[RU]

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с VEGFR-2. Эти антитела используются для лечения неопластических заболеваний, гиперпролиферативных нарушений и ангиогенных заболеваний и могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими агентами.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с VEGFR-2. Эти антитела используются для лечения неопластических заболеваний, гиперпролиферативных нарушений и ангиогенных заболеваний и могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими агентами.

---

Евразийское (21) 201790790 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.08.31
(22) Дата подачи заявки 2015.10.07
(51) Int. Cl.
C07K16/28 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) A61K 45/06 (2006.01)
(54) АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ VEGFR-2/KDR
(31) 62/061,097
(32) 2014.10.07
(33) US
(86) PCT/US2015/054569
(87) WO 2016/057726 2016.04.14
(88) 2016.09.01
(71) Заявитель:
КАДМОН КОРПОРЕЙШН, ЭлЭлСи (US)
(72) Изобретатель:
Лу Дэн, Чжу Чжэньпин (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с VEGFR-2. Эти антитела используются для лечения неопластических заболеваний, гиперпролиферативных нарушений и ангиогенных заболеваний и могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими агентами.
SEQ ID NO.
4 EVQLLE SGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSWYVMG - - jwVR Q A P G К
№ ПО 5 6 7 8
№ ПО 9 о 0
Rabat 345678901234 567890ABCDEFGHIJK12 34567890123
4 RAEDTAVYYCAR IGNYF D Y I W G Q G T L V T V S S
12 RAEDTAVYYCAR |gLAAP RS [wGRGTLVTVSS
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
2420-542092ЕА/032
НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ VEGFR-2/KDR
Область техники
Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с VEGFR-2. Эти антитела используются для лечения неопластических заболеваний и гиперпролиферативных нарушений и могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими агентами.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Эта заявка притязает на приоритет заявки на патент США с № 62/061097, поданной 7 октября 2014 года, которая включена сюда посредством во всей ее полноте. Эта заявка также относится к заявке PCT/US2013/063754, поданной 7 октября 2013, и заявке на патент США с № 61/710420, поданной 5 октября 2012, обе из которых включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.
Предпосылки создания изобретения
Ангиогенез представляет собой очень сложный процесс развития новых кровеносных сосудов, который включает в себя пролиферацию и миграцию капиллярных эндотелиальных клеток из ранее существовавших сосудов и инфильтрацию ими ткани, сборку клеток в трубчатые структуры, соединение новообразующихся трубчатых сборок с замкнутой сосудистой системы и созревание новообразованных капиллярных сосудов.
Ангиогенез имеет большое значение в нормальных физиологических процессах, в том числе эмбриональном развитии, росте фолликулов и заживлении ран. Чрезмерный ангиогенез также приводит к неоваскуляризации в случае неопластических заболеваний и в случае не являющихся неопластическими заболеваний, таких как возрастная дегенерация желтого пятна
(AMD), диабетическая ретинопатия и неоваскулярная глаукома. Было установлено, что антиангиогенная терапия, которая воздействует на фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), вместе с ранибизумабом
(Lucentis(r)) является эффективной в замедлении прогрессирования
AMD. Однако неоваскуляризация является сложным процессом, и множество ангиогенных механизмов, вероятно, вносят свой вклад. Остается потребность в разработке агентов и терапий для лечения заболеваний, связанных с неоваскуляризацией. Сущность изобретения
Настоящим изобретением обеспечиваются антитела человека и их фрагменты, которые связываются с VEGFR-2 (KDR). В некоторых вариантах осуществления антитела блокируют связывание лиганда (например, одного или более из VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D или VEGF-Е) с VEGFR-2. В некоторых вариантах осуществления антитела подавляют активацию VEGFR-2. Эти антитела используются для лечения неопластических заболеваний, в том числе, например, солидных и несолидных опухолей и гиперпролиферативных нарушений. Соответственно, настоящим изобретением обеспечиваются способы подавления активации KDR, способы угнетения роста опухоли, в том числе ингибирования связанного с опухолью ангиогенеза, и способы лечения связанных с ангиогенезом нарушений. Настоящим изобретением обеспечиваются наборы, содержащие антитела человека или фрагменты антител, которые связываются с рецепторами VEGR.
В одном варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается выделенное антитело или его фрагмент, которое(ый) связывается с VEGFR2 человека, включающее(ий) вариабельный домен тяжелой цепи, который включает последовательность CDR1, CDR2 и CDR3, причем:
(i) последовательность CDR1 представляет собой GFTFSWYVMG
(SEQ ID N0:237),
(ii) последовательность CDR2 выбирают из группы, состоящей
SIYPQGGATSYADSVKG (SEQ ID N0:238), SIYPQGGATNYADSVKG (SEQ ID N0:239) и SIYPSGGATNYADSVKG (SEQ ID N0:240); и
(ii) последовательность CDR3 выбирают из группы, состоящей
GNYFDY (SEQ ID N0:241), GNYLDY (SEQ ID N0:242), GPYLDY (SEQ ID N0:243) и
GSYLDY (SEQ ID N0:244),
с условием, что вариабельный домен тяжелой цепи не включает вместе и последовательность CDR2 SEQ ID N0:240, и последовательность CDR3 SEQ ID N0:241.
В одном варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается выделенное антитело или его фрагмент, которое(ый) связывается с VEGFR2 человека, включающее(ий) вариабельный домен легкой цепи, который включает последовательность CDR1, CDR2 и CDR3, причем
(i) последовательность CDR1 представляет собой RASQSVSSNYFG
(SEQ ID N0:245),
(ii) последовательность CDR2 представляет собой GASSRAT (SEQ ID N0:246), и
(iii) последовательность CDR3 выбирают из группы, состоящей
QQFDSLPLT (SEQ ID N0:247), QQHDSSPLS (SEQ ID N0:248), QQFDSSPLS (SEQ ID N0:249) и QQFDSSPLT (SEQ ID N0:250).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения CDR2 вариабельного домена тяжелой цепи имеет последовательность SIYPQGGATSYADSVKG (SEQ ID N0:238), a CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи имеет последовательность GNYFDY (SEQ ID N0:241).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения CDR3 вариабельного домена легкой цепи имеет последовательность QQFDSLPLT (SEQ ID N0:247).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения вариабельный домен тяжелой цепи имеет последовательность, выбираемую из группы, состоящей из
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEWVSSIYPQGGATS YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:200),
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPQGGATN YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:208),
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGATN
YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNYLDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:216),
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGATN YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPYLDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:224), и
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGATN YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYLDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:232).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения вариабельный домен легкой цепи имеет последовательность, выбираемую из группы, состоящей из
DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI
PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQFDSLPLTFGGGTKVEIKR (SEQ ID
N0:204),
DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEP EDSAVYYCQQHDSSPLSFGGGTKVEIKR (SEQ ID N0:212),
DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI
PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQFDSSPLSFGGGTKVEIKR (SEQ ID
N0:220),
DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEP EDSAVYYCQQFDSSPLTFGGGTKVEIKR (SEQ ID N0:228) и
DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEP EDSAVYYCQQFDSSPLTFGGGTKVEIKR (SEQ ID N0:236).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения
вариабельный домен тяжелой цепи имеет последовательность,
которая представляет собой
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYVMGWVRQAPGKGLEWVSSIYPQGGATSYADSV
KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGNYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID
N0:200), а вариабельный домен легкой цепи имеет
последовательность, которая представляет собой
DIQMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQSVSSNYFGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFS GSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQFDSLP LTFGGGTKVEIKR (SEQ ID N0:204).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения
антитело или фрагмент имеет изотип IgG.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело или фрагмент представляет собой scFv, Fv, Fab', Fab, F(ab')2 или диатело.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело или фрагмент связывается с человеческим VEGFR2 и мышиным VEGFR2.
Настоящим изобретением обеспечивается выделенная
нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его фрагмент по настоящему изобретению.
Настоящим изобретением обеспечивается НК-вектор, включающий выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его фрагмент по настоящему изобретению.
Настоящим изобретением обеспечивается прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или фрагмент по настоящему изобретению.
Настоящим изобретением обеспечивается композиция, содержащая антитело или его фрагмент по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящим изобретением обеспечивается способ подавления активации человеческого VEGFR2 или мышиного VEGFR2, включающий приведение клетки в контакт с эффективным количеством антитела или фрагмента по настоящему изобретению.
Настоящим изобретением обеспечивается способ ингибирования ангиогенеза, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или фрагмента по настоящему изобретению.
Настоящим изобретением обеспечивается способ уменьшения роста опухоли, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или фрагмента по настоящему изобретению.
Настоящим изобретением обеспечивается способ лечения неопластических заболеваний у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или фрагмента по настоящему изобретению, причем неопластические заболевания выбирают из группы, состоящей из рака легкого, колоректального рака, почечно-клеточного рака, глиобластомы, рака яичников, рака
мочевого пузыря, рака желудка, множественной миеломы, немелкоклеточного рака легкого и рака поджелудочной железы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ, кроме того, включает введение субъекту эффективного количества антагониста рецептора эпидермального фактора роста (EGFR).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ, кроме того, включает введение субъекту эффективного количества антагониста рецепторной fms-подобной тирозинкиназы (flt-1) .
В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ, кроме того, включает введение субъекту эффективного количества антагониста rho-ассоциированной киназы 2 (R0CK2).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ, кроме того, включает введение субъекту эффективного количества антагониста матриксных металлопротеиназ.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ, кроме того, включает введение субъекту эффективного количества антитела против PDGFR|3.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ, кроме того, включает введение субъекту эффективного количества антитела против PD-L1.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения пациентом является человек.
Краткое описание фигур
На фиг. 1А-С продемонстрированы человеческие
последовательности вариабельных областей тяжелой цепи, легкой цепи лямбда и легкой цепи каппа, соответственно, антител против VEGFR2 по настоящему изобретению, идентифицированных с помощью фагового дисплея.
На фиг. 2 продемонстрировано связывание антител по настоящему изобретению с hVEGFR2 (наверху) и конструкцией, содержащей домены 2 и 3 hVEGFR2 (посередине). Нижняя панель демонстрируют блокирование лиганда (VEGFi65) .
На фиг. 3 показано, что мАт 101 и 102 по настоящему
изобретению ингибируют VEGFA-стимулируемое фосфорилирование VEGFR2, АКТ и МАРК в свиных эндотелиальных клетках аорты (РАЕ) со сверхэкспрессией KDR (VEGFR2 человека).
На фиг. 4 продемонстрировано связывание с hVEGFR2 и блокирование лиганда VEGFi65 с помощью мАт 104, 105, 106 и 108. Схожие результаты были получены для мАт 103, 107, 109 и 110 в отдельном эксперименте. Эти мАт содержат вариабельный домен тяжелой цепи из мАт101, рекомбинированный с различными вариабельными доменами легкой цепи.
На фиг. 5 показано, что мАт 105 и 106 по настоящему изобретению ингибируют VEGFA-стимулируемое фосфорилирование VEGFR2, АКТ и МАРК в свиных эндотелиальных клетках аорты (РАЕ) со сверхэкспрессией KDR (VEGFR2 человека).
На фиг. 6А представлены аминокислотные последовательности
тяжелых цепей пяти антител с созревшей аффинностью, происходящих
от мАт138, которое содержит Ун-домен, имеющий последовательность
SEQ ID N0:4 (последовательность, также представленную на этой
фигуре). На фиг. 6В представлены аминокислотные
последовательности легкой цепи тех же пяти антител с созревшей аффинностью, происходящих из SEQ ID N0:160 (последовательности, также представленной на этой фигуре).
На фиг. 7А представлено связывание антител по настоящему изобретению с растворимым человеческим и мышиным VEGFR2 по сравнению с DC101 (мышиным моноклональным Ат, которое связывается с мышиным VEGFR2) и контрольным антителом, которое связывается только с человеческим VEGFR2. мАт147 связывается как с человеческим, так и с мышиным VEGFR2. мАЮб связывается с человеческим VEGFR2, но не с мышиным VEGFR2. На фиг. 7В представлены данные из экспериментов по блокированию лиганда. мАт147 блокирует связывание человеческого VEGF с человеческим VEGFR2 и связывание мышиного VEGF с мышиным VEGFR2 . мАтЮб блокирует связывание человеческого VEGF с человеческим VEGFR2, но не связывание мышиного VEGF с мышиным VEGFR2.
На фиг. 8А продемонстрировано связывание мАтЮб и мАт147 с человеческим VEGFR2 на клетках HUVEC (эндотелиальных клетках пупочной вены человека) и свиных эндотелиальных клетках аорты
(РАЕ) со сверхэкспрессией KDR (KDR-PAE) . На фиг. 8В показано, что мАт147, но не мАтЮб, связывается с VEGFR2 на мышиных эндотелиальных клетках MS1. На рис. 8А и 8В, контроль представляет собой антитело, которое связывается с hVEGFR2, но не с mVEGFR2.
На фиг. 9 показано ингибирование VEGFR2-oпocpeдoвaннoй передачи сигнала с помощью мАтЮб и мАт147. мАтЮб и мАт14 7 ингибируют фосфорилирование KDR и р44/42 в клетках KDR-PAE (фиг. 9А) и в клетках HUVEC (фиг. 9В) в зависимости от дозы.
На фиг. 10А представлено ингибирование пролиферации клеток KDR-PAE с помощью мАтЮб, мАт147 и контрольного антитела, которое связывается с hVEGFR2. На фиг 10В продемонстрировано ингибирование индуцированной миграции клеток. Миграция клеток KDR-PAE была индуцирована градиентом VEGF (50 нг/мл VEGF (наверху), 100 нг/мл VEGF (внизу)). Диаграмма изображает количество клеток в присутствии 0, б мкг/мл, 3 мкг/мл или 15 мкг/мл антитела мАтЮб или мАт147.
На фиг. 11 представлено ингибирование VEGF-индуцированной миграции клеток KDR-PAE с помощью мАт147.
На фиг. 12А представлено ингибирование VEGFR2-опосредованной передачи сигнала в мышиных клетках ЕОМА с помощью мАт147. А на фиг. 12В представлены исследования с использованием FACS, демонстрирующие, что мАт14 7 характеризуется увеличенным связыванием с клетками ЕОМА по сравнению с контрольными антителами.
Подробное описание изобретения
В одном аспекте настоящим изобретением обеспечиваются новые антитела против VEGFR2, или используются антигенсвязывающие фрагменты таких антител, которые являются эффективными для ингибирования VEGFR2-зaвиcимoй передачи сигнала. Используемый здесь термин "ингибирующий рецептор" означает уменьшение и/или инактивацию внутренней киназной активности рецептора, который передает сигнал. Надежным анализом ингибирования VEGFR2 является уменьшение фосфорилирования рецептора.
Настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом ингибирования VEGFR2. Механизм,
сопровождаемый одним антителом, является необязательно одинаковым с таковым, сопровождаемым другим антителом. Некоторые возможные механизмы включают предотвращение связывания лиганда VEGF с экстраклеточным связывающим доменом VEGFR2, а также предотвращение димеризации или олигомеризации рецепторов. Однако нельзя исключить другие механизмы.
Антитела представляют собой белки, которые распознают и
связывают специфический антиген или вещество. В предпочтительных
вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению
связываются с KDR по крайней мере так же сильно, как и природный
лиганд. Аффинность, представленная константой равновесия для
диссоциации комплекса антигена с антителом (Ко!) , определяет силу
связывания между антигенной детерминантой и антигенсвязывающим
сайтом. Авидность является мерой силы связывания между антителом
и его антигеном. Авидность связана как с аффинностью между
антигенной детерминантой и антигенсвязываюшим сайтом антитела,
как и с количеством сайтов связывания (валентностью) на
антитело. Так, например, одновалентное антитело (например, Fab)
имеет один сайт связывания для конкретного эпитопа. Антитело IgG
имеет два антигенсвязывающих сайта. Типичные значения К
(обратной величины константы диссоциации Kd) составляют от 105 до
1011 литров/моль. Считается, что любое значение К ниже 104
литров/моль означает связывание, которое является
неспецифическим.
Антитело по настоящему изобретению подавляет активацию VEGFR2. Одним из показателей ингибирования VEGFR2 является уменьшение тирозинкиназной активности рецептора. Ингибирование тирозинкиназы может быть определено, используя хорошо известные методы, такие как измерение уровня аутофосфорилирования рецептора. Ингибирование VEGFR2 можно также наблюдать по ингибированию или регулированию событий фосфорилирования природных или синтетических субстратов VEGFR2 и других компонентов пути передачи сигнала от VEGFR2. Фосфорилирование может быть обнаружено, например, с использованием антитела, специфического для фосфотирозина, в анализе ELISA или на Вестерн-блоте. Некоторые анализы для тирозинкиназной активности
описаны в Panek et al. , J. Pharmacol. Exp. Thera., 283: 1433-44 (1997) и Batley et al., Life Sci., 62: 143-50 (1998).
In vivo анализы также могут использоваться. Например, ингибирование тирозинкиназной активности можно наблюдаться с помощью анализов митогенной активности с использованием клеточных линий, стимулированных лигандом рецептора в присутствии и в отсутствие ингибитора. Например, клетки HUVEC (АТСС), стимулированные VEGF, могут быть использованы для анализа ингибирования VEGFR. Другой способ включает тестирование на угнетение роста VEGF-экспрессирующих опухолевых клеток, используя, например, опухолевые клетки человека, инъецированные в мышь. Смотрите, патент США с № 6365157 (Rockwell et al.).
Настоящим изобретением обеспечиваются антитела против VEGFR2, в том числе нуклеиновые кислоты, кодирующие такие антитела, и композиции, содержащие такие антитела. В одном варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается вариабельная область тяжелой цепи выделенного антитела, включающая последовательность CDR-1H, CDR-2H и CDR-3H, причем:
(i) последовательность CDR-1H представляет собой GFTFSWYXiMXz (SEQ ID N0:185), где Xi представляет собой V или I, Х2 представляет собой G или L,
(ii) последовательность CDR-2H представляет собой SIX1X2SGGX3TX4YADSVKG (SEQ ID N0:186), где Xi представляет собой Y или G, Х2 представляет собой Р или S, Х3 представляет собой А или F, Х4 представляет собой N или D, и
(iii) последовательность CDR-3H представляет собой GNYFDY (SEQ ID N0:3) или GLAAPRS (SEQ ID N0:11).
В одном варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается выделенная вариабельная область легкой цепи, включающая CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, причем
(i) последовательность CDR-L1 представляет собой XiGX2X3LX4X5X6X7X8S (SEQ ID N0:187), где Xi представляет собой S, Q или Т, Х2 представляет собой D, Е или Q, Х3 представляет собой К, S, N, I или А, Х4 представляет собой G или R, Х5 представляет собой D, S, Н, Е или N, Х6 представляет собой Е, Y, Q, R или N, Х7 представляет собой Y, F или S, и Х8 представляет собой А или
S, или SGSXiSNX2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID N0:188), где Xi представляет собой S или T, X2 представляет собой I или L, Х3 представляет собой Е или G, Х4 представляет собой Т, S или N, Х5 представляет собой N или Y, Х6 представляет собой Т, Р, А или Y, Х7 представляет собой V или L, и Х8 представляет собой N, I или Y, или XiGX2SX3DX4GX5YDYVS (SEQ ID N0:189), где Xi представляет собой А или Т, Х2 представляет собой S или Т, Х3 представляет собой Н, S или N, Х4 представляет собой I или V, и Х5 представляет собой S или А,
(ii) последовательность CDR-L2 представляет собой XiX2X3X4X5PS (SEQ ID N0:190), где Xi представляет собой Q, D, Т, Y, S или А, Х2 представляет собой D, N, S, Т или V, Х3 представляет собой D, N, S, Т или Y, Х4 представляет собой Q, К, N или L, и Х5 представляет собой R или L, и
(iii) причем последовательность CDR-L3 представляет собой 0Х!1л/Х2Х3Х4Х5Х6Х7Х8 (SEQ ID N0:191), где Xi представляет собой А или Т, Х2 представляет собой D или G, Х3 представляет собой R, или аминокислота отсутствует, Х4 представляет собой S, F или N, Х5 представляет собой S, Т или N, Х6 представляет собой S, Т или Р, Х7 представляет собой А, V, L, I или Y, и Х8 представляет собой V или L, или АХ!1лт0Х2ЪХ3Х4Х5Х6 (SEQ ID N0:192, где Xi представляет собой A, S или Т, Х2 представляет собой N или S, Х3 представляет собой N, I или G, Х4 представляет собой G или S, Х5 представляет собой Р, W или V, и Х6 представляет собой V или L, или MYSTITXiLL (SEQ ID N0:193), где Хг представляет собой А или Т.
В одном варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается выделенная вариабельная область легкой цепи, включающая CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, причем
(i) последовательность CDR-L1 представляет собой RASXiX2X3X4X5X6X7YX8X9 (SEQ ID N0:194), где Xi представляет собой Q, Е или Н, Х2 представляет собой S, R или N, Х3 представляет собой V, I или L, Х4 представляет собой S, R, G или N, Х5 представляет собой S или N, Х6 представляет собой S, N, W или D, Х7 представляет собой G, или аминокислота отсутствует, Х8 представляет собой L или F, и Х9 представляет собой A, G, М или S,
(ii) последовательность CDR-L2 представляет собой GASXiRAT
(SEQ ID N0:195), где Xi представляет собой S, Т, I или N, и
(iii) последовательность CDR-L3 представляет собой
00X1X2X3X4X5X5X7X8 (SEQ ID N0:196), где Xi представляет собой F или
Y, Х2 представляет собой D, G или Y, Х3 представляет собой S, Т
или N, Х4 представляет собой S, L или W, Х5 представляет собой Р,
или аминокислота отсутствует, Х6 представляет собой Р или Т, Х7
представляет собой L, I, V, Р, W или Y, и Х8 представляет собой Т
или S .
В одном варианте осуществления настоящим изобретением обеспечивается антитело, которое включает вариабельный домен тяжелой цепи, включающий одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей CDR из вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи, представленных выше.
Предоставляются неограничивающие примеры
последовательностей VEGFR2-cвязывaющиx антител. Как здесь описано, исходя из библиотек фагового дисплея Fab человека, были идентифицированы два нейтрализующих антитела, которые связываются с VEGFR2 человека, блокируют связывания лиганда VEGFA с hVEGFR2 и ингибируют фосфорилирование VEGFR2 и последующую передачу сигнала, стимулированную VEGFA. Таблица 1 показывает аминокислотные последовательности CDR и вариабельных доменов антител. KD MATIOI И МАТ102 составляют приблизительно 6,6 мМ и 1,7 нМ, соответственно.
Таблица 1 - Аминокислотные последовательности антител в соответствии с SEQ ID N0
мАт
CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
vH-
домен
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3
vL-
домен
101
102
Тяжелая цепь MATIOI была подвергнута перетасовке с генами легкой цепи к (к-библиотекой) и генами легкой цепи X (\-библиотекой). 2 0 уникальных вариантов легкой цепи X были найдены
в результате пэннинга ^-библиотеки как через сорбент с человеческим VEGFR2, так и через сорбент с мышиным VEGFR2. 22 уникальных варианта легкой цепи к были найдены в результате
пэннинга к-библиотеки как через сорбент с человеческим VEGFR2, так и через сорбент с мышиным VEGFR2. Таблица 2 показывает аминокислотные последовательности CDR и вариабельных доменов легких цепей. Kd мАт 105, 106, и 107 были увеличены приблизительно в 10 раз (0,24 нМ, 0,22 нМ и 0,12 нМ, соответственно). Как и исходное антитело, эти антитела связываются с VEGFR2 и блокируют связывания VEGFA с VEGFR2, и ингибируют VEGFA-стимулируемое фосфорилирование VEGFR2, АКТ и МАРК (фиг. 4).
Некоторые из антител, в том числе мАт 138, 139, 140 и 146, также обладают перекрестной реактивностью с мышиным VEGFR2. Эти антитела также ингибировали VEGFA-стимулируемое фосфорилирование VEFGR2 и последующих молекул в пути передачи сигнала, в том числе МАРКА.
Таблица 2 - Легкие цепи к и X в соответствии с SEQ ID NO
мА т
Легкая цепь
SEQ ID NO
мА T
Легкая цепь
SEQ ID NO
CDR-Ll
CDR-L2
CDR-L3
CDR-Ll
CDR-L2
CDR-L31
10 3
12 4
101
102
103
10 4
10 4
12 5
105
106
107
10 8
10 5
12 6
109
110
111
11 2
10 6
12 7
113
114
115
11 6
10 7
12 8
117
118
119
12 0
10 8
12 9
121
122
123
12 4
10 9
13 0
125
126
127
12 8
11 0
13 1
129
130
131
13 2
11 1
13 2
133
134
135
13 6
11 2
13 3
137
138
139
14 0
141
142
143
145
146
147
149
150
151
153
154
155
157
158
159
161
162
163
165
166
167
169
170
171
173
174
175
177
178
179
181
182
183
Настоящим изобретением обеспечивается выделенное антитело против VEGFR2, и его УЕ6ГК2-связывающие фрагменты, которое(ые) включает один, два или три CDR тяжелой цепи и один, два или три CDR легкой цепи, выбираемые из последовательностей, приведенных в Таблице 1 и Таблице 2. В случае антитела по настоящему изобретению, когда более одного CDR выбирают из последовательностей, представленных в таблице 1 и таблице 2, различные CDR не должны выбираться из одного и того же моноклонального антитела, представленного в этих таблицах, но могут быть выбраны из двух или более вариабельных доменов антител, представленных в таблицах. Конкретные варианты осуществления включают, но без ограничения ими, следующее. В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенное антитело против VEGFR2 включает один, два или три CDR тяжелой цепи, имеющие SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2 и SEQ ID N0:3. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело включает один, два или три CDR легкой цепи, имеющие SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6 и SEQ ID N0:7. В другом варианте осуществления антитело
включает один, два или три CDR легкой цепи, имеющие
последовательности, представленные в таблице 1 или 2.
Неограничивающие примеры включают вариабельную область легкой
цепи, включающую одну или более из SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26 и
SEQ ID N0:27, одну или более из SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30 и SEQ
ID N0:31, или одну или более из SEQ ID N0:33, SEQ ID N0:34 и SEQ
ID N0:35. В некоторых вариантах осуществления антитело против
VEGFR2 включает вариабельный домен тяжелой цепи, включающий SEQ
ID N0:4 или SEQ ID N0:12. В некоторых вариантах осуществления
антитело против VEGFR2 включает вариабельный домен легкой цепи,
включающий SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:27, SEQ ID N0:31
или SEQ ID N0:35. В некоторых вариантах осуществления антитела
включают один из указанных выше вариабельных доменов тяжелой
цепи и один из указанных выше вариабельных доменов легкой цепи.
В некоторых вариантах осуществления антитела против VEGFR2 или
их связывающие фрагменты включают один или более CDR или один
или более вариабельных доменов с аминокислотной
последовательностью, идентичной на по крайней мере 85%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95%, по крайней мере 97%, по крайней мере 98% или по крайней мере 99% последовательностям CDR и вариабельных доменов, указанным в таблице 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению имеют аминокислотные последовательности CDR, идентичные тем, которые раскрыты здесь, и каркасные области, которые являются идентичными на по крайней мере 85%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95%.
Термин "идентичность" относится к количеству или проценту идентичных положений, разделяемых двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями, принимая во внимание количества пробелов и длину каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального совмещения двух последовательностей. Термин "по существу идентичные" означает аминокислотную последовательность, которая отличается только консервативными аминокислотными заменами, например, заменой одной аминокислоты на другую того же класса (например, валина на глицин, аргинина на лизин и т.д.) или одной или более неконсервативных замен,
делеций или вставок, находящихся в положениях аминокислотной
последовательности, которые не разрушают функцию белка.
Предпочтительно, когда аминокислотная последовательность на по
крайней мере, 80%, более предпочтительно на по крайней мере 85%
и наиболее предпочтительно на по крайней мере 90% схожа с другой
аминокислотной последовательностью. Способы и компьютерные
программы для определения сходства последовательностей, в том
числе, но не только, пакет программ GCG (Devereux et al.,
Nucleic Acids Research 12: 387, 1984), ВLASTP, BLASTN, FASTA
(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990) и программа ALIGN
(версия 2.0), являются общедоступными. Хорошо известный алгоритм
Smith Waterman также может использоваться для определения
сходства. Программа BLAST является общедоступной из NCBI и
других источников (BLAST Manual, Altschul, et al. , NCBI NLM NIH,
Bethesda, Md. 20894; BLAST 2.0 at
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). При сравнении
последовательностей эти способы принимают во внимание различные замены, делеций и другие модификации. Консервативные замены обычно включают замены в пределах следующих групп: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота, аспарагин, глютамин; серии, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин.
