EA201691580A1 20170228 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/201691580 Полный текст описания [**] EA201691580 20150310 Регистрационный номер и дата заявки CN201410085431.2 20140310 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок CN2015/073960 Номер международной заявки (PCT) WO2015/135467 20150917 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21702 Номер бюллетеня [**] ШЕСТНАДЦАТИЧЛЕННОЕ МАКРОЛИДНОЕ СОЕДИНЕНИЕ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Название документа [8] C07H 17/08, [8] A01N 43/90, [8] A01P 7/04, [8] A01P 7/02, [8] A01P 5/00 Индексы МПК [CN] Хуан Цзюнь, [CN] Ван Цзидун, [CN] Чжан Хуэй, [CN] Ван Линпин, [CN] Ли На, [CN] Ли Мэйхун, [CN] Бай Хуа, [CN] Цзинь Миньци Сведения об авторах [CN] ЧЖЭЦЗЯН ХИСУНЬ ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД., [CN] ЧЖЭЦЗЯН ХИСУНЬ КЕМИКАЛ КО., ЛТД. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201691580a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Шестнадцатичленное макролидное соединение, структура которого соответствует формуле (I), отличающееся тем, что R является CH 3 или C 2 H 5 , и применение указанного соединения. Настоящее соединение имеет разнообразные области применения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Шестнадцатичленное макролидное соединение, структура которого соответствует формуле (I), отличающееся тем, что R является CH 3 или C 2 H 5 , и применение указанного соединения. Настоящее соединение имеет разнообразные области применения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве.


(19)
Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201691580 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.02.28
(22) Дата подачи заявки 2015.03.10
(51) Int. Cl.
C07H17/08 (2006.01) A01N43/90 (2006.0l) A01P 7/04 (2006.01) A01P 7/02 (2006.0l) A01P 5/00 (2006.0l)
(54) ШЕСТНАДЦАТИЧЛЕННОЕ МАКРОЛИДНОЕ СОЕДИНЕНИЕ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
201410085431.2; 201410208660.9 2014.03.10; 2014.05.16
PCT/CN2015/073960
WO 2015/135467 2015.09.17
Заявитель:
ЧЖЭЦЗЯН ХИСУНЬ ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД.; ЧЖЭЦЗЯН ХИСУНЬ КЕМИКАЛ КО., ЛТД. (CN)
Изобретатель:
Хуан Цзюнь, Ван Цзидун, Чжан Хуэй, Ван Линпин, Ли На, Ли Мэйхун, Бай Хуа, Цзинь Миньци (CN)
Представитель: Нилова М.И. (RU)
(57) Шестнадцатичленное макролидное соединение, структура которого соответствует формуле (I), отличающееся тем, что R является CH3 или C2H5, и применение указанного соединения. Настоящее соединение имеет разнообразные области применения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве.
Шестнадцатичленное макролидное соединение и его применение
В настоящей заявке испрашивается приоритет заявки на Китайский патент CN201410085431.2, поданной 10 марта 2014 г., и приоритет заявки на Китайский патент CN201410208660.9, поданной 16 мая 2014 г. Указанные заявки на китайский патент включены в настоящую заявку посредством ссылки на их полное содержание.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области макролидных соединений, в частности к шестнадцатичленным макролидным соединениям, и их применению.
Уровень техники
Шестнадцатичленные макролидные соединения, вырабатываемые стрептомицетами, обладают высокой активностью и широким спектром действия, и широко применяются для предупреждения распространения и контроля численности насекомых-вредителей и клещей в сельском и лесном хозяйстве. Такие соединения разрабатывались и способствовали созданию множества пестицидных препаратов, таких как авермецин, эмамицин бензоат, милбемицин и т.д., и заняли большую долю рынка пестицидов. Такие соединения прочно связываются с почвой в естественной среде, и с трудом поддаются вымыванию и инфильтрации. Указанные соединения могут быстро распадаться с образованием неактивных соединений под действием света или почвенных микроорганизмов. Молекулярные фрагменты указанных соединений могут в конечном счете разлагаться и использоваться растениями и микроорганизмами как источник углерода, без какой-либо остаточной токсичности. Такие соединения уже стали высокоэффективными биологическими пестицидами для применения в сельском хозяйстве и ветеринарии.
Благодаря своим выдающимся свойствам такие соединения и их
гомологи стали предметом всесторонних исследований внутри страны и за ее пределами. Исследователи пытались модифицировать молекулярную структуру посредством химического синтеза или мутирования штамма-продуцента посредством генетической модификации, с целью получения новых соединений с более высокой активностью. Посредством модификации молекулярной структуры уже были синтезированы тысячи соединений, и некоторые из них в настоящее время есть в продаже, включая ивермектин, эмамектин, дорамектин, эприномектин. Указанные модифицированные соединения уже лишены некоторых недостатков соединений-предшественников, а также они улучшены в том, что касается спектра профилактического действия и контроля, инсектицидной активности и токсичности для людей, животных и окружающей среды. Однако активность таких соединений все еще не может удовлетворять потребностям реального применения.
Сущность изобретения
Согласно настоящему изобретению предложены шестнадцатичленные
макролидные соединения и способы их применения.
Технические решения согласно настоящему изобретению достигаются следующим образом:
Шестнадцатичленное макролидное соединение, структурная формула которого соответствует:
Где R является СНз или С2Н5.
Указанное шестнадцатичленное макролидное соединение может быть выделено из ферментативного бульона генетически модифицированной
бактерии МА220, или может быть получено путем искусственного синтеза.
Генетически модифицированную бактерию МА220 получают в ходе двухэтапной генетической модификации авермектин-продуцирующего штамма клеток под названием Streptomyces avermitilis МА-4680, который хранится в Американской коллекции типовых культур под номером доступа АТСС№: 31267.
Этап 1: инактивация гена aveD Streptomyces avermitilis МА-4680. Конструируют рекомбинантную плазмиду с мутацией в гене aveD посредством технологии направленной П1 IP при которой основания из положений 442 - 522 гена aveD Streptomyces avermitilis МА-4680 заменяют на новую последовательность из 81 по (такую новую последовательность из 81 по получают в соответствии со способом, описанным у Gust В, Kieser Т, Chater KF. 2002. REDIRECT Technology: PCR-targeting system in Streptomyces coelicolor A3 (2), The John Innes Foundation, Norwich). Указанную рекомбинантную плазмиду трансформируют в Streptomyces avermitilis МА-4680. После пересева проводят скрининг на генетически модифицированную бактерию с инактивированным геном aveD - Streptomyces avermitilis AD28.
Этап 2: получение генетически модифицированной бактерии МА220, более конкретно ген aveAI в Streptomyces avermitilis AD28 заменяют геном milAI Streptomyces milbemycinicus (штамм номер HS023), который был сохранен в Китайском центре коллекций микробиологических культур (CGMCC, адрес: Институт микробиологии, Китайская академия наук, № 1, Бейчен вест роад, район Чаойанг, Пекин, 18 июня 2013 г. под номером доступа CGMCC №7677).
Ферментативный бульон генетически модифицированной бактерии МА220 является стандартным для данной области техники, и его получают после культивирования генетически модифицированной бактерии МА220 в среде для ферментации. Предпочтительно ферментативный бульон готовят при помощи способа, включающего следующие этапы: посев генетически модифицированной бактерии МА220 в среду для ферментации и культивирование при 25-30°С в течение 5-10 дней. Более предпочтительно одиночную колонию генетически модифицированных бактерий МА220 засевают в среду для посева и культивируют при 28°С при 250 об/мин в течение 40 ч; затем культуру засевают в среду для ферментации при
количестве прививочного материала 6%, и культивируют при 28°С и при 250 об/мин в течение 8 дней, получая при этом ферментативный бульон. Среда для посева является стандартной для данной области техники и предпочтительно содержит следующие компоненты: кукурузный крахмал 2,5%, порошок соевого жмыха 0,8%, арахисовый шрот 1%, сухие дрожжи 0,95% и СоС12 0,003%, рН 7,2-7,4. Среда для ферментации является стандартной для данной области техники и предпочтительно содержит следующие компоненты: кукурузный крахмал 14%, амилазу 0,003%, порошок соевого жмыха 2,0%, сухие дрожжи 1%, порошок цеолита 0,2%, MnS04 0,0024%, Na2Mo04 0,0024% и СоС12"6Н20 0,002%, рН 7,2-7,4.
Показан следующий способ разделения и очистки: ферментативный бульон генетически модифицированной бактерии МА220 фильтруют через сито 100-200, и остаток экстрагируют при помощи этанола; после концентрирования до определенного объема раствор экстрагируют при помощи ЕЮАс; экстрагированный концентрат впоследствии пропускают через капиллярную кварцевую колонку и колонку RP-18, получая указанное соединение.
Применение шестнадцатичленных макролидных соединений при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве.
Согласно предпочтительному варианту реализации указанным шестнадцатичленным макролидным соединением является тенвермектин А (TEVA), когда R = СНз, и тенвермектин В (TEVB), когда R=C2Hs. Предпочтительно указанным шестнадцатичленным макролидным соединением является тенвермектин В, причем массовое сотношение между тенвермектином А и тенвермектином В предпочтительно равно 1:9, 9:1, 2:8, 8:2, 3:7, 7:3, 4:6, 6:4 или 5:5.
Согласно предпочтительному варианту реализации указанным насекомым-вредителем для сельского или лесного хозяйства является один или более, выбранные из Lepidoptera Plutellidae, Lepidoptera Noctuidae, Lepidoptera Lasiocampidae, Lepidoptera borer, Coleoptera Elateridae и Tylenchida Aphelenchoidea. Среди них насекомым-вредителем Lepidoptera
plutellidae как правило является Plutella xylostella. Насекомым-вредителем Lepidoptera noctuidae как правило является одно или более насекомых, выбранных из Spodoptera exigua, Prodenia litura, Mythimna separate платформенного соломотряса, Helicoverpa armigera Губнера (Hubner) и Agrotis ipsilon. Насекомым-вредителем lepidoptera lasiocampidae как правило является шелкопряд сосновый. Насекомым-вредителем Lepidoptera borer как правило является менрбиус. Насекомым-вредителем Coleoptera Elateridae как правило является нематода гемонхус. Насекомым-вредителем Tylenchida Aphelenchoidea как правило является Bursaphelenchus xylophilus. Клеща, вредоносного для сельского и лесного хозяйства, как правило выбирают из лиственного клеща, например, одного или более из Tetranychus cinnabarinus, Tetranychus urticae Коха (Koch) и цитрусового паутинного клеща.
