[RU]

В данном документе раскрыты распознающие молекулы, которые связываются с помощью первого связывающего домена с Fc-эпсилон-рецептором (Fc εR) и с помощью второго связывающего домена с Fc-гамма-рецептором IIB (Fc γRIIB), a также пути применения таких распознающих молекул.

(57) Реферат / Формула:

В данном документе раскрыты распознающие молекулы, которые связываются с помощью первого связывающего домена с Fc-эпсилон-рецептором (Fc εR) и с помощью второго связывающего домена с Fc-гамма-рецептором IIB (Fc γRIIB), a также пути применения таких распознающих молекул.

---

Евразийское (21) 201790314 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.06.30
(22) Дата подачи заявки 2015.08.13
(51) Int. Cl.
C07K16/28 (2006.01) A61K39/395 (2006.01) A61P37/00 (2006.01)
(54) НОВЫЕ АНТИТЕЛА, НАПРАВЛЕННЫЕ НА FC-ГАММА-РЕЦЕПТОР IIB И FC-ЭПСИЛОН-РЕЦЕПТОР
(31) 14002825.9
(32) 2014.08.13
(33) EP
(86) PCT/EP2015/068667
(87) WO 2016/023985 2016.02.18
(71) Заявитель: ЗУППРЕМОЛЬ ГМБХ (DE)
(72) Изобретатель:
Карле Анна, Диренбергер Каролин, Сондерман Петер, Мюллер Мартина, Рит Николе, Поль Томас (DE)
(74) Представитель:
Носырева Е.Л. (RU)
(57) В данном документе раскрыты распознающие молекулы, которые связываются с помощью первого связывающего домена с Fc-эпсилон-рецептором (FceR) и с помощью второго связывающего домена с Fc-гамма-рецептором IIB (FcyRIIB), a также пути применения таких распознающих молекул.
P21217501EA
НОВЫЕ АНТИТЕЛА, НАПРАВЛЕННЫЕ НА FC-ГАММА-РЕЦЕПТОР ПВ
И FC-ЭПСИЛОН-РЕЦЕПТОР
[001] Антитело связывается с антигеном и нейтрализует его посредством предотвращения его связывания со своей эндогенной мишенью (например, рецептором или лигандом) или посредством индуцирования эффекторных ответов, которые приводят к удалению антигена. Для эффективного удаления и/или разрушения антигенов, чужеродных для организма, антитело должно проявлять как высокую аффинность к своему антигену, так и эффективные эффекторные функции. Антитела с полиспецифичностью (такие как, например, биспецифические антитела) применимы для опосредования комплементарных или синергических ответов на несколько антигенов.
[002] Эффекторные функции антитела опосредованы Fc-областью антитела. Эффекторные функции подразделяются на две категории: (1) эффекторные функции, которые действуют после связывания антитела с антигеном (данные функции подразумевают участие системы комплемента или клеток, несущих Fc-рецептор (FcR)); и (2) эффекторные функции, которые действуют независимо от связывания с антигеном (данные функции обеспечивают персистирование антитела в кровотоке и его способность к переносу через клеточные барьеры путем трансцитоза). Поскольку Fc-рецепторы опосредуют эффекторную функцию антитела путем связывания с Fc-областью когнатного антитела рецептора, FcR определяют по их специфичности к изотипам иммуноглобулинов: Fc-рецепторы, специфичные для антител IgG, обозначают как FcyR; Fc-рецепторы антител IgE обозначают как FceR; Fc-рецепторы антител IgA обозначают как FcaR и так далее.
[003] Были идентифицированы три подкласса FcyR: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD 16). FcyRIIB характеризуется наличием мотива ITIM (консенсусная последовательность: V/I-X-Y-X2-V/L, Isakov (1997), Immunol Res.
16, 85-100) в цитоплазматическом домене, который фосфорилируется киназой Lyn при связывании с агрегатами Ig или 1С и колигировании с несущими ITAM активирующими F су-рецепторами. Фосфорилированный ITIM привлекает SH2-домен инозитолполифосфат-5'-фосфатазы (SHIP), которая, в свою очередь, гидролизует фосфоинозитольные мессенджеры, высвобождаемые в результате активации тирозинкиназ, опосредованной ITAM-содержащим FcyR, таким образом предотвращая приток внутриклеточного Са . Перекрестное сшивание FcyRIIB ингибирует активирующий ответ на лигирование FcyR, что, в свою очередь, ингибирует активацию, пролиферацию В-клеток и секрецию ими антител.
[004] Fc-эпсилон-рецепторы (FceR) встречаются на поверхности тучных клеток и базофилов, а также на эозинофилах, моноцитах, макрофагах и тромбоцитах у людей. Существует два типа Fce-рецепторов: FceRI (Fee-рецептор I типа), высокоаффинный рецептор IgE, и FceRII (Fee-рецептор II типа), также известный как CD23, низкоаффинный рецептор IgE. IgE может увеличивать экспрессию обоих типов Fce-рецепторов.
[005] Иммуноглобулин Е (IgE) представляет собой класс антител (или "изотип" иммуноглобулинов (Ig)), который был обнаружен только у млекопитающих. IgE существует в виде мономеров, содержащих две тяжелые цепи (е-цепи) и две легкие цепи, при этом е-цепь содержит 4 Ig-подобных константных домена (Cel-Се4). IgE также играет важную роль в реакциях гиперчувствительности I типа (Gould Н et al. (2003), Annu. Rev. Immunol. 21: 579-628), которые проявляются при различных аллергических заболеваниях, таких как аллергическая астма, большинство типов синусита, аллергический ринит, пищевая аллергия и некоторые типы хронической крапивницы и атопического дерматита. IgE также играет основную роль при аллергических состояниях, таких как анафилактические реакции на определенные лекарственные средства, пчелиные укусы и антигенные препараты, применяемые при специфической десенсибилизирующей иммунотерапии.
[006] IgE запускает IgE-опосредованную аллергическую реакцию путем связывания с FceR, встречающимися на поверхности тучных клеток и базофилов. Связывание антигенов с IgE, уже связанным с FceRI на тучных клетках, приводит к перекрестному сшиванию связанного IgE и агрегации нижерасположенного FceRI, что приводит к дегрануляции и высвобождению медиаторов из клеток. Базофилы при перекрестном сшивании IgE на их поверхности антигенами высвобождают питокины 2 типа, такие как интерлейкин-4 (IL-4) и интерлейкин-13 (IL-13), и другие провоспалительные медиаторы. Низкоаффинный рецептор (FceRII) всегда экспрессируется на В-клетках, но его экспрессия может быть индуцирована с помощью IL-4 на поверхностях макрофагов, эозинофилов, тромбоцитов и некоторых Т-клеток.
[007] Тучные клетки и базофилы являются важными иммунорегулирующими клетками и центральными эффекторными клетками в IgE-зависимых аллергических реакциях и во многих других острых или хронических воспалительных процессах. Данные типы клеток имеют рецепторы как IgG, так и IgE. Активация высокоаффинного рецептора IgE (Fc-эпсилон RI) на участвующих в аллергических реакциях эффекторных клетках, таких как тучные клетки и базофилы, индуцирует множество положительных сигналов посредством иммунорецепторных тирозиновых активирующих мотивов (ITAM), что приводит к быстрому проявлению аллергических воспалительных реакций. В противовес этому, коагрегация рецептора IgG Fc-гамма RIIB опосредует ингибирующие сигналы посредством иммунорецепторных тирозиновых ингибирующих мотивов (ITIM).
[008] Успехи в положительной и отрицательной регуляции экспрессии Fc-рецептора и передачи сигналов через них пролили свет на роль Fc-рецепторов в иммунной системе, указывая на то, что они являются бифункциональными, ингибирующими и активирующими структурами. На основе этих полученных сведений были разработаны новые терапевтические стратегии, такие как применение химерных белков слияния, которые одновременно активируют Fc-эпсилон RI и Fc-гамма RIIB. В этих новых подходах используют преимущество
двухвалентной природы Fc-рецепторов и создают почву для инновационных стратегий модулирования аллергических иммунных реакций. Пример такого химерного белка слияния раскрыт в WO 2002/088317.
[009] Однако, несмотря на тот факт, что из уровня техники известно еще больше таких химерных белков слияния, см. также WO 2006/028956, тем не менее, весьма желательно предложить улучшенные химерные белки слияния, которые проявляют по меньшей мере две функции - во-первых, связывание с Fc-эпсилон-рецептором, и во-вторых, связывание с Fc-гамма-рецептором ПВ, обеспечивая таким образом коагрегапию обоих рецепторов.
[0010] Настоящее раскрытие удовлетворяет данную потребность, предлагая распознающие молекулы, описанные ниже в данном документе, охарактеризованные в формуле изобретения и проиллюстрированные прилагаемыми примерами и фигурами.
[ООН] Зная, что агрегация рецептора IgE с рецептором IgG (FcyRIIb) на базофилах или тучных клетках ингибирует индуцированную аллергеном дегрануляцию клеток (Daeron (1997), Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 138-141), авторы настоящего изобретения предлагают распознающие молекулы, которые, если так можно выразиться, не только обеспечивают перекрестное сшивание или коагрегапию этих двух рецепторов с целью ингибирования IgE-опосредованной активации тучных клеток и базофилов, но также усиливают функцию отрицательной регуляции Fc-гамма RIIB с целью улучшения лечения заболеваний, ассоциированных с базофилами и/или тучными клетками, таких как аллергические заболевания. Как описано в данном документе выше, активация высокоаффинного рецептора IgE (Fc-эпсилон RI) на участвующих в аллергических реакциях эффекторных клетках, таких как тучные клетки и базофилы, приводит к быстрому проявлению аллергических воспалительных реакций. В противовес этому, коагрегация рецептора IgG Fc-гамма RIIB опосредует ингибирующие сигналы посредством иммунорецепторных тирозиновых ингибирующих мотивов (ITIM). Авторы настоящего изобретения
таким образом предположили, не ограничиваясь какой-либо теорией, что усиление/закрепление известного фосфорилирования ITIM Fc-гамма RIIB под воздействием коагрегации рецепторов Fc-гамма RIIB и Fc-эпсилон (см. Zhu et al. (2002), Nat. Med. 8(5), 518-521) может быть благоприятным для противодействия активирующей функции Fc-эпсилон-рецептора или даже превосходства над ней при связывании с IgE, которое приводит к высвобождению предварительно образованных медиаторов и к синтезу позднедействующих лейкотриенов и хемокинов, все из которых вносят вклад, например, в развитие аллергического заболевания.
[0012] Имея эту цель в виду, авторы настоящего изобретения, к своему удивлению, наблюдали, что распознающие молекулы, в частности антитела, предложенные в настоящем раскрытии, существенно повышали уровень фосфорилирования ITIM FcyRIIB и, таким образом, по-видимому, усиливали ингибирующий сигнал, который уже был получен посредством коагрегации рецепторов Fc-гамма RIIB и Fc-эпсилон, так что он оптимально превосходил активирующий сигнал, запускаемый активацией Fc-эпсилон-рецептора при связывании с IgE. Таким образом, распознающие молекулы, в частности антитела, раскрытые в данном документе, обеспечивают две преимущественные функции - они перекрестно сшивают Fc-гамма RIIB и Fc-эпсилон R, что приводит к фосфорилированию ITIM и, таким образом, к ингибированию передачи сигналов через Fc-эпсилон R, а также они усиливают собственно фосфорилирование ITIM Fc-гамма RIIB посредством их связывания с указанным рецептором, что опять-таки ингибирует передачу сигналов через Fc-эпсилон-рецептор в базофилах и тучных клетках. Таким образом, существует двойной эффект, проявляемый распознающими молекулами, в частности антителами по настоящему раскрытию, в отношении ингибирующей роли опосредованной Fc-гамма RIIB передачи сигналов в клетках, которые массово вносят вклад в развитие заболевания, ассоциированного с тучными клетками и/или базофилами. Для получения преимущества от этой опосредованной Fc-гамма RIIB передачи ингибирующих сигналов в базофилах и тучных клетках авторы настоящего
изобретения предлагают распознающие молекулы, в частности антитела по настоящему раскрытию, которые в сравнении, например, с известными из уровня техники антителами, направленными на Fc-гамма RIIB, неожиданно продемонстрировали значительно более сильный эффект в отношении фосфорилирования ITIM, что не могло ожидаться. Такой более сильный эффект является преимущественным, так как он способствует передаче ингибирующих сигналов в тучных клетках и/или базофилах таким образом, чтобы ингибировать IgE-опосредованную активацию тучных клеток и базофилов, оба из каковых типов клеток играют главную роль в возникновении и проявлении, например, аллергических заболеваний.
[0013] Как может быть видно из фигуры 30, антитело на основе IgE, связывающееся с Fc-гамма-рецептором ПВ, раскрытое в данном документе, в действительности способно уменьшить число активированных эозинофилов после их активации пыльцой (55,1%) до уровня, который соответствует необработанным эозинофилам (10,6% по сравнению с 9,5% необработанных эозинофилов). Это показывает активность такого антитела в отрицательной регуляции количества клеток, вовлеченных, например, в развитие аллергических заболеваний, после того как эти клетки были активированы аллергеном путем связывания с данным аллергеном IgE, а его Fc-домена с Fc-эпсилон-рецептором. Эозинофилы наряду с тучными клетками и/или базофилами вовлечены в развитие аллергических заболеваний. Соответственно, предположение авторов настоящего изобретения, которое заключается в том, что усиление/закрепление известного фосфорилирования ITIM Fc-гамма RIIB под воздействием коагрегации рецепторов Fc-гамма RIIB и Fc-эпсилон (см. Zhu et al. (2002), Nat. Med. 8(5), 518-521) может быть благоприятным для противодействия активирующей функции Fc-эпсилон-рецептора при связывании с IgE или даже превосходства над ней, по-видимому, действительно будет перспективным в борьбе, например, с аллергическими заболеваниями.
[0014] Исходя из известных из уровня техники распознающих молекул, связывающихся с Fc-гамма RIIB, в частности распознающих молекул, таких как
антитела, раскрытые в данном документе, преимущественные свойства полипептидов нельзя было ни ожидать, ни предугадать, не говоря уже о том, что было возможно оправданное ожидание успеха их получения, в частности, CDR или вариабельных областей тяжелой и/или легкой цепей антител, охарактеризованных в данном документе. В дополнение к этому улучшенному свойству, распознающие молекулы, описанные в данном документе, также характеризуются преимущественной высокой специфичностью в отношении FcyRIIB человека и/или являются неблокирующими, т. е. их связывание с Fc-рецептором посредством их вариабельной(вариабельных) области(областей) не препятствует связыванию иммунных комплексов (1С) или агрегированного IgG с клетками.
[0015] Преимущественно, распознающая молекула, такая как антитело, раскрытое в данном документе, связывается по цис-типу с клеткой, экспрессирующей Fc-эпсилон-рецептор (FcsR) и Fc-гамма-рецептор ПВ (FcyRIIB), т. е. указанная распознающая молекула связывается с FcsR и FcyRIIB на одной и той же клетке, где такая клетка экспрессирует FcsR и FcyRIIB. Данное свойство распознающей молекулы можно легко протестировать в соответствии с тестом активации базофилов, описанным в примере 5, за исключением того, что к гепаринизированной цельной крови не добавляют антиген. Вкратце, гепаринизированную цельную кровь приводят в контакт с распознающей молекулой, раскрытой в данном документе. Затем цельную кровь инкубируют с детекторным антителом, связывающимся с молекулой CD63 на базофильных клетках в цельной крови, где детекторное антитело характеризуется наличием выявляемой метки, например, флуоресцентной метки, и число клеток, экспрессирующих CD63 на уровне выше порогового, измеряют с помощью, например, методики FACS (сортировки клеток с активированной флуоресценцией). Пороговый уровень может быть определен по гепаринизированной цельной крови, которая не контактировала с указанной распознающей молекулой (что соответствует контролю). Если клетки не экспрессируют CD63 на уровне выше порогового, распознающая молекула
связывается предпочтительно по цис-типу, тогда как экспрессия CD63 на уровне выше порогового указывает на то, что распознающая молекула связывается с клетками по транс-типу, т. е. распознающая молекула связывается с FcsR на первой клетке и с FcyRIIB на второй клетке или с FcyRIIB на первой клетке и с FcsR на второй клетке. Однако, как было сказано, в контексте настоящего раскрытия распознающие молекулы, связывающиеся по цис-типу, являются предпочтительными.
[0016] Соответственно, в настоящем раскрытии предлагаются распознающие молекулы, связывающиеся с помощью первого связывающего домена с Fc-эпсилон-рецептором (FcsR) и с помощью второго связывающего домена с Fc-гамма-рецептором IIB (FcyRIIB).
[0017] Полагают, что распознающие молекулы по настоящему раскрытию конкурируют с собственными патогенными антителами IgE организма за связывание с Fc-эпсилон-рецептором RI (FcsRI) посредством их Fc-части и одновременно обеспечивают совместное перекрестное сшивание FcsRI с FcyRIIB. Полагают, что данный механизм действия предотвращает высвобождение медиаторов из тучных клеток и/или базофилов независимо от специфичности связанного IgE к аллергену. Данный механизм был охарактеризован авторами настоящего изобретения, например, посредством применения FcsRI-экспрессирующих базофилов от страдающих атопией доноров (т. е. доноров с предрасположенностью к развитию иммунных реакций гиперчувствительности в ответ на аллергены). Сенсибилизированные аллергеном базофилы вышеупомянутых страдающих атопией доноров, обработанные распознающей молекулой, раскрытой в данном документе, характеризовались значительно сниженной активацией по сравнению с контролем, как показано в прилагаемых примерах.
[0018] "Распознающая молекула", как используется в данном документе, представляет собой полипептид, который содержит один или более связывающих доменов, где первый связывающий домен связывается с Fc
эпсилон-рецептором (FceR), а второй связывающий домен связывается с Fc-гамма-рецептором IIB (FcyRIIB). Распознающая молекула обеспечивает остов для указанных одного или более связывающих доменов, так, чтобы указанные связывающие домены могли связываться/взаимодействовать с указанной структурой/антигеном/эпитопом-мишенью. Например, такой остов может обеспечиваться белком А, в частности его Z-доменом (аффителами), ImmE7 (иммунными белками), BPTI/APPI (доменами Куница), Ras-связывающим белком AF-6 (PDZ-доменами), харибдотоксином (токсином скорпиона), CTLA-4, Min-23 (ноттинсами), липокалинами (антикалинами), неокарциностатином, доменом фибронектина, доменом с консенсусными анкириновыми повторами или тиоредоксином (Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. 18, 295-304 (2005); Hosse et al., Protein Sci. 15, 14-27 (2006); Nicaise et al., Protein Sci. 13, 1882-1891 (2004); Nygren and Uhlen, Curr. Opin. Struc. Biol. 7, 463-469 (1997)). Предпочтительной распознающей молекулой является антитело.
Связывающие домены распознающей молекулы по настоящему изобретению могут быть соединены посредством линкера. Линкер может представлять собой пептидный линкер. Линкер может содержать (или состоять из) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более аминокислот. Предпочтительными примерами пептидных линкеров являются (G4S)n, где п является целым числом в диапазоне от 1 до 5; (АР)2; (АР)4; (АР)5.7.
Термин "связывающий домен" применительно к настоящему раскрытию характеризует домен, который способен к специфичному связыванию/взаимодействию с указанным эпитопом-мишенью или указанным участком-мишенью на его молекулах-мишенях FcsR и FcyRIIB соответственно. Связывающие домены могут быть получены из донора связывающего домена, как, например, из антитела или из любого вышеупомянутого остова.
Термин "связывающий домен" при использовании в данном документе охватывает то, что связывающий домен может активно связываться с мишенью или может пассивно быть связан, например, рецептором. Соответственно,
связывающий домен применительно к раскрытым в настоящем изобретении молекулам может являться лигандом рецептора, такого как Fc-рецептор.
[0019] Предпочтительный связывающий домен распознающей молекулы представляет собой по меньшей мере часть Fab-домена. "Fab-домен", используемый в данном документе, охватывает (а) вариабельную(вариабельные) область(области) тяжелой и/или легкой цепи или CDR и/или (Ь) каркасный(каркасные) участок(участки) вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи. Таким образом, в связывающем домене, описанном в данном документе, предпочтительно содержатся (а) вариабельная(вариабельные) область(области), как, например, вариабельная область тяжелой и/или легкой цепи, или CDR и/или (Ь) каркасный(каркасные) участок(участки) вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи. Таким образом, распознающая молекула предпочтительно содержит в качестве первого и второго связывающего домена Fab-домен, предпочтительно (а) вариабельную(вариабельные) область(области), как, например, вариабельную область тяжелой и/или легкой цепи, или CDR и/или (Ь) каркасный(каркасные) участок(участки) вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи.
[0020] Другой упоминаемый связывающий домен распознающей молекулы представляет собой константную область (или домен) (Fc-домен) антитела IgG или IgE или его часть. "Часть" Fc-домена при использовании в данном документе предпочтительно имеет такую длину, что она связывается со своим когнатным Fc-рецептором, таким как Fc-эпсилон-рецептор или Fc-гамма-рецептор ПВ.
[0021] Таким образом, предпочтительная распознающая молекула предпочтительно содержит в качестве первого и второго связывающего домена Fc-домен антитела IgG или IgE или его часть, при этом данная часть связывается соответственно с Fc-гамма-рецептором ПВ или Fc-эпсилон-рецептором.
[0022] Распознающая молекула по настоящему раскрытию также предпочтительно содержит в качестве первого связывающего домена Fab-домен,
предпочтительно вариабельную область, такую как вариабельная область тяжелой и/или легкой цепи, или CDR и/или каркасные участки вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи, который связывается с Fc-эпсилон-рецептором, и в качестве второго связывающего домена Fc-домен IgG или его часть, связывающиеся с Fc-гамма-рецептором ПВ.
[0023] Распознающая молекула по настоящему раскрытию более предпочтительно содержит в качестве первого связывающего домена Fc-домен IgE или его часть, связывающиеся с Fc-эпсилон-рецептором, и в качестве второго связывающего домена Fab-домен, предпочтительно вариабельную область, такую как вариабельная область тяжелой и/или легкой цепи, или CDR и/или каркасные участки вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи, который связывается с Fc-гамма-рецептором ПВ.
[0024] Термин "эпитоп" относится к участку на антигене, с которым специфично связывается связывающий домен. "Эпитоп" является антигенным, и поэтому эпитоп иногда также в данном документе называют термином "антигенная структура" или "антигенная детерминанта". Таким образом, связывающий домен является "участком взаимодействия с антигеном". Указанное связывание/взаимодействие также понимают как определяющее "специфичное распознавание". Предпочтительный эпитоп применительно к настоящему изобретению расположен в Fc-эпсилон-рецепторе и Fc-гамма-рецепторе ПВ соответственно. Такой эпитоп предпочтительно расположен во внеклеточной части любого из этих двух Fc-рецепторов.
"Эпитопы" могут быть образованы как смежными аминокислотами, так и несмежными аминокислотами, расположенными рядом друг с другом благодаря сворачиванию белка в третичную структуру. "Линейный эпитоп" представляет собой эпитоп, в котором первичная аминокислотная последовательность содержит распознаваемый эпитоп. Линейный эпитоп обычно содержит по меньшей мере 3 или по меньшей мере 4 и в более обычном случае по меньшей мере 5, или по меньшей мере 6, или по меньшей мере 7, например, от
приблизительно 8 до приблизительно 10 аминокислот в уникальной последовательности.
"Конформационный эпитоп", в отличие от линейного эпитопа, представляет собой эпитоп, в котором первичная последовательность аминокислот, содержащая эпитоп, не является единственным определяющим компонентом распознаваемого эпитопа (например, эпитопа, в котором первичная последовательность аминокислот необязательно распознается связывающим доменом). Обычно конформационный эпитоп содержит большее число аминокислот по сравнению с линейным эпитопом. Что касается распознавания конформационных эпитопов, связывающий домен распознает трехмерную структуру антигена, предпочтительно пептида или белка или его фрагмента. Например, при сворачивании молекулы белка с образованием трехмерной структуры определенные аминокислоты и/или полипептидный каркас, образующие конформационный эпитоп, располагаются рядом друг с другом, позволяя антителу распознавать трехмерный эпитоп, присутствующий только в трехмерной структуре. Способы определения конформации эпитопов включают без ограничения рентгеновскую кристаллографию, двухмерную спектроскопию ядерного магнитного резонанса (2D-NMR), а также сайт-направленное спин-мечение и спектроскопию электронного парамагнитного резонанса (EPR).
[0025] Связывающий домен распознающей молекулы, в частности антитела по настоящему изобретению, преимущественно специфично связывается с FcsR и FcyRIIB соответственно. Термины "(способен к) связыванию с", "специфично распознающий", "направленный на" и "вступает в реакцию с" в соответствии с настоящим изобретением означают, что связывающий домен способен к специфичному взаимодействию с одной или более, как, например, по меньшей мере двумя, по меньшей мере тремя или по меньшей мере четырьмя, аминокислотами эпитопа.
[0026] Термин "Fc-гамма-рецептор ПВ" используется в данном документе взаимозаменяемо с терминами "FcgRIIB", или "Fc-гамма-рецептор ПВ", или
"Fcy-рецептор ПВ", или "FcyRIIB" и включает как мембранный FcyRIIB, так и растворимый FcyRIIB (т. е. внеклеточную часть Fcy-рецептора ПВ). Указанный термин также включает варианты FcyRIIB, такие как FcyRIIB 1 и FcyRIIB2, которые отличаются друг от друга вставкой последовательности из 19 аминокислот в цитоплазматическом домене FcyRIIB 1. Другой вариант, охватываемый указанным термином, представляет собой FcyRIIB3, который является идентичным FcyRIIB2, но о котором отсутствует информация в отношении предполагаемого участка расщепления сигнальной пептидазой.
Иногда в данном документе FcyRIIB также называют "CD32B". Таким образом, этот термин, а также другие термины, используемые для обозначения Fc-гамма-рецептора ПВ, описанного выше, можно использовать взаимозаменяемо с термином "CD32B". Fc-гамма-рецептор ПВ относится к белкам суперсемейства иммуноглобулинов и встречается на многих клетках ростков кроветворения. Как указывает его название, Fc-рецептор ПВ распознает Fc-часть (кристаллизуемый фрагмент) антител, т. е. фрагмент, который соответствует двум С-концевым доменам обеих тяжелых цепей антитела и, как правило, взаимодействует с эффекторными молекулами и клетками, и связывается с ней. Предпочтительный FcyRIIB приведен под SEQ ID NO: 5. Предпочтительный растворимый FcyRIIB приведен под SEQ ID NO: 12.
