[RU]

Настоящее изобретение относится, помимо всего прочего, к способам очистки матричной РНК (мРНК), включающим следующие стадии: (а) осаждение мРНК из неочищенного препарата; (б) подвергание неочищенного препарата, содержащего осажденную мРНК, процессу очистки с участием мембранной фильтрации таким образом, что осажденная мРНК захватывается мембраной; и (в) элюирование захваченной осажденной мРНК из мембраны путем повторной солюбилизации мРНК, что приводит к получению очищенного раствора мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения процессом очистки с использованием мембранной фильтрации, подходящим для настоящего изобретения, является тангенциальная поточная фильтрация.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится, помимо всего прочего, к способам очистки матричной РНК (мРНК), включающим следующие стадии: (а) осаждение мРНК из неочищенного препарата; (б) подвергание неочищенного препарата, содержащего осажденную мРНК, процессу очистки с участием мембранной фильтрации таким образом, что осажденная мРНК захватывается мембраной; и (в) элюирование захваченной осажденной мРНК из мембраны путем повторной солюбилизации мРНК, что приводит к получению очищенного раствора мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения процессом очистки с использованием мембранной фильтрации, подходящим для настоящего изобретения, является тангенциальная поточная фильтрация.

---

Евразийское (21) 201691696 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C12N1/08 (2006.01)
2017.03.31 C07H21/00 (2006.01)
C12N15/10 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2015.04.24
(54) СПОСОБЫ ОЧИСТКИ МАТРИЧНОЙ РНК
(31) 61/984,503
(32) 2014.04.25
(33) US
(86) PCT/US2015/027563
(87) WO 2015/164773 2015.10.29
(71) Заявитель:
ШИР ХЬЮМАН ДЖЕНЕТИК ТЕРАПИС, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Дероза Франк, Диаз Ануша, Карв Шриран, Хартлейн Майкл (US)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU) (57) Настоящее изобретение относится, помимо всего прочего, к способам очистки матричной РНК (мРНК), включающим следующие стадии: (а) осаждение мРНК из неочищенного препарата; (б) подвергание неочищенного препарата, содержащего осажденную мРНК, процессу очистки с участием мембранной фильтрации таким образом, что осажденная мРНК захватывается мембраной; и (в) элюирование захваченной осажденной мРНК из мембраны путем повторной солюбилиза-ции мРНК, что приводит к получению очищенного раствора мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения процессом очистки с использованием мембранной фильтрации, подходящим для настоящего изобретения, является тангенциальная поточная фильтрация.
СПОСОБЫ ОЧИСТКИ МАТРИЧНОЙ РНК
РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент
США № 61/984503, поданной 25 апреля 2014 года, содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Терапия с помощью матричной РНК становится все более важным
подходом для лечения различных заболеваний. Терапия с помощью матричной РНК предусматривает введение матричной РНК (мРНК) пациенту, нуждающегося в лечении и продукции белков, кодируемых мРНК, в организме пациента. Таким образом, существует большая потребность в крупномасштабной продукции безопасного продукта мРНК высокой чистоты, пригодного для терапевтического применения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0003] Настоящее описание изобретения ссылается на Перечень
последовательностей (представленный в электронном виде в виде файла в формате .txt под названием "Sequence listing.txt" от 24 апреля 2015 года). Файл в формате .txt был создан 22 апреля 2015 года и его размер составляет 11184 байт. Полное содержание Перечня последовательностей включено в данный документ посредством ссылки.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] Настоящее изобретение относится к способам эффективной очистки
матричной РНК (мРНК), в частности, синтезированной in vitro мРНК, пригодной для терапевтического применения. Настоящее изобретение, в частности, основано на неожиданном открытии того, что весьма неожиданное сочетание, заключающееся в
осаждении мРНК с последующей фильтрацией через мембрану, приводит к неожиданной успешной крупномасштабной продукции мРНК высокого качества.
[0005] Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к
способам очистки матричной РНК (мРНК), включающих следующие стадии (а) осаждение мРНК из неочищенного препарата; (б) подвергание неочищенного препарата, содержащего осажденную мРНК, процессу очистки с участием мембранной фильтрацией таким образом, что осажденная мРНК захватывается мембраной; и (в) элюирование захваченной осажденной мРНК из мембраны путем повторной солюбилизации мРНК, что приводит к получению очищенного раствора мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения процессом очистки с участием мембранной фильтрации, подходящим для настоящего изобретения, является тангенциальная поточная фильтрация. В некоторых вариантах реализации изобретения процессом очистки с участием мембранной фильтрации, подходящим для настоящего изобретения, является прямоточная фильтрация.
[0006] В некоторых вариантах реализации изобретения стадия осаждения мРНК
включает обработку неочищенного препарата раствором, содержащим реагент, выбранный из группы, состоящей из хлорида лития, хлорида натрия, хлорида калия, гуанидин хлорида, гуанидин тиоцианата, гуанидин изотиоцианата, ацетата аммония и их комбинаций. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящий реагент представляет собой гуанидин тиоцианат.
[0007] В некоторых вариантах реализации изобретения раствор, подходящий для
осаждения мРНК, содержит гуанидин тиоцианат в концентрации около 1 М или более, около 2 М или более, около 3 М или более, около 4 М или более, около 5 М или более, около 6 М или более, около 7 М или более, около 8 М или более, около 9 М или более или около ЮМ или более. В некоторых вариантах реализации изобретения раствор, подходящий для осаждения мРНК, содержит гуанидин тиоцианат в концентрации около 4 М. В некоторых таких вариантах реализации изобретения подходящий раствор дополнительно содержит лаурилсаркозил натрия и/или цитрат натрия. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения раствор, подходящий для осаждения мРНК, содержит 4 М гуанидин тиоцианат, 0,5% лаурилсаркозил натрия и 25 мМ цитрат натрия. В
некоторых вариантах реализации изобретения раствор, подходящий для осаждения мРНК, содержит 4 М гуанидин тиоцианат и 0,5 % лаурилсаркозил натрия. В некоторых вариантах реализации изобретения раствор, подходящий для осаждения мРНК, содержит 4 М гуанидин тиоцианат и 25 мМ цитрат натрия.
[0008] В некоторых вариантах реализации изобретения стадия осаждения мРНК
дополнительно включает в себя стадию обработки неочищенного препарата абсолютным спиртом.
[0009] В некоторых вариантах реализации изобретения стадия осаждения мРНК
дополнительно включает в себя стадию обработки неочищенного препарата изопропиловым спиртом.
[0010] В некоторых вариантах реализации изобретения мембрана, подходящая для
настоящего изобретения, изготовлена из материала, выбранного из группы, состоящей из полиэфирсульфона (мПЭС) (не модифицированный), полиэфирсульфоновой (мПЭС) половолоконной мембраны, поливинилиденфторида (ПВДФ), ацетата целлюлозы, нитроцеллюлозы, СЭЦ (смешанные сложные эфиры целлюлозы), сверхвысокомолекулярного полиэтилена высокой плотности (СВМПЭ), политетрафторэтилена (ПТФЭ), нейлона и их комбинаций.
[ООН] В некоторых вариантах реализации изобретения способ по настоящему
изобретению дополнительно включает стадию отмывания захваченной осажденной мРНК перед элюированием. В некоторых вариантах реализации изобретения стадия отмывания включает в себя множество промывочных циклов с использованием отмывающего раствора, содержащего гуанидиновый буфер и этанол, с последующим использованием этанола с концентрацией около 70-80 % (например, около 70 %, 75 % или 80 % этанола). В некоторых вариантах реализации изобретения множество промывочных циклов, подходящих для настоящего изобретения, представляют собой по меньшей мере 5 или более чем 5 циклов (например, от около 5 до 10 циклов или около 5, 6, 7, 8, 9 или 10 циклов).
[0012] В некоторых вариантах реализации изобретения стадия элюирования
включает повторную солюбилизацию захваченной осажденной мРНК свободной от
РНКазы водой. В некоторых вариантах реализации изобретения свободная от РНКазы вода рециркулирует в течение около 5-10 минут (например, в течение около 5, 6, 7, 8, 9 или 10 минут).
[0013] В некоторых вариантах реализации изобретения способ по настоящему
изобретению дополнительно включает стадию диализа очищенного раствора мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный раствор мРНК подвергают диализу против 1 мМ цитрата натрия с использованием мембраны с номинальным отсечением по молекулярной массе (НОММ) 100 кДа.
[0014] В различных вариантах реализации изобретения, настоящее изобретение
может применяться для очистки мРНК, синтезированной in vitro из неочищенного препарата, содержащего смесь для реакции синтеза мРНК in vitro. В некоторых вариантах реализации изобретения неочищенный препарат содержит незрелые последовательности РНК и/или ферментные реагенты, используемые в синтезе in vitro.
[0015] В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный раствор мРНК
содержит менее чем около 5 % (например, менее чем около 4,5 %, 4 %, 3,5 %, 3 %, 2,5 %, 2 %, 1,5 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %) незрелых последовательностей РНК и/или ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный раствор мРНК содержит менее чем около 1 % (например, менее чем около 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %) незрелых последовательностей РНК и/или ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный раствор мРНК содержит менее чем около 0,5 % (например, менее чем около 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, или 0,1 %) незрелых последовательностей РНК и/или ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный раствор мРНК содержит менее чем около 0,1% незрелых последовательностей РНК и/или ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный раствор мРНК является, по существу свободным от незрелых последовательностей РНК и/или ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro.
[0016] В некоторых вариантах реализации изобретения незрелые
последовательности мРНК и/или ферментные реагенты, используемые в синтезе in vitro, определяют с помощью окрашивания серебром, гель-электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сверхэффективной жидкостной хроматографии СВЭЖХ и/или капиллярного электрофореза.
[0017] В некоторых вариантах реализации изобретения незрелые
последовательности РНК содержат менее чем 15 оснований (например, менее чем 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 основания). В некоторых вариантах реализации изобретения незрелые последовательности РНК содержат около 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11 или 8-10 оснований.
[0018] В некоторых вариантах реализации изобретения ферментные реагенты,
используемые в синтезе in vitro, содержат Т7 РНК-полимеразу, ДНКазу I, пирофосфатазу и/или ингибитор РНКазы.
[0019] В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК очищают в масштабе
равном или большем чем 1 грамм, 5 грамм, 10 грамм, 15 грамм, 20 грамм, 25 грамм, 30 грамм, 35 грамм, 40 грамм, 45 грамм, 50 грамм, 75 грамм, 100 грамм, 150 грамм, 200 грамм, 250 грамм, 300 грамм, 350 грамм, 400 грамм, 450 грамм, 500 грамм, 550 грамм, 600 грамм, 650 грамм, 700 грамм, 750 грамм, 800 грамм, 850 грамм, 900 грамм, 950 грамм , 1 кг, 2,5 кг, 5 кг, 7,5 кг, 10 кг, 25 кг, 50 кг, 75 кг или 100 кг на партию. Как показано в приведенных ниже примерах, партия, содержащая очищенную мРНК в количестве 10 грамм или более (25 грамм или более), может быть легко получена с помощью способов настоящего изобретения.
[0020] В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК очищают перед
добавлением кэпа и/или хвоста к мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК очищают после добавления кэпа и/или хвоста к мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК очищают после добавления кэпа. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК очищают как перед, так и после добавления кэпа и/или хвоста к мРНК.
[0021] В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК имеет длину, равную
или большую чем около 1 кб, 1,5 кб, 2 кб, 2,5 кб, 3 кб, 3,5 кб, 4 кб, 4,5 кб, 5 кб, 6 кб, 7 кб, 8 Кб, 9 кб, 10 кб, 11 кб, 12 кб, 13 кб, 14 кб, 15 кб или 20 кб.
[0022] В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК содержит одну или
более модификаций для повышения стабильности. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более модификаций содержит модифицированный нуклеотид и/или модифицированные сахарофосфатные остовы. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК является немодифицированной.
[0023] В некоторых вариантах реализации изобретения очищенная мРНК имеет
целостность, равную или более чем около 95 % (например, равную или более чем около 96 %, 97 %, 98 % или 99 %). В некоторых вариантах реализации изобретения очищенная мРНК имеет целостность, равную или более чем около 98 %. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенная мРНК имеет целостность, равную или более чем около 99 %.
[0024] В некоторых вариантах реализации изобретения настоящее изобретение
относится к способу очистки матричной РНК (мРНК), включающего (а) осаждение мРНК из неочищенного препарата; (б) подвергание неочищенного препарата, содержащего осажденную мРНК, тангенциальной поточной фильтрацией таким образом, что осажденная мРНК захватывается фильтрационной мембраной, в то время как примеси отбрасываются при проникновении; и (в) элюирование захваченной осажденной мРНК из мембраны путем повторной солюбилизации осажденной мРНК, что приводит к получению очищенного раствора мРНК.
[0025] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу изготовления
матричной РНК (мРНК), включающего синтез мРНК in vitro; и очистку синтезированной in vitro мРНК с использованием метода, описанного в данном документе.
[0026] Помимо всего прочего, в настоящем изобретении также предложена
матричная РНК (мРНК), очищенная с использованием способа, описанного в данном документе.
[0027] В другом аспекте в настоящем изобретении также предложена партия
очищенной мРНК, содержащая 5 грамм или более мРНК одного вида, подходящая для введения субъекту-человеку. В некоторых вариантах реализации изобретения партия содержит 10 грамм или более мРНК одного вида. В некоторых вариантах реализации изобретения партия содержит 25 грамм или более мРНК одного вида. В некоторых вариантах реализации изобретения партия по существу является свободной от примесей процесса синтеза мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения партия по существу является свободной от незрелых последовательностей РНК, ДНК-матриц, и/или ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro мРНК одного вида. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенная мРНК содержит менее чем около 5 % ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенная мРНК имеет целостность более чем около 95 %.
[0028] В другом аспекте в настоящем изобретении также предложена композиция,
содержащая матричную РНК, очищенная с использованием способа, описанного в данном документе.
[0029] В другом аспекте в настоящем изобретении также предложена композиция,
содержащая синтезированную in vitro матричную РНК, причем композиция содержит менее чем 1 % незрелых последовательностей РНК и/или ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro.
[0030] В другом аспекте в настоящем изобретении также предложена композиция,
содержащая синтезированную in vitro матричную РНК (мРНК), причем мРНК имеет целостность равною или более чем 95 %.
[0031] В контексте данной заявки термины "около" и "приблизительно"
используются как эквивалентные. Любые числовые значения, используемые в данной заявке с терминами "около/приблизительно" или без них, предназначены для охвата обычных колебаний, оцененных средним специалистом в данной области техники.
[0032] Другие признаки, объекты и преимущества по данному изобретению станут
очевидными из следующего подробного описания. При этом следует понимать, что подробное описание, обозначающее варианты реализации по данному изобретению,
приводится только для иллюстрации и не является ограничивающим. Различные изменения и модификации в пределах объема данного изобретения будут очевидны для специалистов в данной области из подробного описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0033] Следующие фигуры приведены только в целях наглядности и никоим
образом не ограничивают настоящее изобретение.
[0034] Фигура 1 иллюстрирует типовой процесс крупномасштабной очистки
мРНК, включая стадии загрузки, отмывания и элюирования. Например, осажденная мРНК может быть загружена на мембраны таким образом, что осажденная мРНК может захватываться как ретентат, в то время как растворимые и нерастворимые примеси размером менее чем 0,22 мкм отбрасываются при проникновении. После захвата твердый осадок промывают различными буферами с последующей повторной солюбилизацией и элюированием для получения чистого продукта матричной РНК.