Согласно предпочтительному варианту реализации формой выпуска указанных химических веществ являются вододисперсионные гранулы, эмульгируемый концентрат, водная суспензия или масляная суспензия, микроэмульсия или таблетки.
Согласно предпочтительному варианту реализации вододисперсионные гранулы или таблетки содержат соединение, наполнитель и поверхностно-активное вещество в массовом соотношении 0,5-90% : 10-95% : 3-20%; и предпочтительно, 0,5-87% : 10-95% : 3-20%.
Согласно предпочтительному варианту реализации эмульгируемый концентрат содержит соединение, растворитель и поверхностно-активное вещество в массовом соотношении 0,5-90% : 5-85% : 2-15%.
Согласно предпочтительному варианту реализации водная суспензия или масляная суспензия содержит указанное соединение, воду или растворитель и поверхностно-активное вещество в массовом соотношении 0,5-90% : 5-80% : 5-20%; и предпочтительно 0,5-90% : 10-80% : 5-20%.
Согласно предпочтительному варианту реализации микроэмульсия содержит соединение, воду или растворитель и поверхностно-активное вещество в массовом соотношении 0,5-50% : 40-95% : 4-15%.
Согласно предпочтительному варианту реализации вододисперсионные гранулы содержат соединение, наполнитель и поверхностно-активное вещество в массовом соотношении 0,5-60% 30-98% 1-25%; и предпочтительно 0,5-60% : 30-90% : 4-20%.
Согласно предпочтительному варианту реализации таблетки содержат соединение, наполнитель и поверхностно-активное вещество в массовом соотношении 0,5-90% : 8-85% : 2-20%; и предпочтительно 0,5-90% : 15-85% : 2-20%.
Согласно предпочтительному варианту реализации наполнителем является один из следующих веществ: белая сажа, бентонит и диатомовая земля, или смесь любых двух или более вариантов; растворителем является одно из следующих веществ: метанол, этанол, изопропанол, и-бутанол и канифольное масло, или смесь любых двух или более вариантов; а поверхностно-активное вещество выбирают из нонилфенол-полиоксиэтиленового эфира, октилфенол- полиоксиэтиленового эфира, полиоксиэтиленового эфира стеарила, полиоксиэтиленового эфира лаурила, полиоксиэтиленового эфира канифольной кислоты, эфира сорбитана и жирной кислоты, алкилфенола полиоксиэтиленового эфира фосфата, полиоксиэтиленового эфира фосфата жирных спиртов, конденсата алкилфенола полиоксиэтиленового эфира-формальдегида, додецилбензоата сульфоната кальция, хлорида додецил-триметил-аммония и бетаина.
Согласно предпочтительному варианту реализации способом применения является разбрызгивание или разбрасывание.
Благоприятное действие
Вододисперсионные гранулы, эмульгируемый концентрат, водную суспензию или масляную суспензию, микроэмульсию или таблетки согласно настоящему изобретению можно эффективно применять для предупреждения или контроля численности насекомых-вредителей в сельском и лесном хозяйстве, таких как Tetranychus cinnabarinus, Tetranychus urticae Коха (Koch), цитрусовый паутинный клещ; Plutella xylostella, Spodoptera exigua, Prodenia litura, Helicoverpa armigera Губнер, Agrotis ipsilon, нематода гемонхус, Mythimna separate Уокера (Walker), шелкопряд сосновый, Bursaphelenchus xylophilus, менрбиус и др. Краткое описание фигур
Для описания вариантов реализации настоящего изобретения или технических решений на предыдущем уровне техники, ниже приведены фигуры, которые требуются для иллюстрации вариантов реализации изобретения или
предыдущего уровня техники. Очевидно, что указанные фигуры служат только для демонстрации некоторых вариантов реализации настоящего изобретения, а другие фигуры могут быть получены без какой-либо творческой деятельности специалистом в данной области техники на основании представленных фигур.
На Фиг. 1 показана масс-спектрограмма, соответствующая соединению согласно настоящему изобретению, в котором R является СНз.
На Фиг. 2 показана ^-ЯМР спектрограмма, соответствующая соединению согласно настоящему изобретению, в котором R является СНз, растворенному в CDCh.
На Фиг. 3 показана 13С-ЯМР спектрограмма, соответствующая соединению согласно настоящему изобретению, в котором R является СНз, растворенному в CDCh.
На Фиг. 4 показана ОЕРТ135-спектрограмма, соответствующая соединению согласно настоящему изобретению, в котором R является СНз, растворенному в CDCh.
На Фиг. 5 показана масс-спектрограмма, соответствующая соединению согласно настоящему изобретению, в котором R является С2Н5.
На Фиг. 2 показана ^-ЯМР спектрограмма, соответствующая соединению согласно настоящему изобретению, в котором R является С2Н5, растворенному в CDCh.
На Фиг. 7 показана 13С-ЯМР спектрограмма, соответствующая соединению согласно настоящему изобретению, в котором R является С2Н5, растворенному в CDCh.
На Фиг. 8 показана ОЕРТ135-спектрограмма, соответствующая соединению согласно настоящему изобретению, в котором R является С2Н5, растворенному в CDCh.
На Фиг. 9 показана физическая карта рекомбинантной плазмиды pUAmT14. На Фиг. 10 показана физическая карта рекомбинантной плазмиды pUAmT-kaveD.
На Фиг. 11 показан процесс инактивации гена aveD исходного штамма Streptomyces avermitilis МА-4680.
На Фиг. 12 показана хроматограмма, полученная при ВЭЖХ ферментативного бульона, и на панели А показана ВЭЖХ-хроматограмма ферментативного бульона исходного штамма МА-4680, на панели В - ВЭЖХ
хроматограмма ферментативного бульона генетически модифицированной бактерии AD28.
На Фиг. 13 показан процесс конструирования рекомбинантной плазмиды pMA13aadMAD.
На Фиг. 14 показана схематическая диаграмма, которая отражает изменение генома у штамма 3-22# по сравнению с исходным штаммом HS023.
На Фиг. 15 показан процесс конструирования рекомбинантной плазмиды pUAmT-MA15AAlU.
На Фиг. 16 показана схематическая диаграмма, которая отражает вставку вышестоящего фрагмента гена aveAI в геном штамма 3-22#.
На Фиг. 17 показан процесс конструирования рекомбинантной плазмиды pUAmT-AMA.
На Фиг. 18 показано изменение генома у штамма МА220 по сравнению с генетически модифицированной бактерией AD28.
На Фиг. 19 показано сравнение между продуктами ферментации генетически модифицированной бактерии МА220 и генетически модифицированной бактерией AD28, причем на панели А показан результат ВЭЖХ, где виден продукт ферментации генетически модифицированной бактерии МА220, а на панели В - ВЭЖХ, где виден продукт ферментации генетически модифицированной бактерии AD28.
Подробное описание изобретения
Варианты реализации настоящего изобретения на конкретных примерах будут полностью и наглядно описаны ниже. Очевидно, что описанные ниже примеры представляют собой только часть примером изобретения, но не все. На основании примеров реализации настоящего изобретения все другие примеры, которые могут быть получены специалистами в данной области техники без какой-либо творческой деятельности, попадают в объем притязаний настоящего изобретения.
Пример 1. Конструирование рекомбинантного штамма Streptomyces avermitilis МА220
1. Выделение геномной ДНК из Streptomyces avermitilis и Streptomyces milbemycinicus:
а) Споры Streptomyces avermitilis МА-4680 (АТСС №31267) и Streptomyces
milbemycinicus HS023 (CGMCC №7677) засевали в 30 мл среды TSB (триптический соевый бульон, включение BD, каталожный № 211822), соответственно, и инкубировали при 30°С и 220 об/мин в течение 30-48 ч.
b) Мицелий отбирали путем центрифугирования, промывали его дважды стерилизованной водой, суспендировали в растворе лизоцима (10,3% сахарозы, 10 мМ Tris-HCl, рН 8,0 и 4,0 мг/мл лизоцима), добавляли в 4-кратный объем мицелия и выдерживали на водяной бане при 37°С в течение 1-2 ч.
c) 10% раствор SDS (додецилсульфат натрия) добавляли в соотношении 1:10 (объем/объем), затем добавляя 20 мг/мл раствора протеазы К до конечной концентрации 100 мкг/мл, а затем указанную смесь выдерживали на водяной бане при 37°С в течение 30 мин -1ч.
d) Указанную смесь дважды подвергали экстракции путем добавления
эквивалентного объема раствора фенол-хлороформа
(фенол:хлороформ:изоамиловый спирт = 25:24:1, рН 8,0).
e) К надосадочной жидкости добавляли 1/10 объема ЗМ раствора NaAc-HAc (рН 5,3) и эквивалентный объем изоамилового спирта, и геномную ДНК отбирали путем центрифугирования при 12000 об/мин в течение 5 мин.
f) Осадок дважды промывали 70% этанолом, высушивали при комнатной температуре и растворяли в 10 мМ растворе Tirs-HCl (рН 8,0), содержащем 20 мкг/мл РНКазы, чтобы получить раствор геномной ДНК.
