(57) Реферат / Формула:
Предлагается способ получения AMG 416 или его фармацевтически приемлемой соли. AMG 416 представляет собой синтетический, состоящий из восьми аминокислот селективный пептидный агонист кальцийчувствительного рецептора. Он был разработан в качестве внутривенного лечения вторичного гиперпаратиреоза (SHPT) гемодиализных больных с хроническим заболеванием почек - минеральным и костным расстройством (CKD-MBD).
Евразийское (21) 201692001 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.02.28
(22) Дата подачи заявки 2015.04.03
(51) Int. Cl.
C07K1/02 (2006.01) C07K 7/00 (2006.01) A61K38/08 (2006.01)
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ AMG 416
(31) 61/974,899
(32) 2014.04.03
(33) US
(86) PCT/US2015/024347
(87) WO 2015/154031 2015.10.08
(71) Заявитель: ЭМДЖЕН ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Беземер Ерун, Чэнь Ин, Крокетт Ричард, Кроссли Кевин, Цуй Шен, Хуан Лян, Джонс Сиан, Лоуэр Ашер, Ранганатхан Кришнакумар (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Предлагается способ получения AMG 416 или его фармацевтически приемлемой соли. AMG 416 представляет собой синтетический, состоящий из восьми аминокислот селективный пептидный аго-нист кальцийчувствительного рецептора. Он был разработан в качестве внутривенного лечения вторичного гиперпаратиреоза (SHPT) гемодиализных больных с хроническим заболеванием почек - минеральным и костным расстройством (CKD-MBD).
2420-537700ЕА/045
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ AMG 416
Перекрестные ссылки на родственные заявки
Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки США 61/974899, поданной 3 апреля 2014 г., содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.
ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Список последовательностей предоставляется в электронном виде через EFS в виде текстового файла, созданного 3 апреля 2015 года и названного "0419250488seqlist.txt" (2531 байт), содержание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к области синтеза полипептидов, а более конкретно, к синтезу AMG 416 или его фармацевтически приемлемой соли.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
AMG 416 представляет собой синтетический, состоящий из
восьми аминокислот селективный пептидный агонист
кальцийчувствительного рецептора. Он был разработан в качестве внутривенного лечения вторичного гиперпаратиреоза (SHPT) гемодиализных больных с хроническим заболеванием почек минеральным и костным расстройством (CKD-MBD).
Соль гидрохлорида AMG 416 имеет химическую структуру:
H-L-Cys-OH
S-S
Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2 • х(НС1) (SEQ ID N0:1)
Основная цепь содержит 7 аминокислот, все в D-конфигурации. Остаток цистеина боковой цепи находится в L-конфигурации. Молекулярная формула AMG 416 (свободное основание) представляет собой C38H73N2iOioS2, и имеет расчетную среднюю молекулярную массу 1048,3 Да.
AMG 416 и способ его получения описаны в Международной
Патентной Публикации WO 2011/014707, которая включена в настоящий документ с помощью ссылки для любой цели. Как описано в Международной Патентной публикации WO 2011/014707, AMG 416 может быть собран с помощью твердофазного синтеза из соответствующих Fmoc-защищенных D-аминокислот. После отщепления от смолы, материал может быть обработан Boc-L-Cys(NPyS)-ОН с образованием дисульфидной связи. Вос-группу затем можно удалить трифторацетатом (TFA), и полученный продукт очищают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой и выделяют в виде соли TFA путем лиофилизации. Соль TFA может быть превращена в фармацевтически приемлемую соль путем проведения последующей процедуры солевого обмена. Такие процедуры хорошо известны в данной области техники и включают, например, метод ионного обмена, необязательно с последующей очисткой полученного продукта (например, с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой или обратного осмоса).
Существует потребность в эффективном способе получения AMG 416 или его фармацевтически приемлемой соли (например, AMG 416 НС1), и, в частности, подходящем для производства в промышленном масштабе.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
С точки зрения описанных выше проблем целью настоящего описания является, среди прочего, предложение способа получения AMG 416 или его фармацевтически приемлемой соли.
В первом аспекте изобретения предлагается способ получения AMG 416, причем способ включает: обеспечение связанного со смолой пептида, имеющего структуру, выбранную из группы, состоящей из Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[Смола] (SEQ ID N0:2) и Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg (Pbf)-[Смола] (SEQ ID N0:3); отщепление пептида от твердой подложки; и активацию боковой цепи остатка D-Cys отщепляемого пептида.
В одном или более воплощениях, связанных с первым аспектом, стадии отщепления и активации происходят в одном сосуде.
Еще в одном или нескольких воплощениях, связанный со
смолой пептид вводят в контакт с раствором, содержащим воду,
трифторуксусную кислоту, триизопропилсилан и
дипиридилдисульфид.
Во втором аспекте, предлагается способ получения AMG 416, причем способ включает: обеспечение пептида, имеющего структуру Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2 (SEQ ID N0:4); и контакт пептида с L-Cys с получением конъюгированного продукта.
В некоторых воплощениях, связанных со вторым аспектом, пептид вводят в контакт с водным раствором, содержащим L-Cys и трифторуксусную кислоту.
В некотором следующем воплощении, связанном со вторым аспектом изобретения, способ дополнительно включает лиофилизацию конъюгированного продукта.
Еще в некоторых других воплощениях, способ согласно второму аспекту дополнительно включает контакт конъюгированного продукта с водным раствором, содержащим изопропиловый спирт (IPA) и соляную кислоту (НС1), в результате чего получают осадок, содержащий AMG 416 НС1.
Еще в одном или в нескольких воплощениях, связанных со вторым аспектом, способ дополнительно включает очистку осадка с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Еще в одном третьем аспекте изобретения предлагается способ получения AMG 416, причем способ включает: обеспечение связанного со смолой пептида, имеющего структуру, выбранную из группы, состоящей из Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[Смола] (SEQ ID N0:2) и Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg (Pbf)-[Смола] (SEQ ID N0:3); отщепление пептида от твердой подложки, то есть, чтобы обеспечить пептид без подложки, и активацию боковой цепи остатка D-Cys пептида без подложки для генерации промежуточного продукта AMG 416 SPy (где SPy представляет собой 2-пиридинсульфенил или S-Pyr), растворение промежуточного продукта AMG 416 SPy в водном растворе 0,1% TFA (раствор трифторуксусной кислоты), и очистку AMG 416 SPy
производного с помощью ВЭЖХ.
В некоторых воплощениях, связанных с третьим аспектом изобретения, способ дополнительно включает азеотропную перегонку промежуточного продукта AMG 416 SPy, чтобы тем самым осуществить замену растворителя с получением раствора AMG 416 SPy в новом растворителе, например, в воде и изопропиловом спирте.
Еще в некоторых дополнительных воплощениях, связанных с третьим аспектом, способ дополнительно включает контакт раствора изопропиловый спирт - вода AMG 416 SPy, в некоторых воплощениях в виде его соли трифторуксусной кислоты, с водным раствором, содержащим L-Cys.
В четвертом аспекте изобретения предлагается способ получения H-D-Arg(Pbf)-ОН, то есть подходящего исходного материала для некоторых из представленных здесь способов синтеза.
В некоторых воплощениях, связанных с четвертым аспектом, способ включает превращение Boc-D-Arg-OH в Boc-D-Arg(Pbf)-ОН в присутствии Nal (йодид натрия). Еще в некоторых других воплощениях, йодид натрия присутствует в концентрации, составляющей примерно 5 мол.%.
В некоторых дополнительных воплощениях, связанных с четвертым аспектом, способ дополнительно включает превращение Boc-D-Arg(Pbf)-ОН в D-Arg(Pbf)-ОН, и кристаллизацию D-Arg(Pbf)-ОН в системе растворителей 1РА/вода.
