EA201692035A1 20170428 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/201692035 Полный текст описания [**] EA201692035 20150522 Регистрационный номер и дата заявки ESP201430768 20140523 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2015/061467 Номер международной заявки (PCT) WO2015/177366 20151126 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21704 Номер бюллетеня [**] НОВЫЙ ШТАММ LACTOBACILLUS CASEI, СПОСОБНЫЙ РАЗРУШАТЬ ИММУНОТОКСИЧНЫЙ ПЕПТИД ГЛЮТЕНА Название документа [8] C12N 1/20, [8] A61K 35/747, [8] C12R 1/245 Индексы МПК [ES] Альварес Сиейро Патрисия, [ES] Мартин Мартин Мария Круз, [ES] Редруелло Треллес Бегона, [ES] Ладеро Лосада Виктор, [ES] Фернандес Гарсиа Мария, [ES] Альварес Гонсалес Мигель Анхель Сведения об авторах [ES] КОНСЕХО СУПЕРИОР ДЕ ИНВЕСТИГАСИОНЕС СЬЕНТИФИКАС (КСИС) Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201692035a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Настоящее изобретение относится к бактериальному штамму Lactobacillus casei IPLA12038 с регистрационным номером СЕСТ 8590 и его применению для разрушения глютена, глиадина или производных пептидов. Указанный штамм был выделен из кислого теста, используемого при приготовлении хлеба. Преимущества указанного штамма включают способность использовать глиадин в качестве источника азота, наличие разных видов пептидазной активности, связанных с разрушением указанного пептида, и способность полностью разрушать иммунотоксичный пептид, содержащий 33 аминокислоты, вовлеченный в инициирование целиакии, в течение короткого периода времени. Тот факт, что указанный микроорганизм рассматривается как GRAS and QPS, выделен из ферментированной пищи, чувствителен к антимикробным агентам желудочно-кишечного тракта и устойчив к условиям в желудочно-кишечном тракте, исследованным в условиях in vitro, обеспечивает его применение в качестве пробиотика или нутрицевтической добавки.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к бактериальному штамму Lactobacillus casei IPLA12038 с регистрационным номером СЕСТ 8590 и его применению для разрушения глютена, глиадина или производных пептидов. Указанный штамм был выделен из кислого теста, используемого при приготовлении хлеба. Преимущества указанного штамма включают способность использовать глиадин в качестве источника азота, наличие разных видов пептидазной активности, связанных с разрушением указанного пептида, и способность полностью разрушать иммунотоксичный пептид, содержащий 33 аминокислоты, вовлеченный в инициирование целиакии, в течение короткого периода времени. Тот факт, что указанный микроорганизм рассматривается как GRAS and QPS, выделен из ферментированной пищи, чувствителен к антимикробным агентам желудочно-кишечного тракта и устойчив к условиям в желудочно-кишечном тракте, исследованным в условиях in vitro, обеспечивает его применение в качестве пробиотика или нутрицевтической добавки.


Евразийское (21) 201692035 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.04.28
(22) Дата подачи заявки 2015.05.22
(51) Int. Cl.
C12N1/20 (2006.01) A61K35/747 (2015.01) C12R 1/245 (2006.01)
(54) НОВЫЙ ШТАММ LACTOBACILLUS CASEI, СПОСОБНЫЙ РАЗРУШАТЬ ИММУНОТОКСИЧНЫЙ ПЕПТИД ГЛЮТЕНА
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
P201430768 2014.05.23
PCT/EP2015/061467
WO 2015/177366 2015.11.26
Заявитель:
КОНСЕХО СУПЕРИОР
ДЕ ИНВЕСТИГАСИОНЕС
СЬЕНТИФИКАС (КСИС) (ES) Изобретатель:
Альварес Сиейро Патрисия, Мартин Мартин Мария Круз, Редруелло Треллес Бегона, Ладеро Лосада Виктор, Фернандес Гарсиа Мария, Альварес Гонсалес Мигель Анхель
(ES)
Представитель: Нилова М.И. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к бактериальному штамму Lactobacillus casei IPLA12038 с регистрационным номером СЕСТ 8590 и его применению для разрушения глютена, глиадина или производных пептидов. Указанный штамм был выделен из кислого теста, используемого при приготовлении хлеба. Преимущества указанного штамма включают способность использовать глиадин в качестве источника азота, наличие разных видов пептидазной активности, связанных с разрушением указанного пептида, и способность полностью разрушать иммунотоксичный пептид, содержащий 33 аминокислоты, вовлеченный в инициирование целиакии, в течение короткого периода времени. Тот факт, что указанный микроорганизм рассматривается как GRAS and QPS, выделен из ферментированной пищи, чувствителен к антимикробным агентам желудочно-кишечного тракта и устойчив к условиям в желудочно-кишечном тракте, исследованным в условиях in унго,обеспечивает его применение в качестве пробиотика или нутрицевтиче-ской добавки.
НОВЫЙ ШТАММ LACTOBACILLUS CASEI, СПОСОБНЫЙ РАЗРУШАТЬ ИММУНОТОКСИЧНЫЙ ПЕПТИД ГЛЮТЕНА
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к пищевой и фармацевтической отрасли промышленности. Заявленный штамм можно применять для разрушения глютена, глиадина и их пептидов при производстве ферментированных, функциональных пищевых продуктов и новых пищевых продуктов. Предложенный штамм также можно применять в 10 качестве пробиотической, симбиотической, нутрицевтической или диетической добавки, а также при приготовлении фармацевтических составов для клинического применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
15 Целиакия представляет собой хроническое аутоиммунное заболевание тонкого
кишечника, которое индуцируется потреблением глютена у лиц с генетической предрасположенностью. Типичные симптомы связаны с нарушением функций кишечника вследствие атрофии кишечных ворсинок и гиперплазии крипт, что приводит к резкому уменьшению площади поверхности кишечной стенки (мальабсорбция, диарея, анемия,
20 усталость, потеря веса, вздутие живота и т.д.). В большинстве случаев также развиваются внекишечные симптомы (остеопороз, депрессия, бесплодие и т.д.), помимо этого потребление глютена и целиакия тесно связаны с другими расстройствами, такими как сахарный диабет I типа, синдром Дауна, рассеянный склероз, герпетиформный дерматит, миопатия, артрит, аутизм, шизофрения, лимфома и т.д. Целиакия широко распространена
25 по всему миру и является одним из наиболее распространенных генетических заболеваний, в которое вовлечены генетические и экологические факторы (глютен). Согласно оценкам, распространенность в общей популяции составляет 1%, при этом данное заболевание хорошо поддается диагностике только у 1 из каждых 7-10 пациентов и у 10-12% родственников первой степени родства (Book et al., 2003. Prevalence of celiac
30 disease among relatives of sib pairs with celiac disease in U.S. families. Am J. Gastroenterol. 93; 377-81; Gujral et al., 2012. Celiac disease: Prevalence, diagnosis, pathogenesis and treatment. World J Gastroenterol. 14; 18(42): 6036-6059). Несмотря на то, что до настоящего времени непереносимость глютена связывали с популяциями европейцев и американцев, последние данные свидетельствуют о значительном увеличении числа людей,
35 страдающих данным заболеванием, в других странах, таких как Китай.
Основным экологическим фактором, инициирующим целиакию и связанные с ней расстройства, является глютен. Глютен состоит из набора белков, обнаруженных в зернах разных зерновых культур: пшеницы, ячменя, ржи и овса. Белки глютена могут быть классифицированы на две группы в зависимости от их растворимости в водно-спиртовых 5 растворах: проламины (растворимая фракция) и глютенины (нерастворимая фракция) (Wieser 2007. Chemistry of gluten proteins. Food microbiol. 24; 115-119). Большинство последовательностей пептидов, соответствующих токсичным эпитопам, вовлеченным в инициирование целиакии, представляют собой проламины, которые имеют разные названия в зависимости от той зерновой культуры, из которой они происходят: глиадин
10 для пшеницы, гордеины в ячмене, секалин во ржи и авенины в овсе. Полибелковая структура глютена обеспечивает некоторые технологические характеристики, имеющие большое значение, такие как поглощение воды, удержание газа, когезивность, эластичность и вязкость. Следовательно, глютен является необходимым ингредиентом во многих пищевых продуктах, присутствующим в 70% производимых продуктов, для
15 которого до сих пор не найдена подходящая замена.
Первичная структура глиадинов содержит большой процент остатков пролина (15%) и глутаминовой кислоты (35%), которые придают высокую устойчивость к разрушению ферментами желудочно-кишечного тракта. В результате пептиды, устойчивые к действию ферментов желудочно-кишечного тракта, накапливаются в просвете кишечника (Shan et
20 al. 2005. Identification and analysis of multivalent proteolytically resistant peptides from gluten: implications for celiac sprue. J Proteome Res. 4, 1732-1741). Один из указанных пептидов, пептид, содержащий 33 аминокислоты (33-членный пептид, 33-мер) (LQLQPFPQPQLPYPQPLPYPQPQLPYPQPQPF), был описан как наиболее иммуногенный пептид глютена, содержащий шесть перекрывающихся токсичных эпитопов (Qiao et al.
25 2004. Antigen presentation to celiac lesion-derived T cells of a 33-mer gliadin peptide naturally formed by gastrointestinal digestion. J Immunol 173:1757-1762). У восприимчивых лиц указанные пептиды вызывают патологический ответ, который в конечном итоге приводит к хроническому воспалению слизистой оболочки кишечника, гиперплазии крипт и прогрессирующему повреждению ворсинок кишечника и даже их полному исчезновению.
30 Одним из вовлеченных генетических факторов является главный комплекс
гистосовместимости (HLA). Целиакия связана с экспрессией HLA-DQ2 более чем у 90% пациентов и с экспрессией HLA-DQ8 у большинства оставшихся. После дезаминирования, токсичные пептиды распознаются молекулами HLA-DQ2 и HLA-DQ8. Указанные молекулы презентируют пептиды CD4+ Т-лимфоцитам, которые затем активируются,
35 вызывая адаптивный иммунный ответ (Hausch et al. 2002. Intestinal digestive resistance of
immunodominant gliadin peptides. Am J Physiol Gastroint Liver Physiol. 238:G996-1003). Помимо этого, пептиды глютена также могут инициировать механизмы врожденного иммунитета за счет продукции цитокина ИЛ-15 (Maiuri et al. 2003. Association between innate response to gliadin and activation of pathogenic T cells in coeliac disease. Lancet. 5 362(9377):30-7).
Несмотря на тяжесть симптомов и высокую распространенность заболевания, эффективная терапия до сих пор не разработана. Единственным доступным в настоящее время способом лечения целиакии является строгая безглютеновая диета на протяжении всей жизни пациента. Полное исключение употребления глютена является сложной
10 задачей, поскольку следы глютена обнаруживаются более чем в 80% пищи, которую мы потребляем. Помимо этого, безглютеновые продукты имеют высокую стоимость. Это увеличивает трудности в отношении приверженности этой диете, особенно для некоторых слоев населения, таких как дети и пожилые люди. Для того чтобы облегчить мониторинг безглютеновой диеты и в качестве требования к безопасности пищевых продуктов,
15 Комиссия по выработке Свода правил производства и распространения пищевых продуктов требует, чтобы пищевой продукт был помечен как "не содержащий глютена или безглютеновый", в случае, если он содержит менее 20 частей на миллион (что эквивалентно 10 частям на миллион глиадина), и как продукт "с низком содержанием глютена", если он содержит менее 100 частей на миллион. Однако некоторые пациенты с
20 целиакией чрезвычайно чувствительны к глютену, поэтому употребление даже следовых количеств глютена, присутствующих в пище, может представлять собой серьезный риск для здоровья.