2. Конструирование вектора pUAmT14:
Плазмиду рП773 (полученную от компании "Plant Bioscience Limited)), Норидж, Великобритания; см. Gust В, et al, PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(4): 1541-1546; and Gust B, et al, REDIRECT Technology: PCR-targeting system in streptomyces coelicolor. Norwich: John Innes Centre. (2002)) расщепляли ферментами Xbal (TaKaRa) и BstBI (TaKaRa) в соответствии с инструкцией. Фрагмент из 1271 по, содержащий ген aac(3)IV и oriT, восстанавливали посредством электрофореза. Затупление концов проводили при помощи набора BKL (TaKaRa) в соответствии с инструкцией, и получали Фрагмент 1. Вектор pUC19 расщепляли ферментами Dral (TaKaRa) и Sspl (TaKaRa) в соответствии с инструкцией. Фрагмент вектора
из 1748 по восстанавливали посредством электрофореза и получали Фрагмент 2. Фрагмент 1 и Фрагмент 2 сшивали (проводили сшивку с применением раствора I из TaKaRa в соответствии с инструкцией, как указано ниже), и получали рекомбинантную плазмиду pUAmT14. Физическая карта pUAmT14 показана на Фиг. 9.
3. Конструирование рекомбинантной плазмиды pUAmT-kaveD для инактивации гена aveD Streptomyces avermitilis:
Фрагментом ДНК, присутствующим в Космиде 6-9 (См. ссылку 4: Xia Haiyang, Huang Jun, Hu Minjie et al., Construction of an ordered cosmid library of S. avermitilis for genetic modification of the industrial strains, Chinese Journal of Antibiotics, 2009, 34(7):403-405) был фрагмент в положении 1124992-1167304 оснований в геноме Streptomyces avermitilis МА-4680. Фрагмент в положении 442521 (SEQ Ш №:1) гена aveD выбивали посредством направленной ПНР, и бокс генов устойчивости удаляли при помощи FLP-рекомбиназы, что приводило к образованию рекомбинантной плазмиды 6-9kaveD, из которой последовательность 81 по заменяли но новую последовательность (SEQ Ш №:2). Направленную ПЦР проводили по существу в соответствии со способом, описанном в литературе (См. Gust В, et al, PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(4): 1541-1546; and Gust B, et al, REDIRECT Technology: PCR-targeting system in streptomyces coelicolor. Norwich: John Innes Centre. (2002)). Конкретная процедура была следующей:
a) Проектирование ПЦР-праймера: праймер aveD59 (SEQ Ш №:3) проектировали с 39 по на 5'-конце, идентичными последовательности в положении 403-441 гена aveD, и с 20 по на 3'-конце, применяемыми в качестве "левой ветви" матрицы бокса генов устойчивости; праймер aveD58 (SEQ Ш №:4) конструировали с 39 по на 5'-конце, обратно комплементарными последовательности в положении 522-560 гена aveD, и 20 по на 3'-конце в качестве "правой ветви" матрицы бокса генов устойчивости ("левая ветвь" и "правая ветвь" были константной последовательностью, см. Gust В, Kiser Т, Chater К F. REDIRECT Technology: PCR-targeting system in streptomyces coelicolor. Norwich: John Innes Centre. 2002, Page 6).
b) ПЦР-амплификация бокса генов устойчивости: ПЦР-амплификацию проводили с применением плазмиды рП773 в качестве матрицы, и при этом
a)
применяли ДНК-полимеразу Prime STAR от компании "TaKaRa". Для реакции готовили растворы, перечисленные ниже:
Праймер aveD59 (25 мкМ) 0,5 мкл
Праймер aveD58 (25 мкМ) 0,5 мкл
Плазмида рП773 2 мкл (примерно 10 нг)
Буфер 5 х PrimeSTAR 10 мкл
дНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфаты (2,5 мМ каждого) 4 мкл
ДНК-полимераза PrimeSTAR (2,5 Е/мкл) 0,5 мкл
Бидистиллированная вода 34 мкл
Процедура для ПЦР:
94°С, 2 мин,
(98°С х Ю сек, 50°С х 45 сек, 72°С х 1 мин 30 сек) х Ю циклов,
(98°С х Ю сек, 68°С х 1 мин 30 сек) х 15 циклов,
72°С х 2 мин, 16°С х 1 мин. Целевой фрагмент размером приблизительно 1,4 кб восстанавливали путем вырезания полосы из геля после электрофореза в агарозном геле продукта ПЦР, и восстановление проводили при помощи набора для восстановления из геля (TaKaRa) в соответствии с инструкцией.
d) Трансформация библиотеки плазмид в Е. coli BW25113/рП790: одиночную колонию Е. coli BW25113/pLT790 засевали в 10 мл среды LB (среда Лурия-Бертани) (триптон 1,0%, сухие дрожжи 0,5%, NaCl 0,5% и глюкозы 0,1%), содержащей 25 мкг/мл хлорамфеникола, и культивировали при 30°С и 250 об/мин в течение ночи (14-18 ч, также, как описано ниже). 100 мкл суспензии бактерий, которые культивировали в течение ночи, засевали в 10 мл среды SOB (супероптимальный бульон) (триптон 2,0%, сухие дрожжи 0,5%, NaCl 0,05%, 10 мл 250 ммоль/л раствора КС1 добавляли к 1 л среды, и 5 мл стерильного раствора 2 моль/л MgCh добавляли к среде перед применением), содержащей 25 мкг/мл хлорамфеникола и культивировали при 30°С и 250 об/мин в течение 3-4 ч, пока оптическая плотность на 600 нм (OD600) не достигала приблизительно 0,4. Бактерии отбирали путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 5 мин при 4°С и промывали 10 мл 10% глицерина, предварительно охлажденного на льду. Осадок суспендировали в 100 мкл 10% глицерина, предварительно охлажденного на льду, т.е. компетентные клетки для электротрансформации. К 50 мкл суспензии компетентных клеток добавляли приблизительно 100 нг (2-3 мкл)
библиотеки плазмид-космид 6-9. Электротрансформацию проводили в кювете 0,2 см, предварительно охлажденной на льду. Параметры электрического импульса были следующие: 200 Ом, 25 мкФ и 2,5 кВ. Продолжительность электрического импульса составляла от 4,5 до 4,9 мс. После электрического импульса 1 мл среды LB, предварительно охлажденной на льду, сразу добавляли к суспензии, и культивировали ее при 30°С на шейкере в течение 1 ч. 50 мкл электротрансформированной суспензии распределяли по чашке Петри со средой LB (среда LB, содержащая 1,5% порошка агара), содержащей 100 мкг/мл карбенициллина, 50 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл хлорамфеникола, и инкубировали при 30°С в течение ночи, чтобы получить одиночные колонии.
d) Направленная ПЦР библиотеки плазмид: одиночную колонию Е. coli BW25113/pIJ790, содержащую библиотеку плазмид-космид 6-9, отбирали случайным образом и засевали в 10 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл карбенициллина, 50 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл хлорамфеникола, и культивировали при 30°С и 250 об/мин в течение ночи. 100 мкл суспензии бактерий, культивированных в течение ночи, засевали в 10 мл среды SOB, содержащей 100 мкг/мл карбенициллина, 50 мкг/мл канамицина, 25 мкг/мл хлорамфеникола и 10 мМ L-арабинозы, и культивировали при 30°С и 250 об/мин. Компетентные для электротрансформации клетки готовили в соответствии со способом, описанным на этапе с). К 50 мкл суспензии компетентных клеток добавляли приблизительно 100 нг (2-3 мл) суспензии продукта восстановления после ПЦР, полученного на этапе Ь). Прикладывали электрический импульс в кювете 0,2 см, предварительно охлажденной на льду. Параметры электрического импульса были следующие: 200 Ом, 25 мкФ и 2,5 кВ. Продолжительность электрического импульса составляла от 4,5 до 4,9 мс. К суспензии сразу добавляли 1 мл среды LB, предварительно охлажденной на льду, и культивировали ее при 37°С на шейкере в течение 1 ч. После короткого центрифугирования большую часть надосадочной жидкости сливали, а осадок суспендировали в остатке надосадочной жидкости. Всю суспензию распределяли по чашке Петри со средой LB, содержащей 100 мкг/мл карбенициллина, 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл апрамицина, и инкубировали при 37°С в течение ночи. Одиночные колонии собирали и засевали в 3 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл карбенициллина, 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл апрамицина, и культивировали при 37°С и 250 об/мин приблизительно в течение 6 ч. Плазмиду
извлекали при помощи набора Axygen Plasmid DNA Purification minipre Kit в соответствии с инструкцией. Скрининг на правильные плазмиды проводили путем детекции расщепления с применением рестриктазы, и получали в результате рекомбинантную плазмиду 6-9daveD.
е) Удаление гена устойчивости и oriT посредством FLP: Е. coli DH5a/BT340 засевали в 10 мл среды LB, содержащей 25 мкг/мл хлорамфеникола, и культивировали при 30°С и 250 об/мин в течение ночи. Компетентные клетки для электротрансформации готовили в соответствии со способом, описанным на этапе с). К 50 мкл суспензии компетентных клеток добавляли приблизительно 100 нг (1-2 мл) рекомбинантной плазмиды 6-9daveD, полученной на этапе d). Прикладывали электрический импульс в кювете 0,2 см, предварительно охлажденной на льду. Параметры электрического импульса были следующие: 200 Ом, 25 мкФ и 2,5 кВ. Продолжительность электрического импульса составляла от 4,5 до 4,9 мс. Сразу добавляли 1 мл среды LB, предварительно охлажденной на льду, и культивировали при 30°С на шейкере в течение 1 ч. 50 мкл электротрансформированной суспензии распределяли на чашке Петри со средой LB, содержащей 50 мкг/мл апрамицина и 25 мкг/мл хлорамфеникола, и инкубировали при 30°С в течение 48 ч, получая одиночные колонии. Одиночную колонию отбирали случайным образом и штрихами наносили на не содержащую антибиотиков среду LB для выделения одиночных колоний, и чашку инкубировали при 42°С в течение ночи, что позволяло бактериям впоследствии экспрессировать рекомбиназу FLP и терять плазмиду ВТ340. Отбирали 20-30 одиночных колоний и наносили точечно на чашку Петри с LB, содержащей 50 мкг/мл апрамицина, и на чашку Петри с LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, соответственно, и инкубировали при 37°С в течение ночи. Целевой клон без бокса генов устойчивости был чувствителен к апрамицину, но не к канамицину. Из целевых клонов выделяли плазмиды. Скрининг на правильные плазмиды проводили путем детекции расщепления с применением рестриктазы, и получали в результате рекомбинантную плазмиду 6-9daveD.