[0027] "Растворимый FcyRIIB" также обозначают как "sFcyRIIB". Используемый в данном документе термин "растворимый Fcy-рецептор ПВ" и аналогичные термины относятся к внеклеточной части Fcy-рецептора ПВ. Такая часть может растворяться в жидкости. Как правило, растворимые формы любого класса, изоформы или аллеля FcyR можно идентифицировать по предшествующей "s", например, sCD32 или sFcyRII относится к растворимому Fc-гамма-рецептору RII. Как правило, в отличие от мембранного (т. е. мембраносвязанного) FcyR, растворимый FcyR не содержит трансмембранную область или внутрицитоплазматический "хвост".
[0028] Раскрытый FcyRIIB предпочтительно имеет человеческое происхождение или представляет собой FcyRIIB человека. Термин "человеческое происхождение" следует истолковывать в его наиболее широком смысле. В целом он означает, что FcyR (или его область или фрагмент) имеет сходство или подобие с FcyR человека (т. е. с белком, обнаруживаемом в организме человека) по аминокислотной последовательности и/или структуре.
[0029] В качестве альтернативы, FcyRIIB "человеческого происхождения" может представлять собой рекомбинантный FcyRIIB, полученный путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, например, как описано у Sondermann and Jacob (1999), Biol. Chem. 380(6), 717-721. Вкратце, представляющий интерес ген получают из организма и встраивают в вектор, например, плазмиду или вирус, который затем используют для переноса гена в клетку-хозяина, экспрессирующую рекомбинантный ген и вырабатывающую рекомбинантный белковый продукт. Специалист в данной области без труда поймет, какую клетку-хозяина выбрать для того, чтобы получить FcyRIIB, который, например, является подходящим для получения фармацевтической композиции. Например, в некоторых вариантах осуществления может быть желательным негликозилированный FcyRIIB. Затем специалист в данной области может выбрать прокариотическую клетку-хозяина для экспрессии FcyRIIB, лишенную ферментного аппарата, необходимого для гликозилирования белка. В одном варианте осуществления FcyRIIB можно экспрессировать у прокариот, а затем подвергнуть очистке и рефолдингу в соответствии с описанием WO 00/32767.
[0030] В другом варианте осуществления FcyRIIB можно также получать в эукариотических системах экспрессии. Подходящие системы включают эукариот со специализированным аппаратом для выработки внеклеточных белков, например, с В-клетками. Другие возможные эукариотические системы экспрессии включают без ограничения клетки СНО или НЕК. Таким образом,
указанный растворимый FcyRIIB представляет собой рекомбинантный, растворимый и гликозилированный FcyRIIB.
[0031] FcyRIIB, упоминаемый в данном документе, дополнительно охватывает FcyRIIB, который по сравнению с FcyR дикого типа был модифицирован или изменен в отношении аминокислотной последовательности и содержит, например, дополнительные участки гликозилирования и т.п. Однако, предусматриваются также негликозилированные формы FcyRIIB, и они представляют собой применимый вариант осуществления FcyRIIB.
[0032] Для целей настоящего раскрытия FceR включает как FceRI, так и FceRII. . В данном документе также используются такие термины, как "Fc-эпсилон R" или "Fc-эпсилон-рецептор", все из которых обозначают рецептор, связывающийся с константной областью IgE или ее частью. Все данные термины, таким образом, могут использоваться взаимозаменяемо.
[0033] Предпочтительные первый и второй связывающие домены распознающей молекулы по настоящему раскрытию получены из антитела, предпочтительно указанный первый и/или второй связывающий домен является частью антитела, такой как РаЬ-домен(домены), вариабельная(вариабельные) область(области) тяжелой и/или легкой цепи или CDR и/или каркасные участки вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи антитела.
[0034] В качестве альтернативы, связывающий домен применительно к раскрытым в настоящем изобретении распознающим молекулам предпочтительно может представлять собой константную область (константный домен) или по меньшей мере ее часть, связывающиеся с Fc-рецептором, таким как Fc-эпсилон-рецептор или Fc-гамма-рецептор ПВ. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления как первый, так и второй связывающий домен может представлять собой константную область антитела или по меньшей мере ее часть, такую как Fc-область IgG или Fc-область IgE, связывающиеся с Fc-рецептором, таким как Fc-эпсилон-рецептор или Fc-гамма-рецептор. Соответственно, первый связывающий домен предпочтительно может
представлять собой Fc-область IgE или ее часть, связывающиеся с Fc-эпсилон-рецептором. Второй связывающий домен предпочтительно может представлять собой Fc-область IgG или ее часть, связывающиеся с Fc-гамма-рецептором RII.
[0035] В качестве альтернативы, первый связывающий домен предпочтительно может представлять собой по меньшей мере часть антитела, которое связывается с Fc-эпсилон-рецептором, и второй связывающий домен может представлять собой по меньшей мере часть константной области IgG или ее части, связывающихся с Fc-гамма-рецептором ПВ. Такая молекула представляет собой применимую распознающую молекулу, и ее следует рассматривать как антитело, раскрытое в данном документе, т. е. она имеет вариабельные домены и константную область, такую как Fc-область IgG.
[0036] Аналогично, первый домен предпочтительно может представлять собой по меньшей мере часть константной области IgE или ее части, связывающихся с Fc-эпсилон-рецептором, и второй домен может представлять собой по меньшей мере часть антитела, которое связывается с Fc-гамма-рецептором ПВ. Такая молекула представляет собой применимую распознающую молекулу и в одном варианте осуществления представляет собой антитело, раскрытое в данном документе, т. е. она имеет вариабельные домены и константную область, такую как Fc-область IgE.
[0037] В случае, когда второй связывающий домен (связывающийся с Fc-гамма-рецептором ПВ) распознающей молекулы, описанной в данном документе, представляет собой часть Fab-домена, он предпочтительно содержит в своей вариабельной области тяжелой цепи H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 29, 30 и 31, а в своей вариабельной области легкой цепи L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 32, 33 и 34, где распознающая молекула, предпочтительно антитело, имеющая второй связывающий домен, определенный выше, повышает уровень фосфорилирования ITIM FcyRIIB в клетках Daudi приблизительно в 4-10 раз по
сравнению с клетками Daudi, не обработанными указанной распознающей молекулой.
Из фигуры 7 видно, что антитела GB3 (см. WO 2005/051999) и 2В6 (см. WO 2004/016750), известные из уровня техники, неспособны повышать уровень фосфорилирования ITIM FcyRIIB так, как его может повышать распознающая молекула, предпочтительно антитело, раскрытое в данном документе, такое как 8А6, в виде химерного либо гуманизированного антитела 8А6. Таким образом, соответственно способность или неспособность к повышению уровня фосфорилирования ITIM FcyRIIB, по-видимому, зависит от CDR, в частности от некоторых ключевых аминокислотных остатков, которые присутствуют в 8А6, но не в GB3 и/или 2В6 соответственно. Следовательно, аминокислоты, которые присутствуют только в CDR 8А6 в положениях, аналогичных соответствующим положениям в CDR 2В6 или GB3, можно рассматривать как "ключевые остатки".
[0038] Визуальное сравнение CDR из 2В6, GB3 и 8А6 в отношении ключевых остатков выявило выгодное присутствие в H-CDR1 аминокислотной последовательности, приведенной под SEQ ID NO: 29, в H-CDR2 аминокислотной последовательности, приведенной под SEQ ID NO: 30, в Н-CDR3 аминокислотной последовательности, приведенной под SEQ ID NO: 31, в L-CDR1 аминокислотной последовательности, приведенной под SEQ ID NO: 32, в L-CDR2 аминокислотной последовательности, приведенной под SEQ ID NO: 33, и в L-CDR3 аминокислотной последовательности, приведенной под SEQ ID NO: 34.
Различия между аминокислотными последовательностями CDR 8А6, GB3 и 2В6 можно также выразить в виде степени идентичности (в % идентичности), которая допускается в CDR антитела, раскрытого в данном документе, при использовании CDR 8А6 в качестве эталонных последовательностей. Соответственно, H-CDR1 второго связывающего домена по настоящему изобретению предпочтительно характеризуется идентичностью 60% или более,
как, например, 70%, 80% или 90%, с H-CDR1, которая приведена под SEQ ID NO: 20.
В определенных вариантах осуществления H-CDR2 второго связывающего домена, раскрытого в данном документе, характеризуется идентичностью 36% или более, как, например, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%, с H-CDR2, которая приведена под SEQ ID NO: 21.
В определенных вариантах осуществления H-CDR3 второго связывающего домена, раскрытого в данном документе, характеризуется идентичностью 50% или более, как, например, 60%, 70%, 80% или 90%, с H-CDR3, которая приведена под SEQ ID NO: 22.
В определенных вариантах осуществления L-CDR1 второго связывающего домена, раскрытого в данном документе, характеризуется идентичностью 64% или более, как, например, 70%, 80% или 90%, с L-CDR1, которая приведена под SEQ ID NO: 23.
В определенных вариантах осуществления L-CDR2 второго связывающего домена, раскрытого в данном документе, характеризуется идентичностью 29% или более, как, например, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%, с L-CDR2, которая приведена под SEQ ID NO: 24.
В определенных вариантах осуществления L-CDR3 второго связывающего домена, раскрытого в данном документе, характеризуется идентичностью 78% или более, как, например, 80% или 90%, с L-CDR3, которая приведена под SEQ ID NO: 25.
[0039] Соответственно, в настоящем раскрытии в определенных вариантах осуществления предложена распознающая молекула, имеющая второй связывающий домен (связывающийся с Fc-гамма-рецептором ПВ), которая содержит в своей вариабельной области тяжелой цепи последовательность Н-CDR1, которая на 60% или более идентична последовательности H-CDR1, приведенной под SEQ ID NO: 20, последовательность H-CDR2, которая на 36%
или более идентична последовательности H-CDR2, приведенной под SEQ ID NO: 21, последовательность H-CDR3, которая на 50% или более идентична последовательности H-CDR3, приведенной под SEQ ID NO: 22, последовательность L-CDR1, которая на 64% или более идентична последовательности L-CDR1, приведенной под SEQ ID NO: 23, последовательность L-CDR2, которая на 29% или более идентична последовательности L-CDR2, приведенной под SEQ ID NO: 24, и последовательность L-CDR3, которая на 78% или более идентична последовательности L-CDR3, приведенной под SEQ ID NO: 25.
В некоторых вариантах осуществления распознающая молекула, такая как антитело, кроме того, содержит в CDR ее второго связывающего домена в вариабельной области тяжелой и легкой цепей "ключевые остатки", определенные под SEQ ID NO: 29, 30, 31 (H-CDR) и определенные под SEQ ID NO: 32, 33 и 34 (L-CDR).
Распознающая молекула с таким вторым связывающим доменом повышает уровень фосфорилирования ITIM FcyRIIB в клетках Daudi приблизительно в 410 раз по сравнению с клетками Daudi, не обработанными указанной распознающей молекулой.
[0040] Используемый в данном документе термин "% идентичность" относится к процентной доле идентичных аминокислотных остатков в соответствующем положении в последовательности при сравнении двух аминокислотных последовательностей с использованием оптимального выравнивания последовательностей, которое проиллюстрировано на примере методик ClustalW или X, доступных по адресу www.clustal.org, или эквивалентных методик. Например, в случае выравниваний CDR каждая из CDR (из вариабельной области тяжелой и легкой цепи соответственно), приведенных под SEQ ID NO: 20-25, служит в качестве эталонной последовательности для представляющей интерес последовательности CDR вариабельной области тяжелой или легкой цепи соответственно, например, H-CDR1 под SEQ ID NO: 20 выравнивают с
представляющим интерес H-CDR1. Соответственно, выравнивают обе последовательности (эталонную последовательность и представляющую интерес последовательность), идентифицируют идентичные аминокислотные остатки у обеих последовательностей, и общее количество идентичных аминокислот делят на общее количество аминокислот (длину в аминокислотах) SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24 или 25 соответственно в зависимости от того, выравнивают ли Н-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 или L-CDR3. Результат этого деления представляет собой процентное значение, т. е. процентное значение/степень идентичности.
Такую же процедуру с соответствующими изменениями применяли для сравнения двух вариабельных областей в отношении их степени идентичности.
[0041] Последовательности H-CDR1, приведенные под SEQ ID NO: 14 и 20, являются иллюстративными видами последовательностей H-CDR1, приведенной под SEQ ID NO: 29.
Последовательности H-CDR2, приведенные под SEQ ID NO: 15 и 21, являются иллюстративными видами последовательностей H-CDR2, приведенной под SEQ ID NO: 30.
Последовательности H-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 16 и 22, являются иллюстративными видами последовательностей H-CDR3, приведенной под SEQ ID NO: 31.
Последовательности L-CDR1, приведенные под SEQ ID NO: 17 и 23, являются иллюстративными видами последовательностей L-CDR1, приведенной под SEQ ID NO: 32.
Последовательности L-CDR2, приведенные под SEQ ID NO: 18 и 24, являются иллюстративными видами последовательностей L-CDR2, приведенной под SEQ ID NO: 33.
Последовательности L-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 19 и 25, являются иллюстративными видами последовательностей L-CDR3, приведенной под SEQ IDNO: 34.
[0042] Соответственно, в данном документе предложена распознающая молекула со вторым связывающим доменом (связывающимся с Fc-гамма-рецептором ПВ), которая
(a) содержит в своей вариабельной области тяжелой цепи H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 14, 15 и 16, а в своей вариабельной области легкой цепи L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 17, 18 и 19; или
(b) содержит в своей вариабельной области тяжелой цепи H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 20, 21 и 22, а в своей вариабельной области легкой цепи L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 23, 24 и 25,
где указанная распознающая молекула предпочтительно повышает уровень фосфорилирования ITIM FcyRIIB в клетках Daudi приблизительно в 4-10 раз по сравнению с клетками Daudi, не обработанными указанной распознающей молекулой.
[0043] Распознающая молекула (связывающаяся с Fc-гамма-рецептором ПВ) со вторым связывающим доменом, содержащая в своей вариабельной области тяжелой цепи H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 14, 15 и 16, а в своей вариабельной области легкой цепи L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 17, 18 и 19, или содержащая в своей вариабельной области тяжелой цепи H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 20, 21 и 22, а в своей вариабельной области легкой цепи L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 23, 24 и 25, представляет собой иллюстративную распознающую молекулу. Такая иллюстративная распознающая молекула предпочтительно повышает уровень фосфорилирования
ITIM FcyRIIB в клетках Daudi приблизительно в 4-10 раз по сравнению с клетками Daudi, не обработанными указанной распознающей молекулой.
[0044] В одном варианте осуществления распознающая молекула (связывающаяся с Fc-гамма-рецептором ПВ) имеет второй связывающий домен, который содержит по меньшей мере (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 65% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.
[0045] Кроме того, распознающая молекула (связывающаяся с Fc-гамма-рецептором ПВ) может иметь второй связывающий домен, который содержит по меньшей мере одну из (i) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, и (ii) вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4.
[0046] Такие распознающие молекулы повышают уровень фосфорилирования ITIM FcyRIIB в клетках Daudi приблизительно в 4-10 раз по сравнению с клетками Daudi, не обработанными указанной распознающей молекулой.
[0047] Как описано выше, иллюстративной распознающей молекулой является антитело. Предпочтительным антителом является антитело, которое связывается с помощью первого связывающего домена, который является по меньшей мере частью Fab-домена, с Fc-эпсилон-рецептором и с помощью второго связывающего домена, который представляет собой константную область IgG или ее часть, связывающиеся с Fc-гамма-рецептором ПВ, с Fc-гамма-рецептором ПВ, т. е. антитело, связывающееся с FcsR, предпочтительно типа IgG.
[0048] Другое иллюстративное антитело связывается с помощью первого связывающего домена, который является по меньшей мере частью Fab-домена, с Fc-эпсилон-рецептором и с помощью второго связывающего домена, который является по меньшей мере частью Fab-домена, с Fc-гамма-рецептором ПВ, т. е. представляет собой бифункциональное или биспецифическое антитело, связывающееся с FcsR х антитело, связывающееся с FcyRIIB. В определенных вариантах осуществления антитело не связывается с Fc-гамма-рецептором ПА (FcyRIIA).
[0049] Также предусматривается антитело, которое содержит в качестве первого связывающего домена Fc-домен IgE или его часть и в качестве второго связывающего домена Fc-домен IgG или его часть.
[0050] Другим иллюстративным антителом является антитело, которое связывается с помощью первого связывающего домена, который является константной областью IgE или ее частью, связывающимися с Fc-эпсилон-рецептором, с Fc-эпсилон-рецептором и с помощью второго связывающего домена, который является по меньшей мере частью Fab-домена, с Fc-гамма-рецептором ПВ, т. е. антитело, связывающееся с FcyRIIB, предпочтительно типа IgG. В определенных вариантах осуществления антитело не связывается с Fc-гамма-рецептором ПА (FcyRIIA).
[0051] При использовании в данном документе термин "антитело" означает белок, содержащий один или более полипептидов (содержащих один или более связывающих доменов, предпочтительно антигенсвязывающих доменов), в значительной степени или частично кодируемых генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов. Термин "иммуноглобулин" (Ig) и термин "антитело" используются в данном документе взаимозаменяемо. Общеизвестные гены иммуноглобулинов включают гены константных областей цепей каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также бесчисленное множество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. В частности, при использовании в данном документе термин "антитело", как правило, означает
тетрамерный гликозилированный белок, состоящий из двух легких (L) цепей размером примерно 25 кДа каждая и двух тяжелых (Н) цепей размером примерно 50 кДа каждая. В антителах могут встречаться два типа легких цепей, называемые лямбда и каппа. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей иммуноглобулины можно отнести к пяти основным классам: A, D, Е, G и М, и некоторые из них можно дополнительно подразделить на подклассы (изотипы), например, IgGl, lgG2, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2, причем в определенных вариантах осуществления настоящего раскрытия IgG или IgE являются предпочтительными. Антитело IgM содержит 5 основных гетеротетрамерных звеньев вместе с дополнительным полипептидом, называемым J-цепью, и содержит 10 антигенсвязывающих участков, тогда как антитела IgA содержат от 2 до 5 основных 4-цепочечных звеньев, которые могут полимеризоваться с образованием поливалентных комплексов в комбинации с J-цепью. В случае IgG 4-цепочечное звено обычно имеет массу приблизительно 150000 дальтон. Каждая легкая цепь содержит N-концевой вариабельный (V) домен (VL) и константный (С) домен (CL). Каждая тяжелая цепь содержит N-концевой V-домен (VH), три или четыре С-домена (СН) и шарнирную область.
Константные домены не вовлечены напрямую в связывание антитела с антигеном, но могут проявлять различные эффекторные функции, такие как участие в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Если антитело должно вызывать ADCC, оно предпочтительно относится к подтипу IgGl, тогда как подтип IgG4 не будет обладать способностью вызывать ADCC. Константный домен распознающей молекулы, такой как антитело, может относиться к любому подтипу, описанному в данном документе, предпочтительно к подтипам IgG или IgE, более предпочтительно к подтипу IgE.
[0052] Используемый в данном документе термин "антитело" относится не только к иммуноглобулину (или интактному антителу), но также относится к его фрагменту и охватывает любой полипептид, содержащий антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий домен, такой как Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, scFv,
Fd, стабилизированные дисульфидными связями Fv (sdFv) и другие фрагменты антител, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию, как описано в данном документе. Как правило, такие фрагменты будут содержать антигенсвязывающий домен и обладать такими же свойствами, что и антитела, описанные в данном документе.
[0053] Термин "антитело" также включает без ограничения моноклональные, моноспецифические, поли- или мультиспецифические антитела, такие как биспецифические антитела, гуманизированные, камелизированные, человеческие, одноцепочечные, химерные, синтетические, рекомбинантные, гибридные, мутантные, привитые и созданные in vitro антитела, причем химерные или гуманизированные антитела являются предпочтительными. Термином "гуманизированное антитело" обычно определяют антитело, в котором отвечающие за специфичность CDR НС и LC были перенесены на соответствующие каркасные участки вариабельных областей человека ("трансплантация CDR"). Термин "антитело" также включает scFv, одноцепочечные антитела, диатела или тетратела, доменные антитела (dAb) и нанотела. В контексте настоящего изобретения термин "антитело" также будет включать би-, три- или мультимерные или би-, три- или полифункциональные антитела с несколькими антигенсвязывающими участками, при этом предпочтительно по меньшей мере один из них является связывающим участком, специфичным к FcyRIIB.
[0054] Кроме того, используемый в данном документе термин "антитело" также относится к производным антител (в том числе к фрагментам), описанным в данном документе. "Производное" антитела содержит аминокислотную последовательность, которая была изменена путем введения замен, делеций или добавлений аминокислотных остатков. Кроме того, производное охватывает антитела, которые были модифицированы путем ковалентного присоединения молекулы любого типа к антителу или белку. Примеры таких молекул включают сахара, PEG, гидроксильные, этокси-, карбокси- или аминогруппы, но не ограничиваются ими. Ковалентные модификации антител в результате приводят
к гликозилированию, пегилированию, ацетилированию, фосфорилированию, амидированию, но не ограничиваются ими.
[0055] Антитело предпочтительно представляет собой "выделенное" антитело. Термин "выделенный" при использовании для описания антител, раскрытых в данном документе, означает антитело, которое было идентифицировано, отделено от компонентов среды для его получения и/или извлечено из нее. Выделенное антитело предпочтительно не связано ни с одним из других компонентов среды для его получения. Компоненты-примеси среды для получения антитела, как, например, полученные из рекомбинантных трансфицированных клеток, являются материалами, которые, как правило, препятствуют диагностическим или терапевтическим применениям полипептида, и они могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления антитело будет очищено (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с применением секвенатора с вращающимся стаканом, или (2) до однородности посредством SDS-PAGE в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с применением красителя кумасси синего или предпочтительно серебряного красителя. Тем не менее, обычно выделенное антитело будет получено с помощью по меньшей мере одного этапа очистки.
[0056] Используемый в данном документе термин "специфично связывается" относится к распознающим молекулам, предпочтительно антителам или их фрагментам или производным, которые специфично связываются с FcyRIIB или его фрагментом и не связываются специфично с другими Fc-рецепторами. Распознающая молекула, предпочтительно антитела или их фрагменты или производные, связывается с FcyRIIB посредством второго связывающего домена, например, посредством вариабельного домена антитела. Однако, данные распознающие молекулы, такие как антитела, также могут связываться с Fc-гамма RIIB, например, посредством своего Fc-домена.
[0057] При формировании пары из VH и VL образуется один антигенсвязывающий участок. СН-домен, наиболее проксимальный к VH, обозначается как СН1. Каждая L-цепь соединена с Н-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как две Н-цепи соединены друг с другом одной или более дисульфидными связями в зависимости от изотипа Н-цепи. VH- и VL-домены содержат четыре области с относительно консервативными последовательностями, называемые каркасными участками (FR1, FR2, FR3 и FR4), которые образуют остов для трех областей с гипервариабельными последовательностями (областей, определяющих комплементарность, CDR). CDR содержат большинство остатков, ответственных за специфичные взаимодействия антитела с антигеном. CDR называются CDR1, CDR2 и CDR3. Соответственно, элементы CDR в тяжелой цепи называются HI или H-CDR1, Н2 или H-CDR2 и НЗ или H-CDR3, тогда как элементы CDR в легкой цепи называются L1 или L-CDR1, L2 или L-CDR2 и L3 или L-CDR3.
[0058] Термин "вариабельный" относится к частям доменов иммуноглобулинов, которые проявляют вариабельность в своей последовательности и которые вовлечены в определение специфичности и аффинности связывания конкретного антитела (т. е. к "вариабельному(вариабельным) домену(доменам)"). Вариабельность не распределена равномерно среди всех вариабельных доменов антител; она сконцентрирована в гипервариабельных субдоменах каждой из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. Эти гипервариабельные субдомены называются "областями, определяющими комплементарность" (CDR), из которых три определяют характер связывания вариабельной области легкой цепи (L1-CDRL1, L2-CDR и L3-CDR) и три определяют характер связывания вариабельной области тяжелой цепи (Hl-CDR, H2-CDR и H3-CDR). CDR вносят вклад в функциональную активность молекулы антитела и разделены аминокислотными последовательностями, которые содержат остовные или каркасные участки. Точные определяющие границы и длины CDR зависят от различных систем классификации и нумерации. Ввиду этого CDR могут обозначаться с использованием определений границ по Kabat, Chothia, контактным остаткам или любых других определений, в том числе с помощью
системы нумерации, описанной в данном документе. Несмотря на отличающиеся границы, каждая из данных систем характеризуется некоторой степенью перекрывания в той части, которая составляет так называемые "гипервариабельные области" в вариабельных последовательностях. CDR, определяемые в соответствии с этими системами, следовательно, могут отличаться по длине и граничным зонам относительно прилежащего каркасного участка. См., например, Kabat, Chothia и/или MacCallum et al., (Kabat et al., в приводившейся выше цитате; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901 и MacCallum et al, J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Тем не менее, нумерация в соответствии с так называемой системой Kabat является предпочтительной.
[0059] Иллюстративные вариабельные области второго домена (связывающегося с Fc-гамма-рецептором ПВ) распознающей молекулы, такой как антитело, приведены под SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4.
[0060] Термин "каркасный участок" относится к известным из уровня техники частям вариабельной области антитела, которые присутствуют между более дивергентными (т. е. гипервариабельными) CDR. Такие каркасные участки, как правило, называются каркасными участками 1-4 (FR1, FR2, FR3 и FR4) и обеспечивают остов для представления шести CDR (трех из тяжелой цепи и трех из легкой цепи) в трехмерном пространстве для образования антигенсвязывающей поверхности.
[0061] Распознающие молекулы (связывающиеся с Fc-гамма-рецептором ПВ), такие как антитела (в том числе их фрагменты и производные), преимущественно повышают уровень фосфорилирования ITIM FcyRIIB в клетках Daudi приблизительно в 1,5, 2, 3 или более раз, как, например, приблизительно в 4 раза или более, приблизительно в 5 раз или более, приблизительно в 6 раз или более, приблизительно в 7 раз или более, приблизительно в 8 раз или более, приблизительно в 9 раз или более или приблизительно в 10 раз (т. е. даже почти в 10 раз), по сравнению с клетками Daudi, не обработанными указанной распознающей молекулой. Для такого
сравнения антитело применяют в количестве в диапазоне от 5 мкг/мл до 50 мкг/мл, как, например, 10, 15, 20 или 25 мкг/мл.
