EA201692296A1 20170428 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/201692296 Полный текст описания [**] EA201692296 20111013 Регистрационный номер и дата заявки EP10187751.2 20101015 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21704 Номер бюллетеня [**] МУТАНТЫ BETA VULGARIS, ТОЛЕРАНТНЫЕ К ALS ИНГИБИТОРНЫМ ГЕРБИЦИДАМ Название документа [8] A01H 5/00, [8] C07K 14/415, [8] C12N 15/82 Индексы МПК [DE] Хайн Рюдигер, [DE] Бентинг Юрген, [DE] Донн Гюнтер, [DE] Книттель-Оттлебен Натали, [DE] Хольтшульте Бернд, [DE] Лоок Андреас, [DE] Шпрингманн Клеменс, [DE] Янсен Рудольф Сведения об авторах [DE] БАЙЕР ИНТЕЛЛЕКТУЭЛЬ ПРОПЕРТИ ГМБХ, [DE] КВС ЗААТ АГ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201692296a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Данное изобретение относится к толерантным к ALS ингибиторным гербицидам растениям Beta vulgaris и их частям, которые включают мутацию эндогенного гена ацетолактатсинтазы (ALS), причем этот ALS ген кодирует ALS полипептид, содержащий аминокислоту, отличную от триптофана, в позиции 569 ALS полипептида.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Данное изобретение относится к толерантным к ALS ингибиторным гербицидам растениям Beta vulgaris и их частям, которые включают мутацию эндогенного гена ацетолактатсинтазы (ALS), причем этот ALS ген кодирует ALS полипептид, содержащий аминокислоту, отличную от триптофана, в позиции 569 ALS полипептида.


Евразийское (21) 201692296 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.04.28
(22) Дата подачи заявки 2011.10.13
(51) Int. Cl.
A01H 5/00 (2006.01) C07K14/415 (2006.01) C12N15/82 (2006.01)
(54) МУТАНТЫ BETA VULGARIS, ТОЛЕРАНТНЫЕ К ALS ИНГИБИТОРНЫМ ГЕРБИЦИДАМ
(31) 10187751.2; 61/394,463
(32) 2010.10.15; 2010.10.19
(33) EP; US
(62) 201390454; 2011.10.13
(71) Заявитель:
БАЙЕР ИНТЕЛЛЕКТУЭЛЬ ПРОПЕРТИ ГМБХ; КВС ЗААТ АГ (DE)
(72) Изобретатель:
Хайн Рюдигер, Бентинг Юрген, Донн Гюнтер, Книттель-Оттлебен Натали, Хольтшульте Бернд, Лоок Андреас, Шпрингманн Клеменс, Янсен Рудольф (DE)
(74) Представитель:
Юрчак Л.С. (KZ)
(57) Данное изобретение относится к толерантным к ALS ингибиторным гербицидам растениям Beta vulgaris и их частям, которые включают мутацию эндогенного гена ацетолактатсинтазы (ALS), причем этот ALS ген кодирует ALS полипептид, содержащий аминокислоту, отличную от триптофана, в позиции 569 ALS полипептида.
МУТАНТЫ BETA VULGARIS, ТОЛЕРАНТНЫЕ К ALS ИНГИБИТОРНЫМ ГЕРБИЦИДАМ
Описание
Данное изобретение относится к Beta vulgaris растениям и их частям, которые толерантны к ALS ингибиторным гербицидам, а также к способам их получения.
Культивируемые формы Beta vulgaris (как определено в Ford-Lloyd (2005) Sources of genetic variation, Genus Beta; в книге: Biancardi E., Campbell L.G., Skaracis G.N., De Biaggi M. (eds), Genetics and Breeding of Sugar Beet, Science Publishers, Enfield (NH) , США, pp. 25-33) являются важными сельскохозяйственными культурами в умеренных и субтропических областях. Например, около 2 0% производимого в мире сахара получают из сахарной свеклы. В связи с тем, что рассада и молодые растения свеклы во время первых 6-8 недель их жизни очень чувствительны к сильной конкуренции быстро растущих сорняков, которые выигрывают конкуренцию у молодых культурных растений, необходимы реальные меры контроля сорняков на этих посадках культурных растений.
В последние 4 0 лет гербициды являются предпочтительным средством для контроля сорняков в культуре свеклы. Продукты, используемые для этих целей, такие как фенмедифам, десмедифам и метамитрон, позволяют подавлять рост сорняков на свекловичных полях, не представляя опасности для культурных растений. Однако при неблагоприятных окружающих условиях эффективность этих продуктов не всегда удовлетворительна, особенно если вредные сорняки, такие как Chenopodium album, Amaranthus retroflexus и/или Tripleurospermum inodorata прорастают в течение продолжительного периода времени.
Инновационные гербицидно активные ингредиенты очень желательны для того, чтобы улучшить контроль сорных растений в посадках свеклы. Такие соединения должны действовать против широкого спектра сорняков предпочтительно от прорастания сорняков вплоть
до полного развития сорных растений, не оказывая влияния на культуру свеклы независимо от стадии развития. С помощью классического гербицидного скрининга не удалось обнаружить селективного гербицидно активного ингредиента для свеклы в течение последних десяти лет, который бы удовлетворял всем этим строгим требованиям агрономически предпочтительным образом.
Некоторые химикаты ингибируют энзим "ацетогидроксикислоты синтазы" (AHAS), также известной как "ацетолактат синтаза" (ALS
[ЕС 4.1.3.18]). На ALS могут воздействовать пять структурно различных семейств гербицидов, относящихся к классу ALS ингибиторных гербицидов, таких как (а) сульфонилмочевинные гербициды (Beyer Е.М. и др. (1988), Sulfonylureas in Herbicides: Chemistry, Degradation, and Mode of Action; Marcel Dekker, New York, 1988, 117-189), (b) сульфониламинокарбонилтриазолиноновые гербициды (Pontzen, R., Pflanz.-Nachrichten Bayer, 2002, 55, 3752), (с) имидазолиноновые гербициды (Shaner, D.L. и др., Plant Physiol., 1984, 76, 545-546; Shaner, D.L. и O'Connor, S.L.
(Eds.), The Imidazolinone Herbicides, CRC Press, Boca Raton, FL, 1991), (d) триазолопиримидиновые гербициды (Kleschick W.A. и др., Agric. Food Chem., 1992, 40, 1083-1085), и (e) пиримидинил-
(тио)бензоатные гербициды (Shimizu T.J., Pestic. Sci., 1997, 22, 245-256; Shimizu Т. и др., Acetolactate Syntehase Inhibitors in Herbicide Classes in Development, Boger P., Wakabayashi K., Hirai K., (Eds.), Springer Verlag, Berlin, 2002, 1-41).
ALS участвует в превращении двух пируват молекул в ацетолактат молекулу и двуокись углерода. В реакции используется тиаминпирофосфат для того, чтобы связать между собой две пируват молекулы. Получаемый в результате продукт реакции, ацетолактат, в конечном счете становится валином, лейцином или изолейцином (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine", в Plant Amino Acids, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp. 227-247).
Ингибиторы ALS прерывают биосинтез валина, лейцина и изолейцина в растениях. Последствием является непосредственное истощение соответствующего аминокислотного инструмента, вызывающее остановку биосинтеза белка, приводящее к прекращению роста растения и в конечном случае к гибели растения, и - как минимум - к его повреждению.
ALS ингибиторные гербициды широко применяются в современном сельском хозяйстве в связи с эффективностью при умеренных расходных количествах и с их относительной не токсичностью по отношению к животным, эти семейства гербицидов предотвращают дальнейший рост и развитие чувствительных растений, включая многие виды сорняков. Для того чтобы создать растения с повышенной толерантностью даже по отношению к высоким концентрациям ALS ингибиторных гербицидов, которые могут потребоваться для достаточного контроля сорняков, необходимо дополнительно выводить улучшенные линии или сорта культурных растений, которые устойчивы к ALS-ингибиторным гербицидам, а также создать способы и композиции для производства и применения улучшенных линий или сортов культурных растений, которые устойчивы к ALS-ингибиторным гербицидам.
Широкое разнообразие ALS ингибиторных гербицидов позволяет фермерам контролировать широкий ряд видов сорняков независимо от их стадии роста, однако эти высокоэффективные гербициды не могут быть применены в свекле в связи с тем, что обычные растения свеклы /коммерческие сорта свеклы очень чувствительны к этим ALS ингибиторным гербицидам. Однако, эти ALS ингибиторные гербициды обладают очень хорошей гербицидной активностью по отношению к широколистным и злаковым видам сорняков. Первые гербициды, имеющие моду действия по ингибированию ALS, были созданы для применения в сельском хозяйстве уже 30 лет тому назад. В настоящее время активные вещества этого класса гербицидов проявляют строгий контроль сорняков и широко применяются в
кукурузе и зерновых культурах, а также в двудольных культурах, за исключением сахарной свеклы.
Единственный ALS ингибиторный гербицид, о котором известно, что он применяется в настоящее время по послевсходовой схеме применения в свекле является дебут(r). Этот гербицид (содержащий трифлусульфурон-метил в качестве активного ингредиента плюс специфические соединения для приготовления препарата) разрушается сахарной свеклой до того, как он может ингибировать эндогенный ALS энзим свеклы, но он имеет несколько пробелов при контроле сорняков на площадях, где выращивают свеклу.
С тех пор, как ALS ингибиторные гербициды были применены в сельском хозяйстве, было замечено, что чувствительные виды растений, включая естественно встречающиеся сорняки, время от времени спонтанно развивают толерантность к этому классу гербицидов. Единичные замещения пары оснований в специфических местах ALS гена обычно приводят к более или менее устойчивым вариантам ALS энзима, который показывает различные уровни ингибирования под воздействием ALS ингибиторных гербицидов.
Растения, обладающие мутантными ALS аллелями, поэтому показывают
различные уровни толерантности к ALS ингибиторным гербицидам в
зависимости от химической структуры ALS ингибиторных гербицидов
и местоположения точки мутации в ALS гене. Например, Hattori и
др., (1995), Mol. Gen. Genet. 246: 419-425, описывают единичную
мутацию в Тгр 557 кодоне в Brassica napus клеточной линии
(согласно нумерации Arabidopsis thaliana последовательности,
которую используют в литературе, для того чтобы сравнивать все
ALS/AHAS мутанты, это относится к позиции "574") - которая
соответствует позиции 569 ALS последовательности в свекле. Эти
авторы наблюдали устойчивость по отношению к нескольким членам
подклассов ALS ингибиторных гербицидов, подобных
сульфонилмочевинам, имидазолинонам и триазолопиримидинам.
Мутанты свеклы описаны в связи с точкой мутации в Ala 122 кодоне, которая приводит к определенной толерантности по отношению к ALS ингибиторным гербицидам подкласса имидазолинонов
(W0 98/02526), но которая недостаточна для контроля сорняков по схеме сельскохозяйственного применения. Никакой перекрестной толерантности к другим ALS ингибиторным гербицидным классам не было описано при использовании этого мутанта. Более того, растения свеклы, имеющие вторую точку мутации в Pro 197 кодоне, показывают умеренную толерантность к ALS ингибиторным гербицидам, относящимся к членам подкласса сульфонилмочевинных гербицидов. Также описаны двойные мутанты этих двух
(WO 98/02527). Однако, ни один из этого многообразия мутантов не был использован для выхода на рынок многообразия свеклы в связи с тем, что уровень гербицидной толерантности к ALS ингибиторным гербицидам был недостаточно высок в этих мутантах для агрономического применения.
Stougaard и др., (1990), J. Cell Biochem., Suppl. 14E, 310 описывают выделение ALS мутантов из клеточной культуры тетраплоидной сахарной свеклы. Были выделены два различных ALS гена (ALS I и ALS II), которые отличаются только в аминокислотной позиции 37. Мутант 1 содержит в своем ALS I гене 2 мутации, тогда как мутант 2 содержит 3 мутации в его ALS II гене. После того как эти мутации были разделены, при решении вопроса о том, какая мутация придает устойчивость по отношению к ALS ингибитору, выяснилось, что ALS, синтезированный из рекомбинантного Е. coli, был устойчивым к гербицидам в том случае, когда содержал точечную мутацию в Тгр 57 4 кодоне (согласно нумерации Arabidopsis thaliana последовательности, которую используют в литературе, для того чтобы сравнивать всех ALS мутантов) - которая соответствует позиции 569 ALS последовательности в свекле, ведущей к замещению аминокислоты "Тгр" аминокислотой "Leu". Stougaard и др. не было показано для сахарной свеклы, что мутации в позиции 569 любого из ALS генов сахарной свеклы достаточно для того, чтобы получить приемлемый
уровень толерантности к ALS ингибиторным гербицидам. Кроме того, Stougaard и др. не регенировали или не обращались с растениями сахарной свеклы, содержащими одну мутацию, включая Тгр -> Leu мутацию в позиции 5 69 ALS сахарной свеклы.
Зная об этом, Stougaard и др. сконструировали трансформационный вектор растения, содержащего различные ALS гены для применения при трансформации растений. Однако, до настоящего времени нет дополнительных данных - в частности, отсутствуют данные относительно влияния ALS ингибиторных гербицидов на растения и/или на сельскохозяйственные области, включающие такие мутации в растениях Beta vulgaris, не были открыты этими или другими авторами как в генной инженерии, так и в мутантных растениях в течение более чем 20 лет после этого.
В WO 99/57965 вообще описаны растения сахарной свеклы, устойчивые к сульфонилмочевинам, и способы их получения путем EMS (этилметансульфонатного) мутагенеза. Однако, отдельно от исследований, которые требуются для получения таких мутантов, в данной публикации не предоставляются такие растения и не описывается никаких локализаций в ALS генах, которые могут быть уместны, для получения мутантов, толерантных к ALS ингиторным гербицидам, не открыто никакой корреляции для агрономического применения для этого. Кроме того, существует большая вероятность того, что - путем применения такого сильно мутагенного соединения как EMS - могут быть вызваны дополнительные мутации в другом месте в геноме, которые могут привести к недостаткам вплоть до отсутствия фертильности и/или остановки роста полученных таким образом растений. Более того, в связи с их химическим взаимодействием с ДНК, применение EMS может иметь лакуны при индуцировании специфических мутаций, подобные превращению триплета TGG в TTG, поскольку EMS всегда превращает гуанозин в аденозин.
В некоторых видах сорняков, таких как амарантус (Amaranthus), мутация Тгр 57 4 Leu может быть обнаружена у популяций растений, которые были подвергнуты повторной экспозиции ALS ингибиторным гербицидом. Мутанты Тгр 574 Leu показывают высокий уровень толерантности по отношению к нескольким химическим классам ALS ингибиторных гербицидов, таких как выбираемые из группы, включающей сульфонилмочевины и сульфониламинокарбонил-триазолиноны.
В W0 2008/124495 открыты ALS двойные и тройные мутанты. Согласно WO 2009/046334 были созданы специфические мутации в ALS гене. Однако, агрономически используемые толерантные к гербицидам мутанты Beta vulgaris, содержащие такие мутации согласно WO 2009/046334, до сих не были получены.
Более того, с учетом того факта, например, что из сахарной свеклы получают около 2 0% производимого в мире сахара, также является в высокой степени желательным, чтобы имелись доступные растения сахарной свеклы, которые имеют преимущества в росте по сравнению с высокоэффективными сорняками. Таким образом, в высокой степени желательно иметь доступные, по отношению к ALS генам не трансгенные растения Beta vulgaris, включая растения сахарной свеклы, которые толерантны к ALS ингибиторным гербицидам. Следовательно, имеется необходимость в таких не трансгенных растениях Beta vulgaris, в частности, растений сахарной свеклы, которые толерантны к ALS ингибиторным гербицидам, на агрономически эксплуатируемом уровне ALS ингибиторных гербицидов.
Таким образом, техническая проблема должна быть подчинена этой потребности.
