EA201790005A1 20170630 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/201790005 Полный текст описания [**] EA201790005 20150609 Регистрационный номер и дата заявки ITMI2014A001053 20140610 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок IB2015/054346 Номер международной заявки (PCT) WO2015/189766 20151217 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21706 Номер бюллетеня [**] ПРОЦЕСС ОЧИЩЕНИЯ L-АЛЬФА-ГЛИЦЕРОФОСФОРИЛХОЛИНА Название документа [8] C07F 9/10 Индексы МПК [IT] Де Ферра Лоренцо, [IT] Анибалди Мауро, [IT] Зенони Маурицио Сведения об авторах [IT] КЕМИ СПА Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201790005a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Описан процесс очищения L-альфа-глицерофосфорилхолина, в котором L-альфа-глицерофосфорилхолин (ГФХ) кристаллизуют из диметилсульфоксида (ДМСО) или из смеси ДМСО с как минимум одним другим растворителем, предпочтительно выбранным из воды, спирта, галогенированных растворителей, простых и сложных эфиров и/или амидов. Такой процесс позволяет получить L-альфа-глицерофосфорилхолин с чистотой выше 99,5%, предпочтительно выше 99,7%, более предпочтительно даже выше или равной 99,9%. Также описан способ определения чистоты L-альфа-глицерофосфорилхолина, который включает элюирование L-альфа-глицерофосфорилхолина через ВЭЖХ колонку с неподвижной амино-фазой, и последующее детектирование самого L-альфа-глицерофосфорилхолина, и всех его примесей, при помощи испарительного нефелометрического детектора.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Описан процесс очищения L-альфа-глицерофосфорилхолина, в котором L-альфа-глицерофосфорилхолин (ГФХ) кристаллизуют из диметилсульфоксида (ДМСО) или из смеси ДМСО с как минимум одним другим растворителем, предпочтительно выбранным из воды, спирта, галогенированных растворителей, простых и сложных эфиров и/или амидов. Такой процесс позволяет получить L-альфа-глицерофосфорилхолин с чистотой выше 99,5%, предпочтительно выше 99,7%, более предпочтительно даже выше или равной 99,9%. Также описан способ определения чистоты L-альфа-глицерофосфорилхолина, который включает элюирование L-альфа-глицерофосфорилхолина через ВЭЖХ колонку с неподвижной амино-фазой, и последующее детектирование самого L-альфа-глицерофосфорилхолина, и всех его примесей, при помощи испарительного нефелометрического детектора.


Евразийское (21) 201790005 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07F 9/10 (2006.01)
2017.06.30
(22) Дата подачи заявки 2015.06.09
(54) ПРОЦЕСС ОЧИЩЕНИЯ L-АЛЬФА-ГЛИЦЕРОФОСФОРИЛХОЛИНА
(31) MI2014A001053
(32) 2014.06.10
(33) IT
(86) PCT/IB2015/054346
(87) WO 2015/189766 2015.12.17
(71) Заявитель: КЕМИ СПА (IT)
(72) Изобретатель:
Де Ферра Лоренцо, Анибалди Мауро, Зенони Маурицио (IT)
(74) Представитель:
Гончаров В.В. (BY) (57) Описан процесс очищения L-альфа-глицеро-фосфорилхолина, в котором L-альфа-глицерофос-форилхолин (ГФХ) кристаллизуют из диметил-сульфоксида (ДМСО) или из смеси ДМСО с как минимум одним другим растворителем, предпочтительно выбранным из воды, спирта, галогени-рованных растворителей, простых и сложных эфи-ров и/или амидов. Такой процесс позволяет получить L-альфа-глицерофосфорилхолин с чистотой выше 99,5%, предпочтительно выше 99,7%, более предпочтительно даже выше или равной 99,9%. Также описан способ определения чистоты L-альфа-глицерофосфорилхолина, который включает элюирование L-альфа-глицерофосфорилхолина через ВЭЖХ колонку с неподвижной амино-фа-зой, и последующее детектирование самого L-аль-фа-глицерофосфорилхолина, и всех его примесей, при помощи испарительного нефелометрического детектора.
WO 2015/189766 А1 Процесс очищения L-альфа-глицерофосфорилхолина
Целью заявленного изобретения является процесс очищения L-альфа-глицерофосфорилхолина, в котором L-альфа-глицерофосфорилхолин (ГФХ) кристаллизуют из диметилсульфоксида (ДМСО) или из смеси ДМСО с как минимум одним другим растворителем, предпочтительно выбранным из воды, спирта, галогенированных растворителей, простых и сложных эфиров и/или амидов. Такой процесс позволяет получить L-альфа-глицерофосфорилхолин, который также составляет цель заявленного изобретения, с чистотой выше 99,5%, предпочтительно выше 99,7%, более предпочтительно даже выше или равной 99,9%; в частности, позволяет получить ГФХ, содержащий менее 0,1% (3-ГФХ изомера и/или менее 0,1% циклических молекул ГФХ.
Еще одной целью заявленного изобретения является способ определения чистоты L-альфа-глицерофосфорилхолина, который включает элюирование L-альфа-глицерофосфорилхолина через ВЭЖХ колонку с неподвижной амино-фазой, и последующее детектирование самого L-альфа-глицерофосфорилхолина, и всех его примесей, при помощи испарительного нефелометрического детектора. Текущие экономические и демографические тенденции привели к общему старению населения, и этот феномен особенно ярко проявляется в самых богатых районах мира.
