(57) Реферат / Формула:
Описаны антитела к гемагглютинину вируса гриппа типа В, композиции, содержащие антитела к гемагглютинину вируса гриппа типа В и способы их применения.
Евразийское (21) 201691945 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K16/10 (2006.01)
2017.02.28 A61K39/00 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2015.03.26
(54) АНТИТЕЛА К ГЕМАГГЛЮТИНИНУ ВИРУСА ГРИППА ТИПА B И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
(31) 61/971,123
(32) 2014.03.27
(33) US
(вв) PCT/US2015/022758
(87) WO 2015/148806 2015.10.01
(71) Заявитель: ДЖЕНЕНТЕК, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Свем Ли, Сюй Минь, Балаж Мерседес, Чай Нин, Чиан Нэнси, Чиу Генри, Линь Чжунхуа, Накамура Джеральд Р., Парк Хёнджу (US)
(74) Представитель:
Лыу Т.Н., Угрюмов В.М., Гизатуллина Е.М., Глухарёва А.О., Дементьев В.Н., Карпенко О.Ю., Клюкин В.А., Строкова О.В., Христофоров А.А. (RU)
(57) Описаны антитела к гемагглютинину вируса гриппа типа В, композиции, содержащие антитела к гемагглютинину вируса гриппа типа В и способы их применения.
I ^
АНТИТЕЛА К ГЕМАГГЛЮТИНИНУ ВИРУСА ГРИППА ТИПА В И СПОСОБЫ
ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка испрашивает приоритет США по предварительной заявке № 61/971123, поданной 27 марта 2014 года, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Заявка, рассматриваемая в данный момент, содержит перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и в полном объеме включен в данный документ посредством ссылки. Заявленная ASCII копия, создана 18 марта 2014 года, называется P05794Rl-WO_SL.txt и имеет размер 96612 байт.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
В настоящем изобретении предложены антитела к гемагглютинину вируса гриппа типа В, композиции, которые содержат антитела к гемагглютинину вируса гриппа типа В, и способы их применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Вирусная инфекция гриппа, является причиной от трех до пяти миллионов случаев тяжелой болезни и от 250000 до 500000 смертей каждый год по всему миру. Только в США, от 5 % до 20 % населения инфицируется вирусом гриппа каждый год, причем большинство из этих инфекций вызваны (см., например, Dushoff et al., (2006) Am J Epidemiology 163:181-187; Thompson et al., (2004) JAMA 292:1333-1340; Thompson et al., (2003) JAMA 289:179-186). Однако, инфекции вирусом гриппа типа В объясняют около 10000-100000 госпитализаций в год в случае гриппа только в США, что демонстрирует высокую изменчивость из года в год (1 %-40 % случаев из всех госпитализаций, причиной которых был вирус гриппа, это инфекции вирусом гриппа типа В, со средним 17 %). (См. Zhou et al (2012) Clin Inf Dis 54:1427-1436.) Накладные расходы, которые связаны с гриппозной инфекцией в сфере здравоохранения и снижением производительности труда, являются обширными. Госпитализация и случаи смерти в основном происходят в группах высокого риска, таких, как пожилые люди, дети и хронические больные.
Ингибиторы нейраминидазы одобрены для амбулаторного лечения и профилактики случаев заражения вирусом гриппа типов А и В. Осельтамивир (Тамифлю(r)) является широко используемым профилактическим и ранним терапевтическим вариантом лечения при заражении вирусом гриппа типов А и В. (см., например, Kandel и Hartshorn (2001) BioDrugs: Clinical Immunotherapy,Biopharmaceuticals и Gene Therapy 15:303-323; Nicholson et al., (2000) Lancet 355:1845-1850; Treanor et al., (2000) JAMA 283:1016-1024; и Welliver et al., (2001) JAMA 285:748-754.) Однако, лечение осельтамавиром должно быть начато в течение 48 часов с момента появления симптомов, чтобы обеспечить значительный клинический эффект (см., например, Aoki et al (2003) J Antimicrobial Chemotherapy 51:123-129). Это обязательство ставит под сомнение возможность применять осельтамивир для лечения тяжелобольных пациентов, которые, как правило, находятся вне оптимального 48-часового промежутка лечение в момент обращения. Кроме того, осельтамивир менее эффективен при лечении заражения вирусом гриппа типа В по сравнению с лечением заражения вирусом гриппа типа А, возможно, отчасти благодаря его значению ИК50, которое в 10 раз выше для нейраминидазы гриппа типа В по сравнению с, этим же значением для нейраминидазы гриппа типа А. Следовательно, значительное внимание в последнее время уделяется выявлению терапевтических средств против вируса гриппа типа В для лечения госпитализированных пациентов, которые были инфицированы вирусом гриппа типа В.
В 1988-1989 годах, возникли два весьма различных антигенных варианта вируса гриппа типа В, которые произошли от предковых линий вируса гриппа типа В. Эти вирусы были связанны антигенно либо с вирусом гриппа типа В B/Victoria/2/87, либо с B/Yamagata/16/88 (см., например, Rota et al. (1990) Virology 175:59-68). Следовательно, желательно разработать способ лечения инфекции вирусом гриппа типа В, который является эффективным против предковых линий, линии Victoria, и линии Yamagata вируса гриппа типа В.
В недавних докладах были описаны моноклональные антитела (моноклональное антитело), которые связывают гемагглютинин и нейтрализуют вирус гриппа типа В(см. Kubota-Koketsu et al. (2009) Biochem Biophys Res Comm 387:180-185; Yasugi et al. (2013) PLOS Pathogens 9:el003150, 1-12; Dreyfus et al. (2012) Science Express 337:1343-1348; публикации международных патентных заявок под номерами WO 2013/007770, WO 2013/132007, WO 2013/114885, WO 2010/073647, и публикации международных
патентных заявок США под номерами US 2009/0092620, US 2011/0319600, и US 2011/0319660).
Несмотря на эти отчеты, до сих пор в данной области техники существует необходимость в новых терапевтических средствах против вируса гриппа типа В, которые будут эффективны против широкого спектра штаммов вируса гриппа типа В, включая терапевтические средства против вируса гриппа типа В, которые эффективны при лечении или предотвращении заражения предковыми линиями вируса гриппа типа В, линией Yamagata и линией Victoria. Данное изобретение удовлетворяет эту необходимость и предоставляет другие преимущества для лечения и профилактики заражения вирусом гриппа типа В.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном изобретении предлагаются антитела к гемагглютинину вируса гриппа типа В (т.е., анти-гемагглютининовые антитела, анти-грипповые антитела к вирусу гриппа типа В), композиции, которые содержат анти-грипповые антитела к гемагглютинину вирусу гриппа типа В и способы их применения.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит три гипервариабельные области тяжелой цепи (HVR-H1, HVR-H2, и HVR-H3) и три гипервариабельные области легкой цепи (HVR-L1, HVR-L2, и HVR-L3), причем:
а) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:61;
б) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
группы, состоящей из SEQ Ш NO: 64 и 65;
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:75;
г) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55;
д) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и
(е) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит: последовательности по меньшей мере одной, двух, трех, четырех, пяти и/или шести гипервариабельных областей (HVR) тяжелой цепи, причем:
a) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:61;
б) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
группы, состоящей из SEQ ID N0:64 и 65;
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:75;
г) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:55;
д) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и
е) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит три гипервариабельные области легкой цепи (HVR-L1, HVR-L2 и LVR-L3), причем:
а) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55;
б) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и
в) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит три гипервариабельные области тяжелой цепи (HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3), причем:
а) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:61;
б) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
группы, состоящей из SEQ Ш N0: 64 и 65; и
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:75.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит: последовательности по меньшей мере одной, двух, и/или трех гипервариабельных областей (HVR) легкой цепи, причем:
а) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55;
б) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и
в) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит: последовательности по меньшей мере одной, двух, и/или трех гипервариабельных областей (HVR) тяжелой цепи, причем:
а) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:61;
б) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
группы, состоящей из SEQ Ш N0: 64 и 65; и
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:75.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ Ш N0:79 и 83, а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0:78, 82 и 86.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0:78, 82 и 86.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО Ж):79и 83.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0:81, 85 и 88, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0:80, 84 и 87.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0:80, 84 и 87.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы,
состоящей из SEQ Ш N0:81, 85 и 88.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит три гипервариабельные области тяжелой цепи (HVR-H1, HVR-H2, и HVR-H3) и три гипервариабельные области легкой цепи (HVR-L1, HVR-L2, и HVR-L3), причем:
а) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:62;
б) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:66;
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:76;
г) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55;
д) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и
е) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит: последовательности по меньшей мере одной, двух, трех, четырех, пяти и/или шести гипервариабельных областей (HVR) тяжелой цепи, причем:
а) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:62;
б) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:66;
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:76;
г) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55;
д) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и
е) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит три гипервариабельные области легкой цепи (HVR-L1, HVR-L2 и LVR-L3), причем:
а) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55;
б) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и
в) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит три гипервариабельные области тяжелой цепи (HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3), причем:
a) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:62;
б) HVR- Н2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:66; и
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:76.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит: последовательности по меньшей мере одной, двух, и/или трех гипервариабельных областей (HVR) легкой цепи, причем:
а) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55;
б) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и
в) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит: последовательности по меньшей мере одной, двух, и/или трех гипервариабельных областей (HVR) тяжелой цепи, причем:
а) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:62;
б) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:66; и
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:76.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:89, а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:78.
В некоторых вариантах реализации гемагглютининовое антитело, согласно вариабельную область легкой цепи, последовательность SEQ Ш N0:78.
изобретения, изолированное антинастоящему, изобретению содержит которая содержит аминокислотную
В некоторых вариантах реализации гемагглютининовое антитело, согласно вариабельную область тяжелой цепи, последовательность SEQ Ш N0:89.
изобретения, изолированное антинастоящему изобретению, содержит которая содержит аминокислотную
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти
гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:90, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:80.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:80.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:90.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит три гипервариабельные области тяжелой цепи (HVR-H1, HVR-H2, и HVR-H3) и три гипервариабельные области легкой цепи (HVR-L1, HVR-L2, и HVR-L3), причем:
а) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:63;
б) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
группы, состоящей из SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 и 74;
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:77;
г) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:56;
д) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:58; и
е) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:60.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит: последовательности по меньшей мере одной, двух, трех, четырех, пяти и/или шести гипервариабельных областей (HVR) тяжелой цепи, причем:
а) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:63;
б) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
группы, состоящей из SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 и 74;
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:77;
г) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:56;
д) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:58; и
e) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:60.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит три гипервариабельные области легкой цепи (HVR-L1, HVR-L2 и LVR-L3), причем:
а) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56;
б) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и
в) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:60.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит три гипервариабельные области тяжелой цепи (HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3), причем:
а) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63;
б) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
группы, состоящей из SEQ ID N0: 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 и 74;
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит: последовательности по меньшей мере одной, двух, и/или трех гипервариабельных областей (HVR) легкой цепи, причем:
а) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56;
б) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и
в) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:60.
В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается изолированное анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит: последовательности по меньшей мере одной, двух, и/или трех гипервариабельных областей (HVR) тяжелой цепи, причем:
а) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63;
б) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
группы, состоящей из SEQ Ш N0: 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 и 74;
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем
вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0:92, 95, 97, 99, 101, 103, 105 и 107, а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:91.
В некоторых вариантах реализации гемагглютининовое антитело, согласно вариабельную область легкой цепи, последовательность SEQ ID N0:91.
изобретения, изолированное антинастоящему изобретению, содержит которая содержит аминокислотную
В некоторых вариантах реализации гемагглютининовое антитело, согласно вариабельную область тяжелой цепи, последовательность, выбранную из группы, с 103, 105 и 107.
изобретения, изолированное антинастоящему изобретению, содержит
которая содержит аминокислотную ;тоящей из SEQ ГО N0:92, 95, 97, 99, 101,
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0:94, 96, 98, 100, 102, 104, 106 и 108, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:93.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:93.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, содержит тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0:94, 96, 98, 100, 102, 104, 106 и 108.
В некоторых вариантах реализации изобретения, изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах реализации изобретения
изолированное анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, специфически связывает гемагглютинин вируса гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения изолированное анти-гемагглютининовое антитело представляет собой моноклональное антитело, которое специфически связывает гемагглютинин вируса гриппа типа В.
В данном изобретении также предлагаются изолированные нуклеиновые кислоты, которые кодируют анти-гемагглютининовое антитело настоящего изобретения. В данном изобретении также предлагаются векторы, которые содержат нуклеиновую кислоту, которая кодирует анти-гемагглютининовое антитело настоящего изобретения. В данном изобретении также предлагаются клетки-хозяина, которые содержат нуклеиновую кислоту или вектор настоящего изобретения. Вектор может быть любого типа, например, рекомбинантный вектор, такой как вектор экспрессии. Может быть использована любая разновидность клетки-хозяина. В одном варианте реализации изобретения клетка-хозяин является прокариотической клеткой, например, Е. coli. В другом варианте реализации изобретения клетка-хозяин является эукариотической клеткой, например, клеткой млекопитающего, такой как клетка яичника китайского хомячка (СНО).
В настоящем изобретении дополнительно предлагается способ производства анти-гемагглютининового антитела, согласно настоящему изобретению. Например, в данном изобретении предлагаются способы производства анти-гемагглютининового антитела (которое, как определено в данном документе, включает полноразмерное антитело и его фрагменты), способ, включающий экспрессию в подходящей клетке-хозяине рекомбинантного вектора настоящего изобретения, который кодирует анти-гемагглютининовое антитело или его фрагменты, и таким образом продуцируется антитело или его фрагменты. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает культивирование культуры клетки-хозяина, которая содержит нуклеиновую кислоту, что кодирует анти-гемагглютининовое антитело настоящего изобретения (или его фрагменты), и таким образом экспрессируется нуклеиновая кислота. Способ может дополнительно содержать восстановление анти-гемагглютининового антитела или его фрагментов из культуры клетки-хозяина или культуральной среды клетки-хозяина.
В изобретении также предлагается фармацевтический композиция, которая содержит анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, и
фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать дополнительное терапевтическое средство (например, ингибитор нейраминидазы, такой как осельтамивир или занамивир; другое антитело, например, такое как анти-гемагглютининовое антитело или анти-М2 антитело и т.д.).
В изобретении также предлагаются композиции, которые содержат анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению. Композиция может дополнительно содержать дополнительный терапевтический агент (например, ингибитор нейраминидазы, такой как как осельтамивир или занамивир; другое антитело, например, такое как анти-гемагглютининовое антитело или анти-М2 антитело и т.д.).
В настоящем изобретении предлагается композиция, которая содержит анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, для профилактики инфекции вирусом гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации в изобретении предлагается фармацевтическая композиция, которая содержит анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, для профилактики инфекции вирусом гриппа типа В. В изобретении дополнительно предлагаются композиции, которые содержат анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, для применения при лечении инфекции вирусом гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения, в изобретении предлагается фармацевтическая композиция, которая содержит анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, для применения при лечении инфекции вирусом гриппа типа В. В изобретении дополнительно предлагается композиция, которая содержит анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, для применения в ингибировании инфекции вирусом гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения, в изобретении предлагается фармацевтическая композиция, которая содержит анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, для применения в ингибировании инфекции вирусом гриппа типа В.
Композиции, которые содержат анти-гемагглютининов антитело, согласно настоящему изобретению, могут также быть применены в изготовлении лекарственного средства. Лекарственное средство может применятся в ингибировании, лечении или профилактике инфекции вирусом гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения, лекарственное средство может дополнительно содержать дополнительное терапевтическое средство (например, ингибитор нейраминидазы, такой как
осельтамивир или занамивир; другое антитело, например, такое как анти-гемагглютининовое антитело или анти-М2 антитело; и.т. д.).
В данном изобретении также предлагается способ ингибирования инфекции вирусом гриппа типа В, способ, включающий введение человеку нуждающегося в этом, эффективного количества композиции, которая содержит анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, таким образом ингибируя инфекцию вирусом гриппа типа В. В данном изобретении также предлагается способ лечения инфекции вирусом гриппа типа В, способ, включающий введение человеку нуждающегося в этом, эффективного количества композиции, которая содержит анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, тем самым предоставляет лечение инфекции вирусом гриппа типа В. В данном изобретении также предлагается способ профилактики инфекции вирусом гриппа типа В, способ, включающий введение человеку, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, которая содержит анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, тем самым совершая профилактику инфекции вирусом гриппа типа В.
В данном изобретении также предлагается способ ингибирования, лечения, или профилактики инфекции вирусом гриппа типа В, способ, включающий введение пациенту, нуждающегося в этом, эффективного количества композиции, которая содержит анти-гемагглютининовое антитело согласно настоящему изобретению, и введение пациенту эффективного количества дополнительного терапевтического вещества, таким образом ингибируя, предоставляя лечение, или совершая профилактику инфекции вирусом гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения, дополнительное терапевтическое средство представляет собой ингибитор нейраминидазы, такой как осельтамивир или занамивир. В других вариантах реализации изобретения, дополнительное терапевтическое средство представляет собой другое анти-гемагглютининовое антитело. Еще в одном варианте реализации изобретения, дополнительное терапевтическое средство представляет собой анти-М2 антитело. В различных аспектах изобретения таких комбинированных способов лечения, терапевтические вещества вводятся приблизительно в одно и то же время, вводятся вместе, или вводятся последовательно или беспрерывно. В конкретных вариантах реализации изобретения, введение анти-нейрамидазного ингибитора предшествует введению анти-гемаглютининового антитела согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации изобретения, анти-грипповое антитело к
гемагглютинину вируса гриппа типа В согласно настоящему изобретению является эффективным при нейтрализации, ингибировании, лечении, или профилактике инфекции вирусом гриппа типа В, включая штаммы вируса гриппа типа В различных родословных, в том числе предковых линий, линий Yamagata и Victoria.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается применение анти-гемагглютининового антитела, согласно настоящему изобретению, в производстве лекарственного средства. Лекарственное средство может быть применено в ингибировании, лечении, или профилактике инфекции вирусом гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения, лекарственное средство может дополнительно содержать дополнительное терапевтическое средство (например, ингибитор нейраминидазы, такой как осельтамивир или занамивир; другое антитело, такое как другое анти-гемагглютининовое антитело или анти-М2 антитело; и т.д.).
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается применять нуклеиновую кислоту согласно данному изобретению в производстве лекарственного средства. Лекарственное средство может быть применено в ингибировании, лечении, или профилактике инфекции вирусом гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения, лекарственное средство может дополнительно содержать дополнительное терапевтическое средство (например, ингибитор нейраминидазы, такой как осельтамивир или занамивир; другое антитело, такое как другое анти-гемагглютининовое антитело или анти-М2 антитело; и т.д.).
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается применять вектор экспрессии, согласно данному изобретению, в производстве лекарственного средства. Лекарственное средство может быть применено в ингибировании, лечении, или профилактике инфекции вирусом гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения, лекарственное средство может дополнительно содержать дополнительное терапевтическое средство (например, ингибитор нейраминидазы, такой как осельтамивир или занамивир; другое антитело, такое как другое анти-гемагглютининовое антитело или анти-М2 антитело; и т. д.).
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается применять клетку-хозяина, согласно данному изобретению, в производстве лекарственного средства. Лекарственное средство может быть применено в ингибировании, лечении, или профилактике инфекции вирусом
гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения, лекарственное средство может дополнительно содержать дополнительное терапевтическое средство (например, ингибитор нейраминидазы, такой как осельтамивир или занамивир; другое антитело, такое как другое анти-гемагглютининовое антитело или анти-М2 антитело; и т. д.).
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается применять продукт производства согласно данному изобретению в изготовлении лекарственного средства. Лекарственное средство может быть применено в ингибировании, лечении, или профилактике инфекции вирусом гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения, лекарственное средство может дополнительно содержать дополнительное терапевтическое средство (например, ингибитор нейраминидазы, такой как осельтамивир или занамивир; другое антитело, такой как другое анти-гемагглютининовое антитело или анти-М2 антитело; и т.д.).
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается применять набор продуктов производства, согласно данному изобретению, в изготовлении лекарственного средство. Лекарственное средство может быть применено в ингибировании, лечении, или профилактике инфекции вирусом гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения, лекарственное средство может дополнительно содержать дополнительное терапевтическое средство (например, ингибитор нейраминидазы, такой как осельтамивир или занамивир; другое антитело, такое как другое анти-гемагглютининовое антитело или анти-М2 антитело; и т.д.).
В различных аспектах изобретения, анти-гемагглютининовое антитело согласно настоящему изобретению связывает гемагглютинин вируса гриппа типа В. В еще одном аспекте изобретения, анти-гемагглютининовое антитело согласно настоящему изобретению связывает гемагглютинин и нейтрализует вирус гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения, анти-гемагглютининовое антитело согласно настоящему изобретению нейтрализует вирус гриппа типа В in vitro, in vivo, или in vitro и in vivo.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигуры 1А и 1Б иллюстрируют данные, которые показывают in vitro нейтрализацию различных изолятов вируса гриппа типа В моноклональным антителом 34В5А и моноклональным антителом 33F8, соответственно.
Фигура 2 иллюстрирует данные, которые показывают in vitro нейтрализацию различных изолятов вируса гриппа типа В моноклональным антителом 46В8А.
Фигура 3 иллюстрирует данные, которые показывают эффект моноклонального антитела 34В5С и моноклонального антитела 46В8С на ингибирование гемагглютинации.
Фигура 4 иллюстрирует данные, которые показывают нейтрализацию различных изолятов вируса гриппа типа В моноклональным антителом 46В 8С при in vitro анализе подавления бляшкообразования.
Фигура 5 иллюстрирует данные, которые показывают эффекты моноклонального антитела 34В5С и моноклонального антитела 46В8С на гемагглютинин-опосредованое межклеточное слияние.
Фигуры 6А и 6Б иллюстрируют данные, что показывают процент выживаемости мышей, которые были инфицированы вирусом гриппа типа В B/Victoria/2000, и которым были введены различные количества моноклонального антитела 34В5А (Фигура 6А), в сравнении с процентом выживаемости мышей, которым был введен осельтамивир (Тамифлю) (Фигура 6В).
Фигуры 7А и 7Б иллюстрируют данные, которые показывают процент выживаемости мышей, которые были инфицированные вирусом гриппа типа В B/Wisconsin/2000, и которым были введены различные количества моноклонального антитела 34В5С через 48 часов после инфицирования или через 72 часа после инфицирования, соответственно.
Фигуры 8А, 8Б, 8В, и 8Г иллюстрируют данные, которые показывают процент выживаемости мышей, которые были инфицированные вирусами гриппа типа В B/Wisconsin/2010, B/Victoria/2000, B/Russia/1969, и B/Massachusetts/1966, соответственно, и которым было введено моноклональное антитело 46В8С через 24, 48, или 72 часа после инфицирования.
Фигуры 9А и 9Б иллюстрируют данные, которые показывают процент выживаемости мышей, которые были инфицированные вирусом гриппа типа В B/Wisconsin/2010 и B/Victoria/2000, соответственно, и которым были введены различные количества
моноклонального антитела 46В8С через 72 часа после инфицирования.
Фигуры 10А и 10Б иллюстрируют данные, которые показывают процент выживаемости и процентного изменения массы тела (МТ), соответственно, мышей, которые инфицированные вирусом гриппа типа В B/Victoria/2000 и которым было введено либо моноклональное антитело 46В8С, либо осельтамивир (Тамифлю).
Фигуры ПА и 11Б иллюстрируют данные, которые показывают эффект введения моноклонального антитела 46В8С и осельтамивира (Тамифлю), порознь или в комбинации, на процент выживаемости и легочный вирусный титр, соответственно, у мышей.
Фигуры 12А и 12Б иллюстрируют данные, которые показывают эффект совместного введения моноклонального антитела 46В8С и осельтамивира (Тамифлю).
Фигура 13 иллюстрирует аминокислотные последовательности гипервариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи антител к вирусу гриппа типа В согласно настоящему изобретению.
Фигура 14 иллюстрирует аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи, и тяжелой цепи моноклонального антитела 34В5А.
Фигура 15 иллюстрирует аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи, и тяжелой цепи моноклонального антитела 34В5В.
Фигура 16 иллюстрирует аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи, тяжелой цепи моноклонального антитела 34В5С.
Фигура 17 иллюстрирует аминокислотные последовательности вариабельной область легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи, и тяжелой цепи моноклонального антитела 33F8.
Фигура 18 иллюстрирует аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи, и тяжелой цепи моноклонального антитела 46В8А.
Фигура 19 иллюстрирует аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи, и тяжелой цепи моноклонального антитела 46В 8В.
Фигура 20 иллюстрирует аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи, и тяжелой цепи моноклонального антитела 46В 8С.
Фигура 21 иллюстрирует аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи, и тяжелой цепи моноклонального антитела 46В 8D.
Фигура 22 иллюстрирует аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи, и тяжелой цепи моноклонального антитела 46В8Е.
Фигура 23 иллюстрирует аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи, и тяжелой цепи моноклонального антитела 46В8F.
Фигура 24 иллюстрирует аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи, и тяжелой цепи моноклонального антитела 46В8G.
Фигура 25 иллюстрирует аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, легкой цепи, и тяжелой цепи моноклонального антитела 46В8Н.
Фигуры 26А и 26Б иллюстрируют данные, которые показывают процент выживаемости и процент изменения массы тела (МТ), соответственно, мышей, которые были инфицированные вирусом гриппа типа В B/Brisbane/2008, и которым были введено
моноклональное антитело 46В 8С.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ
"Каркас человеческого акцептора" в контексте данного документа представляет собой каркас, который содержит аминокислотную последовательность каркаса вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркаса вариабельного домена тяжелой цепи (VH), которая получена из каркаса человеческого иммуноглобулина, или человеческого консенсусного каркаса, как определено ниже. Каркас человеческого акцептора "полученный из" каркаса человеческого иммуноглобулина, или человеческого консенсусного каркаса, может содержать такую же аминокислотную последовательность, или он может содержать замены в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах изобретения, количество аминокислотных замен равно 10, или менее, 9, или менее, 8, или менее, 7, или менее, 6, или менее, 5, или менее, 4, или менее, 3, или менее, или 2, или менее. В некоторых вариантах реализации изобретения, последовательность VL каркаса человеческого акцептора является идентичной последовательности VL каркаса человеческого иммуноглобулина, или последовательности человеческого консенсусного каркаса.
"Аффинность" относится к силе совокупности нековалентных взаимодействий между одиночным сайтом связывания молекулы (например, антитело) и ее партнером по связыванию (например, антиген). Если не указано иное, так как используется в настоящем документе, "аффинность связывания" относится к внутренней аффинности связывания, которое отображает 1:1 взаимодействие между членами пары связывания (например, антитело и антиген). Аффинности молекулы X к ее партнеру Y в целом, как правило может быть представлена константой дисоциации (Kd). Аффинность может быть измерена с помощью общепринятых способов, которые известные в данной области техники, включая те, что описаны в данном документе. Специфические иллюстративные и типичные варианты реализации изобретения, применяемые для измерения аффинности связывания, описаны в тексте, что следует ниже.
