[RU]

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с вариантом класса III EGFR (EGFRvIII), и к способам их применения. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела в соответствии с настоящим изобретением связываются с человеческим EGFRvIII с высокой аффинностью. Антителами в соответствии с настоящим изобретением могут быть полностью человеческие антитела. Настоящее изобретение относится к антителам против EGFRvIII, конъюгированным с цитотоксическим средством, радионуклидом или другим фрагментом, негативно влияющим на рост или пролиферацию клеток. Антитела в соответствии с настоящим изобретением применимы для лечения различных злокачественных опухолей.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с вариантом класса III EGFR (EGFRvIII), и к способам их применения. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела в соответствии с настоящим изобретением связываются с человеческим EGFRvIII с высокой аффинностью. Антителами в соответствии с настоящим изобретением могут быть полностью человеческие антитела. Настоящее изобретение относится к антителам против EGFRvIII, конъюгированным с цитотоксическим средством, радионуклидом или другим фрагментом, негативно влияющим на рост или пролиферацию клеток. Антитела в соответствии с настоящим изобретением применимы для лечения различных злокачественных опухолей.

---

Евразийское (21) 201691824 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2016.12.30
(22) Дата подачи заявки 2015.03.10
(51) Int. Cl.
C07K16/28 (2006.01) A61K47/48 (2006.0l) A61K39/395 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01)
(54) АНТИТЕЛА ПРОТИВ EGFRvIII И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
(31) (32)
61/950,963 2014.03.11
(33) US
(86) PCT/US2015/019722
(87) WO 2015/138460 2015.09.17
(71) Заявитель:
РЕГЕНЕРОН ФАРМАСЬЮТИКАЛС, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Киршнер Джессика Р., Макдоналд Дуглас, Терстон Гэвин, Мартин Джоэл Х., Делфино Франк, Ниттоли Томас, Келли Маркус (US)
(74) Представитель:
Карпенко О.Ю., Угрюмов В.М., Лыу Т.Н., Глухарёва А.О., Дементьев В.Н., Клюкин В.А., Христофоров А.А., Гизатуллина Е.М., Строкова О.В. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с вариантом класса III EGFR (EGFRvIII), и к способам их применения. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела в соответствии с настоящим изобретением связываются с человеческим EGFRvIII с высокой аффинностью. Антителами в соответствии с настоящим изобретением могут быть полностью человеческие антитела. Настоящее изобретение относится к антителам против EGFRvIII, конъюгиро-ванным с цитотоксическим средством, радионуклидом или другим фрагментом, негативно влияющим на рост или пролиферацию клеток. Антитела в соответствии с настоящим изобретением применимы для лечения различных злокачественных опухолей.
АНТИТЕЛА ПРОТИВ EGFRvIII И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к человеческим антителам и антигенсвязывающим фрагментам человеческих антител, которые специфично связываются с делеционными мутантами человеческого рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), в частности, с делеционным мутантом класса III EGFRvIII, а также к терапевтическим и диагностическим способам использования таких антител.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Надэкспрессию и/или амплификацию гена рецептора эпидермального фактора роста (EGF) или EGFR регистрировали во многих опухолях человека, в том числе в опухолях молочной железы, яичника, мочевого пузыря, головного мозга и в различных плоскоклеточных карциномах (Wong, A.J. et al, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6899-6903; Harris et al., 1992, Natl. Cancer Inst. Monogr. 11:181-187). Однако нацеливание на EGFR в качестве способа противоопухолевой терапии было проблематичным, поскольку многие нормальные ткани также экспрессируют этот рецептор и могут стать мишенями наряду с опухолевыми целями. Между тем, сообщалось, что многие глиобластомы с амплификацией гена EGFR часто содержат перестройку гена (Ekstrand, A.J. et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4309-4313; Wong A.J. etal, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2965-2969). В одном исследовании выяснили, что 17 из 44 глиобластом имеют одну или несколько альтераций в кодирующей последовательности EGFR, и во всех этих случаях наблюдали амплифицированный EGFR, тогда как ни в одном из 22 случаев без амплификации гена не наблюдали какие-либо опухолеспецифические аномалии последовательности (Frederick, L. et al, 2000, Cancer Res 60:1383-1387). To же исследование также показало, что несколько типов мутаций EGFR могут быть выявлены в отдельных опухолях.
Вариант класса III EGFR (EGFRvIII) является наиболее часто встречающимся вариантом EGFR в глиобластоме (Bigner et al, 1990, Cancer Res 50:8017-8022; Humphrey et al, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87:4207-4211; Yamazaki et al, 1990, Jap J Cancer Res 81:773-779; Ekstrand et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4309-4313; Wikstrand et al, 1995, Cancer Res 55:3140-3148; и Frederick et al, 2000, Cancer Res
60:1383-1387). EGFRvIII характеризуется делецией экзонов 2-7 гена EGFR, приводящей к делеции внутри рамки 801 пары оснований кодирующей области, т.е. к делеции 6-273 аминокислотных остатков (из числа остатков зрелого EGFR), а также к образованию нового глицина в точке слияния (Humphrey et al, 1988, Cancer Res 48:2231-2238; Yamazaki et al, 1990, выше). Было показано, что EGFRvIII обладает лиганд-независимой активностью слабой, но постоянно активной киназы, а также усиленной онкогенностью (Nishikawa et al, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:7727-7731; и Batra et al, 1995, Cell Growth and Differentiation 6:1251-1259). Кроме глиом EGFRvIII выявили при протоковой и внутрипротоковой карциноме молочной железы (Wikstrand et al, 1995, Cancer Res 55:3140-3148), немелкоклеточных карциномах легкого (Garcia de Palazzo et al, 1993, Cancer Res 53:3217-3220), карциномах яичника (Moscatello et al, 1995, Cancer Res 55:5536-5539), злокачественной опухоли предстательной железы (Olapade-Olaopa et al, 2000, British J Cancer 82:186-194) и плоскоклеточной карциноме головы и шеи (Tinhofer et al, 2011, Clin Cancer Res 17(15):5197-5204). Эти и другие исследования показывают, что нормальные ткани, наоборот, не экспрессируют EGFRvIII (Garcia de Palazzo et al, 1993, выше; Wikstrand et al, 1995, выше; и Wikstrand et al, 1998, JNemo Virol 4:148-158). Высокоопухолеспецифическая природа EGFRvIII делает его особенно привлекательной целью для лечения злокачественных опухолей и опухолей, которые экспрессируют данную молекулу.
Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот человеческого EGFR показаны в SEQ Ш NO: 145 и 146, соответственно, а аминокислотная последовательность EGFRvIII показана в SEQ ID NO: 147. Антитела против EGFRvIII описываются, например, в патентах США №№ 5212290, 7736644, 7589180 и 7767792.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с EGFRvIII. Антитела в соответствии с настоящим изобретением применимы, inter alia, для нацеливания на клетки опухоли, которые экспрессируют EGFRvIII. Антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением и их антигенсвязывающие части могут быть использованы отдельно в немодифицированной форме или могут быть включены как часть конъюгата антитело-лекарственное средство или биспецифического антитела.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть
непроцессированными (например, антитело IgGl или IgG4) или могут содержать только антигенсвязывающую часть (например, Fab-, F(ab')2- или scFv-фрагмент), а могут быть модифицированными с изменением функциональных свойств, например, для устранения остаточных эффекторных функций (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).
Типичные антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением приведены в таблицах 1 и 2 в настоящем документе. В таблице 1 приводятся идентификаторы аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи (HCVR), вариабельных областей легкой цепи (LCVR), определяющих комплементарность областей тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) и определяющих комплементарность областей легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) типичных антител против EGFRvIII. В таблице 2 приводятся идентификаторы последовательностей нуклеиновых кислот для HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 типичных антител против EGFRvIII.
Настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с EGFRvIII, содержащим HCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей HCVR, приведенных в таблице 1, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по отношению к ним.
Настоящее изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с EGFRvIII, содержащим LCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей LCVR, приведенных в таблице 1, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по отношению к ним.
Настоящее изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с EGFRvIII, содержащим пару аминокислотных последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), содержащую любую из аминокислотных последовательностей HCVR, приведенных в таблице 1, спаренную с любой из аминокислотных последовательностей LCVR, приведенных в таблице 1. Согласно некоторым вариантам осуществления
настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, содержащим пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, содержащуюся в любом типичном антителе против EGFRvIII, приведенном в таблице 1. Согласно некоторым вариантам осуществления пара аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR выбрана из группы, состоящей из 2/20, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122 и 130/138.
Настоящее изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с EGFRvIII, содержащим CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей HCDR1, приведенных в таблице 1, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.
Настоящее изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с EGFRvIII, содержащим CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей HCDR2, приведенных в таблице 1, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.
Настоящее изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с EGFRvIII, содержащим CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей HCDR3, приведенных в таблице 1, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.
Настоящее изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с EGFRvIII, содержащим CDR1 легкой цепи (LCDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей LCDR1, приведенных в таблице 1, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.
Настоящее изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с EGFRvIII, содержащим CDR2 легкой цепи (LCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей LCDR2, приведенных в таблице 1, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.
Настоящее изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с EGFRvIII, содержащим CDR3 легкой цепи (LCDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей LCDR3, приведенных в таблице 1, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.
Настоящее изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с EGFRvIII, содержащим пару аминокислотных последовательностей HCDR3 и LCDR3 (HCDR3/LCDR3), содержащую любую из аминокислотных последовательностей HCDR3, приведенных в таблице 1, спаренную с любой из аминокислотных последовательностей LCDR3, приведенных в таблице 1. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, содержащим пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, содержащуюся в любом типичном антителе против EGFRvIII, приведенном в таблице 1.
Настоящее изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с EGFRvIII, содержащим ряд из шести CDR (т.е. HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3), содержащихся в любом типичном антителе против EGFRvIII, приведенном в таблице 1. Согласно некоторым вариантам осуществления ряд аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3 -LCDR1-LCDR2-LCDR3, выбранный из группы, состоящей из 4-6-8-12-14-16; 20-22-24-28-30-32; 36-38-40-44-46-48; 52-54-5660-62-64; 68-70-72-76-78-80; 84-86-88-92-94-96; 100-102-104-108-110-112; 116-118-120124-126-128 и 132-134-136-140-142-144.
Согласно родственному варианту осуществления настоящее изобретение
относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с EGFRvIII, содержащим ряд из шести CDR (т.е. HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3), содержащихся в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, как определено любым из типичных антител против EGFRvIII, приведенных в таблице 1. Например, настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающим фрагментам, которые специфично связываются с EGFRvIII, содержащим ряд аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, содержащихся в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранной из группы, состоящей из 18/26; 66/74; 274/282; 290/298 и 370/378. Способы и методики для идентификации CDR в аминокислотных последовательностях HCVR и LCVR хорошо известны в уровне техники и могут быть использованы для идентификации CDR в конкретных аминокислотных последовательностях HCVR и/или LCVR, раскрываемых в настоящем документе. Типичные правила, которые могут быть использованы для идентификации границ CDR, включают в себя, например, определение по Kabat, определение по Chothia и определение АЬМ. В общих чертах, определение по Kabat основывается на изменчивости последовательностей, определение по Chothia основывается на расположении областей структурных петель, а определение АЬМ является сочетанием подходов Kabat и Chothia. См., например, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al, J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); и Martin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56:9268-9272 (1989). Общедоступные базы данных также пригодны для идентификации последовательностей CDR в антителе.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим антитела против EGFRvIII или их части. Например, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любую из аминокислотных последовательностей HCVR, приведенных в таблице 1; согласно некоторым вариантам осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCVR, приведенных в таблице 2, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по отношению к ним.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты,
кодирующим любую из аминокислотных последовательностей LCVR, приведенных в таблице 1; согласно некоторым вариантам осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCVR, приведенных в таблице 2, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по отношению к ним.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любую из аминокислотных последовательностей HCDR1, приведенных в таблице 1; согласно некоторым вариантам осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCDR1, приведенной в таблице 2, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по отношению к ним.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любую из аминокислотных последовательностей HCDR2, приведенных в таблице 1; согласно некоторым вариантам осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCDR2, приведенной в таблице 2, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по отношению к ним.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любую из аминокислотных последовательностей HCDR3, приведенных в таблице 1; согласно некоторым вариантам осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCDR3, приведенной в таблице 2, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по отношению к ним.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любую из аминокислотных последовательностей LCDR1, приведенных в таблице 1; согласно некоторым вариантам осуществления молекула нуклеиновой
кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCDR1, приведенной в таблице 2, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по отношению к ним.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любую из аминокислотных последовательностей LCDR2, приведенных в таблице 1; согласно некоторым вариантам осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCDR2, приведенной в таблице 2, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по отношению к ним.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любую из аминокислотных последовательностей LCDR3, приведенных в таблице 1; согласно некоторым вариантам осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCDR3, приведенной в таблице 2, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по отношению к ним.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим HCVR, при этом HCVR содержит ряд из трех CDR (т.е. HCDR1-HCDR2-HCDR3), при этом ряд аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3 определяется любым из типичных антител против EGFRvIII, приведенных в таблице 1.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим LCVR, при этом LCVR содержит ряд из трех CDR (т.е. LCDR1-LCDR2-LCDR3), при этом ряд аминокислотных последовательностей LCDR1-LCDR2-LCDR3 определяется любым из типичных антител против EGFRvIII, приведенных в таблице 1.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим как HCVR, так и LCVR, при этом HCVR содержит любую аминокислотную последовательность из аминокислотных последовательностей HCVR, приведенных в таблице 1, и при этом LCVR содержит любую аминокислотную последовательность из аминокислотных последовательностей LCVR, приведенных в
таблице 1. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCVR, приведенных в таблице 2, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по отношению к ним, и полинуклеотидную последовательность, выбранную любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCVR, приведенных в таблице 2, или по сути подобной им последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по отношению к ним. Согласно некоторым вариантам осуществления в данном аспекте настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует HCVR и LCVR, при этом как HCVR, так и LCVR происходят из одного и того же антитела против EGFRvIII, приведенного в таблице 1.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам экспрессии, способным экспрессировать полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой или легкой цепи антитела против EGFRvIII. Например, настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторам экспрессии, содержащим любую из вышеупомянутых молекул нуклеиновой кислоты, т.е. молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих любую из последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, приведенных в таблице 1. Также объем настоящего изобретения предусматривает клетки-хозяева, в которые вводятся такие векторы, а также способы получения антител или их частей путем культивирования клеток-хозяев в условиях, обеспечивающих продуцирование антител или фрагментов антител и извлечение полученных таким образом антител и фрагментов антител.
Настоящее изобретение относится к антителам против EGFRvIII, демонстрирующим паттерн модифицированного гликозилирования. Согласно некоторым вариантам осуществления могут быть полезны модификация с удалением нежелательных сайтов гликозилирования или антитело без фукозного фрагмента в олигосахаридной цепи, например, для усиления функции зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (ADCC) (см., Shield et al. (2002), JBC 277:26733). При других применениях может быть осуществлена модификация галактозилирования для модификации комплементзависимой цитотоксичности (CDC).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантное человеческое антитело или его фрагмент,
которые специфично связываются с EGFRvIII, и фармацевтически приемлемый носитель. В родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая является комбинацией антитела против EGFRvIII и второго терапевтического средство. Согласно одному варианту осуществления вторым терапевтическим средством является любое средство, которое успешно объединяется с антителом против EGFRvIII. Настоящее изобретение также относится к конъюгатам антитело-лекарственное средство (ADC), содержащим антитело против EGFRvIII, конъюгированное с цитотоксическим средством. Типичные комбинации терапевтических средств, совместных составов и ADC, включающих в себя антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением, раскрываются в других разделах настоящего документа.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к терапевтическим способам киллинга опухолевых клеток, или ингибирования, или ослабления роста опухолевых клеток с использованием антитела против EGFRvIII или антигенсвязывающей части антитела в соответствии с настоящим изобретением. Терапевтические способы в данном аспекте настоящего изобретения предусматривают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением субъекту при необходимости этого. Подлежащим лечению нарушением является любое заболевание или состояние, которое улучшается, облегчается, ингибируется или предупреждается путем нацеливания на EGFRvIII и/или путем ингибирования опосредованной лигандом клеточной передачи сигнала через EGFRvIII.
Другие варианты осуществления станут очевидны при рассмотрении следующего подробного описания.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показаны результаты вестерн-блота EGFR и EGFRvIII с использованием антител против EGFRvIII (т.е. HlH1863N2(Fuc -), контролей I и II на фиг. 1а; и Н1Н1911, Н1Н1912 и Н1Н1915 на фиг. lb), или антитела против His, при восстанавливающих (верхние панели) и невосстанавливающих (нижние панели) условиях. Дорожки 1 и 6: 10 мкл стандарта BENCHMARK(tm) (INVITROGEN(tm)); дорожки 2 и 7: 400 нг hEGFR-mmh (SEQ ID NO: 154); дорожки 3 и 8: 400 нг hEGFRvIII
mmh (SEQ ID NO: 152); и дорожки 4, 5, 9 и 10: промежуток. Контроль I: человеческое антитело против соединительного пептида EGFRvIII (IgGl), раскрытое в патенте США № 7736644; и контроль II: химерное антитело против EGFRvIII/EGFR, раскрытое в патенте США № 7589180.
На фиг. 2 показаны характеристики связывания HlH1863N2(Fuc -). Соединительный пептид EGFRvIII или пептид из остатков 311-326 в EGFR ("пептид EGFR311-326 "), каждый из которых был меченным биотином через линкер на С-конце, захватывали покрытыми стрептавидином наконечниками OCTET(r) на устройстве FORTEBIO(r) OCTET(r) RED и осуществляли реагирование с HlH1863N2(Fuc -) или контролями I-III. Контроли I и II: такие же, как и описанные выше; контроль III: гуманизированное антитело против EGFRvIII (hlgGl), раскрытое в публикации заявки на выдачу патента США № 2010/0056762. (?): меченный биотином на С-конце соединительный пептид EGFRvIII (SEQ Ш NO: 149); и (¦): меченный биотином на С-конце пептид EGFR311-326 (SEQ ID NO: 151).
На фиг. 3 показана интернализация mAb против EGFRvIII клетками НЕК293, экспрессирующими EGFRvIII (HEK293/EGFRvIII). Связанные с клеточной поверхностью антитела против EGFRvIII и контрольные антитела выявляли с помощью конъюгированного с красителем вторичного антитела (Fab); изображения получали при 40х и определяли количество интернализированных везикул. Контроли I и II: такие же, как и описанные выше; и контроль IV: химерные антитело против EGFR, раскрытое в патенте США № 7060808. (?): интернализация при 37°С; и (¦): интернализация при 4°С.
На фиг. 4 показаны связывание и интернализация антитела против EGFRvIII HlH1863N2(Fuc -) опухолями B16F10.9 или опухолями B16F10.9, экспрессирующими EGFRvIII (B16F10.9/EGFRvIII), которые ксенотрансплантировали мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID). Связанное с клеточной поверхностью (фиг. 4а) или связанное с клеточной поверхностью и интернализированное (фиг. 4Ь) антитело против EGFRvIII или изотипическое контрольное антитело выявляли с помощью конъюгированного с аллофикоцианином антитела против человеческого Fc (hFc-APC) с использованием проточной цитометрии. Показаны средние интенсивности флуоресценции (MIF) через 10 минут (?), 4 часа (|) и 24 часа (¦) после инъекции антитела.
На фиг. 5 показаны результаты анализа фармакокинетических параметров для антитела против EGFRvIII HlH863N2(Fuc +) (фиг. 5d) и контрольных антител (как
описано выше), т.е. контроля I (фиг. 5Ь), контроля III (фиг. 5с) и контроля IV (фиг. 5а), у мышей дикого типа (•) или мышей, экспрессирующих человеческий EGFR (¦).
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Перед прочтением раскрытия настоящего изобретения, следует учитывать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными способами и экспериментальными условиями, так как такие способы и условия могут варьировать. Также следует учитывать, что терминология используется в настоящем документе исключительно с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться исключительно прилагаемой формулой изобретения.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, что обычно известно рядовому специалисту в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Используемый в настоящем документе термин "приблизительно" при использовании в отношении конкретного указанного числового значения означает, что значение может варьировать от указанного значения не более чем на 1%. Например, используемый в настоящем документе термин "приблизительно 100" включает в себя 99 и 101, а также все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.д.).
Хотя при осуществлении или тестировании настоящего изобретения могут быть использованы любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описываемым в настоящем документе, далее будут описаны предпочтительные способы и материалы. Все патенты, заявки на выдачу патентов и непатентные публикации, упомянутые в настоящем описании, тем самым включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Определения
Используемый в настоящем документе термин "EGFRvIII" относится к варианту человеческого EGFR класса III с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 147, или к его биологически активному фрагменту, который обладает любыми характеристиками, специфическими для EGFRvIII, в отличие от тех, которые совместно обычно называют EGFR, если конкретно не указано иное. В EGFRvIII отсутствуют аминокислотные остатки от 6 до 273 из зрелого EGFR (т.е. SEQ ID NO:
146 без сигнального пептида, т.е. остатков 1-24) и содержится новый глициновый остаток в положении 6 между аминокислотными остатками 5 и 274.
Все упоминания белков, полипептидов и фрагментов белков в настоящем документе относятся к человеческой версии соответствующего белка, полипептида или фрагмента белка, если четко не указано происхождение от видов, отличных от человека. Таким образом, термин "EGFRvIII" означает человеческий EGFRvIII, если четко не указано происхождение от видов, отличных от человека, например, "мышиный EGFRvIII", "EGFRvIII обезьяны" и т.д.
Используемый в настоящем документе термин "экспрессируемый на клеточной поверхности EGFRvIII" означает один или несколько белков EGFRvIII или их внеклеточный домен, который экспрессируется на поверхности клетки in vitro или in vivo так, что по меньшей мере часть белка EGFRvIII выставляется на внеклеточную сторону клеточной мембраны и становится доступной для антигенсвязывающей части антитела. Экспрессируемый на клеточной поверхности EGFRvIII может содержать или состоять из белка EGFRvIII, экспрессируемого на поверхности клетки, которая обычно экспрессирует белок EGFRvIII. В качестве альтернативы, экспрессируемый на клеточной поверхности EGFRvIII может содержать или состоять из белка EGFRvIII, экспрессируемого на поверхности клетки, которая обычно не экспрессирует человеческий EGFRvIII на своей поверхности, но искусственно сконструирована с возможностью экспрессии EGFRvIII на своей поверхности.
Используемый в настоящем документе термин "антитело против EGFRvIII" включает в себя как моновалентные антитела с единственной специфичностью, так и биспецифические антитела, содержащие первое плечо, которое связывается с EGFRvIII, и второе плечо, которое связывается со вторым (целевым) антигеном, при этом плечо антитела против EGFRvIII содержит любую из последовательностей HCVR/LCVR или CDR, приведенных в таблице 1 в настоящем документе. Термин "антитело против EGFRvIII" также включает в себя конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC), содержащие антитело против EGFRvIII или его антигенсвязывающую часть, конъюгированную с лекарственным средством или токсином (т.е. цитотоксическим средством). Термин "антитело против EGFRvIII)) также включает в себя конъюгаты антитело-радионуклид (ARC), содержащие антитело против EGFRvIII или его антигенсвязывающую часть, конъюгированные с радионуклидом.
Используемый в настоящем документе термин "антитело" означает любую антигенсвязывающую молекулу или молекулярный комплекс, содержащие по меньшей
мере одну определяющую комплементарность область (CDR), которая специфично связывается или взаимодействует с конкретным антигеном (например, EGFRvIII). Термин "антитело" включает в себя иммуноглобулиновые молекулы, содержащие четыре полипептидных цепи, две тяжелых (Н) цепи и две легких (L) цепи связанные вместе дисульфидными связями, а также их мультимеры (например, IgM). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращается в настоящем документе как HCVR или VH) И константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена Сн1, Сн2 и СнЗ. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращается в настоящем документе как LCVR или VL) И константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен (CLI). Области VH И VL могут быть, кроме того, разделены на области гиперизменчивости, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), чередующиеся с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH И VL СОСТОИТ из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Согласно различным вариантам осуществления настоящего изобретения FR антитела против EGFRvIII (или его антигенсвязывающей части) может быть идентична человеческим зародышевым последовательностям или может быть естественно или искусственно модифицированной. Аминокислотная консенсусная последовательность может быть определена с помощью параллельного анализа двух или более CDR.
