EA201790010A1 20170531 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/201790010 Полный текст описания [**] EA201790010 20150708 Регистрационный номер и дата заявки GB1412175.0 20140709 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок GB2015/051985 Номер международной заявки (PCT) WO2016/005752 20160114 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21705 Номер бюллетеня [**] ГАММА-ДЕЛЬТА T-КЛЕТКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Название документа [8] C12N 5/0783, [8] A61K 35/17 Индексы МПК [GB] Лик Майкл, [GB] Ханниган Адель Сведения об авторах [GB] ТиСи БАЙОФАРМ ЛТД. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201790010a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Способ получения и применения гамма-дельта Т-клеток в аллогенном или аутологичном лечении субъектов, страдающих от вирусной инфекции, грибковой инфекции, протозойной инфекции и рака.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Способ получения и применения гамма-дельта Т-клеток в аллогенном или аутологичном лечении субъектов, страдающих от вирусной инфекции, грибковой инфекции, протозойной инфекции и рака.


Евразийское (21) 201790010 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C12N5/0783 (2010.01)
2017.05.31 A61K 35517 (2015.01)
(22) Дата подачи заявки 2015.07.08
(54) ГАММА-ДЕЛЬТА T-КЛЕТКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
1412175.0; 1415379.5; 1506423.1 2014.07.09; 2014.08.29; 2015.04.15 GB
PCT/GB2015/051985
WO 2016/005752 2016.01.14
Заявитель:
ТиСи БАЙОФАРМ ЛТД. (GB)
Изобретатель:
Лик Майкл, Ханниган Адель (GB)
Представитель: Медведев В.Н. (RU)
(57) Способ получения и применения гамма-дельта Т-клеток в аллогенном или аутологичном лечении субъектов, страдающих от вирусной инфекции, грибковой инфекции, протозойной инфекции и рака.
2420-540011ЕА/011 ГАММА-ДЕЛЬТА Т-КЛЕТКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Область техники, к которой относится изобретение
Данная заявка относится к способам получения и применения гамма-дельта Т-клеток и, в частности, применения гамма-дельта Т-клеток для аллогенных или аутологичных субъектов-реципиентов с целью лечения патологических состояний, включая вирусную инфекцию, грибковую инфекцию, протозойную инфекцию и рак.
Предпосылки создания изобретения
Аллогенная трансплантация стволовых клеток (алло-ТСК) была предложена и опробована для лечения гематологических злокачественных новообразований. Однако основным недостатком такой аллогенной терапии является высокая частота отторжения трансплантата и развитие реакции "трансплантат против хозяина" (GVHD). В попытке улучшения результатов такой трансплантации были использованы идентичные по гаплотипу HLA доноры. Кроме того, были предприняты попытки проведения ТСК в условиях истощения пула Т-клеток и совпадения по HLA с использованием ех vivo истощения пула Т-клеток трансплантата для уменьшения GVHD; однако считается, что это приводит к возрастанию риска отторжения трансплантата.
Если реципиент проходит интенсивную предварительную подготовку для снижения риска отторжения трансплантата и получает трансплантат, истощенный по Т-клеткам, считается, что восстановление иммунитета является недостаточным и слишком много пациентов погибнут от оппортунистических инфекций.
Гамма-дельта Т-лимфоциты представляют собой небольшую
подгруппу клеток в периферической крови у человека (менее 10%).
Гамма-дельта Т-клетки, экспрессирующие Vy9V82 (гамма-9 дельта-
2) Т-клеточный рецептор, узнают эндогенный
изопентенилпирофосфат (IPP), который избыточно продуцируется в раковых клетках в результате нарушения регуляции мевалонатного пути. Способность гамма-дельта Т-лимфоцитов продуцировать в изобилии провоспалительные цитокины, такие как IFN-гамма, их сильная цитотоксическая эффекторная функция и МНС-независимое
узнавание антигенов делает их важной составляющим компонентом противораковой иммунотерапии. Показано, что гамма-дельта Т-клетки способны уничтожать много разных типов опухолевых линий клеток и опухолей in vitro, включая лейкоз, нейробластому и разные карциномы. Кроме того, было продемонстрировано, что гамма-дельта Т-клетки способны узнавать и уничтожать множество различных дифференцированных опухолевых клеток либо спонтанно, либо после обработки разными бисфосфонатами, включая золедронат. Опухолевые клетки человека способны эффективно представлять пирофосфомоноэфирные соединения гамма-дельта Т-клеткам, индуцируя их пролиферацию и продуцирование ими IFN-гамма.
В настоящее время используют две стратегии противоопухолевой терапии гамма-дельта Т-клетками. Первый способ включает адоптивный клеточный перенос размноженных in vitro гамма-дельта Т-клеток обратно в организм пациента (то есть, аутологичное лечение). Второй способ включает in vivo терапевтическое применение стимулирующих гамма-дельта Т-клетки фосфоантигенов или аминобисфосфонатов наряду с низкой дозой рекомбинантного IL-2.
Стратегии аутологичной трансплантации гамма-дельта Т-клеток были использованы для преодоления описанных выше недостатков аллогенной трансплантации стволовых клеток. В качестве части такой методики аутологичной трансплантации ранее, например, в US 2002/0107392, были описаны способы индукции и культивирования достаточных количеств гамма-дельта Т-клеток для оказания терапевтического эффекта аутологичным образом. Однако стратегии аутологичного лечения имеют целый ряд недостатков.
Таким образом, существует потребность в альтернативных и/или усовершенствованных стратегиях аутологичного и аллогенного лечения.
Сущность изобретения
При том, что гамма-дельта Т-клеточная терапия в качестве противораковой терапии обсуждалась применительно к аутологичному использованию, до настоящего времени не
рассматривалось применение такой гамма-дельта Т-клеточной терапии аллогенным образом. Считается, что такое аллогенное применение гамма-дельта Т-клеточной терапии не рассматривалось, как правило, из-за потенциальных проблем, связанных с опосредованным иммунной системой отторжением. Авторы изобретения неожиданно обратили внимание на тот факт, что гамма-дельта Т-клетки, как правило, не вызывают реакцию "трансплантат против хозяина", и что выбор гамма-дельта Т-клеток для аллогенной трансплантации может позволить предоставлять Т-клетки реципиенту с минимальным риском развития реакции "трансплантат против хозяина". Гамма-дельта Т-клетки не рестриктированы по антигенам МНС (Tanaka Y et al. , 1995) . Авторы изобретения считают, что это позволит использовать гамма-дельта Т-клетки в аллогенной трансплантации для обеспечения успешной терапии, при которой гамма-дельта Т-клетки способны избирать клетки мишенями для цитолиза независимо от гаплотипа МНС. Ввиду отсутствия узнавания представленных молекулами МНС антигенов гамма-дельта Т-клетками, авторы настоящего изобретения считают, что риск GVHD был бы сведен к минимуму при высокочистом аллогенном переносе гамма-дельта Т-клеток, в достаточной степени очищенных от других лейкоцитов, включая В-клетки и Т-клетки с альфа-бета Т-клеточным рецептором (TCR). Кроме того, считается, что вероятность отторжения трансплантата будет низкой вследствие иммунодефицитного состояния реципиентов при некоторых болезненных состояниях, включая, но без ограничения, пациентов с тяжелыми вирусными инфекциями, например, инфицированных вирусом Эбола, ВИЧ и вирусом гриппа, а также пациентов с PTLD-EBV и страдающих другими формами рака.