Снижение потенциала человеческого организма в процессе старения, поэтому, стало очень важной проблемой, и, в связи с этим, присутствует насущная потребность определения способов, которые помогают замедлить эту тенденцию. В частности, ослабление умственных способностей - одно из наиболее негативных последствий старения, и множество научно-исследовательских работ посвящены поиску эффективных методов лечения для борьбы с этим недугом. В данной области, одним из самых востребованных препаратов является L-альфа-глицерофосфорилхолин (ГФХ), строение которого представлено далее.
ГФХ общепризнанно используется в качестве терапевтического агента в лечении когнитивных расстройств, и его международное потребление, на основе широкого подтверждения эффективности в медицинской практике и в многочисленных клинических испытаниях, находится на устойчивом уровне.
Способы получения ГФХ могут быть разделены на два главных типа: на основе реакции деацетилирования фосфатидилхолина естественного происхождения и тех, при которых ГФХ синтезируется из сырья, коммерчески доступного на рынке химических промежуточных продуктов.
Способы первого типа имеют преимущество использования в качестве сырья таких продуктов, как лецитин сои, уже широко используемый в пищевой промышленности и отличающихся тем, что их обработка не представляет никакого конкретного риска для безопасности дальнейшего применения. Способы на основе использования синтетического ГФХ могут, наоборот, привести к проблемам в контроле характеристик используемых веществ и, в частности, хиральных синтетических предшественников. Это, главным образом, R-глицидол и R-хлорпропандиол (структуры I и II, обрисованные в общих чертах ниже, соответственно) и, в обоих случаях, они алкилируют молекулы, имеющие высокие характеристики токсичности. Поэтому, предельно ясно, как их использование может вызвать риск во время использования и обработки, и даже опасность в употреблении ГФХ, полученного из них, в случае присутствия остаточных примесей или других соединений (например, промежуточные продукты или побочные продукты), сохраняющие токсичность.
Вне зависимости от способа получения ГФХ, этап, относящийся к очищению и изолированию, имеет огромное влияние на качество продукта, в особенности, его химическая чистота может влиять на его токсичность и терапевтический профиль. Такую чистоту традиционно проверяют при помощи "Тонкослойной Хроматографии" (ТСХ). Этот тип анализа имеет высокие характеристики многосторонности и позволяет оценивать образцы в целом, так как все компоненты, от самого полярного до наименее полярного, являются видимыми в одно и то же время. Этот аналитический метод не является, однако, полностью удовлетворительным в отношении количественного определения всех примесей и разделения соединений с одинаковыми структурными особенностями, что касается, например, изомеров с сопоставимой полярностью.
ВЭЖХ является аналитическим методом, наиболее часто используемым для того, чтобы преодолеть эти недостатки ТСХ; в случае ГФХ, использование ВЭЖХ, однако, менее удачно, чем обычно, из-за характеристик высокополярности аналита, которые ограничивают взаимодействие с неподвижными фазами и отсутствия хромофоров, которые делают возможными использование ультрафиолетового датчика, т.е. более распространенного датчика в лабораториях контроля качества. Опубликованные методы являются неудовлетворительными для чувствительности, и для формы хроматографических сигналов с увеличивающимися или асимметричными пиками; в этих условиях наблюдают снижение разделительной способности, и есть риск наличия сигналов, соответствующих определенным соединениям, которые скрыты под другими хроматографическими сигналами, приводящими к потере способности выделять любые существующие примеси. См., например: J.Am.Oil Chem.Soc (2012) 89:1155-1163; Talanta (2012) 94:22-29; Journal
of Chromatography A (2012)1220:108-114, указанные в данном описании в ссылочном порядке.
Эта ситуация несопоставима с действующими рекомендациями в фармацевтической индустрии, которые предоставляют подробное описание профиля примесей в производстве активных ингредиентов, предназначенных для использования людьми.
Разработка новых аналитических методов для определения качества различных способов получения ГФХ имеет, в связи с этим, первостепенное значение и, если присутствие примесей в полученном ГФХ было определено такими аналитическими методами, введением новых стандартов чистоты для ГФХ и новых методик очищения, например, производство ГФХ в соответствии с действующими стандартами качества. ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ:
Фиг. 1 HPLC-ELSD (ВЭЖХ-детекция по светорассеянию испаренного образца) хроматограмма ГФХ, полученного по методике 1
Фиг. 2 HPLC-ELSD (ВЭЖХ-детекция по светорассеянию испаренного
образца) хроматограмма ГФХ, полученная из образца 2
Фиг. 3 HPLC-ELSD (ВЭЖХ-детекция по светорассеянию испаренного образца) хроматограмма ГФХ, полученная из образца 1 (Сравнительный)
3 1
Фиг. 4 Р (Кв)-ЯМР спектр ГФХ, полученного по методике 2
3 1
Фиг. 5 Р (Кв)-ЯМР спектр ГФХ, полученная из образца 3
Фиг. 6 HPLC-ELSD (ВЭЖХ-детекция по светорассеянию испаренного
образца) хроматограмма ГФХ, полученного по методике 1
Фиг. 7 HPLC-ELSD (ВЭЖХ-детекция по светорассеянию испаренного
образца) хроматограмма ГФХ, полученная из образца 3
Фиг. 8 HPLC-ELSD хроматограмма ГФХ, полученного по методике 3