Используемый в настоящем документе термин "антитело" также включает в себя антигенсвязывающие фрагменты молекул полного антитела. Используемые в настоящем документе термины "антигенсвязывающая часть" антитела, "антигенсвязывающий фрагмент" антитела и т.п. включают в себя любой встречающийся в природе, ферментативно получаемый, синтетический или генетически сконструированный полипептид или гликопротеин, который специфично связывается с антигеном с образованием комплекса. Антигенсвязывающие фрагменты антитела могут быть получены, например, из молекул полного антитела с использованием любых приемлемых стандартных методик, таких как протеолитическое расщепление, или методик рекомбинантного генетического конструирования, предусматривающих манипуляцию с ДНК, кодирующей изменчивые и необязательно константные домены антитела, и экспрессию таковой. Такая ДНК известна и/или легкодоступна, например, из коммерческих источников, библиотек ДНК
(в том числе, например, библиотек антитела против фага), или может быть синтезирована. ДНК может быть секвенирована и подвергнута манипуляции химическим путем или с использованием методик молекулярной биологии, например, с расположением одного или нескольких изменчивых и/или константных доменов в приемлемой конфигурации или с введением кодонов, созданием цистеиновых остатков, модификацией, добавлением или делецией аминокислот и т.д.
Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают в себя (i) Fab-фрагменты; (ii) Р(аЬ')2-фрагменты; (iii) Fd-фрагменты; (iv) Fv-фрагменты; (v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv); (vi) dAb-фрагменты и (vii) минимальные единицы распознавания, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела (например, выделенную определяющую комплементарность область (CDR), такую как пептид CDR3), или ограниченного пептида FR3-CDR3-FR4. Другие сконструированные молекулы, такие как домен-специфические антитела, однодоменные антитела, антитела с исключенным доменом, химерные антитела, CDR-привитые антитела, диатела, триатела, тетратела, минитела, нанотела (например, моновалентные нанотела, двухвалентные нанотела и т.д.), иммунофармацевтические средства на основе модульного белка малого размера (SMIP) и изменчивые домены IgNAR акулы, также предусматриваются используемым в настоящем документе термином "антигенсвязывающий фрагмент".
Антигенсвязывающий фрагмент антитела, как правило, будет содержать по меньшей мере один изменчивый домен. Изменчивый домен может иметь любой размер или состав аминокислот и, как правило, содержит по меньшей мере одну CDR, которая соседствует или находится в рамке с одной или несколькими каркасными последовательностями. В антигенсвязывающих фрагментах, имеющих домен VH, ассоциированный с доменом VL, домены VH И VL могут находиться друг относительно друга в любом приемлемом расположении. Например, вариабельная область может быть димерной и содержать димеры VH-VH, VH-VL ИЛИ VL-VL. В качестве альтернативы, антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный домен VH ИЛИ VL.
Согласно некоторым вариантам осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один изменчивый домен, ковалентно связанный по меньшей мере с одним константным доменом. Неограничивающие типичные конфигурации изменчивых и константных доменов, которые могут находиться в антигенсвязывающем фрагменте антитела в соответствии с настоящим
изобретением, включают в себя: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (X) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3 И (xiv) VL-CL. В любой конфигурации изменчивых и константных доменов, в том числе в любой из типичных конфигураций, приведенных выше, изменчивые и константные домены либо могут быть непосредственно связанными друг с другом, либо могут быть связаны полной или частичной шарнирной или линкерной областью. Шарнирная область может состоять по меньшей мере из 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или больше) аминокислот, которые в результате обеспечивают гибкое или полугибкое соединение между соседними изменчивыми и/или константными доменами в отдельной полипептидной молекуле. Более того, антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) любой из конфигураций изменчивого и константного домена, приведенных выше, в нековалентной связи друг с другом и/или с одним или несколькими мономерными доменами VH ИЛИ VL (например, посредством дисульфидной связи(ей)).
Как и в случае с молекулами полного антитела, антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноспецифическими или мультиспецифическими (например, биспецифическими). Мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент антитела, как правило, будет содержать по меньшей мере два различных изменчивых домена, при этом каждый изменчивый домен способен специфично связываться с отдельным антигеном или с другим эпитопом в том же антигене. Любой формат мультиспецифического антитела, в том числе типичные форматы биспецифического антитела, раскрываемые в настоящем документе, могут быть приспособлены для применения в контексте антигенсвязывающего фрагмента антитела в соответствии с настоящим изобретением с использованием рутинных методик, известных в уровне техники.
Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут функционировать посредством комплементзависимой цитотоксичности (CDC) или зависимой от антитела опосредованной клеткой цитотоксичности (ADCC). Термин "комплементзависимая цитотоксичность" (CDC) относится к лизису экспрессирующих антиген клеток антителом в соответствии с настоящим изобретением в присутствии комплемента. Термин "зависимая от антитела опосредованная клеткой цитотоксичность" (ADCC) относится к опосредованной клеткой реакции, при которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcR) (например,
клетки натуральные киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на целевой клетке, что, тем самым, приводит к лизису целевой клетки. CDC и ADCC могут быть измерены с использованием анализов, которые общепризнаны и известны в уровне техники (см., например, патенты США №№ 5500362 и 5821337, а также Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). Константная область антитела играет важную роль в способности антитела фиксировать комплемент и опосредовать зависимую от клетки цитотоксичность. Таким образом, изотип антитела может быть выбран на основании того, желательно ли для антитела опосредовать цитотоксичность.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антителами против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением являются человеческие антитела. Используемый в настоящем документе термин "человеческое антитело" включает в себя антитела, имеющие изменчивые и константные области, происходящие из человеческих зародышевых последовательностей иммуноглобулина. Человеческие антитела в соответствии с настоящим изобретением могут включать в себя аминокислотные остатки, некодируемые человеческими зародышевыми последовательностями иммуноглобулина (например, мутации, введенные путем рандомного или сайтспецифического мутагенеза in vitro или соматической мутацией in vivo), например в CDR и, в частности, в CDR3. Однако используемый в настоящем документе термин "человеческое антитело" не предусматривает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародыша других видов млекопитающих, таких как мышь, были привиты на человеческие каркасные последовательности.
Согласно некоторым вариантам осуществления антителами могут быть рекомбинантные человеческие антитела. Используемый в настоящем документе термин "рекомбинантное человеческое антитело" включает в себя все человеческие антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными средствами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина (описанные ниже), антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител (описанные ниже), антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным в отношении человеческих генов иммуноглобулина (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью любого другого средства, которое включает в себя сплайсинг
последовательностей человеческого гена иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют изменчивые и константные области, полученные от человеческих зародышевых последовательностей иммуноглобулина. Согласно некоторым вариантам осуществления, однако, такие рекомбинантные человеческие антитела подвергаются in vitro мутагенезу (или, если используется животное, трансгенное в отношении последовательностей человеческого Ig, in vivo соматическому мутагенезу), и, таким образом, аминокислотными последовательностями областей VH И VL рекомбинантных антител являются последовательности, которые, несмотря на то, что получены из человеческих зародышевых последовательностей VH И VL ИЛИ ЯВЛЯЮТСЯ родственными таковым, не могут встречаться в природе в человеческом зародышевом наборе антител in vivo.
Человеческие антитела могут существовать в двух формах, которые ассоциированы с шарнирной гетерогенностью. В одной форме молекула иммуноглобулина содержит стабильную конструкцию из четырех цепей приблизительно 150-160 кДа, в которой димеры удерживаются вместе посредством межцепочечной дисульфидной связи тяжелых цепей. Во второй форме димеры не связываются межцепочечными дисульфидными связями, но молекула приблизительно 75-80 кДа образуется из ковалентно связанных легкой и тяжелой цепей (полуантитело). Такие формы очень трудно отделить даже после аффинной очистки.
Частота появления второй формы в различных интактных изотипах IgG является следствием, но не ограничена структурными различиями, связанными с шарнирной областью изотипа антитела. Единичная аминокислотная замена в шарнирной области шарнира человеческого IgG4 может существенно уменьшать появление второй формы (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) до уровней, обычно наблюдаемых при использовании шарнира IgGl человека. Настоящее изобретение охватывает антитела, имеющие одну или несколько мутаций в шарнире, в области Сн2 или СнЗ, которые могут быть желательны, например, при получении, чтобы повысить выход требуемой формы антитела.
Антителами в соответствии с настоящим изобретением могут быть выделенные антитела. Используемый в настоящем документе термин "выделенное антитело" означает антитело, которое было идентифицировано и отделено по меньшей мере от одного компонента его естественной среды и/или извлечено из такового. Например, антитело, которое было отделено по меньшей мере от одного компонента организма
или от ткани или клетки, в которой антитело встречается в природе или продуцируется в природе, или извлечено из таковых, является выделенным антителом для целей настоящего изобретения. Выделенное антитело также включает в себя антитело in situ в рекомбинантной клетке. Выделенными антителами являются антитела, которые были подвергнуты по меньшей мере одной стадии очистки или выделения. Согласно некоторым вариантам осуществления выделенное антитело, по сути, может не содержать другой клеточный материал и/или химические вещества.
Антитела против EGFRvIII, раскрываемые в настоящем документе, могут содержать одну или несколько аминокислотных замен, вставок и/или делеций в каркасных областях и/или областях CDR изменчивых доменов тяжелой и легкой цепей по сравнению с соответствующими зародышевыми последовательностями, из которых антитела получали. Такие мутации могут быть легко выявлены путем сравнения аминокислотных последовательностей, раскрываемых в настоящем документе, с зародышевыми последовательностями, доступными, например, из общедоступных баз данных последовательностей антител. Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые получают из любых аминокислотных последовательностей, раскрываемых в настоящем документе, при этом одна или несколько аминокислот в одной или нескольких каркасных областях и/или областях CDR мутируют в соответствующий остаток(остатки) зародышевой последовательности, из которой антитело получили, или соответствующий остаток(остатки) другой человеческой зародышевой последовательности, или в консервативную аминокислотную замену соответствующего зародышевого остатка(остатков) (такие изменения последовательностей совместно называют в настоящем документе "зародышевыми мутациями"). Рядовой специалист в данной области, исходя из последовательностей вариабельной области тяжелой и легкой цепей, раскрываемых в настоящем документе, сможет легко получить ряд антител и антигенсвязывающих фрагментов, которые содержат одну или несколько отдельных зародышевых мутаций или их комбинации. Согласно некоторым вариантам осуществления все из каркасных и/или CDR остатков в доменах VH И/ИЛИ VL мутируют обратно в остатки, находящиеся в оригинальной зародышевой последовательности, из которой антитело получали. Согласно другим вариантам осуществления только некоторые остатки мутируют обратно в оригинальную зародышевую последовательность, например, только мутантные остатки, находящиеся в первых 8 аминокислотах из FR1 или в последних 8 аминокислотах из FR4, или только мутантные
остатки, находящиеся в CDR1, CDR2 или CDR3. Согласно другим вариантам осуществления один или несколько каркасных и/или CDR остатков мутируют в соответствующие остатки другой зародышевой последовательности (т.е. зародышевой последовательности, которая отличается от зародышевой последовательности, из которой изначально было получено антитело). Кроме того, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут содержать любую комбинацию двух или более зародышевых мутаций в каркасных областях и/или областях CDR, например, при этом некоторые отдельные остатки мутируют в соответствующий остаток определенной зародышевой последовательности, тогда как некоторые другие остатки, которые отличаются от оригинальной зародышевой последовательности, сохраняются или мутируют в соответствующий остаток другой зародышевой последовательности. При получении антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или несколько зародышевых мутаций, можно легко тестировать на предмет одного или нескольких желательных свойств, таких как улучшенная специфичность связывания, повышенная аффинность связывания, улучшенные или усиленные антагонистические или агонистические биологические свойства (в зависимости от ситуации), пониженная иммуногенность и т.д. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, получаемые таким общим способом, охватываются настоящим изобретением.
Настоящее изобретение также относится к антителам против EGFRvIII, содержащим варианты любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрываемых в настоящем документе, имеющие одну или несколько консервативных замен. Например, настоящее изобретение относится к антителам против EGFRvIII, имеющим аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR, например, с 10 или меньше, 8 или меньше, 6 или меньше, 4 или меньше и т.д. консервативными аминокислотными заменами, относительно любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, изложенных в таблице 1 в настоящем документе.
Термин "эпитоп" относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует с сайтом специфического связывания антигена в вариабельной области молекулы антитела, известной как паратоп. Один антиген может иметь более чем один эпитоп. Таким образом, разные антитела могут связываться с разными участками на антигене и могут обладать разными биологическими эффектами. Эпитопы могут быть либо конформационными, либо линейными. Конформационный эпитоп получается пространственным совмещением аминокислот из различных
сегментов линейной полипептидной цепи. Линейным эпитопом является эпитоп, полученный из соседних аминокислотных остатков в полипептидной цепи. При определенных обстоятельствах эпитоп может включать в себя фрагменты сахаридов, фосфорильных групп или сульфонильных групп в антигене.
Термин "существенная идентичность" или "по сути идентичная" в отношении нуклеиновой кислоты или ее фрагмента указывает на то, что при оптимальном выравнивании с соответствующими нуклеотидными вставками или делециями с другой нуклеиновой кислотой (или комплементарной ей нитью) наблюдается идентичность нуклеотидных последовательностей по меньшей мере на приблизительно 95% и более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 96%, 97%, 98% или 99% нуклеотидных оснований, при измерении любым хорошо известным алгоритмом идентичности последовательностей, таким как FASTA, BLAST или Gap, как обсуждается ниже. Молекула нуклеиновой кислоты, обладающая существенной идентичностью с эталонной молекулой нуклеиновой кислоты, в определенных случаях может кодировать полипептид, имеющий такую же или, по сути, подобную аминокислотную последовательность, что и полипептид, кодируемый эталонной молекулой нуклеиновой кислоты.
В отношении полипептидов термин "существенное подобие" или "по сути, подобный" означает, что две пептидных последовательности при оптимальном выравнивании, таком как с помощью программы GAP или BESTFIT с использованием штрафов за открытие гэпа по умолчанию, обладают по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей, еще более предпочтительно по меньшей мере 98% или 99% идентичностью последовательностей. Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Термин "консервативная аминокислотная замена" означает замену, при которой аминокислотный остаток замещается другим аминокислотным остатком с боковой цепью (R-группой) с подобными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). В целом, консервативная аминокислотная замена, по сути, не будет изменять функциональные свойства белка. В случаях, если две или более аминокислотных последовательности отличаются друг от друга консервативными заменами, процентная идентичность последовательностей или степень подобия может быть скорректирована в сторону повышения, чтобы исправить консервативную природу замены. Средства для осуществления такой корректировки хорошо известным специалистам в данной области, см., например, Pearson (1994)
Methods Mol. Biol. 24: 307-331, включенную в настоящий документ посредством ссылки. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи с подобными химическими свойствами, включают в себя (1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; (2) алифатические гидроксильные боковые цепи: серии и треонин; (3) содержащие амид боковые цепи: аспарагин и глутамин; (4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; (5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; (6) кислотные боковые цепи: аспартат и глутамат, и (7) содержащие серу боковые цепи: цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. В качестве альтернативы, консервативным замещением является любое изменение, имеющее положительное значение в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445, включенной в настоящий документ посредством ссылки. Термин "умеренно консервативное" замещение означает любое изменение, имеющее неотрицательное значение в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250.
Подобие последовательностей полипептидов, которое также называется идентичностью последовательностей, как правило, измеряют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей. Программное обеспечение для анализа белка совмещает подобные последовательности с использованием мер подобия, присвоенные различным заменам, делециям и другим модификациям, в том числе консервативным аминокислотным заменам. Например, программное обеспечение GCG предусматривает программу, такую как Gap и Bestfit, которая может быть использована с параметрами по умолчанию для определения гомологии последовательностей или идентичности последовательностей близкородственных полипептидов, таких как гомологичные полипептиды организмов разных видов, или белка дикого типа и его мутеина, см., например, GCG версии 6.1. Полипептидные последовательности также можно сравнивать с помощью FASTA с использованием параметров по умолчанию или рекомендованных параметров, программы в GCG версии 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает выравнивания и процентную идентичность последовательностей из областей наилучшего перекрывания запрашиваемой и поисковой последовательностями (Pearson (2000), выше). Другим предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности в соответствии с настоящим изобретением с базой данных,
содержащей большое число последовательностей из различных организмов, является компьютерная программа BLAST, особенно BLASTP или TBLASTN, с использованием параметров по умолчанию, см., например, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки.
рН-Зависимое связывание
Настоящее изобретение относится к антителам против EGFRvIII с рН-зависимыми характеристиками связывания. Например, антитело против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением может демонстрировать пониженное связывание с EGFRvIII при кислотном рН по сравнению с нейтральным рН. В качестве альтернативы, антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением могут демонстрировать повышенное связывание с EGFRvIII при кислотном рН по сравнению с нейтральным рН. Термин "кислотный рН" включает в себя значения рН менее приблизительно 6,2, например, приблизительно 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0 или меньше. Используемый в настоящем документе термин "нейтральный рН" означает рН от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,4. Термин "нейтральный рН" включает в себя значения рН приблизительно 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 и 7,4.
В определенных случаях выражение "пониженное связывание с EGFRvIII при кислотном рН по сравнению с нейтральным рН" применяется касательно отношения значения KD связывания антитела с EGFRvIII при кислотном рН к значению KD связывания антитела с EGFRvIII при нейтральном рН (или наоборот). Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут рассматриваться как демонстрирующие "пониженное связывание с EGFRvIII при кислотном рН по сравнению с нейтральным рН" для целей настоящего изобретения, если антитело или его антигенсвязывающий фрагмент демонстрируют отношение кислотное/нейтральное KD приблизительно 3,0 или больше. Согласно некоторым типичным вариантам осуществления отношение кислотное/нейтральное KD ДЛЯ антитела или антигенсвязывающего фрагмента в соответствии с настоящим изобретением может составлять приблизительно 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 или больше.
Антитела с рН-зависимыми характеристиками связывания могут быть получены,
например, путем скрининга популяции антител по пониженному (или повышенному) связыванию с конкретным антигеном при кислотном рН по сравнению с нейтральным рН. Кроме того, модификации антигенсвязывающего домена на аминокислотном уровне могут давать антитела с рН-зависимыми характеристиками. Например, с помощью замены одной или нескольких аминокислот в антигенсвязывающем домене (например, в CDR) на гистидиновый остаток может быть получено антитело с пониженным связыванием антигена при кислотном рН по сравнению с нейтральным рН.
Антитела против EGFRvIII, содержащие Fc-варианты
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения представлены антитела против EGFRvIII, содержащие Fc-домен, содержащий одну или несколько мутаций, которые усиливают или уменьшают связывание антитела с рецептором FcRn, например, при кислотном рН по сравнению с нейтральным рН. Например, настоящее изобретение относится к антителам против EGFRvIII, содержащим мутацию в области Сн2 или СнЗ Fc-домена, при этом мутация(ии) повышает аффинность Fc-домена к FcRn в кислотной среде (например, в эндосоме, в которой рН варьирует от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,0). Такие мутации могут приводить к увеличению времени полужизни в сыворотке крови антитела при введении животному. Неограничивающие примеры таких модификаций Fc включают в себя, например, модификацию в положении 250 (например, Е или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или Т), 254 (например, S или Т) и 256 (например, S/R/Q/E/D или Т), или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, H/L/R/S/P7Q или К) и/или 434 (например, A, W, Н, F или Y (N434A, N434W, N434H, N434F или N434Y)), или модификацию в положении 250 и/или 428, или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. Согласно одному варианту осуществления модификация предусматривает модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S), модификацию 428L, 2591 (например, V259I) и 308F (например, V308F), модификацию 433К (например, Н433К) и 434 (например, 434Y), модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254Т и 256Е), модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L) модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308Р). Согласно следующему варианту осуществления модификация предусматривает модификацию 265А (например, D265A) и/или 297А (например, N297A).
Например, настоящее изобретение относится к антителам против EGFRvIII,
содержащим Fc-домен, содержащий одну или несколько пар или групп мутаций, выбранных из группы, состоящей из 250Q и 248L (например, T250Q и M248L); 252Y, 254Т и 256Е (например, M252Y, S254T и Т256Е); 428L и 434S (например, M428L и N434S); 2571 и 31II (например, P257I и Q31II); 2571 и 434Н (например, P257I и N434H); 376V и 434Н (например, D376V и N434H); 307А, 380А и 434А (например, Т307А, Е380А и N434A); а также 433К и 434F (например, Н433К и N434F). Все возможные комбинаций вышеупомянутых мутаций Fc-домена и другие мутации в изменчивых доменах антитела, раскрываемых в настоящем документе, попадают в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к антителам против EGFRvIII, содержащим химерную константную (Сн) область тяжелой цепи, при этом химерная область Сн содержит сегменты, полученные из областей Сн более чем одного изотипа иммуноглобулина. Например, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут содержать химерную область Сн, содержащую часть или весь домен Сн2, полученный из молекулы человеческого IgGl, человеческого IgG2 или человеческого IgG4, объединенный с частью или всем доменом СнЗ, полученным из молекулы человеческого IgGl, человеческого IgG2 или человеческого IgG4. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела в соответствии с настоящим изобретением содержат химерную область Сн, имеющую химерную шарнирную область. Например, химерный шарнир может содержать "верхнюю шарнирную" аминокислотную последовательность (аминокислотные остатки положений 216-227 согласно нумерации EU), полученную из шарнирной области человеческого IgGl, человеческого IgG2 или человеческого IgG4, объединенной с "нижней шарнирной" последовательностью (аминокислотные остатки положений 228-236 согласно нумерации EU), полученной из шарнирной области человеческого IgGl, человеческого IgG2 или человеческого IgG4. Согласно некоторым вариантам осуществления химерная шарнирная область содержит аминокислотные остатки, полученные из верхнего шарнира человеческого IgGl или человеческого IgG4, аминокислотные остатки, полученные из нижнего шарнира человеческого IgG2. Антитело, содержащее химерную область Сн, как описано в настоящем документе, согласно некоторым вариантам осуществления может обладать модифицированными эффекторными функциями Fc без неблагоприятного влияния на терапевтические или фармакокинетические свойства антитела (см., например, предварительную заявку на выдачу патента США № 61/759578, поданную 1 февраля 2013 года, раскрытие которой тем самым включено в настоящий документ посредством
ссылки во всей своей полноте).
Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC)
Настоящее изобретение относится к конъюгатам антитело-лекарственное средство (ADC), содержащим антитело против EGFRvIII или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированные с терапевтическим фрагментом, таким как цитотоксическое средство, химиотерапевтическое лекарственное средство или радиоизотоп.
Цитотоксические средства включают в себя любое средство, негативно влияющее на рост, жизнеспособность или размножение клеток. Примеры приемлемых цитотоксических средств и химиотерапевтических средств, которые могут быть конъюгированы с антителами против EGFRvIII в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения включают в себя, например, 1-(2-хлорэтил)-1,2-диметансульфонилгидразид, 1,8-дигидрокси-бицикло[7.3.1]тридека-4,9-диен-2,6-диин-13-он, 1-дегидротестостерон, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, 9-аминокамптотецин, актиномицин D, аманитины, аминоптерин, ангуидин, антрациклин, антрамицин (АМС), ауристатины, блеомицин, бусульфан, масляную кислоту, калихемицины, камптотецин, карминомицины, кармустин, цемадотины, цисплатин, колхицин, комбретастатины, циклофосфамид, цитарабин, цитохалазин В, дактиномицин, даунорубицин, декарбазин, диацетоксипентилдоксорубицин, дибромманнит, дигидроксиантрациндион, дисоразолы, доластатин, доксорубицин, дуокармицин, эхиномицины, элеутеробины, эметин, эпотилоны, эсперамицин, эстрамустины, этидия бромид, этопозид, фторурацилы, гелданамицины, грамицидин D, глюкокортикоиды, иринотеканы, лептомицины, леурозины, лидокаин, ломустин (CCNU), майтанзиноиды, мехлорэтамин, мелфалан, меркатопурины, метоптерины, метотрексат, митрамицин, митомицин, митоксантрон, NS-ацетилспермидин, подофиллотоксины, прокаин, пропранолол, птеридины, пуромицин, пирролобензодиазепины (PDB), ризоксины, стрептозотоцин, таллисомицины, таксол, тенопозид, тетракаин, тиоэпахлорамбуцил, томаймицины, топотеканы, тубулузин, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбины и производные любого из вышеупомянутых. Согласно некоторым вариантам осуществления цитотоксическим средством, которое конъюгировано с антителом против EGFRvIII, является майтанзиноид, такой как DM1 или DM4, производное томаймицина или производное доластатина. Другие цитотоксические средства, известные в уровне техники, попадают
в объем настоящего изобретения, в том числе, например, белковые токсины, такие как рицин, токсин С. difficile, экзотоксин Pseudomonas, рицин, дифтерийный токсин, ботулиновый токсин, бриодин, сапорин, токсины лаконоса (т.е. фитолаккатоксин и фитолакцигенин) и другие, такие как изложенные в Sapra et al., Pharmacol. & Therapeutics, 2013, 138:452-469.