Дополнительные воплощения способов, описанных в настоящем документе, будут очевидны из приведенных ниже описания, примеров и формулы изобретения. Как можно понять из вышеизложенного и последующего описания, каждый признак, описанный в настоящем документе, и каждая комбинация двух или более из таких признаков, включены в объем настоящего изобретения при условии, что признаки, включенные в такой комбинации, не являются взаимно несовместимыми. Кроме того, любой признак или комбинацию признаков могут быть специально исключены из любого воплощения настоящего изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГ. 1 демонстрирует химическую структуру AMG 416 (Ac-D-Cys (L-Cys-OH)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2) (SEQ ID N0:1).
ФИГ. 2 демонстрирует химическую структуру смолы Rink Amide AM и Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-смола (SEQ ID N0:3).
ФИГ. 3 демонстрирует схему реакции, в которой промежуточный продукт SPy (Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2) (SEQ ID N0:4) образуется из пептидил-смолы (Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg (Pbf)-NH-смола) (SEQ ID NO: 3).
ФИГ. 4 демонстрирует схему реакции, в которой TFA соль AMG 416 образуется из промежуточного продукта SPy (AA1_7(SPY)) .
ФИГ. 5 демонстрирует схему реакции, в которой соль НС1, AMG 416 образуется из TFA соли AMG 416.
ФИГ. 6 демонстрирует схему реакции, в которой Boc-D-Arg (Pbf) -ОН образуется из Boc-D-Arg-OH.
ФИГ. 7 демонстрирует схему реакции, в которой D-Arg(Pbf)-ОН образуется из Boc-D-Arg(Pbf)-ОН.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение будет описано более подробно ниже. Однако настоящее описание может быть воплощено во многих различных формах и не должно быть истолковано как ограниченное воплощениями, изложенными в данном документе; скорее, эти воплощения предоставлены для того, чтобы описание было полным и завершенным и полностью передавало его объем специалистам в данной области техники.
Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в настоящем документе, либо выше, либо внутри, включены в данное описание в качестве ссылки в полном объеме, если не указано иное. В случае, когда один и тот же термин определяется как в публикации, патенте или в патентной заявке, включенной в настоящий документ с помощью ссылки, так и в настоящем описании, то определение в настоящем описании представляет собой основное определение. Для публикаций, патентов и патентных заявок, упомянутых для описания конкретного типа
соединения, пептида, химии и т.д., части, имеющие отношение к таким соединениям, химии и т.д., являются теми частями документа, которые включены в настоящее описание с помощью ссылки.
Заголовки разделов, используемые в данном документе, предназначены только для организационных целей и не должны истолковываться как ограничивающие описываемую проблему.
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящей заявкой, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистами в данной области техники. Кроме того, если иное не требуется по контексту, термины в единственном числе будут включать в себя множественное число и термины во множественном числе будут включать термины в единственном числе.
Как правило, номенклатура, используемая в связи с ними и методы молекулярной биологии и химии белка, описанные в настоящем документе, являются хорошо известными и широко используются в данной области. Методы и способы настоящей заявки, как правило, осуществляется в соответствии с обычными способами, хорошо известными в данной области и как описано в различных общих и более конкретных ссылках, которые упоминаются и обсуждаются в настоящем описании, если не указано иное. Смотри, например, Laszlo, Peptide-Based Drug Design: Methods and Protocols, Humana Press (2008); Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press (2005); Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), которые включены в настоящий документ с помощью ссылки для любых целей. Методы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно делают в данной области, или как описано в настоящем документе. Терминология, использованная в связи с этим, и лабораторные процедуры и методики аналитической химии, химии органического синтеза и медицинской и фармацевтической химии, описанные в настоящем документе, являются хорошо известными и широко используются в данной области. Стандартные методы могут быть использованы для химического синтеза, химических анализов, фармацевтического
препарата, состава и доставки и лечения пациентов.
Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реагентами и т.д., описанными в настоящем документе, и, как таковые, могут варьироваться. Терминология, использованная в настоящем документе, предназначена исключительно для целей описания конкретных воплощений изобретения и не предназначена для ограничения объема раскрытого изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения.
Термин "примерно", в частности, в отношении данного количества, предназначен для охвата отклонения плюс или минус пять процентов.
I. Общие определения
Артикли "а" и "ап" используются в настоящем документе для обозначения одного или более чем одного (то есть, по меньшей мере, одного) грамматического субъекта статьи, если специально не указано иное. В качестве примера, "элемент" означает один элемент или более чем один элемент.
Термин "AMG 416", также известный как этелькальцетид, ранее известный как велькальцетид или KAI-4169, относится к соединению, имеющему химическое название: N-ацетил-В-цистеинил-В-аланил-В-аргинил-В-аргинил-В-аргинил-В-аланил-В-аргинамид дисульфид с L-цистеином, который имеет следующую структурную формулу:
H-L-Cys-OH S-S
Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2
Ссылка на AMG 416, или на любое соединение или на фрагмент AMG 416, промежуточный продукт или его предшественник, как описано в настоящем документе, как подразумевается, охватывает их нейтральные незаряженных формы, а также их фармацевтически приемлемые соли, гидраты и сольваты.
Термины "AMG 416 гидрохлорид" и "AMG 416 НС1" являются взаимозаменяемыми и относятся к форме соли гидрохлорида AMG
416, имеющего следующую структурную формулу: H-L-Cys-OH
S-S
Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2 • xHCl
Как правило, х имеет значение 3-5 (например, 3, 4 или 5).
Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к форме соединения в виде соли, содержащего, по меньшей мере, одну группу, подходящую для образования соли, которая не вызывает каких-либо существенных отрицательных токсикологических эффектов у пациента. Термин "фармацевтически приемлемая соль" может, в одном аспекте, относятся к относительно нетоксичным, неорганическим или органическим кислотно-аддитивные солям соединений, как представлено в настоящем документе, например, AMG 416, а также фрагментов AMG 416, промежуточных продуктов, предшественников, и тому подобное, обладающих одной или несколькими ионизированными аминогруппами. Типичные соли включают гидробромид, гидрохлорид, сульфат, бисульфат, фосфат, нитрат, ацетат, валерат, олеат, пальмитат, стеарат, лаурат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, нафтилат, мезилат, глюкогептонат, лактобионат и лаурилсульфонат и тому подобное. (Смотри, например, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19). Дополнительные подходящие фармацевтически приемлемые формы солей можно найти, например, в Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, Weinheim/Zurich:Wiley-VCH/VHCA, 2002; P. H. Stahl and C. G. Wermuth, Eds.
Используемые в настоящем описании термины "аминокислота" и
"остаток" являются взаимозаменяемыми и, при использовании в
контексте пептида или полипептида, относятся как к природным и
синтетическим аминокислотам, так и к аналогам аминокислот,
миметикам аминокислот и к не встречающимся в природе
аминокислотам, которые химически подобны природным
аминокислотам. "Свободная аминокислота" или "свободная
аминогруппа" относится к аминокислоте, пептидному фрагменту или к пептиду, содержащему аминогруппу, которая представлена в форме -NH2, то есть, не защищена.
Выражение "защитная группа" или "PG", используемое в
настоящем документе, относится к временному заместителю или
заместителям, которые защищают потенциально реакционноспособную
функциональную группу от нежелательных химических
преобразований. Примеры таких защитных групп включают сложные
эфиры карбоновых кислот, силиловые эфиры спиртов и ацетали и
кетали альдегидов и кетонов, соответственно. Смотри, например,
Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic
Synthesis, 4th ed.;; Wiley: New York, 2007; Isidro-Llobet, A.,
et al. , Amino Acid-Protecting Groups, Chem. Rev 2009, 109,
2455-2504. Реакционноспособные аминокислоты или пептидные
фрагменты, как описано в настоящем документе, часто для
удобства содержат одну или несколько защитных групп на
функциональных группах, которые не являются мишенью объекта
химического превращения. Иллюстративные защитные группы
включают, например, карбоксибензил, также обозначается как
бензилоксикарбонил ("Cbz" или "Z"), 9-флуоренилметоксикарбонил
(Fmoc), 2,2,4,б,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил
(Pbf), трет-бутилоксикарбонил (Вое), тритил (Trt), метиловый эфир (ОМе) , 2-пиридинсульфенил (SPy или S-Pyr) , амид, и тому подобное. В сокращенных структурах, представленных в настоящем документе, -NH2 на С-конце обозначает амидную защитную группу (~ C(0)NH2), "Н" на N-конце относится к свободной аминогруппе, и обозначение защитной группы в скобках означает, что защитная группа находится на 8 азоте орнитина.