[0035] Фигура 2 иллюстрирует типовой окрашенный серебром белковый гель
мРНК модифицированного муковисцидозного трансмембранного регулятора (CFTR) из исходного 1 грамма реакции транскрипции in vitro (ГУТ) в соответствии с предложенными способами (с тремя элюированиями) и контрольными ферментами, присутствующими в реакции ГУТ.
[0036] Фигура 3 иллюстрирует типовой окрашенный серебром белковый гель
мРНК модифицированного CFTR из исходного 1,5 грамма реакции транскрипции in vitro (ГуТ) в соответствии с предложенными способами (с шестью элюированиями) и контрольными ферментами, присутствующими в реакции IVT.
[0037] Фигура 4 иллюстрирует длину типовой мРНК в образцах транскрипции in
vitro (IVT) мРНК модифицированного CFTR, очищенной и отфильтрованной в соответствии с предложенными способами, как показано с помощью электрофореза в агарозном геле. Целостность мРНК модифицированного CFTR сохранялась в полной мере после крупномасштабного осаждения.
[0038] Фигура 5 иллюстрирует типовой окрашенный серебром белковый гель
мРНК аргининосукцинат-синтетазы (ASS1) из исходного 1 грамма реакции транскрипции in vitro (IVT) в соответствии с предложенными способами (с пятью элюированиями) и контрольными ферментами, присутствующими в реакции IVT.
[0039] Фигура 6 иллюстрирует типовой окрашенный SYPRO белковый гель мРНК
аргининосукцинат-синтетазы (ASS1) из исходного 1 грамма реакции транскрипции in vitro (IVT) в соответствии с предложенными способами (с пятью элюированиями) и контрольными ферментами, присутствующими в реакции IVT.
[0040] Фигура 7 иллюстрирует длину типовой мРНК в образцах транскрипции in
vitro (IVT) мРНК ASS1, очищенной и отфильтрованной в соответствии с предложенными способами, как показано с помощью электрофореза в агарозном геле. Целостность мРНК ASS1 сохранялась в полной мере после крупномасштабного осаждения.
[0041] Фигура 8 иллюстрирует типовой окрашенный серебром белковый гель
мРНК люциферазы светляков (FFL) из исходной реакции транскрипции in vitro (IVT) в соответствии с предложенными способами (либо с одним либо з двумя осаждениями) и контрольными ферментами, присутствующими в реакции IVT.
[0042] Фигура 9 иллюстрирует типовой окрашенный SYPRO белковый гель мРНК
люциферазы светляков (FFL) из исходной реакции транскрипции in vitro (IVT) в соответствии с предложенными способами (либо с одним, либо с двумя осаждениями) и контрольными ферментами, присутствующими в реакции IVT.
[0043] Фигура 10 иллюстрирует длину типовой мРНК в образцах транскрипции in
vitro (IVT) мРНК люциферазы светляков (FFL), очищенной и отфильтрованной в соответствии с предложенными способами, как показано с помощью электрофореза в агарозном геле. Целостность мРНК FFL сохранялась в полной мере после крупномасштабного осаждения и повторного осаждения.
[0044] Фигура 11 иллюстрирует типовой окрашенный серебром белковый гель
мРНК аргининосукцинат-синтетазаы (ASS1) из конечной реакции кэпирования и добавления хвоста (с тремя эллюированиями) и контрольными ферментами, присутствующими в реакциях кэпирования и добавления хвоста.
[0045] Фигура 12 иллюстрирует длину типовой конечной мРНК ASS1, очищенной
и отфильтрованной в соответствии с предложенными способами, как показано с помощью электрофореза в агарозном геле. Целостность мРНК ASS1 сохранялась в полной мере после крупномасштабного осаждения и повторного осаждения.
[0046] Фигура 13 иллюстрирует типовую люминесценцию, наблюдаемую в
клеточных лизатах клеток НЕК293Т, обработанных мРНК FFL. Клетки собирали через 24 часа после трансфекции. Представлено сравнение трансляционной способности мРНК, полученной от поставщика, с мРНК, очищенной с помощью спин-колонки (коммерческий набор), с мРНК FFL, очищенной и осажденной посредством ТПФ.
[0047] Фигура 14 иллюстрирует типовые уровни белка CFTR, наблюдаемые в
клеточных лизатах клеток НЕК293Т, трансфицированных мРНК hCFTR. Клетки собирали через 24 часа после трансфекции. Представлено сравнение трансляционной способности мРНК, полученной от поставщика, с мРНК, очищенной с помощью спин-колонки (коммерческий набор), с мРНК hCFTR, очищенной и осажденной посредством ТПФ.
[0048] Фигура 15 иллюстрирует длину типовой мРНК в образце транскрипции in
vitro (IVT) мРНК аргининосукцинат-синтетазы (ASS1), очищенной и отфильтрованной в соответствии с предложенными способами. Целостность мРНК ASS1 сохранялась в полной мере после крупномасштабного (5G) осаждения.
[0049] Фигура 16 иллюстрирует длину типовой мРНК в образце транскрипции in
vitro (IVT) мРНК аргининосукцинат-синтетазы (ASS1) (до и после кэпирования и добавления хвоста), очищенной и отфильтрованной в соответствии с предложенными способами. Целостность мРНК ASS1 сохранялась в полной мере после крупномасштабного (5G) осаждения.
[0050] Фигура 17 иллюстрирует типовой окрашенный серебром белковый гель
мРНК аргининосукцинат-синтетазы (ASS1) после окончательной очистки (5G) в соответствии с предложенными способами, а также контрольными ферментами, присутствующими в реакции.
[0051] Фигура 18 иллюстрирует типовую продукцию человеческого белка ASS1,
наблюдаемую в клеточных лизатах клеток НЕК293Т, обработанных мРНК ASS1. Клетки
собирали через 24 часа после трансфекции. Представлено сравнение трансляционной способности мРНК, очищенной с помощью спин-колонки (коммерческий набор), с мРНК ASS1 (5G), очищенной и осажденной посредством ТПФ.
[0052] Фигура 19 иллюстрирует длину типовой мРНК в образце транскрипции in
vitro (IVT) мРНК муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) (до и после кэпирования и добавления хвоста), очищенной и отфильтрованной в соответствии с предложенными способами, как показано с помощью электрофореза в агарозном геле. Целостность мРНК CFTR сохранялась в полной мере после крупномасштабного (10G) осаждения.
[0053] Фигура 20 иллюстрирует типовой окрашенный серебром белковый гель
мРНК модифицированного муковисцидозного трансмембранного регулятора (CFTR) после окончательной очистки (10G) в соответствии с предложенными способами, а также контрольными ферментами, присутствующими в реакции.
[0054] Фигура 21 иллюстрирует типовые уровни белка CFTR, наблюдаемые в
клеточных лизатах клеток НЕК293Т, трансфицированных мРНК hCFTR, после крупномасштабной продукции и очистки. Клетки собирали через 24 часа после трансфекции.
[0055] Фигура 22 иллюстрирует длину типовой мРНК в образце транскрипции in
vitro (IVT) мРНК аргининосукцинат-синтетазы (ASS1) при 25G крупномасштабной продукции. Целостность мРНК ASS1 сохранялась в полной мере после крупномасштабного (25G) выделения.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0056] Для упрощения понимания настоящего изобретения ниже будут обозначены
некоторые термины. Дополнительные определения следующих терминов и иных терминов излагаются в тексте спецификации.
[0057] Животное: В данном контексте термин "животное" относится к любому
представителю животного мира. В некоторых вариантах реализации изобретения термин
"животное" относится к человеческим особям на любой стадии развития. В некоторых вариантах реализации изобретения термин "животное" относится к не относящимся к человеку животным на любой стадии развития. В некоторых вариантах реализации изобретения животное, не принадлежащее к человеческому роду, представляет собой млекопитающее (например, грызун, мышь, крыса, кролик, обезьяна, собака, кошка, овца, крупный рогатый скот, примат и/или свинья). В некоторых вариантах реализации изобретения животные включают, но не ограничиваются ими, млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых и/или червей. В некоторых вариантах реализации изобретения животное может представлять собой трансгенное животное, генно-инженерное животное и/или клон.
[0058] Приблизительно или около: В данном контексте термин "приблизительно"
или "около" применительно к одному или более значениям, представляющим интерес, относится к значению, которое является сходным с установленным эталонным значением. В некоторых вариантах реализации изобретения термин "приблизительно" или "около" относится к диапазону значений, попадающих в пределы 25 %, 20 %, 19%, 18%, 17%, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11%, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % или менее в любом направлении (более чем или менее чем) установленного эталонного значения, если не указано или не очевидно иное из контекста (кроме случаев, когда такое количество будет превышать 100 % от возможного значения).
[0059] Биологически активный: В данном контексте словосочетание "биологически
активный" относится к характеристике любого вещества, которое обладает активностью в биологической системе, и, в частности, в организме. Например, вещество, которое при введении в организм, оказывает биологический эффект на этот организм, считается биологически активным.
[0060] Экспрессия: В данном контексте термин "экспрессия" последовательности
нуклеиновой кислоты относится к трансляции мРНК в полипептид, сборке множества полипептидов в интактный белок и/или пост-трансляционной модификации полипептида или полностью собранного белка. В данной заявке термины "экспрессия" и "продукция", а также их грамматические эквиваленты используются как взаимозаменяемые.
[0061] Функциональный: В данном контексте термин "функциональная"
биологическая молекула означает форму биологической молекулы, в которой она обладает свойством и/или активностью, которыми она характеризуется.
[0062] Улучшение, увеличение или уменьшение: В данном контексте термины
"улучшение", "увеличение" или "уменьшение", или их грамматические эквиваленты означают изменения параметров относительно первоначального измерения, такого как измерение у того же индивидуума до начала лечения, описанного в данном документе, или измерение у контрольного субъекта (или множества контрольных субъектов) при отсутствии лечения, описанного в данном документе. "Контрольным субъектом" является субъект, имеющий ту же форму заболевания, что и субъект, на которого осуществляется воздействие, и примерно тот же возраст, что и субъект, на которого осуществляется воздействие.
[0063] Примеси: В данном контексте термин "примеси" относится к веществам
внутри ограниченного объема жидкости, газа или твердого вещества, которые по химическому составу отличаются от целевого материала или соединения. Примеси также обозначаются как загрязнители.
[0064] In Vitro: В данном контексте термин "ш vitro" относится к явлениям,
происходящим в искусственной среде, например, в пробирке или реакционном сосуде, в клеточной культуре и т.д., но не в многоклеточном организме.
[0065] In Vivo: В данном контексте термин "ш vivo" относится к явлениям,
происходящим в многоклеточном организме, таком как человек и животное, не принадлежащее к человеческому роду. В контексте клеточных систем, термин может применяться для обозначения явлений, происходящих в живой клетке (в отличие от, например, систем in vitro).
[0066] Выделенный: В данном контексте термин "выделенный" относится к
веществу, и/или объекту, которые были (1) отделены по меньшей мере от некоторых из компонентов, с которыми они были связаны, когда впервые были получены (будь то естественные и/или экспериментальные условия), и/или (2) получены, приготовлены и/или изготовлены человеком. Выделенные вещества и/или объекты могут быть отделены
от около 10 %, около 20 %, около 30 %, около 40 %, около 50 %, около 60 %, около 70 %, около 80 %, около 90 %, около 91 %, около 92 %, около 93 %, около 94 %, около 95 %, около 96 %, около 97 %, около 98 %, около 99 % или более чем около 99 % других компонентов, с которыми они были первоначально связаны. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенные агенты характеризуются чистотой около 80 %, около 85 %, около 90 %, около 91 %, около 92 %, около 93 %, около 94 %, около 95 %, около 96 %, около 97 %, около 98 %, около 99 % или более чем около 99 %. В данном контексте вещество называется "чистым", если оно по существу свободно от других компонентов. В данном контексте при расчете процента чистоты изолированные вещества и/или объекты не должны содержать вспомогательные вещества (например, буфер, растворитель, вода и т.д.).
[0067] матричная РНК (мРНК): В данном контексте термин "матричная РНК
(мРНК)" относится к полинуклеотиду, который кодирует по меньшей мере один полипептид. В данном контексте мРНК охватывает как модифицированную, так и немодифицированную РНК. мРНК может содержать одну или более кодирующих и некодирующих областей.
[0068] Целостность мРНК: В данном контексте термин "целостность мРНК" в
целом относится к качеству мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения целостность мРНК относится к проценту мРНК, которая не разрушается после процесса очистки (например, тангенциальная поточная фильтрация). Целостность мРНК может быть определена с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, например, с помощью электрофореза РНК в агарозном геле (например, Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology).
[0069] Нуклеиновая кислота: В данном контексте, термин "нуклеиновая кислота", в
его самом широком смысле, относится к любому соединению и/или веществу, которое включено или может быть включено в полинуклеотидную цепь. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота представляет собой соединение и/или вещество, которое включено или может быть включено в полинуклеотидную цепь посредством фосфодиэфирной связи. В некоторых вариантах реализации изобретения "нуклеиновая кислота" относится к отдельным остаткам нуклеиновой кислоты (например,
нуклеотиды и/или нуклеозиды). В некоторых вариантах реализации изобретения "нуклеиновая кислота" относится к полинуклеотидной цепи, содержащей остатки отдельных нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации изобретения "нуклеиновая кислота" охватывает РНК, а также одно- и/или двухцепочечную ДНК, и/или кДНК. Кроме того, термины "нуклеиновая кислота", "ДНК", "РНК" или аналогичные термины включают аналоги нуклеиновых кислот, т.е. аналоги, имеющие иной, нежели фосфодиэфирный остов. Например, так называемые "пептидные нуклеиновые кислоты", которые известны в данной области техники и имеют пептидные связи вместо фосфодиэфирных связей в остове, рассматриваются в рамках настоящего изобретения. Термин "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает в себя все последовательности нуклеотидов, которые представляют собой вырожденные версии друг друга и/или кодируют такую же последовательность аминокислот. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки и/или РНК, могут включать интроны. Нуклеиновые кислоты могут быть очищены от естественных источников, получены с использованием рекомбинантных экспрессионных систем и дополнительно очищены, химически синтезированы и т.д. При необходимости, например, в случае химически синтезированных молекул, нуклеиновые кислоты могут содержать нуклеозидные аналоги, такие как аналоги, имеющие химически модифицированные основания или сахара, модификации остова и т.д. Последовательность нуклеиновой кислоты представлена в направлении 5' к 3', если не указано иное. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота представляет собой или содержит естественные нуклеозиды (например, аденозин, тимидин, гуанозин, цитидин, уридин, дезоксиаденозин, дезокситимидин, дезоксигуанозин и дезоксицитидин); нуклеозидные аналоги (например, 2-аминоаденозин, 2-тиотимидин, инозин, пирроло-пиримидин, 3-метиладенозин, 5-метилцитидин, С5-пропинилцитидин, С5-пропинилуридин, 2-аминоаденозин, С5-бромуридин, С5-фторуридин, С5-йодуридин, С5-пропинилуридин, С5-пропинилцитидин, С5-метилцитидин, 2-аминоаденозин, 7-деазааденозин, 7-деазагуанозин, 8-оксоаденозин, 8-оксогуанозин, 0(6)-метилгуанин и/или 2-тиоцитидин); химически модифицированные основания; биологически модифицированные основания (например, метилированные основания);
интеркалированные основания; модифицированные сахара (например, 2'-фторорибоза, рибоза, 2'-дезоксирибоза, арабиноза и гексоза); и/или модифицированные фосфатные группы (например, фосфортиоаты и 5'-7У-фосфорамидитные связи). В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение специально направлено на "немодифицированные нуклеиновые кислоты", смысловые нуклеиновые кислоты (например, полинуклеотиды и остатки, включая нуклеотиды и/или нуклеозиды), которые не были химически модифицированы с целью содействия или обеспечения доставки.