Настоящее изобретение также относится к конъюгатам антитело-радионуклид (ARC), содержащим антитела против EGFRvIII, конъюгированные с одним или несколькими радионуклидами. Типичные радионуклиды, которые могут быть использованы в контексте данного аспекта настоящего изобретения, включают в себя без ограничения, например, 225Ac, 212Bi, 213Bi, 131I, 186Re, 227Th, 222Rn, 223Ra, 224Ra и 90Y.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения представлены ADC, содержащие антитело против EGFRvIII, конъюгированное с цитотоксическим средством (например, любым из цитотоксических средств, раскрытых выше) через линкерную молекулу. Может быть использована любая линкерная молекула или линкерная технология, известная в уровне техники, для создания или конструирования ADC в соответствии с настоящим изобретением. Согласно некоторым вариантам осуществления линкером является расщепляемый линкер. Согласно другим вариантам осуществления линкером является нерасщепляемый линкер. Типичные линкеры, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, включают в себя линкеры, которые содержат или состоят из, например, МС (6-малеимидокапроила), MP (малеимидопропаноила), val-cit (валин-цитруллина), val-ala (валин-аланина), дипептидного сайта в расщепляемом протеазой линкере, ala-phe (аланин-фенилаланина), дипептидного сайта в расщепляемом протеазой линкере, РАВ (п-аминобензилоксикарбонила), SPP (Тч[-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноата), SMCC (М-сукцинимидил-4-(М-малеимидометил)циклогексан-1 -карбоксилата), SIAB (ГЧ-сукцинимидил-(4-йод-ацетил)аминобензоата), а также их вариантов и комбинаций. Дополнительные примеры линкеров, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, раскрываются, например, в патенте США № 7754681 и в Ducry, Bioconjugate Chem., 2010, 27:5-13, а также в ссылках, цитируемых там, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Настоящее изобретение относится к ADC, в которых линкер соединяет антитело против EGFRvIII или антигенсвязывающую молекулу с лекарственным средством или цитотоксином посредством присоединения на определенной аминокислоте в антителе
или антигенсвязывающей молекуле. Типичные аминокислотные присоединения, которые могут быть использованы в контексте данного аспекта настоящего изобретения, включают в себя, например, лизин (см., например, патент США № 5208020; заявку на выдачу патента США № 2010/0129314; Hollander et al, Bioconjugate Chem., 2008, 19:358-361; WO 2005/089808; патент США № 5714586; заявки на выдачу патентов США №№ 2013/0101546 и 2012/0585592), цистеин (см., например, заявку на выдачу патента США № 2007/0258987; WO 2013/055993; WO 2013/055990; WO 2013/053873; WO 2013/053872; WO 2011/130598; заявку на выдачу патента США № 2013/0101546 и патент США №7750116), селеноцистеин (см., например, WO 2008/122039; и Hofer et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2008, 705:12451-12456), формилглицин (см., например, Carrico et al., Nat. Chem. Biol, 2007, 3:321-322; Agarwal et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2013, 770:46-51, и Rabuka et al, Nat. Protocols, 2012, 70:1052-1067), не встречающиеся в природе аминокислоты (см., например, WO 2013/068874 и WO 2012/166559) и кислые аминокислоты (см., например, WO 2012/05982). Линкеры также могут быть конъюгированы с антигенсвязывающим белком путем присоединения к углеводам (см., например, заявку на выдачу патента США № 2008/0305497 и Hollander et al, Bioconjugate Chem., 2008, 19:358-361) и к дисульфидным линкерам (см., например, WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611 и Shaunak etal, Nat. Chem. Biol, 2006, 2:312-313).
Любой известный в уровне техники способ конъюгации химического фрагмента с пептидом, полипептидом или другой макромолекулой может быть использован в контексте настоящего изобретения для создания ADC против EGFRvIII, описываемого в настоящем документе. Типичный способ конъюгации антитела с лекарственным средством через линкер изложен в примере 12 в настоящем документе. Вариации такого типичного способа будут очевидны рядовым специалистам в данной области и охватываются объемом настоящего изобретения.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к ADC, при этом антитело против EGFRvIII, описываемое в настоящем документе (например, антитело, обозначаемое H1H1863N2), конъюгировано с композицией линкер-лекарственное средство, как изложено в WO 2014/145090 (например, соединение "7", также называемое в настоящем документе "М0026"), раскрытие которой тем самым включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте (см. также пример 12 в настоящем документе).
Картирование эпитопа и связанные с этим технологии
Эпитоп, с которым связываются антитела в соответствии с настоящим изобретением, может состоять из одной непрерывной последовательности из 3 или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше) аминокислот белка EGFRvIII. В качестве альтернативы, эпитоп может состоять из множества прерывистых аминокислот (или аминокислотных последовательностей) EGFRvIII. Согласно некоторым вариантам осуществления эпитоп располагается на связывающимся с лигандом домене EGFRvIII или рядом с ним. Согласно другим вариантам осуществления эпитоп располагается вне связывающегося с лигандом домена EGFRvIII, например, располагается на поверхности EGFRvIII, при этом антитело, при связывании с таким эпитопом, не мешает связыванию лиганда с EGFRvIII.
Настоящее изобретение согласно некоторым вариантам осуществления относится к антителам против EGFRvIII, которые специфично связываются с EGFRvIII (но не связываются с EGFR), при этом антитела распознают соединительный пептид EGFRvIII (например, SEQ Ш N0: 148). Такие антитела могут называться в настоящем документе "связующие соединительного пептида", "антитела, связывающиеся с пептидом EGFRvIII" и т.п. Настоящее изобретение согласно другим вариантам осуществления относится к антителам против EGFRvIII, которые специфично связываются с EGFRvIII (но не связываются с EGFR), при этом антитела не распознают соединительный пептид EGFRvIII (например, не распознают соединительный пептид SEQ ID NO: 148 и/или не распознают пептид SEQ ID NO: 165). Такие антитела могут называться в настоящем документе "конформационными связующими", "связующими конформационного эпитопа EGFRvIII)) и т.п.
Различные методики, известные рядовым специалистам в данной области, могут быть использованы для определения взаимодействия антитела с одной или несколькими аминокислотами в полипептиде или белке. Типичные методики включают в себя, например, рутинный перекрестный конкурентный анализ, такой как описанный в Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), аланин-сканирующий мутационный анализ, пептидный блот-анализ (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463) и анализ расщепления пептида. Кроме того, могут быть использованы способы, такие как удаление эпитопа, экстракция эпитопа и химическая модификация антигенов (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Другим способом, который может быть использован для идентификации аминокислот в полипептиде, с
которым взаимодействует антитело, является водородно-дейтериевый обмен, выявляемый масс-спектрометрией. В общих чертах, способ водородно-дейтериевого обмена предусматривает мечение дейтерием представляющего интерес белка с последующим связыванием антитела с меченным дейтерием белком. Затем комплекс белок/антитело перемещают в воду для обеспечения протекания водородно-дейтериевого обмена на всех остатках за исключением остатков, защищенных антителом (которые остаются меченными дейтерием). После диссоциации антитела целевой белок подвергают расщеплению протеазой и масс-спектрометрическому анализу с выявлением тем самым меченных дейтерием остатков, которые соответствуют определенным аминокислотам, с которыми взаимодействует антитело. См., например, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal Chem. 73:256A-265A.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к антителам против EGFRvIII, которые связываются с одним и тем же эпитопом, что и любое из конкретных типичных антител, описываемых в настоящем документе (например, антител, содержащих любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в таблице 1 в настоящем документе). Подобным образом, настоящее изобретение также относится к антителам против EGFRvIII, которые конкурируют за связывание с EGFRvIII с любым их конкретных антител, описываемых в настоящем документе (например, антител, содержащих любую из аминокислотных последовательностей, приведенных в таблице 1 в настоящем документе).
Можно легко определить, связывается ли антитело с тем же эпитопом, что и эталонное антитело против EGFRvIII, или конкурирует за связывание с таковым, с использованием рутинных способов, известных в уровне техники и представленных в настоящем документе. Например, для определения связывания тестируемого антитела с тем же самым эпитопом, что и эталонное антитело против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивают связывание эталонного антитела с белком EGFRvIII. Затем оценивают способность тестируемого антитела связываться с молекулой EGFRvIII. Если тестируемое антитело способно связываться с EGFRvIII после насыщающего связывания с эталонным антителом против EGFRvIII, то можно заключить, что тестируемое антитело связывается с эпитопом, отличным от такового для эталонного антитела против EGFRvIII. С другой стороны, если тестируемое антитело не способно связываться с молекулой EGFRvIII после насыщающего связывания с эталонным антителом против EGFRvIII, то тестируемое антитело может
связываться с тем же самым эпитопом, что и эпитоп, связанный эталонным антителом против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением. Затем можно провести дополнительный рутинный эксперимент (например, анализы пептидной мутации и связывания) для подтверждения того, что наблюдаемое отсутствие связывания тестируемого антитела объясняется связыванием с тем же эпитопом, что и связывание эталонного антитела, или тем, что за отсутствие наблюдаемого связывания отвечает пространственное блокирование (или другое явление). Эксперименты подобного рода могут быть выполнены с использованием ELISA, RIA, Biacore, проточной цитометрии или любого другого количественного или качественного анализа связывания антитела, известного в уровне техники. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения два антитела связываются с одним и тем же (или перекрывающимся) эпитопом, если, например, 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратный избыток одного антитела ингибирует связывание другого по меньшей мере на 50%, но предпочтительно на 75%, 90% или даже 99%, как измерено в анализе конкурентного связывания (см., например, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). В качестве альтернативы, считают, что два антитела связываются с одним и тем же эпитопом, если главным образом все аминокислотные мутации в антигене, которые снижают или исключают связывание одного антитела, снижают или исключают связывание другого. Считают, что два антитела имеют "перекрывающиеся эпитопы", если только подгруппа аминокислотных мутаций, которые снижают или исключают связывание одного антитела, снижают или исключают связывание другого.
Для определения того, конкурирует ли антитело за связывание (или перекрестно конкурирует за связывание) с эталонным антителом против EGFRvIII, описываемый выше метод связывания осуществляют в двух направлениях. Согласно первому направлению обеспечивают связывание эталонного антитела с белком EGFRvIII в условиях насыщения с последующим оцениванием связывания тестируемого антитела с молекулой EGFRvIII. Согласно второму направлению обеспечивают связывание тестируемого антитела с молекулой EGFRvIII в условиях насыщения с последующим оцениванием связывания эталонного антитела с молекулой EGFRvIII. Если, согласно обоим направлениям, только первое (насыщающее) антитело способно связываться с молекулой EGFRvIII, то заключают, что тестируемое антитело и эталонное антитело конкурируют за связывание с EGFRvIII. Как будет понятно рядовому специалисту в данной области, антитело, которое конкурирует за связывание с эталонным антителом, необязательно может связываться с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, но
может пространственно блокировать связывание эталонного антитела путем связывания перекрывающегося или соседнего эпитопа.
Получение человеческих антител
Антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением могут быть полностью человеческими антителами. Способы создания моноклональных антител, в том числе полностью человеческих моноклональных антител, известны в уровне техники. Любые такие известные способы могут быть использованы в контексте настоящего изобретения для получения человеческих антител, которые специфично связываются с человеческим EGFRvIII.
С использованием технологии, например, VELOCIMMIJNE(tm) или любого другого подобного известного способа, для создания полностью человеческих моноклональных антител сначала выделяют высокоаффинные химерные антитела против EGFRvIII, имеющие человеческую вариабельную область и мышиную константную область. Как в нижеприведенном экспериментальном разделе, антитела характеризуют и отбирают по желаемым характеристикам, в том числе по аффинности, активности блокирования лиганда, селективности, эпитопу и т.д. При необходимости мышиные константные области заменяют желаемой человеческой константной областью, например, дикого типа или модифицированного IgGl или IgG4, с созданием полностью человеческого антитела против EGFRvIII. Тогда как выбранная константная область может варьировать согласно конкретному применению, вариабельной области свойственны характеристики высокоаффинного связывания антигена и целевой специфичности. В определенных случаях полностью человеческие антитела против EGFRvIII выделяют непосредственно из антиген-положительных В-клеток.
Биоэквиваленты
Антитела против EGFRvIII и фрагменты антител в соответствии с настоящим изобретением охватывают белки с аминокислотными последовательностями, которые варьируют в отношении таковых в описываемых антителах, но которые сохраняют способность связываться с человеческим EGFRvIII. Такие вариантные антитела и фрагменты антител содержат одно или несколько из добавлений, делеций или замен аминокислот по сравнению с исходной последовательностью, но демонстрируют биологическую активность, которая главным образом эквивалентна таковой описываемых антител. Подобным образом, кодирующие антитело против EGFRvIII
последовательности ДНК в соответствии с настоящим изобретением охватывают последовательности, которые содержат одно или несколько из добавлений, делеций или замен нуклеотидов по сравнению с раскрытой последовательностью, но которые кодируют антитело против EGFRvIII или фрагмент антитела, которые главным образом биоэквивалентны антителу против EGFRvIII или фрагменту антитела в соответствии с настоящим изобретением. Примеры таких вариантных последовательностей аминокислот и ДНК обсуждаются выше.
Два антигенсвязывающих белка или антитела считают биоэквивалентными, если, например, они являются фармацевтическими эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, чья скорость и степень абсорбции не показывают существенного различия при введении при одинаковой молярной дозе при подобных экспериментальных условиях либо однократной дозой, либо многократной дозой. Некоторые антитела будут считать эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, если они эквивалентны по степени их абсорбции, но не по их скорости абсорбции, и все же могут считаться биоэквивалентными, поскольку такие различия в скорости абсорбции являются запланированными и отражены в мечении, но не являются существенными для достижения эффективных концентраций лекарственного средства в организме, например, при длительном применении, и с медицинской точки зрения считаются незначительными для конкретного исследуемого лекарственного продукта.
Согласно одному варианту осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если не наблюдаются с клинической точки зрения существенные различия в их безопасности, чистоте и эффективности.
Согласно одному варианту осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если больной может быть переключен один или несколько раз с эталонного продукта на биологический продукт без предполагаемого повышения риска побочных эффектов, в том числе с клинической точки зрения существенного изменения иммуногенности или уменьшенной эффективности по сравнению с длительной терапией без такого переключения.
Согласно одному варианту осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если они действуют по общему механизму или механизмам действия при условии или условиях применения в случае, если такие механизмы известны.
Биоэквивалентность может быть продемонстрирована in vivo и in vitro
способами. Измерения биоэквивалентности включают в себя, например, (a) in vivo тестирование людей или других млекопитающих, при котором измеряют концентрацию антитела или его метаболитов в крови, плазме, сыворотке крови или другой биологической жидкости как функцию времени; (b) in vitro тестирование, которое коррелирует с данными in vivo биодоступности человека и обоснованно прогнозирует таковые; (с) in vivo тестирование людей или других млекопитающих, при котором измеряют соответствующий видимый фармакологический эффект антитела (или его цели) как функцию времени; и (d) хорошо контролируемое клиническое испытание, при котором устанавливают безопасность, эффективность, или биодоступность, или биоэквивалентность антитела.
Биоэквивалентные варианты антител против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением могут быть сконструированы, например, путем осуществления различных замен остатков или последовательностей или делеции концевых или внутренних остатков или последовательностей, не являющихся необходимыми для биологической активности. Например, цистеиновые остатки, не являющиеся важными для биологической активности, могут быть исключены или заменены на другие аминокислоты для предупреждения образования ненужных или некорректных внутримолекулярных дисульфидных мостиков при ренатурации. В других контекстах биоэквивалентные антитела могут включать в себя варианты антитела против EGFRvIII, содержащие аминокислотные изменения, которые модифицируют характеристики гликозилирования антител, например, мутации, которые исключают или устраняют гликозилирование.
Видовая селективность и видовая перекрестная реактивность
Настоящее изобретение согласно некоторым вариантам осуществления относится к антителам против EGFRvIII, которые связываются с человеческим EGFRvIII, но не с EGFRvIII других видов. Настоящее изобретение также относится к антителам против EGFRvIII, которые связываются с человеческим EGFRvIII и с EGFRvIII одного или нескольких отличных от человека видов. Например, антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением могут связываться с человеческим EGFRvIII и могут связываться или не могут связываться, в зависимости от ситуации, с одним или несколькими EGFRvIII мыши, крысы, морской свинки, хомяка, песчанки, свиньи, кошки, собаки, кролика, козы, овцы, коровы, лошади, верблюда, яванского макака, мармозетки, макака-резус или шимпанзе. Согласно
некоторым типичным вариантам осуществления настоящего изобретения представлены антитела против EGFRvIII, которые специфично связываются с человеческим EGFRvIII и EGFRvIII яванского макака (например, Масаса fascicular is). Другие антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением связываются с человеческим EGFRvIII, но не связываются или лишь слабо связываются с EGFRvIII яванского макака.
Мультиспецифические антитела
Антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть моноспецифическими или мультиспецифическими (например, биспецифическими). Мультиспецифические антитела могут быть специфическими по отношению к разным эпитопам одного целевого полипептида или могут содержать антигенсвязывающие домены, специфические по отношению к более чем одному целевому полипептиду. См., например, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al, 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением могут быть связаны или совместно экспрессированы с другой функциональной молекулой, например, другим пептидом или белком. Например, антитело или его фрагмент могут быть функционально связаны (например, химическим присоединением, генетическим слиянием, нековалентной связью или иным образом) с одним или несколькими другими молекулярными объектами, такими как другое антитело или фрагмент антитела, с получением биспецифического или мультиспецифического антитела со второй специфичностью связывания.
Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, у которых одно плечо иммуноглобулина связывается с человеческим EGFRvIII, а другое плечо иммуноглобулина является специфическим по отношению ко второму антигену. Связывающееся с EGFRvIII плечо может содержать любую из HCVR/LCVR или CDR аминокислотных последовательностей, приведенных в таблице 1 в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам осуществления связывающееся с EGFRvIII плечо связывается с человеческим EGFRvIII и блокирует связывание лиганда с EGFRvIII. Согласно другим вариантам осуществления связывающееся с EGFRvIII плечо связывается с человеческим EGFRvIII, но не блокирует связывание лиганда с EGFRvIII.
Типичный формат биспецифического антитела, который может быть использован в контексте настоящего изобретения, предусматривает применение
первого домена СнЗ иммуноглобулина (Ig) и второго домена СнЗ Ig, при этом первый и второй домены СнЗ Ig отличаются друг от друга по меньшей мере одной аминокислотой, и при этом по меньшей мере одно аминокислотное отличие снижает связывание биспецифического антитела с белком А по сравнению с биспецифическим антителом без аминокислотного отличия. Согласно одному варианту осуществления первый домен СнЗ Ig связывается с белком А, а второй домен СнЗ Ig содержит мутацию, которая снижает или отменяет связывание белка А, такую как модификация H95R (по нумерации экзонов IMGT; H435R - по EU нумерации). Второй СнЗ, кроме того, может содержать модификацию Y96F (по IMGT; Y436F - по EU). Дополнительные модификации, которые могут встречаться во втором СнЗ, включают в себя D16E, L18M, N44S, K52N, V57M и V82I (по IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M и V422I - по EU) в случае антител IgGl; N44S, K52N и V82I (по IMGT; N384S, K392N и V422I - по EU) в случае антител IgG2, а также Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q и V82I (по IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q и V422I -по EU) в случае антител IgG4. Описываемые выше вариации формата биспецифического антитела охватываются объемом настоящего изобретения.
Другие типичные биспецифические форматы, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, включают в себя без ограничения, например, основанные на scFv или диателе биспецифические форматы, слияния IgG-scFv, двойной изменчивый домен (DVD)-Ig, квадрому, "выступы-во-впадины", общую легкую цепь (например, общую легкую цепь с "выступами-во-впадинах" и т.д.), CrossMab, CrossFab, SEEDbody, лейциновую "застежку", DuoBody, IgGl/IgG2, Fab (DAF)-IgG двойного действия и биспецифические форматы Mab2 (см., например, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, и цитируемые там ссылки, для обзора вышеупомянутых форматов). Биспецифические антитела также могут быть сконструированы с использованием конъюгации пептида с нуклеиновой кислотой, например, при которой используются невстречающиеся в природе аминокислоты с ортогональной химической реакционной способностью для создания конъюгатов сайт-специфическое антитело-олигонуклеотид, которые затем самостоятельно собираются в мультимерные комплексы с определенными композицией, валентностью и геометрией (см., например, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]).
Терапевтический состав и введение
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям,
содержащим антитела против EGFRvIII или их антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением. Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением составляют с приемлемыми носителями, вспомогательными средствами и другими средствами, которые обеспечивают улучшенные перенос, доставку, переносимость и т.п. Множество соответствующих составов могут быть найдены в известном всем фармацевтам справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Такие составы включают в себя, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, содержащие липид (катионный или анионный) везикулы (такие как LIPOFECTIN(tm), Life Technologies, Carlsbad, СА), конъюгаты ДНК, безводные абсорбционные пасты, эмульсии "масло-в-воде" и "вода-в-масле", эмульсии карбовакса (полиэтиленгликолей с различной молекулярной массой), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. См. также Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
Доза антитела, вводимая больному, может варьировать в зависимости от возраста и массы больного, целевого заболевания, состояний, пути введения и т.п. Предпочтительную дозу, как правило, рассчитывают по массе тела или площади поверхности тела. Для взрослого больного может быть целесообразным внутривенное введение антитела в соответствии с настоящим изобретением обычно однократной дозой от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мг/кг массы тела, более предпочтительно от приблизительно 0,02 до приблизительно 7, от приблизительно 0,03 до приблизительно 5 или от приблизительно 0,05 до приблизительно 3 мг/кг массы тела. В зависимости от тяжести состояния можно регулировать частоту и длительность лечения. Эффективные дозировки и схемы для введения антител против EGFRvIII могут быть определены эмпирически; например, прогресс у больного можно контролировать путем периодического оценивания и соответственно регулировать дозу. Более того, межвидовое оценивание дозировок можно осуществлять с использованием способов, хорошо известных в уровне техники (например, Mordenti et al, 1991, Pharmaceut. Res. 5:1351).
Известны и могут быть использованы различные системы доставки для введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, например, инкапсулирование в липосомах, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать мутантные вирусы, опосредованный рецепторами эндоцитоз (см., например, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Способы
введения включают в себя без ограничения внутрикожный, внутримышечный, внутриперитонеальный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный пути. Композиция может быть введена любым удобным путем, например, инфузией или болюсной инъекцией, абсорбцией через эпителиальные или слизисто-кожные оболочки (например, через слизистую полости рта, ректальную и кишечную слизистую и т.д.), и может быть введена вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или местным.
Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть доставлена подкожно или внутривенно стандартными иглой и шприцем. Кроме того, в отношении подкожной доставки, удобно применять устройство доставки в виде шприца-ручки при доставке фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением. Такое устройство доставки в виде шприца-ручки может быть многоразовым или одноразовым. В многоразовом устройстве доставки в виде шприца-ручки, как правило, используется сменный картридж, который содержит фармацевтическую композицию. Как только вся фармацевтическая композиция в картридже введена, и картридж опустошился, пустой картридж можно легко снять и заменить новым картриджем, который содержит фармацевтическую композицию. Затем устройство доставки в виде шприца-ручки можно использовать повторно. В одноразовом устройстве доставки в виде шприца-ручки нет сменного картриджа. Напротив, одноразовое устройство доставки в виде шприца-ручки предварительно заполнено фармацевтической композицией, хранящейся в резервуаре устройства. Как только фармацевтическая композиция в резервуаре заканчивается, все устройство выбрасывают.