Успехи в понимании молекулярных и клеточных механизмов данного заболевания привели к разработке новых терапевтических средств. Некоторые из этих стратегий
25 воздействуют на способность глютена стимулировать иммунную систему в слизистой оболочке кишечника, например, путем ингибирования трансглутаминазы в тканях (Khosla et al. 2009. Transglutaminase inhibitors and methods of use thereof. US7579313 B2), путем блокирования презентации антигена молекулам HLA-DQ2 и HLA-DQ8 (Sollid et al. 2007. Drug therapy for celiac sprue. US20070161572/A1) или модулирования действия цитокинов,
30 таких как ИФН или ИЛ-15 (Sandborn у Targan. 2002. Biologic therapy of inflammatory bowel disease. Gastroenterol. 122(6): 1592-608). Перечисленные стратегии модифицируют молекулы, участвующие в многочисленных биологических процессах, поэтому манипуляции с указанными молекулами могут вызвать нежелательные побочные эффекты. В настоящее время проводят исследования других вариантов, направленных на
35 модулирование патологического иммунного ответа, вызванного взаимодействием
токсичных пептидов глютена с иммунокомпетентными клетками индивидуума (Laparra et al., Bifidobacterium longum CECT 7347 modulates immune responses in a gliadin-induced enteropathy animal model. PLoS One. 2012;7(2):e30744).
Другой способ борьбы с целиакией заключается в том, чтобы избежать присутствия 5 токсичных пептидов в пищевых продуктах, что позволило разработать несколько стратегий:
-отбор сортов пшеницы, содержащих меньшее количество токсичных эпитопов (Spaenij-Dekking et al. 2005. Natural variation in toxicity of wheat: potential for selection of nontoxic varieties for celiac disease patients. Potential for selection and breeding of non-toxic
10 wheat varieties. Gastroenterology. 129:797-806).
-использование микроорганизмов, способных гидролизовать иммунотоксичные пептиды в тесте для приготовления хлеба (DiCagno et al. 2004. Sourdough bread made from wheat and nontoxic flours and selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients. Appl Environ Microbiol 70:1088-96).
15 -гидролиз иммунотоксичных пептидов в процессе пищеварения, что предотвращает
их поступление в тонкий кишечник. Например, посредством перорального введения очищенных ферментов растительного или бактериального происхождения, способных разрушать пептиды глютена (Piper et al. 2004. Effect of prolyl endopeptidase on digestive-resistant gliadin peptides in vivo. J Pharmacol Exp Ther.311:213-9; Tack et al. 2013.
20 Consumption of gluten with gluten-degrading enzyme by celiac patients: a pilot-study. World J Gastroenterol. 19(35):5837-47; Gass et al. 2007. Combination enzyme therapy for gastric digestion of dietary gluten in patients with celiac sprue. Gastroenterology. 133(2):472-80).
В источнике WO2011110881 Al раскрыты культуральные супернатанты штаммов Lactobacillus и Streptococcus, которые способны разрушать пептиды глиадина,
25 вовлеченные в патофизиологию целиакии. В частности, процент разрушения пептида 33-мер в супернатантах культур из штаммов Lactobacillus casei Р02503 Al и Р02503 A3 составляет 72,5% и 87,5%, соответственно (таблица 1). Это означает, что доли пептида 33-мер, который остается интактным (не разрушенным) в среде, составляющие 27,5% и 12,5%, по-прежнему является иммунотоксичным.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Краткое описание изобретения
5 Настоящее изобретение относится к новому бактериальному штамму, Lactobacillus
casei IPLA12038 с регистрационным номером СЕСТ 8590, и его клеточным компонентам, секретируемым молекулам и соединениям, полученным в результате его метаболизма, а также к их комбинациям или к любому мутированному или рекомбинантному штамму, полученному из него. Штамм Lactobacillus casei ГРЬА 12038 был депонирован 15 апреля
10 2014 г. в Испанской коллекции типовых культур (Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, СЕСТ, Edificio 3 CUE, Pare Cientific Universitat de Valencia, Catedratico Agustin Escardino, 9, 46980-Paterna, Валенсия, Испания) депозитором Мигелем Анхель Альварес Гонсалесом (Miguel Angel Alvarez Gonzalez), ГРЬА-CSIC, Paseo Rio Linares s/n, 33300 Вильявисиоса-Астурия (Испания). Штамм Z. casei IPLA 12038 получил номер доступа СЕСТ 8590 после
15 того как Международный орган депонирования признал штамм жизнеспособным.
Депозитор rPLA-CSIC уполномочил заявителя, CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFIC AS (С SIC), ссылаться на вышеупомянутый депонированный биологический материал в заявке на европейский патент, имеющей регистрационный номер представителя PD10109PC00, или в любой последующей заявке
20 на патент на ее основании или испрашивающей приоритет согласно указанной заявке, и дал безоговорочное и безотзывное согласие на то, чтобы депонированный материал стал общедоступным в соответствии с правилом 33 ЕРС и любым другим эквивалентным правилом РСТ и/или статьей РСТ с даты подачи вышеупомянутой патентной заявки.
Целевой штамм согласно настоящему изобретению был выделен из кислого теста,
25 используемого при приготовлении хлеба. Указанный штамм был идентифицирован с помощью секвенирования рРНК 16S как принадлежащий к виду Lactobacillus casei. Генетический отличительный признак был определен методом гель-электрофореза в градиенте пульсирующего поля (PFGE), результаты подтвердили, что указанный штамм отличается от других штаммов в пределах того же вида и выявили его уникальность.
30 Основное преимущество настоящего изобретения состоит в том, что штамм
Lactobacillus casei СЕСТ 8590 по отдельности, а не в комбинации с другими бактериальными штаммами, способен полностью разрушать пептид 33-мер в течение 12 часов инкубации. Другие штаммы из предшествующего уровня техники необходимо использовать в комбинации с дополнительными штаммами для разрушения пептидов
35 глютена и им требуется больше времени, чтобы полностью разрушить указанные
пептиды. Другие штаммы предшествующего уровня техники не способны полностью разрушать пептид длиной 33 аминокислоты (пептид 33-мер), что приводит к образованию пула пептидов из 33 аминокислот, которые сохраняют иммунотоксичность. Другие штаммы предшествующего уровня техники способны разрушать другие пептиды глютена 5 (такие как пептиды 20-меры, 18-меры), но не пептид 33-мер.
Штамм согласно настоящему изобретению обладает несколькими видами специфичной пептидазной активности, направленной на гидролиз остатков пролина, одной из основных аминокислот в белках глютена. Сочетание различных пептидаз штамма обеспечивает полное разрушение иммунотоксичного пептида 33-мер (фиг. 1 и 2). 10 В частности, указанный штамм обладает активностью пролидазы (PepQ), пролилиминопептидазы (PepI), дипептидиламинопептидазы IV (РерХ) и аминопептидазы N (PepN).
Целевой штамм согласно настоящему изобретению сохраняет жизнеспособность в условиях стресса в желудочно-кишечном тракте, при низких значениях рН и высокой
15 концентрации солей желчных кислот, исследованных в условиях in vitro. Перечисленные особенности обеспечивают его длительную устойчивость и эффективность в кишечнике после перорального введения, что облегчает его использование в качестве пробиотика или пищевой добавки (Фиг. 3).
Следовательно, согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к
20 композиции, содержащей эффективное количество выделенного штамма Lactobacillus casei, депонированного в Испанской коллекции типовых культур (СЕСТ) под номером доступа СЕСТ 8590, причем указанный штамм способен разрушать глиадин и иммунотоксичный пептид 33-мер, содержащий последовательность SEQ Ш NO: 1 (LQLQPFPQPQLPYPQPLPYPQPQLPYPQPQPF), и был выделен из ферментированного
25 теста, используемого при приготовлении хлеба.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей штамм, определенный выше, для применения в качестве лекарственного средства или в качестве пробиотика.
Другие аспекты настоящего изобретения относятся к фармацевтическому продукту, 30 ветеринарному продукту, продукту лечебного питания, пищевому продукту, пищевой добавке или закваске, пробиотической пищевой композиции, диетической добавке, симбиотической композиции или биотерапевтической композиции, содержащей эффективное количество композиции, определенной выше, совместно с соответствующими количествами приемлемых вспомогательных веществ или пищевых 35 ингредиентов.
И, наконец, другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения мутанта (мутированного варианта) штамма Lactobacillus casei, депонированного в Испанской коллекции типовых культур (СЕСТ) под номером доступа СЕСТ 8590, причем указанный способ включает применение депонированного штамма в качестве исходного 5 материала и применение мутагенеза, и при этом полученный мутант дополнительно сохраняет или по меньшей мере усиливает способность депонированного штамма разрушать глиадин и иммунотоксичный пептид 33-мер, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1.
10 Подробное описание изобретения
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен микроорганизм, способный разрушать глиадин и вышеупомянутый иммунотоксичный пептид, состоящий из 33 аминокислот (33-членный пептид, пептид 33-мер). Указанное функциональное
15 свойство способствует гидролизу и устранению токсичных эпитопов, участвующих в инициировании целиакии, снижению накопления иммунотоксичных пептидов и, следовательно, уменьшает риск развития заболевания. Указанный микроорганизм характеризуется как генетически немодифицированный микроорганизм, выделенный из пищи, непатогенный и отобранный на основании его активности, направленной на
20 разрушение глютена, далее указанный микроорганизм упоминается как целевой микроорганизм согласно настоящему изобретению или штамм согласно настоящему изобретению.
Целевой микроорганизм согласно настоящему изобретению также характеризуется как штамм, принадлежащий к виду Lactobacillus casei, и обеспечивает дополнительные 25 признаки, перечисленные ниже:
- указанный микроорганизм в целом рассматривается как безопасный (признан безопасным, GRAS) Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) и QPS (квалифицированная презумпция безопасности) в соответствии с требованиями Европейского управления по безопасности
30 пищевых продуктов (EFSA) (Adams and Marteau. 1995. On the safety of lactic acid bacteria from food. Int J Food Microbiol. 27, 263-264).
- указанный микроорганизм является частью нормальной микробиоты желудочно-кишечного тракта человека, и в течение многих лет широко использовался в ферментированных пищевых продуктах и в качестве пробиотика для улучшения
-
состояния здоровья организма-хозяина (Tuohy et al. 2003. Using probiotics and prebiotics to gut health Improve Drug Discov Today 8:692-700).
- бактерии, принадлежащие к роду Lactobacillus, были использованы для лечения воспалительных заболеваний кишечника (Clarke et al. 2012. Review article: probiotics for 5 the treatment of irritable bowel syndrome - focus on lactic acid bacteria Aliment Pharmacol Ther. 35:403-413). В частности, результаты исследований с применением штамма Lactobacillus casei свидетельствуют о его способности уменьшать глиадин-индуцированную энтеропатию в животной модели мыши (D'Arienzo et al. 2011. Immunomodulatory effects of Lactobacillus casei administration in a mouse model of gliadin-
10 sensitive enteropathy Scand J Immunol 74:335-341).
