[RU]

Настоящее раскрытие предлагает способ предсказания резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии у пациента с раком предстательной железы, содержащий (a) осуществление непосредственного анализа, содержащего иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (b) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к направленной на AR терапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит CK+, AR+, nucleoli+ СТС в субпопуляции упомянутых СТС. Настоящее раскрытие также предлагает способ предсказания резистентности по отношению к основанной на таксане химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, содержащий (a) осуществление непосредственного анализа, содержащего иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (b) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к основанной на таксане химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит CK+, AR-, nucleoli+, маленький размер в субпопуляции упомянутых СТС.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее раскрытие предлагает способ предсказания резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии у пациента с раком предстательной железы, содержащий (a) осуществление непосредственного анализа, содержащего иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (b) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к направленной на AR терапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит CK+, AR+, nucleoli+ СТС в субпопуляции упомянутых СТС. Настоящее раскрытие также предлагает способ предсказания резистентности по отношению к основанной на таксане химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, содержащий (a) осуществление непосредственного анализа, содержащего иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (b) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к основанной на таксане химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит CK+, AR-, nucleoli+, маленький размер в субпопуляции упомянутых СТС.

---

Евразийское (2D 201691499 <13> А1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. G01N33/574 (2006.01)
2017.02.28 G01N 21/00 (2006.01)
(54) ДИАГНОСТИКА С ПОМОЩЬЮ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК БИОМАРКЕРОВ, ПОЗВОЛЯЮЩИХ ПРЕДСКАЗЫВАТЬ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ПО ОТНОШЕНИЮ К НАПРАВЛЕННЫМ НА АНДРОГЕНОВЫЙ РЕЦЕПТОР (AR)
ТЕРАПИЯМ
(22) Дата подачи заявки 2015.01.29
(31) 61/933,774
(32) 2014.01.30
(33) US
(86) PCT/US2015/013538
(87) WO 2015/116828 2015.08.06
(71) Заявитель:
ЭПИК САЙЕНСИЗ, ИНК. (US)
(72) Изобретатель: Диттамор Райан (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Настоящее раскрытие предлагает способ предсказания резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии у пациента с раком предстательной железы, содержащий (a) осуществление непосредственного анализа, содержащего иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (b) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к направленной на AR терапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит CK +, AR+, nucleoli+ СТС в субпопуляции упомянутых СТС. Настоящее раскрытие также предлагает способ предсказания резистентности по отношению к основанной на таксане химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, содержащий (a) осуществление непосредственного анализа, содержащего иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую характеризацию яд-росодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (b) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к основанной на таксане химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит CK+, AR-, nucleoli+, маленький размер в субпопуляции упомянутых СТС.
2420-536793ЕА/019 ДИАГНОСТИКА С ПОМОЩЬЮ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК БИОМАРКЕРОВ, ПОЗВОЛЯЮЩИХ ПРЕДСКАЗЫВАТЬ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ПО ОТНОШЕНИЮ К НАПРАВЛЕННЫМ НА АНДРОГЕНОВЫЙ РЕЦЕПТОР (AR)
ТЕРАПИЯМ
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США, сериальный № 61/933774, поданной 30 января 2014 года, все содержимое которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
[0002] Настоящее изобретение относится в общем к области диагностики рака и, более конкретно, к способам предсказания резистентности по отношению к направленным на AR терапиям и химиотерапии у пациента с раком предстательной железы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Рак предстательной железы (PC) остается наиболее распространенным некожным раком в США. Только в 2014 году прогнозируемый уровень заболеваемости раком предстательной железы составляет 233000 случаев со смертью 29480 человек, что делает терапию метастатического рака предстательной железы по-настоящему неудовлетворенной медицинской потребностью. Siegel et al., 2014. СА Cancer J Clin. 2014; 64(l):9-29. Эпидемиологические исследования из Европы показывают сравнимые данные с оценкой заболеваемости в 416700 новых случаев в 2012 году, что составляет 22,8% диагнозов рака у мужчин. Всего ожидается 92200 смертей от рака предстательной железы, что делает его одним из трех раков, от которых мужчины умирают с наибольшей вероятностью, с уровнем смертности, составляющим 9, 5%.
[0004] С экспоненциальным ростом появления новых средств, протестированных и утвержденных для лечения пациентов с метастатическим кастрационно-резистентным раком предстательной железы (mCRPC) только за последние 5 лет, возникли проблемы в отношении оптимальной последовательности или комбинации данных средств. Существует несколько руководств, которые помогают клиницистам найти наилучший подход в отношении последовательности, и большинство из них оценивает наличие или
отсутствие симптомов, общее состояние, а также бремя болезни, для того чтобы помочь в определении наилучшей последовательности для данных средств. Mohler et al. , 2014, J Natl Compr Cane Netw. 2013; 11(12):1471-1479; Cookson et al. , 2013, J Urol. 2013; 190 (2):429-438. В настоящее время утвержденные способы лечения используют цитотоксические средства группы таксана, такие как Taxotere(r) (доцетаксел) и Jevtana(r) (кабазитаксел), и препараты для антиандрогенной гормональной терапии, такие как Zytiga(r) (абиратерон, блокирует производство андрогенов) или Xtandi(r) (энзалутамид, ингибитор андрогенового рецептора (AR)).
[0005] Для клиницистов проблемой является выбор наилучшей последовательности применения данных терапий для обеспечения наибольшей пользы для пациентов. При этом неудача при терапии остается значительной проблемой в связи с гетерогенными ответами на терапию среди пациентов и в свете перекрестной резистентности со стороны каждого средства. Mezynski et al., Ann Oncol. 2012; 23(11):2943-2947; Noonan et al., Ann Oncol. 2013; 24 (7) :1802-1807; Pezaro et al. , Eur Urol. 2014, 66(3):459-4 65. Кроме того, пациенты могут терять терапевтическое окно для получения существенной пользы от каждого препарата, о котором доказано, что он обеспечивает увеличение общей выживаемости. Следовательно, лучшие способы идентификации целевых популяций, обладающих наибольшим потенциалом для получения пользы от таргетной терапии, остаются важной задачей.
[000 6] Циркулирующие опухолевые клетки (СТС) представляют значительный шаг вперед в диагностике рака, становящийся даже более привлекательным благодаря неинвазивности их измерения. Cristofanilli et al. , N Engl J Med 351:781-91, (2004). CTC, вышедшие или из первичной опухоли, или из ее метастатических участков, содержат важную информацию о биологии опухоли. Количественное определение и характеризация СТС в качестве жидкой биопсии помогает клиницистам при выборе курса терапии и при наблюдении за тем, как развивается рак пациента. Поэтому СТС могут рассматриваться не только в качестве суррогатных
биомаркеров метастатического заболевания, но также в качестве
многообещающего ключевого инструмента неинвазивного
отслеживания изменений опухоли, ответа на лечение, рецидива рака или результата лечения пациента. Исторически, чрезвычайно низкие уровни СТС в кровотоке в сочетании с их неизвестным фенотипом значительно препятствовали их детектированию и ограничивали их клиническую полезность. В настоящее время разработано множество технологий для детектирования, выделения и характеризации СТС с целью использования их информации.
[0007] Существует необходимость в разработке точных и
неинвазивных способов определения оптимальной
последовательности введения направленной на AR и основанной на таксане химиотерапии для максимизации пользы для отдельного пациента. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этой потребности посредством обеспечения сигнатур биомаркеров, которые предсказывают резистентность по отношению к направленным на AR терапиям и химиотерапии на основе устойчивой к ошибкам платформы для детектирования и характеризации СТС, которая делает возможной фенотипическую характеризацию СТС. Также предлагаются связанные с этим преимущества. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Настоящее изобретение предлагает способы на основе СТС для проспективной идентификации резистентности к направленным на AR терапиям и химиотерапии у пациента с раком предстательной железы.
[0009] Настоящее раскрытие предлагает способ предсказания резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии у пациента с раком предстательной железы, содержащий (а) осуществление непосредственного анализа, содержащего иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к направленной на AR терапии у
пациента с раком предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0010] В некоторых вариантах осуществления настоящее
раскрытие предлагает способ предсказания резистентности по
отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии
у пациента с раком предстательной железы, содержащий (а)
осуществление непосредственного анализа, содержащего
иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую
характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к направленной на AR терапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит СК+, AR+, nucleoli+ СТС в субпопуляции упомянутых СТС. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[ООН] В других вариантах осуществления настоящее
раскрытие предлагает способ предсказания резистентности по
отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии
у пациента с раком предстательной железы, содержащий (а)
осуществление непосредственного анализа, содержащего
иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую
характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к направленной на AR терапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит присутствие положительных по N-концу AR СТС и потерю С-конца AR. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0012] В других вариантах осуществления настоящее
раскрытие предлагает способ предсказания резистентности по
отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии
у пациента с раком предстательной железы, содержащий (а)
осуществление непосредственного анализа, содержащего
иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую
характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к направленной на AR терапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит увеличение гетерогенности СТС по сравнению с эталонной популяцией. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0013] Настоящее раскрытие также предлагает способ
предсказания резистентности по отношению к химиотерапии у
пациента с раком предстательной железы, содержащий (а)
осуществление непосредственного анализа, содержащего
иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую
характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к химиотерапии у пациента с раком предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0014] Настоящее раскрытие также предлагает способ предсказания резистентности по отношению к основанной на таксане химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, содержащий (а) осуществление непосредственного анализа, содержащего иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на
основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к основанной на таксане химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит СК+, AR-, nucleoli+, маленький размер в субпопуляции упомянутых СТС. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0015] В определенных аспектах настоящего изобретения иммунофлуоресцентное окрашивание ядросодержащих клеток содержит пан-цитокератин (СК), кластер дифференцировки (CD) 45, диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и AR. В дополнительных аспектах иммунофлуоресцентное окрашивание AR содержит ядерное окрашивание N-конца и С-конца AR.
[0016] В некоторых аспектах настоящего изобретения предсказание резистентности по отношению к химиотерапии или к направленной на AR терапии дает информацию для последующего принятия решения о лечении. В конкретных вариантах осуществления рак предстательной железы представляет собой метастатический кастрационно-резистентный рак предстательной железы (mCRPC).
[0017] Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из подробного описания и из формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0018] Фигура 1 показывает график, изображающий варианты изменений PSA после направленных на AR-сигнализацию терапий.
[0019] Фигуры 2А и 2В показывают способы, используемые при осуществлении вариантов осуществления, приведенных в качестве примера в настоящем документе, и демографические данные пациентов группы исследования. Фигура 2А показывает схему типичного процесса получения и детектирования СТС: (1) ядросодержащие клетки из образца крови помещают на предметные стекла; (2) предметные стекла хранят в хранилище биологических материалов при -8 0°С; (3) предметные стекла окрашивают с
помощью СК, CD4 5, DAPI и AR; (4) предметные стекла сканируют; (5) выполняют многопараметрические цифровые алгоритмы для патологий; (б) подтверждение СТС с помощью программного и ручного ридера и количественная оценка экспрессии биомаркеров;
(7) для FISH записывают координаты, и удаляют покровное стекло;
(8) выполняют анализ FISH; (9) оценивают БКК в области для
определения нормы; и (10) заново локализуют и оценивают СТС.
Фигура 1В показывает информацию о популяции исследования.
Демографические и клинические характеристики пациентов на
момент включения в исследование показаны на левой и правой
панелях. В исследование были включены тридцать пациентов с
прогрессирующим mCRPC (pts).