Применяют многочисленные многоразовые устройства доставки в виде шприцев-ручек и шприцев для самостоятельной инъекции при подкожной доставке фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением. Примеры включают в себя без ограничения шприц-ручку AUTOPEN(tm) (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), шприц-ручку DISETRONIC(tm) (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), шприц-ручку HUMALOG MIX 75/25(tm), шприц-ручку HUMALOG(tm), шприц-ручку HUMALIN 70/30(tm) (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN(tm) I, II и III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR(tm) (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), шприц-ручку BD(tm) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN(tm), OPTIPEN PRO(tm), OPTIPEN STARLET(tm) и OPTICLIK(tm) (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany) среди прочих. Примеры одноразовых устройств доставки в виде
шприцев-ручек, применяемых при подкожной доставке фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя без ограничения шприц-ручку SOLOSTAR(tm) (Sanofi-Aventis), FLEXPEN(tm) (Novo Nordisk) и KWIKPEN(tm) (Eli Lilly), шприц для самостоятельной инъекции SURECLICK(tm) (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET(tm) (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.) и шприц-ручку HUMIRA(tm) (Abbott Labs, Abbott Park IL) среди прочих.
В некоторых ситуациях фармацевтическая композиция может быть доставлена в системе контролированного высвобождения. Согласно одному варианту осуществления может быть использован насос (см. Langer выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Согласно другому варианту осуществления могут быть использованы полимерные материалы, см. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. Согласно следующему варианту осуществления система контролированного высвобождения может быть помещена рядом с целью композиции, таким образом, при этом необходима только часть системной дозы (см., например, Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Другие системы контролированного высвобождения обсуждаются в обзоре Langer, 1990, Science 249:1527-1533.
Инъекционные препараты могут включать в себя дозированные формы для внутривенных, подкожных, внутрикожных и внутримышечных инъекций, капельных инфузий и т.д. Такие инъекционные препараты могут быть получены общеизвестными способами. Например, инъекционные препараты могут быть получены, например, путем растворения, суспендирования или эмульгирования описываемых выше антитела или его соли в стерильной водной среде или в масляной среде, традиционно используемых для инъекций. Что касается водной среды для инъекций, используют, например, физиологический раствор, изотонический раствор, содержащий глюкозу, другие вспомогательные средства и т.д., которые могут быть использованы в комбинации с соответствующим солю бил изирующим средством, таким как спирт (например, этанол), многоатомный спирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионное поверхностно-активное вещество (например, полисорбат 80, НСО-50 (полиоксиэтилен (50 мол.) аддукт гидрогенизированного касторового масла)) и т.д. Что касается масляной среды, используют, например, кунжутное масло, соевое масло и т.д., которые могут быть использованы в комбинации с солюбилизирующим средством, таким как бензилбензоат, бензиловый спирт и т.д. Полученной таким образом инъекцией предпочтительно заполняют соответствующую
ампулу.
Преимущественно фармацевтические композиции для описываемого выше перорального или парентерального применения получают в дозированных формах с единичной дозой, подходящей для добавления дозы активных ингредиентов. Такие дозированные формы в единичной дозе включают в себя, например, таблетки, пилюли, капсулы, инъекции (ампулы), суппозитории и т.д. Количество вышеупомянутого антитела, как правило, составляет от приблизительно 5 до приблизительно 500 мг на дозированную форму в единичной дозе, в частности, для формы инъекции предпочтительно, чтобы вышеупомянутое антитело составляло от приблизительно 5 до приблизительно 100 мг и от приблизительно 10 до приблизительно 250 мг для других дозированных форм.
Терапевтические применения антител
Настоящее изобретение относится к способам, предусматривающим введение субъекту при необходимости этого терапевтической композиции, содержащей антитело против EGFRvIII или конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий антитело против EGFRvIII (например, антитело против EGFRvIII или ADC, содержащий любую из последовательностей HCVR/LCVR или CDR, приведенных в таблице 1 в настоящем документе). Терапевтическая композиция может содержать любые из антител против EGFRvIII, их антигенсвязывающих фрагментов или ADC, раскрываемых в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Антитела и ADC в соответствии с настоящим изобретением применимы, inter alia, для лечения, предупреждения и/или облегчения какого-либо заболевания или нарушения, ассоциированного с экспрессией или активностью EGFRvIII или опосредованного таковыми, или излечиваемого путем блокирования взаимодействия между EGFRvIII и лигандом EGFR или иного ингибирования активности EGFRvIII и/или передачи сигнала, и/или обеспечения интернализации рецептора, и/или снижения числа рецепторов клеточной поверхности. Например, антитела и ADC в соответствии с настоящим изобретением применимы для лечения опухолей, которые экспрессируют EGFRvIII и/или которые отвечают на опосредованную лигандом передачу сигнала. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением также могут быть использованы для лечения первичных и/или метастатических опухолей, возникающих в головном мозге и оболочках головного мозга, ротоглотке,
легком и бронхиальном дереве, желудочно-кишечном тракте, мужской и женской половой системе, мышце, кости, коже и придатках, соединительной ткани, селезенке, иммунной системе, кроветворных клетках и костном мозге, печени и мочевыводящих путях и специальных органах чувств, таких как глаз. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела и ADC в соответствии с настоящим изобретением используют для лечения одной или нескольких из следующих злокачественных опухолей: почечно-клеточной карциномы, карциномы поджелудочной железы, злокачественной опухоли головы и шеи, злокачественной опухоли предстательной железы, злокачественных глиом, остеосаркомы, колоректальной злокачественной опухоли, злокачественной опухоли желудка (например, злокачественной опухоли желудка с амплификацией МЕТ), злокачественной мезотелиомы, множественной миеломы, злокачественной опухоли яичника, мелкоклеточной злокачественной опухоли легкого, немелкоклеточной злокачественной опухоли легкого, синовиальной саркомы, злокачественной опухоли щитовидной железы, злокачественной опухоли молочной железы или меланомы.
В контексте способов лечения, описываемых в настоящем документе, антитело против EGFRvIII может быть введено в виде монотерапии (т.е. как единственное терапевтическое средство) или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами (примеры которых описываются в других разделах настоящего документа).
Согласно конкретным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли, снижения роста опухоли и/или обеспечения регрессии опухоли у больного. Способы в данном аспекте настоящего изобретения предусматривают введение больному первого конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC), либо отдельно, либо в комбинации со вторым антителом против EGFRvIII или ADC. Первое ADC, как правило, будет содержать антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела и цитотоксин, при этом антитело или антигенсвязывающий фрагмент первого ADC специфично связывается с EGFRvIII, но не связывается с соединительным пептидом EGFRvIII из SEQ Ш N0: 148 или пептидом из SEQ ID N0: 165 (т.е. первый ADC содержит связывающееся с конформационным EGFRvIII антитело). Согласно вариантам осуществления, при которых вводят вторые антитело или ADC, вторые антитело или ADC, как правило, будут содержать антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела и цитотоксин, при этом вторые антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфично
связываются с EGFRvIII, а также связываются с соединительным пептидом EGFRvIII из SEQ Ш N0: 148 и/или пептидом из SEQ ID N0: 165 (т.е. вторые антитело или ADC содержат связывающееся с соединительным пептидом EGFRvIII антитело). При использовании двух отдельных ADC против EGFRvIII в контексте данного аспекта настоящего изобретения согласно некоторым вариантам осуществления оба ADC могут содержать одинаковое цитотоксическое средство или цитотоксическое средство одного и того же класса. Согласно другим вариантам осуществления при использовании двух отдельных ADC против EGFRvIII каждый ADC может содержать отличающееся цитотоксическое средство и/или цитотоксическое средство другого класса. Неограничивающие типичные варианты осуществления данного аспекта настоящего изобретения изложены в настоящем документе в примере 14. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент первого ADC (т.е. связывающееся с конформационным EGFRvIII антитело) содержит определяющие комплементарность области тяжелой и легкой цепей, включающие в себя SEQ Ш N0: 36, 38, 40, 44, 46 и 48, или вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя SEQ ID N0: 34, и вариабельную область легкой цепи, включающую в себя SEQ ID N0: 42.
Комбинационные терапевтические средства и составы
Настоящее изобретение относится к композициям и терапевтическим составам, содержащим любое из антител против EGFRvIII, описываемых в настоящем документе, в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными компонентами, и к способам лечения, предусматривающим введение таких комбинаций субъектам при необходимости этого.
Антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением могут быть совместно составлены и/или введены в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными компонентами, выбранными из группы, состоящей из антагонста PRLR (например, антитела против PRLR или низкомолекулярного ингибитора PRLR), антагониста EGFR (например, антитела против EGFR (например, цетуксимаба или панитумумаба) или низкомолекулярного ингибитора EGFR (например, гефитиниба или эрлотиниба)), антагониста другого представителя семейства EGFR, такого как Her2/ErbB2, ЕгЬВЗ или ЕгЬВ4 (например, антител против ЕгЬВ2 (например, трастузумаба или T-DM1 (KADCYLA(r))), против ЕгЬВЗ или против ЕгЬВ4 или низкомолекулярного ингибитора активности ЕгЬВ2, ЕгЬВЗ
или ErbB4), антагониста сМЕТ (например, антитела против сМЕТ), антагониста IGF1R (например, антитела против IGF1R), ингибитора B-raf (например, вемурафениба, сорафениба, GDC-0879, PLX-4720), ингибитора PDGFR-a (например, антитела против PDGFR-a), ингибитора PDGFR-P (например, антитела против PDGFR-P или низкомолекулярного ингибитора киназы, такого как, например, иматиниб мезилат или сунитиниб малат), ингибитора лиганда PDGF (например, антитела против PDGF-A, -В, -С или -D, аптамера, siRNA и т.д.), антагониста VEGF (например, VEGF-Trap, такого как афлиберсепт, см., например, патент США № 7087411 (также называемый в настоящем документе "ингибирующим VEGF белком слияния"), антитела против VEGF (например, бевацизумаба), низкомолекулярного ингибитора киназы рецептора VEGF (например, сунитиниба, сорафениба или пазопаниба)), антагониста DLL4 (например, антитела против DLL4, раскрываемого в заявке на выдачу патента США № 2009/0142354, такого как REGN421), антагониста (например, антитела против Ang2, раскрываемого в заявке на выдачу патента США №2011/0027286, такого как Н1Н685Р), антагониста FOLH1 (например, антитела против FOLH1), антагониста STEAP1 или STEAP2 (например, антитела против STEAP1 или антитела против STEAP2), антагониста TMPRSS2 (например, антитела против TMPRSS2), антагониста MSLN (например, антитела против MSLN), антагониста СА9 (например, антитела против СА9), уроплакинового антагониста (например, антитела против уроплакина (например, антитела против UPK3A)), антагониста MUC16 (например, антитела против MUC16), антагониста антигена Тп (например, антитела против Тп), антагониста CLEC12A (например, антитела против CLEC12A), антагониста TNFRSF17 (например, антитела против TNFRSF17), антагониста LGR5 (например, антитела против LGR5), моновалентного антагониста CD20 (например, моновалентного антитела против CD20, такого как ритуксимаб), антитела против PD-1, антитела против PD-L1, антитела против CD3, антитела против CTLA-4 и т.д. Другие средства, которые предпочтительно могут быть введены в комбинации с биспецифическими антигенсвязывающими молекулами в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя, например, тамоксифен, ингибиторы ароматазы и цитокиновые ингибиторы, в том числе низкомолекулярные цитокиновые ингибиторы, и антитела, которые связываются с цитокинами, такими как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, или с их соответствующими рецепторами.
Настоящее изобретение относится к композициям и терапевтическим составам, содержащим любое из антител против EGFRvIII, описываемых в настоящем документе,
в комбинации с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами. Примеры химиотерапевтических средств включают в себя алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклосфосфамид (Cytoxan(tm)); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импосульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохинон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, в том числе алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, меклоретамин, меклоретамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномицины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихемицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитадин, 6-азауредин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, подавляющие функцию коры надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; средство для восполнения фолиевой кислоты, такое как фолиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидгликозин; аминолевулиновую кислоту; амсарцин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; этоглюцид; галлия нитрат; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK(tm); разоксан; сизфиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ага-С"); циклофосфамид; тиотепа; таксаны, например, паклитаксел (Taxol(tm), Bristol-Myers
Squibb Oncology, Princeton, N.J.) и доцетаксел (Taxotere(tm); Aventis Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевую кислоту; эсперамицины; капецитабин, а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых из вышеупомянутых. Также данное определение предусматривает противогормональные средства, которые действуют с регулированием или ингибированием действия гормонов в опухолях, такие как антиэстрогены, в том числе, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY 117018, онапристон и торемифен (фарестон); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и гозерелин; а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых из вышеупомянутых.
Антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением также могут быть введены и/или совместно составлены в комбинации с противовирусными средствами, антибиотиками, анальгетиками, кортикостероидами, стероидами, кислородом, антиоксидантами, ингибиторами СОХ, кардиозащитными средствами, металлохелатами, IFN-гамма и/или NSAID.
Дополнительный терапевтически активный компонент(ы), например, какое-либо из приведенных выше средств или их производных, может быть введен до, одновременно или сразу же после введения антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением (для целей настоящего раскрытия такие режимы введения предусматривают введение антитела против EGFRvIII в комбинации с дополнительным терапевтически активным компонентом). Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, в которых антитело против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением совместно составлено с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными компонентами, как описывается в других разделах настоящего документа.
Режимы введения
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения многократные дозы антитела против EGFRvIII (или фармацевтической композиции,
содержащей комбинацию антитела против EGFRvIII и любое из дополнительных терапевтически активных средств, упомянутых в настоящем документе) могут быть введены субъекту за определенный период времени. Способы в данном аспекте настоящего изобретения предусматривают последовательное введение субъекту многократных доз антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением. Используемый в настоящем документе термин "последовательное введение" означает, что каждую дозу антитела против EGFRvIII вводят субъекту в определенный момент времени, например, в разные сутки, разделенные предварительно определенным интервалом (например, часы, сутки, недели или месяцы). Настоящее изобретение относится к способам, которые предусматривают последовательное введение больному однократной начальной дозы антитела против EGFRvIII, а затем одной или нескольких вторичных доз антитела против EGFRvIII и необязательно с последующими одной или несколькими третичными дозами антитела против EGFRvIII.
Термины "начальная доза", "вторичные дозы" и "третичные дозы" относятся к временной последовательности введения антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, "начальная доза" представляет собой дозу, которую вводят в начале режима лечения (также называется "исходной дозой"); "вторичные дозы" представляют собой дозы, которые вводят после начальной дозы; а "третичные дозы" представляют собой дозы, которые вводят после вторичных доз. Все начальная, вторичные и третичные дозы могут содержать одинаковое количество антитела против EGFRvIII, но, как правило, могут отличаться друг от друга по частоте введения. Согласно некоторым вариантам осуществления, однако, количество антитела против EGFRvIII, содержащегося в начальной, вторичных и/или третичных дозах, варьирует от одной к другой (например, повышается или понижается по необходимости) в ходе лечения. Согласно некоторым вариантам осуществления две или более (например, 2, 3, 4 или 5) доз вводят в начале режима лечения как "загружающие дозы", а затем последующие дозы, которые вводят менее часто (например, "поддерживающие дозы").
Согласно некоторым типичным вариантам осуществления настоящего изобретения каждую вторичную и/или третичную дозу вводят через 1-26 (например, 1, 1%, 2, 2%, 3, 3%, 4, 4%, 5, 5%, 6, 6%, 7, 7%, 8, 8%, 9, 9*4, 10, 10%, 11, 1114, 12, 12%, 13, 13%, 14, 14%, 15, 15%, 16, 16%, 17, 17*4, 18, 18%, 19, 19%, 20, 20%, 21, 21%, 22, 22%, 23, 23%, 24, 24%, 25, 25%, 26, 26% или больше) недель после непосредственно
предшествующей дозы. Используемая в настоящем документе фраза "непосредственно предшествующая доза" означает при последовательности нескольких введений дозу антитела против EGFRvIII, которую вводят больному до введения следующей дозы в последовательности без промежуточных доз.
Способы в данном аспекте настоящего изобретения могут предусматривать введение больному любого числа вторичных и/или третичных доз антитела против EGFRvIII. Например, согласно некоторым вариантам осуществления больному вводят только одну вторичную дозу. Согласно другим вариантам осуществления больному вводят две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше) вторичных доз. Подобным образом, согласно некоторым вариантам осуществления больному вводят единственную третичную дозу. Согласно другим вариантам осуществления больному вводят две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше) третичных доз. Режим введения может осуществляться неограниченно в течение жизни конкретного субъекта, или до тех пор, пока в таком лечении больше не будет терапевтической необходимости или пользы.
Согласно вариантам осуществления, предусматривающим несколько вторичных доз, каждая вторичная доза может быть введена с той же частотой, что и другие вторичные дозы. Например, каждая вторичная доза может быть введена больному через 1-2 недели или 1-2 месяца после непосредственно предшествующей дозы. Подобным образом, согласно вариантам осуществления, предусматривающим несколько третичных доз, каждая третичная доза может быть введена с той же частотой, что и другие третичные дозы. Например, каждая третичная доза может быть введена больному через 2-12 недель после непосредственно предшествующей дозы. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения частота введения вторичных и/или третичных доз больному может варьировать в ходе режима лечения. Частота введения также может регулироваться в ходе лечения врачом в зависимости от потребностей отдельного больного после клинического обследования.
Настоящее изобретение относится к режимам введения, при которых 2-6 загружающих доз вводят больному с первой частотой (например, один раз в неделю, один раз каждые две недель, один раз каждые три недели, один раз в месяц, один раз каждые два месяца и т.д.) с последующим введением больному двух или более поддерживающих доз с меньшей частотой. Например, в данном аспекте настоящего изобретения, если загружающие дозы вводят с частотой один раз в месяц, то поддерживающие дозы могут вводить больному один раз каждые шесть недель, один
раз каждые два месяца, один раз каждые три месяца и т.д. Диагностическое применение антител
Антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением также могут быть использованы для выявления и/или измерения EGFRvIII или экспрессирующих EGFRvIII клеток в образце, например, для диагностических целей. Например, антитело против EGFRvIII или его фрагмент могут быть использованы для диагностирования состояния или заболевания, характеризующегося аномальной экспрессией (например, надэкспрессией, недостаточной экспрессией, отсутствием экспрессии и т.д.) EGFRvIII. Типичные диагностические анализы для EGFRvIII могут предусматривать, например, контакт образца, полученного от больного, с антителом против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением, при этом антитело против EGFRvIII метят выявляемой меткой или репортерной молекулой. В качестве альтернативы, немеченое антитело против EGFRvIII может быть использовано в диагностических применениях в комбинации со вторичным антителом, которое как таковое является меченным выявляемой меткой. Выявляемой меткой или репортерной молекулой может быть радиоизотоп, такой как 3Н, 14С, 32Р, 35 S или 1251; флуоресцентный или хемилюминесцентный фрагмент, такой как флуоресцеин изотиоцианат или родамин, или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза, пероксидаза хрена или люцифераза. Специфические типичные анализы, которые могут быть использованы для выявления или измерения EGFRvIII в образце, включают в себя фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) и сортировку флуоресцентно активированных клеток (FACS).
Образцы, которые могут быть использованы в диагностических анализах EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя получаемый от больного образец любой ткани или жидкости, который содержит выявляемые количества белка EGFRvIII или его фрагментов при нормальных или патологических состояниях. Как правило, уровни EGFRvIII в конкретном образце, получаемом от здорового пациента (например, пациента, не пораженного заболеванием или состоянием, ассоциированным с аномальными уровнями или активностью EGFRvIII), будут измерять относительно изначально установленного исходного или стандартного уровня EGFRvIII. Такой исходный уровень EGFRvIII затем можно сравнивать с уровнями EGFRvIII, измеренными в образцах, полученных от индивидуумов,
предположительно страдающих связанным с EGFRvIII заболеванием или состоянием. ПРИМЕРЫ
Следующие примеры использованы для того, чтобы предоставить рядовому специалисту в данной области полное раскрытие и описание осуществления и применения способов и композиций в соответствии с настоящим изобретением, и не предназначены для ограничения объема, который авторы настоящего изобретения рассматривают как изобретение. Были предприняты усилия для обеспечения точности используемых чисел, но следует учитывать некоторые погрешности и отклонения эксперимента. Если не указано иное, молекулярной массой является средняя молекулярная масса, температура указывается в градусах Цельсия, а давление является атмосферным или близко к таковому.
Пример 1. Создание антител против EGFRvIII
Антитела против EGFRvIII получали путем иммунизации мыши VELOCIMMUNE(r) (т.е. модифицированной мыши, содержащей ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой каппа-цепей человеческого иммуноглобулина) иммуногеном, содержащим внеклеточный домен EGFRvIII. Антитела первого набора включали в себя антитела, обозначаемые Н1Н2194Р, Н1Н2195Р, H2M1863N2, H2M1911N, H2M1912N, H2M1915N, H2M1917N, H2M1918N и H3M1913N (как показано в таблицах 1 и 2).
Антительный иммунный ответ контролировали с помощью EGFRvIII-специфического иммуноанализа. При достижении желаемого иммунного ответа собирали спленоциты и сливали с клетками миеломы мыши для сохранения их жизнеспособности и формирования гибридомных клеточных линий. Гибридомные клеточные линии подвергали скринингу и отбору для идентификации клеточных линий, которые продуцировали EGFRvIII-специфические антитела. С использованием этой методики получали некоторые химерные антитела против EGFRvIII (т.е. антитела, обладающие человеческими изменчивыми доменами и мышиными константными доменами). Кроме того, некоторые полностью человеческие антитела против EGFRvIII выделяли непосредственно из антиген-положительных В-клеток без слияния с клетками миеломы, как описывается в заявке на выдачу патента США № 2007/0280945А1.
Отдельно также получали H1H1863N2 с пониженным фукозилированием
["HlH1863N2(Fuc -)"] в линии клеток-хозяев СНО, которые описывали как "8088" в заявке на выдачу патента США № 2010/03 0443 6А1, которая специально включена посредством ссылки во всей своей полноте. Вкратце, последовательности легкой цепи и тяжелой цепи H1H1863N2 клонировали в векторы экспрессии. Два миллиона клеток 8088 трансфицировали плазмидами легкой и тяжелой цепей и вектором pR4004, содержащим ген, кодирующий Сге. Трансфицированные клетки, которые выживали при отборе с помощью 400 мкг/мл гигромицина, адаптировали для роста в суспензии в среде без сыворотки крови и без фукозы. Клетки, которые экспрессировали флуоресцентный белок EGFP, но не DsRed или ECFP, выделяли из трансфицированных клеток проточной цитометрией. Отсортированные клетки высевали во встряхиваемую колбу при 4 х 105 клеток/мл и через трое суток культуральную среду собирали, а белки антитела в ней (т.е. HlH1863N2(Fuc -)) очищали с помощью хроматографии с белком А. Масс-спектрометрическим анализом полученного в результате HlH1863N2(Fuc -) подтверждали, что по сравнению с HlH1863N2(Fuc +), оригинальным антителом, коровая фукоза была удалена. Обозначения "H1H1863N2" и "HlH1863N2(Fuc +)" в настоящем документе относятся к оригинальному антителу без модификаций фукозилирования.
Некоторые биологические свойства типичных антител против EGFRvIII, созданных согласно способам данного примера, подробно описываются в нижеизложенных примерах.
Пример 2. Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот вариабельных областей тяжелой и легкой цепей
В таблице 1 приводятся идентификаторы аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей и CDR отобранных антител против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением. Соответствующие идентификаторы последовательностей нуклеиновых кислот изложены в таблице 2.