Как отмечено, прежние стратегии лечения включали удаление Т-клеток из донорской крови, в частности, периферической крови, с использованием методологии отрицательной селекции или положительной селекции перед проведением аллогенной трансплантации стволовых клеток.
Авторы настоящего изобретения разработали способ, позволяющий собирать клетки от субъекта-донора и обрабатывать
эти донорские клетки таким образом, чтобы обеспечить предоставление достаточных количеств гамма-дельта Т-клеток аллогенно субъекту-реципиенту, с тем, чтобы гамма-дельта Т-клетки могли оказывать терапевтический эффект в организме субъекта-реципиента.
В качестве примера, способ наращивания гамма-дельта Т-клеток, разработанный авторами изобретения, может включать выделение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) из крови или лейкаферезного материала с использованием центрифугирования в градиенте плотности. Выделенные РВМС могут быть криоконсервированы перед их наращиванием в культуре, при этом плазму совместно экстрагируют и сохраняют в качестве аутологичного эксципиента для использования на последующих этапах культивирования гамма-дельта Т-клеток. В вариантах осуществления свежевыделенные (или восстановленные из криоконсервированного состояния) РВМС инокулируют в ростовую среду, содержащую человеческий рекомбинантный IL-2 (например, в концентрации вплоть до 1000 Ед/мл) и золедроновую кислоту
(например, 5 мкМ) . Популяция уб Т-лимфоцитов может быть активирована и избирательно пролиферировать из РВМС в результате добавления золедроновой кислоты (день 0) и непрерывного добавления IL-2 на протяжении 14-дневного периода культивирования. В течение этого периода времени клеточную суспензию можно серийно размножать (как правило, с индексом разведения 1:2) . Через 14 дней после начала культивирования клетки можно собирать и ресуспендировать в растворе Рингера лактата и ЧСА перед тем, как перенести в инфузионный флакон, содержащий 100 мл солевого раствора.
В вариантах осуществления после наращивания гамма-дельта Т-клеточный продукт удовлетворяет следующим минимальным требованиям: более 80% всех клеток составляют Т-лимфоциты (CD3-положительные), гамма-дельта Т-лимфоциты составляют 60% или более от общей популяции Т-лимфоцитов (Угамма9-положительные), NK-клетки составляют менее 2 5% от общей популяции Т-лимфоцитов
(СОЗ-отрицательные/СВ5б-положительные), цитотоксические Т
клетки составляют менее 10% от общей популяции Т-лимфоцитов (СОЗ/СВ8-положительные) и Т-хелперы составляют менее 5% от общей популяции Т-лимфоцитов (СОЗ/СВ4-положительные). В вариантах осуществления популяции клеток, удовлетворяющие данным требованиям, могут быть использованы в качестве исходного материала для создания банков высокочистых аллогенных клеток, в которых, в идеале, более 99% будут составлять гамма-дельта Т-клетки.
Первый аспект настоящего изобретения относится к способу предоставления второму субъекту гамма-дельта Т-клеток аллогенно, включающему этапы
- получения образца, содержащего гамма-дельта Т-клетки, от первого субъекта;
культивирования гамма-дельта Т-клеток с целью последующего введения их второму субъекту.
В вариантах осуществления этап получения может включать
этап сбора гамма-дельта Т-клеток от первого субъекта. Сбор
клеток можно производить от субъекта-донора, который не имеет
текущих проблем со здоровьем, или из материала пуповинной
крови. Соответственно, субъект-реципиент может быть позвоночным
животным, например, млекопитающим, например, человеком или
коммерчески ценным домашним скотом, лабораторным животным,
лошадью, коровой, козой, крысой, мышью, кроликом, свиньей и
тому подобным. В вариантах осуществления первый и второй
субъекты могут быть людьми. Понятно, что в контексте настоящего
изобретения первый субъект является субъектом-донором, у
которого собирают гамма-дельта Т-клетки, и клетки используют
для аллогенного лечения другого, второго, субъекта
(реципиента). Соответственно, первый субъект имеет состояние
предболезни. Используемый в настоящем документе термин
состояние "предболезни" охватывает абсолютный термин
"здоровый", "без заболевания" и относительный термин,
описывающий градацию потенциального прогрессирования
заболевания, "здоровее, чем" или "менее больной, чем" после развития болезни. Поскольку "предболезнь" можно определять по времени до того, как у первого субъекта будет диагностировано
заболевание, первый субъект может быть здоровым в соответствии с абсолютным термином или может уже иметь заболевание, которое еще не проявляется или не диагностировано, или не обнаружено. В вариантах осуществления первый аспект изобретения включает этап культивирования гамма-дельта Т-клеток, полученных от первого субъекта, с тем, чтобы гамма-дельта Т-клетки могли быть предоставлены второму субъекту.
В вариантах осуществления гамма-дельта Т-клетки можно собирать из периферической крови или мононуклеарных клеток периферической крови, полученных после афереза или лейкафереза, или из пуповинной крови. Ex vivo наращивание гамма-дельта Т-клеток из периферической крови предпочтительно приведет к получению гамма-дельта Т-клеток фенотипа Vy9V82 при активации фосфоантигенами или аминобисфосфонатами. Использование пуповинной крови в качестве исходного материала для ex vivo наращивания позволяет избирательно наращивать клетки с некоторыми подтипами Т-клеточного рецептора (TCR) в зависимости от активирующего антигена. Эти изотипы TCR могут включать любую составляющую гамма-дельта TCR пару из Vyl-9 и V81-8, например, но без ограничения, V8l, V82 и V83 варианты TCR. Гамма-дельта Т-клетки дискретных подтипов узнают различные антигены и, таким образом, будут проявлять разные уровни цитотоксичности в зависимости от антигенов, представляемых клетками-мишенями. Относительное содержание каждого дельта-подтипа TCR зависит в значительной степени от условий культивирования и конкретных представляемых антигенов. Условия культивирования можно корректировать для предпочтительного наращивания клеток с TCR нужного изотипа из пуповинной крови. Например, гамма-дельта Т-клетки, экспрессирующие TCR особого изотипа, могут быть более эффективными в лечении конкретной формы рака или в лечении конкретной вирусной инфекции.
В вариантах осуществления этап сбора клеток может включать этап введения первому субъекту средства, потенцирующего гамма-дельта Т-клетки, перед сбором гамма-дельта Т-клеток у первого субъекта.
В вариантах осуществления способ сбора гамма-дельта Т-клеток может включать этап введения первому субъекту потенцирующего средства, такого как фактор роста, которое вызывает мобилизацию лейкоцитов из костного мозга, например, G-CSF, аминобисфосфоната, в частности, памидроновой кислоты, алендроновой кислоты, золедроновой кислоты, ризедроновой кислоты, ибандроновой кислоты, инкадроновой кислоты, их солей и/или их гидратов, TNF-альфа или интерлейкина 2 (Meraviglia S. et al. , 2010).