Антитело со "зрелой аффинностью" относится к антителу с одним или несколькими изменениями в одной или более гипервариабельной области (HVRs), по сравнению с родительским антителом, которое не имеет таких изменений, например, таких изменений, результатом которых является улучшения аффинности антитела к антигену.
Термины "анти-гемагглютининовое антитело" и "антитело, которое связывается с гемагглютинином" относятся к антителу, которое связывает гемагглютинин с достаточным сродством, в результате, антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства при использовании как мишени гемагглютинина, в том числе гемагглютинина вируса гриппа. В одном варианте реализации изобретения, степень связывания анти- гемагглютининового антитела с неродственным, не-гемагглютининовым белком составляет менее чем около 10 % от степени связывания антитела с гемагглютинином, что измерено, например, с помощью радиоиммуноанализа (РИА). В некоторых вариантах реализации изобретения, антитело, которое связывает гемагглютинин имеет константу диссоциации (Kd) < 1мкМ, < 100 нМ, < 10 нМ, < 1 нМ, <0.1 нМ, < 0.01 нМ, или < 0.001 нМ (например, 10"8 М или менее, например, от 10"8М до 10"13М, например, от 10"9М до 10~13 М). В некоторых вариантах реализации изобретения, анти-гемагглютининовое антитело связывается с эпитопом гемагглютинина вируса гриппа типа В, который является консервативным среди гемагглютининов различных штаммов, субтипов, а также изолятов вирусов гриппа типа В, таких как гемагглютинины вирусов гриппа типа В предковой линий, лини Victoria, или лини Yamagata.
Термин "антитело" в настоящем документе используется в широком смысле и охватывает различные структуры антитела, которые включают, но не ограничиваются моноклональными антителами, поликлональными антителами, полиспецифическими антителами (например, биспецифические антитела), и фрагментами антитела при условии, что они проявляют желаемую антигенсвязывающую активность.
"Фрагмент антитела " относится к молекуле, помимо интактного антитела, что содержит часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Фрагмент антитела также относится к молекуле, помимо интактного антитела, которое содержит часть интактного антитела, что связывает гемагглютинин и нейтрализует вирус А грипп. Примеры фрагментов антитела включают, но не ограничиваются Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; диателами; линейными антителами; одноцепочечными молекулами антителами (например, scFv); и полиспецифическими антителами, которые сформированы из фрагментов антитела.
"Антитело, которое связывается с тем же эпитопом" в качестве эталона антитела,
относится к антителу, которое блокирует связывание эталонного антитела с его антигеном при конкурентном анализе на 50 % или более, и наоборот, эталонное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном при конкурентном анализе на 50 % или более. Типичный конкурентный анализ представлен в настоящем документе.
Термин "химерное" антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена из определенного источника или вида, а оставшаяся часть тяжелой и/или легкой цепи получена из различных источников или видов.
"Класс" антитела относится к типу постоянного домена или постоянной области, которые принадлежат его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG, и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi, и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются а, 8, s, у и соответственно.
Термин "цитотоксическое средство", который используется в данном документе, относится к веществу, которое ингибирует клеточную функцию или препятствует ей, и/или вызывает клеточную смерть, или разрушение. Цитотоксические средства включают, но не ограничиваются, радиоактивными изотопами (например, At , I , I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивный изотоп Lu); хемотерапевтическими средствами или лекарствами (например, метотрексат, адриамицын, винка-алкалоиды (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин с, хлорамбуцил, даунорубицин или других интеркалирующие средства); средствами-ингибиторами роста; ферментами и их фрагментами, такими как нуклеолетические ферменты; антибиотиками; токсинами, такими как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты; и различными противоопухолевыми или противораковыми средствами, которые раскрыты ниже.
"Эффекторные функции" относятся к тем биологическим активностям, которые приписывают Fc области антитела, и которые варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание Clq и
комплемент-зависимую цитотоксичность (КЗЦ); связывания Fc рецептора; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ); фагоцитоз; нисходящую регуляцию клеточных поверхностных рецепторов (например, В -клеточного рецептора); и В клеточную активацию.
"Эффективное количество" средства, например, фармацевтической композиции, относится к количеству эффективных, в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата.
Термин "Fc область" в настоящем документе используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Этот термин включает в себя нативную последовательность Fc области и различные Fc области. В одном варианте реализации изобретения, Fc область тяжелой цепи человеческого IgG продолжается от Cys226, или от Рго230, до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако, С-концевой лизин (Lys447) Fc области может присутствовать или отсутствовать. Если не указано иное в настоящем документе, нумерация аминокислотных остатков в Fc области или в константной области соответствует системе нумерации EU, также называемый индексом EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes Health, Bethesda, MD, 1991.
"Каркас" или "FR" относится к остаткам вариабельного домена, кроме остатков гипервариабельной области (HVR). FR вариабельного домена в целом, как правило состоит из четырех FR доменов: FR1, FR2, FR3, и FR4. Соответственно, HVR и FR последовательности в целом, как правило, появляются в следующей последовательности VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Термины "полноразмерное антитело," "интактное антитело", и "целое антитело" используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения антитела, которое имеет структуру, что существенно похожа на нативные структуры антитела? или имеет тяжелые цепи, которые содержат Fc область как определено в настоящем документе.
Термины "клетка-хозяин", "линия клетки-хозяина", и "культура клетки-хозяина"
используются взаимозаменяемо, и относятся к клеткам в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформанты" и "трансформированные клетки", которые включают первично трансформированные клетки и потомство, которое получено от них без учета количества пассажей. Потомство не может быть полностью идентичным по содержанию нуклеиновых кислот относительно материнской клетки, но может содержать мутации. В настоящий документ включено мутантное потомство, которое имеет одну и ту же функцию, или биологическую активность, что и первоначальная трансформированная клетка после скрининга и отбора.
"Человеческое антитело" представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, что соответствует таковой антитела, которое произведено человеком или человеческой клетка или получено из нечеловеческого источника, который использует репертуар человеческих антител или другие человеческие антитело-кодирующие последовательности. Это определение человеческого антитела специфически исключает гуманизированные антитела, которые содержат нечеловеческие, антигенсвязывающие остатки.
"Человеческий консенсусный каркас" являет собой каркас, который представляет наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в наборе VL или VH каркасных человеческих иммуноглобулиновых последовательностей. В целом, как правило, набор человеческих иммуноглобулиновых VL или VH последовательностей представляет собой подгруппу последовательностей вариабельного домена. В целом, как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, как в Kabat et al., Sequences of Proteins Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. В одном варианте реализации изобретения, для VL, подгруппа представляет собой подгруппу каппа I, как в Kabat et al., supra. В одном варианте реализации изобретения, для VH, подгруппа представляет собой подгруппу III как в Kabat et al., supra.
"Гуманизированное" антитело относится к химерному антителу, которое содержит аминокислотные остатки из нечеловеческого HVR и аминокислотные остатки из человеческого FR. В некоторых вариантах реализации изобретения, гуманизированное антитело будет содержать в основном все остатки хотя бы одного, и типично двух, вариабельных доменов, в которых все, или в основном все HVR (например,
CDR),соответствуют таким же нечеловеческого антитела, и все, или в основном BceFR,cooTBeTCTByK> T таким же человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, которая получена из человеческого антитела. "Гуманизированная форма" антитела, например, нечеловеческое антитело, относится к антителу которое подверглось гуманизации.
Термин "гипервариабельная область" или "HVR", используемый в настоящем документе, относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными в последовательности ("определяющие комплементарность области" или "CDR"), и/или которые формируют структурно определенные петли ("гипервариабельные петли") и/или которые содержат антиген-контактирующие остатки ("антигенные контакты"). В целом, как правило, антитела содержат шесть HVR: три в VH (HI, Н2, НЗ), и три в VL (LI, L2, L3). Типичный HVR в настоящем документе включает:
а) гипервариабельные петли, которые встречаются в позициях аминокислотных
остатков 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (HI), 53-55 (Н2), и 96-101 (НЗ) (Chothia
and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
б) CDR, которые встречаются в позициях аминокислотных остатков 24-34 (L1),
50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (HI), 50-65 (Н2), и 95-102 (НЗ) (Kabat et al., Sequencesof
Proteins Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes Health,
Bethesda, MD (1991));
в) антигенные контакты, которые встречаются в позициях аминокислотных
остатков 27с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (HI), 47-58 (Н2), и 93-101 (НЗ)
(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); и
г) комбинации из а), б), и/или в), включая аминокислотные остатки HVR 46-56
(L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (HI), 26-35b (HI), 49-65 (Н2), 93-102 (НЗ),
и 94-102 (НЗ).
Пока не указано инное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, FR остатки) нумеруются в настоящем документе согласно Kabat et al., supra.
"Иммуноконъюгат" представляет собой антитело, которое конъюгировано с одной или более гетерологической молекулой(ами), включая, но не ограничиваясь
цитотоксическим средством.
"Индивид" или "субъект" представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают, но не ограничиваются, одомашненными животными (например, коровы, овцы, коты, собаки, и лошади), приматами (например, человеческие и нечеловеческие приматы такие как обезьяны), кроликами, и грызунами (например, мыши и крысы). В некоторых вариантах реализации, индивид или субъект представляет собой человека.
"Изолированное" антитело представляет собой антитело, которое было отделено от компонента его естественной среды. В некоторых вариантах реализации, антитело очищенно до более чем 95 % или 99 % чистоты, что определяется, например, электрофоретически (например, SDS-PAGE, изоэлектрофокусирование (IEF), капиллярный электрофорез) или хроматографически (например, ионный обмен или обратный фазовой HPLC). Для обзора способов оценки чистоты антитела, см., например, Flatm et al., J. Chromatogr. В 848:79-87 (2007).
"Изолированная" нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, что была отделена от компонента своей естественной среды. Изолированная нуклеиновая кислота содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержится в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует экстрахромосомно или в хромосомном участке, что отличается от ее обычного хромосомного положения.
"Изолированная нуклеиновая кислота, которая кодирует анти-гемагглютининовое антитело" относится к одной или более молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), в том числе такую молекулу(ы) нуклеиновой кислоты в одном векторе, или отдельных векторах, и такая молекула(ы) нуклеиновой кислоты присутствует в одном, или нескольких местоположениях в клетке-хозяине.
Термин "моноклональное антитело", как используется в настоящем документе, относится к антителу, которое получено из популяции в основном гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, которые составляют популяцию, являются идентичными и/или связывают тот же эпитоп, кроме различных антител, например, которые содержат естественно-происходящие мутации или мутаций, которые возникают в ходе
производства препарата моноклональных антител, и такие варианты в целом, как правило присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, определение "моноклональное" указывает на характер антитела, какое было получено из в основном гомогенной популяции антител, и не должно толковаться как требующие производства антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть изготовлены с помощью различных способов, включая но не ограничиваясь способом гибридомы, способами рекомбинантных ДНК, способами фаг-дисплея, и способами применение трансгенных животные, которые содержат все или часть иммуноглобулиновых локусов человека, и такие способы, а также типичные способы получения моноклональных антител, описаны в настоящем документе.
"Голое антитело" относится к антителу, которое не соединено с гетерологичными фрагментами (например, цитотоксическим фрагментом) или радиометкой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтическом препарате.
"Нативное антитело" относится к молекулам иммуноглобулинов естественного происхождения с различными структурами. Например, нативные антитела IgG являются гетеротетрамерными гликопротеинами с массой около 150000 дальтон, которые состоят из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые являются дисульфид-связанными. От N-конца к С-концу, каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), которая также называется вариабельный тяжелый домен, или вариабельный домен тяжелой цепи, за которым следуют три константные домены (CHI, СН2 и СНЗ). Аналогично, от N - конца к С-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также называемую вариабельным легким-доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которым следует константный легкий (CL) домен. Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (к) и лямбда (X), основываясь на аминокислотной последовательности его константного домена.
Термин "вкладыш" используется для обозначения инструкций, которые обычно включаются в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, что содержат
информацию о показаниях, применение, дозировке, назначение, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.
"Процент ( %) идентичности аминокислотной последовательности", по отношению к исходной полипептидной последовательности, определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными аминокислотным остаткам в исходной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривая любые консервативные замены как часть идентичности последовательности. Выравнивание для определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто различными способами, которые находятся в пределах квалификации в данной области техники, например, с помощью общедоступных компьютерных программ, таких как BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, которые необходимы для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. К контексте данного документа, тем не менее, значение процента идентичности аминокислотной последовательности генерируются используя компьютерную программу для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была создана Genentech, Inc., и исходный код был подан с пользовательской документацией в U.S. Copyright Office, Вашингтон Округ Колумбия, 20559, где он зарегистрирован под регистрационным номером TXU510087 Авторского права США. ALIGN-2 программа находится в публичном доступе от Genentech, Inc., Саус-Сан-Франциско, Калифорния, или может быть скомпилирована из исходного кода. ALIGN-2 программа должна быть скомпилированы для применения в операционной системе UNIX, включая разрядный UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены ALIGN-2 программой, и не меняются.
В ситуациях, когда ALIGN-2 используется для сравнения аминокислотных последовательностей, процент идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности А к, с или против данной аминокислотной последовательности Б (что альтернативно может быть сформулирован как то, что данная
аминокислотная последовательность А, которая имеет или содержит определенный процент идентичности аминокислотной последовательности к, с или против данной аминокислотной последовательности Б) вычисляют следующим образом:
100 кратная дробь X/Y
причем X представляет собой число аминокислотных остатков, засчитанные как совпадения программой для сравнения последовательностей ALIGN-2 в том программном выравнивания А и Б, a Y представляет собой общее количество аминокислотных остатков в В. Следует учесть, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности Б, то процент идентичности аминокислотной последовательности А к Б не равен проценту аминокислотной идентичность последовательности Б к А. Если не указано иное, все значения процента идентичности аминокислотной последовательности, которые используются в настоящем документе, получены, как описано в предыдущем пункте с помощью компьютерной программы ALIGN-2.
Термин "фармацевтический препарат" относится к препарату, который находится в такой форме, которая позволяет биологической активности действующего вещества, содержащегося в препарате, быть эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, которые недопустимо токсичны для субъекта, которому будет вводиться препарат.
"Фармацевтически приемлемый носитель" относится к ингредиенту в фармацевтическом препарате, который отличается от активного ингредиента, и который нетоксичен для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает в себя, но не ограничивается, буфером, наполнителем, стабилизатором, или консервантом.
Термин "гемагглютинин", как используется в настоящем документе, относится к любому нативному гемагглютинину из любого источника вируса гриппа, если не указано иное. Этот термин охватывает "полный" необработанный гемагглютинин, так же, как и любую форму гемагглютинина, который является результатом обработки в вирусе гриппа или клетке, которая инфицирована вирусом гриппа. Этот термин также включает в себя естественно-встречающиеся варианты гемагглютинина, например, сплайс-варианты или аллельные варианты. Аминокислотные последовательности
типичного белка гемагглютинина, которые получены от различных штаммов или линий вируса гриппа типа В уже доступны в данной области техники.
Как используется в настоящем документе, "лечение" (и грамматические вариации, такие как "лечить" или "процесс лечения") относится к клиническому вмешательству в попытке изменить естественное состояние индивида, которого лечат, и может быть выполнено либо для профилактики или при состоянии клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают, но не ограничиваются, предотвращением возникновения или рецидива заболевания (например, предотвращение возникновения или рецидива инфекции вирусом гриппа типа В), уменьшением (например, процесс уменьшения) или ослаблением симптомов, уменьшением любых прямых или опосредованных патологических последствий заболевания, снижением скорости прогрессирования заболевания, улучшением или смягчением болезненного состояния, и ремиссией или улучшенным прогнозом. В некоторых вариантах изобретения, антитела согласно данному изобретению используются для задержки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.
Термин "вариабельная область" или "вариабельный домен" относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела в целом, как правило имеют подобную структуру, и каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (HVR) (см., например, Kindt et al. Kuby Irnmunology, 6th ed., W.H. Freem и Co., page 91 (2007)). Одного VH или VL домена может быть достаточно для обеспечения антиген-связывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связывают конкретный антиген, могут быть изолированы с помощью VH или VL домена из антитела, которое связывается с антигеном, путем скрининга библиотеки комплементарных VL или VH доменов, соответственно. См., например, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
Термин "вектор", как применено здесь, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая способна размножать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Термин включает вектор как структуру, которая является само-реплицируемой нуклеиновой кислотой, а также вектор, который внедрен в клетку-хозяина, в которую он был введен. Определенные векторы способны к направленной экспрессии нуклеиновых
кислот, с которыми они функционально соединены. Такие векторы именуются в настоящем документе как "векторы экспрессии".
II. КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ
В одном аспекте, изобретение основано, частично, на анти-гемагглютининовых антителах и их применение. В некоторых вариантах реализации изобретения, в изобретении предлагаются антитела, которые связываются с гемагглютинином. Антитела настоящего изобретения полезны, например, для диагностики, лечения, или профилактики инфекции вирусом гриппа типа А.
А. Типичные Анти-гемагглютининовые антитела В одном аспекте, в изобретении предлагаются изолированые антитела, которые связываются с гемагглютинином. В некоторых вариантах реализации изобретения, анти-гемагглютининовое антитело настоящего изобретения связывает гемагглютинин, связывает гемагглютинин из вируса гриппа типа В, связывает гемагглютинин из вирусов гриппа типа В линии Yamagata, связывает гемагглютинин из вирусов гриппа типа В линии Victoria, связывает гемагглютинин из вируса гриппа типа В предковых линий, или связывает гемагглютинин из линии Yamagata, линии Victoria, и предковых линий вируса гриппа типа В. В других вариантах реализации изобретения, анти-гемагглютининовое антитело согласно настоящему изобретению нейтрализует вирус гриппа типа В in vitro. В других вариантах реализации изобретения, анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, нейтрализует вирус гриппа типа В in vivo. Еще в других вариантах реализации изобретения, анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, уменьшает инфекцию вирусом гриппа типа В, предотвращает инфекцию вирусом гриппа типа В, подавляет инфекцию вирусом гриппа типа В, или лечит инфекцию вирусом гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения, анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, предотвращает, подавляет, или снижает гемагглютинин-опосредованное слияние между мембраной вируса гриппа и эндосомальной мембраной инфицированной клетки и (таким образом предотвращает, подавляет, или снижает попадание вирусной РНК в цитоплазму инфицированной клетки, тем самым предотвращая, подавляя, или снижая дополнительное распространение инфекции вирусом гриппа).
В одном аспекте, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, или шесть HVR, которые выбраны из a) HVR-H1, который содержит: аминокислотную
последовательность SEQ ID N0:61; 6) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:64; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:75; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательности SEQ Ш N0:55; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:57; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:59.
В одном аспекте, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, или шесть HVR, которые выбраны из a) HVR-H1, которая содержит: аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:61; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:65; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:75; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательности SEQ Ш N0:55; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VH HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:61; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:64; и в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:75.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VH HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:61; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:65; и в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:75.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VL HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55; б) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш
N0:57; и в) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит: a) HVR-Н1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:61; б) HVR-H2, котораякоторая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:64; в) HVR-НЗ, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:75; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из SEQ Ш N0:59.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит: a) HVR-Н1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:61; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:65; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:75; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из SEQ Ш N0:59.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ Ш N0:79 и 83.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ Ш N0:78, 82, и 86.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ Ш N0:79 и 83, и вариабельной области легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранная из группы, которая состоит из SEQ ID N0:78, 82 и 86.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:79, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:78.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:83, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:82.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:83, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:86.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:81, 85, и 88.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которая содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:80, 84, и 87.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:81, 85, и 88, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:80, 84, и 87.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:81, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:80.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность
SEQ ID N0:85, и легкую цепь, которое содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ Ш N0:84.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:88, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQIDN0:87.
В одном аспекте, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, или шесть HVR, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:62; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:66; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:76; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VH HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:62; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:66; и в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:76.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VL HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55; б) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и в) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит: a) HVR-Н1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:62; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:66; в) HVR-H3,
которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:76; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из SEQ Ш N0:59.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:89.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:78.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:89, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:78.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:90, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:80.
В одном аспекте, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, или шесть HVR, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID N0:67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, и 74; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:60.
В одном аспекте, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, или шесть HVR, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:67; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:60.
В одном аспекте, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, или шесть HVR, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:68; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:60.
В одном аспекте, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, или шесть HVR, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:69; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:60.
В одном аспекте, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, или шесть HVR, которые выбраы из a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:70; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID
N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:60.
В одном аспекте, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, или шесть HVR, которые выбраны из a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:71; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:60.
В одном аспекте, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, или шесть HVR, которые выбраны из a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:72; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:60.
В одном аспекте, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, или шесть HVR, которые выбраны из a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:73; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:60.
В одном аспекте, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, или шесть HVR, которые выбраны из a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:74; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:60.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VH HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:63; б) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:67; и в) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:77.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VH HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:68; и в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:77.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VH HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:69; и в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:77.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VH HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО
N0:70; и в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VH HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:71; и в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VH HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:72; и в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VH HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:73; и в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VH HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-H1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:74; и в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77.
В одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит по меньшей мере одну, по меньшей мере две, или все три VH HVR последовательности, которые выбраны из: a) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; б) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш
N0:58; и в) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:60.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит: a) HVR-Н1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:67; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из SEQ Ш N0:60.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит: a) HVR-Н1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:68; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из SEQ Ш N0:60.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит: a) HVR-Н1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:69; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из SEQ Ш N0:60.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит: a) HVR-Н1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:70; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:56; д) HVR-L2,
которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из SEQ Ш N0:60.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит: a) HVR-Н1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:71; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из SEQ Ш N0:60.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит: a) HVR-Н1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:72; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из SEQ Ш N0:60.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит: a) HVR-Н1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:73; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77; г) HVR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность, вибраную из SEQ Ш N0:60.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит: a) HVR-Н1, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63; б) HVR-H2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:74; в) HVR-H3, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77; г) HVR-L1,
которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56; д) HVR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58; и е) HVR-L3, которая содержит аминокислотную последовательность, которая выбрана из SEQ Ш N0:60.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID N0:92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, и 107.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело которое содержит вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:91.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ Ш N0: 92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, и 107, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:91.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:92, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:91.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:95, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:91.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:97, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:91.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:99, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:91.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:101, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:91.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:103, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:91.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:105, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:91.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:107, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:91.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которая содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая выбранная из группы, состоящей из SEQ ID N0:94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, и 108.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:93.
В еще одном аспекте, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая выбранна из гурппы, состоящей из SEQ Ш N0: 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, и 108, и легкую цепь, которая
содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:93.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:94, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQIDN0:93.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:96, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQIDN0:93.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:98, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQIDN0:93.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:100, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQIDN0:93.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:102, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQIDN0:93.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:104, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQIDN0:93.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:106, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность
SEQ Ш N0:93.
В одном варианте реализации изобретения, в изобретении предлагается антитело, которое содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:108, и легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность SEQIDN0:93.
В любых вышеуказанных вариантах реализации изобретения, анти-гемагглютининовое антитело согласно настоящему изобретению является гуманизированным. В одном варианте реализации изобретения, анти-гемагглютининовое антитело содержит HVR, такие же как и в любом из вышеуказанных вариантов реализации изобретения, и дополнительно содержит каркас человеческого акцептора, например, каркас человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркас.
В еще одном аспекте, анти-гемагглютининовое антитело настоящего изобретения содержит последовательность тяжелой цепи вариабельного домена (VH), которая имеет по меньшей мере 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, или 100 % идентичности последовательности к аминокислотной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID N0:79, 83, 89, 92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, и 107. В некоторых вариантах реализации изобретения, VH последовательность, которая имеет по меньшей мере 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, или 99 % идентичности, содержит замены (например, консервативные замены), вставки, или делеции относительно эталонной последовательности, но анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит эту последовательность, сохраняет способность связываться с гемагглютинином. В некоторых вариантах реализации изобретения, всего было замещено, вставлено и/или удалено от 1 до 10 аминокислот в SEQ Ш N0:79, 83, 89, 92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, или 107. В некоторых вариантах реализации изобретения, замены, вставки, или делеции случаются в областях вне HVR (т.е., в FR). Необязательно, анти-гемагглютининовое антитело содержит VH последовательность в SEQ Ш N0:79, 83, 89, 92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, или 107, включая пост-трансляционные модификации этой последовательности.
В еще одном аспекте, предлагается анти-гемагглютининовое антитело, причем антитело содержит легкую цепь вариабельного домена (VL), которая имеет по меньшей мере 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, или 100 % идентичности
последовательность к аминокислотной последовательности, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID N0:78, 82, 86, и 91. В некоторых вариантах реализации изобретения, VL последовательность, которая имеет по меньшей мере 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, или 99 % идентичности, содержит замены (например, консервативные замены), вставки, или делеции относительно эталонной последовательности, но анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит эту последовательность, сохраняет способность связываться с гемагглютинином. В некоторых вариантах реализации изобретения, всего было замещено, вставлено и/или удалено от 1 до 10 аминокислот в SEQ Ш N0:78, 82, 86, или 91. В некоторых вариантах реализации изобретения, замены, вставки, или делеции случаются в областях вне HVR (т. е., в FR). Необязательно, анти-гемагглютининовое антитело содержит VL последовательность в SEQ Ш N0:78, 82, 86 или 91, включая пост-трансляционные модификации этой последовательности.
В другом аспекте, предлагается анти-гемагглютининовое антитело, причем антитело включает VH, такое же как в любом из вышеприведенных вариантов реализации изобретения, и VL, такое же как в любом из вышеприведенных вариантов реализации изобретения. В одном варианте реализации изобретения, антитело содержит VH и VL последовательности в SEQ Ш N0:79, 83, 89, 92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, или 107 и SEQ ID N0:78, 82, 86, или 91, соответственно, включая пост-трансляционные модификации этих последовательностей.
В дополнительном аспект, в изобретении предлагается антитело, которое связывается с таким же эпитопом, что и анти-гемагглютининовое антитело, которое предлагается в настоящем документе. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения, предлагаемое антитело связывается с тем же эпитопом, что и анти-гемагглютининовое антитело, которое содержит: VH последовательности SEQ Ш N0:79 и VL
последовательность SEQ Ш N0:78
последовательность SEQ Ш N0:82
последовательность SEQ Ш N0:86
последовательность SEQ Ш N0:78
последовательность SEQ Ш N0:91
последовательность SEQ Ш N0:91
последовательность SEQ Ш N0:91
последовательность SEQ Ш N0:91
VH последовательность SEQ Ш N0:83 и VL
VH последовательность SEQ Ш N0:83 и VL
VH последовательность SEQ Ш N0:89 и VL
VH последовательность SEQ Ш N0:92 и VL
VH последовательность SEQ Ш N0:95 и VL
VH последовательность SEQ Ш N0:97 и VL
VH последовательность SEQ Ш N0:99 и VL
VH последовательность SEQ Ш N0:101 и VL
последовательность SEQ Ш N0:91; VH последовательность SEQ Ш N0:103 и VL последовательность SEQ Ш N0:91; VH последовательность SEQ Ш N0:105 и VL последовательность SEQ Ш N0:91; VH последовательность SEQ Ш N0:107 и VL последовательность SEQ Ш N0:91.