Штамм согласно настоящему изобретению, Lactobacillus casei IPLA12038 с регистрационным номером СЕСТ 8590, был выделен из ферментированного теста, используемого при приготовлении хлеба, из Польши. Указанный штамм был идентифицирован с помощью секвенирования фрагмента рРНК 16S. Секвенированный
15 фрагмент (1007 пар оснований) амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров 27F и 1492R (Lane. 1991. 16S/23S rRNA sequencing, 115-175. In E. Stackebrandt, and M. Goodfellow (primers ed.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, Chichester, UK). При выравнивании полученной последовательности с последовательностями в базах данных было обнаружено максимальное сходство с
20 эквивалентными последовательностями штаммов L. casei. Самый высокий процент идентичности (99%) был получен со штаммом Lactobacillus casei BL23, депонированным в GenBank (номер доступа СР005486.1).
Штамм согласно настоящему изобретению отличается от других штаммов этого же вида. Генетический отличительный признак указанного штамма был определен с
25 помощью методики гель-электрофореза в градиенте пульсирующего поля (PFGE) в соответствии с протоколом, описанным Smith and co-Fresno (Fresno Herrero et al, 2012. Lactobacillus casei strains isolated from cheese reduce biogenic amine accumulation in an experimental model. Int. J. Food Microbiol. 157, 297-304). С помощью этой методики был получен профиль рестрикции хромосомной ДНК штамма, которую подвергали
30 рестрикции ферментом Sfil, что позволяет получить специфичный профиль для каждого штамма. Полученные данные свидетельствуют о том, что в настоящем изобретении предложен уникальный штамм. Дендрограмма взаимосвязи с другими штаммами этого же вида, выделенными из аналогичной естественной среды, была получена с помощью программного обеспечения GeneTools с использованием индекса сходства Дайса. Было
установлено, что указанный штамм на 62% гомологичен штамму Lactobacillus casei BL23,
депонированному в GenBank (номер доступа FM177140.1).
В объеме настоящего изобретения целевой микроорганизм согласно настоящему
изобретению включает его клеточные компоненты, соединения, полученные в результате 5 его метаболизма, секретируемые молекулы и их комбинации, а также любой штамм или
мутант или рекомбинантный штамм, полученный стандартными способами, известными
специалистам в данной области техники.
Новый штамм согласно настоящему изобретению содержит пептидазы с широкой
специфичностью и пептидазы со специфичностью в отношении субстратов, содержащих 10 пролин, таких как иммунотоксичный глиадин, которые вследствие высокого содержания в
них пролина являются устойчивыми к действию ферментов желудочно-кишечного тракта.
В частности, отобранный штамм обладает аминопептидазной активностью (ЕС 3.4.11.11;
PepN) (8,03 мЕД/мг). Касательно видов специфичной активности в отношении остатков
пролина новый штамм согласно настоящему изобретению обладает активностью 15 пролидазы (ЕС 3.4.13.9; PepQ) (9,5 мЕД/мг), пролиниминопептидазы (ЕС 3.4.11.9; PepI)
(0,58 мЕД/мг) и пролилдипептидиламинопептидазы IV (ЕС 3.4.14.5; РерХ) (3,19 мЕД/мг)
(фиг. 1).
Целевой штамм согласно настоящему изобретению может использовать глиадин в качестве единственного источника азота для размножения и развития.
20 Целевой микроорганизм согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что
он разрушает основной иммунотоксичный пептид, присутствующий в глютене. Указанный штамм способен полностью разрушать пептид 33-мер (фиг. 2). Инкубация указанного пептида (195 частей на миллион) в присутствии жизнеспособных клеток выбранного штамма обеспечивает полное разрушение пептида. После восьми часов
25 инкубации целевой штамм согласно настоящему изобретению разрушал 82% иммунотоксичного пептида, и через 12 часов пептид был полностью разрушен. Следовательно, в конкретном варианте реализации, штамм способен полностью разрушать иммунотоксичный пептид 33-мер в течение 12 часов.
Новый целевой штамм согласно настоящему изобретению способен выдерживать
30 прохождение через моделируемый в условиях in vitro желудочно-кишечный тракт. Было установлено, что штамм устойчив к воздействию стресса в желудке и желудочно-кишечном тракте (Fernandez de Palencia et al. 2008. Probiotic strains: survival under simulated gastrointestinal conditions, in vitro adhesion to Caco-2 cells and effect on cytokine secretion. Eur Food Res Technol 227:1475-1484). Целевой штамм согласно настоящему изобретению
35 сохранял жизнеспособность клеток в диапазоне 107-108 КОЕ/мл, и в наиболее
экстремальных условиях, рН=2 и рН=1,8, штамм сохранял жизнеспособность клеток 104 КОЕ/мл (фиг. 3). Полученные результаты подтверждают потенциальную возможность применения указанного штамма в качестве пробиотика. Помимо этого, штамм ресуспендировали в молоке, пищевом носителе, который может выступать в качестве 5 носителя пробиотика и быть источником новых функциональных пищевых продуктов.
При использовании депонированного штамма в качестве исходного материала, квалифицированный специалист в данной области техники может рутинно, с помощью стандартных способов мутагенеза или методик повторного выделения, получить дополнительные мутанты, которые сохраняют или усиливают описанные в настоящем
10 документе соответствующие признаки и преимущества штаммов, входящих в состав композиции согласно настоящему изобретению. Согласно одному конкретному варианту реализации настоящего изобретения мутантов получают с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения мутантов получают путем случайного мутагенеза. Следовательно, другой аспект
15 настоящего изобретения относится к способу получения мутанта штамма Lactobacillus casei СЕСТ8590, причем указанный способ включает применение депонированного штамма в качестве исходного материала и применение мутагенеза, и при этом полученный мутант далее сохраняет или по меньшей мере усиливает способность депонированного штамма разрушать глиадин и иммунотоксичный пептид 33-мер,
20 содержащий последовательность SEQ Ш NO: 1.
Указанные штаммы в целом применяют в виде жизнеспособных клеток. Однако нежизнеспособные клетки также могут быть использованы, такие как погибшие культуры или клеточные лизаты (полученные в результате воздействия измененного рН, ультразвука, облучения, температуры, давления или других средств уничтожения или
25 лизиса бактерий), или композиции, содержащие полезные факторы, вырабатываемые штаммом.
Согласно другому конкретному варианту реализации настоящего изобретения выделенный штамм был ферментирован в искусственной среде и подвергнут последующей обработке после ферментации, чтобы получить бактериальные клетки, при 30 этом полученные бактериальные клетки находятся в жидкой среде или в твердой форме. В частности, способ последующей обработки выбран из группы, включающей: сушку, замораживание, лиофилизацию, сушку в псевдоожиженном слое, распылительную сушку и замораживание в жидкой среде.
Штамм согласно настоящему изобретению получают путем культивирования (или 35 путем ферментации) бактерий в подходящей искусственной среде и в подходящих
условиях. Выражение "искусственная среда" для микроорганизмов означает среду, содержащую природные вещества и необязательно синтетические химические вещества, такие как полимерный поливиниловый спирт, который может воспроизвести некоторые из функций сывороток. Искусственную среду надлежащим образом стерилизуют после 5 смешивания указанных веществ. Соответственно, наряду с природными веществами, распространенные подходящие искусственные среды включают питательные бульоны, которые содержат элементы, включающие источник углерода (например, глюкозу), источник азота (например, аминокислоты и белки), воду и соли, необходимые для размножения бактерий. Ростовые среды могут быть в жидкой форме или часто могут быть
10 смешаны с агаром или другим желирующим агентом для получения твердой среды. В качестве ростовых сред также можно применять любые пищевые основы, на которых бактерии могут размножаться в соответствующих условиях, такие как ингредиенты для приготовления йогурта.
Штаммы можно культивировать по отдельности, чтобы получить чистую культуру.
15 Штаммы также можно культивировать в виде смешанной культуры с другими выбранными микроорганизмами, присутствующими в исходной закваске, или совместно с микроорганизмами, которые не присутствуют в исходной закваске. Заквасочные пищевые продукты относятся к пищевым продуктам, изготовленным из закваски, содержащей по меньшей мере штаммы согласно настоящему изобретению, причем указанные пищевые
20 продукты переносятся субъектами с целиакией. Штамм согласно настоящему изобретению также может быть получен путем культивирования бактерий разных типов по отдельности, с последующим комбинированием их в необходимом соотношении. Ферментирование позволяет получить биомассу, не содержащую каких-либо других микроорганизмов, не представляющих интереса (в отличие от природных штаммов), и
25 может быть достигнуто с использованием любых подходящих природных и/или искусственных питательных веществ. После культивирования, и в зависимости от готового состава, штаммы могут быть использованы в виде очищенных бактерий или, в другом варианте, могут быть использованы бактериальные культуры или клеточные суспензии, как таковые или после соответствующей последующей обработки. В данном
30 описании термин "биомасса" относится к культуре бактериальных штаммов, полученной после культивирования (или ферментации, поскольку термин является синонимом культивирования).
Под термином "последующая (дополнительная) обработка" следует понимать, применительно к настоящему изобретению, любую осуществляемую обработку биомассы 35 с целью получения бактериальных клеток, пригодных для хранения. Цель последующей
обработки заключается в снижении метаболической активности клеток в биомассе, и, следовательно, замедлении скорости вредных клеточных реакций. Другими словами, бактериальные клетки согласно настоящему изобретению переводят в искусственное покоящееся, непролиферативное состояние, в котором клетки почти не имеют 5 метаболической активности, не реплицируют свой генетический материал, не делятся и скорость вредных клеточных реакций практически минимальна. Искусственно индуцированное состояние покоя не встречается в природе. Единственный природный способ уменьшения метаболической активности прокариотических клеток заключается в том, чтобы прекратить генетическую репликацию и остановить деление клеток как это
10 происходит при гибели клеток или их превращении в эндоспоры. В отличие от природных способов достижения состояния покоя клеток, ферментация, индуцированная человеком, и способы последующей обработки, описанные в настоящем документе, переводят штамм согласно настоящему изобретению в неприродное состояние, которое сохраняет жизнеспособность клеток, не являющихся эндоспорами. Следовательно, депонированный
15 штамм в состоянии покоя согласно настоящему изобретению отличается от его природных аналогов.
В результате последующей обработки бактериальные клетки могут находиться в твердой или жидкой форме. В твердой форме сохраненные бактериальные клетки могут представлять собой порошок или гранулы. В любом варианте твердые и жидкие формы,
20 содержащие бактериальные клетки, не присутствуют в природе, следовательно, не являются природными, поскольку они являются результатом искусственного способа(ов) последующей обработки. Способы последующей обработки могут, в определенных вариантах реализации, требовать использования одного или более из так называемых агентов для последующей обработки. Применительно к настоящему изобретению
25 выражение "агент для последующей обработки" относится к соединению, используемому для осуществления способов последующей обработки, описанных в настоящем документе. Агенты для последующей обработки включают, но не ограничиваются ими, дегидратирующие агенты, бактериостатические агенты, криопротекторные агенты (криопротекторы), инертные наполнители (также известные как лиопротекторы),
30 материал-носитель (также известный как материал сердцевины) и т.д., используемые по отдельности или в комбинации.