Данное изобретение направлено на удовлетворение этой потребности и обеспечивает решение этой технической проблемы с помощью ALS ингибиторного гербицида, толерантного к растениям Beta vulgaris
и их частям, содержащим мутацию эндогенного ацетолактат синтазы (ALS) гена, в котором ALS ген кодирует ALS полипептид, содержащий аминокислоту, отличную от триптофана в позиции 5 69 ALS полипептида.
Семена согласно данному изобретению были задепонированы в NCIMB, Aberdeen, Великобритания, под номером NCIMB 41705 12 марта 2010 года.
Применяя различные способы разведения, могут быть впоследствии развиты высокоурожайные коммерческие сорта высококонкурентных на всех специфических рынках, обладающих добавленной сильной толерантностью к ALS ингибиторным гербицидам, при использовании первоначально полученных мутантных растений.
Следует заметить, что используемые в английском тексте формы артикля единственного числа "a", "an" и "the", также охватывают и множественное число, если только в тексте четко не оговорено другое. Так, например, ссылка на реагент ("a reagent") охватывает один или более различных реагентов и ссылка на способ ("the method") охватывает ссылку на эквивалентные стадии и способы, которые известны специалистам и которые могут быть модифицированы или замещены способами описанными здесь.
Все публикации и патенты, цитированные в этом изобретении, включены в виде ссылки в это описание. В том случае, когда материалы, содержащиеся в ссылках, противоречат или не согласуются с этим описанием, описание исключает любой такой материал.
Если по-другому не оговорено, термин "как минимум", предшествующий серии элементов, следует понимать, как относящийся к каждому элементу серии. Специалисты могут опознать или способны установить, используя только рутинные эксперименты, много эквивалентов специфических воплощений изобретения,
описанных здесь. Имеется в виду, что такие эквиваленты также включены в данное изобретение.
Во всем описании и в формуле изобретения, за исключением
случаев, когда контекст говорит о другом, слово "включает", и
его вариации, такие как "включают" и "включая", следует понимать
как включение указанного целого или стадии, или группы целых или
стадий, но не ознаачает исключение любого другого целого или
стадии, или группы целых или стадий. Слово "включает" и его
вариации, с одной стороны, и "содержит" и его аналоговые
вариации, с другой стороны, могут использоваться
взаимозаменяемо, не отдавая предпочтение любому из них.
В данном изобретении были получены растения свеклы, которые включают измененный эндогенный ALS ген (также отнесенный как "AHAS" ген), имеющий точку мутации в Тгр 5 69 кодоне (по отношению к Beta vulgaris ALS аминокислотной последовательности для сравнения, показанной в SEQ ID N0: 2; это равняется позиции 574 Arabidopsis thaliana последовательности для сравнения, как показано в SEQ ID N0: 6) и точка мутации которой была получена в результате нескольких циклов селекции на специально выбранных ALS ингибиторных гербицидах.
Принимая во внимание тот факт, что В. vulgaris растения данного изобретения были получены путем выделения спонтанных мутантных клеток растения, которые напрямую регенерируют до полностью фертильных растений свеклы, как описано здесь более детально, эти растения являются не трансгенными в той мере, как это касается ALS гена.
Кроме того, растения данного изобретения сами по себе, а также их потомство являются фертильными и поэтому могут оказаться полезными для целей размножения без любых дополнительных манипуляций, которые могут вызвать стресс, индуцированный дальнейшим изменением генетической основы. Такие растения,
полученные согласно процедуре селекции, примененной здесь, могут напрямую применяться для того, чтобы создавать разнообразия свеклы и/или гибриды, предоставляющие агрономически полезные уровни толерантности к ALS ингибиторным гербицидам, таким образом, давая возможность для мер инновативного контроля сорняков в местах произрастания свеклы.
Применяемый здесь термин "трансгенный" означает, что ген -который может быть на той же самой или на отличной частице - был введен в растение с помощью подходящего биологического носителя, такого как Agrobacterium tumefaciensг или с помощью другого физического средства, такого как трансформация протопласта или бомбардировка частицами, и который ген может быть экспрессирован в окружении нового хозяина, в частности генетически модифицированного организма (GM0).
В согласии с приведенным выше определением термин "не трансгенный" означает точно противоположное, то есть, что не было введения соответствующего гена с помощью подходящего биологического носителя или с помощью другого физического средства. Однако, мутированный ген может быть перенесен с помощью опыления, или естественно или с помощью процесса размножения с получением другого не трансгенного растения относительно этого специфического гена.
"Эндогенный" ген означает ген растения, который не был введен в растение с помощью техники генной инженерии.
Термин "последовательность", который применяется здесь,
относится к нуклеотидной(ым) последовательности(ям),
полинуклеотиду(ам), последовательности(ям) нуклеиновых кислот, нуклеиновой(ым) кислоте(ам), молекуле нуклеиновой кислоты, пептидам, полипептидам и белкам в зависимости от контекста, в котором использован термин "последовательность".
Термин "нуклеотидная(ые) последовательность(и)",
"полинуклеотид(ы)", "последовательность(и) нуклеиновых кислот", "нуклеиновая(ые) кислота(ы)", "молекула нуклеиновой кислоты" применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к нуклеотидам, как к рибонуклеотидам, так и деоксирибонуклеотидам или к комбинациям обоих, в полимерной неразветвленной форме любой длины. Последовательности нуклеиновых кислот включают ДНК, цДНК, геномные ДНК, РНК, синтетические формы и смешанные полимеры, обе сенс и антисенс ветви спирали, или могут содержать неприродные или производные нуклеотидные основания, что может быть без затруднений определено специалистами.
В том случае, когда здесь применяют термин "полипептид" или "белок" (оба термина применяются здесь взаимозаменяемо), он означает пептид, белок или полипептид, который включает аминокислотную цепь заданной длины, в которой аминокислотные остатки соединены ковалентными пептидными связями. Однако, пептидомиметики таких белков/полипептидов, в которых аминокислота(ы)) и/или пептидная(ые) связь(и) были замещены функциональными аналогами, также охватываются изобретением, как и аминокислоты, отличные от тех 20, которые кодируют ген, такие как селеноцистеин. Пептиды, олигопептиды и белки могут быть объединены термином полипептиды. Термин полипептид также относится к, и не исключает, модификации полипептида, то есть, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п. Такие модификации хорошо описаны в основополагающих текстах и в более детальных монографиях, а также в научно-исследовательской литературе. Полипептид (или белок) который предпочтительно имеется в виду здесь представляет собой В. vulgaris ALS полипептид (или ALS белок) [последовательность SEQ ID NO: 2].
Аминокислотные замещения охватывают аминокислотные изменения, при которых один аминокислотный остаток замещается на отличающийся, встречающийся в природе аминокислотный остаток. Такие замещения можно классифицировать как "консервативные', при
которых аминокислотный остаток, содержащийся в диком виде ALS белка, замещают на другой встречающийся в природе аминокислотный остаток похожего типа, например, Gly^Ala, Val^Ile^Leu, Asp^Glu, Lys^Arg, Asn^Gln или Phe^Trp^Tyr. Замещения, охватываемые данным изобретением также могут быть "не консервативными", при которых аминокислотный остаток, содержащийся в диком виде ALS белка, замещают на аминокислотный остаток с отличающимися свойствами, такой как встречающийся в природе аминокислотный остаток из отличающейся группы (например, замещение заряженной или гидрофобной аминокислоты на аланин). Термин "похожие аминокислоты", применяемый здесь, относится к аминокислотам, которые имеют похожие аминокислотные боковые цепи, то есть аминокислоты, которые имеют полярные не полярные или практически нейтральные боковые цепи. "Не похожие аминокислоты", применяемый здесь, относится к аминокислотам, которые имеют отличающиеся аминокислотные боковые цепи, например, аминокислота с полярной боковой цепью является не похожей по отношению к аминокислоте с не полярной боковой цепью. Полярные боковые цепи обычно имеют тенденцию присутствия на поверхности белка, где они могут взаимодействовать с водным окружением, имеющимся в клетках
("гидрофильные" аминокислоты). С другой стороны, "не полярные" аминокислоты имеют тенденцию оставаться внутри центра белка, где они могут взаимодействовать с похожими не полярными соседями
("гидрофобные" аминокислоты"). К примерам аминокислот, которые содержат полярные боковые цепи, относятся аргинин, аспарагин, аспартат, цистеин, глутамин, глутамат, гистидин, лизин, серии и треонин (все являются гидрофильными, за исключением цистеина, который гидрофобен). К примерам аминокислот, которые содержат не полярные боковые цепи относятся аланин, глицин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин и триптофан (все являются гидрофобными, за исключением глицина, который нейтрален).
Как правило, специалистам известно, исходя из их общих знаний и из контекста, что термины ALS, ALSL, AHAS или AHASL применяют, когда имеются в виду как нуклеотидные последовательности или
нуклеиновые кислоты, так и аминокислотные последовательности или полипептиды, соответственно.
Термин "ген", который применяется здесь, охватывает полимерную
форму нуклеотидов любой длины, как рибонуклеотиды, так и
дезоксирибонуклеотиды. Термин охватывает ДНК и РНК с двойной или
одинарной прядью спирали. Он также охватывает известные типы
модификации, например, метилирование, "введение защитных групп",
замещение одного или более естественно встречающихся нуклеотидов
на его аналог. Предпочтительно ген охватывает кодирующую
последовательность, которая кодирует приведенные здесь
полипептиды. "Кодирующая последовательность" представляет собой
нуклеотидную последовательность, которая транскрибирована в мРНК
и/или транслирована в полипептид, когда ее помещают и когда
находится под контролем подходящей регулирующей
последовательности. Границы кодирующей последовательности
определяются трансляционным стартовым кодоном у 5'-концевой
точки и трансляционным останавливающим кодоном у 3'-концевой
точки. Кодирующая последовательность может включать, но не
ограничивается им, мРНК, цДНК, рекомбинантную
нуклеиновокислотную последовательность или геномный ДНК, в то же время могут присутствовать интроны при определенных обстоятельствах.
В том случае, когда здесь применяют термин "Beta vulgaris", в сокращенном виде он имеет вид "В. vulgaris". Кроме того, здесь применяют термин "свекла". Эти три термина применяют взаимозаменяемо и под ними следует понимать все культивируемые виды Beta vulgaris, как определено в каталоге Ford-Lloyd (2005) Sources of genetic variation, Genus Beta; в книге Biancardi E, Campbell LG, Skaracis GN, De Biaggi M (eds), Genetics and Breeding of Sugar Beet. Science Publishers, Enfield (NH), США, pp 25-33. Аналогично, например, термин "Arabidopsis thaliana" имеет сокращенный вид "A. thaliana". Оба термина взаимозаменяемо применяются здесь.
Термин "позиция", применяемый согласно данному изобретению, означает или позицию аминокислоты в аминокислотной последовательности, приведенной здесь, или позицию нуклеотида внутри нуклеотидной последовательности, приведенной здесь. Термин "соответствующая", применяемый здесь, также означает, что позиция определяется не только номером предшествующих нуклеотидов/аминокислот.
Позиция данного нуклеотида в согласии с данным изобретением, которая может быть замещена, может варьироваться в зависимости от стираний или дополнительных нуклеотидов в другом месте ALS 5'-нетрансляционной области (UTR), включая промотор и/или любую другую регулирующую последовательность или ген (включая эксоны и интроны). Подобным образом, позиция данной аминокислоты в согласии с данным изобретением, которая может быть замещена, может варьироваться в зависимости от стираний или добавлений аминокислот где-нибудь в ALS полипептиде.
Под термином "соответствующая позиция" в согласии с данным изобретением понимают, что нуклеотиды/аминокислоты могут отличаться по указанному номеру, однако могут еще иметь похожие соседние нуклеотиды/аминокислоты. Упомянутые нуклеотиды/аминокислоты, которые могут быть замещены, стерты или добавлены также охвачены термином "соответствующая позиция".
Для того чтобы определить соответствует ли нуклеотидный остаток
или аминокислотный остаток в данной ALS
нуклеотидной/аминокислотной последовательности определенной позиции в нуклеотидной последовательности SEQ ID N0: 1 или аминокислотной последовательности SEQ ID N0: 2, специалисты могут использовать хорошо известные средства и способы, например, выравнивание вручную или с применением компьютерных программ, таких как BLAST (Altschul и др., (1990), Journal of Molecular Biology, 215, 403-410), которые являются исследовательскими инструментами для базового локального отнесения Basic Local Alignment Search Tool or ClustalW (Thompson и др., (1994), Nucleic Acid Res., 22, 4673-4680) или
любые другие подходящие генерирования выравнивания
программы, которые последовательностей.
пригодны
для
Последовательность SEQ ID N0: 1 представляет собой нуклеотидную
последовательность кодирующую Beta vulgaris дикого типа ALS.
Последовательность SEQ ID N0: 2 представляет собой Beta vulgaris
аминокислотную последовательность, полученную из
последовательности SEQ ID N0: 1. Соответственно, кодон в позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности SEQ ID N0: 1 кодирует аминокислоту в позиции 569 (то есть аминокислоту "Тгр" согласно трехбуквенному коду или "W" согласно однобуквенному коду) последовательности SEQ ID N0: 2.
Другая возможность, состоит в применении для определения того,
находится ли нуклеотидный остаток или аминокислотный остаток в
данной ALS нуклеотидной/аминокислотной последовательности в
определенной позиции в нуклеотидной последовательности SEQ ID
N0: 1, нуклеотидной последовательности кодирующей A. thaliana
дикого типа ALS, показанной в последовательности SEQ ID N0: 5.
Последовательность SEQ ID N0: б представляет собой A. thaliana
аминокислотную последовательность, полученную из
последовательности SEQ ID N0: 5.
Соответственно кодон в позиции 1720-1722 нуклеотидной последовательности SEQ ID N0: 5 кодирует аминокислоту в позиции 574 (то есть аминокислоту "Тгр" согласно трехбуквенному коду или "W" согласно однобуквенному коду) последовательности SEQ ID N0. 6.
В A. thaliana дикого типа ALS нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID N0: 5 используется в качестве последовательности для сравнения (как это делают в большей части литературы по этому вопросу, и поэтому используется для создания возможности более легкого сравнения с такими известными последовательностями), кодон, кодирующий аминокислоту, которая отлична от триптофана, находящийся в позиции, соответствующей
позиции 1720-1722 нуклеотидной последовательности A. thaliana ALS гена, показанной в последовательности SEQ ID NO: 5.
Однако, последовательность SEQ ID NO: 1 является более предпочтительной в качестве нуклеотидной последовательности для сравнения и последовательность SEQ ID NO: 2 является более предпочтительной аминокислотной последовательностью для сравнения во всех последующих открытиях.
Следующая таблица представляет обзор последовательностей для сравнения, использованных здесь, когда определяют позицию точки мутации в нуклеотидной последовательности или замещения в аминокислотной последовательности
Последовательность SEQ ID NO:
Тип последовательности
Вид
Нуклеотидная последовательность
В. vulgaris
Аминокислотная последовательность
В. vulgaris
Нуклеотидная
последовательность
(мутированная)
В. vulgaris
Аминокислотная
последовательность
(мутированная)
В. vulgaris
Нуклеотидная последовательность
A. thaliana
Аминокислотная последовательность
A. thaliana
Так, при любом событии, эквивалентную позицию определяют только путем выравнивания с последовательностью для сравнения, такой как SEQ ID NO: 1 или 5 (нуклеотидная последовательность) или SEQ ID NO: 2 или б (аминокислотная последовательность).
В связи с различиями между В. vulgaris дикого типа ALS геном и ALS геном, охватываемым В. vulgaris растением данного изобретения, ALS гены (или полинуклеотидные или нуклеотидные последовательности), охватываемые В. vulgaris растениями данного изобретения, могут также рассматриваться как "мутантные ALS гены", "мутаннтные ALS аллели", "мутантные ALS полинуклеотиды" или подобные. Так, по всему описанию, термины "мутантный аллель", "мутантный ALS аллель", "мутантный ALS ген" или "мутантный ALS полинуклеотид" используются взаимозаменяемо.