[0020] Фигура 3 показывает частоту в Epic по сравнению с CellSearch(r), причем СТС в Epic на мл экстраполировали до СТС на 7,5 мл по сравнению с CellSearch СТС на 7,5 мл. Соответствующие образцы крови обрабатывали с использованием платформы для СТС от CellSearch(r) и Epic Sciences. Подсчет в CellSearch(r) ограничивали 2 00 СТС. СТС в Epic измеряли в 1 мл и экстраполировали на 7,5 мл крови.
[0021] Фигура 4 показывает иммунофлуоресцентные изображения субпопуляций СТС, детектированные на платформе Epic.
[0022] Фигура 5 показывает гетерогенность экспрессии AR наблюдаемых СТС и субпопуляций СТС.
[0023] Фигура б показывает характеризацию СТС и гетерогенность локализации AR. Все клетки включают традиционные СТС, апоптотические СТС, СК- СТС и маленькие СТС.
[0024] Фигура 7 показывает гетерогенность СТС, наблюдаемую в образцах пациентов после различных линий терапии. Для определения гетерогенности каждую клетку относили к 1 из 7 0 категорий. Образцы с большим количеством ненулевых типов и поэтому с большим количеством ненулевых столбцов на графике считали более гетерогенными, чем образцы с несколькими ненулевыми популяциями. Нижняя панель показывает терапии, которым подвергали пациента, от которого получали образец, в то время, когда был взят образец.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0025] Настоящее раскрытие частично основано на идентификации сигнатуры биомаркеров СТС, которая делает возможным проспективное предсказание резистентности по отношению к направленным на AR терапиям у пациента, страдающего от mCRPC. Настоящее раскрытие также частично основано на идентификации сигнатуры биомаркеров СТС, которая делает возможным проспективное предсказание резистентности по отношению к химиотерапии у пациента, страдающего от mCRPC. Оптимальная последовательность введения направленной на AR и основанной на таксане химиотерапии для максимизации пользы для отдельного пациента является неудовлетворенной медицинской потребностью. Настоящее изобретение.
[0026] Настоящее раскрытие предлагает способ предсказания резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии у пациента с раком предстательной железы, содержащий (а) осуществление непосредственного анализа, содержащего иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к направленной на AR терапии у пациента с раком предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0027] В некоторых вариантах осуществления настоящее
раскрытие предлагает способ предсказания резистентности по
отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии
у пациента с раком предстательной железы, содержащий (а)
осуществление непосредственного анализа, содержащего
иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую
характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на
основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к направленной на AR терапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит СК+, AR+, nucleoli+ СТС в субпопуляции упомянутых СТС. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0028] В других вариантах осуществления настоящее
раскрытие предлагает способ предсказания резистентности по
отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии
у пациента с раком предстательной железы, содержащий (а)
осуществление непосредственного анализа, содержащего
иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую
характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к направленной на AR терапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит присутствие положительных по N-концу AR СТС и СТС с потерей С-конца AR. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0029] В других вариантах осуществления настоящее
раскрытие предлагает способ предсказания резистентности по
отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии
у пациента с раком предстательной железы, содержащий (а)
осуществление непосредственного анализа, содержащего
иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую
характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к направленной на AR терапии у
пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит присутствие положительных по N-концу AR СТС. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0030] В других вариантах осуществления настоящее
раскрытие предлагает способ предсказания резистентности по
отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии
у пациента с раком предстательной железы, содержащий (а)
осуществление непосредственного анализа, содержащего
иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую
характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к направленной на AR терапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит увеличение гетерогенности СТС по сравнению с эталонной популяцией. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0031] Настоящее раскрытие также предлагает способ
предсказания резистентности по отношению к химиотерапии у
пациента с раком предстательной железы, содержащий (а)
осуществление непосредственного анализа, содержащего
иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую
характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к химиотерапии у пациента с раком предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0032] Настоящее раскрытие также предлагает способ
предсказания резистентности по отношению к химиотерапии у
пациента с раком предстательной железы, содержащий (а)
осуществление непосредственного анализа, содержащего
иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую
характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит СК+, AR-, nucleoli+, маленький размер в субпопуляции упомянутых СТС. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0033] Настоящее раскрытие также предлагает способ
предсказания резистентности по отношению к основанной на
таксане химиотерапии у пациента с раком, содержащий (а)
осуществление непосредственного анализа, содержащего
иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую
характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к основанной на таксане химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит СК+, AR-, nucleoli+, маленький размер в субпопуляции упомянутых СТС. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления основанная на таксане химиотерапия содержит доцетаксел или кабазитаксел. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0034] Настоящее раскрытие также предлагает способ предсказания резистентности по отношению к основанной на
таксане химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, содержащий (а) осуществление непосредственного анализа, содержащего иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к таксановой химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит СК+, AR-, nucleoli+, маленький размер в субпопуляции упомянутых СТС. В некоторых вариантах осуществления основанная на таксане химиотерапия содержит доцетаксел или кабазитаксел. В некоторых вариантах осуществления резистентность представляет собой de novo резистентность.
[0035] Настоящее раскрытие также предлагает способ предсказания de novo резистентности по отношению к основанной на таксане химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, содержащий (а) осуществление непосредственного анализа, содержащего иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и (Ь) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать de novo резистентность по отношению к таксановой химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, причем сигнатура биомаркеров содержит СК+, AR-, nucleoli+, маленький размер в субпопуляции упомянутых СТС. В некоторых вариантах осуществления основанная на таксане химиотерапия содержит доцетаксел или кабазитаксел.
[0036] В определенных аспектах настоящего изобретения иммунофлуоресцентное окрашивание ядросодержащих клеток содержит пан-цитокератин (СК), кластер дифференцировки (CD) 45, диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и AR. В дополнительных аспектах
иммунофлуоресцентное окрашивание AR содержит ядерное окрашивание N-конца и С-конца AR.
[0037] В некоторых аспектах настоящего изобретения предсказание резистентности по отношению к химиотерапии или к направленной на AR терапии дает информацию для последующего принятия решения о лечении. В конкретных вариантах осуществления рак предстательной железы представляет собой метастатический кастрационно-резистентный рак предстательной железы (mCRPC).
[0038] Андрогены в форме тестостерона или более
сильнодействующего дигидротестостерона (DHT) являются хорошо
охарактеризованными факторами прогрессирования рака
предстательной железы и дифференцировки предстательной железы.
При этом основы лечения раков предстательной железы на поздних
стадиях были установлены десятилетия назад, когда с помощью
кастрации в форме хирургической орхэктомии достигали
значительной регрессии опухоли предстательной железы. С тех пор
стали использовать замену на химическую кастрацию вследствие
предпочтений пациентов. Поэтому антиандрогенная терапия (ADT)
стала стандартным методом системного лечения для
местнораспространенного или метастатического рака
предстательной железы. Хотя ADT почти всегда эффективна, у большинства пациентов, неминуемо происходит прогрессирование заболевания до кастрационной резистентности. В настоящее время признается, что андрогеновый рецептор (AR) остается сверхэкспрессированным несмотря на казалось бы кастрационные уровни тестостерона, в связи с тем, что альтернативные рецепторы могут активировать AR, или другие целевые гены могут способствовать сохранению кастрационно-резистентного фенотипа, поэтому термин "кастрационная резистентность" получил широкое распространение в литературе.
[0039] Ось андрогенового рецептора является проверенной мишенью для лечения кастрационно-резистентного рака предстательной железы. Предполагают, что некоторые нарушения данного пути ведут к андроген-независимому росту, в том числе мутация и амплификация андрогенового рецептора, а также
аутокринное производство тестостерона. Два препарата, направленные на данный путь при кастрационно-резистентном раке предстательной железы - ацетат абиратерона (Zytiga(r)) и энзалутамид (Xtandi(r)) - одобрены для применения у пациентов, которые уже получали химиотерапию. С точки зрения механизма, абиратерон проявляет противоопухолевую активность посредством ингибирования пути 17,20-лиазы, существенного для синтеза тестостерона. Энзалутамид связывается с андрогеновым рецептором и препятствует его транслокации в ядро. Абиратерон также одобрен для пациентов в условиях, предшествующих химиотерапии, на основании результатов недавних клинических исследований.
[0040] С появлением новых системных терапий оптимальная последовательность лечения данными препаратами при mCRPC становится все более важна. Химиотерапия часто указывается при лечении кастрационно-резистентного рака предстательной железы, и основанные на таксане средства, такие как доцетаксел, часто являются первым выбором. Абиратерон (Zytiga) , антиандрогенный препарат, изначально был одобрен только для лечения кастрационно-резистентного рака предстательной железы после химиотерапии. Тем не менее, вследствие успешных результатов лечения многие врачи в настоящее время выписывают абиратерон во время курса лечения заранее. Сочетание абиратерона с энзалутамидом оказалось безопасным, и эффективность данной комбинации по сравнению с одним энзалутамидом подвергается в настоящее время оценке для детектирования пользы с точки зрения выживаемости от комбинационнго подхода в качестве предварительного лечения по сравнению с предполагаемым стандартным последовательным использованием данных средств. Недавние исследования подтвердили, что, поскольку основанная на таксане химиотерапия и абиратерон эффективны отчасти вследствие аналогичных механизмов, предварительное лечение абиратероном может вносить вклад в резистентность по отношению к таксану и снижение эффективности химиотерапии, что свидетельствует о клинической перекрестной резистентности. Способы настоящего изобретения обеспечивают оптимальную последовательность лечения с помощью гормональных средств (абиратерона и энзалутамида) и
цитотоксической химиотерапии (доцетаксела и кабазитаксела).
[0041] Следует отметить, что, как используется в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают отсылки ко множественному, если содержание явно не требует иного. Таким образом, например, ссылка на "биомаркер" включает в себя смесь двух или более биомаркеров и тому подобное.
[0042] Термин "приблизительно", особенно по отношению к заданному количеству, предназначен для охвата отклонений плюс или минус пять процентов.
[0043] Как используется в данной заявке, включая прилагаемую формулу изобретения, формы единственного числа включают отсылки ко множественному, если содержание явно не требует иного, и используются взаимозаменяемо с "по меньшей мере один" и "один или несколько".
[0044] Как используется в настоящем документе, термины "содержит", "содержащий", "включает в себя", "включающий в себя", "охватывает", "охватывая" и любые их варианты предназначены для покрытия неисключительного включения, так что процесс, способ, изделие, характеризуемое способом его получения, или композиция веществ, которые содержат, включают в себя или охватывают элемент или ряд элементов, включают в себя не только эти элементы, но могут включать в себя другие элементы, не перечисленные или свойственные явно такому процессу, способу, изделию, характеризуемому способом его получения, или композиции веществ.
[0045] "Биомаркер" представляет собой любую молекулу, свойство, характеристику или аспект, которые могут быть измерены и соотнесены с вероятностью рака предстательной железы, в частности mCRPC. Термин также охватывает любое свойство, характеристику, признак или аспект СТС, которые могут быть измерены и соотнесены в связи с предсказанием резистентности по отношению к терапии рака предстательной железы, например направленной на AR терапии или химиотерапии на основе таксана. Для биомаркера СТС такой измеримый признак может включать, например, присутствие, отсутствие или
концентрацию биомаркера или его подтипа в биологическом образце, изменение экспрессии белков, иммунофлуоресцентный и/или морфологический фенотип, такой как, например, пан-цитокератин (СК), кластер дифференцировки (CD) 45, диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и AR, ядерное окрашивание N-конца и С-конца AR, детали ядер, контуры ядер, присутствие или отсутствие ядрышек, качество цитоплазмы, количество цитоплазмы, интенсивность вариантов иммунофлуоресцентного окрашивания по сравнению с соответствующими контрольными субъектами и/или присутствие или степень гетерогенности фенотипов, наблюдаемых для биомаркера СТС.
