EA201691682A1 20170228 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/201691682 Полный текст описания [**] EA201691682 20150219 Регистрационный номер и дата заявки US61/943,192 20140221 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2015/016499 Номер международной заявки (PCT) WO2015/127008 20150827 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21702 Номер бюллетеня [**] СПОСОБЫ АНАЛИЗИРОВАНИЯ РЕДКИХ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В КРОВИ КЛЕТОК Название документа [8] G01N 33/53, [8] G01N 33/574, [8] G01N 33/542 Индексы МПК [US] Марринуччи Дена Сведения об авторах [US] ЭПИК САЙЕНСИЗ, ИНК. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201691682a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Данное раскрытие предоставляет способы анализирования редких циркулирующих клеток (РЦК) на клеточном и молекулярном уровне после их определения в необогащенных образцах крови, и способы данного раскрытия выступают в роли диагностических методов для нескольких заболеваний, включая заболевания сердечно-сосудистой системы и рак.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Данное раскрытие предоставляет способы анализирования редких циркулирующих клеток (РЦК) на клеточном и молекулярном уровне после их определения в необогащенных образцах крови, и способы данного раскрытия выступают в роли диагностических методов для нескольких заболеваний, включая заболевания сердечно-сосудистой системы и рак.


Евразийское (21) 201691682 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.02.28
(22) Дата подачи заявки 2015.02.19
(51) Int. Cl.
G01N33/53 (2006.01) G01N33/574 (2006.01) G01N33/542 (2006.01)
(54) СПОСОБЫ АНАЛИЗИРОВАНИЯ РЕДКИХ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В КРОВИ КЛЕТОК
(31) (32)
61/943,192 2014.02.21
(33) US
(86) PCT/US2015/016499
(87) WO 2015/127008 2015.08.27
(71) Заявитель:
ЭПИК САЙЕНСИЗ, ИНК. (US)
(72) Изобретатель: Марринуччи Дена (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Данное раскрытие предоставляет способы анализирования редких циркулирующих клеток (РЦК) на клеточном и молекулярном уровне после их определения в необогащенных образцах крови, и способы данного раскрытия выступают в роли диагностических методов для нескольких заболеваний, включая заболевания сердечно-сосудистой системы и рак.
2420-536917ЕА/045 СПОСОБЫ АНАЛИЗИРОВАНИЯ РЕДКИХ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В КРОВИ КЛЕТОК
Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США с серийным номером 61/943,192, поданной 21 февраля 2014 года, содержание которой во всей полноте включено в данную заявку посредством ссылки.
Настоящее раскрытие в целом относится к способам диагностирования таких заболеваний, как рак или заболевания сердечнососудистой системы, и, более конкретно, к способами молекулярного и клеточного анализа редких циркулирующих в крови клеток (РЦК; RCC), таких как Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК; СТС) или Циркулирующие эндотелиальные клетки (ЦЭК; СЕС).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Определенные типы редких клеток, циркулирующих в кровотоке (редкие циркулирующие клетки, РЦК), в последнее время рассматриваются в качестве чрезвычайно многообещающих кандидатов в биомаркеры для растущего числа определенных заболеваний. Например, Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) считают многообещающим диагностическим и прогностическим маркером для мониторирования прогрессирования рака, а также ответа на противораковую терапию. Более того, Циркулирующие эндотелиальные клетки (ЦЭК) считаются многообещающим диагностическим и прогностическим маркером заболеваний сердечнососудистой системы, таких как острый инфаркт миокарда.
Забор РЦК можно удобным образом производить из образцов крови ("жидкая биопсия"), что позволяет повторно производить забор образцов на протяжении прогрессирования заболевания пациента или на протяжении схемы его лечения. Поэтому диагностические методы, основанные на определении РЦК, их подсчете и анализе, обеспечивают персонализированную оценку индивидуального заболевания пациента в режиме реального времени, что облегчает составление персонализированных схем лечения.
Тем не менее, получению полноценной пользы от разработки биомаркеров РЦК препятствует недостаток технологий для анализа, которые способны точно и надежно определить и подсчитать РЦК, а
также обеспечить дальнейший анализ цитобиологии РЦК {например, экспрессии гена, метаболической активности, локализации белка, локализации РНК), а также молекулярной биологии РЦК {например, анализа генома, протеома, секретома, метаболома). В частности, чрезвычайное низкое содержание РЦК и значительная гетерогенность популяций РЦК ставят задачи для развития надежных диагностических анализов.
Большей части существующих платформ для анализа РЦК недостает чувствительности и точности для обеспечения надежного определения и подсчета РЦК. Более того, огромное количество платформ для анализа РЦК не обеспечивают подробный клеточный или молекулярный анализ РЦК после определения и подсчета данных клеток.
Например, многие способы определения и подсчета РЦК основаны на проточной цитометрии {например, анализ с помощью клеточного сортера с активацией флуоресценции (FACS)) или технологиях захвата антигена или антитела {например, CellSearch(r)) . в то время как проточная цитометрия обеспечивает сортировку клеток, она не может надежно измерить очень небольшие популяции клеток, таких как ЦОК или ЦЭК (-1-10 ЦОК/мл цельной крови), в присутствии более крупных клеточных популяций, таких как белые клетки крови (лейкоциты, WBC;> 1 миллион ЦОК/мл цельной крови). В дополнение, основанные на FACS способы не обеспечивают углубленный анализ морфологии клеток.
Одним выдающимся примером платформ для захвата антигена или антитела для РЦК является платформа CellSearch(r), которая была утверждена FDA (Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств) для мониторирования пациентов с метастатическим раком. Анализ РЦК с захватом антигена или антитела CellSearch(r) недавно был адаптирован для определения ЦЭК (см., например, Damani с соавт., 2012, Sci. Tansl. Med. 4, 126 гаЗЗ) . Тем не менее, CellSearch(r) и сходные платформы с захватом антигена или антитела требуют начальной иммуномагнитной стадии захвата с использованием шариков, целью которой является единичный биомаркер для обогащения очень
редких РЦК в образце перед попыткой их определения и подсчета. Именно эти исходные целенаправленные меры по обогащению делают невозможным объективный мультипараметрический анализ и классификацию гетерогенных популяций РЦК, а также препятствуют выходу любого анализа за пределы единичного биомаркера, применяемого для захвата клетки. Более того, на РЦК-направленные анализы с захватом антигена или антитела всегда оказывает отрицательное влияние недостаточная чувствительность и специфичность анализа.
Из-за наличия ограничений для многих существующих технологий анализа регистрируемое содержание РЦК в образцах крови человека значительно варьируется по литературным данным даже после попыток существенной оптимизации и стандартизации анализа. Данная вариабельность результатов анализов РЦК значительно затрудняет дальнейшее совершенствование РЦК в качестве клинически полезных биомаркеров. Другим препятствием для большинства существующих технологий анализа РЦК является ограниченное количество диагностически значимой обычно обнаруживаемой информации. Типичные анализы РЦК могут определять численность РЦК и описывать общие морфологические свойства клетки {например, размер клетки, распределение по размерам в популяции клеток), но современные анализы РЦК обычно не предоставляют диагностически значимый профиль цитобиологии РЦК {например, в отношении энергетического метаболизма раковых клеток или наличия апоптозных телец) или молекулярной биологии РЦК {например, наличия генетических отклонений, включая слияние генов, анеуплоидию, потерю участков хромосом, наличие определенных онкогенных мутаций или уровней экспрессии онкогена). Таким образом, необходимы новые подходы для точного определения, подсчета и анализа РЦК.
В последнее время была разработана платформа иммуноферментного анализа высокого разрешения (HD), которая обеспечивает надежное определение и подсчет РЦК в присутствии более многочисленных клеток других типов. Анализы HD-РЦК в целом основываются на непосредственном сравнении редких клеток {например, ЦОК или ЦЭК) с многочисленными клетками {например,
лейкоцитами) в необогащенных образцах {например, образцах крови) на предмет определенных иммунофлуоресцентных и морфологических характеристик. В особенности, анализы HD-ЦОК и HD-ЦЭК доказали свою высокую чувствительность, высокую точность и высокую надежность в определении и подсчете ЦОК и ЦЭК.
В то время как современные протоколы анализа HD-РЦК обеспечивают точное определение клеток и их подсчет, в настоящее время имеется значительная нехватка надежных протоколов для последующего анализа цитобиологии РЦК или молекулярной биологии РЦК. Тем не менее, многие ожидают, что более глубокое понимание биологии РЦК будет способствовать развитию значимой диагностики заболеваний, а также эффективных методов их лечения. Например, ожидается, что лучшее понимание биологии ЦОК будет способствовать развитию противораковой терапии следующего поколения, мишенью которой будут ЦОК и которая, таким образом, будет способствовать подавлению метастазирования опухоли. Более того, ожидается, что определение конкретных молекулярных характеристик ЦОК будет иметь непосредственную диагностическую ценность {например, определение мутаций в гене BRCA-1/2) и способствовать персонализированному подбору схемы противораковой терапии для каждого пациента {например, лечение ингибиторами PARP (Поли(АДФ-рибоза)полимеразы)).
Таким образом, существует необходимость в разработке способов, обеспечивающих клеточный и молекулярный анализ РЦК после определения РЦК. Настоящее раскрытие направлено на удовлетворение данной потребности путем предоставления способов для анализирования РЦК в необогащенных образцах, полученных от пациентов. Также предоставлены соответствующие преимущества.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее раскрытие предоставляет способы для дополнительного определения характеристик РЦК после их определения в необогащенном биологическом образце.
В одном аспекте раскрытие предоставляет способ анализирования редких циркулирующих в крови клеток (РЦК) в необогащенном образце крови, включающий: (а) определение РЦК в
необогащенном образце крови, включающее i) определение наличия
или отсутствия одного или более маркеров для
иммунофлуоресцентного определения РЦК в ядерных клетках в
необогащенном образце крови, и ii) оценку морфологии ядерных
клеток, где производят определение РЦК среди ядерных клеток на
основании комбинации четкого иммунофлуоресцентного окрашивания
и морфологических характеристик; (Ь) гашение
иммунофлуоресценции одного или более маркеров для
иммунофлуоресцентного определения РЦК, включающее
контактирование РЦК с буфером-гасителем, где
иммунофлуоресценция гасится более, чем на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,9% или 99, 99%; и (с) анализирование определенных РЦК, включая определение наличия или отсутствия одного или более флуоресцентных маркеров для анализа РЦК.
В некоторых вариантах осуществления маркеры для флуоресцентного анализа РЦК представляют собой маркеры для флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
В некоторых вариантах осуществления более 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% РЦК, определяемых на этапе (а), сохраняются на этапе (с).
В некоторых вариантах осуществления маркеры для флуоресцентного анализа РЦК представляют собой маркеры положительного контроля. В некоторых вариантах осуществления маркеры положительного контроля присутствуют более, чем у 2 5%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% проанализированных на этапе (с) РЦК. В некоторых вариантах осуществления маркеры положительного контроля представляют собой хромосомные маркеры. В некоторых вариантах осуществления маркеры положительного контроля представляют собой маркеры центромера или маркеры теломера.
В некоторых вариантах осуществления маркеры для флуоресцентного анализа РЦК представляют собой генетические мутации, выбираемые из группы, состоящей из транслокации гена, амплификации гена, делеции гена, генной анеуплоидии и хромосомной анеуплоидии.
В некоторых вариантах осуществления анализирование
определенных РЦК дополнительно включает оценку морфологии определенных РЦК.
В некоторых вариантах осуществления РЦК представляют собой циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК). В некоторых вариантах осуществления РЦК представляют собой циркулирующие эпителиальные клетки (ЦЭК). В некоторых вариантах осуществления РЦК представляют собой мимики ЦОК. В некоторых вариантах осуществления РЦК представляют собой кандидаты ЦОК.
В некоторых вариантах осуществления буфер-гаситель включает хаотропное средство. В некоторых вариантах осуществления концентрация хаотропного средства составляет по меньшей мере 2 моль, 3 моль или 4 моль. В некоторых вариантах осуществления буфер-гаситель включает хаотропную соль. В некоторых вариантах осуществления буфер-гаситель включает гуанидин или гуанидиниевую соль. В некоторых вариантах осуществления буфер-гаситель включает гуанидина тиоцианат (гуанидинтиоцианат) или гуанидина хлорид (гуанидингидрохлорид).
В некоторых вариантах осуществления способ представляет собой флуоресцентную сканирующую микроскопию.
В некоторых вариантах осуществления микроскопия предоставляет поле зрение, включающее более 2, 5, 10, 20, 30, 4 0 или 50 РЦК, где каждую РЦК окружают более 10, 50, 100, 150 или 2 00 лейкоцитов.
В некоторых вариантах осуществления определение наличия или отсутствия маркеров для иммунофлуоресцентного определения РЦК включает сравнение четкого иммунофлуоресцентного окрашивания РЦК с четким иммунофлуоресцентным окрашиванием лейкоцитов.
В некоторых вариантах осуществления определение наличия или отсутствия маркеров для флуоресцентного анализа РЦК включает сравнение четкого иммунофлуоресцентного окрашивания РЦК с четкого иммунофлуоресцентного окрашивания лейкоцитов.