Конструирование рекомбинантной плазмиды pUAmT-kaveD: рекомбинантную плазмиду 6-9kaveD расщепляли ферментами Cla I (TaKaRa) и BstB I (TaKaRa) в соответствии с инструкцией, и восстанавливали фрагмент 6984 по, сшивали с вектором pUAmT14, расщепленным ферментом BstB I, и дефосфорилировали (т.е. 1мкл FastAP ("Fermentas") добавляли непосредственно
к реакционному раствору для расщепления и выдерживали на водяной бане при 37°С в течение 5-10 мин также, как описано ниже), что приводило к получению рекомбинантной плазмиды pUAmT-kaveD. Физическая карта pUAmT- kaveD показана на Фиг. 10.
4. Инактивация гена aveD Streptomyces avermitilis МА-4680: а) Трансформация рекомбинантной плазмиды pUAmT-kaveD в Streptomyces avermitilis МА-4680 путем конъюгационного переноса: компетентные клетки для электротрансформации готовили в соответствии со способом, описанным для этапа 3-е), с применением Е. coli ЕТ12567 (pUZ8002) (инкубировали при 37°С, и конечная концентрация антибиотиков в среде была следующая: хлорамфеникол -25 мкг/мл и канамицин - 25 мкг/мл). К 50 мкл суспензии компетентных клеток добавляли приблизительно 100 нг (1-2 мкл) рекомбинантной плазмиды pUAmT-kaveD. Электротрансформацию проводили в кювете 0,2 см, предварительно охлажденной на льду. Параметры электрического импульса были следующие: 200 Ом, 25 мкФ и 2,5 кВ. После электрического импульса к суспензии сразу добавляли 1 мл среды LB, предварительно охлажденной на льду, и культивировали ее при 37°С на шейкере в течение 1 ч. 50 мкл электротрансформированной суспензии распределяли на чашке Петри со средой LB, содержащей 50 мкг/мл апрамицина, 100 мкг/мл карбенициллина, 50 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл хлорамфеникола, и инкубировали при 37°С в течение ночи. Трансформант отбирали случайным образом и засевали в 10 мл среды LB, содержащей 25 мкг/мл хлорамфеникола, 100 мкг/мл карбенициллина, 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл апрамицина, и культивировали при 37°С и 250 об/мин в течение ночи. 100 мкл суспензии бактерий, которые культивировали в течение ночи, засевали в 10 мл свежей среды LB, содержащей 25 мкг/мл хлорамфеникола, 50 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл апрамицина, и культивировали при 37°С и 250 об/мин, пока OD600 не достигала 0,4. Бактерии дважды отмывали 10 мл среды LB и суспендировали в 1 мл среды LB. 500 мкл суспензии бактерий смешивали с приблизительно 108 спор Streptomyces avermitilis МА-4680, которые предварительно суспендировали в 500 мкл 2> (порошок соевого жмыха 2%, маннитол 2% и порошок агара 2%), содержащей 10 мМ MgCh, и инкубировали при 30°С в течение 16-20 ч. Чашку покрывали стерилизованной водой, содержащей 0,5 мг налидиксовой кислоты и 1,25 мг апрамицина, и чашку затем инкубировали при 30°С более 5 д, чтобы получить трансформанты.
Ь) Скрининг на мутантов с инактивированным геном aveD: трансформанты однократно пересевали на чашку Петри с YMS (дрожжевой экстракт 0,4%, растворимый крахмал 0,4%, экстракт солода 1,0% и поршок агара 1,8%), содержащую 20 мкг/мл налидиксовой кислоты и 25 мкг/мл апрамицина, а затем дважды пересевали на чашку Петри с YMS без антибиотиков, чтобы выделить одиночные колонии. После инкубации одиночных колоний в среде YMS с 25 мкг/мл апрамицина или без антибиотика, соответственно, проводили скрининг на апрамицин-чувствительные штаммы. Геномную ДНК отобранных при скрининге апрамицин-чувствительных штаммов выделяли в соответствии со способом 1 в данном примере. Затем проводили ПЦР-тест с применением праймера aveDF (SEQ Ш №:5)/aveDR (SEQ Ш №:6) и aveDF (SEQ Ш №:5)/aveDM (SEQ Ш №:7), соответственно, с ДНК-полимеразой rTaq (TaKaRa, как описана ниже) в соответствии с инструкцией. Для целевого штамма можно амплифицировать последовательность 1094 по с применением прежней пары праймеров, и без такой последовательности с применением последней. В качестве целевого штамма для последующей генетической модификации применяли отобранный при скрининге штамм (под номером AD28). На Фиг. 11 показан процесс инактивации гена aveD в исходном штамме Streptomyces avermitilis МА-4680.
5. Подтверждение путем ферментации генетически модифицированной бактерии AD28: одиночную колонию AD28 засевали в среду для посева (кукурузный крахмал 2,5%, порошок соевого жмыха 0,8%, арахисовый шрот 1%, сухие дрожжи 0,95% и СоС12 0,003%, рН 7,2-7,4) и культивировали при 28°С и 250 об/мин в течение 40 ч. Раствор для посева вносили в ферментативную среду (кукурузный крахмал 14%, амилаза 0,003%, порошок соевого жмыха 2,0%, сухие дрожжи 1%, порошок цеолита 0,2%, MnS04 0,0024%, Na2Mo04 0,0024% и СоСЬ'бНгО 0,002%, рН 7,2-7,4) при количестве прививочного материала 6%, и культивировали при 28°С и 250 об/мин в течение 8 д. К 1 мл ферментативного бульона добавляли 4 мл безводного метанола для пропитки, обрабатывали ультразвуком в течение 1 ч и фильтровали. Для ВЭЖХ (высокоэффективной
жидкостной хроматографии) применяли непосредственно фильтрат. Условия для ВЭЖХ анализа были следующие: колонка: С18 Hypersil ODS2 4,6x250x5 ("Dalian Elite"); подвижная фаза: метанол: этанол : вода = 81:7:12; скорость потока: 1 мл/мин; длина волны поглощения: 240 нм. Результаты показаны на Фиг. 12: на панели А ВЭЖХ-хроматограмма для ферментативного бульона исходного штамма МА-4680. На панели В - ВЭЖХ-хроматограмма для ферментативного бульона генетически модифицированной бактерии AD28. Было показано, что абамектин А уже не производится генетически модифицированной бактерией AD28 во время ферментации.
6. Конструирование рекомбинантной плазмиды pMA13aadMAD с целью замены нижележащего фрагмента гена mil Al Streptomyces milbemycinicus: целевой фрагмент 3 из 3212 по получали в реакции ПЦР с применением в качестве матрицы геномной ДНК Streptomyces milbemycinicus HS023 и праймеров MAI3F1 (SEQ ID №:8) и MA13R2 (SEQ ГО №:9), а также ДНК-полимеразы PrimeSTAR (TaKaRa, такая же, как описана ниже) в соответствии с инструкцией. После расщепления рекомбинантной плазмиды pUAmT14 при помощи Sma I ее дефосфорилировали FastAP и сшивали с фрагментом 3, предварительно обработанным набором BKL, получая в результате рекомбинантную плазмиду pUAmT-MA13'. Фрагмент 4 из 3268 по получали в реакции ПЦР с применением в качестве матрицы геномной ДНК Streptomyces milbemycinicus HS023 и праймеров MA1DF3 (SEQ ГО №:10) и MA1DR4 (SEQ ГО №:11), а также ДНК-полимеразы PrimeSTAR. После расщепления рекомбинантной плазмиды pUAmT-МА13' при помощиEcoRY (TaKaRa) ее дефосфорилировали при помощи FastAP и сшивали с фрагментом 4, предварительно обработанным набором BKL, получая в результате рекомбинантную плазмиду pMD-MAlD. Рекомбинантную плазмиду pUAmT-MA13' расщепляли при помощи Hindlll + Nsil в соответствии с инструкцией (TaKaRa), и фрагмент из 6199 по восстанавливали посредством вырезания полосы из геля, и получали фрагмент 5; рекомбинантную плазмиду pMD-MAlD расщепляли при помощи Hindlll + Nsil, и фрагмент из 3258 по восстанавливали посредством вырезания полосы из геля, и получали фрагмент 6. Фрагмент 5 и фрагмент 6 сшивали и получали рекомбинантную плазмиду pUAmT-MA13D. Фрагмент 7 из 3266 по получали в реакции ПЦР с применением в качестве матрицы геномной ДНК Streptomyces avermitilis МА-4680 и праймеров AA1DF9 (SEQ ГО №:12) и AA1DR10 (SEQ ГО №:13), а также ДНК-полимеразы
PrimeSTAR. Рекомбинантную плазмиду pUAmT-MA13D расщепляли при помощи Nsil (TaKaRa) в соответствии с инструкцией, а затем восстанавливали и обрабатывали набором BKL. Продукт реакции дефосфорилировали при помощи FastAP и сшивали с фрагментом 7, обработанным набором BKL, и получали рекомбинантную плазмиду pMA13aadMAD для замены нижележащего фрагмента гена milAI Streptomyces milbemycinicus. Процесс конструирования показан на Фиг. 13.
7. Замена нижележащего фрагмента гена mil Al Streptomyces milbemycinicus: рекомбинантную плазмиду pMA13aadMAD трансформировали в Streptomyces milbemycinicus HS023 путем конъюгационного переноса, как описано на этапе 4-а). После проведения двукратного скрининга трансформантов путем пересева на среду без антибиотиков одиночные колонии отбирали при помощи зубочистки и засевали на чашки Петри с YMS, содержащей 25 мкг/мл апрамицина, и на чашки Петри с YMS без антибиотиков, соответственно, и инкубировали при 28°С в течение 5-6 дней. Одиночные колонии, которые не росли на среде YMS, содержащей апрамицин, но росли на среде YMS без апрамицина, отбирали для усиленного культивирования в среде YMS. В это время выделяли геномную ДНК в соответствии со способом, описанным на этапе 1, и проводили ПЦР-тест с применением праймера milDFll (SEQ Ш №:14) и milDR12 (SEQ Ш №:15), а также ДНК-полимеразы rTaq. Наличие продукта ПЦР из 3825 по указывало на целевой штамм, тогда как наличие продукта ПЦР из 1467 по подразумевало штамм-ревертант. На основании результатов скрининга штамм 3-22# был определен как Streptomyces milbemycinicus, в котором нижележащий фрагмент гена milAI был успешно заменен, и его применяли как целевой штамм для дальнейших манипуляций. Схема модификаций генома по сравнению с исходным штаммом HS023 в штамме 3-22# показана на Фиг. 14.