[0070] Пациент: В данном контексте термин "пациент" или "субъект" относится к
любому организму, в который могут вводить указанную композицию, например, в экспериментальных, диагностических, профилактических, косметических или терапевтических целях. Типичные пациенты включают животных (например, млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, нечеловекообразные приматы и/или люди). В некоторых вариантах реализации изобретения пациентом является человек. Человек может быть в пре- и постнатальном периоде развития.
[0071] Фармацевтически приемлемый: В данном контексте термин
"фармацевтически приемлемый" относится к веществам, которые, с медицинской точки зрения, пригодны для применения в контакте с тканями человека и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы, или осложнения, соизмеримых с приемлемым соотношением польза/риск.
[0072] Незрелые последовательности РНК: В данном контексте термин "незрелые
последовательности РНК" относится к неполным продуктам реакции синтеза мРНК (например, реакции синтеза in vitro). По разным причинам РНК-полимеразы не всегда выполняют полную транскрипцию ДНК-матрицы; т. е. синтез РНК прекращается преждевременно. Возможные причины преждевременного прекращения синтеза РНК включают в себя качество ДНК-матрицы, последовательностей терминатора полимеразы для конкретной полимеразы, присутствующей в матрице, деградировавшие буферы, температура, истощение рибонуклеотидов, и вторичные структуры мРНК. Незрелые последовательности РНК могут быть любой длины, которая меньше предполагаемой длины желаемого транскрипционного продукта. Например, незрелые последовательности мРНК могут иметь длину менее чем 1000 оснований, менее чем 500 оснований, менее чем
100 оснований, менее чем 50 оснований, менее чем 40 оснований, менее чем 30 оснований, менее чем 20 оснований, менее чем 15 оснований, менее чем 10 оснований или меньше.
[0073] Соль: В данном контексте термин "соль" относится к ионному соединению,
которое является или может возникнуть в результате реакции нейтрализации между кислотой и основанием.
[0074] Субъект: В данном контексте термин "субъект" относится к человеку или
любому животному, не принадлежащему к человеческому роду (например, мышь, крыса, кролик, собака, кошка, крупный рогатый скот, свинья, овца, лошадь или примат). Человек может быть в пре- и постнатальном периоде развития. Во многих вариантах реализации изобретения субъектом является человек. Субъектом может быть пациент, который относится к человеческому роду, обратившийся в медицинское учреждение для диагностики или лечения заболевания. В данном контексте термин "субъект" используют взаимозаменяемо с терминами "индивидуум" или "пациент". Субъект может быть поражен или являться предрасположенным к заболеванию или нарушению, но может и не иметь симптомов заболевания или нарушения.
[0075] По существу: В данном контексте термин "по существу" относится к
качественному состоянию проявления полного или практически полного объема или степени характеристики или свойства, представляющего интерес. Среднему специалисту в области биологии будет понятно, что биологические и химические явления редко, если это вообще случается, доходят до завершения и/или протекают полностью, или достигают или избегают абсолютного результата. Следовательно, термин "по существу" в данном контексте направлен на то, чтобы охватить возможное отсутствие полноты, присущее многим биологическим и химическим явлениям.
[0076] По существу свободны: В данном контексте термин "по существу
свободны" относится к состоянию, при котором присутствует или отсутствует относительно небольшое количество вещества, которое будет удалено (например, незрелые последовательности РНК). Например, "по существу свободны от незрелых последовательностей РНК" означает, что незрелые последовательности РНК присутствуют на уровне менее чем приблизительно 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1,0 %, 0,9 %, 0,8 %,
0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 % или менее (в весовом соотношении) примеси. В альтернативном варианте "по существу свободны от незрелых последовательностей РНК" означает, что незрелые последовательности РНК присутствуют на уровне менее чем около 100 нг, 90 нг, 80 нг, 70 нг, 60 нг, 50 нг, 40 нг, 30 нг, 20 нг, 10 нг, 1 нг, 500 мг, 100 пг, 50 пг, 10 пг или менее.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0077] В настоящем изобретении предложены, помимо всего прочего,
усовершенствованные способы очистки мРНК из неочищенного препарата (например, смесь для реакции синтеза in vitro) на основе процесса, включающего осаждение мРНК с последующей фильтрацией через мембрану (например, тангенциальная поточная фильтрация).
[0078] Различные аспекты данного изобретения подробно описаны в следующих
разделах. Использование разделов не подразумевает ограничения изобретения. Каждый раздел можно применять к любому аспекту изобретения. В данной заявке использование "или" означает "и/или", если не указано иное.
Синтез мРНК
[0079] Настоящее изобретение может применяться для очистки любой мРНК. Как
правило, мРНК рассматривается как тип РНК, который переносит информацию от ДНК к рибосоме. Как правило, период существование мРНК является очень коротким и включает в себя процессинг и трансляцию с последующей деградацией. Как правило, в эукариотических организмах процессинг мРНК включает добавление "кэпа" в N-концевой (5') области и "хвоста" в С-концевой (3') области. Типовой кэп представляет собой 7-метилгуанозин, который является гуанозином, связанным посредством 5'-5'-трифосфатного мостика с первым транскрибируемым нуклеотидом. Наличие кэпа играет важную роль в обеспечении устойчивости к действию нуклеаз, присущих большинству эукариотических клеток. Как правило, хвост образовывается в результате
полиаденилирования, посредством которого полиаденилированный фрагмент добавляется к З'-концу молекулы мРНК. Наличие "хвоста" служит для защиты мРНК от экзонуклеазного расщепления. Матричная РНК транслируется рибосомами в последовательность аминокислот, которые составляют белок.
[0080] По настоящему изобретению мРНК могут быть синтезированы согласно
любому из множества известных способов. Например, по настоящему изобретению мРНК могут быть синтезированы посредством транскрипции in vitro (IVT). Вкратце, IVT, как правило, выполняется с помощью линейной или кольцевой матрицы ДНК, содержащей промотор, пул рибонуклеотидных трифосфатов, буферную систему, которая может включать DTT и ионы магния, а также соответствующую РНК-полимеразу (например, ТЗ, Т7 или SP6 РНК-полимеразу), ДНКазу I, пирофосфатазу и/или ингибитор РНКазы. Точные условия будут зависеть от конкретного применения. Согласно нескольким вариантам реализации изобретения наличие данных реагентов в конечном продукте является нежелательным и может, таким образом, упоминаться как примеси, и препарат, содержащий одну или более данных примесей, может упоминаться как неочищенный препарат.
[0081] Согласно различным вариантам реализации изобретения настоящее
изобретение может применяться для очистки синтезированной in vitro мРНК различной длины. В некоторых вариантах реализации изобретения настоящее изобретение может применяться для очистки синтезированной in vitro мРНК, имеющей длину, равную или составляющую более чем около 1 кб, 1,5 кб, 2 кб, 2,5 кб, 3 кб, 3,5 кб, 4 кб, 4,5 кб, 5 кб 6 кб, 7 кб, 8 кб, 9 кб, 10 кб, 11 кб, 12 кб, 13 кб, 14 кб, 15 кб или 20 кб. В некоторых вариантах реализации изобретения настоящее изобретение может применяться для очистки синтезированной in vitro мРНК, имеющей длину в пределах от около 1-20 кб, около 1-15 кб, около 1-10 кб, около 5-20 кб, около 5-15 кб, около 5-12 кб, около 5-10 кб, около 8-20 кб или около 8-15 кб. Например, длина типовой мРНК может составлять от около 1 кб до около 5 кб. В основном, мРНК будет иметь длину от около 1 кб до около 3 кб. Тем не менее, в некоторых вариантах реализации изобретения мРНК в композиции по изобретению является более длинной (более чем около 20 кб). В некоторых вариантах реализации изобретения настоящее изобретение может применяться для очистки мРНК,
содержащей одну или более модификаций, которые, как правило, повышают стабильность. В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более модификаций выбраны из модифицированного нуклеотида и/или модифицированных сахарофосфатных остовов, 5' и/или 3' нетранслируемой области. В некоторых вариантах реализации изобретения настоящее изобретение может применяться для очистки синтезированной in vitro немодифицированной мРНК.
[0082] Как правило, мРНК модифицируют для повышения стабильности.
Модификации мРНК могут включать, например, модификации нуклеотидов РНК. Таким образом, модифицированная по данному изобретению мРНК может содержать, например, модификации остова, модификации сахара или модификации основания. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК, кодирующие антитела (например, мРНК, кодирующая тяжелую цепь и легкую цепь), могут быть синтезированы из нуклеотидов естественного происхождения и/или нуклеотидных аналогов (модифицированные нуклеотиды) включая, но не ограничиваясь ими, пурины (аденин (А), гуанин (G)) или пиримидины (тимин (Т), цитозин (С), урацил (U)), а также модифицированные аналоги нуклеотидов или производных пуринов и пиримидинов, таких как, например, 1 -метил-аденин, 2-метил-аденин, 2-метилтио-М-6-изопентенил-аденин, М6-метил-аденин, N6-изопентенил-аденин, 2-тио-цитозин, 3-метил-цитозин, 4-ацетил-цитозин, 5-метил-цитозин, 2,6-диаминопурин, 1-метил-гуанин, 2-метил-гуанин, 2,2-диметил-гуанин, 7-метил-гуанин, инозин, 1-метил-инозин, псевдоурацил (5-урацил), дигидро-урацил, 2-тио-урацил, 4-тио-урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тио-урацил, 5-(карбоксигидроксиметил)-урацил, 5-фтор-урацил, 5-бром-урацил, 5-карбоксиметил-аминометил-урацил, 5-метил-2-тио-урацил, 5-метил-урацил, М-урацил-5-оксиуксусная кислоты метиловый эфир, 5-метиламинометил-урацил, 5-метоксиаминометил-2-тио-урацил, 5'-метоксикарбонилметил-урацил, 5-метокси-урацил, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусная кислота (v), 1 -метил-псевдоурацил, квеозин, бета-О-маннозил-квеозин, вибутоксозин, а также фосфороамидаты, фосфоротиоаты, пептидные нуклеотиды, метилфосфонаты, 7-деазагуанозин, 5-метилцитозин и инозин. Получение таких аналогов известно специалисту в данной области техники, например, из патента США № 4373071, патента США № 4401796, патента США № 4415732, патента США № 4458066, патента
США № 4500707, патента США № 4668777, патента США № 4973679, патента США № 5047524, патента США № 5132418, патента США № 5153319, патентов США № 5262530 и 5700642, описания которых включены в настоящий документ в полном объеме посредством ссылки.
[0083] Как правило, синтез мРНК включает добавление "кэпа" в N-концевой (5')
области и "хвоста" в С-концевой (3') области. Наличие кэпа играет важную роль в обеспечении устойчивости к действию нуклеаз, присущих большинству эукариотических клеток. Наличие "хвоста" служит для защиты мРНК от экзонуклеазного расщепления.
[0084] В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК содержит 5'-кэп-
структуру. Добавление 5'-кэпа происходит, как правило, следующим образом: во-первых, концевая фосфатаза РНК удаляет одну из концевых фосфатных групп из 5'-нуклеотида, оставляя два концевых фосфата; затем к концевым фосфатам с помощью гуанилилтрансферазы добавляют гуанозинтрифосфат (ГТФ) с образованием 5'5'5-трифосфатной связи; а затем метилируют 7-азот гуанина с помощью метилтрансферазы. Примеры кэп-структур включают, но не ограничиваются ими, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A и G(5')ppp(5')G.
[0085] В то время как мРНК, полученная в результате транскрипционных реакций
in vitro, может быть желаемой в некоторых вариантах реализации изобретения, другие источники мРНК рассматриваются в пределах объема изобретения, в том числе, мРНК дикого типа, полученные из бактерий, грибов, растений, и/или животных.
[0086] В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК содержит 5'- и/или
З'-нетранслируемую область. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-нетранслируемая область содержит один или более элементов, которые влияют на стабильность или трансляцию мРНК, например, железосвязывающий элемент. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-нетранслируемая область может составлять от около 50 до 500 нуклеотидов в длину.
[0087] В некоторых вариантах реализации изобретения З'-нетранслируемая область
содержит один или более сигналов полиаденилирования, участок связывания для белков, которые влияют на стабильность мРНК в местоположении в клетке, или один или более
участков связывания миРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения длина 3'-нетранслируемой области может составлять от 50 до 500 нуклеотидов или быть длиннее.
[0088] Настоящее изобретение может применяться для очистки мРНК,
кодирующей множество белков. Не ограничивающие примеры очистки мРНК, кодирующих люциферазу светляков, аргининосукцинат-синтетазу, фактор IX, и CFTR, детально описаны в разделе примеры.
[0089] Как правило, настоящее изобретение применяется для очистки мРНК одного
вида, т. е. препарат мРНК, подлежащий очистке, содержит мРНК, полученную из одного гена или одного синтеза, или одной экспрессирующей конструкции. В противоположность этому общая мРНК, очищенная из клетки, содержит множество видов мРНК.
[0090] Способ очистки по настоящему изобретению может быть осуществлен во
время или после синтеза. Например, как описано в данном документе, мРНК может быть очищена перед добавлением кэпа и/или хвоста к мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК очищают после добавления кэпа и/или хвоста к мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК очищают после добавления кэпа. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК очищают как перед, так и после добавления кэпа и/или хвоста к мРНК. В целом, как описано в данном документе стадия очистки может быть осуществлена после каждой стадии синтеза мРНК, необязательно наряду с другими способами очистки, такими как диализ. Например, мРНК может подвергаться диализу для удаления укороченных последовательностей после начального синтеза (например, с или без хвоста) и затем подвергаться осаждению и очистке, как описано в данном документе, а затем после добавления кэпа и/или хвоста, снова подвергаться очистке путем осаждения и очистки.
Осаждение мРНК
[0091] Согласно настоящему изобретению мРНК может быть осаждена из
неочищенного препарата, такого как смесь для реакции синтеза in vitro, используя различные методы осаждения, известные в данной области техники. В данном контексте термин "осаждение" (или любой его грамматический эквивалент) относится к
образованию твердого вещества в растворе. При использовании в сочетании с мРНК, термин "осаждение" относится к образованию нерастворимой или твердой форме мРНК в жидкости.
[0092] Любые и все способы, пригодные для осаждения мРНК могут быть
использованы для осуществления настоящего изобретения. Как правило, осаждение мРНК подразумевает денатурирующие состояние. В данном контексте термин "денатурирующие состояние" относится к любому химическому или физическому состоянию, которое может привести к нарушению нативной конформации мРНК. Поскольку нативная конформация молекулы, как правило, наиболее растворима в воде, разрушение вторичных и третичных структур молекулы может привести к изменению растворимости и к осаждению мРНК из раствора.
[0093] Например, подходящий способ осаждения мРНК из неочищенного
препарата включает обработку неочищенного препарата таким денатурирующим реагентом, чтобы мРНК выпадала в осадок. Типовые денатурирующие реагенты, пригодные для данного изобретения, включают, но не ограничиваются ими, хлорид лития, хлорид натрия, хлорид калия, гуанидин хлорид, гуанидин тиоцианат, гуанидин изотиоцианат, ацетат аммония и их комбинации. Подходящий реагент может предоставляться в твердой форме или в растворе.
[0094] В качестве не ограничивающего примера гуанидин тиоцианат может быть
использован для осаждения мРНК. Как правило, гуанидин тиоцианат может предоставляться в растворе в концентрации около 1 М или более, около 2 М или более, около 3 М или более, около 4 М или более, около 5 М или более, около 6 М или более, около 7 М или более, около 8 М или более, около 9 М или более, или около ЮМ или более. В некоторых вариантах реализации изобретения раствор, подходящий для осаждения мРНК, содержит гуанидин тиоцианат в концентрации около 4 М.