В дополнительном аспекте согласно данному изобретению, анти-гемагглютининовое антитело, в соответствии с каким-либо из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения, представляет собой моноклональное антитело, включая химерное, гуманизированное, или человеческое антитело. В одном варианте реализации изобретения, анти-гемагглютининовое антитело представляет собой фрагмент антитела, например, Fv, Fab, Fab', scFv, диатело, или F(ab')2 фрагмент. В другом варианте реализации изобретения, антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, целое антитело, например, IgGl антитело, или антитело другого класса или изотипа, как определено в настоящем документе.
В дополнительном аспекте, анти-гемагглютининовое антитело, в соответствии с каким-либо из вышеупомянутых вариантов реализации изобретения, может включать любое из свойств, отдельно или в комбинации, как описано в секциях 1-7 ниже:
1. Аффинность антитела В некоторых вариантах реализации изобретения, антитело, которое предлагается в настоящем документе, имеет константу диссоциации (Kd) < 1мкМ, < 100 нМ, < 10 нМ, < 1 нМ, < 0,1 нМ, < 0,01 нМ, или < 0,001 нМ (например, 10~8М или меньше, например, от 10"8М до 10"13М, например, от 10"9М до 10"13 М).
В одном варианте реализации изобретения, Kd измерятся с помощью анализа связывания с применением радиоактивно меченого антигена (РИА). В одном варианте реализации изобретения, РИА выполняется с Fab вариантом антитела интереса и и его антигеном. Например, аффинность связывания раствора Fab для антигена измеряется уравновешиванием Fab с минимальной концентрацией (1251)-меченого антигена в присутствии серий титров немеченого антигена, после захвата связанного антигена плашкой, которая покрыта анти-Fab антителами(См., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Чтобы создать условия для анализа, MICROTITER(r) мульти-ячеечные плашки (Thermo Scientific) покрывают 5 мкг/мл захваченных анти-Fab антител (Cappel Labs) на протяжении ночи в 50 мМ карбонате натрия (рН 9,6), и в дальнейшем блокируют 2 % (мас./об.) бычьим сыровоточным альбумином в PBS от двух до пяти
часов при комнатной температуре (около 23°С). В неадсорбирующей плашке (Nunc №269620), 100 пМ или 26 пМ [1251]-антигена смешивают с серийными разведениями Fab, которые представляют интерес (например, совместимы с оценкой анти-VEGF антитела, Fab-12, в Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Затем Fab, которые представляют интерес, инкубируют на протяжении ночи; однако, инкубация может продолжатся более длительный период (например, около 65 часов) для того, чтобы убедится в достижении равновесия. После этого смеси переносят на плашку захвата, для инкубации при комнатной температуре (например, один час). Затем раствор удаляют и плашку промывают восемь раз 0,1 % полисорбатом 20 (TWEEN-20(r)) в PBS. Когда плашки высохли, добавляется 150 мкл/ячейка синтиланта (MICROSCINT-20 (tm); Packard), и плашки оцениваются на TOPCOUNT (tm) гамма счетчике (Packard) десять минут. Для применения в конкурентном связывающем анализе отбираются те концентрации каждого Fab, которые дают менее чем или ровно 20 % максимального связывания.
Согласно другому варианту реализации изобретения, Kd измеряется, используя BIACORE(r) поверхностный плазмонный резонанс. Например, анализ используя BIACORE(r)-2000 или BIACORE (r)-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, Нью-Джерси) выполняется при 25° С с чипами СМ5 симмобилизованным антигеном при ~10 единицах ответа (ЕО). В одном варианте реализации изобретения, карбоксиметилированные декстрановые биосенсорные чипы (СМ5, BIACORE, Inc.) активируются 1Ч-етил-Л^'- (З-диметиламинопропил)-карбодиимид гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкцией производителя. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инъекцией со скоростью потока 5 мкл/минута для достижения приблизительно 10 единиц ответа (ЕО) связанного белка. После инъекции антигена, 1 М этаноламина впрыскивается для блокирования непрореагировавших групп. Для кинетических измерений, двукратные серийные разведения Fab (0,78 нМ до 500 нМ) вводили в PBS с 0,05 % полисорбатом 20 (TWEEN-20(tm)) ПАВ (PBST) при 25°С со скоростью потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и скорости диссоциации (kQff)
рассчитывается используя простую один-к-одному модель связывания Langmuir (BIACORE (r) Evaluation Software version 3.2) при одновременной подгонке сенсограм ассоциации и диссоциации. Константа диссоциации равновесия (Kd) рассчитывается как отношение k0ff/kon См., например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Если on-
скорость превышает 10^ M~l c~l' как определено с помощью поверхностного
плазменного резонанса, как описано выше, то on-скорость может быть определена с помощью флуоресцентного способа гашения, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение = 295 нм;
эмиссия = 340 нм, 16 нм полоса частот) при 25°С 20 нМ анти-антигенового антитела (Fab форма) в PBS, рН 7,2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, как измерено в спектрометре, таком как спектрофотометре, с возможностю остановки потока (Aviv Instruments), или 8000-серии SLM-AMINCO (tm) спектрофотометр (ThermoSpectronic) с перемешивающей кюветой.
2. Фрагменты антитела В некоторых вариантах реализации изобретения, антитело, которое предлагается в настоящем документе, представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антитела включают, но не ограничиваются, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, и scFv фрагментами, и другими фрагментами, которые описаны ниже. Для обзора определенных фрагментов антитела, см. Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Для обзора scFv фрагментов, см., например, Pluckthiin, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg и Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); см. также WO 93/16185; и патенты США № 5571894 и 5587458. Для обсуждения Fab и F(ab')2 фрагментов, содержащие остатки связывания эпитопа рецептора реутилизациии, имеющие увеличенную in vivo полу-жизнь, см. патент США № 5869046.
Диатела - это фрагменты антитела с двумя антигенсвязывающими сайтами, что могут быть бивалентными или биспецифическими. См., например, ЕР 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Триатела и тетраатела также описаны в Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Однодоменные антитела это фрагменты антитела, которые содержат все, или часть вариабельного домена тяжелой цепи, или все или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения, однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (Domantis, Inc., Уолтем, Массачусетс; См., например, патент США № 6248516 В1).
Фрагменты антитела могут быть приготовлены с помощью различных технологий, включая, но не ограничиваясь протеолитическим расщеплением целостного антитела,
так же как и производством рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е. coli или фаг), как описано в настоящем документе.
3. Химерные и гуманизированные антитела В некоторых вариантах реализации изобретения, антитело, которое предлагается в настоящем документе представляет собой химерное антитело. Определенные химерные антитела описаны, например, в патенте США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). В одном примере, химерное антитело содержит нечеловеческую вариабельную область (например, вариабельную область, которая получена из мыши, крысы, хомяка, кролика, или нечеловеческого примата, такого как обезьяна) и человеческую константную область. В дополнительном примере, химерное антитело представляет собой "класс-измененное" антитело, в котором класс, или подкласс был изменен на отличающийся от родительского антитела. Химерные антитела включаю антиген-связывающие фрагменты антитела этого класса.
В некоторых вариантах реализации изобретения, химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Типично, нечеловеческое антитело гуманизированно, с целью уменьшить иммуногенность для человека, сохраняя при этом специфичность и аффинность родительского нечеловеческого антитела. В целом, как правило, гуманизированное антитело содержит один или больше вариабельных доменов в которых HVR, например, CDR, (или их часть) получена из нечеловеческого антитела, и FR (или их часть) получена из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно также может содержать по меньшей мере часть человеческой константной области. В некоторых вариантах реализации изобретения, некоторые FR остатки в гуманизированном антителе заменены на соответствующие остатки из нечеловеческого антитела (например, антитело из которого получают HVR остатки), например, для того чтобы восстановить или улучшить специфичность или сродство антитела.
Обзор способов производства гуманизированных антител , например, в Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), и дополнительно описаны, например, в Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'I Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); патент США №. 5821337, 7527791, 6982321, и 7087409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (описываются области, которые определяют специфичность (SDR) трансплантации); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (описывается "перепокрытие"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) описывается
"FR перетасование"); и Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (описывается подход "управляемый отбор" для FR перетасования).
Человеческие каркасные области, которые могут быть применены в гуманизации включают, но не ограничиваются: каркасными областями, которые выбраны используя способ "наиболее подходящий" (см., например, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); каркасными областями, которые получены из консенсусных последовательностей человеческого антитела отдельной подгруппы вариабельных областей легкой и тяжелой цепей (см., например, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); и Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); человеческими зрелыми (соматически мутированными) каркасными областями, или человеческими зародышевыми каркасными областями (см., например, Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); и каркасными областями, которые получены из скрининга FR библиотек (см., например, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) и Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
4. Человеческие антитела В некоторых вариантах реализации изобретения, антитело, которое предлагается в настоящем документе, представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела могут быть получены с применением различных способов, которые известные в данной области техники или используя технологии, которые описаны в настоящем документе. Человеческие антитела описаны в целом, как правило в van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450459 (2008).
Человеческое антитело может быть приготовлено введением иммуногена трансгенному животному, которое было изменено для производства целых человеческих антител, или целых антител с человеческими вариабельными областям в ответ на антигенный вызов. Такие животные, как правило, содержат все или часть человеческого иммуноглобулинового локуса, который замещает эндогенный иммуноглобулиновый локус, или которые представлены экстрахромосомно или, которые встроенны случайным образом в хромосомы животного. В таких трансгенных мышах, эндогенные иммуноглобулиновые локусы в целом, как правило были инактивированные. Для обзора способов получения человеческих антител из трансгенных животных, см. Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). См. также, например, патенты США № 6075181 и 6150584, в которых описана XENOMOUSE(tm) технология; патент США № 5770429, в котором
описана HTJMAB(r) технология; патент США № 7041870, в котором описана К-М MOUSE(r) технология, и публикацию заявки на патент США № US 2007/0061900, в которой описана VELOCIMOUSE(r) технология). Человеческие вариабельные области из целых антител, которые производятся такими животными, могут быть дополнительно модифицированы, например, комбинированием с разной человеческой константной областью.
Человеческие антитела могут также быть произведены с помощью способа, основаного на гибридомах. Были описаны лини клеток человеческой миеломы и мышь-человеческой гетеромиеломы для производства человеческих моноклональных антител (см., например, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). Человеческие антитела произведенные с помощью человеческой В-клеточной гибридомной технологиии также описаны в Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Дополнительные способы включают те, которые описаны, например, в патенте США № 7189826 (описано получение моноклональных человеческих IgM антител из гибридомных клеточных линий) и Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (описаны человек-человеческие гибридомы). Человеческая гибридомная технология (Trioma technology) также описана в Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) и Vollmers и Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
Человеческие антитела могут также быть произведены с помощью изолирования вариабельного домена Fv клона в последовательностях, которые выбраны из фаг-дисплей библиотек, полученных из человека. Такие последовательности вариабельного домена могут быть объединены с желаемым человеческим константным доменом. Технологии отбора человеческих антител описаны ниже.
5. Антитела, которые получены из библиотек Антитела, согласно данному изобретению, могут быть изолированы с помощью скрининга кобинаторных библиотек для антител с желанной активностю, или активностями. Например, в данной области техники известно про множество способов производства фаг-дисплей библиотек и скрининга таких библиотек для антител, которые обладают желанными характеристиками связывания. Такие способы рассмотрены, например, в Hoogenboom et al. в Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed.,Human Press, Тотова, Нью-Джерси, 2001) и дополнительно описаны, например, в
McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks и Bradbury, в Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Тотова, Нью-Джерси, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
В некоторых способах фагового дисплея, репертуары VH и VL генов клонируются с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР), и рекомбинируются в случайных фаговых библиотеках, которые потом могут быть подвергнуты скринингу антиген-связывающим фагом как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Фаг обычно отображает фрагменты антитела, либо как фрагменты единой цепи Fv (scFv), или как Fab фрагменты. Библиотеки из иммунизированных источников обеспечивают высокое сродство антитела к иммуногену без необходимости конструирования гибридом. Кроме того, может быть клонирован нативный репертуар (например, из человека), чтобы предоставить единый источник антител для широкого диапазона несобственных и также собственных антигенов без какой-либо иммунизации, как описано Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). В конце концов, нативные библиотеки также могут быть приготовлены искусственным путем с помощью клонирования непереставленных V-генных сегментов из стволовых клеток, и с помощью ГЩР-праймеров, которые содержат случайную последовательность, чтобы кодировать високовариабельные CDR3 области и выполнить перестановку in vitro, как описано Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Патентные заявки, которые описывают фаговые библиотеки человеческих антител, например, включают: патент США № 5750373, и патентные заявки США № 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, и2009/0002360.
Антитела, или фрагменты антитела, которые изолированы из библиотек человеческих антител, считаются человеческими антителами, или фрагментами человеческих антител в настоящем документе.
6. Мультиспецифические антитела В некоторых вариантах реализации изобретения, атнитело, которое предлагается в настоящем документе, представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности связывания по меньшей мере
для двух разных сайтов. В некоторых вариантах реализации изобретения, одна из связывающих специфичностей - это специфичность для гемагглютинина, и другая - это специфичность для любого другого антигена. В некоторых вариантах реализации изобретения, биспецифические антитела могут связываться с двумя разными эпитопами гемагглютинина. Биспецифические антитела могут также быть применены для переноса цитотоксических средстве к клеткам, который экспрессируют гемагглютинин. Биспецифические антитела могут быть приготовлены как полноразмерные антитела или фрагменты антитела.
Технологии для создания мултиспецифических антител включают, но не ограничиваются, рекомбинатной ко-экспрессияей двух иммуноглобулиновых пар тяжелая цепь-легкая цепь, которые имеют разные специфичности (см. Milstein и Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, и Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), и "knob-in-hole" engineering (см., например, патент США № 5,731,168). Мультиспецифические антитела могут также быть произведены с помощью инженерно-электростатических наводимых эффектов для создания Fc-гетеродимерных молекул антитела (WO 2009/089004А1); сшивкой двух или более антител или фрагментов (см., например, Патент США № 4676980, и Brenn et al., Science, 229: 81 (1985)); используя лейциновые зипперы, для создания биспецифического антитела (см., например, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); применяя технологию "диател" для приготовления фрагментов биспецифического антитела (См., например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); и используя одноцепочечные Fv (sFv) димеры (см., например Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); и приготавливая триспецифические антитела как описано, например, в Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Сконструированные антитела с тремя или более функциональными антиген-связывающими сайтами, включая "антитела Octopus," также включены в настоящий документ (см., например, US 2006/0025576А1).
Антитело, или фрагмент, в настоящем документе, также включает " FAb двойного действия" или "DAF", который содержит антиген-связывающий сайт, что связывается с гемагглютинином, так же как и другой, непохожий антиген (см., US 2008/0069820, например).
7. Варианты антител
В некоторых вариантах реализации изобретения, рассматриваются варианты аминокислотной последовательности антител, которые предоставлены в настоящем документе. Например, это может быть желательным для улучшения аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела могут быть подготовлены с помощью внесения подходящих модификаций в нуклеотидную последовательность, которая кодирует антитело, или с помощью пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции, и/или инсерции и/или замены остатков в аминокислотной последовательности антитела. Может быть сделано любое сочетание удаления, вставки и замены, чтобы достичь конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает нужными характеристиками, например, антиген-связыванием.
а) Варианты замены, вставки и удаление В некоторых вариантах реализации изобретения, предлагаются варианты антитела, которые имеют одну или более аминокислотных замен. Сайты интереса для замещающего мутагенеза включают HVR и FR. Консервативные замены показаны в Таблице 1 под заголовком "предпочитаемые замены." Больше существенных изменений предлагается в Таблице 1 под заголовком "типичные замены," и как дополнительно описано ниже со ссылкой на классы аминокислотных боковых цепей. Аминокислотные замены могут быть внесены в антитело интереса, и продукты проскринированы на наличие желаемой активности, например, сохраненное/улучшенное связывания антигена, сниженная иммуногенность, или улучшенный АЗКЦ или КЗЦ.
Один тип варианта замещения предполагает замены одного или более остатков гипервариабельной области родительского антитела(например гуманизированное или человеческое антитело). В целом, как правило, полученный вариант(ы), выбранный(е) для дополнительного исследования, будет(ут) иметь модификации (например, улучшения) определенных биологических свойств (например, повышенное сродство, сниженной иммуногенности) относительно родительского антитела, и/или будет(ут) иметь существенно сохраненные определенные биологические свойства родительского антитела. Типичный вариант замещения представляет собой антитело с созревшей аффинностью, которое может быть произведено удобным способом, например, используя технологии созревания аффинности основанные на фаг-дисплее, таки как те,
что были описаны в настоящем документе. Кратко, один или более HVR остатков мутируют, а вариант антитела выставляют на фаге, и проводят скрининг для конкретной биологической активности (например, аффинность связывания).
Изменения (например, замены) могут быть сделаны в HVR, например, чтобы улучшить аффинность антитела. Такие изменения могут быть сделаны в "горячих точках" HVR, например, остатках, которые кодируются кодонами, что подвергаются мутации с высокой частотой во время процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), и/или остатки, которые контактируют с антигеном, с проведением тестирования аффинности связывания полученых вариантов VH или VL. Созревание аффинности, с помощью конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек были описаны, например, в Hoogenboom et al., в Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) В некоторых вариантах созревания аффинности, вносится разнообразие в вариабельные гены, которые выбраны для созревания с помощью любого из множества способов (например, вносящая ошибки ПНР, перетасовывание цепей, или олигонуклеотид-направленный мутагенез). Затем создается вторичная библиотека. Затем проводят скрининг библиотеки чтобы идентифицировать варианты антитела с желаемой аффинностью. Другие способы внесения разнообразия предполагают HVR-направленные подходы, в которых несколько HVR остатков (например, 4-6 остатки за раз) подвергаются рандомизации. HVR остатки, которые вовлечены в антигенное связывание, могут быть специфически идентифицированы, например, используя сканирование с помощью аланинового мутагенеза, или моделирования. CDR-H3, и CDR-L3 в частности, часто становятся мишенями.
В некоторых вариантах реализации изобретения, замены, инсерции, или делеции могут случатся в одном или более HVR до тех пор пока такие изменения существенно не снижают способность антитела связывать антиген. Например, могут быть сделаны консервативные изменения в HVR (например, консервативные замены, как указано в настоящем документе), которые существенно не снижают аффинность связывания. Такие изменения могут, например, быть за пределами контактирующих остатков антигена в HVR. В некоторых вариантах реализации осуществления вариантов последовательностей VH и VL, которые представлены выше, каждый HVR, или является неизменяемым, или содержит не больше чем одну, две или три аминокислотных замены.
Полезным способом для идентификации остатков, или областей антитела, которые могут быть целями для мутагенеза, называется "аланин-сканирующий мутагенез", как описано Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. В этом способе, остаток или группа целевых остатков (например, заряженные остатки такие как Arg, Asp, His, Lys, и Glu) определяется и заменяется на нейтральные или негативно заряженные аминокислоты (например, аланин или полиаланин), чтобы определить затрагивается ли взаимодействие антитела с антигеном. Дополнительные замены могут быть введены в аминокислотные местоположения, которые демонстрируют функциональную чувствительность к начальным заменам. В качестве альтернативы, или дополнительно, может быть определена кристаллическая структура комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки могут быть сделаны мишенями, или исключены в качестве кандидатов для замещения. Могут быть проскринированы варианты, чтобы определить, содержат ли они нужные свойства.
Аминокислотная последовательность вставок включают амино - и/или карбоксильные-концевые объединения, колеблясь в длине от одного остатка до полипептидов, которые содержат сто или более остатков, также как и инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние N- или С-конца антитела с ферментом (например, для ADEPT) или полипептидом, который увеличевает сивороточный полураспад антитела.
Ь) Варианты гликозилирования В некоторых вариантах реализации изобретения, антитело, которое предлагается в настоящем документе изменяют, чтобы увеличить или уменьшить степень, до которой антитело гликозилировано. Добавление или удаление сайтов гликозилирования антитела может быть удобно сделано изменением аминокислотной последовательности, таким образом, что создается или удаляется один или более сайтов гликозилирования.
Может быть изменен карбогидрат, который прикреплен к Fc-области, которую содержит антитело. Нативные антитела, которые произведены клетками млекопитающего, как правило, содержат ветвистый, двухантенный олигосахарид, который в целом, как правило прикреплен N-связью к Asn297 СН2 домена Fc области. См., например, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997). Олигосахарид может включать различные
карбогидраты, например, маннозу, N-ацетил глюкозамин (GlcNAc), галактозу, и сиаловою кислоту, так же как и фукозу, которая прикреплена к GlcNAc в "стебель" двоантенной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах изобретения, модификации олигосахарида в антителе, согласно данному изобретению, могут быть сделаны для того, чтобы создать варианты антител с определенными улучшеными свойствами.
В одном варианте реализации изобретения, предлагаемые варианты антитела имеют карбогидратную структуру, что не имеет фукозы, и эта структура прикреплена (прямо или непрямо) к Fc области. Например, количество фукозы в таком антителе может быть от 1 % до 80 %, од 1 % до 65 %, от 5 % до 65 % или от 20 % до 40 %. Количество фукозы определяется из расчета среднего количества фукозы в цепи сахара в Asn297, относительно суммы глюкоструктур, которые прикреплены к Asn 297 (например, комплексные, гибридные и высоко манозные структуры) как измерено с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии, как описано в WO 2008/077546, например Asn297 относится к аспарагиновому остатку, который размещен около в положении 297 в Fc области (Ей нумерация остатков Fc области); однако, Asn297 может также быть расположен около ± 3 аминокислоты выше или ниже позиции 297, например, между позициями 294 и 300, из-за незначительных вариаций последовательности в антителе. Такие варианты фукозилирования могут иметь улучшенную АЗКЦ функцию. См., например, патентные заявки США № US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примеры публикаций, которые связаны с "дефукозилироваными" или "фукоз-лишенными" вариантами антитела включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Примеры клеточных линий, способных продуцировать дефукозилированые антитела, включают Lecl3 СНО клетки, которые лишены фуколизирования белков (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 Al, Presta, L; и WO 2004/056312 Al, Adams et al., особенно в примере 11), и нокаутные клеточные лини, такие как альфа-1,6-фукозилтрансферазный ген, FUT8, нокаутные СНО клетки (см., например, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); и WO2003/085107).
Дополнительно предлагаются варианты антител с разделенными олигосахаридами, например, в которых двухантенный олигосахарид, который прикреплен к Fc области антитела, разделен GlcNAc. Такие варианты антитела могут уменьшить фукозилирование и/или улучшить АЗКЦ функцию. Примеры таких вариантов антитела описаны, например, в WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); патенте США № 6602684 (Umana et al.); и US 2005/0123546 (Umana et al.). Предлагаются также варианты антитела по меньшей мере с одним галактозным остатком в олигосахариде, который прикреплен к Fc области. Такие варианты антитела могут улучшить функции КЗЦ. Такие варианты антитела описаны, например, в WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); и WO 1999/22764 (Raju, S.).
с) Варианты Fc области В некоторых вариантах реализации изобретения, может быть введена одна или более аминокислотных модификаций в Fc область антитела, которое предлагается в настоящем документе, тем самым порождая варианты Fc области. Вариант Fc области может содержать последовательность человеческой Fc области (например, человеческую IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 Fc область), которая содержит аминокислотные модификации (например, замены) в одной, или более аминокислотных позициях.
В некоторых вариантах реализации, изобретение предусматривает вариант антитела, которое обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, которые делают его желательным кандидатом для приложений, в которых важен период полураспада антител in vivo, тем не менее определенные эффекторные функции (такие как комплемент и АЗКЦ) являются ненужными или вредными. Может быть проведен анализ цитотоксичности in vitro и/или in vivo, чтобы подтвердить уменьшение/истощение КЗЦ и/или АЗКЦ активностей. Например, могут быть проведены анализы связывания Fc рецептора (FcR), чтобы гарантировать, что антитело утратило FcyR связывания (отсюда, скорее всего, не хватает активность АЗКЦ), но сохраняет способность связываться с FcRn. Первичные клетки для опосредования АЗКЦ, NK клеток, экспрессируют только FcyRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. FcR экспрессия на гематопоетических клетках резюмирована в Таблице 3 на странице 464 Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Неограничивающиеся примеры in vitro анализа для оценки АЗКЦ активности молекулы интереса описаны в патенте США № 5500362 (См.,
например, Hellstrom, I. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) и Hellstrom, I et al., Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (cM.Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Кроме того, могут быть использованы нерадиоактивные способы анализа (см., например, ACTI(tm) нерадиоактивный анализ цитотоксичности для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Маунтин Вью Калифорния; и CytoTox 96(r) нерадиоактивный анализ цитотоксичности (Promega, Мэдиссон, Висконсин). Полезные эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (ОКПК), и клетки естественные киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно может быть оценена АЗКЦ активность молекулы интереса in vivo, например, в животной модели, такой как раскрытая в Clynes et al. Proc. Nat'I Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Анализы связывания Clq могут также проводиться для подтверждения того, что антитело не может связываться с Clq и, следовательно, лишено КЗЦ активности. См., например, Clq и СЗс связывания ИФА в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента может быть выполнен анализ КЗЦ (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); и Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn связывание и in vivo определение клиренса/полужизни также может быть произведено способами, которые известные в данной области техники (см., например, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 17591769 (2006)).
Антитела с пониженой эффекторной функцией включают те, что имеют замены одногоили более остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 в Fc области (патент США № 6737056). Такие Fc мутанты включают Fc мутанты с заменами в двух или более аминокислотных позициях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так-званые "DANA" Fc мутанты с заменами остатков 265 и 297 на аланин (атент США № 7 332 581).
Описаны определенные варианты антитела с улучшенным или сниженным связыванием к FcRs (см., например, патент США № 6737056; WO 2004/056312, и Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)).
В некоторых вариантах реализации изобретения, вариант антитела содержит Fc область с одной или более аминокислотной заменой, которые улучшают АЗКЦ, например, замены в позициях 298, 333, и/или 334 Fc область (EU нумерация остатков).
В некоторых вариантах изобретения, изменения производятся в Fc области, результатом которых является изменение (например, либо улучшение или уменьшение) Clq связывания и/или Комплемент Зависимой Цитотоксичности (КЗЦ), например, как описано в патенте США № 6194551, WO 99/51642, и Idusogie et al. J. Immunol. 164: 41784184 (2000).
Антитела с увеличенным периодом полувыведения и улучшенным связыванием к неонатальному Fc рецептору (FcRn), который который отвечает за перенос материнского IgG к плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), описаны в US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Эти антитела содержат Fc область с одной или более заменами в ней, которые улучшают связывания Fc области с FcRn. Такие Fc варианты включают и те, которые имеют замены в позициях одного или более остатков Fc области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замена остатка 434 Fc области (патент США № 7371826).