H2M1863N2
H2M1911N
H2M1912N
H2M1915N
H2M1917N
100
102
104
106
108
110
112
H2M1918N
114
116
118
120
122
124
126
128
H3M1913N
130
132
134
136
138
140
142
144
Таблица 2: Идентификаторы последовательностей нуклеиновых кислот
SEQ ID NO:
Обозначение антитела
HCVR
HCDR1
HCDR2
HCDR3
LCVR
LCDR1
LCDR2
LCDR3
Н1Н2194Р
Н1Н2195Р
H2M1863N2
H2M1911N
H2M1912N
H2M1915N
H2M1917N
101
103
105
107
109
111
H2M1918N
113
115
117
119
121
123
125
127
H3M1913N
129
131
133
135
137
139
141
143
Антитела в настоящем документе, как правило, называют согласно следующей номенклатуре: приставка Fc (например, "НШ", "Н2М", "НЗМ" и т.д.), затем числовой идентификатор (например, "2194", "2195", "1863" и т.д.), затем суффикс "Р" или "N", как показано в таблицах 1 и 2. Таким образом, согласно данной номенклатуре в настоящем документе антитело может быть названо, например, "H1H2194N", "Н2М1911N", "H3M1913N" и т.д. Приставки НШ, Н2М и НЗМ в обозначении антител, используемых в настоящем документе, указывают на конкретный изотип Fc-области антитела. Например, антитело "НШ" имеет человеческую Fc IgGl, антитело "Н2М" имеет мышиную Fc IgG2, а антитело "НЗМ" имеет мышиную Fc IgG3 (все вариабельные области являются полностью человеческими, что обозначается первым "Н" в обозначении антитела). Рядовому специалисту в данной области будет понятно,
что антитело с определенным изотипом Fc, может быть превращено в антитело с другим изотипом Fc (например, антитело с мышиной Fc IgGl может быть превращено в антитело с человеческим IgG4 и т.д.), но в любом случае изменчивые домены (в том числе CDR), которые обозначаются числовыми идентификаторами, показанными в таблицах 1 и 2, будут оставаться теми же, и, как предполагают, свойства связывания будут идентичными или, по сути, подобными независимо от природы Fc-домена.
Контрольные конструкции, используемые в следующих примерах
В следующие эксперименты в целях сравнения включали следующие контрольные конструкции. Контроль I: человеческое антитело против EGFRvIII (IgGl) с изменчивыми доменами тяжелой и легкой цепей с аминокислотными последовательностями, соответствующими SEQ ID NO: 142 и 144, соответственно, антитела "13.1.2", раскрываемого в патенте США № 7736644; контроль II: химерное антитело против EGFRvIII (hlgGl) с изменчивыми доменами тяжелой и легкой цепей с аминокислотными последовательностями, соответствующими SEQ ID NO: 11 и 12, соответственно, антитела "ch806", раскрываемого в патенте США № 7589180; контроль III: гуманизированное антитело против EGFRvIII (hlgGl) с изменчивыми доменами тяжелой и легкой цепей с аминокислотными последовательностями, соответствующими SEQ ID NO: 42 и 47, соответственно, антитела "hu806", раскрываемого в публикации заявки на выдачу патента США № 2010/0056762; контроль IV: химерное антитело против EGFR с изменчивыми доменами тяжелой и легкой цепей с аминокислотными последовательностями соответствующих доменов "С225", как изложено в патенте США №7060808; и контроль V: человеческое антитело против EGFRvIII (IgGl) с изменчивыми доменами тяжелой и легкой цепей с аминокислотными последовательностями, соответствующими SEQ Ш NO: 2 и 19, соответственно, антитела "131", раскрываемого в патенте США № 7736644 В2. Антитело "13.1.2", как известно, является специфическим в отношении соединительного пептида (SEQ Ш NO: 148) EGFRvIII; а антитела "ch806" и "hu806", как известно, связываются с остатками 311-326 (SEQ ID NO: 165) в EGFR (SEQ Ш NO: 146), который амплифицируется или надэкспрессируется, или с остатками 44-59 в EGFRvIII (SEQ Ш NO: 147).
Пример 3. Определение аффинности связывания EGFRvIII
Аффинности связывания и кинетические константы человеческих
моноклональных антител против EGFRvIII определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 37°С. Измерения выполняли на устройстве Т100 BIACORE(tm). Антитела, называемые человеческими Fc IgGl (т.е. обозначения "НШ"), захватывали на поверхность антитела против человеческого Fc-сенсора (формат захваченного mAb), и растворимые мономерные (EGFR-mmh (SEQ Ш NO: 154) и EGFRvIII-mmh (SEQ Ш NO: 152)) или димерные (EGFR-mFc (SEQ Ш NO: 155) и EGFRvIII-mFc (SEQ Ш NO: 153)) белки инъецировали над поверхностью. В формате захваченного рецептора либо EGFRvIII-mFc, либо EGFR-mFc захватывали чипом BIACORE(tm), и по ним протекали соответствующие антитела. Кинетические константы скорости ассоциации (ка) и диссоциации (kd) определяли путем обработки и подгонки данных к модели связывания 1:1с использованием программного обеспечения Scrubber 2.0 для подбора эмпирической кривой. Константы равновесия диссоциации связывания (KD) И полупериоды диссоциации (ti/г) вычисляли по кинетическим константам скорости как: KD (М) = kd/ka; и tm (минуты) = ln2/(60*kd).
Результаты показаны в таблицах 3 и 4. NB = отсутствие связывания при тестируемых условиях; NT = не тестировали.
EGFR-mFc
H1H1912N
EGFRvIII-mmh
l,83E+04
l,64E-02
8,99E-07
0,7
EGFR-mmh
EGFRvIII-mFc
2,04E+04
9,71E-04
4,77E-08
EGFR-mFc
H1H1913N
EGFRvIII-mmh
l,63E+02
1Д4Е-03
7,03E-06
EGFR-mmh
EGFRvIII-mFc
l,40E+04
ЗД6Е-04
2,26E-08
EGFR-mFc
H1H1915N
EGFRvIII-mmh
EGFR-mmh
EGFRvIII-mFc
EGFR-mFc
Н1Н2194Р
EGFRvIII-mmh
8Д0Е+04
l,37E-03
l,70E-08
EGFR-mmh
7,60E+04
9,60E-04
l,26E-08
EGFRvIII-mFc
9,54E+04
2,22E-04
2,33E-09
EGFR-mFc
8Д0Е+04
l,99E-04
2,43E-09
Н1Н2195Р
EGFRvIII-mmh
6Д8Е+04
6,94E-04
l,07E-08
EGFR-mmh
5,66E+04
5,23E-04
9,20E-09
EGFRvIII-mFc
l,02E+05
1ДЗЕ-04
1Д0Е-09
103
EGFR-mFc
9,20E+04
l,89E-04
2,05E-09
Контроль I
EGFRvIII-mmh
l,29E+05
1,53E-01
1Д9Е-06
EGFR-mmh
EGFRvIII-mFc
7Д5Е+04
7,36E-03
l,03E-07
1,6
EGFR-mFc
Контроль II
EGFRvIII-mmh
4,90E+04
7,33E-03
l,50E-07
EGFR-mmh
EGFRvIII-mFc
2,02E+05
4,08E-04
2,02E-09
EGFR-mFc
Контроль III
EGFRvIII-mmh
8,57E+04
5Д6Е-03
6,02E-08
2,2
EGFR-mmh
EGFRvIII-mFc
2,52E+05
2,98E-04
1Д8Е-09
Контроль II
EGFRvIII-mFc
l,25E+06
7,31E-05
5,90E-11
158
EGFR-mFc
4,44E+05
l,46E-04
3,29E-10
Контроль
III
EGFRvIII-mFc
l,49E+06
l,00E-06
6,70E-13
11550
EGFR-mFc
2,86E+05
6Д7Е-05
2Д5Е-10
187
Как показано в таблицах 3 и 4, некоторые антитела демонстрировали селективность по отношению к EGFRvIII и не связывались с EGFR дикого типа в формате захваченного mAb. В формате захваченного рецептора (таблица 4) H1H863N2, H1H1915N и контроль I демонстрировали наибольшую селективность.
Эксперимент 4: Специфичность антитела, определяемая с помощью ELISA
Для дополнительной характеристики mAb против hEGFRvIII проверяли их специфичность связывания с помощью ELISA. Планшеты покрывали одним из следующих: EGFR-mmh (SEQ ID NO: 154); EGFRvIII-mmh (SEQ ID NO: 152) и соединительный пептид (J-пептид) (SEQ ID NO: 148). В отношении соединительных пептидов, которые были связаны с биотином либо на С-конце (SEQ Ш N0: 149), либо на N-конце (SEQ ID NO: 150) через линкер, планшеты повторно покрывали авидином. Также покрывали нерелевантным пептидом (контрольным пептидом) с биотином или без такового на его N-конце. Антитела против EGFRvIII, а также изотипическое контрольное антитело добавляли в покрытые планшеты и обеспечивали инкубацию в течение 1 часа при 25°С. Затем планшеты промывали и выявляли связанные mAb против EGFRvIII с антителами против человеческого Fc, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP). Планшеты обрабатывали раствором субстрата тетраметилбензидина (ТМВ) для получения колориметрической реакции и нейтрализовали серной кислотой перед считыванием поглощения при 450 нм на устройстве для считывания планшетов VICTOR(tm) Х5. Для анализа данных использовали сигмоидальную модель доза-ответ в программном обеспечении PRISM(tm). Рассчитанное значение ECso, определяемое как 50% концентрация антител, необходимая для развития максимального ответа, использовали как индикатор эффективности связывания. Результаты представлены в таблице 5. Н.т.: не тестировали. Контроли I-III: как описываемые выше.
Таблица 5
Антитело
ЕС5о (нМ)
EGFR-mmh
(25°С)
EGFRvI II-mmh
(25°С)
пептид
пептид с С-концев ым
биотино м
пептид с N-концев ым
биотино м
Контр ольны й
пептид
Контр ольны й
пептид с N-концев ым
биотин ом
H1H1863N2 (Fuc -)
> 10
0,0766
> 10
> 10
> 10
> 10
> 10
H1H1863N2 (Fuc +)
> 10
0,113
> 10
> 10
> 10
> 10
> 10
H1H1911N
9,06
0,0748
> 10
> 10
> 10
> 10
> 10
H1H1912N
0,0405
0,0118
> 10
> 10
> 10
> 10
> 10
H1H1913N
2,55
2,14
> 10
> 10
> 10
> 10
> 10
H1H1915N
> 10
0,167
> 10
> 10
> 10
> 10
> 10
H1H2193P
0,0040
0,0035
> 10
> 10
> 10
> 10
> 10
H1H2194P
0,0037
0,0032
> 10
> 10
> 10
> 10
> 10
H1H2195P
0,0052
0,0049
> 10
> 10
> 10
> 10
> 10
Контроль I
> 10
0,0094
0,118
0,0153
0,0106
> 10
> 10
Контроль II
0,0095
0,0057
> 10
> 10
> 10
> 10
> 10
Контроль III
0,0079
0,0048
Н.т.
Н.т.
Н.т.
Н.т.
Н.т.
Изотипичес кий
контроль
> 10
> 10
> 10
> 10
> 10
> 10
> 10
Антитела H1H1863N2, Н1Н1915 и контроль I демонстрировали сильное связывание с EGFRvIII, но не связывались (> 10 нМ) с EGFR дикого типа. Ни одно из антител, за исключением контроля I (имеющего последовательности, которые соответствуют последовательностям тяжелой и легкой цепей антитела "13.1.2", полученного из мышей, иммунизированных соединительным пептидом (патент США № 7736644), не показало связывания с соединительными пептидами.
Пример 5: Вестерн-блот EGFR и EGFRvIII с использованием антител против EGFRvIII
Одно из антител H1H1863N2 тестировали по его характеристикам связывания с помощью вестерн-блотов как в восстанавливающих, так и в невосстанавливающих условиях. EGFR-mmh (SEQ ID NO: 154) или EGFRvIII-mmh (SEQ ID NO: 152) загружали на гели Tris-Glycine SDS PAGE, прогоняли, а затем переносили на нитроцеллюлозу. После блокирования мембраны разрезали пополам и испытывали либо с антителами против EGFRvIII, либо с антителом против His. Контроли I и II описаны выше.
Как показано на фиг. la, H1H1862N2 (Fuc -) не связывается в восстанавливающих и в невосстанавливающих условиях с EGFRvIII-mmh или EGFR-mmh и, таким образом, имеет конформационный эпитоп для EGFRvIII. В отличие от этого, контроль II связывается как с EGFR дикого типа, так и с вариантом III EGFR в восстанавливающих и в невосстанавливающих условиях, тогда как контроль I, связующее соединительного пептида, является специфическим по отношению к EGFRvIII. И контроль I, и контроль II в отличие от H1H1863N2 имеют линейные эпитопы связывания. На фиг. lb показаны другие антитела против EGFRvIII, которые демонстрируют смешанное поведение при вестерн-блотах.
Пример 6: Анализы связывания пептидов EGFR/EGFRvIII и конкурентного связывания антител
HlH1863N2(Fuc -) тестировали по его характеристикам связывания с использованием анализов связывания пептидов и конкурентного связывания антител. Для экспериментов связывания пептидов соединительный пептид EGFRvIII (SEQ ID NO: 148), меченный через линкер биотином на его С-конце (т.е. LEEKKGNYVVTDHGGGGSK (SEQ ID NO: 149)-биотин), или пептид, состоящий из остатков 311-326 EGFR ("311-326 пептид EGFR"; SEQ ID NO: 165), меченный через линкер биотином на его С-конце (т.е. CGADSYEMEEDGVRKCGGGGSK (SEQ ID NO: 151)-биотин), захватывали на толщине ~ 0,4 нМ с использованием покрытых стрептавидином наконечников OCTET(r) на устройстве FORTEBIO(r) OCTET(r) RED. После захвата пептида покрытые наконечники помещали в 1 -мкМ растворы антитела и регистрировали ответы связывания (см. фиг. 2). Контроли I-III являются такими же, как и описанные выше.
Как и предполагали, контроль I связывался с соединительным пептидом с С-концевым биотином, а контроли II и III связывались с пептидом EGFR 311-326 с С-концевым биотином. HlH1863N2(Fuc -) не связывался ни с одним из пептидов.
Для перекрестной конкуренции антител ~ 200 резонансных единиц (RU) ohEGFRvIII-mmh (SEQ ID NO: 152) захватывали на поверхности BIACORE(tm), покрытой с высокой плотностью поликлональным антителом против пентагистидина (№ по каталогу 34660, QUIAGEN). С использованием метода совместной инъекции захваченный hEGFRvIII-mmh насыщали 5-минутной инъекцией 500 нМ первого mAb, а затем сразу же другой 5-минутной инъекцией второго mAb (500 нМ), которую дополняли 500 нМ первого mAb. Значительное связывание, выражаемое в RU, второго mAb объясняли тем, что оно не конкурирует за связывание с первым mAb. Для контрольных экспериментов использовали изотипически сходные mAb в качестве либо первого mAb, либо второго mAb. Результаты показаны в таблице 6.
HlH1863N2(Fuc -) не конкурирует с каким-либо из контрольных антител I-III за связывание с hEGFRvIII-mmh, захваченным на поверхности. Как и предполагали, контроли II и III, как известно, связываются с остатками 311-326 в EGFR, конкурировали друг с другом за связывание с EGFRvIII-mmh, захваченным на
поверхности.
Пример 7: Селективность связывания клеток антителами против EGFRvIII
Для определения специфичности связывания mAb против EGFRvIII с клетками НЕК293 клетки НЕК293, экспрессирующие EGFRvIII (HEK293/EGFRvIII), и клетки А431 анализировали с помощью сортировки флуоресцентно активированных клеток (FACS). Клетки HEK293/EGFRvIII получали путем трансфекции клеток НЕК293 устойчивыми к неомицину ДНК-векторами, постоянно экспрессирующими непроцессированный hEGFRvIII (SEQ Ш NO: 147), с использованием реагента для трансфекции LIPOFECTAMINE(tm) 2000 (IN VITRO GEN(tm)). Через два дня после трансфекции клетки помещали для отбора G418 на приблизительно две недели. Популяции, положительно экспрессирующие EGFRvIII, выделяли с помощью сортировки флуоресцентно активированных клеток (FACS). В эксперименте использовали клетки НЕК293, экспрессирующие ~ 3 х 106 копий EGFRvIII на клетку. Вкратце, антитела против EGFRvIII при 10 мкг/мл инкубировали с клетками в течение 30 минут при комнатной температуре, промывали, инкубировали со вторичным антителом, т.е. меченным фикоэритрином (РЕ) антителом козы F(ab')2 против человеческого IgG (№ по каталогу 109-116-170, Jackson ImmunoResearch Laboratories), а затем окончательно промывали перед анализом FACS. В другой серии экспериментов антитела против EGFRvIII непосредственно конъюгировали через их лизиновые остатки с флуоресцентным красителем ALEXA FLUOR(r) 488 (INVITROGEN(tm)), тем самым устраняя стадию использования вторичного антитела. Результаты по клеткам НЕК293 и клеткам HEK293/EGFRvIII с использованием непосредственно меченых антител против EGFRvIII, показаны в таблице 7, а результаты с использованием вторичного меченного РЕ антитела против Fc (человеческого или мышиного) показаны в таблице 8. Результаты по клеткам А431 с использованием непосредственно меченых антител против EGFRvIII показаны в таблице 9, а результаты с использованием вторичного меченного РЕ антитела против Fc (человеческого или мышиного) показаны в таблице 10. Контроли I, II, III, IV и V описаны выше. MFI: средняя интенсивность флуоресценции.
НЕК293
родительских)
Неокрашенное
3548
4005
H1H1863N2 (Fuc -)
3776
361000
95,6
H1H1863N2 (Fuc +)
3805
360000
94,6
H1H1911N
3593
55064
15,3
H1H1912N
3727
122000
32,7
H1H1913N
4801
239000
49,8
H1H1915N
3461
73413
21,2
Контроль I
3559
258000
72,5
Контроль II
3582
313000
87,4
Контроль IV
24954
439000
17,6
значения
Неокрашенное
6708
1,0
HlH1863N2(Fuc -)
26036
3,9
H1H1911N
15984
2,4
H1H1912N
14343
2,1
H1H1915N
8440
1,2
Контроль I
9652
1,4
Контроль II
15716
2,3
Контроль III
71514
10,7
Контроль IV
962000
143,4
Некоторые антитела против EGFRvIII демонстрировали явное предпочтение связывания клеточной линии HEK293/EGFRVIII над родительскими клетками НЕК293 при выявлении с использованием либо непосредственно меченых антител против EGFRvIII (таблица 7), либо вторичного меченного РЕ антитела против человеческого IgG (таблица 8). Большинство антител при инкубировании с клетками А431 (30 минут
при 4°С) демонстрировали минимальное связывание или отсутствие связывания, за исключением контрольных антител III и IV (таблицы 9 и 10).
Пример 8: Интернализация mAb против EGFRvIII клетками HEK293/EGFRvIII
MAb против EGFRvIII (10 мкг/мл) инкубировали с клетками HEK293/EGFRVIII (см. вышеприведенный пример 7) в течение 2 часов на льду, а затем два раза промывали с помощью PBS. Затем клетки подвергали 30-минутной инкубации на льду со вторичными конъюгированными с DYLIGHT(tm) 488 антителами против Fab-фрагментов человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories), а затем еще два раза промывали с помощью PBS. Обеспечивали интернализацию антител в течение 1 часа при 37°С в буфере для интернализации (PBS + FBS) или хранили при 4°С. Клетки фиксировали в 4% формальдегиде и ядра окрашивали красителем для ДНК DRAQ5(r) (Cell Signaling Technology, Inc.). Изображения получали при 40х на многопараметровой системе IMAGEXPRESS(tm) (Molecular Devices) и определяли количество интернализированных везикул с использованием программного обеспечения Columbus (Perkin Elmer). Результаты показаны в таблице 11 и на фиг. 3.
Активную интернализацию наблюдали при 37°С для H1H1863N2, контроля II и контроля IV. Интернализацию также наблюдали для H1H1911N, H1H1912N и контроля I.
Пример 9: Связывание антитела против EGFRvIII с ксенотрансплантатом опухоли U87/EGFRvIII
Для дальнейшего определения специфичности H1H1863N2 получали линию клеток человеческой глиобластомы U87, экспрессирующих EGFRvIII, как описано для клеток HEK293/EGFRvIII в примере 7. В эксперименте использовали клетки U87, экспрессирующие ~ 1,5 х 105 копий EGFRvIII на клетку (U87/EGFRvIII). Клетки U87/EGFRvIII (3 х 106 клеток) ксенотрансплантировали больным тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) мышам и обеспечивали рост опухолей до получения медианного размера 200-300 мм3. Затем мышам инъецировали HlH1863N2(Fuc -) или изотипический контроль через хвостовую вену. Через 10 минут, 4 часа и 24 часа после инъекции антитела мышей умерщвляли, а опухоли удаляли и помещали в PBS. Опухоли немедленно разделяли и окрашивали конъюгированным с аллофикоцианином (АРС) антителом против человеческого Fc (hFc-APC). Окрашенные клетки промывали 3 раза потоком PBS, содержащим 2% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,1% азида натрия. Опухоли в моменты времени 10 минут и 4 часа фиксировали в течение ночи, а затем измеряли с помощью проточного цитометра. Опухоли, собранные в момент времени 24 часа, измеряли без фиксации. Все образцы собирали на ACCURI(r) С6 FLOW CYTOMETER(r) (Accuri Cytometers, Inc.) и определяли среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). Результаты представлены в таблице 12. Значения MFI являются средним 2-3 биологических повторностей ± стандартная ошибка среднего (SEM).
По сравнению с изотипическим контролем антитело HlH1863N2(Fuc -) связывалось с опухолевыми клетками U87/EGFRvIII эффективно в зависимости от времени.
Пример 10: Связывание антитела против EGFRvIII с ксенотрансплантатом опухоли B16F10.9/EGFRvIII
Мышам SCID имплантировали пятьдесят тысяч клеток меланомы мышевидных B16F10.9 или B16F10.9, надэкспрессирующих EGFRvIII (B16F10.9/EGFRvIII). Клетки B16F10.9/EGFRvIII получали, как описано для клеток HEK293/EGFRvIII в примере 7. Для данного эксперимента использовали клетки В16F 10.9, экспрессирующие ~ 1,5 х 105 копий EGFRvIII на клетку. Обеспечивали рост опухолей в течение приблизительно 14 дней до получения медианного размера 200-300 мм3. Затем мышам инъецировали HlH1863N2(Fuc -) или изотипический контроль через хвостовую вену. Через 10 минут, 4 часа и 24 часа после инъекции антитела мышей умерщвляли, а опухоли удаляли и помещали в PBS. Опухоли немедленно разделяли и окрашивали конъюгированным с аллофикоцианином антителом против человеческого Fc (hFc-APC). Окрашенные клетки промывали 3 раза потоком PBS (1 х PBS, 2% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,1% азида натрия), фиксировали и пермеабилизировали с использованием стандартных способов. Использовали проточную цитометрию для выявления связанного с клеточной поверхностью HlH1863N2(Fuc -) и анализ выполняли с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Inc.). Результаты представлены в таблице 13 и на фиг. 4а. Для выявления как связанных с клеточной поверхностью, так и внутриклеточно связанных антител клетки окрашивали второй раз с использованием того же антитела против человеческого Fc (hFc-APC) после стадий фиксации и пермеабилизации. Это позволило выявление внутриклеточного антитела. Результаты представлены в таблице 14 и на фиг. 4Ь. Все образцы собирали на ACCURI(r) С6 FLOW CYTOMETER(r) (Accuri Cytometers, Inc.) и определяли среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). MFI для каждого образца регистрировали после вычитания MFI неокрашенного контроля. Значения MFI являются средним двух биологических повторностей (N = 2) ± стандартная ошибка среднего (SEM). * N = 1 для данного момента времени.
10 минут
74 ±67
56 ±2
128 ±49
2003 ±216
4 часа
80 ± 15
195 ±52
54 ±21
4224 ±610
24 часа
79 ±21
155 ±42
72*
5692 ± 595
Таблица 14
Время
после
инъекции
MFI ± SEM (B16F10.9/EGFRvIII) - Окрашивание поверхности и внутренней части
B16F10.9
B16F10.9/EGFRvIII
Изотипический контроль
HlH1863N2(Fuc -)
Изотипический контроль
HlH1863N2(Fuc -)
10 минут
132 ±92
117± 18
155 ±44
2627± 192
4 часа
165 ±22
422± 106
120 ± 22
7785 ± 782
24 часа
135 ± 11
281 ± 51
132*
9578± 852
HlH1863N2(Fuc -) эффективно связывалось с поверхностью клеток B16F10.9, экспрессирующих EGFRvIII в зависимости от времени, тогда как связывание изотипического контроля было минимальным. Повышение суммарного связывания (т.е. связывания с клеточной поверхностью и внутреннего связывания) HlH1863N2(Fuc -) по сравнению с его связыванием только с клеточной поверхностью указывало на то, что связанные с клеточной поверхностью антитела были эффективно интернализированы клетками В16F 10.0.