Существуют два основных неприродных подхода к уменьшению метаболической активности бактериальных клеток и, следовательно, два подхода для проведения последующей обработки. Первый из них представляет собой снижение скорости всех
35 химических реакций. Это может быть достигнуто путем понижения температуры с
помощью охлаждения или замораживания с использованием холодильников, механических морозильников и морозильников на основе жидкого азота. В другом варианте снижение скорости всех химических реакций также может быть достигнуто путем добавления веществ, которые ингибируют размножение бактериальных клеток, а 5 именно бактериостатического агента, сокращенно обозначаемого Bstatic, который представляет собой биологический или химический агент, останавливающий размножение бактерий, не повреждая их, указанные агенты включают бактериостатики и консерванты. Бактериостатические агенты отличаются от бактерицидных, которые вызывают гибель бактерий. Специалисту известен соответствующий бактериостатический
10 агент, пригодный для использования. Например, типичные бактериостатики включают, но не ограничиваются ими, бактериостатические антибиотики, которые ограничивают размножение бактерий, препятствуя выработке бактериального белка, репликации ДНК или другим аспектам бактериального клеточного метаболизма, в соответствующих концентрациях, чтобы сохранить только их бактериостатическую активность.
15 Бактериостатический агент также можно представлять собой любой агент, который добавляют для изменения условий окружающей среды, таких как рН, концентрация соли, или окислительно-восстановительное состояние.
Второй подход к осуществлению последующей обработки заключается в удалении воды из биомассы, способ, который может включать сублимацию воды с использованием
20 лиофилизатора. Подходящие методики удаления воды из биомассы включают сушку, лиофилизацию, распылительную сушку или сушку в псевдоожиженном слое. Способы последующей обработки, которые приводят к получению твердой формы, могут представлять собой сушку, замораживание, лиофилизацию, сушку в псевдоожиженном слое или распылительную сушку.
25 Последующая обработка после культивирования штаммов может заключаться в
замораживании. В этом случае должен быть добавлен один или более криопротекторов. Выражения "криопротекторный агент (или добавка)" и "криопротектор" используются в настоящем изобретении взаимозаменяемо и относятся к химическим веществам, которые защищают клетки при замораживании, в то же время сводя к минимуму пагубный эффект
30 повышенной концентрации растворенного вещества и образования кристаллов льда, что приводит к падению числа жизнеспособных клеток и последующим потерям при промышленном производстве. Наиболее часто используемыми криопротекторными агентами являются диметилсульфоксид (ДМСО) и глицерин, по отдельности или в комбинации; тогда как другие криопротекторы, которые иногда были использованы, по
35 отдельности или в комбинации, включают: полиэтиленгликоль, пропиленгликоль,
глицерин, бетаин (или глицин бетаин), поливинилпирролидон, сорбит, декстран и трегалозу. Криопротекторы, классифицированные по семействам, включают: сульфоксиды, одноатомные спирты и их производные, диолы и их производные, триолы, полиспирты, моно-, ди-, три-, полисахариды, амиды, N-алкиламиды, имиды, 5 гетероциклические соединения, аминокислоты и карбоновые кислоты, белки, пептиды, полипептиды, гликопротеины и неионные поверхностно-активные вещества. Протоколы замораживания бактерий и отбора подходящих криопротекторов могут быть выбраны и известны специалисту в данной области техники. В целом бактерии могут быть легко культивированы или собраны из скошенного агара или чашек с агаром, или из бульонной
10 культуры и собраны центрифугированием. В любом варианте клетки обычно суспендируют в свежей ростовой среде, содержащей криопротекторный агент(ы). Бактерии также могут быть сконцентрированы центрифугированием, но обычно их суспендируют в используемой среде и затем разбавляют путем добавления равного объема свежей ростовой среды, содержащей криопротекторный агент(ы). Затем смесь
15 клеток и криопротектора(ов) инкубируют по меньшей мере 15 минут, но не более чем 4560 минут, для уравновешивания перед охлаждением. Суспензию разливают во флаконы и охлаждают при соответствующей скорости охлаждения.
В том случае, если последующая обработка после культивирования штаммов представляет собой высушивание, как правило, оно заключается в сушке
20 микроорганизмов, суспендированных в культуральной жидкости или ресуспендированных в физиологическом растворе, в эксикаторе под вакуумом над обезвоживающими агентами, такими как H2SO4 или Р2О5.
Способ последующей обработки после культивирования штаммов может заключаться в лиофилизации, в качестве способа удаления воды. Лиофилизация включает
25 удаление воды из замороженных бактериальных суспензий путем сублимации при пониженном давлении. Лиофилизованные культуры лучше всего сохранять при температуре 4 °С или ниже. Сублимация происходит, когда замороженная жидкость переходит непосредственно в газообразное состояние, минуя жидкую фазу. Способ сублимационной сушки позволяет получить стабильный продукт, который может быть
30 легко повторно гидратирован. Указанный способ состоит из трех этапов: предварительного замораживания продукта для образования замороженной структуры, первичной сушки для удаления большей части воды и вторичной сушки для удаления связанной воды. Средства и способы лиофилизации известны в данной области техники и доступны специалисту в данной области техники. В силу объективного и ожидаемого
35 разнообразия промышленных способов производства и выделения лиофилизованных
бактериальных культур, они обычно содержат определенное количество инертного наполнителя, также известного как лиопротектор. Его роль заключается в стандартизации содержания живых пробиотических бактерий в продукте. В коммерчески доступных лиофилизованных культурах используют следующие инертные наполнители: сахарозу, 5 сахар, лактозу, трегалозу, глюкозу, мальтозу, мальтодекстрин, кукурузный крахмал, инулин и другие фармацевтически приемлемые негигроскопичные наполнители. Другие стабилизирующие или лиопротекторные агенты, такие как аскорбиновая кислота, также необязательно используют для образования вязкой пасты, которую подвергают лиофилизации. В любом варианте, полученный таким способом материал может быть
10 измельчен до нужного размера, включая порошок.
Способ последующей обработки после культивирования штаммов может заключаться в распылительной сушке. Распылительная сушка представляет собой способ, при котором жидкий состав превращают в сухой порошок в одну стадию. Способ, как правило, осуществляют, сначала распыляя раствор с образованием искусственно мелких
15 капель с минимально возможным размером, затем максимально увеличивая теплопередачу и скорость испарения воды. Размеры капель могут варьироваться от 20 до 180 мкм в зависимости от форсунки. Существуют два основных типа форсунок: одножидкостная форсунка высокого давления (от 50 до 300 бар) и двухжидкостная форсунка: одна жидкость представляет собой жидкость для высушивания, и второй
20 компонент представляет собой сжатый газ (в основном воздух под давлением от 1 до 7 бар). Капли затем быстро высушивают в большой камере с использованием теплого газа. Полученные в результате сухие частицы собирают с помощью циклонного сепаратора.
Способ последующей обработки после культивирования штаммов может заключаться в сушке в псевдоожиженном слое. При сушке в псевдоожиженном слое в
25 первую очередь необходим материал-носитель (также известный как материал сердцевины), используемый в качестве основы для субстрата, который должен быть высушен. Материал-носитель может представлять собой, но не ограничивается ей, целлюлозу. Подходящий материал-носитель удерживается в воздухе, чтобы обеспечить нанесение субстрата с помощью распылителя. По сравнению с распылительной сушкой
30 используют более низкую температуру. Бактерии распыляют на дисперсный материал-носитель в виде мелких капель. Содержащуюся воду удаляют с помощью потока сухого воздуха, который протекает снизу вверх через псевдоожиженный слой. В то же время поток воздуха обеспечивает псевдоожижение частиц. После этого защитное покрытие наносят в том же веществе на носитель, который покрыт бактериями. Используемое
35 защитное покрытие должно предотвращать повреждение бактериальных клеток путем
стабилизации компонентов, составляющих клеточные мембраны, например, путем создания пористой структуры в высушенном продукте, которая облегчает повторную гидратацию и содержит белки, которые обеспечивают защитное покрытие для клеток. Материал защитного покрытия может представлять собой, но не ограничивается ими, 5 обезжиренное молоко и альгинат кальция. Структура капсулированного продукта, достигнутая с помощью покрытия псевдоожиженным слоем, состоит из по меньшей мере трех частей: внутреннего слоя (сферического) носителя или материала сердцевины, равномерного внешнего слоя защитного покрытия, и в промежутках между ними находится покрытый активный ингредиент, представляющий интерес, а именно, бактерии.
10 В некоторых случаях для получения желаемых свойств продукта необходимо несколько слоев различных покрывающих материалов. Размер полученных микрокапсул колеблется в пределах от 200 мкм до 2 мм.
В качестве альтернативного варианта хранения биомассы в твердой форме, биомасса также может быть сохранена в жидком виде. Это может быть достигнуто путем
15 добавления бактериостатического агента, описанного выше, чтобы остановить размножение бактерий в культуральной среде, или с использованием промежуточной стадии сбора клеток, с последующим ресуспендированием осадка в физиологическом растворе с бактериостатическим агентом и необязательно его замораживанием.
В некоторых случаях, как описано, например, выше, при использовании способа
20 сушки в псевдоожиженном слое, пробиотический препарат подвергают иммобилизации и/или покрытию, или процессу капсулирования, чтобы улучшить срок хранения и/или функциональность. В данной области техники известно несколько методик иммобилизации, покрытия или капсулирования бактерий.
В конкретном варианте реализации настоящего изобретения композиция содержит
25 по меньшей мере один выделенный штамм согласно первому аспекту настоящего изобретения, следовательно, включая штамм СЕСТ 8590 и его мутантов, ферментированный в искусственной среде и подвергнутый последующей обработке после ферментации, чтобы получить бактериальные клетки, при этом полученные бактериальные клетки находятся в жидкой среде или в твердой форме. Согласно
30 конкретному варианту реализации настоящего изобретения способ последующей обработки выбран из группы, состоящей из: сушки, замораживания, лиофилизации, сушки в псевдоожиженном слое, распылительной сушки и замораживания в жидкой среде. Согласно конкретному варианту реализации способ последующей обработки представляет собой лиофилизацию.
Согласно конкретному варианту реализации штамм был генетически модифицирован.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено применение целевого микроорганизма согласно настоящему изобретению для разрушения глиадина и 5 иммунотоксичных пептидов, участвующих в инициации целиакии и расстройств, связанных с потреблением глютена, и предпочтительно иммунотоксичного пептида, содержащего 33 аминокислоты (пептида 33-мер).
В соответствии с описанными выше предпочтительными признаками штамма СЕСТ 8590, другой аспект настоящего изобретения относится к любой из композиций,
10 определенных выше, для применения в предотвращении и/или лечении целиакии и расстройств, связанных с потреблением глютена. Указанный аспект также может быть сформулирован как применение любой из композиций согласно настоящему изобретению для производства фармацевтического продукта, ветеринарного продукта, лекарственного средства, продукта лечебного питания, пищевого продукта или пищевой добавки, при
15 условии, что они переносятся субъектами с целиакией, для предотвращения и/или лечения состояния, связанного с изменениями урогенитальной микробиоты. Указанный аспект также может быть сформулирован как способ предотвращения и/или лечения целиакии и расстройств, связанных с потреблением глютена, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества любой из композиций согласно
20 настоящему изобретению. Согласно конкретному варианту реализации расстройства, связанные с потреблением глютена, представляют собой все заболевания, инициированные глютеном; расстройства, связанные с потреблением глютена, или расстройства, связанные с глютеном, включают целиакию и чувствительность к глютену, отличную от целиакии (NCGS). Ранее "непереносимость глютена" также использовали в
25 качестве общего термина, и выражение "чувствительность к глютену" использовали в качестве общего термина или для обозначения NCGS. Симптомы включают вздутие живота, дискомфорт в животе или боль, диарею, запор, мышечные расстройства, головные боли, мигрени, тяжелое акне, усталость и боли в костях и суставах.
Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическому продукту,
30 ветеринарному продукту, продукту лечебного питания, пищевому продукту или пищевой добавке, переносимой субъектом с целиакией, которые содержат эффективное количество любой из композиций, описанных в настоящем документе, совместно с соответствующими количествами приемлемых вспомогательных веществ.
Применительно к настоящему изобретению все заявленные продукты, композиции и
35 пищевые продукты переносятся субъектами с целиакией. Выражения "переносимый
субъектом с целиакией", "не содержит глютена" и "подходит для субъектов с целиакией" имеют аналогичный смысл и используются в настоящем изобретении взаимозаменяемо.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению целевого микроорганизма согласно настоящему изобретению в производстве пробиотической 5 пищевой композиции, диетической добавки, симбиотической композиции или биотерапевтической композиции, все из которых обеспечивают положительное влияние при снижении риска и улучшении показателей состояния здоровья, связанных с употреблением в пищу глютена, у пациентов.
Термин "пробиотическая пищевая композиция" означает любую комбинацию 10 ингредиентов, комбинацию, содержащую твердый или жидкий пищевой продукт, не содержащий глютена, которая помимо своих питательных свойств имеет специфичные признаки, которые помогают улучшить состояние здоровья и уменьшить риск заболевания.
Под термином "пищевая добавка" понимают дополнительную пищевую добавку, 15 предназначенную для дополнения рациона питания.
Термин "биотерапевтическая композиция" означает продукт, содержащий микробный препарат, обладающий благоприятным влиянием на состояние здоровья или терапевтическим действием.
Термин "симбиотическая композиция" означает функциональный пищевой продукт, 20 содержащий смесь пребиотических и пробиотических пищевых продуктов.
Характеристики микроорганизма согласно настоящему изобретению также позволяют применять его в качестве технологического коадъюванта при приготовлении пищи с пониженным содержанием глютена. Технологический коадъювант означает любое вещество, которое не употребляют в качестве пищи само по себе, но намеренно 25 используют при переработке сырья, пищевых продуктов или их ингредиентов для достижения определенной технологической цели в процессе обработки или переработки, что может привести к непреднамеренному, но технически неизбежному присутствию в готовом продукте остатков самого технологического коадъюванта или его производных, при условии, что они не несут риска для здоровья и не оказывают какого-либо 30 технологического влияния на готовый продукт.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению целевого микроорганизма согласно настоящему изобретению в качестве технологического коадъюванта, который способствует разрушению глиадина и иммунотоксичных пептидов, которые участвуют в инициации целиакии и расстройств, связанных с потреблением 35 глютена.
Другим объектом настоящего изобретения является пробиотическая пищевая композиция, пищевая добавка, симбиотическая композиция или биотерапевтическая композиция, содержащая целевой микроорганизм согласно настоящему изобретению. Пробиотическая пищевая композиция, пищевая добавка, симбиотическая композиция или 5 биотерапевтическая композиция может принимать форму капсул, может быть в лиофилизованной форме, в жидкой форме, в виде таблеток или в виде гелей.
Устойчивость пробиотического штамма согласно настоящему изобретению в условиях крайней кислотности обеспечивает его уникальную пригодность для применения при кислом значении рН, в частности, в молочных продуктах.
10 Другой объект настоящего изобретения относится к применению целевого
микроорганизма согласно настоящему изобретению в получении фармацевтической композиции, которую можно применять для лечения целиакии и расстройств, связанных с потреблением глютена.
Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция,
15 содержащая целевой микроорганизм согласно настоящему изобретению, далее фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению.
Соответственно, композиция согласно настоящему изобретению может быть получена в любой подходящей форме, которая не оказывает отрицательного влияния на жизнеспособность штамма, образующего композицию согласно настоящему изобретению.
20 Выбор вспомогательных веществ и наиболее подходящих способов изготовления, с учетом конкретной цели указанной композиции, находится в пределах квалификации специалистов в области фармацевтической технологии. Композиция может быть введена пероральным и/или ректальным путем.
В отношении подходящей формы для введения композиция согласно настоящему
25 изобретению находится в твердой или жидкой форме, и может быть обеспечена, в частности, в виде порошков, таблеток или пастилок, таблеток для рассасывания, препаратов в виде пленок, растворов, аэрозолей, гранул, пилюль, суспензий, эмульсий, капсул, таблеток и капсул с кишечнорастворимым покрытием, сиропов, жидкостей, эликсиров, конфет, жевательных резинок, суппозиториев и микроклизм.
30 Композиция согласно настоящему изобретению может быть изготовлена в форме, в
которой штамм согласно настоящему изобретению является единственным активным агентом. В другом варианте композиция согласно настоящему изобретению может быть изготовлена в виде смеси с одним или более другими активными агентами. В другом варианте штаммы согласно настоящему изобретению, по отдельности или изготовленные
35 в смеси с одним или более другими активными агентами, также могут быть изготовлены с
использованием фармацевтически- или ветеринарно- приемлемых вспомогательных веществ, или целесообразных добавок, или ингредиентов в случае пищевого продукта. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения композиция дополнительно содержит один или более дополнительных активных агентов. В другом варианте 5 дополнительный активный агент или агенты представляют собой другие пробиотические бактерии, которые не являются антагонистическими по отношению к штамму, образующему композицию согласно настоящему изобретению.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения композиция содержит более одного активного агента, активные агенты могут быть изготовлены в виде
10 единой фармацевтической, ветеринарной, пищевой добавки или в виде медицинской пищевой добавки, которая переносится субъектами с целиакией, или в виде отдельных форм для поочередного или последовательного введения в любом порядке, причем указанную форму, содержащую по меньшей мере один из штаммов согласно настоящему изобретению, вводят перед, по существу одновременно, после или в промежутках между
15 введением другого активного агента(ов).
Помимо этого, введение может быть долговременным или периодическим, по усмотрению наблюдающего практикующего врача, с учетом изменений в патологическом состоянии или каких-либо нежелательных побочных эффектов. "Хроническое" введение относится к введению композиции в непрерывном режиме, в то время как "прерывистое"
20 введение относится к лечению, которое применяют с перерывами.
Эффективное количество колониеобразующих единиц (КОЕ) для штаммов в композиции будет определено специалистами в данной области техники и будет зависеть от готового состава. Например, при пероральном введении без какого-либо другого активного агента, общее количество штаммов согласно настоящему изобретению
25 присутствует в композиции в однократных дозах в количестве, обеспечивающем эффективную суточную дозу от 107 до 1012 КОЕ, в соответствии с действующим законодательством, предпочтительно от 109 до 1011 КОЕ, и, при введении вагинальным или ректальным путем, в количестве, обеспечивающем эффективную суточную дозу от 103 до 1012 КОЕ, предпочтительно от 105 до 1010 КОЕ. Термин "колониеобразующая
30 единица" ("КОЕ") определяется как число бактериальных клеток, выявленное с помощью микробиологических подсчетов на чашках с агаром. Пищевые добавки, переносимые субъектами с целиакией, как правило, содержат пробиотические штаммы в количестве от 107 до 1012 КОЕ/г. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению представляет собой пищевую добавку, не
35 содержащую глютена, для достижения суточных доз, содержащих 109-1011 КОЕ/г.
В данном описании термин "фармацевтический продукт" понимается в широком смысле, включая любую композицию, содержащую активный ингредиент, в данном случае, штаммы согласно настоящему изобретению предпочтительно в виде композиции совместно с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами. Термин 5 "фармацевтический продукт" не ограничивается лекарственными средствами. В настоящей заявке термин "фармацевтически приемлемый" относится к соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые, в пределах целесообразных медицинских показаний, подходят для применения в контакте с тканями субъекта (например, человека) без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической
10 реакции или другой проблемы или осложнения, соразмерно с приемлемым соотношением польза/риск, и дополнительно пригодны для пациентов с целиакией. Каждый носитель, вспомогательное вещество и т.д. также должен быть "приемлемым" в отношении совместимости с другими ингредиентами состава. Приемлемые носители, вспомогательные вещества и т.д. могут быть найдены в стандартных фармацевтических
15 руководствах.
В данном описании термин "вспомогательное вещество" понимают в широком смысле, включая любое природное или синтетическое вещество, изготовленное совместно с активным ингредиентом фармацевтического продукта, ветеринарного продукта, лекарственного средства, пищевой добавки и продукта лечебного питания, все их которых
20 переносятся субъектами с целиакией. Наиболее подходящее вспомогательное вещество(а), которое будет использовано, зависит от готового состава.
Вспомогательные вещества выбраны, но не ограничиваются ими, из группы, состоящей из: наполнителей/разбавителей/объемообразующих агентов, связующих веществ, антиадгезивных агентов, разрыхлителей, покрывающих агентов,
25 предотвращающих слипание агентов, антиоксидантов, смазывающих веществ, подсластителей, ароматизаторов, красителей, поверхностно-активных веществ и других классов фармацевтически и ветеринарно приемлемых вспомогательных веществ, подходящих для пациентов с целиакией.
Наполнители выбраны, но не ограничиваются ими, из группы, состоящей из:
30 инулина, олигофруктозы, пектина, модифицированных пектинов, микрокристаллической целлюлозы, лактозы, крахмала, мальтодекстрина, сахарозы, глюкозы, фруктозы, маннита, ксилита, некристаллизующегося сорбита, карбоната кальция, гидроортофосфата кальция, других инертных неорганических и органических фармакологически приемлемых наполнителей, а также смесей перечисленных веществ. Если лекарственная форма
35 представляет собой суспензию для введения внутрь, то наполнители или разбавители
выбраны из группы, включающей: растительное масло, олеиновую кислоту, олеиловый спирт, жидкий полиэтиленгликоль, другие фармакологически приемлемые инертные жидкости или смеси перечисленных веществ.
Связующие агенты используют в твердых лекарственных формах, например, для 5 удержания ингредиентов в таблетке вместе, чтобы гарантировать, что таблетки и гранулы могут быть формованы с требуемой механической прочностью, а также для придания объема таблеткам с низкой активной дозой. Связующие агенты в твердых лекарственных формах, таких как таблетки, включают: лактозу, сахарозу, кукурузный (маисовый) крахмал, модифицированные крахмалы, микрокристаллическую целлюлозу,
10 модифицированную целлюлозу (например, гидроксипропилметилцеллюлозу (ГГГМЦ) и гидроксиэтилцеллюлозу), другие водорастворимые простые эфиры целлюлозы, поливинилпирролидон (PVP), также известный как повидон, полиэтиленгликоль, сорбит, мальтит, ксилит и двухосновный фосфат кальция; другие подходящие фармакологически приемлемые связующие вещества или смеси перечисленных веществ.