Фиг. 9 HPLC-ELSD (ВЭЖХ-детекция по светорассеянию испаренного
образца) хроматограмма хроматограмма ГФХ, полученная из образца 4
Фиг. 10 HPLC-ELSD (ВЭЖХ-детекция по светорассеянию испаренного
образца) хроматограмма ГФХ, полученная из образца 5 (Сравнительный)
Фиг. 11 HPLC-ELSD (ВЭЖХ-детекция по светорассеянию испаренного образца) хроматограмма ГФХ, полученного по методике 4
Фиг. 12 HPLC-ELSD (ВЭЖХ-детекция по светорассеянию испаренного образца) хроматограмма ГФХ, полученная из образца 6
Фиг. 13 HPLC-ELSD (ВЭЖХ-детекция по светорассеянию испаренного образца) хроматограмма ГФХ, полученная из образца 7 (Сравнительный)
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретателями неожиданно было установлено, что при проведении ВЭЖХ исследования ГФХ возможно устранить проблемы, описанные выше, используя ВЭЖХ колонку с амино-фазой, т.е., те проблемы, при которых амино-функциональность связана с поверхностью неподвижной фазы. Некоторые колонки такого типа доступны на рынке: например, Supelcosil(tm) LC-NH2, Hypersil Gold(tm) амино, Zorbax(r) NH2, YMC(tm) Polyamine II, Nucleosil(r) NH2, Luna(r) NH2. Упомянутая неподвижная фаза может состоять из частиц материала-основы, например, диоксида кремния, с покрытием, включающим полимерное покрытие, содержащим аминогруппы, предпочтительно вторичные и третичные аминогруппы. Описание неподвижной фазы данного типа можно найти на стр.22, 23 публикации "HPLC Columns YMC Classics)), изданной YMC Europe GmbH, указанной в данном описании в ссылочном порядке.
Одновременно, использован испарительный нефелометрический детектор (ELSD).
Такие детекторы описаны, к примеру, в публикациях Anal.Chem (1997) 69:561А-
563А и US6229605, указанных в данном описании в ссылочном порядке.
Они представляют собой инструменты, в которых элюат перемещают в камеру
испарения, где растворитель испаряется, образуя туман из крошечных типовых
частиц, которые рассеивают луч света. Ответ датчика пропорционален
распространению, которое зависит от объёма присутствующего образца; эта
система делает возможным обнаружение примесей, лишенных хромофоров, таких
как ГФХ, также используя неизократические методы элюирования.
При такой комбинации неподвижной фазы и датчика, различные элюенты могут
использоваться и, в частности системы, соответственно состоящие из водных буферных систем, такой как, например, буфер уксуснокислого аммония, возможно в сочетании с органическими растворителями, например, метанолом и/или ацетонитрилом. Такие элюирующие системы могут использоваться в изократическом режиме, т.е. поддерживающем тот же самый элюент во время хроматографического анализа, или в градиентном режиме, при котором состав элюента варьируется во время хроматографии согласно предопределенной программе. Оптимизацию аналитического метода выполняют с использованием информации из источников, описывающих предшествующее и текущее состояния техники.
Целью заявленного изобретения, таким образом, является способ определения чистоты L-альфа-глицерофосфорилхолина, который включает элюирование L-альфа-глицерофосфорилхолина через ВЭЖХ колонку с неподвижной амино-фазой, и последующее детектирование самого L-альфа-глицерофосфорилхолина, и всех его примесей, при помощи испарительного нефелометрического детектора. Подвижная фаза или фазы могут состоять из водного раствора, дипольного органического растворителя или их смеси; упомянутый водный раствор предпочтительно имеет рН от 3 до 6, более предпочтительно от 4 до 5. Упомянутый дипольный органический растворитель может быть Ci-C4 спиртом, ацетонитрилом или их смесью; упомянутый Ci-C4 спирт предпочтительно является метанолом.
Эта комбинация позволяет преодолевать дефект расширения хроматографического пика, соответствующего ГФХ, и в то же время позволяет выполнять определение концентрации ГФХ с высокой чувствительностью.
В то же время было установлено, что возможно обнаружить присутствие в полученном ГФХ других соединений, образующихся во время процесса производства ГФХ, начиная с соевого лецитина.
Среди этих соединений есть L-альфа-глицерофосфоэтаноламин (ГФЭ), сахароза и их аналоги, вырабатываемые в их присутствии или присутствии одного из их предшественников в соевом лецитине, используемом в качестве сырья в
производственном процессе ГФХ.
На фоне этого важного результата, представляла непосредственный интерес проверка более чувствительным и селективным способом, чем в предыдущих случаях, профиля примесей, если таковые имелись, в образцах ГФХ, полученного производственными методами, наиболее подходящими для получения продукта, предназначенного для человеческого использования.
С этой целью, были признаны приемлемыми полусинтетические процессы на основе деацетилирования лецитина, т.е. способа, который, главным образом, будучи полностью синтетической методикой, был признан неприемлемым для производства ГФХ для человеческого использования, ввиду потенциального загрязнения очень токсичным используемым сырьем, таким, как глицидол или хлорпропандиол. Принимая во внимание противопоказания, связанные с производством ГФХ полностью синтетическим способом, образец ГФХ китайского происхождения, произведенный вышеупомянутым способом, был представлен по новой аналитической методике для полномасштабного анализа. Образцы, полученные по полусинтетическим методикам, описаны в WO9013552 (а именно, Пример 2) и ЕР575717 (а именно, Пример 1).