8. Конструирование рекомбинантной плазмиды pUAmT-MA15AAlU с целью вставки вышележащего фрагмента гена aveAI Streptomyces avermitilis AD28: ПЦР проводили с применением в качестве матрицы геномной ДНК Streptomyces milbemycinicus HS023, праймеров MA15F13 (SEQ ID №:16) и MA15R14 (SEQ ID №:17), а также ДНК-полимеразы PrimeSTAR, и получали фрагмент 3097 по. Полученный фрагмент расщепляли при помощи Pstl и Hindlll в соответствии с инструкцией (TaKaRa) и вшивали в плазмиду pUAmT14, расщепленную теми же ферментами, и получали рекомбинантную плазмиду pUAmT-MA15. ПЦР
7.
проводили с применением геномной ДНК Streptomyces avermitilis AD28 (способ выделения геномной ДНК был такой же, как описан на этапе 1 данного примера) в качестве матрицы, праймеров AA1UF15 (SEQ ГО №:18) и AA1DR16 (SEQ ГО №:19), а также ДНК-полимеразы PrimeSTAR, и получали фрагмент 3103 по. Полученный фрагмент расщепляли ЕсоШ и Крп\ в соответствии с инструкцией (TaKaRa) и вшивали в рекомбинантную плазмиду pUAmT-MA15, расщепленную теми же ферментами, получая рекомбинантную плазмиду pUAmT-MA15AAlU. Процесс конструирования показан на Фиг. 15.
9. Вставка вышележащего фрагмента гена aveAI Streptomyces avermitilis в
вышележащее положение гена milAI Streptomyces milbemycinicus: в соответствии
со способом, описанным на этапе 4-а), рекомбинантную плазмиду pUAmT-
MA15AA1U, полученную на этапе 8, трансформировали в штамм 3-22#,
полученный на этапе 7, путем конъюгационного переноса, и полученные
трансформанты были целевыми штаммами. Схема, иллюстрирующая вставку
вышележащего фрагмента гена aveAI ъ геном штамма 3-22#, показана на Фиг. 16.
10. Конструирование рекомбинантной плазмиды pUAmT-AMA с целью
замены гена aveAI Streptomyces avermitilis на ген milAI Streptomyces
milbemycinicus: одну одиночную колонию отбирали из трансформантов,
полученных на этапе 9, и засевали в среду TSB, содержащую 20 мкг/мл
налидиксовой кислоты и 25 мкг/мл апрамицина, и геномную ДНК выделяли в
соответствии со способом, описанном на этапе 1. Выделенную геномную ДНК
расщепляли при помощи Swa I (TaKaRa) в соответствии с инструкцией. После
реакции добавляли 1/10 объема 3 М раствора NaAc-HAc (рН 5,3) и равный объем
изоамилового спирта, и ДНК отбирали посредством центрифугирования при
12000 об/мин в течение 5 мин. Осадок промывали двукратно в 20 мкл 10 мМ
раствора Tris-HCl (рН 8,0), и получали раствор для восстановления. Для
трансформации компетентных клеток E.coli DH5a применяли три микролитра
раствора для восстановления (способ приготовления компетентных клеток DH5a
и процедура электротрансформации были такими же, как описано на этапе 3-е),
за исключением того, что среда не содержала антибиотиков, а температура
инкубации была 37°С). Раствор для трансформации центрифугировали, чтобы
удалить большую часть надосадочной жидкости, и осадок повторно
суспендировали в оставшемся растворе. Всю суспензию распределяли на чашке
Петри со средой LB, содержащей 25 мкг/мл апрамицина, и инкубировали при
37°С в течение 16 ч, и получали трансформанты. После выделения плазмиды из трансформантов получали рекомбинантную плазмиду pUAmT-AMA для замены гена aveAI Streptomyces avermitilis на ген milAI Streptomyces milbemycinicus. Процесс конструирования pUAmТ-АМА показан на Фиг. 17.
11. Замена гена aveAI Streptomyces avermitilis: рекомбинантную плазмиду pUAmT-AMA трансформировали в штамм AD28, полученный на этапе 4, посредством конъюгационного переноса, как описано на этапе 4-а). После двукратного скрининга трансформантов путем пересева на среды без антибиотиков зубочисткой отбирали одиночные колонии, засевали их на чашки Петри со средой YMS, содержащей 25 мкг/мл апрамицина, чашки Петри со средой YMS без антибиотиков, соответственно, и инкубировали при 28°С в течение 5-6 дней. Одиночные колонии, которые не росли на среде YMS, содержащей апрамицин, и росли на среде YMS без антибиотиков, отбирали для усиленного культивирования на среде YMS. В это время геномную ДНК выделяли в соответствии со способом, описанным на этапе 1 данного примера, и проводили ПЦР-тест с применением пар праймеров 025A1EF (SEQ Ш №:20)/026AlER (SEQ Ш №:21) и 027M1EF (SEQ ID №:22)/028MlER (SEQ ГО №:23), а также ДНК-полимеразы rTaq. Для генетически модифицированного штамма с успешной заменой целевой фрагмент из 2005 по можно получить путем амплификации с применением пары праймеров 025A1EF (SEQ ГО №:20)/026AlER (SEQ ГО №:21), и нельзя его получить при применении праймеров 027M1EF (SEQ ГО №:22)/028MlER (SEQ ГО №:23). Для дальнейших экспериментов применяли генетически модифицированный штамм МА220. Схема модификаций генома МА220 по сравнению с генетически модифицированной бактерией AD28 показана на Фиг. 18.
12. Ферментация генетически модифицированной бактерии МА220 и ВЭЖХ: способы были такими же, как на этапе 5 данного примера. Результаты ВЭЖХ показаны на Фиг. 19: на панели А ВЭЖХ, иллюстрирующая продукт ферментации генетически модифицированной бактерии МА220, а на панели В - ВЭЖХ, иллюстрирующая продукт ферментации генетически модифицированной бактерии AD28. Было показано, что, по-видимому, присутствуют два новых соединения (время удерживания 8,773 и 11,066 мин, соответственно), генерируемые при ферментации генетически модифицированной бактерии МА220).
11.
Пример 2 Разделение, очистка и описание структуры тенвермектина А и В Шестнадцатичленное макролидное соединение тенвермектин имеет структуру со следующей общей формулой:
Тенвермектин
Указанное соединение является тенвермектином A (TEVA), когда R = СНз, и тенвермектином В (TEVB), когда R=C2Hs. В смеси метаболитов, генерируемых рекомбинантной бактерией, отношение между тенвермектином А и тенвермектином В составляет 8:2, 7:3 или 9:1.
Способ получения: ферментативный бульон (т.е., ферментативный бульон генетически модифицированной бактерии МА220, полученной на этапе 12 примера 1) фильтровали через фильтрующую ткань и получали фильтрационный осадок. Проводили двукратную экстракцию фильтрационного осадка этанолом и получали экстракт в этаноле. Экстракт в этаноле концентрировали под вакуумом до сухого состояния и экстрагировали при помощи ЕЮ Ас, получая экстракт, содержащий тенвермектин В1 иВ2.
Экстракт смешивали с силикагелем и загружали в колонку, заполненную силикагелем. Производили десорбцию с колонки с применением градиента петролейного эфира/раствора ацетона в отношении 90:10, 80:20, 70:30 и 60:40, соответственно. Фракции отбирали с определенным интервалом и проводили детекцию посредством ТСХ (тонкослойной хроматографии). Получали фракции, содержащие тенвермектин А и тенвермектин В, и концентрировали их до сухого состояния под вакуумом.
Перечисленные выше фракции разделяли посредством хроматографии с обращенной фазой при следующих условиях:
Система ВЭЖХ: полупрепаративная высокоэффективная жидкостная
хроматография Agilent 1100
Колонка: ZORBAX.Eclipse XDB-C18 (250 мм*9,4 мм)) Элюент: метанол/ацетонитрил/вода = 46:46:8 (объем/объем/объем) Скорость потока: 1,5 мл/мин Длина волны детекции: Х=240 нм
Тенвермектин А получали путем отбора пика с временем удерживания 17,1 мин (данные для описания структуры отдельно показаны на Фиг. 1-4); тенвермектин В получали путем отбора пика с временем удерживания 21,5 мин (данные для описания структуры отдельно показаны на Фиг. 5-8). Описание структуры:
Структуры тенвермектина А и В были охарактеризованы посредством спектрального анализа, включая ESI-MS (масс-спектрометрия и ионизацией электрораспылением), ^-ЯМР, 13С-ЯМР и 2-Б-ЯМР и стр. Их физико-химические свойства были следующие:
Тенвермектин А: С45Н68О14, белый порошок, температура плавления 153155 °С; удельное вращение, № -26.7 (с 0,5, EtOH); UV (EtOH) W нм (log s): 244 (4,55);
ИК (KBr), Vmax см"1: 3464, 2931, 1718, 1451, 1381, 1341, 1305, 1198, 1120, 1051, 987;
Данные *Н ЯМР (400 МГц, CDCh) и 13С ЯМР (100 МГц, CDCh) перечислены в Таблице 1; ESI-MS m/z 855 [M+Na]+; HRESJMS m/z, экспериментальное значение: 855.4551 [M+Na]+, расчетное значение: C45H680i4Na 855.4501.