Антитела по настоящему изобретению также включают те,
характеристики связывания которых были улучшены с помощью прямой
мутации, способов созревания аффинности, фагового дисплея или
перетасовки цепей. Аффинность и специфичность могут быть
изменены или улучшены с помощью мутирования CDR и скрининга на
предмет антигенсвязывающих сайтов, имеющих желаемые
характеристики. CDR мутируют различными способами. Один из способов состоит в рандомизации отдельных остатков или комбинаций остатков таким образом, что в совокупности в остальном идентичных антигенсвязывающих сайтов все двадцать аминокислот обнаруживаются в определенных положениях. Альтернативно, мутации индуцируются в диапазоне остатков CDR способами с использованием допускающих ошибки ПЦР (смотрите, например, Hawkins et al, J. Mol Biol, 226: 889-896. (1992)).
Например, векторы фагового дисплея, содержащие гены вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, могут быть размножены в мутаторных штаммах Е. coli (смотрите, например, Low et al., J. Mol Biol, 250: 359-368 (1996)) . Эти способы мутагенеза являются иллюстрацией множества способов, известных специалистам в данной области техники.
Чтобы свести к минимуму иммуногенность антител, которые
связываются с рецепторами VEGF, настоящим изобретением
обеспечиваются антитела, которые включают последовательности
вариабельных и константных доменов человека. Антитела могут
представлять собой или могут объединять члены любого класса
иммуноглобулинов, такого как IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, или его
подклассов. Класс антитела может быть выбран с целью оптимизации
эффекторных функций (например, комплемент-зависимой
цитотоксичности (CDC) и антитело-зависимой клеточной
цитотоксичности (ADCC)) встречающихся в природе антител.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают использование УЕбЕК^-связывающих фрагментов антител. Fv-фрагмент является самым маленьким фрагментом, который содержит целый вариабельный домен тяжелой и легкой цепи, включая все шесть гипервариабельных петлевых участков (CDR). Не имея константных доменов, вариабельные домены связаны нековалентно. Тяжелая и легкая цепи могут быть соединены в одну полипептидную цепь ("одноцепочечный Fv" или "scFv"), используя линкер, который позволяет соединить VH- и Уь-домены с образованием антигенсвязывающего сайта. В одном варианте осуществления настоящего изобретения линкер представляет собой (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3. Поскольку scFv-фрагменты не содержат константные домены целых антител, они значительно меньше целых антител. В scFv-фрагментах также отсутствуют обычные взаимодействия константных доменов тяжелой цепи с другими биологическими молекулами, которые могут быть нежелательными в некоторых вариантах осуществления.
Фрагменты антитела, содержащие VH, VL и необязательно CL, Сн или другие константные домены, также могут быть использованы. Одновалентные фрагменты антител, образуемые в результате
расщепления папаином, упоминаются как Fab и не имеют шарнирную область тяжелой цепи. Фрагменты, образуемые в результате расщепления пепсином, упоминаемые как F(ab')2/ сохраняют шарнирную область тяжелой цепи и являются двухвалентными. Такие фрагменты могут быть также получены рекомбинантно. Множество других полезных антигенсвязывающих фрагментов антител известно в данной области техники и включает, без ограничения, диатела, триатела, однодоменные антител и другие одновалентные и поливалентные форм.
Настоящим изобретением, кроме того, обеспечиваются
поливалентные антигенсвязывающие белки, которые могут быть в
форме, без ограничения, антител, их антигенсвязывающих
фрагментов и белков, включающих целые антигенсвязывающие части
антител или их часть. Поливалентные антигенсвязывающие белки
могут быть моноспецифическими, биспецифическими или
полиспецифическими. Термин "специфичность" относится к числу различных типов антигенных детерминант, с которыми может связываться конкретная молекула. Если молекула иммуноглобулина связывается только с одним типом антигенной детерминанты, молекула иммуноглобулина является моноспецифической. Если молекула иммуноглобулина связывается с различными типами антигенных детерминант, то молекула иммуноглобулина является полиспецифической.
Например, биспецифическое поливалентное одноцепочечное антитело делает возможным распознавание двух различных типов эпитопов. Оба эпитопа могут находиться в одном и том же антигене (например, VEGFR2). В качестве альтернативы, один эпитоп может находиться в одном антигене (например, VEGFR2), а второй эпитоп - в другом антигене.
В одном варианте осуществления поливалентное одноцепочечное антитело включает вариабельный фрагмент легкой цепи, связанный с вариабельным фрагментом тяжелой цепи (по аналогии с scFv), который, кроме того, связан с помощью другого пептидного линкера с по крайней мере одним другим антигенсвязывающим доменом. Как правило, пептидный линкер состоит из приблизительно пятнадцати аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте
осуществления количество VL- и Ун-доменов является равным. Например, двухвалентное одноцепочечное антитело может быть представлено следующим образом: VL Li VH-L2 VL L3 VH или VL Li VH L2 VH-L3 VL, или VH-Li VL L2 VH-L3 VL, или VH Li VL L2 VL-L3 VH. Поливалентные одноцепочечные антитела, которые являются трехвалентными или с большей валентностью, содержат один или более фрагментов антител, присоединенных к двухвалентному одноцепочечному антителу с помощью дополнительных пептидных линкеров. Одним из примеров трехвалентного одноцепочечного антитела является: VL Li VH L2 VL VH L2 VL VH.
Два одноцепочечных антитела могут быть объединены с образованием диатела, также известного как двухвалентный димер. Диатела имеют две цепи. Каждая цепь диатела включает Ун-домен, соединенный с Уь-доменом с помощью короткого линкера из приблизительно 5-10 аминокислотных остатков, например, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2. Такие линкеры являются достаточно короткими, чтобы предотвратить внутрицепочечное спаривание между доменами в одной и той же цепи, соответственно, запуская межцепочечное спаривание между комплементарными доменами в разных цепях, и воссоздают два антигенсвязывающих сайта. Структура диатела является жесткой и компактной, при этом антигенсвязывающие сайты находятся на противоположных концах молекулы. Диатела могут быть моноспецифическими или биспецифическими.
Три одноцепочечных антитела могут быть объединены с
образованием триатела, также известного как трехвалентные
тримеры. В некоторых вариантах осуществления триатела
конструируют с использованием карбоксильного конца VL- или Аб-
домена, непосредственно слитого с амино-концом VH- или Уь-домена,
т.е. без какой-либо линкерной последовательности. Триатело имеет
три Fv-головки с полипептидами, расположенными циклически,
голова к хвосту. Возможная конформация молекулы триатела
является плоской с тремя сайтами связывания, расположенными в
одной плоскости под углом 12 0 градусов друг от друга. Триатела
могут быть моноспецифичными, биспецифическими или
триспецифичными.
Следует понимать, что антитела против VEGFR2 по настоящему изобретению, в случае использования для млекопитающих с целью профилактики или лечения, будут вводиться в виде композиции, дополнительно содержащей фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, например, один или более из воды, физиологического раствора, забуференного фосфатом физиологического раствора, декстрозы, глицерина, этанола и тому подобное, а также их комбинации. Фармацевтически приемлемые носители могут, кроме того, содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие агенты или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность антител.
В способах по настоящему изобретению терапевтически эффективное количество антитела по настоящему изобретению вводят в организм млекопитающего, нуждающегося в этом. Используемый здесь термин "введение означает доставку антител по настоящему изобретению млекопитающему любым способом, который может достичь искомого результата. Они могут вводиться, например, внутривенно или внутримышечно. Хотя антитела человека по настоящему изобретению являются особенно применимыми для введения человеку, они могут вводиться также другим млекопитающим. Используемый здесь термин "млекопитающее", как предполагается, включает, но без ограничения, людей, лабораторных животных, домашних животных и сельскохозяйственных животных. "Терапевтически эффективное количество" означает количество антитела по настоящему изобретению, которое при введении в организме млекопитающего, является эффективным для получения желаемого терапевтического эффекта, например, ингибирования киназной активности. Например, в зависимости от заболевания, в случае антитела может потребоваться 0,1, 1,0, 3,0, 6,0 или 10,0 мг/кг. В случае IgG с молекулярной массой 150000 г/моль (два связывающих сайта), эти дозы соответствуют приблизительно 18 нМ, 180 нМ, 540 нМ, 1,08 мкМ и 1,8 мкМ связывающих сайтов для оставляющего 5 л объема крови.
Антитела по настоящему изобретению применимы для угнетения роста опухоли, ангиогенеза, связанного с ростом опухоли, или
других патологических состояний, сопровождающихся ангиогенезом. Опухоли, которые могут быть подвергнуты лечению, включают первичные опухоли, метастатические опухоли и резистентные опухоли. Резистентные опухоли включают опухоли, которые не реагируют на или являются резистентными к лечению(е) только химиотерапевтическими средствами, только антителами, только облучением или их комбинациями. Резистентные опухоли также включают опухоли, которые, судя по всему, ингибируются в результате лечения такими средствами, но рецидивируют через вплоть до пяти лет, иногда до десяти лет или дольше после прекращения лечения. Антитела являются эффективными для лечения васкуляризированных опухолей и опухолей, которые не являются васкуляризированными, или пока по существу не являются васкуляризированными.
Примеры солидных опухолей, которые могут быть
соответствующим образом подвергнуты лечению, включают карциному
молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак
поджелудочной железы, глиому и лимфому. Некоторые примеры таких
опухолей включают эпидермоидные новообразования, плоскоклеточные
опухоли, такие как опухоли головы и шеи, колоректальные опухоли,
опухоли предстательной железы, опухоли молочной железы, опухоли
легкого, в том числе мелкоклеточные и немелкоклеточные опухоли
легкого, опухоли поджелудочной железы, опухоли щитовидной
железы, опухоли яичников и опухоли печени. Другие примеры
включают саркому Капоши, новообразования ЦНС, нейробластомы,
капиллярные гемангиобластомы, менингиомы и метастазы в головной
мозг, меланому, раки желудочно-кишечного тракта и почек и
саркомы, рабдомиосаркому, глиобластому, предпочтительно
мультиформную глиобластому, и лейомиосаркому. Примеры васкуляризированных раков кожи, в случае которых антагонисты по настоящему изобретению являются эффективными, включают плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак и раки кожи, которые можно лечить путем угнетения роста злокачественных кератиноцитов, таких как злокачественные кератиноциты человека.
Примеры несолидных опухолей включают лейкоз, множественную миелому и лимфому. Некоторые примеры лейкозов включают острый
миелолейкоз (AML), хронический миелолейкоз (CML), острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL), эритроцитарный лейкоз или моноцитарный лейкоз. Некоторые примеры лимфом включают лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому.
Антитела по настоящему изобретению также могут
использоваться для лечения или профилактики патологических
состояний, характеризующихся чрезмерным ангиогенезом,
включающим, например, васкуляризацию и/или воспалению, таких как
атеросклероз, ревматоидный артрит (RA), гемангиомы, ангиофибромы
и псориаз. Другими неограничивающими примерами неопухолевых
ангиогенных заболеваний являются ретинопатия недоношенных
(ретролентальная фиброплазия), отторжение трансплантата
роговицы, инсулинозависимый сахарный диабет, рассеянный склероз, тяжелая миастения, болезнь Крона, аутоиммунный нефрит, первичный билиарный цирроз печени, острый панкреатит, отторжение аллотрансплантата, аллергическое воспаление, контактный дерматит и замедленные реакции гиперчувствительности, воспалительное заболевание кишечника, септический шок, остеопороз, остеоартрит, когнитивные нарушения, вызванные нейрогенным воспалением, синдром Ослера-Вебера, рестеноз и грибковые, паразитарные и вирусные инфекции, в том числе цитомегаловирусные инфекции.
Глазные болезни, характеризующиеся чрезмерным ангиогенезом,
включают неоваскулярную глаукому, пролиферативную ретинопатию,
включая пролиферативную диабетическую ретинопатию, и дегенерацию
желтого пятна. Настоящим изобретением обеспечиваются способы и
соединение для лечения глазных болезней и нарушений. В одном
варианте осуществления в настоящем изобретении предусматривается
лечение возрастной дегенерации желтого пятна (AMD), которое
происходит в "сухой" и "влажной" формах. "Влажная" форма AMD
является причиной потери зрения из-за аномального роста
кровеносных сосудов (неоваскуляризации). Кровотечение,
просачивание и рубцы от этих кровеносных сосудов сетчатки, в конечном счете, приводят к необратимому повреждению фоторецепторов. Сухая форма происходит вследствие атрофии пигментного эпителия сетчатки, что приводит к потере зрения через потерю фоторецепторов (палочек и колбочек) в центральной
части глаза. В другом варианте осуществления настоящим
изобретением обеспечивается способ лечения хориоидальной
неоваскуляризации (CNV). Хориоидальная неоваскуляризация
представляет собой процесс, в случае которого новые кровеносных
сосуды растут в сосудистой оболочке глаза, через оболочку Бруха
и проникают в субретинальное пространство, и является симптомом,
среди других причин, возрастной дегенерации желтого пятна,
миопии и травмы глаза. В другом варианте осуществления настоящим
изобретением обеспечивается способ лечения диабетического
макулярного отека (DME). В другом варианте осуществления
настоящим изобретением обеспечивается способ лечения макулярного
отека, который является вторичным по отношению к окклюзии ветки
вены сетчатки (BRVO) или окклюзии центральной вены сетчатки
(CRVO). Другие заболевания, которые можно лечить в соответствии
с настоящим изобретением, включают, без ограничения,
неоваскуляризацию радужной оболочки глаза, увеит, неоваскулярную
глаукому и ретинит недоношенных (ROP). Способ лечения может быть
профилактическим, например, чтобы предотвратить
неоваскуляризацию роговицы после пересадки роговицы или модулировать процесс заживления ран при трабекулэктомии.
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут преимущественно вводиться со вторыми агентами пациентам, нуждающимся в этом. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело против VEGFR-2 по настоящему изобретению вводят субъекту вместе с противоопухолевым средством. В некоторых вариантах осуществления антитело против VEGFR-2 вводят субъекту вместе со вторым ингибитором ангиогенеза. В некоторых вариантах осуществления антитело против VEGFR-2 по настоящему изобретению вводят вместе с противовоспалительным средством или иммунодепрессантом.
Противоопухолевые средства включают цитотоксические
химиотерапевтические средства, небольшие молекулы и
биологические молекулы направленного действия, а также облучение. Неограничивающие примеры химиотерапевтических средств включают цисплатин, дакарбазин (DTIC), дактиномицин, иринотекан, мехлорэтамин (азотистый иприт), стрептозоцин, циклофосфамид,
кармустин (BCNU), ломустин (CCNU), доксорубицин (адриамицин),
даунорубицин, прокарбазин, митомицин, цитарабин, этопозид,
метотрексат, 5-фторурацил, винбластин, винкристин, блеомицин,
паклитаксел (таксол), доцетаксел (таксотер), альдеслейкин,
аспарагиназу, бусульфан, карбоплатин, кладрибин, дакарбазин,
флоксуридин, флударабин, гидроксимочевину, ифосфамид,
интерферон-альфа, лейпролид, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, пликамицин, митотан, пегаспаргазу, пентостатин, пипоброман, пликамицин, стрептозоцин, тамоксифен, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепу, урамусцин, винорелбин, хлорамбуцил, таксол и их комбинации.