[0095] В дополнение к денатурирующему реагенту подходящий раствор для
осаждением мРНК может содержать дополнительную соль, поверхностно-активное вещество и/или буферный агент. Например, подходящий раствор может дополнительно содержать лаурилсаркозил натрия и/или цитрат натрия. В качестве неограничивающих
примеров, раствор, подходящий для осаждения мРНК, может содержать 4 М гуанидин тиоцианат, 0,5% лаурилсаркозил натрия и 25 мМ цитрат натрия; или 4 М гуанидин тиоцианат и 0,5% лаурилсаркозил натрия; или 4 М гуанидин тиоцианат и 25 мМ цитрат натрия.
[0096] Как правило, желательно инкубировать неочищенный препарат с одним или
более денатурирующими реагентами, описанными в данном документе, в течение определенного периода времени при определенной температуре, которая позволяет осадить значительное количество мРНК. Например, смесь неочищенного препарата и денатурирующего агента можно инкубировать при комнатной температуре или при температуре окружающей среды в течение определенного периода времени. Как правило, подходящим временем инкубации является период, равный или больший чем около 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 60 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящим временем инкубации является период, равный или меньший чем около 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения смесь инкубируют в течение около 5 минут при комнатной температуре. Как правило "комнатная температура" или "температура окружающей среды" относится к температуре в пределах около 20-25 °С, например, около 20 °С, 21 °С, 22 °С, 23 °С, 24 °С или 25 °С. В некоторых вариантах реализации изобретения смесь неочищенного препарата и денатурирующего агента также можно инкубировать при температуре выше комнатной (например, около 30-37 °С или, в частности, при около 30 °С, 31 °С, 32 °С, 33 °С, 34 °С, 35 °С, 36 °С или 37 °С) или ниже комнатной (например, около 15-20 °С или, в частности, при около 15 °С, 16 °С, 17 °С, 18 °С, 19 °С или 20 °С). Инкубационный период может быть отрегулирован в зависимости от температуры инкубации. Как правило, более высокая температура инкубации требует меньшее время инкубации.
[0097] В альтернативном варианте или дополнительно растворитель может быть
использован для облегчения осаждением мРНК. Подходящий типовой растворитель включает, но не ограничивается ими, изопропиловый спирт, ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, этанол, метанол, денатониум и их комбинации. Например, растворитель (например, абсолютный спирт), может быть добавлен к неочищенному
препарату вместе с денатурирующим реагентом или после добавления денатурирующего реагента и инкубации, как описано в данном документе, для дальнейшего повышения и/или ускорения осаждения мРНК. Как правило, после добавления подходящего растворителя (например, абсолютного спирта), смесь можно инкубировать при комнатной температуре в течение другого периода времени. Как правило, подходящий период времени инкубации является равным или большим чем около 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 60 минут. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящий период времени инкубации является равным или меньшим чем около 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 минут. Как правило, смесь инкубируют при комнатной температуре еще в течение около 5 минут. Температура выше или ниже комнатной может быть использована с соответственным регулированием времени инкубации. В альтернативном варианте инкубация может происходить при 4 °С или -20 °С для осаждения.
[0098] Как правило, способы, описанные в данном документе, приводят к
осаждению значительного количества мРНК из неочищенного препарата. В некоторых вариантах реализации изобретения способы, описанные данном документе, приводят к осаждению по меньшей мере около 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99% от общей мРНК из неочищенного препарата. В некоторых вариантах реализации изобретения способы, описанные данном документе, приводят к осаждению по существу 100 % от общей мРНК из неочищенного препарата.
Мембранная Фильтрация
[0099] Согласно настоящему изобретению неочищенный препарат, содержащий
осажденную мРНК, может быть подвергнут процессу очистки с участием мембранной фильтрации таким образом, что осажденная мРНК захватывается или удерживается мембраной. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения, неочищенный препарат подвергается мембранной фильтрации с последующим осаждением без предварительной обработки для удаления нерастворимых веществ.
[0100] Различные типы мембранной фильтрации могут быть использованы для
захвата или удержания осажденной мРНК. Как правило, мембранная фильтрация включает в себя отделения твердых частиц от жидкостей с использованием одной или более проницаемых мембран, наложенных друг на друга. Мембранная фильтрация также может применяться для фильтрации частиц из газовой пробы. В целом, существуют две основные формы мембранной фильтрации, пассивная фильтрация, которая протекает исключительно за счет растворения-диффузии, и активная фильтрация, которая использует положительное давление или отрицательное давление (т.е. вакуум), чтобы заставить жидкость или газ проходить через мембрану.
[0101] Типовой процесс с участием мембранной фильтрации для очистки мРНК
показан на фигуре 1. Как правило, такой процесс включает в себя стадии загрузки, отмывания и элюирования.
Загрузка
[0102] Как правило, стадия загрузки включает в себя загрузку исходной
реакционной смеси (например, неочищенного препарата, содержащего осажденную мРНК) на мембрану и ее прохождение через мембрану с помощью положительного или отрицательного давления, в результате чего ретентат захватывается или удерживается на мембране. В данном контексте термин "ретентат" относится к любому не проникающему растворенному веществу и/или нерастворимому веществу, которое удерживается мембраной. Согласно настоящему изобретению осажденная мРНК захватывается мембраной как ретентат. В данном контексте термин "мембрана" относится к любому пористому слою или листу материала. В данной заявке термин "мембрана" используются взаимозаменяемо с фильтром.
[0103] В некоторых вариантах реализации изобретения пригодная мембрана имеет
размер пор, подходящий для захвата или удержания осажденной мРНК, при этом позволяющий примесям (включая растворимые примеси и/или нерастворимые примеси, имеющие размер меньший, чем размер пор), проходить как пермеат. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящая мембрана имеет средний размер пор равный или более чем около 0,10 мкм, 0,20 мкм, 0,22 мкм, 0,24 мкм, 0,26 мкм, 0,28 мкм,
0,30 мкм, 0,40 мкм, 0,5 мкм или 1,0 мкм. В конкретных вариантах реализации изобретения подходящая мембрана имеет средний размер пор около 0,22 мкм. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящий размер пор для удержания осажденной мРНК может быть определен с помощью номинального молекулярно-массового предела (НММП) осажденной мРНК, также упоминаемого как номинальное отсечение по молекулярной массе (НОММ). Как правило, используются мембрана с размером пор менее чем НММП или НОММ осажденной мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения используется мембрана с размером пор от двух до шести (например, 2, 3, 4, 5 или 6) раз меньше НММП или НОММ осажденной мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящая мембрана по настоящему изобретению может иметь размер пор равный или более чем около 100 килодальтон (кДа), 300 кДа, 500 кДа, 1000 кДа, 1500 кДа, 2000 кДа, 2500 кДа, 3000 кДа, 3500 кДа, 4000 кДа, 4500 кД , 5000 кДа, 5500 кДа, 6000 кДа, 6500 кДа, 7000 кДа, 7500 кДа, 8000 кДа, 8500 кДа, 9000 кДа, 9,500 кДа или 10000 кДа.
[0104] Подходящая мембрана по настоящему изобретению может быть изготовлена
из любого материала. Типовые мембранные материалы включают, но не ограничиваются ими, полиэфирсульфон (мПЭС) (не модифицированный), полиэфирсульфоновоя (мПЭС) половолоконная мембрана, поливинилиденфторид (ПВДФ), ацетат целлюлозы, нитроцеллюлозу, СЭЦ (смешанные сложные эфиры целлюлозы),
сверхвысокомолекулярный полиэтилен (СВМПЭ), политетрафторэтилен (ПТФЭ), нейлон полисульфон, полиэфирсульфон, полиакрилнитрил, полипропилен, поливинилхлорид их комбинации.
[0105] Подходящая мембрана по настоящему изобретению может иметь различную
площадь поверхности. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящая мембрана имеет достаточно большую площадь поверхности для облегчения крупномасштабной продукции мРНК. Например, подходящая мембрана может иметь площадь поверхности равную или больше чем около 2000 см2, 2500 см2, 3000 см2, 3500 см2, 4000 см2, 4500 см2, 5000 см2, 7500 см2, 10000 см2, 5 м2, 10 м2, 12 м2, 15 м2, 20 м2, 24 м2, 25 м2, 30 м2 или 50 м2.
[0106] Мембранная фильтрация может быть осуществлена в различных форматах
для захвата осажденной мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения
мембранная фильтрация осуществляется как часть тангенциальной поточной фильтрации (ТПФ).
[0107] Тангенциальная поточная фильтрация (ТПФ), также известна как
фильтрование в тангенциальном потоке, представляет собой тип фильтрации, в котором материал для фильтрации протекает тангенциально вдоль фильтра, а не через него. При ТПФ нежелательный пермеат проходит через фильтр, в то время как необходимый ретентат (например, осажденная мРНК) проходит вдоль фильтра и захватывается или удерживается на фильтре или мембране ниже по потоку.
[0108] Принципиальным преимуществом тангенциальной поточной фильтрации
является то, что непроницаемый ретентат, который может агрегировать и блокировать фильтр (иногда именуемый "фильтрационным пирогом") во время традиционной "тупиковой" фильтрации, вместо этого продвигается вдоль поверхности фильтра. Данное преимущество тангенциальной поточной фильтрации позволяет быть особенно подходящим для крупномасштабной очистки осажденной мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения загрузка мРНК может быть равной или более чем около 1 грамм, 10 грамм, 50 грамм, 100 грамм, 200 грамм, 300 грамм, 400 грамм, 500 грамм, 600 грамм, 700 грамм, 800 грамм, 900 грамм, 1 кг, 5 кг, 10 кг, 50 кг или 100 кг на партию.
[0109] Существует по крайней мере три переменные, которые имеют важное
значение в типичном процессе ТПФ: трансмембранное давление, скорость подачи и скорость потока пермеата. Трансмембранное давления является силой, которая движет жидкость через фильтр, неся с собой проницаемые молекулы. В некоторых вариантах реализации изобретения трансмембранное давление составляет от 1 до 30 фунтов на квадратный дюйм (фунт/кв. дюйм) включительно.
[ОНО] Скорость подачи (также известная как скорость перекрестного потока)
является скоростью потока раствора через подающий канал, и через фильтр. Скорость подачи определяет силу, которая сметает молекулы, что в противном случае могут засорить или застопорить фильтр и тем самым ограничить поток фильтрата. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет от 1 до 500 л/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет от 50 до 800
мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет от 50 до 750 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет от 50 до 300 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет от 50 до 200 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет от 75 до 200 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет от 100 до 200 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет от 125 до 175 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет 130 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет от 60 мл/мин до 220 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет 60 мл/мин или более. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет 100 мл/мин или более. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет 150 мл/мин или более. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет 200 мл/мин или более. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость подачи составляет 220 мл/мин или более.
[0111] Скоростью потока пермеата является скорость при которой пермеат
удаляется из системы. При постоянной скорости подачи увеличение скорости потока пермеата может увеличить давление на фильтр, что приводит к увеличению скорости фильтрации, причем также потенциально увеличивается риск засорения или застопоривание фильтра. Принципы, теория и устройства, используемые для ТПФ описаны в Michaels и соавт. "Tangential Flow Filtration" в Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications (W. P. Olson, ed., Interpharm Press, Inc., Buffalo Grow, 111. 1995). См. также патенты США № 5256294 и 5490937 для описания высокоэффективной тангенциальной поточной фильтрации (ВЭ-ТПФ), которая представляет собой усовершенствование ТПФ. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока составляет от 1 до 100 л/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока составляет от 10 до 100 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока составляет от 10 до 90 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока составляет от 10 до 80 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока составляет от 10
до 70 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока составляет от 10 до 60 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока составляет от 10 до 50 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока составляет от 10 до 40 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока составляет от 20 до 40 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения скорость потока составляет 30 мл/мин.
[0112] Любые комбинации различных переменных процесса, описанные в данном
документе, могут быть использованы. В некоторых вариантах реализации изобретения тангенциальная поточная фильтрация осуществляется со скоростью подачи приблизительно 100-200 мл/мин (например, приблизительно 100-180 мл/мин, 100-160 мл/мин, 100-140 мл/мин, 110-190 мл/мин, 110-170 мл/мин или 110-150 мл/мин) и/или скоростью потока приблизительно 10-50 мл/мин (например, приблизительно 10-40 мл/мин, 10-30 мл/мин, 20-50 мл/мин или 20-40 мл/мин). В некоторых вариантах реализации изобретения тангенциальная поточная фильтрация осуществляется со скоростью подачи приблизительно 100, ПО, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 мл/мин и/или скоростью потока приблизительно 10, 20, 30, 40, или 50 мл/мин. В некоторых вариантах реализации изобретения тангенциальная поточная фильтрация осуществляется со скоростью подачи приблизительно 500, 750 мл/мин, 1, 2, 3, 4 или 5 л/мин и/или скоростью потока приблизительно 100, 200, 250, 500, 750 мл/мин или 1 л/мин.
Отмывание
[0113] Как правило, захваченная нерастворимая мРНК может быть отмыта перед
элюированием, чтобы избавиться от примесей, удержанных на мембране. В некоторых вариантах реализации изобретения стадия отмывания включает в себя множество промывочных циклов с использованием одного или более отмывающих растворов. Например, стадия отмывания может быть выполнена с помощью множества промывочных циклов с использованием гуанидинового буфера и этанола, а затем 70-80 % этанола (например, около 70 %, 75 % или 80 % этанола). В некоторых вариантах реализации изобретения множеством промывочных циклов является более чем 2, более чем 3, более чем 4, более чем 5, более чем 6, более чем 7, более чем 8, более чем 9 или более чем 10 циклов.
Элюирование
[0114] Как правило, захваченная или удерживаемая мРНК может быть элюирована
путем повторной солюбилизации осажденной мРНК в раствор. Например, захваченная мРНК может быть элюирована свободной от РНКазы водой. В некоторых вариантах реализации изобретения элюирование захваченной мРНК включает рециркуляцию свободной от РНКазы водой. Например, свободная от РНКазы вода может циркулировать в течение около 5-30 минут (например, около 5-25 минут, около 5-20 минут или около 515 минут). В конкретных вариантах реализации изобретения свободная от РНКазы вода рециркулирует в течение около 5-10 минут (например, в течение около 5, 6, 7, 8, 9 или 10 минут).
[0115] В некоторых вариантах реализации изобретения повторно
солюбилизированная мРНК может быть диализована в желаемый препарат в желаемой концентрации. Различные композиции могут быть использованы для диализа. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный раствор мРНК подвергают диализу против 1 мМ цитрата натрия. В некоторых вариантах реализации изобретения очищенный раствор мРНК подвергают диализу с ацетатом натрия, карбонатом аммония, бикарбонатом аммония, ацетатом пиридиния, формиатом пиридиния, ацетатом аммония, мочевиной, хлоридом калия и т.п. В зависимости от размера целевой мРНК могут применяться диализные мембраны с подходящим номинальным отсечением по молекулярной массе (НОММ). Например, подходящие диализные мембраны могут иметь НОММ около 50 кДа, 60 кДа, 70 кДа, 80 кДа, 90 кДа, 100 кДа, 150 кДа, 200 кДа, 250 кДа, 300 кДа, 350 кДа, 400 кДа, 450 кДа или 500 кДа.