Если по-другому здесь не оговорено, эти термины относятся к нуклеотидной последовательности, которая содержит кодон, кодирующий аминокислоту, отличную от триптофана в позиции, которая соответствует позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS гена, показанной в последовательности SEQ ID NO: 1. Если сравнить по отношению к А. thaliana последовательностьи для сравнения, показанной в SEQ ID NO: 5, позиция кодона является 1720-1722.
Таким же образом, эти термины относятся к нуклеотидной
последовательности, которая кодирует ALS белок, который имеет в
позиции, соответствующей позиции 569 аминокислотной
последовательности Beta vulgaris ALS белка, показанной в последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислоту, отличную от триптофана. Если сравнить по отношению к A. thaliana последовательностьи для сравнения, показанной в SEQ ID NO: б, позиция является 574.
Одна "аминокислота, отличная от триптофана" (обозначенного как "Тгр" согласно трехбуквенному коду или "W" эквивалентно согласно однобуквенному коду) охватывает любую встречающуюся в природе аминокислоту, отличную от триптофана. Эти встречающиеся в природе аминокислоты, охватывают аланин (А) , аргинин (R) , аспарагин (N), аспартат (D), цистеин (С), глутамин (Q), глутамат (Е) , глицин (G) , гистидин (Н) , изолейцин (I), лейцин (L) , лизин
(К), метионин (М), фенилаланин (F), пролин (Р), серин (S), треонин (Т), тирозин (Y) или валин (V).
Однако, предпочтительно, когда аминокислота, отличная от триптофана (относящегося к группе нейтрально-полярных аминоксилот), является аминокислотой с физико-химическими свойствами отличными от свойств триптофана, то есть относящейся к любой аминокислоте, проявляющей нейтрально - не полярные, кислотные или основные свойства. Предпочтительно аминокислоту, отличную от триптофана, выбирают из группы, включающей аланин, глицин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, валин и аргинин. Более предпочтительно указанная аминокислота представляет собой нейтральную - не полярную аминокислоту, такую как аланин, глицин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин или валин. Еще более предпочтительно указанная аминокислота представляет собой аланин, глицин, изолейцин, лейцин, валин. Наиболее предпочтительным является глицин и лейцин. Самым предпочтительным является лейцин.
В контрасте, если по особому не оговорено, термины "дикого типа аллель", "дикого типа ALS аллель", "дикого типа ALS ген" или "дикого типа ALS полинуклеотид" относятся к нуклеотидной последовательности, которая кодирует ALS белок, в котором отсутствует W569 замещение по отношению к последовательности SEQ ID N0: 2 (или W574 замещение по отношению к последовательности SEQ ID N0: б) . Эти термины также относятся к нуклеотидным последовательностям, включающим в позиции, соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS гена, показанного в последовательности SEQ ID N0: 1, кодону, кодирующему аминокислоту, отличную от триптофана.
Такой "дикого типа аллель", "дикого типа ALS аллель", "дикого типа ALS ген" или "дикого типа ALS полинуклеотид" может включать или не включать мутации, которые отличны от мутаций, которые вызывает W569 замещение.
По существу, что касается ALS гена, единственное различие между
диким типом В. vulgaris растения и В. vulgaris растением данного
изобретения состоит предпочтительно в том (и особенно), что в
нем специфицирована позиция (в частности, позиция,
соответствующая позиции 1705-1707 нуклеотидной
последовательности В. vulgaris ALS гена, показанной в последовательности SEQ ID NO: 1), В. vulgaris растение данного изобретения содержит кодон, кодирующий аминокислоту, которая отлична от триптофана, предпочтительно кодон кодирует аминокислоту, как специфицировано в другом месте. Однако, как указано выше, могут существовать другие различия, такие как присутствие дополнительных мутаций между диким типом и мутантным ALS аллелем, как указано здесь. Пока эти другие различия неуместны, поскольку присутствуют различия, объясненные перед этим.
Следовательно, W569 замещение (или W574 замещение, в том случае
когда используют A. thaliana ALS аминокислотную
последовательность SEQ ID NO: б для сравнения) является результатом изменения кодона в позиции, соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1 (или в позиции, соответствующей позиции 1720-1722 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, соответственно).
Предпочтительно замещение в позиции 569 является W^L замещением, в котором "L" кодируется любым из кодонов "СТТ", "СТС", "СТА", "CTG", "ТТА" или "TTG".
Более предпочтительно замещение в позиции 569 является W^L
замещением, поскольку происходит превращение "G" нуклеотида в
позиции, соответствующей позиции 17 0 6 нуклеотидной
последовательности в SEQ ID NO: 1 (или в позиции, соответствующей позиции 1721 нуклеотидной последовательности показанной в SEQ ID NO: 5, соответственно), в "Т" нуклеотид.
Соответственно, кодон в позиции, соответствующей позиции 17051707 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1 (или в позиции, соответствующей позиции 1720-1722 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 5, соответственно) меняется из "TGG" в "TTG". В то время как кодон "TGG" кодирует триптофан, кодон "TTG" кодирует лейцин.
В результате, в наиболее предпочтительном варианте данного изобретения обеспечивается Beta vulgaris растение, включающее нуклеотидную последовательность эндогенного ALS гена, кодон TTG (кодирующий лейцин) в позиции соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS мутантного гена, показанную в последовательности SEQ ID NO: 1, эта нуклеотидная последовательность включает (или менее предпочтительно состоит из) последовательность SEQ ID NO: 3.
В. vulgaris растения, кодируемые ALS полипептидом, имеющим в
позиции 569 аминокислотной последовательности Beta vulgaris ALS
белка, показанного в последовательности SEQ ID NO: 2, отличную
от триптофана аминокислоту, предпочтительно включают в
нуклеотидной последовательности эндогенного ALS гена один кодон,
кодирующий отличную от триптофана аминокислоту в позиции,
соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной
последовательности В. vulgaris ALS гена, показанного в последовательности SEQ ID NO: 1.
Термин В. vulgaris "ALS" или "AHAS" ген также включает В.
vulgaris нуклеотидную последовательность, которая, как минимум,
на 90, 95, 97, 98 или 99% идентична с В. vulgaris ALS
нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или 3, в которой
эти на 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичные
нуклеотидные последовательности включают в позиции,
соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной
последовательностьи SEQ ID NO: 1 один кодон, кодирующий отличную от триптофана аминокислоту.
Таким же образом, эти, как минимум, на 90, 95, 97, 98 или 99%
идентичные нуклеотидные последовательности кодируют ALS
полипептид, включающий в позиции, соответствующей позиции 569 в
последовательности SEQ ID NO: 2, отличную от триптофана
аминокислоту. Упомянутые идентичные нуклеотидные
последовательности кодируют ALS белок, который сохраняет активность, как описано здесь, более предпочтительно таким образом закодированный ALS полипептид является толерантным к одному или нескольким ALS ингибиторным гербицидам, как описано здесь. Этот термин также включает аллельные варианты и гомологи кодированного ALS полипептида, который предпочтительно толерантен к одному или более ALS ингибиторных гербицидов, как описано здесь.
Для того чтобы определить имеет ли последовательность нуклеиновых кислот определенную степень идентичности с последовательностями нуклеиновых кислот данного изобретения, специалисты могут использовать хорошо известные средства и способы, например, выравнивание (выверка) , или вручную или с использованием компьютерных программ, которые упомянуты далее ниже в связи с определением термина "гибридизация" и степени гомологии.
Например, BLAST, который означает основной инструмент поиска локалного выравнивания (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402; Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300; Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410), может быть использован для поиска локальных выравниваний последовательностей. BLAST производит выравнивания как нуклеотидных, так и аминокислотных последовательностей, для того чтобы определить схожесть последовательностей. В связи с локальной природой выравнивания, BLAST является особенно полезным при определении точных пар или при идентификации похожих последовательностей. Фундаментальной единицей для выработки BLAST алгоритма является высоко апробированная сегментная пара (HSP). Одна HSP состоит из двух фрагментов
последовательности произвольной, но одинаковой длины, чье выравнивание является локально максимальным и для которой степень выравнивания совпадает или превышает порог или отсечку, установленную пользователем. BLAST приближение состоит в том, чтобы посмотреть HSPs между стоящей под вопросом последовательность и последовательностью из базы данных, для того чтобы определить статистическую важность любой найденной пары, и сделать доклад только для таких пар, которые удовлетворяют выбранным пользователям порогам важности. Параметр Е устанавливает статистическую важность порога для рассматриваемых пар последовательностей из базы данных. Е интерпретируется как верхний предел ожидаемой частоты возможности появления одной HSP (или ряда HSP) в контексте общего поиска в базе данных. О любой последовательности базы данных, чья пара удовлетворяет Е, сообщается в программном выходе.
Аналогичная компьютерная техника, использующая BLAST (Altschul
(1997), цит. выше; Altschul (1993), цит. выше; Altschul (1990),
цит. выше) была применена для поиска идентичных или родственных
молекул в нуклеотидной базе данных, такой как GenBank или EMBL.
Этот анализ является более быстрым, чем основанная на
мультиплетной мембране гибридизация. Кроме того,
чувствительность компьютерного поиска можно модифицировать, для того чтобы определить относится ли определенная пара к категории точно соответствующих или похожих. Основой для поиска является результат расчета, который определяется как:
% идентичности последовательности х % максимума BLAST расчета
100
и он принимает во внимание как последовательностей, так и длину Например, при результате расчета
степень похожести двух пары последовательности. 40, пара является точно
соответствующей с ошибкой в пределах 1-2%; и при результате расчета 70, пара является точно соответствующей. Похожесть молекул обычно идентифицируется путем выбора таких, которые показывают результат расчета между 15 и 40, хотя более низкие результаты могут идентифицировать родственные молекулы.
Термин В. vulgaris "ALS" или "AHAS" полипептиды также охватывает
аминокислотные последовательности, которые, как минимум, на 90,
95, 97, 98 или 99% идентичны с ALS аминокислотной
последовательностью SEQ ID NO: 2 или 4, в которой эти, как
минимум, на 90, 95, 97, 98 или 99% идентичные с аминокислотной
последовательностью содержат в позиции, соответствующей позиции
569 последовательности SEQ ID NO: 2, одну аминокислоту, отличную
от триптофана. Указанная идентичная аминокислотная
последовательность сохраняет активность ALS, как описано здесь, более предпочтительно ALS полипептид является толерантным к ALS ингибиторным гербицидам, как описано здесь.
Активность ALS, если потребуется, может быть измерена в соответствии с опытами, описанными в статье Singh, (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88:4572-4576.
Тем не менее, ALS нуклеотидные последовательности, имеющиеся в виду здесь и кодирующие ALS полипептиды, придают толерантность к одному или более ALS ингибиторным гербицидам (или, наоборот, меньшую чувствительность к ALS ингибиторному гербициду) как описано здесь. Это связано с точкой мутации, приводящей к аминокислотному замещению, как описано выше.
Соответственно, толерантность к одному ALS ингибиторному
гербициду (или, наоборот, меньшая чувствительность к ALS ингибиторному гербициду) может быть измерена путем сравнения ALS активности, определенной для экстрактов клеток растений, которые содержат мутированные ALS последовательности, и растений, у которых отсутствуют мутированные ALS последовательности, в присутствии ALS ингибиторных гербицидов, подобно тому, как
описано в статье Singh и др., (1988), [J. Chromatogr., 444, 251261] .
Однако, более предпочтительные опыты по определению активности
для ALS полипептидов, кодированных нуклеотидной
последовательностью, которая включает кодон, кодирующий аминокислоту, отличную от триптофана в позиции, соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS гена, показанных в SEQ ID NO: 1 могут быть представлены, как показано ниже:
Кодирующую последовательность Beta vulgaris дикого типа и мутанта В. vulgaris растения клонируют в, например, Novagen рЕТ-32а(+) векторах и векторы трансформируют в, например, Escherichia coli AD494 согласно инструкциям изготовителя. Бактерии предпочтительно выращиваемые при температуре 37° С в среде при выбранном давлении, такой как LB-среда, содержащая 100 мг/л карбенциллина и 2 5 мг/л канамицина, индуцируют, например, 1 мМ изопропил-р-0-тиогалактопиранозида при ОБбоо предпочтительно около 0,6, культивированные около 16 часов предпочтительно при температуре 18 °С и выделенные центрифугированием. Батериальные пилюли ресуспендируют в 100 мМ буфера из фосфата натрия рН 7,0, содержащего 0,1 мМ тиамин-пирофосфата, 1 мМ МдС1г и 1 мкМ FAD с концентрацией 1 грамм влажного веса на 2 5 мл буфера и разрушают обрабатывая звуком. Необработанный экстракт белка, полученный после центрифугирования, используют для измерения ALS активности.
После этого проводят опыты с ALS, например, в микротитровальных пластинках с 9б-выемками, применяя модификацию процедуры, описанной в статье Ray, (1984), Plant Physiol., 75, 827-831. Реакционная смесь содержит предпочтительно 2 0 мМ буфера из фосфата калия с рН 7,0, 20 мМ пирувата натрия, 0,45 мМ тиамин-пирофосфата, 0,45 мМ МдС1г, 9 мкМ FAD, ALS энзим и различные концентрации ALS ингибиторов в конечном объеме около 90 мкл.
Опыты инициируют добавлением энзима и заканчивают через предпочтительно 7 5 минут инкубирования при температуре 30°С путем добавления 40 мкл 0,5 М H2SO4. После выдерживания около 60 минут при комнатной температуре добавляют около 8 0 мкл раствора 1,4% а-нафтола и 0,14% креатина в 0,7 М NaOH и дополнительно инкубируют около 4 5 минут при комнатной температуре, определяют поглощение при длине волны 540 нм. р150-значения для ингибирования ALS определяют, как описано в статье Ray, (1984), Plant Physiol., 75, 827-831, используя программу для совпадения кривой XLFit Excel add-in version 4.3.1 фирмы ID Business Solutions Limited, Guildford, Великобритания.
В том случае, когда используют растения, ALS активность
предпочтительно определяют в экстрактах клеток или экстрактах
листьев дикого типа и в экстрактах клеток или экстрактах листьев
полученного мутанта В. vulgaris в присутствии различных
концентраций ALS ингибиторных гербицидов, предпочтительно
сульфонилмочевинных гербицидов или сульфониламинокарбонил-
триазолиноновых гербицидов, более предпочтительно в присутствии
различных концентраций ALS ингибиторного гербицида
"форамсульфурона". ALS предпочтительно экстрагируют из листьев сахарной свеклы или из культур тканей сахарной свеклы, как описано в статье Ray, (1984), Plant Physiol., 75, 827-831.
Предпочтительно, чтобы растения В. vulgaris данного изобретения были менее чувствительными к ALS ингибиторам, предпочтительно, как минимум, в 100 раз менее чувствительны, более предпочтительно, в 500 раз, еще более предпочтительно в 1000 раз и наиболее предпочтительно в 2000 раз. Менее чувствительно, как используется здесь, наоборот может рассматриваться, как "более толерантно" или "более устойчиво". Аналогично, "более толерантное" или "более устойчивое" можно наоборот рассматривать, как "менее чувствительное".
Например, растения В. vulgaris данного изобретения и, в частности, растения В. Vulgaris, описанные в примерах
приложения, являются/является, как минимум, в 2000 раз менее чувствительным к ALS ингибиторному гербициду формасульфурону (представитель ALS ингибиторного подкласса "сульфонилмочевинные гербициды") по сравнению с энзимами дикого типа.