Небольшие молекулы и биологические молекулы направленного действия включают, без ограничения, ингибиторы компонентов путей передачи сигнала, такие как модуляторы тирозинкиназ и ингибиторы рецепторных тирозинкиназ, и агенты, которые связываются со специфическим для опухоли антигенами. Неограничивающими примерами рецепторов факторов роста, участвующих в онкогенезе, являются рецепторы тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), инсулиноподобного фактора роста (IGFR), фактора роста нервов (NGFR) и фактора роста фибробластов (FGFR), и рецепторы семейства рецепторов эпидермального фактора роста, в том числе EGFR (erbBl), HER2 (erbB2), егЬВЗ и егЬВ4.
Антагонисты EGFR включают антитела, которые связываются с EGFR или лигандом для EGFR и подавляют связывание с лигандом и/или активацию рецептора. Например, агент может блокировать образование димеров рецепторов или гетеродимера с другими членами семейства EGFR. Лиганды для EGFR включают, например, EGF, амфирегулин TGF-a, гепарин-связывающий EGF (HB-EGF) и бетарекуллюлин. Антагонист EGFR может связываться снаружи с экстраклеточной частью EGFR, что может или может не ингибировать связывание лиганда, или изнутри с тирозинкиназным доменом. Антагонисты EGFR, кроме того, включают агенты, которые ингибируют EGFR-зависимую передачу сигналов, например, путем ингибирования функции компонента пути передачи сигнала от EGFR. Примеры антагонистов EGFR, которые связываются с EGFR, включают,
без ограничения, биологические молекулы, такие как антитела (и их функциональные эквиваленты), специфические для EGFR, а также небольшие молекулы, такие как синтетические ингибиторы киназ, которые действуют непосредственно на цитоплазматический домен EGFR.
Небольшие молекулы и биологические ингибиторы включают ингибиторы рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), включающие гефитиниб, эрлотиниб и цетуксимаб, ингибиторы HER2 (например, трастузумаб, трастузумаб эмтансин (трастузумаб-DMl, T-DM1) и пертузумаб), антитела против VEGF и фрагменты (например, бевацизумаб), антитела, которые ингибируют CD2 0 (например, ритуксимаб, ибритумомаб), антитела против VEGFR (например, рамуцирумаб (IMC-1121B), IMC-1C11 и CDP791), антитела против PDGFR и иматиниб. Являющиеся небольшими молекулами ингибиторы киназ могут быть специфическими для конкретной тирозинкиназы или ингибиторами двух или более киназ. Так, например, соединение N-(3,4-дихлор-2-фторфенил)-7-({[(3aR,6aS)-2-метилоктагидроциклопента[с]пиррол-5-ил]метил}окси)-б-(метилокси)хиназолин-4-амин (также известное как XL647, EXEL-7647 и KD-019) представляет собой in vitro ингибитор нескольких рецепторных тирозинкиназ (RTK), в том числе EGFR, EphB4, KDR (VEGFR), Flt4 (VEGFR3) и ErbB2, а также является ингибитором киназы SRC, которая участвует в путях, которые приводят к невосприимчивости опухолей к определенным TKI. В одном варианте осуществления настоящего изобретения лечение субъекта, нуждающегося в нем, включает введение ингибитора Rho-киназы формулы I и введение KD-019.
Дазатиниб (BMS-354825, Bristol-Myers Squibb, New York) является еще одним биодоступным при пероральном применении, АТФ-конкурентным ингибитором Src. Дазатиниб также воздействует на Всг-АЫ (одобренный Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (США) для применения для пациентов с хроническим миелогенным лейкозом (CML) или позитивным по филадельфийской хромосоме (Ph+) острым лимфобластным лейкозом (ALL)), а также с-Kit, PDGFR, c-FMS, EpbA2 и SFK. Двумя другими ингибиторами тирозинкиназы Src и Всг-АЫ для перорального применения являются
босутиниб (SKI-606) и саракатиниб (AZD0530).
Хотя VEGFR2 опосредует большинство последующих эффектов VEGF в ангиогенезе, может быть предпочтительным введение второго ингибитора ангиогенеза. Антитела против VEGFR-2 по настоящему изобретению могут быть введены вместе с антителами, которые нейтрализуют другие рецепторы, вовлеченные в рост опухоли или ангиогенез.
Неограничивающие примеры VEGF-связывающих агентов включают антитела против VEGF и ловушки VEGF (т.е. лиганд-связывающие домены рецепторов VEGF). Двумя примерами антител (в том числе VEGF-связывающих фрагментов антител) являются бевацизумаб (Avastin), антитело, которое связывается к VEGF-A, и ранибизумаб (Lucentis), Fab, происходящий от бевацизумаба. В общем, ловушка VEGF представляет собой белок, который содержит VEGF-связывающие домены одного или более белков рецепторов VEGF. Ловушки VEGF включают, без ограничения, растворимый VEGFR-1, растворимый нейропилин 1 (NRP1), растворимый VEGFR-3 (который связывается с VEGF-C и VEGF-D) и афлиберцепт (Zaltrap; Eylea; VEGF Trap R1R2), состоящий из сегментов экстраклеточных доменов рецепторов фактора роста эндотелия сосудов человека VEGFR1 и VEGFR2, слитых с константной областью (Fc) IgGl человека. Конберцепт (КН902) представляет собой слитый белок, который содержит экстраклеточный домен 2 из VEGFR-1 (Flt-1) и экстраклеточный домен 3, 4 из VEGFR2 (KDR) , слитые с Fc-частью IgGl человека. Несколько ловушек VEGF, содержащих Ig-подобные домены KDR и FLT-1 в различных комбинациях, раскрыты в патенте США с № 8216575. Белки DARPin (акроним для разработанных белков с анкириновым повтором) представляют собой разработанные при помощи генной инженерии белки-миметики антител, демонстрирующие, как правило, связывание с высокой степенью специфичности и высоким сродством к белку-мишени. DARPin(r) МР0112 представляет собой ингибитор фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) и вошел в клинические испытания для лечения влажной формы дегенерации желтого пятна и диабетического макулярного отека.
В соответствии с настоящим изобретением можно
воздействовать на экспрессию VEGF. Например, ингибитор VEGF РТС2 99 воздействует на VEGF посттранскрипционно путем селективного связывания с 5'- и 3'-нетранслируемой областью (UTR) матричной РНК (мРНК) для VEGF, тем самым предотвращая трансляцию VEGF. Пегаптаниб (Macugen) представляет собой РНК-аптамер, направленный против VEGF-165.
Плацентарный фактор роста (P1GF) был непосредственно связан с патологическим ангиогенезом. P1GF структурно родственен VEGF, а также является лигандом для VEGFR-1. Следовательно, ловушки VEGF, включающие экстраклеточный домен VEGFR1, (смотрите выше) могут быть использованы для нацеливания на P1GF. Антиангиогенные агенты, кроме того, включают те, которые связываются с рецептором VEGFR-1/Flt-l. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие белки, которые связываются с экстраклеточным доменом VEGFR-1, блокируют связывания одним или обоими из его лигандов, VEGF и P1GF, и/или подавляют VEGF-индуцированную или PlGF-индуцированную активацию VEGFR-1.
PDGF состоит из четырех полипептидных цепей, которые образуют гомодимеры PDGF - АА, ВВ, СС и DD, а также гетеродимер PDGF-AB. Рецепторы PDGF (PDGFR) -а и -(3 опосредуют функции PDGF. В частности, PDGFRa связывается с PDGF-AA, -ВВ, -АВ и -СС, в то время как PDGFR|3 взаимодействует с -ВВ и -DD. Неограничивающие примеры PDGF-связывающих агентов включают антитела против PDGF и ловушки PDGF. Агенты, которые нацелены на PDGF, включают Fovista(tm) (Е10030, Ophthotech), пегилированные аптамеры, воздействующие на PDGF-B, и АХ102 (Sennino et al., 2007, Cancer Res 75 (15): 7359-67), аптамер в виде ДНК-олигонуклеотида, который связывается с PDGF-B.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят субъекту вместе с эффективным количеством антитела против PDGFR|3.
Агенты, которые нацелены на рецепторы PDGF, включают рамуцирумаб (IMC-3G3, IgGi человека) антитело против PDGFRa, креноланиб (СР-868596), селективный ингибитор PDGFRa (1С50=0,9 нМ) и PDGFR|3 (1С50=1,8 нМ) , и нилотиниб (Tasigna(r)), ингибитор
PDGFa и PDGFR|3 И других тирозинкиназ.
Ингибиторы ангиогенеза включают внутриклеточные агенты, которые блокируют передачу сигнала с использованием, например, VEGF, PDGF, лигандов рецепторов VEGF или PDGF, или комплемента. Внутриклеточные агенты, которые ингибируют ингибиторы ангиогенеза, включают следующие, но без ограничения. Сунитиниб
(Sutent; SU11248) является панспецифическим ингибитором в виде
небольшой молекулы VEGFR1-VEGFR3, PDGFRa и PDGFR0, фактора
стволовых клеток (cKIT), Flt-З, и рецептора
колониестимулирующего фактора-1 (CSF-1R). Акситиниб (AG013736; Inlyta) является еще одним являющимся небольшой молекулой ингибитором тирозинкиназ, который ингибирует VEGFR-1-VEGFR-3, PDGFR и cKIT. Цедираниб (AZD2171) является ингибитором VEGFR-1-VEGFR-3, PDGFR|3 И CKIT. Сорафениб (Nexavar) является еще одним являющимся небольшой молекулой ингибитором нескольких тирозин-специфических протеинкиназ, включая VEGFR, PDGFR и киназы Raf. Разопаниб (Votrient; (GW786034) ингибирует VEGFR-1, -2 и -3, cKIT и PDGFR. Форетиниб (GSK1363089; XL880) ингибирует VEGFR2 и МЕТ, как это делает кабозантиниб (Cometriq; XL184). Понатиниб
(Iclusig; АР24534) ингибирует VEGFR, PDGFR и cKIT. Тивозаниб
(AV-951) ингибируют VEGFR-1, VEGFR-2 и VEGFR-3 в пикомолярных концентрациях. СР-547 632 является сильным ингибитором VEGFR-2 и киназ основного фактора роста фибробластов (FGF). Е-3810 ((б-(7-
((1-аминоциклопропил)метокси)-б-метоксихинолин-4-илокси)-N-метил-1-нафтамид) ингибирует киназы VEGFR-1, -2, -3 и FGFR-1 и -2 в наномолярном диапазоне. Бриваниб (BMS-582 664) представляет собой ингибитор VEGFR-2, который также ингибирует передачу сигнала от рецептора FGF. СТ-322 (Adnectin) представляет собой небольшой белок на основе человеческого фибронектинового домена и связывается с и подавляет активацию VEGFR2. Вандетаниб
(Caprelas; Zactima; ZD6474) является ингибитором VEGFR2, EGFR и тирозинкиназ RET. Х-82 (Xcovery) представляет собой являющийся небольшой молекулой индолиноновый ингибитор передачи сигнала через рецепторы факторов роста VEGFR и PDGFR.
В некоторых вариантах осуществления антитела против VEGFR
по настоящему изобретению вводят вместе с ингибиторами матриксных металлопротеиназ. Матриксные металлопротеиназы (ММР), такие как ММР-14, ММР-16 и ММР-2 4, расщепляют компоненты экстраклеточного матрикса (ЕСМ) и базальные мембраны, тем самым позволяя раковым клеткам проникать и инфильтрировать нижележащий стромальный матрикс. Кроме того, ряд рецепторов факторов роста, молекул клеточной адгезии, хемокинов, цитокинов, апоптотических лигандов и ангиогенных факторов являются субстратами ММР. Следовательно, активность ММР может вызвать активацию факторов роста, подавление апоптоза опухолевых клеток, нарушение градиентов концентрации хемокинов, созданных в результате иммунного ответа хозяина, или высвобождение ангиогенных факторов. ММР могут способствовать росту опухоли путем стимулирования высвобождения факторов пролиферации клеток, таких как инсулиноподобные факторы роста, которые связываются со специфическими связывающими белками (IGFBP) (Manes et al. , 1997, J. Biol Chem. 272: 25706-25712).
Коллагеназы, в том числе ММР-2, были обнаружены на повышенных уровнях в случае меланоме и раков толстой кишки, молочной железы, легких, простаты и мочевого пузыря. Как правило, эти повышенные уровни коррелируют с более высокой степенью злокачественности опухоли и инвазивностью. Уровни ММР-2 значительно повышены в сыворотке пациентов с метастатическим раком легких, и у таких пациентов с высокими уровнями ответ на химиотерапии уменьшается. Уровень ММР-14, которая расщепляет ргоММР-2 с высвобождением активной ММР-2, повышен в многочисленных раках и может способствовать росту опухолей, эмболии опухолевыми клетками и подвижности, инвазивности и метастазированию рака (например, опухолей ЦНС (например, глиом), рака головы и шеи, рака ротовой полости, рака гортани, хондросаркомы, рака молочной железы). ММР-16 и ММР-2 4 также повышены в многочисленных раках и могут способствовать как росту опухолей, так и инвазивности и метастазированию рака (например, рака молочной железы, рака гортани, рака яичников, карциномы яичек, меланомы, опухолей головного мозга (например, астроцитомы, глиобластомы, глиомы).
В некоторых вариантах осуществления антитела против VEGFR
по настоящему изобретению вводят вместе с антагонистами ММР-1, в
том числе, но без ограничения, антителами против ММР-14,
раскрытыми в патентах США с № 7745587 и 8106168. В одном
варианте осуществления антитело представляет собой
моноклональное антитело человека DX-2400 (Dyax Corp.). Совместное введение с таким антителом является подходящим для лечения карцином у человека, в том числе, но без ограничения ими, шейки матки, желудка, легких, молочной железы, толстой кишки, головы и шеи, злокачественных опухолей головного мозга и меланомы.
В другом варианте осуществления антитело против VEGFR по
настоящему изобретению можно вводить в комбинации с одним или
несколькими подходящими адъювантами, такими как, например,
цитокины (IL-10 и IL-13, например) или другими
иммунностимуляторами. Однако следует иметь в виду, что введение только антитела против KDR достаточно для предотвращения, ингибирования или уменьшения прогрессирования опухоли терапевтически эффективным образом.