См. также Dune & Winter, Nature 322:738-40 (1988); патент США № 5648260; патент США № 5624821; и WO 94/29351 касательно других примеров вариантов Fc области.
d) Цистеин-спроектированые варианты антитела
В некоторых вариантах реализации изобретения, желательно создать цитеин спроектированные антитела, например, "thioMAbs," в которых один или более остатков антитела заменены цистеиновими остатками. В конкретных вариантах реализации изобретения, замененные остатки встречаются в доступных сайтах антитела. Заменяя эти остатки цистеина, реактивные тиоловые группы, в связи с этим, расположены в доступных сайтах антитела и могут быть применены, чтобы соединить антитело с другими частями, такими как лекарственные части или частями линкерного-лекарства, чтобы создать иммуноконъюгаты, как описано дополнительно в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, любой один или боле нижеследующих остатков могут быть заменены на цистеин: V205 (нумерация Kabat) легкой цепи; А118 (нумерация EU) тяжелой цепи; и S400 (нумерация EU) Fc области тяжелой цепи. Цистеин-спроектированные антитела могут быть произведены как описаны, например, в патенте США № 7521541.
e) Производные Антител
В некоторых вариантах реализации изобретения, антитело, которое предлагается в настоящем документе может быть дополнительно изменено, чтобы содержать
дополнительные небелковые части, которые известные в данной области техники и легко доступны. Части, подходящие для дериватизации антитела, включают, но не ограничиваются водорастворимыми полимерами. Не ограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, но не ограничиваются полиэтиленгликолем (ПЭГ), сополимерами этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллю лозой, декстраном, поливиниловым спиртом, поливинилпирролидоном, поли-1, 3-диоксоланом, поли-1,3,6-триоксаном, этилен/малеиновым ангидридным сополимером, полиаминокислотами (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры), и декстраном или поли(1ч[-винил пирролидольным)полиэтиленгликолем, гомополимерами пропиленгликоля, полипропиленовыми оксид/этиленовыми оксидными сополимерами, полиоксиэтилированными полиолами (например, глицерол), поливиниловым спиртом, и их смесями. Полиэтиленгликолевый пропионилальдегид может иметь преимущества в производстве из-за его стабильности в воде. Полимер может иметь любой молекулярный вес и может быть разветвленным, или неразветвленным. Количество прикрепленных к антителу полимеров может разнится, и если прикреплен более чем один полимер, они могут быть одинаковыми, или разными молекулами. В целом, количество и/или тип полимеров, которые используются для дериватизации может быть определен(о) исходя из соображений, включая, но не ограничиваясь особыми свойствами или функциями антитела, которые должны быть улучшены, в зависимости от того будут ли производные антитела применены в терапии при определенных условиях и т. д.
В другом варианте реализации изобретения, предлагаются конъюгаты антитела и небелковая часть, что могут быть выборочно нагреты воздействием радиации. В одном варианте реализации изобретения, небелковая часть представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Излучение может иметь любую длину волны, и включает, но не ограничивается, длинами волн, которые не наносят вред обычным клеткам, но которые нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой клетки, проксимальные по отношению к небелковой части антитела, разрушаются.
В. Рекомбинантные способы и композиции Антитела могут быть получены с применением рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в патенте США № 4816567. В одном варианте реализации изобретения, предлагается изолированная нуклеиновая кислота, которая кодирует анти-гемагглютининовое антитело, которое описано в настоящем документе. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность,
которая содержит VL и/или аминокислотную последовательность, которая содержит VH антитела (например, легкая и/или тяжелая цепи антитела). В дополнительном варианте реализации изобретения, предлагается один или больше векторов (например, векторы экспрессии) которые содержат такую нуклеиновую кислоту. В дополнительном варианте реализации, предлагается клетка-хозяин, которая содержит такую нуклеиновую кислоту. В одном таком варианте реализации изобретения, клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована): 1) вектор, который содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, что содержит VL антитела, и аминокислотную последовательность, которая содержит VH антитела, или 2) первый вектор, который содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, которая содержит VL антитела, и второй вектор, который содержит нуклеиновую кислоту, что кодирует аминокислотную последовательность, которая содержит VH антитела. В одном варианте клеткой-хозяином является эукариотическая клетка, например линия клеток яичника китайского хомячка (СНО) или линия лимфоидных клеток (например, YO, NSO, Sp20 клеточные линии). В одном варианте реализации изобретения, предлагается способ приготовления анти-гемагглютининового антитела, причем способ содержит культивирование клеток-хозяев, которые содержат нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело, как предлагается выше, в условиях, подходящих для экспрессии антитела, и при необходимости способ восстановление антитела из клетки-хозяина (или питательной среды клетки-хозяина).
Для рекомбинантного производства анти-гемагглютининового антитела, нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело, например, как описано выше, изолируют и вставляют в один или более векторов для дополнительного клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такая нуклеиновая кислота может легко выделена и секвенирована с помощью обычных процедур (например, используя олигонуклеотидные пробы, что способны специфически связываться с генами, которые кодируют тяжелую и легкую цепь антитела).
Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии антитело-кодирующих векторов включает прокариотические или эукариотические клетки, которые описаны в настоящем документе. Например, антитела могут быть выработаны в бактерии, в частности, когда гликозилирование и Fc эффекторная функция не нужны. Для экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактерии, см., например, патенты
США № 5648237, 5789199, и 5840523 (см. также Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, описывающий экспрессию фрагментов антитела в Е. coli.) После экспрессии, антитело может быть изолировано из бактериальной клеточной пасты в растворимую фракцию, и может быть дополнительно очищено.
В дополнение к прокариотам, эукариотические микробы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, являются подходящими для клонирования или экспрессии антител-кодирующих векторов, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были "гуманизированы", результатом чего является производство антител с частично или полностью человеческим шаблоном гликозилирования. CM.Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), and Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела также полученные из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, который могут быть применены в связке с клетками насекомых, в частности для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
Культуры клеток растений также могут быть применены как клетки-хозяева. См., например, патенты США №. 5959177, 6040498, 6420548, 7125978, и 6417429 (описывающие PLANTIBODIES(tm) технологию для производства антител в трансгенных растениях).
Клетки позвоночных также могут быть применены как хозяева. Например, клеточные линии млекопитающих, которые приспособились расти в суспензии, могут быть полезны. Другие примеры полезных клеточных линий млекопитающих - это линия клеток почки обезьяны CV1, которая трансформирована SV40 (COS-7); линия эмбриональных клеток почки человека (клетки 293, или 293, как описано, например, в Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); линия почечных клеток детеныша хомяка (ВНК); линия мышиных клеток сертоли (ТМ4 клетки как описано, например, в Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки Африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); почечные клетки собаки (MDCK; печеночных клеток крысы буффало (BRL
ЗА); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); TRI клетки, как описано, например, в Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); MRC 5 клетки; и FS4 клетки. Другие полезные линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая DHFR" СНО клетки (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Для обзора некоторых линий клеток-хозяев млекопитающих, которые пригодны для выработки антител, см., например, Yazaki и Wu, Methods в Molecular Biology, Vo\. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). С. Анализы
Анти-гемагглютининовые антитела, которые предлагаются в настоящем документе, могут быть идентифицированы, проскринированы, или охарактеризованы по их физико-химическим свойствам и/или биологических активностям с помощью различных анализов, которые известные в данной области техники.
1. Анализы связывания и другие анализы В одном аспекте, антитело согласно данному изобретению проверяется на его антиген-связывающею активность, например, с помощью известных способов, таких как ИФА, вестерн-блоттинг, и т.д..
В еще одном аспекте, анализы конкурентности могут быть применены для идентификации антитела, которое конкурирует в связывании гемагглютинина с любым анти-гемагглютининовым антителом, которое описано в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения, такое конкурирующее антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), который связывается анти-гемагглютининовым антителом, что описано в данном
документе (например,
анти-гемагглютининовое антитело
содержит
последовательность
SEQ
N0:79
последовательность
SEQ
N0:78;
последовательность
SEQ
N0:83
последовательность
SEQ
N0:82;
последовательность
SEQ
N0:83
последовательность
SEQ
N0:86;
последовательность
SEQ
N0:89
последовательность
SEQ
N0:78;
последовательность
SEQ
N0:92
последовательность
SEQ
N0:91;
последовательность
SEQ
N0:95
последовательность
SEQ
N0:91;
последовательность
SEQ
N0:97
последовательность
SEQ
N0:91;
последовательность
SEQ
N0:99
последовательность
SEQ
N0:91;
последовательность
SEQ
N0:101
последовательность
SEQ Ш N0:91;
последовательность SEQ Ш N0:103 и VL последовательность SEQ Ш N0:91; VH последовательность SEQ Ш N0:105 и VL последовательность SEQ Ш N0:91; VH последовательность SEQ Ш N0:107 и VL последовательность SEQ Ш N0:91. Подробные типичные способы для картирования эпитопов, с которыми связываются антитела, содержатся в (1996) "Epitope Mapping Protocols," в Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
В типичном анализе конкурентности, иммобилизованный гемагглютинин инкубируется в растворе, который содержит первое меченое антитело, которое связывается с гемагглютинином, и второе немеченое антитело, которые проверяют на его способность конкурировать с первым антителом за связывание с гемагглютинином. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля, иммобилизованный гемагглютинин инкубируется в растворе, который содержит первое меченное антитело, но не второе немеченое антитело. После инкубации в условиях, которые рекомендуются для связывания первого антитела с гемагглютинином, избыток несвязанного антитела удаляется, и измеряется количество метки, которое связано с иммобилизованными гемагглютинином. Если количество меток, которые связанны с иммобилизованным гемагглютинином, значительно уменьшается в испытуемом образце относительно контрольного образца, тогда это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с гемагглютинином. См.Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. Анализы активности
В одном аспекте, предлагаются анализы для выявления анти-гемагглютининового антитела и его фрагментов, которые имеют биологическую активность. Биологическая активность может включать, например, специфическое связывания с гемагглютинином вируса гриппа типа В, нейтрализацию вируса гриппа типа В, и т.д. Также предлагаются антитела и композиции, которые содержат антитела или их фрагменты, имеющие такую биологическую активность in vivo и/или in vitro.
В некоторых вариантах реализации изобретения, антитело согласно данному изобретению, тестируют на наличие такой биологической активности. См. примеры 3-16 для типичных описаний таких анализов.
D. Иммуноконъюгаты Изобретения также предлагает иммуноконъюгаты, которые содержат анти
гемагглютининовое антитело, согласно настоящему документу, которое конъюгировано с один или более цитотоксическими средствами, таким как хемотерапевтические средства или лекарства, вещества инигбирующие рост, токсины (например, белковые токсины, ферментативно-активные токсины бактериального, грибкового, растительного, или животного происхождения, или их фрагменты), или радиоактивные изотопы.
В одном варианте реализации изобретения, иммуноконъюгат представляет собой антитело-лекарственный конъюгат (АЛК) в котором антитело конъюгировано с одним? или более лекарством, включая, но не ограничиваясь мейтанзаноидом (см. патенты США № 5208020, 5416064 и Europe Patent ЕР 0 425 235 В1); ауристатином, таким монометилауристатина DE и DF (ММАЕ и MMAF) (см. патенты США № 5635483 и 5780588, и 7498298); доластатином; калакьемисином или его производныыми (см. патенты США № 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, и 5877296; НшМ et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); и Lode et al., Cancer Res. 58:29252928 (1998)); антрациклином, таким как дауномицин, или доксорубицин (см. Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:15291532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); и атент США № 6630579); метотрексатом; виндезином; таксаном таким как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тисетаксел, и ортатаксел; трихотеценом; и СС1065.
В другом варианте реализации изобретения, иммуноконъюгат содержит антитело как описано в настоящем документе, которое конъюгировано с энзиматически активным токсином или его фрагментами, включая, но не ограничиваясь цепью А дифтерии, несвязывающимися активными фрагментами дифтерийного токсина, цепью А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепью А рицина, цепью А абрина, цепью А модексина, альфа-сарцином, белками Aleurites fordii, белками дианфина, белками Phytolaca americana (PAPI, PAPII, и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцином, кротином, ингибитором Sapaonaria officinalis, гелонином, митогеллином, рестриктицин, феномицином, эномицином, и трихофициом.
В другом варианте реализации изобретения, иммуноконъюгат содержит антитело как описано в настоящем документе, которое конъюгировано с радиоактивным атомом, чтобы сформировать радиоконъюгат. Различные радиоактивные изотопы доступны для
производства радиоконъюгатов. Примеры включают At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu. Когда радиоконъюгат используется для обнаружения, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например tc99m или 1123, или спиновую метку для ядерной магнитной резонансной (ЯМР) томографии (также известную как магнитно-резонансная томография, МРТ), такую как йод-123, йод-131, -111, фтод-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
Конъюгаты антитела и цитотоксического средства могут быть приготовлены используя
множество бифункциональных белковых соединительных средств, таких как N-
сукцинимидил-3-(2-иридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(гЧ-
малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоестеров (таких как димитил адипимидат НС1), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глютаральдегид), бис-азидо соединения (такие как бис (р-азидобензол) гександиамин), производные бис-дазонимума (такие как бис-(р-диазониумбензол)-етилендиамин), диизоцианат (такой как толуол 2,6-диизоцианат), и бис-соединения фтора (такие как 1,5-дифлюро-2,4-динитробензен). Например, иммунотоксин рицин можно приготовить, как описано в Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Углерод-14-меченая 1-изотиоцианатбензол-3-метилдиатилен триаминопентауксусная кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего средства для объединения радионуклида с антителом. См. WO94/11026. Линкер может быть "расщепляемым линкером", который облегчает освобождения цитотоксического лекарства в клетку. Например, может быть использован кислотно-неустойчивый линкер, пептидазо-чувствительный линкер, фотонеустойчивый линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); патент США № 5208020).
Иммуноконъюгаты или АЛК в настоящем документе, прямо предусмотрены, но не ограничены такими конъюгатами, которые приготовлены с кросс-линкерными-реагентами включая, но не ограничиваясь, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC, и сульфо-SMPB, и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, из Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, Иллинойс, США).
Е. Способы и композиции для диагностики и обнаружения
В некоторых вариантах реализации изобретения, любое из анти-гемагглютининовых антител, которые предлагаются в настоящем документе, являются полезными для обнаружения гемагглютинина, или вируса гриппа типа В в биологическом образце. Термин "обнаружение", как используется в настоящем документе, включает в себя количественное или качественное определение. В некоторых вариантах реализации изобретения, биологический образец содержит клетки или ткани, такие как, например, легкого, верхних дыхательных путей, носового канала, крови, мокроты, или содержит биологический образец, полученный с носового или горлового мазка.
В одном варианте реализации изобретения, предлагается анти-гемагглютининовое антитело для применения в способах диагностики или обнаружения. В дополнительно аспекте, предлагается способ обнаружения присутствия гемагглютинина, или вируса гриппа типа В в биологическом образце. В некоторых вариантах реализации изобретения, способ включает контакт биологического образца с анти-гемагглютининовым антителом, как описано в настоящем документе, при условиях, разрешающих связывания анти-гемагглютининового антитела с гемагглютинином, и обнаружение формирования комлекса между анти-гемагглютининовым антителом и гемагглютинином. Такой способ может быть in vitro или in vivo способом. В одном варианте реализации изобретения, анти-гемагглютининовое антитело применяется для отбора субъектов, которые подходят для терапии анти-гемагглютининовым антителом, например, где гемагглютинин представляет собой биомаркер для отбора пациентов.
Типичные расстройства, которые могут быть диагностированы используя антитело, согласно данному изобретению, включают инфекцию вирусом гриппа типа А, включая инфекцию вирусом гриппа типа В у детей, новорожденных, взрослых и пожилых людей.
В некоторых вариантах реализации изобретения, предлагается меченое анти-гемагглютининовое антитело. Метки включают, но не ограничиваются, метками или фрагментами, которые были обнаружены непосредственно (такие как флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также фрагментами молекул, таких как ферменты и лиганды, которые были обнаружены косвенно, например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Типичные метки включают, но не ограничиваются, радиоизотопами 32Р, 14С, 1251, 3Н, и 1311, редкоземельными хелатами или флуоресцеином и его производными, родамином и его производными, дансилем, умбеллифероном,
люцеферазой например, люциферазой светляка и бактериальной люциферазой (патент США № 4737456), люцефирином, 2,3-дигидрофталазиндионами, пероксидазой хрена (HRP), щелочной фосфатазой, Р-галактозидазой, глюкоамилазой, лизоцимом, оксидазой сахаридовов, например, оксидазой глюкозы, оксидазой галактозы, и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой, гетероциклическими оксидазами, такие как уриказа и ксантиноксидаза, в сочетании с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления предшественника красителя, таким как HPR, лактопероксидаза, или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы, и т.п..
F. Фармацевтические препараты Фармацевтические препараты анти-гемагглютининового антитела, как описано в настоящем документе, готовят путем смешивания такого антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с одним, или более необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Фармацевтически допустимые переносчики являются в целом, как правило нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях, и включают, но не ограничиваются: буферами, такими как фосфатные, цитратные и другие органические кислоты; антиоксидантами, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консервантами (такими как октадецилдиметилбензил хлорид аммония; хлорид гексаметоний; бензалкония хлорид; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкил парабенами, такими как метил-или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанола; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярными (менее чем примерно 10 остатков) полипептидами; белками, такими как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильными полимерами, такими как поливинилпирролидон; аминокислотами, такими как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин, или лизин; моносахаридами, дисахаридами и другими углеводородами, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующими агентами, такими как EDTA; сахарами, такими как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующими контр-ионами, такими как натрий; комплексами металлов (например Zn-белковые комплексы); и/или неионогенными поверхностно-активными вещества, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Типичные фармацевтически приемлемые носители в настоящем документе дополнительно включают внутритканевые лекарственные дисперсионые средства, такие как растворимые нейтрально-активные гиалуронидазные гликопротеины (sHASEGP), например, человеческие растворимые РН-20 гиалуронидазные гликопротеины, такие как
rHuPH20 (HYLENEX(r), Baxter International, Inc.). Определенные типичные sHASEGP и способы их применения, включая rHuPH20, описаны в опубликованных патентных заявках США №. 2005/0260186 и 2006/0104968. В одном аспекте, sHASEGP комбинирован с одной, или более дополнительными глюкозоамингликаназами, такими как хондроитиназы.
Типичные лиофилизированые препараты антитела описаны в патенте США № 6267958. Водные препараты антитела включают те, что описаны в патенте США № 6171586 и WO2006/044908, последние препараты включают гистидин-ацетатный буфер.
Препарат, в настоящем документе, может также содержать больше чем один активный ингредиент, как это необходимо для лечения конкретного симптома, желательно те ингредиенты с взаимодополняемыми активностями, которые не будут негативно влиять друг на друга. Например, это может быть желательно, чтобы дополнительно предоставить ингибитор нейраминидазы, анти-гемагглютининовое антитело, анти-М2 антитело, и т.д. Такие активные ингредиенты соответственно присутствуют в сочетании в количествах, которые являются эффективными для предназначенных целей.
Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, которые приготовлены, например, с помощью технологии коацервации, или с помощью межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцелюлозные, или желатиновые микрокапсулы, и поли-(метилметацилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственного средства (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы), или в макроемульсиях. Такие способы раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Могут быть приготовлены пролонгированные препараты. Подходящие примеры пролонгированных препаратов включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, которые содержат антитело, матрицы которых находятся в форме профилированных изделий, например пленок или микрокапсул.
Препараты могут быть применены для in vivo введения в целом, как правило стерильно. Стерильность может быть легко достигнута, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
G. Терапевтические способы и композиции
Любое анти-гемагглютининовое антитело, которое предлагается в настоящем документе может быть применено в терапевтических способах.
В одном аспекте, предлагается анти-гемагглютининовое антитело для применения как лекарственного средства. В дополнительном аспекте, предлагается анти-гемагглютининовое антитело для применения в лечении, профилактике, или ингибирование инфекции вирусом гриппа типа В. В некоторых вариантах реализации изобретения, предлагается анти-гемагглютининовое антитело для применения в способе лечения. В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело для использования в способе лечения индивидов, которые имеют инфекцию вирусом гриппа типа В, включающем введение индивиду эффективного количества анти-гемагглютининового антитела. В одном таком варианте реализации изобретения, способ дополнительно содержит введение индивиду эффективного количества по меньшей мере одного добавочного терапевтического средства, например, как описано ниже. В дополнительных вариантах реализации, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело для применение в профилактике, ингибировании, или снижении гемагглютинин-опосредованного слияния между вирусной мембраной вируса гриппа типа В и эндосомальной мембраной инфицированной клетки, тем самым препятствуя проникновению вирусной РНК в цитоплазму инфицированной клетки и предотвращая дополнительно распространении инфекции. В некоторых вариантах реализации, в изобретении предлагается анти-гемагглютининовое антитело для применения в способе профилактики, ингибировании, или лечении инфекции вирусом гриппа типа В у индивида, и способ включает введение индивиду эффективного количества анти-гемагглютининового антитела, чтобы предотвратить, ингибировать, или лечить инфекцию вирусом гриппа типа В. "Индивид" согласно любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения являет собой предпочтительно человека.
В дополнительном аспекте, в изобретении предлагается применение анти-гемагглютининового антитела в производстве или приготовлении лекарственного средства. В одном варианте реализации изобретения, лекарственное средство предназначается для лечение инфекции вирусом гриппа типа В. В дополнительном варианте реализации изобретения, лекарственное средство предлагается для применения в способе лечения инфекции вирусом гриппа типа В, и включает введение индивиду, который имеет инфекцию вирусом гриппа типа В, эффективного количества
лекарственного средства. В одном таком варианте реализации изобретения, способ дополнительно содержит введение индивиду эффективного количества по меньшей мере одного добавочного терапевтического средства, например, как описано ниже. В дополнительном варианте реализации изобретения, лекарственное средство предлагается для профилактики, ингибирования, или снижения гемагглютинин-опосредованного слияния между вирусной мембраной вируса гриппа типа В и эндосомальными мембранами инфицированной клетки, таким образом предотвращая проникновения вирусной РНК в цитоплазму инфицированной клетки, и тем самым предотвращая дополнительное распространение инфекции. В дополнительном варианте реализации изобретения, лекарственное средство предлагается для использования в способе профилактики, ингибирования, или лечения инфекции вирусом гриппа типа В у индивида, и способ включает введение индивиду эффективного количества лекарственного средство чтобы предотвратить, ингибировать, или уменьшить, инфекцию вирусом гриппа типа В. "Индивидом", согласно любому из вышеуказанных вариантов, может быть человеком.
В дополнительном аспекте, в изобретении предлагается способ лечения инфекции вирусом гриппа типа В. В одном варианте реализации изобретения, способ включает введение индивиду, который имеет такую инфекцию вирусом гриппа типа В, эффективного количества анти-гемагглютининового антитела. В одном таком вариант реализации изобретения, способ дополнительно включает введение индивиду эффективного количества по меньшей мере одного добавочного терапевтического средства, как описано в настоящем документе. "Индивид" согласному любому из вышеуказанных вариантов реализации изобретения может быть человеком.
В настоящем в изобретении предлагаются анти-гемагглютининовые антитела, эффективные в ингибировании, профилактике, или лечении инфекции вирусом гриппа типа В у индивида (например, субъекта или пациента). В некоторых аспектах изобретения, анти-гемагглютининовое антитело согласно настоящему изобретению эффективно при профилактическом лечении индивида в целях предотвращения инфекции вирусом гриппа типа В индивида.
В некоторых аспектах изобретения, индивид, подходящий для лечения анти-гемагглютининовым антителом, согласно настоящему изобретению, является индивидом, который имеет, или подозревается в инфекции вирусом гриппа типа В. В
некоторых вариантах изобретения, такие индивиды включают младенцев, детей, взрослых, и пожилых людей. В некоторых вариантах реализации изобретения, индивид госпитализирован с инфекцией вирусом гриппа типа В. В других вариантах реализации изобретения, индивид, который имеет инфекцию вирусом гриппа типа В имеет одно или более сопутствующих заболеваний, таких как, например, иммунодефицит, беременность, болезни легких, болезни сердца, болезни почек, или сопутствующие инфекции (например, бактериальная инфекция или вирусная инфекция, такие как бактериальная или вирусная пневмония).
В некоторых аспектах изобретения, лечение индивида анти-гемагглютининовим антителом, согласно настоящему изобретению, уменьшает тяжесть инфекции вирусом гриппа типа В, уменьшает продолжительность инфекции вирусом гриппа типа В , или уменьшает заразность вируса гриппа типа В. В других аспектах, лечение инфекции вирусом гриппа типа В с помощью анти-гемагглютининового антитела, согласно настоящему изобретению, предлагает дополнительную пользу, включая уменьшение длительности госпитализации, уменьшение или предотвращение необходимости применения подразделений скорой помощи (ПСП), уменьшение или предотвращение необходимости в вспомогательной или механической вентиляции, уменьшение или предотвращение необходимости в использовании дополнительного оксигена, и снижение смертности. В некоторых аспектах изобретения, уменьшение длительности госпитализации составляет 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, или дольше чем 5 суток. В некоторых аспектах изобретения, уменьшение необходимости применять подразделения скорой помощи составляет 1 суток, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, или дольше чем 5 суток. В некоторых аспектах, сокращения в необходимости вспомогательной, или искусственной вентиляции легких составляет 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, или дольше, чем 5 суток. В некоторых аспектах, снижение потребности в дополнительном кислороде составляет 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, или дольше, чем 5 суток. В некоторых аспектах изобретения, лечение индивида с помощью анти-гемагглютининового антитела, согласно настоящему изобретению, уменьшает симптомы болезни инфекции вирусом гриппа типа В , такие как, например, жар, острый насморк, озноб, боль в горле, боли в мышцах, ломота в теле, головная боль, кашель, заложенность носа, слабость или усталость, раздражение или слезоточивость глаз, и общий дискомфорт.
В некоторых аспектах изобретения, лечение индивидов анти-гемагглютининовым
антителом, согласно настоящему изобретению, уменьшает время нормализации функции дыхания, такой как уменьшение времени для нормализации частоты дыхания, или уменьшение времени нормализации насыщения кислородом. В некоторых аспектах изобретения, лечение индивидов анти-гемагглютининовым антителом, согласно настоящему изобретению, уменьшает время возвращения к нормальному насыщению кислородом, например, к кислородному насыщению около 92 %, или больше, как измерено в течение 24-часового периода без дополнительного применения кислорода. В других аспектах, лечение индивида анти-гемагглютининовым антителом согласно настоящему изобретению сокращает время для нормализации жизненно важных показателей, таких как частота сердечных сокращений, артериальное давление, частота дыхания и температура.
В некоторых аспектах, лечение физического лица с помощью анти-гемагглютининового антитела, согласно настоящему изобретению, улучшает вирусологические конечные точки, такие как, например, титр вируса гриппа. Титр вируса может быть измерен различными способами, которые известны специалистам в данной области техники, такими как, например, вирусная площадь под кривой (AUC), как измерено, например, количественной ПЦР, или инфекционная доза тканевой культуры (ИДТК50). В некоторых аспектах, результаты лечения больше чем, или равны 50 % уменьшению вирусной AUC, как измерено количественной ПЦР, или ИТДК50.