Предпочтительно растения В. vulgaris данного изобретения менее
чувствительны к различным представителям ALS ингибиторных
гербицидов, подобным сульфонилмочевинным гербицидам,
сульфониламино-карбонилтриазолиноновым гербицидам и
имидазолиноновым гербицидам. Сульфонилмочевинные гербициды и сульфониламино-карбонилтриазолиноновые гербициды, по отношению к которым указанные растения менее чувствительны, предпочтительно выбирают. В более предпочтительном варианте изобретения, растения В. vulgaris данного изобретения менее чувствительны к ALS ингибиторному гербициду форамсульфурону (сульфонилмочевинный гербицид) или к одному или к комбинации с одним или более ALS ингибиторных гербицидов или из подкласса сульфонилмочевинных гербицидов или любого другого подкласса ALS ингибиторных гербицидов.
Следовательно, растения В. vulgaris данного изобретения, которые предпочтительно менее чувствительны к ALS ингибиторному гербициду можно таким же образом охарактеризовать, как "более толерантные к ALS ингибитору" (то есть растения, толерантные к ALS ингибитору).
Таким образом, растение "толерантное к ALS ингибитору" представляет собой растение, в частности, растение В. vulgaris, которое более толерантно к, как минимум, одному ALS ингибиторному гербициду на уровне, при котором он нормально ингибирует рост нормального растения дикого типа, предпочтительно ALS ингибиторный гербицид контролирует растения нормального или дикого типа. Указанные растения нормального или дикого типа не включают в нуклеотидной последовательности никаких аллелей эндогенного ALS гена, кодона, кодирующего
аминокислоту, отличную от триптофана в позиции, соответствующей позиции 1705-1707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS гена, показанной в последовательности SEQ ID NO: 1.
Указанная нуклеотидная последовательность может быть вообще также охарактеризована как нуклеотидная последовательность "толерантная к ALS ингибиторному гербициду". Под "нуклеотидной последовательностью толерантной к ALS ингибиторному гербициду" подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, которая включает нуклеотидную последовательность, содержащую, как минимум, одну мутацию, которая проявляется кодоном, кодирующим аминокислоту, отличную от триптофана, относительно ALS белка, который не содержит в позиции, соответствующей позиции 569 аминокислотной последовательности В. vulgaris ALS белка, показанной в SEQ ID NO: 2 аминокислоту, отличную от триптофана, в которой указанная, как минимум, одна мутация выражается в экспрессии, как минимум, одного ALS белка, чувствительного к ALS ингибиторному гербициду. Под "толерантным к гербициду ALS белком" подразумевается, что ALS белок проявляет более высокую ALS активность по сравнению с ALS активностью дикого типа ALS белка в присутствии, как минимум, одного ALS ингибиторного гербицида, для которого известно, что он вредит ALS активности, и при концентрации или уровне указанного гербицида, для которых известно, что они ингибируют ALS активность ALS белка дикого типа.
Аналогично, термины "ALS-ингибиторный(ые) гербицид(ы)" или просто "ALS-ингибитор(ы)" используются взаимозаменяемо. Как используется здесь, "ALS-ингибиторный гербицид" или "ALS-ингибитор" не означает ограничения одним гербицидом, который воздействует на активность ALS энзима. Так, если особо не оговорено или не следует из контекста, "ALS-ингибиторный гербицид" или "ALS-ингибитор" может быть одним гербицидом или смесью двух, трех, четырех или более гербицидов, известных специалистам, предпочтительно, как специализировано здесь, каждый из них воздействует на активность ALS энзима.
Неожиданно было обнаружено, что даже единственная точка мутации согласно данному изобретению предоставляет агрономически полезные и стабильные уровни толерантности к ALS ингибиторным гербицидам растений В. vulgaris, а также их ростков, в частности, если установлена гомозиготность. По сравнению с толерантными к гербицидам растениями Beta vulgaris той же самой генетической основы, у которых присутствует только гетерозиготно такая мутация, толерантные к гербицидам растения Beta vulgaris, которые являются гомозиготными для мутации, показывают лучший агрономический уровень толерантности к ALS ингибиторному гербициду.
Поэтому, данное изобретение относится к толерантному к ALS ингибиторному гербициду Beta vulgaris растению, имеющему мутацию эндогенного ацетолактатсинтазы (ALS) гена, в котором ALS ген кодирует ALS полипептид, содержащий аминокислоту, которая отлична от триптофана в позиции 569 ALS полипептида. Соответствующая мутация может быть представлена гетерозигозно, и предпочтительно может быть единственной мутацией ALS гена. Более предпочтительно соответствующая мутация может быть гомозиготной, и еще более предпочтительно соответствующая мутация является гомозиготной, представленной в виде единственной мутации эндогенного ALS гена.
Оказалось совсем неожиданным, что достаточно только одной единичной мутации ALS гена в Beta vulgaris, поскольку, например, в W0 2010/037061 указано, что необходимы двойные или тройные мутанты в ALS гене, для того чтобы создать агрономически полезную толерантность к ALS ингибиторным гербицидам.
Следовательно, растения В. vulgaris и их части, которые являются гетерозиготными, менее предпочтительны для мутации, но также охватываются данным изобретением и могут быть достаточными для некоторых схем применения и/или некоторых условий окружающей среды. Также данным изобретением охватываются растения,
содержащие, как минимум, в одном аллеле эндогенного ALS гена один кодон, кодирующий аминокислоту, отличную от триптофана, предпочтительно лейцин в позиции, соответствующей позиции 17051707 нуклеотидной последовательности В. vulgaris ALS гена, показанной в SEQ ID NO: 1, и содержащую один (в случае диплоидии) или более других аллелей (в случае полиплоидии), имеющих одну или более других мутаций в эндогенном ALS гене.
Соответственно, в том случае, когда здесь используют термин "гетерозиготно" или "гетерозиготный", это означает, что растение данного изобретения имеет различные аллели в определенных местах, в частности, в определенных местах ALS гена.
"Гомозиготно" или "гомозиготный" указывает на то, что растение данного изобретения имеет две копии одного и того же аллеля в разных прядях ДНК спирали, в частности, в месте (локусе) ALS гена.
Как использовано здесь, если четко по-другому не оговорено, термин "растение" имеет в виду растение на любой стадии развития.
Предпочтительно, когда растение Beta vulgaris данного
изобретения является ортоплоидным или анортоплоидным.
Ортоплоидное растение может предпочтительно быть гаплоидным,
диплоидным, тетраплоидным, гексаплоидным, октаплоидным,
декаплоидным или додекаплоидным, в то время как анортоплоидное растение может быть предпочтительно триплоидным или пентаплоидным.
Части растения могут быть присоединены к или отделены от всего не поврежденного растения. Такие части растения включают, но не ограничиваются ими, органы, ткани и клетки растения, и предпочтительно семена.
Соответственно, растение В. vulgaris данного изобретения является не трансгенным по отношению к эндогенному ALS гену. Действительно, чужие гены могут быть перенесены в растение путем генетической инженерии или обычными способами, такими как скрещивание. Указанные гены могут быть генами, придающими толерантность к гербицидам, предпочтительно придающие толерантность к гербицидам, отличную от толерантности к ALS ингибиторным гербицидам, гены улучшающие урожайность, гены улучшающие устойчивость к биологическим организмам и/или гены относящиеся к модификации содержания.
Другой аспект данного изобретения относится к способу получения растения Beta vulgaris и его частей, который включает следующие стадии:
(a) экспонирование каллюсов, предпочтительно из сахарной свеклы, в присутствии около 1СГ7 М - 1СГ9 М ALS ингибиторного гербицида, предпочтительно форамсульфурона;
(b) отбор колоний клеток, которые могут расти в присутствии примерно до 3 х 1СГ6 М одного ALS ингибиторного гербицида, предпочтительно форамсульфурона [CAS RN 173159-57-4];
(c) регенерирование ростков в присутствии ALS ингибиторного гербицида, предпочтительно форамсульфурона;
(d) отбор регенерированных растеньиц с помощью ALS ингибиторного гербицида, предпочтительно форамсульфурона, йодсульфурон-метил-натрия [CAS RN 144550-36-7] и/или смеси обоих, в которой доза форамсульфурона предпочтительна эквивалентна 77 0 г а.в./га и доза йодсульфурон-метил-натрия предпочтительно эквивалентна 1-10 г а.в./га (а.в. = активное вещество).
В другом аспекте регенерированные растеньица, полученные согласно приведенным выше стадиям (а) - (d), могут применяться для дальнейшего получения растений Beta vulgaris при использовании следующих стадий (е) - (т):
(e) вегетативное микроразмножение отдельных растеньиц со стадии (d) для освобождения различных положительных вариантов путем установления клеточной линий (клонов) для каждого растеньица, толерантного к ALS ингиторному гербициду;
(f) длительное хранение каждого установленного клона в вегетативном состоянии;
(д) перенос клонированных растений каждого клона из места длительного хранения в теплицу;
(h) яровизация и адаптация в яровизационных камерах для
индуцирования цветения;
(i) перенос яровизированных растений в помещения, где происходит
рост (контролируется температура и освещение);
(j) отбор лучших по выделению пыльцы растений среди лучших цветущих клонов для скрещивания с выхолощенными растениями элитной, но чувствительной к ALS ингибиторным гербицидам линии, для того чтобы избежать отрицательного воздействия сомаклональной вариации на генеративную фертильность (плодовитость) (мужскую и женскую) растеньиц со стадии (d);
(к) обратное скрещивание с элитной линией, как только фертильность будет восстановлена и, наконец, доведение самих гетерозиготных растений до достижения гомозиготного состояния;
(1) производство тестовых скрещиваний с партнером, чувствительным к ALS ингибиторным гербицидам, и собственных семян каждой линии с обратным скрещиванием для полевых оценок;
(т) применение агрохимически приемлемой дозы различных ALS ингибиторных гербицидов, для того чтобы выбрать лучшую преобразованную линию, предпочтительно в ее гомозиготном состоянии.
Линии, полученные согласно приведенным выше стадиям (а) - (т), образуют основу для развития коммерческих многообразий, следуя процедурам, которые известны в сообществе, занимающемся размножением, и поддержаны молекулярной техникой размножения
(такой как, поддерживаемое маркером размножение или поддерживаемая маркером селекция) для ускорения процесса и обеспечения правильной селекции растений, для того чтобы или получить мутацию в ее гомозиготной форме, или в случае, когда содержится одна или более мутаций в различных местах ALS кодирующего эндогенного гена, провести правильную селекцию гетерозиготных растений, которые содержат, как минимум, в одном из аллелей W569 мутацию согласно данному изобретению. (Для обзора смотри Bertrand C.Y. и др., (2008), Phil. Trans. R. Soc, В., 363, 557-572).
Каллюсы получают средствами и способами, которые общеизвестны специалистам, например, как описано в прилагаемых примерах.
Семена, которые были получены на приведенной выше стадии (т) , находятся на хранении в NCIMB, Aberdeen, Великобритания, под номером NCIMB 417 05.
Другой аспект данного изобретения относится к способу получения толерантных к гербициду Beta vulgaris растения и его частей, который включает (i) мутацию эндогенного гена ацетолактат-синтазы (ALS), при которой ALS ген кодирует ALS полипептид, содержащий аминокислоту, которая отлична от триптофана, в позиции 5 69 ALS полипептида, и (ii) дополнительную мутацию в эндогенном ALS гене, включающую следующие стадии:
(a) получение толерантного к ALS ингибиторному гербициду
растения Beta vulgaris, которое включает одну мутацию
эндогенного гена ацетолактатсинтазы (ALS), в котором
ALS ген кодирует ALS полипептид, который содержит
аминокислоту, отличную от триптофана, в позиции 569
ALS полипептида (родитель А);
(b) скрещивание родителя А с растением Beta vulgaris
(родитель В) , которое включает одну или более других
мутаций в эндогенном ALS гене в позиции, отличной от аминокислотной позиции 5 69;
(c) получение потомства Beta vulgaris, которое является гетерозиготным для мутации ALS гена в аминокислотной позиции 5 69 и для одной или более других мутаций ALS гена, кодируемых родителем В;
(d) в которых процесс размножения контролируется
(i) применением маркера, поддерживающего размножение, и/или техники микропоследовательностей, и/или
(ii) применение агрономически приемлемых доз одного или более ALS ингибиторных гербицидов, к которым потомство, созданное согласно стадии (с) , является толерантным.
Соответственно, предусмотрено, что данное изобретение также относится к растениям В. Vulgaris, которые получают приведенными выще способами получения.
В одном не ограничивающем примере растения сахарной свеклы данного изобретения получают, осуществляя следующий не ограничивающий протокол. Не связанный с теорией тот же протокол можно применять для получения растений В. Vulgaris, отличных от сахарной свеклы.
Клеточные культуры сахарной свеклы были инициированы из ростков диплоидной сахарной свеклы генотипа 7Т9044 (как описано, например, в реферате Alexander Dovzhenko, PhD Thesis, Title: "Towards plastid transformation in rapeseed (Brassica napus L.) and sugarbeet (Beta vulgaris L.)", Ludwig-Maximilians-Universitat Mtinchen, Германия, 2001) .
Семена сахарной свеклы погружают на 60 секунд в 7 0-процентный этанол, затем дважды промывают стерильной водой с 0,01% детергента и после этого инкубируют в течение 1-4 часов в 1-процентном NaOCl отбеливателе. Затем семена промывают 3 раза
стерильной Н20 и семена сохраняют в стерильной воде в течение ночи при температуре 4°С. Эмбрионы выделяют, используя пинцет и скальпель.
Свежеприготовленные эмбрионы гк 3 0 минут и затем промывают последней стадии промывания их MS агаровую среду (Murashige и 15, 473-497). Такие эмбрионы, ростки, были использованы i культур сахарной свеклы.
> мещают в 0,5-процентный NaOCl на 3 раза стерильной водой. После помещают в свободную от гормонов Skoog (1962), Physiol. Plantarum, которые развиваются в стерильные ля инициирования регенерируемых
Семядоли, а также гипокотили были разрезаны на сегменты длиной 2-5 мм и затем были культивированы на агаровой (0,8%) отвержденной MS среде, содержащей или 1 мг/л бензиламинопурина (ВАР), или 0,25 мг/л тидиазурона (TDZ). Спустя 4 недели, развившиеся ростковые культуры были перенесены на свежую агаровую среду того же состава и затем меняли культуру с месячным интервалом. Культуры выдерживали при температуре 25 °С при сумеречном свете с циклом 12 час/12 час светло/темно.
После проведения 7-10 смен среды ростковые культуры, которые выращивались на среде, содержащей тидиазурон, сформировался явный тип каллюса, который быстро рос, был мягким и рыхлым. Цвет этого типа каллюса был желтоватый до слегка зеленого. Некоторые из этих рыхлых каллюсов сообразно производили хлорофилл, содержащий исходные ростковые подобные эмбриону структуры. Эти быстро растущие регенерируемые каллюсы были использованы для селекции мутантов сахарной свеклы, толерантных к ALS ингибиторным гербицидам.
Когда этот тип каллюса подвергали экспозиции с 10~9 М сульфонилмочевины форамсульфурона (CAS RN 173159-57-4), клетки выжили, однако произвели менее чем 50% от той биомассы, которую дали их близнецы в среде, которая не содержала ингибитора. В
среде, которая содержала 3 х 1СГ8 М форамсульфурона не было обнаружено никакого роста. Для широкой шкалы экспериментов по селекции мутантов была выбрана концентрация 1СГ7 М форамсульфурона. Колонии выживших и растущих клеток пронумеровывают и переносят по прохождении 4-6 недель на свежую среду, содержащую 3 х 1СГ7 М ингибитора. Одна из этих клеточных колоний была способна расти не только при этой концентрации ингибитора, но даже в присутствии 3 х 1СГ6 М форамсульфурона. Из этого клона (SB574TL), ростки были регенерированы в присутствии ALS-ингибиторных гербицидов и затем ростки были перенесены в MS среду, содержащую 0,05 мг/л нафталинуксусной кислоты (NAA).