[0046] В добавление к биомаркерам СТС, биомаркеры могут дополнительно включать показатели риска, включая, например, возраст, семейную историю, расу и диету. Несколько факторов связаны с увеличенным риском рака предстательной железы. Основную роль играют генетика, увеличение возраста и экологические и географические факторы. Но диетические факторы, такие как высокое потребление жиров - жирных кислот, альфа-линоленовой кислоты, обнаруживаемой в красном мясе, и так далее, дефицит микроэлементов, таких как селен, и низкие уровни витаминов D и Е, также связаны с увеличенным риском развития рака предстательной железы у некоторых индивидуумов.
[0047] Как используется в настоящем документе, термин "сигнатура биомаркеров" обозначает комбинацию, содержащую два или более биомаркера. Количество биомаркеров, подходящих для использования в сигнатуре биомаркеров, зависит от значения резистентности и специфичности для конкретной комбинации значений биомаркеров.
[0048] Термин "пациент", как используется в настоящем документе, предпочтительно, относится к человеку, но также охватывает других млекопитающих. Следует отметить, что, как используется в настоящем документе, термины "организм", "индивидуум", "субъект" или "пациент" используются как синонимы и взаимозаменяемо.
[0049] Термин "направленная на андрогеновый рецептор терапия" или "направленная на AR терапия" в контексте способов,
описанных в настоящем документе, охватывает любую терапию,
которая непосредственно или опосредованно ингибирует путь AR-
сигнализации, в том числе, например, посредством инактивации
производства андрогена, инактивации связывания андрогена с AR
или непосредственной инактивации AR. Поэтому любая терапия,
которая разрушает ось сигнализации AR и ингибирует сигнальный
путь, включена в термин "направленная на AR терапия". Пример
непосредственного ингибирования, энзалутамид, также известный
как MDV3100, является одним из наиболее часто изучаемых
антагонистов AR. Энзалутамид нацелен на несколько этапов в пути
AR-сигнализации. Благодаря его увеличенной аффинности
связывания с AR он может блокировать связывание андрогенов с
рецептором, предотвращая ядерную транслокацию AR, связывание
ДНК и участие коактиватора в комплексе лиганд-рецептор. Одной
из наиболее заметных характеристик энзалутамида является то,
что он способен связывать и ингибировать не только дикого типа,
но также мутантный AR, то есть AR с точечными мутациями,
которые обычно происходят после прогрессирования Рса, который
вызывает кастрационную резистентность. Другим перспективным
средством для лечения CRPC является ацетат абиратерона. Тогда
как энзалутамид нацелен непосредственно на AR, абиратерон
действует посредством опосредованного ингибирования пути AR-
сигнализации. Абиратерон ингибирует CYP17, фермент семейства
цитохрома Р450. Данное ингибирование является важным, поскольку
CYP17 играет существенную роль в синтезе тестостерона.
Соответственно, ингибирование вызывает ингибирование синтеза
тестостерона, ограничивающее количество андрогенов,
циркулирующих в организме, тем самым также ограничивая действие AR. При том, что кастрация способна снизить синтез тестостерона и DHT, она не удаляет все возможные источники андрогенов в организме, таких как внутриопухолевые или надпочечниковые андрогены. Как будет понятно специалистам в данной области техники, любой механизм ингибирования андрогенов является потенциальным направлением для направленной на AR терапии.
[0050] Как используется в настоящем документе, термин "резистентность" в контексте направленной на AR терапии или
химиотерапии, включая таксаны, означает, что субъект не демонстрирует ответа на терапию на основании присущей опухолевым клеткам способности избегать воздействия терапевтического средства. Резистентность включает в себя de novo резистентность и приобретенную резистентность. Пациенты с раком, которые демонстрируют de novo резистентность, не отвечают на химиотерапию с самого начала. Однако при приобретенной резистентности раковые клетки вначале отвечают на химиотерапевтический препарат, но в конечном итоге приобретают резистентность по отношению к нему. Клетки могут также демонстрировать перекрестную резистентность по отношению к другим структурно и механистически несвязанным препаратам -явление, обычно известное как множественная лекарственная резистентность (MDR). Благодаря приобретению MDR, схемы лечения, которые объединяют несколько средств с различными мишенями, перестают быть эффективными.
[0051] Как используется в настоящем документе, термин "гетерогенность СТС" обозначает разнообразие СТС в образце. Гетерогенность может быть определена посредством классификации СТС по дискретным типам и подсчета количества каждого типа, наблюдаемого в образце. Большее количество типов СТС означает, что обнаружено больше различных популяций СТС. Например, из пациентов X и Y в таблице 1 со следующими количествами подтипов СТС пациент X имеет большую гетерогенность, чем пациент Y, даже при том, что они имеют одинаковое количество клеток. Как описано в настоящем документе, присутствие большей степени гетерогенности среди СТС или увеличение гетерогенности по сравнению с эталонным уровнем может являться признаком резистентности по отношению к направленной на AR терапии.
[0 052] Таблица 1
Гетерогенность СТС
Кол-во подтипов
Пациент X
Пациент Y
Тип А
Тип В
Тип С
[0053] Как используется в настоящем документе, термин "циркулирующая опухолевая клетка" или "СТС" предназначен для охвата любых редких клеток, которые присутствуют в биологическом образце, который связан с раком предстательной железы. СТС, которые могут присутствовать в виде традиционных или нетрадиционных отдельных клеток СТС или в виде кластеров СТС, часто представляют собой эпителиальные клетки, распространившиеся из солидных опухолей, обнаруживаемые в очень низких концентрациях в циркуляции пациентов. В термин "СТС" включены "традиционные СТС", который далее определены как отдельные СТС, которые являются цитокератин-положительными, С04 5-отрицательными, содержат ядро DAPI и морфологически отличаются от окружающих белых кровяных клеток. Также термин "СТС" охватывает "нетрадиционные СТС", что относится к СТС, которые отличаются от традиционных СТС по меньшей мере одной характеристикой. Нетрадиционные СТС включают кластеры СТС, СК-отрицательные СТС, которые положительны по меньшей мере по одному дополнительному биомаркеру, который позволяет классифицировать их как СТС, маленькие СТС, nucleoli+ СТС и СТС со спеклами СК. Термин "маленькая СТС" обозначает СТС, которая имеет такой же или меньший размер, чем средний размер БКК в образце. Термин "кластер СТС" также охватывается определением "СТС" и дополнительно означает две или более СТС с соприкасающимися клеточными мембранами.
[0054] В некоторых вариантах осуществления частота СТС с усеченным С-концом AR представляет собой биомаркер, применимый для осуществления способов настоящего изобретения на практике. Как раскрыто в настоящем документе, уменьшение ядерного окрашивания С-конца AR по сравнению с ядерным окрашиванием N-конца AR может быть частью сигнатуры биомаркеров, предсказывающей резистентность по отношению к направленной на AR терапии. Кроме того, уменьшение ядерного окрашивания С-конца AR по сравнению с ядерным окрашиванием N-конца AR может быть частью сигнатуры биомаркеров, предсказывающей резистентность по отношению к ингибиторам CYP17, таким как ортеронел, галетерон и VT-4 64, активаторам РР2А и направленным на N-конец AR
препаратам, таким как EPI-001, EPI-002 и EPI-506.
[0055] В самом широком смысле биологический образец может представлять собой любой образец, который содержит СТС. Образец может содержать физиологическую жидкость, такую как кровь; растворимую фракцию клеточного препарата или аликвоту сред, в которых были выращены клетки; хромосому, органеллу или мембрану, выделенные или экстрагированные из клетки; геномную ДНК, РНК, или кДНК в растворе или связанные с подложкой; клетку; ткань; отпечаток ткани; отпечаток пальцев; клетки; кожу и тому подобное. Биологический образец, полученный от субъекта, может представлять собой любой образец, который содержит клетки, и охватывает любой материал, в котором могут быть детектированы СТС. Образец может представлять собой, например, цельную кровь, плазму, слюну или другую физиологическую жидкость или ткань, которая содержит клетки.
[0056] В конкретных вариантах осуществления биологический образец представляет собой образец крови. Как описано в настоящем документе, образец может представлять собой цельную кровь, более предпочтительно периферическую кровь или фракцию клеток периферической крови. Как будет понятно специалистам в данной области техники, образец крови может включать в себя любую фракцию или компонент крови, без ограничения, Т-клетки, моноциты, нейтрофилы, эритроциты, тромбоциты и микропузырьки, такие как экзосомы и подобные экзосомам везикулы. В контексте настоящего раскрытия кровяные клетки, включенные в образец крови, охватывают любые ядросодержащие клетки и не ограничены компонентами цельной крови. Как таковые, кровяные клетки включают, например, белые кровяные клетки (БКК), а также редкие клетки, включая СТС.
[0057] Каждый образец настоящего раскрытия может содержать множество клеточных популяций и клеточных субпопуляций, которые различимы с помощью способов, хорошо известных в данной области техники (например, FACS, иммуногистохимия). Например, образец крови может содержать популяции неядросодержащих клеток, таких как эритроциты (например, 4-5 миллионов на мкл) или тромбоциты (150000-400000 клеток на мкл), и популяции ядросодержащих
клеток, таких как БКК (например, 4500-10000 клеток на мкл), СЕС или СТС (циркулирующие опухолевые клетки; например, 2-8 00 клеток/). БКК могут содержать клеточные субпопуляции, например, нейтрофилов (2500-8000 клеток на мкл), лимфоцитов (1000-4000 клеток на мкл), моноцитов (100-700 клеток на мкл), эозинофилов (50-500 клеток на мкл), базофилов (25-100 клеток на мкл) и тому подобные. Образцы настоящего раскрытия представляют собой необогащенные образцы, то есть они не обогащены никакой конкретной популяцией или субпопуляцией ядросодержащих клеток. Например, необогащенные образцы крови не обогащены СТС, БКК, В-клетками, Т-клетками, NK-клетками, моноцитами или тому подобными.
[0058] В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец крови, полученный от здорового субъекта или субъекта, который, как полагают, подвержен высокому риску рака предстательной железы или метастазирования существующего рака предстательной железы на основании известных в данной области техники клинически проверенных критериев, включая, например, возраст, расу, семью и историю. В некоторых вариантах осуществления образец крови берут от субъекта, у которого был диагностирован рак предстательной железы и/или mCRPC на основании тканевой или жидкой биопсии и/или хирургии или по клиническим признакам. В некоторых вариантах осуществления образец крови получают от субъекта, демонстрирующего клиническое проявление рака предстательной железы и/или mCRPC, хорошо известное в данной области техники, или у которого обнаружен любой из известных факторов риска рака предстательной железы и/или mCRPC. В конкретных вариантах осуществления пациент страдает от mCRPC.
[0059] Как используется в настоящем документе в контексте идентификации СТС в образце, термин "непосредственный анализ" означает, что СТС детектируют в контексте всех окружающих ядросодержащих клеток, присутствующих в образце, в противоположность детектированию после обогащения образца СТС перед детектированием. В некоторых вариантах осуществления способы содержат микроскопию, обеспечивающую поле зрения,
которое включает в себя как СТС, так и по меньшей мере 200 окружающих белых кровяных клеток (БКК).
