(57) Реферат / Формула:
В настоящем изобретении предлагается усовершенствованный способ очистки целевого гонадотропина из неочищенной смеси, содержащей по меньшей мере один загрязняющий белок. Способ очистки целевого гонадотропина согласно настоящему изобретению включает применение аффинной хроматографии в качестве первой стадии колоночной очистки перед применением каких-либо стадий колоночной хроматографии для дополнительной очистки. Такой способ очистки может дополнительно включать стадию ионообменной хроматографии и/или хроматографии гидрофобного взаимодействия с получением по существу очищенного белка гонадотропина белка с целевым профилем изоформ.
Евразийское (2D 201691834 (13) А1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K14/59 (2006.01)
2017.02.28
(22) Дата подачи заявки 2015.04.17
(54) НОВЫЙ СПОСОБ ОЧИСТКИ ГОНАДОТРОПИНА
(31) 1398/MUM/2014
(32) 2014.04.18
(33) IN
(86) PCT/IN2015/000175
(87) WO 2015/159309 2015.10.22
(71) Заявитель:
КАДИЛА ХЕЛЗКЭР ЛИМИТЕД (IN)
(72) Изобретатель: Мендиратта Санджив Кумар, Бандиопадхиай Санджай, Сингх Аваниш К., Редди Митхра С. (IN)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) В настоящем изобретении предлагается усовершенствованный способ очистки целевого гона-дотропина из неочищенной смеси, содержащей по меньшей мере один загрязняющий белок. Способ очистки целевого гонадотропина согласно настоящему изобретению включает применение аффинной хроматографии в качестве первой стадии колоночной очистки перед применением каких-либо стадий колоночной хроматографии для дополнительной очистки. Такой способ очистки может дополнительно включать стадию ионообменной хроматографии и/или хроматографии гидрофобного взаимодействия с получением по существу очищенного белка гонадотропина белка с целевым профилем изоформ.
2420-537807ЕА/045 НОВЫЙ СПОСОБ ОЧИСТКИ ГОНАДОТРОПИНА
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
В настоящем изобретении предлагается усовершенствованный способ очистки целевого гонадотропина из неочищенной смеси, содержащей по меньшей мере один загрязняющий белок. Способ очистки целевого гонадотропина согласно настоящему изобретению включает применение аффинной хроматографии в качестве первой стадии колоночной очистки перед применением стадий любой колоночной хроматографии для дальнейшей очистки. Такой способ очистки может дополнительно включать стадию ионообменной хроматографии и/или хроматографии гидрофобного взаимодействия с получением по существу очищенного белка гонадотропина с целевым профилем изоформ.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Фолликулостимулирующий гормон представляет собой
гетеродимерный гликопротеин, состоящий из альфа (92 аминокислоты) и бета (111 аминокислот) субъединиц. Гликозилирование происходит на конкретных участках обеих, альфа-и бета-субъединицах. Фолликулостимулирующий гормон контролирует фолликулярный рост яичников у женщин и демонстрирует важную роль в стимулировании сперматогенеза у мужчин. Фолликулостимулирующий гормон показан для следующих терапевтических применений -
Ановуляция у женщин
Контролируемая гиперстимуляция яичников для индуцирования развития множественных фолликулов у женщин для in vitro оплодотворения (ЭКО)/переноса эмбрионов (ПЭ)
Фолликулостимулирующий гормон в комбинации с ЛГ рекомендуется для стимуляции развития фолликулов у женщин
У мужчин с гипогонадотропным гипогонадизмом с сопутствующей терапией ХГЧ.
Авторы настоящего изобретения разработали собственными силами рекомбинантный р-чФСГ или Фоллитропин с помощью технологии р-ДНК с использованием генетически сконструированных клеток СНО в качестве системы-хозяина.
Настоящее изобретение относится к очистке гонадотропинов.
Есть несколько способов очистки, известных в предшествующем
уровне техники для очистки гонадотропинов. Такие способы очистки
включают применение высокоэффективной жидкостной хроматографии
(ВЭЖХ), которая является дорогостоящей и требует большого
количества органического растворителя во время работы (например,
патентный документ WO2006/051070). Высокая стоимость
оборудования и требования большого избытка органических растворителей являются основными ограничения в случае очистки гонадотропина(ов) с помощью ВЭЖХ в промышленном масштабе.