Используемый в настоящем описании термин "агент удаления защиты" или "агент, снимающий защиту" могут быть использованы взаимозаменяемо, и представляет собой химический реагент для удаления аминозащищающих агентов, связанных с аминокислотами, и аминозащищающие агенты могут представлять собой хорошо известные в данной области, такие как, но не ограничиваясь этим, Fmoc и Вое.
Используемый в настоящем документе термин "агент
конденсации", "конденсирующий агент", "активирующий агент",
"агент, активирующий конденсацию" используется в настоящем
документе взаимозаменяемо, относятся к химическим реагентам,
которые облегчает реакцию аминогруппы из одной аминокислоты с
карбоксильной группой из другой аминокислоты с образованием
пептидной связи. Иллюстративные конденсирующие агенты хорошо
известны в данной области и включают, но не ограничиваются
этим, карбодиимиды, такие как N,N'-диизопропилкарбодиимид
(DIC), дициклогексилкарбодиимид (DCC), 1-
[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазол[4,5-Ь]пиридин-3-
оксид гексафторфосфат (HATU), [бензотриазол-1-ил-
окси(диметиламино)метилиден]-диметилазаний; тетрафторборат (TBTU), N,N,N',N'-тетраметил-О-(1Н-бензотриазол-1-ил)урония, 0-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония (HBTU), и N,N-диизопропилэтиламин (DIPEA ) . См., например, El-Faham, A. and Albericio, F., "Peptide Coupling Reagents, More than a Letter Soup", Chem. Rev. 2011, 111, 6557-6602. Такие соединения легко доступны от коммерческих поставщиков.
Используемый в данном описании термин "агент отщепления" означает химическое вещество, которое может отделить пептид, связанный со смолой, от смолы. Агенты отщепления хорошо известны обычным специалистам в данной области техники и включают раствор кислот, содержащий раствор TFA и НС1.
Термин "лечение" относится к любым признакам успеха в лечении или облегчения поражения, патологии или состояния, включая какие-либо объективные или субъективные параметры, такие как ослабление боли или выраженности симптома; ремиссию; уменьшение признаков или симптомов или то, что делает поражение, патологию или состояние более переносимым для пациента; замедление скорости дегенерации или упадка; то что делает конечную точку дегенерации менее изнурительной; улучшение физического или психического благополучия пациента. Лечение или ослабление признаков или симптомов могут быть основаны на объективных или субъективных параметрах; включая результаты физического осмотра. Например, некоторые методы,
представленные а настоящем документе, успешно используют для лечения SHPT у гемодиализных пациентов с CKD-MBD за счет уменьшения сывороточного интактного паратироидного гормона (iPTH).
Термин "эффективное количество", как правило, означает количество, достаточное для уменьшения тяжести и/или частоты симптомов, устранения симптомов и/или их основной причины, предотвращения возникновения симптомов и/или их основной причины, и/или улучшения или устранения повреждений, которые являются следствием или связаны с состоянием заболевания (например, повышенные уровни РТН) . Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество, достаточное для устранения болезненного состояния или симптомов, в частности, состояния или симптомов, связанных с болезненным состоянием, или иное предотвращение, препятствие или обращение вспять прогрессии патологического состояния или любого другого нежелательного симптома, связанного каким-либо образом с заболеванием. Полный терапевтический эффект необязательно имеет место при введении одной дозы, и может проявляться только после введения серии доз. Таким образом, терапевтически эффективное количество может быть введено за один или несколько приемов.
Термины "терапевтически эффективная доза" и
"терапевтически эффективное количество", используемые в настоящем документе, означают количество, которое вызывает биологическую или медицинскую реакцию в системе тканей, у животного или человека, которой добивается исследователь, врач или другой клиницист, которая включает ослабление или облегчение признаков или симптомов заболевания или расстройства, подлежащего лечению, то есть, количество велькальцетида, которое поддерживает наблюдаемый уровень одного или более желательных биологических или медицинских реакций, например понижение iPTH.
Термины "пептид", "полипептид" и "белок" являются взаимозаменяемыми и относятся к полимеру аминокислотных остатков. Термины также применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков
представляет собой аналог или миметик соответствующей природной аминокислоты, а также к встречающимся в природе полимерам аминокислот. Термины могут также охватывать полимеры аминокислот, которые были модифицированы, например, путем добавления углеводных остатков с образованием гликопротеинов, или путем фосфорилирования. Пептиды, полипептиды и белки могут быть получены с помощью жидкофазного или твердофазного синтеза или с помощью генетически сконструированной или рекомбинантной клетки, и включают молекулы, имеющие аминокислотную последовательность.
"Вариант" пептида или полипептида содержит аминокислотную последовательность, в которой один или несколько аминокислотных остатков вставлены, делетированы и/или заменены в аминокислотной последовательности относительно другой полипептидной последовательности. Варианты включают слитые белки.
"Производное" пептида или полипептида представляет собой пептид или полипептид, который был химически модифицирован каким-либо способом, отличным от вариантов со вставкой, делецией или заменой, например, посредством конъюгации с другим химическим компонентом. Такая модификация может включать ковалентное присоединение группы к аминогруппе и/или карбокси-концу пептида или полипептида, например, ацетилирование амино-конца и/или амидирование карбокси-конца пептида или полипептида.
Термин "аминокислота" включает свое обычное значение в
данной области. Двадцать природных аминокислот и их сокращенные
обозначения используются согласно своему обычному применению.
См, Immunology-A Synthesis, 2nd Edition, (Е. S. Golub and D. R.
Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991),
которые включены в настоящий документ в качестве ссылки для
любых целей. Стереоизомеры (например, D-аминокислоты) 19
стандартных аминокислот (за исключением глицина), неприродные
аминокислоты, такие как [альфа]-,[альфа]-дизамещенные
аминокислоты, N-алкиламинокислоты и другие нестандартные аминокислоты также могут быть подходящими компонентами для
полипептидов и включены в выражение "аминокислоты". Примеры
нестандартных аминокислот включают: гомоцистеин, орнитин, 4-
гидроксипролин, [гамма]-карбоксиглутамат, [эпсилон]-N,N,N-
триметиллизин, [эпсилон]-N-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-
ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-
гидроксилизин, [сигма]-N-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В обозначениях полипептида, используемых в настоящем документе, левым направлением является амино-концевое направление и правым направлением является карбокси-концевое направление, в соответствии со стандартным использованием и обозначением.
Термин "Объект" или "пациент", используемый в настоящем документе, может относиться к любым млекопитающим. В типичном воплощении объект или пациент является человеком.
Термин "q.s." означает добавление количества, достаточного для достижения целевой функции, например, доведение раствора до целевого объема (т.е. 100%) .
II. Воплощения изобретения
В одном или более воплощениях, AMG 416 гидрохлорид получают через последовательность стадий способа следующим образом: иллюстративные стадии включают твердофазный пептидный синтез семичленного линейного фрагмента (стадия I) AMG 416, с последующим отщеплением пептидной цепи от смолы с сопутствующей деблокировкой боковой цепи и активацией цистеина (стадия II), за которым следует in-situ конюгация пептидной цепи с L-Cys (образование дисульфидов) с получением неочищенного AMG 416 (стадия III), а затем в некоторых воплощениях немедленная препаративная ВЭЖХ и лиофилизации с получением очищенной TFA-соли AMG 416 (стадия IV) . За стадией IV следует последующий солевой обмен (TFA на НС1) путем осаждения, а в некоторых воплощениях, с последующей микрофильтрацией и лиофилизацией с получением очищенного гидрохлорида AMG 416 (стадия V). Твердофазный пептидный синтез
Семичленный линейный фрагмент AMG 416 может быть синтезирован любым методом, известным в данной области техники, включая твердофазный пептидный синтез (SPPS). Используемый в
настоящем документе термин "твердофазный синтез" или "твердофазный пептидный синтез" относится к методу, известному обычному специалисту в данной области, в котором растущая пептидная цепь связана с твердой подложкой. Твердофазный синтез, как правило, включает стадии: (i), ковалентного связывания первой аминокислоты (в которой аминогруппа блокирована или "защищена") с твердофазной подложкой; (ii) удаления защитной группы из аминогруппы с использованием деблокирующего агента; (iii) активации карбоксила второй аминокислоты (в которой аминогруппа заблокирована) и контакт второй аминокислоты с первой аминокислотой, связанной с носителем твердой фазы таким образом, чтобы был получен дипептид (в котором аминогруппа заблокирована); (iv) повтор стадий образования пептидной связи и, таким образом, пептидная цепь протягивается от С-конца к N-концу; и (v) удаление защитной группы с аминогруппы и отделение пептидной цепи от твердофазной подложки с использованием агента отщепления с получением пептида.