Из результатов, приведенных на фигурах 6, 7 и 8, очевидно, что любое из химерного антитела 8А6 (ch8A6) (содержащего вариабельные области крысы и константную область человека) или гуманизированного антитела 8А6 (hu8A6) существенно повышает уровень фосфорилирования ITIM по сравнению с антителом GB3, известным из уровня техники. Принимая во внимание, что CDR у химерного и гуманизированного антител 8А6 являются практически идентичными, тогда как их каркасные участки (FR) отличаются, и что активность обоих антител в отношении повышения уровня фосфорилирования ITIM FcyRIIB является практически одинаковой (см. фигуру 8), разумно сделать вывод, что CDR обуславливают преимущественное свойство антител, раскрытых в данном документе, заключающееся в существенном повышении уровня фосфорилирования ITIM, например, по сравнению с антителом GB3, известным из уровня техники.
Специалист в данной области без труда способен трансплантировать CDR, описанные в данном документе, для второго связывающего домена распознающей молекулы на соответствующий каркасный участок или, наоборот, трансплантировать каркасные участки на второй связывающий домен распознающей молекулы, такой как антитело с CDR, описанными в данном документе, так, чтобы полученная в результате этого распознающая молекула, такая как антитело, обладала преимущественными свойствами, в частности, свойством повышения уровня фосфорилирования ITIM CD32B, как описано в данном документе.
[0062] Как упоминалось, распознающие молекулы, такие как антитела, раскрытые в данном документе, обладают свойством повышения уровня фосфорилирования ITIM FcyRIIB (CD32B) в клетках Daudi по сравнению с антителом GB3, известным из уровня техники, описанным в WO 2005/051999, которое характеризуется наличием вариабельной области тяжелой цепи,
приведенной под SEQ ID NO: 7 в WO 2005/051999 (см. SEQ ID NO: 26), и вариабельной области легкой цепи, приведенной под SEQ ID NO: 5 в WO 2005/051999 (см. SEQ ID NO: 27).
Повышение уровня фосфорилирования ITIM FcyRIIB (CD32B) в клетках Daudi под воздействием распознающей молекулы, такой как антитело, является приблизительно 4-кратным или большим, приблизительно 5-кратным или большим, приблизительно 6-кратным или большим, приблизительно 7-кратным или большим, приблизительно 8-кратным или большим, приблизительно 9-кратным или большим или приблизительно 10-кратным (т. е. даже почти 10-кратным) по сравнению с клетками Daudi, не обработанными указанной распознающей молекулой.
Фосфорилирование ITIM CD32B (Fc-гамма-рецептора ПВ) в клетках Daudi предпочтительно определяют следующим образом.
3 х 105 клеток Daudi, суспендированных в среде RPMI 1640, дополненной 1% FBS (фетальной бычьей сывороткой крови), оставляют необработанными (контроль) либо инкубируют в течение 25 минут при 37°С, 5% С02 со смесью антител, содержащей антитело мыши к IgM человека (a-hlgM) и антитело кролика к IgG мыши (a-mlgG), где смесь антител содержит 2 мкг/мл a-hlgM (mAB, клон UHB) и 20 мкг/мл a-mlgG. Затем клетки обрабатывают в течение 20 минут при 37°С, 5% С02 распознающей молекулой, такой как антитело, раскрытое в данном документе, или представляющей интерес молекулой, определенной в данном документе ниже, такой как антитело GB3 из WO 2005/051999, соответственно, при этом как распознающую молекулу, так и представляющую интерес молекулу предпочтительно применяют в равных концентрациях и необязательно с буфером в качестве контроля (без антитела). Клетки собирают после инкубирования при 4°С, лизируют и подвергают вестерн-блот-анализу, в ходе которого фосфорилирование выявляют с помощью антитела к фосфотирозину (антитела к CD32B (с фосфорилированным Y292)). В ходе вестерн-блоттинга необязательно проводят зондирование с использованием
антитела, выявляющего, например, В-актин, который служит в качестве контроля нагрузки для вестерн-блот-анализа. В качестве альтернативы клеткам Daudi можно применять РВМС или клетки Raji. Соответственно, во всех вариантах осуществления, в которых применяют клетки Daudi при определении фосфорилирования ITIM, клетки Daudi можно заменить клетками Raji или РВМС.
[0063] Антитело к фосфотирозину предпочтительно связано с группой, генерирующей сигнал. Группа, генерирующая сигнал, относится к композиции, выявляемой с помощью спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических или химических средств. Например, применимые метки
32 35 125
включают радиоактивные метки, такие как Р, S или I; флуоресцентные красители (например, Су-3, Су-5); хромофоры, электроноплотные реагенты; ферменты, которые генерируют выявляемый сигнал (например, широко применяемые в ELISA); или спин-метки. Метка или выявляемый фрагмент имеет или генерирует измеримый сигнал, такой как радиоактивный, хромогенный или флуоресцентный сигнал, который можно применять для количественного определения связанного выявляемого фрагмента в образце.
Группа, генерирующая сигнал, может быть ковалентно или нековалентно связана с антителом к фосфотирозину. Сигнал можно определять в виде сигнала, обеспечиваемого группой, генерирующей сигнал, в антителе к фосфотирозину. Сигнал может представлять собой любой сигнал, который поддается выявлению с помощью, например, спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических или химических средств.
[0064] Повышение уровня фосфорилирования ITIM определяют путем сравнения (i) сигнала, генерируемого группой, генерирующей сигнал, в антителе к фосфотирозину, связывающемся с мотивом ITIM CD32B в клетках, которые были необработанными ("эталонное значение"), с (ii) сигналом, генерируемым группой, генерирующей сигнал, в антителе к фосфотирозину, связывающемся с мотивом ITIM CD32B в клетках, которые были обработаны распознающей
молекулой, такой как антитело, раскрытое в данном документе, при этом если сигнал (ii) превышает сигнал (i), то под воздействием распознающей молекулы, раскрытой в данном документе, произошло повышение уровня фосфорилирования ITIM CD32B. Для такого сравнения распознающую молекулу применяют в количестве в диапазоне от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл, как, например, 10, 15, 20 или 25 мкг/мл. Например, при сравнении антитела GB3, известного из уровня техники, или любой другой молекулы, такой как антитело, связывающееся с CD32B (в совокупности называемых "представляющими интерес молекулами"), такого, которое связывается с эпитопом на CD32B, как описано в данном документе, и/или такого, которое является неблокирующим, как описано в данном документе, с распознающей молекулой с целью определения способности представляющей интерес молекулы и распознающей молекулы к повышению уровня фосфорилирования ITIM CD32B уровень фосфорилирования ITIM определяют, как описано выше для представляющей интерес молекулы и распознающей молекулы. А именно, получают значение для сравнения представляющей интерес молекулы с необработанными клетками и значение для сравнения распознающей молекулы с необработанными клетками. Эти значения можно сравнить друг с другом для того, чтобы определить, обладает ли распознающая молекула способностью к повышению уровня фосфорилирования ITIM в большей степени, как, например, в 4-10 раз (в том числе 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), чем представляющая интерес молекула. Для такого сравнения представляющую интерес молекулу и распознающую молекулу применяют в количестве в диапазоне от 5 мкг/мл до 50 мкг/мл, как, например, 10, 15, 20 или 25 мкг/мл.
[0065] Что касается вариабельной области тяжелой цепи второго связывающего домена (связывающегося с Fc-гамма-рецептором ПВ) распознающей молекулы, раскрытой в данном документе, то в определенных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 3, по меньшей мере с одной из мутаций, выбранных из группы, включающей замену аминокислоты Q в положении 1 на Е, замену аминокислоты V в положении 11 на L, замену
аминокислоты G в положении 42 на К, замену аминокислоты S в положении 50 на V, замену аминокислоты Y в положении 53 на S, замену аминокислоты К в положении 58 на Т, замену аминокислоты G в положении 61 на А, замену аминокислоты S в положении 75 на Т, замену аминокислоты К в положении 76 на R, замену аминокислоты N в положении 77 на S и замену аминокислоты Т в положении 78 на N. Такое антитело характеризуется как содержащее константный домен IgE в качестве первого связывающего домена.
[0066] В случае, когда второй связывающий домен распознающей молекулы представляет собой константный домен IgG или его часть, связывающиеся с Fc-гамма-рецептором ПВ, распознающая молекула характеризуется как содержащая константную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 6, и/или константную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 7.
[0067] В антителе, раскрытом в данном документе, константная область тяжелой цепи содержит аланиновый остаток в положении 297 (N297A) в соответствии с нумерацией аминокислот в белке EU, которая описана Edelman и соавт. в 1969 (соответствует нумерации в последовательности, которая представлена под SEQ ID N0:6 и показана на фигуре 2). Антитела с тяжелой цепью, содержащей аланиновый остаток (Ala, А) в положении 297 (N297A), обозначаются в данном документе индексом "_N297A", тогда как антитела с аспарагиновым остатком (Asn, N) в указанном положении представляют собой "дикий тип" и, следовательно, обозначаются в данном документе индексом "(wt)". Как можно увидеть на фигуре 2, вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела 8А6 дикого типа оканчивается аминокислотным остатком "S" в положении 113 в соответствии с нумерацией аминокислот в белке EU. Константная область указанного антитела начинается в положении 118. Получаемый в результате кажущийся разрыв из 4 аминокислотных остатков вызван переходом на систему нумерации аминокислот в белке EU для константной области и не означает, что какие-либо аминокислотные остатки пропущены.
Такие константные домены с аланиновым остатком в положении 297 в аминокислотной последовательности, представленной под SEQ ID N0:6, действительно характеризуются пониженной или отсутствующей антителозависимой клеточной цитотоксичностью вследствие пониженного или отсутствующего связывания Fc-части антитела с Fc-рецепторами. Аминокислотная последовательность такой константной области с N297A приведена под SEQ ID NO: 28. Соответственно, распознающие молекулы, раскрытые в данном документе, могут содержать в качестве константной области аминокислотную последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 28. У таких антител отсутствует гликозилирование в положении 297 в соответствии с нумерацией аминокислот в белке EU. Таким образом, в данном документе раскрыты антитела, у которых отсутствует гликозилирование в положении 297 в соответствии с нумерацией аминокислот в белке EU в константной области тяжелой цепи, и также охватываются антитела, которые гликозилированы в положении 297 в соответствии с нумерацией аминокислот в белке EU в константной области тяжелой цепи.
[0068] В некоторых вариантах осуществления константный домен (Fc-домен) распознающей молекулы, такой как антитело, раскрытое в данном документе, имеет аллотип Glml7 и содержит аминокислоты К (Lys) в положении 214, Е (Glu) в положении 356, М (Met) в положении 358 и A (Ala) в положении 431 при отсутствии С-концевого К (Lys) (Beck и соавт., 2010).
[0069] В случае, когда второй связывающий домен распознающей молекулы представляет собой константный домен IgG или его часть, связывающиеся с Fc-гамма-рецептором ПВ, константный домен легкой цепи относится к аллотипу КтЗ и может содержать аминокислоты A (Ala) в положении 153 и V (Val) в положении 191.
[0070] Используемый в данном документе термин "аллотип" относится к человеческому аллотипу антител, раскрытых в данном документе. Аллотипы представляют собой аллельные/генетические варианты в рамках
последовательностей константных областей конкретных изотипов. Аллотипы наследуются по аллельному типу. Различные представители вида, таким образом, будут отличаться друг от друга тем, какие конкретные аллели данного изотипа они унаследовали от своих родителей. Kml и Кт2 представляют собой аллотипы каппа-цепей человека; Glm(4) и Glm(17) представляют собой аллотипы гамма-1-цепей человека.
[0071] В случае, когда второй связывающий домен распознающей молекулы представляет собой константный домен IgG или его часть, связывающиеся с Fc-гамма-рецептором ПВ, распознающая молекула может содержать константную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 6, и константную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 7. Такая распознающая молекула характеризуется первым связывающим доменом, представленным константным доменом IgE или его частью, который связывается с Fc-эпсилон-рецептором.
[0072] Что касается вариабельной области легкой цепи второго связывающего домена (связывающегося с Fc-гамма-рецептором ПВ) распознающей молекулы, то в некоторых вариантах осуществления он содержит аминокислотную последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 4, по меньшей мере с одной из мутаций, выбранных из группы, включающей замену аминокислоты Q в положении 1 на N, замену аминокислоты S в положении 28 на N, замену аминокислоты S в положении 31 на Т, замену аминокислоты V в положении 33 на L, замену аминокислоты D в положении 34 на А, замену аминокислоты Y в положении 49 на F, замену аминокислоты Т в положении 53 на N, замену аминокислоты Y в положении 55 на А, замену аминокислоты L в положении 89 на Q и замену аминокислоты N в положении 93 на Y. Такое антитело характеризуется как содержащее константную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 6, и/или константную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 7. Такая распознающая молекула дополнительно
характеризуется первым связывающим доменом, который представляет собой константный домен IgE или его часть, связывающиеся с Fc-эпсилон-рецептором.
[0073] Распознающая молекула (связывающаяся с Fc-гамма-рецептором ПВ), такая как антитело, содержит вариабельную область тяжелой цепи, приведенную под SEQ ID NO: 1 или 3, и/или вариабельную область легкой цепи, приведенную под SEQ ID NO: 2 или 4. Соответственно, распознающая молекула может содержать вариабельную область тяжелой цепи, приведенную под SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, приведенную под SEQ ID NO: 2, или она содержит вариабельную область тяжелой цепи, приведенную под SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, приведенную под SEQ ID NO: 4.
[0074] Распознающая молекула (связывающаяся с Fc-гамма-рецептором ПВ), такая как антитело, раскрытое в данном документе, специфично связывается с эпитопом FcyRIIB человека в пределах аминокислот №№ 20-40 согласно SEQ ID NO: 5.
В некоторых вариантах осуществления распознающая молекула специфично связывается с эпитопом, содержащим мотив GTHSPES в SEQ ID NO: 5. Было показано, что этот аминокислотный мотив является очень специфичным эпитопом FcyRIIB. Распознающие молекулы, такие как антитела, специфично связывающиеся с этим эпитопом, не связываются с FcyRIIA человека. Связывание распознающей молекулы, такой как антитело, с этим эпитопом посредством своей(своих) вариабельной(вариабельных) области(областей) предпочтительно не препятствует связыванию Fc-частей антител с рецептором и не блокирует нормальное физиологическое функционирование рецептора.
[0075] В некоторых вариантах осуществления распознающая молекула (связывающаяся с Fc-гамма-рецептором ПВ), такая как антитело, связывается in vitro с FcyRIIb человека с аффинностью, характеризующейся константой скорости диссоциации, составляющей по меньшей мере 4,9 х 10~4 с"1. Константу скорости диссоциации (k0ff) можно измерить с помощью экспериментов с поверхностным плазмонным резонансом. В частности, связывание антитела с
sFcyRIIB можно проанализировать с помощью поверхностного плазмонного резонанса с использованием биосенсора BIAcore Т200 (GE Healthcare/Biacore).
[0076] Используемый в данном документе термин "аффинность" относится к силе связывания между вариабельными областями одной тяжелой и одной легкой цепей антитела или его фрагмента или производного и их антигеном (например, рецептором FcyRIIB), которая измеряется in vitro. Аффинность определяет силу взаимодействия между эпитопом и антигенсвязывающим участком антитела. Аффинность можно рассчитать с использованием следующей формулы:
КА = [AB-AG]/[AB]*[AG] = kon/koff,
где
КА = константа аффинности,
[АВ] = молярная концентрация незанятых связывающих участков на антителе,
[AG] = молярная концентрация незанятых связывающих участков на антигене,
[AB-AG] = молярная концентрация комплекса антитело-антиген.
[0077] Используемый в данном документе термин "авидность" относится к мере общей прочности комплекса антитело-антиген, которая фактически зависит от параметров (1) аффинности антитела в отношении эпитопа, (2) валентности антитела и антигена и (3) структурного расположения взаимодействующих частей.
[0078] Предусматривается, что распознающая молекула, которая предпочтительно представляет собой антитело, может быть гликозилированной или дегликозилированной.
[0079] В случае, когда первый связывающий домен распознающей молекулы, раскрытой в данном документе, представляет собой константный домен IgE или
его часть, связывающиеся с Fc-эпсилон-рецептором, он может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID N0:35 или 36 или ее часть.
[0080] Предпочтительная часть Fc-домена IgE содержит СеЗ-домен и/или Се4-домен (см. фигуру 15 и SEQ ID NO: 36). Эти домены гомологичны Су2 и СуЗ IgG. В антителе IgG шарнирная область отвечает за необходимую гибкость молекулы и образование димера посредством дисульфидных мостиков. Эта шарнирная область отсутствует в антителе IgE. Вместо нее эту функцию принимает на себя дополнительный Се2-домен.
[0081] Другие иллюстративные части Fc-домена IgE включают в себя Се2-, СеЗ-и/или Се4-домен (см. фигуру 15 и SEQ ID NO: 35).
[0082] Другой тип изменчивости касается разного количества участков N-гликозилирования в Fce-домене. Для молекулы IgE описано несколько участков гликозилирования: N265, N371, N383 и N394. Предусматривается, что один или более из этих участков остаются в неизменном состоянии или подвергаются мутации таким образом, что они больше не могут быть гликозилированными.
[0083] Кроме того, в некоторых вариантах осуществления распознающая молекула, такая как антитело, содержит в качестве первого связывающего домена Fc-домен IgE и может связываться in vitro с FceRI человека с аффинностью, характеризующейся значением Kd по меньшей мере 1,2 х 10" (М).
[0084] В данном документе также предложены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие распознающую молекулу, описанную в данном документе. Используемые в данном документе термины "нуклеиновые кислоты" или "нуклеотидные последовательности" относятся к молекулам ДНК (например, кДНК или геномной ДНК), РНК (мРНК), их комбинациям или гибридным молекулам, содержащим ДНК и РНК. Нуклеиновые кислоты могут быть двух-или однонитевыми и могут содержать одновременно двух- и однонитевые
фрагменты. Наиболее предпочтительными являются двухнитевые молекулы
ДНК.
Соответственно, последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует раскрытую распознающую молекулу, содержит нуклеотиды, кодирующие по меньшей мере те части антитела, которые придают антителу свойства специфичного связывания.
В некоторых вариантах осуществления раскрытые последовательности нуклеиновых кислот кодируют вариабельные области, такие как по меньшей мере CDR, описанные в данном документе.
Иллюстративные последовательности нуклеиновых кислот представлены под SEQ ID NO: 8-11. Специалист в данной области будет осведомлен, что эти нуклеотидные последовательности могут варьироваться в зависимости от используемых способов экспрессии и применяемых для этого систем.
[0085] В данном документе дополнительно предложен вектор на основе нуклеиновой кислоты, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, которые кодируют распознающую молекулу , раскрытую в данном документе. Вектор предпочтительно содержит промотор, под контроль которого помещены вышеуказанные последовательности нуклеиновых кислот. Вектор может представлять собой вектор экспрессии у прокариот или эукариот, где рекомбинантная нуклеиновая кислота экспрессируется в отдельности либо в слиянии с другими пептидами или белками.
[0086] В данном документе также раскрыта клетка-хозяин, трансфицируемая вышеупомянутым вектором. Клетка-хозяин может представлять собой любую клетку, прокариотическую клетку или эукариотическую клетку, и ее можно применять для получения по меньшей мере частей антитела или его фрагмента или производного.
[0087] Также предложен способ получения распознающей молекулы, включающий культивирование клетки-хозяина, описанной в данном документе, в условиях, которые обеспечивают возможность экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в векторе на основе нуклеиновой кислоты, и извлечение полученной таким образом распознающей молекулы.
[0088] Распознающие молекулы, раскрытые в данном документе, можно преимущественно применять в фармацевтической композиции. Такую фармацевтическую композицию можно применять для лечения или профилактики заболеваний, ассоциированных с базофилами, предпочтительно аллергического заболевания.
[0089] Соответственно, также предложены способы лечения или профилактики заболеваний, ассоциированных с базофилами, предпочтительно аллергических заболеваний, при этом указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества распознающей молекулы, раскрытой в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом.
[0090] "Аллергическое заболевание" или "аллергия" относится к определенным заболеваниям, при которых иммунные ответы на антигены окружающей среды вызывают воспаление тканей и дисфункцию органов. Аллергеном является любой антиген, который вызывает аллергию. Таким образом, он может представлять собой либо саму антигенную молекулу, либо ее источник, такой как пыльцевые зерна, клетки кожи животных, яд насекомых или пищевой продукт. IgE играет главную роль при аллергических заболеваниях. Высокоаффинные рецепторы IgE (FceRI) расположены на тучных клетках и базофилах, которые служат в качестве антигенных мишеней, стимулирующих дальнейшее высвобождение медиаторов воспаления, которые вызывают многие проявления аллергического заболевания.
[0091] Термин "аллергическое заболевание" охватывает также IgE-опосредованное воспаление. "IgE-опосредованное воспаление" происходит тогда, когда антиген связывается с антителами IgE, которые занимают рецептор
FceRI на тучных клетках. В течение нескольких минут это связывание вызывает дегрануляцию тучной клетки с высвобождением определенных предварительно образованных медиаторов. Затем дегранулированная клетка начинает синтезировать и высвобождать дополнительные медиаторы de novo. Результатом этого является двухфазный ответ: начальный немедленный эффект в отношении кровеносных сосудов, гладкой мускулатуры и секреции желез (гиперчувствительность немедленного типа) с последующей клеточной инфильтрацией вовлеченного участка через несколько часов. IgE-опосредованное воспаление представляет собой механизм, лежащий в основе атопической аллергии (такой как сенная лихорадка, астма и атопический дерматит), системных анафилактических реакций и аллергической крапивницы (сыпи). Оно может в обычных условиях играть роль первой линии иммунологической защиты, поскольку оно вызывает быстрое расширение кровеносных сосудов, облегчая проход циркулирующих растворимых факторов и клеток к участку контакта с антигеном. Многие из наиболее пагубных характерных черт аллергического заболевания обусловлены действиями лейкоцитов, подвергнутых хемоаттракции.
[0092] В другом аспекте настоящее раскрытие относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента распознающую молекулу. Указанная фармацевтическая композиция может содержать по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, или вспомогательное вещество, или наполнитель. Распознающие молекулы могут быть представлены в фармацевтически приемлемых композициях, которые известны из уровня техники или приведены в общепризнанной фармакопее для применения у животных, и более конкретно, у людей.
[0093] При желании композиция также может содержать незначительные количества увлажняющих или эмульгирующих средств или буферных средств, поддерживающих рН. Данные композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с
замедленным высвобождением и т. п. Композиции можно составить в нейтральной форме или в форме соли.
Фармацевтически приемлемые соли включают без ограничения те, которые образованы анионами, как, например, полученными из хлористоводородной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т. д., и те, которые образованы катионами, как, например, полученными из гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т. д.
[0094] Вышеупомянутую фармацевтическую композицию можно применять для лечения, или профилактики, или диагностики любого заболевания или нарушения, предпочтительно заболеваний, ассоциированных с базофилами, предпочтительно аллергического заболевания.
[0095] Значения величины дозы и частоты введения охватываются терминами "терапевтически эффективный" и "профилактически эффективный". Кроме того, доза и частота введения, как правило, будут варьироваться в соответствии с факторами, специфическими для каждого пациента, в зависимости от конкретных вводимых терапевтических или профилактических средств, типа заболевания, пути введения, а также возраста, массы тела, реакции и анамнеза пациента. Подходящие схемы могут быть выбраны специалистом в данной области. Используемый в данном документе термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству терапевтически активного компонента или средства, которое является достаточным для лечения или уменьшения интенсивности проявлений заболевания или нарушения, для задержки начала проявления заболевания или которое обеспечивает какое-либо терапевтическое преимущество в лечении или управлении течением заболевания.
Для антител, которые являются иллюстративными распознающими молекулами, охватываемыми в данном документе, доза, вводимая пациенту, как правило, составляет от 0,0001 мг/кг до 100мг/кг массы тела пациента. Иллюстративные
вводимые дозы составляют от приблизительно 0,1 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 25 мг/кг, от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 25 мг/кг, от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг, от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 75 мг/кг, от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 12 мг/кг, приблизительно 14 мг/кг, приблизительно 15 мг/кг, приблизительно 17 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг или приблизительно 25 мг/кг. Хорошо известно, что антитела человека характеризуются более длительным временем полужизни в организме человека, чем антитела от других видов. Таким образом, дозу и частоту введения антител или их фрагментов или производных можно уменьшить по сравнению с обычно используемыми дозами антител от других видов.
[0096] Лечение субъекта терапевтически или профилактически эффективным количеством антител или их фрагментов или производных может включать одноразовое лечение или предпочтительно может включать курс лечения. В определенных вариантах осуществления субъекта можно обрабатывать антителами или их фрагментами или производными в диапазоне доз, раскрытых выше, один раз в неделю в течение от приблизительно 1 до приблизительно 10 недель, от приблизительно 2 до приблизительно 8 недель, более предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 7 недель. Можно выбрать наиболее преимущественную форму и способ применения для обеспечения наибольшей пользы для пациента, подлежащего лечению.
Способы введения антитела или его фрагмента или производного включают без ограничения парентеральное введение (например, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное и чресслизистое (например, интраназальный и пероральный пути). В конкретном варианте осуществления антитела вводят внутримышечно,
внутривенно или подкожно. Композиции можно вводить любым удобным путем, например, посредством инфузии или болюсной инъекции, посредством абсорбции через эпителиальную или кожно-слизистую выстилки (например, слизистую ротовой полости, слизистую прямой кишки и кишечника и т. д.), и их можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или локальным. Кроме того, можно также использовать легочное введение, например, путем использования ингалятора или небулайзера, а также составления со средством, образующим аэрозоль.
Используемые в данном документе термины "осуществление лечения" и "лечение" относятся к введению субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству фармацевтической композиции или антитела, которое является достаточным для лечения или уменьшения интенсивности проявлений заболевания или нарушения, для задержки начала проявления заболевания или обеспечения какого-либо терапевтического преимущества в лечении или управлении течением заболевания.