15 Антиадгезивные агенты используют для уменьшения адгезии между порошком
(гранулами) и поверхностям пуансона, предотвращая тем самым прилипание к пуансонам таблеточных прессов. Указанные агенты также используют, чтобы облегчить защиту таблеток от прилипания. Наиболее часто используют стеарат магния.
Помимо разрыхлителей и суперразрыхлителей в твердых лекарственных формах,
20 таких как таблетки и капсулы, используют следующие вещества, но не ограничиваясь перечисленными: поперечно-сшитый поливинилпирролидон, крахмалгликолят натрия, карбоксиметилцеллюлозу натрия, карбоксиметилцеллюлозу кальция и формальдегид-казеин, другие подходящие фармакологически приемлемые разрыхлители и суперразрыхлители или их смеси.
25 Покрытия в случае твердых лекарственных форм, таких как таблетки и гранулы для
заполнения капсул, защищают ингредиенты от повреждения под действием влаги в воздухе, облегчают проглатывание больших, неприятных на вкус таблеток и/или в случае кишечнорастворимых покрытий обеспечивают прохождение через сильнокислую среду желудочного сока (рН около 1) в интактной форме, и обеспечивают высвобождение в
30 двенадцатиперстной кишке или подвздошной кишке (тонкий кишечник). Для получения большинства покрытых таблеток используют пленочное покрытие на основе простого эфира целлюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы (ГПМЦ). В некоторых случаях могут быть использованы другие материалы для покрытия, например, синтетические полимеры и сополимеры, такие как фталат поливинилацетата (PVAP); сополимеры метилакрилата-
35 метакриловой кислоты; сополимеры метилметакрилата-метакриловой кислоты; шеллак,
кукурузный белок зеин или другие полисахариды, воски или воскоподобные вещества, такие как пчелиный воск, стеариновая кислота, высшие жирные спирты, такие как цетиловый или стеариловый спирт, твердый парафин, моностеарат глицерина, дистеарат глицерина или их комбинации. Капсулы покрывают желатином или 5 гидроксипропилметилцеллюлозой.
Кишечнорастворимые покрытия регулируют скорость высвобождения лекарственного препарата и определяют место высвобождения препарата в желудочно-кишечном тракте. Материалы, используемые для кишечнорастворимых покрытий, включают жирные кислоты, воски, шеллак, пластики, растительные волокна и их смеси,
10 также в комбинации с другими вышеупомянутыми покрытиями.
Предотвращающий слипание агент представляет собой добавку, внесенную в порошкообразные или гранулированные материалы, чтобы предотвратить образование комков (слипание) и облегчить упаковку, транспортировку и потребление. В качестве предотвращающих слипание агентов в твердых лекарственных формах, таких как
15 таблетки, капсулы или порошки, используют следующие вещества: стеарат магния, коллоидный диоксид кремния, тальк, другие фармакологически приемлемые предотвращающие слипание агенты или их смеси.
Смазывающие вещества используют в твердых лекарственных формах, в частности, в таблетках и капсулах, чтобы предотвратить слипание ингредиентов и прилипание к
20 пуансонам таблеточных прессов или устройств для наполнения капсул, а также в твердых желатиновых капсулах. В качестве смазывающих веществ в таблетках или твердых желатиновых капсулах наиболее часто применяют тальк или диоксид кремния, жиры, например, растительный стеарин, стеарат магния или стеариновую кислоту, а также их смеси.
25 Подсластители вносят для придания привлекательного вкуса ингредиентам,
особенно в твердых лекарственных формах, например, жевательных таблетках, а также в жидких лекарственных формах, таких как сироп от кашля. Подсластители могут быть выбраны из искусственных, натуральных или синтетических или полусинтетических подсластителей; неограничивающие примеры подсластителей включают аспартам,
30 ацесульфам калия, цикламат, сукралозу, сахарин, сахара или любую их смесь.
Ароматизаторы могут быть использованы, чтобы замаскировать неприятный вкус активных ингредиентов в любой лекарственной форме. Ароматизаторы могут быть природными (например, фруктовый экстракт) или искусственными. Например, (1) для улучшения горького продукта может быть использована мята, вишня или анис; (2) для
35 улучшения соленого продукта может быть использован персик или абрикос, или лакрица;
(3) для улучшения кислого продукта может быть использована малина; и (4) для улучшения чрезмерно сладкого продукта может быть использована ваниль.
За исключением наполнителей из класса вспомогательных веществ, состав согласно настоящему изобретению может содержать другие фармакологически активные или 5 питательные вещества, выбранные из группы, включающей: минеральные вещества в фармацевтически и питательно приемлемой химической форме; и L-аминокислоты.
Способы получения составов согласно настоящему изобретению находятся в пределах квалификации специалиста в данной области техники и будут зависеть от готового лекарственного состава. Например, но не ограничиваясь ими, в случае если
10 готовые лекарственные формы представляют собой твердую форму для введения внутрь, такую как таблетки, капсулы, порошок, гранулы, суспензия для приема внутрь и т.п., способ получения твердых лекарственных форм состава включает гомогенизацию: (1) активного ингредиента(ов), содержащего по меньшей мере одну или более пробиотических бактерий, подвергнутых последующей обработке, согласно настоящему
15 изобретению в эффективном количестве; (2) гомогенизацию с одним или более вспомогательными веществами с получением гомогенной смеси, которую, например, в соответствии с требованиями, смешивают со смазывающим веществом, таким как стеарат магния или другими смазывающими веществами, с получением готовой лекарственной формы в виде порошка. Полученным гомогенным порошком наполняют стандартные
20 желатиновые капсулы или, в другом варианте, капсулы устойчивые к желудочному соку. В случае таблеток, их получают путем прямого прессования или гранулирования. В первом случае получают гомогенную смесь активных ингредиентов и подходящих вспомогательных веществ, таких как безводная лактоза, некристаллизующийся сорбит и другие. Во втором случае таблетки изготавливают из смеси в гранулированной форме.
25 Гранулы получают путем грануляции активных ингредиентов состава с подходящими наполнителями, связующими агентами, разрыхлителями и небольшим количеством очищенной воды. Полученные гранулы просеивают и сушат до тех пор, пока содержание воды не составит <1% масс./масс.
Способ получения жидких лекарственных форм (например, суспензии для приема
30 внутрь) включает гомогенизацию активного ингредиента(ов) состава, содержащего по меньшей мере одну или более пробиотических бактерий, подвергнутых последующей обработке, согласно настоящему изобретению в эффективном количестве в инертном жидком разбавителе (наполнителе), таком как различные растительные масла, такие как подсолнечное, соевое или оливковое масло; олеиновая кислота; олеиловый спирт; жидкие
35 полиэтиленгликоли, такие как ПЭГ 200, ПЭГ 400 или ПЭГ 600; или в других инертных
фармацевтически приемлемых жидкостях. Способ дополнительно включает обработку гомогенной смеси с использованием одного или более способов, выбранных из группы, включающей: (1) стабилизацию состава путем добавления и гомогенизации стабилизаторов суспензии, таких как пчелиный воск, коллоидный диоксид кремния и т.д.; 5 (2) подслащение состава путем добавления и гомогенизации подсластителя; (3) придание аромата составу путем добавления и гомогенизации ароматизатора. Указанные формы состава также могут содержать другие вспомогательные вещества или ингредиенты, обычно используемые в данной области техники.
Фармацевтический продукт может иметь различные формы или названия в
10 зависимости от процедуры одобрения продукта, а также в зависимости от страны. Например, лекарственное средство представляет собой конкретный фармацевтический продукт. Продукт лечебного питания представляет собой другой конкретный фармацевтический продукт, причем лечебный продукт питания не содержит глютен. Термины "продукт лечебного питания" или "продукты питания для специальных
15 медицинских целей" используются в некоторых странах для обозначения продукта питания, специально разработанного и предназначенного для контроля заболевания с помощью продуктов питания, которое характеризуется отличительными требованиями в отношении продуктов питания, которые не могут быть удовлетворены только с помощью стандартного рациона. Они определены в нормативных актах, таких как поправки к
20 Закону об орфанных лекарственных препаратах FDA от 1988 г. в США, и Директива Еврокомиссии 1999/21/ЕС в Европе. Продукты лечебного питания отличаются от более широкой категории пищевых добавок и от традиционных продуктов питания, которые заявлены как полезные для здоровья. Следовательно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению
25 представляет собой продукт лечебного питания.
Обычно пробиотические бактериальные композиции, такие как та, которая раскрыта в настоящем документе, рассматривают в качестве пищевых добавок, пригодных для пациентов с целиакией. Пищевая добавка, подходящая для пациентов с целиакией, также известная как диетическая добавка или питательная добавка, рассматривается как другой
30 конкретный фармацевтический продукт. Это препарат или продукт, предназначенный для дополнения рациона питания, изготовленный из соединений, обычно используемых в пищевых продуктах, которые обеспечивают питательные вещества или полезные ингредиенты, которые обычно не поступают в организм с обычным рационом питания или не могут потребляться в достаточном количестве. В основном, такие пищевые
35 добавки рассматривают как пищевые продукты, но иногда их определяют как
лекарственные препараты, натуральные продукты для здоровья или нутрицевтические продукты. Применительно к настоящему изобретению пищевые добавки также включают нутрицевтики. Пищевые добавки обычно продаются "безрецептурно", т.е. без рецепта. Если пищевая добавка имеет форму пилюли, капсулы, таблетки или порошка, то она 5 содержит вспомогательные вещества, которые аналогичны тем, которые используются в лекарственных средствах. Пищевая добавка, однако, может иметь форму пищевого продукта, который обогащен некоторыми питательными веществами (например, батончик или йогурт). Следовательно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения, композиция согласно настоящему изобретению представляет собой
10 пищевую добавку, которая не должна содержать глютен.
В случае если композиция согласно настоящему изобретению представляет собой пищевую добавку, подходящую для пациентов с целиакией, она может быть введена как таковая, может быть смешана с подходящей жидкостью для питья, не содержащей глютен, такой как вода, йогурт, молоко или фруктовый сок, или может быть смешана с твердым
15 или жидким пищевым продуктом. Применительно к указанной композиции пищевая добавка может быть в форме таблеток или пастилок, пилюль, капсул, гранул, порошков, суспензий, саше, сладостей, батончиков, сиропов и соответствующих форм для введения, как правило, в виде однократной дозы. Предпочтительно пищевую добавку без глютена, содержащую композицию согласно настоящему изобретению, вводят в виде таблеток,
20 пастилок, капсул или порошков, изготовленных в соответствии со стандартными способами получения пищевых добавок.