Подходящие методы твердофазного синтеза хорошо известны в данной области, и включают в себя те, которые описаны в Merrifield, in Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds. 1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963); Davis et al., Biochem. Intl. 10:394-414 (1985); Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1969); U.S. Pat. No. 3,941,763; Finn et al., The Proteins, 3rd ed., vol. 2, pp. 105253 (1976); and Erickson et al., The Proteins, 3rd ed., vol. 2, pp. 257-527 (1976). См., также Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry. Additional Supplementary Volumes to the 4th Ed., Vol E22A, "Synthesis of Peptides and Peptidomimetics", Editor-in-Chief M. Goodman. Georg Thieme Verlag: Stuttgard and New York. 2002, pp. 685-877; Chan, W.C., White, P.D., "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach". Oxford University Press, (200), p. 9-109. Твердофазный синтез, как правило, является предпочтительным методом получения индивидуальных пептидов, таких как AMG 416, так как он часто является одним из наиболее экономически эффективных способов получения пептидов
небольших размеров.
В некоторых воплощениях, линейный фрагмент основной цепи AMG 416 собран с использованием стандартных протоколов твердофазного пептидного синтеза пептидов с использованием стратегии Fmoc-защиты и, например, смолы Rink amide (RAM), такой как доступные от Sigma Aldrich, с получением С-концевого амида, связанного со смолой, наряду с ацетилированием пептидного N-конца. В некоторых других воплощениях могут быть использованы другие смолы и линкеры (например, смола Ramage amide AM, также называемая как смола с трициклическими амидными линкерами). В одном воплощении, сборка основной цепи линейного фрагмента включает стадии: (i) смешивание смолы Fmoc-Rink amide AM с деблокирующим агентом с получением смолы Rink amide AM;
(ii) конденсации (Pbf)-OH-D-ArgFmoc со смолой Rink amide AM с получением Fmoc-D-Arg(PBF)-Rink amide AM смола; (iii), повтор деблокирования Fmoc на стадии (i) и конденсации между аминокислотой и полипептидом на смоле на стадии (ii) для каждого оставшегося аминокислотного остатка линейного фрагмента основной цепи AMG 416, с наращиванием от С-конца к N-концу
(например, с использованием Fmoc-D-Cys(Trt)-ОН, Fmoc-D-Ala-OH и Fmoc-D-Arg(Pbf)-ОН) с образованием полипептидной смолы, представленной SEQ ID N0: 2; и (iv), повтор деблокирования Fmoc на стадии (i) и ацетилирование N-конца с образованием полипептидной смолы, представленной SEQ ID N0: 3. См. ФИГ. 2.
Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[Смола] (SEQ ID NO: 2)
Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[Смола] (SEQ ID NO: 3)
Как правило, отщепление защитной группы Fmoc достигается с помощью деблокирующего агента, такого как пиперидин в DMF. В одном воплощении, конденсацию Fmoc-защищенной аминокислоты проводят в растворителе, таком как диметилформамид (DMF) с использованием подходящего конденсирующего агента, такого как карбодиимид, N,N-диизопропилкарбодиимид (DIC), необязательно в
присутствии добавки, такой, как этил-2-циано-2-
(гидроксиимино)ацетат (Охута) для всех аминокислот, кроме цистеина. В случае удлинения пептидной цепи на цистеин, конденсацию, как правило, проводят с использованием N,N-диизопропилкарбодиимида (DIC) в присутствии бензотриазольной добавки, такой как гидроксибензотриазол (HOBt) в системе растворителей, такой как диметилформамид-дихлорметан, (т.е., DMF, DCM, HOBt, DIC).
Ацетилирование N-конца может быть осуществлено любым методом, известным в данной области техники. В одном воплощении, ацетилирование N-конца проводят с использованием, например, уксусного ангидрида (Ас20) в пиридине и DMF.
Отщепление от смолы
Пептид может быть отделен от подложки, и защитные группы могут быть удалены из боковых цепей любыми способами, известными в данной области техники. См., например, Synthetic Peptides: A User's Guide (G.A. Grant, ed.), W.H. Freeman and Company, New York, 1992; and Chan, W.C., White, P.D. "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach", Oxford University Press (2000), p. 64-66 and 105-109.
В одном воплощении, пептидил-смолу добавляют к коктейлю растворов, содержащему воду (например, деионизированную воду (DIW) ) трифторуксусную кислоту (TFA), триизопропилсилан (TIPS) и дипиридилдисульфид (DPDS). Это позволяет пептиду отделиться от смолы с сопутствующей деблокировкой боковой цепи и активацией цистеина, с получением таким образом in-situ конъюгации с L-Cys. Получают промежуточный продукт SPy из семи аминокислот (AA1~7(SPY)) . См. ФИГ. 3. Последовательность промежуточного продукта SPy представлена в SEQ ID NO: 4.
Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2 (SEQ ID NO: 4)
In-Situ конъюгация и препаративная ВЭЖХ
Промежуточный продукт SPy может быть конъюгирован с L-Cys любым способом, известным в данной области техники. В одном воплощении, конъюгацию L-Cys осуществляют в водном растворе
TFA.
Полученный AMG 416 (TFA соль) может быть очищен любым способом, известным в данной области техники. В одном воплощении AMG 416 (TFA соль) очищают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Например, в одном из воплощений, очистка и концентрирования AMG 416 (TFA соль) включает стадию очистки на ВЭЖХ с обращенной фазой и стадию концентрирования на ВЭЖХ с обращенной фазой. См. ФИГ. 4
Очищенный и концентрированный образец, содержащий AMG 416 (TFA соль) может быть лиофилизован.
Превращение Соли
Соль TFA может быть превращена в фармацевтически приемлемую соль, такую как гидрохлорид, любыми способами, известными в данной области техники.
В одном воплощении, лиофилизированную TFA соль AMG 416 растворяют в водном растворе изопропилового спирта (IPA). Раствор соли TFA затем загружают в раствор НС1 для солевого обмена и осаждения соли НС1. Осадок может быть затем восстановлен водой, отфильтрован через микрофильтр (например, фильтр 0,2 мкм) и лиофилизирован для выделения соли НС1 AMG 416. См. ФИГ. 5.
Очистка промежуточного продукта SPy
В альтернативном воплощении промежуточный продукт SPy очищают перед конъюгацией с L-Cys. Как правило, промежуточные продукты SPy, в частности, промежуточные продукты пептид-SPy, считаются крайне нестабильными, т.е., как полагают, недостаточно стабильными, чтобы выдерживать эффективную очистку, например, с помощью ВЭЖХ. Однако, при достижении предлагаемых здесь способов заявителями неожиданно было обнаружено, что промежуточные продукты пептид-SPy, полученные в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, на самом деле достаточно стабильны, чтобы выдержать отдельную стадию очистки. Кроме того, было также обнаружено, что очистка таких промежуточных продуктов перед конъюгацией с L-Cys может фактически увеличить эффективность и снизить стоимость изготовления конечного продукта пептидного лекарственного
средства.