Пример 11: Фармакокинетические параметры антител против EGFRvIII у мышей
Для определения in vivo селективности антител против EGFRvIII выполняли фармакокинетическое исследование с использованием мышей дикого типа ("мышей WT"), в природе экспрессирующих мышиный EGFR, и гуманизированных мышей EGFR ("мышей hEGFR> ), экспрессирующих человеческий EGFR. Мыши были из кроссбредных линий с фоном, содержащим C57BL6 (75%) и 129Sv (25%). Каждая группа состояла из 5 мышей, либо WT, либо hEGFR. Все антитела вводили подкожно дозой 0,2 мг/кг. Кровь собирали через 0 часов, 6 часов, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 7 дней, 10 дней, 14 дней, 21 день и 30 дней после введения. Уровни человеческих антител в сыворотке крови определяли с помощью "сэндвич"-анализа ELISA. Вкратце,
поликлональным антителом козы против человеческого IgG (Fc-специфическим) (Jackson ImmunoResearch) покрывали 96-луночные планшеты при концентрации один мкг/мл и инкубировали в течение ночи при 4°С. После блокирования планшетов с помощью BSA образцы сыворотки крови в шестикратных серийных разведениях и эталонные стандарты соответствующего антител в двенадцатикратных серийных разведениях добавляли в планшет и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. После промывания с целью удаления несвязанного антитела захваченные человеческие антитела выявляли с использованием того же поликлонального антитела козы против человеческого IgG (Fc-специфического), конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) (Jackson ImmunoResearch) и обрабатывали стандартным колориметрическим субстратом тетраметилбензидином (ТМВ) согласно рекомендации изготовителя. Поглощение при 450 нм регистрировали на устройстве для считывания планшетов и вычисляли концентрацию hlgG в образцах сыворотки крови с использованием эталонной стандартной кривой, полученной с помощью планшета с образцами. Мышиные антитела против человеческих (МАНА) измеряли с использованием стандартных способов, и они, как правило, были низкими.
На фиг. 5a-5d показаны графики зависимости концентрации антител от времени для четырех тестируемых антител. Контроль IV ("МаЬ С225"), как известно, связывается с человеческим EGFR, но не с его мышиным гомологом. Как и предполагали, это антитело демонстрировало быстрый клиренс у мышей hEGFR и медленный клиренс (т.е. отсутствие цель-опосредованного клиренса) у мышей WT (фиг. 5а). Контроль I ("МаЬ 13.1.2"), как известно, связывается с соединительным пептидом EGFRvIII "LEEKKGNYVVTDH", которого нет в человеческом или мышином EGFR. Антитело не связывается с человеческим или мышиным EGFR in vivo. Как и предполагали, это антитело демонстрировало идентичные низкие фармакокинетические показатели клиренса у обоих типов мышей (фиг. 5Ь), и наблюдали отсутствие цель-опосредованного клиренса. Контрольное антитело III ("МаЬ hu806") демонстрировало повышенный клиренс у мышей hEGFR по сравнению с мышами WT (фиг. 5с). Эти данные соответствуют их способности связываться с hEGFR in vitro, как определяли с помощью Biacore (см. пример 3, таблицу 4) и FACS (пример 7, таблица 9). На фиг. 5d показан клиренс HlH1863N2(Fuc +). Данное антитело подобно контролю I демонстрировало идентичные низкие скорости клиренса у мышей обоих типов. Таким образом, H1H1863N2 не связывается с человеческим или мышиным EGFR in vivo.
Пример 12: Конъюгат антитело против EGFRvIII-лекарственное средство ингибирует рост опухоли у in vivo моделей EGFRvIII-положительного аллотрансплантата злокачественной опухоли молочной железы
В данном примере два разных конъюгата антитело-лекарственное средство из типичного антитела против EGFRvIII H1H1863N2 тестировали по их способности ингибировать рост опухоли in vivo. Первый ADC получали путем конъюгации H1H1863N2 с майтанзиноидным токсином DM1 через нерасщепляемый МСС линкер (см., например, патент США № 5208020 и заявку на выдачу патента США № 2010/0129314) с получением "H1H1863N2-MCC-DM1". Второе ADC получали путем конъюгации H1H1863N2 с модифицированной версией DM1, присоединенной к новому расщепляемому линкеру, называемому "М0026" (также известному как "соединение 7" в WO 2014/145090, раскрытие которой включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте), с получением "H1H1863N2-M0026". При тестировании по цитотоксичности in vitro по отношению к клеткам MMT/EGFRvIII H1H1863N2-MCC-DM1 демонстрировал ICso 12 нМ, тогда как H1H1863N2-7 демонстрировал ICso 0,8 нМ, исходя из эквивалентов лекарственного средства.
Для сравнения in vivo эффективности антител против EGFRvIII, конъюгированных с DM1 и М0026, выполняли исследования на мышах с ослабленной иммунной системой, несущих аллотрансплантаты EGFRvIII-положительной злокачественной опухоли молочной железы.
Вкратце, аллотрансплантаты опухолей устанавливали подкожной имплантацией 0,5 х 106 клеток MMT/EGFRvIII в левый бок самок мышей СВ17 SCID (Taconic, Hudson, NY). Как только опухоли достигали среднего объема 140 мм3 (~ день 8), мышей рандомизировали на группы из семи особей и вводили ADC против EGFRvIII с использованием формата либо MCC-DM1, либо М0026 линкер-лекарственное средство. Также оценивали контрольные реагенты, в том числе не связывающие ADC, с использованием формата либо MCC-DM1, либо М0026 линкер-лекарственное средство и среду PBS. ADC вводили при 1 и 5 мг/кг три раза в течение одной недели и после этого контролировали до достижения среднего размера опухоли приблизительно 2000 мм3 в группе, которой вводили только среду. Для этого момента вычисляли ингибирование роста опухоли, как описано ниже.
Средний размер опухоли в отношении обработанной средой группы вычисляли следующим образом: опухоли измеряли штангенциркулями дважды в неделю до
достижения среднего размера 1000 мм в обработанной средой группе; размер опухоли вычисляли с использованием формулы (длина х ширина2)/2. Ингибирование роста
ОПуХОЛИ ВЫЧИСЛЯЛИ ПО Следующей формуле: (1 - ((Тконечная - Тначальная)/(Сконечная -
Сначальная)))*100, в которой Т (группа с обработкой) и С (контрольная группа) представляют среднюю массу опухоли в день достижения обработанной средой группы 1000 мм3. Результаты представлены в таблице 15.
Как представлено в таблице 15, наибольшее ингибирование опухоли наблюдали у мышей, которым вводили 5 мг/кг H1H1863N2-M0026, при этом наблюдали регрессию исходной опухоли. Ингибирование роста опухоли 102% в результате обработки с помощью 5 мг/кг H1H1863N2-M0026 существенно превышало наблюдаемое после обработки опухоли с помощью 5 мг/кг H1H1862N2-MCC-DM1 (83%). Преимущество ингибирования роста опухоли, индуцированной H1H1863N2-M0026, по сравнению с HlH1863N2-mcc-DMl сохранялось также при дозе 1 мг/кг. Никакого противоопухолевого эффекта не наблюдали в группах, обработанных контрольным ADC, с использованием MCC-DM1 или М0026.
Таким образом, в данном примере продемонстрировано, что антитела против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением при введении в форме конъюгатов антитело-лекарственное средство являются высоко эффективными при ингибировании роста опухоли. Кроме того, данный пример подтверждает роль ADC в соответствии с
настоящим изобретением в фактическом обеспечении регрессии опухоли, особенно в контексте антител против EGFRvIII в соответствии с настоящим изобретением (например, H1H1863N2), конъюгированных с молекулой новый линкер/лекарственное средство М0026.
Настоящее изобретение не ограничивается объемом конкретных вариантов осуществления, описываемых в настоящем документе. Более того, различные модификации настоящего изобретения вдобавок к описываемым в настоящем документе станут очевидными специалистам в данной области из вышеизложенного описания и прилагаемых графических материалов. Такие модификации попадают в объем прилагаемой формулы изобретения.
Пример 13: Антитела против EGFRvIII-DMl демонстрируют специфичность по отношению к экспрессирующим EGFRvIII клеткам, а также демонстрируют сильную активность киллинга клеток
В данном примере определяли способность антитела против человеческого EGFRvIII, конъюгированного с майтанзиновым токсином DM1, снижать жизнеспособность клеток с использованием in vitro клеточных анализов.
Непроцессированный человеческий EGFRvIII (SEQ ID NO: 147) или человеческий EGFR дикого типа (SEQ ID NO: 146) стабильно вводили в клеточные линии НЕК293 (293/hEGFRvIII, 293/hEGFRwt), U251 (U251/hEGFRvIII) и ММТ 060562 (MMT/hEGFRvIII). Все клетки получали методиками с использованием LIPOFECTAMINE 2000 и культивировали в полной ростовой среде в присутствии G418.
Экспрессию на клеточной поверхности EGFRwt или EGFRvIII измеряли анализом FACS. Вкратце, 1 х 106 клеток инкубировали с 10 мкг/мл антитела против EGFRvIII H1H1863N2, контрольного mAb против EGFRwt (контроля IV) или изотипического контроля в течение 30 минут на льду в буфере для разбавления антител. После двух промываний буфером для разбавления антител клетки инкубировали с 10 мкг/мл конъюгированного с РЕ вторичного антитела против человеческого антитела в течение 30 минут на льду. После двух дополнительных промываний образцы прогоняли на цитометре Accuri С6 (BD) или Hypercyt (Intellicyt), а данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo. Результаты представлены в таблице 16. Н.о. = не определяли.
Таблица 16: Экспрессия на клеточной поверхности в клеточных линиях
EGFRwt и сконструированных EGFRvIII
Клеточная
Оцениваемое с помощью FACS связывание (превышение MFI
линия
относительно изотипического контроля)
Неокрашен
H1H1863N2
Контроль IV
Только
Изотипиче
ные
(антитело
против
EGFRvIII)
(антитело
против
EGFRwt)
вторичное
ский контроль
НЕК293
49х
HEK293/hE GFRwt
н.о.
332х
HEK293/hE GFRvIII
264х
н.о.
U251
н.о.
U251/hEGF RvIII
13х
н.о.
ММТ/
н.о.
MMT/hEGF RvIII
280х
н.о.
Данные результаты демонстрируют, что экспрессия на поверхности EGFRvIII была сравнима в клеточных линиях HEK293/hEGFRvIII и MMT/hEGFRvIII, тогда как уровни экспрессии U251/EGFRvIII были в приблизительно 20 раз ниже, чем в клеточных системах HEK293/hEGFRvIII и MMT/hEGFRvIII. Связывание EGFRvIII посредством H1H1863N2 не выявляли в родительских клеточных линиях. В отличие от этого, контрольное антитело против EGFRwt (контроль IV) связывалось с родительскими клетками НЕК293 с уровнем, в 49 раз превышающим таковой изотипического контроля. Приемлемое введение вектора экспрессии EGFRwt в клетки НЕК293 повышало экспрессию в 332 раза по сравнению с фоновым значением, которая была сравнима с экспрессией в клетках HEK293/hEGFRvIII и MMT/hEGFRvIII.
Селективное связывание антитела против EGFRvIII H1H1863N2 с EGFRvIII оценивали посредством FACS с использованием клеточных линий родительской НЕК293, HEK293/hEGFRwt, HEK293/hEGFRvIII и А431. Результаты показаны в таблице 17.
Как показано в таблице 17, как H1H1863N2, так и контрольное антитело против EGFR wt (контроль IV) демонстрировали сильное связывание (превышение фонового значения в > 650 раз) с клетками HEK293/EGFRvIII по сравнению с изотипическим контролем. В отличие от этого, H1H1863N2 слабо связывалось с клеточной линией wt-EGFR НЕК293 (превышение фонового значения в три раза) и эндогенно экспрессирующей EGFR клеточной линией А431 (в 13 раз выше контроля). Контрольное антитело против EGFR wt сильно связывалось с экспрессирующими EGFR-wt клетками, подтверждая селективность H1H1863N2 по отношению к EGFRvIII, а не к EGFR дикого типа.
Затем определяли способность антитела против человеческого EGFRvIII, конъюгированного с майтанзиновым токсином DM1, снижать жизнеспособность клеток с использованием in vitro клеточных анализов. Клетки высевали в покрытые PDL 96-луночные планшеты при 250-2000 клеток на лунку на полную ростовую среду и обеспечивали рост в течение ночи. Для кривых жизнеспособности клеток добавляли ADC или свободное лекарственное средство (DMl-SMe) в клетки при конечных концентрациях, варьирующих от 500 нМ до 5 пМ и инкубировали в течение 3 дней. Клетки инкубировали с ССК8 (Dojindo) окончательно в течение 1-3 часов и определяли поглощение при 450 нм (OD450) на устройстве FlexStation 3 (Molecular Devices). Для
всех лунок отнимали фоновые уровни OD450 от обработанных дигитонином (40 нМ) клеток и жизнеспособность выражали как процентное отношение необработанных контролен. Значения IC50 определяли по четырех-параметровому логистическому уравнению по 10-точечной кривой ответа (GraphPad Prism). Результаты показаны в таблицах 18А и 18В. Значения IC50 выражены в нМ и нормализованы для отношения конкретное лекарственное средство/антитело (DAR).
Таблица 18А: Эффективность киллинга клеток для конъюгатов антитело
против EGFRvIII-DMl-лекарственное средство
Клеточная линия
НЕК293
НЕК293/ hEGFRvIII
НЕК293/ hEGFRwt
U251
ADC
ICso (нМ)
килли нга
IC50 (нМ)
киллин га
IC50 (нМ)
киллинг а
ICso (нМ)
киллин га
H1H1863N2-MCC-DM1
> 100
> 100
Антитело
против EGFRwt-
0,2
-1,0
MCC-DM1
DMl-SMe
0,31
0,6
0,57
1,8
Изотипическ
ий контроль-
> 100
> 100
> 100
MCC-DM1
против
EGFRwt-MCC-DM1
DMl-SMe
1,2
0,6
0,7
100
Изотипический
контроль-
MCC-DM1
> 150
Как показано в таблицах 18А и 18В, H1H1863N2-MCC-DM1 снижает жизнеспособность клеточных линий HEK293/hEGFRvIII, U2 51/hEGFRvIII и MMT/hEGFRvIII со значениями ICso, варьирующими от 1,0 до 4,0 нМ. В отличие от этого, изотипический контроль, конъюгированный с DM1, снижает жизнеспособность клеток 293/EGFRvIII и MMT/hEGFRvIII со значениями ICso, превышающими 100 нМ, и клетки U251/hEGFRvIII со значениями ICso 35 нМ. H1H1863N2-MCC-DM1 не оказывал влияния на клетки НЕК293, экспрессирующие EGFR дикого типа (293/hEGFRwt), или на контрольные родительские клеточные линии, подтверждая специфичность по отношению к экспрессирующим EGFRvIII клеткам.
Таким образом, данный пример демонстрирует, что антитело против EGFRvIII H1H1863N2 обладает специфичностью по отношению к экспрессирующим EGFRvIII клеточным линиям и демонстрирует способность специфического киллинга клеток при конъюгировании с токсином DM1.
Пример 14: Улучшенная эффективность киллинга клеток достигается при введении конъюгата связывающееся с конформационным эпитопом EGFRvIII антитело-лекарственное средство в комбинации с конъюгатом связывающееся с соединительным пептидом EGFRvIII антитело-лекарственное средство
В данном примере определяли способность усиливать киллинг клеток путем совместного введения двух различных типов конъюгатов антитело против EGFRvIII-лекарственное средство. Для данного примера тестируемые комбинации состояли из двух разных антител против EGFRvIII: (1) специфического антитела против EGFRvIII, которое не распознавало ADC против соединительного пептида EGFRvIII (называемого в настоящем документе "конформационным связующим"); и (2) специфического антитела против EGFRvIII, которое распознавало соединительный пептид EGFRvIII (называемого в настоящем документе "связующим пептида"). Как показано в примере 6, антитело против EGFRvIII H1H1863N2 не связывается с соединительным пептидом EGFRvIII или остатками 311-326 человеческого EGFR и, поэтому, называется "конформационным связующим".
Перекрестная конкуренция in vitro
Сначала определяли способность H1H1863N2 перекрестно конкурировать с антителом, которые связывается с соединительным пептидом EGFRvIII, с помощью анализа конкуренции за связывание. В данном примере в качестве связывающегося с соединительным пептидом антитела против EGFRvIII использовали контроль V.
Перекрестную конкуренцию определяли с использованием анализа не требующей метки биослойной интерферометрии (ВЫ) в режиме реального времени на биосенсоре Octet НТХ (ForteBio Corp., A Division of Pall Life Sciences). Весь эксперимент выполняли при 25°С в буфере, состоящем из 0,01 М HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% объем/объем поверхностно-активного вещества Р20, 1,0 мг/мл BSA (буфера Octet HBST), в планшете, встряхиваемом при скорости 1000 оборотов в минуту. Для оценки наличия перекрестной конкуренции между двумя антителами за связывание с рекомбинантным человеческим EGFRvIII (hEGFRvIII.mmh; SEQ ID: 152) приблизительно ~ 0,35 нм hEGFRvIII.mmh захватывали на покрытые антителом против пента-His биосенсоры Octet. Затем биосенсоры с захваченным антигеном насыщали первым моноклональным антителом против EGFRvIII (далее называемым "mAb-l") путем погружения в лунки, содержащие 50 мкг/мл раствора mAb-1, на 5 минут. Затем биосенсоры последовательно погружали в лунки,
содержащие 50 мкг/мл раствора второго моноклонального антитела против EGFRvIII (далее называемого "mAb-2"), на 3 минут. Все биосенсоры промывали буфером Octet HBST между каждой стадией эксперимента. Ответ связывания в режиме реального времени контролировали в ходе эксперимента и регистрировали ответ связывания в конце каждой стадии. Сравнивали ответ связывания mAb-2 с hEGFRvIII, предварительного объединенного в комплекс с mAb-1, и определяли конкурирующее/неконкурирующее поведение разных моноклональных антител против EGFRvIII.
С использованием данного экспериментального формата перекрестной конкуренции выяснили, что H1H1863N2 не демонстрирует перекрестную конкуренцию с тестируемым связующим соединительного пептида EGFRvIII, равно как и не конкурирует перекрестно за связывание EGFRvIII с контролем II или контролем IV. Таким образом, результаты данного анализа перекрестной конкуренции указывают на то, что для H1H1863N2 имеется эпитоп связывания, отличный от такового для связующего соединительного пептида EGFRvIII, а также контролей II и IV.
Активность киллинга клеток отдельных конъюгатов антитело против EGFRvIII-лекарственное средство
Затем оценивали способность H1H1863N2-MCC-DM1 и связывающегося с антителом против пептида EGFRvIII ADC снижать жизнеспособность клеток при введении в комбинации. Способность контроля V индуцировать киллинг клеток при конъюгировании с SMCC-DM1 (т.е. контроль V-MCC-DM1) определяли с использованием in vitro клеточного анализа, описываемого в примере 13. Результаты представлены в таблице 19.
DM1)
Изотипический
контроль-MCC-DM1
200
150
250
H1H1863N2-MCC-DM1
0,37
200
3,25
Контроль V-MCC-DM1
0,25
100
200
0,35
Как приводится в таблице 19, ADC против EGFRvIII снижали жизнеспособность клеток различных надэкспрессирующих EGFRvIII клеточных линий со значениями ICso, варьирующими от 0,25 нМ до 3,25 нМ.
Активность киллинга клеток попарных комбинаций конъюгатов антитело против EGFRvIII-лекарственное средство
антитело против EGFRvIII-DMl
Затем тестировали эффективность киллинга клеток для H1H1863N2-MCC-DM1, спаренного со связывающимся с антителом против пептида EGFRvIII ADC на надэкспрессирующих EGFRvIII клеточных линиях в отношении 1:1. Результаты показаны в таблице 20.
DM1 -SMe
(свободный
DM1)
отсутств ие
0,21
0,28
0,19
100
0,19
100
Изотипичес кий
контроль-MCC-DM1
отсутств ие
200
150
100
Как приводится в таблице 20, комбинация H1H1863N2-MCC-DM1 (связующего конформационного эпитопа) и контроля V-MCC-DM1 (связующего соединительного пептида) в результате давала эффективность киллинга клеток, которая была по меньшей мере эквивалентной таковой при обработках только ADC или в определенных случаях сильнее таковой при обработках только ADC. Отсутствие взаимодействия между двумя типами антител предполагает эффективное применение двух неконкурирующих антител с различными цитотоксинами или различными классами цитотоксинов с разными механизмами действия.
Таким образом, данный пример демонстрирует, что H1H1863N2 не конкурирует перекрестно с контрольным связывающимся с пептидом EGFRvIII антителом. Этот уникальный эпитоп позволяет комбинировать его со связывающими пептид EGFRvIII ADC для повышения эффективности киллинга клеток. Эта новая комбинация ADC против EGFRvIII может обеспечивать более высокую терапевтическую эффективность.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> РЕГЕНЕРОН ФАРМАСЬЮТИКАЛС, ИНК.