Штаммы согласно настоящему изобретению также могут входить в состав различных безглютеновых пищевых продуктов, таких как молочные продукты (йогурт, сыр, кисломолочный продукт, порошковое молоко, ферментированный продукт на основе
25 молока, мороженое, ферментированный продукт на основе зерновых, порошок на основе молока), хлеб, батончики, спреды, печенье и крупы, а также напитки, различные виды масла или приправа. В настоящей заявке термин "пищевой продукт" используется в самом широком смысле, включая любой тип продукта, в любой форме представления, которая может поступать в организм животного, за исключением фармацевтических и
30 ветеринарных продуктов. Примеры других пищевых продуктов включают мясные продукты (например, колбасы или мясные спреды), шоколадные спреды, начинки и глазури, шоколад, кондитерские изделия, хлебобулочные изделия (торты, пирожные), соусы и супы, фруктовые соки и забеливатели для кофе. Особенно подходящие пищевые продукты включают пищевые добавки и смеси для грудных детей, при условии, что они
35 переносятся субъектами с целиакией. Пищевой продукт, не содержащий глютен,
предпочтительно содержит материал-носитель, такой как кашица из овсяной муки, продукты питания, ферментированные молочной кислотой, устойчивый крахмал, пищевые волокна, углеводы, белки и гликозилированные белки. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения штаммы согласно настоящему изобретению 5 являются инкапсулированными или имеют покрытие. Следовательно, согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению представляет собой пищевой продукт, не содержащий глютен. В частности, штаммы согласно настоящему изобретению также могут быть в виде закваски, которая представляет собой тесто, содержащее культуру Lactobacillus, включая L. casei
10 СЕСТ 8590 в симбиотической комбинации с дрожжами. Следовательно, конкретный вариант реализации настоящего изобретения представляет собой среду или продукт, ферментированный с помощью композиции, содержащей указанный штамм.
Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению предпочтительно вводят пероральным путем, в твердой или жидкой форме. Типичные
15 примеры фармацевтических форм для перорального введения включают таблетки, капсулы, гранулы, растворы, суспензии и т.д., и могут содержать стандартные вспомогательные вещества, такие как связующие вещества, разбавители, разрыхлители, смазывающие вещества, увлажнители и т.д., и могут быть получены с помощью стандартных способов. В любом варианте вспомогательные вещества выбирают в
20 соответствии с выбранной фармацевтической формой для введения. Обзор различных фармацевтических форм для введения лекарственных препаратов и способов их получения можно найти в книге "Tratado de Farmacia Galenica" de С. FauH i Trillo, 10 Edition, 1993, Luzan 5, S.A. Editions, или в любой книге с аналогичными характеристиками, которая существует в каждой стране.
25 В объем настоящего изобретения также включены способы лечения целиакии и
расстройств, связанных с потреблением глютена, которые включают введение целевого микроорганизма согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, по отдельности или в комбинации с другими лекарственными препаратами или медицинскими методиками.
30 В описании и формуле настоящего изобретения слово "содержит" и его варианты не
предназначены для исключения других технических признаков, добавок, компонентов или этапов. Дополнительные цели, преимущества и признаки настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в данной области техники после изучения описания или могут быть понятны при реализации настоящего изобретения. Помимо этого, настоящее
35 изобретение включает все возможные комбинации конкретных и предпочтительных
вариантов реализации, описанных в настоящем документе. Следующие примеры и чертежи приведены в данном описании в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
5 ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1.- Активность ферментов РерХ, PepI, PepQ and PepN штамма L. casei СЕСТ
8590.
Фиг. 2.- Хроматограмма, полученная при инкубации пептида 33-мер с L. casei СЕСТ 10 8590 в течение 0 ч (верхняя линия) или 12 ч (средняя линия). Следует отметить, что пептид полностью исчез после инкубации со штаммом в течение 12 ч. Реакционная смесь, содержащая штамм, была использована по отдельности, чтобы проверить физические свойства пептидов, полученных в результате нормального метаболизма штамма (нижняя линия). Часть хроматограммы, которая содержит пик, соответствующий пептиду 33-мер, 15 показана в большем масштабе на вставке.
Фиг. 3.- Выживание штамма L. casei СЕСТ 8590 в модели желудочно-кишечного тракта в условиях in vitro. "CS" означает выживание клеток. Штамм L. casei СЕСТ 8590 ресуспендировали в молоке и подвергали воздействию условий, аналогичных таковым в желудочно-кишечном тракте, в условиях in vitro для определения выживаемости клеток. 20 Для моделирования стресса в желудке (G) штамм инкубировали с пепсином и лизоцимом и снижали показатель рН. Для моделирования стресса в желудочно-кишечном тракте (GI) образцы после снижения показателя рН 5, 4,1 и 3 инкубировали с солями желчных кислот и панкреатическими ферментами в течение 20 (Gla) и 120 (Gib) минут.
25 ПРИМЕРЫ
Следующие примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
30 Пример 1. Выделение и отбор целевого штамма согласно настоящему
изобретению
Штамм согласно настоящему изобретению Lactobacillus casei СЕСТ 8590 выделяли из закваски, используемой при приготовлении хлеба, из Польши. Десять граммов образца собирали и гомогенизировали в течение 5 мин в 90 мл физиологического раствора 35 Рингера (Merck, Дармштадт, Германия) с использованием лабораторного гомогенизатора
Stomacher(r) 400 (Seward Ltd., London, UK). После гомогенизации готовили последовательные разведения в физиологическом растворе Рингера, и 50 мкл высевали в среде с определенным химическим составом, содержащей глиадин в качестве единственного источника азота (AHG-M), и инкубировали (одновременно) в трех 5 различных условиях: аэробно при 30 °С, аэробно при 37 °С и в анаэробиозе при 37 °С (в анаэробной установке MAC 500 (Don Whitley Scientific, Западный Йоркшир, Великобританя)). Культуральную среду дополняли циклогексемидом (50 мкг/мл), чтобы ингибировать размножение грибков и дрожжей. Только 27 штаммов были способны размножаться на указанной среде. Из них только 8 были способны образовывать гало
10 вокруг колонии, что свидетельствует о разрушении глиадина в среде AHG-M, и в соответствии с их характеристиками и профилем, определенным с помощью PFGE, один из штаммов представлял собой целевой штамм согласно настоящему изобретению, Lactobacillus casei СЕСТ 8590.
Пример 2. Виды пептидазной активности в отношении синтетических
15 субстратов
Способность штамма гидролизовать белки и пептиды, полученные из глютена, исследовали с помощью количественного определения активности внутриклеточных пептидаз широкого спектра действия и специфично гидролизующих пептидные последовательности, содержащие пролин, присутствующий в пептидах, ответственных за
20 иммунные и токсические реакции на глютен. Для получения клеточных экстрактов использовали 20 мл бактериальной культуры, которую выращивали в течение 20-22 часов в MRS. Клеточные экстракты собирали центрифугированием (8000 g в течение 10 мин), дважды промывали и ресуспендировали в 2 мл буфера, соответствующего ферментативной активности, которую исследуют. Затем образцы разрушали с помощью
25 French Press до 2,3 кДа (Constant Cell Disruption Systems [Low March, Давентри, Нортантс, Великобритания]). Остатки клеток удаляли центрифугированием при 10000 g при 4 °С в течение 30 мин, экстракты, не содержащие клеток, немедленно исследовали.
Виды пептидазной активности характеризовали с использованием специфичных хромогенных субстратов (Bachem, Бубендорф, Швейцария). PepN, PepI и РерХ
30 определяли с использованием Leu-п-нитроанилида (Leu-p-NA), Pro-p-NA и Gly-Pro-p-NA соответственно. Реакционная смесь содержала 825 мкл 10 мМ фосфатного буфера (рН=7,5), 75 мкл соответствующего субстрата (1,2 мМ) и 150 мкл клеточного экстракта. Через 1 ч инкубации при 37 °С реакцию останавливали добавлением 500 мкл 20% трихлоруксусной кислоты. Высвобожденный p-NA измеряли спектрофотометрически при
35 410 нм (U-2800 DIGILAB, Hitachi High-Technologies Corporation, Токио, Япония). PepQ
определяли в соответствии со способом на основе нингидрина (Yaron And Mlynar, 1968) с использованием валина-пролина в качестве субстрата. Реакционная смесь содержала 100 мкл клеточного экстракта в 162,5 мкл цитратного буфера (цитрат натрия [20 мМ] и сульфат цинка [2,5 мМ]), рН=6,5, и 37,5 мкл субстрата (1,2 мМ). Смесь инкубировали в 5 течение 30 мин при 40 °С. Реакцию останавливали путем добавления 350 мкл ледяной уксусной кислоты, для проявления окрашивания вносили 350 мкл реакционной смеси [нингидрин (3% масс/об.), фосфорная кислота (60% об./об.) и ледяная уксусная кислота (40% об./об.)]. Смесь инкубировали в течение 10 мин при 90 °С. Интенсивность окрашивания измеряли спектрофотометрически при 515 нм. Ферментативные
10 количественные исследования проводили с тремя повторами, и полученные данные выражали в виде миллиединиц на мг белка, одну единицу (U) определяли как количество фермента, необходимое для высвобождения 1 мкмоль p-NA, или 1 пмоль аминокислоты, в случае PepQ, в минуту в исследуемых условиях. Общее содержание белка в каждом образце определяли с использованием набора "Protein Assay" Pierce ВСА (Pierce, Рокфорд,
15 США). Результаты представлены на фиг. 1.
Пример 3. Разрушение иммунотоксичного пептида, содержащего 33 аминокислоты
Способность штамма разрушать иммунотоксичный пептид, состоящий из 33 аминокислот (пептид 33-мер), ответственный за инициацию целиакии (Shan et al. 2002
20 Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue Science 297:2275-2279), количественно определяли методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). Пептид 33-мер синтезировали химически с чистотой 95% (Immunosteps S.L., Саламанка, Испания) и растворяли в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН=7,4 (10 мМ). Клеточные культуры выращивали в бульоне MRS при температуре 37 °С до достижения
25 стационарной фазы. Клетки собирали центрифугированием (8000 g в течение 10 мин), дважды промывали в ФСБ (рН=7,4) и ресуспендировали в 1 мл ФСБ. Суспензию клеток (ODeoo = 35) инкубировали с пептидом (50 мкМ = 195 м.д.) при температуре 37 °С, и отбирали образцы (200 мкл) для впрыскивания на колонку для ВЭЖХ (50 мкл) через 0, 8 и 12 часов. Образцы инактивировали нагреванием и хранили при -20 °С до проведения
30 исследований. Перед впрыскиванием образцы фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм НТ Tuffryn(r). Концентрацию субстрата, а также промежуточных продуктов исследовали с помощью ОФ-ВЭЖХ (в соответствии с Shan et al, 2002). Система для ВЭЖХ состоит из разделительного модуля Alliance 2795, КПК с фотодиодным детектором 2996 и программного обеспечения для сбора данных Empower (Waters,
35 Милфорд, Массачусетс, США). Использовали одну колонку XTerra MS С18, 5 мкм,
4,6x150 мм, с предварительной колонкой Nova-Pak С18, 4 мкм, 3,9x20 мм (Waters), с термостатом при температуре 30 °С. Фазы элюции состояли из (А) воды с 0,1% (об./об.) ТФУК (трифторуксусной кислоты) и (В) ацетонитрила с 0,1% (об./об.) трифторуксусной кислоты. Градиент начинали со 100% растворителя А и 0% растворителя В и линейно 5 изменяли, чтобы достигнуть 62,6% растворителя А и 37,4% растворителя В в течение 34 мин. Колонку промывали 100% растворителем В в течение 5 мин и уравновешивали для достижения начального состояния в течение 10 мин. Регистрировали УФ-поглощение при 215 нм и 280 нм. Полученные результаты приведены на фиг. 2. Штамм L. casei СЕСТ 8590 расщеплял пептид вплоть до 82% в течение 8 ч, и полностью расщеплял пептид в течение 10 12 ч (фиг. 2). Интересно отметить, что промежуточные продукты гидролиза не были обнаружены при сравнении последней хроматограммы с хроматограммой, полученной при одновременной инкубации штамма по отдельности (т.е. без субстрата).
