железы, рака легкого, рака бронхов, колоректального рака, рака
предстательной железы, рака желудка, рака яичника, рака мочевого
пузыря, злокачественной опухоли головного мозга или центральной
нервной системы, злокачественной опухоли периферической нервной
системы, рака пищевода, рака шейки матки, злокачественной
опухоли тела или эндометрия матки, злокачественной опухоли
полости рта или глотки, рака печени, рака почки, рака яичка,
рака желчных протоков, злокачественной опухоли тонкого кишечника
или аппендикса, злокачественной опухоли слюнных желез,
злокачественной опухоли щитовидной железы, злокачественной
опухоли надпочечника, остеосаркомы, хондросаркомы,
злокачественной опухоли кроветворных тканей и плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC).
[0268] В одном аспекте изобретение относится к способам
лечения роста злокачественной опухоли, экспрессирующей
опухолеассоциированный антиген у нуждающегося в этом
индивидуума, включающим в себя введение индивидууму
терапевтически эффективного количества агонистического антитела
или фрагмента антитела против GITR по изобретению, как описано в
настоящем документе. Изобретение относится также к
агонистическому антителу или фрагменту антитела против GITR по
изобретению для применения для лечения роста злокачественной
опухоли, экспрессирующей опухолеассоциированный антиген, у
индивидуума. Изобретение, кроме того, относится к композиции,
содержащей антитело или фрагмент антитела по изобретению, для
применения для уменьшения, ингибирования или предотвращения
роста злокачественной опухоли, экспрессирующей
опухолеассоциированный антиген у индивидуума.
[0269] В некоторых вариантах осуществления, представлены
способы облегчения диагностики или прогнозирования
злокачественной опухоли у индивидуума, включающие в себя использование агонистического антитела или фрагмента антитела против GITR по изобретению для детекции экспрессии GITR в опухоли или вблизи опухоли у индивидуума.
[0270] В некоторых вариантах осуществления, пациент имеет инфекционное заболевание, например, бактериальную, вирусную, грибковую или паразитическую инфекцию. Агонистические антитела против GITR находят применение для уменьшения, ингибирования и/или предотвращения паразитической инфекции, например, филяриоза и лейшманиоза.
[0271] В некоторых вариантах осуществления, агонистические антитела против GITR находят применение в лечении вирусной инфекции, включая, без ограничения, инфекцию вирусом гепатита, например, инфекцию хронического гепатита С (HCV), инфекцию вирусом простого герпеса (HSV) или инфекцию вирусом иммунодефицита человека (HIV). В некоторых вариантах осуществления, агонистические антитела против GITR находят
применение для лечения вирусной инфекции, выбранной из группы, состоящей из: гепатита типа А, гепатита типа В, гепатита типа С, гриппа, ветряной оспы, инфекции аденовирусом, вирусом простого герпеса типа I (HSV I), простого герпеса типа II (HSV II), чумы крупного рогатого скота, инфекции риновирусом, эховирусом, ротавирусом, респираторно-синцитиальным вирусом, вирусом папилломы, паповавирусом, цитомегаловирусом, эхиновирусом, арбовирусом, хантавирусом, вирусом коксаки, вирусом свинки, вирусом кори, вирусом краснухи, вирусом полиомиелита, вирусом иммунодефицита человека типа I (HIV I) и вирусом иммунодефицита человека типа II (HIV II), любым пикорнавирусом, энтеровирусом, калицивирусом, любым из группы вирусов Норфолк, тогавирусами, такими как альфавирусы, флавивирусы, коронавирусы, вирусом бешенства, вирусом марбургской болезни, вирусами Эбола, вирусом парагриппа, ортомиксовирусами, буньявирусами, аренавирусами, реовирусами, ротавирусами, орбивирусами, вирусом типа I Т-клеточного лейкоза человека, вирусом типа II Т-клеточного лейкоза человека, вирусом иммунодефицита обезьян, лентивирусами, полиомавирусами, парвовирусами, вирусом Эпштейна-Барр, вирусом б герпеса человека, вирусом 1 герпеса мартышковых (В-вирусом) и поксвирусами.
[0272] В некоторых вариантах осуществления, агонистические антитела против GITR находят применение в лечении бактериальных инфекций, включая, без ограничения, инфекцию видами Neisseria, видами Streptococcus, видами S. mutans, видами Haemophilus, видами Moraxella, видами Bordetella, видами Mycobacterium, видами Legionella, видами Escherichia, видами Vibrio, видами Yersinia, видами Campylobacter, видами Salmonella, видами Listeria, видами Helicobacter, видами Pseudomonas, видами Staphylococcus, видами Enterococcus, видами Clostridium, видами Bacillus, видами Corynebacterium, видами Borrelia, видами Ehrlichia, видами Rickettsia, видами Chlamydia, видами Leptospira, видами Treponema.
Введение антител против GITR
[0273] Терапевт или ветеринар может начинать дозирование антител или фрагментов антител по изобретению, используемых в
фармацевтической композиции на уровнях, более низких, чем необходимые для достижения желательного терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозу до достижения желательного терапевтического эффекта. Как правило, эффективные дозы композиций по настоящему изобретению меняются в зависимости от множества различных факторов, включая конкретное заболевание или состояние, подлежащее лечению, способы введения, участок-мишень, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или животным, другие вводимые лекарственные средства и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Дозы для лечения необходимо титровать для оптимизации безопасности и эффективности. Для введения антитела, дозы лежат в диапазоне приблизительно от 0,0001 до 100 мг/кг, и более обычно, от 0,01 до 5 мг/кг, от массы организма хозяина. Например, дозы могут составлять 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела, или лежать в диапазоне 1-10 мг/кг. Дозирование может являться ежесуточным, еженедельным, один раз в две недели, ежемесячным, или более или менее частым, как необходимо или желательно. Иллюстративный режим лечения предусматривает введение один раз в неделю, один раз в каждые две недели или один раз в месяц, или один раз в каждые З-б месяцев.
[0274] В некоторых вариантах осуществления, вводят полинуклеотид, кодирующий антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу против GITR по изобретению. В вариантах осуществления, где средство представляет собой нуклеиновую кислоту, типичные дозы могут лежать в диапазоне приблизительно от 0,1 мг/кг массы тела вплоть до и включительно, приблизительно 100 мг/кг массы тела, например, между приблизительно 1 мг/кг массы тела и приблизительно 50 мг/кг массы тела. В некоторых вариантах осуществления, они составляют приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 или 50 мг/кг массы тела.
[0275] Антитело или фрагмент антитела можно вводить в однократной или разделенных дозах. Антитело или фрагмент антитела обычно вводят за несколько раз. Интервалы между однократными дозами могут составлять неделю, две недели, месяц
или год, как необходимо или желательно. Интервалы могут также являться неравномерными, по показаниям измерения уровня в крови пациента антитела или фрагмента антитела против GITR. В некоторых способах, дозу корректируют для достижения концентрации в плазме антитела или фрагмента антитела 1-1000 мкг/мл, и в некоторых способах, 25-300 мкг/мл. Альтернативно, антитело или фрагмент антитела можно вводить в форме состава с замедленным высвобождением, в этом случае необходимо менее частое введение. Дозу и частоту меняют в зависимости от времени полужизни антитела или фрагмента антитела у пациента. Как правило, гуманизированные антитела обладают более длительным временем полужизни, чем химерные антитела и не относящиеся к человеку антитела. Дозу и частоту введения можно менять в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактических применениях, относительно низкие дозы вводят в относительно нечастые интервалы в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение в течение всей оставшейся жизни. При терапевтических применениях, иногда необходимы относительно высокие дозы в относительно короткие интервалы, пока прогрессирование заболевания не уменьшится или не прекратится, и предпочтительно, пока для пациента не будет показано частичное или полное облегчение симптомов заболевания. Затем, можно проводить введение пациенту в профилактическом режиме. Совместное введение с вторым средством
[0276] В некоторых вариантах осуществления, антитело,
фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу против GITR
вводят совместно с вторым или третьим фармакологическим
средством. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую
молекулу против GITR и второе или третье средство можно вводить
в форме смеси или в отдельных составах. Антитело, фрагмент
антитела или антигенсвязывающую молекулу против GITR и второе
или третье средство можно вводить одновременно или
последовательно. Антитело, фрагмент антитела или
антигенсвязывающую молекулу против GITR и второе или третье средство можно вводить посредством одного и того же способа
введения или посредством различных способов введения, при
необходимости. Иллюстративные вторые средства и третьи средства
для совместного введения с агонистическими антителами,
фрагментами антител или антигенсвязывающими молекулами против
GITR по настоящему изобретению включают в себя, без ограничения,
первичные антигены или антигены-мишени, средства, увеличивающие
иммуногенность клеток опухоли, средства, ингибирующие или
супрессирующие коингибирующие сигналы. Агонистические антитела,
фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR
можно также вводить совместно с химиотерапевтическим средством,
используемым для лечения состояния заболевания, подвергаемого
лечению, например, для увеличения эффективности
химиотерапевтического средства или для дополнительного усиления иммунного ответа против антигена-мишени. Агонистические антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR также находят применение в видах комбинированной терапии совместно с разработанными способами для лечения указанного состояния заболевания, например, радиоактивным облучением или хирургическим вмешательством.
[0277] Антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR по изобретению можно вводить совместно с первичным антигеном или антигеном-мишенью. Антиген-мишень или вакцина зависят от состояния заболевания, подлежащего лечению. Например, антиген-мишень может происходить из клетки опухоли, бактериальной клетки, гриба, вируса или паразита. Антиген-мишень может находиться в форме пептида, полипептида, клетки или полинуклеотида, при необходимости.
[0278] В некоторых вариантах осуществления, антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR вводят совместно с антигеном-мишенью из вируса, например, выбранного из группы, состоящей из: вируса гепатита типа А, гепатита типа В, гепатита типа С, гриппа, ветряной оспы, аденовируса, вируса простого герпеса типа I (HSV I), вируса простого герпеса типа II (HSV II), вируса чумы крупного рогатого скота, риновируса, эховируса, ротавируса, респираторно-синцитиального вируса, вируса папилломы, паповавируса,
цитомегаловируса, эхиновируса, арбовируса, хантавируса, вируса
коксаки, вируса свинки, вируса кори, вируса краснухи, вируса
полиомиелита, вируса иммунодефицита человека типа I (HIV I) и
вируса иммунодефицита человека типа II (HIV II), любых
пикорнавирусов, энтеровирусов, калицивирусов, любого из группы
вирусов Норфолк, тогавирусов, таких как альфавирусы,
флавивирусы, коронавирусов, вируса бешенства, вируса марбургской
болезни, вирусов Эбола, вируса парагриппа, ортомиксовирусов,
буньявирусов, аренавирусов, реовирусов, ротавирусов,
орбивирусов, вируса типа I Т-клеточного лейкоза человека, вируса типа II Т-клеточного лейкоза человека, вируса иммунодефицита обезьян, лентивирусов, полиомавирусов, парвовирусов, вируса Эпштейна-Барр, вируса б герпеса человека, вируса 1 герпеса мартышковых (В-вируса) и поксвирусов.
[0279] В некоторых вариантах осуществления, антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR вводят совместно с антигеном-мишенью из бактерии, например, выбранной из группы, состоящей из: видов Neisseria, видов Streptococcus, видов S. mutans, Haemophilusг видов Moraxellar видов Bordetellar видов Mycobacteriumr видов Legionellar видов Escherichiar видов Vibrio, видов Yersiniar видов Campylobacterr видов Salmonellar видов Listeria r видов Helicobacterr видов Pseudomonasr видов Staphylococcus r видов Enterococcusr видов Clostridium r видов Bacillusr видов Corynebacteriumr видов Borrelia r видов Ehrlichia r видов Rickettsiar видов Chlamydia r видов Leptospirar видов Treponema.
[0280] В некоторых вариантах осуществления, антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR вводят совместно с опухолеассоциированным антигеном (ТАА). ТАА может представлять собой выделенный полипептид или пептид, может являться частью интактной клетки или частью лизата клеток опухоли. Иллюстративные ТАА обсуждают выше; другие, известные в данной области, также находят применение.
[0281] В некоторых вариантах осуществления, антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR вводят совместно с аутологичными клетками опухолей от пациента,
или аллогенными клетками опухолей того же самого типа ткани от
другого пациента. Клетки опухолей могут находиться в форме
интактных клеток, лизата клеток опухолей, апоптотических клеток
опухолей или тотальной мРНК клеток опухоли. Клетки опухолей
можно подвергать трансфекции для экспрессии полипептида,
улучшающего или усиливающего иммуногенность клеток опухоли для
пациента, например, подвергать трансфекции для экспрессии
гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GM-CSF). Клетки
опухолей могут происходить из любой злокачественной ткани,
включая, без ограничения, эпителиальные злокачественные опухоли
или карциномы, так же как саркомы и лимфомы. В некоторых
вариантах осуществления, злокачественная опухоль представляет
собой меланому, рак яичника, рак почки, колоректальный рак, рак
предстательной железы, рак легкого, включая немелкоклеточный рак
легкого (NSCLC) , рак молочной железы, глиому или фибросаркому.
См., например, Pardee, et al, Immunotherapy (2009) 1(2):249-264,
и обсуждаемые в этом документе ссылки. В одном варианте
осуществления, клетка опухоли происходит, например, из рака
поджелудочной железы, меланом, рака молочной железы, рака
легкого, рака бронхов, колоректального рака, рака предстательной
железы, рака желудка, рака яичника, рака мочевого пузыря,
злокачественной опухоли головного мозга или центральной нервной
системы, злокачественной опухоли периферической нервной системы,
рака пищевода, рака шейки матки, злокачественной опухоли тела
или эндометрия матки, злокачественной опухоли полости рта или
глотки, рака печени, рака почки, рака яичка, рака желчных
протоков, злокачественной опухоли тонкого кишечника или
аппендикса, злокачественной опухоли слюнных желез,
злокачественной опухоли щитовидной железы, злокачественной
опухоли надпочечника, остеосаркомы, хондросаркомы,
злокачественной опухоли кроветворных тканей и плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC).
[0282] В некоторых вариантах осуществления, антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR вводят совместно с цитотоксическим средством. Например, антитела или антигенсвязывающие молекулы против GITR вводят совместно с
агонистическим антителом или антигенсвязывающей молекулой, которые связываются с CD4+ CD25+ регуляторными Т-клетками (Трег) и уменьшают их количество или истощают их. Иллюстративные истощающие Трег антитела или антигенсвязывающие молекулы связываются с CD25 или CCR4. См., Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-575, и обсуждаемые в этом документе ссылки.
[0283] В некоторых вариантах осуществления, антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR вводят совместно с ингибитором коингибирующего сигнала. Иллюстративные ингибиторы включают в себя ингибиторы CTLA-4, LAG3, TIM3 и/или ингибиторы взаимодействия PD-1/PD-L1 (например, В7-Н1). В некоторых вариантах осуществления, антитела против GITR вводят совместно с антителом, связывающим и ингибирующим CTLA-4. В некоторых вариантах осуществления, антитела против GITR вводят совместно с антителом, связывающим и ингибирующим TIM3. В некоторых вариантах осуществления, антитела против GITR вводят совместно с антителом, связывающим и ингибирующим LAG3. В некоторых вариантах осуществления, антитела против GITR вводят совместно с антителом, связывающим и ингибирующим PD-1. В некоторых вариантах осуществления, антитела против GITR вводят совместно с антителом, связывающим и ингибирующим В7-Н1. См., например, Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-575; и Melero, et al., Clin Cancer Res (2009) 15 (5) :1507-1509, и обсуждаемые в этих документах ссылки.
[0284] Антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR можно также вводить совместно с одним или несколькими иммуностимулирующими средствами. Например, в некоторых вариантах осуществления, антитела или фрагменты антител против GITR вводят совместно с иммуностимулирующим цитокином, например, IL-7, IL-12 или IL-15. Альтернативно, антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR можно вводить совместно с вторым иммуностимулирующим антителом. Например, антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR можно также вводить совместно с агонистическим антителом, фрагментом антитела или антигенсвязывающей молекулой из числа других членов
суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей. Иллюстративные вторые иммуностимулирующие мишени включает в себя, без ограничения, член 4 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей TNFRSF4 (известный также как 0X40) или член 9 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (известный также как TNFRSF9, 4-1ВВ или CD137). См., например, Expert Opin Ther Patents (2007) 17(5):567-575; Pardee, et al, Immunotherapy (2009) 1 (2) : 249-264; и Melero, et al. , Clin Cancer Res (2009) 15(5):1507-1509, и обсуждаемые в этих документах ссылки.
[0285] Антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR можно также вводить совместно с химиотерапевтическим средством. Выбранное средство зависит от состояния, подлежащего лечению, например, злокачественной опухоли или инфекционного заболевания, такого как бактериальная инфекция, грибковая инфекция, вирусная инфекция или паразитическая инфекция. Антитела, фрагменты антител или антигенсвязывающие молекулы против GITR можно вводить совместно с химиотерапевтическим средством, известным специалисту в данной области для лечения состояния заболевания, подлежащего лечению. Иллюстративные химиотерапевтические средства обсуждают выше; другие, известные в данной области, также находят применение. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0286] Фигура 1A-1D иллюстрирует эпитопное картирование mAb
против GITR по изобретению. На фигуре 1А изображены результаты
водородно/дейтериевого обмена в сочетании с анализами масс-
спектрометрии (HDXMS) с использованием слитых белков Fc-GITR
(верхняя и средняя кривая) и HIS-GITR (нижняя кривая) и
исходного Ab МАВ1. Нумерация отражает удаление
последовательности сигнального пептида нативного GITR (ак 1-26) . На фигуре 1В изображены схемы конструкций с N-концевой делецией, полученных с использованием внеклеточного домена из GITR человека (hGITR ECD) . На фигуре 1С изображены результаты связывания МАВ4 и МАВ5 с конструкциями ECD hGITR. N-концевая делеция богатого цистеином домена 1 (CRD1) из внеклеточного домена (ECD) GITR человека (hGITR) прекращает связывание МАВ4 и МАВ5 с hGITR. Сходные результаты получены для МАВ7 (данные не
представлены). На фигуре 1D изображены результаты аланинового
сканирующего мутагенеза. МАВ7 связывалось со всеми мутантными
белками за исключением мутанта GITR Е7 8А. Проводили анализы
связывания ForteBio(tm), и результаты также подтвердили потерю
связывания МАВ7 с мутантным белком hGITRE7 8A (данные не
представлены). Результаты относятся к области ECD GITR, включая
CRD1 и включая Е7 8 (SEQ ID N0:88:
RPTGGPGCGPGRLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGD) в качестве области и потенциального эпитопа, вовлеченного в связывание МАВ1 и МАВ7 (исходного mAb).