<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ EGFRvIII И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> A0020WO01
<140> To be assigned <141> Filed herewith
<150> 61/950,963
<151> 2014-03-11 <160> 165
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1 <211> 354 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 1
caggtgcagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtaaaagtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 actggacagg ggcttgagtg gatgggatgg attaacccta acagtgatta cacaggctat 180 gtacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cctccataag tacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gacatcacgg 300 tggtctgaac acttccacca ctggggccag ggcaccctgg tcactgtctc ctca 354
<210> 2 <211> 118 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
Ser
Gly
Ala
Glu
Gly
Val
Lys
Lys
Pro
Gly
Ser
Ala
Lys
Ala
Ser
Thr
Tyr
Thr
Phe
Thr
Glu
Tyr
Gln
Ala 40
Gly
Gln
Gly
Leu
Trp
Met
Ser
Thr
Asp
Tyr
Thr
Gly
Tyr
Ile
Val
Gln
Lys
Phe
Arg
Asp
Thr
Ser
Thr
Ser
Thr
Ala
Tyr 80
Cys
Arg
Ser
Glu
Asp
His
Ala
Val
Tyr
Tyr
Gly
Glu
His
Phe
105
His
Trp
Gly
Gln 110
Thr
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln 1 5
Ser Val Lys Val Ser Cys 20
Asp Ile Asn Trp Val Arg 35
Gly Trp Ile Asn Pro Asn 50
Gln Gly Arg Val Thr Met 65 70
Met Glu Leu Ser Ser Leu
Ala Thr Ser Arg Trp Ser 100
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 3 <211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 3
ggatacacct tcaccagtta tgat 24
<210> 4 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 4
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp 1 5
<210> 5 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 5
attaacccta acagtgatta caca 24
<210> 6 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 6
Ile Asn Pro Asn Ser Asp Tyr Thr 1 5
<210> 7 <211> 33 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 7
gcgacatcac ggtggtctga acacttccac cac 33
<210> 8 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 8
Ala Thr Ser Arg Trp Ser Glu His Phe His His
1 5 10
<210> 9 <211> 342 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 9
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc acaaaccagg acagcctcct aacctactca tttactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaccaata ttatagtact 300
ccattcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaac ga 342
<210> 10 <211> 114 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
10 15 Ser Gln Ser Val Leu Tyr Se 30
Tyr Gln His Lys Pro Gly Gl 45
Ser Thr Arg Glu Ser Gly Va 60
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Th 75 80 Ala Val Tyr Tyr Cys His Gl 90 95 Pro Gly Thr Lys Val Asp Il 110
<210> 11 <211> 36 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 11
cagagtgttt tatacagctc caacaataag aactac 36
<210> 12 <211> 12 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 13
tgggcatct
<210> 14 <211> 3 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 14 Trp Ala Ser 1
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 15
caccaatatt atagtactcc attcact 27 <210> 16
<211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 16
His Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5
<210> 17 <211> 372 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc ccggagactc 60 tcctgtgtag tgtctggatt catcttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atattttatg atggaagtaa tgaatactat 180 gtagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat 240 ctccaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gcgagagggc 300 tacagtcagc ggtacaagta ttacttcggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372
<210> 18 <211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Arg Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Phe Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Gln Arg Tyr Lys Tyr Tyr Phe Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 19 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 19
ggattcatct tcagtagcta tggc 24
<210> 20 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 20
Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5
<210> 21 <211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 21
atattttatg atggaagtaa tgaa 24
<210> 22 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 22
Ile Phe Tyr Asp Gly Ser Asn Glu 1 5
<210> 23 <211> 51 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 23
gcgcgagagg gctacagtca gcggtacaag tattacttcg gtatggacgt c 51
<210> 24 <211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 24
Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Gln Arg Tyr Lys Tyr Tyr Phe Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 25 <211> 324 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 25
gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagcaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttacta ttgtcaacag actaacagtt tcccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa acga 324
<211> 108 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
Gln
Met
Thr
Gln
Ser
Pro
Ser
Ser 10
Val
Val
Thr
Tyr
Ile
Thr
Cys
Arg
Ala
Gly
Ser
Gln
Trp
Ala
Gln
Gln
Gln
Pro
Ser
Lys
Ala
Ser
Ser
Leu
Gln
Phe
Gly
Val
Pro
Ser
Gly
Thr
Asp
Tyr
Thr
Leu
Thr
Ile
Thr
Phe
Ala
Thr 85 Gly
Tyr
Cys
Gln
Gln 90 Ile
Gly
Gly 100
Thr
Lys
Val
Glu 105
Lys
<400> 26 Asp Ile G
1 5 10 15
Ile Se
э Lys Lei
: Arg Phf
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Se
65 70 75 80
гЧ 7\ TiU^ 7\1-^ mU-^ mTTv- mTTv- г*Гт^ гЧ гЧ mU-^ 7\^,-^ o^-^ TiU^ Pro T^'1
<210> 27 <211> 18 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 27
cagggtatta gcagctgg 18
<210> 28 <211> 6 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 28
Gln Gly Ile Ser Ser Trp 1 5
<210> 29 <211> 9 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 29
gctgcatcc
<210> 30 <211> 3 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 30 Ala Ala Ser 1
<210> 31 <211> 27 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 31
caacagacta acagtttccc gctcact 27
<210> 32 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 32
Gln Gln Thr Asn Ser Phe Pro Leu Thr
<210> 33 <211> 366 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 33
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt ccccttcagt agctacgaca tgcactgggt ccgccaagct 120 acaggaaaag gtctggagtg ggtctcagct attggtactg ctggtgccac atactatcca 180 ggctccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccaagaactc cttgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag aggggattac 300 gtttggggga cttatcgtcc cctctttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366
<210> 34 <211> 122 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala He Gly Thr Ala Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Asp Tyr Val Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Leu Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35 <211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 35
ggattcccct tcagtagcta cgac 24
<210> 36 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 36
Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr Asp 1 5
<210> 37 <211> 21 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 37
attggtactg ctggtgccac a 21
<210> 38 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 38
Ile Gly Thr Ala Gly Ala Thr 1 5
<210> 39 <211> 48 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic <400> 39
gcaagagggg attacgtttg ggggacttat cgtcccctct ttgactac 48
<210> 40 <211> 16 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 40
Ala Arg Gly Asp Tyr Val Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Leu Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 41 <211> 321 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 41
gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgct gggccagtca gggcattaac aattatttag cctggtatca acaaaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaaactgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcagcag cttaatagtt acccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 42
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 43 <211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 43
cagggcatta acaattat 18
<210> 44 <211> 6 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 44
Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 1 5
<210> 45 <211> 9 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 45
gctgcatcc
<210> 46 <211> 3 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 46 Ala Ala Ser
<210> 47 <211> 27 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 47
cagcagctta atagttaccc gctcact 27
<210> 48 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 48
Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5
<210> 49 <211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 49
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agatatggca tacactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttggcatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga ccagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatgga 300 ctggagatac gagatcacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372
<210> 50 <211> 124 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp His Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Leu Glu Ile Arg Asp His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
<210> 51 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 51
ggattcacct tcagtagata tggc 24
<210> 52 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<400> 52
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly 1 5
<210> 53 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 53
atttggcatg atggaagtaa taaa 24
<210> 54 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 54
Ile Trp His Asp Gly Ser Asn Lys 1 5
<210> 55 <211> 51 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 55
gcgagagatg gactggagat acgagatcac tactactacg gtatggacgt c 51
<210> 56 <211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 56
Ala Arg Asp Gly Leu Glu Ile Arg Asp His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<211> 321 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 57
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat cggtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtactagt agttggttgg cctggtatca acagaaacca 120 gggaaagccc ctacgctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aaattcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacgtatta ctgccaacag tataacaggt attctcggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaattaa a 321
<210> 58 <211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Thr Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Ser Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 59 <211> 18 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 59
cagagtacta gtagttgg 18
<210> 60 <211> 6 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 60
Gln Ser Thr Ser Ser Trp 1 5
<210> 61 <211> 9 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 61
aaggcgtct
<210> 62 <211> 3 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 62
Lys Ala Ser
<210> 63 <211> 27 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 63
caacagtata acaggtattc tcggacg 27
<210> 64 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 64
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Ser Arg Thr 1 5
<210> 65 <211> 378 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 65
gaagtgcagt tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagtt 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga atagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatatc 300 catgactacg gaaaagatta ctactactac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcaccg tctcctca 378
<210> 66 <211> 126 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
Glu
Val
Gln
Leu
Val
Glu
Ser
Leu
Arg
Leu
Ser
Cys
Ala
Met
His
Ile
Trp
Val
Arg
Ser
Gly
Gly
Ser
Trp
Asn
Lys 65
Arg
Phe
Thr
Ile
Leu
Gln
Met
Asn
Ser
His
Leu
Ala
Lys
Asp
Ile 100
Asp
Met
Asp
Val 115
Trp
Gly
Gln
10 15 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ty
25 30 Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Va
40 45
Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Va 55 60
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ty 75 80 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cy
90 95 Tyr Gly Lys Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gl
105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 120 125
<210> 67 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 67
ggattcacct ttgatgatta tgcc 24
<210> 68 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 68
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5
<210> 69 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 69
attagttgga atagtggtag cata 24
<210> 70 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 70
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile 1 5
<210> 71 <211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 71
gcaaaagata tccatgacta cggaaaagat tactactact actacggtat ggacgtc 57
<210> 72 <211> 19 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 72
Ala Lys Asp Ile His Asp Tyr Gly Lys Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 73 <211> 324 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 73
gaaattgcgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcacctatt tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatgata gttcaccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 74 <211> 108 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 74
Glu Ile Ala Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Ser Pro
85 90 95
100
105
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
inn i n rz
<210> 75 <211> 21 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 75
cagagtgtta gcagcaccta t 21
<210> 76 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 76
Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr 1 5
<210> 77 <211> 9 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 77
ggtgcatcc
<210> 78 <211> 3 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 78 Gly Ala Ser 1
<210> 79 <211> 27 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 79
cagcagtatg atagttcacc gatcacc 27
<210> 80 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 80
Gln Gln Tyr Asp Ser Ser Pro Ile Thr 1 5
<210> 81 <211> 354 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 81
caggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt gcctatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaaaattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccgtc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctggaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcta 300
atggtcggag ttactaacta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc caca 354
<210> 82 <211> 118 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
Ser
Gly
Gly
Gly 10 Gly
Val
Val
Gln
Pro
Gly 15 Ala
Arg
Ala
Ala
Ser
Pro
Phe
Thr
Phe
Ser
Glu
Tyr
Gln
Ala
Ser
Gly
Lys
Gly
Leu
45 Ala
Trp
Val
Gly 55
Asn
Lys
Asn
Tyr 60
Asp
Ser
Val
Ser
Arg
Asp
Asn
Ser
Thr
Lys
Asn
Thr
Leu
Tyr
Cys
Arg
Ala
Glu
Asp
Asn
Ala
Val
Tyr
Tyr
Gly
Gly
Val
Thr 105
Tyr
Trp
Gly
Gln 110
Thr
<210> 83 <211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 83
ggattcacct tcagtgccta tgcc 24
<210> 84 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 84
Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr Ala 1 5
<210> 85 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 85
atatggtatg atggaagtaa taaa 24
<210> 86 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 86
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5
<210> 87 <211> 33 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 87
gcgagagatc taatggtcgg agttactaac tat 33
<210> 88 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 88
Ala Arg Asp Leu Met Val Gly Val Thr Asn Tyr
1 5 10
<210> 89 <211> 339
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 89
gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtcg cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta tacactgatg gaaacaccta cttgaattgg 120 tttcaccaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccgggac 180 tctggggtcc cagacagatt caccggcagt gggtcaggca ctgatttcac actaaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggggtc ttttactgca tgcaaggttc acactggcct 300 ccgtacactt ttggccaggg gaccaagctg gagatcaaa 339
<210> 90 <211> 113 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 90 Asp Val 1
Lys
<210> 91 <211> 33 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 91
caaagcctcg tatacactga tggaaacacc tac 33
<210> 92 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 92
Gln Ser Leu Val Tyr Thr Asp Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 93
<211> 9 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 93
aaggtttct
<210> 94 <211> 3 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 94
Lys Val Ser
<210> 95 <211> 30 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 95
atgcaaggtt cacactggcc tccgtacact 30 <210> 96
<211> 10 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 96
Met Gln Gly Ser His Trp Pro Pro Tyr Thr
1 5 10
<210> 97 <211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 97
caggttcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc ctgcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg atccttcagt ggtaactact ggagctggat ccgccagtcc 120 ccagggaagg ggttggagtg gattggggaa atcaatcatc gtggaaactc caactacaac 180 ccgtccctca agagtcgagg caccatatca ttagacacgt ccaagaacca gttatccctg 240 aagctgaggt ctgtgaccgc cgcggacacg gccatgtatt attgtgtgag agggggtggg 300 gactactact tcggcatgga cgtctggggc caggggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 98 <211> 119 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 98
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ala Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Asn
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Asn Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Gly Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Gly Gly Gly Asp Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 99 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 99
ggtggatcct tcagtggtaa ctac 24
<210> 100 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 100
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Asn Tyr 1 5
<210> 101 <211> 21 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 101
atcaatcatc gtggaaactc c 21
<210> 102
<211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 102
Ile Asn His Arg Gly Asn Ser 1 5
<210> 103
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 103
gtgagagggg gtggggacta ctacttcggc atggacgtc 39
<210> 104 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 104
Val Arg Gly Gly Gly Asp Tyr Tyr Phe Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 105 <211> 321 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 105
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcgt ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattgga aatgatttag gctggtatca gctgagacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct acatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacaa gattacaatt atccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 106 <211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 106
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Leu Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 107 <211> 18 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 107
cagggcattg gaaatgat 18
<210> 108 <211> 6 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 108
Gln Gly Ile Gly Asn Asp 1 5
<210> 109 <211> 9 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 109
gctacatcc
<210> 110 <211> 3 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> НО Ala Thr Ser 1
<210> 111 <211> 27 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 111
ctacaagatt acaattatcc gtggacg 27
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 112
Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr 1 5
<210> 113 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 113
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggagg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagtcc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagttgacct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtatatt tctgtgcgag agggggtggg 300 acctactact acggtatgga cgtttggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 114 <211> 119 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
Leu
Gln 5
Gln
Trp
Leu
20 Trp
Thr Ile
Cys Arg
Ala Gln
Asn
His
Ser
Gly 55
Thr
Ile
Ser 70
Val
<400> 114 Gln Val Gl
1 5 10 15
Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gl
25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tr
35 40 45
Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr As
50 55 60
Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys As
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala 85
Arg Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Tyr 100
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115
Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
90 95
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
105 110
<210> 115 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 115
ggagggtcct tcagtggtta ctac 24
<210> 116 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 116
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr 1 5
<210> 117 <211> 21 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 117
atcaatcata gtggaagcac c 21
<210> 118 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 118
Ile Asn His Ser Gly Ser Thr 1 5
<210> 119 <211> 39 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 119
gcgagagggg gtgggaccta ctactacggt atggacgtt
<210> 120 <211> 13 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 120
Ala Arg Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 121 <211> 321 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 121
gccatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattgga tatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag gattacaatt acccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggatatcaa a 321
<210> 122 <211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
y Ile Gly Tyr As 30
o Lys Leu Leu Il
r Arg Phe Ser Gl
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pr
65 70 75 80
r Asn Tyr Pro Trp
<210> 123 <211> 18 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 123
cagggcattg gatatgat
<210> 124
<211> 6 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 124
Gln Gly Ile Gly Tyr Asp 1 5
<210> 125 <211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 125
gctgcatcc
<210> 126 <211> 3 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 126 Ala Ala Ser
<210> 127 <211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 127
ctacaggatt acaattaccc gtggacg 27
<210> 128 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 128
Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr 1 5
<210> 129 <211> 357 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 129
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg atccttcagt ggtgactact ggagctggat tcgccagtcc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca atagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aaactgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggaggcggg 300 gactactact acggtatgga cgtctggggc ctagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 130 <211> 119 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
Gln
Val
Gln
Leu
Gln
Gln
Thr
Leu
Ser
Leu
Thr
Cys
Tyr
Trp
Ser
Ile
Trp
Ile
Arg
Gly
Glu 50
Asn
His
Ser
Ser 65
Lys
Arg Leu
Val Ser
Thr Ser
Ile
Val 85
Ser
Thr
Arg
Gly
Gly
Gly 100 Thr
Asp
Tyr
Thr
Thr
Val 115
Val
Ser
10 15 Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gl
25 30 Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tr 40 45
55 60 Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Le 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Al
90 95 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Leu Gl 105 110
<210> 131 <211> 24 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 131
ggtggatcct tcagtggtga ctac 24
<210> 132 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Asp Tyr 1 5
<210> 133
<211> 21 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic <400> 133
atcaatcata gtggaagcac c 21
<210> 134 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 134
Ile Asn His Ser Gly Ser Thr 1 5
<210> 135
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 135
gcgagaggag gcggggacta ctactacggt atggacgtc 39 <210> 136
<211> 13 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 136
Ala Arg Gly Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 137 <211> 321 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 137
gccatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattgga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaacctcct gatctatgct acatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacaa gattacaatt acccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 138 <211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 138
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 139 <211> 18 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 139
cagggcattg gaaatgat 18
<210> 140 <211> 6 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 140
Gln Gly Ile Gly Asn Asp 1 5
<210> 141 <211> 9 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 141
gctacatcc
<210> 142 <211> 3 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 142 Ala Thr Ser
<210> 143 <211> 27 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 143
ctacaagatt acaattaccc gtggacg 27
<210> 144 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 144
Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr 1 5
<210> 145 <211> 3633 <212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 145
atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60 gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag 120 ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg 180 gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag 240 accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct 300 ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca 360 gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agctgcccat gagaaattta 420 caggaaatcc tgcatggcgc cgtgcggttc agcaacaacc ctgccctgtg caacgtggag 480 agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc 540 cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg gagctgctgg 600 ggtgcaggag aggagaactg ccagaaactg accaaaatca tctgtgccca gcagtgctcc 660 gggcgctgcc gtggcaagtc ccccagtgac tgctgccaca accagtgtgc tgcaggctgc 720 acaggccccc gggagagcga ctgcctggtc tgccgcaaat tccgagacga agccacgtgc 780 aaggacacct gccccccact catgctctac aaccccacca cgtaccagat ggatgtgaac 840 cccgagggca aatacagctt tggtgccacc tgcgtgaaga agtgtccccg taattatgtg 900 gtgacagatc acggctcgtg cgtccgagcc tgtggggccg acagctatga gatggaggaa 960 gacggcgtcc gcaagtgtaa gaagtgcgaa gggccttgcc gcaaagtgtg taacggaata 1020 ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa 1080 aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg tggcatttag gggtgactcc 1140 ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac cgtaaaggaa 1200 atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct ccatgccttt 1260
gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc 1320 gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat 1380 gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg 1440 tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag 1500 gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc 1560 agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaac 1620 cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca 1680 gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc 1740 cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg 1800 ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc 1860 catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg 1920 cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg 1980 gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg ttcggaagcg cacgctgcgg 2040 aggctgctgc aggagaggga gcttgtggag cctcttacac ccagtggaga agctcccaac 2100 caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc 2160 ggtgcgttcg gcacggtgta taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt 2220 cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc 2280 gatgaagcct acgtgatggc cagcgtggac aacccccacg tgtgccgcct gctgggcatc 2340 tgcctcacct ccaccgtgca gctcatcacg cagctcatgc ccttcggctg cctcctggac 2400 tatgtccggg aacacaaaga caatattggc tcccagtacc tgctcaactg gtgtgtgcag 2460 atcgcaaagg gcatgaacta cttggaggac cgtcgcttgg tgcaccgcga cctggcagcc 2520 aggaacgtac tggtgaaaac accgcagcat gtcaagatca cagattttgg gctggccaaa 2580 ctgctgggtg cggaagagaa agaataccat gcagaaggag gcaaagtgcc tatcaagtgg 2640 atggcattgg aatcaatttt acacagaatc tatacccacc agagtgatgt ctggagctac 2700 ggggtgactg tttgggagtt gatgaccttt ggatccaagc catatgacgg aatccctgcc 2760 agcgagatct cctccatcct ggagaaagga gaacgcctcc ctcagccacc catatgtacc 2820 atcgatgtct acatgatcat ggtcaagtgc tggatgatag acgcagatag tcgcccaaag 2880 ttccgtgagt tgatcatcga attctccaaa atggcccgag acccccagcg ctaccttgtc 2940 attcaggggg atgaaagaat gcatttgcca agtcctacag actccaactt ctaccgtgcc 3000 ctgatggatg aagaagacat ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag 3060 cagggcttct tcagcagccc ctccacgtca cggactcccc tcctgagctc tctgagtgca 3120 accagcaaca attccaccgt ggcttgcatt gatagaaatg ggctgcaaag ctgtcccatc 3180 aaggaagaca gcttcttgca gcgatacagc tcagacccca caggcgcctt gactgaggac 3240 agcatagacg acaccttcct cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg 3300 cccgctggct ctgtgcagaa tcctgtctat cacaatcagc ctctgaaccc cgcgcccagc 3360 agagacccac actaccagga cccccacagc actgcagtgg gcaaccccga gtatctcaac 3420 actgtccagc ccacctgtgt caacagcaca ttcgacagcc ctgcccactg ggcccagaaa 3480 ggcagccacc aaattagcct ggacaaccct gactaccagc aggacttctt tcccaaggaa 3540 gccaagccaa atggcatctt taagggctcc acagctgaaa atgcagaata cctaagggtc 3600 gcgccacaaa gcagtgaatt tattggagca tga 3633
<210> 146 <211> 1210 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385 390 395 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
405 410 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420 425 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
450 455 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465 470 475 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