В течение 4-12 недель ростки формируют стебли, и после этого их переносят в стерильные контейнеры для растений, заполненные влажным, стерилизованным перлитом, поливают в половину силы MS неорганическими ингредиентами. Альтернативно, ростки переносят напрямую из агаровой твердой среды в почвенную смесь, содержащую перлит, в теплицу. В течение первых 10-15 дней после переноса в почву, содержащую субстрат, растения выдерживают в окружении с высокой влажностью воздуха. Во время этого и после этого, когда их выдерживают при нормальных условиях влажности в теплице, растения выдерживают в парнике при искусственном освещении (12 часов) при температуре 20 +-3°С/ 15+-2°С день/ночь.
Спустя 3-5 недель, регенерированные растения, от полученных выше толерантных к форамсульфурону клеточных культур (SB574TL), а также от дикого типа клеточных культур обрабатывают форамсульфуроном, йодсульфурон-метил-натрием (CAS RN 144550-3-7) и смесью обоих этих активных веществ. Тестируемые гербицидные дозы были эквивалентны 7-70 г а.в./га для форамсульфурона и 1-10 г а.в./га для йодсульфурон-метил-натрия. Регенерированные растения и этой линии клеток были толерантны даже при самой высокой дозе гербицида (форамсульфурон, йодсульфурон-метил-натрий и их смеси в соотношении 7:1), тогда как самые низкие дозы уже убивали растения дикого типа.
Ростки тестируют следующим образом (не ограничивающим путем):
Основываясь на линии SB574TL, F2 и F3 семена экспериментальных
гибридов, включающих устойчивые аллели в гетерозиготном
состоянии, а также F4-F6 семена, содержащие мутантные аллели в
гомозиготном состоянии были посеяны в поле и обработаны
форамсульфуроном, йодсульфурон-метил-натрием, а также смесью
обоих ALS ингибиторных гербицидов, когда в растениях развились
3-5 розеточных листочков. Гомозиготные сеянцы оказались
толерантными к смеси 35 г форамсульфурона/га + 7 г
йодсульфурон-метил-натрия/га без остановки роста или любых видимых признаков повреждения. В некоторых случаях гетерозиготные линии обнаружили признаки остановки роста и некоторый хлороз листьев при этих расходных количествах, но они восстановились в течение 3-5 недель, тогда как обычные ростки сахарной свеклы были убиты ALS ингибиторными гербицидами.
ALS мутанты были охарактеризованы следующим образом: Экстракция и анализ последовательности нуклеиновых кислот полученного мутанта был проведен фирмой LGC Genomics GmbH, Berlin, Германия, согласно исправленным стандартным протоколам. Последовательность нуклеиновых кислот, полученная для мутанта сахарной свеклы SB574TL показана в последовательности SEQ ID N0: 3. Последовательность SEQ ID N0: 4 представляет соответствующую аминокислотную последовательность, тогда как последовательность SEQ ID N0: 1 была получена после установления последовательности для дикого типа растения сахарной свеклы, которая была взята в качестве исходного материала. Последовательность SEQ ID N0: 2 представляет соответствующую аминокислотную последовательность дикого типа сахарной свеклы.
Сравнение всех этих последовательностей показывает, что существует только одна мутация в позиции 57 4, но не существует никаких других изменений в любой другой части этого эндогенного ALS гена.
Последовательность SEQ ID No1 (1)
ATGGCGGCTACCTTCACAAACCCAACATTTTCCCCTTCCTCAACTCCATTAACCAAAACC
Последовательность SEQ ID No 3
(1)
ATGGCGGCTACCTTCACAAACCCAACATTTTCCCCTTCCTCAACTCCATTAACCAAAACC
Последовательность SEQ ID No1 (61)
CTAAAATCCCAATCTTCCATCTCTTCAACCCTCCCCTTTTCCACCCCTCCCAAAACCCCA
Последовательность SEQ ID No 3
(61)
CTAAAATCCCAATCTTCCATCTCTTCAACCCTCCCCTTTTCCACCCCTCCCAAAACCCCA
Последовательность SEQ ID No 1 (121)
ACTCCACTCTTTCACCGTCCCCTCCAAATCTCATCCTCCCAATCCCACAAATCATCCGCC
Последовательность SEQ ID No 3
(121)
ACTCCACTCTTTCACCGTCCCCTCCAAATCTCATCCTCCCAATCCCACAAATCATCCGCC
Последовательность SEQ ID No 1 (181)
ATTAAAACACAAACTCAAGCACCTTCTTCTCCAGCTATTGAAGATTCATCTTTCGTTTCT
Последовательность SEQ ID No 3
(181)
ATTAAAACACAAACTCAAGCACCTTCTTCTCCAGCTATTGAAGATTCATCTTTCGTTTCT
Последовательность SEQ ID No1 (241)
CGATTTGGCCCTGATGAACCCAGAAAAGGGTCCGATGTCCTCGTTGAAGCTCTTGAGCGT
Последовательность SEQ ID No 3
(241)
CGATTTGGCCCTGATGAACCCAGAAAAGGGTCCGATGTCCTCGTTGAAGCTCTTGAGCGT
Последовательность SEQ ID No1 (301)
GAAGGTGTTACCAATGTGTTTGCTTACCCTGGTGGTGCATCTATGGAAATCCACCAAGCT
Последовательность SEQ ID No 3 (301)
GAAGGTGTTACCAATGTGTTTGCTTACCCTGGTGGTGCATCTATGGAAATCCACCAAGCT
Последовательность SEQ ID No1 (361)
CTCACACGCTCTAAAACCATCCGCAATGTCCTCCCTCGCCATGAACAAGGCGGGGTTTTC
Последовательность SEQ ID No 3
(361)
CTCACACGCTCTAAAACCATCCGCAATGTCCTCCCTCGCCATGAACAAGGCGGGGTTTTC
Последовательность SEQ ID No1 (421)
GCCGCCGAGGGATATGCTAGAGCTACTGGAAAGGTTGGTGTCTGCATTGCGACTTCTGGT
Последовательность SEQ ID No 3
(421)
GCCGCCGAGGGATATGCTAGAGCTACTGGAAAGGTTGGTGTCTGCATTGCGACTTCTGGT
Последовательность SEQ ID No1 (481)
CCTGGTGCTACCAACCTCGTATCAGGTCTTGCTGACGCTCTCCTTGATTCTGTCCCTCTT
Последовательность SEQ ID No 3
(481)
CCTGGTGCTACCAACCTCGTATCAGGTCTTGCTGACGCTCTCCTTGATTCTGTCCCTCTT
Последовательность SEQ ID No1 (541)
GTTGCCATCACTGGCCAAGTTCCACGCCGTATGATTGGCACTGATGCTTTTCAGGAGACT
Последовательность SEQ ID No 3
(541)
GTTGCCATCACTGGCCAAGTTCCACGCCGTATGATTGGCACTGATGCTTTTCAGGAGACT
Последовательность SEQ ID No1 (601)
CCAATTGTTGAGGTGACAAGGTCTATTACTAAGCATAATTATTTAGTTTTGGATGTAGAG
Последовательность SEQ ID No 3
(601)
CCAATTGTTGAGGTGACAAGGTCTATTACTAAGCATAATTATTTAGTTTTGGATGTAGAG
Последовательность SEQ ID No1 (661)
GATATTCCTAGAATTGTTAAGGAAGCCTTTTTTTTAGCTAATTCTGGTAGGCCTGGACCT
Последовательность SEQ ID No 3
(661)
GATATTCCTAGAATTGTTAAGGAAGCCTTTTTTTTAGCTAATTCTGGTAGGCCTGGACCT
Последовательность SEQ ID No1 (721)
GTTTTGATTGATCTTCCTAAAGATATTCAGCAGCAATTGGTTGTTCCTGATTGGGATAGG
Последовательность SEQ ID No 3
(721)
GTTTTGATTGATCTTCCTAAAGATATTCAGCAGCAATTGGTTGTTCCTGATTGGGATAGG
Последовательность SEQ ID No1 (781)
CCTTTTAAGTTGGGTGGGTATATGTCTAGGCTGCCAAAGTCCAAGTTTTCGACGAATGAG
Последовательность SEQ ID No 3
(781)
CCTTTTAAGTTGGGTGGGTATATGTCTAGGCTGCCAAAGTCCAAGTTTTCGACGAATGAG
Последовательность SEQ ID No1 (841)
GTTGGACTTCTTGAGCAGATTGTGAGGTTGATGAGTGAGTCGAAGAAGCCTGTCTTGTAT
Последовательность SEQ ID No 3
(841)
GTTGGACTTCTTGAGCAGATTGTGAGGTTGATGAGTGAGTCGAAGAAGCCTGTCTTGTAT
Последовательность SEQ ID No1 (901)
GTGGGAGGTGGGTGTTTGAATTCTAGTGAGGAGTTGAGGAGATTTGTTGAGTTGACAGGG
Последовательность SEQ ID No 3
(901)
GTGGGAGGTGGGTGTTTGAATTCTAGTGAGGAGTTGAGGAGATTTGTTGAGTTGACAGGG
Последовательность SEQ ID No1 (961)
ATTCCGGTGGCTAGTACTTTGATGGGGTTGGGGTCTTACCCTTGTAATGATGAACTGTCT
Последовательность SEQ ID No 3 (961)
ATTCCGGTGGCTAGTACTTTGATGGGGTTGGGGTCTTACCCTTGTAATGATGAACTGTCT
Последовательность SEQ ID No1 (1021)
CTTCATATGTTGGGGATGCACGGGACTGTTTATGCCAATTATGCGGTGGATAAGGCGGAT
Последовательность SEQ ID No 3
(1021)
CTTCATATGTTGGGGATGCACGGGACTGTTTATGCCAATTATGCGGTGGATAAGGCGGAT
Последовательность SEQ ID No1 (1081)
TTGTTGCTTGCTTTCGGGGTTAGGTTTGATGATCGTGTGACCGGGAAGCTCGAGGCGTTT
Последовательность SEQ ID No 3
(1081)
TTGTTGCTTGCTTTCGGGGTTAGGTTTGATGATCGTGTGACCGGGAAGCTCGAGGCGTTT
Последовательность SEQ ID No1 (1141)
GCTAGCCGTGCTAAGATTGTGCATATTGATATTGACTCTGCTGAGATTGGGAAGAACAAG
Последовательность SEQ ID No 3
(1141)
GCTAGCCGTGCTAAGATTGTGCATATTGATATTGACTCTGCTGAGATTGGGAAGAACAAG
Последовательность SEQ ID No1 (1201)
CAGCCCCATGTGTCCATTTGTGCTGATGTTAAATTGGCATTGCGGGGTATGAATAAGATT
Последовательность SEQ ID No 3
(1201)
CAGCCCCATGTGTCCATTTGTGCTGATGTTAAATTGGCATTGCGGGGTATGAATAAGATT
Последовательность SEQ ID No1 (1261)
CTGGAGTCTAGAATAGGGAAGCTGAATTTGGATTTCTCCAAGTGGAGAGAAGAATTAGGT
Последовательность SEQ ID No 3
(1261)
CTGGAGTCTAGAATAGGGAAGCTGAATTTGGATTTCTCCAAGTGGAGAGAAGAATTAGGT
Последовательность SEQ ID No1 (1321)
GAGCAGAAGAAGGAATTCCCACTGAGTTTTAAGACATTTGGGGATGCAATTCCTCCACAA
Последовательность SEQ ID No 3
(1321)
GAGCAGAAGAAGGAATTCCCACTGAGTTTTAAGACATTTGGGGATGCAATTCCTCCACAA
Последовательность SEQ ID No1 (1381)
TATGCCATTCAGGTGCTTGATGAGTTGACCAATGGTAATGCTATTATAAGTACTGGTGTT
Последовательность SEQ ID No 3
(1381)
TATGCCATTCAGGTGCTTGATGAGTTGACCAATGGTAATGCTATTATAAGTACTGGTGTT
Последовательность SEQ ID No1 (1441)
GGGCAGCACCAAATGTGGGCTGCGCAGCATTACAAGTACAGAAACCCTCGCCAATGGCTG
Последовательность SEQ ID No 3
(1441)
GGGCAGCACCAAATGTGGGCTGCGCAGCATTACAAGTACAGAAACCCTCGCCAATGGCTG
Последовательность SEQ ID No1 (1501)
ACCTCTGGTGGGTTGGGGGCTATGGGGTTTGGGCTACCAGCCGCCATTGGAGCTGCAGTT
Последовательность SEQ ID No 3
(1501)
ACCTCTGGTGGGTTGGGGGCTATGGGGTTTGGGCTACCAGCCGCCATTGGAGCTGCAGTT
Последовательность SEQ ID No1 (1561)
GCTCGACCAGATGCAGTGGTTGTCGATATTGATGGGGATGGCAGTTTTATTATGAATGTT
Последовательность SEQ ID No 3
(1561)
GCTCGACCAGATGCAGTGGTTGTCGATATTGATGGGGATGGCAGTTTTATTATGAATGTT
Последовательность SEQ ID No1 (1621)
CAAGAGTTGGCTACAATTAGGGTGGAAAATCTCCCAGTTAAGATAATGCTGCTAAACAAT
Последовательность SEQ ID No 3 (1621)
CAAGAGTTGGCTACAATTAGGGTGGAAAATCTCCCAGTTAAGATAATGCTGCTAAACAAT
Последовательность SEQ ID No1 (1681)
CAACATTTAGGTATGGTTGTCCAATGGGAAGATAGGTTCTATAAAGCTAACCGGGCACAT
Последовательность SEQ ID No 3
(1681)
CAACATTTAGGTATGGTTGTCCAATTGGAAGATAGGTTCTATAAAGCTAACCGGGCACAT
Последовательность SEQ ID No1 (1741)
ACATACCTTGGAAACCCTTCCAAATCTGCTGATATCTTCCCTGATATGCTCAAATTCGCT
Последовательность SEQ ID No 3
(1741)
ACATACCTTGGAAACCCTTCCAAATCTGCTGATATCTTCCCTGATATGCTCAAATTCGCT
Последовательность SEQ ID No1 (1801)
GAGGCATGTGATATTCCTTCTGCCCGTGTTAGCAACGTGGCTGATTTGAGGGCCGCCATT
Последовательность SEQ ID No 3
(1801)
GAGGCATGTGATATTCCTTCTGCCCGTGTTAGCAACGTGGCTGATTTGAGGGCCGCCATT
Последовательность SEQ ID No1 (1861)
CAAACAATGTTGGATACTCCAGGGCCGTACCTGCTCGATGTGATTGTACCGCATCAAGAG
Последовательность SEQ ID No 3
(1861)
CAAACAATGTTGGATACTCCAGGGCCGTACCTGCTCGATGTGATTGTACCGCATCAAGAG
Последовательность SEQ ID No1 (1921)
CATGTGTTGCCTATGATTCCAAGTGGTGCCGGTTTCAAGGATACCATTACAGAGGGTGAT
Последовательность SEQ ID No 3
(1921)
CATGTGTTGCCTATGATTCCAAGTGGTGCCGGTTTCAAGGATACCATTACAGAGGGTGAT
Последовательность SEQ ID No1 (1981)
GGAAGAACCTCTTATTGA Последовательность SEQ ID No 3 (1981)
GGAAGAACCTCTTATTGA
Последовательность SEQ ID No. 2 (1)
MAATFTNPTFSPSSTPLTKTLKSQSSISSTLPFSTPPKTPTPLFHRPLQISSSQSHKSSA
Последовательность SEQ ID No.4
(1)
MAATFTNPTFSPSSTPLTKTLKSQSSISSTLPFSTPPKTPTPLFHRPLQISSSQSHKSSA
Последовательность SEQ ID No. 2 (61)
IKTQTQAPSSPAIEDSSFVSRFGPDEPRKGSDVLVEALEREGVTNVFAYPGGASMEIHQA Последовательность SEQ ID No.4 (61)
IKTQTQAPSSPAIEDSSFVSRFGPDEPRKGSDVLVEALEREGVTNVFAYPGGASMEIHQA
Последовательность SEQ ID No. 2 (121)
LTRSKTIRNVLPRHEQGGVFAAEGYARATGKVGVCIATSGPGATNLVSGLADALLDSVPL
Последовательность SEQ ID No.4
(121)
LTRSKTIRNVLPRHEQGGVFAAEGYARATGKVGVCIATSGPGATNLVSGLADALLDSVPL
Последовательность SEQ ID No. 2 (181)
VAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVLDVEDIPRIVKEAFFLANSGRPGP
Последовательность SEQ ID No.4
(181)
VAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVLDVEDIPRIVKEAFFLANSGRPGP
Последовательность SEQ ID No. 2 (241)
VLIDLPKDIQQQLWPDWDRPFKLGGYMSRLPKSKFSTNEVGLLEQIVRLMSESKKPVLY
Последовательность SEQ ID No.4 (241)
VLIDLPKDIQQQLWPDWDRPFKLGGYMSRLPKSKFSTNEVGLLEQIVRLMSESKKPVLY
Последовательность SEQ ID No. 2 (301)
VGGGCLNSSEELRRFVELTGIPVASTLMGLGSYPCNDELSLHMLGMHGTVYANYAVDKAD
Последовательность SEQ ID No.4
(301)
VGGGCLNSSEELRRFVELTGIPVASTLMGLGSYPCNDELSLHMLGMHGTVYANYAVDKAD
Последовательность SEQ ID No. 2 (361)
LLLAFGVRFDDRVTGKLEAFASRAKIVHIDIDSAEIGKNKQPHVSICADVKLALRGMNKI
Последовательность SEQ ID No.4
(361)
LLLAFGVRFDDRVTGKLEAFASRAKIVHIDIDSAEIGKNKQPHVSICADVKLALRGMNKI
Последовательность SEQ ID No. 2 (421)
LESRIGKLNLDFSKWREELGEQKKEFPLSFKTFGDAIPPQYAIQVLDELTNGNAIISTGV
Последовательность SEQ ID No.4
(421)
LESRIGKLNLDFSKWREELGEQKKEFPLSFKTFGDAIPPQYAIQVLDELTNGNAIISTGV
Последовательность SEQ ID No. 2 (481)
GQHQMWAAQHYKYRNPRQWLTSGGLGAMGFGLPAAIGAAVARPDAWVDIDGDGSFIMNV Последовательность SEQ ID No.4 (481)
GQHQMWAAQHYKYRNPRQWLTSGGLGAMGFGLPAAIGAAVARPDAWVDIDGDGSFIMNV
Последовательность SEQ ID No. 2 (541)
QELATIRVENLPVKIMLLNNQHLGMWQWEDRFYKANRAHTYLGNPSKSADIFPDMLKFA
Последовательность SEQ ID No.4
(541)
QELATIRVENLPVKIMLLNNQHLGMWQLEDRFYKANRAHTYLGNPSKSADIFPDMLKFA
Последовательность SEQ ID No. 2 (601)
EACDIPSARVSNVADLRAAIQTMLDTPGPYLLDVIVPHQEHVLPMIPSGAGFKDTITEGD
Последовательность SEQ ID No.4
(601)
EACDIPSARVSNVADLRAAIQTMLDTPGPYLLDVIVPHQEHVLPMIPSGAGFKDTITEGD
Последовательность SEQ ID No. 2
(661)
GRTSY-
Последовательность SEQ ID No.4
(661)
GRTSY-
Однако, вообще предпочтительно, чтобы растения В. vulgaris данного изобретения и их части были пригодны для агрономического использования. "Агрономическое использование" означает, что растения В. vulgaris plants и их части являются полезными для агрономических целей. Например, растения В. vulgaris должны служить цели быть полезными для производства сахара, производства биотоплива (такого как производство биогаза, биобутанола и этанола), производства этанола, производства бетаина и/или уридина. Термин "агрономическое использование" в том случае, когда он применяется здесь, также включает, что растения В. vulgaris данного изобретения являются предпочтительно менее чувствительными к ALS ингибиторным гербицидам, предпочтительно, как минимум, в 100 раз менее чувствительными, более предпочтительно, как минимум, в 500 раз менее чувствительными, еще более предпочтительно, как минимум, в 1000 раз менее чувствительными и наиболее предпочтительно, как минимум, в 2 000 раз менее чувствительными. К ALS ингибиторным гербицидам относится один или более из описанных здесь, предпочтительно им является форамсульфурон сам по себе или в комбинации с одним или более другими ALS ингибиторными гербицидами или из подкласса сульфонилмочевинных гербицидов, или из любого другого подкласса ALS ингибиторных гербицидов, более
предпочтителен форамсульфурон в комбинации с другим сульфонилмочевинным гербицидом и/или ALS ингибитором из подкласса сульфониламинокарбонилтриазолинонов.