[0060] Фундаментальным аспектом настоящего раскрытия является непревзойденная устойчивость раскрытых способов к ошибкам в отношении детектирования СТС. Детектирование редких событий, раскрытое в настоящем документе в отношении СТС, основано на непосредственном, то есть без обогащения, анализе популяции, который охватывает идентификацию редких событий в контексте окружающих нередких событий. Идентификация редких событий в соответствии с раскрытыми способами по сути идентифицирует окружающие события как нередкие события. Учет окружающих нередких событий и определение средних значений для нередких событий, например среднего размера клеток нередких событий, делает возможным калибровку способа детектирования посредством удаления шума. Результатом является устойчивость раскрытых способов к ошибкам, которая не может быть достигнута с помощью способов, которые не основаны на непосредственном анализе, но которые вместо этого сравнивают обогащенные популяции с по сути разрушенными контекстными объектами сравнения для редких событий. Устойчивость способов непосредственного анализа, раскрытых в настоящем документе, к ошибкам делает возможной характеризацию СТС, включая подтипы СТС, описанные в настоящем документе, что обеспечивает идентификацию фенотипов и гетерогенность, которые не могут быть достигнуты с помощью других способов детектирования СТС, и это делает возможным анализ биомаркеров в контексте заявленных способов.
[0061] В некоторых вариантах осуществления способы предсказания резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии или химиотерапии в опухоли пациента с раком предстательной железы могут дополнительно охватывать индивидуальные факторы риска пациента и данные визуализации, что включает любую форму модальности визуализации, известную и используемую в данной области техники, например и без ограничения, с помощью рентгеновской компьютерной томографии (КТ), ультразвука, позитронно
эмиссионной томографии (ПЭТ), электроимпедансной томографии и магнитного резонанса (МРТ). Следует понимать, что специалист в данной области техники может выбрать модальность визуализации на основании множества известных в данной области техники критериев. Как описано в настоящем документе, способы настоящего изобретения могут охватывать один или несколько элементов данных визуализации. В способах, раскрытых в настоящем документе, один или несколько индивидуальных факторов риска могут быть выбраны из группы, состоящей из возраста, расы, семейной истории. Следует понимать, что специалист в данной области техники может выбрать дополнительные индивидуальные факторы риска на основании множества известных в данной области техники критериев. Как описано в настоящем документе, способы настоящего изобретения могут охватывать один или несколько индивидуальных факторов риска. Соответственно, биомаркеры могут включать данные визуализации, индивидуальные факторы риска и данные СТС. Как описано в настоящем документе, биомаркеры также могут включать, но без ограничения, биологические молекулы, содержащие нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, нуклеозиды, аминокислоты, сахара, жирные кислоты, стероиды, метаболиты, пептиды, полипептиды, белки, углеводы, липиды, гормоны, антитела, области интереса, которые служат в качестве суррогатов биологических макромолекул, и их комбинации (например, гликопротеины, рибонуклеопротеины, липопротеины), а также части или фрагменты биологической молекулы.
[00 62] СТС могут быть идентифицированы с помощью любого подходящего способа, в том числе, например, с помощью как морфологических признаков, так и иммунофлуоресцентных признаков. Как будет понятно специалистам в данной области техники, биомаркеры могут включать биологическую молекулу или фрагмент биологической молекулы, изменение и/или детектирование которых может коррелировать, по отдельности или в сочетании с другими измеримыми признаками, с раком предстательной железы и/или mCRPC. СТС, которые могут присутствовать как отдельные клетки или в кластерах СТС, часто представляют собой эпителиальные клетки, распространившиеся из солидных опухолей,
и в очень низких концентрациях присутствуют в циркуляции субъектов. Соответственно, детектирование СТС в образце крови можно назвать детектированием редких событий. СТС имеют относительное содержание в популяции кровяных клеток, составляющее менее чем 1:1000, например, относительное содержание, составляющее менее чем 1:5000, 1:10000, 1:30000, 1:50000, 1:100000, 1:300000, 1:500000 или 1:1000000. В некоторых вариантах осуществления СТС имеет относительное содержание в популяции клеток, составляющее от 1:50000 до 1:100000.
[0063] Образцы настоящего раскрытия могут быть получены с помощью любого средства, в том числе, например, с помощью биопсии твердой ткани или биопсии жидкости (смотри, например, Marrinucci D. et al. , 2012, Phys. Biol. 9 016003). Кратко говоря, в конкретных вариантах осуществления этот процесс может охватывать лизис и удаление красных кровяных клеток в образце крови объемом 7,5 мл, нанесение оставшихся ядросодержащих клеток на специальные микроскопические предметные стекла, каждое из которых вмещает эквивалент примерно 0,5 мл цельной крови. Образец крови может быть экстрагирован из любого источника, о котором известно, что он включает кровяные клетки или их компоненты, такого как венозный, артериальный, периферический, тканевый, спиномозговой и тому подобные. Образцы могут быть обработаны с помощью хорошо известных и обычных клинических способов (например, процедур для отбора и обработки цельной крови). В некоторых вариантах осуществления образец крови отбирают в антикоагулянтные пробирки для сбора крови (ВСТ), которые могут содержать ЭДТА или Streck Cell-Free DNA(tm). В других вариантах осуществления образец крови отбирают в пробирки CellSave(r) (Veridex). Образец крови можно затем хранить в течение вплоть до 12 часов, 24 часов, 36 часов, 48 часов или 60 часов до дальнейшей обработки.
[00 64] В некоторых вариантах осуществления способы настоящего раскрытия содержат начальный этап получения числа белых кровяных клеток (БКК) для образца крови. В определенных вариантах осуществления число БКК может быть получено с помощью
устройства HemoCue(r) WBC (Hemocue, Angelholm, Швеция). В некоторых вариантах осуществления число БКК используют для определения количества крови, требуемого для нанесения постоянного объема загрузки ядросодержащих клеток на предметное стекло и для обратного вычисления эквивалента СТС в объеме крови.
[00 65] В некоторых вариантах осуществления способы настоящего раскрытия содержат начальный этап лизирования эритроцитов в образце крови. В некоторых вариантах осуществления эритроциты лизируют, например, посредством добавления раствора хлорида аммония к образцу крови. В определенных вариантах осуществления образец крови подвергают центрифугированию после лизиса эритроцитов, и ядросодержащие клетки ресуспендируют, например, в растворе ФСБ.
[00 66] В некоторых вариантах осуществления ядросодержащие клетки из образца, такого как образец крови, наносят в виде монослоя на плоскую подложку. Плоская подложка может быть выполнена из любого материала, например любого флуоресцентно прозрачного материала, любого материала, подходящего для прикрепления клеток, любого материала, подходящего для легкого удаления клеточного дебриса, любого материала, имеющего толщину, составляющую <10 0 мкм. В некоторых вариантах осуществления материал представляет собой пленку. В некоторых вариантах осуществления материал представляет собой стеклянное предметное стекло. В определенных вариантах осуществления способ охватывает начальный этап помещения ядросодержащих клеток из образца крови в виде монослоя на стеклянное предметное стекло. Стеклянное предметное стекло может быть покрыто для обеспечения максимального удержания живых клеток (смотри, например, Marrinucci D. et al. , 2012, Phys. Biol. 9 016003) . В некоторых вариантах осуществления на стеклянное предметное стекло наносят приблизительно 0,5 миллиона, 1 миллион, 1,5 миллиона, 2 миллиона, 2,5 миллиона, 3 миллиона, 3,5 миллиона, 4 миллиона, 4,5 миллиона или 5 миллионов ядросодержащих клеток. В некоторых вариантах осуществления способы настоящего раскрытия содержат помещение приблизительно
3 миллионов клеток на стеклянное предметное стекло. В дополнительных вариантах осуществления способы настоящего раскрытия содержат помещение от приблизительно 2 миллионов до приблизительно 3 миллионов клеток на стеклянное предметное стекло. В некоторых вариантах осуществления стеклянное предметное стекло и иммобилизованные клеточные образцы доступны для дальнейшей обработки или экспериментов после завершения способов настоящего раскрытия.
[00 67] В некоторых вариантах осуществления способы
настоящего раскрытия содержат начальный этап идентификации
ядросодержащих клеток в необогащенном образце крови. В
некоторых вариантах осуществления ядросодержащие клетки
идентифицируют с помощью флуоресцентного красителя. В
определенных вариантах осуществления флуоресцентный краситель
содержит краситель, специфический для нуклеиновой кислоты. В
определенных вариантах осуществления флуоресцентным красителем
является диамидино-2-фенилиндол (DAPI). В некоторых вариантах
осуществления иммунофлуоресцентное окрашивание ядросодержащих
клеток содержит пан-цитокератин (СК), кластер дифференцировки
(CD) 45 и DAPI. В некоторых вариантах осуществления, описанных
далее в настоящем документе, СТС имеют иммунофлуоресцентное
окрашивание, отличающееся от окружающих ядросодержащих клеток.
В некоторых вариантах осуществления отличающееся
иммунофлуоресцентное окрашивание СТС содержит DAPI (+), СК (+)
и CD4 5 (-) . В некоторых вариантах осуществления идентификация
СТС дополнительно содержит сравнение интенсивности
флуоресцентного окрашивания пан-цитокератина с окружающими
ядросодержащими клетками. В некоторых вариантах осуществления
идентификация СТС охватывает флуоресцентную сканирующую
микроскопию для детектирования иммунофлуоресцентного
окрашивания ядросодержащих клеток в образце крови. Marrinucci D. et al., 2012, Phys. Biol. 9 016003).
[0068] В конкретных вариантах осуществления все ядросодержащие клетки закрепляют и иммунофлуоресцентно окрашивают с помощью моноклональных антител, нацеленных на цитокератин (СК), промежуточный филамент, обнаруживаемый
исключительно в эпителиальных клетках, панлейкоцитарное специфическое антитело, нацеленное на общий лейкоцитарный антиген CD45, и ядерный краситель, DAPI. Ядросодержащие кровяные клетки могут быть визуализированы в нескольких флуоресцентных каналах для получения цифровых изображений высокого качества и высокого разрешения, которые сохраняют мелкие цитологические детали контуров ядер и цитоплазматическое распределение. При том, что окружающие БКК могут быть идентифицированы с помощью панлейкоцитарного специфического антитела, нацеленного на CD45, СТС могут быть идентифицированы как DAPI ( + ), СК ( + ) и CD45 (-) . В способах, описанных в настоящем документе, СТС имеют иммунофлуоресцентное окрашивание, отличающееся от окружающих ядросодержащих клеток.
[0069] В других вариантах осуществления СТС включают традиционные СТС, также известные как высоко определенные СТС (HD-CTC). Традиционные СТС являются СК-положительными, CD45-отрицательными, содержат интактное DAPI-положительное ядро без идентифицируемых апоптотических изменений или нарушенного внешнего вида и морфологически отличаются от окружающих белых кровяных клеток (БКК). Интенсивности DAPI (+), СК (+) и CD45 (-) могут быть классифицированы как измеримые признаки во время подсчета HD-CTC, как описано ранее (фигура 1) . Nieva et al., Phys Biol 9:016004 (2012). Свободный от обогащения непосредственный анализ, используемый в способах, раскрытых в настоящем документе, приводит к высокой чувствительности и высокой специфичности, при этом добавляя цитоморфологию с высоким разрешением для обеспечения подробной морфологической характеризации популяции СТС, о которой известно, что она является гетерогенной.