[0287] На фигуре 2А-2Е изображены результаты экспериментов связывания антитела МАВ против GITR. Фигура 2А и 2В иллюстрирует, что МАВ4 и МАВ5 специфически связывают GITR человека и яванского макака (2А), но не грызунов (2В), как определено посредством анализов ELISA. Фигура 2С иллюстрирует, что МАВ7 разделяет сходный профиль связывания GITR человека и яванского макака, но не GITR мыши, посредством анализа ELISA. Фигура 2D иллюстрирует, что МАВ7 конкурирует со связыванием GITR-лиганд, как определено посредством конкурентных анализов FACS. Фигура 2Е иллюстрирует результаты анализов ELISA, показывающих, что антитела против GITR по изобретению (например, МАВ4, МАВ5) не связывают другие члены суперсемейства рецепторов
TNF (TNFRSF). Анализ на чипах Protagen(tm) также подтвердил, что антитела не связываются с другими белками, не являющимися мишенями (не показано).
[0288] На фигуре 3A-3D показана внутриклеточная передача сигналов в клетках 2 93, сконструированных для экспрессии GITR. Фигура ЗА иллюстрирует, что рекомбинантный лиганд GITR человека
(GITR-L) активирует внутриклеточную передачу сигналов в клетках 2 93, стабильно трансфицированных для сверхэкспрессии GITR человека. Фигура ЗВ иллюстрирует, что моноклональные антитела МАВ4 и МАВ5 активируют внутриклеточную передачу сигналов в клетках 2 93, трансфицированных для сверхэкспрессии GITR человека сравнимо с GITR-L, когда антитела являются перекрестно сшитыми
(ЕС50 для GITRL составляет приблизительно 65 нМ по сравнению с
ЕС50 приблизительно 2,5 нМ для агонистических антител в присутствии перекрестно сшивающего средства). Фигура ЗС иллюстрирует, что перекрестно сшитое антитело МАВ активирует внутриклеточную передачу сигналов в клетках, поскольку МАВ7 и МАВ8 стимулируют также активацию NFKB В клетках 2 93, стабильно трансфицированных GITR человека и репортерным геном NFkB-люцифераза, сходным образом с перекрестно сшитым МАВ4. Фигура 3D иллюстрирует, что перекрестно сшитые МАВ4 и МАВ5 стимулируют активацию NFKB В клетках 2 93, стабильно трансфицированных GITR яванского макака и репортерным геном NFKB-люцифераза. Сходную активацию наблюдали для перекрестно сшитого МАВ7 (данные не представлены).
[0289] На фигуре 4А-4С изображено, что костимулирующая активность in vitro МАВ7 для Т-клеток зависит от активации Т-клеток. mAb против CD3 (ОКТЗ), против CD28 (CD28.2) и против GITR перекрестно сшивали на бусинах (в соотношении 1:1:3) и затем инкубировали с РВМС. Фигура 4А иллюстрирует, что МАВ7 является коактиватором CD4+ Т-клеток и стимулирует пролиферацию Т-клеток для CD4+ Т-клеток. Фигура 4В иллюстрирует, что МАВ7 является коактиватором CD8+ Т-клеток и стимулирует пролиферацию Т-клеток для CD8+ Т-клеток. Фигура 4С иллюстрирует, что продукция цитокинов, например, продукция IFNy, после привлечения TCR является увеличенной в сочетании с МАВ7. Сходные результаты наблюдали для МАВ4 и 5 (данные не представлены).
[0290] Фигура 5A-D иллюстрирует активность МАВ7 в ADCC in vitro в клетках, экспрессирующих GITR на различных уровнях. На каждой из фигуры 5А, фигуры 5В, фигуры 5С и фигуры 5D изображены результаты активности ADCC с использованием контрольного антитела или антитела МАВ7 при различных уровнях экспрессии GITR. МАВ7 является способным индуцировать передачу сигнала посредством FcgRIIIa, с увеличенной активностью при увеличенных уровнях передачи сигнала посредством GITR.
[0291] Фигура 6A-6D иллюстрирует, что GITR является функциональным у мышей с нокином hGITR-hGITRL. Спленоциты выделяли из мышей с нокином hGITR-hGITRL и культивировали либо
без стимуляции, либо со стимуляцией с использованием антител
aCD3 и aCD8 в течение 48 часов, затем подвергали контрольному
воздействию или воздействию МАВ7 в различных концентрациях в
течение 3 0 минут, затем фиксировали и окрашивали с
использованием конъюгированных с флуорофором антител, и
анализировали посредством проточной цитометрии. На фигуре 6А
изображены результаты, показывающие повышающую регуляцию
экспрессии hGITR на стимулированных CD8+ Т-клетках. На фигуре 6В
изображены результаты связывания антитела против hGITR с Т-
клетками по окрашиванию hFc, показывающие, что МАВ7 может
связываться с hGITR, экспрессированным на мышиных CD8+ Т-
клетках. На фигуре 6С и 6D показано, что связывание МАВ7 со
стимулированными CD8+ Т-клетками коррелирует с увеличенной
активацией Т-клеток, как показано по окрашиванию
внутриклеточного pIKK (6С) и по активации Т-клеток (6D) . *р <0,05, **р <0,005.
[0292] Фигура 7А-7С иллюстрирует, что МАВ7 является функциональным in vivo. Мышей с двойным нокином hGITR-hGITRL с развившимися опухолями Со1оп2б обрабатывали с использованием однократной дозы носителя (п=8/временную точку) или антитела МАВ7 (п=10/временную точку). На фигуре 7А изображены результаты измерения опухолей дважды в неделю и объем опухоли, рассчитанный с использованием уравнения (LxW2)/2. Показанные данные получены для группы временной точки пятнадцать (15) суток. На фигурах 7В и 7С изображены результаты для цельной крови, и на фигурах 7С и 7D изображены результаты для опухолей, собранных через 3 суток после дозирования и анализированных посредством проточной цитометрии по экспрессии hGITR на клеточной поверхности иммуноцитов. (*р <0,05, ****р <0,00005).
[0293] Фигура 8А-8Е иллюстрирует, что МАВ7 вызывает противоопухолевый иммунный ответ на опухоли Colon2 6 in vivo. Мышей с двойным нокином hGITR-hGITRL с развившимися опухолями Со1оп2б обрабатывали с использованием однократной дозы носителя (п=8/временную точку) или МАВ7 (п=10/временную точку). На фигуре 8А изображены результаты для регуляторных Т-клеток через 3 суток после дозирования. На фигуре 8В-8С изображены результаты для
уровней лимфоцитов (8В) и активированных CD8+ Т-клеток (8С), присутствующих в участке опухоли после обработки для опухолей на 15 сутки после дозирования. Абсолютное количество клеток нормализовали по размеру опухоли, чтобы учитывать значительные различия размера опухолей между группами носителя и обработки МАВ7. На фигуре 8D показано соотношение Тэфф/Трег, полученное в результате у подвергнутых обработке животных, как определено по общему количеству внутриопухолевых активированных CD8+ Т-клеток по сравнению с CD4+ FOXP3+ Трег для получения соотношений Тэфф/Трег- На фигуре 8Е изображены результаты анализов спленоцитов для очищенных CD8+ Т-клеток, инкубированных с клетками опухолей Colon2 6 ex-vivo, и измерения ответа CTL с использованием анализа ELISPOT IFNg. (*р <0,05, ***р <0,0005).
[0294] Фигура 9А-9С иллюстрирует, что экспрессия PD-1 подвергается повышающей регуляции на CD8+ Т-клетках в опухолях Со1оп2б, так же как в селезенке, после обработки мышиным суррогатным антителом против GITR, DTA-1. Для суспензий отдельных клеток из целых опухолей или целых селезенок получали профили проточной цитометрии после 2 доз DTA-1. На фигуре 9А показаны результаты для положительных по PD-1 клеток, оцененные как процент от общего количества CD19-CD3+CD8+ Т-клеток. На фигуре 9В показаны результаты для положительных по PD-1 клеток, нормализованные по размеру опухолей, по абсолютному количеству PD-1+CD19-CD3+CD8+ Т-клеток на мм3 объема опухоли. На фигуре 9С изображены результаты, показывающие что экспрессия PD-1 подвергается положительной регуляции на CD8+ Т-клетках в селезенках мышей, несущих опухоль Со1оп2б, после обработки DTA-1. Положительные по PD-1 клетки оценивали как процент от общего количества CD19-CD3+CD8+ Т-клеток. (*р <0,05 и ****р <0,0005).
[0295] Фигура 10 иллюстрирует, что комбинации антител против GITR и против PD-1 обеспечивают преимущество в отношении выживаемости по сравнению с контролем изотипа. Изображены результаты в моделях Со1оп2б на мышах, обработанных антителом против GITR (IgG2a-DTA-l) и против PD-1 (RMP1-14), отдельно или в комбинации, по сравнению с контролем изотипа.
[0296] Фигура 11 иллюстрирует экспрессию LAG3 (первый
столбец), TIM3 (средний столбец) и PD1 (правый столбец) после обработки антителом против GITR, против PD-1 и против GITR/ против PD-1 в комбинациях у мышей с развившимися опухолями Со1оп2б по сравнению с обработкой контрольным для изотипа АЬ. Изображены результаты в моделях Со1оп2б на мышах, обработанных антителом против GITR (IgG2a-DTA-l) и против PD-1 (RMP1-14) отдельно или в комбинации по сравнению с контролем для изотипа. В верхнем ряду показаны результаты для образцов опухолей, и в нижнем ряду изображены результаты для образцов селезенки. Экспрессия LAG3, TIM3 и PD1 подвергается повышающей регуляции в CD8+ Т-клетках в опухолях Со1оп2б после обработки a-GITR и а-PD1. Экспрессия PD-1 подвергается повышающей регуляции в CD8+ Т-клетки в опухолях Со1оп2б после обработки антителами против GITR/ против PD-1 в комбинации. ПРИМЕРЫ
Получение агонистических антител для GITR МАВ2г МАВЗr МАВ4г МАВ5, МАВб, МАВ7 и МАВ8
[0297] Человеческие антитела МАВ2, МАВЗ, МАВ4, МАВ5, МАВб, МАВ7 и МАВ8 получали посредством модификации мышиного моноклонального агонистического антитела для GITR МАВ1 для получения большей гомологии последовательности с человеческим зародышевым антителом. МАВ2, МАВЗ, МАВ4, МАВ5, МАВб, МАВ7 и МАВ8 сохраняют эпитопную специфичность, аффинность и перекрестную реакционную способность по отношению к GITR яванского макака исходного мышиного антитела, МАВ1. МАВ2, МАВЗ, МАВ4, МАВ5, МАВб, МАВ7 и МАВ8 обладают намного более высокой гомологией с человеческой зародышевой последовательностью, чем исходное мышиное антитело, и таким образом, иммунная система человека должна быть более толерантной к ним.
[0298] Мышиное моноклональное МАВ1 модифицировали, чтобы приблизить его белковую последовательность к человеческой зародышевой последовательности и уменьшить его иммуногенность с использованием технологической платформы Humaneered(r), доступной из KaloBios, (South San Francisco, CA (во всемирной сети web на kalobios.com)). Антитела Humaneered(r) являются очень близкими к
человеческим антителам по последовательностям V-области, которые обладают высокой гомологией с человеческой зародышевой последовательностью, сохраняя в то же время специфичность и аффинность исходного или эталонного антитела (Публикация патента США 2005/0255552 и 2006/0134098) . По этому способу сначала идентифицируют минимальные детерминанты специфичности связывания антигена (BSD) в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи эталонного Fab (как правило, последовательности внутри CDR3 тяжелой цепи и CDR3 легкой цепи). Поскольку эти BSD тяжелой и легкой цепи сохраняются во всех библиотеках, сконструированных в ходе процесса, каждая библиотека является сфокусированной на эпитопе, и полученные антитела Humaneered(r) сохранют эпитопную специфичность исходного мышиного антитела.
[0299] Затем получают библиотеки полноразмерных цепей (в
которых полноразмерная вариабельная область легкой или тяжелой
цепи заменена на библиотеку человеческих последовательностей)
и/или кассетные библиотеки (в которых часть вариабельной области
тяжелой или легкой цепи мышиного Fab заменена на библиотеку
человеческих последовательностей). Бактериальную систему
секреции используют для экспрессии членов библиотеки в форме
фрагментов Fab антитела, и проводят скрининг библиотеки по Fab,
которые связывают антиген, с использованием анализа связывания с
отпечатком колоний (CLBA). Положительные клоны подвергают
дальнейшей характеризации для идентификации клонов с наивысшей
аффинностью. Идентифицированные человеческие кассеты,
поддерживающие связывание в контексте оставшихся мышиных последовательностей, комбинируют в окончательном скрининге библиотеки для получения полностью человеческих V-областей.
[0300] Полученные Fab антитела Humaneered(r) обладают последовательностями V-сегмента, происходящими из человеческих библиотек, сохраняют короткие последовательности BSD, идентифицированные внутри областей CDR3, и обладают человеческими зародышевыми каркасными областями 4. Эти Fab переводят в полноразмерные IgG посредством клонирования вариабельных областей тяжелых и легких цепей в экспрессирующие
IgG векторы. Антитела Humaneered(r), полученные этим способом, сохраняют специфичность связывания исходного, мышиного антитела, как правило, обладают эквивалентной или более высокой аффинностью для антигена, чем исходное антитело, и обладают V-областями с высокой степенью идентичности последовательности по сравнению с человеческими зародышевыми генами антител, на уровне белка.
Способы
Получение мышиного mAb против GITR МАВ1
[0301] Трансгенных мышей Bcl-2 (C57BL/6-Tgn (bcl-2), линия 22 wehi) иммунизировали с использованием N-концевой области из GITR человека (ак 26-161) с использованием способа, называемого повторной иммунизацией во множестве участков (RIMMS) (Mclntyre GD. Hybridoma 1997) с последующим получением гибридом из мышей с высоким титром. Гибридому, секретирующую МАВ1, идентифицировали и отбирали с использованием сэндвич-ELISA против hGITR и анализа репортерных генов с NFKB ДЛЯ подтверждения связывания hGITR и агонистической активности.
Клонирование мышиных V-областей
[0302] ДНК вариабельной области из мышиного моноклонального
МАВ1 амплифицировали посредством RT-ПЦР с РНК, полученной из
линии клеток гибридомы, с использованием стандартных способов.
Вариабельную область тяжелой цепи амплифицировали с кДНК МАВ1 с
использованием HV3 (5'- GGGTCTAGACACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTC-3'
(SEQ ID N0:95)) и HCconstant (5'-
G С G Т С ТAGAAY С Т С СACACACAG GRRC СAG Т G GATAGAC-3' (SEQ ID N0:96)).
Вариабельную область легкой цепи амплифицировали с той же самой
кДНК с использованием LV3 (5'-
G G G Т С ТAGACAC CAT G GAGW СACAKW С Т СAG GTCTTTRTA-3' (SEQ ID N0:97)) и LCconstant (5'- GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG-3' (SEQ ID N0:19)). Продукты вариабельных областей тяжелой и легкой цепи вставляли в вектор pcDNA3.1, и последовательность подтверждали. Векторы для тяжелой и легкой цепи использовали в качестве матриц для ПЦР, включающей участки узнавания рестрикционных ферментов для клонирования в векторы KaloBios: Vh в KB1292-His
(модифицированный вариант КВ12 92, кодирующий С-концевой гибкий линкер и метку б-His tag (SEQ ID N0:11) аминокислотной последовательности AAGAS НННННН (SEQ ID N0:13) на CHI) по Ncol
(5') и Nhel (3') ; VK В КВ1296 по Ncol (5') и BsiWI (3') . Затем эти отдельные векторы для тяжелой и легкой цепи объединяли в один бицистронный экспрессирующий Fab вектор KaloBios посредством рестрикционного расщепления с использованием BssHII и Clal, и лигирования. Фрагменты Fab экспрессировали в Е. coli с этого вектора. Этот Fab тестировали по связыванию с антигеном hGITR и обозначили как MABlrFab. Очистка Fab
[0303] Фрагменты Fab экспрессировали посредством секреции из Е. coli с использованием экспрессирующих векторов KaloBios. Клетки выращивали в среде 2 х YT до OD500 ~0,б. Экспрессию индуцировали добавлением IPTG до 100 мкМ и встряхиванием в
течение 4 часов при 33°С. Собранные Fab получали из периплазматических фракций посредством осмотического лизиса и очистки посредством аффинной хроматографии с использованием колонок Ni-NTA, колонок HisTrap HP; GE Healthcare каталожный #17-5247-01) в соответствии со стандартными способами. Fab элюировали в буфер, содержащий 50 0 мМ имидазол и подвергали тщательному диализу против PBS рН7,4 без кальция и магния. Конструирование библиотеки
[0304] Для ограничения комплексности для идентификации взаимодополняющих человеческих CDR, поддерживающих BSD-FR4 в связывании GITR человека, принимали способ кассетной библиотеки, в котором только часть исходного мышиного V-сегмента заменяли на библиотеку человеческих последовательностей. Исходная мышиная VK МАВ1 является наиболее близкой к человеческой зародышевой Vklll, поэтому смесь двух библиотек KaloBios, содержащих зародышевые линии VKIII (КВ1423 и КВ1424), использовали для получения кассетных библиотек VK. Библиотеки KaloBios, содержащие зародышевые линии VH3 (КВ1413, КВ1414), использовали для конструирования кассетных библиотек Vh. Два типа кассет конструировали посредством перекрывающейся ПЦР: предварительные
кассеты (8C1VK3FE-01 и MAB1VH3FE-01) , содержащие человеческие последовательности в кассетах FR1, CDR1 и FR2, и кассеты FR3
(MAB1VK3FR3-01 и MAB1VH3FR3-01)), содержащие человеческие последовательности в FR3, амплифицировали с использованием вышеупомянутых ограниченных зародышевых библиотек KaloBios. Каждую кассетную библиотеку Vh клонировали в вектор KB12 92-His по Ncol (5') и Крп! (3'); каждую кассетную библиотеку VK клонировали в вектор КВ1296-В (модифицированный вариант вектора KaloBios КВ1296, обладающий молчащим участком Hindlll, добавленным в FR4) по Ncol (5') и Hindi II (3') . Полученные плазмидные библиотеки Vh или VK затем комбинировали с комплементарной цепью из оптимизированного исходного Fab
(MABlopVK или МАВ1 opVH (например, предварительную библиотеку Vh комбинировали с оптимизированным эталонным вектором VK) посредством расщепления посредством BssHII и Clal и последующего лигирования для получения библиотек бицистронных векторов, экспрессирующих полноразмерные Fab.
