EA201691521A1 20170228 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/201691521 Полный текст описания [**] EA201691521 20150313 Регистрационный номер и дата заявки US61/968,550 20140321 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2015/020383 Номер международной заявки (PCT) WO2015/142637 20150924 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21702 Номер бюллетеня [**] АНТИТЕЛА К ИНТЕРЛЕЙКИНУ-21 Название документа [8] C07K 16/24 Индексы МПК [US] Дэвис Джулиан, [US] Магрини Фабио, [US] Мартин Андреа Паула, [US] Мозаффариан Неелуфар, [US] Пател Четанкумар Натварлал, [US] Шрёдер Оливер Сведения об авторах [US] ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201691521a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Настоящее изобретение относится к сконструированным, гуманизированным антителам, которые обладают высокой аффинностью связывания и нейтрализуют ИЛ-21 человека, к способам применения указанных антител для лечения состояний, в которых оправданным является антагонистическое воздействие на ИЛ-21 или нейтрализация активности ИЛ-21, таких как аутоиммунные состояния, к композициям и способам получения указанных антител с помощью рекомбинантных методик и фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к сконструированным, гуманизированным антителам, которые обладают высокой аффинностью связывания и нейтрализуют ИЛ-21 человека, к способам применения указанных антител для лечения состояний, в которых оправданным является антагонистическое воздействие на ИЛ-21 или нейтрализация активности ИЛ-21, таких как аутоиммунные состояния, к композициям и способам получения указанных антител с помощью рекомбинантных методик и фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела.


Евразийское (2D 201691521 (13) А1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K16/24 (2006.01)
2017.02.28
(22) Дата подачи заявки 2015.03.13
(54) АНТИТЕЛА К ИНТЕРЛЕЙКИНУ-21
(31) (32)
61/968,550 2014.03.21
(33) US
(вв) PCT/US2015/020383
(87) WO 2015/142637 2015.09.24
(71) Заявитель:
ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US)
(72) Изобретатель:
Дэвис Джулиан, Магрини Фабио, Мартин Андреа Паула, Мозаффариан Неелуфар, Пател Четанкумар Натварлал, Шрёдер Оливер (US)
(74) Представитель:
Лыу Т.Н., Угрюмов В.М., Гизатуллина Е.М., Глухарёва А.О., Дементьев В.Н., Карпенко О.Ю., Клюкин В.А., Строкова О.В., Христофоров А.А. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к сконструированным, гуманизированным антителам, которые обладают высокой аффинностью связывания и нейтрализуют ИЛ-21 человека, к способам применения указанных антител для лечения состояний, в которых оправданным является антагонистическое воздействие на ИЛ-21 или нейтрализация активности ИЛ-21, таких как аутоиммунные состояния, к композициям и способам получения указанных антител с помощью рекомбинантных методик и фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела.
АНТИТЕЛА К ИНТЕРЛЕЙКИНУ-21
Настоящее изобретение относится к сконструированным, гуманизированным антителам, которые обладают высокой аффинностью связывания и нейтрализуют интерлейкин-21 (ИЛ-21) человека, к способам применения указанных антител для лечения состояний, при которых оправданным является антагонистическое воздействие или нейтрализация активности ИЛ-21, таким как аутоиммунные состояния, к композициям и способам получения указанных антител с помощью рекомбинантных методик, а также фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела.
В WO2010/055366 раскрыты антитела человека, полученные из трансгенных мышей, которые, как сообщается, связываются и нейтрализуют ИЛ-21 человека. Конкретное антитело представляет собой антитело, полученное из клона 362.78.
В работе Maurer, М., et al. (Generation and characterization of human anti-human IL-21 neutralizing monoclonal antibodies, 4 MAbs 69 (2012)) описано получение и исходные характеристики панели моноклональных антител человека к ИЛ-21 человека, полученных из мышей, трансгенных по гену IgG человека, включая антитело, полученное из клона 362.78. Клинические исследования антитела к ИЛ-21, описанного в WO2010/055366, US20130323259A1 и в работе Maurer et al., а именно "моноклонального антитела 362.78", которое также упоминается как NN8828 и NNC114-0006 или NNC-0000-0006, были проведены с участием пациентов, страдающих системной красной волчанкой (СКВ) и болезнью Крона.
В WO2012/098113 раскрыто получение кристаллической структуры ИЛ-21 человека в комплексе с фрагментом Fab моноклонального антитела 362.78 (NNC 0114-0005), ранее упомянутого в WO2010/055366, которая была исследована с помощью рентгенографических методов.
В настоящем изобретении, раскрытом в настоящей заявке, предложены альтернативные варианты антител к ИЛ-21, описанных выше. Указанные антитела потенциально являются особенно подходящими для лечения аутоиммунных состояний или заболеваний, таких как первичный синдром Шегрена (ПСШ), синдром Шегрена (СШ) и системная красная волчанка (СКВ), болезнь Грейвса, сахарный диабет 1 типа и другие, для которых доступно несколько методов лечения, и во всем мире все еще существует медицинская потребность в новых методах лечения. Существует острая потребность в более эффективных методах лечения, имеющих лучшие профили безопасности по сравнению с существующими стандартами ухода за пациентами.
В частности, в настоящем изобретении предложены антитела, которые в качестве вариабельной области тяжелой и легкой цепи содержат сконструированную и гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела, упоминаемого в настоящей заявке как АЬ327.
В настоящем изобретении предложены антитела, которые обладают одним или более из следующих свойств: 1) связываются с высокой аффинностью с ИЛ-21 человека и ИЛ-21 яванских макак (KD=0,8+0,5xlO"12 М И 0,3±0,1Х10"12 М, соответственно, при 37 °С, согласно результатам измерения равновесного связывания в растворе с помощью технологии KinExA(r)); 2) связываются со средней аффинностью с ИЛ-21 мыши и крысы (KD=2,4+1,3X10"7 И 2,3±0,2Х10"7 М, соответственно, при 37 °С, согласно результатам измерения равновесного связывания в растворе с помощью технологии KinExA(r)); 3) по существу не связываются с другими членами семейства ИЛ человека, содержащими общую гамма-цепь (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-9 и ИЛ-15); 4) нейтрализуют активность ИЛ-21 человека и яванских макак в конкретном количественном исследовании pan-STAT-IM9-репортерный ген люциферазы с величиной ИК50, которая приблизительно в 6 раз ниже, чем этот показатель для положительного контроля, конструкции hIL-21R-Fc (-46,7 пМ и -41 пМ по сравнению с -271 пМ, соответственно); 5) нейтрализуют индуцированную ИЛ-21 человека пролиферацию первичных В-клеток человека в условиях in vitro с величиной ИК50, которая составляет приблизительно 1,15 нМ; 6) нейтрализуют индуцированную ИЛ-21 человека дифференцировку первичных В-клеток человека в плазматические клетки в условиях in vitro; 7) эффективно блокируют быстрое и кратковременное размножение нескольких типов клеток в селезенке (включая субпопуляции В- и Т-клеток) у мышей, которым путем инъекции вводили ИЛ-21 человека; и/или 8) являются достаточно стабильными для фармацевтического производства, хранения и терапевтического применения.
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предложены антитела, которые связываются с ИЛ-21 человека, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR), причем указанная LCVR содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 7, в CDRL1, последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 8, в CDRL2 и последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 9, в CDRL3, и указанная HCVR, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 10, в CDRH1, последовательность, приведенную в SEQ ГО N0: 11, в CDRH2 и последовательность, приведенную в SEQ ГО N0: 12, в CDRH3.
Предпочтительно антитело в соответствии с настоящим изобретением содержит тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела, причем указанная тяжелая цепь содержит HCVR, имеющую последовательность, приведенную в SEQ Ш NO: 1, и указанная легкая цепь содержит LCVR, имеющую последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 2.
В настоящем изобретении дополнительно предложены антитела, которые связываются с ИЛ-21 человека, содержащие две тяжелые цепи антитела и две легкие цепи антитела, в которых каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность SEQ Ш NO: 1, и в которых каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность SEQ Ш N0: 2.
Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению содержит две тяжелые цепи антитела и две легкие цепи антитела, причем каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность SEQ Ш NO: 1, и каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность SEQ Ш N0: 2.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения предложено антитело АЬ327, которое представляет собой сконструированное и гуманизированное антитело к ИЛ-21 человека, аминокислотная последовательность каждой тяжелой цепи которого представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 3, и аминокислотная последовательность каждой легкой цепи которого представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 4.
В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие антитела согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
В настоящем изобретении также предложены молекулы ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи антител согласно настоящему изобретению, для экспрессии антител согласно настоящему изобретению. В частности, в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена молекула ДНК, содержащая полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 3. В настоящем изобретении также предложена молекула ДНК, содержащая полинуклеотид, последовательность которого представляет собой последовательность, приведенную в
SEQ Ш NO: 5. Указанная полинуклеотидная последовательность соответствует тяжелой цепи антитела.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена молекула ДНК, содержащая полинуклеотид, который кодирует легкую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 4. В настоящем изобретении также предложена молекула ДНК, содержащая полинуклеотид, последовательность которого представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 6. Указанная полинуклеотидная последовательность соответствует легкой цепи антитела.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена молекула ДНК, содержащая полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 3, и содержащая полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 4. В настоящем изобретении также предложена молекула ДНК, содержащая полинуклеотид, последовательность которого представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 5, и содержащая полинуклеотид, последовательность которого представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 6.
В настоящем изобретении предложены клетки млекопитающих для экспрессии антител согласно настоящему изобретению с помощью рекомбинантных методик. В частности, в настоящем изобретении предложена клетка млекопитающего, трансформированная молекулой ДНК согласно настоящему изобретению, описанной выше.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ получения антитела, причем указанное антитело содержит две тяжелые цепи антитела и две легкие цепи иммуноглобулинов, в котором аминокислотная последовательность каждой из двух тяжелых цепей представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 3, и аминокислотная последовательность каждой из двух легких цепей представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 4, и при этом указанный способ включает: а) культивирование клетки млекопитающего согласно настоящему изобретению, описанной выше, в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного антитела, и Ь) выделение экспрессированного антитела. В настоящем изобретении
предложено антитело, полученное с помощью способа согласно настоящему изобретению, описанного непосредственно выше.
В настоящем изобретении предложены способы применения антител, в частности для лечения аутоиммунных состояний (АИ), в частности, первичного синдрома Шегрена (ПСШ), синдрома Шегрена (СШ), системной красной волчанки, болезни Грейвса или диабета 1 типа, способы получения указанных антител, полинуклеотиды, кодирующие указанные антитела, векторы, содержащие указанные нуклеотиды для трансформации клеток-хозяев и экспрессии указанных антител, клетки-хозяева для экспрессии указанных антител, антитела, полученные с помощью способа рекомбинантной экспрессии в системах клеток-хозяев млекопитающих, а также фармацевтические композиции указанных антител, которые содержат указанное антитело и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
В настоящем изобретении предложено применение указанных антител для лечения АИ состояний, в частности таких АИ состояний как первичный синдром Шегрена (ПСШ), синдром Шегрена (СШ), системная красная волчанка, болезнь Грейвса или сахарный диабет 1 типа. В настоящем изобретении предложены антитела для применения в терапии, в лечении аутоиммунных состояний, в лечении первичного синдрома Шегрена (ПСШ), синдрома Шегрена (СШ), системной красной волчанки, болезни Грейвса или сахарного диабета 1 типа, и в частности в лечении первичного синдрома Шегрена (ПСШ), синдрома Шегрена (СШ) или системной красной волчанки. В настоящем изобретении предложено применение антитела согласно настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства для применения в лечении аутоиммунного состояния; для применения в лечении первичного синдрома Шегрена (ПСШ), синдрома Шегрена (СШ), системной красной волчанки, болезни Грейвса или сахарного диабета 1 типа; для лечения первичного синдрома Шегрена (ПСШ), синдрома Шегрена (СШ); или для лечения системной красной волчанки. В частности, в настоящем изобретении предложено применение антитела согласно настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения аутоиммунного состояния; первичного синдрома Шегрена (ПСШ), синдрома Шегрена (ПСШ), системной красной волчанки, болезни Грейвса или сахарного диабета 1 типа; первичного синдрома Шегрена (ПСШ), синдрома Шегрена (СШ); или системной красной волчанки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1. Приведены результаты оценки связывания АЬ327 с ИЛ-21 человека и другими лигандами, которые связываются с рецептором человека, содержащим общую гамма-цепь, с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
Фигура 2. Приведены результаты, указывающие на то, что антитело АЬ327 нейтрализует пролиферацию первичных В-клеток человека, индуцированную ИЛ-21 человека, в условиях in vitro.