[0070] При том, что СТС могут быть идентифицированы как содержащие DAPI (+), СК (+) и CD45 (-) клетки, способы настоящего изобретения могут быть воплощены на практике с любыми другими биомаркерами, которые специалист в данной области техники выберет для характеризации СТС и/или идентификации СТС и кластеров СТС. Специалист в данной области техники знает, как выбирать морфологический признак,
биологическую молекулу или фрагмент биологической молекулы, изменение и/или детектирование которых может коррелировать с СТС. Молекулярные биомаркеры включают, но без ограничения, биологические молекулы, содержащие нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, нуклеозиды, аминокислоты, сахара, жирные кислоты, стероиды, метаболиты, пептиды, полипептиды, белки, углеводы, липиды, гормоны, антитела, области интереса, которые служат в качестве суррогатов биологических макромолекул, и их комбинации
(например, гликопротеины, рибонуклеопротеины, липопротеины). Термин также охватывает части или фрагменты биологической молекулы, например пептидный фрагмент белка или полипептида.
[0071] Специалисту в данной области техники будет ясно, что для идентификации СТС можно использовать ряд способов, включая подходы на основе микроскопии, включая флуоресцентную сканирующую микроскопию (смотри, например, Marrinucci D. et al., 2012, Phys. Biol. 9 016003), масс-спектрометрические подходы, такие как MS/MS, LC-MS/MS, мониторинг множественных реакций (MRM) или SRM и мониторинг ионов-продуктов (PIM), а также включая способы на основе антител, такие как иммунофлуоресценция, иммуногистохимия, методы иммуноанализа, такие как вестерн-блоты, твердофазный иммуноферментный анализ
(ELISA), иммунопреципитация, радиоиммуноанализ, дот-блоттинг и FACS. Методы и протоколы иммуноанализа в целом известны специалистам в данной области техники (Price and Newman, Principles and Practice of Immunoassay, 2nd Edition, Grove's Dictionaries, 1997; и Gosling, Immunoassays: A Practical Approach, Oxford University Press, 2000) . Можно использовать множество методов иммуноанализа, включая конкурентные и неконкурентные методы иммуноанализа (Self et al. , Curr. Opin. Biotechnol., 7:60-65 (1996), смотри также John R. Crowther, The ELISA Guidebook, 1st ed., Humana Press 2000, ISBN 0896037282, и An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, by Chard T, ed., Elsevier Science 1995, ISBN 0444821198).
[0072] Специалисту в данной области техники будет также ясно, что присутствие или отсутствие биомаркеров можно детектировать с помощью любого класса маркер-специфических
связывающих реагентов, известных в данной области техники, включая, например, антитела, аптамеры, белки слияния, такие как белки слияния, включающие в себя белковый рецепторный или белковый лигандный компоненты, или биомаркер-специфические низкомолекулярные связывающие средства. В некоторых вариантах осуществления присутствие или отсутствие СК или CD4 5 определяют с помощью антитела.
[0073] Антитела настоящего раскрытия специфически связываются биомаркером. Антитело может быть получено с помощью любых подходящих способов, известных в данной области техники. Смотри, например, Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed., 1986) . Антитело может представлять собой любой иммуноглобулин или его производное, как природное, так и полностью или частично получаемое синтетически. Все его производные, которые сохраняют способность специфического связывания, также включены в данный термин. Антитело имеет связывающий домен, который гомологичен или в значительной степени гомологичен связывающему домену иммуноглобулина и может происходить из природных источников, или быть частично или полностью получаемым синтетически. Антитело может представлять собой моноклональное или поликлональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой одноцепочечное антитело. Средним специалистам в данной области техники будет ясно, что антитело может быть предоставлено в любой из множества форм, включая, например, гуманизированную, частично гуманизированную, химерную, химерную гуманизированную и так далее. Антитело может представлять собой фрагмент антитела, включая, но без ограничения, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, диатело dsFv и Fd. Антитело может быть получено с помощью любых средств. Например, антитело может быть получено ферментативно или химически посредством фрагментации интактного антитела, и/или оно может быть получено рекомбинантно из гена, кодирующего частичную последовательность антитела. Антитело может содержать одноцепочечный фрагмент антитела. В качестве
альтернативы или дополнительно, антитело может содержать несколько цепей, которые связаны вместе, например с помощью дисульфидных связей, и любые функциональные фрагменты, полученные из таких молекул, причем такие фрагменты сохраняют свойство специфического связывания от родительской молекулы антитела. Благодаря их меньшему размеру в качестве функциональных компонентов целой молекулы фрагменты антител могут предоставлять преимущества по сравнению с интактными антителами при использовании в некоторых иммунохимических методах и экспериментальных применениях.
[0074] Детектируемую метку можно использовать в способах, описанных в настоящем документе, для непосредственного или опосредованного детектирования биомаркеров при идентификации СТС в способах настоящего изобретения. Можно использовать широкий диапазон детектируемых меток, причем выбор метки зависит от требуемой чувствительности, легкости конъюгирования с антителом, требований в отношении стабильности и доступного инструментария и средств утилизации. Специалисты в данной области техники знакомы с выбором подходящей детектируемой метки на основании аналитического детектирования биомаркеров в способах настоящего изобретения. Подходящие детектируемые метки включают, но без ограничения, флуоресцентные красители
(например, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), Oregon Green(tm), родамин, техасский красный, тетрародомина изотиоцианат
(TRITC), СуЗ, Су5, Alexa Fluor(r) 647, Alexa Fluor(r) 555, Alexa Fluor(r) 488), флуоресцентные маркеры (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP), фикоэритрин и так далее), ферменты
(например, люциферазу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и так далее), наночастицы, биотин, дигоксигенин, металлы и тому подобное.
[0075] Для анализа на основе масс-спектрометрии дифференциальное мечение с помощью изотопных реагентов, например изотопных аффинных меток (ICAT) или более современного варианта, который использует реагенты для изобарного мечения, iTRAQ (Applied Biosystems, Foster City, Calif.), с последующими многомерной жидкостной хроматографией (LC) и тандемным масс
спектрометрическим (MS/MS) анализом может предоставить дополнительную методику осуществления способов настоящего раскрытия.
[0076] Хемилюминесцентный анализ с использованием хемилюминесцентного антитела можно использовать для чувствительного, нерадиоактивного детектирования белков. Также подходящим может быть антитело, меченое флуорохромом. Примеры флуорохромов включают, без ограничения, DAPI, флуоресцеин, Hoechst 33258, R-фикоцианин, В-фикоэритрин, R-фикоэритрин, родамин, техасский красный и лиссамин. Непрямые метки включают различные ферменты, хорошо известные в данной области техники, такие как пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза (АР) , бета-галактозидаза, уреаза и тому подобные. Системы детектирования, использующие подходящие субстраты для пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы, бета-галактозидазы хорошо известны в данной области техники.
[0077] Сигнал от прямой или непрямой метки можно анализировать, например, с использованием микроскопа, такого как флуоресцентный микроскоп или флуоресцентный сканирующий микроскоп. В качестве альтернативы, можно использовать спектрофотометр для детектирования цвета от хромогенного субстрата; радиационный счетчик для детектирования излучения, такой как гамма-счетчик для детектирования 1251; или флуориметр для детектирования флуоресценции в присутствии света определенной длины волны. Если необходимо, методы анализа, используемые для осуществления способов настоящего раскрытия на практике могут быть автоматизированными или выполняться с помощью робота, и сигнал от множества образцов можно детектировать одновременно.
[0078] В некоторых вариантах осуществления биомаркеры представляют собой иммунофлуоресцентные маркеры. В некоторых вариантах осуществления иммунофлуоресцентные маркеры содержат маркер, специфический для эпителиальных клеток. В некоторых вариантах осуществления иммунофлуоресцентные маркеры содержат маркер, специфический для белых кровяных клеток (БКК). В некоторых вариантах осуществления один или несколько из
иммунофлуоресцентных маркеров содержат CD4 5 и СК.
[0079] В некоторых вариантах осуществления присутствие или отсутствие иммунофлуоресцентных маркеров в ядросодержащих клетках, таких как СТС или БКК, приводит к отличающимся вариантам иммунофлуоресцентного окрашивания. Варианты иммунофлуоресцентного окрашивания для СТС и БКК можно различать исходя из того, какие из эпителиальных или БКК маркеров детектируют в соответствующих клетках. В некоторых вариантах осуществления определение присутствия или отсутствия одного или нескольких иммунофлуоресцентных маркеров содержит сравнение отличающегося иммунофлуоресцентного окрашивания СТС с отличающимся иммунофлуоресцентным окрашиванием БКК с использованием, например, иммунофлуоресцентного окрашивания CD4 5, которое отчетливо идентифицирует БКК. Существуют другие детектируемые маркеры или комбинации детектируемых маркеров, которые связываются с различными субпопуляциями БКК. Их можно использовать в различных комбинациях, в том числе в комбинации с иммунофлуоресцентным окрашиванием CD4 5 или в качестве его альтернативы.
[008 0] В некоторых вариантах осуществления СТС имеют отличающиеся морфологические характеристики по сравнению с окружающими ядросодержащими клетками. В некоторых вариантах осуществления морфологические характеристики содержат размер ядер, форму ядер, размер клеток, форму клеток и/или ядерно-цитоплазматическое отношение. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно содержит анализ ядросодержащих клеток на детали ядер, контуры ядер, присутствие или отсутствие ядрышек, качество цитоплазмы, количество цитоплазмы, интенсивность вариантов иммунофлуоресцентного окрашивания. Среднему специалисту в данной области техники понятно, что морфологические характеристики настоящего раскрытия могут включать любой признак, свойство, характеристику или аспект клетки, которые могут быть определены и соотнесены с детектированием СТС.
[0081] СТС могут быть охарактеризованы с помощью любого микроскопического способа, известного в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления способ осуществляют посредством флуоресцентной сканирующей микроскопии. В определенных вариантах осуществления микроскопический способ обеспечивает изображения СТС и окружающих их БКК высокого разрешения (смотри, например, Marrinucci D. et al. , 2012, Phys. Biol. 9 016003)). В некоторых вариантах осуществления предметное стекло, покрытое монослоем ядросодержащих клеток из образца, такого как необогащенный образец крови, сканируют с помощью флуоресцентного сканирующего микроскопа, и записывают интенсивности флуоресценции от иммунофлуоресцентных маркеров и ядерных красителей для обеспечения возможности определения присутствия или отсутствия каждого иммунофлуоресцентного маркера и определения морфологии ядросодержащих клеток. В некоторых вариантах осуществления получение и анализ микроскопических данных проводят в автоматическом режиме.
[0082] В некоторых вариантах осуществления идентификация СТС с помощью непосредственного анализа включает в себя детектирование одного или нескольких биомаркеров, например, СК и CD45. Биомаркер считают "присутствующим" в клетке, если его детектируют выше фонового шума соответствующего используемого способа детектирования (например, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз или в 10 раз выше, чем фон; например, 2а или За над фоном) . В некоторых вариантах осуществления биомаркер считают "отсутствующим", если его не детектируют выше фонового шума используемого способа детектирования (например, в <1,5 раза или в <2,0 раза выше, чем фоновый сигнал; например, <1,5а или <2,0а над фоном).