Используемый в данном документе термин "профилактика" относится к применению средства для предупреждения начала проявления заболевания или нарушения. "Профилактически эффективное количество" определяет количество активного компонента или фармацевтического средства, достаточное для предупреждения начала проявления или рецидива заболевания.
Используемые в данном документе термины "нарушение" и "заболевание" используют взаимозаменяемо по отношению к состоянию субъекта. В частности, термин "аутоиммунное заболевание" используют взаимозаменяемо с термином "аутоиммунное нарушение" по отношению к состоянию субъекта, характеризующемуся повреждением клеток, тканей и/или органов, вызванным иммунной реакцией субъекта на его собственные клетки, ткани и/или органы.
[0097] Более того, раскрытые антитела можно применять в целях диагностики для выявления, диагностирования или мониторинга заболеваний или нарушений,
в частности аутоиммунных заболеваний. Антитела или их фрагменты или производные можно применять для анализа уровней FcyRIIB в биологическом образце с применением классических иммуногистологических способов, которые описаны в данном документе или известны специалисту в данной области (например, см. Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101: 976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105: 3087-3096). Другие способы с использованием антител, применимые для выявления экспрессии генов белков, включают иммунологические анализы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и радиоиммунный анализ (RIA).
Таким образом, настоящее раскрытие дополнительно относится к диагностической композиции, содержащей распознающую молекулу, предпочтительно антитело, раскрытое в данном документе.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
SEQ ID NO: 1: аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела крысы 8А6.
SEQ ID NO: 2: аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела крысы 8А6.
SEQ ID NO: 3: аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела hu8A6.
SEQ ID NO: 4: аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела hu8A6.
SEQ ID NO: 5: аминокислотная последовательность FcyRIIB человека.
SEQ ID NO: 6: аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела hu8A6_wt.
SEQ ID NO: 7: аминокислотная последовательность константной области легкой цепи гуманизированного антитела hu8A6_wt.
SEQ ID NO: 8: последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела hu8A6.
SEQ ID NO: 9: последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела hu8A6.
SEQ ID NO: 10: последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая константную область тяжелой цепи гуманизированного антитела hu8A6_wt.
SEQ ID NO: 11: последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая константную область легкой цепи гуманизированного антитела hu8A6_wt.
SEQ ID NO: 12: аминокислотная последовательность растворимого FcyRIIA человека (sFcyRIIA).
SEQ ID NO: 13: аминокислотная последовательность мутантного растворимого FcyRIIA человека (sFcyRIIAmut).
SEQ ID NO: 14: аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи антитела крысы 8А6.
SEQ ID NO: 15: аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела крысы 8А6.
SEQ ID NO: 16: аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела крысы 8А6.
SEQ ID NO: 17: аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела крысы 8А6.
SEQ ID NO: 18: аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела крысы 8А6.
SEQ ID NO: 19: аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела крысы 8А6.
SEQ ID NO: 20: аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела hu8A6.
SEQ ID NO: 21: аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела hu8A6.
SEQ ID NO: 22: аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела hu8A6.
SEQ ID NO: 23: аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела hu8A6.
SEQ ID NO: 24: аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела hu8A6.
SEQ ID NO: 25: аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела hu8A6.
SEQ ID NO: 26: аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела GB3 (см. также SEQ ID NO: 7 в WO 2005/051999).
SEQ ID NO: 27: аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела GB3 (см. также SEQ ID NO: 5 в WO 2005/051999).
SEQ ID NO: 28: аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи, содержащая в положении 297 замену N на А (при допущении, что положение 1 в последовательности, которая приведена в перечне последовательностей, представляет собой положение 118).
SEQ ID NO: 29: аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит ключевые аминокислотные остатки из химерного и гуманизированного антитела 8А6.
SEQ ID NO: 30: аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит ключевые аминокислотные остатки из химерного и гуманизированного антитела 8А6.
SEQ ID NO: 31: аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит ключевые аминокислотные остатки из химерного и гуманизированного антитела 8А6.
SEQ ID NO: 32: аминокислотная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи, которая содержит ключевые аминокислотные остатки из химерного и гуманизированного антитела 8А6.
SEQ ID NO: 33: аминокислотная последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи, которая содержит ключевые аминокислотные остатки из химерного и гуманизированного антитела 8А6.
SEQ ID NO: 34: аминокислотная последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи, которая содержит ключевые аминокислотные остатки из химерного и гуманизированного антитела 8А6.
SEQ ID NO: 35: аминокислотная последовательность Fc-домена IgE, содержащая домены 2, 3 и 4.
SEQ ID NO: 36: аминокислотная последовательность Fc-домена IgE, содержащая домены 3 и 4.
SEQ ID NO: 37: последовательность плазмидной ДНК, кодирующей sFcsRIa.
SEQ ID NO: 38: аминокислотная последовательность пептида формилметионин-лейцин-фенилаланин.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигура 1. Анализ с помощью поверхностного плазмонного резонанса гуманизированного 8А6 согласно SEQ ID NO: 3 и 4 в формате дикого типа либо N297A, ch8A6_N297A (согласно SEQ ID NO: 14 и 15) и chGB3_N297A.
Фигура 2. Последовательности hu8A6_wt и hu8A6_N297A с изображением положения замены аминокислоты N на А в формате N297A.
Фигура 3. Неблокирующие характеристики ch8A6_N297A. Клетки Raji инкубировали с установленным количеством агрегированного IgG человека и различными количествами ch8A6_N297A, chGB3_N297A или блокирующих антител 2В6 или АЬ R &D. Антитела являются неблокирующими.
Фигура 4. Связывание очищенного с помощью белка А антитела (hu8A6_VL + hu8A6_VH и ch8A6_N297A) в концентрациях от 15 мкг/мл до 0,005 мкг/мл с нативным FcyRIIB, экспрессируемым на клетках Raji. Гуманизированные варианты 8А6 связываются с FcyRIIB, экспрессируемым на клетках Raji, с высокой авидностью.
Фигура 5. Связывание 15 мкг/мл антитела (hu8A6_VH + hu8A6_VL и ch8A6_N297A) с нативным FcyRIIA, экспрессируемым на клетках К562. Антитела не связываются с FcyRIIA на К-562.
[0098] Фигура 6а. Фосфорилирование ITIM, уровень которого повышается химерным 8А6 (ch8A6_N297A), в РВМС от здорового донора. РВМС от здорового донора выделяли с применением разделения с помощью фиколла, а затем оставляли необработанными или инкубировали в течение 25 минут со смесью антител, содержащей антитело к IgM (антитело мыши к иммуноглобулину человека) и антитело (кролика) к IgG мыши. Затем клетки обрабатывали в течение 20 минут 5 мкг/мл ch8A6_N297A либо буфером в качестве контроля (без антитела). Клетки собирали после инкубирования и лизировали в соответствии с протоколом. Лизаты подвергали WB-анализу. В-актин = контроль нагрузки.
Фигура 6Ь. Контрольный эксперимент по фосфорилированию ITIM. Клетки Daudi оставляли необработанными или обрабатывали в течение 25 минут антителом изотипического контроля, поликлональным антителом к IgM человека (поликлональное антитело к hlgM), моноклональным антителом к IgM человека (антитело к hlgM), антителом к hlgM + 5 мкг/мл ch8A6 N297A, антителом кролика к IgG мыши (а к IgG мыши), а к IgG мыши + 5 мкг/мл
ch8A6_N297A, смесью антитела к hlgM и а к IgG мыши (смесь АЬ) или смесью АЬ + 5 мкг/мл ch8A6 N297A. В-актин = контроль нагрузки.
Фигура 6с. Антитела по настоящему изобретению усиливают фосфорилирование ITIM при наличии и в отсутствие перекрестного сшивания/колигирования BCR и Fc-гамма RIIB (FcyRIIB) в первичных РВМС.
Фигура 7. Сравнение ch8A6_N297A с антителом, известным из существующего уровня техники (chGB3_N297A). Клетки Daudi человека инкубировали в течение 25 минут со смесью антител, содержащей антитело к IgM (антитело мыши к иммуноглобулину человека) и антитело (кролика) к IgG мыши, или оставляли необработанными. Затем клетки обрабатывали в течение 20 минут различными количествами chGB3 N297A или ch8A6 N297A либо буфером в качестве контроля (без антитела). Клетки собирали после инкубирования и лизировали в соответствии с протоколом. Лизаты подвергали WB-анализу. В-актин = контроль нагрузки.
Фигура 8. Сравнение эффекта гуманизированного варианта hu8A6 N297A, а также ch8A6 N297A и chGB3 N297A в отношении фосфорилирования ITIM в первичных РВМС. После перекрестного сшивания BCR и FcyRIIB с помощью смеси антител добавляли различные антитела в концентрации 5 мкг/мл и проводили вестерн-блот-анализ в отношении фосфорилирования ITIM. В-актин = контроль нагрузки.
Фигура 9. Совместная иммунопреципитация фосфорилированной SHIP-1 и ITIM FcyRIIB. После стимуляции клеток Daudi смесью антител и любым из ch8A6 N297A, блокирующего антитела 2В6, связывающегося с FcyRIIB, или chGB3_N297A (5 мкг/мл) FcyRIIB осаждали из клеточных лизатов, и проводили вестерн-блот-анализ в отношении фосфатазы SHIP-1. Панспецифическое антитело к CD32 (AF1330), используемое в качестве антитела к CD32 = контроль нагрузки.
Фигура 10. Сравнение гуманизированных вариантов 8А6 (hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH 12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7) с ch8A6_N297A. Клетки Daudi оставляли для инкубирования в течение 25 минут с буфером (без обработки) или со смесью (смесь антител), содержащей антитело к IgM (антитело мыши к иммуноглобулину человека) и антитело (кролика) к IgG мыши. Затем клетки обрабатывали в течение 20 минут 0,25 мкг/мл ch8A6_N297A либо гуманизированными вариантами 8А6 (hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7). Клетки собирали после инкубирования и лизировали в соответствии с протоколом. Лизаты подвергали WB-анализу. В-актин = контроль нагрузки.
Фигура 11. Сравнение гуманизированных вариантов 8А6 (hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH 12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7) с ch8A6_N297A, блокирующим антителом, связывающимся с FcyRIIB, и chGB3_N297A. Клетки Daudi оставляли для инкубирования в течение 25 минут с буфером (без обработки) или со смесью (смесь антител), содержащей антитело к IgM (антитело мыши к иммуноглобулину человека) и антитело (кролика) к IgG мыши. Затем клетки обрабатывали в течение 20 минут любым из 0,25 мкг/мл ch8A6_N297A, гуманизированных вариантов 8А6 (hu8A6-VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7), блокирующего антитела 2В6, связывающегося с FcyRIIB, или chGB3_N297A. Клетки собирали после инкубирования, лизировали в соответствии с протоколом и анализировали с помощью вестерн-блот-анализа. Лизаты подвергали WB-анализу. В-актин = контроль нагрузки.
Фигура 12. Схема эксперимента для мышиной модели SLE-PBL. PBL от пациентов-людей со SLE переносят мышам с ослабленным иммунитетом. PBL-клетки трансплантируют, и мышей затем обрабатывают контролем (PBS) или антителом ch8A6_N297A, связывающимся с FcyRIIB, согласно настоящему изобретению.
Фигура 13. Уровень общего IgG человека [мкг/мл] у мышей, которым трансплантировали PBL от доноров-людей, страдающих SLE. Изображены мыши, обработанные контролем (№ 2, PBS) или ch8A6_N297A (№ 3 и № 4).
Фигура 14. Снижение уровня специфичных для конкретного заболевания антител IgG человека к ДНК у обработанных ch8A6_N297A мышей, начиная с 4 недели после переноса/трансплантации SLE-PBL с использованием PBL от доноров-людей, страдающих SLE. Изображены титры антител IgG к ДНК у двух различных мышей, № 3 и № 4 (обработанных ch8A6_N297A), под № 2 показан контроль с PBS.
[0099] Фигура 15. Конструкты, состоящие из Fab-домена химерного антитела IgG, специфичного к FcyRIIB, и Fce-домена антитела IgE. Конструкты отличаются перестройкой Fab из IgG и Fce-домена (В. с Се2-доменом, С. без Се2, но с шарнирной областью IgG) и количеством участков N-гликозилирования. Для сравнения показано схематическое изображение полной молекулы IgG и полной молекулы IgE (А).
Фигура 16. Связывание 8A6-IgE с SM101 (sFcyRIIB), тестируемое с помощью ELISA. На фигуре изображен иллюстративный эксперимент по методу ELISA. Варианты ch8A6-IgE характеризуются такой же аффинностью к антигену SM101 (растворимому FcyRIIB), как и химерное антитело, связывающееся с Fc-гамма RIIB.
Фигура 17. Связывание вариантов 8A6_IgE с sFcsRIa, определяемое с помощью ELISA. На фигуре изображен иллюстративный эксперимент по методу ELISA. Гуманизированные варианты антител на основе IgE, связывающихся с Fc-гамма RIIB, связываются с sFcsRIa с такой же аффинностью, как и соответствующая химерная версия антитела на основе IgE, связывающегося с Fc-гамма RIIB.
Фигура 18. Связывание с клетками антитела на основе IgE, связывающегося с FcyRIIB, посредством FcyRIIB, экспрессируемого на клетках Raji. На фигуре изображен иллюстративный эксперимент по методу FACS, который проводили с
вариантами 8A6_cs2-4degly и 8A6_cs3-4degly в сравнении с ch8A6_N297A. Оба варианта 8A6-IgE, равно как и ch8A6_N297A, характеризуются одинаковой аффинностью к нативному антигену FcyRIIB.
Фигура 19. Связывание 8A6-IgE с SM101, тестируемое с помощью ELISA. На фигуре изображен иллюстративный эксперимент по методу ELISA. Гуманизированные варианты 8A6-IgE характеризуются такой же аффинностью к антигену SM101 (растворимому FcyRIIB), как и химерное антитело, связывающееся с Fc-гамма-рецептором ПВ.
Фигура 20. Связывание вариантов 8A6-IgE с sFcsRIa, определяемое с помощью ELISA. На фигуре изображен иллюстративный эксперимент по методу ELISA. Гуманизированные варианты антител на основе IgE, связывающихся с Fc-гамма RIIB, связываются с sFcsRIa с такой же аффинностью, как и соответствующая химерная версия антитела на основе IgE, связывающегося с Fc-гамма RIIB.
Фигура 21. Тестирование связывания меченого 8A6-IgE-Fluo488 с клетками Raji. Связывание флуоресцентно меченного конструкта с FcyRIIB тестировали на клетках Raji, а клетки СНО (отрицательные по FcyRIIB) служили в качестве контроля. Оценивали флуоресценцию в FITC-канале.
Фигура 22. Связывание ch8A6_ce2-4-degly и ch8A6_N297A с В-клетками в РВМС. FACS-анализ связывания 8A6-IgE (левый блок), 8A6-IgE, маскированного с помощью SM101 (средний блок), и 8A6-IgG (правый блок) с В-клетками. В моменты времени, определенные справа, В-клетки после окрашивания с помощью a-hCD19-PeCy7 анализировали на связывание с 8А6-IgE с помощью FACS-анализа. Числа в правом верхнем квадранте отражают среднюю интенсивность флуоресценции в указанном квадранте.
Фигура 23. Стратегия гейтирования для выявления базофилов. CD 193-положительные клетки с низким значением SSC гейтировали как базофилы. Использовали квадрантные гейты, в которых экспрессию CD63 в необработанных клетках принимали равной 0.
Фигура 24. Экспрессия CD63 в базофилах, обработанных с помощью 8A6 N297A и 8A6_cs2-4-degly в разных концентрациях. Для исключения потенциальных эффектов активации 8A6 N297A и 8A6_ce2-4-degly самими по себе образцы, которые инкубировали с 8A6 N297A и 8A6_ce2-4-degly в течение ночи, анализировали в отношении их экспрессии CD63 без дополнительной активации антигеном.
Фигура 25. Инкубирование с LPS в качестве контроля для 8A6_ce2-4-degly. Цельную кровь инкубировали с 50 EU/мл LPS в течение 24 ч., и анализировали экспрессию CD63.
Фигура 26. Активация контролей через 6 ч.
Фигура 27. Активация образцов, обработанных 8A6-IgG или 8A6-IgE, через 6 ч. Фигура 28. Активация контролей через 24 ч.
Фигура 29. Активация образцов, обработанных 8A6-IgG или 8A6-IgE (дегликозилированным 8A6-cs2-cs4), через 24 ч.
Фигура 30. Тест активации пыльцой.
ПРИМЕРЫ - Создание антител, связывающихся с Fc-гамма-рецептором ПВ
[00100] Пример 1. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА 8А6
Моноклональное антитело клона 8А6 получали путем иммунизации крыс Long-Evans рекомбинантным растворимым рецептором FcyRIIB человека. Получали линии клеток гибридом из клеток селезенки крысы и подвергали скринингу в отношении антител, которые специфично связываются с FcyRIIB человека с большей аффинностью, чем с FcyRIIA. Во-вторых, антитела, вырабатываемые вышеупомянутыми гибридомами, подвергали скринингу в отношении неблокирующих характеристик, т. е. того, чтобы эти антитела по-прежнему
обеспечивали возможность связывания IgG или 1С с мембраносвязанным FcyRIIB, с использованием методик, известных из уровня техники.
50 мкг очищенного рекомбинантного растворимого FcyRIIB человека (sFcyRIIB, SEQ ID NO: 5) инъецировали внутрибрюшинно (i.p.) и подкожно (s.c.) крысам LOU/C с применением неполного адъюванта Фрейнда, дополненного 5 нмоль CpG 2006 (TIB MOLBIOL, Берлин, Германия). После шестинедельного интервала вводили конечную бустерную дозу 50 мкг sFcyRIIB и CpG 2006 i.p. и s.c. за три дня до слияния. Слияние линии клеток миеломы с иммунными клетками селезенки крысы осуществляли в соответствии со стандартными процедурами. Образцы надосадочной жидкости гибридомы тестировали в твердофазном иммунологическом анализе с белком sFcyRIIB или нецелевым белком sFcyRIIA (SEQ ID NO: 12), которыми были покрыты планшеты для ELISA. MAb из надосадочной жидкости культуры тканей, связанные с белками, выявляли с применением mAb, конъюгированных с HRP, к изотипам IgG крысы (антитела TIB 173 к IgG2a, антитела TIB 174 к IgG2b, антитела TIB 170 к IgGl, все из которых получены из АТСС, антитела R-2c к IgG2c, полученного самостоятельно), таким образом избегая mAb из класса IgM. MAb 8А6 (IgG2a крысы) распознавало FcyRIIB и не связывалось с FcyRIIA при использовании в антиген-специфическом анализе по методу ELISA. Анализ с использованием FACS применяли для скрининга антител в отношении специфичного связывания нативного антигена. Кроме того, антитела подвергали скринингу в отношении неблокирующих характеристик, т. е. того, чтобы эти антитела по-прежнему обеспечивали возможность связывания IgG или иммунных комплексов с мембраносвязанным FcyRIIB.
Для получения достаточного количества антитела для определения характеристик химерных и гуманизированных конструктов клетки CHO-S FreeStyle(tm) подвергали транзиентной трансфекции.
За день до трансфекции клетки высевали в количестве 0,5 х 106 клеток/мл. Клетки центрифугировали и ресуспендировали в среде с получением конечной
концентрации клеток 20 х 106 клеток/мл. Для каждой трансфекции 3 мл суспензии клеток переносили в 6-луночный планшет. Плазмидную ДНК для трансфекции выделяли с использованием набора HiSpeed Plasmid Maxi (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя и элюировали Н20, не содержащей эндотоксинов.
Для каждой трансфекции 75 мкг плазмидной ДНК, кодирующей легкую цепь, и 75 мкг плазмидной ДНК, кодирующей тяжелую цепь, добавляли в суспензию клеток и осторожно перемешивали. Затем добавляли PEI (Polyplus) и осторожно перемешивали. Клетки инкубировали в течение 3 ч. при 37°С и 5% С02 при непрерывном встряхивании (100 об./мин.). В суспензию клеток доливали среду до конечного объема 15 мл с достижением конечной концентрации клеток 4 х 106 клеток/мл и переносили в колбу на 125 мл. Клетки инкубировали при 37°С и 5% С02 при непрерывном встряхивании (100 об./мин.), и через 6 дней надосадочную жидкость собирали путем 2-кратного центрифугирования (4000 об./мин., 5 мин.). Надосадочную жидкость фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм, и определяли титр антитела (см. ниже).
Определение титра антитела проводили посредством двух разных способов HPLC, обращенно-фазовой (RP) HPLC и HPLC с белком А. Анализ по методу RP-HPLC проводили с использованием системы HPLC серии Agilent 1200. Данные анализировали с использованием программного обеспечения "ChemStation" версии В.04.02 для систем LC. Компоненты растворителя представляли собой: изопропанол (чистый для HPLC; Roth), ацетонитрил (градиентной чистоты для HPLC; Roth), Н20 (профильтрованную через фильтр с размером пор 0,2 мкм) и тетрафторацетат (TFA) (для синтеза пептидов; Sigma). Растворитель А: Н20, 0,1% TFA; растворитель В: 60% изопропанола, 30% ацетонитрила, 9,9% Н20 и 0,1% TFA. Использовали колонку Phenomenex Jupiter (№ 525166-6) с размером пор 300 А и разделяющий материал с диаметром частиц 5 мкм. Связанное антитело элюировали в линейном градиенте от 30% до 43% растворителя В за 10 мин. Выявление происходило при X = 210 нм с использованием детектора для ультрафиолетовой/видимой области спектра.
Анализ по методу HPLC с белком А проводили с использованием системы HPLC серии Agilent 1200. Данные анализировали с помощью программного обеспечения "ChemStation" модифицированной версии В.04.02. Применяли следующие растворители: растворитель А: 0,05 М Tris/HCl, 0,1 М глицин, 0,15 М NaCl, рН 8,0; растворитель В: 0,05 М Tris/HCl, 0,1 М глицин, 0,15 М NaCl, рН 3,0. Для анализа в аналитическую предколонку Upchurch размером 2 х 20 мм упаковывали 120 мкл среды для перфузионной хроматографии Applied Biosystems Poros(r) 20А (Life Technologies). Связанное антитело элюировали 100% растворителя В. В случае, когда собирали очищенное антитело, фракции нейтрализовали с помощью 56 мМ Tris с рН 8,0.
Экспрессируемые антитела очищали с помощью колонки HiTrap(tm) на 1 мл с рекомбинантным белком A FF (GE Healthcare) посредством жидкостной экспресс-хроматографии белков (Akta Explorer). Подвижный буфер содержал 10 мМ Tris-HCl с рН 8,0, 150 мМ NaCl, элюирующий буфер содержал 100 мМ глицина, 150 мМ NaCl, рН 2,7. Элюированные антитела нейтрализовали 60 мМ Tris-HCl с рН 8,0, концентрировали, подвергали стерилизующей фильтрации и хранили при -80°С.
[00101] Пример 2. СКРИНИНГ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК АНТИТЕЛА 8А6
Скрининг образцов надосадочной жидкости гибридом осуществляли с помощью методик, которые известны из существующего уровня техники, например, анализа связывания с помощью ELISA, анализа с помощью Biacore или анализа связывания с помощью FACS. Для тестирования специфичного связывания антигена химерным или гуманизированными вариантами 8А6 планшеты для ELISA (планшеты Nunc-Immuno, F96 Maxisorp) покрывали 1 мкг/мл sFcyRIIB, sFcyRIIA (SEQ ID NO: 12) или sFcyRIIAmut (SEQ ID NO: 13) в PBS (100 мкл/лунка) на ночь при 4°С. После 3 этапов промывки в 0,01% Tween в PBS проводили блокирование с помощью 2% BSA в PBS (300 мкл/лунка) в течение 2 часов при комнатной температуре. После 3 этапов промывки вносили серийные
разведения очищенного антитела или надосадочной жидкости (100 мкл/лунка) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Очищенные антитела разводили в PBS с 2% BSA. Образцы надосадочной жидкости дополняли 10-кратным объемом PBS и 20% BSA с получением конечной концентрации 2% BSA в PBS. В качестве положительного контроля для FcyRIIA использовали антитело козы, связывающееся с FcyRIIA человека (R &D Systems, AF1875). После 3 этапов промывки в 0,01% Tween в PBS соответствующее вторичное антитело осла к иммуноглобулину козы, конъюгированное с HRP (F(ab')2, Jackson-Immuno-Research), или антитело козы к иммуноглобулину человека, конъюгированное с HRP (F(ab')2, Dianova), инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре (100 мкл/лунка). Лунки промывали 6 раз в 0,01% Tween в PBS. Добавляли субстрат (OPD, содержащий 0,03% Н202) (100 мкл/лунка), и реакцию останавливали путем добавления 4 М H2S04 (50 мкл/лунка). Затем измеряли поглощение на спектрометре при длине волны 492 нм.
Анализ специфичного связывания с нативным антигеном химерного или гуманизированных вариантов 8А6 проводили посредством связывания с клетками на клетках Raji (АТСС(r) CCL-86(tm)) и К-562 (АТСС(r) CCL-243(tm)).
Клетки осаждали центрифугированием (400 g, 5 мин.) и промывали в буфере для FACS (сбалансированный солевой раствор Хэнкса, 1% FCS, 0,01% NaN3). После дополнительного этапа центрифугирования клетки ресуспендировали в буфере для FACS с получением конечной концентрации клеток 2 х 106 клеток/мл, и 50 мкл суспензии клеток добавляли аликвотами в 96-луночный планшет с U-образным дном. Готовили серийные разведения гуманизированных вариантов и ch8A6 в буфере для FACS.
Для подтверждения экспрессии FcyRIIA на клетках К-562 антитело мыши к CD32 человека (Stem Cell Technologies Inc., клон VI.3) разводили в буфере для FACS. 50 мкл разведенных антител добавляли к клеткам и инкубировали в течение 30 мин. при 4°С. Клетки промывали 2 раза в буфере для FACS. Затем
50 мкл вторичного антитела козы к IgG человека, конъюгированного с РЕ (F(ab')2, Dianova), или вторичного антитела козы к IgG мыши, конъюгированного с РЕ (F(ab')2, Dianova), разводили в буфере для FACS, добавляли к клеткам и инкубировали в течение 30 мин. при 4°С. После 2 этапов промывки в буфере для FACS клетки ресуспендировали в 300 мкл буфера для FACS и измеряли на приборе BD FACSCanto(tm) II (программное обеспечение: BD FACSDiva(tm)).