В некоторых вариантах осуществления оценка морфологии ядерных клеток включает сравнение морфологических характеристик РЦК с морфологическими характеристиками окружающих их лейкоцитов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГ. 1 демонстрирует изображения, иллюстрирующие относительное влияние гашения при помощи гуанидинтиоцианатного буфера (GdnSCN) и отмывающего буфера для вестерн блоттинга
(WBSB) на иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК. Изображения в верхнем ряду демонстрируют типичное ядерное окрашивание (DAPI) лейкоцитов и ЦОК в необогащенном образце крови. Изображения в нижнем ряду демонстрируют типичное остаточное цитокератиновое
(СК) иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК после обработки GdnSCN (4 моль, 10 минут; первая и вторая колонки) или после обработки WBSB в течение 5 минут или 10 минут (третья, четвертая и пятая колонки).
ФИГ. 2 демонстрирует изображения, дополнительно иллюстрирующие относительное влияние гашения при помощи гуанидинтиоцианатного буфера (GdnSCN, 4 моль) и отмывающего буфера для вестерн блоттинга (WBSB) на иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК. Изображения в верхнем ряду демонстрируют типичное ядерное окрашивание (DAPI) лейкоцитов и ЦОК в необогащенном образце крови. Изображения в нижнем ряду демонстрируют типичное остаточное цитокератиновое (СК) иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК после обработки GdnSCN
(первая колонка) при комнатной температуре (КТ) или после обработки WBSB при комнатной температуре (вторая колонка) или при 37°С (третья колонка).
ФИГ. 3 демонстрирует изображения, иллюстрирующие относительное влияние гашения при помощи гуанидинтиоцианатного буфера (GdnSCN, 4 моль) и буфера тиоцианата натрия (NaSCN, 4 моль) на иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК. Изображения в верхнем ряду демонстрируют типичное ядерное окрашивание (DAPI) лейкоцитов и ЦОК в необогащенном образце крови. Изображения в нижнем ряду демонстрируют типичное остаточное цитокератиновое
(СК) иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК после обработки GdnSCN (левая колонка) или после обработки NaSCN (правая колонка).
ФИГ. 4 демонстрирует изображения, иллюстрирующие зависимое
от концентрации влияние гашения при помощи
гуанидинтиоцианатного буфера (GdnSCN). Изображения в верхнем ряду демонстрируют типичное ядерное окрашивание (DAPI) лейкоцитов и ЦОК в необогащенном образце крови. Изображения в нижнем ряду демонстрируют типичное остаточное цитокератиновое (СК) иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК после обработки GdnSCN в концентрациях 4 моль, 3 моль, 2 моль или 1 моль.
ФИГ. 5 демонстрирует изображения, иллюстрирующие относительное влияние гуанидинтиоцианатного буфера (GdnSCN, 4 моль), кислотного глицинового буфера (рН 2) и кислотного буфера с глицином/SDS (додецилсульфатом натрия) (предварительно фиксированный) на иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК и жизнеспособность клеток. Изображения в верхнем ряду демонстрируют типичное ядерное окрашивание (DAPI) лейкоцитов и ЦОК в необогащенном образце крови. Изображения в нижнем ряду демонстрируют типичное остаточное цитокератиновое (СК) иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК после обработки GdnSCN (4 моль, левая колонка), глицином (рН 2, 50°С; центральная колонка) или SDS (1%)/глицином (рН 2,2) (предварительно фиксированный 1% формальдегидом; правая колонка).
ФИГ. 6 демонстрирует изображения, иллюстрирующие относительное влияние гуанидинтиоцианатного буфера (GdnSCN, 4 моль), нейтрального глицинового буфера (рН 7) и основного глицинового буфера (рН 10) на иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК и жизнеспособность клеток. Изображения в верхнем ряду демонстрируют типичное ядерное окрашивание (DAPI) лейкоцитов и ЦОК в необогащенном образце крови. Изображения в нижнем ряду демонстрируют типичное остаточное цитокератиновое (СК) иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК после обработки GdnSCN (левая колонка), глицином (рН 2; центральная колонка) или глицином/SDS (предварительно фиксированный; правая колонка).
ФИГ. 7 демонстрирует изображения, иллюстрирующие
относительное влияние гуанидинтиоцианатного буфера (GdnSCN, 4
моль) и буфера с глицином/SDS(1%) (рН 2,2) на
иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК и жизнеспособность клеток.
Изображения в верхнем ряду демонстрируют типичное ядерное
окрашивание (DAPI) лейкоцитов и ЦОК в необогащенном образце
крови. Изображения в нижнем ряду демонстрируют типичное
остаточное цитокератиновое (СК) иммунофлуоресцентное
окрашивание ЦОК после обработки GdnSCN (левая колонка) или SDS (1%)/глицином (рН 2,2) (комнатная температура; правая колонка).
ФИГ. 8 демонстрирует изображения, иллюстрирующие типичные результаты FISH эксперимента, проведенного на необогащенном образце крови, с последующим определением ЦОК в анализе HD-ЦОК данного раскрытия и последующим гашением СК-иммунофлуоресценции при помощи буферов-гасителей с 4 моль GdnSCN. Красные точки представляют собой сигнал от FISH-контрольного зонда (зонд центромерной части 10 хромосомы; канал техасский красный); зеленые точки представляют собой сигналы от FISH-зондов, имеющих мишенью интересующий ген (PTEN; канал флуоресцеин изотиоцианат (FITC)).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее раскрытие частично основывается на открытии, которое касается того, что РЦК можно подвергать дополнительному анализу на предмет их клеточных или молекулярных характеристик после их определения, классифицирования {например, в качестве ЦОК, мимиков ЦОК, кандидатов ЦОК или ЦЭК) и подсчета в необогащенном образце крови. Конкретно настоящее изобретение частично основывается на том открытии, что РЦК, такие как ЦОК, мимики ЦОК, кандидаты ЦОК или ЦЭК можно подвергать дополнительному анализу после их определения, классифицирования и подсчета в необогащенном биологическом образце при помощи анализа HD-РЦК.
В некоторых вариантах осуществления анализы HD-РЦК включают, помимо прочего, определение РЦК в необогащенных образцах крови путем определения наличия или отсутствия определенных маркеров для иммунофлуоресцентного определения РЦК. Например, определение ЦОК может включать определение наличия или отсутствия маркера иммунофлуоресцентного определения цитокератина. В другом примере определение ЦЭК может включать определение наличия или отсутствия маркера
иммунофлуоресцентного определения фактора Виллебранда (vWF).
Настоящее раскрытие дополнительно частично основывается на открытии, которое касается того, что в анализах HD-РЦК РЦК можно дополнительно анализировать путем определения наличия или отсутствия определенных маркеров для иммунофлуоресцентного анализа РЦК. Например, в некоторых вариантах осуществления РЦК можно дополнительно анализировать путем определения или отсутствия мутаций онкогена или повышенных уровней экспрессии онкогена. В некоторых вариантах осуществления определение наличия или отсутствия маркеров для анализа РЦК включает флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH).
Настоящее раскрытие дополнительно основывается на
открытии, которое касается того, что в некоторых вариантах
осуществления определение наличия или отсутствия маркера
иммунофлуоресцентного анализа РЦК требует гашения
иммунофлуоресценции маркера иммунофлуоресцентного определения РЦК.
Настоящее раскрытие дополнительно частично основывается на
открытии, которое касается того, что возникает множество
технических сложностей для эффективного гашения
иммунофлуоресценции маркера иммунофлуоресцентного определения
РЦК при одновременном сохранении РЦК для последующего анализа и
в то же время для поддержания РЦК в состоянии, которое
обеспечивает проведение последующего определения маркеров для
иммунофлуоресцентного определения РЦК. Например, обнаружено,
что многие буферы-гасители и многие аналитические буферы
{например, FISH буферы), которые часто используют специалисты в
данной области техники, либо не обеспечивают достаточное
гашение маркеров для иммунофлуоресцентного анализа РЦК (см.,
например, ФИГ. 2; Отмывающий раствор для Вестерн блоттинга,
WBSB), либо приводят к потере определенных ранее РЦК или
приводят оставшиеся РЦК в состояние, которое не позволяет
провести дальнейшее определение маркеров для
иммунофлуоресцентного анализа РЦК или способствуют невозможности проведения последующего анализа РЦК (см., например, ФИГ. 5, глициновый буфер (рН 2)).
Настоящее раскрытие дополнительно частично основывается на неожиданном открытии, которое касается того, что иммунофлуоресценцию маркеров определения РЦК можно гасить, в то же время сохраняя большое количество РЦК для дополнительного анализа.
Настоящее раскрытие дополнительно частично основывается на неожиданном открытии, которое касается того, что наличие определенных маркеров для иммунофлуоресцентного анализа РЦК можно определить у большого числа РЦК после гашения иммунофлуоресценции маркера иммунофлуоресцентного определения РЦК.
Настоящее раскрытие дополнительно частично основывается на неожиданном открытии, которое касается того, что высокоэффективные буферы-гасители включают буферы, от которых специалисты в данной области техники не ожидают результатов высокого качества при их применении в способах, описанных в данном раскрытии для примера и без привязки к какой-либо теории, поскольку буферы оказывают выраженное стрессовое или разрушающее воздействие на клетки, что приводит либо к потере клеток, либо к потере сигналов маркеров РЦК анализа {например, буферы, содержащие хаотропные реагенты).
Настоящее раскрытие дополнительно частично основывается на неожиданном открытии, которое касается того, что морфологические характеристики РЦК, а также других ядерных клеток в образце {например, белых клеток крови, лейкоцитов) можно в большой степени сохранить после обработки РЦК эффективными буферами-гасителями, которые содержат хаотропные средства, такие как гуанидина тиоцианат и т.п.
Фундаментальным аспектом настоящего раскрытия является надежность раскрытых способов. Определение редких событий (RED) в отношении РЦК, раскрытое в данной заявке, основывается на прямом анализе необогащенной клеточной популяции, который включает определение редких событий в контексте окружающих нередких событий. Определение редких событий в соответствии с раскрытыми способами по своему существу определяет окружающие события как нередкие события. Учитывание окружающих нередких
событий, а также определение средних значений нередких событий, например, среднего размера клеток в нередких событиях, позволяет калибровать способ определения при помощи устранения шума. Результатом является надежность раскрытых способов, которой нельзя достичь, применяя способы, которые не основываются на прямом анализе, но которые вместо этого сравнивают обогащенные популяции и по своему существу являются искаженными контекстуальными сравнениями редких событий.
Раскрытие предоставляет способы для дополнительного
анализирования РЦК {например, ЦОК, мимиков ЦОК, кандидатов ЦОК
или ЦЭК) после их определения в необогащенных образцах крови.
Одним из основных преимуществ настоящего раскрытия является
комбинация высокой точности и чувствительности способа
определения, классифицирования и подсчета РЦК при помощи
последующих способов для анализирования РЦК на предмет их
цитобиологических и молекулярно-биологических характеристик. В
конкретных аспектах последующий анализ РЦК включает анализ
заболевания и биомаркеров, например, определение мутаций в
онкогене {например, мутаций в гене BRCA-1/2) в ЦОК или
определение уровней экспрессии аберрантного онкогена {например,
уровней экспрессии HER2) в ЦЭК. Многие ожидают, что комбинация
точного подсчета РЦК с последующим определением маркеров
заболевания или биомаркеров будет стимулировать
диагностическое, а также прогностическое значение РЦК.
В результате настоящее раскрытие представляет определенное преимущество, например, для пациентов. В частности, преимущество распространяется на пациентов, страдающих раком, поскольку делает возможным улучшенную диагностику их заболевания. Например, способы данного раскрытия улучшают диагностику прогрессирования новообразований или их рецидивирования, а также способствуют анализу опухолевого роста в режиме реального времени на молекулярном и клеточном уровнях. Ожидается, что улучшенное понимание биологии опухоли пациента в целом сможет облегчить персонализацию схем терапии и улучшить исходы лечения.
В данной заявке предоставлены способы анализирования
редких циркулирующих в крови клеток (РЦК) в необогащенной биологическом образце, включающие: (а) определение РЦК в необогащенном биологическом образце, включающее i) определение наличия или отсутствия одного или более маркеров для иммунофлуоресцентного определения РЦК в ядерных клетках в необогащенном биологическом образце, и ii) оценку морфологии ядерных клеток, где производят определение РЦК среди ядерных клеток на основании комбинации четкого окрашивания маркера определения и морфологических характеристик; (Ь) гашение окрашивания одного или более маркеров для иммунофлуоресцентного определения РЦК, включая контактирование РЦК с буфером-гасителем, где окрашивание гасится более, чем на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,9% или 99, 99%; и (с) анализирование определенных РЦК, включая определение наличия или отсутствия одного или более зондов анализа РЦК.
Дополнительно в данной заявке предоставлены способы
анализирования редких циркулирующих клеток (РЦК) в
необогащенной образце крови, включающие (а) определение РЦК в
необогащенном образце крови, включающее i) определение наличия
или отсутствия одного или более маркеров для
иммунофлуоресцентного определения РЦК в ядерных клетках в
необогащенном образце крови, и ii) оценку морфологии ядерных
клеток, где производят определение РЦК среди ядерных клеток на
основании комбинации четкого иммунофлуоресцентного окрашивания
и морфологических характеристик; (Ь) гашение
иммунофлуоресценции одного или более маркеров для иммунофлуоресцентного определения РЦК, включая контактирование РЦК с буфером-гасителем, где иммунофлуоресценция гасится более чем на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,9% или 99,99%; и (с) анализирование определенных РЦК, включая определение наличия или отсутствия одного или более флуоресцентных маркеров для анализа РЦК.