В этих документах описаны методики на основе очистки ГФХ с ионообменными смолами, которые не включают осаждение ГФХ как аддукта с хлоридом кадмия (GPOCdCl2) и хроматографию кварца; поэтому, эти методы, если пренебречь использованием токсичных солей кадмия и низкой производительностью, действительно применимы к крупномасштабному производству ГФХ. Аналитические результаты подтвердили, во всех образцах, присутствие пика, элюирующего раньше и со временем удерживания очень близким к аналогичным показателям ГФХ, с ОВУ (Относительное Время Удерживания) приблизительно 0,94. Этот сигнал значительной интенсивности не соответствует соединениям, наличия которых было бы логично ожидать ввиду особенностей процесса получения, таких, как глицерин, ГФЭ, глицерофосфорная кислота или сахароза. Учитывая, что хроматографические характеристики вновь обнаруженных примесей были настолько схожи с ГФХ, чтобы не акцентировать на них внимание до данного
момента, так, что даже с новым объектом согласно заявленному изобретению, данные ВЭЖХ отличались очень незначительно от ГФХ, авторы выдвигали гипотезу, что данные исследований соответствовали его позиционному изомеру. Химическое строение бета изомера ГФХ ((3-ГФХ) приведено ниже.
ОН О
.О-Р-О' I
'ОН
(3-ГФХ
(3-ГФХ недоступен в коммерческих объёмах и, чтобы проверить, мог ли (3-ГФХ быть примесью, обнаруженной новым методом, его синтез был выполнен согласно схеме, иллюстрированной ниже.
Г2Ф
О II
о-Р-О
СН3(СН2)14СОС1 DMAP
CH2CI2
)^(СН2)14СНз О О
,о-Р-О
чОСО(СН2)14СН3 1,3-ДФФА
HOCH2CH2N(CH3)3+ TsO-
C5H5N TsCI
MeO-Na+
МеОН
JNCH2)14CH3
(3-ГФХ
(3-ГФХ, полученный таким способом, подвергли анализу при помощи ЯМР, для подтверждения структуры, и ВЭЖХ, показывающим не только его высокую чистоту, но также и то, что его время удерживания совместимо с неизвестными примесями, обнаруженными в различных образцах ГФХ. В связи с этим, возможно приписать неизвестному сигналу соответствие структуре (3-ГФХ, и эта атрибуция была подтверждена экспериментами ВЭЖХ методом добавок, при этом, к образцу ГФХ, показавшему присутствие примесей с ОВУ приблизительно 0,94 в ВЭЖХ, добавили калиброванные количества (3-ГФХ, наблюдая соответствующее увеличение сигнала с ОВУ приблизительно 0,94 без расщепления оного.
3 1
Как дальнейшее подтверждение соответствия структуры, были выполнены Р(Кв)-ЯМР эксперименты, которые позволили осуществить идентификацию сигнала на уровне приблизительно -0.6 ч./млн. в образцах, в которых присутствие примесей с ОВУ приблизительно 0,94 было выше. Сигнал (3-ГФХ, синтезируемого по вышеупомянутой схеме, был показан в том же самом значении поля.
3 1
Метод "Р(Кв)-ЯМР является, таким образом, возможной альтернативой ВЭЖХ, однако, из-за его более низкой чувствительности и более широкого оснащения ВЭЖХ в лабораториях контроля качества, объект ВЭЖХ данного изобретения остается предпочтительным для определения соединений, имеющих ОВУ приблизительно 0,94 ((3-ГФХ).
3 1
Посредством ^Р(Кв)-ЯМР анализа было также возможно определить в спектре продукта, полученного согласно ЕР575717, дополнительного сигнала на уровне приблизительно 18,4 ч./млн. Эти значения совместимы со значениями циклического фосфата цГФ, иллюстрированного ниже в форме натриевой соли.
О Na+
цГФ(натриевая соль)
Формирование этого циклического фосфата является осуществимым в условиях изоляции ГФХ согласно методике по ЕР575717. Чтобы поддержать эту гипотезу, подлинный образец цГФ был подготовлен согласно схеме, иллюстрированной ниже.
ГФХ цГФ
Р(Кв)-ЯМР анализ этого продукта подтвердил назначение, показав тот же самый сигнал на уровне приблизительно 18,4 ч./млн. и отсутствие разделения сигнала в соответствующих с использованием добавок.
В свете данных, обнаруженных при помощи инновационных аналитических методов, которые представляют практическое воплощение заявленного изобретения, авторы экспериментально проверили, могли бы известные методы очистки ГФХ соответственно удалить помеченные примеси.
Исключая, по уже упомянутым причинам, очищение комплексообразованием с хлоридом кадмия и хроматографию на диоксиде кремния, авторы определили кристаллизацию из этанола как наилучший метод, с точки зрения промышленной применимости, из тех, о которых сообщают публикации по предшествующему уровню техники (см., например, WO9013552).
Образец, полученный согласно методу по WO9013552, был кристаллизован на этаноле, но анализ ВЭЖХ показал, что очистка была только частичной, с существенным количеством бета изомера (0,48%), все-таки присутствующего в продукте.
Следующая таблица 1 суммирует аналитические результаты изучения образцов ГФХ, полученных при помощи различных методик приготовления.
Новая система для очищения ГФХ была определена, и это открытие также представляет воплощение изобретения.
Новая очистка основана на использовании сульфоксида этана (диметилсульфоксид, ДМСО). Для реализации изобретения этот растворитель может использоваться в различных условиях и в различных количественных отношениях относительно объёма ГФХ, который необходимо очистить.