Характеристика очищенной мРНК
[0116] Конкретным преимуществом, обеспечиваемым настоящим изобретением,
является возможность очистки мРНК, в частности, мРНК синтезированной in vitro, в большом или промышленном масштабе. Например, синтезированная in vitro мРНК может быть очищена в масштабе равном или более чем около 1 грамм, 10 грамм, 50 грамм, 100 грамм, 200 грамм, 300 грамм, 400 грамм, 500 грамм, 600 грамм, 700 грамм, 800 грамм, 900
грамм, 1 кг, 5 кг, 10 кг, 50 кг или 100 кг на партию. В одном конкретном варианте реализации изобретения синтезированная in vitro мРНК может быть очищена в масштабе 10 грамм на партию. В другом конкретном варианте реализации изобретения синтезированная in vitro мРНК может быть очищена в масштабе 100 грамм на партию. Еще в одном варианте реализации изобретения синтезированная in vitro мРНК может быть очищена в масштабе 1 кг на партию.
[0117] В различных вариантах реализации изобретения мРНК, очищенная согласно
настоящему изобретению, по существу свободна от примесей процесса синтеза мРНК, включая, но не ограничиваясь ими, незрелые последовательности РНК, ДНК матрицы, и/или ферментные реагенты, используемые для синтеза in vitro.
[0118] В частности, настоящее изобретение позволяет удалить или устранить
высокую степень незрелых последовательностей РНК (также известных как "укороченные последовательности"). В некоторых вариантах реализации изобретения способ согласно изобретению удаляет более чем около 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % или по существу все незрелые последовательностей РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК, очищенная согласно настоящему изобретению, является по существу свободной от незрелых последовательностей РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК, очищенная согласно настоящему изобретению, содержит менее чем около 5 % (например, менее чем около 4 %, 3 %, 2 % или 1 %) незрелых последовательностей РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК, очищенная согласно настоящему изобретению, содержит менее чем около 1 % (например, менее чем около 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % или 0,1 %) незрелых последовательностей РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК, очищенная согласно настоящему изобретению, содержит неопределяемые незрелые последовательности РНК, как установлено, например, бромистым этидием и/или окрашиванием Кумасси. В некоторых вариантах реализации изобретения незрелые последовательности РНК содержат менее чем 15 оснований (например, менее чем 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 основания). В некоторых вариантах реализации изобретения незрелые последовательности РНК содержат около 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11 или 8-10 оснований.
[0119] В некоторых вариантах реализации изобретения метод согласно настоящего
изобретения позволяет удалить или устранить высокую степень ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro, включая, но не ограничиваясь ими, Т7 РНК-полимеразу, ДНКазу I, пирофосфатазу и/или ингибитор РНКазы. В некоторых вариантах реализации изобретения настоящее изобретение является особенно эффективным для удаления Т7 РНК-полимеразы. В некоторых вариантах реализации изобретения метод согласно изобретению удаляет более чем около 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % или по существу все ферментные реагенты, используемые синтезе в in vitro включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК, очищенная согласно настоящему изобретению, по существу свободна от ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК, очищенная согласно настоящему изобретению, содержит менее чем около 5 % (например, менее чем около 4 %, 3 %, 2 % или 1 %) ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК, очищенная согласно настоящему изобретению, содержит менее чем около 1 % (например, менее чем около 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % или 0,1 %) ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro включительно. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК, очищенная согласно настоящему изобретению, содержит неопределяемые ферментные реагенты, используемые в синтезе in vitro включительно, как установлено с помощью, например, бромистого этидия и/или окрашивания Кумасси.
[0120] Уровень незрелых последовательностей РНК и/или ферментных реагентов в
очищенной мРНК может быть определен с использованием различных способов, известных в данной области техники. Например, незрелые последовательности РНК и/или ферментные реагенты, используемые в синтезе in vitro , могут быть определены с помощью окрашивания серебром, гель-электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сверхэффективной жидкостной хроматографии СВЭЖХ и/или капиллярного электрофореза.
[0121] В различных вариантах реализации изобретения, мРНК, очищенная с
использованием способа, описанного в данном документе, сохраняет высокую степень целостности. В данном контексте термин "целостность мРНК", как правило, относится к
качеству мРНК после очистки. В некоторых вариантах реализации изобретения целостность мРНК относится к проценту мРНК, которая не разрушается после тангенциальной поточная фильтрации. Целостность мРНК может быть определена с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, например, с помощью электрофореза РНК в агарозном геле (например, Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology). В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК, очищенная согласно настоящему изобретению, имеет целостность более чем около 95 % (например, более чем около 96 %, 97 %, 98 %, 99 % или более). В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК, очищенная согласно настоящему изобретению, имеет целостность более чем 98 %. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК, очищенная согласно настоящему изобретению, имеет целостность более чем 99 %. В некоторых вариантах реализации изобретения мРНК, очищенная согласно настоящему изобретению, имеет целостность приблизительно 100%.
Крупномасштабная серийная продукция мРНК для терапевтических применений
[0122] Настоящее изобретение направлено на насущную необходимость
крупномасштабной продукции очищенных мРНК, имеющих высокую степень чистоты и целостности, необходимую для терапевтического применения. Как правило, существующие методы являются небольшими по масштабу и не могут быть расширены до необходимой степени, чтобы сделать коммерческую продукцию мРНК, которая является подходящей для введения субъекту-человеку, достаточно рентабельной. Как показано в примерах, в противоположность этому способы настоящего изобретения являются полностью масштабируемыми и делают рентабельным крупномасштабную продукцию мРНК фармацевтической степени чистоты.
[0123] Каждая партия очищенной мРНК, полученная в соответствии с настоящим
изобретением, содержит 5 грамм или более мРНК одного вида, подходящей для введения in vitro субъекту-человеку. В некоторых вариантах реализации изобретения одна партия содержит 10 грамм или более мРНК одного вида. В конкретном варианте реализации изобретения одна партия содержит 25 грамм или более мРНК одного вида.
[0124] Способ по данному изобретению производит партии очищенной мРНК,
которые по существу свободны от примесей процесса синтеза мРНК. В частности, партии являются по существу свободными от незрелых последовательностей РНК, ДНК-матриц, и/или ферментных реагентов, используемых в синтезе мРНК одного вида. Например, партия очищенной мРНК, полученная согласно изобретению, содержит менее чем около 5 % ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro. Очищенная мРНК в каждой партии, как правило, имеет целостность более чем около 95 %.
[0125] Партии мРНК, полученные согласно способам по изобретению, могут быть
использованы для приготовления терапевтического агента, для которого необходима одна или более стадия(и) последовательной обработки. Как правило, каждая партия мРНК формулируется, например, путем инкапсуляции мРНК в наночастицы, липосомы, полиплексы на основе полимеров и т.д., которые могут быть введены пациенту. Типовые пути введения, но не исключительно, включают внутривенную или легочную доставку очищенной мРНК.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Генерация и очистка матричной РНК (мРНК) Синтез матричной РНК
[0126] Матричная РНК люциферазы светляков (FFL), аргининосукцинат-синтетазы
(ASS1), человеческого муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) синтезировали с помощью транскрипции in vitro из матрицы плазмидной ДНК, кодирующей ген, с последующим добавлением 5'-кэп структуры (Сар 1) (Fechter, Р.; Brownlee, G.G. "Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) и 3'-поли-(А)-хвоста длиной приблизительно 200 нуклеотидов, как определено с помощью гель-электрофореза. 5'- и З'-нетранслируемые области, присутствующие в каждом продукте мРНК, представлены в виде X и Y, соответственно, и определены как указано (vide infra). Синтез целевой конструкции матричной РНК включает в себя двухэтапный процесс, в котором синтезируется исходная нить, состоящая из кодирующей последовательности, фланкированной 5'- и 3'
нетранслируемыми областями. Данную не имеющую кэпа и хвоста конструкцию очищают и подвергают стадии кэпирования, за которой следует стадия добавления поли-А-хвоста. По завершении реакции добавления хвоста аналогичным с первоначальным процессом очистки образом проводится вторая стадия очистки.
Типовая кодон-оптимизированная мРНК муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (CFTR).
Дизайн конструкции:
Xi - SEQ ID NO: 1 - Yi
AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCAU
GGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACA
UCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACG
GGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUG
AGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGG
GAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACG
ACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUG
UUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAU
CACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACA
CUGAAACUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCC
CUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUC
GUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAUUUGGGAGCUG
UUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUU
CAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAA
AUCUCGGAAAGACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCA
AAGCCUAUUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAA
CUGAGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUCGUCAGC
GUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUUUUGCCUUAUGCCUUG
AUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCAAGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUA
UUGCGCAUGGCAGUGACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGAC
UCGCUUGGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAAG
ACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAUGUGACGGCU
UUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGAAUAACAAC
AACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGC
UCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUC
UCGCGGUAGCGGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUA
UGGGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAU
UCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUUU
UCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGGCGUGCCAGU
UGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAACAUCGUCUUGGGAGAAG
GGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGAGCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGG
UAUACAAAGAUGCAGAUUUGUAUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACG
UAUUGACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUA
AGACGAGAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGGCGGACAAGA
UCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCUCAGAGUUGCA
AAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAACUCAUGGGGUGUGACUCAUUCGACCAG
UUCAGCGCGGAACGGCGGAACUCGAUCUUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGC
UUGAGGGUGAUGCCCCGGUAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGC
AGACAGGAGAAUUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACU
CAAUUCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAAUGGAAUUG
AAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGUGCCGGAUUCAGA
GCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUGAUUUCAACCGGACCUACACUU
CAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGCUCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGG
GGCAAAACAUUCACCGCAAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACC
CCAGGCGAAUUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGCAAGAAACC
GGACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGUUUCUUU
GAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAACGUGGAACACAUACUUGCGUUAC
AUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUUUUCGUCCUCAUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUC
UCGCUGAGGUCGCAGCGUCACUUGUGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUU
GCAAGACAAAGGCAAUUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUAUC
ACUUCUACAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGUGGCCGACACUC
UGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUCGUUCACACGCUUAUCACUGU
CUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCUUCAUAGCGUACUGCAGGCUCCCAUGUCC
ACCUUGAAUACGCUCAAGGCGGGAGGUAUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUU
GCAAUUUUGGAUGACCUUCUGCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGC
UGAUCGUGAUUGGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUACAUUUUUG
UCGCGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGCGGGCCUAUUUCUUGCA
GACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUCUGAAGGGAGGUCGCCUAUCUUUAC
GCAUCUUGUGACCAGUUUGAAGGGAUUGUGGACGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCA
GCCCUACUUUGAAACACUGUUCCACAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGG
UUUUUGUAUUUGAGUACCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUU
GUGAUCUUCUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCACGGGAGAGGGC
GAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACUUUG
CAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUGUGGAUAGCCUGAUGAGGUCCGUUUCG
AGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACGGAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACG
AAACCCUAUAAGAAUGGGCAAUUGAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCAC
GUGAAGAAGGAUGACAUCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACCUG
ACGGCAAAAUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCA
UUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAGGAAAAUCGA
CGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUCUGAAUACAGAGGGUGAGAUCCAGAUCG
ACGGCGUUUCGUGGGAUAGCAUCACCUUGCAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAG
UAAUCCCCCAAAAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCC
UUAUGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCU
UCGGAGUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGAUGG
GGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUGGCGCGAUCCGUC
CUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGG
UAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGG
UGAUUCUCUGUGAGCAUCGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUG
UCAUCGAAGAGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGA
GAGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAACUUUUUCC
ACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUCGCGGCCUUGAAAGAA
GAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCUUUAA [SEQ Ш NO: 1]
Типовая кодон-оптимизированная мРНК люциферазы светляков (FFL): Дизайн конструкции: Xi - SEQ ID NO: 2 - Yi
AUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAG
ACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCC
CGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAG
UACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAU
ACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCG
UGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAA
CGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUG
AGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUA
CAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGU
ACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCC
CGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGU
ACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCA
GUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCU
CAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUG
AUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGC
GCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAG
CUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAG
AUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAAC
GCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGC
CAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUG
CCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUG
AACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUA
ACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGG
CGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAG
AGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCC
UGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGA
UGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACC
GAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUG
CGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUG
GACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCG
CCGUGUAA [SEQ Ш NO: 2]
Типовая кодон-оптимизированная мРНК человеческой аргининосукцинат-синтетазы (ASS1)
Дизайн конструкции: Xi - SEQ Ш NO: 3 - Y2
AUGAGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCU
GCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAA
CAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGC
GCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUCAUC
UGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCA
GCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGG
CGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCAAGGGCAACGACCAGGUGCGCUUC
GAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGCA
UGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAA
GCAGCACGGCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAG
AACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGG
CCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCAACACCCCC
GACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAGGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUG
AAGGACGGCACCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGG
UGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGCCGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGG
CAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUGUACCACGCC
CACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAGG
GCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGA
GUGCGAGUUCGUGCGCCACUGCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAG
GUGCAGGUGAGCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCUGGGCCGCGAGAGCCCCC
UGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUACGAGC
CCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACCA
CCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGA [SEQ Ш NO: 3]
5'- и З'-иТЯ-последователъности:
Xi =
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG UGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG [SEQ П) NO: 4]
Yi =
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCC ACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU [SEQ Ш NO: 5]
Y2=
GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCA CUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU [SEQ Ш NO: 6]
Синтез мРНК
[0127] В каждом из приведенных ниже примеров синтез мРНК проводили в
условиях, полностью свободных от РНКаз. Все пробирки, флаконы, наконечники пипеток, пипетки, буферы должны быть свободными от нуклеаз, если явно не указано иное.
[0128] В следующих примерах, если не указано иное, мРНК синтезировали с
помощью транскрипции in vitro из линеаризованной ДНК-матрицы. Для получения желаемой прекурсорной (ГУТ) конструкции мРНК смесь ~8 мкг линеаризованной ДНК, rNTPs (7,25 мМ), DTT (10 мМ), Т7 РНК полимеразы, ингибитора РНКазы, пирофосфатазы и реакционного буфера (10х, 800 мМ Hepes (рН 8,0), 20 мМ спермидина, 250 мМ MgCh, рН 7,7) готовили с использованием воды, свободной от РНКаз, в конечном объеме 180 мл. Реакционную смесь инкубировали при температуре 37°С в диапазоне времени между 20 минутами- 60 минутами. По завершении смесь обрабатывали ДНКазой I в течение дополнительных 15 минут и соответственно гасили.
Добавление 5 '-кэпа и 3 '-хвоста
[0129] Очищенный продукт мРНК из упомянутой ранее стадии ГУТ (и, возможно,
также исходной стадии TFF фильтрации) денатурировали при 65 °С в течение 10 минут. Отдельно части GTP (1,0 мМ), S-аденозил-метионина, ингибитора РНКазы, 2'-0-метилтрансферазы и гуанилилтрансферазы смешивали с реакционным буферном (10х, 500 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 60 мМКС1, 12,5 mMMgCb) до конечной концентрации 1,6 л. После денатурации мРНК охлаждали на льду и затем добавляли к реакционной смеси. Объединенный раствор инкубировали при температуре 37 °С в течение 20-90 минут. По завершении добавляли аликвоты АТР (2,0 мМ), ПолиА полимеразы и присоединяющего реакционного буфера (10х, 500 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 2,5М NaCl, ЮОмМ, MgCk) и всю реакционную смесь далее инкубировали при 37 °С в диапазоне времени от 20-45 минут.
По завершении полученную реакционную смесь гасили и соответствующим образом очищали.
Очистка мРНК
Осаждение мРНК
[0130] Матричная РНК может быть осаждена с использованием различных
способов. Например, использование хлорида лития, хлорида калия, гуанидин хлорида, гуанидин тиоцианата, гуанидин изотиоцианата, ацетата аммония и других солей дает возможность осадить мРНК из реакционной смеси.