Следует отметить, что при применении в данном описании и прилагаемой формуле изобретения термин "приблизительно", в частности относящийся к заданному количеству, предназначен для включения отклонений значений, равных плюс-минус пяти
процентам.
Как применяют в данной заявке, а также в прилагаемой формуле изобретения, формы слов, указанные в единственном числе, также включают формы слов во множественном числе, если это не противоречит контексту, а также они могут взаимозаменяемо применяться с выражениями "по меньшей мере один" и "один или более".
Как применяют в данной заявке, термины "включает", "включающий", "содержит", "содержащий" и их любые вариации предназначены для охвата неисключительного включения, такого как способ, метод, способ производства изделия или композиция определенного состава, которое включает или содержит элемент или перечень элементов, не включает исключительно эти элементы, но может включать другие элементы, перечисленные не точно, или свойственные данному способу, методу, способу производства изделия или композиции определенного состава.
Биологические образцы данного раскрытия могут представлять собой любой образец, в котором подозревают наличие РЦК {например, ЦОК, кандидатов ЦОК, мимиков ЦОК, ЦЭК), включая твердые образцы тканей, такие как костный мозг, а также жидкие образцы, такие как цельная кровь, плазма крови, амниотическая жидкость, плевральная жидкость, перитонеальная жидкость, цереброспинальная жидкость, моча, слюна и смывы бронхов. В некоторых вариантах осуществления биологический образец представляет собой образец крови. Как известно специалистам в данной области техники, биологический образец может включать без ограничений любую фракцию или компонент крови, Т-клетки, моноциты, нейтрофилы, эритроциты, тромбоциты и микропузырьки, такие как экзосомы и экзосомоподобные пузырьки.
Биологические образцы данного раскрытия можно получить от любого организма, включая млекопитающих, таких как люди, приматы {например, мартышки, шимпанзе, орангутаны и гориллы), кошки, собаки, кролики, сельскохозяйственные животные {например, коровы, лошади, козы, овцы, свиньи) и грызуны {например, мыши, крысы, хомячки и морские свинки).
Следует отметить, как применяют в данной заявке, что
термины "организм", "индивид", "субъект" или "пациент" применяются в качестве синонимов и являются взаимозаменяемыми.
Организмы данного раскрытия включают как здоровые организмы, так и организмы, пораженные болезнью.
Пораженные болезнью организмы могут страдать от любого заболевания, связанного с концентрациями аберрантных РЦК. Термин "аберрантные концентрации РЦК", как применяют в данной заявке, относится к концентрациям РЦК в образце, которые значительно отклоняются от медианы концентраций РЦК, обнаруживаемой у популяции здоровых организмов. В некоторых вариантах осуществления аберрантные концентрации РЦК выше медианы концентраций РЦК. В некоторых вариантах осуществления аберрантные концентрации РЦК ниже медианы концентраций РЦК.
В некоторых вариантах осуществления здоровые организмы никогда не страдали от конкретных заболеваний. В некоторых вариантах осуществления здоровые организмы ранее болели. В некоторых вариантах осуществления здоровые организмы проходят стандартное медицинское обследование. В некоторых вариантах осуществления здоровые организмы являются членами контрольной группы в клиническом исследовании. В некоторых вариантах осуществления здоровые организмы находятся в группе риска получения заболевания, что определяется наличием определенных факторов риска, которые хорошо известны специалисту в данной области техники. Такие факторы риска включают без ограничений генетическую предрасположенность, индивидуальный анамнез заболевания, семейный анамнез, факторы образа жизни, факторы окружающей среды, диагностический показатель и т. п.
В некоторых вариантах осуществления организм находится в группе риска развития инфаркта миокарда или другого заболевания сердечнососудистой системы. В некоторых вариантах осуществления организм имеет генетическую предрасположенность к развитию заболеваний сердечнососудистой системы (которая, например, приводит к повышению концентрации холестерина, развитию сахарного диабета, ожирения) или отягощенный семейный анамнез по развитию заболеваний сердечнососудистой системы. В некоторых вариантах осуществления организм подвергается воздействию
определенных факторов образа жизни, которые вызывают развитие
заболеваний сердечнососудистой системы {например, курение
сигарет, низкий уровень физической активности, высокий индекс
массы тела, "западная" диета с высоким содержанием жиров) или
демонстрируют клинические дебюты заболевания сердечнососудистой
системы {например, атеросклеротические бляшки, артериальная
гипертензия, предшествующий отягощенный анамнез пациента, боли
за грудиной, онемение левой руки). В некоторых вариантах
осуществления организм представляет собой пациента, который
проходит медицинское обследование {например,
электрокардиографическое исследование (ЭКГ), анализы крови) для диагностики инфаркта миокарда или наличия рисков развития инфаркта миокарда. В некоторых вариантах осуществления развитие инфаркта миокарда считается неизбежным {например, ожидается развитие инфаркта миокарда в течение одной недели после проведения медицинского обследования). В некоторых вариантах осуществления организм представляет собой пациента, у которого наблюдается повышенная концентрация тропонинов по сравнению с нормальными контролями.
В некоторых вариантах осуществления организм находится в группе риска развития рака. В некоторых вариантах осуществления организм имеет генетическую предрасположенность к развитию рака {например, мутации в гене BRCA 1 или BRCA 2) или отягощенный семейный анамнез по развитию рака. В некоторых вариантах осуществления организм подвергается действию канцерогенов {например, сигаретного дыма, выхлопных газов, смога, асбеста, загрязняющих факторов окружающей среды, токсинов и т.п.).
В некоторых вариантах осуществления пораженный болезнью организм страдает от заболевания сердечнососудистой системы, такого как инфаркт миокарда (ИМ; например, острый инфаркт миокарда (ИМ) или стабильная ишемическая болезнь сердца (ИБС, CAD)) или инсульта. В некоторых вариантах осуществления пораженный болезнью организм страдает от метаболического синдрома {например, сахарного диабета, ожирения).
В некоторых вариантах осуществления пораженный болезнью организм страдает от рака. Рак в данном раскрытии обычно
представляет собой солидную опухоль. Опухоль может включать первичную опухоль и метастатическую опухоль. Опухоль может быть васкуляризована. Рак может по меньше мере отчасти отвечать на терапию {например, хирургическое лечение, химиотерапию, лучевую терапию) или не поддаваться терапии. Рак может быть устойчивым к одной или более схемам противораковой терапии {например, устойчивым к схеме специфической химиотерапии). Рак может включать рак всех стадий, например, I стадии, II стадии, III стадии или IV стадии.
Раки данного раскрытия включают без ограничений рак легких {например, мелкоклеточный рак легкого (SCLC), немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), включая, например, аденокарциному или карциноидную опухоль легкого), рак кожи, рак толстой кишки, рак почки, рак печени, рак поджелудочной железы, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, рак желчного пузыря, рак головного мозга {например, глиому, глиобластому, медуллобластому, нейробластому), рак груди, рак яичников, рак эндометрия, рак простаты, рак яичек и лимфомы {например, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, Т-клеточную лимфому, В-клеточную лимфому).
В некоторых вариантах осуществления пораженный болезнью организм представляет собой организм, не получавший ранее подобное лечение. В некоторых вариантах осуществления пораженный болезнью организм получал лечение до забора образца. В некоторых вариантах осуществления пораженный болезнью организм находился в процессе лечения в момент забора образцов. Лечение может включать без ограничения терапию лекарственными препаратами, лучевую терапию, хирургическое лечение и т.п.
В некоторых вариантах осуществления терапия включает терапию лекарственными препаратами {например, бета-блокаторами, антикоагулянтами {например, аспирином, плавиксом), оксидом азота, гепарином, морфием, статинами, инсулином, химитерапию, терапию антагонистами фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), антагонистами рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR), антагонистами HER2, ингибиторами киназы). В некоторых вариантах осуществления терапия включает хирургическое лечения {например,
эндартерэктомию, иссечение опухоли). В некоторых вариантах лечения терапия включает лучевую терапию. В некоторых вариантах осуществления терапия включает комбинацию методов лечения
{например, комбинацию терапии двумя или более лекарственными препаратами, комбинацию терапии лекарственным средством и лучевой терапии).
В некоторых вариантах осуществления организм представляет собой животную модель. В некоторых вариантах осуществления организм представляет собой животную модель заболевания сердечнососудистой системы. В некоторых вариантах осуществления организм представляет собой животную модель рака, включая без ограничений ксенотрансплантатную модель опухоли у мышей, модель линии трансгенных мышей, имеющих трансгенный онкоген, мышей, нокаутированных по проапоптозному гену и другие. Специалист в данной области техники понимает, что животные модели (мышиные или с участием других организмов) хорошо известны в данной области техники для определенных заболеваний.
В некоторых вариантах осуществления образцы крови получают от пациента. В некоторых вариантах осуществления пациент получает терапию в течение определенного периода времени
{например, в течение более 1 дня, 1 недели, 1 месяца, 3 месяцев, б месяцев, 9 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет, 4 лет, 5 лет) . В некоторых вариантах осуществления образец крови представляет собой несколько образцов крови. В некоторых вариантах осуществления несколько образцов крови собирают в течение определенного периода времени. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один образец крови из нескольких образцов крови получают у пациента до начала проведения терапии в течение определенного периода времени. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один образец крови из нескольких образцов крови получают у пациента, когда тот еще не получал такую терапию. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один образец крови из нескольких образцов крови получают у пациента в течение периода времени, когда пациент получал терапию. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один образец крови из нескольких образцов крови получают у
пациента до начала проведения терапии в течение определенного периода времени, и по меньшей мере один образец получают от пациента в течение периода времени, когда пациент получал терапию. В некоторых вариантах осуществления первый образец крови получают в первый раз во время периода времени, когда пациент получал терапию, и второй образец крови получают во второй раз во время периода времени, когда пациент получал терапию. В некоторых вариантах осуществления первый и второй раз получения образца крови разделены во времени периодом времени, превышающим 1 день, 1 неделю, 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, б месяцев, 9 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет.
В некоторых вариантах осуществления образец крови получают от пациента, страдающего немелкоклеточным раком легких (NSCLC). В некоторых вариантах осуществления образец крови получают от пациента с ИМ.
В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают начальную стадию получения образца крови от пациента.
Каждый из образцов данного раскрытия может содержать несколько клеточных популяций, а также субпопуляцию клеток, которые определяют при помощи способов, хорошо известных в данной области техники {например, FACS, иммуногистохимического анализа). Например, образец крови может содержать популяции безъядерных клеток, таких как эритроциты {например, 4-5 миллионов/мкл) или тромбоциты (150000-400000 клеток/мкл), а также популяции ядерных клеток, таких как белые кровяные клетки (лейкоциты, например, 4500-10000 клеток/мкл), ЦЭК или ЦОК (циркулирующие опухолевые клетки; например, 2-8 00 клеток/мкл). Лейкоциты могут содержать субпопуляции клеток, например, нейтрофилов (2500-8000 клеток/мкл), лимфоцитов (1000-4000 клеток/мкл), моноцитов (100-700 клеток/мкл), эозинофилов (50500 клеток/мкл), базофилов (25-100 клеток/мкл) и т.п. Образцы данного раскрытия являются необогащенными образцами, т.е., они не обогащены какими-либо определенными популяциями или субпопуляциями ядерных клеток. Например, необогащенные образцы крови не обогащены лейкоцитами, В-клетками, Т-клетками, НК
клетками, моноцитами и т.п. Более конкретно, образцы крови данного раскрытия не обогащены никакими РЦК, включая ЦОК, мимики ЦОК, ЦЭК и т.п.
Образцы данного раскрытия можно получить при помощи любого применяемого способа, известного специалисту в данной области техники, включая, например, биопсию твердых тканей или биопсию жидкостей (см., например, Marrinucci D. с соавт., 2012, Phys. Biol. 9 016003; Nieva J. с соавт., 2012, Phys. Biol. 9 016004). Образец крови можно выделить из любого источника, который, как известно, включает клетки крови или ее компоненты, такого как венозный, артериальный, периферический, ткани, спинной мозг и т.п. Образец можно обрабатывать при помощи хорошо известных стандартных клинических способов {например, при помощи процедур забора и обработки цельной крови). В некоторых вариантах осуществления забор образца крови осуществляют в пробирки для забора крови, содержащие антикоагулянт (ВСТ) , которые могут содержать этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК, EDTA) или Streck Cell-Free DNA(tm). В других вариантах осуществления забор образца крови производят в пробирки CellSave(r) (Veridex). Образец крови можно хранить вплоть до 12 часов, 24 часов, 36 часов, 48 часов, 60 часов, 72 часов, 86 часов, 96 часов, 108 часов, 120 часов или дольше перед последующей обработкой.
В некоторых вариантах осуществления способы данного раскрытия включают получение количества белых кровяных клеток (лейкоцитов) в образце крови. В конкретных вариантах осуществления количество лейкоцитов можно получить при помощи прибора HemoCure(r) WBC (Hemocure, Angelholm, Sweden).
В некоторых вариантах осуществления способы данного раскрытия включают стадию лизирования эритроцитов в образце крови. В некоторых вариантах осуществления эритроциты лизируются, например, путем добавления раствора хлорида аммония в образец крови. В некоторых вариантах осуществления образец крови подвергают центрифугированию с последующим лизированием эритроцитов и ресуспендированием ядерных клеток, например, в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS).