В воплощении изобретения, в дополнение к диметилсульфоксиду, могут присутствовать другие растворители, такие, как полярные, средней полярности или неполярные растворители. Эти дополнительные растворители могут принадлежать различным классам растворителей, таких, как, но не ограничиваясь, галогенированные растворители, спирты, простые эфиры, сложные эфиры и амиды. Примеры растворителей, которые могут использоваться для реализации изобретения, но не ограничены ими: вода, метанол, этанол, изопропиловый спирт, n-бутанол, хлористый метилен, тетрагидрофуран, этилацетат и ДМФ. Согласно аспекту изобретения, диметилсульфоксид используется в количестве от 2 до 100 объемных частей на одну весовую часть L-альфа-глицерофосфорилхолина, предпочтительно, от 3 до 70, более предпочтительно, в пределах от 4 до 30, более
предпочтительно, в пределах от 5 до 15 объемных частей.
Согласно дальнейшему аспекту изобретения, любой растворитель или любые дополнительные растворители используются в количестве от 0,01 до 10 объемов на объем диметилсульфоксида ДМСО, предпочтительно, от 0,05 до 5, более предпочтительно, в пределах от 0,1 до 1.
В зависимости от параметров процесса, может быть получена надлежащая кристаллизация ГФХ, или может также быть выполнена очистка кристаллов ГФХ, содержащих примеси, путём их суспендирования в диметилсульфоксиде, используя подходящие сочетания времени и температуры, и затем отделение кристаллов от жидкой фазы; также, в этом случае, другие растворители могут присутствовать в сочетании с диметилсульфоксидом.
Очистка может быть выполнена при различных температурах; как правило, удобно установить различные температуры на различных стадиях процесса очищения, с более низкой температурой в фазе заключительной изоляции ГФХ. Подходящие температуры для проведения очищения могут быть выбраны между 100 °С и 0 °С, предпочтительно между 70 °С и 5 °С, более предпочтительно между 50 °Си 15 °С.
В выборе температуры было бы предпочтительно принять во внимание температуру замерзания диметилсульфоксида, которая может измениться, главным образом, в зависимости от присутствия дополнительных растворителей и концентрации ГФХ других присутствующих примесей.
Для изоляции ГФХ может использоваться оборудование, известное специалисту в данной области техники, такое как центрифуги или системы фильтрации, закрытые или открытые. Кристаллы могут быть непосредственно подвергнуты промыванию, используя тот же самый растворитель или ту же самую смесь растворителей, используемых для очищения; альтернативно, для промывания продукта, могут применять растворители или растворяющие смеси, кроме используемых в этапах кристаллизации или суспендирования.
Соотношение диметилсульфоксида, который будет использоваться, по сравнению с количеством ГФХ, используемого в процессе очищения объекта изобретения,
может значительно измениться и его удобно подбирать согласно существующим методам. На практике, чтобы не снизить более, чем необходимо, производительность процесса, удобно использовать не слишком большие количества диметилсульфоксида и, с другой стороны, эти количества не должны быть чрезмерно малыми, чтобы избежать появления затруднений при операциях разделения кристаллизованного продукта. Соотношения диметилсульфоксида и ГФХ, в пределах от 2 до 100 объемных частей (литры) на весовые части (кг), можно считать приемлемыми для этого воплощения, более предпочтительно, соотношения в пределах от 3 до 70, более предпочтительно, соотношения в пределах от 4 до 30, более предпочтительно, соотношения в пределах от 5 до 15 объемных частей на весовую часть ГФХ.
Особенно преимущественным способом для практического воплощения заявленного изобретения является кристаллизация ГФХ из его растворов в воде, или других растворителях или растворяющих смесях. Добавляя диметилсульфоксид к таким растворам, было установлено, что получены растворы, которые стабильны в течение времени, достаточного, чтобы осуществить дистилляцию без одновременного осаждения ГФХ. Использование более высокой температуры кипения диметилсульфоксида в сравнении с другими традиционными растворителями, обычно используемыми, позволяет незатруднительно изменить, без одновременного осаждения продукта, состав смеси растворителей, используемых для кристаллизации.
Как только готов состав смеси растворителей, возможно инициировать кристаллизацию ГФХ добавлением аликвота кристаллизованного ГФХ, который будет действовать как механизм запуска реакции. Этот вариант не является обязательным; если его применение желательно, образец кристаллов ГФХ может использоваться в качестве механизма запуска, у которого может и не быть особенно высокой степени чистоты, так как отсутствует непосредственная зависимость между качеством используемого механизма запуска реакции и кристаллов ГФХ, изолированных в конце очистки.
Было удивительно наблюдать, как эти методики очищения с использованием
диметилсульфоксида позволяют получать ГФХ с высокой степенью очистки, даже полученного от приготовлений, содержащих существенное количество других молекулярных соединений, включая ранее описанные.
В частности, способность системного объекта очищения согласно данного изобретения удалить бета изомер ГФХ представляется значительной и малопрогнозируемой, так как у оного наблюдаются химико-физические свойства, очень схожие с продуктом, изоляция которого предпочтительна с высокой степенью чистоты.
В отличие от кристаллизации из этанола, было также обнаружено, что объект метода очищения изобретения позволяет освободить ГФХ от некоторых соединений, наиболее часто встречающихся в ГФХ, полученном из лецитинов. В частности, было обнаружено в воплощениях изобретения, что возможно эффективно удалить примеси ГФХ, такие как сахароза и ГФЭ.