Фигура 3. Приведены средние значения процентного изменения массы тела, относительно начальных условий, у мышей с тяжелым иммунодефицитом NSG (NOD-scid ИЛ-2Яу ноль), которым привили мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) и которые получали антитело к ИЛ-21 или антитело для контроля изотипа в течение 42 дней. Лечение проводили во временных точках, обозначенных стрелками.
Условные обозначения: -¦- АЬ327 (10 мг/кг); Т АЬ327 (1 мг/кг); -?- контроль изотипа
(10 мг/кг); - •-не привитые животные.
Фигура 4. Приведены средние значения процентного изменения массы тела, относительно начальных условий, у мышей с тяжелым иммунодефицитом NSG (NOD-scid ИЛ-2Яу ноль), которым привили мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) и которые получали антитело к ИЛ-21 или антитело для контроля изотипа. Лечение проводили во временных точках, обозначенных стрелками. Условные
обозначения: -¦- АЬ327 (10 мг/кг); -?- контроль изотипа (10 мг/кг); -•- не привитые
животные.
Фигуры 5 и 6. Приведены данные, свидетельствующие о том, что лечение с использованием антитела к ИЛ-21 уменьшает лимфоцитарную инфильтрацию в слюнных железах мышей NOD, согласно результатам количественного исследования мРНК (фигура 5) и гистологического исследования (фигура 6, лимфоциты подчеркнуты).
Фигуры 7А и 7В. Приведены данные, свидетельствующие о том, что суррогатное антитело 728 предотвращает развитие аутоиммунного диабета у мышей NOD. Лечение начинают в возрасте 7 недель (А) в качестве профилактики или в возрасте 13 недель (В) во время преддиабетической фазы. Число случаев диабета рассчитывают для каждой группы как два последовательных измерения уровня глюкозы в крови более 250 мг/дл, и представляют в процентах диабетических мышей в каждой группе (A: mlgGl п=12; АЬ728 п=12 и В: mlgGl n=8; Ab728 n=l 1). Число случаев диабета оценивают как данные кривой
выживаемости, и статистическую значимость определяют с помощью лог-рангового критерия (А: р=0,0007 и В: р=0,002).
Применение антител согласно настоящему изобретению
Интерлейкин (ИЛ)-21 вырабатывается различными подгруппами Т-клеток и связывается со сложным рецептором, который состоит из специфичного рецептора, называемого рецептор ИЛ-21 (ИЛ-21Я), и субъединицы общей у-цепи. ИЛ-21 человека вырабатывается в условиях in vivo из молекулы-предшественника, содержащей 162 аминокислоты. Зрелый ИЛ-21 человека состоит из остатков 30-162 (133 аминокислоты) белка-предшественника. Являясь типичным представителем цитокинов I класса, ИЛ-21 имеет комплексную структуру, содержащую четыре спирали, которые расположены в топологии вверх-вверх-вниз-вниз. В соответствии с нумерацией остатков в белке-предшественнике, содержащем 162 аминокислоты, спирали, как полагают, состоят из следующих остатков: А спираль: 41-56, В спираль: 69-84, С спираль: 92-105, и D спираль: 135-148. Упомянутая структура близкородственна структуре других членов семейства цитокинов I типа, в особенности ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-15.
После связывания ИЛ-21 с рецепторным комплексом и последующей активации рецептора передача сигналов происходит через сигнальный путь Jak-STAT. Цепь ИЛ-21Я связывается с ИЛ-21 с высокой аффинностью и обеспечивает большую часть энергии связывания. Однако для передачи сигналов необходимо взаимодействие с общей гамма-цепью. Взаимодействие между ИЛ-21 и ИЛ-21 R опосредовано остатками, присутствующими в спиралях А и С, и небольшой частью петли CD, расположенной непосредственно после С-спирали ИЛ-21 (О. Hamming, et al., Crystal Structure of Interleukin-21 Receptor (IL-21R) Bound to IL-21 Reveals That Sugar Chain Interacting with WSXWS Motif Is Integral Part of IL-21R, 287 J. Biol. Chem. 9454-9460 (2012)).
ИЛ-21 представляет собой цитокин I типа, который оказывает плейотропное действие на ответы врожденной и адаптивной иммунной системы, такие как стимуляция пролиферации лимфоцитов, усиление цитотоксичности, опосредованной CD8+ Т-клетками и NK-клетками, и дифференцировка В-клеток в плазматические клетки. ИЛ-21 секретируется активированными CD4+ Т-клетками, в частности Thl7 и Т-фолликулярными хелперами, а также природными клетками-киллерами. Он играет важную роль в стимуляции развития Thl7 и Т-фолликулярных хелперов с помощью механизма прямой связи. ИЛ-21 также взаимодействует с другими цитокинами, чтобы увеличить цитотоксичность CD8+ Т-клеток и стимулирует пролиферацию CD8+ клеток в присутствии антигенов. ИЛ-21 также влияет на выработку антител В-клетками. ИЛ-21
оказывает различные виды воздействия, включая увеличение пролиферации Т-клеток, контроль дифференцировки В-клеток в клетки памяти и терминально дифференцированные плазматические клетки, а также увеличение активности природных клеток-киллеров. При некоторых состояниях и заболеваниях человека желательным может быть блокирование активности ИЛ-21. В частности, антитело, которое блокирует связывание ИЛ-21 с его рецептором, будет желательным при лечении таких состояний и заболеваний.
С учетом их свойств, антитела согласно настоящему изобретению потенциально являются особенно подходящими для лечения аутоиммунных состояний или заболеваний, при которых взаимодействия Т-клетка-В-клетка, клетки Thl7, Т-фолликулярные клетки-хелперы, плазматические клетки и активированные CD8 и NK-клетки играют преобладающую патогенную роль. Заболевания, которые полностью соответствуют этой категории, включают первичный синдром Шегрена (ПСШ), синдром Шегрена (СШ) и системную красную волчанку (СКВ), для которых доступно несколько методов лечения, и во всем мире остается значительная медицинская потребность в новых методах лечения. Другие потенциальные показания включают болезнь Грейвса и сахарный диабет 1 типа.
Синдром Шегрена представляет собой медленно прогрессирующее системное аутоиммунное заболевание, наблюдаемое у 0,5-1,0% населения, которое преимущественно поражает женщин среднего возраста, хотя оно может развиваться в любом возрасте, как у мужчин, так и женщин. Первичный синдром Шегрена (ПСШ) и синдром Шегрена (СШ) характеризуются хроническим воспалением экзокринных желез, в частности, слюнных и слезных желез. Основными особенностями ПСШ является сухость ротовой полости и глаз ("синдром сухого глаза"), и гистологическим отличительным признаком является очаговая лимфоцитарная инфильтрация экзокринных желез, которую можно определить с помощью незначительной биопсии губной слюнной железы. Наличие синдрома сухого глаза негативно влияет на качество жизни и вызывает местные осложнения в вовлеченной слизистой оболочке. Сильная сухость во рту является неприятным и инвалидизирующим состоянием. Однако проявления, исключая проявления со стороны желез, встречаются у многих пациентов и могут вовлекать практически любой орган. В настоящее время отсутствуют агенты, модифицирующие заболевание, которые одобрены для лечения ПСШ и СШ. Лекарственные средства облегчают симптомы и обеспечивают поддерживающую терапию. Существует потребность в более эффективных методах лечения с лучшими профилями безопасности для пациентов, страдающих ПСШ и СШ. Фармакологическое вмешательство с использованием антител согласно настоящему изобретению может
повлиять на некоторые аспекты нарушения регуляции иммунной системы, которые, по-видимому, имеют причинную связь с патогенезом ПСШ и СШ и, следовательно, могут обеспечить значительную клиническую пользу пациентам. Указанная терапия также может уменьшить потребность в постоянном приеме (неспецифических) иммунодепрессантов, обеспечивая улучшение качества жизни для пациентов, страдающих ПСШ и СШ.
Лечение и введение
Термины "лечение", "лечащий" или "лечить" и т.п. включают ограничение, замедление, остановку или обращение прогрессирования или степени тяжести существующего симптома, состояния, заболевания или расстройства у пациента. Термин "пациент" относится к человеку. Термин "эффективное количество" относится к количеству или дозе антитела согласно настоящему изобретению, которое, при введении однократных или многократных доз пациенту, обеспечивает желаемый эффект у пациента. Эффективное количество может быть легко определено практикующим диагностом или медицинским работником, таким как специалист в данной области техники, с использованием известных методик и путем наблюдения результатов. При определении эффективного количества для пациента следует учитывать ряд факторов, включая размер, возраст и общее состояние здоровья пациента; конкретное вовлеченное заболевание или расстройство; степень тяжести заболевания, состояния или расстройства; ответ отдельного пациента; способ введения; характеристики биодоступности вводимого препарата; выбранную схему приема; использование сопутствующего лекарственного средства; и другие соответствующие факторы.
Антитела согласно настоящему изобретению предназначены для парентерального введения человеку для лечения аутоиммунных состояний. Предпочтительными являются подкожный и внутривенный пути введения. Антитела могут быть изготовлены в виде водных фармацевтических растворов перед введением. Нагрузочная внутривенная доза может быть введена медицинским работником. Как правило, введение, как ожидается, осуществляют путем подкожной инъекции, которую пациент вводит себе самостоятельно или с помощью другого лица, например, медицинского работника. Для подкожных инъекций может быть использован автоматический шприц для самостоятельных инъекций или предварительно заполненный шприц. Дозы могут быть либо фиксированными, т.е. одна и та же масса активного антитела для каждого пациента, либо могут быть основаны на весе тела (массе). Дозы, рассчитанные на основе веса (массы) тела, предпочтительно будут находиться в диапазоне от 0,01 до 30 мг антитела на кг веса (массы) тела пациента.
Более предпочтительно доза будет находиться в диапазоне от 0,1 до 20 мг антитела на кг веса (массы) тела пациента. Частота введения дозы, как ожидается, будет еженедельной или менее частой, в зависимости от фактической фармакокинетики и фармакодинамики у человека. Продолжительность лечения может варьироваться в зависимости от многих факторов и будет определена врачом, поставившим диагноз пациенту, или медицинским работником на основании опыта и профессиональных навыков в данной области техники. Частота и продолжительность лечения может варьироваться в зависимости от показаний. Структура антител согласно настоящему изобретению
Антитела согласно настоящему изобретению имеют третичную и четвертичную структуру, которая типична для полноразмерного антитела IgG человека. При биосинтезе в подходящей клетке-хозяине млекопитающих антитела согласно настоящему изобретению будут секретироваться в виде молекул, состоящих из двух тяжелых цепей и двух легких цепей, причем указанные цепи ковалентно связаны друг с другом внутрицепочечными и межцепочечными дисульфидными связями обычным способом, при этом тяжелые цепи связаны друг с другом и одна легкая цепь связана с каждой из тяжелых цепей. Положения внутрицепочечных и межцепочечных дисульфидных связей хорошо известны.
Каждая тяжелая цепь содержит четыре области, в направлении от N-конца к С-концу: вариабельную область тяжелой цепи, домены CHI IgG, СН2 IgG и СНЗ IgG. Шарнирная область между СН1 и СН2 содержит межцепочечную дисульфидную связь или связи, соединяющие две тяжелые цепи. Каждая легкая цепь содержит две области, в направлении от N-конца к С-концу: вариабельную область легкой цепи и константную область (CL) легкой цепи. Предпочтительно константные области тяжелой цепи представляют собой IgG4 человека или его варианты. Предпочтительно константная область легкой цепи представляет собой каппа-цепь человека. Вариабельные области в совокупности отвечают за функциональные свойства связывания с ИЛ-21 человека и нейтрализацию активности ИЛ-21 человека. Аминокислотные последовательности вариабельных областей антитела согласно настоящему изобретению приведены в SEQ Ш NO: 1 и SEQ Ш N0: 2. Константные области одного антитела согласно настоящему изобретению, АЬ327, приведены в последовательности SEQ Ш N0: 3 и SEQ Ш N0: 4. N-связанный сайт гликозилирования в Asn294 последовательности SEQ Ш N0: 3 может быть гликозилирован.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (НС) антител состоит из вариабельной области тяжелой цепи согласно настоящему изобретению, SEQ Ш NO: 1,
гибридизованной на ее С-конце с соответствующими константными областями тяжелой цепи человека (CHI, СН2, и СНЗ) или близкими по структуре вариантами константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которые могут иметь известную мутацию или мутации для улучшения стабильности или снижения эффекторных функций. Варианты константных областей IgG4 человека, которые содержат мутации, связанные со стабильностью и/или сниженной эффекторной функцией, являются предпочтительными. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи АЬ327 приведена в SEQ Ш N0: 3.