[0305] Ни один из предварительных клонов VH3 не связывал GITR человека с высокой аффинностью, таким образом, конструировали вторую предварительную библиотеку VH3 (MAB1VH3FE-02). Эта библиотека содержит человеческие последовательности в FR1, FR2 и набор CDR2, кодирующих либо исходный мышиный остаток, либо выбранный человеческий зародышевый остаток во всех положениях. Последовательности области FR3 в этой библиотеке происходили из шести клонов, выбранных из библиотеки VH3FR3
(MAB1VH3FR3-01).
[0306] Конечную библиотеку полноразмерных цепей VK
(MAB1VK3FCL-01) конструировали посредством комбинации клонов из предварительной библиотеки VK и кассетной библиотеки VKFR3 с мутантными CDR2 VK, кодирующими либо исходный мышиный, либо выбранный человеческий зародышевый остаток во всех положениях. Полученную библиотеку полноразмерных цепей VK клонировали в КВ129бЬ по участкам Ncol и Hindlll. Эту библиотеку полноразмерных цепей VK подвергали спариванию с рядом избранных клонов из библиотеки VH3FR3 для обеспечения экспрессии
функционального Fab и проводили скрининг посредством CLBS. Специфические для антигена клоны подтверждали посредством ELISA, специфической для GITR человека, и ранжировали посредством ELISA с титрованием по аффинности для антигена. Библиотеку полноразмерных цепей VH3 (MABlVH3FcL-01) получали с использованием клонов, избранных из второй предварительной библиотеки VH3 (MAB1VH3FE-02), с набором последовательностей CDR2, содержащих либо исходный мышиный, либо человеческий остаток в каждом положении. Эту библиотеку полноразмерных цепей VH клонировали в KB1292-his по участкам Ncol и Крп!. Для получения конечной библиотеки, экспрессирующей полноразмерные цепи человеческого Fab, избранные клоны полноразмерных цепей VK комбинировали с библиотекой полноразмерных цепей VH по участкам BssHII и Clal.
Общий способ ELISA
[0307] Слитый белок из рекомбинантного человеческого GITR и человеческого Fc (hGITR-hFc) использовали во всех анализах ELISA. Как правило, антиген hGITR-hFc, разведенный в PBS рН 7,4, связывали с 9б-луночным микропланшетом для титрования при 2 00 нг/лунку посредством инкубации в течение ночи при 4°С. После промывки три раза с использованием PBST, планшет блокировали с использованием раствора 1% BSA в PBS в течение одного часа при 37°С, и затем промывали один раз с использованием PBST. Затем содержащую Fab клеточную среду или разведенный, очищенный Fab (50 мкл) добавляли в каждую лунку. После инкубации при 37°С в
течение одного часа, или инкубации в течение ночи при 4°С, планшет промывали три раза с использованием PBST. Конъюгат HRP с антителом против человеческой цепи каппа (Sigma #А7164), разведенный 1:5000 в PBST (50 мкл) добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали в течение 4 5 мин при комнатной температуре. Планшет промывали три раза с использованием PBST, затем 100 мкл субстрата ТМВ SureBlue (KPL #52-00-03) добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре. Планшет считывали при 650 нм в спектрофотометре.
ELISA для титрования аффинности
[0308] Для оценки связывания антигена избранными продуцирующими Fab клонами, разработали ELISA для титрования аффинности. В этом анализе скомбинированы две последовательные стадии ELISA: на первой стадии, с использованием антител козы против человеческого Fab (Jackson ImmunoResearch Lab #109-005097) для связывания и антител козы против человеческой каппа (Sigma #А7164) для детекции, измеряют концентрации Fab в среде после культивирования клеток для нормализации количества Fab, используемого во втором ELISA для титрования антигена; во втором ELISA, обычном ELISA, специфическом для антигена, получают кривую разведения для связывания антигена с таким же количеством исходного Fab. Посредством сравнения кривых разведения различных клонов идентифицируют клоны с высокой аффинностью. ELISA связывания с отпечатками колоний (CLBA)
[0309] Скрининг библиотек антител Humaneered(r) для фрагментов Fab проводили в основном, как описано в (Публикации патентов США 2005/0255552 и 2006/0134098) с использованием нитроцеллюлозных фильтров, покрытых hGITR-hFC при 2,0 мкг/мл в PBS рН7,4. Fab, связанные с покрытым антигеном фильтром, детектировали с использованием конъюгата с HRP антитела козы против человеческой каппа (Sigma #А7164), разведенного 1:5000 in PBST, и блоты проявляли с использованием системы детекции для Вестерн-блоттинга ECL plus (GE Healthcare #RPN2132).
Удаление участка гликирования в МАВ4
[0310] Участок гликирования "КН" в участке стыковки FR3 и CDR3 тяжелой цепи МАВ4 удаляли посредством замены лизина на аргинин, или замены лизина на аргинин и гистидина на аспарагин. Превращения КН в RH и КН в RN осуществляли посредством мутагенеза на основе ПЦР с использованием плазмиды р50Н в качестве матрицы ДНК. Обратный праймер (TCTGGCGCAGTAATACACGGCC, SEQ ID N0:110) включал аргинин вместо лизина; прямой праймер (NNKGCCTATGGCCATGATGGCG, SEQ ID N0:111) обладал вырожденным тринуклеотидом NNK в участке гистидина. Реакции ПЦР проводили с использованием 100 нг матрицы, 0,2 мкМ каждого праймера, 200 мкМ
dNTP, и 2,5 ед. ДНК-полимеразы pfuUltrall (Strategene) в объеме реакционной смеси 50 мкл. Условия ПЦР представляли собой 94°С в течение 3 мин в течение 1 цикла; 94°С в течение 15 секунд, 52°С в течение 2 0 секунд и 65°С в течение 5 минут в течение 3 0 циклов; и наконец, 1 цикл при 72°С в течение 5 минут. Dpnl (2 ед. ) добавляли в реакционную смесь для ПЦР и инкубировали при 37°С в течение 3 0 минут для удаления матрицы р50Н. Амплифицированные варианты тяжелой цепи МАВ4 разделяли в 1% геле с SYBR и очищали с использованием набора для очистки из геля Qiagen. Очищенный из геля продукт ПЦР обрабатывали полинуклеотид-киназой ДНК Т4, лигировали и трансформировали химически компетентные клетки DH5a (Invitrogen) с отбором в присутствии ампициллина.
[0311] Клоны, несущие тяжелую цепь МАВ7 и МАВ8, отбирали
посредством ПЦР колоний с использованием прямого
(GCCTTTCTCTCCACAGG, SEQ ID N0:112) и обратного
(GGCAAACAACAGATGGCTGG, SEQ ID N0:113) праймеров, следуя протоколу GoTaqClear (Promega). Условия ПЦР представляли собой 94°С в течение 3 минут в течение 1 цикла; 94°С в течение 10 секунд, 55°С в течение 30 секунд, 72°С в течение 45 секунд 25 раз; и наконец, один цикл при 72°С в течение 5 минут. Реакционные смеси после ПЦР очищали для секвенирования посредством инкубации образцов при 37°С в течение 30 минут и 80°С в течение 15 минут с экзонуклеазой I и щелочной фосфатазой креветки. Образцы после ПЦР секвенировали, и результаты анализировали с использованием программного обеспечения Clone Manager. Продукция и очистка антител
[0312] Полученные антитела МАВ2, МАВЗ, МАВ 4, МАВ5, МАВб, МАВ7 и МАВ8 (IgGl каппа) получали посредством совместной трансфекции следующими векторами клеток 2 93 Freestyle с использованием реагента для трансфекции 293fectin (Invitrogen #51-0031) в соответствии с протоколом производителя.
МАВ2 - р35Н+р35карра
МАВЗ - р38Н+р38карра
МАВ4 - р50Н+р35карра
МАВ5 - р51Н+р35карра МАВб - р5бН+р35карра МАВ7 - рМАВ7Н+р35карра МАВ8 - рМАВ8Н+р35карра
[0313] Антитело очищали из супернатантов клеток 293 Freestyle с использованием 5-мл колонки HiTrap HP с белком A (GE Healthcare #17-0403-03). Антитело элюировали с использованием буфера для элюции IgG (Pierce #21004), и буфер меняли на PBS посредством диализа. Аффинную хроматографию с белком А проводили в системе для жидкостной хроматографии AKTA-FPLC (GE Healthcare).
ELISA специфичности
[0314] Для ELISA специфичности, неочищенный лизат клеток получали из бактерий, экспрессирующих члены семейства TNFRSF. Для предотвращения неспецифического связывания с планшетом, добавляли 50 мкл 5% BSA на мл бактериального лизата. 9б-луночный планшет HisGrab Nickel (Pierce #15142) покрывали содержащим TNFRSF бактериальным лизатом при 100 мкл лизата/BSA на лунку и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшет промывали три раза с использованием PBST, затем МАВ разводили до 0,5 мкг/мл в 10% FBS в PBS, и 100 мкл добавляли в каждую лунку. Планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и затем промывали три раза с использованием PBST. Антитело против человеческой каппа (Sigma #А7164), конъюгированное с HRP разводили 1:5000 в 1:1 PBST: 10% FBS в PBS, и 100 мкл добавляли в каждую лунку. Планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, и затем промывали три раза с использованием PBST. 100 мкл субстрата ТМВ SureBlue добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре до остановки реакции с использованием 100 мкл/лунку 2 Н H2SO4. Планшет считывали при 450 нм в спектрофотометре.
ELISA (связывание GITR,. перекрестная реактивноств для видов, аланиновое сканирование)
[0315] Связывание МАВ с GITR из различных видов, различных конструкций аланиновых мутантов или внеклеточного домена GITR
оценивали с использованием 384-луночного планшета, покрытого внеклеточным доменом (ECD) GITR крысы, мыши, человека или яванского макака при 50 нг на лунку и инкубированного в течение ночи при 4°С. Планшет блокировали с использованием раствора 1% BSA в PBS в течение одного часа при комнатной температуре и затем промывали три раза с использованием PBST. Затем МАВ разводили до 0,5 мкг/мл или 1 мкг/мл в PBS, и 20 мкл добавляли в каждую лунку. Планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и затем промывали три раза с использованием PBST. Антитело против человеческой цепи каппа
(Sigma #А7164), антитело против человеческой цепи гамма (Jackson Immunoresearch 109-036-098), антитело козы против антитела мыши
(Jackson ImmunoResearch 115-035-071), конъюгированные с HRP, разводили 1:5000 в блокирующем буфере (25 мкл) и добавляли в каждую лунку, или добавляли конъюгированное с hrp антитело против HIS (QIAGEN 1014992), разведенное 1:1000 в блокирующем буфере. Планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, и затем промывали шесть раз с использованием PBST. 25 мкл субстрата ТМВ SureBlue (KPL 52-00-02) добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре. Планшеты считывали при 650 нм в спектрофотометре.
Линии клеток, клетки Линии клеток
[0316] Для получения линии клеток 293-hGITR-NFKB с репортерным геном, клетки 2 93 стабильно трансфицировали репортерным геном NFKB-люцифераза и GITR человека (или GITR яванского макака). Активацию пути передачи сигнала посредством GITR в этих клетках определяли посредством измерения уровней люциферазы, индуцированных внутри клеток после 2 4 час инкубации с GITR-L или агонистическим антителом. Для оценки эффектов перекрестного сшивания АЬ, их инкубировали с избытком F(ab')2 антитела козы против антител человека, специфического для фрагмента FcyD или белка А перед использованием в анализе репортерного гена.
[0317] Получали клональные линии клеток Daudi, экспрессирующие уровни GITR, наблюдаемые в иммуноцитах человека.
[0318] Получали РВМС яванского макака, и связывание GITR
определяли с использованием МАВ. Кратко, кровь яванского макака
переносили в 50 мл конические пробирки (Falcon, #352098), затем
разводили 1:2 в PBS (HyClone, #SH30256.01) и перемешивали.
Разведенную кровь осторожно наслаивали поверх 18 мл 90% фиколла
Ficoll Paque PLUS (GE Healthcare #17-1440-03, разведенного в
PBS), и пробирки центрифугировали при 2 000 х g в настольной
центрифуге в течение 3 0 минут при комнатной температуре, без
торможения. Слой плазмы осторожно удаляли без нарушения
диффузного слоя РВМС поверх фиколла. Затем РВМС осторожно
собирали, и PBS добавляли к выделенным РВМС, пока объем в
конической пробирке не составлял 45 мл, перемешивали, и затем
центрифугировали при 300 х g в настольной центрифуге в течение
15 минут при комнатной температуре. Супернатант осторожно
отбирали и добавляли 4 мл 1х лизирующего раствора BD (BD
#555899), и образцы осторожно перемешивали на встряхивателе.
После инкубации при комнатной температуре в темноте в течение 3
минут, 4 0 мл PBS добавляли к каждому образцу, и их
центрифугировали при 2 00 х g в настольной центрифуге в течение
10 минут при комнатной температуре. Супернатант осторожно
отбирали, и осадок промывали два раза в 45 мл PBS перед
центрифугированием при 2 00 х g в настольной центрифуге в течение
10 минут при комнатной температуре. Полученный осадок
фильтровали и ресуспендировали при 1x106 клеток/мл в среде для
тестирования CTL (CTLT-005), дополненной
пенициллином/стрептомицином/глутамином (Hyclone #SV30082.01). 100 мкл очищенных РВМС яванского макака помещали в 9б-луночный круглодонный планшет (Corning, #3799). Для активации РВМС, 100 мкл активированных тозилом гранул dynabeads М-2 8 0 (Life Technologies #142.04), конъюгированных с SP34-2/ антителами CD2 8.2 добавляли в каждую лунку. Использовали соотношение 3:1 CD3/CD2 8 бусин к РВМС, и планшеты инкубировали в инкубаторе для культивирования клеток при 37°С в течение 4 8 часов. Для
окрашивания на сутки 0, 2 00 мкл РВМС помещали в 9б-луночный круглодонный планшет (Corning, #3799). Для образцов, стимулированных в течение 4 8 часов, 100 мкл супернатанта осторожно удаляли, и оставшееся содержимое лунки осторожно ресуспендировали, и 2 00 мкл переносили в планшет для окрашивания FACS .
FACS
[0319] Получали планшеты с клетками, ресуспендированными в 200 мкл холодного PBS. Закрепляемый краситель LIVE/DEAD (Life Technologies #L23105) разводили в 50 мкл DMSO и 1 мкл разведенного красителя добавляли/мл холодного PBS, и осадки клеток немедленно ресуспендировали в 100 мкл раствора LIVE/DEAD в PBS, инкубировали в течение 3 0 минут на льду, с защитой от света, затем промывали и ресуспендировали в 100 мкл холодного буфера для FACS, содержащего 2 мкг/мл МАВ7 или контрольного антитела для изотипа IgGl человека, и планшеты инкубировали в течение 3 0 минут на льду с защитой от света. Промывали и ресуспендировали в 100 мкл коктейля антител (антитело против CD3 человека с РегСР Су5.5 (BD #552852), антитело против CD4 человека с Alexa Fluor 700 (BD #560836), антитело против CD8 человека с V450 (BD #561426), антитело против CD25 человека РЕ-Су7 (BD #561405) и затем антитело против антител человека с РЕ в буфере для FACS (Jackson Immuno #109-116-098)), и затем планшеты инкубировали в течение 3 0 минут на льду с защитой от света и затем центрифугировали в настольной центрифуге при 3200 об./мин в течение 1 минуты при 4°С. Клетки промывали в буфере для FACS, затем ресуспендировали в 100 мкл BD CytoFix (BD #554655), и планшеты инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре с защитой от света, затем промывали дважды и ресуспендировали в 100 мкл буфера для FACS. Планшеты накрывали фольгой (Beckman Coulter, #538619) и хранили при 4°С до готовности для считывания. На сутки считывания FACS планшет центрифугировали в настольной центрифуге при 32 0 0 об./мин в течение 1 минуты, и 50 мкл CML латексных бусин (Life Technologies #С37259), 4х105/мл в буфере для FACS, добавляли в
каждую лунку. Планшеты считывали на проточном цитометре BD Fortessa, и данные анализировали с использованием FlowJo. Трансгенные мыши
[0320] Мышей с нокином hGITR получали посредством замены полной кодирующей последовательности (экзонов и интронов) GITR мыши на последовательность кДНК GITR человека. Нетранслируемые последовательности выше инициирующего кодона и ниже стоп-кодона происходят из генома мыши. Нацеливание генов выполняли стандартными способами в клетках ES BALB/c с использованием нацеливающих векторов, несущих гомологичные плечи, происходящие из BALB/c. Несколько клонов клеток ES идентифицировали посредством ПЦР и подтверждали посредством Саузерн-блоттинга содержание точного нокина кДНК человека. В соответствии со стандартными способами эмбриологии мышей, положительные клоны клеток ES инъецировали в бластоцисты, которые переносили псевдобеременным реципиентным суррогатным матерям для получения химерного потомства. Самцов химерных мышей скрещивали с самками BALB/c, экспрессирующими рекомбиназу Сге в их зародышевой линии, для вырезания фланкированной 1охР кассеты устойчивости к неомицину. Для одного из клонов получили белое потомство, указывающее на передачу зародышевой линии ES клеток-мишеней. Вырезание фланкированной 1охР кассеты подтверждали посредством генотипирования ПЦР. На последующей стадии скрещивания с мышами BALB/c дикого типа удаляли рекомбиназу Сге.