Для определения того, обеспечивают ли антитела, связывающиеся с FcyRIIB, по-прежнему возможность связывания IgG или иммунных комплексов с мембраносвязанным FcyRIIB, проводили анализ с использованием FACS. Клетки осаждали центрифугированием (400 g, 5 мин.) и промывали в буфере для FACS (сбалансированный солевой раствор Хэнкса, 1% FCS, 0,01% NaN3). После дополнительного этапа центрифугирования клетки ресуспендировали в буфере для FACS с получением конечной концентрации клеток 2 х 106 клеток/мл. Готовили серийные разведения антител (ch8A6 N297A, chGB3 N297A, Ab R &D mabl875) в буфере для FACS. 25 мкл разведенных антител смешивали в 96-луночном планшете с U-образным дном с 25 мкл меченного А1еха488 агрегированного бериглобина (2,5 мкл/лунка). Агрегированный IgG человека выделяли с помощью эксклюзионной хроматографии на Superdex-200 (16/60) из коммерчески доступного общего IgG-продукта (бериглобина).
50 мкл суспензии клеток добавляли к смеси антитело-бериглобин и инкубировали в течение 1 часа при 4°С. Клетки промывали 2 раза в буфере для FACS. Затем 50 мкл вторичного антитела козы к IgG человека, конъюгированного с РЕ (F(ab')2, Dianova), или вторичного антитела к иммуноглобулину крысы, конъюгированного с РЕ, разводили в буфере для FACS, добавляли к клеткам и инкубировали в течение 30 мин. при 4°С. После 2 этапов промывки в буфере для FACS клетки ресуспендировали в 300 мкл буфера для FACS и измеряли на приборе BD FACSCanto(tm) II (программное обеспечение: BD FACSDiva(tm)) (фиг. 3).
WO 2016/023985
Анализ связывания с помощью FACS
РСТ/ЕР2015/068667
Анализ специфического связывания с нативным антигеном химерного или гуманизированных вариантов 8А6 проводили посредством связывания с клетками на клетках Raji и К-562.
Клетки осаждали центрифугированием (400 g, 5 мин.) и промывали в буфере для FACS (сбалансированный солевой раствор Хэнкса, 1% FCS, 0,01% NaN3). После дополнительного этапа центрифугирования клетки ресуспендировали в буфере для FACS с получением конечной концентрации клеток 2 х 106 клеток/мл, и 50 мкл суспензии клеток добавляли аликвотами в 96-луночный планшет с U-образным дном. Готовили серийные разведения гуманизированных вариантов и ch8A6 в буфере для FACS.
Клетки Raji и К562 инкубировали с возрастающими концентрациями гуманизированных антител и химерным антителом в качестве контроля. Клетки Raji использовали для тестирования связывания с FcyRIIB (фиг. 4), клетки К562 - для анализа неспецифического связывания с FcyRIIA (фиг. 5). Связанные с клетками антитела выявляли с помощью вторичного антитела, конъюгированного с РЕ. Все гуманизированные варианты связывались с FcyRIIB с аффинностью, сравнимой с ch8A6_N297A, и все гуманизированные варианты при этом связывались с FcyRIIB с большей авидностью, чем с FcyRIIA.
Связывание антител с sFcyRIIB и sFcyRIIA анализировали с помощью поверхностного плазмонного резонанса с применением биосенсора Biacore Т200 (GE Healthcare/Biacore). Эксперименты проводили в лаборатории биоаналитики кафедры биологии и микробиологии LMU. Анализируемые антитела захватывали на сенсорном чипе СМ5 серии S с применением набора для захвата антител человека в соответствии с протоколом производителя. Варианты Ни8А6 или ch8A6 захватывали в концентрации 10 нМ в течение 1 мин. Аналит sFcyRIIB инъецировали в различных концентрациях в течение 3 мин. Измерения осуществляли при 25°С и в непрерывном потоке (10 мкл/мин.). Данные
оценивали с применением программного обеспечения для оценки Biacore Т200 (версии 1.0), предполагая связывание 1:1.
[00102] Пример 3. ХИМЕРИЗАЦИЯ АНТИТЕЛА 8А6 КРЫСЫ
Химерное моноклональное антитело 8А6, связывающееся с FcyRIIB, конструировали путем слияния VH-области 8А6 крысы с сигнальным пептидом и константной области IgGl человека. Кроме того, дегликозилированный вариант тяжелой цепи создавали с применением константного домена IgGl, содержащего мутацию N297A. Для конструирования гена легкой цепи 8А6 VL-область 8А6 крысы аналогичным образом сливали с сигнальной последовательностью и последовательностью для константной области каппа-цепи человека с последующим субклонированием в вектор экспрессии у млекопитающих.
[00103] АНАЛИЗЫ IN VITRO
Клетки, реагенты и антитела
Линии клеток лимфомы Беркитта человека Daudi и Ramos приобретали у DSMZ (АСС 78 и АСС 603) и выдерживали в RPMI 1640 (Gibco/Invitrogen), дополненной 10% FBS (Gibco/Invitrogen), NEAA MEM (Gibco/Invitrogen), 1 мМ пирувата натрия (Gibco/Invitrogen) и 2 мМ L-глутамина (Gibco/Invitrogen), при 37°С и 5% СО2. Первичные В-клетки человека очищали от гепаринизированной крови здоровых доноров с применением градиентов плотности фиколла (Leucosep, Greiner Bio-One, раствор для разделения Biocoll, Biochrom) и негативного магнитного выделения (Dynabeads Untouched для В-клеток человека, Invitrogen). Чистоту обогащенных В-клеток изучали с помощью FACS-анализа путем окрашивания антителом к hCD19, конъюгированным с АРС (BD Pharmingen № 555415), антителом к hCD3, конъюгированным с PerCP-Cy5.5 (BD Biosciences № 332771), и антителом к hCD56, конъюгированным с РЕ (BD Pharmingen № 555515). Первичные В-клетки сразу же использовали для
экспериментов без дополнительного культивирования. Блокирующее антитело 2В6, связывающееся с FcyRIIB, соответствовало ЕР1534335.
Протокол стимуляции с использованием стимулирующей смеси растворимых антител
Для одновременной стимуляции BCR и FcyRIIB создавали систему антител с применением смеси антител из 2 мкг/мл моноклонального антитела мыши к hlgM (Southern Biotech, № 9022-01, клон UHB) и 20 мкг/мл моноклонального антитела кролика к mIgG(l,2a,3) (Epitomics, № 3020-1, клон Ml 11-2), у которых Fc-часть перекрестно реагирует с рецептором FcyRIIB человека. Контрольные эксперименты проводили с 20 мкг/мл поликлонального антитела кролика к hlgM (Antibodies Online, № АВIN 117299) или смесью, содержащей 2 мкг/мл антитела hlgM и изотипического контроля mIgG2b (клон МРС-11, BD Pharmingen, № 557351). 3 х 105 клеток из линий клеток лимфомы Daudi или Ramos и первичных В-клеток собирали путем центрифугирования и инкубировали с различными стимулирующими смесями в среде для анализа (RPMI 1640 + 1% FBS) в течение 20 мин. при 37°С.
Затем к образцам добавляли 5 мкг/мл связывающихся с FcyRIIB антител ch8A6 (0,8 мкл в разведении 1:10), 2В6 (1,5 мкл в разведении 1:10) или chGB3_N297A (1,1 мкл в разведении 1:10), и клетки дополнительно инкубировали в течение 2530 мин. Лизис осуществляли, как описано отдельно.
Вестерн-блот-анализ паттернов фосфорилирования
Лизис клеток
Клетки осаждали при 4°С, промывали ледяным PBS и инкубировали в 10 мкл буфера для лизиса (буфера для RIPA (Cell Signaling), дополненного ингибиторами фосфатаз (PhosStop, Roche), ингибиторами протеаз (Complete Ultra Mini, без EDTA, Roche) и 1 мМ PMSF (Fluka Biochemica) в течение 3045 мин. на льду.
SDS-PAGE
После центрифугирования образцы надосадочной жидкости загружали в буфер для образца (буфер LDS для образца NuPAGE, восстановитель для образца NuPAGE, Invitrogen), и к ним применяли SDS-PAGE (гели NuPAGE Novex Bis-Tris Mini, подвижный буфер MES SDS (Invitrogen)). В случае SDS-PAGE добавляли буфер LDS для образца и восстановитель, и образцы нагревали до 95°С в течение 5 мин. Образцы хранили при -20°С или сразу же анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.
Перенос белков на мембраны из PVDF и выявление
Затем белки переносили на мембраны из PVDF (Roti-PVDF, Roth, буфер для переноса - 10 мМ Tris, 100 мМ глицина, 10% метанол, условия переноса: постоянный ток 240 мА, 90 мин. при 4°С). Мембраны блокировали с помощью 5% BSA в TBS-T (10 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween20) и окрашивали антителом, связывающимся с фосфорилированным FcyRIIB/CD32 (pY292) (Cell Epitomics, № 2308-1, 1:50000, при 4°C в течение ночи), или антителом к фосфорилированной SHIP (1:1000, Cell Signaling, № 3941) и конъюгированным с HRP антителом к иммуноглобулину кролика (Jackson ImmunoResearch, № 111036-045, 1:50000 в TBS-T, 1 ч. при комнатной температуре). Хемилюминесценцию (проявляемую с помощью Western Lightning Plus, Perkin Elmer) выявляли на рентгеновских пленках.
Стрипирование
Для последующих анализов с использованием антител, направленных на другие фосфорилированные белки, мембраны подвергали стрипированию (Re-Blot Plus, Millipore) в течение 10 мин., промывали и блокировали перед окрашиванием антителом к fi-актину (Sigma-Aldrich, № А1978, 1:50000 и конъюгированным с HRP антителом к IgG мыши, Sigma-Aldrich, № А9044) или антителами к другим сигнальным белкам.
[00104] Уровень фосфорилирования ITIM FcyRIIB в РВМС от здорового донора существенно повышается раскрытыми антителами
РВМС от здорового донора выделяли и оставляли необработанными либо инкубировали в течение 25 минут со стимулирующей смесью (моноклональное антитело мыши к hlgM и моноклональное антитело кролика к mlgG). Затем клетки обрабатывали ch8A6 либо буфером в качестве контроля. Клеточные лизаты подвергали вестерн-блот-анализу с применением соответствующих детекторных антител, которые представлены в общих чертах выше. Было выявлено существенное повышение уровня фосфорилирования мотива ITIM FcyRIIB в клетках (РВМС, В-клетки) (фиг. 6а). В контрольных экспериментах со стимуляцией клеток стимулирующей смесью в отдельности или только моноклональным антителом мыши к hlgM, моноклональным антителом кролика к mlgG в комбинации с ch8A6 не было продемонстрировано повышение уровня фосфорилирования ITIM FcyRIIB (фиг. 6b). Раскрытые антитела, таким образом, проявляют существенный эффект в отношении фосфорилирования ITIM в клетках человека с перекрестно сшитым BCR (В-клеточным рецептором) и мембраносвязанным (эндогенно экспрессируемым) FcyRIIB, но не в нестимулированных клетках, т.е. клетках без перекрестно сшитого BCR и мембраносвязанного FcyRIIB. В ходе аутоиммунного заболевания BCR и мембраносвязанный FcyRIIB будут перекрестно сшиваться аутоантигенами или иммунными комплексами (1С). Антитела способны к ингибированию функции патогенных аутореактивных В-клеток при аутоиммунном заболевании путем повышения уровня фосфорилирования ITIM FcyRIIB. Антитела, однако, также способны к повышению уровня фосфорилирования ITIM в отсутствие перекрестно сшитого BCR (фиг. 6с).
[00105] Сравнение эффектов ch8A6 и антитела chGB3_N297A
Сравнение эффекта клона ch8A6 N297A и клона chGB3 N297A в отношении фосфорилирования ITIM. Клетки Daudi человека обрабатывали смесью антител, а затем ch8A6 N297A, chGB3 N297A или 2В6, как описано выше. Антитело
chGB3_N297A, подобно ch8A6_N297A, является неблокирующим антителом, связывающимся с FcyRIIB, и распознает аналогичный эпитоп.
При добавлении ch8A6_N297A к обработанным смесью антител клеткам было продемонстрировано повышение уровня фосфорилирования ITIM FcyRIIB уже при концентрациях 0,05 мкг/мл. Хотя для возрастающих концентраций chGB3_N297A была продемонстрирована дозозависимая стимуляция фосфорилирования ингибирующего мотива, неожиданно было выявлено, что данный клон антитела не был способен обеспечивать достижение уровней фосфорилирования, сравнимых с 8А6. Денситометрическое количественное определение на рентгеновской пленке с использованием программного обеспечения "ImageJ" давало при расчете не более чем 2,8-кратное повышение значений сигналов фосфорилирования, тогда как hu8A6_N297A приводило к 9,8-кратному повышению по сравнению с необработанными клетками (фиг. 7). Таким образом, антитела согласно настоящему изобретению явно и неожиданно демонстрируют повышение уровня фосфорилирования ITIM FcyRIIB по сравнению с антителом chGB3_N297A.
[00106] Сравнение эффекта гуманизированного варианта hu8A6, химерного 8A6 N297A и chGB3_N297A в отношении фосфорилирования ITIM в первичных РВМС
Антитело chGB3_N297A, ch8A6_N297A и гуманизированное 8А6 сравнивали по их влиянию на фосфорилирование ITIM FcyRIIB в первичных РВМС человека. После перекрестного сшивания BCR и FcyRIIB с помощью смеси антител добавляли различные антитела в концентрации 5 мкг/мл и проводили вестерн-блот-анализ в отношении фосфорилирования ITIM. В этом случае антитела также неожиданно оказывали существенно усиленный эффект в отношении фосфорилирования ITIM FcyRIIB по сравнению с антителом, известным из существующего уровня техники (фиг. 8).
[00107] Совместная иммунопреципитация фосфорилированного мотива ITIM FcyRIIB и SHIP-1
После перекрестного сшивания рецепторов фосфатаза SHIP привлекается к мембране посредством связывания ее 8Н2-домена с фосфотирозином в мотиве ITIM FcyRIIB с последующим фосфорилированием тирозина в мотиве NPXY в С-концевом домене SHIP-1. Релокализация в мембране и последующее фосфорилирование мотива NPXY являются необходимыми для регуляторной функции SHIP-1. Ее эффект в отношении притока кальция, выживания, роста клеток, блокирования клеточного цикла и апоптоза опосредуется путями PI3K и Akt. Туг 1021 расположен в одном из мотивов NPXY в SHIP-1, и его фосфорилирование является важным для функции SHIP-1 (Nimmerjahn, Ravetch, 2008j.
Клетки Daudi человека стимулировали смесью антител, которая определена в разделе [00103] выше, и после лизиса в буфере для мягкого лизиса (буфере для лизиса при CoIP) образцы инкубировали с 2В6 для захвата FcyRIIB. Комплексы связывали с ферромагнитными гранулами с присоединенным белком G и выделяли с помощью магнитного штатива.
Лизаты с 1 х 10 клеток/образец получали в 500 мкл буфера для лизиса при CoIP, инкубируя клетки в течение 30 мин. на льду и перемешивая вихревой мешалкой каждые 10 мин. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 13000 об./мин. в течение 10 мин. при 4°С, и образцы надосадочной жидкости переносили в новые пробирки. 500 мкл лизатов инкубировали с 10 мкг 2В6 в течение 2-3 ч. при 4°С при вращении с донышка на крышку. Магнитные гранулы с присоединенным белком G дважды промывали 500 мкл буфера для лизиса, и 50 мкл гранул (1,5 мг) добавляли к комплексам лизат-антитело на ночь при 4°С (на вращающееся колесо). Комплексы элюировали из гранул посредством двукратного промывания 200 мкл буфера для лизиса и нагревания гранул в течение 5 мин. в 25 мкл 1 х буфера LDS для образца, содержащего
восстановитель. После центрифугирования при 4000 х g в течение 30 с к 10 мкл надосадочной жидкости применяли SDS-PAGE для вестерн-блот-анализа.
Вестерн-блот-анализы лизатов продемонстрировали значительно возросшие уровни фосфорилированной SHIP-1 в образцах клеток, обработанных смесью антител и ch8A6_N297A. Поскольку осаждение осуществляли с антителом 2В6, специфичным к FcyRIIB, совместно осаждалась только выделенная SHIP-1, связанная с FcyRIIB. Мембраны после стрипирования и повторного окрашивания продемонстрировали усиленное фосфорилирование мотива ITIM FcyRIIB в образцах, обработанных ch8A6_N297A, что коррелировало с сигналами от фосфорилированной SHIP1. При втором повторном окрашивании с помощью а-hFcyRIIB a, b, с (АЬ, связывающееся с FcyRII/CD32 человека, поликлональное, IgG козы, R &D Systems, AF1330) были продемонстрированы равные количества осажденного рецептора FcyRIIB во всех образцах, служащих в качестве контроля нагрузки для SDS-PAGE (фиг. 9).
[00108] Пример 4. ГУМАНИЗАЦИЯ СН8А6 В ФОРМАТЕ IGG
СИ8А6 гуманизировали путем трансплантации последовательностей областей, определяющих комплементарность, из антитела крысы на каркасные участки человека. Для выбора каркасных участков человека последовательности VH И VL сравнивали с последовательностями сегментов вариабельной и соединяющей области зародышевого типа гена Ig человека, полученными из общедоступных баз данных (IMGT; V-BASE). Последовательности зародышевого типа VH 3 30 с IGHJ4 человека и последовательности зародышевого типа VK315 с IGKJ2 человека выбирали для тяжелой и легкой цепей соответственно.
Создавали несколько вариантов гуманизированных тяжелой и легкой цепей. Гены, кодирующие разработанные последовательности гуманизированных VH И VL, после этого субклонировали в вектор экспрессии у млекопитающих. Процедуру скрининга вариантов антител осуществляли непосредственно в надосадочной жидкости культуры трансфицированных клеток CHO-S (Invitrogen). Химерное антитело 8А6 служило в качестве контроля трансфекции
и стандарта в ходе скрининга гуманизированных вариантов. Варианты Ни8А6 анализировали в отношении связывания на клетках Raji с sFcyRIIB и sFcyRIIA посредством ELISA и с нативным FcyRIIB посредством FACS (см. выше). Кроме того, определение кинетических характеристик вариантов антител осуществляли с использованием поверхностного плазмонного резонанса.
[00109] Тестирование гуманизированных вариантов 8А6
Для тестирования видов фосфорилирующей активности у гуманизированных вариантов 8А6 клетки Daudi стимулировали смесью антител, обрабатывали 0,5 или 5 мкг/мл различных вариантов 8А6, и проводили вестерн-блот-анализ в отношении фосфорилирования ITIM.
[00110]Сравнение гуманизированных вариантов 8А6 с ch8A6_N297A
Все тестируемые гуманизированные варианты 8А6 были способны к индукции фосфорилирования рецептора, и уровни фосфорилирования были сравнимыми с индуцируемыми ch8A6_N297A из той же очищаемой партии. Следовательно, не было выявлено потери активности после второго цикла гуманизации. Хотя данные Biacore предполагали различные значения аффинности для различных комбинаций тяжелой и легкой цепи, эти различия нельзя было выявить в вестерн-блот-анализах (фиг. 10).
[00111] Сравнение гуманизированных вариантов 8А6 с ch8A6_N297A, блокирующим антителом, связывающимся с FcyRIIB (2В6), и ch GB3 N29 7А
После окончательного выбора комбинации гуманизированных цепей вариант, в котором тяжелая цепь VHIO объединена с легкой цепью VL6, сравнивали с антителами ch8A6_N297A, 2В6 и chGB3_N297A (фиг. 11).
[00112] АНАЛИЗЫ IN VIVO
Модель SLE-PBL
Rag2/raMMa-c/Fcy-/- мышей облучали в дозе 6 Гр, и им инъецировали внутрибрюшинно различные количества лейкоцитов периферической крови человека в 500 мкл PBS.
Обработку мышей начинали через 2 недели после инъекции клеток после того, как трансплантацию PBL человека от пациента с SLE мышам подтверждали по наличию hlgM или hlgG. Мышей обрабатывали путем внутрибрюшинного введения 200 мкл буфера (PBS) или 20 мкг антитела (ch8A6_N297A) в 200 мкл PBS дважды в неделю в течение 4 недель. Мышей взвешивали, и у них отбирали кровь для получения сыворотки крови один раз в неделю. Образцы сыворотки крови замораживали при -80°С до дальнейшего использования (фиг. 12).
ELISA
Образцы сыворотки крови анализировали с помощью ELISA на наличие общего IgG, IgM человека и антител IgM и IgG к ДНК.
Для количественного определения общего сывороточного IgM и IgG в образцах сыворотки крови использовали набор для количественного определения IgM человека с помощью ELISA от Bethyl и набор для количественного определения IgG человека с помощью ELISA (Biomol) в соответствии с инструкциями производителя. OD измеряли с использованием настраиваемого микропланшетного ридера VersaMax (Molecular Devices) при длине волны 450 и 650 нм.
Для выявления антител к ДНК планшеты для ELISA покрывали 10 мкг/мл метилированного BSA (Sigma) в PBS на 2 ч. при комнатной температуре. После промывки планшеты покрывали 50 мкг/мл ДНК тимуса теленка (Sigma) в PBS при 4°С на ночь. Блокирование неспецифичного связывания осуществляли смесью PBS/0,1% желатин/3% BSA/1 мМ EDTA в течение 2 ч. при комнатной
температуре. Образцы сыворотки крови разводили 1:100 в блокирующем растворе и инкубировали в течение 1 ч. при комнатной температуре. В качестве детекторного антитела использовали конъюгированное с HRP антитело из набора для количественного определения IgM человека (В ethyl), и его разводили 1:10000 в блокирующем растворе с последующим инкубированием в течение 1 ч. при комнатной температуре. PBS использовали для всех этапов промывки. Для выявления добавляли раствор ТМВ, и реакцию останавливали 6% ортофосфорной кислотой.
[00113] Модель SLE-PBL, общий сывороточный иммуноглобулин человека
Анализировали уровни общего IgG человека [мкг/мл] у мышей, которым трансплантировали PBL от доноров-людей, страдающих SLE. Значительных различий в уровне общего IgG человека между PBS и антителом, связывающимся с FcyRIIB, выявлено не было. Антитело согласно настоящему изобретению не оказывало значительного влияния на уровень общего IgG человека (фиг. 13).
[00114] Модель SLE-PBL, влияние на антитела к ДНК (IgG, специфичный для конкретного заболевания)
Существенное снижение уровня специфичного для конкретного заболевания антитела IgG человека к ДНК у мышей, обработанных антителом, связывающимся с FcyRIIB, наблюдали, начиная с 4 недели после переноса/трансплантации SLE-PBL. Раскрытые антитела специфично снижают количество связанных с заболеванием антител к ДНК (фиг. 14).
ПРИМЕР 5 - Образование биспецифического антитела, связывающегося с Fc-гамма-рецептором ПВ и Fc-эпсилон-рецептором
Определение номенклатуры конструктов 8A6-IgG и 8A6-IgE
химерные:
8A6-IgG ch8A6_N297A
8A6 cs2-4
ch8A6 cs2-4
дегликозилированное 8A6_cs2-4
ch8A6_cs2-4- degly
8A6 cs3-4
ch8A6 cs3-4
дегликозилированное 8A6_cs3-4
ch8 A6_cs3 -4-degly
дегликозилированное 8A6_cs2-4, полученное от Trenzyme ch8A6_cs2-4-degly_T
дегликозилированное 8A6_cs3-4, полученное от Trenzyme ch8A6_cs3-4-degly_T
гуманизированные:
8A6_cs2-4 hu8A6_cs2-4
дегликозилированное 8A6_cs2-4 hu8A6_cs2-4- degly
8A6_cs3-4 hu8A6_cs3-4
дегликозилированное 8A6_cs3-4 hu8A6_cs3-4-degly
Описание создания, экспрессии и очистки различных антител на основе IgE, связывающихся с FcyRIIB.
Разработка конструктов
Как изображено на фигуре 15, для всех конструктов общим является то, что Fab-домен гибридного антитела эквивалентен молекуле IgG (вариабельному домену и CL-/CH1-домену). Более того, все конструкты имеют константные СеЗ- и Се4-домены IgE. Эти домены гомологичны Cg2 и Cg3 IgG. В антителе IgG шарнирная область отвечает за необходимую гибкость молекулы и образование димера посредством дисульфидных мостиков. Эта шарнирная область отсутствует в антителе IgE. Вместо шарнирной области эту функцию принимает
на себя дополнительный Се2-домен. Антитело 8A6-IgE характеризуется высокой гибкостью Fab-домена наряду с оптимальной перестройкой Cgl-домена в Се-домен. Ввиду этого были разработаны варианты, содержащие шарнирную область IgG (см. фигуру 15) либо полный Fcs-домен (Се2, СеЗ, Се4) IgE (см. фигуру 15). Другой тип изменчивости касается разного количества участков N-гликозилирования в Fce-домене. Гликозилирование Fc-домена IgE не влияет на аффинность к FceRI, но влияет на экспрессию и стабильность антитела. Эти конструкты клонировали в плазмидные векторы в соответствии со стандартными лабораторными процедурами.
Линии клеток и условия культивирования
Клетки CHO-S культивировали в соответствии с рекомендациями поставщика. Вкратце, клетки культивировали в среде Freestyle для CHO-S, дополненной 2 мМ Glutamax, и пересевали каждые 2-3 дня. Клетки культивировали при 37°С, 5% С02, 100 об./мин. За один день до трансфекции клетки разделяли при плотности 0,5 х 106/мл, и проверяли жизнеспособность (> 96%).
Линии клеток лимфомы Беркитта человека Raji и Daudi культивировали в RPMI 1640, дополненной 10% FBS, NEAA MEM, 1 мМ пирувата натрия и 2 мМ L-глутамина, при 37°С и 5% С02. Клетки пересевали каждые 2-3 дня при плотности 0,2-1,0 х 106 клеток/мл.