В одном из вариантов осуществления способ может включать любой один или более этапов из:
- получения крови, например, пуповинной крови, или клеток, получаемых при аферезе/лейкаферезе, от первого субъекта (донора),
выделения мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или мононуклеарных клеток пуповинной крови (СВМС) из крови,
- добавления аминобисфосфоната и целевого антигена к РВМС или СВМС, и
- культивирования РВМС или СВМС для пролиферации/индукции специфичных для целевого антигена цитотоксических Т-клеток (CTL) и гамма-дельта Т-клеток, и необязательно,
- совместного культивирования РВМС или СВМС, или Т-клеток с искусственными антигенпредставляющими клетками (аАРС) для пролиферации/индукции специфичных для целевого антигена цитотоксических Т-клеток (CTL) и гамма-дельта Т-клеток.
Авторы настоящего изобретения считают, что получение гамма-дельта Т-клеток, которые в значительной степени отделены от других компонентов цельной крови, уменьшает вероятность отторжения трансплантата при аллогенном введении этих по существу выделенных гамма-дельта Т-клеток второму субъекту. Способ получения гамма-дельта Т-клеток для аллогенного введения может включать этап активной очистки, например, выделения гамма-дельта Т-клеток из смешанной клеточной популяции с использованием антител против гамма-дельта Т-клеточного рецептора. Вследствие этого, способ по настоящему изобретению
может включать этап очистки гамма-дельта Т-клеток из цельной крови или ее компонентов. Поскольку гамма-дельта Т-клетки составляют менее 10% от общего количества клеток периферической крови, считается, что очистка образца цельной крови или ее компонентов с тем, чтобы более 10% по массе от массы образца составляли гамма-дельта Т-клетки, повысит эффективность аллогенного лечения субъекта-реципиента. Следовательно, способ по настоящему изобретению может включать этап очистки или наращивания образца цельной крови или ее компонентов с целью достижения содержания в очищенном образце гамма-дельта Т-клеток в количестве, превышающем 10, 25, 50, 75, 85, 90, 95 или 98% от общего числа клеток. Считается, что очистка или наращивание образца цельной крови или ее компонентов с целью достижения содержания в очищенном образце гамма-дельта Т-клеток в количестве, превышающем 10, 25, 50, 75, 85, 90, 95 или 98% от общего числа клеток, и при этом уменьшение в образце количества клеток, которые могут вызывать иммунный ответ и/или отторжение трансплантата, позволит осуществлять аллогенный перенос гамма-дельта Т-клеток.
Любой метод, известный специалисту в данной области, позволяющий очищать гамма-дельта Т-клетки из цельной крови, пуповинной крови или их компонентов, может являться частью настоящего изобретения. Очевидно, что этап очистки должен не влиять или влиять минимально на жизнеспособность гамма-дельта Т-клеток. Например, следующие этапы можно использовать в сочетании или отдельно для проведения вышеуказанной очистки гамма-дельта Т-клеток: диализ (например, аферез и/или лейкаферез); дифференциальное центрифугирование; наращивание гамма-дельта Т-клеток в культуре (например, предпочтительное наращивание в культуре).
Этап очистки можно, по меньшей мере частично, выполнять в процессе этапа культивирования. Например, в процессе этапа культивирования добавление по меньшей мере одного или сочетания определенных компонентов, таких как аминобисфосфонат, в частности, памидроновая кислота, алендроновая кислота, золедроновая кислота, ризедроновая кислота, ибандроновая
кислота, инкадроновая кислота, их соли и/или их гидраты,
позволяет избирательно размножать гамма-дельта Т-клетки в
культуре. Очистку в процессе культивирования клеток также можно
проводить путем добавления синтетических антигенов, таких как
фосфостим/бромгидрин пирофосфат (ВгНРР), синтетический
изопентенил пирофосфат (IPP), (Е)-4-гидрокси-3-метилбут-2-енил пирофосфат (НМВ-РР), или совместного культивирования с искусственными антигенпредставляющими клетками (аАРС) (Wang et al., 2011) . Добавление таких компонентов создает среду культивирования, позволяющую проводить положительную селекцию гамма-дельта Т-клеток, которые в результате составляют, как правило, 70% или более от общего числа клеток в очищенном образце.
Аминобисфосфонат можно добавлять в любое время, начиная с
первого дня культивирования гамма-дельта Т-клеток.
Аминобисфосфонат можно добавлять к мононуклеарным клеткам
периферической крови в 0,05-100 микромолярной концентрации,
предпочтительно 0,1-30 микромолярной концентрации. Бисфосфонат
является аналогом пирофосфорной кислоты и представляет собой
соединение, в котором О (атом кислорода) остова пирофосфорной
кислоты Р-О-Р замещен С (атомом углерода) (Р-С-Р). Его обычно
используют в качестве терапевтического средства против
остеопороза. Аминобисфосфонатом называют соединение из числа
бисфосфонатов, имеющее N (атом азота). Например,
аминобисфосфонат, используемый по настоящему изобретению, не
имеет конкретных ограничений; можно использовать
аминобисфосфонаты и тому подобные соединения, описанные в WO 2006/006720 и WO 2007/029689. Конкретные примеры соединений включают памидроновую кислоту, ее соль и/или их гидрат, алендроновую кислоту, ее соль и/или их гидрат и золедроновую кислоту, ее соль и/или их гидрат (Thompson К. et al., 2010) . Концентрация аминобисфосфонатов предпочтительно составляет 1-30 мкМ для памидроновой кислоты, ее соли и/или их гидрата, 1-3 0 мкМ для алендроновой кислоты, ее соли и/или их гидрата и 0,1-10 мкМ для золедроновой кислоты, ее соли и/или их гидрата. В настоящем документе в качестве примера используют 5 мкМ
золедроновую кислоту.
Соответственно, если период культивирования составляет 7 или более дней, группу клеток, представляющих собой гамма-дельта Т-клетки, можно получать с высокой чистотой; однако культивирование предпочтительно проводить в течение примерно 14 дней, чтобы дополнительно увеличить число гамма-дельта Т-клеток.
В вариантах осуществления период культивирования может составлять примерно 7 или более дней. Соответственно, период культивирования можно увеличивать до примерно 14 или более дней для получения большего количества по существу очищенных популяций гамма-дельта Т-клеток.
Культивирование, как правило, проводят в течение 14 дней,
после чего гамма-дельта Т-клетки прекращают экспоненциальную
пролиферацию. Однако в некоторых вариантах осуществления
предусмотрено более длительное культивирование и избирательное
наращивание гамма-дельта Т-клеток до получения большего их
количества. Такие варианты осуществления включают добавление в
культуру синтетических антигенов (например, синтетических IPP,
DMAPP, Br-HPP, НМВ-РР), периодическое воздействие
искусственными или облученными антигенпредставляющими клетками, добавление иммобилизованных антигенов или антител, или использование пуповинной крови в качестве исходного материала для клеточной культуры.
Соответственно, клетки можно культивировать в этой среде в течение периода по меньшей мере 7 дней для восстановления их рецепторного профиля клеточной поверхности после по меньшей мере двух удвоений популяции.
Необязательно, этап культивирования гамма-дельта Т-клеток может включать этапы изменения рецепторного профиля поверхности гамма-дельта Т-клеток (Iwasaki М. et al., 2011) .