[0083] В некоторых вариантах осуществления присутствие или отсутствие иммунофлуоресцентных маркеров в ядросодержащих клетках определяют посредством выбора длин выдержки во время процесса сканирования флуоресценции, таких что все иммунофлуоресцентные маркеры достигают заранее установленного уровня флуоресценции на БКК в поле зрения. В данных условиях СТС-специфические иммунофлуоресцентные маркеры, даже если они отсутствуют на БКК, видны в БКК в виде фоновых сигналов с
фиксированной высотой. Кроме того, БКК-специфические иммунофлуоресцентные маркеры, которые отсутствуют на СТС, видны в СТС в виде фоновых сигналов с фиксированной высотой. Клетку считают положительной по иммунофлуоресцентному маркеру (то есть маркер считают присутствующим), если ее флуоресцентный сигнал для соответствующего маркера значительно выше, чем зафиксированный фоновый сигнал (например, в 2 раза, в 3 раза, в
5 раз или в 10 раз выше, чем фон; например, 2а или За над фоном). Например, ядросодержащую клетку считают CD4 5-положительной (CD4 5+), если ее флуоресцентный сигнал для CD4 5 значительно выше, чем фоновый сигнал. Клетку считают отрицательной по иммунофлуоресцентному маркеру (то есть маркер считают отсутствующим), если флуоресцентный сигнал клетки для соответствующего маркера не значительно выше фонового сигнала (например, в <1,5 раза или в <2,0 раза выше, чем фоновый сигнал; например, <1,5а или <2,0а над фоном).
[0084] Как правило, каждое микроскопическое поле содержит как СТС, так и БКК. В определенных вариантах осуществления в микроскопическом поле видно по меньшей мере 1, 5, 10, 20, 50, или 100 СТС. В определенных вариантах осуществления в микроскопическом поле видно по меньшей мере в 10, 25, 50, 100, 250, 500 или 1000 раз больше БКК, чем СТС. В определенных вариантах осуществления микроскопическое поле содержит одну или несколько СТС или кластеров СТС, окруженных по меньшей мере 10, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000 или более БКК.
[0085] В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящем документе, идентификация СТС с помощью непосредственного анализа содержит подсчет СТС, которые присутствуют в образце крови. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, охватывают детектирование по меньшей мере 1,0 СТС на мл крови, 1,5 СТС на мл крови, 2,0 СТС на мл крови, 2,5 СТС на мл крови, 3,0 СТС на мл крови, 3,5 СТС на мл крови, 4,0 СТС на мл крови, 4,5 СТС на мл крови, 5,0 СТС на мл крови, 5,5 СТС на мл крови, 6,0 СТС на мл крови, 6,5 СТС на мл крови, 7,0 СТС на мл крови,
7,5 СТС на мл крови, 8,0 СТС на мл крови, 8,5 СТС на мл крови, 9,0 СТС на мл крови, 9,5 СТС на мл крови, 10 СТС на мл крови или более.
[0086] В некоторых вариантах осуществления способов,
описанных в настоящем документе, идентификация СТС содержит
детектирование отличающихся подтипов СТС, включая
нетрадиционные СТС. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, охватывают детектирование по меньшей мере 0,1 кластера СТС на мл крови, 0,2 кластера СТС на мл крови, 0,3 кластера СТС на мл крови, 0,4 кластера СТС на мл крови, 0,5 кластера СТС на мл крови, 0,6 кластера СТС на мл крови, 0,7 кластера СТС на мл крови, 0,8 кластера СТС на мл крови, 0,9 кластера СТС на мл крови, 1 кластера СТС на мл крови, 2 кластеров СТС на мл крови, 3 кластеров СТС на мл крови, 4 кластеров СТС на мл крови, 5 кластеров СТС на мл крови, б кластеров СТС на мл крови, 7 кластеров СТС на мл крови, 8 кластеров СТС на мл крови, 9 кластеров СТС на мл крови, 10 кластеров на мл или более. В конкретном варианте осуществления способы, описанные в настоящем документе, охватывают детектирование по меньшей мере 1 кластера СТС на мл крови.
[0087] В некоторых вариантах осуществления способы предсказание резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии содержит геномный анализ СТС, например с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). В некоторых вариантах осуществления способы предсказание резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии содержит детектирование перестройки гена, связанного с белками, специфическими для трансформации эритробластов (ETS), {ERG). В некоторых вариантах осуществления, способы предсказания резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии содержат детектирование потери гена гомолога фосфатазы и тензина (PTEN) .
[008 8] Стандартные молекулярно-биологические методы, известные в данной области техники и не описанные конкретно, обычно выполняют в соответствии с Sambrook et al. , Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), и с Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md.
(1989), и с Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988), и с Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, и с Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998). Полимеразную цепную реакцию (ПНР) можно в общем проводить в соответствии с PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) . Любой способ, пригодный для определения профиля числа копий ДНК конкретного образца, можно использовать для молекулярного профилирования в соответствии с настоящим изобретением при условии достаточного разрешения для идентификации биомаркеров настоящего изобретения. Специалист в данной области техники осведомлен и способен к использованию ряда различных платформ для оценки изменений числа копий во всем геноме при достаточном разрешении для определения числа копий одного или нескольких биомаркеров настоящего изобретения.
[0089] Анализы с помощью гибридизации in situ хорошо известны и в целом описаны в Angerer et al. , Methods Enzymol. 152:649-660 (1987). В анализе с помощью гибридизации in situ клетки, например от биопсии, фиксируют на твердой подложке, как правило стеклянном предметном стекле. Если нужно исследовать ДНК, клетки денатурируют с помощью тепла или щелочи. Затем клетки приводят в контакт с гибридизационным раствором при умеренной температуре для обеспечения отжига специфических меченых зондов. Зонды, предпочтительно, метят с помощью радиоизотопов или флуоресцентных репортеров. FISH
(флуоресцентная гибридизация in situ) использует флуоресцентные зонды, которые связываются только с теми частями последовательности, с которыми они демонстрируют высокую степень сходства последовательностей.
[0090] FISH представляет собой цитогенетический метод, используемый для детектирования и локализации специфических
полинуклеотидных последовательностей в клетках. Например, FISH
можно использовать для детектирования последовательностей ДНК
на хромосомах. FISH также можно использовать для детектирования
и локализации специфических РНК, например мРНК, в образцах
ткани. В FISH используют флуоресцентные зонды, которые
связываются со специфическими нуклеотидными
последовательностями, с которыми они демонстрируют высокую
степень сходства последовательностей. Для выяснения того,
связаны ли флуоресцентные зонды и где, можно использовать
флуоресцентную микроскопию. В добавление к детектированию
специфических нуклеотидных последовательностей, например
транслокаций, слияния, разрывов, дупликаций и других
хромосомных аномалий, FISH может помочь в определении
пространственно-временных особенностей числа копий
определенного гена и/или экспрессии генов в клетках и тканях.
[0091] В некоторых вариантах осуществления раскрытые способы предсказания резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии или химиотерапии в опухоли пациента с раком предстательной железы охватывают использование предсказательной модели. В других вариантах осуществления раскрытые способы предсказания резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии или химиотерапии в опухоли пациента с раком предстательной железы охватывают сравнение измеримого признака с эталонным признаком. Как может быть ясно специалистам в данной области техники, такое сравнение может представлять собой непосредственное сравнение с эталонным признаком или опосредованное сравнение, при котором эталонный признак включают в предсказательную модель. В других вариантах осуществления анализ измеримого признака для проспективной идентификации резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии или химиотерапии в опухоли пациента с раком предстательной железы охватывает одно или несколько из модели линейного дискриминантного анализа, алгоритма автоматической классификации опорных векторов, модели рекурсивного элиминирования признаков, прогнозного анализа
микроматричной модели, логистической регрессионной модели, алгоритма CART, алгоритма гибкого дерева, алгоритма LART, алгоритма случайного леса, алгоритма MART, алгоритма машинного обучения, метода регрессии со штрафами или их комбинации. В конкретных вариантах осуществления анализ содержит логистическую регрессию. В дополнительных вариантах осуществления способы предсказания резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии или химиотерапии в опухоли пациента с раком предстательной железы выражают в виде показателя по шкале риска.
[0092] Процесс аналитической классификации может использовать любой из множества статистических аналитических способов для работы с количественными данными и обеспечения классификации образца. Примеры подходящих способов включают линейный дискриминантный анализ, рекурсивное элиминирование признаков, прогнозный анализ микроматрицы, логистическую регрессию, алгоритм CART, алгоритм гибкого дерева, алгоритм LART, алгоритм случайного леса, алгоритм MART, алгоритмы машинного обучения и другие способы, известные специалистам в данной области техники.
[0093] Классификация может быть осуществлена в соответствии со способами прогнозного моделирования, которые устанавливают порог для определения вероятности того, что образец принадлежит к данному классу. Данная вероятность, предпочтительно, составляет по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 7 0%, или по меньшей мере 8 0%, или по меньшей мере 90% или выше. Классификации также могут быть осуществлены посредством определения того, приводит ли сравнение между полученным набором данных и опорным набором данных к статистически значимой разнице. Если это так, тогда образец, из которого был получен данный набор данных, классифицируют как не принадлежащий к классу опорного набора данных. И наоборот, если такое сравнение не отличается статистически значимо от опорного набора данных, то образец, из которого был получен данный набор данных, классифицируют как принадлежащий к классу опорного набора данных.
[0094] Предсказательную способность модели можно оценить в
соответствии с ее способностью предоставлять метрику качества,
например AUROC (площадь под ROC-кривой) или точность,
конкретного значения или диапазона значений. Меры площади под
кривой полезны для сравнения точности классификатора по полному
диапазону данных. Классификаторы с большей AUC имеют больше
возможностей для корректной классификации неизвестных между
двумя группами интереса. ROC-анализ можно использовать для
выбора оптимального порога при множестве клинических условий с
уравновешиванием неотъемлемых компромиссов, которые существуют
между специфичностью и чувствительностью. В некоторых вариантах
осуществления порогом желаемого качества является
предсказательная модель, которая будет классифицировать образец с точностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 0,7, по меньшей мере приблизительно 0,75, по меньшей мере приблизительно 0,8, по меньшей мере приблизительно 0,85, по меньшей мере приблизительно 0,9, по меньшей мере приблизительно 0,95 или выше. В качестве альтернативной меры, порог желаемого качества может относиться к предсказательной модели, которая будет классифицировать образец с AUC, составляющей по меньшей мере приблизительно 0,7, по меньшей мере приблизительно 0,75, по меньшей мере приблизительно 0,8, по меньшей мере приблизительно 0,85, по меньшей мере приблизительно 0,9 или больше.
[0095] Как известно в данной области техники, относительные чувствительность и специфичность предсказательной модели могут быть скорректированы в пользу или метрики специфичности, или метрики чувствительности, причем эти две метрики находятся в обратной зависимости. Пределы в модели, описанной выше, могут быть скорректированы для обеспечения выбранного уровня чувствительности или специфичности, в зависимости от конкретных требований выполняемого теста. Одна или обе из чувствительности и специфичности могут составлять по меньшей мере приблизительно 0,7, по меньшей мере приблизительно 0,75, по меньшей мере приблизительно 0,8, по меньшей мере приблизительно 0,85, по меньшей мере приблизительно 0,9 или
больше.
[0096] Исходные данные могут быть первоначально проанализированы посредством измерения значений для каждого измеримого признака или биомаркера, обычно в трех повторностях или несколько раз в трех повторностях. Данными можно манипулировать, например исходные данные можно преобразовать с использованием стандартных кривых, и использовать среднее по трем измерениям для вычисления среднего и стандартного отклонения для каждого пациента. Эти значения могут быть преобразованы перед использованием в моделях, например логарифмически преобразованы, преобразованы по Боксу и Коксу (Box and Сох, Royal Stat. Soc, Series В, 2 6:211-246(1964). Затем данные вводят в предсказательную модель, которая будет классифицировать образец в соответствии с состоянием. Полученная информация может быть передана пациенту или учреждению здравоохранения.