Результаты, представленные в Таблице 2, подчеркивают полноценность воплощений изобретения в очищении ГФХ. В этом отношении, примечательно то, что, как в Примере 6, реализация изобретения демонстрирует возможность кристаллизовать ГФХ также в присутствии Сахаров, в этом случае сахарозы, и высокой эффективности очищения, достижимого даже в этих случаях. С другой стороны, кристаллизация ГФХ из этанола не позволила удовлетворительно удалить сахарозу. Кроме того, ГФХ, и в еще большей степени, сахара, такие как сахароза, ведут себя как ингибиторы кристаллизации, когда этанол используется в качестве растворителя кристаллизации; следовательно, в этих случаях выходы кристаллизации являются настолько низкими, что получают методику, непрактичную в процессах для промышленного производства ГФХ. Дальнейшее воплощение изобретения состоит в ГФХ, чистота которого выше, чем 99,5%, предпочтительно выше, чем 99,7%, еще более предпочтительно с чистотой, выше, чем или равной 99,9%.
Определенная особенность представлена ГФХ, загрязненным меньше, чем на 0,1%
его изомером (3-ГФХ и ГФХ, загрязненным меньше, чем на 0,1% циклическими разновидностями цГФ.
В целях данного изобретения чистота, обозначенная выше, измерена как области
3 1
процента с методами ВЭЖХ и/или Р(Кв)-ЯМР и, предпочтительно, с методами
3 1
ВЭЖХ и/или Р(Кв)-ЯМР, описанными и иллюстрируемыми Примерами 8 и 9, соответственно.
Следующие примеры предназначены, без ограничительного характера, для описания некоторых методов изобретения. ПРИМЕРЫ Методика 1
Приготовление ГФХ согласно Примеру 2 по WO9013552
К 125 г соевого лецитина добавили 500 мл метанола и держали при помешивании до полного растворения. Добавили 20 мл 30%-го метилата натрия в метаноле. Помешивание продолжили при комнатной температуре в течение 3 часов. После фильтрации остаток промыли с метанолом (3 х 10 мл). Фильтрат нейтрализовали (рН приблизительно 6) с ледяной уксусной кислотой, затем сконцентрировали до остаточного объема приблизительно 125 мл, с отделением верхней масляной фазы. Обогащенную более низкую фазу элюировали на колонке, содержащей 140 мл смолы Amberlyst 15 (в кислотной форме), установленной в метаноле. Элюирование продолжили с 375 мл метанола, сопровождаемого 300 мл воды. Водный элюат элюирован на последовательности трех хроматографических колонок, следующим образом подготовленных: первая с 30 мл смолы IR 93 в ОН - форме в воде, вторая с 30 мл смолы IR 401 в ОН - форме в воде, третья с 12 мл смолы IRC 50 в кислотной форме в воде.
Заключительный элюат сконцентрирован до остаточной вязкой жидкости с содержанием воды, равным 15%.
Анализ ВЭЖХ-ELSD показал содержание (3-ГФХ, равного 0.8% (процент площади). Методика 2
Приготовление ГФХ согласно Примеру 1 по ЕР575717
200 г фракции, обогащенной в фосфатидилхолине, полученном в коммерческих
объёмах извлечением лецитина сои, растворили в 600 мл метанола. Полученный раствор элюировали на хроматографической колонке, содержащей смолу Duolite 147 в основной форме, установленой в метаноле. После загрузки обогащенного раствора, элюирование ГФХ завершили с метанолом. Элюат нейтрализован с уксусной кислотой и сконцентрирован до остаточного объема 300 мл, получая острую стратификацию двух фаз. Обогащенная более низкая фаза отделена, разбавлена метанолом и извлечена дважды с 200 мл п-гептана. 800 мл n-бутанола добавлены к обогащенной более низкой фазе, и раствор сконцентрирован к остаточному объему приблизительно 300 мл, охлажден до Т~5 °С и отфильтрован. Кристаллы ГФХ растворены в 30 мл дистиллированной воды и раствор концентрирован до вязкой жидкости с остаточным содержанием воды, равным 15%.
Анализ ВЭЖХ-ELSD показал содержание (3-ГФХ, равное 0,1% (процент площади).
3 1
Р(Кв)-ЯМР анализ показал содержание цГФ, равное 0,2% (процент площади). Методика 3
Получение ГФХ с примесью ГФЭ
ГФЭ в кристаллах добавлен к раствору ГФХ в воде, раствор концентрирован до
вязкой жидкости с остаточным содержанием воды, равной 15%.
Анализ ВЭЖХ-ELSD показал содержание GPE, равное 0,2% (как процент
площади).
Методика 4
Получение ГФХ с примесью сахарозы
Сахароза в кристаллах добавлена к раствору ГФХ в воде, раствор концентрирован
до вязкой жидкости с остаточным содержанием воды, равным 15%.
Анализ ВЭЖХ-ELSD показал содержание сахарозы, равное 2% (как процент
площади).
Пример 1 (Сравнительный)
Очищение ГФХ, полученного по Методике 1 посредством кристаллизации из этанола
2,5 г ГФХ в форме вязкой жидкости (полученной по методике 1) разбавлено в 5 мл
этанола при помешивании при Т~50 °С. Раствор охлажден до Т~10 °С и активирован добавлением нескольких кристаллов ГФХ, через несколько минут наблюдается формирование осадка. Его охладили до Т~5 °С и держали при помешивании от О °С до 5 °С в течение 1,5 часов, кристаллы отфильтровали через бюхнеровскую воронку, промывая с этанолом. После сушки в вакууме получено 1,4 г ГФХ.