Например, этап культивирования может включать один или более подэтапов, которые приводят к уменьшению количества, либо удалению одного или более типов рецепторов на поверхности гамма-дельта Т-клеток, присутствующих в гамма-дельта Т-клетках из образца, полученного от первого субъекта. Такие этапы можно
рассматривать, как "восстановление" или "частичное
восстановление" рецепторного профиля гамма-дельта Т-клеток, то есть, возвращение к нативной или частично нативной форме. Предположительно, такое восстановление повышает способность гамма-дельта Т-клеток к лечению рака и вирусной инфекции. Известно, что некоторые Т-клеточные рецепторы могут быть индуцированы наличием раковых клеток или вирусов в организме субъекта, от которого были получены данные Т-клетки, и было обнаружено, что эти рецепторы в некоторых случаях способны ингибировать способность Т-клеток реагировать на опухоль или вирусную инфекцию. Следовательно, удаление таких рецепторов может приводить к повышению эффективности гамма-дельта Т-клеток по настоящему изобретению.
Уменьшения количества, либо удаления одного или более типов рецепторов гамма-дельта Т-клеток можно добиваться с помощью способа по настоящему изобретению путем культивирования гамма-дельта Т-клеток, полученных от первого субъекта, в течение ряда дней, при этом популяция клеток увеличивается в размере в несколько раз. Например, клетки можно культивировать в течение периода времени по меньшей мере 7 дней для восстановления их рецепторного профиля клеточной поверхности после по меньшей мере двух удвоений популяции.
В случаях, когда рецепторный профиль поверхности гамма-дельта Т-клеток был восстановлен, рецепторы клеточной поверхности, включая, например, ингибиторы иммунных контрольных точек, которые присутствовали на первичных, некультивированных гамма-дельта клетках, такие как опухоль-специфические рецепторы клеточной поверхности B7-H1/PD-L1, B7-DC/PD-L2, PD-1 и CTLA-4, могут исчезать или существенно уменьшаться в количестве во время периода размножения клеток в культуре.
Этап культивирования может дополнительно включать этап мониторинга рецепторного профиля поверхности гамма-дельта Т-клеток с целью определения подходящей продолжительности этапа культивирования, необходимой для значительного уменьшения в количестве или удаления выбранных рецепторов на поверхности гамма-дельта Т-клеток (например, любого одного или любого
сочетания рецепторов, описанных выше (B7-H1/PD-L1, B7-DC/PD-L2, PD-1 и CTLA-4)). Мониторинг рецепторов гамма-дельта Т-клеток можно, например, выполнять с использованием методов проточной цитометрии, таких как те, которые описаны в статье Chan D. et. al., 2014. Вкратце, антитела, специфичные для рецепторов и/или лигандов ингибиторов иммунных контрольных точек, будут использованы для идентификации субпопуляций гамма-дельта Т-клеток (например, совместно окрашенных анти-Удатта9), экспрессирующих ингибиторы иммунных контрольных точек на своей клеточной поверхности.
Дополнительно, или необязательно, этап культивирования по
настоящему изобретению может включать этап(ы), индуцирующие
экспрессию в гамма-дельта Т-клетках таких типов поверхностных
рецепторов гамма-дельта Т-клеток, которые не присутствовали на
поверхности некультивированных гамма-дельта клеток, полученных
от первого субъекта, или этап(ы), индуцирующие увеличение
степени экспрессии такого типа(ов) рецепторов клеточной
поверхности, которые присутствовали на поверхности
некультивированных гамма-дельта клеток, полученных от первого
субъекта. Этого можно добиваться путем стимуляции гамма-дельта
Т-клеток антигеном, полученным из раковых клеток, бактерий,
грибков, простейших или вирусов. Этот антиген можно добавлять в
культуральную ростовую среду с целью повышения эффективности,
антигенпредставляющей способности и цитотоксичности
наращиваемых гамма-дельта Т-клеток. Соответственно, антигены могут быть предоставлены в различных форматах, включая, но без ограничения, иммобилизованные антигены или антитела, облученные клетки опухолевых линий, искусственные антигенпредставляющие клетки и синтетические растворимые антигены. Антиген можно добавлять в культуральную ростовую среду в первый день культивирования. В вариантах осуществления вирус можно выбирать из вируса гриппа, ВИЧ, вируса гепатита С, вируса гепатита В, вариантов вируса герпеса, цитомегаловируса (CMV), вируса Эпштейна-Барр, вируса ветряной оспы, папилломавируса, вируса Эбола, вируса ветряной оспы или вируса натуральной оспы. Альтернативно, антиген может представлять собой антиген,
характерный для клеточной инфекции, бактериальной инфекции, грибковой инфекции или протозойной инфекции. В частности, целевой антиген может быть из вируса гриппа, ВИЧ, вируса гепатита С, вируса гепатита В, вариантов вируса герпеса, цитомегаловируса (CMV), вируса Эбола, вируса Эпштейна-Барр, вируса ветряной оспы, папилломавируса, вируса Эбола, вируса ветряной оспы или вируса натуральной оспы.
Соответственно, антиген может включать активный или инактивированный вирусный фрагмент, пептид, белок, антигенный сегмент, или тому подобное, из такого вирусного организма.
Соответственно, антиген может включать опухоль-специфический антиген, который присутствует только на опухолевых клетках и ни на каких других клетках, и/или опухоль-ассоциированный антиген, который присутствует на некоторых опухолевых клетках, а также некоторых нормальных клетках. Такие опухоль-специфические антигены могут включать, но без ограничения, канцероэмбриональный антиген, СА-125, MUC-1, эпителиальный опухолевый антиген и антиген MAGE-типа, в том числе MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA12, MAGEC2, BAGE, GAGE, XAGE1B, CTAG2, CTAG1, SSX2 или LAGE1, или их сочетания.
Соответственно, для получения соответствующего антигена можно использовать лизат инфицированной клетки, некротическую клетку или раковую клетку. В вариантах осуществления антиген может представлять собой синтезированный антиген, например, синтетический пептид. Альтернативно, антиген можно получать от субъекта. Соответственно, антиген в концентрации примерно 0,022 микрограмм на мл можно добавлять к клеткам на этапе культивирования.
В вариантах осуществления на этапе культивирования мононуклеарных клеток крови можно добавлять факторы, способствующие пролиферации гамма-дельта Т-клеток и поддержанию клеточного фенотипа, такие как IL-2, IL-15 или IL-18 (Garcia V. et al. , 1998, Nussbaumer О. et al. , 2013) . Соответственно, в таких вариантах осуществления IL-2, IL-15 или IL-18, или их сочетания, можно добавлять в культуральную среду в диапазоне концентраций 50-2000 Ед/мл, более предпочтительно 400-1000
Ед/мл. Культивирование, как правило, проводят при температуре
34-38°С, более предпочтительно 37°С, в атмосфере 2-10%, более
предпочтительно 5% СОг. Культуральную среду можно добавлять в
зависимости от количества культивируемых клеток.
Соответственно, в культуральный раствор можно добавлять сыворотку в количестве 0,1-20%. В качестве сыворотки можно использовать, например, эмбриональную телячью сыворотку, АВ сыворотку или аутоплазму.
В вариантах осуществления в культуральную среду можно добавлять факторы, способствующие восстановлению истощенных или анергических гамма-дельта Т-клеток. Соответственно, эти факторы могут включать цитокины, такие как IL-15 или IL-18, или антитела, направленные на конкретные рецепторы или лиганды ингибитора иммунных контрольных точек, например, анти-PD-Ll антитело (Chang К. et al., 2014), однако также могут включать антитела, направленные на CTLA-4, PD-1, PD-2, LAG3, CD80, CD86, В7-НЗ, В7-Н4, HVEM, BTLA, KIR, TIM3 или A2aR.