[0321] Мышей с нокином hGITRL получали посредством замены мышиной кодирующей части экзона 1 на человеческую последовательность кДНК GITRL с последующим сигналом поли-А бычьего гормона роста. Все манипуляции с клетками ES и эмбриологические манипуляции с мышами выполняли способами, сходными со способами, описанными выше. Мышей с двойным нокином hGITR-hGITRL получали посредством скрещивания двух линий-основателей на протяжении 2 поколений для получения гомозиготных мышей с двойным нокином.
Функциональные анализы
[0322] Функциональную активность МАВ тестировали в анализе
репортерных генов с NFKB ПО агонистической активности. МАВ разводили до б мкг/мл в PBS и инкубировали в течение 3 0 минут при комнатной температуре в присутствии/в отсутствие 3-кратного избытка перекрестно сшивающего средства фрагмента F(ab')2 козы против антитела человека, специфического для Fey. Альтернативно, МАВ разводили до б мкг/мл в PBS и инкубировали в течение 3 0 минут при комнатной температуре в присутствии/в отсутствие 2-кратного избытка белка А. Затем 10 мкл инкубированного МАВ добавляли в 3 8 4-луночный белый планшет для анализа с прозрачным дном. Линию клеток НЕК-2 93, стабильно трансфицированных hGITR и репортерным геном с NFKB, разводили до 5x105 клеток/мл, и 2 0 мкл суспензии клеток добавляли в каждую лунку. Планшет инкубировали в течение 24 часов при 37°С в инкубаторе для культивирования клеток. 30 мкл Cell Bright Glo добавляли в каждую лунку, и планшет считывали по люминесценции в Acquest.
[0323] Способность МАВ блокировать связывание лиганда оценивали с использованием исходных клеток НЕК2 93 с репортером NFKB, И стабильные клетки с hGITR использовали в конкурентных анализах связывания и в анализе FACS. Кратко, собранные клетки рассевали при 1х106 клеток на мл, 100 мкл на лунку, в 9б-луночный круглодонный планшет для FACS (Corning), затем ресуспендировали в 200 мкл холодного буфера FACS (IX PBS+1% FBS-HI+0,1% азид натрия) на лунку. Получали раститровку человеческого лиганда GITR от 270 нМ до 1,52 пМ в буфере для FACS при 100 мкл на лунку. Планшеты инкубировали в течение 1 часа на льду с защитой от света, клетки промывали, затем получали 4 нМ растворы контрольного антитела для изотипа или МАВ и добавляли с соответствующие лунки при 100 мкл на лунку, и планшеты инкубировали в течение 1 часа на льду с защитой от света, клетки промывали, затем конъюгированное с РЕ антитело козы против антитела человека для детекции (Jackson ImmunoResearch), полученное при разведении 1:100 в буфере для FACS, добавляли при 100 мкл на лунку, и планшеты инкубировали в течение 3 0 минут на льду с защитой от света. Клетки промывали в буфере для FACS, затем клетки фиксировали с использованием 100 мкл на лунку BD
CytoFix (BD Biosciences) и инкубировали в течение следующих 15 минут на льду с защитой от света. Фиксированные клетки промывали дважды, ресуспендировали в конечном объеме 150 мкл на лунку буфера для FACS, и образцы анализировали в течение 1 недели в проточном цитометре BD Fortessa (BD Bioscience).
[0324] Агонистическую активность МАВ можно также наблюдать для первичных Т-клеток, экспрессирующих эндогенные уровни GITR, посредством пролиферации и секреции цитокинов из первичных Т-клеток. МАВ конъюгировали с активированными тозилом бусинами М-280 (Invitrogen #142.04) в соответствии с инструкциями производителя. В некоторых экспериментах антитела - агонисты CD3 (ОКТЗ) и CD28 (CD28.2) также конъюгировали с бусинами. 1х105 свежеочищенных меченных CFSE РВМС человека рассевали в 10 мкл среды для тестирования CTL (CTL #CTLW-010) в 9б-луночный круглодонный планшет для культивирования клеток. 100 мкл конъюгированных с МАВ бусин затем добавляли в соотношении 1 Т-клетка: 1 бусина. Затем планшеты инкубировали в течение 3 суток при 37°С в инкубаторе для культивирования клеток. Уровни секретированных цитокинов в среде измеряли с использованием мультиплексного анализа MSD, согласно инструкциям производителя. Клетки окрашивали с использованием антител против CD4, CD8a, CD25, GITR и красителя LIVE/DEAD, после окрашивания клетки фиксировали и считывали в проточном цитометре. Пролиферацию каждого типа CD4 и CD8 клеток оценивали посредством окрашивания CFSE и подсчет бусин добавляли до считывания FACS, чтобы позволить нормализацию образцов.
[0325] Костимулирующую активность МАВ для Т-клеток также измеряли с использованием способа ELISpot для детекции IFNg. Кратко, планшеты для ELISPOT (Millipore MSIPS4510) получали посредством покрытия с использованием 7 0% этанола в течение 2 минут с последующей промывкой PBS и инкубацией в течение ночи с 50 мкг моноклонального антитела против IFNg в PBS (Mabtech 33213) . Очищенные CD8+ Т-клетки выделяли из селезенок мышей, обработанных носителем или МАВ7 через 15 суток после дозирования. Т-клетки рассевали в покрытые планшеты для ELISPOT
при 0,25х10лб клеток на лунку в среде для CTL (CTL Test-medium (CTL CTLT-005), 1 мМ Hepes (Mediatech MT25-060-C1), 2 мМ L-глутамин (Mediatech MT25-005-C1), 1 мм пируват натрия (Mediatech МТ2 5-0 0 0-С1) , 100 мкМ MEM заменимые аминокислоты (Mediatech МТ25-025-С1), 66 мкМ 2-меркаптоэтанол (Gibco 21985-023), 100 ед./мл пен./стрепт. (Gibco 10378016). Клетки Со1оп2б обрабатывали с использованием добавки 10% ConA (BD Biosciences 354115) при 37°С в течение 48 часов для повышающей регуляции экспрессии МНС класса II и промывали средой для CTL перед добавлением Т-клеток. Клетки опухолей Со1оп2б (20000/лунку) добавляли к CTL и инкубировали при 37°С в течение 24-48 часов. Затем планшеты промывали с использованием 0,05% Tween-20/PBS, и 10 мкг биотинилированного Mab против IFNg (Mabtech R4-6A2-биотин) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 2 часов при 37°С. Затем планшеты промывали с использованием 0,05% Tween-20/PBS и раствор Vectastain ABC (Вектор Labs РК6100) добавляли в каждую лунку, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем клетки промывали с использованием 0,05% Tween-20/PBS, и субстрат АЕС, полученный в соответствии с протоколом производителя (Sigma А6926), добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 4 минут при комнатной температуре. Затем планшеты промывали водопроводной водой, высушивали и сохраняли в темноте в течение 24 часов перед считыванием.
[0326] Способность МАВ индуцировать ADCC измеряли с использованием анализа репортера. В 9б-луночном белом планшете (Perkin Elmer F6178) 2х103 клеток hGITR-Daudi инкубировали с 4х104 клеток Jurkat-V158 (стабильно экспрессирующих вариант V158 FcgRIIIa человека и репортер NFAT) в соотношении 1 клетка Daudi к 20 клеткам Jurkat в 50 мкл RPMI+10% FBS. Равный объем МАВ добавляли в лунки, и планшеты инкубировали в течение 3 часов при 37°С в инкубаторе для культивирования клеток. После инкубации 60 мкл Bright-Glo добавляли в каждую лунку, и планшет считывали в люминометре.
[0327] Анализы спленоцитов in vitro проводили с использованием селезенок, выделенных из мышей. Кратко, селезенки
от мышей подвергали диссоциации посредством автоматизированной гомогенизации в 5 мл раствора для промывки AutoMACS (Miltenyi Biotech 130-091-222), содержащего 5% BSA (Miltenyi Biotech 130091-376) с использованием пробирок gentleMACS С (Miltenyi Biotech 130-096-334) в устройстве для диссоциации gentleMACS Octo (Miltenyi Biotech 130-095-937) . Гомогенаты пропускали через клеточное сито с размером пор 0,70 мкМ (Fisher Scientific 22363548) и промывали 10 мл буфера AutoMACS. Спленоциты ресуспендировали и рассевали при 100000 клеток/лунку в RPMI
(HyClone SH30027,02)+10% человеческой сыворотки (Cellgro 35-060.С1)+1х пен./стрепт./L-глют. (Gibco 15 140-112) в 9б-луночном планшете для культивирования тканей (Costar 3799). Для стимуляции Т-клеток, 0,4 мкг/мл антитела против CD3 мыши
(eBioscience 16-0031-86) и 0,8 мкг/мл антитела против CD28 мыши
(eBioscience 13-0281-86) добавляли в соответствующие лунки. Через 4 8 часов, клетки либо анализировали немедленно, либо стимулировали с использованием контрольного или терапевтического антитела в течение от 30 минут до 96 часов, окрашивали с использованием конъюгированных с флуорофором антител и анализировали посредством проточной цитометрии.
[0328] Проточная цитометрия: для поверхностных маркеров, клетки окрашивали с использованием антител против CD19 (BD Biosciences 562291), против CD8 (Biolegend 100725), против CD4
(eBioscience 25-0041), против CD69 (BD Biosciences 561238), против hGITR (Miltenyi Biotech 130-092-895) и против hlgG (Life Sciences A-10631) в течение 30 минут при 4С. Для внутриклеточного окрашивания, после инкубации с антителами против поверхности клеток, клетки промывали, фиксировали и пермеабилизовывали с использованием буфера FOXP3 Fix/Perm
(Biolegend 421403) в соответствии с протоколом производителя, и инкубировали с антителом против фосфо-IKKa/b (Cell Signaling 2697) или антителом против FOXP3 (eBioscience 50-4774-42) в течение 3 0 минут при 4С. Клетки считывали на цитометре BD LSRFortessa с использованием программного обеспечения BD FACSDiva (BD Biosciences), и данные проточной цитометрии анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo
(TreeStar Inc.).
[0329] Суспензии отдельных клеток получали из опухолей и селезенок и окрашивали для анализа посредством проточной цитометрии. Например, клеточные маркеры оценивали с использованием следующих антител: a-CD8-BUV395 (клон 53-6.7, BD Biosciences 563786), a-CDl9-АРС-Су7 (клон 6D5, BioLegend 115530), a-CD3-PerCp (клон 145-2С11, BD Bioscience 553067), а-PD-1-PE-Cy7 (клон RMP1-30, Biolegend 109110). Проточную цитометрию проводили в цитометрах BD LSRFortessa с использованием программного обеспечения BD FACSDiva (BD Biosciences). Данные цитометрии анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (FlowJo LLC). Графики получали и статистические расчеты выполняли с использованием программного обеспечения Prism (программного обеспечения GraphPad). Все данные показаны как среднее+стандартное отклонение (SD) . Сравнения групп выполняли с использованием t-критерия Стьюдента с двусторонним 95% доверительным интервалом. Для всех статистических оценок уровень значимости устанавливали на р < 0,05. Указана значимость по сравнению с контрольной группой носителя, если не указано иначе.
[0330] Модели опухолей in vivo. Линию клеток мышиной карциномы ободочной кишки Со1оп2б получали из Отдела лечения и диагностики злокачественных опухолей в Национальном институте онкологии США (ампула: 0507238). Клетки мышиной карциномы Colon26 культивировали в среде RPMI 1640 (HyClone SH30027.02), дополненной 10% FBS (Gibco 10099-141), 10 мМ HEPES (Gibco 15630080) и 1 мМ пируватом натрия (Gibco 11360-070) . Самкам мышей с нокином hGITR-hGITRL в возрасте 8-10 недель инъецировали подкожно в бок 0,5х10лб клеток Со1оп2б в 100 мкл RPMI. Опухоли измеряли с использованием цифрового штангенциркуля, и объем опухоли рассчитывали с использованием уравнения (L х W2)/2. Когда опухоли достигали среднего размера 180 мм3, мышей распределяли случайным образом и вводили дозы с использованием однократной внутрибрюшинной инъекции носителя (PBS) или терапевтического антитела (15 мг/кг) в 2 00 мкл PBS. Мышей умерщвляли, и опухоли
собирали для анализа посредством проточной цитометрии через 7 суток после введения дозы терапевтических антител. Все эксперименты на животных проводили в аккредитованном AAALAC отделе с использованием одобренных IACUC протоколов. Статистический анализ выполняли в программном обеспечении Prism с использованием t-критерия Стьюдента с двусторонним 95% доверительным интервалом или однофакторного ANOVA с коррекцией Тьюки.
[0331] Тестирование суррогатной модели GITR и Со1оп2б на мышах. Самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель из Charles River Labs использовали в качестве экспериментальных животных. Для имплантации, клетки ресуспендировали в 1х сбалансированном солевом растворе Хенкса (Hyclone Cat# SH30030.02) и имплантировали с помощью подкожной инъекции в нижнюю часть правого бока с использованием иглы 28 g (объем инъекции 100 мкл) . После имплантации, мышей рандомизировали в соответствии с объемом опухоли. Мышам вводили дозы 5 мг/кг IgG2a-DTA-l или IgG2a мыши для контроля изотипа посредством подкожной инъекции. Клон DTA-1, антитело крысы против GITR мыши (S. Sakaguchi, Kyoto University, Kyoto Japan), модифицировали для получения мышиного химерного IgG2a посредством слияния последовательностей вариабельной области DTA-1 с мышиными областями Fc IgG2a для получения IgG2a-DTA-l.
[0332] Комбинированная терапия. Для оценки активности in vivo суррогатного антитела против GITR (мышиного IgG2a-DTA-l), в комбинации с суррогатным антителом против PD-1 (крысы, IgG2a RMP1-14, Biolegend), самкам мышей BALB/cJ в возрасте 6-8 недель из Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine) имплантировали подкожно выше правой подмышечной области 5x105 клеток Со1оп2б в объеме 100 мкл. Для имплантации, клетки Со1оп2б суспендировали в PBS Дульбекко, не содержащем кальция и магния, от Lonza (17-512F) . Мышей регистрировали для исследования через десять суток после имплантации при среднем+SEM объеме опухоли 115мм3±7. После случайного распределения в одну из 4 групп (п=10-1б/группу), мышам вводили параллельно один раз в неделю в течение 2 недель
контроль изотипа (группа 1), RMP1-14 (10 мг/кг, группа 2), IgG2a-DTA-l (5 мг/кг, группа 3) или комбинацию RMP1-14 и IgG2a-DTA (10 мг/кг и 5 мг/кг, соответственно, группа 4), как описано в таблице б. Сутки 0 определяли как сутки рандомизации. Группа контроля изотипа включала в себя mIgG2a (Biolegend) при 5 мг/кг и IgG2a крысы (Biolegend) при 10 мг/кг. IgG2a-DTA и его контроль изотипа (mIgG2a) дозировали посредством подкожной инъекции при 5 мг/кг. RMP1-14 и его контроль изотипа (rIgG2a) дозировали посредством внутрибрюшинной инъекции. Объем дозирования составлял 10 мг/мл для всех обработок. Массы тела и объемы опухолей собирали два-три раза в неделю. Индивидуальных животных оценивали как достигших конечной точки, когда объемы опухолей становились равными или превышали 12 00 мм3. Противоопухолевую активность регистрировали на основании изменений медианного времени до конечной точки (ТТЕ) , оцененных посредством анализа выживаемости Каплана-Мейера.
[0333] Комбинированная терапия. Для оценки экспрессии костимулирующих молекул после введения антител против GITR или антител против GITR в комбинации с антителами против PD-1, для суспензий отдельных клеток из целых опухолей и селезенок получали профили проточной цитометрии после 1 дозы антитела против GITR (клон IgG2a-DTA-l) или антитела против PD1 (клон RMP1-14), или антител против GITR+PD1 в комбинации. mIgG2a использовали в качестве контроля. Положительные по LAG3, TIM3 и PD-1 клетки оценивали как процент от общего количества CD3+CD8+ Т-клеток в опухолях и селезенках. Значения р рассчитывали с использованием t-критерия, *р <0,05 и **р <0,005. Результаты
Аминокислотные последовательности мышиной и эталонной V-области
[0334] Продукты RT-ПЦР из клеток гибридомы, экспрессирующих
МАВ1, секвенировали, и эти последовательности в большой степени
(95% или выше) подтверждали на уровне белка с использованием
масс-спектрометра ThermoElectron LTQ-Orbitrap. Затем
вариабельные области тяжелой и легкой цепи МАВ1 клонировали в векторы KaloBios для получения эталонного Fab MABlrFab. Первую
аминокислоту в МАВ1 необходимо было изменить с остатка аспарагина (N) на остаток глутаминовой кислоты (Е), чтобы позволить клонирование в векторы KaloBios для получения эталонного Fab; таким образом, MABlrFab обладает глутаминовой кислотой в первом положении VK. Fab MABlrFab обладает интактными мышиными V-областями из МАВ1, слитыми с человеческими константными областями. В дополнение к MABlrFab, конструировали оптимизированный Fab, MABlopFab. Несколько аминокислотных остатков каркасной области в MABlrFab заменены на человеческие зародышевые остатки в MABlopFab.