Трансфекция CHO-S конструктами FcyRIIB IgE
6 8
В день трансфекции плотность клеток составляла 1,0 - 2,0 х 107мл. 8,0 х 10° клеток разводили в 20 мл среды Freestyle для СНО (40 х 106/мл). Добавляли 1000 мкг плазмидной ДНК (по 500 мкг для каждой из тяжелой и легкой цепи) (50 мкг ДНК/мл объема трансфекционной смеси) с последующим добавлением 2000 мкг PEI (100 мкг PEI/мл объема трансфекционной смеси). Клетки инкубировали в течение 3 ч. при 37°С, 5% С02, 100 об./мин. После этого суспензию клеток разводили 1:10 в среде Freestyle для СНО, добавляли 0,5 мМ вальпроевой кислоты и инкубировали при 31°С, 5% С02, 100 об./мин. в течение
10 дней. Образцы надосадочной жидкости собирали путем центрифугирования в течение 2x10 мин. при 4000 х g.
Определение титра, очистка и эксклюзионная хроматография
Определение титра антител посредством HPLC с белком А
Анализ по методу HPLC с белком А проводили с использованием системы HPLC серии Agilent 1200. Данные анализировали с помощью программного обеспечения "ChemStation" модифицированной версии В.04.02. Применяли следующие растворители: растворитель А: 0,05 М Tris/HCl, 0,1 М глицин, 0,15 М NaCl, рН 8,0; растворитель В: 0,05 М Tris/HCl, 0,1 М глицин, 0,15 М NaCl, рН 3,0. Для анализа в аналитическую предколонку Upchurch (№ С-130В) размером 2 х 20 мм упаковывали 120 мкл среды для перфузионной хроматографии Applied Biosystems Poros(r) 20А (Life Technologies, № 4374732). Связанное антитело элюировали 100% растворителя В. В случае, когда собирали очищенное антитело, фракции нейтрализовали с помощью 56 мМ Tris с рН 8,0.
Очистка 8A6-IgE
После шести дней культивирования клетки собирали, и путем центрифугирования в течение 2 х 10 мин. при 4000 х g получали образцы надосадочной жидкости, содержащие антитела. Антитела очищали с помощью колонки HiTrap на 5 мл с белком A FF (GE Healthcare) посредством жидкостной экспресс-хроматографии белков (Akta Explorer). Связывание антитела с белком А опосредовано его каркасным участком VH3. Подвижный буфер содержал 10 мМ Tris-HCl с рН 8,0, 150 мМ NaCl, элюирующий буфер содержал 100 мМ глицина с рН 2,7, 150 мМ NaCl. Элюированные антитела нейтрализовали 60 мМ Tris-HCl с рН 8,0, концентрировали (Sartorius Vivaspin4) до примерно 1,0 мг/мл, подвергали стерилизующей фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм и хранили при -80°С.
[00115] Пример 6. Определение характеристик химерных конструктов 8А6-IgE
Эксклюзионная HPLC
С целью определения олигомерного состояния и однородности очищенных вариантов 8A6-IgE к образцам применяли SE-HPLC. SE-HPLC проводили с использованием системы HPLC серии Agilent 1200. Данные анализировали с помощью программного обеспечения "ChemStation" модифицированной версии В.04.02. Анализ проводили с помощью колонки Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). Применяли следующий растворитель: 5 мМ His, 150 мМ NaCl, рН 6,5. Применяли 25 мкг белка в концентрации 0,5 мкг/мкл.
В этом случае было выявлено, что гликозилированные варианты 8A6-IgE могут быть склонны к образованию большего числа димеров по сравнению со стандартным ch8A6_N297A, тогда как дегликозилированные 8A6-IgE, по-видимому, были в большей степени расщепленными и характеризовались более высокой процентной долей фрагментов по сравнению со стандартным ch8A6_N297A.
Анализы связывания
Осуществили несколько анализов связывания для анализа аффинности связывания и специфичности антител. Для этих анализов связывания растворимый FceRIa получали в соответствии с нижеприведенным протоколом.
Получение растворимого FcsRIa
Трансфекция CHO-S с помощью sFcsRIa
В день трансфекции плотность клеток составляла -1,0 х 107мл. 500 мл суспензии клеток переносили в две 1-литровые колбы. Реагент Freestyle Мах осторожно переворачивали, и 312,5 мкл разводили в 5 мл Optipro SFM (при комнатной температуре). 312,5 мкг плазмидной ДНК (рАС91, sFcsRIa-H6) (SEQ ID NO: 37) разводили в 5 мл OptiPro SFM и осторожно перемешивали.
Разведенный реагент Freestyle Мах добавляли к смеси ДНК/Optipro SFM и инкубировали в течение 15 мин. при комнатной температуре. К клеткам медленно добавляли смесь ДНК-липид, при этом медленно вращая колбу. Трансфицированные клетки инкубировали при 37°С, 5% СО2, 100 об./мин. в течение 6 дней. Образцы надосадочной жидкости собирали путем центрифугирования в течение 2x10 мин. при 4000 х g.
Очистка sFcsRIa
Для получения рекомбинантного растворимого FceRIa клетки CHO-S трансфицировали внеклеточным доменом FceRIa человека (рАС91) с His-меткой согласно описанному. Очистку sFceRIa от надосадочной жидкости культуры клеток проводили путем очистки с помощью NiNTA (Qiagen, № 1018244) с использованием Akta Explorer. Применяли следующие буферы: буфер для связывания, содержащий 50 мМ NaH2P04, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 8,0; элюирующий буфер, содержащий 50 мМ NaH2P04, 300 мМ NaCl, 400 мМ имидазола, рН 8,0. Связанный sFceRIa элюировали в линейном градиенте от 0% до 100% В. После концентрирования фракций sFceRIa проводили замену буфера на 10 мМ His, рН 6,5. За этим следовала очистка sFceRIa с помощью хроматографии в режиме слабого анионного обмена с DEAE-сефарозой FF (GE Healthcare, № 17-0709-10) с использованием Akta Explorer. Растворитель А содержал 10 мМ His с рН 6,5; растворитель В содержал 10 мМ His, 0,5 мМ NaCl с рН 6,5. Связанный sFceRIa элюировали в линейном градиенте от 2% до 100% В. Концентрированный белок хранили в 10 мМ His, 150 мМ NaCl с рН 6,5 при -80°С.
SDS-PAGE
Для анализа по методу SDS-PAGE 1 мкг очищенного антитела или материала от Trenzyme вносили в гель NuPAGE Bis-Tris (4-12%). Антитела вносили в буфер LDS для образца NuPAGE, в который в восстанавливающих условиях также добавляли восстановитель для образца с предварительным нагреванием до 75°С в течение 10 мин. в соответствии с рекомендациями производителя. SDS-PAGE
осуществляли с постоянной мощностью при 200 В в течение 30 мин. После этого гели дважды промывали в Н20 и окрашивали с помощью окрашивающего раствора SimplyBlue (Life Technologies). Удаление избытка красителя происходило в Н20, и визуализацию гелей проводили с помощью трансиллюминатора (УФ, белый свет).
Анализ связывания с помощью ELISA Связывание 8A6-IgE с sFcyRIIB или sFcsRIa
Для тестирования эффективности связывания антител 8А6_се2-4/8А6_сеЗ-4 в гликозилированном и негликозилированном формате как с sFcyRIIB, так и с sFceRIa осуществляли анализ по методу ELISA. С этой целью 96-луночные планшеты покрывали SM101 или sFceRIa, 1 мкг/мл в PBS (объем 100 мкл), на 1 ч. при комнатной температуре. Планшеты промывали 2 раза в PBS, 0,01% Tween(r)-20 и блокировали в PBS, 2% BSA, 250 мкл/лунка в течение 2 ч. при комнатной температуре. После этапа промывки образцы антител добавляли в соответствующих серийных разведениях в PBS, 2% BSA в покрытые лунки на 1 ч. при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза в PBS, 0,01% Tween(r)-20, и добавляли конъюгированное с HRP вторичное детекторное антитело, направленное на легкую каппа-цепь человека, в разведении 1:8000 в PBS, 2% BSA, на 1 ч. при комнатной температуре. После трех этапов промывки связанное антитело, конъюгированное с HRP, выявляли с помощью OPD, 0,03% Н202, 100 мкл/лунка. Реакцию останавливали с помощью 50 мкл 4 М H2S04, и поглощение измеряли при 492 им с помощью ридера для ELISA (Тесап, Spectra FluorPlus). При прямом связывании с sFcyRIIB было выявлено, что все четыре конструкта 8A6_IgE характеризовались такой же аффинностью к sFcyRIIB, как и антитело ch8A6_N297A (фигура 16), ввиду наличия общего Fab-домена. Однако, при связывании конструктов 8A6-IgE с sFceRIa были продемонстрированы различия между конструктами с Fc-частью IgE полной длины (се2-4) и более короткими версиями (сеЗ-4) (фигура 17).
Связывание 8A6-IgE с sFcyRIIB и sFcsRIa - сэндвич-ELISA
Сэндвич-ELISA осуществляли для того, чтобы показать одновременное связывание с обоими антигенами. Эффективность связывания полученных вариантов 8А6_се2-4/8А6_сеЗ-4 как с sFcyRIIB, так и с sFceRIa в качестве мишеней тестировали в данном анализе по методу сэндвич-ELISA. С этой целью 96-луночные планшеты покрывали растворимым FcyRIIB (SM101), 1 мкг/мл в PBS (объем 100 мкл), на 1 ч. при комнатной температуре. Планшеты промывали 2 раза в PBS, 0,01% Tween(r)-20 и блокировали в PBS, 2% BSA, 250 мкл/лунка в течение 2 ч. при комнатной температуре. После этапа промывки образцы антител добавляли в соответствующих серийных разведениях в PBS, 2% BSA в покрытые лунки на 1 ч. при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза в PBS, 0,01% Tween(r)-20 и инкубировали с sFceRIa, 0,005 мкг/мл в PBS, 2% BSA в течение 1 ч. при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза в PBS, 0,01% Tween(r)-20, и добавляли вторичное биотинилированное детекторное антитело CRA1, направленное на FceRIa человека, в концентрации 0,5 мкг/мл, разведенное в PBS, 2% BSA, на 1 ч. при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза в PBS, 0,01% Tween(r)-20, и добавляли стрептавидин, конъюгированный с HRP, в разведении 1:200 в PBS на 20 мин. при комнатной температуре. После трех этапов промывки, связанный стрептавидин, конъюгированный с HRP, выявляли с помощью OPD, 0,03% Н2О2, 100 мкл/лунка. Реакцию останавливали с помощью 50 мкл 4 М H2SO4, и поглощение измеряли при 492 им с помощью ридера для ELISA.
Сэндвич-ELISA подтверждал результаты, полученные в ELISA. В этом случае также была продемонстрирована низкая аффинность конструктов 8А6_сеЗ-4 к FceRIa при одновременном связывании Fab-фрагмента антитела с FcyRIIB.
Анализ связывания с помощью FACS
Связывание антитела с поверхностью клеток, экспрессирующих нативный FcyRIIB, определяли посредством FACS-анализа. Применяли клетки Raji, так как данная линия клеток-В-лимфоцитов, полученная из лимфомы Беркитта,
экспрессирует FcyRIIB на высоких уровнях. Клетки Raji осаждали, и 1,0 х 105 клеток/лунка высевали в 96-луночные кругло донные планшеты для культур клеток в 50 мкл буфера для FACS (HBSS, 5% FBS, 0,01% NaN3). Подлежащие тестированию антитела вносили к клеткам Raji в соответствующих серийных разведениях в 50 мкл буфера для FACS и инкубировали в течение 1 ч. при 4°С. После двух этапов промывки с помощью 200 мкл буфера для FACS клетки инкубировали с конъюгированным с FITC вторичным антителом, направленным на легкую каппа-цепь человека (Fab)2, разведенным 1:200 в буфере для FACS, в течение 30 мин. при 4°С. После двух этапов промывки клеточные осадки ресуспендировали в 150 мкл буфера для FACS и анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием FACS Canto II (BD Biosciences).
Анализ показал, что для всех вариантов 8А6 связывающая способность Fab-фрагментов в отношении FcyRIIB остается сравнимой с ch8A6 N297A независимо от изменений, внесенных в Fc-часть антитела (фигура 18).
Biacore
Аффинность конструктов антител по отношению к FcyRIIB и FceRIa дополнительно анализировали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с применением системы Biacore(tm) Т200.
SFcyRIIB ковалентно иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 серии S (Biacore, BR-1005-30) с применением стандартного протокола сочетания с аминогруппами (BIAsensor Surface Handbook, Biacore). Варианты антител захватывали в концентрации 50 нМ в течение 1 мин. Аналит sFceRIa инъецировали в различных концентрациях 0,1 - 25 нМ в течение 3 мин. с последующим этапом диссоциации в течение 7 мин. Чип СМ5 регенерировали с помощью буфера, содержащего 3 М MgCb, путем прекращения взаимодействия лиганда и SM101, подготавливая его таким образом для нового цикла анализа. Измерения проводили при 25 °С ив непрерывном потоке (10 мкл/мин.). Оценивание данных проводили с применением программного обеспечения для оценки Biacore Т200 (версии 1.0), предполагая связывание 1:1.
Краткое описание экспериментов по связыванию
Обнаружили, что аффинность связывания всех конструктов к FcyRIIB была равна аффинности исходного антитела IgG. Что касается связывания с FceRIa, результаты определения характеристик связывания 8A6-IgE с обоими антигенами позволяют предположить, что укороченные варианты 8А6_сеЗ-4/degly могут не проявлять такую же высокую аффинность к FceRI, как конструкты IgE полной длины.
[00116] Пример 7. Получение и определение характеристик гуманизированных антител 8A6-IgE
Гуманизация 8A6-IgE
Для гуманизации ch8A6-IgE вариабельную область тяжелой цепи антитела заменяли гуманизированной вариабельной областью тяжелой цепи 10 (VH10) с SEQ ID NO: 3. Вариабельную область легкой цепи 6 (VL6; SEQ ID NO: 4) применяли вместе с гуманизированными тяжелыми цепями для экспрессии гуманизированных конструктов 8A6-IgE.
Замену вариабельной области тяжелой цепи проводили посредством стандартной процедуры клонирования. Замена вариабельной области тяжелой цепи происходила посредством стандартной процедуры клонирования. Правильное встраивание вставок подтверждали с помощью секвенирования
ДНК.
Кроме того, С-концевой лизин последовательности тяжелой цепи удаляли и заменяли стоп-кодоном (AAA -> ТАА). Это значительно уменьшало количество вариантов с разными зарядами. Это было осуществлено путем мутагенеза с помощью ПЦР, и успешную мутацию подтверждали с помощью секвенирования.
Определение характеристик связывания гуманизированных 8A6-IgE с антигеном с помощью ELISA
ELISA осуществляли с применением такого же протокола, как в примере 2. Связывание вариантов hu8A6-IgE тестировали в сравнении с ch8A6_N297A. В данном случае не было выявлено различий в аффинности связывания в отношении растворимого FcyRIIB (фигура 19). Тестировали связывание гуманизированных и химерных вариантов 8A6-IgE с sFceRIa с помощью их Fc-части. Оба варианта 8A6-IgE с укороченной Fc-частью (сеЗ-4), химерный и гуманизированный, продемонстрировали более низкую аффинность в отношении FceRIa по сравнению с вариантами 8A6-IgE с полной Fc-частью (се2-4). Однако, между химерными и гуманизированными антителами не было выявлено различий (фигура 20).
[00117] Пример 8. Мечение 8A6-IgE и кинетика его связывания с моноцитами периферической крови (РВМС)
Исследования связывания с FceRI проводили с конструктом ch8A6_ce2-4 полной длины в его дегликозилированной версии.
Способы
8А6 (IgE) и (IgG) метили флуоресцентным красителем NHS-Fluo488.
500 мкг каждого антитела обессоливали в PBS с применением колонки PD-10 в соответствии с инструкциями изготовителя. Поглощение для элюированных фракций измеряли фотометром при 280 им (эталон: 320 нм), и фракции, содержащие наибольшее количество антител, объединяли. После концентрирования с применением колонок Vivaspin4 можно получить обратно примерно 400 мкг антител.
Флуоресцентный краситель Fluo488 восстанавливали в DMSO, и его концентрацию рассчитывали путем измерения флуоресценции при его максимуме испускания при 517 нм.
Антитело и краситель смешивали в молярном соотношении 1:10, при этом краситель медленно добавляли к раствору антитела при перемешивании образца вихревой мешалкой. Точные расчеты количества антитела и красителя можно найти в приложении. Раствор инкубировали в течение 1 ч. при 25°С при постоянном встряхивании при 300 об./мин. (Eppendorf ThermoMixer). Свободные молекулы красителя отделяли путем очистки с применением колонки PD-10. Фракции с наибольшим количеством меченого белка, измеренным при 280 нм (антитело) и 510 нм (краситель), объединяли, вновь концентрировали с применением колонок Vivaspin4, и рассчитывали конечную концентрацию и степень мечения (D.O.L.).
Для меченых антител проводили расчет конечных показателей: ch8A6_cs2-4-degly-T: 1,35 мкг/мкл, D.O.L.: 2,2 ch8A6_cs3-4-degly-T: 1 мкг/мкл, D.O.L.: 2,86 Расчет количеств флуоресцентного красителя и антитела
• Молекулярная масса 8А6 (IgE): примерно 176000 Да = 176000 г/моль ¦^350 мкг антитела = 2 нмоль
• Молекулярная масса Fluo488: примерно 981 моль/л Ресуспендирование неопределенного количества в DMSO
Разведение 1:5000 в воде и измерение OD5n (максимум испускания красителя) Концентрация [мкг/мкл] = коэффициент разведения х OD517 х 918/80000 = 8,6 нмоль/мкл
• Расчет соотношения красителя и антитела:
Желательное молярное соотношение краситель:антитело =10:1
2 нмоль антитела 20 нмоль красителя
2,3 мкл красителя
Расчет степени мечения (D.O.L.)
• Определения для расчета концентрации и D.O.L. белка
Ацщх = поглощение при максимуме испускания красителя, 517 нм для Fluo488 А28о = поглощение при 280 нм (белок)
CF = поправочный коэффициент; определяемый Interchim конкретно для каждого красителя, связанного с белком; A2go (свободный краситель)/Атах (свободный краситель)
MW: молекулярная масса белка s: коэффициент экстинкции
• с [белок] = 1,4 х (А280 - Amaxx CF)
• D.O.L. = (Атах х М\?)/(с[белок] х екраситель)
Получение РВМС посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколла
Лейкоцитарные пленки от здоровых доноров разводили 1:1 в HBSS, и 30 мл наносили слоем на 15 мл раствора для разделения Biocoll в пробирке Falcon на 50 мл. После центрифугирования при 1000 xg в течение 20 мин. без остановки фракцию лейкоцитов собирали пластиковой пипеткой. Клетки дважды промывали полной средой для роста и подсчитывали в счетной камере Нойбауэра.
Кинетика связывания ch8A6 cs2-4-deglv-T и ch8A6 N297A на РВМС
0,5 х 106 РВМС в 100 мкл полной среды для роста инкубировали в 96-луночном планшете (плоскодонном) в инкубаторе при 37°С со следующими разведениями антител: 2 мкг/мл ch8A6_c82-4-degly-T-cFluo488, 2 мкг/мл ch8A6 N297A-Fluo488, 2 мкг/мл 8А6 ce2-4-degly-T. Для каждого момента времени была приготовлена дополнительная лунка. В качестве контроля связывание с FcyRIIB на РВМС блокировали посредством предварительного инкубирования ch8A6_c82-4-degly-T-Fluo488 с 5-кратным молярным избытком SM101 в течение 30 мин. при комнатной температуре. Блокирование FcyRIIB-связывающего участка тестировали на клетках Raji посредством FACS-анализа после инкубирования.
Через 10, 30, 60, 120 и 240 мин., а также после инкубирования в течение ночи клетки осаждали центрифугированием при 400 х g в течение 5 мин. и ресуспендировали в 100 мкл буфера для FACS, содержащего 2,5 мкл a-hCD19-РеСу7, 5 мкл a-hCD63-PerCP и 2,5 мкл a-hCD193-APC, в кругло донном 96-луночном планшете в течение 30 мин. на льду. После двух этапов промывки буфером для FACS образцы анализировали с использованием FACS Canto П.
Связывание меченных Fluo488 8A6-IgG и 8A6-IgE с клетками Raji
Клетки Raji инкубировали с различными концентрациями меченого антитела, и средние значения флуоресценции наносили на график в зависимости от концентраций антител. Антитело 8A6_ce2-4-degly демонстрировало высокую аффинность связывания со своим рецептором FcyRIIB на поверхности клеток Raji (см. фигуру 21). Специфичность этого связывания подтверждали в анализе клеток СНО, которые инкубировали с тем же конструктом, где не было выявлено поверхностных сигналов от меченого антитела, что и ожидалось, так как у клеток СНО отсутствует рецептор FceRI. Эти данные подтвердили, что связывание антитела не изменялось в ходе всего процесса мечения или благодаря применению связанного флуорохрома]ЧШ-Ршо488.
Маскировка FcyRIIB-связывающего участка 8A6_cs2-4-degly с помощью SM101 в качестве контроля
Для обеспечения выявления связывания Fc-части 8A6-IgE с клетками F(ab)2-домен и, соответственно, FcyRIIB-связывающий участок блокировали посредством предварительного инкубирования антитела с SM101. Связывающую способность конструктов анализировали с помощью FACS. FACS-анализ четко продемонстрировал блокирование связывания 8А6_се2-4-degly со своим рецептором FcyRIIB после предварительного инкубирования с 5-кратным молярным избытком растворимого рецептора (SM101). Среднее значение флуоресценции после предварительного инкубирования с SM101 уменьшилось до 11,8% по сравнению с необработанным антителом. Таким образом, маскированное антитело 8A6_ce2-4-degly можно применять в качестве контроля для инкубирования РВМС.
Кинетика связывания на РВМС
Связывание антитела 8A6-IgE, меченного Fluo488, на выделенных РВМС оценивали посредством FACS-анализа. Таким образом, клетки окрашивали с помощью a-hCD193-APC и a-hCD19-PeCy7 для проведения различий между В-клетками (CD 19) и базофилами (CD 193, низкое значение SSC). CD63 окрашивали для анализа активации базофилов.
Экспрессия CD63 на базофилах в ходе измерений не изменялась (не показано).
На фигуре 22 показаны флуоресцентные сигналы на В-клетках, выявляемые с помощью антитела с a-hCD19-PeCy7. Зеленые цифры отображают измеренные средние значения флуоресценции С019-положительных клеток для антител, меченных Fluo488.
[00118] Пример 9. Тест активации базофилов (ВАТ)
В основе анализа лежит способ, впервые описанный Sainte-Laudy и соавт. в 1994 (Sainte-Laudy, J, et al., Analysis of membrane expression of the CD63 human
basophil activation marker. Applications to allergologic diagnosis. Allerg. Immunol. (Paris) 26, 211-4) и 1996 гг. (Sabbah, A and Sainte-Laudy, J., Flow Cytometry applied to the analysis of Lymphocyte and Basophil activation. ACI International 8, 116-9), где активацию базофилов аллергенами или контролями выявляли с помощью проточной цитометрии, измеряя повышение экспрессии CD63 (gp53) на поверхности клеток. Аллергены и положительные контроли добавляли к гепаринизированной цельной крови, и поверхностную экспрессию CD63 измеряли посредством специфического окрашивания антителами, включающими в себя антитело к hCD193 для идентификации базофилов и антитело к -hCD63 для измерения активации. Параллельно можно измерять высвобождение гистамина в качестве второго параметра для активации и дегрануляции базофилов.
Благодаря перекрестному сшиванию FcyRIIB и FceRI с помощью 8A6-IgE на поверхности базофилов клеточная реакция на аллерген, опосредованная FceRI, снижалась.
Получали 50 мкл гепаринизированной цельной крови от доноров, о которых было известно, что они имели аллергию на пыльцу (или другую определенную форму аллергии на доступный для исследования аллерген).
В данных экспериментах антитело ch8A6_ce2-4-degly применяли в сравнении с химерным 8А6 (IgG) с мутацией N297A ch8A6 N297A.
Для положительного и отрицательного контролей время инкубирования с аллергеном или контролями, составляющее 15 мин., было достаточным для надлежащей активации базофилов, как описано в руководстве к набору.
50 мкл гепаринизированной цельной крови инкубировали с 50 мкл раздражителя (аллергена, fMLP или контрольного антитела к FceRI) и 100 мкл буфера для стимуляции. a-FceRI и fMLP растворяли согласно описанию в руководстве к набору и применяли неразведенными. Аллергены разводили 1:5 в буфере для стимуляции. Готовили буфер и раздражитель в пробирках типа Falcon, и к этому
раствору непосредственно добавляли 50 мкл образца крови без контакта со стенками пробирки. Добавляли 20 мкл окрашивающего реагента или коммерчески доступных антител (a-hCD63-PE и a-hCD193-Alexa647), растворенных в буфере для стимуляции. Образцы осторожно перемешивали вихревой мешалкой и инкубировали на водяной бане, подогретой до 37°С, в течение 15 мин. Для лизиса в каждую пробирку вносили 2 мл лизирующего реагента, затем образцы перемешивали вихревой мешалкой и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин. После центрифугирования при 500 х g в течение 5 мин. образцы надосадочной жидкости удаляли, и осадки ресуспендировали в 300 мкл промывочного буфера из набора. FACS-анализ осуществляли на FACS Canto II с применением следующих параметров:
FSC линейная шкала напряжение: 269
SSC линейная шкала напряжение: 401
FITC логарифмическая шкала напряжение: 447
РЕ логарифмическая шкала напряжение: 379
Антитело a-FceRI и пептид fMLP (формилметиониллейцилфенилаланин, SEQ ID NO: 38) содержались в наборе и применялись в количестве 50 мкл на образец.
Стратегия гейтирования
На фигуре 23 показана стратегия гейтирования в лизированной цельной крови. Параметры FSC и SSC устанавливали линейными. Были видны три популяции: лимфоциты, моноциты и гранулоциты. Базофилы можно было выявить на том же уровне SSC, что и лимфоциты. Откладывание на графике экспрессии CD 193 в зависимости от SSC приводит к выявлению двух отдельных популяций, экспрессирующих CD 193. Популяцию с низким значением SSC идентифицировали как базофильные гранулоциты. На графике, на котором показана экспрессия CD 193 (ось Y) в сравнении с CD63 (ось X), использовали
квадрантные гейты, так что флуоресценция CD63 в необработанных образцах была фактически равной нулю.