В вариантах осуществления этап получения клеток может включать сбор крови или пуповинной крови от субъекта-донора. Объем собранной крови может составлять примерно 15-2 5 мл. В вариантах осуществления этап получения клеток может включать этап сбора, который представляет собой сбор по меньшей мере гамма-дельта Т-клеток от первого субъекта во время одной процедуры. В вариантах осуществления этап сбора может включать несколько сессий сбора.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ получения гамма-дельта Т-клеток может включать этап анализа для определения по меньшей мере одной характеристики клетки, собранной у первого субъекта. В вариантах осуществления по меньшей мере одной характеристикой клетки может быть последовательность ДНК или РНК, или аминокислотная последовательность клетки, протеом клетки или маркер клеточной поверхности клетки. В вариантах осуществления способ может включать этап тканевого типирования гамма-дельта Т-клеток. Характеристики поверхностного маркера гамма-дельта клеток могут
включать (но не ограничиваются ими) CD3, CD4, CD8, CD69, CD56, CD2 7, CD4 5RA, CD4 5, TCR-Vy9, TCR-V52, TCR-V81, TCR-V53, TCR-пан у/8, NKG2D, моноклональные антитела к рецепторам хемокинов CCR5, CCR7, CXCR3 или CXCR5, или их сочетания. Такое типирование может включать получение генотипической и фенотипической информации. Фенотипическая информация может включать наблюдаемые или поддающиеся измерению характеристики на микроскопическом, клеточном или молекулярном уровне. Генотипическая информация может относиться к конкретным генетическим вариациям или мутациям, например, человеческого лейкоцитарного антигена (тип HLA у донора). Соответственно, из гамма-дельта Т-клеток можно получать банки линий клеток клинической категории, которые можно наращивать и проводить их дифференцировку для использования у большого числа пациентов. В вариантах осуществления гамма-дельта Т-клетки можно наращивать ex vivo из исходного материала пуповинной крови и объединять клетки от нескольких доноров, чтобы получать достаточное количество гамма-дельта Т-клеток для создания клеточного банка. В вариантах осуществления такой банк будет образован гамма-дельта Т-клетками, полученными от здоровых доноров-добровольцев с группой крови О, которых отбирают, чтобы максимально увеличить возможность соответствия человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA) и, тем самым, свести к минимуму риск отторжения аллотрансплантата или необходимость использования в больших количествах иммуносупрессивных лекарственных средств. Например, такие банки для пациентов из Великобритании/ЕС могут иметь следующее содержание, что позволит предоставлять лечение значительному проценту населения Великобритании/ЕС с пониженным риском отторжения:
HLA-A HLA-B HLA-DR
Al В8 DR17(3)
А2 В44(12) DR4
A3 В7 DR15(2)
А2 В7 DR15(2)
А2 В44(12) DR7
B62
(15)
DR4
B57
(17)
DR7
B35
DR1
A2 9
(19)
B44
(12)
DR7
ВбО
(40)
DR4
DR17
B27
DR1
B44
(12)
DR13
DR4
DR4
B57
(17)
DR7
ВбО
(40)
DR13
All
B35
DR4
B44
(12)
DR11
A2 4
(9)
DR15
A3 0
(19)
B13
DR7
A31
(19)
ВбО
(40)
DR4
DR1
All
В35
DR1
В65
(14)
DR13
В вариантах осуществления собранные и обработанные гамма-дельта Т-клетки могут быть сгруппированы для будущего использования в клеточном банке или депозитарии. Соответственно, клетки можно хранить в криопротекторе, таком как ДМСО или CryoStor(tm), проводить их замораживание с контролируемой скоростью и хранить в жидком азоте. Гамма-дельта Т-клетки можно хранить в унифицированном хранилище в виде определенных единиц или доз, которые требуются для одного или нескольких этапов лечения.
В одном из вариантов осуществления способ может включать этап обработки популяции клеток, собранных от первого субъекта, средством, увеличивающим сохранность, жизнеспособность или терапевтическую активность гамма-дельта Т-клеток в собранном образце. В одном из вариантов осуществления способ может включать этап консервации, в котором средство для
криоконсервации добавляют к гамма-дельта Т-клеткам в образце гамма-дельта Т-клеток.
В вариантах осуществления гамма-дельта Т-клетка может представлять собой человеческую Vy9VS2 Т-клетку, размноженную в присутствии фосфоантигена изопентенил пирофосфата (IPP).
В вариантах осуществления гамма-дельта Т-клетка может представлять собой размноженную человеческую V81 Т-клетку или V83 Т-клетку.
Второй аспект изобретения относится к способу лечения инфекции или рака у индивидуума, включающему этап предоставления указанному индивидууму гамма-дельта Т-клеток, полученных от другого индивидуума. Таким образом, донорские гамма-дельта Т-клетки используют для лечения инфекции, например, вирусной, грибковой или протозойной инфекции, либо для лечения рака у субъекта-реципиента в случае, когда донор и реципиент являются разными индивидуумами.
Способ введения для предоставления гамма-дельта Т-клеток субъекту-реципиенту может включать внутривенную, внутрикожную, или подкожную инъекцию. Введение индивидууму можно осуществлять в пораженную область или системно.
В вариантах осуществления предложены гамма-дельта Т-клетки от первого субъекта для использования в лечении второго, отличающегося, субъекта, инфицированного вирусом, грибком или простейшими, при этом указанное лечение субъекта является аллогенным.
В вариантах осуществления предложены гамма-дельта Т-клетки от первого субъекта для использования в лечении второго, отличающегося, субъекта, инфицированного вирусом, при этом указанный вирус выбирают из ВИЧ, вируса гриппа или вируса гепатита, причем указанное лечение является аллогенным. В одном из вариантов осуществления вирус может представлять собой вирус гепатита В или гепатита С, вирус гриппа, варианты вируса герпеса, цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барр, вирус ветряной оспы, папилломавирус, вирус ветряной оспы или вирус натуральной оспы.
В вариантах осуществления вирус гриппа может представлять собой вирус гриппа A (Flu А) . В вариантах осуществления вирус гриппа может представлять собой пандемичный вирус птичьего гриппа или свиного гриппа, например, H5N1, H7N3, H7N7, H7N9 и H9N2 (подтипы птичьего гриппа) или H1N1, H1N2, H2N1, H3N1, H3N2 и H2N3 (подтипы свиного гриппа).
В вариантах осуществления предложены гамма-дельта Т-клетки для лечения субъекта, страдающего раком, при этом указанное лечение является аллогенным.
В вариантах осуществления предложены гамма-дельта Т-клетки от первого субъекта для использования в лечении второго субъекта, при этом второй субъект страдает от по меньшей мере одной из вирусной, грибковой или протозойной инфекции. В вариантах осуществления субъекту, получающему гамма-дельта Т-клетки, могут одновременно, последовательно или раздельно вводить иммуносупрессивные лекарственные средства. Введение иммуносупрессивных лекарственных средств может способствовать смягчению какой-либо причиняющей вред реакции иммунной системы на гамма-дельта Т-клетки.
В вариантах осуществления предложены гамма-дельта Т-клетки для лечения субъекта с лимфопролиферативным заболеванием, вызванным вирусом Эпштейна-Барр (EBV-LPD).