Анализ аффинности эталонного и оптимизированного эталонного
Fab
[0335] Человеческие зародышевые остатки, включенные в оптимизированный эталонный MABlopFab в FR1 и FR3, представляют собой остатки, определенные праймерами для ПЦР, использованными для амплификации репертуара человеческих V-сегментов, и таким образом, присутствуют у всех членов библиотек V-областей антитела Humaneered(r). Оптимизированный эталонный Fab сконструирован для оценки того, изменяют или нет любые замены на человеческие зародышевые остатки свойства связывания Fab. Константы аффинности (Ка (1/М с), Kd (1/с) и KD (М) MABlrFab, MABlopFab анализировали с использованием системы ForteBio Octed QK и биосенсоров с высоким уровнем связывания стрептавидина, покрытых биотинилированным hGITR-hFc. По сравнению с MABlrFab, MABlopFab обладал очень сходной Kd, но пятикратным улучшением Ка, указывающим на то, что замены аминокислот в MABlrFab являются допустимыми.
Конструирование библиотеки и отбор Fab антитела Humaneered(r)
[0336] Предварительную библиотеку тяжелой и легкой цепи, и
кассетную библиотеку FR3, семейства зародышевых
последовательностей, ограниченных VH3 и VKIII, получали и подвергали скринингу посредством CLBA. Для VK, клоны, поддерживающие связывание с GITR человека, идентифицированы как из предварительной библиотеки VK (MAB1VK3FE-01) , так и из кассетной библиотеки FR3 (MAB1VK3FR3-01). Для VH, клоны,
поддерживающие связывание с GITR человека, идентифицированы из кассетной библиотеки FR3 (MAB1VH3FR3-01) , но не из предварительной библиотеки VH3 (MAB1VH3FE-01) . Поскольку большинство членов предварительной библиотеки VK И кассетной библиотеки FR3 являлись положительными в CLBA, полный репертуар из этих двух библиотек использовали для конструирования библиотеки полноразмерных цепей VK (MAB1VK3FCL-01) посредством перекрывающейся ПЦР с мутагенным VK CDR2, который кодирует либо исходный мышиный, либо избранный человеческий зародышевый (VKIII L-16) остаток во всех положениях. Ряд положительных по отношению к hGITR клонов идентифицировали из библиотеки VH3FR3 (MAB1VH3FR3-01) посредством CLBA и подтвердили посредством специфической для GITR человека ELISA. Шесть из них использовали для спаривания с библиотекой полноразмерных цепей VK (MAB1VK3FCL-01), для обеспечения экспрессии функционального Fab и скрининга этой библиотеки.
[0337] Поскольку клонов, связывающих hGITR с высокой
аффинностью, не идентифицировали из предварительной библиотеки
VH (MAB1VH3FE-01), затем конструировали вторую предварительную
библиотеку VH3 (MAB1VH3FE-02). Эта библиотека содержит либо
исходный мышиный остаток, либо человеческий зародышевый (VH3 3-
30) остаток в каждом положении последовательностей CDR1 и FR3 из
шести выбранных клонов VHFR3. Множество связывающих hGITR членов
идентифицировали как из библиотеки полноразмерных цепей VK
(MAB1VK3FCL-01 ) , так и из второй предварительной библиотеки VH
(MAB1VH3FE-02). Эти клоны подтверждали посредством
специфического для GITR человека анализа ELISA содержащих Fab супернатантов клеток и ранжировали по ELISA hGITR для титрования аффинности.
[0338] На основании ELISA hGITR для титрования аффинности, четыре клона полноразмерных цепей VK выбраны из библиотеки полноразмерных цепей VK (MABlVK3FcL01), и шесть клонов выбраны из библиотеки MAB1VH3FE-02. Эти шесть клонов VH использовали в качестве остова для конструирования библиотеки полноразмерных цепей VH либо с остатком мышиного МАВ1, либо с наиболее близким
человеческим зародышевым (VH3 3-30) остатком в каждом положении
в CDR2. Этот репертуар полноразмерных цепей VH спаривали с
четырьмя клонами полноразмерных цепей VK для получения конечной
библиотеки полноразмерных цепей человеческого Fab. В CLBA
идентифицировали множество связывающих hGITR клонов,
подтвержденных посредством ELISA с использованием
соответствующего культурального супернатанта в качестве источника Fab. Пять клонов полноразмерных цепей человеческого Fab (МАВ2, МАВЗ, МАВ4, МАВ5 и МАВб) выбраны на основании анализа последовательности ДНК и результатов ELISA hGITR для титрования аффинности.
Тестирование аффинности Fab антитела Humaneered(r) для антигена GITR с использованием анализа ForteBio Octet
[0339] Пять полноразмерных цепей человеческих Fab (МАВ2, МАВЗ, МАВ4, МАВ5 и МАВб) экспрессировали и очищали. Затем кинетику связывания этих человеческих Fab сравнивали с кинетикой оптимизированного эталонного Fab (MABlopFab) с использованием системы ForteBio Octet (цифровые данные обобщены в таблице 3).
Таблица 3. Аффинность Fab для GITR человека
Fab
KD [М]
MABlopFab (а) *
1,25Е-8
МАВ2 (а)
6,84Е-9
МАВЗ (а)
2,98Е-9
MABlopFab (Ь) *
6,59Е-9
МАВ4 (Ь)
2,43Е-9
МАВ5 (Ь)
3,74Е-9
MABlopFab (с) *
1,47Е-8
МАВб (с)
5,94Е-9
*а, Ь, с обозначают три отдельных эксперимента Forte. Результаты представляют собой глобальное соответствие двух повторов образца.
Аминокислотная последовательность антител МАВ2, МАВЗ, МАВ4, МАВ5, МАВб и процент идентичности с человеческой зародышевой
последовательностью
[0340] Аминокислотные последовательности вариабельной области пяти Fab (МАВ2, МАВЗ, МАВ4, МАВ5, МАВб) показаны в таблице 1. Процент идентичности с человеческими зародышевыми последовательностями пяти Fab определяли посредством выравнивания аминокислотных последовательностей Vh и VK против одной зародышевой последовательности (VKIII L16/A27 и VH3 3-30, соответственно; Таблица 4). Остатки в CDRH3 и CDRL3 исключали из расчета для каждой цепи.
Таблица 4. Процент идентичности пяти Fab с человеческими зародышевыми последовательностями
Fab
VKIII L15/A27
VH3 3-30
МАВ 2
95%
86%
90%
МАВЗ
98%
85%
91%
МАВ 4
95%
85%
89%
МАВ 5
95%
83%
89%
МАВб
95%
82%
88%
МАВ 7
95%
85%
89%
МАВ 8
95%
85%
89%
Консервативность антигенного эпитопа GITR человека [0341] Консервативность антигенного эпитопа оценивали посредством непрямого конкурентного ELISA. Все пять Fab блокировали связывание исходного мышиного антитела МАВ1 с GITR человека, что указывает на то, что эти человеческие Fab сохраняют эпитопную специфичность исходного мышиного антитела.
Анализ антигенной специфичности МАВ4 и МАВ5 посредством
ELISA
[0342] Для тестирования того, сохраняется ли антигенная специфичность исходного мышиного антитела МАВ1 в IgG, МАВ2, МАВЗ, МАВ4 и МАВ5, связывание антител с панелью человеческих TNFR тестировали в анализе ELISA. Результаты одного из таких анализов с МАВ4 и МАВ5 (фигура 2С) показывают, что МАВ4 и МАВ5 сохраняют высокую специфичность для GITR, сходную с мышиным антителом МАВ1. Сходные результаты получены с МАВ2, МАВЗ и МАВб.
Связывание антитела с белком GITR человека и яванского макака, но не грызунов, в ELISA
[0343] Исходное мышиное антитело МАВ1 связывается с белком GITR человека и яванского макака, но не грызунов. На фигурах 2А-В показано, что, подобно МАВ1, антитела МАВ4 и МАВ5 являлись способными сходным образом связывать GITR человека и яванского макака, но не GITR грызунов. Сходные результаты получены для МАВб, 7 и 8.
[0344] Аффинность связывания антител-агонистов GITR МАВ4 и МАВ 5 для GITR человека (hGITR) и яванского макака (cGITR), определяли посредством анализа Biacore. См. таблицу 5. Моноклональные антитела МАВ4 и МАВ5 связывают GITR человека с субнаномолярной аффинностью связывания (KD) . Антитела МАВ4 и МАВ5 связывают GITR яванского макака наномолярной аффинностью связывания, приблизительно в 2-3 более низкой, чем аффинность связывания для GITR человека. Агонистические антитела против GITR по изобретению избирательно связываются с GITR человека и яванского макака в ряде биохимических анализов, включая анализы проточной цитометрии, ELISA, Biacore и анализ на чипах Protagen(tm).
[0345] Моноклональное антитело MAB7 связывается с CD4+ Т-клетками человека, так же как яванского макака. Анализ FACS выделенных РВМС яванского макака или человека показал, что МАВ7 связывается с выделенными CD4+ Т-клетками. Кроме того, эксперименты FACS показали повышающую регуляцию GITR (посредством связывания МАВ7) и CD25 после активации РВМС посредством CD3/CD28 (CD4+ Т-клетки). (данные не представлены)
Функциональная активность антител в анализах репортерных
генов и в анализах клеток
[034 6] Антитела анализировали в анализах репортерных генов по функциональной активности (фигура 3) . Каждое из IgG МАВ4, МАВ5, МАВ7 и МАВ8 индуцирует активность NFKB при перекрестном сшивании, на уровнях, сходных с лигандом GITR (GITR-L). См. фигуры 3A-D. Сходные результаты получены с МАВ2, МАВЗ, и МАВб (данные не представлены).
[0347] МАВ7 конкурирует с лигандом GITR человека за связывание с экспрессирующей GITR человека стабильной линией клеток. Анализы конкуренции проводили в наборах из трех повторов значений, анализ конкуренции FACS показывает ингибирование связывания лиганда. См. фигуру 2D.
[0348] Для подтверждения функциональной активности по отношению к эндогенному GITR, антитела конъюгировали с бусинами и инкубировали с очищенными меченными CFSE РВМС человека. МАВ7 индуцирует усиление пролиферации как CD4+ Т-клеток (фигура 4А) , так и CD8+ Т-клеток (фигура 4В) по сравнением с антителом для контроля изотипа. Это усиление пролиферации сопровождалось также увеличением секреции нескольких цитокинов, включая IFNy (Фигура 4С), TNFa, IL-10 и IL-13 (не показано). Сходные результаты получены с МАВ4, МАВ5 (не показано). Авторам настоящего изобретения удалось показать, что усиление пролиферации и продукции IFNyD индуцированные посредством МАВ7, зависели от присутствия агонистических антител против CD3 и против CD2 8 на бусинах. При исключении этих костимулирующих антител, МАВ не оказывал агонистических эффектов на CD4+ или CD8+ Т-клетки. Сходные результаты получены с МАВ2, МАВЗ, МАВ4; МАВ5 и МАВб.
[0349] Обнаружено также, что МАВ7 обладает способностью индуцировать передачу сигнала FcgRIIIa (показана корреляция с активностью ADCC) в анализе in vitro, когда присутствуют высокие уровни GITR. Для клеток Daudi-hGITR, инкубированных с МАВ7 или контрольным АЬ и с линией клеток Jurkat-V158, показали, что МАВ7 является способным индуцировать передачу сигнала FcgRIIIa в анализе in vitro, и что способность МАВ7 индуцировать передачу сигнала FcgRIIIa коррелирует с уровнем рецептора,
экспрессированным на поверхности клеток Daudi (т.е. более высокие уровни рецептора эквивалентны более сильной индукции передачи сигнала FcgRIIIa). См. фигуру 5.
[0350] hGITR экспрессируется на Т-клетках и является функциональным у мышей с нокином hGITR-hGITRL. Спленоциты выделяли из мышей дикого типа или мышей с нокином hGITR-hGITRL и культивировали либо без стимуляции, либо со стимуляцией с использованием антител a-CD3 и a-CD28 в течение 24, 48, 72 или 96 часов. Затем клетки окрашивали с использованием конъюгированных с флуорофором антител и анализировали посредством проточной цитометрии, показывая, что GITR человека экспрессируется, и костимуляция приводит к усилению профиля экспрессии GITR у мышей дикого типа или трансгенных мышей. Для спленоцитов, выделенных из мышей с нокином hGITR-hGITRL, показали индукцию экспрессии GITR в ответ на костимуляцию в культуре (фигура 6А). МАВ7 эффективно связывается с hGITR, экспрессированным на CD8+ клетках (фигура 6В); и связывание МАВ7 со стимулированными Т-клетками коррелирует с увеличенной активацией Т-клеток, как измерено по окрашиванию pIKK (фигура 6С) и маркеру активации Т-клеток CD25+ (фигура 6D).
[0351] МАВ7 является функциональным in vivo. Мышей с двойным нокином hGITR-hGITRL с развившимися опухолями Со1оп2б обрабатывали с использованием однократной дозы носителя (п=8/временную точку) или антитела МАВ7 (п=10/временную точку), как описано выше. Опухоли измеряли дважды в неделю, и объем опухоли рассчитывали с использованием уравнения (LxW2)/2. Для обработанных МАВ животных показана задержка роста опухолей Со1оп2б. Через трое суток после обработки, цельную кровь (фигуры 7В-7С) и опухоли (фигуры 7D-7E) собирали и анализировали посредством проточной цитометрии по экспрессии hGITR на клеточной поверхности иммуноцитов. Результаты позволяют предполагать занятость и сбрасывание hGITR, приводящие к уменьшению количества hGITR в группах обработки для регуляторных Т-клеток и Т-клеток помощников как в крови, так и в опухолях (*р <0,05, ****р <0,00005).
[0352] МАВ7 вызывает противоопухолевый иммунный ответ
против опухолей Colon26 in vivo. Мышей с двойным нокином hGITR-hGITRL с развившимися опухолями Со1оп2б обрабатывали с использованием однократной дозы носителя (п=8/временную точку) или МАВ7 (п=10/временную точку). На фигуре 8А изображены результаты для 3 суток после дозирования, показывающие, что количество Трег уменьшено у животных после обработки. На фигурах 8В-8С изображены результаты для 15 суток после дозирования, показывающие увеличенное количество лимфоцитов (8В) и увеличенное количество активированных CD8+ Т-клеток (8С), присутствующих в участке опухоли после обработки. Абсолютное количество клеток нормализовали по размеру опухоли, чтобы учитывать значительные различия размера опухолей между группами носителя и обработки МАВ7. Результаты для МАВ7 позволяют предполагать, что обработка приводит к увеличению соотношения Тэфф/Трег у подвергнутых обработке животных, как определено по общему количеству внутриопухолевых активированных CD8+ Т-клеток по сравнению с CD4+ F0XP3+ Трег. См. фигуру 8D. Кроме того, результаты анализов спленоцитов для очищенных CD8+ Т-клеток, инкубированных с клетками опухолей Colon2 6 ex-vivo, и измерения ответа CTL с использованием анализа ELISPOT IFNg, позволяют предполагать увеличенный опухолеспецифический ответ IFNg в CD8+ Т-клетках у животных после обработки МАВ7. (*р <0,05, ***р <0,0005). См. фигуру 8Е.
[0353] Обработка мышей с использованием АЬ против mGITR приводит к повышающей регуляции экспрессии PD-1 в опухолях и селезенке. Мышей с развившимися опухолями Со1оп2б обрабатывали с использованием двух доз контрольного антитела или мышиного антитела против mGITR. На фигуре 9А9С изображены результаты, показывающие, что экспрессия PD-1 подвергается повышающей регуляции на CD8+ Т-клетках в опухолях Со1оп2б, так же как в селезенке, после обработки суррогатным антителом против GITR, IgG2a-DTA-l.
[0354] Комбинации антител против GITR и PD-1 обеспечивают преимущество в отношении выживаемости по сравнению с контролем для изотипа. Антитела против GITR (DTA-1) и против PD-1 (RMP1-14) вводили отдельно и в комбинации мышам с развившимися
опухолями Colon2 6. См. фигуру 10. Для комбинированного введения показано значимое преимущество в отношении выживаемости по сравнению с контролем для изотипа (***р <0,0005, попарное сравнение с использованием критерия Гехана-Бреслоу-Вилкоксона). Для монотерапии антителом против mGITR (IgG2a-DTA-l) показано значимое преимущество в отношении выживаемости по сравнению с контролем для изотипа (*р <0,05 в попарном сравнении с использованием критерия Гехана-Бреслоу-Вилкоксона). Данные показывают, что комбинация IgG2a-DTA-l и RMP1-14 обеспечивает статистически значимое преимущество в отношении выживаемости по сравнению с обработкой контролем для изотипа с медианным ТТЕ более 42 суток (медианное ТТЕ не достигнуто) (Р <0,0005) по сравнению с 22 сутками для группы обработки контролем для изотипа. Примечательно, что для 3/10 животных достигнута полная регрессия (CR) , для 2/10 животных достигнуто стабильное заболевание (SD) . Монотерапия IgG2a-DTA-l приводила к медианному ТТЕ 30,5 суток (Р <0,05), где для 3/10 животных достигнуто стабильное заболевание (SD) . Медианная выживаемость в группе после обработки RMP1-14 составляла 24 суток, что не являлось статистически значимо отличным от группы обработки контролем для изотипа. Получали графики Каплана-Мейера и статистические расчеты проводили с использованием программного обеспечения Prism (программного обеспечения GraphPad). Сравнения групп осуществляли посредством попарного сравнения с использованием критерия Гехана-Бреслоу-Вилкоксона. Для всех статистических оценок уровень значимости устанавливали на р < 0,05. Указана значимость по сравнению с контрольной группой носителя. Стабильное заболевание определяли как 3 последовательных измерения объема опухолей с изменением объема опухолей на 10% или менее.