Аминокислотная последовательность легкой цепи (LC) содержит вариабельную область легкой цепи согласно настоящему изобретению, SEQ Ш N0: 2, гибридизованную на ее С-конце с соответствующей константной областью легкой цепи человека (CL) или ее вариантом, близким по структуре. Предпочтительной является константная область легкой каппа-цепи человека. Аминокислотная последовательность легкой цепи АЬ327 приведена в SEQ Ш N0: 4. Для экспрессии АЬ327 могут быть использованы последовательности ДНК, приведенные в SEQ Ш N0: 5 и SEQ Ш N0: 6 для НС и LC, соответственно.
Гипервариабельные области (CDR) LI, L3 и Н2 были определены в соответствии с конвенцией Kabat, и CDR L2, HI и НЗ были определены в соответствии с конвенцией North. Kabat ЕА, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991); North B, et al, J Mol Biol 2011 Feb 18; 406(2): 228-256.
Получение антител согласно настоящему изобретению
Антитела согласно настоящему изобретению могут быть биологически синтезированы, очищены и изготовлены для введения с помощью хорошо известных способов введения. Соответствующую клетку-хозяина, такую как клетка линии НЕК 293 или СНО, кратковременно или стабильно трансфецируют системой экспрессии для секреции антител с использованием заранее определенного соотношения векторов HC:LC, если используют два вектора, или одной векторной системы, кодирующей тяжелую цепь и легкую цепь. Векторы, подходящие для экспрессии и секреции антител из указанных клеток-хозяев, широко используемых в данной области техники, хорошо известны.
После экспрессии и секреции антитела среду очищают, чтобы удалить клетки, и очищенную среду далее очищают с помощью любой из многих широко используемых методик. Например, среда может быть нанесена на колонку с белком А, которая была уравновешена буфером, например, фосфатно-солевым буфером (рН=7,4). Колонку промывают для удаления неспецифично связывающихся компонентов. Связанное
антитело элюируют, например, с помощью градиента рН (например, используя буфер на основе 0,1 М фосфата натрия с рН=6,8 и буфер на основе 0,1 М цитрата натрия с рН=2,5). Фракции антитела детектируют, например, с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, и затем объединяют. Дополнительная очистка является необязательной, в зависимости от предполагаемого применения. Антитело может быть сконцентрировано и/или профильтровано в стерильных условиях с использованием обычных методик. Другие материалы, помимо антитела, такие как компоненты клетки-хозяина и питательной среды, а также растворимые агрегаты и мультимеры антитела, могут быть эффективно сокращены или удалены с использованием обычных методик, включая эксклюзионную хроматографию, хроматографию гидрофобных взаимодействий, катионообменную, анионообменную, аффинную хроматографию или хроматографию на гидроксиапатитном носителе. Чистота антитела после этапов хроматографии, как правило, составляет более 95%. Препарат может храниться при температуре 4 °С, может быть заморожен при -70 °С или лиофилизован.
Антитело АЬ327, использованное в исследованиях, описанных в настоящей заявке, кратковременно экспрессировали в клетках линии НЕК293 после совместной трансфекции отдельными ДНК-векторами для экспрессии тяжелой цепи и легкой цепи, которые содержали последовательности ДНК, приведенные в SEQ Ш N0: 5 и SEQ Ш N0: 6, соответственно, или стабильно экспрессировали в клетках СНО после трансфекции одним ДНК-вектором, который содержал последовательности ДНК, приведенные в SEQ Ш N0: 5 и SEQ Ш N0: 6, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, соответственно. Среду, собранную с 5-дневной культуры клеток линии НЕК293 или 14-дневной смешанной культуры клеток линии СНО, очищали, и полученный сырой супернатант очищали с помощью хроматографии на белке А. Антитело АЬ327 связывалось с белком А смолы и было элюировано с использованием буфера с низким значением рН. Элюированное антитело дополнительно очищали с использованием препаративной эксклюзионной хроматографии (SEC) для материала, полученного после кратковременной трансфекции клеток линии НЕК293, или с использованием мультимодальной анионообменной хроматографии (Capto adhere(r) GE Healthcare Life Sciences) в качестве дополнительного этапа для материала, полученного после стабильной трансфекции клеток линии СНО. Окончательную степень чистоты АЬ327 оценивали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, аналитической эксклюзионной хроматографии-ВЭЖХ и ЖХ/МС. С помощью системы Endosafe(r)-PTS(tm) было показано, что уровни эндотоксина составляют <1 ЕЭ/мг.
Очищенное антитело АЬ327 хранили в ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе), рН=7,2, при 4 °С.
Фармацевтические композиции антител согласно настоящему изобретению
Очищенное антитело может быть изготовлено в виде фармацевтических композиций в соответствии с хорошо известными способами изготовления белков и антител для парентерального введения, в частности для подкожного или внутривенного введения. Антитело может быть лиофилизовано совместно с соответствующими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, и затем восстановлено перед применением с использованием разбавителя на водной основе. В другом варианте антитело может быть изготовлено в водном растворе и может храниться в течение от 1 года до 3 лет перед использованием. В любом случае форма для хранения и форма для инъекции фармацевтических композиций антитела, вероятно, будет содержать фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или вещества, которые представляют собой ингредиенты, отличные от антитела. Фармацевтическая приемлемость ингредиента зависит от его влияния на безопасность и эффективность или на безопасность, чистоту и активность фармацевтической композиции. Если полагают, что ингредиент оказывает достаточно неблагоприятное влияние на безопасность или эффективность (или на безопасность, чистоту или активность), чтобы разрешить его использование в композиции для введения человеку, то такой ингредиент не является фармацевтически приемлемым для использования в фармацевтической композиции антитела.
Жидкая композиция антитела, как правило, будет на водной основе и может содержать, помимо воды, вспомогательные вещества, такие как буферные системы, консервант, если композиция предназначена для многократного использования, хелатирующий агент, агент, поддерживающий тоничность, для корректировки тоничности композиции до величины, которая аналогична таковой в ткани человека, и/или солюбилизирующий или стабилизирующий агент или агенты, например, поверхностно-активное вещество, сурфактант или тому подобное. Получение составов, обладающих подходящей стабильностью для длительного хранения в растворе, может быть довольно сложной задачей. Растворимость, а также химическая и физическая стабильность может быть улучшена, используя процедуры моделирования опыта путем изменения, например, рН, включения (или не включения) различных вспомогательных веществ, а также варьирования типа и концентрации вспомогательных веществ. Общую информацию об изготовлении лекарственных препаратов можно найти в Remington: The Science and Practice of Pharmacy. W. В работе Wang, et al., Antibody Structure, Instability, and
Formulation, 96 J. Pharm. Sci. 1-26 (2007) приведена полезная общая информация об изготовлении антител.
Различные предпочтительные признаки и варианты реализации настоящего изобретения будут далее описаны только в форме неограничивающего примера и количественных способов исследований со ссылкой на прилагаемые чертежи.
Пример 1
Получение, конструирование и гуманизация антител для получения АЬ327
Мышиное антитело к ИЛ-21 человека, 15Н12, выделяли после иммунизации мышей в подушечку стопы и клонирования вариабельных областей антитела к ИЛ-21. Мышей BALB/C иммунизировали с помощью стандартных процедур иммунизации, используя ИЛ-21 человека, полученный на коммерческой основе. Через 3-5 дней после окончательной неадъювантной повторной иммунизации собирали лимфатические узлы и/или селезенки и получали одноклеточные суспензии. Антигенспецифичные клетки обогащали с помощью стандартных методов сортировки с применением биотинилированного или меченого флуорофором ИЛ-21 и культивировали совместно с питающими клетками в течение двух недель перед клонированием вариабельных областей мыши. Антитело идентифицировали с помощью ИФА с захватом антитела к ИЛ-21, и было показано, что указанное антитело блокирует и нейтрализует ИЛ-21 в количественных исследованиях в условиях in vitro с величиной KD приблизительно 5 пМ в отношении ИЛ-21 человека и яванских макак. Фрагменты Fab антитела захватывали с помощью антител козы к каппа-цепи антитела человека и затем подвергали скринингу для определения их способности связываться с биотинилированным ИЛ-21, который, в свою очередь, детектировали с помощью нейтравидина, меченного щелочной фосфатазой.
Антитело дополнительно оптимизировали для связывания с ИЛ-21 мыши и человека, чтобы получить мышиное антитело, 15М2. Для достижения этой цели CDR из выделенных VH и VL мышиного антитела 15Н12 рандомизировали с помощью мутагенеза и полученные антитела подвергали скринингу для оценки связывания с ИЛ-21 человека и мыши с помощью ИФА. Мутации, усиливающие аффинность, затем объединяли, чтобы получить антитело 15М2, которое затем гуманизировали с помощью подхода, основанного на использовании библиотеки участков каркаса. Для получения библиотеки участков каркаса синтезировали двенадцать генов участков каркаса VH зародышевой линии человека (1-24, 1-46, 1-69, 2-5, 3-15, 3-23, 3-53, 3-72, 4-04, 4-39, 5-51 и 6-01) и восемь генов участков каркаса VL человека (А-19, А-26, А-27, В-2, В-3, L-2, L-12 и 0-2), содержащих CDR из антитела 15М2, и клонировали в вектор для экспрессии тяжелой и
легкой цепи IgG4 человека. После кратковременной трансфекции клеток линии НЕК293 с использованием всех 96 комбинаций тяжелых и легких цепей, супернатанты исследовали с помощью ИФА для оценки связывания с ИЛ-21 человека, непосредственно нанесенным на планшет, и с биотинилированным ИЛ-21 в растворе после захвата IgG человека из супернатантов с использованием антитела к каппа-цепи человека. Принимая во внимание проявляемость и активность ИФА, для дальнейшей оптимизации выбрали гуманизированное антитело с CDR, полученными из антитела 15М2, содержащее участок каркаса 1-46 тяжелой цепи человека и участок каркаса 02 легкой цепи человека. Величина KD указанного антитела в отношении ИЛ-21 человека составила приблизительно 0,5 пМ.
Исследование гуманизированного антитела выявило наличие сайта дезамидирования в CDR легкой цепи (Asn92) и сайта изомеризации в CDR тяжелой цепи (Asp55). Для удаления этих горячих точек химического разложения создавали сконструированное антитело, содержащее мутации Asp55Glu тяжелой цепи и Asn92His легкой цепи. Указанные мутации вызвали незначительную потерю аффинности, величина KD в отношении ИЛ-21 человека и макак снизилась до приблизительно 2 пМ. Было установлено, что потеря аффинности была обусловлена мутацией Asp55Glu. Вследствие этого остаток Asp55 сохраняли в тяжелой цепи совместно с мутацией Asn92His в легкой цепи. Рациональные принципы конструирования определили дальнейшую оптимизацию аффинности путем модификации соседнего остатка Ser56 в тяжелой цепи. Исходя из этого, было выбрано сконструированное антитело, содержащее мутацию Ser56Val, которая одновременно уменьшила изомеризацию Asp55 и улучшила аффинность. Аффинность готового антитела в отношении ИЛ-21 человека и яванских макак составляет приблизительно 0,5 пМ. Выбранная константная область принадлежит IgG4 человека с точечными мутациями, которые предотвращают образование половины антитела (S225P) и уменьшают эффекторные функции (F231A/L232A). Исследование in silico с помощью инструментального средства Epivax не выявило заметных горячих точек иммуногенности. Информация о последовательности готового сконструированного гуманизированного антитела ("АЬ327") приведена в таблице 1 ниже.