Пример 4. Оценка устойчивости к стрессовым условиям в желудочно-кишечном тракте
15 Оценивали устойчивость целевого штамма согласно настоящему изобретению к
кислой среде желудочного сока, которая представляет собой первый барьер, ограничивающий жизнеспособность микроорганизмов после приема внутрь, а также к действию солей желчных кислот и ферментов поджелудочной железы. Получали суспензии клеток штамма СЕСТ 8590 (108 КОЕ/мл) в молоке. Клеточные культуры
20 выращивали в 30 мл MRS. Клетки осаждали центрифугированием (15 мин, 3000 g), дважды промывали в 0,85% NaCl (масс./об.) и ресуспендировали в 1 объеме 10% сухого обезжиренного молока (Oxoid). Затем клеточные суспензии подвергали воздействию стресса в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), моделируемого в условиях in vitro. Вначале добавляли 0,1% (масс/об.) лизоцима, имитирующего слюну человека. Стрессовые
25 условия в желудке (G) моделировали путем добавления 0,3% (масс./об.) пепсина (Sigma) и уменьшения показателя рН каждые 20 минут (рН=5, рН=4,1, рН=3, рН=2,1 и рН=1,8). Стресс в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) исследовали после стресса G в образцах, в которых показатель рН был снижен до 5, 4,1 и 3. Чтобы модулировать процессы пищеварения в тонком кишечнике, вносили соли желчных кислот (0,3% масс/об.),
30 коктейль панкреатических ферментов (1 мг/мл амилазы, 1 мг/мл трипсина и 1 мг/мл химотрипсина) до конечной концентрации 5 мг/мл, и показатель рН повышали до 6,5. Образцы отбирали через 20 и 120 минут инкубации в условиях ЖКТ. Для каждого условия отбирали по одному образцу, и получали последовательные разведения в физиологическом растворе 0,85% NaCl (масс./об.). Образцы наносили на MRS с 2%
агаром, и количество жизнеспособных микроорганизмов подсчитывали после инкубации в течение 48 ч при 37 °С. Полученные результаты представлены на фиг. 3.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
Book et al., 2003. Prevalence of celiac disease among relatives of sib pairs with celiac disease in U.S. families. Am J. Gastroenterol. 93; 377-81.
Gujral et al., 2012. Celiac disease: Prevalence, diagnosis, pathogenesis and treatment. World J 5 Gastroenterol. 14; 18(42): 6036-6059.
Adams and Marteau. 1995. On the safety of lactic acid bacteria from food. Int J Food Microbiol. 27, 263-264.
Wieser 2007. Chemistry of gluten proteins. Food microbiol. 24; 115-119.
Shan et al. 2005. Identification and analysis of multivalent proteolytically resistant peptides from 10 gluten: implications for celiac sprue. J Proteome Res. 4, 1732-1741.
Qiao et al. 2004. Antigen presentation to celiac lesion-derived T cells of a 33-mer gliadin peptide
naturally formed by gastrointestinal digestion. J Immunol 173:1757-1762.
Hausch et al. 2002. Intestinal digestive resistance of immunodominant gliadin peptides. Am J
Physiol Gastroint Liver Physiol. 238:G996-1003. 15 Maiuri et al. 2003. Association between innate response to gliadin and activation of pathogenic T
cells in coeliac disease. Lancet. 362(9377):30-7.
Sandborn у Targan. 2002. Biologic therapy of inflammatory bowel disease. Gastroenterol. 122(6):1592-608.
Khosla et al. 2009. Transglutaminase inhibitors and methods of use thereof. US 7579313 B2. 20 Sollid et al. 2007. Drug therapy for celiac sprue. US 20070161572 Al.
Laparra et al., Bifidobacterium longum CECT 7347 modulates immune responses in a gliadin-induced enteropathy animal model. PLoS One. 2012;7(2):e30744.
Spaenij-Dekking et al. 2005. Natural variation in toxicity of wheat: potential for selection of
nontoxic varieties for celiac disease patients. Potential for selection and breeding of non-toxic 25 wheat varieties. Gastroenterology. 129:797-806.
DiCagno et al. 2004. Sourdough bread made from wheat and nontoxic flours and selected
lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients. Appl Environ Microbiol 70:1088-96.
Piper et al. 2004. Effect of prolyl endopeptidase on digestive-resistant gliadin peptides in vivo. J
Pharmacol Exp Ther.311:213-9. 30 Tack et al. 2013. Consumption of gluten with gluten-degrading enzyme by celiac patients: a
pilot-study. World J Gastroenterol. 19(35):5837-47.
Gass et al. 2007. Combination enzyme therapy for gastric digestion of dietary gluten in patients with celiac sprue. Gastroenterology. 133(2):472-80).
Tuohy et al. 2003. Using probiotics and prebiotics to gut health Improve Drug Discov Today 35 8:692-700.
Clarke et al. 2012. Review article: probiotics for the treatment of irritable bowel syndrome -focus on lactic acid bacteria Aliment Pharmacol Ther. 35:403-413.
DArienzo et al. 2011. Immunomodulatory effects of Lactobacillus casei administration in a mouse model of gliadin-sensitive enteropathy Scand J Immunol 74:335-341. 5 Lane. 1991. 16S / 23 S rRNA sequencing, 115-175. In E. Stackebrandt, and M. Goodfellow (primers ed.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, Chichester, UK.
Fresno Herrero et al, 2012. Lactobacillus casei strains isolated from cheese reduce biogenic amine accumulation in an experimental model. Int. J. Food Microbiol. 157, 297-304. 10 Fernandez de Palencia et al. 2008. Probiotic strains: survival under simulated gastrointestinal conditions, in vitro adhesion to Caco-2 cells and effect on cytokine secretion. Eur Food Res Technol 227:1475-1484.
Tratado de Farmacia Galenica" de C. Fauli i Trillo, 10 Edition, 1993, Luzan 5, S.A. Editions. Shan et al. 2002 Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue Science 297:2275-2279.
Перечень последовательностей
<110> КОНСЕХО СУПЕРИОР ДЕ ИНВЕСТИГАСИОНЕС СЬЕНТИФИКАС (КСИС)
<120> Новый штамм Lactobacillus casei, способный разрушать иммунотоксичный пептид глютена
<130> PD10109PC00
<150> ES201430768 <151> 2014-05-23
<160> 1
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1 <211> 32
<212> Белок
<213> Triticum aestivum
<400> 1
Leu Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro
1 5 10 15
Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Pro Phe
20 25 30
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Композиция, содержащая эффективное количество выделенного штамма Lactobacillus casei, депонированного в Испанской коллекции типовых культур (СЕСТ) под номером доступа СЕСТ 8590, причем указанный штамм способен разрушать глиадин и иммунотоксичный пептид из 33 аминокислот, который имеет последовательность SEQ Ш NO: 1, и при этом указанный штамм был выделен из ферментированного теста, используемого при приготовлении хлеба.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный штамм способен полностью разрушать указанный иммунотоксичный пептид из 33 аминокислот в течение 12 часов.
3. Композиция по любому из пп. 1-2, отличающаяся тем, что указанный выделенный штамм был ферментирован в искусственной среде и подвергнут последующей обработке после ферментации, для получения бактериальных клеток, причем указанные полученные бактериальные клетки находятся в жидкой среде или в твердом виде.
4. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что указанный способ последующей обработки выбран из группы, состоящей из: сушки, замораживания, лиофилизации, сушки в псевдоожиженном слое, распылительной сушки и замораживания в жидкой среде.
5. Композиция по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что указанный штамм генетически модифицирован.
6. Композиция по любому из пп. 1-5, для применения в качестве лекарственного средства или в качестве пробиотика.
7. Композиция по любому из пп. 1-5, для применения в предотвращении и/или лечении целиакии и расстройств, связанных с потреблением глютена.
8. Композиция по любому из пп. 1-5, для применения в качестве технологического коадъюванта.
9. Фармацевтический продукт, ветеринарный продукт, продукт лечебного питания, пищевой продукт, пищевая добавка или закваска, пробиотическая пищевая композиция, диетическая добавка, симбиотическая композиция или биотерапевтическая композиция, содержащая эффективное количество композиции согласно любому из пп. 1-5, совместно с соответствующими количествами приемлемых вспомогательных веществ или пищевых ингредиентов.
10. Способ получения мутанта штамма Lactobacillus casei, который депонирован в Испанской коллекции типовых культур (СЕСТ) под номером доступа СЕСТ 8590, при этом указанный способ включает применение указанного депонированного штамма в качестве исходного материала и применение мутагенеза, и при этом указанный полученный мутант дополнительно сохраняет или усиливает по меньшей мере
способность указанного депонированного штамма разрушать глиадин и иммунотоксичный пептид из 33 аминокислот, который имеет последовательность SEQ Ш NO: 1.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ измененная по ст. 34, для вступления в региональную фазу в Евразии
1. Композиция, содержащая эффективное количество выделенного штамма Lactobacillus casei, депонированного в Испанской коллекции типовых культур (СЕСТ) под номером доступа СЕСТ 8590.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанный выделенный штамм был ферментирован в искусственной среде и подвергнут последующей обработке после ферментации, для получения бактериальных клеток, причем указанные полученные бактериальные клетки находятся в жидкой среде или в твердом виде.
3. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что указанный способ последующей обработки выбран из группы, состоящей из: сушки, замораживания, лиофилизации, сушки в псевдоожиженном слое, распылительной сушки и замораживания в жидкой среде.
4. Композиция по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что указанный штамм генетически модифицирован.
5. Композиция по любому из пп. 1-4, для применения в качестве лекарственного средства или в качестве пробиотика.
6. Композиция по любому из пп. 1-4, для применения в предотвращении и/или лечении целиакии и расстройств, связанных с потреблением глютена.
7. Композиция по любому из пп. 1-4, для применения в качестве технологического коадъюванта.
8. Фармацевтический продукт, ветеринарный продукт, продукт лечебного питания, пищевой продукт, пищевая добавка или закваска, пробиотическая пищевая композиция, диетическая добавка, симбиотическая композиция или биотерапевтическая композиция, содержащая эффективное количество композиции согласно любому из пп. 1-4, совместно с соответствующими количествами приемлемых вспомогательных веществ или пищевых ингредиентов.
9. Способ получения мутанта штамма Lactobacillus casei, который депонирован в Испанской коллекции типовых культур (СЕСТ) под номером доступа СЕСТ 8590, при этом указанный способ включает применение указанного депонированного штамма в качестве исходного материала и применение мутагенеза, и при этом указанный полученный мутант дополнительно сохраняет или усиливает по меньшей мере способность указанного депонированного штамма разрушать глиадин и иммунотоксичный пептид из 33 аминокислот, который имеет последовательность SEQ ID NO: 1.
14 12 10
8 6
4 \
2 :
0 i -
¦ РерХ нРер! ? PepQ
ИРерМ
Фиг. 1
1.60 1.20 0.80 0.40
VA А.
0.00
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
ФИГ. 2
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
о, со
.0 с; о о. н I о
Фиг. 3
(19)
(19)
(19)
К Заявке № 201692035
К Заявке № 201692035
1/3
1/3
3/3
3/3