В иллюстративном воплощении, альтернативный способ
осуществляют следующим образом. Метод, описанный ниже и в
Примере 5, пригоден для очистки промежуточного продукта SPy,
как это предусмотрено в настоящем документе, где промежуточный
продукт остается стабильным, и подходит для конъюгации с
тиолсодержащим компонентом, например, посредством образования
дисульфидных связей. Например, промежуточный продукт пептид-SPy
растворяют в водном растворе, содержащем не более чем примерно
0,2% TFA, например, примерно 0,05% - 0,15% TFA, или примерно
0,1% TFA, и затем непосредственно наносят на колонку ВЭЖХ для
хроматографической очистки. Затем может проводиться замена
растворителей фракций ВЭЖХ, содержащих промежуточный продукт
пептид-SPy, например, путем азеотропной перегонки. После замены
растворителя промежуточного продукта пептид-SPy на
соответствующий растворитель, такой как смесь вода-изопропанол, добавляют тиолсодержащим фрагмент, такой как L-Cys, непосредственно к раствору промежуточного продукта пептид-SPy для осуществления конъюгации. Полученный в результате конъюгированный продукт, например, в растворе, затем доступен для солевого обмена.
Конкретное воплощение описанного метода очистки заключается в следующем. После исходного отщепления пептида от подложки смолы и выделения промежуточного продукта AA1~7(SPy), промежуточный продукт растворяли в 0,1% TFA и ацетонитриле, загружали на колонку ВЭЖХ с неподвижной фазой и очищали, как описано выше. Применение 0,1% раствора TFA имеет несколько преимуществ для ВЭЖХ-очистки по сравнению с использованием, например, 0,2% раствора TFA. Например, 0,1% TFA менее вредна для неподвижной фазы в процессе очистки, чем раствор TFA более высокой концентрации. То есть, при использовании такой оптимальной концентрации TFA, происходит меньшее разложение неподвижной фазы, что приводит к более длительному сроку годности неподвижной фазы. Кроме того, промежуточный продукт пептид-SPy (например, AA1~7(SPy)) менее полярный, в результате чего промежуточный продукт лучше удерживается на неподвижной
фазе с обращенной фазой. В результате, в каждом цикле очистки может быть достигнута значительно более высокая нагрузка на неподвижную фазу. В некоторых воплощениях, увеличенная емкость нагрузки увеличивает пропускную способность процесса производства до 1,5-2 раз, или примерно в 1,5 раза.
ВЭЖХ-фракции, содержащие промежуточный продукт SPy в виде соли TFA затем подвергают азеотропной перегонке с достаточным количеством IPA для замены растворителя с ацетонитрила и воды на 15% воды в растворе IPA, подходящем для L-Cys конъюгации и солевого обмена. Этот способ особенно предпочтителен, поскольку конъюгацию и солевой обмен можно проводить в одном сосуде, что дополнительно повышает эффективность и возможности реализации производственного процесса.
Производство Исходного материала Fmoc-D-Arg(Pbf)-ОН
AMG 416 содержит линейную последовательность из 7 аминокислот, 4 из которых представляют собой D-аргинин. В настоящем документе раскрыт способ синтеза Fmoc-D-Arg(Pbf)-ОН, Fmoc-производного D-аргинина, используемого в синтезе AMG 416. Использование исходного материала Fmoc-D-Arg(Pbf)-ОН высокого качества может дать дополнительную чистоту неочищенному AMG 416 от стадии I к стадии III, чтобы тем самым увеличить степень очистки на стадии IV. Еще более важно, что использование исходного материала высокого качества и высокой чистоты может обеспечить целевой и предпочтительный элемент контроля для обеспечения целевой чистоты AMG 416. Был разработан новый способ получения D-Arg(Pbf)-ОН и Fmoc-D-Arg(Pbf)-ОН высокого качества, который производит более высокий выход, требует меньшего количества отдельных операций, обеспечивает более надежный контроль качества и имеет возможность крупномасштабного производства. В общем, способ получения Fmoc-D-Arg (Pbf)-ОН, описанный в настоящем документе, представляет собой значительное увеличение возможности производства AMG 416, сопровождающееся потенциальным ростом качества.
Синтетический путь, который является одним из наиболее кратких синтезов Fmoc-D-Arg(Pbf)-ОН, обнаруженных в литературе, и которые могут быть использованы для промышленного масштаба
синтеза Fmoc-D-Arg (Pbf) -ОН, представлен далее. См., например, Китайский патент № CN101250172B от 2 мая 2012 года. Синтез начинается путем защиты аминогруппы D-Arg с помощью ди-трет-бутилдикарбоната (ВосгО) с получением Boc-D-Arg-OH с приблизительно количественным выходом после выделения. На стадии 2 группу гуанидина боковой цепи защищают группой Pbf в присутствии основания, такого как водный раствор гидроксида натрия. Продукт используют непосредственно на следующей стадии в виде раствора IPA (изопропиловый спирт) без выделения. Стадия 3 включает удаление защитной группы Вое в кислых условиях и выделение соответствующего продукта, D-Arg(Pbf)-ОН, в виде кристаллического промежуточного продукта. Стадия 4 способа включает введение защитной группы Fmoc на функциональные аминогруппы с получением Fmoc-D-Arg(Pbf)-ОН в качестве конечного продукта. Так как продукты обеих стадий, 2 и 4, являются аморфными веществами, то есть, обеспечивают ограниченные возможности удаления примесей, то кристаллический промежуточный продукт D-Arg(Pbf)-ОН (продукт стадии 3) служит в качестве контрольной точки для влияния и обеспечения чистоты конечного продукта.
Получение продукта высокой степени чистоты является серьезной проблемой, когда оно осуществляется, опираясь на способы, описанные в литературе. Множество перекристаллизаций, как правило, требуется для удовлетворения требований к чистоте. В качестве примера, D-Arg(Pbf)-ОН перекристаллизовывают семь раз в тройной системе растворителей EtOH/EtOAc/вода в целях повышения чистоты до целевого уровня. Кроме того, на стадии 2, 20-30% от исходных материалов остаются непрореагировавшими даже в присутствии большого избытка гидроксида натрия и PbfCl, и общий выход (стадия 1-3), как правило, составляет лишь менее 40%.
Усовершенствованный способ, разработанный и описанный в настоящем документе и проиллюстрированный на ФИГ. б и 7, обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с известными способами. Nal вводят в качестве катализатора для превращения Boc-D-Arg-OH в Boc-D-Arg(Pbf)-ОН (стадия 2 на ФИГ. б).
Включение иодида натрия является эффективным для значительного улучшения кинетики реакции и, как следствие, превращение стадии 2 может быть увеличено более чем на 95%, а аналитический выход может составить до ~ 90%. Кроме того, общее количество примесей также уменьшается.
D-Orn(Pbf)-ОН и этиловый эфир D-Arg(PBF)-ОН являются ключевыми примесями, образующимися на стадии 2 и стадии 3 (ФИГ. 7), соответственно, и их трудно удалить с помощью кристаллизации, тем самым способствуя необходимости осуществления множества перекристаллизаций. Усовершенствованный способ, описанный в настоящем документе, дополнительно включает использование изопропилацетата (IPAc), более стерически затрудненного сложного эфира по сравнению с более часто применяемым EtOAc, в качестве растворителя для стадии 3, в которой Boc-D-Arg(Pbf)-ОН преобразуется в D-Arg(Pbf)-ОН. Использование IPAc значительно замедляет побочную реакцию переэтерификации, катализируемую сильной кислотой НС1. В результате, содержание соответствующей примеси, эфира D-Arg(Pbf)-OH, снижается до менее чем примерно 0,5% (по сравнению с более чем 1% в способе, в котором применяют EtOAc). Кроме того, было обнаружено, что изопропиловый спирт (1РА)/вода представляет собой более мощную систему растворителей, что позволяет удаление всех примесей способа с минимизаицей потерь продукта на стадиях кристаллизации. В тестовом прогоне, проводимом в лабораторном масштабе (20 г), чистоту D-Arg(Pbf)-ОН (промежуточная стадия 3) улучшали до более чем 99,7% с использованием только двух кристаллизаций, и общий выход (стадия 1-3) составил приблизительно 7 0%. Одно воплощение этого усовершенствованного способа описано в примере б ниже.