Вирус Эпштейна-Барр (EBV) является членом семейства гамма вирусов герпеса и распространен преимущественно в западных странах (> 90% взрослых людей являются сероположительными). EBV поддерживается в латентном состоянии за счет цитотоксических Т-клеток хозяина (CTL), которые предотвращают реактивацию вируса, тем самым позволяя EBV существовать без проявления симптомов в виде латентной инфекции в В-клетках хозяина.
EBV связан с целым рядом злокачественных В-клеточных заболеваний, таких как лимфома Беркитта (BL), болезнь Ходжкина (HD) и посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (PTLD), помимо форм рака эпителиального происхождения, таких как карцинома носоглотки (NPC) и рак желудка.
Риск развития PTLD часто связан с трансплантацией солидных органов и трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток.
В вариантах осуществления предложены гамма-дельта Т-клетки
от первого субъекта для использования в лечении второго
субъекта, страдающего злокачественным заболеванием,
ассоциированным с EBV.
В вариантах осуществления предложены гамма-дельта Т-клетки одного или более конкретных изотипов гамма-дельта TCR для лечения различных вирусных заболеваний. Например, подтипы v82pos могут быть наиболее эффективны в лечении инфекции ВИЧ и гриппа (Wallace М. et al., 1996, Tu W. et al. 2011), в то время как существуют свидетельства того, что по меньшей мере два подтипа гамма-дельта Т-клеток играют роль в контроле EBV-инфицированных клеток; v8lpos (Farnault L, et al. , 2013) и v82pos клетки (Xiang Z. et al., 2014) . Соответственно, можно выбирать сочетания подтипов гамма-дельта Т-клеток и вводить пациенту для повышения эффективности терапии гамма-дельта Т-клетками. Соответственно, они могут включать популяции гамма-дельта Т-клеток одного изотипа, полученные с использованием дискретных условий культивирования, или мультивалентную популяцию гамма-дельта Т-клеток, полученную одновременно с использованием определенного единого набора параметров культивирования клеток.
Гамма-дельта Т-клетки, используемые в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, могут быть любыми из тех, которые описаны в первом аспекте настоящего изобретения, то есть, после этапов получения и культивирования, описанных выше.
Третий аспект настоящего изобретения относится к способу аутологичного предоставления субъекту гамма-дельта Т-клеток, включающему этапы
- получения образца гамма-дельта Т-клеток от субъекта;
- культивирования гамма-дельта Т-клеток для последующего введения их обратно субъекту.
Любой из этапов получения и культивирования, описанных выше для первого аспекта настоящего изобретения, можно использовать в третьем аспекте настоящего изобретения. Например, этап культивирования гамма-дельта Т-клеток может
включать этапы изменения рецепторного профиля поверхности гамма-дельта Т-клеток, как описано выше.
Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу лечения инфекции или рака у индивидуума, включающему этап предоставления указанному индивидууму гамма-дельта Т-клеток, полученных от этого индивидуума, при этом гамма-дельта Т-клетки были получены способом, описанным в третьем аспекте настоящего изобретения.
В вариантах осуществления рак может представлять собой миелому или меланому. В вариантах осуществления формы рака могут включать, но не ограничиваются ими, рак желудка, почечно-клеточный рак, печеночно-клеточную карциному, рак поджелудочной железы, острый миелоидный лейкоз, множественную миелому, острый лимфобластный лейкоз, немелкоклеточный рак легкого, EBV-LPD, лимфому Беркитта и болезнь Ходжкина.
Следующий аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей гамма-дельта Т-клетку, полученную любым из способов по настоящему изобретению.
В вариантах осуществления композиция содержит унифицированную дозу гамма-дельта Т-клеток, которую можно вводить индивидууму для достижения терапевтического эффекта.
В вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать общую дозу более 25х109 гамма-дельта Т-клеток на человека.
В вариантах осуществления предложена фармацевтическая
композиция, содержащая гамма-дельта Т-клетки и
иммунотерапевтическое антитело, для использования в лечении рака.
В вариантах осуществления иммунотерапевтическое антитело может представлять собой блокирующее каскад иммунных реакций средство, такое как ингибитор PD-1, PDL-1 и/или CTLA-4, ингибиторы PD-1, PDL-1 и CTLA-4, например, разработанные компаниями Roche и Bristol Myers Squibb.
В вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать антитело, способное блокировать ингибирующие
сигналы CTLA-4. Блокирование сигналов CTLA-4 позволяет Т-лимфоцитам узнавать и уничтожать клетки. В вариантах осуществления такое антитело может представлять собой ипилимумаб (MDX-010, MDX-101).
В вариантах осуществления антитело может ингибировать лиганд-1 белка программируемой гибели клеток (PDL-1). В вариантах осуществления такое антитело можно выбирать из MPDL3280A (Roche) или MDX-1105.
В вариантах осуществления фармацевтическую композицию можно комбинировать с цитокином, например, IL-2 или IL-12. В вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать интерферон-гамма.
В вариантах осуществления предложена фармацевтическая
композиция, содержащая гамма-дельта Т-клетки и
химиотерапевтическое средство, для использования в лечении рака.
В вариантах осуществления предложена фармацевтическая композиция, содержащая гамма-дельта Т-клетки и терапевтическое средство, для использования в лечении вирусной инфекции.
В вариантах осуществления фармацевтическую композицию можно использовать в качестве терапевтического или профилактического средства при раке или инфекциях.
В вариантах осуществления изобретения гамма-дельта Т-клетка может представлять собой Vy9V82 Т-клетку.
Предпочтительные признаки и варианты осуществления каждого аспекта изобретения являются таковыми для каждого из других аспектов с соответствующими изменениями, если контекст не требует иного.
Каждый документ, литературный источник, патентная заявка или патент, цитированные в данном тексте, специально включены в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки, это означает, что читатель должен читать и рассматривать их как часть данного текста. То, что документ, литературный источник, патентная заявка или патент, цитированные в данном тексте, не воспроизведены в данном тексте, объясняется исключительно
соображениями лаконичности.
Ссылку на цитируемый материал или информацию, содержащуюся в тексте, не следует воспринимать как признание того, что материал или информация являлись частью общего знания или были известны в любой стране.
В тексте спецификации, если из контекста не следует иное, термины "содержать" или "включать", или их вариации, такие как "содержит" или "содержащий", "включает" или "включающий", следует понимать, как подразумевающие включение указанных целых чисел или групп целых чисел, но не исключение любого другого целого числа или группы целых чисел.