Таблица 6: Комбинированная терапия 1Р=внутрибрюшинно; ЗС=подкожно
Групп а
АЫ (5 мг/кг, SC)
Ab2
п/группу
mIgG2a
rIgG2a (10 мг/кг, IP)
n=10
RMP1-14 (10 мг/кг, IP) mIgG2a
m!gG2a (5 мг/кг, SC)
n=16
DTA-1
rIgG2a (10 мг/кг, IP)
n=10
DTA-1
RMP1-14 (10 мг/кг, IP)
n=10
[0355] Экспрессию костимулирующих молекул оценивали в опухолях после введения антитела против GITR или антитела против GITR в комбинации с антителом против PD-1. См. фигуру 11. Результаты профилей проточной цитометрии суспензий отдельных клеток для целых опухолей и селезенок после 1 дозы антитела против GITR или антитела против PD1, или антител против GITR+PD1 в комбинации показали увеличенную экспрессию LAG3, TIM3 и PD-1 на СБ8+Т-клетках в опухолях Со1оп2б после обработки антителом против GITR, против PD-1 и в комбинации. Для однократной комбинированной дозы показана повышающая регуляция экспрессии PD-1 в CD8+ клетках селезенки.
ВКЛЮЧЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ССЫЛКИ
[0356] Полное содержание всех публикаций, патентов и номеров доступа, упомянутых в настоящем документе, таким образом, приведено в качестве ссылки, как если бы было конкретно и индивидуально указано, что содержание каждой индивидуальной публикации или патента приведено в качестве ссылки.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
[0357] Несмотря на обсуждение конкретных вариантов осуществления рассматриваемого изобретения, вышеуказанное описание является иллюстративным, а не ограничивающим. Множество вариантов по изобретению станут очевидными специалистам в данной области после обзора этого описания и нижеследующей формулы изобретения. Полный объем изобретения следует определять по отношению к пунктам формулы изобретения, вместе с полным объемом их эквивалентов и описания, вместе с такими вариантами.
2017-05-04-06-26-34-186.txt СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Brogdon, Jennifer
Cipolletta, Daniela Dranoff, Glenn Knee., Deborah Wang, Fei
<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА И ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ
<130> PAT056489-WO-PCT
<150> 62/061,644 <151> 2014-10-08
<150> 62/220,764 <151> 2015-09-18
<150> 62/198,673 <151> 2015-07-29
<160> 113
<170> Patentln версии 3.5
<210> 1
<211> 241
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Gin His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
15 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gin Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gin Pro Glu Phe His
65 70 75 80
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gin Gly Val Gin Ser Gin Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gin Cys
100 105 110
He Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gin Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro
130 135 140
Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala
145 150 155 160
Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys
165 170 175
Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gin Leu Gly Leu His He Trp Gin Leu
180 185 190
Arg Ser Gin Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gin Leu Leu Leu Glu Val
195 200 205
Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gin Phe Pro Glu Glu Glu
210 215 220
Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp
225 230 235 240
Val
<210> 2
<211> 255
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Met Ala Gin His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
15 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gin Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gin Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gin Gly Val Gin Ser Gin Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gin Cys
100 105 110
He Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Cys Trp Arg Cys Arg Arg Arg Pro Lys Thr
130 135 140
Pro Glu Ala Ala Ser Ser Pro Arg Lys Ser Gly Ala Ser Asp Arg Gin
145 150 155 160
Arg Arg Arg Gly Gly Trp Glu Thr Cys Gly Cys Glu Pro Gly Arg Pro
165 170 175
Pro Gly Pro Pro Thr Ala Ala Ser Pro Ser Pro Gly Ala Pro Gin Ala
180 185 190
Ala Gly Ala Leu Arg Ser Ala Leu Gly Arg Ala Leu Leu Pro Trp Gin
195 200 205
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Gin Lys Trp Val Gin Glu Gly Gly Ser Asp Gin Arg Pro Gly Pro Cys
210 215 220
Ser Ser Ala Ala Ala Ala Gly Pro Cys Arg Arg Glu Arg Glu Thr Gin
225 230 235 240
Ser Trp Pro Pro Ser Ser Leu Ala Gly Pro Asp Gly Val Gly Ser
245 250 255
<210> 3
<211> 234
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Ala Gin His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
15 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gin Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gin Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gin Gly Val Gin Ser Gin Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gin Cys
100 105 110
He Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gin Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro
2017-05-04-06-26-34-186.txt
130 135 140
Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala
145 150 155 160
Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys
165 170 175
Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gin Leu Gly Leu His He Trp Gin Leu
180 185 190
Arg Lys Thr Gin Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala
195 200 205
Arg Ser Cys Gin Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu
210 215 220
Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val 225 230
<210> 4 <211> 39 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 4
Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys
15 10 15
Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu Glu
20 25 30
Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys 35
<210> 5 <211> 40 <212> PRT
2017-05-04-06-26-34-186.txt <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность <400> 5
Met Cys Val Gin Pro Glu Phe His Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr
15 10 15
Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro Gly Gin Gly Val Gin Ser Gin Gly
20 25 30
Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gin Cys 35 40
<210> 6 <211> 121 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 6
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Val Met
50 55 60
Ala Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 7 <211> 107 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 7
Glu He Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly He Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gin Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105
<210> 8
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность <400> 8
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Ala Ser Leu Met
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 9 <211> 107 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 9
Glu He Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn
2017-05-04-06-26-34-186.txt
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gin Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105
<210> 10 <211> 121 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 10
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ser Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Met
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность <400> 11
His His His His His His 1 5
<210> 12 <211> 121 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 12
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ser Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Met
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность <400> 13
Ala Ala Gly Ala Ser His His His His His His 15 10
<210> 14 <211> 121 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 14
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ser Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Met
50 55 60
Ala Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность <400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser 1 5
<210> 16
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)..(1)
<223> (E/Q)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (14)..(14)
<223> (P/S)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (48)..(48)
<223> (L/V)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (60)..(60)
<223> (А/Т)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (61)..(61)
<223> (A/S)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (63)..(63)
<223> (L/V)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (65)..(65)
<223> (A/G)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (97)..(97)
<223> (K/R)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (98)..(98)
<223> (H/N)
<400> 16
Хаа Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Xaa Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Met
2017-05-04-06-26-34-186.txt 55 60
Xaa Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Xaa Xaa Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (27)..(27)
<223> (E/Q)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (33)..(33)
<223> (L/V)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (39)..(39)
<223> (K/R)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (60)..(60)
<223> (D/A)
<400> 17
Glu He Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Xaa Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Xaa Ala Trp Tyr Gin Gin Xaa Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly He Pro Xaa Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gin Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105
<210> 18 <211> 15 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
15 10 15
<210> 19
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 19
gcgtctagaa ctggatggtg ggaagatgg
<210> 20 <211> 330 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
65 70 75 80
Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu
15 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 22
Ser Tyr Gly Val Asp 1 5
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Val Met Ala
15 10 15
<210> 24 <211> 16 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 24
Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Ala Ser Leu Met Gly
15 10 15
<210> 25 <211> 16 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 25
Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Met Gly
15 10 15
<210> 26 <211> 16 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 26
Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Met Gly
15 10 15
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
2017-05-04-06-26-34-186.txt <223> синтетическая последовательность
<400> 27
Val Не Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Met Ala
15 10 15
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (11)..(11)
<223> (A/T)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (12)..(12)
<223> (A/S)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (14)..(14)
<223> (L/V)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (16)..(16)
<223> (A/G)
<400> 28
Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Met Xaa
15 10 15
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr 15 10
<210> 30 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 30
Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ser Asn Val Ala 15 10
<210> 31 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 31
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala 15 10
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> (E/Q)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)..(10)
<223> (L/V)
<400> 32
Arg Ala Ser Xaa Ser Val Ser Ser Asn Xaa Ala 15 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 33
Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 34
Gly Gin Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5
<210> 35 <211> 30 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 35
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20 25 30
<210> 36 <211> 30 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 36
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ser Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20 25 30
<210> 37
<211> 30
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)..(1)
<223> (E/Q)
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (14)..(14)
<223> (P/S)
<400> 37
Xaa Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Xaa Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20 25 30
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность <400> 38
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 15 10
<210> 39 <211> 14 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 39
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 15 10
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (13)..(13)
<223> (L/V)
<400> 40
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa Gly 15 10
<210> 41
<211> 32
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<220>
<221> ВАРИАНТ <222> (32)..(32) <223> (K/R)
<400> 41
Arg Phe Thr Не Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin
15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Xaa
20 25 30
<210> 42 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 42
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10
<210> 43 <211> 23 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 43
Glu He Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность <400> 44
Trp Туг Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He Tyr
15 10 15
<210> 45 <211> 15 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 45
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He Tyr
15 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (5)..(5)
<223> (K/R)
<400> 46
Trp Tyr Gin Gin Xaa Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He Tyr
15 10 15
<210> 47
<211> 32
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
Gly He Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
15 10 15
Leu Thr He Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 48 <211> 32 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 48
Gly He Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
15 10 15
Leu Thr He Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> (A/D)
<400> 49
Gly He Pro Xaa Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
15 10 15
Leu Thr He Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 50
<210> 51
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 51
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 15 10
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt ctccctcagc agctatggtg tggactgggt tcgccaggct 120
ccaggaaagg gtctggagtg ggtgggagtt atatggggtg gtggaggcac atattatgct 180
tcttctgtca tggccagatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gccgtgtatt actgcgccaa acatgcctat 300
ggccatgatg gcggctttgc tatggattat tggggccagg gtacccttgt gaccgtgagc 360
tea 363
<210> 52 <211> 321 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 52
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgttt ctccaggaga ctctcctgca gggccagtga gagtgttagc agtaatgtag cctggtacca ggccaggcac ccaggctcct catctaeggg gcatccaacc gggccactgg
aagagccacc 60 gcagagacct 120 catcccagcc 180
2017-05-04-06-26-34-186.txt
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 240
gaagattttg cagtgtacta ctgcggccag agctatagct atccatttac ctttggccag 300
<210> 53
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 53
ggcaccaagc ttgaaattaa g 321
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt ctccctcagc agctatggtg tggactgggt tcgccaggct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtt atatggggtg gtggaggcac atattatact 180
gcttctctca tgggcagatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gccgtgtatt actgcgccaa acatgcctat 300
ggccatgatg gcggctttgc tatggattat tggggccagg gtacccttgt gaccgtgagc 360
<210> 54
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 54
tea 363
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggecagtea gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctaeggg gcatccaacc gggccactgg catcccagac 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 240
gaagattttg cagtttacta ctgcggccag agctatagct atccatttac ctttggccag 300
ggcaccaagc ttgaaattaa a 321
<210> 55 <211> 363 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 55
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttagttcagt ctggggggtc tcctgtgcag cctctggatt ctccctcagc agctatggtg tggactgggt ccaggaaagg gtctggagtg ggtgggagtt atatggggtg gtggaggcac tcttctctca tgggcagatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gccgtgtatt actgcgccaa ggccatgatg gcggctttgc tatggattat tggggccagg gtacccttgt tea
cctgagactc 60
tcgccaggct 120
atattatgct 180
gctgtatctg 240
acatgcctat 300
gaccgtgagc 360
363
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttagttcagt ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt ctccctcagc agctatggtg tggactgggt tcgccaggct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtt atatggggtg gtggaggcac atattatact 180
tcttctctca tgggcagatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gccgtgtatt actgcgccaa acatgcctat 300
ggccatgatg gcggctttgc tatggattat tggggccagg gtacccttgt gaccgtgagc 360
tea 363
<210> 57 <211> 363 <212> ДНК
2017-05-04-06-26-34-186.txt <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность <400> 57
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttagttcagt ctggggggtc tcctgtgcag cctctggatt ctccctcagc agctatggtg tggactgggt ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtt atatggggtg gtggaggcac tcttctctca tggccagatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gccgtgtatt actgcgccaa ggccatgatg gcggctttgc tatggattat tggggccagg gtacccttgt tea
cctgagactc 60
tcgccaggct 120
atattatact 180
gctgtatctg 240
acatgcctat 300
gaccgtgagc 360
363
aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 60
ttgagctgea aggccagtga gaatgtggat acttttgtat cctggtatca acagaaacca 120
gaccactctc ctaaactact gatataeggg gcatccaacc ggtacactgg ggtccccgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagaccttg cagattatca ctgtggacag agttacagct atccattcac gtteggcteg 300
gggacaaagt tggaaataaa a 321
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
Asn He Val Met Thr Gin Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
15 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Phe
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp His Ser Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Val Gin Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gin Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
<210> 60
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 60
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acttgcactg tctctgggtt ttcattaagg agctatggtg tagactgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtt atatggggtg gtggaggcac aaattataat 180
tcagctctca tggccaaact gagtatcagc aaagacaagt ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccaa acatgcctat 300
ggtcacgacg gcggttttgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tea 363
<210> 61 <211> 121 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 61
Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin
15 10 15
Ser Leu Ser He Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ala Lys Leu Ser He Ser Lys Asp Lys Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 62
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ala
15 10 15
<210> 63 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 63
Lys Ala Ser Glu Asn Val Asp Thr Phe Val Ser 15 10
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 64
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5
<210> 65 <211> 451 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 65
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
2017-05-04-06-26-34-186.txt
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Val Met
50 55 60
Ala Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
2017-05-04-06-26-34-186.txt
245 250 255
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He
325 330 335
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
<210> бб <211> 214 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> бб
Glu Не Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly He Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gin Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 67
<211> 1353
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
2017-05-04-06-26-34-186.txt
cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg acccagaggt gaagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagtac 900
aacagcacct acagggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaggaataca agtgcaaggt ctccaacaag gccctgccag cccccatcga aaagaccatc 1020
agcaaggcca agggccagcc acgggagccc caggtgtaca ccctgccccc ctcccgggag 1080
gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccca 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagtccagg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
<210> 68
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 68
acccagaaga gcctgagcct gtcccccggc aag 1353
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgttt ctccaggaga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtga gagtgttagc agtaatgtag cctggtacca gcagagacct 120
ggccaggcac ccaggctcct catctaeggg gcatccaacc gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 240
gaagattttg cagtgtacta ctgcggccag agctatagct atccatttac ctttggccag 300
ggcaccaagc ttgaaattaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agegacgage agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gectgetgaa caacttctac 420
ccccgggagg ecaaggtgea gtggaaggtg gacaacgccc tgeagagegg caacagccag 480
gagagegtea ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gectgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggegagt gc 642
<210> 69 <211> 451 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 69
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Ala Ser Leu Met
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
2017-05-04-06-26-34-186.txt
165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He
325 330 335
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
2017-05-04-06-26-34-186.txt
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys 450
<210> 70 <211> 214 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 70
Glu He Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gin Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 71 <211> 1353 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 71