Проводили дополнительное определение характеристик популяций клеток с применением стратегии обратного гейтирования.
На гейты, содержащие популяцию с низким уровнем экспрессии CD63 и популяцию с высоким уровнем экспрессии CD63, накладывали график FSC-SSC для негейтированного лизата цельной крови. Было обнаружено, что популяция с низким уровнем экспрессии располагалась возле популяции лимфоцитов, что подтверждало то, что эта гейтированная популяция представляла собой базофилы. В противоположность этому, популяция с высоким уровнем экспрессии находилась на самом правом краю по оси SSC, что отображает то, что эти клетки были высокогранулярными и представляли собой эозинофильные гранулоциты.
Экспрессия CD63 у положительных и отрицательных контролей
Экспрессию CD63 в необработанных клеток принимали равной 0%, иными словами, только очень немногие положительные клетки в нижнем квадранте квадрантного гейта были установлены как базофилы. Антитело a-FceRI воспроизводимо активировало базофилы до уровней в 90% CD63-положительных клеток, тогда как пептид fMLP индуцировал лишь умеренную экспрессию CD63 при 25-30% положительных клеток.
Для определения того, могут ли антитела, которые подлежат тестированию в отношении их способности ослаблять аллергическую реакцию, активировать базофилы сами по себе, ch8A6_N297A и ch8A6_ce2-4-degly вводили в двух разных концентрациях без дополнительной активации клеток.
На фигуре 24 показаны полученные данные для этих образцов.
Инкубирование образцов цельной крови с 0,5 или 2 мкг/мл 8A6-IgG или 8A6-IgE не активировало базофилы само по себе, как показано на верхней фигуре.
Поверхностная экспрессия CD63 не изменялась, и в двух независимых экспериментах выявили менее 1% положительных клеток.
На следующем этапе анализа исследовали эффект примесей эндотоксинов в отношении активации базофилов. Поскольку 8A6_ce2-4-degly содержит ~30 EU/мл эндотоксина, что обусловлено способом получения, то для исключения эффектов, проистекающих от материала с примесями, проводили контрольный эксперимент с LPS. Таким образом, отдельный образец крови инкубировали с 50 EU/мл LPS (разведенного 1:4 в анализе) параллельно с 8A6_ce2-4-degly в отдельности. Как показано на фигуре 25, обработка базофилов с помощью LPS в концентрациях, ожидаемых при получении с примесями, не приводила к неспецифической активации клеток. Таким образом, эффекты, измеренные после обработки с помощью 8A6_ce2-4-degly, могут напрямую коррелировать с активностью антитела.
Превентивная обработка базофилов с помощью 8А6 cs2-4-degly
Образцы цельной крови инкубировали с контролями, 8A6 N297A и 8А6_се2-4-degly в различных концентрациях. Образцы отбирали в различные моменты времени, и измеряли потенциал базофилов к активации пыльцой.
А) Момент времени 0 ч.
Непосредственно после добавления соответствующих антител к аликвотам цельной крови отбирали первые образцы для момента времени 0, и их потенциал к активации анализировали посредством стимуляции пыльцой. В данный момент времени проводили измерения в двух независимых экспериментах. В этот момент времени, отражающий приблизительно 5 мин. инкубирования с антителами (время от пипетирования до инкубирования образца), не наблюдали эффектов 8A6 N297A или 8A6_ce2-4-degly. Базофилы во всех образцах могли быть активированы пыльцой до получения приблизительно 90% клеток, экспрессирующих CD63.
В) Момент времени 2 ч.
После 2 ч. инкубирования выявляли активацию базофилов без потери активности, что видно по активации с помощью a-FceRI (92% положительных клеток) и стимуляции пыльцой необработанных клеток (93,4%).
Инкубирование с 8A6 N297A в концентрациях в диапазоне от 0,5 до 5 мкг/мл не влияло на активацию базофилов пыльцой (значения от 91 до 91,6% положительных клеток). В этот момент времени уровень активации базофилов, по-видимому, снижался в образцах, которые были обработаны с помощью 8A6_ce2-4-degly (84,4-88%), несмотря на то, что дозозависимость не была выявлена.
C) Момент времени 6 ч.
После 6 ч. инкубирования потенциал клеток к активации положительными контролями уменьшался до приблизительно 85% для активации пыльцой и 87% для обработки с помощью a-FceRI (фигура 26). В то время как при обработке с помощью 8A6-IgG демонстрировались результаты, сравнимые с положительными контролями (85-88%), клетки, которые инкубировали с 8А6-IgE, демонстрировали уменьшение потенциала к активации (76-84%) фигура 27). После инкубирования с 0,5 мкг/мл 8A6_ce2-4-degly только 76,6% базофилов могли быть активированы пыльцой. Тем не менее, дозозависимость выявлена не была, и для более высокой дозы демонстрировалось незначительное повышение экспрессии CD63 по сравнению с обработкой при 0,5 мкг/мл.
D) Момент времени 24 ч.
В последний момент времени, измерения в который проводили в двух независимых экспериментах, демонстрировалось снижение активации для обработки a-FceRI до 75% экспрессии CD63 (фигура 28 и фигура 29).
[00119] Пример 10. Тест активации пыльцой
Гепаринизированную цельную кровь от здорового донора, результат тестирования которого на пыльцевую атопию был положительным, инкубировали в течение ночи с 5 мкг/мл дегликозилированного 8А6_се2-4 или дегликозилированного 8А6_сеЗ-4 (SM301 cs2-4 или cs3-4) соответственно. Для анализа 50 мкл образца крови смешивали с 50 мкл пыльцы (предварительно разведенной 1:5 в буфере для стимуляции), 100 мкл буфера для стимуляции (набор FlowCast) и 20 мкл окрашивающего раствора (3 мкл a-hCD193-Alexa647, 3 мкл a-hCD63-PerCP, 3 мкл a-hCD203c-PE, 11 мкл буфера для стимуляции). Образцы осторожно перемешивали вихревой мешалкой и инкубировали на водяной бане, подогретой до 37°С, в течение 15 мин. Для лизиса в каждую пробирку вносили 2 мл реагента PharmLyse (BD Biosciences), затем образцы снова перемешивали и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин. После центрифугирования при 500 х g в течение 5 мин. образцы надосадочной жидкости удаляли, и осадки ресуспендировали в 300 мкл буфера для FACS. Гейт устанавливали по CD 193-положительным, но CD203c-отрицательным клеткам с высоким значением SSC, которые представляли собой эозинофилы.
[00120] Если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, свойства, такие как молекулярная масса, условия реакции и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицируемые во всех возможных случаях термином "приблизительно". Используемые в данном документе термины "приблизительно" и "примерно" означают в пределах 1015%, предпочтительно в пределах 5-10%. Соответственно, если не указано обратное, числовые параметры, приведенные в описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приблизительными значениями, которые могут изменяться в зависимости от желаемых свойств, которых стремятся достичь с помощью настоящего изобретения. По крайней мере и не в качестве попытки ограничить применение теории эквивалентов объемом формулы настоящего изобретения, каждый числовой параметр должен быть истолкован по меньшей
мере с учетом количества приведенных значащих цифр и путем применения обычных методик округления. Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, отражающие широкий объем настоящего изобретения, являются приблизительными значениями, числовые значения, изложенные в конкретных примерах, приводятся настолько точно, насколько это возможно. Любое числовое значение, однако, по своей сути заключает в себе определенные ошибки, неизбежно проистекающие из стандартного отклонения, встречающегося в соответствующих им тестовых измерениях.
[00121] Формы существительного единственного числа и аналогичные обозначения, применяемые в контексте описания настоящего изобретения (особенно в контексте нижеследующей формулы изобретения), должны толковаться как охватывающие как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или если это явно не противоречит контексту. Указание диапазонов значений в данном документе предназначено лишь для того, чтобы служить в качестве сокращенного способа индивидуальной ссылки на каждую отдельную величину, попадающую в диапазон. Если в данном документе не указано иное, каждая отдельная величина включена в описание так, как если бы она была индивидуально указана в данном документе. Все описанные в данном документе способы можно выполнять в любом подходящем порядке, если иное не указано в данном документе или это иным образом явно не противоречит контексту. Использование всех возможных примеров или иллюстративной формулировки (например, "такой как"), предложенной в данном документе, предназначено лишь для лучшего освещения настоящего изобретения и не накладывает ограничение на объем настоящего изобретения, если не заявлено иное. Ни одна формулировка в описании не должна быть истолкована как указание на любой незаявленный элемент, необходимый для практического осуществления настоящего изобретения.
[00122] Группы альтернативных элементов или вариантов осуществления настоящего изобретения, раскрытого в данном документе, не должны истолковываться как ограничения. Каждый член группы может быть обозначен
и заявлен по отдельности или в любой комбинации с другими членами группы или другими элементами, встречающимися в данном документе. Предполагается, что один или более членов группы могут быть включены в группу или удалены из нее, исходя из соображений удобства и/или патентоспособности. В случаях, когда происходит какое-либо такое включение или удаление, то считается, что описание содержит группу, модифицированную таким образом, которая соответствует письменному описанию всех групп Маркуша, используемых в прилагаемой формуле изобретения.
[00123] Определенные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в данном документе, в том числе лучший способ, известный авторам настоящего изобретения, для осуществления настоящего изобретения. Разумеется, видоизменения этих описанных вариантов осуществления станут очевидными для специалистов в данной области после прочтения приведенного выше описания. Автор настоящего изобретения ожидает, что специалисты в данной области будут использовать такие видоизменения в зависимости от обстоятельств, и авторы настоящего изобретения предусматривают осуществление настоящего изобретения на практике иным образом, нежели конкретно описано в данном документе. Соответственно, настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта изобретения, указанного в формуле изобретения, прилагаемой к данному документу, в соответствии с действующим законодательством. Кроме того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех их возможных вариантах охватывается настоящим изобретением, если иное не указано в данном документе или это иным образом явно не противоречит контексту.
[00124] Конкретные варианты осуществления, раскрытые в данном документе, могут быть дополнительно ограничены в формуле изобретения с помощью формулировки "включающий" или "включающий по сути". При использовании в формуле изобретения переходный термин "включающий", независимо от того, присутствует ли он в поданной заявке или добавлен согласно процедуре внесения изменений, исключает любой элемент, этап или ингредиент, не
указанный в формуле изобретения. Переходный термин "включающий по сути" ограничивает объем формулы изобретения указанными материалами или этапами, а также теми, которые не оказывают существенного влияния на основную(основные) и новую(новые) характеристику (характеристики). Варианты осуществления настоящего изобретения, заявляемые таким образом, в подразумеваемой или в явно выраженной форме описаны в данном документе и включены в него.
[00125] Кроме того, во всем настоящем описании были сделаны многочисленные ссылки на патенты и печатные публикации. Каждая из приведенных выше ссылок и печатных публикаций по отдельности включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[00126] В заключение, следует понимать, что варианты осуществления настоящего изобретения, раскрытые в данном документе, иллюстрируют основные идеи настоящего изобретения. Другие модификации, которые можно использовать, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Таким образом, в качестве примера, но без ограничения, альтернативные варианты выполнения настоящего изобретения можно использовать в соответствии с идеями данного документа. Соответственно, настоящее изобретение не ограничивается строго тем, что показано и описано.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> СуппреМол ГмбХ
<120> Новые антитела, направленные на Fc-гамма-рецептор IIB и Fc-эпсилон-рецептор
<130> SUP15095PCT
<150> EP14002825.9 <151> 2014-08-13
<160> 38
<170> PatentIn, версия 3.5
<210> <211> <212>
? О 1 О ^
113
БЕЛОК
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222> (1)..(113)
<223> VH r8A6
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 2 <211> 108
<212>
БЕЛОК
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<223> VL r8A6
<220>
<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222> (1)..(108)
<223> VL r8A6
<400> 2
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Met Phe Ile Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Asp Trp Phe Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Asn Met Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asn Tyr His Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Thr Leu Glu Leu Lys Arg 100 105
<210> 3
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> гуманизированное антитело
<220>
<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222> (1)..(113)
<223> VH hu8A6
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 4
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> гуманизированное антитело
<220>
<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222> (1)..(108)
<223> VL hu8A6
<400> 4
Gln Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Tyr
20 25 30
Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asn Asn His Pro Tyr
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105
<223> FcyRIIB человека <400> 5
Met Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg
20 25 30
Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly
35 40 45
Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn
50 55 60
Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln
85 90 95
Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys
100 105 110
His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn
115 120 125
Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro
130 135 140
Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile
145 150 155 160
165
175
Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala
170
Pro Ser Ser Ser Pro 180
<210> 6
<211> 329
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<223> гуманизированное антитело
<220>
<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222> (1)..(329)
<223> CH hu8A6_wt
<400> 6
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Туг Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
106
<210> <211> <212> БЕЛОК <213> Искусственная
<220>
<223> гуманизированное антитело
<220>
<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222> (1)..(106)
<223> CL hu8A6_wt
<400> 7
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 8
<211> 339
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> гуманизированное антитело
<220>
<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222> (1)..(339)
<223> VH hu8A6
<400> 8
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactattaca tggcctgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcatcc atatcatacg atggaagcaa taagtactac 180
ggagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaccggga 300
gactactggg gccaaggaac cctggtcacc gtcagctca 339
<210> <211> <212>
324 ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> гуманизированное антитело
<220>
<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222> (1)..(324)
<223> VL hu8A6
<400> 9
cagatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca
gggccagtca
gtccgttggc
tcctatgtcg
actggtacca
gcagaaacct
120
ggccaggctc
ccaggctcct
catctatggt
gcatccacca
ggtacactgg
tatcccagcc
180
aggttcagtg
gcagtgggtc
tgggacagag
ttcactctca
ccatcagcag
cctgcagtct
240
gaagattttg
cagtttatta
ctgtctgcag
tataacaacc
atccttacac
ttttggccag
300
gggaccaagc
tggagatcaa
acgt
324
<210> 10
<211> 990
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> гуманизированное антитело
<220>
<221> ДРУГОЙ ПРИЗНАК <222> (1)..(990) <223> CH hu8A6 wt
<400> 10 gcctccacca
agggcccatc
ggtcttcccc
ctggcaccct
cctccaagag
cacctctggg
ggcacagcgg
ccctgggctg
cctggtcaag
gactacttcc
ccgaaccggt
gacggtgtcg
120
tggaactcag
gcgccctgac
cagcggcgtg
cacaccttcc
cggctgtcct
acagtcctca
180
ggactctact
ccctcagcag
cgtggtgacc
gtgccctcca
gcagcttggg
cacccagacc
240
tacatctgca
acgtgaatca
caagcccagc
aacaccaagg
tggacaagaa
ggttgagccc
300
aaatcttgtg
acaaaactca
cacatgccca
ccgtgcccag
cacctgaact
cctgggggga
360
ccgtcagtct
tcctcttccc
cccaaaaccc
aaggacaccc
tcatgatctc
ccggacccct
420
gaggtcacat
gcgtggtggt
ggacgtgagc
cacgaagacc
ctgaggtcaa
gttcaactgg
480
tacgtggacg
gcgtggaggt
gcataatgcc
aagacaaagc
cgcgggagga
gcagtacaac
540
agcacgtacc
gtgtggtcag
cgtcctcacc
gtcctgcacc
aggactggct
gaatggcaag
600
gagtacaagt
gcaaggtctc
caacaaagcc
ctcccagccc
ccatcgagaa
aaccatctcc
660
aaagccaaag
ggcagccccg
agaaccacag
gtgtacaccc
tgcccccatc
ccgggaggag
720
atgaccaaga
accaggtcag
cctgacctgc
ctggtcaaag
gcttctatcc
cagcgacatc
780
gccgtggagt
gggagagcaa
tgggcagccg
gagaacaact
acaagaccac
gcctcccgtg
840
ctggactccg
acggctcctt
cttcctctac
agcaagctca
ccgtggacaa
gagcaggtgg
900
cagcagggga
acgtcttctc
atgctccgtg
atgcatgagg
ctctgcacaa
ccactacacg
960
cagaagagcc
tctccctgtc
tccgggttaa
990
<211> 321
<212>
ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> гуманизированное антитело
<220>
<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК <222> (1)..(321)
<223> CL hu8A6_wt
<400> 11
acggtggctg caccatcggt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300
ttcaacaggg gagagtgtta g 321
<210> 12
<211> 125
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222> (1)..(125)
<223> растворимый FCyRIIA человека
<400> 12
Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr
1 5 10 15
Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu
20 25 30
Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr
35 40 45
Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val
50 55 60
Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro
65 70 75 80
Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His
85 90 95
Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr
100
105
110
Ile Thr Val Gln Val Pro Ser Met Gly Ser Ser Ser Pro
115 120 125
<210> 13 <211> 179 <212> БЕЛ
БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> ДРУГОЙ_ПРИЗНАК
<222> (1)..(179)
<223> растворимый мутантный FCyRIIA человека
<400> 13
Met Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Asn
1 5 10 15
Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala Arg Ser
20 25 30
Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro
35 40 45
Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser
50 55 60
Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val
65 70 75 80
His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu
85 90 95
Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser Trp Lys
100 105 110
Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys
115 120 125
Lys Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His
130 135 140
Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu
145 150 155 160
Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser Met Gly
165 170 175
Ser Ser Pro
<210> 14
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR1 тяжелой цепи антитела 8A6 крысы
<400> 14
Asp Tyr Tyr Met Ala 1 5
<210> 15
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 тяжелой цепи антитела 8A6 крысы
<400> 15
Ser Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 16
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи антитела 8A6 крысы
<400> 16
Ala Arg Pro Gly Asp Tyr 1 5
<210> 17
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR1 легкой цепи антитела 8A6 крысы
<400> 17
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Tyr Val Asp
1 5 10
<210> 18
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 легкой цепи антитела 8A6 крысы
<400> 18
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5
<210> 19
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 легкой цепи антитела 8A6 крысы
<400> 19
Leu Gln Tyr Asn Tyr His Pro Tyr Thr 1 5
<210> 20
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR1 тяжелой цепи гуманизированного антитела 8A6
<400> 20
Asp Tyr Tyr Met Ala 1 5
<210> 21
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
CDR2 тяжелой цепи гуманизированного антитела 8A6
<400> 21
Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи гуманизированного антитела 8A6 <400> 22
Ala Arg Pro Gly Asp Tyr 1 5
<210> 23
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR1 легкой цепи гуманизированного антитела 8A6
<400> 23
Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Tyr Val Asp
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 легкой цепи гуманизированного антитела 8A6
<400> 24
Gly Ala Ser Thr Arg Tyr Thr 1 5
БЕЛОК
<210> <211> <212>
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 легкой цепи гуманизированного антитела 8A6
<400> 25
Leu Gln Tyr Asn Asn His Pro Tyr Thr 1 5
<210> 26
<211> 104
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> вариабельная область тяжелой цепи антитела GB3
<400> 26
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ile Tyr Trp Val Lys Gln Trp Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Trp Ile Phe Pro Gly Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
50 55 60
Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Leu Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Tyr
85 90 95
Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100
<210> 27
<211> 104
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> вариабельная область легкой цепи антитела GB3
<400> 27
Arg Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ala Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Asn Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100
<210> 28
<211> 329
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> константная область тяжелой цепи IgG с заменой N на A в положении
297 при допущении, что положение 1 представляет собой положение 118
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210
215
220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 29
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR1 вариабельной области тяжелой цепи
<220>
<221> доугое
<222>
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> доугое
<222> (1)..(1)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> доугое
<222> (2)..(2)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> доугое
<222> (3)..(3)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> доугое
<222> (3)..(3)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400> 29
Xaa Xaa Xaa Met Ala 1 5
<210> 30
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 вариабельной области тяжелой цепи
<220>
<221> другое
<222> (2)..(2)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (2)..(2)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (8)..(8)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (9)..(9)
<223> Xaa может представлять собой K или T
<220>
<221> другое
<222> (10)..(10)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (11)..(11)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (16)..(16)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (17)..(17)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (17)..(17)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400> 30
Ser Xaa Ser Tyr Asp Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Asp Ser Val Xaa
Xaa
<210> <211> <212> 31 6
БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 вариабельной области тяжелой цепи
<220>
<221> другое
<222> (3)..(3)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (3)..(3)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (5)..(5)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (6)..(6)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (6)..(6)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400> 31
Ala Arg Xaa Gly Xaa Xaa 1 5
<210> 32
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR1 вариабельной области легкой цепи
<220>
<221> другое
<222> (1)..(1)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (2)..(2)
<223>
Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (3)..(3)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (4)..(4)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (5)..(5)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (7)..(7)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (8)..(8)
<223> Xaa может представлять собой S или T
<220>
<221> другое
<222> (9)..(9)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400> 32
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Val Asp
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 вариабельной области легкой цепи
<220>
<221> другое
<222> (2)..(2)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (3)..(3)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (4)..(4)
<223> Xaa может представлять собой T или N
<400>
Gly Xaa Xaa Xaa Arg Tyr Thr 1 5
<210> 34
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 вариабельной области легкой цепи
<220>
<221> другое
<222> (1)..(1)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (1)..(1)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (2)..(2)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (3)..(3)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (4)..(4)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (7)..(7)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (8)..(8)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (9)..(9)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<220>
<221> другое
<222> (9)..(9)
<223> Xaa может представлять собой любую аминокислоту
<400> 34
Xaa Xaa Xaa Xaa Asn His Xaa Xaa Xaa 1 5
<210> 35
<211> 433
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> константная область IgE человека
<400> 35
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Phe Ser Val Ser Ser Arg
100 105 110
Asp Phe Thr Pro Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly
115 120 125
Gly Gly His Phe Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly
130 135 140
Tyr Thr Pro Gly Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val
145 150 155 160
Met Asp Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu
165 170 175
Ala Ser Thr Gln Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser
180 185 190
Asp Arg Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu
195 200 205
Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala
210
215
220
Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro
225 230 235 240
Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val
245 250 255
Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr
260 265 270
Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr
275 280 285
Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys
290 295 300
Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr
305 310 315 320
Lys Thr Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr
325 330 335
Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile
340 345 350
Gln Asn Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu
355 360 365
Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr
370 375 380
Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala
385 390 395 400
Glu Trp Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala
405 410 415
Ala Ser Pro Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly
420 425 430
Lys
<213> Искусственная
<220>
<223> константные домены 3 и 4 IgE
<400> 36
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro
115 120 125
Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu
130 135 140
Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr
180 185 190
Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro
195 200 205
His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro
210 215 220
Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly
225 230 235 240
Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro
245 250 255
Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp
260 265 270
Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe
275 280 285
Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys
290 295 300
Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln
305 310 315 320
Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys 325 330
<210> 37
<211> 600
<212> ДНК
<210> 38
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> пептид fMLF
<220>
<213> Искусственная
<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ_ОСТАТОК
<222>
<223> ФОРМИЛИРОВАНИЕ
<400> 38
Met Leu Phe 1
Формула изобретения
Первоначально поданная формула изобретения
1. Распознающая молекула, которая связывается с помощью первого связывающего домена с Fce-рецептором (FceR) и с помощью второго связывающего домена с Fc-гамма-рецептором ПВ (FcyRIIB).
2. Распознающая молекула по п. 1, которая представляет собой антитело.
3. Распознающая молекула по п. 2, где антитело не связывается с Fc-гамма-рецептором ПА (FcyRIIA).
4. Распознающая молекула по п. 2 или п. 3, где антитело представляет собой неблокирующее антитело, так что его связывание с Fc-рецептором посредством своих вариабельных областей не препятствует связыванию иммунных комплексов или агрегированного IgG с клетками.
5. Распознающая молекула по п. 4, где указанное антитело является химерным или гуманизированным.
6. Распознающая молекула по любому из предыдущих пунктов, где первый связывающий домен содержит по меньшей мере часть константной области IgE.
7. Распознающая молекула по любому из предыдущих пунктов, где второй домен содержит по меньшей мере часть Fab-домена.
8. Распознающая молекула по любому из предыдущих пунктов, где второй связывающий домен содержит по меньшей мере (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 65% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ
ID NO: 2.
9. Распознающая молекула по любому из предыдущих пунктов, где второй связывающий домен содержит по меньшей мере одну из (i) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, и (ii) вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4.
10. Распознающая молекула по любому из предыдущих пунктов, которая содержит в своем втором связывающем домене следующие последовательности CDR вариабельной области тяжелой и легкой цепи:
(i) последовательность H-CDR1, которая на 60% или более идентична последовательности H-CDR1, приведенной под SEQ ID NO: 20,
(ii) последовательность H-CDR2, которая на 36% или более идентична последовательности H-CDR2, приведенной под SEQ ID NO: 21,
(iii) последовательность H-CDR3, которая на 50% или более идентична последовательности H-CDR3, приведенной под SEQ ID NO: 22,
(iv) последовательность L-CDR1, которая на 64% или более идентична последовательности L-CDR1, приведенной под SEQ ID NO: 23,
(v) последовательность L-CDR2, которая на 29% или более идентична последовательности L-CDR2, приведенной под SEQ ID NO: 24, и
(vi) последовательность L-CDR3, которая на 78% или более идентична последовательности L-CDR3, приведенной под SEQ ID NO: 25,
где указанная распознающая молекула повышает уровень фосфорилирования ITIM FcyRIIB в клетках Daudi приблизительно в 4-10 раз по сравнению с клетками Daudi, не обработанными указанной распознающей молекулой.
11. Распознающая молекула по п. 10, которая содержит в своей вариабельной области тяжелой цепи H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 29, 30 и 31, а в своей вариабельной области легкой цепи L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3, приведенные под SEQ ID NO: 32, 33 и 34, где указанная распознающая молекула повышает уровень фосфорилирования ITIM FcyRIIB в клетках Daudi приблизительно в 4-10 раз по сравнению с клетками Daudi, не обработанными указанной распознающей молекулой.
12. Распознающая молекула по п. 10 или п. 11, которая содержит в своей вариабельной области тяжелой и легкой цепи следующие последовательности CDR:
(a) SEQ ID NO: 14 (CDR-H1), SEQ ID NO: 15 (CDR-H2) и SEQ ID NO: 16 (CDR-H3) в своей вариабельной области тяжелой цепи и SEQ ID NO: 17 (CDR-Ll), SEQ ID NO: 18 (CDR-L2) и SEQ ID NO: 19 (CDR-L3) в своей вариабельной области легкой цепи или
(b) SEQ ID NO: 20 (CDR-H1), SEQ ID NO: 21 (CDR-H2) и SEQ ID NO: 22 (CDR-H3) в своей вариабельной области тяжелой цепи и SEQ ID NO: 23 (CDR-Ll), SEQ ID NO: 24 (CDR-L2) и SEQ ID NO: 25 (CDR-L3) в своей вариабельной области легкой цепи.