Тенвермектин В: С46Н70О14, белый порошок, температура плавления, 153155 °С; удельное вращение, [а]° -18.0 (с 0,5, EtOH); UV (EtOH) W нм (log s): 244 (4.60);
ИК (KBr), Vmax см"1: 3463, 2931, 1717, 1453, 1380, 1341, 1303, 1197, 1106, 1051, 986; данные *H ЯМР (400 МГц, CDCh) и 13C ЯМР (100 МГц, CDCh) перечислены в Таблице 1;
ESI-MS m/z 869 [M+Na]+; HRESFMS m/z экспериментальное значение: 869.4683 [M+Na]+, расчетное значение: C46H7oOi4Na 869.4658.
1,98 dd (11,8, 4,3)
2,00 dd (12,0, 4,3)
97,6 s
97,4 s
1,53 m
1,54 m
35,7 t
35,6 t
1,68 m
1,68 m
1,53 m
1,54 m
27,7 t
27,8 t
1,26 m
1,34 m
36,5 d
34,2 d
3,32 m
3,14m
71,4 d
75,9 d
1,87 brs
1,88 brs
19,9 q
19,9 q
4,65 brd (14,8)
4,66 brd (14,4)
68,5 t
68,5 t
4,70 brd (14,8)
4,71 brd (14,4)
1,17 d (6,0)
1,17 d (6,9)
20,3 q
20,2 q
1,50 brs
1,51 brs
15,2 q
15,2 q
0,84 d (6,6)
0,85 d (6,7)
17,9 q
17,7 q
1,16 d (8,0)
1,36 m
19,4 q
25,6 t
1,68 m
1,00 t (7,3)
10,0 q
4,81 d (3,3)
4,80 d (3,1)
94,5 d
94,7 d
2,29 m
2,27 m
34,7 t
34,6 t
1,60 m
1,60 m
3,61 m
3,63 m
79,4 d
79,4 d
3,24 t (9,2)
3,25 t (8,9)
80,5 d
80,4 d
3,81 m
3,82 m
67,2 d
67,2 d
1,26 d (6,0)
1,26 d (6,0)
18,4 q
18,4 q
5,39 brs
5,41 brs
98,5 d
98,5 d
1,53 m
1,54 m
34,2 t
34,2 t
2,33 m
2,34 m
3,48 m
3,49 m
78,2 d
78,2 d
3,16 t(9,1)
3,17 t (9,1)
76,1 d
76,1 d
3,77 m
3,77 m
68,1 d
68,1 d
1,27 d (7,2)
1,28 d (6,4)
17,7 q
17,7 q
З'-ОСНз
3,46 s
3,44 s
56,7 q
56,6 q
3"-ОСНз
3,42 s
3,43 s
56,4 q
56,4 q
Пример 3
Биологическая активность тенвермектина в отношении насекомых-вредителей и клещей
(1) Лабораторные испытания активности тенвермектина в отношении Tetranychus cinnabarinus: активность тенвермектина в отношении Tetranychus cinnabarinus в качестве тестового вредителя исследовали в лабораторных условиях, и в качестве положительного контроля применяли авермектин. Активность тенвермектина и авермектина сравнивали между собой.
Тестовый организм: Tetranychus cinnabarinus: им заражали рассаду паркинсонии колючей и культивировали в условиях искусственного климата [(26±1)°С, ОВ (70±5)%, 14 ч/дня].
Исследуемые реагенты: 96% (массовые проценты) авермектин, 98% (массовые проценты) тенвермектин (TEVA:TEVB=8:2): 1 г 96% авермектина и 98% тенвермектина взвешивали и добавляли в химический стакан, соответственно, в который добавляли также 93 г метанола и 6 г поверхностно-активного вещества - нонилфенол-полиоксиэтиленового эфира, чтобы концентрация препарата составила 10000 мг/л. Для исследования препарат разводили водой в последовательных разведениях 0,005, 0,01, 0,025 и 0,05 мг/л.
Дизайн эксперимента: применялся метод погружения дисков листьев; отбирали взрослых клещей, которые были выращены в лабораторных условиях, с однородным физиологическим состоянием. Отбирали листья паркинсонии колючей с равномерными условиями роста. При помощи перфоратора готовили диски из листьев диаметром 2 см. Диск листа помещали на гигроскопическую вату в центре пластиковой чаши с выпуклой стороной, направленной вверх. На каждой чаше было по 3 диска листа. Взрослых клещей заселяли на диск листа при помощи маленькой кисточки для письма, по 30 клещей на каждый диск листа. В чащу добавляли требуемое количество воды, затем ее помещали при температуре (26±1)°С и инкубировали в лаборатории при следующих условиях:
интенсивность освещения: 3000-4500 лк, 14 ч/д, ОВ 50%-75%. Количество клещей подсчитывали под стереомикроскопом через 2 ч, и количество не должно было быть менее 20 на каждом диске листа в чаше. Подготовленные реагенты в концентрациях 0,005, 0,01, 0,025 и 0,05 мг/л помещали в химический стакан. Лист удерживали пинцетами и вымачивали в реагентах последовательно, начиная с низкой концентрации и до высокой концентрации в течение 5 с. Для контроля взрослых самок клещей обрабатывали дистиллированной водой. Для каждой концентрации была одна обработка, и для каждой обработки было 3 повтора. После высушивания листа на воздухе обработанные диски листов помещали в климатическую камеру (26±1)°С со световым периодом 14 ч и инкубировали в течение 24 ч. Для поддержания влажности в пространство вокруг чаши добавляли небольшое количество воды.
После вымачивания в реагентах клещи были очень активны, и их активность начинала замедляться через 5-8 часов после обработки. Клещи успокаивались через 12-24 ч.
Критерии определения гибели: во время оценки к клещам аккуратно прикасались кисточкой для письма, и клещ, остающийся без движения, признавался погибшим.
(2) Анализ активности смеси тенвермектина А и В (массовое соотношение
Результаты эксперимента приведены в Таблице 2:
90:10) в отношении Helicoverpa armigera Губнера (Hubner) и Mythimna separate Уокера (Walker).
Активность тенвермектина определяли с применением третьей личиночной стадии Helicoverpa armigera Губнера (Hubner) и третьей личночной стадии Mythimna separate Уокера (Walker) в качестве тестовых насекомых-вредителей, и в качестве положительного контроля применяли милбемицин и авермектин.
Тестовый организм: Helicoverpa armigera Губнера (Hubner), третья личиночная стадия; Mythimna separate Уокера (Walker), третья личиночная стадия.
Исследуемые реагенты: 0,5% тенвермектин, эмульгируемый концентрат, 2% милбемицин, эмульгируемый концентрат, и 0,5% авермектин, эмульгируемый концентрат. Реагенты разводили в воде до заданных концентраций для исследования (конкретно перечислены в Таблице 3 и 4).
Приготовление 0,5% эмульгируемого концентрата тенвермектина: 0,5 г тенвермектина (массовое отношение А:В = 90:10)(переведенные в 100%), 5,0 г метанола алкилфенол-полиоксиэтиленового эфира, добавление метанола до 100 г.
Приготовление 2% эмульгируемого концентрата милбемицина: 2,0 г милбемицина (переведенные в 100%), 5,0 г алкилфенол-полиоксиэтиленового эфира, добавление метанола до 100 г.
Приготовление 0,5% эмульгируемого концентрата авермектина: 0,5 г авермектина (переведенные в 100%), 5,0 г метанола алкилфенол-полиоксиэтиленового эфира, добавление метанола до 100 г.
Дизайн эксперимента: насекомым-вредителям давали корм в сочетании с реагентами. На тестовых насекомых-вредителях оценивали токсичность реагента при попадании в желудок.
Результаты: активность указанных реагентов в отношении третьей личиночной стадии Helicoverpa armigera Губнера (Hubner) и третьей личиночной стадии Mythimna separate Уокера (Walker) приведена в Таблице 3 и 4.
0,5%
100
100
каждой
эмульгируемый
обработки.
концентрат
авермектина
Результаты показывают, что активность тенвермектина была выше, чем активность милбемицина и авермектина в отношении Helicoverpa armigera Губнера (Hubner) и Mythimna separate Уокера (Walker) при одинаковой концентрации.
(3) Анализ активности смеси тенвермектина А и В (массовое соотношение 90:10) в отношении Bursaphelenchus xylophilus
Bursaphelenchus xylophilus является возбудителем увядания хвойных пород, который приводит к гибели большого числа сосен на юге Китая. Активность шестнадцатичленных макролидных соединений, включая тенвермектин, авермектин, ивермектин, милбемицин и эмамектин и др., в лабораторных условиях исследовали с применением в качестве тестового насекомого-вредителя Bursaphelenchus xylophilus, чтобы сравнить различия в активности среди указанных реагентов в отношении Bursaphelenchus xylophilus.
Исследуемые реагенты: 5 реагентов, включая 0,5% эмульгируемый концентрат авермектина, 0,5% эмульгируемый концентрат тенвермектина, 0,5% эмульгируемый концентрат ивермектина, 2% эмульгируемый концентрат милбемицина и 2,5% микроэмульсию эмамицина бензоата.
Дизайн эксперимента: применяли способ погружения. Для каждого реагента исследовали 5 концентраций, включая 2, 5, 10, 20 и 50 мг/л. Для каждой концентрации было 3 повтора. Результаты анализировали статистически через 24 часа.
Результаты: токсичность каждого реагента в отношении Bursaphelenchus xylophilus приведена в Таблице 5.
Таблица 5. Анализ токсичности нескольких шестнадцатичленных макролидных соединений в отношении Bursaphelenchus xylophilus
(4) Эффект соотношения тенвермектина А и тенвермектина В на активность Активность смеси тенвермектина А и тенвермектина В с разными соотношениями исследовали с применением Bursaphelenchus xylophilus в качестве насекомого-вредителя, чтобы сформулировать рекомендации для модификации и процесса ферментации бактерий-продуцентов тенвермектина.