Анализ ВЭЖХ-ELSD показал содержание (3-ГФХ, равное 0,48% (как процент
площади).
Пример 2
Очищение ГФХ, полученного по Методике 1 посредством кристаллизации из ДМСО
К 2,5 г ГФХ в форме вязкой жидкости (полученной по методике 1), добавлены 14 мл диметилсульфоксида, смесь подогрели до Т~50 °С при помешивании, затем охладили до Т~25 °С и активировали добавлением нескольких кристаллов ГФХ. Держали при помешивании от 20 °С до 25 °С в течение 16 часов; за это время наблюдается формирование осадка, кристаллы отфильтровали через бюхнеровскую воронку, промывая с этанолом. После сушки в вакууме получено 1,9 г ГФХ.
Анализ ВЭЖХ-ELSD показал содержание (3-ГФХ, равное 0,16% (процент площади). Пример 3
Очищение ГФХ, полученного по Методике 2 посредством кристаллизации из ДМСО
К 11,2 г ГФХ в форме вязкой жидкости (полученной по методике 2), добавлены 60 мл диметилсульфоксида, смесь подогрели до Т~50 °С при помешивании, затем охладили до Т~25 °С и активировали добавлением нескольких кристаллов ГФХ. Держали при помешивании от 20 °С до 25 °С в течение 16 часов; за это время наблюдается формирование осадка, кристаллы отфильтровали через бюхнеровскую воронку, промывая с этанолом. После сушки в вакууме получено 8,2 г ГФХ. Анализ ВЭЖХ-ELSD показал отсутствие (3-ГФХ
P(Kb)-NMR анализ показал отсутствие цГФ Пример 4
Очищение ГФХ (с примесью ГФЭ) посредством кристаллизации из ДМСО К 10,7 г ГФХ в форме вязкой жидкости (полученной по методике 3) добавлены 20 мл диметилсульфоксида, смесь подогрели до Т~70 °С при помешивании, добавили 80 мл диметилсульфоксида, затем охладили до Т~25 °С и активировали добавлением нескольких кристаллов ГФХ. Держали при помешивании от 20 °С до 25 °С в течение 16 часов; за это время наблюдается формирование осадка, кристаллы отфильтровали через бюхнеровскую воронку, промывая с этанолом. После сушки в вакууме получены 8,7 г ГФХ. Анализ ВЭЖХ-ELSD показал отсутствие ГФЭ. Пример 5 (Сравнительный)
Очищение ГФХ (с примесью ГФЭ) посредством кристаллизации из этанола К 10,7 г ГФХ в форме вязкой жидкости (полученной по методике 3) добавлены 20 мл диметилсульфоксида, смесь подогрели до Т~70 °С при помешивании, добавили 80 мл диметилсульфоксида, затем охладили до Т~25 °С и активировали добавлением нескольких кристаллов ГФХ. Держали при помешивании от 20 °С до 25 °С в течение 16 часов; за это время наблюдается формирование осадка, кристаллы отфильтровали через бюхнеровскую воронку, промывая с этанолом. После сушки в вакууме получены 8,7 г ГФХ. Анализ ВЭЖХ-ELSD показал отсутствие ГФЭ. Пример 6
Очищение ГФХ (с примесью сахарозы) посредством кристаллизации из ДМСО К 11 г ГФХ в форме вязкой жидкости (полученной по методике 4) добавлены 20 мл диметилсульфоксида, смесь подогрели до Т~70 °С при помешивании, добавили 80 мл диметилсульфоксида, затем охладили до Т~25 °С; за это время наблюдается формирование осадка. Держали при помешивании от 20 °С до 25 °С в течение 16 часов, кристаллы отфильтровали через бюхнеровскую воронку, промывая с этанолом.
После сушки в вакууме получены 7,8 г ГФХ.
Анализ ВЭЖХ-ELSD показал отсутствие сахарозы. Пример 7 (Сравнительный)
Очищение ГФХ (с примесью сахарозы) посредством кристаллизации из этанола 11,0 г ГФХ в форме вязкой жидкости (полученной по методике 4) растворены в 20 мл этанола при помешивании при Т~45 °С. Раствор охлажден до Т~5 °С и активирован с несколькими кристаллами ГФХ. Охладили до Т~5 °С и выдерживали при помешивании от 0 °С до 5 °С в течение 2,5 часов; за это время наблюдается формирование осадка, кристаллы отфильтровали через бюхнеровскую воронку, промывая с этанолом. После сушки в вакууме получены 1,1 г ГФХ.
Анализ ВЭЖХ-ELSD показал содержание сахарозы, равное 0,14% (как процент
площади).
Пример 8
Аналитический метод исследования ГФХ посредством ВЭЖХ-ELSD. Рабочие параметры:
ВЭЖХ колонка: YMC(tm) Polyamine II 250 х 4,6 мм (5 мкм)
Температурный режим термостата: 35 °С
Скорость потока: 0,7 мл/мин
Подвижные фазы: Фаза А: 85% (ацетонитрил 75%, метанол 25%)
15% (50 мМ аммониево-ацетатный буфер рН 4.5)
Фаза В: 65% (ацетонитрил 75%, метанол 25%)
35% (50 мМ аммониево-ацетатный буфер рН 4.5)
Градиентный режим:
Минуты
Фаза А%
Фаза В%
Детектор ELSD
Параметры детектора: поток азота = 1,4 мл/мин; температура = 90°С; Коэффициент = 1
Приготовление образцов: разбавление образцов ГФХ до примерно 20 мг/мл в метаноле.