SEQ ID NO:
Идентичность
Длина
Аминокислотная последовательность
Легкая цепь
213
DIQMTQS PS S LS AS VGDR VTITCR AS QDIS NYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGV PS RFS GS GS GTDFTLTIS S LQPEDF AT Y YC QQFHTLRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL S S TLTLS К AD YEKHKV Y ACE VTHQGLS S P VTKSFNRGEC
Характеристики растворимости и стабильности Ab327
Физико-химические свойства АЬ327, относящиеся к растворимости и стабильности, оценивали в составах, содержащих 10 мМ цитрата, рН=6 (С6) или 10 мМ цитрата, рН=6 + 150 мМ NaCl (C6N). Для состава С6 растворимость составила > 122,9 мг/мл, и растворимость в составе C6N составила > 130,9 мг/мл. Вязкость АЬ327 при концентрации 100 мг/мл в составе, содержащем 10 мМ цитрата, 150 мМ NaCl, 0,02% твин-80, рН=6 (C6NT), составила 5,8 сП.
После хранения АЬ327 в течение 4-х недель при 25 °С в буфере, содержащем 10 мМ цитрата, рН=6, изменения в химической и физической неоднородности были незначительными, при этом изменение площади основного пика, наблюдаемого с помощью аналитической катионообменной хроматографии (СЕХ), составило менее 5%. В аналогичных условиях увеличение количества высокомолекулярных агрегатов (HMW), наблюдаемое с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC), составило <0,5%. Образцы для оценки стабильности, которые инкубировали в цитратном буфере с рН=6, не проявляли потери биологической активности в количественном исследовании с использованием клеток через 4 недели инкубации при температуре 40 °С.
Антитело исследовали после 4 недель инкубации при температуре 4 °С, 25 °С и 40 °С в С6 с помощью пептидного картирования методом ЖХ-МС, чтобы определить характеристики горячих точек химического разложения в CDR. Исследование методом ЖХ-МС не выявило существенной изомеризации остатка Asp55 в CDR тяжелой цепи при 40 °С по сравнению с контрольным образцом, который инкубировали при 4 °С. Было выявлено, что количество других распространенных вариантов разрушения CDR увеличилось более чем на 0,5% после 4 недель инкубации при 25 °С по сравнению с
контрольным образцом, который инкубировали при 4 °С, и в совокупности для всех 6 CDR составило менее 5%.
Физическую стабильность АЬ327 оценивали при концентрации 1 мг/мл с помощью исследования быстрого замораживания-оттаивания, и при концентрации 50 мг/мл с помощью исследования медленного замораживания-оттаивания в Сб. В ходе обоих исследований наличие твин-80 уменьшало образование частиц размером 10 микрон. В исследовании с использованием высокой концентрации наличие 150 мМ соли NaCl снижало образование высокомолекулярных агрегатов. В исследовании с использованием низкой концентрации образование высокомолекулярных агрегатов составило 0,7% в присутствии соли и твин-80. В заключение следует отметить, что на основании результатов проведенных исследований установлено, что АЬ327 имеет хорошие свойства раствора, включая вязкость, растворимость и стабильность, чтобы его клинические исследования были продолжены с участием людей.
Функциональные свойства АЬ327
Исследование связывания АЬ327 с ИЛ-21 человека и другими членами семейства рецепторов человека с общей гамма-цепью с помощью ИФА
Цель данного исследования заключалась в определении специфичности связывания АЬ327 с ИЛ-21 человека по сравнению с другими членами семейства рецепторов цитокинов с общей гамма-цепью (ус). Семейство рецепторов цитокинов с общей ус-цепью (ус) состоит из шести членов, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-15 и ИЛ-21. Все члены этого семейства передают сигналы посредством рецепторных комплексов, которые содержат ус-субъединицу. Специфичность АЬ327 в отношении связывания с другими членами семейства цитокинов человека с ус-цепью определяли с помощью ИФА. В общих чертах, АЬ327 захватывали на планшете для ИФА, покрытом антителами козы к каппа-цепи IgG человека. Затем в планшет вносили меченые биотином цитокины, протитрованные в концентрациях от 100 нМ до 780 пМ, и инкубировали в течение 1 часа при 37 °С, и любой связанный цитокин детектировали с помощью нейтравидина, меченого щелочной фосфатазой. Коммерчески доступное мышиное моноклональное антитело к ИЛ-2 и поликлональные антитела козы к ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-9 и ИЛ-15, захваченные с использованием Ig осла к IgG козы, давали положительные сигналы после связывания с биотинилированными цитокинами и детектирования с использованием нейтравидина. Однако для АЬ327 не было обнаружено детектируемого сигнала, за исключением ИЛ-21 человека (таблица 2 ниже, в которой приведены данные ИФА по связыванию АЬ327 и других лигандов, которые связываются с рецептором человека с общей гамма-цепью,
согласно результатам измерения оптической плотности (OD) при 560 нм. См. также фигуру 1). Полученные результаты указывают на то, что антитело АЬ327 является специфичным в отношении ИЛ-21 и не связывается с другими членами семейства рецепторов цитокинов человека, содержащими ус-цепь.
Аффинность связывания АЬ327 в отношении ИЛ-21 человека, яванских макак, мыши, крысы и кролика
Антитело АЬ327 представляет собой сконструированное, гуманизированное моноклональное антитело IgG4, которое связывается и нейтрализует ИЛ-21 человека. Цель данного исследования состояла в том, чтобы определить аффинность связывания АЬ327 в отношении ИЛ-21 человека, яванских макак, мыши, крысы и кролика (последовательности приведены ниже). Кажущуюся аффинность связывания (KD) АЬ327 В отношении ИЛ-21 указанных различных видов определяли с использованием прибора KinExA 3000 при температуре 37 °С. Эксперименты по определению равновесного
связывания в растворе проводили на приборе KinExA с использованием протокола с фиксированной концентрацией антитела и 2-кратными последовательными разведениями ИЛ-21. Образцы уравновешивали при температуре 37 °С в течение 6-36 часов до проведения исследования. Свободное антитело в равновесных образцах детектировали с использованием DyLight 649-конъюгированного поликлонального антитела к области Fc IgG человека. Полученный процент свободного антитела по сравнению с данными о концентрации антигена описывали с использованием модели связывания "аффинность, стандарт" с помощью программного обеспечения KinExA Pro, и определяли наилучшее аппроксимированное значение аффинности связывания (KD).
Средние значения KD на основании трех независимых экспериментов, наряду со стандартным отклонением (человек, яванская макака, мышь и крыса), или на основании одного определения (ИЛ-21 кролика), представлены в таблице 3 ниже (кажущаяся равновесная аффинность связывания АЬ327 в растворе (KD)).
Антитело АЬ327 связывалось с ИЛ-21 человека и яванских макак со средней величиной (п=3) аффинности 0,8±0,5> <10"12 М и 0,3±0Дх10"12 М соответственно, при 37 °С. Антитело АЬ327 связывалось с ИЛ-21 мыши, крысы и кролика с величиной аффинности 2,4+1,Зх10"7 М, 2,3±0,2хЮ"7 М и > 2хЮ"7 М, соответственно. Связывание с ИЛ-21 кролика оценивали на основании сигнала связывания, который был меньше, чем тот, который наблюдали для эквивалентных образцов ИЛ-21 мыши и крысы. На основании полученных результатов было установлено, что АЬ327 имеет аффинность, величина которой находится приблизительно в пикомолярном диапазоне в отношении ИЛ-21 человека и яванских макак, но относительно слабую аффинность в отношении ИЛ-21 мыши, крысы и кролика.
АЬ327 ингибировал ИЛ-21 человека и яванских макак в количественном исследовании IM9 pan-STAT-репортерный ген люциферазы в условиях in vitro
ИЛ-21 активирует семейство тирозинкиназ JAK, которые опосредуют ИЛ-21-зависимую активацию передатчика сигнала и активатора транскрипции (STAT). Способность ИЛ-21 активировать сигнальный путь с участием STAT оценивали с помощью клеток ГМ9. Клетки ГМ9, которые представляют собой линию EBV-трансформированных В-лимфобластоидных клеток, полученных из крови пациента с множественной миеломой, которые естественным образом экспрессируют рецептор ИЛ-21 (ИЛ-21Я) и его ко-рецептор (ус), стабильно трансфицировали с использованием конструкции pan-STAT-репортерный ген люциферазы. Цель указанного эксперимента состояла в том, чтобы с помощью количественного исследования EV19-pan-STAT-репортерный ген люциферазы определить, может ли АЬ327 ингибировать ИЛ-21-зависимую активацию STAT.
Клетки для проведения количественного исследования ГМ9-рап-8ТАТ-репортерный ген люциферазы (субклон клеток ГМ9 1B10/3G2, несущих pan-STAT-репортерный ген люциферазы) культивировали стандартным способом в среде (RPMI-1640, 10% ФБС, Iх пенициллин/стрептомицин, 100 мкг/мл зеоцина для отбора клеток, несущих pan-STAT-репортерный ген люциферазы) в колбах. Для проведения количественного исследования клетки высевали в количестве 50000 клеток/50 мкл/лунку в ТС-обработанные планшеты и инкубировали в течение ночи при 37 °С. Затем клетки обрабатывали АЬ327 в присутствии рекомбинантных белков ИЛ-21 из различных видов. Оценивали диапазон доз АЬ327 от 0 до 6670 пМ (конечная концентрация была основана на молекулярной массе АЬ327=150 кДа). Рекомбинантный ИЛ-21 из различных видов добавляли в каждую лунку до конечной концентрации 66,67 мкМ (в расчете на молекулярную массу=15 кДа). Химерный белок ИЛ-21Я человекаТс (R &D Systems, каталожный номер 991-R2) использовали в качестве положительного контроля, и IgG4 человека использовали в качестве отрицательного контроля. Для положительного и отрицательного контроля оценивали диапазон доз от 0 до 47520 пМ. Испытание проводили с тремя повторами. 96-луночные планшеты помещали в инкубатор для тканевых культур (37 °С, относительная влажность 95%, 5% СО2) и инкубировали в течение 4-х часов. По 100 мкл/лунку раствора One-Glo Luciferase вносили, чтобы остановить реакцию в количественном исследовании. Для регистрации сигнала в планшетах использовали люминометр (Perkin Elmer Victor3).
Результаты выражали в виде ИК50 (половина максимальной ингибирующей концентрации), и рассчитывали с использованием 4-параметрической сигмоидальной математической модели данных (Sigma Plot). Средние значения ИК50 из трех независимых экспериментов и стандартные отклонения приведены в таблице 4 ниже.
В пределах испытанного диапазона доз антитело АЬ327 полностью ингибировало активность STAT, индуцированную ИЛ-21 человека и яванских макак, в зависимости от дозы. Ингибирование под действием АЬ327 было более значимым, чем ингибирование, наблюдаемое для положительного контроля (hIL-21R:Fc), при этом величина ИК50 АЬ327 составила 46,7±2,4 по сравнению с 271± 15,6 для положительного контроля. Антитело для контроля изотипа (hIgG4) не ингибировало активность pan-STAT (данные не показаны). В заключение следует отметить, что антитело АЬ327 эффективно нейтрализовало активность ИЛ-21 человека и яванских макак в условиях in vitro, но не оказывало нейтрализующего действия на ИЛ-21 мыши, крысы или кролика (последовательности приведены выше) в указанных условиях (N.N.D.нейтрализация не обнаружена).
Антитело АЬ327 нейтрализовало пролиферацию первичных В-клеток человека, индуцированную ИЛ-21 человека, в условиях in vitro
Основной функцией В-клеток является выработка антител, которые нейтрализуют и устраняют патогенные микроорганизмы. Антителопродуцирующие В-клетки формируются из наивных В-клеток во время реакций зародышевого центра (GC). Зародышевые центры формируются, когда В-клетки сталкиваются со специфичными антигенами и получают управляющие сигналы от Т-фолликулярных хелперов для размножения, выживания, отбора и дифференциации. Помимо указанных сигналов, В-клетки стимулируются CD40 и многочисленными цитокинами, при этом ИЛ-21 является ключевым фактором, способствующим пролиферации, переключению изотипа, дифференцировке в плазматические клетки и секреции антител. Цель данного исследования заключалась в определении способности АЬ327 ингибировать ИЛ-21-индуцированную пролиферацию первичных В-клеток человека.