Противовоспалительные средства и иммунодепрессанты включают стероидные препараты, такие как глюкокортикоиды (например, дексаметазон), FK506 (такролимус), циклоспорин, финголимод, интерферон, такой как IFN|3 или IFNy, связывающийся с фактором-а некроза опухолей (TNF-oc) белок, такой как инфликсимаб (Remicade), этанерцепт (Enbrel) или адалимумаб (Humira), и микофеноловую кислоту.
Некоторые варианты осуществления включают введение антитела
по настоящему изобретению и второго агента, указанного ниже:
доцетаксела для солидных опухолей, в том числе рака молочной
железы и раков мочевыводящих путей и почки, паклитаксела (для
солидных опухолей, аденокарциномы желудка), FOLFRI (т.е.
иринотекана, фолиновой кислоты, 5-фторурацила) для
колоректального рака, капецитабина (для рака молочной железы), FOLFOX (т.е. оксалиплатина, лейковорина, 5-фторурацил) (для раков желудка, пищевода, гастроэзофагеального рака), эрибулина
(для рака молочной железы), FOLFIRI (т.е., иринотекана, левофолината, 5-фторурацила) (для колоректального рака), карбоплатина (для NSCLC), митоксантрона и преднизона (для рака предстательной железы), OFF (оксалиплатина, фолиновой кислоты, 5-фторурацила) (для колоректального рака), иринотекана и цетуксимаба (для колоректального рака) и дакарбазина (для злокачественной меланомы).
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему
изобретению могут быть конъюгированы с агентом, например,
цитотоксическим лекарственным средством, являющимся цитотоксином
ферментом или радиоизотопом. Этот способ включает введение
только связывающего белка или связывающего белка,
присоединенного к агенту, (например, цитотоксическому
лекарственному средству), субъекту, нуждающемуся в таком лечении. Например, антитела против VEGFR2 или их фрагменты могут быть использованы для доставки наночастиц, содержащих агенты, такие как токсины, в связывающиеся с VEGFR2 клетки или ткани, например, опухоли.
VEGFR2-cвязывaющиe белки могут быть использованы непосредственно in vivo с целью элиминации экспрессирующих антиген клеток через посредство естественной комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) или антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Связывающие белки, описанные здесь, могут включать связывающийся с комплементом эффекторный домен, например, Fc-части из IgGl, -2 или -3 или соответствующие части из IgM, которые связывают комплемент.
Когда антитело против VEGFR-2 по настоящему изобретению вводят со вторым агентом, первый и второй агенты могут вводиться последовательно или одновременно. Каждый агент может вводиться в однократной или многократной дозе, и дозы могут быть введены по любой схеме, в том числе, без ограничения, два раза в день, ежедневно, еженедельно, раз в две недели и ежемесячно.
Настоящее изобретение также включает добавочное введение. Добавочное введение означает, что второй агент вводят пациенту в дополнение к первому агенту, который уже вводят для лечения заболевания или симптома заболевания. В некоторых вариантах
осуществления добавочное введение включает введение второго агента пациенту, у которого введение первого агента не приводит к лечению, или не в достаточной степени приводит к лечению заболевания или симптома заболевания. В других вариантах осуществления добавочное введение включает введение второго агента пациенту, заболевание которого эффективно лечилось введением первого агента.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят путем инъекции, небольшую молекулу вводят перорально. В одном таком варианте осуществление антитело вводят раз в неделю или один раз или два раза в месяц, а небольшую молекулу вводит ежедневно.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят путем инъекции, а ингибитор R0CK2 вводят перорально. В предпочтительном варианте осуществления агенты вводят один раз в день. В соответствии с настоящим изобретением, когда ингибитор ROCK, или антитело против VEGFR2, вводят субъекту для лечения глазной болезни, антагонист TGF-р может вводиться субъекту для уменьшения или предотвращения образование рубцов. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда ингибитор ROCK вводят для лечения глазной болезни, также вводят антагонист TGF-p. В другом варианте осуществления, когда антагонист VEGF вводят субъекту для лечения глазной болезни, также вводят антагонист TGF-p. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, когда ингибитор ROCK и антагонист VEGF вводят субъекту для лечения глазной болезни, также вводят антагонист TGF-p. В случае глазных болезней, связанных с неоваскуляризацией, просачивание из новых кровеносных сосудов сопровождается образованием рубца (например, дископодобного рубца). Настоящее изобретение включает введение антагониста TGF-Р, а также антагониста VEGF и ингибитора R0CK2 субъекту для лечения неоваскуляризации при глазной болезни.
Применимые антагонисты TGF-р включают, без имитирования, следующее: (i) антитела против TGF-р и их антигенсвязывающие
фрагменты, такие как панспецифическое антитело против TGF-p GC-1008 (Genzyme) , антитело против TGF-(3i метелимумаб (CAT-192) (Cambridge Antibody Technology) и антигенсвязывающие фрагменты этих антител, (ii) растворимые рецепторы TGF-p или их лигандсвязывающие фрагменты, такие как Р144, синтетический пептид, охватывающие аминокислоты 730-743 из близкого к мембране лигандсвязывающего домена рецептора TGF-p типа III (Esparza-Lopez et al., 2001, J. Biol. Chem. 27б (18) :14588-96), и слитый белок рецептор TGF-p типа III-Fc (IgGi) (Smith, J. et al. , 1999, Circulation Res. 84:1212-22), (iii) пептиды, которые связываются с рецепторами TGF-p, что блокируют одну или несколько изоформ TGF-|3, например, 2 5-аминокислотные пептиды пептиды из TGF-Pi, TGF-p2 и TGF-Рз, описанные Huang et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:27155-59, которые связываются с рецепторами TGF-p, и (iv)
антисмысловые агенты, которые ингибируют синтез TGF-p, такие как трабедерсен (Antisense Pharma GmbH), олигонуклеотид, который ингибирует синтез TGF-P2. Дополнительные антагонисты описаны в WO2006/052568, WO 02/094833, WO 04/048382, WO 04/048381, WO 04/050659, WO 04/021989, WO 04/026871 и WO 04/026307.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят субъекту вместе с эффективным количеством антитела против PD-L1 (смотрите US 61/927907 и PCT/US15/11657, которые включены сюда посредством ссылки во всей их полноте).
В некоторых вариантах осуществления дозу соединения или композиции вводят субъекту каждый день, через день, каждые два дней, каждый третий день, один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю или раз в две недели. В других вариантах осуществления две, три или четыре дозы соединения или композиции вводят субъекту каждый день, каждые два дня, каждый третий день, раз в неделю или один раз каждые две недели. В некоторых вариантах осуществления дозу(ы) соединения или композиции вводят в течение 2 дней, 3 дней, 5 дней, 7 дней, 14 дней или 21 дней. В некоторых вариантах осуществления дозу соединения или композиции
вводят в течение 1 месяца, 1,5 месяца, 2 месяцев, 2,5 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, б месяцев или более.
Способы введения включают, но без ограничения,
парентеральное, внутрикожное введение, введение в стекловидное
тело, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, подкожное,
интраназальное, эпидуральное, пероральное, сублингвальное,
интраназальное, внутримозговое, интравагинальное,
трансдермальное введение, введение через слизистую, ректально, путем ингаляции или местно, в частности, в уши, нос, глаза или на кожу. Способ введения остается на усмотрение врача. В большинстве случаев введение будет приводить к высвобождению соединения в кровоток. Для лечения глазных болезней является предпочтительным введение биологических агентов в стекловидное тело.
В конкретных вариантах осуществления может быть желательным местное введение соединения. Это может быть достигнуто, например, а не в качестве ограничения, с помощью местной инфузии, местного нанесения, путем инъекции, с помощью катетера или с помощью имплантата, при этом указанный имплантат состоит из пористого, непористого или желеобразного материала, включая мембраны, такие как мембраны Sikalastic(r), или волокна. В таких случаях введение может быть избирательно нацелено на локализованную ткань без существенного высвобождения соединения в кровоток.
Легочное введение также может быть использовано, например, путем использования ингалятора или распылителя и препарата с распылительным агентом, или с помощью перфузии в фторуглероде или синтетическом легочном сурфактанте. В некоторых вариантах осуществления соединение готовят в виде суппозитория с традиционными связующими веществами и носителями, такими как триглицериды.
В другом варианте осуществления соединение доставляется в везикуле, в частности липосоме (смотрите Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al. , in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Bacterial infection, Lopez-Berestein and
Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez Berestein, ibid., pp. 317-327; смотрите в основном там же).
В другом варианте осуществления соединение доставляется в системе с контролируемым высвобождением (смотрите, например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Примеры систем с контролируемым высвобождением, которые обсуждаются в обзоре Langer, 1990, Science 249: 1527-1533, могут использоваться. В одном варианте осуществления может использоваться насос (смотрите Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). В другом варианте осуществления могут быть использованы полимерные материалы (смотрите Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; смотрите также Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105).
Описанные выше схемы введения представлены только с иллюстративной целью и не должны рассматриваться как ограничивающие. Специалист со средним уровнем компетентности в данной области техники без труда поймет, что все дозы находятся в пределах объема настоящего изобретения.
Следует понимать, и ожидается, что изменения принципов настоящего изобретения, раскрытого здесь, могут быть осуществлены квалифицированным специалистом в данной области техники, и предполагается, что такие модификации должны быть включены в объем настоящего изобретения.
На протяжении этой заявки упоминаются различные публикации. Эти публикации включены, таким образом, в эту заявку посредством ссылки во всей их полноте для более полного описания состояния области техники, к которой относится это изобретение. Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, но не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения каким-либо
образом.
ПРИМЕРЫ Пример 1
Идентификация антител, которые связываются с доменами 2 и 3 VEGFR и блокируют связывание лиганда.
Два антитела, связывающиеся с VEGFR2 человека и нейтрализующие его, которые определены в таблице 1, были выделены из библиотек фагового дисплея Fab человека. Антитела блокируют связывание лиганда VEGFA с hVEGFR2 (фиг. 2) . Антитела также связываются с эндотелиальными клетками аорты свиньи (РАЕ), экспрессирующими KDR, и ингибируют VEGFA-стимулируемое фосфорилирование VEGFR2, АКТ и МАРК. (фиг. 3). Таблица 1 показывает аминокислотные последовательности CDR и вариабельных доменов антител. Kd MATIOI И МАТ102 составляют приблизительно 6,6 мМ и 1,7 нМ, соответственно.
Тяжелая цепь MATIOI была подвергнута перетасовке с генами легкой цепи к (к-библиотекой) и генами легкой цепи X (\-библиотекой). 2 0 уникальных вариантов легкой цепи X были найдены
в результате пэннинга ^-библиотеки как через сорбент с человеческим VEGFR2, так и через сорбент с мышиным VEGFR2. 22 уникальных варианта легкой цепи к были найдены в результате пэннинга к-библиотеки как через сорбент с человеческим VEGFR2, так и через сорбент с мышиным VEGFR2. Таблица 2 показывает аминокислотные последовательности CDR и вариабельных доменов легких цепей. Kd мАт 105, 106, и 107 были увеличены приблизительно в 10 раз (0,24 нМ, 0,22 нМ и 0,12 нМ, соответственно) (таблица 3) . Эти антитела и антитело MATIOI, из которого они получены, связываются с доменами 2 и 3 VEGFR и конструкциями, содержащими эти домены.
Таблица 3 - Данные, относящиеся к связыванию антител.
Антитело
Ю^^сек"1
Ю^сек-1
KD нМ
107
55, 8
0, 934
0, 167
109
30,6
3,80
1,24
104
79,2
1, 13
0, 165
110
44,9
3,10
0, 69
108
71,9
1,75
0,244
105
24,3
0,591
0,243
101
29,8
5, 93
1,81
Как и родительское антитело, эти антитела связываются с VEGFR2 и блокируют связывание VEGFA с VEGFR2 (фиг. 4), и ингибируют VEGFA-стимулируемое фосфорилирование VEGFR2, АКТ и МАРК (фиг. 5).
Некоторые из антител, в том числе мАт 138, 139, 140 и 146, также вступают в перекрестную реакцию с VEGFR2 мыши.
Таблица 4
- Перекрестная реактивность
VEGFR2 человека
VEGFR2 мыши
Антитело
К^М^сек"1
Ю^сек"1
К^М^сек"1
Ю^сек"1
138
19,7
1, 42
0, 72
23,4
5,90
2, 55
139
14, 6
1,75
1,20
13, 0
3, 17
2,44
106
35, 6
0, 512
0, 144
мАт 138, 139 и 140 ингибируют VEGFA-стимулируемое фосфорилирование VEFGR2 и последующих молекул в пути передачи сигнала, в том числе МАРК.
Пример 2
Угнетение роста опухоли in vivo
Мышей NOD-SCID (б-8)-недельного возраста подобранных по полу (самок) облучали 3,5 Гр от источника гамма-излучения 137Cs при мощности дозы, составляющей приблизительно 0,9 Гр/мин, и внутривенно инокулировали 2х107 клеток HL60. Через три дня после инокуляции опухоли группы мышей подвергали лечению дважды в неделю различными дозами мАтЮб, и регистрировали время их выживания.
Все не подвергнутые лечению мыши умерли в течение двух недель. Даже при большой массе опухоли, время выживаемости мышей, подвергнутых лечению 10 мг/кг мАтЮб, удлиняется на целых 2 8 дней.
Пример 3
Лечение рака толстой кишки у больного человека Являющихся людьми субъектов с диагнозом рак толстой кишки делят на группы лечения и с учетом стандартной химиотерапевтической схемы. Две группы пациентов лечат
еженедельно 5 мг/кг/неделю или 15 мг/кг/неделю в течение 4-х месяцев. Контрольная группа получает только стандартную химиотерапевтическую схему. Массу опухоли оценивают периодически с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ). Ожидается, что по сравнению с контрольной группой пациенты, которые получали еженедельно лечение антителом, будут демонстрировать значительное уменьшение роста опухоли или размера опухоли, усиление замедления прогрессирования или удлинение времени выживаемости по сравнению с пациентами, которые не получают лечение антителом.
Для созревания аффинности было выбрано мАт138 (таблица 2), содержащее тяжелую цепь MATIOI (SEQ ID N0:4, смотрите фиг. 6А) . Мутации были введены в CDR3 легкой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи. Полученная библиотека была подвергнута пэннингу через сорбент с человеческим и мышиным VEGFR2. Таблица 5 показывает аминокислотные последовательности CDR и вариабельные домены тяжелой и легкой цепи пяти из полученных антител. На фиг. б приведено сравнение последовательностей с тяжелой цепью (SEQ ID N0:4) и легкой цепью каппа (т.е. SEQ ID N0:160) мАт138.