[0097] В некоторых вариантах осуществления способ, раскрытый в настоящем документе для предсказания резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии или химиотерапии в опухоли пациента с раком предстательной железы, имеет специфичность, составляющую > 60%, > 7 0%, > 8 0%, > 90% или больше. В дополнительных вариантах осуществления способы предсказания резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии или химиотерапии в опухоли пациента с раком предстательной железы имеют специфичность > 90% при пороге классификации, составляющем 7,5 СТС на мл крови.
[0098] Как будет понятно специалистам в данной области техники, процесс аналитической классификации может использовать любой из множества статистических аналитических способов для обработки количественных данных и предоставления классификации образца. Примеры полезных способов включают, без ограничения, линейный дискриминантный анализ, рекурсивное элиминирование признаков, прогнозный анализ микроматрицы, логистическую регрессию, алгоритм CART, алгоритм гибкого дерева, алгоритм LART, алгоритм случайного леса, алгоритм MART, алгоритмы
машинного обучения.
[0099] Из приведенного выше описания очевидно, что в изобретении, описанном в настоящем документе, могут быть сделаны варианты и модификации для его адаптации для различных применений и условий. Такие варианты осуществления также находятся в пределах объема нижеследующей формулы изобретения.
[00100] Перечисление списка элементов в любом определении переменной в настоящем документе включает определения этой переменной как любого одного элемента или комбинации (или подкомбинации) перечисленных элементов. Описание варианта осуществления в настоящем документе включает в себя этот вариант осуществления в форме любого одного варианта осуществления или в комбинации с любыми другими вариантами осуществления или их частями.
[00101] Все патенты и публикации, упомянутые в данном описании изобретения, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждый независимый патент и публикация были специфически и по отдельности указаны как включенные посредством ссылки.
[00102] Следующие примеры приведены в качестве иллюстрации, но не ограничения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Характеризации СТС и субпопуляций СТС при прогрессирующем mCRPC
[00103] 48 образцов от 21 уникального пациента с прогрессирующим mCRPC подвергали лечению с помощью направленных на андрогеновый рецептор (AR tx) терапий, 9 (43%) с помощью абиратерона и преднизона (АА+Р) и 12 (57%) с помощью энзалутамида (Е) . Образцы собирали и транспортировали в Epic Sciences, где окрашивали клетки и идентифицировали СТС с помощью флуоресцентных сканеров и алгоритмического анализа. Были идентифицированы СТС, определенные как классические (СК+ CD4 5- с интактными ядрами DAPI и отличающиеся), апоптотические (СК+, CD4 5-, неинтактные ядра) и СК- (СК-, CD4 5-, интактные и отличающиеся). СТС регистрировали на мл крови и исследовали в отношении AR, PTEN и ERG. Данные СТС анализировали в контексте
PSA, Veridex СТС (зарегистрированных на 7,5 мл крови) и клинической истории.
[00104] В соответствии с Epic все 21 пациент имели детектируемые СТС (медиана 23 клетки на мл, диапазон от 2 до 249), тогда как в соответствии с Veridex 14 (67%) пациентов имели > 5 СТС на 7,5 мл (медиана 5 клеток на 7,5 мл, диапазон от 0 до > 200).
[00105] Таблица 2 Исходная экспрессия AR (Epic СТС)
Направленная на AR Тх; N=21
Исходная экспрессия AR (Epic СТС)
Низкая экспрессия AR; N=14
Высокая экспрессия AR; N=7
АА+Р; N=9
Е; N=12
[00106] 0/7 (0%) с высоким AR отвечали на абиратерон плюс преднизон (АА+Р) или энзалутамид (Е) , 8/14 (53%) с низким AR имели снижение PSA и радиографически стабильное заболевание (медиана наблюдения за 12 недель). У всех пациентов в различной степени наблюдали вариации экспрессии белка AR и гетерогенность локализации. 6/21 (29%) пациентов демонстрировали отношение СК-СТС/СТС > 50% (медиана 9 клеток на мл, диапазон 5-38). Перестройка ERG & потеря PTEN коррелировали.
[00107] Анализ СТС с помощью Epic обеспечивает более высокие скорости детектирования, при этом делая возможным анализ отдельных клеток в отношении предсказательных биомаркеров резистентности по отношению к AR направленный терапии. Следует отметить значительную гетерогенность детектирования AR, ERG и PTEN отдельных СТС. Продолжаются исследования для дальнейшего изучения взаимосвязи с результатами лечения.
Пример 2. Характеризация СТС и субпопуляций СТС при прогрессирующем mCRPC
[00108] 32 образца от 3 0 уникальных пациентов с прогрессирующим mCRPC подвергали лечению с помощью направленных на андрогеновый рецептор (AR tx) терапий; 14/30 (46,7%) с
помощью абиратерона и преднизона (АА+Р) и 16/30 (53,3%) с помощью энзалутамида (Е). Образцы собирали и транспортировали в Epic Sciences, где клетки окрашивали и СТС идентифицировали с помощью флуоресцентных сканеров и алгоритмического анализа
(фигура 3) . Были идентифицированы СТС, определенные как традиционные (CK+CD4 5- с интактными ядрами DAPI и морфологически отличающиеся) , апоптотические (CK+CD4 5-, неинтактные ядра) и СК- (CK-CD4 5-, интактные и морфологически отличающиеся) (фигура 4) . СТС, зарегистрированные на мл крови, исследовали на экспрессию AR с помощью иммунофлуоресценции (IF) и на потерю PTEN и перестройки ERG с помощью FISH. Данные СТС анализировали в контексте PSA, количества СТС по CellSearch(r)
(зарегистрированных на 7,5 мл крови) и клинической истории.
[00109] При использовании платформы для СТС от Epic Sciences 2 6/30 (86,7%) пациентов имели > 5 традиционных СТС на 7,5 мл крови (медиана 56 клеток на мл, диапазон от 8 до > 200), тогда как по CellSearch(r) 15/30 (50,0%) пациентов имели > 5 СТС на 7,5 мл (медиана 62 клеток на 7,5 мл, диапазон от б до > 200)
(фигура 3) . Как показано в таблице 3, средняя экспрессия AR > 3,82 или > 5 СК- СТС на мл предсказывали de novo резистентность по сравнению с приобретенной резистентностью (чувствительность= 63%, специфичность=83%, р=0,0235). Никто из пациентов с положительным ответом не имел ни AR> 3,82, ни > 5 СК- СТС на мл. Перестройка ERG и потеря PTEN в de novo резистентной популяции также были повышенными. Ни CellSearch(r) СТС, ни PSA не могли предсказать de novo резистентность.
[00110] Таблица 3 Модель для предсказания de novo резистентности
Модель для предсказания de novo резистентности: средняя экспрессия AR> 3,82 или СК- СТС> 38 на 7,5 мл
Чувствительность
63%
Специфичность
86%
р-значение
0,0106
[00111] Анализ СТС с помощью Epic обеспечивает более высокие скорости детектирования, при этом делая возможным
анализ отдельных клеток в отношении предсказательных биомаркеров чувствительности к направленным на AR терапиям. Следует отметить значительную гетерогенность детектирования AR, ERG и PTEN отдельных СТС. Высокая средняя экспрессия AR во всех субпопуляциях СТС и высокая частота СК- СТС связаны с de novo резистентностью.
Пример 3. Предсказательные биомаркеры чувствительности к сигнализации андрогенового рецептора (ARS) и химиотерапии на основе таксана в циркулирующих опухолевых клетках (СТС) пациентов (pts) с метастатическим кастрационно-резистентным раком предстательной железы (mCRPC)
[00112] 91 образец крови пациентов получали от 79 пациентов для анализа СТС с помощью платформы Epic Sciences до лечения (27 перед А, 28 перед Е, 28 перед D, 8 перед С). Анализ Epic идентифицировал традиционные СТС (СК+, CD4 5-, интактные ядра, морфологически отличающиеся), СК- СТС (СК-, CD45, интактные ядра, морфологически отличающиеся), маленькие СТС (СК+, CD45-, интактные ядра, маленький размер клеток) и кластеры СТС. Если осуществляли окрашивание для экспрессии AR N, AR С, то СТС морфологию анализировали с помощью цифровых алгоритмов патологий. Был разработан классификатор для связи клинических фенотипов с результатом лечения с помощью конкретного средства.
[00113] Сигнатуры биомаркеров А и Е включали: экспрессию AR N/C и присутствие СК+, AR+, nucleoli+ СТС. Сигнатуры биомаркеров D и С включали: присутствие СК+, маленьких, AR-, nucleoli+ СТС. Многовариантные алгоритмы для А и Е и для D и С были статистически связаны с de novo резистентностью. Линия терапии не являлась одномерным предиктором ответа.
[00114] Таблица 4
Исходные сигнатуры СТС
Исходные сигнатуры СТС
Биомаркер
% пациентов с максимальным снижением PSA > 5 0%
Медиана в неделях на исследование (нижняя-верхняя граница)
значение
А и Е (п=55)
+ п=22
9 (5-51)
0,0001
- п=33
48%
29 (5-67)
С и D (п=3б)
+ п=12
17%
10 (3-22)
0,01
- п=2 4
38%
22 (3-69)
[00115] Характеризация СТС идентифицировала
предсказательные биомаркеры чувствительности к ARS Тх и таксановой химиотерапии у пациентов с mCRPC. Предлагаемая сигнатура А и Е отличается от С и D, обеспечивая возможность для лучшего направления выбора лечения и улучшения результатов лечения пациентов с использованием неинвазивной биопсии крови в реальном времени. Планируются проспективные исследования для проверки результатов.
[00116] Перечисление списка элементов в любом определении переменной в настоящем документе включает определения этой переменной как любого одного элемента или комбинации (или подкомбинации) перечисленных элементов. Описание варианта осуществления в настоящем документе включает в себя этот вариант осуществления в форме любого одного варианта осуществления или в комбинации с любыми другими вариантами осуществления или их частями.
[00117] Все патенты и публикации, упомянутые в данном описании изобретения, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждый независимый патент и публикация были специфически и по отдельности указаны как включенные посредством ссылки.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ предсказания резистентности по отношению к направленной на андрогеновый рецептор (AR) терапии у пациента с раком предстательной железы, содержащий
(a) осуществление непосредственного анализа, содержащего
иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую
характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови,
полученном от пациента, для идентификации циркулирующих
опухолевых клеток (СТС) и
(b) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к направленной на AR терапии у пациента с раком предстательной железы.
2. Способ по п. 1, в котором иммунофлуоресцентное окрашивание ядросодержащих клеток содержит пан-цитокератин (СК) , кластер дифференцировки (CD) 45, диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и AR.
3. Способ по п. 1, в котором сигнатура биомаркеров содержит СК+, AR+, nucleoli+ СТС в субпопуляции упомянутых СТС.
4. Способ по п. 1, в котором сигнатура биомаркеров дополнительно содержит присутствие положительных по N-концу AR СТС.
5. Способ по п. 4, в котором сигнатура биомаркеров дополнительно содержит наличие потери С-конца AR.
6. Способ по п. 1, в котором сигнатура биомаркеров содержит увеличение гетерогенности упомянутых СТС по сравнению с эталонной популяцией.