WO2007/065918 раскрывает способ очистки ФСГ или ФСГ-мутанта, включающий стадии воздействия на жидкость, содержащую указанный ФСГ или ФСГ-мутант: (1) аффинной хроматографии со сродством к красителю; (2), слабой анионообменной хроматографии (3) хроматографии гидрофобного взаимодействия; и (4) сильной анионообменной хроматографии; которые могут быть проведены в любом порядке. Это включает необязательную стадию захвата перед первой стадией очистки с использованием в виде стадии (0) аффинной хроматографии со сродством к красителю.
Аффинная хроматография со сродством к красителю представляет собой процедуру очистки белков, основанную на аффинности иммобилизованных красителей к сайтам связывания на множестве белков. Этот метод хроматографии является неспецифичным. Иммобилизованный краситель может неспецифично связываться с гликозилированной молекулой белка. Еще одним недостатком этого метода очистки является то, что может произойти совместное элюирование других белков подобного типа, присутствующих в неочищенной смеси вместе с белком, представляющим интерес. Кроме того, существует также возможность совместного элюирования молекулы красителя или ее части вместе с целевыми частями. Таким образом, это не обеспечивает удовлетворительного уровня чистоты целевого белка. Основным недостатком этих синтетических красителей является то, что процесс выбора для конкретной биомолекулы является эмпирическим и требует процессов обширного скрининга во время разработки метода. При этом настоящее изобретение не включает стадию
аффинной хроматографии со сродством к красителю. Таким образом, в способе очистки, описанном здесь, избегают химического загрязнения красителями или модифицированными красителями.
В W0 2005/063811 раскрыт способ очистки рекомбинантного человеческого ФСГ или варианта ФСГ, включающий стадии ионообменной хроматографии; хроматографии с иммобилизованным ионом металла; и хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), которые могут быть выполнены в любом порядке.
Способ, описанный в настоящем изобретении для очистки гонадотропина, не включает использование ВЭЖХ. Таким образом, настоящее изобретение раскрывает простой и экономически эффективной с высокой степенью масштабируемости, промышленно жизнеспособный и экологически благоприятный способ очистки для получения высокоочищенных гонадотропинов. Способ очистки, раскрытый в настоящем изобретении, также может быть использован для очистки смеси гонадотропинов из неочищенной смеси.
Целью данного изобретения является предложение нового
предпочтительного способа очистки рекомбинантного ФСГ или его
функциональных вариантов. В настоящем изобретении раскрыт новый
способ очистки рекомбинантного человеческого
фолликулостимулирующего гормона, где не используется стадия ВЭЖХ.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предлагается способ очистки гонадотропинов из неочищенной смеси. Неочищенная смесь может включать загрязняющие белки, эндогенные белки, вещества, связанные с продуктами, и другие примеси в дополнение к целевому белку.
В одном аспекте, в настоящем изобретении предлагается способ очистки гонадотропинов из неочищенной смеси, включающий ряд стадий хроматографии, которые не включают ВЭЖХ.
В одном воплощении, в настоящем изобретении предлагается способ очистки гонадотропинов, выделенных из клеточных культур, из неочищенной смеси с помощью аффинной колоночной хроматографии, сначала путем захвата, а затем элюирования белка из колонки с высоким уровнем чистоты. Неочищенная смесь может
включать загрязняющие белки, выделенные из клетки-хозяина, вещества, связанные с продуктом, и другие примеси в дополнение к примесям интересующего белка.
Настоящее изобретение также демонстрирует удаление большинства загрязняюющих белков клетки-хозяина с помощью аффинной хроматографии, элюируя интересующий белок из колонки при условиях буфера с нейтральным рН или при условиях кислого рН с максимальным извлечением.
В одном из воплощений, настоящее изобретение также демонстрирует, что молекулярная целостность целевого белка гонадотропина после элюирования с аффинной колонки в условиях нейтрального или кислого рН остается неизменной в течение по меньшей мере, примерно 2 4 часов по оценкам с помощью аналитической HP-SEC.
В одном из воплощений, в настоящем изобретении также предлагается очистка гонадотропинов с целевыми изоформами в режиме связывания с помощью анионообменной колоночной хроматографии.
В другом воплощении, в настоящем изобретении предлагается удаление остаточных примесей, связанных с процессом и с продуктом, из целевой фракции белка с помощью колоночной хроматографии гидрофобного взаимодействия в режиме связывания-элюирования. Элюирование целевого белка проводят при более низкой проводимости либо в линейном режиме, либо постадийно.