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt ctccctcagc agctatggtg tggactgggt tcgccaggct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtt atatggggtg gtggaggcac atattatact 180
gcttctctca
tgggcagatt
caccatctcc
agagacaatt
ccaagaacac
gctgtatctg
240
caaatgaaca
gcctgagagc
tgaggacacg
gccgtgtatt
actgcgccaa
acatgcctat
300
ggccatgatg
gcggctttgc
tatggattat
tggggccagg
gtacccttgt
gaccgtgagc
360
tcagctagca
ccaagggccc
cagcgtgttc
cccctggccc
ccagcagcaa
gagcaccagc
420
ggcggcacag
ccgccctggg
ctgcctggtg
aaggactact
tccccgagcc
cgtgaccgtg
480
tcctggaaca
gcggagccct
gacctccggc
gtgcacacct
tccccgccgt
gctgcagagc
540
agcggcctgt
acagcctgtc
cagcgtggtg
acagtgccca
gcagcagcct
gggcacccag
600
acctacatct
gcaacgtgaa
ccacaagccc
agcaacacca
aggtggacaa
gagagtggag
660
cccaagagct
gcgacaagac
ccacacctgc
cccccctgcc
cagccccaga
gctgctgggc
720
ggaccctccg
tgttcctgtt
cccccccaag
cccaaggaca
ccctgatgat
cagcaggacc
780
cccgaggtga
cctgcgtggt
ggtggacgtg
agccacgagg
acccagaggt
gaagttcaac
840
tggtacgtgg
acggcgtgga
ggtgcacaac
gccaagacca
agcccagaga
ggagcagtac
900
aacagcacct
acagggtggt
gtccgtgctg
accgtgctgc
accaggactg
gctgaacggc
960
aaggaataca
agtgcaaggt
ctccaacaag
gccctgccag
cccccatcga
aaagaccatc
1020
agcaaggcca
agggccagcc
acgggagccc
caggtgtaca
ccctgccccc
ctcccgggag
1080
gagatgacca
agaaccaggt
gtccctgacc
tgtctggtga
agggcttcta
ccccagcgac
1140
atcgccgtgg
agtgggagag
caacggccag
cccgagaaca
actacaagac
caccccccca
1200
gtgctggaca
gcgacggcag
cttcttcctg
tacagcaagc
tgaccgtgga
caagtccagg
1260
tggcagcagg
gcaacgtgtt
cagctgcagc
gtgatgcacg
aggccctgca
caaccactac
1320
acccagaaga
gcctgagcct
gtcccccggc
aag
1353
<210> 72 <211> 642 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 72
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
2017-05-04-06-26-34-186.txt
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctaeggg gcatccaacc gggccactgg catcccagac 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 240
gaagattttg cagtttacta ctgcggccag agctatagct atccatttac ctttggccag 300
ggcaccaagc ttgaaattaa aegtaeggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agegacgage agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gectgetgaa caacttctac 420
ccccgggagg ecaaggtgea gtggaaggtg gacaacgccc tgeagagegg caacagccag 480
gagagegtea ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gectgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggegagt gc 642
<210> 73 <211> 451 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 73
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ser Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Met
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
2017-05-04-06-26-34-186.txt
85 90 95
Lys His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
2017-05-04-06-26-34-186.txt
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He
325 330 335
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys 450
<210> 74
<211> 1353
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
gaggtgcagc
tggtggagtc
cgggggaggc
ttagttcagt
ctggggggtc
cctgagactc
tcctgtgcag
cctctggatt
ctccctcagc
agctatggtg
tggactgggt
tcgccaggct
120
ccaggaaagg
gtctggagtg
ggtgggagtt
atatggggtg
gtggaggcac
atattatgct
180
tcttctctca
tgggcagatt
caccatctcc
agagacaatt
ccaagaacac
gctgtatctg
240
caaatgaaca
gcctgagagc
tgaggacacg
gccgtgtatt
actgcgccaa
acatgcctat
300
ggccatgatg
gcggctttgc
tatggattat
tggggccagg
gtacccttgt
gaccgtgagc
360
tcagctagca
ccaagggccc
cagcgtgttc
cccctggccc
ccagcagcaa
gagcaccagc
420
ggcggcacag
ccgccctggg
ctgcctggtg
aaggactact
tccccgagcc
cgtgaccgtg
480
tcctggaaca
gcggagccct
gacctccggc
gtgcacacct
tccccgccgt
gctgcagagc
540
agcggcctgt
acagcctgtc
cagcgtggtg
acagtgccca
gcagcagcct
gggcacccag
600
acctacatct
gcaacgtgaa
ccacaagccc
agcaacacca
aggtggacaa
gagagtggag
660
cccaagagct
gcgacaagac
ccacacctgc
cccccctgcc
cagccccaga
gctgctgggc
720
ggaccctccg
tgttcctgtt
cccccccaag
cccaaggaca
ccctgatgat
cagcaggacc
780
cccgaggtga
cctgcgtggt
ggtggacgtg
agccacgagg
acccagaggt
gaagttcaac
840
tggtacgtgg
acggcgtgga
ggtgcacaac
gccaagacca
agcccagaga
ggagcagtac
900
aacagcacct
acagggtggt
gtccgtgctg
accgtgctgc
accaggactg
gctgaacggc
960
aaggaataca
agtgcaaggt
ctccaacaag
gccctgccag
cccccatcga
aaagaccatc
1020
agcaaggcca
agggccagcc
acgggagccc
caggtgtaca
ccctgccccc
ctcccgggag
1080
gagatgacca
agaaccaggt
gtccctgacc
tgtctggtga
agggcttcta
ccccagcgac
1140
atcgccgtgg
agtgggagag
caacggccag
cccgagaaca
actacaagac
caccccccca
1200
gtgctggaca
gcgacggcag
cttcttcctg
tacagcaagc
tgaccgtgga
caagtccagg
1260
tggcagcagg
gcaacgtgtt
cagctgcagc
gtgatgcacg
aggccctgca
caaccactac
1320
acccagaaga
gcctgagcct
gtcccccggc
aag
1353
<210> 75 <211> 451 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность <400> 75
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ser Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Met
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He
325 330 335
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys 450
<210> 76
<211> 1353
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
2017-05-04-06-26-34-186.txt
cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg acccagaggt gaagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagtac 900
aacagcacct acagggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaggaataca agtgcaaggt ctccaacaag gccctgccag cccccatcga aaagaccatc 1020
agcaaggcca agggccagcc acgggagccc caggtgtaca ccctgccccc ctcccgggag 1080
gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccca 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagtccagg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaaga gcctgagcct gtcccccggc aag 1353
<210> 77 <211> 451 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 77
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ser Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Met
50 55 60
Ala Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
2017-05-04-06-26-34-186.txt
85 90 95
Lys His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
2017-05-04-06-26-34-186.txt
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He
325 330 335
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys 450
<210> 78
<211> 1353
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
gaggtgcagc
tggtggagtc
cgggggaggc
ttagttcagt
ctggggggtc
cctgagactc
tcctgtgcag
cctctggatt
ctccctcagc
agctatggtg
tggactgggt
tcgccaggct
120
ccaggaaagg
gtctggagtg
gctgggagtt
atatggggtg
gtggaggcac
atattatact
180
tcttctctca
tggccagatt
caccatctcc
agagacaatt
ccaagaacac
gctgtatctg
240
caaatgaaca
gcctgagagc
tgaggacacg
gccgtgtatt
actgcgccaa
acatgcctat
300
ggccatgatg
gcggctttgc
tatggattat
tggggccagg
gtacccttgt
gaccgtgagc
360
tcagctagca
ccaagggccc
cagcgtgttc
cccctggccc
ccagcagcaa
gagcaccagc
420
ggcggcacag
ccgccctggg
ctgcctggtg
aaggactact
tccccgagcc
cgtgaccgtg
480
tcctggaaca
gcggagccct
gacctccggc
gtgcacacct
tccccgccgt
gctgcagagc
540
agcggcctgt
acagcctgtc
cagcgtggtg
acagtgccca
gcagcagcct
gggcacccag
600
acctacatct
gcaacgtgaa
ccacaagccc
agcaacacca
aggtggacaa
gagagtggag
660
cccaagagct
gcgacaagac
ccacacctgc
cccccctgcc
cagccccaga
gctgctgggc
720
ggaccctccg
tgttcctgtt
cccccccaag
cccaaggaca
ccctgatgat
cagcaggacc
780
cccgaggtga
cctgcgtggt
ggtggacgtg
agccacgagg
acccagaggt
gaagttcaac
840
tggtacgtgg
acggcgtgga
ggtgcacaac
gccaagacca
agcccagaga
ggagcagtac
900
aacagcacct
acagggtggt
gtccgtgctg
accgtgctgc
accaggactg
gctgaacggc
960
aaggaataca
agtgcaaggt
ctccaacaag
gccctgccag
cccccatcga
aaagaccatc
1020
agcaaggcca
agggccagcc
acgggagccc
caggtgtaca
ccctgccccc
ctcccgggag
1080
gagatgacca
agaaccaggt
gtccctgacc
tgtctggtga
agggcttcta
ccccagcgac
1140
atcgccgtgg
agtgggagag
caacggccag
cccgagaaca
actacaagac
caccccccca
1200
gtgctggaca
gcgacggcag
cttcttcctg
tacagcaagc
tgaccgtgga
caagtccagg
1260
tggcagcagg
gcaacgtgtt
cagctgcagc
gtgatgcacg
aggccctgca
caaccactac
1320
acccagaaga
gcctgagcct
gtcccccggc
aag
1353
<210> 79 <211> 7 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность <400> 79
Gly Phe Ser Leu Arg Ser Tyr 1 5
<210> 80
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 80
Trp Gly Gly Gly Gly 1 5
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 81
Ser Glu Asn Val Asp Thr Phe 1 5
<210> 82
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 82
Gly Ala Ser 1
<211> 6 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 83
Ser Туг Ser Туг Pro Phe 1 5
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 84
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 1 5
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 85
Ser Glu Ser Val Ser Ser Asn 1 5
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 86
Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (2)..(2)
<223> (E/Q)
<400> 87
Ser Xaa Ser Val Ser Ser Asn 1 5
<210> 88 <211> 56 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 88
Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Gly Thr
15 10 15
Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg
20 25 30
Asp Tyr Pro Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val
35 40 45
Gin Pro Glu Phe His Cys Gly Asp 50 55
<210> 89 <211> 98 <212> PRT
2017-05-04-06-26-34-186.txt <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность <400> 89
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val He Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys
<210> 90 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 90
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10
<210> 91 <211> 15 <212> PRT
2017-05-04-06-26-34-186.txt <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность <400> 91
Туг Phe Asp Туг Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
15 10 15
<210> 92 <211> 95 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 92
Glu He Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 93
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 15 10
<210> 94 <211> 12 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 94
Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 15 10
<210> 95
<211> 37
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 95
gggtctagac accatggctg tcttggggct gctcttc 37
<210> 96
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 96
gcgtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac 39
<210> 97
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 97
gggtctagac accatggagw cacakwctca ggtctttrta
<210> 98 <211> 88 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 98
Glu He Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85
<210> 99 <211> 121 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 99
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ser Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Met
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 100 <211> 451 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 100
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ser Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Met
2017-05-04-06-26-34-186.txt
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg His Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
2017-05-04-06-26-34-186.txt
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He
325 330 335
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys 450
<210> 101
gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagt ccggcggctc tctgagactg 60
tcttgcgctg cctccggctt ctccctgtcc tcttacggcg tggactgggt gcgacaggcc 120
cctggcaagg gcctggaatg ggtgggagtg atctggggcg gaggcggcac ctactacgcc 180
tcttccctga tgggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag acacgcctac 300
ggccacgacg gcggcttcgc catggattat tggggccagg gcaccctggt gacagtgtcc 360
<210> 102
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 102
tec 363
gagatcgtga tgacccagtc ccccgccacc ctgtctgtgt ctcccggcga gagagccacc 60
ctgagctgea gagcctccga gtccgtgtcc tccaacgtgg cctggtatca gcagagacct 120
ggtcaggccc ctcggctgct gatctaegge gcctctaacc gggccaccgg catccctgcc 180
agattctccg gctccggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatctcccg gctggaaccc 240
gaggacttcg ccgtgtacta ctgcggccag tcctactcat accccttcac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa g 321
<210> 103
<211> 1353
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 103 gaggtgcagc
tggtggaatc
tggcggcgga
ctggtgcagt
ccggcggctc
tctgagactg
tcttgcgctg
cctccggctt
ctccctgtcc
tcttacggcg
tggactgggt
gcgacaggcc
120
cctggcaagg
gcctggaatg
ggtgggagtg
atctggggcg
gaggcggcac
ctactacgcc
180
tcttccctga
tgggccggtt
caccatctcc
cgggacaact
ccaagaacac
cctgtacctg
240
cagatgaact
ccctgcgggc
cgaggacacc
gccgtgtact
actgcgccag
acacgcctac
300
ggccacgacg
gcggcttcgc
catggattat
tggggccagg
gcaccctggt
gacagtgtcc
360
tccgctagca
ccaagggccc
aagtgtgttt
cccctggccc
ccagcagcaa
gtctacttcc
420
ggcggaactg
ctgccctggg
ttgcctggtg
aaggactact
tccccgagcc
cgtgacagtg
480
tcctggaact
ctggggctct
gacttccggc
gtgcacacct
tccccgccgt
gctgcagagc
540
agcggcctgt
acagcctgag
cagcgtggtg
acagtgccct
ccagctctct
gggaacccag
600
acctatatct
gcaacgtgaa
ccacaagccc
agcaacacca
aggtggacaa
gagagtggag
660
cccaagagct
gcgacaagac
ccacacctgc
cccccctgcc
cagctccaga
actgctggga
720
gggccttccg
tgttcctgtt
cccccccaag
cccaaggaca
ccctgatgat
cagcaggacc
780
cccgaggtga
cctgcgtggt
ggtggacgtg
tcccacgagg
acccagaggt
gaagttcaac
840
tggtacgtgg
acggcgtgga
ggtgcacaac
gccaagacca
agcccagaga
ggagcagtac
900
aacagcacct
acagggtggt
gtccgtgctg
accgtgctgc
accaggactg
gctgaacggc
960
aaagaataca
agtgcaaagt
ctccaacaag
gccctgccag
ccccaatcga
aaagacaatc
1020
agcaaggcca
agggccagcc
acgggagccc
caggtgtaca
ccctgccccc
cagccgggag
1080
gagatgacca
agaaccaggt
gtccctgacc
tgtctggtga
agggcttcta
ccccagcgat
1140
atcgccgtgg
agtgggagag
caacggccag
cccgagaaca
actacaagac
caccccccca
1200
gtgctggaca
gcgacggcag
cttcttcctg
tacagcaagc
tgaccgtgga
caagtccagg
1260
tggcagcagg
gcaacgtgtt
cagctgcagc
gtgatgcacg
aggccctgca
caaccactac
1320
acccagaagt
ccctgagcct
gagccccggc
aag
1353
<210> 104 <211> 642 <212> ДНК
Страница
2017-05-04-06-26-34-186.txt <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность <400> 104
gagatcgtga tgacccagtc ccccgccacc ctgtctgtgt ctcccggcga gagagccacc 60
ctgagctgca gagcctccga gtccgtgtcc tccaacgtgg cctggtatca gcagagacct 120
ggtcaggccc ctcggctgct gatctacggc gcctctaacc gggccaccgg catccctgcc 180
agattctccg gctccggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatctcccg gctggaaccc 240
gaggacttcg ccgtgtacta ctgcggccag tcctactcat accccttcac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642
<210> 105 <211> 121 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 105
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ser Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Met
2017-05-04-06-26-34-186.txt
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 106 <211> 451 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 106
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ser Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asp Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val He Trp Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Met
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He
325 330 335
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys 450
<210> 107
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 107
gaggtgcagc tggtggaatc aggcggcgga ctggtgcagt caggcggtag cctgagactg
2017-05-04-06-26-34-186.txt
agctgcgccg cctccggctt tagcctgtct agctacggcg tggactgggt ccgacaggcc 120
cctggcaaag gcctggagtg ggtcggagtg atctggggcg gaggcggaac ctactacgcc 180
tctagcctga tgggccggtt cactatctct agggacaact ctaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact cactgagagc cgaggacacc gccgtctact actgcgctag aaacgcctac 300
ggtcacgacg gcggcttcgc tatggactac tggggtcagg gcaccctggt caccgtgagt 360
<210> 108
<211> 1353
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 108
tea 363
gaggtgcagc tggtggaatc aggcggcgga ctggtgcagt caggcggtag cctgagactg 60
agctgcgccg cctccggctt tagcctgtct agctacggcg tggactgggt ccgacaggcc 120
cctggcaaag gcctggagtg ggtcggagtg atctggggcg gaggcggaac ctactacgcc 180
tctagcctga tgggccggtt cactatctct agggacaact ctaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact cactgagagc cgaggacacc gccgtctact actgcgctag aaacgcctac 300
ggtcacgacg gcggcttcgc tatggactac tggggtcagg gcaccctggt caccgtgagt 360
tcagctagca ctaagggccc aagtgtgttt cccctggccc ccagcagcaa gtctacttcc 420
ggcggaactg ctgccctggg ttgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgacagtg 480
tcctggaact ctggggctct gacttccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg acagtgccct ccagctctct gggaacccag 600
acctatatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagtggag 660
cccaagagct gcgacaagac ccacacctgc cccccctgcc cagctccaga actgctggga 720
gggccttccg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 780
cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg acccagaggt gaagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggagcagtac 900
2017-05-04-06-26-34-186.txt
aacagcacct acagggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaagaataca agtgcaaagt ctccaacaag gccctgccag ccccaatcga aaagacaatc 1020
agcaaggcca agggccagcc acgggagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgggag 1080
gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccca 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagtccagg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc aag 1353
<210> 109 <211> 13 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая последовательность <400> 109
Asn Ala Tyr Gly His Asp Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr 15 10
<210> 110
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 110
tctggcgcag taatacacgg cc 22
<210> 111
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<220>
<221> неопределенный признак <222> (1)..(3)
<223> вырожденная тринуклеотидная последовательность кодона nnk <400> 111
nnkgcctatg gccatgatgg eg 22
<210> 112
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 112
gcctttctct ccacagg 17
<210> 113
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетическая последовательность
<400> 113
ggcaaacaac agatggctgg 20
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенное антитело или фрагмент антитела, или антигенсвязывающая молекула, которые связываются с SEQ ID N0:1, и, где антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула содержит
(a) вариабельную область тяжелой цепи, где:
i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22, и
ii) CDR2 тяжелой цепи содержит последовательность,
выбранную из любой из SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25,
SEQ ID N0:26 и SEQ ID N0:27, и
ii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29 или SEQ ID N0:109; и
(b) вариабельную область легкой цепи, где
i) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30 или SEQ ID N0:31,
ii) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и
iii) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
2. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где вариабельная область тяжелой цепи обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID N0:16, и где вариабельная область легкой цепи обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID N0:17.
3. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где FR4 тяжелой цепи представляет собой человеческую зародышевую FR4.
4. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.З, где FR4 тяжелой цепи представляет собой SEQ ID N0:42.
5. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где FR4 легкой цепи представляет собой человеческую зародышевую FR4.
6. Антитело или фрагмент антитела по п. 5, где FR4 легкой
цепи представляет собой SEQ ID N0:50.
7. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая
молекула по п.1, где:
i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22;
ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:23;
iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29;
iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30;
v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и
vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
8. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где:
i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22;
ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:24;
iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29;
iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:31;
v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и
vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
9. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где:
i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22;
ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:25;
iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29;
iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30;
v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и
vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
10. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где:
i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22;
ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:2 6;
iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29;
iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30;
v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и
vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
11. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где:
i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22;
ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:27;
iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29;
iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30;
ii)
v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и
vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
12. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где:
i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22;
ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:25;
iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:109;
iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30;
v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и
vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
13. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п. 2, где антитело или фрагмент антитела содержит тяжелую цепь, содержащую SEQ ID N0:16, и легкую цепь, содержащую SEQ ID N0:17.
14. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где антитело или фрагмент антитела конкурирует с выделенным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь, содержащую SEQ ID N0:16, и легкую цепь, содержащую SEQ ID N0:17.
15. Выделенное антитело по п.1, где выделенное антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий последовательность, выбранную из любой из SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:99 и SEQ ID N0:105; и вариабельный домен легкой цепи, содержащий SEQ ID N0:7 или SEQ ID N0:9.