В различных аспектах настоящего изобретения, анти-гемагглютининовое антитело, которое предлагается в настоящем документе, является эффективным при лечении инфекции вирусом гриппа типа В когда вводилось около12 часов, около 24 часов, около 36 часов, около 48 часов, около 60 часов, около 72 часов, около 84 часов, и около 96 часов спустя проявления симптомов (например, начало заболевания). В других аспектах, анти-гемагглютининовое антитело, которое предлагается в настоящем документе, является эффективным при лечении инфекции вирусом гриппа типа В, при введении между около 24 часами и 48 часами после начала симптомов (например, человек был симптоматическим между 24 и 48 часами), когда было введено между около 48 часами и 72 часами после начала симптомов, или, когда было введены между около 72 часами и 96 часами после появления симптомов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, анти-гемагглютининовое антитело, согласно настоящему изобретению, является эффективным при лечении, или уменьшении инфекции вирусом гриппа типа В, и продлевает окно лечение текущего стандарта ухода
(например, осельтамиви) свыше 48 часов после появления симптомов.
В дополнительном аспекте, в изобретении предлагается фармацевтические препараты, которые содержат любое анти-гемагглютининовое антитело, которое предлагается в настоящем документе, например, для применения в любом из вышеперечисленных терапевтических способов. В одном варианте реализации изобретения, фармацевтический препарат содержит любое анти-гемагглютининовое антитело, которое предлагается в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте реализации изобретения, фармацевитческий препарат содержит любое анти-гемагглютининовое антитело, которое предлагается в настоящем документе, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, как описано ниже.
Антитела согласно настоящему изобретению могут быть применены отдельно или в сочетании с другими средствами в терапии. Например, антитело согласно настоящему изобретению, может быть введено совместно с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим средством. В некоторых вариантах реализации изобретения, дополнительное терапевтическое средство является ингибитором нейраминидазы (например, занамивиром, осельтамивир фосфатом, амантадином, римантадином), анти-М2 антителом, анти-гемагглютининовым антителом, и т.д. В некоторых аспектах изобретения, лечение индивида, который имеет инфекцию вирусом гриппа типа В с помощью анти-гемагглютининового антитела, согласно настоящему изобретению, которое было введено вместе с ингибитором нейраминидазы, обеспечивает синергетический терапевтический эффект по сравнению с лечением с помощью каждого средства в одиночку.
Такие комбинированные терапии, как отмечалось выше, охватывают комбинированное введение (где два или более терапевтических средства включены в одинаковые или разные препараты), и раздельное введение, в случае которого, введение антитела согласно данному изобретению может случится до, одновременно, и/или после, введения добавочного терапевтического средства, или средств. В одном варианте реализации изобретения, введение анти-гемагглютининового антитела, и введение добавочного терапевтического средства происходит в течение около одного месяца, или в течение около одной, двух, или трех недель, в течение около одних, двух, трех, четырех, пяти, или шести суток, или в течение около одного, двух, трех, четырех, пяти,
шести, восьми, десяти, двенадцати, шестнадцати, двадцати, или двадцати-четырех часов друг от друга.
Антитело согласно настоящему изобретению (и любое дополнительное терапевтическое средство) можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное, и интраназальное, и, если это необходимо для местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные введения включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, или подкожное введение. Дозирование может проходить любым подходящим путем, например путем инъекций, таких как внутривенные, или подкожные инъекции, в зависимости от того, является ли введение кратким, или постоянным. В настоящем документе рассматриваются различные графики дозирования, включая, но не ограничиваясь одним или несколькими введениями через различные моменты времени, болюсным введением, и ритмичным введением.
Антитела согласно данному изобретению могут быть сформулированы, дозированы, и введены в стиле, соответствующим хорошей медицинской практике. Факторы, подлежащие рассмотрению в этом контексте, включают конкретное расстройство, которое лечат, конкретное млекопитающее, которое подвергается лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место доставки средства, способ введения, график введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Антитело может не быть, но необязательно формулируют с одним или несколькими средствами, которые используются в настоящее время для предотвращения, или лечения рассматриваемого расстройства. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела, которое присутствует в композиции, типа нарушения или лечения и других факторов, рассмотренных выше. Они в целом, как правило используются в тех же дозах и с курсами введения, как описано в настоящем документе, или от около 1 до 99 % дозы, как описано в настоящем документе, или в любой дозе и любым курсом, который определяется эмпирически/клинически, чтобы быть подходящими.
Для профилактики или лечения заболевания, соответствующая дозировка антитела согласно данному изобретению (при использовании отдельно, или в сочетании с одним или более другими дополнительными терапевтическими средствами) будет зависеть от типа заболевания, которое подлежит лечению, типа антитела, тяжести и течения
заболевания, вводят ли антитело для профилактических или лечебных целей, предыдущей терапии, клинической истории пациента и его реакции на антитела, и усмотрения лечащего врача. Антитело соответствующим образом вводят пациенту за один раз, или в течение ряда процедур. В зависимости от типа и серьезности заболевания, от около 1 мкг/кг до около 45 мг/кг (например, от около 1,0 мг/кг до около 15 мг/кг) антитела может составлять первоначальная кандидатная дозировка для введения пациенту, будь то, например, одно или более отдельных введения, или непрерывное вливание. Одна типичная суточная доза может варьироваться от около 1 мкг/кг до 100 мг/кг, или более, в зависимости от перечисленных выше факторов. Для повторных введений в течение нескольких суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение, как правило, будет продолжаться вплоть до возникновения желаемого подавления симптомов болезни. Типичные дозировки антитела будут находится в диапазоне от около 1.0 мг/кг до около 45 мг/кг, од около 1.0 мг/кг до около 30 мг/кг, до около 1.0 мг/кг до около 15 мг/кг, от около 1.0 мг/кг до около 10 мг/кг, или от около 1.0 мг/кг до около 5 мг/кг. Таким образом, одна, или больше доз около 1.0 мг/кг, 2.5 мг/кг, 5.0 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 30 мг/кг, или 45 мг/кг (или любая их комбинация) могут быть введены пациенту. Такие дозы можно вводить периодически, например, каждые сутки, каждых двое суток, кажды трое суток, и т.д. Может быть введена начальная верхняя нагрузочная доза, и следующие за ней одна, или более пониженных доз. Дозирование также может быть в форме зафиксированой дозы, такой как, например, 200 мг, 400 мг, 600 мг, 800 мг, 1000 мг, 1200 мг, 1400 мг, 1500 мг, 1600 мг, 1800 мг, 2000 мг, 2200 мг, 2400 мг, 2500 мг, 2600 мг, 2800 мг, 3000 мг, 3200 мг, 3400 мг, 3600 мг, и т.д. Ход этой терапии можно легко контролировать с помощью обычных способов и анализов.
Понятно, что любой из вышеперечисленных препаратов, или терапевтических способов может быть осуществлен с применением иммуноконъюгатов, согласно настоящему изобретению, вместо, или в дополнение к анти-гемагглютининовому антителу.
Н. Производственные изделия В еще одном аспекте, согласно данному изобретению, предлагается производственное изделие, которое содержит материалы, полезные в лечении, профилактике и/или диагностике расстройств, как описано выше. Производственное изделие включает контейнер и этикетку, или вкладыш, который вложен в, или связан с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы, IV растворные мешки, и т.д. Контейнеры могут быть выполнены из различных материалов,
таких как стекло, или пластик. Контейнер содержит композицию, которая является сама по себе, или в сочетании с другой композицией, эффективной для лечения, предотвращения и/или диагностики состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может быть мешком для внутривенного раствора, или флаконом, который имеет пробку, что прокалывается подкожной инъекционной иглой). По крайней мере, одно активное средство в композиции представляет собой антитело изобретения. Этикетка, или листок-вкладыш указывает, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Кроме того, производственное изделие может содержать а) первый контейнер, с содержащейся в нем композицией, причем композиция содержит антитело, согласно настоящему изобретению; и б) второй контейнер, с содержащейся в нем композицией, причем композиция содержит дополнительное цитотоксическое, или иное лечебное средство. Производственное изделие, в этом варианте реализации изобретения, может дополнительно содержать листок-вкладыш, указывая на то, что композиции могут быть применены для лечения конкретного состояния. Альтернативно, или дополнительно, производственное изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, который содержит фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие материалы, которые желательны с коммерческой точки зрения и точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Понятно, что любое из вышеуказанных изделий может включать в себя иммуноконъюгат, согласно настоящему изобретению, вместо, или в дополнение к анти-гемагглютининовому антителу.
III. ПРИМЕРЫ
Ниже приведены примеры способов и композиций, согласно настоящему изобретению. Понятно, что могут практиковаться разные другие варианты реализации изобретения, учитывая общее описания, которое приведено выше.
Пример 1. Обогащения и рост плазмобластов
Чтобы обнаружить и идентифицировать редкие антитела против гемаглютинина вируса гриппа типа В, были разработаны следующие технологии обогащения и роста плазмобластов (см. одновременно находящеюся в подаче заявку на патент, причем серийный номер заявки на патент США 14/077414 и международный номер заявки на
патент PCT/US2013/69567, обе заполнены 12 ноября 2013, и Nakamura et al. (2013) Cell Host & Microbe, 14:93-103, каждая из которых включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки).
Продукты лейкофореза из нормального человеческого донора, который получал сезонную грипповую вакцину Fluvirin(r) (Novartis Lot №111796Р1) 7 суток до сдачи крови, были получены из Blood Centers of the Pacific (S Francisco, CA). Одноядерные клетки периферической крови (ОКПК) были изолированы из продуктов лейкофореза используя стандартные способы. Старые особи женского пола мышей SCID/beige возрастом от шести до восьми-недель были приобретены в Charles River Laboratories (Холлистер, Калифорния) и обеспечены жильем, и содержались в Genentech в соответствии с рекомендациями Американской ассоциации лабораторных животных. Все экспериментальные исследования проводились при одобрении Istitutional Animal Care and Use Committees Genentech Lab Animal Research в AAALACi-аккредитованном объекте в соответствии с руководством по уходу и использованию лабораторных животных, и действующими законам и правилами. Продукты лейкофореза, или крови от здоровых человеческих доноров, были получены после предоставления письменного информированного согласия и этическое одобрение от Western Institutional Review Board.
Были выполнены in vivo антиген-управляемые обогащение и рост плазмобластов, используя внутриселезеночные трансплантационные ОКПК следующим образом. Изолированые ОКПК были ресуспендированы с гемагглютининовыми антигенами (см. ниже) (0.1-2 мкг антигена на каждый один миллион В клеток) и инкубировали 30 минут при 37 °С (ОКПК/антигенный премикс). После этой инкубации ОКПК промывали для удаления несвязавшихся антигенов. Чтобы обогатить плазмобласты, которые производят гемагглютинин перекрестно-реагирующие антитела, специфические к вирусу гриппа типа В, были специфически выбраны варианты гемагглютининового антигена, которые используют для ОКПК/антигенного премикса и сортирование одиночных клеток, чтобы отличатся от вариантов гемагглютининового антигена, который содержатся в грипповой вакцине Fluvirin(r). Антигены гемагглютинина, которые применены в этом исследовании, следовательно, включают гемагглютинин из изолятов вируса гриппа типа В: B/HongKong/1973 (применен в антигенном премиксе и FACS); B/Maryland/1/1959 и B/Wisconsin/2010 (применены в скрининге ИФА); и B/Brisbane/2008 (in vaccine и применены в скрининге ИФА). Гемагглютининовые
антигены были произведены в Genentech с использованием стандартных технологий молекулярной биологии.
Старые SCID/beige мыши женского пола возрастом 6-8 недель (Charles River Laboratories, Холлистер, Калифорния) были сублетально облучены дозой 350 рад, используя как источник цезий-137. Полимиксин В (110 мг/Л) и неомицин (1,.1 г/Л) добавляли к питьевой воде в течение 7 суток после облучения. Четыре часа после облучения, левый бок у каждой мыши побрили и подготовили с помощью Betadine(r) (Purdue Pharma, Stamford, CT) и 70 % спирта. Хирургические процедуры были проведены под наркозом с применением асептических хирургических процедур. Был сделан 1-см кожный разрез чуть ниже реберной границы каждой мыши, затем следовал разрез брюшной стенки и брюшины. Селезенка каждой мыши была аккуратно обнажена и были введены 50х 106 человеческих ОКПК, которые были ресуспендированы в 30 мкл PBS. Разрезы были закрыты в мышечном слое и в коже используя 5-0 Vicryl(r) швы (Ethicon, Сомервиль, Нью-Джерси) и хирургические скрепки, соответственно. Для экспериментов с антиген-специфической клеточной сортировкой, мыши были принесены в жертву на 8 суток после трансплантации, и были собраны их селезенки.
Суспензии единичных клеток селезенки, которые получены из мышей, были окрашены смесью из античеловеческих моноклональних антител CD38 РЕСу7 (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) и IgG Dylight (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Вест Гроув, Пенсильвания), который определяет человеческие IgG+ плазмобласты как CD38BbICOKyK7IgG+ экспрессию. Чтобы идентифицировать перекрестно-реагирующие с гемагглютинином вируса гриппа типа В плазмобласты в суспензии изолированных клеток селезенки, клетки были окрашены гемагглютинином из штамма B/HongKong/1973 вируса гриппа типа В, который был предварительно конъюгирован с FITC или РЕ, соответственно, используя Lightning-Link(r) наборы маркировки (Innova Biosciences, Кембридж, Великобретания).
Из около 2,018 идентифицированных антиген-специфических плазмобластов, с применением способов, которые описаны выше, семь моноклональных антитела показали вирусную нейтрализацию против по меньшей мере одного штамма вируса гриппа типа В, и три моноклональных антитела показали вирусную нейтрализацию против всех протестированных штаммов вируса гриппа типа В, в том числе штаммов вируса гриппа В от предковых линий, линии Yamagata и линии Victoria.
Пример 2. Клонирование IgG из одиночных плазмобластов
Человеческие плазмобласты, перекрестно-реагирующие с гемагглютинином вируса гриппа типа В (описанные выше), были отсортированы поклеточно, в результате чело было получено около 2,018 антиген-специфических плазмобластов. Одиночные плазмобласты были отсортированы прямо в 96-луночных микролуночных планшетах с U-дном, которые содержали 50 мкл RPMI, содержащие 5 % эмбриональную сыворотку с низким содержанием IgG. Плашки центрифугировали 5 минут при 600 х g (Beckm Coulter, Бри, Калифорния), и среда была удалена с помощью аспирации. Клетки были ресуспиндированы и промыты дважды в 90 мкл PBS следуя той же процедуре.
Чтобы создать кДНК кодирующие вариабельные тяжелые цепи и легкие цепи, каждая клетка была ресуспендирована в 6 мкл реакционной смеси Reverse Transcriptase (RT), которая содержала 2 единицы RNaseout (Invitrogen, Гранд Айленд, Нью-Йорк), 0,5 мМ 4дНТФ (Perkin Elmer, Уолтем, Массачусетс), 1,5 мМ MgCh, 37,5 мМ КС1, 10 мМ DTT (дитиотреитол), 0,25 % Nonidet Р40 (US Biological, Марблхед, Массачусетс), 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich), 25 мМ Tris рН 8,3, 0,25 пмол IgGi-4 константных, каппа цепь константных, и альфа цепь константных область-специфических олигонуклеотидов (показаны ниже) и 40 U Superscript III (Invitrogen, Гранд Айленд, Нью-Йорк).
IgGi-4 константный: GAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG (SEQ ID N0:1) Каппа константный: CTCAGCGTCAGGGTGYTGCTGAG (SEQ ID N0:2) Лямбда константный: GGGTKTGGTSGTCTCCAC (SEQ Ш N0:3)
Реакцию инкубировали 3 раза в течение 30-минутных интервалов при 45 °С, 50 °С, и 55° С каждый. После инкубации, реакционная смесь была разбавлена до 15 мкл буфером ТЕ (10 мМ Tris НС1, 1 мМЕДТА). Начальная полимеразная цепная реакция (ПЦР) была проведена чтобы амплифицировать IgG тяжелые цепи, каппа цепи, и лямбда цепи используя 2 мкл разведенной RT смеси, описанной выше, и Advantage-GC 2 Polymerase Mix (Clontech, Маунтен Вью, Калифорния), следуя протоколам производителя. ПЦР амплификация была проведена используя вырожденные нуклеотиды, на основе последовательностей вариабельной тяжелой цепи, зародышевой легкой цепи и константной области, которые указаны ниже.
IGVHla CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGC (SEQ ID N0:4)
IGVHlb
CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGC
(SEQ ID N0:5)
IGVH2
CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCC
(SEQ ID N0:6)
IGVH3
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGG
(SEQ ID N0:7)
IGVH4
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCC
(SEQ ID N0:8)
IGVH5
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG
(SEQ ID N0:9)
IGVH6
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCC
(SEQ ID N0:10)
IGVH7
CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGG
(SEQ ID N0:11)
IGKV1
GHCATCCRGWTGACCCAGTCTC
(SEQ ID N0:12)
IGKV2
GATRTTGTGATGACYCAGWCTC
(SEQ ID N0:13)
IGKV3
GAAATWGTRWTGACRCAGTCTC
(SEQ ID N0:14)
IGKV4
GACATCGTGATGACCCAGTCTCC
(SEQ ID N0:15)
IGKV5
GAAACGACACTCACGCAGTCTC
(SEQ ID N0:16)
IGKV6
GAWRTTGTGMTGACWCAGTCTC
(SEQ ID N0:17)
IGLV1
CAGTCTGTGYTGACKCAGCCRCCCTC
(SEQ ID N0:18)
IGLV2
CAGTCTGCCCTGACTCAGCCT
(SEQ ID N0:19)
IGLV3
TCCTATGAGCTGACWCAGSHVCCCKC
(SEQ ID N0:20)
IGLV4
CAGCCTGTGCTGACTCARTCVCCCTC
(SEQ ID N0:21)
IGLV5
CAGCCTGTGCTGACTCAGCCAACTTC
(SEQ ID N0:22)
IGLV6
AATTTTATGCTGACTCAGCCCCAC
(SEQ ID N0:23)
IGLV7
CAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCC
(SEQ ID N0:24)
IGLV8
CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCC
(SEQ ID N0:25)
IGLV9
CAGCCTGTGCTGACTCAGCCACC
(SEQ ID N0:26)
НС301.5константный GCAGCCCAGGGCSGCTGTGC (SEQ ID N0:27) Каппа102константный GCACACAACAGAGGCAGTTCCAG (SEQ ID N0:28) Лябда202константный CTTGRAGCTCCTCAGAGGAG (SEQ ID N0:29)
Каждая реакции П1 IP амплификации тяжелой цепи и легкой цепи были разделены на две реакции следующим образом: семейства тяжелых цепей VH. 1,2,3 (праймеры IGVHla, IGVHlb, IGVH2, IGVH3) и VH.4,5,6,7 (праймеры IGVH4, IGVH5, IGVH6, и IGVH7); семейтва каппа цепей VK. 1,2,3 (праймеры IGKV1, IGKV2, и IGKV3) и VK.4,5,6 (праймеры IGVK4, IGVK5, и IGVK6); и семейства лямбда цепей VL. 1,2,3,4,5 (IGLV1, IGLV2, IGLV3, IGLV4, и IGLV5) и VL.6,7,8,9 (праймеры IGLV6, IGLV7, IGLV8, и IGLV9). Был использован протокол амплификации тачдаун ПЦР для температурного циклирования.
После реакции, продукты ПЦР амплификации были обработаны Екзонуклеазой 1 (Ехо) и креветочной алкалиновой фосфатазой (SAP) чтобы удалить избыток нуклеотидов и праймеров из каждой реакции ПЦР амплификации (U.S. Biologicals, Марблхед, Массачусетс). Первичные продукты ПЦР амплификации были непосредственно секвенированы, чтобы определить вариабельные последовательности тяжелых цепей и легких цепей, используя секвенирование по Сангеру. Вторые вложенные ПЦР амплификации были выполнены используя вариабельные олигонуклеотиды, которые совпадали с эмбриональными последовательностями тяжелой цепи и легкой цепи, для того, чтобы вставить клонированные последовательности сигнальных и константных областей млекопитающего, применяя следующие нуклеотидные праймеры.
sVHla :
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAG (SEQ Ш N0:30)
sVH2:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCACAGATCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTACGCTGGTG (SEQ ID N0:31)
sVH3vv:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCACAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTC (SEQ ID N0:32)
sVH3gl:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTG (SEQ ID N0:33)
sVH4:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCACAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGG (SEQ ID N0:34)
sVH5:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCAGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAG (SEQ ID N0:35)
sVH6:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCACAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACT (SEQ ID N0:36)
sVH7:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCACAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTG (SEQ ID N0:37)
sVKl:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTG (SEQ Ш N0:38)
sVK2:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCAGATATTGTGATGACTCAGTCTCACTCTCCCTGC (SEQ ID N0:39)
sVK3:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTG (SEQ ID N0:40)
sVK4:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCAGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTG (SEQ ID N0:41)
sVK5:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCAGAAACGACACTCACGCAGTCTCCAGC (SEQ ID N0:42)
sVK6:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCAGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCG (SEQ ID N0:43)
sVLl:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA
CATTCACAGTCTGTGYTGACKCAGCCRCCCTC (SEQ ID N0:44) sVL2:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCACAGTCTGCCCTGACTCAGCCT (SEQ ID N0:45)
sVL3:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCATCCTATGAGCTGACWCAGSHVCCCKC (SEQ ID N0:46)
sVL4:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCACAGCCTGTGCTGACTCARTCVCCCTC (SEQ ID N0:47)
sVL5:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCACAGCCTGTGCTGACTCAGCCAACTTC (SEQ ID N0:48)
sVL6:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCAAATTTTATGCTGACTCAGCCCCAC (SEQ ID N0:49)
sVL7:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCACAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCC (SEQ Ш N0:50)
sVL8:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCACAGACTGTGGTGACCCAGGAGCC (SEQ ID N0:51)
wVL9:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTA CATTCACAGCCTGTGCTGACTCAGCCACC (SEQ ID N0:52)
Тяжелая константная: GCCAGGGGGAAGACCGATG (SEQ ID N0:53
Каппа константная:
CTGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACACAACAGAAGCAGTTCCAGATTTCAACT GCTC (SEQ Ш N0:54)
Лямбда константная: CTTGRAGCTCCTCAGAGGAG (SEQ ID N0:29)
Реакции ПЦР амплификации настроены используя PrimeStar HS DNA Polymerase с GC (Takara Bio, Шига, Япония), в соответствии с рекомендацией производителя. После реакций ПЦР амплификации, продукты были обработаны Exo/SAP, как описано выше. Продукты ПЦР амплификации, кодирующие тяжелую вариабельную цепь и легкую вариабельную цепь, были вставлены в экспрессирующий вектор млекопитающих, применяя рестрикционные продукты, которые свободны от эндонуклеаз. 20 мклпродуктов ПЦР амплификации отжигали на человеческих одноцепочечных ДНК матрицах для IgGi, каппа, и лямбда цепи, применяя протокол мутагенеза согласно Kunkel (см. Kunkel (1985) PNAS 82:488-492). Правильно вставленные продукты были подтверждены ДНК секвенированию. Плазмиды, которые содержали нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелые цепи и легкие цепи, были совместно трансфицированы в 293Т человеческие эмбриональные почечные клетки, применяя трансфекционное средство Fugene (Roche Diagnostic, Индианаполис, Индиана) для временной экспрессии, и были проанализированы их экспрессия и связывания, как описано ниже.
Пример 3. ИФА скрининговый гемагглютининовый анализ
Следующим образом, с помощью иммуноферментного анализа, была исследована способность каждого моноклонального анти-гемагглютининового антитела (например, антитела к вирусу гриппа типа В), которое получено как описано выше, связывать различные гемагглютининовые подтипы из разных вирусных изолятов гриппа типа В. Различные гемагглютинин-экспресирующие плазмиды трансфицировали в 293Т клетки; эти включали гемагглютинин из штаммов вируса гриппа типа В B/Maryland/1/1959, B/Victoria/2000, и B/Brisbane/2008. Спустя двое суток, клетки были лизированы в 50 мМ Tris, рН 8,5 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 1 % Triton Х-100 плюс протеазная ингибиторная смесь (Roche). Ядра были очищены центрифугированием, и результирующие лизаты хранили при -80°С.
Для скрининга ИФА, 384-луночные планшеты (Nunc MaxiSorp) были покрыты 5 мкг/мл лектина Galanthus nivalis (Sigma) в PBS. Плашки были промыты, и затем покрыты разведениями клеточных лизатов, которые содержать различные экспрессируемые гемаглютинины. Плашки промыли и инкубировали с различными разведениями анти-гемагглютининовое антитело, и в дальнейшем с козьим-анти-человеческим-HRP вторичным антитело (Jackson). Плашки были промыты и обработаны для ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) субстрантного обнаружения.
Было получено около 2,018 плазмобластов после поклеточной сортировки, которая описана выше в примере 2. Из этих, 98 моноклональных антител временно экспресировались в 293Т клетках, и затем были отскринированы с помощью ИФА экспонирующего связывания с гемагглютинином из штаммов вируса гриппа типа В B/Maryland/1/1959, B/Victoria/2000, и B/Brisbane/2008.
Пример 4. In vitro нейтрализация вируса В гриппа
Была исследована следующим образом in vitro способность антитела к гемагглютинину вируса гриппа типа В, согласно настоящему изобретению, вызывать широкое гемагглютининововое подтипное связывание и нейтрализацию перечня изолятов вируса гриппа типа В. MDCK клетки выращивали в DMEM среде с добавлением 10 % ФБС как 25 % конфлюэнтного монослоя в 96-луночных черностенных с прозрачным дном плашках для визуализации (Costar 3904). Каждий подтип вируса гриппа типа В был разведен в грипповой среде (DMEM, 0.2 % БСА от Gibco Cat№ 15260, 10 мМ HEPES, пенициллин/стрептомицин/глутамин от Gibco Cat№ 10378, 2 мкг/мл ТРСК обработаного трипсина, от Sigma Cat№ Т1426) до MOI 1, и инкубировали 1 час при 37°С с варьирующими концентрациями моноклонального антитела 34В5А и моноклонального антитела 33F8, в диапазоне от 0,02 до 1,600 нМ. Каждой антитело/вирус-грипповой смеси давали возможность заразить MDCK клетки на протяжении 16 часов при 37 °С, в 5 % СО2 инкубаторе до фиксации клеток холодным 100 % этанолом. Фиксированные клетки затем были покрашены с помощью Hoechst 33342 (Invitrogen Cat№ Н3570), чтобы визуализировать ядра клеток и определить общее число клеток. Клетки были также покрашены последовательно с помощью широко-реагирующих моноклональных антител (Millipore Cat№ моноклональное антитело8258), которые специфичны к нуклеиновыми белкам (НБ) вируса гриппа типа В, и Alexa Fluor 488-конъюгированых козьих анти-мышиных вторичных антител (Invitrogen Cat№ А11029), чтобы определить
число инфицированных клетки. Клетки были запечатлены используя Image Express Micro instrument (Molecular Devices), и снимки данных были проанализированы используя программное обеспечение MetaXpress 3.1.