В некоторых вариантах осуществления ядерные клетки из образца, такого как образец крови, помещают в виде монослоя на плоскую подложку. Плоская подложка может быть изготовлена из любого материала, например, любого флуоресцентно-прозрачного материала, любого материала, способствующего прикреплению клеток, любого материала, способствующего легкому удалению клеточного детрита, любого материала, имеющего толщину < 100 мкм. В некоторых вариантах осуществления данный материал представляет собой пленку. В некоторых вариантах данный материал представляет собой предметное стекло. Предметное стекло может быть покрыто для обеспечения максимального сохранения жизнеспособных клеток (См., например, Marrinucci D. С соавт. , 2012, Phys. Biol. 9 016003) . В некоторых вариантах осуществления приблизительно 0,5 миллиона, 1 миллион, 1,5 миллиона, 2 миллиона, 2,5 миллиона, 3 миллиона, 3,5 миллиона, 4 миллиона, 4,5 миллиона или 5 миллионов ядерных клеток находятся на предметном стекле. В некоторых вариантах осуществления способы данного раскрытия включают начальную стадию помещения ядерных клеток из образца крови на предметное стекло в виде монослоя. В некоторых вариантах осуществления способ включает помещение приблизительно 3 миллионов клеток на предметное стекло. В некоторых вариантах осуществления количество лейкоцитов используют для определения количества крови, необходимой для получения плотного загрузочного объема ядерных клеток на предметном стекле.
В некоторых вариантах осуществления способы данного раскрытия включают начальную стадию определения ядерных клеток в необогащенном образце крови. В некоторых вариантах осуществления ядерные клетки определяют при помощи флуоресцентного окрашивания. В некоторых вариантах осуществления флуоресцентное окрашивание включает окрашивание определенной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления флуоресцентным красителем является диамидино-2-фенилиндол (DAPI).
Термин "редкая клетка", как применяют в данной заявке, относится к клетке, которая имеет относительную численность
менее 1:1000 клеток в популяции клеток, например, относительную численность менее 1:5000, 1:10000, 1:30000, 1:50000, 1:100000, 1:300000, 1:500000 или 1:1000000. В некоторых вариантах осуществления редкая клетка имеет относительную численность, равную от 1:50000 до 1:100000 в популяции клеток.
Термин "клетка образца", как применяют в данной заявке, относится к любой клетке в образце, которая не является редкой клеткой. Например, клетки образца в образце крови включают лейкоциты.
В некоторых вариантах осуществления редкие клетки данного раскрытия представляют собой редкие циркулирующие клетки (РЦК). В некоторых вариантах осуществления РЦК циркулируют в кровотоке организма. В некоторых вариантах осуществления РЦК представляют собой циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК). В некоторых вариантах осуществления РЦК представляют собой циркулирующие эпителиальные клетки (ЦЭК). В некоторых вариантах осуществления РЦК представляют собой мимики ЦОК. В некоторых вариантах осуществления РЦК представляют собой кандидаты ЦОК.
Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) данного раскрытия представляют собой опухолевые клетки, циркулирующие в кровотоке организма.
Циркулирующие эндотелиальные клетки (ЦЭК) данного раскрытия представляют собой эндотелиальные клетки, циркулирующие в кровотоке организма.
Термин "мимики ЦОК", как применяют в данной заявке, относится к клетке, которая, разделяя один или более биомаркеров, морфологических характеристик или их комбинацию с ЦОК, при этом не является ЦОК. В некоторых вариантах осуществления мимики ЦОК представляют собой ЦЭК.
Термин "кандидат ЦОК", как применяют в данной заявке, относится к клетке, которую определяют на основании наличия биомаркера или морфологической характеристики или их комбинации, которые наблюдаются у мимиков ЦОК и ЦОК. Кандидат ЦОК может представлять собой ЦОК или мимики ЦОК. Кандидат ЦОК можно определить как ЦОК или мимика ЦОК на основании определения дополнительных биомаркеров, дополнительных
морфологических характеристик или их комбинации, которые являются характеристикой ЦОК или другой РЦК.
РЦК данного раскрытия определяют среди ядерных клеток образца на основании комбинации определенных биомаркеров и морфологических характеристик.
Термин "маркер для определения ЦЭК", как применяют в данной заявке, относится к биомаркеру, который можно применять для определения ЦЭК, но не других определенных РЦК {например, ЦОК) или определенных клеток образца {например, лейкоцитов). В некоторых вариантах осуществления маркер для определения ЦЭК присутствует в ЦЭК, мимиках ЦОК и кандидатах ЦОК, и отсутствует в ЦОК и лейкоцитах.
Маркеры для определения ЦЭК включают без ограничения любой биомаркер, который является специфическим для эндотелиальных клеток {например, кластер дифференцировки (CD) 14 6, фактор Виллебранда (vWF), CD 31, CD34 или CD 105).
Термин "маркер для определения ЦОК", как применяют в данной заявке, относится к биомаркеру, который можно применять для определения ЦОК, но не других определенных РЦК {например, ЦЭК) или определенных клеток образца {например, лейкоцитов). В некоторых вариантах осуществления маркер для определения ЦОК присутствует в ЦОК, кандидатах ЦОК и мимиках ЦОК, и отсутствует в ЦЭК и лейкоцитах.
Маркеры для определения ЦОК включают без ограничения любые
онкоспецифические биомаркеры. Онкоспецифические биомаркеры
могут включать, например, биомаркеры, которые являются
специфическими для данного представляющего интерес рака
{например, немелкоклеточного рака легкого, NSCLC), клинической
стадии представляющего интерес рака {например, стадии IV) или
свойств клеток представляющего интерес рака {например,
энергетического метаболизма, эпителиально-мезенхимальной
трансдифференциации). В дополнение, онкоспецифические
биомаркеры могут включать более общие онкомаркеры, такие как онкомаркеры, присутствующие при раке нескольких типов, но отсутствующие в нормальных клетках, или онкомаркеры, которые в целом сигнализируют о злокачественной трансформации клетки.
Специалист в данной области техники знает, что в данной области техники известно множество специфических и общих онкоспецифических биомаркеров.
Маркеры для определения ЦОК включают без ограничения киназу анапластической лимфомы (ALK), андрогеновый рецептор (AR), Axl, сМЕТ, цитокератины 1, 4, 5, б, 7, 8, 10, 13, 18 или 19; CD 31, CD 99, CD 117, хромогранин, десмин, Е-кадгерин, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), адгезивную молекулу эпителиальных клеток (ЕрСАМ), поверхностный антиген эпителиоцитов (ЕМА) , белковую жидкость при обширных кистозных болезнях-15 (GCDFP-15), НМВ-45, ингибин, MART-1, МСМ2, Myo D1, миоспецифический актин (MSA), N-кадгерин, нейрофиламент, нейронспецифичную энолазу (NSE), рбЗ, плацентарную щелочную фосфатазу (PLAP), простатический специфический мембранный антиген (PSMA), белок S100, гладкомышечный актин (SMA), синаптофизин, тиреоидный фактор транскрипции-1 (TTF-1), опухолевый М2-РК (т.е., изофермент пируваткиназы типа М2) , виметин и другие.
Термин "маркер для определения РЦК", как применяют в данной заявке, относится к биомаркеру, который присутствует в интересующих РЦК, но отсутствует в клетках образца. В некоторых вариантах осуществления маркер РЦК присутствует у одного типа РЦК {например, маркер ЦЭК присутствует только в ЦЭК). В некоторых вариантах осуществления маркер РЦК присутствует у более, чем одного типа РЦК {например, маркер ЦОК присутствует в ЦОК и мимиках ЦОК) . Маркеры определения ЦОК данного раскрытия можно применять для определения РЦК, но не клеток образца, таких как лейкоциты. Маркеры для определения РЦК включают, например, маркеры ЦОК, маркеры ЦЭК и т.п.
Термин "маркер для определения клеток образца", как применяют в данной заявке, относится к любому биомаркеру, присутствующему по меньшей мере в одной клетке образца, но который не присутствует в РЦК, представляющей интерес. В некоторых вариантах осуществления маркер для определения образца клетки присутствует по меньшей мере в клетках образца одного типа, но отсутствует в ЦЭК, ЦОК, кандидатах ЦОК и
мимиках ЦОК. Маркеры для определения клеток образца данного раскрытия присутствуют в клетке образца, которая представлена в большем количестве, чем ЦЭК, ЦОК, кандидаты ЦОК или мимики ЦОК. В некоторых вариантах осуществления маркер для определения клеток образца присутствует в лейкоцитах и отсутствует в ЦЭК, ЦОК, кандидатах ЦОК и мимиках ЦОК. В некоторых вариантах осуществления маркер для определение клеток образца представляет собой CD45. В некоторых вариантах осуществления способы включают определение наличия или отсутствия маркера определения клеток образца.
Термин "биомаркер", как применяют в данной заявке, относится к биологической молекуле или фрагменту биологической молекулы, изменение и/или определение которой может быть связано с типом РЦК или с конкретным физическим состоянием или состоянием РЦК. В некоторых вариантах осуществления биомаркеры представляют собой маркеры для определения. В некоторых вариантах осуществления биомаркеры представляют собой маркеры для анализа.
Термин "маркер для определения", как применяют в данной заявке, относится к биомаркеру, который применяют для определения принадлежности клетки к типу клеток, представляющему интерес, например, к ЦОК, ЦЭК или лейкоцитам. Маркеры для определения можно применять для дифференцировки одного типа клеток от другого {например, для дифференцировки мимика ЦОК от ЦОК) . В целом, маркеры для определения данного раскрытия можно применять для определения, классифицирования и подсчета клеток.
Термин "маркер для анализа", как применяют в данной заявке, относится к биомаркеру, который применяют для описаний клетки в отношении ее биологических или молекулярно-биологических свойств, представляющих интерес. Например, без ограничений маркеры анализа могут описывать определенные аспекты генома клетки {например, мутации в гене {например, онкогенные мутации), амплификацию гена), транскриптома (профили экспрессии гена), протеома (профили экспрессии белка, посттрансляционную модификацию белка, внутриклеточную
локализацию белка), секретома, метаболома (метаболическая активность, включая энергетический метаболизм), липидома
(профили липидов, липидные рафты) и т.п.
Термин "маркер" и "биомаркер" применяются взаимозаменяемо
на протяжении раскрытия. Такие биомаркеры включают без
ограничений, биологические молекулы, которые включают
нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, нуклеозиды, аминокислоты,
сахара, жирные кислоты, стероиды, метаболиты, пептиды,
полипептиды, белки, углеводы, липиды, гормоны, антитела,
представляющие интерес участки, которые выступают в роли
суррогатов для биологических макромолекул, и комбинации
вышеперечисленных веществ {например, гликопротеины,
рибонуклеопротеины, липопротеины). Термин также включает части или фрагменты биологической молекулы, например, пептидный фрагмент белка или полипептида. В некоторых вариантах осуществления биомаркеры {например, маркеры анализа РЦК) представляют собой маркеры заболевания {например, онкогенные мутации). В некоторых вариантах осуществления биомаркеры
{например, маркеры для анализа РЦК) применяют для различения и определения субпопуляций клеток.
Специалисту в данной области техники известно, что для
определения наличия или отсутствия биомаркера можно применять
множество способов, включая подходы, основанные на микроскопии,
такие как флуоресцентная микроскопия или флуоресцентная
сканирующая микроскопия (см., например, Marrinucci D. с соавт.,
2012, Phys. Biol. 9 016003; Nieva J. с соавт., 2012, Phys.
Biol. 9 016004) . Другие подходы включают масс-спектрометрию,
анализ экспрессии гена {например, генные чипы, Саузерн-
блоттинг, ПЦР, FISH) и подходы, основанные на антителах,
включая иммунофлуоресцентный, иммуногистохимический анализ,
иммунологические анализы {например, Вестерн-блоттинг,
иммуноферментный анализ (ELISA, ИФА), анализ
иммунопреципитации, радиоиммунологический анализ, дот-блоттинг и FACS). В некоторых вариантах осуществления способы данного раскрытия выполняются в механизированной или роботизированной манере. В некоторых вариантах осуществления сигналы от
нескольких образцов определяются одновременно.
Специалисту в данной области техники также известно, что наличие или отсутствие биомаркеров в клетке можно определять при помощи любого класса маркеро-специфических связывающих реагентов, известных в области техники, включая, например, антитела, аптамеры, химерные белки, включая белковый рецептор или компоненты белкового лиганда {например, CD 14 6, vWF, CD 31, CD 34, CD 105 или CD 45-связывающие рецепторы или лиганды) , биомаркер-специфические пептиды, связывающие малые молекулы вещества или нуклеиновые кислоты {например, антисмысловые олигонуклеотиды, гибридизационные зонды).
В некоторых вариантах осуществления наличие или отсутствие vWF, CD 146, CD 31, CD 34, CD 105, CD 45 или цитокератина {например, цитокератина 1, 4, 5, б, 7, 8, 10, 13, 18, или 19) или их комбинаций определяют при помощи антитела. В некоторых вариантах осуществления наличие или отсутствие vWF и одного или более цитокератинов {например, цитокератина 1, 4, 5, б, 7, 8, 10, 13, 18, или 19) определяют при помощи антител. В некоторых вариантах осуществления наличие или отсутствие vWF, одного или более цитокератинов {например, цитокератина 1, 4, 5, б, 7, 8, 10, 13, 18, или 19) или CD 4 5 определяют при помощи антител.