13. Распознающая молекула по любому из предыдущих пунктов, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 3, по меньшей мере с одной из мутаций, выбранных из группы, включающей замену аминокислоты Q в положении 1 на Е, замену аминокислоты V в положении 11 на L, замену аминокислоты G в положении 42 на К, замену аминокислоты S в положении 50 на V, замену аминокислоты Y в положении 53 на S, замену аминокислоты К в положении 58 на Т, замену аминокислоты G в положении 61 на А, замену аминокислоты S в положении 75 на Т, замену аминокислоты К в положении 76 на R, замену аминокислоты N в положении 77 на S и замену аминокислоты Т в положении 78 на N.
13.
14. Распознающая молекула по любому из предыдущих пунктов, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 4, по меньшей мере с одной из мутаций, выбранных из группы, включающей замену аминокислоты Q в положении 1 на N, замену аминокислоты S в положении 28 на N, замену аминокислоты S в положении 31 на Т, замену аминокислоты V в положении 33 на L, замену аминокислоты D в положении 34 на А, замену аминокислоты Y в положении 49 на F, замену аминокислоты Т в положении 53 на N, замену аминокислоты Y в положении 55 на А, замену аминокислоты L в положении 89 на Q и замену аминокислоты N в положении 93 на Y.
15. Распознающая молекула по любому из предыдущих пунктов, где указанная распознающая молекула повышает уровень фосфорилирования ITIM FcyRIIB в клетках Daudi приблизительно в 4-10 раз по сравнению с клетками Daudi, не обработанными указанной распознающей молекулой.
16. Распознающая молекула по любому из предыдущих пунктов, где второй связывающий домен имеет в своей вариабельной области тяжелой цепи аминокислотную последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 1 или 3, и/или в своей вариабельной области легкой цепи аминокислотную последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 2 или 4.
17. Распознающая молекула по любому из пп. 6-16, где константная область IgE имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, 36 или ее часть.
18. Распознающая молекула по любому из пп. 2-17, где антитело является гликозилированным или дегликозилированным.
19. Распознающая молекула по любому из пп. 2-18, где антитело связывается in vitro с FcyRIIB человека с аффинностью, характеризующейся константой скорости диссоциации, составляющей по меньшей мере 4,9 х 10~4 с"1.
13.
20. Распознающая молекула по любому из пп. 2-19, где антитело связывается in vitro с FceRI человека с аффинностью, характеризующейся значением Kd по меньшей мере 1,2 х 10" (М).
21. Распознающая молекула по любому из предыдущих пунктов, которая специфично связывается с эпитопом FcyRIIB человека, содержащим аминокислоты 20-40 согласно SEQ ID NO: 7.
22. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая распознающую молекулу по любому из пп. 1-21.
23. Вектор, содержащий по меньшей мере одну из последовательностей нуклеиновой кислоты по п. 22, встроенную в указанный вектор.
24. Клетка-хозяин, трансфицированная последовательностью нуклеиновой кислоты по п. 22 или вектором по п. 23.
25. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента распознающую молекулу по любому из пп. 1-21, нуклеиновую кислоту по п. 22, вектор по п. 23 или клетку-хозяина по п. 24.
26. Фармацевтическая композиция по п. 25 для лечения или профилактики заболеваний, ассоциированных с базофилами.
27. Фармацевтическая композиция по п. 26 для лечения или профилактики форм аллергии.
28. Распознающая молекула по любому из пп. 1-21 для применения в терапии.
29. Распознающая молекула по любому из пп. 1-21 для применения в лечении или профилактике заболеваний, ассоциированных с базофилами.
30. Распознающая молекула для применения по п. 29, где заболевание, ассоциированное с базофилами, представляет собой аллергическое заболевание.
13.
Анализ с помощью SPR вариантов WT и N297A гуманизированного 8А6, GB3 WT и ch8A6 WT
koffCc1]
hu8A6_wt
9,5 x 10~4
hu8A6_N297A
8,8 x 10~4
ch8A6_wt chGB3_N297A
4,9 x 10"4 1 x 10"2
Фигура 1. Анализ с помощью поверхностного плазмонного резонанса гуманизированного 8А6 (hu8A6_VH10+VL6) согласно SEQ ID NO: 3 и 4 в формате дикого типа либо N297A, ch8A6_WT (согласно SEQ ID NO: 1 и 2) и chGB3_N297A.
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
2/37
Фигура 2
Последовательность hu8A6_wt и hu8A6-N297A
Аминокислоты вариабельных областей просто пронумерованы независимо от какой-либо схемы нумерации. Для лучшего понимания замен аминокислот в Fc-домене была выбрана нумерация по EU.
Тяжелая цепь/гуманизированное 8A6_wt (гликозилированное)
VH-домен (вариант VH10)
1 QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS DYYMAWVRQA PGKGLEWVAS ISYDGSNKYY
61 GDSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARPG DYWGQGTLVT VSS (SEQ ID N0: 3)
Fc-домен (гликозилированный в 1М297/аллотип G1 m 17. содержащий К214; Е356; М358; А43 1 /без С-концевого Lys; согласно нумерации по EU)
118 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 17 8 GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 238 PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN 298 STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 358 MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 418 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG- (SEQ ID NO: 6) Тяжелая цепь/гуманизированное 8A6 N297A (дегликозилированное) VH-домен см. выше
Fc-домен (вариант Ы297А/аллотип G1 m 17. содержащий К214; Е356; М358; А43 1/без С-концевого Lys; согласно нумерации по EU)
118 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 17 8 GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 238 PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYA 298 STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE 358 MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW 418 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG- (SEQ ID NO: 28)
Фигура 2. Последовательности вариантов hu8A6_wt и hu8A6_N297A, в которых показано положение аминокислотной модификации по типу замены N на А в
формате N297A
FACS-анализ, демонстрирующий неблокирующие характеристики ch8A6_N297A
ы о
h-'
ы <*>
Связывание вариантов hu8A6_VH + hu8A6_VL на клетках Raji
Рн К
Ч et о
Я Я
!*|
п о
а U
Ьи4М"_Щ..2 • VH10 hwiA§_Vt§ * ?111(c) hu8A6_Vl7 * ?1110" hu8A6"JVl? ¦ Will §
0,001 0,01 0,1 i "*'
Концентрация антитела [мкг/мл]
Фигура 4. Связывание очищенного с помощью белка А антитела (hu8A6_VL + hu8A6_VH и ch8A6_N297A) в концентрациях от 15 мкг/мл до 0,005 мкг/мл с нативным FcyRIIB, экспрессируемым на клетках Raji. Гуманизированные варианты 8А6 связываются с FcyRIIB, экспрессируемым на клетках Raji, с высокой авидностью.
Связывание вариантов hu8A6_VH + hu8A6_VL на клетках К562
и шт
Щ юн"
й хооо
% ьшт
Я 4ГО0
i <*-т Ф*- л" &х о." -v." л*
; ^ ^ ^ # ^ ^ ^vVv
Фигура 5. Связывание 15 мкг/мл очищенного с помощью белка А антитела (hu8A6_VH + hu8A6_VL и ch8A6_N297A) и ch8A6_N297A с нативным FcyRIIA, экспрессируемым на клетках К562. Антитела согласно настоящему изобретению не связываются с FcyRIIA на клетках К-562.
Фосфорилирование ITIM, уровень которого повышается с помощью ch8A6, в РВМС от
здорового донора
Фигура 6а.
, v4
смесь антител
фосфорилированный ITIM
Анализ фосфорилирования 1ТГМ. РВМС от здорового донора выделяли с применением разделения с помощью фиколла, а затем оставляли необработанными или инкубировали в течение 25 минут со смесью антител, содержащей антитело к IgM (антитело мыши к иммуноглобулину человека) и антитело (кролика) к IgG мыши. Затем клетки обрабатывали в течение 20 минут 5 мкг/мл ch8A6_N297A либо буфером в качестве контроля (без антитела). Клетки собирали после инкубирования и лизировали в соответствии с протоколом. Лизаты подвергали WB-анализу. В-актин = контроль нагрузки.
ы о
h-'
ы <*>
6-актин
4PI
.4*
AS- ,
фосфорилированный ITIM
В-актин
Фигура 6Ь.
Контрольный эксперимент по фосфорилированию 1ТГМ. Клетки Daudi оставляли необработанными или обрабатывали в течение 25 минут антителом изотипического контроля, поликлональным антителом к IgM человека (поликлональное антитело к hlgM), моноклональным антителом к IgM человека (антитело к hlgM), антителом к hlgM + 5 мкг/мл ch8A6_N297A, антителом кролика к IgG мыши (а к IgG мыши), а к IgG мыши + 5 мкг/мл ch8A6_N297A, смесью антитела к hlgM и а к IgG мыши (смесь АЬ) или смесью АЬ + 5 мкг/мл ch8A6_N297A. В-актин = контроль нагрузки.
43 -а ON
перекрестное -сшивание
р1Ш
Фигура 6с.
8А6 (wt), а также hu8A6 продемонстрировали сильное фосфорилирование Fc-гамма RIIB без необходимости в предварительном колигировании BCR и FcyRIIB. После перекрестного сшивания рецепторов с помощью смеси антител 8А6 (wt) и hu8A6, как и ожидалось, были способны индуцировать фосфорилирование ITIM.
*0 О
н и
ы о
h-'
с\ оо с\ с\
Сравнение ch8A6_N297A с антителом, известным из существующего уровня техники (GB3)
,~fC
it-Af -.^v -wAp
? .-^ .s? .s?>
•A' ,.v о> .л> -С- "ч? j.S* A" "V*
+ смесь антител
ijf ^ ^ У ^ S ^
+ смесь антител " 4 -""..^.,-,
ы о
h-'
ы <*>
50кДа 40кДа
ШШт
fc* фосфорилированный ITIM
. . Ij-актин
О ев и °
а " я в ш С
" ю ш о
Jg и
и О
н " с е
43 -а
Фигура 7.
Анализ фосфорилирования 1ТГМ. Клетки Daudi человека оставляли необработанными либо инкубировали в
течение 25 минут со смесью антител, содержащей антитело к IgM (антитело мыши к иммуноглобулину Q
человека) и антитело (кролика) к IgG мыши. Затем клетки обрабатывали в течение 20 минут различными И
количествами chGB3_N297A или ch8A6_N297A либо буфером в качестве контроля (без антитела). Клетки g
собирали после инкубирования и лизировали в соответствии с протоколом. Лизаты подвергали WB-анализу. <7l
В-актин = контроль нагрузки. (r)
С\ С\
Сравнение эффекта гуманизированного варианта hu8A6_N297A, а также chGB3_N297A и ch8A6_N297A в отношении фосфорилирования ITIM в первичных РВМС
JP bjbJ *aJ лЧ
Лег ч#
фосфорилированный ITIM В-актин
О? * * * ^
х + смесь антител - °
Фигура 8. Сравнение эффекта гуманизированного варианта hu8A6_N297A, а также chGB3_N297A и ch8A6_N297A в отношении фосфорилирования ITIM в первичных РВМС. После перекрестного сшивания BCR и FcyRIIB с помощью смеси антител добавляли различные антитела в концентрации 5 мкг/мл и проводили вестерн-блот-анализ в отношении фосфорилирования ITIM. В-актин = контроль нагрузки.
Совместная иммунопреципитация фосфорилированной SHIP-1 и FcyRIIB
^1?
' СЧСС1. nilllNC.I
фосфорилированная SHIP-1
фосфорилированный 1ТГМ
антитело к CD32
¦¦¦¦и
Фигура 9. Совместная иммунопреципитация фосфорилированной SHIP-1 и ITIM FcyRIIB. После стимуляции клеток Daudi смесью антител и любым из ch8A6_N297A, блокирующего антитела 2В6, связывающегося с FcyRIIB, или chGB3_N297A (5 мкг/мл) FcyRIIB осаждали из клеточных лизатов, и проводили вестерн-блот-анализ в отношении фосфатазы SHIP-1. Панспецифическое антитело к CD32 (AF1330), используемое в качестве антитела к CD32 = контроль нагрузки.
Сравнение гуманизированных вариантов 8А6 с ch8A6_N297A
\ 4f
I? ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^
^' # # ^ ^ ^
В-актин
Фигура 10.
Анализ фосфорилирования ITIM. Клетки Daudi оставляли для инкубирования в течение 25 минут с буфером (без обработки) или со смесью (смесь антител), содержащей антитело к IgM (антитело мыши к иммуноглобулину человека) и антитело (кролика) к IgG мыши. Затем клетки обрабатывали в течение 20 минут 0,25 мкг/мл ch8A6_N297A либо гуманизированными вариантами 8А6 hu8A6_VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7. Клетки собирали после инкубирования и лизировали в соответствии с протоколом. Лизаты подвергали WB-анализу. В-актин = контроль нагрузки.
Сравнение гуманизированных вариантов 8А6 с ch8A6_N297A, 2В6 и chGB3_N297A
^ -ЗУ
л л л
-"на
О с.
Jo/ Jto'"
# # ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^
Р-/Г/М
В-актин Фигура 11.
Анализ фосфорилирования ITIM. Клетки Daudi оставляли для инкубирования в течение 25 минут с буфером (без обработки) или со смесью (смесь антител), содержащей антитело к IgM (антитело мыши к иммуноглобулину человека) и антитело (кролика) к IgG мыши. Затем клетки обрабатывали в течение 20 минут любым из 0,25 мкг/мл ch8A6_N297A, гуманизированных вариантов 8А6 hu8A6_VH10+VL2/VH10+VL6/VH10+VL7/VH12+VL2/VH12+VL6/VH12+VL7, блокирующего антитела 2В6 или chGB3_N297A. Клетки собирали после инкубирования и лизировали в соответствии с протоколом. Лизаты подвергали WB-анализу. В-актин = контроль нагрузки.
Модель SLE: схема эксперимента
SLE-PBL
PBS или 20 мкг неблокирующего антитела, связывающегося с FcyRIIB
0 неделя 1 неделя 2 неделя 3 неделя 4 неделя 5 неделя
6 неделя
• инъекция мышам 0,7 х 10Е7 PBL, выделенных из крови пациента с SLE
• дважды в неделю: инъекция PBS (1 мышь)/20 мкг неблокирующего антитела 8А6, связывающегося с FcyRIIB (2 мыши)
• еженедельное тестирование: в сыворотке крови
• ELISA в отношении IgM/IgG
Фигура 12. Схема эксперимента для мышиной модели SLE-PBL. PBL от пациентов-людей со SLE переносят мышам с ослабленным иммунитетом. PBL-клетки трансплантируют, и мышей затем обрабатывают контролем (PBS) или антителом ch8A6_N297A, связывающимся с FcyRIIB, согласно настоящему изобретению.
Модель SLE PBL, общий сывороточный иммуноглобулин человека vo
j№2(PBS) g№.4+ ch8A6_N297A) |№4(+ch8A6_N297A)
140 I
120 ' Л
Модель SLE PBL, влияние на антитела к ДНК (IgG, специфичные для
конкретного заболевания)
[\N^(PBS) 0№3(+ch8A6_N297A) |№4 (+ch8A6_N297A)
0,10 -,
Недели после переноса SLE-PBL
Фигура 14.
Снижение уровня специфичных для конкретного заболевания антител IgG человека к ДНК у обработанных ch8A6_N297A мышей, начиная с 4 недели после переноса/трансплантации SLE-PBL. Изображены титры антител IgG к ДНК у двух различных мышей, № 3 и № 4 (обработанных ch8A6_N297A), под № 2 показан контроль с PBS.
гликозилированное дегликозилированное 8A6-Cs3-Cs4 8A6-Cs3-Cs4
1,6 _ 1,4 1,2
В 0,8
Я 0,6 О
0,4 п
0,2 0,0
Г 1
¦It f
-#-ch8A6_ce2-4
ch8A6_ce2-4 degly
ch8A6_ce3-4 - <*~ch8A6_ce3-4 degly Ж ch8A6 N297A
100 1000 10000
Концентрация (нг/мл)
100000
1,4 1,2 1,0
S X
S 0,8 т
0,4 0,2 0,0
К 0,6
Q О
ch8A6_ce2-4 ch8A6_ce2-4 degly ch8A6_ce3-4 ch8A6_ce3-4 degly
<
и н
ч ч
Я X
800 700 600 500 400 300 200 100
о
0,001 0,01 0,1
-г- 10 100
ch8A6_N297A [-ch8A6_ce2-4 ch8A6_ce3-4 deglye
Концентрация Ab (мкг/мл)
1,4
1,2
,1,0 x
S 0,8 -r
0,4 0,2 0,0
в 0,6
Q О
8A6_ce2-4 8A6_ce2-4degly 8A6_ce3-4 "-*r" 8A6_ce3-4degly
ch8A6 N297A (SM201)
10 100 1000
Концентрация (нг/мл)
10000
1,4 1,2 s1,0 S 0,8
&0,6 Q
°0,4
0,2 0,0
8A6_ce2-4
8A6_ce2-4d
8A6_ce3-4
8A6_ce3-4d
ch8A6_ce2-4d
ch8A6 ce3-4d
10 100 1000
Концентрация (нг/мл)
10000
2000
и н
1600
ft 1200
S X
400
? 800 S
СНО ce2-4d
Raji,ce2-4d
0,01
0,1 1 10
Концентрация (мкг/мл)
100
8А6 (IgE)-Fluo488, маскированный с
ы о
h-'
ы <*> \о оо
8А6 (lgE)-Fluo488
помощью SM101
8A6 (lgG)-Fluo488
'У*
0.99
10375
13.4
104
4427
13.1
1.37
14.5
¦¦г
1С4
Субпопуляции по FSC-A, SSC-A
*С пт ikt
Число событий: 195144 лУ..
1 <У-
1 15"
1'Г
Субпопуляции no FSC-A, SSC-A
1 f T П f ff s
Число событий: 196389
О "
. -*> CD*?
Субпопуляции no FSC-A, SSC-A Число событий: 194997
0.33
10 мин.
"1 ы
о н
ы о
8А6 (IgE)-Fluo488, маскированный с
8А6 (!gE)-Fluo488 помощью SM101 8А6 (lgG)-Fluo488
О h-'
ы <*>
1.84
13.7
0,85
?qiq
14.9
1,77
'oPHHljjjlHKi^
¦: 84.3
0.1 I
\ If
10*-
С л
184.2
0.1
0.2
60 мин.
S 1
43 &
ы ы
, v Ы
я t;
43 w о
Я S
0 *0" "-С' '2" *PЈ-tf"-A* ?3" 5 Субпопуляции по FSC-A, SSC-A
юти*!
Число событий: 193564
Субнонуляции по FSC-A, SSC-A Число событий: 193997
!0=
С 'С !0' 1С
Субпопуляции по FSC-A, SSC-A
5 j гчпй f;s
Число событий: 194636
*0 О
н и
ы о
(Л О
с\ оо с\ с\
8А6 (IgE)-Fluo488, маскированный с
8А6 (lgE)-Fluo488 помощью SM101 8А6 (lgG)-Fluo488
8А6 (IgE)-Fluo488, маскированный с
8A6(lgE]-Fluo488 помощью SMIOI 8А6 (lgG)-Fluo488
] № кг 'T ,rr : to- io* "f *:*J о ,:J i:4 v*-
Субиоиуляции no FSC-A, SSC-A Субпопуляции no FSC-A, SSC-A Субнонуляции no FSC-A, SSC-A
fiO-njf:!; : Число событий: 185040 Число событий: 182721 Число событий: 191387
ы о
8А6 (IgE)-FIuo488, маскированный с О
8А6 jlgE)-Fluo488 помощью SMIOI 8А6 (lgG)-Fluo488
Стратегия гейтирования по CD193 и SSC в FACS
250000 -200000
1G-'
U 150000 100000
10s
5 ?
ю4-1 -ль-
j S 0.64'
50000
10г
SHlI
-т -> -т *---г- 7 . г' г '
О 50000 Ю0000 150000 200000 250000
Негеи I ироканныс
8р^сш-:^г_С.О 1_iintf"3l> > rt "cs
Число событий: 91509
О 50000 100000 150000 200000 %J4n00° " SSC.-A
Нсгситироканныс
S p а с in e n_D 01 _untreaLe d f с 5 Число событий: 91509 базофильные гранулоциты
"+, низкое значение SSC
Число событий: 91509
CD63
50-
0,5 мкг/мл
0,52
> ;i"
2 мкг/мл
SM201
ы о
h-'
ы <*>
; о- !0
! 5 !0>
-л 10'
Д"1 1
'0*
10' i
99,5
100
0 1С-' 3D 1С-
РЕ-A CD 19::.
ТТ^ r-T-rTTTwr-
с" 1С- 1 о ;ол
РЕ-A LDW6
Число событий: 581
Число событий: 557
CD193
8А6 N297A
0,5 мкг/мл (слева) 2 мкг/мл (справа)
*0 О
ы о
CD63
0,17
99,8
¦ -А <*t 1 и
5 IG3
0,52
99,5
SM301 с*2-4
S 1
ы 4-
'я4
43 О
re Я S
ы о
h-'
ы <*>
Число событий:585
Число событий:582
С 15^ 3
8A6_ce2-4-degly
0,5 мкг/мл (слева) 2 мкг/мл (справа)
о н
ы о
(Л О
с\ оо с\ с\
10"
99,6
TJ 1-1 1 J г nij 1-I I f 1Ш| 1-n-pmij ¦
О 1G: 1 С-3 1С4
РЕ-А. CD1 &3
базофилы
БАТ211112 24h_LPS contro'_C01 fcs Число событий: 495
*0 О
ы о
пыльца
антитело, связывающееся с FcsRI
Ы О h-'
ы <*>
85,3
1/1,
87,4
} 1Г ->
14*.
,. II
i 1
Ы ON
14.7
12.6
базофилы
Число событий: 542
базофилы
Число событий: 566
№ 1 СЭМ
базофилы
Число событий: 562
о н
ы о
оо с\ с\
0,5 мкг/мл
2 мкг/мл
5 мкг/мл
84 Л
84.2
1f*i
II11
GO'-!
{ 15.9
15.8
оазофилы
Число событий: 533
базофилы
Число событий: 531 базофилы
Число событий: 569
CD63 0,5 мкг/мл
2 мкг/мл
5 мкг/мл
76.6
и--г
83,6
81.5
SM301
iii "г
a :
23,4
т., ,
, и
16,4
¦|"'"'-rrrp-"| ,
18.5
базофилы
Число событий: 661
с -;: it-1 г/ #
базофилы Число событий: 549
э k> с icJ юг
базофилы
Число событий: 585
без обработки
пыльца
антитело, связывающееся с FcsRI
*--г-ТТ-r-т-
с i;: у}
оазофилы
Число событий: 588
0,34
99.7
ГТ'-",^ ,
:4 -cr
базофилы
Число событий: 585
75.7
; -:: 'Г.: id* 10-
базофилы
Число событий: 551
3 0,5 мкг/мл
2 мкг/мл
5 мкг/мл
76.8
1Г"
70.1
< ,
23.2
29.9
"1 i ",
базофилы
Pi ГС у/ *4- С> , <Т| , да.^- Kfc,
Число событий:561 базофилы
Число событий: 579 оазофилы
Число событий: 523
0,5 мкг/мл
2 мкг/мл
5 мкг/мл
ы о
h-'
ы <*>
59.4
58.1
60.6
SM301
та о
- -•
базофилы
40.6
41.9
"r'rq чччл-г--m !-¦¦-г-] г-у- ^
5 t: 1С" 1С1 i:"
zzA ггл;л базофилы
Число событий: 537 базофилы
Число событий: 573
39.4
Г -с5
CD198
fD fD *0 О
ы о
h-'
СО 193+
FACS 149 8a"s_ufitreat &dpi 7.fc$ Число событий: 674
CD 193+
FACS 143 S asos. urrt reat ed pollen .fcs Число событий: 430
5 мкг/мл дегликозилированного SM301 се2-4
10,6
&ГО3
1СЧ
Т ¦"Т-ТТ
89,4
т"*п- Ч'Н-"т-лг.. ,
О Ю* 103 104 1#
АРС-А: CD133
?0193+
РАШ43Вэ"5 Г-4 foilc-r.fcs
Число событий: 435
СР133* РДШ45Вз$05 3-4 poi: <3i.f"
Число событий: 564
+ пыльца
"я та
fD fD
ы о
ы <*>
н и
ы о
h-'
CD 153+
FACS:49Basos_301 2-4 wo.fcs Число событий: 723
7,76
io2i
92,2
о ю: Ю3 Ю4 105
АРС-А: CQ153
FAC5149 B3SOS_Xi 3-4woics Число событий: 593
без активации
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
(19)
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
(19)
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
(19)
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
(19)
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
(19)
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
РСТ/ЕР2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985 PCT/EP2015/068667
FACS-анализ специфичности связывания гуманизированных вариантов 8А6
FACS-анализ специфичности связывания гуманизированных вариантов 8А6
FACS-анализ специфичности связывания гуманизированных вариантов 8А6
FACS-анализ специфичности связывания гуманизированных вариантов 8А6
FACS-анализ специфичности связывания гуманизированных вариантов 8А6
FACS-анализ специфичности связывания гуманизированных вариантов 8А6
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
15/37
Фигура 15
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
15/37
Фигура 15
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
16/37
Фигура 16
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
16/37
Фигура 16
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
16/37
Фигура 16
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
16/37
Фигура 16
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
17/37
Фигура 17
PCT/EP2015/068667
WO 2016/023985
17/37
Фигура 17
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
18/37
Фигура 19
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
18/37
Фигура 19
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
18/37
Фигура 19
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
18/37
Фигура 19
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
18/37
Фигура 19
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
18/37
Фигура 19
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
18/37
Фигура 19
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
18/37
Фигура 19
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
19/37
Фигура 21
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
19/37
Фигура 21
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
19/37
Фигура 21
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
19/37
Фигура 21
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
19/37
Фигура 21
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
19/37
Фигура 21
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
19/37
Фигура 21
WO 2016/023985
PCT/EP2015/068667
19/37
Фигура 21
С0193
С0193
С0193
С0193
С0193
С0193
С0193
С0193
С0193
С0193
С0193
С0193
CD193
CD193
CD193
CD193
CD193
CD193
CD193
CD193
CD193
CD193
CD193
CD193
CD193
CD193
CD193
CD193