Предпочтительно агрономически используемые растения В. vulgaris, более предпочтительно растения сахарной свеклы данного изобретения являются полностью фертильными (плодовитыми), более предпочтительно имеют фертильность дикого типа. Фертильность является самым важным свойством растений В. vulgaris данного изобретения для того, чтобы быть агрономически используемыми.
Примером агрономически используемого растения В. vulgaris является сахарная свекла. Растения сахарной свеклы данного изобретения при культивировании на площади одного гектара дают урожай (около 80000 - 90000 сахарных свекол), из которого можно предпочтительно получить, как минимум, 4 тонны сахара.
Альтернативно, растение сахарной свеклы данного изобретения предпочтительно имеет содержание сахара 15-20%, предпочтительно, как минимум, 17% для того, чтобы быть агрономически используемым. Таким образом, растения сахарной свеклы, которые имеют содержание сахара 15-20%, предпочтительно, как минимум, 17%, являются предпочтительным воплощением данного изобретение.
Растения данного изобретения могут быть идентифицированы, используя любой способ генотипного анализа. Генотипное определение растений включает применение техники, такой как изоферментный электрофорез, полиморфизм ограниченных длин фрагментов (RFLPs), случайно расширенные полиморфные ДНК (RAPDs), произвольно проведенная полимеразная цепная реакция (AP-PCR), аллеле-зависимая полимеразная цепная реакция (AS-PCR), ДНК расширенные "отпечатки пальцев" (DAF), характеризуемые последовательностью расширенные области (SCARs), полиморфизм расширенных длин фрагментов (AFLPs), повторение простых последовательностей (SSRs), которое также обозначают как
"микросателлиты". Дополнительные композиции и способы для анализа генотипа растений, которые предусмотрены здесь, включают способы, открытые в патентах США U.S. No. 2004/0171027, U.S. No. 2005/02080506 и U.S. No. 2005/0283858.
Другим аспектом данного изобретения является применение растения Beta vulgaris, описанного здесь, и/или снимаемых в виде урожая частей растения или материала для размножения, описанного здесь, для получения/размножения растений Beta vulgaris. Способы получения/размножения растений В. vulgaris plants описаны здесь. Такие способы получения/размножения можно применять для создания растений В. vulgaris данного изобретения, которые дополнительно включают новые свойства растений, такие как толерантность к стрессам, таким как, но не ограничиваясь ими, стресс от засухи, жары, холода, или стресс от содержания соли в почве и тому подобные.
Еще один другой аспект данного изобретения предусматривает применение толерантных к гербицидам растений Beta vulgaris, которые описаны здесь, и/или снимаемых в виде урожая частей или материала для размножения, полученных из них, в способе отбора для селекции растений, толерантных к ALS ингибиторным гербицидам.
Лучше понимание данного изобретения и многих его преимуществ можно получить из следующих примеров, предлагаемых только для иллюстративных целей, но ни в коем случае никак не ограничивающих охват данного изобретения.
Пример 1: Выделение мутанта
Клеточные культуры сахарной свеклы были получены из рассады диплоидной сахарной свеклы генотипа 7Т9044 (как описано, например, в реферате Alexander Dovzhenko, PhD Thesis, Title: "Towards plastid transformation in rapeseed (Brassica napus L.)
and sugarbeet (Beta vulgaris L.)", Ludwig-Maximilians-Universitat Miinchen, Германия, 2001) .
Семена сахарной свеклы погружают на 60 секунд в 7 0-процентный этанол, затем дважды промывают стерильной водой с 0,01% детергента и после этого инкубируют в течение 1-4 часов в 1-процентном NaOCl отбеливателе. Затем семена промывают 3 раза стерильной Н20 и семена сохраняют в стерильной воде в течение ночи при температуре 4°С. Эмбрионы выделяют, используя пинцет и скальпель.
Свежеприготовленные эмбрионы помещают в 0,5-процентный NaOCl на 3 0 минут и затем промывают 3 раза стерильной НгО. После последней стадии промывания их помещают в свободную от гормонов MS агаровую среду (Murashige и Skoog (1962), Physiol. Plantarum, 15, 473-497). Такие эмбрионы, которые развиваются в стерильные сеянцы, были использованы для инициирования регенерируемых культур сахарной свеклы.
Семядоли, а также гипокотили были разрезаны на сегменты длиной 2-5 мм и затем были культивированы на агаровой (0,8%) отвержденной MS среде, содержащей или 1 мг/л бензиламинопурина (ВАР), или 0,25 мг/л тидиазурона (TDZ). Спустя 4 недели, развившиеся ростковые культуры были перенесены на свежую агаровую среду того же состава и затем получали субкультуру с месячным интервалом. Культуры выдерживали при температуре 25 °С при сумеречном свете с циклом 12 час/12 час светло/темно.
Через 7-10 дней субкультуры ростковых культур, которые выращивались на среде, содержащей тидиазурон, сформировали явный тип каллюса, который быстро рос, был мягким и рыхлым. Цвет этого типа каллюса был желтоватый до слегка зеленого. Некоторые их этих рыхлых каллюсов сообразно производили хлорофилл, содержащий исходные ростковые, подобные эмбриону структуры. Эти быстро растущие регенерируемые каллюсы были использованы для селекции
мутантов сахарной свеклы, толерантных к ALS ингибиторным гербицидам.
Когда этот тип каллюса подвергали экспозиции с 1СГ9 М ALS ингибиторного гербицида форамсульфурона (относящегося к подклассу сульфонилмочевин, смотри выше), клетки выжили, однако произвели менее чем 50% от той биомассы, которую дали их близнецы в среде, которая не содержала ингибитора. В среде, которая содержала 3 х 10~8 М форамсульфурона не было обнаружено никакого роста. Для широкой шкалы экспериментов по селекции мутантов была выбрана концентрация 10~7 М форамсульфурона. Колонии выживших и растущих клеток пронумеровывали и переносили по прохождении 4-6 недель на свежую среду, содержащую 3 х 10~7 М ингибитора. Одна из этих клеточных колоний была способна расти не только при этой концентрации ингибитора, но даже в присутствии 3 х 10~6 М форамсульфурона.
Из этого клона (SB574TL) ростки были регенерированы в присутствии ALS-ингибиторных гербицидов и затем ростки были перенесены в MS среду, содержащую 0,05 мг/л нафталинуксусной кислоты (NAA).
В течение 4-12 недель ростки формируют стебли, и после этого их переносят в стерильные контейнеры для растений, заполненные влажным, стерилизованным перлитом, поливают в половину силы MS неорганическими ингредиентами. Альтернативно, растеньица переносят напрямую из агаровой твердой среды в почвенную смесь, содержащую перлит, в теплицу. В течение первых 10-15 дней после переноса в почву, содержащую субстрат, растения выдерживают в окружении с высокой влажностью воздуха. Во время этого и после этого, когда их выдерживают при нормальных условиях влажности в теплице, растения выдерживают в парнике при искусственном освещении (12 часов) при температуре 20 +-3°С/ 15+-2°С день/ночь.
Спустя 3-5 недель, регенерированные растения от полученных выше толерантных к форамсульфурону клеточных культур (SB574TL), а также от дикого типа клеточных культур обрабатывают форамсульфуроном, йодсульфурон-метил-натрием (CAS RN 144550-3-7) и смесью обоих этих активных веществ. Тестируемые гербицидные дозы были эквивалентны 7-70 г а.в./га для форамсульфурона и 1-10 г а.в./га для йодсульфурон-метил-натрия. Регенерированные растения этой толерантной линии клеток были толерантны даже при самой высокой дозе гербицида (форамсульфурон, йодсульфурон-метил-натрий и их смеси в соотношении 7:1), тогда как уже самые низкие дозы убивали растения дикого типа.
Пример 2: Тестирование отпрысков
Основываясь на линии SB574TL, F2 и F3 семена экспериментальных
гибридов, включающих устойчивые аллели в гетерозиготном
состоянии, а также F4-F6 семена, содержащие мутантные аллели в
гомозиготном состоянии были посеяны в поле и обработаны
форамсульфуроном, йодсульфурон-метил-натрием, а также смесью
обоих ALS ингибиторных гербицидов, когда в растениях развились
3-5 розеточных листочков. Гомозиготные сеянцы оказались
толерантными к смеси 35 г форамсульфурона/га + 7 г
йодсульфурон-метил-натрия/га без остановки роста или любых видимых признаков повреждения. В некоторых случаях гетерозиготные линии обнаружили признаки остановки роста и некоторый хлороз листьев при этих расходных количествах, но они восстановились в течение 3-5 недель, тогда как обычные сеянцы сахарной свеклы были убиты ALS ингибиторными гербицидами.
Пример 3: Молекулярная характеристика полученного мутанта
сахарной свеклы (SB574TL)
Экстракция и анализ последовательности нуклеиновых кислот полученного мутанта был проведен фирмой LGC Genomics GmbH, Berlin, Германия, согласно исправленным стандартным протоколам.
Последовательность нуклеиновых кислот, полученная для мутанта сахарной свеклы SB574TL, показана последовательностью SEQ ID N0: 3, с последовательностью SEQ ID N0: 4, представляющей соответствующую аминокислотную последовательность, тогда как последовательность SEQ ID N0: 1 была получена после установления последовательности для дикого типа растения сахарной свеклы, которая была взята в качестве исходного материала. Последовательность SEQ ID N0: 2 представляет соответствующую аминокислотную последовательность дикого типа сахарной свеклы.
Сравнение всех этих последовательностей ясно показывает, что существует только одна мутация в позиции 57 4, но не существует никаких других изменений в любой другой части этого эндогенного ALS гена этого материала из растения сахарной свеклы.
Пример 4: Измерение активности энзима
Кодирующая последовательность Beta vulgaris дикого типа и W574L-мутантного (SB574TL) ALS генов были клонированы в Novagen рЕТ-32а(+) векторы и векторы трансформированы в Escherichia coli AD4 94 согласно инструкциям изготовителя. Бактерии выращивают при температуре 37°С в LB-среде (Luria-Broth-среде) , содержащей 100 мг/л карбенициллина и 25 мг/л канамицина, индуцированного 1 мМ изопропил-Ь-О-тиогалактопиранозида при поглощении ODeoo, равном 0,6, культивируют в течение 16 часов при температуре 18°С и выделяют урожай центрифугированием. Бактериальные пилюли ресуспендируют в 100 мМ буфере из фосфата натрия рН 7,0, содержащем 0,1 мМ тиаминфосфата, 1 мМ МдС1г, и 1 мкМ FAD при концентрации 1 грамм влажного веса на 2 5 мл буфера и разрушают, обрабатывая звуком. Сырой экстракт белка, полученный после центрифугирования, был использован, для измерений активности ALS .