60/40
38,46
43,75
53,85
54,55
9,32233
50/50
38,24
56,25
57,14
61,54
5,279,7
Как видно из Таблицы 6, активность тенвермектина В была выше, чем активность тенвермектина А, и наибольшая активность наблюдалась при отношении тенвермектин А: тенвермектин В = 10:90. Пример 4
Профилактическое и контролирующее действие смеси тенвермектина А и тенвермектина В (массовое соотношение 90:10) на цитрусового паутинного клеща в полевых условиях
Цитрусовый паутинный клещ (т.е., Panonychus citri МакГрегор) является одним из основных вредителей в отношении цитрусовых культур. Он обладает такими свойствами, как маленькие размеры тела, быстрое размножение и множественные поколения, которые приводят к серьезным повреждениям цитрусовых культур. Тенвермектин готовили в форме 2% вододисперисонных гранул для исследования профилактического и контролирующего действия в отношении цитрусового паутинного клеща, чтобы определить его действие в полевых условиях.
Исследуемые реагенты: 2% вододисперсионные гранулы тенвермектина (тенвермектин, этанол и конденсат алкилфенол-полиоксиэтиленового эфира -формальдегида в массовом соотношении 2%: 96% : 4%), и 2% эмульгируемый концентрат авермектина
Время проведения эксперимента: в начале мая, на стадии завязи цитрусовых. Дизайн эксперимента: реагенты разводили в 2000, 4000 и 8000 раз до концентраций 10 мг/л, 5 мг/л и 2,5 мг/л, соответственно. Для каждой концентрации было 3 повтора. 10 цитрусовых деревьев находились на маленькой площади, где они были расположены случайным образом. В качестве контроля применяли воду, в контроле было исследовано 10 деревьев. Распыляли 50 кг реагента в каждой концентрации. Реагент наносили в солнечный день без дождя в последующие 24 часа.
Анализ данных: на каждой маленькой площади исследовали 5 деревьев. Для каждого дерева исследовались по 2 ветки, расположенные на востоке, юге, западе и севере, и в центре дерева. Для каждой ветки количество живых клещей
подсчитывали всего для 5 листьев. Количество живых клещей подсчитывали до нанесения реагента и через 3, 5, 7 и 14 дней после нанесения, соответственно, чтобы оценить скорость сокращения популяции клещей. Профилактическое и контролирующее действие в полевых условиях определяли на основании результатов.
профилактическое и контролирующее действие тенвермектина в отношении
Результаты: профилактическое и контролирующее действие тенвермектина в отношении цитрусового паутинного клеща в полевых условиях приведено в Таблице 7.
цитрусового паутинного клеща превосходит, т.е. более выраженное, чем действие авермектина. Результаты, отмеченные разными буквами, в одной колонке означают значимое различие при уровне значимости 5%. Пример 5
Профилактическое и контролирующее действие смеси тенвермектина А и В (массовое соотношение 90:10) на Spodoptera exigua в полевых условиях
Spodoptera exigua является основным насекомым-вредителем для овощей, и его распространение трудно предотвращать и контролировать. Для исследования профилактического и контролирующего действия тенвермектина в полевых условиях из него готовили 5% микроэмульсию.
Исследуемые реагенты: 5% микроэмульсия тенвермектина (тенвермектин, этанол, изопропанол и эфир жирного спирта и полиоксиэтилена фосфат в массовом соотношении 5% : 40% : 40% : 15%), 2% эмульгируемый концентрат авермектина.
Дизайн эксперимента: объект профилактического и контролирующего действия: Spodoptera exigua; участок Jingfeng 1. Было 4 обработки, включая 3 грамма активного ингредиента/км2, 6 граммов активного ингредиента/км2. Обрабатываемая площадь составляла 30 м2. Было 4 повтора каждого нанесения, и в качестве контроля применяли воду. Реагенты распыляли равномерно вперед и назад на листья традиционным способом, и объем нанесения составил 900 г/км2. Нанесение проводили в солнечный день.
Исследования и анализ данных: перед нанесением определяли исходное количество Spodoptera exigua. Профилактическое и контролирующее действие в полевых условиях определяли через 3 и 10 дней после введения. На каждой маленькой площади было 5 точек отбора проб, по 5 растений на каждую точку, в которой исследовали количество Spodoptera exigua. Профилактическое и контролирующее действие определяли на основании количества живых вредителей и скорости сокращения вредителей.
Скорость сокращения вредителей = (Количество вредителей до нанесения -количество вредителей после нанесения) / количество вредителей до нанесения х 100%
Профилактическое и контролирующее действие = (Скорость сокращения вредителей в группе препарата - скорость сокращения вредителей в контрольной группе)/(1 - скорость сокращения вредителей в контрольной группе) х 100%
Результаты, отмеченные разными буквами, в одной колонке означают значимое различие при уровне значимости 5%. Пример 6
Профилактическое и контролирующее действие смеси тенвермектина А и В (массовое соотношение 90:10) на Piute Па xylostella
Исследуемые реагенты: 5% суспензия тенвермектина (тенвермектин, эфир соснового масла и поверхностно-активное вещество (полиоксиэтилен-лауриловый эфир) в массовом соотношении 5% : 90% : 5%), 4,5% эмульгируемый концентрат высокоэффективного циперметрина (приобретено у "Nanjing Red Sun Co., Ltd.").
Дизайн эксперимента: испытание проводили на капустном поле, и в качестве контроля применяли воду. Площадь составила 20 м2, и была выбрана случайным образом. Было 4 повтора. Для каждой обработки нанесение проводили в форме водяной пыли при помощи ранцевого опрыскивателя MATABI с объемом 900 кг/км2. Пробы отбирали в 5 точках, и на одну точку исследовали по 4 растения. На каждой площади исследовали 20 растений. До нанесения определяли исходное количество. После нанесения определяли количество оставшихся
живых вредителей, чтобы оценить скорость сокращения вредителей. Скорректированное профилактическое и контролирующее действие% = (скорость сокращения вредителей в контрольной группе - скорость сокращения вредителей в группе препарата)/ скорость сокращения вредителей в контрольной группе.
В отношении полученных результатов проводили вариационный анализ, и значимость различий между разными препаратами определяли по критерию Дункана.
Результаты эксперимента приведены в Таблице 9: Таблица 9. Профилактическое и контролирующее действие тенвермектина в
В полевых экспериментах было продемонстрировано, что профилактическое и контролирующее действие тенвермектина в отношении Plutella xylostella в полевых условиях превосходит действие других препаратов.
Описанные выше примеры являются лишь предпочтительными примерами настоящего изобретения и не предназначены, чтобы ограничивать область изобретения. Любые варианты, эквивалентные замены и усовершенствования,
которые выполняются в духе настоящего изобретения, попадают в объем притязаний настоящего изобретения.
<110> ZHEJIANG HISUN PHARMACEUTICAL CO., LTD.; ZHEJIANG HISUN CHEMICAL CO.,
LTD.
<12 0> Шестнадцатичленное макролидное соединение и его применение
<130> P1540010C
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 81
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность оснований 442-522 гена aveD для замещения
<400> 1
atgcccagcc ccgcacaggt gatccgggag atcgcccggg tgctccgccc cggcggccgg 60 ctggccgtca cggacgtcgc a 81
<210> 2
<211> 81
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> последовательность, использованная для замещения последовательности
оснований в положениях 442-522 гена aveD
<400> 2
attccgggga tccgtcgacc tgcagttcga agttcctatt ctctagaaag tataggaact 60 tcgaagcagc tccagcctac a 81
<210> 3
<211> 59
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> aveD59
<400> 3
tccttcgacg cggcgtgggc cctggagtgt ctcctgcaca ttccggggat ccgtcgacc 59
<210> 4
<211> 58
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> aveD58
<400> 4
ctccccgcgc ttcatgccgg tccgcccgaa ggcgcgcagt gtaggctgga gctgcttc
<210> <211> <212>
27 ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> aveDF <400> 5
aagttccctt cccatgcccg gccattg 27
<210> <211> <212>
30 ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> aveDR
<400> 6
attccggcgt actcgtcgat gtgcaccagg 30
<210> <211> <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> aveDM <400> 7
cgggcgatct cccggatcac ctgtg 25
<210> <211> <212>
22 ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MA13F1
<400> 8
cagaccatgt ggctcgtgga gc 22
<210> <211> <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MA13R2 <400> 9
atgcatcagg agaggccgag gtcgttc 27
<210> 10 <211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MA1DF3 <400> 10
atgcatcacg ggtcatccgg cgttgaagcg 30
<210> 11
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MA1DR4
<400> 11
aagcttgagg ggcgagaagg actggtcggg c 31
<210> <211> <212>
12 28 ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> AA1DF9
<400> 12
accggacgcc tgccactccg cccgtatc 28
<210> 13
<211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> AA1DR10
<400> 13
atttaaatgc ctgtgtccgc tccgacgatc gcc 33
14 26
<210> <211> <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> milDF11 <400> 14
tcgaccaccc cacgcccgac gaactc 26
<210> 15
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> milDR12
<400> 15
cgaccacgtc agcgcctcca tcgacac 27
16 27
<210> <211> <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MA15F13 <400> 16
aacctgcaga acatcgctcc cgccccg 27
<210> <211> <212>
17 37 ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> MA15R14
<400> 17
aacaagctta tttaaatccg acggcttgtc cacgtgc 37
<210> 18
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> AA1UF15
<400> 18
aacgaattct gcgagtcgcg acactggc 28
<210> 19 <211> 29 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> AA1DR16 <400> 19
aacggtacct caccgctagg caatgctcg 29
<210> 20 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 025A1EF
<400> 20
gggaggagtt gctggagctg ctgggg
<210> <211> <212>
21 26 ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 026A1ER <400> 21
gtggccaact cgggtgacat gggtcg 26
<210> <211> <212>
22 26 ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 027M1EF
<400> 22
tgcatctgac cgcctacgcc caaccg 26
<210> 23 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 028M1ER
<400> 23
gcgtcggcaa accggtcgta gacccc
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Шестнадцатичленное макролидное соединение, структурная формула которого соответствует:
где R является СНз или С2Н5, и если R является СНз, указанное соединение является тенвермектином А, а если R является С2Н5, указанное соединение является тенвермектином В.
2. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения по п.1 при
получении химических веществ для предупреждения и контроля численности
насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве.
3. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве по п.2, отличающееся тем, что указанное шестнадцатичленное макролидное соединение предпочтительно выбрано из тенвермектина В, тенвермектина А или смеси тенвермектина А и тенвермектина В, причем массовое соотношение между тенвермектином А и тенвермектином В составляет 1:9, 9:1, 2:8, 8:2, 3:7, 7:3, 4:6, 6:4 или 5:5.
4. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве по п.2, отличающееся тем, что указанными вредителями для сельского и лесного хозяйства являются один или более выбранные из Lepidoptera Plutellidae, Lepidoptera Noctuidae, Lepidoptera Lasiocampidae, Lepidoptera borer, Coleoptera
3.
Elateridae и Tylenchida Aphelenchoidea, и/или клещом, вредоносным для сельского и лесного хозяйства является лиственный клещ.
5. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве по п.4, отличающееся тем, что указанным насекомым-вредителем Lepidoptera plutellidae является Plutella xylostella, и/или указанным насекомым-вредителем Lepidoptera noctuidae является один или более выбранные из Spodoptera exigua, Prodenia litura, Mythimna separate Уокера (Walker), Helicoverpa armigera Губнера (Hubner) и Agrotis ipsilon, и/или указанным насекомым-вредителем lepidoptera lasiocampidae является шелкопряд сосновый, и/или указанным насекомым-вредителем Lepidoptera borer является менрбиус, и/или указанным насекомым-вредителем Coleoptera Elateridae является нематода гемонхус, /или указанным насекомым-вредителем Tylenchida Aphelenchoidea является Bursaphelenchus xylophilus, и/или вредным для сельского и лесного хозяйства клещом является один или более выбранный из Tetranychus cinnabarinus, Tetranychus urticae Коха (Koch) и цитрусового паутинного клеща.
6. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве по п.2, отличающееся тем, что формой выпуска указанных химических веществ являются вододисперсионные гранулы, эмульгируемый концентрат, водная суспензия, масляная суспензия, микроэмульсия или таблетки.
7. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве по п.6, отличающееся тем, что указанные вододисперсионные гранулы или таблетки содержат соединение по п.1, наполнитель или растворитель, и поверхностно-активное вещество в массовом соотношении 0,5-90% : 10-95% : 3-20%; и предпочтительно 0,5-87% : 10-95% : 3-20%.
8. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещами в сельском и лесном хозяйстве по п.6, отличающееся тем, что указанный эмульгируемый концентрат содержит указанное соединение, растворитель и поверхностно-активное вещество в массовом соотношении 0,5-90% : 5-85% : 2-15%.
9. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве по п.6, отличающееся тем, что указанная водная суспензия или масляная суспензия содержит указанное соединение, воду или растворитель и поверхностно-активное вещество в массовом соотношении 0,5-90% : 5-80% : 5-20%; и предпочтительно, 0,5-90% : 10-80% : 5-20%.
10. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве по п.6, отличающееся тем, что указанная микроэмульсия содержит указанное соединение, воду или растворитель и поверхностно-активное вещество в массовом соотношении 0,5-50% : 40-95% : 4-15%.
11. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве по п.6, отличающееся тем, что указанные вододисперсионные гранулы содержат указанное соединение, наполнитель и поверхностно-активное вещество в массовом соотношении 0,5-60% : 30-98% : 1-25%; и предпочтительно 0,5-60% : 30-90% : 4-20%; таблетки содержат указанное соединение, наполнитель и поверхностно-активное вещество в массовом соотношении 0,5-90% : 8-85% : 220%; и предпочтительно 0,5-90% : 15-85% : 2-20%.
12. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности
8.
насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве по меньшей мере по одному из п. 7 -11, отличающееся тем, что указанным наполнителем является белая сажа, бентонит и диатомовая земля, или смесь любых двух или более вариантов.
13. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве по меньшей мере по одному из п. 7 -11, отличающееся тем, что указанным растворителем является метанол, этанол, изопропанол, и-бутанол или канифольное масло, или смесь любых двух или более вариантов
14. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве по меньшей мере по одному из п. 7 -11, отличающееся тем, что указанным поверхностно-активным веществом является одно или более вещество, выбранное из нонилфенол-полиоксиэтиленового эфира, октилфенол-полиоксиэтиленового эфира, полиоксиэтиленового эфира стеарила, полиоксиэтиленового эфира лаурила, полиоксиэтиленового эфира канифольной кислоты, эфира сорбитана и жирной кислоты, алкилфенола полиоксиэтиленового эфира фосфата, полиоксиэтиленового эфира фосфата жирных спиртов, конденсата алкилфенола полиоксиэтиленового эфира-формальдегида, додецилбензоата сульфоната кальция, хлорида додецил-триметил-аммония и бетаина.
15. Применение шестнадцатичленного макролидного соединения при получении химических веществ для предупреждения и контроля численности насекомых-вредителей или клещей в сельском и лесном хозяйстве по п.2, отличающееся тем, что способом применения является распыление или разбрасывание.
13.
1 /9
Т:+ с Полный масс-спектр с ионизацией электроспреем [400.00-1200.00]
855.35
эсн
90Н
о о
со о. I-о о о. с о со о.
О О
80 70 605040 3020- 10 0
549.28
600
677.53
700
850.46
774.10
I,HTTP://www.eapatis.com/getimage.asp?src=//eapatis2012/Data/EATXT/Л.
300
856.35
857 31
932 95
| 988.88 1015-67 ,1045.84 1163.47
800 1000 1100 1200
m/z
доли
Jh - (J"* С if r- t. i (tm)* "i . ] -Э 4" - С J J T u C- i
T r i' О f Л (i l'. Л UT IT J H t 'If - i-tf f
¦> ь , t" -r^ ~i r (?- ^ j г *P i"J ,JJ т f f- С- *n ~ *¦* Г4 4- W 4
"r^-tJirqLn^j'eai-I!"
П П - C\ ij* "1 Ј7 < -
t'J U Г С ,D С Е'Л т -H Г
I f 1
-10 196 ^90 170 1ЈC i*> z in 120 110 ICO S3
ФИГ. 3
миллионные доли
¦а 1Л i~- *Л О г
cr м ь. L, ix I i к да L * н с гм'|-
I i Г
20" ISO 180 170 160 153 140 130 120 '110 ИС SO 80 TO (0 SS
доли
Т:+ с Полный масс-спектр с ионизацией электроспреем [400.00-1200.00]
869.32
100
90 8070-
бо-_
5040г
870.34
ЗОН 20-
632 78
600
669.30
700
864.05
763.09 796.23 863.37]
300
871.35 920.21
900 m/z
946.14 1004.92 1080'12
987,22 | Ю16.36 I 1133.78 119563
1000 1100 1200
ФИГ. 5
доли
200 150 180 170 ISO
14 0 130 12 а 110 100 90 30 7Q fcU ЬО +0 JO 20
ФИГ. 7
миллионные доли
i...
III
миллионные доли
200 iso iao i7g leo 150 1*0 хзо 3.20 no 100 so eo 70 &-g so 40 зо 20 ю
BstBI(l)
HhuIIII (1904) SphI(1902) Shfl (18%) Psti (1896) Salt (1886) BaraHI (1874) Smal (1871) Kpnl(18f"9) EcoRl (1853)
lacZo Pvul(1736) N'tk-I (1641)
Aatll (1392)
Ниже aveD тгП Выше aveD // фШШШШШШШШШШЯШ^ШШфШШШШШ // Геномная ДНК S. avermitilis МА-4680
Ниже aveD Мутантный aveD Выше aveD | Плазмида pUAmT-kaveD
pi с ui t
i/ГОJ iWCLilH
Й" S 3 II I i I I
< <
I I
100 7S-30
25 -г
I л
7.5
7.5
10.0
10.0
12.5
12.5
15.0 мин.
15.0
мин.
BKL
Sma )
pUAmT-MAIS'
Hind III i Nil I 6199 no
AA1DF3 ,' AA1DR10
I S. avermitilis
фрагмент 7
milAI
ft Геном S.hygroscopicus HS023
¦ ft ши*- J шят (f плазмида p*,1Al3aa milAI aveAI-0 mi/A 1-0
шшшшшшшшшЪ i msm // Геном S.hygroscopicus 3-22#
ФИГ. 14
MA15F13/MA15R14
S.hygroscopicus
PCR
pUAmT14 3097bp Фрагмент
Pst I / ШтИ^^ I / Hind Hi
pUAmT-MA15
EcoR I / Kpn I
AA1UF15/AA1DR16
S. averm iritis A D2S PCR
31 ОЗЬр фрагмент
EcoR 11 Kpn I
pUAmT-MA15AA1U
8/9 .0 тМА'.-О
, mm I' Геном S.hygroscopicus 3-22# плазмида osi -.**,i:-*i.it
;нв ,у. мутант геном
• " S.hygroscopicus
ФИГ. 16
мутант S.hygroscopicus геном
iiiiiniii iiiiiiimiiiiiiiij фрагмент-ревертант самолигирование
ПЛаЗМИДа nUAniT-A^A
ФИГ. 17
Геномная ДНК S. avermitilisAD-28
плазмида pUAmT-AMA
жгтА 14)
^ # Геномная ДНК S. avermitilis МА220
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
ФИГ. 2
миллионные
ФИГ. 2
миллионные
ФИГ. 2
миллионные
ФИГ. 2
миллионные
2/9
ФИГ. 4
миллионные
2/9
ФИГ. 4
миллионные
2/9
ФИГ. 4
миллионные
2/9
ФИГ. 4
миллионные
2/9
ФИГ. 4
миллионные
2/9
ФИГ. 4
миллионные
3/9
миллионные
3/9
миллионные
3/9
миллионные
3/9
миллионные
4/9
ФИГ. 8
5/9
ФИГ. 10
5/9
ФИГ. 10
5/9
ФИГ. 10
6/9
ФИГ. 12
6/9
ФИГ. 12
6/9
ФИГ. 12
6/9
ФИГ. 12
6/9
ФИГ. 12
7/9
ФИГ. 15
7/9
ФИГ. 15
7/9
ФИГ. 15
ФИГ. 18
9/9