Тангенциальная поточная фильтрация
[0131] В следующих примерах, если не указано иное, система тангенциальной
поточной фильтрации (ТПФ) состояла из фильтрующей мембраны и перистальтического насоса (система Спектрум) с тангенциальной циркуляцией жидкости вдоль мембраны со скоростью подачи ~ 130 мл/мин и скоростью потока 30 мл/мин для пермеата. ТПФ мембрана представляла собой MidiKros 500 кДа mPES 115 см2 (Spectrum Labs). Картридж фильтра промывали перед использованием свободной от нуклеаз водой и затем очищали с помощью 0,2 Н NaOH. В конце систему очищали свободной от нуклеазой водой до тех пор, пока рН пермеата и ретентата не достиглал рН ~ 6. Выделение мРНК с помощью ТПФ можно осуществить как показано на фигуре 1.
Очистка мРНК люциферазы светляков
[0132] В типовом примере очистки мРНК, партия 1 грамм мРНК люциферазы
светляков (FFL) транскрибируется с помощью способов in vitro для получения вышеупомянутой промежуточной конструкции без кэпа и без полиА хвоста. Для данной реакции поддерживали общий объем -180 мл и гасили после завершения добавлением ДНКазы I (~ 9,0 KU). Готовый раствор обрабатывали гомогенным раствором 4 М гуанидин тиоцианата, 0,5 % лаурилсаркозил натрия и 25 мМ цитрата натрия (1500 мл), доводя общий объем до 1,68 л. Полученную смесь выдерживали при комнатной
температуре в течение ~ 5 мин с последующей обработкой 1,1л абсолютным спиртом. мРНК медленно осаждали и суспензию выдерживали при комнатной температуре в течение ~ 5 мин. По завершении всю гетерогенную суспензию прокачивали через фильтрационную мембрану с использованием тангенциальной поточной фильтрации (ТПФ).
[0133] В данном примере использовались половолоконные мембраны из
модифицированного полиэфирсульфона (мПЭС) с площадью поверхности равной 2600 см2. Полученную гетерогенную смесь (после осаждения) прокачивали порциями через систему фильтрации со скорости потока 750 мл/мин в течение приблизительно 8 мин. По завершении полученный захваченный осадок промывали комбинированным раствором гуанидиновый буфер/этанол, затем 80 % этанолом (500 мл, 750 мл/мин) и повторяли множество раз (> 5х). После полной отмывки, твердую мРНК, распределенную вдоль мембраны, обрабатывали свободной от РНКазы водой (250 мл) и рециркулировали в течение 5-10 минут, чтобы обеспечить растворение. Данный процесс повторялся до окончательного восстановления мРНК. По завершению готовый раствор мРНК диализировали против 1 мМ цитрата натрия (рН 6,4) с использованием мембраны с НОММ 100 кДа для удаления остаточного этанола и получения конечного продукта мРНК в соответствующем растворе для хранения. Конечную концентрацию определяли путем измерения абсорбции при длине волны 260 нм Яшах). Чистоту матричной РНК определяли путем измерения УФ-абсорбции (соотношение 260/280), а также белковых гелей (окрашивание серебром, окрашивание SYPRO, Кумасси и т.д.). Целостность матричной РНК определяли с помощью гель-электрофореза, а также анализа продукции белка in vitro/in vivo.
Очистка MPHKASSI
[0134] В другом типовом примере очистки мРНК, партия 1 грамм мРНК ASS1
транскрибируется с помощью способов in vitro для получения вышеупомянутой промежуточной конструкции без кэпа и без полиА хвоста. Для данной реакции поддерживали общий объем -180 мл и гасили после завершения добавлением ДНКазы I (~ 9,0 KU). Готовый раствор обрабатывали гомогенным раствором 4 М гуанидин
тиоцианата, 0,5 % лаурилсаркозила натрия и 25 мМ цитрата натрия (1500 мл), доводя общий объем до 1,68 л. Полученную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение ~ 5 мин с последующей обработкой 1,1л абсолютным спиртом. Матричную РНК медленно осаждали и суспензию выдерживали при комнатной температуре в течение ~ 5 мин. По завершении всю гетерогенную суспензию прокачивали через фильтрационную мембрану с использованием тангенциальной поточной фильтрации (ТПФ) и выделяли, как описано выше.
Очистка мРНК CFTR
[0135] В третьем типовом примере очистки мРНК партия 1,5 грамм мРНК
модифицированного CFTR транскрибируется с помощью способов in vitro для получения вышеупомянутой промежуточной конструкции без кэпа и без полиА хвоста. Для данной реакции поддерживали общий объем ~ 270 мл и гасили после завершения добавлением ДНКазы I (~ 13,5 KU). Готовый раствор обрабатывали гомогенным раствором 4 М гуанидин тиоцианата, 0,5 % лаурилсаркозила натрия и 25 мМ цитрата натрия (1500 мл), доводя общий объем до 1,77 л. Полученную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение ~ 5 мин с последующей обработкой 1,1л абсолютным спиртом. мРНК медленно осаждали и суспензию выдерживали при комнатной температуре в течение ~ 5 мин. По завершении всю гетерогенную суспензию прокачивали через фильтрационную мембрану с использованием тангенциальной поточной фильтрации (ТПФ) и выделяли, как описано выше.
Пример 2. Анализ очищенной мРНК
Исследование на наличие ферментов в очищенной мРНК
Гели, окрашенные SYPRO
[0136] Стандартный гель, окрашенный SYPRO, готовили для определения наличия
каких-либо остаточных ферментных реагентов, присутствующих до и после очистки. Гели проводили при 200 В в течение 35 минут.
Гели, окрашенные серебром
[0137] Окрашивание серебром для всех партий и фракций мРНК осуществляли с
использованием SilverQuest(r) (Life Technologies, Кат. № LC6070), в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, образцы загружали (с и без обработки РНКазой) и контролировали путем сравнения с контрольными линиями загруженных ферментов. Гели проводили при 200 В в течение 35 минут. Экспозиция проводилась в течение 8 минут.
Оценка целостности мРНК с помощью методов электрофореза в агарозном геле
[0138] Если не указано иное, размер и целостность мРНК оценивали с помощью
гель-электрофореза. Применяли либо самостоятельно приготовленный 1,0 % агарозный гель, либо готовый 1,2 % агарозный гель Invitrogen E-Gel. В каждую лунку загружали матричную РНК в количестве 1,0-1,5 мкг. По завершению компоненты спектра мРНК визуализировали с использованием бромистого этидия.
Анализ целостности мРНК in vitro
[0139] Если не указано иное, трансфекциюш vitro мРНК люциферазы светляков
(FFL), мРНК аргининосукцинат-синтетазы (ASS1) и мРНК CFTR проводили с использованием клеток НЕК293Т. Один микрограмм каждой конструкции мРНК трансфицировали в отдельных лунках с использованием липофектамина. Клетки собирали в определенные моменты времени (например, 4 часа, 8 часов и т.д.) и соответственную продукция белков анализировали. Для мРНК FFL клеточные лизаты анализировали на продукцию люциферазы с помощью анализа биолюминесценции. Для мРНК ASS1 клеточные лизаты анализировали на продукцию ASS1 с помощью анализа ELISA. Для мРНК CFTR клеточные лизаты анализировали на продукцию CFTR с помощью Вестерн-блоттинга.
Анализ люциферазы
[0140] Исследование биолюминесценции проводили с использованием Promega
Luciferase Assay System (Кат. № El 500). Реагент Luciferase Assay Reagent готовили путем добавления 10 мл буфера Luciferase Assay Buffer к субстрату Luciferase Assay Substrate и перемешивали с помощью вортекса. По 20 мкл образцов гомогената наносили на 96
луночный планшет с последующим добавлением 20 мкл контроля к каждому образцу. Отдельно 120 мкл реагента Luciferase Assay Reagent (полученного как описано выше) загружали в каждую лунку 96-луночного планшета с плоским дном. Каждый планшет помещали в соответствующие камеры прибора Molecular Device Flex Station и люминесценцию измеряли в относительных единицах люминесценции (ОЕЛ).
Анализ ELISA ASS1
[0141] После стандартных процедур ELISA использовали мышиный анти-ASSl
2D1-2E12 IgGB качестве захватывающего антитела с кроличьим анти-ASSl №3285 IgGB качестве вторичного (определяющего) антитела (Shire Human Genetic Therapies). Козьи антитела к IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), использовали для активации раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидинового (ТМВ) субстрата. Реакцию гасили с помощью 2N H2SO4 через 20 минут. Детектирование контролировали путем абсорбции (450 нм) на приборе Molecular Device SpectraMax. Необработанную сыворотку и органы мыши, и человеческий белок ASS1 использовали в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно.
Вестерн-блоттинг CFTR
[0142] Вестерн-блоттинг проводили на белковых образцах, полученных с
использованием способов иммунопреципитации (Dynabeads G). В целом, клетки или гомогенаты ткани обрабатывали Dynabead G, предварительно связанного с антителом к человеческому CFTR (R &D Systems, МАВ25031). Определение человеческого белка CFTR осуществляли с использованием АЬ570.
Пример 3. Результаты очистки
[0143] Данный пример демонстрирует, что мРНК люциферазы светляков (FFL),
мРНК аргининосукцинат-синтетазы (ASS1) и мРНК муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) были успешно очищены с использованием осаждения с последующей тангенциальной поточной фильтрацией с удалением ферментных реагентов,
а также укороченных последовательностей. Многие типовые хаотропные условия были успешно использованы для осаждения мРНК, как указано выше.
[0144] Чтобы продемонстрировать этот успех, крупномасштабную продукцию (~1
грамм) реакционную смесь IVT мРНК модифицированного CFTR подвергали воздействию 4 М раствора гуанидинового буфера (описанного выше). Затем, полученную смесь обрабатывали абсолютным спиртом и инкубировали в течение пяти минут при комнатной температуре. Выделение осажденной мРНК проводили с помощью ТПФ, как описано выше. На фигуре 2 представлен окрашенный серебром белковый гель, который показывает конечную мРНК, выделенную после ТПФ с использованием указанных выше условий. По завершении на геле не обнаруживаются ферменты (Т7 полимераза, ДНКаза I, пирофосфатаза, ингибитор РНКазы). Дорожки 1-3 содержали модифицированный CFTR после элюирования 1 (Е1), элюирования 2 (Е2) и элюирования 3 (ЕЗ). Дорожки 4-7 содержали контрольные ферменты, присутствующие в IVT реакции. На фигуре 3 представлен окрашенный серебром белковый гель, который демонстрирует чистую мРНК, полученную после осаждения более высокого масштаба (1,5 грамм партия) и процесса фильтрации без остаточных ферментов. Дорожки 1-6 содержали мРНК после элюирования 1-6. Дорожки 7-10 содержали контрольные ферменты, присутствующие в IVT реакции (Т7 полимераза, ДНКаза I, ингибитор РНКазы и пирофосфотаза). На фигуре 4 показано, что мРНК модифицированного CFTR является полностью неповрежденной после такой очистки. Фигура показывает результаты электрофореза мРНК модифицированного CFTR в агарозном (1.0 %) геле после очистки с помощью осаждения и фильтрации. Дорожка 1 содержала маркер RiboRuler HR. Дорожки 2-7 содержали мРНК модифицированного CFTR, очищенную с помощью фильтрации после осаждения.
[0145] Данный процесс является широко применяемым ко множеству различных
конструкций мРНК. Например, вторая конструкция мРНК была синтезирована и очищена с использованием данного метода. В данном случае мРНК аргининосукцинат-синтетазы (ASS1) получали и осаждали с помощью способов, описанных выше. Твердый осадок загружали в систему ТПФ и выделяли согласно описанному процессу. На фигуре 5 представлен анализ геля, окрашенного серебром, конечной выделенной мРНК ASS1, показывающий отсутствие остаточных ферментов (Т7 полимераза, ДНКаза I, ингибитор
РНКазы, пирофосфатаза). Дорожки 1-5 содержали мРНК после элюирования 1-5. Дорожки 6-9 содержали контрольные ферменты, присутствующие в реакции IVT. Дорожка 10 содержала РНКазу А в качестве контроля, поскольку образцы мРНК предварительно обрабатывали РНКазой А перед загрузкой. Фигура 5 демонстрирует отсутствие каких-либо ферментов после интенсивного воздействия на развитие окрашивания серебром. Это было дополнительно подтверждено с помощью окрашивания SYPRO для остаточных ферментов, как показано на фигуре 6. С помощью этого способа можно еще раз продемонстрировать чистоту мРНК ASS1, выделенную с помощью данного процесса. Дорожки 1-5 содержали мРНК после элюирования 1-5. Дорожки 6-9 содержали контрольные ферменты, присутствующие в реакции IVT. В дополнение к этому, гель-электрофорез РНК показал, что сохранилась целостность мРНК ASS1, полноразмерной полностью неповрежденной мРНК ASS1, после данного процесса (фигура 7). На фигуре 7 дорожка 1 содержала маркер RiboRuler HR и дорожки 2-6 содержали мРНК ASS1 после элюирования 1-5.
[0146] Для дальнейшей демонстрации того, что данный метод очистки широко
применяется ко множеству различных конструкций мРНК, мРНК FFL была синтезирована и очищена с использованием данного способа. мРНК осаждали с использованием буферной системы 4 М гуанидина и фильтровали. На фигуре 8 представлен анализ геля, окрашенного серебром, конечной выделенной мРНК FFL, показывающий отсутствие остаточных ферментов. Дорожки 1-4 содержали мРНК FFL, очищенную с помощью одного осаждения (XL1) или двойного осаждения (XL2), с дорожками 2-4, содержащими различные элюирования второго осаждения. Дорожки 6-9 содержали контрольные ферменты, присутствующие в реакции IVT. Фигура 8 демонстрирует отсутствие каких-либо ферментов после интенсивного воздействия на развитие окрашивания серебром. Кроме того, можно увидеть, что одно осаждение является достаточным для удаления всех нежелательных остаточных ферментов. Это было дополнительно подтверждено с помощью окрашивания SYPRO для остаточных ферментов, как показано на фигуре 9. С помощью данного способа можно еще раз продемонстрировать чистоту мРНК FFL, выделенной с помощью данного процесса. На фигуре 9 дорожки 1 -4 содержали мРНК FFL, очищенную с помощью одного осаждения (XL1) или двойного осаждения (XL2), с
дорожками 2-4, содержащими различные элюирования второго осаждения. Дорожки 6-9 содержали контрольные ферменты, присутствующие в реакции ГУТ. В дополнение к этому, гель-электрофорез РНК показал, что сохранилась целостность мРНК FFL, полноразмерной полностью неповрежденной мРНК FFL, после данного процесса (фигура 10). Кроме того, мРНК не отличается после множественного повторного осаждения. На фигуре 10 дорожка 1 содержала маркер RiboRuler HR, и дорожки 2-5 содержали мРНК FFL, очищенную с помощью одного осаждения (XL1) или двойного осаждения (XL2).
[0147] При последующем получении из данной выделенной мРНК конечного
продукта, имеющего кэп и хвост, в дальнейшем использовались способы ТПФ для очистки конечной целевой мРНК. Фигура 11 демонстрирует, что осаждение с последующим захватом и элюированием с использованием тангенциальной поточной фильтрации привело к успешному получению чистого конечного продукта мРНК. На фигуре 11 дорожки 1-3 содержали мРНК ASS1 из реакции добавления кэпа/хвоста с помощью одного осаждения (Е1-3 = элюирование 1-3). Дорожки 4-6 содержали ключевые контрольные ферменты, присутствующие на обоих стадиях реакции. Дорожка 7 содержала РНКазу I в качестве контроля, поскольку образцы мРНК предварительно обрабатывали РНКазой I перед загрузкой. В дополнение к этому, гель-электрофорез РНК показал, что сохранилась целостность мРНК FFL, полноразмерной полностью неповрежденной мРНК FFL после данного процесса (фигура 12). На фигуре 12 дорожки 13 содержали мРНК ASS1 с кэпом и хвостом.