В предпочтительном воплощении, очистка целевого гонадотропина, полученного из неочищенной смеси, осуществляется в соответствии со следующими стадиями:
1. Аффинная хроматография
2. Анионообменная колоночная хроматография с последующими другими подходящими методами очистки, которые известны специалисту в данной области техники и которые не включают ВЭЖХ.
В другом воплощении, очистка целевого гонадотропина, полученного из клеточной культуры, осуществляется в соответствии со следующими стадиями очистки:
1. Аффинная хроматография
2. Анионообменна колоночная хроматография
3. Хроматография гидрофобного взаимодействия
Стадия хроматографии гидрофобного взаимодействия может быть выполнена в любом порядке после стадий аффинной хроматографии. Способ очистки, описанный в настоящей заявке, может быть дополнительно осуществлен с помощью любого метода очистки, который известен специалисту в данной области техники, и который не включает ВЭЖХ.
Такие методы очистки включают диафильтрацию, любую колоночную хроматографию, нанофильтрацию, любой другой известный метод очистки.
Сокращения, используемые в настоящем описании, определены
ниже:
Аффинная Матрица: Аффинная колоночная очистка АЕХ: Анионообменная колоночная хроматография DF: диафильтрация
HIC: Колоночная хроматография гидрофобного взаимодействия HP-SEC: Высокоэффективная эксклюзионная хроматография HPL: Высокоэффективная жидкостная хроматография м-ХГЧ: ХГЧ мочи м-ФСГ: ФСГ мочи
MWCO: отсечка по молекулярной массе NaCl: хлорид натрия UF: ультрафильтрация WFI: вода для инъекций КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фигуре 1 представлен профиль элюирования р-чФСГ из неочищенной смеси с помощью стадии аффинной колоночной хроматографии, используемой в способе очистки.
На Фигуре 2 представлен полипептидный профиль р-чФСГ, элюированного с колонки, с помощью SDS-PAGE в не восстанавливающих условиях.
На Фигуре 3 представлен профиль элюирования р-чФСГ с помощью стадии колоночной хроматографии АЕХ, используемой в способе очистки.
На Фигуре 4 представлена чистота р-чФСГ, очищенного на анионообменной колонке с помощью HP-SEC. На фигуре продемонстрирована чистота с помощью единственного пика р-чФСГ.
На Фигуре 5 представлен хроматографический профиль элюирования р-чФСГ с помощью HIC-хроматографии, используемой в способе очистки.
На Фигуре б представлена чистота р-чФСГ, очищенного с помощью HIC методом аналитической HP-SEC. На фигуре продемонстрирована чистота с помощью единственного пика р-чФСГ.
На Фигуре 7 представлена чистота лекарственного вещества р-чФСГ с помощью HP-SEC.
На Фигуре 8 представлен профиль элюирования м-ХГЧ из неочищенной смеси с помощью стадии аффинной колоночной хроматографии, используемой в способе очистки.
На Фигуре 9 представлен профиль элюирования м-ХГЧ с помощью стадии колоночной хроматографии АЕХ, используемой в способе очистки.
На Фигуре 10 представлен полипептидный профиль м-ХГЧ с помощью SDS-PAGE в не восстанавливающих условиях.
На Фигуре 11 представлен полипептидный профиль очищенного м-ФСГ с помощью SDS-PAGE. На Фигуре 12 представлена чистота м-ФСГ с помощью HP-SEC.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предлагается новый способ очистки для целевого гонадотропина, предпочтительно ФСГ или его функциональных вариантов.
В одном из воплощений, в настоящем изобретении предлагается способ очистки гонадотропина(ов) из неочищенной смеси, включающий применение сначала аффинной хроматографии с последующим применением других стадий колоночной хроматографии, которые не включают ВЭЖХ. Неочищенная смесь может включать загрязняющие белки, эндогенные белки, вещества, связанные с продуктами, и другие примеси дополнительно к целевому белку.
В одном из воплощений, в настоящем изобретении предлагается новый способ очистки гонадотропина(ов), включающий применение стадий аффинной и ионообменной хроматографии. Ионообменная
хроматография может быть анионообменной колоночной
хроматографией или катионообменной колоночной хроматографией.
В одном из воплощений, колоночную матрицу для стадии аффинной хроматографии выбирают из ФСГ-специфической и гонадотропин-специфической аффинной матрицы. В другом воплощении, колоночную матрицу для стадии анионообменной хроматографии выбирают из ДЭАЭ-сефарозы, Mono Q- и Q-сефарозы XL, предпочтительно выбирают Q-сефарозу.