мАт13 8 для VEGFR2 человека, мыши и крысы определяли с помощью анализа Biacore (таблица б).
Таблица 6 - Анализ Biacore связывания с VEGFR2 человека, мыши и крысы
мАт
антиген
138
крысы
4,ЗОЕ+04
1,34Е-03
3,12Е-08
мыши
2,86Е+04
2,ЗЗЕ-03
8,17Е-08
человека
8,98Е+04
6,00Е-04
6,68Е-09
147
крысы
6,45Е+04
8,99Е-04
1,39Е-08
мыши
4,38Е+04
1,28Е-03
2,94Е-08
человека
1,13Е+05
2,82Е-04
2,51Е-09
149
крысы
3,32Е+04
1,43Е-03
4,31Е-08
мыши
2,29Е+04
1,81-03
7,92Е-08
человека
8,62Е+04
6,59Е-04
7,65Е-08
мАт147 исследовали с помощью ELISA на свойства связывания со своим рецептором и блокирования лиганда. мАт147 связывается как с растворимым hVEGFR2, так и с растворимым mVEGFR2 со схожей аффинностью (фиг. 7А) . мАт147 блокирует связывание лиганда с hVEGFR2 подобно специфическому для hVEGFR контрольному антителу, а также блокирует связывание лиганда с mVEGFR2 подобно mVEGFR2-специфическому контрольному антителу (фиг. 7В).
Связывание мАт14 7 с hVEGFR2 и mVEGFR2, представленными на клеточных мембранах, было также подтверждено. На фиг. 8А продемонстрировано связывание с hVEGR2, экспрессируемым эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC), а также эндотелиальными клетками аорты свиньи (РАЕ) со сверхэкспрессией KDR (т.е. VEGFR2 человека). мАт147 также связывалось с mVEGFR, экспрессируемым мышиными эндотелиальными клетками MS1 (фиг. 8В).
мАт147 ингибируют VEGFR-2-опосредуемую передачу сигнала, на что указывает уменьшение фосфорилирования KDR и р42/44 в клетках KDR-PAE (фиг. 9А) и в клетках HUVEC (фиг. 9В) . мАтЮб и мАт147 ингибируют пролиферацию клеток KDR-PAE (фиг. 10А), а также ингибируют VEGF-индуцируемую миграцию клеток KDR-PAE (фиг. 10В) . Эффект мАт147 на ингибирование VEGF-индуцируемой миграции клеток KDR-PAE также продемонстрирован на фиг. 11.
мАт147 также ингибирует VEGFR-2-опосредованную передачу сигнала в мышиных клетках ЕОМА, на что указывает уменьшение
фосфорилирования mVEGFR2 (фиг. 12А). Исследования с использованием FACS показали, что мАт147 характеризуется увеличенным связыванием с клетками ЕОМА по сравнению с контрольными антителами (фиг. 12В).
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Kadmon Corporation LLC Lu, Dan Zhu, Zhenping
<120> Антитела человека против VEGFR-2/KDR
<130> 15487/477P1 <140> 15487/477WO1
<141> 2014-10-07
<160> 250
<170> Патент в версии 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr 1 5
<210> <211> <212> 2 7
Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 2
Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ala 1 5
<210> 3
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 3
Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr 1 5
<210> 4
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 5
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 5
Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 6
Белок
<211> 7
<212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 6
Gln Asp Thr Asn Arg Pro Ser 1 5
<210> 7
Белок
<211> 9
<212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 7
Gln Ala Trp Asp Ser Asn Thr Ala Val
<210> 8
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 8
Gln Ser Val Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Val Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Thr Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Glu Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Asn Thr Ala Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105
<210> 9
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 9
Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
<210> 10
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека <400> 10
Gly Ser Ser Gly Gly Phe 1 5
<210> 11
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 11
Gly Leu Ala Ala Pro Arg Ser 1 5
<210> 12
<211> 116
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 12
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Ile Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Phe Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Ala Pro Arg Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 13
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 13
Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Ile
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 14
Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser 1 5
<210> 15
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 15
Ala Ser Trp Asp Asp Asn Leu Asn Gly Pro Leu
1 5 10
<210> 16
<211> 113
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 16
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Ala Val Ile Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Gly Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Asn Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Gln
100 105 110
Pro
<210> 17
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 17
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Tyr Pro Val Asn
1 5 10
<210> 18
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 18
Ser Thr Asp Gln Arg Pro Ser 1 5
<210> 19
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 19
Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val 1 5
<210> 20
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 20
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Tyr
20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln
65 70 75 80
Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
<210> 21
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 21
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Glu Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 22
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser 1 5
<210> 23
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 23
Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val 1 5
<210> 24
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 24
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Glu Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105
<210> <211> <212> 25 11
Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 25
Ser Gly Asp Asn Leu Arg His Glu Tyr Ser Ser
1 5 10
<210> 26
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 26
Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5
<210> 27
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 27
Gln Ala Trp Gly Ser Ser Thr Val Val
1 5
<210> 28
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 28
Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg His Glu Tyr Ser
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Leu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Gly Ser Ser Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Gln Pro 100 105
<210> 29
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 29
Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Glu Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 30
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser 1 5
<210> 31
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 31
Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Leu Leu 1 5
<210> 32
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400>
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Glu Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Leu Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105
<210> 33
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 33
Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Glu Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 34
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 34
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser 1 5
<210> 35
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 35
Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Leu Leu 1 5
<210> 36
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 36
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Glu Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Leu Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105
<210> 37
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 37
Thr Gly Asp Lys Leu Gly Asp Gln Phe Ala Ser
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 38
Gln Asn Asp Lys Arg Pro Ser 1 5
<210> 39
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 39
Gln Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Leu 1 5
<210> 40
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 40
Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Thr Gly Asp Lys Leu Gly Asp Gln Phe Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Ile Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Gln Asn Asp Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asp Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Leu
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 100 105
<210> <211> <212> 41 11
Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 41
Ser Gly Gln Ile Leu Gly Glu Arg Ser Ala Ser
<210> 42
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 42
Gln Ser Ser Gln Arg Pro Ser
<210> 43
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 43
Gln Thr Trp Asp Thr Ser Ile Leu
<210> 44
<211> 108
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 44
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly His
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Gln Ile Leu Gly Glu Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Leu Tyr
35 40 45
Gln Ser Ser Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ile Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ser Ile
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Thr Ser Ile Leu Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro 100 105
<210> 45
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 45
Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asn Asn Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 46
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 46
Gln Asp Thr Lys Arg Pro Ser 1 5
<210> 47
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 47
Gln Thr Trp Asp Arg Asn Thr Pro Tyr Val
1 5 10
<210> 48
<211> 110
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400>
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ile Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asn Asn Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Glu Thr Gln Thr Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Arg Asn Thr Pro Tyr
85 90 95
Val Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
<210> 49
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 49
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Asn Thr Leu Asn
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 50
Ala Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5
<210> 51
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220> <223>
Библиотека антител человека
<400> 51
Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Ile Gly Pro Val
1 5 10
<210> 52
<211> 113
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 52
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Thr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ala Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ile Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro
<210> 53
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 53
Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Ile
1 5 10
<210> 54
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 54
Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser 1 5
<210> 55
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 55
Ala Ser Trp Asp Asp Asn Leu Asn Gly Pro Leu
1 5 10
<210> 56
<211> 113
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 56
Gln Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Ala Val Ile Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Gly Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Asn Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Gln
100 105 110
Pro
<210> 57
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 57
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Leu Gly Ser Asn Thr Val Asn
<210> 58
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 58
Thr Asn Ser Gln Arg Pro Ser 1 5
<210> 59
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 59
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val
1 5 10
<210> 60
<211> 113
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 60
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Leu Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Leu Gln Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Gln
100 105 110
Pro
<210> 61
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 61
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Ser Asn Tyr Val Tyr
1 5 10
<210> 62
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 62
Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser
<210> 63
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 63
Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Val
<210> 64
<211> 113
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 64
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Gln
100 105 110
Pro
<210> 65
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 65
Thr Gly Ser Ser Asn Asp Ile Gly Ser Tyr Asp Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 66
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 66
Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5
<210> 67
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 67
Met Ser Tyr Thr Ile Thr Ala Leu Leu 1 5
<210> 68
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 68
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Asp Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Asn Asp Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Arg Ala Pro Lys Phe
35 40 45
Ile Leu Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ala Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Phe Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Met Ser Tyr Thr Ile Thr
85 90 95
Ala Leu Leu Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
69 14
Белок
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 69
Thr Gly Ser Ser His Asp Ile Gly Ser Tyr Asp Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 70
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 70
Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5
<210> 71
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 71
Met Ser Tyr Thr Ile Thr Thr Leu Leu 1 5
<210> 72
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 72
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Asp Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser His Asp Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Tyr His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe
35 40 45
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Met Ser Tyr Thr Ile Thr
85 90 95
Thr Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Arg Val Thr Val Leu Ser Gln Pro
100 105 110
<210> 73
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 73
Ala Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asp Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 74
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 74
Asp Val Tyr Asn Arg Pro Ser 1 5
<210> 75
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 75
Met Ser Tyr Thr Ile Thr Thr Leu Leu
<210> 76
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Met Ser Gly Ser Arg Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ala Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Lys His Leu Pro Gly Asn Ala Pro Lys Phe
35 40 45
Ile Leu Tyr Asp Val Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Met Ser Tyr Thr Ile Thr
85 90 95
Thr Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Arg Val Thr Val Leu Ser Gln Pro
100 105 110
<210> 77
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 77
Thr Gly Ser Ser His Asp Ile Gly Ala Tyr Asp Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 78
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 78
Asp Val Tyr Asn Arg Pro Ser 1 5
<210> 79
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Met Ser Tyr Thr Ile Thr Thr Leu Leu 1 5
<210> 80
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 80
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Asp Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser His Asp Ile Gly Ala Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Lys His Leu Pro Gly Asn Ala Pro Lys Phe
35 40 45
Ile Leu Tyr Asp Val Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Met Ser Tyr Thr Ile Thr
85 90 95
Thr Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Arg Val Thr Val Leu Ser Gln Pro
100 105 110
<210> 81
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 81
Thr Gly Ser Ser His Asp Ile Gly Ala Tyr Asp Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 82
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека <400> 82
Asp Val Tyr Asn Arg Pro Ser 1 5
<210> 83
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 83
Met Ser Tyr Thr Ile Thr Thr Leu Leu 1 5
<210> 84
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 84
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser His Asp Ile Gly Ala Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Lys His Leu Pro Gly Asn Ala Pro Lys Phe
35 40 45
Ile Leu Tyr Asp Val Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Met Ser Tyr Thr Ile Thr
85 90 95
Thr Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Arg Val Thr Val Leu Ser Gln Pro
100 105 110
85 14
Белок
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 85
Thr Gly Ser Ser His Asp Ile Gly Ala Tyr Asp Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 86
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 86
Asp Val Tyr Asn Arg Pro Ser 1 5
<210> 87
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 87
Met Ser Tyr Thr Ile Thr Thr Leu Leu 1 5
<210> 88
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 88
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Tyr Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser His Asp Ile Gly Ala Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Lys His Leu Pro Gly Asn Ala Pro Lys Phe
35 40 45
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Met Ser Tyr Thr Ile Thr
85 90 95
Thr Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Arg Val Thr Val Leu Ser Gln Pro
100 105 110
<210> 89
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 89
Thr Gly Ser Ser His Asp Ile Gly Ala Tyr Asp Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 90
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 90
Asp Val Tyr Asn Arg Pro Ser 1 5
<210> 91
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 91
Met Ser Tyr Thr Ile Thr Thr Leu Leu 1 5
<210> 92
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Asp Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser His Asp Ile Gly Ala Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Lys His Leu Pro Gly Asn Ala Pro Lys Phe
35 40 45
Ile Leu Tyr Asp Val Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Met Ser Tyr Thr Ile Thr
85 90 95
Thr Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Arg Val Thr Val Leu Ser Gln Pro
100 105 110
<210> 93
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 93
Thr Gly Ser Ser His Asp Ile Gly Ala Tyr Asp Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 94
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 94
Asp Val Tyr Asn Arg Pro Ser 1 5
<210> 95
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Met Ser Tyr Thr Ile Thr Thr Leu Leu 1 5
<210> 96
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 96
Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Asp Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser His Asp Ile Gly Ala Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Lys His Leu Pro Gly Asn Ala Pro Lys Phe
35 40 45
Ile Leu Tyr Asp Val Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Met Ser Tyr Thr Ile Thr
85 90 95
Thr Leu Leu Phe Gly Thr Gly Thr Arg Val Thr Val Leu Ser Gln Pro
100 105 110
<210> 97
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 97
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 98
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 98
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 99
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 99
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Pro Thr 1 5
<210> 100
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 100
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
101 12
Белок
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 101
Arg Ala Ser Glu Arg Ile Ser Ser Asn Tyr Leu Met
<210> 102
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 102
Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr
<210> 103
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 103
Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr
<210> 104
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 104
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val Leu Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Arg Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Met Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Gly Ser Glu Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Lys Arg 100 105
<210> 105
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 105
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 106
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 106
Gly Ala Ser Ser Arg Ser Thr 1 5
<210> 107
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 107
Gln Gln Phe Asp Thr Leu Pro Ile Thr 1 5
<210> 108
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ser Thr Gly Thr Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Thr Leu Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys Arg 100 105
<210> 109
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 109
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Ser Gly Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 110
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 110
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5
<210> 111
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Thr Ile Thr
1 5
<210> 112
<211> 110
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 112
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Ser
20 25 30
Gly Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Arg Leu
65 70 75 80
Glu Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
85 90 95
Thr Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 113
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 113
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Gly
1 5 10
<210> 114
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 114
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 115
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 115
Gln Gln Phe Asp Asn Leu Pro Val Thr 1 5
<210> 116
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 116
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asn Leu Pro
85 90 95
Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Lys Arg 100 105
117 12
Белок
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 117
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala
<210> 118
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 118
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
<210> 119
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 119
Gln Gln Phe Asp Thr Ser Pro Leu Thr
<210> 120
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 120
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Thr Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Ile Gly Gly Gly Thr Arg Val Asp Ile Lys Arg 100 105
<210> 121
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 121
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 122
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 122
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 123
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 123
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Leu Ser 1 5
<210> 124
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 125
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 125
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Trp Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 126
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 126
Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5
<210> 127
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Leu Thr 1 5
<210> 128
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 128
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Trp
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Ile Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 129
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 129
Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 130
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 130
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 131
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 131
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Pro Thr 1 5
<210> 132
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 132
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
133 12
Белок
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 133
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
<210> 134
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 134
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
<210> 135
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 135
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Pro Thr