485 490 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530 535 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565 570 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610 615 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
625 630 635 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
690 Ile
705 710 715 720
Gly
735
Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala
740
Lys Ala Asn 755
Asp Asn Pro
770
Val Gln Leu
785 790 795 800
Leu
815
Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp
820
Val His Arg 835
His Val Lys
850
Glu Lys Glu
865 870 875 880
Ser
895
Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe
900
Pro Tyr Asp
915
Gly Glu Arg 930
Ile Met Val
945 950 955 960
Pro
975
Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro
980
Asp Ser Asn
995
Val Val Asp 1010
Ser Pro Ser
1025 1030 1035 1040
Leu G
1055
Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp
1060 1065 1070
Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro
1075 1080 1085
Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser
1090 1095 1100
Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser
1105 1110 1115 1120
Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro
1125 1130 1135
Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp
1140 1145 1150
Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp
1155 1160 1165
Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn
1170 1175 1180
Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val
1185 1190 1195 1200
Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 1205 1210
<210> 147 <211> 943
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 147
Met
Arg
Pro
Ser
Gly
Thr
Ala
Gly
Ala
Ala
Glu
Ala
Leu
Cys
Pro
Asp
Ala
Ser
Arg
Ala
Leu
25 Val
Val
Val
Thr 35
His
Gly
Ser
Cys 40
Arg
Tyr
Glu
Cys
Met
Glu
Glu
Asp
Gly
Asn
Val
Arg
Lys
Pro
Ser
Arg
Lys
Val
Cys
Ala
Gly
Ile
Gly
Leu
Ser
Ile
Asn 85
Thr
Asn
Ile
Lys
Ser
Ile
Ser
Gly 100 His
Asp
Leu
His
Ile
Leu
105 Asp
Pro
Ser
Phe
Thr 115 Val
Thr
Pro
Pro
Leu
120 Gly
Pro
Lys
Thr 130 Asn
Lys
Glu
Ile
Thr 135 His
Phe
Leu
Glu 145 Gly
Arg
Thr
Asp
Leu
150 His
Ala
Phe
Glu
Arg
Thr
Lys
Gln 165
Gly
Gln
Phe
Ser 170
Asn
Ile
Thr
Ser 180 Ile
Leu
Gly
Leu
Arg
Ser 185 Asn
Leu
Asp
Val
Ile 195
Lys
Ser
Gly
Asn
Lys
200 Thr
Leu
Asn
Trp 210 Asn
Lys
Leu
Phe
Gly 215 Ser
Ser
Gly
Ser 225 Ala
Arg
Gly
Glu
Asn 230 Glu
Cys
Lys
Ala
Leu
Cys
Ser
Pro 245
Gly
Cys
Trp
Gly 250
Val
Ser
Cys
Arg 260 Glu
Asn
Val
Ser
Arg
Gly 265 Glu
Arg
Asn
Leu
Leu
275
Gly
Glu
Pro
Arg 280
Phe
Ile
Gln 290 Gly
Cys
His
Pro
Glu
Cys 295 Asn
Leu
Pro
Gln
Thr 305 Gly
Arg
Gly
Pro
Asp 310
Lys
Cys
Ile
Gln
Pro
His
Cys
Val 325 Trp
Thr
Cys
Pro
Ala 330 Ala
Asn
Thr
Leu
Val 340 Asn
Lys
Tyr
Ala
Asp 345 Cys
Cys
His
Pro 355 Thr
Cys
Thr
Tyr
Gly 360 Ile
Thr
Cys
Pro 370 Ala
Asn
Gly
Pro
Lys
375
Leu
Pro
Ser
Gly
Leu
Leu
Leu
Leu
Val
Val
Ala
Glu Lys Lys Gly Asn Tyr 30
Ala Cys Gly Ala Asp Ser 45
Cys Lys Lys Cys Glu Gly
Ile Gly Glu Phe Lys Asp 75 80 His Phe Lys Asn Cys Thr 95
Val Ala Phe Arg Gly Asp 110
Gln Glu Leu Asp Ile Leu
125
Leu Ile Gln Ala Trp Pro 140
Asn Leu Glu Ile Ile Arg
155 160 Leu Ala Val Val Ser Leu 175
Lys Glu Ile Ser Asp Gly 190
Cys Tyr Ala Asn Thr Ile 205
Gln Lys Thr Lys Ile Ile 220
Thr Gly Gln Val Cys His 235 240
Pro Glu Pro Arg Asp Cys
255
Glu Cys Val Asp Lys Cys
270
Val Glu Asn Ser Glu Cys 285
Ala Met Asn Ile Thr Cys 300
Cys Ala His Tyr Ile Asp 315 320 Gly Val Met Gly Glu Asn 335
Gly His Val Cys His Leu 350
Gly Pro Gly Leu Glu Gly 365
Ile Ala Thr Gly Met Val 380
Т Г"1 "I т т Tl ^ Г"1 "I т т Т T)"U ^
385 390 395 400
Met Arg Arg Arg His Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu
405 410 415
Gln Glu Arg Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro
420 425 430
Asn Gln Ala Leu Leu Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile
435 440 445
Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp
450 455 460
Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu
465 470 475 480
Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala
485 490 495
Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly
500 505 510
Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe
515 520 525
Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser
530 535 540
Gln Tyr Leu Leu Asn Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr
545 550 555 560
Leu Glu Asp Arg Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val
565 570 575
Leu Val Lys Thr Pro Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala
580 585 590
Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys
595 600 605
Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr
610 615 620
Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu
625 630 635 640
Met Thr Phe Gly Ser Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile
645 650 655
Ser Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys
660 665 670
Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala
675 680 685
Asp Ser Arg Pro Lys Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met
690 695 700
Ala Arg Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met
705 710 715 720
775
Ser Cys
790
Pro Thr 805
Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro 820
Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln
835
Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp 850 855
Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr 865 870 Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro 885
Ser
Asn
Phe 730 Ala
Tyr
Arg
Ala
Leu
Met 735 Ile
Asp
Val
Asp 745
Asp
Glu
Tyr
Leu
750
Pro
Pro 760 Asn
Ser
Thr
Ser
Arg
Thr 765 Ala
Pro
Leu
Leu
Asn
Ser
Thr
Val 780
Cys
Ile
Asp
Pro
Ile
Lys
Glu 795 Thr
Asp
Ser
Phe
Leu
Gln 800 Asp
Gly
Ala
Leu
810 Ile
Glu
Asp
Ser
Ile 815 Pro
Glu
Tyr 825 Pro
Asn
Gln
Ser
Val 830 Gln
Lys
Asn 840
Val
Tyr
His
Asn 845
Pro
Leu
Pro
His
Tyr
Gln
Asp 860 Gln
Pro
His
Ser
Thr
Leu
Asn
Thr
Val 875 Ala
Pro
Thr
Cys
Val 880 His
Ala
His
Trp 890 Gln
Gln
Lys
Gly
Ser 895 Pro
Asp
Tyr
Gln
Asp
Phe
Phe
Lys
900 905 910
Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala
915 920 925
Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala
ПОП ПО С Г\ Л Г\
930 935 940
<210> 148
<211> 13 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 148
Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His
1 5 10
<210> 149 <211> 19 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 149
Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Lys
<210> 150 <211> 18 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 150
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr
1 5 10 15
Asp His
<210> 151 <211> 22 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 151
Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys
1 С 1 n 1С
10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Lys 20
<210> 152 <211> 408 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 152
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr
20 25 30
Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser
35 40 45
Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly
50 55 60
Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp
65 70 75 80
Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr
85 90 95
Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp
100 105 110
Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu
115 120 125
Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro
130 135 140
Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg
145 150 155 160
Ser 180 Ile
Leu
Ser
Gly Gly
Leu Asn
Arg Lys
200 Thr
Ser 185 Asn
Lys
Leu
Phe
Gly 215 Ser
Ser
Gly
Glu
Asn 230 Glu
Cys
Lys
Ser
Pro 245
Gly
Cys
Trp
Arg
260 Glu
Asn Gly
Val Glu
Ser Pro
Arg
Arg 280
Gly 265 Glu
His
Pro
Glu
Cys 295
Leu
Pro
Gly
Pro
Asp 310
Asn
Cys
Ile
Cys
Val 325
Lys
Thr
Cys
Pro
Val
340 Asn
Trp Cys
Lys Thr
Tyr Tyr
Ala
Gly 360 Ile
Asp 345 Cys
Asn
Gly
Pro
Lys
375 Gly
Pro
Glu
Asp
Leu
390 His
Gly
Glu
His
His 405
His
His
Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu
165 170 175
u Lys Glu Ile Ser Asp Gly
190
u Cys Tyr Ala Asn Thr Ile
195 200 205
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile
210 215 220
Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His
225 230 235 240
Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys
250 255
Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys
270
Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys
275 280 285
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys
290 295 300
Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp
305 310 315 320
Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn
330 335 Ala Gly His Val Cys His Leu 350
Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly
355 360 365
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Glu Gln Lys Leu
370 375 380
Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
385 390 395 400
<210> 153 <211> 613 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
Pro
Ser
Gly
Thr
Ala
Gly
Ala
Ala 10 Glu
Leu
Cys
Pro
Asp
Ala
Ser
Arg
Ala
Leu
25 Val
Glu
Thr 35
His
Gly
Ser
Cys 40
Arg
Ala
Met
Glu
Glu
Asp
Gly 55
Val
Arg
Lys
Cys
Arg
Lys
Val
Cys
Ala
Asn
Gly
Ile
Gly
Ile
His
Ser
Ile
Asn 85
Thr
Asn
Ile
Lys
Ser
Gly 100 His
Asp
Leu
His
Ile
Leu
105 Asp
Pro
Val
Thr 115 Val
Thr
Pro
Pro
Leu
120 Gly
Pro
Gln
Lys
Glu
Ile
Thr 135 His
Phe
Leu
Leu
Arg
Thr
Asp
Leu
150 His
Ala
Phe
Glu
Asn 155
Leu
Thr
Lys
Gln 165
Gly
Gln
Phe
Ser 170
Thr
Ser 180 Ile
Leu
Gly
Leu
Arg
Ser 185 Asn
Leu
Lys
Ile 195
Lys
Ser
Gly
Asn
Lys
200 Thr
Leu
Cys
Lys
Leu
Phe
Gly 215
Ser
Gly
Gln
Arg
Gly
Glu
Asn 230 Glu
Ser
Cys
Lys
Ala
Thr 235 Pro
Cys
Ser
Pro 245
Gly
Cys
Trp
Gly 250
Cys
Arg 260 Glu
Asn
Val
Ser
Arg
Gly 265 Glu
Arg
Glu
Leu
275
Gly
Glu
Pro
Arg 280
Phe
Val
Cys
His
Pro
Glu
Cys 295
Leu
Pro
Gln
Ala
Met A
1 5 10 15
7\ 1 -
50 55 60
Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp
65 70 75 80
Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr
a Phe Arg Gly Asp 110
u Leu Asp Ile Leu
125
e Gln Ala Trp Pro
130 135 140
145 150 155 160
Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu
175
u Ile Ser Asp Gly 190
r Ala Asn Thr Ile 205
s Thr Lys Ile Ile
210 215 220
Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His
225 230 235 240
Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys
255
270
О ^
285
290 295 300
Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp
305 310 315 320
Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn
325 330 335
Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu
340 345 350
Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly
355 360 365
Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Glu Pro Arg Gly
370 375 380
Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu
385 390 395 400
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val
405 410 415
Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
420 425 430
Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val
Glu
Val 450
Leu
435 His
Thr
Ala
Thr 465
Arg
Val
Val
Ser
Gly
Lys
Glu
Phe 485 Thr
Pro
Ile
Glu
Arg 500 Val
Gln
Val
Tyr 515
Leu
Val
Thr 530 Glu
Leu
Thr
Cys
Val 545 Glu
Trp
Thr
Asn
Pro
Val
Leu
Asp 565
Arg
Val
Glu
Lys
580 Glu
Lys
Val
Val
His 595
Gly
Arg
Thr
fil n
Pro
Gly
Lys
440 445 Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser
455 460
Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met
470 475 480
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala
490 495 Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro
505 510 Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln
520 525 Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr
535 540
Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr
550 555 560
570 575
585 590 Asn His His Thr Thr Lys Ser 600 605
<210> 154 <211> 684 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
Met
Arg
Pro
Ser
Gly
Ala
Leu
Cys
Pro 20
Ala
Gly
Thr
Ser 35
Asn
Lys
Leu
Ser
Leu
Gln
Arg
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln
65 70
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn 100
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu 115
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu
130 135 His Gly Ala Val Arg Phe Ser 145 150 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile 165
Ser Met Asp Phe Gln Asn His 180
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys 195
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys
210 215
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys
225 230
Gly
Ala
Ala
Glu
Leu
Leu
Ala
Leu
Leu
15 Cys
Ala
Ala
Leu
Leu
Glu
Lys
Lys
Val
Asp
Gln
Gln 40
Gly
Thr
Phe
Glu 45
His
Phe
Asn
Asn
Cys
Glu
Val 60
Val
Leu
Gly
Asn
Arg
Asn
Tyr
Asp
Ile
Leu
Ser
Phe
Leu
Lys
80 Val
Tyr
Val
Leu
90 Ile
Ala
Leu
Asn
Thr
Met
Leu
Gln 105 Val
Ile
Arg
Gly
Asn 110 Asp
Tyr
Ala 120 Pro
Leu
Ser
Asn
Tyr 125 Gln
Ala
Asn
Met
Arg
Asn
Leu
140
Glu
Ile
Leu
Asn
Asn
Pro
Ala 155 Asp
Leu
Cys
Asn
Val
Glu 160 Met
Val
Ser
Ser 170
Phe
Leu
Ser
Asn 175
Leu
Gly 185 Gly
Ser
Cys
Gln
Lys
Cys 190 Asn
Asp
Pro
Trp 200 Ala
Ala
Gly
Glu
Glu 205 Gly
Cys
Gln
Gln
Gln
Cys
Ser 220
Arg
Cys
Arg
Cys
His
Asn
Gln 235
Cys
Ala
Ala
Gly
Cys 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385 390 395 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
405 410 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420 425 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
450 455 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465 470 475 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
485 490 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530 535 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565 570 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610 615 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
625 630 635 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Cys Pro Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile
645 650 655
Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
660 665 670
Leu Ser Gly His His His His His His Ser Ser Gly
<210> 155 <211> 880
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
675 680
<400> 155
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Thr Val Lys Glu 400
485 490 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530 535 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565 570 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610 615 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
625 630 635 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro
645 650 655
Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser
660 665 670
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
675 680 685
Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro
690 695 700
Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala
705 710 715 720
Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val
725 730 735
Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
740 745 750
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr
755 760 765
Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu
770 775 780
Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys
785 790 795 800
Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn
805 810 815
Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp
820 825 830
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys
835 840 845
Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly
850 855 860
<210> 156 <211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 156
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
865 870 875 880
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
<210> 157 <211> 327 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 157
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
325 330
Ser
Arg
135
Pro
120 Thr
Pro
Glu
Val
Thr 140 Asn
125 Cys
Val
Asp 150
Glu
Val
Gln
Phe 155
Trp
Tyr
Asn
Ala
Lys
Thr
Lys 170
Pro
Arg
Glu
Glu
Val
Val
Ser
Val 185 Cys
Leu
Thr
Val
Leu
His 190
Lys
Glu
Tyr
Lys
200
Ile
Lys
Val
Ser
Asn 205 Gly
Lys
Thr 215
Leu
Ser
Lys
Ala
Lys
220 Glu
Gln
Thr 230 Thr
Pro
Pro
Ser
Gln 235 Gly
Glu
Met
Cys
Leu
Val
Lys
250 Gln
Phe
Tyr
Pro
Glu
Ser
Asn
Gly
265 Asp
Pro
Glu
Asn
Asn 270
Leu
Leu
Asp
Ser
280
Gly
Ser
Phe
Phe 285
Lys
Ser
295
Ala
Arg
Trp
Gln
Glu
Gly 300 Tyr
Asn
Val
Glu 310 Gly
Leu
His
Asn
His 315
Thr
Gln
Lys
115
Asp Thr Leu 130
Asp Val Ser
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
180
Trp Leu Asn Gly 195
Pro Ser Ser Ile
210
Glu Pro Gln Val
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
245 250 255
Ile Ala Val Glu 260
Thr Thr Pro Pro 275
Arg Leu Thr Val 290
Cys Ser Val Met
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu
325
<210> 158 <211> 327
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
Lys
Gly
Pro
Ser
Val
Phe
Pro 10 Gly
Leu
Ala
Pro
Cys
Glu 20
Ser
Thr
Ala
Ala
Leu
Cys
Leu
Val
Lys
Pro
Val
Thr
Val
Ser 40 Val
Trp
Asn
Ser
Gly
Ala 45 Gly
Leu
Thr
Phe
Pro
Ala 55
Leu
Gln
Ser
Ser 60
Leu
Val
Val
Thr 70
Val
Pro
Ser
Ser
Ser 75
Leu
Gly
Thr
Asn
Val
Asp
His
Lys
Pro
Ser
Asn
Thr
Lys
Val
<400> 158 Ala Ser Th
1 5 10 15
Val Hi 50
Ser Se
65 70 75 80
Asp
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
Ser
Gln
Glu
Asp 150
Pro
Glu
Val
Gln
Phe 155 Pro
Asn
Trp
Tyr
Glu
Val
His 165
Asn
Ala
Lys
Thr
Lys
170
Arg
Glu
Glu
Thr
Tyr 180
Arg
Val
Val
Ser
Val 185
Leu
Thr
Val
Leu
His 190
Asn 195
Gly
Lys
Glu
Tyr
Lys
200
Cys
Lys
Val
Ser
Asn 205
Lys
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
145 150 155 160
Gln
175
Pro
Ser 210
Ser
Ile
Glu
Lys
Glu 225 Asn
Pro Gln
Gln Val
Val Ser
Tyr Leu
245
Thr 230 Thr
Ile
Ala
Val
Glu 260 Pro
Trp
Glu
Thr
Thr
Pro 275 Thr
Val
Leu
Arg
Leu
290
Val
Asp
Lys
Cys 305
Leu
Ser Ser
Val
Leu
Met Ser
His
Leu
325
Glu 310 Gly
215 220 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 235 240 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
250 255 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 265 270
280 285
295 300 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 315 320
<210> 159 <211> 19 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> VARIANT
<222>
<223> Xaa = Ala <220>
<221> VARIANT <222> (2)...(2)
<223> Xaa = Arg or Lys
<220>
<221> VARIANT <222> (3)...(3) <223> Xaa = Gly or Asp
<220>
<221> VARIANT <222> (4)...(4)
<223> Xaa = Asp, Gly, Ile or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (5)...(5)
<223> Xaa = Tyr, Leu, His or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (6)...(6)
<223> Xaa = Val, Glu, Asp, Met or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (7)...(7)
<223> Xaa = Trp, Ile, Tyr, Val or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (8)...(8) <223> Xaa = Gly or Arg
<220>
<221> VARIANT <222> (9)...(9)
<223> Xaa = Thr, Asp, Lys, Gly or Val
<220>
<221> VARIANT <222> (10)...(10)
<223> Xaa = His, Asp, Thr or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (11)...(11)
<223> Xaa = Tyr or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (12)...(12)
<223> Xaa = Tyr or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (13)...(13) <223> Xaa = Tyr or Asn
<220>
<221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa = Arg or Tyr
<220>
<221> VARIANT <222> (15)...(15)
<223> Xaa = Pro, Tyr or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (16)...(16)
<223> Xaa = Leu, Gly or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (17)...(17) <223> Xaa = Phe, Met or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (18)...(18)
<223> Xaa = Asp or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (19)...(19)
<223> Xaa = Tyr, Val or absent
<400> 159
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa
<210> 160
<211> 10 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> VARIANT <222> (1)...(1) <223> Xaa = Gln, Leu or Met
<220>
<221> VARIANT <222> (2)...(2) <223> Xaa = Gln
<220>
<221> VARIANT <222> (3)...(3)
<223> Xaa = Leu, Tyr, Asp or Gly
<220>
<221> VARIANT <222> (4)...(4)
<223> Xaa = Asn, Asp, Tyr or Ser
<220>
<221> VARIANT <222> (5)...(5)
<223> Xaa = Ser, Arg, Asn or His
<220>
<221> VARIANT <222> (6)...(6) <223> Xaa = Tyr, Ser or Trp
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = Pro or Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)...(8) <223> Xaa = Pro or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (9)...(9)
<223> Xaa = Leu, Arg, Ile, Trp or Tyr
<220>
<221> VARIANT <222> (10)...(10) <223> Xaa = Thr
<400> 160
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 161 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> VARIANT <222> (1)...(1) <223> Xaa = Gly
<220>
<221> VARIANT <222> (2)...(2)
<223> Xaa = Phe or Gly
<220>
<221> VARIANT <222> (3)...(3) <223> Xaa = Pro, Thr or Ser
<220>
<221> VARIANT <222> (4)...(4) <223> Xaa = Phe
<220>
<221> VARIANT <222> (5)...(5)
<223> Xaa = Ser or Asp
<220>
<221> VARIANT <222> (6)...(6)
<223> Xaa = Ser, Arg, Asp, Gly or Ala
<221> VARIANT
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = Tyr or Asp
<220>
<221> VARIANT <222> (8)...(8)
<223> Xaa = Asp, Gly, Ala or Tyr <400> 161
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5
<210> 162 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> VARIANT <222> (1)...(1) <223> Xaa = Ile
<220>
<221> VARIANT <222> (2)...(2)
<223> Xaa = Gly, Trp, Ser or Asn <220>
<221> VARIANT <222> (3)...(3)
<223> Xaa = His, Trp, Tyr or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (4)...(4)
<223> Xaa = Thr, Asp, Asn or His
<220>
<221> VARIANT <222> (5)...(5) <223> Xaa = Ala, Gly or Ser
<220>
<221> VARIANT <222> (6)...(6) <223> Xaa = Gly or Ser
<220>
<221> VARIANT <222> (7)...(7) <223> Xaa = Ala, Asn or Ser
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = Thr, Lys or Ile
<400> 162
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
<210> 163 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> VARIANT <222> (1)...(1) <223> Xaa = Gln
<220>
<221> VARIANT <222> (2)...(2) <223> Xaa = Gly or Ser
<220>
<221> VARIANT <222> (3)...(3)
<223> Xaa = Ile, Thr, Val or Leu <220>
<221> VARIANT <222> (4)...(4)
<223> Xaa = Asn, Ser, Gly or Val
<220>
<221> VARIANT <222> (5)...(5) <223> Xaa = Asn, Ser or Tyr
<220>
<221> VARIANT <222> (6)...(6)
<223> Xaa = Thr or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (7)...(7)
<223> Xaa = Asp or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (8)...(8)
<223> Xaa = Gly or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)...(9)
<223> Xaa = Asn or absent
<220>
<221> VARIANT <222> (10)...(10)
<223> Xaa = Thr or absent
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)...(11)
<223> Xaa = Tyr, Trp or Asp
<400> 163
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 164 <211> 3 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> VARIANT <222> (1)...(1)
<223> Xaa = Ala, Lys or Gly
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = Ala, Thr or Val
<220>
<221> VARIANT <222> (3)...(3) <223> Xaa = Ser
<400> 164
Xaa Xaa Xaa
<210> 165 <211> 16 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 165
Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys
1 5 10 15
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с человеческим EGFRvIII, при этом антитело или его фрагмент не связывается ни с
(i) соединительным пептидом SEQ ID NO: 148, ни с
(ii) пептидом SEQ ID N0: 165.
2. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, при этом антитело или его фрагмент характеризуются равновесной константой диссоциации (KD) ДЛЯ димера человеческого EGFRvIII приблизительно 50 нМ или меньше, приблизительно 20 нМ или меньше, приблизительно 10 нМ или меньше, приблизительно 5,0 нМ или меньше, приблизительно 1,0 нМ или меньше или приблизительно 0,5 нМ или меньше, как измерено анализом поверхностного плазмонного резонанса.
3. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 2, при этом антитело или его фрагмент характеризуются KD В отношении димера человеческого EGFRvIII, превышающей таковую димера EGFRvIII по меньшей мере в приблизительно 4 раза, по меньшей мере в приблизительно 10 раз, по меньшей мере в приблизительно 50 раз, по меньшей мере в приблизительно 100 раз, по меньшей мере в приблизительно 500 раз, по меньшей мере в приблизительно 1000 раз, по меньшей мере в приблизительно 2000 раз или по меньшей мере в приблизительно 3000 раз, как измерено анализом поверхностного плазмонного резонанса.
4. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, при этом антитело или его фрагмент не связываются с димером EGFR при уровне, выявляемом анализом поверхностного плазмонного резонанса.
5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, при этом антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR), и при этом HCVR содержит три определяющие комплементарность области (CDR) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, содержащиеся в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, a LCVR содержит три CDR LCDR1, LCDR2 и LCDR3, содержащиеся в аминокислотной последовательности SEQ ГО NO: 42.
6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 5, в которых HCDR1, HCDR2 и HCDR3 содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 36, 38 и 40, соответственно.
2.
7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по пп. 5 или 6, при этом LCDR1, LCDR2 и LCDR3 содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 44, 46 и 48, соответственно.
8. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с человеческим EGFRvIII, при этом антитело или его фрагмент содержит комбинацию HCDR1 /HCDR2/HCDR3/LCDR1 /LCDR2/LCDR3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4/6/8/12/14/16, 20/22/24/28/30/32, 36/38/40/44/46/48, 52/54/56/60/62/64, 68/70/72/76/78/80, 84/86/88/92/94/96, 100/102/104/108/110/112, 116/118/120/124/126/128 и 132/134/136/140/142/144.
9. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, в котором HCVR содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114 и 130.
10. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, в котором LCVR содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122 и 138.
11. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, при этом антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит пару последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122 и 130/138.
12. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 8, при этом антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит пару последовательностей HCVR/LCVR SEQ ID NO: 34/42.
13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же эпитопом в EGFRvIII, что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 12.
14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют за связывание с EGFRvIII с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по п. 12.
15. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, при этом антитело или антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы с цитотоксином.
16. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 15, при этом цитотоксин выбран из группы, состоящей из биотоксинов, химиотерапевтических средств и радиоизотопов.
17. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 15, при этом цитотоксин выбран из группы, состоящей из майтанзиноидов, ауристатинов, томаймицинов,
2.
дуокармицинов, Ac, Th и каких-либо их производных.
18. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или
антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.
19. Фармацевтическая композиция по п. 18, дополнительно содержащая одно или несколько дополнительных терапевтических средств, выбранных из группы, состоящей из химиотерапевтического средства, противовоспалительных средств и анальгетиков.
20. Способ лечения злокачественной опухоли или опухоли, экспрессирующей EGFRvIII, предусматривающий введение субъекту при необходимости этого терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п. 18.
21. Способ по п. 20, при этом злокачественная опухоль или опухоль выбрана из группы, состоящей из глиобластомы, протоковой или внутрипротоковой карциномы молочной железы, немелкоклеточных карцином легкого, карцином яичника, злокачественной опухоли предстательной железы и плоскоклеточной карциномы головы и шеи.
22. Способ лечения злокачественной опухоли со снижением роста опухоли и/или обеспечением регрессии опухоли у больного, при этом способ предусматривает введение больному при необходимости этого первого конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC), содержащего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и цитотоксин, при этом антитело или антигенсвязывающий фрагмент первого ADC специфично связывается с EGFRvIII, но не связывается с соединительным пептидом SEQ ID N0: 148 или пептидом SEQ ГО N0: 165.
23. Способ по п. 22, при этом способ дополнительно предусматривает введение больному второго ADC, содержащего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и цитотоксин, при этом антитело или антигенсвязывающий фрагмент второго ADC специфично связывается с EGFRvIII, а также связывается с соединительным пептидом SEQ ID NO: 148 и/или пептидом SEQ ГО N0: 165.
24. Способ по п. 22, при этом антитело или антигенсвязывающий фрагмент первого ADC содержит определяющие комплементарность области тяжелой и легкой цепей, содержащие SEQ ГО N0: 36, 38, 40, 44, 46 и 48.
25. Способ по п. 24, при этом антитело или антигенсвязывающий фрагмент первого ADC содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ГО N0: 34, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 42.
19.
1 2345 678910 12 3 4 5 .678910
1 2345.6789 10
кДа
ISO 11Б ¦
Восстанав- " ]
ливающие зт -гь -
19 -
1S -
6 -
115
02 -
Невосстанав- н ливающие эт
26 1" 1S
н1Н1везма
(RJO-)
I \ t ^
Антитело против HIS Контроль I Антитело против HIS Контроль II Антитело против HIS
1 2 3 4 5 6 7 в Э 1С
1 2 3 4 5
6 7 8 910
1 2 3 4 5
б 7 е э ю
кДа 160 -
US ш.
62 ~Щ
АЛ
Восстанав- зт -ливающие a* id -
а "
3**
на ¦" 15 ~
Невосстанав-
В2 -
37 "•
ливающие и "
19 - 15 -
О -
HI HI911
Антитело против HIS
H1H191Z
Антитело против HIS
Н1НШ5
Антитело против HIS
4/8
H1H1863N2 H1H1911N
Контроль I Контроль II Контроль IV
H1H1912N
g g g g g g °
о о g о о о
о о о о о о
р о о о о о
о щ (о т
Относительная интенсивность флуоресценции
Фиг. 3
6000
4000
2000
Изотипический контроль B16F10.9
H1H1S63N2 B1GF10.9
Изотипический контроль Bl6F10.9fE(3FRvl!l
M1H1BS3N2 B16F10.9/EGFRvl!1
е =
Изотипический контроль H1H1S63N2 Изотипический контроль Н1Н1S63N2
B16F10.S B16F10.9 B16F10.WEGFRvlll B16F10.9/EGFFMII
(19)
(19)
(19)
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<210> 26
<210> 26
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<400> 132
<400> 132
<400> 132
<400> 132
<400> 132
<400> 132
675
<220>
<220>
<223> Synthetic
<223> Synthetic
<220>
<220>
<221> VARIANT
<221> VARIANT