Процент инфицированных клеток был определен и нанесен на Y-оси против концентрации антитела (Logio) на Х-оси. Все анализы по нейтрализации были совершены трижды, и данные предоставлены как ИК50 значения в нМ с 95 % доверительными интервалами (95 % CI). Данные были подогнаны к кривой нелинейной регрессии ответа на дозу, чтобы создать ИК50 и 95 % CI.
In vitro кривые нейтрализации ответа на дозу созданы, используя различные концентрации моноклональных антител, которые описаны в настоящем документе, против широкого перечня штаммов вируса гриппа типа В. Фигуры 1А и 1Б иллюстрируют кривые нейтрализации моноклонального антитела 34В5А и моноклонального антитела 33F8 против перечня штаммов вируса гриппа типа В, соответственно. Как проиллюстрировано на Фигурах 1А и 1Б, моноклональное антитело 34В5А и моноклональное антитело 33F8 было эффективно при in vitro нейтрализации широкого перечня штаммов вируса гриппа типа В, включая in vitro активность нейтрализации против предковых линий вируса гриппа типа В, так само, как и против вирусов гриппа типа В из линий Yamagata и Victoria.
B/Maryland/1/1959
Предковый
0,038
0,029 - 0,050
B/Lee/10/1940
Предковый
0,14
0,13-0,15
Фигура 2 иллюстрирует кривые in vitro нейтрализации моноклонального антитело 46В 8 А против перечня штаммов вируса гриппа типа В. Кроме того, как проиллюстрировано на Фигуре 2, моноклональное антитело 46В8А было эффективно при in vitro нейтрализации широкого перечня штаммов вируса гриппа типа В, включая in vitro активность нейтрализации против предковых линий вируса гриппа типа В, так же как и против линий вируса гриппа типа В, что происходят от Yamagata и Victoria.
Эти результаты показывают, что моноклональные антитела согласно настоящему изобретению были способны нейтрализовать дозозависимым образом различные изоляты/штаммы вируса гриппа типа В in vitro. Кроме того, эти результаты показывают, что моноклональные антитела согласно настоящему изобретению были способны нейтрализовать предковые изоляты вируса гриппа типа В, так же как и изоляты вируса гриппа типа В, что образовались поле расхождения линий Yamagata и Victoria, включая нейтрализацию штаммов вируса гриппа типа В Wisconsin/2010, Brisbane/2008, Bangladesh/2007, Malaysia/2004, Victoria/2000, Russia/1969, Massachusettes/1966, Maryland/1959, и Lee/1940.
Эти результаты указывают, что моноклональные антитела согласно настоящему изобретению являются эффективными в лечение и профилактике инфекции вирусом гриппа типа В, и штаммов вируса гриппа типа В из предковых линий, линия Yamagata и линии Victoria.
Пример 5. Анализ ингибирования гемагглютининации вируса гриппа типа В
Чтобы изучить механизм нейтрализации моноклонального антитела 46В 8С и моноклонального антитело 34В5С, анализы ингибирования гемагглютинина (ИГ) были выполнены используя два вируса гриппа типа В: B/Victoria/504/2000 и B/Wisconsin/1/2010. Для каждого вируса гриппа типа В, было сделано восемь последовательных разведений с 5-кратными шагами в фосфатном солевом буфере, начиная с 1:5. Было перенесено пятьдесят мкл каждого разведения в 96-луночную плашку с V-дном (Costar 3894). Эритроциты индейки (TRBC, из Lampire Biological Laboratories Cat№ 7249408) были разведены до 0,5 % в PBS, и было добавлено 50 мкл к
каждой ячейке, содержащей вирус. Плашки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Последнее разбавление вируса (отвечает наименьшей концентрации вируса), которое предотвращало TRBC агрегацию, определяли путем прямой визуализации, и использовали для анализа ингибирование гемагглютинации (ИГ).
ИГ анализ был выполнен с помощью моноклонального антитела 46В 8С и моноклонального антитела 34В5С, двух человеческих моноклональных антител (huMab) с широким грипповым В вирусным гемагглютининовым подтипным связыванием, и контрольного huMab gD5237, которое специфично к гликопротеину D вируса простого герпеса (ВПГ). Восемь серийных разведений каждого антитела с 5-кратным шагом, в диапазоне от 0,0032 - 250 мкг/мл (трижды), смешивали с предопределенным количеством вируса B/Victoria/504/2000, или вируса B/Wisconsin/1/2010 в PBS, и инкубировали при 37 °С в течение 1 часа, как описано выше. Пятьдесят мкл смеси вирус-антитело переносили в 96-луночную плашку с V-дном. TRBC были разведены до 0,5 % в PBS, и 50 мкл было добавлено к каждой ячейке, содержащей 50 мкл смеси вирус-антитело. Каждую плашку инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, и было определено ИГ титры (например, наименьшая концентрация антитела, которая эффективна при ингибирование гемагглютинации) для каждого антитела путем прямой визуализации.
Как показано на Фигуре 3, моноклональное антитело 34В5С было эффективным в ингибировании гемагглютинации эритроцитов индейки (TRBC) вирусами гриппа типа В B/Victoria/504/2000 и B/Wisconsin/1/2010. В противоположность этому, ни моноклональное антитело 46В8С, ни контрольное gD5237 антитело не продемонстрировало инигбирования гемагглютинации каждым вирусом гриппа типа В, даже при наивысших концентраций антитела, которые были протестированы. Данные результаты позволили предположить, что моноклональное антитело 34В5С связывается с рецептор-связывающимся доменом в главной группе гемагглютинина вируса гриппа типа В, и тем самым предотвращает связывание вирусов с рецептором сиаловой кислоты на TRBC. Данные результаты также наводят на мысль, что моноклональное антитело 46В8С связывается с участком гемагглютинина вируса гриппа типа В, который находится вне рецептор-связывающего домена (например, стебельной (или стволовой) области).
Пример 6. In vitro нейтрализация вируса гриппа типа В с помощью анализа ингибирования бляшек
Способность анти-гриппового антитела к гемагглютинину вируса гриппа типа В, согласно настоящему изобретению, нейтрализовать различные изоляты вируса гриппа типа В была дополнительно проанализированы следующим образом. Титр вируса гриппа типа В был определен с помощью анализа бляшек следующим образом. MDCK клетки выращивали в DMEM среде с добавлением 10 % ФБС как конфлюэнтного монослоя в 6-луночных плашках для тканевых культур (Costar 3516). Все штаммы вируса гриппа типа В, которые использовались в этих исследованиях были приобретены в ViraPur (Сан-Диего, Калифорния). Для определения титра вируса, каждый вирусный сток был разведен в грипповой среде (DMEM, 0,2 %БСА от Gibco Cat№ 15260, 10 мМ HEPES, пенициллин/стрептомицин/глютамин от Gibco Cat№ 10378, 2 мкг/мл ТРСК обработанный трипсин от Sigma Cat№ Т1426). Были сделаны шесть 10-кратных последовательных разведений для каждого вируса, от 1:102 до 1:107, и 1 мл каждого использовали, чтобы инфицировать MDCK клетки в 6-луночной плашке. Через два часа после заражения, вирус был удален, и клетки были покрыты 2мл 1:1 смеси 2Х грипповой среды: 2 % агароза. Плашки хранили при комнатной температуре в течение 30 минут, и затем инкубировали при 37 °С в 5 % СО2 в инкубаторе. Трое суток спустя, бляшки были подсчитаны путем прямой визуализации под матовым светом, и был определен титр каждого вируса в бляшко-образующих единицах (БОЕУмл.
Следующим образом было исследовано влияние моноклональных антител, согласно настоящему изобретению, на нейтрализацию вируса гриппа типа В путем анализа ингибирования бляшек. MDCK клетки выращивали в DMEM среде с добавлением 10 % ФБС как конфлюэнтного монослоя в 6-луночных планшетах для культур тканей (Costar 3516). Для каждого вируса гриппа типа В, количество вируса, которое приводило к образованию от 20 до 200 бляшек на лунку в 6-луночном планшете (определяется как описано выше), использовали для анализа ингибирования бляшек. Шесть 3-кратных серийных разведений моноклонального антитела 46В8С в диапазоне от 0,16 до 38,4 нМ были смешаны с каждым вирусом в грипповой среде и инкубированы при 37 °С в течение 1 часа. Один мл смеси вирус-антитело был использован чтобы инфицировать MDCK клетки в 6-луночном планшете, и каждая инфекция была проведена в 3 тройных планшетах. Те же самые серийные разведения моноклонального антитела 46В8С были сделаны в 2Х грипповой среде и смешаны в пропорции 1:1 с 2 % агарозой. Через два
часа после заражения, смесь вирус-антитело была удалена, и клетки были покрыты 2мл смеси антитела-агарозы. Плашки хранили при комнатной температуре в течение 30 минут, и затем инкубировали при 37°С в 5 % СО2 инкубаторе. От пяти до шесть соток спустя, бляшки были подсчитаны путем прямого наблюдения под матовым светом. Процент заражения был определен путем нормализации к наибольшему числу бляшек (при наименьшей концентрации антитела), и нанесен на Y-ось против Log 10 концентрации антитела на Х-оси. Данные были подогнаны к кривой нелинейной регрессии ответа на дозу, чтобы создать ИК50 (концентрация, которая дает 50 % ингибирование) значения с 95 % доверительными интервалами (95 % CI).
Как показано на Фигуре 4, моноклональное антитело 46В8С блокирует in vitro образование бляшек против всех протестированных штаммов вируса гриппа типа В в дозозависимой манере. Значения ИК50, вычислены из данных, сгенерированных на основе анализа формирования бляшек з моноклональным антителом 46В8С, которое описано выше, показаны в Таблице 3 ниже. Как можно увидеть в Таблице 3, моноклональное антитело 46В8С блокирует образование бляшек при очень низких концентрациях, показывая ИК50 значения менее чем 1 нМ.
ТАБЛИЦА 3
Штамм гриппа
Происхождение
ИК50 (нМ)
95 % (нМ)
B/Wisconsin/1/2010
Yamagata
0,64
0,53 0,76
B/Brisbane/2008
Victoria
0,86
0,72-
1,0
B/Bangladesh/2007
Victoria
0,75
0,62 0,92
B/Malaysia/2004
Victoria
0,58
0,36 0,91
B/Victoria/504/2000
Yamagata
0,67
0,62 0,73
B/Russia/1969
Предковый
0,73
0,61 0,86
B/Massachusettes/3/1966
Предковый
0,80
0,65 0,98
B/Maryland/1/1959
Предковый
0,95
0,71-
1,3
B/Lee/10/1940
Предковый
0,68
0,55 0,85
Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что моноклональные антитела настоящего изобретения являются эффективными в ингибировании и нейтрализации формирования бляшек вируса гриппа типа В in vitro используя анализ нейтрализации бляшек, в том числе изолятов вируса гриппа типа В из предковых линий, линий Yamagata и Victoria. Кроме того, эти результаты показали, что моноклональные антитела, согласно настоящему изобретению, ингибируют образование бляшек вируса гриппа типа В in vitro при значениях ИК50 менее 1 нМ.
Пример 7. Анализ ингибирования слияния гемагглютинина вируса гриппа типа В
Для дальнейшего изучения механизма нейтрализации моноклональным антителом 46В8С и моноклональным антитело 34В5С, ингибиторный эффект этих антител в гемагглютинин-опосредованном анализе межклеточного слияния, который обходит шаг связывания с исходным рецептором во время проникновения вируса, был исследован
следующим образом. HeLa клетки были выращены в DMEM + 10 % ФБС до ~ 40 % конфлюэнта в 6-луночных планшетах, для культур тканей (Costar 3516). Клетки в каждой лунке были трансфицированны 10 мг плазмиды, которая экспрессирует гемагглютинин B/Wisconsin/1/2010. Семнадцать часов спустя, трансфекционная смесь была удалена из клеток и свежая среда, которая содержит 10 мМ бутират натрия, была добавлена к клеткам. Среда была снова заменена 6 часами позднее, и клеткам позволяли расти ночь до ~ 80 % конфлюэнта, после чего был произведен анализ ингибирования слияния.
Клетки были промыт в PBS и обработаны 5 мг/мл ТРСК трипсином (Sigma Кат.№ Т1426) в PBS, в течение 7 минут при 37°С. Трипсин был удален, была добавлена культуральная среда, которая содержит 50 мг/мл соевого трипсинового ингибитора, (CalBiochem Кат.№ 65035), и клетки инкубировали в течение 10 минут при 37°С. Затем клетки инкубировали при 37°С в культуральной среде, которая содержит 20 мг/мл или 200 мг/мл моноклонального антитела 46В8С, моноклонального антитела 34В5С, или контрольного человеческого моноклонального антитела gD5237, специфического к гликопротеину D вируса простого герпеса (ВПГ). Спустя 1 час, антитело удаляли, и клетки инкубировали в грипповой среде (рН 4,85) в течение 5 минут при 37 °С. Среду с низким рН удаляли, и клетки инкубировали в питательной среде ночь при 37 °С, допуская формирования синцития. Фазовые изображения клетки делали под 10Х объективом, с помощью Nikon Eclipse ТЕ2000-Е микроскопа и программного обеспечения NIS-Elements AR3.2.
HeLa клетки, которые экспрессируют гемагглютинин вируса гриппа типа В B/Wisconsin/1/2010, инкубировали с 20 мкг/мл, или 200 мкг/мл моноклонального антитела 46В8С, моноклонального антитела 34В5С, или контрольного моноклонального антитела gD5237, перед экспозицией среде с низким рН. Синцитий появлялся в пределах нескольких часов после падения рН и полностью развивался после ночного культивирования. Моноклональное антитело 46В 8С ингибировало формирование синцития как при 20 мкг/мл, так и при 200 мкг/мл; В противоположность этому, ни моноклональное антитело 34В5С, ни контрольное моноклональное антитело gD5237 не блокировали межклеточное слияние, при каждой исследованной концентрации(см. Фигуру 5).
Согласующиеся с результатами, которые были получены в анализе ингибирования гемагглютинация (ИГ), который описан више в примере 5, данные результаты позволяют предположить, что моноклональное антитело 46В 8С является анителом, которое связывает гемагглютининовый стебель, и, следовательно, способно блокировать рН-вызванные конформационные изменения в стебле гемагглютинина, которые требуется для слияния мембраны вируса гриппа типа В. Эти результаты также предполагают, что моноклональное антитело 34В5С возможно связывается с главной группой гемагглютинина и нейтрализует вирус гриппа типа В, блокируя шаг связывания с исходным рецептором, шаг который обойден в анализе межклеточного слияния, что описан в настоящем документе.
Пример 8. Аффинность моноклонального антитела 46В8С к различным гемагглютининам вируса гриппа типа В
Аффинность моноклонального антитела 46В 8 к различным гемагглютининам вируса гриппа типа В определяется следующим образом.
Смеси конкурентной реакции 50 мкл, которые содержали постоянную концентрацию йодированого анти-гриппового антитела к вирусу гриппа типа В (моноклональное антитело 46В8С) и серийно разведенные концентрации немеченого анти-гриппового антитела к вирусу гриппа типа В (моноклональное антитело 46В 8С) в связывающем буфере (DMEM 2 % ФБС, 50 мМ HEPES, рН 7,2 и 0,1 % азида натрия) помещали в 96-луночный планшет. 293 клетки, которые временно экспрессировали различные штаммы вируса В гриппа, были добавлены к смеси конкурентной реакции с плотностью 50000 клеток на 0,2 мл в связывающем буфере. Конкурентные реакции с клетками инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. После 2-часов инкубации, конкурентные реакции переносили на Millipore Multiscreen фильтровальную плашку и промывали четыре раза связывающим буфером, чтобы отделить свободные антитела от связанных йодированных антител. Фильтры были подсчитаны на Wallac Wizard 1470 гамма-счетчике (PerkinElmer Life and Analytical Sciences; Уэллсли, Массачусетс). Данные связывания были оценены используя программное обеспечения New Ligand (Genentech), которое использует алгоритм подгонки за авторством Munson и Rodbard, чтобы определить аффинность связывания (Munson and Rodbard (1980) Anal Biochem 7:2239).
Таблиця X ниже демонстрирует анализ связывания Scatchard моноклонального антитела 46В8С с гемагглютининовыми тримерами из различных вирусов гриппа типа В, которые рекомбинантно экспрессируются на поверхности 293Т клеток. Как показано в Таблице 4
Пример 9. In vivo эффективность моноклонального антитела 34В5А у мышей против B/Victoria/2000 и B/Wisconsin/2010
In vivo эффективность моноклонального антитела 34В5А против грипповой В- вирусной инфекции у мышей определяли следующим образом. DBA/2J мыши (Jackson Lab, Б а
р Харбор,Мэн) были инфицированные интра-назально 50 мкл штама B/Victoria/2000 вируса гриппа типа В, разведенного в грипповой среде (DMEM, 0,2 % БСА, 2 мкг/мл ТРСК-обработаного трипсина) при минимальной ЛДюо дозе (1 х 104 вирус/мыша). Инфекции вируса гриппа разрешили развиваться в течение 72 часов (для B/Victoria/2000 инфекции) перед введением моноклонального антитела 34В5А.
Спустя 72 часа после инфекции вирусом гриппа типа В B/Victoria/2000, различные количества моноклонального антитела 34В5А были введены внутривенно мышам в дозе 15 мг/кг, 3 мг/кг, 0,6 мг/кг, и 0,12 мг/кг в 200 мкл PBS. Контрольным обработанным животным было введено моноклональное антитело gD5237 в самой высокой протестированной эквивалентной дозе моноклонального антитела 34В5А (например, около 15 мг/кг). Мышей проверяли ежедневно на выживаемость и состояние тела, и также взвешивали ежедневно, до 21 суток после инфекции.
Фигура 6А иллюстрирует процент выживаемости (с течением времени, в сутках) мышей, которым были введены различные количества моноклонального антитела 34В5А после 72 часов инфекции вирусом гриппа типа В B/Victoria/2000. Как показано
на Фигуре 6А, на 10 сутки наблюдалась 100 % смертность инфицированных мышей, которым было введено контрольное атитело. Однако, инфицированные мыши, которым было введено моноклональное антитело, согласно настоящему изобретению, показывали повышенную выживаемость. В частности, 100 % выживаемость наблюдалась у мышей, которые были инфицированные вирусом гриппа типа В B/Victoria/2000 при дозе лечения 15 мг/кг моноклонального антитела 34В5А.
Были проведены параллельные опыты, чтобы сравнить эффективность моноклонального антитела 34В5А с таковой Тамифлю (осельтамивир). Тамифлю был введен в 10 мг/кг, 30 мг/кг, или 100 мг/кг ВИЗ, начиная после 72 часов инфекции вирусом. В то время как Тамифлю на самом деле обеспечивал некоторую защиту мышей, которые были инфицированы вирусом гриппа типа В B/Victoria/2000, в сравнении с той же контрольных животных, которые были обработаны только веществом переносчиком, на 11 сутки наблюдалась 100 % смертность, даже при максимальной вводимой дозе (см. Фигуру 6В).
Такие результаты показали, что моноклональные антитела, согласно настоящему изобретению, являются эффективными в лечении инфекции вирусом гриппа типа В in vivo. Кроме того, эти данные показывают, что моноклональные антитела, согласно настоящему изобретению, были эффективны в лечении инфекции вирусом гриппа типа В in vivo когда вводились вплоть до по меньшей мере 72 часов после инфекции вирусом гриппа типа В. Вместе взятые, эти результаты дополнительно показывали что моноклональные антитела, согласно настоящему изобретению, демонстрируют лучшую in vivo эффективность у мышей, в сравнении с той же Тамифлю, когда вводились 72 часа после вирусной инфекции.
Пример 10. In vivo эффективность моноклонального антитело 34В5С у мышей против вируса гриппа типа В B/Wisconsin/2010
In vivo эффективность моноклонального антитела 34В5С против инфекции вирусом гриппа типа В у мышей проводили следующим образом. DBA/2J мыши (Jackson Lab, Бар Харбор, Мэн) были инфицированнны интра-назально 50 мкл штама B/Wisconsin/2010 вирус гриппа типа В, который был разведен в грипповой среде (DMEM, 0,2 % БСА, 2 мкг/мл ТРСК-обработанный трипсином) при минимальной ЛДюо дозе (1 х 106 вирус/мышь). Инфекции вирусом гриппа позволяли прогресировать в течение либо 48 часов, либо 72 часов до внутривенного введения моноклонального
антитела 34В5С.
Спустя 48 часов ил 72 часов после инфекции вирусом гриппа типа В B/Wisconsin/2010, различные количества моноклонального антитела 34В5С были введены внутривенно мыши в дозе 15 мг/кг, 5 мг/кг, и 1,7 мг/кг в 200 мкл PBS. Обработанным контролем животным было введено моноклональное антитело gD5237 в самой высокой тестируемой эквивалентной дозе моноклонального антитела 34В5С (например, около 15 мг/кг). Мышей проверяли ежедневно на выживаемость и состояние тела, и также взвешивали ежедневно, до 21 суток после инфекции.
Фигуры 7А и 7Б иллюстрируют процент выживаемости (с течение времени, в сутках) мышей, которым были введены различные количества моноклонального антитело 34В5С 48 или 72 часа после инфекции вирусом гриппа типа В B/Wisconsin/2010, соответственно. Как показано в Фигурах 7А и 7Б, на 9 или 10 сутки наблюдалась 100 % смертность инфицированных мышей, которым было введено контрольное антитело. Однако, инфицированные мыши, которым было введено моноклональное антитело 34В5С демонстрировали повышенную выживаемость (см. Фигуры 7А и 7Б).
Такие результаты показал, что моноклональные антитела настоящего изобретения являются эффективными при лечении различных инфекций вирусом В. Кроме того, эти данные указывали, что моноклональные антитела настоящего изобретения являются эффективными при лечении инфекции вируса гриппа типа В, когда вводились по крайней мере 72 часа после инфекции вирусом гриппа типа В.
Пример 11. In vivo эффективность моноклонального антитела 46В8С в мышахпротив вируса гриппа типа В B/Wisconsin/2010
Чтобы проверить in vivo эффективность моноклонального антитела 46В8С в мышах, антитело было введено внутривенно мышам, инфицированные четырьмя разными штаммами вируса гриппа типа В (B/Wisconsin/2010, B/Victoria/2000, B/Russia/1969, и B/Mass/1966). DBA/2J мыши (Jackson Lab, Бар Харбор,Мэн) былиинфицированы интра-назально 50 мкл разных штамов вируса гриппа типа В, которые были разведены грипповой средой (DMEM, 0,2 % БСА, 2 мкг/мл ТРСК обработанное трипсином) до 1 х ЛДюо дозе.
В одной серии экспериментов, были применены следующие изоляты вируса гриппа типа В : B/Wisconsin/2010, B/Victoria/2000, B/Russia/1969, и B/Mass/1966. Через 24, 48, или 72 часа после инфекции, анти-гемагглютининовое моноклональное антитело 46В8С вводили внутривенно в околом количестве 15 мг/кг в 200 мкл PBS. Животным, обработаным контролем, давалимо ноклональное антитело gD5237 (15 мг/кг). Мышей проверяли на состояние тела и выживаемость, и взвешивали до 21 суток после инфекции.
Как показано в Фигурах 8А и 8Б, на 10 и 9 сутки наблюдалась 100 % смертность в контрольной группе лечения у мышей, которым был введен штамм вируса B/Wisconsin/2010 и B/Victoria/2000, соответственно. Разовая доза моноклонального антитела 46В8С составляла 15 мг/кг, которая вводилось 24, 48, или 72 часа после инфекции, либо B/Victoria/2000, либоВ/Ма88/1966, приводила к 100 % выживаемости мышей (см. Фигуры 8В и 8D). Разовая доза моноклонального антитела 46В 8С составляла 15 мг/кг, которая вводилась 24 или 48 часов после инфекции, либо B/Wisconsin/2010, либо B/Russia/1969 (так же как, либо B/Victoria/2000, либо B/Mass/1966), приводила к 100 % выживаемости мышей (см. Фигуры 8А, 8Б, 8В, и 8Г). Эти результаты показали, что моноклональное антитело 46В8С было эффективно при лечении инфекций различными штаммами вируса гриппа типа В in vivo. В частности, эти результаты показали, что моноклональное антитело 46В8С было эффективным при лечении инфекции вирусом гриппа типа В и улучшает выживаемости при введение 24, 48 или 72 часа после заражения. Взятые вместе, эти результаты демонстрирую, что моноклональные антитела согласно настоящему изобретению были эффективны при лечении изолятов вируса гриппа типа В из предковых линий, линий Yamagata и Victoria, даже тогда, когда вводились по меньшей мере 72 часа после инфицирования.
Пример 12. In vivo эффективность моноклонального антитела 46В8С в мышах когда вводилось 72 часов после инфекции вирусом гриппа типа В
In vivo эффективность различных доз моноклонального антитела 46В8С против инфекции вирусом гриппа типа В у мышей была проверена следующим образом. DBA/2J мыши (Jackson Lab, Бар Харбор, Мэн) были инфицированы интра-назально 50 мкл штаммами вируса гриппа типа В B/Wisconsin/2010, или B/Victoria/2000, которые были разведены в грипповой среде (DMEM, 0,2 % БСА, 2 мкг/мл ТРСК-обработанной трипсином) в минимальной ЛДдоо дозе. Инфекции вирусом гриппа типа В разрешали развиваться в течение 72 часов до внутривенного введения различных доз
моноклонального антитела 46В 8С.
Спустя 72 часа после инфекции вирусом гриппа типа В, различные количества моноклонального антитело 46В 8С водили внутривенно мышам в дозе 45 мг/кг, 15 мг/кг, или 5 мг/кг в 200 мкл PBS. Животным обработанным контролем было введено моноклональное антитело gD5237 в самой высокой тестируемой эквивалентной дозе около 45 мг/кг. Мышей проверяли ежедневно на выживаемость и состояние тела, и также ежедневно взвешивали, до 21 суток после инфекции.
Как показано в Фигурах 9А и 9Б, введение моноклонального антитела 46В8С, либо в дозе 45 мг/кг, либо в дозе 15 мг/кг 72 часа после инфекции вирусом гриппа типа В приводило к 100 % выживаемости мышей, которые были инфицированы, либо B/Wisconsin/2010, либо B/Victoria/2000, соответственно. Даже в дозе 5 мг/кг, введение моноклонального антитела 46В 8С показывало терапевтическую лечебную эффективность против вируса гриппа типа В B/Wisconsin/2010 и B/Victoria/2000, как измерено в процентах выживаемости мышей, в сравнении с жывотными, которые были обработаны контролем. Эти данные показывают, что моноклональное антитело 46В8С было эффективно при лечении инфекции вирусом гриппа типа В, когда вводилось по меньшей мере в течение 72 часов после инфекции вирусом гриппа типа В.