Лейкоцитарные пленки от пяти здоровых доноров получали из Центра крови Индианы. МКПК выделяли из лейкоцитарных пленок с помощью разделения в градиенте Ficoll-Paque, и CD19+ В-клетки положительно отбирали с помощью магнитных гранул, нацеленных на CD 19 (Miltenyi Biotec). Чистота выделенной популяции, как правило, составляла > 90%. Для того чтобы оценить пролиферативные ответы культивируемых
клеток, очищенные CD19+ клетки культивировали в концентрации 0,5 млн. клеток/мл (0,1 млн. клеток/лунку) в 96-луночных плоскодонных культуральных планшетах с соответствующими стимуляторами (среда RPMI-1640/10% ФБС, содержащая 1 мМ пирувата натрия, несущественные аминокислоты, 10 мМ HEPES, рН=7,0, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) в течение 5 дней при температуре 37 °С и 5% СО2. Выделенные В-клетки инкубировали с комбинацией ИЛ-21 человека в концентрации 3,33 нМ (в расчете на мол. массу=15 кДа) и 2 мкг/мл антител к CD40 человека (BD Pharmingen). Оценивали диапазон доз АЬ327 (от 0,1 нМ до 26,7 нМ), химерного белка рецептор ИЛ-21 человекаТс (от 0,1 нМ до 213,3 нМ, R &D Systems) или IgG4 человека (от 0,1 нМ до 26,7 нМ). Все стимулы и виды обработки вносили при инициации культуры. Через 5 дней культивирования количество [метил-3Н]-тимидина измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика.
Полученные результаты выражены в процентах от максимальной пролиферации, при этом ИЛ-21-опосредованная стимуляция в отсутствие антитела составляет 100%. Концентрацию АЬ327, при которой происходило ингибирование 50% ИЛ-21-индуцированной реакции (ИК50), рассчитывали с использованием 4-параметрической сигмоидальной математической модели данных. Антитело АЬ327 ингибировало пролиферацию первичных В-клеток человека, индуцированную ИЛ-21, в зависимости от дозы. Ингибирование под действием АЬ327 было значительно сильнее, чем ингибирование, наблюдаемое в присутствии положительного контроля, конструкции рецептор ИЛ-21 человека-Fc, которая, в самой высокой концентрации из использованных (26,7 нМ), не смогла полностью ингибировать ИЛ-21-индуцированную пролиферацию (см. фигуру 2). Рассчитанная величина ИК50 для АЬ327 составила 1,15±0,25 нМ (среднее значение 5 независимых экспериментов±стандартное отклонение). Антитело для отрицательного контроля (контроль изотипа hIgG4) не ингибировало пролиферацию первичных В-клеток, индуцированную ИЛ-21. В таблице 5 приведены результаты, указывающие на то, что антитело АЬ327 способно нейтрализовать пролиферацию первичных В-клеток человека, индуцированную ИЛ-21 человека, в условиях in vitro. Значения представляют собой процент пролиферирующих В-клеток человека±стандартное отклонение. В заключение следует отметить, что антитело АЬ327 ингибировало пролиферацию первичных В-клеток человека, индуцированную ИЛ-21, в условиях in vitro.
* *Изменение массы для каждого вида лечения (%)
Антитело АЬ327 нейтрализовало дифференцировку первичных В-клеток человека в плазматические клетки, индуцированную ИЛ-21 человека, в условиях in vitro.
Дифференцировка В-клеток в плазмобласты регулируется путем интеграции сигналов от антигена и Т-клеток (взаимодействие CD40-CD40L и выработка цитокинов). Одним из цитокинов, которые важны для дифференцировки В-клеток человека, является ИЛ-21, который индуцирует формирование плазматических клеток и секрецию антител из активированных наивных В-клеток и В-клеток памяти. Было показано, что ИЛ-21 индуцирует экспрессию CD25 (ИЛ-2Я) на активированных В-клетках, сенсибилизируя эти клетки к действию ИЛ-2, стимулирующему дифференцировку, что обеспечивает кооперативное взаимодействие между ИЛ-2 и ИЛ-21 для усиления формирования плазмобластов и секреции антител. Цель настоящего исследования заключалась в определении способности АЬ327 ингибировать ИЛ-21-индуцированную дифференцировку первичных В-клеток человека в плазматические клетки в условиях in vitro.
Лейкоцитарные пленки получены, как описано выше. Очищенные В-клетки культивировали при плотности 0,75 млн. клеток/мл (0,15 млн. клеток/лунку) в 96-луночных плоскодонных культуральных планшетах с соответствующими стимуляторами (среда RPMI-1640/10% ФБС, содержащая 1 мМ пирувата натрия, несущественные аминокислоты, 10 мМ HEPES, рН=7,0, 100 Ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) в течение 6 дней при температуре 37 °С и 5% СО2. Выделенные В-клетки инкубировали с комбинацией 3,33 нМ ИЛ-21 человека, 1 мкг/мл антитела к CD40 человека (BD Pharmingen), 100 Ед./мл ИЛ-2 человека (Proleukin, Hanna's Pharmaceutical Supply Co.) и/или 26,7 нМ Ab327 или 26,7 нМ антитела IgG4 человека (отрицательный контроль). Через шесть дней культивирования клетки промывали с использованием буфера для окрашивания (2% ФБС/ФСБ) и инкубировали с антителами, специфичными в отношении CD38, IgD, CD 19, CD27 человека (все от BD Biosciences) в течение 40 мин при температуре 4 °С. Исследование с помощью проточной цитометрии с регистрацией пяти красителей проводили с использованием проточного цитометра FC-500 (Beckman Coulter). Плазматические клетки идентифицировали как клетки, экспрессирующие высокие уровни CD38 и низкие уровни IgD (таблица 6 ниже).
Поскольку между донорами существует высокая изменчивость, результаты, приведенные ниже, выражены как кратное увеличение относительного количества плазматических клеток (клетки CD38hlgh + IgDlow), индуцированное добавлением ИЛ-21, причем значение для плазматических клеток, полученных от каждого донора в среде + антитело к CD40+ ИЛ-2, установлено как равное одному (1). Данные представлены как "кратное увеличение" для воздействия на первичные В-клетки человека от пяти здоровых доноров.
Свежие В-клетки, культивированные с комбинацией антитела к CD40 и ИЛ-2, содержат небольшое количество плазматических клеток CD38hlglYIgDlow. Напротив, совместная стимуляция очищенных В-клеток с использованием антител к CD40 и ИЛ-2 в присутствии ИЛ-21 привела к значительной дифференцировке в плазматические клетки. Антитело для отрицательного контроля (изотип hIgG4) не было способно ингибировать активность ИЛ-21. Антитело АЬ327 ингибировало ИЛ-21-индуцированную дифференцировку первичных В-клеток человека в плазматические клетки (п=5 доноров, р=0,008, непарный t-тест АЬ327 по сравнению с изотипическим антителом IgG4). В заключение следует отметить, что антитело АЬ327 ингибировало дифференцировку плазматических клеток, индуцированную ИЛ-21 человека, в условиях in vitro.
Антитело АЬ327 нейтрализовало активность ИЛ-21 человека у мышей.
Инъекция ИЛ-21 мышам приводит к быстрому и кратковременному размножению нескольких типов клеток в селезенке (включая субпопуляции В- и Т-клеток), которые поддаются четкой идентификации с использованием специфичных маркеров. Цель данного эксперимента состояла в изучении способности АЬ327 ингибировать биологическую активность ИЛ-21 человека у мышей.
Самкам мышей C57BL6 в возрасте от восьми до десяти недель (п=5 на группу) вводили внутрибрюшинно (в/б) АЬ327 (1 мг/мышь) или антитело для контроля изотипа (hIgG4, 1 мг/мышь) на 1-й день. На 2-й и 3-й день мышам вводили в/б 50 мкг рекомбинантного ИЛ-21 человека на мышь в сутки или ФСБ. На 4-й день получали суспензию клеток селезенки, и общее количество клеток определяли после лизиса эритроцитов. Относительное процентное содержание ИЛ-21-чувствительных клеток определяли с использованием маркеров клеточной поверхности, Gr-1 и Sca-1, с помощью проточной цитометрии. Общее количество ИЛ-21-чувствительных клеток в селезенке рассчитывали путем умножения процента ИЛ-21-чувствительных клеток (клеток Gr-llowSca-l+) на общее количество клеток в селезенке.
Результаты, приведенные в таблице 7 ниже, представлены как общее количество ИЛ-21-чувствительных клеток (х106) в селезенке каждой из пяти мышей.
Количество клеток селезенки, чувствительных к чИЛ-21 (х106)
ФСБ +ИЗОТИП IgG4
чИЛ-21 + изотип IgG4
чИЛ-21 + АЬ327
2,64
11,78
2,34
2,36
12,27
5,25
Инъекция ИЛ-21 человека вызвала увеличение количества ИЛ-21-чувствительных клеток. Присутствие АЬ327 привело к уменьшению количества этих клеток (р <0,0001, непарный t-тест АЬ327 + ИЛ-21 по сравнению с IgG4 + ИЛ-21 и IgG4 + ФСБ по сравнению с IgG4 + ИЛ-21) по сравнению с этим показателем у животных, которые получили антитело для отрицательного контроля. Воздействие АЬ327 и антитела для отрицательного контроля в каждой группе подтверждали с помощью количественного ИФА. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что антитело АЬ327 эффективно нейтрализовало биологическую активность ИЛ-21 человека в условиях in vivo.
Антитело АЬ327 проявило эффективность в модели активации Т-клеток человека у мышей NGS в условиях in vivo.
Ранее было показано, что нейтрализация ИЛ-21 человека предотвращает прогрессирование заболевания в модели активации Т-клеток человека, в которой мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) прививают мышам с тяжелым иммунодефицитом NSG (NOD-scid IL-2Ry null; Hippen KL, et al. Blocking IL-21 signaling ameliorates xenogeneic GVHD induced by human lymphocytes. Blood 2012; 119: 619). Мыши NSG лишены T-, В- и NK-клеток, а также имеют сниженную функцию макрофагов и дендритных клеток. Трансплантация МКПК человека приводит к явной активации Т-клеток человека и их инфильтрации в кожу, печень, кишечник, легкие и почки мыши. Этот процесс сопровождается синдромом истощения, что в конечном итоге приводит к смерти (Hippen, 2012). Преимуществом данной модели является то, что заболевание обусловлено иммунными клетками человека и цитокинами человека, что обеспечивает возможность испытания в условиях in vivo антител, которые не имеют перекрестной реактивности с другими видами. Цель данного исследования состояла в том, чтобы продемонстрировать эффективность в условиях in vivo и активность АЬ327, направленную на модификацию заболевания, в модели активации Т-клеток человека при введении в профилактическом режиме (антитело вводили, начиная с момента пересадки МКПК) или в терапевтическом режиме (антитело вводили, начиная с 21-го дня после пересадки МКПК).
Перед пересадкой МКПК самок мышей NSG распределяли на группы в зависимости от результатов измерений массы тела в начальных условиях (п=10/группа). На 0-й день мышам вводили внутривенно по 107 МКПК человека, выделенных из лейкоцитарной пленки, полученной из банка крови Сан-Диего. В случае профилактического режима (фигура 3) мышам вводили подкожно 1 или 10 мг/кг АЬ327 или 10 мг/кг антитела для контроля изотипа hIgG4 во время пересадки и затем с частотой один раз в неделю. Измеряли массу тела и контролировали общий внешний вид и состояние здоровья с частотой 2-3 раза в неделю. На 19-й день образцы крови получали путем надреза хвоста и исследовали для определения приживления CD45+ клеток человека с помощью проточной цитометрии. В случае терапевтического режима (фигура 4) животных, которые не получили никакого лечения, повторно распределяли в группы, подобранные на основе данных проточной цитометрии и измерений массы тела. На 21-й день после прививки мышам вводили подкожно 10 мг/кг АЬ327 или 10 мг/кг антитела для контроля изотипа hIgG4, и затем с частотой один раз в неделю. Четырех не привитых мышей включали в качестве "необработанного контроля или не привитых" мышей. Изменение массы тела вычисляли как процент от массы в начальных условиях (масса в день (х)/масса в день 0*100). Результаты представлены в виде изменения массы тела в процентах относительно начального значения в зависимости от времени.