Антитела данного раскрытия специфически связываются с биомаркером. В некоторых вариантах осуществления антитела специфически связываются с одним биомаркером {например, цитокератином 1) . В других вариантах осуществления антитела являются панспецифическими. Панспецифические антитела данного раскрытия могут специфически связываться с одним или более членами семейства биомаркеров {например, одним или более членами семейства цитокератинов, включая цитокератины 1, 4, 5, б, 7, 8, 10, 13, 18 и 19) . Антитело может представлять собой любой иммуноглобулин или его производное, как природного происхождения, так полностью или частично синтезированное. Можно применять все производные антител, которые сохраняют способность к специфическому связыванию. Антитело имеет домен связывания, который гомологичен или в большой степени гомологичен иммуноглобулин-связывающему домену и который может
быть получен из природных источников, а также частично или полностью синтезирован. Антитело представляет собой моноклональное или поликлональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой одноцепочечное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело включает фрагмент одноцепочечного антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело может представлять собой фрагмент антитела, включающий без ограничений Fab, Fab', F(ab')2, svFv, Fv, dsFv диатело и Fd фрагменты. Благодаря их меньшему размеру фрагменты антитела могут иметь преимущества по сравнению с интактными антителами при конкретных применениях. В качестве альтернативы или в дополнение антитело может включать несколько цепей, связанных друг с другом, например, при помощи дисульфидных связей, а также любые функциональные фрагменты, полученные от таких молекул, где такие фрагменты сохраняют свойства специфического связывания родительской молекулы антитела. Специалистам в данной области техники известно, что антитело может быть предоставлено в любой форме, включая, например, гуманизированную, частично гуманизированную, химерную, химерную гуманизированную и т.д. Антитело можно приготовить при помощи любых подходящих способов, известных в данной области техники. Например, антитело может быть изготовлено ферментным или химическим путем при помощи фрагментации интактного антитела, или оно может быть произведено при помощи рекомбинантной технологии из гена, кодирующего частичную последовательность антитела.
Большое количество детектируемых меток можно применять для
прямого или непрямого определения биомаркеров. Подходящие
детектируемые метки включают, но не ограничиваются
флуоресцентными красителями {например, флуоресцеином,
флуоресцеином изотиоцианатом (FITC), Oregon Green(tm), родамином, техасским красным, тетрародамином изотиоцианатом (TRITC), СуЗ, Су5, Alexa Fluor(r) 647, Alexa Fluor(r) 555, Alexa Fluor(r) 488), флуоресцентными белковыми маркерами {например, зеленым флуоресцентным белком (GFP), фикоэритрином), ферментами
{например, люциферазой, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, и т.д.), наночастицами, биотином, дигоксигенином, металлами и т.п.
В некоторых вариантах осуществления биомаркеры представляют собой флуоресцентные маркеры. В некоторых вариантах осуществления биомаркеры представляют собой иммунофлуоресцентные маркеры. В некоторых вариантах осуществления биомаркеры представляют собой маркеры для флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
В некоторых вариантах осуществления иммунофлуоресцентные
маркеры представляют собой маркеры для иммунофлуоресцентного
анализа. В некоторых вариантах осуществления
иммунофлуресцентные маркеры представляют собой маркеры для иммунофлуоресцентного определения. В некоторых вариантах осуществления иммунофлуресцентные маркеры представляют собой маркеры для иммунофлуоресцентного определения РЦК. В некоторых вариантах осуществления иммунофлуресцентные маркеры для определения РЦК представляют собой маркеры для иммунофлуоресцентного определения ЦОК. В некоторых вариантах осуществления иммунофлуресцентные маркеры для определения РЦК представляют собой маркеры для иммунофлуоресцентного определения ЦЭК.
В некоторых вариантах осуществления маркеры для иммунофлуоресцентного определения ЦОК включают цитокератин (СК). Цитокератины включают, например, цитокератин 1, 4, 5, б, 7, 8, 10, 13, 18 или 19. В некоторых вариантах осуществления маркеры для иммунофлуоресцентного определения ЦОК представляют собой множество цитокератинов, включая два или более цитокератинов 1, 4, 5, б, 7, 8, 10, 13, 18 или 19.
В некоторых вариантах осуществления маркеры для иммунофлуоресцентного определения ЦЭК включают фактор Виллебранда (vWF), кластер дифференцировки (CD) 31, CD 34, CD 105, CD 145 или CD 146.
В некоторых клетках маркеры клетки образца представляют собой иммунофлуоресцентные маркеры клетки образца. В некоторых вариантах осуществления иммунофлуоресцентные маркеры клетки
образца являются специфическими для белых клеток крови
(лейкоцитов). В некоторых вариантах осуществления
иммунофлуоресцентные маркеры клетки образца включают CD 45. В некоторых вариантах осуществления способы включают определение наличия или отсутствия одного или более иммунофлуоресцентных маркеров клетки образца в ядерных клетках.
В некоторых вариантах осуществления четкое
иммунофлуоресцентное окрашивание ядерных клеток образца
включает наличие или отсутствие маркеров для
иммунофлуоресцентного определения, таких как маркеры для иммунофлуоресцентного определения РЦК.
В некоторых вариантах осуществления четкое
иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК включает наличие маркера иммунофлуоресцентного определения ЦОК, отсутствие маркера иммунофлуоресцентного определения ЦЭК, а также отсутствие маркера иммунофлуоресцентного определения клетки образца. В некоторых вариантах осуществления четкое иммунофлуоресцентное окрашивание ЦОК включает позитивное окрашивание СК, негативное окрашивание vWF, а также негативное окрашивание CD4 5 (CK+/vWF~ /CD45") .
В некоторых вариантах осуществления четкое
иммунофлуоресцентное окрашивание ЦЭК включает наличие маркера иммунофлуоресцентного определения ЦЭК, отсутствие маркера иммунофлуоресцентного определения ЦОК, а также отсутствие маркера иммунофлуоресцентного определения клетки образца. В некоторых вариантах осуществления четкое иммунофлуоресцентное окрашивание ЦЭК включает позитивное окрашивание vWF, негативное окрашивание СК, а также негативное окрашивание CD45 (vWF+/CK~ /CD45") .
В некоторых вариантах осуществления четкое
иммунофлуоресцентное окрашивание мимиков ЦОК включает наличие маркера иммунофлуоресцентного определения ЦОК, наличие маркера иммунофлуоресцентного определения ЦЭК, а также отсутствие маркера иммунофлуоресцентного определения клетки образца. В некоторых вариантах осуществления четкое иммунофлуоресцентное окрашивание мимиков ЦОК включает позитивное окрашивание СК,
негативное окрашивание vWF, а также негативное окрашивание CD45
(CK+/VWFVCD45-) .
В некоторых вариантах осуществления четкое
иммунофлуоресцентное окрашивание кандидатов ЦОК включает наличие маркера иммунофлуоресцентного определения ЦОК, отсутствие маркера иммунофлуоресцентного определения ЦЭК, а также отсутствие маркера иммунофлуоресцентного определения клетки образца. В некоторых вариантах осуществления четкое иммунофлуоресцентное окрашивание кандидатов ЦОК включает наличие маркера иммунофлуоресцентного определения ЦОК, наличие маркера иммунофлуоресцентного определения ЦЭК, а также отсутствие маркера иммунофлуоресцентного определения клетки образца. В некоторых вариантах осуществления четкое иммунофлуоресцентное окрашивание кандидатов ЦОК включает позитивное окрашивание СК и негативное окрашивание CD45
(CK+/CD45-) .
В некоторых вариантах осуществления четкое
иммунофлуоресцентное окрашивание клетки образца включает наличие маркера иммунофлуоресцентного определения клетки образца, отсутствие маркера иммунофлуоресцентного определения ЦЭК, а также отсутствие маркера иммунофлуоресцентного определения ЦОК.
В некоторых вариантах осуществления четкое
иммунофлуоресцентное окрашивание ЦЭК, ЦОК, мимиков ЦОК, кандидатов ЦОК или клетки образца включает четкие паттерны внутриклеточного окрашивания для маркера иммунофлуоресцентного определения ЦЭК, маркера иммунофлуоресцентного определения ЦОК или маркера иммунофлуоресцентного определения клетки образца. Например, внутриклеточное окрашивание для иммунофлуоресцентного маркера данного раскрытия может быть четко диффузным, прерывистым, цитоплазматическим, ядерным или мембраносвязанным.
В некоторых вариантах осуществления определение наличия или отсутствия маркера иммунофлуоресцентного определения РЦК включает сравнение четкого иммунофлуоресцентного окрашивания РЦК с четким иммунофлуоресцентным окрашиванием лейкоцитов.
В некоторых вариантах осуществления определение наличия
или отсутствия маркера иммунофлуоресцентного определения ЦОК
включает сравнение четкого иммунофлуоресцентного окрашивания
кандидатов ЦОК с четким иммунофлуоресцентным окрашиванием
клетки образца. В некоторых вариантах осуществления определение
наличия или отсутствия маркера иммунофлуоресцентного
определения ЦОК включает сравнение четкого
иммунофлуоресцентного определения кандидатов ЦОК с четким иммунофлуоресцентным окрашиванием лейкоцитов.
В некоторых вариантах осуществления определение наличия
или отсутствия маркера иммунофлуоресцентного определения ЦЭК
включает сравнение четкого иммунофлуоресцентного окрашивания
кандидатов ЦЭК с четким иммунофлуоресцентным окрашиванием
клетки образца. В некоторых вариантах осуществления определение
наличия или отсутствия маркера иммунофлуоресцентного
определения ЦЭК включает сравнение четкого
иммунофлуоресцентного окрашивания кандидатов ЦОК с четким иммунофлуоресцентным окрашиванием лейкоцитов.
В некоторых вариантах осуществления морфологические характеристики включают размер ядра, форму ядра, размер клетки, а также ядерно-цитоплазматическое соотношение. В некоторых вариантах осуществления оценка морфологии РЦК включает оценку РЦК деталей ядра, контура ядра, наличия или отсутствия ядрышка, качества цитоплазмы, количества цитоплазмы или паттернов иммунофлуоресцентного окрашивания. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает оценку агрегационных характеристик РЦК.
Специалисту в данной области техники известно, что морфологические характеристики данного раскрытия могут включать любые свойства, качества, характеристики или аспекты клетки, которые можно определить и которые связаны с определением РЦК.
Способы данного раскрытия могут осуществляться при помощи любого метода микроскопии, известного в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления способ осуществляется при помощи флуоресцентной сканирующей микроскопии. В некоторых вариантах осуществления микроскопический метод предоставляет изображения РЦК, а также окружающих их лейкоцитов высокого
разрешения (см., например, Marrinucci D. с соавт., 2012, Phys. Biol. 9 016003; Nieva J. с соавт., 2012, Phys. Biol. 9 016004). В некоторых вариантах осуществления стекло, покрытое монослоем ядерных клеток из образца, такого как необогащенный образец крови, сканируют при помощи флуоресцентного сканирующего микроскопа и регистрируют интенсивность флуоресценции от маркеров для иммунофлуоресцентного определения и ядерного окрашивания. Полученные сканируемые изображения анализируют для определения наличия или отсутствия маркеров для иммунофлуоресцентного определения, а также для оценки морфологии ядерных клеток, включая РЦК. В некоторых вариантах осуществления сбор данных микроскопии и их анализ проводят в автоматизированной форме.
В некоторых вариантах осуществления поле зрения микроскопа содержит РЦК и лейкоциты. В некоторых вариантах осуществления в поле зрения микроскопа находится по меньшей мере 1, 5, 10, 20, 50 или 100 РЦК. В некоторых вариантах осуществления в поле зрения микроскопа находится по меньшей мере в 10, 25, 50, 100, 250, 500 или 1000 раз большее число лейкоцитов по сравнению с РЦК. В некоторых вариантах осуществления в поле зрения микроскопа находятся РЦК, где каждая РЦК окружают по меньшей мере 10, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000 или более лейкоцитов.
В некоторых вариантах осуществления микроскопия предоставляет поле зрения, включающее более 2, 5, 10, 20, 30, 4 0 или 50 РЦК, где каждую РЦК окружают более 10, 50, 100, 150 или 2 00 лейкоцитов. В некоторых вариантах осуществления микроскопия предоставляет поле зрения, включающее более 10 РЦК, где каждую РЦК окружают более 2 00 лейкоцитов.
В некоторых вариантах осуществления биомаркер считают "присутствующим" в клетке, если его определяемый уровень сигнала и шума выше соответствующих исходных показателей используемого метода определения {например, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз или в 10 раз выше фонового сигнала; на 2а или За выше фона). В некоторых вариантах осуществления биомаркер считают
"отсутствующими", если он не определяется за исходным шумом используемого метода определения {например, в <1,5 раза или <2,0 раза выше сигнала излучения фона; на <1,5а или <2,0а выше фона).
В некоторых вариантах осуществления наличие или отсутствие
иммунофлуоресцентных маркеров в ядерных клетках определяют
путем выбора времени экспозиции в течение периода
флуоресцентного сканирования таким образом, чтобы все
иммунофлуоресцентные маркеры достигли предварительно
установленного уровня флуоресценции на фоне лейкоцитов в поле зрения. В этих условиях маркеры для флуоресцентного определения РЦК, например, являются видимыми на фоне лейкоцитов в виде сигнала излучения фона фиксированной высоты, даже несмотря на то, что соответствующие маркеры для иммунофлуоресцентного определения не присутствуют в лейкоцитах. Более того, лейкоцито-специфические маркеры для иммунофлуоресцентного определения клетки образца являются видимыми на фоне РЦК в виде сигналов излучения фона фиксированной высоты, даже несмотря на то, что маркеры не присутствуют в РЦК.