<210> 136
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 136
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 137
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 137
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 138
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 138
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 139
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 139
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Pro Thr 1 5
<210> 140
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 141
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 141
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 142
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 142
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 143
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro Pro Tyr Thr
1 5 10
<210> 144
<211> 110
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 144
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Asn Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> <211> <212> <213>
145 12
Белок
Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека
<400> 145 антител человека
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 146
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 146
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5
<210> 147
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 147
Gln Gln Phe Asp Asn Trp Pro Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 148
<211> 110
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 148
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asn Trp Pro
85 90 95
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 149
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 149
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Phe Gly
<210> 150
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 150
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
<210> 151
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 151
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Leu Thr
<210> 152
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 152
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Phe Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 153
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 153
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 154
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 154
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 155
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 155
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Leu Ser 1 5
<210> 156
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 157
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 157
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 158
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 158
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5
<210> 159
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Leu Ser 1 5
<210> 160
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Thr
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 161
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 161
Arg Ala Ser Gln Ser Leu Asn Asn Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 162
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 162
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5
<210> 163
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 163
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Pro Thr 1 5
<210> 164
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 164
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Asn Asn Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 165
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 165
Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Asp Tyr Leu Ala
<210> 166
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 166
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
<210> 167
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 167
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Pro Thr
<210> 168
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 168
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 169
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 169
Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Asp Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 170
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 170
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 171
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 171
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Pro Thr 1 5
<210> 172
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 173
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 173
Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Asp Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 174
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 174
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 175
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Pro Thr 1 5
<210> 176
<211> 109
<212> Белок
<213> Библиотека антител человека
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 176
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 177
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 177
Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Asp Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 178
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<400> 178
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 179
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 179
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Pro Thr 1 5
<210> 180
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 180
Ile Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser His Ser Val Ser
20 25 30
Ser Asp Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Arg
35 40 45
Leu Leu Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg
65 70 75 80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser
85 90 95
Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 181
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 181
Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Asp Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 182
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 182
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 183
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 183
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Pro Thr 1 5
<210> 184
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Из библиотеки антител человека
<400> 184
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser His Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Ile Asp Ile Lys Arg 100 105
<210> 185
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)..(8)
<223> остаток представляет собой V или I
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)..(10)
<223> остаток представляет собой G или L
<400> 185
Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr Xaa Met Xaa
1 5 10
<210> 186
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3)..(3)
<223> остаток представляет собой Y или G
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> остаток представляет собой P или S
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)..(8)
<223> остаток представляет собой A или F
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)..(10)
<223> остаток представляет собой N или D
Ser Ile Xaa Xaa Ser Gly Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 187
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)..(1)
<223> остаток представляет собой S Q или T
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3)..(3)
<223> остаток представляет собой D E или Q
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> остаток представляет собой K S N I или A
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (6)..(6)
<223> остаток представляет собой G или R
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (7)..(7)
<223> остаток представляет собой D S H E или N
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)..(8)
<223> остаток представляет собой E Y Q R или N
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (9)..(9)
<223> остаток представляет собой Y F или S
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)..(10)
<223> остаток представляет собой A или S
<400> 187
Xaa Gly Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser
1 5 10
<210> 188
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> остаток представляет собой S или T
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (7)..(7)
<223> остаток представляет собой I или L
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)..(8)
<223> остаток представляет собой E или G
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (9)..(9)
<223> остаток представляет собой T S или N
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)..(10)
<223> остаток представляет собой N или Y
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (11)..(11)
<223> остаток представляет собой T P A или Y
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (12)..(12)
<223> остаток представляет собой V или L
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (13)..(13)
<223> остаток представляет собой N I или Y
<400> 188
Ser Gly Ser Xaa Ser Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 189
<211> 14
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная
ВАРИАНТ
<220> <221> <222>
<223> остаток представляет собой A или T
ВАРИАНТ
(3)..(3)
<220> <221> <222>
<223> остаток представляет собой S или T
ВАРИАНТ
(5)..(5)
<220> <221> <222>
<223> остаток представляет собой H S или N
ВАРИАНТ
(7)..(7)
<220> <221> <222>
<223> остаток представляет собой I или V
ВАРИАНТ
(9)..(9)
<220> <221> <222>
<223> остаток представляет собой S или A
<400> 189
Xaa Gly Xaa Ser Xaa Asp Xaa Gly Xaa Tyr Asp Tyr Val Ser
<210> 190
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)..(1)
<223> остаток представляет собой Q D T Y S или A
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (2)..(2)
<223> остаток представляет собой D N S T или V
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3)..(3)
<223> остаток представляет собой D N S T или Y
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> остаток представляет собой Q K N или L
<222> (5)..(5)
<223> остаток представляет собой R или L <400> 190
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Ser 1 5
<210> 191
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (2)..(2)
<223> остаток представляет собой A или T
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> остаток представляет собой D или G
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (5)..(5)
<223> остаток представляет собой R, или аминокислота отсутствует
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (6)..(6)
<223> остаток представляет собой S F или N
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (7)..(7)
<223> остаток представляет собой S T или N
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)..(8)
<223> остаток представляет собой S T или P
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (9)..(9)
<223> остаток представляет собой A V L I или Y
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)..(10)
<223> остаток представляет собой V или L
<400> 191
<210> 192
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (2)..(2)
<223> остаток представляет собой A S или T
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (6)..(6)
<223> остаток представляет собой N или S
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)..(8)
<223> остаток представляет собой N I или G
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (9)..(9)
<223> остаток представляет собой G или S
ВАРИАНТ (10)..(10)
<220> <221> <222>
<223> остаток представляет собой P W или V
ВАРИАНТ (11)..(11)
<220> <221> <222>
<223> остаток представляет собой V или L
<400> 192
Ala Xaa Trp Asp Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa
<210> 193
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (7)..(7)
<223> остаток представляет собой A или T
<400> 193
<210> 194
<211> 13
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> остаток представляет собой Q E или H
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (5)..(5)
<223> остаток представляет собой S R или N
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (6)..(6)
<223> остаток представляет собой V I или L
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (7)..(7)
<223> остаток представляет собой S R G или N
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)..(8)
<223> остаток представляет собой S или N
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (9)..(9)
<223> остаток представляет собой S N W или D
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)..(10)
<223> остаток представляет собой G, или аминокислота отсутствует
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (12)..(12)
<223> остаток представляет собой L или F
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (13)..(13)
<223> остаток представляет собой A G M или S
<400> 194
Arg Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa
1 5 10
<210> 195
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> остаток представляет собой S T I или N
<400> 195
Gly Ala Ser Xaa Arg Ala Thr
1 5
<210> 196
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3)..(3)
<223> остаток представляет собой F или Y
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> остаток представляет собой D G или Y
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (5)..(5)
<223> остаток представляет собой S T или N
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (6)..(6)
<223> остаток представляет собой S L или W
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (7)..(7)
<223> остаток представляет собой P, или аминокислота отсутствует
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)..(8)
<223> остаток представляет собой P или T
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (9)..(9)
<223> остаток представляет собой L I V P W или Y
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)..(10)
<223> остаток представляет собой T или S
Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 197
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
<400> 197
Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr 1 5
<210> 198
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
<400> 198
Tyr Pro Gln Gly Gly Ala
1 5
<210> 199
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
<400> 199
Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr 1 5
<210> 200
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
<400> 200
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
Val Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Gln Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 201
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
<400> 201
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Phe Gly
1 5 10
<210> 202
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
<400> 202
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 203
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
Gln Gln Phe Asp Ser Leu Pro Leu Thr 1 5
<210> 204
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
<400> 204
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Phe Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Leu Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 205
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
<400> 205
Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr 1 5
<210> 206
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
Tyr Pro Gln Gly Gly Ala
1 5
<210> 207
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
<400> 207
Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr 1 5
<210> 208
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
<400> 208
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Gln Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
<400> 209
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Phe Gly
1 5 10
<210> 210
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
<400> 210
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 211
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутация члена библиотеки
<400> 211
Gln Gln His Asp Ser Ser Pro Leu Ser 1 5
<210> 212
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 212
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Phe Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 213
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 213
Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
<210> 214
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 214
Tyr Pro Ser Gly Gly Ala 1 5
<210> 215
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 215
Gly Asn Tyr Leu Asp Tyr 1 5
<210> 216
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asn Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 217
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 217
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Phe Gly
1 5 10
<210> 218
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 218
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 219
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Leu Ser 1 5
<210> 220
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 220
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Phe Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 221
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 221
<210> <211> <212> <213>
222 6
Белок
Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 222
Tyr Pro Ser Gly Gly Ala 1 5
<210> <211> <212> <213>
<220> <223>
<400>
223 6
Белок
Искусственная последовательность
Мутированная последовательность библиотеки
223
Gly Pro Tyr Leu Asp Tyr 1 5
<210> 224
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 224
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100
105
110
Val Ser Ser
115
<210> 225
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 225
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Phe Gly
1 5 10
<210> 226
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 226
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
<210> 227
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 227
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Leu Thr
<210> 228
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 228
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
Tyr Phe Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 229
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 229
Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr 1 5
<210> 230
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 230
Tyr Pro Ser Gly Gly Ala 1 5
<210> 231
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 231
<210> 232
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 232
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 233
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 233
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Phe Gly
1 5 10
<210> 234
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
Мутированная последовательность библиотеки
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 235
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 235
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Leu Thr 1 5
<210> 236
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 236
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Phe Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105
<210> 237
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 237
Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr Val Met Gly
1 5 10
<210> 238
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 238
Ser Ile Tyr Pro Gln Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> <211> <212> <213>
<220> <223>
<400>
239 17
Белок
Искусственная последовательность
Мутированная последовательность библиотеки
239
Ser Ile Tyr Pro Gln Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 240
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 240
Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> <211> <212> <213>
241 6
Белок
Искусственная последовательность
<223> Мутированная последовательность библиотеки <400> 241
Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr 1 5
<210> 242
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 242
Gly Asn Tyr Leu Asp Tyr
<210> 243
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 243
Gly Pro Tyr Leu Asp Tyr 1 5
<210> 244
<211> 6
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 244
Gly Ser Tyr Leu Asp Tyr 1 5
<210> 245
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 245
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Phe Gly
1 5 10
<210> 246
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 246
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> <211> <212> <213>
247
Белок
Искусственная последовательность
<220> <223>
Мутированная последовательность библиотеки
<400> 247
Gln Gln Phe Asp Ser Leu Pro Leu Thr 1 5
<210> <211> <212> <213>
248
Белок
Искусственная последовательность
<220> <223>
Мутированная последовательность библиотеки
<400> 248
Gln Gln His Asp Ser Ser Pro Leu Ser 1 5
<210> 249
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
<400> 249
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Leu Ser 1 5
<210> 250
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Мутированная последовательность библиотеки
Gln Gln Phe Asp Ser Ser Pro Leu Thr 1 5
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенное антитело или его фрагмент, которое(ый) связывается с VEGFR2 человека, включающее(ий) вариабельный домен тяжелой цепи, который включает последовательность CDR1, CDR2 и CDR3, причем:
(i) последовательность CDR1 представляет собой GFTFSWYVMG
(SEQ ID N0:237),
(ii) последовательность CDR2 выбирают из группы, состоящей
SIYPQGGATSYADSVKG (SEQ ID N0:238), SIYPQGGATNYADSVKG (SEQ ID N0:239) и SIYPSGGATNYADSVKG (SEQ ID N0:240); и
(ii) последовательность CDR3 выбирают из группы, состоящей
GNYFDY (SEQ ID N0:241), GNYLDY (SEQ ID N0:242), GPYLDY (SEQ ID N0:243) и GSYLDY (SEQ ID N0:244),
с условием, что вариабельный домен тяжелой цепи не включает вместе и последовательность CDR2 SEQ ID N0:240, и последовательность CDR3 SEQ ID N0:241.
2. Антитело или фрагмент по п. 1, включающее(ий)
вариабельный домен легкой цепи, который включает
последовательность CDR1, CDR2 и CDR3, причем
(i) последовательность CDR1 представляет собой RASQSVSSNYFG
(SEQ ID N0:245),
(ii) последовательность CDR2 представляет собой GASSRAT (SEQ ID N0:246), и
(iii) последовательность CDR3 выбирают из группы, состоящей
QQFDSLPLT (SEQ ID N0:247), QQHDSSPLS (SEQ ID N0:248), QQFDSSPLS (SEQ ID N0:249) и QQFDSSPLT (SEQ ID N0:250).
3. Антитело или фрагмент по п. 1, в котором CDR2 вариабельного домена тяжелой цепи имеет последовательность
3.
SIYPQGGATSYADSVKG (SEQ ID N0:238), a CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи имеет последовательность GNYFDY (SEQ ID N0:241).
4. Антитело или фрагмент по п. 2, в котором CDR3
вариабельного домена легкой цепи имеет последовательность
QQFDSLPLT (SEQ ID N0:247).
5. Антитело или фрагмент по п. 1, в котором вариабельный домен тяжелой цепи имеет последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID N0:200, SEQ ID N0:208, SEQ ID N0:216, SEQ ID N0:224 и SEQ ID N0:232.
6. Антитело или фрагмент по п. 2, в котором вариабельный домен легкой цепи имеет последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID N0:204, SEQ ID N0:212, SEQ ID N0:220, SEQ ID N0:228 и SEQ ID N0:236.
7. Антитело или фрагмент по п. 2, в котором вариабельный домен тяжелой цепи имеет последовательность, которая представляет SEQ ID N0:200, а вариабельный домен легкой цепи имеет последовательность, которая представляет собой SEQ ID N0:204.
8. Антитело или фрагмент по любому из п. п. 1-7, которое имеет изотип IgG.
9. Антитело или фрагмент по любому из п.п. 1-7, которое(ый) представляет собой scFv, Fv, Fab', Fab, F(ab')2 или диатело.
10. Антитело или фрагмент по любому из п. п. 1-9,
которое(ый) связывается с человеческим VEGFR2 и мышиным VEGFR2.
11. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или фрагмент по любому из п.п. 1-10.
12. НК-вектор, включающий выделенную нуклеиновую кислоту по п. 11.
13. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту по п. 11.
14. Композиция, содержащая антитело или фрагмент по любому из п.п. 1-10 и фармацевтически приемлемый носитель.
15. Способ подавления активации человеческого VEGFR2 или мышиного VEGFR2, включающий приведение клетки в контакт с эффективным количеством антитела или фрагмента по любому из п.п. 1-10 .
11.
16. Способ ингибирования ангиогенеза, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или фрагмента по любому из п.п. 1-10.
17. Способ уменьшения роста опухоли, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или фрагмента по любому из п.п. 1-10.
18. Способ лечения неопластических заболеваний у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или фрагмента по любому из п. п. 1-10, причем неопластические заболевания выбирают из группы, состоящей из рака легкого, колоректального рака, почечно-клеточного рака, глиобластомы, рака яичников, рака мочевого пузыря, рака желудка, множественной миеломы, немелкоклеточного рака легкого и рака поджелудочной железы.