7. Способ предсказания резистентности по отношению к химиотерапии у пациента с раком предстательной железы, содержащий
(а) осуществление непосредственного анализа, содержащего
иммунофлуоресцентное окрашивание и морфологическую
характеризацию ядросодержащих клеток в образце крови, полученном от пациента, для идентификации циркулирующих опухолевых клеток (СТС) и
(b) последующее определение на основании упомянутого непосредственного анализа присутствия сигнатуры биомаркеров, которая позволяет предсказывать резистентность по отношению к химиотерапии у пациента с раком предстательной железы.
8. Способ по п. 7, в котором сигнатура биомаркеров содержит СК+, AR-, nucleoli+, маленький размер в субпопуляции упомянутых СТС.
9. Способ по п. 7, в котором присутствие упомянутой сигнатуры биомаркеров дополнительно указывает на резистентность по отношению к основанной на таксане химиотерапии.
10. Способ по п. 1 или 7, в котором иммунофлуоресцентное окрашивание ядросодержащих клеток содержит пан-цитокератин (СК) , кластер дифференцировки (CD) 45, диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и AR.
11. Способ по п. 10, в котором иммунофлуоресцентное окрашивание AR содержит ядерное окрашивание N-конца или С-конца AR.
12. Способ по п. 1 или 7, в котором упомянутое предсказание дает информацию для последующего принятия решения о лечении.
13. Способ по п. 1 или 7, в котором упомянутые СТС содержат традиционные СТС, кластеры СТС, СК- СТС и маленькие СТС.
14. Способ по п. 1 или 7, содержащий начальный этап нанесения ядросодержащих клеток в виде монослоя на предметное стекло.
15. Способ по п. 1 или 7, в котором рак предстательной железы представляет собой метастатический кастрационно-резистентный рак предстательной железы (mCRPC).
16. Способ по п. 1 или 7, в котором идентификация СТС содержит флуоресцентную сканирующую микроскопию.
17. Способ по п. 16, в котором микроскопия обеспечивает поле зрения, содержащее как СТС, так и по меньшей мере 200 окружающих белых кровяных клеток (БКК).
18. Способ по п. 1 или 7, в котором непосредственный анализ содержит оценку по меньшей мере 4 миллионов
8.
ядросодержащих клеток.
19. Способ по п. 1 или 7, в котором СТС содержат
отличающееся от окружающих ядросодержащих клеток
иммунофлуоресцентное окрашивание.
20. Способ по п. 1 или 7, в котором СТС имеют отличающиеся морфологические характеристики по сравнению с окружающими ядросодержащими клетками.
21. Способ по п. 20, в котором морфологические характеристики содержат одну или несколько из группы, состоящей из размера ядер, формы ядер, наличия отверстий в ядре, размера клеток, формы клеток и ядерно-цитоплазматического отношения, деталей ядер, контуров ядер, присутствия или отсутствия ядрышек, качества цитоплазмы и количества цитоплазмы.
22. Способ по п. 1 или 7, в котором идентификация СТС дополнительно содержит сравнение интенсивности флуоресцентного окрашивания пан-цитокератина с окружающими ядросодержащими клетками.
23. Способ по п. 1 или 7, дополнительно содержащий молекулярную характеризацию СТС.
24. Способ по п. 23, в котором упомянутая молекулярная характеризация содержит флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) .
25. Способ по п. 24, в котором упомянутый анализ FISH детектирует перестройку гена, связанного с белками, специфическими для трансформации эритробластов (ETS), {ERG).
26. Способ по п. 24, в котором упомянутый анализ FISH детектирует потерю гена гомолога фосфатазы и тензина {PTEN)
27. Способ по п. 1 или 7, дополнительно содержащий начальный этап получения числа белых кровяных клеток (БКК) для образца крови.
28. Способ по п. 1 или 7, дополнительно содержащий начальный этап лизирования эритроцитов в образце крови.
29. Способ по п. 1 или 7, дополнительно содержащий начальный этап нанесения ядросодержащих клеток из образца крови в виде монослоя на стеклянное предметное стекло.
30. Способ по п. 1 или 7, дополнительно содержащий
помещение от приблизительно 2 миллионов до приблизительно 3 миллионов клеток на стеклянное предметное стекло.
31. Способ по п. 1 или 7, в котором непосредственный анализ содержит подсчет СТС в образце крови.
32. Способ по п. 1 или 7, в котором биомаркеры анализируют с использованием предсказательной модели.
33. Способ по п. 1 или 7, в котором модель представляет собой многовариантную модель.
По доверенности
Варианты изменений PSA после направленных на AR-сигнализацию терапий
12 недель
500-
75-
# ., <#
Регистрация координат СТС
Удаление покровных стекол
Выполнение анализа FISH
Оценка БКК Повторная локализация и оценка СТС
Характеристика Кол-во (%) или медиана (диапазон)
Характеристика Кол-во (%) или медиана (диапазон)
Кол-во пациентов
Метасташчесюезабодевание
возоаст, лет
87.5 (47 - 85)
Кость
29 (97%)
ервичное лечение
Лимфатический узел
22 (73%)
ПООСТЭТЭКТОМИЯ 1 15 (50%)
Печень
5(17%)
Облучение в (27%)
Легкое
3(10%)
Нет I 7 (23%)
Лоугие мягкие ткани
3(10%)
Теоапии
Г абораторн
ые измерения
Гормональные терапии
PSA. нг/мл
74.5 (1.9-9222)
1-2 линии
5(17%)
зЬ. (г/лл)
11.9 (7.4-16)
3 линии
12(40%)
. <. (ел/л)
138 (54-582)
> 4 линий
13(43%)
)Н. (ел/л)
243.5 (163-976)
-е подвеогались химиотеоапии
20 (67%)
ALB. (г/лл)
4.3 (3.6-5)
Подвергались химиотерапии
10(33%)
СТС (клеток на 7,5 мл)
6 (0-> 200)
ФИГ. 2В
EPIC СТС на мл, экстраполированные до СТС на 7,5 мл, по сравнению с CellSearch СТС на 7,5 мл
имеющие de novo Образцы пациентов Приобретенная резистентность
резистентность ^СТСна 7> 5 мл 153 СК-/ЕМТ СТС на 7,5 мл -•- CellSearcP
Пациенты с положительным ответом
ФИГ. 3
Кластеры
традици-
онных СТС
(СК-ЮР45-)
Традиционные СТС (CK+CD45-)
Апоптоти-ческие СТС (CK+CD45-, неинтактные ядра)
Маленькие СТС (CK+CD45-, маленькие ядра)
5' делеция ERG, наблюдаемая в СК-СТС
Вставка ERG, наблюдаемая в СК-СТС
Вставка ERG, наблюдаемая в маленьких СТС
л. о л.
° СТС
• Кластеры СТС
* СК-СТС
88 Апоптотические
D Маленькие
5 00
1 2 3
9 10 11 12 13
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 28 27 28 29
31 32
имеющие de novo резистентность
Образцы крови
Приобретенная резистентность
Пациенты с положительным ответом
ФИГ. 5
Категория
№ флеботомии
Дата забора
CellSearch(r)
PSA
Всех клеток^ на мл
Средняя экспрессия AR
Статус PTEN
Статус ERG
% в ядре
% поровну в ядре и в цитоплазме
% в цитоплазме
% Отр.
Имеющий de поуо_резистентность
9/19/2012
200
1235.07
16.08
WT*
_JH/fl_(tm)
66%
18%
10%
Имеющий de ".резистентность
2/8/2013
200
9222.04
4.19
_JH/fl_(tm)
38%
81%
Имеющий de ".резистентность
5/8/2013
200
1.90
1.30
100%
Имеющий de почо^езистентность
8/12/20'
548.61
3.44
40%
10%
50%
Имеющий de novo резистентность
9/20/20'
38.61
3.54
н/д
30%
70%
Имеющий de ".резистентность
8/11/20'
471.08
6.42
WT*
н/д
31%
82%
Имеющий de почо^езистентность
7/10/20'
7.94
5.50
. н/д
н/д
20%
40%
40%
Имеющий de ".резистентность
8/29/20'
87.48
4.18
н/д
33%
87%
Имеющий de novo резистентность
5/13/20'
2.97
2.80
н/д
12%
81%
Имеющий de novo резистентность
8/12/20'
89.54
1.53
98%
Имеющий de novo резистентность
8/24/20'
596.92
.8
4.53
..... н/д ....
..... н/д
50%
50%
Имеющий de novo резистентность
4/23/20'
806.95
7.88
н/д
40%
80%
Имеющий de novo резистентность
11/19/2012
2.73
0.00
н/д
н/д
н/д
: н/д....
Имеющий de novo резистентность
8/28/20'
51.10
1.02
н/д......
...^
100%
Имеющий de novo резистентность
7/18/20'
81.30
1.34
100%
Имеющий de novo резистентность
8/7/2013
15.43
1.27
100%
Имеющий de поуо_резистентность
7/2/2013
15.46
1.88
. н/д
100%
Приобретенная резистентность
5/20/2013
200
127.30
16.45
29%
17%
30%
24%
Приобретенная резистентность
5/1/2013
200
151.40
9.21
33%
34%
29%
Приобретенная резистентность
3/27/20'
30.73
7.78
40%
40%
20%
Приобретенная резистентность
5/29/20'
528.97
4.72
. н/д
_JH/fl_(tm)
25%
25%
50%
Приобретенная резистентность
9/11/20'
232.41
1.20
. н/д
_JH/fl_(tm)
100%
Приобретенная резистентность
5/22/20'
7.94
1.28
. н/д
н/д
100%
Приобретенная резистентность
11/28/2012
79.48
1.57
. н/д
н/д
н/д
н/д
н/д
,__йд_
Приобретенная резистентность
11/8/20'
53.42
0.00
н/д
н/д
н/д
н/д
н/д
... н/д .
Приобретенная резистентность
5/28/20'
148.54
1.73
н/д
95%
Приобретенная резистентность
8/12/20'
221.24
1.74
. н/д
_JH/fl_(tm)
93%
Приобретенная резистентность
6/5/2013
18.88
1.71
WT*
_JH/fl_(tm)
17%
83%
Приобретенная резистентность
7/29/20'
226.69
2.39
. н/д
н/д
50%
50%
Приобретенная резистентность
8/12/20'
10.07
0.97
. н/д
_JH/fl_(tm)
100%
Пациент с положительным ответом
7/30/20'
3.24
н/д
. н/д
н/д
н/д
н/д
н/д
Пациент с положительным ответом
6/4/201
20.58
оооооооооооооооооооооо
1.42
н/д
98%
СТС-12-0041
СТС-09-0361
СТС-09-0329
СТС~12~0143
О 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 80
Кол-во фенотипов
Кол-во фенотипов
Кол-во фенотипов
Кол-во фенотипов
1-я линия
2-я линия
3-я линия
Помимо 3-й линии
Не подвергались терапии
Предшествовавшая терапия • Абиратерон
Предшествовавшая терапия
• Энзалутамид
• Химиотерапия
Предшествовавшая терапия
• Кетоконазол
• Абиратерон
• Доцетаксел
• Эксп. терапия
• Энзалутамид
ФИГ. 1
ФИГ. 1
ФИГ. 1
ФИГ. 1
ФИГ. 1
ФИГ. 1
ФИГ. 2А
ФИГ. 2А
ФИГ. 2А
ФИГ. 2А
ФИГ. 4
ФИГ. 4
ФИГ. 4
ФИГ. 4
ФИГ. 4
ФИГ. 4
ФИГ. 4
ФИГ. 4
ФИГ. 4
ФИГ. 6
ФИГ. 7
ФИГ. 7
ФИГ. 7
ФИГ. 7