[0148] Хотя такая характеристика дает информацию относительно чистоты и
размера/целостности мРНК, истинной мерой качества мРНК является ее способность продуцировать желаемый белок. Таким образом, было проведено сравнение каждой выделенной конструкции мРНК FFL (ТПФ к спин-колонкам). Каждую из трех перечисленных ниже конструкций трансфицировали в клетки НЕК293Т, и соответствующую продукцию белка FFL оценивали с помощью белковой активности FFL в виде FFL люминесценции при воздействии на люциферин (yida supra). Клетки собирали через 24 часа после трансфекции.
Конструкции FFL
1. мРНК FFL, приобретенная у внешнего поставщика
2. мРНК FFL, очищенная с помощью коммерческого набора
3. мРНК FFL, очищенная с помощью способа осаждения-ТПФ
[0149] Сравнение результатов люминесценции белка FFL, полученного из каждого
источника, представлено на фигуре 13. Целостность ТПФ-очищенной мРНК FFL поддерживалась на протяжении процесса осаждения и тангенциальной поточной фильтрации в описанных условиях.
[0150] Кроме того, успешное детектирование человеческого белка CFTR было
достигнуто от трансфекции мРНК hCFTR, выделенной с помощью вышеупомянутого процесса. На фигуре 14 показана успешная продукция человеческого белка CFTR после трансфекции мРНК hCFTR, очищенной с помощью либо коммерческих наборов, либо вышеупомянутого способа осаждения на основе ТПФ. Визуализация данного "С-диапазона" для CFTR белка, что свидетельствует о полном размере, правильности сборки белка CFTR, подтверждает полную целостность и активный характер выделенной мРНК с помощью данных условий. В дальнейшем данный процесс легко масштабируется. Например, отдельная конструкция мРНК в масштабе 5 грамм была синтезирована и очищена с использованием данного способа. В данном случае мРНК аргининосукцинат-синтетазы (ASS1) получали и осаждали с помощью способов, описанных выше. Твердый осадок загружали в систему ТПФ и выделяли согласно описанному процессу.
[0151] Целостность изготовленного лекарственного вещества на основе мРНК была
продемонстрирована с использованием двух отдельных способов. Фигура 15 иллюстрирует длину типовой мРНК в образце транскрипции in vitro (IVT) мРНК аргининосукцинат-синтетазы (ASS1), очищенной и отфильтрованной в соответствии с предложенными способами. Длина мРНК была продемонстрирована с помощью электрофореза в агарозном геле на чипе. Невредимость и полноразмерность мРНК была подтверждена с помощью гель-электрофореза (фигура 16) как для ГУТ предшественника, так и для конечной конструкции с кэпом и хвостом. Целостность мРНК ASS1 сохранялась в полной мере после крупномасштабного (5G) осаждения.
[0152] Как было показано ранее, фигура 17 демонстрирует, что осаждение с
последующим захватом и элюированием с использованием тангенциальной поточной фильтрации привело к успешному получению чистого конечного продукта мРНК. Дорожка 1 содержала мРНК ASS1 из реакции добавления кэпа/хвоста, очищенную с помощью одного осаждения. Дорожки 2-8 содержали ключевые контрольные ферменты, присутствующие на обоих стадиях реакции. Дорожка 9 содержала РНКазу I в качестве контроля, поскольку образцы мРНК предварительно обрабатывали РНКазой I перед загрузкой. Такой способ окрашивания серебром демонстрирует отсутствие остаточных ферментов.
[0153] Хотя такая характеристика дает информацию относительно чистоты и
размера/целостности мРНК, истинной мерой качества мРНК является ее способность продуцировать желаемый белок. Таким образом, было проведено сравнение выделенной конструкции мРНК ASS1 (ТПФ к спин-колонкам) (фигура 18). Каждую из перечисленных ниже конструкций трансфицировали в клетки НЕК293Т, и соответствующую продукцию белка ASS1 оценивали с помощью методов ELISA. Клетки собирали через ~18 часов после трансфекции.
[0154] Еще одна демонстрация возможности масштабирования была получена
путем синтеза и очистки мРНК CFTR в масштабе 10 грамм с использованием данного способа. В данном случае мРНК муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (CFTR) получали и осаждали с использованием способов, описанных выше. Твердый осадок загружали в систему ТПФ и выделяли согласно описанному процессу. Целостность изготовленного лекарственного вещества на основе мРНК была продемонстрирована с использованием электрофореза в агарозном геле. Невредимость и полноразмерность мРНК была подтверждена (фигура 19) как для IVT предшественника, так и для конечной конструкции с кэпом и хвостом. Целостность мРНК CFTR сохранялась в полной мере после крупномасштабного (10G) осаждения.
[0155] И вновь, чистота производимого продукта в масштабе 10 грамм была
продемонстрирована с помощью окрашивания серебром, как показано на фигуре 20. Дорожка 1 содержит мРНК CFTR из реакции добавления кэпа/хвоста, очищенную с помощью одного осаждения. Дорожки 2-8 содержали ключевые контрольные ферменты,
присутствующие на обоих стадиях реакции. Дорожка 9 содержала РНКазу I в качестве контроля, поскольку образцы мРНК предварительно обрабатывали РНКазой I перед загрузкой. Такой способ окрашивания серебром демонстрирует отсутствие остаточных ферментов.
[0156] Как описано выше, такая характеристика дает информацию относительно
чистоты и размера/целостности мРНК, однако, истинной мерой качества мРНК является ее способность продуцировать желаемый белок. Следовательно, различные количества мРНК CFTR трансфицировали в клетки НЕК293Т и соответствующую продукцию белка CFTR оценивали с помощью методов Вестерн-блоттинга (фигура 21). Клетки собирали через ~18 часов после трансфекции.
[0157] В другом варианте реализации изобретения еще одна демонстрация
возможности масштабирования была получена путем синтеза и очистки мРНК ASS1 в масштабе 25 грамм с использованием данного способа. В данном случае мРНК аргининосукцинат-синтетазы (ASS1) получали и осаждали с помощью способов, описанных выше. Твердый осадок загружали в систему ТПФ и выделяли согласно описанному процессу. Целостность изготовленного лекарственного вещества на основе мРНК была продемонстрирована с использованием электрофореза в агарозном геле. Невредимость и полноразмерность мРНК была подтверждена (фигура 22) для мРНК ASS1 после крупномасштабного (25G) осаждения.
ЭКВИВАЛЕНТЫ И ОБЪЕМ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0158] Специалисты в данной области техники поймут или будут в состоянии
определить множество эквивалентов конкретных вариантов реализации изобретения, описанных в данном документе, с применением не более чем обыкновенных экспериментов. Объем настоящего изобретения не предназначен для того, чтобы ограничиваться приведенным выше описанием, а скорее является таким, который изложен в следующей формуле изобретения:
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Shire Human Genetic Therapies, Inc.
<12 0> СПОСОБЫ ОЧИСТКИ МАТРИЧНОЙ РНК
<130> 2006685-0881
<150> 61/984503 <151> 2014-04-25
<160> 6
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 4443
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полинуклеотид
<400> 1
augcagcggu ccccgcucga aaaggccagu gucgugucca aacucuucuu cucauggacu 60
cggccuaucc uuagaaaggg guaucggcag aggcuugagu ugucugacau cuaccagauc 120
cccucgguag auucggcgga uaaccucucg gagaagcucg aacgggaaug ggaccgcgaa 180
cucgcgucua agaaaaaccc gaagcucauc aacgcacuga gaaggugcuu cuucuggcgg 240
uucauguucu acgguaucuu cuuguaucuc ggggagguca caaaagcagu ccaaccccug 300
uuguuggguc gcauuaucgc cucguacgac cccgauaaca aagaagaacg gagcaucgcg 360
aucuaccucg ggaucggacu guguuugcuu uucaucguca gaacacuuuu guugcaucca 420
gcaaucuucg gccuccauca caucgguaug cagaugcgaa ucgcuauguu uagcuugauc 480
uacaaaaaga cacugaaacu cucgucgcgg guguuggaua agauuuccau cggucaguug 540
gugucccugc uuaguaauaa ccucaacaaa uucgaugagg gacuggcgcu ggcacauuuc 600
guguggauug ccccguugca agucgcccuu uugaugggcc uuauuuggga gcuguugcag 660
gcaucugccu uuuguggccu gggauuucug auuguguugg cauuguuuca ggcugggcuu 720
gggcggauga ugaugaagua ucgcgaccag agagcgggua aaaucucgga aagacucguc 780
aucacuucgg aaaugaucga aaacauccag ucggucaaag ccuauugcug ggaagaagcu 840
auggagaaga ugauugaaaa ccuccgccaa acugagcuga aacugacccg caaggcggcg 900
uauguccggu auuucaauuc gucagcguuc uucuuuuccg gguucuucgu ugucuuucuc 960
ucgguuuugc cuuaugccuu gauuaagggg auuauccucc gcaagauuuu caccacgauu 1020
ucguucugca uuguauugcg cauggcagug acacggcaau uuccgugggc cgugcagaca 1080
ugguaugacu cgcuuggagc gaucaacaaa auccaagacu ucuugcaaaa gcaagaguac 1140
aagacccugg aguacaaucu uacuacuacg gagguaguaa uggagaaugu gacggcuuuu 1200
ugggaagagg guuuuggaga acuguuugag aaagcaaagc agaauaacaa caaccgcaag 1260
accucaaaug gggacgauuc ccuguuuuuc ucgaacuucu cccugcucgg aacacccgug 1320
uugaaggaca ucaauuucaa gauugagagg ggacagcuuc ucgcgguagc gggaagcacu 1380
ggugcgggaa aaacuagccu cuugauggug auuauggggg agcuugagcc cagcgagggg 1440
aagauuaaac acuccgggcg uaucucauuc uguagccagu uuucauggau caugcccgga 1500
accauuaaag agaacaucau uuucggagua uccuaugaug aguaccgaua cagaucgguc 1560
auuaaggcgu gccaguugga agaggacauu ucuaaguucg ccgagaagga uaacaucguc 1620
uugggagaag gggguauuac auugucggga gggcagcgag cgcggaucag ccucgcgaga 1680
gcgguauaca aagaugcaga uuuguaucug cuugauucac cguuuggaua ccucgacgua 1740
uugacagaaa aagaaaucuu cgagucgugc guguguaaac uuauggcuaa uaagacgaga 1800
auccugguga caucaaaaau ggaacaccuu aagaaggcgg acaagauccu gauccuccac 1860
gaaggaucgu ccuacuuuua cggcacuuuc ucagaguugc aaaacuugca gccggacuuc 1920
ucaagcaaac ucauggggug ugacucauuc gaccaguuca gcgcggaacg gcggaacucg 1980
aucuugacgg aaacgcugca ccgauucucg cuugagggug augccccggu aucguggacc 2040
gagacaaaga agcagucguu uaagcagaca ggagaauuug gugagaaaag aaagaacagu 2100
aucuugaauc cuauuaacuc aauucgcaag uucucaaucg uccagaaaac uccacugcag 2160
augaauggaa uugaagagga uucggacgaa ccccuggagc gcaggcuuag ccucgugccg 2220
gauucagagc aaggggaggc cauucuuccc cggauuucgg ugauuucaac cggaccuaca 2280
cuucaggcga ggcgaaggca auccgugcuc aaccucauga cgcauucggu aaaccagggg 2340
caaaacauuc accgcaaaac gacggccuca acgagaaaag ugucacuugc accccaggcg 2400
aauuugacug aacucgacau cuacagccgu aggcuuucgc aagaaaccgg acuugagauc 2460
agcgaagaaa ucaaugaaga agauuugaaa gaguguuucu uugaugacau ggaaucaauc 2520
ccagcgguga caacguggaa cacauacuug cguuacauca cggugcacaa guccuugauu 2580
uucguccuca ucuggugucu cgugaucuuu cucgcugagg ucgcagcguc acuugugguc 2640
cucuggcugc uugguaauac gcccuugcaa gacaaaggca auucuacaca cucaagaaac 2700
aauuccuaug ccgugauuau cacuucuaca agcucguauu acguguuuua caucuacgua 2760
ggaguggccg acacucugcu cgcgaugggu uucuuccgag gacucccacu cguucacacg 2820
cuuaucacug ucuccaagau ucuccaccau aagaugcuuc auagcguacu gcaggcuccc 2880
auguccaccu ugaauacgcu caaggcggga gguauuuuga aucgcuucuc aaaagauauu 2940
gcaauuuugg augaccuucu gccccugacg aucuucgacu ucauccaguu guugcugauc 3000
gugauugggg cuauugcagu agucgcuguc cuccagccuu acauuuuugu cgcgaccguu 3060
ccggugaucg uggcguuuau caugcugcgg gccuauuucu ugcagacguc acagcagcuu 3120
aagcaacugg agucugaagg gaggucgccu aucuuuacgc aucuugugac caguuugaag 3180
ggauugugga cguugcgcgc cuuuggcagg cagcccuacu uugaaacacu guuccacaaa 3240
gcgcugaauc uccauacggc aaauugguuu uuguauuuga guacccuccg augguuucag 3300
augcgcauug agaugauuuu ugugaucuuc uuuaucgcgg ugacuuuuau cuccaucuug 3360
accacgggag agggcgaggg acgggucggu auuauccuga cacucgccau gaacauuaug 3420
agcacuuugc agugggcagu gaacagcucg auugaugugg auagccugau gagguccguu 3480
ucgagggucu uuaaguucau cgacaugccg acggagggaa agcccacaaa aaguacgaaa 3540
cccuauaaga augggcaauu gaguaaggua augaucaucg agaacaguca cgugaagaag 3600
gaugacaucu ggccuagcgg gggucagaug accgugaagg accugacggc aaaauacacc 3660
gagggaggga acgcaauccu ugaaaacauc ucguucagca uuagccccgg ucagcgugug 3720
ggguugcucg ggaggaccgg gucaggaaaa ucgacguugc ugucggccuu cuugagacuu 3780
cugaauacag agggugagau ccagaucgac ggcguuucgu gggauagcau caccuugcag 3840
caguggcgga aagcguuugg aguaaucccc caaaaggucu uuaucuuuag cggaaccuuc 3900
cgaaagaauc ucgauccuua ugaacagugg ucagaucaag agauuuggaa agucgcggac 3960
gagguuggcc uucggagugu aaucgagcag uuuccgggaa aacucgacuu uguccuugua 4020
gaugggggau gcguccuguc gcaugggcac aagcagcuca ugugccuggc gcgauccguc 4080
cucucuaaag cgaaaauucu ucucuuggau gaaccuucgg cccaucugga cccgguaacg 4140
uaucagauca ucagaaggac acuuaagcag gcguuugccg acugcacggu gauucucugu 4200
gagcaucgua ucgaggccau gcucgaaugc cagcaauuuc uugucaucga agagaauaag 4260
guccgccagu acgacuccau ccagaagcug cuuaaugaga gaucauuguu ccggcaggcg 4320
auuucaccau ccgauagggu gaaacuuuuu ccacacagaa auucgucgaa gugcaagucc 4380
aaaccgcaga ucgcggccuu gaaagaagag acugaagaag aaguucaaga cacgcgucuu 4440
uaa 4443
<210> 2 <211> 1653 <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полинуклеотид
<400> 2
auggaagaug ccaaaaacau uaagaagggc ccagcgccau ucuacccacu cgaagacggg 60
accgccggcg agcagcugca caaagccaug aagcgcuacg cccuggugcc cggcaccauc 120
gccuuuaccg acgcacauau cgagguggac auuaccuacg ccgaguacuu cgagaugagc 180
guucggcugg cagaagcuau gaagcgcuau gggcugaaua caaaccaucg gaucguggug 240
ugcagcgaga auagcuugca guucuucaug cccguguugg gugcccuguu caucggugug 300
gcuguggccc cagcuaacga caucuacaac gagcgcgagc ugcugaacag caugggcauc 360
agccagccca ccgucguauu cgugagcaag aaagggcugc aaaagauccu caacgugcaa 420
aagaagcuac cgaucauaca aaagaucauc aucauggaua gcaagaccga cuaccagggc 480
uuccaaagca uguacaccuu cgugacuucc cauuugccac ccggcuucaa cgaguacgac 540
uucgugcccg agagcuucga ccgggacaaa accaucgccc ugaucaugaa caguaguggc 600
aguaccggau ugcccaaggg cguagcccua ccgcaccgca ccgcuugugu ccgauucagu 660