Клетка считается позитивной на предмет наличия иммунофлуоресцентного маркера (т.е, маркер считается присутствующим в клетке), если ее флуоресцентный сигнал для соответствующего маркера значительно выше фиксированного сигнала излучения фона {например, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз или в 10 раз выше фонового сигнала; на 2а или За выше) . Например, ядерные клетки считаются CD 4 5-позитивными (CD45+) , если их флуоресцентный сигнал для CD 4 5 значительно выше сигнала излучения фона. Клетка считается негативной по иммунофлуоресцентному маркеру (т.е., маркер считается отсутствующим), если флуоресцентный сигнал клетки для соответствующего маркера незначительно выше сигнала излучения или шума фона {например, в <1,5 раза или <2,0 раза выше сигнала излучения фона; на <1,5а или <2,0а выше фона).
Уровни относительной экспрессии маркера
иммунофлуоресцентного определения РЦК можно выразить путем
сравнения флуоресцентного сигнала клетки, которая является позитивной по соответствующему маркеру {например, ЦОК, кандидата ЦОК, мимика ЦОК или ЦЭК) с соответствующим флуоресцентным сигналом окружающих клеток, которые являются негативными по маркеру иммунофлуоресцентного определения РЦК {например, лейкоцитов). Например, относительная экспрессия маркера ЦОК цитокератина на данном кандидате ЦОК составляет > 5, если флуоресцентный сигнал цитокератина на клетки в 5 раз выше, чем, например, средний сигнал или медиана флуоресцентного сигнала окружающих лейкоцитов.
Клетка считается ядерной клеткой, если она демонстрирует флуоресцентный сигнал при ядерном окрашивании {например, DAPI), который значительно превышает сигнал излучения фона или шума, например, такого, который определяют для безъядерного тромбоцита или для соответствующих не содержащих клетки областей на предметном стекле.
В некоторых вариантах осуществления определение наличия маркера иммунофлуоресцентного определения ЦОК в ядерных клетках включает определение ядерных клеток, имеющих относительную экспрессию маркеров определения ЦОК > 2, > 3, > 4, > 5, > б, > 7, > 8, > 9 или > 10. В некоторых вариантах осуществления определение наличия СК в ядерных клетках включает определение ядерных клеток, имеющих относительную экспрессию СК> 3.
В некоторых вариантах осуществления определение наличия маркера иммунофлуоресцентного определения ЦЭК в кандидатах ЦОК включает определение кандидатов ЦОК, имеющих относительную экспрессию маркеров определения ЦЭК > 2, > 3, > 4, > 5, > б, > 7, > 8, > 9 или > 10. В некоторых вариантах осуществления определение наличия vWF в кандидатах ЦОК включает определение клеток-кандидатов, имеющих относительную экспрессию vWF> 6.
В некоторых вариантах осуществления морфологическая оценка
ядерных клеток, такая как определение их размера или формы,
основывается на флуоресцентных сигналах маркера
иммунофлуоресцентного определения {см., например, Marrinucci D. с соавт., 2012, Phys. Biol. 9 016003; Nieva J. с соавт., 2012, Phys. Biol. 9 016004).
В некоторых вариантах осуществления РЦК морфологически отличаются от окружающих их ядерных клеток, таких как лейкоциты. В некоторых вариантах осуществления оценка морфологии ядерных клеток включает сравнение морфологических характеристик РЦК с морфологическими характеристиками окружающих лейкоцитов.
В некоторых вариантах осуществления ЦОК, мимики ЦОК,
кандидаты ЦОК и ЦЭК морфологически отличаются от окружающих их
лейкоцитов. В некоторых вариантах осуществления оценка
морфологии кандидатов ЦОК включает сравнение морфологических
характеристик кандидатов ЦОК с морфологическими
характеристиками окружающих лейкоцитов.
В некоторых вариантах осуществления ЦОК, мимики ЦОК, кандидаты ЦОК и ЦЭК морфологически отличаются друг от друга. В некоторых вариантах осуществления оценка морфологии кандидатов ЦОК включает сравнение морфологических характеристик кандидатов ЦОК с морфологическими характеристиками ЦОК. В некоторых вариантах осуществления оценка морфологии кандидатов ЦОК включает сравнение морфологических характеристик кандидатов ЦОК с морфологическими характеристиками ЦЭК.
Морфологические свойства, характерные для ЦОК и мимиков ЦОК, включают, например, без ограничений наличие четких и интактных ядер, наличие ядер неправильной формы, наличие конденсированного хроматина, области ядра, превышающей по размеру область ядра в лейкоцитах, области цитоплазмы, превышающей по размеру область цитоплазмы в лейкоцитах более высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение по сравнению с лейкоцитами, наличие агрегатов двух или более цитокератин-позитивных (СК+) клеток или комбинации вышеперечисленных свойств.
Морфологические свойства, характерные для ЦЭК и мимиков ЦОК включают, например, без ограничений наличие ядер неправильной формы, наличие продолговатых ядер, наличие вытянутой цитоплазмы, области ядра, превышающей по размеру область ядра в лейкоцитах, области цитоплазмы, превышающей по размеру область цитоплазмы в лейкоцитах более высокое ядерно
цитоплазматическое соотношение по сравнению с лейкоцитами, наличие агрегатов двух или более цитокератин-позитивных (vWF+) клеток или комбинации вышеперечисленных свойств.
В некоторых вариантах осуществления (среднее арифметическое или среднее) значение области ядра в РЦК в поле зрения микроскопа по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% превышает область ядра в лейкоцитах.
В некоторых вариантах осуществления (среднее арифметическое или среднее) значение области цитоплазмы в РЦК в поле зрения микроскопа по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% превышает область цитоплазмы в лейкоцитах.
В некоторых вариантах осуществления (среднее арифметическое или среднее) ядерно-цитоплазматическое соотношение в РЦК в поле зрения микроскопа по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% превышает ядерно-цитоплазматическое соотношение в лейкоцитах.
В некоторых вариантах осуществления (также называемых
Анализом РЦК "высокого разрешения (HD)") сравнение РЦК (т.е.,
представляющих интерес клеток-мишеней) с окружающими
лейкоцитами (т.е., клетками отрицательного контроля) улучшает
эффективность способа, например, путем повышения точности,
специфичности или чувствительности способа по сравнению со
способами, где такое сравнение не производится. В некоторых
вариантах осуществления РЦК сравнивают с окружающими
лейкоцитами при определении наличия или отсутствия маркера
иммунофлуоресцентного определения РЦК. В некоторых вариантах
осуществления РЦК сравнивают с окружающими лейкоцитами, когда
оценивают морфологию ядерных клеток. В некоторых вариантах
осуществления РЦК сравнивают с окружающими лейкоцитами при
определении наличия или отсутствия маркера
иммунофлуоресцентного определения РЦК и при оценке морфологии ядерных клеток.
В некоторых вариантах осуществления оценка морфологии ядерных клеток включает оценку морфологии агрегатов РЦК. В некоторых вариантах осуществления оценка морфологии агрегатов
РЦК включает подсчет агрегатов РЦК в образце крови. В некоторых вариантах осуществления оценка морфологии агрегатов РЦК включает оценку доли определенных РЦК, которые находятся в форме агрегатов. В некоторых вариантах осуществления оценка морфологии агрегатов РЦК включает подсчет среднего количества или среднего числа клеток на агрегат в образце.
В некоторых вариантах осуществления способы применяют для подсчета концентрации РЦК в образце {например, в [РЦК/мл]. Например, определение ЦОК в образце крови человека производят в соответствии со способами данного раскрытия. Далее в поле зрения определяют отношение ЦОК к общему количеству ядерных клеток {например, ЦОК, кандидатов ЦОК, мимиков ЦОК, ЦЭК плюс клеток образца, таких как лейкоциты). Далее соотношение мимиков ЦОК к общему количеству ядерных клеток умножают на концентрацию общего количества ядерных клеток в образце крови {например, как определяют при помощи стандартного автоматизирована устройства для подсчета клеток) для подсчета концентрации мимиков ЦОК в образце крови.
В соответствии со способами данного раскрытия РЦК можно дополнительно анализировать после их определения, а также опционально подсчитывать при помощи способа данного раскрытия.
В некоторых вариантах осуществления способы данного раскрытия включают гашение окрашивания одного или более маркеров определения РЦК, включающее контактирование РЦК с буфером-гасителем, где окрашивание гасится более, чем на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%.
В некоторых вариантах осуществления способы данного
раскрытия включают гашение иммунофлуоресценции одного или более
маркеров для иммунофлуоресцентного определения РЦК, включающее
контактирование РЦК с буфером-гасителем, где
иммунофлуоресценция гасится более, чем на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%.
В некоторых вариантах осуществления буфер-гаситель содержит хаотропное средство. Термин "хаотропное средство", как применяют в данной заявке, относится к веществу, которое может
разрушать вторичную или третичную структуру биологических макромолекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты {например, ДНК, РНК), или растворять бислои липидов, например, цитоплазматические мембраны. Хаотропные средства включают без ограничения хаотропные соли {например, гаунидина хлорид
(гуанидингидрохлорид), перхлорат лития, ацетат лития, хлорид магния, додецилсульфат натрия), хаотропные растворители
{например, бутанол, этанол) или незаряженные твердые хаотропы
{например, мочевину, тиомочевину).
В некоторых вариантах осуществления концентрация хаотропного средства составляет менее 10 моль, менее 8 моль, менее б моль, менее 4 моль, менее 2 моль, менее 1 моль или менее 0,5 моль. В некоторых вариантах осуществления концентрация хаотропного средства составляет по меньшей мере 0,5 моль, по меньшей мере 1 моль, по меньшей мере 2 моль, по меньшей мере 4 моль, по меньшей мере б моль или по меньшей мере
8 моль.
В некоторых вариантах осуществления буфер-гаситель содержит хаотропную соль. В некоторых вариантах осуществления буфер-гаситель содержит гуанидин или гуанидиниевую соль. В некоторых вариантах осуществления буфер-гаситель содержит гуанидина тиоцианат (гуанидинтиоцианат) или гуанидина хлорид (гуанидингидрохлорид).
В некоторых вариантах осуществления РЦК контактируют с буфером-гасителем в течение периода времени, превышающего 1 минуту, превышающего 2 минуты, превышающего 3 минуты, превышающего 4 минуты, превышающего 5 минут, превышающего б минут, превышающего 7 минут, превышающего 8 минут, превышающего
9 минут, превышающего 10 минут, превышающего 15 минут или превышающего 2 0 минут. В некоторых вариантах осуществления РЦК контактируют с буфером-гасителем в течение периода времени, равного менее чем 1 минуте, менее чем 45 секундам, менее чем 30 секундам, менее чем 15 секундам, менее чем 10 секундам или менее чем 5 секундам.
В некоторых вариантах осуществления РЦК контактируют с
буфером-гасителем при температуре менее 37°С, менее 34°С, менее 30°С, менее 25°С, менее 20°С, менее 15°С, менее 10°С, менее 5°С или менее 1°С. В некоторых вариантах осуществления РЦК контактируют с буфером-гасителем при температуре приблизительно 4°С.
В некоторых вариантах осуществления РЦК определяют в необогащенном образце крови, помещенном на плоскую подложку {например, на предметное стекло). В некоторых вариантах осуществления фракцию РЦК, определенную в анализе HD-РЦК, смывают с плоской подложки во время инкубирования с буфером-гасителем. Данные клетки являются физически недоступными для дальнейшего анализа.
В некоторых вариантах осуществления более 50%, более 55%, более 60%, более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 95% или более 99% определенных РЦК, которые присутствуют на плоской подложке до инкубирования с буфером-гасителем, сохраняются на плоской подложке после инкубирования с буфером-гасителем.
В некоторых вариантах осуществления более 50%, более 55%, более 60%, более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 95% или более 99% РЦК, которые определяют в образце крови при помощи способа данного раскрытия, физически присутствуют для проведения дальнейшего анализа после инкубирования с буфером-гасителем.
В некоторых вариантах осуществления более 25%, более 30%, более 35%, более 40%, более 45%, более 50%, более 55%, более 60%, более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 95% или более 99% РЦК, определенных на этапе (а) способа данного раскрытия, сохраняются на этапе (с) способа данного раскрытия.
В некоторых вариантах осуществления способы включают анализирование определенных РЦК путем определения наличия или отсутствия одного или более флуоресцентных маркеров для анализа РЦК. В некоторых вариантах осуществления маркеры для анализа РЦК присутствуют у более, чем 25%, более чем 30%, более, чем
35%, более, чем 40%, более, чем 45%, более, чем 50%, более, чем 55%, более, чем 60%, более, чем 65%, более, чем 70%, более, чем 75%, более, чем 80%, более, чем 85%, более, чем 90%, более, чем 95%, или более, чем 99% РЦК, проанализированных на этапе (с) способа данного раскрытия.
В некоторых вариантах осуществления определение наличия или отсутствия флуоресцентных маркеров для анализа РЦК включает сравнение четкого флуоресцентного окрашивания РЦК с четким флуоресцентным окрашиванием лейкоцитов.