16. Выделенное антитело по п.15, где выделенное антитело, фрагмент антитела, или антигенсвязывающая молекула содержит любой из:
i) вариабельного домена тяжелой цепи, содержащего SEQ ID N0:6, и вариабельного домена легкой цепи, содержащего SEQ ID N0:7;
ii) вариабельного домена тяжелой цепи, содержащего SEQ ID N0:8, и вариабельного домена легкой цепи, содержащего SEQ ID N0:9;
iii) вариабельного домена тяжелой цепи, содержащего SEQ ID
N0:10, и вариабельного домена легкой цепи, содержащего SEQ ID N0:7;
iv) вариабельного домена тяжелой цепи, содержащего SEQ ID N0:12, и вариабельного домена легкой цепи, содержащего SEQ ID N0:7;
v) вариабельного домена тяжелой цепи, содержащего SEQ ID N0:14, и вариабельного домена легкой цепи, содержащего SEQ ID N0:7;
vi) вариабельного домена тяжелой цепи, содержащего SEQ ID N0:99, и вариабельного домена легкой цепи, содержащего SEQ ID N0:7; и
vii) вариабельного домена тяжелой цепи, содержащего SEQ ID N0:105, и вариабельного домена легкой цепи, содержащего SEQ ID N0:7.
17. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где указанные антитело или фрагмент антитела, или антигенсвязывающая молекула являются гуманизированными.
18. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, содержащие фрагмент Fab'.
19. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где антитело или фрагмент антитела содержит Fc IgG.
20. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, содержащие одноцепочечное антитело (scFv).
21. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, содержащие человеческую константную область.
22. Выделенное антитело по п.21, где выделенное антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность, выбранную из любой из SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:73, SEQ ID N0:75, SEQ ID N0:77, SEQ ID N0:100 и SEQ ID N0:106; и легкую цепь, содержащую SEQ ID N0:66 или SEQ ID N0:70.
23. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где антитело или фрагмент антитела является перекрестно сшитым с вторым антителом или фрагментом антитела,
17.
где антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула представляет собой агонист SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:3.
24. Выделенное антитело или фрагмент антитела, или антигенсвязывающая молекула, связывающие SEQ ID N0:1, выбранные из любого из:
A. антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы, где:
i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22,
ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:23,
iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29,
iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30,
v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и
vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34;
B. антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы, где:
i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22,
ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:24,
iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29,
iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:31,
v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и
vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34;
C. антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы, где:
i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22,
ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:25,
iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29,
iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30,
v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и
vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34;
D. антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы, где:
i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22,
ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:2 6,
iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29,
iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30,
ii)
v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и
vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34;
E. антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы, где:
i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22,
ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:27,
iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:29,
iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30,
v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и
vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34; и
F. антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы, где:
i) CDR1 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:22,
ii) CDR2 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:25,
iii) CDR3 тяжелой цепи содержит SEQ ID N0:109,
iv) CDR1 легкой цепи содержит SEQ ID N0:30,
v) CDR2 легкой цепи содержит SEQ ID N0:33, и
vi) CDR3 легкой цепи содержит SEQ ID N0:34.
25. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.24, где указанные антитело или фрагмент антитела, или антигенсвязывающая молекула являются гуманизированными.
26. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.24, содержащие фрагмент Fab'.
27. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.24, где антитело или фрагмент антитела содержит Fc IgG.
28. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.24, содержащие одноцепочечное антитело (scFv).
29. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.24, содержащие человеческую константную область.
30. Выделенное антитело по п.2 9, где выделенное антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность, выбранную из любой из SEQ ID N0:65, SEQ ID N0:69, SEQ ID N0:73, SEQ ID N0:75, SEQ ID N0:77, SEQ ID N0:100 и SEQ ID N0:106; и легкую цепь,
25.
содержащую SEQ ID N0:66 или SEQ ID N0:70.
31. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.24, где антитело или фрагмент антитела является перекрестно сшитым с вторым антителом или фрагментом антитела, где антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула является агонистом SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2 или SEQ ID N0:3.
32. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где антитело или фрагмент антитела является глико зилиро в анным.
33. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.1, где антитело является модифицированным или является экспрессированным в модифицированной клетке, где такая модификация приводит к усиленной эффекторной функции по отношению к FcR антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы.
34. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.24, где антитело или фрагмент антитела является глико зилиро в анным.
35. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по п.24, где антитело является модифицированным или является экспрессированным в модифицированной клетке, где такая модификация приводит к усиленной эффекторной функции по отношению к FcR антитела, фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы.
36. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-35, где антитело или фрагмент антитела индуцирует увеличенное соотношение Тэфф:Трег in vivo.
37. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-35, где антитело или фрагмент антитела индуцирует усиленный иммунный ответ in vivo.
38. Антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-31, где антитело обладает перекрестной реактивностью по отношению к GITR не относящегося к человеку примата, и не обладает перекрестной реактивностью по отношению к GITR грызунов.
39. Полинуклеотид, кодирующий антитело, фрагмент антитела,
или антигенсвязывающую молекулу по любому из пп. 1-35.
40. Композиция, содержащая выделенное антитело, фрагмент
антитела, или антигенсвязывающую молекулу по любому из пп. 1-35
и фармацевтически приемлемый носитель.
41. Композиция по п.4 0, дополнительно содержащая
связывающую молекулу, нацеленную на опухолеассоциированный
антиген, антагонист CTLA4, LAG3 или TIM3, или ингибитор
взаимодействия PD-1/PD-L1.
42. Набор, содержащий антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу по любому из пп. 1-35.
43. Способ усиления ответа Т-клеток у нуждающегося в этом индивидуума, включающий в себя введение индивидууму терапевтически эффективного количества выделенного антитела, фрагмента антитела, или антигенсвязывающей молекулы по любому из пп. 1-35.
44. Способ по п.43, где антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу вводят совместно с антигеном, антагонистом CTLA4, LAG3 или TIM3, или ингибитором взаимодействия PD-1/PD-L1.
45. Способ по п.43, где антитело, фрагмент антитела или
антигенсвязывающую молекулу вводят совместно с
химиотерапевтическим средством или цитотоксином.
46. Способ по п.43, где ответ Т-клеток представляет собой ответ Т-клеток CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL).
47. Способ по п.43, где индивидуум имеет злокачественную опухоль, экспрессирующую опухолеассоциированный антиген.
48. Способ по п.47, где антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу вводят совместно с клетками злокачественных опухолей от индивидуума.
49. Способ по п.47, где злокачественная опухоль выбрана из
группы, состоящей из меланомы, рака яичника, колоректального
рака, рака предстательной железы, немелкоклеточного рака легкого
(NSCLC), рака молочной железы и плоскоклеточной карциномы головы
и шеи (HNSCC).
50. Способ по п.43, где ответ Т-клеток представляет собой
ответ CD4+ Т-клеток-помощников (Th).
51. Способ лечения роста злокачественной опухоли,
экспрессирующей опухолеассоциированный антиген, у нуждающегося в
этом индивидуума, включающий в себя введение индивидууму
терапевтически эффективного количества выделенного антитела,
фрагмента антитела или антигенсвязывающей молекулы по любому из
пп. 1-35.
52. Способ по п.51, где антитело, фрагмент антитела или
антигенсвязывающую молекулу вводят совместно с
опухолеассоциированным антигеном.
53. Способ по п.51, где антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающую молекулу вводят совместно с антагонистом CTLA4, LAG3 или TIM3, или ингибитором взаимодействия PD-1/PD-L1.
54. Способ по п.51, где антитело или фрагмент антитела вводят совместно с химиотерапевтическим средством или цитотоксином.
55. Способ по п.51, где антитело или фрагмент антитела вводят совместно с клетками злокачественных опухолей от индивидуума.
56. Способ по п.51, где злокачественная опухоль выбрана из
группы, состоящей из меланомы, рака яичника, колоректального
рака, рака предстательной железы, немелкоклеточного рака легкого
(NSCLC), лимфомы, рака молочной железы и плоскоклеточной
карциномы головы и шеи (HNSCC).
57. Выделенное антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-35 для применения для усиления ответа Т-клеток у нуждающегося в этом индивидуума.
58. Выделенное антитело, фрагмент антитела или антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-35 для применения в лечении роста опухоли у нуждающегося в этом индивидуума.
По доверенности
CRD1
CRD2
CRD3
hGITR ecd
hGITR CRD 1-tail
hGITR CRD2-tail
i i i
hGITR CRD-taif
i i i
hGITR ecd-tail
ФИГ. 1B
uo со
Q О
1.2 1
0.8 0.6 0.4 0.2
-I-
7-/ у
П Ш*\ asm
hGITR ecd CRD1-tail CRD2-tail CRD3-tail tail 0 MAB4 ? MAB5 ? КОНТРОЛЬНОЕ MAB
<С
<С
<С
¦ <
<с
¦ <
<с
<с
<с
<с
<с
<с
<с
<с
<с
<с
<с
<с
<с
<с
<с
СЧ|
СЧ|
АЛАНИНОВЫЕ МУТАНТНЫЕ КОНСТРУКЦИИ
о ?
о си ы
со m
MAB4
0.5 0
MAB4
S GITR ЧЕЛОВЕКА ?МщкдАНСК0Г0
32.5-о 2-
LO л г-
g 1.5° 1-
0.501С МАВ4 МАВ5
GITR ЧЕЛОВЕКА 0 GITR МЫШИ QGITR КРЫСЫ
ФИГ. 2А
ФИГ. 2В
21.81.61.4-о1.2-
со 1-
О0.8-0.60.40.20-
GITR ЧЕЛОВЕКА
GITR МЫШИ
GITR
ЯВАНСКОГО МАКАКА
КОНКУРЕНЦИЯ ЛИГАНДА GITR ЧЕЛОВЕКА И МАВ7
-ft*
4 нМ КОНТРОЛЬ ИЗОТИПА
Q-'H | ! АннР ! Пни? iQiinff fimffi-fVnffii
О ¦ <- . <- ^ о о
о о о е-: о
Я о ° о
МОЛЯРНОЕ СООТНОШЕНИЕ ЛИГАНДА GITR ЧЕЛОВЕКА И МАВ7/К0НТР0ЛЯ ИЗОТИПА
ФИГ. 2С
< О Ю N
Li_ ^ CЈ ГО
LJ- О С О
?3 m ° 8
O" T^" CM" Ю" QЈ" Ю n Q- ГУ ГУ
О О CD Li_ О О Z Z
ГО X О О О
. . Tj- о о (л
^ О О I-
MAB4 ? MAB5 0 КОНТРОЛЬНОЕ MAB
ФИГ. 2E
).1 1 10 100 1000 10000
[GITR-L] нМ GITR-L ЧЕЛОВЕКА
ФИГ. ЗА
0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000
[mAb] HM MAB4 MAB4+XL - MAB5
X О
<1 X О
X L
654321* 0
н h
0.01 0.1 1 10 100 1000 КОНЦЕНТРАЦИЯ (нМ)
MAB4+XL * MAB7+XL ¦ MAB8+XL [mAb] HM MAB4+XL -л- MAB5+XL
HGITR-DAUDI #2C3 (-4000 МОЛЕКУЛ GITR)
HGITR-DAUDI #1F5 (-5700 МОЛЕКУЛ GITR)
HGITR-DAUDI #1F7 (-8700 МОЛЕКУЛ GITR)
ФИГ. 5B
HGITR-DAUDI #2G11 (-5700 МОЛЕКУЛ GITR)
[Ab] нМ
оо О
-20
5" дд
-I 1 1 Г-
Q_ LQ О
ТТ О О О <^> LO о о
_01 т- LO
МАВ7 (нМ)
О ¦
О О со
+ ио см Q О
80 60 40 20 0
-20
о "=с
О-LQ О СО
ТТ О О О <^> LO о о
_С71 т- LO
МАВ7 (нМ)
ФИГ. 6D
Q_ О
+' 1500
-в- НОСИТЕЛЬ -•- MAB7, 15 мг/кг t ДОЗА
CD LU
О § О +
о T CO
ЮО-i 80604020-
-201 ****
m 1.0-
+ оо О О + со О О
0.5-
О I- О Ш со ^
0.0-
? -0.5
****
-I-
CD о
сЬ ш
О § О +
о т СО Q О 150п
100-
50-
-I-
****
-I- CD +
со О О + со О О
О I- О Ш со ^
25 20 15 10 5 0 -5
-г****
1-
О ¦
ОО со X I- > < О LT. ш о
I- 2
О О
<
2x1051
1х105Н
5x104Н
LU СО
сз 2
ФИГ. 8В
сЬ О
80 п
о nz оо
со ^
Ш + О LO
со О Q
ш + <г со
S| 60
40-
2o^ °
1500
р=0.052
§| 1000
о 4
I- о
о 9
о г-
0 500
сз сз
СЕЛЕЗЕНКА, CD8 PD-1-
40-
о о
? 20-
ОПУХОЛЬ, CD8PD-1+
****
со О
со + > < I-
ш о_ О
=Г + " SCO |
ОО ьс: +
4000 3000 2000 1000 0
-1000
CD8 PD1+
оо О О + со О
О ¦
О О со
40 и 302010 0
****
о см о
О СМ
а см О
ФИГ. 9А
ФИГ. 9В
ФИГ. 9С
100
*** D
25-
7 14 21 28 35
СУТКИ ПОСЛЕ ИМПЛАНТАЦИИ ОПУХОЛИ
КОНТРОЛЬ ИЗОТИПА
В АНТИТЕЛО ПРОТИВ RMPI-14+АНТИТЕЛО ПРОТИВ mlgG2a
С АНТИТЕЛО ПРОТИВ DTA-1+АНТИТЕЛО ПРОТИВ rlgG2a D АНТИТЕЛО ПРОТИВ DTA-1+АНТИТЕЛО ПРОТИВ RMP1-14
40-
100 8060-
со Q О
I 203 0-
О со
О со
со +
\zz CD
CD I
о о_ I
О х
со О О со 80 60 40 20 0 о
О со
А А
А А
О со
\zz CD
т т
\zz\ CD
.100806040-
со Q
§20-
°- 0
О со
о о_
А А
О со
+ се \zz CD
ГТ"
cd \=
CD I
о а_ I
2.0-
со Q О
со CD <
g 1.5-
1.00.5-
О СО
О.О-^г
О со
о о_
"А А
О со
\zz CD
CD I
Q_ I
а <
со О О со
5 4 3 2 1
-I-
О со
О со
о о_
О со
\zz CD
о I
Q_ I
О Q_
" 28 1-
O-^LT
О CO
A A
О со
+ cr \zz CD
CD I
Q_ I
(19)
Страница 1
Страница 1
Страница 2
Страница 2
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 7
Страница 7
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 9
Страница 8
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 11
Страница 11
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 13
Страница 14
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 16
Страница 16
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 17
<400> 21
Страница 17
<400> 21
Страница 18
<400> 23
Страница 18
<400> 23
Страница 19
Страница 19
<400> 29
Страница 20
<400> 29
Страница 20
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 21
Страница 21
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 22
Страница 22
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 24
Страница 24
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 25
Страница 25
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
<400> 47
Страница 26
<400> 47
Страница 26
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
<210> 50
Страница 27
<210> 50
Страница 27
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 29
Страница 28
<400> 59
Страница 31
<400> 59
Страница 31
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
<400> 62
Страница 33
Страница 32
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
<400> 62
Страница 33
Страница 32
Страница 35
Страница 35
450
2017-05-04-06-26-34-186.txt
450
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 37
Страница 37
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 39
Страница 40
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 39
Страница 40
Страница 42
Страница 42
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 43
Страница 43
Страница 45
Страница 45
Страница 46
Страница 46
<400> 74
Страница 47
<400> 74
Страница 47
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 48
Страница 48
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 49
Страница 49
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 52
Страница 52
Страница 53
Страница 53
<400> 78
Страница 54
<400> 78
Страница 54
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 55
<210> 83
Страница 56
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 55
<210> 83
Страница 56
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 58
Страница 58
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 58
Страница 58
Страница 59
Страница 59
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 61
Страница 61
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 62
Страница 62
Страница 64
Страница 64
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница бб
Страница бб
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 68
Страница 68
Страница 69
Страница 69
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 70
Страница 70
Страница 72
Страница 72
2017-05-04-06-26-34-186.txt
2017-05-04-06-26-34-186.txt
Страница 74
Страница 74
181
181
ФИГ. 1А
ФИГ. 1А
2/14
2/14
ФИГ. 1С
ФИГ. 1С
2/14
2/14
ФИГ. 1С
ФИГ. 1С
2/14
2/14
ФИГ. 1С
ФИГ. 1С
2/14
2/14
ФИГ. 1С
ФИГ. 1С
ФИГ. 1D
ФИГ. 1D
4/14
4/14
ФИГ. 2D
ФИГ. 2D
4/14
4/14
ФИГ. 2D
ФИГ. 2D
4/14
4/14
ФИГ. 2D
ФИГ. 2D
5/14
5/14
ФИГ. 3D
ФИГ. 3C
ФИГ. 3D
ФИГ. 3C
7/14
7/14
ФИГ. 4С
ФИГ. 4С
ФИГ. 5D
ФИГ. 5C
ФИГ. 5D
ФИГ. 5C
ФИГ. 5D
ФИГ. 5C
ФИГ. 5D
ФИГ. 5C
9/14
9/14
ФИГ. 6С
ФИГ. 6С
ФИГ. 7В
ФИГ. 7D
ФИГ. 7Е
ФИГ. 7С
ФИГ. 7В
ФИГ. 7D
ФИГ. 7Е
ФИГ. 7С
ФИГ. 7В
ФИГ. 7D
ФИГ. 7Е
ФИГ. 7С
ФИГ. 7В
ФИГ. 7D
ФИГ. 7Е
ФИГ. 7С
ФИГ. 7В
ФИГ. 7D
ФИГ. 7Е
ФИГ. 7С
ФИГ. 7В
ФИГ. 7D
ФИГ. 7Е
ФИГ. 7С
11/14
11/14
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
11/14
11/14
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
11/14
11/14
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
11/14
11/14
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
11/14
11/14
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
11/14
11/14
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
11/14
11/14
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
ФИГ. 8Е
ФИГ. 8D
ФИГ. 10
ФИГ. 10
ФИГ. 10
ФИГ. 10
ФИГ. 10
ФИГ. 10
ФИГ. 10
ФИГ. 10
ФИГ. 10
ФИГ. 10
ФИГ. 10
ФИГ. 10
-100
-100
ФИГ. 11
ФИГ. 11