caugcccgcg accccaucuu cggcaaccag aucauccccg acaccgcuau ccucagcgug 720
gugccauuuc accacggcuu cggcauguuc accacgcugg gcuacuugau cugcggcuuu 780
cgggucgugc ucauguaccg cuucgaggag gagcuauucu ugcgcagcuu gcaagacuau 840
aagauucaau cugcccugcu ggugcccaca cuauuuagcu ucuucgcuaa gagcacucuc 900
aucgacaagu acgaccuaag caacuugcac gagaucgcca gcggcggggc gccgcucagc 960
aaggagguag gugaggccgu ggccaaacgc uuccaccuac caggcauccg ccagggcuac 1020
ggccugacag aaacaaccag cgccauucug aucacccccg aaggggacga caagccuggc 1080
gcaguaggca agguggugcc cuucuucgag gcuaaggugg uggacuugga caccgguaag 1140
acacugggug ugaaccagcg cggcgagcug ugcguccgug gccccaugau caugagcggc 1200
uacguuaaca accccgaggc uacaaacgcu cucaucgaca aggacggcug gcugcacagc 1260
ggcgacaucg ccuacuggga cgaggacgag cacuucuuca ucguggaccg gcugaagagc 1320
cugaucaaau acaagggcua ccagguagcc ccagccgaac uggagagcau ccugcugcaa 1380
caccccaaca ucuucgacgc cggggucgcc ggccugcccg acgacgaugc cggcgagcug 1440
cccgccgcag ucgucgugcu ggaacacggu aaaaccauga ccgagaagga gaucguggac 1500
uauguggcca gccagguuac aaccgccaag aagcugcgcg gugguguugu guucguggac 1560
gaggugccua aaggacugac cggcaaguug gacgcccgca agauccgcga gauucucauu 1620
aaggccaaga agggcggcaa gaucgccgug uaa 1653
<210> 3 <211> 1239 <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полинуклеотид
<400> 3
augagcagca agggcagcgu ggugcuggcc uacagcggcg gccuggacac cagcugcauc 60
cugguguggc ugaaggagca gggcuacgac gugaucgccu accuggccaa caucggccag 120
aaggaggacu ucgaggaggc ccgcaagaag gcccugaagc ugggcgccaa gaagguguuc 180
aucgaggacg ugagccgcga guucguggag gaguucaucu ggcccgccau ccagagcagc 240
gcccuguacg aggaccgcua ccugcugggc accagccugg cccgccccug caucgcccgc 300
aagcaggugg agaucgccca gcgcgagggc gccaaguacg ugagccacgg cgccaccggc 360
aagggcaacg accaggugcg cuucgagcug agcugcuaca gccuggcccc ccagaucaag 420
gugaucgccc ccuggcgcau gcccgaguuc uacaaccgcu ucaagggccg caacgaccug 480
auggaguacg ccaagcagca cggcaucccc auccccguga cccccaagaa ccccuggagc 540
auggacgaga accugaugca caucagcuac gaggccggca uccuggagaa ccccaagaac 600
caggcccccc ccggccugua caccaagacc caggaccccg ccaaggcccc caacaccccc 660
gacauccugg agaucgaguu caagaagggc gugcccguga aggugaccaa cgugaaggac 720
ggcaccaccc accagaccag ccuggagcug uucauguacc ugaacgaggu ggccggcaag 780
cacggcgugg gccgcaucga caucguggag aaccgcuuca ucggcaugaa gagccgcggc 840
aucuacgaga cccccgccgg caccauccug uaccacgccc accuggacau cgaggccuuc 900
accauggacc gcgaggugcg caagaucaag cagggccugg gccugaaguu cgccgagcug 960
guguacaccg gcuucuggca cagccccgag ugcgaguucg ugcgccacug caucgccaag 1020
agccaggagc gcguggaggg caaggugcag gugagcgugc ugaagggcca gguguacauc 1080
cugggccgcg agagcccccu gagccuguac aacgaggagc uggugagcau gaacgugcag 1140
ggcgacuacg agcccaccga cgccaccggc uucaucaaca ucaacagccu gcgccugaag 1200
gaguaccacc gccugcagag caaggugacc gccaaguga 1239
<210> 4 <211> 140 <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полинуклеотид
<400> 4
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg 140
<210> 5
<211> 105
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полинуклеотид
<400> 5
cggguggcau cccugugacc ccuccccagu gccucuccug gcccuggaag uugccacucc
agugcccacc agccuugucc uaauaaaauu aaguugcauc aagcu
105
<210> <211> <212>
105 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полинуклеотид
<400> 6
ggguggcauc ccugugaccc cuccccagug ccucuccugg cccuggaagu ugccacucca
gugcccacca gccuuguccu aauaaaauua aguugcauca aagcu
105
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ очистки матричной РНК (мРНК), включающий
(а) осаждение мРНК из неочищенного препарата; и
(б) подвергание неочищенного препарата, содержащего осажденную мРНК,
способу очистки с участием мембранной фильтрации таким образом, что осажденная
мРНК захватывается мембраной; и
(в) элюирование захваченной осажденной мРНК из мембраны путем повторной
солюбилизации мРНК, что приводит к получению очищенного раствора мРНК.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс очистки с участием мембранной фильтрации представляет собой тангенциальную поточную фильтрацию.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс очистки с участием мембранной фильтрации представляет собой прямоточную фильтрацию.
4. Способ по пп. 1, 2 или 3, отличающийся тем, что стадия осаждения мРНК включает обработку неочищенного препарата раствором, содержащим реагент, выбранный из группы, состоящей из хлорида лития, хлорида калия, гуанидин хлорида, гуанидин тиоцианата, гуанидин изотиоцианата, ацетата аммония и их комбинаций.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что реагент представляет собой гуанидин тиоцианат.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что раствор содержит 4 М гуанидин тиоцианата, 0,5% лаурилсаркозила натрия и 25 мМ цитрата натрия.
7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что раствор содержит 4 М гуанидин тиоцианата и 0,5 % лаурилсаркозила натрия.
8. Способ по п. 5, отличающийся тем, что раствор содержит 4 М гуанидин тиоцианата и мМ цитрата натрия.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия
осаждения мРНК дополнительно включает стадию обработки неочищенного препарата
абсолютным спиртом.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что мембрана, выбрана из группы, состоящей из полиэфирсульфона (мПЭС) (не модифицированный), полиэфирсульфоновой (мПЭС) половолоконной мембраны, поливинилиденфторида (ПВДФ), ацетата целлюлозы, нитроцеллюлозы, СЭЦ (смешанные сложные эфиры целлюлозы), сверхвысокомолекулярного полиэтилена высокой плотности (СВМПЭ), политетрафторэтилена (ПТФЭ), нейлона и их комбинаций.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что способ дополнительно включает отмывание захваченной осажденной мРНК перед элюированием.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что стадия отмывания включает множество промывочных циклов с использованием отмывающего раствора, содержащего гуанидиновый буфер и этанол, с последующим использованием этанола в концентрации около 70-80 %.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что множество промывочных циклов составляет более чем 5 циклов.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия элюирования включает повторную солюбилизацию захваченной осажденной мРНК свободной от РНКазы водой.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что свободная от РНКазы вода рециркулирует в течение 5-10 минут.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что способ далее включает стадию диализа раствора очищенной мРНК.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что очищенный раствор мРНК диализируют против 1 мМ цитрата натрия с использованием мембраны с номинальным отсечением по молекулярной массе (НОММ) 100 кДа.
10.
18. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что мРНК синтезируют in vitro, а неочищенный препарат содержит смесь для реакции синтеза мРНК in vitro.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что неочищенный препарат содержит незрелые последовательности РНК и/или ферментные реагенты, используемые для синтеза in vitro.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что очищенный раствор мРНК содержит менее чем 1 % незрелых последовательностей РНК и/или ферментных реагентов, используемых для синтеза in vitro.
21. Способ по п. 19, отличающийся тем, что очищенный раствор мРНК содержит менее чем 0,5 % незрелых последовательностей РНК и/или ферментных реагентов, используемых для синтеза in vitro.
22. Способ по п. 19, отличающийся тем, что очищенный раствор мРНК содержит менее чем 0,1 % незрелых последовательностей РНК и/или ферментных реагентов, используемых для синтеза in vitro.
23. Способ по п. 19, отличающийся тем, что очищенный раствор мРНК является по существу свободным от незрелых последовательностей РНК и/или ферментных реагентов, используемых для синтеза in vitro.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что незрелые последовательности РНК и/или ферментные реагенты, используемые для синтеза in vitro определяют с помощью окрашивания серебром, гель-электрофореза, ВЭЖХ, СВЭЖХ и/или капиллярного электрофореза.
25. Способ по любому из пп. 19-24, отличающийся тем, что незрелые последовательности РНК содержат менее чем 15 оснований.
26. Способ по любому из пп. 19-24, отличающийся тем, что незрелые последовательности РНК содержат около 8-12 оснований.
27. Способ по любому из пп. 19-24, отличающийся тем, что ферментные реагенты, используемые для синтеза in vitro, содержат Т7 РНК-полимеразу, ДНКазу I, пирофосфатазу и/или ингибитор РНКазы.
10.
28. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что мРНК очищают в масштабе равном или более чем 1 грамм, 10 грамм, 100 грамм, 1 кг, 10 кг, 100 кг на партию.
29. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что мРНК очищают перед добавлением кэпа и хвоста к мРНК.
30. Способ по любому из пп. 1-28, отличающийся тем, мРНК очищают после добавления кэпа и хвоста к мРНК.
31. Способ по любому из пп. 1-28, отличающийся тем, мРНК очищают после добавления кэпа.
32. Способ по любому из пп. 1-28, отличающийся тем, мРНК очищают как перед, так и после добавления кэпа и/или хвоста к мРНК.
33. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что мРНК имеет длину, равную или более чем около 1 кб, 1,5 кб, 2 кб, 2,5 кб, 3 кб, 3,5 кб, 4 кб, 4,5 кб, 5 кб, 6 кб, 7 кб, 8 кб, 9 кб, 10 кб, 11 кб, 12 кб, 13 кб, 14 кб, 15 кб или 20 кб.
34. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что мРНК содержит одну или более модификаций с целью повышения стабильности.
35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что одна или более модификаций включают модифицированный нуклеотид и/или модифицированные сахарофосфатные остовы.
36. Способ по любому из пп. 1-33, отличающийся тем, мРНК является немодифицированной.
37. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что очищенная мРНК имеет целостность равную или более чем 95 %.
38. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что очищенная мРНК имеет целостность равную или более чем 98 %.
39. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что очищенная мРНК имеет целостность равную или более чем 99 %.
40. Способ очистки матричной РНК (мРНК), включающий
10.
(а) осаждение мРНК из неочищенного препарата; и
(б) подвергание неочищенного препарата, содержащего осажденную мРНК,
тангенциальной поточной фильтрации таким образом, что осажденная мРНК
захватывается фильтрационной мембраной в то время как загрязнения удаляются путем
фильтрации; и
(в) элюирование захваченной осажденной мРНК путем повторной солюбилизации
осажденной мРНК, что приводит к получению очищенного раствора мРНК.
41. Способ изготовления матричной РНК (мРНК), включающий:
синтез мРНК in vitro; и
очистку синтезированной in vitro мРНК, с использованием способа по любому из предшествующих пунктов.
42. Матричная РНК (мРНК), очищенная с использованием способа по любому из предшествующих пунктов.
43. Партия очищенной мРНК, содержащая 5 грамм или более мРНК одного вида, подходящая для введения субъекту-человеку.
44. Партия по п. 43, содержащая 10 грамм или более мРНК одного вида.
45. Партия по п. 43, содержащая 25 грамм или более мРНК одного вида.
46. Партия по любому из пп. 42-45, которая является по существу свободной от примесей процесса синтеза мРНК.
47. Партия по п. 46, отличающаяся тем, что партия является по существу свободной от незрелых последовательностей РНК, ДНК-матриц, и/или ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro мРНК одного вида.
48. Партия по любому из пп. 43-47, отличающаяся тем, что очищенная мРНК содержит менее чем около 5 % ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro.
49. Партия по любому из пп. 43-48, отличающаяся тем, что очищенная мРНК имеет целостность более чем около 95 %.
42.
50. Композиция, содержащая матричную РНК, очищенную с использованием способа по любому из предшествующих пунктов.
51. Композиция, содержащая синтезированную in vitro матричную РНК, отличающаяся тем, что композиция содержит менее чем 1 % незрелых последовательностей РНК и/или ферментных реагентов, используемых в синтезе in vitro.
52. Композиция, содержащая синтезированную in vitro матричную РНК (мРНК), отличающаяся тем, что мРНК имеет целостность равную или более чем 95 %.
42.
Стадия1: Загрузка Стадия2: Отмывание СтадияЗ: Элюирование
Ретентат
Ретентат
JJLflJLllJ*
Ы Јi *i $ *
Подача
Подача
JUUUUL
IPU№
HI HfR"lif
Льригг
irjTUtlT
lUilhll 1 ,
11 11 > i и i
Подача
ф Примеси осажденной
мРНК (Растворимые и/
" или
менее чем 0,22м кМ)
Фиг. 1
Солюбилизир тованная мРНК
2/22
-i Li. 1 Ш
t~i О D U U ^ ^
t t t §- с X
t= C= t= ? ^ ° ^
r^- г-- r-- bЈ
Фиг. 2
3/22
^- C-v| СО -^t UT> CЈJ С
^' ч1 .' х х'- ^' ^ га
^=1- -=t- -=i- -"=r т 2
чу- *у -ty- чу- ч. • чу- q[ Я
-СГГЭ СИЗ _> СГ7~_> CJT5
СО СО СО СО со со f-- X
CD CD CD CD CD CD |_ ^
ИМИ
¦е-
Фиг. 3
4/22
5/22
6/22
CD UJ
11 1
r--
^=1-
¦9-
Фиг. 6
7/22
8/22
9/22
C4|
co~
> <
> <.
ci>
r--
r--
Фиг. 9
10/22
11/22
Фиг. 11
12/22
13/22
Продуцирование люциферазы в клетках ВНК
.ООЕ+08
.ООЕ+07
.ООЕ+06 .ООЕ+05
.ООЕ+04
.ООЕ+03
.ООЕ+02
.ООЕ+01
.ООЕ+00
Фиг. 13
14/22
444
--!--
200
150
25"Г
1301.
I I * I I I I
25 200
[нт]
Фиг. 15
Фиг. 16
17/22
S. га
т- CL
со <и
СО 5
< Ё=
^ О
I 1= о-
-80)
¦е-
s 6
Фиг. 17
18/22
19/22
I Q. S
f О
X Q.
Фиг. 20
21/22
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)