Маркер для анализа РЦК может включать любую молекулярную
пробу, которая показывает цитобиологический или молекулярный
биологический статус РЦК. Цитобиологический или молекулярный
биологический статус РЦК может включать без ограничений
морфологические характеристики клетки, динамические свойства
клетки (например, клеточную подвижность, адгезию к субстратам
внеклеточного матрикса), внутриклеточную локализацию или
структурные характеристики {например, внутриклеточную
локализацию органелл, биомолекул; образование и локализацию биомолекулярных скоплений, таких как липидные рафты), метаболические характеристики {например, энергетический метаболизм, внутриклеточную передачу сигнала), характеристики генома {например, экспрессию гена, мутации гена, сплайсинг РНК) или протеомные характеристики (экспрессию белка, локализацию, посттрансляционную модификацию, секретомный профиль).
В некоторых вариантах осуществления маркер для анализа РЦК включает генетическую мутацию {например, делецию, удвоение, амплификацию, транслокацию, точечную мутацию гена). В некоторых вариантах осуществления маркер для анализа РЦК включает повышенную экспрессию представляющего интерес гена (например, онкогена). В некоторых вариантах осуществления маркер для анализа РЦК включает сниженную экспрессию представляющего интерес гена (например, гена-супрессора опухолевого роста). В некоторых вариантах осуществления маркер для анализа РЦК включает повышенную экспрессию представляющей интерес мРНК. В некоторых вариантах осуществления маркер для анализа РЦК включает повышенную экспрессию представляющего интерес белка
{например, HER2, Bcl-2). В некоторых вариантах осуществления
маркер для анализа РЦК включает специфическую внутриклеточную
локализацию представляющего интерес белка {например, ядерную
локализацию, цитоплазматическую локализацию). В некоторых
вариантах осуществления маркер для анализа РЦК включает
посттрансляционную модификацию белка {например,
фосфорилирование, метилирование).
В некоторых вариантах осуществления маркер для анализа РЦК представляет собой генетическую мутацию, включая транслокацию гена, инверсию гена, амплификацию гена, делецию гена, анеуплоидию гена или хромосомную анеуплоидию.
В некоторых вариантах осуществления маркер для анализа РЦК представляет собой онкоген. Онкогены включают без ограничений PTEN, ALK, PIK3CA, MET, ROS, RET, HER2, ERG, AURKA, BRCA 1, BRCA 2, P53, RAS, RAF, EGFR, HER2, WNT, MYC, FAS, TRK, CDK, SRC, SYK, ВТК и ABL.
В некоторых вариантах осуществления маркер для анализа РЦК представляет собой маркер положительного контроля. Маркер положительного контроля может представлять собой любой молекулярный или клеточный маркер, который предположительно будет присутствовать практически на каждой клетке в представляющей интерес популяции РЦК, например, в любой РЦК, находящейся в поле зрения микроскопа. В некоторых вариантах осуществления маркер положительного контроля представляет собой хромосомный маркер {например, маркер для хромосом человека 10, 15, 5, 3 и т.п. В некоторых вариантах осуществления маркер положительного контроля представляет собой маркер теломера.
В некоторых вариантах осуществления определение наличия или отсутствия маркера положительного контроля является показателем того, подходит ли представляющая интерес клетка, например, РЦК в поле зрения микроскопа, для дальнейшего анализа после определения РЦК при помощи анализа HD-РЦК данного раскрытия. Без стремления быть привязанными к какой-либо теории считают, что РЦК, которые успешно определены на этапе (а) способа данного раскрытия, но в которых невозможно определить маркер положительного контроля на этапе (с) способа данного
раскрытия, были повреждены во время стадии гашения (Ь) таким образом, что данные РЦК непригодны для дальнейшего молекулярного или клеточного анализа. И напротив, РЦК, которые были успешно определены и в которых можно определить маркер положительного контроля, пригодны для дальнейшего анализа.
В некоторых вариантах осуществления наличие маркера положительной контрольной пробы определяется у более 25%, более 30%, более 35%, более 40%, более 45%, более 50%, более 55%, более 60%, более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 95% или более 99% определенных РЦК, проанализированных на этапе (с).
Наличие или отсутствие маркера анализа РЦК в клетке можно определить, применяя любой класс маркер-специфических связывающих веществ (зонды анализа РЦК), известный в области техники, включая, например, антитела, аптамеры, химерные белки, такие как химерные белки, включающие белковый рецептор или компоненты белкового лиганда, маркер-специфические пептиды, связывающие малые молекулы вещества или нуклеиновые кислоты {например, антисмысловые олигонуклеотиды, гибридизационные зонды).
Маркеры для анализа РЦК можно определить при помощи
способов, таких как флуоресцентная сканирующая микроскопия,
масс-спектрометрия, генные чипы, белковые чипы,
иммуногистохимический анализ, секвенирование всего генома и т.п. В некоторых вариантах осуществления наличие или отсутствие маркера РЦК определяют при помощи определения вариантов числа копий гена, при помощи секвенирования экзома, при помощи мутационного анализа генов биомаркеров или при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В некоторых вариантах осуществления маркер для анализа РЦК представляет собой несколько маркеров для анализа РЦК.
В некоторых вариантах осуществления маркер для анализа РЦК представляет собой маркер флуоресцентного анализа.
В некоторых вариантах осуществления маркер для анализа РЦК представляет собой маркер флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). В некоторых вариантах осуществления FISH маркер
представляет собой хромосомный маркер генетических отклонений, включая без ограничения слияние гена, анеуплоидию, а также потерю участков хромосом. В некоторых вариантах осуществления FISH маркер представляет собой хромосомный маркер генетических мутаций, включая транслокацию гена, амплификацию гена, а также делеции гена. В некоторых вариантах осуществления FISH маркер представляет собой маркер положительного контроля.
В некоторых вариантах осуществления наличие или отсутствие FISH маркера определяют при помощи FISH зонда. В некоторых вариантах осуществления FISH зонды включают синтетические олигонуклеотиды ДНК, связанные с флуоресцентным красителем. Специалисту в данной области техники известно, что многие флуоресцентные красители для FISH зондов хорошо известны в данной области техники и включают без ограничений SpectrumOrange(tm), SpectrumGreen(tm) и SpectrumAqua(tm). В некоторых вариантах осуществления FISH зонд связывается с молекулой ДНК
(ДНК-FISH). В некоторых вариантах осуществления FISH зонд связывается с молекулой РНК (РНК-FISH).
FISH зонды включают без ограничений локус-специфические зонды, каждый из которых связывается с определенным участком хромосомы, альфоидные или центромерные зонды-повторы, которые образуются из повторяющихся последовательностей, обнаруживаемых в центре каждой хромосомы, а также зонды на всю хромосому, которые включают набор из более маленьких зондов, каждый из которых связывается с различной последовательностью на протяжении данной хромосомы. Другие FISH зонды включают без ограничения зонды, окрашивающие целую хромосому (WPP), зонды, окрашивающие плечо хромосомы (АРР), зонды, окрашивающие хромосомные участки (ТРР), зонды для подсчета хромосом (СЕР), субтеломерные зонды (CSP), а также локус-специфические зонды
(CLP), также часто называемые LSI (локус-специфическими идентификационными) зондами.
FISH зонды можно применять отдельно или в комбинации с другими FISH зондами или с другими зондами для анализа РЦК. Комбинации FISH зондов могут включать более 2 зондов, более 3
зондов, более 4 зондов, более 5 зондов, более б зондов, более 7 зондов, более 9 зондов, более 9 зондов, более 10 зондов, более 15 зондов, более 20 зондов, более 25 зондов, более 50 зондов, более 75 зондов или более 100 зондов. В некоторых вариантах осуществления комбинации FISH зондов включают одноцветные зонды, двухцветные зонды, трехцветные зонды или четырехцветные зонды.
В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают контактирование РЦК с FISH зондом. В некоторых вариантах осуществления РЦК контактируют с FISH зондом в течение более чем 1 минуты, более чем 1 минуты, более чем 2 минут, более чем 3 минут, более чем 4 минут, более чем 5 минут, более чем б минут, более чем 7 минут, более чем 8 минут, более чем 9 минут, более чем 10 минут, более чем 15 минут или более чем 2 0 минут.
В некоторых вариантах осуществления РЦК контактируют с FISH зондом при температуре приблизительно выше 35°С, приблизительно выше 37°С, приблизительно выше 4 0°С, приблизительно выше 42°С, приблизительно выше 44°С или приблизительно выше 4б°С.
В некоторых вариантах осуществления анализирование определенных РЦК дополнительно включает оценку морфологии определенных РЦК. В некоторых вариантах осуществления обработка РЦК буфером-гасителем не меняет в значительной степени морфологические характеристики РЦК.
В некоторых аспектах способы данного раскрытия применяют для определения, подсчета и определения характеристик РЦК в необогащенных образцах крови для пациентов.
В некоторых вариантах осуществления необогащенный образец крови представляет собой несколько необогащенных образцов крови. В некоторых вариантах осуществления маркеры для анализа РЦК присутствуют у более чем 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% проанализированных РЦК в более чем 80%, 85%, 90%, 95% или 99% образцов крови из нескольких образцов крови. В некоторых
вариантах осуществления несколько необогащенных образцов крови получено от нескольких пациентов.
Из вышеизложенного описания очевидно, что могут иметь место вариации и модификации описанного в данной заявке изобретения для его адаптации к различным способам и условиям применения. Такие варианты осуществления также находятся в рамках следующей ниже формулы изобретения.
Раскрытие списка элементов по всем возможным параметрам определения в данной заявке включает определения данного параметра в виде любого единичного элемента или комбинации (или субкомбинации) перечисленных элементов. Раскрытие варианта осуществления данной заявки включает такой вариант осуществления в виде любого единичного варианта осуществления или в виде комбинации с любыми другими вариантами осуществления или их частей.
Все патенты и публикации, упомянутые в данном описании, включены в данную заявку посредством ссылки в такой же мере, как если бы каждый отдельный патент или публикация были конкретно и отдельно указаны включенными в материалы настоящей заявки посредством ссылки.
Следующие примеры предоставлены с иллюстративными, но не ограничивающими целями.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Определение, подсчет и определение характеристик ЦОК в необогащенных образцах крови, полученных от пациентов, страдающих раком.
Сначала образцы крови получают от трех пациентов с подтвержденным немелкоклеточным раком легких (NSCLC). Кандидаты ЦОК определяют в каждом образце, как описано, например, у Marrinucci D. с соавт. (2012), Phys. Biol. 9(1) 016003 или у Nieva J. с соавт. (2012), Phys. Biol. 9(1) 016004.
Если не вдаваться в подробности, образцы крови подвергают лизису красных клеток крови с последующим приготовлением монослоя ядерных клеток на стандартных стеклянных подложках. После фиксации параформальдегидом (PFA) и пермеабилизации метанолом клетки инкубируют с пан-антикератиновыми антителами,
распознающими цитокератины 1, 4, 5, б, 7, 8, 10, 13, 18 и 19, а
также предварительно конъюгированными анти-СБ4 5-антителом с
последующим инкубированием с А1еха(tm)555-конъюгированным
вторичным антителом и DAPI в качестве ядерного красителя. Все
ядерные клетки в образце отображаются в нескольких
флуоресцентных каналах для получения цифровых снимков высокого
качества и высокого разрешения, которые сохраняют хорошую
клеточную детализацию контура ядра и цитоплазматического
распределения. Клетки, которые являются как цитокератин-
позитивными (СК+) , так и CD45 негативными (CD45~) , определяют
при помощи стандартных компьютерных алгоритмов и далее
подвергают морфологическому анализу {например, анализируют их
ядерно-цитоплазматическое соотношение). Оценку клеток
производят путем прямого обзора захваченных микроскопических изображения и классифицируют как кандидаты ЦОК на основании клеточной морфологии {например, их низкого ядерно-цитоплазматического соотношения), а также иммунофенотипа (например, СК+/ CD4 5") .
Пример 2: FISH-анализ ЦОК у необогащенных образцах крови, полученных от пациентов, страдающих раком.
Данный пример демонстрирует, что ЦОК можно дополнительно анализировать на предмет их молекулярной биологии или цитобиологии после того, как произведено их определение при помощи анализа HD-ЦОК. Данный пример дополнительно демонстрирует, что эффективный буфер-гаситель представляет собой тот, который обеспечивает эффективное гашение иммунофлуоресцентного окрашивания (например, окрашивания маркеров для иммунофлуоресцентного определения ЦОК), в то же время сохраняя определенные ЦОК в состоянии, сохраняющем возможность их последующего анализа при помощи флуоресцентной гибридизации in situ (FISH анализ).
Протокол FISH после определения ЦОК при помощи анализа HD-
ЦОК
После протокола анализа HD-ЦОК, описанного выше, необогащенные образцы крови подвергают дальнейшему анализу, как
описано далее.