В предпочтительном воплощении, способ очистки
гонадотропина(ов) включает следующие хроматографические стадии:
1. Аффинная хроматография
2. Анионообменная или катионообменная колоночная
хроматография
3. Н1С-хроматография
Такие стадии колоночной хроматографии могут быть выполнены в любом порядке.
В другом воплощении, в настоящем изобретении предлагается удаление остаточных примесей, связанных со способом и с продуктом, из целевой белковой фракции с помощью колоночной хроматографии гидрофобного взаимодействия в режиме связывания-элюирования. Элюирование целевого белка проводят в градиенте понижения концентрации соли в виде основного пика.
В следующем воплощении, матрицу колонки для хроматографии
гидрофобного взаимодействия выбирают из фенилсефарозы,
бутилсефарозы, октилсефарозы, предпочтительно, выбирают
фенилсефарозу.
В дополнительном воплощении, соль для элюирования целевого белка на стадии хроматографии гидрофобного взаимодействия выбирают из сульфата аммония, хлорида натрия, хлорида аммония и сульфата натрия, предпочтительно, выбирают сульфат аммония.
В еще более предпочтительном воплощении, очистку гонадотропина(ов) из неочищенной смеси осуществляют в соответствии со следующими стадиями:
- Стадия 1: Разделение клеток и восстановление условий
- Стадия 2: Аффинная колоночная хроматография
- Стадия 3: вирусная инактивация
- Стадия 4: ультрафильтрация-диафильтрация и восстановление условий (UF/DF)
- Стадия 5: анионообменная колоночная хроматография (АЕХ)
- Стадия б: Восстановление условий
Стадия 7: колоночная хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)
- Стадия 8: Ультрафильтрация-диафильтрация
- Стадия 9: Выведение вирусов с помощью нанофильтрации
- Стадия 10: Микрофильтрация
- Стадия 11: Хранение в замороженном состоянии
В другом воплощении, очистка целевого гонадотропина, полученного из неочищенной смеси может осуществляться без применения стадий хроматографии HIC.
В следующем воплощении среду диафильтрации выбирают из воды, буфера Tris-Cl, цитратного буфера, фосфатного буфера, сукцинатного буфера, ацетатного буфера и их комбинации.
В предпочтительном воплощении, гонадотропин выбирают из фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ) , хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) и их подходящей комбинации.
В более предпочтительном воплощении гонадотропин выбирают из р-чФСГ, м-ФСГ, р-чЛГ, м-ЛГ, р-ХГЧ и м-ХГЧ.
Стадии колоночной хроматографии согласно настоящему изобретению описаны более подробно ниже:
I) Аффинная колоночная хроматография:
Осветленную надосадочную жидкость после восстановления условий пропускают через гонадотропин-специфичную матрицу аффинной колонки для селективного захвата целевого гонадотропина из неочищенной смеси. До начала элюирования целевого белка аффинную матрицу подвергают промежуточной промывке колонки. Целевой белок элюируют из колонки при приблизительно нейтральном рН.
II) Анионообменная колоночная хроматография
После диафильтрации раствор, содержащий рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон, загружают на анионообменную колонку для дополнительной очистки целевого белка с целевым
профилем изоформ. Эту колоночную стадию проводят в режиме
связывания-элюирования и выполняют, главным образом, для
удаления нежелательных изоформ рекомбинантного
фолликулостимулирующего гормона, выделяя при этом указанный белок с целевыми изоформами. Белки загружают на колонку при рН примерно 8 для связывания с матрицей. Матрицу колонки промывают тем же уравновешивающим буфером для удаления несвязанных примесей. После промывки уравновешивающим буфером, проводят вторую промывку буфером с рН ниже, чем рН исходного уравновешивающего буфера. Впоследствии, проводят третью промывку при кислом рН в присутствии NaCl. Колонку повторно уравновешивают уравновешивающим буфером и элюирование целевого белка осуществляют с увеличением проводимости. Для проведения анионообменной хроматографии в соответствии с настоящим изобретением, другие анионообменные смолы, которые также могут использоваться, могут быть выбраны из ДЭАЭ-сефарозы, Mono Q-, Q-сефарозы XL, и тому подобное. Анионообменную смолу, Q-сефарозу, использовали в настоящем изобретении.