Пример 13. Сравнение in vivo эффективности моноклонального антитела 46В8С и осельтамивира при тяжелой инфекции вирусом гриппа типа В у мышей
Для сравнения эффективность антитела к гемагглютинину вируса гриппа типа В, согласно настоящему изобретению, с эффективностю осельтамивирфосфата (Тамифлю(r)) у мышей, были проведены следующие исследования. Balb/c мыши (Charles River Laboratories, Холлистер, Калифорния) на 6 неделе жизни были инфицированы интра-назально 50 мкл штамма вируса гриппа типа В B/Victoria/2000 в 4хЛДюо- Спустя 48 часов после инфекции, анти-гемагглютининовое 46В8С антитело было введено в качестве разовой дозы 45 мг/кг, или было введено контрольное IgG в 200 мкл PBS внутривенно. В этих экспериментах, сравнивали режим дозировки осельтамивира, состоящий из 2 мг доз дважды ежедневно (ВИЗ) в течение пяти суток, с единоразовой внутривенной дозой -15 мг/кг моноклонального антитела 46В8С(осельтамивир (например, Тамифлю(r)) использовали в любом примере, который описан в настоящем документе, был получен из Toronto Research Chemicals, Кат.. №. 0701000).
Как показано на Фигуре 10А, на 9 сутки наблюдалась 100 % смертность в животных, обработанных контрольным-IgG (моноклональное антитело gD5237), и на 11 сутки наблюдалась 100 % смертность среди животных, обработаных Тамифлю. Однако, одна 15 мг/кг доза моноклонального антитела 46В8С защищала около 75 % инфицированных животных от инъекции летальным вирусом гриппа типа В. Дополнительно, животные, обработаные моноклональным антителом 46В 8С, демонстрировали восстановление в % изменении веса тела (см. Фигуру 10Б).
Пример 14. Моноклональное антитело 46В8С является безопасным в комбинации с Тамифлю и снижает легочный титр
Чтобы дополнительно изучить применение и эффективность анти-грипповых антител к гемагглютинину вируса гриппа типа В, согласно настоящему изобретению, по отношению к осельтамивир-фосфату (Тамифлю(r)) у мышей, были проведены следующие исследования. Balb/c мыши (Charles River Laboratories, Холлистер, Калифорния) на 6-неделю жизни были инфицированы интра-назально 50 мкл штамма вируса гриппа типа В B/Victoria/2000 в 1х ЛДюо- Спустя 48 часов после инфекции, анти-гемагглютининовое моноклональное антитело 46В 8С было введено в качестве разовой дозы 15 мг/кг, или был введен контрольный IgG в количестве 200 мкл PBS интра-назально. В этих экспериментах, режим введения осельтамивира состоящий из 2 мг доз дважды ежедневно (BID) в течение пяти суток (100 мг/кг) сравнивали с единоразовой внутривенной дозой -15 мг/кг моноклонального антитела 46В 8С. Также проводилось комбинированное лечение.
Как показано на Фигуре ПА, на 11 сутки наблюдалась 100 % смертность среди животных, обработанных контрольным IgG (моноклональное антитело gD5237). Оданко, одна 15 мг/кг доза моноклонального антитела 46В 8С приводила к 100 % выживаемости мышей, когда его водили отдельно, или в комбинации с Тамифлю. Кроме того, лечение животных комбинацией моноклонального антитела 46В8С и Тамифлю было безопасным и эффективным в этой in vivo модели инфекции вирусом гриппа типа В.
Как показано на Фигуре 11Б, введение моноклонального антитела 46В8С, либо отдельно, либов комбинаци с Тамифлю, демонстрировало снижение легочного титра вируса гриппа типа В в сравнении тем, что наблюдался вконтроль-обработанных животных, или в животных, обработанных только Тамифлю.
Эти результаты показали, что моноклональные антитела настоящего изобретения являются безопасными и эффективными при использовании в сочетании с ингибиторами нейраминидазы (например, осельтамивиром).
Пример 15. Синергия моноклонального антитела 46В8С с осельтамивиром в модели тяжелой инфекции вирусом гриппа типа В у мышей
Для дальнейшего изучения эффективности совместного введения анти-гриппового антитела к гемагглютинину вируса гриппа типа В согласно настоящему изобретению и осельтамивир-фосфата (Тамифлю(r)) у мышей, были выполнены следующие исследования. Balb/c мыши (Charles River Laboratories, Холлистер, Калифорния) на 6-неделю жизни были инфицированы интра-назально 50 мкл штамма вируса гриппа типа В B/Victoria/2000 в 4х ЛДюо- Спустя 48 часов после инфекции, анти-гемагглютининовое моноклональное антитело 46В 8С было введено в качестве одиночной дозы в количестве либо 15 мг/кг, либо 5 мг/кг, или контрольный IgG в количестве 200 мкл PBS внутривенно. В этих експериментах, режим дозирования осельтамивир состоящий из 2 мг доз дважды ежедневно (ВИЗ) в течение пяти суток сравнивали с единоразовой внутривенной дозой -15 мг/кг моноклонального антитела 46В 8С. В этих экспериментах, режим дозирования осельтамивира состоящий из 2 мг доз дважды ежедневно (ВИЗ) в течение пяти суток (100 мг/кг). Животных обрабатывали либо контрольным антителом, только моноклональным антителом 46В8С, только осельтамивир, или комбинацией моноклонального антитела 46В8С и осельтамивира.
Как проиллюстрировано на Фигуре 12А и 12В, животные, которым был введено либо контрольное антитело, либо только Тамифлю, демонстрировали 100 % смертность на 9 или 10 сутки. Дополнительно, животные, которым были введены моноклональные антитело 46В8С в количестве 5 мг/кг, к 9 суткам демонстрировали 100 % смертность в этой модели тяжелой инфекции вирусом гриппа типа В. Однако, комбинированное лечение моноклональным антителом 46В8С и Тамифлю приводило к увеличению выживаемости при дозах либо 5 мг/кг или 15 мг/кг.
Эти результаты показали, что комбинированное лечение с применением антитела настоящего изобретения вместе с осельтамивиром обеспечивает некоторую степень синергии в результатах лечения по сравнению с каждым курсом лечения по отдельности.
Пример 16. Конкурентное ИФА
Конкурентные ИФА анализы разрабатываются используя гемагглютинин вируса гриппа типа В (например, B/Victoria/2000, B/Wisconsin/2010, и т.д.). ИФА-плашкам, которые покрыты гемагглютинином, позволяют связывать тестовое антитело при различных концентрациях (Х-ось) перед добавлением насыщающих концентраций биотин-меченых моноклональных антител, согласно настоящему изобретению (например, моноклональное антитело 48В8С, и т.д.). Если тестовое антитело конкурировало за гемагглютининовый эпитоп вируса гриппа типа В с моноклональным антителом, согласно настоящему изобретению, биотиновый ИФА сигнал (Y-ось) уменьшался, как функция увеличивающейся концентрации тестового антитела. Данный связывания согласовывают с нелинейной кривой ответа на дозу, чтобы определить значение ЕС50, определенное в нМ.
Моноклональное антитело, согласно настоящему изобретению, биотинилируется через аминовую связь в соответствии с рекомендуемым протоколом производителя (Sulfo-NHS-LC-LC, Pierce, Рокфорд, Иллинойс). Конечная концентрация стока биотинилированного моноклонального антитела составляет, например, 13,2 мМ. Чтобы определить оптимальную концентрацию для применения, биотинилированное моноклональное антитело серийно титруют против иммобилизованного гемагглютинина из вируса гриппа типа В. Белки рекомбинантного гемагглютинина разбавляют до 2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS) и распределяют (100 мкл) по 96-луночных Nunc Maxisorp плашках (Nunc, Рочестер, Нью-Йорк). Плашки накрывают и оставляют на ночь при 4°С, промывают в PBS, и затем блокируют в течение 1-часа при комнатной температуре с помощью PBS, который содержит 1 % бычий сывороточный альбумин (БСА, Sigma-Aldrich, Сент Луис, Миссури).
Затем каждая плашка получает 100 мкл серийно разведенного биотинилированого моноклонального антитела, начиная с начальной концентрации 88 нМ с 1/3 разведением в PBS, который содержит 1,0 % БСА и 0,05 % полисорбата 20 (Sigma-Aldrich). После одного часа инкубации, плашки промываются и затем инкубируются с 100 мкл 1:5000 разведением стрептавидин-конъюгированой пероксидазой хрена (Caltag Laboratories, Карлсбад, Калифорния) в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации, плашки промывают и проявляют 100 мкл ТМВ субстрата (Kirkegaard и Репу Laboratories, Inc. Гейтерсберг, Мэриленд). Плашки считываются на SpectraMax plate reader (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния.) при ОП 450 нМ. Оптимальная
концентрация биотинилированого моноклонального антитела определяется , например, как 1 нМ.
Пример 17. In vivo эффективность моноклонального антитела 46В8С у мышей против вируса гриппа типа В B/Brisbane/2008
Чтобы проверить in vivo эффективность моноклонального антитела 46В8С у мышей против вируса гриппа типа В B/Brisbane/2008, вируса гриппа типа В Victoria линии (Viapur, LLC, Сан-Диего, Калифорния), были выполнены следующие исследования. DBA/2J мыши были инфицированы интра-назально минимальной 1 х ЛДдоо дозой (1Х104 PFU/мышь) вируса гриппа типа В B/Brisbane/2008. Спустя 24, 48, и 72 часов после-инфекции, 8 группам мышиных самок было внутривенно введено моноклональное антитело 46В 8С в количестве 15 мг/кг в 0,1 мл PBS. Мышей проверяли на выживаемость, и взвешивали вплоть к 21 суткам после инфекции. В качестве контроля, группу инфицированных мышей обрабатывали человеческим IgGl антителом анти-gD (нет известных целей в мыши) в количестве 15 мг/кг 72 часа после инфицирования.
Как показано на Фигуре 26А, к 11 суткам наблюдалась 100 % смертность в группе, обработанной контролем, у мышей, которым был введен вирус гриппа типа В B/Brisbane/2008. Одна доза моноклонального антитела 46В8С в количестве 15 мг/кг, которая была введена 24, 48 или 72 часа после инфекции вирусом гриппа типа В B/Brisbane/2008 приводила к 100 % выживаемости мышей (см. Фигуру 26А). Фигура 26Б демонстрирует изменения в весе у мышей при различных условиях и обработках, которые описаны выше.
Данные результаты показали, что моноклональное антитело 46В8С было эффективно в лечении инфекции вирусом гриппа типа В B/Brisbane/2008, из линииУкиша.
Статистический анализ
Статистические данные были рассчитаны с применением JMP версии 9.0.2 программного обеспечения (SAS Institute). Експеременты выживаемости сравнивали используя лог-ранговый тест. Р значения <0,05 рассматривались как значимые. Кривые и значения ИК50 были нанесены и вычислены используя программное обеспечения Graphpad Prism версии 5.0.
Не смотря на то, что выше изложенное изобретение было описано в некоторых деталях
путем иллюстрации и примера в целях ясности понимания, описания и примеры не следует рассматривать как ограничивающие возможности изобретения. Раскрытия всей патентной и научно-технической литературы цитируемой здесь, включены во всей их
полноте посредством ссылки.
Перечень последовательностей
<12 0> АНТИТЕЛА К ГЕМАГГЛЮТИНИНУ ВИРУСА ГРИППА ТИПА B И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> P05794R1-WO
<140> <141>
<150> 61/971123
<151> 2014-03-27
<160> 108
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1 <211> 22 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 1
gaagtagtcc ttgaccaggc ag 22
<210> 2 <211> 23 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 2
ctcagcgtca gggtgytgct gag 23
<210> 3 <211> 18 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 3
gggtktggts gtctccac 18
<210> 4 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 4
caggtgcagc tggtgcagtc tggggc 26
<210> 5 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 5
caggtccagc tggtgcagtc tggggc 26
<210> 6 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 6
caggtcacct tgaaggagtc tggtcc 26
<210> 7 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 7
gaggtgcagc tggtggagtc tggggg 26
<210> 8 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<210> 9 <211> 23 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 9
gaggtgcagc tggtgcagtc tgg 23
<210> 10 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 10
caggtacagc tgcagcagtc aggtcc 26
<210> 11 <211> 23 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 11
caggtgcagc tggtgcaatc tgg 23
<210> 12 <211> 22 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 12
ghcatccrgw tgacccagtc tc 22
<210> 13 <211> 22 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 13
gatrttgtga tgacycagwc tc 22
<210> 14 <211> 22 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 14
gaaatwgtrw tgacrcagtc tc 22
<210> 15 <211> 23 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 15
gacatcgtga tgacccagtc tcc 23
<210> 16 <211> 22 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 16
gaaacgacac tcacgcagtc tc 22
<210> 17 <211> 22 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 17
gawrttgtgm tgacwcagtc tc
<210> 18 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 18
cagtctgtgy tgackcagcc rccctc 26
<210> 19 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 19
cagtctgccc tgactcagcc t 21
<210> 20 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 20
tcctatgagc tgacwcagsh vccckc 26
<210> 21 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 21
cagcctgtgc tgactcartc vccctc 26
<210> 22 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
олигонуклеотид"
<210> 23 <211> 24 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 23
aattttatgc tgactcagcc ccac 24
<210> 24 <211> 24 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 24
caggctgtgg tgactcagga gccc 24
<210> 25 <211> 23 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 25
cagactgtgg tgacccagga gcc 23
<210> 26 <211> 23 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 26
cagcctgtgc tgactcagcc acc 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 27
gcagcccagg gcsgctgtgc 20
<210> 28 <211> 23 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический олигонуклеотид"
<400> 28
gcacacaaca gaggcagttc cag 23
<210> 29 <211> 20 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 29
cttgragctc ctcagaggag 20
<210> 30 <211> 98 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 30
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacaggtgca gctggtgcag tctggggctg aggtgaag 98
<210> 31 <211> 98 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<210> 32 <211> 98
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 32
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacaggtgca gctggtggag tctgggggag gcgtggtc 98
<210> 33
<211> 95
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 33
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cagaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttg 95
<210> 34 <211> 96 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 34
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacaggtgca gctgcaggag tcgggcccag gactgg 96
<210> 35 <211> 101 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
polynucleotide"
<210> 36 <211> 94 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 36
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacaggtaca gctgcagcag tcaggtccag gact 94
<210> 37
<211> 95 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 37
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacaggtgca gctggtgcaa tctgggtctg agttg 95
<210> 38 <211> 95 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 38
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cagacatcca gatgacccag tctccatcct ccctg 95
<210> 39 <211> 95 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<210> 40 <211> 101 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический polynucleotide"
<400> 40
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
cagaaattgt gttgacacag tctccagcca ccctgtcttt g 101
<210> 41 <211> 101 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический polynucleotide"
<400> 41
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60
cagacatcgt gatgacccag tctccagact ccctggctgt g 101
<210> 42 <211> 88 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 42
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cagaaacgac actcacgcag tctccagc 88
<210> 43 <211> 94 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<210> 44 <211> 88 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 44
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacagtctgt gytgackcag ccrccctc 88
<210> 45 <211> 83 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 45
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacagtctgc cctgactcag cct 83
<210> 46 <211> 88 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 46
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 catcctatga gctgacwcag shvccckc 88
<210> 47 <211> 88 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<210> 48 <211> 88 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 48
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacagcctgt gctgactcag ccaacttc 88
<210> 49 <211> 86 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 49
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 caaattttat gctgactcag ccccac 86
<210> 50 <211> 86 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 50
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacaggctgt ggtgactcag gagccc 86
<210> 51 <211> 85 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<210> 52 <211> 85 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 52
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacagcctgt gctgactcag ccacc 85
<210> 53 <211> 19 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 53
gccaggggga agaccgatg 19
<210> 54 <211> 59 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический праймер"
<400> 54
ctgggataga agttattcag caggcacaca acagaagcag ttccagattt caactgctc 59
<210> 55 <211> 14
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<210> 56 <211> 16 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 56
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 57 <211> 7 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 57
Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 58 <211> 7 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 58
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5
<210> 59 <211> 10 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 59
Ala Ser Tyr Ala Gly Asn Asn Ile Tyr Val
1 5 10
<211> 9 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 60
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 61 <211> 5 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 61
Gly Tyr Tyr Ile His 1 5
<210> 62 <211> 5 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 62
Ala His His Met His
1 5
<210> 63 <211> 5 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 63
Ser Gln Trp Ile Gly
1 5
<210> 64
<211> 17
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 64
Arg Ile Asp Pro Asn Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 65 <211> 17 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 65
Arg Ile Asp Pro Asn Gly Ala Gly Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 66 <211> 17 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 66
Trp Ile Asp Pro Asn Asn Asp Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 67 <211> 17 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
Met Met Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
<210> 68
<211> 17 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 68
Met Met Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 69 <211> 17 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 69
Met Met Tyr Pro Gly Glu Ser Glu Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 70 <211> 17 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 70
Met Met Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
<210> 71 <211> 17 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 71
Met Met Tyr Pro Gly Ser Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 72 <211> 17 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 72
Met Met Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 73 <211> 17 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 73
Met Met Tyr Pro Gly Asp Thr Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 74 <211> 17 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 74
Met Met Tyr Pro Gly Glu Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 75 <211> 14
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 75
Trp Asp Trp Asn Phe Asp Leu Tyr Leu Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 76
<211> 14 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 76
Trp Ala Trp Asn Phe Asp Phe Phe Leu Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 77 <211> 14 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 77
Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
1 5 10
<210> 78 <211> 108
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 78
10 15
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Arg Gly Gln
1 С 1 П 1С
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Thr Ser Asp Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val
35 40 45
Ile Leu Tyr Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Phe Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Ala Gly Asn
85 90 95
Asn Ile Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr 100 105
<210> 79 <211> 123 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 79
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Met Asp Thr Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ala Ser
115 120
<210> 80 <211> 216 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 80
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Arg Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Thr Ser Asp Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val
35 40 45
Ile Leu Tyr Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Phe Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Ala Gly Asn
85 90 95
Asn Ile Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215
<210> 81 <211> 453 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Gly Ser Gly Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Met Asp Thr Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Trp Asn Phe Asp Leu Tyr Leu Gly Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 82
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 82
Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Arg Gly Gln Ser
1 5 10 15
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Thr Ser Asp Ile Gly Ser Tyr Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Ile
35 40 45
Leu Tyr Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Phe Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Ala Gly Asn Asn
85 90 95
Ile Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr 100 105
<210> 83 <211> 123 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Gly Ala Gly Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Met Asp Thr Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Trp Asn Phe Asp Leu Tyr Leu Gly Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ala Ser 115 120
<210> 84
<211> 215
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 84
Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Arg Gly Gln Ser
1 5 10 15
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Thr Ser Asp Ile Gly Ser Tyr Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Ile
35 40 45
Leu Tyr Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Phe Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys
180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215
<210> 85
<211> 452
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 85
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Gly Ala Gly Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Ala Arg Trp Asp Trp Asn Phe Asp Leu Tyr Leu Gly Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 86
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 86
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Arg Gly Gln Ser
1 5 10 15
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Thr Ser Asp Ile Gly Ser Tyr Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Ile
35 40 45
Leu Tyr Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr 100 105
<210> 87
<211> 215
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 87
Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Arg Gly Gln Ser
1 5 10 15
Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Thr Ser Asp Ile Gly Ser Tyr Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Ile
35 40 45
Leu Tyr Glu Val Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Phe Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Ala Gly Asn Asn
85 90 95
Ile Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu
115 120 125
Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro
130 135 140
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala
165 170 175
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215
<210> 88 <211> 453 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 88
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Gly Ala Gly Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Met Asp Thr Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Trp Asn Phe Asp Leu Tyr Leu Gly Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 89
<211> 123
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ala His
20 25 30
His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gly Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asn Asn Asp Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Met Asp Thr Ser Ile His Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Tyr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Trp Ala Trp Asn Phe Asp Phe Phe Leu Gly Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser 115 120
<210> 90 <211> 453 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ala His
20 25 30
His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gly Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asn Asn Asp Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Met Asp Thr Ser Ile His Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Tyr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Trp Ala Trp Asn Phe Asp Phe Phe Leu Gly Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 91
<211> 112
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 91
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 92
<211> 123
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
<210> 93 <211> 219 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 93
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 94 <211> 453 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 95
<211> 123
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 96 <211> 453 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 97
<211> 123
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Glu Ser Glu Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 98
<211> 453
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Glu Ser Glu Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 99
<211> 123
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
<210> 100 <211> 453 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Asp Ala Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
<210> 101 <211> 123 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Ser Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 102 <211> 453 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Ser Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 103 <211> 123
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
Gly Met Met Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 104 <211> 453
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 104
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Ala Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 105 <211> 123
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Asp Thr Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
<210> 106 <211> 453 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Asp Thr Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
<210> 107 <211> 123 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Met Tyr Pro Gly Glu Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 108 <211> 453 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 108
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Gly Met Met Tyr Pro Gly Glu Ser Asp Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Изолированное анти-гемагглютининовое моноклональное антитело, которое специфически связывает гемагглютинин вируса гриппа типа В, содержащее три гипервариабельные области тяжелой цепи (HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3) и три гипервариабельные области легкой цепи (HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3), причем
а) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:63;
б) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
группы, состоящей из SEQ ID N0:67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 и 74;
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:77;
г) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:56;
д) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:58;
е) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:60.
2. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 1, отличающееся тем, что антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:91.
3. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 1, отличающееся тем, что антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:92, 95, 97, 99, 101, 103, 105, и 107.
4. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п.1, отличающееся тем, что антитело содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, причем вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:91, а вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:92, 95, 97, 99, 101, 103, 105 и 107.
5. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 1, отличающееся тем, что антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:93.
6. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 1, отличающееся тем, что антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ Ш N0:94, 96, 98, 100, 102, 104, 106 и 108.
7. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 1, отличающееся тем, что антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:93, и тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:94, 96, 98, 100, 102, 104, 106 и 108.
8. Изолированное анти-гемагглютининовое моноклональное антитело, которое специфически связывает гемагглютинин вируса гриппа типа В, содержащее три гипервариабельные области тяжелой цепи (HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3) и три гипервариабельные области легкой цепи (HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3), причем:
а) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:61;
б) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из
группы, состоящей из SEQ Ш N0:64 и 65;
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:75;
г) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55;
д) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57;
е) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
9. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 8, отличающееся тем, что антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:78, 82 и 86.
10. Изолироанное анти-гемагглютининовое антитело по п. 8, отличающееся тем, что антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:79 и 83.
11.
Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 8, отличающееся тем, что
антитело содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, причем вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность выбранную из группы состоящей из SEQ ID N0:78, 82 и 86, а вариабельная область тяжелой цепи, содержит аминокислотную последовательность выбранную из группы состоящей из SEQ ID N0:79 и 83.
12. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 8, отличающееся тем, что антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:80, 84 и 87.
13. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 8, отличающееся тем, что антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ Ш N0:81, 85 и 88.
14. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 8, отличающееся тем, что антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем легкая цепь содержит аминокислотную последовательность выбранную из группы состоящей из SEQ ID N0:80, 84 и 87, а тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность выбранную из группы состоящей из SEQ Ш N0:81, 85 и 88
15. Изолированное анти-гемагглютининовое моноклональное антитело которое специфически связывает гемагглютинин вируса гриппа типа В, содержащее три гипервариабельные области тяжелой цепи (HVR-H1, HVR-H2 и HVR-H3) и три гипервариабельные области легкой цепи (HVR-L1, HVR-L2 и HVR-L3), причем:
а) HVR-H1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:62;
б) HVR-H2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:66;
в) HVR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:76;
г) HVR-L1 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:55;
д) HVR-L2 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:57;
е) HVR-L3 содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:59.
16. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 15, отличающееся тем, что антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую
16.
аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:78.
17. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 15, отличающееся тем, что антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:89.
18. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 15, отличающееся тем, что антитело содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, причем вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:78, а вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ Ш N0:89.
19. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 15, отличающееся тем, что антитело содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:80.
20. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 15, отличающееся тем, что антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0:90.
21. Изолированное анти-гемагглютининовое антитело по п. 15, отличающееся тем, что антитело содержит легкую цепь и тяжелую цепь, причем легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ГО N0:80, а тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:90.
22. Способ лечения, ингибирования, или профилактики инфекции вирусом гриппа типа В у индивида, нуждающегося в этом, причем способ включает введение индивиду эффективного количества композиции, содержащей антитело по любому из пунктов 1-21, тем самым обеспечивая лечение, ингибирование или предотвращение инфекции вируса гриппа типа В.
23. Способ по п. 22, отличающейся тем, что способ дополнительно включает введение индивиду дополнительного терапевтического средства.
24. Способ по п. 23, отличающейся тем, что дополнительное терапевтическое
17.
средство является ингибитором нейраминидазы, анти-гемагглютининовым антителом или анти-М2 антителом.
25. Композиция, содержащая антитело по любому из пп. 1-21.
26. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из пп. 1-21 и фармацевтически приемлемый носитель.
27. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из пп. 121.
28. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 27.
29. Способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п.
28, результатом которого является производство антитела.
30. Применение антитела по любому из пп. 1-21 в производстве лекарственного
средства.
31. Применение по п. 30, отличающееся тем, что лекарственное средство
предназначено для лечения, ингибирования или профилактики инфекции
вирусом гриппа типа В.
s s
ffl -Э-i S
0U8. 1A Антитело (M)
ю-12 ю-11 ю-10 ю-9 ю-8 ю-7 ю-6 ю-5 Фиг. 1B Антитело(M)
Антитело (мкг/мл) gD5237 34В5 46В8
gD5237
250 ^^^^^^^^^^^^^^^^^^Щ 50 ^^^^^^^^^^^^^^^^^Д
0.4 ^^^^^^^^^^^^^^^^^И 0.08 ^^^^^^^^^^^^^^^^^1 0.016 ^^^^^^^^^^^^^^^^^^Щ 0.0032 ^^^^^^^^^^^^^^^^^1
Victoria/2000
^-
Фиг. 3
Фуг. 6А
9 12 15 18
День
100 80' 60 40' 20 0
Контроль --(c)-10 мг/кг BID -30 МГ/КГ BID -О-100 мг/гг BID
; 1
6--*
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Фиг. 6B "ень
20 мкг/мл
20С мкг/мл
¦у-
Фиг. 5
100 80 60 40 20 0
-#~gD5237 О -15 мг/кг -Л- 5 мг/кг --Ў•-1.7 мг/кг
V А А
100-1
80-
60-
<
У--
40-
I 1
20-
1 1 1
-и"
-(r)--gD:5237 О -15 мг/кг Л '5 мг/кг
-Ў-1,7 мг/кг
12 15 18 21
День
Фиг. 7В
Wisconsin 100 pi.-- i". •-•
-Контроль
¦24 ч,
•48 ч.
• 72 ч.
-т-
-Контроль
-¦24 ч.
~-ш
- -48 ч.
-72 ч.