Опыты с ALS проводили углублениями, используя
на микротитровальных пластинках с 9 6-модификацию процедуры, которая описана в
работе Ray (1984). Реакционная смесь содержала 20 мМ фосфатнокалиевого буфера рН 7,0, 20 мМ пирувата натрия, 0,45 мМ тиамин-пирофосфата, 0,45 мМ МдС1г, 9 мкМ FAD, ALS энзим и различные концентрации ALS ингибиторов в конечном объеме 90 мкл. Опыты инициировались добавлением энзима и останавливались через
7 5 минут инкубирования при температуре 30°С путем добавления 4 0 мкл 0,5 М H2SO4. После выдерживания в течение 60 минут при комнатной температуре добавляют 80 мкл раствора 1,4% а-нафтола и 0,14% креатинина в 0,7 М NaOH и дополнительно инкубируют 4 5 минут при комнатной температуре, и определяют поглощение при длине волны 540 нм. р150-значения для ингибирования ALS определяют, как описано в статье Ray (1984), используя программу XLFit Excel add-in version 4.3.1 для подгонки кривой фирмы ID Business Solutions Limited.
8 сумме мутантный энзим был, как минимум, 2 000 раз менее чувствительным по отношению к ALS ингибитору форамсульфурону чем дикого типа энзим.
Пример 5: Измерение активности энзима (из растений)
ALS был экстрагирован из культур листьев сахарной свеклы или тканей сахарной свеклы, как описано в статье Ray (1984), Plant Physiol., 75:827-831.
ALS активность была определена в экстрактах листьев дикого типа сахарной свеклы и экстрактах листьев полученных из SB574TL в присутствии различных концентраций форамсульфурона, как описано в примере 4.
В сумме мутантный энзим был, как минимум, 2 000 раз менее чувствительным по отношению к ALS ингибитору форамсульфурону чем дикого типа энзим.
Пример б: Полевые испытания при применении гомозиготных
толерантных к ALS ингибиторным гербицидам растений
сахарной свеклы
Основываясь на SB574TL, F4-F6 семена, включающие мутантные аллели эндогенного ALS гена в гомозиготном состоянии, были использованы для дальнейшего тестирования.
Семена растений гомозиготных SB574TL мутантных растений и семена традиционного сорта KLARINA (обычно используемый для сравнения, чувствительный к ALS ингибиторам сорт сахарной свеклы, не имеющий соответствующих мутаций в позиции 5 69 его ALS белка) были посеяны в поле и выращены до различных стадий роста согласно ВВСН стандарту (как описано в монографии "Entwicklungsstadien mono- und dikotyler Pflanzen", 2nd edition, 2001, ed. Uwe Meier, Biologische Bundesanstalt fur Land und Forstwirtschaft).
После этого растения были обработаны соответствующими ALS ингибиторными гербицидами, как специфицировано ниже в таблице 1, которые были идентичны гербицидам, применявшимся во время процедуры селекции. Расходное количество воды, использованной во время различных применений, составляло 200 л/га.
Через 8, 14 и 28 дней (как указано в таблице 1) после применения
(ДПП = дней после применения) соответствующего(их) ALS
ингибиторного (ых) гербицида (ов), оценивают повреждение
В этом
"100%"
имеется
фитотоксичность/фито у различных растений сахарной свеклы в соответствии со шкалой от 0% до 100%.
контексте, "0%" означает "нет фитотоксичности/фито" и означает, что все растения убиты (в таблице 1 под фито в виду фитотоксичности/фито).
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Bayer CropScience AG and KWS SAAT AG
<12 0> толерантные к ALS ингибиторным гербицидам мутанты Beta vulgaris <130> BCS 09-1021 / KWS 0172 EP <160> 6
<170> патент в версии 3.3
<210> 1
<211> 1998
<212> ДНК
<213> Beta vulgaris
<400> 1
atggcggcta ccttcacaaa cccaacattt tccccttcct caactccatt aaccaaaacc 60
ctaaaatccc aatcttccat ctcttcaacc ctcccctttt ccacccctcc caaaacccca 120
actccactct ttcaccgtcc cctccaaatc tcatcctccc aatcccacaa atcatccgcc 180
attaaaacac aaactcaagc accttcttct ccagctattg aagattcatc tttcgtttct 240
cgatttggcc ctgatgaacc cagaaaaggg tccgatgtcc tcgttgaagc tcttgagcgt 300
gaaggtgtta ccaatgtgtt tgcttaccct ggtggtgcat ctatggaaat ccaccaagct 360
ctcacacgct ctaaaaccat ccgcaatgtc ctccctcgcc atgaacaagg cggggttttc 420
gccgccgagg gatatgctag agctactgga aaggttggtg tctgcattgc gacttctggt 480
cctggtgcta ccaacctcgt atcaggtctt gctgacgctc tccttgattc tgtccctctt 540
gttgccatca ctggccaagt tccacgccgt atgattggca ctgatgcttt tcaggagact 600
ccaattgttg aggtgacaag gtctattact aagcataatt atttagtttt ggatgtagag 660
gatattccta gaattgttaa ggaagccttt tttttagcta attctggtag gcctggacct 720
gttttgattg atcttcctaa agatattcag cagcaattgg ttgttcctga ttgggatagg 780
ccttttaagt tgggtgggta tatgtctagg ctgccaaagt ccaagttttc gacgaatgag 840
gttggacttc ttgagcagat tgtgaggttg atgagtgagt cgaagaagcc tgtcttgtat 900
gtgggaggtg ggtgtttgaa ttctagtgag gagttgagga gatttgttga gttgacaggg 960
attccggtgg ctagtacttt gatggggttg gggtcttacc cttgtaatga tgaactgtct 1020
cttcatatgt tggggatgca cgggactgtt tatgccaatt atgcggtgga taaggcggat 1080
ttgttgcttg ctttcggggt taggtttgat gatcgtgtga ccgggaagct cgaggcgttt 1140
gctagccgtg ctaagattgt gcatattgat attgactctg ctgagattgg gaagaacaag 1200
cagccccatg tgtccatttg tgctgatgtt aaattggcat tgcggggtat gaataagatt 1260
ctggagtcta gaatagggaa gctgaatttg gatttctcca agtggagaga agaattaggt 1320
gagcagaaga aggaattccc actgagtttt aagacatttg gggatgcaat tcctccacaa 1380
tatgccattc aggtgcttga tgagttgacc aatggtaatg ctattataag tactggtgtt 1440
gggcagcacc aaatgtgggc tgcgcagcat tacaagtaca gaaaccctcg ccaatggctg 1500
acctctggtg ggttgggggc tatggggttt gggctaccag ccgccattgg agctgcagtt 1560
gctcgaccag atgcagtggt tgtcgatatt gatggggatg gcagttttat tatgaatgtt 1620
caagagttgg ctacaattag ggtggaaaat ctcccagtta agataatgct gctaaacaat 1680
caacatttag gtatggttgt ccaatgggaa gataggttct ataaagctaa ccgggcacat 1740
acataccttg gaaacccttc caaatctgct gatatcttcc ctgatatgct caaattcgct 1800
gaggcatgtg atattccttc tgcccgtgtt agcaacgtgg ctgatttgag ggccgccatt I860
caaacaatgt tggatactcc agggccgtac ctgctcgatg tgattgtacc gcatcaagag 1920
catgtgttgc ctatgattcc aagtggtgcc ggtttcaagg ataccattac agagggtgat 1980
ggaagaacct cttattga 1998
<210> 2
<211> 665
<212> PRT
<213> Beta vulgaris
<400> 2
Met Ala Ala Thr Phe Thr Asn Pro Thr Phe Ser Pro Ser Ser Thr Pro
15 10 15
Leu Thr Lys Thr Leu Lys Ser Gin Ser Ser lie Ser Ser Thr Leu Pro
20 25 30
Phe Ser Thr Pro Pro Lys Thr Pro Thr Pro Leu Phe His Arg Pro Leu
35 40 45
Gin lie Ser Ser Ser Gin Ser His Lys Ser Ser Ala lie Lys Thr Gin
50 55 60
Thr Gin Ala Pro Ser Ser Pro Ala lie Glu Asp Ser Ser Phe Val Ser
65 70 75 80
Arg Phe Gly Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ser Asp Val Leu Val Glu
90 95
Ala Leu Glu Arg Glu Gly Val Thr Asn Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly
100 105 110
Ala Ser Met Glu lie His Gin Ala Leu Thr Arg Ser Lys Thr lie Arg
115 120 125
Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gin Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly
130 135 140
Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Lys Val Gly Val Cys lie Ala Thr Ser Gly
145 150 155 160
Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp
165 170 175
Ser Val Pro Leu Val Ala lie Thr Gly Gin Val Pro Arg Arg Met lie
180 185 190
Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu Thr Pro lie Val Glu Val Thr Arg Ser
195 200 205
lie Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp lie Pro Arg
210 215 220
lie Val Lys Glu Ala Phe Phe Leu Ala Asn Ser Gly Arg Pro Gly Pro
225 230 235 240
Val Leu lie Asp Leu Pro Lys Asp lie Gin Gin Gin Leu Val Val Pro
245 250 255
Asp Trp Asp Arg Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro
260 265 270
Lys Ser Lys Phe Ser Thr Asn Glu Val Gly Leu Leu Glu Gin lie Val
275 280 285
Arg Leu Met Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly
290 295 300
Cys Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly
305 310 315 320
He Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr Pro Cys Asn
325 330 335
Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala
340 345 350
Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg
355 360 365
Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala
370 375 380
Lys He Val His He Asp He Asp Ser Ala Glu He Gly Lys Asn Lys
385 390 395 400
Gin Pro His Val Ser He Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Arg Gly
405 410 415
Met Asn Lys He Leu Glu Ser Arg He Gly Lys Leu Asn Leu Asp Phe
420 425 430
Ser Lys Trp Arg Glu Glu Leu Gly Glu Gin Lys Lys Glu Phe Pro Leu
435 440 445
Ser Phe Lys Thr Phe Gly Asp Ala He Pro Pro Gin Tyr Ala He Gin
450 455 460
Val Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly Asn Ala He He Ser Thr Gly Val
465 470 475 480
Gly Gin His Gin Met Trp Ala Ala Gin His Tyr Lys Tyr Arg Asn Pro
485 490 495
Arg Gin Trp Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu
500 505 510
Pro Ala Ala He Gly Ala Ala Val Ala Arg Pro Asp Ala Val Val Val
515 520 525
Asp He Asp Gly Asp Gly Ser Phe He Met Asn Val Gin Glu Leu Ala
530 535 540
Thr He Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys He Met Leu Leu Asn Asn
545 550 555 560
Gin His Leu Gly Met Val Val Gin Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala
565 570 575
Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Ser Lys Ser Ala Asp He
580 585 590
Phe Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala Glu Ala Cys Asp He Pro Ser Ala
595 600 605
Arg Val Ser Asn Val Ala Asp Leu Arg Ala Ala He Gin Thr Met Leu
610 615 620
Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val He Val Pro His Gin Glu
625 630 635 640
His Val Leu Pro Met He Pro Ser Gly Ala Gly Phe Lys Asp Thr He
645 650 655
Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Ser Tyr 660 665
<210> 3
<211> 1998
<212> ДНК
<213> Beta vulgaris
<220>
<221> мутация
<222> (1706)..(1706)
<223> замещение гуанозина на тимидин <400> 3
atggcggcta ccttcacaaa cccaacattt tccccttcct caactccatt aaccaaaacc 60 ctaaaatccc aatcttccat ctcttcaacc ctcccctttt ccacccctcc caaaacccca 120 actccactct ttcaccgtcc cctccaaatc tcatcctccc aatcccacaa atcatccgcc 180 attaaaacac aaactcaagc accttcttct ccagctattg aagattcatc tttcgtttct 240 cgatttggcc ctgatgaacc cagaaaaggg tccgatgtcc tcgttgaagc tcttgagcgt 300 gaaggtgtta ccaatgtgtt tgcttaccct ggtggtgcat ctatggaaat ccaccaagct 360 ctcacacgct ctaaaaccat ccgcaatgtc ctccctcgcc atgaacaagg cggggttttc 420 gccgccgagg gatatgctag agctactgga aaggttggtg tctgcattgc gacttctggt 480
cctggtgcta ccaacctcgt atcaggtctt gctgacgctc tccttgattc tgtccctctt 540
gttgccatca ctggccaagt tccacgccgt atgattggca ctgatgcttt tcaggagact 600
ccaattgttg aggtgacaag gtctattact aagcataatt atttagtttt ggatgtagag 660
gatattccta gaattgttaa ggaagccttt tttttagcta attctggtag gcctggacct 720
gttttgattg atcttcctaa agatattcag cagcaattgg ttgttcctga ttgggatagg 780
ccttttaagt tgggtgggta tatgtctagg ctgccaaagt ccaagttttc gacgaatgag 840
gttggacttc ttgagcagat tgtgaggttg atgagtgagt cgaagaagcc tgtcttgtat 900
gtgggaggtg ggtgtttgaa ttctagtgag gagttgagga gatttgttga gttgacaggg 960
attccggtgg ctagtacttt gatggggttg gggtcttacc cttgtaatga tgaactgtct 1020
cttcatatgt tggggatgca cgggactgtt tatgccaatt atgcggtgga taaggcggat 1080
ttgttgcttg ctttcggggt taggtttgat gatcgtgtga ccgggaagct cgaggcgttt 1140
gctagccgtg ctaagattgt gcatattgat attgactctg ctgagattgg gaagaacaag 1200
cagccccatg tgtccatttg tgctgatgtt aaattggcat tgcggggtat gaataagatt 1260
ctggagtcta gaatagggaa gctgaatttg gatttctcca agtggagaga agaattaggt 1320
gagcagaaga aggaattccc actgagtttt aagacatttg gggatgcaat tcctccacaa 1380
tatgccattc aggtgcttga tgagttgacc aatggtaatg ctattataag tactggtgtt 1440
gggcagcacc aaatgtgggc tgcgcagcat tacaagtaca gaaaccctcg ccaatggctg 1500
acctctggtg ggttgggggc tatggggttt gggctaccag ccgccattgg agctgcagtt 1560
gctcgaccag atgcagtggt tgtcgatatt gatggggatg gcagttttat tatgaatgtt 1620
caagagttgg ctacaattag ggtggaaaat ctcccagtta agataatgct gctaaacaat 1680
caacatttag gtatggttgt ccaattggaa gataggttct ataaagctaa ccgggcacat 1740
acataccttg gaaacccttc caaatctgct gatatcttcc ctgatatgct caaattcgct 1800
gaggcatgtg atattccttc tgcccgtgtt agcaacgtgg ctgatttgag ggccgccatt I860
caaacaatgt tggatactcc agggccgtac ctgctcgatg tgattgtacc gcatcaagag 1920
catgtgttgc ctatgattcc aagtggtgcc ggtttcaagg ataccattac agagggtgat 1980
ggaagaacct cttattga 1998
<210> 4
<211> 665
<212> PRT
<213> Beta vulgaris
<220>
<221> MISC_CBCMCTBA <222> (569)..(569)
<223> замещение триптофана на лейцин <400> 4
Met Ala Ala Thr Phe Thr Asn Pro Thr Phe Ser Pro Ser Ser Thr Pro
15 10 15
Leu Thr Lys Thr Leu Lys Ser Gin Ser Ser He Ser Ser Thr Leu Pro
20 25 30
Phe Ser Thr Pro Pro Lys Thr Pro Thr Pro Leu Phe His Arg Pro Leu
35 40 45
Gin He Ser Ser Ser Gin Ser His Lys Ser Ser Ala He Lys Thr Gin
50 55 60
Thr Gin Ala Pro Ser Ser Pro Ala He Glu Asp Ser Ser Phe Val Ser
65 70 75 80
Arg Phe Gly Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ser Asp Val Leu Val Glu
85 90 95
Ala Leu Glu Arg Glu Gly Val Thr Asn Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly
100 105 110
Ala Ser Met Glu He His Gin Ala Leu Thr Arg Ser Lys Thr He Arg
115 120 125
Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gin Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly
130 135 140
Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Lys Val Gly Val Cys He Ala Thr Ser Gly
145 150 155 160
Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp
165 170 175
Ser Val Pro Leu Val Ala He Thr Gly Gin Val Pro Arg Arg Met He
180 185 190
Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu Thr Pro He Val Glu Val Thr Arg Ser
195 200 205
He Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp He Pro Arg
210 215 220
He Val Lys Glu Ala Phe Phe Leu Ala Asn Ser Gly Arg Pro Gly Pro
225 230 235 240
Val Leu He Asp Leu Pro Lys Asp He Gin Gin Gin Leu Val Val Pro
245 250 255
Asp Trp Asp Arg Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro
260 265 270
Lys Ser Lys Phe Ser Thr Asn Glu Val Gly Leu Leu Glu Gin He Val
275 280 285
Arg Leu Met Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly
290 295 300
Cys Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly
305 310 315 320
He Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr Pro Cys Asn
325 330 335
Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala
340 345 350
Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg
355 360 365
Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala
370 375 380
Lys He Val His He Asp He Asp Ser Ala Glu He Gly Lys Asn Lys
385 390 395 400
Gin Pro His Val Ser He Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Arg Gly
405 410 415
Met Asn Lys He Leu Glu Ser Arg He Gly Lys Leu Asn Leu Asp Phe
420 425 430
Ser Lys Trp Arg Glu Glu Leu Gly Glu Gin Lys Lys Glu Phe Pro Leu
435 440 445
Ser Phe Lys Thr Phe Gly Asp Ala He Pro Pro Gin Tyr Ala He Gin
450 455 460
Val Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly Asn Ala He He Ser Thr Gly Val
465 470 475 480
Gly Gin His Gin Met Trp Ala Ala Gin His Tyr Lys Tyr Arg Asn Pro
485 490 495
Arg Gin Trp Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu
500 505 510
Pro Ala Ala He Gly Ala Ala Val Ala Arg Pro Asp Ala Val Val Val
515 520 525
Asp He Asp Gly Asp Gly Ser Phe He Met Asn Val Gin Glu Leu Ala
530 535 540
Thr He Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys He Met Leu Leu Asn Asn
545 550 555 560
Gin His Leu Gly Met Val Val Gin Leu Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala
565 570 575
Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Ser Lys Ser Ala Asp He
580 585 590
Phe Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala Glu Ala Cys Asp He Pro Ser Ala
595 600 605
Arg Val Ser Asn Val Ala Asp Leu Arg Ala Ala He Gin Thr Met Leu
610 615 620
Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val He Val Pro His Gin Glu
625 630 635 640
His Val Leu Pro Met He Pro Ser Gly Ala Gly Phe Lys Asp Thr He
645 650 655
Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Ser Tyr
<210> 5 <211> 2013 <212> ДНК
<213> Arabidopsis thaliana <400> 5
atggcggcgg саасаасаас aacaacaaca tcttcttcga tctccttctc caccaaacca 60
tctccttcct cctccaaatc accattacca atctccagat tctccctccc attctcccta 120
aaccccaaca aatcatcctc ctcctcccgc cgccgcggta tcaaatccag ctctccctcc 180
tccatctccg ccgtgctcaa cacaaccacc aatgtcacaa ccactccctc tccaaccaaa 240
cctaccaaac ccgaaacatt catctcccga ttcgctccag atcaaccccg caaaggcgct 300
gatatcctcg tcgaagcttt agaacgtcaa ggcgtagaaa ccgtattcgc ttaccctgga 360
ggtgcatcaa tggagattca ccaagcctta acccgctctt cctcaatccg taacgtcctt 420
cctcgtcacg aacaaggagg tgtattcgca gcagaaggat acgctcgatc ctcaggtaaa 480
ccaggtatct gtatagccac ttcaggtccc ggagctacaa atctcgttag cggattagcc 540
gatgcgttgt tagatagtgt tcctcttgta gcaatcacag gacaagtccc tcgtcgtatg 600
attggtacag atgcgtttca agagactccg attgttgagg taacgcgttc gattacgaag 660
cataactatc ttgtgatgga tgttgaagat atccctagga ttattgagga agctttcttt 720
ttagctactt ctggtagacc tggacctgtt ttggttgatg ttcctaaaga tattcaacaa 780
cagcttgcga ttcctaattg ggaacaggct atgagattac ctggttatat gtctaggatg 840
cctaaacctc cggaagattc tcatttggag cagattgtta ggttgatttc tgagtctaag 900
aagcctgtgt tgtatgttgg tggtggttgt ttgaattcta gcgatgaatt gggtaggttt 960
gttgagctta cggggatccc tgttgcgagt acgttgatgg ggctgggatc ttatccttgt 1020
gatgatgagt tgtcgttaca tatgcttgga atgcatggga cggtgtatgc gaattacgct 1080
gtggagcata gtgatttgtt gttggcgttt ggggtgaggt ttgatgatcg cgtcacgggt 1140
aagcttgagg cttttgctag tagggctaag attgttcata ttgatattga ctctgctgag 1200
attgggaaga ataagactcc tcatgtgtct gtgtgtggtg atgtcaagct ggctttgcaa 1260
gggatgaata aggttcttga gaaccgagct gaggagctta agcttgattt tggagtttgg 1320
aggaatgagt tgaacgtaca gaaacagaag tttccgttga gctttaagac gtttggggaa 1380
gctattcctc cacagtatgc gattaaggtc cttgatgagt tgactgatgg aaaagccata 1440
ataagtactg gtgtcgggca acatcaaatg tgggcggcgc agttctacaa ttacaagaag 1500
ccaaggcagt ggctatcatc aggaggcctt ggagctatgg gttttggact tcctgctgcc 1560
attggagcgt ctgttgctaa ccctgatgca atagttgtgg atattgacgg agatggaagc 1620
tttataatga atgtgcaaga gctggccaca atccgtgtag agcaacttcc agtgaagata 1680
ctcttattaa acaaccagca tcttggcatg gttatgcaat gggaagatcg gttctacaag 1740
gctaaccgag ctcacacatt tctcggggat ccggctcagg aggacgagat attcccgaac 1800
atgttgctgt ttgcagcagc ttgcgggatt ccagcggcga gggtgacaaa gaaagcagat I860
ctccgagaag ctattcagac aatgctggat acaccaggac cttacctgtt ggatgtgatt 1920
tgtccgcacc aagaacatgt gttgccgatg atcccgagtg gtggcacttt caacgatgtc 1980
ataacggaag gagatggccg gattaaatac tga 2013
<210> 6 <211> 670 <212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana <400> 6
Met Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ser He Ser Phe
15 10 15
Ser Thr Lys Pro Ser Pro Ser Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro He Ser
20 25 30
Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser Leu Asn Pro Asn Lys Ser Ser Ser Ser
35 40 45
Ser Arg Arg Arg Gly He Lys Ser Ser Ser Pro Ser Ser He Ser Ala
50 55 60
Val Leu Asn Thr Thr Thr Asn Val Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Lys
65 70 75 80
Pro Thr Lys Pro Glu Thr Phe He Ser Arg Phe Ala Pro Asp Gin Pro
85 90 95
Arg Lys Gly Ala Asp He Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gin Gly Val
100 105 110
Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu He His Gin
115 120 125
Ala Leu Thr Arg Ser Ser Ser He Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu
130 135 140
Gin Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys
145 150 155 160
Pro Gly He Cys He Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val
165 170 175
Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala He
180 185 190
Thr Gly Gin Val Pro Arg Arg Met He Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu
195 200 205
Thr Pro He Val Glu Val Thr Arg Ser He Thr Lys His Asn Tyr Leu
210 215 220
Val Met Asp Val Glu Asp He Pro Arg He He Glu Glu Ala Phe Phe
225 230 235 240
Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys
245 250 255
Asp He Gin Gin Gin Leu Ala He Pro Asn Trp Glu Gin Ala Met Arg
260 265 270
Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Met Pro Lys Pro Pro Glu Asp Ser His
275 280 285
Leu Glu Gin He Val Arg Leu He Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu
290 295 300
Tyr Val Gly Gly Gly Cys Leu Asn Ser Ser Asp Glu Leu Gly Arg Phe
305 310 315 320
Val Glu Leu Thr Gly He Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly
325 330 335
Ser Tyr Pro Cys Asp Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His
340 345 350
Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu
355 360 365
Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala
370 375 380
Phe Ala Ser Arg Ala Lys He Val His He Asp He Asp Ser Ala Glu
385 390 395 400
He Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys
405 410 415
Leu Ala Leu Gin Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu
420 425 430
Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Asn Glu Leu Asn Val Gin Lys
435 440 445
Gin Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala He Pro Pro
450 455 460
Gin Tyr Ala He Lys Val Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala He
465 470 475 480
He Ser Thr Gly Val Gly Gin His Gin Met Trp Ala Ala Gin Phe Tyr
485 490 495
Asn Tyr Lys Lys Pro Arg Gin Trp Leu Ser Ser Gly Gly Leu Gly Ala
500 505 510
Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala He Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro
515 520 525
Asp Ala He Val Val Asp He Asp Gly Asp Gly Ser Phe He Met Asn
530 535 540
Val Gin Glu Leu Ala Thr He Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Val
545 550 555 560
Leu Leu Leu Asn Asn Gin His Leu Gly Met Val Met Gin Trp Glu Asp
565 570 575
Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Phe Leu Gly Asp Pro Ala
580 585 590
Gin Glu Asp Glu He Phe Pro Asn Met Leu Leu Phe Ala Ala Ala Cys
595 600 605
Gly He Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Ala Asp Leu Arg Glu Ala
610 615 620
He Gin Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val He
625 630 635 640
Cys Pro His Gin Glu His Val Leu Pro Met He Pro Asn Gly Gly Thr
645 650 655
Phe Asn Asp Val He Thr Glu Gly Asp Gly Arg He Lys Tyr
660 665 670
К заявке, выделенной из заявки № 201390454
Формула изобретения
1. Толерантное к ALS ингибиторным гербицидам растение Beta vulgaris и его органы, которые включают мутацию эндогенного гена ацетолактатсинтазы (ALS) в положении, соответствующем положению 1705-1707 эталонной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный мутировавший ген ALS кодирует ALS полипептид, содержащий аминокислоту, отличную от триптофана, в положении 569 ALS полипептида, причем растение Beta vulgaris является, как минимум, в 2000 раз менее чувствительным к ALS ингибитору.
2. Растение Beta vulgaris и его органы согласно п. 1, в которых ALS полипептид содержит в положении 569 аминокислоту аланин, глицин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, валин или аргинин.
3. Растение Beta vulgaris и его органы согласно п. 1, в которых ALS ген кодирует ALS полипептид, содержащий аминокислоту, отличную от триптофана, в положении 569 ALS полипептида с последовательностью SEQ ID NO: 2.
4. Растение Beta vulgaris и его органы согласно п. 1, в которых ALS полипептид содержит в положении 569 аминокислоту лейцин и в которых эндогенный ALS ген идентичен нуклеотидной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 3.
5. Растение Beta vulgaris и его органы согласно п. 1, в которых ALS полипептид содержит в положении 569 аминокислоту лейцин.
6. Растение Beta vulgaris и его органы согласно п. 1, в которых указанная мутация является гомозиготной, представленной в виде единственной мутации эндогенного гена ALS.
7. Растение Beta vulgaris и его органы согласно п. 1, которые толерантны к
одному или более ALS ингибиторным гербицидам, относящимся к группе,
состоящей из сульфонилмочевинных гербицидов,
сульфониламинокарбонилтриазолиноновых гербицидов,
имидазолиноновых гербицидов, триазолопиримидиновых гербицидов и
пиримидинил(тио)бензоатных гербицидов.
8. Растение Beta vulgaris и его органы согласно п. 1, которые являются гомозиготными по мутации эндогенного гена ацетолактатсинтазы (ALS).
9. Растение Beta vulgaris и его органы согласно п. 1, причем органы растения являются семенами.
10. Способ получения растения Beta vulgaris и его органов по п. 1, который включает следующие стадии:
(a) экспонирование каллюсов В. vulgaris в присутствии около 10"7 М -10"9 М ALS ингибиторного гербицида;
(b) отбор колоний клеток, которые могут расти в присутствии до 3 х 10"6 М ALS ингибиторного гербицида;
(c) регенерирование ростков в присутствии ALS ингибиторного гербицида;
(а!) отбор регенерированных растеньиц с помощью ALS ингибиторного гербицида, которые содержат мутацию эндогенного гена ацетолактатсинтазы (ALS) в положении, соответствующем положению 1705-1707 эталонной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный мутировавший ген ALS кодирует ALS полипептид, содержащий аминокислоту, отличную от триптофана, в положении 569 ALS полипептида.
Способ по п. 10, в котором ALS ингибиторным гербицид на стадиях (а), (Ь) и/или (с) является форамсульфуроном.
Способ по п. 10 или 11, в котором на стадии (а!) в качестве ALS ингибиторного гербицида используют форамсульфурон, йодсульфурон-метил-натрий и/или их смесь.
Способ по п. 12, в котором доза форамсульфурона эквивалентна 7-70 г а.в./га, а доза йодсульфурон-метил-натрия эквивалентна 1-10 г а.в./га.
Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practical, search terms used)
EPO-Internal, BIOSIS, EMBL, FSTA, WPI Data
* Special categories of cited documents :
'A* document defining the general state of the art which is not considered to be of particular relevance
*E" earlier document but published on or after the international filing date
"L* document which may throw doubts on priority claim(s) or which is cited to establish the publication date of another citation or other special reason (as specified)
'O* document referring to an oral disclosure, use, exhibition or other means
T* later document published after the international filing date or priority date and not in conflict with the application but cited to understand the principle or theory underlying the invention
"X" document of particular relevance; the claimed invention cannot be considered novel or cannot be considered to involve an inventive step when the dooument is taken alone
"Y" dooument of particular relevance; the claimed invention
cannot be considered to involve an inventive step when the document is combined with one or more other suoh documents, such combination being obvious to a person skilled in the art.
INTERNATIONAL SEARCH REPORT
Information on patent family members
International application No
PCT/EP2011/067925
Patent dooument cited in search report
Publication date
Patent family member(s)
Publication date
DE 19821613 Al 18-11-1999 AU 4262499 A 29-11-1999
DE 19821613 Al 18-11-1999 WO 9957966 Al 18-11-1999
WO 9802526 Al 22-01-1998
362976
-06
-2007
3596497
-02
-1998
64235
-06
-2004
103075
-08
-1999
1230218
-09
-1999
99O0146
-08
-1999
69737751
-09
-2007
0944716
-08
-2007
0944716
-09
-1999
2287955
-12
-2007
9903914
-04
-2000
H11514531
-12
-1999
331176
-06
-1999
944716
-06
-2007
4499
-04
-2000
9900120
-03
-1999
72429
-03
-2005
5773702
-06
-1998
9802526
-01
-1998
W0 9802527 Al 22-01-1998
342960
-11
-2006
3596697
-02
-1998
65035
-12
-2006
1230217
-09
-1999
9900145
-08
-1999
69736841
-02
-2007
0960190
-02
-2007
0960190
-12
-1999
2274546
-05
-2007
3842299
-11
-2006
H11513895
-11
-1999
331175
-06
-1999
4399
-04
-2000
9900115
-04
-1999
9802527
-01
-1998
W0 2007005581 A2 11-01-2007
058429
-02
-2008
2006265984
-01
-2007
PI0612384
-01
-2009
2613087
-01
-2007
101287836
-10
-2008
200800174
-08
-2008
1902136
-03
-2008
2400022
-12
-2011
2009504137
-02
-2009
200709185
-02
-2008
200907590
-06
-2010
2011209232
-08
-2011
2007005581
-01
-2007
200800947
-06
-2010
WO 2006094084 A2 08-09-2006 AR 053442 Al 09-05-2007
CR 9356 A 21-01-2008
EP 1856266 A2 21-11-2007
Form PCT/ISA/210 (patent family annex) (April 2005)
Form PCT/ISA/210 (patent family annex) (April 2005)
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
page 2 of 2
page 1 of 2
page 2 of 2
page 1 of 2
page 2 of 2
page 1 of 2
page 2 of 2
page 1 of 2
page 2 of 2
page 1 of 2
page 2 of 2
page 1 of 2
page 2 of 2
page 1 of 2