III) Колоночная хроматография гидрофобного взаимодействия: Очистку целевого белка гонадотропина из смеси, содержащей по меньшей мере одну нежелательную примесь, проводят с помощью колоночной хроматографии гидрофобного взаимодействия в режиме связывания-элюирования. После завершения загрузки белка на колонку, целевой белок гонадотропин элюируют из колонки в градиенте понижения концентрации соли, т.е. со снижением проводимости по сравнению с проводимостью уравновешивающего буфера. Элюирование целевого белка гонадотропина происходит в виде одного пика. Элюированный белок собирают во фракции, и фракции, имеющие целевой уровень чистоты, объединяют вместе. Для проведения колоночной хроматографии гидрофобного взаимодействия в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться HIС-смолы, типа фенилсефарозы, бутилсефарозы 4 FF, октилсефарозы и т.д..
Аналитический метод, используемый в настоящем изобретении: HP-SEC: Аналитическую эксклюзионную хроматографию (HP-SEC) осуществляют с использованием колонки TSK-3000, уравновешенной
натрий-фосфатным буфером с рН 6,7, содержащим сульфат натрия. Белок элюировали в изократическом режиме при 0,5 мл/мин.
Стадии очистки согласно настоящему изобретению описаны более подробно ниже:
Примеры:
Здесь настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами, не ограничивающими его, которые не следует рассматривать как ограничение объема изобретения каким-либо образом:
Пример 1: Очистка рекомбинантного ФСГ
Стадия 1: Разделение клеток и восстановление условий
После сбора партии, клетки отделяли от культурального бульона, сначала с помощью центрифугирования с последующей глубокой фильтрацией с целью получения прозрачной надосадочной жидкости, содержащей белок, представляющий интерес, наряду с другими растворимыми примесями. Центрифугирование проводили примерно при 10000 g х 30 мин. Глубокую фильтрацию осуществляли с использованием мембраны 0,45^-0,22 мкм для дополнительного осветления. Очищенную надосадочную жидкость восстанавливали для работы при условиях уравновешивающего буфера следующей аффинной колонки, например, рН и проводимость. Эта стадия не потребуется, когда гонадотропин, полученный из мочи, будет очищен.
Стадия 2: Аффинная колоночная хроматография
Осветленную надосадочную жидкость после восстановления пропускали через матрицу аффинной колонки для селективного захвата целевого белка. До начала элюирования целевого белка аффинную матрицу подвергали промежуточной промывке колонки. Целевой белок элюировали из колонки при приблизительно нейтральном рН. Профиль колоночной хроматографии представлен на Фигуре 1. Аффинно-очищенный белок демонстрирует чистоту в виде единственной полосы в геле при анализе с помощью SDS-PAGE, как показано на Фигуре 2.
Стадия 3: Ультрафильтрация-диафильтрация и восстановление условий
Белок, элюированный с аффинной колонки, восстанавливали с помощью UF/DF с использованием мембранного фильтра с отсечкой MWCO 10 кДа против буфера низкой ионной силы Tris-Cl, рН 7, с тем, чтобы соответствовать условиям уравновешивающего буфера стадии следующей колонки (Q-колонка) (например, рН и проводимость). Диафильтрованный белковый раствор пропускали через фильтр 0,22 мкм, перед загрузкой на в Q-колонку.
Стадия 4: вирусная инактивация
Диафильтрованный белковый раствор инкубировали при тех же условиях рН в присутствии растворителя/детергента или детергента в течение примерно 4-6 часов при условии комнатной температуры при постоянном перемешивании для инактивации вирусов.
Стадия 5: Анионообменная колоночная хроматография (АЕХ)
После диафильтрации раствор, содержащий рекомбинантный
фолликулостимулирующий гормон, загружали на анионообменную
колонку для дополнительной очистки целевого белка с целевым
профилем изоформ. Эту колоночную стадию осуществляли в режиме
связывания-элюирования и выполняли, главным образом, для
удаления нежелательных изоформ рекомбинантного
фолликулостимулирующего гормона, выделяя при этом указанный белок с целевыми изоформами. Профиль колоночной хроматографии представлен на Фигуре 3. Белки загружали на колонку при рН примерно 8 для связывания с матрицей. Матрицу колонки промывали тем же уравновешивающим буфером для удаления несвязанных примесей. После промывки уравновешивающим буфером осуществляли вторую промывку буфером с рН ниже, чем у исходного уравновешивающего буфера. Затем проводили третью промывку при кислом рН в присутствии NaCl. Колонку повторно уравновешивали уравновешивающим буфером и элюирование целевого белка осуществляли с увеличением проводимости.
После стадии Q-колонки наблюдали чистоту целевого рекомбинантного белка ФСГ более чем 98% по оценкам с помощью HP-SEC, как представлено на Фигуре 4.