При использовании профилактического режима у мышей, получавших антитело человека для контроля изотипа (см. фигуру 3, открытые квадраты), уже через 20 дней после переноса клеток развился фенотип истощения. На 45-й день после переноса клеток средняя потеря массы тела в группе контроля изотипа превышала 10% от начального уровня, и большинство мышей находились в угнетенном состоянии и, соответственно, исследование было прекращено. Лечение с использованием 10 мг/кг/неделю АЬ327 (фигура 3, закрытые квадраты), начатое в день пересадки (профилактический режим), полностью устраняло фенотип истощения. Мыши продолжали набирать массу тела, аналогично непривитым мышам. Показатели массы тела статистически значимо отличались от таковых в группе контроля изотипа (р=0,000846 и р <0,001 АЬ327 по сравнению с контролем изотипа, и не привитые мыши по сравнению с контролем изотипа, соответственно, двухфакторный дисперсионный анализ, повторные измерения). Антитело АЬ327 в дозе 1 мг/кг/неделю (фигура 3, закрашенные треугольники) оказывало частичное действие, которое, по-видимому, заключалось в замедлении прогрессирования потери массы тела. Однако показатели массы тела мышей в этой группе статистически не отличались от таковых в группе контроля изотипа. В таблице 8 приведены средние
значения±стандартное отклонение для процента изменения массы тела относительно начального уровня у мышей с тяжелым иммунодефицитом NSG (NOD-scid IL-2Ry null), которым привили мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) и которые получали антитело к ИЛ-21 или антитело для контроля изотипа в течение 45 дней. Лечение начали в то же самое время, что и пересадку МКПК. Существует значительное различие между группой, получавшей 10 мг/кг АЬ327, и группой контроля изотипа.
Как было отмечено выше, введение МНПК человека привело к развитию фенотипа истощения уже приблизительно через 20 дней после пересадки. Для того чтобы изучить,
способна ли блокада ИЛ-21 человека остановить текущее ухудшающееся заболевание (терапевтический режим), мыши получали 10 мг/кг/неделю АЬ327 или hIgG4 для контроля изотипа, начиная с 21-го дня после пересадки. Как показано на фигуре 4, мыши, которым вводили антитело для контроля изотипа IgG4 человека (открытые квадраты) продолжали терять массу тела. Напротив, лечение с использованием АЬ327, начатое после возникновения симптомов заболевания (21-й день после пересадки, фигура 4, заштрихованные квадраты), эффективно уменьшало фенотип истощения. Средняя масса тела в этой группе статистически достоверно отличалась от таковой в группе контроля изотипа (р=0,042, двухфакторный дисперсионный анализ, повторные измерения). Разница в потере массы тела и степени тяжести заболевания не была обусловлена различиями в приживлении клеток человека у мышей. Количество периферических CD45+ клеток человека, а также клеток человека в селезенке в конце исследования было незначительно выше у мышей, получавших АЬ327, по сравнению с животными, получавшими антитело для контроля изотипа. Подводя итог, следует отметить, что антитело АЬ327 было эффективным и обладало активностью в отношении модификации заболевания в ксеногенной модели активации Т-клеток в условиях in vivo. В таблице 9 приведены средние значения±сгандартное отклонение для процентного изменения массы тела, зарегистрированные, начиная с 21-го дня у мышей с тяжелым иммунодефицитом NSG (NOD-scid IL-2Ry null), которым привили мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) и которые получали антитело к ИЛ-21 или антитело для контроля изотипа. Лечение начинали на 21-й день. Существует достоверное различие между группой, получавшей АЬ327 10 мг/кг, и группой контроля изотипа.
Фармакокинетику АЬ327 описывали после введения однократной дозы 3 мг/кг внутривенно или подкожно у самцов яванских макак. Образцы сыворотки крови собирали через 1008 часов после введения дозы (6 недель). Профили зависимости концентрации от времени получали после количественной оценки антитела с использованием двух методов ИФА (общий IgG человека или захват антигена). Метод определения общего IgG человека представляет собой вариант ИФА для измерения концентрации антитела к ИЛ-21. Стандарты, контрольные и испытываемые образцы инкубировали с фрагментом F(ab')2 антитела козы к IgG человека AffiniPure(r) (покрывающее антитело), который был иммобилизован на планшете для микротитрования. После инкубации в лунки добавляли мышиное антитело к IgG4 человека, конъюгированное с ПХ (пероксидазой хрена). После отмывки несвязанного фермента в лунки вносили раствор субстрата ТМВ SureBlue(r) (тетраметилбензидин). Развитие окрашивания останавливали путем добавления раствора кислоты, и измеряли оптическую плотность при 450 нм с коррекцией длины волны, установленной на 650 нм.
Метод захвата антигена представляет собой вариант ИФА для измерения концентрации антитела к ИЛ-21. Стандарты, контрольные и испытываемые образцы инкубировали с ИЛ-21 человека, конъюгированным с биотином, который был иммобилизован на планшете для микротитрования, покрытом стрептавидином. После инкубации в лунки добавляли мышиное антитело к IgG4 человека, конъюгированное с ПХ (пероксидазой хрена). После отмывки несвязанного фермента в лунки добавляли раствор субстрата ТМВ SureBlue(r) (тетраметилбензидин). Развитие окрашивания останавливали путем добавления раствора кислоты, и измеряли оптическую плотность при 450 нм с коррекцией длины волны, установленной на 650 нм. Диапазон количественного исследования составил 5-500 нг/мл.
Результаты исследования фармакокинетики (средние значения), представлены ниже в таблице 10 и таблице 11. В каждой группе было по двое животных.
Сокращениями - период полувыведения, AUCo-t - площадь под кривой от момента времени 0 до последней концентрации, поддающейся количественному определению, AUCo-inf - площадь под кривой от момента времени 0 до бесконечности, АИС%экстрап. -процент AUCo-inf в результате экстраполяции от последней концентрации, поддающейся количественному определению, до бесконечности, CLss - оценка общего клиренса, Vss -оценка объема распределения в равновесном состоянии. *Величины терминального периода полувыведения рассчитывали в промежутке времени от 72 до 168 часов.
Сокращениями - период полувыведения, Ттах - время достижения максимальной концентрации, Стах - максимальная концентрация, AUCo-t - площадь под кривой от момента времени 0 до последней концентрации, поддающейся количественному определению, AUCo-inf - площадь под кривой от момента времени 0 до бесконечности, АиС%экстрап. - процент AUCo-м в результате экстраполяции от последней концентрации, поддающейся количественному определению, до бесконечности, CLss/F -клиренс/биодоступность, F% - биодоступность, рассчитанная с использованием в качестве эталона средней дозы 3 мг/кг в/в по формуле: (AUCo-inf п/к/AUCo-inf в/в)/(в/в доза/п/к доза)* 100. *Величины терминального периода полувыведения рассчитывали в промежутке времени от 96 до 336 часов.
После однократного внутривенного или подкожного введения АЬ327 самцам яванских макак профили зависимости концентрации от времени указывали на образование антител к лекарственному препарату (ADA), и наличие ADA было подтверждено у 4/4 обезьян. Средний терминальный период полувыведения составил 105-249 часов и был
рассчитан на основании наклона кривой для промежутка времени от 72 до 168 часов, чтобы избежать значительного влияния ADA. Среднее значение клиренса составило 0,430,48 мл/ч/кг, полученная величина находится за пределами типичного диапазона клиренса для моноклонального антитела 0,2-0,4 мл/ч/кг.
После подкожного введения биодоступность составила 72-74%, полученная величина находится в пределах типичного диапазона для моноклонального антитела (50100%). Несмотря на формирование ADA параметры фармакокинетики АЬ327 у обезьян были относительно сходны с ожидаемыми для моноклонального антитела, связывающегося с растворимым лигандом, при этом величина клиренса была незначительно выше нормальной.
На основании результатов этих исследований был сделан вывод о том, что фармакокинетика АЬ327 у человека будет находиться в пределах ожидаемого диапазона для гуманизированного антитела IgG4. Прогнозируемый клиренс у человека составляет 0,3 мл/ч/кг (0,02 л/ч у человека весом 70 кг) на основании аллометрического масштабирования клиренса у обезьян, и прогнозируемая биодоступность у человека составит 50-75%.
Лечение с использованием антитела к ИЛ-21 мыши уменьшало лимфоцитарную инфильтрацию в слюнных железах мышей NOD.
Поскольку АЬ327 не нейтрализует ИЛ-21 грызунов, для использования в доклинических моделях заболеваний была разработана суррогатная молекула. Антитело АЬ728 представляет собой мышиное моноклональное антитело IgGl, которое специфично связывается с ИЛ-21 мыши. Аффинность связывания ИЛ-21 мыши с АЬ728 составляет 1 пМ. Антитело АЬ728 было способно полностью нейтрализовать ИЛ-21 мыши в количественных исследованиях в условиях in vitro и in vivo.
Диабетические мыши без ожирения (NOD) широко используются в качестве модели синдрома Шегрена, поскольку в слюнных железах этих мышей спонтанно развивается лимфоцитарная инфильтрация. Предыдущее исследование выявило, что локальное подавление уровней ИЛ-21 в подчелюстных железах мышей NOD с использованием лентивирусов, кодирующих кшРНК, нацеленные на ИЛ-21, может задержать развитие симптомов, сходных с синдромом Шегрена (Liu Н, et al. Local suppression of IL-21 in submandibular glands retards the development of Sjogren's syndrome in non-obese diabetic mice. J Oral Pathol Med 2012; 41:728). Цель данного эксперимента заключалась в изучении возможности предотвращения или ослабления развития синдрома Шегрена у мышей NOD в результате системного введения АЬ728, антитела-суррогата для АЬ327.
Самки мышей NOD получали АЬ728 или изотипический контроль mlgGl (20 мг/кг/неделю), начиная с 7-недельного возраста. Мышей умерщвляли в возрасте 18 недель, и собирали слюнные железы. Часть слюнной железы фиксировали в 1,6% ПФА+ 20% сахарозы при 4 °С в течение ночи, заливали соединением О.С.Т. и хранили при -80 °С до проведения иммунофлуоресцентного исследования. Другую часть образца замораживали в жидком азоте для исследований мРНК.
У мышей NOD очаговое воспаление в подчелюстных слюнных железах и слезных железах развивается примерно с возраста 8 недель и более. Появляющиеся очаги сопоставимы по структуре и клеточному составу с инфильтратами, обнаруженными в некоторых слюнных железах человека, с присутствием в них Т- и В-клеток. Для того чтобы изучить, может ли лечение с использованием антитела к ИЛ-21 облегчить лимфоцитарную инфильтрацию в слюнные железы мышей NOD, проводили иммунофлуоресцентное окрашивание. В общих чертах, замороженные срезы слюнных желез толщиной 8 мкм промывали ФСБ и затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с очищенными первичными антителами с последующей инкубацией с подходящими мечеными вторичными антителами в течение 30 мин. Первичные антитела представляли собой антитела к CD3 (Т-клетки) и антитела к В220 (В-клетки) от BD Biosciences. Вторичные антитела представляли собой иммуноглобулин козы, конъюгированный с Alexa Fluor-488, к IgG крысы и иммуноглобулин козы, конъюгированный с DyLight-594, к Ig серого хомячка от Jackson ImmunoResearch Laboratories. DAPI использовали для идентификации ядер клеток.
Мыши NOD, получавшие контрольное антитело mlgGl, имели типичные лимфоцитарные инфильтраты, расположенные в виде перидуктальных агрегатов с высокоорганизованными скоплениями Т- и В-лимфоцитов (фигура 6), напоминающими лимфоцитарные очаги, которые обнаружены у пациентов с синдромом Шегрена. Лечение АЬ728 эффективно уменьшило не только количество, но и размер наблюдаемых очагов.
Развитие лимфоидных агрегатов при синдроме Шегрена, как полагают, регулируется эктопической выработкой лимфоидного хемокина CXCL13 и его когнатного рецептора CXCR5, которые регулируют рециркуляцию и размещение В-клеток и CD4+ Т-фолликулярных хелперов (TFH) в структурах зародышевого центра. Было показано, что ИЛ-21 участвует в поддержании TFH и структур зародышевых центров. ИЛ-21 также контролирует активацию CD8+ Т-лимфоцитов, которые, как полагают, разрушают клетки-мишени с помощью перфорина и гранзимов. Чтобы изучить, приводит ли лечение с использованием антитела к ИЛ-21 к уменьшению экспрессии указанных маркеров, общую
РНК выделяли из замороженных слюнных желез путем гомогенизации в тризоле с последующей очисткой с помощью набора RNeasy Mini (Qiagen, Inc.). Концентрации РНК определяли на основании спектрофотометрического поглощения при длине волны 260 нм. РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием высокопроизводительного набора для обратной транскрипции кДНК (РЕ Applied Biosystems). Все реакции проводили с тремя повторами для определения относительного содержания исследуемых мРНК. Наборы праймеров-зондов для ИЛ-21 (Mm00517640_ml), CXCR5 (Mm00432086_ml), CXCL13 (Mm04214185_sl), CCR9 (Mm02620030_sl), гранзима В (Mm00442834_ml) и CD8 (MmOl 182107_gl) получали от РЕ Applied Biosystems. GusB (Mm00446956_ml) измеряли в качестве эндогенных контролей, чтобы нормировать вариабельность уровней экспрессии генов. Данные по экспрессии обрабатывали с использованием метода Delta Ct. Отдельные значения Ct рассчитывали как средние значения трех измерений.