Специалисту в данной области будет понятно, что настоящее изобретение также распространяется на варианты и производные AMG 416. Например, в одном воплощении, способы, представленные в настоящем документе, могут также быть использованы вместе с N-ацетил-D-цистеинил-О-аланил-О-аргинил-D-аргинил-О-аргинил-D-аланил-О-аргинамид дисульфидом с D-цистеин. В другом воплощении, раскрытые составы также могут быть использованы
вместе с Ы-ацетил-Ъ-цистеинил-Ъ-аланил-Ъ-аргинил-Ъ-аргинил-Ъ-аргинил-Ъ-аланил-Ъ-аргинамид дисульфидом с D-цистеином и/или N-ацетил-Ъ-цистеинил-Ъ-аланил-Ъ-аргинил-Ъ-аргинил-Ъ-аргинил-Ъ-аланил-Ъ-аргинамид дисульфидом с L-цистеином. В другом воплощении, раскрытый состав также может быть использован вместе с N-ацетил-В-цистеинил-В-аргинил-В-аланил-В-аргинил-В-аргинил-В-аланил-В-аргинамид дисульфидом с L-цистеином, и/или N-ацетил-В-цистеинил-В-аргинил-В-аланил-В-аргинил-В-аргинил-В-аланил-В-аргинамид дисульфидом с В-цистеином. Кроме того, настоящие способы могут быть использованы для приготовления одного или нескольких соединений, представленных в Таблице 1, Таблице 2, Таблице 3, Таблице 4, Таблице 5, Таблице б, Таблице 7, Таблице 8, Таблице 9 и/или в Таблице 10 Международной Патент. Публикации № WO 2011/014707. В дополнительных воплощениях, способы, описанные в настоящем документе, также могут быть использованы для получения соединений, описанных в Международной Пат. Публикации № WO 2011/014707.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры, включающие проведенные эксперименты и достигнутые результаты, представлены исключительно в иллюстративных целях и не должны истолковываться как ограничивающие объем прилагаемой формулы изобретения.
ПРИМЕР 1А
Синтез линейного фрагмента основной цепи
Синтез линейного фрагмента основной цепи представлен на ФИГ. 2. Смолу Rink Amide AM (Fmoc-2,4-диметокси-4' (карбоксиметилокси)-бензгидриламин, связанный со смолой Aminomethyl) (1 кг) добавляли в BMF (5,8 л/кг) и раствор перемешивали при 22°С. Смолу фильтровали и взвесь промывали. Образец тестировали на остаточный Fmoc (УФ-тест) и остаточный пиперидин (рН) . Были проведены колориметрические тесты Кайзера и/или TNBS, чтобы гарантировать, что было проведено удаление защитной группы Fmoc.
Первые шесть конденсаций аминокислотных производных проводили согласно той же процедуре предварительной активации,
конденсации и промывки. 1,6 экв защищенной Fmoc аминокислоты добавляли в DMF, 8,9 л/кг при 22°С. Затем добавляли Охута (2,45 экв) . Раствор охлаждали до 21°С и добавляли DIC (2,13 экв), и давали пройти реакции. Предварительно активированный раствор объединяли со смолой и давали пройти реакции. Добавляли DIC
(1,07 экв) и давали пройти реакции при 22°С. Образец тестировали на неполную конденсацию с использованием колориметрических тестов Кайзера и/или TNBS. Материал промывали с последующим удалением защитной группы Fmoc и последующей промывкой. Образец тестировали на остаточный Fmoc (УФ-тест) и остаточный пиперидин (рН) . Проводили колориметрические тесты Кайзера и/или TNBS для гарантии удаления защитной группы Fmoc.
Fmoc-D-Cys(Trt)-ОН 1,6 экв добавляли к 1:1,7 DMF:DCM раствора, 12 л/кг, с последующим добавлением HOBt.H20 (2,45 экв) . Раствор охлаждали до 20°С и добавляли DIC (2,13 экв), и давали пройти реакции. Предварительно активированный раствор объединяли со смолой и реакции давали пройти при 22°С. DIC 1,07 экв загружали в реакцию SPPS, где отношение DFM/DCM составило примерно 1:1. Реакцию давали пройти при 22°С. Образец тестировали на неполную конденсацию с помощью колориметрических тестов Кайзера и/или TNBS.
Материал промывали с последующим удалением защитной группы Fmoc и последующей промывкой. Образец испытывали на остаточный Fmoc (УФ-тест) и остаточный пиперидин (рН) . Проводили колориметрические тесты Кайзера и/или TNBS для гарантии удаления защитной группы Fmoc.
DMF (0 л/кг); Уксусный ангидрид (1,06 л/кг) и пиридин
(1,06 л/кг) добавляли к раствору, и полученный раствор перемешивали для предварительной активации. Раствор предварительной активации объединяли со смолой и перемешивали при 22°С. Материал фильтровали и промывали. Образец тестировали на неполное кэппирование с использованием колориметрических тестов Кайзера и/или TNBS. Материал промывали как суспензию. Смолу сушили в атмосфере азота без перемешивания. Отбирали образец сухой смолы и тестировали на LOD и остаточный
растворитель. См., ФИГ. 2. ПРИМЕР 1В
Синтез линейного фрагмента основной цепи
Синтез линейного фрагмента основной цепи AMG 416 представлен на ФИГ. 2. Пептидную цепь наращивали от С-конца к N-концу на смоле Rink AM amide, 1 аминокислота за один цикл. Каждый цикл состоял из 2 стадий реакции: 1) отщепление Fmoc от N-конца; 2) конденсация следующей Fmoc-защищенной аминокислоты или конечное ацетилирование.
Начало SPPS: смолу Rink AM amide (1 моль) переносили в реактор SPPS и промывали N,N'-диметилформамидом (DMF).
Отщепление Fmoc: Смолу из предыдущей стадии суспендировали в растворе 20% пиперидина в DMF в течение, по меньшей мере, 10 мин. Полноту отщепления Fmoc отслеживали с помощью измерения ультрафиолетового (УФ) поглощения. После завершения отщепления Fmoc смолу промывали поочередно с помощью DMFA и изопропанола (IPA) до тех пор, пока не будет достигнуто нейтральное рН.
Конденсация Fmoc-аминокислот: После стадии отщепления Fmoc осуществляли реакцию конденсации путем смешивания смолы с раствором Fmoc-защищенного производного аминокислоты (> 1,2 моль) и активирующих реагентов (> 1,8 моль) (N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIC) и этил(гидроксиимино)-цианоацетат (Охута)) в DMFA. Для конденсации Fmoc-D-Cys(Trt)-ОН, DIC и гидрат 1-гидроксибензотриазола (HOBt) использовали в качестве активирующих агентов, и смесь DMF и дихлорметана (DCM) использовали в качестве реакционного растворителя. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Для отслеживания полноты конденсации осуществляли колориметрические тесты Кайзера и TNBS. Требовалось получение отрицательных результаты обоих тестов, Кайзера и TNBS, прежде чем процесс переводили на следующий цикл. После каждой стадии конденсации и кэппирования смолу поочередно промывали DMF и IPA.
Конечное ацетилирование: После конечного снятия защиты Fmoc, N-концевую аминогруппу пептида ацетилировали с использованием уксусного ангидрида и пиридина в DMF. Тесты
Кайзера и TNBS проводили для контроля завершения ацетилирования. Если ацетилирование была неполным, то такую же процедуру ацетилирования повторяли до тех пор, пока не получали отрицательные результаты обоих тестов, Кайзера и TNBS.
И, наконец, защищенный пептидный остов лекарственного вещества на смоле (AMG 416-смола) выделяли фильтрацией, промывали DMF, IPA и ацетонитрилом (ACN) и сушили при пониженном давлении.