Варианты осуществления изобретения далее будут описаны исключительно в качестве примера, со ссылкой на сопроводительные фигуры, в которых
Фигура 1 иллюстрирует иммунофенотипирование РВМС в начале культивирования и через 14 дней наращивания в культуре с избирательной активацией и пролиферацией популяции уб Т-клеток (Угамма9 Удельта2), при этом иммунофенотипирование клеточных популяций методом проточной цитометрии проводили в начале процесса культивирования (день 0) с использованием РВМС, выделенных из человеческой крови в качестве исходного материала, и в конце процесса селективного наращивания (день 14) : - А - гистограмма выделенных РВМС в день 0, окрашенных
анти-Угамма9-ИТС антителом для определения процента уб Т-клеток в исходной популяции РВМС (1,3% РВМС составляют уб Т-клетки): В - Дот-блот анализ популяции клеток через 14 дней селективного культивирования, окрашенных анти-СБЗ (Т-клетки) и анти-Угамма9 (уб Т-клетки (77,5% Т-клеток составляют уб Т-клетки): C,D - Изображения в светлом поле выделенных РВМС (С) и популяции клеток через 14 дней наращивания в культуре (D): Е -Таблица с указанием процентов уб Т-клеток, присутствующих в каждой популяции культивируемых клеток;
Фигура 2 иллюстрирует экспоненциальный рост клеток, селективно наращиваемых в культуре для активации и пролиферации популяции уб Т-клеток (Угамма9 Удельта2), при этом значительное
количество высокочистых уб Т-клеток получены ко дню 12, которые, как показано с использованием панели EBV-положительных линий клеток лимфомы in vitro, являются мощными эффекторами цитолиза раковых клеток - Иммунофенотипирование клеточных популяций методом проточной цитометрии проводили в начале процесса культивирования (день 0) с использованием РВМС, выделенных из человеческой крови в качестве исходного материала, и позднее в процессе селективного наращивания (день 12) : - А - Диаграмма роста с указанием общего числа жизнеспособных клеток в культуре на протяжении первых 12 дней наращивания, с общим количеством 4x109 клеток, достигнутым ко дню 12: В,С - Анализ методом проточной цитометрии исходных РВМС
(В) и популяции клеток через 12 дней селективного наращивания в культуре (С), демонстрирующий наличие 3,1% (день 0) и 8 7,1%
(день 12) уб Т-клеток (анти-Угамма9), соответственно: D - уб Т-клетки инкубировали с пятью EBV-положительными линиями клеток-мишеней (BL2 В95-8, BL30 В95-8, BL74 В95-8, Raj i и IB4) при соотношении эффектор:мишень, составляющем 5:1, в течение 16 часов - вызываемый уб Т-клетками цитолиз измеряли с использованием нерадиоактивной системы анализа Cytotox96 и выражали в виде процента от максимального лизиса клеток-мишеней; и
Фигура 3 иллюстрирует способ очистки с помощью антител, используемый для выделения клеток дискретных фенотипов из гетерогенной клеточной популяции, при этом в данном примере клетки отбирали с помощью антитела против пан-уб Т-клеточных рецепторов, с получением уб Т-клеточной популяции исключительно высокой чистоты - Иммунофенотипирование методом проточной цитометрии клеточной популяции до очистки (А) и после очистки (В) с использованием конъюгированного с FITC антитела против уб Т-клеточных рецепторов показало, что уб Т-клетки получены с
чистотой 99,7% из исходного материала, содержащего 45% уб Т-клеток.
Гамма-дельта Т-клетки можно наращивать в культуре с
использованием методики, описанной в статье Nicol A.J. et. al., 2 011. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли центрифугированием в градиенте плотности с использованием Ficoll-Paque (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) , и Vy9V82 Т-клетки избирательно пролиферировали при культивировании РВМС в среде RPMI 1640 (Lonza, Walkersville, MD, USA) с добавлением 10% человеческой АВ плазмы (Lonza) , L-глутамина (2мМ; Lonza) и гентамицина (40 мкг; Pfizer, Bentley, WA, Australia). Рекомбинантный человеческий IL-2 (700 МЕ/мл; Novartis, Basel, Switzerland) и золедронат (1 мкМ; Novartis) добавляли в день 0 и дополнительно добавляли IL-2 (350 МЕ/мл) каждые 2-3 дня на протяжении периода культивирования. Через 714 дней культивирования очищенные популяции эффекторных клеток, содержащие 7 0-95% Vy9V82 Т-клеток, были получены для in vitro функциональной оценки путем истощения пулов CD4+, CD8+ и CD5 6+ клеток с использованием miniMACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany).
Аутологичное лечение пациентов с солидными опухолями Vy9V82 Т-клетками, размноженными ex vivo, как показано, давало клинический результат (Noguchi et al., 2011) . Кроме того, доказано, что аллогенное лечение совпадающими по HLA антигенам, размноженными ex vivo оф TCR-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) является эффективным способом лечения EBV-PTLD (Haque Т et al., 2007) . Вследствие этого, авторы настоящего изобретения считают, что лечение рака и вирусных инфекций аллогенными гамма-дельта Т-клетками является возможным и, вероятно, обеспечит наглядный терапевтический эффект для пациентов.
Хотя изобретение было, в частности, продемонстрировано и описано со ссылкой на конкретные примеры, специалистам в данной области будет понятно, что могут быть внесены различные изменения, относящиеся к форме и деталям, без отклонения от объема настоящего изобретения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Chan D. , Gibson Н.М., Aufiero В.М., Wilson A.J., Hafner
M.S., Mi Q.S. and Wong H.K. Differential CTLA-4 expression in human CD4+ versus CD8+ T cells is associated with increased NFAT1 and inhibition of CD4+ proliferation. Genes Immun., 2014, 15(1): 25-32.
Chang K., Svabek C, Vazquez-Guillamet C, Sato В., Rasche D., Wilson S., Robbins P., Ulbrandt N.., Suzich J, Green J., Patera A.C., Blair W., Krishnan S., Hotchkiss R. Targeting the programmed cell death 1: programmed cell death ligand 1 pathway reverses T cell exhaustion in patients with sepsis. Crit Care., 2014, 8:R3
Farnault L., Gertner-Dardenne J., Gondois-Rey F., Michel G., Chambost H., Hirsch I. and Olive D. Clinical evidence implicating gamma-delta T cells in EBV control following cord blood transplantation. Bone Marrow Transplant., 2013, 11: 14789.
Garcia V.E., Jullien D., Song M., Uyemura K., Shuai K., Morita C.T. and Modlin R.L. IL-15 Enhances the Response of Human уб T Cells to Nonpetide Microbial Antigens J. Immunol., 1998, 160: 4322-4329.
Haque Т., Wilkie G.M., Jones M.M., Higgins CD., Urquhart G., Wingate P., Burns D., McAulay K., Turner M., Bellamy C, Amlot P.L., Kelly D., MacGilchrist A., Gandhi M.K., Swerdlow A.J. and Crawford D.H. Allogeneic cytotoxic T-cell therapy for EBV-positive posttransplantation lymphoproliferative disease: results of a phase 2 multicenter clinical trial. Blood. 2007 Aug 15; 110 (4) : 1123-31.
Iwasaki M., Tanaka Y., Kobayashi H., Murata-Hirai K., Miyabe H., Sugie Т., Toi M. and Minato N. Expression and function of PD-1 in human cd T cells that recognize phosphoantigens. Eur. J. Immunol., 2011, 41: 345-355.
Meraviglia S., Eberl M., Vermijlen D., Todaro M., Buccheri S., Cicero G., La Mendola C, Guggino G., D'Asaro M., Orlando V., Scarpa F., Roberts A., Caccamo N., Stassi G., Dieli F., Hayday A.C. In vivo manipulation of Vgamma9Vdelta2 T cells with zoledronate and low-dose interleukin-2 for immunotherapy of
advanced breast cancer patients. Clin Exp Immunol., 2010, 161(2) : 290-7 .
Nicol A.J., Tokuyama H., Mattarollo S.R., Hagi Т., Suzuki K., Yokokawa K. and Nieda M. Clinical evaluation of autologous gamma delta T cell-based immunotherapy for metastatic solid tumours. Br J Cancer, 2011, 105(6): 778-86.