Victoria
Фиг. 8В
Mass
ЮО-Е
80' 60' 40 20
Фиг. 8D
10 15
День
10 15
День
100
8060-
1008060-1 40 20' 0
Фиг. 9А
10 15
День
Фиг. 9В
10 15
День
100 80
8040200
Фиг. 10 А
6";
10 15
День
-#-Контроль
•0--Tamiflu 46В8
"'О-о
-#-Контроль - -О - Tamiflu --Я--46В8
1-1-*Т--Г"-Г г-I 1 1-T-'"I "' T-"I Г(tm)
r-ntfltDNOP050"-W4tK
Фиг. ЮВ День
100 80 60
40-! 20 0
1°51
1 1°4] о
О 103. О
101,
-Контропь -
- &- 46В8
-Tamiflu -
-V- Комбинация
Фиг. 11А Двнь
День 3 День 4 День 6 Фиг. 11В Дней после инфекции
100 80 60-I 40
204
ЗА.
1 ¦
-#-Контроль •О---Tamiflu 100 мг/кг BID -¦- -46В8 15 мг/кг Комбинация
100-
80' 60-I 40 20-I
-•-Контроль
¦¦О -Tamiflu 100 мг/кг BID
- -Ш- -46В8 15 мг/кг
-Д- Комбинация
Фаг. ?2А
10 15
День
Фаг. ?2В
10 15
День
mAb
CDR LI
CDR L2
CDR L3
CDR HI
CDR H2
CDR H3
34B5A
TGSTSDIGSYNYVS
{SEQ ID NO: 55)
EVSQRPS
(SEQ ID NO: 57)
ASYAGNNIYV
(SEQ ID NO: 59)
GYYIH
(SEQ ID NO: 61}
RT DPNGSGTTYACKFQG
(SEQ ID HO: 64)
WDWNFDLYLGWFDP
(SEQ ID HO: 75)
34B5B
TGSTSDIGSYNYVS !SEQ ID NO: 55)
EVSQRPS
(SEQ ID NO: 57)
ASYAGNNIYV
(SEQ ID NO: 53)
GYYIH
(SEQ ID NO: 61)
RIDPNGAGTTYAQKFQG
(SEQ ID HQ: 65)
WDWNFDLYLGWFDP
(SEQ ID HO: 75)
34B5C
TGSTSDIGSYNYVS {SEQ ID HO: 55)
EVSQRPS
(SEQ ID HO: 57)
ASYAGNNIYV
(SEQ ID HO: 53)
GYYIH
(SEQ ID SO: 61)
RIDPNGAGTTYAQKFQG
(SEQ ID HO: 65)
WDWNFDLYLGWFDP
(SEQ ID NO: 75)
33P8
TGS TS D1GS YN YVS
{SEQ ID SO: 55)
EVSQRPS
(SEQ TD BO: 57)
ASYAGNNIYV
(SEQ ID SO: 59)
AHHHH
{SEQ ID NO: 62)
WIDPNNDGTIYAQKFQG
(SEQ ID HO: 66)
WAWNFDFFLGWFDP
(SEQ ID HO: 76)
46B8A
RSSQSLLRSNGYNYLD
{SEQ ID NO: 56)
LGSHKAS
(SEQ ID NO: 58)
HQALQTPYT
{SEQ ID КО: 60)
SQWIG
(SEQ ID NO: 63)
MMYPGDSDTIYSPSFQG
(SEQ ID NO: 67)
GPGYSGYHYGWFDT
(SEQ ID NO: 7?)
46B8B
RSSQSLLRSNGYNYLD
(SEQ ID HO: 56)
LGSMRAS
(SEQ ID NO: 58)
HQALQTPYT
(SEQ ID NO: 60)
SQWIG
(SEQ ID NO: 63)
MMYPGDADJU YSPSFQG (SEQ ID NO: 68)
GPGYSGYHYGWFDT
(SEQ ID HO: 77)
46B8C
RSSQSLLRSNGYNYLD (SEQ ID HQs 56)
LGSNRAS
(SEQ ID HO: 58)
HQALQTPYT
{SEQ ID NO: 60)
SQWIG
{SEQ ID BO: 63)
MMYPGESETIYSPSFQG
(SEQ ID NO: 69)
GPGYSGYHYGWFDT (SEQ ID HO: 77)
4618D
RSSQSLLRSNGYNYLD
{SEQ ID HO: 56)
LGSNRAS
(SEQ ID HO: 58)
HQALQTPYT
(SEQ ID NO: 60)
SQWIG
(SEQ ID КО: 63)
MMYPGDADTIYSPSFQG
(SEQ ID NO: 70)
GPGYSGYHYGWFDT (SEQ ID NO: 77)
46B8E
SSSQSLLRSNGYMYLD {SEQ ID HO: 56)
LGSMRAS
(SEQ ID NO: 58)
HQALQTPYT
(SEQ ID MO: 60)
SQWIG
(SEQ ID MO: 63)
HMYPGSSDTIYSPSFQG (SEQ ID NO: 71)
GPGYSGYHYGWFDT (SEQ ID HO: 77)
46B8F
RSSQSLLRSNGYNYLD
{SEQ ID HO: 56)
LGSNRAS
(SEQ ID NO: 58)
HQALQTPYT
(SEQ ID NO: 60)
SQKIG
(SEQ ID КО: 63)
MM YPGDSDAIYSPSFQG
(SEQ ID NO: 72)
GPGYSGYHYGWFDT (SEQ ID HO: 77)
46B8G
RSSQSLLRSNGYNYLD
{SEQ ID NO: 56)
LGSNRAS
(SEQ ID NO: 58)
HQALQTPYT
(SEQ ID NO: 60)
SQKIG
(SEQ ID NO: 63)
MMYPGDTDT1YSPSFQG (SEQ ID BOs 73)
GPGYSGYHYGWFDT (SEQ ID NO: 77)
46B8H
RSSQSLLRSNGYNYLD (SEQ ID HO; 56)
LGSNRAS
(SEQ ID NO: 58)
HQALQTPYT
(SEQ ID HO: 60)
SQWIG
(SEQ ID NO: 63)
MMYPGESDT1YSPSFQG (SEQ ID NO: 74)
GPGYSGYHYGWFDT
(SEQ ID NO: 77)
Фиг. 13
Моноклональное антитело 34В5А
Вариабельная область легкой цепи
QSVLTOPPSASGSRGQSlTISCTGSTSDIGSYMYVSWYQQHPGTAPKVlLyKVSQRPSGVPDRb'SGSKSGNTAFLTVSGLQTDDEADyY CASYAGNNJ YVFGSGTKVT {SEQ ID МО; 78)
Вариабельная область тяжелой цепи
QVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYYIHWVRQAPGQGLEWHGRIDPNGSGTTYAQKFQGRVTLTMDTSITTAYMELSRLRFD DTAIYYCARWPWNFDLYLGWFPPWGOGTPVTVAS (SFO ID НО: 79)
Легкая цепь
QSVTiTQPPSASGSRGQSTTTSCTGSTSDTGSYNYVSWYQOHPGTAPKVTIjYKVSQRPSGVPDRFSGSKSGNTAFLTVSGLQTDDEADyY CASYAGNNTYVFGSGTKVTVIJGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATIJVCLTSDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAA SSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ TO NO: 80)
Тяжелая цепь
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPNGSGTTYAQKFQGRVTLTMDTSITTAYMELSRLRFD DTA I YYCARWDV;NKDLYLGWFDPWGOGTPVTVASASTKGPSVFPI.APSSKSTSGGTAALGCt,VKDYFPKPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLOSSGI YSI.SSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSN'TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTI.MISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNKYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLHGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 81)
Фиг, 14
Моноклональное антитело 34В5В
Вариабельная область легкой цели
SVLTOPPSASGSRGQSITISCTGSTSDlGSYMҐVSWyQQHPGTAPKVH,YEVSQRPSGVPDRFSGSKSGNTAFLTVSGLQAEDEADYҐC ASYAGNNIYVFGSGTKVT (SEQ ID NO: 82)
Вариабельная область тяжелой цепи
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYi tTGYYiHWVRQAPGQGbEWMGR1DPNGAGTTYAQKKQGRVTLTMDXSITTAYMKLSRLRFD DTAIYYCARWDWNFDLYLGWFDPWGQGTPVTVAS (SEQ ID NO: 83)
Легкаяцепь
SVLTOPPSASGSRGOSITISCTGSTSDIGSYNYVSWYQQHPGTAPKVILYEVSORPSGVPDRFSGSKSGNTAFLTVSGLOAEDEADYYC ASYAGNNIYVFGSGTKVTVLGOPKAHPTVTLFPPSSEELOANKATLVCLTSDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAAS
SYLSLTPEOWKSHKSYSCOVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEO ID NO; 84)
T"KereMj4enb_
EVQIiVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYTHWVRQAPGQGIjEWMGRIDPNGAGTTYAQKFQGRVTriTHDTSITTAYHEI.SRI> RFD DTAI YYCARWDWNFDLYIiGWFDPWGQGTPVTVASASTKGPSVFPIjAPSSKSTSGGTAALGCIjVKDYFPEPVTVSWNSGATiTSGVHTFPA
?Ь038С1,?ЗЬЗЗУДГТУРЗЗЗЬСТ0ТТТСНУШКРЗМТКУОКК?ЕРКЗСОКТНТСРРСАРЕ1,ЬССРЗ?РЬРРРКРКОТШТ5КТРЕУТСУ VVDVSHEDPEVKFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAXJPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWOQGNVFSCSVMHEAI.HNHYTOKSLSI.SPGK (SEQ ID MO: 85)
Фиг. 15
Моноклональное антитело 34В5С
Вариабельная область легкой цепи
SALTQPPSASGSRGQSITISCTGSTSDIGSiNXVSWfQQHPGTAPKVlLYEVSQRPSGVPDRFSGSKSGHTAFLTVSGLQAEDEADyYC ASYAGNNIYVFGSGTKVT (SEQ ID КО! 86)
Вариабельная область тяжелой цепи
HVQLVOSGAEVKKPGASVK VSCKASGYIFTGYYI HV.'VRQAPGQGLEWMGR 1DPNGAG'TT YAQKFQGKV'f L'I'MDTS ITT'AYMLLSRLRFD DTAiYYCARWDWNFDLYLGWFDPWGQGTPVTVAS (SEQ ID SO: 83)
Лажая цепь
SALTOPPSASGSRGQSITISCTGSTSDIGSyNYVSWYQOHPGTAPKVILYEVSQRPSGVPDRFSGSKSGNTAFLTVSGLQAEDEADYYC AS YAGNNI Y'VFGSGTKVTVI,GOPKAN'PTVTI,FPr.SSKKLOANKATI,VCI,ISDFYPGAV"TVAWKAi)SSPVKAGVETTTPSK0SNNKYAAS
SYLSLTPEQWKSHKSYSCOVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID HO: 8?)
Тяжелая цепь _
EVQI,VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYYIHWRQAPGQGI,EWHGRTDPNGAGTTYAQKFQGRҐTLTMDTSITTAYMELSRLRFD ОТА1У?САНИОтаРВЬУ1,СИРОРйС0СТРУТ?АЗА5ТКСР5?РРЬАР35К8Т8СЙТААШСШКО?КРЕР?Т?ЗШН5САТТ5СУНТРРА VI ҐVҐDҐSHEDPEҐKFNWYҐDGVEVHNAKTKPREEQYMSTҐRҐVSҐLTVLHQDtiJLNGKEYKCKҐSHKAI,PAPIEKTISKAKGQPREPQҐYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEHHYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID HOs 88}
Фиг. 16
Моноклональное антитело 33F8
Вариабельная область легкой цепи
QSVLTQPPSASGSRGQSITiSCTGSTSDlGSYNYVSWYQQHPGTAPKVILtEVSQRPSGVPDRFSGSKSGNTAFLTVSGLQTDDEADYlf CASYAGNNIYVFGSGTKVT (SEQ ID MO: 78)
Вариабельная область тяжелой цепи
OVQLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTHJAKHMHV.'VRQAPGQGLGWMGWl DPNNDGT1 YAOKFQGRV'f LTMDTSI HTAYKLLSGLRYD DTAIYYCVRWAWNFDFFLGWFDPWGQGTLVTVAS (SEQ ID NO: 89)
Легкая цепь
OSVLTOPPSASGSRGOSITISCTGSTSDIGSYNYVSWYQQHPGTAPKVILYEVSQRPSGVPDRFSGSKSGNTAFLTVSGLOTDDEADYY CASYAGNNIYVFGSGTKVTVLGOPKANPTVTLFPPSSEELOANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAA SSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 80)
Т яж 6 це п ь
QVQIiVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNAHHMHWVRQAPGQGIjGWHGWTDPNNDGTTYAQK FQGRVTtiTMDTSIHTAYMEIiSGIiRYD
ОТАТУУСУКМАШРОРРТ.СНРОРМСОСТЮТУАЗАЗТКСРЗУРР^АРЗЗКЗТЗССТААЬССЬУКОУРРЕРОТУЗШШСАТТЗбУНТГРА VIiQSSGLYSbSSWTVPSSSLGTQTYICSVHHKPSNTKVBKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRKFQYNSTYRVVSVI.TVI HODWLNGKEYKCKVSNKAI PAPIFKTISKAKGQPREPQVYT
LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENMYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGHVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 90)
Фиг. 17
Моноклональное антитепо 46В8 &
Вариабельная область легкой цепи
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLRSNGYNVLDWyLQKPGQSPQLHYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG VYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIK {SEQ ID NO: 91)
Вариабельная область тяжелой цепи
EVQLVQSGAEVKKPGESLKlSCKVSGYSf'rSQWIGWVRQMPGKGLEWIGWiYPGDSDTIYSPStOGQVTISADNSlSTAYLQWSSLKAS DTAi YYCASGPGYSGYHYGWFDTWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 92)
Легкая цепь
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLRSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSKRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG VYYCHQALQTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 93)
EVQLVQSGAEVKKPGESI.K ISCKVSGYSF"! SQWIGWVRQNPGKGI.EWIGMM YPGDSDTI YSPSFQGQVT ISADNS ISTAYLQWSSLKAS DTAIYYCASGPGYSGYHYGViFDTWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAI/rSGVH'IFPA VLQSSGLYSLSSVVI'VPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLHISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVtXiVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVI.HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPlEKTlSKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPtNNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 94)
Фиг. 18
Моноклональное антитело 46В8В
Вариабельная область легкой цепи
DI VMTQSPLSLPVTPGEPAS I SCRSSQSLI.RSNGYNYLDKYLQKPGQSPQLL I YLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG
VYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID HO: 31)
Вариабельная область тяжелой цепи
EVQI/v'QSGAEVKKPGESLKlSCKVSGYSFTSQVaGWVkQMPGKGLEV.'IGMMYPGDADAlYSPSKQGQVTlSADNS ISTAYLQWSSLKAS DTA I Y'YCAS GPG YSGYH YGW FDTWGQGTLVTVS S (SEQ ID MO: 95)
Легкая цепь
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLRSNGYRYLDWYLQKPGQSPQLL1YLGSURASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG VYYCMOALOTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSOESVTEQDSKDSTY SLSSTIJTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC (SEO ID NO: 93)
Тяжелая цвг"ь
EVQLVQSGAF.VKKPGEST.KTSCKVSGYSFTSQWT GWVRQMPGKGIJEWTGMMYPGDADATYSPSFQGQVTTSADNSTSTAYLQWSSIJKAS DTA I YYCASCJJGYSGYH YGWFDTWClQXTri.VTVSSASTTGPSVFPT.APSSKSTSGGTAAI.GCI VKDYFPKPVTVSWNSGALTSCiVH TFPA VLQSSGTJYSLSSVVTVPSSSIIGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFIIFPPKPKDTLMISRTPEVTC VWDVSHFDPEVKFNWYVrXIVEVHNAKTKF'REEQYNSTYRVVSVI/I'VI HQDV"T,NGKEYKCKVSNKAI.PAPIEKTISKAKGQF'REPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENMYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 36)
Фиг, 19
Моноклональное антитело 4638с
Вариабельная область легкой цепи
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLRSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG VYYCMQAI.QTPYTFGQGTKl.KIK (SEQ ID HO: 31)
Вариабельная область тяжелой цепи
EVQLVQSGAEVKKPGESLK1SCKVSGYSFTSQW1GWVRQMPGKGLEW1GMHYPGESET1YSPSFQGQVT1SADNSISTAYLQWSSLKAS DTAIYYCASGPGYSGYHYGWFDTWGQGTLVTVSS (SEQ ID HQ: 37)
Легкая цепь
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLRSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG VYYGMQALQTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQIiKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALOSGNSQESVTEQDSKDSTY
SI.SSTIJTI.SKADYFKHKVYACF.VTHOGI.SSPVTKSFNRCiKC (SEQ ID NO: 93)
Тяжелая цепь
EVQLVQSGAEVKKPGESI.KTSCKVSGYSFTSQWTGWVRQMPGKGIIEWTGMMYPGESETTYSPSFQGQVTTSADNSTSTAYLQWSSIJKAS DTAIYYCASGPGYSGYHYGWFDTWGQGTIiVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCItVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT
LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEMHYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NOt 98)
Фиг. 20
Моноклональное антитело 46B8D
Вариабельная область легкой цепи
DI VMTQSPLSLPVTPGEPAS I SCRSSQSLI.RSNGYNYLDKYLQKPGQSPQLL I YLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG VY YCMQALQTP YTFGQGTKLE IК { SEQ ID HO: 31)
Вариабельная область тяжелой цепи
EVQLVQSGAF.VKKPGESLK1SCKVSGYSETSQVtIGWVRQHPGKGLEWiGHMYPGDAD1IYSPSFQGQVT1SADNSISTAYLQWSSLKAS DTAIYYCASGPGYSGYHYGWFDTWGQGTLVTVS S (SEQ ID MO: 33)
Легкая цепь
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLRSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLK!SRVEAEDVG VYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 93)
Тяжелая цепь
KVQLVQSGAKVKKPGESI.KISCKVSGYSFTSQWTGWVRQHPGKGLEWIGMHYPGDADTTYSPSFQGQVTTSADNSTSTAYLQWSSIJKAS DTAIYYCASGPGYSGYHYGWFDTWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPIiAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLQSSGLYSLSSWTVPSSSTGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC
VWDVSHEDPEVKFHWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSRF:EKTKNQVSLTCIVKGFYPSDIAVEWESNC^PENNYKTTPPVI.DSDGSFFLYSKI.TVDKSRWQQGNVFSCSVHHEALHNHYTQK
SLSLSPGK (SEQ ID NOt 100}
Фиг. 21
Моноклональное антитело 46В8Е
Вариабельная область легкой цепи
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLI.RSNGYNYLDKYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG VYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 31)
Вариабельная область тяжелой цепи
EVQLVQSGAEVKKPGESLK1SCKVSGYS1-TSQWIGV.'VKQMPGKGLEWIGMMYPGSSDIIYSPSFQGQVT1SADNSISTAYLQWSSLKAS DTAIYYCASGPGYSGYHYGWFDTWGQGTLVTVSS (SEQ ID MO: 101)
Легкая цепь
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLI.RSNGYN YLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG VYYCHOALOTPYTFGQGTKI,EIKRTVAAPSVFIFPPSDEOI.KSGTASVVCIT.NNFYPRKAKVQV;KVDNAI,OSGNSQFSVTFQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 93)
Тяжелая цепь
EVQT.VQSGAEVKKPGESI.KTSCKVSGYSFTSQWTGWVRQMPCKGLFWTGMMYPGSSNTT YSPSFQGQVT TSADNSTSTA YT.QWSSI.К AS DTATYYCASGPGYSGYHYGWFDTWGQGTI VLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHFDPEVKFNWYVrXWEVHNAKTKPRFEQYNSTYRVVSVLTVIHQDKT.NGKFYKCKVSNKAI.PAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREENTKNQVSI.TCr.VKGFYPSDIAVKV;ESNGQPENNYKTTPPVI.DSDGSFFLYSKI.TV[^SRWQQGNVFSCSVHHEALHNHYTQK
SLSLSPGK (SEQ ID NOз 102)
Фиг. 22
Моноклональное антитело 46B8F
Вариабельная область легкой цепи
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLKSNGYNYLDKYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG
VYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 91)
Вариабельная область тяжелой цепи
EVQLVQSGAEVKKPGESLK ISCKVSGYSFTSQWIGVA'RQMPGKGLEW1GMHY PGUSDAIYSPSFQGQVTISADNS1STAYLQWSSI.KAS DTA1YYCASGPGYSGYHYGWFDTWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 103)
Легкая цепь
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSOSLLRSNGyMYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSHRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG VYYCHOALOTPYTFGQGTKT.KIKRTVAAPSVFIFPPSDEOI.KSGTASVVCI.LNNFYPRKAKVOWKVDNALOSGNSOKSVTFODSKDSTY SLSSTT.TLS К ADYEKHKVYACEVTHOGl.SSPVTKSFNRGFC (SEQ ID NO: 93)
Тяжелая цепь
EVQLVQSUAKVKRPGKSI.KISCKVSGYSFTSQHTGWVROMPGKGLEWTGMMYPGDSDATYSPSFQGQVTTSADNSTSTAYLQWSSLKAS DTATYYCASGPGYSGYHYGWFDTHGQGTIJVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAI.GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVnVSHFDPf;VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVI HQDWLNGKFYKCKVSNKAI.PAPTEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSRF.EHTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENHYKTTPPVI.DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVNtlFALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 104}
Фиг. 23
Моноклональное антитело 46B8G
Вариабельная область легкой цепи
DI VMTQSPLSLPVTPGEPAS I SCRSSQSI.I.RSNGYNYLDKYLQKPGQSPQLL I YLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVG VYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 91}
Вариабельная область тяжелой цепи
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKVSGYSFTSQWIGWVRQMPGKGLEWIGMMYPGDTDTIYSPSFQGQVTISADNS1STAXLQWSSLKAS DTA1YYCASGPGYSGYHYGWFDTWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 105)
Легкая цепь g
DlVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLRSNGYHYLDWYLQKPGQSPOLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG -~
VYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY fo
SI.SSTLTLSKAOYFKHKVYACEVTHQGI.SSPVTKSFNRGFC (SEQ ID NO: 93)
Тяжелая цепь _
EVQIiVQSGAEVKKPGESLKTSCKVSGYSFTSQWTGWVRQMPGKGLEWTGMMYPGDTDTTYSPSFQGQVTTSADNSTSTAYLQWSSIiKAS DTATYYCASGPGYSGYHYGWFDTWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPIiAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VTiQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVD <;VEVHNAKTKPREFQYNSTYRVVSVI,TV1.HQDV.T,NGKEYKCKVSNKAI,PAPT EKT ISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 106)
Фиг. 24
Моноклональное антитело 46В8Н
Вариабельная область пегкой цепи
DlVMTQSPLSLPVTPGEPAS I SCRSSQSI.LRSNGYNYLDKYLQKPGQSPQLL I YLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLK ISRVEAEDVG VYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIK {SEQ ID NO: 91}
Вариабельная область тяжелой цепи
KVQLVQSGAEVKKPGESLK1SCKVSGYSFTSQW1GWVRQHPGKGLEW1GMMYPGESDTIYSPSFQGQVTISADNS1STAXLQWSSLKAS
DTA 1? YCASGPGY SGYHYGWFD'TWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 107)
Легкая цепь
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLRSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG VYYCMQALOTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNMFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 93)
Тяжелая цепь
KVQLVQtiUAKVKKPGEST.KTSCKVSGYSFTSQWTGWVRQMPGKGLEWTGMMYPGESDTTYSPSFQGQVTTSADNSTSTAYLQWSSIiKAS DTATYYCASGPGYSGYHYGWFDTWGQGTIiVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VT.QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYTCHVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE'SESKGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NOt 108}
Фиг. 25
40-
.gD:5237 72 ч.э1
¦ 46В8 24 ч. PI
¦ 46В8 48 ч. PI •46В8 72ч.Щ
Фиг. 26А
День
140-1
120'
100-
# 80-
• I I I I I • I * I i I I ¦ "f1 к:
"- т- Фиг. 26В
День
<110> ДЖЕНЕНТЕК, ИНК. И ДР.
<110> ДЖЕНЕНТЕК, ИНК. И ДР.
<400> 8
caggtgcagc tgcaggagtc gggccc
<400> 8
caggtgcagc tgcaggagtc gggccc
<220>
<220>
<400> 22
cagcctgtgc tgactcagcc aacttc 26
<210> 27 <211> 20
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер"
<400> 31
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacagatcac cttgaaggag tctggtccta cgctggtg 98
праймер"
<400> 31
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacagatcac cttgaaggag tctggtccta cgctggtg 98
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический
<400> 35
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cagaggtgca gctggtgcag tctggagcag aggtgaaaaa g 101
<400> 35
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cagaggtgca gctggtgcag tctggagcag aggtgaaaaa g 101
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер"
<400> 39
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cagatattgt gatgactcag tctcactctc cctgc 95
праймер"
<400> 39
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cagatattgt gatgactcag tctcactctc cctgc 95
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер"
<400> 43
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cagaaattgt gctgactcag tctccagact ttcg 94
праймер"
<400> 43
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cagaaattgt gctgactcag tctccagact ttcg 94
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер"
<400> 47
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacagcctgt gctgactcar tcvccctc 88
праймер"
<400> 47
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacagcctgt gctgactcar tcvccctc 88
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический
<220>
<221> источник
<223> /примечание=" Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер"
<400> 51
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacagactgt ggtgacccag gagcc 85
праймер"
<400> 51
ccaccatggg atggtcatgt atcatccttt ttctagtagc aactgcaact ggagtacatt 60 cacagactgt ggtgacccag gagcc 85
<400> 55
Thr Gly Ser Thr Ser Asp Ile Gly Ser Tyr Asn Tyr Val Ser
<400> 55
Thr Gly Ser Thr Ser Asp Ile Gly Ser Tyr Asn Tyr Val Ser
<210> 60
<210> 60
<210> 60
<210> 60
Gly
Gly
Gly
Gly
<221> источник
<221> источник
<220>
<221> источник
<220>
<221> источник
Ala Arg Trp Asp Trp Asn Phe Asp Leu Tyr Leu Gly Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Ala Arg Trp Asp Trp Asn Phe Asp Leu Tyr Leu Gly Trp Phe Asp Pro
100 105 110
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Ala Gly Asn Asn
85 90 95
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Ala Gly Asn Asn
85 90 95
Ile Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Ile Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro
100 105 110
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Met Asp Thr Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Met Asp Thr Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Phe Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Phe Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Phe Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Ala Gly Asn Asn
85 90 95
Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Ala Gly Asn Asn
85 90 95
180
185
190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
180
185
190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
<400> 90
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Ser
20 25 30
10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Ser
20 25 30
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
<400> 96
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
<400> 96
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
100
110
105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
100
110
105
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys 450
Leu Ser Pro Gly Lys 450
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Tyr His Tyr Gly Trp Phe Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys 450
Leu Ser Pro Gly Lys 450
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Gln
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
108
108
109
112
112
120
1/22
120
1/22
120
1/22
120
1/22
120
1/22
120
1/22
120
1/22
120
1/22
3/22
3/22
3/22
3/22
3/22
3/22
5/22