ПРИМЕР 2А
Отщепление линейного фрагмента основной цепи от смолы Раствор коктейля получали смешиванием DIW (0,16 л/кг); TFA (5,64 л/кг); TIPS (0,46 экв) и DPDS, (6,41 экв) при комнатной температуре, а затем охлаждением раствора до 0 ± 2°С. Пептид на смоле добавляли к раствору коктейля при 0 ± 2°С, и раствор нагревали до 2 5°С и давали реакции пройти. Смолу удаляли фильтрацией и промывали. Раствор выдерживали при температуре -10°С и добавляли 6,8:1 раствор IPE:MeCN (24,5 л/кг) при
температуре -10°С в течение некоторого времени для контроля температуры и осаждения. Реакция протекала, и промежуточный продукт AMG 416 SPy фильтровали при температуре -5°С и промывали. Промежуточный продукт SPy сушили при 2 0°С под полным вакуумом. См. ФИГ. 3. ПРИМЕР 2В
Отщепление линейного фрагмента основной цепи от смолы Раствор отщепления получали в реакторе путем смешивания TFA, Н20 и триизопропилсилана (TIPS) в приблизительном соотношении 96,9:2,6:0,5 (об/об/об). К раствору отщепления, DPDS (> 1,2 моль) добавляли в качестве активирующего реагента сульфгидрильную группу D-цистеина. AMG 416-смолу (1 моль) загружали в реактор, и реакционную смесь перемешивали в течение > 1 часа при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали. Фильтрат и промывочные растворы переносили в другой реактор и охлаждали. Холодную смесь анти-растворителя диизопропилового эфира (IPE) и ACN затем загружали в раствор для осаждения AMG 416-SPy. Суспензию фильтровали через фильтр-осушитель, и
фильтрат AMG 416-SPy затем промывали с помощью ACN и IPE и сушили при температуре приблизительно 2 0°С при пониженном давлении на фильтре-осушителе. ПРИМЕР 3.
In-Situ конъюгация с L-цистеином/препаративная ВЭЖХ
Промежуточный продукт AMG 416 SPy (1 моль) добавляли к 0,2% раствору TFA. L-цистеин (> 1,1 моль) добавляли к раствору, и давали реакции пройти при комнатной температуре в течение, по меньшей мере, 15 мин.
Очистку неочищенного продукта AMG 416 проводили с помощью препаративной хроматографии с использованием С18 силикагеля в качестве неподвижной фазы и с использованием ACN/H20 в качестве подвижной фазы и TFA в качестве модификатора. Неочищенный раствор AMG 416 из Стадии III загружали на колонку и использовали метод линейного градиента для стадии очистки. Элюирование отслеживали с помощью УФ-поглощения при 230 нм. После каждой загрузки колонку промывали 80% ACN в воде (об/об) до получения стабильного базового уровня УФ. Фракции хранили при 5°С, проводили забор образцов и затем собирали фракции, имеющие требуемую чистоту (определенную с помощью ВЭЖХ). Объединенные пулы из прогона очистки концентрировали путем осуществления прогона концентрирования с использованием той же колонки ВЭЖХ. Фракции хранили при 5°С. Фракции с целой чистотой (определенной с помощью ВЭЖХ) лиофилизировали для выделения TFA соли AMG 416. См. ФИГ. 4.
ПРИМЕР 4
Солевой обмен
TFA соль AMG 416 добавляли к раствору 15% воды в IPA (об/об) 10 л/кг при 10°С до тех пор, пока не наблюдали полного растворения. Раствор добавляли к раствору 12М водной НС1, 0,27 л/кг и IPA 49,4 л/кг в течение 3 часов с помощью подслойного добавления, что приводило к непосредственному осаждению соли AMG 416 4,5 НС1. Загрузку выдерживали в течение 3 часов и отбирали пробы для анализа.
Материал фильтровали и взвесь промывали 96 масс.% IPA, 10
л/кг. Фильтрат ресуспендировали в течение 4 часов в 10 л/кг 96% масс.% IPA. Материал фильтровали и далее суспензию промывали 96% IPA, 10 л/кг, а затем IPA 10 л/кг. Материал сушили при полном вакууме при 25°С. Сухой фильтрат растворяли в воде 8 л/кг, и смесь концентрировали с помощью перегонки для удаления остаточного IPA и достижения целевой концентрации. Температуру раствора поддерживали ниже 25°С на протяжении перегонки. См. ФИГ. 5.
ПРИМЕР 5
Очистка промежуточного продукта SPy и получение AMG 416
НС1
Здесь описан альтернативный способ получения НС1 соли AMG 416. Как описано выше в Примере 2, промежуточный продукт SPy сушили при 2 0°С при полном вакууме после отщепления от смолы, осаждения и фильтрации. Осадок растворяли в 0,1% водном растворе TFA и наносили на колонку С-18 для очистки ВЭЖХ. Колонку прогоняли при <60 бар, и температура раствора составляла все это время 15-25°С.В качестве элюентов выступали 0,1% TFA в ацетонитриле и 0,1% TFA в воде. Фракции хранили при 5°С, их отбирали и затем фракции объединяли. Объединенные пулы из двух прогонов разводили и осуществляли прогон концентрирования/очистки с использованием той же колонки ВЭЖХ для уменьшения общего объема и удаления дополнительных примесей. Фракции хранили при 5°С.
Фракции, содержащие промежуточный продукт AMG 416 SPy, подвергали азеотропной перегонке для замены растворителя с 0,1% TFA на 15% воду в растворе IPA, загружая IPA по мере необходимости. К полученному в результате промежуточному продукту AMG 416 SPy в растворе IPA затем добавляют L-цистеин 1,15 экв, и реакции давали пройти при комнатной температуре для осуществления конъюгации и образования TFA соли AMG 416, как описано выше в Примере 4. Раствор AMG 416 TFA добавляли к раствору 12М водного раствора НС1, 0,27 л/кг и IPA 49,4 л/кг в течение 3 часов посредством подслойного добавления, что приводило к непосредственному осаждению соли AMG 416 4,5 НС1.
Загрузку выдерживают в течение 3 часов и отбирали пробы для анализа.
Материал фильтровали, и взвесь промывали 96 масс.% IPA, 10 л/кг. Затем фильтрат ресуспендировали в течение 4 часов в 10 л/кг 96% масс.% IPA. Материал фильтровали и далее суспензию промывали 96% IPA, 10 л/кг, а затем IPA 10 л/кг. Материал сушили при полном вакууме при 2 5°С. Сухой фильтрат растворяли в воде 8 л/кг, и загрузку концентрировали с помощью перегонки для удаления остаточного IPA и достижения целевой концентрации. Температуру раствора поддерживали ниже 2 5°С на протяжении перегонки.
ПРИМЕР 6
Синтез H-D-Arg(Pbf)-ОН
Синтез линейного фрагмента основной цепи, как описано в примере 1, требует использования Fmoc-D-Arg(Pbf)-ОН для добавления субъединиц D-аргинина, которые составляют до 4 из 7 остатков в линейном фрагменте. Усовершенствованный и более эффективный способ синтеза Fmoc-D-Arg(Pbf)-ОН описан ниже.