Noguchi A., Kaneko Т., Kamigaki Т., Fujimoto K., Ozawa M., Saito M., Ariyoshi N. and Goto S. Zoledronate-activated Vy9y8 T cell-based immunotherapy is feasible and restores the impairment of уб T cells in patients with solid tumors. Cytotherapy. 2011 Jan; 13(1): 92-7.
Nussbaumer 0., Gruenbacher G., Gander H., Komuczki J., Rahm A. and Thurnher M. Essential requirements of zoledronate-induced cytokine and уб T cell proliferative responses. J. Immunol., 2013, 191(3): 1346-55.
Tanaka Y., Morita C.T., Tanaka Y., Nieves E., Brenner M.B., Bloom B.R. Natural and synthetic non-peptide antigens recognized by human gamma delta T cells. Nature. 1995, 375 (6527) : 155-8 .
Thompson K., Roelofs A.J., Jauhiainen M., Monkkonen H., Monkkonen J. and Rogers M.J. Activation of уб T Cells by Bisphosphonates (Chapter from Osteoimmunoligy, Advances in Experimental Medicine and Biology 658, DOI 10.1007/978-1-4419-1050-9_2).
Tu W., Zheng J., Liu Y., Sia S.F., Liu M., Qin G., Ng I.H., Xiang Z., Lam K.T., Peiris J.S. and Lau Y.L. The
aminobisphosphonate pamidronate controls influenza pathogenesis by expanding a gammadelta T cell population in humanized mice. J Exp Med., 2011, 208(7): 1511-22.
Wallace M., Bartz S.R., Chang W.L., Mackenzie D.A., Pauza CD. and Malkovsky M. Gamma delta T lymphocyte responses to HIV. Clin Exp Immunol., 1996, 103(2): 177-84.
Wang H., Sarikonda G., Puan K., Tanaka Y., Feng J., Giner J., Cao R., Monkkonen J., Oldfield E. and Morita C.T. Indirect Stimulation of Human Vg2Vd2 T Cells through Alterations in
Isoprenoid Metabolism. J. Immunol., 2011, 187: 5099-113.
Xiang Z., Liu Y., Zheng J., Liu M., Lv A., Gao Y., Ни H., Lam K.T., Chan G.C., Yang Y., Chen H., Tsao G.S., Bonneville M., Lau Y.L. and Tu W. Targeted activation of human Vy9V52-T cells controls epstein-barr virus-induced В cell lymphoproliferative disease. Cancer Cell, 2014, 26(4): 565-76.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ предоставления гамма-дельта Т-клеток от первого
субъекта второму аллогенному субъекту, включающий:
- получение образца, содержащего гамма-дельта Т-клетки, от первого субъекта; и
- культивирование гамма-дельта Т-клеток, присутствующих в образце, с целью введения гамма-дельта Т-клеток второму субъекту.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап
культивирования гамма-дельта Т-клеток приводит к увеличению
количества гамма-дельта Т-клеток в образце относительно клеток
других типов в образце.
3. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что этап культивирования включает этап очистки гамма-дельта Т-клеток в образце от клеток других типов в образце.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что на этапе очистки используют антитело против гамма-дельта Т-клеток для очистки и выделения гамма-дельта Т-клеток из клеток других типов в образце.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что гамма-дельта Т-клетки культивируют или очищают для того, чтобы они составляли более 10% от общего числа клеток, присутствующих в образце.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что этап культивирования включает один или более подэтапов для уменьшения количества, либо удаления одного или более типов поверхностных рецепторов гамма-дельта Т-клеток, присутствующих на гамма-дельта Т-клетках в образце от первого субъекта.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что этап культивирования включает этап, который приводит к экспрессии в гамма-дельта Т-клетках поверхностных рецепторов такого типа(ов), которые не присутствовали на поверхности некультивированных гамма-дельта Т-клеток от первого субъекта, или который приводит к увеличению степени экспрессии поверхностных рецепторов такого типа(ов),
5.
которые присутствовали на поверхности гамма-дельта Т-клеток от первого субъекта.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий этап мониторинга рецепторного профиля клеточной поверхности гамма-дельта Т-клеток в образце.
9. Способ лечения инфекции или рака у индивидуума, включающий этап предоставления указанному индивидууму гамма-дельта Т-клеток, полученных от другого аллогенного индивидуума.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что гамма-дельта Т-клетки получают способом по любому из пунктов 1-8.
11. Гамма-дельта Т-клетки от первого субъекта, предназначенные для лечения второго аллогенного субъекта, страдающего от рака или инфекции.
12. Гамма-дельта Т-клетки от первого субъекта, предназначенные для лечения второго аллогенного субъекта, которые вводят одновременно, раздельно или последовательно с иммуносупрессивным лекарственным средством.
13. Способ лечения по п. 9 или гамма-дельта Т-клетки, предназначенные для лечения второго аллогенного субъекта, по п. 11 или 12, в случае, когда инфекция представляет собой по меньшей мере одну из вирусной, грибковой или протозойной инфекции.
14. Фармацевтическая композиция, содержащая гамма-дельта Т-клетки, предназначенная для использования в лечении рака или инфекции.
15. Фармацевтическая композиция, содержащая гамма-дельта Т-клетки и иммунотерапевтическое антитело, для одновременного, раздельного или последовательного применения в лечении рака, либо вирусной, грибковой или протозойной инфекции.
По доверенности
ФИГ. 1А ДеньО-PBMCs
А01 РВМС
Гейт: Клетки Р1
VraMMa9-FITC-A
540011
День 14-уб Т-клетки
А01 Размноженные Т-клетки Гейт: Клетки
101 102
103
104 105 106
VraMMa9-FITC-A
7.2
ФИГ. 1С ФИГ. 1D
День 0 - PBMCs День 14 - уб Т-клетки
Культура
Окрашивание антителом
уб Т-клетки
День О
\/гамма9+
13%
День 14
CD3+/VraMMa9+
77.5%
ФИГ. 2А
Рост клеток
?400
? зоо
о 200 ш
g 100
87.1% v6 Т-клетки /
3.1% v5 Т-клетки
9 I
1 0 <
4 6 8 10
Дни в культуре
ФИГ. 2В
День О
А04 Vg9-FITC CD3 -АРС CD45-PE
Гейт: (CD45+ в живых клетках)
о о. <
со О О
101
10'
10J
104
105
10е
7.2
\/гамма9-ПТС-А
ФИГ. 2С
День 12
А04 Vg9-FITC CD3 -АРС CD45-PE
Гейт: (CD45+ в живых клетках)
101 102 103 104 105
VraMMa9-FITC-A
10е
7.2
ФИГ. 2D
Цитотоксичность уб Т-клеток в отношении EBV-положительных линий клеток
О О
о н о 40
Линия EBV-положительных клеток-мишеней
ФИГ. ЗА
Смешанная Т-клеточная популяция
Образец_001-Оп 1
FITC-A
анти- уб TCR
ФИГ. ЗВ
очищенные антителом против уб TCR
Образец_001-Ро$1
о .1
со ~
о Е
3 см -3
СМ -
> ^ :
1= ю -
о -.
о ю
I I 111111 ' 1
I I 1 "111|" 1'"1-I I I 11 111 1-I I I П1Ц Г
103 104 ю5
FITC-A
анти- уб TCR-FITC
1/8
2/8
2/8
3/8
4/8
4/8
4/8
5/8
5/8
5/8
5/8
6/8
6/8
7/8
7/8
7/8
8/8
8/8
8/8
8/8