Объём пробы: 20-40 мкл
ПРИМЕЧАНИЕ: колебания начального порога, которые наблюдаются до ВУ~5 минут, присутствуют в холостом растворе (не из-за веществ, присутствующих в образце).
В следующей таблице представлены референтные значения элюирования химических соединений, представляющих интерес.
Химические соединения
Время удерживания
ОВУ
Относительное время удерживания касательно ГФХ
ГФХ
-16,2 мин
р-ГФХ
-15,3 мин
-0,94
ГФЭ
-31,5 мин
-1,94
сахароза
-22,0 мин
-1,36
Предел обнаружения (LOD) примесей, проанализированных с использованием этого метода, составляет меньше чем 0,01% относительно ГФХ. Пример 9
Аналитический метод исследования ГФХ посредством Р(Кв)-ЯМР
Оборудование: ЯМР Varian VXR-200 или как минимум аналог .
Приготовление образца: 0,8 г ГФХ для анализа растворяют в 0,8 мл D20 и
помещают в ЯМР колбу.
Температура комнатная
Количество остановок сбора данных: Не менее 400
В следующей таблице представлены референтные значения элюирования исследованных соединений.
Химические соединения
Р-ЯМР химический сдвиг (ч./млн.)
ГФХ
-од
Р-ГФХ
-0,6
ГФЭ
0,4
цГФ
18,4
Предел обнаружения (LOD) примесей, проанализированных с использованием этого метода, составляет меньше чем 0,01% относительно ГФХ.
| Евразийский" патентный поверенный
Владимир В, Гончаров
Рсгмстргционнь^ номер "34
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Процесс очищения L-альфа-глицерофосфорилхолина, отличающийся тем, что L-альфа-глицерофосфорилхолин кристаллизуют из диметилсульфоксида (ДМСО) или из смеси ДМСО с как минимум одним другим растворителем.
2. Процесс по п. 1, отличающийся тем, что упомянутый как минимум один другой растворитель выбран из воды, спирта, галогенированных растворителей, простых и сложных эфиров и/или амидов.
3. Процесс по п.2, отличающийся тем, что упомянутый спирт является метанолом, этанолом, изопропанолом и/или n-бутанолом; упомянутый галогенированный растворитель является метилен хлоридом; упомянутый простой эфир является тетрагидрофураном; упомянутый сложный эфир является этилацетатом; упомянутый амид является диметилформамидом (ДМФА).
4. Процесс по п. 1, отличающийся тем, что ДМСО представлен в количестве от 2 до 100 объёмных долей на массовую долю L-альфа-глицерофосфорилхолина, предпочтительно от 5 до 15 объёмных долей.
5. Процесс по п. 1, отличающийся тем, что упомянутый как минимум один другой растворитель представлен в количестве от 0,01 до 10 объёмов на объём ДМСО, предпочтительно от 0,1 до 1.
6. Процесс по п. 1, отличающийся тем, что упомянутую кристаллизацию проводят в температурном диапазоне от 0 °С до 100 °С, предпочтительно от 15 °С до 50 °С.
7. L-альфа-глицерофосфорилхолин с чистотой выше 99,5%, предпочтительно выше 99,7%, более предпочтительно выше или равной 99,9%.
8. L-альфа-глицерофосфорилхолин, содержащий менее 0,1% (3-ГФХ изомера и/или менее 0,1% циклических молекул ГФХ.
9. Способ определения чистоты L-альфа-глицерофосфорилхолина, который включает элюирование L-альфа-глицерофосфорилхолина через ВЭЖХ колонку с амино- неподвижной фазой и последующее детектирование самого L-альфа
глицерофосфорилхолина и всех его примесей при помощи испарительного нефелометрического детектора.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что упомянутая неподвижная фаза содержит вторичные и третичные аминогруппы.
11. Способ по п.9, отличающийся тем, что упомянутая неподвижная фаза состоит из частиц материала-основы, предпочтительно диоксида кремния, с полимерным покрытием, включающим аминогруппы, предпочтительно вторичные и третичные.
12. Способ по п.9, отличающийся тем, что подвижные фазы состоят из водного раствора, дипольного органического растворителя или их смеси.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что упомянутый водный раствор имеет рН от 3 до 6, предпочтительно от 4 до 5.
14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что упомянутый дипольный органический растворитель представляет собой Ci-C4 спирт, ацетонитрил или их смесь.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что упомянутый Ci-C4 спирт является метанолом.
10.
патентный
Евразийский
поверенный
Владимир В. Гончаров
п""^т"онмпнньД номер -Ц
{1.013 -а
ГФХ
¦ р"' ¦ ¦ | |1111|мч] | Ml|illl|i|Ji|lli||llll| ||i|i,iiiipi|||i|iijiHF|nn|i|H|iMi|iiii|iinriMriFii|iiii |fiii|llll| |i|i^4r"l|lllllll^l1""l> l"|""Hlllfr
IB 19 17 1в 15 M 11 IJ 11 10 9 S T в 5 A it 1 0 -1 J
Фиг. 5
^сахароза
I ¦ г г-
-[-' > '-г-
35 МИН
Фиг. 13
WO 2015/189766 А1
WO 2015/189766 А1
WO 2015/189766 А1
WO 2015/189766 А1
WO 2015/189766 А1