Количества транскриптов мРНК CXCL13, CXCR5, ИЛ-21, CD8 и гранзима В были статистически значимо снижены у мышей, получавших АЬ728, по сравнению с мышами, получавшими контрольное антитело mlgGl. На фигуре 5 приведены результаты исследования мРНК в слюнных железах мышей. Как следует из полученных результатов, лечение модулирует экспрессию белков, вовлеченных в патофизиологию указанного заболевания. Подводя итог, следует отметить, что введение антитела к ИЛ-21 мыши (АЬ728) уменьшало лимфоцитарную инфильтрацию в слюнных железах и задерживало развитие СШ-подобных симптомов у мышей NOD.
Лечение с использованием антитела к ИЛ-21 мыши (АЬ728) предотвращает развитие диабета у мышей NOD.
Антитело АЬ728 представляет собой мышиное моноклональное антитело IgGl, которое специфично связывается с ИЛ-21 мыши. Аффинность связывания ИЛ-21 мыши с суррогатным антителом АЬ728 составляет 1 пМ. Антитело АЬ728 полностью нейтрализовало ИЛ-21 мыши в количественных исследованиях в условиях in vivo и in vitro.
Сахарный диабет I типа человека представляет собой аутоиммунное заболевание, которое возникает вследствие аутореактивного разрушения продуцирующих инсулин бета-клеток в островках Лангерганса поджелудочной железы, что приводит к последующему ухудшению выработки инсулина. Линия диабетических мышей без ожирения (NOD) страдает аналогичным заболеванием, а также используется в качестве модельной системы для исследования механизмов, вовлеченных в начало и
распространение аутоиммунного ответа. Гистологические исследования выявили наличие нескольких инфильтратов иммунных клеток в островках до приблизительно 3-4-недельного возраста, при котором у мышей мужского и женского пола возникают мононуклеарные инфильтраты, которые окружают островок (периинсулит). Инфильтраты прогрессируют и вторгаются в островки (инсулит) с последующим развитием гипергликемии и резко выраженного диабета, который начинается в возрасте приблизительно 12 недель.
Результаты предыдущей работы выявили, что подавление передачи сигналов с участием ИЛ-21 у мышей NOD приводит к почти полному устранению развития заболевания (Spolski R, et al. IL-21 signaling is critical for the development of type I diabetes in the NOD mouse. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105:14028, 2008). Цель эксперимента состояла в том, чтобы изучить, может ли системное введение АЬ728 предотвратить или ослабить развитие диабета у мышей NOD.
Самки мышей NOD получали АЬ728 или антитело для контроля изотипа mlgGl (20 мг/кг/неделю) в разные периоды течения заболевания. В одной группе мышей лечение начали в возрасте 7 недель (исследование профилактического действия, фигура 7А), тогда как в другой группе животных лечение начали в 13-недельном возрасте (поздняя доклиническая стадия, фигура 7В). В обоих случаях мыши находились под контролем для наблюдения за развитием сахарного диабета до достижения 37-недельного возраста. Для того чтобы контролировать развитие сахарного диабета, в крови еженедельно контролировали уровень глюкозы, и животных рассматривали как диабетических, если уровень глюкозы в крови превышал 250 мг/дл для двух последовательных измерений. Воздействие АЬ728 подтверждали с помощью количественного ИФА.
У мышей NOD, получавших контрольное антитело mlgGl, развитие диабета начиналось в возрасте 13-15 недель, и у 75% мышей заболевание прогрессировало до выраженного диабета к возрасту 37 недель (у 9 из 12 мышей в исследовании профилактического действия, и у 6 из 8 мышей в исследовании поздней доклинической стадии - фигуры 7А и 7В). Напротив, лечение с использованием антитела к ИЛ-21 привело к значительной задержке прогрессирования диабета. Только у одной из 12 мышей (8%, фигура 7А, р=0,0007) развился сахарный диабет, когда лечение начали в возрасте 7 недель, и только у одной из одиннадцати мышей (9%, фигура 7В, р=0,002) заболевание прогрессировало до выраженного диабета, когда лечение начали во время поздней доклинической стадии.
Подводя итог, следует отметить, что введение антитела к ИЛ-21 мыши (АЬ728) эффективно предотвращало развитие диабета у мышей NOD.
Последовательности Аминокислотная последовательность АЬ327
SEQID N0:
Идентичность
Длина
Последовательность
Вариабельная
область тяжелой цепи
117
Q VQLVQS GAE VKKPG AS VKVS С KAS G Y TFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGLIDTS D V YTIYNQKFKGRVTMTRDTS TS T V YME LS S LRS EDTAV Y YC ARYGPLAMD YWGQ GTLVTVSS
Вариабельная
область легкой цепи
106
DIQMTQS PS S LS AS VGDRVTITCRAS QDIS N YLNW YQQKPGKAPKLLIY YTS RLHS G V PSRFSGSGS GTDFTLTIS S LQPEDFAT Y YC QQFHTLRTFGGGTKVEIK
Тяжелая цепь
443
Q VQLVQS GAE VKKPG AS VKVS С KAS G Y TFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGLIDTS DV YTIYNQKFKGRVTMTRDTS TS TV YME LS S LRS EDTAV YYC ARYGPLAMD YWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSEST AALGCLVKD YFPEPVT VS WNS GALTS GV HTFPAVLQS S GLYS LS S V VT VPS S S LGTKT YTCN VDHKPS NTKVD KRVES KYGPPCPP CPAPE AAGGPS VFLFPPKPKDTLMIS RTPE VTC VVVD VS QEDPE VQFNWYVDG VEVH NAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ PREPQ V YTLPPS QEEMTKNQ VS LTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGS FFLYS RLT VD KS RWQEGN VFS CS VM HE ALHNH YTQKS LS LS LG
SEQ ID NO:
Идентичность
Длина
Последовательность
Легкая цепь
213
DIQMTQS PS S LS AS VGDRVTITCRAS QDIS N YLNW YQQKPGKAPKLLIY YTS RLHS G V PSRFSGSGS GTDFTLTIS S LQPEDFAT Y YC QQFHTLRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PS DEQLKS GTAS V VCLLNNFYPRE AK VQ WKVDNALQS GNS QES VTEQDS KDSTYS L S S TLTLS KAD YEKHKV YACE VTHQGLS S P VTKSFNRGEC
LC- CDR1
RASQDISNYLN
LC- CDR2
Y YTS RLHS
LC- CDR3
QQFHTLRT
HC-CDR1
KAS G YTFTD YWMH
HC-CDR2
LIDTSDVYTIYNQKFKG
HC-CDR3
ARYGPLAMDY
В описании примеров и количественных способов исследований были использованы следующие последовательности.
ИЛ-21 человека - Регистрационный номер в UniprotKB/Swiss #Q9HBE4 QDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLP APED VETNCEWSAFSCFQKAQLKS ANT GNNERIIN VS IKKLKRKPPS TN AGRRQKHRLTCPS CDS YEKKPPKEFLERFKS LLQKMIH QHLSSRTHGSEDS (SEQ ID N0:13)
ИЛ-21 яванских макак - Последовательность была клонирована в исследовательском центре, не доступна в публичных базах данных
QDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLDPEFLPAPEDVETNCEWSAISCFQKAQLKSANTG NNERIINLSIKKLKRKS PS TG AERRQKHRLTCPS CDS YEKKPPKEFLERFKS LLQKMIHQH LSSRTHGSEDS (SEQ ID N0:14)
ИЛ-21 мыши - Регистрационный номер в UniprotKB/Swiss #Q9ES17 HKSSPQGPDRLLIRLRHLIDIVEQLKIYENDLDPELLSAPQDVKGHCEHAAFACFQKAKL KPSNPGNNKTFIIDLVAQLRRRLPARRGGKKQKHIAKCPSCDSYEKRTPKEFLERLKWLL QKMIHQHLS (SEQ ID N0:15)
ИЛ-21 крысы - Регистрационный номер в UniprotKB/Swiss #A3QPB9
HKSSPQRPDHLLIRLRHLMDIVEQLKIYENDLDPELLTAPQDVKGQCEHEAFACFQKAK LKPSNTGNNKTFINDLLAQLRRRLPAKRTGNKQRHMAKCPSCDLYEKKTPKEFLERLK WLLQKMIHQHLS (SEQ ID N0:16)
ИЛ-21 кролика - (коммерческий реагент - R &D Systems, каталожный номер #7274-RB/CF)
HKSSSKGQDRYMIRMHQLLDIVDQLQSDVNDLDPDFLPAPQDVQKGCEQSAFSCFQKA QLKP AN AGDNGKRIS S LIKQLKRKLPS TKS KKTQKHRPTCPS С YS YEKKNLKEFLERLKS LIQKMIHQHLLEHLR (SEQ ID N0:17)
ДНК для экспрессии Ab327
SEQ
ID Идентичность Длина Последовательность NO:
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctg gggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggctacacattca ctgactactggatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagg gcttgagtggatgggactgattgatacttctgatgtttatactatcta caatcaaaagttcaagggcagagtcaccatgaccagggacacg tccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctga ggacacggccgtgtattactgtgcaagatatgggcccctggcta tggactactggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcagc ctccaccaagggcccatcggtcttcccgctagcgccctgctcca ggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtca aggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcagg cgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagt cctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctcc agcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcaca agcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaata 5 Тяжелая цепь tggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgg
gggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactct catgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggac gtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtgg atggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggagg agcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtc ctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaag gtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctc caaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccct gcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcct gacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtgg agtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagacca cgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagca ggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtct tctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacac agaagagcctctccctgtctctgggt
SEQ ID NO:
Идентичность
Длина
Последовательность
Легкая цепь
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtag
gagacagagtcaccatcacttgcagggcaagtcaggacattag
caattatttaaactggtatcagcagaaaccagggaaagccccta
agctcctgatctattacacatcaagattacactcaggggtcccatc
aaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccat
cagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacag
tttcacacgcttcggacgttcggcggagggaccaaggtggaga
tcaaaagaactgtggcggcgccatctgtcttcatcttcccgccat
ctgatgagcagttgaaatccggaactgcctctgttgtgtgcctgct
gaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtg
gataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacag
agcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccc
tgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgc
ctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag
agcttcaacaggggagagtgc
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ
<12 0> АНТИТЕЛА К ИНТЕРЛЕЙКИНУ-21
<130> X20141
<150> 61/968550
<151> 2014-03-21
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 117 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Leu Ile Asp Thr Ser Asp Val Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Pro Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 2 <211> 106 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> synthetic construct
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Page 1
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe His Thr Leu Arg Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 3
<211> 443
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Leu Ile Asp Thr Ser Asp Val Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Pro Leu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120
125
Page 2
Ala Pro 130 135
Cys
140
Ser
Leu Val
145 150
Lys
155
Asp 160
Gly Ala
165 170
Leu
175
Thr
Ser Gly 180 185
Leu
190
Tyr
Leu Gly
195 200
Thr 205
Lys
Thr Lys 210 215
Val 220
Asp
Pro Cys
225 230
Pro 235
Ala 240
Pro Pro
245 250
Lys
255
Pro
Thr Cys 260 265
Val 270
Val
Asn Trp
275 280
Tyr 285
Val
Arg Glu 290 295
Glu 300
Gln
Val Leu
305 310
His
315
Gln 320
Ser Asn
325 330
Lys
335
Gly
Lys Gly
340 345
Gln 350
Pro
Glu Glu 355 360
Met 365
Thr
Phe Tyr 370 375
Pro 380
Ser
Glu Asn 385 390
Asn 395
Tyr 400
Page 3
Phe Phe 405 410
Leu
415
Tyr
Gly Asn 420 425
Val 430
Phe
Arg Ser Thr Ser Tyr Phe Pro Glu Ser Gly Val His
Ser Leu Ser Ser Thr Tyr Thr Cys Lys Arg Val Glu Pro Glu Ala Ala
Lys Asp Thr Leu Val Asp Val Ser
Asp Gly Val Glu Phe Asn Ser Thr Asp Trp Leu Asn Leu Pro Ser Ser Arg Glu Pro Gln Lys Asn Gln Val Asp Ile Ala Val Lys Thr Thr Pro
Ser Arg Leu Thr Ser Cys Ser Val
Glu Ser Thr Ala Pro Val Thr Val Thr Phe Pro Ala Val Val Thr Val Asn Val Asp His Ser Lys Tyr Gly Gly Gly Pro Ser Met Ile Ser Arg Gln Glu Asp Pro Val His Asn Ala Tyr Arg Val Val Gly Lys Glu Tyr Ile Glu Lys Thr Val Tyr Thr Leu Ser Leu Thr Cys Glu Trp Glu Ser
Pro Val Leu Asp Val Asp Lys Ser
Met His Glu Ala
Ala Leu Gly Cys Ser Trp Asn Ser Val Leu Gln Ser
Pro Ser Ser Ser Lys Pro Ser Asn Pro Pro Cys Pro Val Phe Leu Phe Thr Pro Glu Val Glu Val Gln Phe
Lys Thr Lys Pro Ser Val Leu Thr Lys Cys Lys Val Ile Ser Lys Ala Pro Pro Ser Gln Leu Val Lys Gly Asn Gly Gln Pro Ser Asp Gly Ser
Arg Trp Gln Glu Leu His Asn His
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440
<210> 4
<211> 213 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Page 4
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 5
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Gln Gln Phe His Thr Leu Arg Thr Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 5
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggcta cacattcact gactactgga tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggactg attgatactt ctgatgttta tactatctac 180 aatcaaaagt tcaagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagatatggg 300 cccctggcta tggactactg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc agcctccacc 360 aagggcccat cggtcttccc gctagcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 600 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 660 cccccatgcc caccctgccc agcacctgag gccgccgggg gaccatcagt cttcctgttc 720 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 780 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 900 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 960 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1080 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggaaagc 1140 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1260 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1320 tctctgggt 1329
<210> 6
Page 5 ?