Синтез начинали с защиты аминогруппы D-Arg с помощью ди-трет-бутилдикарбоната (Вос20) с получением Boc-D-Arg-OH с приблизительно количественным выходом после выделения с помощью кристаллизации по стандартной методике, описанной в литературе. Гуанидиновую группу боковой цепи аргинина защищали группой Pbf с помощью добавления в течение одного часа (0-5°С) раствора ацетон/THF 10/1 Pbf-Cl (1,3 экв) в присутствии водного раствора NaOH (4,3 экв)/Nal (5% моль) в качестве основы, с получением Boc-D-Arg(Pbf)-ОН (85-90% выход анализируемого вещества) см. ФИГ. 6. Boc-D-Arg(Pbf)-ОН в растворе IPAc обрабатывали с помощью 4,8 экв. концентрированной НС1 при 2 0°С в течение приблизительно б ч. По окончании реакции органический слой отбрасывали и неочищенный продукт отделяли от водного слоя путем доведения рН до 5 с помощью NaOH, после чего наблюдали образование белой суспензии. См. ФИГ. 7. Когда надосадочная жидкость имела концентрацию приблизительно 3 мг/мл при 2 0°С, то ее фильтровали при комнатной температуре, и полученный фильтрат
промывали водой и сушили под вакуумом. Общий выход анализа после этой стадии составил примерно 80-85%. Чистота H-D-Arg(Pbf)-OH была увеличена до > 98,5% с помощью первой перекристаллизации из 3/1 вода/IPA (об/об). Когда надосадочная жидкость имела концентрацию примерно 7 мг/мл, ее фильтровали и сушили в вакууме. После этой стадии общий выход анализируемого вещества составил примерно 75%. (Обычно на этой стадии наблюдают примерно 10% потерь продукта). Осуществляли вторую стадию перекристаллизации из 4/1 вода/IPA (об/об). Фильтрацию проводили, когда концентрация надосадочной жидкости составила примерно 3,7 мг/мл. Вторая перекристаллизация увеличила чистоту H-D-Arg(Pbf)-ОН примерно до 99,84 процентов беспримесности (LCAP) с помощью ВЭЖХ с беспримесностью более 0,2 LCAP. Типичный выход этой стадии составлял примерно 93% с потерями продукта примерно 5%. H-D-Arg-(Pbf)-ОН затем вступал в реакцию с FmocOSu в соответствии со стандартными протоколами и продукт Fmoc-D-Arg(Pbf)-ОН выделяли с помощью стандартной процедуры, описанной в литературе.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Bezemer, Jeroen Chen, Ying Crockett, Richard Crossley, Kevin Cui, Sheng Huang, Liang Jones, Sian Lower, Asher
Ranganathan, Krishnakumar <120> Способ получения AMG 416 <130> 041925-0488.WO00 <140> Not yet assigned
<141> Filed Herewith
<150> US 61/974,899
<151> 2014-04-03 <160> 4
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> ВАРИАНТ <222>
<223> Xaa = D-Cys <220>
<221> Пост-трансляционная модификация
<222> (1)..(1)
<223> N-концевое ацетилирование
<220>
<221> ДИСУЛЬФИД
<222> (1)..(1)
<223> Cys-Cys дисульфидная связь с Cys
<220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2), (6) <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg <220>
<221> Пост-трансляционная модификация
<222> (7)
<223> C-концевое амидирование
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
<210> 2 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys(trt)
<220>
<221> Пост-трансляционная модификация
<222> (1)..(1)
<223> прикрепленный к Fmoc
<220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2), (6) <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg(Pfb)
<220>
<221> Пост-трансляционная модификация
<222> (7)
<223> прикрепленный к смоле
<400> 2
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
<210> 3 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys(Trt)
<220>
<221> Пост-трансляционная модификация
<222> (1)..(1)
<223> N-концевое ацетилирование
<220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2), (6) <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg(Pbf) <220>
<221> Пост-трансляционная модификация
<222> (7)
<223> прикрепленный к смоле
<400> 3
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 4 <211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический пептид
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = D-Cys(SPy)
<220>
<221> Пост-трансляционная модификация
<222> (1)..(1)
<223> N-концевое ацетилирование
<220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2), (6) <223> Xaa = D-Ala
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3), (4), (5), (7)
<223> Xaa = D-Arg <220>
<221> Пост-трансляционная модификация
<222> (7)
<223> C-концевое амидирование
<400> 4
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения AMG 416, включающий:
обеспечение связанного со смолой пептида, имеющего структуру, выбранную из группы, состоящей из Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[Смола] (SEQ ID NO: 2) и Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[Смола] (SEQ ID NO: 3);
отщепление пептида от твердой подложки; и
активацию боковой цепи остатка D-Cys.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что отщепление и активация происходят в одном сосуде.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что связанный со
смолой пептид контактирует с раствором, содержащим воду,
трифторуксусную кислоту, триизопропилсилан и
дипиридилдисульфид.
4. Способ получения AMG 416, включающий:
обеспечение пептида, имеющего структуру Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2 (SEQ ID NO: 4); и
контакт пептида с L-Cys с получением конъюгированного продукта.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что пептид
контактирует с водным раствором, содержащим L-Cys и
трифторуксусную кислоту.
6. Способ по п. 4, дополнительно включающий лиофилизацию конъюгированного продукта.
7. Способ по п.4, дополнительно включающий контакт конъюгированного продукта с водным раствором, содержащим IPA и НС1, с получением в результате осадка, содержащего AMG 416 НС1 (SEQ ID NO: 1).
8. Способ по п. 7, дополнительно включающий очистку осадка с помощью ВЭЖХ.
9. Способ приготовления AMG 416, включающий:
обеспечение пептида, имеющего структуру, Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2 (SEQ ID NO: 4) в растворе TFA;
очистку пептида с помощью ВЭЖХ;
осуществление замены растворителя путем азеотропной перегонки; и
контакт пептида с L-Cys с получением конъюгированного продукта.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что пептид контактирует с водным раствором L-Cys и воды в IPA.
11. Способ по п.10, дополнительно включающий контакт конъюгированного продукта с водным раствором, содержащим IPA и НС1, с получением в результате осадка, содержащего AMG 416 НС1 (SEQ ID NO: 1) .
12. Способ синтеза D-Arg(Pbf)-ОН, включающий: превращение Boc-D-Arg-OH в Boc-D-Arg(Pbf)-ОН путем
смешивания Boc-D-Arg-OH с PbfCl, NaOH и Nal.
13. Способ по п.12, дополнительно включающий: превращение Boc-D-Arg(Pbf)-ОН в D-Arg(Pbf)-ОН путем
смешивания Boc-D-Arg(Pbf)-ОН с НС1 и IPAc.
По доверенности
H2N^NH .NH
н О J н О HN HN
,A A
HN" NH2 HN" NH2 HN" NH2
NH,
Ac-D-Cys(L-Cys-OH)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2
ФИГ. 1
Ol CO
о о
смола Rink amide AM
.0 NH cfNANH V""
н WNH
H YS HN^O о
HN' HN Q J
HN=( N , UM^M'S. HN.5PI H^N \\ 0
о Y|
Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH-Смола
ФИГ. 2
^0 NH HNt> 0SNANH °y4
H 0 = н О Г н 0 =
^ ^О^Триизопропилсилан ^Л^о T^lTj З^нГо
, . VO / Of ^ о О lfV HN HN^ HN
NHJN' Hfs^} < П S HN^NH2 HNANH2 HNANH2
н WNH
II J о о J н о
1,2-ди(пиридин-2-ил)дисульфан
Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH-CMOnap3C °H
2,2,2-трифторуксусная кислота
AA1"7(spy)
ФИГ. 3
H2N^NH H2NYNH
1н rNH
AWHW||WNH> 0.20% TFA/H20 ^^WrfAV 9
S HN' HN' HN
HN HN HN ^SH f nH i i i
HN^NH2 HN*V HN^NH2 H2N \.OH W^tf" ^ 2 HN NH2 HN NH2
дд1-7{эру) ° AMG 416 (соль TFA)
ФИГ. 4
HN^NH2 HN'^NH2 HN""NH2
HCI
AMG 416 (соль TFA)
AMG 416 (соль HCI)
ФИГ. 5
H2N^NH
T PbfCI (1.3 ЭКВ. )
Hlskaq NaOH(4.3 ЭКВ. )/Nal (5%М0Л.)
о г ю/1 Ацетон/THF, 0-5 °С
O^N^Y°H 1ч добавление
н о Стадия 2
Boc-D-Arg-OH ппп/ лп
У 90% АВ
(Аналитический Выход)
ФИГ. 6
Boc-D-Arg(Pbf)-OH
-s=o
HN^NH
0AN^f' н 11
HN^NH HN
70% выход (стадия 2 и 3), 93 масс.%,99.7LCAP, < 0.1% H-Orn(Pbf)-OH, < 0.2% D-Arg(Pbf)-OPr-/
D-Arg(Pbf)-OH
ФИГ. 7
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