Стадия 6: Восстановление условий
Перед загрузкой на колонку HIC диафильтрованный белковый раствор смешивали с концентрированным раствором хлорида натрия
для дальнейшей работы при уравновешивающих условиях Н1С-колонки и пропускали через мембранный фильтр 0,22 мкм.
Стадия 7: Колоночная хроматография гидрофобного
взаимодействия (HIC)
После восстановления условий, белковый раствор, содержащий целевой белок, пропускали через матрицу хроматографии гидрофобного взаимодействия для дальнейшей очистки в режиме связывания-элюирования. После связывания с матрицей колонки, белок элюировали при более низкой проводимости либо в линейной форме, либо постадийно. Профиль колоночной хроматографии представлен на Фигуре 5. Основной элюированный пик, содержащий рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон, собирали для дальнейшей обработки. После третьей колоночной стадии, было достигнуто более чем 99% чистоты целевого рекомбинантного ФСГ по оценкам с помощью HP-SEC, как представлено на Фигуре 6.
Стадия 8: Ультрафильтрации-диафильтрация
После третьей колоночной стадии, раствор, содержащий рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон, подвергали стадии ультрафильтрации-диафильтрации для замены буфера в условиях комнатной температуры.
Стадия 9: Нанофильтрация
После стадии замены буфера рекомбинантный
фолликулостимулирующий гормон подвергали стадии нанофильтрации для выведения вируса. Не наблюдали существенной потери белка или агрегации во время и после стадии нанофильтрации по оценкам с помощью HP-SEC. После нанофильтрации наблюдали чистоту рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона, составляющую более чем 99%.
Стадия 10: Микрофильтрация
Наконец, раствор очищенного рекомбинантного
фолликулостимулирующего гормона асептически пропускали через мембранный фильтр 0,22 мкм и хранили либо в жидкой форме в холодных условиях (для кратковременного хранения), либо в замороженном состоянии для длительного хранения при концентрации от 0,2 мг/мл до 2,5 мг/мл.
После конечной очистки наблюдали, что чистота рекомбинантного ФСГ составила, по меньшей мере, 99% по оценкам с помощью HP-SEC, как представлено на Фигуре 7.
После конечной очистки наблюдали, что профиль изоформ очищенного рекомбинантного белка ФСГ был аналогичен стандарту.
Пример 2. Очистка ХГЧ мочи
Стадия 1: Аффинная колоночная хроматография
Неочищенную смесь м-ХГЧ после восстановления пропускали через матрицу аффинной колонки для селективного захвата целевого белка и для последующего элюирования. До начала элюирования целевого белка аффинную матрицу подвергали промежуточной промывке колонки. Целевой белок элюировали из колонки при кислом рН. Профиль колоночной хроматографии представлен на Фигуре 8.
Стадия 2: Ультрафильтрация-диафильтрации и восстановление условий
Белок, элюированный с аффинной колонки, восстанавливали с помощью UF/DF с использованием мембранного фильтра с отсечкой 10 кДа MWCO против буфера низкой ионной силы рН 7, с тем, чтобы соответствовать условиям уравновешивающего буфера на стадии следующей колонки (Q) (например, рН и проводимость). Диафильтрованный белковый раствор пропускали через фильтр 0,22 мкм перед загрузкой на Q-колонку.
Стадия 3: вирусная инактивация
Диафильтрованный белковый раствор инкубировали при тех же условиях рН в присутствии растворителя/детергента или детергента в течение примерно 4-6 часов при условии комнатной температуры при постоянном перемешивании для инактивации вирусов.
Стадия 4: Анионообменная колоночная хроматография (АЕХ)
После диафильтрации раствор, содержащий м-ХГЧ, загружали на
анионообменную колонку для дополнительной очистки целевого белка
с целевым профилем изоформ. Эту колоночную стадию осуществляли в
режиме связывания-элюирования и выполняли, главным образом, для
удаления нежелательных изоформ рекомбинантного
фолликулостимулирующего гормона, выделяя при этом указанный белок с целевыми изоформами. Профиль колоночной хроматографии представлен на Фигуре 9. Белки загружали на колонку при рН
примерно 8 для связывания с матрицей. Матрицу колонки промывали тем же уравновешивающим буфером для удаления несвязанных примесей. После промывки уравновешивающим буфером осуществляли вторую промывку буфером с рН ниже, чем у исходного уравновешивающего буфера. Впоследствии, проводили третью промывку при кислом рН в присутствии NaCl. Колонку повторно уравновешивали уравновешивающим буфером и элюирование целевого белка осуществляли с увеличением проводимости.