<211> 639 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 6
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattac acatcaagat tacactcagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag tttcacacgc ttcggacgtt cggcggaggg 300 accaaggtgg agatcaaaag aactgtggcg gcgccatctg tcttcatctt cccgccatct 360 gatgagcagt tgaaatccgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgc 639
<211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 7
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10
<210> 8 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 8
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5
<210> 9 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 9
Page 6 ?
Gln Gln Phe His Thr Leu Arg Thr 1 5
<210> 10
<211> 13
<212>
PRT
Artificial Sequence
<220>
<223>
synthetic construct <400>
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 11
<211>
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220> <223>
synthetic construct
<400> 11
Leu Ile Asp Thr Ser Asp Val Tyr Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 10
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223>
synthetic construct
<400> 12
Ala Arg Tyr Gly Pro Leu Ala Met Asp Tyr 1 5 10
<210> 13
<211> 131
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220> <223>
This protein was recombinantly produced and is identical to the homo sapien sequence.
<400> 13
Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp 1 5 10 15
Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala 20 25 30
Page 7
Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe 35 40 45
Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile 50 55 60
Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn 65 70 75 80
Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser 85 90 95
Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu
100 105 110
Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser 115 120 125
Glu Asp Ser 130
<210> 14
<211> 131
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220> <223>
This protein was recombinantly produced and is identical to the Cynomolgus monkey sequence.
Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp
1 5 10 15
Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Asp Pro Glu Phe Leu Pro Ala 20 25 30
Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Ile Ser Cys Phe 35 40 45
Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile 50 55 60
Ile Asn Leu Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Ser Pro Ser Thr Gly
65 70 75 80
Ala Glu Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser 85 90 95
Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu
100 105 110
Page 8
Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser 115 120 125
Glu Asp Ser 130
<210>
<211> 129
<212>
PRT
<213>
Artificial Sequence
<220> <223>
This protein was recombinantly produced and is identical to the mus musculus sequence.
<400> 15
His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg Leu Arg
1 5 10 15
His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp Leu
20 25 30
Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys Glu 35 40 45
His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser Asn 50 55 60
Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu Val Ala Gln Leu Arg 65 70 75 80
Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His Ile Ala 85 90 95
Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu Phe
100 105 110
Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu
115 120 125
Ser
<210> 16
<211> 129
<212> PRT
<213>
Artificial Sequence
<220> <223>
This protein was recombinantly produced and is identical to the rattus norvegicus sequence.
<400> 16
His Lys Ser Ser Pro Gln Arg Pro Asp His Leu Leu Ile Arg Leu Arg Page 9
1 5
10 15
His Leu Met Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp Leu 20 25 30
Asp Pro Glu Leu Leu Thr Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly Gln Cys Glu 35 40 45
His Glu Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser Asn 50 55 60
Thr Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Asn Asp Leu Leu Ala Gln Leu Arg 65 70 75 80
Arg Arg Leu Pro Ala Lys Arg Thr Gly Asn Lys Gln Arg His Met Ala 85 90 95
Lys Cys Pro Ser Cys Asp Leu Tyr Glu Lys Lys Thr Pro Lys Glu Phe
100 105 110
Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu
115 120 125
Ser
<210> 17
<211> 133
<212> PRT
<213>
Artificial Sequence
<220> <223>
This protein was recombinantly produced and is identical to the oryctolagus cuniculus sequence.
<400> 17
His Lys Ser Ser Ser Lys Gly Gln Asp Arg Tyr Met Ile Arg Met His
1 5 10 15
Gln Leu Leu Asp Ile Val Asp Gln Leu Gln Ser Asp Val Asn Asp Leu
20 25 30
Asp Pro Asp Phe Leu Pro Ala Pro Gln Asp Val Gln Lys Gly Cys Glu 35 40 45
Gln Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Pro Ala Asn 50 55 60
Ala Gly Asp Asn Gly Lys Arg Ile Ser Ser Leu Ile Lys Gln Leu Lys
65 70 75 80
Arg Lys Leu Pro Ser Thr Lys Ser Lys Lys Thr Gln Lys His Arg Pro
85 90 95 Page 10
Thr Cys Pro Ser Cys Tyr Ser Tyr Glu Lys Lys Asn Leu Lys Glu Phe 100 105 110
Leu Glu Arg Leu Lys Ser Leu Ile Gln Lys Met Ile His Gln His Leu
115 120 125
Leu Glu His Leu Arg
130
Page 11
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело, которое связывается с интерлейкином (ИЛ)-21 человека, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) и вариабельную область легкой цепи (LCVR), в котором указанная LCVR содержит последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 7, в CDRL1, последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 8, в CDRL2 и последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 9, в CDRL3, и в котором указанная HCVR содержит последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 10, в CDRH1, последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 11, в CDRH2 и последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 12, в CDRH3.
2. Антитело по п. 1, содержащее тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела, в котором указанная тяжелая цепь содержит HCVR, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ГО NO: 1, и в котором указанная легкая цепь содержит LCVR, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ГО N0: 2.
3. Антитело по п. 1 или п. 2, состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, в котором каждая указанная тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ГО NO: 1, и в котором каждая указанная легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ГО N0: 2.
4. Антитело по любому из пп. 1-3, в котором аминокислотная последовательность каждой указанной тяжелой цепи представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ГО N0: 3, и аминокислотная последовательность каждой указанной легкой цепи представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ГО N0: 4.
5. Молекула ДНК, содержащая полинуклеотид, который кодирует указанную тяжелую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность, приведенную в SEQ IDNO: 3.
6. Молекула ДНК по п. 5, в которой последовательность указанного полинуклеотида, кодирующего указанную тяжелую цепь антитела, представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ГО N0: 5.
7. Молекула ДНК, содержащая полинуклеотид, который кодирует указанную легкую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ГО N0: 4.
8. Молекула ДНК по п. 7, в которой последовательность указанного полинуклеотида, кодирующего указанную легкую цепь антитела, представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 6.
9. Молекула ДНК, содержащая полинуклеотид, который кодирует указанную тяжелую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ID N0: 3, и содержащая полинуклеотид, который кодирует указанную легкую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 4.
10. Молекула ДНК по п. 9, в которой последовательность указанного полинуклеотида, который кодирует указанную тяжелую цепь антитела, представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 5, и в которой последовательность указанного полинуклеотида, который кодирует указанную легкую цепь антитела, представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 6.
11. Клетка млекопитающего, трансформированная молекулой ДНК по п. 5 или п. 6, и молекулой ДНК по п. 7 или п. 9, причем указанная трансформированная клетка млекопитающего способна экспрессировать антитело, содержащее две тяжелые цепи антитела и две легкие цепи иммуноглобулинов, в котором аминокислотная последовательность каждой из двух указанных тяжелых цепей представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 3, и аминокислотная последовательность каждой из двух указанных легких цепей представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 4.
12. Клетка млекопитающего, трансформированная молекулой ДНК по п. 9 или п. 10, причем указанная трансформированная клетка млекопитающего способна экспрессировать антитело, содержащее две тяжелые цепи антитела и две легкие цепи иммуноглобулинов, в котором аминокислотная последовательность каждой из двух указанных тяжелых цепей представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 3, и аминокислотная последовательность каждой из двух указанных легких цепей, представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 4.
13. Способ получения антитела, причем указанное антитело содержит две тяжелые цепи антитела и две легкие цепи иммуноглобулинов, при этом аминокислотная последовательность каждой из двух указанных тяжелых цепей представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 3, и аминокислотная последовательность каждой из двух указанных легких цепей представляет собой последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 4, включающий:
a) , культивирование указанной клетки млекопитающего по п. 11 или клетки
млекопитающего по п. 12 в условиях, обеспечивающих экспрессию антитела, и
b) . выделение указанного экспрессированного антитела.
14. Антитело, полученное в соответствии со способом по п. 13.
15. Способ лечения аутоиммунного состояния у пациента, включающий введение указанному пациенту эффективной дозы антитела по любому из пп. 1-4 или п. 14.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанное аутоиммунное состояние представляет собой первичный синдром Шегрена, синдром Шегрена, системную красную волчанку, болезнь Грейвса или сахарный диабет 1 -го типа.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что указанное аутоиммунное состояние представляет собой первичный синдром Шегрена или синдром Шегрена.
18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что указанное аутоиммунное состояние представляет собой системную красную волчанку.
19. Антитело по любому из пп. 1-4 или п. 14 для применения в терапии.
20. Антитело по п. 19 для применения в лечении аутоиммунного состояния.
21. Антитело по п. 19 для применения в лечении первичного синдрома Шегрена, синдрома Шегрена, системной красной волчанки, болезни Грейвса или сахарного диабета 1 типа.
22. Антитело по п. 19 для применения в лечении первичного синдрома Шегрена или синдрома Шегрена.
23. Антитело по п. 19 для применения в лечении системной красной волчанки.
24. Фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело по любому из пп. 1, 2 или 12 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
14.
а 6
1.5.
1,0-
0.5-
0,0 0,01
2.0! 1.5 1,00.5.
0,0' 0.01
0,1 1 10
0,01 0,1 1 10 нМ
1 10
М О
к f 120-
1SQ.
20-
0.1
Масса тела
р*0,0№846
Лечение
0 7 14 21 й 36 "
¦ф ^ i Т т т ""
Кол-во дней после пересадки
Фиг. 4
Масса тела
Лечение
14 21 28 35 42
% 4 ¦ +
Кол-во дней после пересадки
Фиг. 5
CXCR5
CXCL13 "--21
Контроль изотипа mlgGl
АЬ728
Фиг. 7A
100
о н
ю а к
л н о о
о со
Начало лечения
Начало лечения
<220>
<211> 1329
<210> 7
<400>
WO 2015/142637
1/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
1/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
1/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
2/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
2/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
2/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
2/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
2/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
2/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
2/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
3/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
3/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
3/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
3/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
4/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
4/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
4/4
PCT7US2015/020383
WO 2015/142637
4/4
PCT7US2015/020383