19. Способ по любому из п.п. 16-18, который, кроме того, включает введение субъекту эффективного количества антагониста рецептора эпидермального фактора роста (EGFR).
20. Способ по любому из п.п. 16-18, который, кроме того, включает введение субъекту эффективного количества антагониста рецепторной fms-подобной тирозинкиназы (flt-1).
21. Способ по любому из п.п. 16-18, который, кроме того, включает введение субъекту эффективного количества антагониста rho-ассоциированной киназы 2 (ROCK2).
22. Способ по любому из п.п. 16-18, который, кроме того, включает введение субъекту эффективного количества антагониста матриксных металлопротеиназ.
23. Способ по любому из п.п. 16-18, который, кроме того, включает введение субъекту эффективного количества антитела против PDGFR|3.
24. Способ по любому из п.п. 16-18, который, кроме того, включает введение субъекту эффективного количества антитела против PD-L1.
25. Способ по любому из п. п. 16-18, в котором пациентом является человек.
11.
№ по Kabat
SEQ ID NO. 4
1 2 1234567890123456789012345
EVQLLE SGGGLVQPGGSLRLSCAAS EVQLLE SGGGLVQPGGSLRLSCAAS
6789012345AB
GFTFSWYVMG GFTFSWYIML
67890123
WVRQAPGK WVRQAPGK
№ ПО
Kabat
SEQ ID NO. 4
12 4 5 6 7 8 9
G L E W V S G L E W V S
А В
С 3
5 6
9 0 1
2 3 4 5
P -
- S
G A
Y A D
S V К G
s -
- S
G F
Y A D
S V К G
8 9 0 1
6 7
2 3 4 5 6 7
2 А В С
8 9 0 1
RFTISRDNSKNTLYLQMNSL RFTISRDNSKNTLYLQMNSL
№ ПО
Kabat
SEQ ID NO. 4
345678901234
RAEDTAVYYCAR RAEDTAVYYCAR
1 0
567890ABCDEFGHIJK12
GNYF DY
GLAAP RS
1 0
34567890123
WGQGTLVTVSS WGRGTLVTVSS
ФИГ. 1A
Kabat
SEQ ID NO.
7 А В С D
Е F
8 9
I G
I G
I G
I G
L G
I Е
G S
G S
VGA
G А
G А
G А
G А
G А
ФИГ. 1В1
Kabat
SEQ ID NO
ФИГ. 1В2
l о
Kabat
5 А В С D Е
F 6
SEQ ID NO:
Т Р
L N G
L I G
L N G
L N G
L S G
ФИГ. 1ВЗ
Kabat 123456789012345678
SEQ ID NO:
100 DIQMTQSPGTLSLSPGER
104 DIQMTQSPGTLSVLPGER
108 DIQMTQSPGTLSLSPGER
112 DIQMTQSPATLSLSPGER
116 DIQMTQSPGTLSLSPGER
120 DIQMTQSPGTLSLSPGER
124 DIQMTQSPGTLSLSPGER
128 DIQMTQSPGTLSLSPGER
132 DIQMTQSPGTLSLSPGER
136 DIQMTQSPGTLSLSPGER
140 DIQMTQSPGTLSLSPGER
144 DIQMTQSPGTLSLSPGER
148 DIQMTQSPGTLSLSPGER
152 DIQMTQSPGTLSLSPGEG
156 DIQMTQSPGTLSLSPGER
160 DIQMTQSPGTLSLSPGDR
164 DIQMTQSPGTLSLSPGER
168 DIQMTQSPATLSLSPGER
172 D IQMTQSPATLSVSPGER
176 DIQMTQSPGTLSLSPGER
180 DIQMTQSPDTLSLSPGER
184 DIQMTQSPDTLSLSPGER
А В С D Е
F 8
S I
ФИГ. 1С1
№ по Kabat
SEQ ID NO:
8 9 0
123456789
5 0
1 2 3 4 5 6
6 7 8
789012345678901234567890
100
104
108
112
116
120
124
128
132
136
140
144
148
152
156
160
164
168
172
176
180
184
ФИГ. 1С2
№ ПО
Kabat
SEQ ID NO:
100
104
108
112
116
120
124
128
132
136
140
144
148
152
156
160
164
168
172
176
180
184
QQFDSSP РТ
QQYYSSP LT
QQFDTLP IT
QQYGSST IT
QQFDNLP VT
QQFDTSP LT
QQFDSSP LS
QQFDSSP LT
QQFDSSP PT
QQFDSSP PT
QQFDSSP PT
QQFGSSPP YT
QQFDNWPP WT
QQFDSSP LT
QQFDSSP LS
QQFDSSP LS
QQFDSSP PT
QQFDSSP PT
QQFDSSP PT
QQFDSSP PT
QQFDSSP PT
QQFDSSP PT
М К
м к
ФИГ. 1СЗ
Связывание с hVEGFR2
Log (И|
Связывание с D2-3 Fc VEGFR2
0.0 I ,
-11 -10 -9- -В -7 -6
Lqgi|l|
Блокирование связывания VEGF-165 с VEGFR2
¦16 -14 -12 -10 -S -в Log (Ml
ФИГ. 2
VEGF - #-####+ + 40 НГ/МЛ
AT - - 15 15 3 0.6 0.12 0.024 0.005 МКГ/МЛ
-mm mmm ^ - тшт mmm mm -" KDR
101 • ... P-AKT
-. - "... тяя^ АКТ
^SS SS: 2SS2S? S S55 SSr SSS P44/42
VEGF - #-# + ##+ + 40 НГ/МЛ
AT - 15 15 3 0.6 0.12 0.024 0.005 МКГ/МЛ
~~ mmm mm mm mm mmm mm "ь" Ши" KDR
- -
ФИГ. 3
Связывание с hVEGFR2(1)
42 41 -10 -9-3-7-6
Log {MI
Log (Щ
ФИГ. 4
Блокирование связывания VEGF-165 с VEGFR2(1)
VEGF (40 нг/мл) - ########
АнТИТеЛО (МКГ/МЛ) О О 7.5 2.5 0.83 0.27 0.09 0.03 0.01
KDR
P~KDR ям. ...^ ""^ 101
P-KDR ^ ""**• " "Г " Ю5
KDR
VEGF (40 нг/мл) -+ + ++ ++ + +
АнТИТеЛО (МКГ/МЛ) О О 7.5 2.5 0.83 0.27 0.09 0.03 0.01
-' - -- ттт "ат* ттт р-Р44/42
Р44/42 106
.,, ^ ^ -, ^ р.р44/42
. ",.. щтят ^ ^ р-Р44/42
_ _ \_ _ _ _ ^ р4^2 105
VEGF (30 нг/мл) - ********
АнТИТеЛО (МКГ/МЛ) - - 15 5 1.7 0.56 0.19 0.06 0.02
, p-Akt
106 _ _ -^ _ -т _ ~
- - -. " p-Akt
105 "~ - - - Akt
ФИГ. 5
№ по Kabat
SEQ ID NO. 4 200 208 216 224 232
1 2 1234567890123456789012345
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS EVQLLE SGGGLVQPGGSLRLSCAAS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
1 2
3 4
W Y
V M
W Y
V M
W Y
V M
W Y
V M
W Y
V M
W Y
V M
№ по Kabat
SEQ ID NO. 4 200 208 216 224 232
345678901
2 А
SGGATNYAD
М N
QGGATSYAD
М N
QGGATNYAD
М N
SGGATNYAD
М N
SGGATNYAD
М N
SGGATNYAD
М N
№ по Kabat
SEQ ID NO. 4 200 208 216 224 232
345678901234
RAEDTAVYYCAR RAEDTAVYYCAR RAEDTAVYYCAR RAEDTAVYYCAR RAEDTAVYYCAR RAEDTAVYYCAR
1 0
567890ABCDEFGHIJK12
GNYF DY
GNYF DY
GNYF DY
GNYL DY
GPYL DY
GSYL DY
1 0
ФИГ. 6A
№ по Kabat
SEQ ID NO: 160 204 212 220 228 236
№ ПО
Kabat
SEQ ID NO: 160 204 212 220 228 236
7 А В С D Е
F 8
5 6 7
Q S
W Y Q
Q S
W Y Q
Q S
W Y Q
Q S
W Y Q
Q S
W Y Q
Q S
W Y Q
№ по Kabat
SEQ ID NO: 160 204 212 220 228 236
1 О
9 0 12
5 А В С D Е
F 6
3 4
Q Q F D
К V
Q Q F D
К V
Q Q Н D
К V
Q Q F D
К V
Q Q F D
К V
Q Q F D
К V
ФИГ. 6В
hVEGFR2
(+) мАт против VEGFR2 мыши (отличное 2' At) мАт147 мАтЮб
(+) At против VEGFR2 человека
Log (M)
hVEGF-hVEGFR2
ELISA блокирования
mVEGF-mVEGFR2
-13
-12
* Л ж
-11 -10 Log (M)
ш го
140 120 100
80-J
20 0 -20
-13 -12 -11 -10 -9 Log (М)
(+) мАт против VEGFR2
мыши
мАт147
мАтЮб
(+) Ат против VEGFR2 человека
ФИГ. 7
П ш
Связывание с IWEGFR2 на HUVEC и KDR-PAE
HUVEC
KDR-PAE
30-,
20-
ш о
го ^
9-5
Ш s
X О 10-
О о
-14
-12
-10 Log (М)
-•- (+) At - мАтЮб ^мАт147
-•- (+) Ат
- мАтЮб
- мАт147
Связывание с mVEGFR2 на клетках MS1
Связывание с MS1
ш о
^ i
го ^
8-р
Ш S
20-,
15-
10-
+ Ат
мАтЮб
мАт147
-12
-11
-10 -9 -8 Log (М)
ФИГ. 8
мАтЮб мАт147 (-)Ат hVEGF-A (30 нг/мл): - ######## Ат (мкг/мл): - - ^ Q.6 0.12 д о.б 0.12 0.12
ят- KDR
Р-Р44/42
"И- Р44/42
hVEGF-A (30 нг/мл Ат (мкг/мл
(+)Ат
# 1
# 5
мАтЮб мАт147 (-)Ат
# 5
ФИГ. 9
p-KDR
KDR
Р-Р44/42
Р44/42
Концентрация антитела, нМ
400 350 100
;so
,'ПО
ISO 100
50 нг/мл VEGF (наверху) 100 нг/мл VEGF (внизу)
х^ xi^ xi^
^ к <# ^ ^
^ # <г # # # #
ФИГ. 10
(наверху): 15 мкг/мл AT (внизу): 100 нг/мл of VEGF
(наверху): 3 мкг/мл AT внизу): 100 нг/мл of VEGF
(наверху): 0.6 мкг/мл AT (внизу): 100 нг/мл of VEGF
(наверху): Отсутствие AT : Отсутствие VEGF
(наверху): Отсутствие Ат (внизу): 100 нг/мл of VEGF
00 CD
ФИГ. 11
(+), Ат против hVEGFR2 мАт147 (-)Ат
Антитело, мкг/мл: 10 3 t ю 3 г ы
i " I t ¦ I
mVEGF, 50 нг/мл: ¦ ¦
I- о
цвет
Юм кг/мл of Ат
красный
только 2' Ат
розовый
мАт147
лаймовый
(+), anti-mVEGFR2-l
морской
(+), anti-mVEGFR2-2
волны
""""Г" I I 11 in | YnrrtrVrrp i i i iini'ii i i i i in
ЮеО 10e1 1Ce2 ЮеЗ 10e4
Желтая флуоресценция (YEL-HLog)
ФИГ. 12
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
<210> <211> <212>
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Ile Leu Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ile Leu Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 76
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 76
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 76
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 76
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 76
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 76
<220>
<223> Библиотека антител человека
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 79
<400> 79
<210> <211> <212>
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Ile Leu Tyr Asp Val Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ile Leu Tyr Asp Val Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400>
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400>
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<220>
<223> Из библиотеки Fab человека
<400> 95
<400> 95
<210> <211> <212>
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<220>
108
<223> Библиотека антител человека
<400>
<220>
108
<223> Библиотека антител человека
<400>
<220>
<223> Библиотека антител человека
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 111
<400> 111
<210> <211> <212>
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<220>
124
<223> Библиотека антител человека
<400>
<220>
124
<223> Библиотека антител человека
<400>
<220>
<223> Библиотека антител человека
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 127
<400> 127
<210> <211> <212>
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<213> Искусственная последовательность
<213> Искусственная последовательность
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<220>
140
<223> Из библиотеки антител человека
<400>
<220>
140
<223> Из библиотеки антител человека
<400>
<220>
<223> Библиотека антител человека
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 143
<400> 143
<220>
<220>
<400> 143
<400> 143
<220>
<220>
<400> 143
<400> 143
<220>
<220>
<223> Библиотека антител человека
<223> Библиотека антител человека
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<220>
156
<223> Библиотека антител человека
<400>
<220>
156
<223> Библиотека антител человека
<400>
<220>
<223> Библиотека антител человека
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 159
<400> 159
<220>
<220>
<223> Библиотека антител человека
<223> Библиотека антител человека
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<220>
172
<223> Из библиотеки антител человека
<400>
<220>
172
<223> Из библиотеки антител человека
<400>
<220>
<223> Библиотека антител человека
<220>
<223> Библиотека антител человека
<400> 175
<400> 175
<220>
<220>
<223> Библиотека антител человека
<223> Библиотека антител человека
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
<400> 186
<400> 186
ВАРИАНТ
<220> <221>
ВАРИАНТ
<220> <221>
ВАРИАНТ
<220> <221>
ВАРИАНТ
<220> <221>
ВАРИАНТ
<220> <221>
ВАРИАНТ
<220> <221>
ВАРИАНТ
<220> <221>
ВАРИАНТ
<220> <221>
Gln Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
Gln Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
Met Tyr Ser Thr Ile Thr Xaa Leu Leu 1 5
Met Tyr Ser Thr Ile Thr Xaa Leu Leu 1 5
<400> 196
<400> 196
203
<400>
203
<400>
203
<400>
203
<400>
<400> 206
<210> 209
<400> 216
<400> 216
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 219
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 219
Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr 1 5
Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr 1 5
Gly Ser Tyr Leu Asp Tyr 1 5
Gly Ser Tyr Leu Asp Tyr 1 5
Gly Ser Tyr Leu Asp Tyr 1 5
Gly Ser Tyr Leu Asp Tyr 1 5
<220> <223>
<220> <223>
<400> 234
<400> 234
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
<400> 250
<400> 250
№ по
1 2
№ по
1 2
№ по
№ по
№ по l
2 3
№ по l
2 3
215
8/19
215
8/19
9/19
9/19
11/19
11/19
17/19
17/19
17/19
17/19
17/19
17/19
17/19
19/19
19/19
19/19