После стадии Q-колонки наблюдали чистоту в виде единственной полосы с помощью SDS - PAGE, как представлено на Фигуре 10.
Стадия 5: Ультрафильтрация-диафильтрация
После третьей колоночной стадии раствор, содержащий м-ХГЧ, подвергали стадии ультрафильтрации-диафильтрации для замены буфера в условиях комнатной температуры.
Стадия 7: Микрофильтрация
Наконец, раствор очищенного м-ХГЧ асептически пропускали через мембранный фильтр 0,22 мкм и хранили либо в жидкой форме в холодных условиях (для кратковременного хранения), либо в замороженном состоянии для длительного хранения при концентрации от 0,2 мг/мл до 2,5 мг/мл.
После конечной очистки наблюдали, что профиль изоформ очищенного м-ХГЧ аналогичен стандартному м-ХГЧ.
Пример 3: Очистка ФСГ мочи
Способ очистки м-ФСГ проводили таким образом, как это описано в примере 2. Очищенный м-ФСГ демонстрирует чистоту в виде единственной полосы в геле по оценкам с помощью SDS-PAGE (Фигура 11) и демонстрирует чистоту более чем 98% по оценкам с помощью HP-SEC (Фигура 12).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ очистки гонадотропина, включающий следующие основные стадии:
(a) аффинной хроматографии;
(b) анионообменной хроматографии, с последующими другими подходящими стадиями очистки.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что матрица аффинной хроматографии представляет собой гонадотропин-специфичную аффинную матрицу.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование гонадотропина после стадии (а) проводят в буфере при условиях нейтрального рН или при условиях кислого рН.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что анионообменную смолу выбирают из DEAE-сефарозы, Mono Q- и Q-сефарозы XL, предпочтительно выбирают Q-сефарозу.
5. Способ очистки гонадотропина, включающий следующие стадии:
(a) аффинной хроматографии;
(b) анионообменной хроматографии;
(c) хроматографии гидрофобного взаимодействия,
где стадии (Ь) и (с) могут быть выполнены в любом порядке.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что матрицу гидрофобной колонки выбирают из фенилсефарозы, бутилсефарозы, октилсефарозы, предпочтительно, выбирают фенилсефарозу.
7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что на стадии (с) гонадотропин элюируют из колонки в градиенте понижения концентрации соли.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что соль выбирают из сульфата аммония, хлорида натрия, хлорида аммония и сульфата натрия, предпочтительно, выбирают сульфата аммония.
9. Способ очистки гонадотропина по любому из предыдущих пунктов из неочищенной смеси, включающий следующие стадии:
(a) разделения клеток и восстановления условий;
(b) аффинной колоночной хроматографии;
(c) ультрафильтрации-диафильтрации и восстановления
условий;
(d) вирусной инактивации;
(e) анионообменной колоночной хроматографии (АЕХ);
(f) восстановления условий;
(д) колоночной хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC);
(h) уль трафиль трации-диафиль трации;
(i) нанофильтрации;
(j) микрофильтрации
где стадии гидрофобной и анионообменной хроматографии могут быть выполнены в любом порядке после стадий аффинной хроматографии (с)-(j).
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что среду
диафильтрации выбирают из буфера Tris-Cl, фосфатного буфера,
ацетатного буфера, цитратного буфера, сукцинатного буфера и их
комбинации.
11. Способ по пп.5 и 9, отличающийся тем, что аффинную хроматографию проводят согласно пп. 2 и 3; анионообменную хроматографию проводят согласно п. 4 и гидрофобную хроматографию проводят согласно пп.б-8.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что гонадотропин либо из культуры клеток, либо из неочищенной смеси, выделенных из мочи.
13. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что гонадотропин выбирают из фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, хорионический гонадотропина человека и их комбинации.
14. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что гонадотропин выбирают из р-чФСГ, м-ФСГ, р-чЛГ, м-ЛГ, р-ХГЧ и м-ХГЧ.
По доверенности
ИЗМЕНЕННАЯ ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ, ПРЕДЛОЖЕННАЯ ЗАЯВИТЕЛЕМ ДЛЯ РАССМОТРЕНИЯ (СТ. 34 РСТ)
1. Способ очистки гонадотропина, включающий последовательно следующие основные стадии:
a. аффинной хроматографии;
b. анионообменной хроматографии, с последующими другими
подходящими стадиями очистки.