Покровные стекла удаляют с предметных стекол и помещают
последние в буфер-гаситель. Буферы-гасители, время
инкубирования и температура инкубирования описаны далее. Стекла
далее инкубируют на протяжении 5 минут в 5% растворе
формальдегида в фосфатно-солевом буфере (PBS). Далее стекла
переносят в 70% раствор этанола в воде, инкубируют в течение 2
минут, переносят в 85% раствор этанола в воде, инкубируют в
течение еще 2 минут, переносят в 100% раствор этанола и
инкубируют в течение следующих 2 минут. Задняя и боковые
поверхности стекла протирают мягкой тканью, и далее стекла
высушивают на воздухе. Далее на горизонтальную часть покровного
стекла наносят 20 мкл раствора FISH зонда (содержащего,
например, зонд гена-мишени, включая зонды PTEN или ERG, или
контрольный зонд, включая центромерные зонды), в
гибридизационном буфере, покровное стекло помещают на предметное стекло стороной с зондами. Раствор зонда распределяют до границ покровного стекла, и покровные стекла аккуратно сдавливают, чтобы избежать появления пузырьков воздуха. Границу далее запечатывают каучуковым клеем. За 10-минутным инкубированием при 8 3°С (что обеспечивает денатурацию ДНК) следует 1-24-часовое инкубирование при 37°С (что обеспечивает гибридизацию ДНК-FISH зонда). Покровные стекла далее удаляют и предметные стекла сначала помещают в раствор 0,4xSSC (стандартный солевой раствор)/0,3% Igepal, рН 7 на 2 минуты и далее переносят в раствор 2xSSC/0,l% Igepal, рН 7 на 1-10 минут. Предметные стекла удаляют, добавляют контрастный краситель DAPI и края покровного стекла запаивают при помощи лака для ногтей. Наконец, предметные стекла подвергают анализу при помощи флуоресцентной сканирующей микроскопии.
Сравнение буферов-гасителей
В типичных экспериментах определение ЦОК в необогащенных образцах крови включает иммунофлуоресцентное определение цитокератина (СК) . На удивление инкубирование образцов ЦОК с 4 моль буфера-гасителя гуанидина тиоцианата (GdnSCN) приводит к
эффективному уменьшению СК-иммунофлуоресценции и в то же время в большой степени сохраняет клеточную морфологию ЦОК {например, форму и размеры клеток, форму и размеры ядер) . См. , напримерг ФИГ. 1.
В типичных экспериментах время инкубирования в буфере-гасителе, равное приблизительно 5-10 минутам, является достаточным для достижения уменьшения СК-иммунофлуоресценции. Более того, температура инкубирования в буфере-гасителе между 4°С и комнатной температурой приводит к эффективному уменьшению СК-иммунофлуоресценции. Концентрации GdnSCN, равные всего 2 моль, оказываются достаточными для эффективного уменьшения СК-иммунофлуоресценции. См., напримерг ФИГ. 4.
Гашение СК-иммунофлуоресценции оказывается более эффективными по отношению к ЦОК, имеющим более низкую относительную экспрессию СК по сравнению с клетками, имеющих более высокую относительную экспрессию СК. В целом, буферы GdnSCN, как оказалось, гасят СК-иммунофлуоресценцию по меньшей мере на 75%. В некоторых экспериментах было достигнуто гашение иммунофлуоресценции вплоть до 90%, вплоть до 99% или более.
На удивление, инкубирование с буферами GdnSCN приводит к сохранению большинства предварительно определенных ЦОК на предметных стеклах. В целом, сохраняется более 60% предварительно определенных ЦОК. В некоторых экспериментах сохраняется более 70%, 80% и даже вплоть до 95% предварительно определенных ЦОК.
Обычно более 8 5% сохраненных ЦОК демонстрируют сигналы
FISH маркеров положительного контроля, например, маркера
центромера хромосомы 10. В некоторых экспериментах более 70%,
8 0% и даже вплоть до 95% предварительно определенных ЦОК
демонстрируют положительные сигналы FISH маркеров
положительного контроля.
Обнаружено, что удивляющая активность GdnSCN буфера зависит от наличия хаотропного средства гуанидина. Например, обнаружено, что буферы тиоцианата натрия (NaSCN) не гасят СК-иммунофлуоресценцию. См., напримерг ФИГ. 3.
В дополнение, обнаружено, что многие другие буферы, которые обычно применяют в протоколах молекулярной биологии или цитобиологии, также являются неэффективными гасителями СК-иммунофлуоресценции (см., например, ФИГ. 1, 2, 5, 6 и 7) или разрушают клеточную морфологию ЦОК (см., например, ФИГ. 5, центральная колонка).
Неэффективные буферы включают тиоцианат натрия (NaSCN), Thermo Scientific Restore(tm) отмывающий буфер для Вестерн-блоттинга, Глицин/SDS при рН 2, Глицин/SDS при рН 4, Глицин/SDS при рН 7, Глицин/SDS при рН 10 и другие трис-буферы, содержащие комбинации SDS, трис, бетамеркаптоэтанола или дитиотреитола (DTT).
Результаты типичного FISH эксперимента, проведенного на клетках необогащенного образца крови после определения ЦОК в анализе HD-ЦОК, а также гашения СК-иммунофлуоресценции при помощи 4 моль GdnSCN буферов продемонстрированы на ФИГ. 8.
Подводя итоги, можно сказать, что содержащие гуанидин буферы оказались эффективными в отношении гашения иммунофлуоресценции ЦОК после их определения в анализах HD-ЦОК, при этом сохраняя большую часть определенных ЦОК доступными для дальнейшего анализа, а также сохраняя клеточную морфологию ЦОК.
Хотя данное раскрытие описывается в отношении раскрытых вариантов осуществления, специалисту в данной области техники нетрудно понять, что конкретные примеры и исследования, подробно описанные выше, являются только иллюстрацией к данному раскрытию. Следует понимать, что можно производить различные модификации, при этом не отступая от сущности раскрытия. Соответственно, раскрытие ограничено только следующей формулой изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ анализирования редких циркулирующих клеток (РЦК)
в необогащенном образце крови, включающий (а) определение РЦК в
необогащенном образце крови, включающее i) определение наличия
или отсутствия одного или более маркеров для
иммунофлуоресцентного определения РЦК в ядерных клетках в
необогащенном образце крови, и ii) оценку морфологии ядерных
клеток, где производят определение РЦК среди ядерных клеток на
основании комбинации четкого иммунофлуоресцентного окрашивания
и морфологических характеристик; (Ь) гашение
иммунофлуоресценции одного или более маркеров для
иммунофлуоресцентного определения РЦК, включающее
контактирование РЦК с буфером-гасителем, где
иммунофлуоресценция гасится более, чем на 50%, 60%, 70%, 80%,
90%, 95%, 99%, 99,9% или 99, 99%; и (с) анализирование
определенных РЦК, включающее определение наличия или отсутствия
одного или более флуоресцентных маркеров для анализа РЦК.
2. Способ по п. 1, где маркеры для флуоресцентного анализа РЦК представляют собой маркеры для флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
3. Способ по п. 1, где более 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% РЦК, определяемых на этапе (а), сохраняются на этапе (с).
4. Способ по п. 1, где маркеры для флуоресцентного анализа РЦК представляют собой маркеры положительного контроля.
5. Способ по п. 4, где маркеры положительного контроля присутствуют у более, чем 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% проанализированных на этапе (с) РЦК.
6. Способ по п. 4, где маркеры положительного контроля представляют собой хромосомные маркеры.
7. Способ по п. 4, где маркеры положительного контроля представляют собой маркеры центромера ил маркеры теломера.
8. Способ по п. 1, где маркеры для анализа РЦК
представляют собой генетические мутации, выбираемые из группы,
состоящей из транслокации гена, амплификации гена, делеции
гена, генной анеуплоидии и хромосомной анеуплоидии.
9. Способ по п. 1, где анализирование определенных РЦК
дополнительно включает оценку морфологии определенных РЦК.
10. Способ по п. 1, где РЦК представляют собой циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК).
11. Способ по п. 1, где РЦК представляют собой циркулирующие эпителиальные клетки (ЦЭК).
12. Способ по п. 1, где РЦК представляют собой мимики ЦОК.
13. Способ по п. 1, где РЦК представляют собой кандидаты
ЦОК.
14. Способ по п. 1, где буфер-гаситель включает хаотропное средство.
15. Способ по п. 14, где концентрация хаотропного средства составляет по меньшей мере 2 моль, 3 моль или 4 моль.
16. Способ по п. 1, где буфер-гаситель включает хаотропную
соль .
17. Способ по п. 1, где буфер-гаситель включает гуанидин или гуанидиниевую соль.
18. Способ по п. 1, где буфер-гаситель включает гуанидина
тиоцианат (гуанидинтиоцианат) или гуанидина хлорид
(гуанидингидрохлорид).
19. Способ по п. 1, где РЦК контактируют с буфером-гасителем в течение периода времени, превышающего 1 минуту, превышающего 2 минуты, превышающего 3 минуты, превышающего 4 минуты, превышающего 5 минут, превышающего б минут, превышающего 7 минут, превышающего 8 минут, превышающего 9 минут, превышающего 10 минут, превышающего 15 минут или превышающего 2 0 минут.
20. Способ по п. 1, где проанализированные РЦК включают агрегаты РЦК.
21. Способ по п. 1, где определение РЦК производят на плоской подложке.
22. Способ по п. 1, где способ осуществляется при помощи флуоресцентной сканирующей микроскопии.
23. Способ по п. 22, где микроскопия предоставляет поле зрения микроскопа, включающее более 2, 5, 10, 20, 30, 40 или 50
17.
РЦК, где каждую РЦК окружают более 10, 50, 100, 150 или 2 00 лейкоцитов.
24. Способ по п. 1, где определение наличия или отсутствия маркеров для иммунофлуоресцентного определения РЦК включает сравнение четкого иммунофлуоресцентного окрашивания РЦК с четким иммунофлуоресцентным окрашиванием лейкоцитов.
25. Способ по п. 1, где определение наличия или отсутствия флуоресцентных маркеров для анализа РЦК включает сравнение четкого иммунофлуоресцентного окрашивания РЦК с четким иммунофлуоресцентным окрашиванием лейкоцитов.
26. Способ по п. 1, где иммунофлуоресцентные маркеры для определения РЦК представляют собой маркеры для флуоресцентного определения ЦОК.
27. Способ по п. 1, где маркеры для иммунофлуоресцентного определения ЦОК включают цитокератин (СК).
28. Способ по п. 1, где маркеры для флуоресцентного определения РЦК представляют собой маркеры для иммунофлуоресцентного определения ЦЭК.
29. Способ по п. 1, где маркеры для иммунофлуоресцентного определения ЦЭК включают фактор Виллебранда (vWF).
30. Способ по п. 1, где этап (а) дополнительно включает определение наличия или отсутствия одного или более иммунофлуоресцентных маркеров клеток образца в ядерных клетках.
31. Способ по п. 30, где иммунофлуоресцентные маркеры клеток образца являются специфическими для белых клеток крови (лейкоцитов).
32. Способ по п. 30, где иммунофлуоресцентные маркеры клеток образца включают CD 45.
33. Способ по п. 1, где оценка морфологии ядерных клеток включает сравнение морфологических характеристик РЦК с морфологическими характеристиками окружающих лейкоцитов.
34. Способ по п. 1, где морфологические характеристики включают размер ядра, форму ядра, размер клетки, форму клетки или ядерно-цитоплазматическое соотношение.
35. Способ по п. 1, где оценка морфологии ядерных клеток включает оценку ядерных клеток на предмет деталей ядра, контура
24.
ядра, наличия или отсутствия ядрышка, качества цитоплазмы, количества цитоплазмы или паттернов иммунофлуоресцентного окрашивания.
36. Способ по п. 1, дополнительно включающий начальную стадию получение образца крови от пациента.
37. Способ по п. 1, где образец крови получают от пациента, страдающего немелкоклеточным раком легких (NSCLC).
38. Способ по п. 1, где необогащенный образец крови представляет собой несколько необогащенных образцов крови.
39. Способ по п. 1, где несколько необогащенных образцов крови получают от нескольких пациентов.
По доверенности
статочное СК окрашивание
WBSB 5 минут WBcSTBe^r WBSC?e1lMM2HyT'
Остаточное СК окрашивание Н Остаточное СК окрашивание
сл со
CD CD
GdnSCN комнатная WBSB комнатная
температура температура
DAPI
Остаточное С К окрашивание
GdnSCN
NaSCN
DAPI
GdnSCN 4 моль
GdnSCN 3 моль
GdnSCN 2 моль
GdnSCN 1 моль
GdnSCN ГЛИЦ5Ио" fH 2)
SDS(1%)/rnnMHH (рН 2) предварительная фиксированный, комнатная температура
DAPI
Остаточное С К окрашивание *Клетки разрушены
GdnSCN
Глицин (рН 7) Глицин (рН 10)
комнатная температура комнатная температура
DAPI
Остаточное СК окрашивание
GdnSCN
ШЙШЙШ^тШШЙ11111111111111111111111[11ШТ1Ш11П1^^-
SDS(1%)/niMMMH (рН 2,2) комнатная температура
DAPI
Остаточное С К окрашивание
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
ФИГ. 1
ФИГ. 1
ФИГ. 1
ФИГ. 1
ФИГ. 2
ФИГ. 2
ФИГ. 2
ФИГ. 2
ФИГ. 3
ФИГ. 3
ФИГ. 3
ФИГ. 3
ФИГ. 3
ФИГ. 3
ФИГ. 4
ФИГ. 4
ФИГ. 4
ФИГ. 4
ФИГ. 5
ФИГ. 5
ФИГ. 5
ФИГ. 5
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 7
ФИГ. 7
ФИГ. 7
ФИГ. 7
ФИГ. 7
ФИГ. 7
ФИГ. 8
ФИГ. 8