где матрица аффинной хроматографии представляет собой гонадотропин-специфичную аффинную матрицу.
2. Способ по п. 1, где элюирование гонадотропина после стадии (а) проводят в буфере при условиях нейтрального рН или при условиях кислого рН.
3. Способ по п. 1, где анионообменную смолу выбирают из DEAE-сефарозы, Mono Q- и Q-сефарозы XL, предпочтительно выбирают Q-сефарозу.
4. Способ очистки гонадотропина по п. 1, включающий
последовательно следующие стадии:
(a) аффинной хроматографии;
(b) анионообменной хроматографии;
(c) хроматографии гидрофобного взаимодействия
5. Способ по п. 4, где гидрофобную матрицу колонки выбирают из фенилсефарозы, бутилсефарозы, октилсефарозы, предпочтительно, выбирают фенилсефарозу.
6. Способ по п. 4, где в стадии (с) гонадотропин элюируют с колонки в градиенте понижения концентрации соли.
7. Способ по п. б, где соль выбирают из сульфата аммония, хлорида натрия, хлорида аммония и сульфата натрия, предпочтительно выбирают сульфат аммония.
8. Способ очистки гонадотропина по любому из предыдущих пунктов из неочищенной смеси, включающий следующие стадии:
(a) разделения клеток и восстановления условий;
(b) аффинной колоночной хроматографии;
(c) ультрафильтрации-диафильтрации и восстановления
условий;
(d) вирусной инактивации;
(e) анионообменной колоночной хроматографии (АЕХ);
(d)
(f) восстановления условий;
(g) колоночной хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC);
(h) уль трафиль трации-диафиль трации;
(i) нанофильтрации;
(j) микрофильтрации
где стадии гидрофобной и анионообменной хроматографии могут осуществляться в любом порядке после стадий аффинной хроматографии; стадии (c)-(j) могут проводиться в любом порядке.
9. Способ по п. 8, где диафильтрационную среду выбирают из
буфера Tris-Cl, фосфатного буфера, ацетатного буфера, цитратного
буфера, сукцинатного буфера и их комбинации.
10. Способ по пп. 4 и 8, где аффинную хроматографию проводят согласно п. 2; анионообменную хроматографию проводят согласно п. 3 и хроматографию гидрофобного взаимодействия проводят согласно пп. 5-7.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где гонадотропин либо из клеточной культуры, выделенной из мочи, либо из неочищенной смеси, выделенной из мочи.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где гонадотропин выбирают из фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, хорионического гонадотропина человека и их комбинации.
13. Способ по любому из предыдущих пунктов, где гонадотропин выбирают из р-чФСГ, м-ФСГ, р-чЛГ, м-ЛГ, р-ХГЧ и м-ХГЧ.
По доверенности
1500
1000
500
-e-
со m
m о zn m
Основной пик
CJ>
ее со
CJ>
0 L
5000
10000
15000
20000
25000
30000
ФИГ.1
со ^1 оо о ^1
12% не восстанавливающий ¦ PAGE ¦ окрашивание СВВ
М 12345 6 7
Дорожка М: Маркер (14,4-97,4 кДа)
Дорожка 1: Осветленный сбор
Дорожка 2: загрузка на аффинную колонку
Дорожка 3: FT-промывка аффинной колонки
Дорожка 4: промывка 100 мМ NaCI аффинной колонки
Дорожка 5: Элюированная с аффинной колонки основная фракция
Дорожка 6: Внутренний эталонный стандарт
Дорожка 7: кислотная полоса
ФИГ.2
12% SDS PAGE в невосстанавливающих условиях
97,4 кДа 66,2
45,0
31,0
21,5 14,4
М: белковый маркер 14,4кДа-97,4кДа Дорожка 1: Стандарт Дорожка 2: загрузка АЕХ-колонки Дорожка 3: элюат и промывка АЕХ-колонки Дорожка 4: промывка 1 АЕХ-колонки Дорожка 5: промывка 2 АЕХ-колонки Дорожка 6: основной пик АЕХ-колонки Дорожка 7: промывка 3 АЕХ-колонки Дорожка 8: промывка 0,5N NaOH АЕХ-колонки
ФИГ.10
М: белковый маркер 14,4 кДа - 97,4 кДа Дорожка 1: Стандарт Дорожка 2: Очищенный м-ФСГ
ФИГ.11
ФИГ.12
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
2/11
2/11
2/11
2/11
2/11
2/11
4/11
4/11
6/11
7/11
9/11
10/11
10/11
11/11
11/11
